MX2014011006A - Anticuerpos anti - lgr5 e inmunoconjugados. - Google Patents

Anticuerpos anti - lgr5 e inmunoconjugados.

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MX2014011006A
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sequence
amino acid
lgr5
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Andrew Polson
Yan Wu
Jo-Anne Hongo
Wei-Ching Liang
Rajesh Vij
Weiguang Mao
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Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-LgR5 e inmunoconjugados y métodos para usarlos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-LGR5 E INMUNO-CONJUGADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos anti-LgR5 e inmunoconjugados y a métodos para usarlos.
ANTECEDENTES El receptor-5 acoplado a proteína G que contiene repetición rica en leucina (LgR5) es una proteína transmembrana siete que se encuentra en la superficie de las células madre intestinales (ISC) cíclicas activas. Las ISC que expresan LgR5 son sensibles a la modulación de Wnt y son las principales responsables de la regeneración homeostática del epitelio intestinal. La eliminación de las células que expresan LgR5 en ratones no afecta la homeostasis del epitelio intestinal, sin embargo, esto sugiere que otros tipos de células pueden compensar la pérdida de esta población de células. Tian y col., Nature 478: 255-259 (2011) . Las R-spondinas potencian la señalización de WNT a través de WNT3A y las cuatro R-spondinas, RSP01, RSP02, RSP03 y RSP04, se pueden unir a LgR5. Lau y col., Nature 476: 293-297 (2011) .
La LgR5 humana es una proteína de 907 aminoácidos, de los cuales se predice que -540 aminoácidos se encuentran en el espacio extracelular después de la escisión de la secuencia señal amino terminal. LgR5 comprende 17 motivos de repetición rica en leucina imperfectos en el ectodominio y una región rica en cisterna ubicada entre las repeticiones ricas en leucina y el primer dominio transmembrana.
En la técnica existe la necesidad de agentes que tengan como diana a LgR5 para el diagnóstico y el tratamiento de las afecciones asociadas a LgR5, como el cáncer. La invención satisface esa necesidad y proporciona otros beneficios.
COMPENDIO La invención proporciona anticuerpos anti-LgR5 e inmunoconjugados y métodos para usarlos.
En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado que se une a LgR5. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene al menos una o más de las siguientes características, en cualquier combinación: (a) se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-555 de SEQ ID N. ° : 67 o se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-123 de SEQ ID N.°: 67 o se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-323 de SEQ ID N. ° : 67 o se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-424 de SEQ ID N.°: 67 o se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 324-555 de SEQ ID N. ° : 67 o se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 324-424 de SEQ ID N.°: 67; (b) se une a LgR5 con una afinidad de = 5 nM o = 4 nM o = 3 nM o < 2 nM o < l nM y opcionalmente = 0,0001 nM o = 0,001 nM o = 0,01 nM; (c) no interrumpe significativamente la unión de R-spondina (RSPO) a LgR5; (d) no interrumpe significativamente la señalización de beta-catenina; (e) no interrumpe significativamente la activación por RSPO de la señalización de LgR5; (f) activa la escisión de la caspasa 3; (g) reconoce la LgR5 humana y de roedores; (h) reconoce la LgR5 humana pero no la LgR5 de roedores; (i) no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en su forma no conjugada y (j) no induce la diferenciación de células madre.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 aislado se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-323 de SEQ ID N.°: 67 con una afinidad de = 5 nM o = 4 nM o = 3 nM o = 2 nM o = I nM y opcionalmente = 0,0001 nM o = 0, 001 nM o > 0,01 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 aislado se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-123 de SEQ ID N.°: 67 con una afinidad de = 5 nM o = 4 nM o = 3 nM o = 2 nM o = l nM y opcionalmente 0, 0001 nM o = 0,001 nM o > 0,01 n .
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 aislado se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 324-424 de SEQ ID N.°: 67 con una afinidad de = 5 nM o = 4 nM o < 3 nM o = 2 nM o = l nM y opcionalmente = 0, 0001 nM o = 0, 001 nM o = 0,01 nM.
En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 no interrumpe significativamente la unión de R-spondina (RSPO) a LgR5. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 no interrumpe significativamente la señalización de wnt/beta-catenina. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 no interrumpe significativamente la activación por RSPO de la señalización de LgR5. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 activa la escisión de la caspasa 3. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 reconoce la LgR5 humana y de roedores. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 reconoce la LgR5 humana pero no la LgR5 de roedores . En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en su forma no conjugada. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 no induce la diferenciación de células madre.
En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 es un anticuerpo IgGl, IgG2a o IgG2b. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, el anticuerpo anti-LgR5 es un fragmento de anticuerpo que se une a LgR5. En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 aislados, LgR5 es LgR5 humana de SEQ ID N. ° : 67.
En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-323 de SEQ ID N.°: 67. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a LgR5 con una afinidad de = 5 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl, IgG2a o IgG2b. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a LgR5. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana de SEQ ID N. ° : 67.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32, (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29 y (c) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 31. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 30, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 31 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 32. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además una secuencia FR3 marco de cadena pesada de SEQ ID N. ° : 41. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además una secuencia FR3 marco de cadena ligera de SEQ ID . ° : 35.
En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 8; o (b) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N . ° : 7 ; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) . En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 8. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VL de SEQ ID N.°: 7. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende una secuencia VH de SEQ ID N. ° : 8 y una secuencia VL de SEQ ID N.°: 7.
En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56, (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53 y (c) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 55. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 54, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 55 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además (a) HV -L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 51, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 51, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53.
En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 24; o (b) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:23; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) . En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 24. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VL de SEQ ID N.°: 23. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 24 y una secuencia VL de SEQ ID N. ° : 23.
En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 50, (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47 y (c) HVR-H2 que qomprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 495. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 48, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 49 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 45, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 46 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 45, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 46 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID . ° : 47.
En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 22; o (b) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) . En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 22. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VL de SEQ ID N. ° : 21. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende una secuencia VH de SEQ ID N. ° : 22 y una secuencia VL de SEQ ID N.°: 21.
En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62, (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59 y (c) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 61. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 60, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 61 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 62. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 58 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 58 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59.
En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende (a) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 26; o (b) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:25; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) . En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 26. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VL de SEQ ID N.°: 25. En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 26 y una secuencia VL de SEQ ID N. ° : 25.
En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo descrito en el presente. En algunas realizaciones, se proporciona una célula huésped que comprende el ácido nucleico. En algunas realizaciones, se proporciona un método para producir un anticuerpo descrito en el presente. En algunas realizaciones, el método comprende cultivar la célula huésped que comprende el ácido nucleico que codifica un anticuerpo.
En algunas realizaciones, se proporcionan inmunoconjugados . En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-LgR5 y un agente citotóxico. En algunas realizaciones, un inmunoconjugado tiene la fórmula A -(L-D)p en donde: (a) Ab es un anticuerpo descrito en el presente; (b) L es un ligador; (c) D es un fármaco seleccionado de un maitansinoide, una auristatina, una caliqueamicina, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina; y (d) p oscila entre 1 y 8. En algunas realizaciones, D es una auristatina. En algunas de dichas realizaciones, D tiene la fórmula DE en donde R2 y R6 son cada uno metilo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada R8 se selecciona independientemente de CH3, 0-CH3, OH y H; R9 es H; y R18 es - C (R8) 2-C (R8) 2-arilo. En algunas realizaciones, D es MMAE que tiene la estructura: En algunas realizaciones, pirrolobenzodiazepina de Fórmula A: en donde las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3 ; R2 se selecciona independientemente de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y opcionalmente además se selecciona de halo o dihalo, en donde RD se selecciona independientemente de R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; Q se selecciona independientemente de O, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es O, S03M, en donde es un catión metálico; R y R' se seleccionan cada uno independientemente de grupos alquilo 0?-8, alquilo Ci-i2, heterociclilo C3-8, heterociclilo C3-2o y arilo C5.20 opcionalmente sustituidos y opcionalmente con relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo heterocíclico de 4 , 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; R12, R16, R19 y R17 son como se definió para R2, R6, R9 y R7 respectivamente; R" es un grupo alquileno C3_i2, cuya cadena puede ser interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos que están opcionalmente sustituidos; y X y X' se seleccionan independientemente de O, S y N(H) . En algunas de dichas realizaciones, D es en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, D es un derivado nemorrubicina. En algunas realizaciones, D tiene estructura seleccionada de : y En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un ligador que es escindible mediante una proteasa. En algunas realizaciones, el ligador comprende un dipéptido val-cit o un dipéptido Phe-Lys. En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un ligador que es lábil al ácido. En algunas de dichas realizaciones, el ligador comprende hidrazona .
En algunas realizaciones, un inmunoconjugado tiene una fórmula seleccionada de: en donde S es un átomo de azufre; ?? En algunas realizaciones, p oscila entre 2 y 5.
En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 30, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 31 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 32; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27, (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 29. En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 8 y una secuencia VL de SEQ ID N . ° : 7.
En algunas realizaciones, se proporcionan formulaciones farmacéuticas. En algunas de dichas realizaciones, una formulación farmacéutica comprende un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a LgR5, p. ej . , como se describió aquí. En algunas realizaciones, una formulación farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es Avastin® (bevacizumab) .
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar individuos que tienen cánceres LgR5 positivos. En algunas de dichas realizaciones, un método comprende administrar una formulación farmacéutica que comprende un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a LgR5, p. ej . , como se describió aquí. En algunas realizaciones, el cáncer LgR5 positivo se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de ovario y cáncer endometrial. En algunas realizaciones, el cáncer LgR5 positivo es un cáncer de intestino delgado. En algunas realizaciones, un cáncer de intestino delgado es un cáncer de duodeno, yeyuno y/o ilio. En algunas realizaciones, un cáncer de intestino delgado es un cáncer de yeyuno y/o ilio. En algunas realizaciones, un cáncer LgR5 positivo comprende una mutación Kras, una mutación APC o una mutación Kras y una mutación APC (p. ej . , en al menos una parte de las células cancerosas) . En algunas realizaciones, un método comprende administrar un agente terapéutico adicional al individuo. En algunas de dichas realizaciones, el agente terapéutico adicional es Avastin® (bevacizumab) .
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para inhibir la proliferación de una célula LgR5 positiva. En algunas realizaciones, el método comprende exponer la célula a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a LgR5 en condiciones que permiten la unión del inmunoconjugado a LgR5 en la superficie de la célula. En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 es un anticuerpo descrito en el presente. En algunas realizaciones, se inhibe de ese modo la proliferación de la célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula de cáncer colorrectal, de cáncer de intestino delgado, de cáncer de páncreas, de cáncer de ovario y de cáncer endometrial.
En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 se conjuga con un marcador. En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 es un anticuerpo descrito en el presente. En algunas realizaciones, el marcador es un emisor de positrones. En algunas realizaciones, el emisor de positrones es 89Zr.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para detectar la LgR5 humana en una muestra biológica. En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-LgR5 en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-LgR5 a una LgR5 humana natural y detectar si se forma un complejo del anticuerpo anti-LgR5 y una LgR5 humana natural en la muestra biológica. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 es un anticuerpo descrito en el presente. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de cáncer colorrectal, de cáncer de intestino delgado, de cáncer de páncreas, de cáncer de ovario o de cáncer endometrial.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para detectar un cáncer LgR5 positivo. En algunas de dichas realizaciones, un método comprende (i) administrar un anticuerpo anti-LgR5 marcado a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un cáncer LgR5 positivo y (ii) detectar el anticuerpo anti-LgR5 marcado en el sujeto, en donde la detección del anticuerpo anti-LgR5 marcado indica un cáncer LgR5 positivo en el sujeto. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 es un anticuerpo descrito en el presente .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una representación gráfica de los niveles de expresión genética de LgR5 humana en diversos tejidos, como se describe en el Ejemplo A. El recuadro en la Figura 1 muestra una representación gráfica de los niveles de expresión genética de LgR5 humana en tejidos normales de colon y en tumores de colon, como se describe en el Ejemplo A.
La Figura 2 muestra la expresión de LgR5 en tumores de colon mediante hibridación in situ, como se describe en el Ejemplo B.
La Figura 3A-B muestra (FIG.3A) la prevalencia de diversos niveles de expresión de LgR5 en una micromatriz de tejido de tumor de colon y (FIG.3B) la heterogeneidad de la expresión de LgR5 en tres núcleos de cada muestra de adenocarcinoma colorrectal, ambas determinadas mediante hibridación in situ, como se describe en el Ejemplo B.
La Figura 4 muestra las propiedades de determinados anticuerpos monoclonales anti-LgR5 desarrollados como se describe en los Ejemplos de C a F.
La Figura 5 muestra una alineación de las secuencias de región variable de cadena ligera del anticuerpo murino mu8Ell y sus variantes humanizadas (hu8Ell.vl a hu8Ell.v8). Las tres regiones hipervariables (HVR: HVR1, HVR2 , HVR3) se indican con casillas en las secuencias.
La Figura 6 muestra una alineación de las secuencias de región variable de cadena pesada del anticuerpo murino mu8Ell y sus variantes humanizadas (hu8Ell.vl a hu8Ell.v8). Las tres regiones hipervariables (HVR: HVR1, HVR2 , HVR3 ) se indican con casillas en las secuencias.
La Figura 7 muestra las secuencias de región variable de cadena ligera de los anticuerpos murinos 3G12 y 2H6. Las tres regiones hipervariables (HVR: HVR1, HVR2 , HVR3) se indican con casillas en las secuencias.
La Figura 8 muestra las secuencias de región variable de cadena pesada de los anticuerpos murinos 3G12 y 2H6. Las tres regiones hipervariables (HVR: HVR1, HVR2, HVR3) se indican con casillas en las secuencias.
La Figura 9 muestra las mediciones de afinidad del anticuerpo quimérico ch8Ell y diversas variantes humanizadas, como se describe en el Ejemplo E.
La Figura 10 muestra la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo humano YW353. Las tres regiones hipervariables (HVR: HVR1, HVR2, HVR3) se indican con casillas en las secuencias.
La Figura 11 muestra la secuencia de región variable de cadena pesada del anticuerpo humano YW353. Las tres regiones hipervariables (HVR: HVR1, HVR2, HVR3) se indican con casillas en las secuencias.
Las Figuras 12A-C muestran una alineación de LgR5 de humano, de mono cynomolgus, de rata y de ratón.
La Figura 13 muestra que los inmunoconjugados de anti-LgR5 demuestran eficacia en los xenoinjertos de cáncer de colon LoVo, como se describe en el Ejemplo L.
La Figura 14 muestra que los inmunoconjugados de anti-LgR5 demuestran eficacia en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124, como se describe en el Ejemplo M.
La Figura 15 muestra que el inmunoconjugado huYW353-vcMMAE demuestra eficacia en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124 de 3 , 6 y 12 mg/kg, como se describe en el Ejemplo M.
La Figura 16 muestra la expresión de ARNm de LgR5 en tejido normal y pólipos de cólones de ratones AV y AKV, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 17 muestra que la supervivencia de los ratones AKV que recibieron el anticuerpo anti-LgR5 y un conjugado de anticuerpo anti-LgR5- fármaco fue más prolongada que la supervivencia de los ratones AKV de control, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 18 muestra el porcentaje del área del tumor que es positiva para la caspasa 3 escindida en ratones AKV que recibieron un ADC de control, un ADC anti-LgR5 o un anticuerpo anti-LgR5, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 19 muestra que los ratones AKV que recibieron el conjugado de anticuerpo anti-LgR5-fármaco presentaron perxodos de supervivencia más prolongados que los ratones AKV sin tratar y que los ratones AKV que recibieron gpl20-ADC o anti-LgR5, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 20 muestra el área LgR5+ en pólipos del intestino delgado y en pólipos de colon en ratones AKV LgRó^^, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 21A-B muestra (FIG.21A) el área CC3+GFP+ por área celular en ratones AKV LgK5DTR + de ADC de control y tratados con anti-LgR5-ADC y (FIG.21B) la tinción inmunohistoquimica ejemplar en los ratones AKV Lgf?5DTR/+ de ADC de control y tratados con anti-LgR5-ADC, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 22 muestra el área KÍ67+ por área celular (células GFP+ o células GFP- ) en ratones AKV Lgf?5DTR/+ de ADC de control y tratados con anti-LgR5-ADC, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 23 muestra la proporción de la intensidad de GFP al área GFP+ en criptas y tumores de ratones AKV LgR5DTR/+, como se describe en el Ejemplo N.
La Figura 24 muestra que los inmunoconjugados huYW353-vcMMAE, hu8Ellv2-vc AE y ch8Ell-vcMMAE demuestran eficacia en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124, como se describe en el Ejemplo 0.
La Figura 25 muestra que el inmunoconjugado hu8Ellv2-vcMMAE demuestra eficacia en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124, como se describe en el Ejemplo O.
La Figura 26 muestra que los inmunoconjugados huYW353-vcM AE y hu8Ellv2-vcMMAE demuestran eficacia en los xenoinjertos de cáncer de colon LoVoXl.l, como se describe en el Ejemplo P.
La Figura 27 muestra que el inmunoconjugado hu8Ellv2-vcMMAE demuestra eficacia en los xenoinjertos de cáncer de colon LoVoXl.l, como se describe en el Ejemplo P.
La Figura 28 muestra que los inmunoconjugados huYW353-vcMMAE, huYW353-acetal-PNU y huYW353 -vcPNU demuestran eficacia en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124, como se describe en el Ejemplo Q.
La Figura 29 muestra que los inmunoconjugados hu8Ellv2-acetal-P U, hu8Ellv2-vcPNU y hu8Ellv2-P U demuestran en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124, como se describe en el Ejemplo R.
La Figura 30 muestra los resultados de la administración de determinados inmunoconjugados de hu8Ellv2 e inmunoconjugados de anticuerpos de control en xenoinjertos de cáncer de colon LoVoXl.l, como se describe en el Ejemplo S.
La Figura 31 muestra que el inmunoconjugado hu8Ellv2-acetal-PNU demuestra eficacia en los xenoinjertos de cáncer de colon LoVoXl.l en ratones que recibieron anticuerpo de control en exceso, como se describe en el Ejemplo S.
La Figura 32 muestra que un inmunoconjugado de PBD huYW353 anti-LgR5 demuestra eficacia en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124, como se describe en el Ejemplo T.
La Figura 33 muestra que un inmunoconjugado de PBD hu8Ellv2 anti-LgR5 demuestra eficacia en los xenoinjertos de cáncer de páncreas D5124, como se describe en el Ejemplo T.
La Figura 34 muestra que un inmunoconjugado de PBD hu8Ellv2 anti-LgR5 demuestra eficacia en un xenoinjerto de cáncer de colon LoVoXl.l, como se describe en el Ejemplo U.
La Figura 35A-E muestra las estructuras de (FIG.35A) un inmunoconjugado anticuerpo-vcMMAE, (FIG.35B) un inmunoconjugado anticuerpo-acetal-P U, (FIG.35C) un inmunoconjugado anticuerpo-acetal-PNU, (FIG.35D) un inmunoconjugado anticuerpo-PNU y (FIG.35E) un inmunoconjugado anticuerpo-vcPBD .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE DETERMINADAS REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN I . DEFINICIONES Un "marco receptor humano", a los fines de la presente, es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano, como se define a continuación. Un marco receptor humano "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, la cantidad de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco receptor humano VL es idéntico en secuencia a la secuencia del marco de inmunoglobulina humana VL o a la secuencia del marco de consenso humano.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (p. ej . , un anticuerpo) y su compañero de unión (p. ej . , un antígeno) . A menos que se indique lo contrario, según se emplea aquí, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (p. ej . , anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su compañero Y generalmente se puede representar por la constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir a través de métodos comunes conocidos en la técnica, incluso los descritos en el presente. A continuación se describen realizaciones específicas ilustrativas y ejemplares para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR) , en comparación con un anticuerpo padre que no posee dichas alteraciones, dichas alteraciones producen una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Los términos "anticuerpo anti-LgR5" y "un anticuerpo que se une a LgR5" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a LgR5 con afinidad suficiente de modo que el anticuerpo es útil como agente diagnóstico o terapéutico que tiene como diana a LgR5. En una realización, la medida de unión de un anticuerpo anti-LgR5 a una proteína no LgR5 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a LgR5 según lo medido, p. ej . , mediante un radioinmunoensayo (RIA) . En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a LgR5 tiene una constante de disociación (Kd) de = 1 µ?, = 100 nM, < 10 nM, , = 5 Nm, , < 4 nM, , = 3 nM, , < 2 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (p. ej . , 10"8 M o menos, p. ej . de 10"8 M a 10~13 M, p. ej . , de 10"9 M a 10"13 M) . En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 se une a un epítopo de LgR5 que se conserva entre LgR5 de especies diferentes .
El término "anticuerpo" se utiliza en el presente en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluso, entre otros, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej . , anticuerpos biespecificos) , y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando presenten la actividad de unión al antígeno deseada .
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto y que se une al antígeno al cual el anticuerpo intacto se une. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab' )2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena única (p. ej . scFv) ; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo .
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición por el 50 % o más y, contrariamente, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición por el 50 % o más. En el presente se proporciona un ensayo de competición ejemplar.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen a la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza, típicamente, por el crecimiento celular/proliferación sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma (p. ej . , linfoma de Hodgkin y linfoma de no Hodgkin) , blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más específicos de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de células pequeñas de pulmón, cáncer de células no pequeñas de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de intestino delgado, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos , y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una porción de la cadena pesada o ligera se deriva de una fuente de especies específica, mientras que el resto de la cadena pesada o ligera se deriva de una fuente de especies diferente .
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases importantes de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , p. ej . , IgGi, lgG2, lgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente.
El término "agente citotóxico" , según se emplea aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular o provoca destrucción o muerte celular. Los agentes citotóxicos incluyen, entre otros, isótopos radioactivos (p. ej-, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y isótopos radioactivos de Lu) ; agentes quimioterapéuticos o fármacos (p. ej . , metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorrubicina, malfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes) ; agentes inhibidores del crecimiento; sus enzimas y fragmentos, por ejemplo enzimas nucleolíticas ; antibióticos; toxinas, por ejemplo toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, animal vegetal, incluso sus fragmentos o variantes; y los diversos agentes antitumorales o anticáncer divulgados a continuación.
"Funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varía con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: Unión a Clq y citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) ; unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) ; fagocitosis; subregulación de receptores de la superficie celular (p. ej . receptor de las células B) ; y activación de las células B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, p. ej . , una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante períodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "epítopo" se refiere el sitio específico en una molécula de antígeno a la cual un anticuerpo se une.
El término "región Fe" aquí se utiliza para definir una región terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante . El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. En una realización, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hacia el extremo carboxilo terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina en el terminal C (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario aquí, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fe o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Marco" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR) . El FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominio FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por lo tanto, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FRl-Hl(Ll)-FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.
Los término "anticuerpo de longitud completa" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se utilizan aquí de forma alternativa para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define en el presente.
El término "formas glicosiladas de LgR5" se refiere a formas naturales de LgR5 que están modificadas postraduccionalmente por la adición de residuos de carbohidratos .
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se utilizan de forma alternativa y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluso la progenie de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula primaria transformada y progenie derivada de la misma independientemente de la cantidad de pasajes. Es posible que la progenie no sea completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula madre, pero puede contener mutaciones . La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica examinada o seleccionada en la célula originalmente transformada se incluyen aquí.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponden a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivada de un origen no humano que utiliza repertorios de anticuerpo humano u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humano.
Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los residuos de aminoácidos más habituales en una selección de secuencias marco VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest , quinta edición, publicación NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols . 1-3. En una realización, para la VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat y col., mencionado anteriormente. En una realización, para la VH, el subgrupo es subgrupo III como en Kabat y col., mencionado anteriormente .
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de FR humanos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un, y típicamente dos, dominios variable, en el cual todas o sustancialmente todas las HVR (p. ej . , las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todos o sustancialmente todos los FR corresponden a los de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, p. ej . , un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que a experimentado humanización.
El término "región hipervariable" o "HVR" , según se emplea aquí, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2 , H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3) . Las HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) , siendo la última de más alta variabilidad de secuencia o que participa en el reconocimiento de antígeno. Bucles hipervariables ejemplares se producen en residuos de aminoácidos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) , 91-96 (L3) , 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3).
(Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2 , CDR-L3 , CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en residuos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de Hl, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). A excepción de CDRl en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables . Las CDR también comprenden "residuos determinantes de especificidad" o "SDR" , que son residuos que se ponen en contacto con el antigeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas o a-CDR . a-CDR Ejemplares (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en residuos de aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2, 89-96 de L3 , 31-35B de Hl, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front . Biosci. 13:1619-1633 (2008)). A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (p. ej . , residuos de RF) se enumeran aquí de acuerdo con Kabat y col., mencionado anteriormente .
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluso, entre otros, con un agente citotóxico.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, entre otros, animales domesticados (p. ej . , vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (p. ej . , seres humanos y primates no humanos, por ejemplo monos) , conejos y roedores (p. ej . , ratones y ratas). En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su entorno natural . En determinadas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta más del 95 % o el 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (p. ej . , SDS-PAGE, centrado isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatografía (p. ej . , intercambio iónico o HPLC de fase inversa) . Para una revisión de los métodos de evaluación de pureza de un anticuerpo, véase, p. ej . , Flatman y col., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) .
Un "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que comúnmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente éxtracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-LgR5" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o sus fragmentos) , incluso las moléculas de ácido nucleico en un único vector o vectores separados y las moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula huésped.
El término "LgR5", según se emplea aquí, se refiere a cualquier LgR5 nativa madura que resulta del procesamiento de una proteína precursora LgR5 en una célula. El término incluye LgR5 de cualquier ser vertebrado, incluso mamíferos, por ejemplo primates (p. ej . humanos y monos cynomolgus) y roedores (p. ej . , ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. El término también incluye variantes naturales de LgR5, p. ej . , variantes de corte o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora LgR5 humana ejemplar, con secuencia señal (aminoácidos 1-21) se muestra en la SEQ ID N.°: 67. La secuencia de aminoácidos de una LgR5 humana madura ejemplar se muestra en la SEQ ID N. ° : 68. La secuencia prevista para los aminoácidos de 33 a 907 de una LgR5 de monos cynomolgus ejemplar se muestra en la SEQ ID N.°: 69. Las secuencias de aminoácidos para la precursora LgR5 de rata ejemplar (con secuencia señal, aminoácidos 1-21) y las secuencias maduras se muestran en las SEQ ID N.°: 70 y 71, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos para la precursora LgR5 de ratón ejemplar (con secuencia señal, aminoácidos 1-21) y las secuencias maduras se muestran en las SEQ ID N. ° : 72 y 73, respectivamente.
El término "cáncer LgR5 positivo" se refiere a un cáncer que comprende células que expresan LgR5 en su superficie. Para terminar si una célula expresa LgR5 en la superficie, se considera que la expresión de ARNm de LgR5 corresponde a la expresión de LgR5 en la superficie celular. En algunas realizaciones, la expresión de ARNm en LgR5 se determina a través de un método seleccionado entre hibridación in situ y RT-PCR (incluso RT-PCR cuantitativo) . Alternativamente, la expresión de LgR5 en la superficie celular se puede determinar, por ejemplo, utilizando anticuerpos para LgR5 en un método como inmunohistoquímica, FACS , etc .
El término "célula LgR5 positiva" se refiere a una célula que expresa LgR5 en su superficie .
El término "anticuerpo monoclonal" , según se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos o se unen al mismo epítopo, excepto por los anticuerpos variantes posibles, p. ej . , que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades mínimas . A diferencia a las preparaciones de anticuerpos policlonales , que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único single determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo a través de ningún método específico. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención se pueden hacer a través de diversas técnicas incluso, entre otros, el método de hibridoma, métodos de ADN recombinantes , métodos de visualización de fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte del locus de la inmunoglobulina, los cuales métodos y otros métodos ejemplares para realizar anticuerpos monoclonales se describen en el presente.
Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con una porción heteróloga (p. ej . , una porción citotóxica) o radiomarcado . El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltones, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlace disulfuro. Del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también denominada un dominio variable pesado o un dominio variable de cadena pesada, seguido por los tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) . De forma similar, del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también denominada un dominio variable ligero o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno o dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?) , en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término "prospecto de envase" se utiliza para referirse a las instrucciones que se suelen incluir en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones o advertencias referente al uso de dichos productos terapéuticos .
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación a fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversos modos que son conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando un software informático disponible al público, por ejemplo software BLAST, BLAST-2 , ALIGN o egalign (DNASTAR) . Los entendidos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para la alineación de secuencias, incluso cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparan. A los fines del presente, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue realizado por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina del Derecho de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está registrada con el número de registro de derechos de autor de Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público por Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se compilará para su uso en un sistema operativo UNIX, incluso UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A para, con o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (que se puede redactar alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y en donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos marcados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B, en donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A para B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B para A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados aquí se obtienen como se describe en el párrafo anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que es de forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido allí sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se le administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que es no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.
Según se emplea aquí, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales como "tratar" o "se trata") se refiere a una intervención clínica para alterar el curso natural del individuo que se está tratando y se puede realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseados del tratamiento incluyen, entre otros, evitar la aparición o la recurrencia de una enfermedad, aliviar los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, evitar la metástasis, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejoría en el pronóstico. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan para retardar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar el avance de una enfermedad.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligerea de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) . (Véase, p. ej . , Kindt y col. Kuby Immunology, 6a ed. , W.H. Freeman y Co. , página 91 (2007)). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para lograr especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno específico se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una genoteca de dominio VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, p. ej . , Portolano y col., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson y col., Nature 352:624-628 (1991).
El término "vector", según se emplea aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al cual está unida. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la cual se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos de forma operativa. Dichos vectores se denominan en el presente como "vectores de expresión" .
"Alquilo" es hidrocarburo C1-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Ejemplos de metilo (Me, -CH3) , etilo (Et, -CH2CH3) , 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3) , 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3 ) , 2-metilo- 1-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH (CH3) 2) / 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3) CH2CH3) , 2 -metil-2 -propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-pentilo ( -CH (CH3) CH2CH2CH3) , 3-pentilo (-CH (CH2CH3) 2) , 2-metil-2-butilo ( -C (CH3 ) 2CH2CH3) , 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2) , 3-metil-l-butilo ( -CH2CH2CH (CH3 ) 2) , 2-metil-l-butilo (-CH2CH (CH3) CH2CH3) , 1-hexilo (- CH2CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-hexilo (-CH(CH3) CH2CH2CH2CH3) , 3-hexilo (-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3) ) , 2-metil-2-pentilo (-C(CH3) 2CH2CH2CH3) , 3-metil-2-pentilo ( -CH (CH3 ) CH ( CH3 ) CH2CH3 ) , 4-metil-2-pentilo ( -CH (CH3 ) CH2CH (CH3 ) 2) , 3-metil-3-pentilo (-C(CH3) (CH2CH3) 2) , 2 -metil- 3-pentilo ( -CH (CH2CH3 ) CH (CH3 ) 2 ) , 2,3-dimetil-2-butilo ( -C ( CH3 ) 2CH (CH3 ) 2) > 3 , 3 -dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3.
