TW201325613A - 治療黑色素瘤之治療組合及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供抗ETBR抗體與MAP激酶抑制劑之治療組合及使用該等治療組合治療黑色素瘤之方法。
Description
本發明一般而言涉及藉由使用某些抗體及小分子藥物組合治療黑色素瘤。
本申請案根據35 USC 119(e)主張2011年10月28日申請之美國臨時申請案第61/552,893號及2012年8月2日申請之美國臨時申請案第61/678,978號之權利,其內容以引用之方式併入本文中。
黑色素瘤為近來發病率驚人地增加之皮膚癌的侵襲性形式(Thompson JF等人,Cutaneous melanoma in the era of molecular profiling.Lancet 2009;374:362-5)。雖然可用局部病變外科切除術實現治癒,但黑色素瘤晚期僅對目前批准的療法作出不良反應。IV期轉移性黑色素瘤之5年存活率為約10%(Thompson,Lancet 2009)。新穎治療性方法,包括Bcl2之反義分子、CTLA4之抗體、小分子RAF激酶抑制劑以及過繼性免疫療法,目前正處於轉移性黑色素瘤之臨床試驗中(Ascierto PA等人,Melanoma:a model for testing new agents in combination therapies.J Transl Med 2010;8:38-45)。雖然此等新近研究中之一些的結果似乎令人鼓舞,但對總存活率產生持久影響可能需要治療組合,包括額外的新穎藥劑。
然而,應認識到黑色素瘤可證明例如在為細胞對生長因子之反應性所需的某些信號轉導路徑中之分子變化。因
此,已嘗試將黑色素瘤分層為分子亞型以便用最適當的療法治療各亞型,而不是將黑色素瘤作為單一疾病來治療。
一種黑色素瘤亞型在MAP激酶路徑中帶有畸變。MAPK路徑為使細胞內反應與生長因子與細胞表面受體之結合相聯繫的磷酸化驅動信號轉導級聯。此路徑調節數個過程,包括細胞增殖及分化,且通常在多種癌症中出現異常調節。(Sebolt-Leopold JS,Herrera R.Targeting the mitogen-activated protein kinase cascade to treat cancer.Nat Rev Cancer.2004;4:937-947)。經典的MAPK路徑由RAS、RAF、MEK及ERK組成,其中RAS觸發RAF/MEK/ERK激酶複合物之形成,隨後經由蛋白質磷酸化驅動關鍵調節因子之轉錄。用靶向路徑中之關鍵蛋白質的藥劑抑制MAPK信號傳導可能能夠抑制多種腫瘤類型中之生長(Wong K-K等人,Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/MEK/ERK pathway.Recent Pat Anticancer Drug Discov.2009;4:28-35)。
MEK/ERK路徑之不當活化促進細胞在無外源生長因子存在下生長。GDC-0973(亦稱為XL518)為MEK1/2(一種活化ERK1/2之MAPK激酶)之有效且高選擇性的小分子抑制劑(Johnston S.XL518,a potent,selective,orally bioavailable MEK1 inhibitor,downregulates the Ras/Raf/MEK/ERK pathway in vivo,resulting in tumor growth inhibition and regression in preclinical models.刊登在AACR-NCI-EORTC Symposium on Molecular Targets and Cancer
Therapeutics中;2007年10月22日;San Francisco,CA.Abstract C209)。因此,自細胞表面Ras及Raf至ERK之致癌信號受中斷。對ERK活化之持續抑制轉化為降低之增殖及細胞凋亡之誘導。在多個臨床前研究中,已顯示GDC-0973抑制細胞生長及誘導腫瘤消退。
近來,維羅非尼(vemurafenib),亦稱為Zelboraf®,為一種B-Raf酶抑制劑,經美國食品與藥物管理局批准用於治療晚期黑色素瘤。已顯示維羅非尼引起黑色素瘤細胞株之漸進式細胞死亡(Sala E等人,BRAF silencing by short hairpin RNA or chemical blockade by PLX4032 leads to different responses in melanoma and thyroid carcinoma cells.Mol.Cancer Res.6(5):751-9(2008年5月)。若B-Raf具有常見的V600E突變,則維羅非尼中斷B-Raf/MEK/ERK路徑上之B-Raf/MEK步驟。維羅非尼對癌症具有V600E BRAF突變(即在B-RAF蛋白質上之編號600的胺基酸位置,正常纈胺酸置換為麩胺酸)之黑色素瘤患者為有效的。約60%之黑色素瘤具有V600E BRAF突變。無此突變之黑色素瘤細胞似乎不受維羅非尼抑制;維羅非尼反常地刺激正常BRAF且可以促進腫瘤生長(Hatzivassiliou G等人,RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.Nature 464(7287):431-5;Halaban R等人,PLX4032,a Selective BRAF(V600E)Kinase Inhibitor,Activates the ERK Pathway and Enhances Cell Migration and Proliferation of BRAF(WT) Melanoma Cells.
Pigment Cell Melanoma Res 23(2):190-200(2010年2月)。雖然臨床試驗揭露,與DTIC相比,經維羅非尼治療之患者之存活提高、客觀反應率提高且無進展存活提高,但疾病很可能後發(Nazarian R.等人,Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E)inhibition by RTK or N-RAS upregulation.Nature第468卷,第973-977頁(2010年12月16日))。
儘管黑色素瘤癌症療法有所進展,但急切需要能夠有效地抑制贅生性細胞生長之額外的治療性治療。因此,本發明之一目標在於鑑別治療劑組合以產生適用於治療性治療黑色素瘤癌症之相關組合物。
本發明涵蓋一種罹患黑色素瘤之個體中之腫瘤生長抑制(TGI)的方法,包含向個體投與有效量之抗內皮素B受體(ETBR)抗體藥物結合物與有效量之MAP激酶抑制劑之組合。
在一個態樣中,抗ETBR抗體藥物結合物與MAP激酶抑制劑之組合為協同性。在另一態樣中,關於協同性組合,TGI高於抗ETBR抗體藥物結合物單獨使用時所見的TGI或高於MAP激酶抑制劑單獨使用時所見的TGI。在另一態樣中,關於協同性組合,TGI比抗ETBR抗體藥物結合物單獨使用時高約10%、或約15%、或約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%,或TGI比MAP激酶抑制劑單獨使用時高約10%、或約15%、或約20%、或約
25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%。
在上文描述之本發明之另一態樣中,抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。在所主張方法之又一態樣中,抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。在所主張方法之又一態樣中,抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。此方法之另一態樣還包括亦具有為SEQ ID NO:8之VL的抗ETBR抗體。
在上文描述之所主張方法的一個態樣中,抗ETBR抗體結合至細胞毒素,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑,且其中該細胞毒素為毒素。在所主張發明之另一態樣中,毒素選自由類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamicin)及奧瑞他汀(auristatin)組成之群。在本發明之又一態樣中,毒素為類美登素。
在上文描述之所主張方法之一個態樣中,MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。在上文描述之所主張方法之又一態樣中,BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。在另一態樣中,BRAF抑制劑具有以下化學結構:
在上文描述之所主張方法之另一態樣中,MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。在上文描述之所主張方法之又一態樣中,MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述之所主張方法之又一態樣中,MEK抑制劑具有以下化學結構:
在本發明之一個態樣中,涵蓋描述一種治療黑色素瘤之方法,該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之MAP激酶抑制劑及抗ETBR抗體。在上文描述之所主張方法之另一態樣中,該黑色素瘤為ETBR陽性。在所主張方法之又一態樣中,該黑色素瘤為轉移性的。在所主張方法之又一態樣中,該個體過去未曾接受MAP激酶抑制劑之療法。在所主張方法之又一態樣中,該個體具有V600E BRAF基因突變或該個體為BRAF野生型,無V600E BRAF突變。在
所主張方法之又一態樣中,個體過去未曾接受MAP激酶抑制劑之療法。
在上文描述之所主張方法之另一態樣中,抗ETBR抗體與MAP激酶抑制劑之組合為協同性。在另一態樣中,關於協同性組合,TGI高於抗ETBR抗體單獨使用時所見的TGI或高於MAP激酶抑制劑單獨使用時所見的TGI。在又一態樣中,關於協同性組合,TGI比抗ETBR抗體單獨使用時高約10%、或約15%、或約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%,或TGI比MAP激酶抑制劑單獨使用時高約10%、或約15%、或約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%。
在上文描述之本發明之另一態樣中,抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。在所主張方法之又一態樣中,抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。在所主張方法之又一態樣中,抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。此方法之另一態樣還包括亦具有為SEQ ID NO:8之VL的抗ETBR抗體。
在上文描述之所主張方法的一個態樣中,抗ETBR抗體
結合至細胞毒素,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑,且其中該細胞毒素為毒素。在所主張發明之另一態樣中,毒素選自由類美登素、卡奇黴素及奧瑞他汀組成之群。在本發明之又一態樣中,毒素為類美登素。
在上文描述之所主張方法之一個態樣中,MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。在上文描述之方法之又一態樣中,BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。在另一態樣中,BRAF抑制劑具有以下化學結構:
在上文描述之所主張方法之另一態樣中,MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。在上文描述之所主張方法之又一態樣中,MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述之所主張方法之又一態樣中,MEK抑制劑具有以下化學結構:
在本發明之一個態樣中,涵蓋描述一種治療黑色素瘤之方法,該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之MAP激酶抑制劑及抗ETBR抗體藥物結合物,其中首先向該有需要個體投與MAP激酶抑制劑。在本發明之另一態樣中,在投與該MAP激酶抑制劑之後,投與該抗ETBR抗體藥物結合物。或者,本發明涵蓋之方法包括同時投與抗ETBR抗體及MAP激酶抑制劑。
在本發明之一個態樣中,涵蓋描述一種治療黑色素瘤之方法,該方法包含向有需要個體投與治療有效量之MAP激酶抑制劑及抗ETBR抗體藥物結合物,其中依次投與抗ETBR抗體藥物結合物及MAP激酶抑制劑,其中首先向個體投與抗ETBR抗體藥物結合物且在投與抗ETBR抗體藥物結合物之後向個體投與MAP激酶抑制劑。
在本發明之一個態樣中,涵蓋描述一種治療黑色素瘤之方法,該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之MAP激酶抑制劑及抗ETBR抗體藥物結合物,其中首先向個體投與MAP激酶抑制劑且在投與MAP激酶抑制劑之後向個體投與抗ETBR抗體藥物結合物。
除本發明之以上涵蓋之態樣以外,更涵蓋描述一種治療黑色素瘤之方法,該方法包含向有需要之個體投與治療有
效量之MAP激酶抑制劑及抗ETBR抗體藥物結合物,其中該抗ETBR抗體藥物結合物經靜脈內投與。在本發明之所主張方法中,亦涵蓋抗ETBR抗體藥物結合物之劑量為約0.1 mpk、或約0.2 mpk、或約0.3 mpk、或約0.5 mpk、或約1 mpk、或約5 mpk、或約10 mpk、或約15 mpk、或約20 mpk、或約25 mpk、或約30 mpk。
除本發明之以上涵蓋之態樣以外,更涵蓋描述一種治療黑色素瘤之方法,該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之MAP激酶抑制劑及抗ETBR抗體藥物結合物,其中MAP激酶抑制劑經口投與。在本發明之所主張方法中,亦涵蓋BRAF抑制劑之劑量為約1 mpk、或約2 mpk、或約3 mpk、或約4 mpk、或約5 mpk、或約6 mpk、或約7 mpk、或約8 mpk、或約9 mpk、或約10 mpk、或約11 mpk、或約12 mpk、或約15 mpk、或約20 mpk、或約30 mpk。
在本發明之一個態樣中,涵蓋製品用於罹患黑色素瘤之個體之TGI,該製品包含含有抗ETBR抗體藥物結合物組合物及MAP激酶抑制劑組合物之包裝。更涵蓋該抗ETBR抗體藥物結合物特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。或者,亦涵蓋該抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。所涵蓋之另一替代為具有可變重鏈及可變輕鏈之抗
ETBR抗體,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。在又一替代中,抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9,且VL為SEQ ID NO:8。在製品之另一態樣中,抗ETBR抗體結合至細胞毒素,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑。在另一態樣中,細胞毒素為毒素,其中該毒素選自由類美登素、卡奇黴素及奧瑞他汀組成之群。在一個態樣中,毒素為類美登素。
在上文描述之治療黑色素瘤之方法的一個態樣中,亦涵蓋MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。在上文描述之方法之又一態樣中,BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。另外,涵蓋BRAF抑制劑具有以下化學結構:
在上文描述之所主張方法之另一態樣中,MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。在上文描述之所主張方法之又一態樣中,MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述之所主張方法之又一態樣中,MEK抑制劑具有以下化學
結構:
在本發明之一個態樣中,涵蓋治療個體之黑色素瘤之製品,該製品包含含有抗ETBR抗體藥物結合物組合物及MAP激酶抑制劑組合物之包裝。更涵蓋該抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。或者,亦涵蓋該抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。所涵蓋之另一替代為具有可變重鏈及可變輕鏈之抗ETBR抗體,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。在又一替代中,抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9,且VL為SEQ ID NO:8。在製品之另一態樣中,抗ETBR抗體結合至細胞毒素,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑。在另一態樣中,細胞毒素為毒素,其中該毒素選自由類美登素、卡奇黴素及奧瑞他汀組成之群。在一個態樣中,毒素為類美登素。
在上文描述之製品之一個態樣中,亦涵蓋MAP激酶抑制
劑為BRAF抑制劑。在上文描述之製品之又一態樣中,BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。另外,涵蓋BRAF抑制劑具有以下化學結構:
在上文描述之製品之另一態樣中,MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。在上文描述之製品之又一態樣中,MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述之製品之又一態樣中,MEK抑制劑具有以下化學結構:
涵蓋本發明之一個態樣為抗ETBR抗體藥物結合物及MAP激酶抑制劑之用途,其用於製備用以黑色素瘤之TGI的藥劑。更涵蓋該抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。或者,亦涵蓋該抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三
個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。所涵蓋之另一替代為具有可變重鏈及可變輕鏈之抗ETBR抗體,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。在又一替代中,抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9,且VL為SEQ ID NO:8。在製品之另一態樣中,抗ETBR抗體結合至細胞毒素,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑。在另一態樣中,細胞毒素為毒素,其中該毒素選自由類美登素、卡奇黴素及奧瑞他汀組成之群。在一個態樣中,毒素為類美登素。
在上文描述之藥劑之用途的一個態樣中,亦涵蓋MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。在上文描述之藥劑之用途的又一態樣中,BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。另外,涵蓋BRAF抑制劑具有以下化學結構:
在上文描述之藥劑之用途的另一態樣中,MAP激酶抑制
劑為MEK抑制劑。在上文描述之藥劑之用途的又一態樣中,MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述之藥劑之用途的又一態樣中,MEK抑制劑具有以下化學結構:
涵蓋本發明之一個態樣為包含抗ETBR抗體藥物結合物組合物及MAP激酶抑制劑組合物之製品的用途,其用於製備用以黑色素瘤之TGI的藥劑。更涵蓋該抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。或者,亦涵蓋該抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。所涵蓋之另一替代為具有可變重鏈及可變輕鏈之抗ETBR抗體,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。在又一替代中,抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9,且VL為SEQ ID NO:8。在製品之用途之另一態樣中,抗ETBR抗體結合至細胞毒素,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑。在另
一態樣中,細胞毒素為毒素,其中該毒素選自由類美登素、卡奇黴素及奧瑞他汀組成之群。在一個態樣中,毒素為類美登素。
在上文描述之製品之用途的一個態樣中,亦涵蓋MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。在上文描述之製品之用途的又一態樣中,BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。另外,涵蓋BRAF抑制劑具有以下化學結構:
在上文描述之製品之用途的另一態樣中,MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。在上文描述之製品之用途的又一態樣中,MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述之製品之用途的又一態樣中,MEK抑制劑具有以下化學結構:
出於本文之目的,「接受體人類構架」為包含來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架(如以下所定義)之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列,或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中,胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中,VL接受體人類構架與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架在序列上一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與該分子之結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另作指示,否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例在下文描述。
「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體,在一或多個高變區(HVR)中具有一或多個變化之抗體,此等變化使抗體
對抗原之親和力得到改良。
術語「抗ETBR抗體」及「結合ETBR之抗體」係指能夠以充分的親和力結合內皮素B受體(ETBR)之抗體,以使該抗體在靶向ETBR中適用作診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中,如例如由放射免疫分析(RIA)所量測,抗ETBR抗體結合無關的非ETBR蛋白質之程度小於抗體結合ETBR之約10%。在某些實施例中,結合ETBR之抗體之解離常數(Kd)為1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如為10-8 M或更少,例如為10-8 M至10-13 M,例如為10-9 M至10-13 M)。在某些實施例中,抗ETBR抗體結合在來自不同物種之ETBR中為保守的ETBR之抗原決定基。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構,包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段,只要其展現所要抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指並非完整抗體之分子,其包含結合完整抗體所結合之抗原的完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;雙功能抗體;線性抗體;單鏈抗體分子(例如scFv);及由抗體片段形成之多特異性抗體。
與參照抗體「結合至相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中將參照抗體與其抗原的結合阻斷50%或50%以上之抗體,及反之,參照抗體在競爭分析中將抗體與其抗原
的結合阻斷50%或50%以上。本文提供一種例示性競爭分析。
如本文使用之術語「BRAF」係指絲胺酸/蘇胺酸-蛋白激酶B-Raf,亦稱為原癌基因B-Raf或v-Raf鼠類肉瘤病毒致癌基因同源物B1,其為在人類中由BRAF基因編碼之蛋白質。B-Raf蛋白質在細胞中及在細胞生長中參與發送信號。
如本文使用之術語「BRAF抑制劑」或「BRAFi」係指可抑制或中斷B-Raf/MEK/ERK路徑上之B-Raf/MEK步驟的若干已知的小分子藥物化合物。適合的BRAFi之實例可包括(但不限於)2010年8月27日申請之國際專利申請案PCT/US2010/047007、2010年8月27日申請之國際專利申請案PCT/US2010/046975、2010年8月27日申請之國際專利申請案PCT/US2010/046952、2010年8月27日申請之國際專利申請案PCT/US2010/046955及2006年6月21日申請之國際專利申請案PCT/US2010/024361中所描述之BRAFi。另一實例可為但不限於GSK 2118436,CAS登記號為405554-55-4,亦稱為5-[2-[4-[2-(二甲基胺基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]-2,3-二氫-1H-茚-1-酮肟。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種,而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在5種主要抗體類別:IgA、IgD、IgE、IgG及
IgM,且其中若干可進一步分為子類(同型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於免疫球蛋白之不同類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、Zr89及Lu放射性同位素);化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑);生長抑制劑;酶及其片段,諸如核分解酶;抗生素;毒素,諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素,包括其片段及/或變異體;及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性,其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括:C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調;及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時間有效達成所要治療或預防結果之量。
除非另外指出,否則如本文使用之術語「ETBR」係指
來自任何脊椎動物來源之任何天然的內皮素B受體(ETBR),包括哺乳動物,諸如靈長類動物(例如人類)及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未加工ETBR以及由細胞中之加工所產生之ETBR之任何形式。該術語亦涵蓋天然存在之ETBR變異體,例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類ETBR之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:10中(參見Nakamuta M等人,Cloning and Sequence Analysis of a cDNA encoding Human non-selective type of endothelin receptor,Biochem Biophys Res Commun.1991年5月31日:177(1):34-9)。
如本文使用之術語「抗ETBR抗體-ADC」係指本文所述之結合至毒素之任何抗ETBR抗體。此類毒素包括(但不限於)類美登素或詳言之單甲基奧瑞他汀(monomethylauristatin,MMAE)。涵蓋抗ETBR抗體-ADC為一種「本發明之抗ETBR抗體」。
本文之術語「Fc區」用於定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中,人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而,Fc區之C端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外說明,否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統,亦稱為EU索引,如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR一般由4個FR域組成:FR1、FR2、FR3及FR4。因此,HVR及FR序列一般按以下順序出現於VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用來指代結構實質上類似於原生抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
如本文使用之術語「945」或「BRAFi-945」係指為4-胺基-N-(6-氯-2-氟-3-(3-氟基丙基磺醯胺基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲醯胺之B-Raf酶抑制劑且具有如2010年8月27日申請之國際專利申請案PCT/US2010/046955之實例15中所揭示之下式之結構,該申請案以全文引用之方式併入本文中:
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且指已引入了外源性核酸之細胞,包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」,其包括原生轉型細胞及源自其之子代(不管繼代次數)。子代之核酸含量與母細胞可能不完全相同,但可含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變子代。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義尤其排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為代表所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言,人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之子群。一般而言,該序列子群為Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中之子群。在一個實施例中,對於VL而言,該子群為Kabat等人,同上中之子群κI。在一個實施例中,對於VH而言,子群為如Kabat等人(同上文)中之子群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中,人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部,其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR,且全部或實質上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。
如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上高度可變及/或形成結構確定之環(「高變環」)的各區。一般而言,原生四鏈抗體包含6個HVR;3
