ES2716812T3 - Anticuerpos que se unen específicamente al receptor EphA2 - Google Patents

Anticuerpos que se unen específicamente al receptor EphA2 Download PDF

Info

Publication number
ES2716812T3
ES2716812T3 ES10765689T ES10765689T ES2716812T3 ES 2716812 T3 ES2716812 T3 ES 2716812T3 ES 10765689 T ES10765689 T ES 10765689T ES 10765689 T ES10765689 T ES 10765689T ES 2716812 T3 ES2716812 T3 ES 2716812T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
conjugate
epitope
antibodies
epha2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10765689T
Other languages
English (en)
Inventor
Hervé Bouchard
Alain Commercon
Claudia Fromond
Vincent Mikol
Fabienne Parker
Ingrid Sassoon
Daniel Tavares
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41557445&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2716812(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sanofi SA filed Critical Sanofi SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2716812T3 publication Critical patent/ES2716812T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos que se unen específicamente al receptor EphA2.
La presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este que se une específicamente a un receptor EphA2.
Se refiere, además, a un conjugado que comprende un agente citotóxico que se une covalentemente al anticuerpo y un método para preparar dicho conjugado.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una enfermedad caracterizada por la proliferación descontrolada, que resulta de una transducción de señal aberrante. Las formas más peligrosas de cáncer son células malignas que tienen la capacidad de propagarse, ya sea por crecimiento directo en tejido adyacente a través de la invasión, o por implantación en sitios distantes mediante metástasis. Las células metastásicas han adquirido la capacidad de desprenderse del tumor primario, trasladarse a sitios distantes a través del torrente circulatorio o sistema linfático, y colonizar microentornos distantes y extraños.
Ahora está claro que las moléculas Eph participan en estados de enfermedad como el cáncer. Los receptores Eph son una familia única de tirosina cinasas receptoras (RTK, por sus siglas en inglés), la más grande en el genoma, que consiste en catorce receptores, divididos en dos grupos A y B, que interactúan con ocho ligandos Ephrin unidos a la membrana (Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6: 462-475). La unión de los receptores Eph a sus ligandos induce la aglomeración del receptor, la activación de la actividad de cinasa y la posterior transfosforilación de los dominios citoplasmáticos en residuos tirosina, que crean sitios de acoplamiento para varias proteínas de señalización (Kullander, K. and Klein, R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486; Noren, N. K. and Pasquale, E. B., 2004, Cell signal., 16: 655-666).
Se ha informado sobre la sobreexpresión del receptor EphA2 en cánceres de ovario, mama, próstata, pulmón, colon, esófago, célula renal, cuello uterino y melanoma. Se ha sugerido que EphA2 es un regulador positivo del crecimiento celular y la supervivencia en células malignas (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179­ 1187). También se ha descrito un papel para EphA2 en el cáncer, dado que la sobreexpresión de EphA2 sola es suficiente para transformar las células epiteliales mamarias en un fenotipo maligno (Zelinski et al., 2001, Cancer Res., 61: 2301-2306) y aumenta la metástasis espontánea hacia sitios distantes (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187). Además, hay cada vez más pruebas que sugieren que EphA2 participa en la angiogénesis tumoral (Ogawa et al., 2000, Oncogene, 19: 6043-6052; Cheng et al. 2002, Mol. Cancer Res., 1: 2-11; Cheng et al., 2003, Neoplasia, 5 (5): 445-456; Dobrzanski et al., 2004, Cancer Res., 64: 910-919).
Se ha demostrado que la fosforilación de EphA2 está vinculada con su abundancia. El EphA2 fosforilado en tirosina se internaliza rápidamente y queda destinado a la degradación, mientras que el EphA2 no fosforilado demuestra recambio reducido y, por lo tanto, se acumula en la superficie celular. Actualmente se cree que este tipo de modelo podría contribuir a una mayor frecuencia de sobreexpresión de EphA2 en el cáncer (Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187). Sin embargo, la realidad puede ser más compleja, dado que datos recientes parecen indicar un papel para las funciones dependientes e independientes de EphA2 en la progresión tumoral (Fang W. B., 2005, Oncogene, 24: 7859-7868).
Se han desarrollado anticuerpos agonistas que promueven la fosforilación en tirosina e internalización de EphA2, que resulta, en última instancia, en la inhibición del crecimiento de las células tumorales (Dodge-Zantek et al., 1999, Cell Growth & Differ., 10: 629-638; WO 01/12172, WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642).
La solicitud WO 2006/084226 describe anticuerpos que no aumentan ni disminuyen la actividad de EphA2 cinasa, pero que son capaces de impedir la proliferación de las células tumorales. Sin embargo, no hay indicación en ella de que estos anticuerpos previenen la unión de EphrinA1 al receptor e inhiben la fosforilación de EphA2 inducida por EphrinA1. Se ha propuesto el uso de anticuerpos antagonistas en WO 2004/092343, pero no se ha descrito ningún anticuerpo propiamente dicho en ella. Se han descrito anticuerpos que reconocen EphA2 que son verdaderos antagonistas en WO 2008/010101, así como variantes humanizadas y conjugados de estos. Estos anticuerpos y derivados de estos inhiben el crecimiento de células tumorales dependiente de EphA2 cinasa.
Sin embargo, todavía existe la necesidad de medicamentos nuevos y eficaces que se puedan usar en el tratamiento del cáncer.
Compendio de la invención
Un objeto de la invención es proporcionar nuevos agentes que se unen específicamente a miembros de la familia del receptor Eph de clase A, tales como EphA2, e inhiben la actividad celular del receptor al antagonizar al receptor. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva incluye anticuerpos o fragmentos de estos que reconocen el receptor EphA2, preferiblemente humano y funcionan como antagonistas de dicho receptor. Estos anticuerpos carecen de toda actividad agonista. La invención es como se define en las reivindicaciones.
El anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este de la presente memoria descriptiva comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, dicha cadena pesada comprende tres regiones de determinación de la complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y dicha cadena ligera comprende tres regiones de determinación de la complementariedad secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 4, 5 y 6. En una realización preferida, dicho anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este está humanizado o acondicionado.
La invención se refiere, en particular, a un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este que se une específicamente a un receptor EphA2 y comprende al menos una cadena pesada y al menos una ligera, en donde dicha cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 12, y en donde dicha cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 14.
En una realización adicional, la cadena pesada de dicho anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, y la cadena ligera de dicho anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.
Según se describe en la presente memoria, el dicho anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este se conjuga con un agente citotóxico. Por lo tanto, un aspecto de la presente memoria descriptiva es describir un conjugado de un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de unión a epítopo de este, en donde dicho conjugado comprende un agente citotóxico unido que se elige entre:
el compuesto de fórmula (XIII):
Figure imgf000003_0001
el compuesto de fórmula (XIV):
Figure imgf000004_0001
el compuesto de fórmula (XXIV):
Figure imgf000004_0002
el compuesto de fórmula (XXV):
Figure imgf000004_0003
el compuesto de fórmula (XXVI):
Figure imgf000005_0001
y
el compuesto de fórmula (XXVII):
Figure imgf000005_0002
En un aspecto preferido, el conjugado comprende el compuesto de fórmula (XIII) como el agente citotóxico. En una realización, la cantidad de moléculas de maitansinoide unidas por molécula de anticuerpo (DAR) en dicho conjugado comprende entre 4 y 7 moléculas de maitansinoide/molécula de anticuerpo, dicha DAR se determina al medir por vía espectrofotométrica la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm.
En otro aspecto, se proporciona un método para preparar un conjugado que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una disolución acuosa, opcionalmente tamponada, de un agente de unión a célula con una disolución de un compuesto citotóxico;
(ii) después, separar opcionalmente el conjugado que se formó en (i) de los reactivos que no hicieron reacción y cualquier aglomerado que pueda estar presente en la disolución;
en donde el agente de unión a célula es un anticuerpo según las reivindicaciones 1-3, y un agente citotóxico elegido entre:
el compuesto de fórmula (XVII):
Figure imgf000006_0001
en donde Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno; y el compuesto de fórmula (XVIII):
Figure imgf000006_0002
en donde Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno. Los conjugados que se pueden obtener mediante dicho método están comprendidos dentro del alcance de la presente memoria descriptiva. En particular, dicho conjugado tiene una estructura elegida entre las estructuras de la fórmula (XV):
Figure imgf000007_0001
y de la fórmula (XVI):
Figure imgf000007_0002
en donde Ab es un anticuerpo según la presente invención y n es un número entero comprendido entre 1 y 15. En una realización preferida, n está comprendido entre 4 y 7. En otra realización preferida, el conjugado de la invención tiene la estructura de la fórmula (XV).
La afinidad del anticuerpo de la invención o fragmento de unión a epítopo de este por el antígeno no se ve afectada por el proceso de conjugación; por otro lado, la conjugación de un agente citotóxico con los anticuerpos de la técnica anterior resulta en una afinidad menor por EphA2. El dicho anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este de la presente invención, cuando se conjuga con un agente citotóxico, muestra más potencia y es más selectivo al destruir células tumorales que expresan EphA2 que los conjugados de la técnica anterior. Además, los conjugados de la presente invención exhiben propiedades farmacocinéticas ventajosas con respecto a los conjugados de la técnica anterior, tal como un aclaramiento más lento, una mejor exposición y una estabilidad aumentada del conjugado in vivo. Duchas propiedades serían particularmente útiles, junto con la elevada eficacia citotóxica y selectividad, para desarrollar un medicamento que es a la vez seguro y eficaz.
Por lo tanto, la invención abarca una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención o fragmento de unión a epítopo de este, o un conjugado de este, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión a epítopo de estos, o conjugados de estos, se pueden usar como un medicamento. En particular, se pueden usar para producir un medicamento para tratar el cáncer. En una realización preferida, el dicho cáncer se elige entre carcinoma, incluidos los de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides y piel; incluido el carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluida, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluidas leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; otros tumores, incluidos melanoma, seminoma, teratocarcinoma, cáncer folicular tiroideo, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluidos astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas.
Leyendas de figuras
Figura 1: Secuencias de la CDR, la Vh y la Vl de mu2H11R35R74, y de la Vh y la Vl de hu2H11 R35R74.
Figura 2: Espectro de HRMS de hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 usando el método C (ejemplo 1a.1.) Figura 3: Espectro de HRMS de hu2H11 R35R74-PEG4-Mal-DM4 usando el método C (ejemplo 1b.1.)
Figura 4: Análisis de la cinética de la fosforilación de EphA2 en células MDA-MB-231. WT: células no tratadas naturales; MW: marcador de peso molecular; P-EphA2: Epha2 fosforilado
Figuras 5A y 5B: Inhibición de la fosforilación de EphA2 después de la inducción mediante EphrinA1/Fc, respectivamente, en células NCI-H1299 (5A) y células MDA-MB-231 (5B); WT: células no tratadas naturales; MW: marcador de peso molecular; P-EphA2: EphA2 fosforilado.
Figura 6: Actividad citotóxica de hu2H11 R35R74-PEG4-Mal-DM4 (círculos rellenos pequeños: DAR = 6,7; círculos rellenos grandes: DAR = 7,0) en comparación con hu2H11 -PEG4-Mal-DM4.
Figura 7: Representación de gráfico de tiempo (escala semilogarítmica) de las concentraciones en plasma medias (n=2) de hu2H11-SPDB-DM4 después de una dosis simple por administración intravenosa de 20 mg/kg de inmunoconjugado en HGS a ratones CD-1 macho. Se muestran la concentración total de IgG humana (diamantes rellenos) y la fracción de conjugado (cuadrados abiertos).
Figura 8: Representación de gráfico de tiempo (escala semilogarítmica) de las concentraciones en plasma medias (n=2) de hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 después de una dosis simple por administración intravenosa de 20 mg/kg de inmunoconjugado en HGS a ratones CD-1 macho. Se muestran la concentración total de IgG humana (diamantes rellenos) y la fracción de conjugado (cuadrados abiertos).
Figuras 9A y 9B: Parámetros PK para hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 a diversos DAR, representación de gráfico de barras de la exposición a (AUC(0-inf); figura 9A) y aclaramiento (CI; figura 9B) de diversos ADC como una función de la DAR después de una dosis simple por administración intravenosa de 20 mg/kg de inmunoconjugado en HGS a ratones CD-1 macho (n=4).
Figura 10: ilustra el mapeo del epítopo de EphA2 para Fab2H11.
Figura 11: es la secuencia de EphA2 en donde los residuos en gris oscuro son parte del epítopo; los residuos en gris claro no son visibles en las estructuras de cristal.
Figura 12 A: representa la estructura general del complejo y la figura 12B es una ampliación de la parte con las dos mutaciones de Fab.
Figura 13: es una representación de la estructura del parátopo.
Figura 14: Espectro de HRMS de hu2H11 R35R74-PEG4-NMeAc-DM4.
Figura 15: Espectro de HRMS de hu2H11 R35R74-PEG8-NHAc-DM4.
Figura 16: Espectro de HRMS de hu2H11 R35R74-PEG4-Allyl-DM4.
Figura 17: Espectro de HRMS de hu2H11-PEG4-NHAc-DM4.
Descripción detallada de la invención
A menos que se definan de cualquier otra manera, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, los términos en singular incluirán plurales y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en la presente memoria son las conocidas y usadas comúnmente en la técnica. La puesta en práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de cualquier otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la literatura, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et ah, eds., 1987 y actualizaciones periódicas); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al, ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante, como se realizan comúnmente en la técnica o como se describen en la presente memoria. Las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente memoria son las conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Se usan técnicas estándares para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y suministro farmacéuticos, y el tratamiento de pacientes.
Se describen en la presente memoria nuevos anticuerpos y fragmentos de estos, capaces de unirse específicamente al receptor EphA2 y antagonizar a dicho receptor. En particular, los nuevos anticuerpos o fragmentos de la memoria descriptiva se unen específicamente a receptores Eph en la superficie celular, pero preferiblemente desprovistos de toda actividad agonista. Por otro lado, son capaces de inhibir las funciones celulares del receptor incluso en presencia de sus ligandos.
Según se usa en la presente memoria, el término “receptor EphA2” se refiere a una tirosina cinasa que pertenece a la familia de receptores Eph (revisado en Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6, 462-475), y que comprende, por ejemplo, una secuencia amínica como en los núms. de acceso a Genbank NM_004431 (EphA2 humano), NM_010139 (EphA2 murino) o NXM_345596 (EphA2 de rata). El EphA2 humano es un receptor EphA2 preferido. El término “ligando de EphA2”, según se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína que se une a, y opcionalmente activa (p. ej., estimula la autofosforilación de) un receptor EphA2. Un ligando de EphA2 preferido en la presente memoria es “EphrinA1”, que se une al receptor EphA2 y comprende, por ejemplo, una secuencia amínica como en el acceso a Genbank n M_004428 (EphrinA1 humana).
El término “antagonista”, según se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de una molécula diana, tal como un receptor EphA2. Los antagonistas pueden actuar al interferir en la unión de un receptor a un ligando y vice versa, al disminuir la fosforilación de EphA2 que podría inducirse mediante un ligando y/o al inhibir las vías intracelulares que se inducen mediante la unión de dicho ligando, y/o al inhibir la homo/hetero-oligomerización de receptores EphA. El antagonista puede bloquear completamente las interacciones receptor-ligando o puede reducir sustancialmente dichas interacciones. Todos estos puntos de intervención mediante un antagonista se considerarán equivalentes a los fines de la presente invención. Por lo tanto, se incluyen dentro del alcance de la memoria descriptiva los antagonistas (p. ej., anticuerpos neutralizantes) que se unen al receptor EphA2, al ligando de EphA2 o a un complejo de un receptor EphA2 y un ligando de EphA2; variantes o derivados de secuencia de aminoácidos de un receptor EphA2 o ligando de EphA2 que antagonizan la interacción entre un receptor EphA2 y un ligando de EphA2; receptor EphA2 soluble o ligando de EphA2 soluble, opcionalmente fusionado con una molécula heteróloga tal como una región de inmunoglobulina (p. ej., una inmunoadhesina); un complejo que comprende un receptor EphA2 en asociación con un ligando de EphA2; péptidos de secuencia sintéticos o naturales que se unen a un receptor EphA2 o un ligando de EphA2. En un aspecto preferido, el antagonista es un anticuerpo.
El término “agonista”, según se usa en la presente memoria, se refiere cualquier compuesto, incluida una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula grande, una molécula pequeña, capaz de activar una o más de las actividades biológicas de la molécula diana. Los agonistas de EphA2 actúan al estimular la fosforilación de la proteína, desencadenado, de esta manera, la degradación de dicha proteína.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente memoria descriptiva describe, entre otras características, anticuerpos monoclonales anti-EphA2, anticuerpos humanizados anti-EphA2 y fragmentos de los anticuerpos anti-EphA2. Cada uno de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención se diseña para reconocer y unirse específicamente al receptor EphA2, y actúa como un antagonista del receptor EphA2, inhibiendo la fosforilación inducida por los ligandos de EphA2.
El receptor EphA2 pertenece a la familia de receptores cuya fosforilación de la cola citoplasmática aumenta después de la unión al ligando para interactuar con una variedad de proteínas adaptadoras y de señalización, lo que conduce a la activación de diferentes vías de señalización celulares posteriores (Kullander, K. and Klein, R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486; Noren, N. K. and Pasquale, E. B., 2004, Cell signal., 16: 655-666). Según se usa en la presente memoria, el término “señalización mediada por EphA2” se refiere a todos los eventos celulares que se producen en respuesta a la unión al ligando de EphA2. Aunque los anticuerpos descritos en técnica anterior agonizan el receptor EphA2, y, en particular, aumentan la fosforilación en tirosina de la proteína EphA2, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención carecen preferiblemente de todas dichas propiedades agonistas. En particular, son incapaces de estimular la fosforilación de EphA2 por sí mismos. Al igual que los anticuerpos descritos en WO 2008/010101, los anticuerpos antagonistas y fragmentos de anticuerpos de la invención están desprovistos de toda actividad agonista. En una realización específica, se puede usar para promover la fosforilación en tirosina de EphA2, a diferencia de otros anticuerpos descritos en la técnica anterior (Dodge-Zantek et al., 1999, Cell Growth & Differ., 10: 629-638; WO 01/12172, WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642).
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos anti-EphA2 antagonistas propiamente dichos. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención tienen la capacidad de inhibir las funciones celulares del receptor EphA2, incluso en presencia de los ligandos de dicho receptor EphA2, p. ej., EphrinA1. En una realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención pueden inhibir la unión de un ligando a un receptor EphA2. En un aspecto preferido, la unión de EphrinA1 a EphA2 se evita mediante los anticuerpos y fragmentos de estos según se describen en la presente memoria. Notablemente, en otra realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención tienen la capacidad de inhibir la fosforilación en tirosina del receptor EphA2, incluso en presencia de EphrinA1.
Anticuerpos
El término “anticuerpo” se usa en la presente memoria en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa) de cualquier isotipo tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos quiméricos y fragmentos de anticuerpo. Se puede generar un anticuerpo reactivo con un antígeno específico mediante métodos recombinantes tales como selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, o al inmunizar un animal con el antígeno o un ácido nucleico que codifica el antígeno.
Un anticuerpo típico comprende dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que se enlazan mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Según se usa en la presente memoria, “Vh” o “VH” se refiere a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, que incluye la cadena pesada de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' o F(ab')2. Cuando se hace referencia a “Vl” o “VL” se refiere a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo, que incluye la cadena ligera de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' o F(ab')2. Cada región variable contiene tres segmentos denominados “regiones de determinación de la complementariedad” (“CDR”, por sus siglas en inglés) o “regiones hipervariables”, que son principalmente responsables de unirse a un epítopo de un antígeno. Normalmente se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas de manera secuencial desde el extremo N. Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables se denominan “regiones marco” (“FR”, por sus siglas en inglés). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, y adoptan en su mayoría una configuración de lámina beta, conectada mediante las tres CDR, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas muy estrechamente entre sí mediante las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991).
Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés), la fagocitosis a través de la unión al receptor Fcy, velocidad de aclaramiento de semivida a través del receptor Fc neonatal (FcRn) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) a través del complemento C1q de la cascada de complemento.
Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distinguibles, llamados kappa (K) y lambda (A), en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej., IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 5, £, y y M, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen mediante una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más (véase, p. ej., Fundamental Immunology Ch. 7, Paul, W., ed., 2a edición, Raven Press, N. Y., 1989). Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen y describen en general en, por ejemplo, Abbas et al. (Cellular y Mol. Immunology, 4a edición, W. B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más proteínas o péptidos distintos.
Un “anticuerpo policlonal” es un anticuerpo que se produjo entre o en presencia de uno o más anticuerpos distintos no idénticos. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de linfocitos B en presencia de diversos otros linfocitos B que producen anticuerpos no idénticos. Normalmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente de un animal inmunizado.
Un “anticuerpo monoclonal”, según se usa en la presente memoria, es un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que forman esta población son esencialmente idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que podrían estar presentes en cantidades menores. Estos anticuerpos se dirigen contra un epítopo simple y, por lo tanto, son altamente específicos. Un “anticuerpo no conjugado”, a los efectos de la presente, es un anticuerpo que no está conjugado con un resto citotóxico ni radioetiqueta.
Un “epítopo” es el sitio en el antígeno al que se une un anticuerpo. Puede estar formado por residuos contiguos o por residuos no contiguos que se acercan estrechamente mediante el plegado de una proteína antigénica. Los epítopos formados por aminoácidos contiguos típicamente se conservan tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por aminoácidos no contiguos típicamente se pierdan con dicha exposición.
Según se usa en la presente memoria, el término “KD” se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo/antígeno específica. “Afinidad de unión” generalmente se refiere a la intensidad de la suma total de interacciones no covalente entre un sitio de unión simple de una molécula {p. ej., un anticuerpo) y su pareja de unión (p. ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, según se usa en la presente memoria, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 : 1 entre miembros de un par de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente se puede representar mediante la Kd. La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la presente memoria. Los anticuerpos con afinidad baja generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos con afinidad alta generalmente se unen al antígeno de manera más rápida y tienden a permanecer unidos más tiempo. En la técnica se conoce una variedad de métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de estos puede usarse a los efectos de la presente invención.
La presente invención procede a partir de un anticuerpo anti-EphA2 murino, en la presente memoria mu2H11 R35R74, que está completamente caracterizado con respecto a las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada, la identificación de las CDR, la identificación de los aminoácidos superficiales y los medios para su expresión en forma recombinante.
El anticuerpo murino de la invención se puede obtener, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio del anticuerpo 53.2H11. El anticuerpo 53.2H11 se produce mediante un hibridoma depositado en virtud del Tratado de Budapest, el 16 de junio, en la American Type Culture Collection (Colección estadounidense de cultivos tipo), con el número de acceso PTA-7662, y que se describe en la solicitud PCT WO 2008/010101. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de 53.2H11, la identificación de las CDR, la identificación de los aminoácidos superficiales, así como las secuencias polinucleotídicas que codifican dichas cadenas ligera y pesada se describen todas en WO 2008/010101.
Las secuencias de aminoácidos y ADN primarias de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo mu2H11R35R74 y de versiones humanizadas de estas se describen en la presente memoria. En un aspecto, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos o fragmento de unión a epítopo de estos que comprenden una o más CDR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 5, 6. En un aspecto, los anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, y dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 4, 5, 6.
En una realización preferida, el parátopo de dichos anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a epítopo de estos comprende en la cadena ligera: Arg35 del bucle L1, Tyr54, Arg58 y Asp60 de L2.
En una realización preferida, el parátopo de dichos anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a epítopo de estos comprende la cadena pesada: Thr30, Ala31, Tyr32 y Tyr33 del bucle H1, Asn52, Tyr54, Asn55 y Phe57 de H2 y Glu99, Phe100, Tyr101, Gly102, Tyr103 y Tyr105 de H3.
Dichos anticuerpos o fragmentos de unión a epítopo de estos pueden comprender mutaciones:
en la posición: Thr H28,
en una de pocas de las siguientes posiciones en la cadena ligera: 35, 26 a 31,34 a 37, 55, 56, 57, 59 y 94 a 102, y/o en una de pocas de las siguientes posiciones en la cadena pesada: 28, 54 y 57.
En otra realización, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a un epítopo del receptor EphA2 humano que comprende los residuos Gly49, Lys50, Gly51, Asp53, Cys70, Asn71, Val72, Met73, Ser74, Gly75, Gln77, Phe108, Pro109, Gly110, Gly111, Ser113 y Ser114 del LBD del dominio extracelular del receptor EphA2 o una forma conservadoramente sustituida de estos. En un aspecto adicional, los anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO 8. En otra realización preferida, los anticuerpos de la invención comprenden una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO 10.
Anticuerpo 2H11R35R74 humanizado o acondicionado
Según se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que contiene una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Un “anticuerpo quimérico”, según se usa en la presente memoria, es un anticuerpo en el que la región constante, o una porción de esta, se altera, reemplaza o intercambia, de manera que la región variable se enlace a una región constante de una especie diferente, o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo. “Anticuerpo quimérico” también se refiere a un anticuerpo en el que la región variable, o una porción de esta, se altera, reemplaza o intercambia, de manera que la región constante se enlace a una región variable de una especie diferente, o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo.
El objetivo de la humanización es la reducción de la inmunogenicidad de un anticuerpo xenógeno, tal como un anticuerpo murino, para su introducción en un humano, mientras se mantienen la afinidad de unión a antígeno y la especificidad completas del anticuerpo. Los anticuerpos humanizados o anticuerpos adaptados para no ser rechazados por otros mamíferos se pueden producir utilizando diversas tecnologías tales como rebarnizado e injerto de CDR. Según se usa en la presente memoria, la tecnología de rebarnizado utiliza una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagénesis para alterar las superficies distintas de CDR de las regiones variables del anticuerpo para que se parezcan a las superficies de anticuerpos conocidos del hospedante diana.
Las estrategias y métodos para rebarnizar los anticuerpos y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos dentro de un hospedante diferente se describen en la patente estadounidense núm. 5.639.641. De manera resumida, en un método preferido, (1) se generan alineaciones de posición de una concentración de regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo para proporcionar un conjunto de posiciones expuestas en la superficie del marco de región variable de cadena pesada y ligera en donde las alineaciones de posición para todas las regiones variables son al menos aproximadamente 98 % idénticas; (2) se define un conjunto de residuos aminoacídicos expuestos en la superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera para un anticuerpo de roedor (o fragmento de este); (3) se identifica un conjunto de residuos aminoacídicos expuestos en la superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera que es más estrechamente idéntico al conjunto de residuos aminoacídicos expuestos en la superficie del roedor; (4) el conjunto de residuos aminoacídicos expuestos en la superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera definido en la etapa (2) se sustituye con el conjunto de residuos aminoacídicos expuestos en la superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera identificado en la etapa (3), excepto aquellos residuos aminoacídicos que están a 5 Á de cualquier átomo de cualquier residuo de las regiones de determinación de la complementariedad del anticuerpo de roedor; y (5) se produce el anticuerpo de roedor humanizado que tiene especificidad de unión.
Otro método preferido de humanización de anticuerpos, basado en la identificación de residuos flexibles, se ha descrito en la solicitud PCT WO 2009/032661. Dicho método comprende las siguientes etapas: (1) construir un modelo de homología del mAb genitor y ejecutar una simulación de dinámica molecular; (2) analizar los residuos flexibles e identificar los residuos más flexibles de una molécula de anticuerpo no humano, así como identificar residuos o motivos que probablemente serán una fuente de heterogeneidad o de reacción de degradación; (3) identificar un anticuerpo humano que exhibe el conjunto más similar de áreas de reconocimiento al anticuerpo genitor; (4) determinar los residuos flexibles que se van mutar, los residuos o motivos que probablemente serán fuente de heterogeneidad y degradación también se mutan; y (5) verificar la presencia de epítopos de linfocitos T o linfocitos B conocidos. Los residuos flexibles se pueden encontrar usando un cálculo de dinámica molecular que usa un modelo disolvente implícito, que explica la interacción del disolvente de agua con los átomos de proteína durante el período de tiempo de la simulación.
