ES2955886T3 - Método y moléculas - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona un método de bioconjugación y compuestos para su uso en el mismo. El método de bioconjugación comprende la etapa de conjugar una molécula biológica que contiene un primer grupo funcional insaturado con una carga útil que comprende un segundo grupo funcional insaturado, en donde el primer y segundo grupo funcional insaturado son complementarios entre sí de modo que la conjugación es una reacción de dichos grupos funcionales. mediante una reacción de Diels-Alder que forma un anillo de ciclohexeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método y moléculas
La presente divulgación se refiere a un método de conjugación de una molécula biológica con una carga útil, a una molécula preparada mediante dicho método, a composiciones que comprenden la misma, a ciertas estructuras de aminoácidos novedosas particularmente adecuadas para su uso en el método y al uso de las moléculas biológicas y las composiciones en el tratamiento, en particular el tratamiento de respuestas inflamatorias, incluido cáncer.
ANTECEDENTES
Hay una serie de productos farmacéuticos registrados que comprenden un componente de proteína/polipéptido unido a un polímero o toxina. A menudo, el polímero es polietilenglicol y se conjuga con el polipéptido haciendo reaccionar un residuo de aminoácido de cisteína o lisina (en particular, la cadena lateral de un residuo de lisina) con un grupo maleimida o un grupo éster de NHS, respectivamente. Otros compuestos terapéuticos, tales como conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), se preparan de un modo similar, donde la toxina/fármaco lleva una maleimida reactiva u otros grupos funcionales apropiados para unirse a un anticuerpo. A continuación, se muestran genéricamente ejemplos de tales reacciones:
El empleo de un residuo de aminoácido nativo en el polipéptido puede dar como resultado un producto de conjugación que contiene una mezcla de especies. Además, si el residuo de aminoácido objetivo para la reacción de conjugación está en un pliegue proteico o es, por ejemplo, inaccesible al disolvente, pueden requerirse condiciones severas para llevar a cabo la reacción de conjugación. Sin embargo, generalmente es deseable emplear condiciones suaves en presencia de una molécula biológica porque la actividad de la molécula puede verse dañada por condiciones severas.
Las reacciones de conjugación básicas para acoplarse a residuos nativos en moléculas biológicas han cambiado muy poco en los últimos cinco a diez años, con ejemplos de tales reacciones que se muestran a continuación. Sin embargo, estas reacciones son cada vez más importantes, ya que es probable que los productos biológicos de segunda generación, tales como los conjugados de anticuerpos y fármacos, contribuyan significativamente al tratamiento de enfermedades, tales como el cáncer. Puede usarse química, tal como la denominada química Click, en la bioconjugación con grupos funcionales no nativos empleando, por ejemplo, reacciones de cicloadición de azida-alquino, cicloadiciones de azidaalquino tensas, adiciones de alquino-nitrona, reacciones de un alqueno y una azida [cicloadición 3 más 2], reacciones de Diels-Alder de demanda inversa de alqueno y tetrazina o reacciones de alqueno y tetrazol [Husigen].
Los grupos funcionales no naturales requeridos para estas reacciones pueden instalarse en proteínas mediante modificación química de lisinas, cisteínas o tirosinas nativas, o mediante la expresión de proteínas que incorporaron aminoácidos no naturales en la estructura de la proteína. A continuación se muestran ejemplos de tales químicas: Conjugación con grupos funcionales de proteínas naturales
Conjugación con grupos funcionales de proteínas no naturales
Aunque muchas de las químicas de conjugación mostradas anteriormente han ampliado las posibilidades disponibles para preparar bioconjugados, sus aplicaciones para preparar moléculas terapéuticas pueden estar limitadas debido a; largos tiempos de reacción, necesidad de catalizadores que podrían oxidar grupos funcionales de proteínas, parejas de reacción hidrófobas que afectan a las propiedades de las proteínas, tal como la tendencia a agregarse, posibles problemas de seguridad con productos intermedios explosivos (es decir, compuestos de azida), por nombrar algunos problemas.
Además, el empleo de las químicas mostradas anteriormente para producir ADC mediante el acoplamiento a grupos funcionales de proteínas no naturales requiere el desarrollo de una toxina/fármaco que contenga el grupo reactivo complementario adecuado, lo que podría complicar el desarrollo de fármacos ya que algunos grupos reactivos pueden no ser compatibles con ciertas cargas útiles, y/ o puede tener un impacto sobre las propiedades de la carga útil, tales como la hidrofobicidad y la solubilidad. Actualmente, se han desarrollado muchas cargas útiles de ADC para incluir grupos maleimida para la conjugación con tioles de cisteína. Sería útil disponer de un método alternativo para conjugar una molécula biológica con otra entidad, tal como un polímero o una carga útil, por ejemplo, que utilice un grupo funcional que esté actualmente disponible (como la maleimida) y que se sepa que es compatible con una amplia gama de las cargas útiles deseadas. Además, sería útil tener una reacción de conjugación que tuviera una o más de las siguientes propiedades, específica, rápida, que emplee condiciones suaves o moderadas y capaz de reaccionar con residuos de aminoácidos que no estén expuestos al disolvente.
Shi et al Angew. Chem. Int. Ed.2007, 46, 6126 -6131 se refieren a nanopartículas inmunopoliméricas preparadas mediante química de diels-alder. El documento WO 2014/207245 se refiere a anticuerpos conjugados con al menos una molécula de ácido nucleico y a su uso en ensayos de inmunodetección múltiplex. El documento WO 2013/092998 se refiere a métodos para la funcionalización de inmunoglobulinas, en particular con fármacos. El documento WO 01/87347 se refiere a un conjugado de agente de reticulación heterobifuncional sustituido por un inmunomodulador y una unidad de reconocimiento celular. Dantas de Araujo et al Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 296 -301 se refieren al ligamiento de dielsalder y a la inmovilización superficial de proteínas. Pozsgay et al Organic Letters. 2002, 4, 3191-3194 se refieren a un método para la bioconjugación de hidratos de carbono usando cicloadición de diels-alder.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un método de bioconjugación que comprende la etapa de conjugar una molécula de anticuerpo biológico que contiene un primer grupo funcional insaturado con un fármaco
que comprende un segundo grupo funcional insaturado, en donde los grupos funcionales insaturados primero y segundo son complementarios entre sí de manera que la conjugación es una reacción de dichos grupos funcionales por medio de una reacción de Diels-Alder que forma un anillo de ciclohexeno, en donde el primer grupo funcional es un dieno y el segundo grupo funcional es una maleimida.
La reacción de Diels-Alder tal como se emplea en el presente documento se refiere a una reacción de cicloadición 4 más 2 que forma un anillo de ciclohexeno, que puede ser parte de un sistema de anillos condensados. Un ejemplo genérico de la reacción se muestra a continuación:
Sorprendentemente, los presentes inventores han establecido que esta reacción puede emplearse en condiciones suaves en reacciones de conjugación específicas que comprenden una molécula biológica. En algunos casos, las reacciones tardan tan solo dos horas a temperatura ambiente. En otros casos, la reacción de bioconjugación puede producirse en una etapa, sin necesidad de reactivos adicionales aparte de la carga útil, la proteína y el disolvente.
Además, los agentes de reticulación reactivos y los aminoácidos no naturales que comprenden la funcionalidad dieno deseada para transformaciones de Diels-Alder eficientes son accesibles sintéticamente y pueden producirse con altos rendimientos en rutas simples y directas.
El dieno puede incorporarse a la molécula de anticuerpo mediante la adición de un ligador o mediante la incorporación de un aminoácido no natural en la secuencia polipeptídica. Entonces, puede incorporarse el grupo funcional complementario requerido a la carga útil (fármaco).
Lo siguiente es una representación esquemática de la conjugación de una carga útil a un aminoácido no natural que comprende un dieno en un aminoácido:
Ventajosamente, el producto de la reacción de conjugación es estable en medio biológico a la temperatura corporal. Sin embargo, si se desea, la reacción puede revertirse exponiendo el producto de conjugación a temperaturas elevadas, por ejemplo 60°C o más.
En una realización, el dieno es un dieno lineal, dieno carbocíclico o dieno heterocíclico, por ejemplo, el dieno comprende un butadieno, un ciclopentadieno, un 1,3-ciclohexadieno, furano o antraceno.
En una realización, el dieno está contenido en un aminoácido no natural, por ejemplo un aminoácido no natural derivado de lisina, cisteína, selenocisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, glicina y tirosina.
En una realización, el dieno está en una cadena lateral del aminoácido.
En una realización el amino no natural tiene una fórmula (I):
RX-X1-Oo-iC(O)-residuo de aminoácido (I)
en donde:
RX
representa un grupo insaturado seleccionado de un:
i) dieno conjugado lineal C4-9,
ii) carbociclilo C5-14 que comprende un dieno conjugado, y
iii) un heterociclilo de 5 a 14 miembros que comprende 1,2 o 3 heteroátomos seleccionados de O, N y S, y un dieno conjugado,
en donde i), ii) y iii) pueden llevar hasta cinco sustituyentes, (tales como uno, dos o tres sustituyentes) por ejemplo, los sustituyentes se seleccionan independientemente de alquilo C1-3, oxo, halógeno, sulfo, sulfhidrilo, amino, -alquilen C1-3N3 o -alquinilo C2-5; y
X 1
representa
i) una cadena de alquileno Ci-s saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, en donde al menos un carbono (por ejemplo 1,2 o 3 carbonos) se reemplaza por un heteroátomo seleccionado de O, N, S(O)0-3 , en donde dicha cadena está opcionalmente sustituida por uno o más grupos independientemente seleccionados de oxo, halógeno, amino, -alquilen C1-3N3 o -alquinilo C2-5; o
ii) junto con un carbono del carbociclilo o heterociclilo representa un anillo de ciclopropano unido a una cadena de alquileno C1-6 saturada o insaturada (en particular saturada) ramificada o no ramificada, en donde al menos un carbono (por ejemplo 1, 2 o 3 carbonos) se reemplaza por un heteroátomo seleccionado de O, N, S(O)0-3, en donde dicha cadena está opcionalmente sustituida por uno o más grupos independientemente seleccionados de oxo, halógeno, amino, -alquilen C1-3N3 o -alquinilo C2-5 y -Oo-iC(O)-está unido a través de una cadena lateral de un aminoácido.
En una realización, el aminoácido no natural es un residuo de la estructura de fórmula (II):
en donde
X 2
representa -C-, -C(R')-, -CH2 o O;
R'
representa H o alquilo C1-3,
Ra
representa
i) una cadena de alquileno Ci-s saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, en donde al menos un carbono (por ejemplo 1,2 o 3 carbonos) se reemplaza por un heteroátomo seleccionado de O, N, S(O)0-3 , en donde dicha cadena está opcionalmente sustituida por uno o más grupos independientemente seleccionados de oxo, halógeno, amino; o
ii) junto con un carbono del anillo de 5 miembros representa un anillo de ciclopropano unido a una cadena de alquileno C1-6 saturada o insaturada (en particular saturada) ramificada o no ramificada, en donde al menos un carbono (por ejemplo 1, 2 o 3 carbonos) se reemplaza por un heteroátomo seleccionado de O, N, S(O)0-3, en donde dicha cadena está opcionalmente sustituida por uno o más grupos independientemente seleccionados de oxo, halógeno, amino;
Rb
representa H, -O-alquilo C1-3, alquilo Cisque lleva opcionalmente un sustituyente hidroxilo, -alquilen C1-3N3 o -alquinilo C2-5;
Rc
representa H, -O-alquilo C1-3, alquilo C1-6que lleva opcionalmente un sustituyente hidroxilo, -alquilen C1-3N3 o -alquinilo C2-5;
Rd
representa H, -O-alquilo C1-3, alquilo C1-6que lleva opcionalmente un sustituyente hidroxilo, -alquilen C1-3N3 o -alquinilo C2-5;
Re
representa H, cadena de alquileno Ci-s saturada o insaturada (en particular saturada) ramificada o no ramificada, en donde uno o más carbonos se reemplazan opcionalmente por -O- y la cadena está opcionalmente sustituida por uno o más átomos de halógeno (tales como yodo), N3 o -alquinilo C2-5.
En una realización, Ra es -(CH2)mC(O)-, -CH2 (CH)C(O)-, -(CH2)mCH2OC(O)-, -CHCHCHzOC(O)-, o -OCH2CH2COC(O)-y m representa 0 o 1.
En una realización, Rb es H, -O-alquilo C1-3, -CH3 , -CH(CH3)2, CH2OH, -CH2 N3 o -CCH.
En una realización, Rc es H, -O-alquilo C1-3, -CH3 , -CH(CH3)2, CH2OH, -CH2N3 o -CCH.
En una realización, Rd es H, -O-alquilo C1-3, -CH3 , -CH(CH3)2 , CH2OH, -CH2 N3 o -CCH.
En una realización, Re representa H o -CH2OCH2CH2N3.
En una realización, el aminoácido no natural es un residuo de la estructura de fórmula (IIa):
En una realización, el aminoácido no natural tiene la estructura de fórmula (IIb):
En una realización, el aminoácido no natural tiene la estructura de fórmula (He):
en donde Ra, Rb, Rc, Rd, Re se definieron anteriormente y X2' es -C- o -CR' tal como se definió anteriormente.
En general, los compuestos, por ejemplo fórmulas (I), (II), (Ila), (IIb) y (IIc), contendrán como máximo solo un grupo azida. En una realización, el aminoácido no natural se selecciona del grupo que comprende:
En una realización, el método comprende una pre-etapa de conjugación del dieno por medio de un ligador con un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo, por ejemplo donde el aminoácido es una cisteína o lisina.
En una realización, el dieno antes de la adición a dicho residuo de aminoácido en la molécula biológica tiene la estructura de fórmula (NI):
RX-Bn-X3m-Yp-Z (III)
en donde
n representa 0 o 1;
m representa 0 o 1;
p representa 0 o 1;
RX representa un grupo insaturado seleccionado de un:
i) dieno conjugado lineal C4-9,
ii) carbociclilo C5-14 que comprende un dieno conjugado, y
iii) un heterociclilo de 5 a 14 miembros que comprende 1,2 o 3 heteroátomos seleccionados de O, N y S, y un dieno conjugado,
en donde i), ii) y iii) pueden llevar hasta cinco sustituyentes, (tales como uno, dos o tres sustituyentes) por ejemplo donde los sustituyentes se seleccionan independientemente de alquilo C1-3, oxo, halógeno, sulfo, sulfhidrilo, amino, -alquilen C1-3N3 o -alquinilo C2-5; y
B representa alquileno C1-6, -cicloalquil C3-4-alquilen C1-6-; en donde opcionalmente un residuo de azúcar (tal como glucosa, glucosamina, galactosa, galactosamina, lactosa, manosa y fructosa) está contenido en la cadena de alquileno de uno cualquiera del mismo, y en donde la cadena de alquileno de una cualquiera de dichas variables definidas para B lleva opcionalmente uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de un residuo de azúcar unido a N y O (tal como glucosa, glucosamina, galactosa, galactosamina, lactosa, manosa y fructosa):
X3 representa -(R1)NC(O)-, -C(O) N(R1)-, -OC(O)-, -OC(O)N-;
R1 representa H o -CH2OCH2CH2R2 ;
R2 representa -N3 , alquinilo C2-5 o halógeno, tal como yodo;
Y representa -(OCH2)q-alquileno C2-6, o -alquileno C2-6 opcionalmente sustituido con - NR3R4,
en donde q es de 1 a 7000;
R3 y R4 representan independientemente H o alquilo C1-3;
Z representa -C(O)OR5 , R5, -NC(O)R6, -alquileno C2-5, CH2-O-NH2 , alquino, azida, 3-arilpropiolonitrilo o halógeno tal como yodo;
R5 representa alquilo C1-6, succinimida, C6F4 H (tetrafluorohexilo) o H:
R5' representa un grupo de puente de azufre, por ejemplo una dibromomaleimida, una dicloroacetona o un derivado de uno cualquiera de los mismos,
R6 representa:
R7 es alquileno C1-6 que lleva opcionalmente uno o más (tales como uno, dos o tres) grupos seleccionados de hidroxilo, sulfo, amino y -(OCH2)V-alquileno C2-6, y fenilo que lleva opcionalmente uno o más (tales como uno, dos o tres) grupos seleccionados de hidroxilo, sulfo, amino y -(OCH2)V-alquileno C2-6,
v es u n número entero 1,2, 3, 4 o 5
W'M/W'
representa donde el fragmento se conecta al resto de la molécula.
En una realización, el dieno tiene una estructura:
En una realización, la reacción se realiza a una temperatura en el intervalo de 10 a 40 °C, por ejemplo temperatura ambiental.
En una realización, la reacción se realiza en disolvente acuoso, por ejemplo sistemas de disolventes orgánicos acuosos, un tampón tal como PBS que comprende opcionalmente un disolvente aprótico polar, tal como DMSO o un tensioactivo, tal como polisorbato 80 o combinaciones del mismo.
En una realización, la molécula de anticuerpo se modifica por ingeniería genética para añadir o eliminar uno o más residuos de lisina de la secuencia original o nativa.
En una realización, la molécula de anticuerpo se modifica por ingeniería genética para añadir o eliminar uno o más residuos de cisteína de la secuencia original o nativa.
En una realización, la molécula de anticuerpo se modifica por ingeniería genética para añadir o eliminar uno o más residuos de tirosina de la secuencia original o nativa.
En una realización, la molécula de anticuerpo se modifica por ingeniería genética para añadir uno o más residuos de aminoácido naturales o no naturales a la secuencia original o nativa.
En una realización, la molécula de anticuerpo es una molécula terapéutica.
En un aspecto independiente, se proporciona también un anticuerpo o fragmento de unión del mismo conjugado a un fármaco, de o bien fórmula (IVa):
RY representa el fármaco; y
RZ representa el anticuerpo o fragmento de unión del mismo, o bien
una fórmula (IVb):
RY representa el fármaco;
RZ representa el anticuerpo o fragmento de unión del mismo, por ejemplo tal como se define en el presente documento; y
X4 representa -O- o -CH2-,
en donde la reacción de conjugación que une el anticuerpo o fragmento de unión del mismo al fármaco era por medio de una reacción de Diels-Alder entre una molécula de anticuerpo que contiene un dieno y un fármaco que contiene una maleimida, para formar un anillo de ciclohexeno.
También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo conjugado con un fármaco según las reivindicaciones y un diluyente, portador y/o excipiente, por ejemplo donde la composición es una formulación parenteral.
Por tanto, se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión del mismo conjugado con un fármaco o una composición farmacéutica tal como se da a conocer en el presente documento, para su uso en el tratamiento.
Divulgación detallada
La conjugación (reacción) tal como se emplea en el presente documento es simplemente una reacción que une una molécula con otra entidad. En el contexto de la presente memoria descriptiva, una molécula biológica conjugada, por ejemplo, con una carga útil es el producto obtenido de una reacción de conjugación.
Un método de bioconjugación tal como se emplea en el presente documento se refiere a un método para unir una molécula biológica con otra entidad, por ejemplo, un fármaco.
Un residuo de aminoácido tal como se emplea en el presente documento se refiere a un aminoácido natural o no natural unido, por ejemplo, a otro aminoácido, a través del terminal N y/o C del aminoácido, en particular cuando al menos una unión es un enlace peptídico.
Un aminoácido no natural tal como se emplea en el presente documento se refiere a un aminoácido que es distinto de uno de los veintiún aminoácidos de origen natural. Por ejemplo, el aminoácido no natural comprende un dieno o dienófilo y también contiene los grupos funcionales amino y carboxílico en las posiciones relativas que son características de los aminoácidos naturales. Ciertos aminoácidos no naturales y métodos para preparar los mismos se dan a conocer en el documento WO2015/019192. En una realización, el dienófilo está contenido en un aminoácido no natural, tal como norbornenolisina, que se da a conocer en el documento US2015/0005481.
Los aminoácidos no naturales generalmente se derivan de aminoácidos naturales. Derivado de un aminoácido natural se refiere al hecho de que el aminoácido no natural se basa en (o incorpora) o es similar a la estructura del aminoácido natural, por ejemplo, la cadena de alquileno en la lisina puede acortarse para proporcionar una cadena de 3 carbonos a diferencia de la cadena natural de 4 carbonos, pero todavía existe relación o similitud estructural con la lisina. Por tanto, los derivados de aminoácidos naturales incluyen modificaciones tales como incorporar el dieno o dienófilo, alargar o acortar una cadena de alquileno, añadir uno o más sustituyentes a un nitrógeno, oxígeno, azufre en una cadena lateral o convertir un nitrógeno, oxígeno o azufre en un grupo funcional diferente o una combinación de cualquiera de los mismos. Normalmente, la mayoría de las modificaciones serán la adición de estructura en el aminoácido no natural. Sin embargo, la modificación puede incluir eliminar o reemplazar un átomo que se encuentra de manera natural en un aminoácido. Aminoácido natural tal como se emplea en el presente documento se refiere a los 21 aminoácidos proteinogénicos (es decir, arginina, histidina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, selenocisteína, glicina, prolina, alanina, valina, isoleucina, leucina , metionina, fenilalanina, tirosina y triptófano).
En una realización, el aminoácido no natural que comprende un dieno se incorpora en la secuencia de aminoácidos de la molécula de anticuerpo, por ejemplo, en el proceso de expresión de un polipéptido recombinante. Esto es ventajoso porque ubica el aminoácido en una posición precisa, lo que luego facilita una reacción de conjugación muy específica con la carga útil.
En una realización, el aminoácido no natural puede unirse a la molécula biológica por medio de un enlazador y una reacción de conjugación.
Dienófilo tal como se emplea en el presente documento es un grupo funcional que reacciona con un dieno. En una realización, el dienófilo comprende un alqueno (con un doble enlace, en particular un doble enlace).
Dieno tal como se emplea en el presente documento se refiere a dos dobles enlaces (dos grupos -eno). Sin embargo, dichos dos grupos deben estar en proximidad entre sí. Por tanto, generalmente un dieno tal como se emplea en el presente documento se referirá a un dieno conjugado, a menos que el contexto indique lo contrario.
Dieno conjugado tal como se emplea en el presente documento se refiere a doble enlace-enlace simple-doble enlace en un contexto lineal o cíclico.
Un dieno conjugado en un contexto lineal incluye dienos conjugados lineales C4-9, tales como butadieno, pentadieno, hexadieno, heptadieno, octadieno y nonadieno. Lineal en este contexto se refiere a no cíclico y, por lo tanto, incluye la versión ramificada de cadenas de carbono C4-9 que comprenden un dieno conjugado.
Los dienos conjugados en un contexto cíclico incluyen, por ejemplo, un carbociclo monocíclico, tal como ciclopentadieno o ciclohexadieno, o en un sistema carbocíclico bi o tricíclico, tal como un sistema que comprende ciclopentadieno o ciclohexadieno fusionado con otro anillo. En una realización, el dieno conjugado no es aromático. El dieno conjugado no debe confundirse con la reacción de conjugación, los dos "no están relacionados".
Carbociclo tal como se emplea en el presente documento se refiere a un sistema de anillos, donde los anillos que constituyen el sistema están hechos de átomos de carbono, es decir, los heteroátomos no contribuyen a la estructura del anillo. Sin embargo, el carbociclo puede llevar uno o más sustituyentes y el sustituyente puede contener heteroátomos. En una realización, el carbociclo está parcialmente insaturado o es aromático.
Ciclopropano es un carbociclo de tres miembros. En algunas realizaciones, un anillo de ciclopropano se une a un anillo de dieno carbocíclico o un anillo de dieno heterocíclico, por ejemplo, tal como se muestra en algunas de las estructuras del presente documento. Esto es ventajoso porque minimiza la propensión del dieno a reaccionar consigo mismo, lo que puede producirse con dienos reactivos. Este anillo de ciclopropano en la presente memoria descriptiva no se define como un sustituyente per se, sino que se define en cuando a la cadena o "enlazador" que se une el sistema de anillos que comprende el dieno.
Carbociclilo C5-14 que comprende un dieno conjugado tal como se emplea en el presente documento se refiere a un sistema de anillos carbocíclicos de 5 a 14 miembros, que puede llevar uno o más sustituyentes, por ejemplo uno, dos, tres, tres, cuatro sustituyentes.
El carbociclo que comprende un dieno conjugado o un dieneófilo forma parte de los grupos funcionales reactivos que se encuentran en el aminoácido no natural o será un componente del enlazador añadido antes de la conjugación con la "carga útil". Los ejemplos de carbociclos C5-14 incluyen ciclopentadieno (incluido ciclopentadieno sustituido o no sustituido), ciclohexadieno (incluido ciclohexadieno sustituido o no sustituido), antraceno (incluido antraceno sustituido o no sustituido).
En una realización, el ciclopentadieno en un aminoácido no natural o enlazador no está sustituido. En una realización, el ciclopentadieno se conecta al aminoácido no natural o revestimiento por medio de un anillo de ciclopropano.
En una realización, el ciclopentadieno en un aminoácido no natural o enlazador comprende uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes alquilo C1-3, por ejemplo, el ciclopentadieno lleva cinco sustituyentes metilo.
Heterociclilo tal como se emplea en el presente documento se refiere a un anillo saturado o parcialmente insaturado o aromático que comprende uno o más, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados independientemente de O, N y S, opcionalmente uno o dos carbonos en el anillo pueden llevar un sustituyente oxo. Claramente, cualquier valencia de un heteroátomo no empleado en la formación o retención de la estructura del anillo puede llenarse con hidrógeno o un sustituyente, tal como sea apropiado. Por tanto, los sustituyentes en los heterociclos pueden estar en el carbono o en un heteroátomo, tal como N, tal como sea apropiado.
El heterociclo de 5 a 14 miembros contendrá de 5 a 14 miembros que constituyen el sistema de anillos, por ejemplo, que comprende uno, dos o tres heteroátomos. El heterociclo puede llevar, por ejemplo, uno, dos o tres sustituyentes. Generalmente, el heterociclo generalmente comprenderá dieno o dienófilo y, por tanto, estará al menos parcialmente insaturado y puede ser aromático.
Heterociclo de 5 a 14 miembros comprenderá generalmente un dieno o un dienófilo para incorporarlo a un aminoácido o enlazador no natural. Los ejemplos de heterociclos que comprenden un dieno incluyen furano (incluido furano sustituido o no sustituido, en particular furano sustituido) y 2H-pirano (incluidas formas sustituidas o no sustituidas del mismo). Los ejemplos de heterociclos que comprenden un dienófilo incluyen maleimida, vinilpiridina, pirrolina (tal como 2-pirrolina y 3-pirrolina) y 3,4-dihidropirano.
En un furano se lleva al menos un sustituyente, por ejemplo, un sustituyente donador de electrones, como alcoxi, en particular en uno (tal como uno) metoxi.
Cuando el dieno se introduce en la molécula de anticuerpo por medio de un enlazador, la funcionalidad tal como N3, halo, succinimida o un alquino puede reaccionar con, por ejemplo, lisina en la secuencia de aminoácidos de la molécula de anticuerpo.
Alquilo tal como se usa en el presente documento se refiere a alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada, tal como, sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, butilo, n-butilo y terc-butilo. En una realización, alquilo se refiere a alquilo de cadena lineal.
