CN102791737A - 特异性结合epha2受体的抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及特异性结合EPHA2受体的抗体或其表位结合片段。它进一步涉及包含与抗体共价结合的细胞毒剂的缀合物及用于制备此类缀合物的方法。

Description

特异性结合EPHA2受体的抗体
本发明涉及特异性结合EphA2受体的抗体或其表位结合片段。
它进一步涉及包含与抗体共价结合的细胞毒剂的缀合物及用于制备此类缀合物的方法。
发明背景
癌症是一种以源自异常信号转导的不受控制的增殖为特征的疾病。最危险的癌症形式是恶性细胞，其具有通过经由侵入而直接生长入相邻组织中，或者通过转移而植入远距离部位中，从而扩散的能力。转移细胞已经获得了从原发性肿瘤脱离，经由血流或淋巴系统移位到远距离部位并在远距离的且无关的微环境形成集落的能力。
现在清楚的是，Eph分子牵涉疾病状态诸如癌症。Eph受体是一种在基因组中最大的独特的受体酪氨酸激酶(RTK)家族，其由与8种膜结合肝配蛋白配体相互作用的14种受体组成，分成两组A和B(Pasquale,E.B.等,2005,NatureReviews Mol.Cell Biol.,6:462-475)。Eph受体对其配体的结合诱导受体聚簇，激活激酶活性，随后对酪氨酸残基进行胞质域的反式磷酸化，为许多信号传导蛋白质创建对接位点(docking site)(Kullander，K.和Klein,R.,2002,NatureReviews Mol.Cell Biol.,3:475-486;Noren,N.K.和Pasquale,E.B.,2004,Cellsignal.,16:655-666)。
已经在卵巢、乳腺、前列腺、肺、结肠、食管、肾细胞、宫颈癌和黑素瘤中报告了EphA2受体的过表达。提示了EphA2是恶性细胞的细胞生长和存活的正调节物(Landen,C.N.等,2005,Expert.Opin.Ther.Targets,9(6):1179-1187)。还已经描述了EphA2在癌症中的作用，因为单独的EphA2过表达足以将乳腺上皮细胞转化成恶性表型(Zelinski等,2001,Cancer Res.,61:2301-2306)，而且提高对远距离部位的自发转移(Landen,C.N.等,2005,Expert.Opin.Ther.Targets,9(6):1179-1187)。此外，越来越多的证据提示了EphA2牵涉肿瘤血管生成(Ogawa等,2000,Oncogene,19:6043-6052;Cheng等2002,Mol.Cancer Res.,1:2-11;Cheng等,2003,Neoplasia,5(5):445-456;Dobrzanski等,2004,Cancer Res.,64:910-919)。
已经显示了EphA2的磷酸化与其丰度相关联。酪氨酸磷酸化的EphA2被快速内在化，并且注定要进行降解，而未磷酸化的EphA2被证明翻转(turnover)降低，并且因此在细胞表面积累。目前认为此种模型可以促成癌症中高频率的EphA2过表达(Landen,C.N.等,2005,Expert.Opin.Ther.Targets,9(6):1179-1187)。然而，事实可能更复杂，因为最近的数据似乎指示EphA2激酶依赖性和不依赖性功能在肿瘤进展中的作用(Fang W.B.,2005,Oncogene,24:7859-7868)。
已经开发出激动性抗体，其促进EphA2酪氨酸磷酸化和内在化，最终导致对肿瘤细胞生长的抑制(Dodge-Zantek等,1999,Cell Growth&Differ，10:629-638;WO 01/12172,WO 03/094859,WO 2004/014292,WO 2004/101764,WO 2006/023403,WO 2006/047637,WO 2007/030642)。
申请WO 2006/084226披露了既不提高也不降低EphA2激酶活性，但是能够阻碍肿瘤细胞增殖的抗体。然而，其中没有指示这些抗体阻止肝配蛋白A1结合受体，并且抑制肝配蛋白A1诱导的EphA2磷酸化。WO 2004/092343中已经提出了使用拮抗性抗体，但是其中没有披露实际的抗体。WO 2008/010101中已经描述了作为真实的拮抗剂的识别EphA2的抗体及其人源化变体和缀合物。这些抗体及其衍生物抑制EphA2激酶依赖性肿瘤细胞生长。
然而，仍需要可以在癌症疗法中使用的新的且有效的药物。
发明概述
本发明的一个目的是提供新的药剂，其特异性结合A类Eph受体家族成员，诸如EphA2，并且通过拮抗受体来抑制受体的细胞活性。如此，本发明包括识别EphA2受体，优选地人的，并且发挥所述受体的拮抗剂功能的抗体或其片段。这些抗体缺乏任何激动剂活性。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的具有以SEQ ID NO:1、2、和3代表的氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个连续的具有以SEQID NO:4、5、和6代表的氨基酸序列的互补决定区。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其表位结合片段是人源化的或重修表面的(resurfaced)。在一个甚至更优选的实施方案中，所述抗体或其表位结合片段的重链包含由SEQID NO:12组成的氨基酸序列，且所述抗体或其表位结合片段的轻链包含由SEQ ID NO:14组成的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，所述抗体的重链具有氨基酸序列SEQ ID NO:18，且所述抗体的轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:16。
在另一个实施方案中，所述抗体或其表位结合片段与细胞毒剂缀合。因此，本发明的一个方面提供了本发明的抗体或其表位结合片段的缀合物，其中所述缀合物包含选自下组的结合的细胞毒剂：
式(XIII)的化合物：
式(XIV)的化合物：
Figure BDA00001723216000032
式(XXIV)的化合物：
Figure BDA00001723216000041
式(XXV)的化合物：
Figure BDA00001723216000042
式(XXVI)的化合物：
Figure BDA00001723216000043
和
式(XXVII)的化合物：
Figure BDA00001723216000051
在一个优选的实施方案中，缀合物包含式(XIII)的化合物作为细胞毒剂。在又一个优选的实施方案中，所述缀合物中的每个抗体分子结合的美登木素生物碱类分子的数目(DAR)包括4-7个美登木素生物碱类分子/抗体分子，所述DAR通过用分光光度法测量252nm和280nm的吸光度比率来测定。
在另一方面，提供了一种用于制备缀合物的方法，其包括下列步骤：
(i)使任选缓冲的细胞结合剂水溶液与细胞毒性化合物的溶液接触；
(ii)然后，任选地分开在(i)中形成的缀合物与未反应的试剂和可能存在于溶液中的任何聚集体；
其中所述细胞结合剂是依照权利要求1-3的抗体，而细胞毒剂选自：
式(XVII)的化合物：
Figure BDA00001723216000052
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子；和
式(XVIII)的化合物：
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子。
通过所述方法可获得的缀合物包含在本发明的范围内。特别地，所述缀合物具有选自式(XV)和式(XVI)结构的结构：
其中Ab是依照本发明的抗体，且n是包括在1和15间的整数。在一个优选的实施方案中，n包括在4和7之间。在另一个优选的实施方案中，本发明的缀合物具有式(XV)的结构。
本发明的抗体或其表位结合片段对抗原的亲和力不受缀合方法影响；另一方面，现有技术的细胞毒剂与抗体的缀合导致对EphA2的亲和力降低。本发明的所述抗体或其表位结合片段在与细胞毒剂缀合时更加显示效力，并且在杀死表达EphA2的肿瘤细胞方面比现有技术的缀合物更有效。另外，本发明的缀合物展现出比现有技术的缀合物有利的药代动力学特性，诸如更缓慢的清除、更好的暴露、及缀合物在体内的稳定性升高。此类特性以及高细胞毒性功效和选择性对于开发安全且有效的药物会是特别有用的。
因此，本发明涵盖含有本发明的抗体或其表位结合片段、或其缀合物和药学可接受载体或赋形剂的药物组合物。本发明的抗体或其表位结合片段或其缀合物可以作为药物使用。特别地，可以使用它们来生成治疗癌症的药物。在一个优选的实施方案中，所述癌症选自：癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤；髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、和骨肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、甲状腺滤泡性癌、着色性干皮病、角化棘皮瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤、和神经鞘瘤。
附图简述
图1：mu2H11R35R74的VH和VL及hu2H11R35R74的VH和VL的CDR序列。
图2：使用方法C(实施例1a.1.)得到的hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的HRMS谱
图3：使用方法C(实施例1b.1.)得到的hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4的HRMS谱
图4：对MDA-MB-231细胞中的EphA2磷酸化的动力学分析。WT：野生型未处理的细胞；MW：分子量标志物；P-EphA2：磷酸化的Epha2
图5A和5B：分别在NCI-H1299细胞(5A)和MDA-MB-231细胞(5B)上对肝配蛋白A1/Fc诱导后EphA2磷酸化的抑制；WT：野生型未处理的细胞；MW：分子量标志物；P-EphA2：磷酸化的EphA2。
图6：与hu2H11-PEG4-Mal-DM4相比hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4(小的实心圆圈：DAR=6.7；大的实心圆圈：DAR=7.0)的细胞毒性活性。
图7：在对雄性CD-1小鼠的单剂静脉内施用HGS中的20mg/kg免疫缀合物后hu2H11-SPDB-DM4的均值血浆浓度(n=2)的时距图(半对数比例尺)表示。显示了人IgG(实体菱形)和缀合物级分(空心正方形)的总浓度。
图8：在对雄性CD-1小鼠的单剂静脉内施用HGS中的20mg/kg免疫缀合物后hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的均值血浆浓度(n=2)的时距图(半对数比例尺)表示。显示了人IgG(实体菱形)和缀合物级分(空心正方形)的总浓度。
图9A和9B：多个DAR的hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的PK参数，柱状图表示在对雄性CD-1小鼠(n=4)的单剂静脉内施用HGS中的20mg/kg免疫缀合物后对几种ADC的暴露(AUC(O-inf)；图9A)和清除(CI；图9B)作为DAR的函数。
图10：显示了Fab2H11的EphA2表位的定位。
图11：是EphA2的序列，其中暗灰色的残基是表位的一部分；亮灰色的残基在晶体结构中不可见。
图12A：代表复合物的总体结构，而图12B是具有两处Fab突变的部分的放大。
图13：代表互补位的结构。
图14：hu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4的HRMS谱。
图15：hu2H11R35R74-PEG8-NHAc-DM4的HRMS谱。
图16：hu2H11R35R74-PEG4-Allyl-DM4的HRMS谱。
图17：hu2H11-PEG4-NHAc-DM4的HRMS谱。
发明详述
除非本文中另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的意义。此外，除非上下文另有需要，单数术语应当包括复数，且复数术语应当包括单数。一般地，本文中所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名和技术是那些在本领域中公知的且通常使用的。除非另有指示，本发明的实践采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在下列文献中完整解释，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984);AnimalCell Culture(R.I.Freshney编,1987);Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987及周期性更新);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994);A PracticalGuide to Molecular Cloning(Perbal Bernard V.,1988);Phage Display:ALaboratory Manual(Barbas等,2001)。
依照制造商的规定来实施酶反应和纯化技术，如本领域中通常实现的或如本文中所描述的。本文中所描述的分析化学、合成有机化学、及医学和药学化学结合使用的命名和实验室规程和技术是那些在本领域中公知的并通常使用的。使用用于化学合成、化学分析、药学制备、配制、和投递及患者治疗的标准技术。
本文中提供了新的抗体及其片段，其能够特异性结合EphA2受体，并且拮抗所述受体。具体地，本发明的新抗体或片段特异性结合细胞表面上的Eph受体，但是优先地缺乏任何激动剂活性。另一方面，它们能够抑制受体的细胞功能，即使在存在其配体的情况中。
如本文中所使用的，术语“EphA2受体”指一种酪氨酸激酶，其属于Eph受体家族(综述见Pasquale,E.B.等,2005,Nature Reviews Mol.Cell Biol.,6,462-475)，并且包含例如如在Genbank登录号NM_004431(人EphA2)、NM_010139(鼠EphA2)、或NXM_345596(大鼠EphA2)中的氨基酸序列。人EphA2是优选的EphA2受体。如本文中所使用的，术语“EphA2配体”指结合并且任选地激活EphA2受体(例如，刺激其自身磷酸化)的蛋白质。本文中优选的EphA2配体是“肝配蛋白A1”，其结合EphA2受体，并且包含例如如在Genbank登录号NM_004428(人肝配蛋白A1)中的氨基酸序列。
如本文中所使用的，术语“拮抗剂”指能够抑制靶分子诸如EphA2受体的一种或多种生物学活性的分子。拮抗剂可以通过干扰受体对配体的结合(且反之亦然)，通过降低可以由配体诱导的EphA2磷酸化，和/或通过抑制由此类配体的结合诱导的胞内途径，和/或通过抑制EphA受体的同/异寡聚化起作用。拮抗剂可以完全阻断受体-配体相互作用，或者可以实质性降低此类相互作用。为了本发明的目的，拮抗剂的所有此类干扰的点应当被认为是等同的。如此，包括在本发明范围内的是拮抗剂(例如中和性抗体)，其结合EphA2受体，EphA2配体或EphA2受体和EphA2配体的复合物；EphA2受体或EphA2配体的氨基酸序列变体或衍生物，其拮抗EphA2受体和EphA2配体之间的相互作用；可溶性EphA2受体或可溶性EphA2配体，其任选融合到异源分子例如免疫球蛋白区(例如免疫粘附分子)；复合物，其包含联合EphA2配体的EphA2受体；合成或天然的序列肽，其结合EphA2受体或EphA2配体。在一个优选的实施方案中，拮抗剂是抗体。
如本文中所使用的，术语“激动剂”指能够激活靶分子的一种或者多种生物活性的任何化合物，包括蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、缀合物、大分子、小分子。EphA2激动剂通过刺激蛋白质的磷酸化，由此触发所述蛋白质的降解来起作用。
如此，在一个优选的实施方式中，本发明提供了抗EphA2单克隆抗体、抗EphA2人源化抗体以及抗EphA2抗体的片段等。本发明的每种抗体和抗体片段都被设计成特异性识别并结合EphA2受体，并且充当EphA2受体拮抗剂，其抑制由EphA2配体诱导的磷酸化。
EphA2受体属于如下的受体家族，其细胞质尾部磷酸化在配体结合后升高，以与多种衔接头(adapter)和信号传导蛋白相互作用，这引起激活不同下游细胞信号传导途径(Kullander,K.和Klein,R.,2002,Nature Reviews Mol.Cell Biol.,3:475-486;Noren,N.K.和Pasquale,E.B.,2004,Cell signal.,16:655-666)。如本文中所使用的，术语“EphA2介导的信号传导”指所有如下的细胞事件，其响应EphA2结合配体而发生。虽然现有技术中所披露的抗体激动EphA2受体，特别地提高EphA2蛋白的酪氨酸磷酸化，但是本发明的抗体和抗体片段优先缺乏任何这类激动特性。特别地，它们不能刺激EphA2自身磷酸化。与WO 2008/010101中描述的抗体一样，本发明的拮抗性抗体和抗体片段缺乏缺乏任何激动剂活性。在一个具体的实施方案中，与现有技术(Dodge-Zantek等,1999,Cell Growth&Differ.,10:629-638;WO 01/12172,WO03/094859,WO 2004/014292,WO 2004/101764,WO 2006/023403,WO2006/047637,WO 2007/030642)中所描述的其它抗体不同，它们不能促进EphA2的酪氨酸磷酸化。
本发明提供实际的拮抗性抗EphA2抗体。本发明的抗体和抗体片段具有抑制EphA2受体的细胞功能的能力，即使在存在所述EphA2受体配体，例如肝配蛋白A1的情况中。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体片段可以抑制配体对EphA2受体的结合。在一个优选的实施方案中，由本发明提供的抗体及其片段阻止肝配蛋白A1对EphA2的结合。显著地，在另一个实施方案中，本发明的抗体及抗体片段能够抑制EphA2受体的酪氨酸磷酸化，即使在存在肝配蛋白A1的情况中。
抗体
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且明确覆盖任何同种型诸如IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体和抗体片段。可以通过重组方法诸如选择噬菌体或类似载体中的重组抗体文库，或者通过用抗原或抗原编码核酸免疫动物来生成与特定抗原具反应性的抗体。
典型的抗体包括通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。每条重和轻链含有恒定区和可变区。如本文中所使用的，“VH”或“VH”指抗体免疫球蛋白重链，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的重链的可变区。提及“VL”或“VL”指抗体免疫球蛋白轻链，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的轻链的可变区。每个可变区含有三个称作“互补决定区”(“CDR”)或“高变区”的区段，其主要负责结合抗原的表位。它们通常称为CDR1、CDR2、和CDR3(从N端序贯编号)。可变区中更高度保守的部分称作“框架区”(“FR”)。天然重和轻链的可变域各含有四个FR区，它们大多采取β-片层构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-片层结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR区非常接近地保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(见Kabat等,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD,1991)。
恒定域不直接牵涉抗体对抗原的结合，但是展现出各种效应器功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、经由结合Feγ受体的吞噬、经由新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期清除率和经由补体级联的C1q组分的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可以归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。在轻和重链内，可变和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包含约10个或更多个(10more)氨基酸的“D”区(见例如Fundamental Immunology第7章,Paul,W.编,第2版,Raven Press,N.Y.,1989)。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的，并且一般记载于例如Abbas等(Cellular andMol.Immunology,第4版W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价联合形成的较大融合分子的一部分。
“多克隆抗体”指作为一种或者多种其它不同的抗体之一，或者在存在一种或者多种其它不相同的抗体的情况中生成的抗体。通常，多克隆抗体是在存在生成不同抗体的几种其它B淋巴细胞的情况中自B-淋巴细胞生成的。通常，多克隆抗体是直接自经免疫的动物获得的。
如本文中所使用的，“单克隆抗体”指自基本上同质的抗体群体获得的抗体，即形成此群体的抗体基本上是相同的，除了可能以微小量存在的可能的天然存在的突变外。这些抗体针对单一表位，并且因此是高度特异性的。
出于本文中的目的，“裸抗体(裸露的抗体)”指没有与细胞毒性模块或放射性标记物缀合的抗体。
“表位”指抗原上抗体结合的位点。它可以由连续的残基或者由通过折叠抗原性蛋白质紧密接近的非连续残基形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后得到保留，而在所述暴露下通常丧失由非连续氨基酸形成的表位。
如本文中所使用的，术语“KD”指特定抗体/抗原相互作用的解离常数。“结合亲和力”一般指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如，抗原)间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，如本文中所使用的，“结合亲和力”指反映结合对成员(例如，抗体和抗原)间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力一般可以以KD表示。可以通过本领域中已知的常见方法，包括那些在本文中描述的方法来测量亲和力。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原，而且趋于容易解离，而高亲和力抗体一般较快地结合抗原，而且趋于较长地保持结合。多种测量结合亲和力的方法是本领域中已知的，任何所述方法可以用于本发明的目的。
本发明源于鼠抗EphA2抗体，本文中为mu2H11R35R74，其就轻和重链两者的氨基酸序列、CDR鉴定、表面氨基酸鉴定、和其以重组形式表达的手段而言得到完全表征。
可以例如通过抗体53.2H11的定点诱变来获得本发明的鼠抗体。53.2H11抗体由在布达佩斯条约下于6月16日以保藏号PTA-7662保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤生成，并且记载于PCT申请WO 2008/010101。如此，53.2H11的轻和重链两者的氨基酸序列、CDR的鉴定、表面氨基酸的鉴定、以及编码所述轻和重链的多核苷酸序列均披露于WO 2008/010101。
在本文中公开了抗体mu2H11R35R74轻和重链及其人源化型式的一级氨基酸和DNA序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个CDR的抗体或其表位结合片段，所述CDR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，且所述重链包含三个连续的具有选自SEQ ID NO:1、2、3的氨基酸序列的CDR，且所述轻链包含三个连续的具有选自SEQ ID NO:4、5、6的氨基酸序列的CDR。
在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其表位结合片段的互补位在轻链中包含：环L1的Arg35、L2的Tyr54、Arg58和Asp60。
在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其表位结合片段的互补位包含重链：环H1的Thr30、Ala31、Tyr32和Tyr33、H2的Asn52、Tyr54、Asn55和Phe57，和H3的Glu99、Phe100、Tyr101、Gly102、Tyr103和Tyr105。
所述抗体或其表位结合片段可以包含突变：
在位置：Thr H28处
在轻链上的下列少数位置之一处：35、26至31、34至37、55、56、57、59和94至102，和/或
在重链上的下列少数位置之一处：28、54和57。
在另一个实施方案中，本发明的抗体特异性结合人EphA2受体表位，该人EphA2受体表位包含来自EphA2受体胞外域的LBD的残基Gly49、Lys50、Gly51、Asp53、Cys70、Asn71、Val72、Met73、Ser74、Gly75、Gln77、Phe108、Pro109、Gly110、Gly111、Ser113和Ser114，或其保守取代形式。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含具有由SEQ ID NO 8组成的氨基酸序列的VH。在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含具有由SEQID NO 10组成的氨基酸序列的VL。
人源化或重修表面的2H11R35R74抗体
