CN108273070A - 细胞和药物靶向转接结构及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疾病的细胞治疗和免疫治疗领域，具体涉及一种细胞和药物靶向转接结构及其制备与应用。本发明经过广泛而深入的研究提供了一种全新的应用于改善效应细胞作用特异性的细胞转接结构及提高效应细胞活性的方法，为细胞治疗和免疫治疗提供了一种全新的思路。

Description

细胞和药物靶向转接结构及其制备与应用
技术领域
本发明属于疾病的细胞治疗和免疫治疗领域，具体涉及一种细胞和药物靶向转接结构及其制备与应用。
背景技术
癌症作为一种恶性疾病严重威胁着人类的生命健康，目前针对癌症的治疗方法有放疗、化疗、免疫疗法等。随着科学技术的发展，免疫疗法使一小部分癌症病人的生存期延长，甚至有些得到治愈，尤其对于其他治疗方法已经不敏感的癌症病人，他们在接受免疫治疗后病情缓解，治疗效果显著。
正常情况下，人体免疫系统在被激活后就会特异性地识别杀伤癌细胞。但是在癌症病人体内，癌症的发生发展过程中发生了免疫逃逸。如何激活免疫系统重新发挥作用是治疗的关键，其中过继性T细胞免疫治疗得到了很大的发展。
基因工程化的T细胞的方法主要包括基因工程化T细胞受体和基因工程化嵌合抗原受体两种。T细胞受体技术主要是将病人的癌细胞和T细胞共培养，而后从与癌细胞发生反应的T细胞中克隆TCR基因，通过转染等使T细胞表达抗癌T细胞受体而后通过结合主要组织相容复合物递呈的肿瘤相关抗原激活T淋巴细胞发挥作用。嵌合抗原受体方法也是体外改造扩增使T细胞表达抗肿瘤的嵌合抗原受体，回输到病人体内与肿瘤相关抗原结合，激活T细胞分泌细胞因子发挥杀伤肿瘤细胞的作用。基因工程话的T细胞方法在治疗癌症方面发挥了很大的作用，但是操作复杂，成本高，只针对单一病患。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种细胞和药物靶向转接结构及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种细胞转接结构，为能特异性结合效应细胞的纳米粒，所述细胞转接结构以纳米粒为主体，所述纳米粒上连接有结合效应细胞表面抗原的蛋白。
需要说明的是所述纳米粒的粒径范围为50-1000nm均可。所述纳米粒的粒径范围还可以是80-100nm。并不限定为必须为100nm以下，也不限定为实施例中所列举的具体的粒径范围。
进一步地，所述效应细胞为T细胞。进一步地，所述T细胞为T淋巴细胞。
当效应细胞为T细胞时，所述结合效应细胞表面抗原的抗体可以是抗分化簇3抗体。
进一步地，所述效应细胞为干细胞。
当效应细胞为干细胞时，所述结合效应细胞表面抗原的抗体可以是细胞表面LGR5抗体或RSPO蛋白。
进一步地，所述纳米粒上除了连接有结合效应细胞表面抗原的蛋白，还连接有具有识别和靶向作用的抗体。
进一步地，所述具有识别和靶向作用特异性的抗体为肿瘤组织中高表达抗原的抗体。
例如，所述具有识别和靶向作用特异性的抗体可以是人转铁蛋白受体(transferrinreceptor)的抗体。
进一步地，所述具有识别和靶向作用特异性的抗体可以是抗前列腺癌细胞表面特异性膜抗原的抗体。
进一步地，所述纳米粒上连接有靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体以及识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例范围是(1～23)：(1～4)。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例范围是(1～23)：1。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例范围是(1～9)：1。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例范围是(1～4)：1。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例范围是(1～9)：(1～4)。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例范围是(1～4)：(1～4)。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例范围是1：(1～4)。
进一步地，每个纳米粒上连接的所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的个数比例可以是1:4、1:1、4:1、9:1或23:1。
进一步地，所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为15～200。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为15～120。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为15～60。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为15～30。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为30～200。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为30～120。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为30～60。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为60～200。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为60～120。所述纳米粒上连接的单链抗体的总个数为120～200。
