TW201906637A - 方法及分子 - Google Patents

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Abstract

本發明提供生物偶聯方法及用於其中之化合物。該生物偶聯方法包括使含有第一不飽和官能基之生物分子與包括第二不飽和官能基之有效載荷藥偶聯之步驟，其中該等第一及第二不飽和官能基彼此互補，從而偶聯係該等官能基經由形成環己烯環之狄爾斯-阿爾德反應(Diels-Alder reaction)進行之反應。

Description

方法及分子
本發明係關於使生物分子偶聯至有效載荷藥之方法、藉由該方法製得之分子、包括該分子之組合物、尤其適用於該方法之某些新穎胺基酸結構及生物分子及組合物在治療、尤其治療發炎性反應(包含癌症)中之用途。
存在諸多包括連接至聚合物或毒素之蛋白質/多肽組分之註冊醫藥產品。通常，聚合物係聚乙二醇且其藉由分別使半胱胺酸或離胺酸胺基酸殘基(尤其離胺酸殘基之側鏈)與馬來醯亞胺基團或NHS-酯基團進行反應而偶聯至多肽。其他治療化合物(例如抗體-藥物偶聯物(ADC))係以類似方式製得，其中毒素/藥物具有用於附接至抗體之反應性馬來醯亞胺或其他適當官能基，該等反應之實例一般地展示於下文中：
在多肽中採用天然胺基酸殘基可產生含有混合物質之偶聯產物。另外，若用於偶聯反應之靶胺基酸殘基位於蛋白質摺疊中或係(例如)溶劑不可接近的，則可能需要苛刻條件以驅使完成偶聯反應。然而，通常期望在生物分子存在下採用溫和條件，此乃因分子活性可由苛刻條件損害。
用於偶合至生物分子中之天然殘基之基本偶聯反應在過去5至10年中之變化極小，其中該等反應之實例展示於下文中。然而，該等反應變得愈加重要，此乃因二代生物產物(例如抗體藥物偶聯物)很可能對治療疾病(例如癌症)具有顯著貢獻。可使用諸如所謂的點擊化學(Click-Chemistry)等化學來生物偶聯至用於諸如以下等反應之非天然官能基：疊氮化物-炔烴環加成反應、緊繃性疊氮化物-炔烴環加成、炔烴-硝酮添加、烯烴及疊氮化物之反應[3+2環加成]、烯烴及四嗪逆需求狄爾斯-阿爾德反應(Diels-Alder reaction)或烯烴及四唑[Husigen]反應。
可藉由化學修飾天然離胺酸、半胱胺酸或酪胺酸或藉由表現在蛋白質結構中納入非天然胺基酸之蛋白質來將該等反應所需之非天然官能基安置於蛋白質上。該等化學之實例展示於下文中： 儘管上文所展示之許多偶聯化學已擴展了可用於製備生物偶聯物之可能性，但其製備治療分子之適應性可受限於以下因素：長反應時間、需要可氧化蛋白質官能基之觸媒、影響蛋白質性質(例如聚集趨勢)之疏水性反應配偶體、關於爆炸性中間體(亦即疊氮化物化合物)之潛在安全性問題(僅列舉少數問題)。
另外，採用上文所展示化學經由偶合至非天然蛋白質官能基來產生ADC需要研發含有適當互補反應性基團之毒素/藥物，該互補反應性基團可使得藥物研發變得複雜，此乃因一些反應性基團可能與某些有效載荷藥不相容及/或可影響有效載荷藥性質(例如疏水性及溶解性)。當前，已研發許多包含用於偶聯至半胱胺酸硫醇之馬來醯亞胺基團之ADC有效載荷藥。使生物分子偶聯至另一實體(例如聚合物或有效載荷藥)之替代方法將係有用的，例如利用當前可用(例如馬來醯亞胺)且已知與眾多種期望有效載荷藥相容之官能基之方法。另外，具有下列性質中之一或多者之偶聯反應係有用的：特異性、迅速、採用溫和或適度條件及能夠與非溶劑暴露性胺基酸殘基進行反應。
因此，在一態樣中，提供生物偶聯方法，該方法包括使含有第一不飽和官能基之生物分子與包括第二不飽和官能基之有效載荷藥偶聯之步驟，其中第一及第二不飽和官能基彼此互補，從而偶聯係該等官能基經由形成環己烯環之狄爾斯-阿爾德反應進行之反應。
如本文所採用之狄爾斯-阿爾德反應係指形成環己烯環之4+2環加成反應，該環己烯環可為稠合環系統之一部分。反應之一般實例展示於下文中：。 令人吃驚地，本發明者已確定，此反應可在溫和條件下用於包括生物分子之特定偶聯反應中。在一些情況下，該反應在室溫下耗費少至兩小時。在其他情況下，生物偶聯反應可發生於一個步驟中，且無需除有效載荷藥、蛋白質及溶劑外之其他試劑。
另外，反應性交聯劑及包括期望用於有效狄爾斯-阿爾德轉變之二烯官能基之非天然胺基酸可以合成方式獲得且可在簡單且直接之途徑中以高產率產生。
可經由添加連接體或藉由將非天然胺基酸納入多肽序列中來將二烯或親二烯物納入生物分子中。然後可將所需互補官能基納入有效載荷藥中。
下圖係有效載荷藥偶聯至在胺基酸中包括二烯之非天然胺基酸之示意圖示：有利的是，偶聯反應產物在體溫下於生物環境中較為穩定。然而，若期望，則可藉由將偶聯產物暴露於升高溫度(例如60℃或更高溫度)來逆轉反應。
在一實施例中，第一官能基(亦即生物分子內)係二烯。
在一實施例中，第二官能基(亦即有效載荷藥中)係(例如)選自以下之親二烯物：馬來醯亞胺、馬來酸酯、富馬酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、甲基乙烯基酮、乙烯基吡啶、醯胺及丁-2-炔二酸酯、醌、乙炔。
在一實施例中，第二官能基係二烯。
在一實施例中，第一官能基(亦即生物分子中)係親二烯物，例如馬來酸酯、馬來醯亞胺、富馬酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、甲基乙烯基酮、乙烯基吡啶、丁-2-炔二酸之醯胺及酯、醌、乙炔。
在一實施例中，第一官能基係非天然胺基酸(例如包括降莰烯之非天然胺基酸)中之親二烯物。
在一實施例中，二烯係直鏈二烯、碳環二烯或雜環二烯，舉例而言，二烯包括丁二烯、環戊二烯、1, 3-環己二烯、呋喃或蒽。
在一實施例中，二烯含於非天然胺基酸(例如衍生自離胺酸、半胱胺酸、硒半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甘胺酸及酪胺酸之非天然胺基酸)中。
在一實施例中，二烯位於胺基酸之側鏈中。
在一實施例中，非天然胺基具有式(I )：RX -X1 -O0-1 C(O)- 胺基酸殘基 (I) 其中：RX 代表選自以下之不飽和基團： i) C4-9 直鏈共軛二烯， ii) 包括共軛二烯之C5-14 碳環基，及 iii) 5至14員雜環基，其包括1、2或3個選自O、N及S之雜原子及共軛二烯， 其中i)、ii)及iii)可具有最多5個取代基(例如一個、兩個或三個取代基)，舉例而言，取代基獨立地選自C1-3 烷基、側氧基、鹵素、磺基、硫氫基、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；且X1 代表i) 飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基之基團取代；或ii) 與來自碳環基或雜環基之碳一起代表連接至飽和或不飽和(尤其飽和)具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基鏈之環丙烷環，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基之基團取代，且-O0-1 C(O)- 經由胺基酸之側鏈連接。
在一實施例中，非天然胺基酸係式(II )結構之殘基：其中X2 代表-C-、-C(R’)-、-CH2 或O；R’ 代表H或C1-3 烷基，Ra 代表i) 飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之基團取代；或ii) 與來自5員環之碳一起代表連接至飽和或不飽和(尤其飽和)具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基鏈之環丙烷環，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之基團取代；Rb 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Rc 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Rd 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Re 代表H、飽和或不飽和(尤其飽和)具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中一或多個碳視情況由-O-置換且該鏈視情況經一或多個鹵素原子(例如碘)、N3 或-C2-5 炔基取代。
在一實施例中，Ra 係-(CH2 )mC(O)-、-CH2 (CH3 )C(O)-、-(CH2 )mCH2 OC(O)-、-CHCHCH2 OC(O)-或-OCH2 CH2 COC(O)-且m 代表0或1。
在一實施例中，Rb 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
在一實施例中，Rc 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
在一實施例中，Rd 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
在一實施例中，Re 代表H或-CH2 OCH2 CH2 N3 。
在一實施例中，非天然胺基酸係式(IIa )結構之殘基：其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及X2 定義於上文中。
在一實施例中，非天然胺基酸具有式(IIb)結構：其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及X2 定義於上文中。
在一實施例中，非天然胺基酸具有式(IIc )結構：其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 定義於上文中且X2 ’ 係如上文所定義之-C-或-CR’。
通常，諸如式(I )、(II )、(IIa )、(IIb )及(IIc )等化合物至多含有僅一個疊氮化物基團。
在一實施例中，非天然胺基酸係選自包括以下之群： 在一實施例中，該方法包括使二烯或親二烯物(尤其二烯)經由連接體偶聯至生物分子中之胺基酸殘基之預步驟，舉例而言，其中胺基酸係半胱胺酸或離胺酸。
在一實施例中，在加成至生物分子中之該胺基酸殘基之前之二烯具有式(III )結構：RX -Bn-X3 m-Yp-Z (III) 其中n 代表0或1；m 代表0或1；p 代表0或1；RX 代表選自以下之不飽和基團： i) C4-9 直鏈共軛二烯， ii) 包括共軛二烯之C5-14 碳環基，及 iii) 5至14員雜環基，其包括1、2或3個選自O、N及S之雜原子及共軛二烯， 其中i)、ii)及iii)可具有最多5個取代基(例如一個、兩個或三個取代基)，舉例而言，其中取代基獨立地選自C1-3 烷基、側氧基、鹵素、磺基、硫氫基、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；且B 代表C1-6 伸烷基、-C3-4 環烷基C1-6 伸烷基-；其中視情況糖殘基(例如葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖及果糖)含於該等基團中之任一者之伸烷基鏈中，且其中針對B所定義該等變量中之任一者之伸烷基鏈視情況具有一或兩個獨立地選自N-及O-連接糖殘基(例如葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖及果糖)之取代基；X3 代表-(R1 )NC(O)-、-C(O) N(R1 )-、-OC(O)-、-OC(O)N-；R1 代表H或-CH2 OCH2 CH2 R2 ；R2 代表-N3 、C2-5 炔基或鹵素(例如碘)；Y 代表-(OCH2 )qC2-6 伸烷基或視情況經-NR3 R4 取代之-C2-6 伸烷基， 其中q為1至7000；R3 及R4 獨立地代表H或C1-3 烷基；Z 代表-C(O)OR5 、R5’ 、-NC(O)R6 、-C2-5 伸烷基、CH2 -O-NH2 、炔烴、疊氮化物、3-芳基丙炔腈或鹵素(例如碘)；R5 代表C1-6 烷基、琥珀醯亞胺、C6 F4 H (四氟己基)或H；R5’ 代表硫橋接基團，例如二溴馬來醯亞胺、二氯丙酮或其中之任一者之衍生物，R6 代表：其中R7 係視情況具有一或多個(例如一個、兩個或三個)選自羥基、磺基、胺基及-(OCH2 )v C2-6 伸烷基之基團之C1-6 伸烷基及視情況具有一或多個(例如一個、兩個或三個)選自羥基、磺基、胺基及-(OCH2 )v C2-6 伸烷基之基團之苯基， v係整數1、2、3、4或5代表其中片段連結至分子之其餘部分。
在一實施例中，二烯具有以下結構：在一實施例中，在10℃至40℃範圍內之溫度，例如環境溫度下實施反應。
在一實施例中，在水性溶劑(例如水性有機溶劑系統)、緩衝液(例如視情況包括極性非質子溶劑(例如DMSO)之PBS)或表面活性劑(例如聚山梨醇酯80)或其組合中實施反應。
在一實施例中，治療生物分子係(例如)選自包括配體、受體、抗體分子之群之多肽。
在一實施例中，改造生物分子以針對原始或天然序列添加或去除一或多個離胺酸殘基。
在一實施例中，改造生物分子以針對原始或天然序列添加或去除一或多個半胱胺酸殘基。
在一實施例中，改造生物分子以針對原始或天然序列添加或去除一或多個酪胺酸殘基。
在一實施例中，改造生物分子以針對原始或天然序列添加一或多個天然或非天然胺基酸殘基。
在一實施例中，生物分子係治療分子。
在一實施例中，有效載荷藥係選自：a. 奧裡斯他汀(auristatin)，其例如選自包括MMAE (單甲基奧裡斯他汀(monomethyl auristatin) E), MMAF (單甲基奧裡斯他汀F)、多柔比星(doxorubicin)、微管溶素(tubulysin)及多卡米星(duocarmycin)之群；b. 包括類美登素(maytansinoid)，例如N 2'-去乙醯基-N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(maytansine) (DM1)、N 2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)及N 2'-去乙醯基-N 2'(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)，c. 吡咯并苯并二氮呯(PBD)或亞胺基苯并二氮呯(IBD)d. 拓撲異構酶抑制劑，例如SN-38、伊立替康(irinotecan)、依沙替康(exatecan)或DxD1。e. 係毒素，及f. 聚合物，例如天然聚合物(例如澱粉、聚(麩胺酸)、聚(天門冬胺酸)、聚(離胺酸)或白蛋白)或合成聚合物(例如PEG)。
在另一獨立態樣中，提供偶聯至自或可自本發明方法獲得之有效載荷藥之生物分子。
在一獨立態樣中，亦提供經由二烯與親二烯物之間之狄爾斯-阿爾德反應偶聯至有效載荷藥以形成環己烯環之生物分子。
在一實施例中，環己烯環係(例如)包括最多20個原子之稠合環系統之一部分。
在一實施例中，稠合環系統具有式(IVa )：(IVa) 其中 RY 代表例如如本文所定義之有效載荷藥；且 RZ 代表例如如本文所定義之生物分子，或 式(IVb )：其中 RY 代表例如如本文所定義之有效載荷藥； RZ 代表例如如本文所定義之生物分子；且 X4 代表-O-或-CH2 -。
在一實施例中，生物分子係抗體或其結合片段。
亦提供偶聯至本發明有效載荷藥之生物分子，其中有效載荷藥係選自：a. 奧裡斯他汀，其例如選自包括微管溶素或吡咯并苯并二氮呯(PBD)、MMAE (單甲基奧裡斯他汀E)、MMAF (單甲基奧裡斯他汀F)、多柔比星及多卡米星之群； b.包括類美登素，例如N 2'-去乙醯基-N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)、N 2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)及N 2'-去乙醯基-N 2'(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)， c. 係毒素， d. 聚合物，例如天然聚合物(例如澱粉、聚(麩胺酸)或白蛋白)或合成聚合物(例如PEG)。
亦提供包括偶聯至本發明有效載荷藥之生物分子及稀釋劑、載劑及/或賦形劑之醫藥組合物，舉例而言，其中該組合物係非經腸調配物。
本發明另外提供治療患者之方法，其包括投與治療有效量之偶聯至有效載荷藥之生物分子或如本文所揭示之醫藥組合物。
因此，提供用於治療之偶聯至有效載荷藥之生物分子或如本文所揭示之醫藥組合物。
本發明之另一態樣係偶聯至有效載荷藥之生物分子或如本文所揭示之醫藥組合物用於製造藥劑之用途。
在一獨立態樣中，提供包括二烯或親二烯物之非天然胺基酸，舉例而言，其中二烯或親二烯物位於側鏈中。
在一實施例中，本發明之非天然胺基酸係衍生自離胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、硒半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甘胺酸及酪胺酸。
在一實施例中，本發明之非天然胺基酸具有式(I )：RX -X1 -O0-1 C(O)- 胺基酸殘基 (I) 其中：RX 代表選自以下之不飽和基團： i) C4-9 直鏈共軛二烯， ii) 包括共軛二烯之C5-14 碳環基，及 iii) 5至14員雜環基，其包括1、2或3個選自O、N及S之雜原子及共軛二烯， 其中i)、ii)及iii)可具有一個、兩個或三個取代基；且X1 代表C1-5 烷基，且O0-1 C(O) 經由胺基酸之側鏈連接。
在一實施例中，非天然胺基酸具有式(II )：或其鹽，其中X2 代表-C-、CR’、-CH2 或O；Ra 代表i) 飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之基團取代；或ii) 與來自5員環之碳一起代表連接至飽和或不飽和(例如飽和)具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基鏈之環丙烷環，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之基團取代；Rb 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Rc 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Rd 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Re 代表H、飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中一或多個碳視情況由-O-置換且該鏈視情況經一或多個鹵素原子(例如碘)、N3 或-C2-5 炔基取代。
在一實施例中，Ra 、Rb 、Rc 、Rd 及Re 係如本文所定義。
在一實施例中，非天然胺基酸係式(IIa)結構之殘基：或其鹽，其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及X2 係如上文針對式(II)化合物所定義。
在一實施例中，非天然胺基酸具有式(IIb)結構：或其鹽，其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及X2 係如上文針對式(II)化合物所定義。
在一實施例中，非天然胺基酸具有式(IIc)結構：或其鹽，其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及X2 係如上文針對式(II)化合物所定義。
在一實施例中，非天然胺基酸係選自包括以下之群：或其中之任一者之鹽。
亦提供包括本發明之非天然胺基酸之多肽。
在一實施例中，生物偶聯反應並不使生物分子偶聯至凝膠或顆粒。
在一獨立態樣中，提供生物偶聯方法，該方法包括使含有第一不飽和官能基之生物分子與包括第二不飽和官能基之實體偶聯之步驟，其中第一及第二不飽和官能基彼此係互補對，從而互補對之一種官能基係二烯且互補對中之另一官能基係親二烯物且偶聯係該等官能基經由形成環己烯環之狄爾斯-阿爾德反應進行之反應，條件係二烯並非未經取代之呋喃。
在一獨立態樣中，提供生物偶聯方法，該方法包括使含有非天然胺基酸中之第一不飽和官能基之生物分子與包括第二不飽和官能基之實體偶聯之步驟，其中第一及第二不飽和官能基彼此係互補對，從而互補對之一種官能基係二烯且互補對中之另一官能基係親二烯物且偶聯係該等官能基經由形成環己烯環之狄爾斯-阿爾德反應進行之反應。
本文所用之生物分子係具有至少一種生物活性之多肽。
在一實施例中，生物分子係治療生物分子，亦即可用於療法、尤其特定人類療法中之生物分子。
本文所用之偶聯(反應)簡言之係連接分子與另一實體之反應。在本說明書之背景中，偶聯至(例如)有效載荷藥之生物分子係自偶聯反應獲得之產物。
本文所用之生物偶聯方法係指使生物分子連接至另一實體(例如有效載荷藥)之方法。
本說明書背景中之實體包含有效載荷藥，例如聚合物及/或毒素、固體表面(例如板)、顆粒或諸如此類。有效載荷藥之實例更詳細地闡述於下文中。
本文所用之胺基酸殘基係指經由胺基酸之N及/或C末端連接(例如)至另一胺基酸之天然或非天然胺基酸，特定而言，其中至少一種連接係肽鍵。
本文所用之非天然胺基酸係指除21種天然胺基酸中之一者外之胺基酸。舉例而言，非天然胺基酸包括二烯或親二烯物且亦在天然胺基酸之特徵性相對位置含有胺基及羧酸官能基。某些非天然胺基酸及其製備方法揭示於WO2015/019192中，該案件以引用方式併入本文中。在一實施例中，親二烯物含於非天然胺基酸(例如降莰烯離胺酸)中，此揭示於US2015/0005481中，該案件以引用方式併入本文中。
非天然胺基酸通常係衍生自天然胺基酸。衍生自天然胺基酸係指，非天然胺基酸實際上係基於(或納入)或類似於天然胺基酸之結構，舉例而言，可縮短離胺酸中之伸烷基鏈以提供不同於天然4碳鏈之3碳鏈，但與離胺酸之結構關係或類似性仍然存在。因此，天然胺基酸之衍生物包含諸如以下等修飾：納入二烯或親二烯物、伸長或縮短伸烷基鏈、向側鏈中之氮、氧、硫添加一或多個取代基或將氮、氧或硫轉化成不同官能基或其中之任一者之組合。通常，大部分修飾將在非天然胺基酸中添加結構。然而，修飾可包含去除或代替天然存在於胺基酸中之原子。
本文所用之天然胺基酸係指21種蛋白原性胺基酸(亦即精胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、硒半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸)。
在一實施例中，將包括二烯或親二烯物之非天然胺基酸納入生物分子之胺基酸序列中(例如在重組多肽之表現過程中)。此較為有利，此乃因其精確定位胺基酸，此然後促進了與有效載荷藥之極特異性偶聯反應。
在一實施例中，非天然胺基酸可經由連接體及偶聯反應附加至生物分子。
本文所用之親二烯物係與二烯反應之官能基。在一實施例中，親二烯物包括烯烴(具有至少一個雙鍵、尤其一個雙鍵)。
本文所用之二烯係指兩個雙鍵(兩個-烯基團)。然而，該兩個基團需要彼此鄰近。因此，通常，除非上下文另外指示，否則本文所用之二烯係指共軛二烯。
本文所用之共軛二烯係指線性或環狀背景中之雙鍵-單鍵-雙鍵。
線性背景中之共軛二烯包含C4-9直鏈共軛二烯，例如丁二烯、戊二烯、己二烯、庚二烯、辛二烯及壬二烯。此背景中之線性係指非環狀且由此包含含有共軛二烯之C4-9碳鏈之具支鏈形式。
環狀背景中之共軛二烯包含(例如)單環碳環(例如環戊二烯或環己二烯)或雙環或三環碳環系統(例如包括稠合至另一環之環戊二烯或環己二烯之系統)。在一實施例中，共軛二烯並非芳香族。共軛二烯並不與偶聯反應混淆，二者「不相關」。
本文所用之碳環係指環系統，其中構成系統之環係由碳原子構成，亦即雜原子並不有貢獻於環結構。然而，碳環可具有一或多個取代基且取代基可含有雜原子。在一實施例中，碳環係部分地不飽和或芳香族。
環丙烷係三員碳環。在一些實施例中，環丙烷環附加於碳環二烯環或雜環二烯環上，例如如本文之一些結構所展示。此較為有利，此乃因其最小化二烯自反應(其可與反應性二烯發生)之傾向。本說明書中之此環丙烷環本身並不定義為取代基，而是，其係針對附接至包括二烯之環系統之鏈或「連接體」來定義。
本文所用之包括共軛二烯之C5-14碳環基係指5至14員碳環系統，其可具有一或多種取代基，例如一個、兩個、三個、四個取代基。
包括共軛二烯或親二烯物之碳環係非天然胺基酸中所發現反應性官能基之一部分，或係在與「有效載荷藥」偶聯之前添加之連接體之組分。C5-14碳環之實例包含環戊二烯(包含經取代或未經取代之環戊二烯)、環己二烯(包含經取代或未經取代之環己二烯)、蒽(包含經取代或未經取代之蒽)。
在一實施例中，非天然胺基酸或連接體中之環戊二烯未經取代。在一實施例中，環戊二烯經由環丙烷環連結至非天然胺基酸或連接體。
在一實施例中，非天然胺基酸或連接體中之環戊二烯包括一個、兩個、三個、四個或五個C1-3烷基取代基，舉例而言，環戊二烯具有五個甲基取代基。
本文所用之雜環基係指包括一或多個(例如1、2、3或4個)獨立地選自O、N及S之雜原子之飽和或部分地不飽和或芳香族環，視情況，環中之一或兩個碳可具有側氧基取代基。顯而易見，在適當時，雜原子中未用於形成或維持環結構之任何化合價可由氫或取代基填充。因此，在適當時，雜環上之取代基可位於碳或雜原子(例如N)上。
5至14員雜環含有5至14個構成環系統之成員，例如包括一個、兩個或三個雜原子。雜環可(例如)具有一個、兩個或三個取代基。一般而言，雜環通常包括二烯或親二烯物且由此至少部分地不飽和且可為芳香族。
5至14員雜環通常包括納入非天然胺基酸或連接體中之二烯或親二烯物。包括二烯之雜環實例包含呋喃(包含經取代或未經取代之呋喃、尤其經取代呋喃)及2H-吡喃(包含其經取代或未經取代之形式)。包括親二烯物之雜環實例包含馬來醯亞胺、乙烯基吡啶、吡咯啶(例如2-吡咯啶及3-吡咯啶)及3,4-二氫吡喃。
在一種呋喃中，其具有至少一個取代基，例如推電子取代基，例如烷氧基、尤其至少一個(例如一個)甲氧基。
在經由連接體將二烯或親二烯物引入生物分子中之情形下，諸如N3、鹵基、琥珀醯亞胺或炔烴等官能基可與(例如)生物分子之胺基酸序列中之離胺酸發生反應。
本文所用之烷基係指直鏈或具支鏈烷基，例如(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、正丁基及第三丁基。在一實施例中，烷基係指直鏈烷基。
本文所用之烷氧基係指直鏈或具支鏈烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基。本文所用之烷氧基亦延伸至氧原子位於烷基鏈內之實施例，例如-C1-3烷基OC1-3烷基，例如-CH2CH2OCH3或-CH2OCH3。因此，在一實施例中，烷氧基經由碳連接至分子之其餘部分。在一實施例中，烷氧基經由氧連接至分子之其餘部分，例如-C0烷基OC1-6烷基。在一實施例中，本發明係關於直鏈烷氧基。
本文所用之胺基係指-NH2，C1-4單或二-醯基胺基分別意欲係指-NHC(O)C1-3烷基及(-NC(O)C1-3烷基) C(O)C1-3烷基)。
C1-4單或二-烷基胺基分別意欲係指-NHC1-4烷基及-N(C1-4烷基) (C1-4烷基)。
鹵素或鹵基包含氟、氯、溴或碘、尤其氟、氯或溴、尤其氟或氯。
本文所用之側氧基係指C=O且通常表示為C(O)。
本文所用之伸烷基係指具支鏈或無支鏈碳基團，例如亞甲基(-CH2-)或其鏈。
本文所用之C2-5 炔烴係指在線性或具支鏈配置中含有三鍵及2至5個碳原子之基團或自由基。
對於飽和或不飽和、具支鏈或無支鏈C1-8烷基鏈而言，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳，適宜地1或2個，尤其1個)由選自O、N、S(O)0-3之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素之基團取代，熟習此項技術者應明瞭，在技術上適當時，雜原子可置換一級、二級或三級碳(亦即CH3 、-CH2 -或-CH-)或具支鏈碳基團。
本文所用之N3 係指疊氮化物。
本文所用之磺基係指鍵結至一個、兩個或三個氧原子之硫原子。
本文所用之巰基係指鍵結至一或多個氫原子之硫原子，其可在質子化形式與非質子化形式之間平衡存在。
環己烯環係經由狄爾斯-阿爾德機制獲得之本發明反應之偶聯產物之特徵性特徵，其係單環系統或稠合環系統(例如雙環系統)之一部分。
用於添加至式(III)化合物中之適宜糖包含葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖、半乳糖胺、甘露糖、果糖、半乳糖、麥芽糖及乳糖。有利的是，添加糖分子可增加溶解性。
用於本發明中之多肽 術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為直鏈或具支鏈，其可包括經修飾胺基酸，且其可雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋天然或藉由干預經修飾之胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，例如與標記組分偶聯。該定義亦包含(例如)含有一或多種胺基酸類似物(例如包含非天然胺基酸等)以及業內已知之其他修飾之多肽。應理解，本發明多肽係基於抗體。
本文所用之多肽係指5個或更多個胺基酸之序列，其含有或不含包括至少一種硫醇基團之二級或三級結構。因此，在本發明中，術語「多肽」包含肽、多肽及蛋白質。除非另外指定，否則該等術語可互換使用。
在一實施例中，多肽係蛋白質。蛋白質通常含有二級及/或三級結構且可為單體或多聚體形式。
在一實施例中，蛋白質係呈單鏈或相關鏈或其結合片段之形式之抗體。
本文所用之抗體分子係提及抗體、抗體結合片段及抗體形式(例如包括該等抗體或其結合片段之多特異性抗體)之一般術語。
術語「抗體」或「免疫球蛋白」可在本文中互換使用，其包含全抗體及其任一抗原結合片段或單鏈。
典型抗體包括至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈，該等鏈藉由二硫鍵互連。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH、VH區或VH結構域)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個或四個恆定結構域：CH1、CH2、CH3及CH4。Fc區包含含有抗體中排除第一恆定區免疫球蛋白結構域及其片段之恆定區之多肽。因此，對於IgG而言，「Fc區」係指CH2及CH3及視情況N-末端連接至該等結構域之撓性鉸鏈區之全部或一部分。術語「Fc區」可係指獨立之此區域或在抗體、抗體片段或Fc融合蛋白之背景中之此區域。
每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL、VL區或VL結構域)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域CL。
VH及VL區可進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區域(稱為框架區(FW))，二者間雜排列。每一VH及VL由3個CDR及4個FW組成，其自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。框架區可根據其各別VH及VL區來指定。因此，舉例而言，VH-FW1係指VH之第一框架區。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可調介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包含免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q))之結合。
術語「抗體」意指識別靶(例如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述物質之組合)且經由免疫球蛋白分子之可變區內之至少一個抗原識別位點(亦稱為結合位點)與其特異性結合之免疫球蛋白分子或其抗原結合片段。如本文中所使用，術語「抗體」涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈抗體片段(scFv及經二硫化物穩定之scFv (dsFv))、多特異性抗體(例如自至少兩種不同抗體生成之雙特異性抗體或自抗體片段形成之多特異性抗體，例如參見PCT公開案WO96/27011、WO2007/024715、WO2009018386、WO2009/080251、WO2013006544、WO2013/070565及WO2013/096291)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包括抗體之抗原結合片段之融合蛋白及任一包括抗原結合片段之其他經修飾免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現期望生物活性。
抗體可為以下中之任一者：5個主要種類之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM；或子類(同型) (例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)；或異型(例如Gm，例如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em及Km(1、2或3))。不同種類之免疫球蛋白具有不同且熟知之亞單元結構及三維構形。抗體可衍生自任一哺乳動物，包含(但不限於)人類、猴、豬、馬、兔、狗、貓、小鼠等或其他動物(例如鳥，例如雞)。
術語「抗原結合片段」係指包括完整抗體之抗原決定可變區之片段。業內已知，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來實施。抗體片段之實例包含(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、線性抗體、單鏈抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。
因此，在一實施例中，本發明中所用抗體之可包括具有全長重鏈及輕鏈或其片段之完整抗體分子且可為(但不限於) Fab、經修飾Fab、Fab’、經修飾Fab’、F(ab’)2、Fv、單一結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二價抗體、三價抗體或四價抗體、雙-scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、其組合及上述物質中之任一者之表位結合片段。