Alcoxi tal como se usa en el presente documento se refiere a alcoxi de cadena lineal o ramificada, por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi, butoxi. Alcoxi tal como se emplea en el presente documento también se extiende a realizaciones en las que el átomo de oxígeno está ubicado dentro de la cadena de alquilo, por ejemplo -alquil C1-3-O-alquilo 1-3, tal como -CH2CH2OCH3 o -CH2OCH3. Así, en una realización, el alcoxi se une a través de carbono al resto de la molécula. En una realización, el alcoxi se une a través de oxígeno al resto de la molécula, por ejemplo -alquil C0-O-alquilo C1-6. En una realización, la divulgación se refiere a alcoxi de cadena lineal.
Amino tal como se emplea en el presente documento se refiere a -NH2, mono o diacilamino C1-4 se refiere a -NHC(O)alquilo C1-3 y un (-NC(O)alquil C1-3)C(O)alquilo C1-3) respectivamente.
Mono o dialquilamino C1-4 se refiere a -NH-alquilo C1-4 y -N(alquil C1-4)(alquilo C1-4) respectivamente.
Halógeno o halo incluye flúor, cloro, bromo o yodo, en particular flúor, cloro o bromo, especialmente flúor o cloro.
Oxo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a C=O y habitualmente se representará como C(O).
Alquileno tal como se emplea en el presente documento se refiere a radicales de carbono ramificados o no ramificados, tales como metileno (-CH2-) o cadenas del mismo.
Alquilo C2-5 tal como se emplea en el presente documento se refiere a un grupo o radical que contiene: un triple enlace; y entre dos y 5 átomos de carbono en disposición lineal o ramificada.
En relación con una cadena de alquilo C1-8 saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, en donde al menos un carbono (por ejemplo, 1, 2 o 3 carbonos, adecuadamente 1 o 2, en particular 1) se reemplaza por un heteroátomo seleccionado de O, N, S(O)0-3, en donde dicha cadena está opcionalmente sustituida por uno o más grupos independientemente seleccionados de oxo, halógeno, quedará claro para los expertos en la técnica que el heteroátomo puede reemplazar a un carbono primario, secundario o terciario, es decir CH3 , - CH2- o un -CH- o un grupo de carbono ramificado, tal como sea técnicamente apropiado.
N3 tal como se emplea en el presente documento se refiere a una azida.
Sulfo tal como se emplea en el presente documento se refiere a un átomo de azufre unido a uno, dos o tres átomos de oxígeno.
Sulfohidrilo tal como se emplea en el presente documento se refiere a un átomo de azufre unido a uno o más átomos de hidrógeno, que pueden existir en equilibrio entre las formas protonada y no protonada.
El anillo de ciclohexeno, que es el rasgo característico del producto conjugado de la reacción según la presente divulgación por medio del mecanismo de Diels-Alder, un sistema monocíclico o parte de un sistema de anillos condensados, tal como un sistema bicíclico.
Los azúcares adecuados para la adición a compuestos de fórmula (III) incluyen glucosa, glucosamina, galactosa, galactosamina, manosa, fructosa, galactosa, maltosa y lactosa. Ventajosamente, la adición de una molécula de azúcar puede aumentar la solubilidad.
Polipéptidos para su uso en la presente divulgación
Molécula de anticuerpo tal como se emplea en el presente documento es un término genérico que se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión de anticuerpos y formatos de anticuerpos tales como anticuerpos multiespecíficos que comprenden dichos anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos.
Los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina", utilizados indistintamente en el presente documento, incluyen los anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas simples de los mismos.
Un anticuerpo típico comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH, región VH o dominio VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres o cuatro dominios constantes, CH1, CH2, CH3 y CH4. La región Fc incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante, y fragmentos de los mismos. Por tanto, para IgG, la "región Fc" se refiere a CH2 y CH3 y opcionalmente la totalidad o una porción de la región de bisagra flexible N-terminal respecto a estos dominios. El término "región Fc" puede referirse a esta región aislada, o esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fc.
Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL, región VL o dominio VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL.
Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está formada por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones marco pueden designarse según sus respectivas regiones VH y VL. Por tanto, por ejemplo, VH-FW1 se referiría a la primera región marco de VH. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos huésped o factores, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno de la misma que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, hidrato de carbono, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno (también denominado sitio de unión) dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv y scFv estabilizados por disulfuro (dsFv)), anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de al menos dos anticuerpos diferentes o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO96/27011, WO2007/024715, WO2009018386, WO2009/080251, WO2013006544, WO2013/070565 y WO2013/096291), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un fragmento de unión a antígeno siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada.
Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b, o c), Am, Em y Km(1, 2 o 3)). Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos se pueden obtener de cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitación, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc., u otros animales tales como aves (por ejemplo, pollos).
El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento que comprende regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Se conoce en la técnica que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Por tanto, en una realización, el anticuerpo usado en la presente invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o un fragmento de las mismas y puede ser, pero no se limita a Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de un solo dominio (por ejemplo VH o VL o VHH), scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, combinaciones de los mismos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores.
Otros anticuerpos contemplados específicamente son anticuerpos "oligoclonales" que son una mezcla predeterminada de anticuerpos monoclonales distinto. Véanse, por ejemplo, la publicación PCT WO 95/20401; patentes estadounidenses n.os
5.789.208 y 6.335.163. Preferiblemente, los anticuerpos oligoclonales consisten en una mezcla predeterminada de anticuerpos contra uno o más epítopos que se generan en una sola célula. Más preferiblemente, los anticuerpos oligoclonales comprenden una pluralidad de cadenas pesadas capaces de aparearse con una cadena ligera común para generar anticuerpos con especificidades múltiples (por ejemplo, publicación PCT WO 04/009618). Los anticuerpos oligoclonales son particularmente útiles cuando se desea seleccionar como diana múltiples epítopos en una sola molécula diana. Los expertos en la técnica sabrán o podrán determinar qué tipo de anticuerpo o mezcla de anticuerpos es aplicable para un fin previsto y una necesidad deseada.
Moléculas de carga útil
Carga útil, tal como se emplea en el presente documento, se refiere a un fármaco, que pretende "administrarse" a una ubicación de región diana mediante conjugación con el polipéptido. En general, la carga útil será generalmente una molécula efectora, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en una toxina, por ejemplo, una citotoxina, tal como un agente quimioterápico, un fármaco, un profármaco, una enzima, un inmunomodulador, un agente antiangiogénico, un agente pro-apoptótico, una citocina, una hormona, un anticuerpo o fragmento del mismo, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo ADN, ARN y fragmentos de los mismos (por ejemplo, una molécula antisentido o un gen), radionúclidos, en particular radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopia de RMN o ESR.
Los ejemplos de moléculas de fármacos para su uso en la presente divulgación incluyen mostaza nitrogenada, derivado de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosourea, gemcitabina, triazeno, análogo de ácido fólico, antraciclina, taxano, inhibidor de COX-2, análogo de pirimidina, análogo de purina, antibiótico, inhibidor enzimático, epipodofilotoxina, complejo de coordinación de platino, alcaloide de la vinca, urea sustituida, derivado de metilhidrazina, supresor adrenocortical, antagonista hormonal, endostatina, taxol, camptotecina, doxorrubicina, análogo de doxorrubicina, antimetabolito, agente alquilante, antimitótico, agente antiangiogénico, inhibidor de tirosina cinasa, inhibidor de mTOR, inhibidor de topoisomerasa, inhibidor de proteína de choque térmico (HSP90), inhibidor de proteosoma, inhibidor de HDAC, agente proapoptótico, metotrexato, CPT-11 o una combinación de los mismos.
En aspectos particulares, el fármaco es amifostina, cisplatino, dacarbazina, dactinomicina, mecloretamina, estreptozocina, ciclofosfamida, carrnustina, lomustina, doxorubicina lipo, gemcitabina, daunorubicina, daunorubicina lipo, procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina , vincristina, bleomicina, paclitaxel, docetaxel, aldesleucina, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cladribina, 10-hidroxi-7-etil-camptotecina (SN38), gefitinib, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarubicina, mesna, interferón alfa, interferon beta, irinotecán, mitoxantrona, topotecán, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, postostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, inhibidores de clorambucilo aromatasa, y combinaciones de los mismos.
En una realización, el fármaco se selecciona del grupo que comprende alquilfosfocolinas, inhibidores de la topoisomerasa I, taxoides y suramina.
En una realización, el fármaco (también una citotoxina en este caso) comprende antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU ) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), carboplatino, antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina o glucurónido de doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
En algunos aspectos, el fármaco es una auristatina (patentes estadounidenses n.os 5.635.483; 5.780.588), por ejemplo, MMAE (monometil auristatina E) o MMAF (monometil auristatina F). En otros aspectos, el fármaco es una dolastatina o un análogo o derivado peptídico de dolastatina. Se ha demostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 45:3580-3584 (2001))) y tienen actividad anticancerígena (documento US5.663.149). El resto de fármaco de dolastatina o auristatina puede unirse al compuesto de conjugado a través del extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) terminal del resto de fármaco peptídico. Véase, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO2002/088172.
En otros aspectos, el fármaco es un maitansinoide. En algunos aspectos, el maitansinoide es N 2'-desacetil-N 2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1), N 2'-desacetil-N2'-(4-mercapto-1-oxopentil) -maitansina (DM3) o N 2'-desacetil-N 2'(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4). Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente estadounidense n.° 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente estadounidense n.° 4.151.042). Se dan a conocer maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428;
4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
Los restos de fármaco maitansinoide son restos de fármaco atractivos en conjugados de anticuerpo y fármaco porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) susceptibles de derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de los enlazadores distintos de disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) eficaces contra una variedad de líneas de células tumorales. Se dan a conocer conjugados que contienen maitansinoides, métodos de fabricación de los mismos y su uso terapéutico, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP0425235; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) (inmunoconjugados descritos que comprenden un maitansinoide denominado DM1); y Chari et al., Cancer Research 52:127-13 (1992).
Los maitansinoides se conocen bien en la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se dan a conocer maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.208.020. Los restos de fármaco maitansinoide a modo de ejemplo incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, tales como: C-19-decloro (documento US4.256.746) preparado por reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetil)+/-C-19-decloro (patentes estadounidenses n.os 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o decloración usando LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /-decloro (patente estadounidense n.° 4.294.757) (preparado por acilación usando cloruros de acilo), y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Los restos de fármaco maitansinoide a modo de ejemplo también incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C-9-SH, preparado por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5 (patente estadounidense n.° 4.424.219); C-14-alcoximetil(desmetoxi/cH2OR) (patente estadounidense n.° 4.331.598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc), preparado a partir de Nocardia (patente estadounidense n.° 4.450.254); C-15-hidroxi/aciloxi, preparado por la conversión de maitansinol por Streptomyces (patente estadounidense n.° 4.364.866); C-15-metoxi, aislado de Trewia nudiflora (patentes estadounidenses n.os 4.313.946 y 4.315.929); C-18-N-desmetil, preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces (patentes estadounidenses n.os 4.362.663 y 4.322.348); y 4,5-desoxi, preparado por la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio/LAH (patente estadounidense n.° 4.371.533). Se sabe que muchas posiciones en los compuestos de maitansina son útiles como posición de unión, dependiendo del tipo de unión. Por ejemplo, para formar una unión éster, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo son todas adecuadas.
En algunos aspectos, el fármaco es caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN bicatenario en concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296.
Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, y1I, a2I, a3I, N-acetil-Y11, PSAG y 011 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses anteriormente mencionadas de American Cyanamid).
En algunos aspectos, el fármaco es tubulisina. Las tubulisinas son miembros de una clase de productos naturales aislados de especies mixobacterianas (Sasse et al., J. Antibiot. 53:879-885 (2000)). Como agentes de interacción con el citoesqueleto, las tubulisinas son venenos mitóticos que inhiben la polimerización de la tubulina y conducen a la detención del ciclo celular y la apoptosis (Steinmetz et al., Chem. En t. ed. 43:4888-4892 (2004)); Khalil et al., ChemBioChem. 7:678-683 (2006); Kaur et al., Biochem. J. 396: 235-242 (2006)). Las tubulisinas son moléculas citotóxicas extremadamente potentes, que superan la inhibición del crecimiento celular de cualquier agente quimioterápico tradicional clínicamente relevante, por ejemplo, epotilonas, paclitaxel y vinblastina. Además, son potentes contra líneas celulares resistentes a múltiples fármacos (Domling et al., Mol. Diversity 9:141-147 (2005)). Estos compuestos muestran una alta citotoxicidad sometida a prueba contra un panel de líneas celulares de cáncer con valores de CI50 en el intervalo picomolar bajo; por tanto, son de interés como agentes terapéuticos contra el cáncer. Véase, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO2012/019123.
Se dan a conocer conjugados de tubulisina, por ejemplo, en el documento US7.776.814.
En algunos aspectos, el fármaco es una pirrolobenzodiazepina (PBD). Las PBD son moléculas relativamente pequeñas y algunas tienen la capacidad de reconocer y unirse covalentemente a secuencias específicas en el surco menor del ADN y, por tanto, presentan actividad antibiótica/antitumoral. En la técnica se conocen varias PBD y derivados de las mismas, por ejemplo, dímeros de PBD (por ejemplo, SJG-136 o SG2000), dímeros de PBD insaturados en C2, dímeros de pirrolobenzodiazepina que llevan sustituciones de arilo en C2 (por ejemplo, SG2285), profármaco de dímeros de PBD que se activa por hidrólisis (por ejemplo, SG2285) y polipirrol-PBD (por ejemplo, SG2274). Las PBD se describen adicionalmente en las publicaciones internacionales n.os W02000/012507, WO2007/039752, WO2005/110423, WO2005/085251, y W02005/040170 y la patente estadounidense n.° 7.612.062.
En algunos aspectos, el fármaco es un inhibidor de la topoisomerasa. Los inhibidores de la topoisomerasa son compuestos que bloquean la acción de la topoisomerasa (topoisomerasa I y II), que son enzimas que controlan los cambios en la
estructura del ADN al catalizar la rotura y unión de la estructura principal de fosfodiéster de las hebras de ADN durante el ciclo celular normal.
En una realización, el fármaco es una auristatina, una tubulisina o una pirrolobenzodiazepina (PBD).
En una realización, la auristatina es MMAE (monometil auristatina E) o MMAF (monometil auristatina F).
En una realización, el fármaco es un maitansinoide, por ejemplo, N 2'-desacetil-N 2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1), N 2'-desacetil-N2'-(4-mercapto- 1-oxopentil)-maitansina (DM3) o N 2'-desacetil-N 2'(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4).
Otras definiciones
Antes de describir en detalle las realizaciones proporcionadas, debe entenderse que esta divulgación no se limita a composiciones o etapas de proceso específicas y, como tal, puede variar. Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto claramente dicte lo contrario. En el presente documento los términos "un" (o "uno(a)"), así como los términos "uno(a) o más" y "al menos uno(a)" pueden usarse indistintamente.
Además, cuando en el presente documento se usa "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Igualmente, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que se refiere la presente divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente divulgación.
Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo. Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos, que pueden obtenerse haciendo referencia a la memoria descriptiva como un conjunto. Por consiguiente, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.
Se hace referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, se hace referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Cuando se hace referencia a la posición de los residuos de aminoácidos dentro de un anticuerpo mediante un número, la numeración es según el sistema de numeración KABAT.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluidos, pero sin limitarse a, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares, que van a ser el receptor de un tratamiento concreto. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" pueden usarse indistintamente en referencia a un sujeto humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del principio activo (por ejemplo, un compuesto de conjugado dado a conocer en el presente documento) sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la composición. Tal composición puede comprender uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Tal composición puede ser estéril.
Se entiende que siempre que en el presente documento se describan aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
Composiciones
La presente divulgación se extiende a composiciones que comprenden una molécula descrita en el presente documento), en particular una composición farmacéutica (o composición de diagnóstico) que comprende una molécula de la presente divulgación y un excipiente, diluyente o portador farmacéutico.
La composición habitualmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable en el contexto de una formulación de vacuna.
La divulgación también se extiende a procesos de preparación de dichas composiciones, por ejemplo, la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar una molécula de la presente divulgación, tal como una molécula hidrolizada de la divulgación de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
El anticuerpo de la divulgación puede ser el único principio activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede ir acompañado de otros principios activos.
Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula según la divulgación. El término "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección objetivo, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. La cantidad terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente o bien en ensayos de cultivo celular o bien en modelos animales, habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. Luego, tal información puede usarse para determinar dosis y vías útiles para la administración en seres humanos.
Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.
El portador farmacéuticamente aceptable no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.
Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en tales composiciones, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones, para su ingestión por parte del paciente.
Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, disolución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de la divulgación puede estar en forma seca, para su reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.
Convenientemente, en las formulaciones según la presente divulgación, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo, por ejemplo, si el pH de la formulación es 7, entonces un pI de 8-9 o superior puede ser apropiado. Si querer limitarse a la teoría, se cree que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo permanece en solución.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por cualquiera de varias vías, incluidas, pero sin limitarse a, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También pueden usarse hipopulverizaciones para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Normalmente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, como o bien disoluciones líquidas o bien suspensiones. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.
La administración directa de las composiciones generalmente se realizará mediante inyección por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse a una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.
Está disponible una discusión detallada de los portadores farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Tratamiento
La presente divulgación también se extiende a compuestos para uso en métodos de tratamiento de un paciente que lo necesite administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula según la presente divulgación o una composición, tal como una composición farmacéutica que comprende la misma.
En una realización, se proporciona una molécula de la presente divulgación o una composición que comprende la misma, para su uso en el tratamiento, en particular para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección descrita en el presente documento, tal como cáncer.
En una realización, se proporciona el uso de una molécula de la presente divulgación o una composición que comprende la misma en la fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad descrita en el presente documento, tal como cáncer.
Por tanto, las moléculas de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección patológica. Los anticuerpos proporcionados por la presente invención son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunitarios, trastornos fibróticos y cánceres. El término "enfermedad inflamatoria" o "trastorno" y "enfermedad o trastorno inmunitario" incluye artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad de Still, enfermedad de Muckle Wells, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, SLE (lupus eritematoso sistémico), asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, esclerosis múltiple, vasculitis, diabetes mellitus de tipo I, trasplante y enfermedad de injerto contra huésped.
El término "trastorno fibrótico" incluye fibrosis pulmonar idiopática (IPF), esclerosis sistémica (o esclerodermia), fibrosis renal, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, hipertensión, enfermedad renal terminal, fibrosis peritoneal (diálisis peritoneal ambulatoria continua), cirrosis hepática, degeneración macular relacionada con la edad (ARMD), retinopatía, fibrosis reactiva cardíaca, cicatrización, queloides, quemaduras, úlceras cutáneas, angioplastia, cirugía de derivación coronaria, artroplastia y cirugía de cataratas.
El término "cáncer" incluye un nuevo crecimiento maligno que surge del epitelio, que se encuentra en la piel o, más comúnmente, el revestimiento de los órganos del cuerpo, por ejemplo: mama, ovario, próstata, colon, pulmón, riñón, páncreas, estómago, vejiga o intestino. Los cánceres tienden a infiltrarse en el tejido adyacente y diseminarse (metastatizarse) a órganos distantes, por ejemplo: a los huesos, el hígado, los pulmones o el cerebro.
Los sujetos que van a tratarse pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones, las composiciones están adaptadas para su administración a sujetos humanos.
En el contexto de esta memoria descriptiva, "que comprende" debe interpretarse como "que incluye". Las realizaciones de la invención que comprenden ciertas características/elementos también pretenden extenderse a realizaciones alternativas "que consisten" o "que consisten esencialmente" en los elementos/características relevantes.
Cuando sea técnicamente apropiado, pueden combinarse realizaciones de la invención.
La presente invención se describe adicionalmente a modo de ilustración únicamente en los siguientes ejemplos, que se refieren a las figuras adjuntas, en las que:
SIGLAS NNAA
Aminoácido no natural
DAR
Razón de fármaco:anticuerpo, también usada generalmente para describir la razón de cualquier especie conjugada tal como enlazadores.
BREVE RESUMEN DE LAS FIGURAS
Figura 1.1.
Muestra la espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con furano-NHS.
Figura 1.2.
Muestra espectros de masas desglicosilados reducidos de muestras de AcM-enlazador de furano después de 20 h de reacción con MMAE.
Figura 1.3.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida del producto de reacción de AcM-enlazador de furano alloc lisina.
Figura 2.1.
Diseño general de agentes de reticulación de ciclopentanodieno (A) y ciclopentadieno NNAA (B) descritos en el ejemplo 2.
Figura 3.1.
Muestra la espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con CP1-NHS.
Figura 3.2.
Muestra espectros de masas glicosilados reducidos de productos de reacción de AcM-enlazador de CP1 maleimido MMAE ampliados para mostrar cadenas de AcM tanto pesadas como ligeras.
Figura 3.3.
Muestra espectros de masas desglicosilados reducidos de productos de reacción de AcM-enlazador de CP1 maleimido MMAE ampliados para mostrar la región de cadena pesada de AcM.
Figura 3.4.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida del producto de reacción de AcM-enlazador de CP1 alloc lisina, que indica que no se produjo conjugación.
Figura 4.1.
Muestra la espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con CP1-NHS.
Figura 4.2.
Muestra espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM no modificado, AcM-enlazador de CP1 (denotado como AcM-CP1 dentro de la figura) y AcM-enlazador de CP1 que reaccionó con AM-MMAE (denotado como AcM-CP1 AM-MMAE dentro de la figura) a 15 min y 2,5 h.
Figura 4.3.
Reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE. Se determinó dieno de CP1 sin reaccionar a partir de las intensidades de picos de los espectros de masas desglicosilados reducidos.
Figura 5.1.
Muestra la espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con CP1-NHS.
Figura 5.2.
Muestra los espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM no modificado, AcM modificado con CP-1 y CP1-AcM-enlazador que reaccionó con PM-MMAE a 5 min y 150 min.
Figura 5.3.
Muestra la reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE. A) Concentración molar de dieno de CP1 sin reaccionar a lo largo del tiempo. Se determinó dieno de CP1 sin reaccionar por AcM a partir de las intensidades de picos de los espectros de masas desglicosilados reducidos. B) Gráfico de concentración inversa usado para calcular las velocidades de reacción.
Figura 6.1.
Muestra los títulos de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA tras la expresión en células de mamífero que comprenden TRS mutante o mutant o wt. La concentración final de CP1-NNAA en el medio y el tiempo de alimentación variaron tal como se indica en el eje x.
Figura 6.2.
Muestra el análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA. A) Intervalo de masa que muestra la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de AcM. B) Espectro ampliado que muestra solo la cadena pesada de AcM.
Figura 6.3.
Muestra el análisis de SEC de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA que indica que se obtuvo un producto monomérico. Se indican los sólidos de alto peso molecular (HMWS).
Figura 6.4.
Muestra el análisis de AcM 1C1 K274CP1-NNAA mediante SDS-PAGE.
Figura 6.5.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de productos de conjugación de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA-MMAE.
Figura 6.6.
Muestra el análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de conjugación de AcM 1C1 K274CP1-NNAA-AM-MMAE.
Figura 6.7.
Muestra la estructura química de CP1-NNAA e isómeros del compuesto, que existen como una razón 1:1. Figura 6.8.
Muestra la estructura química del compuesto 50, un análogo de furano de CP1-NNAA descrito en la bibliografía. Este compuesto se usó como control para estudios de expresión con AcM 12G3H11.
Figura 6.9.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de productos de conjugación de AcM 12G3H11 K274CP1-NnAa -MMAE. A) anticuerpo sin reaccionar, B) producto de reacción de AM-MMAE, C) producto de reacción de PM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas como ligeras del anticuerpo.
Figura 6.10.
Muestra el análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de conjugación de AcM 1C1 K274CP1-NNAA-AM-MMAE. A) anticuerpo sin reaccionar, B) producto de reacción de a M-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas como ligeras del anticuerpo y también especies de alto peso molecular.
Figura 7.1.
Muestra la estabilidad en suero de rata de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE. Se incubó ADC en suero de rata a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada (HC). No se observó desconjugación significativa.
Figura 7.2.
Muestra la estabilidad en suero de rata de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE. Se incubó ADC en suero de rata a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada
(HC). No se observó desconjugación significativa, sin embargo, se observó escisión del enlazador en el grupo fenilacetamida. Véase el anexo 7 para la descripción del producto de escisión.
Figura 7.3.
Muestra la estabilidad en suero de ratón de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE. Se incubó ADC en suero de ratón a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada (HC). No se observó desconjugación significativa, sin embargo, se observó escisión del enlazador casi completa en el dipéptido val-cit. Véase el anexo 7 para la descripción del producto de escisión.
Figura 7.4.
Muestra la estabilidad en suero de ratón de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE. Se incubó ADC en suero de ratón a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada (HC). No se observó desconjugación significativa, sin embargo, se observó escisión del enlazador casi completa. Véase el anexo 7 para la descripción de los productos de escisión.
Figura 7.5.
Muestra las estructuras químicas de cargas útiles de MMAE y su peso molecular.
Figura 7.6.
Muestra las estructuras químicas de productos de escisión predominantes observados tras la incubación de ADC en suero de ratón. A) y B) muestran las especies restantes en el anticuerpo (unión de CP1-maleimida no mostrada) para conjugados de AM-MMAE y PM-MMAE, respectivamente. C) Muestra las especies liberadas después de la escisión del dipéptido val-cit.
Figura 7.7.
Muestra la estructura química de productos de escisión de PM-MMAE tras la incubación en suero de rata. A) especies restantes en el anticuerpo y B) especies liberadas.
Figura 8.1.
Diseño general de agentes de reticulación de espirociclopentadieno (A) y espirociclopentadieno NNAA (B) descritos en el ejemplo 8.
Figura 9.1.
Muestra los espectros de masas desglicosilados intactos antes (A) y después (B) de la reacción con CP2-NHS. Los números por debajo de los picos en (B) indican el número de grupos de enlazador de CP2 introducidos en el AcM. La estimación de la introducción del enlazador de CP2 por las intensidades de picos produce 3,29 enlazadores de CP2 por AcM.
Figura 9.2.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de AcM-enlazador de CP2 antes y después de la reacción con AM-MMAE y PM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas como ligeras.
Figura 9.3.
Muestra los espectros de masas desglicosilados reducidos de productos de reacción de AcM-enlazador de CP2 maleimido MMAE. Se amplían los espectros para la cadena pesada de anticuerpo.
Figura 10.1.
Muestra unos espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM-enlazador de CP2 y AcM-enlazador de CP2 que reaccionó con AM-MMAE a 4 h y 48 h. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada solo.
Figura 10.2.
Muestra unos espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM-enlazador de CP2 y AcM-enlazador de CP2 que reaccionó con PM-MMAE a 4 h y 48 h. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada solo.
Figura 10.3.
Muestra la reacción de AcM-CP2-enlazador con maleimido-MMAE. A) Concentración molar de dieno de CP2 sin reaccionar a lo largo del tiempo. Se determinó dieno de CP2 sin reaccionar por AcM a partir de las intensidades de picos de los espectros de masas desglicosilados reducidos. B) Gráfico de concentración inversa usado para calcular las velocidades de reacción.
Figura 11.1.
Muestra los títulos y la viabilidad celular de AcM 12G3H11 K274CP2-NNAA tras la expresión en células de mamífero que comprenden tRS mutante o de tipo natural.
Figura 11.2.
Muestra los espectros de masas desglicosilados de AcM 1C1 K274CP2-NNAA.
Figura 11.3.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada de AcM 1C1 S239CP2-NNAA.
Figura 11.4.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada de AcM de tipo natural 1C1.
Figura 11.5.