Los anticuerpos se pueden humanizar mediante el uso de una variedad de técnicas distintas que incluyen injerto de CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; patentes estadounidenses Núms. 5.530.101; y 5.585.089), rechapado o rebarnizado (EP 0592106; EP 0519596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973) y transposición de cadena (patente estadounidense N.° 5.565.332).
En ciertas realizaciones, las cadenas variables y constantes de los anticuerpos, o los fragmentos, variantes o derivados de unión a antígeno de estos son completamente humanos. Los anticuerpos completamente humanos se pueden producir usando técnicas que se conocen en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos completamente humanos contra un antígeno específico se pueden preparar al administrar el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a una exposición antigénica, pero cuyos loci endógenos se han inhabilitado. Las técnicas de ejemplo que se pueden usar para producir dichos anticuerpos se describen en las patentes estadounidenses: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. Se conocen otras técnicas en la técnica. Asimismo, los anticuerpos completamente humanos se pueden producir mediante diversas tecnologías de visualización, p. ej., visualización en fagos u otros sistemas de visualización víricos. Véanse también las patentes estadounidenses núms. 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318; y las publicaciones de solicitud de patente internacionales con número WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos humanizados o fragmentos de estos, que reconocen el receptor EphA2 y actúan como antagonistas. En una realización preferida, los anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a epítopo de estos tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que expresa el receptor EphA2. En una realización adicional, el anticuerpo humanizado o fragmento de unión a epítopo de este tienen la capacidad adicional de inhibir la migración de una célula cancerosa metastásica que expresa el receptor EphA2.
Según se describe en la presente memoria, dicho anticuerpo humanizado es un anticuerpo 2H11R35R74 humanizado o un fragmento de unión a epítopo de este.
En una realización, los anticuerpos humanizados de la invención se obtienen mediante mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias polinucleotídicas que codifican hu53.2H11 (WO 2008/010101) denominadas en la presente memoria hu2H11.
En realizaciones más preferidas, se proporcionan versiones acondicionadas o humanizadas del anticuerpo 2H11R35R74 en donde los residuos expuestos en la superficie del anticuerpo o sus fragmentos se reemplazan en ambas cadenas ligera y pesada para parecerse más estrechamente a las superficies de anticuerpo humano conocidas. El anticuerpo 2H11R35R74 humanizado o fragmentos de unión a epítopo de este de la presente invención tienen propiedades mejoradas. Por ejemplo, los anticuerpos 2H11R35R74 humanizados o fragmentos de unión a epítopo de estos reconocen específicamente el receptor EphA2. Más preferiblemente, el anticuerpo 2H11R35R74 humanizado o fragmentos de unión a epítopo de este tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célula que expresa el receptor EphA2.
Las versiones humanizadas del anticuerpo 2H11R35R74 también se caracterizan en su totalidad en la presente memoria con respecto a sus respectivas secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas ligera y pesada, las secuencias de ADN de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada, la identificación de las CDR, la identificación de sus aminoácidos superficiales y la descripción de medios para su expresión en forma recombinante. Sin embargo, el alcance de la presente memoria descriptiva no se limita a anticuerpos y fragmentos que comprenden estas secuencias. En cambio, todos los anticuerpos y fragmentos que se unen específicamente al receptor EphA2 se describen en la presente memoria. Preferiblemente, los anticuerpos y fragmentos que se unen específicamente al receptor EphA2 antagonizan la actividad biológica del receptor. Más preferiblemente, dichos anticuerpos, además, carecen sustancialmente de actividad agonista. Por lo tanto, los anticuerpos y fragmentos de unión a epítopo de la presente memoria descriptiva pueden diferir del anticuerpo 2H11R35R74 o los derivados humanizados de este, en las secuencias de aminoácidos de sus estructuras, CDR y/o cadena ligera y cadena pesada, y todavía estar dentro del alcance de la presente memoria descriptiva.
Las CDR del anticuerpo 2H11R35R74 se han determinado al resolver la estructura de cristal del fragmento Fab de 2H11R35R74 formando complejo con el dominio extracelular del receptor EphA2. Se han identificado los residuos de 2H11R35R74 que interactúan con el dominio extracelular de EphA2. Por consiguiente, se describen anticuerpos y fragmentos que tienen propiedades mejoradas producidos mediante, por ejemplo, maduración de afinidad de un anticuerpo de la presente memoria descriptiva.
Se identificaron los genes de la línea germinal de IgVK y Jk de cadena ligera y los genes de la línea germinal de IgVh y Jh de cadena pesada de ratón de donde probablemente se derivó 53.2H11, y se describieron en WO 2008/010101. Los números de acceso de dichas secuencias de línea germinal son, respectivamente, MMU231196 y AF303833. Dichas secuencias de gen de línea germinal son útiles para identificar mutaciones somáticas en los anticuerpos, incluso en las CDR.
Las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo 2H11R35R74 y las secuencias de sus CDR no se conocían anteriormente y se describen en la presente solicitud. Dicha información se puede usar para producir versiones humanizadas del anticuerpo 2H11R35R74. También se pueden obtener anticuerpos 2H11R35R74 humanizados de la invención mediante mutagénesis dirigida al sitio de hu2H11. Estos anticuerpos anti-EphA2 humanizados o sus derivados también se pueden usar como el agente de unión a célula de los conjugados de la presente memoria descriptiva.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos humanizados o fragmento de unión a epítopo de estos que comprenden una o más CDR que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 5, 6. En un aspecto adicional, los anticuerpos humanizados de la memoria descriptiva comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, y en donde dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 4, 5 y 6.
En un aspecto, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo 2H11R35R74 humanizado o fragmentos de este que comprenden una Vh que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO. 12. En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo 2H11R35R74 humanizado o fragmentos de este que comprenden una Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO 14.
En un aspecto preferido, se describe un anticuerpo 2H11R35R74 humanizado, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende tres CDR secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, en donde dicha cadena ligera comprende tres CDR secuenciales que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, en donde dicha cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO. 12, y en donde dicha cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO. 14.
Polinucleótidos, vectores y células hospedantes.
Se describen ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-EphA2 de la invención. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2. En un aspecto preferido, un ácido nucleico simple codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-EphA2 y otra molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2.
En otro aspecto de la presente memoria descriptiva, se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de las SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18. En un aspecto, el polinucleótido de la memoria descriptiva se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15 y 17. La memoria descriptiva no se limita a dichos polinucleótidos de por sí, sino que también incluye todos los polinucleótidos que exhiben al menos 80 % de identidad con dichos polinucleótidos.
El término “polinucleótido”, al que se hace referencia en la presente memoria, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.
El término “polinucleótido aislado”, según se usa en la presente memoria, significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o algunas combinación de estos, que en virtud de su origen el “polinucleótido aislado” (1) no se asocia con todo ni una porción de un polinucleótido en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (2) está funcionalmente enlazado a un polinucleótido con el que no está enlazado en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más extensa.
La memoria descriptiva describe vectores que comprenden los polinucleótidos de la invención. En un aspecto, el vector contiene un polinucleótido que codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-EphA2. En otro aspecto, dicho polinucleótido codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-EphA2. La memoria descriptiva también describe vectores que comprenden moléculas polinucleotídicas que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo y sondas de estos.
Para expresar la cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos anti-EphA2 de la invención, los polinucleótidos que codifican dichas cadenas pesada y/o ligera se insertan en vectores de expresión de manera que los genes estén funcionalmente enlazados con secuencias de transcripción y traducción.
Las secuencias “enlazadas funcionalmente” incluyen secuencias de control de expresión que son contiguas al gen de interés y secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término “secuencia de control de expresión”, según se usa en la presente memoria, se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para provocar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que están ligadas. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de iniciación de transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras adecuadas; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y, cuando se desea, secuencias que potencian la secreción de la proteína. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedante; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen secuencias promotoras, de sitio de unión ribosómico y de terminación de transcripción; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen secuencias promotoras y de terminación de la transcripción. Se pretende que el término “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias de pareja de fusión.
Se pretende que el término “vector”, según se usa en la presente memoria, haga referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedante tras la introducción en la célula hospedante y, de esta manera, se replican junto con el genoma hospedante.
Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están funcionalmente enlazados. Dichos vectores se denominan en la presente memoria “vectores de expresión recombinante” (o simplemente, “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se pueden usar de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, se pretende que la memoria descriptiva incluya dichas formas de vectores de expresión, tales como plásmidos bacterianos, YAC, cósmidos, retrovirus, episomas derivados de VEB y todos los otros vectores que el experto sabe que son convenientes para garantizar la expresión de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos descritos en la presente memoria. El experto apreciará que los polinucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera se pueden clonar en diferentes vectores o en el mismo vector. En un aspecto preferido, dichos polinucleótidos se clonan en el mismo vector.
Los polinucleótidos de la memoria descriptiva y vectores que comprenden estas moléculas se pueden usar para la transformación de una célula hospedante de mamífero adecuada, o cualquier otro tipo de célula hospedante conocida por el experto. Se pretende que el término “célula hospedante recombinante” (o simplemente “célula hospedante”), según se usa en la presente memoria, haga referencia a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se entenderá que se pretende que dichos términos hagan referencia no solo a la célula objeto específico, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones posteriores por influencias de mutación o ambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula genitora, pero aun así se incluye dentro del alcance del término “célula hospedante”, según se usa en la presente memoria. La transformación puede hacerse mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedante. Dichos métodos son conocidos para el experto en la técnica e incluyen transformación mediada por dextrano, precipitación de fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del polinucleótido en liposomas, inyección biolística y microinyección directa de ADN en núcleos.
Fragmentos de anticuerpo
Los anticuerpos de la presente invención incluyen los anticuerpos de longitud completa descritos anteriormente, así como fragmentos de unión a epítopo. Según se usa en la presente memoria, “fragmentos de anticuerpo” incluye cualquier porción de un anticuerpo que conserva la capacidad de unirse al epítopo reconocido por el anticuerpo de longitud completa, generalmente denominados “fragmentos de unión a epítopo”. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' y F(ab')2 , Fd, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados por disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprende una región Vl o Vh. Los fragmentos de unión a epítopo, incluidos anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la región(es) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una porción de los siguientes: región bisagra, dominios Ch1 , Ch2 y Ch3.
Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo contienen las seis CDR del anticuerpo entero, aunque los fragmentos que contienen menos de todas dichas regiones, tal como tres, cuatro o cinco CDR, son también funcionales. Además, los fragmentos pueden ser o pueden combinar miembros de una cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, y las subclases de estas.
Los fragmentos Fab y F(ab')2 se pueden producir mediante escisión proteolítica, usando enzimas tales como papaína (fragmentos Fab) o pepsinas (fragmentos F(ab')2).
Los fragmentos “FV de cadena simple” (“scFv”) son fragmentos de unión a epítopo que contienen al menos un fragmento de una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) enlazada a al menos un fragmento de una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL). El enlazador puede ser un péptido corto, flexible seleccionado para garantizar que se produzca el pliegue tridimensional adecuado de las regiones (VL) y (VH) una vez que están enlazadas para mantener la especificidad de unión a la molécula diana del anticuerpo entero del cual se deriva el fragmento de anticuerpo de cadena simple. El extremo carboxílico de la secuencia (Vl) o (Vh) se puede enlazar covalentemente mediante un enlazador al extremo de aminoácido de una secuencia de (Vl) o (Vh) complementaria. Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple de la presente invención contienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos una de las regiones variables o de determinación de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos enteros descritos en la presente memoria descriptiva, pero carecen de algunos o todos los dominios constantes de dichos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión al antígeno, pero constituyen una porción importante de la estructura de los anticuerpos enteros. Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple, por lo tanto, pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos que contienen una parte o un dominio constante entero. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo de cadena simple tienden a no tener interacciones indeseadas entre moléculas biológicas y la región constante de cadena pesada, u otra actividad biológica indeseada. Además, los fragmentos de anticuerpo de cadena simple son considerablemente más pequeños que los anticuerpos enteros y, por lo tanto, pueden tener mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos enteros, lo que permite que los fragmentos de anticuerpos de cadena simple localicen y se unan a sitios de unión a antígeno diana de manera más eficaz. Además, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir a una escala relativamente grande en células procariotas, lo que facilita su producción. Además, debido al tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpo de cadena simple es menos probable que provoquen una respuesta inmunitaria en un receptor que los anticuerpos enteros.
Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple se pueden generar mediante clonación molecular, biblioteca de visualización en fagos de anticuerpo o técnicas similares conocidas para el experto. Estas proteínas se pueden producir, por ejemplo, en células eucariotas o células procariotas, incluidas bacterias. Los fragmentos de unión a epítopo de la presente invención también se pueden generar usando diversos métodos de visualización en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de visualización en fagos, los dominios de anticuerpo funcionales se visualizan en la superficie de partículas de fago que llevan las secuencias polinucleotídicas que los codifican. En particular, dicho fago se puede utilizar para visualizar los dominios de unión a epítopo expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (p. ej., humanos o murinos). El fago que expresa un dominio de unión a epítopo que se une al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con el antígeno, p. ej., usando antígeno etiquetado unido o capturado en una superficie sólida o perla. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen los dominios de unión fd y M13 expresados a partir de los fagos con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados por disulfuro fusionados recombinantemente con la proteína de gen III o gen VIII de fago.
Los ejemplos de métodos de visualización en fagos que se pueden usar para producir fragmentos de unión a epítopo de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; la solicitud PCT n.° PCT/GB91/01134; las publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes estadounidenses núms. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Después de la selección en fagos, se pueden aislar las regiones del fago que codifican los fragmentos y usarse para generar los fragmentos de unión a epítopo a través de la expresión en un hospedante elegido, incluidas células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias, usando tecnología de ADN recombinante, p. ej., según se describe en detalle más adelante. Por ejemplo, también se pueden emplear técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques, 12(6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI, 34: 26-34; y Better et al., 1988, Science, 240: 1041-1043. Los ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir Fv de cadena simple y anticuerpos incluyen los descritos en las patentes estadounidenses núms. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 7995-7999; Skerra et al., 1988, Science, 240: 1038-1040.
Equivalentes funcionales
También se incluyen dentro del alcance de la memoria descriptiva los equivalentes funcionales del anticuerpo anti-EphA y el anticuerpo anti-receptor EphA2 humanizado. El término “equivalentes funcionales” incluyen anticuerpos con secuencias homólogas, anticuerpos quiméricos, anticuerpos artificiales y anticuerpos modificados, por ejemplo, en donde cada equivalente funcional se define por su capacidad de unirse al receptor EphA2. El experto entenderá que hay una superposición entre el grupo de moléculas denominadas “fragmentos de anticuerpo” y el grupo denominado “equivalentes funcionales”. Los métodos para producir equivalentes funcionales son conocidos para el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT WO 93/21319, la patente europea n.° EP 0239400; la solicitud PCT WO 89/09622; la patente europea n.° EP 0338745; y la solicitud de patente europea EP 0332424.
Los anticuerpos con secuencias homólogas son los anticuerpos con secuencias de aminoácidos que tienen homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-EphA y un anticuerpo anti-EphA humanizado de la presente invención. Preferiblemente, la homología es con la secuencia de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA y el anticuerpo anti-EphA humanizado de la presente invención. “Homología de secuencia”, según se aplica a una secuencia de aminoácidos en la presente memoria se define como una secuencia con al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % de homología de secuencia y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia con respecto a otra secuencia de aminoácidos, según se determina, por ejemplo, mediante el método de búsqueda FASTA según Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444-2448.
Un anticuerpo quimérico es uno en el que las diferentes porciones de un anticuerpo se derivan de diferentes especies de animales. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino apareada con una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase, p. ej., Morrison, 1985, Science, 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods, 125: 191-202; las patentes estadounidenses Núms.
5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.
Las formas humanizadas de anticuerpos quiméricos se producir al sustituir las regiones de determinación de la complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, por un dominio de marco humano, p. ej., véase la Pub. PCT N.° WO 92/22653. Los anticuerpos quiméricos humanizados preferiblemente tienen regiones constantes y regiones variables distintas de las regiones de determinación de la complementariedad (CDR) derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones del anticuerpo humano correspondiente y CDR derivadas sustancialmente o exclusivamente de un mamífero distinto de un humano.
Los anticuerpos artificiales incluyen fragmentos scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y mru (véanse las revisiones de Winter, G. and Milstein, C., 1991, Nature, 349: 293-299; Hudson, P.J., 1999, Current Opinion in Immunology, 11: 548-557), cada uno de los cuales tiene capacidad de unión a antígeno. En el fragmento Fv de cadena simple (scFv), los dominios Vh y Vl de un anticuerpo se enlazan mediante un péptido flexible. Típicamente, este péptido enlazador tiene una longitud de aproximadamente 15 residuos aminoacídicos. Si el enlazador es mucho más pequeño, por ejemplo, de 5 aminoácidos, se forman diacuerpos, que son dímeros de scFv bivalentes. Si el enlazador se reduce a menos de tres residuos aminoacídicos, se forman estructuras triméricas y tetraméricas que se denominan triacuerpos y tetracuerpos. La unidad de unión más pequeña de un anticuerpo es una CDR, típicamente la CDR2 de la cadena pesada que tiene suficiente reconocimiento y unión específicos que se puede usar por separado. Dicho fragmento se denomina unidad de reconocimiento molecular o mru (por sus siglas en inglés). Diversas de dichas mru se pueden enlazar con péptidos enlazadores cortos y formar, de esta manera, una proteína de unión artificial con mayor avidez que una mru simple.
Los equivalentes funcionales de la presente solicitud también incluyen anticuerpos modificados, p. ej., anticuerpos modificados mediante el acoplamiento covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos que se han modificado, p. ej., mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, ligadura a un ligando celular u otra proteína, etc. El acoplamiento covalente no evita que el anticuerpo genere una respuesta antiidiotípica. Estas modificaciones se pueden llevar a cabo mediante técnicas conocidas que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los equivalentes funcionales se pueden producir al intercambiar diferentes CDR en cadenas diferentes dentro de marcos diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, a partir de un conjunto dado de CDR pueden surgir diferentes clases de anticuerpo mediante la sustitución de diferentes cadenas pesadas, por medio de la cual se pueden producir, por ejemplo, tipos e isotipos de anticuerpo IgG 1 -4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE. De manera similar, se pueden producir anticuerpos artificiales dentro del alcance de la memoria descriptiva al embeber un conjunto dado de CDR dentro de un marco completamente sintético.
Los equivalentes funcionales se pueden producir sin inconvenientes mediante mutación, eliminación e/o inserción dentro de las secuencias de región variable y/o constante que flanquean un conjunto específico de CDR, usando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica.
Los fragmentos de anticuerpo y equivalentes funcionales de la presente memoria descriptiva abarcas las moléculas con un grado detectable de unión a EphA2, cuando se comparan con el anticuerpo 2H11R35R74. Un grado detectable de unión incluye todos los valores en el intervalo de al menos 10-100 %, preferiblemente, al menos 50 %, 60 % o 70 %, más preferiblemente, al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de la capacidad de unión del anticuerpo 2H11R35R74 murino a EphA2.
Anticuerpos mejorados
Las CDR son de fundamental importancia para el reconocimiento del epítopo y la unión del anticuerpo. Sin embargo, se pueden hacer cambios a los residuos que comprenden las CDR sin interferir en la capacidad del anticuerpo para reconocer y unirse a su epítopo cognado. Por ejemplo, se pueden hacer cambios que no afectan el reconocimiento del epítopo, pero aumentan la afinidad de unión del anticuerpo por el epítopo.
Por lo tanto, también se incluyen en el alcance de la presente memoria descriptiva versiones mejoradas de los anticuerpos murinos y humanizados, que también reconocen y se unen específicamente a EphA2, preferiblemente con afinidad aumentada.
Diversos estudios han analizado los efectos de introducir uno o más cambios aminoacídicos en diversas posiciones de la secuencia de un anticuerpo, en función del conocimiento de la secuencia del anticuerpo primario, sus propiedades tales como unión y nivel de expresión (Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254: 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: 8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535­ 539).
En estos estudios, se han generado equivalentes del anticuerpo primario al cambiar las secuencias de los genes de la cadena pesada y ligera en la CDR1, CDR2, CDR3, o regiones marco, usando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótido, mutagénesis en casete, PCR propensa a errores, redistribución de ADN o cepas mutadas de E. coli (Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Capítulo 16, págs. 277-291, en "Phage Display of Peptides and Proteins'', Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press). Estos métodos de cambiar la secuencia del anticuerpo primario han resultado en afinidades mejoradas de los anticuerpos secundarios (Gram, H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 3576-3580; Boder, E. T. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97: 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2: 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol. Biol., 256: 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277: 16365­ 16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 27622-27628).
Mediante una estrategia dirigida similar de cambiar uno o más residuos aminoacídicos del anticuerpo, las secuencias de anticuerpo descritas en la presente memoria descriptiva se pueden usar para desarrollar anticuerpos anti-EphA2 con funciones mejoradas, incluida afinidad mejorada por EphA2.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distintas de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (preferiblemente, sustituciones de aminoácidos conservadoras) se pueden hacer en la secuencia de origen natural (preferiblemente, en la porción del polipéptido fuera del(de los) dominio(s) que forman contactos intermoleculares). Una sustitución de aminoácidos conservadora no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia genitora (p. ej., un aminoácido para reemplazo no debe tender a descomponer una hélice que se produce en la secuencia genitora, ni alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia genitora). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N. Y. (1991)); y Thornton et al., 1991, Nature, 354: 105.
Los anticuerpos mejorados incluyen también los anticuerpos que tienen características mejoradas que se preparan mediante las técnicas estándares de inmunización animal, formación de hibridoma y selección de anticuerpos con características específicas.
Se cree que la interacción entre la región constante de un anticuerpo y diversos receptores Fc (FcyR) media las funciones efectoras del anticuerpo que incluyen citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), fijación de complemento, fagocitosis y semivida/aclaramiento del anticuerpo. Se pueden llevar a cabo diversas modificaciones en la región constante de anticuerpos de la memoria descriptiva dependiendo de la propiedad deseada. Por ejemplo, se detallan mutaciones específicas en la región constante para convertir un anticuerpo lítico en no lítico en EP 0629 240B1 y EP 0307434B2 o se puede incorporar un epítopo de unión a receptor de recuperación en el anticuerpo para aumentar la semivida en suero (véase US 5.739.277). Existen cinco receptores Fcy humanos reconocidos actualmente, FcyR (I), FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa y FcRn neonatal. Shields et al. (J. Biol.Chem., 27: 6591-6604, 2001) demostraron que un conjunto común de residuos de IgGI participa en la unión a todos los FcyR, mientras que FcyRII y FcyRIII usan sitios distintos fuera de este conjunto común. Un grupo de residuos de IgGI redujo la unión a todos FcyR cuando se alteró a alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 y Pro-239. Todos están en el dominio CH2 de IgG y aglomerados cerca de la bisagra que une CH1 y CH2. Mientras FcyRI usa solo el conjunto común de residuos de IgGI para la unión, FcyRII y FcyRIII interactúan con residuos distintos además de con el conjunto común.
La alteración de algunos residuos redujo la unión solo a FcyRII (p. ej., Arg-292) o FcyRIII (p. ej., Glu-293). Algunas variantes exhibieron unión mejorada a FcyRII o FcyRIII, pero no afectaron la unión al otro receptor (p. ej., Ser-267Ala mejoró la unión a FcyRII, pero la unión a FcyRIII no fue afectada). Otras variantes exhibieron unión mejorada a FcyRII o FcyRIII con reducción de la unión al otro receptor (p. ej., Ser-298Ala mejoró la unión a FcyRII y redujo la unión a FcyRIII). Para FcYRIIIa, las mejores variantes de unión de IgGI tenían sustituciones de alanina combinadas en Ser-298, Glu-333 y Lys-334. Se cree que el receptor FcRn neonatal participa en el aclaramiento del anticuerpo y la transcitosis a través de los tejidos (véase Junghans R.P, 1997, Immunol. Res., 16: 29-57 y Ghetie et al., 2000, Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766). Los residuos de IgGI humana que se determinó que interactúan directamente con el FcRn humano incluyen Ne253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435. Los cambios en cualquiera de estas posiciones descritas en esta sección pueden posibilitar una semivida en suero aumentada y/o propiedades efectoras alteradas de los anticuerpos de la memoria descriptiva.
Otras modificaciones incluyen variantes de glucosilación de los anticuerpos de la invención. Se sabe que la glucosilación de anticuerpos en posiciones conservadas en sus regiones constantes tiene un profundo efecto en la función del anticuerpo, particularmente en funciones efectoras como las descritas anteriormente, véase, por ejemplo, Boyd et al (Mol. Immunol,. 32: 1311-1318, 1996). Se contemplan variantes de glucosilación de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de estos de la presente invención en donde uno o más restos carbohidrato se agregan, sustituyen, eliminan o modifican. La introducción de un motivo asparagina-X- serina o asparagina-X-treonina crea un posible sitio para el acoplamiento enzimático de restos carbohidrato y, por lo tanto, puede usarse para manipular el glicosilato de un anticuerpo. En Raju et al. (Biochemistry 40: 8868-8876, 2001) la sialilación terminal de una inmunoadhesina TNFR-IgG se aumentó a través de un proceso de regalactosilación y/o resialilación usando p-1,4-galactosiltransferasa y/o alfa, 2,3 sialiltransferasa. Se cree que aumentar la sialilación terminal aumenta la semivida de la inmunoglobulina. Los anticuerpos, en común con la mayoría de las glicoproteínas, se producen típicamente como una mezcla de glicoformas. Esta mezcla es particularmente evidente cuando los anticuerpos se producen en células eucariotas, particularmente, de mamíferos. Se ha desarrollado una variedad de métodos para producir glicoformas definidas (véase Zhang et al. 2004, Science 303: 371; Sears et al, 2001, Science 291: 2344; Wacker et al., 2002, Science 298: 1790; Davis et al. 2002, Chem.Rev. 102: 579; Hang et al., 2001, Acc.Chem. Res. 34: 727). Por lo tanto, la invención contempla una pluralidad de anticuerpos (monoclonales) (que pueden ser del isotipo de IgG, p. ej., IgG1) según se describen en la presente memoria que comprenden una cantidad definida (p. ej., 7 o menos, por ejemplo, 5 o menos, tal como dos o una única) glicoforma(s) de dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de estos.
Por lo tanto, los anticuerpos mejorados según la invención incluyen en particular anticuerpos con propiedades funcionales potenciadas. Generan especial interés los anticuerpos con capacidad potenciada para mediar las funciones efectoras citotóxicas celulares tales como la ADCC. Dichos anticuerpos se pueden obtener al producir sustituciones simples o múltiples en el marco constante del anticuerpo y alterar, por lo tanto, su interacción con los receptores Fc. Los métodos para diseñar dichos mutantes se pueden encontrar, por ejemplo, en Lazar et al. (2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(11): 4005-4010) y Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336(5): 1239-49). Véanse también WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO2006/047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338, WO 2007/041635. También es posible usar líneas celulares genomanipuladas específicamente para la producción de anticuerpos mejorados. En particular, estas líneas tienen regulación alterada de la vía de glucosilación, por ejemplo, que resulta en anticuerpos que están escasamente fucosilados o incluso totalmente desfucosilados. Tales líneas celulares y métodos para genomanipularlas se describen en, p. ej., Shinkawa et al. (2003, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473), Ferrara et al. (2006, J. Biol. Chem. 281(8): 5032-5036; 2006, Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-61), EP 1272527 B1, EP 1331 266, EP 1498490, EP 1498491, EP 1676910, EP 1792987 y WO 99/54342.
