FI97889C - Uusi menetelmä bakteerien ja kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten ja N-asyylidihydrojohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Uusi menetelmä bakteerien ja kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten ja N-asyylidihydrojohdannaisten valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI97889C
FI97889C FI901865A FI901865A FI97889C FI 97889 C FI97889 C FI 97889C FI 901865 A FI901865 A FI 901865A FI 901865 A FI901865 A FI 901865A FI 97889 C FI97889 C FI 97889C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
formula
compound
acyl
ethyl acetate
derivatives
Prior art date
Application number
FI901865A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI901865A0 (fi
FI97889B (fi
Inventor
May Dean-Ming Lee
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of FI901865A0 publication Critical patent/FI901865A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI97889B publication Critical patent/FI97889B/fi
Publication of FI97889C publication Critical patent/FI97889C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/29—Micromonospora

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

97889
Uusi menetelmä bakteerien ja kasvainten vastaisten 88-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten ja N-asyylidi-hydro j ohdanna isten valmistami sek s i 5 Tämä keksintö koskee uutta menetelmää LL-E33288- antibioottikompleksin a2Br-, B^-, x^-, a/-, β.^-, xja 61I-komponenttien N-asyyli johdannaisten ja N-asyylidihydro-johdannaisten valmistamiseksi. Johdannaiset valmistetaan keksinnön mukaisesti saattamalla antibiootti reagoimaan 10 substituoimattoman tai substituoidun happoanhydridin, asyylikationiekviValentin tai happokloridin kanssa. Nämä N-asyylijohdannaiset ovat tehokkaita bakteerien ja kasvainten vastaisia aineita.
Piirustusten lyhyt kuvaus 15 Kuvio I: N-asetyyli-88-E3328861I:n ^-NMR-spektri.
Kuvio II: N-formyyli-LL-E3328861I:n 1H-NMR-spektri.
Kuvio III: N-asetyyli-88-E33288x1I:n ultraviolet- tiabsorptiospektri.
Kuvio IV: N-asetyyli-88-E33288x1I:n infrapuna-ab- 20 sorptiospektri.
Kuvio V: N-asetyyli-88-E33288x1I:n 1H-NMR-spektri.
Kuvio VI: N-asetyyli-88-E33288x1I:n 13C-NMR-spektri.
Kuvio VII: N-asetyylidihydro-LL-E33288x1I:n ultra-violettiabsorptiospektri.
25 Kuvio VIII: N-asetyylidihydro-LL-E33288x1I:n 1H-NMR- spektri.
Bakteerien ja kasvainten vastaisten aineiden ryhmä, joka tunnetaan yhteisnimityksellä LL-E33288-kompleksi, on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 970 198 (jätetty 30. tam-30 mikuuta 1987), ja näitä aineita käytetään tämän keksinnön mukaisten N-asyylijohdannaisten valmistukseen. Edellä mainitussa patenttihakemuksessa kuvataan LL-E33288-kompleksi, sen komponentit, nimittäin 88^33288¾0% LL-E33288a2Br, 88-E33288a3Br, LL-E33288a4Br, 88-6332888^, LL-E33288S2Br, 88- 35 E33288x1Br, 88-633288(1^, 88-833288¾1, 88-E33288031, 88- i 2 97889 E33288Ö!1, LL-E332888!1, LL-E33288B21, LL-E33288X!1 ja LL-E33288Ö!1, ja menetelmät niiden valmistamiseksi ilmastetulla fermentaatiolla, jossa käytetään uutta Micromonospora echinospora ssp. calichensis -kantaa tai sen luonnollisia 5 tai johdettuja mutantteja. Joidenkin edellä mainittujen komponenttien todennäköiset kemialliset kaavat on esitetty US-patenttijulkaisussa 4 970 198, ja ne on esitetty uudelleen jäljempänä taulukossa I.
10 Taulukko 1 LL-E33288-komponenttien todennäköiset rakenteet
«,oXpC
OCH, q H Γ^-O^j 20 —f r/ OCH, R3= ΟΗ,-Γ^Ο'Τ' OCH, 25
Nimitys Ri R2 X
E33288q 1 H C2H5 1
30 E33288/31I R3 (CH^CH I
E33288t1I r3 C2H5 I
E332886,1 R3 CH3 1 Ε33288α ΒΓ H C2H5 Br E33288^Br r3 <CH3>2CH Br 35 E332887lBr R3 C2H5 Br , 97889
Kuten taulukossa I esitetyistä rakenteista voidaan havaita, LL-E33288-antibioottikompleksin a2Br-, 8^-, τ1ΒΓ-, c^1-, Bi1-, Tj^1— ja 611-komponentit sisältävät kukin sekundäärisen aminoryhmän, joka on osa substituoitua 4-5 aminopentoosiyksikköä. Nyt on todettu, että minkä tahansa edellä mainitun komponentin reaktio substituoimattoman tai substituoidun, tyydyttyneen tai tyydyttymättömän alkyyli-tai aryylihappoanhydridin, happokloridin tai asyylikatio-niekviValentin kanssa johtaa asyyliryhmän liittymiseen 10 sekundääriseen aminoryhmään, kuten kaaviossa I jäljempänä on esitetty.
H
I (R-CO)gO r-co R-co R.-N-U -► · -► 1 J v 2 Rg-N-U Cdihydro)
15 Kaavio I
jossa W on taulukossa I esitetyn aminopentoosin R2NH-ryh-mään kiinnittynyt substituentti, R on vety tai haarautunut tai haarautumaton alkyyli(C1.10)- tai alkyleeni( )ryhmä, 20 aryyli- tai heteroaryyliryhmä, tai aryylialkyyliiC^g)- tai heteroaryylialkyyliiCi.g)ryhmä, jotka kaikki ovat mahdollisesti substituoituja yhdellä tai useammalla hydroksi-, amino-, karboksi-, halogeeni-, nitro-, alemmalla (C1.3)al-koksi- tai alemmalla (02.5 )tioalkoksiryhmällä.
25 N-asyylijohdannaiset valmistetaan myös US-patentti- julkaisun 5 037 651 mukaisten LL-E33288-antibioottien di-hydrojohdannaisista, nimittäin dihydro-LL-E33288a2Br: sta, dihydro-LL-E33288B1Br: sta, dihydro-E33288t1Br: sta, dihydro-LL-E33288a21:sta, dihydro-LL-E33288B1I:sta, dihydro-LL-30 E33288t1I:sta ja dihydro-LL-E3328861I:sta.
Esimerkiksi LL-E33288X!1:n reaktio etikkahappoan-hydridin kanssa metanolissa tuottaa N-asetyyli-LL-E33288x1I:ä, kun taas LL-E3328861I:n reaktio etikkahapon ja muurahaishapon seka-anhydridin kanssa tuottaa N-formyyli-35 4 97889 LL-E3328861I:ä, ja molemmat ovat tehokkaita uusia kasvainten vastaisia antibiootteja. Dihydro-LL-E33288x1I:n reaktio etikkahappoanhydridin kanssa metanolissa tuottaa N-asetyy-lidihydro-LL-E33288r1I: ä. N-asetyylidihydro-LL-E33288x1I: ä 5 valmistetaan myös N-asetyyli-LL-E33288x1I:n reaktiolla nat-riumboorihydridin kanssa olosuhteissa, jotka on kuvattu US-patenttijulkaisussa 5 037 651.
Keksinnön kohteena on menetelmä kaavan (I) mukaisten, bakteerien ja kasvainten vastaisten, LL-E33288-anti- 10 bioottikompleksin a2Br-, βχΒΓ-, ΧχΒΓ-, α2χ-, βχ1-, Χχ1- ja δχ1-komponenttien N-asyylijohdannaisten ja N-asyylidihydrojohdannaisten valmistamiseksi, 0 15 R-C-N-W (I) R2 jossa W on 20 \4 R5 HO .·„/ OCHj o OCH, 30 R on vety tai haarautunut tai haarautumaton alkyyli(Cx_x0)-tai alkyleeni(Cx_10) ryhmä, aryyli- tai heteroaryyliryhmä, tai aryylialkyyli(Cx_5)- tai heteroaryylialkyyli( Οχ.5) ryhmä, jotka kaikki ovat mahdollisesti substituoituja yhdellä tai useammalla hydroksi-, amino-, karboksi-, halogeeni-, 35 nitro-, alemmalla (0χ_3)alkoksi- tai alemmalla (Cx_5)tioal-koksiryhmällä; Rx on H tai III I liiti I i iM . : i 5 97889 ν/Λ/ν' CHj'T ° / HO —----
OCH’ OH
5 R2 on CH3, C2H5 tai CH(CH3)2; R4 on OH, kun R5 on H, tai R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin; ja X on jodi- tai bro-miatomi.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että 10 a) johdannaisten valmistamiseksi, joissa R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin, annetaan antibiootin LL-E33288, jolla on kaava
H-N-W
15 R2 jossa symbolin W substituentit R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin, reagoida sopivasti substituoidun anhydridin, happokloridin, etikka- ja muurahaishapon seka-anhydridin 20 tai meripihkahapon monometyyliesterin anhydridin kanssa metyylialkoholissa lämpötilassa väliltä -5 - noin +5 "C yhden tunnin ajan ja ympäristön lämpötilassa 1-20 tuntia, tuote saostetaan etyyliasetaatista heksaaneilla ja puhdistetaan kromatografisesti, 25 b) minkä jälkeen vastaavien dihydrojohdannaisten valmistamiseksi saatetaan näin saatu N-asyylijohdannainen, jolla on kaava: 0
II
30 R-C-N-W
R2 reagoimaan natriumborohydridin alkoholiliuoksen kanssa metyylijodidin alkoholiliuoksessa 5 minuutin - 5 tunnin 35 ajan lämpötilassa väliltä -5 "C - noin +5 °C, boraatti-kompleksi hajotetaan etikkahapon etanoliliuoksella ja saatu dihydrotuote puhdistetaan kromatografisesti.