进一步地，所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体为抗分化簇3单链抗体。亦即anti-CD3 scFv。可通过市购途径获得。
进一步地，所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体为抗前列腺癌细胞表面特异性膜抗原单链抗体。亦即anti-PSMA scFv。可通过市购途径获得。
进一步地，所述纳米粒内部可以包载药物，也可以不包载药物。当所述纳米粒内部包载药物时，所述药物可以选自有助于协助激活T淋巴细胞发挥免疫作用的药物或对癌细胞有抑制或者杀伤作用的药物。至于是否包载药物，是包载其中一类药物还是同时包载两类药物，可根据实际需求进行选择。例如，所述纳米粒还包载了提高效应细胞活性的药物。所述纳米粒包载的提高效应细胞活性的药物选自双磷酸盐化合物阿伦磷酸、帕米磷酸、内皮细胞受体激酶抑制尼达尼布nintedanib、转化生长因子-beta分泌抑制剂橙皮素Hesperetin、糖原合成激酶3抑制剂CHIR-99021或唑来膦酸。
进一步地，所述纳米粒为脂质纳米粒。本发明对于脂质纳米粒的成分没有特殊的限制。
如本发明的一些实施方式中所列举的，所述脂质纳米粒的组成成分可包括磷脂，胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物、连接所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体的脂质分子。
所述磷脂可以是氢化大豆卵磷脂。
一般地，所述磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物的摩尔比可以为(40～60)：(30～50)：(0.1～8)。
进一步地，所述靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与所述识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体分别与所述脂质纳米粒中的脂质分子连接。所述脂质分子带有马来酰亚胺基团。所述单链抗体分别与脂质分子的马来酰亚胺基团连接。所述单链抗体分别与脂质分子通过硫醚键连接。
本发明的第二方面，提供前述细胞转接结构的制备方法，包括如下步骤：
(1)将靶向效应细胞表面特异性膜抗原的抗体与带有特定基团的脂质衍生物反应制备抗效应细胞表面特异性膜抗原的抗体修饰的脂质衍生物；
(2)将识别和靶向靶细胞表面特异性膜抗原的抗体与带有特定基团的脂质衍生物反应制备抗靶向靶细胞表面特异性膜抗原的抗体修饰的脂质衍生物；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的脂质衍生物与脂质纳米粒混合，获得细胞转接结构。
上述方法中所使用的脂质纳米粒可以是本领域技术人员已经制备好的脂质纳米粒，也可以使用者自己制备。例如可采用薄膜分散法或乙醇注入法进行制备。
进一步地，所述步骤(2)中，所述特定基团为马来酰亚胺。可用还原剂等方法处理抗体使其与脂质衍生物中的特定基团结合，如用TCEP还原使抗体中暴露的巯基更好地与带有马来酰亚胺的脂质衍生物结合。
进一步地，所述步骤(3)中，所述特定基团为马来酰亚胺。可用还原剂等方法处理抗体使其与脂质衍生物中的特定基团结合，如用TCEP还原使抗体中暴露的巯基更好地与带有马来酰亚胺的脂质衍生物结合。
进一步地，步骤(3)中，混合时，可使用混匀仪在37摄氏度下孵育24小时。
在一种实施方式中，所述制备方法，包括如下步骤：
(1)将靶向T淋巴细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与带有特定基团的脂质衍生物反应制备抗T淋巴细胞表面特异性膜抗原单链抗体修饰的脂质衍生物；
(2)将识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与带有特定基团的脂质衍生物反应制备抗癌细胞表面特异性膜抗原单链抗体修饰的脂质衍生物；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的脂质衍生物与脂质纳米粒混合，获得细胞转接结构。
在另外一种实施方式中，所述制备方法，包括如下步骤：
(1)将靶向干细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与带有特定基团的脂质衍生物反应制备抗干细胞表面特异性膜抗原单链抗体修饰的脂质衍生物；