個在VH(H1、H2、H3)中且3個在VL(L1、L2、L3)中。HVR一般包含來自高變環及/或「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基,互補決定區具有最高序列變異性及/或涉及抗原識別。例示性高變環出現在胺基酸殘基26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)及96至101(H3)處。(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24至34、L2之胺基酸殘基50至56、L3之胺基酸殘基89至97、H1之胺基酸殘基31至35B、H2之胺基酸殘基50至65及H3之胺基酸殘基95至102處。(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除VH中之CDR1外,CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」,該等殘基為接觸抗原之殘基。SDR係含於稱為簡化CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之CDR區內。例示性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31至34、L2之胺基酸殘基50至55、L3之胺基酸殘基89至96、H1之胺基酸殘基31至35B、H2之胺基酸殘基50至58及H3之胺基酸殘基95至102處。(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指示,否則本文中可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)係根據Kabat等人,同上進行編號。
「免疫結合物」為與一或多個異源分子,包括(但不限於)細胞毒性劑結合之抗體。
「個體(individual或subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物,諸如猴)、家兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中,個體為人類。
「分離」之抗體為與自然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中,抗體係純化至高於95%或99%純度,如由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法的綜述,參見例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
「經分離」核酸係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。經分離核酸包括如下核酸分子:該核酸分子含於通常含有該核酸分子之細胞中,但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置上。
「編碼抗ETBR抗體之分離之核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一或多個核酸分子,包括處於單個載體或各別載體中之該(等)核酸分子,且該(等)核酸分子存在於宿主細胞中之一或多個位置上。
如本文使用之術語「促分裂素原活化蛋白激酶」(MAP激酶)係指屬於CMGC(CDK/MAPK/GSK3/CLK)激酶群之絲胺酸/蘇胺酸特異性蛋白質激酶。哺乳動物之ERK1/2路徑
可能為最佳特徵化MAPK系統。此路徑之最重要上游活化劑為Raf蛋白質(A-Raf、B-Raf或c-Raf),對生長因子(EGF、FGF、PDGF等)之反應之關鍵介體。
如本文使用之術語「MAPK/ERK激酶」(MEK)係指在MAPK路徑中佔據中心作用之酪胺酸激酶。MEK之組成性活性形式之表現引起細胞株轉型。
如本文使用之術語「MEK抑制劑」(MEKi)係指可抑制或中斷MAP激酶路徑上之MEK步驟的若干已知的小分子藥物化合物。適合的MEKi之實例可包括(但不限於)描述為MEKi-623、MEKi-973或GSK1120212之MEKi。
如本文使用之術語「MEKi-973」係指MEK抑制劑(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮,具有以下結構:
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體,亦即除可能之變異抗體(例如含有天然產生之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異抗體,此等變異體通常以較小量存在)之外,構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反,單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單個決定
子。因此,修飾語「單株」指示抗體在獲自實質上均質之抗體群體時的特徵,且不應視為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如,根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製造,包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法,該等方法及用於製造單株抗體之其他例示性方法描述於本文中。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「原生抗體」係指具有不同結構之天然產生之免疫球蛋白分子。舉例而言,天然IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白,由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端,各重鏈具有可變區(VH),亦稱為可變重域或重鏈可變域,繼而為3個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地,自N端至C端,各輕鏈具有可變區(VL),亦稱為可變輕域或輕鏈可變域,繼而為恆定輕(CL)域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種,稱為κ及λ。
術語「藥品說明書」用於指示市售治療產品包裝中慣常包括之說明書,其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、關於使用該等治療產品之禁忌及/或警告之資訊。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對候選序列與參考多肽序列且必要時引
入間隙以達成最大序列一致性百分比之後,且在不將任何保守型取代視為序列一致性之一部分的情況下,候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術內之多種方式,例如使用公開可得之電腦軟體,諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體,達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可確定適於比對序列之參數,包括為在所比較序列之全長上達成最大比對所需要的任何演算法。然而,為達成本文之目的,使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創作,且源程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔,其中在該版權局其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得,或可自源程式碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下,如下計算既定胺基酸序列A對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某一對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%):100×分數X/Y
其中X為在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配的胺基酸殘基數目,且其中Y為B中胺基酸殘基總數。應瞭解,若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度,則A與B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B與A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外明確規定,否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性百分比值均使用ALIGN-2電腦程式如緊鄰的前一段中所述而獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈某種形式以允許所含活性成分之生物活性有效且不含對該調配物所投與之個體有不可接受之毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外的對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語「RG7204」係指B-Raf酶抑制劑,分子式為C23H18ClF2N3O3S且具有以下結構:
如本文所用之「治療(treatment)」(及其語法變體,諸如「治療(treat)」或「治療(treating」)係指試圖改變所治療之個體的自然病程之臨床介入,且可進行以用於預防或在
臨床病理學病程中進行。所要治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病病狀、及緩和或改善預後。在一些實施例中,本發明抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結合至抗原之域。原生抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)通常具有類似結構,其中各域包含4個保守構架區(FR)及3個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91頁(2007)。)單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外,結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL域進行分離以分別篩選互補VL域或VH域之庫。參見例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用之術語「載體」係指一種能夠傳播其所連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自我複製型核酸結構(self-replicating nucleic acid structure)形式之載體以及併入其所引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
在一個態樣中,本發明部分地基於結合ETBR之抗體。本發明抗體適用於例如治療黑色素瘤。
例示性抗ETBR抗體
在一個態樣中,本發明提供結合ETBR之分離的抗體。在某些實施例中,抗ETBR抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之CDR:(a)CDR-L1(KSSQSLLDSDGKTYLN,SEQ ID NO:7),(b)CDR-L2(LVSKLDS,SEQ ID NO:8),(c)CDR-L3(WQGTHFPYT;SEQ ID NO:9),(d)CDR-H1(GYTFTSYWMQ;SEQ ID NO:1),(e)CDR-H2(TIYPGDGDTSYAQKFKG;SEQ ID NO:2),及(f)CDR-H3(WGYAYDIDN;SEQ ID NO:3)。
在任何上述實施例中,抗ETBR抗體為人類化的。在一個實施例中,抗ETBR抗體包含任何上述實施例中之CDR,且進一步包含接受體人類構架,例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在另一態樣中,本發明提供一種分離的抗ETBR抗體,其具有SEQ ID NO:8之VL胺基酸序列及SEQ ID NO:7之VH胺基酸序列。在又一態樣中,本發明提供一種抗ETBR抗體,其具有SEQ ID NO:8之VL序列及SEQ ID NO:9之VH胺基酸序列。
在另一態樣中,抗ETBR抗體包含與SEQ ID NO:7或9之胺基酸序列之序列一致性為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中,一致性為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失,但包含該序列之抗ETBR抗體保留結合至ETBR之能
力。在某些實施例中,在SEQ ID NO:7或9中,總計1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中,取代、插入或缺失發生在CDR外部的區中(亦即FR中)。
在另一態樣中,提供一種抗ETBR抗體,其中該抗體包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列之序列一致性為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中,一致性為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失,但包含該序列之抗ETBR抗體保留結合至ETBR之能力。在某些實施例中,在SEQ ID NO:8中,總計1至10個胺基酸係經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中,取代、插入或缺失發生在HVR外部之區中(亦即在FR中)。
在另一態樣中,提供一種抗ETBR抗體,其中該抗體包含如以上所提供任何實施例中之VH及如以上所提供任何實施例中之VL。在一個實施例中,抗體包含分別在SEQ ID NO:7或9及SEQ ID NO:8中之VH及VL序列,包括此等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中,本發明提供一種與本文提供之抗ETBR抗體結合相同抗原決定基之抗體。舉例來說,在某些實施例中,提供一種與抗ETBR抗體結合相同抗原決定基的抗體,其包含SEQ ID NO:7或9之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列。在某些實施例中,提供一種抗ETBR抗體,其結
合至由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR之N端細胞外域#1片段內的抗原決定基。
在本發明之另一態樣中,根據任何上述實施例之抗ETBR抗體為單株抗體,包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中,抗ETBR抗體為抗體片段,例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一個實施例中,該抗體為全長抗體,例如完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中,根據任何以上實施例之抗ETBR抗體可並有任何如以下章節1-7中所述之特徵中的一者或任何該等特徵之組合。
抗體親和力
在某些實施例中,本文提供之抗體之解離常數(Kd)為1 μM,100 nM,10 nM,1 nM,0.1 nM,0.01 nM,或0.001 nM(例如為10-8 M或更小,例如10-8 M至10-13 M,例如10-9 M至10-13 M)。
在一個實施例中,藉由如關於以下分析所述用相關抗體之Fab型式及其抗原進行的放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測Kd。藉由在未經標記抗原滴定系列存在下使Fab與最小濃度之經(125I)標記抗原平衡,接著用經抗Fab抗體塗佈之培養盤捕捉結合抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(參見例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。為了確立分析條件,將MICROTITER®多孔培養盤(Thermo Scientific)用含5 μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel
Labs)之50 mM碳酸鈉(pH 9.6)溶液塗佈隔夜,且隨後在室溫(約23℃)下用含於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷二至五小時。在非吸附培養盤(Nunc #269620)中,將100 pM或26 pM[125I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如按照Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中針對抗VEGF抗體Fab-12之分析法)。接著培育相關Fab隔夜;然而,可持續培育較長時期(例如約65小時)以確保達到平衡。此後,在室溫下將混合物轉移至捕捉培養盤中,以用於培育(例如1小時)。隨後移除溶液,且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS洗滌培養盤8次。當培養盤已乾燥時,每孔添加150 μl閃爍劑(MICROSCINT-20TM;Packard),且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對培養盤計數10分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合度之各Fab的濃度用於競爭性結合分析。
根據另一個實施例,使用表面電漿子共振分析,使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ),在25℃下,用固定抗原CM5晶片,在約10個反應單位(RU)下量測Kd。簡言之,根據供應商之說明書,用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIAcore Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋抗原至5 μg/ml(~0.2 μM),之後以5 μl/min之流速注射,以達到約10個反應單位(RU)之偶合蛋白質。繼注射抗原之後,注射1 M乙醇胺以阻斷未反應基團。量測動力學
時,在25℃下,以約25 μl/min之流速注射含在0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中的Fab之兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE®分析軟體3.2版),同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。以koff/kon比率來計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若藉由上述表面電漿共振分析測定之締合速率超過106 M-1s-1,則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率,該技術在25℃下,在遞增濃度之抗原存在下,量測PBS(pH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或減少(激發=295 nm;發射=340 nm,16 nm帶通),其係在分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中量測。
抗體片段
在某些實施例中,本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述,參見Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。關於scFv片段之綜述,參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore編,(Springer-Verlag,New York),第269-315頁(1994);亦參見
WO 93/16185;及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救援受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的討論,參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
單域抗體為包含抗體之所有或一部分重鏈可變域或所有或一部分輕鏈可變域之抗體片段。在某些實施例中,單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA;參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由多種技術製備,包括(但不限於)如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。
嵌合及人類化抗體
在某些實施例中,本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體例如描述於美國專利第4,816,567號;及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一個實例中,嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中,嵌合抗體為「類別轉
換」抗體,其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中,嵌合抗體為人類化抗體。通常,對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性,同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言,人類化抗體包含一或多個可變域,其中HVR(例如CDR)(或其部分)來源於非人類抗體,且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中,人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中,且進一步描述於以下文獻中:例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號;Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述「表面重整」);Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述「FR改組」);及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述進行FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括但不限於:使用「最佳
擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993));源自具有輕或重鏈可變區之特殊子群之人類抗體的共同序列的構架區(參見例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993));人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));及源自篩選FR庫之構架區(參見例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
人類抗體
在某些實施例中,本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術已知之不同技術製造。人類抗體一般描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向轉殖基因動物投與免疫原來製備,該轉殖基因動物已經修飾以對抗原攻擊作出反應而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此等動物通常含有置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中之全部或部分人類免疫球蛋白基因座。在此等轉殖基因小鼠中,內源性免疫球蛋白基因座通常不被活化。關於由轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述,參見Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。
亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號(描述XENOMOUSETM技術);美國專利第5,770,429號(描述HUMAB®技術);美國專利第7,041,870號(描述K-M MOUSE®技術)及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號(描述VELOCIMOUSE®技術)。來自由此等動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合來進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如於以下中描述之方法:美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(三體雜交瘤(Trioma)技術)亦描述於以下中:Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
人類抗體亦可藉由分離自人類來源噬菌體呈現庫選擇之
Fv純系可變域序列產生。此等可變域序列可接著與所要人類恆定域組合。下文描述自抗體庫選擇人類抗體之技術。
自庫獲得之抗體
本發明抗體可藉由篩選組合庫中具有所要活性之抗體來分離。舉例而言,此項技術中已知用於產生噬菌體呈現庫及篩選此等庫中具有所要結合特徵之抗體的多種方法。該等方法綜述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,2001)中,且進一步描述於例如以下文獻中:McCafferty等人,Nature 348:552-554;Clackson等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌體呈現方法中,藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因之譜系且在噬菌體庫中隨機重組,其可隨後如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。
或者,如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述,可(例如自人類)選殖原生譜系以提供抗多種非自體抗原以及自體抗原之抗體的單一來源而無需任何免疫接種。最後,如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述,亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高可變CDR3區且完成活體外重排來合成製造原生庫。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括例如:美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
多特異性抗體
在某些實施例中,本文提供之抗體為多特異性抗體,例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中,結合特異性之一係針對ETBR而另一個係針對任何其他抗原。在某些實施例中,雙特異性抗體可與ETBR之兩個不同抗原決定基結合。亦可使用雙特異性抗體將細胞毒性劑定位於表現ETBR之細胞中。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異
性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305:537(1983));WO 93/08829及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991)),及「洞中突結(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下來製備:工程改造靜電牽引效應以製造抗體Fc-異源二聚分子(WO 2009/089004A1);使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人,Science,229:81(1985));使用白胺酸拉鏈以製造雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992));使用「雙功能抗體」技術以製造雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));及使用單鏈Fv(sFv)二聚物(參見例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994));及製備三特異性抗體,如例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所描述。
具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之經工程改造抗體(包括「章魚抗體(Octopus antibody)」)亦包括在本文中(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括包含結合至ETBR以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
抗體變異體
在某些實施例中,涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變
異體。舉例而言,可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成進行製備。此等修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內進行殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體,其限制條件為最終構築體具有所要特徵,例如抗原結合。
取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中,提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於進行取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代展示於表1中之標題「保守性取代」下。更實質性變化提供於表1中之標題「例示性取代」下且如下文關於胺基酸側鏈類別所進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩選具有所要活性,例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據常見的側鏈性質來分組:疏水性:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;酸性:Asp、Glu;鹼性:His、Lys、Arg;影響鏈定向之殘基:Gly、Pro;芳族:Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言,選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物性質方面具有改進(例如改良)(例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物性質。一種例示性取代變異體為親和力成熟抗體,其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)方便地產生。簡言之,使一或多個HVR殘基突變且
在噬菌體上呈現變異抗體並篩選具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異抗體。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。此等改變可在HVR「熱點(hotspot)」(亦即由在體細胞成熟過程中以高頻率發生突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行,且測試所得變異型VH或VL之結合親和力。藉由構築二級庫且自二級庫再選擇來進行親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中,藉由多種方法之任一者(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生二級庫。接著篩選庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法,其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特定鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在某些實施例中,取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內,只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言,可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。此等改變可在HVR「熱點」或SDR之外部。在以上提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中,各HVR未改變或含有不
