PT93715B

PT93715B - Processo para a preparacao de derivados n-acilo dos antibioticos antitumores ll-e33288

Info

Publication number: PT93715B
Application number: PT93715A
Authority: PT
Inventors: May Dean-Ming Lee
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1990-04-10
Publication date: 1996-08-30
Also published as: DE69033839T2; US5079233A; DK1097937T3; IL93732A0; PH27361A; KR0149493B1; CZ297668B6; EP1097937B1; EP0392376B1; SK281179B6; AU627863B2; CZ53598A3; CA2014472C; SK188390A3; NO901654D0; AU5324890A; PT93715A; DE69033839D1; ES2240000T3; CN1048390A

Description

PATENTE DE INVBNÇAO

N2 93.715 .

NOME: AMERICAN CYANAMID COMPANY., norte-americana, indus trial, com sede em Wayne, New Jersey, ESTADOS UNIDOÍ DA AMERICA DO NORTE

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS N-ACILO DOS ANTIBIÓTICOS ANTITUMORES LL-E33288

INVENTORES: MAY DEAN-MING LEE

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Harço de 1883.

ESTADOS UNIDOS DA AMERICA DO NORTE, EM 14 DE ABRIL DE 1989, SOB 0 No.07/338,928

AMERICAN CYANAMID COMPANY ”FT(UCt.SSO PARA A F‘PEr*AP;-*, CA Ο Uu ut.n ΑΝΤΙTUMORES LL--E33233

IVADOS N-ACILO DOS ANTIBIÓTICOS

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

0	invento refere	br. bd 3. Lí	.ΪΠ proc		pa	r a a	jjr ejjar rfçe.u	-I ... ·—í
N-	acilo e di—h	idrc-N-·	3.C Í 1 C)	d ··?.	fa	m í 1 i	a dos açen	t <3 S
*- z'·.	nos e antitu	ÍTiCrSS	“ D Cl hl θ c	I d £· 5		ο I ec	t .ί. va«neπ te c	CiTtO

complexo E33'2tíS ± asserscialmente caracterizado pela reacção do antibiótico

H-N-14 í

R.-, :om um cloreto de ácido em anidrido aproprisdairiente substituído.

U O <ai ί 1 d f éster de monometiIo do ácido succínico em álcool metílico a uma até vinte e cerca ds -*-ó ‘-‘C durante um período de unia hora e a. temperatura ambiente durante ume. até vinte e Quatro

rtir de -3.c(-?tΞto de etilo coin hi l·· ri

N=. de Série 004 154, apresentado em 30 de Janeiro de 1ύΒ7

Cl I ± U :.l U

i n v e n t o d e s c r e v e o s d e r i v a dos M - a c i I o d o s c ο m ρ o n e n tes

Br i i i i , gama, , α , Ε, , gama e <$ e dos- derivados ¹ Br ¹ „ Br ¹ Br I I jiieuttis , (1, _? gama., , P(_r. , , do complexo antibiótico LL-E332S8 preparados por

ac i	1-di	”hl	dro	d	Obp cu
ma, X	I w	^,sí	T do		comp·
ac ç	ao d	o	an t i	b	i ó t i c
idr	ido	de	ác id	o	OU c
í do	„ Es-	teS	de	r	i vado

ou cloreto ds ác ido nao substituída ou substi·

Breve Descr irão, dos Desenho!

Figura I: Espectro de ressonância magnética de prcitSo de N-aceti1-LL-E332S86

Figura II: Espectro de ressonância magnética de protâ N-formi 1-LL-E3323S-S _χ ¹.

N-aceti 1 -LL-E332'sátíqama rxgura xvs cspet u cr í e nitra v s r m e 1 h *_

.. I de N-aceti 1-LL-E3'

Ha arbuiiu-i·:· de h-acecii-i_L-t.;,o2íádgama

-4—

Figura VII: Espectro de absorção de ultravioleta de N-aceti 1 -di-hidro~-LL-E33238asma

Figura VIIIsEspectro de ressonância magnética de protão de lM-acetil~di“hidro“LL--E332BSaania₁ ¹ .

Descrição Detalhada do___Invento

A -família de agentes antibacterianos e antitumcres, conhecidos colectivamente por complexo LL-E33288, é descrita e reivindicada no Pedido Eopendente da Patente dos E.U.A. com o NQ de Série 009 321 , apresentado em 30 de Janeiro de 1987 e é utilizada para preparar os derivados IM-acilo deste invento.. □ pedido de patente anterior descreve o complexo LL-E33288, os seus componentes, -E332S8u^^Br. -E332S'Sqa.ma.

n ornead amente, Br

L.L-E332SScí

Br

-E332S3B , LS_-E3328S2_< ^Br?

Br I ¹ I < , LL-E332S8.a. , L.L-E33288^ ι I ¹ f

LL-E3328SE^ , LL-E332S8gama_}

LL-E3323SO.

L!_~ E332títíc!. LL-E33238Í1.

Br

LL~E33288cu/ L.L-E332!

L.L.LLLL.- e

Br métodos para a sua produção por fermentação aeróbica utilizando uma nova estirpe de Micromonospora echinosoora ssp. caliçhensis ou seus mutantes naturais ou derivados. As estruturas químicas propostas de alguns dos componentes acima nomeados são reveladas no IMS de Série 009 321 a são reproduzidas na Tabela I sequinte.

Propostas para cs Componentes LL-E332B8

R3=

CHj

HO^.

O <7

OCHj

OH

Designação

Ff

LL.--E3

LL.--ET

L.L---E3

L.L-E3

L.L-EZ

LL-E2

L.L--E3

38a,

.. ·.-/ H : 88gama

2386·.

288a,

238β.

•Br 'Br

283qsma

Br

H	C H “ ·~\ ¹ ‘cr Z. U	T
R,	(CH,)^CH	I
·-*	x_
R,	C.-,H_U_	I
	ãí vj
R-t	CH,	I
H	z. u	Br
R-r	í CH, }„,CH	Br
	·-’ ui.
R-r	C.-,H,_	Br
	z. sj

Como pode ser visto a partir das estruturas reveladas na Tabela I, os componentes «_r.^Br» Qarna,^Br , α„^χ , β ¹ , gama/ γ x.. 1 1 xi 1 ” 1

6, do complexo antibiótico LL-E332S3 confim, cada um, um grupo sarte de uma unidade 4-aminopentcise jberti que a reacção de qualquer dos um equivalente de catião acilo de ds ácido alquíiico ou arílico, não tem como resultado a introdução de

amino secundário que faz substituída. Foi agora desc comoonentes snteriores com anidrido de acido ou clorst s lí b s t. i t u í d o o u s u b s t. .11 u i. d o, uma u ο ι^- o nu grupu am e c u n d a r ι o l. o m o se mos tino

Esquema I s e□u i nt e.

Η

R„-/l-W em que W é Tabela I, R (R--CO' Ο

R-CQ

R._,-ríi-w

Esquema I o substituinte é hidrogénio

R -N-W ligado a R.-,ΝΗ- da aminopentose ou um grupo alquileno (C, -C. ., ) 1 10 na ou alquilo CC^-C^l ramificado ou não ramificado, ou um grupo ou heteroarilo, ou. um grupo arilo-alquilo ÍC^-C^) ou heteroarilo-alquilo todos facultativaments vj ' mais grupos hidroxilo, amino, carboxilo, (C—C-, 5 inferior, ou tioalcoxilo (C,-C,_5 1 o ’ i 5 ari lo substituídos por um ou halo, nitro, alcoxilo

Os derivados N-acilo são também preparados a partir do antibióticc-s LL-E1 di~hidro-LL-E332B8f derivados di-hidro do Br d i-hid ro-LL-E33288a c——nnn Br

-t-iiidogama , d i--hidro-LL-E33288gama antibióticos LL-E332SS, nomeadamente,

Br 1 ’ di-hidro-LLI d i~hidro-l_L-E3328S*

Ί ’ do Pedido de

Patente progenitor de NS de Série 0Õ4 154.

