TW201343674A - 抗ｌｇｒ５抗體及免疫結合物 - Google Patents

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Weiguang Mao
Paul Polakis
Andrew Polson
Rajesh Vij
Yan Wu
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Abstract

本發明提供抗LgR5抗體及免疫結合物以及其使用方法。

Description

抗LGR5抗體及免疫結合物
本發明係關於抗LgR5抗體及免疫結合物以及使用其之方法。
含有富含白胺酸之重複序列之G蛋白偶聯受體5(LgR5)為一種存在於活躍循環之腸幹細胞(ISC)表面上之七次跨膜蛋白。表現LgR5之ISC對Wnt調節敏感且主要負責腸上皮之體內恆定再生。然而，消除小鼠之表現LgR5之細胞並不影響腸上皮之體內恆定，表明其他細胞類型可抵償此細胞群體之喪失。Tian等人，Nature 478：255-259(2011)。R-脊椎蛋白(R-spondin)增強藉由WNT3A達成之WNT信號傳導，且所有四種R-脊椎蛋白RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4皆能夠結合於LgR5。Lau等人，Nature 476：293-297(2011)。
人類LgR5為一種含907個胺基酸之蛋白質，其中預測在胺基端信號序列裂解後，有約540個胺基酸在細胞外間隙中。LgR5包含處於胞外域中之17個富含白胺酸之不完全重複基元及位於富含白胺酸之重複序列與第一跨膜域之間的富含半胱胺酸之區域。
此項技術中對靶向LgR5以診斷及治療LgR5相關病狀(諸如癌症)之藥劑存在需要。本發明滿足彼需要且提供其他益處。
本發明提供抗LgR5抗體及免疫結合物以及使用其之方法。
在一些實施例中，提供結合LgR5之分離之抗體。在一些實施例 中，該抗體具有呈任何組合形式之至少一或多個以下特徵：(a)結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-555內之抗原決定基及/或結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-123內之抗原決定基及/或結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-323內之抗原決定基及/或結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-424內之抗原決定基及/或結合於SEQ ID NO：67之胺基酸324-555內之抗原決定基及/或結合於SEQ ID NO：67之胺基酸324-424內之抗原決定基；(b)結合LgR5之親和力5nM或4nM或3nM或2nM或1nM，且視情況0.0001nM或0.001nM或0.01nM；(c)不顯著破壞R-脊椎蛋白(RSPO)與LgR5之結合；(d)不顯著破壞β-連環蛋白(beta-catenin)信號傳導；(e)不顯著破壞RSPO對LgR5信號傳導之活化；(f)活化半胱天冬酶(caspase)3裂解；(g)識別人類LgR5與齧齒動物LgR5兩者；(h)識別人類LgR5而不識別齧齒動物LgR5；(i)在其未結合形式下不顯著抑制腫瘤生長；及(j)不誘導幹細胞分化。
在一些實施例中，分離之抗LgR5抗體結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-323內之抗原決定基的親和力5nM或4nM或3nM或2nM或1nM且視情況0.0001nM或0.001nM或0.01nM。
在一些實施例中，分離之抗LgR5抗體結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-123內之抗原決定基的親和力5nM或4nM或3nM或2nM或1nM且視情況0.0001nM或0.001nM或0.01nM。
在一些實施例中，分離之抗LgR5抗體結合於SEQ ID NO：67之胺基酸324-424內之抗原決定基的親和力5nM或4nM或3nM或2nM或1nM且視情況0.0001nM或0.001nM或0.01nM。
在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體不顯著破壞R-脊椎蛋白(RSPO)與LgR5之結合。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體不顯著破壞wnt/β-連環蛋白信號傳導。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體不顯著破壞 RSPO對LgR5信號傳導之活化。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體活化半胱天冬酶3裂解。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體識別人類LgR5與齧齒動物LgR5兩者。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體識別人類LgR5而不識別齧齒動物LgR5。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體在其未結合形式下不顯著抑制腫瘤生長。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體不誘導幹細胞分化。
在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體為單株抗體。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體為IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，抗LgR5抗體為結合LgR5之抗體片段。在任何分離之抗LgR5抗體之一些實施例中，LgR5為具有SEQ ID NO：67之人類LgR5。
在一些實施例中，結合LgR5之抗體結合SEQ ID NO：67之胺基酸22-323內之抗原決定基。在一些實施例中，該抗體結合於LgR5之親和力5nM。在一些實施例中，該抗體為單株抗體。在一些實施例中，該抗體為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。在一些實施例中，該抗體為IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。在一些實施例中，該抗體為結合LgR5之抗體片段。在一些實施例中，LgR5為具有SEQ ID NO：67之人類LgR5。
在一些實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：31之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3。在一些實施例中，該抗體進一步包含重鏈構架FR3序列SEQ ID NO：41。在一些實施例中，該抗體進一步包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。在一些實施例中，分離之抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體進一步包含輕鏈構架FR3序列SEQ ID NO：35。
在一些實施例中，分離之抗體包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95%序列一致性之VH序列；或(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一些實施例中，該抗體包含VH序列SEQ ID NO：8。在一些實施例中，該抗體包含VL序列SEQ ID NO：7。在一些實施例中，分離之抗體包含VH序列SEQ ID NO：8及VL序列SEQ ID NO：7。
在一些實施例中，結合LgR5之抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3。在一些實施例中，該抗體進一步包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。在一些實施例中，分離之抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。
在一些實施例中，分離之抗體包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：24具有至少95%序列一致性之VH序列；或(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：23具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一些實施例中，該抗體包含VH序列SEQ ID NO：24。在一些實施例中，該抗體包含VL序列SEQ ID NO：23。在一些實施例中，分離之抗體包含VH序列SEQ ID NO：24及VL序列SEQ ID NO：23。
在一些實施例中，結合LgR5之抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：495之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3。在一些實施例中，該抗體進一步包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。在一些實施例中，分離之抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。
在一些實施例中，分離之抗體包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：22具有至少95%序列一致性之VH序列；或(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：21具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一些實施例中，該抗體包含VH序列SEQ ID NO：22。在一些實施例中，該抗體包含VL序列SEQ ID NO：21。在一些實施例中，分離之抗體包含VH序列SEQ ID NO：22及VL序列SEQ ID NO：21。
在一些實施例中，結合LgR5之抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2。在一些實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3。在一些實施例中，該抗體進一步包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。在一些實施例中，分離之抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。
在一些實施例中，分離之抗體包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少95%序列一致性之VH序列；或(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：25具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一些實施例中，該抗體包含VH序列SEQ ID NO：26。在一些實施例中，該抗體包含VL序列SEQ ID NO：25。在一些實施例中，分離之抗體包含VH序列SEQ ID NO：26及VL序列SEQ ID NO：25。
在一些實施例中，提供一種編碼本文所述之抗體之分離之核酸。在一些實施例中，提供一種包含該核酸之宿主細胞。在一些實施例中，提供一種產生本文所述之抗體之方法。在一些實施例中，該方法包括培養包含編碼抗體之核酸之宿主細胞。
在一些實施例中，提供免疫結合物。在一些實施例中，免疫結合物包含抗LgR5抗體及細胞毒性劑。在一些實施例中，免疫結合物具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab為本文所述之抗體；(b)L為連接子；(c)D為選自美登木素(maytansinoid)、奧里斯他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯及奈莫柔比星(nemorubicin)衍 生物之藥物；且(d)p在1-8之範圍內。在一些實施例中，D為奧里斯他汀。在一些此等實施例中，D具有式DE
其中R2及R6各自為甲基，R3及R4各自為異丙基，R5為H，R7為第二丁基，各R8係獨立地選自CH3、O-CH3、OH及H；R9為H；且R18為-C(R8)2-C(R8)2-芳基。在一些實施例中，D為具有以下結構之MMAE：
在一些實施例中，D為式A之吡咯并苯并二氮呯： 其中點線指示在C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2係獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD係獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q係獨立地選自O、S及NH；R11為H或R或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'係各自獨立地選自視情況經取代之C1-8烴基、C1-12烴基、C3-8雜環基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且視情況對於基團NRR'，R及R'連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；R12、R16、R19及 R17分別係如對於R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可間雜有一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳環；且X及X'係獨立地選自O、S及N(H)。在一些此等實施例中，D為 其中n為0或1。
在一些實施例中，D為奈莫柔比星衍生物。在一些實施例中，D具有選自以下之結構：
在一些實施例中，免疫結合物包含可由蛋白酶裂解之連接子。在一些實施例中，連接子包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。在一些實施例中，免疫結合物包含酸不穩定性連接子。在一些此等實施例中，連 接子包含腙。
在一些實施例中，免疫結合物具有選自以下之式： 其中S為硫原子；
在一些實施例中，p在2-5之範圍內。
在一些實施例中，免疫結合物包含抗體，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。 在一些實施例中，免疫結合物包含含有VH序列SEQ ID NO：8及VL序列SEQ ID NO：7之抗體。
在一些實施例中，提供醫藥調配物。在一些此等實施例中，醫藥調配物包含含有例如如本文所述之結合LgR5之抗體的免疫結合物。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含其他治療劑。在一些實施例中，其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗(bevacizumab))。
在一些實施例中，提供治療患有LgR5陽性癌症之個體之方法。 在一些此等實施例中，方法包括投與包含免疫結合物之醫藥調配物，該免疫結合物包含例如如本文所述之結合LgR5之抗體。在一些實施例中，LgR5陽性癌症係選自結腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌及子宮內膜癌。在一些實施例中，LgR5陽性癌症為小腸癌。在一些實施例中，小腸癌為十二指腸、空腸及/或回腸之癌症。在一些實施例中， 小腸癌為空腸及/或回腸之癌症。在一些實施例中，LgR5陽性癌症包含Kras突變、APC突變或Kras突變與APC突變兩者(例如在至少一部分癌細胞中)。在一些實施例中，方法包括向個體投與其他治療劑。在一些此等實施例中，其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗)。
在一些實施例中，提供抑制LgR5陽性細胞增殖之方法。在一些實施例中，該方法包括使細胞在容許免疫結合物結合於細胞表面上之LgR5的條件下暴露於包含結合LgR5之抗體之免疫結合物。在一些實施例中，結合LgR5之抗體為本文所述之抗體。在一些實施例中，藉此抑制細胞增殖。在一些實施例中，該細胞為結腸直腸癌細胞、小腸癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞或子宮內膜癌細胞。
在一些實施例中，使結合LgR5之抗體結合於標記。在一些實施例中，結合LgR5之抗體為本文所述之抗體。在一些實施例中，標記為正電子發射體。在一些實施例中，正電子發射體為89Zr。
在一些實施例中，提供一種偵測生物樣品中之人類LgR5之方法。在一些實施例中，方法包括使生物樣品與抗LgR5抗體在容許該抗LgR5抗體結合於天然存在之人類LgR5之條件下接觸，及偵測在該抗LgR5抗體與該生物樣品中之天然存在之人類LgR5之間是否形成複合物。在一些實施例中，抗LgR5抗體為本文所述之抗體。在一些實施例中，生物樣品為結腸直腸癌樣品、小腸癌樣品、胰腺癌樣品、卵巢癌樣品或子宮內膜癌樣品。
在一些實施例中，提供一種偵測LgR5陽性癌症之方法。在一些此等實施例中，方法包括(i)向患有或懷疑患有LgR5陽性癌症之受試者投與經標記抗LgR5抗體，及(ii)偵測該受試者體內之該經標記抗LgR5抗體，其中偵測到該經標記抗LgR5抗體指示在該受試者體內存在LgR5陽性癌症。在一些實施例中，抗LgR5抗體為本文所述之抗體。
圖1圖示如實例A中所述之各種組織中人類LgR5基因表現量的圖示。圖1中之插圖圖示如實例A中所述之正常結腸組織及結腸腫瘤中人類LgR5基因表現量的圖示。
圖2圖示如實例B中所述之藉由原位雜交測定之LgR5在結腸腫瘤中的表現。
圖3圖示(A)結腸腫瘤組織微陣列中各種LgR5表現量之出現率，及(B)來自各結腸直腸腺癌樣品之三個核心中LgR5表現的異質性，兩者均藉由原位雜交測定，如實例B中所述。
圖4圖示如實例C至F中所述產生之某些抗LgR5單株抗體之性質。
圖5圖示鼠類抗體mu8E11及其人類化變異體(hu8E11.v1至hu8E11.v8)之輕鏈可變區序列的比對。三個高變區(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中藉由方框加以指示。
圖6圖示鼠類抗體mu8E11及其人類化變異體(hu8E11.v1至hu8E11.v8)之重鏈可變區序列的比對。三個高變區(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中藉由方框加以指示。
圖7圖示鼠類抗體3G12及2H6之輕鏈可變區序列。三個高變區(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中藉由方框加以指示。
圖8圖示鼠類抗體3G12及2H6之重鏈可變區序列。三個高變區(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中藉由方框加以指示。
圖9圖示如實例E中所述之嵌合抗體ch8E11及各種人類化變異體之親和力量測結果。
圖10圖示人類抗體YW353之輕鏈可變區序列。三個高變區(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中藉由方框加以指示。
圖11圖示人類抗體YW353之重鏈可變區序列。三個高變區(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中藉由方框加以指示。
圖12A-C圖示人類、石蟹獼猴、大鼠及小鼠LgR5的比對。
圖13圖示如實例L中所述，抗LgR5免疫結合物在LoVo結腸癌異種移植物中展現功效。
圖14圖示如實例M中所述，抗LgR5免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖15圖示如實例M中所述，3mg/kg、6mg/kg及12mg/kg之huYW353-vcMMAE免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖16圖示如實例N中所述之來自AV及AKV小鼠之結腸之正常組織及息肉中的LgR5 mRNA表現。
圖17圖示如實例N中所述投與抗LgR5抗體及抗LgR5抗體-藥物結合物之AKV小鼠之存活期，該等小鼠之存活時間長於對照AKV小鼠。
圖18圖示如實例N中所述投與對照ADC、抗LgR5 ADC或抗LgR5抗體之AKV小鼠中針對裂解之半胱天冬酶3呈陽性的腫瘤面積百分比。
圖19圖示如實例N中所述，投與抗LgR5抗體-藥物結合物之AKV小鼠的存活時間長於未處理AKV小鼠及投與gp120-ADC或抗LgR5之AKV小鼠。
圖20圖示如實例N中所述在AKV LgR5 DTR/+小鼠中之小腸息肉及結腸息肉中之LgR5+面積。
圖21圖示(A)經對照ADC及經抗LgR5-ADC處理之AKV LgR5 DTR/+小鼠中每單位細胞面積之CC3+GFP+面積，及(B)經對照ADC及經抗LgR5-ADC處理之AKV LgR5 DTR/+小鼠中之示範性免疫組織化學染色，如實例N中所述。
圖22圖示如實例N中所述，在經對照ADC及經抗LgR5-ADC處理 之AKV LgR5 DTR/+小鼠中每單位細胞面積(GFP+細胞或GFP-細胞)之Ki67+面積。
圖23圖示如實例N中所述，在AKV LgR5 DTR/+小鼠之隱窩及腫瘤中GFP強度與GFP+面積之比率。
圖24圖示如實例O中所述，huYW353-vcMMAE、hu8E11v2-vcMMAE及ch8E11-vcMMAE免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖25圖示如實例O中所述，hu8E11v2-vcMMAE免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖26圖示如實例P中所述，huYW353-vcMMAE及hu8E11v2-vcMMAE免疫結合物在LoVoX1.1結腸癌異種移植物中展現功效。
圖27圖示如實例P中所述，hu8E11v2-vcMMAE免疫結合物在LoVoX1.1結腸癌異種移植物中展現功效。
圖28圖示如實例Q中所述，huYW353-vcMMAE、huYW353-縮醛-PNU及huYW353-vcPNU免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖29圖示如實例R中所述，hu8E11v2-縮醛-PNU、hu8E11v2-vcPNU及hu8E11v2-PNU免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖30圖示如實例S中所述，投與某些hu8E11v2免疫結合物及對照抗體免疫結合物在LoVoX1.1結腸癌異種移植物中之結果。
圖31圖示如實例S中所述，在共投與過量對照抗體之小鼠中，hu8E11v2-縮醛-PNU免疫結合物在LoVoX1.1結腸癌異種移植物中展現功效。
圖32圖示如實例T中所述，抗LgR5 huYW353 PBD免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖33圖示如實例T中所述，抗LgR5 hu8E11v2 PBD免疫結合物在D5124胰腺癌異種移植物中展現功效。
圖34圖示如實例U中所述，抗LgR5 hu8E11v2 PBD免疫結合物在LoVoX1.1結腸癌異種移植物中展現功效。
圖35圖示以下各物之結構：(A)抗體-vcMMAE免疫結合物，(B)抗體-縮醛-PNU免疫結合物，(C)抗體-縮醛-PNU免疫結合物，(D)抗體-PNU免疫結合物，及(E)抗體-vcPBD免疫結合物。
I.定義
出於本文之目的，「接受體人類構架」為以下構架，其包含源於如以下定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架的胺基酸序列。「源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含與人類免疫球蛋白構架或人類共同構架相同之胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化數目為10處或10處以下、9處或9處以下、8處或8處以下、7處或7處以下、6處或6處以下、5處或5處以下、4處或4處以下、3處或3處以下，或2處或2處以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用的強度總和。除非另外指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述者)加以量測。在下文中描述量測結合親和力之特定說明性及示範性實施例。
「親和力成熟」抗體係指在一或多個高變區(HVR)中具有一或多處改變之抗體，與不具有該等改變之親本抗體相比，該等改變改良該抗體對抗原之親和力。
術語「抗LgR5抗體」及「結合LgR5之抗體」係指能夠以足夠親和力結合LgR5之抗體，從而該抗體適用作靶向LgR5之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，抗LgR5抗體與無關非LgR5蛋白之結合程度小於抗體與LgR5之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合LgR5之抗體之解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、5Nm、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗LgR5抗體結合在來自不同物種之LgR5間保守的LgR5抗原決定基。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體之一部分且結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
與參照抗體「結合相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中將參照抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上之抗體，且反之，參照抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上。本文提供示範性競爭分析。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物之特徵通常在於細胞生長/增殖失調之生理學病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、 肉瘤及白血病。此等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病及其他淋巴球增生性病症及各種類型之頭頸部癌。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指抗體重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干類別可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或導致細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；抗生素；細菌、真菌、植物或動物來源之毒素，諸如小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及以下揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨 抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；及B細胞活化。
例如醫藥調配物之藥劑之「有效量」係指在一定劑量下且持續一段必需時間有效達成所需治療性或防治性結果之量。
術語「抗原決定基」係指抗原分子上由抗體結合之特定位點。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之含有至少一部分恆定區之C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外規定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變域殘基。 可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用且係指具有實質上與原生抗體結構類似之結構或具有含有如本文定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「LgR5之糖基化形式」係指藉由添加碳水化合物殘基而得到轉譯後修飾的LgR5之天然存在之形式。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入有外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿 主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及源於其之子代而不考慮繼代數目。子代在核酸內含物方面可能與母細胞不完全相同，而可能含有突變。本文包括具有與在原始轉型細胞中所篩檢或選擇相同之功能或生物活性之突變型子代。
「人類抗體」為具有對應於由人類或人類細胞所產生或源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體胺基酸序列之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為代表在人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群κI。在一個實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含源於人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。例如非人類抗體之抗體之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。
如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變及/或形成結構確定之環(「高變環」)之各區域。一般而言，原生四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環之胺基酸殘基及/或來自 「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，互補決定區具有最高序列可變性及/或涉及於抗原識別。示範性高變環存在於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處。(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。)示範性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)存在於L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除VH中之CDR1之外，CDR通常包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含作為接觸抗原之殘基的「特異性決定殘基」或「SDR」。SDR係含在CDR之稱為縮略CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區域內。示範性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)存在於L1之胺基酸殘基31-34、L2之胺基酸殘基50-55、L3之胺基酸殘基89-96、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-58及H3之胺基酸殘基95-102處。(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)。)除非另外指示，否則HVR殘基及可變域中之其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)加以編號。
「免疫結合物」為結合於一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體或受試者為人類。
「分離之抗體」為已與其自然環境之組分分離之抗體。在一些 實施例中，將抗體純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。對於評定抗體純度之方法之評述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「分離之核酸」係指已與其自然環境之組分分離之核酸分子。 分離之核酸包括通常含有核酸分子之細胞中含有之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
「編碼抗LgR5抗體之分離之核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括在單個載體或各別載體中之此(此等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之此(此等)核酸分子。
如本文所用之術語「LgR5」係指由加工細胞中之LgR5前驅蛋白所產生之任何原生成熟LgR5。除非另外指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源之LgR5，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及石蟹獼猴(cynomolgus monkey))；及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語亦包括LgR5之天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。具有信號序列(胺基酸1-21)之示範性人類LgR5前驅蛋白之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：67中。示範性成熟人類LgR5之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：68中。示範性石蟹獼猴LgR5之胺基酸33至907之預測序列顯示於SEQ ID NO：69中。示範性大鼠LgR5前驅體(具有信號序列胺基酸1-21)之胺基酸序列及成熟序列分別顯示於SEQ ID NO：70及71中。示範性小鼠LgR5前驅體(具有信號序列胺基酸1-21)之胺基酸序列及成熟序列分別顯示於SEQ ID NO：72及73中。
術語「LgR5陽性癌症」係指包含在表面上表現LgR5之細胞之癌 症。出於確定細胞是否在表面上表現LgR5之目的，將LgR5 mRNA表現視為與LgR5在細胞表面上表現相關聯。在一些實施例中，LgR5 mRNA之表現係藉由選自原位雜交及RT-PCR(包括定量RT-PCR)之方法加以測定。或者，LgR5在細胞表面上之表現可例如在諸如免疫組織化學、FACS等之方法中使用針對LgR5之抗體來測定。
術語「LgR5陽性細胞」係指在表面上表現LgR5之細胞。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體群體獲得之抗體，亦即除可能之變異抗體(例如含有天然存在之突變或在製備單株抗體製備物期間產生，此等變異體通常少量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製備物不同，單株抗體製備物之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體係獲自實質上均質之抗體群體的特徵，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，此等方法及製備單株抗體之其他示範性方法在本文中加以描述。
「裸抗體」係指未結合於異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「原生抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚醣蛋白，由經二硫鍵鍵結之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，隨後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，隨後為恆定輕(CL) 域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列指定為稱為κ及λ之兩種類型中之一者。
術語「藥品說明書」用於指慣常包括在治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此等治療性產品相關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。
相對於參照多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參照多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參照多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術中之技能範圍內之多種方式，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體來比對以便測定胺基酸序列一致性百分比。 熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較之序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech公司創造，且原始程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可公開自Genentech公司(South San Francisco,California)獲得，或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A對於、與或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(或者可稱為既定胺基酸序列A對於、與或相對於既定胺基酸序列B具有或包含某一百分比之胺基酸序列一致性)係如下加以計算： 100乘分數X/Y