? El término "alquilo Cx-C8" , según se emplea aquí, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Grupos "alquilo Ci-C8" representativos incluyen, entre otros, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, n-hexilo, -n-hepilo, -n-octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquilos Ci-C8 ramificados incluyen, entre otros, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -tere-butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, alquilos Ci-C8 insaturados incluyen, entre otros, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, 2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, -2-metil-2-butenilo, 2, 3-dimetil-2-butenil, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo,-acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, -2-butinilo, 1-pentinilo, -2-pentinilo, -3-metil-l butinilo. Un grupo alquilo Ci-C8 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluso, entre otros, alquilo -Ci-C8/ -O- (alquilo Ci-Ce) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S03R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 Y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
El término "alquilo C3.-C12", según se emplea aquí, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Un grupo alquilo C1-C12 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluso, entre otros, alquilo -Cx-Cs, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -SO3R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
El término "alquilo Ci-C6" , según se emplea aquí, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Grupos "alquilo Ci-C6" representativos incluyen, entre otros, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, n-hexilo, -n-hepilo, -n-octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquiles C!-Ce ramificados incluyen, entre otros, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -tere-butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, alquiles C;L-C6 insaturados incluyen, entre otros, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, 2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, -2-metil-2-butenilo, 2 , 3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo y 3-hexilo. Un grupo alquilo Ci-C6 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos, como se describió anteriormente para el grupo alquilo Ci-C8.
El término "alquilo C1-C4" , según se emplea aquí, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Grupos "alquilo C1-C4" representativos incluyen, entre otros, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo; mientras que los alquilos Ci-C4 ramificados incluyen, entre otros, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, - ere-butilo ; los alquilos C1-C4 insaturados incluyen, entre otros, -vinil, -alilo, 1-butenilo, -2-butenilo y -isobutilenilo. Un grupo alquilo C!-C4 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos, como se describió anteriormente para el grupo alquilo d-Ce.
"Alcoxi" es un grupo alquilo unido con enlace sencillo a un oxígeno. Grupos alcoxi ejemplares incluyen, entre otros, metoxi (-OCH3) y etoxi (-OCH2CH3) . Un "alcoxi Cx-Cs" es un grupo alcoxi de 1 a 5 átomos de carbono . Los grupos alcoxi pueden ser no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos, como se describió anteriormente para los grupos alquilo.
"Alquenilo" es hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2, carbono-carbono. Ejemplos incluyen, entre otros: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo ( -CH2CH=CH2) , ciclopentenilo (-C5H7) y 5-hexenilo (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2) . Un "alquenilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp , carbono-carbono .
"Alquinilo" es hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp, carbono-carbono. Ejemplos incluyen, entre otros: acetileno (-C=CH) y propargilo (-CH2C=CH) . Un "alquinilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace Sp, carbono-carbono .
"Alquileno" se refiere a una cadena ramificada o lineal saturada, o un radical hidrocarbonado cíclico de 1 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alcano base. Los radicales alquileno típicos incluyen, entre otros: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-) , 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-) , 1,4-butilo ( -CH2CH2CH2CH2- ) , y similares .
Un "alquileno QL-CIO" es un grupo hidrocarbonado de cadena lineal saturado de fórmula - (CH2) 1-10- · Ejemplos de un alquileno Ci-C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno y decaleno.
"Alquenileno" se refiere a una cadena ramificada o lineal insaturada, o un radical hidrocarbonado cíclico de 2 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alqueno base. Los radicales alquenileno típicos incluyen, entre otros: 1,2-etileno (-CH=CH-) .
"Alquinileno" se refiere a una cadena ramificada o lineal insaturada, o un radical hidrocarbonado cíclico de 2 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alquino base . Los radicales alquinileno típicos incluyen, entre otros: acetileno (-C=C-), propargilo (-CH2C=C-) y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C=C- ) .
"Arilo" se refiere a un grupo aromático carbocíclico . Ejemplos de grupos arilo incluyen, entre otros, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo aromático carbocíclico o un grupo aromático heterocíclico puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluso, entre otros, alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', S(0)2R', -S(0)R' , -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
Un "arilo C5-C2o" es un grupo arilo de 5 a 20 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos . Ejemplos de grupos arilo C5-C20 incluyen, entre otros, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-C20 puede ser sustituido o no sustituido como se describió anteriormente para los grupos arilo. Un "arilo C5-C14" es un grupo arilo de 5 a 14 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos. Ejemplos de grupos arilo C5-C14 incluyen, entre otros, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-C14 puede ser sustituido o no sustituido como se describió anteriormente para los grupos arilo .
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en las configuraciones orto, meta o para como se muestra en las siguientes estructuras: en las cuales el grupo fenilo puede ser no sustituido o sustituido con más de cuatro grupos incluso, entre otros, alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un terminal o átomo de carbono sp3, se reemplaza por un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen, entre otros, bencilo, 2-feniletan-l-ilo, 2- fenileten-l-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2- naftileten-l-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-l-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, p. ej . la porción alquilo, incluso los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y la porción arilo es de 5 a 14 átomos de carbono .
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un terminal o átomo de carbono sp3, se reemplaza por un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, entre otros, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo y similares. Los grupos heteroarilalquilo comprenden de 6 a 20 átomos de carbono, p. ej . la porción alquilo, incluso los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y la porción heteroarilo es de 5 a 14 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, 0, P y S. La porción heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, 0, P y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5] , [5,5] , [5,6] o [6,6] .
"Alquilo sustituido" , "arilo sustituido" y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo y arilalquilo respectivamente, en los cuales uno o más átomos de hidrógeno son reemplazados independientemente por un sustituyente .
Sustituyentes típicos incluyen, entre otros, -X, -R, -O", -0R, -SR, -S", -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=0, -NCS, -NO, -N02, =N2, -N3, NC(=0)R, -C(=0)R, -C(=0)NR2, -S03", -S03H, -S(=0)2R, -OS(=0)2OR, -S(=0)2NR, -S(=0)R, -OP (=0) (OR) 2 , -P(=0) (OR)2, -P03í -P03H2í -C(=0)R, -C(=0)X, -C(=S)R, -C02R, -C02, -C(=S)OR, -C(=0)SR, -C(=S)SR, -C(=0)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2í en donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br o I; y cada R es independientemente -H, alquilo C2-Ci8, arilo C6-C20, C3-Ci4 heterociclo, grupo protector o porción profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno como se describió anteriormente también se pueden sustituid de manera similar.
"Heteroarilo" y "heterociclo" se refiere a un sistema de anillos en los cuales uno o más átomos de los anillos son un heteroátomo, p. ej . nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclo comprende de 3 a 20 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5] , [5,5] , [5,6] o [6,6] .
Heterociclos ejemplares se describen, p. ej . , en Paquette, Leo A. , "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamín, Nueva York, 1968) , particularmente capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente), en particular volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Ejemplos de heterociclos incluyen a modo de ejemplo y sin limitación piridilo, dihidroipiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo) , tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo azufre oxidado, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1, 2, 5-tiadiazinilo, 2H, 6H-1, 5 , 2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, lH-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, ß-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo.
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos unidos a carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrólo o tetrahidropirrolo, posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3 o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 de una isoquinolina. Aún más típicamente, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5- piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4 -piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2 -pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo( 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos unidos a nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrólo, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3 -pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, lH-indazol, posición 2 de un isoindol o isoindolina, posición 4 de una morfolina y posición 9 de un carbazol o ß-carbolina. Aún más típicamente, heterociclos unidos a nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo y 1-piperidinilo .
Un "heterociclo C3-C8" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el cual de uno a cuatro átomos de carbono del anillo son reemplazados independientemente por un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, entre otros, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, coumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con más de siete grupos incluso, entre otros, alquilo -Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', C(0)NH2, -C(0)NHR', -C (0) N (R' ) 2-NHC (O) R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , - H2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
"Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo es reemplazado por un enlace. Un heterociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con más de seis grupos incluso, entre otros, alquilo -Ci-C8, -0- (alquilo C!-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', C(0)NH2, -C(0) HR', -C (O) N (R' ) 2-NHC (O) R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
Un "heterociclo C3-C20" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el cual de uno a cuatro átomos de carbono del anillo son reemplazados independientemente por un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Un heterociclo C3-C20 puede ser no sustituido o sustituido con más de siete grupos incluso, entre otros, alquilo -Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R' , -C(0)OR', C(0)NH2, -C(0)NHR', -C (0) N (R' ) 2-NHC (O) R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 Y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -QL-CS y arilo.
"Heterociclo C3-C2o" se refiere a un grupo heterociclo C3-C20 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo es reemplazado por un enlace.
"Carbociclo" significa un anillo saturado o insaturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o de 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 6 átomos del anillo, aún más típicamente 5 o 6 átomos del anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos del anillo, p. je. Dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] o 9 o 10 átomos del anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6] . Ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2 -enilo, 1-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carbocíclico no aromático saturado o insaturado de 3-, 4-, 5-, 6-, 7- u 8-miembros. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, entre otros, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1, 4-ciclohexadienilo, -cicloheptilo, -1,3-cicloheptadienilo, -1, 3 , 5-cicloheptatrienilo, -ciclooctilo y -ciclooctadienilo. Un grupo carbociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluso, entre otros, alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo C^-Ce) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C (O) N (R' ) 2-NHC (O) R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Cx-Cs y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo es reemplazado por un enlace.
"Ligador" se refiere a una porción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une por enlace covalente un anticuerpo a una porción fármaco. En diversas realizaciones, los ligadores incluyen un radical divalente, por ejemplo un alquildiilo, un arildiilo, un heteroarildiilo, porciones como: - (CR2) n0 (CR2) n-, unidades de repetición de alquiloxi (p. ej . polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (p. ej . polietilenamino, Jeffamine™) ; y éster diácido y amidas incluso succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida. En diversas realizaciones, los ligadores pueden comprender uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo valina, fenilalanina, lisina y homolisina.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de imposibilidad de superposición de imágenes especulares, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponxbles con sus imágenes especulares.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen constitución química idéntica, pero difieren con relación a la disposición de los átomos o grupos en el espacio .
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, p. ej . puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse mediante procedimientos analíticos de alta resolución, por ejemplo electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las convenciones y definiciones estereoquímicas utilizadas en el presente generalmente siguen S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. Y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar el plano de luz polarizada plana. Para describir un compuesto ópticamente activo, se utilizan los prefijos D y L, o R y S, para indicar la configuración absoluta de la molécula sobre sus centros quirales. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de luz polarizada plana por el compuesto; (-) o 1 significa que el compuesto es levógiro. Un compuesto con prefijo ( +) o d es dextrógiro. Para una determinada estructura química, estos estereoisómeros son idénticos salvo que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también se puede denominar enantiómero, y una mezcla de dichos isómeros se suele denominar mezcla enantiomérica . Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que se puede producir en donde no haya habido estereoselección o estereoespecificidad en un proceso o reacción química. Los término "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, carentes de actividad óptica.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede ser sustituido por otro grupo funcional. Determinados grupos salientes se conocen en la técnica, y ejemplos incluyen, entre otros, un haluro (p. ej . , cloruro, bromuro, yoduro) , metansulfonilo (mesilo) , p-toluensulfonilo (tosilo) , trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato .
El término "grupo protector" se refiere a un sustituyente que comúnmente se emplea para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras hace reaccionar otros grupos funcionales en el compuesto. Por ejemplo, un "grupo amino protector" es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad del amino en el compuesto. Grupos amino protectores adecuados incluyen, entre otros, acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC) , benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc) . Para ver una descripción general de grupos protectores y su uso, véase T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991, o una edición posterior.
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos que se unen a LgR5 e inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos . Los anticuerpos y los inmunoconj ugados de la invención son útiles, p. ej . , para el diagnóstico o tratamiento de cánceres LgR5 positivos.
A. Anticuerpos anti-LgR5 ejemplares En algunas realizaciones, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a LgR5. LgR5 es una proteína transmembrana siete que se encuentra, por ejemplo, en la superficie de las células madre intestinales cíclicas activas. Como se demuestra en el presente, LgR5 se expresa en aproximadamente el 77 % de secciones de tumor de colon examinadas .
Una secuencia de una proteína precursora LgR5 humana natural ejemplar, con secuencia señal (aminoácidos 1-21) se proporciona en SEQ ID N. ° : 67 y la secuencia de proteína LgR5 madura correspondiente se muestra en SEQ ID N.°: 68 (correspondiente a los aminoácidos 22-907 de SEQ ID N.°: 67).
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 tiene al menos una o más de las siguientes características, en cualquier combinación: (a) se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-555 de SEQ ID N.°: 67; (b) se une a LgR5 con una afinidad de = 5 nM, = 4 nM, = 3 nM, = 2 nM o = 1 nM y, opcionalmente = 0,0001 nM, > 0,001 nM o > 0,01 nM; (c) no interrumpe significativamente la unión de R-spondina (RSPO) a LgR5; (d) no interrumpe significativamente la señalización de beta-catenina; (e) no interrumpe significativamente la activación por RSPO de la señalización de LgR5; (f) activa la escisión de la caspasa 3; (g) reconoce la LgR5 humana y de roedores; (h) reconoce la LgR5 humana pero no la LgR5 de roedores; (i) no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en su forma no conjugada y (j ) no induce la diferenciación de células madre. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 es 8E11 y sus variantes humanizadas, por ejemplo hu8Ell.v2; YW353; 2H6 y 3G12. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana. En algunas realizaciones, LgR5 se selecciona de LgR5 humana, de mono cynomolgus, de ratón y de rata. (a) se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-555 de SEQ ID N.° : 67 Los métodos para determinar si un anticuerpo anti-LgR5 se une a un epítopo de LgR5 se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la unión de un anticuerpo anti-LgR5 a un epítopo de LgR5 (p. ej . , dentro de los aminoácidos 22-555 de SEQ ID N.°: 67) se puede determinar mediante la expresión de polipéptidos de LgR5 con eliminaciones de terminales N y C en 293 células y evaluando mediante FACS como describe en el ejemplo I la unión del anticuerpo a los polipéptidos truncados. En algunas realizaciones, una reducción sustancial (= 70 % de reducción) o eliminación de la unión del anticuerpo a un polipéptido truncado en comparación con la unión a LgR5 de longitud completa expresada en 293 células indica que el anticuerpo no se une a ese polipéptido truncado. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana o LgR5 de mono cynomolgus .
En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende el dominio amino terminal rico en leucina de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 25-66 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende una o más repeticiones ricas en leucina (LRR) de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 67-446 de SEQ ID N.°:67; LRR 1-16 de LgR5) . En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 1 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 67-90 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 2 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 91-112 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 3 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 115-136 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 4 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 139-160 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 5 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 163-184 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 6 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 187-208 de SEQ ID N.°:67) . En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 7 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 211-232 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 8 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 235-256 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 9 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 258-279 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 10 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 282-303 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 11 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 306-328 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 12 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 329-350 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 13 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 353-374 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 14 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 375-396 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 15 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 399-420 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende LRR 16 de LgR5 (p. ej . , residuos de aminoácidos 423-446 de SEQ ID N.°:67). En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende cualquiera de LRR1 a LRR11, de LRR2 a LRR11, de LRR3 a LRR11, de LLR1 a LLR3, de LLR2 a LLR3 , de LLR2 a LLR8, de LLR3 a LL7o de LLR4 a LLR6.
En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende un epítopo dentro de los aminoácidos 22-555 de SEQ ID N.°: 67. En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende un epítopo dentro de los aminoácidos 22-424 de SEQ ID N.°: 67. En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende un epítopo dentro de los aminoácidos 22-123 de SEQ ID N.°: 67. En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende un epítopo dentro de los aminoácidos 22-323 de SEQ ID N. ° : 67. En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende un epítopo dentro de los aminoácidos 324-555 de SEQ ID N.°: 67. En algunas realizaciones, el epítopo de LgR5 comprende un epítopo dentro de los aminoácidos 324-424 de SEQ ID N. ° : 67.
Se entiende que el aspecto y las realizaciones descritas en el presente incluyen "que consiste" o "que consiste esencialmente en" aspectos y realizaciones. (b) se une a LgR5 con una afinidad de = 5 nM, = 4 nM, = 3 nM, = 2 nM, o = 1 nM y, opcionalmente = 0,0001 nM, = 0,001 nM o = 0,01 nM Los métodos para determinar la afinidad de unión se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la afinidad de unión se puede determinar de acuerdo con un ensayo BIAcore18 como se describe en el presente en el ejemplo E. Específicamente, en algunas realizaciones, Kd se puede medir utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIACORE^-SOOO (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . Se pueden activar chips de CM5 de grado de investigación BIAcore™ con reactivos de l-etil-3- (3 -dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se pueden acoplar IgG de cabra anti-Fc humana a los chips para obtener aproximadamente 10.000 unidades de respuesta (RU) en cada célula de flujo. Se pueden bloquear los grupos de acoplamiento sin reaccionar con etanolamina 1 M. Para las mediciones cinéticas, se pueden capturar los anticuerpos anti-LGR5 para obtener aproximadamente 300 RU. Se pueden inyectar diluciones seriadas en dos etapas de ECD de LgR5 humana (por ejemplo, aminoácidos 22-557 (o un fragmento similar, por ejemplo 22-555) fusionados con His-Fc expresado en un sistema de baculovirus o aminoácidos 22-558 (o un fragmento similar, por ejemplo 22-555) fusionados con Fe expresado a partir de células CHO; 125 nM a 0,49 nM) en tampón HBS-P (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, surfactante P20 al 0,005 %) a 25° C con una velocidad de flujo de 30 µ?/min. Se pueden calcular las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (kQff) utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1 (BIAcore™ Evaluation Software versión 3.2). Se puede calcular la constante de equilibrio de disociación (Kd) como la proporción koff/kon. Si la velocidad de asociación excede 106 M"1 s"1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno de 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según lo medido en un espectrómetro, por ejemplo un espectrofotómetro con método para la parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco* de 8000 series (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 se une a LgR5 con una afinidad de aproximadamente cualquiera de < 5 nM, < 4 nM, < 3 nM, < 2 nM o < 1 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 se une a LgR5 con una afinidad de aproximadamente = 5. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 se une a LgR5 con una afinidad de aproximadamente = 4 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 se une a LgR5 con una afinidad de aproximadamente = 3 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 se une a LgR5 con una afinidad de aproximadamente = 2 nM. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana o LgR5 de mono cynomolgus .
Como aprecian los entendidos en la técnica, la referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro incluye (y describe) realizaciones que son directas al valor o parámetro de por sí. Por ejemplo, la descripción con referencia a "aproximadamente X" incluye una descripción de "X" . (c) no interrumpe significativamente la unión de R-spondina (RSPO) a LgR5 Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de interrumpir la unión de un RSPO a LgR5 se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de interrumpir significativamente la unión de un R-spondina (RSPO) a LgR5 se puede determinar por citometría de flujo. En algunas realizaciones, por ejemplo, 293 células que expresan LgR5 se pueden poner en contacto con RSPO etiquetado con fluorescencia, por ejemplo RSPOl, RSP02, RSP03 o RSP04 , en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-LgR5. La unión de RSPO a las 293 células se puede detectar utilizando separación de células activadas por fluorescencia (FACS) . En algunas realizaciones, una disminución en la unión de RSPO en presencia de un anticuerpo anti-LgR5 de menos que aproximadamente el 25 % en comparación con la unión de RSPO en presencia de un anticuerpo de control, indica que el anticuerpo anti-LgR5 no interrumpe significativamente la unión de RSPO a LgR5.
En algunas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de interrumpir significativamente la unión de un R-spondina (RSPO) a LgR5 se puede determinar por ensayo BIAcore. En algunas realizaciones, por ejemplo, el dominio extracelular de LgR5 se puede inmovilizar en chips de CM5, p. ej . , como se describe en el presente, y la unión de RSPO, por ejemplo RSP01, RSP02, RSPO3 o RSP04, a la LgR5 inmovilizada se puede determinar en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-LgR5. En algunas realizaciones, una disminución en la unión de RSPO en presencia de un anticuerpo anti-LgR5 de menos que aproximadamente el 25 % en comparación con la unión de RSPO en presencia de un anticuerpo de control, indica que el anticuerpo anti-LgR5 no interrumpe significativamente la unión de RSPO a LgR5.
En algunas realizaciones, el RSPO se selecciona de RSPOl, RSP02, RSPO3 y RS 04. En algunas realizaciones, el anticuerpo interrumpe la unión por menos que aproximadamente el 25 %, menos que aproximadamente el 20 ¾, menos que aproximadamente el 15 % o menos que aproximadamente el 10 %. En algunas realizaciones, el anticuerpo no interrumpe de manera detectable la unión de un RSPO a LgR5. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana o LgR5 de mono cynomolgus . (d) no interrumpe significativamente la señalización de wnt/beta-catenina Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de interrumpir la señalización de wnt/beta-catenina se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de interrumpir significativamente la señalización de wnt/beta-catenina se puede determinar utilizando un ensayo de gen indicador. En algunas realizaciones, por ejemplo, un constructo indicador que comprende un gen indicador (por ejemplo, un gen de luciferasa) bajo el control de un promotor sensible a wnt/beta-catenina (por ejemplo, un promotor que comprende sitios de unión al ADN TCF/LEF multimerizados) se puede transíectar en células que expresan LgR5. Las células luego se ponen en contacto con un ligando de Wnt, por ejemplo Wnt3a y un RSPO, por ejemplo RSPOl, RSP02, RSP03 o RSP04, en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-LgR5, y la expresión de luciferasa se mide. En algunas realizaciones, una disminución en la expresión de luciferasa en presencia de un anticuerpo de menos que aproximadamente el 25 % en comparación con la expresión de luciferasa en presencia de un anticuerpo de control, indica que el anticuerpo anti-LgR5 no interrumpe significativamente la señalización de beta-catenina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo interrumpe la señalización de beta-catenina por menos que aproximadamente el 25 %, menos que aproximadamente el 20 %, menos que aproximadamente el 15 % o menos que aproximadamente el 10 %. En algunas realizaciones, el anticuerpo no interrumpe de manera detectable la señalización de beta-catenina. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana o LgR5 de mono cynomolgus. (e) no interrumpe significativamente la activación por RSPO de la señalización de LgR5 Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de interrumpir la activación por RSPO de LgR5 se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de interrumpir significativamente la activación por RSPO de la señalización de LgR5 se puede determinar utilizando un ensayo de gen indicador. En algunas realizaciones, por ejemplo, un constructo indicador que comprende un gen indicador (por ejemplo, un gen de luciferasa) bajo el control de un promotor sensible a beta-catenina (por ejemplo, un promotor que comprende sitios de unión al ADN TCF/LEF multimerizados) se puede transfectar en células que expresan LgR5. Las células luego se pueden poner en contacto con un ligando de nt, por ejemplo Wnt3a, en presencia y ausencia de un RSPO, por ejemplo RSP01, RSP02, RSP03 o RSP04 , y la activación de la señalización de LgR5 se puede medir como el aumento de la expresión de luciferasa en presencia del RSPO. La activación de la señalización de LgR5 también se puede medir en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-LgR5. En algunas realizaciones, una disminución en la activación de la señalización de LgR5 en presencia de RSPOl, RSP02 , RSP03 o RSP04 de menos que aproximadamente el 25 % cuando las células se ponen en contacto con un anticuerpo anti-LgR5 con respecto a un anticuerpo de control, indica que el anticuerpo anti-LgR5 no interrumpe significativamente la activación por RSPO de la señalización de LgR5.
En algunas realizaciones, el RSPO se selecciona de RSPOl, RSP02, RSP03 y RSP04. En algunas realizaciones, el anticuerpo interrumpe la activación por RSPO de la señalización de LgR5 por menos que aproximadamente el 25 %, menos que aproximadamente el 20 %, menos que aproximadamente el 15 % o menos que aproximadamente el 10 %. En algunas realizaciones, el anticuerpo no interrumpe de manera detectable la activación por RSPO de la señalización de LgR5. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana. En algunas realizaciones, LgR5 es LgR5 humana o LgR5 de mono cynomolgus. (f) activa la escisión de la caspasa 3 Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de activar la escisión de la caspasa 3 se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de activar la escisión de la caspasa 3 se puede determinar en un modelo de xenoinjerto en roedores, p. ej . , como se describe en el ejemplo N. En algunas realizaciones, la presencia de la caspasa escindida 3 se puede medir en función del área del tumor, por ejemplo, en tejidos de intestino delgado y colon fijados con formalina, incrustados en parafina (FFPE) recogidos de ratones modelo con tumorogénesis intestinal a los cuales se le administró un anticuerpo anti-LgR5. La presencia de caspasa escindida 3 se puede determinar, en algunas realizaciones, utilizando inmunohistoquímica . Además, en algunas realizaciones, la escisión de la caspasa 3 se puede determinar como un porcentaje del área del tumor positivo, p. ej . , como se muestra en el ejemplo N y la figura 18.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 aumenta el porcentaje de del área del tumor positivo de la caspasa 3 de acuerdo con el ensayo descrito en el ejemplo N por aproximadamente cualquier de al menos el 20 %, al menos el 25 I, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 100 % (es decir, el porcentaje de dobles áreas del tumor positivo) . (g) reconoce la LgR5 humana y de roedores Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de unirse a la LgR5 humana y de roedores se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, los polipéptidos de LgR5 humana y de roedores se expresan en 293 células y la unión del anticuerpo a las 293 células que expresan LgR5 se evalúa mediante FACS como describe en el ejemplo G. En algunas realizaciones, la LgR5 de roedores es LgR5 de ratón o de rata. En algunas realizaciones, la LgR5 de roedores es de LgR5 ratón. (h) reconoce la LgR5 humana pero no la LgR5 de roedores Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de unirse a la LgR5 humana pero no la de roedores se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, los polipéptidos de LgR5 humana y de roedores se expresan en 293 células y la unión del anticuerpo a las 293 células que expresan LgR5 se evalúa mediante FACS como describe en el ejemplo G. En algunas realizaciones, la LgR5 de roedores es LgR5 de ratón o de rata. En algunas realizaciones, la LgR5 de roedores es de LgR5 ratón. (i) no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en su forma no conjugada Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de inhibir el crecimiento tumoral en su forma no conjugada se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, se utiliza un modelo de xenoinjerto en roedores, por ejemplo el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 descrito en el ejemplo M. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en su forma no conjugada en un modelo de xenoinjerto de línea celular de cáncer de colon LoVo, por ejemplo, como se describe en el ejemplo L. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en su forma no conjugada en un modelo de tumorigénesis intestinal murina, por ejemplo, como se describe en el ejemplo N. La inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto o modelo de tumorigénesis intestinal murina se determina en comparación con un control de vehículo o anticuerpo de control.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 inhibe el crecimiento tumoral en su forma no conjugada por menos que aproximadamente el 25 %, menos que aproximadamente el 20 %, menos que aproximadamente el 15 % o menos que aproximadamente el 10 %. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 no inhibe de forma detectable el crecimiento tumoral en su forma no conjugada. (j) no induce la diferenciación de células madre Los métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-LgR5 de inducir la diferenciación de células madre se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la diferenciación de células madre se puede ensayar mediante la determinación de la capacidad de diferenciación de las células columnares de la base de la cripta (CBC) , que son células madre de ciclo rápido en el intestino delgado que expresa LgR5, por ejemplo, en enterocitos, células caliciformes o células enteroendocrinas , en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-LgR5. En algunas realizaciones, se considera que un anticuerpo anti-LgR5 no induce la diferenciación de células madre si aproximadamente cualquiera de menos que el 25 %, menos que el 20 %, menos que el 15 % o menos que el 10 % de una población de CBC se diferencia en presencia del anticuerpo anti-LgR5 en condiciones en las que un anticuerpo de control también induce la diferenciación de células madre en menos que aproximadamente el 25 % de una población de CBC.
En algunas realizaciones, un inmunoconjugado del anticuerpo anti-LgR5 inhibe el crecimiento tumoral a través de un mecanismo fundamental que no induce la diferenciación de células madre. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado del anticuerpo anti-LgR5 inhibe el crecimiento tumoral a través de actividad citotóxica mediada a través de un agente citotóxico conjugado con el anticuerpo en el inmunoconjugado .
Anticuerpo 8E11 y otras realizaciones En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-LgR5 que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 30; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 31; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 28; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 30; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 31; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 32. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 30, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 31 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 29. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 29.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 30, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 32; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VL HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 29.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 30; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 29.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-LgR5 está humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-LgR5 comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un marco receptor humano, p. ej . un marco de inmunoglobulina humana o un marco humano de consenso. En determinadas realizaciones, el marco receptor humano es el marco consenso VL kappa IV (VLKiv) humano o el marco VH ???. En determinadas realizaciones, el marco receptor humano es el marco consenso VL kappa IV (VLKIV) humano o el marco VH VHi que comprende un mutación R71S y una mutación A78V en la región FR3 marco de cadena pesada .
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un secuencia FR3 marco de cadena pesada seleccionada de SEQ ID N. ° : de 40 a 43. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un secuencia FR3 marco de cadena pesada de SEQ ID N.°: de 41. En algunas de dichas realizaciones, el marco del dominio variable de cadena pesada es un marco VHi humano modificado que tiene una secuencia FR3 seleccionada de SEQ ID N.°: de 40 a 43. En algunas de dichas realizaciones, el marco del dominio variable de cadena pesada es un marco VHi humano modificado que tiene una secuencia FR3 de SEQ ID N.°: 41.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un secuencia FR3 marco de cadena ligera de SEQ ID N. ° : 36. En algunas de dichas realizaciones, el marco del dominio variable de cadena pesada es un marco consenso VL kappa IV (VLKiv) modificado que tiene una secuencia FR3 de SEQ ID N.°: 36.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 ¾, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras) , inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en una secuencia seleccionada de SEQ ID N. ° : 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en una secuencia seleccionada de SEQ ID N.°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) .
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 6. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 10. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 12. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 14. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que l tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 16. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 18. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 20.
Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VH seleccionada de SEQ ID N.°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de; (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 30, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 32.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende dominio (VL) variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En determinadas realizaciones, una secuencia VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N. ° : 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) .
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 7. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 9. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 11. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 13. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 17. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VL) del dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 19.
Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VL de una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 28 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N. ° : 6 y SEQ ID N.°: 5, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 8 y SEQ ID N.°: 7, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 10 y SEQ ID N.°: 9, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 12 y SEQ ID N.°: 11, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N. ° : 14 y SEQ ID N.°: 13, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 16 y SEQ ID N.°: 15, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 18 y SEQ ID N.°: 17, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 20 y SEQ ID N.°: 19, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LgR5 proporcionado en el presente. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que anticuerpo un anti-LgR5 que comprende una secuencia VH de SEQ ID N . ° : 8 y una secuencia VL de SEQ ID N.°: 7. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 67 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 22-323. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 68 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 1-312.