Como exemplo, a reacção de LL-E33288gama₁ ¹ com anidrido ¹ I acética em metanol produz N-acetil-LL-£3328Sqama₁ enquanto a

I ¹ com a mistura de anidrido de ácido reacção ds ace tico e

LL-E332SSÍ •ác idO

ΌΓιΤιΙΟΟ deles íiOVus e potentes d i-hi dro-LL-E33288gama produz N-formi 1-L.L-E332S8í·^ , qualquer A reacçáo de metanol produz om anidrido I

N-acetil~di-hidro--LL-E33288qama₁ ' . 0 N-acetil-di-hidro-LL-E33288Ϊ é também produzido, boro-hidreto de

S é r i e N 2 Θ õ 4 í 5 4 . A1 q u m a s N de ι1 o dos antibióticos pe 1 a •acção de N-aceti1-LL-E332S3gasódio sob as condicSes descritas na das estruturas químicas dos derivados anticancerígenos LL—E33283 e di—hidro—

-LL-E33288 são mostradas na Tabela II sequinte

-Β-

9Tabela II (cont.)

E strutu ras Propostas	para os Derivados	N~Acilo dos	An t i b iót i c os
LL-E3328S e di-hidro	LL-E322SS

.)

Deiign ag 3u	^R1	R_?	*4	^R0	X
N-Acil-di-hidro
LI_-E332S3u^ N-Ac i 1 L.L-É33288o	PI	C.„H^ cftC		□H		H	I
H			=0	H	1
N-Ac i 1 -d i-hidro *		Z. vJ
LL-E332888 N-Ac i1 LL-E33288β ¹	R,	(CPU) (CHÇ)	^CH 2CH	OH	=0	H H	I I
M-Ac.i 1 ~di~h.i.d rij LL-E33288gama. - N-Ac i1 LL-E33288gama ¹N-Aci1-di-hidro
8,	C-Λ '-'-O¹		OH	-0	H H	I I
	Ζ. U
LL-E332S8S M-Acil LL-E33238.S.-,¹	R„ f:2	CH-, ch2		OH	=0	H H	I I
M-Aci1-di-hidro ,—Br LL-tó._-.2títíu^ N-Ac i 1 L.L-É33288a^		”*
PI H	^C2^H5		DH	=0	H H	Br Br
N-Ac i1-d i~ hid ro
LL-E33288B M-Aci 1 LL~E33238!?>	^RT RZ	(CPU) (CH^)	^CH fCH	OH	=0	H H	Br Br
N - A c i 1 - d i - h i d r ρ , , — _______, Rr
L1— fc. ·_> uj Cj d c¹. ΙΓί â . N-Ac i1 LL-E33zS3gama_t	R^ r2	C^H^ CfH^		OH	-0	H H	Br Br

R --- hidrogénio ou um grupo alquileno (C^-C^-A ou alquilo (C^-C^^) ramificado ou não ramificado, ou um grupo arilo ou heteroarilo, ou um grupo arilo—alquila (Cj-Cc;) ou. heteroarila-alguilo (C^-Cc·), todos f acu 1 ta ti vamen te substituídos por u.m ou mais grupos hidroxilo, amino, carboxilo, halo, nitro, alcoxilo (Cj-C·?) inferior, ou tioalcoxilo (C, -Cc·) inferior.

-)

J

As carac	cterísticas físico-químicas de quatro dos derivados
N--aceti 1 o dos	antibióticos antitumores LL-E332B8, nomeadamente
N-acetil LL-E	:.3.26863¹ , N-formil LL-E332886, ¹, N-acetil LL-E33288- 1 i
I M gamaj e Γ-Ϊ—=	?.ceti 1 -di~hidro-LL-E33288gama estão descritas a
seguir.

-acetil LL-E332SBÃ·*¹

a)	peso molecular; 1395, determinado por EM-FAB;
b)	fórmula molecular: C_c, Η_,_ΛΝ^Ο__ IS, , sendo a massa jò / Q ·.:« zz. 4-' exacta para N+K, determinada por ΕΜ-FAB de alta
, c )	resolução, de 1434,2329 para , H-. .KUO^IS ,K; e espectro de ressonância magnética de protão: como se mostra na Figura I <300 ΜΗξ , CBCl.,).
N-formil LL-E'	I
5 )	peso molecular: 1331, determinado por EN-FAB;
b)	fórmula molecular; 13. , sendo a massa / Z. .Z ,Ζ *r exacta para M+K, determinada por ΕΙΊ-FAB de alta
J ^C '	resolução, de 1420,2172 para e espectro de ressonância magnética de protão; como se mostra na Figura II (300 MHc, CDC1_).
' N - a o e t i 1 L.L - E(	^ZSSqamSj ¹
) a)	peso molecular: 1409 determinado por EN-FAB;
b)	fórmula molecular: CL-í-b . N-Cb.-, IS_a , sendo a massa exacta para N+H, determinada por ΕΜ-FAB de alta
c )	resolução, de 1410,2954 para 2₅₇H-₇-₇N-rO_or,I espectro de absorção de ultravioleta; como se mostra na Figura III (metanol);

11d) um espectro de absorção de infravermelho:

com ci mostra na Figura IV (disco ds KBr);

espectro de ressonância magnética de protão: como e ?

		se	mostra, na	Figura V (30©	MHz, CDC1-J	5
		f) es	pectro de r	es	sonãncia	magnética	de	carbono
		como se	mcstr	a	na Figur	a VI	(75,43	MHz	, CBCl-.,
		de	TMS	) com	picos s	ignificativos	1istados
		se	g u i r s
14,(3	q	17,6	q	17,7	q	19,0	q	22,4	q	22,8
25,4	q	·-&, /	t	36,9	t	39,2	+. u	47,6	t	51,6
52,4	q	53,1	t	57,0	q	57,2	q	58,8	t	60,9
61,7	q	64,4	d	67,0	d	63,1	d	68,4	d	69,0
69,1	d	70,5	d	71,1	d	71,7	s	71,9	d	7 Λ • X. _? ‘V
77 , 6	d	80,8	u	83,2	3	87,0	3	93,5	s	97,9
98,1	S	99,7	d	1 00,0	S	101,3	d	102,6	d	123,2
124,5	d	127,1	d	130,2	_S	133,4	s	136,5	s	142,9
143,0	s	150,6	cx	151,5	s	155,0	5	172,3	5	191,9

192,1 s.

N-ac e ti 1 -d i-h i d ro-LL.-E332.aBq ama.

a) espectro de absorção de ultravioleta: como se mostra na Figura VII (metanol);

b) espectro de ressonância magnética de protão:; como se mostra na Figura VIII (300 MHz, CDC1-J.

Os derivados N-acilo dos antibióticos antitumores LI..-E33288 são mais convenientemente caracterizados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e por cromatograf ia. de camada fina (TLC).

