CN104411721A - 抗lgr5抗体和免疫缀合物 - Google Patents

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W.茂
P.波拉基斯
A.波尔森
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Abstract

本发明提供抗LgR5抗体和免疫缀合物及其使用方法。

Description

抗LGR5抗体和免疫缀合物
发明领域
本发明涉及抗LgR5抗体和免疫缀合物以及其使用方法。
背景
含有富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体5(LgR5)是一种存在于活跃循环的肠干细胞(ISC)表面上的七次跨膜蛋白。表达LgR5的ISC对Wnt调节敏感并且主要负责肠上皮的体内平衡再生。然而，消除小鼠的表达LgR5的细胞并不影响肠上皮的体内平衡，这表明其它细胞类型可补偿此细胞群体的丧失。Tian等,Nature 478:255-259(2011)。R-脊椎蛋白(R-spondin)增强由WNT3A达成的WNT信号传导，并且所有四种R-脊椎蛋白RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4都能够结合LgR5。Lau等,Nature 476:293-297(2011)。
人LgR5是一种含907个氨基酸的蛋白质，其中预测在氨基端信号序列裂解后，有约540个氨基酸在细胞外间隙中。LgR5包含处于胞外域中的17个富含亮氨酸的不完全重复基序和位于富含亮氨酸的重复序列与第一跨膜域之间的富含半胱胺酸的区域。
本领域存在本领域对靶向LgR5以诊断和治疗LgR5相关病状(如癌症)的药剂的需要。本发明满足该需要并且提供其它益处。
概述
本发明提供抗LgR5抗体和免疫缀合物以及其使用方法。
在一些实施方案中，提供结合LgR5的分离的抗体。在一些实施方案中，所述抗体具有呈任何组合形式的至少一个或多个以下特征：(a)结合SEQ IDNO:67的氨基酸22-555内的表位和/或结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-123内的表位和/或结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-323内的表位和/或结合SEQID NO:67的氨基酸22-424内的表位和/或结合SEQ ID NO:67的氨基酸324-555内的表位和/或结合SEQ ID NO:67的氨基酸324-424内的表位；(b)结合LgR5的亲和力≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM，并且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM；(c)不显著破坏R-脊椎蛋白(RSPO)与LgR5的结合；(d)不显著破坏β-连环蛋白(beta-catenin)信号传导；(e)不显著破坏RSPO对LgR5信号传导的活化；(f)活化半胱天冬酶3裂解；(g)识别人LgR5与啮齿动物LgR5两者；(h)识别人LgR5而不识别啮齿动物LgR5；(i)在其未缀合形式下不显著抑制肿瘤生长；和(j)不诱导干细胞分化。
在一些实施方案中，分离的抗LgR5抗体结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-323内的表位的亲和力≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM，并且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM。
在一些实施方案中，分离的抗LgR5抗体结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-123内的表位的亲和力≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM，并且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM。
在一些实施方案中，分离的抗LgR5抗体结合SEQ ID NO:67的氨基酸324-424内的表位的亲和力≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM并且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM。
在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体不显著破坏R-脊椎蛋白(RSPO)与LgR5的结合。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体不显著破坏wnt/β-连环蛋白信号传导。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体不显著破坏RSPO对LgR5信号传导的活化。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体活化半胱天冬酶3裂解。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体识别人LgR5与啮齿动物LgR5两者。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体识别人LgR5而不识别啮齿动物LgR5。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体在其未缀合形式下不显著抑制肿瘤生长。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体不诱导干细胞分化。
在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体为单克隆抗体。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，抗LgR5抗体为结合LgR5的抗体片段。在任何分离的抗LgR5抗体的一些实施方案中，LgR5为具有SEQ ID NO:67的人LgR5。
在一些实施方案中，结合LgR5的抗体结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-323内的表位。在一些实施方案中，所述抗体结合LgR5的亲和力≤5nM。在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。在一些实施方案中，所述抗体为结合LgR5的抗体片段。在一些实施方案中，LgR5为具有SEQ ID NO:67的人LgR5。
在一些实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2。在一些实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含重链框架FR3序列SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含轻链框架FR3序列SEQ ID NO:35。
在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含VH序列SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，所述抗体包含VL序列SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，分离的抗体包含VH序列SEQ ID NO:8和VL序列SEQ ID NO:7。
在一些实施方案中，结合LgR5的抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:56的HVR-H3，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HVR-H2。在一些实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQID NO:55的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的HVR-H3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含VH序列SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，所述抗体包含VL序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，分离的抗体包含VH序列SEQ ID NO:24和VL序列SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，结合LgR5的抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:50的HVR-H3，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:495的HVR-H2。在一些实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含(a)包含氨基酸序列SEQID NO:45的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。
在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含VH序列SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，所述抗体包含VL序列SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，分离的抗体包含VH序列SEQ ID NO:22和VL序列SEQ ID NO:21。
在一些实施方案中，结合LgR5的抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:62的HVR-H3，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2。在一些实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQID NO:61的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。
在一些实施方案中，分离的抗体包含(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含VH序列SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，所述抗体包含VL序列SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，分离的抗体包含VH序列SEQ ID NO:26和VL序列SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，提供一种编码本文所述的抗体的分离的核酸。在一些实施方案中，提供一种包含所述核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供一种产生本文所述的抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞。
在一些实施方案中，提供免疫缀合物。在一些实施方案中，免疫缀合物包含抗LgR5抗体和细胞毒性剂。在一些实施方案中，免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab为本文所述的抗体；(b)L为接头；(c)D为选自美登木素(maytansinoid)、奥里斯他汀(auristatin)、卡奇霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮杂卓和奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物的药物；并且(d)p在1-8的范围内。在一些实施方案中，D为奥里斯他汀。在一些这类实施方案中，D具有式DE
其中R2和R6各自为甲基，R3和R4各自为异丙基，R5为H，R7为仲丁基，各R8独立地选自CH3、O-CH3、OH和H；R9为H；并且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。在一些实施方案中，D为具有以下结构的MMAE：
在一些实施方案中，D为式A的吡咯并苯并二氮杂卓：
其中点线指示在C1与C2或C2与C3之间任选地存在双键；R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且任选地进一步选自卤基或二卤基，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤基；R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；Q独立地选自O、S和NH；R11为H或R或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；R和R'各自独立地选自任选取代的C1-8烃基、C1-12烃基、C3-8杂环基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并且任选地相对于基团NRR'，R和R'连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的4元、5元、6元或7元杂环；R12、R16、R19和R17分别是如对于R2、R6、R9和R7所定义；R"为C3-12亚烷基，该链可间杂有一个或多个杂原子和/或任选取代的芳环；并且X和X'独立地选自O、S和N(H)。在一些这类实施方案中，D为
其中n为0或1。
在一些实施方案中，D为奈莫柔比星衍生物。在一些实施方案中，D具有选自以下的结构：
在一些实施方案中，免疫缀合物包含可由蛋白酶裂解的接头。在一些实施方案中，接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。在一些实施方案中，免疫缀合物包含酸不稳定性接头。在一些这类实施方案中，接头包含腙。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有选自以下的式：
其中S为硫原子；
在一些实施方案中，p在2-5的范围内。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含抗体，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1，(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2，和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。在一些实施方案中，免疫缀合物包含含有VH序列SEQ ID NO:8和VL序列SEQ ID NO:7的抗体。
在一些实施方案中，提供药物制剂。在一些这类实施方案中，药物制剂包含含有例如如本文所述的结合LgR5的抗体的免疫缀合物。在一些实施方案中，药物制剂进一步包含其它治疗剂。在一些实施方案中，其它治疗剂为(贝伐单抗(bevacizumab))。
在一些实施方案中，提供治疗患有LgR5阳性癌症的个体的方法。在一些这类实施方案中，方法包括施用包含免疫缀合物的药物制剂，该免疫缀合物包含例如如本文所述的结合LgR5的抗体。在一些实施方案中，LgR5阳性癌症选自结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌。在一些实施方案中，LgR5阳性癌症为小肠癌。在一些实施方案中，小肠癌为十二指肠、空肠和/或回肠的癌症。在一些实施方案中，小肠癌为空肠和/或回肠的癌症。在一些实施方案中，LgR5阳性癌症包括Kras突变、APC突变或Kras突变与APC突变两者(例如在至少一部分癌细胞中)。在一些实施方案中，方法包括向个体施用其它治疗剂。在一些这类实施方案中，其它治疗剂为(贝伐单抗)。
在一些实施方案中，提供抑制LgR5阳性细胞增殖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞在容许免疫缀合物结合细胞表面上的LgR5的条件下暴露于包含结合LgR5的抗体的免疫缀合物。在一些实施方案中，结合LgR5的抗体为本文所述的抗体。在一些实施方案中，借此抑制细胞增殖。在一些实施方案中，所述细胞为结肠直肠癌细胞、小肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或子宫内膜癌细胞。
在一些实施方案中，使结合LgR5的抗体缀合标记。在一些实施方案中，结合LgR5的抗体为本文所述的抗体。在一些实施方案中，标记为正电子发射体。在一些实施方案中，正电子发射体为89Zr。
在一些实施方案中，提供一种检测生物样品中的人LgR5的方法。在一些实施方案中，方法包括使生物样品与抗LgR5抗体在容许所述抗LgR5抗体结合天然存在的人LgR5的条件下相接触，和检测在所述抗LgR5抗体与所述生物样品中的天然存在的人LgR5之间是否形成复合物。在一些实施方案中，抗LgR5抗体为本文所述的抗体。在一些实施方案中，生物样品为结肠直肠癌样品、小肠癌样品、胰腺癌样品、卵巢癌样品或子宫内膜癌样品。
在一些实施方案中，提供一种检测LgR5阳性癌症的方法。在一些这类实施方案中，方法包括(i)向患有或疑似患有LgR5阳性癌症的受试者施用经标记的的抗LgR5抗体，和(ii)检测所述受试者体内的所述经标记的抗LgR5抗体，其中检测到所述经标记的抗LgR5抗体指示在所述受试者体内存在LgR5阳性癌症。在一些实施方案中，抗LgR5抗体为本文所述的抗体。
附图简述
图1示出如实施例A中所述，各种组织中人LgR5基因表达水平的图形表示。图1中的插图示出如实施例A中所述，正常结肠组织和结肠肿瘤中人LgR5基因表达水平的图形表示。
图2示出如实施例B中所述，通过原位杂交测定的LgR5在结肠肿瘤中的表达。
图3示出(A)结肠肿瘤组织微阵列中各种LgR5表达水平的出现率，和(B)来自各结肠直肠腺癌样品的三个核心中LgR5表达的异质性，两者均通过原位杂交测定，如实施例B中所述。
图4示出如实施例C至F中所述产生的某些抗LgR5单克隆抗体的特性。
图5示出鼠抗体mu8E11及其人源化变异体(hu8E11.v1至hu8E11.v8)的轻链可变区序列的比对。三个高变区(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中用方框来指示。
图6示出鼠抗体mu8E11及其人源化变异体(hu8E11.v1至hu8E11.v8)的重链可变区序列的比对。三个高变区(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中用方框来指示。
图7示出鼠抗体3G12和2H6的轻链可变区序列。三个高变区(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中用方框来指示。
图8示出鼠抗体3G12和2H6的重链可变区序列。三个高变区(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中用方框来指示。
图9示出如实施例E中所述，嵌合抗体ch8E11和各种人源化变异体的亲和力测量结果。
图10示出人抗体YW353的轻链可变区序列。三个高变区(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中用方框来指示。
图11示出人抗体YW353的重链可变区序列。三个高变区(HVR：HVR1、HVR2、HVR3)在序列中用方框来指示。
图12A至12C示出人、石蟹猴、大鼠和小鼠LgR5的比对。
图13示出如实施例L中所述，抗LgR5免疫缀合物在LoVo结肠癌异种移植物中展现出功效。
图14示出如实施例M中所述，抗LgR5免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图15示出如实施例M中所述，3mg/kg、6mg/kg和12mg/kg的huYW353-vcMMAE免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图16示出如实施例N中所述，来自AV和AKV小鼠的结肠的正常组织和息肉中的LgR5mRNA表达。
图17示出如实施例N中所述，施用抗LgR5抗体和抗LgR5抗体-药物缀合物的AKV小鼠的存活期，所述小鼠的存活时间长于对照AKV小鼠。
图18示出如实施例N中所述，施用对照ADC、抗LgR5ADC或抗LgR5抗体的AKV小鼠中针对裂解的半胱天冬酶3呈阳性的肿瘤面积百分比。
图19示出如实施例N中所述，施用抗LgR5抗体-药物缀合物的AKV小鼠的存活时间长于未处理AKV小鼠和施用gp120-ADC或抗LgR5的AKV小鼠。
图20示出如实施例N中所述，在AKV LgR5DTR/+小鼠中的小肠息肉和结肠息肉中的LgR5+面积。
图21示出如实施例N中所述，(A)经对照ADC和经抗LgR5-ADC处理的AKV LgR5DTR/+小鼠中每单位细胞面积的CC3+GFP+面积，和(B)经对照ADC和经抗LgR5-ADC处理的AKV LgR5DTR/+小鼠中的示例性免疫组织化学染色。
图22示出如实施例N中所述，在经对照ADC和经抗LgR5-ADC处理的AKV LgR5DTR/+小鼠中每单位细胞面积(GFP+细胞或GFP-细胞)的Ki67+面积。
图23示出如实施例N中所述，在AKV LgR5DTR/+小鼠的隐窝和肿瘤中GFP强度与GFP+面积的比率。
图24示出如实施例O中所述，huYW353-vcMMAE、hu8E11v2-vcMMAE和ch8E11-vcMMAE免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图25示出如实施例O中所述，hu8E11v2-vcMMAE免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图26示出如实施例P中所述，huYW353-vcMMAE和hu8E11v2-vcMMAE免疫缀合物在LoVoX1.1结肠癌异种移植物中展现出功效。
图27示出如实施例P中所述，hu8E11v2-vcMMAE免疫缀合物在LoVoX1.1结肠癌异种移植物中展现出功效。
图28示出如实施例Q中所述，huYW353-vcMMAE、huYW353-缩醛-PNU和huYW353-vcPNU免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图29示出如实施例R中所述，hu8E11v2-缩醛-PNU、hu8E11v2-vcPNU和hu8E11v2-PNU免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图30示出如实施例S中所述，施用某些hu8E11v2免疫缀合物和对照抗体免疫缀合物在LoVoX1.1结肠癌异种移植物中的结果。
图31示出如实施例S中所述，在共施用过量对照抗体的小鼠中，hu8E11v2-缩醛-PNU免疫缀合物在LoVoX1.1结肠癌异种移植物中展现出功效。
图32示出如实施例T中所述，抗LgR5huYW353PBD免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图33示出如实施例T中所述，抗LgR5hu8E11v2PBD免疫缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中展现出功效。
图34示出如实施例U中所述，抗LgR5hu8E11v2PBD免疫缀合物在LoVoX1.1结肠癌异种移植物中展现出功效。
图35示出以下各物的结构：(A)抗体-vcMMAE免疫缀合物，(B)抗体-缩醛-PNU免疫缀合物，(C)抗体-缩醛-PNU免疫缀合物，(D)抗体-PNU免疫缀合物，和(E)抗体-vcPBD免疫缀合物。
本发明的某些实施方案的详述
I.定义
出于本文的目的，“接受体人框架”为以下框架，其包含源于如以下定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列。“源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接受体人框架可包含与人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化数目为10处或10处以下、9处或9处以下、8处或8处以下、7处或7处以下、6处或6处以下、5处或5处以下、4处或4处以下、3处或3处以下，或2处或2处以下。在一些实施方案中，VL接受体人框架的序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指示，否则如本文所使用的“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文所述的那些)加以测量。在下文中描述测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一或多处改变的抗体，与不具有这类改变的亲本抗体相比，这类改变提高所述抗体对抗原的亲和力。
术语“抗LgR5抗体”和“结合LgR5的抗体”是指能够以足够的亲和力结合LgR5的抗体，这样使得所述抗体适用作靶向LgR5的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗LgR5抗体与无关非LgR5蛋白的结合程度小于抗体与LgR5的结合程度的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的。在某些实施方案中，结合LgR5的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5Nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗LgR5抗体结合在来自不同物种的LgR5之中保守的LgR5表位。
术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现所需抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实施例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中将参照抗体与其抗原的结合阻断50％或以上的抗体，并且反的，参照抗体在竞争测定中将所述抗体与其抗原的结合阻断50％或以上。本文提供示例性竞争测定。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖失调的生理学病状。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(例如霍奇金氏(Hodgkin's)和非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症和各种类型的头颈部癌。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源于不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指抗体重链所具有的恒定域或恒定区的类型。存在五种主要抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干类别可进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道诺霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核分解酶；抗生素；细菌、真菌、植物或动物来源的毒素，如小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变异体；和以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
例如药物制剂的药剂的“有效量”是指在一定剂量下并且持续一段必需时间有效达到所需治疗性或防治性结果的量。
术语“表位”是指抗原分子上由抗体结合的特定位点。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。所述术语包括原生序列Fc区和变异型Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，还称为EU索引，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR通常由四个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用并且是指具有实质上与原生抗体结构类似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“LgR5的糖基化形式”是指通过添加碳水化合物残基而得到翻译后修饰的LgR5的天然存在的形式。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指已引入外源性核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和源于其的子代而不考虑继代数目。子代在核酸内容物方面可能与母细胞不完全相同，而可能含有突变。本文包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变型子代。
“人抗体”为具有对应于由人或人细胞所产生或源于利用人抗体谱系或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列是选自可变域序列的亚群。一般而言，序列亚群是如Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中的亚群。在一个实施方案中，对于VL，亚群是如Kabat等(同上)中的亚群κI。在一个实施方案中，对于VH，亚群是如Kabat等(同上)中的亚群III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含实质上至少一个(并且通常两个)中的全部可变域，其中全部或实质上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且全部或实质上全部FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可包含源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，是指已进行人源化的抗体。
如本文所使用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域中序列高变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的各区域。一般而言，原生四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，互补决定区具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65和H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含作为接触抗原的残基的“特异性决定残基”或“SDR”。SDR包含在CDR的称为缩略CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指示，否则HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等(同上)进行编号。
“免疫缀合物”为结合一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如母牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者为人。
“分离的抗体”为已与其自然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)所测定。对于评定抗体纯度的方法的评述，参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的核酸”是指已与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“编码抗LgR5抗体的分离的核酸”是指一个或多个编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的这种(这类)核酸分子和存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这种(这类)核酸分子。
如本文所使用的术语“LgR5”是指由加工细胞中的LgR5前体蛋白所产生的任何原生成熟LgR5。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的LgR5，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人和石蟹猴)；和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语还包括LgR5的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。具有信号序列(氨基酸1-21)的示例性人LgR5前体蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:67中。示例性成熟人LgR5的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:68中。示例性石蟹猴LgR5的氨基酸33至907的预测序列显示于SEQ ID NO:69中。示例性大鼠LgR5前体(具有信号序列氨基酸1-21)的氨基酸序列和成熟序列分别显示于SEQ ID NO:70和71中。示例性小鼠LgR5前体(具有信号序列氨基酸1-21)的氨基酸序列和成熟序列分别显示于SEQ ID NO:72和73中。
术语“LgR5阳性癌症”是指包含在表面上表达LgR5的细胞的癌症。出于确定细胞是否在表面上表达LgR5的目的，将LgR5mRNA表达视为与LgR5在细胞表面上表达相关联。在一些实施方案中，LgR5mRNA的表达通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法进行测定。或者，LgR5在细胞表面上的表达可例如在如免疫组织化学、FACS等的方法中使用针对LgR5的抗体来测定。
术语“LgR5阳性细胞”是指在表面上表达LgR5的细胞。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从实质上均质的抗体群体获得的抗体，即除可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在制备单克隆抗体制备物期间产生，这类变体通常少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定子。因此，修饰语“单克隆”指示抗体是获自实质上均质的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体呈现方法和利用含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这类方法和制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文中予以描述。
“裸抗体”是指未结合异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“原生抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，原生IgG抗体为约150,000道尔顿的杂四聚糖蛋白，经由二硫键键合的两个相同轻链和两个相同重链构成。自N端至C端，各重链具有可变区(VH)，还称为可变重域或重链可变域，随后为三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N端至C端，各轻链具有可变区(VL)，还称为可变轻域或轻链可变域，随后为恒定轻(CL)域。抗体的轻链可基于其恒定域的氨基酸序列指定为称为κ和λ的两种类型中的一者。