Realizaciones adicionales de la invención incluyen anticuerpos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de estos acoplados a un polímero no proteináceo tal como polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquileno. La conjugación de proteínas a PEG es una técnica establecida para aumentar la semivida de las proteínas, así como reducir la antigenicidad e inmunogenicidad de las proteínas. El uso de PEGilación con diferentes pesos moleculares y estilos (lineal o ramificado) se ha investigado con anticuerpos intactos, así como con fragmentos Fab' (Koumenis I. L. et al., 2000, Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95).
La presente invención también incluye conjugados citotóxicos o conjugados de anticuerpo-fármaco o conjugados como se definen en las reivindicaciones. Según se usan en la presente memoria, todos estos términos tienen el mismo significado y son intercambiables.
Estos conjugados citotóxicos comprenden dos componentes primarios, un agente de unión a célula y un agente citotóxico.
Según se usa en la presente memoria, el término “agente de unión a célula” se refiere a un agente que reconoce y se une específicamente al receptor EphA2 en la superficie celular. En un aspecto, el agente de unión a célula reconoce específicamente el receptor EphA2 de manera que posibilita que el conjugado actúe de manera dirigida con escasos efectos secundarios que resultan de la unión no específica.
En otro aspecto, el agente de unión a célula, según se describe en la presente memoria, reconoce específicamente el receptor EphA2 de manera que el conjugado estará en contacto con la célula diana durante un período de tiempo suficiente para posibilitar que la porción de fármaco citotóxico del conjugado actúe en la célula, y/o para posibilitar que la célula internalice el conjugado.
En un aspecto preferido, los conjugados citotóxicos comprenden un anticuerpo anti-EphA2 como el agente de unión a célula, más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal 2H11R35R74 murino. En una realización más preferida, el conjugado citotóxico comprende un anticuerpo 2H11R35R74 humanizado o un fragmento de unión a epítopo de este. El anticuerpo 2H11R35R74 es capaz de reconocer específicamente un receptor EphA, tal como EphA2, y dirige el agente citotóxico a una célula o un tejido anormal, tal como células cancerosas, de manera dirigida.
El segundo componente de los conjugados citotóxicos de la presente invención es un agente citotóxico, según se define en las reivindicaciones. El término “agente citotóxico”, según se usa en la presente memoria, se refiere a una sustancia que reduce o bloquea la función o el crecimiento de células y/o provoca la destrucción de células.
Según se describe en la presente memoria, el agente citotóxico es un taxoide, un maitansinoide tal como DM1 o DM4, un fármaco pequeño, un derivado de tomaimicina, un profármaco, CC-1065 o un análogo de CC-1065. En aspectos preferidos, los agentes de unión a célula de la presente invención se acoplan covalentemente, directamente o a través de un enlazador escindible o no escindible al agente citotóxico. “Enlazador”, según se usa en la presente memoria, significa un resto químico que comprende una unión covalente o una cadena de átomos que acopla covalentemente un anticuerpo a un resto de fármaco.
Por lo tanto, la presente memoria descriptiva contempla el uso de conjugados entre (1) un agente de unión a célula que reconoce y se une al receptor EphA2, y (2) un agente citotóxico. En los conjugados citotóxicos, el agente de unión a célula tiene una afinidad alta por el receptor EphA2 y el agente citotóxico tiene un alto grado de citotoxicidad para células que expresan el receptor EphA2, de manera que los conjugados citotóxicos de la presente invención forman agentes destructores eficaces.
Los conjugados de anticuerpos para EphA2 antagonistas se han descrito anteriormente. Por ejemplo, WO 2008/010101 describe los anticuerpos 37.3D7 humanizado y 53.2H11 humanizado conjugados a L-DM4, N2'desacetil-N2'(4-metilo-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina, usando el enlazador SPDB (N-hidroxisuccinimida éster de ácido 4-[2-piridilditio]butanoico) (véase el Ejemplo 10 de WO 2008/010101; hu37.3D7-SPDB-DM4 y hu2H11 - SPDB-DM4).
Cuando se conjuga a un agente citotóxico, los anticuerpos de la invención muestran varias propiedades ventajosas con respecto a los anticuerpos de la técnica anterior. En particular, la conjugación no afecta la afinidad de los anticuerpos de la invención por el receptor EphA2, mientras que la unión de 53.2H11 a EphA2 se ve negativamente afectada por el acoplamiento de un agente citotóxico a dicho anticuerpo 53.2H11.
Los agentes de unión a célula, agentes citotóxicos y enlazadores se describen en más detalle más adelante.
Agentes de unión a célula
La eficacia de los compuestos de la presente invención como agentes terapéuticos depende de la cuidadosa selección de un agente de unión a célula adecuado. Los agentes de unión a célula según se describen en la presente memoria pueden ser de cualquier tipo conocido actualmente, o que se vuelva conocido e incluyen péptidos y no péptidos. El agente de unión a célula puede ser cualquier compuesto que se puede unir a una célula, ya sea de manera específico o no específica. Generalmente, estos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión a célula.
Los ejemplos más específicos de agentes de unión a célula que se pueden usar incluyen:
anticuerpos policlonales;
anticuerpos monoclonales;
fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab' y F(ab')2 , Fv (Parham, 1983, J. Immunol., 131:2895-2902; Spring et al., 1974, J. Immunol., 113: 470-478; Nisonoff et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244).
Preferiblemente, se usa un anticuerpo anti-EphA2 humanizado como el agente de unión a célula de la presente memoria descriptiva. Más preferiblemente, el anticuerpo anti-EphA2 humanizado es un anticuerpo 2H11R35R74 humanizado.
Agentes citotóxicos
En otro aspecto, el anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a epítopo de este, según se describe en la presente memoria, se puede conjugar con un fármaco, tal como un maitansinoide, un derivado de tomaimicina o un derivado de duocarmicina para formar un profármaco que tiene citotoxicidad específica hacia células que expresan antígeno al dirigir el fármaco al receptor EphA2. Los conjugados citotóxicos que comprenden dichos anticuerpos y un fármaco pequeño, altamente tóxico (p. ej., maitansinoides, derivados de tomaimicina, y CC-1065 y análogos de CC-1065) se pueden usar como un producto terapéutico para el tratamiento de tumores, tales como, por ejemplo, tumores de mama y ovario.
El agente citotóxico usado en el conjugado citotóxico de la presente memoria descriptiva puede ser cualquier compuesto que resulta en la destrucción de una célula o induce la muerte celular o, de alguna manera, disminuye la viabilidad celular. Los agentes citotóxicos preferidos incluyen, por ejemplo, maitansinoides y análogos de maitansinoide, derivados de tomaimicina, y CC-1065 y análogos de CC-1065, definidos más adelante. Estos agentes citotóxicos se conjugan con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, equivalentes funcionales, anticuerpos mejorados y sus análogos, según se describen en la presente memoria.
Los conjugados citotóxicos se pueden preparar mediante métodos in vitro. Para enlazar un fármaco o profármaco al anticuerpo, se usa un grupo de enlace. Los grupos de enlace adecuados se conocen en la técnica e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos sensibles a ácido, grupos fotolábiles, grupos sensibles a peptidasa y grupos sensibles a esterasa.
Los grupos de enlace de ejemplos son grupos disulfuro y grupos tioéter. Por ejemplo, se pueden construir conjugados usando una reacción de intercambio de disulfuro o al formar una unión tioéter entre el anticuerpo y el fármaco o profármaco. Los ejemplos de enlazadores que llevan dichos grupos de enlace incluyen N-succinimidil piridilditiopropionato (SPDP) y N-succinimidil piridilditiobutirato (SPDB), cuyo grupo reactivo ditiopiridilo (véase Bourdon M.A. et al., Biochem. J., 173: 723-737, 1978; US 5208020) hace reacción con un grupo reactivo químico citotóxico tal como -SH para formar una nueva unión -S-S-. A continuación, el grupo N-succinimidiloxi preferiblemente hace reacción con los grupos amino presentes en el anticuerpo para formar uniones amida.
En otro aspecto preferido, el agente citotóxico se enlaza al agente de unión a célula usando grupos de enlace de polietilenglicol (PEG), como se expone en US 6.716.821. Los grupos de enlace de PEG de ejemplo incluyen enlazadores de PEG heterobifuncionales que se unen a los agentes citotóxicos y a los agentes de unión a célula a través de un grupo sulfhidrilo o disulfuro funcional en un extremo, un éster activo en el otro extremo (US 6.716.821). También se pueden usar enlazadores de PEG que no se unen a los agentes citotóxicos a través de un grupo sulfhidrilo o disulfuro funcional.
Se contempla específicamente un agente citotóxico que lleva un grupo de enlace de polietilenglicol (PEG) que tiene éster activo terminal de fórmula (I):
Figure imgf000021_0001
en donde Z es dicho agente citotóxico, dicho agente citotóxico se selecciona del grupo de maitansinoides y análogos de maitansinoide, derivados de tomaimicina, y CC-1065 y análogos de CC-1065, y
en donde Y es Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno. En otro aspecto preferido, se describe un agente citotóxico, dicho agente citotóxico lleva un grupo de enlace de polietilenglicol (PEG) que tiene éster activo terminal y es de fórmula (II):
Figure imgf000021_0002
en donde Z es dicho agente citotóxico, dicho agente citotóxico se selecciona del grupo de maitansinoides y análogos de maitansinoide, derivado de tomaimicina, y CC-1065 y análogos de CC-1065, y
en donde Y es Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno. Preparación del conjugado
En general, el conjugado se puede obtener mediante un proceso que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una disolución acuosa, opcionalmente tamponada, de un agente de unión a célula con una disolución de un compuesto citotóxico;
(ii) después, separar opcionalmente el conjugado que se formó en (i) de los reactivos que no hicieron reacción y cualquier aglomerado que pueda estar presente en la disolución.
En un aspecto, el agente de unión a célula es un anticuerpo; más específicamente, el agente de unión a célula es el anticuerpo mu2H11R35R74 o una versión humanizada de este. En otro aspecto, el agente citotóxico es un compuesto fórmula (I) o (II), en donde Z es un maitansinoide; en particular, Z es DM4.
Se entenderá que los conjugados que se pueden obtener mediante este método están comprendidos dentro del alcance de la memoria descriptiva.
La disolución acuosa del agente de unión a célula se puede tamponar con tampones tales como, p. ej., fosfato potásico o ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (tampón HEPES). El tampón depende de la naturaleza del agente de unión a célula. El compuesto citotóxico está en disolución en un disolvente polar orgánico, p. ej., dimetilsulfóxido (DMSO) o dimetilacetamida (DMA).
La temperatura de reacción normalmente está comprendida entre 20 y 40 °C. El tiempo de reacción puede variar de 1 a 24 horas. La reacción entre el agente de unión a célula y el agente citotóxico se puede monitorear mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEG, por sus siglas en inglés) con un detector refractométrico y/o de UV. Si el rendimiento del conjugado es demasiado bajo, se puede extender el tiempo de reacción.
El experto en la técnica puede usar varios métodos cromatográficos diferentes para llevar a cabo la separación de la etapa (ii): el conjugado se puede purificar, p. ej., mediante SEG, cromatografía de adsorción (tal como cromatografía de intercambio iónico, IEC, por sus siglas en inglés), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés), cromatografía de afinidad, cromatografía con soporte mixto, tal como cromatografía en hidroxiapatita o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés). También se puede usar purificación mediante diálisis o diafiltración.
Un ejemplo de un proceso que se puede usar se describe en el Ejemplo I.b.1.
Según se usa en la presente memoria, el término “aglomerados” significa las asociaciones que se pueden formar entre dos o más agentes de unión a célula, donde dichos agentes están modificados o no por conjugación. Los aglomerados se pueden formar por la influencia de una gran cantidad de parámetros, tales como alta concentración de agente de unión a célula en la disolución, el pH de la disolución, fuerzas de cizallamiento altas, la cantidad de dímeros unidos y su carácter hidrófobo, la temperatura (véase Wang & Gosh, 2008, J. Membrane Sci., 318: 311-316, y las referencias citadas en él); cabe señalar que la influencia relativa de algunos de estos parámetros no está establecida claramente. En el caso de proteínas y anticuerpos, el experto en la técnica consultará Cromwell et al. (2006, AAPS Jounal, 8(3): E572-E579). El contenido en los aglomerados se puede determinar con técnicas conocidas para el experto, tales como s Ec (véase Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480).
Después de la etapa (i) o (ii), la disolución que contiene conjugado se puede someter a una etapa adicional (iii) de ultrafiltración y/o diafiltración.
El conjugado se puede recuperar al final de estas etapas en una disolución acuosa.
Maitansinoides
Entre los agentes citotóxicos que se pueden usar en la presente memoria descriptiva para formar un conjugado citotóxico, están los maitansinoides y análogos de maitansinoide. Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol. Los maitansinoides son fármacos que inhiben la formación de microtúbulos y que son altamente tóxicos para células de mamíferos.
Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Los maitansinoides adecuados se describen en las patentes estadounidenses núms. 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; y 5.846.545.
Los ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que tienen un anillo aromático modificado incluyen: (1) C-19-descloro (patente estadounidense n.° 4.256.746) (preparado mediante reducción por LAH de ansamitocina P2);
(2) C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) /-C-19-descloro (patentes estadounidenses núms. 4.361.650 y 4.307.016) (preparado mediante desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o descloración usando LAH); y
(3) C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /-descloro (patente estadounidense n.° 4.294.757) (preparado mediante acilación usando cloruros de acilo).
Los ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que tienen modificaciones de otras posiciones incluyen:
(1) C-9-SH (patente estadounidense n.° 4.424.219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); (2) C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (patente estadounidense n.° 4.331.598);
(3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente estadounidense n.° 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia);
(4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente estadounidense n.° 4.364.866) (preparado mediante la conversión de maitansinol mediante Sreptomyces);
(5) C-15-metoxi (patentes estadounidenses núms. 4.313.946 y 4.315.929) (aislado a partir de Trewia nudiflora); (6) C-18-N-desmetilo (patentes estadounidenses núms. 4.362.663 y 4.322.348) (preparado mediante la desmetilación de maitansinol mediante Sreptomyces); y
(7) 4,5-desoxi (patente estadounidense n.° 4.371.533) (preparado mediante la reducción por tricloruro de titanio/LHA de maitansinol).
En un aspecto, los conjugados citotóxicos de la presente memoria descriptiva utilizan el maitansinoide que contiene tiol (DM1), formalmente denominado N2-desacetil-N2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como el agente citotóxico. El DM1 se representa mediante la siguiente fórmula estructural (III):
Figure imgf000023_0001
En otro aspecto, los conjugados citotóxicos de la presente memoria descriptiva utilizan el maitansinoide que contiene tiol DM4, formalmente denominado N2-desacetil-N-2(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina, como el agente citotóxico. El DM4 se representa mediante la siguiente fórmula estructural (IV):
Figure imgf000023_0002
En aspectos adicionales de la memoria descriptiva, se pueden usar otras maitansinas, incluidos maitansinoides que contienen tiol y disulfuro que lleven una sustitución mono o di-alquilo en el átomo de carbono que lleva el átomo de azufre. Estos incluyen un maitansinoide que tiene, en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo, una cadena lateral de aminoácido acilada con un grupo acilo que lleva un grupo sulfhidrilo impedido, en donde el átomo de carbono del grupo acilo que lleva la funcionalidad de tiol tiene uno o dos sustituyentes, dichos sustituyentes son CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, en donde uno de los sustituyentes puede ser H, y en donde el grupo acilo tiene una longitud de cadena lineal de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad de carbonilo y el átomo de azufre.
Dichas maitansinas adicionales incluyen compuestos representados por la fórmula (V):
Figure imgf000024_0001
en donde:
Y' representa
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5R6)mDu(CRn=CR12)r(C=C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ,
en donde:
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, R2 puede ser H;
A, B, D son cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
R3 , R4 , R5, R6, R7, R8, R9 , R10, R11 y R12 son cada uno independientemente H, CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
l, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento; y Z es H, SR o -COR, en donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
Las realizaciones preferidas de fórmula (V) incluyen compuestos de fórmula (V) en donde:
R1 es metilo, R2 es H y Z es H.
R1 y R2 son metilo y Z es H.
R1 es metilo, R2 es H y Z es -SCH3.
R1 y R2 son metilo y Z es -SCH3.
Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (VI-L), (VI-D) o (VI-D,L):
Figure imgf000025_0001
en donde:
Y representa (CR7 R8)i(CR5 R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ,
en donde:
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, R2 puede ser H;
R3 , R4 , R5, R6, R7 y R8, son cada uno independientemente H, CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
I, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además, n puede ser 0;
Z es H, SR o -COR, en donde R es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y
May representa un maitansinoide que lleva la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo.
Las realizaciones preferidas de fórmulas (VI-L), (VI-D) y (VI-D,L) incluyen compuestos de fórmulas (VI-L), (VI-D) y (VI-D,L) en donde:
R1 es metilo, R2 es H, R5 , R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0 y Z es H.
R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7 , R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0 y Z es H.
R1 es metilo, R2 es H, R5 , R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0 y Z es -SCH3.
R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0 y Z es -SCH3.
Preferiblemente, el agente citotóxico se representa mediante la fórmula (VI-L).
Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (VII):
Figure imgf000026_0001
en donde:
Y representa (CR7 R8)i(CR5 R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ,
en donde:
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, R2 puede ser H;
R3 , R4 , R5, R6, R7 y R8, son cada uno independientemente H, CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además, n puede ser 0; y
Z es H, SR o -COR, en donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
Las realizaciones preferidas de fórmula (VII) incluyen compuestos de fórmula (VII) en donde:
R1 es metilo, R2 es H, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H; l y m son cada uno 1; n es 0 y Z es H.
R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1; n es 0; y Z es H.
R1 es metilo, R2 es H, R5 , R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0 y Z es -SCH3.
R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7 , R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0 y Z es -SCH3.
Dichas maitansinas adicionales incluyen, además, compuestos representados por la fórmula (VIIII-L), (VIII-D) o (VIII-D,L):
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0002
en donde:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2,
en donde:
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, R2 puede ser H;
R3 , R4 , R5, R6, R7 y R8, son cada uno independientemente H, CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
I, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además, n puede ser 0;
Z2 es SR o COR, en donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y
May es un maitansinoide.
Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (IX):
Figure imgf000027_0001
en donde:
Y2' representa
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5R6)mDn(CRn=CR12)r(C=C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2,
en donde:
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3 , C2H5, alquilo o alquenilo lineal ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, R2 puede ser H;
A, B y D son cada uno independientemente cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3 a 10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
R3 , R4 , R5, R6, R7, Rs, R9 , R10, R11 y R12 son cada uno independientemente H, CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
l, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento; y Z2 es SR o -COR, en donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 - 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
Las realizaciones preferidas de fórmula (IX) incluyen compuestos de fórmula (IX) en donde: R1 es metilo, R2 es H. Los maitansinoides mencionados anteriormente se pueden conjugar con un anticuerpo anti-EphA 2H11R35R74 o un homólogo o fragmento de este, en donde el anticuerpo se enlaza al maitansinoide usando la funcionalidad tiol o disulfuro que está presente en el grupo acilo de una cadena lateral de aminoácido acilada que se encuentra en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo del maitansinoide, y en donde el grupo acilo de la cadena lateral de aminoácido acilada tiene su funcionalidad tiol o disulfuro ubicada en un átomo de carbono que tiene uno o dos sustituyentes, dichos sustituyentes son CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, uno de los sustituyentes puede ser H, y en donde el grupo acilo tiene una longitud de cadena lineal de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad de carbonilo y el átomo de azufre.
Un conjugado preferido de la presente memoria descriptiva es uno que comprende el anticuerpo anti-EphA 2H11R35R74 o un homólogo o fragmento de este, conjugado con, o que se puede obtener mediante conjugación con, un maitansinoide de fórmula (X):
Figure imgf000028_0001
en donde:
Y1' representa
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5R6)mD4(CR11=CR12)r(C=C)sBt(CR3R4)nCR1R2S-,
en donde:
A, B y D son cada uno independientemente cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3 - 10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
R3 , R4, R5, R6, R7, R8, R9, R1o, R11 y R12 son cada uno independientemente H, CH3 , C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y
l, m, n, o, p, q, r, s y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, siempre que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento.
Preferiblemente, R1 es metilo, R2 es H, o R1 y R2 son metilo.
Un conjugado incluso más preferido de la presente memoria descriptiva es uno que comprende el anticuerpo anti-EphA 2H11R35R74 o un homólogo o fragmento de este, conjugado con un maitansinoide de fórmula (XI-L), (XI-D) o (XI-D,L):
Figure imgf000029_0001
en donde:
Y1 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2S-,
en donde:
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además, R2 puede ser H;
R3 , R4 , R5, R6, R7 y R8, son cada uno independientemente H, CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además, n puede ser 0; y
May representa un maitansinol que lleva la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo. Las realizaciones preferidas de fórmulas (XI-L), (XI-D) y (XI-D,L) incluyen compuestos de fórmulas (XI-L), (XI-D) y (XI-D,L) en donde:
R1 es metilo, R2 es H, o R1 y R2 son metilo,
R1 es metilo, R2 es H, R5 , R6, R7 y R8 son cada uno H; l y m son cada uno 1; n es 0,
R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son 1; n es 0.
Preferiblemente, el agente citotóxico se representa mediante la fórmula (XI-L).
Un conjugado preferido adicional de la presente memoria descriptiva es uno que comprende el anticuerpo anti-EphA 2H11R35R74 o un homólogo o fragmento de este, conjugado con un maitansinoide de fórmula (XII):
Figure imgf000030_0001
en donde los sustituyentes son como se definieron para la fórmula (XI) anteriormente.
Se prefieren especialmente cualesquiera de los compuestos descritos anteriormente, en donde R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1 y n es 0.
Se prefieren, además, especialmente cualesquiera de los compuestos descritos anteriormente, en donde R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son 1 y n es 0
Además, se prefiere el estereoisómero L-aminoacilo.
Cada uno de los maitansinoides descritos en la solicitud de patente estadounidense pendiente con número 10/849.136, presentada el 20 de mayo de 2004, también se puede usar en el conjugado citotóxico de la presente memoria descriptiva.
Grupos de enlace que contienen disulfuro
Para enlazar el maitansinoide a un agente de unión a célula, tal como el anticuerpo 2H11R35R74, el maitansinoide comprende un resto de enlace. El resto de enlace contiene una unión química que posibilita la liberación de maitansinoides completamente activos en un sitio específico. Las uniones químicas adecuadas se conocen en la técnica e incluyen uniones disulfuro, uniones sensibles a ácido, uniones fotolábiles, uniones sensibles a peptidasa y uniones sensibles a esterasa.
El resto de enlace también comprende un grupo químico reactivo. En una realización preferida, el grupo químico reactivo se usa para unirse covalentemente al maitansinoide a través de un resto de enlace de unión disulfuro. Los grupos químicos reactivos particularmente preferidos son ésteres de W-succinimidilo y ésteres de N-sulfosuccinimidilo.
Los maitansinoides particularmente preferidos que comprenden un resto de enlace que contiene un grupo químico reactivo son ésteres de maitansinol C-3 y sus análogos donde el resto de enlace contiene una unión disulfuro y el grupo reactivo químico comprende un éster de W-succinimidilo o W-sulfosuccinimidilo.
Muchas posiciones en maitansinoides pueden servir como la posición para enlazar químicamente el resto de enlace. Por ejemplo, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con hidroxi y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi se espera que sean todas útiles. Sin embargo, se prefiere la posición C-3 y la posición C-3 de maitansinol se prefiere especialmente.
Aunque la síntesis de ésteres de maitansinol que tienen un resto de enlace se describe en relación con restos de enlace que contienen unión disulfuro, el experto en la técnica entenderá que también se pueden usar restos de enlace con otras uniones químicas (según se describieron anteriormente) con la presente memoria descriptiva, así como otros maitansinoides. Los ejemplos específicos de otras uniones químicas incluyen uniones sensibles a ácido, uniones fotolábiles, uniones sensibles a peptidasa y uniones sensibles a esterasa. La descripción de la patente estadounidense n.° 5.208.020 expone la producción de maitansinoides que llevan dichas uniones.
La síntesis de maitansinoides y derivados de maitansinoide que tienen un resto disulfuro que lleva un grupo reactivo se describe en las patentes estadounidenses núms. 6.441.163 y 6.333.410 y la solicitud estadounidense n.° 10/161.651.
Grupos de enlace que contienen PEG
Los maitansinoides también se pueden enlazar al agente de unión a célula usando grupos de enlace de PEG como se expone en la patente estadounidense n.° 6.716.821. Estos grupos de enlace de PEG son solubles en agua y en disolventes no acuosos, y se pueden usar para ligar uno o más agentes citotóxicos a un agente de unión a célula. Los grupos de enlace de PEG de ejemplo incluyen enlazadores de PEG heterobifuncionales que se unen a los agentes citotóxicos y a los agentes de unión a célula en extremos opuestos de los enlazadores a través de un grupo sulfhidrilo o disulfuro funcional en un extremo y un éster activo en el otro extremo.
Como ejemplo general de la síntesis de un conjugado citotóxico usando un grupo de enlace de PEG, se hace referencia nuevamente a la patente estadounidense n.° 6.716.821 para obtener los detalles específicos.
La síntesis comienza con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que llevan un resto de PEG reactivo con un agente de unión a célula, que resulta en el desplazamiento del éster activo terminal de cada resto de PEG reactivo por un residuo aminoacídico del agente de unión a célula, tal como el anticuerpo 2H11R35R74, para proporcionar un conjugado citotóxico que comprende uno o más agentes citotóxicos unidos a un agente de unión a célula a través de un grupo de enlace de PEG. También se pueden usar grupos de enlace de PEG que no se unen a los agentes citotóxicos a través de un grupo sulfhidrilo o disulfuro funcional.
Por lo tanto, comprendido dentro del alcance de la memoria descriptiva se encuentra el maitansinoide de fórmula (XIII), denominado en la presente memoria PEG4-NHAc-DM4:
Figure imgf000031_0001
También comprendido dentro del significado de la memoria descriptiva se encuentra el maitansinoide de fórmula (XIV), denominado en la presente memoria PEG4-Mal-DM4:
Figure imgf000032_0001
También comprendido dentro del significado de la memoria descriptiva se encuentra el maitansinoide de fórmula (XXIV), denominado en la presente memoria SPDB-DM4:
Figure imgf000032_0002
También comprendido dentro del significado de la memoria descriptiva se encuentra maitansinoide de fórmula (XXV), denominado en la presente memoria: _PEG4-NMeAc-DM4
Figure imgf000032_0003
También comprendido dentro del significado de la memoria descriptiva se encuentra el maitansinoide de fórmula (XXVI), denominado en la presente memoria: PEG8-NHAc-DM4
Figure imgf000033_0001
También comprendido dentro del significado de la memoria descriptiva se encuentra el maitansinoide de fórmula (XXVII), denominado en la presente memoria: _PEG4-Allyl-DM4
Figure imgf000033_0002
Los maitansinoides que contienen un grupo reactivo, tal como DM4, se hacen reaccionar con un anticuerpo, tal como el anticuerpo 2H11R35R74, para producir conjugados citotóxicos, en donde el citotóxico se acopla covalentemente al anticuerpo. Estos conjugados se pueden purificar mediante HPLC o filtración en gel.
Un aspecto de la memoria descriptiva es un conjugado del anticuerpo 2H11R35R74, o de una versión humanizada de este, dicho conjugado comprende un agente citotóxico acoplado covalentemente a dicho anticuerpo 2H11R35R74, dicho agente citotóxico se elige entre el maitansinoide de fórmula (XIII) y el maitansinoide de fórmula (XIV). Según se describe en la presente memoria, la conjugación del maitansinoide de fórmula (XIII) con el anticuerpo 2H11R35R74 de la invención resultará en un conjugado 2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4. En otro aspecto, el maitansinoide de fórmula (XIV) se conjuga con el anticuerpo 2H11R35R74 de la invención para proporcionar un conjugado 2H11 R35R74-PEG4-Mal-DM4.