具體涵蓋之其他抗體係「寡株」抗體，其係不同單株抗體之預定混合物。例如參見PCT公開案WO 95/20401；美國專利第5,789,208號及第6,335,163號。較佳地，在單一細胞中生成由針對一或多種表位之抗體之預定混合物組成之寡株抗體。更佳地，寡株抗體包括複數條能夠與公用輕鏈配對以生成具有多種特異性之抗體之重鏈(例如PCT公開案WO 04/009618)。寡株抗體尤其可用於期望靶向單一靶分子上之多個表位時。熟習此項技術者將知曉或可確定何種類型之抗體或抗體混合物適用於預期目的及期望需要。
具有涵蓋用於本發明之其他部分係較小經改造蛋白質結構域，例如支架(例如參見美國專利公開案第2003/0082630號及第2003/0157561號)。支架係基於已知天然、非抗體結構域家族、具體地蛋白質細胞外結構域，其通常具有較小大小(約100至約300 AA)且含有與高構形耐受性可變結構域有關之高度結構化核心以容許插入、缺失或其他取代。該等可變結構域可產生用於任一靶向蛋白之假定結合界面。一般而言，一般蛋白質支架之設計由以下兩個主要步驟組成：(i)選擇具有期望特徵之適宜核心蛋白，及(ii)藉由誘變一部分或所有接受高結構可變性之結構域來生成複合組合庫，以適當形式(亦即噬菌體、核糖體、細菌或酵母)顯示該等庫並篩選庫中具有期望結合特性(例如靶特異性及/或親和力)之誘變支架。親代支架之結構可高度可變且包含高度結構化之蛋白質結構域，該等結構域包含(但不限於) FnIII結構域(例如阿德奈汀(AdNectin)，例如參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)、US2008/00139791及WO 2005/056764；TN3，例如參見WO2009/058379及WO2011/130324)；蛋白質A之Z結構域(親和體，例如參見Protein Eng. Des. Sel. 17,455-462 (2004)及EP1641818A1)；來自LDL受體之結構域A (高親和性多聚物，例如參見Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月))；錨蛋白重複結構域(DARPins, J. Mol. Biol. 332,489-503 (2003), PNAS (2003)及Biol. 369, (2007)及WO02/20565)；C-型凝集素結構域(四聯蛋白，例如參見WO02/48189)。若期望，則可將兩個或更多個該等經改造支架結構域連接至一起以形成多價結合蛋白。端視應用/疾病適應症，個別結構域可靶向單一類型之蛋白質或若干蛋白質。
實際上，任一分子(或其部分，例如亞單元、結構域、基序或表位)可由包含(但不限於)以下之部分靶向及/或納入其中：整合膜蛋白，包含離子通道、離子幫浦、G-蛋白偶合受體、結構蛋白；黏附蛋白，例如整聯蛋白；轉運蛋白；涉及信號轉導之蛋白質及脂質錨定蛋白(包含G蛋白)；酶，例如激酶(包含膜錨定激酶)、膜結合酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、脂肪酸合成酶、消解酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶)、溶菌酶、聚合酶；受體，例如激素受體、淋巴因子受體、單核因子受體、生長因子受體、細胞介素受體；細胞介素；及更多部分。
在一些態樣中，本發明中所用之多肽靶向且/或納入選自(例如)以下之生長因子、細胞介素、細胞介素相關蛋白、生長因子、受體配體或受體之全部或一部分(例如亞單元、結構域、基序或表位)：BMP1、BMP2、BMP3B (GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (G-CSF)、EPO、FGF1 (αFGF)、FGF2 (βFGF)、FGF3 (int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6 (HST-2)、FGF7 (KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、FGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFRL1、FGFR6、IGF1、IGF2、IGF1R、IGF2R、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、 IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1 (ε)、FIL1 (ζ)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL2RA、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL28RA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVRL1、GFRA1、LTA (TNF-β)、LTB、TNF (TNF-α)、TNFSF4 (OX40配體)、TNFSF5 (CD40配體)、TNFSF6 (FasL)、TNFSF7 (CD27配體)、TNFSF8 (CD30配體)、TNFSF9 (4-1BB配體)、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12 (APO3L)、TNFSF13 (April)、TNFSF13B、TNFSF14 (HVEM-L)、TNFSF15 (VEGI)、TNFSF18、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF10A (Trail受體)、TNFRSF10B (Trail受體2)、TNFRSF10C (Trail受體3)、TNFRSF10D (Trail受體4)、FIGF (VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、KDR、FLT1、FLT4、NRP1、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP (瘦素)、PTN、ALK及THPO。
在一些態樣中，本發明中所用之多肽靶向且/或納入選自(例如)以下之趨化介素、趨化介素受體或趨化介素相關蛋白之全部或一部分(例如亞單元、結構域、基序或表位)：CCL1(I-309)、CCL2 (MCP-1/MCAF)、CCL3 (MIP-1a)、CCL4 (MIP-1b)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP-3)、CCL8 (mcp-2)、CCL11 (嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL13 (MCP-4)、CCL15 (MIP-1d)、CCL16 (HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18 (PARC)、CCL19 (MIP-3b)、CCL20 (MIP-3a)、CCL21 (SLC/艾克杜斯(exodus)-2)、CCL22 (MDC/STC-1)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25 (TECK)、CCL26 (嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCL27 (CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2 (GRO2)、CXCL3 (GRO3)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9 (MIG)、CXCL10 (IP 10)、CXCL11 (I-TAC)、CXCL12 (SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4 (CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL1 (SCYD1)、SCYE1、XCL1 (淋巴細胞趨化蛋白(lymphotactin))、XCL2 (SCM-1b)、BLR1 (MDR15)、CCBP2 (D6/JAB61)、CCR1 (CKR1/HM145)、CCR2 (mcp-1RB/RA)、CCR3 (CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5 (CMKBR5/ChemR13)、CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7 (CKR7/EBI1)、CCR8 (CMKBR8/TER1/ CKR-L1)、CCR9 (GPR-9-6)、CCRL1 (VSHK1)、CCRL2 (L-CCR)、XCR1 (GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1 (V28)、CXCR4、GPR2 (CCR10)、GPR31、GPR81 (FKSG80)、CXCR3 (GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA (IL8Ra)、IL8RB (IL8Rb)、LTB4R (GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10 (C10)、EPO、FY (DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2及VHL。
在一些態樣中，本發明中所用之多肽靶向且/或納入選自(例如)以下之蛋白質之全部或一部分(例如亞單元、結構域、基序或表位)：腎素；生長激素，包含人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；濾泡刺激激素；降鈣素；促黃體生成激素；升糖素；凝血因子，例如因子VII、因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)及溫韋伯氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，例如蛋白質C；心房利尿鈉因子；肺表面活性劑；纖維蛋白溶酶原活化劑，例如尿激酶或人類尿或組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；腦啡肽酶；RANTES (活化調控之正常T細胞表現及分泌因子)；人類巨噬球發炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人類血清白蛋白；苗勒氏抑制物(Muellerian-inhibiting substance)；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，例如β-內醯胺酶；DNase；IgE；細胞毒性T-淋巴球相關抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；活化素；蛋白質A或D；類風濕性因子；神經營養因子，例如骨源神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5或神經營養蛋白-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經生長因子；表皮生長因子(EGF)；胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，例如CD2、CD3、CD4、CD 8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80及CD147；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜之一部分，例如gp120；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；細胞黏附分子，例如LFA-1、Mac 1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3及VCAM；a4/p7整聯蛋白及Xv/p3整聯蛋白，包含其一或多個亞單元；整聯蛋白α亞單元，例如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整聯蛋白β亞單元，例如CD29、CD 18、CD61、CD104、β5、β6、β7及β8；整聯蛋白亞單元組合，包含(但不限於) αVβ3、αVβ5及α4β7；細胞凋亡路徑之成員；IgE；血液基團抗原；flk2/flt3受體；肥胖症(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白質C；Eph受體，例如EphA2、EphA4、EphB2等；人類白血球抗原(HLA)，例如HLA-DR；補體蛋白，例如補體受體CR1、C1Rq及其他補體因子(例如C3及C5)；醣蛋白受體，例如GpIbα、GPIIb/IIIa及CD200。
亦涵蓋特異性結合及/或包括癌症抗原之部分，該等癌症抗原包含(但不限於) ALK受體(多效蛋白受體)、多效蛋白、KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸性磷酸鹽；前列腺特異性抗原(PSA)；黑色素瘤相關抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特異性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多態上皮黏蛋白抗原；人類乳脂小球體抗原；結腸直腸腫瘤相關抗原，例如：CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1及LEA；伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)抗原-38.13；CD19；人類B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑色素瘤特異性抗原，例如神經節苷脂GD2、神經節苷脂GD3、神經節苷脂GM2及神經節苷脂GM3；腫瘤特異性移植型細胞表面抗原(TSTA)；病毒誘導性腫瘤抗原，包含T-抗原、DNA腫瘤病毒及RNA腫瘤病毒之包膜抗原；癌胚胎抗原-α-胎蛋白，例如結腸CEA、5T4癌胚胎滋養層醣蛋白及膀胱腫瘤癌胚胎抗原；分化抗原，例如人類肺癌抗原L6及L20；纖維肉瘤抗原；人類白血病T細胞抗原-Gp37；擬醣蛋白；鞘脂；乳癌抗原，例如EGFR (表皮生長因子受體)；NY-BR-16、NY-BR-16、HER2抗原(p185HER2)及HER3；多態上皮黏蛋白(PEM)；惡性人類淋巴球抗原-APO-1；分化抗原，例如發現於胎兒紅血球中之I抗原；發現於成人紅血球中之一級內胚層I抗原；植入前胚胎；發現於胃腺癌中之I(Ma)；發現於乳房上皮中之M18、M39；發現於骨髓樣細胞中之SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；VIM-D5；發現於結腸直腸癌中之D156-22；TRA-1-85 (血型H)；發現於睪丸癌及卵巢癌中之SCP-1；發現於結腸腺癌中之C14；發現於肺腺癌中之F3；發現於胃癌中之AH6；Y半抗原；發現於胚胎癌細胞中之Ley；TL5 (血型A)；發現於A431細胞中之EGF受體；發現於胰臟癌中之E1系列(血型B)；發現於胚胎癌細胞中之FC10.2；胃腺癌抗原；發現於腺癌中之CO-514 (血型Lea)；發現於腺癌中之NS-10；CO-43 (血型Leb)；發現於A431細胞之EGF受體中之G49；發現於結腸腺癌中之MH2 (血型ALeb/Ley)；發現於結腸癌中之19.9；胃癌黏蛋白；發現於骨髓樣細胞中之T5A7；發現於黑色素瘤中之R24；發現於胚胎癌細胞中之4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2及M1:22:25:8及發現於4至8細胞階段胚胎中之SSEA-3及SSEA-4；皮膚T細胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；Sialy Tn (STn)抗原；結腸癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12變體A；腺癌抗原ART1；副腫瘤性相關腦-睪丸癌抗原(腫瘤神經元抗原MA2；副腫瘤性神經元抗原)；神經-腫瘤學腹側抗原2 (NOVA2)；肝細胞癌抗原基因520；腫瘤相關抗原CO-029；腫瘤相關抗原MAGE-C1 (癌症/睪丸抗原CT7)、MAGE-B1 (MAGE-XP抗原)、MAGE-B2 (DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b及MAGE-X2；癌症-睪丸抗原(NY-EOS-1)及上文所列示多肽中之任一者之片段。
在一實施例中，所採用多肽係重組多肽。「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術產生之多肽或蛋白質。考慮分離表現於經改造宿主細胞中之以重組方式產生之多肽及蛋白質以用於本發明目的，如已經分離、分級分離或部分地或實質上藉由任一適宜技術純化之天然或重組多肽。本文所揭示之多肽可使用業內已知方法以重組方式產生。或者，本文所揭示之蛋白質及肽可以化學方式合成。
有效載荷藥分子 實體包含顆粒(例如奈米顆粒或微顆粒)、固體載體(例如板)且亦包含有效載荷藥。
有效載荷藥通常並不擴展至包含顆粒或固體載體。通常，有效載荷藥向生物分子提供一定改良並(例如)增加或最佳化所得治療性偶聯產物之性質。改良包含靶向、增加之溶解性、增加之半衰期、效應物功能、其他(另一)新活性、增加之活性、提供可檢測標記、減小毒性(舉例而言，有效載荷藥可將生物分子轉化成前藥)。
本文所用之有效載荷藥係指意欲藉由偶聯至多肽來「遞送」至靶區域位置之分子或組分。一般而言，有效載荷藥通常係(例如)選自由以下組成之群之效應物分子：毒素(例如細胞毒素，例如化學治療劑)、藥物、前藥、酶、免疫調節劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、細胞介素、激素、抗體或其片段、合成或天然聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段，例如反義分子或基因)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金屬、奈米顆粒及報告基因基團(例如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜術檢測之化合物)。
在一實施例中，有效載荷藥係選自包括以下之群：毒素、藥物、放射性核素、免疫調節劑、細胞介素、淋巴因子、趨化介素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、肽核酸、光活性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、非天然胺基酸、肽、脂質、聚合物、碳水化合物、支架分子、螢光標籤、可視化肽、生物素、血清半衰期延長劑、捕獲標籤、螯合劑、固體載體或其組合。
在一實施例中，有效載荷藥係藥物分子(在本文中亦稱為藥物)。用於本發明中之藥物分子之實例包含氮芥(nitrogen mustard)、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱(gemcitabine)、三氮烯、葉酸類似物、蒽環、紫杉烷(taxane)、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、鉑配位錯合物、長春花生物鹼、經取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質阻抑劑、激素拮抗劑、內皮抑素、紫杉醇(taxol)、喜樹鹼(camptothecin)、多柔比星、多柔比星類似物、抗代謝物、烷基化劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑、酪胺酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白體抑制劑、HDAC抑制劑、促細胞凋亡劑、胺甲喋呤(methotrexate)、CPT-11或其組合，且其中偶聯係。
在特定態樣中，藥物係阿米福汀(amifostine)、順鉑(cisplatin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、更生黴素(dactinomycin)、甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、鏈脲黴素(streptozocin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、多柔比星脂質體、吉西他濱、柔紅黴素(daunorubicin)、柔紅黴素脂質體、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂黴素(mitomycin)、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷(etoposide)、胺甲喋呤、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、博來黴素(bleomycin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、阿地介白素(aldesleukin)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、10-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、吉非替尼(gefitinib)、達卡巴嗪、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、羥基脲(hydroxyurea)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊達比星(idarubicin)、美司鈉(mesna)、干擾素α、干擾素β、伊立替康、米托蒽醌(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)、柳培林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、普卡黴素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他汀(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡黴素、鏈脲黴素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睪內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱(vinorelbine)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)芳香酶抑制劑及其組合。
在一實施例中，藥物係選自包括烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、類紫杉醇(taxoid)及舒拉明(suramin)之群。
在一實施例中，有效載荷藥包括微管溶素(例如微管溶素A)，微管溶素係具有抗有絲分裂活性之細胞毒性肽。
在一實施例中，毒素包括細胞毒素或細胞毒性劑(包含任一有害於(例如殺死)細胞之藥劑)。實例包含阿匹利定(aplidin)、阿那曲唑(anastrozole)、氮胞苷(azacytidine)、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚蟲素-1 (bryostatin-1)、白消安、考布他汀(combrestatin)、卡莫司汀、多拉司他汀(dolastatin)、埃博黴素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、類美登素、海綿抑制素(spongistatin)、根瘤菌素(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrin)、根黴素(roridin)、哈米特林(hemiasterlin)、紫杉醇、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。
在一實施例中，藥物(在此情形下亦係細胞毒素)包括抗代謝物(例如胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶胺烯咪胺(decarbazine))、烷基化劑(例如甲基二氯乙基胺、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、卡鉑、蒽環類(例如柔紅黴素(先前稱為道諾黴素(daunomycin))及多柔比星或多柔比星葡糖苷酸)、抗生素(例如更生黴素(先前稱為放線菌素、博來黴素、光輝黴素、安麯黴素(anthramycin) (AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或多卡米星)及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。
在一些態樣中，藥物係奧裡斯他汀(美國專利第5,635,483號、第5,780,588號)，例如MMAE (單甲基奧裡斯他汀E)或MMAF (單甲基奧裡斯他汀F)。在其他態樣中，藥物係多拉斯他汀(dolastatin)或多拉斯他汀肽類似物或衍生物。拉斯他汀及奧裡斯他汀已展示可干擾微管動力學、GTP水解以及核及細胞分裂(Woyke等人，Antimicrob. Agents and Chemother. 45:3580-3584 (2001))且具有抗癌活性(US5,663,149)。多拉斯他汀或奧裡斯他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N (胺基)末端或C (羧基)末端附接至偶聯物化合物。例如參見國際公開案第WO2002/088172號，其全部內容以引用方式併入本文中。
在其他態樣中，藥物係類美登素。在一些態樣中，類美登素係N 2'-去乙醯基-N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)、N 2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)或N 2'-去乙醯基-N 2'(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。類美登素係藉由抑制微管蛋白聚合來作用之有絲分裂抑制劑。美登素最初係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離(美國專利第3,896,111號)。隨後發現，某些微生物亦產生類美登素，例如美登醇(maytansinol)及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成美登醇以及其衍生物及類似物揭示於(例如)以下案號之美國專利中：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，該等專利之全部內容以引用方式併入本文中。
類美登素藥物部分係抗體藥物偶聯物中之有吸引力之藥物部分，此乃因其：(i)相對容易地藉由發酵或化學修飾、發酵產物衍生來製備，(ii)適於使用適於經由非二硫化物連接體偶聯至抗體之官能基進行衍生，(iii)在血漿中較為穩定，且(iv)可有效抵抗各種腫瘤細胞系。含有類美登素之偶聯物、其製備方法及其治療用途揭示於(例如)以下文獻中：美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP0425235；Liu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) (闡述包類指定美登素DM1之免疫偶聯物)；及Chari等人，Cancer Research 52:127-131 (1992)，該等專利之全部內容以引用方式併入本文中。
類美登素在業內已眾所周知且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。適宜類美登素揭示於(例如)美國專利第5,208,020號中。實例性類美登素藥物部分包含具有以下經修飾芳香族環者，例如：C-19-去氯(US4,256,746)，藉由安絲菌素(ansamytocin) P2之氫化鋰鋁還原製得)；C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/−C-19-去氯(美國專利第4,361,650號及第4,307,016號) (藉由去甲基化使用鏈黴菌(Streptomyces)或藉由放線菌(Actinomyces)或藉由去氯使用LAH製得)；及C-20-去甲氧基、C-20-醯基氧基(—OCOR)、+/−去氯(美國專利第4,294,757號) (藉由醯基化使用醯基氯製得)及在其他位置具有修飾者。實例性類美登素藥物部分亦包含具有諸如以下等修飾者：C-9-SH，藉由美登醇與H2S或P2S5之反應製得(美國專利第4,424,219號)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR) (美國專利第4,331,598號)；C-14-羥甲基或醯基氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)，自Nocardia製得(美國專利第4,450,254號)；C-15-羥基/醯基氧基，藉由使用鏈黴菌轉化美登醇製得(美國專利第4,364,866號)；C-15-甲氧基，自滑桃樹(Trewia nudiflora)分離(美國專利第4,313,946號及第4,315,929號)；C-18-N-去甲基，藉由使用鏈黴菌使美登醇去甲基化製得(美國專利第4,362,663號及第4,322,348號)；及4,5-去氧，藉由美登醇之三氯化鈦/LAH還原製得(美國專利第4,371,533號)。端視連接類型，美登素化合物上之許多位置已知可用作鍵聯位置。舉例而言，為形成酯鍵聯，具有羥基之C-3位置、經羥甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置皆適宜。
在一些態樣中，藥物係卡奇黴素。卡奇黴素家族抗生素能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙鏈DNA斷裂。關於卡奇黴素家族之偶聯物之製備，例如參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、第5,877,296號，該等專利之全部內容以引用方式併入本文中。可使用之卡奇黴素之結構類似物包含(但不限於) γ1I、α2I、α3I、N-乙醯基-γ1I、PSAG及θ11 (Hinman等人，Cancer Research 53:3336-3342 (1993)；Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928 (1998)及上文所提及之頒予American Cyanamid之美國專利)。
在一些態樣中，藥物係微管溶素。微管溶素係自黏細菌物質分離之天然產物種類之成員(Sasse等人，J. Antibiot. 53:879-885 (2000))。作為細胞骨架相互作用藥劑，微管溶素係抑制微管蛋白聚合且引起細胞週期停滯及細胞凋亡之有絲分裂毒劑(Steinmetz等人，Chem. Int. Ed. 43:4888-4892 (2004)；Khalil等人，ChemBioChem. 7:678-683 (2006)；Kaur等人，Biochem. J. 396: 235-242 (2006))。微管溶素係極強力細胞毒性分子，且超過任一臨床相關傳統化學治療劑(例如埃博黴素、太平洋紫杉醇及長春鹼)之細胞生長抑制。另外，其強烈抵抗多藥物抗性細胞系(Domling等人，Mol. Diversity 9:141-147 (2005))。該等化合物展示針對癌細胞系組之高測試細胞毒性且IC50值在低皮莫耳範圍內；因此，其作為抗癌治療劑較受關注。例如參見國際公開案第WO/2012019123號，其全部內容以引用方式併入本文中。微管溶素偶聯物揭示於(例如) US7,776,814中。
在一些態樣中，藥物係吡咯并苯并二氮呯(PBD)。PBD係相對較小分子且一些分子能夠識別並共價結合至DNA小溝中之特定序列且由此展現抗生素/抗腫瘤活性。業內已知諸多PBD及其衍生物，例如PBD二聚體(例如SJG-136或SG2000)、C2-不飽和PBD二聚體、具有C2芳基取代之吡咯并苯并二氮呯二聚體(例如SG2285)、藉由水解活化之PBD二聚體前藥(例如SG2285)及聚吡咯-PBD (例如SG2274)。PBD進一步闡述於國際公開案第WO2000/012507號、第WO2007/039752號、第WO2005/110423號、第WO2005/085251號及第WO2005/040170號及美國專利第7,612,062號，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些態樣中，藥物係拓撲異構酶抑制劑。拓撲異構酶抑制劑係阻斷拓撲異構酶(拓撲異構酶I及II)之作用之化合物，拓撲異構酶係在正常細胞週期期間藉由催化DNA鏈之磷酸二酯主鏈之斷裂及再連結來控制DNA結構變化之酶。