En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti-LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluso un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-LgR5 es un fragmento de anticuerpo, p. ej . , un fragmento Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o F(ab' )2- En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud sustancialmente completa, p. ej . , un anticuerpo IgGl u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, solas o en combinación, como se describe en las secciones 1-7 a continuación.
Anticuerpo YW353 y otras realizaciones En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-LgR5 que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 60; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 61; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 58; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 59.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 60; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 61; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 61. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 60, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 61 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 62.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VL HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 58; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 58 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 59.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 60, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 61 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 62; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VL HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 58 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 60; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 61; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 58 y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 59.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-LgR5 es un anticuerpo humano.
En otros aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 26. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 26 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en SEQ ID N.°: 26. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en SEQ ID N. ° : 26. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VH de SEQ ID N.°: 26, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de; (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 60, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 61 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende un dominio (VL) variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 25. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 25 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras) , inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en SEQ ID N.°: 25. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en SEQ ID N.°: 25. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VL de SEQ ID N.°: 25, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID . ° : 58 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 59.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 26 y SEQ ID N.°: 25, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LgR5 proporcionado en el presente. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que anticuerpo un anti-LgR5 que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 26 y una secuencia VL de SEQ ID N.°: 25. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 67 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 22-123. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 68 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 1-102.
En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti- LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluso un anticuerpo humano. En una realización, un anticuerpo anti-LgR5 es un fragmento de anticuerpo, p. ej . , un fragmento Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o F(ab')2- En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud sustancialmente completa, p. ej . , un anticuerpo IgG2a u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, solas o en combinación, como se describe en las secciones 1-7 a continuación.
Anticuerpo 3G12 y otras realizaciones En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-LgR5 que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 48; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 49; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 45; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 46; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 48; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 49; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N . ° : 50. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 49. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 48, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 49 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 45; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 46; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 45; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 46 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 47.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 48, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 49 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 50; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VL HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 45, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 46 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 47.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 48; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 49; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 45; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 46 y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-LgR5 está humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-LgR5 comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un marco receptor humano, p. ej . un marco de inmunoglobulina humana o un marco humano de consenso. En determinadas realizaciones, el marco receptor humano es el marco consenso VL kappa (VLK) humano o el marco de consenso 3 (VH3) de VH subgrupo humano.
En otros aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 , 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 22. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 22 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras) , inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 22. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 22. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) .
Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VH de SEQ ID N. ° : 22, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de; (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 48, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 49 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 50.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende un dominio (VL) variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 21. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 21 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras) , inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 21. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 21. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) .
Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VL de SEQ ID N.°: 21, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 45; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 46 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 47.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 22 y SEQ ID N.°: 21, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LgR5 proporcionado en el presente. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que anticuerpo un anti-LgR5 que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 22 y una secuencia VL de SEQ ID NÍ°: 21. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 67 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 324-423. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N. ° : 68 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 303-402. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N. ° : 67 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 324-555. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 68 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 303-534.
En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti-LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluso un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-LgR5 es un fragmento de anticuerpo, p. ej . , un fragmento Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o F(ab')2- En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud sustancialmente completa, p. ej . , un anticuerpo IgGl u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, solas o en combinación, como se describe en las secciones 1-7 a continuación.
Anticuerpo 2H6 y otras realizaciones En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-LgR5 que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 54; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 55; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 51; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HV seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 54; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 55; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 55. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 54, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 55 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 56.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 51; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 51; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 53.
En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 54, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 55 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°: 56; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias VL HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 51, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 53.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 54; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 55; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 56; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 51; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52 y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 53.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-LgR5 está humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-LgR5 comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un marco receptor humano, p. ej . un marco de inmunoglobulina humana o un marco humano de consenso. En determinadas realizaciones, el marco receptor humano es el marco consenso VL kappa (VLK) humano o el marco 3 (VH3) de VH subgrupo humano.
En otros aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 comprende una secuencia (VH) del dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 24. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 24 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 24. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 24. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) .
Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VH de SEQ ID N.°: 24, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de; (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.c: 54, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 55 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 56.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende un dominio (VL) variable de cadena ligera que tiene al menos el 90 %, 91 %, I 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 23. En determinadas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 23 contiene sustituciones (p. ej . , sustituciones conservadoras) , inserciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LgR5 que comprende esa secuencia mantiene la capacidad de unirse a LgR5. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 23. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 23. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR) .
Opcionalmente, el anticuerpo anti-LgR5 comprende la secuencia VL de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 23, incluso modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 51; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 52 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 53.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°: 24 y SEQ ID N.°: 23, respectivamente, incluso modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LgR5 proporcionado en el presente. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que anticuerpo un anti-LgR5 que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°: 24 y una secuencia VL de SEQ ID N.°: 23. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N. ° : 67 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 324-423. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 68 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 303-402. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 67 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 324-555. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de SEQ ID N.°: 68 de, dentro o que se superpone con los aminoácidos 303-534.
En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti-LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluso un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-LgR5 es un fragmento de anticuerpo, p. ej . , un fragmento Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo o F(ab')2- En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud sustancialmente completa, p. ej . , un anticuerpo IgGl u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, solas o en combinación, como se describe en las secciones 1-7 a continuación. 1. Afinidad, del anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, = 100 nM, = 10 n , = 1 nM, < 0,1 nM, = 0,01 nM o < 0,001 nM y, opcionalmente, es > 10~13 M. (p. ej . 10"8 M o menor, p. ej . de 10~8 M a 10~13 M, p. ej . , de 10"9 M a 10"13 M) .
En una realización, Kd se mide mediante un ensayo de unión al antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de unión a la solución de los Fab por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoración de antígeno sin marcar, luego capturando el antígeno de enlace con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, p. e . , Chen y col., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubrieron múltiples pocilios MICROTITER* (Thermo Scientific) durante la noche con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6) y posteriormente se bloquearon con albúmina de suero bovino al 2 % (v/v) en PBS de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , se mezclan 100 pM o 26 pM de antígeno marcado con [125I] con diluciones seriales de un Fab de interés (p. ej . , coherente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta y col., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés luego se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más extenso (p. ej . , aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcance el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se traspasan a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (p. ej . , durante una hora) . Luego se elimina la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0,1 % (TWEEN-20e) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 µ?/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20 ™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT ™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual al 20 % de unión máxima se eligen para el uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra realización, Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIACOREe-2000 o un BIACORE *-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips de CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . En resumen, los chips del biosensor del dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clohidrato de N-etil-W - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, para 5 µg/ml (~0,2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, 1 M de etanolamina se inyecta pora bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas en dos etapas de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con surfactante polisorbato 20 al 0,05 % (TWEEN-20™) (PBST) a 25 °C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (^??) y las velocidades de disociación (kcff) se calculan utilizando modelo de unión Langmuir simple (BIACORE Evaluation Software versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensorgramas de asociación y disociación. La constante de equilibrio de disociación (Kd) se calcula como la proporción koff kon- Véase, p. ej . , Chen y col., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) . Si la velocidad de asociación excede 106 M"1 s"1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25 "C de un anticuerpo anti-antígeno de 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según lo medido en un espectrómetro, por ejemplo un espectrofotómetro con método para la parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco* de 8000 series (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 2. Fragmentos de anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, entre otros, fragmentos Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2, Fv y scFv y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson y col. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, véase, p. ej . , Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994); véase también WO 93/16185; y patentes estadounidenses N. ° 5.571.894 y 5.587.458. Para conocer un planteamiento de fragmentos Fab y F(ab' )2 que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen una vida media in vivo aumentada, véase patente estadounidense N. ° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos . Véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson y col., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson y col., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de único dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de único dominio es un anticuerpo de único dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, p. ej . , la patente estadounidense N.° 6.248.516 Bl) .
Los fragmentos de anticuerpo se pueden realizar a través de diversas técnicas, incluso, entre otros, digestión proteolítica de anticuerpo intacto así como producción por células huésped recombinantes (p. ej . E. coli o fagos), como se describe en el presente. 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente es un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, p. ej . , en la patente estadounidense N. ° 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (p . ej . , una región variable derivada de uh ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, por ejemplo un uno) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "de clase cambiada" en el cual la clase o subclase se ha cambiado de la del anticuerpo padre. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión al antígeno de los mismos .
En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad de los seres humanos, mientras retienen la especificidad y afinidad del anticuerpo madre no humano. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los cuales las HVR, p. ej . , las CDR, (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Opcionalmente, un anticuerpo humanizado comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (p. ej . , el anticuerpo del cual se derivan los residuos de HVR) , p. ej . , para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos para realizarlos se revisan, p. ej . , en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y además se describen, p. ej . , en Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); Queen y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 86:10029-10033 (1989); patentes estadounidenses N.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri y col., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de SDR (a-CDR) ) ; Padlan, Mol. Immunol . 28:489-498 (1991) (que describe el "recubrimiento"); Dall'Acqua y col., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR" ) ; y Osbourn y col., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka y col., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" para reordenamiento de FR) .
Las regiones marco humanas que se pueden utilizar para la humanización incluyen, entre otros: regiones marco seleccionadas utilizando el método "de ajuste óptimo" (véase, p. ej . , Sims y col. J. Immunol . 151:2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, p. ej . , Cárter y col. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89:4285 (1992); y Presta y col. J. Iiñmunol . , 151:2623 (1993)); regiones marco maduras humanas (somáticamente mutado) o regiones marco germinales humanas ( éase, p. ej . , Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) ) ; y regiones marco derivadas de evaluar las genotecas de FR (véase, p. ej . , Baca y col., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok y col., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpos humanos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel, Curr.
Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la estimulación antígenica. Dichos animales típicamente contienen todo o parte del locus de la inmunoglobulina humana, que reemplaza el locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas de los animales. En dichos ratones transgénicos, el locus de inmunoglobulina endógena generalmente ha sido inactivada. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véase también, p. ej . , las patentes estadounidense N.6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente estadounidense N. ° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; la patente estadounidense N.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente estadounidense N. ° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®) . Las regiones variables humanas de los anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar adicionalmente, p. ej . , combinando con una región constante humana diferente.
Los anticuerpos humanos también se pueden realizar a través de métodos basados en hibridoma. Se han descrito mieloma humano y las líneas celulares de heteromieloma humana-de ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, p. ej . , Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner y col., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Los anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridomas de células B humanas también se describen en Li y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense N.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM monoclonales humanos a partir de las líneas celulares de hibridomas) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4) : 265-268 (2006) (que describe hibridomas humanos-humanos) . La tecnología de hibridomas humanos (Trioma technology) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3) :185-91 (2005) .
Los anticuerpos humanos también se pueden generar aislando las secuencias de dominio variable de coles de Fv seleccionadas de las genotecas de expresión de fagos derivados de humanos. Dichas secuencias de dominio variable luego se pueden combinar con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de las genotecas de anticuerpos se describe a continuación. 5. Anticuerpos derivados de genotecas Los anticuerpos de la invención se pueden aislar evaluando las genotecas combinatorias para los anticuerpos con la actividad o las actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica diversos métodos para generar genotecas de expresión de fagos y evaluar dichas genotecas para que los anticuerpos tengan las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, p. ej . , en Hoogenboom y col. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien y col., ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, p. ej . , en cCafferty y col., Nature 348:552-554; Clackson y col., Nature 352: 624-628 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu y col., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee y col., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee y col., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004) .
En determinados métodos de expresión de fagos, los repertorios de genes VH y VL se clonan por separado a través de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en genotecas en fagos, que luego se pueden evaluar para fagos de unión al antígeno como se describe en inter y col., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagos típicamente expresan fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv de cadena única (scFv) o como fragmentos Fab. Las genotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de hibridomas de construcción. Alternativamente, el repertorio virgen se puede clonar (p. ej . , de humanos) para proporcionar una única fuente de anticuerpos de un amplio intervalo de antígenos no autónomos y no autónomos sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths y col., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las genotecas vírgenes también se pueden realizar sintéticamente clonando segmentos de genes V no reordenados a partir de células madres y utilizando cebadores PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen genotecas de anticuerpos humanos en fagos incluyen, por ejemplo: patente estadounidense N.° 5.750.373 y publicaciones de patentes estadounidenses N.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de las genotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en el presente. 6. Anticuerpos multiespecíficos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente es un anticuerpo multiespecífico, p. ej . un anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es por LgR5 y la otra es por cualquier otro antígeno. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es por LgR5 y la otra es por CD3. Véase, p. ej . , patente estadounidense N.° 5.821.337. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecífieos se pueden unir a dos epítopos de LgR5 diferentes. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos en las células que expresan LgR5. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para realizar anticuerpos multiespecíficos incluyen, entre otros, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, Traunecker y col., EMBO J. 10: 3655 (1991)) e ingeniería genética wknob-in-hole" (véase, p. ej . , la patente estadounidense N. ° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden realizar por ingeniería de efectos de orientación por interacción electrostática para realizar moléculas heterodiméricas Fe de anticuerpos (WO 2009/089004A1) ; entrecruzando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, p. ej . , la patente estadounidense N.° 4.676.980, y Brennan y col., Science, 229: 81 (1985)); utilizando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecxficos (véase, p. ej . , Kostelny y col., J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992)); utilizando tecnología "diacuerpo" para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, p. ej . , Hollinger y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:6444-6448 (1993)); utilizando dímeros de Fv de cadena única (sFv) (véase, p. ej . Gruber y col., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecífieos como se describe, p. ej . , en Tutt y col. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Los anticuerpos modificados genéticamente con tres o más sitios de unión al antígeno funcionales, incluso "anticuerpos pulpo" , también se incluyen en el presente (véase, p. ej . US 2006/0025576A1) .
El anticuerpo o fragmento en el presente también incluye un "Fab de actuación doble" o "DAF" que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a LgR5 así como otro antígeno diferente (véase, US 2008/0069820, por ejemplo) . 7. Variantes de anticuerpos En determinadas realizaciones, se contemplan las variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos proporcionadas en el presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar introduciendo modificaciones adecuadas en la secuencia de nucleótidos que codifican el anticuerpo o por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se puede realizar para llegar al constructo final, siempre y cuando el constructo final posea las características deseadas, p. ej . , unión al antígeno. a) Variantes de la sustitución, inserción y eliminación En determinadas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título "sustituciones preferidas" . Cambios más sustanciales se proporcionan en la Tabla 1 bajo el título "sustituciones ejemplares" y se describen adicionalmente a continuación con referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés y los productos se pueden evaluar para una actividad deseada, p. ej . , unión al antígeno mantenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mej orada .
TABLA 1 Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral : (1) hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílieos neutrales: cys, ser, thr; asn; gln; (3) ácidos: asp, glu,- (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: gly, pro; (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.
Un tipo de variante sustitucional implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo padre (p. ej . un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para estudios adicionales tendrán modificaciones (p. ej . , mejoras) en determinadas propiedades biológicas (p. ej . , mayor afinidad, inmunogenicidad reducida) en comparación con el anticuerpo padre o tendrán determinadas propiedades biológicas del anticuerpo padre sustancialmente conservadas . Una variante sustitucional ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad, que se puede generar convenientemente, p. ej . , utilizando técnicas de maduración de la afinidad basadas en expresión de fagos como las descritas en el presente. En resumen, uno o más residuos de HVR se mutan y los anticuerpos variantes se expresan en fagos y se evalúan para una actividad biológica particular (p. e . afinidad de unión) .
Se pueden realizar alteraciones (p. ej . , sustituciones) en las HVR, p. ej . , para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos de calor" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante los procesos de maduración somáticos (véase, p. ej . , Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) o SDR (a-CDR) , con la variante resultante VH o VL evaluada para la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de la afinidad construyendo y volviendo a seleccionar de genotecas secundarias, p. ej . , en Hoogenboom y col. En Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien y col., ed. , Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunas realizaciones de la maduración de la afinidad, se introduce la diversidad en los genes variables escogidos para la maduración a través de cualquiera de diversos métodos (p. ej . , PCR susceptible a errores, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida a oligonucleótidos) . Luego se crea una genoteca secundaria. La genoteca luego se evalúa para identificar cualquier variante de anticuerpos con la afinidad deseada. Otro método para introducir la diversidad comprende enfoques dirigidos a HVR, en los cuales varios residuos de HVR (p. ej . , residuos 4-6 por vez) se eligen al azar. Los residuos de HVR que participan en la unión al antígeno se pueden identificar especialmente, p. ej . , utilizando mutagénesis de exploración de alanina o modelado. Se suele apuntar a CDR-H3 y CDR-L3 en particular.
En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se pueden producir dentro de una o más HVR de modo que dichas alteraciones no reducen sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, en HVR se pueden realizar alteraciones conservadoras (p. ej . , las sustituciones conservadoras como se proporcionan en el presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión. Dichas alteraciones pueden ser fuera de los "puntos de calor" de HVR o SDR. En determinadas realizaciones de las secuencias VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR no se modifica o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos .
Un método útil de identificación de residuos o regiones de un anticuerpo al cual se puede apuntar para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos diana (p. ej . , residuos cargados, por ejemplo arg, asp, his, lys y glu) se identifican y reemplazan por un aminoácido neutral o con carga negativa (p. ej . , alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno resulta afectada. Se pueden introducir sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o adicionalmente, se utiliza una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Se puede apuntar a dichos residuos de contacto y a los residuos vecinos o se pueden eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden evaluar las variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de amino terminal o carboxilo terminal con una longitud que oscila entre un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de un solo residuo de aminoácidos o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionil del terminal N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del extremo amino terminal o extremo carboxilo terminal del anticuerpo a una enzima (p. ej . para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo. b) Variantes de glicosilación En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente se altera para aumentar o disminuir la medida a la cual el anticuerpo se glicosila. La adición o eliminación de sitios de glicosilación a un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que uno o más sitios de glicosilación se crean o eliminan.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido a ella se puede alterar. Los anticuerpos nativos producidos por células mamíferas típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente está unido por un enlace N-a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Véase, p. ej . , Wright y col. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, p. ej . , mañosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc) , galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpos con determinadas propiedades mejoradas.
En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpos con una estructura de carbohidratos que carece de fucosa unida (directamente o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de entre el 1 I y el 80 ¾, de entre el 1 ¾ y el 65 I, de entre el 5 % y el 65 % o de entre el 20 % y el 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcares en Asn297, en comparación con la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (p. ej . estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosea) según lo medido por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado en aproximadamente la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de residuos de la región Fe) ; sin embargo, Asn297 también se puede ubicar aproximadamente + 3 aminoácidos hacia arriba o hacia abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a las variaciones menores de secuencias en los anticuerpos . Dichas variantes de fucosilación pueden tener función ADCC mejorada. Véase, p. ej . , las publicaciones de patentes estadounidenses N.° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "defucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; O 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140; Okazaki y col. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki y col. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluye células CHO Lecl3 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka y col. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente estadounidense US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams y col., especialmente en el Ejemplo 11) , y líneas celulares transgénicas , por ejemplo gen alfa-1, 6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO transgénicas (véase, p. ej . , Yamane-Ohnuki y col. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. y col., Biotechnol. Bioeng. , 94 (4) : 680-688 (2006); y WO2003/085107) .
Además se proporcionan variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisectados, p. ej . , en los cuales un oligosacárido biantenario unido a la región Fe del anticuerpo se bisecta por GlcNAc . Dichas variantes de anticuerpos pueden tener fucosilación reducida o función ADCC mejorada. Ejemplos de dichas variantes de anticuerpos se describen, p. ej . , en WO 2003/011878 (Jean-Mairet y col . ; patente estadounidense N.° 6.602.684 (Umana y colj; y US 2005/0123546 (Umana y col . ) . También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos se describen, p. ej . , en WO 1997/30087 (Patel y col.;; WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.). c) Variantes de la región Fe En determinadas realizaciones, una o más modificaciones de aminoácidos se pueden introducir en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en el presente, generado así una variante de la región Fe . La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (p. ej . , una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (p. ej . una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En determinadas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que la convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la vida media del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo determinadas funciones efectoras (por ejemplo complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo para confirmar la reducción/pérdida las de actividades CDC o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fe (FcR) se pueden realizar para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC) , pero mantiene la capacidad de unión a FcRn. Las principales células para mediar células ADCC, NK, solamente expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Ejemplos no exhaustivos de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describe en la patente estadounidense N.° 5.500.362 (véase, p. ej . Hellstrom, I. y col. Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M. y col., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) ) . Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad ACTI™ no radioactivo de citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad CytoTox 96ffi radioactivo (Promega, Madison, WI) . Células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células destructoras naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, p. ej . , en un modelo animal, por ejemplo el divulgado en Clynes y col. Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a Clq para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a Clq y, por lo tanto, carece de actividad CDC. Véase, p. ej . , ELISA de unión a Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación de complementos, se puede realizar un ensayo con CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. y col., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar la unión a FcRn y las determinaciones in vivo de eliminación/vida media utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej . , Petkova, S.B. y col., Int'l. Immunol. 18(12) .1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen los que tienen sustitución de uno o más residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense N.° 6.737.056). Dichos mutantes Fe incluyen los mutantes Fe con sustituciones en dos o más posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluso el mutante Fe también denominado "DA A" con sustitución de residuos 265 y 297 de alanina (patente estadounidense N.° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpos con unión a FcR mejorada o disminuida. (Véase, p. e . , la patente estadounidense N. ° 6.737.056; WO 2004/056312 y Shields y col., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran ADCC, p. ej . , sustituciones en las posiciones 298, 333 o 334 de la región Fe (numeración EU de residuos) .
En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fe que producen unión a Clq alterada (es decir, ya sea mejorada o disminuida) o citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) , p. ej . , como se describe en la patente estadounidense N. ° 6.194.551, WO 99/51642, y Idusogie y col. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con vidas medias mayores y unión mejorada al receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable de la transferencia de IgG materna al feto (Guyer y col., J. Iínmunol. 117:587 (1976) y Kim y col., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton y col.). Esos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en ellas que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Dichas variantes de Fe incluyen las que tienen sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fe : 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, p. ej . , sustitución del residuo de la región Fe 434 (patente estadounidense N. ° 7.371.826).
Véase también Duncan & Winter, Na ture 322:738-40 (1988); patente estadounidense N. ° 5.648.260; patente estadounidense N.° 5.624.821; y WO 94/29351 referentes a otros ejemplos de variantes de la región Fe. d) Variantes de anticuerpos modificados genéticamente con cisteína En determinadas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos modificados genéticamente con cisteína, p. ej . , "thioMAbs", en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo se sustituye con residuos de cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, grupos tiol reactivos se ubican en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo a otras porciones, por ejemplo porciones de fármaco o porciones fármaco-ligador, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en el presente. En determinadas realizaciones, cualquiera o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fe dé cadena pesada. Los anticuerpos modificados genéticamente con cisteína se pueden generar como se describe, p. ej . , en la patente estadounidense N. ° 7.521.541.
Un (LC) V205C thiomab hu8Ell.v2 de cadena ligera ejemplar tiene las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID N. ° : 64 y 74, respectivamente. Un (HC) A118C thiomab hu8Ell.v2 de cadena pesada tiene las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID N.°: 75 y 63, respectivamente. Un (HC) S400C thiomab hu8Ell.v2 de cadena pesada tiene las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID N.°: 76 y 63, respectivamente.
Un (LC) V205C thiomab YW353 de cadena ligera ejemplar tiene las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID N.°: 66 y 77, respectivamente. Un (HC) A118C thiomab Y 353 de cadena pesada tiene las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID N.°: 78 y 65, respectivamente. Un (HC) S400C thiomab YW353 de cadena pesada tiene las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID N. ° : 79 y 65, respectivamente.
Otros thiomabs V205C modificados genéticamente con cisteína ejemplares comprenden una cadena ligera que comprende una región variable seleccionada de SEQ ID N. ° : 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 y una región constante de SEQ ID N.°: 80; y una cadena pesada que comprende una región variable seleccionada de SEQ ID N.°: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 y una región constante de cadena pesada humana, por ejemplo una IgGl . Otros thiomabs A118C modificados genéticamente con cisteína ejemplares comprenden una cadena ligera que comprende una región variable seleccionada de SEQ ID N.°: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 y una región constante de cadena ligera humana, por ejemplo una región constante de cadena ligera kappa humana; y una cadena pesada que comprende un región variable selección de SEQ ID N, °: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 y una región constante de SEQ ID N.°: 81. Otros thiomabs S400C modificados genéticamente con cistexna ejemplares comprenden una cadena ligera que comprende una región variable seleccionada de SEQ ID N . ° : 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 y una región constante de cadena ligera humana, por ejemplo una región constante de cadena ligera kappa humana; y una cadena pesada que comprende un región variable selección de SEQ ID N, ° : 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 y una región constante de SEQ ID N. ° : 82. e) Derivados de anticuerpos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente se pueden modificar adicionalmente para contener porciones no proteináceas adicionales que se conocen en la técnica y se encuentran fácilmente disponibles. Las porciones adecuadas para la derivación del anticuerpo incluyen, entre otros, polímeros solubles en agua. Ejemplos no exhaustivos de polímeros solubles en agua incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilalcohol, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, etileno/copolímero de anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona) olietilenglicol, homopolímeros propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado (p. ej . , glicerol) , polivinilalcohol y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si hay más de un polímero unido, pueden ser las mismas moléculas o moléculas diferentes. En general, la cantidad o tipo de polímeros utilizados para la derivación se pueden determinar en base a consideraciones incluso, entre otros, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se mejorará, si el derivado de anticuerpo se utilizará en una terapia en condiciones definidas, etc.
En otra realización, se proporcionan los conjugados de un anticuerpo y la porción no proteinácea que se puede calentar de forma selectiva mediante la exposición a la radiación. En una realización, la porción no proteinácea es un nanotu o de carbono (Kam y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, entre otros, longitudes de onda que no dañan las células comunes, pero que calientan la porción no proteinácea a una temperatura en la cual las células próximas a la porción no proteinácea del anticuerpo mueren.
B. Composiciones y métodos recombinantes Los anticuerpos se pueden producir utilizando composiciones y métodos recombinantes, p. ej . , como se describe en la patente de estadounidense N. ° 4.816.567. En una realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-LgR5 descrito en el presente. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia VL o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (p. ej . , las cadenas ligera o pesada del anticuerpo) . En otra realización, se proporcionan uno o más vectores (p. ej . , vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otra realización, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En dicha realización, una célula huésped comprende (p. ej . , se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH el anticuerpo. En una realización, la célula huésped es eucariota, p. e . una célula ovárica de hámster chino (CHO) o célula linfoide (p. ej . , célula YO, NSO, Sp20) . En una realización, se proporciona un método para realizar un anticuerpo anti-LgR5, en donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporcionó anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente , recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped) .
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-LgR5, se aisla un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, p. ej . , como se describió anteriormente, y se inserta en uno o más vectores par ala clonación o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente mediante los procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo) .
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando la glicosilación y la función efectora de Fe no se necesitan. Para la expresión de fragmentos y polipéptidos de anticuerpos en bacterias, véase, p. ej . , las patentes estadounidenses N.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli) . Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de células bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o la levadura son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores codificantes de anticuerpos, incluso cepas de hongos y levadura cuyas vías de glicosilación se han "humanizado" , dando lugar a la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcialmente o completamente humano. Véase Gerngross, Wa . Biotech. 22:1409-1414 (2004) y Li y col., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden utilizar junto con células de insectos, particularmente para la transfeccion de células de Spodoptera frugiperda .
También se pueden utilizar como huéspedes los cultivos celulares vegetales. Véase, p. ej . , las patentes estadounidense N. ° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLA TIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .
También se pueden utilizar como huéspedes las células dé los vertebrados. Por ejemplo, las líneas celulares mamíferas que se adaptan para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huésped mamíferas útiles son líneas de células CV1 de riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7) ; líneas embrionarias humanas de riñon (células 293 o 293 como se describe, p. ej . , en Graham y col., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK) ; células de sertoli de ratón (células TM4 como se describe, p. ej . , en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76) ; células de carcinoma cervical humano (HELA) ; células de riñon canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) ; células de pulmón humano (W138) ; células de hígado humano (Hep G2) ; tumor de mama de ratón (MMT 060562) ; células TRI, como se describe, p. ej . , en Mather y col., A nals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares huésped mamíferas útiles incluyen células ováricas de hámster chino (CHO) , incluso células DHFR" CHO (Urlaub y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, por ejemplo YO, NS0 u Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares huésped mamíferas adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, p. ej . , Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology,. Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003) .
C . Ensayos Los anticuerpos anti-LgR5 proporcionados en el presente se pueden identificar, evaluar o caracterizar para conocer sus propiedades físicas/químicas o actividades biológicas a través de diversos ensayos conocidos en la técnica.
En un aspecto, se evalúa un anticuerpo de la invención para conocer su actividad de unión al antígeno, p. ej . , a través de métodos conocidos, por ejemplo ELISA, BIACore'8, FACS o análisis de transferencia Western.
En otro aspecto, se pueden utilizar ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compete con cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente para la unión a LgR5. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (p. ej . , un epitopo lineal o un epítopo conformacional) que está unido por un anticuerpo descrito en el presente. Métodos ejemplares detallados para mapear un epítopo al cual se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" , en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) .
En un ensayo de competición ejemplar, se incuba la LgR5 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcada que se une a LgR5 (p. ej . , cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente) y un segundo anticuerpo sin marcar que se está evaluando para conocer su capacidad de competir con el primer anticuerpo para la unión a LgR5. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas . Como control, se incuba la LgR5 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado y no el segundo anticuerpo sin marcar. Después de la incubación en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a LgR5, se elimina el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con la LgR5 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con la LgR5 inmovilizada es sustancialmente reducida en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo para la unión a LgR5. Véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) .
D. Inmunocon ugados La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-LgR5 conjugado en el presente a uno o más agentes citotóxicos, por ejemplo agentes qüimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (p. ej . , toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, animal vegetal o fragmentos de las mismas) , o isótopos radioactivos (es decir, un radioconjugado) .
Los inmunoconjugados permiten la administración dirigida de una porción de fármaco a un tumor y, en algunas realizaciones, la acumulación intracelular allí, en donde la administración sistemática de fármacos no conjugados puede producir niveles inaceptables de toxicidad a las células normales (Polakis P. (2005) Current Opinión in Pharmacology 5:382-387) .
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) son moléculas quimioterapéuticas dirigidas que combinan propiedades los anticuerpos y los fármacos citotóxicos teniendo como diana fármacos citotóxicos potentes para células tumorales que expresan antígeno (Teicher, B.A. (2009) Current Cáncer Drug Targets 9:982-1004), potenciando así el índice terapéutico maximizando la eficacia y minimizando toxicidad específica (Cárter, P.J. y Senter P.D. (2008) The Cáncer Jour. 14 (3) : 154-169 ; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107.