Por lo tanto, una realización preferida se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene una estructura que consiste en la estructura de la fórmula (XV):
Figure imgf000033_0003
en donde Ab es un anticuerpo de la invención y n es un número entero comprendido entre 1 y 15. Preferiblemente, n está comprendido entre 1 y 10. Incluso más preferiblemente, n está comprendido entre 5 y 7. En otra realización adicionalmente preferida, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo 2H11R35R74 o una versión humanizada de este, y el conjugado es un conjugado 2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4.
Por lo tanto, otra realización preferida se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene una estructura que consiste en la estructura de la fórmula (XVI):
Figure imgf000034_0001
en donde Ab es un anticuerpo de la invención y n es un número entero comprendido entre 1 y 15. Preferiblemente, n está comprendido entre 1 y 10. Incluso más preferiblemente, n está comprendido entre 5 y 7. En otra realización adicionalmente preferida, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo 2H11R35R74 o una versión humanizada de este, y el conjugado es un conjugado 2H11 R35R74-PEG4-Mal-DM4.
Se proporcionan varios esquemas excelentes para producir dichos conjugados de anticuerpo-maitansinoide en la patente estadounidense n.° 6.333.410 y las solicitudes estadounidenses núms. 09/867.598, 10/161.651 y 10/024.290. Según se explicó anteriormente, en general, el conjugado se puede obtener mediante un proceso que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una disolución acuosa, opcionalmente tamponada, de un anticuerpo con una disolución de un maitansinoide;
(ii) después, separar opcionalmente el conjugado que se formó en (i) de los reactivos que no hicieron reacción y cualquier aglomerado que pueda estar presente en la disolución.
Más específicamente, se puede incubar una disolución de un anticuerpo en tampón acuoso con un exceso molar de maitansinoide que tiene un resto disulfuro que lleva un grupo reactivo. La mezcla de reacción se puede aplacar mediante la adición de un exceso de amina (tal como etanolamina, taurina, etc.). El conjugado de maitansinoideanticuerpo a continuación se puede purificar mediante filtración en gel.
En un aspecto del proceso, el anticuerpo es el anticuerpo mu2H11R35R74 o una versión humanizada de este. En otro aspecto de dicho proceso, el agente citotóxico es un agente citotóxico elegido entre:
el compuesto de fórmula (XVII):
Figure imgf000035_0001
en donde Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno; y el compuesto de fórmula (XVIII):
Figure imgf000035_0002
en donde Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno. Un ejemplo de un proceso que se puede usar con el anticuerpo y un compuesto de fórmula (XVII) o (XVIII) se proporciona en el Ejemplo I.
La cantidad de moléculas de maitansinoide unidas por molécula de anticuerpo (“relación entre fármaco y anticuerpo” o “DAR”, por sus siglas en inglés) se puede determinar espectrofotométricamente al medir la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm de una disolución del conjugado sustancialmente purificado (es decir, después de la etapa (ii)). En particular, dicha DAR se puede determinar espectrofotométricamente usando los coeficientes de extinción medidos a respectivamente 280 y 252 nm para el anticuerpo: £a280= 224000 M-1 cm-1 y £a252 = 82880 M-1cm-1; asumiendo un peso molecular promedio de 160000 para el anticuerpo y para el maitansinoide, £d28ü= 5180 M-1cm-1 y £d252= 26159 M-1cm-1). El método de cálculo se deriva de Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, tomo 525, 445, Springer Science y se describe más detalladamente a continuación:
Las absorbancias para el conjugado a 252 nm (A252) y a 280 nm (A28ü) se miden en el pico monomérico del análisis SEC (que permite calcular el parámetro “DAR(SEC)”) o usando un aparato espectrofotómetro clásico (que permite calcular el parámetro “DAR(UV)”). Las absorbancias se pueden expresar de la siguiente manera:
A252 = (Cd X Ed252) (Ca X £a252)
A28ü = (Cd X £D28o) (Ca x £A28o)
en donde:
cd y ca son, respectivamente, las concentraciones en la disolución del maitansinoide y del anticuerpo £d252 y sD280 son, respectivamente, los coeficientes de extinción molar del maitansinoide a 252 nm y 280 nm £a252 y £a280 son, respectivamente, los coeficientes de extinción molar del anticuerpo a 252 nm y 280 nm.
La resolución de estas dos ecuaciones con dos incógnitas conduce a las siguientes ecuaciones:
Figure imgf000036_0001
A continuación, se calcula la DAR promedio a partir de la relación entre la concentración del fármaco y la del anticuerpo:
DAR = Cd /Ca
La DAR promedio medida con un espectrofotómetro de UV (DAR(UV)) es más particularmente mayor que 4, más particularmente, entre 4 y 10, incluso más particularmente, entre 4 y 7, incluso más particularmente, entre 5,5 y 8 e incluso más particularmente entre 5,9 y 7,5
En un aspecto adicional, la memoria descriptiva describe un conjugado del anticuerpo 2H11R35R74, o de una versión humanizada de este, y un compuesto de fórmula (XVII) o (XVIII), en donde la DAR comprende entre 4 y 7 moléculas de maitansinoide/molécula de anticuerpo, dicha DAR se determina al medir por vía espectrofotométrica la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm de una disolución del conjugado sustancialmente purificado.
Los conjugados que se pueden obtener mediante el proceso descrito anteriormente están comprendidos dentro del alcance de la presente memoria descriptiva. En un aspecto particular, dichos conjugados tienen una estructura elegida entre la fórmula (XV) y la fórmula (XVI), en donde Ab es un anticuerpo de la invención y en donde n está comprendido entre 4 y 10. En una realización preferida, n está comprendido entre 4 y 7. En otra realización preferida, dichos conjugados tienen la estructura de la fórmula (XV).
Los conjugados de anticuerpos con fármacos maitansinoides se pueden evaluar para determinar su capacidad para suprimir la proliferación de diversas líneas celulares indeseadas in vitro. Por ejemplo, las líneas celulares tales como la línea de carcinoma epidermoide humano A-431, la línea celular de cáncer de pulmón microcítico humano SW2, la línea de tumor mamario humano SKBR3 y la línea celular de linfoma de Burkitt Namalwa se pueden usar fácilmente para evaluar la citotoxicidad de estos compuestos. Las células a evaluar se pueden exponer a los compuestos durante 24 horas y medir las fracciones de células supervivientes en ensayos directos mediante métodos conocidos. A continuación, se pueden calcular los valores de CI50 a partir de los resultados de los ensayos.
Derivados de tomaimicina
El citotóxico, según se describe en la presente memoria, también puede ser un derivado de tomaimicina. Los derivados de tomaimicina son pirrolo[1,4]benzodiazepinas (PBD), una clase conocida de compuestos que ejercen sus propiedades biológicas al unirse covalentemente al N2 De guanina en al surco menor del ADN. Los PBD incluyen varios que se unen al surco menor tales como antramicina, neotramicina y DC-81.
Los derivados nuevos de tomaimicina que conservan una citotoxicidad alta y pueden enlazarse de manera eficaz a agentes de unión a célula y se describen en la solicitud internacional n.° PCT/IB2007/000142. Los complejos de agente de unión a célula-derivado de tomaimicina permiten que se aplique la medición total de la acción citotóxica de los derivados de tomaimicina de manera dirigida solo contra células indeseadas y se evitan, de esta manera, efectos secundarios debido al daño a células sanas que no son diana.
El agente citotóxico según la presente memoria descriptiva comprende uno o más derivados de tomaimicina, enlazados a un agente de unión a célula, tal como el anticuerpo 2H11R35R74, a través de un grupo de enlace. El grupo de enlace es parte de un resto químico que se une covalentemente a un derivado de tomaimicina a través de métodos convencionales. En una realización preferida, el resto químico se puede unir covalentemente al resto de tomaimicina a través de una unión disulfuro.
Los derivados de tomaimicina útiles en la presente memoria descriptiva tienen la fórmula (XX) que se muestra a continuación:
Figure imgf000037_0001
en donde
---- representa una unión simple opcional;
Figure imgf000037_0002
representa una unión simple o una unión doble;
siempre que cuando
Figure imgf000037_0003
representa una unión simple, U y U', iguales o diferentes, representan independientemente H, y W y W', iguales o diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en OH, un éter tal como -OR, un éster (p. ej., un acetato), tal como -OCOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como -OCONRR', un carbamato cíclico, de manera que N10 y C11 sean una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR', un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico de manera que N10 y C11 sean una parte del ciclo, -SH, un sulfuro tal como -SR, un sulfóxido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfonato tal como -SO3 -, una sulfonamida tal como -NRSOOR, una amina tal como -NRR', amina opcionalmente cíclica de manera que N10 y C11 sean una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR', una amida tal como -NRCOR, un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquil o triarilfosfonio, un grupo derivado de aminoácido; Preferiblemente, W y W' son iguales o diferentes y son OH, OMe, OEt, NHCONH2 , SMe;
y cuando
Figure imgf000037_0004
representa una unión doble, U y U' están ausentes y W y W' representan H;
■ R1, R2, R1', R2' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de Haluro o Alquilo opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3 , Or , Arilo, Het, S(O)qR, o R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos una unión doble que contiene grupo =B y =B' respectivamente.
Preferiblemente, R1 y R2 y R1' y R2' forman juntos una unión doble que contiene grupo =B y =B' respectivamente.
■ B y B' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de Alquenilo que está opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3 , OR, Arilo, Het, S(O)qR o B y B' representan un átomo de oxígeno.
Preferiblemente, B=B'.
Más preferiblemente, B=B'= =CH2 o =CH-CH3 ,
■ X, X' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de uno o más -O-, -NR-, -(C=O)-, -S(O)q-.
Preferiblemente, X=X'.
Más preferiblemente, X=X'=O.
■ A, A' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de Alquilo o Alquenilo que contiene opcionalmente un oxígeno, un nitrógeno o un átomo de azufre, cada uno opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3 , OR, S(O)qR, Arilo, Het, Alquilo, Alquenilo.
Preferiblemente, A=A'.
Más preferiblemente, A=A'= alquilo insustituido lineal.
■ Y, Y' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de H, OR;
Preferiblemente, Y=Y'.
Más preferiblemente, Y=Y'=OAlquilo, más preferiblemente OMetilo.
■ T s -NR-, -O-, -S(O)q-, o un arilo, cicloalquilo, heterocíclico o heteroarilo de 4 a 10 miembros, cada uno opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3 , R, OR, S(O)qR y/o enlazador(es), o un Alquilo ramificado, opcionalmente sustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR y/o enlazador(es), o un Alquilo lineal sustituido por uno o más Hal, CN, NRR', CF3 , OR, S(O)qR y/o enlazador(es).
Preferiblemente, T es un arilo o heteroarilo de 4 a 10 miembros, más preferiblemente fenilo o piridilo, opcionalmente sustituido por uno o más enlazador(es).
Dicho enlazador comprende un grupo de enlace. Los grupos de enlace adecuados se conocen en la técnica e incluyen tiol, sulfuro, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos sensibles a ácido, grupos fotolábiles, grupos sensibles a peptidasa y grupos sensibles a esterasa. Se prefieren los grupos disulfuro y grupos tioéter.
Cuando el grupo de enlace es un grupo que contiene tiol-, sulfuro (o el llamado tioéter -S-) o disulfuro (-S-S-), la cadena lateral que lleva el grupo tiol, sulfuro o disulfuro puede ser lineal o ramificada, aromática o heterocíclica. El experto en la técnica puede identificar sin inconvenientes las cadenas laterales adecuadas.
Preferiblemente, dicho enlazador es de fórmula:
-G-D-(Z)p-S-Z'
donde
G es una unión simple o doble, -O-, -S- o -NR-;
D es una unión simple o -E-, -E-NR-, -E-NR-F-, -E-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-NR-CO-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NR-C-S-, -E-NR-CS-F-;
donde E y F son iguales o diferentes y se eligen independientemente de -(OCH2CH2)iAlquilo(OCH2CH2)j-, -Alquilo(OCH2CH2)i-Alquilo-, -(OCH2CH2)i-, - (OCH2CH2)iCicloalquilo(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iHeterocíclico(OCH2CH2)j-, - (OCH2CH2)iArilo(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iHeteroarilo(OCH2CH2)j-, -Alquilo-(OCH2CH2)iAlquilo(OCH2CH2)j-, -Alquilo-(OCH2CH2)i-, -Alquilo-(OCH2CH2)iCicloalquilo(OCH2CH2)j-, -Alquilo(OCH2CH2)iHeterocíclico(OCH2CH2)j-, - Alquilo-(OCH2CH2)iArilo(OCH2CH2)j-, -Alquilo(OCH2CH2)iHeteroarilo(OCH2CH2)j-, - Cicloalquilo-Alquilo-, -Alquilo-Cicloalquilo-, -Heterocíclico-Alquilo-, -Alquilo-Heterocíclico-, -AlquiloArilo-, -Arilo-Alquilo-, -Alquilo-Heteroarilo-, -Heteroarilo-Alquilo- lineal o ramificado; donde i y j, idénticos o diferentes son números enteros y se eligen independientemente de 0, 1 a 2000;
Z es -Alquilo- lineal o ramificado;
p es 0 o 1;
Z' representa H, un grupo protector tiol tal como COR, R20 o SR20, en donde R20 representa H, metilo, Alquilo, Cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido, siempre que cuando Z' es H, dicho compuesto esté en equilibrio con el compuesto correspondiente formado median ciclación intramolecular que resulta de la adición del grupo tiol -SH en la unión imina -NH= de uno de los restos PBD.
■ n, n', iguales o diferentes son 0 o 1.
■ q es 0, 1 o 2.
■ R, R' son iguales o diferentes y se eligen independientemente de H, Alquilo, Arilo cada uno opcionalmente sustituido por Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR, Arilo, Het;
o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmacéuticamente aceptables, o la estructura polimórfica cristalina de estos compuestos o sus isómeros, racematos, diaestereómeros o enantiómeros ópticos.
Los compuestos de la fórmula general (XX) que tiene estereoisómeros y geométricos son también parte de la memoria descriptiva.
Se sabe que la unión doble N-10, C-11 de derivados de tomaimicina de fórmula (XX) se puede convertir sin inconvenientes de manera reversible en aductos de imina correspondientes en presencia de agua, un alcohol, un tiol, una amina primaria o secundaria, urea y otros nucleófilos. Este proceso es reversible y puede regenerar fácilmente los derivados de tomaimicina correspondientes en presencia de un agente deshidratante, en un disolvente orgánico no prótico, al vacío o a temperaturas elevadas (Z. Tozuka, 1983, J. Antibiotics, 36: 276).
Por lo tanto, los derivados de tomaimicina reversibles de fórmula general (XXI) también se pueden usar en la presente memoria descriptiva:
Figure imgf000039_0001
donde A, X, Y, n, T, A', X', Y', n', R1, R2, R1', R2' se definen como en la fórmula (XX) y W y W' son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en OH, un éter tal como -OR, un éster (p. ej., un acetato), tal como -OCOR, -COOR, un carbonato tal como -OCOOR, un carbamato tal como - OCONRR', un carbamato cíclico, de manera que N10 y C11 sean una parte del ciclo, una urea tal como -NRCONRR', un tiocarbamato tal como -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico de manera que N10 y C11 sean una parte del ciclo, -SH, un sulfuro tal como -SR, un sulfóxido tal como -SOR, una sulfona tal como -SOOR, un sulfonato tal como -SO3 -, una sulfonamida tal como -NRSOOR, una amina tal como -NRR', amina opcionalmente cíclica de manera que N10 y C11 sean una parte del ciclo, un derivado de hidroxilamina tal como -NROR', una amida tal como -NRCOR, - NRCONRR', un azido tal como -N3, un ciano, un halo, un trialquil o triarilfosfonio, un grupo derivado de aminoácido. Preferiblemente, W y W' son iguales o diferentes y son OH, Ome, Oet, NHCONH2 , SMe.
Los compuestos de fórmula (XXI), por lo tanto, pueden considerarse como solvatos, incluida agua cuando el disolvente es agua; estos solvatos pueden ser particularmente útiles.
Los compuestos preferidos son los de fórmula (XXII) o (XXIII):
Figure imgf000039_0002
donde X, X', A, A', Y, Y', T, n, n' se definen como anteriormente.
Los compuestos de fórmula (XX) pueden prepararse de diversas formas conocidas para los expertos en la técnica. Los compuestos se pueden sintetizar, por ejemplo, mediante aplicación o adaptación de los métodos descritos más adelante, o variaciones a estos según apreciará el experto. Las modificaciones y sustituciones adecuadas se apreciarán sin inconvenientes y se conocen o se pueden obtener sin inconvenientes en la literatura científica dirigida a los expertos en la técnica. En particular, dichos métodos se pueden encontrar en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1999.
Los métodos para sintetizar los derivados de tomaimicina que se pueden usar en la memoria descriptiva se describen en la solicitud internacional n.° PCT/IB2007/000142. Los compuestos de la presente memoria descriptiva se pueden preparar mediante una variedad de vías sintéticas. Los reactivos y materiales de partida están disponibles comercialmente, o se pueden sintetizar sin inconvenientes mediante técnicas conocidas para el experto en la técnica (véase, por ejemplo, WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, FR1516743, M. Mori et al., 1986, Tetrahedron, 42: 3793-3806).
Las moléculas de conjugado de la memoria descriptiva se pueden formar mediante el uso de cualquier técnica. Los derivados de tomaimicina de la memoria descriptiva se pueden enlazar a un anticuerpo u otro agente de unión a célula a través de un enlazador sensible a ácido o mediante un enlazador fotolábil. Los derivados se pueden condensar con un péptido que tiene una secuencia adecuada y posteriormente enlazarse a un agente de unión a célula para producir un enlazador sensible a peptidasa. Los conjugados se pueden preparar para que contengan un grupo hidroxilo primario, que se pueden acilar y después enlazar a un agente de unión a célula para producir un conjugado que se puede escindir mediante esterasas intracelulares para liberar el derivado libre. Preferiblemente, los derivados se sintetizan para que contengan un grupo tiol libre o protegido, y después uno o más derivados que contienen disulfuro o tiol se enlazan cada uno covalentemente al agente de unión a célula a través de una unión disulfuro o un enlace tioéter.
Se describen numerosos métodos de conjugación en USP 5.416.064 y USP 5.475.092. Los derivados de tomaimicina se pueden modificar para proporcionar un grupo amino libre y después enlazarse a un anticuerpo u otro agente de unión a célula a través de un enlazador sensible a ácido o un enlazador fotolábil. Los derivados de tomaimicina con un grupo amino o carboxilo libre se pueden condensar con un péptido y posteriormente enlazarse a un agente de unión a célula para producir un enlazador sensible a peptidasa. Los derivados de tomaimicina con un grupo hidroxilo libre en el enlazador se pueden acilar y después enlazar a un agente de unión a célula para producir un conjugado que se puede escindir mediante esterasas intracelulares para liberar el fármaco libre. Lo más preferiblemente, los derivados de tomaimicina se tratan para crear un grupo tiol libre o protegido, y después los dímeros de tomaimicina que contienen disulfuro o tiol se enlazan al agente de unión a célula a través de uniones disulfuro.
Preferiblemente, los conjugados de anticuerpo monoclonal- o agente de unión a célula-derivado de tomaimicina son los que se ligan a través una unión disulfuro, según se describió anteriormente, que son capaces de suministrar derivados de tomaimicina. Dichos conjugados de unión a célula se preparan mediante métodos conocidos tales como modificar anticuerpos monoclonales son succinimidil piridil-ditiopropionato (SPDP) (Carlsson et al., 1978, Biochem. J., 173: 723-737). El grupo tiopiridilo resultante a continuación se desplaza mediante tratamiento con derivados de tomaimicina que contienen tiol para producir conjugados enlazados por disulfuro. Alternativamente, en el caso de derivados de tomaimicina con arilditio, la formación del conjugado de unión a célula se lleva a cabo mediante el desplazamiento directo del aril-tiol del derivado de tomaimicina mediante grupos sulfhidrilo introducidos previamente en las moléculas del anticuerpo. Los conjugados que contienen 1 a 10 fármacos derivados de tomaimicina enlazados a través de un puente disulfuro se preparan sin inconvenientes mediante cualquier método.
Más específicamente, una disolución del anticuerpo modificado por ditio-nitropiridilo a una concentración de 2,5 mg/ml en tampón de fosfato potásico 0,05 M, a pH 7,5 que contiene 2 mM de EDTA se trata con el derivado de tomaimicina que contiene tiol (1,3 eq. molar/grupo ditiopiridilo). La liberación de nitropiridinationa del anticuerpo modificado se monitorea espectrofotométricamente a 325 nm y se completa en aproximadamente 16 horas. El conjugado de anticuerpo-derivado de tomaimicina se purifica y libera del fármaco que no hizo reacción y otro material de bajo peso molecular mediante filtración en gel a través de una columna de Sephadex G-25 o Sephacryl S300. La cantidad de restos de derivado de tomaimicina unidos por molécula de anticuerpo se puede determinar al medir la relación de la absorbancia a 230 nm y 275 nm. Se puede enlazar un promedio de 1-10 moléculas de derivado de tomaimicina/molécula de anticuerpo a través de uniones disulfuro mediante este método.
El efecto de la conjugación sobre la afinidad de unión hacia las células que expresan antígeno se puede determinar usando los métodos descritos anteriormente por Liu et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 8618-8623. La citotoxicidad de los derivados de tomaimicina y sus conjugados con anticuerpo para líneas celulares se puede medir mediante retroextrapolación de curvas de proliferación celular, según se describe en Goldmacher et al., 1985, J. Immunol., 135: 3648-3651. La citotoxicidad de estos compuestos para líneas celulares adherentes se puede determinar mediante ensayos clonogénicos, según se describe en Goldmacher et al., 1986, J. Cell Biol., 102: 1312­ 1319.
Análogos de CC-1065
El agente citotóxico usado en los conjugados citotóxicos según la presente memoria descriptiva también puede ser un CC-1065 o un derivado de este.
CC-1065 es un potente antibiótico antitumoral aislado a partir de caldo de cultivo de Streptomyces zelensis. CC-1065 es aproximadamente 1000 veces más potente in vitro que los fármacos antineoplásicos usados comúnmente, tales como doxorrubicina, metotrexato y vincristina (B.K. Bhuyan et al., 1982, Cancer Res., 42, 3532-3537). CC-1065 y sus análogos se describen en las patentes estadounidenses núms. 6.372.738, 6.340.701,5.846.545 y 5.585.499.
La potencia citotóxica de CC-1065 se ha correlacionado con su actividad alquilante y su actividad de unión al ADN o de intercalación de ADN. Estas dos actividades residen en partes separadas de la molécula. Por lo tanto, la actividad alquilante está contenida en la subunidad ciclopropapirroloindol (CPI) y la actividad de unión a ADN residen en las dos subunidades pirroloindol.
Aunque CC-1065 tiene ciertas características atractivas como agente citotóxico, tiene limitaciones en el uso terapéutico. La administración de CC-1065 a ratones causó una hepatotoxicidad retardada que condujo a la mortalidad el día 50 después de una dosis intravenosa simple de 12,5 pg/kg (V. L. Reynolds et al., 1986, J. Antibiotics, XXIX: 319-334). Esto ha incentivado esfuerzos para desarrollar análogos que no causen toxicidad retardada, y se ha descrito la síntesis de análogos más simples modelados a partir de CC-1065 (M.A. Warpehoski et al., 1988, J. Med. Chem., 31: 590-603).
En otra serie de análogos, el resto CPI se reemplazó por un resto ciclopropa[c]benz[e]indol (CBI) (D.L. Boger et al., 1990, J. Org. Chem., 55: 5823-5833; D.L. Boger et al., 1991, BioOrg. Med. Chem. Lett., 1: 115-120). Estos compuestos mantienen la potencia in vitro alta del fármaco genitor, sin causar toxicidad retardada en ratones. Al igual que CC-1065, estos compuestos son agentes alquilantes que se unen al surco menor del ADN de manera covalente para provocar la muerte celular. Sin embargo, la evaluación clínica de los análogos más prometedores, Adozelesina y Carzelesina, condujo a resultados decepcionantes (B.F. Foster et al., 1996, Investigational New Drugs, 13: 321-326; I. Wolff et al., 1996, Clin. Cancer Res., 2: 1717-1723). Estos fármacos exhiben escasos efectos terapéuticos debido a su elevada toxicidad sistémica.
La eficacia terapéutica de los análogos de CC-1065 se puede mejorar en gran medida al cambiar la distribución in vivo a través del suministro dirigido al sitio del tumor, que resulta en toxicidad más baja en los tejidos que no son diana y, por lo tanto, toxicidad sistémica más baja. Para lograr este objetivo, se han descrito conjugados de análogos o derivados de CC-1065 con agentes de unión a célula que se dirigen específicamente a células tumorales (patentes estadounidenses; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545). Estos conjugados exhiben típicamente citotoxicidad específica para la diana elevada in vitro y excelente actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de tumor humano en ratones (R.V. J. Chari et al., 1995, Cancer Res., 55: 4079-4084).
Recientemente, se han descrito profármacos de análogos de CC-1065 con solubilidad potenciada en medio acuoso (solicitud de patente europea n.° 06290379.4). En estos profármacos, el grupo fenólico de la porción alquilante de la molécula se protege con una funcionalidad que vuelve al fármaco estable tras el almacenamiento en disolución acuosa ácida, y confiere al fármaco solubilidad en agua aumentada en comparación con un análogo desprotegido. El grupo protector se escinde sin inconvenientes in vivo a pH fisiológico para proporcionar el fármaco activo correspondiente. En los profármacos descritos en EP 06290379.4, el sustituyente fenólico se protege como un ácido sulfónico que contiene fenilcarbamato que posee una carga a pH fisiológica y, por lo tanto, solubilidad en agua potenciada. Para potenciar adicionalmente la solubilidad en agua, se puede introducir un separador de polietilenglicol opcional en el enlazador entre la subunidad indolilo y la ligadura escindible tal como un grupo disulfuro. La introducción de este separador no altera la potencia del fármaco.
Los métodos para sintetizar los análogos de CC-1065 que se pueden usar en los conjugados citotóxicos de la presente memoria descriptiva, junto con métodos para conjugar los análogos a agentes de unión a célula tales como anticuerpos, se describen en detalle en EP 06290379.4 y las patentes estadounidenses núms. 5.475.092, 5.846.545, 5.585.499, 6.534.660 y 6.586.618 y en las solicitudes estadounidenses núms. 10/116.053 y 10/265.452.
Otros fármacos
Los fármacos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, derivados de leptomicina, mitomicina C, clorambucilo, caliqueamicina, tubulisina y análogos de tubulisina, duocarmicina y análogos de duocarmicina, dolastatina y análogos de dolastatina tales como auristatinas son también adecuados para la preparación de conjugados de la presente memoria descriptiva. Las moléculas de fármaco también se pueden enlazar a las moléculas de anticuerpo a través de una molécula portadora intermediaria tal como seroalbúmina. Los compuestos de doxorrubicina y daunorrubicina, según se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.630.579, también pueden ser agentes citotóxicos útiles.
Composición terapéutica
La invención también se refiere a una composición terapéutica para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento del cáncer que incluye (pero no se limita a) los siguientes: carcinoma, incluidos los de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides y piel; incluido el carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluida, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluidas leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, incluidos melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluidos astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; u otros tumores, incluido melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma, y otros cánceres todavía por determinar en los que EphA2 se expresa predominantemente. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento del cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, ovarios, cuello uterino y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, un sarcoma, de vías respiratorias y digestivas altas, un glioma, gástrico, hepático u otros carcinomas en los que se expresa EphA2. En particular, el cáncer es un cáncer metastásico. En otra realización, dicha composición farmacéutica se relaciona con otros trastornos tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus sistémico, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de injerto, tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardíaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad del injerto contra el hospedante; infecciones víricas, tales como infección por mV, infección por VIH, SIDA, etc.; e infecciones parasitarias, tales como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis y otras según lo determinar el experto en la técnica.