J )

-120 sistema de HPLC -analítica preferida para a caracterização de alguns dos derivados N-acilo dos antibióticos antitumores LL.-E33233 é mostrado a seguir:

CoI urna :

Fase Móvel:

Razão de Fluxo; Detecção s

Analytichem Sepralyte C^g, 5 μ, 4,6 mm acetato de amónio aquoso 0,2 M, pH 6,0 ;; acetonitrilo, 50:50

1,5 ml/minuto cm

UV e x54 nm h Tabela III dã os tempos de retenção aproximados dos derivados N-acilo dos antibióticos antitumores LL-E33288:

J )

Tabela III

Antibióticos An ti tumores

N-acilo-LL~E33238

Tempo de Retenção (minutos)

.) )

N-aceti 1 L.L-E3328Sqama ^{1 1} I

N-formi1 LL-E33238gama^ N-acetil LL-E3323SS ¹M-f ormi1 LL-E33233 S ¹LL-E332S8gama₁ ^ILL.-E332S8S ¹ ó, ó 6,2 4,5 4,2 8,0 Ó , 0 sistema de TLC analítica preferido para a caracterização de alguns dos derivados N-acilo dos antibióticos antitumores LL-E3323S é mostrado a seguir:

Adsorvente:

Detecção:

Sistema Solvente

Placas de TLC de Alta Eficiência (HF'TLC)

Wbatman, tipo LHP-KF;

Visualizada por efeito quenching (diminuição de fluorescência) sob lampada de UV de comprimento de onda curto (254 nm);

Acetato de etilo saturado com tampão fosfato aquoso õ,lM a pH 7,0.

J )

A Tabela IV dá os valores aproximados de Rf de dos derivados N-acilo dos antibióticos antitumores LL-E3' sistema de TLC anterior:

alguns no

-14T abe1 a

IV

An t i b ió t ic os An t i tumores N-ac i10-LL-E33288

-acetil	!_i_-E33288g ama
!-f ormi 1	LL-E33288gama
t-ace ti 1	LL-E3328SS, ¹
	¹1
1-f ormi 1	LL-E33288S,

N-aceti1-di-hidro~LL-E33288gama₁ ¹ I

N-mon oms til sue c in i 1 -LL-ESoZtóSgama. LL-E3328tígama,

LL-E332S8ÓJ¹

0,53 θ,53 Õ,25 0,31 0,38 0,42 0,25 0,14

Os derivados N-acilo dos antibióticos antitumores LL-E33288 são úteis como agentes antibacterianos.

)

A actividade antibacteriana in vitro de N-aceti 1--L.L--E33288ÍJ^I, N-f ormi 1 ~!_L~E33283£ ¹ e N-aceti 1 LL-E3323Qgama ¹ foi determinada contra um espectro de bactérias gram-positivas e gram-negativas por um método de diluição de ágar padrão. Verteu-se em caixas de Petri ágar de Mue11er-Hinton gue continha concentrações dos antibióticos diminuídas duas vezes. As superfíΛ cies de ágar foram inoculadas com 1 até 5 10 unidades que formam colónias de bactérias por meio de um dispositivo de replicação Steers.

As concentrações mais baixas ds

N-aci1-LL-E33283 que inibiu o crescimento riana após cerca de 18 horas de incubação a foi registada como sendo a concentração in piara essa estirpe.

antibiótico antitumor de uma estirpe ba.cte— aproximadamente 35 ’^:'C ibitória mínima (MIC)

Os resultados estão suaiarizados na Tabela V.

J )

Ac.tj,vidade Antibacteriana In vitro de Antibióticos N-Acil—LL_oi' *t *T_t ς? o g

Concentração Inibitória Mínima

i -505 La )

pg / m 1

Organismo	N-aceti1	-LL- N·	-f orm.i 1 -LL-	N-aceti1-LL-
	-E332S8Í!¹	-E332S8ôj^	~E332S8gama
Escherichia coli	CMC84-11		7	·'
Escherichia coli	N231KMP)	'-y	1	··. ?
Escherichia coli	ATCC25722	1	1
Klebsiella pneumoniae	CMC84-5	8	4	'··.
!< 1 e bs i e11a pneumon i ae	AD(MP)	1	1	2
Enterobacter cloacae	CMC34-4	4	4	··.
Serratia márcescens	F-35(MP)	8	4	>2
Pseudomonas aeruginosa	12-4-4(MP)	4		··. Γ»
Pseudomonas aeruginosa	ATCC27853	4
S ta ρ hy 1 oc oc c u.s au reus	Smith (MP)	0, 12	0,06	0,008
S t a p h y 1 oc o c c u s au r e li s	ATCC25P23	0,25	0,12	0,0Ó
S ta ρ h y 1 oc oc c u. s e ρ i d e i'—
mid is	ATCC12228	0,015	0,03	0,12
Streptococcus faecalis	ATCC29212	0,0Ó	0,00	0., 12
S t r e p t o c o c c u s f a e c a 1 i s	10 83-28	0,5	0,12	0,12

Os derivados N-auilo dus antibióticos antitumores LL-E33 288 são também activos como agentes antitumores como se determinou rto Biochemical Induction Assay (ΒΙΑ) , um sistema de ensaio bacteriano que especifioamente mede a capacidade de um agente em, directa ou indirectamente, provocar danos em ADN, organismo indicador para este teste é um lisogene Ε, col i-lambda, geneticamente construído de ta.l maneira que resulta um evento danificador no ADN na expressão do gene para a enzima R-galactosidase. Esta, enzima pode ser determinada qualitativa ou quantitativamente por um ensaio bioquímica sendo uma indicação de que ocorreu um dano no ADN.

Foi utilizada uma versão modificada do BIA líquido quantitativo revelada por Elespuru, R. e Yarmolinsky, Μ., Environmental Mutagenesis, 1_? -5 (197'?) para avaliar estes compostos.

Certos protocolos e sistemas de teste in vivo têm sido desenvolvidos pelo National Câncer Institute para, testar compostos com o fim de determinar a sua adequação como agentes anti-neo plásicos. Estes têm sido relatados em Câncer Chemotherapy Reports, Parts III, Vol . 3, M.Q 2 (1972), Seran, et al.. Estes protocolos têm estabelecido testes de rastreio padronizados que são normalmente seguidos no campo ds testagem para agentes an t itumores.

Destes sistemas, são particularmente significativos para o presente invento o leucemia linfocítica P3SS, melanoma melanótico B1B e adenocarcinoma do cólon 2b. Estes neoplasmas são utilizados para testagem como tumores transplantáveis em ratos. SeraliTiente, a actividade antitumores signif icativa, mostrada nestes protocolos por um aumento percentual do tempo de sobrevivência médio dos animais tratados (T) sobre os animais de controlo (C) , é indicativa de resultados semelhantes em leucemias e tumores sólidos humanos.

-18Teste Leucemia Linfocítica P3s3

Os animais utilizados foram ratos BDF^ , todos do mesmo sexo, pesando um mínimo de 17 g e todos situados numa gama. de pesos de 3 g. Foram 5 ou ó ratos por grupo de teste. 0 transplante do tumor foi feito por injecção intraperitoneal de 0,5 ml de fluido ascítico diluído que continha 10^a células de leucemia 1 inffocítica F’333.

Os compostos de teste foram administrados intraperitonealmente num volume de 0,5 ml de Klucel a 0,2 7. em solução salina normal nos dias 1, 5 e 9 <relativamente à inoculação do tumor) nas doses indicadas.

Os ratos foram pesados e os sobreviventes registados numa base regular durante 30 dias. Foram calculados o tempo de sobrevivência médio e a razão tempo de sobrevivência de animais tratados (T)/ de controlo <C). 0 antibiótico antitumor procjenitor, LL~E3323Sgama, foi utilizado como controlo positivo.