在一些態樣中，毒素包括(例如)相思子素、馬錢子鹼、毒芹素、白喉毒素、肉毒菌毒素、志賀毒素(shiga toxin)、內毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍亂毒素、鐮葉芹醇(falcarinol)、α毒素、格爾德黴素(geldanamycin)、白樹素、百脈根苷(lotaustralin)、蓖麻毒蛋白、番木鼈鹼(strychnine)、河豚毒素(tetrodotoxin)、皂素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌腸毒素-A、商陸抗病毒蛋白、假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素、假單胞菌屬內毒素或其組合。在其他態樣中，毒素包括(例如)莫迪素(modeccin) A鏈、α-八疊球菌(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商路(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(Saponaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、新黴素(neomycin)、新月毒素(tricothecene)或其組合。例如參見國際公開案第WO1993/021232號。
在一些態樣中，螯合劑係DTPA、EC、DMSA、EDTA、Cy-EDTA、EDTMP、DTPA、CyDTPA、Cy2DTPA、BOPTA、DTPA-MA、DTPA-BA、DTPMP、DOTA、TRITA、TETA、DOTMA、DOTA-MA、HP-DO3A、pNB-DOTA、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTPP、DOTBzP、DOTPME、HEDP、DTTP、N3S三醯胺硫醇、DADS、MAMA、DADT、N2S4二胺四硫醇、N2P2二硫醇-雙膦、6-肼基菸鹼酸、丙胺肟、四胺、環拉胺(cyclam)或其組合。
在一實施例中，藥物係奧裡斯他汀、微管溶素或吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
在一實施例中，奧裡斯他汀係MMAE (單甲基奧裡斯他汀E)或MMAF (單甲基奧裡斯他汀F)。
在一實施例中，藥物係類美登素，例如N 2'-去乙醯基-N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)、N 2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)或N 2'-去乙醯基-N 2'(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。
放射性核素之實例包含3H、11C、13N、15O、18F、32P、33P、35S、47Sc、51Cr、54Mn、57Co、58Co、59Fe、62Cu、65Zn、 67Cu、67Ga、68Ge、75Br、75Se、76Br、77Br、77As、80mBr、85Sr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo及99mTc、103Pd、103m Rh、103 Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、109Pt、111Ag、111In、112In、113mIn、113Sn、115In、117Sn、119Sb、121mTe、121I、122mTe、125mTe、125I、126I、131I、133I、133Xe、140La、142Pr、143Pr、149Pm、152Dy、153Sm、153Gd、159Gd、161Ho、161Tb、165Tm、166Dy、166Ho、167Tm、168Tm、169Er、169Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、188W、189mOs、189Re、192Ir、194Ir、197Pt、198Au、199Au、201T1、203Hg、211At、211Bi、211Pb、212Pb、212Bi、213Bi、215Po、217At、219Rn、221Fr、223Ra、224Ac、225Ac、225Fm、252Cf及其組合。
在一實施例中，放射性核素係選自包括以下或由其組成之群：鉻(51Cr)、鈷(57Co)、氟(18F)、釓(153Gd、159Gd)、鍺(68Ge)、鈥(166Ho)、銦(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、鑭(140La)、鎦(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鐠(142Pr)、鉕(149Pm)、錸(186Re、188Re)、銠(105Rh)、釕(97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鍶(85Sr)、硫(35S)、鍀(99Tc)、鉈(201Tl)、錫(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb)、釔(90Y)、鋅(65Zn)或其組合。
在一實施例中，放射性核素藉由螯合劑附接至本發明之偶聯物化合物。
在一實施例中，有效載荷藥係例如(包括)以下之血清半衰期延長劑：白蛋白、白蛋白結合多肽、PAS、人類絨毛膜促性腺激素之C-末端肽(CTP)之β亞單元、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、XTEN、白蛋白結合小分子或其組合。
若效應物分子係聚合物，則其通常可為合成或天然聚合物，例如視情況經取代之直鏈或具支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧化烯聚合物或具支鏈或無支鏈多醣(例如均-或雜-多醣)。
可存在於上文所提及合成聚合物上之具體可選取代基包含一或多個羥基、甲基或甲氧基。
具體天然聚合物包含乳糖、透明質酸、硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、海藻酸鹽、纖維素直鏈澱粉、右旋糖酐、醣原或其衍生物。
在一些實施例中，聚合物係聚乙二醇(PEG)、具支鏈PEG、聚唾液酸(PSA)、羥基烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、聚三葡萄糖、幾丁聚醣、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、右旋糖酐、羧甲基-右旋糖酐、聚環氧烷(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯基吡咯啶酮、聚膦氮烯、聚噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基甲醛) (PHF)、2-甲基丙烯醯基氧基-2'-乙基三甲基磷酸銨(MPC)。在一些實施例中，聚合物係聚乙二醇。在本發明之一實施例中，聚乙二醇具有300至10,000,000、500至100,000、1000至50,000、1500至30,000、2,000至20,000 Da、3,000至5,000 Da及4,000至5,000 Da之分子量範圍。在其他實施例中，聚乙二醇具有約1,000 Da、約1,500 Da、約2,000 Da、約3,000 Da、約4,000 Da、約5,000 Da、約10,000 Da、約20,000 Da、約30,000 Da、約40,000 Da、約50,000 Da或更高之分子量。此可轉換成1至7000個PEG單體單元，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000個單元(定義於本文其他處)。
在一實施例中，有效載荷藥或多肽(生物分子)包括可視化標記。可視化標記包含(但不限於)發色團、螢光團、螢光蛋白、磷光染料、串聯染料、顆粒、半抗原、酶、放射性同位素或其組合。
在一實施例中，可視化標記係可視化肽。在一些態樣中，可視化肽使得能夠在活體外、在活體內、離體或以其任一組合可視化或局部化偶聯物化合物。在一些態樣中，可視化肽係(例如)生物素受體肽、硫辛酸受體肽、螢光蛋白、用於連接雙砷染料或用於偶聯介穩定鍀之含有半胱胺酸之肽、用於偶聯用於基於螢光共振能量轉移(FRET)之鄰近分析之銪晶籠化合物之肽或其任一組合。在一些態樣中，螢光蛋白係(例如)綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、增強綠色螢光蛋白(EGFP)、增強黃色螢光蛋白(EYFP)或其任一組合。在一些態樣中，螢光蛋白係藻膽蛋白或其衍生物。
螢光蛋白、尤其藻膽蛋白可用於產生串聯染料標記之標記試劑。該等串聯染料包括螢光蛋白及用於獲得較大斯托克斯位移(stokes shift) (其中發射光譜自螢光蛋白之吸收光譜之波長更遠離移位)之目的之螢光團。此可有效用於檢測試樣中之較低量之靶，其中將所發射螢光最大程度地最佳化，換言之，極少發射光由螢光蛋白再吸收。為此，螢光蛋白及螢光團用作能量轉移對，其中螢光蛋白在螢光團吸收之波長下發射，且然後螢光團在較僅使用螢光蛋白可獲得之螢光蛋白遠的波長下發射。功能組合可為藻膽蛋白及磺基玫瑰紅螢光團或如業內已知之磺酸化青色素螢光團。螢光團有時用作能量供體且螢光蛋白係能量受體。
在其他態樣中，雙砷染料係4’,5’-雙(1,3,2-二硫基砷環戊烷-2-基)螢光黃(FlAsH)。在一些態樣中，生物素受體肽促進了基於抗生物素蛋白-及鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)之試劑之偶聯。在一些態樣中，硫辛酸受體肽促進了硫醇反應性探針與結合硫辛酸之偶聯或螢光硫辛酸類似物之直接連接。
在一實施例中，R1或多肽(尤其R1)包括螢光標籤。在一些態樣中，螢光標籤包括(例如)螢光黃型染料、玫瑰紅型染料、丹磺醯基型染料、麗絲胺(lissamine)型染料、青色素型染料、藻紅素型染料、德克薩斯紅(Texas Red)型染料或其任一組合。適於偶聯至本文所揭示之半胱胺酸改造抗體或其抗原結合片段之螢光團包含(但不限於)：芘(包含任一相應衍生物化合物)、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-胺基-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)、青色素(包含任何相應化合物)、羰花青(包含任何相應化合物)、喹諾酮(carbostyryl)、卟啉、水楊酸鹽、鄰胺基苯甲酸鹽、薁、苝、吡啶、喹啉、硼雜聚氮雜二環戊二烯并苯(包含任何相應化合物)、呫噸(包含任何相應化合物)、噁嗪(包含任何相應化合物)或苯并噁嗪、卡巴嗪(carbazine) (包含任何相應化合物)、次聯苯甲酮、香豆素(包含所揭示相應化合物)、苯并呋喃(包含相應化合物)及苯并次聯苯甲酮(benzphenalenone) (包含任何相應化合物)及其衍生物。如本文中所使用，噁嗪包含試鹵靈(resorufin) (包含任何相應化合物)、胺基噁嗪酮、二胺基噁嗪及其苯并取代類似物或其任一組合。
在某些態樣中，螢光團包含(例如)呫噸(對甲胺基酚、玫瑰紅、螢光黃及其衍生物)、香豆素、青色素、芘、噁嗪、硼雜聚氮雜二環戊二烯并苯或其任一組合。在一些實施例中，該等螢光團係(例如)磺酸化呫噸、氟化呫噸、磺酸化香豆素、氟化香豆素、磺酸化青色素或其任一組合。亦包含以商品名出售且通常稱為ALEXA FLUOR®、DYLIGHT®、CY DYES®、BODIPY®、OREGON GREEN®、PACIFIC BLUE®、IRDYES®、FAM®、FITC®及ROX®之染料。
如本文所揭示經由連接體「Z」附接之螢光團之選擇將決定最終化合物之吸收及螢光發射性質。可使用之螢光團標記之物理性質包含(但不限於)光譜特性(吸收、發射及斯托克斯位移)、螢光強度、壽命、偏振及光漂白速率或其組合。所有該等物理性質可用於區分一種螢光團與另一螢光團，且由此容許用於多工分析。在某些態樣中，螢光團在大於480 nm之波長下具有最大吸收。在一些態樣中，螢光團在接近488 nm至514 nm (尤其適於藉由氬離子雷射激發源之輸出來激發)或546 nm (尤其適於藉由汞弧燈來激發)下或接近該等波長下吸收。在一些態樣中，螢光團可在NIR (近紅外區)中發射以用於組織或整個生物體應用。螢光標記之其他期望性質可包含細胞滲透性及低毒性，例如在細胞或生物體(例如活動物)中標記抗體時。
在一實施例中，多肽包括捕獲標籤。在一些態樣中，捕獲標籤係生物素或His6標籤。生物素較為有用，此乃因其可用於酶系統中以進一步放大可檢測信號，且其亦可用作標籤以用於親和力層析中以達成分離目的。出於檢測目的，可使用具有關於生物素之親和力之酶偶聯物，例如抗生物素蛋白-HRP。
隨後，可添加過氧化物酶受質以產生可檢測信號。除生物素外，可使用其他半抗原，包含激素、天然及合成藥物、污染物、過敏原、效應物分子、生長因子、趨化介素、細胞介素、淋巴因子、胺基酸、肽、化學中間體、核苷酸及諸如此類。
在一實施例中，有效載荷藥包括酶。酶係有效標記，此乃因可放大可檢測信號，從而增加分析敏感性。酶本身通常不產生可檢測反應，但用於在其接觸適當受質時分解受質，從而經轉化受質產生螢光、比色或發光信號。酶放大可檢測信號，此乃因標記試劑上之一種酶可產生多種轉化成可檢測信號之受質。選擇酶受質以產生可量測產物(例如比色、螢光或化學發光)。業內廣泛使用該等受質且在業內已習知。
在一些實施例中，比色或螢光受質及酶之組合使用氧化還原酶(例如辣根過氧化物酶)及諸如3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)及3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)等受質來產生區別性色彩(分別為褐色及紅色)。產生可檢測產物之其他比色氧化還原酶受質包含(但不限於)：2,2-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)、鄰-苯二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、鄰-聯茴香胺、5-胺基水楊酸、4-氯-1-萘酚。螢光受質包含(但不限於)高草香酸或4-羥基-3-甲氧基苯基乙酸、經還原吩噁嗪及經還原苯并噻嗪(包含Amplex® Red試劑及其變體)以及經還原二氫呫噸(包含二氫螢光黃及二氫玫瑰紅(包含二氫玫瑰紅123))。
本發明擴展至採用代表獨特種類之過氧化物酶受質之酪胺醯胺過氧化物酶受質，其中該等過氧化物酶受質可固有地可在酶作用之前檢測，但在闡述為酪胺醯胺信號擴增(TSA)之過程中藉由過氧化物酶作用「固定於適當位置」。該等受質廣泛用於標記細胞、組織或陣列試樣中之靶以隨後藉由顯微術、流式細胞術、光學掃描及螢光術進行檢測。
本發明擴展至比色(且在一些情形下螢光)受質及酶之組合，該組合有時使用磷酸酶(例如酸性磷酸酶、鹼性磷酸酶或此一磷酸酶之重組形式)與比色受質(例如5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)、6-氯-3-吲哚基磷酸鹽、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸鹽、對-硝基苯基磷酸鹽或鄰-硝基苯基磷酸鹽)或螢光受質(例如4-甲基傘形酮基磷酸鹽、6,8-二氟-7-羥基-4-甲基香豆素基磷酸鹽(DiFMUP，美國專利第5,830,912號)、螢光黃二磷酸鹽、3-O-甲基螢光黃磷酸鹽、試鹵靈磷酸鹽、9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸鹽(DDAO磷酸鹽)或ELF 97、ELF 39或相關磷酸鹽)。
本發明亦擴展至包括醣苷酶、尤其β-半乳醣苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶及β-葡萄醣苷酶以及其他適宜酶之有效載荷藥。適當比色受質包含(但不限於) 5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)及類似吲哚基半乳醣苷、葡萄醣苷及葡萄糖醛酸苷、鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)及對-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷。在一些實施例中，螢光受質包含試鹵靈β-D- 吡喃半乳糖苷、螢光黃二半乳糖苷(FDG)、螢光黃二葡萄醣苷及其結構變體、4-甲基傘形酮基β-D-吡喃半乳糖苷、羧基傘形酮基β-D-吡喃半乳糖苷及氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。
其他酶包含(但不限於)水解酶(例如膽鹼酯酶及肽酶)、氧化酶(例如葡萄糖氧化酶及細胞色素氧化酶)及還原酶(已知其適宜受質)。
產生化學發光之酶及其適當受質可用於納入本發明分子中。該等物質包含(但不限於)螢光素酶及水母素之天然及重組形式。另外，磷酸酶、醣苷酶及氧化酶之化學發光產生受質(例如含有穩定雙氧烷、發光胺、異胺基苯二醯肼及吖啶鎓酯)富有成效。
其他定義 在詳細闡述所提供實施例之前，應理解，本發明並不限於具體組合物或製程步驟，且由此可有所變化。除非上下文另外明確指示，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a、an)」及「該」包含複數個指示物。術語「一(a)」(或「一(an)」)以及術語「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
另外，本文所用之「及/或」應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中之每一者且含有或不含另一者。因此，本文在諸如「A及/或B」等片語中所用之術語「及/或」意欲包含「A及B」、「A或B」、「A」 (單獨)及「B」 (單獨)。同樣，如在片語(例如「A、B及/或C」)中所使用，術語「及/或」意欲涵蓋下列態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本揭示內容所屬領域技術者通常所理解相同之意義。舉例而言， the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show，第2版，2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999, Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology，修訂版，2000, Oxford University Press向熟習此項技術者提供本發明中所使用許多術語之一般性字典。
單位、前綴及符號係以其國際單位製(Système International de Unite，SI)接受之形式來表示。數字範圍包含界定該範圍之數字。除非另外指示，否則胺基酸序列係按胺基至羧基取向自左至右書寫。本文提供之標題並不限制各個態樣，該等態樣可參照整體說明書來掌握。因此，下文即將定義之術語係參照說明書全文更全面地定義。
胺基酸在本文中可由其通常習知之三個字母符號或由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推薦之單字母符號來提及。同樣，核苷酸係藉由其通常所接受之單字母代碼來提及。在藉由數量提及抗體內胺基酸殘基之位置之情形下，編號係根據KABAT編號系統。
術語「個體」係指任一動物(例如哺乳動物)，包含(但不限於)人類、非人類靈長類動物、齧齒類動物及諸如此類，其係特定治療之接受者。通常，在提及人類個體時，術語「個體」及「患者」可互換使用。
術語「醫藥組合物」係指一種製劑，其呈允許活性成分之生物活性有效之形式(例如本文所揭示之偶聯物化合物)，且其不含對投與該組合物之個體具有不可接受毒性的其他組分。該組合物可包括一或多種醫藥上可接受之賦形劑。該組合物可為無菌的。
如本文所揭示偶聯物化合物之「有效量」係足以實施明確陳述之目的之量。「有效量」可根據所陳述目的、憑經驗及以常規方式確定。
術語「治療有效量」係指有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或病症之本文所揭示偶聯物化合物或其他藥物之量。
在用於本文中時，詞語「標記」係指直接或間接偶聯至本文所揭示之經改造抗體或其片段(例如半胱胺酸改造抗體或其片段)以生成「經標記」偶聯物化合物之可檢測化合物或組合物。標記可為自身可檢測(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記情形下，標記可催化受質化合物或組合物發生可檢測之化學變化。
諸如「治療(treating、treatment或to treat)」等術語係指(1)治癒、減慢、減輕所診斷病理學病狀或病症之症狀及/或停止該所診斷病理學病狀或病症之進展之治療措施；及(2)預防及/或減緩靶向病理學病狀或病症之發展之預防性(prophylactic或preventative)措施。因此，需要治療者包含已患有該病症者；易患該病症者；及擬預防該病症者。在某些態樣中，根據本發明方法，若患者展示(例如)疾病或病狀(例如某一類型癌症)之完全、部分或短暫緩解，則個體成功地「治療」該疾病或病狀(例如癌症)。
術語「多核苷酸」及「核酸」在本文中可互換使用且係指任一長度之核苷酸聚合物(包含DNA及RNA)。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物或任一可藉由DNA或RNA聚合酶納入聚合物中之受質。多核苷酸可包括經修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。
如本文中所使用，術語「載體」係指能夠遞送且在一些態樣中表現宿主細胞中一或多個所關注基因或序列之構築體。載體之實例包含(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏粒或噬菌體載體、與陰離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞(例如產生細胞)。
如本文中所使用，本說明書之上下文中之術語「包括」應詮釋為「包含」。
根據所用術語背景在適當時，本文所用之「用於本發明中」係指用於本文所揭示方法中、用於包含本文所揭示中間體之分子中或用於二者中。
應理解，不論本文中在哪裡以言語「包括」闡述態樣，亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」闡述之其他類似態樣。
本文所闡述之任一陽性實施例或其組合可為陰性排除(亦即免責聲明)之基礎。
組合物 本發明擴展至包括本文所闡述分子(例如本發明之水解分子)之組合物、尤其包括本發明分子及醫藥賦形劑、稀釋劑或載劑之醫藥組合物(或診斷組合物)。
該組合物通常將作為無菌醫藥組合物之部分供應，該組合物通常將包含醫藥上可接受之載劑。在疫苗調配物之背景中，本發明之醫藥組合物可另外包括醫藥上可接受之佐劑。
本發明亦擴展至製備該等組合物，例如製備醫藥或診斷組合物之製程，其包括添加並混合本發明分子(例如本發明之水解分子)以及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者。
本發明抗體可為醫藥或診斷組合物中之唯一活性成分或可伴有其他活性成分。
醫藥組合物適宜地包括治療有效量之本發明分子。本文所用之術語「治療有效量」係指治療、改善或預防靶向疾病或病狀或展現可檢測之治療或預防效應所需之治療劑之量。可先在細胞培養分析中或在動物模型中，通常在齧齒類動物、兔、狗、豬或靈長類動物中估計治療有效量。動物模型亦可用於測定適當濃度範圍及投與途徑。隨後可使用該等資訊來確定適用於人類之投藥劑量及途徑。
組合物可個別地投與患者或可與其他製劑、藥物或激素組合(例如同時、依序或分開)投與。
醫藥上可接受之載劑自身不應誘導對接受組合物之個體有害之抗體之產生且不應有毒。適宜載劑可為大的、緩慢代謝之大分子，例如蛋白質、多肽、脂質體、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物及無活性病毒顆粒。
治療組合物中之醫藥上可接受之載劑可另外含有液體，例如水、鹽水、甘油及乙醇。另外，該等組合物中可存在輔助物質(例如潤濕劑或乳化劑或pH緩衝物質)。該等載劑使得能夠將醫藥組合物調配成錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液，以供患者攝入。
適於投藥之形式包括適於非經腸投與，例如藉由注射或輸注，例如藉由濃注注射或連續輸注之形式。若產物用於注射或輸注，則其可採用含於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式，且其可含有調配劑，例如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，本發明分子可呈乾物形式，使用前先與適當無菌液體復水使用。
適宜地，在本發明調配物中，最終調配物之pH與抗體之等電點之值並不相近，舉例而言，若調配物之pH為7，則8-9或更大之pI可能適當。儘管不期望受限於理論，但據信此可最終提供具有改良穩定性之最終調配物，舉例而言，抗體保留於溶液中。
本發明之醫藥組合物可藉由多種途徑中之任一者投與，包含(但不限於)經口、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、室內(intraventricular)、經皮(transdermal)、透皮(transcutaneous)(例如參見WO98/20734)、皮下、腹膜腔內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。亦可使用皮下注射器以投與本發明之醫藥組合物。通常，治療組合物可製備成可注射劑，係呈液體溶液或懸浮液形式。亦可製備適於在注射之前在液體媒劑中製成溶液或懸浮液之固體形式。
組合物之直接遞送通常將藉由注射、皮下、腹膜腔內、靜脈內或肌內完成，或遞送至組織之間質間隙。組合物亦可投與病灶中。劑量治療可為單一劑量時間表或多個劑量時間表。
醫藥上可接受之載劑之充分論述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)中。
治療 本發明亦擴展至治療有需要之患者之方法，其係藉由投與治療有效量之本發明分子或包括其之組合物(例如醫藥組合物)來達成。
在一實施例中，提供本發明分子或包括其之組合物，其用於治療、尤其用於治療本文所闡述之疾病或病狀(例如癌症)。
在一實施例中，提供本發明分子或包括其之組合物之用途，其用以製造用於治療本文所闡述之病狀或疾病(例如癌症)之藥劑。
因此，本發明分子可用於治療及/或預防病理學病狀。
由本發明提供之抗體可用於治療包含發炎性疾病及病症、免疫疾病及病症、纖維化病症及癌症之疾病或病症。
術語「發炎性疾病」或「病症」及「免疫疾病或病症」包含類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、斯提耳病(still's disease)、穆克爾韋爾斯病病(Muckle Wells disease)、牛皮癬、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、SLE (全身性紅斑狼瘡)、氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、多發性硬化、血管炎、I型糖尿病、移植及移植物抗宿主疾病。
術語「纖維化病症」包含特發性肺纖維化(IPF)、全身性硬化(或硬皮症)、腎纖維化、糖尿病性腎病變、IgA腎病變、高血壓、晚期腎病、腹膜腔纖維化(持續不臥床腹膜腔透透析)、肝肝硬化、年齡相關性黃斑退化(ARMD)、視網膜病變、心臟反應性纖維化、結瘢、瘢痕瘤、燒傷、皮膚潰瘍、血管成形術、冠狀動脈旁路手術、關節成形術及白內障手術。
術語「癌症」包含源自上皮之惡性新生長，其發現於皮膚或更常見地身體器官(例如乳房、卵巢、前列腺、結腸、肺、腎、胰臟、胃、膀胱或腸)之內層中。癌症往往浸入毗鄰組織中並擴散(轉移)至遠端器官(例如骨、肝、肺或腦)。
擬治療之個體可為動物。然而，在一或多個實施例中，組合物適於投與人類個體。
在本說明書之背景中，「包括」擬詮釋為「包含」。
包括某些特徵/要素之本發明實施例亦意欲擴展至「由相關要素/特徵組成」或「基本上由其組成」之替代實施例。
若技術上適當，則可組合本發明實施例。
技術參考文獻(例如專利及申請案)以引用方式併入本文中。
本文所具體且明確列舉之任何實施例可單獨或與一或多個其他另外實施例組合形成免責聲明之基礎。
在下列實例中僅以闡釋方式且參照附圖來進一步闡述本發明。
首字母縮寫 NNAA 非天然胺基酸DAR 藥物:抗體比，其通常亦用於闡述任何偶聯物質(例如連接體)之比率。
實例 實例 1. 用於生成 ADC 之呋喃 - 馬來醯亞胺反應 將呋喃-馬來醯亞胺反應評估為用以生成ADC之偶聯方式。呋喃-NHS係由SynChem, Inc.以90%純度提供。
在mAb 上引入呋喃官能基 ： 藉由離胺酸一級胺與NHS-酯活化呋喃連接體之反應來將呋喃二烯官能基安置於IgG1 mAb上。此方式產生具有經修飾mAb之隨機偶聯、醯胺連接呋喃基團(稱為mAb-呋喃連接體)。應注意，mAb-呋喃-連接體在某些圖中可表示為mAb-呋喃，清晰起見可參見圖注。使用pH 7.2 PBS將Mab溶液調節至5 mg/mL (3 mL, 15 mg mAb, 0.1 µmol, 1當量)，隨後添加10% v/v 1 M NaHCO3 。將此溶液冷凍於冰上且添加30 µL呋喃-NHS (於DMAc中之10 mM儲備液，0.3 µmol, 3當量)。在冰上繼續進行反應5分鐘，且然後在室溫及連續混合下進行1 h。藉由質譜監測反應進展且以30 µL部分添加呋喃-NHS直至達成約2呋喃/mAb之偶聯程度為止。總共添加3次呋喃-NHS且添加總體積為90 µL (0.9 µmol, 9當量)。藉由透析(Slide-A-Lyzer, 10 kDa MWCO)在0℃下於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中純化經反應mAb 24 h。反應圖1.1. 將呋喃官能基引入mAb上。
經呋喃修飾之mAb 與馬來醯亞胺基-MMAE 之反應 ： 經由呋喃基團與MMAE上所含之烷基-或苯基-馬來醯亞胺基團之狄爾斯-阿爾德 4+2環加成偶合來將MMAE ADC有效載荷藥安置於mAb-呋喃-連接體上。首先，組合mAb-呋喃-連接體溶液(286 µL, 3.5 mg/mL, 6.7 nmol, 1當量)與10% v/v NaH2 PO4 及20% v/v DMSO。接下來，將AM-MMAE或PM-MMAE溶液(10 µL於DMAc中之10 mM儲備溶液，100 nmol, 15當量)添加至抗體溶液中。在環境氣氛下封蓋反應混合物且在37℃及混合下繼續進行反應20 h。在20 h反應時期完成之後，添加N-乙醯基半胱胺酸(8 μL 100 mM溶液，8當量)且將溶液在室溫下進一步培育15分鐘以淬滅馬來醯亞胺基團。在淬滅之後，使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化偶聯物，然後藉由去醣基化質譜進行分析，如下文所闡述。使用於75 mM NaOH中之200 mM儲備溶液(10 µL, 2 µmol, 300當量)使Alloc-離胺酸與如上文所闡述經呋喃-連接體修飾之 mAb進行反應。A) 反應圖1.2. A) mAb-呋喃-連接體與馬來醯亞胺基-MMAE之反應，B) AM-MMAE及PM-MMAE之化學結構。
質譜分析 ： 首先，使用EndoS (New England BioLabs)藉由以下方式將mAb或mAb偶聯物去醣基化：組合50 µL試樣(1 mg/mL mAb)與5 µL glyco緩衝液1 (New England BioLabs)及5 µL Remove-iT EndoS (以1:10稀釋於PBS中，20,000單位/mL，New England BioLabs)，隨後在37℃下培育1 h。藉由添加5 μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5 M, Thermo Fisher Scientific)並在37℃下培育10 min來製備還原試樣。使用配備有RP-HPLC管柱之Agilent 6520B Q-TOF質譜儀(ZORBAX 300 Diphenyl RRHD，1.8微米，2.1 mm × 50 mm)實施質譜分析。高效液相層析(HPLC)參數如下：流速為0.5 ml/min；移動相A為於HPLC等級H2 O中之0.1% (v/v)甲酸，且移動相B為於乙腈中之0.1% (v/v)甲酸。在90%A/10%B中平衡管柱，亦使用該溶液將mAb試樣去鹽，隨後在20%A/80%B中洗脫。在100-3000m/z 、正極性、氣體溫度為350℃、噴霧器壓力為48 lb/in2 且毛細管電壓為5,000 V下收集質譜數據。使用供應商所提供(Agilent v.B.04.00) MassHunter定性分析軟體來分析數據且使用來自解捲積光譜之峰強度推導出每一試樣中之物質相對比例。
圖 1.1. 在mAb與呋喃-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。
圖1.2. 在與MMAE反應20 h之後mAb-呋喃-連接體試樣之還原性去醣基化質量光譜。放大光譜以展示僅mAb重鏈之質量區。針對mAb輕鏈觀察到類似結果。據觀察，將MMAE添加至含有或不含呋喃之mAb重鏈中，從而指示非特異性偶聯。表1.1. 37℃下之20小時mAb-呋喃-連接體反應之匯總 *(相對於mAb)
圖1.3. mAb-呋喃-連接體alloc離胺酸反應產物之還原性去醣基化質譜分析。未觀察到對應於偶聯物之預期質量之峰。、 alloc-離胺酸之結構展示於下圖中。
使用胺反應性呋喃-NHS分子來將呋喃官能基引入抗體中。藉由mAb修飾反應中所用呋喃-NHS之量來控制呋喃官能度。因此，可藉由調節莫耳進料比來達成或多或少之呋喃。mAb-呋喃-連接體與馬來醯亞胺基-MMAE之反應係無效及非特異性的。烷基-或苯基-馬來醯亞胺有效載荷藥皆不能達成超過5%之特異性偶聯，即使在37℃下經20 h反應時間之後。PM-MMAE與mAb之非特異性反應(可能經由胺之邁克爾加成)高於AM-MMAE 12倍，從而指示此馬來醯亞胺基團之較高反應性。另外，PM-馬來醯亞胺MMAE有效載荷藥之非特異性反應(可能與胺)似乎高於與呋喃之特異性反應約4倍。呋喃-馬來醯亞胺偶合不適於產生ADC。
實例 2. 含有環戊二烯 (CP1) 之化合物之合成 基於圖2.1中所展示之一般設計來製備交聯劑及非天然胺基酸(NNAA)。