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden:
una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención, y
un portador farmacéuticamente aceptable, que puede ser inerte o fisiológicamente activo.
Según se usa en la presente memoria, “portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen todos y cualesquiera disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen uno o más de agua, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de estos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición. En particular, los ejemplos relevantes de portador adecuado incluyen: (1) disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH ~ 7,4, que contiene o no contiene aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de seroalbúmina humana, (2) disolución salina al 0,9 % (0,9 % p/v de cloruro de sodio (NaCl)), y (3) dextrosa al 5 % (p/v); y también pueden contener un antioxidante tal como triptamina y un agente estabilizante tal como Tween 20.
Las composiciones en la presente memoria también pueden contener un agente terapéutico adicional, según sea necesario para el trastorno específico que se esté tratando. Preferiblemente, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención, y el compuesto complementariamente activo tendrán actividades complementarias, no se afectan de manera adversa entre sí. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es un antagonista de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés), tromboplastina hística (TF, por sus siglas en inglés), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés) o receptor HER2.
Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, pero la forma preferida depende del modo de administración previsto y la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas preferidas están en forma de disoluciones inyectables o infusionables. El modo de administración preferido es parenteral (p. ej. intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo). En una realización preferida, las composiciones de la invención se administran por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo. En otra realización preferida, se inyectan por vía intramuscular, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales, así como sistémicos. También se pueden administrar por nebulización. Se pueden preparar composiciones estériles para administración parenteral al incorporar el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención en la cantidad necesaria al disolvente adecuado y posteriormente someterlos a esterilización mediante microfiltración. Como disolvente o vehículo se puede usar agua, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como una combinación de estos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular, agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. Las composiciones estériles para administración parenteral también se pueden preparar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en el momento del uso en agua estéril o cualquier otro medio inyectable estéril.
Las dosis dependen del efecto deseado, la duración del tratamiento y la vía de administración usada; son generalmente de entre 5 mg y 1000 mg por día para un adulto con dosificaciones unitarias que varían de 1 mg a 250 mg de sustancia activa.
En general, el doctor determinará la dosificación adecuada dependiendo de la edad, peso y cualquier otro factor específico del sujeto que se va a tratar.
Métodos terapéuticos de uso
En otra realización, la presente memoria descriptiva describe un método para inhibir la actividad del receptor EphA2 mediante la administración de un anticuerpo que antagoniza con dicho receptor EphA2, a un paciente que lo necesita. Cualquiera del tipo de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados citotóxicos de la invención se puede usar terapéuticamente. La memoria descriptiva, por lo tanto, incluye el uso de anticuerpos anti-EphA2 antagonistas, fragmentos de estos, o conjugados citotóxicos de estos como medicamentos. En una realización preferida, el anticuerpo anti-EphA2 antagonista es el anticuerpo 2H11R35R74 o una variante humanizada de este.
Según se describe en la presente memoria, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados citotóxicos de la invención se usan para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En un aspecto, una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, y que contiene un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado citotóxico de la invención se usa para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. También es una realización de la invención que los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y conjugados citotóxicos de la invención también se pueden usar para producir un medicamento para tratar dicho trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una realización, el trastorno es un cáncer. En particular, el cáncer es un cáncer metastásico. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y conjugados citotóxicos de la invención también se pueden usar para tratar la neovascularización de dicho tumor neoplásico.
Por consiguiente, según se describe en la presente memoria, las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles para el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres, que incluyen (pero no se limitan a) los siguientes: carcinoma, incluidos los de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides y piel; incluido el carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluida, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluidas leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, incluidos melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluidos astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; u otros tumores, incluido melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma, y otros cánceres todavía por determinar en los que EphA se expresa predominantemente. En una realización preferida, el cáncer es un cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, útero, ovario, cuello uterino y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, un sarcoma, de vías respiratorias y digestivas altas, un glioma, gástrico, hepático u otros carcinomas en los que se expresa EphA. En otra realización, dicha composición farmacéutica se relaciona con otros trastornos tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus sistémico, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de injerto, tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardíaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad del injerto contra el hospedante; infecciones víricas, tales como infección por mV, infección por VIH, SIDA, etc.; e infecciones parasitarias, tales como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis y otras según lo determinar el experto en la técnica.
De manera similar, la presente memoria descriptiva describe un método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas que comprende poner en contacto las células diana o tejido que contiene células diana, con una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención, o un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o un agente terapéutico que comprende un conjugado citotóxico, ya sea solo o en combinación con otros agentes citotóxicos o terapéuticos.
El método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas se puede poner en práctica in vitro, in vivo o ex vivo. Según se usa en la presente memoria, “inhibir el crecimiento” significa retardar el crecimiento de una célula, disminuir la viabilidad celular, causar la muerte de una célula lisar una célula e inducir la muerte celular, ya sea en un período de tiempo corto o extenso.
Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante al mismo paciente para destruir las células enfermas o malignas; tratamientos de médula ósea antes de su trasplante para destruir linfocitos T competentes y evitar la enfermedad del injerto contra el hospedante (GVHD, por sus siglas en inglés); tratamientos de cultivos celulares para destruir todas las células excepto las variantes deseadas que no expresan el antígeno diana; o para destruir las variantes que expresar el antígeno indeseado.
Un experto en la técnica puede determinar sin inconvenientes las condiciones para el uso no clínico in vitro.
Los ejemplos de uso clínico ex vivo son extraer células tumorales o células linfoides de la médula ósea antes del trasplante autólogo en el tratamiento del cáncer o en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, o extraer linfocitos T u otras células linfoides de médula ósea o tejido autólogo o alógeno antes del trasplante para evitar la enfermedad de injerto contra hospedante (GVHD). El tratamiento se puede llevar a cabo como se indica a continuación. Se recoge la médula ósea del paciente u otro individuo y después se incuba en medio que contiene suero al cual se agrega el agente citotóxico de la invención. Las concentraciones varían de aproximadamente 10 pM a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37 °C. Un experto en la técnica puede determinar sin inconvenientes las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación, es decir, la dosis. Después de la incubación, las células de médula ósea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente mediante infusión i.v. según métodos conocidos. En circunstancias donde el paciente recibe otro tratamiento tal como un ciclo de quimioterapia mielosupresora o irradiación corporal total entre el momento de la recolección de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de médula tratadas se almacenan congeladas en nitrógeno líquido usando equipo médico estándar.
Para el uso clínico in vivo, el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo de unión a epítopo o el conjugado citotóxico de la invención se suministrará como disoluciones que se someten a prueba para determinar su esterilidad y niveles de endotoxinas. Los ejemplos de protocolos adecuados de administración de conjugado citotóxico se describen a continuación. Los conjugados se suministran semanalmente durante 4 semanas como un bolo i.v. por semana. Las dosis de bolo se suministran en 50 a 100 ml de disolución salina normal a la cual se pueden agregar 5 a 10 ml de seroalbúmina humana. Las dosificaciones serán de 10 pg a 100 mg por administración, i.v. (intervalo de 100 ng a 1 mg/kg por día). Más preferiblemente, las dosificaciones variarán de 50 pg a 30 mg. Los más preferiblemente, las dosificaciones variarán de 1 mg a 20 mg. Después de cuatro semanas de tratamiento, el paciente puede continuar recibiendo el tratamiento semanalmente. El experto en la técnica puede determinar los protocolos clínicos específicos en relación con la vía de administración, excipientes, diluyentes, dosificaciones, tiempos, etc., según lo amerite la situación clínica.
Diagnóstico
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención también se pueden usar para detectar EphA2 en una muestra biológica in vitro o in vivo. En un aspecto, los anticuerpos anti-EphA2 de la invención se usan para determinar el nivel de EphA2 en un tejido o en células derivadas del tejido. En un aspecto preferido, el tejido es un tejido enfermo. En un aspecto preferido del método, el tejido es un tumor o una biopsia de este. En un aspecto preferido del método, un tejido o una biopsia de este primero se extrae de un paciente y, a continuación, se pueden determinar los niveles de EphA2 en el tejido o biopsia en un inmunoensayo con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención. El tejido o biopsia de este se puede congelar o fijar. El mismo método se puede usar para determinar otras propiedades de la proteína EphA2, tales como su nivel de fosforilación en tirosina, niveles en superficie celular o ubicación celular.
El método descrito anteriormente se puede usar para diagnosticar un cáncer en un sujeto que se sabe o se sospecha que tiene cáncer, en donde el nivel de EphA2 medido en dicho paciente se compara con el de un sujeto de referencia normal o patrón. Dicho método, a continuación, se puede usar para determinar si un tumor expresa EphA2, lo que puede sugerir que el tumor responderá bien al tratamiento con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados de anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, el tumor es un cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, útero, ovario, cuello uterino y órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, un sarcoma, un glioma, gástrico, hepático, de vías respiratorias y digestivas altas u otros carcinomas en los que se expresa EphA2, y otros cánceres que todavía se determinarán en los que EphA2 se expresa predominantemente.
La presente memoria descriptiva describe, además, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a epítopo de estos que se etiquetan adicionalmente para su uso en aplicaciones de investigación y diagnóstico. En un aspecto preferido, la etiqueta es una radioetiqueta, un fluoróforo, un cromóforo, un agente para generación de imágenes o un ion metálico.
También se describe un método para diagnóstico en el que dichos anticuerpos o fragmentos de unión a epítopo de estos etiquetados se administran a un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer y se mide o monitorea la distribución de la etiqueta dentro del cuerpo del sujeto.
Kit
La presente memoria descriptiva también incluye kits, p. ej., que comprenden un conjugado citotóxico descrito e instrucciones para el uso del conjugado citotóxico para destruir tipo de células específicos. Las instrucciones pueden incluir orientaciones para usar los conjugados citotóxicos in vitro, in vivo o ex vivo.
Típicamente, el kit tendrá un compartimento que contiene el conjugado citotóxico. El conjugado citotóxico puede estar en forma liofilizada, forma líquida u otra forma adecuada para incluirse en un kit. El kit puede contener, además, elementos adicionales necesarios para poner en práctica el método descrito en las instrucciones del kit, tal como una disolución esterilizada para reconstituir un polvo liofilizado, agentes adicionales para combinarlos con el conjugado citotóxico antes de la administración a un paciente, y herramientas que auxilian en la administración del conjugado a un paciente.
La presente invención también se refiere a un artículo de fabricación que comprende:
- a) un material de envasado
- b) un anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este o un conjugado, y
c) una etiqueta o prospecto del envase contenido dentro de dicho material de envasado que indica que dicho anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este es eficaz para tratar el cáncer.
Ejemplos
Ejemplo 1
Preparación de conjugados
Conjugación de 2H11R35R74 con DM4
Esquemas sintéticos generales
Ejemplo 1a: hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4
Figure imgf000046_0001
Método a: Cromatografía líquida de presión elevada - Espectrometría de masas (LCMS)
Se obtuvieron espectros en un sistema Waters UPLC-SQD en modo de electropulverización positivo y/o negativo (ES+/-). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna: ACQUITY BEH C18, 1,7 pm - 2,1x30 mm; disolventes: A: H2O (ácido fórmico al 0,1 %) B: CH3CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 45 °C; velocidad de flujo: 0,6 ml/min; gradiente (2 min): de 5 a 50 % de B en 1 min; 1,3 min: 100 % de B; 1,45 min: 100 % de B; 1,75 min: 5 % de B.
Método B: Cromatografía líquida de presión elevada - Espectrometría de masas (LCMS)
Se obtuvieron espectros en un sistema Waters ZQ en modo de electropulverización positivo y/o negativo (ES+/-). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna: XBridge C18 2,5 pm 3x50 mm; disolventes: A: H2O (ácido fórmico al 0,1 %) B: CH3CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 70 °C; velocidad de flujo: 0,9 ml/min; gradiente (7 min): de 5 a 100 % de B en 5,3 min; 5,5 min: 100 % de B; 6,3 min: 5 % de B.
Método C: desglucosilación y espectrometría de masas de alta resolución de inmunoconjugado (HRMS)
Las desglucosilación es una técnica de digestión enzimática por medio de glucosidasa. La desglucosilación se hace a partir de 500 pl de conjugado 100 pl de tampón Tris HCl 50 mM 10 pl de enzima glucanasa-F (100 unidades de enzima liofilizada/ 100 pl de agua). El medio se somete a agitación vorticial y se mantiene una noche a 37 °C. La muestra desglucosilada a continuación está lista para analizarse en HRMS. Se obtuvieron espectros de masa en un sistema Waters Q-Tof-2 en modo de electropulverización positivo (ES+). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna: 4 pm BioSuite 250 URH SEC 4,6x300 mm (Waters); disolventes: A: formiato de amonio 25 mM ácido fórmico al 1 % B: CH3CN; temperatura de columna: 30 °C; velocidad de flujo 0,4 ml/min; elución isocrática 70 % de A 30 % de B (15 min).
Método D: Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (SEC)
> Columna: columna TSKgel G3000 SWXL 5 gm, 7,8 mm x 30 cm, TOSOH BIOSCIENCE, n.° de parte de LLC: 08541
^ Fase móvil: KCI (0,2M), KH2 PO4 (0,052M) K2HPO4 (0,107M), iPrOH (20 % en volumen)
^ Condiciones de análisis: elución isocrática a 0,5 ml/min durante 30 minutos
Método E: espectrometría de masas (MS)
Se obtuvieron espectros a través de ionización química (gas reactivo: amoníaco) en un sistema WATERS GCTof (introducción directa sin LC).
Método F: Cromatografía líquida de presión elevada - Espectrometría de masas (LCMS)
Se obtuvieron espectros en un sistema Waters UPLC-SQD en modo de electropulverización positivo y/o negativo (ES+/-). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna: ACQUITY BEH C18, 1,7 gm - 2,1x50 mm; disolventes: A: H2O (ácido fórmico al 0,1 %) B: CH3CN (ácido fórmico al 0,1 %); temperatura de columna: 50 °C; velocidad de flujo: 1 ml/min; gradiente (2 min): de 5 a 50 % de B en 0,8 min; 1,2 min: 100 % de B; 1,85 min: 100 % de B; 1,95: 5 % de B.
Abreviaturas:
AcOEt: acetato de etilo; ALK: grupo alquileno (C1-C12), particularmente alquileno (C1-C6); DAR: Relación entre fármaco y anticuerpo; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; DCC: N,N'-diciclohexilcarbodiimida; DCM diclorometano; DEAD: dietilazodicarboxilato; DIC: N,N'-diisopropilcarbodiimide; DIPEA: N,N-diisopropiletilamina DMA: dimetilacetamida; DMAP: 4-dimetilaminopiridina; DME: dimetoxietano; DMF: dimetilformamida; DMSO dimetilsulfóxido; s: coeficiente de extinción molar; EEDQ: 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina; EDCI: N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida; EDTA: ácido etileno-diamina-tetraacético; Fmoc: fluorenilmetoxocarbonilo; Hal: átomo de halógeno; HOBt: 1-hidroxibenzotriazol; HEPES: 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico; NHS: N-hidroxisuccinimida; iPrOH: alcohol isopropílico; NMP: N-metilpirrolidinona; Rf: factor de retención; RP: presión reducida; RT: temperatura ambiente; SEC: cromatografía de exclusión por tamaño; TBDMS: ferc-butildimetilsililo; TEA: trietilamina; TFA: ácido trifluoroacético; TFAA: anhídrido trifluoroacético; TFF: filtración de flujo tangencial; THF: tetrahidrofurano; TIPS: triisopropilsililo; TLC: cromatografía de capa delgada; tR: tiempo de retención.
Contenido de tampones:
^ Tampón A (pH 6,5): NaCl (50mM), KPi (50mM), EDTA (2mM)
^ Tampón HGS (pH 5,5): Histidina (10mM), Glicina (130 mM), sacarosa al 5 % (p/v), HCl (8mM)
Parámetros para los cálculos de la concentración de Ab y L-DM4 (consultar el método de cálculo: Therapeutic Antibodies and Protocols, tomo 525, 445):
^ Coeficientes de extinción molar para hu2H11R35R74 (224000 a 280nM; 82880 a 252nM) y L-DM4 (5180 a 280nM; 26159 a 252nM), asumiendo un peso molecular promedio de 160000 para el anticuerpo.
Ejemplo 1a:
1a.1. Preparación del conjugado enlazado con PEG4-acetamido:
hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4
Figure imgf000048_0001
Con agitación magnética, a temperatura ambiente, se agregaron 9 ml de hu2H11R35R74 (14,36 mg/ml en tampón A), después 16,85 ml de tampón A, 3,23 ml de HEPES 1M, 1,59 ml de DMA y posteriormente 1,64 ml de una disolución en 10mM DMA de éster activado con L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS. Después de 1 hora 30 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 0,085 ml adicionales de la disolución en 10mM DMA del éster activado con L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS. Después de 1 hora 45 minutos a temperatura ambiente, el medio de conjugación bruto se diluya con 60 ml de tampón HGS y se purifica mediante TFF en casetes Pellicon 3. La muestra se diafiltra contra ~ 10 volúmenes de muestra de tampón HGS y después se recoge. El tanque y los conductos de TFF se lavan con 10 ml adicionales de tampón HGS. Las dos disoluciones se mezclan, se esterilizan por filtro a través de PVDF de 0,22 gm, se concentran en Amicon 15 y se esterilizan por filtro a través de PVDF de 0,22 gm. Por lo tanto, se obtuvieron 17 ml de inmunoconjugado hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 (c = 5,76 mg/ml). A continuación, se analiza el inmunoconjugado para determinar la carga de fármaco final y la pureza monomérica.
Análisis SEC (método D): DAR (SEC) = 5,4; RT = 16,757; pureza monomérica = 99,5 %
Datos de HRMS (método C): véase la Figura 2
1 a.2. Preparación de éster activado por L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS:
Figure imgf000048_0002
Con agitación magnética, a temperatura ambiente, se introducen 154,3 mg de L-DM4 en un vial de vidrio. A continuación, se agrega una disolución de 90 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2-bromoacetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico en 0,94 ml de DMA y posteriormente 36 gl de DIEA. Después de 23 horas a temperatura ambiente, el medio de reacción se diluye con 5 ml de AcOEt y se lava con 7 ml de agua. La fase acuosa se extrae con 5 ml de AcOEt. Las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio, se concentrarse hasta secarse a presión reducida. Se obtienen 228 mg de aceite viscoso amarillo pálido, cuyo producto se diluye con una cantidad mínima de DMA y se purifica mediante cromatografía ultra rápida sobre 30g de gel de sílice injertado con C18 (gradiente de elución agua:acetonitrilo 95:5 a 5:95 en volumen). Después de la concentración de las fracciones 2 y 3 a presión reducida, se obtiene un aceite viscoso incoloro, cuyo producto se diluye con una cantidad mínima de DMA y se purifica mediante cromatografía ultra rápida sobre 30g de gel de sílice injertado con C18 (gradiente de elución agua:acetonitrilo 95:5 a 5:95 en volumen). Después de la concentración de las fracciones 33 a 35 a presión reducida, se obtienen 41 mg de éster activado por L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS en forma de un producto blanco similar a merengue, cuyas características son las siguientes:
Espectro de masas: método B
Tiempo de retención (min) = 4,06
[M+H-H2O]+: m/z 1164; [M+H]+: m/z 1182;
[M-H+HCO2H]-: m/z 1226
RMN análisis 1H (500 MHz, 5 en ppm, cloroformo-d): 0,80 (s, 3 H); 1,21 (s, 3 H); 1,22 (s, 3 H); 1,25 (m, 1 H); 1,29 (d, J=6,7 Hz, 6 H); 1,46 (m, 1 H); 1,57 (d, J=13,4 Hz, 1 H); 1,64 (s, 3 H); 1,76 a 1,83 (m, 1 H); 1,88 a 1,96 (m, 1 H); 2,18 (dd, J=2,5 et 14,3 Hz, 1 H); 2,36 (m, 1 H); 2,53 (m, 1 H); 2,61 (dd, J=12,5 et 14,3 Hz, 1 H); 2,82 a 2,92 (m, 10 H); 2,98 (d, J=16,7 Hz, 1 H); 3,03 (d, J=9,6 Hz, 1 H); 3,15 (d, J=12,9 Hz, 1 H); 3,22 (s, 3 H); 3,32 (s a, 1 H); 3,36 (s, 3 H); 3,42 (m, 2 H); 3,50 (d, J=9,1 Hz, 1 H); 3,53 (t, J=5,2 Hz, 2 H); 3,58 a 3,67 (m, 13 H); 3,84 (t, J=6,4 Hz, 2 H); 3,99 (s, 3 H); 4,27 (m,1 H); 4,77 (dd, J=2,9 et 11,9 Hz, 1 H); 5,42 (q, J=6,7 Hz, 1 H); 5,66 (dd, J=9,1 et 15,4 Hz, 1 H); 6,23 (s,1 H); 6,43 (dd, J=11,3 et 15,4 Hz, 1 H); 6,64 (d, J=1,1 Hz, 1 H); 6,74 (d, J=11,3 Hz, 1 H); 6,85 (d, J=1,1 Hz, 1 H); 7,08 (t, J=5,2 Hz, 1 H).
1a.3. Preparación de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2-bromo-acetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico:
Figure imgf000049_0001
Con agitación magnética, a temperatura ambiente, se introducen 671,4 mg de ácido 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (CA(PEG)4, Pierce) en un vial de vidrio. A continuación, se agrega una disolución de 597,4 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido bromo-acético en 14 ml de diclorometano. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, se agregan 0,396 ml de DIC (N,N'-diisopropilcarbodiimida). Después de 1 hora 30 minutos, el medio de reacción bruto se filtra sobre vidrio sinterizado y el filtrado se purifica mediante cromatografía ultra rápida en 100g de gel de sílice injertado con CN (gradiente de elución n.heptano/iPrOH/AcOEt con porción de iPrOH creciente). Después de la concentración de las fracciones 30 a 45 a presión reducida, se obtienen 761 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2-bromo-acetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico en forma de un aceite incoloro, cuyas características son las siguientes:
Espectro de masas: método A
Tiempo de retención (min) = 0,74
[M+H]+: m/z 483/485
[M-H+HCO2H]-: m/z 527/529
Se podría preparar 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido bromo-acético siguiendo el protocolo publicado (Biochemistry, 1974, 481).
Ejemplo 1b:
1b.1. Preparación de conjugado enlazado con PEG4-Mal:
hu2H11 R35R74-PEG4-Mal-DM4
Figure imgf000049_0002
Con agitación magnética, a temperatura ambiente, se agregaron 4 ml de hu2H11R35R74 (14,36 mg/ml en tampón A), después 7,5 ml de tampón A, 1,45 ml de HEPES 1M, 1,15 ml de DMA y posteriormente 0,305 ml de una disolución en 10mM DMA de éster activado con L-DM4-Mal-PEG4-CONHS. Después de 7 horas a temperatura ambiente, el medio de conjugación bruto se diluye con 70 ml de tampón HGS y se purifica mediante TFF en casetes Pellicon 3. La muestra se diafiltra contra ~ 10 volúmenes de muestra de tampón HGS y después se recoge. El tanque y los conductos de TFF se lavan con 10 ml adicionales de tampón HGS. Las dos disoluciones se mezclan, se concentran en Amicon 15 y se esterilizan por filtro a través de PVDF de 0,22 gm. Por lo tanto, se obtuvieron 8,0 ml de inmunoconjugado hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4 (c = 5,09 mg/ml). A continuación, se analiza el inmunoconjugado para determinar la carga de fármaco final y la pureza monomérica.
Análisis SEC (método D): DAR (SEC) = 5,3; RT = 16,680; pureza monomérica = 99,5 %
Datos de HRMS (método C): véase la Figura 3
1b.2. Preparación de éster activado por L-DM4-Mal-PEG4-CONHS:
Figure imgf000050_0001
Con agitación magnética, a temperatura ambiente, se agregan sucesivamente 50 mg de L-DM4, 17,2 mg de DIEA soportado (3,72 mmol/g) y una disolución de 36,2 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-propionilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico (disponibles comercialmente, SM(PEG)4, Pierce) en 360 gl de DMA. Después de 1 hora 30 minutos a temperatura ambiente, el medio de reacción se filtra, los sólidos se lavan con AcOEt y los filtrados combinados se purifica directamente mediante cromatografía ultra rápida en 14 g de gel de sílice injertado con CN (gradiente de elución heptano:AcOEt:iPrOH con contribución de iPrOH creciente). Después de la concentración de las fracciones que contienen el producto esperado a presión reducida, se obtienen 29,8 mg de éster activado por L-DM4-Mal-PEG4-CONHS en forma de un vidrio incoloro, cuyas características son las siguientes:
Espectro de masas: método A
Tiempo de retención (min) = 1,24 / 1,25 (2 diaestereoisómeros)
[M+H]+: m/z 1293
[M-H+HCO2H]-: m/z 1337
Ejemplo 1c: Preparación de conjugado enlazado con SPDB:
hu2H11 R35R74-SPDB-DM4
Figure imgf000050_0002
Se conjugaron anticuerpos 2H11R35R74 humanizados con L-DM4 N2'desacetil-N2'(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina usando el enlazador SPDB (N-hidroxsuccinimida éster de ácido 4-[2-piridilditio]butanoico) enlazador usando el mismo protocolo que se describió anteriormente en WO 2008010101A9 con otros anticuerpos hu2H11. De manera resumida, el anticuerpo se modificó a 8 mg/mL con un exceso molar de 5,5 o 6,5 veces de SPDB para hu2H11 y hu37.3D7, respectivamente. La reacción se llevó a cabo en Tampón A (50 mM KPi/50 mM NaCl/2 mM EDTA, pH 6,5, 95 % v/v) con EtOH (5 % v/v) durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, el anticuerpo modificado se purificó mediante la columna de desalación SephadexG25 con Tampón A. Después, el anticuerpo modificado se hizo reaccionar con un exceso molar de 1,7 veces de DM4 con respecto al enlazador SPDB. La reacción se llevó a cabo a 2,5 mg/mL de anticuerpo en Tampón A (97 % v/v) y DMA (dimetilacetamida, 3 % v/v) a temperatura ambiente durante 20 horas. El conjugado se purificó mediante una columna de desalación SephadexG25 con 10 mM de Histidina, 130 mM de Glicina, sacarosa al 5 %, pH5,5. La relación entre fármaco y anticuerpo fue de 4,0 para hu37.3D7-SPDB-DM4 y 3,1 para hu2H11-SPDB-DM4.
Ejemplo 1d: Preparación del conjugado hu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4
Figure imgf000051_0001
1d.1 Preparación del conjugado hu2H11 R35R74-PEG4-NMeAc-DM4
Con agitación magnética a RT, se agregan 4 ml de hu2H11R35R74 (14,36 mg/ml en tampón A), después 7,5 ml de tampón A, 1,45 ml de HEPES 1M, 1,05 ml de DMA y posteriormente 0,39 ml de una disolución en 10mM DMA de éster activado con L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS. Después de 30 min a RT, se agregan 0,19 ml adicionales de la disolución en 10mM DMA del éster activado con L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS. Después de 3 horas a RT, el medio de conjugación bruto se diluye con 65 ml de tampón HGS y se purifica mediante TFF en casetes Pellicon 3. La muestra se diafiltra contra ~10 volúmenes de muestra de tampón HGS y después se recoge. El tanque y los conductos de TFF se lavan con 10 ml adicionales de tampón HGS. Las dos disoluciones se mezclan, se concentran en Amicon 15 y se esterilizan por filtro a través de PVDF de 0,22 pm. Por lo tanto, se obtuvieron 8,5 ml de conjugado hu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4 (c = 6,01 mg/ml). A continuación, se analiza el conjugado para determinar la carga de fármaco final y la pureza monomérica. Análisis SEC (D): DAR (SEC)= 5,5; RT= 16,7 min; pureza monomérica 99,4 %; datos de HRMS: véase la Figura 14.