Os resultados dos testes de N-aceti 1-LL-E332SS6, N—formil—LL—E332QtíSe N—acetil LL—E33233gama estão sumariza— j dos na Tabela VI. Se T/C ;;100 (7«) é 125 ou superior, o composto testado é considerado como tendo actividade antitumores signifiC rrl t .'ί. V c9. «.

J )

Tabela VI

Teste Leucemia Linfocitica F‘388 )

Dose	Sobrevivência riéd ia. (dias)	T/C x ICC (7.)
Comρosto	(mg/kg)
solução salina		11,0
N-siceti l-LL-E332SSe£ ¹	0,1	13,0	1 18
	0,05	27,5	268
	0,025	26,0	236
	0,0 í 25	20,0	182
	0,006	20,0	182
N-ac e t i 1-LL-E33288.5' ₁ ¹	0,1	11,5	105
	Θ , 05	30,0	ny -T xi / ·„*«
	0,025	25,0	227
	0,0125	23,0	207
	0,006	17,5	177
N-formi1-LL-E332S85	0,1	12,5	114
	0,05	27,e	245
	Λ í>oc;	cr
	V η		Xi Φ xJ
	0,0125	21,0	171
	0 , &&ij	20,5	186
Ll_-E33288gama ¹	0,01	13,0	118
		'“.cr
		X.J; 3·
	0,0025	30,0	273
	0,00125	26,5	241

N--aceti 1-LL-E3Z

SSgama

LL~E33283gama.

0,08	18	164
0 , 04	28,5	268
0,02	23,0	'—i cr cr X- v.t ·_!
0,003	17,5	158
0,0025	14,0	12.7
0,00125	13,5	123

0,01	r-»z-. cr	205
0,005	26,0	23 ó
0,0025	24,5
0,00125	21,0	181
0,0006	18,0	173

-21Teste Melanoma Melanótico Blá

Os animais utilizados foram ratos BDF , todos do mesmo sexo, pesando um mínimo de 17 g e todos situados numa gama. de pesos de 3 g. Há normalmente 5 ου ó ratos por grupo de teste.

Uma porção de 1 g de tumor melanoma Bló foi homogeneizado em 10 ml de uma. solução de sal balanceada -fria, e forain implantadas intraperitonalmente, em cada um dos ratos de teste, aliquotas de 0,5 ml.

Os· compostos de teste foram administrados intraperitonealmente nos dias 1 até 9 (relativamente à inoculação do tumor) em várias doses.

Os ratos foram pesados e os sobreviventes registados numa base regular durante 60 dias. Foram calculados o tempo de sobrevivência médio e a razão tempo de sobrevivência de tratados (T)/ de controlo (C). 0 antibiótico antitumor progenitor, LL-E33288gama , foi utilizado como controlo positivo.

Os resultados dos testes de N—stce ti 1 ~LL—E332835. e

I ¹

N-a.ceti 1-LL-E33288gama estão sumarizados na Tabela VII. Se

T/C xlO0 (7.) for 125 ou superior, o composto testado é considerada coma tenda actividade antitumores significativa.

Tabela_VII

Teste Melanoma Melanótico 5Ί6 )

Composto		Dose ( mq / k g )	S o b r e v i v ê' n c i a Média í dias >	T/C ;·; 1 /.)
solução salina			21,0
N--aceti 1-L.L-E3	32886'. ¹	0,025	35,5	169
		0,0125	27,5	131
		0,006	26,0	124
		0,003	^•5 Λ ¹ , ·-·	119
		0,0015	21,5	102
LL-E332tí8gama.	I	0,0025	39,0	Η i—i i_ J. Ou
		0,00125	39,0	186
		0,006	35,0	167
		0003	29_n5	140
		0,0015	24,5	117
N-aceti 1-L.L-E3	3288gama. ¹	0,025	26,0	124
		0,0125	38,0	181
		0,006	39,0	18 6
		0,003	cr	160
		0,0015	O · cr X- , vJ	126
		0,0007	26,0	124
		0,0Θ035	24,5	1 16
		0,00017	23,5	112
LL--E332S8g ama	I	0,005	8,0	38
		0,0025	27,0	129
		0,00125	Λ -! cr 1 q	193
		0,0006	45,0	214
		0,0003	35 , 5	169
		0,00015	35,0	167
		0,00007	34,5	164
		0,00003	31	148

00

Teste ftdenocarcinoma oc? Cólon

Os animais utilizados foram ratos fêmeas CD^F^ pesando um mínimo de 17 g e todos situados numa gama de pesos de 3 g.

Havia 5 ou 6 ratos por grupo de teste com três grupos de 5 ou 6 animais utilizados como controlos não tratados para cada um dos testes.

implante do tumor foi feito por injecção intraperitoneal de 0,5 ml de um tumor brei do cólon 26 em meio Eagle's MEM contendo agente bacteriano.

Os compostos de teste foram administrados nealmente nos dias 1, 5 e 9 (relativamente às doses intraperitode implante do tumor).

Os ratos foram pesados e os mortos registados numa base regular durante 30 dias. Foram calculados os tempos de sobrevivência médio para animais tratados (T)/ de controlo (C). 0 antibiótica antitumar progenitor, LL-E332SSgama ¹, foi utilizada como controlo positivo.

)

Os resultados dos testes de N-aceti1-LL-E332SQ£^ estão sumarizados na Tabela VIII. Se T/C ;;100 (7.) é 130 ou superior., o composto testado ê considerado como tendo actividade antitumores significativa.

at

Τ e s t te A d e η o c a r c i π o m a do C 6 1 o n 2 6 )

)

Dose	Sobrevivência Média (dias)	T/C x 100 (7.)
C(.) 11 r p O = i_u	(mg/kg)
s ο I li ς: ã o s a 1 i n a		16,0
N-aceti1-LL-E332836 ¹	0,05	'Τ· cr	141
	0 ,'025	40,0	25C
	0,0125	21,0	131
	0,006	24,5	153
	0,003	19,0	1 19
	0,0015	19,0	119
	0,0007	19,0	119
LL-E33288gama	0,01	14,0	88
	0,005	35,0	219
	0,0025	21 ,5	134
	0,00125	24,0	150
	0,0006	19,5	j OO
	C'í i~A	1 O í*	1 l T

	0,00015	17,5	109
0 invento é	ad icíona1roente	descrito pelos	seguintes

exemplos não limitantes )

Ε ;< en; ο 1 ο 1

Preparação e purificação de N-aceti 1 ~l-L-E5528Só^

Foi adicionado gota a gota anidrido acético (2 ml) a uma solução metanólica agitada de LL-E332835(6©8 mg, 57 7. puro, em 6© ml) arrefecida num banho de água gelada. A mistura de reacção foi deixada em agitação a © *C durante 1 hora, em seguida aquecida lentamertte até à temperatura ambiente e deixou-se continuar a. reacção durante outras 3 horas. A mistura de reacção foi em seguida concentrada in vacuo e o resíduo foi recebido numa mistura de 6© ml de diclorometano e 6© ml de água.

A fase aquosa foi neutralizada com hidróxido de sódio aquoso diluído de maneira a remover a maior parte do ácido acético da fase organica como possível. A fase orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio anidro, concentrada até um pequeno volume e fez-se uma precipitação por adição de hexanos para dar 6©4 mg de W-aceti 1~LL~E332886'^ cru.