材料及方法 ： 除非另外陳述，否則在N2 氣氛下使用試劑級溶劑來實施反應。將DCM及甲苯儲存於3Å分子篩中。使THF通過活化氧化鋁管柱上方。所用商業獲得性試劑皆按接收狀態使用。使用E. Merck矽膠60 F254預塗覆板(0.25 mm)實施薄層層析(TLC)且藉由曝光於UV光(254 nm)來觀察或使用對-茴香醛、茚三酮或過錳酸鉀染色。使用正相矽膠(60 Å, 0.040 - 0.063 mm, Geduran)實施急速管柱層析。在Varian光譜儀(400、500或600 MHz)上記錄1 H NMR光譜且相對於氘化溶劑信號進行報告。如下所述來報告1 H NMR光譜之數據：化學位移(d ppm)、多重性、偶合常數(Hz)及積分。在Varian光譜儀(100、125或150 MHz)上記錄13 C NMR光譜。以化學位移(δ ppm)形式來報告13 C NMR光譜之數據。自UC Santa Barbara質譜設施在具有場去吸附(FD)來源之(Waters Corp.) GCT Premier高解析度飛行時間質譜儀上獲得質譜。
CP1-NNAA (4) 之合成
2-(環戊二烯基)乙醇異構體(1 )：將溴乙酸甲酯(6.0 mL, 63 mmol, 1.05當量)添加至THF (60 mL)中並冷卻至-78℃。經10 min逐滴添加環戊二烯基鈉(於THF中之2 M溶液，30 mL, 60 mmol, 1當量)。將反應液在-78℃下攪拌2 hr。使用H2 O (6 mL)及矽膠(6 g)終止反應並升溫至室溫。經由二氧化矽塞過濾反應混合物，然後使用DCM (100 mL)沖洗。合併有機層並去除溶劑以產生褐色油狀物形式之2-(環戊二烯基)乙酸甲酯異構體(1:1)，其直接用於下一步驟中。
將LAH (4.55 g, 120. mmol, 2當量)添加至THF (300 mL)中並冷卻至0℃。經1 hr以4部分逐滴添加溶於THF (10 mL)中之粗製2-(環戊二烯基)乙酸甲酯(60 mmol)。將反應液升溫至室溫並攪拌直至起始材料耗盡為止(TLC, 2 hr)。將反應液冷卻至0℃並使用H2 O (10 mL)逐滴緩慢驟冷，然後添加NaOH (4 M於H2 O中，5 mL)。添加H2 O (20 mL)，過濾混合物，並使用Et2 O (100 mL)沖洗。合併濾液並去除溶劑。將殘餘物懸浮於鹽水(100 mL)中並使用Et2 O (3×100 mL)萃取。合併有機層，使用鹽水(100 mL)洗滌，藉由MgSO4 乾燥，過濾，並去除溶劑。經由二氧化矽塞(己烷:EtOAc, 2:1)過濾殘餘物並去除溶劑以產生琥珀色油狀物形式之1 (5.45 g, 83%)。為防止二聚合，應將1 冷凍儲存於苯基質中。
Rf (己烷:EtOAc, 4:1): 0.11；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 6.50 - 6.13 (m, 3 H), 3.81 (td,J = 6.3, 10.1 Hz, 2 H), 3.01 (d,J = 1.6 Hz, 1 H), 2.95 (d,J = 1.6 Hz, 1 H), 2.70 (dt,J = 1.2, 6.5 Hz, 1 H), 2.66 (dt,J = 1.4, 6.4 Hz, 1 H), 1.52 (s, 1 H) ppm。
碳酸2-(環戊二烯基)乙基酯4-硝基苯基酯異構體(2 )：將2 (2.86 g, 26.0 mmol, 1當量)添加至DCM (100 mL)中並冷卻至0℃。添加吡啶(5.2 mL, 65 mmol, 2.5當量)，隨後經10 min以2部分添加氯甲酸4-硝基苯基酯(5.76 g, 28.6 mmol, 1.1當量)。去除冰浴且攪拌反應液直至起始材料耗盡(TLC, 40 min)為止。將反應液傾倒至分液漏斗中並使用於H2 O中之飽和NH4 Cl (100 mL)洗滌。使用DCM (100 mL)萃取水層。合併有機層，使用鹽水(50 mL)洗滌，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，並去除溶劑。對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 6:1)以產生黃色油狀物形式之2 (5.69 g, 80%)，該產物在冷凍器中發生固化。
Rf (己烷:EtOAc, 4:1): 0.43；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 8.34 - 8.24 (m, 2 H), 7.40 - 7.34 (m, 2 H), 6.56 - 6.13 (m, 3 H), 4.47 (td,J = 6.8, 10.2 Hz, 2 H), 3.02 (d,J = 0.8 Hz, 1 H), 2.98 (d,J = 1.2 Hz, 1 H), 2.88 (dtd,J = 1.0, 6.9, 16.1 Hz, 2 H) ppm。
Fmoc-Lys(甲酸2-(環戊二烯基)乙基酯)-OH異構體(3 )：將2 (3.60 g, 13.1 mmol, 1當量)添加至DMF (30 mL)中，隨後添加Fmoc-Lys-OH (5.78 g, 15.7 mmol, 1.2當量)及DIPEA (5.4 mL, 32 mmol, 2.4當量)。攪拌反應液直至起始材料耗盡為止(NMR, 3.5 hr)，然後傾倒至EtOAc (100 mL)及 H2 O (140 mL)中。使用HCl (1 M, 60 mL)酸化水層，傾倒至分液漏斗中，且分離各層。使用EtOAc (2 × 100 mL)萃取水層。合併有機層，使用鹽水(100 mL)洗滌，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，並去除溶劑。對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 3:1，然後DCM:MeOH:AcOH, 89:10:1)以產生白色發泡體形式之3 (4.73 g, 72%)。
Rf (DCM:MeOH:AcOH, 89:10:1): 0.50；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 7.76 (d,J = 7.4 Hz, 2 H), 7.66 - 7.56 (m, 2 H), 7.39 (t,J = 7.4 Hz, 2 H), 7.31 (t,J = 7.2 Hz, 2 H), 6.57 - 5.96 (m, 3 H), 5.85 - 5.54 (m, 1 H), 4.84 - 4.11 (m, 7 H), 3.27 - 2.61 (m, 6 H), 1.99 - 1.11 (m, 6 H) ppm。
CP1-NNAA (4 ):將3 (4.61 g, 9.13 mmol, 1當量)添加至DMF (130 mL)中，隨後添加六氫吡啶(14.4 mL)。攪拌反應液直至起始材料耗盡為止(TLC, 90 min)，然後去除溶劑。將Et2 O (100 mL)添加至殘餘物中，且將懸浮液超音波處理5 min。過濾懸浮液並使用Et2 O (100 mL)沖洗。將固體懸浮於MeOH (10 mL)中，攪拌10 min，添加Et2 O (40 mL)，過濾懸浮液並使用Et2 O (50 mL)沖洗。在真空下乾燥化合物以產生淺棕色粉末形式之4 (2.15 g, 84%)。
1 H NMR (400 MHz，甲醇-d4 +一滴TFA) δ 6.53 - 6.07 (m, 3 H), 4.29 - 4.11 (m, 2 H), 3.96 (t, J = 6.3 Hz, 1 H), 3.11 (t, J = 1.0 Hz, 2 H), 3.01 - 2.62 (m, 3 H), 2.02 - 1.81 (m, 2 H), 1.62 - 1.35 (m, 4 H) ppm；C14 H22 N2 O4 [M+H]+ 之MS (FD)確切質量計算值：283.17，實驗值：283.19。
CP1-NHS (6) 之合成
4-(2-(環戊二烯基)乙氧基)-4-側氧基丁酸異構體(5 )：將DCM (1.5 mL)添加至含有1 (0.33 g, 3.0 mmol, 1當量)之小瓶中。添加Et3 N (0.42 mL, 3.0 mmol, 1當量)、DMAP (37 mg, 0.30 mmol, 0.1當量)及琥珀酸酐(0.33 g, 3.3 mmol, 1.1當量)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌直至起始材料耗盡為止(TLC, 60 min)。使用DCM (50 mL)將反應混合物傾倒至分液漏斗中並使用HCl水溶液(1 M, 50 mL)萃取，然後使用H2 O (50 mL)萃取。藉由MgSO4 乾燥有機層，過濾，並去除溶劑以產生淺棕色粉末形式之5 (0.57 g, 90%)。
Rf (EtOAc): 0.67；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 11.49 (br. s., 1 H), 6.49 - 6.05 (m, 3 H), 4.27 (td,J = 7.0, 9.0 Hz, 2 H), 2.94 (d,J = 17.6 Hz, 2 H), 2.80 - 2.56 (m, 6 H) ppm。
CP1-NHS (6 ):將THF (10 mL)添加至含有5 (0.42 g, 2.0 mmol, 1當量)之小瓶中。添加NHS (0.32 g, 2.8 mmol, 1.4當量)、EDC·HCl (0.46 g, 2.4 mmol, 1.2當量)及DCM (5 mL)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌過夜。去除溶劑且對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 1:1)以產生澄清、黏性油狀物形式之6 (0.48 g, 78%)。在偶聯至抗體之後，CP1-NHS稱為CP1-連接體。
Rf (己烷:EtOAc, 1:1): 0.38；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 6.49 - 6.40 (m, 3 H), 6.31 (dd,J = 1.2, 5.1 Hz, 1 H), 6.25 (td,J = 1.5, 2.8 Hz, 1 H), 6.11 (td,J = 1.8, 3.0 Hz, 1 H), 4.30 (td,J = 7.0, 9.0 Hz, 4 H), 3.00 - 2.90 (m, 8 H), 2.85 (br. s., 8 H), 2.80 - 2.68 (m, 8 H)；13 C NMR (125 MHz, CDCl3 ) δ 170.8, 170.8, 168.9, 168.8, 167.6, 167.6, 144.3, 142.3, 134.2, 134.1, 132.3, 131.4, 128.4, 128.0, 64.5, 64.2, 43.5, 41.4, 29.7, 29.0, 28.7, 26.2, 25.5 ppm。
自市售NaCp與溴乙酸甲酯之反應來合成環戊二烯(CP)官能化非天然胺基酸(NNAA)。使用LAH將粗製酯還原成醇1 ，該醇係以異構體混合物(約1:1)之形式獲得。在儲存於-20℃下時，1 將發生二聚合，其應冷凍儲存於苯基質中或立即使用。1 與氯甲酸4-硝基苯基酯之反應會產生活化胺基甲酸酯2 ，該活化胺基甲酸酯可在-20℃下儲存若干週。嘗試2 與離胺酸銅之反應，但在使用8-羥基喹啉或EDTA處理之後NNAA4 之分離並不良好。2 與Boc-Lys-OH之反應提供經Boc保護之NNAA (71%) (或使用三光氣自1 直接獲得，38%)，但使用TFA、甲酸或路易斯酸(Lewis acid)去除Boc基團之工作可快速分解CP環。使2 與Fmoc-Lys-OH進行反應可產生經Fmoc保護之3 ，可使用六氫吡啶將該產物去保護以獲得NNAA4 。化合物4 在常用氘化溶劑中具有較差溶解性。可添加一滴TFA以增加溶解性，但在數小時之後引起分解。在溶於D2 O中時，4 中之CP質子與催化化NaOH發生交換，此乃因隨後發生[1,5]-氫化物位移。
自1 與琥珀酸酐產生酸5 之反應開始來合成CP1官能化NHS-酯。使酸5 與EDC∙HCl及N -羥基琥珀醯亞胺進行反應以產生NHS酯6 。在室溫下，6 上之CP環經數天發生二聚合，但其可儲存於-20℃下超過一個月。
實例 3. 用於經由經交聯劑修飾之 mAb 來製備 ADC 之 CP1 二烯 - 馬來醯亞胺偶聯 針對生物偶聯來評估環戊二烯-馬來醯亞胺反應，其中經由連接體引入環戊二烯基團。
在mAb 上引入CP1 官能基 ： 藉由離胺酸一級胺與CP1-NHS (化合物6)之反應來將CP1二烯官能基安置於IgG1 mAb上。此方式產生具有經修飾mAb之隨機偶聯、醯胺連接環戊二烯基團(稱為mAb-CP1-連接體)。應注意，mAb-CP1-連接體在一些圖中亦可稱為mAb-CP1，清晰起見可參見圖注。典型mAb修飾反應如下所述。使用pH 7.2 PBS將Mab溶液調節至5 mg/mL (3 mL, 15 mg mAb, 100 nmol, 1當量)，隨後添加10% v/v 1 M NaHCO3 。將此溶液冷凍於冰上且添加30 µL CP1-NHS (於DMAc中之10 mM儲備液，300 nmol, 3當量)。在冰上繼續進行反應5分鐘，隨後在室溫及連續混合下反應1 h。藉由透析(Slide-A-Lyzer, 10 kDa MWCO)在0℃下於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中純化經反應mAb 24 h。如下文所闡述藉由完整去醣基化質譜來量化CP1-連接體引入且發現在此實例中為每mAb中具有2.3個CP1，此對應於77%之CP1-NHS轉化成抗體偶聯物。在各種條件下實施之此反應之結果匯總闡述於附錄A3.1中。反應圖3.1. 使用CP1-NHS修飾mAb以生成mAb-CP1-連接體。
經CP1 修飾之mAb 與馬來醯亞胺基-MMAE 之反應 ： 使用PBS (pH 7.4)將mAb-CP1-連接體(2.3 CP1二烯/mAb, 1 mg, 6.7 nmol mAb, 1當量)稀釋至最終濃度為3.5 mg/mL。接下來，添加DMSO以產生20% v/v溶液，隨後添加1 M磷酸二氫鈉以產生10% v/v溶液。添加所有溶液組分可產生包括2.7 mg/mL mAb、41.4 μM CP1二烯、1.78 M DMSO、110 mM磷酸鈉、100 mM NaCl之pH 5.5混合物。將AM-MMAE或PM-MMAE (10 μL於DMAc中之10 mM儲備溶液，100 nmol, 15當量)添加至抗體溶液中。將反應混合物短暫渦旋並在22℃或37℃及混合下繼續進行反應。在4 h反應之後，添加N-乙醯基半胱胺酸(8 μL 100 mM溶液，120當量)以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。然後使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分。然後藉由還原性去醣基化質譜如下文所闡述來分析試樣。反應圖3.2. mAb-CP1-連接體與馬來醯亞胺基MMAE之反應。
質譜分析 ： 如實例1中所闡述來分析試樣。
圖3.1. 在mAb與CP1-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。(B)中之峰下方數字指示引入mAb中之CP1-連接體基團之數量。應注意，(A)中之較高MW峰組代表醣基化mAb。藉由峰強度來估計CP1-連接體引入得出每一mAb具有2.3個CP1-連接體。表3.1 CP1-NHS mAb反應之匯總
圖3.2. mAb-CP1-連接體馬來醯亞胺基-MMAE反應產物之還原性去醣基化質譜。放大以展示mAb重鏈及輕鏈。
圖3.3. mAb-CP1-連接體馬來醯亞胺基MMAE反應產物之還原性去醣基化質譜，其放大展示mAb重鏈區。DAR-0指示並無MMAE偶聯至mAb重鏈，DAR-1指示一個MMAE偶聯至mAb重鏈且DAR-2指示兩個MMAE偶聯至mAb重鏈。在反應產物中未檢測到未偶聯CP1-連接體峰且自相應重鏈CP1-連接體峰追蹤到所有MMAE偶聯物峰，從而指示偶聯對CP1-連接體基團具有特異性。表3.2. mAb-CP1-連接體馬來醯亞胺基-MMAE反應之匯總a a 所有反應皆係在2.7 mg/mL mAb-CP1-連接體下實施4 h。
圖3.4. mAb-CP1-連接體alloc離胺酸反應產物之還原性去醣基化質譜分析。未觀察到對應於偶聯物之預期質量之峰。
在室溫下於4 h內，安置於抗體表面上之CP1二烯基團完全與馬來醯亞胺基-MMAE前藥進行反應。藉由質譜未觀察到非特異性偶聯，此乃因自mAb-CP1-連接體峰追蹤到所有CP1-連接體-MMAE偶聯物峰，且未追蹤到非未修飾mAb峰(亦即缺乏CP1-連接體)。此與mAb-呋喃-連接體與馬來醯亞胺基MMAE之反應完全不同，在該反應中，在37℃下於20 h之後僅觀察到約2-20%偶聯(包含非特異性偶聯)。使用mAb-CP1-連接體之二烯-馬來醯亞胺偶聯基於偶合可優於mAb-呋喃-連接體。
實例 4. 在 0.6 莫耳當量馬來醯亞胺基 -MMAE: 含於 CP1-mAb- 連接體上之二烯基團下 mAb-CP1- 連接體偶聯至馬來醯亞胺基 -MMAE 之動力學 在0.6莫耳當量馬來醯亞胺基-MMAE:含於mAb-CP1-連接體上之二烯之化學計量學下探究mAb-CP1-連接體與馬來醯亞胺基MMAE之反應動力學。
在mAb 上引入CP1 官能基 ： 藉由離胺酸一級胺與CP1-NHS (化合物6)之反應來將CP1二烯官能基安置於IgG1 mAb上。此方式產生隨機偶聯、醯胺連接之環戊二烯基團。所得偶聯物稱為mAb-CP1-連接體且亦可稱為mAb-CP1，清晰起見可參見圖注。使用pH 7.2 PBS將Mab溶液調節至3.7 mg/mL (3 mL, 11.1 mg mAb, 74 nmol, 1當量)，隨後添加10% v/v 1 M NaHCO3 。將此溶液冷凍於冰上且添加40 µL CP1-NHS (於DMAc中之10 mM儲備液，400 nmol, 5.4當量)。在室溫及連續混合下繼續進行反應1 h。藉由透析(Slide-A-Lyzer, 10 kDa MWCO)在0℃下於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中純化經反應mAb 24 h。如下文所闡述藉由完整去醣基化質譜來量化CP1二烯引入且發現其為每mAb中具有3.99 CP1二烯，此對應於74%之CP1-NHS轉化成抗體偶聯物。
mAb-CP1- 連接體與馬來醯亞胺基-MMAE 之反應 ： 使用PBS (pH 7.4)將經CP1修飾之mAb (3.99 CP1二烯/mAb, 3 mg, 80 nmol CP1二烯，1當量)稀釋至最終濃度為1.7 mg/mL。接下來，添加DMSO以產生20% v/v溶液，隨後添加1 M磷酸二氫鈉以產生10% v/v溶液。添加所有溶液組分可產生包括1.3 mg/mL mAb、34.6 μM CP1二烯、1.78 M DMSO、110 mM磷酸鈉、100 mM NaCl之pH 5.5混合物。將AM-MMAE或PM-MMAE (5.2 μL於DMSO中之10 mM儲備溶液，52 nmol, 0.67當量)添加至抗體溶液中。將反應混合物短暫渦旋並在22℃及混合下繼續進行反應。在各個時間點取出等分試樣(180 μL)且添加N-乙醯基半胱胺酸(2 μL 100 mM溶液，38當量)以淬滅馬來醯亞胺基團。然後使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分。然後藉由還原性去醣基化質譜如下文所闡述來分析試樣。
質譜分析 ： 如實例1中所闡述來分析試樣。
CP1 二烯- 馬來醯亞胺反應速率常數之計算 ： 自去醣基化、還原性質譜中之峰強度來測定馬來醯亞胺基-MMAE與抗體二烯之反應之二階速率常數。藉由mAb-CP1-連接體峰之消失及mAb-CP1-連接體-AM MMAE峰之出現來監測反應進展，但僅使用抗體重鏈上之mAb-CP1-連接體峰強度來計算經反應CP1二烯之相對豐度。使用下述方程式計算mAb重鏈上之未反應CP1二烯基團之相對量：a =未修飾重鏈之峰強度 b =具有一個CP1-連接體基團之重鏈之峰強度之總和 c =具有兩個CP1-連接體基團之重鏈之峰強度之總和 d =具有三個CP1-連接體基團之重鏈之峰強度 注意：亦在計算中包含含有馬來醯亞胺基-MMAE之重鏈。舉例而言，包含CP1-連接體-2 + 1馬來醯亞胺基-MMAE作為CP1-連接體-1物質。
結果 圖 4.1. 在mAb與CP1-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。
圖4.2. 未修飾mAb、mAb-CP1-連接體(mAb-CP1)及與AM-MMAE反應之mAb-CP1-連接體(mAb-CP1 AM-MMAE)在15 min及2.5 h時之還原性去醣基化質譜。
圖4.3. mAb-CP1-連接體與馬來醯亞胺基-MMAE隨時間之反應。自還原性去醣基化質譜之峰強度測定未反應二烯。表4.1 mAb-CP1-連接體偶聯結果之匯總a a 所有偶聯反應皆係在pH 5.5、20% DMSO、22℃及1.3 mg/mL mAb下實施3.5 hb 供給計算為莫耳當量馬來醯亞胺基-MMAE:CP1二烯c 自還原性去醣基化質譜之峰強度來計算。
CP1二烯(含於mAb-CP1-連接體上)與馬來醯亞胺基-MMAE之反應較為快速且具有水性條件特異性，其中在約10分鐘時達成完全反應。基於馬來醯亞胺基-MMAE所計算之莫耳供給比與自完整質譜所觀察之偶聯程度相匹配，此乃因MMAE莫耳供給與二烯至偶聯物之轉化率基本上相同。
實例 5. 在 1.0 莫耳當量馬來醯亞胺基 -MMAE: 二烯基團下 mAb-CP1- 連接體偶聯至馬來醯亞胺基 -MMAE 之動力學 評估在22℃下CP1二烯與馬來醯亞胺基MMAE之反應動力學。
在mAb 上引入CP1 官能基 ： 藉由離胺酸一級胺與CP1-NHS (化合物6)之反應來將CP1二烯官能基安置於IgG1 mAb上。此方式產生隨機偶聯、醯胺連接之環戊二烯基團。使用pH 7.2 PBS將Mab溶液調節至5 mg/mL (3 mL, 5 mg mAb, 100 nmol, 1當量)，隨後添加10% v/v 1 M NaHCO3 。將此溶液冷凍於冰上且添加40 µL CP1-NHS (於DMAc中之10 mM儲備液，400 nmol, 4當量)。將反應混合物短暫渦旋並在室溫及連續混合下培育1 h。藉由透析(Slide-A-Lyzer, 10 kDa MWCO)在0℃下於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中純化經反應mAb 24 h。如下文所闡述藉由完整去醣基化質譜來量化CP1二烯引入且發現其為每mAb中具有3.7 CP1二烯，此對應於92%之CP1-NHS轉化成抗體偶聯物。
mAb-CP1- 連接體與馬來醯亞胺基-MMAE 之反應 ： 使用PBS (pH 7.4)將mAb-CP1-連接體(3.7 CP1二烯/mAb, 3 mg, 74 nmol CP1二烯，1當量)稀釋至最終濃度為1.7 mg/mL。接下來，添加DMSO以產生20% v/v溶液，隨後添加1 M磷酸二氫鈉以產生10% v/v溶液。添加所有溶液組分可產生包括1.3 mg/mL mAb、32.3 μM CP1二烯、1.78 M DMSO、110 mM磷酸鈉、100 mM NaCl之pH 5.5混合物。將AM-MMAE或PM-MMAE (7.4 μL於DMSO中之10 mM儲備溶液，74 nmol, 1當量)添加至抗體溶液中。將反應混合物短暫渦旋並在22℃及混合下繼續進行反應。在各個時間點取出等分試樣(180 μL)且添加N-乙醯基半胱胺酸(3 μL 100 mM溶液，51當量)以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。然後使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分。然後藉由還原性去醣基化質譜如下文所闡述來分析試樣。
質譜分析 ： 如實例1中所闡述來分析試樣。
CP1 二烯- 馬來醯亞胺反應速率常數之計算 ： 自去醣基化、還原性質譜中之峰強度來測定馬來醯亞胺基-MMAE與mAb二烯之反應之二階速率常數。藉由mAb-CP1-連接體峰之消失及mAb-CP1-連接體-馬來醯亞胺基-MMAE峰之出現來監測反應進展，但僅使用抗體重鏈上之mAb-CP1-連接體峰強度來計算經反應CP1二烯之相對豐度。使用下述方程式計算mAb-CP1-連接體上之未反應CP1二烯基團：a =未修飾重鏈之峰強度 b =具有一個CP1-連接體基團之重鏈之峰強度之總和 c =具有兩個CP1-連接體基團之重鏈之峰強度之總和 d =具有三個CP1-連接體基團之重鏈之峰強度 e =未修飾輕鏈之峰強度 f =具有一個CP1-連接體基團之輕鏈之峰強度之總和 g =具有兩個CP1-連接體基團之輕鏈之峰強度之總和
以莫耳濃度單位進一步分析偶聯數據以測定動力學常數。藉由自1/[CP1]對時間之繪圖所生成曲線之斜率及線性回歸分析來測定二階速率常數。使用下文所展示之方程式自二階反應速率常數來計算反應半衰期： k2 =二階速率常數 [CP1]0 =在時間=0時之CP1二烯濃度
圖5.1. 在mAb與CP1-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。峰上方之數字指示存在於該mAb物質上之CP1連接體基團之數量。
圖5.2. 未修飾mAb、mAb-CP1-連接體(mAb-CP1)及與PM-MMAE反應之mAb-CP1-連接體(mAb-CP1 PM-MMAE)在5 min及150 min時之還原性去醣基化質譜。放大光譜以僅展示重鏈。
圖5.3. mAb-CP1-連接體與馬來醯亞胺基-MMAE之反應。A)未反應CP1二烯隨時間之莫耳濃度。自還原性去醣基化質譜之峰強度測定每mAb之未反應CP1二烯。B)用於計算反應速率之濃度倒數圖。表5.1 mAb-CP1-連接體與馬來醯亞胺基MMAE之二烯-馬來醯亞胺偶合動力學反應之匯總a,b,c a 所有偶聯反應皆係在pH 5.5、20% DMSO、22℃及1.3 mg/mL經CP1修飾之mAb下實施b 所用之MMAE:CP1二烯莫耳比率為1:1c 自還原性去醣基化質譜之峰強度進行計算d 在150分鐘反應之後
CP1二烯與馬來醯亞胺基-MMAE之反應較為快速且具有特異性，其中半衰期約為數分鐘。兩種馬來醯亞胺基-MMAE之反應轉化率為90%或更高。苯基馬來醯亞胺反應速率略高於烷基馬來醯亞胺速率，然而，兩類馬來醯亞胺之間之速率及最終轉化率係相當的。
實例 6. 抗體中之 CP1-NNAA 納入 將CP1-NNAA納入抗體之位置K274中，評價所表現mAb之品質及CP1二烯在抗體納入之後之反應性。
CP1-NNAA 儲備溶液之製備 ： 組合CP1-NNAA (0.5 g, 1.77 mmol)與6.81 mL H2 O及1.38 mL 1 M NaOH。在室溫下攪拌所得漿液直至所有固體皆溶解為止(10分鐘)。在完全溶解之後，使淺黃色溶液通過0.2 μm過濾器，等分，並儲存於-80℃下直至使用。此程序產生8.2 mL 216 mM CP1及168 mM NaOH儲備溶液。
抗體表現 ：將在Fc位置K274或S239具有琥珀型突變之12G3H11或1C1 IgG1抗體基因選殖至專屬pOE抗體表現載體中。將構築體與編碼PylRS雙重突變體(Y306A/Y384F)或野生型PylRS之質體及含有tRNA表現盒之串聯重複(pORIP 9X tRNA)之質體一起轉染至CHO-G22 (PEImax，1.5L G22細胞)中。在轉染後4小時，向細胞中添加3.3%進料F9 (專屬)及0.2%進料F10 (專屬)且將細胞在34℃下進一步培育。第二天，以相對於1C1.K274轉染細胞0.26 mM之最終濃度添加CP1-NNAA。在第3天及第7天再次向細胞供給6.6%進料F9及0.4%進料F10。旋轉細胞且在第11天收穫上清液。藉由IgSelect親和管柱(GE Health Care Life Science)純化上清液。使用50 mM甘胺酸、30 mM NaCl (pH 3.5)洗脫緩衝液洗脫抗體，使用1 M pH 7.5 Tris緩衝液中和，並透析至pH 7.2 PBS中。藉由吸光度量測在280 nm下測定所洗脫抗體之濃度。1C1.K274.12G3H11 mAb之回計算效價為47 mg/L且係以較小規模下之類似方式來表示，其中CP1-NNAA進料濃度及供給時間有所變化。藉由SDS-PAGE使用標準方法來分析所回收抗體。亦藉由粒徑篩析層析及質譜如下文所闡述來分析抗體。將納入CP1-NNAA之抗體表示為mAb-CP1-NNAA以區分於mAb-CP1-連接體構築體，或表示為mAb-[位置]CP1-NNAA，其中[位置]指示突變至CP1-NNAA之胺基酸編號及胺基酸符號。
粒徑篩析層析(SEC) ： 使用配備有三級檢測器陣列(Viscotek 301, Viscotek, Houson, TX)之Agilent 1100毛細管LC系統實施SEC分析；將波長設定於280 nm，且在TSK-GEL G3000SWXL管柱(Toso Bioscience LLC, Montgomeryville, PA)上使用100 mM pH 6.8磷酸鈉緩衝液在1 mL/min之流速下運行試樣。
mAb-CP1-NNAA 與馬來醯亞胺基MMAE 之偶聯 ： 使用PBS (0.133 mL)將mAb-CP1-NNAA (0.4 mg, 2.7 nmol, 1當量)調節至3 mg/mL。添加DMSO (27 μL)及1 M磷酸二氫鈉(13 μL)以分別產生約20% v/v及10% v/v之溶液。將馬來醯亞胺基-MMAE (5 μL於DMSO中之10 mM儲備液，13 nmol, 5當量)添加至mAb-CP1-NNAA溶液中且將混合物短暫渦旋。使用AM-MMAE及PM-MMAE製備ADC。在室溫及連續混合下繼續進行反應1 h。添加N-乙醯基半胱胺酸(1.1 μL，100 mM, 108 nmol, 40當量)且將溶液再培育15 min以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。然後使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分。隨後藉由還原性質譜如下文所闡述來分析試樣。反應圖6.1. A) mAb-CP1-NNAA與馬來醯亞胺基MMAE之反應。藉由使離胺酸突變至CP1-NNAA來將CP1-NNAA納入位置K274。
質譜分析 ： 對於去醣基化mAb分析而言，組合EndoS (5 µL Remove-iT EndoS，以1:10稀釋於PBS中，20,000單位/mL，New England BioLabs)與50 µL試樣(1 mg/mL mAb)及5 µL glyco緩衝液1 (New England BioLabs)，且隨後在37℃下培育1 h。藉由添加5 μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5 M, Thermo Fisher Scientific)並在37℃下培育10 min來製備還原試樣。使用配備有RP-HPLC管柱之Agilent 6520B Q-TOF質譜儀(ZORBAX 300 Diphenyl RRHD，1.8微米，2.1 mm × 50 mm)實施質譜分析。高效液相層析(HPLC)參數如下：流速為0.5 ml/min；移動相A為於HPLC等級H2 O中之0.1% (v/v)甲酸，且移動相B為於乙腈中之0.1% (v/v)甲酸。在90%A/10%B中平衡管柱，亦使用該溶液將mAb試樣去鹽，隨後在20%A/80%B中洗脫。在100-3000m/z 、正極性、氣體溫度為350℃、噴霧器壓力為48 lb/in2 且毛細管電壓為5,000 V下收集質譜數據。使用供應商所提供(Agilent v.B.04.00) MassHunter定性分析軟體來分析數據且使用來自解捲積光譜之峰強度推導出每一試樣中之物質相對比例，如先前所闡述。
圖6.1. 在表現於包括突變體或wt tRNA合成酶(TRS)之哺乳動物細胞中之後12G3H11 K274CP1-NNAA mAb之效價。培養基中之CP1-NNAA最終濃度及供給時間有所變化，如x軸上所指示。應注意，50號非天然胺基酸之結構展示於圖6.8中。表6.1 1C1 K274CP1-NNAA mAb產生之匯總
圖6.2. 12G3H11 K274CP1-NNAA mAb之好一些醣基化質譜分析。A)展示mAb輕鏈(LC)及重鏈(HC)之質量範圍。B)僅展示mAb重鏈之放大光譜。假設將CP1NNAA納入抗體重鏈中，所觀察重鏈質量(51129.55 amu)密切匹配所計算重鏈質量(51127 amu)。
圖6.3. 12G3H11 K274CP1-NNAA mAb之SEC分析，其指示獲得單體產物。指示高分子量物質(HMWS)。
圖6.4. 1C1-K274CP1-NNAA mAb (1C1.K274CP1)之SDS-PAGE分析。
圖6.5. 12G3H11 K274CP1-NNAAmAb-MMAE偶聯產物之還原性去醣基化質譜分析。A)未反應抗體，B) AM-MMAE反應產物，C) PM-MMAE反應產物。放大光譜以僅展示mAb重鏈。
圖6.6. 1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE偶聯產物之還原性醣基化質譜分析。A)未反應抗體，B) AM-MMAE反應產物。放大光譜以僅展示mAb重鏈(HC)。展示重鏈及輕鏈之放大光譜展示於圖6.9及6.10中。
圖6.7. 展示化合物異構體(其以1:1比率存在)之CP1-NNAA之化學結構。
圖6.8. 化合物50之化學結構，該化合物係文獻中所闡述之CP1-NNAA之呋喃類似物。使用此化合物作為使用12G3H11 mAb之表現研究之對照。
圖6.9. 12G3H11 K274CP1-NNAA mAb-MMAE偶聯產物之還原性去醣基化質譜分析。A)未反應抗體，B) AM-MMAE反應產物，C) PM-MMAE反應產物。放大光譜以展示抗體之重鏈及輕鏈。
圖6.10. 1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE偶聯產物之還原性醣基化質譜分析。A)未反應抗體，B) AM-MMAE反應產物。放大光譜以展示抗體之重鏈及輕鏈亦及高分子量物質。表6.2 K274CP1-NNAA mAb-MMAE偶聯數據之匯總a,b,c a 所有偶聯反應皆係在pH 5.5、20% DMSO、22℃及3 mg/mL CP1-NNAA mAb下實施。將CP1-NNAA納入位置K274中以代替離胺酸b 所用之MMAE:CP1二烯莫耳比率為2.5:1c 自還原性質譜之峰強度進行計算d DAR=藥物對抗體比，連接體裂解物質不包含於DAR計算中