Muestra el análisis de SEC de AcM 1C1 K274CP2-NNAA que indica que se obtuvo un producto monomérico.
Figura 11.6.
Muestra el análisis de SEC de AcM 1C1 S239CP2-NNAA que indica que se obtuvo un producto monomérico.
Figura 11.7.
Muestra el análisis de AcM 1C1-K274CP2-NNAA y AcM 1C1-S239CP2-NNAA mediante SDS-PAGE.
Figura 12.1.
Muestra el esquema general para la generación de ADC de AcM-CP2-NNAA y ADC de 239C-AcM.
Figura 12.2.
Muestra el análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de moléculas de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína antes y después de la reacción con AM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada de AcM.
Figura 12.3.
Muestra el análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de moléculas de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína antes y después de la reacción con AM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar la cadena ligera de AcM.
Figura 12.4.
Muestra el análisis de cromatografía de interacción hidrófoba de ADC de AcM-CP2-NNAA y ADC de AcM-cisteína.
Figura 12.5.
Muestra el análisis de cromatografía de alto rendimiento de fase inversa reducido de ADC de AcM-CP2-NNAA y ADC de AcM-cisteína.
Figura 12.6.
Muestra el análisis de SDS-PAGE reducido de ADC de AcM-CP2-NNAA y ADC de AcM-cisteína.
Figura 12.7.
Muestra el análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de ADC de AcM-CP2-NNAA antes y después de la incubación en suero de rata durante 7 días a 37 °C. Se amplían los espectros de masas para mostrar la cadena pesada (HC) solo.
Figura 12.8.
Muestra la cuantificación de DAR de ADC de AcM-CP2-NNAA antes y después de la incubación en suero de rata durante 7 d a 37 °C. Las DAR se calcularon a partir de las alturas de picos de los espectros de masas mostrados en la figura 12.7. Los valores se notifican como la media ± desviación estándar, n=3.
Figura 12.9.
Muestra la citotoxicidad de ADC de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína hacia células cancerosas PC3 in vitro. Figura 13.1.
Muestra posiciones de éster en enlazadores de A) CP1-NHS y B) CP1b-NHS.
Figura 14.1.
Muestra el análisis de espectrometría de masas de conjugados de AcM-CP1b. Los números por encima de los picos indican el número de enlazadores (B y E) o AM-MMAE (C y F) conjugados con el AcM. Todas las muestras se desglicosilaron con EndoS antes del análisis.
Figura 14.2.
Muestra el análisis de espectrometría de masas de conjugados de AcM-F2. Los números por encima de los picos indican el número de enlazadores (B y E) o AM-MMAE (C y F) conjugados con el AcM. Todas las muestras se desglicosilaron con EndoS antes del análisis.
Figura 14.3.
Muestra el análisis de espectrometría de masas de conjugados de AcM-cisteína. Se indican la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de AcM (A-D), así como el número de MMAE conjugados (B y D). Todas las muestras se desglicosilaron con EndoS y se redujeron antes del análisis.
Figura 14.4.
Muestra el análisis de rRP-HPLC de AcM, conjugados de AcM-enlazador y ADC. Se indican la cadena ligera y las cadenas pesadas de AcM, el número de MMAE conjugados con AcM también se indican para muestras de ADC.
Figura 14.5.
Muestra el análisis de SEC de AcM, conjugados de AcM-enlazador y ADC. Se indican especies de alto peso molecular (HMWS).
Figura 14.6.
Muestra la retención del fármaco en ADC tras la incubación en suero de rata durante 7 d.
Figura 14.7.
Muestra la actividad in vitro de ADC hacia A) células NCI-N87 y B) células SκΒR3 positivas para receptor. Figura 14.8.
Muestra la actividad antitumoral de ADC de Herceptin-enlazador hacia modelos de tumor de xenoinjerto de N87 subcutáneo en ratones.
Figura 15.1.
Muestra el análisis de SDS-PAGE de ADC de 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508. A) no reducido B) reducido.
Figura 15.2.
Muestra el análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de conjugación de AcM 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508. A) AcM sin reaccionar B) producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto la cadena pesada (HC) como la cadena ligera (LC) del anticuerpo.
Figura 15.3.
Muestra el análisis de SEC de ADC de 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC que indica que se obtuvo una alta cantidad de producto monomérico. Se indican los sólidos de alto peso molecular (HMWS).
Figura 16.1.
Muestra el análisis de SDS-PAGE de ADC de 1C1 CP2-NNAA AZ1508 y ADC de 1C1 cisteína AZ1508. A) Muestras no reducidas, B) muestras reducidas.
Figura 16.2.
Muestra datos analíticos para el análisis de ADC de 1C1 S239CP2-NNAA AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.3.
Muestra datos analíticos para el análisis de ADC de 1C1 K274CP2-NNAA AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.4.
Muestra datos analíticos para el análisis de ADC de 1C1 N297CP2-NNAA AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.5.
Muestra datos analíticos para el análisis de ADC de 1C1 S239C AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.6.
Muestra datos analíticos para el análisis de ADC de 1C1 K274C AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.7.
Muestra datos analíticos para el análisis de ADC de 1C1 N297C AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 17.1.
Muestra espectros de masas glicosilados reducidos representativos de ADC de 1C1 CP2-NNAA y ADC de 1C1 cisteína-AZ1508 antes y después de la incubación en suero de rata. (A) Posición S239, (B) posición K274, (C) posición N297. Se indican especies no conjugadas y conjugadas.
Figura 17.2.
Muestra la cuantificación de AZ1508 que queda unido a CP2-NNAA o anticuerpos modificados por ingeniería genética con cisteína tras la incubación en suero de rata durante 7 d a 37 °C. Las razones de fármaco:anticuerpo (DAR) se calcularon a partir de espectros de masas glicosilados reducidos. Los datos representan el promedio ± desviación estándar, n=3.
Figura 17.3.
Muestra la cuantificación de AZ1508 que queda unido a CP2-NNAA o anticuerpos modificados por ingeniería genética con cisteína tras la incubación en suero de ratón durante 7 d a 37 °C. Las razones de fármaco:anticuerpo (DAR) se calcularon a partir de espectros de masas glicosilados reducidos. Se consideró AZ1508 desacetilado una especie conjugada para el análisis. Los datos representan el promedio ± desviación estándar, n=3.
Figura 18.1.
Muestra la cinética de conjugación de AcM 1C1 CP1-NNAA y 1C1 CP2-NNAA con AZ1508 medida mediante espectrometría de masas glicosilada reducida. Los datos se representan gráficamente como el promedio ± error absoluto, n=2 1C1 K274CP1-NNAA, 1C1 K274CP2-NNAA y 1C1 N297CP2-NNAA, y promedio ± desviación estándar n=3 para 1C1 S239CP2-NNAA.
Figura 18.2.
Muestra el gráfico de concentración inversa que muestra el consumo de dieno tras la reacción de AcM CP1-NNAA y CP2-NNAA con AZ1508. AcM (A) 1C1 K274CP1-NNAA, (B) 1C1 S239CP2, 1C1 K274CP2-NNAA y N297CP2-NNAA. Los datos se representan gráficamente como el promedio ± error absoluto, n=21C1 K274CP1-NNAA, 1C1 K274CP2-NNAA y 1C1 N297CP2-NNAA, y promedio ± desviación estándar n=3 para 1C1 S239CP2-NNAA.
Figura 19.1.
Muestra la actividad antitumoral de ADC de 1C1 CP2-NNAA AZ1508 contra modelos de tumor de xenoinjerto de PC3 en ratones.
Figura 20.1.
Muestra análisis de dispersión de luz dinámica (DLS) de nanopartículas de oro funcionalizadas con maleimida de 60 nm antes y después de la incubación anticuerpos 1C1 de tipo natural (WT) o 1C1 K274CP1-NNAA (CP1-NNAA AcM) durante 2 h a 25 °C.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Reacción de furano-maleimida para la generación de ADC
La reacción de furano-maleimida se evaluó como una modalidad de conjugación para generar ADC. SynChem, Inc. proporcionó furano-NHS con una pureza del 90 %.
Introducción de la funcionalidad furano sobre AcM: Se instaló la funcionalidad furanodieno sobre AcM IgG1 mediante reacción de aminas primarias de lisina con un enlazador de furano activado por éster de NHS. Este enfoque dio como resultado grupos furano unidos a amida conjugados aleatoriamente con el AcM modificado denominado AcM-enlazador de furano. Obsérvese que el AcM-enlazador de furano puede denotarse como AcM-furano en ciertas figuras, véase la leyendas de las figuras como aclaración. Se ajustó la disolución de AcM a 5 mg/ml (3 ml, 15 mg de AcM, 0,1 |jmol, 1 eq.) con PBS pH 7,2 seguido por la adición de NaHCO31 M al 10 % v/v. Se enfrió esta disolución sobre hielo y se añadieron 30 j l de furano-NHS (disolución madre 10 mM en DMAc, 0,3 jmol, 3 eq.). La reacción transcurrió sobre hielo durante 5 minutos y luego a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se monitorizó el progreso de la reacción mediante espectrometría de masas y se añadió furano-NHS en porciones de 30 j l hasta que se logró un grado de conjugación de ~2 furanos/AcM. En total, se realizaron 3 adiciones de furano-NHS con un volumen total de 90 j l (0,9 jmol, 9 eq.) añadido. Se purificó AcM reaccionado mediante diálisis (Slide-A-Lyzer, MWCO de 10 kDa) frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0 °C durante 24 h.
Reacción de AcM modificado con furano con maleimido-MMAE: Se instalaron cargas útiles de ADC de MMAE sobre AcM-enlazador de furano a través de acoplamiento por cidoadición de Diels-Alder 4+2 de grupos furano a grupos o bien alquil o bien fenil-maleimida contenidos en MMAE. En primer lugar, se combinó disolución de AcM-enlazador de furano (286 μl, 3,5 mg/ml, 6,7 nmol, 1 eq.) con NaH2PO4 al 10 % v/v y DMSO al 20 % v/v. A continuación, se añadió disolución de AM-MMAE o PM-MMAE (10 μl de una disolución madre 10 mM en DMAc, 100 nmol, 15 eq.) a la disolución de anticuerpo. Se tapó la mezcla de reacción bajo atmósfera ambiental y la reacción transcurrió a 37 °C durante 20 h con mezclado. Después de que se completara el periodo de reacción de 20 h, se añadió N-acetilcisteína (8 μl de una disolución 100 mM, 8 equivalentes) y la disolución se incubó adicionalmente a temperatura ambiente durante 15 minutos para extinguir los grupos maleimida. Tras la extinción, se purificaron los conjugados usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) antes del análisis mediante espectrometría de masas desglicosilada tal como se describe a continuación. Se hizo reaccionar alloc-lisina con AcM modificado con enlazador de furano tal como se describió anteriormente usando una disolución madre 200 mM en NaOH 75 mM (10 μl, 2 pmol, 300 equiv.).
Esquema 1.2. A) Reacdón de AcM-enlazador de furano con maleimido-MMAE, B) estructura
química de AM-MMAE y PM-MMAE.
Análisis de espectrometría de masasi En primer lugar, se desglicosilaron AcM o conjugados de AcM con EndoS (New England BioLabs) combinando 50 μl de muestra (AcM 1 mg/ml) con 5 μl de tampón glyco 1 (New England BioLabs) y 5 μl de Remove-iT EndoS (dilución 1:10 en PBS, 20.000 unidades/ml, New England BioLabs) seguido por incubación durante 1 h a 37 °C. Se prepararon muestras reducidas mediante la adición de 5 μl de disolución Bond-Breaker TCEP (0,5 M, Thermo Fisher Scientific) e incubación durante 10 min a 37 °C. Se realizó análisis de espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas Agilent 6520B Q-TOF equipado con una columna de RP-HPLC (ZORBAX 300 Diphenyl RRHD, 1,8 micrómetros, 2,1 mm x 50 mm). Los parámetros de la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (Hp Lc ) fueron los siguientes: velocidad de flujo, 0,5 ml/min; la fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en H2O de calidad para HPLC, y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo. Se equilibró la columna en el 90 % de A/el 10 % de B, que también se usó para desalar las muestras de AcM, seguido por elución en el 20 % de A/el 80 % de B. Se recogieron datos de espec. de masas durante 100-3000 m/z, polaridad positiva, una temperatura del gas de 350 °C, una presión del nebulizador de 48 lb/in2 y un voltaje capilar de 5.000 V. Se analizaron los datos usando el software de análisis cualitativo
MassHunter suministrado por el proveedor (Agilent v.B.04.00) y se usaron las intensidades de picos de los espectros deconvolucionados para derivar la proporción relativa de especies en cada muestra.
Figura 1.1. Espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con furano-NHS.
Figura 1.2. Espectros de masas desglicosilados reducidos de muestras de AcM-enlazador de furano después de 20 h de reacción con MMAE. Se ampliaron los espectros para mostrar la región de masa de la cadena pesada de AcM solo. Se observaron resultados similares para cadenas ligeras de AcM. Se observó que se añadía MMAE a la cadena pesada de AcM con y sin furano, indicando conjugación no específica.
Tabla 1.1. Resumen de reacciones de AcM-enlazador de furano a 37 °C durante 20 horas
Figura 1.3. Análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida del producto de reacción de AcM-enlazador de furano alloc lisina. No se observaron picos correspondientes a la masa esperada del conjugado. La estructura de alloclisina se muestra por debajo del gráfico.
La introducción de la funcionalidad furano en un anticuerpo se logró usando una molécula de furano-NHS reactiva con amida. El grado de funcionalidad furano se controló por la cantidad de furano-NHS usada en la reacción de modificación de AcM. Pudo lograrse más o menos furano ajustando la razón de alimentación molar en consecuencia. La reacción de AcM-enlazador de furano con maleimido-MMAE fue ineficaz y no específica. Ni las cargas útiles de alquil-maleimida ni las de fenil-maleimida lograron más de un 5 % de conjugación específica, incluso después de 20 h de tiempo de reacción a 37 °C. La reacción no específica con AcM (presumiblemente a través de adición de Michael a aminas) fue 12 veces mayor para PM-MMAE en comparación con AM-MMAE, indicando la mayor reactividad de este grupo maleimida. Además, la reacción no específica (presumiblemente para aminas) parecía ser mayor que la reacción específica para furanos en ~ 4 veces para la carga útil de PM-maleimida MMAE. El acoplamiento de furano-maleimida no es propenso para la producción de ADC.
Ejemplo 2. Síntesis de compuestos que contienen ciclopentadieno (CP1)
Se prepararon agentes de reticulación y aminoácidos no naturales (NNAA) basándose en el diseño general mostrado en la figura 2.1.
Materiales y métodos:A menos que se establezca otra cosa, las reacciones se realizaron bajo una atmósfera de N2 usando disolventes de calidad para reactivo. Se almacenaron DCM y tolueno sobre tamices moleculares de 3Á. Se hizo pasar THF sobre una columna de alúmina activada. Todos los reactivos obtenidos comercialmente se usaron tal como se recibieron. Se realizó cromatografía en capa fina (TLC) con placas prerrecubiertas con gel de sílice 60 F254 de E. Merck (0,25 mm) y se visualizó mediante exposición a luz UV (254 nm) o se tiñó con p-anisaldehído, ninhidrina o permanganato de potasio. Se realizó cromatografía en columna ultrarrápida usando gel de sílice en fase normal (60 Á, 0,040 - 0,063 mm, Geduran). Se registraron los espectros de 1H-RMN en espectrómetros Varian (400, 500 o 600 MHz) y se notifican en relación con las señales de disolvente deuterado. Los datos para los espectros de 1H-RMN se notifican tal como sigue: desplazamiento químico (5 ppm), multiplicidad, constante de acoplamiento (Hz) e integración. Se registraron los espectros de 13C-RMN en espectrómetros Varian (100, 125 o 150 MHz).
Los datos para los espectros de 13C-RMN se notifican en cuanto al desplazamiento químico (5 ppm). Los espectros de masas se obtuvieron de la instalación de espectrometría de masas de UC Santa Barbara en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de alta resolución GCT Premier (Waters Corp.) con una fuente de desorción de campo (FD).
Síntesis de CP1-NNAA (4)
Isómeros de 2-(ciclopentadienil)etanol (1):
Se añadió bromoacetato de metilo (6,0 ml, 63 mmol, 1,05 eq.) a THF (60 ml) y se enfrió hasta -78 °C. Se añadió ciclopentadienuro de sodio (disolución 2 M en THF, 30 ml, 60 mmol, 1 eq.) gota a gota a lo largo de 10 min. Se agitó la reacción a -78 °C durante 2 h. Se extinguió la reacción con H2O (6 ml) y gel de sílice (6 g) y se permitió que se calentara hasta ta. Se filtró la mezcla de reacción a través de un tapón de sílice, luego se enjuagó con DCM (100 ml). Se combinaron las fases orgánicas y se eliminó el disolvente para producir isómeros de 2-(ciclopentadienil)acetato de metilo (1:1) como un aceite marrón, que se usó directamente en la siguiente etapa.
Se añadió LAH (4,55 g, 120. mmol, 2 eq.) a THF (300 ml) y se enfrió hasta 0 °C. Se añadió 2-(ciclopentadienil)acetato de metilo en bruto (60 mmol) en THF (10 ml) gota a gota en 4 porciones a lo largo de 1 h. Se permitió que la reacción se calentara hasta ta y se agitó hasta el consumo del material de partida (TLC, 2 h). Se enfrió la reacción hasta 0 °C y se extinguió lentamente con H2O (10 ml) gota a gota, luego NaOH (4 M en H2O, 5 ml). Se añadió H2O (20 ml), se filtró la mezcla y se enjuagó con Et2O (100 ml). Se combinaron los filtrados y se eliminó el disolvente. Se disolvió el residuo en salmuera (100 ml) y se extrajo con Et2O (3 x 100 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se eliminó el disolvente. Se filtró el residuo a través de un tapón de sílice (hexano:EtOAc, 2:1) y se eliminó el disolvente para producir 1 (5,45 g, 83 %) como un aceite ámbar. Para impedir la dimerización, 1 debe almacenarse congelado en una matriz de benceno.
Rf (hexano:EtOAc, 4:1): 0,11; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 56,50 - 6,13 (m, 3 H), 3,81 (td, J = 6,3, 10,1 Hz, 2 H), 3,01 (d, J= 1,6 Hz, 1 H), 2,95 (d, J= 1,6 Hz, 1 H), 2,70 (dt, J= 1,2, 6,5 Hz, 1 H), 2,66 (dt, J= 1,4, 6,4 Hz, 1 H), 1,52 (s, 1 H) ppm.
Se añadió 2 (2,86 g, 26,0 mmol, 1 eq.) a DCM (100 ml) y se enfrió hasta 0 °C. Se añadió piridina (5,2 ml, 65 mmol, 2,5 eq.) seguido por cloroformiato de 4-nitrofenilo (5,76 g, 28,6 mmol, 1,1 eq.) en 2 porciones a lo largo de 10 min. Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción hasta el consumo del material de partida (TLC, 40 min). Se vertió la reacción en un embudo de decantación y se lavó con NH4Cl saturado en H2O (100 ml). Se extrajo la fase acuosa con DCM (100 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se eliminó el disolvente. Se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 6:1) para producir 2 (5,69 g, 80 %) como un aceite amarillo que solidifica en el congelador.
Rf (hexano:EtOAc, 4:1): 0,43; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 58,34 - 8,24 (m, 2 H), 7,40 - 7,34 (m, 2 H), 6,56 - 6,13 (m, 3 H), 4,47 (td, J= 6,8, 10,2 Hz, 2 H), 3,02 (d, J= 0,8 Hz, 1 H), 2,98 (d, J= 1,2 Hz, 1 H), 2,88 (dtd, J= 1,0, 6,9, 16,1 Hz, 2 H) ppm.
Se añadió 2 (3,60 g, 13,1 mmol, 1 eq.) a DMF (30 ml), seguido por Fmoc-Lys-OH (5,78 g, 15,7 mmol, 1,2 eq.) y DIPEA (5,4 ml, 32 mmol, 2,4 eq.). Se agitó la reacción hasta el consumo del material de partida (RMN, 3,5 h), luego se vertió en EtOAc (100 ml) y H2O (140 ml). Se acidificó la fase acuosa con HCl (1 M, 60 ml), se vertió en un embudo de decantación y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (2 x 100 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se eliminó el disolvente. Se sometió el residuo a
cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 3:1 luego DCM:MeOH:AcOH, 89:10:1) para producir 3 (4,73 g, 72 %) como una espuma blanca.
Rf (DCM:MeOH:AcOH, 89:10:1): 0,50; 1H RMN (400 MHz, CDCls) 57,76 (d, J = 7,4 Hz, 2 H), 7,66 - 7,56 (m, 2 H), 7,39 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 7,31 (t, J = 7,2 Hz, 2 H), 6,57 - 5,96 (m, 3 H), 5,85 - 5,54 (m, 1 H), 4,84 - 4,11 (m, 7 H), 3,27 - 2,61 (m, 6 H), 1,99 - 1,11 (m, 6 H) ppm.
CP1-NNAA(4):
Se añadió 3 (4,61 g, 9,13 mmol, 1 eq.) a DMF (130 ml), seguido por piperidina (14,4 ml). Se agitó la reacción hasta el consumo del material de partida (TLC, 90 min), luego se eliminó el disolvente. Se añadió Et2O (100 ml) al residuo, y se sonicó la suspensión durante 5 min. Se filtró la suspensión y se enjuagó con Et2O (100 ml). Se suspendió el sólido en MeOH (10 ml), se agitó durante 10 min, se añadió Et2O (40 ml), se filtró la suspensión y se enjuagó con Et2O (50 ml). Se secó el compuesto a vacío para producir 4 (2,15 g, 84 %) como un polvo tostado.
1H RMN (400 MHz, Metanol-d4 una gota TFA) 56,53 - 6,07 (m, 3 H), 4,29 - 4,11 (m, 2 H), 3,96 (t, J = 6,3 Hz, 1 H), 3,11 (t, J = 1,0 Hz, 2 H), 3,01 - 2,62 (m, 3 H), 2,02 - 1,81 (m, 2 H), 1,62 - 1,35 (m, 4 H) ppm; MS (FD) Masa exacta calc. Para C14H22N2O4 [M+H]+: 283,17, hallada: 283,19.
Síntesis de CP1-NHS (6)
Isómeros de ácido 4-(2-(ciclopentadienil)etoxi)-4-oxobutanoico (5):
Se añadió DCM (1,5 ml) a un vial que contenía 1 (0,33 g, 3,0 mmol, 1 eq.). Se añadieron Et3N (0,42 ml, 3,0 mmol, 1 eq.), DMAP (37 mg, 0,30 mmol, 0,1 eq.) y anhídrido succínico (0,33 g, 3,3 mmol, 1,1 eq.), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta hasta el consumo del material de partida (TLC, 60 min). Se vertió la mezcla de reacción en un embudo de separación con DCM (50 ml) y se extrajo con HCl acuoso (1 M, 50 ml), luego H2O (50 ml). Se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y se eliminó el disolvente para producir 5 (0,57 g, 90 %) como un polvo tostado.
Rf (EtOAc): 0,67; 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 11,49 (s a., 1 H), 6,49 - 6,05 (m, 3 H), 4,27 (td, J = 7,0, 9,0 Hz, 2 H), 2,94 (d, J = 17,6 Hz, 2 H), 2,80 - 2,56 (m, 6 H) ppm.
CP1-NHS (6):
Se añadió THF (10 ml) a un vial que contenía 5 (0,42 g, 2,0 mmol, 1 eq.). Se añadieron NHS (0,32 g, 2,8 mmol, 1,4 eq.), EDCHCl (0,46 g, 2,4 mmol, 1,2 eq.) y DCM (5 ml), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta durante la noche. Se eliminó el disolvente y se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 1:1) para producir 6 (0,48 g, 78 %) como un aceite viscoso y transparente. CP1-NHS se denomina enlazador de CP1 tras la conjugación con anticuerpos.
Rf (hexano:EtOAc, 1:1): 0,38; 1H RMN (400 MHz, CDCls) 56,49 - 6,40 (m, 3 H), 6,31 (dd, J = 1,2, 5,1 Hz, 1 H), 6,25 (td, J = 1,5, 2,8 Hz, 1 H), 6,11 (td, J = 1,8, 3,0 Hz, 1 H), 4,30 (td, J= 7,0, 9,0 Hz, 4 H), 3,00 - 2,90 (m, 8 H), 2,85 (s a., 8 H), 2,80 - 2,68 (m, 8 H); 13C RMN (125 MHz, CDCls) 5170,8, 170,8, 168,9, 168,8, 167,6, 167,6, 144,3, 142,3, 134,2, 134,1, 132,3, 131,4, 128,4, 128,0, 64,5, 64,2, 43,5, 41,4, 29,7, 29,0, 28,7, 26,2, 25,5 ppm.
La síntesis de aminoácido no natural (NNAA) funcionalizado con ciclopentadieno (CP) comenzó con la reacción de NaCp disponible comercialmente con bromoacetato de metilo. El éster en bruto se redujo con LAH al alcohol 1, que se obtuvo como una mezcla de isómeros (~1:1). 1 se dimerizará cuando se almacena a -20 °C, debe almacenarse congelado en una matriz de benceno o usarse inmediatamente. La reacción de 1 con cloroformiato de 4-nitrofenilo produjo el carbamato activado 2, que puede almacenarse durante varias semanas a -20 °C. Se intentó la reacción de 2 con lisinato de cobre, pero el aislamiento de NNAA 4 tras el tratamiento con 8-hidroxiquinolina o EDTA no fue fructífero. La reacción de 2 con Boc-Lys-OH proporcionó el NNAA protegido con Boc en un 71 % (o directamente a partir de 1 usando trifosgeno en un 38 %) pero los esfuerzos por eliminar el grupo Boc usando TFA, ácido fórmico o ácido de Lewis condujeron a una rápida descomposición del anillo de CP. La reacción de 2 con Fmoc-Lys-OH produce el 3 protegido con Fmoc, que podría desprotegerse usando piperidina para obtener el NNAA 4. El compuesto 4 tiene escasa solubilidad en disolventes deuterados comúnmente usados. Puede añadirse una gota de TFA para aumentar la solubilidad, pero conduce a descomposición después de varias horas. Los protones de CP en 4 se intercambian cuando se disuelve en D2O con NaOH catalítico debido a desplazamientos secuenciales de [1,5]-hidruro.
La síntesis de un éster de NHS funcionalizado con CP1 comenzó con la reacción de 1 con anhídrido succínico para producir el ácido 5. El ácido 5 se hizo reaccionar con EDCHCl y N-hidroxisuccinimida para producir el éster de NHS 6. A temperatura ambiente, el anillo de CP en 6 se dimerizará a lo largo de varios días, pero puede almacenarse durante más de un mes a -20 °C.
Ejemplo 3. Conjugación de dieno de CP1-maleimida para la preparación de ADC por medio de AcM modificado con agente de reticulación
Se evaluaron reacciones de ciclopentadieno-maleimida para la bioconjugación, donde se introdujeron grupos ciclopentadieno por medio de un enlazador.