6 97889
Joitakin syövän vastaisten LL-E33288- ja dihydro-LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten kemiallisia rakenteita on esitetty jäljempänä taulukossa II:
5 Taulukko II
Todennäköisiä rakenteita LL-E33288- ja dihydro-LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisille 10 F* ph HO·.,,/ v J 1 CM, Λ a r,rAT«,
15 R.o'^OCH, OH
°CH· o O
”2 OCHj 20 k/v/v/' rj- SSCZ^f OCHj 7 97889
Taulukko 11 (jatkoa)
Todennäköisiä rakenteita LL-E33288- ja dihydro-LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisille 5 --------------------------------------------------------
Nimitys R2 R2 R4 R5 χ N-asyylidihydro-LL-
£33288¾1 H C2H5 OH H I
10 N-asyyli-LL-E33288a2I H C2H5 =0 I
N-asyylidihydro-LL-
E33288BJ1 R3 (CH3)2CH OH H I
N-asyyli-LL-E3328881I R3 (CH3)2CH =0 I
N-asyylidihydro-LL-
15 E33288X!1 R3 C2H5 OH H I
N-asyyli-LL-E33288x1I R3 C2H5 =0 I
N-asyylidihydro-LL-
E33288Ö!1 R3 CH3 OH H I
N-asyyli-LL-E3328861I R3 CH3 =0 I
20 N-asyylidihydro-LL- E33288a2Br H C2H5 OH H Br N-asyyli-LL-E33288a2Br H C2H5 =0 Br N-asyylidihydro-LL- £332883^ R3 (CH3)2CH OH H Br 25 N-asyyli-LL-E33288B1Br R3 (CH3)2CH =0 Br N-asyylidihydro-LL- E33288x1Br R3 C2H5 OH H Br N-asyyli-LL-E33288x1Br R3 C2H5 =0 Br 30 R = vety tai haarautunut tai haarautumaton alkyyliiC^o)- tai alkyleeni ( Cj.jo ) ryhmä, aryyli- tai heteroaryyliryhmä, tai aryylialkyyliiC^g)- tai heteroaryylialkyyliiC^iryh-mä, ja kaikki ovat mahdollisesti substituoituja yhdellä tai useammalla hydroksi-, amino-, karboksi-, halogeeni-, 35 nitro-, alemmalla (Cj.j)alkoksi- tai alemmalla (C^Jtioal-koksiryhmällä.
8 97889
Neljän kasvainten vastaisen LL-E33288-antibiootin N-asyylijohdannaisten, nimittäin N-asetyyli-LL-E3328861I:n, N-formyyli-LL-E33288611:n, N-asetyyli-LL-E33288x1I:n ja N-asetyylidihydro-LL-E33288x1I:n, fysikaaliskemiallisia omi-5 naisuuksia on kuvattu jäljempänä.
N-asetyyli-LL-E33288611 a) moolimassa: 1395, määritetty FABMSrlla; b) molekyylikaava: C56H74N3022IS4, tarkka massa M+K:lle, 1434,2329 yhdisteelle C56H74N3022IS4K, määritettiin 10 korkean erotuskyvyn FABMS:lla; ja c) 1H-NMR-spektri: kuten kuviossa I on esitetty (300 MHz, CDC13).
N-formyyli-LL-E3328861I
a) moolimassa: 1381, määritetty FABMS:11a; 15 b) molekyy likaava: C55H72N3022IS4, tarkka massa M+K:lle, 1420,2172 yhdisteelle C55H72N3022IS4K, määritettiin korkean erotuskyvyn FABMS:11a; ja c) 1H-NMR-spektri: kuten kuviossa II on esitetty (300 MHz, CDC13).
20 N-asetyyli-LL-E33288x1I
a) moolimassa: 1409, määritetty FABMS:11a; b) molekyy likaava: C57H76N3022IS4, tarkka massa M+H:lle, 1410,2954 yhdisteelle C57H77N3022IS4, määritettiin korkean erotuskyvyn FABMS:11a; ja 25 c) ultraviolettiabsorptiospektri: kuten kuviossa III on esitetty (metanoli); d) infrapuna-absorptiospektri: kuten kuviossa IV on esitetty (KBr-levy); e) Hl-NMR-spektri: kuten kuviossa V on esitetty (300 30 MHz, CDC13); f) 13C-NMR-spektri: kuten kuviossa VI on esitetty (75,43 MHz, CDC13, ppm TMS:sta), merkittävät piikit on lueteltu alla: 35 9 97889 14.0 q 17,6 q 17,7 q 19,0 q 22,4 q 22,8 q 25,4 q 36,7 t 36,9 t 39,2 t 47,6 t 51,6 d 5 52,4 q 53,1 t 57,0 q 57,2 q 58,8 t 60,9 q 61,7 q 64,4 d 67,0 d 68,1 d 68,4 d 69,0 d 69.1 d 70.,5 d 71,1 d 71,7 s 71,9 d 72,4 d 77,6 d 80,8 d 83,2 s 87,0 s 93,5 s 97,9 d 10 98.1 s 99,7 d 100,9 s 101,3 d 102,6 d 123,2 d 124,5 d 127.,1 d 130,2 s 133,4 s 136,5 s 142^ s 143.0 s 150,6 s 151,5 s 155.0 s 172.^ s 191,9 s 192.1 s 15
N-asetyylidihydro-LL-E33288r1I
a) ultraviolettiabsorptiospektri: kuten kuviossa VII on esitetty (metanoli); 20 b) 1H-NMR-spektri: kuten kuviossa VIII on esitetty (300 MHz, CDC13).
Kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaiset karakterisoidaan helpoimmin korkeapai-nenestekromatografiällä (HPLC) ja ohutkerroskromatogra-25 fiällä (TLC).
Edullinen analyyttinen HPLC-systeemi joidenkin kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten karakterisoimiseksi on esitetty alla:
Pylväs: Analytichem Sepralyte C18, 5μ, 4,6 mm x 25 cm 30 Liikkuva faasi: 0,2 M ammoniumasetaatin vesiliuos, pH 6,0: asetonitriili, 50:50 Virtausnopeus: 1,5 ml/min
Toteaminen :UV254nm ja UV280na
Taulukossa III on esitetty joidenkin kasvainten 35 vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten likimääräiset retentioajat: 10 97889
Taulukko III
kasvainten vastaiset N-asyyli- Retentioaika 5 LL-E33288-antibiootit (minuutteja) N-asetyyli-LL-E33288T1I 6,6 N-formyyli-LL-E33288T11 6,2 N-asetyyli-LL-E3328861I 4,5 10 N-formyyli-LL-E3328861I 4,2 LL-E33288x11 8,0 LL-E3328861i 6,0
Edullinen TLC-systeemi kasvainten vastaisten LL-15 E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten karakterisoi- miseksi on esitetty alla:
Adsorbentti: Whatman korkeapaine-TLC- (HPTLC-) levyt,tyyppi LHP-KF;
Toteaminen: Visualisoitiin lopettamalla vaikutus lyhyen 20 aallonpituuden UV-lampulla (254 nm);
Liuotinsysteemi: Etyyliasetaatti, joka oli kyllästetty 0,1 M fosfaattipuskurin vesiliuoksella pH:ssa 7,0.
Taulukossa VI on esitetty joidenkin kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten li-25 kimääräiset Rf-arvot edellä mainitussa TLC-systeemissä: n 97889
Taulukko IV
kasvainten vastaiset N-asyyli- Rf LL-E33288-antibiootit 5 -------------------------------------------------------- N-asetyyli-LL-E33288x1I 0,53 N-formyyli-LL-E33288x11 0,53 N-asetyyli-LL-E3328861I 0,25 N-formyyli-LL-E33288611 0,31 10 N-asetyylidihydro-LL-E33288x1I 0,38 N-monometyylisukkinyyli-LL-E33288x1I 0,42 LL-E33288x1I 0,25 LL-E33288Ö!1 0,14 15 Kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N- asyylijohdannaiset ovat käyttökelpoisia bakteerien vastaisina aineina. N-asetyyli-LL-E3328861I :n, N-formyyli-LL-E3328861I:n ja N-asetyyli-LL-E33288x11:n bakteerien vastainen aktiivisuus in vitro määritettiin erilaisia gram-posi-20 tiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan tavanomaisella agar-laimennusmenetelmällä. Mueller-Hinton-agar, joka sisälsi kaksi kertaa pienemmät pitoisuudet antibiootteja, kaadettiin petri-maljoille. Agar-pinnoille siirros-tettiin 1 x 104 - 5 x 104 pesäkkeitä muodostavaa bakteeri-25 yksikköä Steers-kopiointimenetelmällä. Alhaisin kasvainten vastaisen N-asyyli-LL-E33288-antibiootin pitoisuus, joka inhiboi bakteerikannan kasvua noin 18 tuntia inkuboinnin jälkeen suunnilleen 35 °C:ssa, merkittiin muistiin minimaalisena inhiboivana pitoisuutena (MIC) tälle kannalle. 30 Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa V.
Taulukko V
i2 97889 N-asyyli-LL-E33288-antibioottien bakteerien vastainen aktiivisuus in vitro 5 Minimaalinen inhiboiva pitoisuus N-asetyy- N-formyy- N-ase-li LL- li LL- tyyli
Organismi £332886^ £332886^ LL- 10 E33288X!1
Escherichia coli CMC 84-11 2 2 >2
Escherichia coli No. 311 (MP) 2 1 >2
Escherichia coli ATCC 25922 1 1 >2 15 Klebsiella pneumoniae CMC 84-5 8 4 >2
Klebsiella pneumoniae AD (MP) 1 1 2
Enterobacter clocae CMC 84-4 4 4 >2
Serratia marcescens F-35 (MP) 8 4 >2
Pseudomonas aeruginosa 20 12-4-4 (MP) 4 2 >2
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 4 2 >2
Staphylococcus aureus Smith (MP) 0,12 0,06 0,008
Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,25 0,12 0,06 25 Staphylococcus epidermidisc ATCC 25923 0,015 0,03 0,12
Streptococcus faecalis ATCC 29212 0,06 0,06 0,12
Streptococcus faecalis 10 83-28 0,5 0,12 0,12 30
Kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaiset ovat myös aktiivisia kasvainten vastaisina aineina, kuten on määritetty biokemiallisessa in-duktiokokeessa (BIA), bakteerikoesysteemissä, jolla mita-35 taan erityisesti aineen kykyä aloittaa suoraan tai epäsuo- 13 97889 rasti DNA:n vahingoittuminen. Indikaattoriorganismi tätä koetta varten on E. colilambda-lysogeeni, joka on rakentunut geneettisesti siten, että DNA:n vahingoittumistapah-tuma johtaa β-glaktosidaasi-entsyymin geenin ilmentymi-5 seen. Tämä entsyymi voidaan määrittää kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti biokemiallisella kokeella ilmaisuna DNA-vaurioiden esiintymisenä.