其中X為藉由序列比對程式ALIGN-2在彼程式對A與B進行比對時評為一致匹配之胺基酸殘基數，且其中Y為B中之胺基酸殘基總數。應瞭解當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對於B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B對於A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外明確陳述，否則本文使用之所有胺基酸序列一致性百分比值皆係使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述來獲得。
術語「醫藥調配物」係指以下製劑，其呈允許當中所含之活性成分之生物活性有效之形式，且不含對調配物所將投與之受試者有不可接受毒性之其他組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對受試者無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用之「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程，且可為達成防治目的或在臨床病理過程中進行之臨床介入。合乎需要之治療作用包括(但不限於)防止疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理學結果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病病況及緩和或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗體與抗原結合之結構域。原生抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可分別使用來自結合特定抗原之抗體之VH 或VL域篩檢互補VL或VH域之文庫來分離結合該特定抗原之抗體。參見例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用之術語「載體」係指能夠使其所連接之另一核酸增殖之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構形式之載體以及併入當中已引入有其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠導引與其可操作地連接之核酸表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
「烴基」為含有正鏈碳原子、二級碳原子、三級碳原子或環碳原子之C1-C18烴。實例為甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、異丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、異丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、第二丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、第三丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)。
如本文所用之術語「C1-C8烴基」係指具有1至8個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。代表性「C1-C8烴基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛 基、-正壬基及-正癸基；而分支鏈C1-C8烴基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基、2-甲基丁基，不飽和C1-C8烴基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基。C1-C8烴基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
如本文所用之術語「C1-C12烴基」係指具有1至12個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。C1-C12烴基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
如本文所用之術語「C1-C6烴基」係指具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。代表性「C1-C6烴基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基及-正己基；而分支鏈C1-C6烴基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基及2-甲基丁基；不飽和C1-C6烴基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、 2-己基及3-己基。C1-C6烴基可未經取代或經一或多個如上文對於C1-C8烴基所述之基團取代。
如本文所用之術語「C1-C4烴基」係指具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈飽和或不飽和烴。代表性「C1-C4烴基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而分支鏈C1-C4烴基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基；不飽和C1-C4烴基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基。C1-C4烴基可未經取代或經一或多個如上文對於C1-C8烴基所述之基團取代。
「烴氧基」為以單鍵鍵結於氧之烴基。示範性烴氧基包括(但不限於)甲氧基(-OCH3)及乙氧基(-OCH2CH3)。「C1-C5烴氧基」為具有1至5個碳原子之烴氧基。烴氧基可未經取代或經一或多個如上文對於烴基所述之基團取代。
「烯基」為具有至少一個不飽和位點(亦即碳-碳sp 2 雙鍵)且含有正鏈碳原子、二級碳原子、三級碳原子或環碳原子之C2-C18烴。實例包括(但不限於)：乙烯或乙烯基(-CH=CH2)、烯丙基(-CH2CH=CH2)、環戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)。「C2-C8烯基」為具有至少一個不飽和位點(亦即碳-碳sp 2 雙鍵)且含有2至8個正鏈碳原子、二級碳原子、三級碳原子或環碳原子之烴。
「炔基」為具有至少一個不飽和位點(亦即碳-碳sp參鍵)且含有正鏈碳原子、二級碳原子、三級碳原子或環碳原子之C2-C18烴。實例包括(但不限於)：乙炔基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2C≡CH)。「C2-C8炔基」為具有至少一個不飽和位點(亦即碳-碳sp參鍵)且含有2至8個正鏈碳原子、二級碳原子、三級碳原子或環碳原子之烴。
「伸烷基」係指具有1-18個碳原子且具有藉由自母體烷烴之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所獲得之兩個單價基團中心 的飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烷基包括(但不限於)：亞甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)及其類似基團。
「C1-C10伸烷基」為具有式-(CH2)1-10-之直鏈飽和烴基。C1-C10伸烷基之實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基及伸癸基。
「伸烯基」係指具有2-18個碳原子且具有藉由自母體烯烴之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所獲得之兩個單價基團中心的不飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烯基包括(但不限於)：1,2-乙烯基(-CH=CH-)。
「伸炔基」係指具有2-18個碳原子且具有藉由自母體炔烴之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所獲得之兩個單價基團中心的不飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸炔基包括(但不限於)：乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
「芳基」係指碳環芳族基團。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。碳環芳族基團或雜環芳族基團可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
「C5-C20芳基」為在碳環芳環中具有5至20個碳原子之芳基。C5-C20芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C20芳基可如上文對於芳基所述經取代或未經取代。「C5-C14芳基」為在碳環芳環中具有5至14個碳原子之芳基。C5-C14芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C14芳基可如上文對於芳基所述經取代或未經取代。
「伸芳基」為如以下結構中所示，具有兩個共價鍵且可呈鄰位、間位或對位組態之芳基：
其中苯基可未經取代或經至多四個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
「芳基烴基」係指一個鍵結於碳原子(通常為末端或sp3碳原子)之氫原子經芳基置換的無環烴基。典型芳基烴基包括(但不限於)苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基及其類似基團。芳基烴基包含6至20個碳原子，例如芳基烴基之烴基部分(包括烷基、烯基或炔基)為1至6個碳原子且芳基部分為5至14個碳原子。
「雜芳基烴基」係指一個鍵結於碳原子(通常為末端或sp3碳原子)之氫原子經雜芳基置換的無環烴基。典型雜芳基烴基包括(但不限於)2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基及其類似基團。雜芳基烴基包含6至20個碳原子，例如雜芳基烴基之烴基部分(包括烷基、烯基或炔基)為1至6個碳原子且雜芳基部分為5至14個碳原子以及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜芳基烴基之雜芳基部分可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
「經取代之烴基」、「經取代之芳基」及「經取代之芳基烴基」 分別意謂一或多個氫原子各自獨立地經取代基置換之烴基、芳基及芳基烴基。典型取代基包括(但不限於)-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、NC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(=O)2R、-OS(=O)2OR、-S(=O)2NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2、-P(=O)(OR)2、-PO3、-PO3H2、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2R、-CO2、-C(=S)OR、-C(=O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NR2、-C(=S)NR2、-C(=NR)NR2，其中各X獨立地為鹵素：F、Cl、Br或I；且各R獨立地為-H、C2-C18烴基、C6-C20芳基、C3-C14雜環、保護基或前藥部分。如上所述之伸烷基、伸烯基及伸炔基亦可類似地經取代。
「雜芳基」及「雜環」係指一或多個環原子為雜原子(例如氮、氧及硫)之環系統。雜環基團包含3至20個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜環可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
示範性雜環例如描述於Paquette,Leo A.,「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」(W.A.Benjamin,New York,1968)，特定言之第1、3、4、6、7及9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs」(John Wiley & Sons,New York,1950年至今)，特定言之第13、14、16、19及28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中。
雜環之實例包括例如(而不限於)吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧化四氫噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻 萘基、吲哚基、吲哚烯基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、2-吡咯啶酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙-四氫呋喃基、四氫哌喃基、雙-四氫哌喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻嗯基、哌喃基、異苯并呋喃基、烯基、基、啡噁噻基、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、吲哚嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋呫基、啡噁嗪基、異唍基、唍基、咪唑啶基、咪唑啉基、吡唑啶基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基及靛紅醯基。
舉例而言而不限於，碳鍵結型雜環係在以下位置處鍵結：吡啶之2、3、4、5或6位；噠嗪之3、4、5或6位；嘧啶之2、4、5或6位；吡嗪之2、3、5或6位；呋喃、四氫呋喃、硫呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑之2、4或5位；異噁唑、吡唑或異噻唑之3、4或5位；氮丙啶之2或3位；氮雜環丁烷之2、3或4位；喹啉之2、3、4、5、6、7或8位；或異喹啉之1、3、4、5、6、7或8位。更通常，碳鍵結型雜環包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
舉例而言而不限於，氮鍵結型雜環係在以下位置處鍵結：氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑 啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑之1位；異吲哚或異吲哚啉之2位；嗎啉之4位；及咔唑或β-咔啉之9位。更通常，氮鍵結型雜環包括1-氮丙啶基、1-氮雜環丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。
「C3-C8雜環」係指芳族或非芳族C3-C8碳環，其中一至四個環碳原子係獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子置換。C3-C8雜環之代表性實例包括(但不限於)苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、異喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基及四唑基。C3-C8雜環可未經取代或經至多七個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
「C3-C8雜環基」係指以上定義之C3-C8雜環基團，其中雜環基團之一個氫原子經一鍵置換。C3-C8雜環基可未經取代或經至多六個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
「C3-C20雜環」係指芳族或非芳族C3-C8碳環，其中一至四個環碳原子係獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子置換。C3-C20雜環可未經取代或經至多七個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8 烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
「C3-C20雜環基」係指以上定義之C3-C20雜環基團，其中雜環基團之一個氫原子經一鍵置換。
「碳環」意謂具有3至7個碳原子之呈單環形式或具有7至12個碳原子之呈雙環形式之飽和或不飽和環。單環碳環具有3至6個環原子，更通常具有5或6個環原子。雙環碳環具有例如排列成雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統之7至12個環原子或排列成雙環[5,6]或[6,6]系統之9或10個環原子。單環碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環庚基及環辛基。
「C3-C8碳環」為3員、4員、5員、6員、7員或8員飽和或不飽和非芳族碳環。代表性C3-C8碳環包括(但不限於)-環丙基、-環丁基、-環戊基、-環戊二烯基、-環己基、-環己烯基、-1,3-環己二烯基、-1,4-環己二烯基、-環庚基、-1,3-環庚二烯基、-1,3,5-環庚三烯基、-環辛基及-環辛二烯基。C3-C8碳環基團可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下之基團取代：-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'係獨立地選自H、-C1-C8烴基及芳基。
「C3-C8碳環基」係指以上定義之C3-C8碳環基團，其中碳環基團之一個氫原子經一鍵置換。
「連接子」係指包含共價鍵或一系列原子之使抗體共價連接於 藥物部分之化學部分。在各種實施例中，連接子包括二價基團，諸如烴二基、芳二基、雜芳二基、諸如以下之部分：-(CR2)nO(CR2)n-、烴氧基之重複單元(例如聚伸乙基氧基、PEG、聚亞甲基氧基)及烴基胺基之重複單元(例如聚伸乙基胺基，JeffamineTM)；及二酸酯及醯胺，包括丁二酸酯、丁二醯胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己醯胺。在各種實施例中，連接子可包含一或多個胺基酸殘基，諸如纈胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及高離胺酸。
術語「對掌性」係指分子具有與鏡像搭配物不可重疊之性質，而術語「非對掌性」係指分子可重疊於其鏡像搭配物上。
術語「立體異構體」係指具有相同化學組成，但在原子或基團於空間中之排列方面不同之化合物。
「非對映異構體」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且分子不互為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質及反應性。非對映異構體之混合物可在諸如電泳及層析之高解析度分析程序下分離。
「對映異構體」係指化合物之兩個互為不可重疊鏡像之立體異構體。
本文使用之立體化學定義及慣例通常遵循S.P.Parker編，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book 公司，New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley & Sons公司，New York。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其能夠使平面偏振光之平面旋轉。在描述光學活性化合物時，字首D及L或R及S用於表示分子圍繞其對掌性中心之絕對組態。字首d及l或(+)及(-)用於指定由化合物所致之平面偏振光旋轉方向，其中(-)或l意謂化合物為左旋化合物。字首為(+)或d之化合物為右旋化合物。對於既定化學結構，此等立體異構體為相 同的，例外之處為其互為鏡像。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且此等異構體之混合物常稱為對映異構混合物。對映異構體之50：50混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，其可在化學反應或製程中不存在立體選擇或立體特異性時存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指兩種對映異構物質之缺乏光學活性之等莫耳混合物。
「離去基團」係指可經另一官能基取代之官能基。某些離去基團在此項技術中為熟知的，且實例包括(但不限於)鹵基(例如氯基、溴基、碘基)、甲烷磺醯基(甲磺醯基)、對甲苯磺醯基(甲苯磺醯基)、三氟甲基磺醯基(三氟甲磺酸酯基)及三氟甲基磺酸酯基。
術語「保護基」係指通常用於在使化合物上之其他官能基反應時阻隔或保護特定官能基之取代基。舉例而言，「胺基保護基」為連接於胺基之阻隔或保護化合物中之胺基官能基的取代基。適合胺基保護基包括(但不限於)乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)及9-茀基亞甲基氧基羰基(Fmoc)。對於保護基及其使用之一般性描述，參見T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,1991或後期版本。
II.組合物及方法
在一個態樣中，本發明係部分基於結合LgR5之抗體及包含此等抗體之免疫結合物。本發明之抗體及免疫結合物例如適用於診斷或治療LgR5陽性癌症。
A.示範性抗LgR5抗體
在一些實施例中，本發明提供結合LgR5之分離之抗體。LgR5為一種例如存在於活躍循環之腸幹細胞表面上之七次跨膜蛋白。如本文所顯示，約77%之所檢查之結腸腫瘤切片中表現有LgR5。
具有信號序列(胺基酸1-21)之示範性天然存在之人類LgR5前驅蛋 白序列提供於SEQ ID NO：67中，且相應成熟LgR5蛋白質序列顯示於SEQ ID NO：68(對應於SEQ ID NO：67之胺基酸22-907)中。
在某些實施例中，抗LgR5抗體具有呈任何組合形式之至少一或多個以下特徵：(a)結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-555內之抗原決定基；(b)結合LgR5之親和力5nM或4nM或3nM或2nM或1nM，且視情況0.0001nM或0.001nM或0.01nM；(c)不顯著破壞R-脊椎蛋白(RSPO)與LgR5之結合；(d)不顯著破壞β-連環蛋白信號傳導；(e)不顯著破壞RSPO對LgR5信號傳導之活化；(f)活化半胱天冬酶3裂解；(g)識別人類LgR5與齧齒動物LgR5兩者；(h)識別人類LgR5而不識別齧齒動物LgR5；(i)在其未結合形式下不顯著抑制腫瘤生長；及(j)不誘導幹細胞分化。在一些實施例中，抗LgR5抗體為8E11及其人類化變異體，諸如hu8E11.v2；YW353；2H6；及3G12。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5。在一些實施例中，LgR5係選自人類、石蟹獼猴、小鼠及大鼠LgR5。
(a)結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22-555內之抗原決定基
確定抗LgR5抗體是否結合於LgR5之抗原決定基之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可藉由在293細胞中表現N端及C端缺失之LgR5多肽且如實例I中所述藉由FACS測試抗體與截短型多肽之結合來確定抗LgR5抗體與LgR5之抗原決定基(例如在SEQ ID NO：67之胺基酸22-555內)之結合。在一些實施例中，相對於與293細胞中表現之全長LgR5之結合，抗體與截短型多肽之結合實質性減少(減少70%)或消除指示該抗體不結合於彼截短型多肽。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5或石蟹獼猴LgR5。
在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之富含白胺酸之N端結構域(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基25-66)。在一些實施例 中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之一或多個富含白胺酸之重複序列(LRR)(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基67-446；LgR5之LRR1-16)。 在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 1(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基67-90)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 2(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基91-112)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 3(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基115-136)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 4(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基139-160)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 5(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基163-184)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 6(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基187-208)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 7(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基211-232)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 8(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基235-256)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 9(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基258-279)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 10(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基282-303)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 11(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基306-328)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 12(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基329-350)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 13(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基353-374)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 14(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基375-396)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 15(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基399-420)。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含LgR5之LRR 16(例如SEQ ID NO：67之胺基酸殘基423-446)。在一些實 施例中，LgR5之抗原決定基包含以下任一者：LRR1至LRR11、LRR2至LRR11、LRR3至LRR11、LLR1至LLR3、LLR2至LLR3、LLR2至LLR8、LLR3至LL7或LLR4至LLR6。
在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含SEQ ID NO：67之胺基酸22-555內之抗原決定基。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含SEQ ID NO：67之胺基酸22-424內之抗原決定基。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含SEQ ID NO：67之胺基酸22-123內之抗原決定基。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含SEQ ID NO：67之胺基酸22-323內之抗原決定基。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含SEQ ID NO：67之胺基酸324-555內之抗原決定基。在一些實施例中，LgR5之抗原決定基包含SEQ ID NO：67之胺基酸324-424內之抗原決定基。
應瞭解本文所述之態樣及實施例包括「由態樣及實施例組成」及/或「由態樣及實施例有效地組成」。
(b)結合LgR5之親和力 5nM或 4nM或 3nM或 2nM或 1nM，且視情況 0.0001nM或 0.001nM或 0.01nM
測定結合親和力之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，結合親和力可根據如本文在實例E中所述之BIAcore®分析來測定。詳言之，在一些實施例中，可利用BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)，使用表面電漿子共振分析來量測Kd。可根據供應商之說明書用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)試劑活化BIAcoreTM研究級CM5晶片。可使山羊抗人類Fc IgG偶合於晶片以在各流動槽中達成約10,000反應單位(RU)。可用1M乙醇胺阻斷未反應偶合基團。對於動力學量測，可捕捉抗LGR5抗體以達成約300 RU。可在25℃下以流速30μl/min注射人類LgR5 ECD(例如在桿狀病毒系統中表現之融合於His-Fc之胺基酸22- 557(或類似片段，諸如22-555)或由CHO細胞表現之融合於Fc之胺基酸22-558(或類似片段，諸如22-555)；125nM至0.49nM)於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之兩倍連續稀釋液。可使用1：1朗繆爾(Langmuir)結合模型(BIAcoreTM評估軟體第3.2版)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)可計算為比率koff/kon。若藉由以上表面電漿子共振分析測定之締合速率超過106M-1s-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該螢光淬滅技術量測在遞增濃度之抗原存在下於PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25℃下之螢光發射強度的增加或減少(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)，如在分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-Aminco®分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。
在一些實施例中，抗LgR5抗體結合LgR5之親和力為約以下任一者：5nM或4nM或3nM或2nM或1nM。在一些實施例中，抗LgR5抗體結合LgR5之親和力為約5nM。在一些實施例中，抗LgR5抗體結合LgR5之親和力為約4nM。在一些實施例中，抗LgR5抗體結合LgR5之親和力為約3nM。在一些實施例中，抗LgR5抗體結合LgR5之親和力為約2nM。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5或石蟹獼猴LgR5。
如熟習此項技術者所瞭解，提及「約」某一值或參數包括(且描述)有關於彼值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括對「X」之描述。
(c)不顯著破壞R-脊椎蛋白(RSPO)與LgR5之結合
測定抗LgR5抗體破壞RSPO與LgR5之結合之能力的方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可藉由流動式細胞測量術測定抗LgR5抗體顯著破壞R-脊椎蛋白(RSPO)與LgR5之結合的能力。在一些 實施例中，例如可使表現LgR5之293細胞與經螢光標記之RSPO(諸如RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4)在存在及不存在抗LgR5抗體下接觸。可使用螢光活化細胞分選(FACS)來偵測RSPO與293細胞之結合。在一些實施例中，相對於在對照抗體存在下之RSPO結合，在抗LgR5抗體存在下RSPO結合之減少小於約25%指示抗LgR5抗體不顯著破壞RSPO與LgR5之結合。
在一些實施例中，可藉由BIAcore分析測定抗LgR5抗體顯著破壞R-脊椎蛋白(RSPO)與LgR5之結合的能力。在一些實施例中，舉例而言，可例如如本文所述使LgR5細胞外域固定在CM5晶片上，且可在存在及不存在抗LgR5抗體下測定RSPO(諸如RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4)與固定之LgR5的結合。在一些實施例中，相對於在對照抗體存在下之RSPO結合，在抗LgR5抗體存在下RSPO結合之減少小於約25%指示抗LgR5抗體不顯著破壞RSPO與LgR5之結合。
在一些實施例中，RSPO係選自RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4。在一些實施例中，抗體對結合之破壞小於約25%、小於約20%、小於約15%或小於約10%。在一些實施例中，抗體不可偵測地破壞RSPO與LgR5之結合。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5或石蟹獼猴LgR5。
(d)不顯著破壞wnt/β-連環蛋白信號傳導
測定抗LgR5抗體破壞wut/β-連環蛋白信號傳導之能力之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可使用報導基因分析測定抗LgR5抗體顯著破壞wnt/β-連環蛋白信號傳導之能力。在一些實施例中，例如可將包含在wut/β-連環蛋白反應性啟動子(諸如包含多聚化TCF/LEF DNA結合位點之啟動子)控制下之報導基因(諸如螢光素酶(luciferase)基因)之報導構築體轉染至表現LgR5之細胞中。接著使細胞與Wnt配體(諸如Wnt3a)及RSPO(諸如RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或 RSPO4)在存在及不存在抗LgR5抗體下接觸，且量測螢光素酶表現。在一些實施例中，相對於在對照抗體存在下之螢光素酶表現，在抗體存在下螢光素酶表現之減少小於約25%指示抗LgR5抗體不顯著破壞β-連環蛋白信號傳導。
在一些實施例中，抗體對β-連環蛋白信號傳導之破壞小於約25%、小於約20%、小於約15%或小於約10%。在一些實施例中，抗體不可偵測地破壞β-連環蛋白信號傳導。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5或石蟹獼猴LgR5。
(e)不顯著破壞RSPO對LgR5信號傳導之活化