术语“包装说明书”用于指惯常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用这类治疗性产品相关的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对参照多肽序列与候选序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比之后，并且在不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以本领域技术范围内的多种方式，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来比对以便测定氨基酸序列同一性百分比。本领域技术人员可确定适用于比对序列的参数，包括在所比较的序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创造，并且源代码已与用户文档一起在美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)存档，其中其以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可自Genentech公司,South San Francisco,California公开获得，或可自源代码编译。ALIGN-2程序应编译用于UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)。所有序列比较参数都由ALIGN-2程序设定并且不改变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对于、与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(或者可称为给定氨基酸序列A对于、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含某一百分比的氨基酸序列同一性)如下进行计算：
100乘分数X/Y
其中X为通过序列比对程序ALIGN-2在该程序对A与B进行比对时评为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中Y为B中的氨基酸残基总数。应了解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对于B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B对于A的氨基酸序列同一性百分比。除非另外明确陈述，否则本文使用的所有氨基酸序列同一性百分比值都如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序来获得。
术语“药物制剂”是指以下制剂，其呈允许当中所含的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对制剂所将施用于的受试者产生不可接受的毒性的其它组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所使用的“治疗(treatment)”(及其语法变化形式，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然病程，并且可为实现防治目的或在临床病理过程中进行的临床干预。合乎需要的治疗作用包括但不限于防止疾病发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病病况和缓和或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病产生或减缓疾病进展。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链中涉及抗体与抗原结合的结构域。原生抗体的重链可变域和轻链可变域(分别为VH和VL)通常具有类似结构，其中各结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单一VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可分别使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合所述特定抗原的抗体。参见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所使用的术语“载体”是指能够使其所连接的另一核酸增殖的核酸分子。所述术语包括呈自我复制核酸结构形式的载体以及并入当中已引入有其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够导引与其可操作地连接的核酸表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
“烷基”为含有正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的C1-C18烃。实例为甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)。
如本文所使用的术语“C1-C8烷基”是指具有1至8个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烃。代表性“C1-C8烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而支链C1-C8烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基；不饱和C1-C8烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基。C1-C8烷基可以是未取代的或被一个或多个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
如本文所使用的术语“C1-C12烷基”是指具有1至12个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烃。C1-C12烷基可以是未取代的或被一个或多个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
如本文所使用的术语“C1-C6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烃。代表性“C1-C6烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基和-正己基；而支链C1-C6烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和2-甲基丁基；不饱和C1-C6烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基和-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基和3-己基。C1-C6烷基可以是未取代的或被一个或多个如上文对于C1-C8烷基所述的基团取代。
如本文所使用的术语“C1-C4烷基”是指具有1至4个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烃。代表性“C1-C4烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而支链C1-C4烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基；不饱和C1-C4烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基和-异丁烯基。C1-C4烷基可以是未取代的或被一个或多个如上文对于C1-C8烷基所述的基团取代。
“烷氧基”为以单键键合氧的烷基。示例性烷氧基包括但不限于甲氧基(-OCH3)和乙氧基(-OCH2CH3)。“C1-C5烷氧基”为具有1至5个碳原子的烷氧基。烷氧基可以是未取代的或被一个或多个如上文对于烷基所述的基团取代。
“烯基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)并且含有正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的C2-C18烃。实例包括但不限于：乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。“C2-C8烯基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)并且含有2至8个正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的烃。
“炔基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp参键)并且含有正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的C2-C18烃。实例包括但不限于：乙炔基(-C≡CH)和炔丙基(-CH2C≡CH)。“C2-C8炔基”为具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp参键)并且含有2至8个正链碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的烃。
“亚烷基”是指具有1-18个碳原子并且具有通过自母体烷烃的同一碳原子或两个不同碳原子移除两个氢原子所获得的两个单价基团中心的饱和支链或直链或环状烃基。典型亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等等。
“C1-C10亚烷基”为具有式-(CH2)1-10-的直链饱和烃基。C1-C10亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。
“亚烯基”是指具有2-18个碳原子并且具有通过自母体烯烃的同一碳原子或两个不同碳原子移除两个氢原子所获得的两个单价基团中心的不饱和支链或直链或环状烃基。典型亚烯基包括但不限于：1,2-乙烯基(-CH＝CH-)。
“亚炔基”是指具有2-18个碳原子并且具有通过自母体炔烃的同一碳原子或两个不同碳原子移除两个氢原子所获得的两个单价基团中心的不饱和支链或直链或环状烃基。典型亚炔基包括但不限于：乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
“芳基”是指碳环芳族基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。碳环芳族基团或杂环芳族基团可以是未取代的或被一个或多个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C5-C20芳基”为在碳环芳环中具有5至20个碳原子的芳基。C5-C20芳基的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。C5-C20芳基可以是如上文对于芳基所述被取代或未取代的。“C5-C14芳基”为在碳环芳环中具有5至14个碳原子的芳基。C5-C14芳基的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。C5-C14芳基可以是如上文对于芳基所述被取代或未取代的。
“亚芳基”是如以下结构中所示，具有两个共价键并且可呈邻位、间位或对位构型的芳基：
其中苯基可以是未取代的或被多达四个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
“芳基烷基”是指一个键合于碳原子(通常为末端或sp3碳原子)的氢原子被芳基置换的无环烷基。典型芳基烷基包括但不限于苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基等等。芳基烷基包含6至20个碳原子，例如芳基烷基的烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子并且芳基部分为5至14个碳原子。
“杂芳基烷基”是指一个键合于碳原子(通常为末端或sp3碳原子)的氢原子被杂芳基置换的无环烷基。典型杂芳基烷基包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基等等。杂芳基烷基包含6至20个碳原子，例如杂芳基烷基的烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子并且杂芳基部分为5至14个碳原子以及1至3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳基烷基的杂芳基部分可为具有3至7个环成员(2至6个碳原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。
“取代的烷基”、”取代的芳基”和“取代的芳基烷基”分别意指一个或多个氢原子各自独立地被取代基置换的烷基、芳基和芳基烷基。典型取代基包括但不限于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2，其中各X独立地为卤素：F、Cl、Br或I；并且各R独立地为-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14杂环、保护基或前药部分。如上所述的亚烷基、亚烯基和亚炔基还可类似地被取代。
“杂芳基”和“杂环”是指一个或多个环原子为杂原子(例如氮、氧和硫)的环系统。杂环基团包含3至20个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子。杂环可为具有3至7个环成员(2至6个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。
示例性杂环例如描述于Paquette,Leo A.,“Principles of ModernHeterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968)，具体而言第1、3、4、6、7和9章；“The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series ofMonographs”(John Wiley & Sons,New York,1950年至今)，具体而言第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中。
杂环的实例包括例如而不限于吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基、硫氧化四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚烯基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖口辛基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻嗯基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、吨基、吩噁噻基、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲哚嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、口辛啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋呫基、吩噁嗪基、异苯并二氢吡喃基、二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红酰基。
举例而言而不限于，碳键合型杂环在以下位置处键合：吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、硫呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮丙啶的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位；喹啉的2、3、4、5、6、7或8位；或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。更通常，碳键合型杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
举例而言而不限于，氮键合型杂环在以下位置处键合：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉的2位；吗啉的4位；和咔唑或β-咔啉的9位。更通常，氮键合型杂环包括1-氮丙啶基、1-氮杂环丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。
“C3-C8杂环”是指芳族或非芳族C3-C8碳环，其中一至四个环碳原子独立地被来自由O、S和N组成的组的杂原子置换。C3-C8杂环的代表性实例包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。C3-C8杂环可以是未取代的或被多达七个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C8杂环基”是指以上定义的C3-C8杂环基团，其中杂环基团的一个氢原子被一键置换。C3-C8杂环基可以是未取代的或被多达六个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C20杂环”是指芳族或非芳族C3-C8碳环，其中一至四个环碳原子独立地被来自由O、S和N组成的组的杂原子置换。C3-C20杂环可以是未取代的或被多达七个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C20杂环基”是指以上定义的C3-C20杂环基团，其中杂环基团的一个氢原子被一键置换。
“碳环”意指具有3至7个碳原子的呈单环形式或具有7至12个碳原子的呈双环形式的饱和或不饱和环。单环碳环具有3至6个环原子，更通常具有5或6个环原子。双环碳环具有例如排列成双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统的7至12个环原子或排列成双环[5,6]或[6,6]系统的9或10个环原子。单环碳环的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基和环辛基。
“C3-C8碳环”为3元、4元、5元、6元、7元或8元饱和或不饱和非芳族碳环。代表性C3-C8碳环包括但不限于-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-环庚基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基、-环辛基和-环辛二烯基。C3-C8碳环基团可以是未取代的或被一个或多个包括但不限于以下的基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
“C3-C8碳环基”是指以上定义的C3-C8碳环基团，其中碳环基团的一个氢原子被一键置换。
“接头”是指包含共价键或一系列原子的使抗体共价连接于药物部分的化学部分。在各种实施方案中，接头包括二价基团，如烷二基、芳二基、杂芳二基、如以下的部分：-(CR2)nO(CR2)n-、烷氧基的重复单元(例如聚亚乙基氧基、PEG、聚亚甲基氧基)和烷基氨基的重复单元(例如聚亚乙基氨基，JeffamineTM)；和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。在各种实施方案中，接头可包含一个或多个氨基酸残基，如缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和高赖氨酸。
术语“手性”是指分子具有与镜像搭配物不可重迭的特性，而术语“非手性”是指分子可重迭于其镜像搭配物上。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但在原子或基团于空间中的排列方面不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性和反应性。非对映异构体的混合物可在如电泳和色谱法的高分辨率分析程序下分离。
“对映异构体”是指化合物的两个互为不可重迭镜像的立体异构体。
本文使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker编,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book公司,New York；及Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley& Sons公司,New York。许多有机化合物以光学活性形式存在，即其能够使平面偏振光的平面旋转。在描述光学活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于指定由化合物所致的平面偏振光旋转方向，其中(-)或l意指化合物为左旋化合物。前缀为(+)或d的化合物为右旋化合物。对于给定化学结构，这些立体异构体是相同的，例外之处为其互为镜像。特定立体异构体还可称为对映异构体，并且这类异构体的混合物常称为对映异构混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可在化学反应或过程中不存在立体选择或立体特异性时存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种对映异构物质的缺乏光学活性的等摩尔混合物。
“离去基团”是指可被另一官能团取代的官能团。某些离去基团在本领域是众所周知的，并且实例包括但不限于卤基(例如氯基、溴基、碘基)、甲烷磺酰基(甲磺酰基)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(三氟甲磺酸酯基)和三氟甲基磺酸酯基。
术语“保护基”是指通常用于在使化合物上的其它官能团反应时阻隔或保护特定官能团的取代基。例如，“氨基保护基”为连接于氨基的阻隔或保护化合物中的氨基官能团的取代基。适合氨基保护基包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)和9-茐基亚甲基氧基羰基(Fmoc)。对于保护基及其使用的一般性描述，参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991或后期版本。
II.组合物和方法
在一方面，本发明部分基于结合LgR5的抗体和包含这类抗体的免疫缀合物。本发明的抗体和免疫缀合物例如适用于诊断或治疗LgR5阳性癌症。
A.示例性抗LgR5抗体
在一些实施方案中，本发明提供结合LgR5的分离的抗体。LgR5是一种例如存在于活跃循环的肠干细胞表面上的七次跨膜蛋白。如本文所显示，约77％的所检查的结肠肿瘤切片中表达有LgR5。
具有信号序列(氨基酸1-21)的示例性天然存在的人LgR5前体蛋白序列提供于SEQ ID NO:67中，并且相应成熟LgR5蛋白质序列显示于SEQ ID NO:68(对应于SEQ ID NO:67的氨基酸22-907)中。
在某些实施方案中，抗LgR5抗体具有呈任何组合形式的至少一个或多个以下特征：(a)结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-555内的表位；(b)结合LgR5的亲和力≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM，并且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM；(c)不显著破坏R-脊椎蛋白(RSPO)与LgR5的结合；(d)不显著破坏β-连环蛋白信号传导；(e)不显著破坏RSPO对LgR5信号传导的活化；(f)活化半胱天冬酶3裂解；(g)识别人LgR5与啮齿动物LgR5两者；(h)识别人LgR5而不识别啮齿动物LgR5；(i)在其未缀合形式下不显著抑制肿瘤生长；和(j)不诱导干细胞分化。在一些实施方案中，抗LgR5抗体为8E11及其人源化变体，如hu8E11.v2；YW353；2H6；和3G12。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5。在一些实施方案中，LgR5是选自人、石蟹猴、小鼠和大鼠LgR5。
(a)结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-555内的表位
确定抗LgR5抗体是否结合LgR5的表位的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，可通过在293细胞中表达N端和C端缺失的LgR5多肽并且如实施例I中所述通过FACS测试抗体与截短型多肽的结合来确定抗LgR5抗体与LgR5的表位(例如在SEQ ID NO:67的氨基酸22-555内)的结合。在一些实施方案中，相对于与293细胞中表达的全长LgR5的结合，抗体与截短型多肽的结合实质性减少(减少≥70％)或消除指示所述抗体不结合该截短型多肽。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5或石蟹猴LgR5。
在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的富含亮氨酸的N端结构域(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基25-66)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的一个或多个富含亮氨酸的重复序列(LRR)(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基67-446；LgR5的LRR 1-16)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 1(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基67-90)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 2(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基91-112)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 3(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基115-136)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 4(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基139-160)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 5(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基163-184)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 6(例如SEQID NO:67的氨基酸残基187-208)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 7(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基211-232)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 8(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基235-256)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 9(例如SEQ IDNO:67的氨基酸残基258-279)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 10(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基282-303)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 11(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基306-328)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 12(例如SEQID NO:67的氨基酸残基329-350)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 13(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基353-374)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 14(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基375-396)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 15(例如SEQID NO:67的氨基酸残基399-420)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含LgR5的LRR 16(例如SEQ ID NO:67的氨基酸残基423-446)。在一些实施方案中，LgR5的表位包含以下任一者：LRR1至LRR11、LRR2至LRR11、LRR3至LRR11、LLR1至LLR3、LLR2至LLR3、LLR2至LLR8、LLR3至LL7或LLR4至LLR6。
在一些实施方案中，LgR5的表位包含SEQ ID NO:67的氨基酸22-555内的表位。在一些实施方案中，LgR5的表位包含SEQ ID NO:67的氨基酸22-424内的表位。在一些实施方案中，LgR5的表位包含SEQ ID NO:67的氨基酸22-123内的表位。在一些实施方案中，LgR5的表位包含SEQ ID NO:67的氨基酸22-323内的表位。在一些实施方案中，LgR5的表位包含SEQ IDNO:67的氨基酸324-555内的表位。在一些实施方案中，LgR5的表位包含SEQ ID NO:67的氨基酸324-424内的表位。
应了解本文所述的方面和实施方案包括“由方面和实施方案组成”和/或“由方面和实施方案有效地组成”。
(b)结合LgR5的亲和力≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM，并且任选地≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM
测定结合亲和力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，结合亲和力可根据如本文在实施例E中所述的分析来测定。确切而言，在一些实施方案中，可利用-3000(BIAcore公司,Piscataway,NJ)，使用表面等离子体共振测定来测量Kd。可根据供应商的说明书用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化BIAcoreTM研究级CM5芯片。可使山羊抗人Fc IgG偶联于芯片以在各流动池中达到约10,000反应单位(RU)。可用1M乙醇胺阻断未反应的偶联基团。对于动力学测量，可捕获抗LGR5抗体以达到约300RU。可在25℃下以流速30μl/min注射人LgR5ECD(例如在杆状病毒系统中表达的融合于His-Fc的氨基酸22-557(或类似片段，如22-555)或由CHO细胞表达的融合于Fc的氨基酸22-558(或类似片段，如22-555)；125nM至0.49nM)于HBS-P缓冲液(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中的两倍连续稀释液。可使用1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreTM评估软件第3.2版)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)可计算为比率koff/kon。若通过以上表面等离子体共振测定测定的缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术来测定缔合速率，所述荧光淬灭技术测量在递增浓度的抗原存在下于PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃下的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在分光计(如配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色管的8000系列分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量。
在一些实施方案中，抗LgR5抗体结合LgR5的亲和力为约以下任一者：≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM。在一些实施方案中，抗LgR5抗体结合LgR5的亲和力为约≤5nM。在一些实施方案中，抗LgR5抗体结合LgR5的亲和力为约≤4nM。在一些实施方案中，抗LgR5抗体结合LgR5的亲和力为约≤3nM。在一些实施方案中，抗LgR5抗体结合LgR5的亲和力为约≤2nM。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5或石蟹猴LgR5。
如本领域技术人员所了解，提及“约”某一值或参数包括(并且描述)有关于该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
(c)不显著破坏R-脊椎蛋白(RSPO)与LgR5的结合
测定抗LgR5抗体破坏RSPO与LgR5的结合的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，可通过流式细胞术测定抗LgR5抗体显著破坏R-脊椎蛋白(RSPO)与LgR5的结合的能力。在一些实施方案中，例如可使表达LgR5的293细胞与荧光标记的RSPO(如RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)在存在和不存在抗LgR5抗体下相接触。可使用荧光活化细胞分选(FACS)来检测RSPO与293细胞的结合。在一些实施方案中，相对于在对照抗体存在下的RSPO结合，在抗LgR5抗体存在下RSPO结合的减少小于约25％指示抗LgR5抗体不显著破坏RSPO与LgR5的结合。
在一些实施方案中，可通过BIAcore测定测定抗LgR5抗体显著破坏R-脊椎蛋白(RSPO)与LgR5的结合的能力。在一些实施方案中，例如，可例如如本文所述使LgR5细胞外域固定在CM5芯片上，并且可在存在和不存在抗LgR5抗体下测定RSPO(如RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)与固定的LgR5的结合。在一些实施方案中，相对于在对照抗体存在下的RSPO结合，在抗LgR5抗体存在下RSPO结合的减少小于约25％指示抗LgR5抗体不显著破坏RSPO与LgR5的结合。
在一些实施方案中，RSPO选自RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。在一些实施方案中，抗体对结合的破坏小于约25％、小于约20％、小于约15％或小于约10％。在一些实施方案中，抗体不可检测地破坏RSPO与LgR5的结合。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5或石蟹猴LgR5。