Los compuestos ADC de la invención incluyen los que tienen actividad contra el cáncer. En algunas realizaciones, los compuestos ADC incluyen un anticuerpo conjugado, es decir, unido por enlace covalente, a la porción de fármaco. Eñ algunas realizaciones, el anticuerpo está unido por enlace covalente a la porción de fármaco a través de un ligador. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención administran selectivamente una dosis eficaz de un fármaco a un tejido de tumor, por lo tanto se puede lograr mayor selectividad, es decir, una menor dosis eficaz, mientras aumenta el índice terapéutico ("ventana terapéutica").
La porción de fármaco (D) de los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) pueden incluir cualquier compuesto, porción o grupo que tenga un efecto citotóxico o citostático. Las porciones de fármaco pueden ejercer sus efectos citotóxico o citostático a través de mecanismos incluso, entre otros, unión a la tubulina, interacción o unión al ADN e inhibición de polimerasa ARN, síntesis proteica o topoisomerasa. Porciones de fármaco ejemplares incluyen, entre otros, un maitansinoide, dolastatina, auristatina, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepina (PBD) , nemorrubicina y sus derivados, P U-159682, antraciclina, duocarmicina, alcaloides de la vinca, taxano, tricoteceno, CC1065, camptotecina, elinafida y estereoisómeros , isósteros, análogos y sus derivados que tienen actividad citotóxica. Ejemplos no exhaustivos de dichos inmunocon ugados se presentan más detalladamente a continuación. 1. Conjugados de anticuerpo-fármaco ejemplares Una realización ejemplar de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) que tiene como diana una célula tumoral, una porción de fármaco (D) y una porción de ligador (L) que une el Ab a D. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a la porción de ligador (L) a través de uno o más residuos de aminoácidos, como lisina o cisteína.
Un ADC ejemplar tiene la Fórmula I: Ab-(L-D)p I en donde p es de 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, la cantidad de porciones de fármaco que se pueden conjugar con un anticuerpo es limitada por la cantidad de residuos de cisteína libres. En algunas realizaciones, se introducen los residuos de cisteína libres en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo a través de los métodos descritos en el presente. Los ADC ejemplares de Fórmula I incluyen, entre otros, anticuerpos que tienen 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de cisteína modificados (Lyon, R. y col. (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). En algunas realizaciones, uno o más residuos de cisteína libres ya están presentes en un anticuerpo, sin la utilización de ingeniería genética, en cuyo caso se pueden utilizar los residuos de cisteína libres existentes para conjugar el anticuerpo con un fármaco. En algunas realizaciones, se expone un anticuerpo a condiciones reductoras antes de la conjugación del anticuerpo para generar uno o más residuos de cisteína libres. a) Ligado es ejemplares Un "ligador" (L) es una porción bifuncional o multifuncional que se puede utilizar para unir una o más porciones de fármaco (D) a un anticuerpo (Ab) para formar un conjugado de anticuerpo- fármaco (ADC) de Fórmula I. En algunas realizaciones, se pueden preparar conjugados de anticuerpo- fármaco (ADC) utilizando un ligador que tenga grupos funcionales reactivos para unirse por enlace covalente al fármaco y al anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un tiol de cisteína de un anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional reactivo de un ligador o un intermedio de fármaco-ligador para producir un ADC.
En un aspecto, un ligador tiene un grupo funcional capaz de reaccionar con una cisteína libre presente en un anticuerpo para formar un enlace covalente. Ejemplos no exhaustivos de dichos grupos funcionales reactivos incluyen maleimida, haloacetamidas, a-haloacetilo, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos . Véase, p. e . , el método de conjugación en la página 766 de Klussman y col. (2004), Bioconjugate Chemistry 15 (4 ): 765-773 y los ejemplos del presente.
En algunas realizaciones, un ligador tiene un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Ejemplos de dichos grupos electrófilos incluyen, entre otros, grupos carbonilo de aldehidos y cetonas . En algunas realizaciones, un heteroátomo del grupo funcional reactivo del ligador puede reaccionar con un grupo electrófilo de un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad del anticuerpo. Ejemplos no exhaustivos de dichos grupos funcionales reactivos incluyen, entre otros, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
Un ligador puede comprender uno o más componentes ligadores. Ejemplos de componentes ligadores ejemplares incluyen 6-maleimidocaproil ( "MC" ) , maleimidopropanoil ( "MP" ) , valina-citrulina ("val-cit" o "ve"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo (un "PAB" ) , N-succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP") y 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("MCC"). Se conocen varios componentes ligadores en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación.
Un ligador puede ser un "ligador escindible" que facilita la liberación de un fármaco. Ejemplos no exhaustivos de ligadores escindibles incluyen ligadores lábiles al ácido (p. ej . , que comprenden hidrazona) , ligadores sensibles a proteasa (p. ej . , sensibles a peptidasa) , ligadores fotolábiles o ligadores que contienen disulfuro (Chari y col., Cáncer Research 52:127-131 (1992); US 5208020).
En algunas realizaciones, un ligador tiene la siguiente Fórmula II : en donde A es una "unidad extensora" y a es un entero de 0 a 1; W es una "unidad de aminoácido" y w es un entero de 0 a 12; Y es una "unidad espadadora" e y es 0, 1 o 2. Un ADC que comprende el ligador de Fórmula II tiene la Fórmula I (A) : Ab- (Aa-Ww-Yy-D) p en donde Ab, D y p se definen como se describió anteriormente para la Fórmula I . Realizaciones ejemplares de dichos ligadores se describen en la patente estadounidense N.° 7.498.298, que se incorpora expresamente al presente por referencia.
En algunas realizaciones, un componente ligador comprende una "unidad extensora" (A) que une un anticuerpo con otro componente ligador o con una porción de fármaco. A continuación se presentan ejemplos no exhaustivos de unidades extensoras (en donde la línea ondeada indica los sitios de unión covalente con un anticuerpo, fármaco u otros componentes ligadores) : En algunas realizaciones, un componente ligador comprende una "unidad de aminoácido" (W) . En algunas de dichas realizaciones, la unidad de aminoácido permite la escisión del ligador a través de una proteasa, facilitando así la liberación del fármaco del inmunoconjugado tras la exposición a las proteasas intracelulares, como las enzimas lisosómicas (Doronina y col. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784) . Ejemplos de unidades de aminoácido incluyen, entre otros, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos . Ejemplos de dipéptidos incluyen, entre otros, valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) ; fenilalanina-lisina (fk o phe-lys) ; fenilalanina-homolisina (phe-homolys) ; y N-metil-valina-citrulina (Me-val-c t) . Ejemplos de tripéptidos incluyen, entre otros, glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Una unidad de aminoácido puede comprender residuos de aminoácidos naturales o aminoácidos menores o análogos de aminoácidos no naturales, como la citrulina. Las unidades de aminoácido se pueden diseñar y optimizar para la escisión enzimática por una enzima específica, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor, catepsina B, C y D o una proteasa plasmina.
Típicamente, se pueden preparar ligadores tipo péptido médiante la formación de un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con un método de síntesis de fase líquida (p. ej . , E. Schróder y K. Lübke (1965) "The Peptides" , volumen 1, pp 76-136, Academic Press) .
En algunas realizaciones, un componente ligador comprende una "unidad espaciadora" (Y) que une el anticuerpo con una porción de fármaco, ya sea directamente o a través de una unidad extensora o una unidad de aminoácido. Una unidad espaciadora puede ser "autodestructiva" o "no autodestructiva" . Una unidad espaciadora "no autodestructiva" es una unidad en la cual parte o toda la unidad espaciadora permanece unida a la porción de fármaco tras la escisión del ADC. Ejemplos de unidades espaciadoras no autodestructivas incluyen, entre otros, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. En algunas realizaciones, la escisión enzimática de un ADC que contiene una unidad espaciadora glicina-glicina por una proteasa asociada a una célula tumoral provoca la liberación de una porción glicina-glicina- fármaco del resto del ADC. En algunas realizaciones, se somete la porción glicina-glicina- fármaco a una etapa de hidrólisis en la célula tumoral, escindiendo así la unidad espaciadora glicina-glicina de la porción de f rmaco .
Una unidad espaciadora "autodestructiva" permite la liberación de la porción de fármaco. En determinadas realizaciones, una unidad espaciadora de un ligador comprende una unidad de p-aminobencilo . En algunas de dichas realizaciones, un alcohol p-aminobencílico se une a una unidad de aminoácido a través de un enlace amida y se forma un carbamato, metilcarbamato o carbonato entre el alcohol bencílico y el fármaco (Hamann y col. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). En algunas realizaciones, la unidad espaciadora comprende p-aminobenciloxicarbonilo (I?AB) . En algunas realizaciones, un ADC que comprende un ligador autodestructi o tiene la estructura: en donde Q es alquilo -Cx-Cg, -O- (alquilo Ci-C8) , -halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero en el intervalo de 0 a ; X puede ser una o más unidades espaciadoras adicionales o puede estar ausente; y p oscila entre 1 y aproximadamente 20. En algunas realizaciones, p oscila entre 1 y 10, l y 7, l y 5 1 y 4. Ejemplos no exhaustivos de unidades espadadoras incluyen: en donde Ri y R2 se seleccionan de manera independiente de H y alquilo CX-C6. En algunas realizaciones, Rl y R2 son cada uno -CH3.
Otros ejemplos de espaciadores autodestructivos incluyen, entre otros, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB, como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (patente estadounidense N. ° 7.375.078; Hay y col. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett . 9:2237) y orto- o para-aminobencilacetales . En algunas realizaciones, se pueden utilizar espaciadores que sufren ciclización luego de la hidrólisis del enlace amida, como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues y col. (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillos biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] adecuadamente sustituidos (Storm y col. (1972) J. A er. Chem. Soc. 94:5815) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, y col. (1990) J. Org. Chem. 55:5867) . El enlace de un fármaco al carbono de un residuo de glicina es otro ejemplo de un espaciador autodestructivo que puede ser útil en ADC (Kingsbury y col. (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
En algunas realizaciones, el ligador L puede ser un ligador de tipo dendrítico para la unión covalente de más de una porción de fármaco a un anticuerpo a través de una porción ligadora multifuncional ramificada (Sun y col. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun y col. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los ligadores dendríticos pueden aumentar la proporción molar de fármaco a anticuerpo, es decir, la carga, que está relacionada con la potencia del ADC. Por lo tanto, cuando un anticuerpo tiene solo un grupo tiol de cisterna reactivo, se pueden unir muchas porciones de fármaco a través de un ligador dendrítico.
A continuación, se muestran ejemplos no exhaustivos de ligadores en el contexto de un ADC de Fórmula I : val-cit en donde Ri y R2 se seleccionan de manera independiente de H y alquilo Ci-C6. En algunas realizaciones, Rl y R2 son cada uno -CH3. en donde n es de 0 a 12. En algunas realizaciones, n es de 2 a 10. En algunas realizaciones, n es de 4 a 8.
Otros ejemplos no exhaustivos de ADC incluyen las estructuras : en donde X es cada R es independientemente H o alquilo Ci-C6; y n es de 1 a 12.
En algunas realizaciones, se sustituye un ligador por grupos que modulan la solubilidad o reactividad. Como ejemplo no exhaustivo, un sustituyente cargado como sulfonato (-S03~) o amonio puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo del ligador y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo del ligador con el anticuerpo o la porción de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L (intermedio de anticuerpo-ligador) con D o D-L (intermedio de f rmaco-ligador) con Ab, dependiendo de la vía de síntesis utilizada para preparar el ADC. En algunas realizaciones, una porción del ligador se acopla al anticuerpo y una porción del ligador se acopla al fármaco, y después el Ab- (porción de ligador) a se acopla a la fármaco- (porción de ligador) b para formar el ADC de Fórmula I.
Los compuestos de la invención contemplan expresamente, entre otros, el ADC preparado con los siguientes reactivos de ligadores: bis-maleimido-trioxietilenglicol (BMPEO) , éster de N- ( ß-maleimidopropiloxi) -N-hidroxi succinimida (BMPS) , éster de N- ( e-maleimidocaproiloxi) succinimida (EMCS) , éster de N- [?-maleimidobutiriloxi] succinimida (GMBS) , 1, 6-hexan-bis-vinilsulfona (HBVS) , succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxi- (6-amidocaproato) (LC-SMCC) , éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), hidrazida de ácido 4 - (4 -N-Maleimidofenil) utírico (MPBH) , succinimidil 3- (bromoacetamido) propionato (SBAP) , succinimidil yodoacetato (SIA) , succinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato (SIAB) , N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , N-succinimidil-4- (2-piridiltio)pentanoato (SPP) , succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC) , succinimidil 4- (p-maleimidofenil) butirato (SMPB) , succinimidil 6- [ (beta-maleimidopropionamido) hexanoato] (SMPH) , iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y succinimidil- (4 -vinilsulfon) enzoato (SVSB) e incluido los reactivos bis-maleimida: ditiobismaleimidoetano (DTME) , 1,4-Bismaleimidobutano (BMB) , 1,4 Bismaleimidil-2 , 3 -dihidroxibutano (BMDB) , bismaleimidohexano (BMH) , bismaleimidoetano (BMOE) , BM(PEG)2 (se muestra a continuación) y BM(PEG)3 (se muestra a continuación); derivados bifuncionales de imidoésteres (como clorhidrato de dimetil adipimidato) , ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (como 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (como 1,5-difluoro-2, 4 -dinitrobenceno) . En algunas realizaciones, los reactivos bis-maleimida permiten la unión del grupo tiol de una cisteína en el anticuerpo a una porción de fármaco, ligador o intermedio de ligador-fármaco que contiene tiol. Otros grupos funcionales que son reactivos a grupos tiol incluyen, entre otros, yodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato .
BM(PEG)2 BM(PEG)3 Determinados reactivos de ligadores útiles se pueden obtener de varias fuentes comerciales, como Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL) , Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) o se pueden sintetizar de acuerdo con los procedimientos descritos en la técnica; por ejemplo, en Toki y col. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, y col. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60: 5352-5355 ; Frisch y col. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminpentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase, p. ej . , WO94/11026. b) Porciones de fármaco ejemplares (1) Maitansina y maitansinoides En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de maitansinoide . Los maitansinoides son derivados de la maitansina y son inhibidores mitóticos que actúan mediante la inhibición de la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Máytenus serrata (N. ° de patente estadounidense 3896111) . Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente estadounidense N.° 4.151.042). Los maitansinoides sintéticos se divulgan, por ejemplo, en las patentes estadounidenses N. ° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663 y 4.371.533.
Las porciones de fármacos maitansinoides son porciones de fármacos atractivos en los conjugados de anticuerpo-fármaco porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivación de productos de fermentación, (ii) favorecen la derivación con grupos funcionales adecuados para la conjugación mediante ligadores no disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) eficaces contra diversas líneas celulares tumorales .
Algunos maitansinoides adecuados para utilizar como porciones de fármacos maitansinoides son conocidos en la técnica y se pueden aislar de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos o se pueden producir utilizando técnicas de ingeniería genética (véase, p. ej . , Yu y col. (2002) PNAS 99:7968-7973) . Los maitansinoides también se pueden preparar sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos .
Ejemplos de porciones de fármacos maitansinoides incluyen, entre otros, aquellos que tienen un anillo aromático modificado, por ejemplo: C- 19 -descloro (pat. de EUA N.° 4256746) (preparado, por ejemplo, por reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2) ; C-20-hidroxi (o C-20-demetil) +/-C-19-descloro (pat. de EUA N.° 4361650 y 4307016) (preparado, por ejemplo, por desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o decloración utilizando LAH) ; y C-20-desmetoxi , C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (pat. de EUA N.° 4.294.757) (preparado, por ejemplo, por acilación utilizando cloruros de acilo) y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones del anillo aromático .
Ejemplos de porciones de fármacos maitansinoides también incluyen aquellos que tienen modificaciones como: C- 9-SH (pat. de EUA N.° 4424219) (preparado, por ejemplo, por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5) ; C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2 OR) (US 4331598) ; C-14 -hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (pat. de EUA N. ° 4450254) (preparado, por ejemplo, a partir de Nocardia) ; C-15-hidroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado, por ejemplo, por la conversión de maitansinol por Streptomyces) ; C-15-metoxi (pat. de EUA N.° 4313946 y 4315929) (por ejemplo, aislado de Trewia nudlflora) ; C-18-N-desmetilo (pat. de EUA N.° 4362663 y 4322348) (preparado, por ejemplo, por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces) ; y 4,5-desoxi (US 4371533) (preparado, por ejemplo, por la reducción con tricloruro de titanio/LAH de maitansinol) .
Muchas posiciones en los compuestos de maitansinoides son útiles como la posición de enlace. Por ejemplo, un enlace éster se puede formar mediante la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. En algunas realizaciones, la reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En algunas realizaciones, se forma el enlace en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
Las porciones de fármacos maitansinoides incluyen aquellas que tienen la estructura: en donde la línea ondeada indica la unión covalente del átomo de azufre de la porción de fármaco maitansinoide con un ligador de un ADC. Cada R puede ser independientemente H o un grupo Ci-C6. La cadena de alquileno que une el grupo amida al átomo de azufre puede ser metanilo, etanilo o propilo, es decir, m es 1, 2 o 3 (US 633410; US 5208020; Chari y col. (1992) Cáncer Res. 52:127-131; Liu y col. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci USA 93:8618-8623) .
Se contemplan todos los estereoisómeros de la porción de fármaco maitansinoide para el ADC de la invención, es decir, cualquier combinación de las configuraciones R y S en los carbonos quirales (US 7276497; US 6913748; US 6441163; US 633410 (RE39151) ; US 5208020; Widdison y col. (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408, que se incorporan por referencia en su totalidad) . En algunas realizaciones, la porción de fármaco maitansinoide tiene la siguiente estereoquímica: Las realizaciones ejemplares de las porciones de fármacos maitansinoides incluyen, entre otros, DM1 ; DM3 y DM4, que tienen las estructuras: en donde la línea ondeada indica la unión covalente del átomo de azufre del fármaco con un ligador (L) de un conjugado anticuerpo- fármaco .
Otros conjugados de anticuerpo de maitansinoide- fármaco ejemplares tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en donde Ab es anticuerpo y p es entre 1 y aproximadamente 20. En algunas realizaciones, p es de 1 a 10, p es de 1 a 7, p es de 1 a 5 o p es de 1 a 4) : Los conjugados de anticuerpo-fármaco ejemplares en donde DM1 está unido a través de un ligador BMPEO a un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y la abreviatura: en donde Ab es anticuerpo; n es 0, 1 o 2; y p es de 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, p es de 1 a 10, p es de 1 a 7, p es de 1 a 5 o p es de 1 a 4.
Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos para prepararlos y su uso terapéutico se divulgan, por ejemplo, en las patentes de EUA N.° 5.208.020 y 5.416.064; US 2005/0276812 Al; y en la patente europea EP 0 425 235 Bl, cuyas divulgaciones se incorporan expresamente al presente por referencia. Véase también Liu y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996); y Chari y col. Cáncer Research 52:127-131 (1992).
En algunas realizaciones, se pueden preparar los conjugados de anticuerpo-maitansinoide a través del enlace químico de un anticuerpo con una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Véase, p. ej . , la patente estadounidense N.° 5.208.020 (cuya divulgación se incorpora expresamente al presente por referencia) . En algunas realizaciones, ADC con un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha presentado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente la función o la solubilidad del anticuerpo. En algunas instancias, incluso se espera que una molécula de toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad con respecto al uso del anticuerpo desnudo.
Grupos de unión ejemplares para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoide incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en el presente y aquellos descritos en la patente estadounidense N.° 5208020; patente EP 0 425 235 Bl; Chari y col. Cáncer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 Al; y US 2005/016993 Al, cuyas divulgaciones se incorporan expresamente al presente por referencia. (2) Auristatinas y dolastatinas Las porciones de fármaco incluyen las dolastatinas, auristatinas y sus análogos y derivados (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431). Las auristatinas son derivados del compuesto de molusco marino dolastatina-10. Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular, se ha observado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con las dinámicas microtubulares, la hidrólisis GTP y la división nuclear y celular (Woyke y col. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12) : 3580-3584) y presentan actividad contra el cáncer (US 5663149) y antifúngica (Pettit y col. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción de fármaco de dolastatina/auristatina se puede unir al anticuerpo a través del extremo amino terminal o del extremo carboxilo terminal de la porción de fármaco peptídica (WO 02/088172; Doronina y col. (2003) Nature Biotechnology 21(7) :778-784; Francisco y col. (2003) Blood 102(4) :1458-1465) .
Las realizaciones ejemplares de auristatina incluyen las porciones de fármaco de monometilauristatina unidas al extremo amino terminal DE y DF, divulgadas en US 7498298 y US 7659241, cuyas divulgaciones se incorporan a la presente por referencia en su totalidad: en donde la línea ondeada de DE y DF indica el sitio de unión covalente a un anticuerpo o anticuerpo-componente ligador e independientemente en cada ubicación: R2 se selecciona de H y alquilo Ci-C8; R3 se selecciona de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 y alquilo Cx-Cs- (heterociclo C3-C8) ; R4 se selecciona de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Ci-C8, alquilo Ci-Cg- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 y alquilo Cx-C8- (heterociclo C3-C8) ; R5 se selecciona de H y metilo; o R4 y R5 forman en conjunto un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en donde Ra y Rb se seleccionan de manera independiente de H, alquilo Ci-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona de 2 , 3, 4, 5 y 6 ; R6 se selecciona de H y alquilo Ci-C8; R7 se selecciona de H, alquilo Ci-C8í carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Ci-C8, alquilo Cx-C3- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 y alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 se selecciona de manera independiente de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8 y 0- (alquilo Ci-C8) ; R9 se selecciona de H y alquilo C^-Cs; R10 se selecciona de arilo o heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH o NR12, en donde R12 es alquilo Ci-C8; R11 se selecciona de H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130)m-R14 o - (R130) m-CH (R15) 2 ; m es un entero en el intervalo de 1 a 1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo Ci-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-S03H o - (CH2) n-S03-alquilo Ci-Ce; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo Ci-C8 o -(CH2)n-COOH; R18 se selecciona de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C(R8) 2-C (R8) 2- (heterociclo C3-C8) y -C (R3) 2-C (R8) 2- (carbociclo C3-C8) ; y n es un entero en el intervalo de 0 a 6.
En una realización, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H o metilo. En una realización ejemplar, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H y R7 es sec-butilo.
En otra realización, R2 y R6 son cada uno metilo y R9 es -H.
En otra realización, cada aparición de R8 es -OCH3.
En una realización ejemplar, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y Rs son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3 y R9 es -H.
En una realización, Z es -O- o -NH- .
En una realización, R10 es arilo.
En una realización ejemplar, R10 es -fenilo.
En una realización ejemplar, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En una realización, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2/ en donde R15 es - (CH2) n-N (R16) 2 y R16 es -alquilo Cx-C8 o -(CH2)n-COOH.
En otra realización, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en donde R15 es - (CH2)n-S03H.
Una realización de auristatina ejemplar de la fórmula DE es MMAE, en donde la línea ondeada indica la unión covalente a un ligador (L) de un conjugado de anticuerpo-fármaco : Una realización de auristatina ejemplar de la fórmula DF es MMAF, en donde la línea ondeada indica la unión covalente a un ligador (L) de un conjugado de anticuerpo-fármaco : Otras realizaciones ejemplares incluyen compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones carboxi de fenilalanina en el extremo carboxilo terminal de la porción de fármaco de auristatina pentapeptídica (WO 2007/008848) y compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de cadena lateral de fenilalanina en el extremo carboxilo terminal de la porción de fármaco de auristatina pentapeptídica (WO 2007/008603) .
Realizaciones ejemplares no exhaustivas de ADC de Fórmula I que comprenden MMAE o MMAF y diversos componentes ligadores tienen la siguientes estructuras y abreviaturas (en donde "Ab" es un anticuerpo; p es de 1 a aproximadamente 8, "Val-Cit" es un dipéptido de valina-citrulina; y "S" es un átomo de azufre : Ab-MC-MMAF Realizaciones ejemplares no exhaustivas de ADC de Fórmula I que comprenden MMAF y diversos componentes ligadores incluyen además Ab-MC-PAB- MAF y Ab-PAB-MMAF. Se ha observado que los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un ligador que no es escindible proteolíticamente presentan actividad similar a la de los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un ligador escindible proteolíticamente (Doronina y col. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124). En algunas de dichas realizaciones, se cree que la liberación del fármaco es efectuada por la degradación del anticuerpo en la célula.
Típicamente, se pueden preparar porciones de fármacos basados en péptidos mediante la formación de un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con un método de síntesis de fase líquida (véase, p. ej . , E. Schróder y K. Lübke, 1965, "The Peptides" , volumen 1, pp 76-136, Academic Press) . Las porciones de fármaco de auristatina/dolastatina, en algunas realizaciones, se pueden preparar según los métodos: US 7498298; US 5635483; US 5780588; Pettit y col. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit y col. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., y col. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit y col. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; y Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21 (7) : 778-784.
En algunas realizaciones, se pueden preparar las porciones de fármaco de auristatina/dolastatina de fórmulas DE, como MMAE y DF, como MMAF e intermedios de fármaco-ligador y sus derivados, como MC-M AF, C- MAE, MC-vc-PAB-MMAF y MC-vc-PAB-MMAE utilizando los métodos descritos en US 7498298; Doronina y col. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; y Doronina y col. (2003) Nat . Biotech. 21:778-784 y después se pueden conjugar con un anticuerpo de interés. (3) Caliqueamicina En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina, y sus análogos puede producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones inferiores a las picomolares (Hinman y col., (1993) Cáncer Research 53:3336-3342; Lode y col., (1998) Cáncer Research 58:2925-2928). La caliqueamicina tiene sitios de acción intracelular, pero en determinados casos no cruza fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos puede, en algunas realizaciones, mejorar enormemente sus efectos citotóxicos. Métodos ejemplares no exhaustivos para preparar conjugados de anticuerpo-fármaco con una porción de fármaco de caliqueamicina se describen, por ejemplo, en US 5712374; US 5714586; US 5739116 y US 5767285. (4) Pirrolobenzodiazepinas En algunas realizaciones, un ADC comprende una pirrolobenzodiazepina (PBD) . En algunas realizaciones, los dímeros de PDB reconocen y se unen a secuencias de ADN específicas. El producto natural antramicina, una PBD, se registró por primera vez en 1965 (Leimgruber y col., (1965) J. Am. Chem. Soc. , 87:5793-5795; Leimgruber y col., (1965) J. Am. Chem. Soc, 87:5791-5793). Desde entonces, se han registrado varias PBD, naturales y análogas (Thurston y col., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465 incluido dímeros de la estructura de PBD tricíclica (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099). Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular, se cree que la estructura del dímero confiere la forma tridimensional adecuada para la isohelicidad con el surco menor del ADN de forma B, lo que produce un calce perfecto en el sitio de unión (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 3-11 (1975); Hurley y Needham-VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230-237). Se ha observado que los compuestos de PBD diméricos que tienen sustituyentes arilo C2 son útiles como agentes citotóxicos (Hartley y col. (2010) Cáncer Res. 70 (17) :6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927- 2941; Howard y col. (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19 (22) :6463-6466) .
Los dímeros de PBD se han conjugado con anticuerpos y se ha observado que el ADC resultante presenta propiedades contra el cáncer. Sitios de enlace ejemplares no exhaustivos en el dímero de PBD incluyen el anillo pirrólo de cinco miembros, el enlace entre las unidades de PBD y el grupo imina N10-C11 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598) .
Ejemplos de componentes de ADC de dímero de PBD no exhaustivos son de Fórmula A: y sus sales y solvatos, en donde: la línea ondeada indica el sitio de unión covalente ligador; las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3 ; R2 se selecciona de manera independiente de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR y opcionalmente se selecciona además de halo o dihalo, en donde RD se selecciona de manera independiente de R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan de manera independiente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona de manera independiente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; Q se selecciona de manera independiente de 0, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es O, S03M, cuando M es un catión metálico; R y R' se seleccionan de manera independiente de grupos alquilo Ci-8, alquilo Ci-i2, heterociclilo C3-8, heterociclo C3_20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y, opcionalmente con relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; R12, R16, R19 y R17 son como se definió para R2, R6, R9 y R7 respectivamente ; R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede ser interrumpida por uno o más heteroátomos , p. ej . , 0, S, N(H), Me o anillos aromáticos, p. ej . benceno o piridina, los cuales están opcionalmente sustituidos; y X y X' se seleccionan de manera independiente de O, S y N(H) .
En algunas realizaciones, R y R' se seleccionan de manera independiente de grupos alquilo heterociclilo C3-20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y, opcionalmente con relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; En algunas realizaciones, R9 y R19 son H.
En algunas realizaciones, Rs y R16 son H.
En algunas realizaciones, R7 y R17 son ambos 0R7A, cuando R7A es alquilo C1-4 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R7A es Me. En algunas realizaciones, R7A es Ch2Ph, cuando Ph es un grupo fenilo.
En algunas realizaciones, X es O.
En algunas realizaciones, R11 es H.
En algunas realizaciones, hay un doble enlace entre C2 y C3 en cada unidad monomérica.
En algunas realizaciones, R2 y R12 se seleccionan de manera independiente de H y R. En algunas realizaciones, R2 y R12 son independientemente R. En algunas realizaciones, R2 y R12 son independientemente arilo C5-2o o arilo C5-7 o arilo C8_10 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R2 y R12 son independientemente fenilo, tienilo, naftilo, piridilo, quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R2 y R12 se seleccionan de manera independiente de =0, =CH2, =CH-RD y =C(RD)2- En algunas realizaciones, R2 y R12 son =CH2. En algunas realizaciones, R2 y R12 son H. En algunas realizaciones, R2 y R12 son =0. En algunas realizaciones, R2 y R12 son =CF2. En algunas realizaciones, R2 o R12 son independientemente =C(RD)2. En algunas realizaciones, R2 o R12 son independientemente =CH-RD.
En algunas realizaciones, cuando R2 o R12 es =CH-RD, cada grupo puede tener independientemente cualquiera de las siguientes configuraciones: (l) En algunas realizaciones, un =CH-RD tiene la configuración (I) .
En algunas realizaciones, R" es un grupo alquileno C3 o un grupo alquileno C5.
En algunas realizaciones, un componente de dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(I) : En algunas realizaciones, un componente de dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(II) : en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, un componente de dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(III) : A (III) ; en donde RE y RE" se seleccionan de manera independiente de H o RD, en donde RD es como se definió anteriormente; y en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, n es 0. En algunas realizaciones, n es 1. En algunas realizaciones, RE o RE" es H. En algunas realizaciones, RE y RE" son H. En algunas realizaciones, RE o RE" es RD, en donde RD es alquilo Ci-i2 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RE o RE" es RD, en donde RD es metilo.