測定抗LgR5抗體破壞RSPO對LgR5之活化之能力的方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可使用報導基因分析測定抗LgR5抗體顯著破壞RSPO對LgR5信號傳導之活化的能力。在一些實施例中，例如可將包含在β-連環蛋白反應性啟動子(諸如包含多聚化TCF/LEF DNA結合位點之啟動子)控制下之報導基因(諸如螢光素酶基因)之報導構築體轉染至表現LgR5之細胞中。可接著使細胞與Wnt配體(諸如Wnt3a)在存在及不存在RSPO(諸如RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4)下接觸，且LgR5信號傳導之活化可量測為在RSPO存在下螢光素酶表現增加。亦可在存在及不存在抗LgR5抗體下量測LgR5信號傳導之活化。在一些實施例中，相對於對照抗體，當使細胞與抗LgR5抗體接觸時，LgR5信號傳導在RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4存在下之活化的減少小於約25%指示抗LgR5抗體不顯著破壞RSPO對LgR5信號傳導之活化。
在一些實施例中，RSPO係選自RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4。在一些實施例中，抗體對於RSPO對LgR5信號傳導之活化的破壞小於約25%、小於約20%、小於約15%或小於約10%。在一些實施例中，抗體不可偵測地破壞RSPO對LgR5信號傳導之活化。在一些 實施例中，LgR5為人類LgR5。在一些實施例中，LgR5為人類LgR5或石蟹獼猴LgR5。
(f)活化半胱天冬酶3裂解
測定抗LgR5抗體活化半胱天冬酶3裂解之能力之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可例如如實例N中所述，在齧齒動物異種移植模型中測定抗LgR5抗體活化半胱天冬酶3裂解之能力。在一些實施例中，可例如在自投與抗LgR5抗體之腸腫瘤形成模型小鼠收集之經福馬林固定石蠟包埋(FFPE)之小腸及結腸組織中量測與腫瘤面積有關的裂解之半胱天冬酶3之存在。在一些實施例中，可使用免疫組織化學測定裂解之半胱天冬酶3之存在。此外，在一些實施例中，半胱天冬酶3裂解可測定為陽性腫瘤面積百分比，例如如實例N及圖18中所示。
在一些實施例中，根據實例N中所述之分析，抗LgR5抗體使半胱天冬酶3陽性腫瘤面積之百分比增加約以下任一者：至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%(亦即陽性腫瘤面積之百分比加倍)。
(g)識別人類LgR5與齧齒動物LgR5兩者
測定抗LgR5抗體結合人類及齧齒動物LgR5之能力之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，使人類及齧齒動物LgR5多肽在293細胞中表現且藉由FACS測試抗體與表現LgR5之293細胞之結合，如實例G中所述。在一些實施例中，齧齒動物LgR5為小鼠或大鼠LgR5。在一些實施例中，齧齒動物LgR5為小鼠LgR5。
(h)識別人類LgR5而不識別齧齒動物LgR5
測定抗LgR5抗體結合人類LgR5而不結合齧齒動物LgR5之能力的 方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，使人類及齧齒動物LgR5多肽在293細胞中表現且藉由FACS測試抗體與表現LgR5之293細胞之結合，如實例G中所述。在一些實施例中，齧齒動物LgR5為小鼠或大鼠LgR5。在一些實施例中，齧齒動物LgR5為小鼠LgR5。
(i)在其未結合形式下不顯著抑制腫瘤生長
測定抗LgR5抗體在其未結合形式下抑制腫瘤生長之能力的方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，使用齧齒動物異種移植模型，諸如實例M中所述之D5124胰腺癌異種移植模型。在一些實施例中，例如如實例L中所述，在LoVo結腸癌細胞株異種移植模型中，抗LgR5抗體在其未結合形式下不顯著抑制腫瘤生長。在一些實施例中，例如如實例N中所述，在鼠類腸腫瘤形成模型中，抗LgR5抗體在其未結合形式下不顯著抑制腫瘤生長。相對於媒劑對照或對照抗體來測定對異種移植模型或鼠類腸腫瘤形成模型中之腫瘤生長的抑制作用。
在一些實施例中，抗LgR5抗體在其未結合形式下對腫瘤生長之抑制小於約25%、小於約20%、小於約15%或小於約10%。在一些實施例中，抗LgR5抗體在其未結合形式下不可偵測地抑制腫瘤生長。
(j)不誘導幹細胞分化
測定抗LgR5抗體誘導幹細胞分化之能力之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可藉由在存在及不存在抗LgR5抗體下測定作為小腸中表現LgR5之快速循環幹細胞的隱窩底部柱狀細胞(CBC)分化成例如腸上皮細胞、杯狀細胞及/或腸內分泌細胞之能力來分析幹細胞分化。在一些實施例中，若在抗LgR5抗體存在下CBC群體中約有少於25%、少於20%、少於15%或少於10%中之任一者於對照抗體亦誘導CBC群體之少於約25%進行幹細胞分化所處的條件下分化，則抗LgR5抗體係視為不誘導幹細胞分化。
在一些實施例中，抗LgR5抗體免疫結合物經由不誘導幹細胞分化之主要機制來抑制腫瘤生長。在一些此等實施例中，抗LgR5抗體免疫結合物經由細胞毒性活性來抑制腫瘤生長，該細胞毒性活性係經由免疫結合物中結合於抗體之細胞毒性劑介導。
抗體8E11及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR之抗LgR5抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3、含有胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2。在另一實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2；及 (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列之VH域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之VL域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。
在任何以上實施例中，抗LgR5抗體係經人類化。在一個實施例中，抗LgR5抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κ IV共同(VLKIV)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κ IV共同(VLKIV)構架及/或VH構架VH1，其在重鏈構架區FR3中包含R71S突變及A78V突變。
在一些實施例中，抗LgR5抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含選自SEQ ID NO：40至43之重鏈構架FR3序列。 在一些實施例中，抗LgR5抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含重鏈構架FR3序列SEQ ID NO：41。在一些此等實施例中，重鏈可變域構架為經修飾之具有選自SEQ ID NO：40至43之FR3序列之人類VH1構架。在一些此等實施例中，重鏈可變域構架為經修飾之具有FR3序列SEQ ID NO：41之人類VH1構架。
在一些實施例中，抗LgR5抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含輕鏈構架FR3序列SEQ ID NO：36。在一些此等實施例中，重鏈可變域構架為經修飾之具有FR3序列SEQ ID NO：36之VL κ IV共同(VLKIV)構架。
在另一態樣中，抗LgR5抗體包含與選自SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18及20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與選自SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18及20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗LgR5抗體保留結合LgR5之能力。在某些實施例中，選自SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18及20之序列中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，選自SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18及20之序列中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。
在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：10具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：12具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：18具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：20具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。
視情況，抗LgR5抗體包含選自SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18及20之VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17及19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與選自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17及19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗LgR5抗體保留結合LgR5之能力。在某些實施例中，選自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17及19之胺基酸序列中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，選自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17及19之胺基酸序列中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。
在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：15具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。在一些 實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：17具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。在一些實施例中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：19具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)序列。
視情況，抗LgR5抗體包含具有選自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17及19之胺基酸序列之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含如以上提供之任何實施例中之VH及如以上提供之任何實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：5中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：7中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：9中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：11中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：13中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：15中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17中之VH序列及VL 序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：19中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本發明提供一種與本文提供之抗LgR5抗體結合相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供一種與包含VH序列SEQ ID NO：8及VL序列SEQ ID NO：7之抗LgR5抗體結合相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：67中來自胺基酸22-323、在胺基酸22-323內或與胺基酸22-323重疊之抗原決定基的抗體。在一些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：68中來自胺基酸1-312、在胺基酸1-312內或與胺基酸1-312重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗LgR5抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體可併有單獨或呈組合形式之如以下部分1-7中所述之任何特徵。
抗體YW353及其他實施例
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR之抗LgR5抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全 部三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3、含有胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2。在另一實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列之VH域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之HVR-H1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2，及(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之VL域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含胺基酸序 列SEQ ID NO：60之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-L3。
在任何以上實施例中，抗LgR5抗體為人類抗體。
在另一態樣中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗LgR5抗體保留結合LgR5之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：26中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：26中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。視情況，抗LgR5抗體包含VH序列SEQ ID NO：26，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：25具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與胺基酸序列SEQ ID NO：25具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失， 但包含彼序列之抗LgR5抗體保留結合LgR5之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：25中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：25中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。視情況，抗LgR5抗體包含VL序列SEQ ID NO：25，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含如以上提供之任何實施例中之VH及如以上提供之任何實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：25中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本發明提供一種與本文提供之抗LgR5抗體結合相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供一種與包含VH序列SEQ ID NO：26及VL序列SEQ ID NO：25之抗LgR5抗體結合相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：67中來自胺基酸22-123、在胺基酸22-123內或與胺基酸22-123重疊之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：68中來自胺基酸1-102、在胺基酸1-102內或與胺基酸1-102重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗LgR5抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體可併有單獨或呈組合形式之如以下部分1-7中所述之任何特徵。
抗體3G12及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR之抗LgR5抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3、含有胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2。在另一實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1；(b)包含胺基酸 序列SEQ ID NO：46之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列之VH域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之HVR-H1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之VL域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。
在任何以上實施例中，抗LgR5抗體係經人類化。在一個實施例中，抗LgR5抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VLκ共同(VLK)構架及/或人類VH亞群3共同(VH3)構架。
在另一態樣中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：22具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與胺基酸序列SEQ ID NO：22具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗LgR5抗體保 留結合LgR5之能力。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：22中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：22中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。
視情況，抗LgR5抗體包含VH序列SEQ ID NO：22，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之HVR-H3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：21具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與胺基酸序列SEQ ID NO：21具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗LgR5抗體保留結合LgR5之能力。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：21中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：21中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。
視情況，抗LgR5抗體包含VL序列SEQ ID NO：21，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之HVR-L3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含如以上提供之任何實施例中之VH及如以上提供之任何實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：21中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本發明提供一種與本文提供之抗LgR5抗體結合相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供一種與包含VH序列SEQ ID NO：22及VL序列SEQ ID NO：21之抗LgR5抗體結合相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：67中來自胺基酸324-423、在胺基酸324-423內或與胺基酸324-423重疊之抗原決定基的抗體。在一些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：68中來自胺基酸303-402、在胺基酸303-402內或與胺基酸303-402重疊之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：67中來自胺基酸324-555、在胺基酸324-555內或與胺基酸324-555重疊之抗原決定基的抗體。在一些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：68中來自胺基酸303-534、在胺基酸303-534內或與胺基酸303-534重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗LgR5抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體可併有單獨或呈組合形式之如以下部分1-7中所述之任何特徵。
抗體2H6及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR之抗LgR5抗體：(a)包含胺基 酸序列SEQ ID NO：54之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。在另一實施例中，該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3、含有胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3及含有胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2。在另一實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供一種包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列之VH域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之HVR-H1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR- H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：56之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列之VL域：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1，(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2；及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。
在任何以上實施例中，抗LgR5抗體係經人類化。在一個實施例中，抗LgR5抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κ共同(VLK)構架及/或人類VH亞群3(VH3)構架。
在另一態樣中，抗LgR5抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與胺基酸序列SEQ ID NO：24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗LgR5抗體保留結合LgR5之能力。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：24中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：24中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。
視情況，抗LgR5抗體包含VH序列SEQ ID NO：24，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之HVR-H1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55之HVR-H2，及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之HVR-H3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：23具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與胺基酸序列SEQ ID NO：23具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗LgR5抗體保留結合LgR5之能力。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：23中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：23中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部之區域中(亦即在FR中)。
視情況，抗LgR5抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：23之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之HVR-L2；及(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之HVR-L3。
在另一態樣中，提供一種抗LgR5抗體，其中該抗體包含如以上提供之任何實施例中之VH及如以上提供之任何實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別於SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：23中之VH序列及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本發明提供一種與本文提供之抗LgR5抗體結合 相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供一種與包含VH序列SEQ ID NO：24及VL序列SEQ ID NO：23之抗LgR5抗體結合相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：67中來自胺基酸324-423、在胺基酸324-423內或與胺基酸324-423重疊之抗原決定基的抗體。在一些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：68中來自胺基酸303-402、在胺基酸303-402內或與胺基酸303-402重疊之抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：67中來自胺基酸324-555、在胺基酸324-555內或與胺基酸324-555重疊之抗原決定基的抗體。在一些實施例中，提供一種結合SEQ ID NO：68中來自胺基酸303-534、在胺基酸303-534內或與胺基酸303-534重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗LgR5抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗LgR5抗體可併有單獨或呈組合形式之如以下部分1-7中所述之任何特徵。
1.抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體之解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM，且視情況10-13M。(例如10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一個實施例中，藉由用相關抗體之Fab型式及其抗原如由以下分析所述進行放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測Kd。Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由在一滴定系列之未標記抗原存在下使Fab與最 小濃度之經(125I)-標記之抗原平衡，接著用經抗Fab抗體塗佈之培養盤捕捉所結合抗原來量測(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析條件，將MICROTITER®多孔培養盤(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)之50mM碳酸鈉(pH 9.6)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷2至5小時。在非吸附性培養盤(Nunc，編號：269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如符合Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體Fab-12之評定)。接著將相關Fab培育隔夜；然而，培育可持續較長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉培養盤中以在室溫下培育(例如1小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS將培養盤洗滌八次。當培養盤已乾燥時，每孔添加150μl閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對培養盤進行計數10分鐘。選擇各Fab之達成小於或等於最大結合之20%的濃度以用於競爭性結合分析中。
根據另一實施例，使用表面電漿子共振分析，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)，在25℃下用固定抗原CM5晶片以約10反應單位(RU)來量測Kd。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後在流速5μl/min下注射以達成約10反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗原之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以約25μl/min之流速注射Fab於含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中之兩倍 連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(BIACORE®評估軟體第3.2版)，藉由同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係計算為比率koff/kon。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由以上表面電漿子共振分析測定之締合速率超過106M-1s-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該螢光淬滅技術量測在遞增濃度之抗原存在下於PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25℃下之螢光發射強度的增加或減少(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)，如在分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。
2.抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段及下述其他片段。對於某些抗體片段之評述，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。對於scFv片段之評述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore 編，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。對於包含補救受體結合抗原決定基殘基且活體內半衰期有所延長之Fab及F(ab')2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為可具二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或全部或一部分輕鏈可變域之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Dornantis公司，Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術製備，包括(但不限於)如本文所述之蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
3.嵌合抗體及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體例如描述於美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類相較於親本抗體之類別或子類已發生改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中例如CDR之HVR(或其部分)源於非人類抗體，且FR(或其部分)源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如作為HVR殘基之來源的抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法例如評述於Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步例如描述於以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重塑(resurfacing)」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「定向選擇」法)。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳配合」法選擇之構架區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；源於輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體共同序列之構架區(參見例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及由篩檢FR文庫獲得之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來產生。人類抗體一般性地描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