(d)不显著破坏wnt/β-连环蛋白信号传导
测定抗LgR5抗体破坏wnt/β-连环蛋白信号传导的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，可使用报告基因测定测定抗LgR5抗体显著破坏wnt/β-连环蛋白信号传导的能力。在一些实施方案中，例如可将包含在wnt/β-连环蛋白反应性启动子(如包含多聚化TCF/LEF DNA结合位点的启动子)控制下的报告基因(如荧光素酶基因)的报告构建体转染至表达LgR5的细胞中。接着使细胞与Wnt配体(如Wnt3a)和RSPO(如RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)在存在和不存在抗LgR5抗体下接触，并且测量荧光素酶表达。在一些实施方案中，相对于在对照抗体存在下的荧光素酶表达，在抗体存在下荧光素酶表达的减少小于约25％指示抗LgR5抗体不显著破坏β-连环蛋白信号传导。
在一些实施方案中，抗体对β-连环蛋白信号传导的破坏小于约25％、小于约20％、小于约15％或小于约10％。在一些实施方案中，抗体不可检测地破坏β-连环蛋白信号传导。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5或石蟹猴LgR5。
(e)不显著破坏RSPO对LgR5信号传导的活化
测定抗LgR5抗体破坏RSPO对LgR5的活化的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，可使用报告基因分析测定抗LgR5抗体显著破坏RSPO对LgR5信号传导的活化的能力。在一些实施方案中，例如可将包含在β-连环蛋白反应性启动子(如包含多聚化TCF/LEF DNA结合位点的启动子)控制下的报告基因(如荧光素酶基因)的报告构建体转染至表达LgR5的细胞中。可接着使细胞与Wnt配体(如Wnt3a)在存在和不存在RSPO(如RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)下接触，并且LgR5信号传导的活化可测量为在RSPO存在下荧光素酶表达增加。还可在存在和不存在抗LgR5抗体下测量LgR5信号传导的活化。在一些实施方案中，相对于对照抗体，当使细胞与抗LgR5抗体接触时，LgR5信号传导在RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4存在下的活化的减少小于约25％指示抗LgR5抗体不显著破坏RSPO对LgR5信号传导的活化。
在一些实施方案中，RSPO是选自RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。在一些实施方案中，抗体对于RSPO对LgR5信号传导的活化的破坏小于约25％、小于约20％、小于约15％或小于约10％。在一些实施方案中，抗体不可检测地破坏RSPO对LgR5信号传导的活化。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5。在一些实施方案中，LgR5为人LgR5或石蟹猴LgR5。
(f)活化半胱天冬酶3裂解
测定抗LgR5抗体活化半胱天冬酶3裂解的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，可例如如实施例N中所述，在啮齿动物异种移植模型中测定抗LgR5抗体活化半胱天冬酶3裂解的能力。在一些实施方案中，可例如在自施用抗LgR5抗体的肠肿瘤形成模型小鼠收集的经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的小肠和结肠组织中测量与肿瘤面积有关的裂解的半胱天冬酶3的存在。在一些实施方案中，可使用免疫组织化学测定裂解的半胱天冬酶3的存在。此外，在一些实施方案中，半胱天冬酶3裂解可测定为阳性肿瘤面积百分比，例如如实施例N和图18中所示。
在一些实施方案中，根据实施例N中所述的测定，抗LgR5抗体使半胱天冬酶3阳性肿瘤面积的百分比增加约以下任一者：至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％(即阳性肿瘤面积的百分比加倍)。
(g)识别人LgR5与啮齿动物LgR5两者
测定抗LgR5抗体结合人和啮齿动物LgR5的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，使人和啮齿动物LgR5多肽在293细胞中表达并且通过FACS测试抗体与表达LgR5的293细胞的结合，如实施例G中所述。在一些实施方案中，啮齿动物LgR5为小鼠或大鼠LgR5。在一些实施方案中，啮齿动物LgR5为小鼠LgR5。
(h)识别人LgR5而不识别啮齿动物LgR5
测定抗LgR5抗体结合人LgR5而不结合啮齿动物LgR5的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，使人和啮齿动物LgR5多肽在293细胞中表达并且通过FACS测试抗体与表达LgR5的293细胞的结合，如实施例G中所述。在一些实施方案中，啮齿动物LgR5为小鼠或大鼠LgR5。在一些实施方案中，啮齿动物LgR5为小鼠LgR5。
(i)在其未缀合形式下不显著抑制肿瘤生长
测定抗LgR5抗体在其未缀合形式下抑制肿瘤生长的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，使用啮齿动物异种移植模型，如实施例M中所述的D5124胰腺癌异种移植模型。在一些实施方案中，例如如实施例L中所述，在LoVo结肠癌细胞系异种移植模型中，抗LgR5抗体在其未缀合形式下不显著抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，例如如实施例N中所述，在鼠肠肿瘤形成模型中，抗LgR5抗体在其未缀合形式下不显著抑制肿瘤生长。相对于媒介物对照或对照抗体来测定对异种移植模型或鼠肠肿瘤形成模型中的肿瘤生长的抑制作用。
在一些实施方案中，抗LgR5抗体在其未缀合形式下对肿瘤生长的抑制小于约25％、小于约20％、小于约15％或小于约10％。在一些实施方案中，抗LgR5抗体在其未缀合形式下不可检测地抑制肿瘤生长。
(j)不诱导干细胞分化
测定抗LgR5抗体诱导干细胞分化的能力的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，可通过在存在和不存在抗LgR5抗体下测定作为小肠中表达LgR5的快速循环干细胞的隐窝底部柱状细胞(CBC)分化成例如肠上皮细胞、杯状细胞和/或肠内分泌细胞的能力来分析干细胞分化。在一些实施方案中，若在抗LgR5抗体存在下CBC群体中约有少于25％、少于20％、少于15％或少于10％中的任一者在对照抗体也诱导CBC群体的少于约25％进行干细胞分化所处的条件下分化，则抗LgR5抗体被视为不诱导干细胞分化。
在一些实施方案中，抗LgR5抗体免疫缀合物通过不诱导干细胞分化的主要机制来抑制肿瘤生长。在一些这类实施方案中，抗LgR5抗体免疫缀合物通过经由免疫缀合物中缀合抗体的细胞毒性剂介导的细胞毒性活性来抑制肿瘤生长。
抗体8E11和其它实施方案
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗LgR5抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。
在一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:32的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:32的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3、含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3和含有氨基酸序列SEQID NO:31的HVR-H2。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:29的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的VH域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的VL域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:30的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。
在任何以上实施方案中，抗LgR5抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗LgR5抗体包含如任何以上实施方案中的HVR，并且进一步包含人接受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人接受体框架为人VLκIV共有(VLKIV)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，人接受体框架为人VLκIV共有(VLKIV)框架和/或VH框架VH1，其在重链框架区FR3中包含R71S突变和A78V突变。
在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含如任何以上实施方案中的HVR，并且进一步包含选自SEQ ID NO:40至43的重链框架FR3序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含如任何以上实施方案中的HVR，并且进一步包含重链框架FR3序列SEQ ID NO:41。在一些这类实施方案中，重链可变域框架为修饰的具有选自SEQ ID NO:40至43的FR3序列的人VH1框架。在一些这类实施方案中，重链可变域框架为修饰的具有FR3序列SEQ ID NO:41的人VH1框架。
在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含如任何以上实施方案中的HVR，并且进一步包含轻链框架FR3序列SEQ ID NO:36。在一些这类实施方案中，重链可变域框架为修饰的具有FR3序列SEQ ID NO:36的VLκIV共有(VLKIV)框架。
在另一方面，抗LgR5抗体包含与选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18和20的序列中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，选自SEQ IDNO:6、8、10、12、14、16、18和20的序列中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。
在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。
任选地，抗LgR5抗体包含选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18和20的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ IDNO:5、7、9、11、13、15、17和19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与选自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17和19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，选自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17和19的氨基酸序列中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，选自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17和19的氨基酸序列中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。
在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。在一些实施方案中，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。
任选地，抗LgR5抗体包含具有选自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17和19的氨基酸序列的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:5中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:7中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:11中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:13中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:15中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:17中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:19中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一方面，本发明提供一种与本文提供的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供一种与包含VH序列SEQ ID NO:8和VL序列SEQ ID NO:7的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:67中来自氨基酸22-323、在氨基酸22-323内或与氨基酸22-323重叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:68中来自氨基酸1-312、在氨基酸1-312内或与氨基酸1-312重叠的表位的抗体。
在本发明的另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗LgR5抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如IgG1抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同种型。
在另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体可并入单独或呈组合形式的如以下部分1-7中所述的任何特征。
抗体YW353和其它实施方案
在一方面，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗LgR5抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。
在一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:62的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:62的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3、含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3和含有氨基酸序列SEQID NO:61的HVR-H2。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:59的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的VH域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2，和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3；和(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的VL域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:60的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何以上实施方案中，抗LgR5抗体为人抗体。
在另一方面，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ IDNO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:26中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:26中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗LgR5抗体包含VH序列SEQ ID NO:26，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:25中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:25中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，抗LgR5抗体包含VL序列SEQID NO:25，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:59的HVR-L3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一方面，本发明提供一种与本文提供的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供一种与包含VH序列SEQ ID NO:26和VL序列SEQ ID NO:25的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:67中来自氨基酸22-123、在氨基酸22-123内或与氨基酸22-123重叠的表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:68中来自氨基酸1-102、在氨基酸1-102内或与氨基酸1-102重叠的表位的抗体。
在本发明的另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗LgR5抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如IgG2a抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同种型。
在另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体可并入单独或呈组合形式的如以下部分1-7中所述的任何特征。
抗体3G12和其它实施方案
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗LgR5抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。
在一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:50的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:50的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3、含有氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3和含有氨基酸序列SEQID NO:49的HVR-H2。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:47的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的VH域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的VL域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:48的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。
在任何以上实施方案中，抗LgR5抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗LgR5抗体包含如任何以上实施方案中的HVR，并且进一步包含人接受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人接受体框架为人VLκ共有(VLK)框架和/或人VH亚群3共有(VH3)框架。
在另一方面，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ IDNO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:22中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:22中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。
任选地，抗LgR5抗体包含VH序列SEQ ID NO:22，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:49的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:21中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:21中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。
任选地，抗LgR5抗体包含VL序列SEQ ID NO:21，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:46的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HVR-L3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:21中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一方面，本发明提供一种与本文提供的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供一种与包含VH序列SEQ ID NO:22和VL序列SEQ ID NO:21的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:67中来自氨基酸324-423、在氨基酸324-423内或与氨基酸324-423重叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:68中来自氨基酸303-402、在氨基酸303-402内或与氨基酸303-402重叠的表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种结合SEQID NO:67中来自氨基酸324-555、在氨基酸324-555内或与氨基酸324-555重叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:68中来自氨基酸303-534、在氨基酸303-534内或与氨基酸303-534重叠的表位的抗体。
在本发明的另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗LgR5抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如IgG1抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同种型。
在另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体可并入单独或呈组合形式的如以下部分1-7中所述的任何特征。
抗体2H6和其它实施方案
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗LgR5抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:56的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:56的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:56的HVR-H3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:56的HVR-H3、含有氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3和含有氨基酸序列SEQID NO:55的HVR-H2。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供一种包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的抗体：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ IDNO:53的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列的VH域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列的VL域：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1，(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含氨基酸序列SEQ IDNO:54的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在任何以上实施方案中，抗LgR5抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗LgR5抗体包含如任何以上实施方案中的HVR，并且进一步包含人接受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人接受体框架为人VLκ共有(VLK)框架和/或人VH亚群3(VH3)框架。
在另一方面，抗LgR5抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ IDNO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:24中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:24中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。
任选地，抗LgR5抗体包含VH序列SEQ ID NO:24，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:55的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的HVR-H3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗LgR5抗体保留结合LgR5的能力。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:23中总共1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO:23中总共1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。
任选地，抗LgR5抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:23的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在具体实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HVR-L3。
在另一方面，提供一种抗LgR5抗体，其中所述抗体包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:23中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一方面，本发明提供一种与本文提供的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供一种与包含VH序列SEQ ID NO:24和VL序列SEQ ID NO:23的抗LgR5抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:67中来自氨基酸324-423、在氨基酸324-423内或与氨基酸324-423重叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:68中来自氨基酸303-402、在氨基酸303-402内或与氨基酸303-402重叠的表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种结合SEQID NO:67中来自氨基酸324-555、在氨基酸324-555内或与氨基酸324-555重叠的表位的抗体。在一些实施方案中，提供一种结合SEQ ID NO:68中来自氨基酸303-534、在氨基酸303-534内或与氨基酸303-534重叠的表位的抗体。
在本发明的另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗LgR5抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如IgG1抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同种型。
在另一方面，根据任何以上实施方案的抗LgR5抗体可并入单独或呈组合形式的如以下部分1-7中所述的任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM，并且任选地≥10-13M。(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，通过用相关抗体的Fab型式及其抗原如由以下测定所述进行放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量Kd。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在一滴定系列的未标记抗原存在下使Fab与最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡，接着用抗Fab抗体涂布的培养板捕获所结合抗原来测量(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立测定条件，将多孔培养板(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)涂布过夜，并且随后在室温(约23℃)下用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS阻断2至5小时。在非吸附性培养板(Nunc，编号：269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与相关Fab的连续稀释液混合(例如符合Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评定)。接着将相关Fab孵育过夜；然而，孵育可持续较长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获培养板中以在室温下孵育(例如1小时)。接着去除溶液并且用含0.1％聚山梨醇酯20()的PBS将培养板洗涤八次。当培养板已干燥时，每孔添加150μl闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对培养板进行计数10分钟。选择各Fab的给出小于或等于最大结合的20％的浓度以用于竞争性结合测定。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定，使用-2000或-3000(BIAcore公司,Piscataway,NJ)，在25℃下用固定抗原CM5芯片以约10反应单位(RU)来测量Kd。简言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后在流速5μl/min下注射以获得约10反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/min的流速注射Fab于含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗缪尔结合模型(评估软件第3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感器图谱来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若通过以上表面等离子体共振测定测定的缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术来测定缔合速率，所述荧光淬灭技术测量在递增浓度的抗原存在下于PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃下的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在分光计(如配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色管的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段和下述其它片段。对于某些抗体片段的评述，参见Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的评述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并且活体内半衰期有所延长的Fab和F(ab')2片段的论述，参见美国专利号5,869,046。