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”指如下的嵌合抗体，其含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列。如本文中所使用的，“嵌合抗体”是一种如下的抗体，其中将恒定区或其一部分改变、替换或交换，使得可变区与不同物种或者属于另一抗体类或亚类的恒定区连接。“嵌合抗体”还指一种如下的抗体，其中将可变区或其一部分改变、替换或交换，使得恒定区与不同物种或者属于另一抗体类或亚类的可变区连接。
人源化的目的是降低导入人中的异种抗体诸如鼠抗体的免疫原性，同时维持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。可以使用几种技术诸如表面重修和CDR嫁接来生成人源化抗体或适合于不被其它哺乳动物排异的抗体。如本文中所使用的，表面重修技术使用分子建模、统计学分析和诱变的组合来改变抗体可变区的非CDR表面，从而类似于靶宿主的已知抗体的表面。
用于抗体表面重修的策略和方法以及用于降低抗体在不同宿主内的免疫原性的其它方法披露于美国专利5,639,641，在此通过提及而将其完整收录。简言之，在一个优选的方法中，(1)产生抗体重和轻链可变区的集合的位置比对，以给出一组重和轻链可变区框架表面暴露位置，其中所有可变区的位置比对至少约98%相同；(2)对啮齿类抗体(或其片段)限定一组重和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(3)鉴定与一组啮齿类表面暴露的氨基酸残基最紧密相同的一组重和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基；(4)除了在所述啮齿类抗体互补决定区的任何残基的任何原子的5埃内的那些氨基酸残基外，将在步骤(2)中所限定的一组重和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基用步骤(3)中所鉴定的一组重和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基替换；及(5)生成具有结合特异性的人源化啮齿类抗体。
基于柔性残基的鉴定来使抗体人源化的另一种优选的方法已经记载于PCT申请WO 2009/032661。所述方法包括下列步骤：(1)建造亲本单抗的同源性模型，并且运行分子动力学模拟；(2)分析柔性残基，并鉴定非人抗体分子的最具柔性的残基，及鉴定有可能是异质性或降解反应来源的残基或基序；(3)鉴定与亲本抗体展现出最相似的整个识别区的人抗体；(4)测定要突变的柔性残基，还将有可能是异质性和降解来源的残基或基序突变；并(5)检查已知的T细胞或B细胞表位的存在。可以使用隐式溶剂模型(implicit solventmodel)使用分子动力学计算来寻找柔性残基，所述隐式溶剂模型造成水溶剂与蛋白质原子在模拟时段里的相互作用。
可以使用多种其它技术来使抗体人源化，所述技术包括CDR-嫁接(EP 0239 400;WO 91/09967;美国专利No.5,530,101;及5,585,089)、镶饰(veneering)或重修表面(EP 0 592 106;EP 0 519 596;Padlan E.A.,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498;Studnicka G.M.等,1994,ProteinEngineeR1ng 7(6):805-814;Roguska M.A.等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:969-973)和链改组(美国专利No.5,565,332)。
在某些实施方案中，抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的可变和恒定区两者都是完全人的。可以使用本领域中已知的技术来生成完全人的抗体。例如，可以通过对转基因动物施用抗原来制备针对特定抗原的完全人抗体，所述转基因动物已经被修饰为响应抗原性考验而生成此类抗体，但是其内源基因座已经丧失能力。可以用于生成此类抗体的例示性技术记载于美国专利：6,150,584;6,458,592;6,420,140。其它技术是本领域中已知的。同样地，可以通过各种展示技术，例如噬菌体展示或其它病毒展示系统来生成完全人抗体。还可见美国专利No.4,444,887,4,716,111,5,545,806和5,814,318;及国际专利申请公开文本号WO 98/46645,WO 98/50433,WO 98/24893,WO98/16654,WO 96/34096,WO 96/33735和WO 91/10741(通过提及而将所述参考文献完整收录)。
本发明提供了识别EphA2受体并且充当拮抗剂的人源化抗体或其片段。在一个优选的实施方案中，人源化抗体或其表位结合片段具有抑制表达EphA2受体的癌细胞生长的额外能力。在又一个实施方案中，人源化抗体或其表位结合片段具有抑制表达EphA2受体的转移癌细胞迁移的额外能力。
此类人源化抗体的一个优选的实施方案是人源化2H11R35R74抗体或其表位结合片段。
在另一个优选的实施方案中，通过编码hu53.2H11(WO 2008/010101)(本文中称为hu2H11)的多核苷酸序列的定点诱变来获得本发明的人源化抗体。
在更优选的实施方案中，提供了2H11R35R74抗体的重修表面或人源化型式，其中在轻和重链两者中替换抗体或其片段的表面暴露残基以更紧密类似于已知的人抗体表面。本发明的人源化2H11R35R74抗体或其表位结合片段具有改善的特性。例如，人源化2H11R35R74抗体或其表位结合片段特异性识别EphA2受体。更优选地，人源化2H11R35R74抗体或其表位结合片段具有抑制EphA2受体表达细胞生长的额外能力。
2H11R35R74抗体的人源化型式就其轻和重链可变区两者的相应的氨基酸序列、轻和重链可变区的基因的DNA序列、CDR的鉴定、其表面氨基酸的鉴定、和其以重组形式表达的手段的公开而言在本文中也得到完全表征。然而，本发明的范围不限于包含这些序列的抗体和片段。取而代之，本发明中包括特异性结合EphA2受体的所有抗体和片段。优选地，特异性结合EphA2受体的抗体和片段拮抗受体的生物学活性。更优选地，此外，此类抗体基本上缺乏激动剂活性。如此，本发明的抗体和其表位结合抗体片段可以在其支架、CDR、和/或轻链和重链的氨基酸序列上与2H11R35R74抗体或其人源化衍生物存在不同，而且仍落入本发明的范围内。
已经通过解析与EphA2受体的胞外域复合的2H11R35R74的Fab片段的晶体结构来确定2H11R35R74抗体的CDR。已经鉴定出来自2H11R35R74的与EphA2的胞外域相互作用的残基。因而，提供了具有通过例如本发明抗体的亲和力成熟产生的改善的特性的抗体和片段。
可能衍生53.2H11的小鼠轻链IgVκ和Jκ种系基因和重链IgVh和Jh种系基因已经得到鉴定，并且披露于WO 2008/010101。所述种系序列的登录号分别为MMU231196和AF303833。此类种系基因序列可用于鉴定抗体中，包括CDR中的体细胞突变。
2H11R35R74抗体的重链和轻链可变区的序列及其CDR序列先前是未知的，并且在本申请中列出。可以使用此类信息来生成2H11R35R74抗体的人源化型式。还有可能通过hu2H11的定点诱变来获得本发明的人源化2H11R35R74抗体。也可以使用这些人源化的抗EphA2抗体或其衍生物作为本发明的缀合物的细胞结合剂。
如此，在一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个CDR的人源化抗体或其表位结合片段，所述CDR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6。在一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的具有以SEQ IDNO:1、2、和3代表的氨基酸序列的CDR，且其中所述轻链包含三个连续的具有以SEQ ID NO:4、5、和6代表的氨基酸序列的CDR。
在一个实施方案中，本发明提供了人源化2H11R35R74抗体或其片段，其包含具有由SEQ ID NO.12组成的氨基酸序列的VH。在另一个实施方案中，本发明提供了人源化2H11R35R74抗体或其片段，其包含具有由SEQ ID NO.14组成的氨基酸序列的VL。
在一个优选的实施方案中，提供了人源化2H11R35R74抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的具有以SEQ IDNO:1、2、和3代表的氨基酸序列的CDR，其中所述轻链包含三个连续的具有以SEQ ID NO:4、5、和6代表的氨基酸序列的CDR，其中所述重链具有由SEQ ID NO.12组成的氨基酸序列，且其中所述轻链具有由SEQ ID NO.14组成的氨基酸序列。
多核苷酸、载体、和宿主细胞。
提供了编码本发明的抗EphA2抗体的核酸。在一个实施方案中，核酸分子编码抗EphA2免疫球蛋白的重和/或轻链。在一个优选的实施方案中，单一核酸编码抗EphA2免疫球蛋白的重链，而另一核酸分子编码抗EphA2免疫球蛋白的轻链。
在本发明的另一方面，提供了编码具有选自下组的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16和18。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸选自下组：SEQ ID NO:7、9、11、13、15和17。本发明不限于所述多核苷酸本身，而且还包括与所述多核苷酸展现出至少80%同一性的所有多核苷酸。
如本文中所提及的，术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的经修饰形式)的聚合形式。该术语包括单和双链形式的DNA。
如本文中所使用的，术语“分离的多核苷酸”应当指基因组、cDNA、或合成起源或它们的一些组合的多核苷酸，根据其起源，“分离的多核苷酸”(1)与在自然界中找到“分离的多核苷酸”的多核苷酸的整个或部分无关，(2)与其在自然界中不相连的多核苷酸可操作连接，或者(3)不以较大序列的一部分存在于自然界中。
本发明提供了包含本发明的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，载体含有编码抗EphA2免疫球蛋白的重链的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码抗EphA2免疫球蛋白的轻链。本发明还提供了包含编码其融合蛋白、经修饰的抗体、抗体片段、和探针的多核苷酸分子的载体。
为了表达本发明的抗EphA2抗体的重和/或轻链，将编码所述重和/或轻链的多核苷酸插入表达载体中，使得基因与转录和翻译序列可操作连接。
“可操作连接的”序列包括与感兴趣的基因相邻的表达控制序列和反式或远距离起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列两者。如本文中所使用的，术语“表达控制序列”指实现与它们连接的编码序列的表达和加工必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定化胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；及在期望时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质随宿主生物体而存在不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点、和转录终止序列；在真核生物中，一般地，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图最少包括其存在对于表达和加工必需的所有构件，并且还可以包括其存在是有利的额外构件，例如前导序列和融合配偶序列。
如本文中所使用的，术语“载体”意图指能够运输已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指一种可以对其连接别的DNA区段的环形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中可以将别的DNA区段连接入病毒基因组中。某些载体能够在接受它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加体哺乳动物载体)在导入宿主细胞中后可以整合入宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。
某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或仅“表达载体”)。一般地，重组DNA技术中应用的表达载体为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意图包括此类形式的表达载体，诸如细菌质粒、YAC、粘粒、逆转录病毒、EBV衍生的附加体、和技术人员会知道对于确保本发明抗体的重和/或轻链的表达便利的所有其它载体。技术人员会认识到可以将编码重和轻链的多核苷酸克隆入不同载体或同一载体中。在一个优选的实施方案中，在同一载体中克隆所述多核苷酸。
可以使用本发明的多核苷酸和包含这些分子的载体来转化合适的哺乳动物宿主细胞，或技术人员已知的任何其它类型的宿主细胞。如本文中所使用的，术语“重组宿主细胞”(或仅“宿主细胞”)意图指已经接受重组表达载体导入的细胞。应当理解，此类术语意图不仅指特定的主题细胞，而且还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响而可能在随后的世代中发生某些修饰，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不相同，但是仍包含在如本文中所使用的术语“宿主细胞”的范围内。
可以通过用于将多核苷酸导入宿主细胞中的任何已知的方法来转化。此类方法是本领域技术人员公知的，并且包括右旋糖苷介导的转化、磷酸钙沉淀、Polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸封装到脂质体中、生物射弹注射和对细胞核直接显微注射DNA。
抗体片段
本发明的抗体包括上文所讨论的全长抗体及表位结合片段两者。如本文中所使用的，“抗体片段”包含抗体中保留结合全长抗体识别的表位的能力的任何部分，一般称作“表位结合片段”。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(dsFv)和包含VL或VH区的片段。表位结合片段(包括单链抗体)可以包含单独的或与以下的整体或部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2、和CH3域。
此类片段可以含有一个或两个Fab片段或F(ab’)2片段。优选地，抗体片段含有全抗体的所有6个CDR，尽管含有少于全部此类区，诸如3、4或5个CDR的片段也是功能性的。此外，片段可以是或者可以组合下列任一免疫球蛋白类及其亚类的成员：IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE。
可以使用酶诸如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab’)2片段)通过蛋白水解切割来生成Fab和F(ab’)2片段。
“单链FV”(“scFv”)片段是含有连接的抗体重链可变区(VH)的至少一个片段和抗体轻链可变区(VL)的至少一个片段的表位结合片段。接头可以是一种短的柔性肽，其选择为确保一旦(VL)和(VH)区连接便发生其正确的三维折叠，使得维持单链抗体片段来源的全抗体的靶分子结合特异性。(VL)或(VH)序列的羧基端可以通过接头与互补(VL)或(VH)序列的氨基酸端共价连接。
本发明的单链抗体片段含有具有本说明书中所描述的全抗体的至少一个可变或互补决定区(CDR)的氨基酸序列，但是缺乏那些抗体的一些或所有恒定域。这些恒定域对于抗原结合不是必要的，但是构成全抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服与使用含有部分或整个恒定域的抗体有关的一些问题。例如，单链抗体片段趋于没有生物分子与重链恒定区间不期望的相互作用，或者其它不想要的生物学活性。另外，单链抗体片段比全抗体小得相当多，并且因此可以具有比全抗体大的毛细管通透性，允许单链抗体片段更有效地定位并结合靶抗原结合位点。还有，可以在原核细胞中以相对较大的规模生成抗体片段，如此便于其生产。此外，单链抗体片段的相对较小的尺寸使它们与全抗体相比不太可能激发接受体中的免疫应答。
可以通过分子克隆、抗体噬菌体展示文库或熟练技术人员公知的类似技术来生成单链抗体片段。这些蛋白质可以例如在真核细胞或原核细胞，包括细菌中生成。也可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法来生成本发明的表位结合片段。在噬菌体展示方法中，功能性抗体域展示于携带其编码多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别地，可以利用此类噬菌体来展示自全集或组合抗体文库(例如人的或鼠的)表达的表位结合域。可以用抗原，例如使用被固体表面或珠结合或捕获的经标记抗原选择或鉴定出表达结合感兴趣抗原的表位结合域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包含自噬菌体表达的fd和M13结合域及与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体域。
可以用于生成本发明的表位结合片段的噬菌体展示方法的例子包括那些披露于Brinkman等,1995,J.Immunol.Methods,182:41-50;Ames等,1995,J.Immunol.Methods,184:177-186;Kettleborough等,1994,Eur.J.Immunol.,24:952-958;Persic等,1997,Gene 187:9-18;Burton等,1994,Advances inImmunology,57:191-280;PCT申请No.PCT/GB91/01134;PCT公开文本WO90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO 92/18619;WO 93/11236;WO95/15982;WO 95/20401;及美国专利No.5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108的；通过提及而将每篇完整收入本文。
在噬菌体选择后，可以将编码片段的噬菌体区分离，并用于经由在选定的宿主，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达来生成表位结合片段，其使用重组DNA技术来进行，例如如下文详细描述的。例如，也可以采用重组生成Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术，其使用本领域中已知的方法，诸如那些披露于PCT公开文本WO 92/22324;Mullinax等,1992,BioTechniques,12(6):864-869;Sawai等,1995,AJR1,34:26-34;及Better等,1988,Science,240:1041-1043的技术来进行；通过提及而将所述参考文献完整收录。可以用于生成单链Fv和抗体的技术的例子包括那些记载于美国专利No.4,946,778和5,258,498;Huston等,1991,Methods in Enzymology 203:46-88;Shu等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:7995-7999;Skerra等,1988,Science,240:1038-1040的。
功能性等同物
本发明的范围内还包括抗EphA抗体和人源化抗EphA2受体抗体的功能性等同物。术语“功能性等同物”包括例如具有同源序列的抗体、嵌合抗体、人工抗体和经修饰的抗体，其中每种功能性等同物以它们结合EphA2受体的能力限定。熟练技术人员会理解在称作“抗体片段”的分子组和称作“功能性等同物”的组中存在重叠。生成功能性等同物的方法是本领域技术人员已知的，并披露于例如PCT申请WO 93/21319,欧洲专利No.EP 0239400;PCT申请WO 89/09622;欧洲专利No.EP 0338745;及欧洲专利申请EP 0332424，通过提及而以其各自的全部内容将其收录。
具有同源序列的抗体是氨基酸序列与本发明的抗EphA抗体和人源化抗EphA抗体氨基酸序列具有序列同源性的那些抗体。优选地，同源性是与本发明抗EphA抗体和人源化抗EphA抗体的可变区的氨基酸序列得到的。如本文中应用于氨基酸序列的，“序列同源性”定义为与另一个氨基酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、或94%序列同源性，且更优选地至少约95%、96%、97%、98%、或99%序列同源性的序列，如例如通过依照Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444-2448的FASTA搜索方法确定的。
嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的抗体。例如，一种抗体，其具有与人免疫球蛋白恒定区配对的源自鼠单克隆抗体的可变区。生成嵌合抗体的方法是本领域中已知的。见例如MorR1son,1985,Science,229:1202;Oi等,1986,BioTechniques,4:214;Gillies等,1989,J.Immunol.Methods,125:191-202;美国专利No.5,807,715;4,816,567;和4,816,397，通过提及而将其完整收入本文。
通过将例如小鼠抗体的互补决定区替换入人框架域中来生成人源化形式的嵌合抗体，例如见PCT公开文本No.W0 92/22653。优选地，人源化的嵌合抗体具有基本上或完全源自相应的人抗体区的除互补决定区(CDR)以外的恒定区和可变区和基本上或完全源自除人之外的哺乳动物的CDR。
人工抗体包括scFv片段、双抗体、三抗体、四抗体和mru(见Winter,G.和Milstein,C,1991,Nature,349:293-299;Hudson,P.J.,1999,Current Opinionin Immunology,11:548-557的综述)，其各自具有抗原结合能力。在单链Fv片段(scFv)中，抗体的VH和VL域通过柔性肽连接。典型地，此接头肽长约15个氨基酸残基。若接头太小，例如5个氨基酸，则形成双抗体，其为二价scFv二聚体。若接头减少到小于3个氨基酸残基，则形成称作三抗体和四抗体的三聚和四聚结构。抗体的最小结合单元是CDR，典型地重链的CDR2，其具有充分的特异性识别和结合，从而其能够分开使用。此类片段称作分子识别单元或mru。几种此类mru可以与短的接头肽连接在一起，因此形成具有比单个mru高的亲合力的人工结合蛋白。
本申请的功能性等同物还包括经修饰的抗体，例如通过将任何类型的分子共价附接于抗体而修饰的抗体。例如，经修饰的抗体包括已经通过例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接等修饰过的抗体。共价附接没有阻止抗体产生抗独特型应答。可以通过已知的技术来实施这些修饰，包括但不限于特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、代谢合成衣霉素等。另外，经修饰的抗体可以含有一种或者多种非经典氨基酸。
可以通过互换不同框架内不同链上的不同CDR来生成功能性等同物。如此，例如，通过替代不同重链，对于给定的一组CDR，不同类抗体是有可能的，由此例如可以生成IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗体类型和同种型。类似地，可以通过将给定的一组CDR包埋于完全合成的框架内来生成本发明范围内的人工抗体。
可以使用本领域中已知的极其多种方法通过在特定组的CDR侧翼的可变和/或恒定区序列内的突变、删除和/或插入来容易地生成功能性等同物。
本发明的抗体片段和功能性等同物涵盖在与2H11R35R74抗体相比时具有可检出的对EphA2的结合程度的那些分子。可检出的结合程度包括范围为鼠2H11R35R74抗体对EphA2的结合能力的至少10-100%，优选地至少50%、60%或70%，更优选地至少75%、80%、85%、90%、95%或99%的所有数值。
改善的抗体
CDR对于表位识别和抗体结合是最重要的。然而，可以在不干扰抗体识别并结合其关联表位的能力的情况中对构成CDR的残基进行改变。例如，可以进行如下的变化，其不影响表位识别，仍提高抗体对表位的结合亲和力。
如此，本发明范围中还包括鼠和人源化抗体两者的改善的型式，其也特异性识别并结合EphA2，优选地以升高的亲和力。
几项研究已经调查了基于一级抗体序列的知识，在抗体序列中在多个位置处引入一处或多处氨基酸变化对其特性诸如结合和表达水平的影响(Yang,W.P.等,1995,J.Mol.Biol.,254:392-403;Rader,C.等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,95:8910-8915;Vaughan,T.J.等,1998,Nature Biotechnology,16:535-539)。
在这些研究中，已经通过改变CDR1、CDR2、CDR3、或框架区中的重和轻链基因的序列来生成一级抗体的等同物，其使用诸如寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组、或大肠杆菌增变株(mutator)等方法来进行(Vaughan,T.J.等,1998,Nature Biotechnology,16:535-539;Adey,N.B.等,1996,第16章,第277页-第291页,于“Phage Display of Peptides andProteins”,Kay,B.K.等编,Academic Press)。改变一级抗体序列的这些方法已经导致二级抗体的亲和力改善(Gram,H.等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:3576-3580;Boder，E.T.等,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97:10701-10705;Davies,J.和R1echmann,L,1996,Immunotechnolgy，2:169-179;Thompson,J.等,1996,J.Mol.Biol.,256:77-88;Short,M.K.等,2002,J.Biol.Chem.,277:16365-16370;Furukawa,K.等,2001,J.Biol.Chem.,276:27622-27628)。