可藉由向已經改良之轉殖基因動物投與免疫原以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體來製備人類抗體。此等動物通常含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座，該等人類免疫球蛋白基因座置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合於動物之染色體中。在此等轉殖基因小鼠中，內源性免疫 球蛋白基因座通常已經不活化。對於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法之評述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號；及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。來自此等動物所產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而經進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株已有所描述。(參見例如Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。))經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如以下文獻中所述之方法：美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)；及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(三源融合瘤(Trioma)技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)；及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
亦可藉由分離選自來源於人類之噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序列來產生人類抗體。接著可將此等可變域序列與所需人類恆定域組合。以下描述自抗體文庫中選擇人類抗體之技術。
5.來源於文庫之抗體
可藉由篩檢組合文庫中具有一或多種所需活性之抗體來分離本發明之抗體。舉例而言，此項技術中已知多種用於產生噬菌體呈現文庫及篩檢此等文庫中具有所需結合特徵之抗體之方法。此等方法例如評述於Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且例如進一步描述於以下文獻中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖VH及VL基因之譜系且隨機重組於噬菌體文庫中，接著可篩檢該等文庫中之抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常呈現呈單鏈Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式之抗體片段。來自經免疫接種之來源之文庫不需建構融合瘤即可提供對免疫原具有高親和力之抗體。或者，可選殖(例如自人類選殖)天然譜系以在不進行任何免疫接種的情況下提供針對多種非自體抗原以及自體抗原之抗體的單一來源，如藉由Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，亦可藉由以下方式合成性製備天然文庫：自幹細胞選殖未重排之V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高變CDR3區並在活體外達成重排，如藉由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第 2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中被視為人類抗體或人類抗體片段。
6.多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對LgR5，而另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對LgR5，而另一者係針對CD3。參見例如美國專利第5,821,337號。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於LgR5之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑定位於表現LgR5之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性之兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))；及「杵入臼(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式來製備：工程改造靜電牽引效應(electrostatic steering effect)以製備抗體Fc-雜二聚分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術以製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人， J.Immunol.147：60(1991)中所述。
本文亦包括具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚狀抗體(Octopus antibody)」(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括「雙重作用性FAb」或「DAF」，其包含結合LgR5以及另一不同抗原之抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820)。
7.抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列內之殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合性。
a)取代、插入及缺失型變異體
在某些實施例中，提供具有一或多處胺基酸取代之抗體變異體。相關取代型突變誘發位點包括HVR及FR。保守性取代顯示於表1中之標題「較佳取代」下。更多實質性變化提供於表1中之標題「示範性取代」下，且如以下關於胺基酸側鏈類別進一步所述。可將胺基酸取代引入相關抗體中且針對所需活性(例如保留/改良之抗原結合性、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)篩檢產物。
可根據共同側鏈性質對胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員交換成另一類別。
一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體在某些生物學性質方面將有所改變(例如改良)(例如親和力增強、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物學性質。示範性取代型變異體為親和力成熟抗體，其宜例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述者)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且使變異抗體呈現在噬菌體上並針對特定生物活性(例如結合親和力)加以篩檢。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率發生突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行此等改變，且測試所得變異VH或VL之結合親和力。藉由建構二級文庫並自其中進行再選擇來達成親和力成熟已例如描述於Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一者將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩檢該文庫以鑒別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向法，其中使若干HVR殘基(例如每次4-6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特異性鑒別涉及於抗原結合中之HVR殘基。通常尤其靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文提供之保守性取代)。此等改變可在HVR「熱點」或SDR外部。 在以上提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有至多一處、兩處或三處胺基酸取代。
一種適用於鑒別抗體中可作為突變誘發之目標之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如藉由Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，鑒別某一殘基或一組目標殘基(例如帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，使用抗原-抗體複合物之晶體結構鑒別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選者加以靶向或消除。可篩檢變異體以確定其是否含有所需性質。
胺基酸序列插入物包括長度在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽之範圍內的胺基端及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，改變本文提供之抗體以增加或降低抗體糖基化之程度。向抗體中添加糖基化位點或使抗體糖基化位點缺失宜藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個糖基化位點來達成。
當抗體包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含通常藉由N-鍵聯連接於Fc區之CH2域之Asn297的分支雙觸角寡醣。參見例如Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接於雙觸角寡醣結構之「主 幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏連接(直接或間接)於Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，岩藻糖在此抗體中之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如藉由MALDI-TOF質譜所量測，藉由相對於連接於Asn297之所有糖結構(例如複合甘露糖結構、混合甘露糖結構及高甘露糖結構)之總和計算糖鏈內Asn297處岩藻糖的平均量來測定岩藻糖之量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中大約位置297(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基；然而，Asn297亦可因抗體中之微小序列變異而位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即在位置294與300之間。此等岩藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化作用之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號(Presta,L)；及WO 2004/056312 A1(Adams等人)(尤其在實例11處))及基因剔除細胞株， 諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分型寡醣之抗體變異體，例如其中連接於抗體之Fc區之雙觸角寡醣係由GlcNAc平分。此等抗體變異體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此等抗體變異體之實例例如描述於WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在連接於Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改良之CDC功能。此等抗體變異體例如描述於WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多處胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，藉此使該抗體變異體成為許多應用之理想候選物，在該等應用中，抗體之活體內半衰期為重要的，但某些效應功能(諸如補體及ADCC)則為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol. 9：457-492(1991)之第464頁上之表3中。評定相關分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於以下文獻中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可採用非放射性分析方法，參見例如用於流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。適用於此等分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型(諸如Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭示之動物模型)中於活體內評定相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法對FcRn結合及活體內清除率/半衰期進行測定(參見例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
效應功能有所降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。此等Fc突變體包括胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
描述與FcR之結合得以改良或削弱之某些抗體變異體。(參見例 如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。)
在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多處改良ADCC之胺基酸取代(例如在Fc區之位置298、333及/或334(EU殘基編號)處之取代)的Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變以使得C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)發生改變(亦即改良或削弱)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
半衰期有所延長且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合得到改良的抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中，新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。彼等抗體包含具有一或多處改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等Fc變異體包括在以下一或多個Fc區殘基處具有取代之變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「硫代單抗(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，從而使反應性硫醇基定位在抗體之可及位點處且可用於使抗體結合於其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分) 以產生免疫結合物，如本文進一步所述。在某些實施例中，以下任何一或多個殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生半胱胺酸工程改造抗體。
示範性hu8E11.v2輕鏈(LC)V205C硫代單抗之重鏈及輕鏈序列分別為SEQ ID NO：64及74。示範性hu8E11.v2重鏈(HC)A118C硫代單抗之重鏈及輕鏈序列分別為SEQ ID NO：75及63。示範性hu8E11.v2重鏈(HC)S400C硫代單抗之重鏈及輕鏈序列分別為SEQ ID NO：76及63。
示範性YW353輕鏈(LC)V205C硫代單抗之重鏈及輕鏈序列分別為SEQ ID NO：66及77。示範性YW353重鏈(HC)A118C硫代單抗之重鏈及輕鏈序列分別為SEQ ID NO：78及65。示範性YW353重鏈(HC)S400C硫代單抗之重鏈及輕鏈序列分別為SEQ ID NO：79及65。
其他示範性V205C半胱胺酸工程改造硫代單抗包含含有選自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23之可變區及SEQ ID NO：80之恆定區的輕鏈；及含有選自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及24之可變區及人類重鏈恆定區(諸如IgG1)之重鏈。其他示範性A118C半胱胺酸工程改造硫代單抗包含含有選自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23之可變區及人類輕鏈恆定區(諸如κ輕鏈恆定區)之輕鏈；及含有選自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及24之可變區及SEQ ID NO：81之恆定區之重鏈。其他示範性S400C半胱胺酸工程改造硫代單抗包含含有選自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21及23之可變區及人類輕鏈恆定區(諸如κ輕鏈恆定區)之輕鏈；及含有選自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及24之可變區及SEQ ID NO：82之恆定區的重鏈。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白質部分。適於使抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚1,3-二氧雜環戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可分枝或未分枝。連接於抗體之聚合物之數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)欲改良之抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將在確定條件下用於療法中等考慮加以確定。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由曝露於輻射加以選擇性加熱之非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但會將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分鄰近之細胞之溫度的波長。
B.重組方法及組合物
可使用例如如美國專利第4,816,567號中所述之重組方法及組合物產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗LgR5抗體之分離之核酸。此核酸可編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及/或包含抗體之VH的胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供一種包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞 包含(例如經轉型而具有)：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列的核酸之載體，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列的核酸之第一載體及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列的核酸之第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗LgR5抗體之方法，其中該方法包括在適於表現該抗體之條件下培養如以上提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
為重組產生抗LgR5抗體，分離編碼例如如上所述之抗體之核酸且將其插入一或多個載體中以進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)容易地分離此核酸並定序。
適用於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，可在細菌中產生抗體，尤其是在不需要糖基化及Fc效應功能時。對於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其描述在大腸桿菌中表現抗體片段。)在表現之後，可自於可溶性部分中之細菌細胞糊狀物中分離抗體且可將其進一步純化。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為適用於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之抗體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)；及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑒別出眾多可連同昆蟲細胞一起使用之桿狀病毒株，特別是用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，適合於懸浮生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽托利細胞(sertoli cell)(如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述之TRI細胞；MRC5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。對於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株之評述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C.分析
可藉由此項技術中已知之各種分析鑒別、篩檢或表徵本文提供 之抗LgR5抗體之物理/化學性質及/或生物活性。
在一個態樣中，例如藉由已知方法，諸如ELISA、BIACore®、FACS或西方墨點法(Western blot)來測試本發明之抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑒別與本文所述之任何抗體競爭結合於LgR5之抗體。在某些實施例中，該種競爭抗體結合於與本文所述之抗體所結合之抗原決定基相同的抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。定位抗體所結合之抗原決定基之詳細示範性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols,」Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一示範性競爭分析中，在包含結合LgR5之第一經標記抗體(例如本文所述之任何抗體)及第二未標記抗體(將測試其與該第一抗體競爭結合於LgR5之能力)的溶液中培育經固定之LgR5。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體而不含第二未標記抗體之溶液中培育經固定之LgR5。在容許第一抗體結合於LgR5之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與經固定之LgR5締合之標記之量。若相對於對照樣品，測試樣品中與經固定之LgR5締合之標記之量實質上降低，則指示第二抗體與第一抗體競爭結合於LgR5。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含結合於一或多種細胞毒性劑之本文抗LgR5抗體，該一或多種細胞毒性劑為諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素；細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素；或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
免疫結合物允許向腫瘤靶向傳遞藥物部分，且在一些實施例 中，允許藥物部分在腫瘤中細胞內累積，其中全身性投與未結合之藥物可能會對正常細胞產生不可接受程度之毒性(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5：382-387)。
抗體-藥物結合物(ADC)為靶向化學治療分子，其藉由使有效細胞毒性藥物靶向抗原表現腫瘤細胞(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9：982-1004)，從而藉由使功效達到最大且使脫靶毒性降至最低來增強治療指數(Carter,P.J.及Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3)：154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41：98-107)而組合抗體與細胞毒性藥物兩者之性質。
本發明之ADC化合物包括具有抗癌活性之化合物。在一些實施例中，ADC化合物包括結合(亦即共價連接)於藥物部分之抗體。在一些實施例中，抗體經由連接子共價連接於藥物部分。本發明之抗體-藥物結合物(ADC)將有效劑量之藥物選擇性傳遞至腫瘤組織，藉此可達成較大選擇性(亦即較低有效劑量)，同時增加治療指數(「治療窗」)。
抗體-藥物結合物(ADC)之藥物部分(D)可包括具有細胞毒性或細胞生長抑制作用之任何化合物、部分或基團。藥物部分可藉由包括(但不限於)以下之機制來賦予其細胞毒性及細胞生長抑制作用：微管蛋白結合、DNA結合或嵌入及抑制RNA聚合酶、蛋白質合成及/或拓撲異構酶。示範性藥物部分包括(但不限於)美登木素、多拉司他汀(dolastatin)、奧里斯他汀、卡奇黴素、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽環黴素(anthracycline)、倍癌黴素(duocarmycin)、長春花生物鹼、紫杉烷(taxane)、新月毒素(trichothecene)、CC1065、喜樹鹼(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)及其具有細胞毒性活性之立體異構體、電子等排體、類似物及衍生物。以下進一步詳細論述此等免疫結合物之非限制性實例。
1.示範性抗體-藥物結合物
抗體-藥物結合物(ADC)化合物之一示範性實施例包含靶向腫瘤細胞之抗體(Ab)、藥物部分(D)及使Ab連接於D之連接子部分(L)。在一些實施例中，抗體經由一或多個胺基酸殘基(諸如離胺酸及/或半胱胺酸)連接於連接子部分(L)。
示範性ADC具有式I：Ab-(L-D)p I
其中p為1至約20。在一些實施例中，可結合於抗體之藥物部分之數目受限於游離半胱胺酸殘基之數目。在一些實施例中，藉由本文所述之方法將游離半胱胺酸殘基引入抗體胺基酸序列中。示範性式I之ADC包括(但不限於)具有1、2、3或4個經工程改造之半胱胺酸胺基酸之抗體(Lyon,R.等人，(2012)Methods in Enzym.502：123-138)。在一些實施例中，一或多個游離半胱胺酸殘基在未使用工程改造的情況下已存在於抗體中，在該情況下，現存游離半胱胺酸殘基可用於使抗體結合於藥物。在一些實施例中，在進行抗體結合之前使抗體暴露於還原條件以產生一或多個游離半胱胺酸殘基。
a)示範性連接子
「連接子」(L)為可用於使一或多個藥物部分(D)連接於抗體(Ab)以形成式I之抗體-藥物結合物(ADC)之雙官能或多官能部分。在一些實施例中，可使用具有用於共價連接於藥物及抗體之反應性官能基之連接子製備抗體-藥物結合物(ADC)。舉例而言，在一些實施例中，抗體(Ab)之半胱胺酸硫醇可與連接子或藥物-連接子中間物之反應性官能基形成鍵以製備ADC。
在一個態樣中，連接子具有能夠與存在於抗體上之游離半胱胺酸反應以形成共價鍵之官能基。非限制性示範性此等反應性官能基包括順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯胺、α-鹵乙醯基、活化酯(諸如丁二醯亞 胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯)、酸酐、酸氯化物、磺醯氯化物、異氰酸酯及異硫氰酸酯。參見例如在Klussman等人，(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773之第766頁處之結合方法及本文中之實例。
在一些實施例中，連接子具有能夠與存在於抗體上之親電子基團反應之官能基。示範性此等親電子基團包括(但不限於)醛及酮羰基。在一些實施例中，連接子之反應性官能基之雜原子可與抗體上之親電子基團反應且與抗體單元形成共價鍵。非限制性示範性此等反應性官能基包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼。
連接子可包含一或多種連接子組分。示範性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲基氧基羰基(「PAB」)、N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(「SPP」)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(「MCC」)。各種連接子組分在此項技術中為已知的，以下描述其中一些連接子組分。
連接子可為有助於釋放藥物之「可裂解連接子」。非限制性示範性可裂解連接子包括酸不穩定性連接子(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)連接子、光不穩定性連接子或含有二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；US 5208020)。
在某些實施例中，連接子具有下式II：-Aa-Ww-Yy-II
其中A為「延伸子單元」，且a為0至1之整數；W為「胺基酸單元」，且w為0至12之整數；Y為「間隔子單元」，且y為0、1或2。包含式II連接子之ADC具有式I(A)：Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p，其中Ab、D及p係 如上文對於式I所定義。此等連接子之示範性實施例描述於美國專利第7,498,298號中，該專利以引用的方式明確併入本文中。
在一些實施例中，連接子組分包含使抗體連接於另一連接子組分或藥物部分之「延伸子單元」(A)。以下顯示非限制性示範性延伸子單元(其中波形線指示與抗體、藥物或其他連接子組分共價連接之位點)：
在一些實施例中，連接子組分包含「胺基酸單元」(W)。在一些此等實施例中，胺基酸單元允許連接子由蛋白酶裂解，從而有助於在暴露於細胞內蛋白酶(諸如溶酶體酶)後自免疫結合物釋放藥物(Doronina等人，(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784)。示範性胺基酸單元包括(但不限於)二肽、三肽、四肽及五肽。示範性二肽包括(但不限於)纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；苯丙胺酸-高離胺酸(phe-homolys)；及N- 甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。示範性三肽包括(但不限於)甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可包含天然存在之胺基酸殘基及/或次要胺基酸及/或非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可經設計及最佳化以可由特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D，或纖維蛋白溶酶蛋白酶)進行酶促裂解。
通常，肽型連接子可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此等肽鍵可例如根據液相合成法來製備(例如E.Schröder及K.Lübke,(1965)「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，Academic Press)。
在一些實施例中，連接子組分包含使抗體直接或經由延伸子單元及/或胺基酸單元連接於藥物部分之「間隔子單元」(Y)。間隔子單元可為「自我分解型」或「非自我分解型」間隔子單元。「非自我分解型」間隔子單元為間隔子單元之一部分或全部在ADC裂解後仍結合於藥物部分之間隔子單元。非自我分解型間隔子單元之實例包括(但不限於)甘胺酸間隔子單元及甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。在一些實施例中，由腫瘤細胞相關蛋白酶對含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之ADC進行酶促裂解會使得甘胺酸-甘胺酸-藥物部分自ADC之其餘部分釋放。在一些此等實施例中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中經受水解步驟，由此自藥物部分裂解甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。
「自我分解型」間隔子單元允許釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔子單元包含對胺基苯甲基單元。在一些此等實施例中，對胺基苯甲醇經由醯胺鍵連接於胺基酸單元，且在苯甲醇與藥物之間形成胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人，(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103)。在一些實施例中，間隔子單元包含對胺基苯甲基氧基羰基(PAB)。在一些實施例中，包 含自我分解型連接子之ADC具有以下結構：
其中Q為-C1-C8烴基、-O-(C1-C8烴基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為0至4範圍內之整數；X可為一或多個另外之間隔子單元或可不存在；且p在1至約20之範圍內。在一些實施例中，p在1至10、1至7、1至5或1至4之範圍內。非限制性示範性間隔子單元X包括：及；其中R1及R2係獨立地選自H及C1-C6烴基。在一些實施例中，R1及R2各自為-CH3。
自我分解型間隔子之其他實例包括(但不限於)在電子學方面與PAB基團類似之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(美國專利第7,375,078號；Hay等人，(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰胺基苯甲基縮醛或對胺基苯甲基縮醛。在一些實施例中，可使用在醯胺鍵水解後進行環化之間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人，(1995)Chemistry Biology 2：223)、經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人，(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人，(1990)J.Org.Chem.55：5867)。藥物與甘胺酸殘基之α-碳之鍵聯為可適用於ADC中之自我分解型間隔子之另一實例(Kingsbury等人，(1984)J.Med.Chem.27：1447)。
在一些實施例中，連接子L可為用於經由分支多官能連接子部分使一個以上藥物部分共價連接於抗體之樹枝型連接子(Sun等人，(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等 人，(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。樹枝狀連接子可增加藥物與抗體的莫耳比，亦即負載量，此與ADC之效能相關。因此，當抗體僅攜帶一個反應性半胱胺酸硫醇基時，可經由樹枝狀連接子連接許多藥物部分。
以下顯示在式I之ADC之情形下的非限制性示範性連接子： ；其中R1 及R2係獨立地選自H及C1-C6烴基。在一些實施例中，R1及R2各自為-CH3。
Ab；其中n為0至12。在一些實施例中，n為2至10。在一些實施例中，n為4至8。
其他非限制性示範性ADC包括以下結構： 其中X為： Y為： 各R獨立地為H或C1-C6烴基；且n為1至12。
在一些實施例中，連接子經調節溶解性及/或反應性之基團取代。作為一非限制性實例，諸如磺酸酯基(-SO3 -)或銨之帶電荷取代基可增加連接子試劑之水溶性且有助於連接子試劑與抗體及/或藥物部分之偶合反應，或有助於Ab-L(抗體-連接子中間物)與D，或有助於D-L(藥物-連接子中間物)與Ab之偶合反應，視用於製備ADC之合成途徑而定。在一些實施例中，使連接子之一部分偶合於抗體且使連接子之一部分偶合於藥物，且接著使Ab-(連接子部分)a偶合於藥物-(連接子部分)b以形成式I之ADC。