超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於鑑別抗體中可作為突變誘發目標之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」,如Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中,鑑別出一個殘基或一組目標殘基(例如帶電荷殘基,諸如arg、asp、his、lys及glu)且置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外,利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所要性質。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之胺基及/或羧基未端融合體,以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如,對於ADEPT而言)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合體。
糖基化變異體
在某些實施例中,對本文提供之抗體進行改變以增加或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來方便地達成。
在抗體包含Fc區之情況下,可改變與其連接之碳水化合
物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支雙觸角(biantennary)寡醣,其通常藉由N-鍵聯連接至Fc區之CH2域的Asn297。參見例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物,例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸,以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中,可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質之抗體變異體。
在一個實施例中,提供具有缺乏與Fc區連接(直接或間接)之海藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言,此抗體中海藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如例如WO 2008/077546中所述,藉由相對於與Asn 297連接之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)之總和計算Asn297處糖鏈內海藻糖的平均量來測定海藻糖之量,如藉由MALDI-TOF質譜所量測。Asn297係指大致位於Fc區中位置297(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基;然而,歸因於抗體中之微小序列變化,Asn297亦可能位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處,亦即介於位置294與300之間。此等海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.);第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去海藻糖化」或「海藻糖缺失」抗體之公開案之實例包括:US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US
2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO 2005/053742;WO 2002/031140;Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能夠產生去海藻糖化抗體之細胞株之實例包括蛋白質海藻糖化不足之Lec13 CHO細胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號,Presta,L;及WO 2004/056312 A1,Adams等人,尤其實例11),及基因剔除細胞株,諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8,基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO 2003/085107)。
另外提供具有對分寡醣之抗體變異體,例如其中與抗體之Fc區連接之雙觸角寡醣由GlcNAc對分。此等抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供寡醣中至少1個半乳糖殘基連接至Fc區之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改良之CDC功能。此等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人);WO 1998/58964(Raju,S.);及WO
1999/22764(Raju,S.)中。
Fc區變異體
在某些實施例中,可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中,藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中,本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體,此使得該抗體成為合乎應用需要之候選物,在該等應用中,活體內抗體半衰期較重要,而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。舉例而言,可進行Fc受體(FcR)結合分析,以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性),但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII,而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概括於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)之第464頁之表3中。評定相關分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者,可使用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細
胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA);及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於該等分析之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺滅(NK)細胞。或者或另外,可在活體內,例如在動物模型(諸如在Clynes等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中揭示之彼動物模型)中,評估相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體無法與C1q結合且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化,可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003);及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代之Fc突變體,包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合得到改良或減弱之某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號;WO 2004/056312
及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些實施例中,抗體變異體包含具有改良ADCC之一或多個胺基酸取代,例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代的Fc區。
在一些實施例中,在Fc區中產生改變,致使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或削弱),例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
半衰期增加且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合得以改良之抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中,新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。彼等抗體包含其中具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合的取代之Fc區。此等Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之Fc變異體:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434,例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例,亦參見Duncan及Winter,Nature 322:738-40(1988);美國專利第5,648,260號;美國專利第5,624,821號;及WO 94/29351。
半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中,可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體,例如「硫基MAb(thioMAb)」,其中抗體之一或多個
殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中,經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基,反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中,任一或多個以下殘基可用半胱胺酸取代:輕鏈之V205(Kabat編號);重鏈之A118(EU編號);及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸工程改造抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生。
抗體衍生物
在某些實施例中,本文提供之抗體可進行進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白質部分。適於衍生化抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醯因其於水中之穩定性而可於製造時具有優點。聚合物可具有任何分子量,且可具支鏈或不具支鏈。連接至抗體之聚合物數目可變化,且若連接一種以上聚合物,則該等聚合物可為相同或不同分子。一般而言,用於衍生作用
之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特殊性質或功能,抗體衍生物是否將用於指定條件下之療法等考慮來確定。
在另一個實施例中,提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性加熱之非蛋白部分的結合物。在一個實施例中,非蛋白質性部分為碳奈米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。此輻射可具有任一波長,且包括但不限於不損傷一般細胞但能將非蛋白部分加熱至可殺死抗體-非蛋白部分近側之細胞之溫度的波長。
重組方法及組合物
可使用例如如美國專利第4,816,567號中所述之重組法及組合物來產生抗體。在一個實施例中,提供編碼本文描述之抗ETBR抗體的分離之核酸。此核酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一個實施例中,提供一或多種包含此核酸之載體(例如表現載體)。在另一個實施例中,提供包含此核酸之宿主細胞。在一個該實施例中,宿主細胞包含(例如已經以下轉型):(1)包含某一核酸之載體,該核酸編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列,或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體;及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中,宿主細胞為真核細胞,例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中,提供一種製備
抗ETBR抗體之方法,其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞,及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
對於重組產生抗ETBR抗體,分離編碼例如如上所述之抗體之核酸且插入一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言,抗體可於細菌中產生,特定言之在不需要糖基化及Fc效應功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽,參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254頁描述抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現之後,抗體可自細菌細胞漿(bacterial cell paste)分離於可溶性部分中且可進一步純化。
除原核生物外,諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適於抗體編碼載體之選殖或表現宿主,包括糖基化路徑已經「人類化」,從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)及Li等人,Nat.Biotech.
24:210-215(2006)。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)獲得。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別出可與昆蟲細胞聯合使用且尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之眾多桿狀病毒病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言,可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。適用之哺乳動物宿主細胞株之其他實例為由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7);人類胚腎細胞株(293或293細胞,如例如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠塞氏細胞(TM4細胞,如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述);猴腎細胞(CV1);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人類宮頸癌細胞(HELA);犬腎細胞(MDCK;布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A);人類肺細胞(W138);人類肝細胞(Hep G2);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562);TRI細胞,如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述;MRC 5細胞;及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 77:4216(1980));及骨髓瘤細胞株,諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述,參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。
分析
本文提供之抗ETBR抗體可藉由此項技術中已知之各種分析針對其物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
結合分析及其他分析
在一個態樣中,例如藉由已知方法(諸如ELISA、西方墨點法等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中,競爭分析可用於鑑別與例如Hu5E9v.1或Hu5E9v.2競爭結合至ETBR之抗體。在某些實施例中,此類競爭抗體結合至由Hu5E9v.1或Hu5E9v.2結合之相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於定位抗體結合之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols,」Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。在本發明之一個態樣中,本文所述之抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。
在例示性競爭分析中,在包含結合至ETBR之第一標記的抗體(例如Hu5E9v.1或Hu5E9v.2)及被測試與第一抗體競
爭結合至ETBR之能力的第二未標記的抗體的溶液中培育固定的ETBR。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照,在包含第一標記的抗體但不包含第二未標記的抗體的溶液中培育固定之ETBR。在容許第一抗體結合至ETBR之條件下培育之後,移除過量的未結合抗體,且量測與固定之ETBR締合之標記的量。若測試樣品中與固定之ETBR締合的標記之量相對於對照樣品實質上減少,則指示第二抗體與第一抗體競爭結合至ETBR。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
活性分析
在一個態樣中,提供分析以鑑別抗ETBR抗體及/或BRAFi化合物是否具有生物活性。生物活性可包括實例中所述之生物活性,例如活體外黑色素瘤細胞存活分析或活體內異種移植物模型,其中將黑色素瘤細胞株移植於裸小鼠中且評定腫瘤生長抑制(TGI)。
免疫結合物
本發明亦提供包含結合至一或多種細胞毒性劑之本文之抗ETBR抗體的免疫結合物,該等細胞毒性劑諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素;細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素;或其片段)、或放射性同位素。
本發明亦提供包含結合至一或多種細胞毒性劑之抗體的免疫結合物(可互換地稱為「抗體-藥物結合物」或
「ADC」),該一或多種細胞毒性劑為諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素,源於細菌、真菌、植物或動物之酶促活性毒素,或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
免疫結合物已用於在癌症治療中局部傳遞細胞毒性劑,亦即殺死或抑制細胞生長或增殖之藥物(Xie等人,(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291;Kovtun等人,(2006)Cancer Res.66(6):3214-3121;Law等人,(2006)Cancer Res.66(4):2328-2337;Lambert,J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5:543-549;Wu等人,(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137-1146;Payne,G.(2003)i 3:207-212;Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614;Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26:151-172;美國專利第4,975,278號)。免疫結合物允許靶向傳遞藥物部分至腫瘤並在其中進行細胞內積聚,其中全身性投與未結合的藥物可能對正常細胞以及設法去除之腫瘤細胞產生不可接受程度之毒性(Baldwin等人,Lancet(1986年3月15日)第603-05頁;Thorpe(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,」Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications(A.Pinchera等人編)第475-506頁。已報導適用於此等策略中之多株抗體與單株抗體(Rowland等人,(1986)Cancer Immunol.Immunorher.21:183-87)。該等方法中使用的藥物包括道諾黴素、阿黴素、甲胺蝶呤及
長春地辛(Rowland等人,(1986)同上)。用於抗體-毒素結合物之毒素包括細菌毒素,諸如白喉毒素;植物毒素,諸如篦麻毒素(ricin);小分子毒素,諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人,(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581;Mandler等人,(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10:1025-1028;Mandler等人,(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791);類美登素(EP 1391213;Liu等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623);及卡奇黴素(Lode等人,(1998)Cancer Res.58:2928;Hinman等人,(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。設計及細化ADC之努力集中在單株抗體(mAb)以及藥物作用機制之選擇性、藥物連接、藥物/抗體比率(負載)及藥物釋放性質方面(McDonagh(2006)Protein Eng.Design & Sel.;Doronina等人,(2006)Bioconj.Chem.17:114-124;Erickson等人,(2006)Cancer Res.66(8):1-8;Sanderson等人,(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852;Jeffrey等人,(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358;Hamblett等人,(2004)Clin.Caneer Res.10:7063-7070)。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制而發揮其細胞毒性作用。有些細胞毒性藥物當與大抗體或蛋白質受體配位體結合時易變成非活性的或弱活性的。
ZEVALIN®(替坦異貝莫單抗(ibritumomab tiuxetan),Biogen/Idec)為由針對正常及惡性B淋巴細胞表面上發現之CD20抗原之鼠類IgG1κ單株抗體及由硫脲連接子-螯合劑結
合之111In或90Y放射性同位素構成之抗體-放射性同位素結合物(Wiseman等人,(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77;Wiseman等人(2002)Blood 99(12):4336-42;Witzig等人,(2002)J.Clin.Oncol.20(10):2453-63;Witzig等人,(2002)J.Clin.Oncol.20(15):3262-69)。儘管ZEVALIN具有抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的活性,但在大部分患者中投藥會導致嚴重及長期血細胞減少症。MYLOTARGTM(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin),Wyeth Pharmaceuticals),一種由連接至卡奇黴素的huCD33抗體構成之抗體藥物結合物,於2000年獲准用於注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future (2000)25(7):686;美國專利第4970198號、第5079233號、第5585089號、第5606040號、第5693762號、第5739116號、第5767285號、第5773001號)。由連接至曲妥珠單抗之類美登素DM1構成的抗體-藥物結合物(ADC)在過度表現HER2之曲妥珠單抗敏感性及曲妥珠單抗抗性腫瘤細胞株及人類癌症異種移植物模型中顯示有效抗腫瘤活性。曲妥珠單抗-MCC-DM1(T-DM1)目前正在疾病用HER2引導之療法很難治癒之患者中進行II期臨床試驗評估(Beeram等人,(2007)「A phase I study of trastuzumab-MCC-DM1(T-DM1),a first-in-class HER2 antibody-drug conjugate(ADC),in patients(pts)with HER2+ metastatic breast cancer(BC)」,American Society of Clinical Oncology 第43期:6月02日(Abs 1042;Krop等人,European Cancer
Conference ECCO,Poster 2118,2007年9月23-27日,Barcelona;US 7097840;US 2005/0276812;US 2005/0166993)。奧瑞他汀肽、奧瑞他汀E(AE)及單甲基奧瑞他汀(MMAE)、海兔毒素之合成類似物結合至嵌合單株抗體cBR96(對癌瘤上之Lewis Y具有特異性)及cAC10(對血液學惡性疾病上之CD30具有特異性)(Doronina等人,(2003)Nature Biotechnol.21(7):778-784),且正處於治療性開發中。
在某些實施例中,免疫結合物包含抗體及化學治療劑或其他毒素。適用於產生免疫結合物之化學治療劑描述於本文(例如上文)中。酶促活性毒素及其片段亦可使用且其描述於本文中。
在某些實施例中,免疫結合物包含抗體及一或多個小分子藥物部分(毒素),包括但不限於小分子藥物,諸如卡奇黴素、類美登素、海兔毒素、奧瑞他汀、蒽環黴素、紫杉烷、新月毒素(tricothecene)及CC1065,及此等藥物之具有細胞毒性活性之衍生物。此類免疫結合物之實例更詳細地論述於下文中。
例示性免疫結合物
本發明之免疫結合物(或「抗體-藥物結合物」(「ADC」))可具有下式I,其中抗體經由視情況存在之連接子(L)結合(亦即共價連接)於一或多個藥物部分(D)。
Ab-(L-D)p I因此,抗體可直接或經由連接子結合至藥物。在式I中,p
為每個抗體之藥物部分的平均數,其可介於例如每個抗體約1個至約20個藥物部分的範圍內,且在某些實施例中,每個抗體1個至約8個藥物部分。
例示性連接子
連接子可包含一或多個連接子組分。例示性連接子組分包括6-馬來醯亞胺基己醯基(「MC」)、馬來醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲氧羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺基酯(「SPP」)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸N-丁二醯亞胺基酯(「SMCC」)及(4-碘基-乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺基酯(「SIAB」)。此項技術中已知不同的連接子組分,其中一些描述如下。
連接子可為有助於在細胞中釋放藥物之「可裂解連接子」。舉例而言,可使用酸不穩定連接子(例如腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫基之連接子(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992);美國專利第5,208,020號)。
在某些實施例中,連接子如下式II所示:-Aa-Ww-Yy- II其中A為延伸子單元,且a為0至1之整數;W為胺基酸單元,且w為0至12之整數;Y為間隔子單元,且y為0、1或2;且Ab、D及p如上文對於式I所定義。該等連接子之例示
性實施例描述於US 2005-0238649 A1中,該案以引用的方式明確地併入本文中。
在一些實施例中,連接子組分可包含使抗體連接至另一連接子組分或藥物部分的「延伸子單元」。例示性延伸子單元如下所示(其中波形線指示與抗體共價連接之位點):
在一些實施例中,連接子組分可包含胺基酸單元。在一個此類實施例中,胺基酸單元使得可藉由蛋白酶裂解連接子,從而有助於在暴露於細胞內蛋白酶(諸如溶酶體酶)之後自免疫結合物釋放藥物。參見例如Doronina等人,(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784。例示性胺基酸單元
包括(但不限於)二肽、三肽、四肽及五肽。例示性二肽包括:纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe);苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys);或N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。例示性三肽包括甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-giy-giy)。胺基酸單元可包含天然存在之胺基酸殘基以及微量胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物,諸如瓜胺酸。胺基酸單元可在其對藉由特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶,組織蛋白酶(cathepsin)B、C及D,或纖維蛋白溶酶(plasmin)蛋白酶)達成之酶促裂解之選擇性方面進行設計及最佳化。
在一些實施例中,連接子組分可包含直接或經由延伸子單元及/或胺基酸單元將抗體連接至藥物部分之「間隔子」單元。間隔子單元可為「自我分解型」或「非自我分解型」間隔子單元。「非自我分解型」間隔子單元為間隔子單元之一部分或全部在酶促(例如蛋白水解)裂解ADC之後仍結合至藥物部分的間隔子單元。非自我分解型間隔子單元之實例包括(但不限於)甘胺酸間隔子單元及甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。亦涵蓋易遭受序列特異性酶促裂解之肽間隔子的其他組合。舉例而言,藉由腫瘤-細胞相關蛋白酶酶促裂解含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之ADC將引起自ADC之其餘部分釋放甘胺酸-甘胺酸-藥物部分。在一個此類實施例中,隨後甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中進行各別水解步驟,從而使甘胺酸-甘胺酸間隔子單元
與藥物部分裂解。