En algunas realizaciones, un componente de dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A (IV) : en donde Ar1 y Ar2 son independientemente arilo C5-2o opcionalmente sustituido; en donde Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes; y en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, un componente de dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(V) : en donde Ar1 y Ar2 son independientemente arilo C5-2o opcionalmente sustituido; en donde Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes; y en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 se seleccionan independientemente de fenilo, furanilo, tiofenilo y piridilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 son independientemente fenilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 son independientemente tien-2-ilo o tien-3-ilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 son independientemente quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido. El grupo quinolinilo o isoquinolinilo puede estar unido al núcleo de PBD a través de cualquier posición de anillo disponible. Por ejemplo, el quinolinilo puede ser quinolin-2-ilo, quinolin-3-ilo, quinolin-4ilo, quinolin-5-ilo, quinolin-6-ilo, quinolin-7-ilo y quinolin-8-ilo. En algunas realizaciones, el quinolinilo se selecciona de quinolin-3 -ilo y quinolin-6-ilo . El isoquinolinilo puede ser isoquinolin-l-ilo, isoquinolin-3 -ilo, isoquinolin-4ilo, isoquinolin-5-ilo, isoquinolin-6-ilo, isoquinolin-7-ilo e isoquinolin-8-ilo. En algunas realizaciones, el isoquinolinilo se selecciona de isoquinolin-3-ilo y isoquinolin-6-ilo.
Otros ejemplos de componentes de ADC de dímero de PBD no exhaustivos son de Fórmula B: y sus sales y solvatos, en donde: la línea ondeada indica el sitio de unión covalente al ligador; la línea ondeada conectada al OH indica la configuración S o R; RV1 y Rv2 se seleccionan de manera independiente de H, metilo, etilo y fenilo (el cual fenilo puede estar opcionalmente sustituido con fluoro, especialmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6; en donde RV1 y Rv2 pueden ser iguales o diferentes; y n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, RV1 y RV2 se seleccionan de manera independiente de H, fenilo y 4-fluorofenilo .
En algunas realizaciones, un ligador puede estar unido en uno de varios sitios de la porción de fármaco del dímero de PBD, incluida la imina N10 del anillo B, la posición endo/exo C-2 del anillo C o la unidad de enlace que une los anillos A (véase las estructuras C(I) y C(II) a continuación) .
Ejemplos de componentes de ADC de dímero de PBD no exhaustivos incluyen las Fórmulas C(I) y C(II): Las Fórmulas C(I) y C(II) se muestran en su forma de imina N10-C11. Ejemplos de porciones de fármaco PBD también incluyen las formas de carbinolamina y carbinolamina protegida, como se muestra en la tabla a continuación: en donde : X es CH2 (n = 1 a 5) , N u O; Z y Z' se seleccionan de manera independiente de OR y NR2, en donde R es una cadena alquilo primaria, secundaria o terciaria que contiene de 1 a 5 átomos de carbono ,- Ri, R'i, R2 y R'2 se seleccionan de manera independiente de H, alquilo Ci-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, arilo C5-20 (incluido arilos sustituidos) , grupos heteroarilo Cs-20, -NH2, -NHMe, -OH y -SH, en donde, en algunas realizaciones, las cadenas alquilo, alquenilo y alquinilo comprenden hasta 5 átomos de carbono ; R3 y R'3 se seleccionan de manera independiente de H, OR, HR y NR2, en donde R es una cadena alquilo primaria, secundaria o terciaria que contiene de 1 a 5 átomos de carbono ; R4 y R'4 se seleccionan de manera independiente de H, Me y OMe; R5 se selecciona de alquilo Ci-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, arilo C5-20 (incluido arilos sustituidos por halo, nitro, ciano, alcoxi, alquilo, heterociclilo) y los grupos heteroarilo C5-20, en donde, en algunas realizaciones, las cadenas alquilo, alquenilo y alquinilo comprenden hasta 5 átomos de carbono; R es H, alquilo Cx-Cs o un grupo protector (como acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC) , benciloxicarbonilo (CBZ) , 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc) o una porción que comprende una unidad autodestructora como valina-citrulina-PAB) ; R12 es H, alquilo Ci-C8 o un grupo protector; en donde un hidrógeno de uno de Ri# R'i, R2, R'2 R5 o R12 o un hidrógeno del espaciador -OCH2CH2 (X) nCH2CH20- entre los anillos A se reemplaza por un enlace conectado al ligador del ADC.
Ejemplos de porciones de dimero de PDB de ADC incluyen, entre otros (la línea ondeada indica el sitio de unión covalente al ligador) : Dimero de PBD; Realizaciones ejemplares no exhaustivas de ADC que comprende dxmeros de PBD tienen la siguientes estructuras : Dímero de PBD-Phe-Lys-PAB-Ab, en donde: n es de 0 a 12. En algunas realizaciones, n es de 2 a En algunas realizaciones, n es de 4 a 8. En algunas izaciones, n se selecciona de 4, 5, 6, 7 y 8.
Los ligadores del dimero de PBD-val-cit-PAB-Ab y del dimero de PBD-Phe-Lys-PAB-Ab son escindibles por proteasa, mientras que el ligador del dimero de PBD-maleimida-acetal es lábil al ácido.
Los dímeros de PBD y ADC que comprende dímeros de PBD se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej . , WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598. (5) Antraciclinas En algunas realizaciones, un ADC comprende una antraciclina. Las antraciclinas son compuestos antibióticos que presentan actividad citotóxica. Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular, los estudios han indicado que las antraciclinas pueden actuar para destruir las células a través de diversos mecanismos, incluido: 1) intercalación de las moléculas de fármaco en el ADN de la célula que inhibe la síntesis de ácidos nucleicos dependientes del ADN; 2) producción por el fármaco de radicales libres que después reaccionan con las macromoléculas celulares para causar daño a las células o 3) interacciones de las moléculas de fármaco con la membrana celular (véase, p. ej . , C. Peterson y col., "Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" en Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. en pp.97-102) . Debido a su potencial citotóxico, las antraciclinas se han utilizado en el tratamiento de varios tipos de cáncer como la leucemia, carcinoma de mama, carcinoma pulmonar, adenocarcinoma de ovario y sarcomas (véase, p. ej . , P.H- Wiernik, en Anthracycline : Current Status And New Developments p 11) .
Ejemplos no exhaustivos de antraciclinas incluyen la doxorrubicina, la epirrubicina, la idarrubicina, la daunomicina, la nemorrubicina y sus derivados. Se han preparado y estudiado inmunoconjugados y profármacos de daunorrubicina y doxorrubicina (Kratz y col. (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey y col. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov y col. (2005) Bioconj . Chem. 16:717-721; Nagy y col. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834; Dubowchik y col. (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King y col. (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; US 6630579). El conjugado de anticuerpo-fármaco BR96 -doxorrubicina reacciona específicamente con el antígeno asociado al tumor Lewis-Y y se ha evaluado en estudios de fase I y II (Saleh y col. (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani y col. (2000) Cáncer Jour. 6:78-81; Tolcher y col. (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484) .
PNU-159682 es un metabolito potente (o derivado) de la nemorrubicina (Quintieri y col. (2005) Clinical Cáncer Research 11 (4) : 1608-1617) . La nemorrubicina es un análogo semisintético de la doxorrubicina con un grupo 2-metoximorfolino en el aminoglucósido de doxorrubicina y se ha evaluado clínicamente (Grandi y col. (1990) Cáncer Treat. Rev. 17:133; Ripamonti y col. (1992) Brit. J. Cáncer 65:703; ) , incluso en ensayos de fase Il/III para el carcinoma hepatocelular (Sun y col. (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Absl448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cáncer Research, 44:1° ed. , Abs 4649; Pacciarini y col. (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116) . ejemplo no exhaustivo de ADC que comprendí nemorrubicina o derivados de nemorrubicina se muestra en la Fórmula la: (la) en donde Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi C1-C5 o una sal farmacéuticamente aceptable de estos; Li y Z juntos son un ligador (L) como se describe en el presente ,- T es un anticuerpo (Ab) como se describe en el presente; y m es entre 1 y aproximadamente 20. En algunas realizaciones, m oscila entre 1 y 10, l y 7, l y 5 o l y 4.
En algunas realizaciones, Rj. y R2 son metoxi (-OMe) .
Otro ejemplo no exhaustivo de ADC que comprende nemorrubicina o derivados de nemorrubicina se muestra en la Fórmula Ib : en donde Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi C1-C5 o una sal farmacéuticamente aceptable de estos? L2 y Z juntos son un ligador (L) como se describe en el presente ; T es un anticuerpo (Ab) como se describe en el presente; y m es entre 1 y aproximadamente 20. En algunas realizaciones, m oscila entre 1 y 10, l y 7, l y 5 o l y 4.
En algunas realizaciones, Rj. y R2 son metoxi (-OMe) . En algunas realizaciones, el componente de nemorrubicina de un ADC que contiene nemorrubicina es P U-159682. En algunas de dichas realizaciones, la porción de fármaco del ADC puede tener una de las siguientes estructuras : en donde la línea ondeada indica la unión al ligador (L) .
Las antraciclinas , incluido PNU- 159682 , se pueden conjugar con anticuerpos a través de varios sitios de enlace y diversos ligadores (US 2011/0076287; WO2009/099741 ; US 2010/0034837; WO 2010/009124), incluido los ligadores descritos en el presente.
Ejemplos de ADC que comprenden una nemorrubicina y un ligador incluyen, entre otros: PNU- 159682 -va 1-cit- PAB- e s ac ia dor -fib ; PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador (R1!2) -Ab, en donde: Rx y R2 se seleccionan de manera independiente de H y alquilo Ci-Cg; y PNÜ-159632-aaIeimida-ja3.
El ligador de PNU-159682 maleimida acetal-Ab es lábil al ácido, mientras que los ligadores de PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador-Ab y PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador (R1^) -Ab son escindibles por proteasa. (6) Otras porciones de fármaco Las porciones de fármaco también incluyen la geldanamicina (Mandler y col. (2000) J. Nat. Cáncer Inst. 92 (19) : 1573-1581; Mandler y col. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler y col. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791); y sus fragmentos y toxinas enzimáticamente activas, incluido, entre otros, cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de mo ordica charantia , curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos . Véase, p. ej . , WO 93/21232.
Las porciones de fármaco también incluyen compuestos con actividad nucleolítica (p. ej . , una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN) .
En determinadas realizaciones, un inmunoconjugado puede comprender un átomo altamente radiactivo. Existen diversos isótopos radiactivos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu. En algunas realizaciones, cuando se utiliza un inmunoconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo Te" o I123, o un marcador de spin para imagenología de resonancia magnética nuclear (N R) (también conocida como imagenología por resonancia magnética, MRI) , por ejemplo cicornio-89, yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbona-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El cicornio-89 puede ser complejo para diversos agentes quelantes de metal y conjugado con anticuerpos, p. ej . , para imagenología PET (WO 2011/056983).
Los radiomarcadores u otros marcadores se pueden incorporar en el inmunoconjugado de formas conocidas. Por ejemplo, un péptido puede ser biosintetizado o sinterizado químicamente utilizando precursores de aminoácidos adecuados que comprenden, por ejemplo, uno o más átomos de flúor-19 en el lugar de uno o más hidrógenos. En algunas realizaciones, los marcadores como Te", I123, Re186, Re188 e In111 se pueden unir mediante un residuo de cisteína en el anticuerpo. En algunas realizaciones, itrio- 90 se puede unir mediante un residuo de lisina del anticuerpo. En algunas realizaciones, se pueden utilizar el método de IODOGEN (Fraker y colaboradores (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80: 49-57 para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe determinados métodos .
En determinadas realizaciones, un inmunoconjugado pueden comprender un anticuerpo conjugado con una enzima activadora de profármacos . En algunas de dichas realizaciones, una enzima activadora de profármacos convierte un profármaco (p. ej . , un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase WO 81/01145) a un fármaco activo, por ejemplo un profármaco contra el cáncer. Dichos inmunoconjugados son útiles, en algunas realizaciones, en la terapia con profármacos mediada por enzimas dependiente de anticuerpos ("ADEPT"). Las enzimas que se pueden conjuga con un anticuerpo incluyen, entre otros, fosfatasas alcalinas, que son útiles para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasas , que son útiles para convertir fármacos que contienen fosfato en profármacos libres; citosina desaminasa, que es útil para convertir 5- fluorocitosina no tóxica en el profármaco contra el cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, por ejemplo proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (por ejemplo catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, que son útiles para convertir profármacos que contienen D-amina y sustituyentes; enzimas de escisión de carbohidratos, por ejemplo ß-galactosidasa y neuraminidasa, que son útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa, que es útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, por ejemplo penicilina V amidasa y penicilina G amidasa, que son útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. En algunas realizaciones, las enzimas pueden estar unidas por enlace covalente a anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Véase, p. ej . , Neuberger y col., Nature 312:604-608 (1984). c) Carga de fármaco La carga de fármaco está representada por p, la cantidad promedio de porciones de fármaco por anticuerpo en una molécula de Fórmula I. La carga de fármaco puede oscilar entre 1 y 20 porciones de fármaco (D) por anticuerpo. ADC de Fórmula I incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con un intervalo de porciones de fármaco de entre 1 y 20. La cantidad promedio de porciones de fármaco por anticuerpo en preparaciones de ADC de reacciones de conjugación se puede caracterizar a través de medios convencionales, por ejemplo espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. En algunas realizaciones, la separación, purificación y caracterización de ADC homogénea en donde p es un determinado valor de ADC con otros cargas de fármaco se puede lograr por medios como HPLC de fase inversa o electroforesis .
Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, p se puede limitar por la cantidad de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, en donde la unión es un tiol de cisteína, como en determinadas realizaciones ejemplares anteriores, un anticuerpo puede tener solamente uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener solamente uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales un ligador se puede unir. En determinadas realizaciones, la carga de fármaco más alta, p. ej . p >5, puede provocar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de permeabilidad celular de determinados conjugados de anticuerpo- fármaco. En determinadas realizaciones, la carga de fármaco promedio para un ADC oscila entre 1 y aproximadamente 8 ; entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6 ; o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5. De hecho, se ha demostrado que para determinados ADC, la proporción óptima de porciones de fármaco por anticuerpo puede ser menos que 8 y puede ser entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 (US 7498298) .
En determinadas realizaciones, menos que el máximo teórico de porciones de fármaco se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionan con el intermedio de f rmaco-ligador o reactivo del ligador, como se presenta a continuación. Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que se pueden unir a una porción de fármaco; de hecho, la mayoría de los residuos de tiol de cisteína en los anticuerpos existen como puentes disulfuro. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se puede reducir con un agente reductor como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , en condiciones reductoras parciales o totales, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleófilos reactivos, por ejemplo lisina o cisteina.
La carga (proporción fármaco/anticuerpo) de un ADC se pueden controlar de maneras diferentes y, por ejemplo: (i) limitando el exceso molar de intermedio de ligador- fármaco o reactivo del ligador respecto del anticuerpo, (ii) limitando el tiempo o temperatura de reacción de conjugación y (iii) con condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación de tiol de cisteina.
Se entenderá que en donde más de un grupo nucleófilo reaccione con un intermedio de ligador- fármaco o reactivo del ligador, el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de una o más porciones de fármaco unidas a un anticuerpo. La cantidad promedio de fármaco por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla mediante un ensayo de ELISA doble de anticuerpos, que es específico para el anticuerpo y específico para el fármaco. Las moléculas ADC individuales se pueden identificar en la mezcla a través de espectroscopia de masas y separar por HPLC, p. ej . cromatografía de interacción hidrófoba (véase, p. ej . , McDonagh y colaboradores (2006) Prot . Engr. Design & Selection 19 (7) : 299-307 ; Hamblett y colaboradores (2004) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., y col. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjúgate," Resumen N. ° 624, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual eeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volúmen 45, marzo de 2004; Alley, S.C., y col. "Controlling the locatxon of drug attachment in antibody-drug conjugates," Resumen N.° 627, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual Meeting, marzo de 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004) . En determinadas realizaciones, un ADC homogéneo con un solo valor de carga se puede aislar de la mezcla de conjugación por electroforesis o cromatografía. d) Determinados métodos para preparar inmunoconjugados Un ADC de Fórmula I se puede preparar a través de varias vías que emplean reacciones, condiciones y reactivos orgánicos químicos conocidos por el entendido en la técnica, incluso: (1) la reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo del ligador bivalente para formar Ab-L mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con una porción de fármaco D; y (2) la reacción de un grupo nucleófilo de una porción de fármaco con un reactivo del ligador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con un grupo nucleófilo de un anticuerpo. Métodos ejemplares para preparar un ADC de Fórmula I a través de la última vía se describen en US 7498298, que se incorpora expresamente a la presente por referencia.
Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, entre otros: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino de cadena lateral, p. ej . lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, p. ej . cisteína y (iv) grupos hidroxilo de azúcar o amino en donde el anticuerpo se glicosila. Los grupos amino, tiol y hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en porciones ligadoras y reactivos de ligadores, incluso: (i) ésteres activos, por ejemplo ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo, por ejemplo haloacetamidas ; y (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Determinados anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes cisteína. Los anticuerpos pueden ser reactivos para la conjugación con reactivos de ligadores por el tratamiento con un agente reductor, por ejemplo DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , de modo que el anticuerpo se reduce completamente o parcialmente. Por lo tanto, cada puente cisteína formará, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleófilos adicionales se pueden introducir en anticuerpos a través de la modificación de residuos de lisina, p. ej . , haciendo reaccionar residuos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) , produciendo la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos también se pueden introducir en un anticuerpo introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (p. ej . , preparando anticuerpos variantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no naturales) .
Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención también se pueden producir mediante la reacción entre un grupo electrófilo en un anticuerpo, por ejemplo un grupo carbonilo de aldehido o cetona, con un grupo nucleófilo en un reactivo del ligador o fármaco. Los grupos nucleófilos útiles en un reactivo del ligador incluyen, entre otros, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida . En una realización, se modifica un anticuerpo para introducir porciones electrófilas que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo del ligador o fármaco. En otra realización, los azúcares de anticuerpos glicosilados se puede oxidar, p. ej . con reactivos oxidantes de periodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos de ligadores o porciones de fármaco. Los grupos amina base Schiff resultantes pueden formar un enlace estable o se pueden reducir, p. ej . por reactivos de borohidruro para formar enlaces amina estables . En una realización, la reacción de la porción de carbohidratos de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o metaperiodato sódico puede producir grupos carbonilo (aldehido y cetona) en el anticuerpo que pueden reaccionar con grupos adecuados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra realización, los anticuerpos que contienen residuos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con metaperiodato sódico, dando lugar a la producción de un aldehido en el lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Dicho aldehido se puede hacer reaccionar con una porción de fármaco o nucleófilo del ligador.
Los grupos nucleófilos ejemplares en una porción de fármaco incluyen, entre otros: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos o porciones ligadoras y reactivos de ligadores incluso: (i) esteres activos, por ejemplo ésteres NHS, ásteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo, por ejemplo haloacetamidas ; y (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida.
Reactivos de ligadores cruzados ejemplares no exhaustivos que se pueden utilizar para preparar ADC se describen en el presente en la sección titulada "Ligadores ejemplares" . Métodos para utilizar dichos reactivos de ligadores cruzados para unir dos porciones, incluso una porción proteínica y una porción química, se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, una proteína de fusión que comprende un anticuerpo y un agente citotóxico se puede realizar, p. ej . , a través de técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. Una molécula de ADN recombxnante puede comprender regiones que codifican el anticuerpo y las porciones citotóxicas del conjugado, ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un ligador peptídico que no destruye las propiedades deseadas del conjugado .
En otra realización, un anticuerpo se puede conjugar con un "receptor" (por ejemplo estreptavidina) para la utilización en la pre-identificación del tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente depurador y luego la administración de un "ligando" (p. ej . , avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (p. ej . , un fármaco o radionucleótido) .
? . Métodos y composiciones para el diagnóstico y la detección En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 proporcionados en el presente es útil para detectar la presencia de LgR5 en una muestra biológica. El término "detectar", según se emplea en la presente, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. Una "muestra biológica" comprende, p. ej . , una célula o tejido (p. ej . , material de biopsia, incluso tejido canceroso o potencraímente canceroso de colon, colorrectal, de intestino delgado, endometrial, pancreático o de ovario) .
En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5 para uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de LgR5 en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-LgR5 como se describe en el presente en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-LgR5 a LgR5, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-LgR5 y LgR5 en la muestra biológica. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se utiliza un anticuerpo anti-LgR5 para seleccionar sujetos que califican para la terapia con un anticuerpo anti-LgR5, p. ej . en donde LgR5 es un biomarcador para la selección de pacientes. En una realización adicional, la muestra biológica es una célula o tejido (p. ej . , material de biopsia, incluso tejido canceroso o potencialmente canceroso de colon, colorrectal, de intestino delgado, endometrial, pancreático o de ovario) .
En una realización adicional, se utiliza un anticuerpo anti-LgR5 in vivo para detectar, p. ej . , por imagenología in vivo, un cáncer LgR5 positivo en un sujeto, p. ej . , a fines de diagnosticar, pronosticar o estadificación del cáncer, determinando el curso de la terapia adecuado, o controlando la respuesta de un cáncer a la terapia. Un método conocido en la técnica para la detección in vivo es la inmuno tomografía por emisión de inmuno-posit ones (inmuno-PET) , como se describe, p. ej . , en van Dongen y col., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) y Verel y col., J. Nucí. Med. 44:1271-1281 (2003) . En dichas realizaciones, se proporciona un método para detectar un cáncer LgR5 positivo en un sujeto, el cual método comprende administrar un anticuerpo anti-LgR5 marcado a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un cáncer LgR5 positivo, y detectar el anticuerpo anti-LgR5 marcado en el sujeto, en donde la detección del anticuerpo anti-LgR5 marcado indica un cáncer LgR5 positivo en el sujeto. En determinadas de dichas realizaciones, el anticuerpo anti-LgR5 marcado comprende un anticuerpo anti-LgR5 conjugado con un emisor de positrones, por ejemplo 68Ga, 18F, 64Cu, 8SY, 76Br, 89Zr y 124I. En una realización particular, el emisor de positrones es 89Zr.
En realizaciones adicionales, un método de diagnóstico o detección comprenden poner en contacto un primer anticuerpo anti-LgR5 inmovilizado de un sustrato con una muestra biológica que se va a evaluar para conocer la presencia de LgR5, exponiendo el sustrato a un segundo anticuerpo anti-LgR5, y detectando si el segundo anti-LgR5 se une a un complejo entre el primer anticuerpo anti-LgR5 y LgR5 en la muestra biológica. Un sustrato puede ser cualquier medio de apoyo, p. ej . , vidrio, metal, cerámica, perlas poliméricas, portaobjetos, chips y otros sustratos. En determinadas realizaciones, la muestra biológica comprende una célula o tejido (p. ej . , material de biopsia, incluso tejido canceroso o potencialmente canceroso de colon, colorrectal, de intestino delgado, endometrial, pancreático o de ovario) . En determinadas realizaciones, el primero y el segundo anticuerpo anti-LgR5 es cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente. En algunas de dichas realizaciones, el segundo anticuerpo anti-LgR5 puede ser 8E11 o anticuerpos derivados de 8E11, p. ej . , como se describe en el presente. En algunas de dichas realizaciones, el segundo anticuerpo anti-LgR5 puede ser YW353 o anticuerpos derivados de YW353, p. ej . , como se describe en el presente. En algunas realizaciones, el primero o el segundo anticuerpo anti-LgR5 se selecciona de 3G12 y 2H6 y anticuerpos derivados de 3G12 o 2H6, p. ej . , como se describe en el presente.
Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar o detectar de acuerdo con cualquier de las realizaciones anteriores incluyen cánceres LgR5 positivos, por ejemplo cáncer colorrectal LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma) , cáncer de intestino delgado LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma, sarcoma (p. ej . , leiomiosarcoma) , tumores carcinoide, tumor estromal gastrointestinal y linfoma) cáncer de ovario LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma seroso de ovario) , cáncer de páncreas LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma pancreático ductal) y cáncer endometrial LgR5 positivo. En algunas realizaciones, un cáncer LgR5 positivo es un cáncer que recibe un puntaje de inmunohistoquímica (IHC) o hibridación in situ (ISH) anti-LgR5 mayor que "0", que corresponde a muy débil o sin tinción en >90 % de las células tumorales, en las condiciones descritas aquí en el Ejemplo B. En otra realización, un cáncer LgR5 positivo expresa LgR5 en un nivel 1+, 2+ o 3+ , como se define en las condiciones descritas aquí en el Ejemplo B. En algunas realizaciones, un cáncer LgR5 positivo es un cáncer que expresa LgR5 de acuerdo con un ensayo de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) que detecta el ARNm de LgR5. En algunas realizaciones, el RT-PCR es RT-PCR cuantitativo.
En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LgR5 marcados. Los marcadores incluyen, entre otros, marcadores o porciones que se detectan directamente (por ejemplo marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos , quimioluminiscente y radioactivos), así como porciones, por ejemplo enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, p. ej . , a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Marcadores ejemplares incluyen, entre otros, los radioisótopos 32P, 1C, 125I, 3H y 131I, fluoroforos como los quelatos de tierras raras o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, el dansilo, la umbeliferona, las luceriferasas , por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente estadounidense N.° 4.737.456), luciferina, 2, 3-dihidroftalazinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de los sacáridos, p. ej . , glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, por ejemplo, uricasa y xantina oxidasa, acopladas a una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, por ejemplo, HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y otros similares. En otra realización, un marcador es un emisor de positrones. Los emisores de positrones incluyen, entre otros, 68Ga, 18F, 64Cu, 8SY, 76Br, 89Zr y 124I. En una realización particular, un emisor de positrones es 89Zr.
F. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado como se describe aquí se preparan mezclando dicho anticuerpo o inmunoconjugado que tienen el grado de pureza deseado con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales {Remington 's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen, entre otros: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluido el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptido de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos) ,-proteínas, por ejemplo, albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina,-monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluido glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes, por ejemplo, EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, por ejemplo, sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) ; o surfactantes no iónicos tales como polietilenglicol (PEG) . Los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente incluyen además agentes intersticiales de dispersión del fármaco, por ejemplo glicoproteínas hialuronidasa solubles activas neutras (sHASEGP) , por ejemplo, glicoproteínas hialuronidasa PH-20 soluble humana, por ejemplo rHuPH20 (HYLENEX'", Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y métodos para su uso, incluso rHuPH20, se describen en las publicaciones de patentes estadounidenses N. ° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas como condroitinasas adicionales.
Formulaciones liofilizadas de anticuerpo o inmunoconjugado ejemplares se describen en la patente estadounidense N. ° 6.267.958. Las formulaciones acuosas de anticuerpo o inmunoconjugado incluyen las descritas en las patentes estadounidenses N.° 6171.586 y O2006/044908 , las últimas formulaciones incluyen un tampón de histidina-acetato.
La formulación en el presente también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente las que tienen actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Por ejemplo, en algunas instancias, puede ser deseable proporcionar adicionalmente Avastin® (bevacizumab) , p. ej . , para el tratamiento de cáncer LgR5 positivo, por ejemplo cáncer de colon LgR5 positivo o cáncer colorrectal LgR5 positivo.
Los ingredientes activos pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .
Se pueden formular preparaciones de liberación progresiva. Ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación progresiva incluyen las matrices semipermeables de los polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo o inmunoconj ugado, estas matrices tienen formas de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones para ser utilizadas en la administración in vivo, generalmente son estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, p. ej . , a través de membranas de filtración estériles. 6. Composiciones y métodos terapéuticos Cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 o inmunoconjugados proporcionados aquí se puede utilizar en métodos, p. ej . , métodos terapéuticos.
En un aspecto, un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado proporcionado aquí se utiliza en un método para inhibir la proliferación de una célula LgR5 positiva, el cual método comprende exponer la célula al anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconj ugado en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado a LgR5 en la superficie de la célula, inhibiendo así la proliferación de la célula. En determinadas realizaciones, el método es un método in vitro o in vivo. En realizaciones adicionales, la célula es una célula colorrectal, de intestino delgado, de páncreas, de ovario y endometrial.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconj ugado proporcionado aquí se utiliza en un método para tratar cáncer que comprende una mutación en un gen Kras o una mutación en un gen de coli (APC) de poliposis adenomatosa en al menos una porción de las células del cáncer. En diversas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer de colon, colorrectal, de intestino delgado, de ovario, de páncreas y endometrial. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado proporcionado aquí se utiliza en un método para tratar un cáncer de colon o colorrectal que comprende una mutación en un gen Kras o una mutación en un gen APC en al menos una porción de las células del cáncer. Mutaciones Kras ejemplares no exhaustivas encontradas en cánceres (incluso cánceres de colon y colorrectal) incluyen mutaciones en codón Kras 12 (p. ej . , G12D, G12V, G12R, G12C, G12S y G12A) , codón 13 (p. ej . , G13D and G13C) , codón 61 (p. ej . , G61H, G61L, G61E y G61K) y codón 146. Véase, p. ej . , Yokota, Anticancer Agents Med. Chem. , 12: 163-171 (2012); Wicki y col., Swiss Med. Wkly, 140: W13112 (2010) . Las mutaciones APC ejemplares no exhaustivas encontradas en cánceres incluyen mutaciones en la región de mutación del grupo (MCR) , por ejemplo codones de parada y mutaciones de desplazamiento que dan como resultado un producto genético APC truncado. Véase, p. ej . , Chandra y col., PLoS One, 7: e34479 (2012); y Kohler y col., Hum. Mol. Genet., 17: 1978-1987 (2008).
En algunas realizaciones, un método para tratar cáncer comprende administrar un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado a un sujeto, en donde el sujeto tienen un cáncer que comprende una mutación Kras o una mutación APC en al menos una porción de las células de cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer de colon, colorrectal, de intestino delgado, de ovario, de páncreas y endometrial . En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de colon o colorrectal. En algunas realizaciones, se ha determinado previamente que el sujeto tiene un cáncer que comprende una mutación Kras o una mutación APC en al menos una porción de las células de cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es LgR5 positivo.
Se puede analizar la presencia de varios biomarcadores en una muestra a través de diversas metodologías, muchas de las cuales se conocen en la técnica y las conocen los entendidos en la técnica, incluso, entre otros, inmunohistoquímica ("IHC"), análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA, separación de células activadas por fluorescencia ("FACS"), MassARRAY, ensayos basados en sangre proteómicos, cuantitativos (como por ejemplo Serum ELISA) , ensayos bioquímicos de actividad enzimática, hibridación in situ, análisis de transferencia Southern, análisis de transferencia Northern, secuenciación del genoma completo, reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") incluso PCR cuantitativo en tiempo real (wqRT-PCR") y otros métodos de detección de tipo de amplificación, por ejemplo, ADN, SISBA, TMA ramificado y similares, ARN-Seq, FISH, análisis de micromatrices, perfilado de la expresión genética, o análisis serial de expresión genética ("SAGE"), así como cualquiera de diversos ensayos que se pueden realizar por análisis de matrices de las proteínas, genes o tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de los genes y los productos genéticos se encuentran, por ejemplo, en Ausubel y col., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis) . También se pueden utilizar inmunoensayos multiplexados tales como los disponibles a través de Rules Based Medicine o Meso Scale Discovery ( WMSD" ) .