Introducción de la funcionalidad CP1 sobre AcM: Se instaló la funcionalidad dieno de CP1 sobre AcM IgG 1 mediante reacción de aminas primarias de lisina con CP1-NHS (compuesto 6). Este enfoque dio como resultado grupos ciclopentadieno unidos a amida conjugados aleatoriamente, con el AcM modificado denominado AcM-enlazador de CP1. Obsérvese que el AcM-enlazador de CP1 también puede denominarse AcM-CP1 en algunas figuras, véase la leyenda de las figuras como aclaración. Una reacción de modificación de AcM típica se describe tal como sigue. Se ajustó la disolución de AcM a 5 mg/ml (3 ml, 15 mg de AcM, 100 nmol, 1 eq.) con PBS pH 7,2 seguido por la adición de NaHcO31 M al 10 % v/v. Esta disolución se enfrió sobre hielo y se añadieron 30 |jl de CP1-NHS (disolución madre 10 mM en DMAc, 300 nmol, 3 equivalentes). La reacción transcurrió sobre hielo durante 5 minutos seguido por reacción a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se purificó AcM reaccionado mediante diálisis (Slide-A-Lyzer, MWCO de 10 kDa) frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0 °C durante 24 h. Se cuantificó la introducción de enlazador de CP1 mediante espectrometría de masas desglicosilada intacta tal como se describe a continuación y se encontró que era de 2,3 CP1 por AcM en este ejemplo, lo que corresponde a un 77 % de conversión de CP1-NHS en conjugado de anticuerpo. Se describe un resumen de los resultados para esta reacción realizada en diversas condiciones en el anexo A3.1.
Reacción de AcM modificado con CPI con maleimido-MMAE¿ Se diluyó AcM-enlazador de CP1 (2,3 dieno de CP1/AcM, 1 mg, AcM 6,7 nmol, 1 equivalente) con PBS (pH 7,4) hasta una concentración final de 3,5 mg/ml. A continuación, se añadió DMSO para producir una disolución al 20 % v/v seguido por la adición de fosfato de sodio monobásico 1 M para producir una disolución al 10 % v/v. La adición de todos los componentes de la disolución produjo una mezcla que comprendía AcM 2,7 mg/ml, dieno de CP1 41,4 ^M, DMSO 1,78 M, fosfato de sodio 110 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5. Se añadió AM-MMAE o PM-MMAE (10 ^l de una disolución madre 10 mM en DMAc, 100 nmol, 15 equivalentes) a la disolución de anticuerpo. La mezcla de reacción se agitó con vórtex brevemente y se permitió que transcurriera a 22 °C o 37 °C con mezclado. Después de 4 h de reacción, se añadió N-acetilcisteína (8 ^l de una disolución 100 mM, 120 equivalentes) para extinguir los grupos maleimida sin reaccionar. Entonces se purificaron las muestras usando dispositivos p D Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla. Entonces se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas desglicosilada reducida tal como se describe a continuación.
Esquema 3.2. Reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido MMAE.
Análisis de espectrometría de masas: Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Figura 3.1. Espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con CP1-NHS. Los números por debajo de los picos en (B) indican el número de grupos de CP1-enlazador introducidos en el AcM. Obsérvese que el conjunto de picos de MW mayor en (A) representan AcM glicosilado. La estimación de la introducción del enlazador de CP1 por las intensidades de picos produce 2,3 enlazadores de CP1 por AcM.
Tabla 3.1 Resumen de reacciones de CP1-NHS AcM
Figura 3.2. Espectros de masas glicosilados reducidos de productos de reacción de AcM-enlazador de CP1 maleimido-MMAE. Ampliado para mostrar tanto las cadenas pesadas como ligeras de AcM.
Figura 3.3. Espectros de masas desglicosilados reducidos de productos de reacción de AcM-enlazador de CP1 maleimido MMAE ampliados para mostrar la región de cadena pesada de AcM. DAR-0 indica ausencia de MMAE conjugado con la cadena pesada de AcM, DAR-1 indica un MMAE conjugado con la cadena pesada de AcM y DAR-2 indica dos MMAE conjugados con la cadena pesada de AcM. No se detectaron picos de enlazador de CP1 no conjugado en el producto de reacción y todos los picos de conjugado de MMAE se rastrearon a partir de los correspondientes picos de enlazador de CP1 de cadena pesada, indicando que la conjugación era específica para grupos de enlazador de CP1.
Tabla 3.2. Resumen de las reacciones de AcM-enlazador de CP1 maleimido-MMAEa
Figura 3.4. Análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida del producto de reacción de AcM-enlazador de CP1 alloc lisina. No se observaron picos correspondientes a la masa esperada del conjugado.
Los grupos de dieno de CP1 instalados sobre la superficie de los anticuerpos reaccionaron completamente con profármacos de maleimido-MMAE en el plazo de 4 h a temperatura ambiente. No se observó conjugación inespecífica mediante espectrometría de masas, ya que todos los picos de conjugados de CP1-MMAE se rastrearon a partir de picos de AcM-enlazador de CP1, no picos de AcM sin modificar (es decir, que carecen de enlazador de CP1). Esto contrasta fuertemente con reacciones de AcM-enlazador de furano con maleimido MMAE, donde solo se observó un -2-20 % de conjugación, incluida conjugación inespecífica después de 20 h a 37 °C. La conjugación de dieno-maleimida con AcM-enlazador de CP1 es una mejora sobre el acoplamiento basado en AcM-enlazador de furano.
Ejemplo 4. Cinética de conjugación de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE a 0,6 equivalentes molares de maleimido-MMAE con respecto a grupos dieno contenidos en CP1-AcM-enlazador
Se investigó la cinética de reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido MMAE a la estequiometría de 0,6 equivalentes molares de maleimido-MMAE con respecto a dieno contenidos en AcM-enlazador de CP1.
Introducción de la funcionalidad CP1 sobre AcM: Se instaló la funcionalidad dieno de CP1 sobre AcM IgG 1 mediante reacción de aminas primarias de lisina con CP1-NHS (compuesto 6). Este enfoque dio como resultado grupos ciclopentanodieno unidos a amina conjugados aleatoriamente. El conjugado resultante se denominó AcM-enlazador de CP1 y también puede denominarse AcM-CP1, véanse las leyendas de las figuras como aclaración. Se ajustó la disolución de AcM a 3,7 mg/ml (3 ml, 11,1 mg de AcM, 74 nmol, 1 eq.) con PBS pH 7,2 seguido por la adición de NaHCO31 M al 10 % v/v. Esta disolución se enfrió sobre hielo y se añadieron 40 |jl de CP1-NHS (disolución madre 10 mM en DMAc, 400 nmol, 5,4 equivalentes). La reacción transcurrió a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se purificó AcM reaccionado mediante diálisis (Slide-A-Lyzer, MWCO de 10 kDa) frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0 °C durante 24 h. Se cuantificó la introducción de dieno de CP1 mediante espectrometría de masas desglicosilada intacta tal como se describe a continuación y se encontró que era de 3,99 dienos de CP1 por AcM, lo que corresponde a un 74 % de conversión de CP1-NHS en conjugado de anticuerpo.
Reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE: Se diluyó AcM modificado con CP1 (3,99 dieno de CP1/AcM, 3 mg, 80 nmol de dieno de CP1, 1 equivalente) con PBS (pH 7,4) hasta una concentración final de 1,7 mg/ml. A continuación, se añadió DMSO para producir una disolución al 20 % v/v seguido por la adición de fosfato de sodio monobásico 1 M para producir una disolución al 10 % v/v. La adición de todos los componentes de la disolución produjo una mezcla que comprendía AcM 1,3 mg/ml, dieno de CP1 34,6 jM , DMSO 1,78 M, fosfato de sodio 110 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5. Se añadió disolución madre de AM-MMAE o PM-m Ma E (5,2 j l de una disolución madre 10 mM en DMSO, 52 nmol, 0,67 equivalentes) a la disolución de anticuerpo. La mezcla de reacción se agitó con vórtex brevemente y se permitió que transcurriera a 22 °C con mezclado. Se retiraron alícuotas (180 j l) a diversos puntos de tiempo y se añadió N-acetilcisteína (2 j l de una disolución 100 mM, 38 equivalentes) para extinguir los grupos maleimida. Entonces se purificaron las muestras usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla. Entonces se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas desglicosilada reducida tal como se describe a continuación.
Análisis de espectrometría de masas: Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Cálculo de las constantes de velocidad de reacción de dieno de CP1-maleimida: Se determinaron las constantes de velocidad de segundo orden para la reacción de maleimido-MMAE con dienos de anticuerpo a partir de las intensidades de picos en espectros de masas glicosilados reducidos. Se monitorizó el progreso de la reacción mediante tanto la desaparición de los picos de AcM-enlazador de CP1 como la aparición de picos de AcM-enlazador de CP1-AM MMAE, pero solo se usaron las intensidades de picos de AcM-enlazador de CP1 en las cadenas pesadas de anticuerpos para calcular la abundancia relativa de dieno de CP1 reaccionado. La cantidad relativa de grupos dieno de CP1 sin reaccionar en las cadenas pesadas de AcM se calculó usando la ecuación a continuación:
1. a = intensidad de pico de cadena pesada sin modificar
2. b = suma de intensidades de picos de cadenas pesadas con un grupo de enlazador de CP1
3. c = suma de intensidades de picos de cadenas pesadas con dos grupos de enlazador de CP1
4. d = intensidad de pico de cadena pesada con tres grupos de enlazador de CP1
Nota: también se incluyeron cadenas pesadas que contenían maleimido-MMAE en el cálculo. Por ejemplo, se incluirían enlazador de CP1-2 1 maleimido-MMAE como especie de enlazador de CP1-1.
Resultados
Figura 4.1. Espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con CP1-NHS.
Figura 4.2. Espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM sin modificar, AcM-enlazador de CP1 (AcM-CP1) y AcM-enlazador de CP1 que reaccionó con AM-MMAE (AcM-CP1 AM-MMAE) a 15 min y 2,5 h.
Figura 4.3. Reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE a lo largo del tiempo. Se determinó dieno sin reaccionar a partir de las intensidades de picos de los espectros de masas desglicosilados reducidos.
Tabla 4.1 Resumen de resultados de conjugación de AcM-enlazador de CP1a
La reacción de dienos de CP1 (contenidos en AcM-enlazador de CP1) con maleimido-MMAE fue rápida y específica en condiciones acuosas, con una reacción completa lograda del orden de decenas de minutos. Las razones de alimentación molar calculadas de maleimido-MMAE coinciden con el grado de conjugación observado a partir del espectro de masas intacto, ya que la alimentación molar de MMAE y la conversión de dieno en conjugado eran esencialmente las mismas.
Ejemplo 5. Cinética de conjugación de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE a 1,0 equivalentes molares de maleimido-MMAE con respecto a grupos dieno
Se evaluó la cinética de reacción de dienos de CP1 con maleimido MMAE a 22 °C.
Introducción de la funcionalidad CP1 sobre AcM: Se instaló la funcionalidad dieno de CP1 sobre AcM IgG 1 mediante reacción de aminas primarias de lisina con CP1-NHS (compuesto 6). Este enfoque dio como resultado grupos ciclopentanodieno unidos a amina conjugados aleatoriamente. Se ajustó la disolución de AcM a 5 mg/ml (3 ml, 5 mg de AcM, 100 nmol, 1 eq.) con PBS pH 7,2 seguido por la adición de NaHCO31 M al 10 % v/v. Esta disolución se enfrió sobre hielo y se añadieron 40 ^l de CP1-NHS (disolución madre 10 mM en DMAc, 400 nmol, 4 equivalentes). La mezcla de reacción se agitó con vórtex brevemente y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se purificó AcM reaccionado mediante diálisis (Slide-A-Lyzer, MWCO de 10 kDa) frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0 °C durante 24 h. Se cuantificó la introducción de dieno de CP1 mediante espectrometría de masas desglicosilada intacta tal como se describe a continuación y se encontró que era de 3,7 dienos de CP1 por AcM, lo que corresponde a un 92 % de conversión de CP1-NHS en conjugado de anticuerpo.
Reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE: Se diluyó AcM-enlazador de CP1 (3,7 dieno de CP1/AcM, 3 mg, dieno de CP1 74 nmol, 1 equivalente) con PBS (pH 7,4) hasta una concentración final de 1,7 mg/ml. A continuación, se añadió DMSO para producir una disolución al 20 % v/v seguido por la adición de fosfato de sodio monobásico 1 M para producir una disolución al 10 % v/v. La adición de todos los componentes de la disolución produjo una mezcla que comprendía AcM 1,3 mg/ml, dieno de CP1 32,3 ^M, DMSO 1,78 M, fosfato de sodio 110 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5. Se añadió disolución madre de AM-MMAE o PM-Mm AE (7,4 ^l de una disolución madre 10 mM en DMSO, 74 nmol, 1 equivalente) a la disolución de anticuerpo. La mezcla de reacción se agitó con vórtex brevemente y se permitió que transcurriera a 22 °C con mezclado. Se retiraron alícuotas (180 |jl) a diversos puntos de tiempo y se añadió N-acetilcisteína (3 ^l de una disolución 100 mM, 51 equivalentes) para extinguir los grupos maleimida sin reaccionar. Entonces se purificaron las muestras usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla. Entonces se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas desglicosilada reducida tal como se describe a continuación.
Análisis de espectrometría de masas: Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Cálculo de las constantes de velocidad de reacción de dieno de CP1-maleimida:_Se determinaron las constantes de velocidad de segundo orden para la reacción de maleimido-MMAE con dienos de AcM a partir de las intensidades de picos en espectros de masas desglicosilados reducidos. Se monitorizó el progreso de la reacción mediante tanto la desaparición de los picos de AcM-enlazador de CP1 como la aparición de picos de AcM-enlazador de CP1-maleimido MMAE, pero solo se usaron las intensidades de picos de AcM-enlazador de CP1 en las cadenas pesadas de anticuerpos para calcular la abundancia relativa de dienos de CP1 reaccionados. Se calcularon los grupos dieno de CP1 sin reaccionar en AcM-enlazador de CP1 usando la ecuación a continuación:
1. a = intensidad de pico de cadena pesada sin modificar
2. b = suma de intensidades de picos de cadenas pesadas con un grupo de enlazador de CP1
3. c = suma de intensidades de picos de cadenas pesadas con dos grupos de enlazador de CP1
4. d = intensidad de pico de cadena pesada con tres grupos de enlazador de CP1
5. e = intensidad de pico de cadena ligera sin modificar
6. f = suma de intensidades de picos de cadenas ligeras con un grupo de enlazador de CP 1
7. g = suma de intensidades de picos de cadenas ligeras con dos grupos de enlazador de CP1
Se analizaron adicionalmente los datos de conjugación en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Se determinaron las constantes de velocidad de segundo orden a partir de las pendientes de curvas generadas a partir de la representación gráfica de 1/[CP1] frente al tiempo y análisis de regresión lineal. Se calcularon las semividas de reacción a partir de las constantes de velocidad de reacción de segundo orden usando la ecuación mostrada a continuación:
k 2 = constante de velocidad de segundo orden
[CP1]0= concentración de dieno de CP1 a tiempo=0
Figura 5.1. Espectrometría de masas desglicosilada intacta antes (A) y después (B) de la reacción de AcM con CP1-NHS. Los números por encima de los picos indican el número de grupos de enlazador de CP1 presentes en esa especie de AcM.
Figura 5.2. Espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM sin modificar, AcM-enlazador de CP1 (AcM-CP1) y AcM-enlazador de CP1 que reaccionó con PM-MMAE (AcM-CP1 PM-MMAE) a 5 min y 150 min. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada solo.
Figura 5.3. Reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido-MMAE. A) Concentración molar de dieno de CP1 sin reaccionar a lo largo del tiempo. Se determinó dieno de CP1 sin reaccionar por AcM a partir de las intensidades de picos de los espectros de masas desglicosilados reducidos. B) Gráfico de concentración inversa usado para calcular las velocidades de reacción.
Tabla 5.1 Resumen de la cinética de acoplamiento de dieno-maleimida para la reacción de AcM-enlazador de CP1 con maleimido MMAEabc
Carga útil Constant t i /2 (min) con
PM-MMAE 54 ± 1,2 8,9 97 "todas las reacciones de conjugación realizadas a pH 5,5, DMSO al 20 %, 22 °C y AcM modificado con CP1 1,3 mg/ml bla razón molar de MMAE:dieno de CP1 usada fue 1:1
ccalculado a partir de las intensidades de picos de espectros de masas desglicosilados reducidos
La reacción de dienos de CP1 con maleimido-MMAE fue rápida y específica, con semividas del orden de varios minutos. La conversión de la reacción fue del 90 % o más para ambos maleimido-MMAE. Las velocidades de reacción de fenilmaleimida fueron ligeramente mayores que las velocidades de alquilmaleimida, sin embargo, las velocidades y la conversión final fueron comparables entre los dos tipos de maleimidas.
Ejemplo 6. Incorporación de CP1-NNAA en un anticuerpo
Se incorporó CP1-NNAA en la posición K274 de un anticuerpo, se evaluaron la calidad del AcM expresado y la reactividad de dieno de CP1 tras la incorporación del anticuerpo.
Preparación de la disolución madre de CP1-NNAA: Se combinó CP1-NNAA (0,5 g, 1,77 mmol) con 6,81 ml de H2O y 1,38 ml de NaOH 1 M. Se agitó la suspensión resultante a temperatura ambiente hasta que se disolvieron todos los sólidos (10 minutos). Tras completarse la disolución, la disolución de color amarillo claro se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 μm, se tomaron alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Este procedimiento dio como resultado 8,2 ml de disolución madre de CP1 216 mM y NaOH 168 mM.
Expresión de anticuerpos: Los genes de anticuerpos IgG1 12G3H11 o 1C1 con una mutación ámbar en la posición de Fc K274 o S239 se clonaron en un vector de expresión de anticuerpos pOE patentado. El constructo se transfectó en CHO-G22 mediante PEImax (1,5 l de células g 22), junto con un plásmido que codifica para el mutante doble de PylRS (Y306A/Y384F) o PylRS de tipo natural y un plásmido que contiene repeticiones en tándem del casete de expresión de ARNt (pORIP 9X ARNt). Cuatro horas después de la transfección, se añadieron a las células el 3,3 % de alimentación F9 (patentada) y el 0,2 % de alimentación f 10 (patentada) y se incubaron adicionalmente las células a 34 °C. Se añadió CP1-NNAA el día siguiente a una concentración final de 0,26 mM para células transfectadas con 1C1.K274. Se alimentaron de nuevo las células el día 3 y día 7 con el 6,6 % de alimentación F9 y el 0,4 % de alimentación F10. Se centrifugaron las células y se recogió el sobrenadante el día 11. Se purificó el sobrenadante mediante una columan de afinidad IgSelect (GE Health Care Life Science). Se eluyó el anticuerpo con glicina 50 mM, NaCl 30 mM, tampón de elución pH 3,5, se neutralizó con tampón Tris 1 M pH 7,5 y se dializó en PBS, pH 7,2. Se determinó la concentración de anticuerpo eluido mediante medición de la absorbancia a 280 nm. El título retrocalculado fue de 47 mg/l para AcM 1C1.K274.12G3H11 que se expresó de una manera similar a menor escala, con variación de la concentración de alimentación de CP1-NNAA y los tiempos de alimentación. Se analizó el anticuerpo recuperado mediante SDS-PAGE usando métodos convencionales. Se analizó también el anticuerpo mediante cromatografía de exclusión molecular y espectrometría de masas tal como se describe a continuación. Los anticuerpos que incorporan CP1-NNAA se denotan como AcM-CP1-NNAA para distinguirlos de constructos de AcM-enlazador de Cp1, o AcM-[posición]CP1-NNAA donde [posición] indica el número de aminoácido y el símbolo de aminoácido que se mutó a CP1-NNAA.
Cromatografía de exclusión molecular (SEC):_Se realizó análisis de SEC usando un sistema de LC capilar Agilent 1100 equipado con una matriz de detectores triple (Viscotek 301, Viscotek, Houson, TX); la longitud de onda se fijó en 280 nm y las muestras se procesaron en una columna TSK-GEL G3000SWXL (Toso Bioscience LLC, Montgomeryville, PA) usando tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 6,8 a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
Conjugación de AcM-CP1-NNAA con maleimido MMAE:_Se ajustó AcM-CP1-NNAA (0,4 mg, 2,7 nmol, 1 equivalente) a 3 mg/ml con PBS (0,133 ml). Se añadieron DMSO (27 μl) y fosfato de sodio monobásico 1 M (13 μl) para producir una disolución al -20 % y 10 % v/v, respectivamente. Se añadió maleimido-MMAE (5 μl de disolución madre 10 mM en DMSO, 13 nmol, 5 equivalentes) a disolución de AcM-CP1-NNAA y la mezcla se agitó con vórtex brevemente. Se prepararon ADC con tanto AM-MMAE como PM-MMAE. La reacción transcurrió a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se añadió N-acetilcisteína (1,1 μl de 100 mM, 108 nmol, 40 equivalentes) y se incubó la disolución durante 15 min adicionales para extinguir los grupos maleimida sin reaccionar. Entonces se purificaron las muestras usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla. Posteriormente se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas reducida tal como se describe a continuación.
Esquema 6.1. A) Reacción de AcM-CPl-NNAA con maleimido MMAE. Se incorporó
CP1-NNAA en la posición K274 mediante mutación de lisina a CP1-NNAA.
Análisis de espectrometría de masas: Para el análisis de AcM desglicosilado, se combinó EndoS (5 μl de Remove-iT EndoS (dilución 1:10 en PBS, 20.000 unidades/ml, New England BioLabs) con 50 μl de muestra (AcM 1 mg/ml) y 5 μl de tampón glyco 1 (New England BioLabs) y seguido por incubación durante 1 h a 37 °C. Se prepararon muestras reducidas mediante la adición de 5 μl de disolución Bond-Breaker TCEP (0,5 M, Thermo Fisher Scientific) e incubación durante 10 min a 37 °C. Se realizó análisis de espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas Agilent 6520B Q-TOF equipado con una columna RP-HPLC (ZORBAX 300 Diphenyl RRHD, 1,8 micrómetros, 2,1 mm x 50 mm). Los parámetros de la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) fueron los siguientes: velocidad de flujo, 0,5 ml/min; la fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en H2O de calidad para HPLC, y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo. Se equilibró la columna en el 90 % de A/el 10 % de B, que también se usó para desalar las muestras de AcM, seguido por elución en el 20 % de A/el 80 % de B. Se recogieron datos de espec. de masas durante 100-3000 m/z, polaridad positiva, una temperatura del gas de 350 °C, una presión del nebulizador de 48 lb/in2 y un voltaje capilar de
5.000 V. Se analizaron los datos usando el software de análisis cualitativo MassHunter suministrado por el proveedor (Agilent v.B.04.00) y se usaron las intensidades de picos de los espectros deconvolucionados para derivar la proporción relativa de especies en cada muestra tal como se describió anteriormente.
Figura 6.1. Títulos de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA después de la expresión en células de mamífero que comprenden ARNt sintetasa (TRS) mutante o wt. La concentración final de CP1-NNAA en el medio y el tiempo de alimentación variaron tal como se indica en el eje x. Obsérvese que la estructura del aminoácido no natural n.° 50 se muestra en la figura 6.8. Tabla 6.1 Resumen de la producción del AcM 1C1 K274CP1-NNAA
Figura 6.2. Análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA. A) Intervalo de masa que muestra la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de AcM. B) Espectro ampliado que muestra solo la cadena pesada de AcM. La masa observada de la cadena pesada (51129.55 amu) coincide estrechamente con la masa calculada de la cadena pesada (51127 amu) suponiendo la incorporación de CP1NNAA en la cadena pesada del anticuerpo. Figura 6.3. Análisis de SEC de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA que indica que se obtuvo un producto monomérico. Se indican especies de alto peso molecular (HMWS).
Figura 6.4. Análisis de AcM 1C1-K274CP1-NNAA (1C1.K274CP1) mediante SDS-PAGE.
Figura 6.5. Análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de productos de conjugación de 12G3H11 K274CP1-NNAAAcM-MMAE. A) anticuerpo sin reaccionar, B) producto de reacción de AM-MMAE, C) producto de reacción de PM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada de AcM solo.
Figura 6.6. Análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de conjugación de AcM 1C1 K274CP1-NNAA-AM-MMAE. A) anticuerpo sin reaccionar, B) producto de reacción de AM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada (HC) de anticuerpo solo. Se muestran espectros no ampliados que muestran tanto las cadenas pesadas como ligeras en las figuras 6.9 y 6.10.
Figura 6.7. Estructura química de CP1-NNAA que muestra isómeros del compuesto, que existen como una razón 1:1. Figura 6.8. Estructura química del compuesto 50, un análogo de furano de CP1-NNAA descrito en la bibliografía. Este compuesto se usó como control para estudios de expresión con AcM 12G3H11.
Figura 6.9. Análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de productos de conjugación de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA-MMAE. A) anticuerpo sin reaccionar, B) producto de reacción de AM-MMAE, C) producto de reacción de PM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas como ligeras del anticuerpo.
Figura 6.10. Análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de conjugación de AcM 1C1 K274CP1-NNAA-AM-MMAE. A) anticuerpo sin reaccionar, B) producto de reacción de AM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas como ligeras del anticuerpo y también especies de alto peso molecular.
Tabla 6.2 Resumen de los datos de conjugación de AcM K274CP1-NNAA-MMAEabc
"todas las reacciones de conjugación realizadas a pH 5,5, DMSO al 20 %, 22 °C y AcM CP1-NNAA 3
mg/ml. Se incorporó CP1-NNAA en la posición K274 en lugar de lisina
bla razón molar de MMAE:dieno de CP1 usada fue 2.5:1
ccalculado a partir de las intensidades de picos de espectros de masas reducidos
dDAR= razón de fármaco con respecto a anticuerpo, especies con ligador escindido no incluidas en el
cálculo de DAR
La incorporación de CP1-NNAA en anticuerpos en la posición K274 se confirmó usando dos constructos de anticuerpo diferentes; 12G3H11 y 1C1. El anticuerpo recuperado era de alta calidad, sin producto truncado y muy poco agregado. El título logrado para la producción a escala de 1,7 l del anticuerpo 1C1 fue razonablemente alta considerando la baja cantidad de CP1-NNAA alimentada a las células. La reactividad de dieno de CP1 se conservó a lo largo del proceso de expresión y purificación tal como se indicó por la conversión casi completa de anticuerpo en ADC.
Ejemplo 7. Estabilidad en suero de conjugados de fármaco-anticuerpo de AcM CP1-NNAA Maleimido MMAE
Estabilidad del producto de cicloadición 4+2 (enlace ciclopentadieno-maleimida) en medio fisiológico ex vivo mediante incubación en suero de rata y ratón durante 7 días a 37 °C.
Generación de ADC: Se conjugó 12G3H11 K274CP1-NNAA que lleva CP1-NNAA en la posición K274 con maleimido MMAE para producir el ADC deseado. En primer lugar, se ajustó AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA (0,4 mg, 2,7 nmol, 1 equivalente) a 3 mg/ml con PBS (0,133 ml). Se añadieron DMSO (27 |jl) y fosfato de sodio monobásico 1 M (13 |jl) para producir una disolución al 20 % y 10 % v/v, respectivamente. Se añadió maleimido-MMAE (5 j l de disolución madre 10 mM en DMSO, 13 nmol, 5 equivalentes) a disolución de AcM 12G3H11 K274CP1-NNAA y la mezcla se agitó con vórtex brevemente. La reacción transcurrió a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se añadió N-acetilcisteína (1,1 j l de 100 mM, 108 nmol, 40 equivalentes) y se incubó la disolución durante 15 min adicionales para extinguir los grupos maleimida sin reaccionar. Entonces se purificaron las muestras usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla. Posteriormente se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas reducida tal como se describe a continuación para confirmar la conjugación y cuantificar la razón de fármaco:anticuerpo.