1d.2 Preparación de éster activado por L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS
Con agitación magnética a RT, se introducen 133,4 mg de L-DM4 en un vial de vidrio. A continuación, se agrega una disolución de 85 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[(2-bromo-acetil)-metil-amino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico en 0,2 ml de DMA y posteriormente 32,9 pl de DIEA. Después de 1 hora a RT, el medio de reacción se purifica mediante cromatografía ultra rápida en 30 g de gel de sílice injertado con C18 (gradiente de elución agua:acetonitrilo 95:5 a 5:95 en volumen). Después de la concentración de las fracciones que contienen el producto deseado a RP, se obtienen 71,3 mg de éster activado por L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS en forma de un producto similar a vidrio incoloro. Espectro de masas (D): RT=0,98 min; [M+H-H2O]+ : m/z 1178 (señal principal); [M+Na]+ : m/z 1218; [M-H+HCO2H]- : m/z 1240 ; 1H RMN (500 m Hz, 5 en ppm, cloroformo-d) : 0,81 (s, 3 H) ; 1,20 a 1,33 (m, 13 H) ; 1,42 a 1,52 (m, 1 H) ; 1,56 a 1,61 (m, 1 H) ; 1,65 (s, 3 H) ; 1,73 a 1,83 (m, 1 H) ; 1,96 a 2.04 (m, 1 H) ; 2,19 (dd, J=2,8 y 14,4 Hz, 1 H) ; 2,29 a 2,41 (m, 1 H) ; 2,55 a 2,66 (m, 2 H) ; 2,83 a 2,93 (m, 12 H) ; 3.04 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 3,12 (d, J=12,7 Hz, 1 H) ; 3,18 a 3,25 (m, 5 H) ; 3,37 (s, 3 H) ; 3,47 a 3,54 (m, 3 H) ; 3,57 a 3,68 (m, 15 H) ; 3,85 (t, J=6,6 Hz, 2 H) ; 3,99 (s, 3 H) ; 4,29 (m, 1 H) ; 4,79 (dd, J=2,8 y 12,2 Hz, 1 H) ; 5,41 (q, J=6,7 Hz, 1 H) ; 5,68 (dd, J=9,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,23 (s, 1 H) ; 6,43 (dd, J=11,0 y 15,2 Hz, 1 H) ; 6,66 (s, 1 H) ; 6,74 (d, J=11,0 Hz, 1 H) ; 6,83 (s, 1 H).
1d.3 Preparación de 2,5-dioxo-pirrolidin-1 -il éster de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[(2-bromo-acetil)-metil-amino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico
Figure imgf000052_0001
Con agitación magnética, a RT, en un matraz de fondo redondo, se introducen sucesivamente 115,1 mg de ácido 3-(2-{2-[2-(2-metilamino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico, 1,5 ml de DCM, 97,3 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido bromo-acético. Después de 2 h, se agregan 72 pl de DIEA y después de 1 hora adicional a RT, se agregan 70,2 pl de DIC. El medio de reacción bruto se mantiene 4 h a RT, 16 h a -20 °C y después se purifica mediante cromatografía ultra rápida en 30 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM:metanol de 0:100 a 3:97 en volumen). Después de la concentración de las fracciones que contienen el producto deseado a RP, se obtienen 85,8 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[(2-bromo-acetil)-metil-amino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico en forma de un sólido blanco. Espectro de masas (A): TR= 0,84 min ; [M+H]+ : m/z 497/499
1d.4 Preparación de ácido 3-(2-{2-[2-(2-metilamino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico
Figure imgf000052_0002
En una atmósfera inerte de argón, en un matraz de fondo redondo, con agitación magnética, se introducen sucesivamente 120,1 mg de éster metílico de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-trifluoro-acetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico, 1 ml de THF anhidro y 59,8 pl de CH3L El medio de reacción se enfría con un baño de hielo/agua a aproximadamente 0 °C, y se agregan lentamente 16,1 mg de NaH (50 % puro en aceite) en porciones pequeñas. Después de 15 min a 0 °C, y 1 h a RT, el medio de reacción bruto se concentra hasta secarse a RP, y se diluye con 0,5 ml de THF y 0,8 ml de agua. A continuación, a RT, se agregan 30,6 mg de LiOH al medio de reacción. El medio de reacción bruto se mantiene 2 h a RT, 16 h a -20 °C y después se purifica mediante cromatografía ultra rápida en 30 g de gel de sílice injertado con C18 (gradiente de elución agua:acetonitrilo de 95:5 a 5:95 en volumen). Después de la concentración de las fracciones que contienen el producto deseado a RP, se obtienen 115,3 mg de ácido 3-(2-{2 -[2 -(2 -metilamino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico en forma de un aceite amarillo.
1d.5 Preparación de éster metílico de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-trifluoro-acetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico
Figure imgf000052_0003
En una atmósfera inerte de argón, en un matraz de fondo redondo, con agitación magnética, se introducen sucesivamente 230 mg de ácido 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (CA(PEG)4, Pierce), 2 ml de DCM y 1 ml de metanol. A RT, se agrega lentamente 1 ml de trimetilsilildiazometano (disolución 2M en hexano) al medio de reacción. Después de 2 h a RT, el exceso de trimetilsilildiazometano se neutraliza mediante la adición de ácido acético. El medio de reacción bruto después se evapora hasta secarse a RP. El residuo obtenido se diluye con 2 ml de DCM, se enfría hasta 0 °C con un baño de agua-hielo, después se agregan sucesivamente 363 pl de TEA y 300 pl de TFAA. Después de 2 h 30 min a RT y 19 h a -20 °C, se agregan sucesivamente 363 pl de TEA y 300 pl de TFAA. Después de 4 h 30 min a RT y el medio bruto se concentra a -20 °C y después se purifica mediante cromatografía ultra rápida en 30 g de gel de sílice injertado con C18 (gradiente de elución agua:acetonitrilo de 95:5 a 5:95 en volumen). Después de la concentración de las fracciones que contienen el producto deseado a RP, se obtienen 123 mg de éster metílico de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-trifluoro-acetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico en forma de un aceite amarillo pálido. Espectro de masas (A): TR= 0,90 min ; [M+H]+ : m/z 376 ; [M-H]- : m/z 374.
Ejemplo 1e: Preparación del conjugado hu2H11R35R74-PEG8-NHAc-DM4
Figure imgf000053_0001
1e.1 Preparación del conjugado hu2H11 R35R74-PEG8-NHAc-DM4
Con agitación magnética a RT, se agregan 4 ml de hu2H11R35R74 (14,36 mg/ml en tampón A), después 7,5 ml de tampón A, 1,45 ml de HEPES 1M, 1,05 ml de DMA y posteriormente 0,405 ml de una disolución en 10 mM DMA de éster activado con L-DM4-AcNMe-PEG8-CONHS. Después de 30 min a RT, se agrega 0,1 ml adicionales de la disolución en 10mM DMA del éster activado con L-DM4-AcNMe-PEG8-CONHS. Después de 1 hora 45 min a RT, el medio de conjugación bruto se diluye con 60 ml de tampón HGS y se purifica mediante TFF en casetes Pellicon 3. La muestra se diafiltra contra ~10 volúmenes de muestra de tampón HGS y después se recoge. El tanque y los conductos de TFF se lavan con 10 ml adicionales de tampón HGS. Las dos disoluciones se mezclan, se concentran en Amicon 15 y se esterilizan por filtro a través de PVDF de 0,22 gm. Por lo tanto, se obtuvieron 7,0 ml de conjugado hu2H11R35R74-PEG8-AcNMe-DM4 (c = 6,95 mg/ml). A continuación, se analiza el conjugado para determinar la carga de fármaco final y la pureza monomérica. Análisis SEC (D): DAR (SEC)= 5,0; RT= 16,593 min; pureza monomérica 99,5 %; datos de HRMS: véase la Figura 15.
1e.f Preparación de éster activado por L-DM4-AcNH-PEG8-CONHS
Con agitación magnética a RT, se introducen 65 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-bromo-propionilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico en un vial de vidrio, posteriormente un disolución de 67,7 mg de L-DM4 en 0,85 ml de DMA y 16,5 gl de DIEA. Después de 48 horas a RT, el medio de reacción se purifica mediante cromatografía ultra rápida en 10 g de gel de sílice (gradiente de elución DCM:MeOH 100:0 a 90:10 en volumen). Después de la concentración de las fracciones 18 a 26 a RP, se obtienen 17 mg de éster activado por L-DM4-AcNH-PEG8-CONHS en forma de un producto similar a vidrio incoloro. Espectro de masas (B): RT= 4,08 min; [M+H-H2O]+ : m/z 1340 (señal principal); [M+Na]+ : m/z 1380; [M-H+HCO2H]-: m/z 1402 ; 1H RMN (400 MHz, 5 en ppm, cloroformo-d) : 0,81 (s, 3 H) ; 1,22 (s, 3 H) ; 1,23 (s, 3 H) ; 1,26 (m, 1 H) ; 1,30 (d, J=6,8 Hz, 6 H) ; 1,41 a 1,52 (m, 1 H) ; 1,65 (s, 3 H) ; 1,80 (m, 1 H) ; 1,89 a 1,99 (m, 1 H) ; 2,19 (m, 1 H) ; 2,37 (m, 1 H) ; 2,47 a 2,67 (m, 2 H) ; 2,81 a 2,93 (m, 10 H) ; 2,99 (d, J=16,6 Hz, 1 H) ; 3,04 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 3,16 (d a, J=13,7 Hz, 1 H) ; 3,23 (s, 3 H) ; 3,32 (s a, 1 H) ; 3,37 (s, 3 H) ; 3,44 (m, 2 H) ; 3,51 (d, J=9,1 Hz, 1 H) ; 3,54 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,59 a 3,73 (m, 29 H) ; 3,86 (t, J=6,6 Hz, 2 H) ; 4,00 (s, 3 H) ; 4,22 a 4,33 (m, 1 H) ; 4,78 (dd, J=2,9 y 12,2 Hz, 1 H) ; 5,43 (q, J=6,8 Hz, 1 H) ; 5,67 (dd, J=9,0 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,23 (s, 1 H) ; 6,44 (dd, J=11,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,65 (d, J=1,5 Hz, 1 H) ; 6,75 (d, J=11,2 Hz, 1 H) ; 6,86 (d, J=1,5 Hz, 1 H) ; 7,02 a 7,13 (m, 1 H).
1e.g Preparación de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-bromo-propionilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico:
Figure imgf000053_0002
Con agitación magnética a RT, se introducen sucesivamente 100 mg de ácido 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (CA(PEG)4, Pierce), 2 ml de DCM y 53,5 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido bromoacético en un vial de vidrio. Después de 1 h a RT, se agregan 35,1 gl de DIC. Después 1 h, el medio de reacción bruto se filtra sobre vidrio sinterizado, se concentra hasta secarse a RP, se diluye con 10 ml de AcOEt, se filtra sobre vidrio sinterizado y se concentra hasta secarse a RP. Se obtienen 76,5 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-bromo-propionilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico en forma de un aceite incoloro. Espectro de masas (A): TR= 0,80 min ; [M+H]+ : m/z 659/661 ; [M-H+HCO2H]- : m/z 703/705
Ejemplo 1f: Preparación del conjugado hu2H11 R35R74-PEG4-Allyl-DM4
Figure imgf000054_0002
1f.1 Preparación del conjugado hu2H11R35R74-PEG4-Allyl-DM4
Con agitación magnética a RT, se agregan 4 ml de hu2H11R35R74 (14,36 mg/ml en tampón A), después 7,5 ml de tampón A, 1,45 ml de HEPES 1M, 1,14 ml de DMA y posteriormente 0,3 ml de una disolución en 10 mM DMA de éster activado con L-DM4-Allyl-PEG4-CONHS. Después de 30 min a RT, se agregan 0,125 ml adicionales de la disolución en 10mM DMA del éster activado con L-DM4-Allyl-PEG4-CONHS. Después de 1 hora 25 min a RT, el medio de conjugación bruto se diluye con 65 ml de tampón HGS y se purifica mediante TFF en casetes Pellicon 3. La muestra se diafiltra contra ~ 10 volúmenes de muestra de tampón HGS y después se recoge. El tanque y los conductos de TFF se lavan con 10 ml adicionales de tampón HGS. Las dos disoluciones se mezclan, se concentran en Amicon 15 y se esterilizan por filtro a través de PVDF de 0,22 pm. Por lo tanto, se obtuvieron 8,0 ml de conjugado hu2H11 R35R74-PEG4-Allyl-DM4 (c = 5,22 mg/ml). A continuación, se analiza el conjugado para determinar la carga de fármaco final y la pureza monomérica. Análisis SEC (H): DAR (SEC)= 5,3; RT= 16,767 min; pureza monomérica 99,4 %; datos de HrMs : véase la Figura 16.
1f.2 Preparación de éster activado por L-DM4-Allyl-PEG4-CONHS
Con agitación magnética a RT, se introducen 70 mg de L-DM4, 45 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-(2-{2-[2-(4-bromo-but-2-eniloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (Bromo-Allyl-PEG4-CONHS), 0,5 mg de DMA y 23,5 pl de DlEA en un vial de vidrio. Después de 2 h a RT y 17 h a -20 °C, se agregan 50 pl de DIEA. Después de 24 horas a RT, el medio de reacción se purifica mediante cromatografía ultra rápida en 30 g de gel de sílice injertado con C-18 (gradiente de elución agua:acetonitrilo 95:5 a 5:95 en volumen). Después de la concentración de las fracciones que contienen el producto esperado a RP, se obtienen 47,1 mg de éster activado por L-DM4-Allyl-PEG4-CONHS en forma de un sólido blanco. Espectro de masas (D): TR= 1,06 min ; [M+Na]+ : m/z 1173 ; 1H RMN (500 MHz, 5 en ppm , cloroformo-d) : 0,81 (s, 3 H) ; 1,18 a 1,39 (m, 13 H) ; 1,42 a 1,52 (m, 1 H) ; 1,58 (d, J=13,4 Hz, 1 H) ; 1,65 (s, 3 H) ; 1,73 a 1,82 (m, 1 H) ; 1,86 a 1,95 (m, 1 H) ; 2,19 (d, J=14,3 Hz, 1 H) ; 2,40 (m, 1 H) ; 2,51 a 2,65 (m, 2 H) ; 2,82 a 2,95 (m, 9 H) ; 2,98 a 3,07 (m, 2 H) ; 3,12 (d, J=12,6 Hz, 1 H) ; 3,18 a 3,27 (m, 1 H) ; 3,23 (s, 3 H) ;3,36 (s, 3 H) ; 3,51 (d, J=9,1 Hz, 1 H) ; 3,54 a 3,82 (m, 13 H) ; 3,86 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,91 a 3,95 (m, 2 H) ; 3,99 (s, 3 H) ; 4,28 (t, J=11,0 Hz, 1 H) ; 4,78 (dd, J=2,6 et 11,9 Hz, 1 H) ; 5,44 (q, J=6,7 Hz, 1 H) ; 5,49 a 5,63 (m, 2 H) ; 5,68 (dd, J=9,1 y 15,0 Hz, 1 H) ; 6,24 (s, 1 H) ; 6,43 (dd, J=11,1 y 15,0 Hz, 1 H) ; 6,66 (s, 1 H) ; 6,77 (d, J=11,1 Hz, 1 H) ; 6,83 (s, 1 H).
1f.3 Preparación de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-(2-{2-[2-(4-bromo-but-2-eniloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico
Figure imgf000054_0001
A RT, se introducen sucesivamente 200 mg de ácido 3-(2-{2-[2-(4-bromo-but-2-eniloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico, 4 ml de DCM y 232,3 mg de DCC soportado (2 equivalentes) en un vial de vidrio. Después de 1 h a RT, se agregan 64,8 mg de n Hs . Después 5 h a RT, el medio de reacción bruto se filtra sobre vidrio sinterizado, los sólidos se lavan con DCM y los filtrados combinados se concentran hasta secarse en RP. La purificación mediante cromatografía ultra rápida en 15 g de gel de sílice (gradiente de elución MeOH:DCM 0:100 a 10:90 en volumen) y la concentración de las fracciones que contenían el producto esperado a RP, proporcionaron 46 mg de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster de ácido 3-(2-{2-[2-(4-bromo-but-2-eniloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (Bromo-Allyl-PEG4-CONHS) obtenidos en forma de un aceite amarillo pálido. Espectro de masas (A): TR= 1,02 min ; [M+H]+ : m/z 454/456 ; [M+Na]+ : m/z 476/478 ; [M-H+HCO2H]- : m/z 498/500.
1f.4 Preparación de ácido 3-(2-{2-[2-(4-bromo-but-2-eniloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico
Figure imgf000055_0001
A RT, una disolución de 1 g de éster terc-butílico de ácido 3-(2-{2-[2-(4-bromo-but-2-eniloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (comercialmente disponible), 6 ml de TFA y 3 ml de DCM se agita durante 3 h y después se concentra hasta secarse a RP. El residuo oleoso se diluye con tolueno y se concentra hasta secarse a RP para proporcionar 853 mg de ácido 3-(2-{2-[2-(4-bromo-but-2-eniloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico en forma de un aceite marrón. Ejemplo 1g: Preparación del conjugado hu2H11-PEG4-NHAc-DM4
El conjugado hu2H11 -PEG4-NHAc-DM4 podría prepararse de manera similar al ejemplo 1: con agitación magnética, a RT, se agrega 1 ml de hu2H11 (8,52 mg/ml en tampón A), después 0,7 ml de tampón A, 0,213 ml de HEPES 1M, 0,7 ml de DMA y posteriormente 0,085 ml de una disolución en 10 mM DMA de éster activado con L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS diluido con 0,128 ml de DMA. Después de 2 h a RT, el medio se concentra en Amicon 4 a 7000 G, se intercambia el tampón con tampón HGS en columna Nap-10 y finalmente se purifica en una columna de 5 ml Zeba. Por lo tanto, se obtuvieron 1,15 ml de conjugado hu2H11-PEG4-NHAc-DM4 (c = 3,78 mg/ml). A continuación, se analiza el conjugado para determinar la carga de fármaco final y la pureza monomérica. Análisis SEC (método D): DAR (UV)= 6,6; DAR (SEC)= 5,6; RT= 15,387 min; pureza monomérica 99,7 %; datos de HRMS: véase la Figura 17. Ejemplo 2
Inhibición de la actividad de autofosforilación de EphA2 mediante hu2H11R35R74
Materiales y métodos
Líneas celulares y anticuerpos
Se obtuvo la línea celular de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 de ECAAC (n.° de ref. 92020424). Se obtuvo la línea celular de carcinoma pulmonar no microcítico NCI-H1299 de ATCC (n.° de ref. CRL-5803). Ambas líneas celulares se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternero fetal inactivado por al calor al 10 % y 2 mM de L-Gln. Se obtuvo la quimera de dominio extracelular/Fc de Ephrin-A1 de ratón recombinante (EphrinA1/Fc) de Sigma (n.° de ref. E 9902) o de R & D Systems (n.° de ref. 602-A1). Se obtuvieron el anticuerpo clon D7 anti-Eck/EphA2 (Ab) y el Ab anti-fosfotirosina 4G10 de Millipore (n.° de ref. 05-480 y 05-321 respectivamente). Se generó el Ab testigo de isotipo chKTI en Immunogen Inc. Corresponde a la versión quimérica del Ab anti-inhibidor de tripsina de grano de soja Kunitz (KTI, n.° de ref. de ATCC HB9515) donde las regiones constantes de cadena pesada y ligera de Ig se reemplazaron por la cadena ligera k humana y la cadena pesada y1 humana. El Ab recombinante se purificó en ImmunoGen (lote de chKTI n.° 2539-91) a partir de sobrenadantes de cultivo de células HEK293T transfectadas transitoriamente con un plásmido de expresión para las cadenas pesada y ligera. Se produjeron los Ab anti-EphA2 humanizados hu2H11(n.° de lote LP08191) y hu2H11R35R74 (n.° de lote LP09077) en Sanofi-Aventis a partir de líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO)/GS Lonza transfectadas de manera estable. Ambos Ab se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo mediante cromatografía de afinidad sobre proteína A-sefarosa y posteriormente cromatografía de intercambio aniónico según procedimientos estándares. Se llevó a cabo una etapa de cromatografía adicional sobre hidroxiapatita cerámica. Todas las preparaciones se almacenaron en 1xPBS a 4 °C y se sometieron a prueba para determinar niveles de endotoxina bajos usando el método LAL cinético. El clon C4 de anticuerpo anti-actina era de Millipore (n.° de ref. MAB1501). El Ab de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (PO) era de Jackson Immunoresearch (n.° de ref. 115-035-003).
Inducción de fosforilación
Se colocaron en placas células MDA-MB-231 en medio completo en discos de Petri P100 (5 placas por muestra) a 3 x 106 células por placa y se incubaron durante 48 h a 37 °C en una incubadora de CO2. Las células se privaron de suero durante 18 h y posteriormente se trataron con 10 pg/mL de hu2H11 o hu2H11-R35/R74 o con EphrinA1/Fc a 2 pg/mL 10 min a 2 h a 37 °C.
Inhibición de la fosforilación
Se incubaron células MDA-MB-231 o NCI-H1299 privadas de suero con chKTI, hu2H11 o hu2H11R35R74 (10 pg/mL) 1 h a 37 °C. A continuación, se agregó 1 pg/mL de EphrinA1/Fc y las células se incubaron 10-30 min adicionales a 37 °C.
Preparación de extractos celulares
Se recogieron muestras celulares sobre hielo mediante raspado, se transfirieron a tubos cónicos de 15 mL y se centrifugaron 5 min a 1300 rpm. Después de un lavado con 1 x de disolución salina tamponada con fosfato (PBS; n.° de Invitrogen 14190), las células se resuspendieron en 300 pL de tampón de lisis (n.° de ref. de Biosource FNN0011) complementado improvisadamente con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, por sus siglas en inglés), 1 x cóctel inhibidor de proteasa (n.° de ref. de Sigma P2714) y 1 x inhibidor de fosfatasa Halt (n.° de ref. de Pierce 78420). Los extractos celulares se mantuvieron sobre hielo 45 min con ocasional agitación vorticial, se centrifugaron 10 min a 15000 rpm y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso adicional. La concentración proteica se determinó mediante el método de ácido bicinconínico (BCA) usando un kit de Pierce (n.° de ref. 23227).
Inmunoprecipitación
Se llevó a cabo una etapa de prelimpieza de los extractos celulares (0,3-0,5 mg por muestra) al añadir flujo rápido de proteína G Sepharose 4 (n.° de ref. de GE Healthcare Life Sciences 17-0618-01) previamente equilibrado en tampón de lisis (1 h a 4 °C sobre un rotador). La incubación se llevó a cabo 30 min a 4 °C sobre un rotador. Las muestras se centrifugaron 2 min a 1500 rpm, se recogió el sobrenadante y se incubó durante toda la noche sobre un rotador con el clon D7 de Ab anti-EphA2 (4 pL por muestra). La inmunoprecipitación se llevó a cabo con proteína G Sepharose 4 h a 4 °C sobre un rotador. Las muestras se centrifugaron 2 min a 1500 rpm a 4 °C y se lavaron 3 veces 5 min con 100 pL de tampón de lisis. Las perlas inmunoprecipitadas se resuspendieron en 50 pL de 4 x tampón de muestra NuPAGE LDS (n.° de ref. de Invitrogen NP0007) complementado con agente reductor NuPAGE (n.° de ref. de Invitrogen NP0009), se calentaron 5 min a 95 °C, se centrifugaron 5 min 1500 rpm y se mantuvieron a -20 °C o se sometieron a electroforesis.
Inmunotransferencia
Los inmunoprecipitados o extractos celulares se cargaron sobre un gel Bis-Tris Midi al 4-12 % (n.° de Invitrogen NP0322BOX) con marcadores de peso molecular de referencia (n.° de ref. de GE healthcare Life Sciences RPN800) y se llevó a cabo la electroforesis durante 3 h a 150 V en tampón MOPS-SDS 1 x (n.° de ref. de Invitrogen NP0001). La electrotransferencia se llevó a cabo sobre membranas PVDF (n.° de ref. de Invitrogen LC2007) con un aparato iblot™ (Invitrogen) usando el programa 3. El bloqueo de las membranas se llevó a cabo en TBST 1x (es decir, disolución salina tamponada con Tris n.° de ref. de Sigma T 5912, Tween 20 al 0,1 % n.° de ref. de Sigma P1379) complementada con seroalbúmina bovina al 5 %. El etiquetado con el clon D7 de Ab anti-EphA2 o el Ab antifosfotirosina 4G10 se llevó a cabo durante toda la noche a 4 °C en el mismo tampón. El etiquetado con el clon C4 de Ab anti-actina se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente. Después del posterior lavado de las membranas con 1 x TBST, se llevó a cabo el desarrollo de las inmunotransferencias usando el Ab anti-ratón de cabra conjugado con PO y el kit ECL de Perkin Elmer (n.° de ref. NEL 104001EA). La luminiscencia se leyó en un aparato Fuji4000. Resultados
La inducción de la fosforilación de EphA2 mediante los Ab hu2H11 o hu2H11R35R74 se investigó en células MDA-MB231 usando EphrinA1/Fc recombinante como testigo positivo. Los resultados se presentan en la Figura 4. No se pudo detectar ninguna inducción de fosforilación con ninguno de los dos Ab después de 10 min a 2 h, mientras la EphrinA1/Fc recombinante indujo una intensa fosforilación del receptor EphA2 a los 10 min con una decaída de la señal que se inició después de 1 h y una degradación del receptor que comenzó a ser visible después de 2 h.
Se investigó la inhibición de la fosforilación de EphA2 después de la inducción mediante EphrinA1/Fc en células NCI-H1299 y MDA-MB-231. Los resultados se presentan en las Figuras 5A y 5B. En ambos casos, la preincubación de las células con cualquiera de los dos Ab inhibió la fosforilación del receptor EphA2 mediante EphrinA1/Fc.
Podemos concluir que hu2H11 y hu2H11R35R74 tienen actividad inhibidora similar sobre el receptor EphA2.
Ejemplo 3
Caracterización de la unión de anticuerpos anti-EphA2 conjugados, hu2H11R35R74 y hu2H11.
La interacción de los anticuerpos anti-EphA2 hu2H11 y hu2H11R35R74, ya sea no conjugados o conjugados con DM4 con el enlazador PEG4-NHAc, con EphA2-Fc inmovilizado se monitoreó mediante detección de resonancia en plasmones superficiales usando un instrumento BIAcore 3000 (GE healthcare, n.° CH321). EphA2-Fc (10 μg/ml; tampón acetato
pH = 4,5) se acopló a la matriz de un chip sensor C1 (GE healthcare BR-1005-40) a 10 pl/min usando un protocolo de acoplamiento por amina estándar con EDC (N-etil-N'-[dimetilaminopropil]carbodiimida)/NHS (N-hidroxisuccinimida). La densidad se controló a un nivel de respuesta aumentado de ~ 100 unidades de respuesta (RU, por sus siglas en inglés) en experimentos de unión cinéticos. Las IgG se diluyeron en 0,01 M de Hepes, pH 7,4 que contenía 0,15 M de NaCl, 3mM de EDTA y P20 al 0,005 %. Las diluciones posteriores se hicieron en el mismo tampón. Todos los experimentos de unión se llevaron a cabo a 25 °C con concentraciones de IgG típicamente que variaban de 50 a 0,2 nM a una velocidad de flujo de 50 pl/min.