使用兩種不同抗體構築體12G3H11及1C1來證實CP1-NNAA在抗體位置K274中之納入。所回收抗體具有高品質，無截短產物且聚集極少。考慮到供給至細胞中之CP1-NNAA量較低，1.7 L規模1C1抗體產生所達成之效價相當高。CP1二烯反應性在整個表現及純化過程中得以保留，如藉由抗體接近完全轉化至ADC所指示。
實例 7. CP1-NNAA mAb 馬來醯亞胺基 MMAE 抗體藥物偶聯物之血清穩定性 4+2環加成產物(環戊二烯-馬來醯亞胺鍵)在生理學環境中之離體穩定性，藉由在37℃下於大鼠及小鼠血清中培育7天。
ADC 之生成 ： 使在位置K274具有CP1-NNAA之12G3H11 K274CP1-NNAA偶聯至馬來醯亞胺基MMAE以產生期望ADC。首先，使用PBS (0.133 mL)將12G3H11 K274CP1-NNAA mAb (0.4 mg, 2.7 nmol, 1當量)調節至3 mg/mL。添加DMSO (27 µL)及1M磷酸二氫鈉(13 µL)以分別產生約20 v/v%及10% v/v之溶液。將馬來醯亞胺基-MMAE (5 μL於DMSO中之10 mM儲備液，13 nmol, 5當量)添加至12G3H11 K274CP1-NNAA mAb溶液中且將混合物短暫渦旋。在室溫及連續混合下繼續進行反應1 h。添加N-乙醯基半胱胺酸(1.1 μL，100 mM, 108 nmol, 40當量)且將溶液再培育15 min以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。然後使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分。隨後藉由還原性質譜如下文所闡述來分析試樣以證實偶聯並量化藥物:抗體比。
血清穩定性分析 ： 在全大鼠血清(Jackson Immunoresearch編號：012-000-120)及全小鼠血清(Jackson Immunoresearch編號：015-000-120)中評估ADC試樣。使用無菌水根據製造商方案來重構經凍乾血清產物。向血清中添加ADC試樣以產生0.2 mg/mL抗體溶液。使ADC/血清混合物通過0.2 μm過濾器，封蓋於氣密性小瓶中並在37℃下培育。取出等分試樣並冷凍以用作T=0 d參考。將剩餘試樣在37℃下培育7 d，隨後藉由免疫捕獲使用Fc特異性抗人類IgG-瓊脂糖樹脂(Sigma-Aldrich)回收抗體(偶聯及未偶聯)。使用PBS沖洗樹脂兩次，使用IgG洗脫緩衝液沖洗一次，且然後使用PBS再沖洗兩次。然後組合ADC血清試樣與抗人類IgG樹脂(100 µL ADC-血清混合物，50 µL樹脂漿液)並在室溫下輕微混合15分鐘。藉由離心回收樹脂且然後使用PBS洗滌兩次。將樹脂糰粒再懸浮於100 µL IgG洗脫緩衝液(Thermo Scientific)中並在室溫下進一步培育5分鐘。藉由離心去除樹脂且然後將20 µL 10X Glyco緩衝液1 (New England Biolabs)及5 µL Endo S (Remove iT EndoS, New England Biolabs)添加至上清液中，隨後在37℃下培育1 h。無菌過濾去醣基化人類抗體溶液，使用TCEP (Bond Breaker 0.5 M TCEP溶液，Thermo Fisher Scientific)還原並藉由LC/MS分析。自質譜峰高測定偶聯抗體百分比並量化連接體裂解產物。
質譜分析 ：如實例1中所闡述來分析試樣。
圖7.1. 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC之大鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於大鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯。
圖7.2. 12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC之大鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於大鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯，然而，在苯基乙醯胺基團處觀察到連接體裂解。裂解產物之闡述可參見附錄7。
圖7.3. 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC之小鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於小鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯，然而，在val-cit二肽處觀察到接近完全之連接體裂解。裂解產物之闡述可參見附錄7。
圖7.4. 12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC之小鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於小鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯，然而，觀察到幾乎完全之連接體裂解。裂解產物之闡述可參見附錄7。表7.1 12G3H11 K274CP1-NNAA MMAE ADC血清穩定性數據之匯總a,b a 使用具有K274CP1-NNAA突變之12G3H11 mAb製得之ADC。b 將試樣在37℃下培育7天c 自還原性去醣基化質譜之峰強度來計算。d 經裂解連接體物質不包含於DAR計算中。理論DAR = 2。e val-cit二肽裂解及苯基乙醯胺裂解有助於整體連接體裂解及藥物損失。f 在連接體中觀察到苯基乙醯胺裂解，但未觀察到val-cit二肽裂解。
圖7.5. 展示分子量之MMAE有效載荷藥化學結構。
圖7.6. 在小鼠血清中培育ADC後觀察到之主要裂解產物之化學結構。A)及B)分別展示保留於AM-MMAE及PM-MMAE偶聯物之抗體(未展示CP1-馬來醯亞胺鍵聯)上之物質。C)展示在val-cit二肽裂解之後釋放之物質。
圖7.7. 在大鼠血清培育後之PM-MMAE裂解產物之化學結構。A)保留於抗體上之物質及B)所釋放物質。
mAb-CP1-NNAA與馬來醯亞胺基-MMAE之間之環戊二烯-馬來醯亞胺偶聯產物在大鼠及小鼠血清中經7天時段較為穩定，不論MMAE有效載荷藥上所含之馬來醯亞胺之類型如何。發現ADC有效載荷藥之其他部分在形成馬來醯亞胺-CP1二烯鍵之前發生降解。具體而言，苯基馬來醯亞胺-及烷基馬來醯亞胺-MMAE有效載荷藥皆在小鼠血清中展現高val-cit二肽裂解，此很可能係源於高度暴露之K274偶聯位點之酶促可及性。苯基-馬來醯亞胺偶聯物在苯基馬來醯亞胺與val-cit二肽之間在苯基乙醯胺處展示額外結構易感性。大鼠血清中之此裂解之顯著性大於小鼠血清。尚不明了在製程中何時發生苯基乙醯胺裂解，此乃因其自第0天至第7天並未增加。裂解可能發生於包含低pH沖洗步驟之免疫捕獲期間。總而言之，環戊二烯-馬來醯亞胺偶聯產物在生理學環境中顯示穩定性。
實例 8. 含有螺環戊二烯 (CP2) 之化合物之合成 製備具有下文所展示一般結構之含有螺環戊二烯之交聯劑及非天然胺基酸(NNAA)：圖 8.1. 實例8中所闡述之螺環戊二烯交聯劑(A)及螺環戊二烯NNAA (B)之一般設計。
自市售NaCp溶液與環氧氯丙烷之反應(以卡里拉反應(Carreira’s reaction)之修改形式)開始來合成CP2-NNAA (10 )。 1 使用外消旋環氧氯丙烷，但可使用對映異構純環氧氯丙烷以91%對映異構體過量來合成7 。7 與氯甲酸4-硝基苯基酯之反應產生經活化胺基甲酸酯8 。使8 與Fmoc-Lys-OH進行反應可產生經Fmoc保護之9 ，可使用六氫吡啶去保護以獲得NNAA10 。化合物10 展示高於4 之酸穩定性，且在其合成中並無中間體在儲存於-20℃時展示二聚合或分解。
自7 與琥珀酸酐之產生酸11 之反應開始來合成CP2官能化NHS-酯12 。使酸7 與EDC∙HCl及N -羥基琥珀醯亞胺進行反應以產生NHS酯12 。化合物12 在室溫下儲存數天時似乎並不發生二聚合。
材料及方法 ： 除非另外陳述，否則在N2 氣氛下使用試劑級溶劑來實施反應。將DCM及甲苯儲存於3Å分子篩中。使THF通過活化氧化鋁管柱上方。所用商業獲得性試劑皆按接收狀態使用。使用E. Merck矽膠60 F254預塗覆板(0.25 mm)實施薄層層析(TLC)且藉由曝光於UV光(254 nm)來觀察或使用對-茴香醛、茚三酮或過錳酸鉀染色。使用正相矽膠(60 Å, 0.040 - 0.063 mm, Geduran)實施急速管柱層析。在Varian光譜儀(400、500或600 MHz)上記錄1 H NMR光譜且相對於氘化溶劑信號進行報告。如下所述來報告1 H NMR光譜之數據：化學位移(δ ppm)、多重性、偶合常數(Hz)及積分。在Varian光譜儀(100、125或150 MHz)上記錄13 C NMR光譜。以化學位移(δ ppm)形式來報告13 C NMR光譜之數據。自UC Santa Barbara質譜設施在具有場去吸附(FD)來源之(Waters Corp.) GCT Premier高解析度飛行時間質譜儀上獲得質譜。
CP2-NNAA (10) 之合成
螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲醇(7 )：將環戊二烯化鈉(於THF中之2 M溶液，10 mL, 20 mmol, 4當量)添加至THF (40 mL)中並冷卻至0℃。逐滴添加環氧氯丙烷(0.39 mL, 5.0 mmol, 1當量)且將反應液在0℃下攪拌1.5 hr，然後在室溫下進一步攪拌2 hr。使用H2 O (40 mL)終止反應，然後轉移至分液漏斗中。添加NaHCO3 飽和水溶液(40 mL)及乙醚(40 mL)並分離各層。使用鹽水(40 mL)洗滌有機層，藉由MgSO4 乾燥，過濾，且然後去除溶劑。對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 2:1)以產生褐色油狀物形式之7 (0.48 g, 78%)。
Rf (己烷:EtOAc, 2:1): 0.22；1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ 6.64 (td,J = 1.6, 5.1 Hz, 1 H), 6.51 (td,J = 1.7, 5.1 Hz, 1 H), 6.27 (tdd,J = 1.0, 2.1, 5.2 Hz, 1 H), 6.12 (td,J = 1.7, 5.1 Hz, 1 H), 4.08 - 3.88 (m, 1 H), 3.59 (dd,J = 8.8, 11.7 Hz, 1 H), 2.48 - 2.40 (m, 1 H), 1.87 (dd,J = 4.3, 8.7 Hz, 1 H), 1.69 (dd,J = 4.4, 7.0 Hz, 1 H), 1.57 (br. s., 1 H) ppm；13 C NMR (125 MHz, CDCl3 ) δ 139.4, 133.9, 131.7, 128.6, 64.9, 41.9, 30.0, 17.6 ppm。
碳酸4-硝基苯基酯螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲基酯(8 )：將7 (2.80 g, 22.9 mmol, 1當量)添加至DCM (100 mL)中並冷卻至0℃。添加吡啶(4.61 mL, 57.3 mmol, 2.5當量)，隨後添加氯甲酸4-硝基苯基酯(5.08 g, 25.2 mmol, 1.1當量)。在0℃下攪拌反應液直至起始材料耗盡為止(TLC, 30 min)。將反應液傾倒至分液漏斗中並使用使用NH4 Cl之飽和水溶液(100 mL)洗滌。使用DCM (50 mL)萃取水層。合併有機層，使用鹽水(50 mL)洗滌，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，並去除溶劑。對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 6:1 to 4:1)以產生琥珀色油狀物形式之8 (5.17 g, 79%)。
Rf (己烷:EtOAc, 4:1): 0.28；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 8.28 (d,J = 9.0 Hz, 2 H), 7.37 (d,J = 9.0 Hz, 2 H), 6.62 (td,J = 1.7, 5.2 Hz, 1 H), 6.53 (td,J = 1.7, 4.8 Hz, 1 H), 6.25 (td,J = 1.8, 5.5 Hz, 1 H), 6.11 (td,J = 1.6, 5.1 Hz, 1 H), 4.53 (dd,J = 7.6, 11.5 Hz, 1 H), 4.40 (dd,J = 7.4, 11.3 Hz, 1 H), 2.52 (quin,J = 7.6 Hz, 1 H), 1.92 (dd,J = 4.7, 8.6 Hz, 1 H), 1.76 (dd,J = 4.7, 6.7 Hz, 1 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 155.4, 152.3, 145.3, 138.6, 133.8, 131.7, 129.4, 125.2, 121.7, 70.9, 41.5, 24.6, 16.9 ppm。
Fmoc-Lys(碳酸螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲基酯)-OH (9 )：將8 (5.12 g, 17.8 mmol, 1當量)添加至DMF (40 mL)中，隨後添加Fmoc-Lys-OH (7.87 g, 21.4 mmol, 1.2當量)及DIPEA (7.44 mL, 42.7 mmol, 2.4當量)。攪拌反應液直至起始材料耗盡為止(NMR, 3.5 hr)，然後傾倒至EtOAc (100 mL)及 H2 O (140 mL)中。使用HCl (1 M, 100 mL)將水層酸化至pH 2-3，傾倒至分液漏斗中，並分離各層。使用EtOAc (2 × 100 mL)萃取水層。合併有機層，使用鹽水(100 mL)洗滌，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，並去除溶劑。對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 3:1，然後DCM:MeOH:AcOH, 89:10:1)並去除溶劑。藉由將產物懸浮於DCM中來去除殘餘AcOH及DMF，使用鹽水洗滌，藉由Na2 SO4 乾燥有機層，過濾，然後去除溶劑以產生蛋殼型發泡體形式之9 (7.43 g, 81%)。
Rf (DCM:MeOH, 90:10): 0.39；1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ 8.62 (br. s., 1 H), 7.75 (d,J = 7.3 Hz, 2 H), 7.66 - 7.49 (m, 2 H), 7.39 (t,J = 7.4 Hz, 2 H), 7.30 (t,J = 7.3 Hz, 2 H), 6.54 (br. s., 1 H), 6.47 (br. s., 1 H), 6.21 (br. s., 1 H), 6.04 (br. s., 1 H), 5.74 (d,J = 7.3 Hz, 1 H), 4.91 (br. s., 1 H), 4.53 - 4.00 (m, 5 H), 3.21 - 3.00 (m, 2 H), 2.97 (s, 1 H), 2.90 (d,J = 0.8 Hz, 1 H), 2.47 - 2.31 (m, 1 H), 1.95 - 1.27 (m, 6 H) ppm；13 C NMR (125 MHz, CDCl3 ) 163.2, 156.7, 143.6, 141.2, 138.9, 134.5, 130.9, 128.9, 127.6, 127.0, 125.1, 119.9, 115.6, 67.0, 66.5, 53.5, 47.1, 41.6, 40.4, 36.8, 31.8, 29.2, 25.7, 22.2, 21.4, 17.1 δ ppm。
CP2-NNAA (10 )：將9 (5.50 g, 10.6 mmol, 1當量)添加至DMF (150 mL)中，隨後添加六氫吡啶(16.8 mL)。攪拌反應液直至起始材料耗盡為止(TLC, 90 min)，然後去除溶劑。將Et2 O (100 mL)添加至殘餘物中，且將懸浮液超音波處理5 min。過濾懸浮液並使用H2 O (2 × 100 mL)及Et2 O (100 mL)沖洗。將固體懸浮於MeOH (10 mL)中，攪拌10 min且輕微升溫(約40℃)，添加Et2 O (40 mL)，過濾懸浮液並使用Et2 O (2 × 50 mL)沖洗。在真空下乾燥化合物以產生白色粉末形式之10 (2.24 g, 71%)。
Rf (DCM:MeOH, 85:15): 0.29；1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 + 1滴TFA) δ 8.20 (br. s., 3 H), 7.16 (t, J = 5.5 Hz, 1 H), 6.48 (td, J = 1.8, 5.1 Hz, 1 H), 6.40 (d, J = 5.1 Hz, 1 H), 6.32 (d, J = 5.1 Hz, 1 H), 6.12 (td, J = 1.9, 4.9 Hz, 1 H), 4.24 (dd, J = 6.7, 11.7 Hz, 1 H), 3.99 (dd, J = 7.6, 11.5 Hz, 1 H), 3.88 (d, J = 5.1 Hz, 1 H), 2.94 (d, J = 5.9 Hz, 2 H), 2.37 (quin, J = 7.5 Hz, 1 H), 1.83 - 1.63 (m, 4 H), 1.44 - 1.19 (m, 4 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6 + 1滴TFA)：
171.2, 156.2, 139.3, 135.2, 130.4, 128.3, 65.3, 51.9, 42.0, 29.7, 28.9, 25.7, 21.6, 16.4；C15 H22 N2 O4 [M]+ 之MS (EI)確切質量計算值：294.1580，實驗值：294.1571。
CP2-NHS (12) 之合成
4-側氧基-4-(螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲氧基)丁酸(11 ):將DCM (1.5 mL)添加至含有1 (0.37 g, 3.0 mmol, 1當量)之小瓶中。添加Et3 N (0.42 mL, 3.0 mmol, 1當量)、DMAP (37 mg, 0.30 mmol, 0.1當量)及琥珀酸酐(0.33 g, 3.3 mmol, 1.1當量)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌直至起始材料耗盡為止(TLC, 1.75 hr)。使用DCM (50 mL)將反應混合物傾倒至分液漏斗中並使用HCl水溶液(1 M, 50 mL)洗滌。使用DCM (50 mL)萃取水層，合併有機層，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，並去除溶劑以產生具有用於下一反應之足夠純度之11 。
Rf (EtOAc): 0.56；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 10.60 (br. s., 1 H), 6.57 (td,J = 1.9, 5.3 Hz, 1 H), 6.50 (td,J = 1.8, 5.1 Hz, 1 H), 6.21 (td,J = 1.7, 5.2 Hz, 1 H), 6.07 (td,J = 1.8, 5.1 Hz, 1 H), 4.37 (dd,J = 7.4, 11.7 Hz, 1 H), 4.20 (dd,J = 7.0, 11.7 Hz, 1 H), 2.74 - 2.57 (m, 4 H), 2.42 (quin,J = 7.8 Hz, 1 H), 1.85 (dd,J = 4.5, 8.4 Hz, 1 H), 1.69 (dd,J = 4.3, 7.0 Hz, 1 H) ppm。
CP2-NHS (12 )：將THF (10 mL)添加至含有11 ( 3.0 mmol, 1當量)之小瓶中。添加NHS (0.48 g, 4.2 mmol, 1.4當量)、EDC·HCl (0.69 g, 3.6 mmol, 1.2當量)及DCM (5 mL)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌過夜。去除溶劑且對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 1:1)以產生無色黏性油狀物形式之12 (0.59 g, 62%，兩個步驟)。
Rf (己烷:EtOAc, 1:1): 0.34；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 6.56 (td, J = 1.8, 5.1 Hz, 1 H), 6.48 (td, J = 1.8, 5.1 Hz, 1 H), 6.21 (td, J = 1.6, 3.4 Hz, 1 H), 6.06 (td, J = 1.6, 3.4 Hz, 1 H), 4.36 (dd, J = 7.4, 11.7 Hz, 1 H), 4.21 (dd, J = 7.4, 11.7 Hz, 1 H), 2.93 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 2.83 (s, 4 H), 2.73 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.42 (quin, J = 7.6 Hz, 1 H), 1.83 (dd, J = 4.3, 8.6 Hz, 1 H), 1.68 (dd, J = 4.5, 6.8 Hz, 1 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 170.8, 168.9, 167.6, 138.8, 134.3, 131.2, 129.0, 66.6, 41.5, 28.6, 26.2, 25.5, 25.1, 17.3 ppm。
1. Ledford, B. E.; Carreira, E. M., Total Synthesis of (+)-Trehazolin: Optically Active Spirocycloheptadienes as Useful Precursors for the Synthesis of Amino Cyclopentitols.Journal of the American Chemical Society 1995, 117 , 11811-11812。
實例 9. 用於經由經交聯劑修飾之 mAb 來製備 ADC 之 CP2 二烯 - 馬來醯亞胺偶聯 評估用於生物偶聯之螺環戊二烯-馬來醯亞胺反應之可行性。經由胺反應性異雙官能連接體使用實例3中所闡述之相同一般策略來引入螺環戊二烯基團。
在mAb 上引入CP2 官能基 ： 藉由離胺酸一級胺與NHS-酯活化CP2二烯之反應將CP2二烯官能基安置於IgG1 mAb上。此方式產生隨機偶聯、醯胺連接之環戊二烯基團。所得抗體稱為mAb-CP2-連接體，但亦可在圖中表示為mAb-CP2。清晰起見可參見圖注。典型mAb修飾反應如下所述。使用pH 7.2 PBS將Mab溶液調節至5 mg/mL (3 mL, 15 mg mAb, 100 nmol, 1當量)，隨後添加10% v/v 1 M NaHCO3 。將此溶液冷凍於冰上且添加35 µL CP2-NHS (於DMAc中之10 mM儲備液，350 nmol, 3.5當量)。在冰上繼續進行反應5分鐘，隨後在室溫及連續混合下反應1 h。藉由透析(Slide-A-Lyzer, 10 kDa MWCO)在0℃下於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中純化經反應mAb 24 h。如下文所闡述藉由完整去醣基化質譜來量化CP2引入且發現在此實例中為每mAb中具有3.29個CP2-連接體(及由此二烯)，此對應於94%之CP2-NHS轉化成抗體偶聯物。反應圖9.1. 使用CP2-NHS修飾mAb
經CP2 修飾之mAb 與馬來醯亞胺基-MMAE 之反應 ： 使用PBS (pH 7.4)將mAb-CP2-連接體(3.29 CP2二烯/mAb, 1 mg, 6.7 nmol mAb, 1當量)稀釋至最終濃度為3.16 mg/mL。接下來，添加DMSO以產生20% v/v溶液，隨後添加1 M磷酸二氫鈉以產生10% v/v溶液。添加所有溶液組分可產生包括2.43 mg/mL mAb、53.3 μM CP2、1.78 M DMSO、110 mM磷酸鈉、100 mM NaCl之pH 5.5混合物。將AM-MMAE或PM-MMAE (10 μL於DMAc中之10 mM儲備溶液，100 nmol, 15當量)添加至抗體溶液中。將反應混合物短暫渦旋並在22℃或37℃及混合下繼續進行反應。在4 h反應之後，添加N-乙醯基半胱胺酸(8 μL 100 mM溶液，120當量)以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分。隨後藉由還原性去醣基化質譜如下文所闡述來分析試樣。反應圖9.2. mAb-CP2-連接體與馬來醯亞胺基MMAE之反應。
質譜分析 ： 如實例1中所闡述來分析試樣。
圖9.1. 在與CP2-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。(B)中之峰下方數字指示引入mAb中之CP2-二烯基團之數量。藉由峰強度來估計CP2-二烯引入得出每一mAb具有3.29個CP2-連接體。表9.1 CP2-NHS mAb反應之匯總
圖9.2. mAb-CP2-連接體在與AM-MMAE及PM-MMAE反應之前及之後之還原性去醣基化質譜分析。放大光譜以展示重鏈及輕鏈。
圖9.3. mAb-CP2-連接體馬來醯亞胺基MMAE反應產物之還原性去醣基化質譜。放大光譜以展示抗體重鏈。偶聯物質之編號指示於每一峰上方。表9.2 mAb-CP2-連接體馬來醯亞胺基-MMAE反應之匯總a a 所有反應皆係在2.43 mg/mL mAb-CP2-連接體下實施4 h。
在室溫下於4 h內，安置於抗體表面上之CP2二烯基團部分地與馬來醯亞胺基-MMAE前藥進行反應。藉由質譜未觀察到非特異性偶聯，此乃因自mAb-CP2-連接體峰追蹤到所有偶聯物峰且並無未反應mAb。對於與馬來醯亞胺基-MMAE有效載荷藥之反應而言，此反應之有效性遠大於呋喃二烯，但有效性小於CP1二烯。此方式可用於產生生物偶聯物。
實例 10. 在 1.0 莫耳當量馬來醯亞胺基 -MMAE: 二烯基團下 mAb-CP2- 連接體偶聯至馬來醯亞胺基 -MMAE 之動力學 評估在22℃下CP2二烯與馬來醯亞胺基MMAE之反應動力學。
在mAb 上引入CP2 二烯官能基 ： 藉由離胺酸一級胺與NHS-酯活化CP2之反應將CP2官能基安置於IgG1 mAb上。此方式產生隨機偶聯、醯胺連接之環戊二烯基團。典型mAb修飾反應如下所述。使用pH 7.2 PBS將Mab溶液調節至5 mg/mL (3 mL, 15 mg mAb, 100 nmol, 1當量)，隨後添加10% v/v 1 M NaHCO3 。將此溶液冷凍於冰上且添加35 µL CP2-NHS (於DMAc中之10 mM儲備液，350 nmol, 3.5當量)。在冰上繼續進行反應5分鐘，隨後在室溫及連續混合下反應1 h。藉由透析(Slide-A-Lyzer, 10 kDa MWCO)在0℃下於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中純化經反應mAb 24 h。如下文所闡述藉由完整去醣基化質譜來量化CP2-連接體引入且發現在此實例中為每mAb中具有3.29個CP2-連接體(及由此二烯)，此對應於94%之CP2-NHS轉化成抗體偶聯物。
經CP2 修飾之mAb 與馬來醯亞胺基-MMAE 之反應 ： 使用PBS (pH 7.4)將mAb-CP2-連接體(3 mg, 3.29 CP2/mAb, 66 nmol CP2二烯，1當量)稀釋至最終濃度為1.7 mg/mL。接下來，添加DMSO以產生20% v/v溶液，隨後添加1 M磷酸二氫鈉以產生10% v/v溶液。添加所有溶液組分可產生包括1.3 mg/mL mAb、32.3 μM CP2二烯、1.78 M DMSO、110 mM磷酸鈉、100 mM NaCl之pH 5.5混合物。將AM-MMAE或PM-MMAE (6.6 μL於DMSO中之10 mM儲備溶液，66 nmol, 1當量)添加至抗體溶液中。將反應混合物短暫渦旋並在22℃及混合下繼續進行反應。在各個時間點取出等分試樣(180 μL)且添加N-乙醯基半胱胺酸(3 μL 100 mM溶液，45當量)以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。然後使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分。然後藉由還原性去醣基化質譜如下文所闡述來分析試樣。
質譜分析 ： 如實例1中所闡述來分析試樣。
CP2 二烯- 馬來醯亞胺反應速率常數之計算 ： 自去醣基化還原性質譜中之峰強度來測定馬來醯亞胺基-MMAE與mAb-CP2-連接體中之CP2二烯之反應之二階速率常數。藉由mAb-CP2-連接體峰之消失及mAb-CP2-連接體-MMAE偶聯物峰之出現來監測反應進展，但僅使用抗體重鏈上之mAb-CP2-連接體峰強度來計算經反應CP2二烯之相對豐度。使用下述方程式計算mAb重鏈上之未反應CP2二烯基團：a =未修飾重鏈之峰強度 b =具有一個CP2二烯基團之重鏈之峰強度之總和 c =具有兩個CP2二烯基團之重鏈之峰強度之總和 d =具有三個CP2二烯基團之重鏈之峰強度 e =未修飾輕鏈之峰強度 f =具有一個CP2二烯基團之輕鏈之峰強度之總和 g =具有兩個CP2二烯基團之輕鏈之峰強度之總和
以莫耳濃度單位進一步分析偶聯數據以測定動力學常數。藉由自1/[CP2二烯]對時間之繪圖所生成曲線之斜率及線性回歸分析來測定二階速率常數。使用下文所展示之方程式自二階反應速率常數來計算反應半衰期： k2 =二階速率常數 [CP2]0 =時間=0時之CP2二烯濃度
圖10.1. mAb-CP2-連接體及與AM-MMAE反應之mAb-CP2-連接體在4 h及48 h時之還原性去醣基化質譜。放大光譜以僅展示重鏈。標記每一峰以指示偶聯物質之編號。
圖10.2. mAb-CP2-連接體及與PM-MMAE反應之CP2-mAb在4 h及48 h時之還原性去醣基化質譜。放大光譜以僅展示重鏈。標記每一峰以指示偶聯物質之編號。
圖10.3. mAb-CP2-連接體二烯與馬來醯亞胺基-MMAE之反應。A)未反應CP2二烯隨時間之莫耳濃度。自還原性去醣基化質譜之峰強度測定每mAb之未反應CP2二烯。B)用於計算反應速率之濃度倒數圖。表10.1 mAb-CP2-連接體二烯與-馬來醯亞胺基-MMAE之反應之動力學數據之匯總a,b,c a 所有偶聯反應皆係在pH 5.5、20% DMSO、22℃及1.3 mg/mL經CP2修飾之mAb下實施b 所用之MMAE:CP2二烯莫耳比率為1:1c 自48h時量測之還原性去醣基化質譜之峰強度來計算。
CP2二烯與馬來醯亞胺基-MMAE之反應慢於CP1二烯，其中半衰期約為數小時。不同於CP1二烯，在苯基-馬來醯亞胺與烷基-馬來醯亞胺中觀察到反應速率並無差異。在48 h反應之後，AM-MMAE之反應轉化率為90%，但PM-MMAE僅為73%。考慮到兩種受質之類似速率常數，可能一部分苯基馬來醯亞胺在延長時間之後於該等條件下發生降解，由此限制了整體轉化率。
實例 11. 抗體中之 CP2-NNAA 納入 將CP2-NNAA納入抗EphA2 (1C1)抗體之位置K274或S239中，評價所表現mAb之品質及CP2-NNAA二烯在抗體納入之後之反應性。
CP2 NNAA 儲備溶液之製備 ： 在H2 O中組合CP2 NNAA (0.5 g, 1.7 mmol)與7.8 mL 0.2 M NaOH。在室溫下攪拌所得漿液直至所有固體皆溶解為止(10分鐘)。在完全溶解之後，使淺黃色溶液通過0.2 μm過濾器，等分，並儲存於-80℃下直至使用。此程序產生8.2 mL 216 mM CP2 NNAA儲備溶液。
CP2-NNAA之結構
抗體表現 ：將在Fc位置K274或S239具有琥珀型突變之12G3H11或1C1 IgG1抗體基因選殖至專屬pOE抗體表現載體中。將構築體與編碼PylRS雙重突變體(Y306A/Y384F)或野生型PylRS之質體及含有tRNA表現盒之串聯重複(pORIP 9X tRNA)之質體一起轉染至CHO-G22 (PEImax，1.5 L G22細胞)中。在轉染後4小時，向細胞中添加3.3%進料F9 (專屬)及0.2%進料F10 (專屬)且在34℃下進一步培育細胞。第二天，以0.26 mM之最終濃度(對於1C1 K274及1C1 S239轉染細胞)添加CP2-NNAA。在第3天及第7天再次向細胞供給6.6%進料F9及0.4%進料F10。旋轉細胞且在第11天收穫上清液。藉由IgSelect親和管柱(GE Health Care Life Science)純化上清液。使用50 mM甘胺酸、30 mM NaCl (pH 3.5)洗脫緩衝液洗脫抗體，使用1 M pH 7.5 Tris緩衝液中和，並透析至pH 7.2 PBS中。藉由吸光度量測在280 nm下測定所洗脫抗體之濃度。1C1 K274CP2-NNAA之回計算效價為57 mg/L且1C1 S239CP2-NNAA之回計算效價為76 mg/L。以較小規模下之類似方式來表示12G3H11 mAb，其中CP2-NNAA進料濃度。藉由SDS-PAGE使用標準方法來分析所回收抗體。亦藉由粒徑篩析層析及質譜如下文所闡述來分析抗體。將納入CP2-NNAA之抗體表示為mAb-CP1-NNAA以區分於mAb-CP2-連接體構築體，或表示為mAb-[位置]CP2-NNAA，其中[位置]指示突變至CP2-NNAA之胺基酸編號及胺基酸符號。