□ N-aceti1-LL-E33238Ó cru anterior foi dissolvido em 3 ml de acetonitriloxacetato de amónio a ©,2 M, pH 6,© (35:65) e foi cromatografada em quatro levas numa coluna Sepralyte C o

(1,5 x 21 cm). As colunas foram eluídas a 1© ml/min primeiro com acetonitrilosacetato de amónio a ©,2 M pH 6,© (35:65) durante 3© minutos e, em seguida, com um gradiente linear até acetonitrilo:acetato de amónio a ©,2 Μ, pH 6,© (4©:6©) durante 6© minutos.

Durante toda a cromatografia os eluentes da coluna foram seguidos em UV254 _nm ^{e ÃS} fracções foram recolhidas todos os 2,5 minutos. As fracções correspondentes a picos foram analisadas por HF'LC e as que continham W-aceti 1 -LL-E33238ó'^ ¹ de acordo com a análise por HPLC foram reunidas e concentradas in____vacuo para remover o acetonitrilo.

N--acet.il-LL-E332883presente na mistura extractado em acetato de etilo e a fase de acetato de seca sobre sulfato de sódio anidro, concentrada até volume e dela se fez uma precipitação por adição de he dar lóí mg de N-aceti 1 -LL-E3328Sé'.

aquosa foi etilo foi um pequeno xanos para

A análisa por TLC (gel de sílica E. Merck 6© F_?c.^ pré-revestida com folhas de alumínio, ©,2 mm, isopropanol a 3 7. em acetato de etilo saturado com di-hidrogenofosfato de potássio ©,1 M, detectado por bioautografia utilizando o ensaio de indução bioquímico de ágar) mostrou que a amostra de N-acetil-LL-E332886^ semi-purifiçado anterior continha qu.antidades-traços da amostra de LL-E332SSÓ não reagida. 0 N-aceti 1 -LL-E332886' semi-purifiçado <160 mg) foi dissolvido em 1 ml de acetato de etilo e cromatografado numa coluna (1,5 cm 90 cm) Bio-Sil A (20-40 μ, Bio-Rad Laboratories) atestada e equilibrada. com acetato de etilo. A coluna foi primeiramente eluída com acetato de etilo a uma razão de fluxo de 3,6 ml/minuto durante 3,5 horas, recolhendo-se fracçSes de 18 ml. D eluente foi mudado para isopropanol a 3 7. em acetato de etilo saturado com di-hidrocjenofosfato de potássio 0,1 M e a eluição continuou durante outras 3,5 horas.

)

As fracçSes foram analisadas por TLC, como anteriormente, e as que continham N-aceti1-LL-E332S3S ¹ puro (fracçSes 58-64) foram reunidas, concentradas in vacuo até à secura, redissolvidas numa pequena quantidade de acetato de etilo e fez-se uma precipitaç.âo por adição de bexanos para dar 118 mq de N-aceti1-LL-E332SS# * analiticamente puro, que não continha quantidades detectáveis do antibiótico antitumores progenitor não acilado.

espectro de r sonãncia magnética de protão é mastraFigura I.

txeeipi o

Preparação e purificação de N-formi1-LL-E532S8£^ □ anidrido misto de ácido acético e ácido fórmico 'foi preparado na ocasião por adição gota a. gota de 2Θ0 μΐ de ácido fórmico a 400 μΐ de anidrido acético arrefecido num banho de água gelada. A mistura de reacção foi em seguida aquecida a 50 '-C durante 5 minutos para completar a troca de anidrido e foi em seguida mantida a 0 ^C'C.

anidrido misto de ácido acético e ácido fórmico (100 μ1) preparado anteriormente foi adicionado gota a gota a uma solução metanólica agitada de LL~E33288£ parcialmente purificado (’?2 mg, 45 7. puro, em 30 ml) arrefecida num banho de água gelada.,, A mistura de reacção foi deixada em agitação a ô ®C durante 45 minutos, foram em seguida, adicionados hexanos (2Θ ml) è mistura de reacção e a mistura de reacção foi concentrada in vacuo até à secura.

foi redissolvido em acetato de etilo precipitado por adição de hexanos para, dar um precipitado esponjoso que foi recolhido por precipitação, pitado foi redissolvido numa pequena quantidade de acetato de etilo e fez-se novamente uma precipitação por adição de hexanos para dar M—for— mi ].-L.L-E :ru fi amostra de N-formi1-L!_-E3328Q£ ¹ cru anterior foi parcialmente purificada por TLC preparativa sobre qel de silica (duas placas de Analtech Silica Sei GF pré-revestidas, 2000 μ,

-2620 χ 20 cm) eluindo com acetato de etilo saturado com tampão fosfato a pH 7,0. A faixa desejada foi extirpada e o N-formi1-LL•-Έ332886 foi recuperado por lavagem do gel de silica com cloreto de meti 1eno:metano1 (80:20) para dar, sobre manipulação,

110 mg de N-formi1-LL-E33288ôjparcialmente purificado.

□ N-formi1-LL-E332S36parcialmente purificado anterior foi dissolvido em 1 ml de acetonitrilo: acetato de amónio, pH 6,0 (36:65) e foi cromatografado sobre uma coluna Sepralyte C^g <1,5 x 20 cm). A coluna foi eluída a Q ml/min com acetonitrilo:acetato de amónio a 0,2 Μ pH 6,0 (35:65) durante 1,75 horas, com seguimento em UV„,_, e recolhendo-se fracçSes de 20 ml.

254 nm

As fracçSes correspondentes a picos foram analisadas por HPLC e as que continham N-formi1-LL-E33288S^de acordo com a análise por HPLC foram reunidas e concentradas in vacuo para remover o acetonitrilo.

.)

L)

A mistura aquosa enevoada que continha N-formi1-LL~E33288ó'^ foi extractada com acetato de etilo e a fase de acetato de etilo foi concentrada até è secura. O residuo foi redisso1vido em cloreto de metileno, seco sobre sulfato de sódio anidro, concentrado e precipitado por adição de hexanc-s para dar 36,5 mg de N-formil-LL-E332SS6^semi-purificado.

A análise por TLC (gel de sílica E. Merck 60 F,,, z’54 pré-revestida com folhas de alumínio, 0,2 mm, isopropanol a 3 7. em acetato ds etilo saturado com hidrogenDfosfato de potássio 0,1 M, detectado por bioautoqrafia utilizando o ensaio de indução bioquímico de ágar) mostrou que a amostra de N-formil-LL-E332S8Í ¹ semi-purifiçado anterior continha quantidades-traços ¹ II da amostra de L.L-E332886j e gama^ não reagida.

semi-purifiçado (36,5 mg) foi

N-formi1-LL-E33288S ¹dissolvido em 1 ml de acetato de etilo e cromatografado numa coluna (1,5 cm x 23 cm) Bio-Sil A (20-44 μ, Bio-Rad Laboratories) atestada e equilibrada com acetato de etilo. A coluna foi primeiramente eluída com acetato de etilo a uma razão de fluxo de 1,2 ml/minuto durante 2 horas, recolhendo-se fracções de 6 ml.O eluente foi mudado para acetato de etilo:propanol (97:3) e a eluição continuou durante outras 2 horas.

ís f r

·) foram analisadas por TLC (gel de sílica E.

Merck 60 F, pré-revestida. com folhas de alumínio,

0, isopropanol a 3 7 em acetato de etilo saturado com hidrogenofosfato de potássio 0,1 M, detectado por pulverização com uma.

solução de acetato cúprico a 3 7 em ácido fosfórico aquoso a 8 7) e as que? continham N-formi 1 -LL~E332B8ó'₁ puro (fracções 35-38) foram reunidas e concentradas in vacuo até à secura. 0 resíduo foi redissolvido numa pequena quantidade de acetato de etilo e precipitado por adição de hexanos para dar uma amostra de N-aceti 1-LL-E332886'. que ainda, estava contaminada com quantidades ¹ I (traços) de LL-E3328Sgama. que não reagiu..