本發明化合物明確涵蓋(但不限於)用以下連接子試劑製備之ADC：雙-順丁烯二醯亞胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-順丁烯二醯亞胺基丙基氧基)-N-羥基丁二醯亞胺酯(BMPS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基)丁二醯亞胺酯(EMCS)、N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基]丁二醯亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯基碸(HBVS)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸)丁二醯亞胺酯(LC-SMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、3-(溴乙醯胺基)丙酸丁二醯亞胺酯(SBAP)、碘乙酸丁二醯亞胺酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸丁二醯亞胺酯(SIAB)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸丁二醯亞胺酯(SMPB)、6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸]丁二醯亞胺酯(SMPH)、亞胺基硫雑環戊烷(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基- MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯(SVSB)，且包括雙-順丁烯二醯亞胺試劑：二硫基雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(以下所示)及BM(PEG)3(以下所示)；亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己烷二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-伸乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些實施例中，雙-順丁烯二醯亞胺試劑允許抗體中之半胱胺酸之硫醇基連接於含硫醇之藥物部分、連接子或連接子-藥物中間物。與硫醇基具有反應性之其他官能基包括(但不限於)碘乙醯胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯及異硫氰酸酯。
某些適用之連接子試劑可自各種商業來源獲得，諸如Pierce Biotechnology公司(Rockford,IL)、Molecular Biosciences公司(Boulder,CO)，或可根據此項技術中；例如以下文獻中所述之程序合成：Toki等人，(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；Dubowchik等人，(1997)Tetrahedron Letters,38：5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355；Frisch等人，(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189； US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828。
碳-14標記之1-異硫氰醯基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸結合於抗體之示範性螯合劑。參見例如WO94/11026。
b)示範性藥物部分
(1)美登素(Maytansine)及美登木素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個美登木素分子之抗體。美登木素為美登素之衍生物，且為藉由抑制微管蛋白聚合而起作用之有絲分裂抑制劑。美登素最初自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離(美國專利第3896111號)。隨後，發現某些微生物亦產生美登木素，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成美登木素例如揭示於美國專利第4,137,230號；第4,248,870號；第4,256,746號；第4,260,608號；第4,265,814號；第4,294,757號；第4,307,016號；第4,308,268號；第4,308,269號；第4,309,428號；第4,313,946號；第4,315,929號；第4,317,821號；第4,322,348號；第4,331,598號；第4,361,650號；第4,364,866號；第4,424,219號；第4,450,254號；第4,362,663號；及第4,371,533號中。
美登木素藥物部分為抗體-藥物結合物中之有吸引力之藥物部分，因為其：(i)相對容易藉由發酵或化學修飾或衍生化發酵產物來製備得到，(ii)易受適用於經由非二硫化物連接子結合於抗體之官能基衍生化，(iii)在血漿中穩定，及(iv)對多種腫瘤細胞株有效。
適用作美登木素藥物部分之某些美登木素在此項技術中為已知的且可根據已知方法自天然來源分離或使用遺傳工程改造技術產生(參見例如Yu等人，(2002)PNAS 99：7968-7973)。美登木素亦可根據已知方法合成製備。
示範性美登木素藥物部分包括(但不限於)具有諸如以下之經修飾 芳環的美登木素藥物部分：C-19-去氯(美國專利第4256746號)(例如藉由用氫化鋰鋁還原安絲菌素(ansamytocin)P2來製備)；C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4361650號及第4307016號)(例如藉由使用鏈黴菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)進行去甲基化或使用LAH進行去氯來製備)；及C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(例如藉由使用醯氯化物進行醯化來製備)以及在芳環之其他位置處具有修飾者。
示範性美登木素藥物部分亦包括具有諸如以下之修飾的美登木素藥物部分：C-9-SH(美國專利第4424219號)(例如藉由使美登醇與H2S或P2S5反應來製備)；C-14-烴氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；C-14-羥甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4450254號)(例如自土壤絲菌(Nocardia)製備)；C-15-羥基/醯氧基(US 4364866)(例如藉由鏈黴菌使美登醇轉化來製備)；C-15-甲氧基(美國專利第4313946號及第4315929號)(例如自滑桃樹(Trewia nudlflora)分離)；C-18-N-去甲基(美國專利第4362663號及第4322348號)(例如藉由用鏈黴菌對美登醇進行去甲基化來製備)；及4,5-去氧(US 4371533)(例如藉由用三氯化鈦/LAH還原美登醇來製備)。
美登木素化合物上之許多位置適用作鍵聯位置。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與羥基反應來形成酯鍵。在一些實施例中，反應可發生在具有羥基之C-3位置、經羥甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置處。在一些實施例中，在美登醇或美登醇類似物之C-3位置處形成鍵聯。
美登木素藥物部分包括具有以下結構者：
其中波形線指示美登木素藥物部分之硫原子與ADC之連接子的共價連接。各R可獨立地為H或C1-C6烴基。使醯胺基連接於硫原子之伸烷基鏈可為甲烷基、乙烷基或丙基，亦即m為1、2或3(US 633410；US 5208020；Chari等人，(1992)Cancer Res.52：127-131；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：8618-8623)。
美登木素藥物部分之所有立體異構體皆預期用於本發明之ADC，亦即在對掌性碳處R及S組態之任何組合(US 7276497；US 6913748；US 6441163；US 633410(RE39151)；US 5208020；Widdison等人，(2006)J.Med.Chem.49：4392-4408，其以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，美登木素藥物部分具有以下立體化學：
美登木素藥物部分之示範性實施例包括(但不限於)具有以下結構之DM1；DM3；及DM4：
其中波形線指示藥物之硫原子與抗體-藥物結合物之連接子(L)的共價連接。
其他示範性美登木素抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫(其中Ab為抗體且p為1至約20。在一些實施例中，p為1至10，p為1至7，p為1至5，或p為1至4)：
DM1經由BMPEO連接子連接於抗體之硫醇基之示範性抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫：
其中Ab為抗體；n為0、1或2；且p為1至約20。在一些實施例中，p為1至10，p為1至7，p為1至5，或p為1至4。
含有美登木素之免疫結合物、其製備方法及其治療用途例如揭 示於美國專利第5,208,020號及第5,416,064號；US 2005/0276812 A1；及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，該等專利之揭示內容以引用的方式明確併入本文中。亦參見Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)；及Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)。
在一些實施例中，抗體-美登木素結合物可藉由使抗體化學連接於美登木素分子而不顯著削弱抗體或美登木素分子之生物活性來製備。參見例如美國專利第5,208,020號(其揭示內容以引用的方式明確併入本文中)。在一些實施例中，每個抗體分子結合有平均3-4個美登木素分子之ADC在增強對目標細胞之細胞毒性方面已顯示出功效而不負面影響抗體之功能或溶解性。在一些情況下，甚至每個抗體分子一個毒素分子預期亦會使細胞毒性增強超過使用裸抗體。
用於製備抗體-美登木素結合物之示範性連接基團包括例如本文所述者及以下文獻中所揭示者：美國專利第5208020號；歐洲專利0 425 235 B1；Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；US 2005/0276812 A1；及US 2005/016993 A1，該等文獻之揭示內容以引用的方式明確併入本文中。
(2)奧里斯他汀及多拉司他汀
藥物部分包括多拉司他汀、奧里斯他汀及其類似物及衍生物(US 5635483；US 5780588；US 5767237；US 6124431)。奧里斯他汀為海洋軟體動物化合物多拉司他汀-10之衍生物。儘管不意欲受任何特定理論束縛，但多拉司他汀及奧里斯他汀已經顯示會干擾微管動力學、GTP水解以及核及細胞分裂(Woyke等人，(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5663149)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀/奧里斯他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端連接於抗體(WO 02/088172；Doronina等人，(2003) Nature Biotechnology 21(7)：778-784；Francisco等人，(2003)Blood 102(4)：1458-1465)。
示範性奧里斯他汀實施例包括US 7498298及US 7659241中揭示之N端連接型單甲基奧里斯他汀藥物部分DE及DF，該等專利之揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中：
其中DE及DF之波形線指示與抗體或抗體-連接子組分共價連接之位點，且獨立地在各位置處：R2係選自H及C1-C8烴基；R3係選自H、C1-C8烴基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烴基-芳基、C1-C8烴基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烴基-(C3-C8雜環)；R4係選自H、C1-C8烴基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烴基-芳基、C1-C8烴基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烴基-(C3-C8雜環)；R5係選自H及甲基；或R4與R5共同形成碳環且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra及Rb係獨立地選自H、C1-C8烴基及C3-C8碳環且n係選自2、3、4、5及6；R6係選自H及C1-C8烴基；R7係選自H、C1-C8烴基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烴基-芳基、C1-C8烴基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烴基-(C3-C8雜環)；各R8係獨立地選自H、OH、C1-C8烴基、C3-C8碳環及O-(C1-C8烴基)； R9係選自H及C1-C8烴基；R10係選自芳基或C3-C8雜環；Z為O、S、NH或NR12，其中R12為C1-C8烴基；R11係選自H、C1-C20烴基、芳基、C3-C8雜環、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m為1-1000範圍內之整數；R13為C2-C8烴基；R14為H或C1-C8烴基；R15在每次出現時皆獨立地為H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烴基；R16在每次出現時皆獨立地為H、C1-C8烴基或-(CH2)n-COOH；R18係選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環)及-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環)；且n為0至6範圍內之整數。
在一個實施例中，R3、R4及R7獨立地為異丙基或第二丁基且R5為-H或甲基。在一示範性實施例中，R3及R4各自為異丙基，R5為-H，且R7為第二丁基。
在另一實施例中，R2及R6各自為甲基，且R9為-H。
在另一實施例中，R8在每次出現時皆為-OCH3。
在一示範性實施例中，R3及R4各自為異丙基，R2及R6各自為甲基，R5為-H，R7為第二丁基，R8在每次出現時皆為-OCH3，且R9為-H。
在一個實施例中，Z為-O-或-NH-。
在一個實施例中，R10為芳基。
在一示範性實施例中，R10為-苯基。
在一示範性實施例中，當Z為-O-時，R11為-H、甲基或第三丁 基。
在一個實施例中，當Z為-NH時，R11為-CH(R15)2，其中R15為-(CH2)n-N(R16)2，且R16為-C1-C8烴基或-(CH2)n-COOH。
在另一實施例中，當Z為-NH時，R11為-CH(R15)2，其中R15為-(CH2)n-SO3H。
具有式DE之一示範性奧里斯他汀實施例為MMAE，其中波形線指示與抗體-藥物結合物之連接子(L)之共價連接：
具有式DF之一示範性奧里斯他汀實施例為MMAF，其中波形線指示與抗體-藥物結合物之連接子(L)之共價連接：
其他示範性實施例包括在五肽奧里斯他汀藥物部分之C端處具有苯丙胺酸羧基修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽奧里斯他汀藥物部分之C端處具有苯丙胺酸側鏈修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008603)。
包含MMAE或MMAF及各種連接子組分之式I之ADC之非限制性示範性實施例具有以下結構及縮寫(其中「Ab」為抗體；p為1至約8，「Val-Cit」為纈胺酸-瓜胺酸二肽；且「S」為硫原子)：
包含MMAF及各種連接子組分之式I之ADC之非限制性示範性實施例進一步包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。包含藉由不可蛋白水解裂解之連接子連接於抗體之MMAF的免疫結合物已經顯示具有與包含藉由可蛋白水解裂解之連接子連接於抗體之MMAF之免疫結合物類似的活性(Doronina等人，(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)。在一些此等實施例中，咸信藉由抗體在細胞中之降解來實現藥物釋放。
通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此等肽鍵可例如根據液相合成法製備(參見例如E.Schröder及K.Lübke,「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)。在一些實施例中，奧里斯他汀/多拉司他汀藥物部分可根據以下之方法製備：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465； Pettit等人，(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；Pettit等人，(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
在一些實施例中，具有式DE之奧里斯他汀/多拉司他汀藥物部分(諸如MMAE)及具有式DF之奧里斯他汀/多拉司他汀藥物部分(諸如MMAF)及其藥物-連接子中間物及衍生物(諸如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF及MC-vc-PAB-MMAE)可使用以下文獻中所述之方法製備且接著結合於相關抗體：US 7498298；Doronina等人，(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124；及Doronina等人，(2003)Nat.Biotech.21：778-784。
(3)卡奇黴素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個卡奇黴素分子之抗體。卡奇黴素家族之抗生素及其類似物能夠在低於皮莫耳濃度下引起雙股DNA斷裂(Hinman等人，(1993)Cancer Research 53：3336-3342；Lode等人，(1998)Cancer Research 58：2925-2928)。卡奇黴素具有細胞內作用位點，但在某些情況下不易於跨越質膜。因此，在一些實施例中，此等藥劑經由抗體介導之內化達成之細胞攝取可極大增強其細胞毒性作用。製備具有卡奇黴素藥物部分之抗體-藥物結合物之非限制性示範性方法例如描述於US 5712374；US 5714586；US 5739116；及US 5767285中。
(4)吡咯并苯并二氮呯
在一些實施例中，ADC包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些實施例中，PDB二聚體識別且結合於特定DNA序列。天然產物安麯黴素(anthramycin)(一種PBD)最初在1965年得到報導(Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87：5793-5795；Leimgruber等人，(1965)J. Am.Chem.Soc.,87：5791-5793)。從此，許多天然存在之PBD及PBD類似物已得到報導(Thurston等人，(1994)Chem.Rev.1994,433-465)，包括三環PBD骨架之二聚體(US 6884799；US 7049311；US 7067511；US 7265105；US 7511032；US 7528126；US 7557099)。在不意欲受任何特定理論束縛下，咸信二聚體結構會賦予適當之三維形狀以與B型DNA之小溝具等螺旋性(isohelicity)，從而在結合位點處引起適貼配合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19：230-237)。攜帶C2芳基取代基之二聚PBD化合物已經顯示適用作細胞毒性劑(Hartley等人，(2010)Cancer Res.70(17)：6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7)：2927-2941；Howard等人，(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters 19(22)：6463-6466)。
已使PBD二聚體結合於抗體且所得ADC經顯示具有抗癌性質。 PBD二聚體上之非限制性示範性鍵聯位點包括五員吡咯并環、PBD單元之間的系鏈及N10-C11亞胺基團(WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598)。
ADC之非限制性示範性PBD二聚體組分具有式A：
以及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示與連接子共價連接之位點；點線指示視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；R2係獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、 =C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD係獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q係獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'係各自獨立地選自視情況經取代之C1-8烴基、C1-12烴基、C3-8雜環基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況對於基團NRR'，R及R'連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；R12、R16、R19及R17分別係如對於R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可間雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代；且X及X'係獨立地選自O、S及N(H)。
在一些實施例中，R及R'係各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烴基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況對於基團NRR'，R及R'連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環。
在一些實施例中，R9及R19為H。
在一些實施例中，R6及R16為H。
在一些實施例中，R7及R17均為OR7A，其中R7A為視情況經取代之C1-4烴基。在一些實施例中，R7A為Me。在一些實施例中，R7A為Ch2Ph，其中Ph為苯基。
在一些實施例中，X為O。
在一些實施例中，R11為H。
在一些實施例中，在各單體單元中之C2與C3之間存在雙鍵。
在一些實施例中，R2及R12係獨立地選自H及R。在一些實施例中，R2及R12獨立地為R。在一些實施例中，R2及R12獨立地為視情況經取代之C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些實施例中，R2及R12獨立地為視情況經取代之苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或異喹啉基。在一些實施例中，R2及R12係獨立地選自=O、=CH2、=CH-RD及=C(RD)2。在一些實施例中，R2及R12各自為=CH2。在一些實施例中，R2及R12各自為H。在一些實施例中，R2及R12各自為=O。在一些實施例中，R2及R12各自為=CF2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地為=C(RD)2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地為=CH-RD。
在一些實施例中，當R2及/或R12為=CH-RD時，各基團可獨立地具有以下所示之任一組態：
在一些實施例中，=CH-RD係呈組態(I)。
在一些實施例中，R"為C3伸烷基或C5伸烷基。
在一些實施例中，ADC之示範性PBD二聚體組分具有式A(I)之結構： 其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之示範性PBD二聚體組分具有式A(II)之結構： 其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之示範性PBD二聚體組分具有式A(III)之結構： 其中RE及RE"係各自獨立地選自H或RD，其中RD係如上所定義；且其中n為0或1。
在一些實施例中，n為0。在一些實施例中，n為1。在一些實施例中，RE及/或RE"為H。在一些實施例中，RE及RE"為H。在一些實施例中，RE及/或RE"為RD，其中RD為視情況經取代之C1-12烴基。在一些實施例中，RE及/或RE"為RD，其中RD為甲基。
在一些實施例中，ADC之示範性PBD二聚體組分具有式A(IV)之結構： 其中Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1與Ar2可相同或不同；且其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之示範性PBD二聚體組分具有式A(V)之 結構： 其中Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1與Ar2可相同或不同；且其中n為0或1。
在一些實施例中，Ar1及Ar2係各自獨立地選自視情況經取代之苯基、呋喃基、噻吩基及吡啶基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何可用環位置結合於PBD核心。舉例而言，喹啉基可為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。在一些實施例中，喹啉基係選自喹啉-3-基及喹啉-6-基。異喹啉基可為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4-基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。在一些實施例中，異喹啉基係選自異喹啉-3-基及異喹啉-6-基。
ADC之其他非限制性示範性PBD二聚體組分具有式B：
以及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示與連接子共價連接之位點；連接於OH之波形線指示S或R組態； RV1及RV2係獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟基取代，特定言之在4位上經取代)及C5-6雜環基；其中RV1與RV2可相同或不同；且n為0或1。
在一些實施例中，RV1及RV2係獨立地選自H、苯基及4-氟苯基。
在一些實施例中，連接子可連接在PBD二聚體藥物部分之各個位點中之一者上，包括B環之N10亞胺、C環之C-2內向/外向位或連接A環之系鏈單元(參見以下結構C(I)及C(II))。
ADC之非限制性示範性PBD二聚體組分包括式C(I)及C(II)：
式C(I)及C(II)係以其N10-C11亞胺形式顯示。示範性PBD藥物部分亦包括甲醇胺以及經保護之甲醇胺形式，如下表中所示：
其中：X為CH2(n=1至5)、N或O；Z及Z'係獨立地選自OR及NR2，其中R為含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烴基鏈；R1、R'1、R2及R'2係各自獨立地選自H、C1-C8烴基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括經取代之芳基)、C5-20雜芳基、-NH2、- NHMe、-OH及-SH，其中，在一些實施例中，烴基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子；R3及R'3係獨立地選自H、OR、NHR及NR2，其中R為含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烴基鏈；R4及R'4係獨立地選自H、Me及OMe；R5係選自C1-C8烴基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括經鹵基、硝基、氰基、烴氧基、烴基、雜環基取代之芳基)及C5-20雜芳基，其中，在一些實施例中，烴基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子；R11為H、C1-C8烴基或保護基(諸如乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)、9-茀基亞甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自我分解性單元之部分，諸如纈胺酸-瓜胺酸-PAB)；R12為H、C1-C8烴基或保護基；其中R1、R'1、R2、R'2、R5或R12中之一者之氫或A環之間的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-間隔子之氫經連接於ADC之連接子的鍵置換。
ADC之示範性PDB二聚體部分包括(但不限於)(波形線指示與連接子共價連接之位點)： PBD二聚體； 包含PBD二聚體之ADC之非限制性示範性實施例具有以下結構：
PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab；
PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab，其中：n為0至12。在一些實施例中，n為2至10。在一些實施例中，n為4至8。在一些實施例中，n係選自4、5、6、7及8。
PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab及PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab之連接子可為蛋白酶所裂解，而PBD二聚體-順丁烯二醯亞胺-縮醛之連接子具有酸不穩定性。
PBD二聚體及包含PBD二聚體之ADC可根據此項技術中已知之方法製備。參見例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598。
(5)蒽環黴素
在一些實施例中，ADC包含蒽環黴素。蒽環黴素為展現細胞毒性活性之抗生素化合物。儘管不意欲受任何特定理論束縛，但研究已指示蒽環黴素可藉由許多不同機制起作用來殺死細胞，該等機制包括：1)藥物分子嵌入細胞之DNA中，藉此抑制DNA依賴性核酸合成；2)藉由藥物產生自由基，該等自由基接著與細胞巨分子反應以對細胞造成破壞，及/或3)藥物分子與細胞膜相互作用(參見例如C.Peterson等人，「Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia」,Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R.Bachur,「Free Radical Damage」(同上)，在第97-102頁)。由於蒽環黴素之細胞毒性潛力，其已用於治療眾多癌症，諸如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(參見例如P.H-Wiernik,Anthracycline：Current Status And New Developments，第11頁)。
非限制性示範性蒽環黴素包括小紅莓、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、柔紅黴素(daunomycin)、奈莫柔比星及其衍生物。已製備並研究道諾黴素及小紅莓之免疫結合物及前藥(Kratz等人，(2006)Current Med.Chem.13：477-523；Jeffrey等人，(2006)Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362；Torgov等人，(2005)Bioconj.Chem.16：717-721；Nagy等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834；Dubowchik等人，(2002)Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532；King等人，(2002)J.Med.Chem.45：4336-4343；EP 0328147；US 6630579)。抗體-藥物結合物BR96-小紅莓與腫瘤相關抗原Lewis-Y特異性反應且已在I期及II期研究中進行評估(Saleh等人，(2000)J.Clin.Oncology 18：2282-2292；Ajani等人，(2000)Cancer Jour.6：78-81；Tolcher等人，(1999)J.Clin.Oncology 17：478-484)。
PNU-159682為奈莫柔比星之一種有效代謝物(或衍生物)(Quintieri等人，(2005)Clinical Cancer Research 11(4)：1608-1617)。奈莫柔比星為小紅莓之一種在小紅莓之糖苷胺基上具有2-甲氧基嗎啉基之半合成類似物且已處於臨床評估中(Grandi等人，(1990)Cancer Treat.Rev.17：133；Ripamonti等人，(1992)Brit.J.Cancer 65：703)，包括針對肝細胞癌之II/III期試驗(Sun等人，(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22,Abs1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research ,44：第1版，Abs 464.9；Pacciarini等人，(2006)Jour.Clin.Oncology 24：14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之非限制性示範性ADC顯示於式Ia中：
其中R1為氫原子、羥基或甲氧基且R2為C1-C5烴氧基；或其醫藥學上可接受之鹽；L1及Z一起為如本文所述之連接子(L)；T為如本文所述之抗體(Ab)；且m為1至約20。在一些實施例中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2均為甲氧基(-OMe)。
另一包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之非限制性示範性 ADC顯示於式Ib中：
其中R1為氫原子、羥基或甲氧基且R2為C1-C5烴氧基；或其醫藥學上可接受之鹽；L2及Z一起為如本文所述之連接子(L)；T為如本文所述之抗體(Ab)；且m為1至約20。在一些實施例中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2均為甲氧基(-OMe)。
在一些實施例中，含奈莫柔比星ADC之奈莫柔比星組分為PNU-159682。在一些此等實施例中，ADC之藥物部分可具有以下結構中之一者： 其中波形線指示與連接子(L)之連接。
包括PNU-159682之蒽環黴素可經由若干鍵聯位點及包括本文所述之連接子之多種連接子(US 2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)結合於抗體。
包含奈莫柔比星及連接子之示範性ADC包括(但不限於)：
PNU-159682-順丁烯二醯亞胺縮醛-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子(R1R2)-Ab，其中：R1及R2係獨立地選自H及C1-C6烴基；以及
PNU-159682-順丁烯二醯亞胺-Ab。
PNU-159682-順丁烯二醯亞胺縮醛-Ab之連接子具有酸不穩定性，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab、PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子-Ab及PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子(R1R2)-Ab之連接子可為蛋白酶所裂解。
(6)其他藥物部分
藥物部分亦包括格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人，(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人，(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人，(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)；及酶活性毒素及其片段，包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、康乃馨(dianthin)蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecenes)。參見例如WO 93/21232。
藥物部分亦包括具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶)。
在某些實施例中，免疫結合物可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用於產生放射性結合抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在一些實施例中，當使用免疫結合物進行偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如Tc99或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，諸如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合劑錯合且結合於抗體例如以用於PET成像(WO 2011/056983)。