「自我分解型」間隔子單元使得可不經各別水解步驟釋放藥物部分。在某些實施例中,連接子之間隔子單元包含對胺基苯甲基單元。在一個此類實施例中,對胺基苯甲醇經由醯胺鍵連接至胺基酸單元,且在苯甲醇與細胞毒性劑之間生成胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯。參見例如Hamann等人,(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103。在一個實施例中,間隔子單元為對胺基苯甲氧基羰基(PAB)。在某些實施例中,對胺基苯甲基單元之伸苯基部分經Qm取代,其中Q為-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基;且m為0-4範圍內之整數。自我分解型間隔子單元之實例進一步包括(但不限於)電子方面類似於對胺基苯甲基醇的芳族化合物(參見例如US 2005/0256030 A1),諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人,(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)及鄰或對胺基苯甲基縮醛。可使用醯胺鍵水解之後進行環化的間隔子,諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人,Chemistry Biology,1995,2,223);經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人,J.Amer.Chem.Soc.,1972,94,5815);及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人,J.Org.Chem.,1990,55,5867)。去除在甘胺酸之a位取代之含胺藥物(Kingsbury等人,J.Med.Chem.,1984,27,1447)亦為適用於ADC之自我分解型間隔子之實例。
在一個實施例中,間隔子單元為如下文所述之分支鏈雙
(羥甲基)苯乙烯(BHMS)單元,其可用於併入及釋放多個藥物。
在另一個實施例中,連接子L可為樹突型連接子以經由分支鏈多官能連接子部分將一個以上藥物部分共價連接至抗體(Sun等人,(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215;Sun等人,(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹突狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳比,亦即負載,此與ADC之效能有關。因此,當經半胱胺酸工程改造之抗體僅具有一個反應性半胱胺酸硫醇基時,可經由樹突狀連接子連接多個藥物部分。
例示性連接子組分及其組合如下在式II ADC之情形下所示:
連接子組分(包括延伸子、間隔子及胺基酸單元)可藉由此項技術中已知之方法(諸如US 2005-0238649 A1中所述之方法)合成。
例示性藥物部分
美登素與類美登素
在一些實施例中,免疫結合物包含結合至一或多個類美登素分子之抗體。類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合發揮作用之有絲分裂抑制劑。美登素最先係自東非灌木齒葉美
登木(Maytenus serrata)分離(美國專利第3896111號)。隨後,發現某些微生物亦產生類美登素,諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。美國專利第4,137,230號、第4,248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號中揭示合成之美登醇及其衍生物及類似物。
類美登素藥物部分在抗體藥物結合物中為吸引人的藥物部分,原因在於:(i)相對易可藉由醱酵或醱酵產物之化學修飾或衍生作用製備;(ii)易經適合經由非二硫化物連接子結合抗體的官能基衍生化;(iii)在血漿中穩定;及(iv)有效抗擊各種腫瘤細胞株。
適合用作類美登素藥物部分之美登素化合物在此項技術中為熟知的且可根據已知方法自天然源分離或使用基因工程改造技術製造(參見Yu等人(2002)PNAS 99:7968-7973)。美登醇及美登醇類似物亦可根據已知方法以合成方式製備。
例示性類美登素藥物部分包括具有經修飾芳族環之部分,諸如:C-19-去氯(美國專利第4256746號)(藉由安絲菌素(ansamytocin)P2之氫化鋰鋁還原製備);C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4361650號及第
4307016號)(藉由使用鏈黴菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)去甲基化或使用LAH去氯製備);及C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(藉由使用醯基氯化物來醯基化製備)及其他位置具有修飾之部分。
例示性類美登素藥物部分亦包括具有修飾之部分,諸如:C-9-SH(美國專利第4424219號)(藉由美登醇與H2S或P2S5反應製備);C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(US 4331598);C-14-羥甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4450254號)(由奴卡菌(Nocardia)製備);C-15-羥基/醯氧基(US 4364866)(藉由鏈黴菌轉化美登醇製備);C-15-甲氧基(美國專利第4313946號及第4315929號)(自滑桃樹(Trewia nudlflora)分離);C-18-N-去甲基(美國專利第4362663號及第4322348號)(藉由鏈黴菌使美登醇去甲基化製備);及4,5-去氧(US 4371533)(藉由三氯化鈦/LAH還原美登醇製備)。
已知美登素化合物上之多個位置視連接類型而定適用作鍵聯位置。舉例而言,對於形成酯鍵而言,具有羥基之C-3位置、經羥甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置全為適合的。
類美登素藥物部分包括具有以下結構之部分:
其中波形線指示類美登素藥物部分之硫原子共價連接至ADC之連接子。R可獨立地為H或C1-C6烷基。使醯胺基連接至硫原子之伸烷基鏈可為甲基、乙基或丙基,亦即m為1、2或3(US 633410;US 5208020;Chari等人,(1992)Cancer Res.52:127-131;Liu等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93:8618-8623)。
涵蓋類美登素藥物部分之所有立體異構體為本發明化合物,亦即D之對掌性碳處之R及S組態之任何組合(US 7276497;US 6913748;US 6441163;US 633410(RE39151);US 5208020;Widdison等人,(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408,其均以全文引用之方式併入本文中)。在一個實施例中,類美登素藥物部分將具有以下立體化學:
類美登素藥物部分之例示性實施例包括:DM1;DM3;及DM4,其具有以下結構:
其中波形線指示藥物之硫原子共價連接至抗體-藥物結合物之連接子(L)。已報導由SMCC連接至DM1之HERCEPTIN®(曲妥珠單抗)(WO 2005/037992;US 2005/0276812;US 2005/016993)。
其他例示性類美登素抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫(其中Ab為抗體且p為1至約8):
DM1經由BMPEO連接子連接至抗體之硫醇基的例示性抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫:
其中Ab為抗體;n為0、1或2;且p為1、2、3或4。
含有類美登素之免疫結合物、其製造方法及其治療用途揭示於例如以下文獻中:美國專利第5,208,020號、第5,416,064號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1,其揭示內容特此明確地以引用之方式併入。Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之類美登素(命名為DM1)的免疫結合物。已發現該結合物對所培養
之結腸癌細胞具有高細胞毒性且在活體內腫瘤生長分析中展示抗腫瘤活性。Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)描述免疫結合物,其中類美登素經由二硫化物連接子結合至結合至人類結腸癌細胞株上之抗原的鼠類抗體A7,或結合至結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1。活體外測試TA.1-類美登素結合物對人類乳癌細胞株SK-BR-3的細胞毒性,該細胞株每個細胞表現3×105個HER-2表面抗原。藥物結合物達成與游離類美登素藥物類似之細胞毒性程度,該細胞毒性程度可藉由增加每個抗體分子類美登素分子之數目而增加。A7-類美登素結合物在小鼠體內展示出低全身性細胞毒性。
可藉由在不顯著降低抗體或類美登素分子之生物學活性的情況下將抗體與類美登素分子化學連接來製備抗體-類美登素結合物。例如參見美國專利第5,208,020號(其揭示內容係以引用之方式明確地併入本文中)。平均每個抗體分子結合3-4個類美登素分子已展示出增強標靶細胞之細胞毒性之功效而對抗體功能或溶解性並無不利影響,但預期即使1個毒素/抗體分子亦可增強細胞毒性超過使用裸抗體。類美登素為此項技術中所熟知,且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。適合之類美登素揭示於例如美國專利第5,208,020號及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較佳類美登素為美登醇及在美登醇分子之芳環中或其他位置處修飾之美登醇類似物,諸如各種美登醇酯。
存在許多製造抗體-類美登素結合物之此項技術已知之
連接基團,包括例如以下文獻中所揭示的連接基團:美國專利第5208020號或EP專利0 425 235 B1;Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992);及US 2005/016993 A1,其揭示內容特此明確地以引用之方式併入中。包含連接子組分SMCC之抗體-類美登素結合物可如US 2005/0276812 A1,「Antibody-drug conjugates and Methods」中所揭示製備。連接子包含如以上所確定專利中所揭示的二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團。本文中描述且例示其他連接子。
抗體與類美登素之結合物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得,該等蛋白質偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在某些實施例中,偶合劑為提供二硫鍵之3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)(Carlsson等人,Biochem.J.173:723-737(1978))或4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯(SPP)。
可視連接類型而定使連接子連接至類美登素分子之各個位置。舉例而言,可藉由使用習知偶合技術與羥基反應形
成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經羥甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置處。在一個較佳實施例中,該鍵聯可在美登醇或美登醇類似物之C-3位置處形成。
奧瑞他汀及海兔毒素
在一些實施例中,免疫結合物包含結合至多拉司他汀或多拉司他汀肽類似物或衍生物(例如奧瑞他汀(美國專利第5635483號;第5780588號))之抗體。海兔毒素及奧瑞他汀已展示干擾微管動力學、GTP水解及核及細胞分裂(Woyke等人,(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584),且具有抗癌症(美國專利第5663149號)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端連接至抗體(WO 02/088172)。
例示性奧瑞他汀實施例包括N端連接之單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF(US 7498298)。
肽藥物部分可選自下式DE及DF:
其中DE及DF之波形線表示與抗體或抗體-連接子組分之共價連接位點,且在各位置處獨立地:R2係選自H及C1-C8烷基;R3係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環);R4係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環);R5選自H及甲基;或R4及R5共同形成碳環,且具有式-(CRaRb)n-,其中Ra及Rb係獨立地選自H、C1-C8烷基及C3-C8碳環,且n係選自2、3、4、5及6;R6係選自H及C1-C8烷基;R7係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環);各R8係獨立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環及O-(C1-C8烷基);R9係選自H及C1-C8烷基;R10係選自芳基或C3-C8雜環;Z為O、S、NH或NR12,其中R12為C1-C8烷基;R11係選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2;m為介於1-1000範圍內之整數;
R13為C2-C8烷基;R14為H或C1-C8烷基;R15在每次出現時獨立地為H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基;R16在每次出現時獨立地為H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH;R18係選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環)及-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環);且n為0至6範圍內之整數。
在一個實施例中,R3、R4及R7係獨立地為異丙基或第二丁基,且R5為-H或甲基。在一個例示性實施例中,R3及R4各自為異丙基,R5為-H,且R7為第二丁基。在另一個實施例中,R2及R6各自為甲基,且R9為-H。在另一個實施例中,R8在每次出現時為-OCH3。在一個例示性實施例中,R3及R4各自為異丙基,R2及R6各自為甲基,R5為-H,R7為第二丁基,R8在每次出現時為-OCH3,且R9為-H。在一個實施例中,Z為-O-或-NH-。在一個實施例中,R10為芳基。在一個例示性實施例中,R10為-苯基。在一個例示性實施例中,當Z為-O-時,R11為-H、甲基或第三丁基。在一個實施例中,當Z為-NH時,R11為-CH(R15)2,其中R15為-(CH2)n-N(R16)2,且R16為-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。在另一個實施例中,當Z為-NH時,R11為-CH(R15)2,其中R15為-(CH2)n-SO3H。
式DE之例示性奧瑞他汀實施例為MMAE,其中波形線指
示共價連接至抗體-藥物結合物之連接子(L):
式DF之例示性奧瑞他汀實施例為MMAF,其中波形線指示共價連接至抗體-藥物結合物之連接子(L)(參見US 7498298及Doronina等人,(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124):
其他例示性實施例包括在五肽奧瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸羧基修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽奧瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸側鏈修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008603)。
其他藥物部分包括以下MMAF衍生物,其中波形線指示共價連接至抗體-藥物結合物之連接子(L):
在一個態樣中,包括(但不限於)三乙二醇酯(TEG)之親水性基團如上所示可在R11處連接至藥物部分。在不受任何特定理論限制的情況下,親水性基團有助於藥物部分之內化及不聚結。
包含奧瑞他汀/海兔毒素或其衍生物的式I之ADC之例示性實施例描述於US 7498298及Doronina等人,(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124(明確地以引用之方式併入本文)中。包含MMAE或MMAF及不同連接子組分的式I之ADC之例示性實施例具有以下結構及縮寫(其中「Ab」為抗體;p為1至約8,「Val-Cit」為纈胺酸-瓜胺酸二肽;且「S」為硫原子:
包含MMAF及各種連接子組分之式I ADC之例示性實施例另外包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。有趣的是,包含由不可以蛋白水解方式裂解之連接子連接至抗體之MMAF的免疫接合物已展示具有與包含由可以蛋白水解方式裂解之連接子連接至抗體之MMAF的免疫接合物相當的活性。參見Doronina等人,(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124。在該等情況下,咸信藥物釋放藉由細胞內之抗體降解實現。同上。
肽基藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。該等肽鍵例如可根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參見E.Schröder及K.Lübke,「The Peptides」,第1卷,第76-136頁,1965,Academic Press)製備。奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下文獻之方法製備:US 2005-0238649 A1;美國專利第5635483號;美國專利第5780588號;Pettit等人(1989)J. Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277;Pettit,G.R.等人,Synthesis,1996,719-725;Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5:859-863;及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。
詳言之,式DF之奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分(諸如MMAE及其衍生物)可使用US 7498298及Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124中所述之方法製備。式DE之奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分(諸如MMAE及其衍生物)可使用Doronina等人(2003)Nat.Biotech.21:778-784中所述之方法製備。藥物連接子部分MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF及MC-vc-PAB-MMAE可方便地由例如如Doronina等人,(2003)Nat.Biotech.21:778-784及US 7498298中所描述之常規方法合成,且隨後結合至相關抗體。
卡奇黴素
在其他實施例中,免疫結合物包含結合至一或多個卡奇黴素分子之抗體。抗生素之卡奇黴素家族能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA碎片。對於製備卡奇黴素家族之結合物,參見美國專利第5,712,374、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、第5,877,296號(均屬於American Cyanamid Company)。可使用之卡奇黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙醯基-γ1 I、PSAG及
θI 1(Hinman等人,Cancer Research 53:3336-3342(1993);Lode等人,Cancer Research 58:2925-2928(1998);及屬於American Cyanamid之上述美國專利)。抗體可結合之另一種抗腫瘤藥物為QFA,其為抗葉酸物。卡奇黴素與QFA均具有細胞內作用位點且不易於跨過質膜。因此,被細胞經由抗體介導之內化作用吸收之此等藥劑可大幅增強其細胞毒性作用。
其他細胞毒性劑
可結合抗體之其他抗腫瘤劑包括蒽環黴素(Kratz等人,(2006)Current Med.Chem.13:477-523;Jeffrey等人,(2006)Bioorganic & Med.Chem.Letters 16:358-362;Torgov等人,(2005)Bioconj.Chem.16:717-721;Nagy等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97:829-834;Dubowchik等人,(2002)Bioorg.& Med.Chem.Letters 12:1529-1532;King等人,(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343;US 6630579)、BCNU、鏈脲佐菌(streptozocin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶、總稱為LL-E33288複合物之藥劑家族(描述於美國專利第5,053,394號、第5,770,710號中)以及埃斯培拉黴素(esperamicins)(美國專利第5,877,296號)。
可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(獲自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、香石竹毒蛋白質
(dianthin)、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白質(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。
本發明另外涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切酶,諸如去氧核糖核酸酶;DNase)之間所形成的免疫結合物。
在某些實施例中,免疫結合物可包含高度放射性原子。可使用多種放射性同位素產生放射性結合抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、Zr89及Lu放射性同位素。當使用免疫結合物進行偵測時,其可包含用於閃爍攝影術研究之放射性原子,例如tc99m或I123;或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱作磁共振成像,mri)之自旋標記,諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可依已知方式將放射性標記或其他標記併入免疫結合物中。舉例而言,肽可生物合成,或可藉由使用涉及例如以氟-19替代氫之合適胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成來合成。諸如tc99m或I123、Re186、Re188、Zr89及In111之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。IODOGEN方法(Fraker等人,(1978)Biochem. Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用於合併碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)詳細地描述了其他方法。
在某些實施例中,免疫結合物可包含結合至將前藥(例如肽基化學治療劑,參見WO 81/01145)轉化為活性藥物(諸如抗癌藥)之前藥活化酶的抗體。該等免疫結合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法(「ADEPT」)。可結合至抗體之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶,其適用於將含磷酸酯前藥轉化為游離態藥物;芳基硫酸酯酶,其適用於將含硫酸酯前藥轉化為游離態藥物;胞嘧啶去胺酶,其適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥5-氟尿嘧啶;蛋白酶,諸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L),其適用於將含肽前藥轉化為游離態藥物;D-丙胺醯基羧基肽酶,其適用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥;碳水化合物裂解酶,諸如β-半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶,其適用於將糖基化前藥轉化為游離態藥物;β-內醯胺酶,其適用於將用β-內醯胺衍生之藥物轉化為游離態藥物;及青黴素醯胺酶,諸如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶,其適用於將胺氮分別用苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生之藥物轉化為游離態藥物。酶可藉由此項技術中熟知之重組DNA技術共價結合至抗體。例如參見Neuberger等人,Nature 312:604-608(1984)。
藥物負載
藥物負載由p(式I分子中每個抗體之藥物部分平均數)表示。藥物負載可介於每個抗體1個至20個藥物部分(D)範圍內。式I之ADC包括與1個至20個範圍之藥物部分結合之抗體的集合。來自結合反應之ADC製劑中每個抗體之藥物部分平均數可由習知方式(諸如質譜、ELISA分析法及HPLC)表徵。亦可測定ADC中p之定量分佈。在一些情況下,p為特定值之均質ADC與具有其他藥物負載之ADC的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式達成。
對於一些抗體藥物結合物,p可能受抗體上之連接位點數目的限制。舉例而言,若連接如以上例示性實施例為半胱胺酸硫醇基,則抗體可能僅具有一個或數個半胱胺酸硫醇基,或可能僅具有一個或數個具有足夠反應性之硫醇基,連接子可經由該等硫醇基連接。在某些實施例中,較高藥物負載(例如p>5)可能使得某些抗體藥物結合物凝集、不溶、具毒性或喪失細胞滲透性。在某些實施例中,本發明ADC之藥物負載在1至約8、約2至約6、或約3至約5範圍內。實際上,對於某些ADC已顯示,每個抗體之藥物部分之最佳比率可小於8,且可為約2至約5。參見US 2005-0238649 A1。
在某些實施例中,在結合反應期間,少於理論最大值之藥物部分與抗體結合。抗體可含有例如不與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基,如下文所論述。一般地,抗體不含有可連接至藥物部分之許多游離及反應性半胱胺酸硫醇基;實際上,抗體中大多數半胱胺酸硫醇
殘基以二硫橋鍵形式存在。在某些實施例中,抗體可在部分或完全還原條件下用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑還原,產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中,使抗體經受變性條件以暴露諸如離胺酸或半胱胺酸之反應性親核基團。
ADC之負載(藥物/抗體比率)可以不同的方式控制,例如藉由(i)限制相對於抗體莫耳過量之藥物-連接子中間體或連接子試劑,(ii)限制結合反應時間或溫度,及(iii)半胱胺酸硫醇修飾之部分或限制的還原條件。
應瞭解當一個以上親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑、隨後藥物部分試劑反應時,所得產物為具有一或多個藥物部分連接至抗體之分佈的ADC化合物之混合物。每個抗體之藥物平均數目可由該混合物藉由雙ELISA抗體分析計算,該分析對於抗體具有特異性且對於藥物具有特異性。混合物中之個別ADC分子可藉由質譜鑑別且利用HPLC(例如疏水性交互作用層析)分離(參見例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design & Selection 19(7):299-307;Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070;Hamblett,K.J.等人,「Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,」摘要號624,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月;Alley,S.C.等人,「Controlling the location of
drug attachment in antibody-drug conjugates,」摘要號627,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月)。在某些實施例中,可藉由電泳或層析自結合混合物分離具有單一負載值之均質ADC。
某些製備免疫結合物之方法
式I之ADC可藉由以下數種途徑採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑製備,包括:(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L,繼而與藥物部分D反應;及(2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L,繼而與抗體之親核基團反應。經由後一種途徑製備式I ADC之例示性方法描述於US 2005-0238649 A1中,該專利以引用的方式明確地併入本文中。
抗體上之親核基團包括但不限於:(i)N端胺基;(ii)側鏈胺基,例如離胺酸;(iii)側鏈硫醇基,例如半胱胺酸;及(iv)糖羥基或胺基,其中抗體經糖基化。胺、硫醇及羥基為親核性的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵,親電子基團包括:(i)活性酯,諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物;(ii)烷基鹵及苄基鹵,諸如鹵代乙醯胺;(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原之鏈間二硫鍵,亦即半胱胺酸橋。可藉由用還原劑(諸如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP))處理以使抗體完全或部分還原而使抗
體對與連接子試劑結合具有反應性。由此,各半胱胺酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由例如藉由使離胺酸殘基與2-亞胺基硫雜環戊烷(喬特氏試劑(Traut's reagent))反應使胺轉化為硫醇來修飾離胺酸殘基而將其他親核基團引入抗體中。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多半胱胺酸殘基(例如藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體)而將反應性硫醇基引入抗體中。
本發明之抗體-藥物結合物亦可藉由使抗體上之親電子基團(諸如醛或酮羰基)與連接子試劑或藥物上之親核基團反應產生。連接子試劑上之有用親核基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴腙(thiosemicarbazone)、羧酸肼及芳基醯肼。在一個實施例中,抗體經修飾以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應的親電子部分。在另一個實施例中,可例如用過碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體之糖以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵,或可經例如硼氫化物試劑還原而形成穩定胺鍵。在一個實施例中,糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可於抗體中產生可與藥物上之適當基團反應的羰基(醛及酮)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一個實施例中,含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與偏過碘酸鈉反應,從而製得醛來代替第一胺基酸(Geoghegan及Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.