通过改变抗体的一个或多个氨基酸残基的类似的定向策略，可以使用本发明中所描述的抗体序列来开发具有改善的功能，包括改善的对EphA2的亲和力的抗EphA2抗体。
优选的氨基酸取代是如下的那些取代：其(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，和(4)赋予或修饰此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可以包括具有与天然存在的肽序列不同的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列中(优选地在形成分子间接触的域外部的多肽部分中)进行一处或多处氨基酸取代(优选地保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应实质上改变亲代序列的结构特征(例如氨基酸替代不应趋于破坏在亲本序列中存在的螺旋，或者破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的例子记载于Proteins,Structures and Molecular PR1nciples(Creighton编,W.H.Freeman and Company,New York(1984));Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；及Thornton等,1991,Nature,354:105，通过提及而将它们各自收入本文。
改善的抗体还包括具有改善特征的那些抗体，其是通过动物免疫、杂交瘤形成和选择具有特定特征的抗体的标准技术制备的。
认为抗体的恒定区与各种Fc受体(FcγR)间的相互作用介导抗体的效应器功能，其包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体的固定、吞噬和抗体的半衰期/清除。可以根据期望的特性来实施对本发明抗体的恒定区的各种修饰。例如，在恒定区中使得本来为溶解性的抗体成为非溶解性的特定突变详述于EP 0629 240B1和EP 0307 434B2，或者可以将补救受体结合表位掺入抗体中以延长血清半衰期(见US 5,739,277)。目前存在着5种公认的人Fcγ受体，即FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和新生儿FcRn。Shields等(J.Biol.Chem.,27:6591-6604,2001)表明共同的一组IgGI残基牵涉结合所有FcγR，而FcγRII和FcγRIII利用在此共同组外部的独特位点。一组IgGI残基在改变为丙氨酸时降低对所有FcγR的结合：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239。它们都在IgG CH2域中，并且在连接CH1和CH2的铰链附近聚簇。虽然FcγRI仅利用共同的一组用于结合的IgGI残基，但是在共同的组外，FcγRII和FcγRIII与独特的残基相互作用。
对一些残基的改变仅降低对FcγRII(例如Arg-292)或FcγRIII(例如Glu-293)的结合。一些变体显示改善的对FcγRII或FcγRIII的结合，但是不影响对其它受体的结合(例如Ser-267Ala改善对FcgRII的结合，但是对FcγRIII的结合不受影响)。其它变体展现出改善的对FcγRII或FcγRIII的结合及对其它受体的结合降低(例如Ser-298Ala改善对FcγRIII的结合，并且降低对FcγRII的结合)。对于FcγRIIIa，最好的结合IgGI变体在Ser-298、Glu-333和Lys-334处具有组合的丙氨酸取代。认为新生儿FcRn受体牵涉抗体清除和转胞吞通过组织两者(见Junghans R.P，1997,Immunol.Res.,16:29-57和Ghetie等,2000,Annu.Rev.lmmunol.18:739-766)。确定为与人FcRn直接相互作用的人IgGI残基包括Ne253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。在此部分中所描述的这些位置之任一处的转换可以实现本发明抗体的延长的血清半衰期和/或改变的效应器特性。
其它修饰包括本发明抗体的糖基化变体。已知在其恒定区中的保守位置处的抗体糖基化对抗体功能，特别地效应器功能诸如上文所描述的那些效应器功能具有深远的影响，见例如Boyd等(Mol.Immunol,.32:1311-1318,1996)。涵盖本发明的抗体或其抗原结合片段的糖基化变体，其中将一个或多个碳水化合物模块添加、取代、删除或修饰。天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序的引入创建碳水化合物模块酶促附接的潜在位点，并且因此可以用于操作抗体的糖基化。在Raju等(Biochemistry 40:8868-8876,2001)中，使用β-1,4-半乳糖基转移酶和/或α,2,3唾液酸转移酶经由再半乳糖基化和/或再唾液酸化过程来提高TNFR-1gG免疫粘附素的末端唾液酸化。认为提高末端唾液酸化延长免疫球蛋白的半衰期。与大多数糖蛋白一样，抗体通常以糖形混合物生成。当抗体在真核，特别地哺乳动物细胞中生成时，此混合物是特别明显的。已经开发出多种方法来制造限定的糖形(见Zhang等2004,Science303:371;Sears等,2001,Science 291:2344;Wacker等,2002,Science 298:1790;Davis等2002,Chem.Rev.102:579;Hang等,2001,Acc.Chem.Res.34:727)。如此，本发明涵盖如本文中所描述的多种(单克隆)抗体(其可以是IgG同种型的，例如IgG1)，其包含限定数目(例如，7或更少，例如5或更少，诸如两种或单种)的所述抗体或其抗原结合片段的糖形。
因此，依照本发明的改善的抗体特别包括具有增强的功能性特性的抗体。特别感兴趣的是那些具有增强的介导细胞的细胞毒性效应器功能诸如ADCC的能力的抗体。可以通过在抗体的恒定框架中进行单处或多处取代，如此改变其与Fc受体的相互作用来获得此类抗体。用于设计此类突变体的方法可以参见例如Lazar等(2006,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(11):4005-4010)和Okazaki等(2004,J.Mol.Biol.336(5):1239-49)。还可见WO03/074679,WO 2004/029207,WO 2004/099249,WO2006/047350,WO2006/019447,WO 2006/105338,WO 2007/041635。还有可能使用为了生成改善的抗体而特别工程化改造的细胞系。特别地，这些系具有改变的糖基化途径调节，例如生成较差地岩藻糖基化或甚至完全地去岩藻糖基化的抗体。此类细胞系及用于工程化改造它们的方法披露于例如Shinkawa等(2003,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473),Ferrara等(2006,J.Biol.Chem.281(8):5032-5036;2006,Biotechnol.Bioeng.93(5):851-61),EP 1 272 527 B1,EP 1331 266,EP 1 498 490,EP 1 498 491,EP 1 676 910,EP 1 792 987及WO99/54342。
本发明的其它实施方案包括与非蛋白质性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯偶联的本发明的抗体或其抗原结合片段。蛋白质与PEG的缀合是一种用于延长蛋白质半衰期及降低蛋白质的抗原性和免疫原性的确立的技术。已经用完整的抗体及Fab’片段调查了使用具有不同分子量和样式(线性或分支)的PEG化(Koumenis I.L.等,2000,Int.J.Pharmaceut.198:83-95)。
本发明还包括细胞毒性缀合物、或抗体-药物缀合物、或缀合物。如本文中所使用的，所有这些术语具有相同的意义，并且是可互换的。
这些细胞毒性缀合物包含两个主要构件，即细胞结合剂和细胞毒剂。
如本文中所使用的，术语“细胞结合剂”指特异性识别并结合细胞表面上的EphA2受体的药剂。在一个实施方式中，细胞结合剂特异性识别EphA2受体，使得其允许缀合物以靶向方式起作用，很少有源自非特异性结合所引起的副作用。
在另一个实施方案中，本发明的细胞结合剂还特异性识别EphA2受体，从而缀合物会与靶细胞接触充分的时间段以允许缀合物的细胞毒性药物部分对细胞起作用，和/或允许缀合物被细胞内在化。
在一个优选的实施方案中，细胞毒性缀合物包含抗EphA2抗体作为细胞结合剂，更优选地鼠2H11R35R74单克隆抗体。在一个更优选的实施方案中，细胞毒性缀合物包含人源化2H11R35R74抗体或其表位结合片段。2H11R35R74抗体能够特异性识别EphA受体，诸如EphA2，并且将细胞毒剂以靶向性方式引导至异常细胞或组织，诸如癌细胞。
本发明的细胞毒性缀合物的第二构件是细胞毒剂。如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”指降低或阻断细胞的功能或生长和/或引起对细胞的破坏的物质。
在优选的实施方案中，细胞毒剂是紫杉烷(taxoid)、美登木素生物碱类诸如DM1或DM4、小分子药物、茅屋霉素(tomaymycin)衍生物、前药、CC-1065或CC-1065类似物。在优选的实施方案中，本发明的细胞结合剂直接或经由可切割或不可切割的接头共价附接于细胞毒剂。如本文中所使用的，“接头”意指包含将抗体共价附接于药物模块的共价键或原子链的化学模块。
如此，本发明涵盖(1)识别并结合EphA2受体的细胞结合剂与(2)细胞毒剂间的缀合物的用途。在细胞毒性缀合物中，细胞结合剂具有对EphA2受体的高亲和力，而细胞毒剂具有对表达EphA2受体的细胞的高度细胞毒性，使得本发明的细胞毒性缀合物形成有效的杀伤剂。
先前已经描述了拮抗性EphA2抗体的缀合物。例如，WO 2008/010101披露了与L-DM4，即N2’去乙酰-N2’(4-甲基-4-巯基-1-氧戊基)-美登素缀合的人源化37.3D7和人源化53.2H11抗体，其使用SPDB(4-[2-吡啶基二硫代]丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)接头得到(见WO 2008/010101的实施例10；hu37.3D7-SPDB-DM4和hu2H11-SPDB-DM4)。
在与细胞毒剂缀合时，本发明的抗体显示许多比现有技术的抗体有利的特性。特别地，缀合物不影响本发明抗体对EphA2受体的亲和力，而53.2H11对EphA2的结合由于细胞毒剂附接于所述53.2H11抗体而受到负面影响。
下文更为详细地讨论了细胞结合剂、细胞毒剂、和接头。
细胞结合剂
本发明的化合物作为治疗剂的效率取决于合适的细胞结合剂的仔细选择。细胞结合剂可以是目前已知的或变得已知的任何种类的，并且包括肽和非肽。细胞结合剂可以是能以特异性或非特异性方式结合细胞的任何化合物。一般地，这些可以是抗体(尤其是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养物转运分子(诸如运铁蛋白)、或任何其它细胞结合分子或物质。
可以使用的细胞结合剂的更具体的例子包括：
多克隆抗体；
单克隆抗体；
抗体片段诸如Fab、Fab’、和F(ab’)2、Fv(Parham,1983,J.Immunol.,131:2895-2902;SpR1ng等,1974,J.Immunol.,113:470-478;Nisonoff等,1960,Arch.Biochem.Biophys.,89:230-244)。
优选地，使用人源化的抗EphA2抗体作为本发明的细胞结合剂。更优选地，人源化的抗EphA2抗体是人源化的2H11R35R74抗体。
细胞毒剂
在另一个实施方案中，人源化抗体或其表位结合片段可以与药物诸如美登木素生物碱类、茅屋霉素(tomaymycin)衍生物或度卡霉素(duocarmycin)衍生物缀合以形成具有通过将药物靶向至EphA2受体而具有针对抗原表达细胞的特异性细胞毒性的前药。包含此类抗体和小的高度毒性药物(例如，美登木素生物碱类、茅屋霉素衍生物及CC-1065和CC-1065类似物)的细胞毒性缀合物可以作为治疗剂用于治疗肿瘤，诸如例如乳腺和卵巢肿瘤。
本发明的细胞毒性缀合物中使用的细胞毒剂可以是导致细胞死亡，或诱导细胞死亡，或以某种方式降低细胞存活力的任何化合物。优选的细胞毒剂包括例如美登木素生物碱类和美登木素生物碱类似物、茅屋霉素衍生物及CC-1065和CC-1065类似物(下文定义)。这些细胞毒剂与抗体、抗体片段、功能性等同物、改善的抗体及其类似物缀合，如本文中所公开的。
可以通过体外方法来制备细胞毒性缀合物。为了连接药物或前药与抗体，使用连接基团。合适的连接基团是本领域中公知的，并且包括二硫基、硫醚基团、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团和酯酶不稳定性基团。
例示性的连接基团是二硫基和硫醚基团。例如，可以使用二硫化物交换反应或者通过在抗体与药物或前药间形成硫醚键来构建缀合物。携带此类连接基团的接头的例子包括N-琥珀酰亚氨基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)和N-琥珀酰亚氨基吡啶基二硫代丁酸酯(SPDB)，其二硫代吡啶基反应基团(见Bourdon M.A.等,Biochem.J.,173:723-737,1978;US 5208020)与细胞毒性化学反应基团诸如-SH起反应以形成新键-S-S-。然后，N-琥珀酰亚氨基氧基基团优先与存在于抗体上的氨基基团起反应以形成酰胺键。
在另一个优选的实施方案中，使用聚乙二醇(PEG)连接基团来连接细胞毒剂与细胞结合剂，如US 6,716,821中所列的。
例示性的PEG连接基团包括异双功能PEG接头，其经由在一端的功能性硫氢基或二硫基和在另一端的活性酯来结合细胞毒剂和细胞结合剂(US6,716,821)。还有可能使用不经由功能性硫氢基或二硫基结合细胞毒剂的PEG接头。
明确涵盖的是式(I)的携带具有末端活性酯的聚乙二醇(PEG)连接基团的细胞毒剂：
Figure BDA00001723216000291
其中Z是所述细胞毒剂，所述细胞毒剂选自下组：美登木素生物碱类和美登木素生物碱类似物、茅屋霉素衍生物及CC-1065和CC-1065类似物，且
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子。在另一个优选的实施方案中，提供了如下的细胞毒剂，所述细胞毒剂携带具有末端活性酯的聚乙二醇(PEG)连接基团并具有式(II)：
Figure BDA00001723216000292
其中Z是所述细胞毒剂，所述细胞毒剂选自下组：美登木素生物碱类和美登木素生物碱类似物、茅屋霉素衍生物及CC-1065和CC-1065类似物，且
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子。
缀合物的制备
一般地，可以通过包括下列步骤的方法来获得缀合物：
(i)使任选缓冲的细胞结合剂水溶液与细胞毒性化合物的溶液接触；
(ii)然后，任选地分开在(i)中形成的缀合物与未反应的试剂和可能存在于溶液中的任何聚集体。
在一方面，细胞结合剂是抗体；更具体地，细胞结合剂是mu2H11R35R74抗体或其人源化型式。在另一方面，细胞毒剂是式(I)或(II)的化合物，其中Z是美登木素生物碱类；特别地，Z是DM4。
理解的是，通过此方法可获得的缀合物包含在本发明的范围内。
可以用缓冲剂诸如例如磷酸钾或N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(Hepes缓冲剂)缓冲细胞结合剂水溶液。缓冲剂取决于细胞结合剂的性质。细胞毒性化合物在有机极性溶剂，例如二甲亚砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)中的溶液中。
反应温度通常包括在20和40°C间。反应时间可以从1变化至24小时。可以通过具有折射计量和/或UV检测仪的大小排阻层析(SEC)来监测细胞结合剂和细胞毒剂间的反应。若缀合物收率太低，则可以延长反应时间。
本领域技术人员可以使用多种不同层析法来实施步骤(ii)的分离：可以例如通过SEC、吸附层析(诸如离子交换层析，IEC)、疏水相互作用层析(HIC)、亲和层析、混合支持物层析诸如羟磷灰石层析、或高效液相层析(HPLC)来纯化缀合物。也可以使用通过透析或渗滤的纯化。
可以使用的方法的例子记载于实施例I.b.1。
如本文中所使用的，术语“聚集体”意指可以在两个或更多个细胞结合剂间形成的联合体，所述药剂通过缀合修饰或不然。可以在许多参数，诸如溶液中高浓度的细胞结合剂、溶液的pH、高剪切力、键合二聚体的数目及其疏水特征、温度的影响下形成聚集体(见Wang和Gosh,2008,J.Membrane Sci.,318:311-316，及其中引用的参考文献)；注意到这些中的一些参数的相对影响没有清楚确立。在蛋白质和抗体的情况中，本领域技术人员会参考Cromwell等(2006,AAPS Jounal,8(3):E572-E579)。可以用技术人员公知的技术诸如SEC来测定聚集体含量(见Walter等,1993,Anal.Biochem.,212(2):469-480)。
在步骤(i)或(ii)后，可以将含有缀合物的溶液进行额外的超滤和/或渗滤步骤(iii)。
在这些步骤结束时在水溶液中回收缀合物。
美登木素生物碱类
可以在本发明中用于形成细胞毒性缀合物的细胞毒剂之一是美登木素生物碱类及美登木素生物碱类似物。合适的美登木素生物碱类的例子包括美登醇和美登醇类似物。美登木素生物碱类是抑制微管形成，并且对哺乳动物细胞具有高度毒性的药物。
合适的美登醇类似物的例子包括那些具有经修饰的芳香环的和那些在其它位置处具有修饰的。此类合适的美登木素生物碱类披露于美国专利No.4,424,219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;6,333,410;5,475,092;5,585,499;和5,846,545。
具有经修饰芳香环的美登醇的合适类似物的具体例子包括：
(1)C-19-去氯(美国专利No.4,256,746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的LAH还原来制备)；
(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属(Streptomyces)或放线菌属(Actinomyces)的去甲基化或者使用LAH的去氯化来制备)；和
(3)C-20-去甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-去氯(美国专利No4,294,757)(通过使用酰氯的酰胺化来制备)。
具有其它位置的修饰的美登醇的合适类似物的具体例子包括：
(1)C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)；
(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)；
(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(自诺卡氏菌属(Nocardia)制备)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)(通过由链霉菌属转化美登醇来制备)；
(5)C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)(自滑桃树(Trewianudiflora)分离)；
(6)C-18-N-去甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)(通过由链霉菌属对美登醇去甲基化来制备)；以及
(7)4,5-去氧(美国专利No 4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。
在一个优选的实施方案中，本发明的细胞毒性缀合物利用含有硫醇的美登木素生物碱类(DM1)，其正式地称作N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素作为细胞毒剂。DM1由以下结构式(III)表示：
在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞毒性缀合物利用含有硫醇的美登木素生物碱类DM4，其正式地称作N2’-去乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素作为细胞毒剂。DM4由以下结构式(IV)表示：
Figure BDA00001723216000322
在本发明的其它实施方案中，可以使用其它美登素，包括在携带硫原子的碳原子上携带单或二烷基(alkyl)取代的含有硫醇和二硫化物的美登木素生物碱类。这些包括具有C-3,C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基、具有携带受阻硫氢基基团的酰基基团的酰化氨基酸侧链的美登木素生物碱类，其中携带硫醇官能团的酰基基团的碳原子具有一个或者两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性或分支烷基或烯基(alkyl or alkenyl)、具有3至10个碳原子的环状烷基或烯基(alkyl or alkenyl)、苯基、取代的苯基、或杂环芳基或杂环烷基(heterocycloalkyl)根，而且进一步，其中取代基之一可以是H，且其中酰基基团在羰基官能团与硫原子之间具有至少3个碳原子的直链长度。
此类其它美登素包括由式(V)表示的化合物：
Figure BDA00001723216000331
其中：
Y’代表
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2各自独立的是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，且另外，R2可以是H；
A、B、D是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基；
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立的是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基；
l,m,n,o,p,q,r,s和t各自独立是0或1至5的整数，只要l,m,n,o,p,q,r,s和t中的至少两个在任何一个时间不是0；且
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基,具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基。
式(V)的优选的实施方案包括式(V)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，且Z是H。
R1和R2是甲基，且Z是H。
R1是甲基，R2是H，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，且Z是-SCH3。
此类其它美登素还包括以式(VI-L)、(VI-D)、或(VI-D,L)表示的化合物：
Figure BDA00001723216000341
其中：
Y代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2各自独立是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基，且另外，R2可以是H；
R3,R4,R5,R6,R7和R8各自独立是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基；
l、m和n各自独立是1至5的整数，且另外，n可以是0；
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性或分支烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环形烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基；且
May代表美登木素生物碱类，其在C-3,C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处携带侧链。
式(VI-L)、(VI-D)和(VI-D,L)的优选实施方案包括式(VI-L)、(VI-D)和(VI-D,L)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8各自是H，l和m各自是1，n是0，且Z是H。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8各自是H，l和m是1，n是0，且Z是H。
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7、和R8各自是H，l和m各自是1，n是0，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8各自是H，l和m是1，n是0，且Z是-SCH3。
优选地，细胞毒剂以式(VI-L)表示。
此类其它美登素还包括以式(VII)表示的化合物：
Figure BDA00001723216000351
其中：
Y代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2各自独立是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，且另外，R2可以是H；
R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基；
l,m和n各自独立是1至5的整数，且另外，n可以是0；且