La inhibición de la proliferación celular in vítro se puede ensayar utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™, comercializado por Promega (Madison, WI) . Ese ensayo determina la cantidad de células viables en cultivo en base a la cuantificación de ATP presente, que es una indicación de células metabólicamente activas. Véase Crouch y col. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, pat. de EUA N. ° 6602677. El ensayo se puede realizar en formato de 96 o 384 pocilios, favoreciendo la evaluación de alto rendimiento (HTS) automática. Véase Cree y col. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento del ensayo comprende la adición de un solo reactivo (CellTiter-Glo18 Reagent) directamente a las células cultivadas. Esto produce lisis celular y generación de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, que es directamente proporcional a la cantidad de células viables presentes en cultivo. Los datos se pueden registrar por un luminómetro o dispositivo de imagen CCD de cámara. La salida de luminiscencia se expresa como unidades livianas relativas (RLU) .
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado par uso como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5 o inmunocon ugado para su uso en un método de tratamiento. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado para su uso para tratar cáncer LgR5 positivo. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado para su uso en un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer LgR5 positivo, el cual método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-LgR5 o inmunoco jugado . En dicha realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, p. ej . , como se describe a continuación.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado para su uso en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para el tratamiento de cáncer LgR5 positivo. En una realización adicional, el medicamento es para el uso en un método para tratar cáncer LgR5 positivo, el cual método comprende administrar a un individuo que tiene cáncer LgR5 positivo una cantidad eficaz del medicamento. En dicha realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, p. ej . , como se describe a continuación.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar cáncer LgR5 positivo. En una realización, el método comprende administrar a un individuo que tiene dicho cáncer LgR5 positivo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-LgR5 o inmunoconjugado. En dicha realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación.
Un cáncer LgR5 positivo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser, p. ej . , cáncer de colon o colorrectal LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma) , cáncer de intestino delgado LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma, sarcoma (p. ej . , leiomiosarcoma) , tumores carcinoide, tumor estromal gastrointestinal y linfoma) , cáncer de ovario LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma seroso de ovario) , cáncer de páncreas LgR5 positivo (incluso adenocarcinoma pancreático ductal) y cáncer endometrial LgR5 positivo. En algunas realizaciones, un cáncer LgR5 positivo es un cáncer que recibe un puntaje de inmunohistoquímica (IHC) o hibridación in situ (ISH) anti-LgR5 mayor que "0", que corresponde a muy débil o sin tinción en >90 % de las células tumorales, en las condiciones descritas aquí en el Ejemplo B. En otra realización, un cáncer LgR5 positivo expresa LgR5 en un nivel 1+, 2+ o 3+ , como se define en las condiciones descritas aquí en el Ejemplo B. En algunas realizaciones, un cáncer LgR5 positivo es un cáncer que expresa LgR5 de acuerdo con un ensayo de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) que detecta el ARNm de LgR5. En algunas realizaciones, el RT-PCR es RT-PCR cuantitativo.
Un ™individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 o inmunoconjugado proporcionado aquí, p. ej . , para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 o inmunoconjugados proporcionados aquí y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-LgR5 o inmunoconjugados proporcionados aquí y al menos un agente terapéutico adicional, p. ej . , como se describe a continuación.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se pueden utilizar solos o junto con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se pueden administrar con al menos un agente terapéutico adicional. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico adicional e Avastin® (bevacizumab) , p. ej . , para el tratamiento de cáncer LgR5 positivo tal como cáncer de colon LgR5 positivo o cáncer colorrectal LgR5 positivo .
Dichas terapias de combinación indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (en donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma formulación o en formulaciones separadas) y administración separada, en cuyo caso la administración de un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede suceder antes, simultáneamente o después de la administración del agente terapéutico adicional o adyuvante. Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención también se pueden utilizar junto con radioterapia.
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar a través de cualquier medio adecuado, incluso parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea, para el tratamiento local, la administración intralesional . Las infusiones parentales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier vía adecuada, p. ej . por inyección, por ejemplo inyecciones intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte en si la administración es breve o crónica. En el presente se contemplan diversos planes de dosificación incluso, entre otros, las administraciones única o múltiple durante varios puntos de tiempo, la administración como un bolo y la infusión por pulso.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de forma coherente con buenas prácticas médicas . Los factores para la consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el plan de administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. Se necesita el anticuerpo o inmunoconjugado, pero se formulan opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para evitar o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de esos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o inmunoconjugado hay presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Estos generalmente se utilizan en las mismas dosis y con las vías de administración como se describe aquí, o entre aproximadamente el 1 y el 99 % de las dosis descritas aquí, o en cualquier dosis y a través de cualquier vía que se determina que es empíricamente/clínicamente adecuada.
Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosis adecuada de un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (cuando se utiliza solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se tratará, del tipo de anticuerpo o inmunoconjugado, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, de si el anticuerpo o inmunoconjugado se administra para fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo o inmunoconjugado y del criterio del médico tratante. El anticuerpo o inmunoconjugado se administra adecuadamente al paciente en una instancia o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, entre aproximadamente 1 g/kg y 15 mg/kg (p. ej . 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo o inmunoconjugado puede ser una posible dosis inicial para administrar al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones independientes o mediante una infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, generalmente, el tratamiento se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosis del anticuerpo o inmunoconjugado sería en el intervalo de entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, se puede administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de estos) . Estas dosis se pueden administrar de forma intermitente, p. ej . , todas las semanas o cada tres semanas (p. ej . de modo que el paciente reciba entre aproximadamente dos y aproximadamente veinte o, p. ej . , aproximadamente seis dosis del anticuerpo) . Se puede administrar una mayor dosis de carga inicial, seguida de una o más dosis inferiores. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden resultar útiles. El progreso de esta terapia se puede monitorizar fácilmente a través de técnicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores se pueden llevar a cabo utilizando un inmunoconjugado de la invención y un anticuerpo anti-LgR5.
H . Artículos de producción [001] En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de producción que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente . El artículo de producción comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto de envase en el recipiente o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden ser de diversos materiales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, por sí misma o combinada con otra composición, resulta eficaz para tratar, prevenir o diagnosticar el trastorno y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que contiene un tapón que puede perforarse con una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención. La etiqueta o prospecto de envase indica que la composición se utiliza para tratar la afección correspondiente. Además, el artículo de producción puede comprender (a) un primer recipiente que contiene una composición, en donde la composición comprende un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención; y (b) un segundo recipiente que contiene una composición, en donde la composición comprende otro agente citotóxico u otro tipo de agente terapéutico. El artículo de producción en la presente realización de la invención puede comprender además un prospecto de envase que indica que las composiciones se pueden utilizar para tratar una afección específica. Alternativamente, o además, el artículo de producción puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina con tampón de fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluso otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
III. EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de los métodos y las composiciones de la invención. Se entiende que se pueden llevar a la práctica muchas otras realizaciones, dada las descripción general proporcionada anteriormente.
A. Expresión genética de LgR5 humana Se analizó la expresión genética de LgR5 humana utilizando una base de datos patentada que contiene información de expresión genética (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) . El análisis gráfico de la base de datos GeneExpress® se realizó utilizando un visor de perfiles de micromatrices . La Figura 1 es una representación gráfica de la expresión genética de LgR5 humana en diversos tejidos. La escala en el eje "y" indica los niveles de expresión genética según la intensidad de la señal de hibridación. Aparecen puntos a la izquierda y a la derecha de la línea que se extiende desde el nombre de cada tejido enumerado. Los puntos que aparecen a la izquierda de la línea representan la expresión genética en el tejido normal y los puntos que aparecen a la derecha de la línea representan la expresión genética en los tejidos tumorales y enfermos. La Figura 1 muestra un aumento en la expresión genética de LgR5 en determinados tejidos tumorales o enfermos en comparación con sus contrapartes normales. En particular, LgR5 se sobreexpresa sustancialmente en los tumores colorrectales, endometriales y de ovario. El recuadro de la Figura 1 muestra que LgR5 se sobreexpresa en al menos los siguientes tumores de colon: adenocarcinoma, tumores benignos y tumores de colon metastáticos y también en tej idos con un contenido de tumor de colon inferior al 50 % ("tumor bajo" en el recuadro de la Figura 1) ; pero no se sobreexpresa en el colon normal, en la enfermedad de Crohn o en la colitis ulcerativa. La expresión de la LgR5 humana es mucho más baja en los tejidos normales, con niveles bajos de expresión en los tejidos cerebrales, musculares, de ovario y de placenta normales.
B. Prevalencia de la LgR5 humana en los tumores de colon Para evaluar la expresión de LgR5 en el cáncer colorrectal, se adquirieron 57 adenocarcinomas colorrectales primarios de múltiples fuentes (Asterand, Detroit, MI; Bio-Options, Fullerton, CA; University of Michigan, Ann Arbor, MI; Cytomyx, Rockville, MD; Cooperative Human Tissue Network, Nashville, TN; Indivumed, Hamburgo, Alemania; ProteoGenex, Culver City, CA) . El cuarenta y cuatro por ciento de las muestras fue de hombres y la edad promedio de los pacientes fue de 66 años (intervalo entre 31 y 93 años) . Se montaron micromatrices de tejido (TMA) utilizando núcleos duplicados como se describe en Bubendorf L, y col., J Pathol. Sept . 2001 ; 195 (1) : 72-9 e incluyeron cinco muestras de mucosa colorrectal normal de casos coincidentes.
Se determinó la expresión de LgR5 mediante hibridación in situ utilizando las sondas de oligonucleótidos que se muestran en la Tabla 2. Véase, p. ej . , Jubb AM, y col., Methods Mol Biol 2006; 326:255-64. Se utilizó ISH para ß-actina para confirmar la integridad del ARNm en los tejidos de cáncer colorrectal antes del análisis.
La intensidad de hibridación de LgR5 fue evaluada por un patólogo capacitado de acuerdo con el siguiente esquema, teniendo en cuenta la intensidad (granos de plata) así como la amplitud de la tinción. 0 (negativo) : muy débil o sin hibridación en >90 % de las células tumorales 1+ (leve) : el patrón de hibridación predominante es débil 2+ (moderado) : el patrón de hibridación predominante es moderadamente fuerte en la mayoría (> 50 %) de las células neoplásicas 3+ (fuerte) : el patrón de hibridación predominante es fuerte en la mayoría (> 50 %) de las células neoplásicas Se utilizaron sondas de sensores para controlar la especificidad de la hibridación.
La Figura 2 muestra secciones de tumores de colon ejemplares con niveles de tinción de 1+, 2+ y 3+. Los paneles superiores muestran imágenes de campo oscuro y los paneles inferiores muestran imágenes de campo claro. El depósito de granos de plata en las imágenes de campo oscuro indica la hibridación de la sonda y la expresión del ARNm de LgR5. -77 % (41/53) de las secciones de tumor de colon analizadas fueron LgR5 positivas, presentaron tinción en los niveles 1+, 2+ o 3+ y el 34 % (18/53) presentaron tinción 2+ o 3+. Cuatro de las 57 muestras analizadas no informaron la expresión de LgR5.
Para evaluar la importancia de la expresión de Lgr5 en los tumores de colon, se reunió retrospectivamente una serie de pacientes basada en la población que se habían sometido a extirpaciones quirúrgicas de adenocarcinoma colorrectal de los archivos de patología del St . James' University Hospital (Leeds, RU) de 1988 a 2003. Se construyeron micromatrices de tejido (TMA) con un núcleo de mucosa normal y tres núcleos de adenocarcinoma por paciente como se describe en Bubendorf L, y col., J Pathol. Sept . 2001; 195 (1) : 72-9. Se realizó ISH y se evaluó como se describió anteriormente . También se determinó la heterogeneidad de la expresión entre los tres núcleos del mismo tumor y se expresa como la proporción de tumores que presentaron un nivel particular de discordancia en uno de los tres núcleos. Por ejemplo, si tres núcleos tuvieron puntajes de +1, +3 y +3, uno de los tres núcleos de ese tumor es discordante en 2.
La Figura 3A muestra la prevalencia de los niveles de 0, 1+, 2+ y 3+ de la tinción de LgR5 en la micromatriz de tejido de tumor de colon, medida por hibridación in situ. El 75 % de los tejidos de tumor de colon presentaron tinción en los niveles de 1+, 2+ o 3+, el 37 % presentó tinción 2+ o 3+. La Figura 3B muestra la heterogeneidad de la expresión de LgR5. El 67 % de los tumores no presentó heterogeneidad entre los tres núcleos. El 32 % presenta una discordancia de 1 en uno de los tres núcleos y solo el 1 % presentó una discordancia superior a 1.
C. Greneración de anticuerpo monoclonal de ratón Se generaron anticuerpos monoclonales contra LgR5 humana utilizando los siguientes procedimientos. Se expresó el dominio extracelular de LgR5 humana (ECD; aminoácidos 22-557) con una Fe terminal C marcada con His de un sistema de expresión de baculovirus y se purificó en una columna Ni-NTA (Qiagen) , seguido de filtración en gel en una columna Superdex 200 en MES 20 mM pH 6,0, clorhidrato de guanidina 6 M como se describió anteriormente (Kirchhofer y col., 2003) y diálisis en PBS para su almacenamiento a -80° C.
Se inyectaron quince ratones Balb/c (Charles River Laboratories International, Inc., Hollister, CA, EUA) con ADN plasmídico de huLgR5 en solución de Ringer con lactato (a través de la vena de la cola) o con ECD LgR5 humana recombinante como se describió anteriormente (a través de las almohadillas de las patas traseras) en adyuvante que contenía escualeno metabolizable (4 % v/v) , Tween 80 (0,2 % v/v) , 6,6-dimicolato de trehalosa (0,05 % p/v) y monofosforil lípido A (0,05 % p/v; Sigma Aldrich, EUA). Se evaluaron los títulos séricos mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) estándar y FACS después de 6-9 inyecciones. Se fusionaron células B esplénicas cosechadas de un total de 5 ratones con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653 ; Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EUA) por electrofusión (Hybrimune; Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA, EUA) . Después de 10-14 días, se evaluaron los sobrenadantes de hibridomas en cuanto a la secreción de anticuerpos mediante ELISA. Se expandieron todos los clones positivos y se evaluaron nuevamente en cuanto a la unión a huLgR5 y a muLgR5 mediante ELISA y FACS (es decir, a la unión a células 293-huLGR5 y 293-muLGR5) . Los clones de hibridomas 8E11.1.1 (identificados de los ratones inmunizados con ADN) y 2H6.3.5 y 3G12.2.1 (de los ratones inmunizados con la proteína) presentaron inmunounión alta después de dos series de subclonación (mediante dilución limitada) y se ampliaron para la purificación en biorreactores INTEGRA CELLine 1000 (INTEGRA Biosciences AG, Zizers, Suiza) . Se purificaron los sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad, se filtraron en condiciones estériles y se guardaron a 4o C en PBS. Se determinó que los isotipos de los mAb eran IgGl (cadena ligera kappa) utilizando el Isostrip Mouse mAb Isotyping Kit (Roche Applied Biosciences, Indian polis, IN, EUA) .
La Figura 4 muestra determinados anticuerpos monoclonales generados, junto con determinadas propiedades, algunas de las cuales se describirán más detalladamente a continuación .
D. Clonación y quime ización de los anticuerpos monoclonales de ratón Se clonaron y se quimerizaron los anticuerpos monoclonales 8E11, 3G12 y 2H6 como se muestra a continuación.
Se extrajo el ARN total de las células de hibridoma que producen 8E11 murino, 3G12 murino o 2H6 murino utilizando los métodos convencionales. Se amplificaron los dominios ligero variable (VL) y pesado variable (VH) utilizando RT-PCR con cebadores degenerados a las cadenas pesada y ligera. Los cebadores directos fueron específicos para la secuencia de aminoácidos terminal N de las regiones VL y VH. Respectivamente, se diseñaron los cebadores inversos LC y HC para hibridar con una región en el dominio ligero constante (CL) y dominio pesado constante 1 (CH1) , que son altamente conservados entre las especies . Se determinó la secuencia de polinucleótidos de las inserciones utilizando métodos de secuenciación de rutina. Las secuencias de aminoácidos VL y VH de 8E11 se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente (SEQ ID N. ° : 3 y 4, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos VL y VH de 3G12 y 2H6 se muestran en las Figuras 7 y 8, respectivamente. Las secuencias VL y VH del anticuerpo 3G12 se muestran en SEQ ID N.°: 21 y 22, respectivamente y las secuencias VL y VH del anticuerpo 2H6 se muestran en SEQ ID N. ° : 23 y 24, respectivamente.
Se quimerizó cada anticuerpo mediante la clonación de la región variable de cadena pesada de ratón en una región constante de cadena pesada de IgGl humana y la clonación de región variable de cadena ligera en una región constante de cadena ligera kappa humana.
E. Humanización de 8E11 Se humanizó el anticuerpo monoclonal 8E11 como se describe a continuación. Los números de los residuos son de acuerdo con Kabat y col . , Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .
Injertos directos de la región hipervariable en el marco receptor humano de consenso Se evaluaron las variantes construidas durante la humanización de 8E11 en forma de una IgG. Se alinearon los dominios VL y VH de 8E11 murino con las secuencias de consenso VL kappa IV (VLKiv) humana y VH subgrupo I ( ^) humana. Se introdujeron por ingeniería genética las regiones hipervariables del anticuerpo murino 8E11 (muSEll) en los marcos receptores VLKiV y VH;n para generar 8Ell.vl. Específicamente, del dominio VL de mu8Ell, se injertaron las posiciones 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en VLKiv Del dominio VH de mu8Ell, se injertaron las posiciones 26-35 (Hl) , 49-65 (H2) y 95-102 (H3) en V¾ . Además, se mantuvieron las posiciones 71 y 78 en el marco III de VH de la secuencia de ratón en 8Ell.vl. Se descubrió que esos residuos formaban parte de los residuos marco que actúan como la zona "Vernier" , que pueden ajustar la estructura de las CDR y ajustar el ajuste del antlgeno. Véase, p. ej . , Foote y Winter, J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992) (Figuras 5 y 6) . Estas definiciones de CDR incluyen las posiciones definidas por su hipervariabilidad de secuencia (Wu, T. T. y Kabat, E. A. (1970)), su ubicación estructural (Chothia, C. y Lesk, A. M. (1987) ) y su participación en los contactos antígeno-anticuerpo (MacCallum y col., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) ) .
Se generaron otras variantes de 8E11 para evaluar las contribuciones de otras posiciones Vernier, como la posición 68 en la cadena ligera y las posiciones 67 y 69 en la cadena pesada. Se generó 8Ell.v2 humanizado mediante la retención de dos residuos adicionales de ratón, en las posiciones 67 y 69 de la región variable de cadena pesada. La secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región variable de cadena pesada para 8Ell.v2, y otras variantes, se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente.
Las variantes humanizadas de 8E11 fueron generadas por mutagénesis de Kunkel utilizando un oligonucleótido diferente para cada región hipervariable . Se identificaron los clones correctos mediante secuenciación de ADN.
Evaluación de las variantes A los efectos de la evaluación, se produjeron inicialmente variantes de IgG en células 293. Se transíectaron vectores codificantes de VL y VH en células 293. Se purificó la IgG a partir del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
Se determinó la afinidad de cada variante de IgG de 8E11 para la LgR5 humana mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un BIAcore™-3000. Se activaron chips de CM5 de grado de investigación BIAcore™ con reactivos de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se acoplaron IgG de cabra anti-Fc humana a los chips para obtener aproximadamente 10.000 unidades de respuesta (RU) en cada célula de flujo. Se bloquearon los grupos de acoplamiento sin reaccionar con etanolamina 1 M. Para las mediciones cinéticas, se capturaron los anticuerpos anti-LGR5 para obtener aproximadamente 300 RU. Se inyectaron diluciones seriadas en dos etapas de ECD de LgR5 humana (aminoácidos 22-557 fusionados con His-Fc expresado en un sistema de baculovirus o aminoácidos 22-558 fusionados con Fe expresado a partir de células CHO; 125 nM a 0,49 nM) en tampón HBS-P (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, surfactante P20 al 0,005 %) a 25° C con una velocidad de flujo de 30 µ?/min. Se calcularon las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1 (BIAcore™ Evaluation Software versión 3.2). Se calculó la constante de equilibrio de disociación (Kd) como la proporción k0ff/kon.
Resul tados El marco receptor humano utilizado para la humanización de 8E11 se basa en el consenso VL kappa IV (VLKIV) humano y en el marco VH receptor G? . Se produjeron y se evaluaron ocho variantes humanizadas de mu8Ell en cuanto a la afinidad por LgR5 mediante BIAcore™. Las regiones variables de cadena ligera y las regiones variables de cadena pesada de cada una de las variantes se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente. Los resultados de las mediciones de afinidad se muestran en la Figura 9.
Para mejorar la afinidad de unión de 8E11.V1, se modificaron la posición 68 en la cadena ligera y las posiciones de 67 y 69 en la cadena pesada por los residuos que se encuentran en estas posiciones en mu8Ell. Se modificaron las posiciones 71 y 78 en la cadena pesada por los residuos que se encuentran en estas posiciones en el marco humano VH!. Se expresaron combinaciones de estas cadenas ligeras y pesadas alteradas como IgG, se purificaron como se describió anteriormente y se evaluaron en cuanto a la unión a la LgR5 humana mediante Biacore (Figura 9) .
Se generó la variante hu8Ell.v2 cambiando las posiciones 67 y 69 de la cadena pesada de hu8Ell.vl por los residuos que se encuentran en esas posiciones en mu8Ell. La afinidad (KD) de hu8Ell.v2 resultó ser aproximadamente igual a la del anticuerpo ch8Ell madre.
Compendio de los cambios para el 8Ell.v2 humanizado Se injertaron las 6 CDR de 8E11 murino (definidas como las posiciones 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) , 26-35 (Hl) , 49-65 (H2) y 93-102 (H3) ) en los dominios VLKiv de consenso humano y receptor ??t. Las posiciones 67, 69, 71 y 78 se volvieron a cambiar a residuos murinos de mu8Ell. 8Ell.v2 humanizado tiene una afinidad por LgR5 similar al 8E11 quimérico.
A lo largo de la presente solicitud, los anticuerpos monoclonales de ratón 8E11, 2H6 y 3G12 se denominan alternativamente como 8E11, m8Ell o mu8Ell; y 2H6, m2H6 o mu2H6; y 3G12, m3G12 o mu3G12; respectivamente. Los anticuerpos monoclonales quiméricos 8E11, 2H6 y 3G12 se denominan 8E11 quimérico o ch8Ell; 2H6 quimérico o ch2H6 ; y 3G12 quimérico o ch3G12; respectivamente. El anticuerpo monoclonal humanizado 8Ell.v2 también se puede denominar 8Bllv2, h8Ellv.2 o hu8Ellv.2.
F. Generación de un anticuerpo monoclonal humano a través de expresión en fago Se expresó ECD de LgR5 humana (aminoácidos 22-555) con un FLAG terminal N en células CHO y se purificó en una resina anti-FLAG durante la noche y se eluyó con ácido acético 0,1 M, pH 2,7. Se purificó la proteína mediante filtración en gel en una columna Superdex 200 en PBS y se dializó en PBS para guardar a -80° C.
Para el cribado, se utilizaron genotecas de anticuerpos humanos en fagos con diversidades sintéticas en las regiones determinantes complementarias seleccionadas (Hl, H2, H3) , que imitan la diversidad natural del repertorio de IgG humanas. Se expresaron los fragmentos Fab en forma bivalente en la superficie de las partículas de bacteriófagos M13 (Lee y col. (2004) J Mol Biol 340, 1073-93) . Se utilizó como antígeno ECD de LgR5 humana (aminoácidos 22-555) producido como se describió anteriormente. Se recubrieron inmunoplacas MaxiSorp de 96 pocilios Nunc (Nunc) durante la noche a 4° C con proteína de ECD de LgR5 (10 pg/ml) y se bloquearon durante 1 hora con tampón PBST (PBS, Tween 20 al 0,05 %) complementado con BSA al 1 % . Se añadieron las genotecas de anticuerpos en fagos y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Se lavaron las placas con tampón PBST y se eluyeron los fagos unidos con HCL 50 mM/NaCl 500 mM durante 30 minutos y se neutralizaron con un mismo volumen de base Tris 1 M. Se amplificaron los fagos recuperados en células XL-1 blue de E.coli. Durante los ciclos de selección posteriores, se disminuyó el tiempo de incubación de los anticuerpos de fagos a 2 horas y se aumentó la rigurosidad del lavado de las placas (Liang y col. (2007) J Mol Biol 366, 815-829) . Se identificaron los anticuerpos de fagos únicos y específicos que se unen al ECD de LgR5 humana mediante ELISA de fagos y secuenciación de ADN. Se reconstruyeron determinados clones, incluido YW353, a IgG de longitud completa mediante la clonación de las regiones VL y VH en los vectores LPG3 y LPG4, respectivamente. Se expresaron transitoriamente los anticuerpos en células mamíferas y se purificaron en columnas de proteína A (C rter y col. (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89, 4285-9) .
Las secuencias de las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada para el anticuerpo humano YW353 se muestran en las Figuras 10 y 11, respectivamente (SEQ ID N.°: 26 y 25) . Las secuencias de cadena pesada de IgGl y de cadena ligera kappa para el anticuerpo humano YW353 se muestran en las SEQ ID N.°: 66 y 65, respectivamente. Como YW353 se generó a partir de una genoteca de anticuerpos humanos en fagos, los términos "YW353" y "huYW353" se utilizan indistintamente en el presente . 6. Reactividad cruzada de las especies Se evaluaron los anticuerpos monoclonales para determinar si reaccionan en forma cruzada con LgR5 de especies diferentes de la humana. Las Figuras 12A a C muestran una alineación entre LgR5 humana (SEQ ID N.°: 67), d mono cynomolgus (SEQ ID N. ° : 69), de rata (SEQ ID N.°: 70) y de ratón (SEQ ID N.°: 72). Los residuos que son idénticos entre las cuatro especies están indicados con asteriscos (*) . La Figura 4 muestra los resultados del análisis FACS de células 293 transíectadas de forma estable con LgR5 marcada con epítopo gD (LgR5 humana, de mono cynomolgus, de rata o de ratón); teñidas con 10 g/ml de anticuerpo YW353, ch8Ell, hu8Ell.v2, 2H6 o 3G12 ; y detectadas con anticuerpo antihumano de cabra conjugado con R-ficoeritrina. Las células 293 sin transfectar normalmente no expresan LgR5. El anticuerpo YW353 se une a la LgR5 humana y de mono cynomolgus, pero no a la LgR5 de rata o de ratón. Los anticuerpos Ch8Ell y hu8Ell.v2 se unen a la LgR5 de las cuatro especies, aunque la unión a la LgR5 de rata no es tan fuerte como la unión a la LgR5 humana, de mono cynomolgus o de ratón. El anticuerpo 2H6 se une a la LgR5 humana y de ratón y no se evaluó en cuanto a la unión a la LgR5 de mono cynomolgus o de rata. El anticuerpo 3G12 presenta unión fuerte a la LgR5 humana, unión menos fuerte a la LgR5 de ratón y no se evaluó en cuanto a la unión a la LgR5 de mono cynomolgus o de rata.
H. Afinidades de los anticuerpos Se determinó la afinidad de cada anticuerpo para la LgR5 humana mediante resonancia de plasmón superficial utjilizando un BIAcore™-3000, sustancialmente como se describió anteriormente en el Ejemplo E.
Como se muestra en la Figura 4, el anticuerpo YW353 se unió a la LgR5 humana con una afinidad de 1,6 nM. Los anticuerpos Ch8Ell y hu8Ell.v2 se unieron a la LgR5 humana con afinidades de 2,4 nm y 3,1 nm, respectivamente. Los anticuerpos 2H6 y 3G12 se unieron a la LgR5 humana con afinidades de 208 nM y 72 nM, respectivamente.
Se realizó análisis de Scatchard siguiendo los procedimientos convencionales (Holmes y col., Science 256:1205-1210 (1992)) para determinar las afinidades de unión relativas de los anticuerpos YW353, ch8Ell y hu8Ellv2.
Se marcaron los anticuerpos anti-Lgr5 con [I125] utilizando el método de lodogen indirecto. Se purificaron los anticuerpos anti-Lgr5 marcados con [I125] a partir de 125I-Na libre mediante filtración en gel utilizando una columna NAP-5 (GE Healthcare) ; los anticuerpos anti-Lgr5 yodados purificados presentaron un intervalo de actividades específicas de 13,92 a 19,01 µCi/µg. Se colocaron en placas de 96 pocilios mezclas de ensayos de competición de 50 µ]1? de volumen que contenían una concentración fija de anticuerpo marcado con [I125] y concentraciones decrecientes de anticuerpo diluido seriadamente sin marcar. Se cultivaron células 293 con expresión estable de Lgr5 humana, de rata o de ratón en medio de cultivo a 37° C en C02 al 5 %. Se separaron las células del matraz utilizando solución de disociación celular Sigma y se lavaron con tampón de unión, que consistía en Medio eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 2 % (FBS) , HEPES 50 mM (pH 7,2) y azida de sodio al 0,1 %. Se añadieron las células lavadas a las placas de 96 pocilios a una densidad de 250.000 células en 0,2 mL de tampón de unión. La concentración final del anticuerpo marcado con [I125] en cada pocilio fue 200 pM. La concentración final del anticuerpo sin marcar en el ensayo de competición osciló entre 500 nM a través de diez etapas de dilución en 2 veces a un ensayo solo de tampón de 0 nM. Los ensayos de competición se realizaron por triplicado. Se incubaron los ensayos de competición durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación de 2 horas, se traspasaron los ensayos de competición a una placa de filtro illipore ultiscreen (Billerica, MA) y se lavaron 4 veces con tampón de unión para separar el anticuerpo marcado con [I125] unido del libre. Se contaron los filtros en un contador gamma Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.; Wellesley, MA) . Se evaluaron los datos de unión utilizando software NewLigand (Genentech) , que utiliza el algoritmo de ajuste de Munson y Robard para determinar la afinidad de unión del anticuerpo (Munson y Robard 1980) .
Como se muestra en la Figura 4, Y 353 unido a LgR5 humana marcada con gD se expresó en células 293 transíectadas de forma estable con una afinidad de 0,2 nM. Ch8Ell unido a LgR5 humana marcada con gD y LgR5 de ratón marcada con gD se expresó en células 293 transfectadas de forma estable con afinidades de 0,4 nM y 0,2 nM, respectivamente. Hu8Ellv2 unido a LgR5 humana marcada con gD, LgR5 de ratón marcada con gD y LgR5 de rata marcada con gD se expresó en células 293 transfectadas de forma estable con afinidades de 0,3-0,7 nM, 0,5-0,6 nM y 2,4-2,8 nM, respectivamente. Estos valores de Kd generalmente fueron inferiores a los determinados mediante BIAcore* .