放射性標記或其他標記可以已知方式併入免疫結合物中。舉例 而言，肽可生物合成或使用包含例如一或多個氟-19原子以替代一或多個氫之適合胺基酸前驅體加以化學合成。在一些實施例中，諸如Tc99、I123、Re186、Re188及In111之標記可經由抗體中之半胱胺酸殘基加以連接。在一些實施例中，釔-90可經由抗體之離胺酸殘基加以連接。在一些實施例中，可使用IODOGEN法(Fraker等人，(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)描述某些其他方法。
在某些實施例中，免疫結合物可包含結合於前藥活化酶之抗體。在一些此等實施例中，前藥活化酶將前藥(例如肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉化成活性藥物，諸如抗癌藥物。在一些實施例中，此等免疫結合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法(「ADEPT」)中。可結合於抗體之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶，其適用於將含磷酸酯前藥轉化成游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於將含硫酸酯前藥轉化成游離藥物；胞嘧啶去胺酶，其適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)，其適用於將含肽前藥轉化成游離藥物；D-丙胺醯基羧基肽酶，其適用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶，其適用於將糖基化前藥轉化成游離藥物；β-內醯胺酶，其適用於將經β-內醯胺衍生化之藥物轉化成游離藥物；及青黴素(penicillin)醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其適用於將在胺氮處分別經苯氧乙醯基或苯基乙醯基衍生化之藥物轉化成游離藥物。在一些實施例中，可藉由此項技術中熟知之重組DNA技術使酶共價結合於抗體。參見例如Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)。
c)藥物負載量
藥物負載量由p表示，即式I分子中每個抗體所對應之藥物部分之平均數目。藥物負載量可在每個抗體1至20個藥物部分(D)之範圍內。式I之ADC包括結合有一定範圍(1至20個)之藥物部分之抗體的集合。由結合反應獲得之ADC製備物中每個抗體所對應之藥物部分之平均數目可藉由諸如質譜、ELISA分析及HPLC之習知方式來表徵。亦可測定用p表示之ADC的定量分佈。在一些情況下，可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式自具有其他藥物負載量之ADC分離、純化及表徵p為某一值之均質ADC。
對於一些抗體-藥物結合物，p可受限於抗體上連接位點之數目。舉例而言，當連接物為如以上某些示範性實施例中之半胱胺酸硫醇時，抗體可僅具有一個或具有若干個半胱胺酸硫醇基，或可僅具有一個或具有若干個可藉以連接連接子之具有足夠反應性之硫醇基。在某些實施例中，較高藥物負載量(例如p>5)可導致某些抗體-藥物結合物聚集、不溶、毒性或細胞滲透性喪失。在某些實施例中，ADC之平均藥物負載量在1至約8；約2至約6；或約3至約5之範圍內。實際上，已顯示對於某些ADC，最佳藥物部分/抗體比率可小於8，且可為約2至約5(US 7498298)。
在某些實施例中，使少於理論最大值之藥物部分在結合反應期間結合於抗體。抗體可含有例如不與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基，如下文所論述。一般而言，抗體並非含有許多可連接於藥物部分之游離及反應性半胱胺酸硫醇基；實際上，抗體中之大多數半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋鍵形式存在。在某些實施例中，可用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑，在部分或完全還原條件下還原抗體，以產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，使抗體經受變性條件以暴露反應性親核基團，諸如離胺酸 或半胱胺酸。
ADC之負載量(藥物/抗體比率)可以不同方式加以控制，且例如藉由以下來控制：(i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體之莫耳過量，(ii)限制結合反應時間或溫度，及(iii)部分或完全限制用於半胱胺酸硫醇修飾之還原性條件。
應瞭解當一個以上親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應時，則所得產物為分佈有一或多個連接於抗體之藥物部分之ADC化合物的混合物。每個抗體所對應之藥物之平均數目可藉由對抗體具有特異性且對藥物具有特異性之雙重ELISA抗體分析自混合物計算。可藉由質譜鑒別混合物中之個別ADC分子且藉由HPLC(例如疏水性相互作用層析)分離(參見例如McDonagh等人，(2006)Prot.Engr.Design & Selection 19(7)：299-307；Hamblett等人，(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070；Hamblett,K.J.等人，「Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」，摘要第624號，American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人，「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」，摘要第627號，American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月)。在某些實施例中，具有單一負載量值之均質ADC可藉由電泳或層析自結合混合物中分離。
d)某些製備免疫結合物之方法
式I之ADC可採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑，藉由多種途徑製備，包括：(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L，隨後與藥物部分D反應；及(2)使 藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，隨後與抗體之親核基團反應。經由後一途徑製備式I之ADC之示範性方法描述於US 7498298中，該專利以引用的方式明確併入本文中。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N端胺基，(ii)側鏈胺基，例如離胺酸，(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸，及(iv)糖羥基或胺基(在抗體經糖基化的情況下)。胺基、硫醇基及羥基具有親核性且能夠與包括以下之連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烴基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑處理以使抗體完全或部分還原來使抗體具有與連接子試劑結合之反應性。各半胱胺酸橋因此將在理論上形成兩個反應性硫醇親核體。 其他親核基團可經由例如藉由使離胺酸殘基與2-亞胺基硫雑環戊烷(特勞特氏試劑(Traut's reagent))反應，從而使得胺轉化成硫醇以修飾離胺酸殘基而引入抗體中。反應性硫醇基亦可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基來引入抗體中(例如藉由製備包含一或多個非原生半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體來達成)。
本發明之抗體-藥物結合物亦可藉由抗體上之親電子基團(諸如醛或酮羰基)與連接子試劑或藥物上之親核基團之間的反應來產生。連接子試劑上之適用親核基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼。在一個實施例中，抗體經修飾以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應之親電子部分。在另一實施例中，糖基化抗體之糖可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應之醛基或酮基。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵聯，或可例如藉由硼氫化物試劑還原 以形成穩定胺鍵聯。在一個實施例中，使糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可在抗體中產生可與藥物上之適當基團反應之羰基(醛及酮)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，可使含有N端絲胺酸或酥胺酸殘基之抗體與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛而非第一胺基酸(Geoghegan及Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。可使該種醛與藥物部分或連接子親核體反應。
藥物部分上之示範性親核基團包括(但不限於)：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡腙、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，其能夠與包括以下之連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烴基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。
可用於製備ADC之非限制性示範性交叉連接子試劑在本文中描述於標題為「示範性連接子」之部分中。使用此等交叉連接子試劑來連接兩個部分(包括蛋白質部分及化學部分)之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可例如藉由重組技術或肽合成來製備包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。重組DNA分子可包含編碼結合物之抗體及細胞毒性部分之區域，該等區域彼此鄰近或由編碼不破壞結合物之所需性質之連接子肽的區域分開。
在另一實施例中，抗體可結合於「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素(streptavidin))以用於腫瘤預靶向中，其中向患者投與抗體-受體結合物，隨後使用清除劑自循環中移除未結合之結合物且接著投與結合於細胞毒性劑(例如藥物或放射性核苷酸)之「配體」(例如抗生物素蛋白(avidin))。
E.用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文提供之任何抗LgR5抗體皆適用於偵測LgR5在生物樣品中之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。「生物樣品」包含例如細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或潛在癌性結腸、結腸直腸、小腸、子宮內膜、胰腺或卵巢組織)。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法中之抗LgR5抗體。在另一態樣中，提供一種偵測LgR5在生物樣品中之存在之方法。在某些實施例中，該方法包括使生物樣品與如本文所述之抗LgR5抗體在容許該抗LgR5抗體結合於LgR5之條件下接觸，及偵測在該抗LgR5抗體與該生物樣品中之LgR5之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，例如在LgR5為用於選擇患者之生物標記的情況下，使用抗LgR5抗體選擇適合於用抗LgR5抗體進行之療法的受試者。在另一實施例中，生物樣品為細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或潛在癌性結腸、結腸直腸、小腸、子宮內膜、胰腺或卵巢組織)。
在另一實施例中，例如出於對癌症進行診斷、預測或分級；確定適當療程；或監測癌症對療法之反應之目的，在活體內使用抗LgR5抗體例如藉由活體內成像來偵測受試者之LgR5陽性癌症。此項技術中已知之一種用於活體內偵測之方法為免疫正電子發射斷層攝影術(免疫PET)，如例如van Dongen等人，The Oncologist 12：1379-1389(2007)及Verel等人，J.Nucl.Med.44：1271-1281(2003)中所述。在此等實施例中，提供一種用於偵測受試者之LgR5陽性癌症之方法，該方法包括向患有或懷疑患有LgR5陽性癌症之受試者投與經標記抗LgR5抗體，及偵測該受試者體內之該經標記抗LgR5抗體，其中偵測到該經標記抗LgR5抗體指示在該受試者體內存在LgR5陽性癌症。在某些此等實施例中，經標記抗LgR5抗體包含結合於諸如68Ga、18F、 64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I之正電子發射體之抗LgR5抗體。在一特定實施例中，正電子發射體為89Zr。
在其他實施例中，診斷或偵測方法包括使固定於基質之第一抗LgR5抗體與欲測試LgR5之存在之生物樣品接觸，使該基質暴露於第二抗LgR5抗體，及偵測該第二抗LgR5是否結合於該第一抗LgR5抗體與該生物樣品中之LgR5之間的複合物。基質可為任何支撐性介質，例如玻璃、金屬、陶瓷、聚合珠粒、載片、晶片及其他基質。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或潛在癌性結腸、結腸直腸、小腸、子宮內膜、胰腺或卵巢組織)。在某些實施例中，第一或第二抗LgR5抗體為本文所述之任何抗體。在一些此等實施例中，第二抗LgR5抗體可為例如如本文所述之8E11或源於8E11之抗體。在一些此等實施例中，第二抗LgR5抗體可為例如如本文所述之YW353或源於YW353之抗體。在一些實施例中，第一或第二抗LgR5抗體係選自例如如本文所述之3G12及2H6及源於3G12及/或2H6之抗體。
可根據以上任何實施例診斷或偵測之示範性病症包括LgR5陽性癌症，諸如LgR5陽性結腸直腸癌(包括腺癌)、LgR5陽性小腸癌(包括腺癌、肉瘤(例如平滑肌肉瘤)、類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤及淋巴瘤)、LgR5陽性卵巢癌(包括卵巢漿液性腺癌)、LgR5陽性胰腺癌(包括胰腺導管腺癌)及LgR5陽性子宮內膜癌。在一些實施例中，LgR5陽性癌症為所得到之抗LgR5免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)計分大於「0」之癌症，計分為0對應於在本文於實例B中所述之條件下，在>90%之腫瘤細胞中染色極弱或無染色。在另一實施例中，LgR5陽性癌症以如本文於實例B中所述之條件下所定義之1+級、2+級或3+級表現LgR5。在一些實施例中，LgR5陽性癌症為根據偵測LgR5 mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析測定表現LgR5之癌症。在一些實施例中， RT-PCR為定量RT-PCR。
在某些實施例中，提供經標記抗LgR5抗體。標記包括(但不限於)可直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子密集標記、化學發光標記及放射性標記)以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配體。示範性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土金屬螯合物或螢光素(fluorescein)及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基；傘形酮(umbelliferone)；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素(luciferin)；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶(uricase)及黃嘌呤氧化酶，以及採用過氧化氫來氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基；及其類似標記。在另一實施例中，標記為正電子發射體。正電子發射體包括(但不限於)68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I。在一特定實施例中，正電子發射體為89Zr。
F.醫藥調配物
如本文所述之抗LgR5抗體或免疫結合物之醫藥調配物係藉由混合具有所需純度之此抗體或免疫結合物與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980))而製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲 醇；對羥基苯甲酸烴酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚(catechol)；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文之示範性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International公司)。某些示範性sHASEGP(包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡糖胺聚糖酶，諸如軟骨素酶(chondroitinase)組合。
示範性凍乾抗體或免疫結合物調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體或免疫結合物調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述者，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文之調配物亦可含有一種以上如為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充活性的活性成分。舉例而言，在一些情況下，可能需要進一步提供Avastin®(貝伐單抗)以例如治療LgR5陽性癌症，諸如LgR5陽性結腸癌或LgR5陽性結腸直腸癌。
可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分截留於所製備之微膠囊中，例如分別於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微 球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或於巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體或免疫結合物之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物品，例如薄膜或微膠囊形式。
欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。可易於例如藉由經無菌過濾膜過濾來達成無菌。
G.治療方法及組合物
本文提供之任何抗LgR5抗體或免疫結合物皆可用於例如治療方法之方法中。
在一個態樣中，本文提供之抗LgR5抗體或免疫結合物係用於抑制LgR5陽性細胞增殖之方法中，該方法包括在容許該抗LgR5抗體或免疫結合物結合於該細胞之表面上之LgR5的條件下使該細胞暴露於該抗LgR5抗體或免疫結合物，藉此抑制該細胞之增殖。在某些實施例中，該方法為活體外或活體內方法。在其他實施例中，細胞為結腸、結腸直腸、小腸、卵巢、胰腺或子宮內膜細胞。
在一些實施例中，本文提供之抗LgR5抗體或免疫結合物係用於治療癌症的方法中，該癌症在至少一部分癌細胞中包含Kras基因突變及/或腺瘤性多發性結腸息肉(APC)基因突變。在各種實施例中，癌症係選自結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌、卵巢癌、胰腺癌及子宮內膜癌。在一些實施例中，本文提供之抗LgR5抗體或免疫結合物係用於治療結腸癌或結腸直腸癌的方法中，該結腸癌或結腸直腸癌在至少一部分癌細胞中包含Kras基因突變及/或APC基因突變。存在於癌症(包括結腸癌及結腸直腸癌)中之非限制性示範性Kras突變包括Kras密碼子12處之突變(例如G12D、G12V、G12R、G12C、G12S及G12A)、密 碼子13處之突變(例如G13D及G13C)、密碼子61處之突變(例如G61H、G61L、G61E及G61K)及密碼子146處之突變。參見例如Yokota,Anticancer Agents Med.Chem.,12：163-171(2012)；Wicki等人，Swiss Med.Wkly,140：w13112(2010)。存在於癌症中之非限制性示範性APC突變包括突變密集區(MCR)中之突變，諸如終止密碼子及框移突變，其會產生截短型APC基因產物。參見例如Chandra等人，PLoS One,7：e34479(2012)；及Kohler等人，Hum.Mol.Genet.,17：1978-1987(2008)。
在一些實施例中，一種治療癌症之方法包括向受試者投與抗LgR5抗體或免疫結合物，其中該受試者患有在至少一部分癌細胞中包含Kras突變及/或APC突變之癌症。在一些實施例中，癌症係選自結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌、卵巢癌、胰腺癌及子宮內膜癌。在一些實施例中，癌症為結腸癌及/或結腸直腸癌。在一些實施例中，該受試者先前已經確定患有在至少一部分癌細胞中包含Kras突變及/或APC突變之癌症。在一些實施例中，癌症為LgR5陽性癌症。
可藉由許多方法分析各種生物標記在樣品中之存在，其中許多方法在此項技術中為已知的且由熟練技術人員所瞭解，該等方法包括(但不限於)免疫組織化學(「IHC」)、西方墨點分析、免疫沈澱、分子結合分析、ELISA、ELIFA、螢光活化細胞分選(「FACS」)、MassARRAY、蛋白質組學、基於血液之定量分析(如例如血清ELISA)、生物化學酶活性分析、原位雜交、南方分析、北方分析、全基因組定序、聚合酶鏈反應(「PCR」)(包括定量即時PCR(「qRT-PCR」))及其他擴增型偵測方法(諸如分支DNA、SISBA、TMA及其類似方法)、RNA-Seq、FISH、微陣列分析、基因表現譜分析及/或基因表現系列分析(「SAGE」)，以及可藉由蛋白質、基因及/或組織陣列分析進行之廣泛多種分析中之任一者。用於評估基因及基因產物狀態 之典型方案例如見於Ausubel等人編，1995,Current Protocols In Molecular Biology，第2單元(北方墨點法)、第4單元(南方墨點法)、第15單元(免疫墨點法)及第18單元(PCR分析)中。亦可使用多重免疫分析，諸如可自Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery(「MSD」)獲得之免疫分析。
可使用可自Promega(Madison,WI)購得之CellTiter-GloTM發光細胞活力分析來分析在活體外對細胞增殖之抑制作用。彼分析基於對存在之ATP進行定量來測定培養物中之活細胞數，ATP為具有代謝活性之細胞之指示物。參見Crouch等人，(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88；美國專利第6602677號。分析可以96孔或384孔形式進行，從而使得可進行自動高通量篩檢(HTS)。參見Cree等人，(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404。分析程序涉及向培養細胞中直接添加單一試劑(CellTiter-Glo®試劑)。此會導致細胞溶解及產生藉由螢光素酶反應所產生之發光信號。發光信號與存在之ATP之量成比例，存在之ATP之量與培養物中存在之活細胞數成正比。資料可由光度計或CCD攝影機成像裝置記錄。發光輸出值係表示為相對光單位(RLU)。
在另一態樣中，提供一種用作藥物之抗LgR5抗體或免疫結合物。在其他態樣中，提供一種用於治療方法中之抗LgR5抗體或免疫結合物。在某些實施例中，提供一種用於治療LgR5陽性癌症之抗LgR5抗體或免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有LgR5陽性癌症之個體之方法中的抗LgR5抗體或免疫結合物，該方法包括向該個體投與有效量之該抗LgR5抗體或免疫結合物。在一個此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種例如如下所述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供抗LgR5抗體或免疫結合物用於製造或製備藥物之用途。在一個實施例中，該藥物係用於治療LgR5陽性 癌症。在另一實施例中，該藥物係用於治療LgR5陽性癌症之方法中，該方法包括向患有LgR5陽性癌症之個體投與有效量之該藥物。在一個此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種例如如下所述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療LgR5陽性癌症之方法。在一個實施例中，該方法包括向患有此LgR5陽性癌症之個體投與有效量之抗LgR5抗體或免疫結合物。在一個此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種如下所述之其他治療劑。
根據以上任何實施例之LgR5陽性癌症可為例如LgR5陽性結腸癌或結腸直腸癌(包括腺癌)、LgR5陽性小腸癌(包括腺癌、肉瘤(例如平滑肌肉瘤)、類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤及淋巴瘤)、LgR5陽性卵巢癌(包括卵巢漿液性腺癌)、LgR5陽性胰腺癌(包括胰腺導管腺癌)及LgR5陽性子宮內膜癌。在一些實施例中，LgR5陽性癌症為所得到之抗LgR5免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)計分大於「0」之癌症，計分為0對應於在本文於實例B中所述之條件下，在>90%之腫瘤細胞中染色極弱或無染色。在另一實施例中，LgR5陽性癌症以如本文於實例B中所述之條件下所定義之1+級、2+級或3+級表現LgR5。在一些實施例中，LgR5陽性癌症為根據偵測LgR5 mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析測定表現LgR5之癌症。在一些實施例中，RT-PCR為定量RT-PCR。
根據以上任何實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之任何抗LgR5抗體或免疫結合物之例如用於以上任何治療方法中的醫藥調配物。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗LgR5抗體或免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗LgR5抗體或免疫結合物及至少一種例如如下所述之其他 治療劑。
本發明之抗體或免疫結合物可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明之抗體或免疫結合物可與至少一種其他治療劑共投與。在某些實施例中，其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗)，例如用於治療LgR5陽性癌症，諸如LgR5陽性結腸癌或LgR5陽性結腸直腸癌。
以上所述之此等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或各別調配物中)，及單獨投藥，在該情況下，可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與本發明之抗體或免疫結合物。本發明之抗體或免疫結合物亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體或免疫結合物(及任何其他治療劑)可藉由任何適合方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內投藥，且在需要用於局部治療時，包括病變內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。可藉由任何適合途徑進行給藥，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射進行給藥，在某種程度上視投藥為短期抑或長期而定。本文涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或歷經各個時間點多次投藥、快速注射投藥及脈衝輸注。
將以符合優良醫學規範之方式對本發明之抗體或免疫結合物進行調配、給藥及投藥。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體或免疫結合物無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量視調配物中存在之抗體或免疫結合物之量、病症或治療類型及以上論述之其他因素而定。此等藥劑係通常以與本文所述相同之劑量及用如本文所述之投藥途徑，或以本文所述劑量之約1%至99%，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任 何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑加以使用。
為預防或治療疾病，本發明之抗體或免疫結合物(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將視欲治療疾病之類型、抗體或免疫結合物之類型、疾病之嚴重性及病程、投與抗體或免疫結合物係出於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體或免疫結合物之反應及主治醫師之判斷而定。抗體或免疫結合物適合一次性或歷經一系列治療向患者投與。視疾病之類型及嚴重性而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)之抗體或免疫結合物可為用於向患者投與之初始候選劑量，無論是例如藉由一或多次分開投藥，或是藉由連續輸注投藥。視以上提及之因素而定，一種典型日劑量可能在約1μg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上之範圍內。對於歷經數天或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療將通常持續直至對疾病症狀產生所需抑制作用為止。抗體或免疫結合物之一種示範性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg之一或多種劑量(或其任何組合)。此等劑量可間歇投與，例如每週或每三週一次(例如以使患者接受約兩劑至約二十劑，或例如約六劑抗體)。最初可投與較高之起始劑量，接著可投與一或多種較低劑量。然而，其他給藥方案可能適用。此療法之進展易於藉由習知技術及分析加以監測。
應瞭解以上任何調配物或治療方法皆可使用本發明之免疫結合物與抗LgR5抗體兩者進行。
H.製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。該製品包含容器及在該容器上或與該容器相伴之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容 納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病症之另一組合物組合之組合物且可具有無菌存取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體或免疫結合物。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體或免疫結合物；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點看來合乎需要之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
III.實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解鑒於以上提供之一般性描述，可實施各種其他實施例。
A.人類LgR5基因表現
使用含有基因表現資訊之專有資料庫(GeneExpress®，Gene Logic公司，Gaithersburg,MD)分析人類LgR5基因表現。使用微陣列譜檢視器對GeneExpress®資料庫進行圖解分析。圖1為各種組織中之人類LgR5基因表現之圖示。y軸上之標度指示基於雜交信號強度之基因表現量。點出現在自所列之各組織之名稱延伸之線的左側與右側。出現在線左側之點表示正常組織中之基因表現，且出現在線右側之點表示腫瘤及患病組織中之基因表現。圖1圖示相對於某些腫瘤或患病組織之正常對應物，LgR5基因在某些腫瘤或患病組織中之表現有所增加。特定言之，LgR5實質上過度表現於結腸直腸腫瘤、子宮內膜腫 瘤及卵巢腫瘤中。圖1插圖圖示LgR5過度表現於至少以下結腸腫瘤中：腺癌、良性腫瘤及轉移性結腸腫瘤，以及過度表現於結腸腫瘤含量小於50%之組織中(圖1插圖中之「較低腫瘤」)；但不過度表現於正常結腸、克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎中。人類LgR5在正常組織中之表現低得多，其中在正常腦、肌肉、卵巢及胎盤組織中之表現量較低。
B.人類LgR5在結腸腫瘤中之出現率
為評估LgR5在結腸直腸癌中之表現，自多個來源(Asterand,Detroit,MI；Bio-Options,Fullerton,CA；University of Michigan,Ann Arbor,MI；Cytomyx,Rockville,MD；Cooperative Human Tissue Network,Nashville,TN；Indivumed,Hamburg,Germany；ProteoGenex,Culver City,CA)獲得57個原發性結腸直腸腺癌。44%之樣品來自男性，且患者之平均年齡為66歲(在31歲至93歲之範圍內)。如BubendorfL等人，J Pathol.2001年9月；195(1)：72-9中所述，使用重複核心組裝組織微陣列(TMA)，且包括來自匹配病例之五個正常結腸直腸黏膜樣品。
使用表2中所示之寡核苷酸探針，藉由原位雜交測定LgR5表現。參見例如Jubb AM等人，Methods Mol Biol 2006；326：255-64。使用β-肌動蛋白之ISH在分析之前確認結腸直腸癌組織中之mRNA完整性。
根據以下方案，在考慮強度(銀粒)以及染色寬度下，由經專門訓練的病理學家對LgR5雜交強度進行計分。
0(陰性)：>90%腫瘤細胞中極弱雜交或無雜交
1+(輕度)：主要雜交型態微弱
2+(中度)：在大多數(>50%)贅生性細胞中主要雜交型態中等強烈
3+(強烈)：在大多數(>50%)贅生性細胞中主要雜交型態強烈
使用有義探針來控制雜交特異性。
圖2圖示具有1+級、2+級及3+級染色之示範性結腸腫瘤切片。頂部畫面圖示暗視野影像且底部畫面圖示亮視野影像。暗視野影像中之銀粒沈積指示探針之雜交及LgR5 mRNA之表現。所分析之約77%(41/53)之結腸腫瘤切片呈LgR5陽性，顯示出1+級、2+級或3+級之染色，其中34%(18/53)顯示出2+級或3+級之染色。所分析之57個樣品中有4個樣品無LgR5表現資訊。
為評估結腸腫瘤中Lgr5表現之顯著性，根據聖詹姆斯大學醫烷(St James' University Hospital)(Leeds,UK)自1988年至2003年之病理學檔案對一系列基於群體之已進行手術切除結腸直腸腺癌之患者進行回顧性彙編。如Bubendorf L等人，J Pathol.2001年9月；195(1)：72-9中所述，用每個患者一個正常黏膜核心及三個腺癌核心建構組織微陣列(TMA)。如上所述進行ISH且計分。亦確定來自同一腫瘤之三個核心之間的表現異質性，且表示為在三個核心中之一者中顯示特定不一致度之腫瘤之比例。舉例而言，若三個核心具有+1、+3及+3之計分，則來自彼腫瘤之三個核心中之一者的不一致度為2。
圖3A圖示結腸腫瘤組織微陣列中藉由原位雜交所量測之0級、1+級、2+級及3+級LgR5染色之出現率。75%之結腸腫瘤組織顯示出1+級、2+級或3+級之染色，其中37%顯示出2+級或3+級染色。圖3B圖示LgR5表現之異質性。67%之腫瘤在三個核心之間未顯示出異質性。 32%顯示三個核心中之一者具有1之不一致度，且僅1%顯示出大於1之不一致度。
C.小鼠單株抗體產生
使用以下程序產生針對人類LgR5之單株抗體。自桿狀病毒表現系統表現具有C端標記His之Fc的人類LgR5細胞外域(ECD；胺基酸22-557)，且在Ni-NTA管柱(Qiagen)上純化，隨後如先前(Kirchhofer等人，2003)所述於20mM MES(pH 6.0)、6M鹽酸胍中在Superdex 200管柱上進行凝膠過濾且透析至PBS中以儲存於-80℃下。