Esta amostra foi novamente cromatografada numa coluna (0,8 x 20 cm) Bio-Sil A atestada e equilibrada com acetato de etilo. A coluna foi eluída com acetato de etilo a uma razão de fluxo de 1,2 ml/minuto durante 4 horas, recolhendo-se fracções de tj ml. As fracções foram analisadas por TLC como anteriormente e as que continham N-formi 1-LL-E33288-S ¹ puro (fracções 14-33) foram reunidas e trabalhadas como anteriormente para dar 12,2 q de N-formi 1-LL-E332885'₁ ¹ analiticamente puro, não contendo quantidades detestáveis do antibiótico progenitor não acilado.

espectro de ressonância magnética de protão é mostra.

do na Figura. II.

—.^:.yExemp1 ο

PreparacSo a purificação ue N-formi1-LL-E anidrido misto de ácido acético e ácido fórmico <100 μΐ), preparado recentemente como se descreveu no Exemplo 2, foi adicionado gota íí gota a uma solução metanólica agitada de I

LL-E33283S_χ parcialmente purificado (639 mg, 70 X puro, em 150 ml) arrefecida num banho de água gelada. A mistura de reacção foi deixada em agitação a 0 ^C’C durante 1 hora, foram em seguida adicionados hexanos em excesso à mistura de reacção e a mistura foi concentrada in vacuo até cerca de 75 ml.

acetato de etilo (cerca concentrada até cerca

Foi adicionado solução e a mistura foi

N-formil-LL-E3328S5'_x ¹ cru <676 mg) foi precipitado por adição

300 ml de hexanos.

de 200 ml) de 5Θ ml e

Cl

O de

Q N-formi1-LL-E3328SS_χ ¹ cru foi dissolvido em 3 ml de acetato de etilo e cromatografado numa coluna (2,5 cm x 95 cm) Bio-Sil A (40-30 μι) atestada e equilibrada em acetato de etilo. A coluna foi eluída a 10 ml/minuto com acetato de etilo até a banda amarela estar fora da coluna (1,75 horas). Foi em seguida eluída a 5 ml/minuto com acetato de etilo saturado com di-hidrogenofosfato de potássio 0,1 M durante outras 5 horas.

Durante a cromatografia foram recolhidas fracções de 20 ml. As fracções foram analisadas por TLC (gel de sílica E„ Merck 60 8-754 pré-revestida com folhas de alumínio, 0,2 mm, isopropanol a 3 X em acetato de etilo saturado com di-hidrogenofosfato de potássio 0,1 M, detectado por pulverização com uma solução de acetato cúprico a. 3 X em ácido fosfórico aquoso a 8 X) e as fracçSes (92-93) que contêm a maior parte

N-f ormi 1-LL-E33283-5' foram reunidas e trabalhadas por concentra¹ I ção e precipitação para dar N-aceti 1-L.L-E332S3.5'^ parcialmente purifiçado.

A análise por TLC (detectado por bioautografia utilizando o ensaio de indução bioquímico de ágar) desta amostra, mostrou-a livre de qualquer LL~E332336'^^ não reagida.

N-formi1-LL-E332S3Spa.rcialmente purificado foi dissolvido em 4 ml de acetonitrilo:acetato de amónio O,2 M, pH 6,0 (35:65) e foi cromatografado em duas levas numa coluna

Sepralyte C,_ (1,5 45 cm) equilibradas com acetonitri 1 o:acetato lo de amónio 0,2 M, pH 6,0 (35:65). A coluna foi eluída a com o mesmo solvente durante 3 horas, com seguimento em e recolhendo fracções de 20 ml. As fracções correspondentes a picos foram analisadas por HF’LC e as que continham N-formi1-LL~E3328Sé'j^ de acordo com a análise por HF'LC foram reunidas e concentradas in vacu.o para, remover o acetonitrilo.

ml/min

U'L.c , z.54 nm

N-formi1-LL-E332SS6 presente na mistura aquosa foi extractado em acetato de etilo e trabalhado com concentração para dar 161 mg de N-formi1-LL-E3328SSj¹.

espectro de ressonância magnética de protão é mostrada na Figura II.

Exemplo 4

Preparação de N-acet.i I -LL-~E3328Sqama, uma

Foi adicionado gota a solução metanólica agitada gota anidrido acético (4 ml) a de LL-E332S3gama.j parcialmente )

purificada (1,25 g, 85 7. pura, em 100 ml de metanol) num banho de água gelada. A mistura de reacção foi agitação a 0 °C durante 1 hora, em seguida aquecida até á temperatura ambiente e deixou-se continuar durante outras 2 horas. A mistura de reacção foi concentrada in vacuo e o resíduo foi recebido numa ICC ml de diclorometano e 100 ml de água.

arrefecida deixada em lentamente a reacção em seguida mistura de

A fase aquosa foi neutralizada com hidróxido de sódio aquoso diluído de maneira a remover da fase organica a maior parte do ácido acético. A fase orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio anidro, concentrada até um pequeno volume e fez-se uma precipitação por adição de hexanos para dar 1,18 g de N-acetil-L.L-E332B8gama80 7. puro, que pode ser purificado seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 1 para dar N-aceti 1 -LL-E33288gama * * puro

Os espectros de ultravioleta, de infravermelho, de protão e de carbono-13 são mostrados nas Figuras III-VI.

Exemplo 5

Preparação de N-formil-LL~E55288qama₁ ¹ anidrido misto de ácido acético e ácido fórmico (100 μΐ) preparado recentemente como se descreveu no Exemplo 2 foi adicionada gota. a gota a uma solução metanólica agitada de LL-E33288gama analiticamente puro (49,ó mg em 50 ml de metanol) arrefecida num banho de água gelada. A mistura de reacção foi deixada em agitação a Q '-'C durante uma hora e a seguir á temperatura ambiente durante a noite.

Foi ent seguida concentrada até à secura, rsdissolvida nuiit pequeno volume de acetato de etilo ε o produto foi precipitado por adição de hexano. 0 precipitado seco foi redissolvido em IO ítí 1 de isstanol 5 tratado rovanienta com o anidrido misto de ácido acético e ácido fórmico (400 μΐ5. A mistura de reacção foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 2 horas e foi manipulada com concentração e precipitação como se descreveu anteriormente para dar N-formil-LL-E332S)Sçama_i * cru na forma de um sói ide? esbranquiçado.

□ N-formi1-LL-E332SSgama„cru foi purificado por TLC preparativa (duas placas de 2Θ x 20 cm Analtech Silica Gel G?F adelgaçada), eluindo com isopropanol a 3 % em acetato de etilo saturado com di-hidrogenofosfato de potássio 0,1 M para dar N-f ormi 1 -LL-E33288gama * ^k semi-puri f içado

Exem cl c?_ó

Freoaração de N-acetil-di-hidro-LL-b sGqaíiia,

Foi adicionada uma porção de iodeto de metilo a uma solução de 25 mg de N-aceti1-LL-E33288gama₁(preparado como se descreveu no Exemplo 4) em 8 ml de etanol absoluto e a mistura foi arrefecida num banho de água gelada. A esta solução foi adicionado '1 ml de uma solução etanólica 0,4 M de borcí-hidreto de sódio em duas porções iguais. Suando a reacção sa completou (10 minutos depois da adição da segunda porção de boro-hidreto de sódio), o borato complexo foi decomposto pela adição de 400 μΐ de uma solução etanólica 4 M de ácido acético.