双抗体为可具二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体和四功能抗体还描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单域抗体为包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体为人单域抗体(Domantis公司,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于如本文所述的蛋白水解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体例如描述于美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实施例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或子类相较于亲本抗体的类别或子类已发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中例如CDR的HVR(或其部分)源于非人抗体，并且FR(或其部分)源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如作为HVR残基的来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如评述于Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步例如描述于以下文献中：Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall'Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“定向选择”法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的框架区(参见例如Sims等,J.Immunol.151:2296(1993))；源于轻链或重链可变区的特定亚群的人抗体共同序列的框架区(参见例如Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和由筛选FR文库获得的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体为人抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术来产生。人抗体一般性地描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可通过向已经改良的转基因动物施用免疫原以响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体来制备人抗体。这类动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座置换内源性免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合于动物的染色体中。在这类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经被灭活。对于自转基因动物获得人抗体的方法的评述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和号6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870；和描述技术的美国专利申请公布号US2007/0061900。来自这类动物所产生的完整抗体的人可变区可例如通过与不同人恒定区组合而被进一步修饰。
人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有所描述。(参见例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker公司,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其它方法包括例如以下文献中所述的方法：美国专利号7,189,826(描述自杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)；和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)；以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列来产生人抗体。接着可将这类可变域序列与所需人恒定域组合。以下描述从抗体文库中选择人抗体的技术。
5.来源于文库的抗体
可通过筛选组合文库中具有一或多种所需活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，本领域已知多种用于产生噬菌体展示文库和筛选这类文库中具有所需结合特征的抗体的方法。这类方法例如评述于Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并且例如进一步描述于以下文献中：McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的谱系并且随机重组于噬菌体文库中，接着可筛选所述文库中的抗原结合噬菌体，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常展示呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自免疫过的来源的文库不需构建杂交瘤即可提供对免疫原具有高亲和力的抗体。或者，可克隆(例如自人克隆)天然谱系以在不进行任何免疫作用的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体的单一来源，如通过Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，还可通过以下方式合成性制备天然文库：自干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区并在体外实现重排，如通过Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
自人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一者是针对LgR5，而另一者是针对任何其它抗原。在某些实施方案中，结合特异性中的一者是针对LgR5，而另一者是针对CD3。参见例如美国专利号5,821,337。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合LgR5的两个不同表位。双特异性抗体还可用于使细胞毒性剂定位于表达LgR5的细胞。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)；WO 93/08829；和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))；和“杵入臼(knob-in-hole)”工程化(参见例如美国专利号5,731,168号)。多特异性抗体还可通过以下方式来制备：工程化静电牵引效应(electrostatic steering effect)以制备抗体Fc-杂二聚分子(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，如例如Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)中所述。
本文还包括具有三个或三个以上功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼状抗体(Octopus antibody)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用性FAb”或“DAF”，其包含结合LgR5以及另一不同抗原的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合性。
a)取代、插入和缺失型变体
在某些实施方案中，提供具有一或多处氨基酸取代的抗体变体。相关取代型诱变位点包括HVR和FR。保守性取代显示于表1中的标题“优选取代”下。更多实质性变化提供于表1中的标题“示例性取代”下，并且如以下关于氨基酸侧链类别进一步所述。可将氨基酸取代引入相关抗体中并且针对所需活性(例如保留/改进的抗原结合性、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)筛选产物。
表1
可根据共同侧链特性对氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要将这些类别中的一种的成员交换成另一种类别。
一种类型的取代型变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面将有所改变(例如改进)(例如亲和力增强、免疫原性降低)和/或将实质上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代型变体为亲和力成熟抗体，其宜例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变并且使变异抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可在HVR中进行改变(例如取代)例如以改进抗体亲和力。可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间以高频率发生突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行这类改变，并且测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并从其中进行再选择来实现亲和力成熟已例如描述于Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001)。)中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选用于成熟的可变基因中。接着产生二级文库。接着筛选所述文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR定向法，其中使若干HVR残基(例如每次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性鉴别涉及于抗原结合中的HVR残基。通常尤其靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要这类改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性取代)。这类改变可在HVR“热点”或SDR外部。在以上提供的变异VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变或含有至多一处、两处或三处氨基酸取代。
一种适用于鉴别抗体中可作为诱变的目标的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别某一残基或一组目标残基(例如带电荷残基，如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可作为取代候选者被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入物包括长度在一个残基至含有一百个或一百个以上残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合物，以及具有单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入型变体包括抗体的N端或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。向抗体中添加糖基化位点或使抗体糖基化位点缺失宜通过改变氨基酸序列以产生或移除一个或多个糖基化位点来完成。
当抗体包含Fc区时，可改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的原生抗体通常包含通常通过N-键连接于Fc区的CH2域的Asn297的支链双触角寡醣。参见例如Wright等,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡醣可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡醣结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明的抗体中的寡醣进行修饰以产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏连接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，岩藻糖在此抗体中的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如通过MALDI-TOF质谱所测量，通过相对于连接于Asn297的所有糖结构(例如复合甘露糖结构、混合甘露糖结构和高甘露糖结构)的总和计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中大约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297还可因抗体中的微小序列变异而位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。这类岩藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化作用的Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1(Presta,L)；和WO 2004/056312A1(Adams等)(尤其在实施例11处))和基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供具有等分寡醣的抗体变体，例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡醣被GlcNAc平分。这类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。这类抗体变体的实施例例如描述于WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684号(Umana等)；和US2005/0123546(Umana等)中。还提供在连接于Fc区的寡醣中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可具有改进的CDC功能。这类抗体变体例如描述于WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可将一或多处氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些而非所有效应子功能的抗体变体，借此使所述抗体变体成为许多应用的理想候选物，在所述应用中，抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(如补体和ADCC)则是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评定相关分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实施例描述于以下文献中：美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性测定方法，参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology公司,Mountain View,CA)；和非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。适用于这类测定的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者或另外，可例如在动物模型(如Clynes等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型)中于体内评定相关分子的ADCC活性。还可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评定补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能有所降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的抗体(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被丙氨酸取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述与FcR的结合得以改进或削弱的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一或多处改进ADCC的氨基酸取代(例如在Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)处的取代)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变以使得C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生改变(即改进或削弱)，例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
半衰期有所延长并且与新生儿Fc受体(FcRn)的结合得到改进的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)中，所述新生儿Fc受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含具有一或多处改进Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。这类Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有取代的变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826号)。
关于Fc区变体的其它实施例，还参见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而使反应性硫醇基定位在抗体的可及位点处并且可用于使抗体结缀合其它部分(如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施方案中，以下任何一个或多个残基可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述来产生半胱氨酸工程化抗体。
示例性hu8E11.v2轻链(LC)V205C thiomab的重链和轻链序列分别为SEQ ID NO:64和74。示例性hu8E11.v2重链(HC)A118C thiomab的重链和轻链序列分别为SEQ ID NO:75和63。示例性hu8E11.v2重链(HC)S400Cthiomab的重链和轻链序列分别为SEQ ID NO:76和63。
示例性YW353轻链(LC)V205C thiomab的重链和轻链序列分别为SEQID NO:66和77。示例性YW353重链(HC)A118C thiomab的重链和轻链序列分别为SEQ ID NO:78和65。示例性YW353重链(HC)S400C thiomab的重链和轻链序列分别为SEQ ID NO:79和65。
其它示例性V205C半胱氨酸工程化thiomab包含含有选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的可变区和SEQ ID NO:80的恒定区的轻链；和含有选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的可变区和人重链恒定区(如IgG1)的重链。其它示例性A118C半胱氨酸工程化thiomab包含含有选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的可变区和人轻链恒定区(如κ轻链恒定区)的轻链；和含有选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的可变区和SEQ ID NO:81的恒定区的重链。其它示例性S400C半胱氨酸工程化thiomab包含含有选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的可变区和人轻链恒定区(如κ轻链恒定区)的轻链；和含有选自SEQ IDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的可变区和SEQ ID NO:82的恒定区的重链。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文提供的抗体可被进一步修饰以含有本领域已知并且易于获得的其它非蛋白质部分。适于使抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中的稳定性而具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，并且可支化或未支化。连接于抗体的聚合物的数目可变化，并且若连接多于一个聚合物，则其可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括但不限于欲改进的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将在限定条件下用于疗法中等考虑因素进行确定。
在另一个实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射进行选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分为碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但会将非蛋白质部分加热至杀死抗体-非蛋白质部分邻近的细胞的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗体。在一个实施方案中，提供编码本文所述的抗LgR5抗体的分离的核酸。这种核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供一或多种包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供一种包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如经转化而具有)：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制备抗LgR5抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养如以上提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地自所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
为重组产生抗LgR5抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸并且将其插入一个或多个载体中以进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离此核酸并测序。
适用于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可在细菌中产生抗体，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达之后，可从可溶性部分中的细菌细胞糊状物中分离抗体并且可将其进一步纯化。
除原核生物之外，如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适用于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已被“人源化”，从而产生具有部分或完全人糖基化型态的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞还源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴别出众多可连同昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
还可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是适用的。适用哺乳动物宿主细胞系的其它实例为通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠赛尔托利细胞(sertoli cell)(如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人子宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它适用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的评述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.测定
可通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本文提供的抗LgR5抗体的物理/化学特性和/或生物活性。
在一方面，例如通过已知方法，如ELISA、FACS或蛋白质印迹(Western blot)来测试本发明的抗体的抗原结合活性。
在另一方面，可使用竞争测定来鉴别与本文所述的任何抗体竞争结合LgR5的抗体。在某些实施方案中，这种竞争抗体结合与本文所述的抗体所结合的表位相同的表位(例如线性或构象表位)。定位抗体所结合的表位的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”Methods inMolecular Biology,第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一示例性竞争测定中，在包含结合LgR5的第一经标记的抗体(例如本文所述的任何抗体)和第二未标记抗体(将测试其与所述第一抗体竞争结合LgR5的能力)的溶液中孵育固定的LgR5。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记的抗体而不含第二未标记抗体的溶液中孵育固定的LgR5。在容许第一抗体结合LgR5的条件下孵育之后，去除过量未结合抗体，并且测量与经固定的LgR5缔合的标记的量。若相对于对照样品，测试样品中与固定的LgR5缔合的标记的量实质上降低，则指示第二抗体与第一抗体竞争结合LgR5。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual,第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，其包含缀合一种或多种细胞毒性剂的本文抗LgR5抗体，所述一种或多种细胞毒性剂如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素；或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
免疫缀合物允许向肿瘤靶向递送药物部分，并且在一些实施方案中，允许药物部分在肿瘤中细胞内累积，其中全身性施用未缀合的药物可能会对正常细胞产生不可接受水平的毒性(Polakis P.(2005)Current Opinion inPharmacology 5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)是靶向化学治疗分子，其通过使有效细胞毒性药物靶向抗原表达肿瘤细胞(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets9:982-1004)，从而通过使功效达到最大并且使脱靶毒性降至最低来增强治疗指数(Carter,P.J.和Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)而组合抗体与细胞毒性药物两者的特性。
本发明的ADC化合物包括具有抗癌活性的化合物。在一些实施方案中，ADC化合物包括缀合(即共价连接)于药物部分的抗体。在一些实施方案中，抗体经由接头共价连接于药物部分。本发明的抗体-药物缀合物(ADC)将有效剂量的药物选择性递送至肿瘤组织，借此可获得较大选择性(即较低有效剂量)，同时增加治疗指数(“治疗窗”)。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物部分(D)可包括具有细胞毒性或细胞生长抑制作用的任何化合物、部分或基团。药物部分可通过包括但不限于以下的机制来赋予其细胞毒性和细胞生长抑制作用：微管蛋白结合、DNA结合或嵌入以及抑制RNA聚合酶、蛋白质合成和/或拓扑异构酶。示例性药物部分包括但不限于美登木素、多拉司他汀(dolastatin)、奥里斯他汀、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽环霉素(anthracycline)、倍癌霉素(duocarmycin)、长春花生物碱、紫杉烷(taxane)、单端孢毒素(trichothecene)、CC1065、喜树碱(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)及其具有细胞毒性活性的立体异构体、电子等排体、类似物和衍生物。以下进一步详细论述这类免疫缀合物的非限制性实例。
1.示例性抗体-药物缀合物
抗体-药物缀合物(ADC)化合物的示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)、药物部分(D)和使Ab连接于D的接头部分(L)。在一些实施方案中，抗体经由一个或多个氨基酸残基(如赖氨酸和/或半胱氨酸)连接于接头部分(L)。
示例性ADC具有式I：
Ab-(L-D)p   I
其中p为1至约20。在一些实施方案中，可缀合抗体的药物部分的数目受限于游离半胱氨酸残基的数目。在一些实施方案中，通过本文所述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。示例性式I的ADC包括但不限于具有1、2、3或4个工程化的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等,(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基在未使用工程化的情况下已存在于抗体中，在这种情况下，现存游离半胱氨酸残基可用于使抗体缀合药物。在一些实施方案中，在进行抗体缀合之前使抗体暴露于还原条件以产生一个或多个游离半胱氨酸残基。
a)示例性接头
“接头”(L)是可用于使一个或多个药物部分(D)连接于抗体(Ab)以形成式I的抗体-药物缀合物(ADC)的双官能或多官能部分。在一些实施方案中，可使用具有用于共价连接于药物和抗体的反应性官能团的接头制备抗体-药物缀合物(ADC)。例如，在一些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。
在一方面，接头具有能够与存在于抗体上的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团。非限制性示例性这类反应性官能团包括马来酰亚胺、卤乙酰胺、α-卤乙酰基、活化酯(如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯)、酸酐、酸氯化物、磺酰氯化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。参见例如在Klussman等,(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773的第766页处的缀合方法和本文中的实施例。
在一些实施方案中，接头具有能够与存在于抗体上的亲电子基团反应的官能团。示例性这类亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单元形成共价键。非限制性示例性这类反应性官能团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、胺苯硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
接头可包含一种或多种接头组分。示例性接头组分包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苯甲基氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)和4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(“MCC”)。各种接头组分在本领域是已知的，以下描述其中一些接头组分。
接头可以是有助于释放药物的“可裂解接头”。非限制性示例性可裂解接头包括酸不稳定性接头(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)接头、光不稳定性接头或含有二硫化物的接头(Chari等,Cancer Research52:127-131(1992)；US 5208020)。
在某些实施方案中，接头具有下式II：
-Aa-Ww-Yy-   II
其中A为“延伸子单元”，并且a为0至1的整数；W为“氨基酸单元”，并且w为0至12的整数；Y为“间隔子单元”，并且y为0、1或2。包含式II接头的ADC具有式I(A)：Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p，其中Ab、D和p是如上文对于式I所定义。这类接头的示例性实施方案描述于美国专利号7,498,298中，所述专利以引用的方式明确并入本文。
在一些实施方案中，接头组分包含使抗体连接于另一接头组分或药物部分的“延伸子单元”(A)。以下显示非限制性示例性延伸子单元(其中波形线指示与抗体、药物或其它接头组分共价连接的位点)：
在一些实施方案中，接头组分包含“氨基酸单元”(W)。在一些这类实施方案中，氨基酸单元允许接头由蛋白酶裂解，从而有助于在暴露于细胞内蛋白酶(如溶酶体酶)后从免疫缀合物释放药物(Doronina等,(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。氨基酸单元可被设计和优化用来由特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D，或纤维蛋白溶酶蛋白酶)进行酶促裂解。
通常，肽型接头可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这类肽键可例如根据液相合成法来制备(例如和K.Lübke,(1965)“The Peptides”,第1卷,第76-136页,Academic Press)。
在一些实施方案中，接头组分包含使抗体直接或经由延伸子单元和/或氨基酸单元连接于药物部分的“间隔子单元”(Y)。间隔子单元可为“自我牺牲型”或“非自我牺牲型”间隔子单元。“非自我牺牲型”间隔子单元是间隔子单元的一部分或全部在ADC裂解后仍结合药物部分的间隔子单元。非自我牺牲型间隔子单元的实例包括但不限于甘氨酸间隔子单元和甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。在一些实施方案中，由肿瘤细胞相关蛋白酶对含有甘氨酸-甘氨酸间隔子单元的ADC进行酶促裂解会使得甘氨酸-甘氨酸-药物部分从ADC的其余部分释放。在一些这类实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物部分在肿瘤细胞中经受水解步骤，由此从药物部分裂解甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。
“自我牺牲型”间隔子单元允许释放药物部分。在某些实施方案中，接头的间隔子单元包含对氨基苯甲基单元。在一些这类实施方案中，对氨基苯甲醇经由酰胺键连接于氨基酸单元，并且在苯甲醇与药物之间形成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等,(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些实施方案中，间隔子单元包含对氨基苯甲基氧基羰基(PAB)。在一些实施方案中，包含自我牺牲型接头的ADC具有以下结构：