Näiden yhdisteiden määrittämiseen käytettiin kvantitatiivisen nestemäisen BIA:n modifioitua muunnosta, jon-10 ka ovat kuvanneet Elespuru, R. ja Yarmolinsky, M., Environmental Mutagenesis 1 (1979) 65.
Tietyt in vivo -koesysteemit ja -menetelmät on kehittänyt National Cancer Institute yhdisteiden analysoimiseksi niin, että pystytään määrittämään niiden sopivuus 15 anti-neoplastisina aineina. Näistä on raportoitu julkaisussa "Cancer Chemotherapy Reports", Osa III, Voi. 3, n:o 2 (1972), Geran et ai. Nämä menetelmät ovat aikaansaaneet standardisoidut seulontakokeet, joita yleensä käytetään analysoitaessa kasvainten vastaisia aineita. Näistä sys-20 teemeistä lymfosyyttinen leukemia P388, melanoottinen melanoma B16 ja paksusuolen 26-adenokarsinoma ovat erityisen merkittäviä tälle keksinnölle. Näitä neoplasmeja käytetään analysointiin istutettavina kasvaimina hiirissä. Yleensä merkittävä kasvainten vastainen aktiivisuus, joka on näis-25 sä menetelmissä esitetty käsiteltyjen eläinten (T) keskimääräisten eloonjäämisaikojen suhteena kontrollieläinten (C) keskimääräisiin eloonjäämisaikoihin prosentteina, antaa samankaltaiset tulokset ihmisen leukemioita ja kiinteitä kasvaimia vastaan.
30 Lymfosyyttinen leukemia P388 -koe Käytetyt eläimet olivat BDF1-hiiriä, jotka olivat kaikki samaa sukupuolta ja painoivat vähintään 17 g ja enintään 20 g. Koeryhmässä oli 5 tai 6 hiirtä. Kasvain siirrettiin vatsakalvon sisään ruiskeella, jossa oli 0,5 35 ml laimeata askiittista nestettä, joka sisälsi 106 lymfo- 14 97889 syyttistä leukemia-P388-solua. Koeyhdisteet annettiin vatsakalvon sisään 0,5 ml:ssa 0,2 % Klucelia tavallisessa suolaliuoksessa päivinä 1, 5 ja 9 (suhteessa kasvaimen siirtämiseen) esitettyinä annoksina. Hiiret punnittiin ja 5 eloonjääneet kirjattiin säännöllisin väliajoin 30 vuorokauden ajan. Laskettiin mediaani eloonjäämisajalle ja kä siteltyjen (T) eläimien eloonjäämisajan suhde vertailu-eläinten (C) eloonjäämisaikaan. Positiivisessa vertailukokeessa käytettiin alkuperäistä kasvainten vastaista anti-10 bioottia LL-E33288'c1I:a.
N-asetyyli-LL-E3328861I:n, N-formyyli-LL-E3328861I:n ja N-asetyyli-LL-E33288r1I:n koetuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa VI. Jos T/C x 100 (%) on 125 tai yli, testatulla yhdisteellä katsotaan olevan merkittävä kas-15 vainten vastainen aktiivisuus.
15 97889
Taulukko VI
Lymfosyyttinen leukemia-P388 -koe 5
Mediaani-
Annos arvo eloon-T/C X 100 Yhdlste (mg/Kg) jäämiselle (%) (vuorokausia)
Suolaliuos 11,0 10 ' ^tyyli^^332885'1 °I1 13,0 118 0,05 29,5 268 0,025 26,0 236 0,0125 20,0 182 15 0,006 20,0 182 N-ase~ ..1^1^332885]1 0,1 11,5 105 tyyli 0,05 30,0 273 0,025 25,0 227 20 0,0125 23,0 209 0,006 195 177 N-f ormyy-'LL-E332885]1 0,1 12r5 114 11 0,05 27f0 245 25 0,025 22,5 205 0,0125 21,0 191 0,006 20,5 186 LL-E33288Y11 0,01 13,0 118 30 0,005 25,0 227 0,0025 30,0 273 0,00125 26,5 241 16 97889
Taulukko VI (jatkoa)
Lymfosyyttinen leukemia-P388 -koe 5 Suolaliuos 11,0 ^yyli-^33288*1 0,.08 18 164 0(04 29f5 268 0,02. 28,0 255 0,005 17,5 159 10 0,0025 14,0 127 0,00125 13,5 123 LL-E33288Y1I 0,0, ^ 205 0,005 26,0 236 15 0,0025 24,5 223 0,00125 21,0 191 0,0006 19,0 173 20
Melanoottinen melanoma-B16 -koe Käytetyt eläimet olivat BDF1-hiiriä, jotka olivat kaikki samaa sukupuolta ja painoivat vähintään 17 g ja enintään 20 g. Koeryhmässä oli tavallisesti 6 hiirtä. 1 25 g:n erä melanoma-B16-kasvainta homogenoitiin 10 ml:ssa kylmää tasapainotettua suolaliuosta, ja 0,5 ml:n erä homo-genaattia siirrettiin jokaisen koehiiren vatsakalvon sisään. Koeyhdisteet annettiin vatsakalvon sisään päivinä 1-9 (suhteessa kasvaimen siirtämiseen) erilaisina annok-30 sinä. Hiiret punnittiin ja eloonjääneet kirjattiin säännöllisin väliajoin 60 vuorokauden ajan. Laskettiin mediaani eloonjäämisajalle ja käsiteltyjen (T) eläimien eloon-jäämisajan suhde vertailueläinten (C) eloonjäämisaikaan. Positiivisessa vertailukokeessa käytettiin alkuperäistä 35 kasvainten vastaista antibioottia LL-E33288t11:a.
17 97889 N-asetyyli-LL-E33288611:n ja N-asetyyli-LL-Ε33288τ11:η koetuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa VII. Jos T/C x 100 (%) on 125 tai yli, testatulla yhdisteellä katsotaan olevan merkittävä kasvainten vastainen 5 aktiivisuus.
Taulukko VII
18 97889
Melanoottinen melanoma-Bl6 -koe -—-—-- J Mediaaniarvo
Annos eloonjäämi- T/C X 100
Yhdiste (mg/Kg) selle (%) (vuorokausia)
Suolaliuos 21,0 10 N-, 1^^-^^332885]1 0,025 35,5 169 0.0125 27,5 131 0,006 26,0 124 0,003 25,0 119 0,0015 21.5 102 15 LL-E33288711 0,0025 39.0 186 0,00125 39,0 186 0,0006 35,0 167 0,0003 29,5 140 20 0,00015 24,5 117
Suolaliuos 21,0 N- ase- -LL-E33288Y11 0.025 26,0 124 9 c tyyli ' 0,0125 38,0 181 0,006 39,0 186 0,003 33,5 160 0,0015 26;5 126 0,0007 26,0 124 30 0,00035 24,5 116 0,00017 235 112 1β 97889 1 y
Taulukko Vll (jatkuu)
Melanoottinen melanoma-B16 -koe 5 LL-E33288Y11 0,005 8,0 38 0,0025 27(0 129 0,00125 41,5 198 0,0006 45,0 214 0,0003 35,5 169 10 0,00015 35,0 167 0,00007 34,5 164 0,00003 31 148 15 Paksusuolen 26-adenokarsinoma -koe Käytetyt eläimet olivat CD^-naarashiiriä, jotka painoivat vähintään 17 g ja enintään 20 g. Koeryhmässä oli 5 tai 6 hiirtä, ja kolmea 5 tai 6 eläimen ryhmää käytettiin käsittelemättöminä vertailuryhminä kussakin kokeessa. 20 Kasvainsiirroste injektoitiin vatsakalvon sisään niin, että ruiskeessa oli 0,5 ml 2-prosenttista paksusuolen 26-kasvainsolukkoa Eaglen MEM-väliaineessa, joka sisälsi bakteerien vastaista ainetta. Koeyhdisteet annettiin vatsa-kalvon sisään päivinä 1, 5 ja 9 (suhteessa kasvaimen siir-25 rostusannoksiin). Hiiret punnittiin ja kuolleiden määrät kirjattiin säännöllisin väliajoin 30 vuorokauden ajan. Laskettiin mediaani eloonjäämisajalle ja käsiteltyjen (T) eläimien eloonjäämisajan suhde vertailueläinten (C) eloon-jäämisaikaan. Positiivisena vertailukokeena käytettiin 30 alkuperäistä kasvainten vastaista antibioottia LL- E33288x1I:a.
N-asetyyli-LL-E3328861I:n koetuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa VIII. Jos T/C x 100 (%) on 130 tai yli, testatulla yhdisteellä katsotaan olevan merkittävä 35 kasvainten vastainen aktiivisuus.
20 97889
Taulukko Vili
Paksusuolen 26-adenokarsinoma -koe . Mediaaniarvo „ 5 Yhdiste Annos eloonjääBi_ T/CX100 (mg/kg) selle (%) _(vuorokausia)
Suolaliuos 16;0 N-ase- -LL-E332885il 0,05 22.5 141 in tyyli 10 0,025 40,0 250 0,0125 21,0 131 0,006 24f5 153 0,003 19,0 119 0,0015 19,0 119 15 0,0007 19,0 119 1Χ-Ε33288γιΙ 0,01 14,0 88 0,005 35,0 219 20 0,0025 21,5 134 0,00125 24,0 150 0,0006 19,5 122 0,0003 18,0 113 0,00015 17,5 109 25 _______
Keksintöä kuvaavat edelleen seuraavat esimerkit, jotka eivät ole rajoittavia.