用含huLgR5質體DNA之乳酸林格氏溶液(經由尾靜脈)或用含如上所述之重組人類LgR5 ECD之佐劑(經由後足墊)對15隻Balb/c小鼠(Charles River Laboratories International公司，Hollister,CA,USA)進行注射，該佐劑含有可代謝角鯊烯(squalene)(4% v/v)、吐溫80(Tween 80)(0.2% v/v)、海藻糖6,6-二黴菌酸酯(0.05% w/v)及單磷醯基脂質A(0.05% w/v；Sigma Aldrich,USA)。在6-9次注射之後，藉由標準酶聯免疫吸附分析(ELISA)及FACS評估血清效價。藉由電融合(Hybrimune；Harvard Apparatus公司，Holliston,MA,USA)使自總共5隻小鼠收集之脾B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(X63.Ag8.653；美國菌種中心(American Type Culture Collection)，Manassas,VA,USA)融合。在10-14天之後，藉由ELISA針對抗體分泌篩檢融合瘤上清液。接著擴充所有陽性純系且藉由ELISA及FACS針對與huLgR5及muLgR5之結合(亦即針對與293-huLGR5及293-muLGR5細胞之結合)進行再篩檢。在兩輪次.選殖(藉由限制稀釋法)之後，融合瘤純系8E11.1.1(自DNA免疫接種小鼠所鑒別)以及2H6.3.5及3G12.2.1(兩者均來自蛋白質免疫接種之小鼠)顯示出高免疫結合性且按比例擴大以供在INTEGRA CELLine 1000生物反應器(INTEGRA Biosciences AG,Zizers,Switzerland)中純化。接著藉由親和層析純化上清液，無菌過濾且在4℃下於PBS中儲 存。使用Isostrip小鼠單株抗體同型分析套組(Roche Applied Biosciences,Indianapolis,IN,USA)確定該等單株抗體之同型為IgG1(κ輕鏈)。
圖4圖示產生之某些單株抗體以及某些性質，其中一些將在以下進一步詳細描述。
D.小鼠單株抗體之選殖及嵌合
如下選殖且嵌合單株抗體8E11、3G12及2H6。
使用標準方法自產生鼠類8E11、鼠類3G12或鼠類2H6之融合瘤細胞提取總RNA。用針對重鏈及輕鏈之簡並引子，使用RT-PCR擴增可變輕(VL)域及可變重(VH)域。正向引子對VL及VH區之N端胺基酸序列具有特異性。分別設計LC及HC反向引子以黏接於在物種之間高度保守之恆定輕域(CL)及恆定重域1(CH1)中之區域。使用常規定序方法測定插入物之聚核苷酸序列。8E11 VL及VH胺基酸序列分別圖示於圖5及圖6中(分別為SEQ ID NO：3及4)。3G12及2H6 VL及VH胺基酸序列分別圖示於圖7及圖8中。抗體3G12之VL及VH序列分別顯示於SEQ ID NO：21及22中，且抗體2H6之VL及VH序列分別顯示於SEQ ID NO：23及24中。
藉由將小鼠重鏈可變區選殖於人類IgG1重鏈恆定區上且將輕鏈可變區選殖於人類κ輕鏈恆定區上來使各抗體嵌合。
E. 8E11之人類化
如下所述使單株抗體8E11人類化。殘基編號係根據Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
於接受體人類共同構架上之直接高變區移植
以IgG形式評定在8E11之人類化期間建構之變異體。將來自鼠類8E11之VL及VH域與人類VL κ IV(VLKIV)及人類VH亞群I(VHI)共同序 列比對。將來自鼠類8E11(mu8E11)抗體之高變區工程改造於VLKIV及VHI接受體構架中以產生8E11.v1。詳言之，將來自mu8E11 VL域之位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植於VLKIV中。將來自mu8E11 VH域之位置26-35(H1)、49-65(H2)及95-102(H3)移植於VHI中。此外，VH之構架III中之位置71及78自8E11.v1中之小鼠序列保留。發現彼等殘基為充當可調節CDR結構及微調抗原配合之「標(Vernier)」區域之構架殘基的一部分。參見例如Foote及Winter,J.Mol.Biol.224：487-499(1992)(圖5及圖6)。此等CDR定義包括藉由其序列高變性(Wu,T.T.及Kabat,E.A.(1970))、其結構位置(Chothia,C.及Lesk,A.M.(1987))及其涉及於抗原-抗體接觸中(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))所確定之位置。
產生其他8E11變異體以評估諸如輕鏈中之位置68及重鏈中之位置67及69之其他標位置的作用。藉由在重鏈可變區之位置67及69處保留兩個附加小鼠殘基來產生人類化8E11.v2。8E11.v2及其他變異體之輕鏈可變區序列及重鏈可變區序列分別圖示於圖5及圖6中。
藉由使用針對各高變區之各別寡核苷酸進行Kunkel突變誘發來產生8E11之人類化變異體。藉由DNA定序鑒別正確純系。
評定變異體
出於篩檢目的，最初於293細胞中產生IgG變異體。將編碼VL及VH之載體轉染至293細胞中。藉由蛋白質A親和層析自細胞培養基中純化IgG。
藉由使用BIAcoreTM-3000進行表面電漿子共振來測定各8E11 IgG變異體對人類LgR5之親和力。根據供應商說明書，用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)試劑活化BIAcoreTM研究級CM5晶片。使山羊抗人類Fc IgG偶合於晶片以在各流動槽中達成約10,000反應單位(RU)。用1M乙醇胺阻斷未反應之偶 合基團。對於動力學量測，捕捉抗LGR5抗體以達成約300 RU。可在25℃下以流速30μl/min注射人類LgR5 ECD(在桿狀病毒系統中表現之融合於His-Fc之胺基酸22-557，或由CHO細胞表現之融合於Fc之胺基酸22-558；125nM至0.49nM)於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之兩倍連續稀釋液。使用1：1朗繆爾結合模型(BIAcoreTM評估軟體第3.2版)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係計算為比率koff/kon。
結果
用於使8E11人類化之人類接受體構架係基於人類VL κ IV共同(VLKIV)構架及接受體VH構架VHI。產生mu8E11之八種人類化變異體且藉由BIAcoreTM測試LgR5親和力。各變異體之輕鏈可變區及重鏈可變區分別圖示於圖5及圖6中。親和力量測結果圖示於圖9中。
為改良8E11.v1之結合親和力，將輕鏈中之位置68及重鏈中之位置67及69變成在mu8E11中之此等位置處存在之殘基。將重鏈中之位置71及78變成在人類構架VHI中之此等位置處存在之殘基。使此等經改變輕鏈與重鏈之組合以IgG形式表現且如上所述加以純化，並藉由Biacore評定與人類LgR5之結合(圖9)。
藉由將hu8E11.v1重鏈之位置67及69變成在mu8E11中之彼等位置處存在之殘基來產生變異體hu8E11.v2。發現hu8E11.v2之親和力(KD)與親本ch8E11抗體大致相同。
人類化8E11.v2之變化的概述
將6個鼠類8E11 CDR(如位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)及93-102(H3)所界定)移植於人類共同VLKIV及VHI接受體域中。使位置67、69、71及78變回為mu8E11中之鼠類殘基。人類化8E11.v2對LgR5之親和力與嵌合8E11類似。
在整篇本申請案中，小鼠單株抗體8E11、2H6及3G12以替代方式分別稱為8E11、m8E11或mu8E11；及2H6、m2H6或mu2H6；及3G12、m3G12或mu3G12。嵌合單株抗體8E11、2H6及3G12分別稱為嵌合8E11或ch8E11；嵌合2H6或ch2H6；及嵌合3G12或ch3G12。人類化單株抗體8E11.v2亦可稱為8E11v2、h8E11v.2或hu8E11v.2。
F.藉由噬菌體呈現產生人類單株抗體
在CHO細胞中表現具有N端FLAG之人類LgR5 ECD(胺基酸22-555)且在抗FLAG樹脂上純化隔夜，並接著用0.1M乙酸(pH 2.7)溶離。接著藉由在Superdex 200管柱上於PBS中進行凝膠過濾來純化蛋白質且接著透析至PBS中以儲存在-80℃下。
將在所選互補決定區(H1、H2、H3)中具有合成多樣性，從而模擬人類IgG譜系之天然多樣性的人類噬菌體抗體文庫用於淘選。使Fab片段以二價形式呈現於M13噬菌體粒子之表面上(Lee等人，(2004)J Mol Biol 340,1073-93)。使用如上所述產生之人類LgR5 ECD(胺基酸22-555)作為抗原。在4℃下用LgR5 ECD蛋白質(10μg/ml)將Nunc 96孔MaxiSorp免疫培養盤(Nunc)塗佈隔夜且用補充有1% BSA之PBST緩衝液(PBS、0.05%吐溫20)阻斷1小時。添加抗體噬菌體文庫且在室溫下培育隔夜。用PBST緩衝液洗滌培養盤且用50mM HCL/500mM NaCl溶離結合之噬菌體30分鐘並用等體積之1M Tris鹼中和。在大腸桿菌XL-1 blue細胞中擴增回收之噬菌體。在隨後數輪選擇期間，將噬菌體抗體之培育時間縮短至2小時且逐漸增加培養盤洗滌之嚴格度(Liang等人，(2007)J Mol Biol 366,815-829)。藉由噬菌體ELISA及DNA定序來鑒別結合人類LgR5 ECD之獨特且具特異性之噬菌體抗體。藉由將VL及VH區分別選殖至LPG3及LPG4載體中來將包括YW353之某些純系重排成全長IgG。使抗體短暫表現於哺乳動物細胞中且在蛋白質A管柱上純化(Carter等人，(1992)Proc Natl Acad Sci U S A 89,4285-9)。
人類抗體YW353之輕鏈及重鏈可變區序列分別圖示於圖10及圖11中(SEQ ID NO：26及25)。人類抗體YW353之IgG1重鏈及κ輕鏈序列分別顯示於SEQ ID NO：66及65中。由於YW353係自人類抗體噬菌體文庫產生，所以術語「YW353」與「huYW353」在本文中可互換使用。
G.物種交叉反應性
測試單株抗體以確定其是否與來自除人類以外之物種之LgR5交叉反應。圖12A至圖12C圖示人類LgR5(SEQ ID NO：67)、石蟹獼猴LgR5(SEQ ID NO：69)、大鼠LgR5(SEQ ID NO：70)及小鼠LgR5(SEQ ID NO：72)之間的比對。所有四個物種間一致之殘基用星號(*)指示。 圖4圖示以下FACS分析之結果：用標記gD抗原決定基之LgR5(人類、石蟹獼猴、大鼠或小鼠LgR5)穩定轉染293細胞；用10μg/ml YW353、ch8E11、hu8E11.v2、2H6或3G12抗體染色；且用結合R-藻紅素(Phycoerythrin)之山羊抗人類抗體偵測。未轉染之293細胞通常不表現LgR5。YW353抗體結合人類及石蟹獼猴LgR5而不結合大鼠或小鼠LgR5。Ch8E11及hu8E11.v2抗體結合所有四個物種之LgR5，但與大鼠LgR5之結合不如與人類、石蟹獼猴或小鼠LgR5之結合強。2H6抗體結合於人類及小鼠LgR5，且未測試出其結合於石蟹獼猴或大鼠LgR5。3G12抗體顯示強烈結合於人類LgR5，與小鼠LgR5之結合強度較低，且未測試出其結合於石蟹獼猴或大鼠LgR5。
H.抗體親和力
藉由實質上如上文在實例E中所述，使用BIAcoreTM-3000進行表面電漿子共振來測定各抗體對人類LgR5之親和力。
如圖4中所示，YW353抗體結合於人類LgR5之親和力為1.6nM。Ch8E11及hu8E11.v2抗體結合於人類LgR5之親和力分別為2.4nm及3.1 nm。2H6及3G12抗體結合於人類LgR5之親和力分別為208nM及72nM。
遵循標準程序(Holmes等人，Science 256：1205-1210(1992))進行斯卡查德(Scatchard)分析以測定YW353、ch8E11及hu8E11v2抗體之相對結合親和力。
使用間接Iodogen法使抗Lgr5抗體經[I125]標記。使用NAP-5管柱(GE Healthcare)，藉由凝膠過濾自游離125I-Na純化經[I125]標記之抗Lgr5抗體；經純化之碘化抗Lgr5抗體之比活性在13.92至19.01μCi/μg之範圍內。將50μL體積之含有固定濃度之經[I125]標記之抗體及遞減濃度之經連續稀釋之未標記抗體的競爭分析混合物置放於96孔培養盤中。在37℃下在5% CO2中於生長培養基中培養穩定表現人類、大鼠或小鼠Lgr5之293細胞。使用Sigma細胞解離溶液使細胞自燒瓶脫壁且用結合緩衝液洗滌，該結合緩衝液由含2%胎牛血清(FBS)、50mM HEPES(pH 7.2)及0.1%疊氮化鈉之杜氏經改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)組成。以在0.2mL結合緩衝液中含250,000個細胞之密度將經洗滌之細胞添加至96孔培養盤中。經[I125]標記之抗體在各孔中之最終濃度為200pM。經由10步2倍稀釋使得未標記抗體在競爭分析物中之最終濃度在500nM至0nM僅含緩衝液之分析物之範圍內。一式三份進行競爭分析。在室溫下培育競爭分析物2小時。在培育2小時之後，將競爭分析物轉移至Millipore多重篩檢過濾培養盤(Billerica,MA)中且用結合緩衝液洗滌4次以使游離抗體與結合之經[I125]標記之抗體分離。在Wallac Wizard 1470 γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences公司；Wellesley,MA)上對過濾器計數。使用NewLigand軟體(Genentech)評估結合資料，該軟體使用Munson及Robard之擬合演算法來確定抗體之結合親和力(Munson及Robard,1980)。
如圖4中所示，YW353結合於穩定轉染之293細胞上表現之標記gD之人類LgR5的親和力為0.2nM。Ch8E11結合於穩定轉染之293細胞上表現之標記gD之人類LgR5及標記gD之小鼠LgR5的親和力分別為0.4nM及0.2nM。Hu8E11v2結合於穩定轉染之293細胞上表現之標記gD之人類LgR5、標記gD之小鼠LgR5及標記gD之大鼠LgR5的親和力分別為0.3-0.7nM、0.5-0.6nM及2.4-2.8nM。此等Kd值通常低於藉由BIAcore®所測定者。
I.抗原決定基定位
為確定LgR5中由各抗體所結合之區域，將用標記gD抗原決定基且具有各種N端及/或C端缺失之LgR5短暫轉染的293細胞用10μg/ml YW353、ch8E11、hu8E11v2、2H6或3G12抗體染色；且用結合R-藻紅素之山羊抗人類抗體偵測結合。抗體YW353、8E11、2H6及3G12皆結合於標記gD抗原決定基之全長LgR5。抗體2H6及3G12結合於標記gD抗原決定基之LgR5324-907(SEQ ID NO：67之胺基酸324-907)。抗體YW353及8E11不結合於標記gD抗原決定基之LgR5324-907。僅抗體YW353結合於標記gD抗原決定基且具有C端GPI錨之LgR522-123(SEQ ID NO：67之胺基酸22-123)。抗體YW353與8E11兩者均結合於標記gD抗原決定基且具有C端GPI錨之LgR522-323(SEQ ID NO：67之胺基酸22-323)，但抗體2H6及3G12並非如此。最後，無抗體結合於標記gD抗原決定基之LgR5424-907(SEQ ID NO：67之胺基酸424-907)。
圖4在標題為「抗原決定基區域」之行中概述彼等結果。如彼圖中所示，抗體YW353結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22至123之區域中的抗原決定基；抗體8E11及其人類化變異體結合於SEQ ID NO：67之胺基酸22至323之區域中的抗原決定基；且抗體2H6及3G12結合於SEQ ID NO：67之胺基酸324至423之區域中的抗原決定基。
J.產生抗LgR5抗體藥物結合物
為了較大規模產生抗體，在CHO細胞中產生抗體。將編碼VL及VH之載體轉染至CHO細胞中且藉由蛋白質A親和層析自細胞培養基中純化IgG。
抗LgR5抗體MMAE結合物
藉由使YW353(分別顯示於SEQ ID NO：66及65中之IgG1重鏈及κ輕鏈序列)、hu8E11v2(分別顯示於SEQ ID NO：64及63中之IgG1重鏈及κ輕鏈序列)、mu8E11、ch8E11、2H6、ch2H6、3G12及ch3G12結合於本文所述之藥物-連接子部分MC-vc-PAB-MMAE來產生抗LgR5抗體-藥物結合物(ADC)。為方便起見，藥物-連接子部分MC-vc-PAB-MMAE在此等實例中及在圖中有時稱為「vcMMAE」或「VCE」。在結合之前，根據WO 2004/010957 A2中所述之方法，使用標準方法用TCEP部分還原抗體。根據例如Doronina等人，(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784及US 2005/0238649 A1中所述之方法，使用標準方法使部分還原之抗體結合於藥物-連接子部分。簡言之，將部分還原之抗體與藥物-連接子部分組合以使藥物-連接子部分結合於抗體之經還原半胱胺酸殘基。淬滅結合反應，且純化ADC。確定各ADC之藥物負載量(每個抗體所對應之藥物部分之平均數目)且對於抗LgR5抗體而言，在3.3與4.0之間。抗體-vcMMAE免疫結合物之結構圖示於圖35A中(p=藥物負載量)。
抗LgR5抗體PNU結合物
藉由使YW353 A118C硫代單抗(分別顯示於SEQ ID NO：78及65中之IgG1 A118C重鏈及κ輕鏈序列)或hu8E11v2硫代單抗(分別顯示於SEQ ID NO：75及63中之IgG1 A118C重鏈及κ輕鏈序列)結合於PNU藥物-連接子部分來產生抗LgR5抗體-PNU藥物結合物(ADC)。在結合之前，用二硫蘇糖醇(DTT)還原抗體以自硫代抗體之經工程改造半胱胺酸移除阻隔基團(例如半胱胺酸)。此過程亦還原抗體之鏈間二硫鍵。 純化還原之抗體以移除釋放之阻隔基團且使用去氫抗壞血酸(dhAA)再氧化鏈間二硫化物。
對於包含val-cit連接子及PNU之抗體-藥物結合物，將完整抗體與藥物-連接子部分MC-val-cit-PAB-間隔子-PNU-159682(「val-cit」在本文中亦可稱為「vc」)組合以使藥物-連接子部分結合於抗體之經工程改造之半胱胺酸殘基。藉由添加過量N-乙醯基-半胱胺酸來與任何游離連接子-藥物部分反應以淬滅結合反應，且純化ADC。ADC之藥物負載量(每個抗體所對應之藥物部分之平均數目)在約1.8至2之範圍內。抗體-vcPNU免疫結合物之結構圖示於圖35B中(p=藥物負載量)。
對於包含縮醛連接子及PNU之抗體藥物結合物，將完整抗體與藥物-連接子部分MC-縮醛-PNU-159682組合以使藥物-連接子部分結合於抗體之經工程改造之半胱胺酸殘基。藉由添加過量N-乙醯基-半胱胺酸來與任何游離連接子-藥物部分反應以淬滅結合反應，且純化ADC。ADC之藥物負載量(每個抗體所對應之藥物部分之平均數目)為約1.8至2。抗體-縮醛-PNU免疫結合物之結構圖示於圖35C中(p=藥物負載量)。
對於包含不可裂解連接子及PNU之抗體藥物結合物，將完整抗體與藥物-連接子部分MC-PNU-159682組合以使藥物-連接子部分結合於抗體之經工程改造之半胱胺酸殘基。藉由添加過量N-乙醯基-半胱胺酸來與任何游離連接子-藥物部分反應以淬滅結合反應，且純化ADC。ADC之藥物負載量(每個抗體所對應之藥物部分之平均數目)為約1.8至2。抗體-PNU免疫結合物之結構圖示於圖35D中(p=藥物負載量)。
抗LgR5抗體PBD結合物
藉由使YW353 A118C硫代單抗(分別顯示於SEQ ID NO：78及65中之IgG1 A118C重鏈及κ輕鏈序列)或hu8E11v2硫代單抗(分別顯示於 SEQ ID NO：75及63中之IgG1 A118C重鏈及κ輕鏈序列)結合於PBD藥物-連接子部分來產生抗LgR5抗體-PBD藥物結合物(ADC)。在結合之前，用二硫蘇糖醇(DTT)還原抗體以自硫代抗體之經工程改造半胱胺酸移除阻隔基團(例如半胱胺酸)。此過程亦還原抗體之鏈間二硫鍵。純化還原之抗體以移除釋放之阻隔基團且使用去氫抗壞血酸(dhAA)再氧化鏈間二硫化物。
對於包含val-cit連接子及PBD之抗體-藥物結合物，將完整抗體與藥物-連接子部分MC-val-cit-PAB-PBD(「val-cit」在本文中亦可稱為「vc」)組合以使藥物-連接子部分結合於抗體之經工程改造之半胱胺酸殘基。藉由添加過量N-乙醯基-半胱胺酸來與任何游離連接子-藥物部分反應以淬滅結合反應，且純化ADC。ADC之藥物負載量(每個抗體所對應之藥物部分之平均數目)在約1.8至2之範圍內。抗體-vcPBD之結構圖示於圖35E中(p=藥物負載量)。
K.抗LgR5抗體藥物結合物在大鼠中之毒性
為評估抗LgR5抗體8E11.v2-vcMMAE之潛在毒性，每週一次向6隻雄性史泊格-多利(Sprague-Dawley)大鼠投與12mg/kg 8E11.v2-vcMMAE持續四週，且每週一次向6隻雄性史泊格-多利大鼠投與20mg/kg 8E11.v2-vcMMAE持續兩週。每週一次向4隻雄性史泊格-多利對照大鼠投與單獨媒劑持續兩週，且每週一次向4隻雄性史泊格-多利對照大鼠投與單獨媒劑持續四週。在第12天對兩週組中之大鼠進行屍檢且在第26天對四週組中之大鼠進行屍檢。
簡言之，相較於對照大鼠，投與8E11.v2-vcMMAE之所有大鼠皆顯示紅血球量(紅血球、血容比、血紅素及網狀紅血球)、嗜中性球及血小板有所降低。相較於對照大鼠，投與20mg/kg 8E11.v2-vcMMAE之大鼠亦顯示白血球計數及淋巴細胞有所降低。此外，相較於對照大鼠，投與8E11.v2-vcMMAE之所有大鼠皆顯示肝酶ALT、AST、ALP及 GGT有所增加及總膽紅素有所增加。
對自研究收集之組織之組織病理學分析顯示在投與8E11.v2-vcMMAE之大鼠中存在淋巴及造血組織之細胞消耗，且快速分裂組織中之有絲分裂像增加。投與20mg/kg 8E11.v2-vcMMAE之大鼠亦顯示最小限度肝壞死、最小限度有絲分裂像增加及單細胞隱窩壞死/細胞凋亡及最小限度輕度肺泡組織細胞增多症及II型細胞增生。
所觀測到之病理學變化類似於在投與其他vcMMAE抗體-藥物結合物之大鼠中所觀測到之病理學。似乎不存在任何證據表明在胃腸道中有LgR5抗原依賴性毒性。
L.抗LgR5抗體藥物結合物在LoVo結腸癌細胞株異種移植物中之功效
使用LoVo結腸癌異種移植模型研究抗LgR5 ADC之功效。LoVo細胞為具有APC突變之結腸直腸腺癌細胞株(ATCC，編號：CCL 229)。LgR5高表現於LoVo細胞中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。將500萬個LoVo細胞(藉由使用YW353進行FACS確定呈LgR5陽性)於HBSS-基質膠中皮下注射於NCR裸小鼠之背側腹中，且在接種後第六天，給與小鼠5mg/kg鼠類抗gp120-vcMMAE對照抗體-藥物結合物、人類抗gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物、huYW353-vcMMAE抗體-藥物結合物、mu8E11-vcMMAE抗體-藥物結合物、mu2H6-vcMMAE抗體-藥物結合物或mu3G12-vcMMAE抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(PBS)進行單次靜脈內注射。在注射後第一天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖13中所示，用所測試之所有四種抗LgR5抗體-藥物結合物皆達成實質性腫瘤生長抑制作用。
M.抗LgR5抗體藥物結合物在D5124胰腺癌異種移植物中之功效
使用具有β-連環蛋白突變之D5124胰腺癌異種移植模型研究抗LgR5 ADC之功效。LgR5高表現於D5124腫瘤中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片(藉由使用YW353及8E11進行FACS確定呈LgR5陽性)皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第18天，給與小鼠6mg/kg人類抗gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物、3mg/kg或6mg/kg huYW353-vcMMAE抗體-藥物結合物、3mg/kg或6mg/kg ch8E11-vcMMAE抗體-藥物結合物、3mg/kg或6mg/kg ch2H6-vcMMAE抗體-藥物結合物，或3mg/kg或6mg/kg ch3G12-vcMMAE抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5；圖14中之「HB#8」)進行單次靜脈內注射。在注射後第一天及第八天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖14中所示，在兩種劑量之huYW353-vcMMAE、ch8E11-vcMMAE及ch3G12-vcMMAE下均達成實質性腫瘤生長抑制作用。在6mg/kg ch2H6-vcMMAE下亦達成實質性腫瘤生長抑制作用。
接著測試各種劑量之YW353-vcMMAE在上述D5124胰腺癌異種移植模型中之功效。將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片(藉由使用YW353及8E11進行FACS確定呈LgR5陽性)皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第23天，給與小鼠0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg huYW353-vcMMAE抗體-藥物結合物；或12mg/kg huYW353；或7.2mg/kg或14.4mg/kg人類抗gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物；或單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5；圖15中之「HB#8」)之單次靜脈內注射。在注射後第1天、第4天及第14天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖15中所示，在3mg/kg huYW353-vcMMAE下達成實質性腫瘤生長抑制作用，且在6mg/kg及12mg/kg huYW353-vcMMAE下達成幾乎完全腫瘤生長抑制作用。
N. mu8E11及mu8E11-vcMMAE在鼠類腸腫瘤形成模型中之功效
研究mu8E11及mu8E11-vcMMAE在鼠類腸腫瘤形成模型APCmin/+；LSL-KrasG12D；VillinCre(「AKV小鼠」)中之功效。AKV小鼠為使APCmin/+；VillinCre(「AV小鼠」)與LSL-KrasG12D小鼠雜交所得之結果。在AV小鼠在結腸中產生0-4個腺瘤且在小腸中產生100個腺瘤同時，AKV小鼠則可在結腸中產生平均140個腺瘤且在小腸中產生平均100個腺瘤(資料未示)。量測LgR5 mRNA在AV及AKV小鼠之正常組織及息肉中之表現，且發現LgR5在AKV小鼠中顯著過度表現於來自小腸與結腸兩者之息肉中(圖16)。為觀測LgR5在AKV小鼠之小腸及結腸中之表現，使AKV小鼠與具有含有框內連接於位於Lgr5基因中之人類白喉毒素受體cDNA之增強型綠色螢光蛋白(EGFP)的卡匣之小鼠雜交。參見Tian等人，Nature,478：255-260(2011)。觀測AKV Lgr5 DTR/+小鼠中小腸息肉及大腸息肉中之EGFP表現面積。彼實驗之結果圖示於圖20中。發現LgR5表現在小腸息肉與結腸息肉之間並無顯著不同，且此外，在腫瘤尺寸與LgR5+面積之間不存在相關性。腫瘤之平均LgR5+面積為8%，但在腫瘤間廣泛不同。初步結果顯示人類結腸直腸腫瘤中之LgR5+面積可顯著高於小鼠，表明抗LgR5 ADC療法在人類中之治療指數可甚至比在小鼠中更佳。
為評定此等動物內腸隱窩與腫瘤之間的Lgr5表現差異，獲得來自AKV Lgr5 DTR/+小鼠之腸道且在組織切片上對GFP進行直接觀測。此後定量腫瘤及正常隱窩之各GFP陽性像素強度。為確定相對GFP強度，用強度計分除以GFP+面積。如圖23中所示，在AKV Lgr5 DTR/+小鼠中，LgR5在腫瘤中之表現高於在腸隱窩中之表現。
用AKV小鼠進行總體存活期研究以確定抗LgR5抗體是否可延長存活期。向10隻AKV小鼠投與15mg/kg mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE；向6隻AKV小鼠投與15mg/kg mu8E11，且向9隻小鼠投與15mg/kg對照抗體抗gp120-MC-vc-MMAE。在6週大時開始每週投與抗體及ADC一次直至小鼠死亡或視為瀕死(如藉由與嚴重無生氣、體重減輕及貧血之徵象相關之標準準則所確定)為止，在瀕死之情況下將小鼠處死。
總體存活期研究之結果圖示於圖17中。未處理對照資料表示22隻AKV小鼠之歷史存活率。在彼實驗中，投與mu8E11或mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE之AKV小鼠之存活時間顯著長於未處理AKV小鼠或投與對照ADC之AKV小鼠。基於此等結果，如上所述評估另外之動物。彼實驗之結果圖示於圖19中。在該較大實驗中，投與mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE之AKV小鼠之存活時間顯著長於未處理AKV小鼠或投與對照ADC之AKV小鼠，且存活時間亦長於投與mu8E11之小鼠。在死亡時，投與對照ADC之AKV小鼠與投與抗LgR5-ADC之AKV小鼠具有類似之息肉數目及尺寸，表明抗LgR5-ADC可減緩疾病且藉此延長存活期。
為確定抗LgR5抗體及/或抗LgR5 ADC是否在AKV小鼠之胃腸腫瘤中引起細胞凋亡，量測與腫瘤面積有關的裂解之半胱天冬酶3之存在。對在死亡時收集之經福馬林固定石蠟包埋(FFPE)之小腸及結腸組織針對裂解之半胱天冬酶3進行免疫組織化學染色(Cell Signaling Technologies；Danvers,MA，目錄號9661L)。藉由Olympus Nanozoomer自動載片掃描平台獲得染色載片之影像且在Matlab套裝軟體(Mathworks,Natick,MA)中分析手動鑒別之腫瘤特異性區域。定量陽性染色面積及總腫瘤面積。儘管很少，但在用抗LgR5 ADC處理之後，仍在隱窩中可見到裂解之半胱天冬酶3，而在經對照ADC處理之 動物中則未觀測到，表明LgR5表現細胞得到特異性靶向。
彼實驗之結果圖示於圖18中。相較於經對照ADC處理之AKV小鼠，抗LgR5抗體投藥與抗LgR5 ADC投藥兩者均使得AKV小鼠中對於裂解之半胱天冬酶3之存在呈陽性的腫瘤面積百分比出現統計顯著性增加。
為證明細胞凋亡發生在LgR5+細胞中，向AKV Lgr5 DTR/+小鼠投與15mg/kg mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE或15mg/kg對照抗體抗gp120-MC-vc-MMAE(第1天)。在第4天，將小鼠處死且觀測來自胃腸道(小腸及大腸)之腫瘤中EGFP及裂解之半胱天冬酶3的表現。接著測定每單位總細胞面積CC3+GFP+面積之量。如圖21A中所示，經抗LgR5-ADC處理之小鼠傾向於相較於對照處理小鼠具有較大之CC3+GFP+面積比例，但在彼實驗中不具有統計顯著性。圖21B圖示經對照ADC處理之小鼠(左側畫面)及經抗LgR5-ADC處理之小鼠(右側畫面)之示範性免疫組織化學染色。此等結果證明在抗LgR5-ADC處理後，LgR5表現細胞之細胞凋亡有增加之趨勢。
為確定LgR5表現細胞之細胞增殖是否受抗LgR5治療劑影響，量測來自經對照-ADC處理及經抗LgR5-ADC處理之AKV Lgr5 DTR/+小鼠之胃腸道之EGFP+細胞群體及EGFP-細胞群體中之每單位細胞面積Ki67+面積。Ki67為一種與細胞增殖相關之核蛋白質。自Neomarker獲得用於免疫組織化學染色之Ki67抗體。彼實驗之結果圖示於圖22中。在GFP+細胞群體與GFP-細胞群體兩者中，相較於對照ADC，在來自用抗LgR5-ADC處理之AKV Lgr5 DTR/+小鼠之腫瘤中存在顯著較小增殖細胞面積，如藉由Ki67染色所量測。此等結果表明抗LgR5-ADC會減少增殖及/或抑制增殖性子代形成。
抗LgR5抗體藥物結合物在D5124胰腺癌異種移植物中之功效
使用具有β-連環蛋白突變之D5124胰腺癌異種移植模型研究抗 LgR5 ADC之功效。LgR5高表現於D5124腫瘤中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第22天，給與小鼠2.62mg/kg或5.23mg/kg huYW353-vcMMAE抗體-藥物結合物、3mg/kg或6mg/kg ch8E11-vcMMAE抗體-藥物結合物或3mg/kg或6mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物；或6mg/kg人類化抗gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)進行單次靜脈內注射(n=每組8隻小鼠)。在注射後第一天及第八天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖24中所示，在兩種劑量之huYW353-vcMMAE、兩種劑量之hu8E11v2-vcMMAE及6mg/kg ch8E11v2-vcMMAE下達成實質性腫瘤生長抑制作用。
接著測試各種劑量之hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物在上述D5124胰腺癌異種移植模型中之功效。將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第26天，給與小鼠0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物；或15mg/kg hu8E11v2；或6.37mg/kg或12.73mg/kg人類抗gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物；或15mg/kg人類化抗gD對照抗體；或單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)之單次靜脈內注射(n=每組8隻小鼠)。
如圖25中所示，在3mg/kg及6mg/kg hu8E11v2-vcMMAE下達成實質性腫瘤生長抑制作用，且在12mg/kg hu8E11v2-vcMMAE下達成腫瘤消退。
P.抗LgR5抗體藥物結合物在LoVoX1.1結腸癌細胞株異種移植物 中之功效
使用LoVo結腸癌異種移植模型研究抗LgR5 ADC之功效。LoVo細胞為一種具有APC突變之結腸直腸腺癌細胞株(ATCC，編號：CCL 229)，且獲得次株系LoVoX1.1以達成在小鼠體內之最佳生長。簡言之，用LoVo細胞接種小鼠。一旦腫瘤生長，即收集具有所需生長速率之腫瘤。切碎腫瘤且使其於培養物中生長以產生細胞株LoVoX1.1。LgR5表現於LoVoX1.1細胞中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。將500萬個LoVoX1.1細胞於HBSS-基質膠中皮下注射於C.B-17 SCID小鼠之背側腹中，且在接種後第13天，給與小鼠3mg/kg或6mg/kg huYW353-vcMMAE抗體-藥物結合物、3mg/kg或6mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物、15mg/kg hu8E11v2抗體；15mg/kg人類化抗gD 5B6對照抗體；或6mg/kg人類化抗gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)進行單次靜脈內注射(n=每組10隻小鼠)。
如圖26中所示，在6mg/kg hu8E11v2-vcMMAE及6mg/kg huYW353-vcMMAE下達成實質性腫瘤生長抑制作用。
接著測試各種劑量之hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物在上述LoVoX1.1結腸直腸腺癌異種移植模型中之功效。將500萬個LoVoX1.1細胞於HBSS-基質膠中皮下注射於C.B-17 SCID小鼠之背側腹中，且在接種後第10天，給與小鼠1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg或15mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物；或15mg/kg hu8E11v2；或6mg/kg或15mg/kg人類化抗gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物；或單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)之單次靜脈內注射(n=每組9隻小 鼠)。在注射後第1天、第7天及第14天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖27中所示，在6mg/kg、10mg/kg及15mg/kg hu8E11v2-vcMMAE下達成實質性腫瘤生長抑制作用。
Q.抗LgR5抗體藥物結合物在D5124胰腺癌異種移植物中之功效
使用具有β-連環蛋白突變之D5124胰腺癌異種移植模型研究抗LgR5 ADC之功效。LgR5高表現於D5124腫瘤中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第26天，給與小鼠1mg/kg huYW353-vcMMAE抗體-藥物結合物、1mg/kg huYW353-vcPNU抗體-藥物結合物、1mg/kg huYW353-PNU抗體-藥物結合物、1mg/kg huYW353-縮醛-PNU抗體-藥物結合物；或1mg/kg人類化抗gD 5B6-vcPNU對照抗體-藥物結合物、1mg/kg人類化抗gD 5B6-PNU對照抗體-藥物結合物，或1mg/kg人類化抗gD 5B6-縮醛-PNU對照抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)進行單次靜脈內注射(n=每組9隻小鼠)。在注射後第3天、第7天及第14天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖28中所示，用1mg/kg huYW353-vcMMAE及1mg/kg huYW353-縮醛-PNU達成實質性腫瘤生長抑制作用，且用1mg/kg huYW353-vcPNU達成幾乎完全腫瘤生長抑制作用。1隻用1mg/kg huYW353-縮醛-PNU處理之小鼠顯示出完全反應(亦即該小鼠在研究結束時無可偵測腫瘤)。此外，2隻用1mg/kg huYW353-vcPNU處理之小鼠顯示出部分反應(亦即較第0天時之初始腫瘤體積縮減>50%)。
R.抗LgR5抗體藥物結合物在D5124胰腺癌異種移植物中之功效