3:138-146;US 5362852)。此類醛可與藥物部分或連接子親核體反應。
同樣,藥物部分上之親核基團包括(但不限於):胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴腙、羧酸肼及芳基醯肼基團,其能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵,親電子基團包括:(i)活性酯,諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物;(ii)烷基鹵及苄基鹵,諸如鹵代乙醯胺;(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基。
本發明之化合物明確涵蓋(但不限於)用如下交聯劑試劑製備之ADC:BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯),該等交聯劑試劑為可購得的(例如購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
包含抗體與細胞毒性劑之免疫結合物亦可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得,該等蛋白質偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯
基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言,蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science,238:1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸結合至抗體之例示性螯合劑。參見WO94/11026。
或者,可例如藉由重組技術或肽合成製備包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白質。重組DNA分子可包含編碼結合物之抗體及細胞毒性部分之區域,該等區域彼此相鄰或藉由不破壞結合物之所需性質的編碼連接子肽之區域分隔。
在另一個實施例中,可使抗體結合至「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)以用於預靶向腫瘤,其中將抗體-受體結合物投與患者,隨後使用清除劑自循環中移除未結合之結合物,且接著投與結合至細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)之「配位體」(例如抗生物素蛋白)。
醫藥調配物
在一個態樣中,本發明進一步提供包含至少一種本發明抗體及/或至少一種其免疫結合物的醫藥調配物。在一些實施例中,醫藥調配物包含1)本發明之抗體及/或其免疫結合物,及2)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中,醫藥調配物包含1)本發明之抗體及/或其免疫結合物,及視情況存在之2)至少另一種治療劑。其他治療劑包括(但不限於)下述治療劑。
包含本發明抗體或免疫結合物之醫藥調配物藉由混合具有所要純度之抗體或免疫結合物與視情況可選的生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑而製備以供儲存(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980)),呈水溶液或凍乾或其他乾燥的調配物形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對接受者無毒性,且包括緩衝液,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)、氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、對羥基苯甲酸烷酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物);及/或非離子界面活性劑,諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。欲用於活體內投藥之醫藥調配物一般無菌。其可容易地藉由經由無菌過濾膜過濾來實現。
例如,亦可藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成份裹入所製備之微囊中,例如分別將羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊裹入膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米囊劑)或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放之製劑之適合的實例包括含有本發明抗體或免疫結合物之固體疏水性聚合物之半透性基質,該基質呈成形之物品(例如膜或微囊)形式。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如,聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物與醋酸亮丙瑞林構成之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物(諸如,乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸)使分子能夠經100天釋放,但某些水凝膠經較短時期釋放蛋白質。雖然囊封之抗體或免疫結合物在體內保留很長時間,但當暴露於37℃之濕氣中可使其變性或聚集,從而導致生物活性損失且產生可能的免疫原性變化。視所涉及之機制而定,可設計合理策略以達成穩定化。舉例而言,若發現聚集機制為經由硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵,則可藉由修飾氫硫基殘基、由酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特異性聚合物基質組合物來實
現穩定化。
抗體可以任何適合形式調配以傳遞至標靶細胞/組織。舉例而言,抗體可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或適用於傳遞藥物至哺乳動物之界面活性劑構成之小微脂粒。脂質體之組分通常排列為雙層形式,類似於生物膜之脂質排列。含有抗體之脂質體由諸如以下中所述之此項技術中已知之方法製備:Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980);美國專利第4,485,045號及第4,544,545號;及1997年10月23日公開之WO97/38731。循環時間增長之脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。
尤其適用之脂質體可藉由用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物以逆相蒸發法來產生。脂質體經具有規定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。本發明抗體之Fab'片段可經由二硫基互換反應而結合至如Martin等人,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)所述之脂質體。該脂質體中視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。
在另一個實施例中,免疫結合物包含結合至酶促活性毒素或其片段之如本文所述之抗體,該等毒素或其片段包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、篦麻毒素A鏈、相思子
毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白質、香石竹毒蛋白質、洋商陸蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白質、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及新月毒素。
在另一個實施例中,免疫結合物包含結合至放射性原子之如本文所述之抗體以形成放射性結合物。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括Zr89、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時,其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子,例如tc99m或I123;用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像,mri)之自旋標記,諸如再次碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備,該等偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對二重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言,蓖麻毒素免疫毒素可
如Vitetta等人,Science,238:1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸結合至抗體之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言,可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫化物連接子(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992);美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用以下可購得(例如自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A購得)之交聯試劑製備的此等結合物,該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB、及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。
醫藥調配物
如本文所述之抗ETBR抗體之醫藥調配物係藉由混合具有所要純度之該抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980))而製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下對接受者通常無毒,且包括(但不限於):緩衝劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防
腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨;氯化六羥季銨;氯化苯甲烴銨;苄索氯銨;苯酚;丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烷酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;及間甲酚);低分子量(少於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物);及/或非離子型界面活性劑,諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑,諸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白,諸如rHuPH20(HYLENEX®,Baxter International,Inc.)。某些所使用之例示性sHASEGP及方法(包括rHuPH20)描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中,sHASEGP與一或多個額外葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO 2006/044908中所述之調配物,後者調配物包括組胺酸乙酸鹽緩衝劑。
本文之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需的活性成分,較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充活性的活性成分。舉例而言,可能希望進一步提供BRAF抑制劑、MEK抑制劑、或抗CTLA-4抗體、易普利單抗(ipilimumab)。此等活性成分適合以有效達成預定目的之量組合存在。
可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分裹入所製備之微囊中,例如分別將羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊裹入膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放型製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質,此等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)之形式。
欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。容易例如藉由經無菌過濾膜過濾實現滅菌。
治療方法及組合物
本文提供之任何抗ETBR抗體均可用於治療性方法中。
在一個態樣中,提供用作藥劑之抗ETBR抗體。在另一態樣中,該等方法提供適用作藥劑之抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合。在另外的態樣中,此類組合適用於治療黑色素瘤及/或轉移性黑色素瘤。在某些實施例中,提供抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合,其用於治療方法中。在
某些實施例中,本發明提供一種抗ETBR抗體,其用於治療罹患黑色素瘤及/或轉移性黑色素瘤之個體之方法中,該方法包含投與個體有效量之抗ETBR抗體及有效量之BRAF抑制劑。在一個此類實施例中,該方法進一步包含投與個體有效量之至少一種其他治療劑,例如如下文所述,所述之組合。在其他實施例中,本發明提供抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合,其用於腫瘤生長抑制(TGI)。在某些實施例中,本發明提供一種抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合,其用於抑制個體之腫瘤生長之方法中,該方法包含投與個體有效之抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合以抑制腫瘤生長。根據任何上述實施例之「個體」較佳為人類。
在另一態樣中,本發明提供抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合之用途,其用於製造或製備藥劑。在一個實施例中,藥劑用於治療黑色素瘤及/或轉移性黑色素瘤。在另一個實施例中,藥劑用於治療黑色素瘤及/或轉移性黑色素瘤之方法中,該方法包含投與罹患黑色素瘤及/或轉移性黑色素瘤之個體有效量之藥劑。在一個此類實施例中,該方法進一步包含投與該個體有效量之至少一種其他治療劑,例如,如下文所述。在另一個實施例中,藥劑用於腫瘤生長抑制。在另一個實施例中,藥劑用於個體之腫瘤生長抑制之方法中,該方法包含投與個體有效量之藥劑以抑制腫瘤生長。根據上述任何實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中,本發明提供包含本文提供之任何抗
ETBR抗體例如與BRAF抑制劑之組合的醫藥調配物,其用於任何上述治療性方法中。在一個實施例中,醫藥調配物包含本文提供之任何抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中,醫藥調配物包含本文提供之任何抗ETBR抗體與BRAF抑制劑之組合及例如如下文所述之至少一種其他治療劑。
本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言,本發明抗體可與至少一種其他治療劑共同投藥。在某些非限制性實施例中,額外的治療劑為BRAF抑制劑、MEK抑制劑或抗CTLA-4抗體,諸如易普利單抗(ipilimumab)。
上述該等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或各別調配物中),及獨立投藥,在此狀況下本發明抗體之投與可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。本發明抗體亦可與放射療法組合使用。
本發明抗體(及任何額外的治療劑,諸如BRAF抑制劑)可藉由任何適合的手段投與,包括非經腸、肺內及鼻內投藥,且必要時,對於局部治療,包括瘤內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。部分視投藥為短期或長期而定,可藉由任何適當途徑(例如藉由注射,諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本發明涵蓋多種給藥時程,包括(但不限於)在多個時間點單次或多次投與、團式投與及脈衝輸注。或者,BRAF抑制劑可以錠劑
或膠囊或液體形式經口投與。
本發明之抗體將以符合良好醫療實踐之方式加以調配、給藥及投與。在此背景下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及從業醫生已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所討論之病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視調配物中存在之抗體量、病症或治療之類型以及其他上述因素而定。該等藥劑通常以與本文中所述之相同劑量且利用本文中所述之投藥途徑使用,或以本文中所述劑量之約1%至99%使用,或以憑經驗/臨床上確定為適當的任意劑量及任何途徑使用。
為預防或治療疾病,本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視所治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重度及病程、投與抗體以達成預防性抑或治療性目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體適於一次性或經一系列治療投與患者。無論例如藉由一或多次分開投藥,抑或藉由連續輸注,視疾病類型及嚴重程度而定,抗體投與患者的初始候選劑量為約1 μg/kg至15 mg/kg(例如,0.1 mg/kg-10 mg/kg)。一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高劑量之範圍內,此視上文所提及之因素而定。對於歷經數天或更長時間的重複投藥,治療視病狀而定通常可持續直至疾病症狀發生所要抑制為止。抗體
之一種例示性劑量在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此,可將約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg中之一或多個劑量(或其任何組合)投與患者。該等劑量可間歇地投與,例如,每週或每三週(例如,以使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量的抗體)。可投與最初較高起始劑量,接著可投與一或多個較低劑量。然而,其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析加以監控。
製品
在本發明之另一態樣中,提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之材料的製品。該製品包含容器及該容器上黏貼或該容器隨附之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納組合物自身或容納與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物,且可具有無菌存取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或藥品說明書係指示該組合物用於治療所選病狀。此外,該製品可包含(a)內含組合物的第一容器,其中該組合物包含本發明之抗體;及(b)內含組合物的第二容器,其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或治療劑。本發明之實施例中的製品可另外包含藥品說明書,該藥品說明書指示組合物可用於治療特定病狀。或者或另外,該製品可進一步包含
一種包含醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。其可另外包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料,包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
以下為本發明方法及組合物之實例。應瞭解,考慮到上文提供之一般說明,可實踐各種其他實施例。
實例1:活體外評估由抗ETBR ADC所致之特異性細胞殺死
針對表現相對較低之ETBR複本數的黑色素瘤細胞株(在細胞株A2058(獲自美國菌種保存中心)之情況下)或表現相對較高之ETBR複本數的黑色素瘤細胞株(在細胞株UACC-257X2.2之情況下)活體外評估抗ETBR抗體-ADC候選物Hu5E9v1-ADC。UACC-257X2.2細胞株為就活體內生長而言最佳化之親本UACC-257細胞株(NCI-腓特烈癌症DCT腫瘤儲存庫(NCI-Frederick Cancer DCT Tumor Repository))之衍生物。在雌性NCr裸小鼠的右側皮下注射親本UACC-257細胞,收集一個腫瘤並解離,使之在活體外生長,從而產生UACC-257X1.2細胞株。再次在雌性NCr裸小鼠之右側皮下注射UACC-257X1.2細胞株以努力改進細胞株的生長。收集來自此研究之腫瘤且再次使之適應於在活體外生
長以產生UACC-257X2.2細胞株。如由流式細胞術所測定,此細胞株表現高含量的ETBR。如下評估此等細胞株中受體含量與Hu5E9v1-vc-MMAE細胞殺死之關係。
使黑色素瘤細胞株A2058及UACC-257X2.2在適當的培養基中在37℃及5% CO2下生長。為評估Hu5E9v1-ADC對細胞活力之作用,將細胞塗鋪於96孔透明底黑色培養盤的50 μL正常生長培養基中,每孔1,500個。24小時後,再向一式三份孔中添加50 μL含各濃度Hu5E9v1-ADC之連續稀釋液的培養基。5天後,使用CellTiter-Glo場致發光細胞活力試劑(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Reagent)(G7572;Promega Corporation)且用EnVision 2101多標籤讀取器(EnVision 2101 Mutilabel Reader)(Perkin-Elmer)確定細胞存活。
測定每一細胞之抗體結合位點(斯克伽分析(Scatchard analysis)):藉由在冰上與固定濃度之125I標記之Hu5E9v1-ADC以及遞增濃度之未標記Hu5E9v1-ADC一起培育黑色素瘤細胞4小時,估算各抗體之親和力常數及細胞表面結合位點數目。藉由使用分析程式方法進行非線性曲線擬合來分析資料。
如圖2A及2B中所示,藉由斯克伽分析,A2058及UACC-257X2.2上每個細胞之Hu5E9v1-ADC結合位點數目分別估算為1,582個位點及33,939個位點。用抗ETBR ADC候選物滴定此等細胞株展示出,相對於對照ADC,一般與ETBR表現含量成比例之特異性細胞殺死。
實例2:活體內評估由抗ETBR ADC所致之特異性腫瘤殺死
基於以上實例1中所描述的研究,選擇黑色素瘤細胞株A2058及UACC-257X2.2作為代表寬範圍的ETBR表現的用於活體內抗腫瘤活性研究之適合的模型。UACC-257X2.2黑色素瘤細胞株為就活體內生長而言最佳化之親本UACC-257黑色素瘤細胞株(國家癌症研究所(NCI))之衍生物。詳言之,在雌性NCr裸小鼠的右側皮下注射親本UACC-257細胞,收集一個腫瘤並使之在活體外生長,從而產生UACC-257X1.2細胞株。再次在雌性NCr裸小鼠之右側皮下注射UACC-257X1.2細胞株以努力改進細胞株的生長。收集來自此研究之腫瘤且再次使之適應於在活體外生長以產生UACC-257X2.2細胞株。此細胞株及源自此細胞株之腫瘤類似於親本細胞株UACC-257表現ETBR(資料未圖示)。
接著,使用黑色素瘤細胞株在上文描述之異種移植小鼠模型中進行功效研究。所有研究根據實驗室動物之護理及使用的指南(參考:Institute of Laboratory Animal Resources(NIH publication no.85-23),Washington,DC:National Academies Press;1996)進行。用含5×106個UACC-257X2.2細胞的具Matrigel之HBSS或含5×106個A2058細胞的具Matrigel之HBSS在背右側皮下接種來自查爾斯河實驗室(Charles River Laboratory)之10至14週齡的雌性CRL Nu/Nu或NCr裸小鼠。當腫瘤體積達到約200 mm3(第0天)時,將動物隨機分組,每組10隻。