Esimerkki 1 N-asetyyli-LL-E332886,*:n valmistus ja puhdistus 30 Etikkahappoanhydridiä (2 ml) lisättiin tipoittain osittain puhdistetun LL-E3328861I:n (608 mg, 57 % puhdas) metanolipitoiseen (60 ml) liuokseen, jota sekoitettiin ja joka oli jäähdytetty jää-vesi -hauteella. Reaktioseoksen annettiin sekoittua 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, sitten se läm-35 mitettiin hitaasti huoneen lämpötilaan, ja reaktion annet- 2i 97889 tiin jatkua vielä 3 tuntia. Sen jälkeen reaktioseos väke-vöitiin tyhjössä, ja jäännös otettiin talteen seokseen, jonka muodostivat 60 ml sekä dikloorimetaania että vettä. Vesifaasi neutraloitiin laimealla natriumhydroksidin vesi-5 liuoksella, jotta saataisiin poistetuksi mahdollisimman suuri osa etikkahappoa orgaanisesta faasista. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin vedettömällä natriumsul-faatilla, väkevöitiin pieneen tilavuuteen ja saostettiin lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin raakatuotteena 604 10 mg N-asetyyli-LL-E3328861I: a.
Edellä raakatuotteena saatu N-asetyyli-LL-E3328861I liuotettiin 8 ml:aan asetonitriilin ja 0,2 M ammoniumase-taatin seosta (pH 6,0, 35:65), ja kromatografoitiin neljässä erässä Sepralyte C18 -pylväällä (1,5 x 21 cm). Pyl-15 väitä eluoitiin 10 ml/min ensin asetonitriilin ja 0,2 M ammoniumasetaatin seoksella (pH 6,0, 35:65) 30 minuuttia ja sen jälkeen lineaarisella gradientilla asetonitriilin ja 0,2 M ammoniumasetaatin seokseen (pH 6,0, 40:60) 60 minuutin aikana. Kromatografian ajan pylväseluentteja 20 kontrolloitiin UV254nm:ssa ja fraktiot kerättiin 2,5 minuutin välein. Piikkifraktiot analysoitiin HPLC:llä, ja ne, jotka sisälsivät puhdasta N-asetyyli-LL-E3328861I:a HPLC-analyysin mukaan, yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä asetonitriilin poistamiseksi. N-asetyyli-LL-E3328861I, joka 25 oli läsnä vesipitoisessa seoksessa, uutettiin etyyliasetaattiin, ja etyyliasetaattifaasi kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla, väkevöitiin pieneen tilavuuteen ja saostettiin lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin 161 mg puoliksi puhdistettua N-asetyyli-LL-E33288611I:a.
30 TLC-analyysi (E. Merck silikageeli 60 F254 :lla etu käteen peitetyt alumiinilevyt, 0,2 mm, 3 % isopropanoli etyyliasetaatissa, kyllästetty 0,1 M kaliumdivetyfosfaa-tilla, todettiin bioautografiällä käyttäen agar-biokemial-lista induktiokoetta) osoitti, että edellä saatu puoliksi 35 puhdistettu N-asetyyli-LL-E3328861I-erä sisälsi jälkiä rea- 22 97889 goimattomasta LL-E3328861I: sta. Puoliksi puhdistettu N-ase-tyyli-LL-E33288611 (160 mg) liuotettiin 1 ml:aan etyyliasetaattia ja kromatografoitiin Bio-Sil A (20 - 44 μ, Bio-Rad Laboratories) -pylväällä (1,5 cm x 90 cm), joka oli 5 pakattu ja tasapainotettu etyyliasetaatilla. Pylvästä eluoitiin ensin etyyliasetaatilla virtausnopeudella 3,6 ml/min 3,5 tunnin ajan ja kerättiin 18 ml:n fraktioita. Eluentti vaihdettiin 3-prosenttiseksi isopropanoliksi etyyliasetaatissa, joka oli tehty kylläiseksi 0,1 M ka-10 liumdivetyfosfaatilla ja eluointia jatkettiin vielä 3,5 tuntia. Fraktiot analysoitiin TLCrllä kuten edellä ja ne, jotka sisälsivät puhdasta N-asetyyli-LL-E3328861I:a (fraktiot 58 - 64), yhdistettiin, väkevöitiin tyhjössä kuiviin, liuotettiin uudelleen pieneen määrään etyyliasetaattia ja 15 seostettiin lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin 118 mg analyyttisesti puhdasta N-asetyyli-LL-E3328861I:a, joka ei sisältänyt havaittavia määriä asyloimatonta alkuperäistä kasvainten vastaista antibioottia. 1H-NMR-spektri on esitetty kuviossa I.
20 Esimerkki 2 N-formyyli-LL-E3328861I:n valmistus ja puhdistus Etikkahapon ja muurahaishapon seka-anhydridi valmistettiin lisäämällä 200 μΐ muurahaishappoa tipoittain 400 pl:aan etikkahappoanhydridiä, joka oli jäähdytetty 25 jää-vesi -hauteessa. Sen jälkeen reaktioseos lämmitettiin 50 °C:seen 5 minuutiksi anhydridivaihdon täydentämiseksi ja sitten pidettiin 0 °C:ssa. Edellä valmistettu etikka-hapon ja muurahaishapon seka-anhydridi (100 μΐ) lisättiin tipoittain osittain puhdistetun LL-E33288611:n (92 mg, 30 45 % puhdas) metanolipitoiseen (30 ml) liuokseen, jota sekoitettiin ja joka oli jäähdytetty jää-vesi -hauteessa. Reaktioseoksen annettiin sekoittua 0 °C:ssa 45 minuutin ajan, sen jälkeen reaktioseokseen lisättiin heksaaneja (20 ml), ja seos väkevöitiin tyhjössä oleellisesti kuiviin. 35 Jäännös liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin ja saos- 23 97889 tettiin lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin paksu, tahmea sakka, joka otettiin talteen sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin uudelleen pieneen määrään etyyliasetaattia ja seostettiin jälleen lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin 5 raakatuotteena N-formyyli-LL-E3328861I:a.
Edellä raakatuotteena saatu N-formyyli-LL-E3328861I-erä osittain puhdistettiin preparatiivisella TLC:lla sili-kageelillä (kaksi Analtech Silica Gel GF -etukäteen peitettyä levyä, 2000 μ, 20 x 20 cm) eluoiden etyyliasetaa-10 tiliä, joka oli kyllästetty fosfaattipuskurilla, pH 7,0.
Haluttu nauha leikattiin irti ja N-formyyli-LL-E3328861I otettiin talteen pesemällä silikageeli metyleenikloridin ja metanolin seoksella (80:20), jolloin saatiin käsittelyllä 110 mg osittain puhdistettua N-formyyli-LL-15 £332886/:3.
Edellä saatu osittain puhdistettu N-formyyli-LL-E332886/ liuotettiin 1 ml:aan asetonitriilin ja ammonium-asetaatin seosta (pH 6,0, 35:65) ja kromatografoltiin Sep-ralyte C18-pylväällä (1,5 x 20 cm). Pylvästä eluoitiin 8 20 ml/min asetonitriilin ja 0,2 M ammoniumasetaatin seoksella (pH 6,0, 35:65) 1,75 tuntia, tarkkailtiin UV254ne:ssa ja otettiin talteen 20 ml:n fraktioita. Piikkifraktiot analysoitiin HPLC:llä ja ne, jotka sisälsivät puhdasta N-for-myyli-LL-E33288611:a HPLC-analyysin mukaan, yhdistettiin 25 ja väkevöitiin tyhjössä asetonitriilin poistamiseksi. Sa meaa vesipitoista seosta, joka sisälsi N-formyyli-LL-E3328861I:a, uutettiin etyyliasetaatilla ja etyyliasetaat-tifaasi väkevöitiin kuiviin. Jäännös liuotettiin uudelleen metyleenikloridiin, kuivattiin vedettömällä natriumsulfaa-30 tiliä, väkevöitiin ja seostettiin lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin 36,5 mg puoliksi puhdistettua N-formyyli-LL-E332886/:a.
TLC-analyysi (E. Merck silikageeli 60 F254:lla etukäteen peitetyt alumiinilevyt, 0,2 mm, 3 % isopropanoli 35 etyyliasetaatissa, kyllästetty 0,1 M kaliumvetyfosfaatil- 24 97889 la, todettiin bioautografialla käyttäen agar-biokemiallista induktiokoetta) osoitti, että edellä mainittu puoliksi puhdistettu N-formyyli-LL-E3328861I-erä sisälsi pieniä määriä reagoimatonta LL-E3328861I:a ja -x1I:a. Puoliksi puh-5 distettu N-formyyli-LL-E3328861I (36,5 mg) liuotettiin 1 ml:aan etyyliasetaattia ja kromatografoitiin Bio-Sil A (20 - 44 μ, Bio-Rad Laboratories) -pylväällä (1,5 cm x 23 cm), joka oli pakattu ja tasapainotettu etyyliasetaatilla. Kolonnia eluoitiin ensin etyyliasetaatilla virtausno-10 peudella 1,2 ml/min 2 tunnin ajan ja kerättiin 6 ml:n fraktioita. Eluentti vaihdettiin etyyliasetaatin ja meta-nolin seokseen (97:3), ja eluointia jatkettiin vielä 2 tuntia. Fraktiot analysoitiin TLC:llä (E. Merck silikagee-li 60 F254:lla etukäteen peitetyt alumiinilevyt, 0,2 mm, 15 3 % isopropanoli etyyliasetaatissa, joka oli kyllästetty 0,1 M kaliumvetyfosfaatilla, todettiin sumuttamalla 3-pro-senttisella kupariasetaatin liuoksella 8-prosenttisessa fosforihapon vesiliuoksessa), ja ne, jotka sisälsivät puhdasta N-formyyli-LL-E33288611:a (fraktiot 35 - 38), yhdis-20 tettiin ja väkevöitiin tyhjössä kuiviin. Jäännös liuotettiin uudelleen pieneen määrään etyyliasetaattia ja seostettiin lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin N-asetyyli-LL-E3328861I-erä, jossa oli vielä mukana jälkiä reagoimattomasta LL-E33288x11:sta. Tämä erä kromatografoitiin jäl-25 leen Bio-Sil A-pylväällä (0,8 x 20 cm), joka oli pakattu ja tasapainotettu etyyliasetaatilla. Pylvästä eluoitiin etyyliasetaatilla virtausnopeudella 1,2 ml/min 4 tunnin ajan ja kerättiin 6 ml:n fraktioita. Fraktiot analysoitiin TLC:llä kuten edellä ja ne, jotka sisälsivät puhdasta N-30 formyyli-LL-E3328861I:a (fraktiot 14 - 33), yhdistettiin ja käsiteltiin kuten edellä, jolloin saatiin 12,2 mg analyyttisesti puhdasta N-formyyli-LL-E3328861I:a, joka ei sisältänyt havaittavia määriä asyloimatonta alkuperäistä antibioottia. xH-NMR-spektri on esitetty kuviossa II.