Los datos se recogieron durante aproximadamente 12 min (2 min de tiempo de asociación y 10 min de tiempo de disociación) e impulso de 1 min a 30 gl/min de 1M de NaCI, se usaron 50 mM de NaOH para regenerar la superficie. Las IgG también se hicieron fluir sobre una célula no revestida y los sensogramas de las pasadas en blanco se restaron de los obtenidos con los chips acoplados a EphA2-Fc. Los datos se ajustaron a un modelo de unión 1:1 Langmuir con deriva del valor inicial. Este algoritmo calcula la kon y la koff, a partir de las cuales se deduce la constante de disociación en equilibrio aparente Kd, como la relación entre las dos constantes de velocidad (koff/kon). Los valores obtenidos se indican en la Tabla I.
La constante de afinidad se midió primero con hu2H11 y hu2H11R35R74 no conjugados. El análisis de los datos de unión de hu2H11 a EphA2-Fc proporcionan una Kd de 0,30 nM; este valor fue similar a la Kd de hu2H11R35R74 (0,22 nM). Sin embargo, cuando se usaron anticuerpos conjugados en el ensayo, los resultados fueron considerablemente diferentes: el hu2H11 conjugado con una relación entre fármaco y anticuerpo alta tal como 7,5 exhibió una Kd aumentada 5,4 veces, cuando se comparó con el anticuerpo no conjugado (1,62 nM con respecto a 0,30 nM). Por otro lado, la Kd de hu2H11R35R74 conjugado con una relación entre fármaco y anticuerpo de 7,4 no fue diferente de la del anticuerpo no conjugado (0,27 nM con respecto a 0,22 nM). Además, la Kd no fue significativamente diferente para las relaciones entre fármaco y anticuerpo de 5,6 a 8,4.
Concluimos que la afinidad del anticuerpo 2H11R35R74 no se ve afectada por la conjugación, incluso a relaciones entre fármaco y anticuerpo altas.
Ejemplo 4
Inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan EphA2 mediante 2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4 humanizado
Inhibición de células tumorales Lovo
Se colocaron en placas células tumorales Lovo (2000 por pocillo) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos en medios que contenían suero completos. Los conjugados diluyeron en serie y se agregaron a pocillos por triplicado a concentraciones que variaban entre 10-7 y 10-12 M. Las células se cultivaron a 37 °C/CO2 al 5 % en presencia de los conjugados de anticuerpo-compuesto citotóxico durante 5 días, después de este tiempo se llevó a cabo un ensayo de 4 h WST8 según las instrucciones del fabricante (Dojindo Cell Counting Kit-8, n.° de cat. CK04) para evaluar la supervivencia y el crecimiento celular. Las muestras en blanco con reactivos sin células se restaron de las lecturas de los pocillos de prueba y los datos se graficaron como fracciones de supervivencia obtenidas al dividir las lecturas de las células tratadas con conjugado entre el promedio de lecturas de los pocillos testigo de células tratadas con vehículo.
La potencia citotóxica de dos lotes de hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4 a relaciones altas de maitansina/anticuerpo (6,70 D/A y 7,00 D/A) se compararon con la de un conjugado de hu2H11 natural-PEG4-Mal-DM4 que tenía una relación entre maitansina/anticuerpo comparable (6,99 D/A). Como puede observarse en la Figura 7, los dos conjugados hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4 exhibieron potencia más alta que el conjugado correspondiente del hu2H11 natural contra la línea celular Lovo positiva para EphA2 (Tabla II).
Ejemplo 5
Inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan EphA2 mediante 2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 humanizado
Inhibición del crecimiento de MDA-MB231 y SKMEL28
Las células en fase exponencial de crecimiento se tripsinizaron y resuspendieron en su respectivo medio de cultivo (DMEM/F12 Gibco n.° 21331; SVF al 10 % Gibco n.° 10500-056; 2nM de Glutamina Gibco n.° 25030 para las células MDA-MB231; DMEM (Gibco n.° 11960) SVF al 10 % Gibco n.° 10500-056; 2nM de Glutamina Gibco n.° 25030 para las células SKMEL-28). La suspensión celular se distribuyó en placas de cultivo de 96 pocillos Cytostar (GE Healthcare Europe, n.° RPNQ0163) en medios que contenían suero completos a una densidad de 5000 células/pocillo (MDA-MB231, SKMEL-28). Después de revestimiento durante 4 horas, se agregaron diluciones en serie de los conjugados a pocillos por triplicado a concentraciones que variaban entre 10-7 y 10-12 M. Las células se cultivaron a 37 °C/CO2 al 5 % en presencia de los conjugados de anticuerpo-compuesto citotóxico durante 3 días. El 4° día, se agregaron 10 gl de una disolución de 14C timidina (0,1 gCi/pocillo (Perkin Elmer n.° NEC56825000) a cada pocillo. La captación de 14C timidina se midió 96 horas después del inicio del experimento con un contador radioactivo microbeta (Perkin Elmer). Las muestras en blanco con reactivos sin células se restaron de las lecturas de los pocillos de prueba y los datos se graficaron como fracciones de supervivencia obtenidas al dividir las lecturas de las células tratadas con conjugado entre el promedio de lecturas de los pocillos testigo de células tratadas con vehículo. En algunos experimentos, se agregó anticuerpo no conjugado (2H11 o 2H11R35R74) a los pocillos a una concentración de 1 gM en el inicio del experimento y se midió la inhibición de la proliferación como se describió anteriormente.
Resultados
Los resultados que se indican en la tabla III sugiere que 2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4, así como los conjugados 2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4 son mejores que los conjugados anteriores en relación con la inhibición de la proliferación in vitro de las células MDA-MB231 y la selectividad in vitro contra células menos antígeno (SKMEL-28) Ejemplo 6
Estudio de farmacocinética
El presente estudio se diseñó para evaluar el comportamiento farmacocinético del conjugado hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 (DAR = 5,5) en comparación con el conjugado hu2H11-SPDB-DM4 (DAR = 3,9) en ratones CD-1. Los animales recibieron 20 mg/kg mediante vía IV de cada conjugado y se recogió sangre después de 0, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 504, 672 h de la inyección. Se midieron los niveles en plasma de los conjugados de anticuerpo y fárma
estándares. Las concentraciones en plasma de los conjugados y su componente de anticuerpo (anticuerpo total, una suma del anticuerpo conjugado y todo anticuerpo desconjugado) se midieron mediante técnicas ELISA específicas. Los parámetros farmacocinéticos relacionados con el aclaramiento para el componente de anticuerpo de hu2H11-SPDB-DM4 (total) se calcularon como Cl (aclaramiento) de 0,00043 L/h/kg, T1/2 (semivida terminal) de 160 h, AUC 0-inf (área debajo de las curvas de concentración-tiempo desde el tiempo cero hasta infinito) de 47000000 ng.h/mL, Vdss (volumen de distribución en estado estacionario) de 0,095 L/kg y C0 (concentración en tiempo 0) de 270000 ng/mL.
Los parámetros farmacocinéticos para el conjugado hu2H11-SPDB-DM4 se calcularon como Cl de 0,00070 L/h/kg, T1/2 de 87 h, AUC 0-inf de 28000000 ng.h/mL, Vdss de 0,080 L/kg y C0 de 360000 ng/mL.
Los parámetros PK para el componente de anticuerpo de hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 (total) fueron Cl de 0,00027 L/h/kg, T1/2 de 190 h, AUC 0-inf de 73000000 ng.h/mL, Vdss de 0,068 L/kg y C0 de 530000 ng/mL.
Finalmente, el conjugado hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 exhibió los valores: 0,00036 L/h/kg para aclaramiento, T1/2 de 150 h, AUC 0-inf de 56000000 ng.h/mL, Vdss de 0,069 L/kg y C0 de 600000 ng/mL.
En conclusión, el conjugado hu2H11-SPDB-DM4 se aclara más rápidamente que hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4. Además, en comparación con hu2H11-SPDB-DM4, hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 exhibió una exposición mejor (AUC 0-inf) y una separación más estrecha entre las curvas de anticuerpo total conjugado y anticuerpo total (comparar las Figuras 7 y 8).
Ejemplo 7
Efecto antitumoral del conjugado hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 y hu2H11-PEG4-NHAc-DM4 contra un tumor de colon primario, CR-LRB-004P implantado en ratones SCID hembra
Materiales y métodos
Para la evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados, los animales se pesaron a diario y los tumores se midieron de 2 veces por semana mediante calibre. Los pesos tumorales se calcularon usando la fórmula masa (mg) = [longitud (mm) x ancho (mm)2]/2. La evaluación de la actividad antitumoral se hizo a la dosis no tóxica más alta (HNTD, por sus siglas en inglés).
Una dosificación que producía una pérdida de peso corporal (bwl, por sus siglas en inglés) de 20 % en el nadir (media de grupo) o 10 % o más muertes por fármaco, se consideró una dosificación excesivamente tóxica. Los pesos corporales de los animales incluían los pesos tumorales. Los criterios de valoración de la eficacia primaria son □ΔT/ΔC, porcentaje de mediana de regresión, regresiones parciales y completas (PR y CR, por sus siglas en inglés) y sobrevivientes sin tumor (TFS, por sus siglas en inglés).
Los cambios en el volumen del tumor de cada tumor para cada tratado (T) y testigo (C) se calcularon al restar el volumen del tumor en el día del primer tratamiento (día de estadificación) del volumen del tumor en el día de la observación especificado. La mediana AT se calcula para el grupo tratado y la mediana AC se calcula para el grupo testigo. A continuación, se calcula la relación ΔT/ΔC y se expresa como un porcentaje:
% ΔT/ΔC = - m -- e -- d - i - a - n -- a - (T -- t - 70 )
mediana(Ct - --- C--0-)- X100
La dosis se considera terapéuticamente activa cuando ΔT/ΔC es menor que 40 % y muy activa cuando ΔT/ΔC es menor que 10 %. Si la ΔT/ΔC es menor que 0, la dosis se considera altamente activa y se registra la fecha del porcentaje de regresión (ref 1):
% de regresión tumoral: se define como el % de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado en un día de observación especificado en comparación con su volumen en el primer día del primer tratamiento.
En un punto de tiempo específico y para cada animal, se calcula el % de regresión. A continuación, se calcula la mediana del % de regresión para el grupo.
volumen,,-volumen,
% de regresión (a t) ----------------------------- xlOO
volumen
Regresión parcial (PR): Las regresiones se definen como parciales si el volumen tumoral disminuye hasta el 50 % del volumen tumoral en el inicio del tratamiento.
Regresión completa (CR): La regresión completa se alcanza cuando el volumen tumoral = 0 mm3 (se considera CR cuando el volumen tumoral no se puede registrar).
TFS: Sin tumor se define como los animales con tumores indetectables al finalizar el estudio (>100 días después del último tratamiento)
Resultados
El efecto antitumoral del conjugado hu2H11-PEG4-NHAc-DM4 y hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 se evaluó a 2 niveles de dosis contra un tumor de colon primario, CR-LRB-004P, que expresa intensamente la diana, implantado S.C. en ratones SCID hembra. El grupo testigo se dejó sin tratar. Las dosis se expresaron en milígramos de proteína por kilogramo. Se administró hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 a 40 y 10 mg/kg, mediante una inyección de bolo intravenosa (IV), el día 15. Para proporcionar la dosis equivalente de DM4, se administró hu2H11-PEG4-NHAc-DM4 a 44 y 11 mg/kg.
Como se muestra en la Tabla V, usando una pauta de administración simple en el tumor CR-LRB-004P, hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 fue activo a 40 y 10 mg/kg con una ΔT/ΔC de 28 y 39 % respectivamente, mientras que hu2H11-PEG4-NHAc-DM4 fue activo solo a 44 mg/kg con una ΔT/ΔC de 26 %. A 10 mg/kg, hu2H11-PEG4-NHAc-DM4 no fue activo en este modelo.
A partir de estos resultados, el conjugado hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 a una dosis más baja exhibió una actividad mejor que el conjugado hu2H11 -PEG4-NHAc-DM4.
Ejemplo 8
Impacto de la DAR sobre la actividad antitumoral de hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 contra el adenocarcinoma prostático PC-3 en ratones SCID hembra
Se evaluó el efecto de la DAR en la actividad antitumoral del conjugado de anticuerpo y fármaco hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 al comparar dos dosis eficaces bajas a seis relaciones diferentes entre fármaco y anticuerpo (DAR) en tumores prostáticos PC-3 implantados S.C. en SCID hembra. El grupo testigo se dejó sin tratar. Las dosis se expresaron en milígramos de proteína por kilogramo La DAR se determinó mediante un método UV. Se administró hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 a 10 y 5 mg/kg con DAR de 3,4, 4,4, 5,9, 6,2, 7,4 y 8,4, respectivamente, mediante una inyección de bolo intravenosa (IV), el día 16.
Materiales y métodos
Para la evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados, los animales se pesaron a diario y los tumores se midieron de 2 veces por semana mediante calibre. Los pesos tumorales se calcularon usando la fórmula masa (mg) = [longitud (mm) x ancho (mm)2]/2. La evaluación de la actividad antitumoral se hizo a la dosis no tóxica más alta (HNTD, por sus siglas en inglés).
Una dosificación que producía una pérdida de peso corporal (bwl, por sus siglas en inglés) de 20 % en el nadir (media de grupo) o 10 % o más muertes por fármaco, se consideró una dosificación excesivamente tóxica. Los pesos corporales de los animales incluían los pesos tumorales. Los criterios de valoración de la eficacia primaria son □ΔT/ΔC, porcentaje de mediana de regresión, regresiones parciales y completas (PR y CR, por sus siglas en inglés) y sobrevivientes sin tumor (TFS, por sus siglas en inglés).
Los cambios en el volumen del tumor de cada tumor para cada tratado (T) y testigo (C) se calcularon al restar el volumen del tumor en el día del primer tratamiento (día de estadificación) del volumen del tumor en el día de la observación especificado. La mediana AT se calcula para el grupo tratado y la mediana AC se calcula para el grupo testigo. A continuación, se calcula la relación ΔT/ΔC y se expresa como un porcentaje:
% ΔT/ΔC = mecl
media ia
n n
a a
( (
C T
t t
- - C T
0 0
) ) xlOO
La dosis se considera terapéuticamente activa cuando ΔT/ΔC es menor que 40 % y muy activa cuando ΔT/ΔC es menor que 10 %. Si la ΔT/ΔC es menor que 0, la dosis se considera altamente activa y se registra la fecha del porcentaje de regresión (ref 1):
% de regresión tumoral: se define como el % de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado en un día de observación especificado en comparación con su volumen en el primer día del primer tratamiento.
En un punto de tiempo específico y para cada animal, se calcula el % de regresión. A continuación, se calcula la mediana del % de regresión para el grupo.
volumen,,-volumen,
% de regresión (a t) = -------------------------- xlOO
volumen
Regresión parcial (PR): Las regresiones se definen como parciales si el volumen tumoral disminuye hasta el 50 % del volumen tumoral en el inicio del tratamiento.
Regresión completa (CR): La regresión completa se alcanza cuando el volumen tumoral = 0 mm3 (se considera CR cuando el volumen tumoral no se puede registrar).
TFS: Sin tumor se define como los animales con tumores indetectables al finalizar el estudio (>100 días después del último tratamiento)
Resultados
Como se ilustra en la tabla VI, usando una pauto de administración simple, hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 a 10 mg/kg exhibió actividad desde una DAR de 4,4 hasta la DAR más alta de 8,4.
A 5 mg/kg, hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 exhibió actividad desde una DAR de 5,9 hasta la DAR más alta de 8,4.
En conclusión, la DAR tiene un efecto sobre la actividad en el tumor de hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 y se puede deducir a partir de estos resultados que la DAR óptima de hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 es al menos igual a 5,9.
Ejemplo 9
Impacto de la DAR sobre los parámetros PK de hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4.
Se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 a diferentes relaciones fármaco-anticuerpo (DAR) en ratones CD-1 macho después de una administración intravenosa simple de 20 mg/kg de conjugado. Se midieron los niveles en plasma de los conjugados para establecer los parámetros farmacocinéticos de dosis simple básicos en condiciones estándares. Los parámetros PK se compararon con los del anticuerpo genitor no conjugado. Las concentraciones en plasma de los conjugados y su componente de anticuerpo (anticuerpo total, una suma del anticuerpo conjugado y todo anticuerpo desconjugado) se midieron mediante técnicas ELISA específicas.
Los resultados (véanse las Figures 9A y 9B) muestran una correlación inversa entre los valores de DAR y la exposición a los componentes de anticuerpo totales con valores de AUC 0-inf de 83000000, 61 000000, 48 000 000, 46000000, 41000000 y 27000000 ngh/mL para la DAR de 0, 3,4, 4,3, 5,9, 6,6 y 7,4, respectivamente. De manera similar, existe una correlación inversa entre los valores de DAR y la exposición al conjugado con valores de AUC 0-inf de 39000000, 30000000, 27000000, 29000000 y 20000000 ng h/mL para la DAR de 3,4, 4,3, 5,9, 6,6 y 7,4, respectivamente.
Existe una correlación perfecta entre los valores de DAR y la eliminación del componente de anticuerpo con valores de Cl de 0,00024, 0,00033, 0,00042, 0,00043, 0,00049 y 0,00074 L/h/kg para la DAR de 0, 3,4, 4,3, 5,9, 6,6 y 7,4, respectivamente.
De manera similar, existe una correlación casi perfecta entre los valores de DAR y la eliminación del conjugado con valores de Cl de 0,00051, 0,00066, 0,00075, 0,00069, 0,00099 L/h/kg para la DAR de 3,4, 4,3, 5,9, 6,6 y 7,4, respectivamente.
En conclusión, la DAR tiene un impacto sobre los parámetros PK con una exposición disminuida y una eliminación aumentada cuando aumenta la DAR.
Según los resultados de la evaluación de eficacia y PK, el DAR óptimo se incluirá entre 5,9 y 7,4.
Ejemplo 10
Evaluación de hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 contra el adenocarcinoma prostático PC-3 en ratones SCID hembra
El efecto antitumoral del conjugado de anticuerpo y fármaco hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 se evaluó a 8 niveles de dosis contra un tumor prostático medible PC-3, que expresa intensamente la diana, implantado S.C. en ratones SCID hembra. El grupo testigo se dejó sin tratar. Las dosis se expresan en milígramos de proteína por kilogramo
Se administraron a 160, 120, 80, 40, 20, 10, 5 y 2,5 mg/kg, mediante una inyección de bolo intravenosa (IV) el día 17. Materiales y métodos
Para la evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados, los animales se pesaron a diario y los tumores se midieron de 2 veces por semana mediante calibre. Los pesos tumorales se calcularon usando la fórmula masa (mg) = [longitud (mm) x ancho (mm)2]/2. La evaluación de la actividad antitumoral se hizo a la dosis no tóxica más alta (HNTD, por sus siglas en inglés).
Una dosificación que producía una pérdida de peso corporal (bwl, por sus siglas en inglés) de 20 % en el nadir (media de grupo) o 10 % o más muertes por fármaco, se consideró una dosificación excesivamente tóxica. Los pesos corporales de los animales incluían los pesos tumorales. Los criterios de valoración de la eficacia primaria son □ΔT/ΔC, porcentaje de mediana de regresión, regresiones parciales y completas (PR y CR, por sus siglas en inglés) y sobrevivientes sin tumor (TFS, por sus siglas en inglés).
Los cambios en el volumen del tumor de cada tumor para cada tratado (T) y testigo (C) se calcularon al restar el volumen del tumor en el día del primer tratamiento (día de estadificación) del volumen del tumor en el día de la observación especificado. La mediana AT se calcula para el grupo tratado y la mediana AC se calcula para el grupo testigo. A continuación, se calcula la relación ΔT/ΔC y se expresa como un porcentaje:
Figure imgf000061_0001
La dosis se considera terapéuticamente activa cuando ΔT/ΔC es menor que 40 % y muy activa cuando ΔT/ΔC es menor que 10 %. Si la ΔT/ΔC es menor que 0, la dosis se considera altamente activa y se registra la fecha del porcentaje de regresión (ref 1):
% de regresión tumoral: se define como el % de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado en un día de observación especificado en comparación con su volumen en el primer día del primer tratamiento.
En un punto de tiempo específico y para cada animal, se calcula el % de regresión. A continuación, se calcula la mediana del % de regresión para el grupo.
Figure imgf000061_0002
Regresión parcial (PR): Las regresiones se definen como parciales si el volumen tumoral disminuye hasta el 50 % del volumen tumoral en el inicio del tratamiento.
Regresión completa (CR): La regresión completa se alcanza cuando el volumen tumoral = 0 mm3 (se considera CR cuando el volumen tumoral no se puede registrar).
TFS: Sin tumor se define como los animales con tumores indetectables al finalizar el estudio (>100 días después del último tratamiento)
Resultados
Con una pauta de administración simple, se halló que la dosis de conjugado más alta evaluada (160 mg/kg) era tóxica, indujo pérdida de peso corporal y muertes relacionadas con el fármaco.
Como se ilustra en la tabla VIII a la HNTD (120 mg/kg) y otras dosis más bajas, el compuesto fue altamente activo. Para todas las dosis excepto para 2,5 mg/kg, hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 indujo regresiones parciales y para 120, 80 y 20 mg/kg indujo regresiones completas. Además, el modelo tumoral era caquéxico y la administración del compuesto redujo la pérdida de peso corporal en el nadir en comparación con el testigo
En conclusión, hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 exhibió una actividad alta con una buena dosis-efecto sobre el modelo tumoral prostático PC-3.
Ejemplo 11
Mapeo del epítopo e identificación del parátopo mediante determinación estructural de la estructura de cristal del dominio extracelular del receptor EphA2 en complejo con el fragmento Fab de hu2H11-R35-R74 a resolución 2,1 Á. Material y métodos
Se llevaron a cabo ensayos de cristalización iniciales en el dominio extracelular glucosilado del receptor EphA2-Fc en complejo con el Fab de hu2H11R35-74. Se obtuvieron cristales solo en presencia de tripsina. Estos cristales se analizaron y el mapeo peptídico mostró que contenían el Fab, alguna porción del dominio de extremo N del dominio extracelular de EphA2 y de Fc. Se produjo otro lote de complejo, esta vez usando dominio extracelular aglucosilado del dominio extracelular del receptor EphA2 con etiqueta His terminal, en complejo con el fragmento Fab recombinante de hu2H11 R34-R74-His. Ambas construcciones del receptor EphA2 proporcionan la misma estructura del complejo entre el receptor EphA2 y hu2H11R34-R75.
La región extracelular del receptor EphA2 está compuesta por 4 dominios y se ha demostrado que es muy flexible: el LBD (dominio de unión a ligando), el CRD (dominio rico en cisteína) y dos repeticiones de fibronectina, nFN3 y cFN3. Los diferentes dominios se usaron como modelos de búsqueda para el cálculo del reemplazo molecular ya sea solos o en combinación; también se produjeron y usaron modelos de los dominios variables y constantes de Fab, así como un modelo del Fc (pdb código 11GT) para resolver la estructura de cristal.
Se sometieron a prueba diversas condiciones de cristalización y se usó un conjunto de datos a 2,1 Á recogidos en el ESRF para resolver la estructura del complejo. Nos ha permitido analizar la interfaz entre el dominio extracelular del receptor EphA2 y hu2H11R34-R74.
Aunque la longitud completa de la región extracelular de EphA2 (25-534) estuvo presente inicialmente, los cristales contenían solo los dominios LBD y CRD de la proteína (residuos 25-325 o 327 dependiendo del cristal (aquí se usa una numeración secuencial).
Resultados
Mapeo de epítopos
Figura 10: ilustra el mapeo del epítopo del dominio extracelular del receptor EphA2 para hu2H11R34-R75 (los residuos del epítopo se definen como los residuos que contienen átomos que están a 4 Á de cualquier átomo de los residuos de CDR del fragmento Fab de hu2H11R34-R74).
El epítopo del dominio extracelular del receptor EphA2 cuando se une al fragmento Fab de hu2H11R34-R74 es un epítopo conformacional que incluye los residuos del dominio LBD Gly49, Lys50, Gly51, Asp53, Cys70, Asn71, Val72, Met73, Ser74, Gly75, Gln77, Phe108, Pro109, Gly110, Gly111, Ser113 y Ser114.
Figura 11: muestra los residuos del dominio extracelular del receptor EphA2 que son parte del epítopo (representados en gris oscuro); los residuos en gris claro no son visibles en las estructuras de cristal.
Figura 12 A: representa la estructura general del complejo y la Figura 11B es una ampliación de la parte con las dos mutaciones de introducidas en la posición 35 y 74.
La conjugación de hu2H11 se produce en los residuos lisina superficiales. Dos de estos se mutaron en arginina. Estos dos residuos, R74 de cadena pesada y R35 de cadena ligera se representan en la Figura 12B:
R74 se encuentra próximo a la interfaz, orientado de manera opuesta al dominio extracelular del receptor EphA2 y a aproximadamente 10 Á del dominio extracelular más cercano
R35 es uno de los residuos de parátopo y forma una unión H con Asp53 del dominio extracelular del receptor EphA2. Sería muy probable que un residuo lisina hiciera las mismas interacciones con el antígeno y su conjugación claramente sería nociva para la unión al anticuerpo.
Análisis del parátopo
En la interfaz entre el dominio extracelular del receptor EphA2 y hu2H11R35-R74 no participa todo el bucle de CDR. Como puede observarse en la Figura 12, participan en la unión principalmente las CDR de cadena pesada. Esto sugiere que se pueden introducir cambios en las CDR de hu2H11, particularmente en la cadena ligera, pero no exclusivamente, sin afectar de manera adversa la unión al receptor EphA2. El bucle L3 de la cadena ligera no participa en absoluto en la interfaz, mientras que solo un residuo en el extremo de L1 (Arg35) interactúa con el dominio de extracelular de EphA2. Esto implica que cambios en el bucle L3 no impactarían la unión a EphA2 y que el bucle L1 debería tolerar mutaciones/inserciones de residuos aminoacídicos, siempre que no desestabilicen la conformación y orientación del residuo Arg35.
En el parátopo de hu2H11-R35-R74 para el receptor EphA2 participan los siguientes residuos de la cadena ligera: Arg35 del bucle L1, Tyr54, Arg58 y Asp60 de L2. En la cadena pesada participan los siguientes residuos: Thr30, Ala31, Tyr32 y Tyr33 del bucle H1, Asn52, Tyr54, Asn55 y Phe57 de H2 y Glu99, Phe100, Tyr101, Gly102, Tyr103 y Tyr105 de H3. Se usa un esquema de numeración secuencial para las cadenas ligera y pesada.
Podría ser posible mejorar la afinidad del anticuerpo hu2H11-R35-R74 por el receptor EphA2 usando los datos estructurales y, por ejemplo, la estrategia descrita en Clark et al (Protein Science (2006), 15:949-960) o Lippow et al (Nature Biotech (2007), 10:1171-76).
Bucle H1: podría ser posible crear interacciones adicionales, por ejemplo, con Asp76, mediante mutación sensata de Thr H28.
En las interacciones entre la cadena ligera y el receptor Epha2 no participan residuos. Sin embargo, crear nuevas interacciones probablemente requería inserciones significativas en el bucle L1 o L3.
Las interacciones entre estos bucles y el receptor EphA2 se produce a través de residuos bastante grandes o largos: cualquier cambio en este entorno podría resultar en la pérdida de la afinidad de unión.
Esta estructura de rayos X destaca los residuos de las CDR que se pueden mutar y que esto no afectaría la unión a EphA2.