其中Q为-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为0至4范围内的整数；X可以是一个或多个另外的间隔子单元或可不存在；并且p在1至约20的范围内。在一些实施方案中，p在1至10、1至7、1至5或1至4的范围内。非限制性示例性间隔子单元X包括：
其中R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1和R2各自为-CH3。
自我牺牲型间隔子的其它实例包括但不限于在电子学方面与PAB基团类似的芳族化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利号7,375,078；Hay等,(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻氨基苯甲基缩醛或对氨基苯甲基缩醛。在一些实施方案中，可使用在酰胺键水解后进行环化的间隔子，如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等,(1995)Chemistry Biology2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(Storm等,(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等,(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基的α-碳的键是可适用于ADC中的自我牺牲型间隔子的另一个实例(Kingsbury等,(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
在一些实施方案中，接头L可以是用于经由分支多官能接头部分使一个以上药物部分共价连接于抗体的树枝型接头(Sun等,(2002)Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等,(2003)Bioorganic &Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。树枝状接头可增加药物与抗体的摩尔比，即负载量，此与ADC的效能相关。因此，当抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基时，可经由树枝状接头连接许多药物部分。
以下显示在式I的ADC的背景下的非限制性示例性接头：
；其中R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1和R2各自为-CH3。
其中n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。
其它非限制性示例性ADC包括以下结构：
其中X为：
Y为：
各R独立地为H或C1-C6烷基；并且n为1至12。
在一些实施方案中，接头被调节溶解性和/或反应性的基团取代。作为非限制性实例，如磺酸酯基(-SO3 -)或铵的带电荷取代基可增加接头试剂的水溶性并且有助于接头试剂与抗体和/或药物部分的偶联反应，或有助于Ab-L(抗体-接头中间体)与D的偶联反应，或有助于D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于制备ADC的合成途径。在一些实施方案中，使接头的一部分偶联于抗体并且使接头的一部分偶联于药物，并且接着使Ab-(接头部分)a偶联于药物-(接头部分)b以形成式I的ADC。
本发明的化合物明确涵盖(但不限于)用以下接头试剂制备的ADC：双-马来酰亚氨基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-马来酰亚氨基丙基氧基)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-马来酰亚氨基己酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ-马来酰亚氨基丁酰基氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双-乙烯基砜(HBVS)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸)琥珀酰亚胺酯(LC-SMCC)、间马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚氨基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(SBAP)、碘乙酸琥珀酰亚胺酯(SIA)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(SIAB)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、6-[(β-马来酰亚氨基丙酰氨基)己酸]琥珀酰亚胺酯(SMPH)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，以及琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，并且包括双-马来酰亚胺试剂：二硫基双马来酰亚氨基乙烷(DTME)、1,4-双马来酰亚氨基丁烷(BMB)、1,4-双马来酰亚氨基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双马来酰亚氨基己烷(BMH)、双马来酰亚氨基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(以下所示)和BM(PEG)3(以下所示)；亚氨基酯的双官能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-亚乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些实施方案中，双-马来酰亚胺试剂允许抗体中的半胱氨酸的硫醇基连接于含硫醇的药物部分、接头或接头-药物中间体。与硫醇基具有反应性的其它官能团包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
某些适用的接头试剂可从各种商业来源获得，如Pierce Biotechnology公司(Rockford,IL)、Molecular Biosciences公司(Boulder,CO)，或可根据本领域；例如以下文献中所述的程序合成：Toki等,(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchik等,(1997)Tetrahedron Letters,38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frisch等,(1996)Bioconjugate Chem.7:180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO 04/032828。
碳-14标记的1-异硫氰酰基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种用于使放射性核苷酸缀合抗体的示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。
b)示例性药物部分
(1)美登素(Maytansine)和美登木素
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合一个或多个美登木素分子的抗体。美登木素为美登素的衍生物，并且为通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初是从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离(美国专利号3896111)。随后，发现某些微生物也产生美登木素，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成美登木素例如公开于美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中。
美登木素药物部分为抗体-药物缀合物中的有吸引力的药物部分，因为其：(i)相对容易通过发酵或化学修饰或衍生化发酵产物来制备得到，(ii)易受适用于经由非二硫化物接头缀合抗体的官能团衍生化，(iii)在血浆中稳定，并且(iv)对多种肿瘤细胞系有效。
适用作美登木素药物部分的某些美登木素在本领域是已知的并且可根据已知方法从天然来源分离或使用遗传工程化技术来产生(参见例如Yu等,(2002)PNAS 99:7968-7973)。美登木素还可根据已知方法合成制备。
示例性美登木素药物部分包括但不限于具有如以下的修饰芳环的美登木素药物部分：C-19-去氯(美国专利号4256746)(例如通过用氢化锂铝还原安丝菌素(ansamytocin)P2来制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利号4361650和4307016)(例如通过使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)进行去甲基化或使用LAH进行去氯来制备)；和C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利号4,294,757)(例如通过使用酰氯化物进行酰化来制备)，以及在芳环的其它位置处具有修饰的那些。
示例性美登木素药物部分还包括具有如以下的修饰的美登木素药物部分：C-9-SH(美国专利号4424219)(例如通过使美登醇与H2S或P2S5反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4450254)(例如由土壤丝菌(Nocardia)制备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(例如通过链霉菌使美登醇转化来制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4313946和4315929号)(例如自滑桃树(Trewianudlflora)分离)；C-18-N-去甲基(美国专利号4362663和4322348)(例如通过用链霉菌对美登醇进行去甲基化来制备)；和4,5-脱氧(US 4371533)(例如通过用三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。
美登木素化合物上的许多位置适用作键位置。例如，可通过使用常规偶联技术与羟基反应来形成酯键。在一些实施方案中，反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置处。在一些实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置处形成键。
美登木素药物部分包括具有以下结构的那些：
其中波形线指示美登木素药物部分的硫原子与ADC的接头的共价连接。各R可独立地为H或C1-C6烷基。使酰氨基连接于硫原子的亚烷基链可以是甲烷基、乙烷基或丙基，即m为1、2或3(US 633410；US 5208020；Chari等,(1992)Cancer Res.52:127-131；Liu等,(1996)Proc.Natl.Acad.SciUSA 93:8618-8623)。
美登木素药物部分的所有立体异构体都预期用于本发明的ADC，即在手性碳处R和S构型的任何组合(US 7276497；US 6913748；US 6441163；US 633410(RE39151)；US 5208020；Widdison等,(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408，其整体以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，美登木素药物部分具有以下立体化学：
美登木素药物部分的示例性实施方案包括但不限于具有以下结构的DM1；DM3；和DM4：
其中波形线指示药物的硫原子与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价连接。
其它示例性美登木素抗体-药物缀合物具有以下结构和缩写(其中Ab为抗体并且p为1至约20。在一些实施方案中，p为1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4)：
Ab-SPP-DM1
Ab-SMCC-DM1。
DM1经由BMPEO接头连接于抗体的硫醇基的示例性抗体-药物缀合物具有以下结构和缩写：
其中Ab为抗体；n为0、1或2；并且p为1至约20。在一些实施方案中，p为1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4。
含有美登木素的免疫缀合物、其制备方法及其治疗用途例如公开于美国专利号5,208,020和5,416,064；US 2005/0276812A1；和欧洲专利EP 0425235B1中，所述专利的公开内容以引用的方式明确并入本文。还参见Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)；和Chari等,Cancer Research52:127-131(1992)。
在一些实施方案中，抗体-美登木素缀合物可通过使抗体化学连接于美登木素分子而不显著削弱抗体或美登木素分子的生物活性来制备。参见例如美国专利号5,208,020(其公开内容以引用的方式明确并入本文)。在一些实施方案中，每个抗体分子结合有平均3-4个美登木素分子的ADC在增强对靶细胞的细胞毒性方面已显示出功效而不负面影响抗体的功能或溶解性。在一些情况下，甚至每个抗体分子一个毒素分子预期也会使细胞毒性增强超过使用裸抗体。
用于制备抗体-美登木素缀合物的示例性连接基团包括例如本文所述的那些和以下文献中所公开的那些：美国专利号5208020；欧洲专利0 425 235B1；Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；US 2005/0276812A1；和US 2005/016993A1，所述文献的公开内容以引用的方式明确并入本文。
(2)奥里斯他汀和多拉司他汀
药物部分包括多拉司他汀、奥里斯他汀及其类似物和衍生物(US5635483；US 5780588；US 5767237；US 6124431)。奥里斯他汀为海洋软件动物化合物多拉司他汀-10的衍生物。尽管不意欲受任何特定理论束缚，但多拉司他汀和奥里斯他汀已经显示会干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等,(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit等,(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。多拉司他汀/奥里斯他汀药物部分可经由肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端连接于抗体(WO 02/088172；Doronina等,(2003)Nature Biotechnology 21(7):778-784；Francisco等,(2003)Blood102(4):1458-1465)。
示例性奥里斯他汀实施方案包括US 7498298和US 7659241中公开的N端连接型单甲基奥里斯他汀药物部分DE和DF，所述专利的公开内容以全文引用的方式明确并入本文：
其中DE和DF的波形线指示与抗体或抗体-接头组分共价连接的位点，并且独立地在各位置处：
R2选自H和C1-C8烷基；
R3选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或R4与R5共同形成碳环并且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烷基和C3-C8碳环并且n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烷基；
R7选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
各R8独立地选自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
R9选自H和C1-C8烷基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O、S、NH或NR12，其中R12为C1-C8烷基；
R11选自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
m为1-1000范围内的整数；
R13为C2-C8烷基；
R14为H或C1-C8烷基；
R15在每次出现时都独立地为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
R16在每次出现时都独立地为H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；并且
n为0至6范围内的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立地为异丙基或仲丁基并且R5为-H或甲基。在示例性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，并且R7为仲丁基。
在另一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，并且R9为-H。
在另一个实施方案中，R8在每次出现时都为-OCH3。
在示例性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8在每次出现时都为-OCH3，并且R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在示例性实施方案中，R10为-苯基。
在示例性实施方案中，当Z为-O-时，R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，并且R16为-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
具有式DE的示例性奥里斯他汀实施方案为MMAE，其中波形线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价连接：
MMAE。
具有式DF的示例性奥里斯他汀实施方案为MMAF，其中波形线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价连接：
MMAF。
其它示例性实施方案包括在五肽奥里斯他汀药物部分的C端处具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽奥里斯他汀药物部分的C端处具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO2007/008603)。
包含MMAE或MMAF和各种接头组分的式I的ADC的非限制性示例性实施方案具有以下结构和缩写(其中“Ab”为抗体；p为1至约8，“Val-Cit”为缬氨酸-瓜氨酸二肽；并且“S”为硫原子)：
Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Ab-MC-MMAE
Ab-MC-MMAF。
包含MMAF和各种接头组分的式I的ADC的非限制性示例性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。包含经由不可蛋白水解裂解的接头连接于抗体的MMAF的免疫缀合物已经显示具有与包含经由可蛋白水解裂解的接头连接于抗体的MMAF的免疫缀合物相当的活性(Doronina等,(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124)。在一些这类实施方案中，相信通过抗体在细胞中的降解可实现药物释放。
通常，基于肽的药物部分可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这类肽键可例如根据液相合成法来制备(参见例如E.和K.Lübke,“The Peptides”,第1卷,第76-136页,1965,AcademicPress)。在一些实施方案中，奥里斯他汀/多拉司他汀药物部分可根据以下文献的方法制备：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit等,(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit等,(1998)Anti-Cancer Drug Design13:243-277；Pettit,G.R.等,Synthesis,1996,719-725；Pettit等,(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863；和Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。
在一些实施方案中，式DE的奥里斯他汀/多拉司他汀药物部分(如MMAE)和式DF的奥里斯他汀/多拉司他汀药物部分(如MMAF)及其药物-接头中间体和衍生物(如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF和MC-vc-PAB-MMAE)可使用以下文献中所述的方法来制备并且接着缀合相关抗体：US 7498298；Doronina等,(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124；和Doronina等,(2003)Nat.Biotech.21:778-784。
(3)卡奇霉素
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合一个或多个卡奇霉素分子的抗体。卡奇霉素家族的抗生素及其类似物能够在亚皮摩尔浓度下引起双链DNA断裂(Hinman等,(1993)Cancer Research 53:3336-3342；Lode等,(1998)Cancer Research 58:2925-2928)。卡奇霉素具有细胞内作用位点，但在某些情况下不易于跨越质膜。因此，在一些实施方案中，这类药剂经由抗体介导的内化实现的细胞摄取可极大增强其细胞毒性作用。制备具有卡奇霉素药物部分的抗体-药物缀合物的非限制性示例性方法例如描述于US 5712374；US5714586；US 5739116；和US 5767285中。
(4)吡咯并苯并二氮杂卓
在一些实施方案中，ADC包含吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。在一些实施方案中，PDB二聚体识别并且结合特定DNA序列。天然产物安曲霉素(anthramycin)(一种PBD)最初在1965年得到报道(Leimgruber等,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795；Leimgruber等,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。从此，许多天然存在的PBD和PBD类似物已得到报道(Thurston等,(1994)Chem.Rev.1994,433-465)，包括三环PBD骨架的二聚体(US 6884799；US 7049311；US 7067511；US 7265105；US 7511032；US7528126；US 7557099)。在不意欲受任何特定理论束缚下，相信二聚体结构会赋予适当的三维形状以与B型DNA的小沟具有等螺旋性(isohelicity)，从而在结合位点处引起适贴配合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,NewYork,第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19:230-237)。携带C2芳基取代基的二聚PBD化合物已经显示适用作细胞毒性剂(Hartley等,(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard等,(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters 19(22):6463-6466)。
已使PBD二聚体缀合抗体并且所得ADC显示具有抗癌特性。PBD二聚体上的非限制性示例性键位点包括五元吡咯并环、PBD单元之间的系链和N10-C11亚胺基团(WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598)。
ADC的非限制性示例性PBD二聚体组分具有式A：
以及其盐和溶剂合物，其中：
波形线指示与接头共价连接的位点；
点线指示任选地在C1与C2或C2与C3之间存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且任选地进一步选自卤基或二卤基，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤基；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；
Q独立地选自O、S和NH；
R11为H或R，或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R'各自独立地选自任选取代的C1-8烷基、C1-12烷基、C3-8杂环基、C3-20杂环和C5-20芳基，并且任选地对于基团NRR'，R和R'连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的4元、5元、6元或7元杂环；
R12、R16、R19和R17分别是如对于R2、R6、R9和R7所定义；
R"为C3-12亚烷基，该链可间杂有一个或多个杂原子(例如O、S、N(H)、NMe)和/或芳环(例如苯或吡啶)，所述环是任选取代的；并且
X和X'独立地选自O、S和N(H)。
在一些实施方案中，R和R'各自独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环和C5-20芳基，并且任选地对于基团NRR'，R和R'连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的4元、5元、6元或7元杂环。
在一些实施方案中，R9和R19为H。
在一些实施方案中，R6和R16为H。
在一些实施方案中，R7和R17均为OR7A，其中R7A为任选取代的C1-4烷基。在一些实施方案中，R7A为Me。在一些实施方案中，R7A为Ch2Ph，其中Ph为苯基。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，R11为H。
在一些实施方案中，在各单体单元中的C2与C3之间存在双键。
在一些实施方案中，R2和R12独立地选自H和R。在一些实施方案中，R2和R12独立地为R。在一些实施方案中，R2和R12独立地为任选取代的C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些实施方案中，R2和R12独立地为任选取代的苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。在一些实施方案中，R2和R12独立地选自＝O、＝CH2、＝CH-RD和＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝CH2。在一些实施方案中，R2和R12各自为H。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝O。在一些实施方案中，R2和R12各自为＝CF2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立地为＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2和/或R12独立地为＝CH-RD。
在一些实施方案中，当R2和/或R12为＝CH-RD时，各基团可独立地具有以下所示的任一构型：
在一些实施方案中，＝CH-RD是呈构型(I)。
在一些实施方案中，R"为C3亚烷基或C5亚烷基。
在一些实施方案中，ADC的示例性PBD二聚体组分具有式A(I)的结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的示例性PBD二聚体组分具有式A(II)的结构：
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的示例性PBD二聚体组分具有式A(III)的结构：
其中RE和RE″各自独立地选自H或RD，其中RD是如上所定义；并且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，RE和/或RE"为H。在一些实施方案中，RE和RE"为H。在一些实施方案中，RE和/或RE"为RD，其中RD为任选取代的C1-12烷基。在一些实施方案中，RE和/或RE"为RD，其中RD为甲基。
一些实施方案中，ADC的示例性PBD二聚体组分具有式A(IV)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1与Ar2可相同或不同；并且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC的示例性PBD二聚体组分具有式A(V)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基；其中Ar1与Ar2可相同或不同；并且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地选自任选取代的苯基、呋喃基、噻吩基和吡啶基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的苯基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可经由任何可用环位置结合PBD核心。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基和喹啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可以是异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。在一些实施方案中，异喹啉基选自异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。
ADC的另外非限制性示例性PBD二聚体组分具有式B：
以及其盐和溶剂合物，其中：
波形线指示与接头共价连接的位点；
连接于OH的波形线指示S或R构型；
RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基(所述苯基可任选地被氟基取代，具体是在4位上被取代)和C5-6杂环基；其中RV1与RV2可相同或不同；并且
n为0或1。
在一些实施方案中，RV1和RV2独立地选自H、苯基和4-氟苯基。
在一些实施方案中，接头可连接在PBD二聚体药物部分的各个位点中的一个位点上，包括B环的N10亚胺、C环的C-2内向/外向位或连接A环的系链单元(参见以下结构C(I)和C(II))。
ADC的非限制性示例性PBD二聚体组分包括式C(I)和C(II)：
式C(I)和C(II)以其N10-C11亚胺形式显示。示例性PBD药物部分还包括甲醇胺以及受保护的甲醇胺形式，如下表中所示：
其中：
X为CH2(n＝1至5)、N或O；
Z和Z'独立地选自OR和NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烷基链；
R1、R'1、R2和R'2各自独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括取代的芳基)、C5-20杂芳基、-NH2、-NHMe、-OH和-SH，其中，在一些实施方案中，烷基、烯基和炔基链包含多达5个碳原子；
R3和R'3独立地选自H、OR、NHR和NR2，其中R为含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烷基链；
R4和R'4独立地选自H、Me和OMe；
R5选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括被卤基、硝基、氰基、烷氧基、烷基、杂环基取代的芳基)和C5-20杂芳基，其中，在一些实施方案中，烷基、烯基和炔基链包含多达5个碳原子；
R11为H、C1-C8烷基或保护基(如乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)、9-茐基亚甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自我牺牲性单元的部分，如缬氨酸-瓜氨酸-PAB)；
R12为H、C1-C8烷基或保护基；
其中R1、R'1、R2、R'2、R5或R12中之一的氢或A环之间的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-间隔子的氢被连接于ADC的接头的键置换。
ADC的示例性PDB二聚体部分包括但不限于(波形线指示与接头共价连接的位点)：
二聚体；
包含PBD二聚体的ADC的非限制性示例性实施方案具有以下结构：
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab；
PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab，其中：
n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。在一些实施方案中，n选自4、5、6、7和8。
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab和PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab的接头可为蛋白酶所裂解，而PBD二聚体-马来酰亚胺-缩醛的接头具有酸不稳定性。
PBD二聚体和包含PBD二聚体的ADC可根据本领域已知的方法来制备。参见例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598。
(5)蒽环霉素
在一些实施方案中，ADC包含蒽环霉素。蒽环霉素是展现细胞毒性活性的抗生素化合物。尽管不意欲受任何特定理论束缚，但研究已指示蒽环霉素可通过许多不同机制起作用来杀死细胞，所述机制包括：1)药物分子嵌入细胞的DNA中，由此抑制DNA依赖性核酸合成；2)通过药物产生自由基，所述自由基接着与细胞大分子反应以对细胞造成损害，和/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如C.Peterson等,“Transport And Storage OfAnthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia”,Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R.Bachur,“Free Radical Damage”(同上),在第97-102页)。由于蒽环霉素的细胞毒性潜力，它们已用于治疗众多癌症，如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌和肉瘤(参见例如P.H-Wiernik,Anthracycline: Current Status And New Developments,第11页)。