Ensayo de estabilidad en suero: Se evaluaron muestras de ADC en suero de rata completo (Jackson Immunoresearch, cat.:012-000-120) y suero de ratón completo (Jackson Immunoresearch, cat.:015-000-120). Se reconstituyó producto de suero liofiolizado con agua estéril según el protocolo del fabricante. Se añadió muestra de ADC al suero para dar como resultado una disolución de anticuerpo 0,2 mg/ml. Las mezclas de ADC/suero se hicieron pasar a través de un filtro de 0,2 jm , se taparon en un vial estanco al aire y se incubaron a 37 °C. Se retiró una alícuota y se congeló para servir como referencia de T=0 d. Se incubó la muestra restante a 37 °C durante 7 d, seguido por la recuperación de anticuerpo (conjugado y no conjugado) mediante inmunocaptura usando resina de agarosa anti-IgG humana específica de Fc (Sigma-Aldrich). Se enjuagó la resina dos veces con PBS, una vez con tampón de elución de IgG y luego dos veces más con PBS. Entonces se combinaron muestras de ADC-suero con resina anti-IgG humana (100 j l de mezcla de ADC-suero, 50 j l de suspensión de resina) y se mezclaron suavemente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se recuperó la resina mediante centrifugación y luego se lavó dos veces con PBS. Se suspendió el sedimento de resina en 100 j l de tampón de elución de IgG (Thermo Scientific) y se incubó adicionalmente durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó la resina mediante centrifugación y luego se añadieron 20 j l de tampón 10X Glyco 1 (New England Biolabs) y 5 j l de Endo S (Remove iT EndoS, New England Biolabs) al sobrenadante seguido por incubación durante 1 h a 37 °C. La disolución de anticuerpo humano desglicosilado se esterilizó por filtración, se redujo con TCEP (disolución Bond Breaker 0,5 M TCEP, Thermo Fisher Scientific) y se analizó mediante LC/MS. El porcentaje de anticuerpo conjugado y la cuantificación de productos de escisión del enlazador se determinaron a partir de las alturas de los picos de los espectros de masas.
Análisis de espectrometría de masas. Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Figura 7.1. Estabilidad en suero de rata de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE. Se incubó ADC en suero de rata a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada (HC). No se observó desconjugación significativa.
Figura 7.2. Estabilidad en suero de rata de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE. Se incubó ADC en suero de rata a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada (HC). No se observó desconjugación significativa, sin embargo, se observó escisión del enlazador en el grupo fenilacetamida. Véase el anexo 7 para la descripción del producto de escisión.
Figura 7.3. Estabilidad en suero de ratón de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE. Se incubó ADC en suero de ratón a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada (HC). No se observó desconjugación significativa, sin embargo, se observó escisión del enlazador casi completa en el dipéptido val-cit. Véase el anexo 7 para la descripción del producto de escisión.
Figura 7.4. Estabilidad en suero de ratón de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAAPM-MMAE. Se incubó ADC en suero de ratón a 37 °C durante 7 días y se recuperó mediante inmunocaptura antes del análisis de espectrometría de masas reducida. Se amplían los espectros para mostrar detalles en la región de masa de la cadena pesada (HC). No se observó desconjugación significativa, sin embargo, se observó escisión del enlazador casi completa. Véase el anexo 7 para la descripción de los productos de escisión.
Tabla 7.1 Resumen de datos de estabilidad en suero de ADC de 12G3H11 K274CP1-NNAA MMAEab
Figura 7.5. Estructuras químicas de cargas útiles de MMAE que muestran el peso molecular.
Figura 7.6. Estructuras químicas de productos de escisión predominantes observados tras la incubación de ADC en suero de ratón. A) y B) muestran las especies restantes en el anticuerpo (unión de CP1-maleimida no mostrada) para conjugados de AM-MMAE y PM-MMAE, respectivamente. C) Muestra las especies liberadas después de la escisión del dipéptido valcit.
Figura 7.7. Estructura química de productos de escisión de PM-MMAE tras la incubación en suero de rata. A) especies restantes en el anticuerpo y B) especies liberadas.
Los productos de conjugación de ciclopentadieno-maleimida entre AcM-CP1-NNAA y maleimido-MMAE son estables en suero de rata y de ratón a lo largo de un periodo de 7 días independientemente del tipo de maleimida contenida en la carga útil de MMAE. Se encontró que otras partes de la carga útil del ADC se degradaban antes que el enlace de maleimida-dieno de CP1. Específicamente, las cargas útiles de tanto fenilmaleimida- como alquilmaleimida-MMAE presentaron una escisión de dipéptido de val-cit alta en suero de ratón, probablemente debido a la accesibilidad enzimática al sitio de conjugación K274 altamente expuesto. El conjugado de fenil-maleimida mostró una susceptibilidad estructural adicional en la fenilacetamida entre la fenilmaleimida y el dipéptido val-cit. Esta escisión fue más evidente en suero de rata que en suero de ratón. No está claro en qué punto del proceso se produjo la escisión de la fenilacetamida, ya que no aumentó del día 0 al día 7. Es posible que la escisión se produjera durante la inmunocaptura, que incluye una etapa de
enjuague con pH bajo. En general, se demostró la estabilidad del producto de conjugación de cidopentadieno-maleimida en condiciones fisiológicas.
Ejemplo 8. Síntesis de compuestos que contienen espirociclopentadieno (CP2)
Se prepararon agentes de reticulación que contienen espirociclopentadieno y aminoácidos no naturales (NNAA) con la estructura general mostrada a continuación:
Figura 8.1. Diseño general de agentes de reticulación de espirociclopentadieno (A) y espirociclopentadieno NNAA (B) descritos en el ejemplo 8.
La síntesis de CP2-NNAA (10) comenzó con la reacción de una disolución de NaCp comercialmente disponible con epiclorohidrina en una versión modificada de la reacción de Carreira.1 Se usó epiclorohidrina racémica, pero 7 puede sintetizarse con un 91 % de ee usando epiclorohidrina enantiopura. La reacción de 7 con cloroformiato de 4-nitrofenilo produjo el carbamato activado 8. La reacción de 8 con Fmoc-Lys-OH produce el 9 protegido con Fmoc, que podría desprotegerse usando piperidina para obtener el NNAA 10. El compuesto 10 muestra una mayor estabilidad en ácido en comparación con 4, y ninguno de los productos intermedios en su síntesis muestra dimerización o descomposición cuando se almacena a -20 °C.
La síntesis del éster de NHS funcionalizado con CP2 12 comenzó con la reacción de 7 con anhídrido succínico para producir el ácido 11. El ácido 7 se hizo reaccionar con EDCHCl y W-hidroxisuccinimida para producir el éster de NHS 12. El compuesto 12 no parece dimerizarse cuando se almacena durante varios días a temperatura ambiente.
Materiales y métodos:A menos que se establezca otra cosa, las reacciones se realizaron bajo una atmósfera de N2 usando disolventes de calidad para reactivo. Se almacenaron DCM y tolueno sobre tamices moleculares de 3Á. Se hizo pasar THF sobre una columna de alúmina activada. Todos los reactivos obtenidos comercialmente se usaron tal como se recibieron. Se realizó cromatografía en capa fina (TLC) con placas prerrecubiertas con gel de sílice 60 F254 de E. Merck (0,25 mm) y se visualizó mediante exposición a luz UV (254 nm) o se tiñó con p-anisaldehído, ninhidrina o permanganato de potasio. Se realizó cromatografía en columna ultrarrápida usando gel de sílice en fase normal (60 Á, 0,040 - 0,063 mm, Geduran). Se registraron los espectros de 1H-RMN en espectrómetros Varian (400, 500 o 600 MHz) y se notifican en relación con las señales de disolvente deuterado. Los datos para los espectros de 1H-RMN se notifican tal como sigue: desplazamiento químico (5 ppm), multiplicidad, constante de acoplamiento (Hz) e integración. Se registraron los espectros de 13C-RMN en espectrómetros Varian (100, 125 o 150 MHz). Los datos para los espectros de 13C-RMN se notifican en cuanto al desplazamiento químico (5 ppm). Los espectros de masas se obtuvieron de la instalación de espectrometría de masas de UC Santa Barbara en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de alta resolución GCT Premier (Waters Corp.) con una fuente de desorción de campo (FD).
Síntesis de CP2-NNAA (10)
Se añadió ciclopentadienuro de sodio (disolución 2 M en THF, 10 ml, 20 mmol, 4 eq.) a THF (40 ml) y se enfrió hasta 0 °C. Se añadió gota a gota epiclorohidrina (0,39 ml, 5,0 mmol, 1 eq.) y se agitó la reacción a 0 °C durante 1,5 h, luego 2 h adicionales a ta. Se extinguió la reacción con H2O (40 ml), luego se transfirió a un embudo de decantación. Se añadieron una disolución saturada de NaHCO3 en H2O (40 ml) y éter (40 ml) y se separaron las fases. Se secó la fase orgánica con salmuera (40 ml), se secó sobre MgSO4, se filtró y luego se eliminó el disolvente. Se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 2:1) para producir 7 (0,48 g, 78 %) como un aceite marrón.
Rf (hexano:EtOAc, 2:1): 0,22; 1H RMN (500 MHz, CDCb) 56,64 (td, J = 1,6, 5,1 Hz, 1 H), 6,51 (td, J = 1,7, 5,1 Hz, 1 H), 6,27 (tdd, J = 1,0, 2,1, 5,2 Hz, 1 H), 6,12 (td, J = 1,7, 5,1 Hz, 1 H), 4,08 - 3,88 (m, 1 H), 3,59 (dd, J = 8,8, 11,7 Hz, 1 H), 2,48 - 2,40 (m, 1 H), 1,87 (dd, J = 4,3, 8,7 Hz, 1 H), 1,69 (dd, J = 4,4, 7,0 Hz, 1 H), 1,57 (s a., 1 H) ppm; 13C RMN (125 MHz, CDCb) 5 139,4, 133,9, 131,7, 128,6, 64,9, 41,9, 30,0, 17,6 ppm.
Carbonato de 4-nitrofenilespiro[2.4]hepta-4,6-dien-1-ilmetilo (8):
Se añadió 7 (2,80 g, 22,9 mmol, 1 eq.) a DCM (100 ml) y se enfrió hasta 0 °C. Se añadió piridina (4,61 ml, 57,3 mmol, 2,5 eq.) seguido por cloroformiato de 4-nitrofenilo (5,08 g, 25,2 mmol, 1,1 eq.). Se agitó la reacción a 0 °C hasta el consumo del material de partida (TLC, 30 min). Se vertió la reacción en un embudo de decantación y se lavó con una disolución saturada de NH4Cl en H2O (100 ml). Se extrajo la fase acuosa con DCM (50 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se eliminó el disolvente. Se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 6:1 a 4:1) para producir 8 (5,17 g, 79 %) como un aceite ámbar.
Rf (hexano:EtOAc, 4:1): 0,28; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 58,28 (d, J = 9,0 Hz, 2 H), 7,37 (d, J = 9,0 Hz, 2 H), 6,62 (td, J = 1,7, 5,2 Hz, 1 H), 6,53 (td, J = 1,7, 4,8 Hz, 1 H), 6,25 (td, J = 1,8, 5,5 Hz, 1 H), 6,11 (td, J = 1,6, 5,1 Hz, 1 H), 4,53 (dd, J = 7,6, 11,5 Hz, 1 H), 4,40 (dd, J = 7,4, 11,3 Hz, 1 H), 2,52 (quin, J = 7,6 Hz, 1 H), 1,92 (dd, J = 4,7, 8,6 Hz, 1 H), 1,76 (dd, J = 4,7, 6,7 Hz, 1 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCb) 5 155,4, 152,3, 145,3, 138,6, 133,8, 131,7, 129,4, 125,2, 121,7, 70,9, 41,5, 24,6, 16,9 ppm.
Fmoc-Lys(carbonato de espiro[2.4]hepta-4,6-dien-1-ilmetilo)-OH (9):
Se añadió 8 (5,12 g, 17,8 mmol, 1 eq.) a DMF (40 ml), seguido por Fmoc-Lys-OH (7,87 g, 21,4 mmol, 1,2 eq.) y DIPEA (7,44 ml, 42,7 mmol, 2,4 eq.). Se agitó la reacción hasta el consumo del material de partida (RMN, 3,5 h), luego se vertió en EtOAc (100 ml) y H2O (140 ml). Se acidificó la fase acuosa hasta pH 2-3 con HCl (1 M, 100 ml), se vertió en un embudo de decantación y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (2 x 100 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se eliminó el disolvente. Se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 3:1 luego DCM:MeOH:AcOH, 89:10:1) y se eliminó el disolvente. Se eliminaron AcOH y DMF residuales suspendiendo el producto en DCM, lavando con salmuera, secando la fase orgánica sobre Na2SO4, filtrando, luego eliminando el disolvente para producir 9 (7,43 g, 81 %) como una espuma de cáscara de huevo.
Rf(DCM:MeOH, 90:10): 0,39; 1H RMN (500 MHz, CDCla) 58,62 (s a., 1 H), 7,75 (d, J = 7,3 Hz, 2 H), 7,66 - 7,49 (m, 2 H), 7,39 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 7,30 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 6,54 (s a., 1 H), 6,47 (s a., 1 H), 6,21 (s a., 1 H), 6,04 (s a., 1 H), 5,74 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 4,91 (s a., 1 H), 4,53 - 4,00 (m, 5 H), 3,21 - 3,00 (m, 2 H), 2,97 (s, 1 H), 2,90 (d, J = 0,8 Hz, 1 H), 2,47 -2,31 (m, 1 H), 1,95 - 1,27 (m, 6 H) ppm; 13C RMN (125 MHz, CDCla) 163,2, 156,7, 143,6, 141,2, 138,9, 134,5, 130,9, 128,9, 127,6, 127,0, 125,1, 119,9, 115,6, 67,0, 66,5, 53,5, 47,1,41,6, 40,4, 36,8, 31,8, 29,2, 25,7, 22,2, 21,4, 17,1 5 ppm.
CP2-NNAA (10):
Se añadió 9 (5,50 g, 10,6 mmol, 1 eq.) a DMF (150 ml), seguido por piperidina (16,8 ml). Se agitó la reacción hasta el consumo del material de partida (TLC, 90 min), luego se eliminó el disolvente. Se añadió Et2O (100 ml) al residuo y se sonicó la suspensión durante 5 min. Se filtró la suspensión y se enjuagó con H2O (2 x 100 ml) y Et2O (100 ml). Se suspendió el sólido en MeOH (10 ml), se agitó durante 10 min con calentamiento suave (~40 °C), se añadió Et2O (40 ml), se filtró la suspensión y se enjuagó con Et2O (2 x 50 ml). Se secó el compuesto a vacío para producir 10 (2,24 g, 71 %) como un polvo blanco.
Rf (DCM:MeOH, 85:15): 0,29; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6 1 gota de TFA) 58,20 (s a., 3 H), 7,16 (t, J = 5,5 Hz, 1 H), 6,48 (td, J = 1,8, 5,1 Hz, 1 H), 6,40 (d, J = 5,1 Hz, 1 H), 6,32 (d, J = 5,1 Hz, 1 H), 6,12 (td, J = 1,9, 4,9 Hz, 1 H), 4,24 (dd, J = 6,7, 11,7 Hz, 1 H), 3,99 (dd, J = 7,6, 11,5 Hz, 1 H), 3,88 (d, J = 5,1 Hz, 1 H), 2,94 (d, J = 5,9 Hz, 2 H), 2,37 (quin, J = 7,5 Hz, 1 H), 1,83 - 1,63 (m, 4 H), 1,44 - 1,19 (m, 4 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, DMSO-d6 1 gota de TFA): 171,2, 156,2, 139,3, 135,2, 130,4, 128,3, 65,3, 51,9, 42,0, 29,7, 28,9, 25,7, 21,6, 16,4; MS (EI) Masa exacta calc. para C15H22N2O4 [M]+: 294,1580, encontrado: 294,1571.
Síntesis de CP2-NHS (12)
Ácido 4-oxo-4-(espiro[2.4]hepta-4,6-dien-1-ilmetoxi)butanoico(11):
Se añadió DCM (1,5 ml) a un vial que contenía 1 (0,37 g, 3,0 mmol, 1 eq.). Se añadieron Et3N (0,42 ml, 3,0 mmol, 1 eq.), DMAP (37 mg, 0,30 mmol, 0,1 eq.) y anhídrido succínico (0,33 g, 3,3 mmol, 1,1 eq.), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta hasta el consumo del material de partida (TLC, 1,75 h). Se vertió la mezcla de reacción en un embudo de decantación con DCM (50 ml) y se lavó con HCl acuoso (1 M, 50 ml). Se extrajo la fase acuosa con DCM (50 ml), se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se eliminó el disolvente para producir 11 de pureza suficiente para la siguiente reacción.
Rf (EtOAc): 0,56; 1H RMN (400 MHz, CDCla) 510,60 (s a., 1 H), 6,57 (td, J = 1,9, 5,3 Hz, 1 H), 6,50 (td, J = 1,8, 5,1 Hz, 1 H), 6,21 (td, J = 1,7, 5,2 Hz, 1 H), 6,07 (td, J = 1,8, 5,1 Hz, 1 H), 4,37 (dd, J = 7,4, 11,7 Hz, 1 H), 4,20 (dd, J = 7,0, 11,7 Hz, 1 H), 2,74 - 2,57 (m, 4 H), 2,42 (quin, J = 7,8 Hz, 1 H), 1,85 (dd, J = 4,5, 8,4 Hz, 1 H), 1,69 (dd, J = 4,3, 7,0 Hz, 1 H) ppm.
CP2-NHS (12):
Se añadió THF (10 ml) a un vial que contenía 11 (theo 3,0 mmol, 1 eq.). Se añadieron NHS (0,48 g, 4,2 mmol, 1,4 eq.), EDCHCl (0,69 g, 3,6 mmol, 1,2 eq.) y DCM (5 ml), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta durante la noche. Se eliminó el disolvente y se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 1:1) para producir 12 (0,59 g, 62 % a lo largo de dos etapas) como un aceite incoloro y viscoso.
Rf (hexano:EtOAc, 1: 1): 0,34; 1H RMN (400 MHz, CDCla) 56,56 (td, J = 1,8, 5,1 Hz, 1 H), 6,48 (td, J = 1,8, 5,1 Hz, 1 H), 6,21 (td, J = 1,6, 3,4 Hz, 1 H), 6,06 (td, J = 1,6, 3,4 Hz, 1 H), 4,36 (dd, J = 7,4, 11,7 Hz, 1 H), 4,21 (dd, J = 7,4, 11,7 Hz, 1 H), 2,93 (t, J = 7,0 Hz, 2 H), 2,83 (s, 4 H), 2,73 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 2,42 (quin, J = 7,6 Hz, 1 H), 1,83 (dd, J = 4,3, 8,6 Hz, 1 H), 1,68 (dd, J = 4,5, 6,8 Hz, 1 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCls) 5 170,8, 168,9, 167,6, 138,8, 134,3, 131,2, 129,0, 66,6, 41,5, 28,6, 26,2, 25,5, 25,1, 17,3 ppm.
1. Ledford, B. E.; Carreira, E. M., Total Synthesis of (+)-Trehazolin: Optically Active Spirocicloheptadienes as Useful Precursors for the Synthesis of Amino ciclopentitols. Journal of the American Chemical Society 1995, 117, 11811 11812.
Ejemplo 9. Conjugación de dieno de CP2-maleimida para la preparación de ADC por medio de AcM modificado con agente de reticulación
Se evaluó la viabilidad de reacciones de espirociclopentadieno-maleimida para la bioconjugación. Se introdujeron grupos espirociclopentadieno por medio de un enlazador heterobifuncional reactivo con amina con la misma estrategia general descrita en el ejemplo 3.
Introducción de la funcionalidad CP2 sobre AcM: Se instaló la funcionalidad dieno de CP2 sobre AcM IgG1 mediante reacción de aminas primarias de lisina con dieno de CP2 activado por éster de NHS. Este enfoque dio como resultado grupos ciclopentanodieno unidos a amina conjugados aleatoriamente. El anticuerpo resultante se denomina AcM-enlazador de CP2, pero puede denotarse también como AcM-CP2 en las figuras. Véanse las leyendas de las figuras como aclaración. Una reacción de modificación de AcM típica se describe tal como sigue. Se ajustó la disolución de AcM a 5 mg/ml (3 ml, 15 mg de AcM, 100 nmol, 1 eq.) con PBS pH 7,2 seguido por la adición de NaHCO31 M al 10 % v/v. Esta disolución se enfrió sobre hielo y se añadieron 35 |jl de CP2-NHS (disolución madre 10 mM en DMAc, 350 nmol, 3,5 equivalentes). La reacción transcurrió sobre hielo durante 5 minutos seguido por reacción a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se purificó AcM reaccionado mediante diálisis (Slide-A-Lyzer, MWCO de 10 kDa) frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0 °C durante 24 h. Se cuantificó la introducción de CP2 mediante espectrometría de masas desglicosilada intacta tal como se describe a continuación y se encontró que era de 3,29 enlazadores de CP2 (y por tanto dieno) por AcM en este ejemplo, lo que corresponde a un 94 % de conversión de CP2-NHS en conjugado de anticuerpo.
Reacción de AcMmodificado con CP2 con maleimido-MMAE: Se diluyó AcM-enlazador de CP2 (3,29 dienos de CP2/AcM, 1 mg, AcM 6,7 nmol, 1 equivalente) con PBS (pH 7,4) hasta una concentración final de 3,16 mg/ml. A continuación, se añadió DMSO para producir una disolución al 20 % v/v seguido por la adición de fosfato de sodio monobásico 1 M para producir una disolución al 10 % v/v. La adición de todos los componentes de la disolución produjo una mezcla que comprendía AcM 2,43 mg/ml, CP2 53,3 ^M, DMSO 1,78 M, fosfato de sodio 110 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5. Se añadió AM-MMAE o PM-MMAE (10 ^l de una disolución madre 10 mM en DMAc, 100 nmol, 15 equivalentes) a la disolución de anticuerpo. La mezcla de reacción se agitó con vórtex brevemente y se permitió que transcurriera a 22 °C o 37 °C con mezclado. Después de 4 h de reacción, se añadió N-acetilcisteína (8 |jl de una disolución 100 mM, 120 equivalentes) para extinguir los grupos maleimida sin reaccionar. Se purificaron las muestras usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla. Se analizaron posteriormente las muestras mediante espectrometría de masas desglicosilada reducida tal como se describe a continuación.
Esquema 9.2. Reacción de AcM-enlazador de CP2 con maleimido MMAE.
Análisis de espectrometría de masas: Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Figura 9.1. Espectros de masas desglicosilados intactos antes (A) y después (B) de la reacción con CP2-NHS. Los números por debajo de los picos en (B) indican el número de grupos de dieno de CP2 introducidos en el AcM. La estimación de la introducción del enlazador de CP2 por las intensidades de picos produce 3,29 dienos de CP2 por AcM. Tabla 9.1 Resumen de la reacción de AcM CP2-NHS
Figura 9.2. Análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de AcM-enlazador de CP2 antes y después de la reacción con AM-MMAE y PM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas como ligeras. Figura 9.3. Espectros de masas desglicosilados reducidos de productos de reacción de AcM-enlazador de CP2 maleimido MMAE. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada de anticuerpo. El número de especies conjugadas se indica por encima de cada pico.
Tabla 9.2 Resumen de reacciones de AcM-enlazador de CP2 maleimido-MMAEa
Los grupos de dieno de CP2 instalados sobre la superficie de los anticuerpos reaccionaron parcialmente con profármacos de maleimido-MMAE en el plazo de 4 h a temperatura ambiente. No se observó conjugación inespecífica mediante espectrometría de masas, ya que todos los picos de conjugados se rastrearon a partir de picos de AcM-enlazador de CP2 y no AcM sin reaccionar. Esta reacción es mucho más eficiente que el furanodieno, pero menos eficiente que el dieno de CP1 para la reacción con cargas útiles de maleimido-MMAE. Este enfoque puede usarse para la producción de bioconjugados.
Ejemplo 10. Cinética de conjugación de AcM-enlazador de CP2 con maleimido-MMAE a 1,0 equivalentes molares de maleimido-MMAE con respecto a grupos dieno
Se evaluó la cinética de reacción de dienos de CP2 con maleimido MMAE a 22 °C.
Introducción de la funcionalidad dieno de CP2 sobre AcM: Se instaló la funcionalidad CP2 sobre AcM IgG 1 mediante reacción de aminas primarias de lisina con CP2 activado por éster de NHS. Este enfoque dio como resultado grupos ciclopentanodieno unidos a amina conjugados aleatoriamente. Una reacción de modificación de AcM típica se describe tal como sigue. Se ajustó la disolución de AcM a 5 mg/ml (3 ml, 15 mg de AcM, 100 nmol, 1 eq.) con PBS pH 7,2 seguido por la adición de NaHCO3 1 M al 10 % v/v. Esta disolución se enfrió sobre hielo y se añadieron 35 |jl de CP2-NHS (disolución madre 10 mM en DMAc, 350 nmol, 3,5 equivalentes). La reacción transcurrió sobre hielo durante 5 minutos seguido por reacción a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se purificó AcM reaccionado mediante diálisis (Slide-A-Lyzer, MWCO de 10 kDa) frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0 °C durante 24 h. Se cuantificó la introducción de enlazador de CP2 mediante espectrometría de masas desglicosilada intacta tal como se describe a continuación y se encontró que era de 3,29 enlazadores de CP2 (y por tanto dieno) por AcM en este ejemplo, lo que corresponde a un 94 % de conversión de CP2-NHS en conjugado de anticuerpo.
Reacción de AcM modificado por CP2 con maleimido-MMAE: Se diluyó AcM-enlazador de CP2 (3 mg, 3,29 CP2/AcM, dieno de CP266 nmol, 1 equivalente) con PBS (pH 7,4) hasta una concentración final de 1,7 mg/ml. A continuación, se añadió DMSO para producir una disolución al 20 % v/v seguido por la adición de fosfato de sodio monobásico 1 M para producir una disolución al 10 % v/v. La adición de todos los componentes de la disolución produjo una mezcla que comprendía AcM 1,3 mg/ml, dieno de CP232,3 jM , DMSO 1,78 M, fosfato de sodio 110 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5. Se añadió disolución madre de AM-MMAE o PM-Mm AE (6,6 j l de una disolución madre 10 mM en DMSO, 66 nmol, 1 equivalente) a la disolución de anticuerpo. La mezcla de reacción se agitó con vórtex brevemente y se permitió que transcurriera a 22 °C con mezclado. Se retiraron alícuotas (180 j l) a diversos puntos de tiempo y se añadió N-acetilcisteína (3 j l de una disolución 100 mM, 45 equivalentes) para extinguir los grupos maleimida sin reaccionar. Entonces se purificaron las muestras usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla. Entonces se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas desglicosilada reducida tal como se describe a continuación.