I . Mapeo de epitopos Para determinar la región de LgR5 unida a cada anticuerpo, se tiñeron células 293 transfectadas transitoriamente con LgR5 marcada con epítopo gD con varias eliminaciones de terminales N y/o C con 10 pg/ml de anticuerpo YW353, ch8Ell, hu8Ellv2, 2H6 o 3G12; y se detectó la unión con anticuerpo antihumano de cabra conjugado con R-ficoeritrina. Los anticuerpos YW353, 8E11, 2H6 y 3G12 se unieron a LgR5 de longitud completa marcada con epítopo gD. Los anticuerpos 2H6 y 3G12 se unieron a LgR5324-907 marcada con epítopo gD (aminoácidos 324-907 de SEQ ID N. ° : 67). Los anticuerpos YW353 y 8E11 no se unieron a LgR5324-907 marcada con epítopo gD. Solo el anticuerpo YW353 se unió a LgR522-i23 marcada con epítopo gD (aminoácidos 22-123 de SEQ ID N.°: 67) con un anclaje GPI terminal C. Los anticuerpos YW353 y 8E11 se unieron a LgR522-323 marcada con epítopo gD (aminoácidos 22-323 de SEQ ID N. ° : 67) con un anclaje GPI terminal C, pero los anticuerpos 2H6 y 3G12 no. Por último, ninguno de los anticuerpos se unieron a LgR5424-907 marcada con epítopo gD (aminoácidos 424-907 de SEQ ID N.°: 67).
La Figura 4 resume esos resultados en la columna titulada "región de epítopos" . Como se muestra en esa figura, el anticuerpo YW353 se une a un epítopo en la región de los aminoácidos 22 a 123 de SEQ ID N.°: 67; el anticuerpo 8E11 y sujs variantes humanizadas se unen a un epítopo en la región de los aminoácidos 22 a 323 de SEQ ID N. ° : 67; y los anticuerpos 2H6 y 3G12 se unen a un epítopo en la región de los aminoácidos 324 a 423 de SEQ ID N.°: 67.
J. Producción de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco Para una producción de anticuerpos a mayor escala, se produjeron los anticuerpos en células CHO. Se transfectaron vectores codificantes de VL y VH en células CHO y se purificó lá IgG a partir del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
Conjugados de MMAE y anticuerpo anti-LgR5 Se produjeron conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco (ADC) mediante la conjugación de YW353 (las secuencias de cadena pesada de IgGl y de cadena ligera kappa que se muestran en SEQ ID N. ° : 66 y 65, respectivamente), hu8Ellv2 (las secuencias de cadena pesada de IgGl y de cadena ligera kappa que se muestran en SEQ ID N.°: 64 y 63, respectivamente), mu8Ell, ch8Ell, 2H6, ch2H6, 3G12 y ch3G12 con la porción fármaco-ligador MC-vc-PAB-MMAE, que se describe aquí. Por practicidad, la porción f rmaco- ligador MC-vc-PAB-MMAE a veces se menciona en estos Ejemplos y en las Figuras como "vcMMAE" o "VCE" . Antes de la conjugación, se redujeron parcialmente los anticuerpos con TCEP utilizando métodos convencionales de acuerdo con la metodología descrita en WO 2004/010957 A2. Se conjugaron los anticuerpos parcialmente reducidos con la porción f rmaco- ligador utilizando métodos convencionales de acuerdo con la metodología descrita, p. ej . , en Doronina y col. (2003) Nat. Biotechnol . 21:778-784 y US 2005/0238649 Al. En resumen, se combinaron los anticuerpos parcialmente reducidos con la porción f rmaco- ligador para permitir la conjugación de la porción fármaco-ligador con los residuos de cisteína reducidos del anticuerpo. Se interrumpieron las reacciones de conjugación y se purificaron los ADC. Se determinó la carga de fármaco (cantidad promedio de porciones de fármaco por anticuerpo) para cada ADC y fue entre 3,3 y 4,0 para los anticuerpos anti-LgR5. La estructura de un inmunoconjugado de anticuerpo- cMMAE se muestra en la Figura 35A (p = carga de fármaco) .
Conjugados de PNU y anticuerpo anti-LgR5 Se produjeron conjugados de anticuerpo anti-LgR5-fármaco PNU (ADC) mediante la conjugación de YW353 A118C thioMab (las secuencias de cadena pesada de IgGl A118C y de cadena ligera kappa que se muestran en SEQ ID N . ° : 78 y 65, respectivamente) o hu8Ellv2 thioMab (las secuencias de cadena pesada de IgGl A118C y de cadena ligera kappa que se muestran en SEQ ID N.°: 75 y 63, respectivamente) con porciones ligadoras del fármaco PNU. Antes de la conjugación, se redujo el anticuerpo con ditiotreitol (DTT) para eliminar los grupos de bloqueo (p. ej . cisteína) de las cisteínas modificadas genéticamente del tio-anticuerpo . Este proceso también reduce los enlaces disulfuro intercadena del anticuerpo. Se purificó el anticuerpo reducido para eliminar los grupos de bloqueo liberados y se reoxidizaron los disulfuros intercadena utilizando ácido dehidroascórbico (dhAA) .
Para los conjugados de fármaco y anticuerpo que comprenden un ligador val-cit y PNU, se combinó el anticuerpo intacto con la porción fármaco-ligador MC-val-cit-PAB-espaciador-PNU-159682 ("val-cit" también se puede denominar en el presente "ve") para permitir la conjugación de la porción f rmaco-ligador con los residuos de cisteína modificados genéticamente del anticuerpo. Se interrumpió la reacción de conjugación mediante el añadido de N-acetil-cisteína en exceso para reaccionar con cualquier porción fármaco-ligador libre y se purificó el ADC. La carga de fármaco (cantidad promedio de porciones de fármaco por anticuerpo) para el ADC osciló entre aproximadamente 1,8 y 2.
La estructura de un inmunoconjugado de anticuerpo-vePNU se muestra en la Figura 35B (p = carga de fármaco) .
Para los conjugados de fármaco y anticuerpo que comprenden un ligador acetal y PNU, se combinó el anticuerpo intacto con la porción fármaco- ligador MC-acetal-PNU-159682 para permitir la conjugación de la porción fármaco- ligador con los residuos de cisteina modificados genéticamente del anticuerpo. Se interrumpió la reacción de conjugación mediante el añadido de N-acetil-cisteína en exceso para reaccionar con cualquier porción fármaco- ligador libre y se purificó el ADC. La carga de fármaco (cantidad promedio de porciones de fármaco por anticuerpo) para el ADC fue de entre aproximadamente 1,8 y 2. La estructura de un inmunoconjugado de anticuerpo-acetal-PNU se muestra en la Figura 35C (p = carga de fármaco) .
Para los conjugados de fármaco y anticuerpo que comprenden un ligador no escindible y PNU, se combinó el anticuerpo intacto con la porción fármaco-ligador MC-PNU-159682 para permitir la conjugación de la porción fármaco-ligador con los residuos de cisteina modificados genéticamente del anticuerpo. Se interrumpió la reacción de conjugación mediante el añadido de N-acetil-cisteína en exceso para reaccionar con cualquier porción fármaco- ligador libre y se purificó el ADC. La carga de fármaco (cantidad promedio de porciones de fármaco por anticuerpo) para el ADC fue de entre aproximadamente 1,8 y 2. La estructura de un inmunoconjugado de anticuerpo-PNU se muestra en la Figura 35D (p = carga de fármaco) .
Conjugado de PBD y anticuerpo anti-LgR5 Se produjeron conjugados de anticuerpo anti-LgR5-fármaco PBD (ADC) mediante la conjugación de YW353 A118C thioMab (las secuencias de cadena pesada de IgGl A118C y de cadena ligera kappa que se muestran en SEQ ID N. ° : 78 y 65, respectivamente) o hu8Ellv2 thioMab (las secuencias de cadena pesada de IgGl A118C y de cadena ligera kappa que se muestran en SEQ ID N.°: 75 y 63, respectivamente) con porciones ligadoras del fármaco PBD. Antes de la conjugación, se redujo el anticuerpo con ditiotreitol (DTT) para eliminar los grupos de bloqueo (p. ej . cisteína) de las cisteínas modificadas genéticamente del tio-anticuerpo . Este proceso también reduce los enlaces disulfuro intercadena del anticuerpo. Se purificó el anticuerpo reducido para eliminar los grupos de bloqueo liberados y se reoxidizaron los disulfuros intercadena utilizando ácido dehidroascórbico (dhAA) .
Para los conjugados de fármaco y anticuerpo que comprenden un ligador val-cit y PBD, se combinó el anticuerpo intacto con la porción fármaco- ligador MC-val-cit-PAB-PBD ("val-cit" también se puede denominar en el presente "ve") para permitir la conjugación de la porción fármaco- ligador con los residuos de cisteína modificados genéticamente del anticuerpo. Se interrumpió la reacción de conjugación mediante el añadido de N-acetil-cisteína en exceso para reaccionar con cualquier porción f rmaco- ligador libre y se purificó el ADC. La carga de fármaco (cantidad promedio de porciones de fármaco por anticuerpo) para el ADC osciló entre aproximadamente 1,8 y 2. La estructura de un anticuerpo-vePBD se muestra en la Figura 35E (p = carga de fármaco) .
K. Toxicidad del conjugado de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en ratas Para evaluar la toxicidad potencial del anticuerpo anti-LgR5 8E11. v2-vcMMAE, se les administró a seis ratas macho Sprague-Dawley 12 mg/kg de 8E11. v2-vcMMAE una vez por semana durante cuatro semanas y se les administró a seis ratas macho Sprague-Dawley 20 mg/kg de 8E11. v2-vcMMAE una vez por semana durante dos semanas . Se les administró a cuatro ratas macho Sprague-Dawley de control vehículo solo una vez por semana durante dos semanas y se les administró a cuatro ratas macho Sprague-Dawley de control vehículo solo una vez por semana durante cuatro semanas . A las ratas de los grupos de dos semanas se les realizó necropsia el día 12 y a las ratas de los grupos de cuatro semanas se les realizó necropsia el día 26.
En resumen, todas las ratas que recibieron 8Ell.v2-vcMMAE presentaron reducción de la masa eritrocitaria (glóbulos rojos, hematocritos, hemoglobina y reticulocitos) , de los neutrófilos y de las plaquetas en comparación con las ratas de control. Las ratas que recibieron 20 mg/kg de 8E11. v2-vcMMAE también presentaron un recuento reducido de glóbulos blancos y linfocitos en comparación con las ratas de control. Además, todas las ratas que recibieron 8E11.V2-vcMMAE presentaron aumentos en las enzimas hepáticas ALT, AST, ALP y GGT y un aumento de la bilirrubina total en comparación con las ratas de control .
El análisis histopatológico de los tejidos recogidos del estudio mostró pérdida celular de los tej idos linfoides y hematopoyéticos en las ratas que recibieron 8E11.v2-vcMMAE, así como un aumento en las cifras mitóticas en los tejidos de división rápida. Las ratas que recibieron 20 mg/kg de 8E11. v2-vcMMAE también presentaron necrosis hepática mínima, aumento en las cifras mitóticas y necrosis/apoptosis criptal unicelular mínimos y histiocitosis alveolar leve e hiperplasia celular tipo II mínimos .
Los cambios patológicos observados fueron similares a la patología observada en las ratas que recibieron otros conjugados de anticuerpo vcMMAE- fármaco. Aparentemente, no se detectaron pruebas de toxicidad dependiente del antígeno de LgR5 en el tracto GI .
L. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de linea celular de cáncer de colon LoVo Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon LoVo. Las células LoVo son una línea celular de adenocarcinoma colorrectal con una mutación APC (N. ° de ATCC CCL 229). LgR5 se expresa altamente en las células LoVo y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se inyectaron por vía subcutánea cinco millones de células LoVo (LgR5 positivas mediante FACS utilizando YW353) en HBSS-matrigel en el flanco dorsal de ratones desnudos NCR y seis días después de la inoculación se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 5 mg/kg de conjugado de anti-gpl20 murino-anticuerpo de control vcMMAE-fármaco, conjugado de 5B6 anti-gD humano-anticuerpo de control vcMMAE- fármaco, conjugado de huYW353 -anticuerpo vcMMAE-fármaco, conjugado de mu8Ell-anticuerpo vcMMAE- fármaco, conjugado de mu2H6-anticuerpo vcMMAE-fármaco o conjugado de mu3G12-anticuerpo vcMMAE-fármaco; o con vehículo (PBS) solo. Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK un día después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 13 , se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con los cuatro conjugados de anticuerpo anti-LgR5-fármaco evaluados.
M. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124, que tiene una mutación de ß-catenina. LgR5 se expresa altamente en los tumores D5124 y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 (LgR5 positivos mediante FACS utilizando YW353 y 8E11) de veinte a 30 mm3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 18 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 6 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humano-anticuerpo de control vcMMAE-fármaco, 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de huYW353 -anticuerpo vcMMAE-fármaco, 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de ch8Ell- anticuerpo vcMMAE-fármaco, 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de ch2H6-anticuerpo vcMMAE-fármaco o 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de ch3G12 -anticuerpo vcMMAE- fármaco; o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5; "HB#8" en la Figura 14) solo. Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK uno y ocho días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 14, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con ambas dosis de huYW353 -vcMMAE, ch8Ell-vcMMAE y ch3G12 -vcMMAE . También se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 6 mg/kg de ch2H6 -vcMMAE.
Se evaluó la eficacia de varias dosis de YW353 -vcMMAE en el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 descrito anteriormente . Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 (LgR5 positivos mediante FACS utilizando Y 353 y 8E11) de veinte a 30 mm3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 23 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg o 12 mg/kg de conjugado de huYW353 -anticuerpo vcMMAE-fármaco; o 12 mg/kg de huYW353; o 7,2 mg/kg o 14,4 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humano-anticuerpo de control vcMMAE-fármaco; o vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5; "HB#8" en la Figura 15) solo. Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK uno, cuatro y 14 días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 15, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 3 mg/kg de huYW353-vcMMAE y se logró una inhibición casi total del crecimiento tumoral con 6 mg/kg y 12 mg/kg de huYW353-vcMMAE. N. Eficacia de mu8Ell y mu8Ell-vcMMAE en modelo de tumorigénesis intestinal murina Se investigó la eficacia de muSEll y mu8Ell-vcMMAE en un modelo de tumorigénesis intestinal murina, APCmin/+; LSL-KrasG12D; VillinCre ("ratones AKV"). Los ratones AKV son el resultado de cruzar APCmin +; VillinCre ("ratones AV" ) con ratones LSL-KrasG12D. Mientras que los ratones AV desarrollan 0-4 adenomas en el colon y 100 adenomas en el intestino delgado, los ratones AKV desarrollan un promedio de 140 adenomas en el colon y 100 adenomas en el intestino delgado (no se muestran los datos) . Se midió la expresión de ARNm de LgR5 en tejido normal y en pólipos de ratones AV y AKV, y se descubrió que LgR5 estaba significativamente sobreexpresada en los pólipos del intestino delgado y del colon en los ratones AKV (Figura 16) . Para visualizar la expresión de LgR5 en el intestino delgado y el colon de los ratones AKV, se cruzaron ratones AKV con ratones que tenían un cásete que contenía una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) unido dentro de un marco al ADNc del receptor de la toxina diftérica humana ubicado en el gen Lgr5. Véase Tian y col., Nature, 478: 255-260 (2011). Se visualizaron las áreas de expresión de EGFP en los pólipos del intestino delgado y en los pólipos del intestino grueso en los ratones AKV Igr5DTR +. Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 20. Se observó que la expresión de LgR5 no difiere significativamente entre los pólipos del intestino delgado y los pólipos de colon, y además, no se observó correlación entre el tamaño del tumor y el área de LgR5+. El área de LgR5+ promedio de los tumores fue del 8 %, pero varió ampliamente entre los tumores. Los resultados preliminares muestran que el área de LgR5+ en los tumores colorrectales de los seres humanos puede ser significativamente mayor que en los ratones, lo que sugiere que el índice terapéutico de la terapia con ADC de anti-LgR5 en los seres humanos puede ser incluso mejor que en los ratones.
Para evaluar las diferencias de expresión de Lgr5 entre las criptas intestinales y los tumores en estos animales, se obtuvieron tractos intestinales de ratones AKV Lgr5DTR + y se realizó visualización directa de GFP en secciones de los tejidos. Se cuantificaron las criptas normales y los tumores en cuanto a la intensidad de cada pixel positivo de GFP. Para determinar la intensidad de GFP relativa, se dividió el puntaje de intensidad entre el área GFP+. Como se muestra en la Figura 23, la expresión de LgR5 es mayor en los tumores que en las criptas intestinales en los ratones AKV Lgr5DTR +.
Se realizó un estudio de supervivencia general con ratones AKV para determinar si el anticuerpo anti-LgR5 puede aumentar la supervivencia. Se les administró a diez ratones AKV 15 mg/kg de mu8Ell-MC-vc-PAB-MMAE; se les administró a seis ratones AKV 15 mg/kg de mu8Ell y se les administró a 9 ratones 15 mg/kg de anticuerpo de control anti-gpl20-MC-vc-M AE. Los anticuerpos y los ADC se administraron semanalmente a partir de las 6 semanas de edad hasta la muerte de los ratones o hasta que se consideraron moribundos (según se determinó a través de criterios convencionales relacionados con los signos de letargo grave, pérdida de peso y anemia) , en cuyo caso los ratones fueron sacrificados.
Los resultados del estudio de supervivencia general se muestran en la Figura 17. Los datos del control no tratado representan las tasas históricas de supervivencia de 22 ratones AKV. En ese experimento, los ratones AKV que recibieron mu8Ell o mu8Ell-MC-vc-PAB-MMAE tuvieron períodos de supervivencia significativamente mayores que los ratones AKV sin tratar o los ratones AKV que recibieron un ADC de control. Según estos resultados, se evaluaron otros animales como se describió anteriormente . Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 19. En el experimento más grande, los ratones AKV que recibieron mu8Ell-MC-vc-PAB-MMAE tuvieron períodos de supervivencia significativamente mayores que los ratones AKV sin tratar o los ratones AKV que recibieron un ADC de control y también tuvieron un período de supervivencia mayor que los ratones que recibieron mu8Ell. En el momento de la muerte, los ratones AKV que recibieron el ADC de control y anti-LgR5-ADC tuvieron cantidades y tamaños similares de pólipos, lo que sugiere que anti-LgR5-ADC puede ralentizar la enfermedad y extender así la supervivencia.
Para determinar si el anticuerpo anti-LgR5 y/o anti-LgR5 ADC provocó apoptosis en los tumores gastrointestinales de los ratones AKV, se midió la presencia de la caspasa 3 escindida en función del área del tumor. Se sometieron los tejidos de intestino delgado y colon fijados con formalina, incrustados en parafina (FFPE) recogidos en el momento de la muerte a tinción inmunohistoquímica para la caspasa 3 escindida (Cell Signaling Technologies; Danvers, MA, N.° cat . 9661L) . Se obtuvieron imágenes de los portaobjetos teñidos a través de la plataforma de escaneo de portaobjetos automática Olympus Nanozoomer y se analizaron áreas específicas del tumor identificadas manualmente en el paquete de software Matlab (Mathworks, Natick, MA) . Se cuantificó el área teñida positivamente y el área total del tumor. Aunque fue poco frecuente, se observó caspasa 3 escindida en las criptas después del tratamiento con ADC anti-LgR5, pero no se observó en los animales tratados con ADC de control, lo que sugiere que se está apuntando específicamente a las células que expresan LgR5.
Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 18. La administración de anticuerpo anti-LgR5 y de ADC de anti-LgR5 provocó un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje del área del tumor en los ratones AKV que fue positivo para la presencia de caspasa 3 escindida, en comparación con los ratones AKV tratados con ADC de control .
Para demostrar que se está produciendo apoptosis en las células LgR5+, se les administró a ratones AKV Lgr5DTR + 15 mg/kg de mu8Ell-MC-vc-PAB-MMAE o 15 mg/kg de anticuerpo de control anti-gpl20-MC-vc-MMAE (día 1). El día 4, se sacrificaron los ratones y se visualizaron los tumores del tracto gastrointestinal (intestino delgado y grueso) en cuanto a la expresión de EGFP y caspasa 3 escindida. Se determinó la cantidad de área CC3+GFP+ por área celular total. Como se muestra en la Figura 21A, los ratones tratados con anti-LgR5-ADC tendieron a presentar una mayor proporción de área CC3+GFP+ que los ratones tratados con control, aunque no tuvo significancia estadística en ese experimento. La Figura 2IB muestra tinción inmunohistoquímica ejemplar de los ratones tratados con ADC de control (paneles a la izquierda) y ratones tratados con anti-LgR5-ADC (paneles a la derecha) . Estos resultados demuestran una tendencia hacia el aumento de la apoptosis en las células que expresan LgR5 tras el tratamiento con anti-LgR5-ADC .
Para determinar si la proliferación celular de las células que expresan LgR5 resulta afectada por el tratamiento con anti-LgR5, se midió el área ??67+ por área celular en la población de células EGFP+ y en la población de células EGFP-del tracto gastrointestinal de los ratones AKV Lgr5DTR'+ tratados con ADC de control y tratados con anti-LgR5-ADC. Ki67 es una proteína nuclear asociada con la proliferación celular. Los anticuerpos Ki67 para la tinción inmunohistoquímica se obtuvieron de Neomarker. Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 22. Se observó un área celular proliferativa significativamente inferior, según lo medido a través de tinción de Ki67, en los tumores de los ratones AKV Igr5DTR + tratados con anti-LgR5-ADC que con ADC de control, en las poblaciones de células GFP+ y GFP- . Estos resultados sugieren que anti-LgR5-ADC reduce la proliferación y/o inhibe la formación de la progenie proliferativ . 0. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124, que tiene una mutación de ß-catenina. LgR5 se expresa altamente en los tumores D5124 y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 de veinte a 30 mm3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 22 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 2,62 mg/kg o 5,23 mg/kg de conjugado de huYW353 -anticuerpo vcMMAE- fármaco, 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de ch8Ell-anticuerpo vcMMAE-fármaco o 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcMMAE-fármaco; o 6 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcMMAE-fármaco; o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 8 ratones por grupo) . Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK uno y ocho días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 24, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con ambas dosis de huYW353 -vcMMAE, con ambas dosis de hu8Ellv2 -vcMMAE y con 6 mg/kg de ch8Ellv2-vcMMAE .
Se evaluó la eficacia de varias dosis de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcMMAE- fármaco en el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 descrito anteriormente. Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 de veinte a 30 nuti3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 26 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg o 12 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2 -anticuerpo vcMMAE-fármaco; o 15 mg/kg de hu8Ellv2; o 6,37 mg/kg o 12,73 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humano-anticuerpo de control vcMMAE- fármaco; o 15 mg/kg anticuerpo de control anti-gD humanizado; o vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 8 ratones por grupo) .
Como se muestra en la Figura 25, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 3 mg/kg y 6 mg/kg de hu8Ellv2-vcMMAE y se logró la regresión del tumor con 12 mg/kg de hu8Ellv2-vcMMAE.
P. Eficacia de conjugados de anticuerpo ant±-LgR5 y fármaco en xenoin erto de linea celular de cáncer de colon LoVoXl .1 Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon LoVo. Las células LoVo son una línea celular de adenocarcinoma colorrectal con una mutación APC (N. ° de ATCC CCL 229) y se derivó la sublínea LoVoXl.1 para un crecimiento óptimo en ratones. En resumen, se inocularon los ratones con células LoVo. Una vez que los tumores estaban creciendo, se cosechó un tumor con una tasa de crecimiento deseable. El tumor se cortó en trozos pequeños y se cultivó en cultivo para establecer la línea celular LoVoXl .1. LgR5 se expresa en las células LoVoXl.1 y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se inyectaron por vía subcutánea cinco millones de células LoVoXl .1 en HBSS-matrigel en el flanco dorsal de ratones C.B-17 SCID y 13 días después de la inoculación se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de huYW353 -anticuerpo vcMMAE-fármaco, 3 mg/kg o 6 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2 -anticuerpo vcMMAE-fármaco; 15 mg/kg de anticuerpo hu8Ellv2; 15 mg/kg anticuerpo de control 5B6 anti-gD humanizado; o 6 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcMMAE- fármaco; o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 10 ratones por grupo) .
Como se muestra en la Figura 26, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 6 mg/kg de hu8Ellv2-vcMMAE y 6 mg/kg de huYW353-vcMMAE .
Se evaluó la eficacia de varias dosis de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcMMAE- fármaco en el modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma colorrectal de LoVoXl.l descrito anteriormente . Se inyectaron por vía subcutánea cinco millones de células LoVoXl.l en HBSS-matrigel en el flanco dorsal de ratones C.B-17 SCID y 10 días después de la inoculación se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcMMAE-fármaco; o 15 mg/kg de hu8Ellv2; o 6 mg/kg o 15 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcMMAE-fármaco; o vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 9 ratones por grupo) . Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK uno, siete y 14 días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 27, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 6 mg/kg, 10 mg/kg y 15 mg/kg de hu8Ellv2-vcMMAE .
Q. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124, que tiene una mutación de ß-catenina. LgR5 se expresa altamente en los tumores D5124 y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 de veinte a 30 mm3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 26 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 1 mg/kg de conjugado de huYW353 -anticuerpo vcMMAE-fármaco, 1 mg/kg de conjugado de huY 353 -anticuerpo vcP U-fármaco, 1 mg/kg de conjugado de huYW353-anticuerpo P U-fármaco, 1 mg/kg de conjugado de huYW353 -acetal-anticuerpo PNU-fármaco; o 1 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcPNU-fármaco, 1 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control PNU-fármaco o 1 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-acetal-anticuerpo de control PNU- fármaco ; o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 9 ratones por grupo). Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK tres, siete y 14 días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 28, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 1 mg/kg de huYW353-vcMMAE y 1 mg/kg de huYW353 -acetal-PNU y se logró una inhibición casi total del crecimiento tumoral con 1 mg/kg de huYW353-vcPNU. Uno de los ratones tratados con 1 mg/kg de huYW353 -acetal-PNU presentó una respuesta completa (es decir, el ratón no tenía un tumor detectable al final del estudio) . Además, dos de los ratones tratados con 1 mg/kg de huYW353- vcPNU presentaron una respuesta parcial (es decir, >50 % de reducción del volumen inicial del tumor en el día 0) .
R. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 Se evaluó la eficacia de varias dosis de conjugado de anticuerpo hu8Ellv2- fármaco en el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124. Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 de veinte a 30 mm3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 22 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 2 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcM AE- fármaco; o 2 mg/kg de hu8Ellv2-vcPNU; o 2 mg/kg o 10 mg/kg de hu8Ellv2-acetal-PNU; o 2 mg/kg o 10 mg/kg de hu8Ellv2-PNU; 2 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcPNU-fármaco, 10 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-acetal-anticuerpo de control PNU- fármaco o 10 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control PNU- fármaco; o vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 8 ratones por grupo) .
Como se muestra en la Figura 29, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 2 mg/kg de hu8Ellv2-acetal-PNU y se logró una inhibición casi total del crecimiento tumoral con 10 mg/kg de hu8Ellv2-acetal-PNU, 2 mg/kg de hu8Ellv2-vcPNU y 2 mg/kg y 10 mg/kg de hu8Ellv2-PNU.
S. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de linea celular de cáncer de colon LoVo Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon LoVo. Las células LoVo son una línea celular de adenocarcinoma colorrectal con una mutación APC (N. ° de ATCC CCL 229) y se derivó la sublínea LoVoXl .1 para un crecimiento óptimo en ratones. En resumen, se inocularon los ratones con células LoVo. Una vez que los tumores estaban creciendo, se cosechó un tumor con una tasa de crecimiento deseable. El tumor se cortó en trozos pequeños y se cultivó en cultivo para establecer la línea celular LoVoXl .1. LgR5 se expresa en las células LoVoXl .1 y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se inyectaron por vía subcutánea cinco millones de células LoVoXl .1 en HBSS-matrigel en el flanco dorsal de ratones C.B-17 SCID y 11 días después de la inoculación se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 2 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcMMAE- fármaco, 2 mg/kg de hu8Ellv2-vcPNU, 2 mg/kg de hu8Ellv2-acetal-P U o 2 mg/kg de hu8Ellv2-P U; o 2 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcP U- fármaco, 2 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-acetal-anticuerpo de control PNU-fármaco o 2 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control PNU- fármaco; o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 10 ratones por grupo) . Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK uno, siete y 14 días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 30, en este experimento, aparentemente determinados anticuerpos de control presentaron una inhibición sustancial del crecimiento tumoral (véase 2 mg/kg de 5B6 anti-gD humanizado-vePNU y 2 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-acetal-anticuerpo de control PNU- fármaco) .
Debido a los efectos no específicos evidentes del anticuerpo de control en el experimento anterior, se evaluó el modelo de adenocarcinoma colorrectal de LoVoXl .1 con un conjugado de anticuerpo de control-fármaco diferente (que se une a un antígeno diferente no expresado en la superficie de las células LoVo) y con la administración de un exceso de anticuerpo de control anti-gD para bloquear los posibles sitios de unión no específica al anticuerpo en las células tumorales. Se inyectaron por vía subcutánea cinco millones de células LoVoXl.l en HBSS-matrigel en el flanco dorsal de ratones C.B-17 SCID y siete días después de la inoculación se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 10 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-acetal-anticuerpo PNU-fármaco; o 10 mg/kg de conjugado de tioAb-acetal-anticuerpo de control PNU-fármaco; o vehículo (fosfato de sodio 50 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 7) solo (n = 5 ratones por grupo) . Además, se les administró a los ratones 30 mg/kg de anticuerpo de control anti-gD humanizado i.p. una vez por semana hasta el final del estudio, comenzando el mismo día que la administración de los anticuerpos de prueba, pero 4 horas antes .
Como se muestra en la Figura 31, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 10 mg/kg de hu8Ellv2-acetal-PNU y el anticuerpo de control no inhibió el crecimiento tumoral .
T. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124 Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 YW353 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124, que tiene una mutación de ß-catenina. LgR5 se expresa altamente en los tumores D5124 y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 de veinte a 30 mm3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 26 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 1 mg/kg de conjugado de huYW353-anticuerpo vcM AE-fármaco, 1 mg/kg de conjugado de huYW353 -anticuerpo vePBD-fármaco; o 1 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcPBD-fármaco,- o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 9 ratones por grupo). Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK uno, siete y catorce días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 32, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 1 mg/kg de huYW353-vcMMAE y 1 mg/kg de huYW353 -vcPBD . Uno de los ratones tratados con 1 mg/kg de huYW353-vcPBD presentó una respuesta completa (es decir, el ratón no tenía un tumor detectable al final del estudio) .