非限制性示例性蒽环霉素包括阿霉素、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、柔红霉素(daunomycin)、奈莫柔比星及其衍生物。已制备并研究了道诺霉素和阿霉素的免疫缀合物和前药(Kratz等,(2006)Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey等,(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362；Torgov等,(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy等,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834；Dubowchik等,(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532；King等,(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；EP0328147；US 6630579)。抗体-药物缀合物BR96-阿霉素与肿瘤相关抗原Lewis-Y特异性反应并且已在I期和II期研究中进行评估(Saleh等,(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292；Ajani等,(2000)Cancer Jour.6:78-81；Tolcher等,(1999)J.Clin.Oncology 17:478-484)。
PNU-159682为奈莫柔比星的一种有效代谢物(或衍生物)(Quintieri等,(2005)Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617)。奈莫柔比星为阿霉素的一种在阿霉素的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基的半合成类似物并且已处于临床评估中(Grandi等,(1990)Cancer Treat.Rev.17:133；Ripamonti等,(1992)Brit.J.Cancer 65:703)，包括针对肝细胞癌的II/III期试验(Sun等,(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22,Abs1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research,44:第1版,Abs 4649；Pacciarini等,(2006)Jour.Clin.Oncology 24:14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的非限制性示例性ADC显示于式Ia中：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基并且R2为C1-C5烷氧基；或其药学上可接受的盐；
L1和Z一起为如本文所述的接头(L)；
T为如本文所述的抗体(Ab)；并且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些实施方案中，R1和R2均为甲氧基(-OMe)。
另一包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的非限制性示例性ADC显示于式Ib中：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基并且R2为C1-C5烷氧基；或其药学上可接受的盐；
L2和Z一起为如本文所述的接头(L)；
T为如本文所述的抗体(Ab)；并且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些实施方案中，R1和R2均为甲氧基(-OMe)。
在一些实施方案中，含奈莫柔比星ADC的奈莫柔比星组分为PNU-159682。在一些这类实施方案中，ADC的药物部分可具有以下结构中的一种：
其中波形线指示与接头(L)的连接。
包括PNU-159682的蒽环霉素可经由若干键位点和包括本文所述的接头的多种接头(US 2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO2010/009124)缀合抗体。
包含奈莫柔比星和接头的示例性ADC包括但不限于：
PNU-159682-马来酰亚胺缩醛-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子-Ab；
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子(R1R2)-Ab，其中：
R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基；以及
PNU-159682-马来酰亚胺-Ab。
PNU-159682-马来酰亚胺缩醛-Ab的接头具有酸不稳定性，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab、PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子-Ab和PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子(R1R2)-Ab的接头可为蛋白酶所裂解。
(6)其它药物部分
药物部分还包括格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等,(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等,(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等,(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)；和酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A链、相思豆毒素(abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、石竹素(dianthin)蛋白质、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和霉菌毒素(tricothecenes)。参见例如WO 93/21232。
药物部分还包括具有核分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶)。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在一些实施方案中，当使用免疫缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如Tc99或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(还称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂络合并且缀合抗体例如以用于PET成像(WO 2011/056983)。
放射性标记或其它标记可以已知方式并入免疫缀合物中。例如，肽可被生物合成或使用包含例如一个或多个氟-19原子以替代一个或多个氢的适合氨基酸前体进行化学合成。在一些实施方案中，如Tc99、I123、Re186、Re188和In111的标记可经由抗体中的半胱氨酸残基来连接。在一些实施方案中，钇-90可经由抗体的赖氨酸残基来连接。在一些实施方案中，可使用IODOGEN法(Fraker等,(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)并入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)描述某些其它方法。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含缀合前药活化酶的抗体。在一些这类实施方案中，前药活化酶将前药(例如肽基化学治疗剂，参见WO81/01145)转化成活性药物，如抗癌药物。在一些实施方案中，这类免疫缀合物适用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)。可缀合抗体的酶包括但不限于碱性磷酸酶，其适用于将含磷酸酯前药转化成游离药物；芳基硫酸酯酶，其适用于将含硫酸酯前药转化成游离药物；胞嘧啶脱氨酶，其适用于将无毒5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)，其适用于将含肽前药转化成游离药物；D-丙氨酰基羧基肽酶，其适用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其适用于将糖基化前药转化成游离药物；β-内酰胺酶，其适用于将经β-内酰胺衍生化的药物转化成游离药物；和青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其适用于将在胺氮处分别经苯氧乙酰基或苯基乙酰基衍生化的药物转化成游离药物。在一些实施方案中，可通过本领域熟知的重组DNA技术使酶共价结合抗体。参见例如Neuberger等,Nature 312:604-608(1984)。
c)药物负载量
药物负载量由p表示，即式I分子中每抗体药物部分的平均数目。药物负载量可在每个抗体1至20个药物部分(D)的范围内。式I的ADC包括缀合有一定范围(1至20个)的药物部分的抗体的集合。由缀合反应获得的ADC制备物中每抗体药物部分的平均数目可通过如质谱、ELISA测定和HPLC的常规方式来表征。还可测定用p表示的ADC的定量分布。在一些情况下，可通过如反相HPLC或电泳的方式从具有其它药物负载量的ADC分离、纯化和表征p为某一值的均质ADC。
对于一些抗体-药物缀合物，p可受限于抗体上连接位点的数目。例如，当连接物是如以上某些示例性实施方案中的半胱氨酸硫醇时，抗体可仅具有一个或具有若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或具有若干个可借以连接接头的具有足够反应性的硫醇基。在某些实施方案中，较高药物负载量(例如p>5)可导致某些抗体-药物缀合物聚集、不溶、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施方案中，ADC的平均药物负载量在1至约8；约2至约6；或约3至约5的范围内。实际上，已显示对于某些ADC，最佳药物部分/抗体比率可小于8，并且可以为约2至约5(US 7498298)。
在某些实施方案中，使少于理论最大值的药物部分在缀合反应期间缀合抗体。抗体可含有例如不与药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基，如下文所论述。一般而言，抗体并非含有许多可连接于药物部分的游离和反应性半胱氨酸硫醇基；实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥键形式存在。在某些实施方案中，可用如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂，在部分或完全还原条件下还原抗体，以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，使抗体经受变性条件以暴露反应性亲核基团，如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载量(药物/抗体比率)可以不同方式进行控制，并且例如通过以下来控制：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)部分或完全限制用于半胱氨酸硫醇修饰的还原性条件。
应了解当一个以上亲核基团与药物-接头中间体或接头试剂反应时，则所得产物为分布有一个或多个连接于抗体的药物部分的ADC化合物的混合物。每抗体药物的平均数目可通过对抗体具有特异性并且对药物具有特异性的双重ELISA抗体测定从混合物计算。可通过质谱鉴别混合物中的个别ADC分子并且通过HPLC(例如疏水性相互作用色谱法)分离(参见例如McDonagh等,(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblett等,(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.等,“Effect of drugloading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30antibody-drug conjugate”,摘要第624号,American Association for CancerResearch,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月；Alley,S.C.等,“Controlling the location of drug attachmentin antibody-drug conjugates”,摘要第627号,American Association for CancerResearch,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月)。在某些实施方案中，具有单一负载量值的均质ADC可通过电泳或色谱法从缀合混合物中分离。
d)某些制备免疫缀合物的方法
式I的ADC可采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，通过多种途径制备，包括：(1)使抗体的亲核基团与二价接头试剂反应以经由共价键形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)使药物部分的亲核基团与二价接头试剂反应以经由共价键形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。用于经由后一途径制备式I的ADC的示例性方法描述于US 7498298中，所述专利以引用的方式明确并入本文。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N端氨基，(ii)侧链氨基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基(在抗体经糖基化的情况下)。氨基、硫醇基和羟基具有亲核性并且能够与包括以下的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，如卤乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚氨基团。某些抗体具有可还原链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂处理以使抗体完全或部分还原来使抗体具有与接头试剂缀合的反应性。各半胱氨酸桥因此将在理论上形成两个反应性硫醇亲核体。其它亲核基团可经由例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特氏试剂(Traut'sreagent))反应，从而使得胺转化成硫醇以修饰赖氨酸残基而引入抗体中。反应性硫醇基还可通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基来引入抗体中(例如通过制备包含一个或多个非原生半胱氨酸氨基酸残基的变异抗体来实现)。
本发明的抗体-药物缀合物还可通过抗体上的亲电子基团(如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来产生。接头试剂上的适用亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、胺苯硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。在一个实施方案中，抗体被修饰以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。在另一个实施方案中，糖基化抗体的糖可例如用过碘酸盐氧化试剂氧化以形成可与接头试剂或药物部分的氨基反应的醛基或酮基。所得亚胺希夫碱(Schiff base)基团可形成稳定键，或可例如通过硼氢化物试剂还原以形成稳定胺键。在一个实施方案中，使糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠反应可在抗体中产生可与药物上的适当基团反应的羰基(醛和酮)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，可使含有N端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体与偏高碘酸钠反应，从而产生醛代替第一氨基酸(Geoghegan和Stroh,(1992)BioconjugateChem.3:138-146；US 5362852)。可使这种醛与药物部分或接头亲核体反应。
药物部分上的示例性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、胺苯硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，其能够与包括以下的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚氨基团。
可用于制备ADC的非限制性示例性交叉接头试剂在本文中描述于标题为“示例性接头”的部分中。使用这类交叉接头试剂来连接两个部分(包括蛋白质部分和化学部分)的方法在本领域是已知的。在一些实施方案中，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。重组DNA分子可包含编码缀合物的抗体和细胞毒性部分的区域，所述区域彼此邻近或由编码不破坏缀合物的所需特性的接头肽的区域分开。
在又一个实施方案中，抗体可缀合“受体”(如抗生蛋白链菌素)以在肿瘤预靶向中利用，其中向患者施用抗体-受体缀合物，随后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物并且接着施用缀合细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗LgR5抗体都适用于检测LgR5在生物样品中的存在。如本文所使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物样品”包含例如细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性结肠、结肠直肠、小肠、子宫内膜、胰腺或卵巢组织)。
在一个实施方案中，提供一种用于诊断或检测方法的抗LgR5抗体。在另一方面，提供一种检测LgR5在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使生物样品与如本文所述的抗LgR5抗体在容许所述抗LgR5抗体结合LgR5的条件下接触，以及检测在所述抗LgR5抗体与所述生物样品中的LgR5之间是否形成复合物。此方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，例如在LgR5为用于选择患者的生物标记的情况下，使用抗LgR5抗体选择适合于用抗LgR5抗体进行的疗法的受试者。在另一个实施方案中，生物样品为细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性结肠、结肠直肠、小肠、子宫内膜、胰腺或卵巢组织)。
在另一个实施方案中，例如出于对癌症进行诊断、预测或分级；确定适当疗程；或监测癌症对疗法的反应的目的，在体内使用抗LgR5抗体例如通过体内成像来检测受试者的LgR5阳性癌症。本领域已知的一种用于体内检测的方法为免疫正电子发射断层摄影术(免疫PET)，如例如van Dongen等,The Oncologist 12:1379-1389(2007)和Verel等,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)中所述。在这类实施方案中，提供一种用于检测受试者的LgR5阳性癌症的方法，所述方法包括向患有或疑似患有LgR5阳性癌症的受试者施用标记的抗LgR5抗体，以及检测所述受试者体内的所述标记的抗LgR5抗体，其中检测到所述标记的抗LgR5抗体指示在所述受试者体内存在LgR5阳性癌症。在某些这类实施方案中，所述标记的抗LgR5抗体包含缀合如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr和124I的正电子发射体的抗LgR5抗体。在具体实施方案中，正电子发射体为89Zr。
在其它实施方案中，一种诊断或检测方法包括使固定于基质的第一抗LgR5抗体与欲测试LgR5的存在的生物样品接触，使所述基质暴露于第二抗LgR5抗体，以及检测所述第二抗LgR5是否结合所述第一抗LgR5抗体与所述生物样品中的LgR5之间的复合物。基质可以是任何支撑性介质，例如玻璃、金属、陶瓷、聚合珠粒、载片、芯片和其它基质。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性结肠、结肠直肠、小肠、子宫内膜、胰腺或卵巢组织)。在某些实施方案中，第一或第二抗LgR5抗体为本文所述的任何抗体。在一些这类实施方案中，第二抗LgR5抗体可以是例如如本文所述的8E11或源于8E11的抗体。在一些这类实施方案中，第二抗LgR5抗体可以是例如如本文所述的YW353或源于YW353的抗体。在一些实施方案中，第一或第二抗LgR5抗体选自例如如本文所述的3G12和2H6和源于3G12和/或2H6的抗体。
可根据以上任何实施方案诊断或检测的示例性病症包括LgR5阳性癌症，如LgR5阳性结肠直肠癌(包括腺癌)、LgR5阳性小肠癌(包括腺癌、肉瘤(例如平滑肌肉瘤)、类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤和淋巴瘤)、LgR5阳性卵巢癌(包括卵巢浆液性腺癌)、LgR5阳性胰腺癌(包括胰腺导管腺癌)和LgR5阳性子宫内膜癌。在一些实施方案中，LgR5阳性癌症为所得到的抗LgR5免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)计分大于“0”的癌症，计分大于0对应于在本文于实施例B中所述的条件下，在>90％的肿瘤细胞中染色极弱或无染色。在另一个实施方案中，LgR5阳性癌症以如本文于实施例B中所述的条件下所定义的1+级、2+级或3+级表达LgR5。在一些实施方案中，LgR5阳性癌症为根据检测LgR5mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定确定表达LgR5的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
在某些实施方案中，提供标记的抗LgR5抗体。标记包括但不限于可直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色标记、电子密集标记、化学发光标记和放射性标记)以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，如稀土金属螯合物或荧光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹酰基；伞形酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456号)；荧光素；2,3-二氢酞嗪二酮；辣根过氧化酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋标记；噬菌体标记；稳定自由基等等。在另一个实施方案中，标记为正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr和124I。在具体实施方案中，正电子发射体为89Zr。
F.药物制剂
如本文所述的抗LgR5抗体或免疫缀合物的药物制剂是通过混合具有所需纯度的此抗体或免疫缀合物与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980))而制备成冻干制剂或水溶液形式。药学上可接受的载体通常在所使用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、二醣和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International公司)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，sHASEGP与一种或多种其它葡糖胺聚糖酶，如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体或免疫缀合物制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体或免疫缀合物制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后者制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文的制剂还可含有一种以上如为所治疗的特定适应症所必需的活性成分，优选为具有不会对彼此产生不利影响的补充活性的活性成分。例如，在一些情况下，可能需要进一步提供(贝伐单抗)以例如治疗LgR5阳性癌症，如LgR5阳性结肠癌或LgR5阳性结肠直肠癌。
可例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分截留于所制备的微胶囊中，例如分别在胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或于巨乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微胶囊形式。
欲用于体内给药的制剂通常是无菌的。无菌可易于例如通过经无菌过滤膜过滤来实现。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗LgR5抗体或免疫缀合物都可用于例如治疗方法的方法中。
在一方面，本文提供的抗LgR5抗体或免疫缀合物是用于一种抑制LgR5阳性细胞增殖的方法，所述方法包括在容许所述抗LgR5抗体或免疫缀合物结合所述细胞的表面上的LgR5的条件下使所述细胞暴露于所述抗LgR5抗体或免疫缀合物，由此抑制所述细胞的增殖。在某些实施方案中，所述方法为体外或体内方法。在其它实施方案中，细胞为结肠、结肠直肠、小肠、卵巢、胰腺或子宫内膜细胞。
在一些实施方案中，本文提供的抗LgR5抗体或免疫缀合物是用于一种治疗癌症的方法，所述癌症在至少一部分癌细胞中包含Kras基因突变和/或腺瘤性结肠息肉(APC)基因突变。在各种实施方案中，癌症选自结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、卵巢癌、胰腺癌和子宫内膜癌。在一些实施方案中，本文提供的抗LgR5抗体或免疫缀合物是用于一种治疗结肠癌或结肠直肠癌的方法，所述结肠癌或结肠直肠癌在至少一部分癌细胞中包含Kras基因突变和/或APC基因突变。存在于癌症(包括结肠癌和结肠直肠癌)中的非限制性示例性Kras突变包括Kras密码子12处的突变(例如G12D、G12V、G12R、G12C、G12S和G12A)、密码子13处的突变(例如G13D和G13C)、密码子61处的突变(例如G61H、G61L、G61E和G61K)和密码子146处的突变。参见例如Yokota,Anticancer Agents Med.Chem.,12:163-171(2012)；Wicki等,Swiss Med.Wkly,140:w13112(2010)。存在于癌症中的非限制性示例性APC突变包括突变密集区(MCR)中的突变，如终止密码子和移码突变，其会产生截短型APC基因产物。参见例如Chandra等,PLoS One,7:e34479(2012)；和Kohler等,Hum.Mol.Genet.,17:1978-1987(2008)。
在一些实施方案中，一种治疗癌症的方法包括向受试者施用抗LgR5抗体或免疫缀合物，其中所述受试者患有在至少一部分癌细胞中包含Kras突变和/或APC突变的癌症。在一些实施方案中，癌症选自结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、卵巢癌、胰腺癌和子宫内膜癌。在一些实施方案中，癌症为结肠癌和/或结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述受试者先前已经确定患有在至少一部分癌细胞中包含Kras突变和/或APC突变的癌症。在一些实施方案中，癌症为LgR5阳性癌症。
可通过许多方法分析各种生物标记在样品中的存在，其中许多方法在本领域是已知的并且为熟练技术人员所了解，所述方法包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、ELISA、ELIFA、荧光活化细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、基于血液的定量测定(例如像血清ELISA)、生物化学酶活性测定、原位杂交、DNA分析、RNA分析、全基因组测序、聚合酶链反应(“PCR”)(包括定量实时PCR(“qRT-PCR”))和其它扩增型检测方法(如分支DNA、SISBA、TMA等等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达谱分析和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的广泛多种分析中的任一种。用于评估基因和基因产物状态的典型方案例如见于Ausubel等编,1995,Current Protocols In Molecular Biology,第2单元(RNA印迹法)、第4单元(DNA印迹法)、第15单元(免疫印迹法)和第18单元(PCR分析)中。还可使用多重免疫测定，如可自Rules Based Medicine或Meso ScaleDiscovery(“MSD”)获得的免疫测定。
可使用可自Promega(Madison,WI)商购的CellTiter-GloTM发光细胞活力测定来测定在体外对细胞增殖的抑制作用。该测定基于对存在的ATP进行定量来测定培养物中的活细胞数，ATP为具有代谢活性的细胞的指示物。参见Crouch等,(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；美国专利号6602677。测定可以96孔或384孔形式进行，从而使得可进行自动高通量筛选(HTS)。参见Cree等,(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。测定程序涉及向培养细胞中直接添加单一试剂(试剂)。这会导致细胞溶解并产生通过荧光素酶反应所产生的发光信号。发光信号与存在的ATP的量成比例，存在的ATP的量与培养物中存在的活细胞数成正比。数据可由亮度计或CCD摄影机成像装置记录。发光输出值表示为相对光单位(RLU)。
在另一方面，提供一种用作药物的抗LgR5抗体或免疫缀合物。在其它方面，提供一种用于治疗方法的抗LgR5抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，提供一种用于治疗LgR5阳性癌症的抗LgR5抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有LgR5阳性癌症的个体的方法的抗LgR5抗体或免疫缀合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述抗LgR5抗体或免疫缀合物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
在另一方面，本发明提供抗LgR5抗体或免疫缀合物用于制造或制备药物的用途。在一个实施方案中，所述药物是用于治疗LgR5阳性癌症。在另一个实施方案中，所述药物是用于治疗LgR5阳性癌症的方法，所述方法包括向患有LgR5阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗LgR5阳性癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有这种LgR5阳性癌症的个体施用有效量的抗LgR5抗体或免疫缀合物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种如下所述的其它治疗剂。
根据以上任何实施方案的LgR5阳性癌症可以是例如LgR5阳性结肠癌或结肠直肠癌(包括腺癌)、LgR5阳性小肠癌(包括腺癌、肉瘤(例如平滑肌肉瘤)、类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤和淋巴瘤)、LgR5阳性卵巢癌(包括卵巢浆液性腺癌)、LgR5阳性胰腺癌(包括胰腺导管腺癌)和LgR5阳性子宫内膜癌。在一些实施方案中，LgR5阳性癌症为所得到的抗LgR5免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)计分大于“0”的癌症，计分大于0对应于在本文于实施例B中所述的条件下，在>90％的肿瘤细胞中染色极弱或无染色。在另一个实施方案中，LgR5阳性癌症以如本文于实施例B中所述的条件下所定义的1+级、2+级或3+级表达LgR5。在一些实施方案中，LgR5阳性癌症为根据检测LgR5mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定确定表达LgR5的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
根据以上任何实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供包含本文提供的任何抗LgR5抗体或免疫缀合物的例如用于以上任何治疗方法的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗LgR5抗体或免疫缀合物和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗LgR5抗体或免疫缀合物和至少一种例如如下所述的其它治疗剂。
本发明的抗体或免疫缀合物可单独或与其它药剂组合在疗法中使用。例如，本发明的抗体或免疫缀合物可与至少一种其它治疗剂共同施用。在某些实施方案中，其它治疗剂为(贝伐单抗)，例如用于治疗LgR5阳性癌症，如LgR5阳性结肠癌或LgR5阳性结肠直肠癌。
以上所述的这类组合疗法涵盖组合给药(其中两种或两种治疗剂包括在同一或单独制剂中)，和单独给药，在这种情况下，可在施用其它治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后施用本发明的抗体或免疫缀合物。本发明的抗体或免疫缀合物还可与放射疗法组合使用。
本发明的抗体或免疫缀合物(和任何其它治疗剂)可通过任何适合方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内给药，并且在需要用于局部治疗时，包括病灶内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。可通过任何适合途径进行给药，例如通过注射，如静脉内或皮下注射进行给药，这在某种程度上取决于给药是短期抑或是长期的。本文涵盖各种给药方案，包括但不限于单次给药或历经各个时间点多次给药、大剂量给药和脉冲输注。
将以符合良好医学规范的方式对本发明的抗体或免疫缀合物进行配制、给药和施用。在此情形下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个别患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、给药方法、给药方案和医学从业者已知的其它因素。抗体或免疫缀合物无须但任选地与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。这类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或免疫缀合物的量、病症或治疗类型和以上论述的其它因素。这类药剂通常以与本文所述相同的剂量并用如本文所述的给药途径，或以本文所述剂量的约1％至99％，或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量并且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径进行使用。