粒徑篩析層析 ： 使用配備有三級檢測器陣列(Viscotek 301, Viscotek, Houson, TX)之Agilent 1100毛細管LC系統實施SEC分析；將波長設定於280 nm，且在TSK-GEL G3000SWXL管柱(Toso Bioscience LLC, Montgomeryville, PA)上使用100 mM pH 6.8磷酸鈉緩衝液在1 mL/min之流速下運行試樣。
質譜分析 ： 對於去醣基化mAb分析而言，組合EndoS (5 µL Remove-iT EndoS，以1:10稀釋於PBS中，20,000單位/mL，New England BioLabs)與50 µL試樣(1 mg/mL mAb)及5 µL glyco緩衝液1 (New England BioLabs)，且隨後在37℃下培育1 h。藉由添加5 μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5 M, Thermo Fisher Scientific)並在37℃下培育10 min來製備還原試樣。使用配備有RP-HPLC管柱之Agilent 6520B Q-TOF質譜儀(ZORBAX 300 Diphenyl RRHD，1.8微米，2.1 mm × 50 mm)實施質譜分析。高效液相層析(HPLC)參數如下：流速為0.5 ml/min；移動相A為於HPLC等級H2 O中之0.1% (v/v)甲酸，且移動相B為於乙腈中之0.1% (v/v)甲酸。在90%A/10%B中平衡管柱，亦使用該溶液將mAb試樣去鹽，隨後在20%A/80%B中洗脫。在100-3000m/z 、正極性、氣體溫度為350℃、噴霧器壓力為48 lb/in2 且毛細管電壓為5,000 V下收集質譜數據。使用供應商所提供(Agilent v.B.04.00) MassHunter定性分析軟體來分析數據且使用來自解捲積光譜之峰強度推導出每一試樣中之物質相對比例。
圖11.1. 12G3H11 K274CP2-NNAA mAb在表現於包括突變體或野生型tRS之哺乳動物細胞中之後之效價及細胞存活率。培養基中之CP2-NNAA最終濃度指示於圖例中。使用突變體tRS之12G3H11 K274CP2-NNAA mAb表現與使用野生型tRS之疊氮基-離胺酸相當，且具有最小毒性。表11.1 1C1 K274CP2-NNAA及1C1 S239CP2-NNAA mAb產生之匯總
圖 11.2. 去醣基化1C1 K274CP2-NNAA mAb之質譜分析。A)完整mAb，B)還原mAb，放大展示輕鏈(LC)及重鏈(HC)。假設在完整mAb結構中納入兩個CP2-NNAA，則所觀察完整質量密切匹配所計算完整質量(147546.03)。假設在抗體重鏈中納入一個CP2-NNAA，則所觀察重鏈質量密切匹配所計算重鏈質量(50325.93)。據觀察，在mAb輕鏈中未納入CP2-NNAA。1C1野生型mAb之類似光譜展示於圖11.4中。
圖11.3. 去醣基化1C1 S239CP2-NNAA mAb之質譜分析。A)完整mAb，B)還原mAb，放大展示輕鏈(LC)及重鏈(HC)。假設在完整mAb結構中納入兩個CP2胺基酸，則所觀察完整質量密切匹配所計算完整質量(147628.23)。假設在抗體重鏈中納入CP2-NNAA，則所觀察重鏈質量密切匹配所計算重鏈質量(50367.03)。據觀察，在mAb輕鏈中未納入CP2-NNAA。1C1野生型mAb之類似光譜展示於圖11.4中。
圖11.4. 去醣基化1C1野生型 mAb之質譜分析。A)完整mAb，B)還原mAb，放大展示輕鏈(LC)及重鏈(HC)。A)展示完整mAb之質量範圍，B)展示輕鏈(LC)及重鏈(HC)之質量範圍。表11.2 1C1-K274CP2-NNAA及1C1-S239CP2-NNAA mAb之質譜數據之匯總
圖 11.5. 1C1 K274CP2-NNAA mAb之SEC分析，其指示獲得單體產物。指示高分子量物質(HMWS)。
圖11.6. 1C1 S239CP2-NNAA mAb之SEC分析，其指示獲得單體產物。
圖11.7. 1C1-K274CP2-NNAA mAb及1C1-S239CP2-NNAA mAb之SDS-PAGE分析。
藉由質譜證實在抗體之位置K274及S239納入CP2-NNAA。所回收抗體具有高品質，無截短產物且聚集極少。考慮到供給至細胞中之CP2-NNAA量較低，在1C1抗體之2 L產生規模下所達成之效價相當高。
實例 12. 具有 1C1 K274CP2-NNAA 及 1C1 S239CP2-NNAA mAb 之 ADC 之產生及評估 藉由與AM-MMAE偶聯來評價CP2-NNAA在納入抗EphA2 (1C1)抗體(mAb)之位置K274或S239中之後之反應性。評估所得ADC以測定藥物:抗體比(DAR)、血清穩定性及活體外細胞毒性。
CP2-mAb ADC 之製備 ：在一個步驟中簡單地藉由混合抗體與烷基-馬來醯亞胺MMAE (AM-MMAE)來製備CP2-NNAA mAb ADC。首先，使用PBS (4 mL總體積)將1C1-S239CP2-NNAA mAb溶液(8 mg, 53 nmol, 1當量)稀釋至2 mg/mL。添加DMSO (813 μL)及1 M磷酸二氫鈉(407 μL)以分別產生約20% v/v及約10% v/v之溶液。將AM-MMAE (53.3 μL於DMSO中之10 mM儲備液，533 nmol, 10當量)添加至1C1-S239CP2-NNAA mAb溶液中且將混合物短暫渦旋。在室溫及連續混合下繼續進行反應7 h。添加N-乙醯基半胱胺酸(43 μL於水中之100 mM儲備液，4.3 μmol, 80當量)且將溶液再培育15 min以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。然後使用蒸餾水將反應混合物稀釋3倍並實施CHT層析(Bio-Scale Mini柱CHT型II 40 µm介質管柱)。使用自緩衝液A (10 mM磷酸鹽，pH 7.0)至緩衝液B (10 mM磷酸鹽，pH 7.0，含有2M NaCl)之梯度經25分鐘洗脫ADC。在CHT層析之後，藉由透析在4℃下於slide-a-lyzer盒中將試樣緩衝液交換至補充有1 mM EDTA之pH 7.4 PBS中。使1C1-K274CP2-NNAA mAb與AM-MMAE以相同方式偶聯，只是在室溫下繼續進行反應17 h。
位點特異性半胱胺酸ADC 之製備 ： 在一些實驗中，將mAb-CP2-NNAA ADC與半胱胺酸偶聯之ADC進行比較。出於此目的，產生在位置239包括半胱胺酸之抗體(稱為1C1-239C)。在以下三個步驟中使AM-MMAE偶聯至1C1-239C：i)還原並透析，ii)氧化，iii)與AM-MMAE反應。首先，藉由以下方式來輕度還原抗體以生成游離硫氫基：組合4 mL於含有1 mM EDTA之10 mM pH 7.4 PBS中之2.5 mg/mL抗體溶液(10 mg抗體，66.7 nM, 1當量)與53 µL 50 mM TCEP水溶液(2.7 µmol，相對於 mAb為40當量)，隨後在37℃下輕微混合3 h。將經還原抗體轉移至slide-a-lyzer透析盒(10K MWCO)中並在4℃下，於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中透析24 h，且更換緩衝液數次。藉由以下方式氧化該還原抗體，再形成內部二硫化物：添加去氫抗壞血酸(27 µL於DMSO中之50 mM儲備液，1.3 µmol, 20當量)，隨後在室溫下混合4 h。組合經氧化抗體溶液與20% v/v DMSO，隨後添加AM-MMAE (53 µL於DMSO中之10 mM儲備液，530 nmol，8當量)。在室溫及混合下繼續進行反應1 h，隨後添加N-乙醯基半胱胺酸(43 µL於水中之100 mM儲備液，4.2 µmol, 64當量)以淬滅未反應馬來醯亞胺。然後使用蒸餾水將反應混合物稀釋3倍，並如上文所闡述進行CHT層析及透析。
圖12.1. mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-239C ADC之產生，及AM-MMAE之結構。應注意， mAb-CP2-NNAA ADC係在一個步驟中產生，而產生mAb-239C ADC則需4個步驟。(B)中所繪示之R基團可為內源性含硫醇小分子(例如半胱胺酸)。
質譜術分析 ： 如實例1中所闡述來分析試樣。
HIC 層析分析 ： 藉由粒徑篩析層析，使用Proteomics HIC Butyl NPS管柱(4.6×35 mm, 5 µm, Sepax)來分析ADC，該管柱係使用100% A至100%B之梯度經22分鐘(移動相A：25 mM pH 8.0 Tris, 1.5 M (NH4 )2 SO4 ，移動相B：25 mM pH 8.0 Tris, 5% (v/v)異丙醇)在室溫下來洗脫。藉由280 nm下之UV吸光度來檢測蛋白質。每一次分析注射約50-100 µg蛋白質。
rRP-HPLC 分析 ： 每一次分析，使用42 mM二硫蘇糖醇(DTT)，在37℃下，於pH 7.2 PBS中還原抗體及ADC 20分鐘。將10 µg還原抗體及ADC加載於PLRP-S, 1000Å管柱(2.1 × 50 mm, Agilent)上，並在40℃下，以0.5 mL/min流速之5% B至100% B之梯度，歷經25分鐘(移動相A：於水中之0.1%三氟乙酸，及移動相B：於乙腈中之0.1%三氟乙酸)洗脫。使用來自層析圖之積分峰面積測定偶聯百分比。
ADC 之血清穩定性 ： 在大鼠血清中培育ADC以展示狄爾斯-阿爾德偶聯物之穩定性。將ADC添加至正常大鼠血清(Jackson Immunoresearch)中以達成0.2 mg/mL (1.33 µM抗體)之最終濃度，其中添加至血清中之ADC溶液之總體積小於10%。無菌過濾ADC-血清混合物且自此混合物取出等分試樣並冷凍作為t=0對照。然後將剩餘試樣在37℃及無攪拌下於密封容器中進一步培育。藉由免疫沈澱使用Fc特異性抗人類IgG-瓊脂糖樹脂(Sigma-Aldrich)自大鼠血清回收偶聯及未偶聯人類抗體。使用PBS沖洗樹脂兩次，使用IgG洗脫緩衝液沖洗一次，且然後使用PBS再沖洗兩次。然後組合ADC-小鼠血清試樣與抗人類IgG樹脂(100 µL ADC-血清混合物，50 µL樹脂漿液)並在室溫下混合15分鐘。藉由離心回收樹脂且然後使用PBS洗滌兩次。將經洗滌樹脂再懸浮於100 µL IgG洗脫緩衝液(Thermo Scientific)中並在室溫下進一步培育5分鐘。藉由離心去除樹脂且然後將20 µL 10X glycobuffer 1 (New England Biolabs)添加至上清液中。無菌過濾所回收人類抗體溶液，並與EndoS一起在37℃下培育1 h。然後使用TCEP還原去醣基化mAb並藉由LC/MS如上文所闡述進行分析。自質譜之峰高來測定偶聯抗體百分比。
活體外細胞毒性分析 ：自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection) (ATCC)獲得人類前列腺癌細胞系PC3。將PC3細胞在37℃、5% CO2 下維持於補充有10%熱滅活胎牛血清(HI-FBS) (Life Technologies)之RPMI1640培養基(Life Technologies)中。使細胞生長至指數生長期，藉由輕度胰蛋白酶化來收穫並以1500個細胞/孔接種於96孔培養板中。使細胞黏附24 h且然後使用自4000 ng/mL開始以9個濃度一式兩份連續稀釋4倍之抗體及ADC進行處理。將經處理細胞培養6天並使用CellTiter-Glo發光存活率分析(Promega)遵循製造商方案來測定細胞存活率。將細胞存活率計算為對照未處理細胞之百分比。使用邏輯非線性回歸分析利用Prism軟體(GraphPad)來測定ADC細胞毒性之IC50 。
圖12.2. mAb-CP2-NNAA及mAb-半胱胺酸在與AM-MMAE反應之前及之後之還原性醣基化質譜分析。放大光譜以展示mAb重鏈。指示ADC試樣之藥物:抗體比(DAR) 0及1之峰，每一構築體預計每一重鏈具有一個藥物(DAR 1)。
圖12.3. mAb-CP2-NNAA及mAb-半胱胺酸在與AM-MMAE反應之前及之後之還原性醣基化質譜分析。放大光譜以展示mAb輕鏈。未檢測到AM-MMAE輕鏈偶聯物，從而指示偶聯在mAb重鏈中為位點特異性。 表12.1 mAb-CP2-NNAA ADC之質譜表徵之匯總a a 自醣基化、還原性質譜來分析mAb重鏈b 自偶聯及未偶聯物質之相對峰高來計算
圖12.4. mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-半胱胺酸ADC之疏水性相互作用層析分析。對應於1C1 CP2-NNAA滯留時間之峰消失及出現具有增加之滯留時間之峰指示AM-MMAE偶聯至mAb。應注意，檢測到1C1 K274CP2-NNAA ADC DAR 1及DAR 2物質。
圖12.5. mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-半胱胺酸ADC之還原性反相高效層析分析。ADC中之重鏈峰消失及出現較長滯留時間之峰指示AM-MMAE偶聯至重鏈。輕鏈(LC)峰滯留時間在偶聯之前及之後並不改變，從而指示偶聯對mAb重鏈具有特異性。 表12.2 藉由層析方法進行之ADC表徵之匯總 a 自偶聯物質與未偶聯物質之間之相對峰面積來計算
圖12.6. mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-半胱胺酸ADC之還原性SDS-PAGE分析。
圖12.7. mAb-CP2-NNAA ADC在37℃下於大鼠血清中培育7天之前及之後之還原性去醣基化質譜分析。放大質譜以僅展示重鏈(HC)。在血清培育試樣(D及H)中缺乏未偶聯HC信號可指示，狄爾斯-阿爾德偶聯物較為穩定。
圖12.8. mAb-CP2-NNAA ADC DAR在37℃下於大鼠血清中培育7 d之前及之後之量化。自圖12.7中所展示質譜之峰高來計算DAR。將值報告為平均值±標準偏差，n=3。在該等條件下檢測到並無藥物損失。
圖12.9. mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-半胱胺酸ADC對PC3癌細胞之活體外細胞毒性。mAb-CP2-NNAA AM-MMAE ADC與藉由AM-MMAE之位點特異性半胱胺酸偶聯製得之類似ADC展現類似功效。
CP2-NNAA二烯以類似於半胱胺酸硫氫基之轉化率與AM-MMAE上所含之馬來醯亞胺進行反應。mAb-CP2-NNAA ADC與mAb-半胱胺酸ADC之製備之主要差異在於偶聯製程中之步驟數量有所減少。半胱胺酸mAb之產生需要3個步驟及2天，而CP2-NNAA mAb ADC係在一個步驟中於小於24 h內產生。所得mAb-CP2-NNAA ADC在生理學相關條件下較為穩定且在37℃下於大鼠血清中培育7天時並不展示藥物損失。CP2-NNAA mAb ADC在活體外較為強力，且活性類似於藉由位點特異性半胱胺酸偶聯製得之ADC。
實例 13. 含有環戊二烯及呋喃之化合物之合成。 材料及方法 ： 除非另外陳述，否則在N2 氣氛下使用試劑級溶劑來實施反應。將DCM及甲苯儲存於3Å分子篩中。使THF通過活化氧化鋁管柱上方。所用商業獲得性試劑皆按接收狀態使用。使用E. Merck矽膠60 F254預塗覆板(0.25 mm)實施薄層層析(TLC)且藉由曝光於UV光(254 nm)來觀察或使用對-茴香醛、茚三酮或過錳酸鉀染色。使用正相矽膠(60 Å, 0.040 - 0.063 mm, Geduran)實施急速管柱層析。在Varian光譜儀(400、500或600 MHz)上記錄1 H NMR光譜且相對於氘化溶劑信號進行報告。如下所述來報告1 H NMR光譜之數據：化學位移(δ ppm)、多重性、偶合常數(Hz)及積分。在Varian光譜儀(100、125或150 MHz)上記錄13 C NMR光譜。以化學位移(δ ppm)形式來報告13 C NMR光譜之數據。自UC Santa Barbara質譜設施在具有場去吸附(FD)來源之(Waters Corp.) GCT Premier高解析度飛行時間質譜儀上獲得質譜。
CP3-NHS (13) 之合成
琥珀酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1,2,3,4,5-五甲基環戊-2,4-二烯基)甲基酯(13 )：將DCM (8 mL)添加至含有(1,2,3,4,5-五甲基環戊-2,4-二烯基)甲醇1 (0.33 g, 2.0 mmol, 1當量)之小瓶中。添加Et3 N (0.64 mL, 4.6 mmol, 2.3當量)、DMAP (46 mg, 0.38 mmol, 0.2當量)及琥珀酸酐(0.46 g, 4.6 mmol, 2.3當量)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌過夜。使用H2 O (1 mL)終止反應，然後傾倒至分液漏斗中。添加HCl (1 M, 50 mL)並使用DCM (2 × 50 mL)萃取。合併有機層，使用鹽水(50 mL)洗滌，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，並去除溶劑以產生4-側氧基-4-((1,2,3,4,5-五甲基環戊-2,4-二烯基)甲氧基)丁酸，其直接用於下一反應中。
Rf (EtOAc): 0.24；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 3.98 (s, 2 H), 2.64 - 2.59 (m, 2 H), 2.59 - 2.54 (m, 2 H), 1.76 (s, 6 H), 1.74 (s, 6 H), 0.95 (s, 3 H) ppm。
將THF (10 mL)添加至含有4-側氧基-4-((1,2,3,4,5-五甲基環戊-2,4-二烯基)甲氧基)丁酸(約2 mmol)之小瓶中。添加NHS (0.61 g, 5.3 mmol, 2.7當量)、EDC·HCl (0.87 g, 4.6 mmol, 2.3當量)及DCM (6 mL)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌過夜。去除溶劑且對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 3:1 → 2:1)以產生白色固體形式之7 (0.39 g, 55%，兩個步驟)。
Rf (己烷:EtOAc, 7:3): 0.27；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 4.00 (s, 2 H), 2.89 (t,J = 6.7 Hz, 2 H), 2.85 (br. s., 4 H), 2.67 (t,J = 7.8 Hz, 2 H), 1.77 (s, 6 H), 1.74 (s, 6 H), 0.95 (s, 3 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 170.7, 168.9, 167.6, 138.4, 135.0, 68.2, 55.3, 28.6, 26.2, 25.5, 16.8, 11.0, 10.1 ppm；IR (ATR) 2973, 2935, 1815, 1782, 1729, 1208, 1089, 1069, 967 cm-1 ；C19 H25 NO6 [M]+ 之HRMS (EI)確切質量計算值：363.1682，實驗值：363.1676。
F2-NHS (17) 之合成
9,9-二乙氧基-6-羥基壬-7-炔酸甲酯(14 )：將3,3-二乙氧基丙-1-炔(0.72 mL, 5.0 mmol, 1當量)添加至THF (15 mL)中，然後冷卻至-78℃。逐滴添加nBuLi (2.33 M於己烷中，2.4 mL, 5.5 mmol, 1.1當量)，然後將反應混合物在-78℃下進一步攪拌30 min。逐滴添加溶於THF (5 mL)中之6-側氧基己酸甲酯(0.87 g, 6.0 mmol, 1.2當量)，然後將反應混合物在-78℃下攪拌1 hr。將反應混合物傾倒至含有碳酸氫鈉飽和水溶液(100 mL)之分液漏斗中，然後使用Et2 O (2 × 50 mL)萃取。使用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，藉由MgSO4 乾燥，過濾，去除溶劑，並對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 2:1)以產生澄清及無色油狀物形式之14 (1.1 g, 80%)。
Rf (己烷:EtOAc, 6:4): 0.41；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 5.28 (d,J = 1.6 Hz, 1 H), 4.47 - 4.36 (m,J = 3.5 Hz, 1 H), 3.76 - 3.67 (m, 2 H), 3.67 - 3.63 (m, 3 H), 3.56 (qd,J = 7.0, 9.4 Hz, 2 H), 2.34 - 2.27 (m, 3 H), 1.76 - 1.59 (m, 4 H), 1.54 - 1.42 (m, 2 H), 1.21 (t,J = 7.0 Hz, 6 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 174.0, 91.2, 86.2, 80.0, 61.8, 60.8, 60.8, 51.5, 36.9, 33.8, 24.6, 24.4, 15.0 ppm；IR (ATR) 3451, 2932, 1736, 1437, 1328, 1135, 1051, 1012 cm-1 ；C14 H23 O5 [M-H]+ 之HRMS (EI)確切質量計算值：271.1545，實驗值：271.1546。
5-(3-甲氧基呋喃-2-基)戊酸甲酯(15 )：將MeOH (3.9 mL)添加至含有14 (1.06 g, 3.89 mmol, 1當量)之小瓶中。添加PPh3 AuNTf2 (29 mg, 0.039 mmol, 0.01當量)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌過夜。將反應混合物傾倒至含有鹽水(50 mL)之分液漏斗中，然後使用DCM (2 × 50 mL)萃取。使用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，去除溶劑，並對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 15:1→ 9:1)以產生澄清及無色油狀物形式之15 (0.35 g, 43 %)。
Rf (己烷:EtOAc, 9:1): 0.35；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 7.11 (d,J = 2.0 Hz, 1 H), 6.27 (d,J = 2.0 Hz, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 3.66 (s, 3 H), 2.61 (t,J = 6.8 Hz, 2 H), 2.33 (t,J = 7.2 Hz, 2 H), 1.69 - 1.60 (m, 4 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 174.1, 143.3, 139.2, 138.9, 102.9, 59.4, 51.4, 33.7, 27.5, 24.5, 24.3 ppm；IR (ATR) 2950, 1734, 1662, 1600, 1230, 1179, 1111 cm-1 ；C11 H16 O4 [M]+ 之HRMS (EI)確切質量計算值：212.1049，實驗值：212.1045。
5-(3-甲氧基呋喃-2-基)戊酸(16 )：向含有溶於MeOH (4 mL)中之15 (0.331 g, 1.56 mmol, 1當量)之小瓶中添加NaOH (0.125 g, 3.12 mmol, 2當量)於H2 O (4 mL)中之溶液。在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌30 min。將反應混合物傾倒至含有H2 O (50 mL)之分液漏斗中且添加HCl (1 M於H2 O中)直至pH為2-3 (約4 mL)。使用DCM (2 × 50 mL)萃取水層。使用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，去除溶劑以產生澄清及無色油狀物形式之16 (0.280 g, 90%)。
Rf (己烷:EtOAc, 1:1): 0.55；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 10.37 (br. s., 1 H), 7.12 (d,J = 2.0 Hz, 1 H), 6.28 (d,J = 2.0 Hz, 1 H), 3.73 (s, 3 H), 2.62 (t,J = 6.5 Hz, 2 H), 2.38 (t,J = 6.5 Hz, 2 H), 1.73 - 1.61 (m, 4 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 179.8, 143.4, 139.1, 139.0, 102.9, 59.4, 33.7, 27.4, 24.4, 24.0 ppm；IR (ATR) 3133, 2940, 1706, 1662, 1454, 1411, 1279, 1236, 1109 cm-1 ；C10 H14 O4 [M]+ 之HRMS (EI)確切質量計算值：198.0892，實驗值：198.0890。
5-(3-甲氧基呋喃-2-基)戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(17 )：將THF (5 mL)添加至含有16 (0.265 g, 1.34 mmol, 1當量)之小瓶中。添加NHS (0.216 g, 1.87 mmol, 1.4當量)、EDC·HCl (0.308 g, 1.61 mmol, 1.2當量)及DCM (3 mL)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌過夜。去除溶劑且對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 2:1 →1:1)以產生無色、黏性油狀物形式之17 (0.293 g, 74 %)。
Rf (己烷:EtOAc, 2:1): 0.33；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 7.11 (d,J = 2.0 Hz, 1 H), 6.27 (d,J = 2.0 Hz, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 2.82 (br. s., 4 H), 2.69 - 2.54 (m, 4 H), 1.81 - 1.60 (m, 4 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 169.1, 168.5, 143.5, 139.1, 138.7, 102.8, 59.3, 30.5, 27.0, 25.5, 24.2, 23.8 ppm；IR (ATR) 2948, 1814, 1735, 1638, 1413, 1206, 1058, 1046 cm-1 ；C14 H17 NO6 [M]+ 之HRMS (EI)確切質量計算值：295.1056，實驗值：295.1062。
CP1b-NHS (19) 之合成
3-(環戊-1,3-二烯基)丙酸及3-(環戊-1,4-二烯基)丙酸(12 )：將3-溴丙酸乙酯(1.65 mL, 12.9 mmol, 1當量)添加至THF (30 mL)中並冷卻至-78℃。經5 min逐滴添加環戊二烯化鈉(於THF中之2 M溶液，6.45 mL, 12.9 mmol, 1當量)且將反應液在-78℃下攪拌3.5 hr。將反應液傾倒至DCM (20 mL)中且添加矽膠(6 g)。經由矽膠使用DCM (100 mL)過濾反應混合物並去除溶劑以產生黃色油狀物形式之3-(環戊二烯基)丙酸乙酯異構體。
光譜數據匹配文獻報告數據。3
Rf (己烷:EtOAc, 9:1): 0.45；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 6.47 - 6.02 (m, 3 H), 4.17 - 4.11 (m, 2 H), 2.96 (s, 0.31 H), 2.91 (d,J = 1.4 Hz, 1.69 H), 2.78 - 2.68 (m,J = 1.7 Hz, 2 H), 2.59 - 2.53 (m, 2 H), 1.26 (t,J = 7.1 Hz, 3 H)。
向溶於EtOH (20 mL)中之3-(環戊二烯基)丙酸乙酯異構體(約12.9 mmol)之溶液中添加NaOH (2.0 g, 50 mmol, 3.9當量)於H2 O (20 mL)中之溶液。將反應液在室溫下攪拌15 min。將反應混合物傾倒至含有H2 O (50 mL)及DCM (50 mL)之分液漏斗中。使用HCl (1 M於H2 O中)將水層酸化至 pH 2 (約70 mL)。分離各層，然後使用DCM (50 mL)萃取水層。使用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，藉由Na2 SO4 乾燥，過濾，去除溶劑以產生褐色固體形式之18 (0.50 g, 28%，兩個步驟)。
Rf (己烷:EtOAc, 1:2): 0.69；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 10.57 (br. s., 1 H), 6.49 - 6.02 (m, 3 H), 2.97 (d,J = 1.6 Hz, 1.07 H), 2.92 (d,J = 1.2 Hz, 0.93 H), 2.82 - 2.68 (m, 2 H), 2.68 - 2.58 (m, 2 H) ppm；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 179.7, 179.7, 147.1, 144.9, 134.2, 134.1, 132.3, 131.1, 127.0, 126.4, 43.3, 41.3, 33.9, 33.3, 25.5, 24.7 ppm；IR (ATR) 3070, 2926, 1705, 1412, 1283, 1205, 913 cm-1 ；C8 H10 NO2 [M]+ 之HRMS (EI)確切質量計算值：138.0681，實驗值：138.0678。
3-(環戊-1,3-二烯基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯及3-(環戊-1,4-二烯基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(19 )：將THF (10 mL)添加至含有18 (0.460 g, 3.33 mmol, 1當量)之小瓶中。添加NHS (0.537 g, 4.66 mmol, 1.4當量)、EDC·HCl (0.766 g, 4.00 mmol, 1.2當量)及DCM (6 mL)，在空氣氣氛下封蓋反應液，並在室溫下攪拌過夜。去除溶劑且對殘餘物實施急速管柱層析(己烷:EtOAc, 2:1 → 1:1)以產生蛋殼型粉末形式之19 (0.438 g, 56%)。
Rf (己烷:EtOAc, 2:1): 0.29；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 6.47 - 6.08 (m, 3 H), 2.97 (d,J = 1.2 Hz, 1.2 H), 2.92 (d,J = 1.6 Hz, 0.8 H), 2.90 - 2.75 (m, 8 H)；13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 169.1, 168.2, 168.1, 145.7, 143.9, 134.4, 133.8, 132.2, 131.4, 127.7, 127.1, 43.2, 41.4, 30.8, 30.2, 25.5, 25.3, 24.5；IR (ATR) 2947, 1810, 1779, 1735, 1420, 1366, 1204, 1062, 1046 cm-1 ；C12 H13 NO4 [M]+ 之HRMS (EI)確切質量計算值：235.0845，實驗值：235.0848。
使用Cp*Li及3-溴丙酸乙酯來合成五甲基環戊二烯(CP3) NHS-衍生物之嘗試已失敗，且代之以發生消除而生成丙烯酸乙酯。CP*Li與溴乙酸甲酯之反應係成功的，但在酯水解及再酸化之後，化合物發生意外環化。第三策略使用Boydston (1,2,3,4,5-五甲基環戊-2,4-二烯基)甲醇1 ，該試劑與琥珀酸酐反應產生中間體酸，該中間體酸未經進一步純化即使用。與EDC∙HCl及N -羥基琥珀醯亞胺之反應會產生NHS酯13 。
呋喃(F2) NHS-衍生物之設計及合成係由Sheppard關於3-烷氧基呋喃之工作所啟發。2 將3,3-二乙氧基丙-1-炔之鋰鹽添加至6-側氧基己酸甲酯中以形成醇14 ，使用催化性金(I)在甲醇中環化以產生3-甲氧基呋喃15 。水解15 之酯，然後與EDC∙HCl及N -羥基琥珀醯亞胺反應產生NHS酯17 。
自NaCP與3-溴丙酸乙酯之反應開始來合成不含內部酯之CP1 NHS-衍生物(CP1b)，然後實施酯水解以產生酸12 。與EDC∙HCl及N -羥基琥珀醯亞胺之反應可產生NHS酯19 。CP1與CP1b之間之結構差異展示於圖13.1中。