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基。
式(VII)的优选的实施方案包括式(VII)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7、和R8各自是H；l和m各自是1；n是0；且Z是H。
R1和R2是甲基；R5、R6、R7、R8各自是H，l和m是1；n是0；且Z是H。
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7、和R8各自是H，；l和m各自是1，n是0，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8各自是H，l和m是1，n是0，且Z是-SCH3。
此类其它美登素进一步包括以式(VIIII-L)、(VIII-D)、或(VIII-D,L)表示的化合物：
其中：
Y2表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2，
其中：
R1和R2各自独立是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，且另外，R2可以是H；
R3,R4,R5,R6,R7和R8各自独立是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性环形烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基；
l,m和n各自独立是1至5的整数，且另外，n可以是0；
Z2是SR或COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基；且
May是美登木素生物碱类。
此类其它美登素还包括以式(IX)表示的化合物：
其中：
Y2’代表
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2，其中：
R1和R2各自独立是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性或分支烷基或烯基、具有3至10个碳原子的环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，且另外，R2可以是H；
A、B、和D各自独立是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳香基或杂环烷基；
R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9,R10,R11和R12各自独立是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基；
l,m,n,o,p,q,r,s和t各自独立是0或1至5的整数，只要l,m,n,o,p,q,r,s和t中的至少两个在任何一个时间不是0；且Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3-10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、或简单的或取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基。
式(IX)的优选的实施方案包括式(IX)的化合物，其中：R1是甲基，R2是H。
上文提及的美登木素生物碱类可以与抗EphA抗体2H11R35R74或其类似物或片段缀合，其中使用存在于美登木素生物碱类的C-3,C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处找到的酰化氨基酸侧链的酰基基团上的硫醇或二硫化物官能团来连接抗体与美登木素生物碱类，且其中酰化氨基酸侧链的酰基基团的硫醇或二硫化物官能团位于具有一个或两个取代基的碳原子处，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基，且另外，取代基之一可以是H，且其中酰基基团具有羰基官能团和硫原子间的至少三个碳原子的线性链长度。
本发明的优选的缀合物是包含与式(X)的美登木素生物碱类缀合的或通过用式(X)的美登木素生物碱类缀合可获得的抗EphA抗体2H11R35R74或其同系物或片段的缀合物：
Figure BDA00001723216000381
其中：
Y1’代表
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2S-，
其中：
A、B、和D各自独立是具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳香基或杂环烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基；且
l,m,n,o,p,q,r,s和t各自独立是0或1至5的整数，只要l,m,n,o,p,q,r,s和t中的至少两个在任何一个时间不是0。
优选地，R1是甲基，R2是H，或R1和R2是甲基。
本发明的一种甚至更优选的缀合物是包含与式(XI-L)、(XI-D)或(XI-D,L)的美登木素生物碱类缀合的抗EphA抗体2H11R35R74或其同系物或片段的缀合物：
Figure BDA00001723216000391
其中：
Y1代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-，
其中：
R1和R2各自独立是CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基、杂环芳香基或杂环烷基，且另外，R2可以是H；
R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立是H、CH3、C2H5、具有1至10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3至10个碳原子的分支或环形烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基；
l,m和n各自独立是1至5的整数，且另外，n可以是0；且
May代表在C-3,C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处携带侧链的美登醇。
式(XI-L)、(XI-D)和(XI-D,L)的优选的实施方案包括式(XI-L)、(XI-D)和(XI-D,L)的化合物，其中：
R1是甲基，R2是H，或R1和R2是甲基，
R1是甲基，R2是H，R5、R6、R7和R8各自是H；l和m各自是1；n是0，R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8各自是H；l和m是1；n是0。
优选地，细胞毒剂以式(XI-L)表示。
本发明的别的优选的缀合物是包含与式(XII)的美登木素生物碱类缀合的抗EphA抗体2H11R35R74或其同系物或片段的缀合物：
Figure BDA00001723216000401
其中取代基如上文对式(XI)定义的。
特别优选的是任何上述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8各自是H，l和m各自是1，且n是0。
进一步特别优选的是任何上述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8各自是H，l和m是1，且n是0。
此外，L-氨基酰基立体异构体是优选的。
2004年5月20日提交的悬而未决的美国专利申请号10/849,136中教导的每种美登木素生物碱类也可以在本发明的细胞毒性缀合物中使用。通过提及而将美国专利申请号10/849,136的全部公开内容收入本文。
含有二硫化物的连接基团
为了连接美登木素生物碱类与细胞结合剂，诸如2H11R35R74抗体，美登木素生物碱类包含连接模块。连接模块含有允许在特定位点处释放完全活性的美登木素生物碱类的化学键。合适的化学键是本领域中公知的，并且包括二硫键、酸不稳定性键、光不稳定性键、肽酶不稳定性键和酯酶不稳定性键。
连接模块还包含反应性化学基团。在一个优选的实施方案中，经由二硫键连接模块，使用反应性化学基团来共价结合美登木素生物碱类。
特别优选的反应性化学基团是N-琥珀酰亚氨基酯和N-磺基琥珀酰亚氨基酯。
特别优选的包含含有反应性化学基团的连接模块的美登木素生物碱类是美登醇的C-3酯及其类似物，其中连接模块含有二硫键，而化学反应性基团包含N-琥珀酰亚氨基或N-磺基琥珀酰亚氨基酯。
美登木素生物碱类上的许多位置可以充当化学连接连接模块的位置。例如，具有羟基基团的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基基团的C-20位置均预期是有用的。然而，C-3位置是优选的，且美登醇的C-3位置是特别优选的。
虽然就含有二硫键的连接模块而言描述了具有连接模块的美登醇酯的合成，但是本领域技术人员应当理解具有其它化学键(如上文所描述的)的连接模块也可以与本发明一起使用，其它美登木素生物碱类也可以。其它化学键的具体例子包括酸不稳定的键、光不稳定性键、肽酶不稳定性键和酯酶不稳定性键。美国专利No.5,208,020(将其收入本文)的公开内容教导了携带此类键的美登木素生物碱类的生成。
具有携带反应性基团的二硫化物模块的美登木素生物碱类和美登木素生物碱类衍生物的合成记载于美国专利No.6,441,163和6,333,410及美国申请No.10/161,651，通过提及而将每篇收入本文。
含有PEG的连接基团
也可以使用PEG连接基团来连接美登木素生物碱类与细胞结合剂，如美国专利No.6,716,821中所列的。这些PEG连接基团在水和非水性溶剂中都是可溶的，并且可以用于将一种或多种细胞毒剂与细胞结合剂连接。例示性的PEG连接基团包括异双功能性PEG接头，其经由一端的功能性硫氢基或二硫化物基团和另一端的活性酯在接头的相对末端结合细胞毒剂和细胞结合剂。
作为使用PEG连接基团来合成细胞毒性缀合物的通用例子，关于具体详情，再次参考美国专利No.6,716,821。
合成以一种或多种携带反应性PEG模块的细胞毒剂与细胞结合剂的反应开始，导致每个反应性PEG模块的末端活性酯被细胞结合剂，诸如2H11R35R74抗体的氨基酸残基替换，以生成包含经由PEG连接基团与细胞结合剂共价键合的一种或多种细胞毒剂的细胞毒性缀合物。有可能使用如下的PEG连接基团，其不经由功能性硫氢基或二硫化物基团来结合细胞毒剂。
如此，本发明的范围内包括式(XIII)的美登木素生物碱类，在本文中称为PEG4-NHAc-DM4：
Figure BDA00001723216000421
本发明的意义内还包括式(XIV)的美登木素生物碱类，在本文中称为PEG4-Mal-DM4：
Figure BDA00001723216000422
本发明的意义内还包括式(XXIV)的美登木素生物碱类，在本文中称为SPDB-DM4：
Figure BDA00001723216000431
本发明的意义内还包括式(XXV)的美登木素生物碱类，在本文中称为PEG4-NMeAc-DM4：
Figure BDA00001723216000432
本发明的意义内还包括式(XXVI)的美登木素生物碱类，在本文中称为PEG8-NHAc-DM4：
Figure BDA00001723216000433
本发明的意义内还包括式(XXVII)的美登木素生物碱类，在本文中称为PEG4-Allyl-DM4：
将含有反应性基团的美登木素生物碱类，诸如DM4与抗体诸如2H11R35R74抗体起反应，以生成细胞毒性缀合物，其中所述细胞毒剂共价附接于抗体。可以通过HPLC或通过凝胶过滤来纯化这些缀合物。
本发明的一个优选的实施方案是2H11R35R74抗体或其人源化型式的缀合物，所述缀合物包含共价附接于所述2H11R35R74抗体的细胞毒剂，所述细胞毒剂选自：式(XIII)的美登木素生物碱类和式(XIV)的美登木素生物碱类。在一个更优选的实施方案中，式(XIII)的美登木素生物碱类与本发明的2H11R35R74抗体的缀合会生成2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4缀合物。在另一个进一步优选的实施方案中，将式(XIV)的美登木素生物碱类与本发明的2H11R35R74抗体缀合以生成2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4缀合物。
如此，一个优选的实施方案涉及具有由式(XV)的结构组成的结构的抗体-药物缀合物：
Figure BDA00001723216000442
其中Ab是本发明的抗体，且n是包含在1和15间的整数。优先地，n包含在1和10之间。甚至更优先地，n包含在5和7之间。在另一个进一步优选的实施方案中，本发明的抗体是2H11R35R74抗体或其人源化型式，且缀合物是2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4缀合物。
如此，另一个优选的实施方案涉及具有由式(XVI)的结构组成的结构的抗体-药物缀合物：
Figure BDA00001723216000451
其中Ab是本发明的抗体，且n是包含在1和15间的整数。优先地，n包含在1和10之间。甚至更优先地，n包含在5和7之间。在另一个进一步优选的实施方案中，本发明的抗体是2H11R35R74抗体或其人源化型式，且缀合物是2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4缀合物。
美国专利No.6,333,410及美国申请No.09/867,598、10/161,651和10/024,290(将每篇完整收入本文)中提供了用于生成此类抗体-美登木素生物碱类缀合物的数种卓越的方案。
如上文所解释的，一般地，可以通过包括下列步骤的方法来获得缀合物：
(i)使任选缓冲的抗体水溶液与美登木素生物碱类的溶液接触；
(ii)然后，任选地分开在(i)中形成的缀合物与未反应的试剂和可能存在于溶液中的任何聚集体；
更具体地，可以将水性缓冲液中的抗体溶液与摩尔过量的美登木素生物碱一起温育，所述美登木素生物碱类具有携带反应性基团的二硫化物模块。可以通过添加过量的胺(诸如乙醇胺、牛磺酸(taurine)等)来淬灭反应混合物。然后可以通过凝胶过滤来纯化美登木素生物碱类-抗体缀合物。
在所述方法的一个方面，抗体是mu2H11R35R74抗体或其人源化型式。在所述方法的另一个方面，细胞毒剂是选自下组的细胞毒剂：
式(XVII)的化合物：
Figure BDA00001723216000452
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子；和式(XVIII)的化合物：
Figure BDA00001723216000461
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子。
实施例I中给出了可以与抗体和式(XVII)或(XVIII)的化合物一起使用的方法的例子。
可以通过测量基本上纯化的缀合物溶液于252nm和280nm的吸光度的比率用分光光度法测定每个抗体分子结合的美登木素生物碱类分子的数目(“药物比抗体比率”或“DAR”)(其在步骤(ii)后)。特别地，可以使用对抗体分别于280和252nm测量的消光系数用分光光度法测定所述DAR：εA280=224,000M-1cm-1和εA252=82,880M-1cm-1；假设平均160,000分子量(对于抗体)，且对于美登木素生物碱类，εD280=5,180M-1cm-1和εD252=26,159M-1cm-1。计算方法源自Antony S.Dimitrov(编),LLC,2009,Therapeutic Antibodies and Protocols,第525,445卷,Springer Science，并且在下文更为详细地描述：
在SEC分析(允许计算“DAR(SEC)”参数)的单体峰上或者使用经典的分光光度计装置(允许计算“DAR(UV)”参数)来测量缀合物于252nm(A252)和280nm(A280)的吸光度。吸光度可以如下表示：
A252=(CD X εD252)+(CA X εA252)
A280=(CD X εD280)+(CA X εA280)
其中：
CD和CA分别是美登木素生物碱类和抗体在溶液中的浓度
εD252和εD280分别是美登木素生物碱类于252nm和280nm的摩尔消光系数
εA252和εA280别是抗体于252nm和280nm的摩尔消光系数。
具有两个未知数的这两个等式的解析导致以下等式：
CD=[(εA280 x A252)-(εA252 x A280)]/[(εD252 x εA280)-(εA252 x εD280)]
CA=[A280-(CD x εD280)]/εA280
然后，自药物浓度与抗体浓度的比率计算平均DAR：
DAR=CD/CA
更具体地，用UV分光光度计测量的平均DAR(DAR(UV))高于4，更具体地4-10，甚至更具体地4-7，甚至更具体地5.5-8，且甚至更具体地5.9-7.5。
在又一个进一步优选的实施方案中，本发明包括2H11R35R74抗体或其人源化型式和式(XVII)或(XVIII)的化合物的缀合物，其中DAR包含在4-7个美登木素生物碱类分子/抗体分子间，所述DAR通过用分光光度法测量基本上纯化的缀合物的溶液于252nm和280nm的吸光度的比率来测定。
通过上述方法可获得的缀合物包含在本发明的范围内。在一个具体的方面，此类缀合物具有选自下组的结构：式(XV)和式(XVI)，其中Ab是本发明的抗体，且其中n包含在4和10之间。在一个优选的实施方案中，n包含在4和7之间。在另一个优选的实施方案中，所述缀合物具有式(XV)的结构。
可以对抗体与美登木素生物碱类药物的缀合物评估其在体外抑制各种不想要的细胞系增殖的能力。例如，可以容易地使用细胞系诸如人表皮样癌(epidermoid carcinoma)系A-431、人小细胞肺癌细胞系SW2、人乳腺肿瘤系SKBR3和伯基特氏淋巴瘤细胞系Namalwa来评估这些化合物的细胞毒性。可以将要评估的细胞暴露于所述化合物达24小时，并通过已知的方法在直接测定法中测量细胞的存活分数。然后，可以自测定法的结果计算IC50值。
茅屋霉素衍生物
依照本发明的细胞毒素也可以是茅屋霉素衍生物。茅屋霉素衍生物是吡咯[1,4]苯并二氮卓(benzodiazepines,PBDs)，即已知的一类通过共价结合DNA小沟中的鸟嘌呤N2来展现其生物学特性的化合物。PBD包括许多小沟结合剂诸如安曲霉素(anthramycin)、新丝拉霉素(neothramycin)和DC-81。
保留高细胞毒性并且可以有效连接细胞结合剂的新型茅屋霉素衍生物记载于国际申请No.PCT/IB2007/000142，通过提及而将其内容收入本文。细胞结合剂-茅屋霉素衍生物复合物允许仅针对不想要的细胞以靶向性方式应用茅屋霉素衍生物的完全限度的细胞毒性作用，因此避免了由于对非靶向的健康细胞的损伤所致的副作用。
依照本发明的细胞毒剂包含经由连接基团连接的一种或多种茅屋霉素衍生物和细胞结合剂，诸如2H11R35R74抗体。连接基团是经由常规方法与茅屋霉素衍生物共价结合的化学模块的一部分。在一个优选的实施方案中，可以经由二硫键将化学模块与茅屋霉素衍生物共价结合。
可用于本发明的茅屋霉素衍生物具有下文所显示的式(XX)：
Figure BDA00001723216000481
其中
----代表任选的单键；
代表单键或双键；
只要当
Figure BDA00001723216000483
代表单键时，U和U’(相同或不同)独立代表H，且W和W’(相同或不同)独立选自下组：OH、醚诸如-OR、酯(例如乙酸酯)，诸如-OCOR，碳酸酯诸如-OCOOR、氨基甲酸酯诸如-OCONRR’、环形氨基甲酸酯，使得N10和C11是环的一部分，脲诸如-NRCONRR’、硫代氨基甲酸酯诸如-OCSNHR、环形硫代氨基甲酸酯，使得N10和C11是环的一部分，-SH、硫化物诸如-SR、亚砜诸如-SOR、砜诸如-SOOR、磺酸酯诸如-SO3-、磺酰胺诸如-NRSOOR、胺诸如-NRR’、任选地环形胺，使得N10和C11是环的一部分、羟胺衍生物诸如-NROR’、酰胺诸如-NRCOR、叠氮基(azido)诸如-N3、氰基、卤素、三烷基(trialkyl)或三芳基磷、氨基酸衍生基团；优选地，W和W’是相同或不同的，并且是OH、OMe、OEt、NHCONH2、SMe；
并且在
Figure BDA00001723216000484
代表双键时，U和U’是缺乏的，且W和W’代表H;
·R1、R2、R1’、R2’是相同或不同的，且独立选自卤化物或任选地被下列一种或多种取代的烷基：Hal、CN、NRR’、CF3、OR、芳基、Het,S(O)qR，或者R1和R2及R1’和R2’分别一起形成含有基团=B和=B’的双键。
优选地，R1和R2及R1’和R2’分别一起形成含有基团=B和=B’的双键。
·B和B’是相同或不同的，且独立选自任选地被下列一种或多种取代的烯基：Hal、CN、NRR’、CF3、OR、芳基、Het、S(O)qR，或者B和B’代表氧原子。
优选地，B=B’。
更优选地，B=B’==CH2或=CH-CH3，
X,X’是相同或不同的，且独立选自下列一种或多种：
-O-、-NR-、-(C=0)-、-S(O)q-，
优选地，X=X’。
更优选地，X=X’=O。
·A,A’是相同或不同的，且独立选自任选地含有氧、氮、或硫原子的烷基或烯基，其各自任选地被下列一种或多种取代：Hal、CN、NRR’、CF3、OR、S(O)qR、芳基、Het、烷基、烯基。
优选地，A=A’。
更优选地，A=A’=线性的未取代烷基(alkyl)。
·Y，Y’是相同或不同的，且独立选自H、OR；
优选地，Y=Y’。
更优选地，Y=Y’=O烷基，更优选地O甲基。
·T是-NR-、-O-、-S(O)q-、或4至10元芳基、环烷基(cycloalkyl)、杂环或杂芳基，其各自任选地被下列一种或多种取代：Hal、CN、NRR’、CF3、R、OR、S(O)qR、和/或接头，或分支的烷基(alkyl)，其任选地被下列一种或多种取代：Hal、CN、NRR’、CF3、OR、S(O)qR和/或接头，或线性烷基，其被下列一种或多种取代：Hal、CN、NRR’、CF3、OR、S(O)qR和/或接头。
优选地，T是4至10元芳基或杂芳基，更优选地苯基或吡啶基，其任选地被一个或多个接头取代。
所述接头包含连接基团。合适的连接基团是本领域中公知的，并且包括硫醇、硫化物、二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团和酯酶不稳定性基团。优选的是二硫化物基团和硫醚基团。
在连接基团是含有硫醇、硫化物(或者所谓的硫醚-S-)或二硫化物(-S-S-)的基团时，携带硫醇、硫化物或二硫化物基团的侧链可以是线性或分支的、芳香族或杂环的。本领域普通技术人员可以容易地鉴定合适的侧链。
优选地，所述接头具有下式：
-G-D-(Z)p-S-Z’
其中
G是单或双键、-O-、-S-或-NR-；
D是单键或-E-、-E-NR-、-E-NR-F-、-E-O-、-E-O-F-、-E-NR-CO-、-E-NR-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、-E-S-、-E-S-F-、-E-NR-C-S-、-E-NR-CS-F-；
其中E和F是相同或不同的，且独立选自线性或分支的-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i-烷基-、-(OCH2CH2)i-、-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i杂环(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i-、-烷基-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i杂环(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-、-环烷基-烷基-、-烷基-环烷基-、-杂环-烷基-、-烷基-杂环-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基-、-烷基-杂芳基-、-杂芳基-烷基-；
其中i和j是相同或不同的整数，且独立选自0、1至2000；
Z是线性或分支的-烷基-；
P是0或1；
Z’代表H、硫醇保护基团诸如COR、R20或SR20，其中R20代表H、甲基、烷基，任选地取代的环烷基、芳基、杂芳基或杂环，只要在Z’是H时，所述化合物与通过源自在PBD模块之一的亚胺键-NH=上添加硫醇基团-SH的分子内环化所形成的相应化合物平衡。
·n、n’(相等或不同)是0或1，
·q是0、1或2。
·R,R’是相等或不同的，且独立选自H、烷基、芳基，其各自任选地被Hal、CN、NRR’、CF3、R、OR、S(O)qR、芳基、Het取代；
或其药学可接受盐、水合物或水合盐、或这些化合物的多形态晶体结构或其光学异构体、外消旋物、非对映异构体或对映异构体。
具有几何和立体异构体的通式(XX)的化合物也是本发明的一部分。
已知式(XX)的茅屋霉素衍生物的N-10,C-11双键在存在水、醇、硫醇、伯胺或仲胺、脲、和其它亲核试剂的情况中容易以可逆的方式被转化成相应的亚胺加成物。这种过程是可逆的，并且可以在存在脱水剂的情况中在非质子有机溶剂中、在真空中或高温下容易再生相应的茅屋霉素衍生物(Z.Tozuka,1983,J.Antibiotics,36:276)。
如此，通式(XXI)的茅屋霉素衍生物的可逆衍生物也可以用于本发明：
Figure BDA00001723216000511
其中A、X、Y、n、T、A’、X’、Y’、n’、R1、R2、R1’、R2’如在式(XX)中定义的，且W、W’是相同或不同的，且选自下组：OH、醚诸如-OR、酯(例如，乙酸酯)、诸如-OCOR、-COOR、碳酸酯诸如-OCOOR、氨基甲酸酯诸如-OCONRR’、环形氨基甲酸酯，使得N10和C11是环的一部分，脲诸如-NRCONRR’、硫代氨基甲酸酯诸如-OCSNHR、环形硫代氨基甲酸酯，使得N10和C11是环的一部分，-SH、硫化物诸如-SR、亚砜诸如-SOR、砜诸如-SOOR、磺酸酯诸如-SO3-、磺酰胺诸如-NRSOOR、胺诸如-NRR’、任选地环形胺，使得N10和C11是环的一部分、羟胺衍生物诸如-NROR’、酰胺诸如-NRCOR、-NRCONRR’、叠氮基诸如-N3、氰基、卤素、三烷基或三芳基磷、氨基酸衍生基团。优选地，W和W’是相同或不同的，并且是OH、Ome、Oet、NHCONH2、SMe。
如此，可以认为式(XXI)的化合物是溶剂化物，在溶剂是水时包含水；这些溶剂化物可以是特别有用的。
优选的化合物是那些具有式(XXII)或(XXIII)的化合物：