为预防或治疗疾病，本发明的抗体或免疫缀合物(当单独或与一种或多种其它额外治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于欲治疗疾病的类型、抗体或免疫缀合物的类型、疾病的严重性和病程、施用抗体或免疫缀合物是否出于预防目的抑或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体或免疫缀合物的反应和主治医师的判断。抗体或免疫缀合物适合一次性或历经一系列治疗向患者施用。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或免疫缀合物可以是用于向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一或多次分开给药，或是通过连续输注给药。依据以上提及的因素，一种典型日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更大的范围内。对于历经数天或更长时间的重复给药，依据病状，治疗将通常持续直至对疾病症状产生所需抑制作用为止。抗体或免疫缀合物的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任何组合)。这类剂量可间歇施用，例如每周或每三周一次(例如以使患者接受约两剂至约二十剂，或例如约六剂抗体)。最初可施用较高的起始剂量，接着可施用一种或多种较低剂量。然而，其它给药方案可能适用。此疗法的进展易于通过常规技术和测定进行监测。
应了解以上任何制剂或治疗方法都可使用本发明的免疫缀合物与抗LgR5抗体两者进行。
H.制品
在本发明的另一方面，提供一种含有适用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质的制品。所述制品包含容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装说明书。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器、静脉内溶液袋等。容器可由如玻璃或塑料的多种材料形成。容器容纳单独或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一种组合物组合的组合物并且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有可由皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体或免疫缀合物。标签或包装说明书指示组合物用于治疗所选病状。此外，所述制品可包括(a)含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体或免疫缀合物；和(b)含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的此实施方案中的制品可进一步包括指示组合物可用于治疗特定病状的包装说明书。或者或另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。其可进一步包括自商业和使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
III.实施例
以下为本发明的方法和组合物的实施例。应了解鉴于以上提供的一般性描述，可实践各种其它实施方案。
A.人LgR5基因表达
使用含有基因表达信息的专有数据库(Gene Logic公司,Gaithersburg,MD)分析人LgR5基因表达。使用微阵列谱查看器对数据库进行图解分析。图1为各种组织中的人LgR5基因表达的图形表示。y轴上的标度指示基于杂交信号强度的基因表达水平。点出现在从所列的各组织的名称延伸的线的左侧与右侧。出现在线左侧的点表示正常组织中的基因表达，而出现在线右侧的点表示肿瘤和患病组织中的基因表达。图1示出相对于某些肿瘤或患病组织的正常对应物，LgR5基因在某些肿瘤或患病组织中的表达有所增加。具体而言，LgR5实质上在结肠直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤和卵巢肿瘤中过度表达。图1插图示出LgR5在至少以下结肠肿瘤中过度表达：腺癌、良性肿瘤和转移性结肠肿瘤，并且还在结肠肿瘤含量小于50％的组织中(图1插图中的“较低肿瘤”)过度表达；但不在正常结肠、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎中过度表达。人LgR5在正常组织中的表达低得多，其中在正常脑、肌肉、卵巢和胎盘组织中的表达水平较低。
B.人LgR5在结肠肿瘤中的出现率
为评估LgR5在结肠直肠癌中的表达，从多个来源(Asterand,Detroit,MI；Bio-Options,Fullerton,CA；University of Michigan,Ann Arbor,MI；Cytomyx,Rockville,MD；Cooperative Human Tissue Network,Nashville,TN；Indivumed,Hamburg,Germany；ProteoGenex,Culver City,CA)获得57个原发性结肠直肠腺癌。44％的样品来自男性，并且患者的平均年龄为66岁(在31岁至93岁的范围内)。如Bubendorf L等,J Pathol.2001年9月；195(1):72-9中所述，使用重复核心组装组织微阵列(TMA)，并且组织微阵列包括来自匹配病例的五个正常结肠直肠粘膜样品。
使用表2中所示的寡核苷酸探针，通过原位杂交测定LgR5表达。参见例如Jubb AM等,Methods Mol Biol 2006；326:255-64。使用β-肌动蛋白的ISH在分析之前确认结肠直肠癌组织中的mRNA完整性。
根据以下方案，在考虑强度(银粒)以及染色宽度下，经由训练有素的病理学家对LgR5杂交强度进行计分。
0(阴性)：>90％肿瘤细胞中极弱杂交或无杂交
1+(轻度)：主要杂交型式微弱
2+(中度)：在大多数(>50％)赘生性细胞中主要杂交型式中等强烈
3+(强烈)：在大多数(>50％)赘生性细胞中主要杂交型式强烈
使用有义探针来控制杂交特异性。
图2示出具有1+级、2+级和3+级染色的示例性结肠肿瘤切片。上图示出暗视野图像并且下图示出亮视野图像。暗视野图像中的银粒沉积指示探针的杂交和LgR5mRNA的表达。所分析的约77％(41/53)的结肠肿瘤切片呈LgR5阳性，显示出1+级、2+级或3+级的染色，其中34％(18/53)显示出2+级或3+级的染色。所分析的57个样品中有4个样品无LgR5表达信息。
为评估结肠肿瘤中Lgr5表达的显著性，根据圣詹姆斯大学医院(StJames'University Hospital)(Leeds,UK)自1988年至2003年的病理学档案对一系列基于群体的已进行手术切除结肠直肠腺癌的患者进行回顾性汇编。如Bubendorf L等,J Pathol.2001年9月；195(1):72-9中所述，用每个患者一个正常粘膜核心和三个腺癌核心构建组织微阵列(TMA)。如上所述进行ISH并且计分。还确定来自同一肿瘤的三个核心之间的表达异质性，并且表示为在三个核心中的一个中显示特定不一致水平的肿瘤的比例。例如，若三个核心具有+1、+3和+3的计分，则来自该肿瘤的三个核心中的一个的不一致度为2。
图3A示出结肠肿瘤组织微阵列中通过原位杂交所测量的0级、1+级、2+级和3+级LgR5染色的出现率。75％的结肠肿瘤组织显示出1+级、2+级或3+级的染色，其中37％显示出2+级或3+级染色。图3B示出LgR5表达的异质性。67％的肿瘤在三个核心之间未显示出异质性。32％显示三个核心中的一个具有1的不一致度，并且仅1％显示出大于1的不一致度。
C.小鼠单克隆抗体产生
使用以下程序产生针对人LgR5的单克隆抗体。从杆状病毒表达系统表达具有C端加标记His的Fc的人LgR5细胞外域(ECD；氨基酸22-557)，并且在Ni-NTA管柱(Qiagen)上纯化，随后如先前(Kirchhofer等,2003)所述于20mM MES(pH 6.0)、6M盐酸胍中在Superdex 200管柱上进行凝胶过滤并且透析至PBS中以储存于-80℃下。
用含huLgR5质体DNA的乳酸林格氏溶液(经由尾静脉)或用含如上所述的重组人LgR5ECD的佐剂(经由后足垫)对15只Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories International公司,Hollister,CA,USA)进行注射，所述佐剂含有可代谢角鲨烯(4％v/v)、吐温80(Tween 80)(0.2％v/v)、海藻糖6,6-二霉菌酸酯(0.05％w/v)和单磷酰基脂质A(0.05％w/v；Sigma Aldrich,USA)。在6-9次注射之后，通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)和FACS评估血清效价。通过电融合(Hybrimune；Harvard Apparatus公司,Holliston,MA,USA)使自总共5只小鼠收集的脾B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas,VA,USA)融合。在10-14天之后，通过ELISA针对抗体分泌筛选杂交瘤上清液。接着扩充所有阳性克隆并且通过ELISA和FACS针对与huLgR5和muLgR5的结合(即针对与293-huLGR5和293-muLGR5细胞的结合)进行再筛选。在两轮亚克隆(通过限制稀释法)之后，杂交瘤克隆8E11.1.1(从DNA免疫接种小鼠所鉴别)以及2H6.3.5和3G12.2.1(两者均来自蛋白质免疫接种的小鼠)显示出高免疫结合性并且按比例扩大以供在INTEGRA CELLine 1000生物反应器(INTEGRABiosciences AG,Zizers,Switzerland)中纯化。接着通过亲和色谱法纯化上清液，无菌过滤并且在4℃下于PBS中储存。使用Isostrip小鼠mAb同种型试剂盒(Roche Applied Biosciences,Indianapolis,IN,USA)确定所述mAb的同种型为IgG1(κ轻链)。
图4示出产生的某些单克隆抗体以及某些特性，其中一些将在以下进一步详细描述。
D.小鼠单克隆抗体的克隆和嵌合
如下克隆并且嵌合单克隆抗体8E11、3G12和2H6。
使用标准方法从产生鼠8E11、鼠3G12或鼠2H6的杂交瘤细胞提取总RNA。用针对重链和轻链的简并引物，使用RT-PCR扩增可变轻(VL)域和可变重(VH)域。正向引物对VL和VH区的N端氨基酸序列具有特异性。LC和HC反向引物分别被设计来与在物种之间高度保守的恒定轻域(CL)和恒定重域1(CH1)中的区域退火。使用常规测序方法测定插入物的聚核苷酸序列。8E11VL和VH氨基酸序列分别示出于图5和图6中(分别为SEQ ID NO:3和4)。3G12和2H6VL和VH氨基酸序列分别示出于图7和图8中。抗体3G12的VL和VH序列分别显示于SEQ ID NO:21和22中，并且抗体2H6的VL和VH序列分别显示于SEQ ID NO:23和24中。
通过将小鼠重链可变区克隆于人IgG1重链恒定区上并且将轻链可变区克隆于人κ轻链恒定区上来使各抗体嵌合。
E.8E11的人源化
如下所述使单克隆抗体8E11人源化。残基编号是根据Kabat等,Sequences of proteins of immunological interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
到接受体人共有框架上的直接高变区移植
以IgG形式评定在8E11的人源化期间构建的变体。将来自鼠8E11的VL和VH域与人VLκIV(VLKIV)和人VH亚群I(VHI)共有序列比对。将来自鼠8E11(mu8E11)抗体的高变区工程化于VLKIV和VHI接受体框架中以产生8E11.v1。确切而言，将来自mu8E11VL域的位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)移植到VLKIV中。将来自mu8E11VH域的位置26-35(H1)、49-65(H2)和95-102(H3)移植到VHI中。此外，VH的框架III中的位置71和78自8E11.v1中的小鼠序列保留。发现那些残基是充当可调节CDR结构和微调抗原配合的“游标(Vernier)”区域的框架残基的一部分。参见例如Foote和Winter,J.Mol.Biol.224:487-499(1992)(图5和图6)。这些CDR定义包括通过其序列高变性(Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970))、其结构位置(Chothia,C.和Lesk,A.M.(1987))及其涉及于抗原-抗体接触中(MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))所确定的位置。
产生其它8E11变体以评估如轻链中的位置68和重链中的位置67和69的其它游标位置的作用。通过在重链可变区的位置67和69处保留两个附加小鼠残基来产生人源化8E11.v2。8E11.v2和其它变体的轻链可变区序列和重链可变区序列分别示出于图5和图6中。
通过使用针对各高变区的各别寡核苷酸进行Kunkel诱变来产生8E11的人源化变体。通过DNA测序鉴别正确克隆。
变体评定
出于筛选目的，最初在293细胞中产生IgG变体。将编码VL和VH的载体转染至293细胞中。通过蛋白质A亲和色谱法从细胞培养基中纯化IgG。
通过使用BIAcoreTM-3000进行表面等离子体共振来测定各8E11IgG变体对人LgR5的亲和力。根据供应商说明书，用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化BIAcoreTM研究级CM5芯片。使山羊抗人Fc IgG偶联于芯片以在各流动池中达到约10,000反应单位(RU)。用1M乙醇胺阻断未反应的偶联基团。对于动力学测量，捕获抗LGR5抗体以达到约300RU。可在25℃下以流速30μl/min注射人LgR5ECD(在杆状病毒系统中表达的融合于His-Fc的氨基酸22-557，或由CHO细胞表达的融合于Fc的氨基酸22-558；125nM至0.49nM)于HBS-P缓冲液(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)中的两倍连续稀释液。使用1:1朗缪尔结合模型(BIAcoreTM评估软件第3.2版)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)为计算比率koff/kon。
结果
用于使8E11人源化的人接受体框架是基于人VLκIV共有(VLKIV)框架和接受体VH框架VHI。产生mu8E11的八种人源化变体并且通过BIAcoreTM测试LgR5亲和力。各变体的轻链可变区和重链可变区分别示出于图5和图6中。亲和力测量结果示出于图9中。
为改进8E11.v1的结合亲和力，将轻链中的位置68和重链中的位置67和69变成在mu8E11中的这些位置处存在的残基。将重链中的位置71和78变成在人框架VHI中的这些位置处存在的残基。使这些改变的轻链与重链的组合以IgG形式表达并且如上所述进行纯化，并通过Biacore评定与人LgR5的结合(图9)。
通过将hu8E11.v1重链的位置67和69变成在mu8E11中的那些位置处存在的残基来产生变体hu8E11.v2。发现hu8E11.v2的亲和力(KD)与亲本ch8E11抗体大致相同。
人源化8E11.v2的变化的概述
将6个鼠8E11CDR(如位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)和93-102(H3)所限定)移植到人共有VLKIV和VHI接受体域中。使位置67、69、71和78变回为mu8E11中的鼠残基。人源化8E11.v2对LgR5的亲和力与嵌合8E11相当。
在本申请通篇中，小鼠单克隆抗体8E11、2H6和3G12分别替代地称为8E11、m8E11或mu8E11；和2H6、m2H6或mu2H6；和3G12、m3G12或mu3G12。嵌合单克隆抗体8E11、2H6和3G12分别称为嵌合8E11或ch8E11；嵌合2H6或ch2H6；和嵌合3G12或ch3G12。人源化单克隆抗体8E11.v2还可称为8E11v2、h8E11v.2或hu8E11v.2。
F.通过噬菌体展示产生人单克隆抗体
具有N端FLAG的人LgR5ECD(氨基酸22-555)在CHO细胞中表达并且在抗FLAG树脂上纯化过夜，并接着用0.1M乙酸(pH 2.7)洗脱。接着通过在Superdex 200柱上于PBS中进行凝胶过滤来纯化蛋白质并且接着透析至PBS中以在-80℃下储存。
将在所选互补决定区(H1、H2、H3)中具有合成多样性，从而模拟人IgG谱系的天然多样性的人噬菌体抗体文库用于淘选。使Fab片段以二价形式展示于M13噬菌体粒子的表面上(Lee等,(2004)J Mol Biol 340,1073-93)。使用如上所述产生的人LgR5ECD(氨基酸22-555)作为抗原。在4℃下用LgR5ECD蛋白质(10μg/ml)将Nunc 96孔MaxiSorp免疫培养板(Nunc)涂布过夜并且用补充有1％BSA的PBST缓冲液(PBS、0.05％吐温20)阻断1小时。添加抗体噬菌体文库并且在室温下孵育过夜。用PBST缓冲液洗涤培养板并且用50mM HCL/500mM NaCl洗脱结合的噬菌体30分钟并用等体积的1M Tris碱中和。在大肠杆菌XL-1blue细胞中扩增回收的噬菌体。在随后数轮选择期间，将噬菌体抗体的孵育时间缩短至2小时并且逐渐增加培养板洗涤的严格度(Liang等,(2007)J Mol Biol 366,815-829)。通过噬菌体ELISA和DNA测序来鉴别结合人LgR5ECD的独特且具特异性的噬菌体抗体。通过将VL和VH区分别克隆至LPG3和LPG4载体中来将包括YW353的某些克隆重排成全长IgG。使抗体在哺乳动物细胞中瞬时表达并且在蛋白质A柱上纯化(Carter等,(1992)Proc Natl Acad Sci U S A 89,4285-9)。
人抗体YW353的轻链和重链可变区序列分别示出于图10和图11中(SEQ ID NO:26和25)。人抗体YW353的IgG1重链和κ轻链序列分别显示于SEQ ID NO:66和65中。由于YW353产生自人抗体噬菌体文库，所以术语“YW353”与“huYW353”在本文中可互换使用。
G.物种交叉反应性
测试单克隆抗体以确定其是否与来自非人物种的LgR5交叉反应。图12A至图12C示出人LgR5(SEQ ID NO:67)、石蟹猴LgR5(SEQ ID NO:69)、大鼠LgR5(SEQ ID NO:70)和小鼠LgR5(SEQ ID NO:72)之间的比对。所有四个物种间相同的残基用星号(*)指示。图4示出以下FACS分析的结果：用加标记gD表位的LgR5(人、石蟹猴、大鼠或小鼠LgR5)稳定转染293细胞；用10μg/ml YW353、ch8E11、hu8E11.v2、2H6或3G12抗体进行染色；并且用缀合R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin)的山羊抗人抗体检测。未转染的293细胞通常不表达LgR5。YW353抗体结合人和石蟹猴LgR5而不结合大鼠或小鼠LgR5。Ch8E11和hu8E11.v2抗体结合所有四个物种的LgR5，但与大鼠LgR5的结合不如与人、石蟹猴或小鼠LgR5的结合强。2H6抗体结合人和小鼠LgR5，并且未测试出其结合石蟹猴或大鼠LgR5。3G12抗体显示强烈结合人LgR5，与小鼠LgR5的结合强度较低，并且未测试出其结合石蟹猴或大鼠LgR5。
H.抗体亲和力
通过实质上如上文在实施例E中所述，使用BIAcoreTM-3000进行表面等离子体共振来测定各抗体对人LgR5的亲和力。
如图4中所示，YW353抗体结合人LgR5的亲和力为1.6nM。Ch8E11和hu8E11.v2抗体结合人LgR5的亲和力分别为2.4nm和3.1nm。2H6和3G12抗体结合人LgR5的亲和力分别为208nM和72nM。
遵循标准程序(Holmes等,Science 256:1205-1210(1992))进行Scatchard分析以测定YW353、ch8E11和hu8E11v2抗体的相对结合亲和力。
使用间接Iodogen法对抗Lgr5抗体进行[I125]标记。使用NAP-5柱(GEHealthcare)，通过凝胶过滤自游离125I-Na纯化[I125]标记的抗Lgr5抗体；纯化的碘化抗Lgr5抗体的比活性在13.92至19.01μCi/μg的范围内。将50μL体积的含有固定浓度的[I125]标记的抗体和递减浓度的连续稀释的未标记抗体的竞争测定混合物放置在96孔培养板中。在37℃下在5％CO2中于生长培养基中培养稳定表达人、大鼠或小鼠Lgr5的293细胞。使用Sigma细胞解离溶液使细胞脱离烧瓶并且用结合缓冲液洗涤，所述结合缓冲液由含2％胎牛血清(FBS)、50mM HEPES(pH 7.2)和0.1％叠氮化钠的杜氏改进的依格培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)组成。以在0.2mL结合缓冲液中含250,000个细胞的密度将洗涤的细胞添加至96孔培养板中。[I125]标记的抗体在各孔中的最终浓度为200pM。经由10步2倍稀释使得未标记抗体在竞争测定物中的最终浓度在500nM至0nM仅含缓冲液的测定物的范围内。一式三份进行竞争测定。在室温下孵育竞争测定物2小时。在孵育2小时之后，将竞争测定物转移至Millipore多重筛选过滤培养板(Billerica,MA)中并且用结合缓冲液洗涤4次以使游离抗体与结合的[I125]标记的抗体分离。在Wallac Wizard 1470γ计数器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences公司；Wellesley,MA)上对过滤器进行计数。使用NewLigand软件(Genentech)评估结合数据，所述软件使用Munson和Robard的拟合算法来确定抗体的结合亲和力(Munson和Robard,1980)
如图4中所示，YW353结合在稳定转染的293细胞上表达的加标记gD的人LgR5的亲和力为0.2nM。Ch8E11结合在稳定转染的293细胞上表达的加标记gD的人LgR5和加标记gD的小鼠LgR5的亲和力分别为0.4nM和0.2nM。Hu8E11v2结合在稳定转染的293细胞上表达的加标记gD的人LgR5、加标记gD的小鼠LgR5和加标记gD的大鼠LgR5的亲和力分别为0.3-0.7nM、0.5-0.6nM和2.4-2.8nM。这类Kd值通常低于通过所测定的那些。
I.表位作图
为确定LgR5中被各抗体所结合的区域，将用加标记gD表位并且具有各种N端和/或C端缺失的LgR5瞬时转染的293细胞用10μg/ml YW353、ch8E11、hu8E11v2、2H6或3G12抗体染色；并且用缀合R-藻红蛋白的山羊抗人抗体检测结合。抗体YW353、8E11、2H6和3G12都结合加标记gD表位的全长LgR5。抗体2H6和3G12结合加标记gD表位的LgR5324-907(SEQ IDNO:67的氨基酸324-907)。抗体YW353和8E11不结合加标记gD表位的LgR5324-907。仅抗体YW353结合加标记gD表位并且具有C端GPI锚的LgR522-123(SEQ ID NO:67的氨基酸22-123)。抗体YW353与8E11两者均结合加标记gD表位并且具有C端GPI锚的LgR522-323(SEQ ID NO:67的氨基酸22-323)，但抗体2H6和3G12并非如此。最后，无抗体结合加标记gD表位的LgR5424-907(SEQ ID NO:67的氨基酸424-907)。
图4在标题为“表位区域”的行中概述那些结果。如该图中所示，抗体YW353结合SEQ ID NO:67的氨基酸22至123的区域中的表位；抗体8E11及其人源化变体结合SEQ ID NO:67的氨基酸22至323的区域中的表位；并且抗体2H6和3G12结合SEQ ID NO:67的氨基酸324至423的区域中的表位。
J.抗LgR5抗体药物缀合物的产生
为了较大规模产生抗体，在CHO细胞中产生抗体。将编码VL和VH的载体转染至CHO细胞中并且通过蛋白质A亲和色谱法从细胞培养基中纯化IgG。
抗LgR5抗体MMAE缀合物
通过使YW353(分别显示于SEQ ID NO:66和65中的IgG1重链和κ轻链序列)、hu8E11v2(分别显示于SEQ ID NO:64和63中的IgG1重链和κ轻链序列)、mu8E11、ch8E11、2H6、ch2H6、3G12和ch3G12缀合本文所述的药物-接头部分MC-vc-PAB-MMAE来产生抗LgR5抗体-药物缀合物(ADC)。为方便起见，药物-接头部分MC-vc-PAB-MMAE在这类实施例中和在图中有时称为“vcMMAE”或“VCE”。在缀合之前，根据WO 2004/010957A2中所述的方法，使用标准方法用TCEP部分还原抗体。根据例如Doronina等,(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784和US 2005/0238649A1中所述的方法，使用标准方法使部分还原的抗体缀合药物-接头部分。简言之，将部分还原的抗体与药物-接头部分组合以使药物-接头部分缀合抗体的还原半胱氨酸残基。淬灭缀合反应，并且纯化ADC。确定各ADC的药物负载量(每抗体药物部分的平均数目)并且对于抗LgR5抗体而言，药物负载在3.3与4.0之间。抗体-vcMMAE免疫缀合物的结构示出于图35A中(p＝药物负载量)。
抗LgR5抗体PNU缀合物
通过使YW353A118C thioMab(分别显示于SEQ ID NO:78和65中的IgG1A118C重链和κ轻链序列)或hu8E11v2thioMab(分别显示于SEQ ID NO:75和63中的IgG1A118C重链和κ轻链序列)缀合PNU药物-接头部分来产生抗LgR5抗体-PNU药物缀合物(ADC)。在缀合之前，用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以从硫代抗体的工程化半胱氨酸去除阻断基团(例如半胱氨酸)。此过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以去除释放的阻断基团并且使用去氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。
对于包含val-cit接头和PNU的抗体-药物缀合物，将完整抗体与药物-接头部分MC-val-cit-PAB-间隔子-PNU-159682(“val-cit”在本文中还可称为“vc”)组合以使药物-接头部分缀合抗体的工程化半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应，并且纯化ADC。ADC的药物负载量(每抗体药物部分的平均数目)在约1.8至2的范围内。抗体-vcPNU免疫缀合物的结构示出于图35B中(p＝药物负载量)。
对于包含缩醛接头和PNU的抗体药物缀合物，将完整抗体与药物-接头部分MC-缩醛-PNU-159682组合以使药物-接头部分缀合抗体的工程化半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应，并且纯化ADC。ADC的药物负载量(每抗体药物部分的平均数目)为约1.8至2。抗体-缩醛-PNU免疫缀合物的结构示出于图35C中(p＝药物负载量)。
对于包含不可裂解接头和PNU的抗体药物缀合物，将完整抗体与药物-接头部分MC-PNU-159682组合以使药物-接头部分缀合抗体的工程化半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应，并且纯化ADC。ADC的药物负载量(每抗体药物部分的平均数目)为约1.8至2。抗体-PNU免疫缀合物的结构示出于图35D中(p＝药物负载量)。
抗LgR5抗体PBD缀合物
通过使YW353A118C thioMab(分别显示于SEQ ID NO:78和65中的IgG1A118C重链和κ轻链序列)或hu8E11v2thioMab(分别显示于SEQ ID NO:75和63中的IgG1A118C重链和κ轻链序列)结合PBD药物-接头部分来产生抗LgR5抗体-PBD药物缀合物(ADC)。在结合之前，用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体以自硫代抗体的经工程化半胱氨酸去除阻断基团(例如半胱氨酸)。此过程还还原抗体的链间二硫键。纯化还原的抗体以去除释放的阻断基团并且使用去氢抗坏血酸(dhAA)再氧化链间二硫化物。
对于包含val-cit接头和PBD的抗体-药物缀合物，将完整抗体与药物-接头部分MC-val-cit-PAB-PBD(“val-cit”在本文中还可称为“vc”)组合以使药物-接头部分结合抗体的经工程化的半胱氨酸残基。通过添加过量N-乙酰基-半胱氨酸来与任何游离接头-药物部分反应以淬灭缀合反应，并且纯化ADC。ADC的药物负载量(每抗体药物部分的平均数目)在约1.8至2的范围内。抗体-vcPBD的结构示出于图35E中(p＝药物负载量)。
K.抗LgR5抗体药物缀合物在大鼠中的毒性
为评估抗LgR5抗体8E11.v2-vcMMAE的潜在毒性，每周一次向6只雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠施用12mg/kg 8E11.v2-vcMMAE持续四周，并且每周一次向6只雄性斯普拉格-杜勒大鼠施用20mg/kg8E11.v2-vcMMAE持续两周。每周一次向4只雄性斯普拉格-杜勒对照大鼠施用单独媒介物持续两周，并且每周一次向4只雄性斯普拉格-杜勒对照大鼠施用单独媒介物持续四周。在第12天对两周组中的大鼠进行尸检并且在第26天对四周组中的大鼠进行尸检。
简言之，相较于对照大鼠，施用8E11.v2-vcMMAE的所有大鼠都显示红细胞量(红细胞、血细胞比容、血红蛋白和网织红细胞)、嗜中性粒细胞和血小板有所降低。相较于对照大鼠，施用20mg/kg 8E11.v2-vcMMAE的大鼠还显示白细胞计数和淋巴细胞有所降低。此外，相较于对照大鼠，施用8E11.v2-vcMMAE的所有大鼠都显示肝酶ALT、AST、ALP和GGT有所增加和总胆红素有所增加。
对从研究收集的组织的组织病理学分析显示在施用8E11.v2-vcMMAE的大鼠中存在淋巴和造血组织的细胞消耗，并且快速分裂组织中的有丝分裂象增加。施用20mg/kg 8E11.v2-vcMMAE的大鼠还显示最小限度肝坏死、最小限度有丝分裂象增加和单细胞隐窝坏死/细胞凋亡和最小限度轻度肺泡组织细胞增多症和II型细胞增生。
所观测到的病理学变化类似于在施用其它vcMMAE抗体-药物缀合物的大鼠中所观测到的病理学。似乎不存在任何证据表明在胃肠道中有LgR5抗原依赖性毒性。
L.抗LgR5抗体药物缀合物在LoVo结肠癌细胞系异种移植物中的功效
使用LoVo结肠癌异种移植模型研究抗LgR5ADC的功效。LoVo细胞为具有APC突变的结肠直肠腺癌细胞系(ATCC#CCL 229)。LgR5在LoVo细胞中高度表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将500万个LoVo细胞(通过使用YW353进行FACS确定呈LgR5阳性)于HBSS-基质胶中皮下注射于NCR裸小鼠的背侧腹中，并且在接种后第六天，给与小鼠5mg/kg鼠抗gp120-vcMMAE对照抗体-药物缀合物、人抗gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物、huYW353-vcMMAE抗体-药物缀合物、mu8E11-vcMMAE抗体-药物缀合物、mu2H6-vcMMAE抗体-药物缀合物或mu3G12-vcMMAE抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(PBS)进行单次静脉内注射。在注射后第一天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图13中所示，用所测试的所有四种抗LgR5抗体-药物缀合物都实现了实质性肿瘤生长抑制作用。
M.抗LgR5抗体药物缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中的功效
使用具有β-连环蛋白突变的D5124胰腺癌异种移植模型研究抗LgR5ADC的功效。LgR5在D5124肿瘤中高度表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片(通过使用YW353和8E11进行FACS确定呈LgR5阳性)皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第18天，给与小鼠6mg/kg人抗gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物、3mg/kg或6mg/kghuYW353-vcMMAE抗体-药物缀合物、3mg/kg或6mg/kg ch8E11-vcMMAE抗体-药物缀合物、3mg/kg或6mg/kg ch2H6-vcMMAE抗体-药物缀合物，或3mg/kg或6mg/kg ch3G12-vcMMAE抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5；图14中的“HB#8”)进行单次静脉内注射。在注射后第一天和第八天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图14中所示，在两种剂量的huYW353-vcMMAE、ch8E11-vcMMAE和ch3G12-vcMMAE下均实现了实质性肿瘤生长抑制作用。在6mg/kgch2H6-vcMMAE下也实现了实质性肿瘤生长抑制作用。
接着测试各种剂量的YW353-vcMMAE在上述D5124胰腺癌异种移植模型中的功效。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片(通过使用YW353和8E11进行FACS确定呈LgR5阳性)皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第23天，给与小鼠0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg huYW353-vcMMAE抗体-药物缀合物；或12mg/kg huYW353；或7.2mg/kg或14.4mg/kg人抗gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物；或单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5；图15中的“HB#8”)的单次静脉内注射。在注射后第1天、第4天和第14天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图15中所示，在3mg/kg huYW353-vcMMAE下实现了实质性肿瘤生长抑制作用，并且在6mg/kg和12mg/kg huYW353-vcMMAE下实现几乎完全肿瘤生长抑制作用。
N.mu8E11和mu8E11-vcMMAE在鼠肠肿瘤发生模型中的功效
研究mu8E11和mu8E11-vcMMAE在鼠肠肿瘤发生模型APCmin/+；LSL-KrasG12D；VillinCre(“AKV小鼠”)中的功效。AKV小鼠是使APCmin/+；VillinCre(“AV小鼠”)与LSL-KrasG12D小鼠杂交所得的结果。在AV小鼠在结肠中产生0-4个腺瘤并且在小肠中产生100个腺瘤同时，AKV小鼠则可在结肠中产生平均140个腺瘤并且在小肠中产生平均100个腺瘤(数据未示出)。测量LgR5mRNA在AV和AKV小鼠的正常组织和息肉中的表达，并且发现LgR5在AKV小鼠中在来自小肠与结肠两者的息肉中显著过度表达(图16)。为观测LgR5在AKV小鼠的小肠和结肠中的表达，使AKV小鼠与具有含有框内连接于位于Lgr5基因中的人白喉毒素受体cDNA的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因盒的小鼠杂交。参见Tian等,Nature,478:255-260(2011)。观测AKV Lgr5DTR/+小鼠中小肠息肉和大肠息肉中的EGFP表达面积。该实验的结果示出于图20中。发现LgR5表达在小肠息肉与结肠息肉之间并无显著不同，并且此外，在肿瘤尺寸与LgR5+面积之间不存在相关性。肿瘤的平均LgR5+面积为8％，但在肿瘤间广泛不同。初步结果显示人结肠直肠肿瘤中的LgR5+面积可显著高于小鼠，这表明抗LgR5ADC疗法在人中的治疗指数可甚至比在小鼠中更佳。