35 25 97889
Esimerkki 3 N-formyyli-LL-E332886,I:n valmistus ,1a puhdistus
Etikkahapon ja muurahaishapon seka-anhydridi (750 μΐ), joka oli juuri valmistettu kuten esimerkissä 2 on 5 kuvattu, lisättiin tipoittain osittain puhdistetun LL-E3328861I:n (689 mg, 70 % puhdas) metanolipi toi seen (150 ml) liuokseen, jota sekoitettiin ja joka oli jäähdytetty jää-vesi -hauteella. Reaktioseoksen annettiin sekoittua 0 °C:ssa yhden tunnin ajan, sen jälkeen reaktioseokseen 10 lisättiin ylimäärä heksaaneja ja seos väkevöitiin tyhjössä noin 75 mlrksi. Liuokseen lisättiin etyyliasetaattia (noin 200 ml), ja seos väkevöitiin noin 50 ml:ksi ja raakatuot-teena saatava N-formyyli-LL-E332886II (676 mg) saostettiin lisäämällä 300 ml heksaaneja.
15 Raakatuotteena saatu N-formyyli-LL-E33288611 liuo tettiin 3 ml:aan etyyliasetaattia ja kromatografoitiin Bio-Sil A- (40 - 80 μ) pylväällä (2,5 x 95 cm), joka oli pakattu ja tasapainotettu etyyliasetaatilla. Pylvästä eluoitiin virtausnopeudella 10 ml/min etyyliasetaatilla, 20 kunnes keltainen nauha oli poistunut pylväästä (1,75 tuntia). Sen jälkeen sitä eluoitiin virtausnopeudella 5 ml/min etyyliasetaatilla, joka oli kyllästetty 0,1 M ka-liumdivetyfosfaatilla, vielä 5 tuntia. Kromatografian aikana kerättiin 20 ml:n fraktioita. Fraktiot analysoitiin 25 TLC:llä (E. Merck silikageeli 60 F254:lla etukäteen peitetyt alumiinilevyt, 0,2 mm, 3 % isopropanoli etyyliasetaatissa, joka oli kyllästetty 0,1 M kaliumdivetyfosfaatilla, todettiin sumuttamalla 3-prosenttisella kupariasetaatin liuoksella 8-prosenttisessa fosforihapon vesiliuoksessa), 30 ja pääosan N-formyyli-LL-E33288611:sta sisältävät fraktiot (92 - 98) yhdistettiin ja käsiteltiin väkevöimällä ja saostamalla, jolloin saatiin 294 mg osittain puhdistettua N-formyyli-LL-E3328861I:a. Tämän erän TLC-analyysi (todettiin bioautografialla käyttäen agar-biokemiallista induk-35 tiokoetta) osoitti, ettei siinä ollut yhtään reagoimatonta LL-E3328861I:a jäljellä.
26 97889
Osittain puhdistettu N-formyyli-LL-E3328861I liuotettiin 4 ml:aan asetonitriilin ja 0,2 M ammoniumasetaatin seosta (pH 6,0, 35:65) ja kromatografoitiin kahdessa erässä Sepralyte C18-pylväällä (1,5 x 45 cm), joka oli tasapai-5 notettu asetonitriilin ja 0,2 M ammoniumasetaatin seoksella (pH 6,0, 35:65). Pylvästä eluoitiin virtausnopeudella 8 ml/min samalla liuottimena 3 tunnin ajan ja tarkkailtiin UV254nB:ssa ja kerättiin 20 ml:n fraktioita. Piikkifraktiot analysoitiin HPLC:llä ja ne, jotka sisälsivät puhdasta N-10 formyyli-LL-E3328861I: a HPLC-analyysin mukaan, yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä asetonitriilin poistamiseksi. Vesipitoisessa seoksessa läsnäoleva N-formyyli-LL-E3328861I uutettiin etyyliasetaattiin ja käsiteltiin väkevöimällä ja seostamalla, jolloin saatiin 161 mg puhdasta N-formyyli-15 LL-E3328861I:a. 1H-NMR-spektri on esitetty kuviossa II.
Esimerkki 4 N-asetyyli-LL-E33288x.,I:n valmistus
Etikkahappoanhydridiä (4 ml) lisättiin tipoittain osittain puhdistetun LL-E33288x11:n (1,25 g, 85 % puhdas) 20 liuokseen metanolissa (100 ml), jota sekoitettiin ja joka oli jäähdytetty jää-vesi -hauteessa. Reaktioseoksen annettiin sekoittua 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, sen jälkeen lämmitettiin hitaasti huoneen lämpötilaan, ja reaktion annettiin jatkua vielä 2 tuntia. Sitten reaktioseos väkevöitiin 25 tyhjössä ja jäännös otettiin talteen seokseen, jonka muodostivat 100 ml sekä dikloorimetaania että vettä. Vesifaasi neutraloitiin laimealla natriumhydroksidin vesiliuoksella, jotta saataisiin poistetuksi suurin osa orgaanisessa faasissa olevasta etikkahaposta. Orgaaninen faasi ero-30 tettiin, kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla, väkevöitiin pieneen tilavuuteen, ja tuote saostettiin lisäämällä heksaaneja, jolloin saatiin 1,18 g 80-prosenttisesti puhdasta N-asetyyli-LL-E33288x1I: a, joka voidaan puhdistaa esimerkissä 1 kuvatun menettelyn mukaisesti, jolloin saa-35 daan puhdasta N-asetyyli-LL-E33288x1I:a. Ultravioletti-, 27 97889 infrapuna-, protoni- ja hiili-13-spektrit on esitetty kuvioissa III - VI.
Esimerkki 5 N-formyyli-LL-E33288x1I:n valmistus 5 Etikkahapon ja muurahaishapon seka-anhydridi (100 μΐ), joka oli juuri valmistettu kuten esimerkissä 2 on kuvattu, lisättiin tipoittain analyyttisesti puhtaan LL-Ε33288τ11:η (49,6 mg) metanolipitoiseen (50 ml) liuokseen, jota sekoitettiin ja joka oli jäähdytetty jää-vesi -hau-10 teella. Reaktioseoksen annettiin sekoittua 0 eC:ssa yhden tunnin ajan ja sen jälkeen huoneen lämpötilassa yön yli. Sen jälkeen se väkevöitiin kuiviin, liuotettiin uudelleen pieneen määrään etyyliasetaattia, ja tuote seostettiin lisäämällä heksaania. Kuivattu sakka liuotettiin uudelleen 15 10 ml:aan metanolia ja sitä käsiteltiin jälleen etikka- hapon ja muurahaishapon seka-anhydridillä (400 μΐ). Reaktioseoksen annettiin sekoittua huoneen lämpötilassa 2 tunnin ajan ja sitä käsiteltiin väkevöimällä ja saostamalla kuten edellä on kuvattu, jolloin saatiin raakatuotteena N-20 formyyli-LL-E33288x11:a luonnonvalkoisena kiinteänä aineena. Raakatuotteena saatu N-formyyli-LL-E33288r1I puhdistettiin preparatiivisella TLC:llä (kaksi 20 cm x 20 cm Analtech suippoa silikageeli GF-levyä, eluoitiin 3 % iso-propanolilla etyyliasetaatissa, joka oli kyllästetty 0,1 M 25 kaliumdivetyfosfaatilla), jolloin saatiin puoliksi puhdistettu N-formyyli-LL-E33288r1I.
Esimerkki 6 N-asetyylidihydro-LL-E33288x1*:n valmistus 2 ml:n erä metyylijodidia lisättiin liuokseen, jon-30 ka muodosti 25 mg N-asetyyli-LL-E33288x1I:a (valmistettu kuten esimerkissä 4 on kuvattu) 8 ml:ssa absoluuttista etanolia, ja seos jäähdytettiin jää-vesi -hauteessa. Tähän lisättiin 1 ml 0,4 M natriumboorihydridin etanolipitoista liuosta kahdessa yhtä suuressa erässä. Kun reaktio oli 35 mennyt loppuun (10 minuuttia toisen natriumboorihydridi- 28 97889 liuoserän lisäämisen jälkeen), boraattikompleksi hajotettiin lisäämällä 400 μΐ 4 M etikkahapon etanolipitoista liuosta. Sen jälkeen reaktioseos väkevöitiin kullankeltaiseksi jäännökseksi, joka liuotettiin uudelleen 10 ml:aan 5 etyyliasetaattia, laimennettiin 10 ml:11a dikloorimetaania ja väkevöitiin uudelleen kuiviin. Jäännös liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin, liukenematon boraattisuola suodatettiin, ja liuos väkevöitiin kuiviin, jolloin saatiin luonnnonvalkoinen kiinteä aine, joka suspendoitiin 4 10 ml:aan vettä ja vietiin Bond Elut™- (Analytichem International ) C18-patruunan läpi. Patruunaa eluoitiin seuraavaksi 4 ml:11a sekä vettä, metanolin ja veden seosta (1:1) että metanolia. Metanolieluaatti, joka sisälsi suurimman osan N-asetyyli-LL-E33288x1I:sta, väkevöitiin, jolloin saatiin 15 luonnonvalkoinen kiinteä aine, ja puhdistettiin edelleen preparatiivisella TLC:llä (Analtech-silikageeli GF, 20 x 20 cm, 1000 μ:n kerrospaksuus, eluointi etyyliasetaatin ja metanolin seoksella, 97:3), jolloin saatiin analyyttisesti puhdasta N-asetyylidihydro-LL-E33288x1I:a. UV- ja 1H-NMR-20 spektri on esitetty kuvioissa VII ja VIII.
Esimerkki 7 N-monometyylisukkinyyli-LL-E33288x11:n valmistus
Meripihkahapon monometyyliesterin anhydridiä (55 mg) lisättiin kolmessa erässä LL-E33288x11:n (12,3 mg) liu-25 okseen metanolissa (2 ml) ja pidettiin huoneen lämpötilassa kolmen vuorokauden ajan. Reaktioseos väkevöitiin kuiviin ja jäännös liuotettiin uudelleen pieneen määrään etyyliasetaattia ja saostettiin lisäämällä heksaania. Ku-mimaista sakkaa trituroitiin perusteellisesti dietyylieet-30 terillä ja sen jälkeen liuotettiin uudelleen pieneen määrään etyyliasetaattia ja saostettiin lisäämällä dietyyli-eetteriä ja heksaania, jolloin saatiin raakatuotteena N-monometyylisukkinyyli-LL-E33288x1I: a.