Figure BDA00001723216000512
其中X、X’、A、A’、Y、Y’、T、n、n’如上文那样定义。
可以以本领域技术人员公知的多种方式来制备式(XX)的化合物。可以例如通过应用或采用下文所描述的方法或如熟练技术人员领会的其变型来合成化合物。合适的修饰和取代对于本领域技术人员会是容易显而易见且公知的，或者从科学文献容易可获得。特别地，此类方法可以参见R.C.Larock,Comprehensive Organic Transformations,Wiley-VCH Publishers,1999。
用于合成可以在本发明中使用的茅屋霉素衍生物的方法记载于国际申请No.PCT/IB2007/000142。可以通过多种合成路径来制备本发明的化合物。试剂和起始材料是商品化的，或者本发明普通技术人员通过公知技术容易合成(见例如WO 00/12508,WO 00/12507,W0 2005/040170,WO 2005/085260,FR1516743,M.Mori等,1986,Tetrahedron,42:3793-3806)。
可以使用任何技术来形成本发明的缀合物分子。可以经由酸不稳定性接头，或者通过光不稳定性接头来连接本发明的茅屋霉素衍生物与抗体或其它细胞结合剂。可以将衍生物与具有合适序列的肽缩合，随后与细胞结合剂连接以生成肽酶不稳定性接头。可以将缀合物制备为含有伯羟基基团，其可以酰化，然后与细胞结合剂连接以生成可以通过胞内酯酶切割而释放游离衍生物的缀合物。优选地，将衍生物合成为含有游离的或受保护的硫醇基团，然后经由二硫键或硫醚连接来将一种或多种含有二硫化物或硫醇的衍生物分别与细胞结合剂共价连接。
USP 5,416,064和USP 5,475,092中教导了多种缀合方法。可以修饰茅屋霉素衍生物以产生游离的氨基基团，然后经由酸不稳定性接头或光不稳定性接头来连接抗体或其它细胞结合剂。可以将具有游离氨基或羧基基团的茅屋霉素衍生物与肽缩合，随后与细胞结合剂连接以生成肽酶不稳定性接头。可以将在接头上具有游离羟基基团的茅屋霉素衍生物酰化，然后与细胞结合剂连接以生成可以通过胞内酯酶切割而释放游离的药物的缀合物。最优选地，处理茅屋霉素衍生物以创建游离的或受保护的硫醇基团，然后，经由二硫键将含有二硫化物或硫醇的茅屋霉素二聚体与细胞结合剂连接。
优选地，单克隆抗体或细胞结合剂-茅屋霉素衍生物缀合物是那些经由二硫键连接的缀合物，如上文所讨论的，其能够投递茅屋霉素衍生物。通过已知方法，诸如通过用琥珀酰亚氨基吡啶基-二硫代丙酸酯(SPDP)修饰单克隆抗体(Carlsson等,1978,Biochem.J.,173:723-737)来制备此类细胞结合缀合物。然后，通过用含有硫醇的茅屋霉素衍生物处理来置换所得的硫代吡啶基基团以生成二硫化物连接的缀合物。或者，在芳基二硫代茅屋霉素衍生物的情况中，通过用先前导入抗体分子中的硫氢基基团直接置换茅屋霉素衍生物的芳基-硫醇来实现细胞结合缀合物的形成。容易通过任一方法制备含有经由二硫桥连接的1至10个茅屋霉素衍生物的缀合物。
更具体地，用含有硫醇的茅屋霉素衍生物(1.3摩尔当量/二硫代吡啶基基团)处理在含有2mM EDTA的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中的2.5mg/ml浓度的经二硫代-硝基吡啶基修饰的抗体的溶液。用分光光度法于325nm监测自经修饰的抗体释放的硝基吡啶硫醇(nitropyridinethione)，并且在约16小时中完成。通过凝胶过滤通过Sephadex G-25或Sephacryl S300柱来将抗体-茅屋霉素衍生物缀合物纯化，并且去掉未反应的药物和其它低分子量材料。可以通过测量230nm和275nm的吸光度比率来测定每个抗体分子结合的茅屋霉素衍生物模块数目。可以通过此方法经由二硫键连接平均1-10个茅屋霉素衍生物分子/抗体分子。
可以使用先前由Liu等,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93:8618-8623所描述的方法来测定缀合对针对抗原表达细胞的结合亲和力的影响。可以通过细胞增殖曲线的反推来测量茅屋霉素衍生物及其抗体缀合物对细胞系的细胞毒性，如记载于Goldmacher等,1985,J.Immunol.,135:3648-3651的。可以通过克隆形成(clonogenic)测定法来测定这些化合物对粘着细胞系的细胞毒性，如记载于Goldmacher等,1986,J.Cell Biol.,102:1312-1319的。
CC-1065类似物
在依照本发明的细胞毒性缀合物中使用的细胞毒剂也可以是CC-1065或其衍生物。
CC-1065是一种自Streptomyces zelensis的培养液分离的有力的抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外比通常使用的抗癌药物诸如多柔比星、甲氨蝶呤和长春新碱有力约1000倍(B.K.Bhuyan等,1982,Cancer Res.,42,3532-3537)。CC-1065及其类似物披露于美国专利No.6,372,738,6,340,701,5,846,545和5,585,499。
已经将CC-1065的细胞毒性效力与其烷基化活性及其DNA结合或DNA插入活性联系起来。这两种活性存在于分子的不同部分。如此，烷基化活性包含在环丙吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole,CPI)亚基中，而DNA结合活性存在于两个吡咯并吲哚亚基中。
虽然CC-1065作为细胞毒剂具有某些有吸引力的特征，但是它在治疗用途方面具有局限。对小鼠施用CC-1065引起延迟的肝毒性，导致静脉内单剂12.5μg/kg后第50天的致命性(V.L.Reynolds等,1986,J.Antibiotics,XXIX:319-334)。这已经激励开发不引起延迟的毒性的类似物的努力，并且已经描述了以CC-1065为模型的更简单的类似物的合成(M.A.Warpehoski等,1988,J.Med.Chem.,31:590-603)。
在另一批类似物中，通过环丙苯并吲哚(cyclopropa[c]benz[e]indole,CBI)模块置换CPI模块(D.L.Boger等,1990,J.Org.Chem.,55:5823-5833;D.L.Boger等,1991,BioOrg.Med.Chem.Lett,1:115-120)。这些化合物维持母药的高体外效力，而不引起小鼠中的延迟毒性。与CC-1065一样，这些化合物是烷化剂，其以共价方式结合DNA的小沟以引起细胞死亡。然而，对最有希望的类似物阿多来新(Adozelesin)和卡折来新(Carzelesin)的临床评估已经产生令人失望的结果(B.F.Foster等,1996,Investigational New Drugs,13:321-326;I.Wolff等,1996,Clin.Cancer Res.,2:1717-1723)。这些药物由于其高系统毒性而展现出较差的治疗效果。
可以通过对肿瘤部位的靶向性投递来改变体内分布，导致对非靶定组织的毒性降低，并且如此导致系统性毒性降低来极大地改善CC-1065类似物的治疗效力。为了实现此目的，已经描述了CC-1065的类似物和衍生物与特异性靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的缀合物(美国专利5,475,092;5,585,499;5,846,545)。这些缀合物通常展现出较高的体外靶物特异性细胞毒性，及小鼠中的人肿瘤异种移植物模型中的优越抗肿瘤活性(R.V.J.Chari等,1995,Cancer Res.,55:4079-4084)。
最近，已经描述了在水性介质中具有增强的溶解度的CC-1065类似物的前药(欧洲专利申请No.06290379.4)。在这些前药中，用如下的官能团保护分子烷基化部分的酚基团，所述官能团在酸性水溶液中贮存后使药物稳定，并且与不受保护的类似物相比对药物赋予升高的水溶解度。保护基团在生理学pH容易在体内切割以给出相应的活性药物。在记载于EP 06290379.4的前药中，酚取代基作为含有苯氨基甲酸酯的磺酸受到保护，其在生理学pH拥有电荷，并且如此具有增强的水溶解度。为了进一步增强水溶解度，可以将任选的聚乙二醇间隔物引入吲哚基亚基和可切割连接诸如二硫基间的接头中。此间隔物的引入不改变药物的效力。
用于合成可以在本发明的细胞毒性缀合物中使用的CC-1065类似物的方法以及用于缀合类似物与细胞结合剂诸如抗体的方法详细记载于EP06290379.4(通过提及而将其内容收入本文)和美国专利No.5,475,092,5,846,545,5,585,499,6,534,660和6,586,618及美国申请No.10/116,053和10/265,452。
其它药物
药物诸如甲氨蝶呤、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、长春新碱(vincrstine)、长春碱(vinblastine)、美法仑(melphalan)、细霉素(leptomycin)衍生物、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、加利车霉素(calicheamicin)、tubulysin和tubulysin类似物、duocarmycin和duocarmycin类似物、多拉司他汀(dolastatin)和多拉司他汀类似物诸如auristatin也适合于制备本发明的缀合物。药物分子也可以经由中间载体分子诸如血清清蛋白与抗体分子连接。如例如记载于美国专利No.6,630,579的多柔比星和柔红霉素化合物也可以是有用的细胞毒剂。
治疗性组合物
本发明还涉及用于治疗哺乳动物中的超增殖性病症的治疗性组合物，其包含治疗有效量的本发明的化合物和药学可接受载体。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症，包括(但不限于)下列各项：癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤；髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤、和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸胎癌，及仍要测定的主要表达EphA2的其它癌症。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗肺、乳腺、结肠、前列腺、肾、胰腺、卵巢、宫颈、和淋巴器官癌、骨肉瘤、滑膜癌、肉瘤、头和颈、胶质瘤、胃、肝或表达EphA2的其它癌。特别地，癌症是转移癌。在另一个实施方案中，所述药物组合物涉及其它病症，诸如例如自身免疫性疾病，诸如系统性狼疮(systemic lupus)、类风湿性关节炎、和多发性硬化；移植物排斥，诸如肾移植物排斥、肝移植物排斥、肺移植物排斥、心脏移植物排斥、和骨髓移植物排斥；移植物抗宿主病；病毒性感染，诸如mV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生物感染，诸如贾第鞭毛虫病(giardiasis)、阿米巴病(amoebiasis)、血吸虫病(schistosomiasis)及如本领域普通技术人员确定的其它疾病。
本发明提供了药物组合物，其包含：
有效量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物，和
药学可接受载体，其可以是惰性或生理上有活性的。
如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等的一种或者多种及其组合。在许多情况中，会优选的是组合物中包含等张剂诸如糖类、多元醇或氯化钠。特别地，合适载体的相关例子包括：(1)Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(pH约7.4)，其含有或不含约1mg/ml至25mg/ml人血清清蛋白，(2)0.9%盐水(0.9%w/v氯化钠(NaCl))，和(3)5%(w/v)右旋糖；并且还可以含有抗氧化剂诸如色胺和稳定剂诸如Tween 20。
本文中的组合物还可以含有别的治疗剂，如对于所治疗的特定病症必需的。优选地，本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物以及补充的活性化合物会具有互补的活性，其没有彼此不利地影响。在一个优选的实施方案中，所述别的治疗剂是成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白C、蛋白S、血小板衍生的生长因子(PDGF)或HER2受体的拮抗剂。
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂量形式，但是优选的形式取决于意图的施用模式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式。优选的施用模式是胃肠外(例如静脉内、肌内、腹膜内、皮下)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物作为推注静脉内，或者通过在一段时间里连续输注施用。在另一个优选的实施方案中，它们通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、肿瘤内、肿瘤周、损伤内、或损伤周路径注射，以施加局部以及系统性治疗效果。它们也可以通过雾化施用。
可以通过将需要量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物掺入合适的溶剂中，接着通过微滤进行灭菌来制备供胃肠外施用的无菌组合物。作为溶剂或媒介物，可以使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。在许多情况中，会优选的是组合物中包含等张剂例如糖类、多元醇或氯化钠。这些组合物还可以含有佐剂，特别是湿润、等张、乳化、分散和稳定剂。用于胃肠外施用的无菌组合物也可以以无菌固体组合物的形式制备，其可以在使用时溶解于无菌水或任何其它可注射无菌介质中。
剂量取决于期望的效果、治疗持续时间和所使用的施用路径；对于成人，它们一般在每日5mg和1000mg之间，单位剂量范围为1mg至250mg活性物质。
一般地，医生会根据对要治疗受试者特异性的年龄、重量和任何其它因素来决定合适的剂量。
治疗性使用方法
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于抑制EphA2受体活性的方法，其通过对有此需要的患者施用拮抗所述EphA2受体的抗体来进行。可以治疗性使用本发明的任何类型的抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物。如此，本发明包括使用拮抗性抗EphA2抗体、其片段、或其细胞毒性缀合物作为药物。在一个优选的实施方案中，拮抗性抗EphA2抗体是2H11R35R74抗体或其人源化变体。
在一个优选的实施方案中，使用本发明的抗体、抗体片段、或细胞毒性缀合物来治疗哺乳动物中的超增殖性病症。在一个更优选的实施方案中，使用上文所公开的，且含有本发明的抗体、抗体片段、或细胞毒性缀合物的药物组合物之一来治疗哺乳动物中的超增殖性病症。也是本发明的一个实施方案的是，也可以使用本发明的抗体、抗体片段、和细胞毒性缀合物来生成药物以治疗哺乳动物中的所述超增殖性病症。在一个实施方案中，病症是癌症。特别地，癌症是转移性癌症。也可以使用本发明的抗体、抗体片段、和细胞毒性缀合物来治疗所述癌肿瘤的心血管化。
因而，本发明的药物组合物可用于治疗或预防多种癌症，包括(但不限于)下列各项：癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤；髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤、和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸胎癌，及仍要测定的主要表达EphA2的其它癌症。在一个优选的实施方案中，癌症是肺、乳腺、结肠、前列腺、肾、胰腺、卵巢、宫颈、和淋巴器官癌、骨肉瘤、滑膜癌、肉瘤、头和颈、胶质瘤、胃、肝癌或表达EphA2的其它癌。在另一个实施方案中，所述药物组合物涉及其它病症，诸如例如自身免疫性疾病，诸如系统性狼疮(systemic lupus)、类风湿性关节炎、和多发性硬化；移植物排斥，诸如肾移植物排斥、肝移植物排斥、肺移植物排斥、心脏移植物排斥、和骨髓移植物排斥；移植物抗宿主病；病毒性感染，诸如mV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生物感染，诸如贾第鞭毛虫病(giardiasis)、阿米巴病(amoebiasis)、血吸虫病(schistosomiasis)及如本领域普通技术人员确定的其它疾病。
类似地，本发明提供了抑制选定细胞群生长的方法，包括使靶细胞或含有靶细胞的组织与单独的或与其它细胞毒剂或治疗剂组合的有效量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物或者包含细胞毒性缀合物的抗体、抗体片段或治疗剂接触。
可以在体外、体内或离体实施抑制选定细胞群生长的方法。如本文中所使用的，“抑制生长”意指减缓细胞生长，降低细胞存活力，引起细胞死亡，裂解细胞和诱导细胞死亡，无论是在短的还是长的时间段里。
体外使用的例子包括在其移植入相同患者前处理自体骨髓以杀死患病的或恶性的细胞；在其移植前处理骨髓以杀死有能力的T细胞并预防移植物抗宿主病(GVHD)；处理细胞培养物以杀死除了期望的不表达靶抗原的变体外的全部细胞；或者杀死表达不期望抗原的变体。
本领域普通技术人员容易确定非临床体外使用的条件。
临床离体使用的例子是在癌症治疗或自身免疫性疾病的治疗中在自体移植前自骨髓除去肿瘤细胞或淋巴样细胞，或者在移植前从自体或异基因骨髓或组织中除去T细胞和其它淋巴样细胞，以预防移植物抗宿主病(GVHD)。可以如下实施处理。从患者或其它个体收获骨髓，然后在添加有本发明细胞毒剂的含有血清的培养基中温育。浓度范围为约10μM至1pM，于约37°C持续约30分钟至约48小时。本领域普通技术人员容易确定精确的浓度条件和温育时间，即剂量。在温育后，用含有血清的培养基清洗骨髓细胞，并依照已知的方法通过i.v.输注返回到患者。在患者在收获骨髓和再输注经处理的细胞的时间之间接受其它治疗诸如消融化学疗法或全身照射过程的情况中，使用标准医学设备在液氮中冷冻贮存经处理的骨髓细胞。
对于临床体内使用，本发明的抗体、表位结合抗体片段或细胞毒性缀合物会作为溶液供应，对所述溶液测试无菌性和内毒素水平。细胞毒性缀合物施用的合适方案的例子如下。缀合物每周以每周i.v.推注给予4周。推注剂量在50至100ml可以添加有5至10ml人血清清蛋白的正常盐水中给予。剂量会是每次i.v.施用10μg至100mg(范围为每天100ng至1mg/kg)。更优选地，剂量范围会为50μg至30mg。最优选地，剂量范围会为1mg至20mg。在治疗4周后，患者可以继续接受每周一次的治疗。关于施用路径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床方案可以由本领域普通技术人员以临床情况保证(clinicalsituation warrant)确定。
诊断
也可以使用本发明的抗体或抗体片段来在体外或体内检测生物学样品中的EphA2。在一个实施方案中，使用本发明的抗EphA2抗体来测定组织或源自组织的细胞中的EphA2水平。在一个优选的实施方案中，组织是患病的组织。在方法的一个优选的实施方案中，组织是肿瘤或其活组织检查。在方法的一个优选的实施方案中，首先自患者切出组织或其活组织检查，然后可以在免疫测定法中用本发明的抗体或抗体片段测定组织或活组织检查中的EphA2水平。可以将组织或其活组织检查冷冻或固定。可以使用相同的方法来测定EphA2蛋白的其它特性，诸如其酪氨酸磷酸化水平、细胞表面水平、或细胞定位。
可以使用上文所描述的方法来诊断已知或怀疑患有癌症的受试者中的癌症，其中比较所述患者中测量的EphA2水平与正常参照受试者或标准品的。然后，可以使用所述方法来测定肿瘤是否表达EphA2，这可以提示肿瘤会良好地响应用本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物的治疗。优选地，肿瘤是肺、乳腺、结肠、前列腺、肾、胰腺、子宫、卵巢、宫颈和淋巴器官癌、骨肉瘤、滑膜癌、肉瘤、胶质瘤、胃、肝、头和颈癌或表达EphA2的其它癌及仍要测定的主要表达EphA2的其它癌。
本发明进一步提供了供研究或诊断应用的进一步标记的单克隆抗体、人源化抗体及其表位结合片段。在优选的实施方案中，标记物是放射性标记物、荧光团、生色团、成像剂或金属离子。
还提供了诊断方法，其中对怀疑患有癌症的受试者施用所述经标记的抗体或其表位结合片段，并且测量或监测受试者身体内的标记物的分布。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，例如包含所描述的细胞毒性缀合物和使用该细胞毒性缀合物杀死特定细胞类型的用法说明书。用法说明书可以包括体外、体内或离体使用细胞毒性缀合物的指导。
典型地，试剂盒会具有含有细胞毒性缀合物的区室。细胞毒性缀合物可以为冻干形式、液体形式或其它适于包含在试剂盒中的形式。试剂盒还可以含有实施试剂盒中的用法说明书上所描述方法需要的其它成分，诸如用于重建冻干粉末的无菌溶液、用于在对患者施用前与细胞毒性缀合物组合的其它药剂，以及辅助对患者施用缀合物的工具。
本发明还涉及制品，其包含：
a)包装材料，
b)抗体或其表位结合片段或缀合物，和
c)所述包装材料内含有的标签或包装插页，其指示所述抗体或其表位结合片段对于治疗癌症是有效的。
实施例
实施例1
缀合物的制备
2H11R35R74与DM4的缀合
通用合成方案
实施例1a：hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4
实施例1b：hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4
Figure BDA00001723216000621
方法A：高压液相层析-质谱术(LCMS)
已经在Waters UPLC-SQD系统上以正和/或负电喷雾模式(ES+/-)获得谱。层析条件如下：柱：ACQUITY BEH C18,1,7μm-2,1x30mm；溶剂：A：H2O(0,1%甲酸)B：CH3CN(0,1%甲酸)；柱温：45°C；流速：0,6ml/分钟；梯度(2分钟)：在1分钟中自5至50%B；1,3分钟：100%B；1,45分钟：100%B；1,75分钟：5%B。
方法B：高压液相层析-质谱术(LCMS)
已经在Waters ZQ系统上以正和/或负电喷雾模式(ES+/-)获得谱。层析条件如下：柱：XBridge C18 2,5μm 3x50mm；溶剂：A：H2O(0,1%甲酸)B：CH3CN(0,1%甲酸；柱温：70°C；流速：0,9ml/分钟；梯度(7分钟)：在5,3分钟中自5至100%B；5,5分钟：100%B；6,3分钟：5%B。
方法C：免疫缀合物的去糖基化和高分辨率质谱术(HRMS)
去糖基化是一种依靠糖苷酶进行酶消化的技术。自500μl缀合物+100μlTris缓冲液HCl 50mM+10μl聚糖酶-F酶(100个单位的冷冻干燥的酶/100μl水)进行去糖基化。将介质涡旋振荡，并于37°C维持一晚。然后，将去糖基化的样品准备好在HRMS中分析。在Waters Q-Tof-2系统中以电喷雾正模式(ES+)获得质谱。层析条件如下：柱：4μm BioSuite 250 URH SEC 4,6x300mm(Waters)；溶剂：A：甲酸铵25mM+1%甲酸；B：CH3CN；柱温：30°C；流速0,4ml/分钟；等度洗脱70%A+30%B(15分钟)。
方法D：分析用大小排阻层析(SEC)
Figure BDA00001723216000631
柱：TSKgel G3000 SWXL 5μm柱，7.8mm x 30cm,TOSOH BIOSCIENCE,LLC Part#:08541
Figure BDA00001723216000632
流动相：KCl(0.2M)、KH2PO4(0.052M)K2HPO4(0.107M)，iPrOH(按体积计为20%)
Figure BDA00001723216000633
分析条件：以0.5ml/分钟等度洗脱30分钟
方法E：质谱术(MS)
已经在WATERS GCTof系统(直接导入，而没有LC)上经由化学离子化(反应物气体：含氨的)获得谱。
方法F：高压液相层析-质谱术(LCMS)
已经在Waters UPLC-SQD系统上以正和/或负电喷雾模式(ES+/-)获得了谱。层析条件如下：柱：ACQUITY BEH C18 1,7μm-2,1x50mm；溶剂：A：H2O(0,1%甲酸)B：CH3CN(0,1%甲酸)；柱温：50°C；流速：1ml/分钟；梯度(2分钟)：在0.8分钟中自5至50%B；1,2分钟：100%B；1,85分钟：100%B；1,95：5%B。
缩写：
AcOEt：乙酸乙酯；ALK：(C1-C12)烯基基团，特别地(C1-C6)烯基；DAR：药物抗体比率；DBU：1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺；DCM：二氯甲烷；DEAD：偶氮二羧酸二乙酯；DIC：N,N’-二异丙基碳二酰亚胺；DIPEA：N,N-二异丙基乙胺：DMA：二甲基乙酰胺；DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DME：二甲氧基乙烷；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；ε：摩尔消光系数；EEDQ：2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉；EDCI：N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亚胺；EDTA：乙二胺四乙酸；Fmoc：芴基甲氧基羰基；Hal：卤素原子；HOBt：1-羟基苯并三唑；HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙磺酸；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；iPrOH：异丙醇；NMP：N-甲基吡咯烷酮；Rf：保留因子；RP：降低的压力；RT：室温；SEC：大小排阻层析；TBDMS：叔-丁基二甲基甲硅烷基；TEA：三乙胺；TFA：三氟乙酸；TFAA：三氟乙酸酐；TFF：正切流动过滤；THF：四氢呋喃(tetrahydrofurane)；TIPS：三异丙基甲硅烷基；TLC：薄层层析；tR：保留时间。