A mistura de reacção foi sm seguida concentrada até dar um resíduo amarela dourado que foi redissolvido em 10 ml de acetato de etilo, diluido ccm 10 ml de diclorometano

reconcentrado até à secura. Este resíduo foi redissalvido em acetato de etilo, o sal borato insolúvel foi separado por filtra—

TN de um cartucho Bond Elut ’ (ftnalytichem Internacional! u.

mádido esbr anqu io ado que foi suspenso em 4 ml de áqua e passado através 0 cartucho foi sequencialmente eluído com 4 ml de água, 4 ml de mi.-/ι; eyuci λ : ,t , « *·. mi ue me ..u< í..,í „

U eluato de metanol, gue continha a maior parte do

T

N-aceti 1-d i~hidrc;~LL~E3328Sqama _ή , foi concen trado para, dar um sólido esbranquiçado que foi pósteriormente purificado por preparativa (Analtsch Silica Sal Sr, 20 x 20 cm.

TLC íessura camada de 1000 μ, eluição com acetato de etilo:metanol 97:3) para τ dar N-acet.il-d i-hidro-L.L-E33288gama “ analiticamente puro,.

□ espectro de ressonância. magnética, de ultravioleta e deprotão é mostrado na Figura VII

Exemplo 7

P r ε o a r a. ç ã o de N—monome ti I succ in i 1 — LL—E332Sciqaína.

anidrido do éster

TOl cionado em ti gama₁

-ambiente durante um período de trâs dias

12,3 aq) em metanol monometί1ico do ácido succínico pcrçóas a uma solução cis LL-E332S8 (2 ml) e mantido á temperatura

A mistura de reacção foi concentrada até à secura, foi redissolvida num pequeno volume ds acetato de etilo e precipitada por adição de hexano, 0 precipitado oomoso fo.i triturado orofundaments com em seguida foi redissolvi num pequeno volume de acetato de etilo e precipitado por adição de

éter dietílico e hexano para dar M—monometi 1 succini 1 -·L.L

T rnãj c ru. »

Claims

REIVINDICAÇÕES

I^a. - Processo para a preparação de um derivado N-acetilo de fórmula:

O

II

R-C-N-W em que W é

R é hidrogénio ou um grupo alquileno ou alquilo ramificado ou não ramificado, ou um grupo arilo ou heteroarilo, ou um grupo aril-alquilo (C^-Cg) ou heteroaril-alquilo (C₁~C₅), todos facultativamente substituídos por um ou mais grupos hidroxilo, amino, carboxilo, halo, nitro, alcoxilo (Cg-Cg) inferior, ou tioalcoxilo (C-C_) inferior; R, é H ou i □ 1

ΛΛ/'

CH ^OCH’ OH é OH quando R, é H ou R, e o 4

R_ é CH,, Ο,Η^ ou. CH(CH,)„; R, .d. -' ' xi -! -4 X. ' 4 tomados conjuntamente são um earbonilo; e X é um átomo de iodo ou de bromo; preparado a partir de um composto de -fórmula:

H-N-W

A,,

P H- p J- Pi H- I e designado por antibiótico LL-E332aa, a.f' , li, , gama. , , τ I I , χ 1 xfá i „ ganiâj ,, í'i e suas partes cor respondem tes di-hidro caracterizado pela r a e c ç 3 o d o a ri t :i. b i 61 i c o

H-N-W i

R_? com um cloreto de á.cido em anidrido apropriadaroents substituído, o anidrido misto dos ácidc éster de monometilo do á.cido succínico em álcool metílico uma temperatura entre -5 a cerca ds +5 ''-O durante .m período de uma hora e á. temperatura ambiente durante uma até vinte e quatro horas„ a precipitação a partir de acetato de etilo com hexanos ou, oara creoarar a=· a s p a r t e s c o r r e s o o n d ente s d i — h i d r o , . Cl ‘-IIderivado M~acet.ilo da fórmulas

R-C-N-W i

a partir dos anteriores numa solução de iodato de metilcj em álcool a uma temperatura entre —5 °C e cerca de +5 ^C'C, com uma solução alcoólica de boro-hidreto de 'o heras, ecomposição de borato complexo com ácido acèt:

? t a ηάlico e di-hidrc desejado per cromatt qrafi a
2si. - Processo de acordo cem a Reivindicação 1 caracts 'iza.de por se preparar um composto de fórmula:

K-u-m-W onde R é ou H; R--, é tri,, ou (CH^)_oCH, oela reacção de

H-C-N-W

L nnrtp P: é cH,, CH-ΧΗ,^ cu (C-H^.)^,CH, com anidrido acético ou o misto dos ácidos acético e fórmico em metanol a -5 °C

o. r-J até cerca de +5 °C durante cerca de unia hov

z.

rizsdo por sí

- Processo de acordo com a Reivindicação 1 caractepreparar um composto de fórmula:

R - C - N - W (d í - h i d r o)

RA jiide* R é CH_T uu H; Fa. é CH-..·, CH-XH,-, uu ( CH..»' _nUH, pela reaLijãu ds

R-C-N-W i

F-A onde R_? é LH-., CH_,CH_O ou (Cf-LX^CH, com boro—hidreto de sódio numa solução alcoólica a -5 °C até cerca de +5 °C durante 5 minuto?

4<5. Processo de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado por ss preparar um composto fórmula:

-N~W

Ru que é o antibiótico antitumor N-acetil-LL definido como anteriorraente; R é CH-,; R, é
3>32títí5’^ , Sm que W e s/W'

CH,

HO

OCH,

OH

R._, é CH-, R, e R,_ tomados con j uri tamente são um carbonilo; X é um .ú- ·-’ '77

á. torno de iodo ή o qu.e tsnis

a) um espectro de ressonância magnética de protão como se mostra na Fiqura I;

molecular ds 1395 como se determinou por

1 ta H r’ por

EM-FAEh uma fórmu1 molecular C^,H_.M-0_nnIS, com uma massa •jS / 4 o· zz 4

Ί+Κ

-.+-í η λ ri a a 1 ta resolução de 1434,2329 para um tempo de retenção de 4,5 minutos

I8 κ.

^X — .-I ‘ · , por

IRL.C

C.

: o 1 un.a An a 1y 11c hem 8e p r d 1 y t e 5 p, 4,ó mm 25 cm com uma fase móvel de acetato

18’ ac e ca tc de amónio aquoso O,2 M a pH 6,0, feita 1:1 com acetonitri.lo e tendo uma razão de fluxo de 1,5 ml/minuto com detecção UV em 254 nm e 280 nm; e um R_j. de 0,31 em lâminas de TLC de Alta Precisão CHPTLC) Whatman, Tipo LHP-KF utilizando acetato de etilo saturado com tampão fosfato aquoso 0,1 M pH /,0., visualizado utilizando de 254 nm.

uma arai d

uv lo ccm a Reivindicaçí preparar um composto de fórmu.la:

ic te41

U

H

R-C-N-W que é c s def i n i. d o r< í i b i ó t i c o a n t í t u m o r N - f o rmil—LL- E33288 ο, ^A , e m q u e W como -ãnteriormente; R é H; R, é u\z\z»