Claims (20)

  1. 97889
  2. 1. Menetelmä kaavan (I) mukaisten, bakteerien ja kasvainten vastaisten, LL-E33288-antibioottikompleksin 5 a2Br-, 8^-, XjBr-, cij1-, 8^-, τ^- ja 6^-komponenttien N-asyylijohdannaisten ja N-asyylidihydrojohdannaisten valmistamiseksi , 0 II
  3. 10 R-C-N-W (I) K jossa W on
  4. 15 R4 _ f* ? CH, CHjSSS^/ J I T I c”> n .--kJN OCHj
  5. 20 R.O^Y^OCH, OH P^J OCHj O OCHj 25. on vety tai haarautunut tai haarautumaton alkyyliCC^o)-tai alkyleeni(C1.10) ryhmä, aryyli- tai heteroaryyliryhmä, tai aryylialkyyliiC^)- tai heteroaryylialkyyliiC^) ryhmä, jotka kaikki ovat mahdollisesti substituoituja yhdellä tai useammalla hydroksi-, amino-, karboksi-, halogeeni-, 30 nitro-, alemmalla (C1.3)alkoksi- tai alemmalla (C^^tioal-koksiryhmällä; Rx on H tai v/N/VO
  6. 35 HCoH£Z^y OCH’ OH 97889 R2 on CH3, C2Hs tai CH(CH3)2; R4 on OH, kun R5 on H, tai R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin; ja X on jodi- tai bro-miatomi, tunnettu siitä, että a) johdannaisten valmistamiseksi, joissa R4 ja R5 5 muodostavat yhdessä karbonyylin, annetaan antibiootin LL-E33288, jolla on kaava H-N-W R2 10 jossa symbolin W substituentit R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin, reagoida sopivasti substituoidun anhydridin, happokloridin, etikka- ja muurahaishapon seka-anhydridin tai meripihkahapon monometyyliesterin anhydridin kanssa 15 metyylialkoholissa lämpötilassa väliltä -5 - noin +5 °C yhden tunnin ajan ja ympäristön lämpötilassa 1-20 tuntia, tuote saostetaan etyyliasetaatista heksaaneilla ja puhdistetaan kromatografisesti, b) minkä jälkeen vastaavien dihydrojohdannaisten 20 valmistamiseksi saatetaan näin saatu N-asyylijohdannainen, jolla on kaava: O II R-C-N-W
  7. 25 R2 reagoimaan natriumborohydridin alkoholiliuoksen kanssa metyylijodidin alkoholiliuoksessa 5 minuutin - 5 tunnin ajan lämpötilassa väliltä -5 eC - noin +5 °C, boraatti-30 kompleksi hajotetaan etikkahapon etanoliliuoksella ja saatu dihydrotuote puhdistetaan kromatografisesti.
  8. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava 35 31 97889 0 II R-C-N-W R2 5 ja joka on kasvainten vastainen antibiootti N-asetyyli-LL-E33288Ö!1, jossa kaavassa W on määritelty edellä; R on CH3; Rj on 10 OCH, *
  9. 1 OH R2 on CH3; R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin; X on jodi ja jonka yhdisteen 15 a) ^-NMR-spektri on esitetty kuviossa I; b) moolimassa on 1395 määritettynä FAB-MS:lla; c) molekyylikaava on C56H74N3022IS4 ja tarkka massa M+K:lle määritettynä korkean erotuskyvyn FAB-MS:lla on 1434,2329 yhdisteelle C56H75N3022IS4K; 20 d) retentioaika on 4,5 minuuttia HPLCillä käyttäen pylvästä Analytichem Sepralyte C18, 5 pm, 4,6 mm x 25 cm ja liikkuvana faasina 0,2 M ammoniumasetaatin vesiliuosta, jonka pH on 6,0 ja johon on lisätty asetonitriiliä suhteessa 1:1 ja jonka virtausnopeus on 1,5 ml/min, ja jolla 25 todettiin UV-huiput 254 nm:ssa ja 280 nm:ssa; ja e) Rf on 0,25 Whatmanin korkeapaine-TLC- (HPTLC) levyillä, tyyppi LHP-KF, käyttäen etyyliasetaattia, joka on kyllästetty 0,1 M vesipitoisella fosfaattipuskurilla pH:ssa 7,0, visualisoitu käyttäen 254 nm:n UV-lamppua.
  10. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava O
  11. 35 R-C-N-W R2 97889 ja joka on kasvainten vastainen antibiootti N-formyyli-LL-E33288Ö!1, jossa kaavassa W on määritelty edellä; R on H; R: on ΆΑΛ 5 0-71 OCH, '
  12. 5 OH R2 on CH3; R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin; X on 10 jodi, ja jonka yhdisteen a) 1H-NMR-spektri on esitetty kuviossa II; b) moolimassa on 1381 määritettynä FAB-MS:lla; c) molekyylikaava on C55H72N3022IS4 ja tarkka massa M+K:lle on 1420,2172 määritettynä korkean erotuskyvyn FAB-
  13. 15 MS :11a yhdisteelle C55H72N3022IS4K; d) retentioaika on 4,2 minuuttia HPLC:llä käyttäen pylvästä Analytichem Sepralyte Cie, 5 pm, 4,6 mm x 25 cm ja liikkuvana faasina 0,2 M ammoniumasetaatin vesiliuosta pH:ssa 6,0, ja johon on lisätty asetonitriiliä suhteessa 20 1:1 ja jonka virtausnopeus on 1,5 ml/min, ja jolla todet tiin UV-huiput 254 nm:ssa ja 280 nm:ssa; ja e) Rf on 0,31 Whatman korkeapaine-TLC- (HPTLC-) levyillä, tyyppi LHP-KF, käyttäen etyyliasetaattia, joka on kyllästetty 0,1 M vesipitoisella fosfaattipuskurilla 25 pH:ssa 7,0 ja joka visualisoitiin käyttäen 254 nm:n υνί amppua.
  14. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava 30 0 II R-C-N-W *2 35 ja joka on kasvainten vastainen antibiootti N-asetyyli-LL-E33288X!1, jossa kaavassa W on määritelty edellä; R on CH3; Rx on 97889 »yv/V' CHj-^T^O-y HO ----- 0CH’ OH 5 R2 on C2H5; R4 ja R5 muodostavat yhdessä karbonyylin; X on jodi ja jonka yhdisteen a) ultraviolettispektri on esitetty kuviossa III; b) infrapuna-absorptiospektri on esitetty kuviossa
  15. 10 IV; c) 1H-NMR-spektri on esitetty kuviossa V; ja d) 13C-NMR-spektri on esitetty kuviossa VI, jossa merkittäviä piikkejä ovat: 14.0 q 17,6 q 17,7 q 19,0 q 22,4 q 22,8 q 15 25,4 q 36,7 t 36,9 t 39,2 t 47,6 t 51,6 d 52,4 q 53,1 t 57,0 q 57,2 q 58,8 t 60,9 q 61,7 q 64,4 d 67,0 d 68,1 d 68,4 d 69,0 d 69.1 d 70,5 d 71,1 d 71,7 s 71,9 d 72,4 d 77,6 d 80,8 d 83,2 s 87,0 s 93,5 s 97,9 d 20 98,1 s 99,7 d 100,9 s 101,3 d 102,6 d 123,2 d 124,5 d 127,1 d 130,2 s 133,4 s 136,5 s 142,9 s 143.0 s 150,6 s 151,5 s 155,0 s 172,3 s 191,9 s 192.1 s e) moolimassa on 1409 määritettynä FAB-MS:lla; 25 f) molekyylikaava on C57H76N3022IS4 ja tarkka massa M+H:lle määritettynä korkean erotuskyvyn FAB-MS:lla on 1410,2954 yhdisteelle C57H76N3022IS4K; g) retentioaika on 6,6 minuuttia HPLCrllä käyttäen pylvästä Analytichem Sepralyte C18, 5 pm, 4,6 mm x 25 cm ja 30 liikkuvana faasina 0,2 M ammoniumasetaatin vesiliuosta pH:ssa 6,0 ja johon on lisätty asetonitriiliä suhteessa 1:1 ja jonka virtausnopeus on 1,5 ml/min, ja jolla todettiin UV-huiput 254 nm:ssa ja 280 nm:ssa; ja h) Rf on 0,53 Whatman korkeapaine-TLC- (HPTLC-) 35 levyillä, tyyppi LHP-KF, käyttäen etyyliasetaattia, joka on kyllästetty 0,1 M vesipitoisella fosfaattipuskurilla 97889 pH:ssa 7,0 ja joka visualisoitiin käyttäen 254 nm:n UV-lamppua.
  16. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaa- 5 va O tl R-C-N-W R2 10 ja joka yhdiste on kasvainten vastainen antibiootti N-ase-tyylidihydro-LL-E33288x11, jossa kaavassa W on määritelty edellä; R on CH3; Rx on v/V/V/» HO OCHj I * OH R2 on C2H5; R4 on OH; R5 on H; X on jodi; ja jonka yhdis-20 teen a) ultraviolettiabsorptiospektri on esitetty kuviossa VII; b) 1H-NMR-spektri on esitetty kuvassa Vili; ja c) Rf on 0,38 Whatman korkeapaine-TLC- (HPTLC-) 25 levyillä, tyyppi LHP-KF, käyttäen etyyliasetaattia, joka on kyllästetty 0,1 M vesipitoisella fosfaattipuskurilla pHrssa 7,0 ja joka visualisoitiin käyttäen 254 nm:n υνί amppua.
  17. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-30 n e t t u siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava O II R-C-N-W 1 R2 97889 jossa R on CH3 tai H; R2 on CH3, CH3CH2 tai (CH3)2CH, saattamalla yhdiste, jolla on kaava 0 II
  18. 5 R-C-N-W R2 jossa R2 on CH3, CH3CH2 tai (CH3)2CH, reagoimaan etikkahappo-anhydridin kanssa tai etikkahapon ja muurahaishapon seka-10 anhydridin kanssa metanolissa -5 - +5 °C:ssa noin yhden tunnin ajan.