圖13.1. A)CP1-NHS及B) CP1b-NHS連接體中之酯位置之概述。1. Peterson, G. I.; Church, D. C.; Yakelis, N. A.; Boydston, A. J., 1,2-oxazine linker as a thermal trigger for self-immolative polymers.Polymer 2014, 55 , 5980-5985。 2. Foster, R. W.; Benhamou, L.; Porter, M. J.; Bučar, D.-K.; Hailes, H. C.; Tame, C. J.; Sheppard, T. D., Irreversible endo-Selective Diels-Alder Reactions of Substituted Alkoxyfurans: A General Synthesis of endo-Cantharimides.Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany) 2015, 21 , 6107-6114。 3. Honzíček, J.; Mukhopadhyay, A.; Santos-Silva, T.; Romão, M. J.; Romão, C. C., Ring-Functionalized Molybdenocene Complexes.Organometallics 2009, 28 , 2871-2879。
實例 14. 使用經連接體修飾之抗體製得之 ADC 之評估。 評估藉由AM-MMAE與經連接體修飾之抗體之狄爾斯-阿爾德偶聯所生成ADC之穩定性及功效。將狄爾斯-阿爾德偶聯物與半胱胺酸-偶聯物進行比較。
材料 .表現所有抗體(IgG1形式)並使用標準分子生物學方法純化。除非另有所述，否則所有試劑皆購自商業供應商。呋喃‐2‐基甲基琥珀醯胺酸NHS酯(F1-NHS)及馬來醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對-胺基苄基氧基羰基-單甲基-奧裡斯他汀-E (AM-MMAE)係購自SynChem, Inc. (Elk Grove Village, IL)。
mAb- 連接體偶聯物之製備 ： 藉由上述含有NHS酯之連接體17 及19 (F2及CP1b)與離胺酸胺之反應來將二烯官能基隨機納入抗體中。藉由反應中所使用NHS-連接體之量來控制mAb修飾程度且端視實驗靶向不同連接體密度。用於使用CP1修飾mAb之一般程序闡述如下：首先，使用pH 7.2 PBS將mAb溶液調節至5 mg/mL (3 mL, 15 mg mAb, 100 nmol, 1當量)，隨後添加10% v/v 1 M NaHCO3 。在冰上冷凍此溶液且添加30 µL CP1b-NHS (於DMAc中之10 mM儲備液，300 nmol, 3當量，亦稱為CP1-連接體)。在冰上繼續進行反應5分鐘，隨後在室溫及連續混合下反應1 h。藉由透析(Slide-A-Lyzer, 10 kDa MWCO)在4℃下於PBS (1 mM EDTA, pH 7.4)中純化經反應mAb 24 h。藉由如下文所闡述之完整去醣基化質譜來量化CP1-連接體引入。反應圖14.1 mAb-CP1b-連接體及mAb-F2-連接體偶聯物之製備。
ADC 之製備 ： 自赫賽汀(在靶)或IgG-1同型對照-1 (脫靶) mAb使用經由連接體之狄爾斯-阿爾德偶聯及直接偶聯至抗體半胱胺酸硫醇來製備抗體藥物-偶聯物。自經CP1b-NHS (化合物19 )及F2-NHS (化合物17 )連接體修飾之抗體使用與針對mAb-CP1b-連接體所闡述相同之一般程序如下所述來製備狄爾斯-阿爾德ADC：使用pH 7.4 PBS將mAb-CP1b-連接體(10 mg, 67 nmol, 1當量)稀釋至4.27 mg/mL，隨後添加DMSO (493 μL)及1 M磷酸二氫鈉(247 μL)以分別產生約20%及10%之v/v溶液。將AM-MMAE (53.3 μL於DMSO中之10 mM儲備液，530 nmol, 8當量)添加至抗體溶液中且在室溫及混合下繼續反應4 h。添加N-乙醯基半胱胺酸(43 μL 100 mM水溶液，4.3 μmol, 64當量)淬滅未反應馬來醯亞胺。使用CHT層析自反應混合物純化ADC。使用蒸餾水將ADC溶液稀釋3倍並加載於Bio-Scale Mini柱CHT型II 40 µm介質管柱上。使用自緩衝液A (10 mM磷酸鹽，pH 7.0)至緩衝液B (10 mM磷酸鹽，pH 7.0，含有2M NaCl)之梯度經25分鐘以5 mL/min之流速洗脫ADC。在CHT層析之後，使用slide-a-lyzer盒在4℃下將ADC試樣之緩衝液交換至PBS中。遵循與使用mAb-F2-連接體構築體製得之ADC相同之程序，只是AM-MMAE偶聯反應在室溫下持續24 h。應注意，每一mAb在與AM-MMAE反應之前之二烯含量提供於表14.1中。相對於用於偶聯反應之mAb之8當量AM-MMAE對應於大約2莫耳當量相對於二烯之AM-MMAE。
亦藉由使AM-MMAE偶聯至抗體鉸鏈區中所含之半胱胺酸硫醇來製備ADC。首先，使用含有1 mM EDTA之PBS將抗體(10 mg, 67 nmol, 1當量)溶液調節至2.5 mg/mL。接下來，添加TCEP (10 μL 50 mM水溶液，500 nmol, 7.5當量)以還原鉸鏈二硫化物，且將混合物在37℃及混合下培育1 h。接下來，添加DMSO (410 μL，反應中之最終濃度為10% v/v)且在室溫及混合下繼續反應1 h。添加N-乙醯基半胱胺酸以淬滅未反應馬來醯亞胺基團且藉由CHT層析及透析如上文所闡述來純化ADC。在名稱中使用Cys來表示藉由偶聯至鉸鏈半胱胺酸製得之ADC，例如：赫賽汀-Cys-MMAE。
rRP-HPLC 分析 ： 每一次分析，使用42 mM二硫蘇糖醇(DTT)將抗體及ADC在37℃下於pH 7.2 PBS中還原20分鐘。將10 µg經還原抗體及ADC加載於PLRP-S, 1000Å管柱(2.1 × 50 mm, Agilent)上並在40℃下以0.5 mL/min之流速使用5% B至100% B之梯度經60分鐘(移動相A：於水中之0.1%三氟乙酸，及移動相B：於乙腈中之0.1%三氟乙酸)洗脫。使用來自層析圖之積分峰面積測定偶聯百分比。
粒徑篩析層析分析 ： 使用配備有三級檢測器陣列(Viscotek 301, Viscotek, Houson, TX)之Agilent 1100毛細管LC系統實施SEC分析；將波長設定於280 nm，且在TSK-GEL G3000SWXL管柱(Toso Bioscience LLC, Montgomeryville, PA)上使用100 mM pH 6.8磷酸鈉緩衝液(10%異丙醇)在1 mL/min之流速下運行試樣(50 μg)。
血清穩定性分析 ： 在大鼠血清中培育ADC以展示抗體-有效載荷藥鍵聯之穩定性。將ADC添加至正常大鼠血清(Jackson Immunoresearch)中以達成0.2 mg/mL (1.33 µM抗體)之最終濃度，其中添加至血清中之ADC溶液之總體積小於10%。無菌過濾ADC-血清混合物且自此混合物取出等分試樣並冷凍作為t=0對照。然後將剩餘試樣在37℃下於密封容器中進一步培育7 d。藉由免疫沈澱使用Fc特異性抗人類IgG-瓊脂糖樹脂(Sigma-Aldrich)自大鼠血清回收偶聯及未偶聯人類抗體。使用PBS沖洗樹脂兩次，使用IgG洗脫緩衝液沖洗一次，且然後使用PBS再沖洗兩次。然後組合ADC-小鼠血清試樣與抗人類IgG樹脂(100 µL ADC-血清混合物，50 µL樹脂漿液)並在室溫下混合15分鐘。藉由離心回收樹脂且然後使用PBS洗滌兩次。將經洗滌樹脂再懸浮於100 µL IgG洗脫緩衝液(Thermo Scientific)中並在室溫下進一步培育5分鐘。藉由離心去除樹脂且然後將20 µL 10X glycobuffer 1 (New England Biolabs)添加至上清液中。無菌過濾所回收人類抗體溶液，並與EndoS一起在37℃下培育1 h。然後使用TCEP還原去醣基化mAb並藉由LC/MS如上文所闡述進行分析。自質譜之峰高如實例12中所闡述來測定偶聯抗體百分比。
質譜術分析 ： 如實例1中所闡述來分析試樣。
活體外細胞毒性分析 ：自美國模式培養物保藏所(ATCC)獲得SKBR3及N87癌細胞系。將細胞在37℃、5% CO2 下維持於補充有10%熱滅活胎牛血清(HI-FBS) (Life Technologies)之RPMI 1640培養基(Life Technologies)中。將收穫於指數生長期中之SKBR3及NCI-N87細胞以2500及2000個細胞/孔接種於96孔培養板中並使其黏附過夜。然後在第二天使用ADC以自4000 ng/mL至64,000 ng/mL (9個濃度)之4倍連續稀釋液一式兩份來處理細胞。將經處理細胞培養6天且使用CellTiter-Glo發光存活率分析(Promega)遵循製造商方案來測定細胞存活率。將細胞存活率計算為未處理對照細胞之百分比。使用邏輯非線性回歸分析利用Prism軟體(GraphPad)來測定IC50 值。
活體內腫瘤生長抑制 ： 在小鼠皮下N87異種移植物模型中進一步評估使用經F2及CP1b連接體修飾之mAb製得之赫賽汀-MMAE ADC之活體內抗腫瘤活性。藉由將N87細胞(於50%基質膠中之5百萬個N87細胞)經皮下接種至4-6週齡雌性無胸腺裸小鼠中來製備腫瘤。在腫瘤達到大約200 mm3 時，將小鼠隨機分配成組且每組5隻小鼠。以指示劑量經靜脈內投與ADC且在細胞接種後第5天投用。每週使用測徑器量測腫瘤尺寸(長軸及短軸)兩次。使用以下方程式計算腫瘤體積：其中， a=腫瘤長軸，以mm表示 b =腫瘤短軸，以mm表示
圖14.1. mAb-CP1b-連接體偶聯物之質譜分析。峰上方數字指示偶聯至mAb之連接體(B及E)或AM-MMAE (C及F)之數量。使用EndoS在分析之前將所有試樣去醣基化。
圖14.2. mAb-F2-連接體偶聯物之質譜分析。峰上方數字指示偶聯至mAb之連接體(B及E)或AM-MMAE (C及F)之數量。使用EndoS在分析之前將所有試樣去醣基化。
圖14.3. mAb-半胱胺酸偶聯物之質譜分析。指示(A-D) mAb輕鏈(LC)及重鏈(HC)以及偶聯AM-MMAE之數量(B及D)。使用EndoS將所有試樣去醣基化並在分析之前還原。
圖14.4. mAb、mAb-連接體偶聯物及ADC之rRP-HPLC分析。指示mAb之輕鏈及重鏈，亦指示ADC試樣中偶聯至mAb之AM-MMAE之數量。
圖14.5. mAb、mAb-連接體偶聯物及ADC之SEC分析。指示高分子量物質(HMWS)。
圖14.6. A) ADC在大鼠血清中培育7 d後之還原性去醣基化質譜分析。放大光譜以僅展示重鏈。藥物損失指示為DAR-1及DAR-2物質峰高相對於DAR-0峰高之降低。B)使用質譜數據之剩餘藥物之量化(%)。數據展示為平均值+/-標準偏差，n=3。
圖14.7. ADC對A) NCI-N87細胞及B) SKBR3細胞之活體外活性。
圖14.8. 赫賽汀-連接體MMAE ADC對於小鼠中之皮下N87腫瘤模型之腫瘤生長抑制活性。表14.1連接體-偶聯ADC及半胱胺酸-偶聯ADC之匯總 a 不使用連接體製得之ADC偶聯至天然半胱胺酸 表14.2連接體偶聯ADC及半胱胺酸偶聯ADC之活體外功效。 a 自表14.1中所報告之MS及rRP-HPLC值計算之平均DAR
經由馬來醯亞胺基-MMAE與赫賽汀及IgG同型對照mAb之狄爾斯-阿爾德反應或邁克爾加成來製備ADC。經由交聯劑將狄爾斯-阿爾德反應性基團引入離胺酸胺上，隨後與AM-MMAE進行反應，而使AM-MMAE與天然半胱胺酸硫醇進行邁克爾加成(稱為Cys-ADC)。兩種偶聯方法皆產生具藥物含量為3-4個MMAE藥物/mAb之異質ADC。
AM-MMAE至CP1b-及F2連接體修飾mAb之狄爾斯-阿爾德加成較為有效，且藉由質譜證實接近定量轉化。另外，使用環戊二烯或甲氧基-呋喃連接體修飾mAb且隨後藉由狄爾斯-阿爾德反應附接AM-MMAE並不增加偶聯產物中之聚集物含量，如藉由SEC分析所指示。總而言之，藉由狄爾斯-阿爾德偶聯產生之ADC具有高品質。
大鼠血清中之ADC穩定性之質譜分析證實，使用mAb-CP1b-連接體及mAb-F2-連接製得之狄爾斯-阿爾德構築體體之穩定性大於藉由至半胱胺酸硫醇之邁克爾加成生成之構築體。在37℃下於大鼠血清中培育7天使得mAb-半胱胺酸ADC損失60%之藥物，而mAb-CP1b-連接體ADC及mAb-F2-連接體ADC在相同條件下展示小於10%之藥物損失。
赫賽汀mAb-CP1b-連接體ADC及赫賽汀mAb-F2-連接體ADC係Her2陽性N87及SKBR3細胞系之細胞增殖之強力抑制劑，其中IC50 值類似於相應半胱胺酸連接之ADC。非靶向同型對照ADC之功效小於在靶赫賽汀構築體2000-4000倍，且使用狄爾斯-阿爾德及半胱胺酸ADC構築體觀察到類似活體外功效。最後，使用經CP1b及F2連接體修飾之mAb製得之赫賽汀ADC係腫瘤生長之活體內強力抑制劑。在3 mg/kg ADC劑量下於N87皮下腫瘤模型中觀察到完全腫瘤停滯30天。此結果證實，藉由狄爾斯-阿爾德反應產生之ADC在活體內足夠穩定以誘發治療效應。
實例 15. 水性緩衝液及有機溶劑中之狄爾斯 - 阿爾德反應速率常數之對比 。 測定有機條件中之小分子二烯-馬來醯亞胺反應動力學以與水性條件中之基於抗體之反應進行比較。針對以下物質測定連接體修飾mAb上之二烯與馬來醯亞胺之間之反應速率常數：mAb-CP1b-連接體、mAb-CP2-連接體、mAb-CP3-連接體及mAb-F2-連接體。
有機溶劑中之二烯- 馬來醯亞胺反應速率之測定 ： 在NMR管(每一最終濃度為0.01 M)中組合二烯及於CDCl3 中之N -乙基馬來醯亞胺並藉由1 H NMR在室溫下進行監測。使用N -乙基馬來醯亞胺之乙基峰(3.59或1.20 ppm)及DA-偶聯物之乙基峰(通常4.40或1.05 ppm)之積分來計算起始材料之濃度[A]。[A] = 0.01 M * (起始材料之積分) / (起始材料 +產物之積分)
將倒數濃度(1 / [A])針對時間(s)繪圖。自最佳擬合線獲得二階反應速率(M-1 s-1 )。使用三個實驗之平均速率及標準偏差。
mAb- 連接體偶聯物之製備 ： 藉由含有NHS酯之連接體CP1b-連接體(化合物19)、CP2-連接體(化合物12)、CP3-連接體(化合物13)及F2-連接體(化合物17) (闡述於實例9及實例14中)之反應將二烯官能基隨機納入抗體中。CP3-NHS與mAb之反應展示於反應圖15.1中。藉由反應中所使用NHS-連接體之量來控制mAb修飾程度且端視實驗靶向不同連接體密度。藉由完整去醣基化質譜如實例1中所闡述來測定每一mAb中之連接體(及由此二烯)之數量。反應圖15.1. mAb-CP3-連接體之製備。
經連接體修飾之mAb 與馬來醯亞胺基-MMAE 之反應 ： 使經連接體修飾之mAb中所含之二烯反應與1莫耳當量AM-MMAE (二烯:馬來醯亞胺)在水性緩衝液中如實例10中所闡述進行反應。
mAb- 連接體二烯- 馬來醯亞胺反應速率常數之計算 ： 自去醣基化還原性質譜中之峰強度如實例10中所闡述來測定馬來醯亞胺基-MMAE與mAb-連接體中之二烯之反應的二階速率常數。對於一種試樣而言，如實例4中所闡述僅分析重鏈峰。表15.1 AM-MMAE與經二烯連接體修飾之mAb在水性緩衝液中及N-乙基馬來醯亞胺與二烯連接體在CDCl3 中之反應速率之匯總。 a)所有偶聯反應皆係在補充有100 mM磷酸二氫鈉、20% DMSO之pH 5.5 PBS中實施。 b)所有反應皆係使用1當量AM-MMAE (相對於二烯)來實施。所有反應之mAb濃度皆為1.3 mg/mL ± 0.35 mg/mL。 c)所有反應皆係在室溫下於CDCl3 中使用二烯-連接體(0.01 M)及N -乙基馬來醯亞胺(0.01 M)來實施。 d)自未反應mAb-連接體峰(去醣基化及還原性質譜分析)之濃度計算k2 (H2 O)。分析重鏈及輕鏈。 e)自1 H NMR光譜中之診斷峰之積分計算k2 (CDCl3 )。該等值係3個運行之平均值及標準偏差。 f)使用CP1b連接體。 g) ND，未測定。 h)僅分析重鏈。
馬來醯亞胺化合物及二烯化合物在抗體/水性條件及小分子/有機溶劑條件中之反應速率常數之對比證實，此反應在生物偶聯應用中具有若干關鍵特徵。首先，未修飾呋喃之反應性不足以在典型生物偶聯條件下使馬來醯亞胺化合物偶聯至抗體。此可藉由缺乏AM-MMAE與IgG-呋喃之偶聯來予以證實，該偶聯在20 h之後展示最小反應且亦與其他二烯相比其與馬來醯亞胺在有機條件中之反應之速率常數降低約100-1000倍。第二，可證實，水性條件中之狄爾斯-阿爾德反應在抗體偶聯之背景中有所加速。反應加速度對於此化學用於產生生物偶聯物之實際應用至關重要，僅考慮有機條件速率常數將使得狄爾斯-阿爾德反應對本文所闡述之所有二烯並無吸引力。舉例而言，CP1-連接體中所含之環戊二烯在與馬來醯亞胺(AM-MMAE)之基於抗體之水性反應展現大約10分鐘的反應半衰期，而相應有機相反應將需要3.6天。最後，結果顯示，可調整二烯反應性，其中修飾化學結構可增加或降低與親二烯物之反應速率。總而言之，環戊二烯及經修飾呋喃官能基適用於抗體及馬來醯亞胺基化合物在溫和條件下於約1-2 mg/mL範圍內之抗體濃度下之有效生物偶聯反應，而簡單之未修飾呋喃則不適用。
實例 15. 使用 1C1-K274CP1 NNAA mAb 及 AZ1508 藥物 - 連接體來產生 ADC 評價使用納入抗體之位置K274中之CP1-NNAA與AZ1508藥物-連接體來製備ADC之可行性。
抗體生成. 使用實例6中所闡述之方法將CP1-NNAA納入1C1抗體中。
1C1 K274CP1-mAb 與AZ1508 之偶聯 ： 使用PBS (0.133 mL)將K274CP1 NNAA-mAb (0.4 mg, 2.7 nmol, 1當量)調節至3 mg/mL。添加DMSO (27 μL)及1 M磷酸二氫鈉(13 μL)以分別產生約20% v/v及10% v/v之溶液。將AZ1508 (5 μL於DMSO中之10 mM儲備液，13 nmol, 5當量)添加至1C1 K274CP1-mAb溶液中且將混合物短暫渦旋。在室溫及連續混合下繼續進行反應17 h。添加N-乙醯基半胱胺酸(1.1 μL，100 mM, 108 nmol, 40當量)且將溶液再培育15 min以淬滅未反應馬來醯亞胺基團。然後使用水將試樣稀釋3倍並使用CHT層析純化。隨後藉由還原性質譜及SEC如實例6及12中所闡述來分析試樣。反應圖15.1. A) K274CP1-NNAA mAb與AZ1508之反應。B) AZ1508之結構。
1C1 K274CP1-NNAA ADC 之表徵 ：藉由還原性質譜及SEC如實例6及12中所闡述來分析試樣。如實例12中所闡述分析PC3細胞中之活體外活性。
圖15.1. 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC之SDS-PAGE分析。A)未還原，B)還原。
圖15.2. 1C1 K274CP1-NNAA mAb AZ1508偶聯產物之還原性醣基化質譜分析。A)未反應mAb，B) AZ1508反應產物。放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。
圖15.3. 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC之SEC分析，其指示獲得高單體產物。指示高分子量固體(HMWS)。表15.1 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC性質之匯總a,b,c a 所有偶聯反應皆係在pH 5.5、20% DMSO、22℃及3 mg/mL 1C1 K274CP1-NNAA mAb下實施。將CP1-NNAA納入位置K274中以代替離胺酸b 所用之AZ1508:CP1二烯莫耳比率為2.5:1c 自還原性質譜之峰強度進行計算d DAR=藥物對抗體比e 在EphA2受體陽性PC3細胞中測定
證實CP1-NNAA二烯在納入1C1抗體之位置K274後對AZ1508之反應性。ADC產物具有高品質，且具有＞95%之偶聯及極少聚集物。所得ADC對受體陽性PC3細胞具有活性。
實例 16. 使用 1C1 S239CP2-NNAA 、 1C1 K274CP2-NNAA 及 1C1 N297CP2-NNAA 抗體與 AZ1508 藥物 - 連接體生成 ADC 且與類似半胱胺酸連接之位點特異性 AZ1508 ADC 進行比較。 使用藉由在表現質體中使天然胺基酸密碼子突變至琥珀終止密碼子而在位置S239、K274及N297納入CP2-NNAA之1C1抗體來製備具有AZ1508藥物-連接體之ADC。將CP2-NNAA納入單獨抗體之每一位置中。
抗體生成 ： 將CP2-NNAA納入1C1抗體中並使用實例6中所闡述之方法進行表現。藉由定點誘變使用標準分子生物學技術來將半胱胺酸納入1C1抗體中。
1C1 CP2-NNAA mAb 與AZ1508 之偶聯 ： 針對所有三種CP2-NNAA抗體構築體使用實例12中所闡述之程序實施相同偶聯方法，唯一區別在於使用AZ1508代替AM-MMAE。應注意，藉由簡單混合AZ1508與CP2-NNAA mAb且隨後混合來達成藥物-連接體偶聯。反應圖16.1. A) CP2-NNAA mAb與AZ1508之反應。AZ1508之結構可參見反應圖15.1。
1C1 半胱胺酸改造mAb 與AZ1508 之偶聯。 使用實例12中所闡述之相同方法來製備位點特異性半胱胺酸連接之AZ1508 ADC，唯一區別在於使用AZ1508代替AM-MMAE。應注意，必須還原半胱胺酸-mAb，透析，並在添加AZ1508之前氧化。
1C1 CP2-NNAA ADC 及1C1 半胱胺酸改造之ADC 之表徵 。藉由SDS-PAGE、還原性質譜、HIC、rRP-HPLC及SEC如實例6及12中所闡述來分析試樣。如實例12中所闡述分析經培養PC3細胞中之活體外活性。
圖16.1. 1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC及1C1半胱胺酸AZ1508 ADC之SDS-PAGE分析。A)未還原試樣，B)還原試樣。
圖16.2. 1C1 S239CP2-NNAA AZ1508 ADC之分析。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。
圖16.3. 1C1 K274CP2-NNAA AZ1508 ADC之分析。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。
圖16.4. 1C1 N297CP2-NNAA AZ1508 ADC之分析。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。
圖16.5. 1C1 S239C AZ1508 ADC之分析。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。
圖16.6. 1C1 K274C AZ1508 ADC之分析。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。
圖16.7. 1C1 N297C AZ1508 ADC之分析。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。表16.1 1C1 CP2-NNAA及半胱胺酸mAb ADC之匯總a,b a 所有CP2 NNAA偶聯反應皆係在pH 5.5、20% DMSO、22℃及3 mg/mL mAb下實施。b 所用之AZ1508:CP2莫耳比率為2.5:1c 藉由SEC跡線中之峰面積測得d DAR=藥物對抗體比ｅ 自還原性質譜之峰強度進行計算f 在分析完整ADC後藉由峰面積測得g 藉由還原性質譜測得h 在EphA2受體陽性PC3細胞中測得。
將CP2-NNAA納入1C1抗體之三個位置中且證實對AZ1508之反應性。應注意，將CP2-NNAA納入單獨抗體之每一位置中。使用CP2-NNAA mAb製得之ADC具有高品質，其具有＞95%之偶聯及極少聚集物。所得CP2-NNAA AZ1508 ADC對受體陽性PC3細胞具有活性。
CP2-NNAA ADC與相應半胱胺酸改造抗體之對比揭示，位置N297適用於CP2-NNAA突變，但不適用於半胱胺酸突變。在偶聯程序期間在此位置引入半胱胺酸會產生二硫化物錯配，如藉由SDS-PAGE結果所證實。在N297CP2-NNAA ADC中觀察到並無二硫化物錯配。此可證實，可經CP2-NNAA引入不適用於半胱胺酸納入之位置中，其中半胱胺酸可影響抗體框架中之天然二硫化物。
實例 17.CP1-NNAA 及 CP2-NNAA AZ1508 ADC 在小鼠及大鼠血清中之穩定性 評估藉由狄爾斯-阿爾德偶聯製得之AZ1508 ADC之血清穩定性。針對抗體與有效載荷藥(亦即狄爾斯-阿爾德加合物)之間之化學鍵來評價ADC穩定性。亦呈現類似半胱胺酸連接之(硫基琥珀醯亞胺) ADC之穩定性於用於對比。
方法 ：將1C1 AZ1508 ADC在37℃下以小鼠血清或大鼠血清中離體培育7 d，藉由免疫捕獲回收，並藉由質譜如實例7中所闡述進行分析。藉由質譜中之峰高如實例7中所闡述來測定偶聯抗體及未偶聯抗體之相對量。在小鼠血清培育試樣中，觀察到AZ1508之去乙醯化。去乙醯化AZ1508可視為用於計算DAR之偶聯物質。
圖17.1. 1C1 CP2-NNAA ADC及1C1半胱胺酸-AZ1508 ADC在大鼠血清中培育之前及之後之代表性還原性醣基化質譜。天然胺基酸突變至CP2-NNAA或半胱胺酸，如在(A)位置S239、(B)位置K274、(C)位置N297所指示。指示未偶聯物質及偶聯物質。
圖17.2. 在37℃下於大鼠血清中培育7 d之後附接至CP2-NNAA或半胱胺酸改造抗體之剩餘AZ1508之量化。自還原性醣基化質譜計算藥物:抗體比(DAR)。數據代表平均值±標準偏差，n=3。
圖17.3. 在37℃下於小鼠血清中培育7 d之後附接至CP2-NNAA或半胱胺酸改造抗體之剩餘AZ1508之量化。自還原性醣基化質譜計算藥物:抗體比(DAR)。去乙醯化AZ1508可視為用於分析之偶聯物質。數據代表平均值±標準偏差，n=3。
圖17.4. 在37℃下於大鼠血清中培育7 d之後附接至CP1-NNAA抗體之剩餘AZ1508之量化。自還原性醣基化質譜計算藥物:抗體比(DAR)。數據代表平均值±標準偏差，n=3。
1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC在37℃下於大鼠或小鼠血清中培育7 d後之分析證實，狄爾斯-阿爾德加合物較為穩定，此乃因觀察到並無藥物損失。在位置K274製得之1C1 CP1-NNAA AZ1508亦展示在37℃下於大鼠血清中培育7 d之後並無藥物損失，然而，使用經受相同條件之類似半胱胺酸連接之ADC觀察到顯著藥物損失。半胱胺酸連接之ADC穩定性具有位置依賴性，其中在位置S239較為穩定且在位置K274及N297並不穩定。在半胱胺酸連接之ADC之情形下，AZ1508經由硫基琥珀醯亞胺鍵聯偶合至抗體，該物質可發生逆向邁克爾去偶聯反應，從而損失藥物。此過程對暴露位置之影響大於埋入位置，因此，針對半胱胺酸連接之ADC觀察到位置依賴性穩定性。另一方面，對於CP1及CP2二烯而言，狄爾斯-阿爾德加合物在對於硫基琥珀醯亞胺而言不穩定位置處係穩定的。因此，狄爾斯-阿爾德偶聯至環戊二烯NNAA代表在偶聯穩定性方面優於基於硫醇之偶聯策略之優點。
實例 18. 含有 CP1-NNAA 或 CP2-NNAA 之 1C1 mAb 與 AZ1508 之反應動力學。 在納入1C1抗體框架中之位置S239、K274或N297中後評估二烯NNAA之反應性。
方法 ： 使1C1 CP1-NNAA或CP2-NNAA抗體(3 mg, 1.3 mg/mL mAb, 17.4 µM二烯，1當量)與AZ1508 (4 µL於DMSO中之10 mM儲備液，40 nmol, 1當量)在22℃下於0.1 M磷酸鈉、0.15 M NaCl、20% DMSO (pH 5.5)中進行反應。在預定時間點自反應混合物取出等分試樣(100 µL)且添加N-乙醯基半胱胺酸(3 µL，100 mM，於水中，8當量)，隨後在室溫下培育15分鐘以淬滅未反應馬來醯亞胺。然後使用PD Spintrap G-25裝置(GE Healthcare Life Sciences)純化試樣以自混合物去除小分子組分且隨後藉由還原性醣基化質譜進行分析。質譜分析程序及動力學常數計算闡述於實例5及10中。
圖18.1. 藉由還原性醣基化質譜量測之1C1 CP1-NNAA及1C1 CP2-NNAA mAb與AZ1508之偶聯動力學。數據繪示為平均值±絕對誤差(n=2，對於1C1 K274CP1-NNAA、1C1 K274CP2-NNAA及1C1 N297CP2-NNAA)及平均值±標準偏差(n=3，對於1C1 S239CP2-NNAA)。
圖18.2. 濃度倒數繪圖，該繪圖展示在CP1-NNAA及CP2-NNAA mAb與AZ1508發生反應時之二烯消耗。(A) 1C1 K274CP1-NNAA，(B) 1C1 S239CP2、1C1 K274CP2-NNAA及N297CP2-NNAA mAb。數據繪示為平均值±絕對誤差(n=2，對於1C1 K274CP1-NNAA、1C1 K274CP2-NNAA及1C1 N297CP2-NNAA)及平均值±標準偏差(n=3，對於1C1 S239CP2-NNAA)。表 18.1. 1C1 CP1-NNAA及CP2-NNAA mAb與AZ1508之反應之動力學數據匯總。a,b,c a 所有偶聯反應皆係在補充有100 mM磷酸二氫鈉、20% DMSO之pH 5.5 PBS中實施。b 所用之AZ1508:CP1-NNAA或CP2-NNAA二烯莫耳比率為1:1。所有反應之mAb濃度皆為1.3 mg/mL (17.3 µM二烯)。c 藉由還原性醣基化質譜監測二烯反應。d 自二烯濃度(M)倒數對時間(s)繪圖之最佳擬合線測得。e 使用實例5及10中所展示之半衰期方程式計算。
使具有CP1-NNAA或CP2-NNAA之抗體與含有馬來醯亞胺之藥物-連接體AZ1508在1:1莫耳當量之二烯:馬來醯亞胺下進行反應。CP1-NNAA mAb之反應半衰期為12分鐘且CP2-NNAA mAb為3-10小時。在48 h量測期之後達成之最終轉化率介於87%-100%之間。
實例 19. 使用 CP2-NNAA mAb 及 AZ1508 製得之 ADC 之抗腫瘤活性。 評估使用1C1 CP2-NNAA及AZ1508藥物-連接體製得之ADC抑制小鼠中PC3異種移植物之腫瘤生長之能力。
ADC 製備 ： 使用1C1 mAb如實例16中所闡述來製備ADC。使用同型對照抗體製備非EphA2結合性ADC (稱為R347)。將CP2-NNAA納入位置S239及N297中(對於1C1 mAb)及位置S239中(對於R347 mAb)。
活體內方法 ：在Charles River Discovery Services North Carolina (CR Discovery Services)根據實驗室動物護理與使用導則(Guide for Care and Use of Laboratory Animals )關於約束、飼養、手術程序、進料及流體調控以及獸醫護理之推薦來實施腫瘤生長抑制研究。藉由將PC3細胞(於50%基質膠中之10百萬個細胞)經皮下接種至8-9週齡雌性無胸腺裸小鼠中而在小鼠中確立PC3異種移植物腫瘤模型。17天後(指定為研究之第1天)，腫瘤體積達到約150-200 mm3 且將小鼠隨機分配成組，每組8隻小鼠。在研究之第1天，開始投藥且以3 mg/kg經由尾部靜脈注射來投與ADC。每週一次以3 mg/kg在三個週內投用ADC且總共投與三個劑量。隨後每週兩次使用測徑器量測腫瘤尺寸(長軸及短軸)。使用實例14中之方程式來計算腫瘤體積。
圖19.1. 在投與CP2-NNAA AZ1508 ADC後小鼠中之PC3異種移植物之腫瘤生長抑制。使用納入位置S239或N297之CP2-NNAA來製備在靶1C1 mAb ADC，而使用納入位置S239之CP2來製備非靶向同型對照R347 mAb ADC。以3 mg/kg在第0、7及14天經靜脈內投用ADC (使用箭頭指示)。數據表示為平均值±標準偏差，N=8。
在首次注射ADC後，1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC可有效抑制小鼠中之EphA2陽性PC3異種移植物模型中之腫瘤生長至少60天。使用非結合性R347 mAb製得之脫靶ADC之功效小於在靶ADC。
實例 20.CP1-NNAA 抗體與馬來醯亞胺官能化奈米顆粒之偶聯。 使1C1 K274CP1-NNAA抗體與60 nm馬來醯亞胺官能化金奈米顆粒進行反應。
方法 ： 自商業套組(Sigma Aldrich，目錄號9009465)根據製造商說明書來製備馬來醯亞胺官能化60 nm金奈米顆粒。首先，將經凍乾馬來醯亞胺官能化金奈米顆粒產物再懸浮於套組中所提供之100 µL反應緩衝液中。接下來，以0.5 mg/mL在PBS中製備野生型(WT)或K274CP1-NNAA 1C1抗體之溶液。組合奈米顆粒溶液(10 µL)及抗體溶液(10 µL)並藉由上下吸取來混合數次。在25℃下繼續偶聯反應2 h，隨後使用Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK)進行光散射分析。一式三份實施每一偶聯反應。反應圖20.1. 1C1 K274CP1-NNAA mAb與馬來醯亞胺官能化金奈米顆粒之反應。
圖20.1. 60 nm馬來醯亞胺官能化金奈米顆粒在25℃下與1C1野生型(WT)或1C1 K274CP1-NNAA抗體(CP1-NNAA mAb)一起培育2 h之前及之後之動態光散射分析(DLS)。表1.奈米顆粒及奈米顆粒-mAb偶聯物之光散射數據之匯總。 a) 每一反應試樣代表獨立實驗。 b) 將大小報告為以奈米表示之數量平均直徑。
納入CP1-NNAA之抗體經由狄爾斯-阿爾德反應偶聯至馬來醯亞胺官能化奈米顆粒。