缓冲液内容物：
Figure BDA00001723216000641
缓冲液A(pH 6.5)：NaCl(50mM)、KPi(50mM)、EDTA(2mM)
Figure BDA00001723216000642
缓冲液HGS(pH 5.5)：组氨酸(10mM)、甘氨酸(130mM)、蔗糖5%(w/v)、HCl(8mM)
Ab和L-DM4浓度计算的参数(参照计算方法：Therapeutic Antibodies andProtocols,第525卷,445):
Figure BDA00001723216000643
hu2H11R35R74(于280nM为224000；于252nM为82880)和L-DM4(于280nM为5180；于252nM为26159)的摩尔消光系数，假设抗体为平均160000分子量。
实施例1a：
1a.1.与PEG4-乙酰氨基连接的缀合物的制备：
在磁搅动下，于室温，添加9ml hu2H11R35R74(缓冲液A中的14.36mg/ml)，然后是16.85ml缓冲液A、3.23ml HEPES 1M、1.59ml DMA、接着是1.64ml 10mM L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。在于室温1小时30分钟后，添加额外的0.085ml 10mML-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。在于室温1小时45分钟后，将粗制的缀合介质用60ml HGS缓冲液稀释，并通过在Pellicon 3盒上的TFF纯化。将样品针对约10个样品体积的HGS缓冲液透滤，然后收集。用额外的10mlHGS缓冲液清洗TFF罐和线。将两种溶液混合，通过0.22μm PVDF过滤灭菌，在Amicon 15上浓缩，并通过0.22μm PVDF过滤灭菌。如此，获得17mlhu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4免疫缀合物(c=5.76mg/ml)。然后，对免疫缀合物分析最终的药物负荷(drug load)和单体纯度。
SEC分析(方法D)：DAR(SEC)=5.4;RT=16.757；单体纯度=99.5%
HRMS数据(方法C)：见图2
1a.2.L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的制备：
Figure BDA00001723216000651
在磁搅动下，于室温，将154.3mg L-DM4导入玻璃小瓶中。然后，添加0.94ml DMA中的90mg 3-[2-(2-{2-[2-(2-溴代-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯溶液，接着是36μl DIEA。在于室温23小时后，将反应介质用5ml AcOEt稀释，并用7ml水清洗。用5ml AcOEt提取水相。将组合的有机相通过硫酸镁干燥，在降低的压力下浓缩至干燥。获得228mg浅黄色粘性油，将该产物用最少量的DMA稀释，并通过在30g C18嫁接的硅胶上进行的快速层析来纯化(洗脱梯度水:乙腈95:5至5:95(按体积计))。在降低的压力下将级分2和3浓缩后，获得无色的粘性油，将该产物用最少量的DMA稀释，并通过在30g C18嫁接的硅胶上进行的快速层析(flash-chromatography)来纯化(洗脱梯度水:乙腈95:5至5:95(按体积计))。在降低的压力下将级分33至35浓缩后，以白色蛋糖霜(meringue)样产物形式获得41mg L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯，其特征如下：
质谱：方法B
保留时间(分钟)=4,06
[M+H-H2O]+:m/z 1164;[M+H]+:m/z 1182；
[M-H+HCO2H]-:m/z 1226
NMR分析1H(500MHz,以ppm表示的δ，氯仿-d)：0,80(s,3H);1,21(s,3H);1,22(s,3H);1,25(m,1H);1,29(d,J=6,7Hz,6H);1,46(m,1H);1,57(d,J=13,4Hz,1H);1,64(s,3H);1,76至1,83(m,1H);1,88至1,96(m,1H);2,18(dd,J=2,5et 14,3Hz,1H);2,36(m,1H);2,53(m,1H);2,61(dd,J=12,5et 14,3Hz,1H);2,82至2,92(m,10H);2,98(d,J=16,7Hz,1H);3,03(d,J=9,6Hz,1H);3,15(d,J=12,9Hz,1H);3,22(s,3H);3,32(s大的,1H);3,36(s,3H);3,42(m,2H);3,50(d,J=9,1Hz,1H);3,53(t,J=5,2Hz,2H);3,58至3,67(m,13H);3,84(t,J=6,4Hz,2H);3,99(s,3H);4,27(m,1H);4,77(dd,J=2,9et 11,9Hz,1H);5,42(q,J=6,7Hz,1H);5,66(dd,J=9,1et 15,4Hz,1H);6,23(s,1H);6,43(dd,J=11,3et 15,4Hz,1H);6,64(d,J=1,1Hz,1H);6,74(d,J=11,3Hz,1H);6,85(d,J=1,1Hz,1H);7,08(t,J=5,2Hz,1H)。
1a.3.3-[2-(2-{2-[2-(2-溴代-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙 酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯的制备：
Figure BDA00001723216000661
在磁搅动下，于室温，将671.4mg 3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(CA(PEG)4,Pierce)导入玻璃小瓶中。然后添加14ml二氯甲烷中的597.4mg溴代-乙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯的溶液。在于室温15分钟后，添加0.396ml DIC(N,N’-二异丙基碳二酰亚胺)。在1小时30分钟后，将粗制反应介质在烧结玻璃上过滤，并通过在100g CN嫁接的硅胶上进行的快速层析来纯化滤液(洗脱梯度具有增加的iPrOH部分的n.庚烷/iPrOH/AcOEt)。在降低压力下将级分30至45浓缩后，以无色油形式获得了761mg3-[2-(2-{2-[2-(2-溴代-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯，其特征如下：
质谱：方法A
保留时间(分钟)=0,74
[M+H]+:m/z 483/485
[M-H+HCO2H]-:m/z 527/529
可以遵循公开的方案(Biochemistry，1974,481)来制备溴乙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯。
实施例1b：
1b.1.与PEG4-Mal连接的缀合物的制备：
Figure BDA00001723216000671
在磁搅动下，于室温，添加4ml hu2H11R35R74(缓冲液A中的14.36mg/ml)，然后是7.5ml缓冲液A、1.45ml HEPES 1M、1.15ml DMA，接着是0.305ml 10mM L-DM4-Mal-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。在于室温7小时后，将粗制的缀合介质用70ml HGS缓冲液稀释，并通过在Pellicon 3盒上的TFF纯化。将样品针对约10个样品体积的HGS缓冲液透滤，然后收集。用额外的10ml HGS缓冲液清洗TFF罐和线。将两种溶液混合，在Amicon 15上浓缩，并通过0.22μm PVDF过滤灭菌。如此，获得了8.0mlhu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4免疫缀合物(c=5.09mg/ml)。然后，对免疫缀合物分析最终的药物负荷和单体纯度。
SEC分析(方法D)：DAR(SEC)=5.3;RT=16.680；单体纯度=99.5%
HRMS数据(方法C)；见图3
1b.2.L-DM4-Mal-PEG4-CONHS活化酯的制备：
Figure BDA00001723216000672
在磁搅动下，于室温，连续添加50mg L-DM4、17.2mg支持的DIEA(3.72mmol/g)和360μl DMA中的36.2mg 3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-二氧-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯(商品化的，SM(PEG)4,Pierce)溶液。在于室温1小时30分钟后，将反应介质过滤，将固体用AcOEt清洗，并通过在14g CN嫁接的硅胶上进行的快速层析来直接纯化组合的滤液(洗脱梯度，具有增加的iPrOH贡献的庚烷:AcOEt:iPrOH)。在降低的压力下将含有期望产物的级分浓缩后，以无色玻璃形式获得了29.8mg L-DM4-Mal-PEG4-CONHS活化酯，其特征如下：
质谱：方法A
保留时间(分钟)=1,24/1,25(2种非对映异构体)
[M+H]+:m/z 1293
[M-H+HCO2H]-:m/z 1337
实施例1c：与SPDB连接的缀合物的制备：
使用SPDB(4-[2-吡啶基二硫代]丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)接头来将人源化2H11R35R74抗体与L-DM4 N2’脱乙酰基-N2’(4-甲基-4-疏基-1-氧戊基)-美登素缀合，其使用与用其它hu2H11抗体的先前记载于WO 2008010101A9中的相同方案进行。简言之，用5.5或6.5倍摩尔过量的SPDB(分别对于hu2H11和hu37.3D7)于8mg/mL修饰抗体。在具有EtOH(5%v/v)的缓冲液A(50mMKPi/50mM NaCl/2mM EDTA,pH 6.5,95%v/v)中于室温实施反应达90分钟。然后，用缓冲液A通过SephadexG25脱盐柱纯化经修饰的抗体。接着，通过SPDB接头将经修饰的抗体与1.7倍摩尔过量的DM4起反应。在缓冲液A(97%v/v)和DMA(二甲基乙酰胺,3%v/v)中于室温以2.5mg/mL抗体实施反应达20小时。用10mM组氨酸、130mM甘氨酸、5%蔗糖(pH5.5)通过SephadexG25脱盐柱纯化缀合物。药物与抗体比率是4.0(对于hu37.3D7-SPDB-DM4)和3.1(对于hu2H11-SPDB-DM4)。
实施例1d：缀合物hu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4的制备
Figure BDA00001723216000691
1d.1缀合物hu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4的制备
于RT在磁搅动下，添加4ml hu2H11R35R74(缓冲液A中的14.36mg/ml)，然后是7.5ml缓冲液A、1.45ml HEPES 1M、1.05ml DMA，接着是0.39ml 10mML-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。于室温30分钟后，添加额外的0.19ml 10mM L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。在于RT3小时后，将粗制缀合介质用65ml HGS缓冲液稀释，并通过在Pellicon 3盒上的TFF纯化。将样品针对约10个样品体积的HGS缓冲液透滤，然后收集。用额外的10ml HGS缓冲液清洗TFF罐和线。将两种溶液混合，在Amicon 15上浓缩，并通过0.22μm PVDF过滤灭菌。如此，获得了8.5mlhu2H11R35R74-PEG4-NMeAc-DM4缀合物(c=6.01mg/ml)。然后，对缀合物分析最终的药物负荷和单体纯度。
SEC分析(D)：DAR(SEC)=5.5；RT=16.7分钟；单体纯度=99.4%；HRMS 数据：见图14。
1d.2L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯的制备
于RT在磁搅动下，将133.4mg L-DM4导入玻璃小瓶中。然后添加0.2mlDMA中的85mg 3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴代-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯的溶液，接着是32.9μl DIEA。在于RT 1小时后，通过在30g C18嫁接的硅胶上进行的快速层析来纯化反应介质(洗脱梯度水:乙腈95:5至5:95(按体积计))。在RP下将含有期望产物的级分浓缩后，以无色玻璃样产物形式获得了71.3mgL-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯。质谱(D)：RT=0.98分钟；[M+H-H2O]+:m/z 1178(主要信号)；[M+Na]+:m/z 1218;[M-H+HCO2H]-:m/z 1240;1H NMR(500MHz,以ppm表示的δ，氯仿-d)：0,81(s,3H);1,20至1,33(m,13H);1,42至1,52(m,1H);1,56至1,61(m,1H);1,65(s,3H);1,73至1,83(m,1H);1,96至2,04(m,1H);2,19(dd,J=2,8和14,4Hz,1H);2,29至2,41(m,1H);2,55至2,66(m,2H);2,83至2,93(m,12H);3,04(d,J=9,8Hz,1H);3,12(d,J=12,7Hz,1H);3,18至3,25(m,5H);3,37(s,3H);3,47至3,54(m,3H);3,57至3,68(m,15H);3,85(t,J=6,6Hz,2H);3,99(s,3H);4,29(m,1H);4,79(dd,J=2,8和12,2Hz,1H);5,41(q,J=6,7Hz,1H);5,68(dd,J=9,3et 15,2Hz,1H);6,23(s,1H);6,43(dd,J=11,0和15,2Hz,1H);6,66(s,1H);6,74(d,J=11,0Hz,1H);6,83(s,1H)。
1d.3 3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴代-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧 基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯的制备
Figure BDA00001723216000701
在磁搅动下，于RT，在圆底烧瓶中，连续导入115.1mg 3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸、1.5ml DCM、97.3mg溴乙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯。在2小时后，添加72μl DIEA，并于RT再过1小时后，添加70.2μl DIC。将粗制的反应介质于RT保持4小时，于-20°C保持16小时，然后通过在30g硅胶上快速层析来纯化(洗脱梯度，DCM:甲醇，自0:100至3:97(按体积计))。在RP下将含有期望产物的级分浓缩后，以白色固体形式获得了85.8mg 3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴代-乙酰基)-甲基-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯。质谱(A)：RT=0,84分钟；[M+H]+:m/z497/499
1d.4 3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸的制 备
在氩的惰性气氛下，在圆底摇瓶中，在磁搅动的情况中，连续导入120.1mg 3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯、1ml无水THF和59.8μl CH3I。将反应介质用于约0°C的冰/水浴冷却，并按小份缓慢添加16.1mg NaH(在油中50%纯的)。在于0°C 15分钟，及于RT 1小时后，将粗制反应介质在RP下浓缩至干燥，并用0.5ml THF和0.8ml水稀释。然后，于RT，将30.6mg LiOH添加至反应介质。将粗制反应介质于RT保持2小时，于-20°C保持16小时，然后通过在30g C18嫁接的硅胶上快速层析来纯化(洗脱梯度，水:乙腈，自95:5至5:95(按体积计))。在RP下将含有期望产物的级分浓缩后，以黄色油形式获得了115.3mg 3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸。
1d.5 3-[2-(2-{2-[2-(2.2.2-三氟-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)- 乙氧基]-丙酸甲酯的制备
Figure BDA00001723216000711
在氩的惰性气氛下，在圆底摇瓶中，在磁搅动的情况中，连续导入230mg3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(CA(PEG)4,Pierce)、2ml DCM和1ml甲醇。于RT，将1ml三甲基甲硅烷基重氮甲烷(己烷中的2M溶液)缓慢添加至反应介质。在于RT 2小时后，通过添加乙酸来中和过量的三甲基甲硅烷基重氮甲烷。然后，将粗制反应介质在RP下蒸发至干燥。将获得的残留物用2ml DCM稀释，用水-冰浴冷却至0°C，然后连续添加363μlTEA和300μl TFAA。在于RT 2小时30分钟及于-20°C 19小时后，连续添加363μl TEA和300μl TFAA。在于RT 4小时30分钟后，并将粗制介质于-20°C贮存，然后通过在30g C18嫁接的硅胶上快速层析来纯化(洗脱梯度，水:乙腈，自95:5至5:95(按体积计))。在RP下将含有期望产物的级分浓缩后，以浅黄色油形式获得123mg 3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯。质谱(A)：RT=0,90分钟;[M+H]+:m/z 376;[M-H]-:m/z 374。
实施例1e：缀合物hu2H11R35R74-PEG8-NHAc-DM4的制备
1e.1缀合物hu2H11R35R74-PEG8-NHAc-DM4的制备
于RT在磁搅动下，添加4ml hu2H11R35R74(缓冲液A中的14.36mg/ml)，然后是7.5ml缓冲液A、1.45ml HEPES 1M、1.05ml DMA，接着是0.405ml10mM L-DM4-AcNMe-PEG8-CONHS活化酯的DMA溶液。在于RT 30分钟后，添加额外的0.1ml 10mM L-DM4-AcNMe-PEG8-CONHS活化酯的DMA溶液。在于RT 1小时45分钟后，将粗制的缀合介质用60ml HGS缓冲液稀释，并通过在Pellicon 3盒上的TFF纯化。将样品针对约10个样品体积的HGS缓冲液透滤，然后收集。用额外的10ml HGS缓冲液清洗TFF罐和线。将两种溶液混合，在Amicon 15上浓缩，并通过0.22μm PVDF过滤灭菌。如此，获得了7.0mlhu2H11R35R74-PEG8-AcNMe-DM4缀合物(c=6.95mg/ml)。然后，对缀合物分析最终的药物负荷和单体纯度。SEC分析(D)：DAR(SEC)=5.0;RT=16.593分钟;单体纯度=99.5%;HRMS数据：见图15。
1e.f L-DM4-AcNH-PEG8-CONHS活化酯的制备
于RT在磁搅动下，将65mg 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴代-丙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯导入玻璃小瓶中，接着是0.85ml DMA和16,5μlDIEA中的67.7mg L-DM4的溶液。于RT 48小时后，通过在10g硅胶上快速层析来纯化反应介质(洗脱梯度，DCM:MeOH 100:0至90:10(按体积计))。在将级分18至26在RP下浓缩后，以无色玻璃形式获得了17mgL-DM4-AcNH-PEG8-CONHS活化酯。质谱(B)：RT=4,08分钟;[M+H-H2O]+:m/z 1340(主要信号);[M+Na]+:m/z 1380;[M-H+HCO2H]-:m/z 1402;1H NMR(400MHz,以ppm表示的δ，氯仿-d):0.81(s,3H);1,22(s,3H);1,23(s,3H);1,26(m,1H);1,30(d,J=6,8Hz,6H);1,41至1,52(m,1H);1,65(s,3H);1,80(m,1H);1,89至1,99(m,1H);2,19(m,1H);2,37(m,1H);2,47à2,67(m,2H);2,81à2,93(m,10H);2,99(d,J=16,6Hz,1H);3,04(d,J=9,8Hz,1H);3,16(d宽的,J=13,7Hz,1H);3,23(s,3H);3,32(s宽的,1H);3,37(s,3H);3,44(m,2H);3,51(d,J=9,1Hz,1H);3,54(t,J=5,4Hz,2H);3,59à3,73(m,29H);3,86(t,J=6,6Hz,2H);4,00(s,3H);4,22至4,33(m,1H);4,78(dd,J=2,9和12,2Hz,1H);5,43(q,J=6,8Hz,1H);5,67(dd,J=9,0et 15,2Hz,1H);6,23(s,1H);6,44(dd,J=11,2et 15,2Hz,1H);6,65(d,J=1,5Hz,1H);6,75(d,J=11,2Hz,1H);6,86(d,J=1,5Hz,1H);7,02à7,13(m,1H)。
1e.g 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴代-丙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基 酯的制备：
Figure BDA00001723216000731
于RT在磁搅动下，将100mg 3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(CA(PEG)4,Pierce)、2ml DCM和53.5mg溴乙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯连续导入玻璃小瓶中。于RT 1小时后，添加35.1μl DIC。在1小时后，将粗制反应介质在烧结玻璃上过滤，在RP下浓缩至干燥，用10ml AcOEt稀释，在烧结玻璃上过滤，并在RP下浓缩至干燥。以无色油形式获得了76.5mg3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴代-丙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯。质谱 (A)：RT=0,80分钟；[M+H]+:m/z 659/661;[M-H+HCO2H]-:m/z 703/705
实施例1f：缀合物hu2H11R35R74-PEG4-烯丙基-DM4的制备
Figure BDA00001723216000741
1f.1缀合物hu2H11R35R74-PEG4-烯丙基-DM4的制备
于RT在磁搅动下，添加4ml hu2H11R35R74(缓冲液A中的14.36mg/ml)，然后是7.5ml缓冲液A、1.45ml HEPES 1M、1.14ml DMA，接着是0.3ml 10mML-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。于RT 30分钟后，添加额外的0.125ml 10mM L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。于RT1小时25分钟后，将粗制的缀合介质用65ml HGS缓冲液稀释，并通过在Pellicon 3盒上的TFF纯化。将样品针对约10个样品体积的HGS缓冲液透滤，然后收集。用额外的10ml HGS缓冲液清洗TFF罐和线。将两种溶液混合，在Amicon 15上浓缩，并通过0.22μm PVDF过滤灭菌。如此，获得了8.0mlhu2H11R35R74-PEG4-烯丙基-DM4缀合物(c=5.22mg/ml)。然后，对缀合物分析最终的药物负荷和单体纯度。SEC分析(H)：DAR(SEC)=5.3；RT=16.767分钟；单体纯度=99.4%；HRMS数据：见图16。
1f.2 L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯的制备
于RT在磁搅动下，将70mg L-DM4、45mg 3-(2-{2-[2-(4-溴代-丁-2-烯基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯(溴代-烯丙基-PEG4-CONHS)、0.5ml DMA和23.5μl DIEA连续导入玻璃小瓶中。于RT 2小时及于-20°C 17小时后，添加50μl DIEA。在于RT 24小时后，通过在30g C-18嫁接的硅胶上快速层析来纯化反应介质(洗脱梯度，水:乙腈95:5至5:95(按体积计))。在将含有预期产物的级分在RP下浓缩后，以白色固体形式获得了47.1mgL-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯。质谱(D):RT=1.06分钟；[M+Na]+:m/z 1173；1H NMR(500MHz，以ppm表示的δ，氯仿-d)：0.81(s,3H);1,18à1,39(m,13H);1,42至1,52(m,1H);1,58(d,J=13,4Hz,1H);1,65(s,3H);1,73至1,82(m,1H);1,86à1,95(m,1H);2,19(d,J=14,3Hz,1H);2,40(m,1H);2,51至2,65(m,2H);2,82至2,95(m,9H);2,98至3,07(m,2H);3,12(d,J=12,6Hz,1H);3,18至3,27(m,1H);3,23(s,3H);3,36(s,3H);3,51(d,J=9,1Hz,1H);3,54à3,82(m,13H);3,86(t,J=6,4Hz,2H);3,91à3,95(m,2H);3,99(s,3H);4,28(t,J=11,0Hz,1H);4,78(dd,J=2,6et 11,9Hz,1H);5,44(q,J=6,7Hz,1H);5,49至5,63(m,2H);5,68(dd,J=9,1和15,0Hz,1H);6,24(s,1H);6,43(dd,J=11,1和15,0Hz,1H);6,66(s,1H);6,77(d,J=11,1Hz,1H);6,83(s,1H)。