为评定这类动物内肠隐窝与肿瘤之间的Lgr5表达差异，获得来自AKVLgr5DTR/+小鼠的肠道并且在组织切片上对GFP进行直接观测。此后定量肿瘤和正常隐窝的各GFP阳性像素强度。为确定相对GFP强度，用强度计分除以GFP+面积。如图23中所示，在AKV Lgr5DTR/+小鼠中，LgR5在肿瘤中的表达高于在肠隐窝中的表达。
用AKV小鼠进行总体存活期研究以确定抗LgR5抗体是否可延长存活期。向10只AKV小鼠施用15mg/kg mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE；向6只AKV小鼠施用15mg/kg mu8E11，并且向9只小鼠施用15mg/kg对照抗体抗gp120-MC-vc-MMAE。在6周大时开始每周施用抗体和ADC一次直至小鼠死亡或视为濒死(如通过与严重无生气、体重减轻和贫血的征象相关的标准准则所确定)为止，在濒死的情况下将小鼠处死。
总体存活期研究的结果示出于图17中。未处理对照数据表示22只AKV小鼠的历史存活率。在该实验中，施用mu8E11或mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE的AKV小鼠的存活时间显著长于未处理AKV小鼠或施用对照ADC的AKV小鼠。基于这类结果，如上所述评估另外的动物。该实验的结果示出于图19中。在所述较大实验中，施用mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE的AKV小鼠的存活时间显著长于未处理AKV小鼠或施用对照ADC的AKV小鼠，并且存活时间还长于施用mu8E11的小鼠。在死亡时，施用对照ADC的AKV小鼠与施用抗LgR5-ADC的AKV小鼠具有类似的息肉数目和尺寸，这表明抗LgR5-ADC可减缓疾病并且由此延长存活期。
为确定抗LgR5抗体和/或抗LgR5ADC是否在AKV小鼠的胃肠肿瘤中引起细胞凋亡，根据肿瘤面积测量裂解的半胱天冬酶3的存在。对在死亡时收集的经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的小肠和结肠组织针对裂解的半胱天冬酶3进行免疫组织化学染色(Cell Signaling Technologies；Danvers,MA,目录号9661L)。通过Olympus Nanozoomer自动载片扫描平台获得染色载片的图像并且在Matlab软件包(Mathworks,Natick,MA)中分析手动鉴别的肿瘤特异性区域。定量阳性染色面积和总肿瘤面积。尽管很少，但在用抗LgR5ADC处理之后，仍在隐窝中可见到裂解的半胱天冬酶3，但在经对照ADC处理的动物中则未观测到，这表明LgR5表达细胞被特异性靶向。
该实验的结果示出于图18中。相较于经对照ADC处理的AKV小鼠，抗LgR5抗体给药与抗LgR5ADC给药两者均使得AKV小鼠中对于裂解的半胱天冬酶3的存在呈阳性的肿瘤面积百分比出现统计显著性增加。
为证明细胞凋亡发生在LgR5+细胞中，向AKV Lgr5DTR/+小鼠施用15mg/kg mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE或15mg/kg对照抗体抗gp120-MC-vc-MMAE(第1天)。在第4天，将小鼠处死并且观测来自胃肠道(小肠和大肠)的肿瘤中EGFP和裂解的半胱天冬酶3的表达。接着测定每单位总细胞面积CC3+GFP+面积的量。如图21A中所示，经抗LgR5-ADC处理的小鼠倾向于比对照处理小鼠具有更大的CC3+GFP+面积比例，但在该实验中不具有统计显著性。图21B示出经对照ADC处理的小鼠(左图)和经抗LgR5-ADC处理的小鼠(右图)的示例性免疫组织化学染色。这类结果证明在抗LgR5-ADC处理后，LgR5表达细胞的细胞凋亡有增加的趋势。
为确定LgR5表达细胞的细胞增殖是否受抗LgR5治疗影响，测量来自经对照-ADC处理和经抗LgR5-ADC处理的AKV Lgr5DTR/+小鼠的胃肠道的EGFP+细胞群体和EGFP-细胞群体中的每单位细胞面积Ki67+面积。Ki67是一种与细胞增殖相关的核蛋白质。从Neomarker获得用于免疫组织化学染色的Ki67抗体。该实验的结果示出于图22中。在GFP+细胞群体与GFP-细胞群体两者中，相较于对照ADC，在来自用抗LgR5-ADC处理的AKV Lgr5DTR/+小鼠的肿瘤中存在显著较小增殖细胞面积，如通过Ki67染色所测量。这些结果表明抗LgR5-ADC会减少增殖性子代增殖和/或抑制增殖性子代形成。
O.抗LgR5抗体药物缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中的功效
使用具有β-连环蛋白突变的D5124胰腺癌异种移植模型研究抗LgR5ADC的功效。LgR5在D5124肿瘤中高度表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第22天，给与小鼠2.62mg/kg或5.23mg/kg huYW353-vcMMAE抗体-药物缀合物、3mg/kg或6mg/kg ch8E11-vcMMAE抗体-药物缀合物或3mg/kg或6mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物；或6mg/kg人源化抗gD5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)进行单次静脉内注射(n＝每组8只小鼠)。在注射后第一天和第八天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图24中所示，在两种剂量的huYW353-vcMMAE、两种剂量的hu8E11v2-vcMMAE和6mg/kg ch8E11v2-vcMMAE下实现了实质性肿瘤生长抑制作用。
接着测试各种剂量的hu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物在上述D5124胰腺癌异种移植模型中的功效。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第26天，给与小鼠0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物；或15mg/kg hu8E11v2；或6.37mg/kg或12.73mg/kg人抗gD5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物；或15mg/kg人源化抗gD对照抗体；或单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)的单次静脉内注射(n＝每组8只小鼠)。
如图25中所示，在3mg/kg和6mg/kg hu8E11v2-vcMMAE下实现了实质性肿瘤生长抑制作用，并且在12mg/kg hu8E11v2-vcMMAE下实现肿瘤消退。
P.抗LgR5抗体药物缀合物在LoVoX1.1结肠癌细胞系异种移植物中的功效
使用LoVo结肠癌异种移植模型研究抗LgR5ADC的功效。LoVo细胞是一种具有APC突变的结肠直肠腺癌细胞系(ATCC#CCL 229)，并且获得亚系LoVoX1.1以在小鼠体内实现最佳生长。简言之，用LoVo细胞接种小鼠。一旦肿瘤生长，即收集具有所需生长速率的肿瘤。切碎肿瘤并且使其在培养物中生长以产生细胞系LoVoX1.1。LgR5在LoVoX1.1细胞中表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将500万个LoVoX1.1细胞于HBSS-基质胶中皮下注射于C.B-17SCID小鼠的背侧腹中，并且在接种后第13天，给与小鼠3mg/kg或6mg/kghuYW353-vcMMAE抗体-药物缀合物、3mg/kg或6mg/kghu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物；15mg/kg hu8E11v2抗体；15mg/kg人源化抗gD 5B6对照抗体；或6mg/kg人源化抗gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)进行单次静脉内注射(n＝每组10只小鼠)。
如图26中所示，在6mg/kg hu8E11v2-vcMMAE和6mg/kghuYW353-vcMMAE下实现了实质性肿瘤生长抑制作用。
接着测试各种剂量的hu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物在上述LoVoX1.1结肠直肠腺癌异种移植模型中的功效。将500万个LoVoX1.1细胞于HBSS-基质胶中皮下注射于C.B-17SCID小鼠的背侧腹中，并且在接种后第10天，给与小鼠1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg或15mg/kghu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物；或15mg/kg hu8E11v2；或6mg/kg或15mg/kg人源化抗gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物；或单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH5.5)的单次静脉内注射(n＝每组9只小鼠)。在注射后第1天、第7天和第14天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图27中所示，在6mg/kg、10mg/kg和15mg/kg hu8E11v2-vcMMAE下实现了实质性肿瘤生长抑制作用。
Q.抗LgR5抗体药物缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中的功效
使用具有β-连环蛋白突变的D5124胰腺癌异种移植模型研究抗LgR5ADC的功效。LgR5在D5124肿瘤中高度表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第26天，给与小鼠1mg/kg huYW353-vcMMAE抗体-药物缀合物、1mg/kghuYW353-vcPNU抗体-药物缀合物、1mg/kg huYW353-PNU抗体-药物缀合物、1mg/kg huYW353-缩醛-PNU抗体-药物缀合物；或1mg/kg人源化抗gD5B6-vcPNU对照抗体-药物缀合物、1mg/kg人源化抗gD 5B6-PNU对照抗体-药物缀合物，或1mg/kg人源化抗gD 5B6-缩醛-PNU对照抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)进行单次静脉内注射(n＝每组9只小鼠)。在注射后第3天、第7天和第14天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图28中所示，用1mg/kg huYW353-vcMMAE和1mg/kg huYW353-缩醛-PNU实现了实质性肿瘤生长抑制作用，并且用1mg/kghuYW353-vcPNU实现几乎完全肿瘤生长抑制作用。1只用1mg/kghuYW353-缩醛-PNU处理的小鼠显示出完全反应(即所述小鼠在研究结束时无可检测肿瘤)。此外，2只用1mg/kg huYW353-vcPNU处理的小鼠显示出部分反应(即较第0天时的初始肿瘤体积缩减>50％)。
R.抗LgR5抗体药物缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中的功效
测试各种剂量的hu8E11v2抗体-药物缀合物在D5124胰腺癌异种移植模型中的功效。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第22天，给与小鼠2mg/kghu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物；或2mg/kg hu8E11v2-vcPNU；或2mg/kg或10mg/kg hu8E11v2-缩醛-PNU；或2mg/kg或10mg/kghu8E11v2-PNU；2mg/kg人源化抗gD 5B6-vcPNU对照抗体-药物缀合物、10mg/kg人源化抗gD 5B6-缩醛-PNU对照抗体药物缀合物，或10mg/kg人源化抗gD 5B6-PNU对照抗体药物缀合物；或单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)的单次静脉内注射(n＝每组8只小鼠)。
如图29中所示，在2mg/kg hu8E11v2-缩醛-PNU下实现了实质性肿瘤生长抑制作用，并且在10mg/kg hu8E11v2-缩醛-PNU、2mg/kghu8E11v2-vcPNU以及2mg/kg和10mg/kg hu8E11v2-PNU下实现几乎完全肿瘤生长抑制作用。
S.抗LgR5抗体药物缀合物在LoVo结肠癌细胞系异种移植物中的功效
使用LoVo结肠癌异种移植模型研究抗LgR5ADC的功效。LoVo细胞是一种具有APC突变的结肠直肠腺癌细胞系(ATCC#CCL 229)，并且获得亚系LoVoX1.1以在小鼠体内实现最佳生长。简言之，用LoVo细胞接种小鼠。一旦肿瘤生长，即收集具有所需生长速率的肿瘤。切碎肿瘤并且使其在培养物中生长以产生细胞系LoVoX1.1。LgR5在LoVoX1.1细胞中表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将500万个LoVoX1.1细胞于HBSS-基质胶中皮下注射于C.B-17SCID小鼠的背侧腹中，并且在接种后第11天，给与小鼠2mg/kg hu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物、2mg/kg hu8E11v2-vcPNU、2mg/kg hu8E11v2-缩醛-PNU或2mg/kg hu8E11v2-PNU；或2mg/kg人源化抗gD 5B6-vcPNU对照抗体-药物缀合物、2mg/kg人源化抗gD 5B6-缩醛-PNU对照抗体药物缀合物，或2mg/kg人源化抗gD 5B6-PNU对照抗体药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)进行单次静脉内注射(n＝每组10只小鼠)。在注射后第1天、第7天和第14天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图30中所示，在此实验中，某些对照抗体似乎显示出实质性肿瘤生长抑制作用(参见2mg/kg人源化抗gD 5B6-vcPNU和2mg/kg人源化抗gD5B6-缩醛-PNU对照抗体药物缀合物)。
由于对照抗体在先前实验中具有明显非特异性作用，所以用不同对照抗体-药物缀合物(其结合不在LoVo细胞的表面上表达的不同抗原)，并且在施用过量抗gD对照抗体以阻断肿瘤细胞上可能的非特异性抗体结合位点下测试LoVoX1.1结肠直肠腺癌模型。将500万个LoVoX1.1细胞于HBSS-基质胶中皮下注射于C.B-17SCID小鼠的背侧腹中并且在接种后第7天，给与小鼠10mg/kg hu8E11v2-缩醛-PNU抗体-药物缀合物；或10mg/kg thioAb-缩醛-PNU对照抗体-药物缀合物；或单独媒介物(50mM磷酸钠、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 7)的单次静脉内注射(n＝每组5只小鼠)。此外，每周一次向小鼠腹膜内(i.p.)施用30mg/kg人源化抗gD对照抗体直至研究结束为止，在与施用测试抗体同一天开始，但在施用测试抗体之前4小时进行。
如图31中所示，用10mg/kg hu8E11v2-缩醛-PNU实现了实质性肿瘤生长抑制作用并且对照抗体不抑制肿瘤生长。
T.抗LgR5抗体药物缀合物在D5124胰腺癌异种移植物中的功效
使用具有β-连环蛋白突变的D5124胰腺癌异种移植模型研究YW353抗LgR5ADC的功效。LgR5在D5124肿瘤中高度表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第26天，给与小鼠1mg/kg huYW353-vcMMAE抗体-药物缀合物、1mg/kg huYW353-vcPBD抗体-药物缀合物；或1mg/kg人源化抗gD5B6-vcPBD对照抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)进行单次静脉内注射(n＝每组9只小鼠)。在注射后第1天、第7天和第14天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图32中所示，用1mg/kg huYW353-vcMMAE和1mg/kghuYW353-vcPBD实现了实质性肿瘤生长抑制作用。1只用1mg/kghuYW353-vcPBD处理的小鼠显示出完全反应(即所述小鼠在研究结束时无可检测的肿瘤)。
在一个单独实验中，使用D5124胰腺癌异种移植模型研究hu8E11v2抗LgR5ADC的功效。将20mm3至30mm3D5124肿瘤碎片皮下植入于NCR裸小鼠的背侧腹区域中，并且在移植后第22天，给与小鼠2mg/kghu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物、2mg/kg hu8E11v2-vcPBD抗体-药物缀合物；或2mg/kg人源化抗gD 5B6-vcPBD对照抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)进行单次静脉内注射(n＝每组8只小鼠)。
如图33中所示，用2mg/kg hu8E11v2-vcMMAE实现了实质性肿瘤生长抑制作用，并且用2mg/kg hu8E11v2-vcPBD实现肿瘤消退。
U.抗LgR5抗体药物缀合物在LoVoX1.1结肠癌细胞系异种移植物中的功效
使用LoVoX1.1结肠癌异种移植模型研究抗LgR5ADC的功效。LoVo细胞是一种具有APC突变的结肠直肠腺癌细胞系(ATCC#CCL 229)，并且获得亚系LoVoX1.1以在小鼠体内实现最佳生长。简言之，用LoVo细胞接种小鼠。一旦肿瘤生长，即收集具有所需生长速率的肿瘤。切碎肿瘤并且使其在培养物中生长以产生细胞系LoVoX1.1。LgR5在LoVoX1.1细胞中表达，并且通过微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、FACS和蛋白质印迹确认。将500万个LoVoX1.1细胞于HBSS-基质胶中皮下注射于C.B-17SCID小鼠的背侧腹中，并且在接种后第11天，给与小鼠2mg/kghu8E11v2-vcMMAE抗体-药物缀合物、2mg/kg hu8E11v2-vcPBD抗体-药物缀合物；或2mg/kg人源化抗gD 5B6-vcPBD对照抗体-药物缀合物的单次静脉内注射；或用单独媒介物(组氨酸缓冲液：20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％吐温20，pH 5.5)进行单次静脉内注射(n＝每组10只小鼠)。在注射后第1天、第7天和第14天，通过PK取血来确认抗体的存在。
如图34中所示，用2mg/kg hu8E11v2-vcPBD实现了完全肿瘤生长抑制作用。
尽管出于清楚理解的目的已通过说明和实施例对上述本发明进行了相当详细的描述，但描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容都以全文引用的方式明确并入本文。

Claims (59)

1.一种结合LgR5的分离的抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO:67的氨基酸22-323内或SEQ ID NO:67的氨基酸22-123内的表位并且所述抗体结合LgR5的亲和力≤5nM。
2.如权利要求1所述的抗体，其为单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的抗体，其为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
4.如权利要求1所述的抗体，其为结合LgR5的抗体片段。
5.如权利要求1所述的抗体，其中LgR5为具有SEQ ID NO:67的人LgR5。
6.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3、包含氨基酸序列SEQ IDNO:29的HVR-L3和包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2；或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3、包含氨基酸序列SEQ IDNO:59的HVR-L3和包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2。
7.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:31的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3；或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:61的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3。
8.如权利要求7所述的抗体，其中所述抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:30的HVR-H1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3和：
a)重链框架FR3序列SEQ ID NO:40；
b)重链框架FR3序列SEQ ID NO:41；
c)重链框架FR3序列SEQ ID NO:42；或
d)重链框架FR3序列SEQ ID NO:43。
9.如权利要求7或权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HVR-H3、包含氨基酸序列SEQ IDNO:29的HVR-L3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HVR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3；或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的HVR-H3、包含氨基酸序列SEQ IDNO:59的HVR-L3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的HVR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。
10.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:28的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3；或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:58的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的HVR-L3。
11.如权利要求9或权利要求10所述的抗体，其中所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的HVR-L1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:28的HVR-L2和含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-L3，并且进一步包含轻链框架FR3序列SEQ ID NO:35。
12.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的VH序列；
b)与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的VL序列；
c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列；
d)与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少95％序列同一性的VH序列；
e)与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少95％序列同一性的VL序列；
f)如(d)中的VH序列和如(e)中的VL序列；
g)与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少95％序列同一性的VH序列；
h)与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少95％序列同一性的VL序列；
i)如(g)中的VH序列和如(h)中的VL序列；
j)与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的VH序列；
k)与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少95％序列同一性的VL序列；
l)如(j)中的VH序列和如(k)中的VL序列；
m)与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的VH序列；
n)与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的VL序列；
o)如(m)中的VH序列和如(n)中的VL序列；
p)与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的VH序列；
q)与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的VL序列；
r)如(p)中的VH序列和如(q)中的VL序列；
s)与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少95％序列同一性的VH序列；
t)与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少95％序列同一性的VL序列；
u)如(s)中的VH序列和如(t)中的VL序列；
v)与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少95％序列同一性的VH序列；
w)与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少95％序列同一性的VL序列；
x)如(v)中的VH序列和如(w)中的VL序列；
y)与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的VH序列；
z)与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的VL序列；或
aa)如(y)中的VH序列和如(z)中的VL序列。
13.如权利要求12所述的抗体，其包含选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20和26的VH序列。
14.如权利要求12或权利要求13所述的抗体，其包含选自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19和25的VL序列。
15.一种抗体，其包含：
a)VH序列SEQ ID NO:6和VL序列SEQ ID NO:5；
b)VH序列SEQ ID NO:8和VL序列SEQ ID NO:7；
c)VH序列SEQ ID NO:10和VL序列SEQ ID NO:9；
d)VH序列SEQ ID NO:12和VL序列SEQ ID NO:11；
e)VH序列SEQ ID NO:14和VL序列SEQ ID NO:13；
f)VH序列SEQ ID NO:16和VL序列SEQ ID NO:15；
g)VH序列SEQ ID NO:18和VL序列SEQ ID NO:17；
h)VH序列SEQ ID NO:20和VL序列SEQ ID NO:19；或
i)VH序列SEQ ID NO:26和VL序列SEQ ID NO:25。
16.如权利要求1至15中任一项所述的抗体，其为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。
17.分离的核酸，其编码如权利要求1至16中任一项所述的抗体。
18.一种宿主细胞，其包含如权利要求17所述的核酸。
19.一种产生抗体的方法，所述方法包括培养如权利要求18所述的宿主细胞以产生所述抗体。
20.一种免疫缀合物，其包含如权利要求1至16中任一项所述的抗体和细胞毒性剂。
21.如权利要求20所述的免疫缀合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：
(a)Ab是如权利要求1至15中任一项所述的抗体；
(b)L为接头；
(c)D为选自美登木素、奥里斯他汀、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓和奈莫柔比星衍生物的药物；并且
(d)p在1-8的范围内。
22.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中D为奥里斯他汀。
23.如权利要求22所述的免疫缀合物，其中D具有式DE
并且其中R2和R6各自为甲基，R3和R4各自为异丙基，R5为H，R7为仲丁基，各R8独立地选自CH3、O-CH3、OH和H；R9为H；并且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
24.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述药物为MMAE。
25.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中D为式A的吡咯并苯并二氮杂卓：
其中点线指示任选地在C1与C2或C2与C3之间存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且任选地进一步选自卤基或二卤基，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤基；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；
Q独立地选自O、S和NH；
R11为H或R，或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R'各自独立地选自任选取代的C1-8烷基、C3-8杂环基和C5-20芳基，并且任选地对于基团NRR'，R和R'连同其所连接的氮原子一起形成任选取代的4元、5元、6元或7元杂环；
R12、R16、R19和R17分别如对于R2、R6、R9和R7所定义；
R"为C3-12亚烷基，所述链可间杂有一个或多个杂原子和/或任选取代的芳环；并且
X和X'独立地选自O、S和N(H)。
26.如权利要求25所述的免疫缀合物，其中D具有以下结构：
其中n为0或1。
27.如权利要求25所述的免疫缀合物，其中D具有选自以下的结构：
其中RE和RE"各自独立地选自H或RD，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤基；
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选取代的C5-20芳基；并且
其中n为0或1。
28.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中D为式B的吡咯并苯并二氮杂卓：
其中水平波形线指示与所述接头共价连接的位点；
RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基、苯基、氟取代的苯基和C5-6杂环基；并且
n为0或1。
29.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中D为奈莫柔比星衍生物。
30.如权利要求29所述的免疫缀合物，其中D具有选自以下的结构：
31.如权利要求21至30中任一项所述的免疫缀合物，其中所述接头可由蛋白酶裂解。
32.如权利要求31所述的免疫缀合物，其中所述接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
33.如权利要求21至30中任一项所述的免疫缀合物，其中所述接头具有酸不稳定性。
34.如权利要求33所述的免疫缀合物，其中所述接头包含腙。
35.如权利要求23所述的免疫缀合物，其具有下式：
其中S为硫原子。
36.如权利要求26所述的免疫缀合物，其具有下式：
37.如权利要求30所述的免疫缀合物，其具有选自以下的式：
38.如权利要求21至37中任一项所述的免疫缀合物，其中p在2-5的范围内。
39.如权利要求21至38中任一项所述的免疫缀合物，其包含如权利要求9所述的抗体。
40.如权利要求21至38中任一项所述的免疫缀合物，其包含如权利要求15所述的抗体。
41.一种药物制剂，其包含如权利要求21至40中任一项所述的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
42.如权利要求41所述的药物制剂，其进一步包含其它治疗剂。
43.如权利要求42所述的药物制剂，其中所述其它治疗剂为(贝伐单抗)。
44.一种治疗患有LgR5阳性癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求21至40中任一项所述的免疫缀合物。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述LgR5阳性癌症选自结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌。
46.如权利要求45所述的方法，其进一步包括向所述个体施用其它治疗剂。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述其它治疗剂为(贝伐单抗)。
48.一种抑制LgR5阳性细胞增殖的方法，所述方法包括在容许如权利要求21至40中任一项所述的免疫缀合物结合所述细胞的表面上的LgR5的条件下使所述细胞暴露于所述免疫缀合物，由此抑制所述细胞的增殖。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述细胞为结肠直肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或子宫内膜癌细胞。
50.如权利要求1至16中任一项所述的抗体，其缀合标记。
51.如权利要求50所述的抗体，其中所述标记为正电子发射体。
52.如权利要求51所述的抗体，其中所述正电子发射体为89Zr。
53.一种检测生物样品中的人LgR5的方法，所述方法包括使所述生物样品与如权利要求1至16中任一项所述的抗LgR5抗体在容许所述抗LgR5抗体结合天然存在的人LgR5的条件下接触，以及检测在所述抗LgR5抗体与所述生物样品中的天然存在的人LgR5之间是否形成复合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述抗LgR5抗体是如权利要求9或权利要求15所述的抗体。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述生物样品为结肠直肠癌样品、胰腺癌样品、卵巢癌样品或子宫内膜癌样品。
56.一种检测LgR5阳性癌症的方法，其包括(i)向患有或疑似患有LgR5阳性癌症的受试者施用标记的抗LgR5抗体，其中所述标记的抗LgR5抗体包含如权利要求1至16中任一项所述的抗LgR5抗体，以及(ii)检测所述受试者体内的所述标记的抗LgR5抗体，其中检测到所述标记的抗LgR5抗体指示在所述受试者体内存在LgR5阳性癌症。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述标记的抗LgR5抗体是标记的如权利要求8或权利要求14所述的抗体。
58.如权利要求56或权利要求57所述的方法，其中所述标记的抗LgR5抗体包含缀合正电子发射体的抗LgR5抗体。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述正电子发射体为89Zr。
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