圖 1.1 . 展示在mAb與呋喃-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。圖 1.2. 展示在與MMAE反應20 h之後mAb-呋喃-連接體試樣之還原性去醣基化質譜。圖 1.3. 展示mAb-呋喃-連接體alloc離胺酸反應產物之還原性去醣基化質譜分析。圖 2.1. 實例2中所闡述之環戊二烯交聯劑(A)及環戊二烯NNAA (B)之一般設計。圖 3.1. 展示在mAb與CP1-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。圖 3.2. 展示mAb-CP1-連接體馬來醯亞胺基MMAE反應產物之還原性醣基化質譜，其放大展示重及輕mAb鏈。圖 3.3. 展示mAb-CP1-連接體馬來醯亞胺基MMAE反應產物之還原性去醣基化質譜，其放大展示mAb重鏈區。圖 3.4. 展示mAb-CP1-連接體alloc離胺酸反應產物之還原性去醣基化質譜分析，其指示並不發生偶聯。圖 4.1. 展示在mAb與CP1-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。圖 4.2. 展示未修飾mAb、mAb-CP1-連接體(在圖內表示為mAb-CP1)及與AM-MMAE反應之mAb-CP1-連接體(在圖內表示為mAb-CP1 AM-MMAE)在15 min及2.5 h時之還原性去醣基化質譜。圖 4.3. mAb-CP1-連接體與馬來醯亞胺基-MMAE之反應。自還原性去醣基化質譜之峰強度測定未反應CP1二烯。圖 5.1. 展示在mAb與CP1-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。圖 5.2. 展示未修飾mAb、經CP-1修飾之mAb及與PM-MMAE反應之CP1-mAb-連接體在5 min及150 min時之還原性去醣基化質譜。圖 5.3. 展示mAb-CP1-連接體與馬來醯亞胺基-MMAE之反應。A)未反應CP1二烯隨時間之莫耳濃度。自還原性去醣基化質譜之峰強度測定每mAb之未反應CP1二烯。B)用於計算反應速率之濃度倒數圖。圖 6.1. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb在表現於包括突變體或wt TRS之哺乳動物細胞中之後之效價。培養基中之CP1-NNAA最終濃度及供給時間有所變化，如x軸上所指示。圖 6.2. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb之還原性醣基化質譜分析。A)展示mAb輕鏈(LC)及重鏈(HC)之質量範圍。B)僅展示mAb重鏈之放大光譜。圖 6.3. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb之SEC分析，其指示獲得單體產物。指示高分子量固體(HMWS)。圖 6.4. 展示1C1 K274CP1-NNAA mAb之SDS-PAGE分析。圖 6.5. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb-MMAE偶聯產物之還原性去醣基化質譜分析。圖 6.6. 展示1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE偶聯產物之還原性醣基化質譜分析。圖 6.7. 展示CP1-NNAA及化合物異構體(其以1:1比率存在)之化學結構。圖 6.8. 展示化合物50之化學結構，該化合物係文獻中所闡述之CP1-NNAA之呋喃類似物。使用此化合物作為使用12G3H11 mAb之表現研究之對照。圖 6.9. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb-MMAE偶聯產物之還原性去醣基化質譜分析。A)未反應抗體，B) AM-MMAE反應產物，C) PM-MMAE反應產物。放大光譜以展示抗體之重鏈及輕鏈。圖 6.10. 展示1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE偶聯產物之還原性醣基化質譜分析。A)未反應抗體，B) AM-MMAE反應產物。放大光譜以展示抗體之重鏈及輕鏈亦及高分子量物質。圖 7.1. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC之大鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於大鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯。圖 7.2. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC之大鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於大鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯，然而，在苯基乙醯胺基團處觀察到連接體裂解。裂解產物之闡述可參見附錄7。圖 7.3. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC之小鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於小鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯，然而，在val-cit二肽處觀察到接近完全之連接體裂解。裂解產物之闡述可參見附錄7。 圖7.4. 展示12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC之小鼠血清穩定性。將ADC在37℃下於小鼠血清中培育7天並在還原性質譜分析之前藉由免疫捕獲進行回收。放大光譜以展示重鏈(HC)質量區中之細節。未觀察到顯著去偶聯，然而，觀察到幾乎完全之連接體裂解。裂解產物之闡述可參見附錄7。圖 7.5. 展示MMAE有效載荷藥之化學結構及其分子量。圖 7.6. 展示在小鼠血清中培育ADC後觀察到之主要裂解產物之化學結構。A)及B)分別展示AM-MMAE及PM-MMAE偶聯物保留於抗體上之物質(未展示CP1-馬來醯亞胺鍵聯)。C)展示在val-cit二肽裂解之後釋放之物質。圖 7.7. 展示在大鼠血清培育後PM-MMAE裂解產物之化學結構。A)保留於抗體上之物質及B)所釋放物質。圖 8.1. 實例8中所闡述之螺環戊二烯交聯劑(A)及螺環戊二烯NNAA (B)之一般設計。圖 9.1. 展示在與CP2-NHS之反應之前(A)及之後(B)之完整去醣基化質譜。(B)中之峰下方數字指示引入mAb中之CP2-連接體基團之數量。藉由峰強度來估計CP2-連接體引入得出每一mAb具有3.29個CP2-連接體。圖 9.2. 展示在與AM-MMAE及PM-MMAE反應之前及之後mAb-CP2-連接體之還原性去醣基化質譜分析。放大光譜以展示重鏈及輕鏈。圖 9.3. 展示mAb-CP2-連接體馬來醯亞胺基MMAE反應產物之還原性去醣基化質譜。放大光譜以展示抗體重鏈。圖 10.1. 展示mAb-CP2-連接體及與AM-MMAE反應之mAb-CP2-連接體在4 h及48 h時之還原性去醣基化質譜。放大光譜以僅展示重鏈。圖 10.2. 展示mAb-CP2-連接體及與PM-MMAE反應之mAb-CP2-連接體在4 h及48 h時之還原性去醣基化質譜。放大光譜以僅展示重鏈。圖 10.3. 展示mAb-CP2-連接體與馬來醯亞胺基-MMAE之反應。A)未反應CP2二烯隨時間之莫耳濃度。自還原性去醣基化質譜之峰強度測定每mAb之未反應CP2二烯。B)用於計算反應速率之濃度倒數圖。圖 11.1. 展示12G3H11 K274CP2-NNAA mAb在表現於包括突變體或野生型tRS之哺乳動物細胞中之後之效價及細胞存活率。圖 11.2. 展示1C1 K274CP2-NNAA mAb之去醣基化質譜。圖 11.3. 展示1C1 S239CP2-NNAA mAb之去醣基化質譜分析。圖 11.4. 展示1C1野生型mAb之去醣基化質譜分析。圖 11.5. 展示1C1 K274CP2-NNAA mAb之SEC分析，其指示獲得單體產物。圖 11.6. 展示1C1 S239CP2-NNAA mAb之SEC分析，其指示獲得單體產物。圖 11.7. 展示1C1-K274CP2-NNAA mAb及1C1-S239CP2-NNAA mAb之SDS-PAGE分析。圖 12.1. 展示用於生成mAb-CP2-NNAA ADC及239C-mAb ADC之一般反應圖。圖 12.2. 展示mAb-CP2-NNAA及mAb-半胱胺酸分子在與AM-MMAE反應之前及之後之還原性醣基化質譜分析。放大光譜以展示mAb重鏈。圖 12.3. 展示mAb-CP2-NNAA及mAb-半胱胺酸分子在與AM-MMAE反應之前及之後之還原性醣基化質譜分析。放大光譜以展示mAb輕鏈。圖 12.4. 展示mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-半胱胺酸ADC之疏水性相互作用層析分析。圖 12.5. 展示mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-半胱胺酸ADC之還原性反相高效層析分析。圖 12.6. 展示mAb-CP2-NNAA ADC及mAb-半胱胺酸ADC之還原性SDS-PAGE分析。圖 12.7. 展示mAb-CP2-NNAA ADC在37℃下於大鼠血清中培育7天之前及之後之還原性去醣基化質譜分析。放大質譜以僅展示重鏈(HC)。圖 12.8. 展示mAb-CP2-NNAA ADC DAR在37℃下於大鼠血清中培育7 d之前及之後之量化。自圖12.7中所展示質譜之峰高來計算DAR。將值報告為平均值±標準偏差，n=3。圖 12.9. 展示mAb-CP2-NNAA及mAb-半胱胺酸ADC針對PC3癌細胞之活體外細胞毒性。圖 13.1. 展示A)CP1-NHS及B) CP1b-NHS連接體中之酯位置。圖 14.1. 展示mAb-CP1b偶聯物之質譜分析。峰上方數字指示偶聯至mAb之連接體(B及E)或AM-MMAE (C及F)之數量。使用EndoS在分析之前將所有試樣去醣基化。圖 14.2. 展示mAb-F2偶聯物之質譜分析。峰上方數字指示偶聯至mAb之連接體(B及E)或AM-MMAE (C及F)之數量。使用EndoS在分析之前將所有試樣去醣基化。圖 14.3. 展示mAb-半胱胺酸偶聯物之質譜分析。指示(A-D) mAb輕鏈(LC)及重鏈(HC)以及偶聯MMAE之數量(B及D)。使用EndoS將所有試樣去醣基化並在分析之前還原。圖 14.4. 展示mAb、mAb-連接體偶聯物及ADC之rRP-HPLC分析。指示mAb之輕鏈及重鏈，亦指示ADC試樣中偶聯至mAb之MMAE之數量。圖 14.5. 展示mAb、mAb-連接體偶聯物及ADC之SEC分析。指示高分子量物質(HMWS)。圖 14.6. 展示在大鼠血清中培育7 d後保留於ADC上之藥物。圖 14.7. 展示ADC對於受體陽性A) NCI-N87細胞及B) SKBR3細胞之活體外活性。圖 14.8. 展示赫賽汀(Herceptin)-連接體ADC對於小鼠中之皮下N87異種移植物腫瘤模型之抗腫瘤活性。圖 15.1. 展示1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC之SDS-PAGE分析。A)未還原，B)還原。圖 15.2. 展示1C1 K274CP1-NNAA mAb AZ1508偶聯產物之還原性醣基化質譜分析。A)未反應mAb，B) AZ1508反應產物。放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。圖 15.3. 展示1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC之SEC分析，其指示獲得高單體產物。指示高分子量固體(HMWS)。圖 16.1. 展示1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC及1C1半胱胺酸AZ1508 ADC之SDS-PAGE分析。A)未還原試樣，B)還原試樣。圖 16.2. 展示1C1 S239CP2-NNAA AZ1508 ADC之分析的分析數據。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。圖 16.3. 展示1C1 K274CP2-NNAA AZ1508 ADC之分析的分析數據。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。圖 16.4. 展示1C1 N297CP2-NNAA AZ1508 ADC之分析的分析數據。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。圖 16.5. 展示1C1 S239C AZ1508 ADC之分析的分析數據。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。圖 16.6. 展示1C1 K274C AZ1508 ADC之分析的分析數據。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。圖 16.7. 展示1C1 N297C AZ1508 ADC之分析的分析數據。A)未反應mAb之還原性醣基化質譜分析。B) AZ1508反應產物之還原性醣基化質譜分析。C)未反應抗體及AZ1508偶聯產物之HIC分析，D) AZ1508反應產物之SEC分析。在(A)及(B)中，放大光譜以展示抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)。圖 17.1. 展示1C1 CP2-NNAA ADC及1C1半胱胺酸-AZ1508 ADC在大鼠血清中培育之前及之後之代表性還原性醣基化質譜。(A)位置S239，(B)位置K274，(C)位置N297。指示未偶聯物質及偶聯物質。圖 17.2. 展示在37℃下於大鼠血清中培育7 d之後附接至CP2-NNAA或半胱胺酸改造抗體之剩餘AZ1508之量化。自還原性醣基化質譜計算藥物:抗體比(DAR)。數據代表平均值±標準偏差，n=3。圖 17.3. 展示在37℃下於小鼠血清中培育7 d之後附接至CP2-NNAA或半胱胺酸改造抗體之剩餘AZ1508之量化。自還原性醣基化質譜計算藥物:抗體比(DAR)。去乙醯化AZ1508可視為用於分析之偶聯物質。數據代表平均值±標準偏差，n=3。圖 17.4. 在37℃下於大鼠血清中培育7 d之後附接至CP1-NNAA抗體之剩餘AZ1508之量化。自還原性醣基化質譜計算藥物:抗體比(DAR)。數據代表平均值±標準偏差，n=3。圖 18.1. 展示藉由還原性醣基化質譜量測之1C1 CP1-NNAA及1C1 CP2-NNAA mAb與AZ1508之偶聯動力學。數據繪示為平均值±絕對誤差(n=2，對於1C1 K274CP1-NNAA、1C1 K274CP2-NNAA及1C1 N297CP2-NNAA)及平均值±標準偏差(n=3，對於1C1 S239CP2-NNAA)。圖 18.2. 展示濃度倒數繪圖，該繪圖展示在CP1-NNAA及CP2-NNAA mAb與AZ1508發生反應時之二烯消耗。(A) 1C1 K274CP1-NNAA，(B) 1C1 S239CP2、1C1 K274CP2-NNAA及N297CP2-NNAA mAb。數據繪示為平均值±絕對誤差(n=2，對於1C1 K274CP1-NNAA、1C1 K274CP2-NNAA及1C1 N297CP2-NNAA)及平均值±標準偏差(n=3，對於1C1 S239CP2-NNAA)。圖 19.1. 展示1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC對於小鼠中之PC3異種移植物腫瘤模型之抗腫瘤活性。圖 20.1. 展示60 nm馬來醯亞胺官能化金奈米顆粒在25℃下與1C1野生型(WT)或1C1 K274CP1-NNAA抗體(CP1-NNAA mAb)一起培育2 h之前及之後之動態光散射分析(DLS)。

Claims (62)

  1. 一種生物偶聯方法，其包括使含有第一不飽和官能基之生物分子與包括第二不飽和官能基之有效載荷藥偶聯之步驟，其中該等第一及第二不飽和官能基彼此互補，從而偶聯係該等官能基經由形成環己烯環之狄爾斯-阿爾德反應(Diels-Alder reaction)進行之反應。
  2. 如請求項1之生物偶聯方法，其中該第一官能基係二烯。
  3. 如請求項2之生物偶聯方法，其中該第二官能基係親二烯物，例如馬來醯亞胺、馬來酸酯、富馬酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、甲基乙烯基酮、丁-2-炔二酸之醯胺及酯、醌、乙炔。
  4. 如請求項1之生物偶聯方法，其中該第二官能基係二烯。
  5. 如請求項4之生物偶聯方法，其中該第一官能基係選自以下之親二烯物：馬來酸酯、馬來醯亞胺、富馬酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、甲基乙烯基酮、丁-2-炔二酸之醯胺及酯、醌、乙炔。
  6. 如請求項3或5之生物偶聯方法，其中該親二烯物含於非天然胺基酸中，例如包括降莰烯之非天然胺基酸。
  7. 如請求項2至6中任一項之生物偶聯方法，其中該二烯係線性二烯、碳環二烯或雜環二烯。
  8. 如請求項7之生物偶聯方法，其中該二烯包括丁二烯、環戊二烯、1,3-環己二烯、呋喃或蒽。
  9. 如請求項2至8中任一項之生物偶聯方法，其中該二烯含於非天然胺基酸中。
  10. 如請求項9之生物偶聯方法，其中該二烯係衍生自離胺酸、半胱胺酸、硒半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸之非天然胺基酸。
  11. 如請求項8或9之生物偶聯方法，其中該二烯位於該胺基酸之側鏈中。
  12. 如請求項8至10中任一項之生物偶聯方法，其中該非天然胺基具有式(I)：RX -X1 -O0-1 C(O)- 胺基殘基 (I) 其中：RX 代表選自以下之不飽和基團： iv) C4-9 直鏈共軛二烯，v) 包括共軛二烯之C5-14 碳環基，及vi) 5至14員雜環基，其包括1、2或3個選自O、N及S之雜原子，及共軛二烯，其中i)、ii)及iii)可具有最多5個取代基(例如一個、兩個或三個取代基)，舉例而言，該等取代基獨立地選自C1-3 烷基、側氧基、鹵素、磺基、硫氫基、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；且X1 代表i) 飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基之基團取代；或ii) 與來自碳環基或雜環基之碳一起代表連接至飽和或不飽和(尤其飽和)具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基鏈之環丙烷環，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基之基團取代，且O0-1 C(O) 經由胺基酸之側鏈連接。
  13. 如請求項12之生物偶聯方法，其中該等取代基獨立地選自側氧基、鹵素、磺基、硫氫基、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基。
  14. 如請求項12或13之生物偶聯方法，其中該非天然胺基酸係式(II )結構之殘基：其中X2 代表-C-、-C(R’)-、-CH2 或O；Ra 代表i) 飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之基團取代；或ii) 與來自式(II)中所定義5員環之碳一起代表連接至飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基鏈之環丙烷環，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個(例如1、2或3個)獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之基團取代；Rb 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 、或-C2-5 炔基；Rc 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 、或-C2-5 炔基；Rd 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、-C1-3 伸烷基N3 、或-C2-5 炔基；Re 代表H、飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中一或多個碳視情況由-O-置換且該鏈視情況經一或多個鹵素原子(例如碘)、N3 或-C2-5 炔基取代。
  15. 如請求項14之生物偶聯方法，其中Ra 係-CH(CH2 )CH2 COC(O)-、-OCH2 CH2 COC(O)-、-(CH2 )mCH2 OC(O)-、-CH (CH2 )C(O)-、-(CH2 )mCH2 C(O)-、-CH(CH3 )C(O)-、C1-6 伸烷基(例如-CH2 CH2 -)，且m 代表0或1。
  16. 如請求項14或15之生物偶聯方法，其中Rb 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
  17. 如請求項14至16中任一項之生物偶聯方法，其中Rc 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
  18. 如請求項14至17中任一項之生物偶聯方法，其中Rd 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
  19. 如請求項14至18中任一項之生物偶聯方法，其中Re 代表H或-CH2 OCH2 CH2 N3 。
  20. 如請求項14至19中任一項之生物偶聯方法，其中該非天然胺基酸係式(IIa )結構之殘基：其中Ra 、Rb 、 Rc 、 Rd 、 Re 及X2 定義於上文中。
  21. 如請求項14至19中任一項之生物偶聯方法，其中該非天然胺基酸具有式(IIb )結構：其中Ra 、Rb 、 Rc 、 Rd 、 Re 及X2 定義於上文中。
  22. 如請求項14至19中任一項之生物偶聯方法，其中該非天然胺基酸具有式(IIc )結構：其中Ra 、Rb 、 Rc 、 Rd 、 Re 定義於上文中且X2’ 係-C-或CR’。
  23. 如請求項9至22中任一項之生物偶聯方法，其中該非天然胺基酸係選自包括以下之群：。
  24. 如請求項1至23中任一項之生物偶聯方法，其中該親二烯物位於非天然胺基酸之側鏈中。
  25. 如請求項1至24中任一項之生物偶聯方法，其中該方法包括使該二烯或親二烯物(尤其該二烯)經由連接體偶聯至該生物分子中之胺基酸殘基之預步驟。
  26. 如請求項25之生物偶聯方法，其中該胺基酸係半胱胺酸或離胺酸。
  27. 如請求項25或26之生物偶聯反應，其中該二烯在添加至該生物分子中之該胺基酸殘基中之前具有式(III)結構：RX -Bn-X3 m-Yp-Z (III) 或其具有O或N連接糖之衍生物 其中n 代表0或1；m 代表0或1；p 代表0或1；RX 代表選自以下之不飽和基團： i) C4-9 直鏈共軛二烯，ii) 包括共軛二烯之C5-14 碳環基，及iii) 5至14員雜環基，其包括1、2或3個選自O、N及S之雜原子，及共軛二烯，其中i)、ii)及iii)可具有最多5個取代基(例如一個、兩個或三個取代基)，舉例而言，其中該等取代基獨立地選自C1-3 烷基、側氧基、鹵素、磺基、硫氫基、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；且B 代表C1-6 伸烷基、-C3-4 環烷基C1-6 伸烷基-；其中視情況糖殘基(例如葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖及果糖)含於該等基團中之任一者之伸烷基鏈中，且其中針對B所定義之該等變量中之任一者之該伸烷基鏈視情況具有一或兩個獨立地選自N-及O-連接糖殘基(例如葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖及果糖)-之取代基；X3 代表-(R1 )NC(O)-、-C(O) N(R1 )-、-OC(O)-、-OC(O)N-；R1 代表H或-CH2 OCH2 CH2 R2 ；R2 代表-N3 、C2-5 炔基或鹵素(例如碘)；Y 代表-(OCH2 )qC2-6 伸烷基或視情況經-NR3 R4 取代之-C2-6 伸烷基， 其中q為1至7000；R3 及R4 獨立地代表H或C1-3 烷基；Z 代表-C(O)OR5 、R5’ 、-NC(O)R6 、-C2-5 伸烷基、CH2 -O-NH2 、炔烴、疊氮化物、3-芳基丙炔腈或鹵素(例如碘)；R5 代表C1-6 烷基、琥珀醯亞胺、C6 F4 H (四氟己基)或H；R5’ 代表硫橋接基團，例如二溴馬來醯亞胺、二氯丙酮或其中之任一者之衍生物，R6 代表：其中R7 係視情況具有一或多個(例如一個、兩個或三個)選自羥基、磺基、胺基及-(OCH2 )v C2-6 伸烷基之基團之C1-6 伸烷基及視情況具有一或多個(例如一個、兩個或三個)選自羥基、磺基、胺基及-(OCH2 )v C2-6 伸烷基之基團之苯基， v係整數1、2、3、4或5代表其中該片段連結至該分子之其餘部分。
  28. 如請求項25至27中任一項之生物偶聯方法，其中該二烯具有以下結構：。
  29. 如請求項1至28中任一項之生物偶聯方法，其中該反應係在10℃至40℃範圍內之溫度，例如環境溫度下進行。
  30. 如請求項1至29中任一項之生物偶聯方法，其中在水性溶劑，例如水性有機溶劑系統；緩衝液，例如視情況包括諸如DMSO之極性非質子溶劑之PBS；或表面活性劑，例如聚山梨醇酯80；或其組合中進行。
  31. 如請求項1至30中任一項之生物偶聯方法，其中該生物分子係多肽。
  32. 如請求項31之生物偶聯反應，其中該多肽係選自包括配體、受體、抗體分子之群。
  33. 如請求項1至32中任一項之生物偶聯方法，其中該生物分子係治療性分子。
  34. 如請求項1至33中任一項之生物偶聯反應，其中改造該生物分子，以便自原始或天然序列去除一或多個離胺酸殘基。
  35. 如請求項1至34中任一項之生物偶聯反應，其中該有效載荷藥係選自： a. 奧裡斯他汀(auristatin)，例如選自包括微管溶素(tubulysin)或吡咯并苯并二氮呯(PBD)、MMAE (單甲基奧裡斯他汀E)、MMAF (單甲基奧裡斯他汀F)、多柔比星(doxorubicin)、微管溶素及多卡米星(duocarmycin)之群； b.包括類美登素(maytansinoid)，例如N 2'-去乙醯基-N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(maytansine) (DM1)、N 2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)及N 2'-去乙醯基-N 2'(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)， c. 係毒素， d.聚合物，例如天然聚合物，例如澱粉、聚(麩胺酸)、聚(天門冬胺酸)、聚(離胺酸)或白蛋白；或合成聚合物，例如PEG。
  36. 一種偶聯至有效載荷藥之生物分子，其係自或可自如請求項1至35中任一項之方法所獲得。
  37. 一種偶聯至有效載荷藥之生物分子，其中連接該生物分子與該有效載荷藥之偶聯反應係經由二烯與親二烯物之間之狄爾斯-阿爾德反應以形成環己烯環。
  38. 如請求項37之偶聯至有效載荷藥之生物分子，其中該環己烯環係例如包括最多20個原子之稠合環系統之一部分。
  39. 如請求項38之偶聯至有效載荷藥之生物分子，其具有式(IVa )：其中 RY 代表該有效載荷藥；且 RZ 代表該生物分子。
  40. 如請求項38之偶聯至有效載荷藥之生物分子，其具有式(IVb )：其中 RY 代表該有效載荷藥； RZ 代表該生物分子；且 X4 代表-O-或-CH2 -。
  41. 如請求項36至40中任一項之偶聯至有效載荷藥之生物分子，其中該生物分子係抗體或其結合片段。
  42. 如請求項36至41中任一項之偶聯至有效載荷藥之生物分子，其中該有效載荷藥係選自： a. 奧裡斯他汀，例如選自包括微管溶素或吡咯并苯并二氮呯(PBD)、MMAE (單甲基奧裡斯他汀E)、MMAF (單甲基奧裡斯他汀F)、多柔比星及多卡米星之群； b.包括類美登素，例如N 2'-去乙醯基-N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)、N 2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)及N 2'-去乙醯基-N 2'(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)， c. 係毒素， d. 聚合物，例如天然聚合物；例如澱粉、聚(麩胺酸)或白蛋白；或合成聚合物，例如PEG。
  43. 一種醫藥組合物，其包括如請求項36至42中任一項所定義之偶聯至有效載荷藥之生物分子，及稀釋劑、載劑及/或賦形劑。
  44. 如請求項43之醫藥組合物，其中該組合物係非經腸調配物。
  45. 一種治療患者之方法，其包括投與治療有效量之如請求項36至42中任一項之偶聯至有效載荷藥之生物分子或如請求項43或44之醫藥組合物。
  46. 如請求項36至42中任一項之偶聯至有效載荷藥之生物分子或如請求項43或44之醫藥組合物，其用於治療。
  47. 一種如請求項36至42中任一項之偶聯至有效載荷藥之生物分子及稀釋劑或如請求項43或44之醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑。
  48. 一種非天然胺基酸，其包括二烯或親二烯物。
  49. 一種非天然胺基酸，其中該二烯或親二烯物係位於側鏈中。
  50. 如請求項48或49之非天然胺基，其衍生自離胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸。
  51. 如請求項48至50中任一項之非天然胺基酸，其具有式(I)：RX -X1 -O0-1 C(O)- 胺基殘基 (I) 其中：RX 代表選自以下之不飽和基團： iv) C4-9 直鏈共軛二烯，v) 包括共軛二烯之C5-14 碳環基，及vi) 5至14員雜環基，其包括1、2或3個選自O、N及S之雜原子及共軛二烯，其中i)、ii)及iii)可具有最多5個取代基(例如一個、兩個或三個取代基)，舉例而言，該等取代基獨立地選自C1-3 烷基、側氧基、鹵素、磺基、硫氫基、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；且X1 代表iii) 飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基之基團取代；或iv) 與來自碳環基或雜環基之碳一起代表連接至飽和或不飽和(尤其飽和)具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基鏈之環丙烷環，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基之基團取代，且-O0-1 C(O)- 經由胺基酸之側鏈連接。
  52. 如請求項51之非天然胺基酸，其中該非天然胺基酸具有式(II)：或其鹽，其中X2 代表-C-、-CH2 或O；Ra 代表i) 飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)0-3 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之基團取代；或ii) 與來自5員環之碳一起代表連接至飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-6 伸烷基鏈之環丙烷環，其中至少一個碳(例如1、2或3個碳)由選自O、N、S(O)p 之雜原子置換，其中該鏈視情況經一或多個獨立地選自側氧基、鹵素、磺基、硫氫基、胺基之基團取代；Rb 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、- C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Rc 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、- C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Rd 代表H、-OC1-3 烷基、視情況具有羥基取代基之C1-6 烷基、- C1-3 伸烷基N3 或-C2-5 炔基；Re 代表H、飽和或不飽和具支鏈或無支鏈C1-8 伸烷基鏈，其中 一或多個碳視情況由-O-置換且該鏈視情況經一或多個鹵素原 子(例如碘)、N3 或-C2-5 炔基取代。
  53. 如請求項52之非天然胺基酸，其中Ra 係-(CH2 )mC(O)-、-CH2 (CH3 )C(O)-、-(CH2 )mCH2 OC(O)-、-CHCHCH2 OC(O)-、-OCH2 CH2 COC(O)-且m 代表0或1。
  54. 如請求項52或53之非天然胺基酸，其中Rb 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
  55. 如請求項52至53中任一項之非天然胺基酸，其中Rc 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
  56. 如請求項52至55中任一項之非天然胺基酸，其中Rd 係H、-OC1-3 烷基、-CH3 、-CH(CH3 )2 、CH2 OH、-CH2 N3 或-CCH。
  57. 如請求項52至56中任一項之非天然胺基酸，其中Re 代表H或-CH2 OCH2 CH2 N3 。
  58. 如請求項52至57中任一項之非天然胺基酸，其中該非天然胺基酸係式(IIa)結構之殘基：或其鹽，其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及X2 係如上文針對式(II)化合物所定義。
  59. 如請求項52至58中任一項之非天然胺基酸，其中該非天然胺基酸具有式(IIb)結構：或其鹽，其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 及X2 係如上文針對式(II)化合物所定義。
  60. 如請求項52至58中任一項之非天然胺基酸，其中該非天然胺基酸具有式(IIc)結構：或其鹽，其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 、Re 定義於上文中且X2 ’ 係如上文所定義之-C-或-CR’。
  61. 如請求項60之非天然胺基酸，其中該非天然胺基酸係選自包括以下之群： 或其中之任一者之鹽。
  62. 一種多肽，其包括如請求項51至61中任一項之非天然胺基酸。
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