對於單一藥劑功效研究,在第0天以單一靜脈內(IV)注射形式投與1 mpk、3 mpk或6 mpk(mg/kg)之抗ETBR ADC候選物Hu5E9v1-ADC。亦投與對照ADC抗體及媒劑對照。由每組10隻動物確定平均腫瘤體積及標準偏差。每週兩次量測腫瘤體積直至研究結束。
高ETBR複本數UACC-257X2.2細胞株之結果展示於圖3A中,且低ETBR複本數細胞株A2058之結果展示於圖3B中。與實例1中所描述之活體外細胞殺死實驗一致,UACC-257X2.2異種移植腫瘤對Hu5E9v1-ADC更具反應性。雖然對1 mg/kg劑量組之功效不明顯,但對單次劑量之3 mg/kg及6 mg/kg Hu5E9v1-ADC作出反應,觀察到持續的腫瘤消退(圖3A)。
向具有低ETBR複本數A2058腫瘤之動物投與3 mg/kg及6 mg/kg劑量之Hu5E9v1-ADC、6 mg/kg對照ADC或媒劑對照。相對於匹配劑量之對照ADC或媒劑,在高劑量之6 mpk Hu5E9v1-ADC下觀察到腫瘤負荷之部分減小。3 mg/kg之Hu5E9v1-ADC之劑量組的功效並不明顯。因此,在代表人類黑色素瘤中之ETBR表現範圍之下限的A2058異種移植物模型中腫瘤負荷之減小(Asundi等人,2011)表明可用候選物Hu5E9v1-ADC作為單一藥劑在對應於人類黑色素瘤中所遇到之全表現範圍之ETBR的腫瘤中實現功效。
實例3:BRAF抑制劑藥物對於ETBR表現含量之作用
在以下代表不同遺傳黑色素瘤背景之多種黑色素瘤細胞中:諸如BRAF之突變體(V600E)、BRAF之野生型及RAS
之突變體(Q61L),評估BRAF抑制劑藥物對於ETBR轉錄物及蛋白質(總蛋白及細胞表面蛋白)之表現含量之作用。
用改變濃度之BRAF抑制劑藥物(「BRAFi」)(詳言之RG7204)藉由向在4孔培養皿上培養24小時的細胞中添加適當的藥物量來處理黑色素瘤細胞株UACC-257X2.2、A2058、COLO 829、IPC-298(ATCC)。
為確定BRAFi對於ETBR及對照核糖體蛋白L19(RPL19)轉錄物含量之作用,進行以下實驗。藉由刮擦自培養盤收集經RG7204處理24小時之細胞且使用Qiashredder及RNeasy迷你型套組(79654、74104,來自Qiagen,Valencia,CA)加工以獲得總RNA。使用來自Applied Biosystems(ABI,Foster City,CA)之試劑建立Taqman分析,且使用來自ABI之7500實時PCR機器及軟體進行分析。設計引子-探針組,使引子側接經報導體染料FAM及淬滅體染料TAMRA雙重標記的螢光探針。
用於RPL19之引子-探針組如下:前置引子-5' AGC GGA TTC TCA TGG AAC A(SEQ ID NO:11);反置引子-5' CTG GTC AGC CAG GAG CTT(SEQ ID NO:12)及探針-5' TCC ACA AGC TGA AGG CAG ACA AGG(SEQ ID NO:13)。
用於ETBR之引子-探針組如下:前置引子-5'TCA CTG AAT TCC TGC ATT AAC C(SEQ ID NO:14),反置引子-5'GCA TAA GCA TGA CTT AAA GCA GTT(SEQ ID NO:15)及探針-5' AAT TGC TCT GTA
TTT GGT GAG CAA AAG ATT CAA(SEQ ID NO:16)。
UACC-257X2.2之結果展示於圖4A中,A2058之結果展示於圖8A中,且COLO 829之結果展示於圖6A中。此等結果證明,與未添加BRAFi RG7204之對照細胞相比,用BRAFi RG7204處理24小時似乎使所有所測試之細胞株中之ETBR轉錄物增加。
為測試ETBR轉錄物因BRAFi處理所致之增加是否亦導致ETBR總蛋白質含量之任何變化,如上所述對經BRAFi RG7204處理之相同細胞株進行西方墨點實驗。對於西方墨點法,使用以下試劑:對於蛋白質之偵測:抗ETBR自身產生的單株抗體1H1.8.5.、抗磷酸化p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗體(9101,Cell Signaling Technology)、抗p44/42 MAPK(Erk1/2)抗體(9102,Cell Signaling Technology),且作為對照之兔子多株抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)抗體(PA1-987;Affinity Bioreagents)及小鼠單株抗β-微管蛋白抗體(556321,BD Pharmingen)。UACC-257X2.2之結果展示於圖4B中,A2058之結果展示於圖8B中,COLO 829之結果展示於圖6B中,且IPC-298之結果展示於圖10中。此等結果證明,與未添加BRAFi之對照細胞相比,在所測試之UACC-257X2.2、A2058及COLO 829細胞株中,用BRAFi RG7204處理24小時似乎使ETBR總蛋白質含量增加。然而,就對BRAF為野生型且對RAS(Q61L)為突變型之細胞株IPC-298而言,在不同的BRAFi劑量下比較時,BRAFi似乎不使ETBR含量增加,相反如圖
10中所示,似乎刺激磷光體-ERK之含量。
為確定由BRAFi處理所致之所觀察到之總ETBR蛋白質含量的增加是否亦導致ETBR表面蛋白質含量增加,進行螢光激活細胞分類(FACS)分析。將細胞收集於含2.5 mmol/L EDTA的PBS中,且在含有1% FBS之PBS緩衝液中進行洗滌。所有後續步驟均在4℃下進行。將細胞依序與3 μg/mL抗ETBR抗體Hu5E9v1及抗人類IgG螢光偵測試劑(A11013;Invitrogen)一起培育1小時。隨後用FACS Calibur流式細胞儀(BD Biosciences)分析細胞。UACC-257X2.2之結果展示於圖4C中,A2058之結果展示於圖8C中,且COLO 829之結果展示於圖6C中。此等結果證明,與未添加BRAFi之對照細胞相比,用BRAFi RG7204處理24小時似乎使所有所測試之細胞株中所表現之表面ETBR蛋白質之含量增加。然而,如圖11A-C中所示,就細胞株IPC-298而言,BRAFi RG7204似乎在所有所測試之劑量下均使ETBR含量減小。
實例4:BRAF抑制劑藥物對於抗ETBR ADC活體內功效之作用
鑒於以上實例3中所證明的結果,測試BRAF抑制劑藥物對於抗ETBR ADC活體內功效之影響。為進行此測試,針對上文描述之UACC-257X2.2黑色素瘤模型,評估Hu5E9v1-ADC與BRAFi-945之不同組合的活體內功效。使腫瘤生長至約200 mm3之平均大小,於是將動物隨機分組,每組10隻。研究第0天開始,一天一次×21天經口投與適當的媒劑對照(Klucel LF)或劑量為1 mpk、6 mpk或20
mpk之BRAFi-945。研究第1天,經由尾巴靜脈,(在兩次劑量之945之後)經靜脈內投與單次1 mpk或3 mpk劑量之Hu5E9v1-ADC或對照(一種組胺酸緩衝液#8)。
由每組10隻動物確定平均腫瘤體積。每週兩次量測腫瘤體積直至研究結束。使用UltraCal IV測徑規(型號54 10 111,Fred V.Fowler Company;Newton,MA)在兩個維度(長度及寬度)上量測腫瘤體積。利用12.2.8版本Excel(Microsoft;Redmond,WA),使用以下公式計算腫瘤體積:腫瘤體積(mm3)=(長度×寬度2)x 0.5
為分析隨時間來自相同動物之腫瘤體積之重複量測值,使用混合建模之線性混合效應(LME)方法(Pinheiro等人,2009)。此方法可解決重複量測值及在研究結束之前由動物之非治療相關結束所致之少量的中途退出比率。使用三次回歸樣條擬合各劑量下log2腫瘤體積對時程之非線性曲線。此等非線性曲線則與混合模型內之劑量相關。以媒劑百分比表示之腫瘤生長抑制(TGI)使用下式以相對於媒劑之每天擬合曲線下面積(AUC)%來計算:
使用此式,TGI值為100%指示腫瘤停滯,>1%但<100%指示腫瘤生長延遲,且>100%指示腫瘤消退。為獲得TGI%之不確定性間隔(UI),使用擬合曲線及擬合協方差矩陣產生隨機樣本作為TGI%分佈之近似。隨機樣本由擬合-混合模型之1000次模擬之實現值構成,其中各實現值之%TGI
重新計算。此處,報導之UI為95%時間之值,假定該擬合模型,TGI%之重新計算值將落在此區域內。使用模擬分佈之2.5及97.5百分位數作為上限及下限UI。
結果展示於圖5A、5B、5C、5D及5E中。Hu5E9v1-ADC與BRAFi-945之所有組合證明功效高於任一藥物作為單獨單一藥劑時。在所測試之最低含量下組合之兩種藥物產生之組合功效與在所測試之最高劑量下所實現的組合功效幾乎不能區別。
實例5:在COLO 829異種移植物中對於抗ETBR ADC及BRAFi組合進行活體內劑量測試
以上實例中所描述之研究使得可對Hu5E9v1-ADC與BRAF抑制劑藥物RG7204之活體內組合功效之評估進一步細化。預期藥物之間缺乏拮抗作用,因此在較低劑量下測試藥物之組合功效。選擇COLO 829異種移植物模型作為ETBR表現之中等含量的代表,進一步增加組合研究之嚴格度。使腫瘤生長至約200 mm3之平均大小,於是將動物隨機分組,每組9隻。第0天開始,每天兩次經口投與適當的媒劑對照(Klucel LF)或劑量為10 mpk或30 mpk之G00044364.1-12(RG7204),持續21天。第1天,(在三次劑量之RG7204之後)經靜脈內投與1 mpk或3 mpk單次劑量之Hu5E9v1-ADC或對照(一種組胺酸緩衝液#8)。結果展示於圖7A、7B、7C及7D中。
中間範圍劑量之兩種藥物(30 mg/kg RG7204及3 mg/kg Hu5E9v1-ADC)良好組合在一起以產生高於任一單獨藥物
的組合功效。較低劑量之兩種藥物之其他組合的趨勢類似,唯一例外為組合測試之最低劑量。
實例6:在A2058異種移植物中對於抗ETBR ADC及BRAFi組合進行活體內劑量測試
測試Hu5E9v1-ADC及RG7204在A2058異種移植物模型中之功效。此模型因其呈現出之高嚴格度而頗受關注。A2058異種移植物模型表示黑色素瘤患者中所發現之ETBR表現範圍之下限,由此使之成為實現抗ETBR ADC功效之挑戰性模型。另外,儘管存在其BRAF V600E突變狀態,但已證明此模型不對RG7204作出反應,活體外殺死功效>20 μM(資料未圖示)。
使腫瘤生長至約200 mm3之平均大小,於是將動物隨機分組,每組10隻。第0天開始,每天兩次經口投與適當的媒劑對照(Klucel LF)或劑量為10 mpk或30 mpk之RG7204,持續21天。第1天,(在三次劑量之RG7204之後)經靜脈內向尾巴靜脈投與3 mpk或6 mpk單次劑量之Hu5E9v1-ADC或對照(一種組胺酸緩衝液#8)。結果展示於圖9A、9B、9C及9D中。
結果顯示,在所有所測試之情況下,Hu5E9v1-ADC與RG7204之組合證明功效高於單獨的任何單一藥劑。針對A2058模型,單獨10 mg/kg劑量之RG7204不展示單一藥劑功效(參見圖9A及圖9C)。然而,當與6 mg/kg劑量之Hu5E9v1-ADC組合時,所實現之功效比單獨任一藥劑時佳(參見圖9A及圖9C)。10 mg/kg RG7204與6 mg/kg
Hu5E9v1-ADC之組合(圖9A)證明組合功效與所測試之最高劑量下所實現之組合功效(亦即如圖9B中所示之30 mpk RG7204與6 mpk Hu5E9v1-ADC)幾乎不能區分。
表3概述在如上所述之改變劑量下所測試之三個黑色素瘤異種移植物模型,為證明組合作用,表示為抗ETBR ADC與BRAF抑制劑組合使用時與抗ETBR ADC作為單一藥劑之TGI%或BRAF抑制劑作為單一藥劑之TGI%相比的△%(最後一欄)。使用如上所述之線性混合效應(LME)建模方法計算TGI%。
實例7:MEK抑制劑藥物對於ETBR表現含量之作用
在以下為BRAF野生型或突變型及/或RAS野生型或突變型的多種黑色素瘤細胞中:COLO829(BRAFV600E)、A2058(BRAFV600E)、SK23-MEL(BRAFWT/RASWT)或IPC-298(BRAFWT/RASC61L),評估MEK抑制劑藥物對於ETBR轉錄物及蛋白質(總蛋白及細胞表面蛋白)之表現含量之作用。
用改變濃度(0 μM、0.01 μM、0.1 μM或1 μM)之MEK抑制劑藥物(「MEKi-973」或「MEKi-623」)藉由向在4孔培養皿上培養24小時的細胞中添加適當的藥物量來處理黑色素瘤細胞株A2058、COLO 829、SK23-MEL及IPC-298(ATCC)。
為確定MEKi對於ETBR轉錄物含量之作用,如以上在實例3中所述進行以下實驗。藉由刮擦自培養盤收集經MEKi-973處理24小時之細胞且使用Qiashredder及RNeasy迷你型套組(79654、74104,來自Qiagen,Valencia,CA)加
工以獲得總RNA。使用來自Applied Biosystems(ABI,Foster City,CA)之試劑建立Taqman分析,且使用來自ABI之7500實時PCR機器及軟體進行分析。設計引子-探針組,使引子側接經報導體染料FAM及淬滅體染料TAMRA雙重標記的螢光探針。
用於RPL19之引子-探針組如下:前置引子-5' AGC GGA TTC TCA TGG AAC A(SEQ ID NO:11);反置引子-5' CTG GTC AGC CAG GAG CTT(SEQ ID NO:12)及探針-5' TCC ACA AGC TGA AGG CAG ACA AGG(SEQ ID NO:13)。
用於ETBR之引子-探針組如下:前置引子-5'TCA CTG AAT TCC TGC ATT AAC C(SEQ ID NO:14),反置引子-5'GCA TAA GCA TGA CTT AAA GCA GTT(SEQ ID NO:15)及探針-5' AAT TGC TCT GTA TTT GGT GAG CAA AAG ATT CAA(SEQ ID NO:16)。
經指示劑量之MEKi-623處理之A2058的結果展示於圖14A中且經指示劑量之MEKi-973處理之A2058的結果展示於圖14B中。此等結果證明,與未添加MEK抑制劑之對照細胞相比,用MEK抑制劑處理24小時似乎使ETBR轉錄物增加。
為測試ETBR轉錄物因MEKi處理所致之增加是否亦導致ETBR總蛋白質含量之任何變化,如上所述對經MEKi-973處理之細胞株COLO829(BRAFV600E)、A2058(BRAFV600E)、SK23-MEL(BRAFWT/RASWT)或IPC-298(BRAFWT/RASC61L)
進行西方墨點實驗。對於西方墨點法,使用以下試劑:對於蛋白質之偵測:抗ETBR自身產生的單株抗體1H1.8.5.、抗磷酸化p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗體(9101,Cell Signaling Technology)、抗p44/42 MAPK(Erk1/2)抗體(9102,Cell Signaling Technology),且作為對照之兔子多株抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)抗體(PA1-987;Affinity Bioreagents)及小鼠單株抗β-微管蛋白抗體(556321,BD Pharmingen)。經MEKi-623處理之A2058之結果展示於圖15A中,且經MEKi-973處理之A2058之結果展示於圖15B中,經MEKi-623處理之COLO 829之結果展示於圖12A中,且經MEKi-973處理之COLO 829之結果展示於圖12B中,經MEKi-623處理之SK23-MEL之結果展示於圖19A中,且經MEKi-973處理之SK23-MEL之結果展示於圖19B中,且經MEKi-623處理之IPC-298之結果展示於圖22A中,且經MEKi-973處理之IPC-298之結果展示於圖22B中。此等結果證明,與未添加MEKi之對照細胞相比,用MEKi-623或MEKi-973處理24小時似乎使所有所測試之細胞株中之ETBR總蛋白質含量增加。
為確定由MEKi處理所致之所觀察到之總ETBR蛋白質含量的增加是否亦導致ETBR表面蛋白質含量增加,如上所述進行螢光激活細胞分類(FACS)分析。將細胞收集於含2.5 mmol/L EDTA的PBS中,且在含有1% FBS之PBS緩衝液中進行洗滌。所有後續步驟均在4℃下進行。將細胞依序與3 μg/mL抗ETBR抗體Hu5E9v1及抗人類IgG螢光偵測試
劑(A11013;Invitrogen)一起培育1小時。隨後用FACS Calibur流式細胞儀(BD Biosciences)分析細胞。A2058之結果展示於圖16A-F中,COLO829之結果展示於圖13A-F中,SK23-MEL之結果展示於圖20A-F中,且IPC-298之結果展示於圖23A-F中。此等結果證明,與未添加MEK抑制劑之對照細胞相比,用MEKi-623或MEKi-973處理24小時似乎使所有所測試之細胞株中所表現之表面ETBR蛋白質之含量增加。
實例8:MEK抑制劑藥物對於抗ETBR ADC活體內功效之作用
鑒於以上實例7中所證明的結果,測試本文所述之MEK抑制劑對於抗ETBR ADC活體內功效之影響。為進行此測試,針對A2058及SK-MEL-23及IPC-298黑色素瘤活體內模型評估Hu5E9v1-ADC與MEKi-623及/或MEKi-973之不同組合之活體內功效,如以上實例4中所描述進行。在研究第0天開始,一天一次×21天經口投與適當的甲基纖維素吐溫(tween)媒劑對照(0.5%甲基纖維素、0.2%吐溫-80(Tween-80)(MCT))或劑量為1 mpk、3 mpk或7.5 mpk之MEK抑制劑。研究第1天,經由尾巴靜脈,(在兩次劑量之MEK抑制劑之後)經靜脈內投與單次3 mpk或6 mpk劑量之Hu5E9v1-ADC或對照(一種組胺酸緩衝液#8)。
結果展示於圖17A-B、圖21、圖24及圖25中。令人驚訝的是,所測試之Hu5E9v1-ADC及MEK抑制劑之所有組合證明功效高於任一藥物作為單獨單一藥劑的相加功效。
實例9:A2058及COLO 829黑色素瘤異種移植物之PD研究
在呈現於圖7中之研究結束時收集之腫瘤(COLO 829相對於抗ETBR-ADC與BRAFi RG7204之組合)不展示ETBR之增加。此可歸因於腫瘤收集時間(第34天)完全超出所投與BRAFi藥物之清除期的事實。為了評估BRAFi/MEKi對於細胞株之活體外作用(亦即ETBR之增加及Perk之降低)是否亦發生在活體內,且因此抗ETBR ADC與BRAFi/MEKi組合時產生更大功效,進行以下實驗。
使A2058或COLO 829腫瘤生長至約200 mm3之平均大小,於是將動物隨機分組,每組5-6隻。對於BRAFi PD研究,每天兩次投與適當的媒劑對照(Klucel LF)或劑量為10 mpk或30 mpk之RG7204,持續3天(圖27A)。對於MEKi PD研究,一天一次經口投與適當的媒劑對照或劑量為5 mpk及10 mpk之MEKi-973,持續3天(圖27B)。將在研究結束時收集之急驟冷凍的腫瘤均質化並加工以獲得RNA及/或蛋白質。使用來自Applied Biosystems(ABI,Foster City,CA)之試劑建立Taqman分析,且使用來自ABI之7500實時PCR機器及軟體進行分析。設計引子-探針組,使引子側接經報導體染料FAM及淬滅體染料TAMRA雙重標記的螢光探針。相對於參考基因(諸如Hprt1(次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶1)或GAPDH(甘油醛3磷酸脫氫酶))之轉錄物含量,使用對此等基因之人類同源物具有特異性之引子及探針組,校正腫瘤中的ETBR轉錄物含量。
用於參考基因Hprt1(次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶1)之引子-
探針組如下:前置引子-5' CAC ATC AAA GAC AGC ATC TAA GAA(SEQ ID NO:17);反置引子-5' CAA GTT GGA AAA TAC AGT CAA CAT T(SEQ ID NO:18)及探針-5' TTT TGT TCT GTC CTG GAA TTA TTT TAG TAG TGT TTC A(SEQ ID NO:19)。
用於ETBR之引子-探針組如下:前置引子-5' TCA CTG AAT TCC TGC ATT AAC C(SEQ ID NO:14);反置引子-5'GCA TAA GCA TGA CTT AAA GCA GTT(SEQ ID NO:15)及探針-5' AAT TGC TCT GTA TTT GGT GAG CAA AAG ATT CAA(SEQ ID NO:16)。
用於參考基因GAPDH(甘油醛3磷酸脫氫酶)之引子-探針組如下:前置引子-5' GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC(SEQ ID NO:20),反置引子-5' GAA GGT GAA GGT CGG AGT C(SEQ ID NO:21),及探針-5' CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC(SEQ ID NO:22)。
圖27A展示與對照媒劑相比,BRAFi活體內誘導ETBR mRNA。圖27B展示與對照媒劑相比,MEKi-973亦活體內誘導ETBR mRNA。
藉由西方墨點法使用以下試劑評估腫瘤中之磷酸化erk及總erk蛋白質含量:對於蛋白質之偵測:抗磷酸化p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗體(9101,Cell Signaling Technology)、抗p44/42 MAPK(Erk1/2)抗體(9102,Cell
Signaling Technology)及作為對照之小鼠單株抗β-微管蛋白抗體(556321,BD Pharmingen)(圖26)。此處,與對照相比,BRAFi似乎活體內抑制Perk。
雖然上文已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例略為詳細地描述本發明,但不應將該等描述及實例解釋為限制本發明之範疇。本文引用之所有專利及科學文獻的揭示內容以引用的方式全部明確併入本文中。
圖1為MAP激酶路徑之示意圖。
圖2證明受體含量與活體外ADC細胞殺死之關係。受體複本/細胞之指標數由斯克伽分析估算。圖A展示由抗ETBR ADC滴定測定之黑色素瘤細胞株UACC-257X2.2之細胞殺死,且圖B為黑色素瘤細胞株A2058之細胞殺死。將
指示濃度之抗ETBR ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)、對照IgG-vc-MMAE或等效量之PBS媒劑對照與細胞一起培育5天,且使用CellTiter-Glo評估相對的細胞活力(y軸)。
圖3展示抗ETBR ADC在異種移植小鼠模型中之活體內功效。在用UACC-257X2.2(圖A)或A2058(圖B)細胞接種的小鼠中建立皮下腫瘤。當腫瘤體積達到約200 mm3(第0天)時,給予動物指示劑量的對照ADC(對照-vc-MMAE)或抗ETBR ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)之單一IV注射。由每組10隻動物確定平均腫瘤體積及標準偏差(如圖所示)。
圖4展示經改變之濃度之BRAFi-945處理24小時的UACC-257X2.2黑色素瘤細胞中的ETBR表現。圖A展示相對於RPL19轉錄物校正之ETBR轉錄物。圖B展示總ETBR及GAPDH(對照)蛋白質在50 μg全細胞溶解產物中的表現。圖C展示如流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在活的細胞中的表現,其中第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,中間峰指示未經BRAF抑制劑處理的細胞,且最後一個峰指示經BRAF抑制劑處理之細胞。
圖5展示改變劑量之抗ETBR ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)及BRAFi-945針對UACC-257X2.2黑色素瘤異種移植小鼠模型之活體內組合功效。在經UACC-257X2.2細胞株接種之小鼠中建立皮下腫瘤。當腫瘤體積達到約200 mm3(第0天)時,一天一次經口給予動物BRAFi-945或媒劑對照,持續21天。第1天(兩次劑量之BRAFi-945之後),給予動物指示劑量之媒劑或抗ETBR ADC的單一IV注射。由每組10隻動
物確定平均腫瘤體積及標準偏差。藥物及劑量資訊如下所示:圖A展示1 mpk BRAFi-945及1 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)組合;圖B展示1 mpk BRAFi-945及3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)組合;圖C展示6 mpk BRAFi-945及1 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)組合;圖D展示6 mpk BRAFi-945及3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)組合;及圖E展示20 mpk BRAFi-945及3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)組合。
圖6展示經改變之濃度之BRAF抑制劑RG7204處理24小時的COLO 829黑色素瘤細胞中的ETBR表現。圖A展示相對於RPL19轉錄物校正之ETBR轉錄物。圖B展示總ETBR及GAPDH(對照)蛋白質在50 μg全細胞溶解產物中的表現。圖C展示如流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在活的細胞中的表現,其中第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,第二峰指示未經BRAF抑制劑處理的細胞,且第三峰指示經BRAF抑制劑處理之細胞。