測試各種劑量之hu8E11v2抗體-藥物結合物在D5124胰腺癌異種 移植模型中之功效。將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第22天，給與小鼠2mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物；或2mg/kg hu8E11v2-vcPNU；或2mg/kg或10mg/kg hu8E11v2-縮醛-PNU；或2mg/kg或10mg/kg hu8E11v2-PNU；2mg/kg人類化抗gD 5B6-vcPNU對照抗體-藥物結合物、10mg/kg人類化抗gD 5B6-縮醛-PNU對照抗體藥物結合物，或10mg/kg人類化抗gD 5B6-PNU對照抗體藥物結合物；或單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)之單次靜脈內注射(n=每組8隻小鼠)。
如圖29中所示，在2mg/kg hu8E11v2-縮醛-PNU下達成實質性腫瘤生長抑制作用，且在10mg/kg hu8E11v2-縮醛-PNU、2mg/kg hu8E11v2-vcPNU以及2mg/kg及10mg/kg hu8E11v2-PNU下達成幾乎完全腫瘤生長抑制作用。
S.抗LgR5抗體藥物結合物在LoVo結腸癌細胞株異種移植物中之功效
使用LoVo結腸癌異種移植模型研究抗LgR5 ADC之功效。LoVo細胞為一種具有APC突變之結腸直腸腺癌細胞株(ATCC，編號：CCL 229)，且獲得次株系LoVoX1.1以達成在小鼠體內之最佳生長。簡言之，用LoVo細胞接種小鼠。一旦腫瘤生長，即收集具有所需生長速率之腫瘤。切碎腫瘤且使其於培養物中生長以產生細胞株LoVoX1.1。LgR5表現於LoVoX1.1細胞中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。將500萬個LoVoX1.1細胞於HBSS-基質膠中皮下注射於C.B-17 SCID小鼠之背側腹中，且在接種後第11天，給與小鼠2mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物、2mg/kg hu8E11v2-vcPNU、2mg/kg hu8E11v2-縮醛-PNU或2mg/kg hu8E11v2-PNU；或2mg/kg人類化抗gD 5B6-vcPNU對 照抗體-藥物結合物、2mg/kg人類化抗gD 5B6-縮醛-PNU對照抗體藥物結合物，或2mg/kg人類化抗gD 5B6-PNU對照抗體藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)進行單次靜脈內注射(n=每組10隻小鼠)。在注射後第1天、第7天及第14天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖30中所示，在此實驗中，某些對照抗體似乎顯示出實質性腫瘤生長抑制作用(參見2mg/kg人類化抗gD 5B6-vcPNU及2mg/kg人類化抗gD 5B6-縮醛-PNU對照抗體藥物結合物)。
由於對照抗體在先前實驗中具有明顯非特異性作用，所以用不同對照抗體-藥物結合物(其結合於不表現於LoVo細胞之表面上之不同抗原)，且在投與過量抗gD對照抗體以阻斷腫瘤細胞上可能之非特異性抗體結合位點下測試LoVoX1.1結腸直腸腺癌模型。將500萬個LoVoX1.1細胞於HBSS-基質膠中皮下注射於C.B-17 SCID小鼠之背側腹中且在接種後第7天，給與小鼠10mg/kg hu8E11v2-縮醛-PNU抗體-藥物結合物；或10mg/kg硫代抗體-縮醛-PNU對照抗體-藥物結合物；或單獨媒劑(50mM磷酸鈉、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 7)之單次靜脈內注射(n=每組5隻小鼠)。此外，每週一次向小鼠腹膜內(i.p.)投與30mg/kg人類化抗gD對照抗體直至研究結束為止，在與測試抗體投藥同一天開始，但在測試抗體投藥之前4小時進行。
如圖31中所示，用10mg/kg hu8E11v2-縮醛-PNU達成實質性腫瘤生長抑制作用且對照抗體不抑制腫瘤生長。
T.抗LgR5抗體藥物結合物在D5124胰腺癌異種移植物中之功效
使用具有β-連環蛋白突變之D5124胰腺癌異種移植模型研究YW353抗LgR5 ADC之功效。LgR5高表現於D5124腫瘤中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。 將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第26天，給與小鼠1mg/kg huYW353-vcMMAE抗體-藥物結合物、1mg/kg huYW353-vcPBD抗體-藥物結合物；或1mg/kg人類化抗gD 5B6-vcPBD對照抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)進行單次靜脈內注射(n=每組9隻小鼠)。在注射後第1天、第7天及第14天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖32中所示，用1mg/kg huYW353-vcMMAE及1mg/kg huYW353-vcPBD達成實質性腫瘤生長抑制作用。1隻用1mg/kg huYW353-vcPBD處理之小鼠顯示出完全反應(亦即該小鼠在研究結束時無可偵測腫瘤)。
在一單獨實驗中，使用D5124胰腺癌異種移植模型研究hu8E11v2抗LgR5 ADC之功效。將20mm3至30mm3 D5124腫瘤碎片皮下植入於NCR裸小鼠之背側腹區域中，且在移植後第22天，給與小鼠2mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物、2mg/kg hu8E11v2-vcPBD抗體-藥物結合物；或2mg/kg人類化抗gD 5B6-vcPBD對照抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)進行單次靜脈內注射(n=每組8隻小鼠)。
如圖33中所示，用2mg/kg hu8E11v2-vcMMAE達成實質性腫瘤生長抑制作用，且用2mg/kg hu8E11v2-vcPBD達成腫瘤消退。
U.抗LgR5抗體藥物結合物在LoVoX1.1結腸癌細胞株異種移植物中之功效
使用LoVoX1.1結腸癌異種移植模型研究抗LgR5 ADC之功效。LoVo細胞為一種具有APC突變之結腸直腸腺癌細胞株(ATCC，編號：CCL 229)，且獲得次株系LoVoX1.1以達成在小鼠體內之最佳生長。 簡言之，用LoVo細胞接種小鼠。一旦腫瘤生長，即收集具有所需生長速率之腫瘤。切碎腫瘤且使其於培養物中生長以產生細胞株LoVoX1.1。LgR5表現於LoVoX1.1細胞中，且藉由微陣列、TaqMan®定量RT-PCR、原位雜交、FACS及西方墨點法確認。將500萬個LoVoX1.1細胞於HBSS-基質膠中皮下注射於C.B-17 SCID小鼠之背側腹中，且在接種後第11天，給與小鼠2mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗體-藥物結合物、2mg/kg hu8E11v2-vcPBD抗體-藥物結合物；或2mg/kg人類化抗gD 5B6-vcPBD對照抗體-藥物結合物之單次靜脈內注射；或用單獨媒劑(組胺酸緩衝液：20mM組胺酸乙酸鹽、240mM蔗糖、0.02%吐溫20，pH 5.5)進行單次靜脈內注射(n=每組10隻小鼠)。在注射後第1天、第7天及第14天，藉由PK取血來確認抗體之存在。
如圖34中所示，用2mg/kg hu8E11v2-vcPBD達成完全腫瘤生長抑制作用。
儘管上述本發明已出於清楚理解之目的藉由說明及實例方式相當詳細地加以描述，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文引用之所有專利及科學文獻之揭示內容皆以全文引用的方式明確併入本文中。
<110> 喬安 宏格 毛衛剛 保羅 波拉基斯 安佐 波森 拉傑許 維吉 吳 彥
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<211> 114
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<220>
<223> 合成：hukIV
<400> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：huVH1
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<223> 合成：mu8E11輕鏈可變區
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<223> 合成：mu8E11重鏈可變區
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<220>
<223> 合成：hu8E11.v1重鏈可變區
<400> 6
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v2輕鏈可變區
<400> 7
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人二序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v2重鏈可變區
<400> 8
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v3輕鏈可變區
<400> 9
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v3重鏈可變區
<400> 10
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v4輕鏈可變區
<400> 11
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v4重鏈可變區
<400> 12
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v5輕鏈可變區
<400> 13
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v5重鏈可變區
<400> 14
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v6輕鏈可變區
<400> 15
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v6重鏈可變區
<400> 16
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v7輕鏈可變區
<400> 17
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v7重鏈可變區
<400> 18
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v8輕鏈可變區
<400> 19
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v8重鏈可變區
<400> 20
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12輕鏈可變區
<400> 21
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12重鏈可變區
<400> 22
<210> 23
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6輕鏈可變區
<400> 23
<210> 24
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6重鏈可變區
<400> 24
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353輕鏈可變區
<400> 25
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353重鏈可變區
<400> 26
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu8E11 HVR L1
<400> 27
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu8E11 HVR L2
<400> 28
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu8E11 HVR L3
<400> 29
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu8E11 HVR H1
<400> 30
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu8E11 HVR H2
<400> 31
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu8E11 HVR H3
<400> 32
<210> 33
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11輕鏈(LC)構架1(FR1)
<400> 33
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11 LC FR2
<400> 34
<210> 35
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11.v1 LC FR3/Hu8E11.v2 LC FR3/Hu8E11.v5 LC FR3/Hu8E11.v6 LC FR3
<400> 35
<210> 36
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11.v3 LC FR3/Hu8E11.v4 LC FR3/Hu8E11.v7 LC FR3/Hu8E11.v8 LC FR3
<400> 36
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11 LC FR4
<400> 37
<210> 38
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11重鏈(HC)構架1(FR1)
<400> 38
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11 HC FR2
<400> 39
<210> 40
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11.v1 HC FR3/Hu8E11.v3 HC FR3
<400> 40
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11.v2 HC FR3/Hu8E11.v4 HC FR3
<400> 41
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11.v5 HC FR3/Hu8E11.v7 HC FR3
<400> 42
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11.v6 HC FR3/Hu8E11.v8 HC FR3
<400> 43
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hu8E11 HC FR4
<400> 44
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12 HVR L1
<400> 45
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12 HVR L2
<400> 46
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12 HVR L3
<400> 47
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12 HVR H1
<400> 48
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12 HVR H2
<400> 49
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu3G12 HVR H3
<400> 50
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6 HVR L1
<400> 51
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6 HVR L2
<400> 52
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6 HVR L3
<400> 53
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6 HVR H1
<400> 54
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6 HVR H2
<400> 55
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：mu2H6 HVR H3
<400> 56
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 HVR L1
<400> 57
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 HVR L2
<400> 58
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 HVR L3
<400> 59
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 HVR H1
<400> 60
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 HVR H2
<400> 61
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 HVR H3
<400> 62
<210> 63
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v2輕鏈
<400> 63
<210> 64
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v2重鏈
<400> 64
<210> 65
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353輕鏈
<400> 65
<210> 66
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353重鏈
<400> 66
<210> 67
<211> 907
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 人類LgR5前驅體；LGR5_人類NP_003658：信號序列=胺基酸1-21
<400> 67
<210> 68
<211> 886
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 成熟人類LgR5，無信號序列；胺基酸22至907
<400> 68
<210> 69
<211> 875
<212> PRT
<213> 石蟹獼猴
<220>
<221> misc_feature
<223> 預測之石蟹獼猴LgR5部分序列；預測對應於全長前驅體之胺基酸33至907
<400> 69
<210> 70
<211> 907
<212> PRT
<213> 鼠屬
<220>
<221> misc_feature
<223> 大鼠LgR5前驅體；LGR5_大鼠NP_001100254；信號序列=胺基酸1-21
<400> 70
<210> 71
<211> 886
<212> PRT
<213> 鼠屬
<220>
<221> misc_feature
<223> 成熟大鼠LgR5，無信號序列；胺基酸22至907
<400> 71
<210> 72
<211> 907
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 小鼠LgR5前驅體；LGR5_小鼠NP_034325；信號序列=胺基酸1-21
<400> 72
<210> 73
<211> 886
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> 成熟小鼠LgR5，無信號序列；胺基酸22至907
<400> 73
<210> 74
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v2 V205C半胱胺酸工程改造輕鏈(Igk)
<400> 74
<210> 75
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v2 A118C半胱胺酸工程改造重鏈(IgG1)
<400> 75
<210> 76
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hu8E11.v2 S400C半胱胺酸工程改造重鏈(IgG1)
<400> 76
<210> 77
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 V205C半胱胺酸工程改造輕鏈(Igk)
<400> 77
<210> 78
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 A118C半胱胺酸工程改造重鏈(IgG1)
<400> 78
<210> 79
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：YW353 S400C半胱胺酸工程改造重鏈(IgG1)
<400> 79
<210> 80
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：V205C半胱胺酸工程改造輕鏈恆定區(Igk)
<400> 80
<210> 81
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A118C半胱胺酸工程改造重鏈恆定區(IgG1)
<400> 81
<210> 82
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：S400C半胱胺酸工程改造重鏈恆定區(IgG1)
<400> 82
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：引子
<400> 83
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：引子
<400> 84
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：引子
<400> 85
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：引子
<400> 86

Claims (59)

  1. 一種結合LgR5之分離之抗體，其中該抗體結合SEQ ID NO：67之胺：基酸22-323內或SEQ ID NO：67之胺基酸22-123內之抗原決定基且該抗體結合於LgR5之親和力5nM。
  2. 如請求項1之抗體，其為單株抗體。
  3. 如請求項1之抗體，其為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
  4. 如請求項1之抗體，其為結合LgR5之抗體片段。
  5. 如請求項1之抗體，其中LgR5為具有SEQ ID NO：67之人類LgR5。
  6. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2；或b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3；或b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之HVR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3。
  8. 如請求項7之抗體，其中該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-H1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2、含有 胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3及：a)重鏈構架FR3序列SEQ ID NO：40；b)重鏈構架FR3序列SEQ ID NO：41；c)重鏈構架FR3序列SEQ ID NO：42；或d)重鏈構架FR3序列SEQ ID NO：43。
  9. 如請求項7或8之抗體，其中該抗體包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之HVR-H2、包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3；或b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之HVR-H2、包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。
  10. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含：a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3；或b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之HVR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之HVR-L2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之HVR-L3。
  11. 如請求項9或10之抗體，其中該抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-L1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L3，且進一步包含輕鏈構 架FR3序列SEQ ID NO：35。
  12. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含：a)與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95%序列一致性之VH序列；b)與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性之VL序列；c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列；d)與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95%序列一致性之VH序列；e)與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95%序列一致性之VL序列；f)如(d)中之VH序列及如(e)中之VL序列；g)與胺基酸序列SEQ ID NO：10具有至少95%序列一致性之VH序列；h)與胺基酸序列SEQ ID NO：9具有至少95%序列一致性之VL序列；i)如(g)中之VH序列及如(h)中之VL序列；j)與胺基酸序列SEQ ID NO：12具有至少95%序列一致性之VH序列；k)與胺基酸序列SEQ ID NO：11具有至少95%序列一致性之VL序列；l)如(j)中之VH序列及如(k)中之VL序列；m)與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有至少95%序列一致性之VH序列；n)與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少95%序列一致性之VL序列； o)如(m)中之VH序列及如(n)中之VL序列；p)與胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少95%序列一致性之VH序列；q)與胺基酸序列SEQ ID NO：15具有至少95%序列一致性之VL序列；r)如(p)中之VH序列及如(q)中之VL序列；s)與胺基酸序列SEQ ID NO：18具有至少95%序列一致性之VH序列；t)與胺基酸序列SEQ ID NO：17具有至少95%序列一致性之VL序列；u)如(s)中之VH序列及如(t)中之VL序列；v)與胺基酸序列SEQ ID NO：20具有至少95%序列一致性之VH序列；w)與胺基酸序列SEQ ID NO：19具有至少95%序列一致性之VL序列；x)如(v)中之VH序列及如(w)中之VL序列；y)與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少95%序列一致性之VH序列；z)與胺基酸序列SEQ ID NO：25具有至少95%序列一致性之VL序列；或aa)如(y)中之VH序列及如(z)中之VL序列。
  13. 如請求項12之抗體，其包含選自SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20及26之VH序列。
  14. 如請求項12或13之抗體，其包含選自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19及25之VL序列。
  15. 一種抗體，其包含： a)VH序列SEQ ID NO：6及VL序列SEQ ID NO：5；b)VH序列SEQ ID NO：8及VL序列SEQ ID NO：7；c)VH序列SEQ ID NO：10及VL序列SEQ ID NO：9；d)VH序列SEQ ID NO：12及VL序列SEQ ID NO：11；e)VH序列SEQ ID NO：14及VL序列SEQ ID NO：13；f)VH序列SEQ ID NO：16及VL序列SEQ ID NO：15；g)VH序列SEQ ID NO：18及VL序列SEQ ID NO：17；h)VH序列SEQ ID NO：20及VL序列SEQ ID NO：19；或i)VH序列SEQ ID NO：26及VL序列SEQ ID NO：25。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗體，其為IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。
  17. 一種分離之核酸，其編碼如請求項1至16中任一項之抗體。
  18. 一種宿主細胞，其包含如請求項17之核酸。
  19. 一種產生抗體之方法，其包括培養如請求項18之宿主細胞以產生該抗體。
  20. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至16中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  21. 如請求項20之免疫結合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab為如請求項1至15中任一項之抗體；(b)L為連接子；(c)D為選自美登木素(maytansinoid)、奧里斯他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯及奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物之藥物；且(d)p在1-8之範圍內。
  22. 如請求項21之免疫結合物，其中D為奧里斯他汀。
  23. 如請求項22之免疫結合物，其中D具有式DE 且其中R2及R6各自為甲基，R3及R4各自為異丙基，R5為H，R7為第二丁基，各R8係獨立地選自CH3、O-CH3、OH及H；R9為H；且R18為-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
  24. 如請求項21之免疫結合物，其中該藥物為MMAE。
  25. 如請求項21之免疫結合物，其中D為式A之吡咯并苯并二氮呯： 其中該等點線指示視情況在C1與C2或C2與C3之間存在雙鍵；R2係獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD係獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q係獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'係各自獨立地選自視情況經取代之C1-8烴基、C3-8雜環基及C5-20芳基，且視情況對於基團NRR'，R及R'連同其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環； R12、R16、R19及R17分別係如對於R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可間雜有一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳環；且X及X'係獨立地選自O、S及N(H)。
  26. 如請求項25之免疫結合物，其中D具有以下結構： 其中n為0或1。
  27. 如請求項25之免疫結合物，其中D具有選自以下之結構： 其中RE及RE"係各自獨立地選自H或RD，其中RD係獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；其中Ar1及Ar2各自獨立地為視情況經取代之C5-20芳基；且 其中n為0或1。
  28. 如請求項21之免疫結合物，其中D為式B之吡咯并苯并二氮呯： 其中該水平波形線指示與該連接子共價連接之位點；RV1及RV2係獨立地選自H、甲基、乙基、苯基、氟取代之苯基及C5-6雜環基；且n為0或1。
  29. 如請求項21之免疫結合物，其中D為奈莫柔比星衍生物。
  30. 如請求項29之免疫結合物，其中D具有選自以下之結構：
  31. 如請求項21至30中任一項之免疫結合物，其中該連接子可由蛋 白酶裂解。
  32. 如請求項31之免疫結合物，其中該連接子包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
  33. 如請求項21至30中任一項之免疫結合物，其中該連接子具有酸不穩定性。
  34. 如請求項33之免疫結合物，其中該連接子包含腙。
  35. 如請求項23之免疫結合物，其具有下式： 其中S為硫原子。
  36. 如請求項26之免疫結合物，其具有下式：
  37. 如請求項30之免疫結合物，其具有選自以下之式：
  38. 如請求項21至37中任一項之免疫結合物，其中p在2-5之範圍內。
  39. 如請求項21至38中任一項之免疫結合物，其包含如請求項9之抗體。
  40. 如請求項21至38中任一項之免疫結合物，其包含如請求項15之抗體。
  41. 一種醫藥調配物，其包含如請求項21至40中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  42. 如請求項41之醫藥調配物，其進一步包含其他治療劑。
  43. 如請求項42之醫藥調配物，其中該其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗(bevacizumab))。
  44. 一種治療患有LgR5陽性癌症之個體之方法，該方法包括向該個體投與有效量之如請求項21至40中任一項之免疫結合物。
  45. 如請求項44之方法，其中該LgR5陽性癌症係選自結腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌及子宮內膜癌。
  46. 如請求項45之方法，其進一步包括向該個體投與其他治療劑。
  47. 如請求項46之方法，其中該其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗)。
  48. 一種抑制LgR5陽性細胞增殖之方法，該方法包括在容許如請求項21至40中任一項之免疫結合物結合於該細胞之表面上之LgR5的條件下使該細胞暴露於該免疫結合物，藉此抑制該細胞之增殖。
  49. 如請求項48之方法，其中該細胞為結腸直腸癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞或子宮內膜癌細胞。
  50. 如請求項1至16中任一項之抗體，其結合於標記。
  51. 如請求項50之抗體，其中該標記為正電子發射體。
  52. 如請求項51之抗體，其中該正電子發射體為89Zr。
  53. 一種偵測生物樣品中之人類LgR5之方法，其包括使該生物樣品與如請求項1至16中任一項之抗LgR5抗體在容許該抗LgR5抗體結合於天然存在之人類LgR5的條件下接觸，及偵測在該抗LgR5抗體與該生物樣品中之天然存在之人類LgR5之間是否形成複合物。
  54. 如請求項53之方法，其中該抗LgR5抗體為如請求項9或15之抗體。
  55. 如請求項53之方法，其中該生物樣品為結腸直腸癌樣品、胰腺癌樣品、卵巢癌樣品或子宮內膜癌樣品。
  56. 一種偵測LgR5陽性癌症之方法，其包括(i)向患有或懷疑患有LgR5陽性癌症之受試者投與經標記抗LgR5抗體，其中該經標記抗LgR5抗體包含如請求項1至16中任一項之抗LgR5抗體，及(ii)偵測該受試者體內之該經標記抗LgR5抗體，其中偵測到該經標記抗LgR5抗體指示在該受試者體內存在LgR5陽性癌症。
  57. 如請求項56之方法，其中該經標記抗LgR5抗體為經標記之如請求項8或14之抗體。
  58. 如請求項56或57之方法，其中該經標記抗LgR5抗體包含結合於正電子發射體之抗LgR5抗體。
  59. 如請求項58之方法，其中該正電子發射體為89Zr。
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