1f.3 3-(2-{2-[2-(4-溴代-丁-2-烯基氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基)-丙酸 2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯的制备
Figure BDA00001723216000751
于RT，将200mg 3-(2-{2-[2-(4-溴代-丁-2-烯基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸、4ml DCM和232.3mg支持的DCC(2个当量)连续导入玻璃小瓶中。于RT 1小时后，添加64.8mg NHS。于RT 5小时后，将粗制反应介质在烧结玻璃上过滤，将固体用DCM清洗，并将组合的滤液在RP下浓缩至干燥。通过在15g硅胶上快速层析纯化(洗脱梯度，MeOH:DCM 0:100至10:90(按体积计))，并将含有期望产物的级分在RP下浓缩，以浅黄色油形式获得46mg3-(2-{2-[2-(4-溴代-丁-2-烯基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸2,5-二氧-吡咯烷-1-基酯(溴代-烯丙基-PEG4-CONHS)。质谱(A)：RT=1,02分钟;[M+H]+:m/z 454/456;[M+Na]+:m/z 476/478;[M-H+HCO2H]-:m/z498/500。
1f.4 3-(2-{2-[2-(4-溴代-丁-2-烯基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸的 制备
于RT，将1g 3-(2-{2-[2-(4-溴代-丁-2-烯基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸叔丁酯(商品化的)、6ml TFA和3ml DCM的溶液在3小时期间搅动，然后在RP下浓缩至干燥。将油状残留物用甲苯稀释，并在RP下浓缩至干燥，提供853mg棕色油形式的3-(2-{2-[2-(4-溴代-丁-2-烯基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸。
实施例1g：缀合物hu2H11-PEG4-NHAc-DM4的制备
可以以与实施例1相似的方式制备了缀合物hu2H11-PEG4-NHAc-DM4：在搅动下，于RT，添加1ml hu2H11(缓冲液A中的8.52mg/ml)，然后是0.7ml缓冲液A、0.213ml HEPES 1M、0.7ml DMA，接着是0.085ml 10mM用0.128mlDMA稀释的L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯的DMA溶液。于RT 2小时后，将粗制介质在Amicon 4上以7000G浓缩，用HGS缓冲液在Nap-10柱上进行缓冲液更换，并且最终在5ml Zeba柱上纯化。如此，获得了1.15mlhu2H11-PEG4-NHAc-DM4缀合物(c=3.78mg/ml)。然后，对缀合物分析最终的药物负荷和单体纯度。SEC分析(方法D)：DAR(UV)=6.6；DAR(SEC)=5.6；RT=15.387分钟；单体纯度=99.7%;HRMS数据：见图17。
实施例2
hu2H11R35R74对EphA2自身磷酸化活性的抑制
材料和方法
细胞系和抗体
自ECAAC(参照#92020424)获得了乳腺癌细胞系MDA-MB-231。非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299获自ATCC(参照#CRL-5803)。将这两种细胞系在补充有10%热灭活的胎牛血清和2mM L-Gln的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中维持。重组小鼠肝配蛋白-A1胞外域/Fc嵌合物(肝配蛋白A1/Fc)获自Sigma(参照#E 9902)或R&D Systems(参照#602-A1)。抗Eck/EphA2克隆D7抗体(Ab)和抗磷酸酪氨酸Ab 4G10获自Millipore(分别为参照#05-480和05-321)。chKTI同种型对照Ab在Immunogen Inc.生成。它对应于抗Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂Ab(KTI,ATCC参照#HB9515)的嵌合型式，其中通过人κ轻链和人γ1重链替换Ig重和轻链恒定区。重组Ab在ImmunoGen(chKTI批次#2539-91)自用重和轻链的表达质粒瞬时转染的HEK293T细胞的培养物上清液纯化。人源化抗EphA2 Ab hu2H11(批次#LP08191)和hu2H11R35R74(批次#LP09077)在Sanofi-Aventis自经稳定转染的Lonza中国仓鼠卵巢(CHO)/GS细胞系生成。依照标准的规程通过在蛋白A-Sepharose上亲和层析，接着进行阴离子交换层析自培养物上清液纯化这两种Ab。在陶瓷羟磷灰石上实施另外的层析步骤。将所有制备物在1 x PBS中于4°C贮存，并通过使用动力学LAL方法来测试低内毒素水平。抗肌动蛋白抗体克隆C4来自Millipore(参照#MAB1501)。经过氧化物酶(PO)缀合的山羊抗小鼠IgG Ab来自JacksonImmunoresearch(参照#115-035-003)。
磷酸化的诱导
将MDA-MB-231细胞以每块板3 x 106个细胞在P100培养皿(每个样品5块板)中在完全培养基中铺板，并于37°C在CO2培养箱中温育48小时。让细胞血清饥饿18小时，随后用hu2H11或hu2H11-R35/R74 10μg/mL或用2μg/mL的肝配蛋白A1/Fc于37°C处理10分钟至2小时。
对磷酸化的抑制
将血清饥饿的MDA-MB-231或NCI-H1299细胞与chKTI、hu2H11或hu2H11R35R74(10g/mL)于37°C一起温育1小时。然后，将肝配蛋白A1/Fc以1μg/mL添加，并将细胞于37°C再温育10-30分钟。
细胞提取物的制备
将细胞样品通过刮擦在冰上收获，转移至15mL圆锥管中，并以1300rpm离心5分钟。在用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS;Invitrogen#14190)清洗一次后，将细胞在300μl临时补充有1mM苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulphonylfluoride,PMSF)、1x蛋白酶抑制剂混合物(Sigma参照#P2714)和1 x Halt磷酸酶抑制剂(Pierce参照#78420)的裂解缓冲液(Biosource参照#FNN0011)中重悬。将细胞提取物在冰上在偶然涡旋振荡的情况中保持45分钟，以15000rpm离心10分钟，并于-80°C保持，直至进一步使用。使用来自Pierce(参照#23227)的试剂盒通过二辛可宁酸(BCA)法来测定蛋白质浓度。
免疫沉淀
通过添加先前在裂解缓冲液中平衡(在旋转仪上于4°C 1小时)的蛋白GSepharose 4快速流动(fast flow)(GE Healthcare Life Sciences参照#17-0618-01)来实施细胞提取物(每份样品0.3-0.5mg)的预清洁步骤。在旋转仪上于4°C实施温育30分钟。将样品以1500rpm离心2分钟，将上清液收集，并在旋转仪上与抗EphA2 Ab克隆D7(每份样品4μl)一起温育过夜。在旋转仪上于4°C用蛋白GSepharose实施免疫沉淀4小时。将样品以1500rpm于4°C离心2分钟，并用100μl裂解缓冲液清洗3次，5分钟。将免疫沉淀珠在补充有NuPAGE还原剂(Invitrogen参照#NP0009)的50μl 4 x NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen参照#NP0007)中重悬，于95°C加热5分钟，以1500rpm离心5分钟，并于-20°C保持或者进行电泳。
免疫印迹
与参照分子量标志物(GE healthcare Life Sciences参照#RPN800)一起将免疫沉淀物或细胞提取物在4-12%Bis-Tris Midi凝胶(Invitrogen#NP0322BOX)上上样，并以150V在MOPS-SDS缓冲液1x(Invitrogen参照#NP0001)中实施电泳3小时。用i-blotTM装置(Invitrogen)使用程序3在PVDF膜(Invitrogen参照#LC2007)上实施电印迹。在补充有5%牛血清清蛋白的TBST1x(即，Tris-缓冲盐水Sigma参照#T 5912、0.1%Tween 20Sigma参照#P1379)中实施对膜的封闭。于4°C在相同缓冲液中将用抗EphA2 Ab克隆D7或抗磷酸酪氨酸4G10 Ab的标记实施过夜。将用抗肌动蛋白Ab克隆C4的标记于室温实施1小时。在随后用1 x TBST清洗膜后，使用经PO缀合的山羊抗小鼠Ab和来自Perkin Elmer(参照#NEL 104001 EA)的ECL试剂盒来实施免疫印迹的显现。在Fuji4000装置上读取发光。
结果
使用重组肝配蛋白A1/Fc作为阳性对照在MDA-MB231细胞中调查hu2H11或hu2H11R35R74 Ab对EphA2磷酸化的诱导。图4中呈现了结果。自10分钟至2小时用两种Ab之任一不能检测到磷酸化的诱导，而重组肝配蛋白A1/Fc在10分钟时诱导强烈的EphA2受体磷酸化，其中信号在1小时时开始下降，并且受体降解在2小时时开始可见。
在NCI-H1299和MDA-MB-231细胞中调查肝配蛋白A1/Fc诱导后对EphA2磷酸化的抑制。在图5A和5B中呈现了结果。在这两种情况中，细胞与两种Ab之任一的预温育抑制了肝配蛋白A1/Fc对EphA2受体的磷酸化。
我们可以推断hu2H11和hu2H11R35R74对EphA2受体具有相似的抑制活性。
实施例3
经缀合的抗EphA2抗体hu2H11R35R74和hu2H11的结合表征。
使用BIAcore 3000仪(GE healthcare,N°CH321)通过表面等离振子共振检测来监测抗EphA2抗体hu2H11和hu2H11R35R74(或是裸露的或是用PEG4-NHAc接头与DM4缀合的)与固定化的EphA2-Fc的相互作用。使用标准的胺偶联方案用EDC(N-乙基-N’-[二甲基-氨丙基]碳二亚胺)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)以10μl/分钟将EphA2-Fc(10mg/ml；乙酸缓冲液pH=4.5)与C1传感器芯片(GE healthcare BR-1005-40)的基质偶联。在动力学结合实验中以约100个响应单位(RU)的升高的响应水平控制密度。将IgG在含有0.15M NaCl、3mMEDTA和0.005%P20的0.01M Hepes,pH 7.4中稀释。在相同缓冲液中进行所有随后的稀释。于25°C以范围通常为50至0.2nM的IgG浓度以50μl/分钟的流速实施所有结合实验。
将数据收集约12分钟(2分钟结合时间和10分钟解离时间)，并以30μl/分钟1M NaCl、50mM NaOH使用1分钟脉冲来再生表面。还将IgG在未包被的室上流过，并自那些用EphA2-Fc偶联芯片获得的传感图扣除来自空白运行的传感图。将数据以漂流基线(drifting baseline)拟合至1∶1朗缪尔(Langmuir)结合模型。此算法计算kon和koff两者，自其将表观平衡解离常数KD推导为两个速率常数的比率(koff/kon)。表I中标示了获得的数值。
首先，用裸露的hu2H11和hu2H11R35R74测量亲和常数。对hu2H11与EphA2-Fc的结合数据的分析给出0.30nM的KD；此数值与hu2H11R35R74的KD(0.22nM)相似。然而，在测定法中使用经缀合的抗体时，结果是显著不同的：在与裸露的抗体相比时，具有高的药物与抗体比率诸如7.5的经缀合的hu2H11展现出升高5.4倍的KD(1.62nM对0.30nM)。另一方面，以药物与抗体比率7.4缀合的hu2H11R35R74的KD与裸露抗体的KD不是不同的(0.27nM对0.22nM)。此外，KD对于范围为5.6至8.4的药物与抗体比率不是显著不同的。
我们推断2H11R35R74抗体的亲和力不受缀合影响，即使药物与抗体比例较高。
实施例4
人源化2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4对EphA2表达肿瘤细胞生长的抑制对Lovo肿瘤细胞的抑制
将Lovo肿瘤细胞(每孔2000个)在含有血清的完全培养基中在96孔组织培养板中分配。将缀合物连续稀释，并以范围在10-7和10-12M间的浓度添加至一式三份的孔。将细胞在存在抗体-细胞毒性化合物缀合物的情况中于37°C/5%CO2培养5天，在该时间后，依照制造商的用法说明书(Dojindo细胞计数试剂盒-8,产品目录编号CK04)实施4小时WST8测定法以评估细胞存活和生长。自测试孔读出扣除无细胞试剂空白，并将数据绘图为通过用经缀合物处理的细胞的读出除以来自经媒介物处理的细胞的对照孔的读出的平均值来获得的存活分数。
将高美登素/抗体比率(6.70D/A和7.00D/A)的两批hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4的细胞毒性效力与具有相当的美登素/抗体比率(6.99D/A)的野生型hu2H11-PEG4-Mal-DM4缀合物的细胞毒性效力比较。如可以在图7中看到的，两种hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4缀合物显示比野生型hu2H11的相应缀合物更高的针对EphA2阳性Lovo细胞系的效力(表II)。
实施例5
人源化2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4对EphA2表达肿瘤细胞生长的抑制对MDA-MB231和SKMEL28生长的抑制
将指数生长期的细胞用胰蛋白酶处理，并在其相应的培养基(DMEM/F12Gibco#21331；10%SVF Gibco#10500-056；2nM谷氨酰胺Gibco#25030(对于MDA-MB231细胞)；DMEM(Gibco#11960)10%SVF Gibco#10500-056；2nM谷氨酰胺Gibco#25030(对于SKMEL-28细胞))中重悬。将细胞悬浮液以5000个细胞/孔的密度(MDA-MB231,SKMEL-28)在含有血清的完全培养基中在96孔Cytostar培养板(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中分配。在包被4小时后，将缀合物的连续稀释液以范围为在10-7和10-12M间的浓度添加至一式三份的孔。将细胞在存在抗体-细胞毒性化合物缀合物的情况中于37°C/5%CO2培养3天。在第4天，将10μl 14C胸苷(0.1μCi/孔)(Perkin Elmer#NEC56825000)溶液添加至每孔。在实验开始后96小时用Microbeta放射性计数器(Perkin Elmer)来测量14C胸苷的摄取。自测试孔读出扣除无细胞试剂空白，并将数据绘图为通过用经缀合物处理的细胞的读出除以来自经媒介物处理的细胞的对照孔的读出的平均值来获得的存活分数。在一些实验中，在开始实验时将裸露的抗体(2H11或2H11R35R74)以1μM的浓度添加至孔，并测量对增殖的抑制，如先前所描述的。
结果
在表III中报告的结果提示了，2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4及2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4缀合物就对MDA-MB231细胞的体外增殖抑制及针对抗原负性细胞(SKMEL-28)的体外选择性而言比前一些缀合物更高。
实施例6
药代动力学研究
本研究设计为评估与hu2H11-SPDB-DM4缀合物(DAR=3.9)相比hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4缀合物(DAR=5.5)在CD-1小鼠中的药代动力学行为。动物通过IV路径来接受20mg/kg每种缀合物，并且在注射后0,8,24,48,72,120,168,240,336,504,672小时收集血液。在标准条件下测量抗体药物缀合物的血浆水平以建立基础单剂药代动力学参数。通过特异性ELISA技术来测量缀合物及其抗体构件(总体抗体，即经缀合物的抗体和任何去缀合的抗体的总和)的血浆浓度。
hu2H11-SPDB-DM4的抗体构件(总的)的清除相关药代动力学参数计算为：CI(清除)为0.00043L/h/kg，T1/2(末端半衰期)为160小时，AUC 0-inf(从时间0至无穷大的浓度时间曲线下面积)为47,000,000ng.h/mL，Vdss(分布的稳态体积)为0.095L/kg，而C0(在时间0时的浓度)为270,000ng/mL。
hu2H11-SPDB-DM4缀合物的药代动力学参数计算为：CI为0.00070L/h/kg，T1/2为87小时，AUC 0-inf为28,000,000ng.h/mL，Vdss为0.080L/kg，而C0为360,000ng/mL。
hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的抗体构件(总的)的PK参数为：CI为0.00027L/h/kg，T1/2为190小时，AUC 0-inf为73,000,000ng.h/mL，Vdss为0.068L/kg，而C0为530,000ng/mL。
最后，hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4缀合物显示下列数值：对于清除为0.00036L/h/kg、T1/2为150h，AUC 0-inf为56,000,000ng.h/mL，Vdss为0.069L/kg，而C0为600,000ng/mL。
总之，hu2H11-SPDB-DM4缀合物比hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4更快地清除。此外，与hu2H11-SPDB-DM4相比，hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4显示更好的暴露(AUC 0-inf)和在总的经缀合抗体与总的抗体曲线间更窄的分开(比较图7和8)。
实施例7
hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4和hu2H11-PEG4-NHAc-DM4缀合物针 对雌性SCID小鼠中植入的原发性结肠肿瘤CR-LRB-004P的抗肿瘤效果
材料和方法
为了评估缀合物的抗肿瘤活性，每天对动物称重，并且通过测径器对肿瘤每周测量2次。使用公式质量(mg)=[长度(mm)x宽度(mm)2]/2来计算肿瘤重量。在最高的非毒性剂量(HNTD)完成抗肿瘤活性评估。
认为在最低点产生20%体重减轻(bwl)(组的均值)或10%或更大的药物死亡的剂量是过度毒性剂量。动物体重包括肿瘤重量。主要功效终点是ΔT/ΔC、百分比中值消退、部分和完全消退(PR和CR)及无肿瘤存活者(TFS)。
通过自规定的观察日的肿瘤体积扣除第一次处理当天(起始日)的肿瘤体积对每个肿瘤计算每个经处理(T)和对照(C)的肿瘤体积变化。对处理组计算中值ΔT，而对对照组计算中值ΔC。然后，计算比率ΔT/ΔC，并表示为百分比：
Figure BDA00001723216000821
认为在ΔT/ΔC低于40%时，剂量是治疗活性的，且在ΔT/ΔC低于10%时，是非常有活性的。若ΔT/ΔC低于0，则认为剂量是高度活性的，并且消退百分比是载明日期的(dated)(参照1)：
%肿瘤消退：定义为在规定的观察日与其在第一次处理的第一天的体积相比处理组中的肿瘤体积缩小的%。
在特定的时间点时及对于每只动物，计算%消退。然后，对每组计算中值%消退。
部分消退(PR)：若肿瘤体积缩小到在开始处理时的肿瘤体积的50%，则消退定义为部分的。
完全消退(CR)：在肿瘤体积=0mm3时，实现完全消退(在不能记录到肿瘤体积时认为CR)。
TFS：无肿瘤定义为在研究结束时(在最后一次处理后大于100天)检测不到肿瘤的动物
结果
在两剂水平针对雌性SCID小鼠中S.C.植入的强烈表达靶物的可测量原发性结肠肿瘤CR-LRB-004P评估hu2H11-PEG4-NHAc-DM4-缀合物和hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的抗肿瘤效果。将对照组保持未处理。剂量以每千克的毫克蛋白质表述。在第15天通过静脉内(IV)推注以40和10mg/kg施用hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4。为了给予等同剂量的DM4，以44和11mg/kg施用hu2H11-PEG4-NHAc-DM4。
如表V上所显示的，在CR-LRB-004P肿瘤中使用单次施用日程表，hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4在40和10mg/kg时是有活性的，分别具有28和39%的△T/△C，而hu2H11-PEG4-NHAc-DM4仅在44mg/kg时是有活性的，具有26%的△T/△C。在10mg/kg，hu2H11-PEG4-NHAc-DM4在此模型中没有活性。
从这些结果看，较低剂量的hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4-缀合物比hu2H11-PEG4-NHAc-DM4缀合物展现出更好的活性。
实施例8
DAR对hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4针对SCID雌性小鼠中的前列腺癌 PC-3的抗肿瘤活性的影响
评估DAR对抗体药物缀合物hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的抗肿瘤活性的影响，其对雌性SCID中S.C.植入的前列腺PC-3肿瘤在6种不同药物抗体比率(DAR)比较两种低效率剂量。将对照组保持未处理。剂量以每千克的毫克蛋白质表示。通过UV方法测定DAR。在第16天通过静脉内(IV)推注分别以10和5mg/kg以3.4、4.4、5.9、6.2、7.4和8.4的DAR施用hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4。
材料和方法
为了评估缀合物的抗肿瘤活性，每天对动物称重，并且通过测径器对肿瘤每周测量2次。使用公式质量(mg)=[长度(mm)x宽度(mm)2]/2来计算肿瘤重量。在最高的非毒性剂量(HNTD)完成抗肿瘤活性评估。
认为在最低点产生20%体重减轻(bwl)(组的均值)或10%或更大的药物死亡的剂量是过度毒性剂量。动物体重包括肿瘤重量。主要功效终点是ΔT/ΔC、百分比中值消退、部分和完全消退(PR和CR)及无肿瘤存活者(TFS)。
通过自规定的观察日的肿瘤体积扣除第一次处理当天(起始日)的肿瘤体积对每个肿瘤计算每个经处理(T)和对照(C)的肿瘤体积变化。对处理组计算中值ΔT，而对对照组计算中值ΔC。然后，计算比率ΔT/ΔC，并表示为百分比：
Figure BDA00001723216000841
认为在ΔT/ΔC低于40%时，剂量是治疗活性的，且在ΔT/ΔC低于10%时，是非常有活性的。若ΔT/ΔC低于0，则认为剂量是高度活性的，并且消退百分比是载明日期的(参照1)：
%肿瘤消退：定义为在规定的观察日与其在第一次处理的第一天的体积相比处理组中的肿瘤体积缩小的%。
在特定的时间点时及对于每只动物，计算%消退。然后，对每组计算中值%消退。
Figure BDA00001723216000842
部分消退(PR)：若肿瘤体积缩小到在开始处理时的肿瘤体积的50%，则消退定义为部分的。
完全消退(CR)：在肿瘤体积=0mm3时，实现完全消退(在不能记录到肿瘤体积时认为CR)。
TFS：无肿瘤定义为在研究结束时(在最后一次处理后大于100天)检测不到肿瘤的动物
结果
如表VI中所显示的，使用单次施用日程表，10mg/kg的hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4自4.4的DAR至8.4的较高DAR显示活性。
在5mg/kg，hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4自5.9的DAR至8.4的较高DAR显示活性。
总之，DAR对hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的肿瘤活性具有影响，并且可以自这些结果推导hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的最佳DAR至少等于5.9。
实施例9
DAR对hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的PK参数的影响。
在单次静脉内施用20mg/kg缀合物后在雄性CD-1小鼠中评估了不同药物-抗体比率(DAR)的hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的药代动力学特性。在标准条件下测量缀合物的血浆水平以建立基础单剂药代动力学参数。将PK参数与裸露的亲本抗体的PK参数比较。通过特异性ELISA技术来测量缀合物及其抗体构件(总体抗体，即经缀合的抗体和任何去缀合的抗体的总和)的血浆浓度。
结果(见图9A和9B)显示了DAR数值与分别具有83,000,000、61,000,000、48,000,000、46,000,000、41,000,000和27,000,000ng·h/mL的AUC 0-inf值(对于0、3.4、4.3、5.9、6.6和7.4的DAR)的对总抗体构件的暴露间的反相关。