圖7證明抗ETBR ADC及BRAF抑制劑RG7204針對COLO 829黑色素瘤異種移植小鼠模型之活體內組合功效。在經COLO 829黑色素瘤細胞株接種之小鼠中建立皮下腫瘤。當腫瘤體積達到約200 mm3(第0天)時,每天兩次經口給予動物RG7204,持續21天。第1天(三次劑量之RG7204之後),給予動物指示劑量之媒劑或抗ETBR ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)的單一IV注射。由每組9隻動物確定平均腫瘤體積及標準偏差。藥物及劑量資訊如下所示:圖A展示3 mpk
抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與30 mpk RG7204之組合;圖B展示1 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與30 mpk RG7204之組合;圖C展示1 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與10 mpk RG7204之組合;及圖D展示3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與10 mpk RG7204之組合。
圖8展示經改變之濃度之BRAF抑制劑RG7204處理24小時的A2058黑色素瘤細胞中的ETBR表現。圖A展示相對於RPL19轉錄物校正之ETBR轉錄物;圖B展示總ETBR及GAPDH(對照)蛋白質在100 μg全細胞溶解產物中的表現;及圖C展示如流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在活的細胞中的表現。第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,第二峰指示未經BRAF抑制劑處理的細胞,且第三峰指示經BRAF抑制劑處理之細胞。
圖9證明抗ETBR ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)及BRAF抑制劑RG7204針對A2058黑色素瘤異種移植小鼠模型之活體內組合功效。在經A2058黑色素瘤細胞株接種之小鼠中建立皮下腫瘤。當腫瘤體積達到約200 mm3(第0天)時,每天兩次經口給予動物RG7204,持續21天。第1天(三次劑量之RG7204之後),給予動物指示劑量之媒劑或抗ETBR ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)的單一IV注射。由每組10隻動物確定平均腫瘤體積及標準偏差。藥物及劑量資訊如以下各圖所示:圖A展示6 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與10 mpk RG7204之組合;圖B展示6 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-
vc-MMAE)與30 mpk RG7204之組合;圖C展示3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與10 mpk RG7204之組合;及圖D展示3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與30 mpk RG7204之組合。
圖10展示用BRAFi RG7204進行之西方墨點實驗,展示總ETBR、Perk及erk蛋白質及對照蛋白質GAPDH及β-微管蛋白在來自IPC-298黑色素瘤細胞之25至100 μg全細胞溶解產物中的表現。
圖11展示在與0.1 μM、1 μM及10 μM BRAFi RG7204(分別為圖A、B及C)一起培育之後,由流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在IPC-298活的細胞中的表現。第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,第二峰指示經BRAF抑制劑處理的細胞,且第三峰指示未經BRAF抑制劑處理之細胞。
圖12展示用濃度為0 μM、0.01 μM、0.1 μM及1 μM之MEKi-623(圖A)及MEKi-973(圖B)進行之西方墨點實驗,展示總ETBR、Perk及erk蛋白質及對照蛋白質GAPDH及β-微管蛋白在來自COLO 829黑色素瘤細胞之50 μg全細胞溶解產物中的表現。
圖13展示在與0.01 μM(圖A及D)、0.1 μM(圖B及E)及1 μM(圖C及F)MEKi-623(分別為圖A、B及C)或MEKi-973(分別為圖D、E及F)一起培育後,由流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在COLO 829活的細胞中的表現。第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,第二峰指示未經MEK
抑制劑處理的細胞,且第三峰指示經MEK抑制劑處理之細胞。
圖14展示相對於RPL19轉錄物校正之ETBR mRNA在用改變濃度之MEKi-623(圖A)或MEKi-973(圖B)處理24小時之A2058黑色素瘤細胞中的表現。
圖15展示用濃度為0 μM、0.01 μM、0.1 μM及1 μM之MEKi-623(圖A)及MEKi-973(圖B)進行之西方墨點實驗,展示總ETBR、Perk及erk蛋白質及對照蛋白質GAPDH及β-微管蛋白在來自A2058黑色素瘤細胞之50-100 μg全細胞溶解產物中的表現。
圖16展示在與0.01 μM(圖A及D)、0.1 μM(圖B及E)及1 μM(圖C及F)MEKi-623(分別為圖A、B及C)或MEKi-973(分別為圖D、E及F)一起培育後,由流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在A2058活的細胞中的表現。第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,第二峰指示未經MEK抑制劑處理的細胞,且第三峰指示經MEK抑制劑處理之細胞。
圖17證明抗ETBR ADC(Hu5E17v1-vc-MMAE)及MEKi-973針對A2058黑色素瘤異種移植小鼠模型之活體內組合功效。在經A2058黑色素瘤細胞株接種之小鼠中建立皮下腫瘤。當腫瘤體積達到約200 mm3(第0天)時,一天一次經口給予動物MEKi-973,持續21天。第1天(兩次劑量之MEKi-973之後),給予動物指示劑量之媒劑或抗ETBR ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)的單一IV注射。由每組9隻動物確定平均腫瘤體積及標準偏差。藥物及劑量資訊如以下各圖中
所示:圖A展示7.5 mpk抗gD ADC(對照)與7.5 mpk MEKi-973之組合,與媒劑對照及單獨抗gD ADC相比;圖B展示6 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與7.5 mpk MEKi-973之組合,與媒劑對照及單獨7.5 mpk MEKi-973(GDC-0973)或單獨6 mpk抗ETBR-ADC相比。
圖18展示相對於RPL19轉錄物校正之ETBR轉錄物在用改變濃度之MEKi-623(圖A)或MEKi-973(圖B)處理24小時之SK23-MEL黑色素瘤細胞中的表現。
圖19展示用濃度為0 μM、0.01 μM、0.1 μM及1 μM之MEKi-623(圖A)及MEKi-973(圖B)進行之西方墨點實驗,展示總ETBR、Perk及erk蛋白質及對照蛋白質GAPDH及β-微管蛋白在來自SK23-MEL黑色素瘤細胞之50 μg全細胞溶解產物中的表現。
圖20展示在與0.01 μM(圖A及D)、0.1 μM(圖B及E)及1 μM(圖C及F)MEKi-623(分別為圖A、B及C)或MEKi-973(分別為圖D、E及F)一起培育後,由流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在活的SK23-MEL細胞中的表現。第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,第二峰指示未經MEK抑制劑處理的細胞,且第三峰指示經MEK抑制劑處理之細胞。
圖21證明抗ETBR ADC(Hu5E21v1-vc-MMAE)及MEKi-973針對SK23-MEL黑色素瘤異種移植小鼠模型之活體內組合功效。藥物及劑量資訊如以下各圖中所示:圖A展示6 mpk抗gD ADC(對照)與7.5 mpk MEKi-973之組合,與媒劑
對照、單獨7.5 mpk MEKi-973及6 mpk抗gD ADC相比較;圖B展示6 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與7.5 mpk MEKi-973之組合(「組合」),與媒劑對照及單獨7.5 mpk MEKi-973或單獨6 mpk抗ETBR-ADC相比較。圖C展示3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與3 mpk MEKi-973之組合(「組合」),與媒劑對照、3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)或3 mpk MEKi-973相比較。圖D展示3 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與7.5 mpk MEKi-973之組合(「組合」),與媒劑對照及單獨7.5 mpk MEKi-973或3 mpk抗ETBR-ADC相比較。圖E展示6 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與3 mpk MEKi-973之組合(「組合」),與媒劑對照及單獨3 mpk MEKi-973或單獨6 mpk抗ETBR-ADC相比較。
圖22展示用濃度為0 μM、0.01 μM、0.1 μM及1 μM之MEKi-623(圖A)及MEKi-973(圖B)進行之西方墨點實驗,展示總ETBR、Perk及erk蛋白質及對照蛋白質GAPDH及β-微管蛋白在來自IPC-298黑色素瘤細胞之25-100 μg全細胞溶解產物中的表現。
圖23展示在與0.01 μM(圖A及D)、0.1 μM(圖B及E)及1 μM(圖C及F)MEKi-623(分別為圖A、B及C)或MEKi-973(分別為圖D、E及F)一起培育後,由流式細胞術所見的表面ETBR蛋白質在活的IPC-298細胞中的表現。第一峰指示單獨經二次偵測試劑處理的細胞,第二峰指示未經MEK抑制劑處理的細胞,且第三峰指示經MEK抑制劑處理之細
胞。
圖24證明抗ETBR ADC(Hu5E24v1-vc-MMAE)及MEKi-623針對IPC-298黑色素瘤異種移植小鼠模型之活體內組合功效。藥物及劑量資訊如以下各圖中所示:圖A展示6 mpk抗gD ADC(對照)與1 mpk MEKi-623之組合,與媒劑對照、單獨1 mpk MEKi-623及6 mpk抗gD ADC相比較;圖B展示6 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與1 mpk MEKi-623之組合(「組合」),與媒劑對照及單獨1 mpk MEKi-623或單獨6 mpk抗ETBR-ADC相比較。
圖25說明抗ETBR ADC(Hu5E24v1-vc-MMAE)及MEKi-973針對IPC-298黑色素瘤異種移植小鼠模型之活體內組合功效。藥物及劑量資訊如以下各圖中所示:圖A展示6 mpk抗gD ADC(對照)與7.5 mpk MEKi-973之組合,與媒劑對照、單獨7.5 mpk MEKi-973及6 mpk抗gD ADC相比較;圖B展示6 mpk抗ETBR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)與7.5 mpk MEKi-973之組合(「組合」),與媒劑對照及單獨7.5 mpk MEKi-973或單獨6 mpk抗ETBR-ADC相比較。
圖26描繪磷酸化erk及總erk蛋白質在經媒劑或30 mpk BRAFi RG7204處理之COLO 829腫瘤中之表現。
圖27描繪ETBR轉錄物在經BRAFi RG7204處理之COLO 829腫瘤中(圖A)及在經MEKi-973處理3天之A2058腫瘤中(圖B)之表現。圖A展示COLO 829細胞株中、經媒劑對照或10 mpk或30 mpk RG7204處理之COLO 892腫瘤中相對於對照GAPDH校正之ETBR轉錄物。圖B展示經媒劑對照或5
mpk或10 mpk MEKi-973處理之A2058腫瘤中相對於對照Hprt1校正之ETBR轉錄物。
<110> 美商建南德克公司
<120> 治療黑色素瘤之治療組合及方法
<130> P4777R1
<140> 101139342
<141> 2012-10-24
<150> US 61/552,893
<151> 2011-10-28
<150> US 61/678,978
<151> 2012-08-02
<160> 22
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
<210> 2
<211> 17
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<213> 小家鼠
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
<210> 6
<211> 9
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<213> 小家鼠
<400> 6
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化可變重鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化可變輕鏈
<400> 8
<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化可變重鏈。
<400> 9
<210> 10
<211> 442
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<213> 智人
<400> 10
<210> 11
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Claims (77)
- 一種抗內皮素B受體(ETBR)抗體與MAP激酶抑制劑之組合之用途,其用於製造用以在罹患黑色素瘤的個體中之腫瘤生長抑制作用(TGI)之藥劑。
- 如請求項1之用途,其中該組合為協同性。
- 如請求項1之用途,其中該TGI高於抗ETBR抗體單獨使用時所見之TGI。
- 如請求項1之用途,其中該TGI高於MAP激酶抑制劑單獨使用時所見之TGI。
- 如請求項3之用途,其中該TGI比抗ETBR抗體單獨使用時高約10%、或約15%、或約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%。
- 如請求項4之用途,其中該TGI比MAP激酶抑制劑單獨使用時高約10%、或約15%、或約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%。
- 如請求項1之用途,其中該抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。
- 如請求項1之用途,其中該抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為 SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。
- 如請求項1之用途,其中該抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。
- 如請求項9之用途,其中該VL為SEQ ID NO:8。
- 如請求項1之用途,其中該抗ETBR抗體結合至細胞毒素。
- 如請求項11之用途,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑。
- 如請求項12之用途,其中該細胞毒素為毒素。
- 如請求項13之用途,其中該毒素選自由類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamicin)及奧瑞他汀(auristatin)組成之群。
- 如請求項14之用途,其中該毒素為類美登素。
- 如請求項1之用途,其中該MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。
- 如請求項16之用途,其中該BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。
- 如請求項16之用途,其中該BRAF抑制劑具有以下化學結構:
- 如請求項1之用途,其中該MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。
- 如請求項19之用途,其中該MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。
- 如請求項19之用途,其中該MEK抑制劑具有以下化學結構:
- 一種MAP激酶抑制劑及抗ETBR抗體之用途,其用於製造用以治療黑色素瘤之藥劑。
- 如請求項22之用途,其中該組合為協同性。
- 如請求項22之用途,其中該TGI高於抗ETBR抗體單獨使用時所見之TGI。
- 如請求項22之用途,其中該TGI高於MAP激酶抑制劑單獨使用時所見之TGI。
- 如請求項24之用途,其中該TGI比抗ETBR抗體單獨使用 時高約10%、或約15%、或約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%。
- 如請求項25之用途,其中該TGI比MAP激酶抑制劑單獨使用時高約10%、或約15%、或約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約50%、或約55%、或約60%、或約65%、或約70%。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體具有三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。
- 如請求項30之用途,其中該VL為SEQ ID NO:8。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體結合至細胞毒素。
- 如請求項32之用途,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑。
- 如請求項33之用途,其中該細胞毒素為毒素。
- 如請求項34之用途,其中該毒素選自由類美登素、卡奇 黴素及奧瑞他汀組成之群。
- 如請求項35之用途,其中該毒素為類美登素。
- 如請求項22之用途,其中該MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。
- 如請求項37之用途,其中該BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。
- 如請求項37之用途,其中該BRAF抑制劑具有以下化學結構:
- 如請求項22之用途,其中該MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。
- 如請求項40之用途,其中該MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。
- 如請求項40之用途,其中該MEK抑制劑具有以下化學結構:
- 如請求項22之用途,其中該黑色素瘤為ETBR陽性。
- 如請求項22之用途,其中該黑色素瘤為轉移性。
- 如請求項22之用途,其中該個體過去未曾接受MAP激酶抑制劑之療法。
- 如請求項22之用途,其中該個體具有V600E BRAF基因突變。
- 如請求項22之用途,其中該個體為V600E野生型。
- 如請求項22之用途,其中先對有此需要之個體投與該MAP激酶抑制劑。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體在投與該MAP激酶抑制劑之後投與。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體與該MAP激酶抑制劑同時投與。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體與該MAP激酶抑制劑依次投與。
- 如請求項51之用途,其中先對該個體投與該抗ETBR抗體。
- 如請求項52之用途,其中該MAP激酶抑制劑在投與該抗ETBR抗體之後投與該個體。
- 如請求項51之用途,其中先對該個體投與該MAP激酶抑 制劑。
- 如請求項54之用途,其中該抗ETBR抗體在投與該MAP激酶抑制劑之後投與該個體。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體經靜脈內投與。
- 如請求項22之用途,其中該抗ETBR抗體之劑量為約0.1 mpk、或約0.2 mpk、或約0.3 mpk、或約0.5 mpk、或約1 mpk、或約5 mpk、或約10 mpk、或約15 mpk、或約20 mpk、或約25 mpk、或約30 mpk。
- 如請求項22之用途,其中該MAP激酶抑制劑經口投與。
- 如請求項22之用途,其中該MAP激酶抑制劑之劑量為約1 mpk、或約2 mpk、或約3 mpk、或約4 mpk、或約5 mpk、或約6 mpk、或約7 mpk、或約8 mpk、或約9 mpk、或約10 mpk、或約11 mpk、或約12 mpk、或約15 mpk、或約20 mpk或約30 mpk。
- 一種用於罹患黑色素瘤之個體之TGI的製品,該製品包含含有抗ETBR抗體組合物及MAP激酶抑制劑組合物之包裝。
- 一種用於治療個體之黑色素瘤之製品,該製品包含含有抗ETBR抗體組合物及MAP激酶抑制劑組合物之包裝。
- 如請求項60或61之製品,其中該抗ETBR抗體特異性結合由SEQ ID NO:10之編號64至101之胺基酸組成的ETBR抗原決定基。
- 如請求項60或61之製品,其中該抗ETBR抗體具有三個 可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR,其中VH CDR1為SEQ ID NO:1,VH CDR2為SEQ ID NO:2,VH CDR3為SEQ ID NO:3,且其中VL CDR1為SEQ ID NO:4,VL CDR2為SEQ ID NO:5,VL CDR3為SEQ ID NO:6。
- 如請求項60或61之製品,其中該抗ETBR抗體具有可變重鏈及可變輕鏈,其中該VH為SEQ ID NO:7或9。
- 如請求項64之製品,其中該VL為SEQ ID NO:8。
- 如請求項60或61之製品,其中該抗ETBR抗體結合至細胞毒素。
- 如請求項66之製品,其中該細胞毒素為選自由毒素、抗生素、放射性同位素及溶核酶組成之群的細胞毒性劑。
- 如請求項67之製品,其中該細胞毒素為毒素。
- 如請求項68之製品,其中該毒素選自由類美登素、卡奇黴素及奧瑞他汀組成之群。
- 如請求項69之製品,其中該毒素為類美登素。
- 如請求項60或61之製品,其中該MAP激酶抑制劑為BRAF抑制劑。
- 如請求項71之製品,其中該BRAF抑制劑為丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-醯胺。
- 如請求項71之製品,其中該RRAF抑制劑具有以下化學結構:
- 如請求項60或61之製品,其中該MAP激酶抑制劑為MEK抑制劑。
- 如請求項74之製品,其中該MEK抑制劑為(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)胺基)苯基)(3-羥基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。
- 如請求項74之製品,其中該MEK抑制劑具有以下化學結構:
- 一種如請求項60或61之製品的用途,其用於製備用以黑色素瘤之TGI的藥劑。
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WO1981001145A1 (en) | 1979-10-18 | 1981-04-30 | Univ Illinois | Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs |
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US4313946A (en) | 1981-01-27 | 1982-02-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora |
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US4485045A (en) | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4544545A (en) | 1983-06-20 | 1985-10-01 | Trustees University Of Massachusetts | Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting |
US4970198A (en) | 1985-10-17 | 1990-11-13 | American Cyanamid Company | Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex) |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
US5079233A (en) | 1987-01-30 | 1992-01-07 | American Cyanamid Company | N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same |
WO1988007089A1 (en) | 1987-03-18 | 1988-09-22 | Medical Research Council | Altered antibodies |
US4975278A (en) | 1988-02-26 | 1990-12-04 | Bristol-Myers Company | Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells |
US5770701A (en) | 1987-10-30 | 1998-06-23 | American Cyanamid Company | Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents |
US5053394A (en) | 1988-09-21 | 1991-10-01 | American Cyanamid Company | Targeted forms of methyltrithio antitumor agents |
US5606040A (en) | 1987-10-30 | 1997-02-25 | American Cyanamid Company | Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group |
JP2919890B2 (ja) | 1988-11-11 | 1999-07-19 | メディカル リサーチ カウンスル | 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用 |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
CA2026147C (en) | 1989-10-25 | 2006-02-07 | Ravi J. Chari | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
CA2405246A1 (en) | 1990-12-03 | 1992-06-11 | Genentech, Inc. | Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties |
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CA2103059C (en) | 1991-06-14 | 2005-03-22 | Paul J. Carter | Method for making humanized antibodies |
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JP3050424B2 (ja) * | 1991-07-12 | 2000-06-12 | 塩野義製薬株式会社 | ヒトエンドセリンリセプター |
CA2116774C (en) | 1991-09-19 | 2003-11-11 | Paul J. Carter | Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies |
US5362852A (en) | 1991-09-27 | 1994-11-08 | Pfizer Inc. | Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
CA2129663C (en) | 1992-02-06 | 2005-07-05 | James S. Huston | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
ZA932522B (en) | 1992-04-10 | 1993-12-20 | Res Dev Foundation | Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens |
NZ258392A (en) | 1992-11-13 | 1997-09-22 | Idec Pharma Corp | Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona |
US5635483A (en) | 1992-12-03 | 1997-06-03 | Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University | Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides |
US5780588A (en) | 1993-01-26 | 1998-07-14 | Arizona Board Of Regents | Elucidation and synthesis of selected pentapeptides |
AU691811B2 (en) | 1993-06-16 | 1998-05-28 | Celltech Therapeutics Limited | Antibodies |
US5773001A (en) | 1994-06-03 | 1998-06-30 | American Cyanamid Company | Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis |
US5789199A (en) | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US6214388B1 (en) | 1994-11-09 | 2001-04-10 | The Regents Of The University Of California | Immunoliposomes that optimize internalization into target cells |
US5663149A (en) | 1994-12-13 | 1997-09-02 | Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University | Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides |
US5840523A (en) | 1995-03-01 | 1998-11-24 | Genetech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5712374A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-27 | American Cyanamid Company | Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
US5714586A (en) | 1995-06-07 | 1998-02-03 | American Cyanamid Company | Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
GB9603256D0 (en) | 1996-02-16 | 1996-04-17 | Wellcome Found | Antibodies |
US6171586B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
DE69830315T2 (de) | 1997-06-24 | 2006-02-02 | Genentech Inc., San Francisco | Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
WO1999022764A1 (en) | 1997-10-31 | 1999-05-14 | Genentech, Inc. | Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms |
US6610833B1 (en) | 1997-11-24 | 2003-08-26 | The Institute For Human Genetics And Biochemistry | Monoclonal human natural antibodies |
DK1034298T3 (da) | 1997-12-05 | 2012-01-30 | Scripps Research Inst | Humanisering af murint antistof |
JP2002510481A (ja) | 1998-04-02 | 2002-04-09 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 抗体変異体及びその断片 |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
ATE458007T1 (de) | 1998-04-20 | 2010-03-15 | Glycart Biotechnology Ag | Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
ES2694002T3 (es) | 1999-01-15 | 2018-12-17 | Genentech, Inc. | Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante |
CA2704600C (en) | 1999-04-09 | 2016-10-25 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | A method for producing antibodies with increased adcc activity |
US7566452B1 (en) * | 1999-05-04 | 2009-07-28 | New York University | Cancer treatment with endothelin receptor antagonists |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
DE60022369T2 (de) | 1999-10-04 | 2006-05-18 | Medicago Inc., Sainte Foy | Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff |
JP4668498B2 (ja) | 1999-10-19 | 2011-04-13 | 協和発酵キリン株式会社 | ポリペプチドの製造方法 |
US20030180714A1 (en) | 1999-12-15 | 2003-09-25 | Genentech, Inc. | Shotgun scanning |
ATE344801T1 (de) | 1999-12-29 | 2006-11-15 | Immunogen Inc | Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung |
US7097840B2 (en) | 2000-03-16 | 2006-08-29 | Genentech, Inc. | Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates |
AU2001247616B2 (en) | 2000-04-11 | 2007-06-14 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
HU231090B1 (hu) | 2000-10-06 | 2020-07-28 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Antitest-kompozíciót termelő sejt |
US7064191B2 (en) | 2000-10-06 | 2006-06-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for purifying antibody |
US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US7041870B2 (en) | 2000-11-30 | 2006-05-09 | Medarex, Inc. | Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies |
US6884869B2 (en) | 2001-04-30 | 2005-04-26 | Seattle Genetics, Inc. | Pentapeptide compounds and uses related thereto |
US6441163B1 (en) | 2001-05-31 | 2002-08-27 | Immunogen, Inc. | Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents |
CA2838062C (en) | 2001-08-03 | 2015-12-22 | Roche Glycart Ag | Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity |
HUP0600342A3 (en) | 2001-10-25 | 2011-03-28 | Genentech Inc | Glycoprotein compositions |
US20040093621A1 (en) | 2001-12-25 | 2004-05-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Antibody composition which specifically binds to CD20 |
JPWO2003084569A1 (ja) | 2002-04-09 | 2005-08-11 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗体組成物含有医薬 |
AU2003236020B2 (en) | 2002-04-09 | 2009-03-19 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport |
US20040259150A1 (en) | 2002-04-09 | 2004-12-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa |
JPWO2003085118A1 (ja) | 2002-04-09 | 2005-08-11 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗体組成物の製造方法 |
WO2003084570A1 (fr) | 2002-04-09 | 2003-10-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia |
BR0309145A (pt) | 2002-04-09 | 2005-02-01 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Células das quais o genoma é modificado |
EP1513879B1 (en) | 2002-06-03 | 2018-08-22 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
AU2003259163B2 (en) | 2002-08-16 | 2008-07-03 | Immunogen, Inc. | Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs |
EP1391213A1 (en) | 2002-08-21 | 2004-02-25 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents |
US7361740B2 (en) | 2002-10-15 | 2008-04-22 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
TWI335821B (en) | 2002-12-16 | 2011-01-11 | Genentech Inc | Immunoglobulin variants and uses thereof |
US20050079574A1 (en) | 2003-01-16 | 2005-04-14 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
US7871607B2 (en) | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
US20060104968A1 (en) | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
US7755007B2 (en) | 2003-04-17 | 2010-07-13 | K&H Manufacturing, Inc | Heated pet mat |
US8088387B2 (en) | 2003-10-10 | 2012-01-03 | Immunogen Inc. | Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates |
US7276497B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-10-02 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising new maytansinoids |
US20080241884A1 (en) | 2003-10-08 | 2008-10-02 | Kenya Shitara | Fused Protein Composition |
EP1705251A4 (en) | 2003-10-09 | 2009-10-28 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE |
WO2005044859A2 (en) | 2003-11-05 | 2005-05-19 | Glycart Biotechnology Ag | Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function |
SI1725249T1 (sl) | 2003-11-06 | 2014-04-30 | Seattle Genetics, Inc. | Spojine monometilvalina, sposobne konjugacije na ligande |
JPWO2005053742A1 (ja) | 2003-12-04 | 2007-06-28 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗体組成物を含有する医薬 |
US7004206B2 (en) | 2004-01-29 | 2006-02-28 | Viken James P | Automatic fluid exchanger |
WO2005082023A2 (en) | 2004-02-23 | 2005-09-09 | Genentech, Inc. | Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates |
AU2005230848B9 (en) | 2004-03-31 | 2011-06-02 | Genentech, Inc. | Humanized anti-TGF-beta antibodies |
US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
ES2403055T3 (es) | 2004-04-13 | 2013-05-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Anticuerpos anti-P-selectina |
EP2286844A3 (en) | 2004-06-01 | 2012-08-22 | Genentech, Inc. | Antibody-drug conjugates and methods |
TWI380996B (zh) | 2004-09-17 | 2013-01-01 | Hoffmann La Roche | 抗ox40l抗體 |
WO2006034488A2 (en) | 2004-09-23 | 2006-03-30 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
JO3000B1 (ar) | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
US20070020657A1 (en) * | 2005-05-20 | 2007-01-25 | Grebe Stefan K | Methods for detecting circulating tumor cells |
EP3498289A1 (en) | 2005-07-07 | 2019-06-19 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus |
WO2007008848A2 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus |
JP5129143B2 (ja) * | 2005-10-07 | 2013-01-23 | エグゼリクシス, インコーポレイテッド | Mekインヒビターおよびその使用方法 |
EP2465870A1 (en) | 2005-11-07 | 2012-06-20 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences |
US20070237764A1 (en) | 2005-12-02 | 2007-10-11 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
CA2651567A1 (en) | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with optimized scaffolds |
US10118970B2 (en) | 2006-08-30 | 2018-11-06 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies |
US20080226635A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-09-18 | Hans Koll | Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof |
CN100592373C (zh) | 2007-05-25 | 2010-02-24 | 群康科技(深圳)有限公司 | 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法 |
DK2235064T3 (en) | 2008-01-07 | 2016-01-11 | Amgen Inc | A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects |
MX2011000440A (es) * | 2008-07-11 | 2011-02-24 | Novartis Ag | Combinacion de (a) un inhibidor de fosfoinositido 3-cinasa y (b) un modulador de la ruta de ras/raf/mek. |
JP2013507415A (ja) * | 2009-10-12 | 2013-03-04 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | Pi3k阻害剤とmek阻害剤の併用 |
MA34057B1 (fr) * | 2010-02-23 | 2013-03-05 | Genentech Inc | Compositions et methodes pour le diagnostic et le traitement d'une tumeur |
-
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