Análisis de espectrometría de masas: Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Cálculo de las constantes de velocidad de reacción de dieno de CP2-maleimida: Se determinaron las constantes de velocidad de segundo orden para la reacción de maleimido-MMAE con dienos de CP2 en AcM-enlazador de CP2 a partir de las intensidades de picos en espectros de masas reducidos desglicosilados. Se monitorizó el progreso de la reacción mediante tanto la desaparición de los picos de AcM-enlazador de CP2 como la aparición de picos de conjugado de AcM-enlazador de CP2-MMAE, pero solo se usaron las intensidades de picos de AcM-enlazador de CP2 en las cadenas pesadas de anticuerpos para calcular la abundancia relativa de dieno de CP2 reaccionado. Se calcularon los grupos dieno de CP2 sin reaccionar en cadenas pesadas de AcM usando la ecuación a continuación:
1. a = intensidad de pico de cadena pesada sin modificar
2. b = suma de intensidades de picos de cadenas pesadas con un grupo dieno de CP2
3. c = suma de intensidades de picos de cadenas pesadas con dos grupos dieno de CP2
4. d = intensidad de pico de cadena pesada con tres grupos dieno de CP2
5. e = intensidad de pico de cadena ligera sin modificar
6. f = suma de intensidades de picos de cadenas ligeras con un grupo dieno de CP2
7. g = suma de intensidades de picos de cadenas ligeras con dos grupos dieno de CP2
Se analizaron adicionalmente los datos de conjugación en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Se determinaron las constantes de velocidad de segundo orden a partir de las pendientes de curvas generadas a partir de la representación gráfica de 1/[dieno de CP2] frente al tiempo y análisis de regresión lineal. Se calcularon las semividas de reacción a partir de las constantes de velocidad de reacción de segundo orden usando la ecuación mostrada a continuación:
k 2 = constante de velocidad de segundo orden
[CP2]0= concentración de dieno de CP2 a tiempo=0
Figura 10.1. Espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM-enlazador de CP2 y AcM-enlazador de CP2 que reaccionó con AM-MMAE a 4 h y 48 h. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada solo. Cada pico está marcado para indicar el número de especies conjugadas.
Figura 10.2. Espectros de masas desglicosilados reducidos de AcM-enlazador de CP2 y CP2-AcM que reaccionó con PM-MMAE a 4 h y 48 h. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada solo. Cada pico está marcado para indicar el número de especies conjugadas.
Figura 10.3. Reacción de AcM-dienos de enlazador de CP2 con maleimido-MMAE. A) Concentración molar de dieno de CP2 sin reaccionar a lo largo del tiempo. Se determinó dieno de CP2 sin reaccionar por AcM a partir de las intensidades de picos de los espectros de masas desglicosilados reducidos. B) Gráfico de concentración inversa usado para calcular las velocidades de reacción.
Tabla 10.1 Resumen de datos cinéticos para la reacción de AcM-dieno de enlazador de CP2 con maleimido-MMAEabc
atodas las reacciones de conjugación realizadas a pH 5,5, DMSO al 20 %, 22 °C y AcM modificado con CP2 1,3 mg/ml bla razón molar de MMAE:dieno de CP2 usada fue 1:1
ccalculado a partir de las intensidades de picos de espectros de masas desglicosilados reducidos de medición a 48 h. La reacción de dieno de CP2 con maleimido-MMAE fue más lenta que dienos de CP1, con semividas del orden de varias horas. A diferencia del dieno de CP1, no se observaron diferencias en la velocidad de reacción para fenil- frente a alquilmaleimida. La conversión de la reacción fue del 90 % para AM-MMAE, pero solo del 73 % para PM-MMAE después de 48 h de reacción. Dadas las constantes de velocidad similares para ambos sustratos, es posible que una porción de las fenilmaleimidas se degraden después de un tiempo prolongado en estas condiciones, limitando así la conversión global. Ejemplo 11. Incorporación de CP2-NNAA en anticuerpos
Se evaluó la incorporación de CP2-NNAA en la posición K274 o S239 de un anticuerpo anti-EphA2 (1C1), la calidad del AcM expresado y la reactividad dieno de CP2-NNAA tras la incorporación del anticuerpo.
Preparación de la disolución madre de CP2 NNAA: Se combinó CP2 NNAA (0,5 g, 1,7 mmol) con 7,8 ml de NaOH 0,2 M en H2O. Se agitó la suspensión resultante a temperatura ambiente hasta que se disolvieron todos los sólidos (10 minutos). Tras completarse la disolución, la disolución de color amarillo claro se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 ^m, se
tomaron alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Este procedimiento dio como resultado 8,2 ml de disolución madre madre de CP2 NNAA 216 mM.
Expresión de anticuerpos: Los genes de anticuerpos IgG1 12G3H11 o 1C1 con una mutación ámbar en la posición de Fc K274 o S239 se clonaron en un vector de expresión de anticuerpos pOE patentado. El constructo se transfectó en CHO-G22 mediante PEImax (1,5 l de células G22), junto con un plásmido que codifica para el doble mutante de PylRS (Y306A/Y384F) o PylRS de tipo natural y un plásmido que contiene repeticiones en tándem del casete de expresión de ARNt (pORIP 9X ARNt). Cuatro horas después de la transfección, se añadieron a las células el 3,3 % de alimentación F9 (patentada) y el 0,2 % de alimentación F10 (patentada) y se incubaron adicionalmente las células a 34 grados. Se añadió CP2-NNAA el día siguiente a una concentración final de 0,26 mM para células transfectadas con 1C1 K274 y 1C1 S239. Se alimentaron de nuevo las células el día 3 y día 7 con el 6 , 6 % de alimentación F9 y el 0,4 % de alimentación F10. Se centrifugaron las células y se recogió el sobrenadante el día 11. Se purificó el sobrenadante mediante una columna de afinidad IgSelect (GE Health Care Life Science). Se eluyó el anticuerpo con glicina 50 mM, NaCl 30 mM, tampón de elución pH 3,5, se neutralizó con tampón Tris 1 M pH 7,5 y se dializó en PBS, pH 7,2. Se determinó la concentración de anticuerpo eluido mediante medición de la absorbancia a 2 8 0 nm. El título retrocalclado fue de 57 mg/l para 1C1 K274CP2-NNAA y 76 mg/l para 1C1 S239CP2-NNAA. Se expresó AcM 12G3H11 de una manera similar a menor escala, con variación de la concentración de alimentación de CP2-NNAA. Se analizó el anticuerpo recuperado mediante SDS-PAGE usando métodos convencionales. Se analizó también el anticuerpo mediante cromatografía de exclusión molecular y espectrometría de masas tal como se describe a continuación. Los anticuerpos que incorporan CP2-NNAA se denotan como AcM-CP1-NNAA para distinguirlos de constructos de AcM-enlazador de CP2 , o AcM-[posición]CP2-NNAA donde [posición] indica el número de aminoácido y el símbolo de aminoácido que se mutó a CP2-NNAA.
Cromatografía de exclusión molecular:_Se realizó análisis de SEC usando un sistema de LC capilar Agilent 1100 equipado con una matriz de detectores triple (Viscotek 301, Viscotek, Houson, TX); la longitud de onda se fijó en 280 nm y las muestras se procesaron en una columna TSK-GEL G3000SWXI (Toso Bioscience LLC, Montgomeryville, PA) usando tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 6 , 8 a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
Análisis de espectrometría de masas: Para el análisis de AcM desglicosilado, se combinó EndoS (5 |jl de Remove-iT EndoS (dilución 1:10 en PBS, 20.000 unidades/ml, New England BioLabs) con 50 j l de muestra (AcM 1 mg/ml) y 5 j l de tampón glyco 1 (New England BioLabs) y seguido por incubación durante 1 h a 37 °C. Se prepararon muestras reducidas mediante la adición de 5 j l de disolución Bond-Breaker TCEP (0,5 M, Thermo Fisher Scientific) e incubación durante 10 min a 37 °C. Se realizó análisis de espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas Agilent 6520B Q-TOF equipado con una columna RP-HPLC (ZORBAX 300 Diphenyl RRHD, 1,8 micrómetros, 2,1 mm x 50 mm). Los parámetros de la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) fueron los siguientes: velocidad de flujo, 0,5 ml/min; la fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en H2O de calidad para HPLC, y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo. Se equilibró la columna en el 90 % de A/el 10 % de B, que también se usó para desalar las muestras de AcM, seguido por elución en el 20 % de A/el 80 % de B. Se recogieron datos de espec. de masas durante 100-3000 m/z, polaridad positiva, una temperatura del gas de 350 °C, una presión del nebulizador de 48 lb/pulgadas2 y un voltaje capilar de 5.000 V. Se analizaron los datos usando el software de análisis cualitativo MassHunter suministrado por el proveedor (Agilent v.B.04.00) y se usaron las intensidades de picos de los espectros deconvolucionados para derivar la proporción relativa de especies en cada muestra.
Figura 11.1. Títulos y la viabilidad celular de AcM 12G3H11 K274CP2-NNAA tras la expresión en células de mamífero que comprenden tRS mutante o de tipo natural. La concentración final de CP2-NNAA en el medio se indica en la leyenda de la figura. La expresión de AcM 12G3H11 K274CP2-NNAA con tRS mutante fue comparable a azido-lisina con tRS de tipo natural, con toxicidad mínima.
Tabla 11.1 Resumen de la producción del AcM 1C1 K274CP2-NNAA y 1C1 S239CP2-NNAA
Figura 11.2. Análisis de espectrometría de masas de AcM 1C1 K274CP2-NNAA desglicosilado. A) AcM intacto B) AcM reducido ampliado para mostrar la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC). La masa intacta observada coincidía estrechamente con la masa intacta calculada (147546.03) suponiendo la incorporación de dos CP2-NNAA en la estructura de AcM intacto. La masa observada de la cadena pesada coincidía estrechamente con la masa calculada de la cadena pesada (50325,93) suponiendo la incorporación de CP2-NNAA en la cadena pesada del anticuerpo. No se observó incorporación de CP2-NNAA en la cadena ligera de AcM. Se muestran espectros análogos para AcM de tipo natural 1C1 en la figura 11.4.
Figura 11.3. Análisis de espectrometría de masas de AcM 1C1 S239CP2-NNAA desglicosilado. A) AcM intacto B) AcM reducido ampliado para mostrar la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC). La masa intacta observada coincidía estrechamente con la masa intacta calculada (147628.23) suponiendo la incorporación de dos aminoácidos de CP2 en la estructura de AcM intacto. La masa observada de la cadena pesada coincidía estrechamente con la masa calculada de la cadena pesada (50367,03) suponiendo la incorporación de CP2-NNAA en la cadena pesada del anticuerpo. No se observó incorporación de CP2-NNAA en la cadena ligera de AcM. Se muestran espectros análogos para AcM de tipo natural 1C1 en la figura 11.4
Figura 11.4. Análisis de espectrometría de masas de AcM de tipo natural 1C1 desglicosilado. A) AcM intacto B) AcM reducido ampliado para mostrar la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC). A) Intervalo de masa que muestra AcM intacto, B) intervalo de masa que muestra la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC).
Tabla 11.2 Resumen de datos de espectrometría de masas para AcM 1C1-K274CP2-NNAA y 1C1-S239CP2-NNAA
Figura 11.5. Análisis de SEC de AcM 1C1 K274CP2-NNAA que indica que se obtuvo un producto monomérico. Se indican especies de alto peso molecular (HMWS).
Figura 11.6. Análisis de SEC de AcM 1C1 S239CP2-NNAA que indica que se obtuvo un producto monomérico.
Figura 11.7. Análisis de AcM 1C1-K274CP2-NNAA y AcM 1C1-S239CP2-NNAA mediante SDS-PAGE.
La incorporación de CP2-NNAA en los anticuerpos en las posiciones K274 y S239 se confirmó por espectrometría de masas. El anticuerpo recuperado era de alta calidad, sin producto truncado y muy poco agregado. Los títulos logrados a escala de producción de 2 l para el anticuerpo 1C1 fueron razonablemente altos considerando la baja cantidad de CP2-NNAA alimentada a las células.
Ejemplo 12. Producción y evaluación de ADC con AcM 1C1 K274CP2-NNAA y 1C1 S239CP2-NNAA
La reactividad de CP2-NNAA después de la incorporación en AcM en la posición K274 o S239 de un anticuerpo anti-EphA2 (1C1) se evaluó mediante conjugación con AM-MMAE. Los ADC resultantes se evaluaron para determinar la razón de fármaco:anticuerpo (DAR), la estabilidad del suero y la citotoxicidad in vitro.
Preparación de ADC de CP2-AcM:_Se prepararon ADC de AcM CP2-NNAA en una sola etapa, simplemente mezclando el anticuerpo con alquil-maleimida Mm Ae (AM-MMAE). En primer lugar, se diluyó la disolución de AcM 1C1-S239CP2-NNAA (8 mg, 53 nmol, 1 equivalente) hasta 2 mg/ml con PBS (4 ml de volumen total). Se añadieron DMSO (813 |jl) y fosfato de sodio monobásico 1 M (407 j l) para producir una disolución al ~20 % y -10 % v/v, respectivamente. Se añadió AM-MMAE (53,3 j l de disolución madre 10 mM en DMSO, 533 nmol, 10 equivalentes) a la disolución de AcM 1C1-S239CP2-NNAA y la mezcla se agitó con vórtex brevemente. La reacción transcurrió a temperatura ambiente durante 7 h con mezclado continuo. Se añadió N-acetilcisteína (43 j l de disolución madre 100 mM en agua, 4,3 jmol, 80 equivalentes) y la disolución se incubó durante 15 min adicionales para extinguir los grupos de maleimida sin reaccionar. Entonces, la mezcla de reacción se diluyó 3 veces con agua destilada y se sometió a cromatografía CHT (columna de medio de 40 jm Bio-Scale Mini Cartridge CHT Tipo II). El ADC se eluyó con un gradiente de tampón A (fosfato 10 mM, pH 7,0) a tampón B (fosfato 10 mM, pH 7,0 que contenía NaCl 2 M) durante 25 minutos. Después de la cromatografía CHT, la muestra se sometió a intercambio de tampón por PBS complementado con EDTA 1 mM, pH 7,4 mediante diálisis en un casete slide-a-lyzer a 4 °C. El AcM 1C1-K274Cp2-NNAA se conjugó con AM-MMAE de la misma manera, excepto que la reacción transcurrió durante 17 horas a temperatura ambiente.
Preparación ADC de cisteína específicos de sitio: Para algunos experimentos, se compararon ADC de AcM-CP2-NNAA con ADC conjugados con cisteína. Para este propósito, se generó un anticuerpo que comprendía una cisteína en la posición 239 (denominado 1C1-239C). La conjugación de AM-MMAE con 1C1-239C se realizó en tres etapas; i) reducción y diálisis, ii) oxidación, iii) reacción con AM-MMAE. En primer lugar, se redujeron los anticuerpos levemente para generar sulfhidrilos libres mediante la combinación de 4 ml de una disolución de anticuerpos 2,5 mg/ml en PBS 10 mM pH 7,4 que contenía EDTA 1 mM (10 mg de anticuerpo, 66,7 nM, 1 eq.) con 53 |jl de una disolución de TCEP 50 mM en agua (2,7 |jmol, 40 eq. en relación con AcM) seguido de mezclado suave a 37 °C durante 3 h. El anticuerpo reducido se transfirió a un casete de diálisis slide-a-lyzer (MWCO de 10 K) y se dializó frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 4 °C durante 24 h con varios cambios de tampón. El anticuerpo reducido se oxidó para reformar los disulfuros internos mediante la adición de ácido deshidroascórbico (27 j l de disolución madre 50 mM en DMSO, 1,3 jmol, 20 eq.) seguido de mezclado durante 4 h a temperatura ambiente. La disolución de anticuerpos oxidados se combinó con DMSO al 20 % v/v seguido de la adición de AM-MMAE (53 j l de una disolución madre 10 mM en DMSO, 530 nmol, 8 eq.). La reacción transcurrió a temperatura ambiente con mezclado durante 1 h seguido de la adición de N-acetilcisteína (43 j l de disolución madre 100 mM en agua, 4,2 jmol, 64 eq.) para extinguir las maleimidas sin reaccionar. Entonces, la mezcla de reacción se diluyó tres veces con agua destilada y se sometió a cromatografía CHT y diálisis tal como se describió anteriormente.
Figura 12.1. Generación de ADC de AcM-CP2-NNAA y ADC de AcM-239C, y estructura de AM-MMAE. Obsérvese que la producción de ADC de AcM-CP2-NNAA se logró en una etapa, mientras que la producción del ADC de AcM-239C se produjo en 4 etapas. El grupo R representado en (B) podría ser una molécula pequeña que contiene tiol endógeno tal como cisteína.
Análisis de espectrometría de masas: Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Análisis de cromatografía HIC: Se analizaron ADC mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna Proteomics HIC Butyl NPS (4,6x35 mm, 5 jm , Sepax) eluida con un gradiente del 100 % de A al 100 % de B a lo largo de 22 minutos (fase móvil A: Tris 25 mM pH 8,0, (NH4)2SO41,5 M, fase móvil B: Tris 25 mM pH 8,0, alcohol isopropílico al 5 % (v/v)) a temperatura ambiente. Se detectó la proteína mediante absorbancia UV a 280 nm. Se inyectaron aproximadamente 50-100 jg de proteína para cada análisis.
Análisis de rRP-HPLC: Para cada análisis, se redujeron los anticuerpos y ADC a 37 °C durante 20 minutos usando ditiotreitol (DTT) 42 mM en PBS pH 7,2. Se cargaron 10 jg de anticuerpos reducidos y ADC sobre una columna PLRP-S, 1000Á (2,1 x 50 mm, Agilent) y se eluyó a 40°C a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min con un gradiente del 5 % de B al 100 % de B a lo largo de 25 minutos (fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua, y fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo). Se determinó el porcentaje de conjugación usando las áreas de picos integradas a partir del cromatograma.
Estabilidad en suero de ADC: Se incubaron ADC en suero de rata para someter a prueba la estabilidad del conjugado de Diels-Alder. Se añadieron ADC a suero de rata normal (Jackson Immunoresearch) para lograr una concentración final de 0,2 mg/ml (anticuerpo 1,33 jM ), con un volumen total de disolución de ADC añadida al suero inferior al 10 %. La mezcla ADC-suero se esterilizó por filtración y se retiró una alícuota de esta mezcla y se congeló como control de t=0. La muestra restante se incubó entonces adicionalmente a 37 °C en un recipiente sellado sin agitación. Se recuperó anticuerpo humano conjugado y no conjugado del suero de rata mediante inmunoprecipitación usando resina de agarosa anti-IgG humana específica de Fc (Sigma-Aldrich). Se enjuagó la resina dos veces con PBS, una vez con tampón de elución de IgG y luego dos veces más con PBS. Entonces se combinaron muestras de ADC-suero de ratón con resina anti-IgG humana (100 j l de mezcla de ADC-suero, 50 j l de suspensión de resina) y se mezclaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se recuperó la resina mediante centrifugación y luego se lavó dos veces con PBS. Se suspendió la resina lavada en 100 j l de tampón de elución de IgG (Thermo Scientific) y se incubó adicionalmente durante 5 minutos a temperatura ambiente. La resina se retiró por centrifugación y luego se añadieron al sobrenadante 20 j l de tampón 10X glyco 1 (New England Biolabs). La disolución de anticuerpo humano recuperado se esterilizó por filtración y se incubó con EndoS durante 1 hora a 37 °C. Entonces, se redujeron los AcM desglicosilados con TCEP y se analizaron mediante LC/MS tal como se describió anteriormente. El porcentaje de anticuerpo conjugado se determinó a partir de las alturas de los picos de los espectros de masas.
Análisis de citotoxicidad in vitro:_La línea celular de cáncer de próstata humano PC3 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células PC3 se mantuvieron en medios RPMI1640 (Life Technologies) complementados con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (HI-FBS) (Life Technologies) a 37 °C en CO2 al 5 %. Se hicieron crecer las células hasta la fase de crecimiento exponencial, se recogieron mediante tripsinización suave y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a 1500 células/pocillo. Se permitió que las células se adhirieran durante 24 h y luego se trataron con anticuerpos y ADC sometidos a dilución en serie de 4 veces a 9 concentraciones por duplicado partiendo de 4000 ng/ml. Las células tratadas se cultivaron durante 6 días y se determinó la viabilidad celular usando el ensayo de viabilidad luminiscente CellTiter-Glo (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se calculó como un porcentaje de las células de control sin tratar. Se determinó la CI50 de la citotoxicidad para los ADC usando análisis de regresión logística no lineal con el software Prism (GraphPad).
Figura 12.2. Análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína antes y después de la reacción con AM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada de AcM. Se indican los
picos 0 y 1 de la razón de fármaco:anticuerpo (DAR) para muestras de ADC, se espera un fármaco por cadena pesada (DAR 1) para cada constructo.
Figura 12.3. Análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína antes y después de la reacción con AM-MMAE. Se amplían los espectros para mostrar la cadena ligera de AcM. No se detectaron conjugados de cadena ligera AM-MMAE, indicando que la conjugación era específica de sitio de la cadena pesada de AcM.
Tabla 12.1 Resumen de la caracterización de ADC de AcM-CP2-NNAA mediante espectrometría de masas3
Figura 12.4. Análisis de cromatografía de interacción hidrófoba de ADC de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína. La desaparición del pico correspondiente al tiempo de retención de 1C1 CP2-NNAA y la aparición de un pico con tiempo de retención aumentado indica la conjugación de AM-MMAE con AcM. Obsérvese que, para ADC de 1C1 K274CP2-NNAA, se detectan las especies DAR 1 y DAR 2.
Figura 12.5. Análisis de cromatografía de alto rendimiento de fase inversa reducido de ADC de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína. La desaparición del pico de cadena pesada en ADC y la aparición de un pico de tiempo de retención más prolongado indica la conjugación de AM-MMAE con la cadena pesada. El tiempo de retención de pico de la cadena ligera (LC) no cambió antes y después de la conjugación, indicando que la conjugación era específica para la cadena pesada de AcM.
Tabla 12.2 Resumen de la caracterización de ADC mediante métodos de cromatografía
Figura 12.6. Análisis de SDS-PAGE reducido de ADC de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína.
Figura 12.7. Análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de ADC de AcM-CP2-NNAA antes y después de la incubación en suero de rata durante 7 días a 37 °C. Se amplían los espectros de masas para mostrar la cadena pesada (HC) solo. La falta de señal de HC no conjugada en muestras incubadas con suero (D y H) indica que el conjugado de Diels-Alder era estable.
Figura 12.8. Cuantificación de DAR de ADC de AcM-CP2-NNAA antes y después de la incubación en suero de rata durante 7 d a 37 °C. Las DAR se calcularon a partir de las alturas de los picos de los espectros de masas mostrados en la figura 12.7. Los valores se notifican como la media ± desviación estándar, n=3. No se detectó pérdida de fármaco en estas condiciones.
Figura 12.9. Citotoxicidad de ADC de AcM-CP2-NNAA y AcM-cisteína hacia células cancerosas PC3 in vitro. Los ADC de AcM-CP2-NNAA AM-MMAE presentaron potencias similares al ADC análogo preparado mediante conjugación de cisteína específica de sitio de AM-MMAE.
El dieno de CP2-NNAA reaccionó con maleimida contenida en AM-MMAE con conversiones similares a grupos sulfhidrilo de cisteína. La diferencia clave en la preparación del ADC de AcM-CP2-NNAA frente al ADC de AcM-cisteína fue la reducción del número de etapas en el proceso de conjugación. El AcM de cisteína requirió 3 etapas y 2 días para la producción, mientras que los ADC de AcM CP2-NNAA se produjeron en una etapa en menos de 24 h. Los ADC de AcM-CP2-NNAA resultantes son estables en condiciones fisiológicamente relevantes y no mostraron pérdida de fármaco
cuando se incubaron en suero de rata a 37 °C durante 7 días. Los ADC de AcM CP2-NNAA fueron potentes in vitro, con actividades similares a un ADC preparado por conjugación de cisteína específica de sitio.
Ejemplo 13. Síntesis de compuestos que contienen ciclopentadieno y furano.
Materiales y métodos:A menos que se establezca otra cosa, las reacciones se realizaron bajo una atmósfera de N2 usando disolventes de calidad para reactivo. Se almacenaron DCM y tolueno sobre tamices moleculares de 3Á. Se hizo pasar THF sobre una columna de alúmina activada. Todos los reactivos obtenidos comercialmente se usaron tal como se recibieron. Se realizó cromatografía en capa fina (TLC) con placas prerrecubiertas con gel de sílice 60 F254 de E. Merck (0,25 mm) y se visualizó mediante exposición a luz UV (254 nm) o se tiñó con p-anisaldehído, ninhidrina o permanganato de potasio. Se realizó cromatografía en columna ultrarrápida usando gel de sílice en fase normal (60 Á, 0,040 - 0,063 mm, Geduran). Se registraron los espectros de 1H-RMN en espectrómetros Varian (400, 500 o 600 MHz) y se notifican en relación con las señales de disolvente deuterado. Los datos para los espectros de 1H-RMN se notifican tal como sigue: desplazamiento químico (5 ppm), multiplicidad, constante de acoplamiento (Hz) e integración. Se registraron los espectros de 13C-RMN en espectrómetros Varian (100, 125 o 150 MHz). Los datos para los espectros de 13C-RMN se notifican en cuanto al desplazamiento químico (5 ppm). Los espectros de masas se obtuvieron de la instalación de espectrometría de masas de UC Santa Barbara en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de alta resolución GCT Premier (Waters Corp.) con una fuente de desorción de campo (FD).
Síntesis de CP3-NHS (13)
Succinato de 2,5-dioxopirrolidin-1-il(1,2,3,4,5-pentametilciclopenta-2,4-dienil)metilo (13):
Se añadió DCM (8 ml) a un vial que contenía (1,2,3,4,5-pentametilciclopenta-2,4-dienil)metanol1 (0,33 g, 2,0 mmol, 1 eq.). Se añadieron Et3N (0,64 ml, 4,6 mmol, 2,3 eq.), DMAp (46 mg, 0,38 mmol, 0,2 eq.) y anhídrido succínico (0,46 g, 4,6 mmol, 2,3 eq.), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta durante la noche. Se extinguió la reacción con H2O (1 ml), luego se vertió en un embudo de decantación. Se añadió HCl (1 M, 50 ml) y se extrajo con DCM (2 x 50 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se eliminó el disolvente para producir ácido 4-oxo-4-((1,2,3,4,5-pentametilciclopenta-2,4-dienil)metoxi)butanoico que se usó directamente en la siguiente reacción.
Rf (EtOAc): 0.24; 1H RMN (400 MHz, CDCla) 53,98 (s, 2 H), 2,64 - 2,59 (m, 2 H), 2,59 - 2,54 (m, 2 H), 1,76 (s, 6 H), 1,74 (s, 6 H), 0,95 (s, 3 H) ppm.
Se añadió THF (10 ml) a un vial que contenía ácido 4-oxo-4-((1,2,3,4,5-pentametilciclopenta-2,4-dienil)metoxi)butanoico (~2 mmol). Se añadieron NHS (0,61 g, 5,3 mmol, 2,7 eq.), EDCHCl (0,87 g, 4,6 mmol, 2,3 eq.) y DCM (6 ml), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta durante la noche. Se eliminó el disolvente y se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 3:1 ^ 2:1) para producir 7 (0,39 g, 55 % a lo largo de dos etapas) como un sólido blanco.