类似地，在DAR值与分别具有39,000,000、30,000,000、27,000,000、29,000,000和20,000,000ng·h/mL的AUC 0-inf值(对于3.4、4.3、5.9、6.6和7.4的DAR)的对缀合物的暴露间存在着反相关。
在DAR值与分别具有0.00024、0.00033、0.00042、0.00043、0.00049和0.00074L/h/kg的CI值(对于DAR 0、3.4、4.3、5.9、6.6和7.4)的抗体构件消除间存在着完美的关联。
类似地，在DAR值与分别具有0.00051、0.00066、0.00075、0.00069、0.00099L/h/kg的CI值(对于DAR 3.4、4.3、5.9、6.6和7.4)的缀合物消除间几乎存在着完美的关联。
总之，DAR对PK参数具有影响，在DAR增加时暴露降低且消除升高。
依照来自功效和PK评估的结果，最佳的DAR会包含在5.9和7.4之间。
实施例10
针对SCID雌性小鼠中的前列腺癌PC-3评估 hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4
在8个剂量水平针对雌性SCID小鼠中S.C.植入的强烈表达靶物的可测量前列腺PC-3肿瘤评估抗体药物缀合物hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4的抗肿瘤效果。将对照组保持未处理。剂量以每千克的毫克蛋白质表示。
在第17天时通过静脉内(IV)推注以160、120、80、40、20、10、5和2.5mg/kg施用它们。
材料和方法
为了评估缀合物的抗肿瘤活性，每天对动物称重，并且通过测径器对肿瘤每周测量2次。使用公式质量(mg)=[长度(mm)x宽度(mm)2]/2来计算肿瘤重量。在最高的非毒性剂量(HNTD)完成抗肿瘤活性评估。
认为在最低点产生20%体重减轻(bwl)(组的均值)或10%或更大的药物死亡的剂量是过度毒性剂量。动物体重包括肿瘤重量。主要功效终点是ΔT/ΔC、百分比中值消退、部分和完全消退(PR和CR)及无肿瘤存活者(TFS)。
通过自规定的观察日的肿瘤体积扣除第一次处理当天(起始日)的肿瘤体积对每个肿瘤计算每个经处理(T)和对照(C)的肿瘤体积变化。对处理组计算中值ΔT，而对对照组计算中值ΔC。然后，计算比率ΔT/ΔC，并表示为百分比：
Figure BDA00001723216000861
认为在ΔT/ΔC低于40%时，剂量是治疗活性的，且在ΔT/ΔC低于10%时，是非常有活性的。若ΔT/ΔC低于0，则认为剂量是高度活性的，并且消退百分比是载明日期的(参照1)：
%肿瘤消退：定义为在规定的观察日与其在第一次处理的第一天的体积相比处理组中的肿瘤体积缩小的%。
在特定的时间点时及对于每只动物，计算%消退。然后，对每组计算中值%消退。
Figure BDA00001723216000862
部分消退(PR)：若肿瘤体积缩小到在开始处理时的肿瘤体积的50%，则消退定义为部分的。
完全消退(CR)：在肿瘤体积=0mm3时，实现完全消退(在不能记录到肿瘤体积时认为CR)。
TFS：无肿瘤定义为在研究结束时(在最后一次处理后大于100天)检测不到肿瘤的动物
结果
使用单次施用日程表，发现测试的最高缀合物剂量(160mg/kg)是有毒性的，诱导体重减轻和药物相关死亡。
如表VIII上所显示的，在HNTD(120mg/kg)及其它最低剂量，化合物是高度活性的。对于除了2.5mg/kg外的所有剂量，hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4诱导部分消退，而对于120、80和20mg/kg，它诱导完全消退。另外，肿瘤模型是恶病质的(cachexic)，并且与对照相比，施用化合物在最低点降低体重减轻。
总之，hu2H11R35R74-PEG4-NHAc-DM4对前列腺PC-3肿瘤模型显示高活性及良好的剂量效果。
实施例11
通过以2.1埃分辨率结构测定与来自hu2H11-R35-R74的Fab片段复合的 EphA2受体胞外域的晶体结构来定位表位并鉴定互补位。
材料和方法
对与hu2H11R35-74的Fab复合的EphA2受体-Fc的糖基化胞外域进行初始的结晶试验。仅在存在胰蛋白酶的情况中获得晶体。分析这些晶体，并且肽定位显示了它们含有Fab、EphA2胞外域的N端域和Fc的一些部分。生成另一批复合物，这次使用与来自hu2H11R34-R74-His的重组Fab片段复合的具有末端His标签的EphA2受体的非糖基化胞外域进行。这两种EphA2受体构建体提供在EphA2受体与hu2H11R34-R75间的复合物的相同结构。
EphA2受体的胞外区由4个域生成，并且已经显示了非常有柔性：LBD(配体结合域)、CRD(富含半胱氨酸(cystein)的域)和两个纤连蛋白重复nFN3和cFN3。单独或组合使用不同域作为分子替换计算的搜索模型；还生成并使用Fab可变和恒定域的模型及Fc的模型(pdb代码1lGT)以解析晶体结构。
测试各种结晶条件，并使用在ESRF收集的2.1埃数据集来解析复合物结构。它已经使我们能够分析EphA2受体胞外域与hu2H11R34-R74间的界面。
即使最初存在全长EphA2胞外区(25-534)，晶体仅含有蛋白质的LBD和CRD域(残基25-325或327，这取决于晶体(在本文中使用连续编号方式))。
结果
表位定位
图10：对hu2H11R34-R75显示了EphA2受体表位的胞外域的定位(表位残基定义为含有位于离hu2H11R34-R74Fab片段CDR残基的任何原子4埃内的原子的残基)。
在结合hu2H11R34-R74的Fab片段时EphA2受体胞外域的表位是一种构象表位，其包含LBD域Gly49、Lys50、Gly51、Asp53、Cys70、Asn71、Val72、Met73、Ser74、Gly75、Gln77、Phe108、Pro109、Gly110、Gly111、Ser113和Ser114的残基。
图11：显示了来自EphA2受体胞外域的作为表位一部分的残基(以暗灰色表示)；亮灰色的残基在晶体结构中不可见。
图12A：代表复合物的总体结构，而图11B是具有第35位和第74位引入的两处突变的部分的放大。
在表面赖氨酸残基上发生hu2H11的缀合。将这些中的两个突变成精氨酸。图12B中描绘了这两个残基重链R74和轻链R35：
R74位于界面附近，背对EphA2受体的胞外域，并且离最近的胞外域R35约10埃的是互补位残基之一，并且它与来自EphA2受体胞外域的Asp53形成氢键。赖氨酸残基非常有可能会与抗原进行相同的相互作用，并且其缀合物对于抗体结合明显会是有害的。
互补位分析
EphA2受体的胞外域与hu2H11R35-R74间的界面不牵涉所有CDR环。如可以自图12看到的，重链CDR主要牵涉结合。这提示了可以在没有不利影响对EphA2受体的结合的情况中引入hu2H11(特别在轻链中，但是不排他)的CDR变化。轻链的环L3根本不牵涉界面，而仅在L1末端的一个残基(Arg35)与EphA2的胞外域相互作用。这暗示了环L3的变化不应影响对EphA2的结合，而且环L1应当耐受氨基酸残基的突变/插入，只要它们不使Arg35残基构象和取向不稳定。
hu2H11-R35-R74对EphA2受体的互补位牵涉轻链的下列残基：环L1的Arg35、L2的Tyr54、Arg58和Asp60。它牵涉重链的下列残基：环H1的Thr30、Ala31、Tyr32和Tyr33，H2的Asn52、Tyr54、Asn55和Phe57和H3的Glu99、Phe100、Tyr101、Gly102、Tyr103和Tyr105。对轻和重链使用连续编号方案。
可能有可能使用结构数据及例如通过Clark等(Protein Science(2006),15:949-960)或Lippow等(Nature Biotech(2007),10:1171-76)描述的方法来改善hu2H11-R35-R74抗体对EphA2受体的亲和力。
环H1：可能有可能通过Thr H28的明智突变来创建额外的相互作用，例如与Asp76的相互作用。
轻链和EphA2受体间的相互作用不牵涉许多残基。然而，创建新的相互作用有可能会需要在环L1或L3中的大量插入。
经由相当大的或长的残基发生这些环与EphA2受体间的相互作用：此环境的任何变化可能导致结合亲和力的丧失。
此X-射线结构突出显示了可以突变，不应影响对EphA2的结合的来自CDR的残基。
在以下描述中，不应修饰来自互补位的残基，除非如此规定，以保留对EphA2受体的结合。还理解的是，CDR中的突变不应影响来自互补位的残基的构象和取向以保留对EphA2受体的结合。残基编号方式是连续的，并且不遵循Kabbat规定，如Al-Lazikani((1997)J.Mol.Biol.273,927-948)中所使用的。“X”代表“任何残基”，而“-”标示不应在此位置处进行修饰。
在CDR L1(SEQ ID°4)中，除了D33和R35外，对序列没有限制，只要环的长度是保守的，并且它采用规范结构L1-kappa4，如记载于J.Mol.Biol.(1992)227:799-817,J.Mol.Biol.(1992)227:776-798及Al-Lazikani等(上文引用的)的。这意味着肽键的扭转角落入Al-Lazikani等(上文引用的)的图5中限定的公认范围内。
已经将Arg35突变为阻止此残基处的缀合。然而，Lys会与EphA2进行相同的相互作用，并且因此预测亲本hu2H11抗体会与EphA2受体进行相同的相互作用，并且衔接EphA2受体的同一表位。
Asp是第33位的优选残基。
  编号方式   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37
  初始序列   S   Q   S   L   I   H   S   D   G   R   T   Y
  建议的突变   X   X   X   X   X   X   X   D   X   R/K   X   X
在CDR L2(SEQ ID°5)中，可以用保守取代诸如Ile替换两个Leu。可以用Ile替换Val(不太有利)。可以用任何残基替换环的第一个Ser，而第二个可以用另一个亲水性/带电荷的残基替换。不应改变Tyr残基(54)。
  编号方式   54   55   56   57   58   59   60   61
  初始序列   Y   L   V   S   R   L   D   S
  建议的突变   -   L/I   V/i   X   -   L/I   -   S/T/D/N/E/Q
在CDR L3(SEQ ID°6)中，对序列没有限制，对环的长度也没有，只要它采用规范的结构L3-kappa1，如Al-Lazikani等(上文所引用的)中限定的。
  编号方式   94   95   96   97   98   99   100   101   102
  初始序列   W   Q   G   S   H   F   P   R   T
  建议的突变   X   X   X   X   X   X   X   X   X
在CDR H1(SEQ ID°1)GYTFTAYY)周围，环的第一个Thr(Thr 28)是亲和力成熟的潜在位置。
  编号方式   26   27   28   29   30   31   32   33
  初始序列   G   Y   T   F   T   A   Y   Y
  建议的突变   -   -   特殊的   -   -   -   -   -
在CDR H2(SEQ ID°2)中，可以用任何芳香族残基(F/Y/W)替换Phe和Tyr。
  编号方式   52   53   54   55   56   57
  初始序列   N   P   Y   N   G   F
  建议的突变   -   -   Y/F/W   -   -   F/Y/W
关于CDR H3(EFYGYRYFDV)，不应对此环进行改变。
  编号方式   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108
  初始序列   E   F   Y   G   Y   R   Y   F   D   V
  建议的突变  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -
肝配蛋白结合位点
hu2H11抗体显示功能性活性：它抑制肝配蛋白-A1结合，而肝配蛋白-A1诱导EphA2的磷酸化。已经公开了与肝配蛋白A1复合的EphA2受体的LBD和CRD域结构(PDB代码3MBW)。在与hu2H11R35R74的Fab片段复合的EphA2的结构上重叠此结构时，清楚表现出2H11R35R74的Fab片段的轻链与EphA2上的肝配蛋白-A1结合区重叠，并且因此确认hu2H11抗体的竞争性质。
实施例12
人源化2H11R35R74-DM4缀合物对EphA2表达肿瘤细胞的生长抑制
将指数生长期的MDA-MB231细胞用胰蛋白酶处理，并在培养基(DMEM/F12 Gibco#21331;10%SVF Gibco#10500-056;2nM谷氨酰胺Gibco#)中重悬。将细胞悬浮液以5000个细胞/孔的密度在含有血清的完全培养基中在96孔Cytostar培养板(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中分配。在包被4小时后，将缀合物的连续稀释液以范围为在10-7和10-12M间的浓度添加至一式三份的孔。将细胞在存在抗体-细胞毒性化合物缀合物的情况中于37°C/5%CO2培养3天。在第4天，将10μl 14C胸苷(0.1μCi/孔)(Perkin Elmer#NEC56825000)溶液添加至每孔。在实验开始后96小时用Microbeta放射性计数器(Perkin Elmer)来测量14C胸苷的摄取。自测试孔读出扣除无细胞试剂空白，并将数据绘图为通过用经缀合物处理的细胞的读出除以来自经媒介物处理的细胞的对照孔的读出的平均值来获得的存活分数。在一些实验中，在开始实验时将裸露的抗体(2H11或2H11R35R74)以1μM的浓度添加至孔，并测量对增殖的抑制，如先前所描述的。
结果
表IX中报告的结果提示了测试的所有2H11R35R74 DM4缀合物在抑制MDA-MB231细胞生长方面与hu2H11R35R74-Peg4-AcNH-DM4一样有力。
实施例13
对2h11-DM4缀合物针对SCID雌性小鼠中的结肠腺癌Lovo的抗肿瘤活性评 估不同接头。
材料和方法
为了评估缀合物的抗肿瘤活性，每天对动物称重，并且通过测径器对肿瘤每周测量2次。使用公式质量(mg)=[长度(mm)x宽度(mm)2]/2来计算肿瘤重量。在最高的非毒性剂量(HNTD)完成抗肿瘤活性评估。
认为在最低点产生20%体重减轻(bwl)(组的均值)或10%或更大的药物死亡的剂量是过度毒性剂量。动物体重包括肿瘤重量。主要功效终点是ΔT/ΔC、百分比中值消退、部分和完全消退(PR和CR)及无肿瘤存活者(TFS)。
通过自规定的观察日的肿瘤体积扣除第一次处理当天(起始日)的肿瘤体积对每个肿瘤计算每个经处理(T)和对照(C)的肿瘤体积变化。对处理组计算中值ΔT，而对对照组计算中值ΔC。然后，计算比率ΔT/ΔC，并表示为百分比：
Figure BDA00001723216000921
认为在ΔT/ΔC低于40%时，剂量是治疗活性的，且在ΔT/ΔC低于10%时，是非常有活性的。若ΔT/ΔC低于0，则认为剂量是高度活性的，并且消退百分比是载明日期的(参照1)：
%肿瘤消退：定义为在规定的观察日与其在第一次处理的第一天的体积相比处理组中的肿瘤体积缩小的%。
在特定的时间点时及对于每只动物，计算%消退。然后，对每组计算中值%消退。
Figure BDA00001723216000922
部分消退(PR)：若肿瘤体积缩小到在开始处理时的肿瘤体积的50%，则消退定义为部分的。
完全消退(CR)：在肿瘤体积=0mm3时，实现完全消退(在不能记录到肿瘤体积时认为CR)。
TFS：无肿瘤定义为在研究结束时(在最后一次处理后大于100天)检测不到肿瘤的动物
结果
评估具有不同不可切割接头hu2H11-R35R74-PEG4-AcNH-DM4、hu2H11-R35R74-PEG8-AcNH-DM4、hu2H11-R35R74-PEG4-AcNMe-DM4、hu2H11-R35R74-PEG4-烯丙基-DM4和hu2H11-R35R74-乙酰基-DM4的抗体药物2h11-DM4缀合物的抗肿瘤活性，其对雌性SCID中S.C.植入的结肠Lovo肿瘤比较相同剂量的600μg DM4/kg。将对照组保持未处理。剂量以每千克的微克DM4表示。在第14天通过静脉内(IV)推注来施用缀合物。
如表X中所显示的，使用单次施用日程表，所有5种缀合物以ΔT/ΔC<0对Lovo肿瘤模型展现出相同的高活性及对体重减轻的相同影响(在对照组中-13.3%对处理组的-9.5%至11.2%)。与分别对于hu2H11-R35R74-PEG4-AcNMe-DM4、hu2H11-R35R74-乙酰基-DM4、hu2H11-R35R74-PEG4-烯丙基-DM4和hu2H11-R35R74-PEG8-AcNH-DM4的72%、69%、41%和33%的肿瘤消退且没有CR相比，hu2H11-R35R74-PEG4-AcNH-DM4展现出肿瘤消退82%及1例CR的最高效力。
表
表I：对hu2H11R35R74及其缀合物对EphA2的结合的Biacore分析
表II：hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4对Lovo细胞的细胞毒性活性
  缀合物   DAR   IC50(M)
  hu2H11-PEG4-Mal-DM4   6.99   1.22E-10
  hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4   6.70   7.96E-11
  hu2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4   7.00   1.16E-11
表III：hu2H11R35R74及其缀合物对MDA MB231细胞和SKMEL-28细胞的细胞毒性
Figure BDA00001723216000941
Figure BDA00001723216000951
Figure BDA00001723216000961
Figure BDA00001723216000971
Figure BDA00001723216000981
Figure BDA00001723216000991
Figure BDA00001723216001001
Figure IDA00001723216500011
Figure IDA00001723216500021
Figure IDA00001723216500031
Figure IDA00001723216500041
Figure IDA00001723216500051
Figure IDA00001723216500061
Figure IDA00001723216500091
Figure IDA00001723216500101
Figure IDA00001723216500111
Figure IDA00001723216500121

Claims (26)

1.一种抗体或其表位结合片段，其特异性结合EphA2受体，并且包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的具有以SEQ IDNO:1、2、和3代表的氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个连续的具有以SEQ ID NO:4、5、和6代表的氨基酸序列的互补决定区。
2.依照权利要求1的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段是人源化的或重修表面的抗体或其表位结合片段。
3.依照权利要求1的抗体或其表位结合片段，其中所述重链包含由SEQ IDNO:12组成的氨基酸序列，且其中所述轻链包含由SEQ ID NO:14组成的氨基酸序列。
4.依照权利要求1的抗体或其表位结合片段，其中所述重链为(consist in)氨基酸序列SEQ ID NO:18，且其中所述轻链为氨基酸序列SEQ ID NO:16。
5.依照权利要求1-4的抗体或表位结合片段的缀合物，其中所述缀合物包含选自下组的细胞毒剂：
a)式(XIII)的美登木素生物碱类：
Figure FDA00002112985600011
b)式(XIV)的美登木素生物碱类：
Figure FDA00002112985600021
c)式(XXIV)的美登木素生物碱类：
Figure FDA00002112985600022
d)式(XXV)的美登木素生物碱类：
Figure FDA00002112985600023
e)式(XXVI)的美登木素生物碱类：
Figure FDA00002112985600031
f)式(XXVII)的美登木素生物碱类：
Figure FDA00002112985600032
6.依照权利要求5的缀合物，其中所述细胞毒剂与所述抗体共价结合。
7.依照权利要求5或6中任一项的缀合物，其中所述细胞毒剂是式(XIII)的美登木素生物碱类。
8.一种用于制备缀合物的方法，包括下列步骤：
(i)使任选缓冲的细胞结合剂水溶液与细胞毒性化合物的溶液接触；
(ii)然后，任选地分开在(i)中形成的缀合物与未反应的试剂和可能存在于溶液中的任何聚集体；
其中所述细胞结合剂是依照权利要求1-4的抗体，而细胞毒剂选自：
式(XVII)的化合物：
Figure FDA00002112985600041
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子；和式(XVIII)的化合物：
Figure FDA00002112985600042
其中Y是N-琥珀酰亚氨基氧基、N-磺基琥珀酰亚氨基氧基、N-邻苯二甲酰亚氨基氧基、N-磺基邻苯二甲酰亚氨基氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯基氧基、3-磺酰基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧基、咪唑基、或卤素原子；和。
9.通过权利要求8的方法能够获得的缀合物。
10.依照权利要求9的缀合物，所述缀合物具有选自式(XV)和式(XVI)结构的结构：
Figure FDA00002112985600051
其中Ab是依照权利要求1-3的抗体，且n是1至15的整数。
11.权利要求10的抗体-药物缀合物，其中n是4至7。
12.权利要求11的抗体-药物缀合物，其具有式(XV)的结构。
13.一种药物组合物，其含有依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求6、7和8中任一项的缀合物，和药学可接受载体或赋形剂。
14.依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求5、6和7中任一项的缀合物，其作为药物使用。
15.依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求5、6和7中任一项的缀合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述癌症选自：癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤；髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤、和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸胎癌。
17.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段的互补位在轻链中包含：环L1的Arg35、L2的Tyr54、Arg58和Asp60。
18.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段的互补位在重链中包含：环H1的Thr30、Ala31、Tyr32和Tyr33、H2的Asn52、Tyr54、Asn55和Phe57和H3的Glu99、Phe100、Tyr101、Gly102、Tyr103和Tyr105。
19.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段包含位置：Thr H28处的突变。
20.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段包含所述轻链上的下列少数位置之一处的突变：35、26至31、34至37、55、56、57、59和94至102。
21.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段包含所述重链上的下列少数位置之一处的突变：28、54和57。
22.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其特异性结合人EphA2受体的表位，该人EphA2受体的表位包含来自EphA2受体胞外域的LBD的残基Gly49、Lys50、Gly51、Asp53、Cys70、Asn71、Val72、Met73、Ser74、Gly75、Gln77、Phe108、Pro109、Gly110、Gly111、Ser113和Ser114，或其保守取代形式。
23.依照权利要求6、7和8中任一项的缀合物，其具有高于4的平均DAR，所述DAR用UV分光光度计测量，并通过以下等式DAR=CD/CA确定：
其中：
CD=[(εA280x A252)-(εA252x A280)]/[(εD252x εA280)-(εA252x εD280)]
CA=[A280-(CD x εD280)]/εA280
εD252=26,159M-1cm-1
εD280=5,180M-1cm-1
εA280=224,000M-1cm-1
εA252=82,880M-1cm-1
A252和A280是分别于252和280nm在UV分光光度计上测量的缀合物的吸光度。
24.依照权利要求23的缀合物，其具有4至10或5至8的平均DAR。
25.依照权利要求23的缀合物，其具有5.9至7.5的平均DAR。
26.一种制品，其包含：
a)包装材料，
b)依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求6至8和23至25中任一项的缀合物，和
c)所述包装材料内含有的标签或包装插页，其指示所述抗体或其表位结合片段对于治疗癌症是有效的。
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