  19. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava 15 0 II R-C-N-W (dihydro) K 20 jossa R on CH3 tai H; R2 on CH3, CH3CH2 tai (CH3)2CH, saattamalla yhdiste, jolla on kaava O II R-C-N-W
  20. 25 K jossa R2 on CH3, CH3CH2 tai (CH3)2CH, reagoimaan natriumboo-rihydridin kanssa alkoholipitoisessa liuoksessa lämpötilassa välillä -5 - noin +5 °C 5 minuutista 5 tuntiin pi-30 tuisena aikana. 97889
FI901865A 1989-04-14 1990-04-12 Uusi menetelmä bakteerien ja kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten ja N-asyylidihydrojohdannaisten valmistamiseksi FI97889C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33892889 1989-04-14
US07/338,928 US5079233A (en) 1987-01-30 1989-04-14 N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI901865A0 FI901865A0 (fi) 1990-05-12
FI97889B FI97889B (fi) 1996-11-29
FI97889C true FI97889C (fi) 1997-03-10

Family

ID=23326735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI901865A FI97889C (fi) 1989-04-14 1990-04-12 Uusi menetelmä bakteerien ja kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien N-asyylijohdannaisten ja N-asyylidihydrojohdannaisten valmistamiseksi

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5079233A (fi)
EP (2) EP0392376B1 (fi)
JP (1) JP3083309B2 (fi)
KR (1) KR0149493B1 (fi)
CN (1) CN1027267C (fi)
AT (2) ATE297405T1 (fi)
AU (1) AU627863B2 (fi)
CA (1) CA2014472C (fi)
CZ (2) CZ284618B6 (fi)
DE (2) DE69033839T2 (fi)
DK (2) DK1097937T3 (fi)
ES (2) ES2162783T3 (fi)
FI (1) FI97889C (fi)
IE (1) IE20011013A1 (fi)
IL (1) IL93732A (fi)
NO (1) NO172938C (fi)
NZ (1) NZ233149A (fi)
PH (1) PH27361A (fi)
PT (1) PT93715B (fi)
SG (1) SG47857A1 (fi)
SK (1) SK281179B6 (fi)
ZA (1) ZA902839B (fi)

Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
WO1997014421A1 (en) * 1995-10-20 1997-04-24 University Of Utah Research Foundation Namenamicin, an enediyne antitumor antibiotic from the marine ascidian polysyncraton lithostrotum
JP4813660B2 (ja) 1998-11-27 2011-11-09 ダーウィン ディスカバリー リミテッド 骨鉱化作用を増加するための組成物および方法
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US7608681B2 (en) * 1999-12-24 2009-10-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
US20040001827A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20050287153A1 (en) * 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20060228364A1 (en) * 1999-12-24 2006-10-12 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20040023910A1 (en) * 2001-09-28 2004-02-05 Zhiming Zhang Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas
US20110045005A1 (en) 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
SG187991A1 (en) 2002-05-02 2013-03-28 Wyeth Corp Calicheamicin derivative-carrier conjugates
US7381409B2 (en) 2003-06-16 2008-06-03 Celltech R&D, Inc. Antibodies specific for sclerostin and methods of screening and use therefor
AU2004261980A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Genentech, Inc. Antibody CDR polypeptide sequences with restricted diversity
US20050282168A1 (en) * 2003-09-29 2005-12-22 Wyeth Cell surface molecules as markers and therapeutic agents against kidney cancers
EP3434275A1 (en) 2003-11-06 2019-01-30 Seattle Genetics, Inc. Assay for cancer cells based on the use of auristatin conjugates with antibodies
AU2004309347B2 (en) 2003-12-19 2010-03-04 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
TW200539855A (en) * 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
MXPA06014065A (es) 2004-06-01 2007-01-31 Genentech Inc Conjugados de droga-anticuerpo y metodos.
US20060222850A1 (en) * 2005-04-01 2006-10-05 The University Of Chicago Synthesis of a self assembled hybrid of ultrananocrystalline diamond and carbon nanotubes
WO2006026759A2 (en) 2004-09-03 2006-03-09 Genentech, Inc. Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
US20060088522A1 (en) * 2004-09-10 2006-04-27 Wyeth Humanized anti-5T4 antibodies and anti-5T4/calicheamicin conjugates
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
JP2008515889A (ja) * 2004-10-05 2008-05-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 毒性の低下した治療剤
JP4993645B2 (ja) 2004-12-01 2012-08-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体薬剤結合体および方法
US20070003559A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Wyeth Methods of determining pharmacokinetics of targeted therapies
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
KR101434682B1 (ko) * 2005-12-02 2014-08-27 제넨테크, 인크. 결합 폴리펩티드 및 이들의 용도
WO2007064919A2 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP1957097A1 (en) * 2005-12-06 2008-08-20 Wyeth a Corporation of the State of Delaware Interleukin-11 compositions and methods of use
CN103396485B (zh) 2005-12-15 2016-08-10 健泰科生物技术公司 靶向多聚泛蛋白的方法和组合物
EP1973950B1 (en) 2006-01-05 2014-09-17 Genentech, Inc. Anti-ephb4 antibodies and methods using the same
TW200806685A (en) * 2006-02-21 2008-02-01 Wyeth Corp Processes for the convergent synthesis of calicheamicin derivatives
NZ596295A (en) 2006-03-10 2013-01-25 Wyeth Corp Anti-5T4 antibodies and uses thereof
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
WO2007140371A2 (en) 2006-05-30 2007-12-06 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
AU2007308792B2 (en) 2006-10-27 2013-01-24 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
BRPI0806403A2 (pt) 2007-02-09 2011-09-06 Genentech Inc anticorpo anti-robo4, usode um anticorpo e método de obtenção de imagem
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
SI2465541T1 (sl) 2007-05-22 2018-10-30 Wyeth Llc Izboljšani postopki za izdelavo hidrazidov
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
PE20090309A1 (es) * 2007-06-04 2009-04-18 Wyeth Corp Conjugado portador-caliqueamicina y un metodo de deteccion de caliqueamicina
TWI580694B (zh) 2007-11-30 2017-05-01 建南德克公司 抗-ｖｅｇｆ抗體
ES2613963T3 (es) 2008-01-18 2017-05-29 Medimmune, Llc Anticuerpos manipulados con cisteína para conjugación específica de sitio
EP3208612B1 (en) 2008-04-09 2019-09-18 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
MX2010012368A (es) * 2008-05-16 2010-12-06 Genentech Inc Uso de biomarcadores para evaluar un tratamiento contra trastornos inflamatorios gastrointestinales con antagonistas de beta7-integrina.
JP5986745B2 (ja) 2008-07-15 2016-09-06 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｐｔｆｅ様のアルミニウム・コート・ガラススライド上のグリカンアレイおよび関連する方法
SG10201402742YA (en) 2009-03-20 2014-08-28 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
HRP20150965T1 (hr) * 2009-03-25 2015-11-06 Genentech, Inc. Anti-fgr3 protutijela i metode koje ih koriste
CA2766405A1 (en) 2009-06-22 2011-01-13 Medimmune, Llc Engineered fc regions for site-specific conjugation
DK2473522T3 (en) 2009-09-02 2016-11-28 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
CA2771817A1 (en) * 2009-10-19 2011-04-28 Genentech, Inc. Modulators of hepatocyte growth factor activator
BR112012009412A2 (pt) 2009-10-22 2016-11-29 Genentech Inc 'anticorpo anti-hepsina isolado, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira, método para fabricar um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso do anticorpo e método para fabricar um anticorpo anti-serina protease'
BR112012009409A2 (pt) 2009-10-22 2017-02-21 Genentech Inc método de identificação de uma substância inibidora, molécula antagonista, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, método para fabricar a molécula, composição, artigo de fabricação, método de inibição de uma atividade biológica, método de tratamento de uma condição patológica, método para detectar msp em uma amostra e método para detectar hepsina em uma amostra
WO2011056494A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
SI2496601T1 (sl) 2009-11-05 2017-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Tehnike in sestavek za sekrecijo heterolognih polipeptidov
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
TWI505836B (zh) 2009-12-11 2015-11-01 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ－ｃ抗體及其使用方法
NZ600826A (en) 2009-12-23 2014-09-26 Genentech Inc Anti-bv8 antibodies and uses thereof
KR101723615B1 (ko) 2010-01-12 2017-04-06 한상선 천연 한약재를 이용한 샴푸 조성물
TWI504410B (zh) 2010-02-08 2015-10-21 Agensys Inc 結合至１６１ｐ２ｆ１０ｂ蛋白之抗體藥物結合物（ａｄｃ）
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
BR112012029866A2 (pt) 2010-06-03 2017-03-07 Genentech Inc método para a determinação da presença de uma proteína steap-1
EP2621526B1 (en) 2010-09-29 2018-06-06 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (adc) that bind to 191p4d12 proteins
AU2011312205B2 (en) 2010-10-05 2015-08-13 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
EP3763740A1 (en) 2011-01-26 2021-01-13 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
PH12014500925A1 (en) 2011-10-28 2014-06-09 Genentech Inc Therapeutic combinations and methods of treating melanoma
EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
CN102584915B (zh) * 2011-12-31 2014-07-23 沈阳药科大学 一种芳香酸类化合物及其用途
WO2013106489A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 The Scripps Research Institute Humanized antibodies with ultralong cdr3s
US10774132B2 (en) 2012-01-09 2020-09-15 The Scripps Research Instittue Ultralong complementarity determining regions and uses thereof
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
ES2723885T3 (es) 2012-07-19 2019-09-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpos anti-Siglec-15
CN104812775B (zh) 2012-07-25 2019-05-03 塞尔德克斯医疗公司 抗kit抗体及其用途
WO2014031498A1 (en) 2012-08-18 2014-02-27 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
SG10201912773TA (en) 2012-08-23 2020-02-27 Agensys Inc Antibody drug conjugates (adc) that bind to 158p1d7 proteins
CA2890265C (en) 2012-11-05 2023-01-17 Pierre Fabre Medicament Antigen binding proteins and their use as addressing product for the treatment of cancer
US10086054B2 (en) 2013-06-26 2018-10-02 Academia Sinica RM2 antigens and use thereof
WO2014210564A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
US10640574B2 (en) 2013-07-18 2020-05-05 Taurus Biosciences, Llc Humanized antibodies with ultralong complementary determining regions
WO2015017146A2 (en) 2013-07-18 2015-02-05 Fabrus, Inc. Antibodies with ultralong complementarity determining regions
HK1225621A1 (zh) 2013-08-01 2017-09-15 Agensys, Inc. 结合cd37蛋白的抗体药物偶联物(adc)
JP6486368B2 (ja) 2013-09-06 2019-03-20 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ 改変されたグリコシル基を含む糖脂質を用いたヒトｉＮＫＴ細胞の活性化
BR112016010051A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Pfizer ?conjugados de anticorpo-fármaco anti-efna4?