En otro experimento, se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 hu8Ellv2 utilizando el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas D5124. Se implantaron subcutáneamente fragmentos de tumores D5124 de veinte a 30 mm3 en el área del flanco dorsal de ratones desnudos NCR y 22 días después del transplante se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 2 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcMMAE-fármaco, 2 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcPBD-fármaco; o 2 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vcPBD-fármaco; o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 8 ratones por grupo) .
Como se muestra en la Figura 33, se logró una inhibición sustancial del crecimiento tumoral con 2 mg/kg de hu8Ellv2-vcMMAE y se logró la regresión del tumor con 2 mg/kg de hu8Ellv2-vcPBD.
U. Eficacia de conjugados de anticuerpo anti-LgR5 y fármaco en xenoinjerto de linea celular de cáncer de colon LoVoXl.l Se investigó la eficacia de los ADC anti-LgR5 utilizando un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon LoVoXl.l. Las células LoVo son una línea celular de adenocarcinoma colorrectal con una mutación APC (N.° de ATCC CCL 229) y se derivó la sublínea LoVoXl.l para un crecimiento óptimo en ratones. En resumen, se inocularon los ratones con células LoVo. Una vez que los tumores estaban creciendo, se cosechó un tumor con una tasa de crecimiento deseable . El tumor se cortó en trozos pequeños y se cultivó en cultivo para establecer la línea celular LoVoXl.l. LgR5 se expresa en las células LoVoXl.l y se confirmó mediante micromatriz, RT-PCR cuantitativa TaqMan®, hibridación in situ, FACS y análisis de transferencia Western. Se inyectaron por vía subcutánea cinco millones de células LoVoXl.l en HBSS-matrigel en el flanco dorsal de ratones C.B-17 SCID y 11 días después de la inoculación se les administró a los ratones una única inyección intravenosa de 2 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcMMAE-fármaco, 2 mg/kg de conjugado de hu8Ellv2-anticuerpo vcPBD- fármaco; o 2 mg/kg de conjugado de 5B6 anti-gD humanizado-anticuerpo de control vePBD-fármaco; o con vehículo (tampón histidina: acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 5,5) solo (n = 10 ratones por grupo) . Se confirmó la presencia de los anticuerpos mediante sangrados PK uno, siete y 14 días después de la inyección.
Como se muestra en la Figura 34, se logró una inhibición completa del crecimiento tumoral con 2 mg/kg de hu8Ellv2-vcPBD.
Aunque la invención anterior se ha descrito bastante detalladamente a modo de ejemplo con el objetivo de su claridad y comprensión, no se debe considerar que las descripciones y los ejemplos limiten el alcance de la invención. Las divulgaciones de todas las patentes y bibliografía científica citadas en el presente se incorporan expresamente en su totalidad por referencia.
Tabla de secuencias SEO 13 N. Des ripción Secuencia LAVSI ERAT INCK5SQSVL YS SiiHKlT Lrt KLLIYÜASTR ESGYPDRFSG SGSGTDFILT ISSLQAED7& YYYCQQYYST PFTFGQGYKV E:K¾ hu7H-. E70?.VQSSaE 7KKPG VE7 SCKASGYTFT SYYIHWRQA PGQGLSMIGW INPCSSHTlfY AQEFQSPOTTI IRDTSTSTAY LEL.SSLRSED IfivYYCJtRF YwSQGTL i región Nr/LTQSP&S LAVSLSQRAT I£CRSSES7D SYSNSFMEWY variable de QQRPG2PPRL LIYL&SMLES 3"PARFSGSG SRYDFILIIS cadena ligar PYEABn&ATY YCQ NYEDPF TFSS TK¥EI KR de S.5EI1 re ó Q"Q,Q:Q:SGXE SCK3.TGYTFS A ¾>II¾*IKQR variable de PGHGLEW13E ILPGSD5TD KE FKVK&TF SSDTSSBTYY cadena esada IQjííSLXYED SJ^V YCÍtRGG HYSSLBiWGQ de ~..ÍEil región DXVXXSSSDS LS.VS.L3ERAT IHCRASESvD KYGMSFHKWY vari*bl« d* OQEPGCPPKI, LIXIASHLES SVFDEF3GSG SCrCFTITIS cadena ligera SLQAEDV&AFY YCQQNYEDPF TFGQGYK EI R de huSEll.vl región EVQL^QSSAE YXK?SASYK7 SCKPLSGYTFS AYWIEwYRQA variable de PGQGLESIGE IL GSDSTE'Y HEKFKvRVII YSDTSTST7Y cadena esad» LELSSLRSED G?VYYC¾KGS KYS=2£¾WSQ GII-VTYSS de haSEll.vI regió IVHTQSP3S LS.VS1GERAI IHCRASESVD MYGN3FMHWY variable de QQKPGQGPEL LIYLASKLES GVPDRFSGS3 SGYDFTLTIS cadena ligera, SÍOGÍEDVGYV YCQSMYEDPF TFGOSTKVEI KR de hu.5Ell.v2 región EVQL QSG&E 7KRPSASVK7 SCK&SSYIFS A WIEMYKÜ variable de PGQGLEWISE ILPGSDSTDY KEKFKVR&IF ISDISISTITY cadena pesada LEliSSLRSED YAVYYCARGG EY3SSBYW3Q GIIÍYTVSS de hüSEil.v2 región DIVMTQSP S LAYSLSERAI IHCR SESYD BYGÍfSFMEWY variable de QQKPGQPPKL LIYLAS.ÍLE3 S"PDRFSGSG SRYDFIIIIS cadena ligera, SLQAEDVA7Y YCQ'QHYEDPF TFSQGYK7EI KR de n SEli.v.3 regió EVQLVQSGAE "KKPGASVK7 SCK&SGYTFS KOflEWmk variable de PG-2GLEWISE -LPSSYSTDY KEKF YR7TI TFDTSTSTYY cadena pesada LELSSLRSED YAyYYCARGG KYGSLDYKGQ GYL TYSS de httSEÍl.v3 DIYHTSSP2S. LAVSISERAT IKCRASE37D i'YGNSFMHWY variable de Q PGQPPKL 1IYLASKLES 37PDRF3GSS .SRIDFIIIYS cadena lige SLQAEDVAFY YC QMYEDPF IFSQGCKVEI IR de h sEll.v región E7QL7QSSAE VXKPSAS7K7 SCKASGYTFS AYWIE1YG¾A variable de PGQGLEWIGE ILEGSDSYDY NEKFK7R&TF TSDTSYSTYY cadena pesada LEL33LRSEO YA7YYCARGG KYSSLDYKSQ GYLVTVSS de haS?íl.v4 región D-YMTCSP 5 L-kVSLSESAT IH SASESV «YGMSFHHWY variable de QQ PGQPPKL LIY1ÁSHLES G7PDRF3GS3 SGYDFILIIS cadena lisera SLQ.¾ED"/A £ YCQQ1-3YEDPF TFG-QGYKVEI KR de h BEll.vE región EVQ17QSSAE "EKPGASVKY SCKASGYIFS AY«IE¾VPiQA variable de PGQGLEWIGE ILFGSGSYDY KEKFKTRVTI rRBTSTSTAY cadena pesada. LELSSLRSED YATYYCARGG KYGSLDYMSQ GYLVTYSS Yi?3 E-3 H7R Hi GF-FT3YSIS Y¾3S3 H¥R H EIY PGGYID YADS7KG SW3 S3 H¥R H3 ARLFF Y adena lig rs DIYMTQSPBi INCR&SZSTD F GNSFMHWY d« huSEII .v2 QQKFGQPPEL LIYLASNLES S"PDRFSGS3 SGXE-FXLIIS SLQAEm¾¥Y YCQQMYE3PF IFGQGTKVEI KRXVAAFS"/F IFPPSDEQIE SGIAS CLL MMFYPEEAKV Q¾KVD¾ALi£ 3KSQE3VIEQ DSK STYSiiS STLTL5KADY EEKK¥YACE¥ XHQSLSSP¥X KSFNRGEC ade a, pesada EVQt^QS E YEKPGASYKV SCKASGYXFS ftlEWVRQ ds hii3Ell.v2 IGQGLEHIGE ILPGSXSXBY KEEF VPJ.TF XSDXSXSXYY IELS3LRSED TAVYYCARGG EYGSLDYWGQ GTL T¥SSAS XEGPS FPIA PSSKS SGGT AALGCLvEDY FPEP"7TVS5Ri SGALTSG¥HI FEA LQSSGL YSLS3WT7P SSSLGTQTYI KVKHi SN K I>KK7EPKS CDRXHtCPPC PAPELIGGPS YF1FEPKPKD 7LKISRXPE7 ICWyWSKE DPEVKFN1Y" QGVE¥HBAET KPREEQYHST YRT<T/£VLIVL HQDKLNGKEY CKV3NK&1P APXEKXXSKA KGQPEEPQVY XLPPSREEKX K Q¥SLTCi¥ KGFYPSDIAV EH1SSGQEEN NYKTXPP¥LD SDGSFF1YSK LX¥DK5B.WQQ GMVFSCS!MH E&LHNEYIQK SLSLSFSK c&d*r¡a ligera OXQÍÍTQ-SPSS LS&SVGDRVT IICR&SQWS r.¾".¾.HYQQKP GKAPKLLIYS AS !YSGYPS RFSGSGSSXD FXLXISSLQF EDFAXYYXQQ SYTTPPTFSQ ST VEIKRT" AAPS7FIFPP SDEQLESSXA SWXLINNFY PRE-AKVQKEV DKAL SGHSG ESYXEQOSKD SIYSISSXLX Í.S.KABYEKHK ¥¥ACE¥XKQG 1SSP¥XKSFK RGEC cideas pesada E¥QLYESGGG :-:-?LPI SCAASGFIFX £YSISSVRQA Y 353 PGKGLEWAE IYPPGSYTDY ADSYKSRFII .IADT3ENTAY IQHKSLRAED T&VYYCSKAR IFFDYWGQGT LYTVSSASTK SPSYFPLAPS SESXSSGXAA 1GCLVKDYFP EPVIYSSH5 ALXSGYKXFP AYLQSSGLYS LSSYYXYPSS SLGTQIYICK VNEKF3BXK7 DKK7EPKSCX KXKXCPPCPA PELLGGPSYF LFPPKPEDIl MISRXPEYXC WvDVSHEDP E7KFHWYVDG YEYHHARIKP REEQYM5XYR WSYLTYLHQ DSvLMSKEYKC EYS XALPAP XEKTISKA G QPREPQVYXL •Q¥SLXCI KG FYPSDIAVEif ESMGQPE.ÍHY KXXPPYXXSD GSFFLYSEIX YXJ S WQQGN "FSCSVMKEA LKi'KYTQKSL SLFPG: Prssarssra MDXSRLGYLL SLP¥LiQLAI GGSSPP,=G¥L LRGCPXECKC isP;S h-isia-a; EPDGEMLLR" DCSX1G SEL £KX,="FX£Y lGP.5_ -iiBat 1LPNPLPSLR FLEE1R1AGN ALXYIPKG F X L SLE^K H?_C0365S; 1 XKCL HVP XEALQHLESL QSLELDAMHI SYYPPSCFSG sscuencia OA1TEIPYQ AFRSLSALQA HriALMEIHH s*ñal = IPDY&F3HLS SL IH HNM RI'HSiGEECF BGLHSLETLB aaincscicios INYNNLXEFP XAIRXISNIA EXGFHSMMIFi SIPEKAFVC^ PSLIIIEFYD KPXQFYGE.SA FQKLPELRTL YLKGASQIIE FPDLXGXAMi E3LILIGAQI SSLPQX/CNQ ¡PKLQ LB¡£ YKLLEXiPSF SYCQKLQK:!.1RHNEIYEIK "DXFQQILSL RSLKLAWHEI AIIKPMAFST IPSIIKL LS S LLSSFPIX GiHGtXELKL XGMKALQSLX SSElsFPELK¥ IEHPYAYQCC AFGYCEBAYK ¿SH'QWNEGDN SSMDDLHEED AGHFQAQXER DIiEDFLiLDFE EXLKAIKS7Q CSPSPGPFEP CEKLLD'S¾LI RXGWXIAYl ALXGNAL¥XS XVFEEPLYIS PIKLLIGVIA SYN!-SLXGYSS A¥LAG DAFX FGSFARHGAW WEKG7SCHV! 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Claims (60)

REIVINDICACIONES :
1. Un anticuerpo aislado que se une a LgR5 en donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 22-323 de SEQ ID N. ° : 67 o dentro de los aminoácidos 22-123 de SEQ ID N.°: 67 y se une a LgR5 con una afinidad de = 5 nM.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo monoclonal .
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un fragmento de anticuerpo que se une a LgR5.
5. El anticuerpo de la reivindicación 1 en donde LgR5 es LgR5 humana de SEQ ID N.°: 67.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo comprende : a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 29 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31; o b) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 59 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 61.
7. El anticuerpo de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo comprende : a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 30, HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31 y HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32; o b) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 60, HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 61 y HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62.
8. El anticuerpo de la reivindicación 7 en donde el anticuerpo comprende HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 30, HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31, HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32 y: a) secuencia FR3 marco de cadena pesada de SEQ ID N.°: 40; b) secuencia FR3 marco de cadena pesada de SEQ ID N. ° : 41; c) secuencia FR3 marco de cadena pesada de SEQ ID N. ° : 42; o d) secuencia FR3 marco de cadena pesada de SEQ ID N.°: 43.
9. El anticuerpo de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8 en donde el anticuerpo comprende: a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 32, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29, HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 31, HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 27, HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 29; O b) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 62, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59, HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 61, HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 57, HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 58 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 59.
10. El anticuerpo de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo comprende: a) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27, HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 28 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29; o b) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 57, HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 58 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 59.
11. El anticuerpo de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 en donde el anticuerpo comprende HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 27, HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 28 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29 y que además comprende una secuencia FR3 marco de cadena ligera de SEQ ID N.°: 35.
12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el anticuerpo comprende : a) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID . ° : 6 ; b) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N . ° : 5 ; c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) ; d) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N . ° : 8 ; e) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 7 ; f) una secuencia VH como en (d) y una secuencia VL como en (e) ; g) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N . ° : 10 ; h) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 9 ; i) una secuencia VH como en (g) y una secuencia VL como eri (h) ; j) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 12; k) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 11; 1) una secuencia VH como en (j) y una secuencia VL como en (k) ; m) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 14; n) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 13; o) una secuencia VH como en (m) y una secuencia VL como en (n) ; p) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID . ° : 16; q) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 15; r) una secuencia VH como en (p) y una secuencia VL como en (q) ; s) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 18; t) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 17; u) una secuencia VH como en (s) y una secuencia VL como en (t) ; v) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 20; w) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 19; x) una secuencia VH como en (v) y una secuencia VL como en (w) ; y) una secuencia VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 26; z) una secuencia VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. ° : 25; o aa) una secuencia VH como en (y) y una secuencia VL como en (z) .
13. El anticuerpo de la reivindicación 12 que comprende una secuencia VH seleccionada de SEQ ID N.°: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 26.
14. El anticuerpo de la reivindicación 12 o de la reivindicación 13 que comprende una secuencia VL seleccionada de SEQ ID N.°: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 y 25.
15. Un anticuerpo que comprende: a) una secuencia VH de SEQ ID N.°: 6 y una secuencia VL de SEQ ID . ° : 5 ; b) una secuencia VH de SEQ ID N.°: 8 y una secuencia VL de SEQ ID N . ° : 7 ; c) una secuencia VH de SEQ ID N.°: 10 y una secuencia VL de SEQ ID N . ° : 9; d) una secuencia VH de SEQ ID N.°: 12 y una secuencia VL de SEQ ID N. ° : 11; e) una secuencia VH de SEQ ID N.°: 14 y una secuencia VL de SEQ ID N. ° : 13; f) una secuencia VH de SEQ ID N.°: 16 y una secuencia VL de SEQ ID N . ° : 15; g) una secuencia VH de SEQ ID N.°: 18 y una secuencia VL de SEQ ID N. ° : 17; h) una secuencia VH de SEQ ID N. ° : 20 y una secuencia VL de SEQ ID N. ° : 19; o i) una secuencia VH de SEQ ID N. ° : 26 y una secuencia VL de SEQ ID N . ° : 25.
16. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 15 que es un anticuerpo IgGl, IgG2a o IgG2b.
17. El ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16.
18. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 17.
19. Un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 18 para que se produzca el anticuerpo.
20. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16 y un agente citotóxico .
21. El inmunoconj ugado de la reivindicación 20 que tiene la fórmula Ab-(L-D)p en donde: (a) Ab es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 15; (b) L es un ligador; (c) D es un fármaco seleccionado de un maitansinoide, una auristatina, una caliqueamiciña, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorrubicina; y (d) p oscila entre 1 y 8.
22. El inmunoconjugado de la reivindicación 21 en donde D es una auristatina.
23. El inmunoconjugado de la reivindicación 22 en donde D tiene la fórmula DE y en donde R2 y R6 son cada uno metilo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada R8 se selecciona independientemente de CH3, 0-CH3, OH y H; R9 es H; y R18 es -C(R8) 2-C(R8) 2-arilo.
24. El inmunoconjugado de la reivindicación 21 en donde el fármaco es MMAE.
25. El inmunoconjugado de la reivindicación 21 en donde D es una pirrolobenzodiazepina de Fórmula A: en donde las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o C2 y C3; R2 se selecciona de manera independiente de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR y opcionalmente se selecciona además de halo o dihalo, en donde RD se selecciona de manera independiente de R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan de manera independiente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2í NHR, NRR', N02, Me3Sn y halo; R7 se selecciona de manera independiente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2 , NHR, NRR', N02 , Me3Sn y halo; Q se selecciona de manera independiente de 0, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es O, S03M, cuando M es un catión metálico; R y R' se seleccionan de manera independiente de grupos alquilo Ci-8, heterociclilo C3-8 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y, opcionalmente con relación al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; R12, R16, R19 y R17 son como se definió para R2, R6, R9 y R7 respectivamente; R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede ser interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos que están opcionalmente sustituidos; y X y X' se seleccionan de manera independiente de O, S y N(H) .
26. El inmunoconjugado de la reivindicación 25 en donde D tiene la estructura: en donde n es 0 o 1.
27. El inmunoconjugado de la reivindicación 25 en donde D tiene una estructura seleccionada de : en donde RE y RE" se seleccionan de manera independiente de H o RD, en donde RD se selecciona de manera independiente de R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; en donde Ar1 y Ar2 son independientemente arilo C5_2o opcionalmente sustituido; y en donde n es 0 o 1.
28. El inmunoconjugado de la reivindicación 21 en donde D es una pirrolobenzodiazepina de Fórmula B:
29. en donde la línea ondeada horizontal indica el sitio de unión covalente al ligador; RV1 y RV2 se seleccionan de manera independiente de H, metilo, etilo, fenilo, fenilo sustituido con fluoro y heterociclilo C5-6; y n es 0 o 1.
30. El inmunoconjugado de la reivindicación 21 en donde D es un derivado de nemorrubicin .
31. El inmunoconjugado de la reivindicación 29 en donde D tiene una estructura seleccionada de:
32. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 30 en donde el ligador es escindible por una proteasa.
33. El inmunoco ugado de la reivindicación 31 en donde el ligador comprende un dipéptido val-cit o un dipéptido Phe-Lys .
34. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 30 en donde el ligador es lábil al ácido .
35. El inmunoconjugado de la reivindicación 33 en donde el ligador comprende hidrazona.
36. El inmunoconjugado de la reivindicación 23 que tiene la fórmula: en donde S es un átomo de azufre .
37. El inmunoconjugado de la reivindicación 26 que tiene la fórmula:
38. El inmunoconjugado de la reivindicación 30 que tiene una fórmula seleccionada de: 326
39. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 37 en donde p oscila entre 2 y 5.
40. El inraunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 38 que comprende el anticuerpo de la reivindicación 9.
41. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 38 que comprende el anticuerpo de la reivindicación 15.
42. Una formulación farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 40 y un portador farmacéuticamente aceptable.
43. La formulación farmacéutica de la reivindicación 41 que comprende además un agente terapéutico adicional .
44. La formulación farmacéutica de la reivindicación 42 en donde el agente terapéutico adicional es Avastin® (bevacizumab) .
45. Un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer LgR5 positivo, el cual método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 40.
46. El método de la reivindicación 44 en el cual el cáncer LgR5 positivo se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de páncreas , cáncer de ovario y cáncer endometrial .
47. El método de la reivindicación 45 que comprende además administrar un agente terapéutico adicional al individuo .
48. El método de la reivindicación 46 en donde el agente terapéutico adicional es Avastin® (bevacizumab) .
49. Un método para inhibir la proliferación de una célula LgR5 positiva, el cual método comprende exponer la célula al inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 40 en condiciones que permiten la unión del inmunoconjugado a LgR5 en la superficie de la célula, inhibiendo así la proliferación de la célula.
50. El método de la reivindicación 48 en donde la célula es una célula de cáncer colorrectal, de páncreas, de ovario o endometrial .
51. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16 conjugado con un marcador.
52. El anticuerpo de la reivindicación 50 en donde el marcador es un emisor de positrones.
53. El anticuerpo de la reivindicación 51 en donde el emisor de positrones es 89Zr.
54. Un método para detectar la LgR5 humana en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo anti-LgR5 de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16 en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-LgR5 a una LgR5 humana natural y detectar si se forma un complejo del anticuerpo anti-LgR5 y una LgR5 humana natural en la muestra biológica.
55. El método de la reivindicación 53 en donde el anticuerpo anti-LgR5 es un anticuerpo como en la reivindicación 9 o en la reivindicación 15.
56. El método de la reivindicación 53 en donde la muestra biológica es una muestra de cáncer colorrectal, una muestra de cáncer de páncreas, una muestra de cáncer de ovario o una muestra de cáncer endometrial .
57. Un método para detectar un cáncer LgR5 positivo que comprende (i) administrar un anticuerpo anti-LgR5 marcado a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un cáncer LgR5 positivo, en donde el anticuerpo anti-LgR5 marcado comprende el anticuerpo anti-LgR5 de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16 y (ii) detectar el anticuerpo anti-LgR5 marcado en el sujeto, en donde la detección del anticuerpo anti-LgR5 marcado indica un cáncer LgR5 positivo en el sujeto.
58. El método de la reivindicación 56 en donde el anticuerpo anti-LgR5 marcado es un anticuerpo como en la reivindicación 8 o en la reivindicación 14 que está marcado.
59. El método de la reivindicación 56 o de la reivindicación 57 en el cual el anticuerpo anti-LgR5 marcado comprende un anticuerpo anti-LgR5 conjugado con un emisor de positrones .
60. El método de la reivindicación 58 en donde el emisor de positrones es 89Zr.
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Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014011006A MX2014011006A (es) 2012-03-30 2013-03-29 Anticuerpos anti - lgr5 e inmunoconjugados.

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US (2) US9175089B2 (es)
EP (1) EP2831118A1 (es)
JP (2) JP6404811B2 (es)
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SG (1) SG11201405881TA (es)
TW (1) TW201343674A (es)
WO (1) WO2013149159A1 (es)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8158757B2 (en) 2007-07-02 2012-04-17 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
CN106167526A (zh) 2011-07-15 2016-11-30 昂考梅德药品有限公司 Rspo结合剂和其应用
AU2012332587B2 (en) 2011-11-01 2017-02-23 Bionomics, Inc. Antibodies and methods of treating cancer
ES2697674T3 (es) 2011-11-01 2019-01-25 Bionomics Inc Procedimientos para bloquear el crecimiento de células madre cancerosas
RU2014148162A (ru) 2012-05-01 2016-06-20 Дженентек, Инк. Анти-pmel17 антитела и их иммуноконъюгаты
NZ704269A (en) 2012-07-13 2016-05-27 Oncomed Pharm Inc Rspo3 binding agents and uses thereof
WO2014159835A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
EP3046940B1 (en) * 2013-09-17 2019-07-03 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods of using anti-lgr5 antibodies
CN109575136A (zh) * 2013-12-12 2019-04-05 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 新型抗dpep3抗体和使用方法
BR112016012410A2 (pt) * 2013-12-16 2017-09-26 Genentech Inc conjugado de droga e anticorpo, composto conjugado de droga e anticorpo, composto não-peptídico, método de tratamento de doenças em seres humanos e composição farmacêutica
SG11201607109QA (en) 2014-02-28 2016-09-29 Merus Nv Antibodies that bind egfr and erbb3
WO2015153916A1 (en) * 2014-04-04 2015-10-08 Bionomics, Inc. Humanized antibodies that bind lgr5
JP2015209384A (ja) * 2014-04-24 2015-11-24 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 医薬製剤
CN106459202A (zh) * 2014-06-11 2017-02-22 豪夫迈·罗氏有限公司 抗LgR5抗体及其用途
MX2017003022A (es) * 2014-09-12 2017-05-12 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados.
TW201625689A (zh) * 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 抗－ｂ７－ｈ４抗體及免疫結合物
JP2017528523A (ja) 2014-09-16 2017-09-28 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 線維性疾患の治療
CN107124870A (zh) * 2014-09-17 2017-09-01 基因泰克公司 包含抗her2抗体和吡咯并苯并二氮杂*的免疫缀合物
CA2969689A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
CN106188293A (zh) * 2015-04-17 2016-12-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗c-Met抗体和抗c-Met抗体-细胞毒性药物偶联物及其医药用途
CN115925944A (zh) * 2015-10-23 2023-04-07 美勒斯公司 抑制癌症生长的结合分子
CN105274061A (zh) * 2015-10-26 2016-01-27 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗lgr5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗lgr5单克隆抗体和应用
GB201602356D0 (en) * 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017161414A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 Bionomics Limited Administration of an anti-lgr5 monoclonal antibody
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
NZ750974A (en) * 2016-09-16 2024-01-26 Bionomics Ltd Antibody and checkpoint inhibitor combination therapy
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
WO2018103739A1 (zh) * 2016-12-09 2018-06-14 凯惠科技发展(上海)有限公司 抗体药物偶联物、制备方法、中间体、药物组合物及应用
SG11201907208XA (en) 2017-02-10 2019-09-27 Regeneron Pharma Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
WO2018182422A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Merus N.V. Erbb-2 and erbb3 binding bispecific antibodies for use in the treatment f cells that have an nrg1 fusion gene
US20200114017A1 (en) * 2017-06-16 2020-04-16 Bionomics Limited Antibody drug conjugates that bind lgr5
MY197688A (en) 2017-07-24 2023-07-05 Regeneron Pharma Anti-cd8 antibodies and uses thereof
EP3665198A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Merus N.V. Antibodies that bind egfr and cmet
CN108273070B (zh) * 2018-02-11 2020-10-16 上海交通大学 细胞和药物靶向转接结构及其制备与应用
AU2021246485A1 (en) * 2020-04-01 2022-11-17 The Regents Of The University Of California Immunotheranostic agent targeting mesenchymal stem cell-derived cancer cells and mesenchymal stem cell associated disease
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
WO2023166318A2 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Cambridge Enterprise Limited Therapeutic antibodies
WO2024092016A1 (en) * 2022-10-26 2024-05-02 Research Development Foundation Cell targeting constructs and uses thereof

Family Cites Families (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US633410A (en) 1898-09-22 1899-09-19 George A Ames Ice-cutter.
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
IL89220A (en) 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
ATE282630T1 (de) 1993-10-01 2004-12-15 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd Dolastatin-derivate
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP1193270B1 (en) 1998-08-27 2003-05-14 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP2266607A3 (en) 1999-10-01 2011-04-20 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ATE303445T1 (de) 1999-10-04 2005-09-15 Medicago Inc Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU3942202A (en) 2000-11-30 2002-06-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
GB0103998D0 (en) 2001-02-19 2001-04-04 King S College London Method
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
AU2002339845B2 (en) 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
EP1482972A4 (en) 2001-11-20 2005-11-23 Seattle Genetics Inc TREATMENT OF IMMUNOLOGICAL DISORDERS USING ANTI-CD30 ANTIBODIES
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AU2003294210A1 (en) 2002-07-31 2004-05-04 Seattle Genetics, Inc Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
SI1572744T1 (sl) 2002-12-16 2010-09-30 Genentech Inc Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2520898C (en) 2003-03-31 2009-10-20 Council Of Scientific And Industrial Research Non-cross-linking pyrrolo(2,1-c)(1,4)benzodiazepines as potential antitumour agents and process thereof
US7755007B2 (en) 2003-04-17 2010-07-13 K&H Manufacturing, Inc Heated pet mat
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
DE10339820A1 (de) * 2003-08-22 2005-03-17 Hinzmann, Bernd, Dr. Verwendung von an GPR49 bindenden Substanzen zur Diagnose und Behandlung von Krebs
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
US7511032B2 (en) 2003-10-22 2009-03-31 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
TR201809892T4 (tr) 2003-11-05 2018-07-23 Roche Glycart Ag Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller.
DK1725249T3 (en) 2003-11-06 2014-03-17 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugating to ligands.
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US7375078B2 (en) 2004-02-23 2008-05-20 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
US7528126B2 (en) 2004-03-09 2009-05-05 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7662936B2 (en) 2004-04-07 2010-02-16 Genentech, Inc. Mass spectrometry of antibody conjugates
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
WO2006060533A2 (en) 2004-12-01 2006-06-08 Genentech, Inc. Conjugates of 1, 8-bis-naphthalimides with an antibody
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
US8343928B2 (en) 2005-07-07 2013-01-01 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain replacements at the C-terminus
WO2007100385A2 (en) 2005-10-31 2007-09-07 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ES2374964T3 (es) 2006-01-25 2012-02-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina.
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
NZ574215A (en) 2006-07-18 2012-07-27 Sanofi Aventis Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8158757B2 (en) * 2007-07-02 2012-04-17 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
SI2019104T1 (sl) 2007-07-19 2013-12-31 Sanofi Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomaimicinske derivate, in njihova terapevtska uporaba
CA2705509A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-gpr49 antibody
GB0723317D0 (en) 2007-11-28 2008-01-09 Glaxo Group Ltd Compounds
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
EP2240495B1 (en) 2008-02-01 2015-07-15 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
US8900589B2 (en) 2008-07-15 2014-12-02 Genetech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
WO2010016766A2 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Antibodies recognizing endogenous human lgr5 and/or lgr6
CA2752884A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for protein labelling
TW201106972A (en) * 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
US20130028917A1 (en) 2010-04-15 2013-01-31 Spirogen Developments Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
NZ602840A (en) 2010-06-03 2014-11-28 Genentech Inc Immuno-pet imaging of antibodies and immunoconjugates and uses therefor
WO2011156328A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP2640727B1 (en) 2010-11-17 2015-05-13 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
RU2013140685A (ru) 2011-02-04 2015-03-10 Дженентек, Инк. ВАРИАНТЫ Fc, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
JP5987053B2 (ja) 2011-05-12 2016-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングｌｃ−ｍｓ／ｍｓ法
AU2012322607B2 (en) 2011-10-14 2017-02-16 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof

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