Rf (hexano:EtOAc, 7:3): 0,27; 1H RMN (400 MHz, CDCla) 54,00 (s, 2 H), 2,89 (t, J = 6,7 Hz, 2 H), 2,85 (s a., 4 H), 2,67 (t, J = 7,8 Hz, 2 H), 1,77 (s, 6 H), 1,74 (s, 6 H), 0,95 (s, 3 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 170,7, 168,9, 167,6, 138,4, 135,0, 68,2, 55,3, 28,6, 26,2, 25,5, 16,8, 11,0, 10,1 ppm; IR (ATR) 2973, 2935, 1815, 1782, 1729, 1208, 1089, 1069, 967 cm-1; HRMS (EI) Masa exacta calc. para C19H25NO6 [M]+: 363,1682, encontrado: 363,1676.
Síntesis de F2-NHS (17)
9,9-Dietoxi-6-hidroxinon-7-inoato de metilo (14):
Se añadió 3,3-dietoxiprop-1-ino (0,72 ml, 5,0 mmol, 1 eq.) a THF (15 ml), luego se enfrió hasta -78 °C. Se añadió gota a gota nBuLi (2,33 M en hexanos, 2,4 ml, 5,5 mmol, 1,1 eq.), luego se agitó la mezcla de reacción 30 min adicionales a -78 °C. Se añadió 6-oxohexanoato de metilo (0,87 g, 6,0 mmol, 1,2 eq.) en THF (5 ml) gota a gota, luego se agitó la mezcla de reacción a -78 °C durante 1 h. Se vertió la mezcla de reacción en un embudo de decantación que contenía una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (100 ml), luego se extrajo con Et2O (2 x 50 ml). Se lavaron las fases
orgánicas combinadas con salmuera (50 ml), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, se eliminó el disolvente y se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 2:1) para producir 14 (1,1 g, 80 %) como un aceite transparente e incoloro.
Rf (hexano:EtOAc, 6:4): 0,41; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 55,28 (d, J = 1,6 Hz, 1 H), 4,47 - 4,36 (m, J = 3,5 Hz, 1 H), 3,76 - 3,67 (m, 2 H), 3,67 - 3,63 (m, 3 H), 3,56 (qd, J = 7,0, 9,4 Hz, 2 H), 2,34 - 2,27 (m, 3 H), 1,76 - 1,59 (m, 4 H), 1,54 - 1,42 (m, 2 H), 1,21 (t, J= 7,0 Hz, 6 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 174,0, 91,2, 86,2, 80,0, 61,8, 60,8, 60,8, 51,5, 36,9, 33,8, 24,6, 24,4, 15,0 ppm; IR (ATR) 3451,2932, 1736, 1437, 1328, 1135, 1051, 1012 cm-1; HRMS (EI) Masa exacta calc. para C14H23O5 [M-H]+: 271,1545, encontrado: 271,1546.
5-(3-Metoxifuran-2-il)pentanoato de metilo (15):
Se añadió MeOH (3,9 ml) a un vial que contenía 14 (1,06 g, 3,89 mmol, 1 eq.). Se añadió PPh3AuNTf2 (29 mg, 0,039 mmol, 0,01 eq.), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta durante la noche. Se vertió la mezcla de reacción en un embudo de decantación que contenía salmuera (50 ml), luego se extrajo con DCM (2 x 50 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se eliminó el disolvente y se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 15:1 ^ 9:1) para producir 15 (0.35 g, 43 %) como un aceite transparente e incoloro.
Rf (hexano:EtOAc, 9:1): 0,35; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 57,11 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 6,27 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 3,72 (s, 3 H), 3,66 (s, 3 H), 2,61 (t, J = 6,8 Hz, 2 H), 2,33 (t, J = 7,2 Hz, 2 H), 1,69 - 1,60 (m, 4 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 174,1, 143,3, 139,2, 138,9, 102,9, 59,4, 51,4, 33,7, 27,5, 24,5, 24,3 ppm; IR (ATR) 2950, 1734, 1662, 1600, 1230, 1179, 1111 cm_1; HRMS (EI) Masa exacta calc. para C11H16O4 [M]+: 212,1049, encontrado: 212,1045.
Ácido 5-(3-metoxifuran-2-il)pentanoico (16):
A un vial que contenía 15 (0,331 g, 1,56 mmol, 1 eq.) disuelto en MeOH (4 ml) se le añadió una disolución de NaOH (0,125 g, 3,12 mmol, 2 eq.) en H2O (4 ml). Se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire, y se agitó a ta 30 min. Se vertió la mezcla de reacción en un embudo de decantación que contenía H2O (50 ml) y se añadió HCl (1 M en H2O) hasta pH 2-3 (~4 ml). La capa acuosa se extrajo con DCM (2 * 50 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se eliminó el disolvente para producir 16 (0,280 g, 90 %) como un aceite transparente e incoloro.
Rf (hexano:EtOAc, 1:1): 0,55; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 510,37 (s a., 1 H), 7,12 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 6,28 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 3,73 (s, 3 H), 2,62 (t, J = 6,5 Hz, 2 H), 2,38 (t, J = 6,5 Hz, 2 H), 1,73 - 1,61 (m, 4 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCb) 5 179,8, 143,4, 139,1, 139,0, 102,9, 59,4, 33,7, 27,4, 24,4, 24,0 ppm; IR (ATR) 3133, 2940, 1706, 1662, 1454, 1411, 1279, 1236, 1109 cm-1; HRMS (EI) Masa exacta calc. para C10H14O4 [M]+: 198,0892, encontrado: 198,0890.
5-(3-Metoxifuran-2-il)pentanoato de 2,5-dioxopirrohdm-1-No (17):
Se añadió THF (5 ml) a un vial que contenía 16 (0,265 g, 1,34 mmol, 1 eq.). Se añadieron NHS (0,216 g, 1,87 mmol, 1,4 eq.), EDCHCl (0,308 g, 1,61 mmol, 1,2 eq.) y DCM (3 ml), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta durante la noche. Se eliminó el disolvente y se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 2:1 ^ 1:1) para producir 17 (0,293 g, 74 %) como un aceite incoloro, viscoso.
Rf (hexano:EtOAc, 2:1): 0,33; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 57,11 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 6,27 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 3,72 (s, 3 H), 2,82 (s a., 4 H), 2,69 - 2,54 (m, 4 H), 1,81 - 1,60 (m, 4 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 169,1, 168,5, 143,5, 139,1, 138,7, 102,8, 59,3, 30,5, 27,0, 25,5, 24,2, 23,8 ppm; IR (ATR) 2948, 1814, 1735, 1638, 1413, 1206, 1058, 1046 cm-1; HRMS (EI) Masa exacta calc. para C14H17NO6 [M]+: 295,1056, encontrado: 295,1062.
Síntesis de CPIb-NHS (19)
Ácido 3-(ciclopenta-1,3-dienil)propanoico y ácido 3-(ciclopenta-1,4-dienil)propanoico (12):
Se añadió 3-bromopropionato de etilo (1,65 ml, 12,9 mmol, 1 eq.) a THF (30 ml) y se enfrió hasta -78 °C. Se añadió ciclopentadienuro de sodio (disolución 2 M en THF, 6,45 ml, 12,9 mmol, 1 eq.) gota a gota a lo largo de 5 min y se agitó la reacción a -78 °C durante 3,5 h. Se vertió la reacción en DCM (20 ml) y se añadió gel de sílice ( 6 g). Se filtró la mezcla de reacción a través de gel de sílice con DCM (100 ml) y se eliminó el disolvente para producir isómeros de 3-(ciclopentadienil)propanoato de etilo como un aceite amarillo.
Los datos espectrales coincidían con los datos notificados en la bibliografía.3
Rf(hexano:EtOAc, 9:1): 0,45; 1H RMN (400 MHz, CDCla) 56,47 - 6,02 (m, 3 H), 4,17 - 4,11 (m, 2 H), 2,96 (s, 0,31 H), 2,91 (d, J = 1,4 Hz, 1,69 H), 2,78 - 2,68 (m, J = 1,7 Hz, 2 H), 2,59 - 2,53 (m, 2 H), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3 H).
A una disolución de isómeros de 3-(ciclopentadienil)propanoato de etilo (-12,9 mmol) disuelto en EtOH (20 ml) se le añadió una disolución de NaOH (2,0 g, 50 mmol, 3,9 eq.) en H2O (20 ml). Se agitó la reacción a ta durante 15 min. Se vertió la mezcla de reacción en un embudo de decantación que contenía H2O (50 ml) y DCM (50 ml). Se acidificó la fase acuosa con HCl (1 M en H2O) hasta pH 2 (~70 ml). Se separaron las fases, luego se extrajo la fase acuosa con DCM (50 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera (50 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se eliminó el disolvente para producir 18 (0,50 g, 28 % dos etapas) como un sólido marrón.
Rf (hexano:EtOAc, 1:2): 0,69; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 510,57 (s a., 1 H), 6,49 - 6,02 (m, 3 H), 2,97 (d, J = 1,6 Hz, 1,07 H), 2,92 (d, J = 1,2 Hz, 0,93 H), 2,82 - 2,68 (m, 2 H), 2,68 - 2,58 (m, 2 H) ppm; 13C RMN (100 MHz, CDCls) 5179,7, 179,7, 1 4 7 ,1 , 1 4 4 ,9 , 1 3 4 ,2 , 134,1, 132,3, 131,1, 127,0, 126,4, 43,3, 41,3, 33,9, 33,3, 25,5, 24,7 ppm; IR (ATR) 3070, 2926, 1705, 1412, 1283, 1205, 913 cm-1; HRMS (EI) Masa exacta calc. para C8H10NO2 [M]+: 138,0681, encontrado: 138,0678.
3-(Ciclopenta-1,3-dienil)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo y 3-(ciclopenta-1,4-dienil)propanoato de 2,5-d ioxopirrolid in-1-ilo (19):
Se añadió THF (10 ml) a un vial que contenía 18 (0,460 g, 3,33 mmol, 1 eq.). Se añadieron NHS (0,537 g, 4,66 mmol, 1,4 eq.), EDCHCl (0,766 g, 4,00 mmol, 1,2 eq.) y DCM ( 6 ml), se tapó la reacción bajo una atmósfera de aire y se agitó a ta durante la noche. Se eliminó el disolvente y se sometió el residuo a cromatografía en columna ultrarrápida (hexano:EtOAc, 2:1 ^ 1:1) para producir 19 (0,438 g, 56 %) como un polvo de cáscara de huevo.
Rf (hexano:EtOAc, 2:1): 0,29; 1H RMN (400 MHz, CDCb) 56,47 - 6,08 (m, 3 H), 2,97 (d, J = 1,2 Hz, 1,2 H), 2,92 (d, J = 1,6 Hz, 0,8 H), 2,90 - 2,75 (m, 8 H); 13C RMN (100 MHz, CDCb) 5 169,1, 168,2, 168,1, 145,7, 143,9, 134,4, 133,8, 132,2, 131,4, 127,7, 127,1, 43,2, 41,4, 30,8, 30,2, 25,5, 25,3, 24,5; IR (ATR) 2947, 1810, 1779, 1735, 1420, 1366, 1204, 1062, 1046 cm_1; HRMS (EI) Masa exacta calc. para C12H13NO4 [M]+: 235,0845, encontrado: 235,0848.
Un intento de sintetizar un derivado NHS de pentametilciclopentadieno (CP3) usando Cp*Li y 3-bromopropionato de etilo fracasó, y en lugar de someterse a eliminación el acrilato de etilo. La reacción de CP*Li con bromoacetato de metilo tuvo éxito, pero después de la hidrólisis del éster y la reacidificación, el compuesto experimentó una ciclación inesperada. La tercera estrategia usó (1,2,3,4,5-pentametilciclopenta-2,4-dienil)metanol de Boydston,1 que se hizo reaccionar con
anhídrido succínico para producir el ácido intermedio, que se usó sin purificación adicional. La reacción con EDCHCl y N-hidroxisuccinimida produjo el éster de NHS 13. El diseño y la síntesis del derivado de NHS de furano (F2) se inspiraron en el trabajo de Sheppard sobre los 3-alcoxifuranos.2 La sal de litio de 3,3-dietoxiprop-1-ina se añadió a 6-oxohexanoato de metilo para formar el alcohol 14, que se cicló usando oro catalítico (I) en metanol para producir 3-metoxifurano 15. El éster de 15 se hidrolizó y luego se hizo reaccionar con EDCHCl y N-hidroxisuccinimida para producir el éster NHS 17
La síntesis de un derivado de CP1 NHS que no contiene un éster interno (CP1b) comenzó con la reacción de NaCP con 3-bromopropionato de etilo, luego la hidrólisis del éster para producir el ácido 12. La reacción con EDC HCl y N-hidroxisuccinimida produjo el éster de NHS 19. Las diferencias estructurales entre CP1 y CP1b se muestran en la figura 13.1.
Figura 13.1. Visión general de las posiciones de éster en enlazadores de A) CP1-NHS y B) CPlb-NHS.
1. Peterson, G. I.; Church, D. C.; Yakelis, N. A.; Boydston, A. J., 1,2-oxazine linker as a thermal trigger for selfimmolative polymers. Polymer 2014, 55, 5980-5985.
2. Foster, R. W.; Benhamou, L.; Porter, M. J.; Bucar, D.-K.; Hailes, H. C.; Tame, C. J.; Sheppard, T. D., Irreversible endo-Selective Diels-Alder Reactions of Substituted Alkoxyfurans: A General Synthesis of endo-Cantharimides. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany) 2015, 21, 6107-6114.
3. Honzícek, J.; Mukhopadhyay, A.; Santos-Silva, T.; Romao, M. J.; Romao, C. C., Ring-Functionalized Molybdenocene Complexes. Organometallics 2009, 28, 2871-2879.
Ejemplo 14. Evaluación de ADC preparados con anticuerpo modificado con enlazador.
Se evaluaron la estabilidad y la potencia de los ADC generados por la conjugación de Diels-Alder de AM-MMAE con el anticuerpo modificado con enlazador. Los conjugados de Diels-Alder se compararon con los conjugados de cisteína.
Materiales. Todos los anticuerpos (formato IgG1) se expresaron y purificaron usando métodos convencionales de biología molecular. Todos los reactivos se adquirieron de proveedores comerciales a menos que se indique lo contrario. El éster de NHS del ácido furan-2-ilmetilsuccinámico (F1-NHS) y maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilmonometil-auristatina-E (AM-MMAE) se adquirieron de SynChem, Inc. (Elk Grove Village, IL).
Preparación de conjugados de AcM-enlazador: Se incorporó la funcionalidad dieno aleatoriamente en los anticuerpos mediante la reacción de los enlazadores que contienen éster de NHS 17 y 19 (F2 y CP1b) descritos anteriormente con aminas de lisina. El grado de modificación del AcM se controló mediante la cantidad de enlazador de NHS usado en la reacción y se seleccionaron diferentes densidades de enlazador dependiendo del experimento. Un procedimiento general para la modificación de AcM con CP1 se describe a continuación: En primer lugar, se ajustó la disolución de AcM a 5 mg/ml (3 ml, 15 mg de AcM, 100 nmol, 1 eq.) con PBS pH 7,2 seguido por la adición de NaHCO31 M al 10 % v/v. Esta disolución se enfrió en hielo y se añadieron 30 |jl de CPlb-NHS (disolución madre 10 mM en DMAc, 300 nmol, 3 equivalentes, también denominado enlazador de Cp1). La reacción transcurrió sobre hielo durante 5 minutos seguido por reacción a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado continuo. Se purificó AcM reaccionado mediante diálisis (Slide-A-Lyzer, MWCO de 10 kDa) frente a PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4, 4 °C durante 24 h. Se cuantificó la introducción de enlazador de CP1 mediante espectrometría de masas desglicosilada intacta tal como se describe a continuación.
Preparación de ADC Se prepararon conjugados de fármaco y anticuerpo a partir de AcM Herceptin (en la diana) o control de isotipo de IgG-1-1 (fuera de la diana) usando conjugación de Diels-Alder por medio de enlazadores y conjugación directa con tioles de cisteína de anticuerpo. Se prepararon ADC de Diels-Alder a partir de los anticuerpos modificados con enlazador CP1b-NHS (compuesto 19) y F2-n Hs (compuesto 17) usando el mismo procedimiento general descrito para AcM-CPlb-enlazador de la siguiente manera: se diluyó AcM-CPlb-enlazador (10 mg, 67 nmol, 1 equivalente) hasta 4,27 mg/ml con PBS, pH 7,4, seguido de adición de DMSO (493 μl) y fosfato de sodio monobásico 1 M (247 μl) para producir disoluciones de ~20 % y 10 % v/v respectivamente. Se añadió AM-MMAE (53,3 μl de disolución madre l0 mM en DMSO, 530 nmol, 8 equivalentes) a la disolución de anticuerpo y la reacción continuó a temperatura ambiente con mezclado durante 4 h. Se añadió N-acetilcisteína (43 |jl de una disolución 100 mM en agua, 4,3 |jmol, 64 equivalentes) para extinguir las maleimidas sin reaccionar. El ADC se purificó de la mezcla de reacción usando cromatografía CHT. La disolución de ADC se diluyó 3 veces con agua destilada y se cargó en una columna de medios Bio-Scale Mini Cartridge CHT Tipo II de 40 μm. El ADC se eluyó con un gradiente de tampón A (fosfato 10 mM, pH 7,0) a tampón B (fosfato 10 mM, pH 7,0 que contenía NaCl 2 M) a lo largo de 25 minutos a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Después de la cromatografía CHT, la muestra de ADC se sometió a intercambio de tampón por PBS usando un cassette slide-a-lyzer a 4 °C. Se siguió el mismo procedimiento para los ADC preparados con constructos de AcM-enlazador de F2, con la excepción de que la reacción de conjugación de AM-MMAE continuó durante 24 ha temperatura ambiente. Obsérvese que el contenido de dieno para cada AcM antes de la reacción con AM-MMAE se proporciona en la tabla 14.1.8 equivalentes de AM-MMAE en relación con el AcM usado para la reacción de conjugación corresponden a aproximadamente 2 equivalentes molares de AM-MMAE en relación con el dieno.
También se prepararon ADC mediante conjugación de AM-MMAE con tioles de cisteína contenidos en la región bisagra del anticuerpo. En primer lugar, la disolución de anticuerpo (10 mg, 67 nmol, 1 equivalente) se ajustó a 2,5 mg/ml con PBS que contenía EDTA 1 mM. A continuación, se añadió Tc EP (10 μl de disolución 50 mM en agua, 500 nmol, 7,5 equivalentes) para reducir los disulfuros de bisagra, y se incubó la mezcla a 37 °C con agitación durante 1 h. A continuación, se añadió d Ms O (410 μl, concentración final del 10 % v/v en la reacción) y la reacción continuó a temperatura ambiente con mezclado durante 1 h. Se añadió N-acetilcisteína para extinguir los grupos de maleimida sin reaccionar y se purificó el ADC mediante cromatografía CHT y diálisis tal como se describió anteriormente. Los ADC preparados por conjugación con cisteínas de bisagra se denotan con Cys en el nombre, por ejemplo: Herceptin-Cys-MMAE.
Análisis de rRP-HPLC: Para cada análisis, se redujeron los anticuerpos y ADC a 37 °C durante 20 minutos usando ditiotreitol (DTT) 42 mM en PBS pH 7,2. Se cargaron 10 μg de anticuerpos reducidos y ADC sobre una columna PLRP-S, 1000Á (2,1 x 50 mm, Agilent) y se eluyó a 40°C a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min con un gradiente del 5 % de B al 100 % de B a lo largo de 60 minutos (fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua, y fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo). Se determinó el porcentaje de conjugación usando las áreas de picos integradas a partir del cromatograma.
Análisis de cromatografía de exclusión molecular Se realizó análisis de SEC usando un sistema de LC capilar Agilent 1100 equipado con una matriz de detectores triple (Viscotek 301, Viscotek, Houson, TX); la longitud de onda se fijó en 280 nm y las muestras (50 μg) se procesaron en una columna TSK-GEL G3000SWXI (Toso Bioscience LLC, Montgomeryville, PA) usando tampón fosfato de sodio 100 mM, alcohol isopropílico al 10 %, pH 6,8, a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
Análisis de estabilidad en suero: Se incubaron ADC en suero de rata para someter a prueba la estabilidad de la unión anticuerpo-carga útil. Se añadieron ADC a suero de rata normal (Jackson Immunoresearch) para lograr una concentración final de 0,2 mg/ml (anticuerpo 1,33 |j M), con un volumen total de disolución de ADC añadida al suero inferior al 10 %. La mezcla ADC-suero se esterilizó por filtración y se retiró una alícuota de esta mezcla y se congeló como control de t=0. Entonces se incubó adicionalmente la muestra restante a 37 °C en un recipiente sellado durante 7 d. Se recuperó anticuerpo humano conjugado y no conjugado a partir del suero de rata mediante inmunoprecipitación usando resina anti-IgG humana específica de Fc (Sigma-Aldrich). Se enjuagó la resina dos veces con PBS, una vez con tampón de elución de IgG y luego dos veces más con PBS. Entonces se combinaron muestras de ADC-suero de ratón con resina anti-IgG humana (100 j l de mezcla de ADC-suero, 50 j l de suspensión de resina) y se mezclaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se recuperó la resina mediante centrifugación y luego se lavó dos veces con PBS. Se suspendió la resina lavada en 100 j l de tampón de elución de IgG (Thermo Scientific) y se incubó adicionalmente durante 5 minutos a temperatura ambiente. La resina se retiró por centrifugación y luego se añadieron al sobrenadante 20 j l de tampón 10X glyco 1 (New England Biolabs). La disolución de anticuerpo humano recuperado se esterilizó por filtración y se incubó con EndoS durante 1 hora a 37 °C. Entonces, se redujeron los AcM desglicosilados con TCEP y se analizaron mediante LC/MS tal como se describió anteriormente. Se determinó el porcentaje de anticuerpo conjugado a partir de las alturas de los picos de los espectros de masas tal como se describe en el ejemplo 12.
Análisis de espectrometría de masas: Se analizaron las muestras tal como se describe en el ejemplo 1.
Análisis de citotoxicidad in vitro: Las líneas celulares de cáncer SκΒR3 y N87 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Life Technologies) complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (HI-FBS) (Life Technologies) a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células SκΒR3 y NCI-N87 recogidas en la fase de crecimiento exponencial se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a 2500 y 2000 células/pocillo y se permitió que se adhirieran durante la noche. Entonces, se trataron las células el día siguiente con ADC en diluciones en serie de 4 veces desde 4000 y 64.000 ng/ml (9 concentraciones) por duplicado. Las células tratadas se cultivaron durante 6 días y se determinó la viabilidad celular usando el ensayo de viabilidad luminiscente CellTiter-Glo (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se calculó como porcentaje de las células de control sin tratar. Se determinaron los valores de CI50 usando análisis de regresión logística no lineal con el software Prism (GraphPad).
Inhibición del crecimiento tumoral in vivo: Los ADC de Herceptin-MMAE preparados con AcM modificados con enlazador de F2 y CPlb se evaluaron adicionalmente para determinar la actividad antitumoral in vivo en un modelo de xenoinjerto subcutáneo de N87 en ratones. Los tumores se prepararon por inoculación de células N87 (5 millones de células N87 en Matrigel al 50%) por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos hembra de 4-6 semanas de edad. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3, los ratones se asignaron al azar en grupos, 5 ratones por grupo. Se administraron ADC IV a las dosis indicadas y se dosificaron el día 5 después de la inoculación celular. Las dimensiones del tumor (eje largo y eje corto) se midieron dos veces por semana con calibres. El volumen tumoral se calculó usando la ecuación:
Donde,
1. a= eje largo del tumor en mm
2. b = eje corto del tumor en mm
Figura 14.1. Análisis de espectrometría de masas de conjugados de AcM-enlazador de CPlb. Los números por encima de los picos indican el número de enlazadores (B y E) o AM-MMAE (C y F) conjugados con el AcM. Todas las muestras se desglicosilaron con EndoS antes del análisis.
Figura 14.2. Análisis de espectrometría de masas de conjugados de AcM-enlazador de F2. Los números por encima de los picos indican el número de enlazadores (B y E) o AM-MMAE (C y F) conjugados con el AcM. Todas las muestras se desglicosilaron con EndoS antes del análisis.
Figura 14.3. Análisis de espectrometría de masas de conjugados de AcM-cisteína. Se indican la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de AcM (A-D), así como el número de AM-MMAE conjugados (B y D). Todas las muestras se desglicosilaron con EndoS y se redujeron antes del análisis.
Figura 14.4. Análisis de rRP-HPLC de AcM, conjugados de AcM-enlazador y ADC. Se indican la cadena ligera y las cadenas pesadas de AcM, el número de AM-MMAE conjugados con AcM también se indica para muestras de ADC.
Figura 14.5. Análisis de SEC de AcM, conjugados de AcM-enlazador y ADC. Se indican especies de alto peso molecular (HMWS).
Figura 14.6. A) Análisis de espectrometría de masas desglicosilada reducida de ADC tras la incubación en suero de rata durante 7 d. Se amplían los espectros para mostrar la cadena pesada solo. La pérdida de fármaco se indica como una disminución de las alturas de los picos de las especies DAR-1 y DAR-2 en relación con la altura del pico de DAR-0. B) Cuantificación del fármaco restante (%) usando datos de espectrometría de masas. Los datos se muestran como el promedio /- la desviación estándar, n=3.
Figura 14.7. Actividad in vitro de ADC hacia A) células NCI-N87 y B) células SκΒR3.
Figura 14.8. Actividad de inhibición del crecimiento tumoral de ADC de Herceptin-enlazador MMAE hacia modelos de tumor N87 subcutáneo en ratones.
Tabla 14.1 Resumen de ADC conjugados con enlazador y conjugados con cisteína
Tabla 14.2 Potencia in vitro de ADC conjugados a enlazador y conjugados a cisteína.
Se prepararon ADC por medio de reacción de Diels-Alder o adición de Michael de maleimido-MMAE a AcM de Herceptin y control de isotipo de IgG. Se introdujeron grupos reactivos de Diels-Alder en aminas de lisina por medio de agentes de reticulación, seguido de reacción con AM-MMAE, mientras que la adición de Michael de AM-MMAE se produjo con tioles de cisteína nativos (denominados Cys-ADC). Ambos métodos de conjugación produjeron ADC heterogéneos con un contenido de fármaco de 3-4 fármacos de MMAE por AcM.
La adición de Diels-Alder de AM-MMAE a AcM modificado con enlazador de CP1 b y F2 fue eficiente, con una conversión casi cuantitativa confirmada por espectrometría de masas. Además, la modificación de los AcM con enlazadores de ciclopentadieno o metoxifurano y la unión posterior de AM-MMAE mediante reacción de Diels-Alder no aumentó el contenido de agregados en los productos de conjugado, tal como indica el análisis de SEC. En general, los ADC producidos por conjugación de Diels-Alder fueron de alta calidad.