CH

HO

OCHj I ’ OH

R,, é CH-,; iodo; e c

R, e R,_ tomados conjuntamente são um carbonilo; X é > H ç r Çf- π] ;

de ressonância magnética de protão como se mostra na Figura II;

u.íií peso molecular de 1381 como se determinou por EM-FAB;

d )

uma fór mu. 1 t? ;·; cd. L. C cr. jj ·£λ Γ <3. molecular Cc-c-H-.^N-.O—^IS. i_um uma 5b /2 o 22 4 Í*l+K determinada par Επ-FAB de ,Tf ct 2 3 ct al ta resolução d £? 1420,2172 para C^H^ J\L,O^ ί 3„Κ ; um tempo retenção de 4,2 minutos por HPLC utilizando ma coluna Analytichem Sepralyte ^L 18 ’ 5 p, 4,6 m iiTí x 25 cm com uma fase móvel de a cetato

de amónio aquoso 0,2 M a pH 6,0, feita 1:1 com acetonitrilo e tendo uma razão de fluxo de 1,5 ml/minuto com detecção UV em 254 nm e 280 nm; e um de u,31 em laminas de TLC de Alta Precisão (HPTLC) Whatman, Tipo LHP—KF utilizan etato de etilo saturado com tampão fosfato aquoso 0,1 M a ?Η 7,θ, visualizado utilizando uma lâmpada da UV ό-S, — F' rΌ c e s s ι..· de scurdu com a Reivindicação í csrscte— ίο pcc ss preparar um composta de i cirinuic.:

R-C-N-W

I i

Fu ; o antibiótico anti tumor N-aceti 1 -LL-E3328Sgama , em que W irsido como anteriormente; R é CH-.; R, é

CH_a-7 0-7 och, 2 ’ OH

R.-, é iodo;

CH.-,H^; R e R_r tomados con j un tamente são um carbonilo; X .c o 4 j ; e qus tem:

um espectro de ultravioleta como se mostra na Figura III;

u m e s pec cr ο de a b s or c ao de 1 π 1’ r a v e r m s i b o c o m o s e mostra na Figura IV;

um espectro de ressonância magnética de protão como se mostra na Fioura V; e um espsctro de ressonância magnética de carbono-13 como se mostra na Figura VI com picos siqnificativos a seguir listados:

14·, 0 n •i 17 ,6 q 17 ,7 q f O i .· £·) q + +- R 4 q “? D Q ¹ n n 25,4 q +6 1 > X. •jO ? 38, .u Λ T nz _? b X 51 ô d 52,4 q er-r , 1 t 57 ,0 q rr ~7 -} / «t ·-> q 20 q o t Çi •1 -⁷ q 61 , / q £ £ .4 .•J '—j / ,0 i. Q «j 1 d 63, 4 L. Q ί··| !· 4

68,1 d

70,5 d

O -? -4 •C./ .·' η ·—} ·._i |“|Q -7 _!

7 7,/ G

15©. 6 s

71,1 d

Ó·.? <1 X. C8

100,8 s

151,5 s

101.3 d

133.4 s 155,0 s

71,8 d

83,5 s

102,6 d /2,4 d

87,8 d

142.8

181.8 um pese molecular de 1408 como se determinou por uma fórmula molecular 5^^,/1-.0.-,..,15^ com uma. massa exacta para M+H determinada por EM-FAB de alta resolução de 1410,2854 para , N...CU- IS . K;

um tempo de retenção u t i 1 i z and o uma colun a

HPLC

Cio, x o

h) de 6,6 minutos por ftna 1 y t i c hem Sepra1yte 5 μ, 4,6 mm x 25 cm com uma fase móvel de acetato de amónio aquoso ã,2 M a pH 6,0, feita 1:1 com acetonitrilo e tendo uma razão de fluxo de 1,5 ml/minuto com detecção UV em 254 nm e 23© nm; e um Rj. de ©,53 em lâminas de TLC de Alta Precisão (HPTLC) Whatman, Tipo LHP—KF utilizando acetato de etilo saturado com tampão fosfato aquoso 0,1 M a pH 7,0, visualizado utilizando uma. lâmpada de UV de 254 nm.

^?S, - Processo de acordo com a Reivindicação 1 :arac te rizado por pi' eμ·3Γd!'

-44R-C-hS-W que é o antibiótico antitumor N-a.cefci l-di-hidro-LL-E3·'; βφ nue W é definido como anteriormente; R é CH,; R, é ' · J.

SSgama.

ΑΛΤ cHj-T^o-y

OCH, I ’ OH

R_ é R, é OH; R_ é Η; X é iodo; e que tem:

z. z. 4 'D

a) um espectro de ultravioleta como se mostra na Figura VII;

b) u.m espectro de ressonância, magnética de protão como se mostra na Figura VIII; e

o) um R^ de 0,36 em lâminas de TLC de Alta Precisão CHPTLC) Whatman, Tipo LHF'-KF utilizando acetato de etilo saturado com tampão fosfato aquoso 0,1 M a pH 7,0, visualizado utilizando uma lâmpada de UV de 254 nm.

ê(> i X tlfct 1 fo'ê. — Métiodo ds tratavnenf.ci de ir>fe<cces bacteria.nê.s em is sangue quente caracterizado por compreender a adminisjs referidos animais de uma quantidade antibacterianamen— fl

R-C-N-W em que W é

OCHj

R é hidrogénio ou um grupo alquileno (^c1“^c10) ^ou alquilo (C^-C^) ramificado ou não ramificado, ou um grupo arilo ou heteroarilo, ou um grupo aril-alquilo ou heteroaril-alquilo (C^^-Cg), todos facultativamente substituídos por um ou mais grupos hidroxilo, amino, carboxilo, halo, nitro, alcoxilo (^c1~^c3) inferior, ou tioalcoxilo inferior; R^ é H ou

R._, tZ¹ U-ri-r , C,-,H_S ou CH(CH^) - R é õ ’ ⁿ 4 OH t.Oi IVãCsCrS· C o n j u π t. ·=< íb í-· ~ί te são um carbor ií 1: de bromo; n ?j ç? é p Γ “ parado a partir dt? H-N l-W

íS ÍTi q U t

H-N-W

L à designada por LL-E33233

.. Br p BrV._ , b.

Br

.. I p I '-'2 , gama., , cu, , , gama, suas partes correspondentes di-hidro? situando-se a qama ι de dosagem de administação de 0,2 a 0,00005 mg, de preferência de 0,1 a 0,Θ0Θ3 mg.

9ê- Método de inibição do crescimento de tumores animais ds sangue quente caracterizado por compreender a tração aos referidos animais de uma quantidade oncolítica de um com ρo sto d e f ó rmula;

em

R-C-N-W

R,em que W é

OCH]

R é hidrogénio ou uni grupo alquileno ^ou alquilo (C^-C^) ramificado ou não ramificado, ou um grupo arilo ou heteroarilo, ou um grupo aril-alquilo (C -C_) ou heteroaril-alquilo (C -Cl, JL j lo todos facultativamente substituídos por um ou mais grupos hidroxilo, amino, carboxilo, halo, nitro, alcoxilo (C^-C.^) inferior, ou tioalcoxilo (C₁~C₅) inferior; R^ é H ou sZC/V'

R₂ é CH₃, C₂H₅ ou CH(CH₃)₂; R₄ é OH quando R₅ é H ou R₄ e R₅tomados conjuntamente são um carbonilo; e X é um átomo de iodo ou de bromo que é preparado a partir de um composto de fórmula:

H-N-W em que

-48H-N-W

Ρ Γ Ρ Γ J ί Τ é designado por LL-E33288, , β^' , gama/’' , α„^χ, β, ^χ , gaina^ ,

Sj¹.· e suas partes ccrrsspcndantss di-hidro; situando-se a gama de dosagem de administação ds 0,2 a 0,00005 mg, ds preferência de 0,1 a 0,0003 mg.

Lisboa, IO de Abril de 1990