En las siguientes descripciones, los residuos del parátopo no se deben modificar, a menos que se especifique para conservar la unión al receptor EphA2. También se entiende que las mutaciones en las CDR no afectarían la conformación y orientación de los residuos del parátopo para conservarla unión al receptor EphA2. La numeración de los residuos es secuencial y no sigue las convenciones de Kabbat, según se usan en Al-Lazikani ((1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948). “X” representa “cualquier residuo”, mientras que “-” indica que no se debe hacer ninguna modificación en esta posición.
En la L1 de CDR (SEQ ID °4), excepto D 33 y R35, no hay restricción en la secuencia siempre que la longitud del bucle se conserve y adopte la estructura canónica L1-kappa4 según se describe en J. Mol. Biol. (1992) 227: 799-817, J. Mol. Biol. (1992) 227: 776-798 y en Al-Lazikani et al (mencionado supra). Esto significa que los ángulos de torsión de las uniones peptídicas están dentro del intervalo aceptado definido en la Figura 5 de Al-Lazikani et al (citado supra).
Arg35 se ha mutado para evitar la conjugación en este residuo. Sin embargo, un Lys haría las mismas interacciones con EphA2 y, por lo tanto, se pronostica que el anticuerpo hu2H11 genitor hará la misma interacción con el receptor EphA2 y se unirá con el mismo epítopo del receptor EphA2.
Un Asp es el residuo preferido en la posición 33.
Figure imgf000063_0001
En la L2 de CDR (SEQ ID N°5) ambos Leu podrían reemplazarse por una sustitución conservadora tal como Ile. Val podría reemplazarse por Ile (menos favorable). El primer Ser del bucle se puede reemplazar por cualquier residuo, mientras que el segundo podría reemplazarse por otro residuo hidrófilo/cargado. El residuo Tyr (54) no se debería cambiar.
Figure imgf000064_0001
En la L3 de CDR (SEQ ID N°6) no hay restricción en la secuencia ni longitud del bucle, siempre que adopte la estructura canónica L3-kappa1 según se describe en Al-Lazikani et al (citado supra).
Figure imgf000064_0002
Alrededor de la H1 de CDR (SEQ ID N°1) GYTFTAYY) el primer Thr del bucle (Thr 28) es una posible posición para la maduración de la afinidad.
Figure imgf000064_0003
En la H2 de CDR (SEQ ID N°2) el Phe y el Tyr se pueden reemplazar por cualquier residuo aromático (F/Y/W).
Figure imgf000064_0004
En la H3 de CDR (EFYGYRYFDV) no se debería hacer ningún cambio en este bucle.
Figure imgf000064_0005
Sitio de unión a Ephrin
El anticuerpo hu2H11 muestra actividad funcional: inhibe la unión a ephrin-A1 y la fosforilación inducida por ephrin-A1 de EphA2. Se ha publicado la estructura de los dominios LBD y CRD del receptor EphA2 en complejo con ephrinA1 (PDB código 3MBW). Cuando se superpone esta estructura con la de EphA2 en complejo con el fragmento Fab de hu2H11R35R74, aparece de manera clara que la cadena ligera del fragmento Fab de 2H11R35R74 se superpone con el área de unión de ephrin-A1 en EphA2 y, por lo tanto, confirma la naturaleza competitiva del anticuerpo hu2H11.
Ejemplo 12
Inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan EphA2 mediante conjugados de 2H11R35R74-DM4 humanizados
Las células MDA-MB231 en fase exponencial de crecimiento se tripsinizaron y resuspendieron en medio de cultivo (DMEM/F12 Gibco n.° 21331; SVF al 10 % Gibco n.° 10500-056; 2nM de Glutamina Gibco n.°). La suspensión celular se distribuyó en placas de cultivo de 96 pocillos Cytostar (GE Healthcare Europe, n.° RPNQ0163) en medios que contenían suero completo a una densidad de 5000 células/pocillo. Después de revestimiento durante 4 horas, se agregaron diluciones en serie de los conjugados a pocillos por triplicado a concentraciones que variaban entre 10­ 7 y 10-12 M. Las células se cultivaron a 37 °C/CO2 al 5 % en presencia de los conjugados de anticuerpo-compuesto citotóxico durante 3 días. El 4° día, se agregaron 10 gl de una disolución de 14C timidina (0,1 gCi/pocillo (Perkin Elmer n.° NEC56825000) a cada pocillo. La captación de 14C timidina se midió 96 horas después del inicio del experimento con un contador radioactivo microbeta (Perkin Elmer). Las muestras en blanco con reactivos sin células se restaron de las lecturas de los pocillos de prueba y los datos se graficaron como fracciones de supervivencia obtenidas al dividir las lecturas de las células tratadas con conjugado entre el promedio de lecturas de los pocillos testigo de células tratadas con vehículo. En algunos experimentos, se agregó anticuerpo no conjugado (2H11 o 2H11R35R74) a los pocillos a una concentración de 1 gM en el inicio del experimento y se midió la inhibición de la proliferación como se describió anteriormente.
Resultados
Los resultados que se indican en la tabla IX sugieren que todos los conjugados de 2H11R35R74 DM4 evaluados son tan potentes como hu2H11 R35R74-Peg4-AcNH-DM4 para inhibir el crecimiento de células MDA-MB231.
Ejemplo 13
Evaluación de diferentes enlazadores sobre la actividad antitumoral de conjugados de 2h11-DM4 contra adenocarcinoma de colon Lovo en ratones SCID hembra
Materiales y métodos
Para la evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados, los animales se pesaron a diario y los tumores se midieron de 2 veces por semana mediante calibre. Los pesos tumorales se calcularon usando la fórmula masa (mg) = [longitud (mm) x ancho (mm)2]/2. La evaluación de la actividad antitumoral se hizo a la dosis no tóxica más alta (HNTD, por sus siglas en inglés).
Una dosificación que producía una pérdida de peso corporal (bwl, por sus siglas en inglés) de 20 % en el nadir (media de grupo) o 10 % o más muertes por fármaco, se consideró una dosificación excesivamente tóxica. Los pesos corporales de los animales incluían los pesos tumorales. Los criterios de valoración de la eficacia primaria son □ΔT/ΔC, porcentaje de mediana de regresión, regresiones parciales y completas (PR y CR, por sus siglas en inglés) y sobrevivientes sin tumor (TFS, por sus siglas en inglés).
Los cambios en el volumen del tumor de cada tumor para cada tratado (T) y testigo (C) se calcularon al restar el volumen del tumor en el día del primer tratamiento (día de estadificación) del volumen del tumor en el día de la observación especificado. La mediana ΔT se calcula para el grupo tratado y la mediana ΔC se calcula para el grupo testigo. A continuación, se calcula la relación ΔT/ΔC y se expresa como un porcentaje:
Figure imgf000065_0001
La dosis se considera terapéuticamente activa cuando ΔT/ΔC es menor que 40 % y muy activa cuando ΔT/ΔC es menor que 10 %. Si la ΔT/ΔC es menor que 0, la dosis se considera altamente activa y se registra la fecha del porcentaje de regresión (ref 1):
% de regresión tumoral: se define como el % de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado en un día de observación especificado en comparación con su volumen en el primer día del primer tratamiento.
En un punto de tiempo específico y para cada animal, se calcula el % de regresión. A continuación, se calcula la mediana del % de regresión para el grupo.
Figure imgf000065_0002
Regresión parcial (PR): Las regresiones se definen como parciales si el volumen tumoral disminuye hasta el 50 % del volumen tumoral en el inicio del tratamiento.
Regresión completa (CR): La regresión completa se alcanza cuando el volumen tumoral = 0 mm3 (se considera CR cuando el volumen tumoral no se puede registrar).
TFS: Sin tumor se define como los animales con tumores indetectables al finalizar el estudio (>100 días después del último tratamiento)
Resultados
La actividad antitumoral de los conjugados de anticuerpo y fármaco 2h11-DM4 con diferentes enlazadores no escindibles hu2H11 -R35R74-PEG4-AcNH-DM4, hu2H11 -R35R74-PEG8-AcNH-DM4, hu2H11-R35R74-PEG4-AcNMe-DM4, hu2H11-R35R74-PEG4-Allyl-DM4 y hu2H11-R35R74-Acetilo-DM4 se evaluó al comparar la misma dosis de 600 pg de DM4/kg en tumores de colon Lovo implantados S.C. en SCID hembra. El grupo testigo se dejó sin tratar. Las dosis se expresaron en microgramos de DM4 por kilogramo. Los conjugados de administraron mediante una inyección de bolo intravenosa (IV) el día 14.
Como se ilustra en la Tabla X, usando una pauta de administración simple, los cinco conjugados exhibieron la misma actividad alta sobre el modelo de tumor Lovo con una ΔT/ΔC <0 y el mismo impacto sobre la pérdida de peso corporal (-13,3 % en el grupo testigo frente a -9,5 % a 11,2 % para los grupos tratados). El hu2H11-R35R74-PEG4-AcNH-DM4 exhibió la mejor eficacia con una regresión tumoral de 82 % y 1CR en comparación con regresiones tumorales de 72 %, 69 %, 41 % y 33 % sin CR para hu2H11-R35R74-PEG4-AcNMe-DM4, hu2H11-R35R74-Acetilo-DM4, hu2H11 -R35R74-PEG4-Allyl-DM4 y hu2H11 -R35R74-PEG8-AcNH-DM4, respectivamente.
TABLAS
Tabla I: Análisis Biacore de la unión de hu2H11R35R74 y conjugados de este a EphA2
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000066_0001
Tabla II: Actividad citotóxica de hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4 en células Lovo
Figure imgf000066_0003
Tabla III: Citotoxicidad de hu2H11R35R74 y conjugados de este en células MDA MB231 y células SKMEL-28
Figure imgf000067_0001
Tabla IV: Parámetros farmacocinéticos de conjugados tras una administración intravenosa simple de 20 mg/kg de hu2H11-SPDB-DM4 y hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 en tampón HGS a ratones CD-1. Los valores se determinaron a partir de las concentraciones en plasma medias
Figure imgf000067_0002
Figure imgf000067_0003
Tabla V: Evaluación de la actividad antitumoral del conjugado hu2H11- PEG4-NHAc -DM4 y el conjugado hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 contra tumor de colon humano avanzado en ratones SCID hembra.
Figure imgf000067_0004
Figure imgf000068_0001
Tabla VI - Evaluación de la actividad antitumoral del conjugado hu2H11 R35R74-PEG4-NHAc-DM4 a diferentes DAR contra el adenocarcinoma prostético humano avanzado PC-3 en ratones SCID hembra
Figure imgf000068_0002
Figure imgf000069_0001
Tabla VIII - Evaluación de la actividad antitumoral del conjugado hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4 contra el adenocarcinoma prostético humano avanzado PC-3 en ratones SCID hembra.
Figure imgf000069_0002
Figure imgf000070_0001
Tabla IX: Citotoxicidad de hu2H11R35R74 y conjugados de hu2H11R35R74 y DM4 en células MDA MB231
Figure imgf000070_0002
Tabla X: Evaluación de la actividad antitumoral del conjugado hu2H11-R35R74-DM4 con diferentes enlazadores no escindibles contra adenocarcinoma de colon humano avanzado Lovo en ratones SCID hembra.
Figure imgf000070_0003

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este que se une específicamente a un receptor EphA2 y comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera,
en donde dicha cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 12, y en donde dicha cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 14.
2. Un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este según la reivindicación 1, en donde dicha cadena pesada consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, y en donde dicha cadena ligera consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.
3. Un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este según la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a epítopo de este es un anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este humanizado o acondicionado:
4. Un conjugado de un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo según las reivindicaciones 1-3,
en donde dicho conjugado comprende un agente citotóxico elegido entre:
a) el maitansinoide de fórmula (XIII):
Figure imgf000090_0001
b) el maitansinoide de fórmula (XIV):
Figure imgf000090_0002
c) el maitansinoide de fórmula (XXIV):
Figure imgf000091_0002
d) el maitansinoide de fórmula (XXV):
Figure imgf000091_0001
e) el maitansinoide de fórmula (XXVI):
Figure imgf000092_0001
f) el maitansinoide de fórmula (XXVI):
Figure imgf000092_0002
5. Un conjugado según la reivindicación 4, en donde dicho agente citotóxico se une covalentemente al anticuerpo.
6. Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde el agente citotóxico es el maitansinoide de fórmula (XiII).
7. Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, dicho conjugado tiene una estructura elegida entre las estructuras de la fórmula (XV):
Figure imgf000093_0001
y de la fórmula (XVI):
Figure imgf000093_0002
en donde Ab es un anticuerpo según las reivindicaciones 1-3 y n es un número entero comprendido entre 1 y 15.
8. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 7, en donde n está comprendido entre 4 y 7.
9. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 8 que tiene la estructura de fórmula (XV).
10. Un método para preparar un conjugado que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una disolución acuosa, opcionalmente tamponada, de un agente de unión a célula con una disolución de un compuesto citotóxico;
(ii) después, separar opcionalmente el conjugado que se formó en (i) de los reactivos que no hicieron reacción y cualquier aglomerado que pueda estar presente en la disolución;
en donde el agente de unión a célula es un anticuerpo según las reivindicaciones 1-3, y un agente citotóxico elegido entre:
el compuesto de fórmula (XVII):
Figure imgf000094_0001
en donde Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno; y el compuesto de fórmula (XVIII):
Figure imgf000094_0002
en donde Y es N-succinimidiloxi, N-sulfosuccinimidiloxi, N-ftalimidiloxi, N-sulfoftalimidiloxi, 2-nitrofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, 2,4-dinitrofeniloxi, 3-sulfonil-4-nitrofeniloxi, 3-carboxi-4-nitrofeniloxi, imidazolilo o átomo de halógeno.
11. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Un anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, para su uso como un medicamento.
13. El uso de anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, para producir un medicamento para tratar el cáncer.
14. El uso de la reivindicación 13, en donde el cáncer se elige entre carcinoma, incluidos los de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides y piel; incluido el carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluida, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluidas leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, incluidos melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluidos astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; u otros tumores, incluido melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma.
15. Un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este según las reivindicaciones 1-3, en donde el parátopo de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a epítopo de este comprende en la cadena ligera: Arg35 del bucle L1, Tyr54, Arg58 y Asp60 de L2.
16. Un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este según las reivindicaciones 1-3, en donde el parátopo de dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a epítopo de este comprende en la cadena pesada: Thr30, Ala31, Tyr32 y Tyr33 del bucle H1, Asn52, Tyr54, Asn55 y Phe57 de H2 y Glu99, Phe100, Tyr101, Gly102, Tyr103 y Tyr105 de H3.
17. Un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este según las reivindicaciones 1-3, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a epítopo de este comprende una mutación en la posición: Thr H28.
18. Un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo de este según las reivindicaciones 1 a 3, que une específicamente a un epítopo del receptor EphA2 humano que comprende los residuos Gly49, Lys50, Gly51, Asp53, Cys70, Asn71, Val72, Met73, Ser74, Gly75, Gln77, Phe108, Pro109, Gly110, Gly111, Ser113 y Ser114 del LBD del dominio extracelular del receptor EphA2 o una forma conservadoramente sustituida de estos.
19. Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9 que tiene una DAR promedio mayor que 4, la DAR se mide con un espectrofotómetro de UV y se determina mediante la siguiente ecuación
DAR = CD / CA
con:
Figure imgf000095_0001
A252 y A280 como las absorbancias del conjugado medidas en un espectrofotómetro de UV a 252 y 280 nm, respectivamente.
20. Un conjugado según la reivindicación 19 que tiene una DAR promedio comprendida entre 4 y 10 o 5 y 8.
21. Un conjugado según la reivindicación 20 que tiene una DAR promedio comprendida entre 5,9 y 7,5.
22. Un artículo de fabricación que comprende:
- a) un material de envasado
- b) un anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-9 y 21 a 23, y
- c) una etiqueta o prospecto del envase contenido dentro de dicho material de envasado que indica que dicho anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este es eficaz para tratar el cáncer.
23. El anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, para su uso en el tratamiento del cáncer.
24. El anticuerpo o fragmento de unión a epítopo de este, o el conjugado para su uso según la reivindicación 23, caracterizado porque dicho cáncer se elige entre carcinoma, incluidos los de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides y piel; incluido el carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluida, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluidas leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, incluidos melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluidos astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; u otros tumores, incluido melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma.
ES10765689T 2009-10-02 2010-09-30 Anticuerpos que se unen específicamente al receptor EphA2 Active ES2716812T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09305938 2009-10-02
PCT/IB2010/054422 WO2011039724A1 (en) 2009-10-02 2010-09-30 Antibodies that specifically bind to the epha2 receptor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2716812T3 true ES2716812T3 (es) 2019-06-17

Family

ID=41557445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10765689T Active ES2716812T3 (es) 2009-10-02 2010-09-30 Anticuerpos que se unen específicamente al receptor EphA2

Country Status (26)

Country Link
US (2) US8668910B2 (es)
EP (1) EP2483312B1 (es)
JP (1) JP5943837B2 (es)
KR (1) KR101746882B1 (es)
CN (1) CN102791737B (es)
AR (1) AR078470A1 (es)
AU (1) AU2010302250B2 (es)
BR (1) BR112012007205A2 (es)
CA (1) CA2776022A1 (es)
CL (1) CL2012000824A1 (es)
CR (1) CR20120148A (es)
EA (1) EA201270491A1 (es)
EC (1) ECSP12011757A (es)
ES (1) ES2716812T3 (es)
HN (1) HN2012000643A (es)
IL (1) IL218940A (es)
MA (1) MA33701B1 (es)
MX (1) MX2012003996A (es)
NI (1) NI201200052A (es)
NZ (1) NZ599140A (es)
PE (1) PE20121563A1 (es)
TN (1) TN2012000130A1 (es)
TW (1) TW201116297A (es)
UY (1) UY32914A (es)
WO (1) WO2011039724A1 (es)
ZA (1) ZA201202329B (es)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1928503B1 (en) 2005-08-24 2012-10-03 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
MX2009000709A (es) 2006-07-18 2009-02-04 Sanofi Aventis Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer.
PL2437790T3 (pl) 2009-06-03 2019-09-30 Immunogen, Inc. Sposoby sprzęgania
UY32914A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Anticuerpos que se usan específicamente al receptor epha2
TW201117814A (en) * 2009-10-02 2011-06-01 Sanofi Aventis New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
KR20220123130A (ko) 2011-03-29 2022-09-05 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
SG11201502429YA (en) * 2012-10-04 2015-04-29 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
CN104688740A (zh) * 2012-12-21 2015-06-10 百奥泰生物科技(广州)有限公司 类美登素衍生物及其制备方法和用途
KR102252925B1 (ko) 2013-08-26 2021-05-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 마크롤라이드 디아스테레오머를 포함하는 약제학적 조성물, 이의 합성 방법 및 치료학적 용도
CN105793268B (zh) * 2013-12-02 2019-03-15 香港浸会大学 具有两个稠合大环的抗癌性美登木素类化合物
SG11201609917PA (en) 2014-05-29 2016-12-29 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
CA2958882A1 (en) * 2014-09-02 2016-03-10 Immunogen, Inc. Methods for formulating antibody drug conjugate compositions
US10829558B2 (en) 2014-10-24 2020-11-10 Research Corporation Technologies, Inc. Small antibody-like polypeptides that bind to EPHA2 receptor
EP3220959A1 (en) 2014-11-19 2017-09-27 ImmunoGen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
CN106188293A (zh) * 2015-04-17 2016-12-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗c-Met抗体和抗c-Met抗体-细胞毒性药物偶联物及其医药用途
KR101636882B1 (ko) * 2015-06-25 2016-07-06 전남대학교 산학협력단 인간 피브로넥틴 도메인 Ⅲ 기본 골격의 신규 인간 ＥｐｈＡ2 특이적 결합 단백질 및 그의 용도
TWI714661B (zh) 2015-11-05 2021-01-01 法商賽諾菲公司 新穎念珠藻素化合物及接合物、其製備與其治療用途
RU2018130108A (ru) 2016-02-05 2020-03-06 Иммуноджен, Инк. Эффективный способ получения конъюгатов связывающийся с клеткой агент цитотоксический агент
AU2018265333C1 (en) 2017-05-10 2023-08-17 Sanofi Peptidic linkers and cryptophycin conjugates, useful in therapy, and their preparation
AU2018285412B2 (en) * 2017-06-14 2022-06-23 Universität Zürich Cyclic peptides for protection against respiratory syncytial virus
EP3489684B1 (en) * 2017-11-27 2024-06-26 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for photobleaching stained cells
EP3828206A4 (en) 2018-07-25 2022-04-20 Daiichi Sankyo Company, Limited METHOD OF PREPARING AN ANTIBODY DRUG CONJUGATE
JP2024536382A (ja) 2021-10-07 2024-10-04 サノフイ イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン化合物及びそのコンジュゲート、それらの調製並びにそれらの治療用途
KR20240073177A (ko) * 2022-11-10 2024-05-24 전남대학교산학협력단 다중에피토프 펩타이드를 포함하는 신경교종 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2429001A (en) 1946-12-28 1947-10-14 Axel H Stone Artificial hand
FR1516743A (fr) 1966-04-01 1968-02-05 Rhone Poulenc Sa Nouvel antibiotique et son procédé de préparation par culture de streptomyces croceus
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
KR900700134A (ko) 1988-04-15 1990-08-11 원본미기재 Il-2 수용체-특이적 키메릭 항체
WO1989009825A1 (en) 1988-04-16 1989-10-19 Celltech Limited Method for producing recombinant dna proteins
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
FR2706228B1 (fr) 1993-06-08 1995-08-11 Salmson Pompes Procédé et dispositif de régulation de l'alimentation d'un moteur électrique asynchrone.
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
EP1231268B1 (en) 1994-01-31 2005-07-27 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP1709970A1 (en) 1995-04-27 2006-10-11 Abgenix, Inc. Human antibodies against EGFR, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5882644A (en) 1996-03-22 1999-03-16 Protein Design Labs, Inc. Monoclonal antibodies specific for the platelet derived growth factor β receptor and methods of use thereof
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
TR199902553T2 (xx) 1997-04-14 2000-03-21 Micromet Gesellschaft F�R Biomedizinische Forschung Mbh �nsan v�cuduna kar�� antijen resept�rlerinin �retimi i�in yeni metod ve kullan�mlar�.
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2244210T3 (es) 1998-08-27 2005-12-01 Spirogen Limited Pirrolobenzodiazepinas.
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
WO2001012172A1 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Purdue Research Foundation Treatment of metastatic disease
WO2001038318A1 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7101976B1 (en) 2000-09-12 2006-09-05 Purdue Research Foundation EphA2 monoclonal antibodies and methods of making and using same
EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
EP1519956B1 (en) 2002-05-10 2011-09-21 Medimmune, Inc. Epha2 monoclonal antibodies and methods of use thereof
US20040091486A1 (en) 2002-05-10 2004-05-13 Kinch Michael S. EphA2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
AU2004230539A1 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Medimmune, Llc EphA2, hypoproliferative cell disorders and epithelial and endothelial reconstitution
JP4838720B2 (ja) 2003-05-13 2011-12-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 転移および転移がもたらす骨格関連現象を調節する方法
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
WO2005035741A1 (ja) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ゲノムが改変された細胞
ATE516288T1 (de) 2003-10-22 2011-07-15 Us Gov Health & Human Serv Pyrrolobenzodiazepinderivate, zusammensetzungen, die diese enthalten, und damit in zusammenhang stehende verfahren
JP5166861B2 (ja) 2004-03-09 2013-03-21 スピロゲン リミティッド ピロロベンゾジアゼピン
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US7541330B2 (en) 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
SI2471813T1 (sl) 2004-07-15 2015-03-31 Xencor, Inc. Optimirane Fc variante
US20060223147A1 (en) 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
US7659374B2 (en) 2004-08-16 2010-02-09 Medimmune, Llc Eph receptor Fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
WO2006047637A1 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune, Inc. Use of modulators of epha2 and ephrina1 for the treatment and prevention of infections
WO2006084226A2 (en) 2005-02-04 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to epha2 and methods of use thereof
AU2006230413B8 (en) 2005-03-31 2011-01-20 Xencor, Inc Fc variants with optimized properties
KR20080080482A (ko) 2005-09-07 2008-09-04 메디뮨 엘엘씨 독소가 컨쥬게이트된 ｅｐｈ 수용체 항체
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
EP1862178A1 (en) 2005-12-07 2007-12-05 Université de Mons-Hainaut Use of HLTF antibodies for diagnosis and treatment of cancer
RS52060B (en) 2006-01-25 2012-04-30 Sanofi CYTOTOXIC AGENTS CONTAINING NEW TOMAIMYCIN DERIVATIVES
EP1832577A1 (en) 2006-03-07 2007-09-12 Sanofi-Aventis Improved prodrugs of CC-1065 analogs
MX2009000709A (es) * 2006-07-18 2009-02-04 Sanofi Aventis Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer.
MX346172B (es) 2007-08-29 2017-03-10 Sanofi - Aventis Anticuerpos anti - cxcr5 humanizados, derivados de los mismos y su uso.
UY32914A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Anticuerpos que se usan específicamente al receptor epha2
TW201117814A (en) * 2009-10-02 2011-06-01 Sanofi Aventis New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody
US11605302B2 (en) 2020-11-10 2023-03-14 Rockwell Collins, Inc. Time-critical obstacle avoidance path planning in uncertain environments

Also Published As

Publication number Publication date
US8668910B2 (en) 2014-03-11
NI201200052A (es) 2012-08-09
TW201116297A (en) 2011-05-16
MX2012003996A (es) 2012-06-27
JP5943837B2 (ja) 2016-07-05
ECSP12011757A (es) 2012-07-31
US20120201828A1 (en) 2012-08-09
CN102791737A (zh) 2012-11-21
TN2012000130A1 (en) 2013-09-19
KR101746882B1 (ko) 2017-06-14
NZ599140A (en) 2014-05-30
PE20121563A1 (es) 2012-11-29
BR112012007205A2 (pt) 2019-09-24
CA2776022A1 (en) 2011-04-07
CN102791737B (zh) 2016-02-24
CL2012000824A1 (es) 2012-08-17
AR078470A1 (es) 2011-11-09
KR20120086299A (ko) 2012-08-02
US20150044197A1 (en) 2015-02-12
AU2010302250B2 (en) 2015-09-17
HN2012000643A (es) 2015-03-09
EP2483312A1 (en) 2012-08-08
EA201270491A1 (ru) 2012-11-30
EP2483312B1 (en) 2018-12-19
AU2010302250A1 (en) 2012-04-19
WO2011039724A1 (en) 2011-04-07
IL218940A (en) 2016-08-31
MA33701B1 (fr) 2012-10-01
US9676864B2 (en) 2017-06-13
IL218940A0 (en) 2012-07-31
UY32914A (es) 2011-04-29
ZA201202329B (en) 2013-06-26
JP2013506654A (ja) 2013-02-28
CR20120148A (es) 2012-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2716812T3 (es) Anticuerpos que se unen específicamente al receptor EphA2
US11897961B2 (en) Anti-CD123 antibodies and conjugates and derivatives thereof
AU2019272250B2 (en) Anti-mesothelin antibody and antibody-drug conjugate thereof
ES2673822T3 (es) Anticuerpo antagonista contra EphA2 para el tratamiento de cáncer
CN110903395A (zh) 抗体、偶联物及其制备方法和用途
BR112016013482B1 (pt) Conjugado de anticorpo anti-her2-fármaco, fármacos antitumor e/ou anticâncer e composição farmacêutica
ES2955886T3 (es) Método y moléculas
BR112021009251A2 (pt) conjugado anticorpo-fármaco, anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, métodos para produção de um anticorpo com glicano remodelado, de um conjugado anticorpo-fármaco, do anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo e para tratamento de um tumor.
CN115515644A (zh) 一种抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
EP4410372A1 (en) Antibody, antibody-drug conjugate thereof and use thereof