TW201620939A (zh) 2014-01-16 2016-06-16 中央研究院 治療及檢測癌症之組合物及方法
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
RU2685728C2 (ru) 2014-01-29 2019-04-23 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Конъюгат лиганд - цитотоксическое лекарственное средство, способ его получения и его применения
ES2694857T3 (es) 2014-02-04 2018-12-27 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de uso de la misma
EP3129767B1 (en) 2014-03-27 2021-09-01 Academia Sinica Reactive labelling compounds and uses thereof
KR20220018620A (ko) 2014-04-25 2022-02-15 피에르 파브르 메디카먼트 Igf-1r 항체 및 암 치료를 위한 운반체를 어드레싱하는 그의 용도
EP3137114B8 (en) 2014-04-30 2021-08-04 Pfizer Inc. Anti-ptk7 antibody-drug conjugates
DK3149045T3 (da) 2014-05-27 2023-03-06 Academia Sinica Sammensætninger og fremgangsmåder vedrørende universelle glycoformer til forbedret antistofeffekt
AU2015267045B2 (en) 2014-05-27 2021-02-25 Academia Sinica Anti-HER2 glycoantibodies and uses thereof
KR20170003720A (ko) 2014-05-27 2017-01-09 아카데미아 시니카 항-ｃｄ20 글리코항체 및 이의 용도
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
JP7063538B2 (ja) 2014-05-28 2022-05-09 アカデミア シニカ 抗ＴＮＦα糖操作抗体群およびその使用
WO2016034968A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Pfizer Inc. Therapeutic antibody
EP3191500A4 (en) 2014-09-08 2018-04-11 Academia Sinica HUMAN iNKT CELL ACTIVATION USING GLYCOLIPIDS
CN107108740B (zh) 2014-11-05 2021-09-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗fgfr2/3抗体及其使用方法
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10342858B2 (en) 2015-01-24 2019-07-09 Academia Sinica Glycan conjugates and methods of use thereof
KR102630294B1 (ko) 2015-01-24 2024-01-26 아카데미아 시니카 암 마커 및 이를 사용하는 방법
WO2016126972A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP3365025B1 (en) 2015-10-20 2020-07-15 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
ES2975747T3 (es) 2015-11-30 2024-07-12 Univ California Administración de carga útil específica de tumor y activación inmunitaria utilizando un anticuerpo humano que se dirige a un antígeno de superficie celular de tumor altamente específico
AU2017213826A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2017153432A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Pierre Fabre Medicament A new universal method to capture and analyze adcs for characterization of drug distribution and the drug-to-antibody ratio in biological samples
AU2017231749A1 (en) 2016-03-08 2018-09-20 Academia Sinica Methods for modular synthesis of N-glycans and arrays thereof
WO2017180713A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Orimabs Ltd. Anti-psma antibodies and use thereof
JP2019524706A (ja) 2016-07-08 2019-09-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｍｕｃ１６陽性癌治療の応答性を評価するためのヒト精巣上体タンパク質４（ｈｅ４）の使用
AU2017316663B2 (en) 2016-08-22 2024-02-22 CHO Pharma Inc. Antibodies, binding fragments, and methods of use
WO2019018647A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Pfizer Inc. ANTI-GD3 ANTIBODIES AND CONJUGATES ANTIBODY-MEDICATION
EP3720504A1 (en) 2017-12-06 2020-10-14 Synaffix B.V. Enediyne conjugates
CN112739340B (zh) 2018-07-23 2025-05-13 海德堡医药研究有限责任公司 抗cd5抗体药物缀合物(adc)在同种异体细胞疗法中的用途
BR112021004656A2 (pt) 2018-09-26 2021-06-01 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. conjugado fármaco-ligante de análogo exatecano, método para preparar o mesmo e aplicação do mesmo
US20220267452A1 (en) 2019-07-12 2022-08-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-mutation type fgfr3 antibody and use therefor
EP4025606A1 (en) 2019-09-04 2022-07-13 Y-Biologics Inc. Anti-vsig4 antibody or antigen binding fragment and uses thereof
WO2021148003A1 (zh) 2020-01-22 2021-07-29 上海森辉医药有限公司 艾日布林衍生物的药物偶联物、其制备方法及其在医药上的应用
WO2021190581A1 (zh) 2020-03-25 2021-09-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含抗体药物偶联物的药物组合物及其用途
JP7730836B2 (ja) 2020-03-25 2025-08-28 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗体薬物複合体の調製方法
KR20230156727A (ko) 2021-03-03 2023-11-14 피에르 파브르 메디카먼트 항-vsig4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 용도
EP4172212A1 (en) 2021-04-30 2023-05-03 Pierre Fabre Medicament New stable anti-vista antibody

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5644076B2 (fi) * 1973-07-12 1981-10-16
ATE219096T1 (de) * 1987-01-30 2002-06-15 American Cyanamid Co Dihydroderivate der antibiotika vom typ ll-e33288
US4837206A (en) * 1987-04-29 1989-06-06 Bristol-Myers Company Esperamicin derivatives
ES2059464T3 (es) * 1987-10-30 1994-11-16 American Cyanamid Co Formas especificamente dirigidas de agentes antitumorales de metiltritio.
IL115770A (en) * 1989-04-14 1999-03-12 American Cyanamid Co Substituted disulfides of formula q-sp-ss-w their preparation and use for inhibiting the growth of tumours and for treating bacterial infections

Also Published As

Publication number Publication date
PT93715B (pt) 1996-08-30
US5079233A (en) 1992-01-07
IE20011013A1 (en) 2002-12-30
NO901654D0 (no) 1990-04-11
DE69034194T2 (de) 2005-11-03
KR900016242A (ko) 1990-11-13
SG47857A1 (en) 1998-04-17
DE69033839D1 (de) 2001-12-06
CZ284618B6 (cs) 1999-01-13
CN1048390A (zh) 1991-01-09
ATE207926T1 (de) 2001-11-15
SK188390A3 (en) 2000-12-11
CA2014472A1 (en) 1990-10-14
DK1097937T3 (da) 2005-09-19
IL93732A0 (en) 1990-12-23
EP0392376A2 (en) 1990-10-17
DK0392376T3 (da) 2001-12-03
FI901865A0 (fi) 1990-05-12
DE69034194D1 (de) 2005-07-14
NO172938C (no) 1993-12-29
KR0149493B1 (ko) 1998-08-17
NO901654L (no) 1990-10-15
CA2014472C (en) 2000-03-28
CZ188390A3 (cs) 1998-10-14
JP3083309B2 (ja) 2000-09-04
CN1027267C (zh) 1995-01-04
PH27361A (en) 1993-06-21
EP0392376B1 (en) 2001-10-31
JPH032192A (ja) 1991-01-08
CZ53598A3 (cs) 1998-09-16
HK1011368A1 (en) 1999-07-09
ATE297405T1 (de) 2005-06-15
ES2162783T3 (es) 2002-01-16
HK1035540A1 (en) 2001-11-30
NZ233149A (en) 1996-02-27
ZA902839B (en) 1991-12-24
SK281179B6 (sk) 2000-12-11
EP1097937A1 (en) 2001-05-09
EP0392376A3 (en) 1991-08-14
DE69033839T2 (de) 2002-06-06
AU5324890A (en) 1990-10-18
NO172938B (no) 1993-06-21
AU627863B2 (en) 1992-09-03
PT93715A (pt) 1990-11-20
ES2240000T3 (es) 2005-10-16
FI97889B (fi) 1996-11-29
IL93732A (en) 1994-11-28
CZ297668B6 (cs) 2007-02-28
EP1097937B1 (en) 2005-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0392376B1 (en) N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics
US5606040A (en) Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
Kiyoto et al. A NEW ANTITUMOR ANTIBIOTIC, FR-900482 II. PRODUCTION, ISOLATION, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY
WO2007038868A2 (en) Novel enediyne compound and uses thereof
AU612714B2 (en) Disulfur analogs of ll-e33288 antitumor agents
KASAI et al. Structure of nanaomycin E, a new nanaomycin
Barker et al. G1549, a new cyclic hydroxamic acid antibiotic, isolated from culture broth of Pseudomonas alcaligenes
Cooper et al. Sch 37137, a novel antifungal compound produced by a Micromonospora sp. Taxonomy, fermentation, isolation, structure and biological properties
CA1307256C (en) Bbm-1675c and d antitumor antibiotics
Volkmann et al. Biosynthetic Capacities of Actinomycetes. 3 Naphthgeranine F, a Minor Congener of the Naphthgeranine Group Produced by Streptomyces violaceus
WERNER et al. Gunacin, a new quinone antibiotic from Ustilago sp.
Sasaki et al. Chemical modification of streptovaricin C I. 19-O-substituted damavaricin C
US4703128A (en) Guanidylfungin derivatives and their production
HK1011368B (en) N-acyl derivatives of the ll-e33288 antitumor antibiotics
CA1301167C (en) Pseudoaglycones of ll-e33288 antibiotics
US4921700A (en) BBM-1675c and d antitumor antibiotics
AU674115B2 (en) IT-62-B substance and medicinal composition containing the same
EP0118732A2 (en) An anthracycline compound, a process for the production thereof, a pharmaceutical composition containing the same and its use as a medicament
IE83550B1 (en) N-acyl derivatives of the LL-E33288 anti-tumour antibiotics
FI70414C (fi) Foerfarande foer framstaellning av nya 4&#39;-jodderivater av antracyklinglykosider
WO2022232109A1 (en) Synthesis of cbn and cbnv
Rahman et al. An Imidazopyridinone and Further Metabolites from Streptomycetes [1]
EP0534137A2 (en) Kedarcidin antitumor chromophore

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: WYETH HOLDINGS CORPORATION