El análisis de la estabilidad de ADC en suero de rata mediante espectrometría de masas demostró que los constructos de Diels-Alder preparados con AcM-enlazador de CP1b y AcM-enlazador de F2 eran más estables que los constructos generados por adición de Michael a tioles de cisteína. La incubación en suero de rata durante 7 días a 37 °C dio como resultado una pérdida de fármaco del 60 % para ADC de AcM-cisteína, mientras que los ADC de AcM-enlazador de CP1 b y AcM-enlazador de F2 mostraron menos del 10 % de pérdida de fármaco en las mismas condiciones. Los ADC de Herceptin AcM-enlazador de CP1 b y Herceptin AcM-enlazador de F2 fueron potentes inhibidores de la proliferación celular hacia líneas celulares positivas para Her2 N87 y SκΒR3, con valores de CI50 similares al ADC unido a cisteína correspondiente. Los a Dc de control de isotipo sin direccionamiento fueron de 2000 a 4000 veces menos potentes que los constructos de Herceptin en la diana, con potencias in vitro similares observadas para constructos de ADC de Diels
Alder y cisteína. Finalmente, los ADC de Herceptin preparados con AcM modificados con enlazador de CP1 b y F2 fueron potentes inhibidores del crecimiento tumoral in vivo. Se observó estasis tumoral completa durante 30 días en modelos de tumor subcutáneo N87 a una dosis de ADC de 3 mg/kg. Este resultado confirma que los ADC producidos por reacción de Diels-Alder son suficientemente estables in vivo para obtener un efecto terapéutico.
Ejemplo 15. Comparación de las constantes de velocidad de la reacción de Diels-Alder en tampón acuoso y disolvente orgánico.
Se determinó la cinética de las reacciones de dieno-maleimida de molécula pequeña en condiciones orgánicas para compararlas con reacciones basadas en anticuerpos en condiciones acuosas. Se determinaron las constantes de velocidad de reacción entre dienos en AcM modificados con enlazador y maleimida; AcM-enlazador de CP1, AcM-enlazador de CP2, AcM-enlazador de CP3 y AcM-enlazador de F2.
Determinación de la velocidad de reacción de dieno-maleimida en disolventes orgánicos: Se combinaron dieno y N-etilmaleimida en CDCb en un tubo de RMN (concentración final 0,01 M cada uno) y se monitorizaron mediante 1H-RMN a temperatura ambiente. La concentración de material de partida [A] se calculó usando la integración de picos de etilo de N-etilmaleimida (3,59 o 1,20 ppm) y el/los picos de etilo del conjugado de DA (normalmente 4,40 o 1,05 ppm).
[A] = 0,01 M * (integración de material de partida) / (integración de material de partida producto)
La concentración inversa (1 / [A]) se representó gráficamente frente al tiempo (s). Se obtuvo la velocidad de reacción de segundo orden (M-1s-1) a partir de la línea de mejor ajuste. Se usó la velocidad y desviación estándar promedio de tres experimentos.
Preparación de conjugados de AcM-enlazador: Se incorporó la funcionalidad dieno aleatoriamente en los anticuerpos mediante reacción de los enlazadores que contienen éster de NHS enlazador de CP1b (compuesto 19), enlazador de CP2 (compuesto 12), enlazador de CP3 (compuesto 13) y enlazador de F2 (compuesto 17) descritos en el ejemplo 9 y ejemplo 14. La reacción de CP3-NHS con AcM se muestra en el esquema 15.1. El grado de modificación del AcM se controló mediante la cantidad de enlazador de NHS usado en la reacción y se seleccionaron diferentes densidades de enlazador dependiendo del experimento. El número de enlazadores (y por tanto dienos) por AcM se determinó mediante espectrometría de masas desglicosilada intacta tal como se describe en el ejemplo 1.
Reacción de AcM modificado con enlazador con maleimido-MMAE: Los dienos contenidos en AcM modificados con enlazador se hicieron reaccionar con 1 equivalente molar de AM-MMAE (dieno:maleimida) en tampón acuoso tal como se describe en el ejemplo 10.
Cálculo de las constantes de velocidad de reacción de AcM-enlazador dieno-maleimida: Se determinaron las constantes de velocidad de segundo orden para la reacción de maleimido-MMAE con dienos en AcM-enlazadores a partir de las intensidades de los picos en espectros de masas reducidos desglicosilados tal como se describe en el ejemplo 10. Para una muestra, solo se analizaron los picos de cadena pesada tal como se describe en el ejemplo 4.
Tabla 15.1 Resumen de las velocidades de reacción de AM-MMAE con AcM modificados con enlazadores de dieno en tampón acuoso y N-etilmaleimida con enlazadores de dieno en CDCb.
La comparación de las constantes de velocidad de reacción entre los compuestos de maleimida y los compuestos de dieno en condiciones de anticuerpo/acuosas y de molécula pequeña/disolvente orgánico demuestra varias características clave de esta reacción para aplicaciones de bioconjugación. En primer lugar, el furano no modificado es insuficientemente reactivo para la conjugación de compuestos de maleimida con anticuerpos en condiciones típicas de bioconjugación. Esto se evidencia por la falta de conjugación de AM-MMAE con IgG-furano, que mostró una reacción mínima después de 20 h y también una disminución de ~100-1000 veces en la constante de velocidad para la reacción con maleimida en condiciones orgánicas en comparación con otros dienos. En segundo lugar, se confirmó la aceleración de la reacción de Diels-Alder en condiciones acuosas en el contexto de la conjugación de anticuerpos. La aceleración de la velocidad de reacción es crucial para la aplicación práctica de esta química para la producción de bioconjugados; la sola consideración de las constantes de velocidad de las condiciones orgánicas haría que la reacción de Diels-Alder no fuera atractiva para todos los dienos descritos en el presente documento. Por ejemplo, el ciclopentadieno contenido en el enlazador de CP1 presentó una semivida de reacción de aproximadamente 10 minutos en reacción acuosa basada en anticuerpos con maleimida (AM-MMAE), mientras que la reacción en fase orgánica correspondiente requeriría 3,6 días. Finalmente, los resultados demuestran que la reactividad del dieno es ajustable, donde la modificación de la estructura química puede aumentar o disminuir la velocidad de reacción con el dienófilo. En conjunto, los grupos funcionales de ciclopentadieno y furano modificado son susceptibles de reacciones de bioconjugación eficientes entre anticuerpos y compuestos de maleimido en condiciones suaves a concentraciones de anticuerpos en el intervalo de ~1-2 mg/ml, mientras que el furano simple sin modificar no lo es.
Ejemplo 15. Producción de ADC con AcM 1C1-K274CP1 NNAA y enlazador de fármaco AZ1508
Se evaluó la viabilidad de la preparación de ADC con CP1-NNAA incorporado en la posición K274 de un anticuerpo con enlazador de fármaco AZ1508.
Generación de anticuerpos. Se incorporó CP1-NNAA en el anticuerpo 1C1 usando los métodos descritos en el ejemplo 6.
Conjugación de 1C1 K274CP1-AcM con AZ1508: Se ajustó K274CP1 NNAA-AcM (0,4 mg, 2,7 nmol, 1 equivalente) a 3 mg/ml con PBS (0,133 ml). Se añadieron DMSO (27 |jl) y fosfato de sodio monobásico 1 M (13 |jl) para producir una disolución al ~20 % y 10 % v/v, respectivamente. Se añadió AZ1508 (5 j l de disolución madre 10 mM en DMSo , 13 nmol, 5 equivalentes) a disolución de 1C1 K274CP1-AcM y se agitó con vórtex la mezcla brevemente. La reacción transcurrió a temperatura ambiente durante 17 h con mezclado continuo. Se añadió N-acetilcisteína (1,1 j l de 100 mM, 108 nmol, 40 equivalentes) y se incubó la disolución durante 15 min adicionales para extinguir los grupos maleimida sin reaccionar. Entonces se diluyeron las muestras 3 veces con agua y se purificaron usando cromatografía CHT. Posteriormente se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas reducida y SEC tal como se describe en los ejemplos 6 y 12.
Esquema 15.1. A) Reacción de AcM K274CP1 -NNAA con AZI508. B) Estructura de AZI508
Caracterización de ADC de ICIK274CP1-NNAA: Se analizaron las muestras mediante espectrometría de masas reducida y SEC tal como se describe en los ejemplos 6 y 12. La actividad in vitro en células PC3 se realizó tal como se describe en el ejemplo 12.
Figura 15.1. Análisis de SDS-PAGE de ADC de 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508. A) no reducido B) reducido.
Figura 15.2. Análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de conjugación de AcM 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508. A) AcM sin reaccionar B) producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto la cadena pesada (HC) como la cadena ligera (LC) del anticuerpo.
Figura 15.3. Análisis de SEC de ADC de 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 que indica que se obtuvo una alta cantidad de producto monomérico. Se indican los sólidos de alto peso molecular (HMWS).
Tabla 15.1 Resumen de las propiedades de ADC de 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508abc
"todas las reacciones de conjugación realizadas a pH 5,5, DMSO al 20 %, 22 °C y AcM 1C1 K274CP1-NNAA 3 mg/ml. Se incorporó CP1-NNAA en la posición K274 en lugar de lisina
bla razón molar de AZ1508:dieno de CP1 fue 2.5:1
ccalculado a partir de las intensidades de picos de espectros de masas reducidos
dDAR= razón de fármaco con respecto a anticuerpo
Determinado en células PC3 positivas para receptor de EphA2
Se confirmó la reactividad de dieno de CP1-NNAA hacia AZ1508 tras su incorporación en la posición K274 del anticuerpo 1C1. El producto de ADC era de alta calidad, con >95 % de conjugación y muy poco agregado. El ADC resultante era activo hacia células PC3 positivas para receptor.
Ejemplo 16. Generación de ADC con anticuerpos 1C1 S239CP2-NNAA, 1C1 K274CP2-NNAA y 1C1 N297CP2-NNAA con enlazador de fármaco AZ1508 y comparación con ADC de AZ1508 específicos de sitio unidos a cisteína análogos.
Se prepararon ADC que llevan enlazador de fármaco AZ1508 con anticuerpos 1C1 que incorporan CP2-NNAA en las posiciones S239, K274 y N297 mediante mutación del codón de aminoácido nativo a un codón de terminación ámbar en el plásmido de expresión. Se incorporó CP2-NNAA en cada posición en anticuerpos separados.
Generación de anticuerpos: Se incorporó CP2-NNAA en anticuerpos 1C1 y se expresó usando los métodos descritos en el ejemplo 6. Se incorporó cisteína en anticuerpos 1C1 mediante mutagénesis dirigida al sitio usando técnicas convencionales de biología molecular.
Conjugación de AcM 1C1 CP2-NNAA con AZ1508: Se realizó el mismo método de conjugación para los tres constructos de anticuerpos CP2-NNAA, usando el procedimiento descrito en el ejemplo 12, siendo la única diferencia que se reemplazó AM-MMAE con AZ1508. Obsérvese que la conjugación del enlazador de fármaco se logra simplemente mezclando AZ1508 con AcM CP2-NNAA y luego mezclando.
Esquema 16.1. A) Reacción de AcM CP2-NNAA con AZI 508. Véase el esquema 15.1 para la
estructura de AZ1508.
Conjugación de AcM modificados por ingeniería genética con cisteína 1C1 con AZ1508. Se prepararon ADC de AZ1508 unidos a cisteína específicos de sitio usando el mismo método descrito en el ejemplo 12 siendo la única diferencia que AM-MMAE se sustituyó por AZ1508. Obsérvese que la cisteína-AcM debe reducirse, dializarse y oxidarse antes de la adición de AZ1508.
Caracterización de ADC de 1C1 CP2-NNAA y ADC modificados por ingeniería genética con cisteína de 1C1. Se analizaron las muestras mediante SDS-PAGE, espectrometría de masas reducida, HIC, rRP-HPLC y SEC tal como se describe en los ejemplos 6 y 12. La actividad in vitro en células PC3 cultivadas se realizó tal como se describe en el ejemplo 12.
Figura 16.1. Análisis de SDS-PAGE de ADC de 1C1 CP2-NNAA AZ1508 y ADC de 1C1 cisteína AZ1508. A) Muestras no reducidas, B) muestras reducidas.
Figura 16.2. Análisis de ADC de 1C1 S239CP2-NNAA AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (Hc ) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.3. Análisis de ADC de 1C1 K274CP2-NNAA AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (Hc ) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.4. Análisis de ADC de 1C1 N297CP2-NNAA AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (Hc ) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.5. Análisis de ADC de 1C1 S239C AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.6. Análisis de ADC de 1C1 K274C AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Figura 16.7. Análisis de ADC de 1C1 N297C AZ1508. A) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida de AcM sin reaccionar. B) análisis de espectrometría de masas glicosilada reducida del producto de reacción AZ1508. C) Análisis de HIC de anticuerpo sin reaccionar y producto de conjugación AZ1508, D) análisis de SEC de producto de reacción AZ1508. Se amplían los espectros para mostrar tanto las cadenas pesadas (HC) como ligeras (LC) del anticuerpo en (A) y (B).
Tabla 16.1 Resumen de ADC de ACM 1C1 CP2-NNAA y cisteínaab
atodas las reacciones de conjugación de CP2 NNAA realizadas a pH 5,5, DMSO al 20 %, 22 °C y AcM 3
mg/ml.
bla razón molar de AZ1508:CP2 usada fue 2.5:1
cdeterminado por las áreas de picos en trazas de SEC
dDAR= razón de fármaco con respecto a anticuerpo
ecalculado a partir de las intensidades de picos de espectros de masas reducidos
Determinado por las áreas de picos tras el análisis de ADC intactos
gdeterminado por los espectros de masas reducidos
hDeterminado en células PC3 positivas para receptor de EphA2.
Se incorporó CP2-NNAA en tres posiciones del anticuerpo 1C1 y se confirmó la reactividad hacia AZ 1508. Obsérvese que se incorporó CP2-NNAA en cada posición en anticuerpos separados. Los ADC preparados con AcM CP2-NNAA fueron de alta calidad, con >95 % de conjugación y muy poco agregado. Los ADC de CP2-NNAA AZ1508 resultantes eran activos hacia células PC3 positivas para receptor.
La comparación de los ADC de CP2-NNAA con los correspondientes anticuerpos modificados por ingeniería genética con cisteína reveló que la posición N297 es susceptible de mutación con CP2-NNAA pero no con cisteína. La introducción de cisteína en esta posición da como resultado la mezcla de disulfuro durante el procedimiento de conjugación, como lo demuestran los resultados de SDS-PAGE. No se observó mezcla de disulfuro para el ADC de N297CP2-NNAA. Esto demuestra que CP2-NNAA puede introducirse en posiciones no adecuadas para la incorporación de cisteína, donde la cisteína puede afectar a los disulfuros nativos en el armazón del anticuerpo.
Ejemplo 17. Estabilidad de ADC de CP1-NNAA y CP2-NNAA AZ1508 en suero de ratón y rata
Se evaluó la estabilidad en suero de los ADC de AZ1508 preparados por conjugación de Diels-Alder. La estabilidad de los ADC se evaluó en relación con el enlace químico entre el anticuerpo y la carga útil (es decir, el aducto de Diels-Alder). También se presenta para comparación la estabilidad de ADC análogos unidos a cisteína (tiosuccinimida).
Método: Se incubaron ADC de 1C1 AZ1508 en suero de ratón o suero de rata, ex vivo durante 7 días a 37 °C, se recuperaron por inmunocaptura y se analizaron por espectrometría de masas tal como se describe en el ejemplo 7. Se
determinaron las cantidades relativas de anticuerpo conjugado y no conjugado por las alturas de picos en espectros de masas tal como se describe en el ejemplo 7. Para las muestras incubadas con suero de ratón, se observó desacetilación de AZ1508. AZ1508 desacetilado se consideró como una especie conjugada para el cálculo de DAR.
Figura 17.1. Espectros de masas glicosilados reducidos representativos de ADC de 1C1 CP2-NNAA y 1C1 cisteína-AZ1508 antes y después de la incubación en suero de rata. Los aminoácidos naturales se mutaron a CP2-NNAA o cisteína tal como se indica en (A) posición S239, (B) posición K274, (C) posición N297. Se indican especies no conjugadas y conjugadas.
Figura 17.2. Cuantificación de AZ1508 que queda unido a CP2-NNAA o anticuerpos modificados por ingeniería genética con cisteína tras la incubación en suero de rata durante 7 d a 37 °C. Las razones de fármaco:anticuerpo (DAR) se calcularon a partir de espectros de masas glicosilados reducidos. Los datos representan el promedio ± desviación estándar, n=3.
Figura 17.3. Cuantificación de AZ1508 que queda unido a CP2-NNAA o anticuerpos modificados por ingeniería genética con cisteína tras la incubación en suero de ratón durante 7 d a 37 °C. Las razones de fármaco:anticuerpo (DAR) se calcularon a partir de espectros de masas glicosilados reducidos. Se consideró AZ1508 desacetilado una especie conjugada para el análisis. Los datos representan el promedio ± desviación estándar, n=3.
Figura 17.4. Cuantificación de AZ1508 que queda unido a anticuerpos CP1-NNAA tras la incubación en suero de rata durante 7 d a 37 °C. Las razones de fármaco:anticuerpo (DAR) se calcularon a partir de espectros de masas glicosilados reducidos. Los datos representan el promedio ± desviación estándar, n=3.
El análisis de ADC de 1C1 CP2-NNAA AZ1508 tras la incubación en suero de rata o de ratón durante 7 d a 37 °C demostró que el aducto de Diels-Alder era estable, ya que no se observó pérdida de fármaco. 1C1 CP1-NNAA AZ1508 preparado en la posición K274 tampoco mostró pérdida de fármaco en suero de rata después de 7 días de incubación a 37 °C; sin embargo, se observó una pérdida significativa de fármaco para los ADC unidos a cisteína análogos sujetos a las mismas condiciones. La estabilidad del ADC unido a cisteína dependía de la posición, siendo estable la posición S239 y no así las posiciones K274 y N297. En el caso de los ADC unidos a cisteína, AZ1508 se acopla al anticuerpo por medio de un enlace de tiosuccinimida, que puede experimentar la reacción de desconjugación de retro-Michael, conduciendo a pérdida de fármaco. Este proceso afecta a las posiciones expuestas más que a las posiciones enterradas, por tanto se observa una estabilidad dependiente de la posición para los ADC unidos a cisteína. Los aductos de Diels-Alder, por otro lado, eran estables en posiciones inestables para las tiosuccinimidas, tanto para los dienos de CP1 como para los de CP2. Por tanto, la conjugación de Diels-Alder con ciclopentadieno NNAA representa una ventaja sobre las estrategias de conjugación basadas en tiol en cuando a la estabilidad del conjugado.
Ejemplo 18. Cinética de reacción de AcM 1C1 que contiene CP1-NNAA o CP2-NNAA con AZ1508.
La reactividad de los NNAA de dieno se evaluó después de la incorporación en las posiciones S239, K274 o N297 en el armazón del anticuerpo 1C1.
Métodos: Los anticuerpos 1C1 CP1-NNAA o CP2-NNAA (3 mg, 1,3 mg/ml de AcM, dieno 17,4 |j M, 1 equivalente) se hicieron reaccionar con AZ1508 (4 j l de disolución madre 10 mM en DMSO, 40 nmol, 1 equivalente) en fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, DMSO al 20 %, pH 5,5, 22 °C. Se extrajeron alícuotas (100 j l) de la mezcla de reacción en puntos de tiempo predeterminados y se añadió N-acetilcisteína (3 j l de 100 mM en agua, 8 equivalentes) seguido de incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente para extinguir las maleimidas sin reaccionar. Entonces se purificaron las muestras usando dispositivos PD Spintrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences) para eliminar componentes de molécula pequeña de la mezcla y, posteriormente, se analizaron mediante espectrometría de masas glicosilada reducida. Los procedimientos de análisis de espectrometría de masas y los cálculos de la constante cinética se describen en los ejemplos 5 y 10.
Figura 18.1. Cinética de conjugación de AcM 1C1 CP1-NNAA y 1C1 CP2-NNAA con AZ1508 medida mediante espectrometría de masas glicosilada reducida. Los datos se representan gráficamente como el promedio ± error absoluto, n=2 1C1 K274CP1-NNAA, 1C1 K274CP2-NNAA y 1C1 N297CP2-NNAA, y promedio ± desviación estándar n=3 para 1C1 S239CP2-NNAA.
Figura 18.2. Gráfico de concentración inversa que muestra el consumo de dieno tras la reacción de AcM CP1-NNAA y CP2-NNAA con AZ1508. AcM (A) 1C1 K274CP1-NNAA, (B) 1C1 S239CP2, 1C1 K274CP2-NNAA y N297CP2-NNAA. Los datos se representan gráficamente como el promedio ± error absoluto, n=2 1C1 K274CP1-NNAA, 1C1 K274CP2-NNAA y 1C1 N297CP2-NNAA, y promedio ± desviación estándar n=3 para 1C1 S239CP2-NNAA.
Tabla 18.1. Resumen de los datos cinéticos para la reacción de AcM 1C1 CP1-NNAA y CP2-NNAA con AZ1508.abc
Los anticuerpos que llevan CP1-NNAA o CP2-NNAA reaccionaron con el enlazador de fármaco que contiene maleimida AZ1508 a 1:1 equivalente molar de dieno:maleimida. Semividas de reacción de 12 minutos para AcM CP1-NNAA y 3-10 horas para AcM CP2-NNAA. Las conversiones finales logradas después del periodo de medición de 48 h oscilaron entre el 87-100%.
Ejemplo 19. Actividad antitumoral de ADC preparados con AcM CP2-NNAA y AZ1508.
Se evaluó la capacidad de los ADC preparados con 1C1 CP2-NNAA y enlazador de fármaco AZ1508 para inhibir el crecimiento tumoral de xenoinjertos de PC3 en ratones.
Preparación de ADC: Se prepararon ADC con AcM 1C1 tal como se describe en el ejemplo 16. Se prepararon ADC que no se unen a EphA2 con un anticuerpo de control de isotipo (denominado R347). Se incorporó CP2-NNAA en las posiciones S239 y N297 para AcM 1C1 y en la posición S239 para AcM R347.
Métodos in vivo: Los estudios de inhibición del crecimiento tumoral se realizaron en Charles River Discovery Services North Carolina (CR Discovery Services) de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio con respecto a la inmovilización, la cría, los procedimientos quirúrgicos, la regulación de alimentos y líquidos, y la atención veterinaria. Se establecieron modelos de tumor de xenoinjerto de PC3 en ratones mediante la inoculación de células PC3 (10 millones de células en Matrigel al 50%) por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos hembra de 8-9 semanas de edad. Diecisiete días después, designado como día 1 del estudio, los volúmenes tumorales alcanzaron ~ 150-200 mm3 y los ratones se asignaron aleatoriamente en grupos, 8 ratones por grupo. El día 1 del estudio, se inició la dosificación y se administró ADC a 3 mg/kg mediante inyección en la vena de la cola. Se dosificó ADC una vez por semana a 3 mg/kg a lo largo de tres semanas para un total de tres dosis. Las dimensiones del tumor (eje largo y eje corto) se midieron posteriormente dos veces por semana con calibres. El volumen tumoral se calculó usando la ecuación del ejemplo 14.
Figura 19.1. Inhibición del crecimiento tumoral de xenoinjertos de PC3 en ratones después de la administración de ADC de CP2-NNAA AZ1508. Se prepararon ADC de AcM 1C1 en la diana con CP2-NNAA incorporado en la posición S239 o N297, mientras que el ADC de AcM R347 de control de isotipo sin direccionamiento se preparó con CP2 incorporado en la posición S239. Los ADC se dosificaron por vía intravenosa a 3 mg/kg los días 0, 7 y 14 (indicados con flechas). Los datos se representan como el promedio ± desviación estándar, N=8.
Los ADC de 1C1 CP2-NNAA AZ1508 fueron eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de PC3 positivos para EphA2 en ratones durante al menos 60 días después de la primera inyección de ADC. El ADC fuera de la diana preparado con AcM R347 sin unión no fue tan potente como los ADC en la diana.
Ejemplo 20. Conjugación de anticuerpo CP1-NNAA con nanopartículas funcionalizadas con maleimida.
Se hizo reaccionar anticuerpo 1C1 K274CP1-NNAA con nanopartículas de oro funcionalizadas con maleimida de 60 nm.
Método: Se prepararon nanopartículas de oro de 60 nm funcionalizadas con maleimida a partir de un kit comercial (Sigma Aldrich, n.° de catálogo 9009465) según las instrucciones del fabricante. En primer lugar, el producto de nanopartículas de oro funcionalizadas con maleimida liofilizadas se resuspendió en 100 j l de tampón de reacción proporcionado en el kit. A continuación, se prepararon disoluciones de anticuerpos de tipo natural (WT) o K274CP1-NNAA 1C1 a 0,5 mg/ml en PBS. La disolución de nanopartículas (10 j l) y la disolución de anticuerpos (10 j l) se combinaron y se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. La reacción de conjugación continuó durante 2 horas a 25 °C, seguida
de un análisis de dispersión de luz usando un instrumento Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, Reino Unido). Cada reacción de conjugación se realizó por triplicado.
Esquema 20.1. Reacción de AcM 1C1 K274CP1-NNAA con nanopartículas de oro
funcionalizadas con maleimida.
Figura 20.1. Dispersión de luz dinámica (DLS) de nanopartículas de oro funcionalizadas con maleimida de 60 nm antes y después de la incubación con anticuerpos 1C1 de tipo natural (WT) o 1C1 K274CP1-NNAA (AcM CP1-NNAA) durante 2 h a 25 °C.
Tabla 1. Resumen de los datos de dispersión de luz para nanopartículas y conjugados de nanopartícula-AcM.
Anticuerpo que incorpora CP1-NNAA conjugado con nanopartículas funcionalizadas con maleimida por medio de una reacción de Diels-Alder.
Claims (10)
1. Método de bioconjugación que comprende la etapa de conjugar una molécula de anticuerpo que contiene un primer grupo funcional insaturado con un fármaco que comprende un segundo grupo funcional insaturado, en donde los grupos funcionales insaturados primero y segundo son complementarios entre sí de manera que la conjugación es una reacción de dichos grupos funcionales por medio de una reacción de Diels-Alder que forma un anillo de ciclohexeno, en donde el primer grupo funcional es un dieno y el segundo grupo funcional es una maleimida.
2. Método de bioconjugación según la reivindicación 1, en donde el dieno es un dieno lineal, dieno carbocíclico o dieno heterocíclico, opcionalmente en donde el dieno comprende un butadieno, un ciclopentadieno, un 1,3-ciclohexadieno, un furano o antraceno.
3. Método de bioconjugación según la reivindicación 1 o 2, en donde el dieno está contenido en un aminoácido no natural, opcionalmente en donde el dieno es una cadena lateral del aminoácido.
4. Método de bioconjugación según la reivindicación 3, en donde el dieno es un aminoácido no natural derivado de lisina, cisteína, selenocisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina.
6. Método de bioconjugación según la reivindicación 1 o 2, en donde el método comprende una pre-etapa de conjugación del dieno por medio de un enlazador a un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo, opcionalmente en donde el aminoácido es una cisteína o lisina.
8. Anticuerpo o fragmento de unión del mismo conjugado con un fármaco, de o bien
a. fórmula (IVa):
en donde
RY representa el fármaco; y
RZ representa el anticuerpo o fragmento de unión del mismo; o bien de
b. fórmula (IVb):
en donde
RY representa el fármaco;
RZ representa el anticuerpo o fragmento de unión del mismo; y
X4 representa -O- o -CH2-,
en donde la reacción de conjugación que une el anticuerpo o fragmento de unión del mismo al fármaco era por medio de una reacción de Diels-Alder entre un dieno y un dienófilo para formar un anillo de ciclohexeno.
9. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión del mismo conjugado con una carga útil tal como se define en la reivindicación 8 y un diluyente, portador y/o excipiente.
10. Anticuerpo o fragmento de unión del mismo conjugado con una carga útil tal como se define en la reivindicación 8 y un diluyente o una composición farmacéutica tal como se define en la reivindicación 9, para su uso en tratamiento.
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