(2)将识别和靶向癌细胞表面特异性膜抗原的单链抗体与带有特定基团的脂质衍生物反应制备抗癌细胞表面特异性膜抗原单链抗体修饰的脂质衍生物；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的脂质衍生物与脂质纳米粒混合，获得细胞转接结构。
本发明的第三方面，提供前述细胞转接结构在制备效应细胞活性促进剂中的用途。
在一种列举的实施方式中，提供前述细胞转接结构在制备T细胞活性促进剂中的用途。
所述T细胞活性促进剂能提高T细胞的效应功能和/或提高T细胞对靶细胞的杀伤能力。如本发明实施例所列举的，所述T细胞活性促进剂能提高T淋巴细胞或gamma delta T细胞的效应功能，也能提高T细胞或gamma delta T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
另外，效应细胞还可以是干细胞。
在在一种列举的实施方式中，提供前述细胞转接结构在制备干细胞活性促进剂中的用途。
所述干细胞活性促进剂能提高干细胞的效应功能和/或提高干细胞对靶细胞的杀伤能力。如本发明实施例所列举的，所述干细胞活性促进剂能提高干细胞的效应功能，也能提高干细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。所干细胞可以是诱导性多能干细胞(IPS细胞)。
本发明的第四方面，提供前述细胞转接结构用于提高效应细胞活性的用途。
在一种列举的实施方式中，提供前述细胞转接结构用于提高T细胞活性的用途。
提高T细胞活性包括但不限制于提高T细胞的效应功能。进一步地，所述提高T细胞活性包括提高T细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
在一种列举的实施方式中，所述T细胞可以是T淋巴细胞或gamma delta T细胞。通过将前述细胞转接结构与T淋巴细胞或gamma delta T细胞孵育，使得前述细胞转接结构与T淋巴细胞结合，提高了T淋巴细胞的效应功能，进而提高了T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤能力。该用途亦可被认为是一种提高T淋巴细胞的效应的用途或提高淋巴细胞杀伤能力的用途。
另外，效应细胞还可以是干细胞。
在一种列举的实施方式中，提供前述细胞转接结构用于提高干细胞活性的用途。
提高干细胞活性包括但不限制于提高干细胞的效应功能。进一步地，所述提高干细胞活性包括提高干细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
在一种列举的实施方式中，所述干细胞可以是诱导性多能干细胞(IPS细胞)。通过将前述细胞转接结构与诱导性多能干细胞(IPS细胞)孵育，使得前述细胞转接结构与诱导性多能干细胞(IPS细胞)结合，提高了诱导性多能干细胞(IPS细胞)的效应功能，进而提高了诱导性多能干细胞(IPS细胞)的肿瘤细胞杀伤能力。该用途亦可被认为是一种提高诱导性多能干细胞(IPS细胞)的效应的用途或提高诱导性多能干细胞(IPS细胞)杀伤能力的用途。
本发明的第五方面，提供一种提高效应细胞活性的方法，包括步骤：将前述细胞转接结构与效应细胞结合从而提高效应细胞活性。
例如可将所述细胞转接结构与效应细胞混合孵育，制备具有细胞治疗作用的细胞。
又例如可将所述细胞转接结构注射入体内，在体内提高效应细胞的活性。
在一种列举的实施方式中，提供一种提高T细胞活性的方法，包括步骤：将前述细胞转接结构与T细胞结合从而提高T细胞活性。
提高T细胞活性包括但不限制于提高T细胞的效应功能。进一步地，所述提高T细胞活性包括提高T细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
在一种列举的实施方式中，所述T细胞可以是T淋巴细胞或gamma delta T。通过将前述细胞转接结构与T淋巴细胞或gamma delta T孵育，使得前述细胞转接结构与T淋巴细胞或gamma delta T结合，提高了T淋巴细胞或gamma delta T的效应功能，进而提高了T淋巴细胞或gamma delta T的肿瘤细胞杀伤能力。该方法亦可被认为是一种提高T淋巴细胞或gamma delta T的效应功能的方法或提高T淋巴细胞或gamma delta T杀伤能力的方法。
在另外一种实施方式中，所述干细胞可以是诱导性多能干细胞(IPS细胞)。通过将前述细胞转接结构与诱导性多能干细胞(IPS细胞)孵育，使得前述细胞转接结构与诱导性多能干细胞(IPS细胞)结合，提高了诱导性多能干细胞(IPS细胞)的效应功能，进而提高了诱导性多能干细胞(IPS细胞)的肿瘤细胞杀伤能力。该方法亦可被认为是一种提高诱导性多能干细胞(IPS细胞)的的效应功能的方法或提高诱导性多能干细胞(IPS细胞)杀伤能力的方法。
所述的提高T或干细胞细胞活性的方法可以是体内的或体外的。
采用本发明的方法体外处理后活性提高的T细胞或干细胞可被用于治疗的或非治疗的目的。
本发明的第六方面，提供一种结合了前述细胞转接结构的T细胞或干细胞。
所述T细胞可以是T淋巴细胞或gamma delta T细胞。所述干细胞可以是诱导性多能干细胞(IPS细胞)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究提供了一种全新的应用于提高效应细胞活性的细胞转接结构及提高效应细胞活性的方法，为肿瘤免疫治疗提供了一种全新的思路。
附图说明
图1：细胞转接结构的结构示意图。
图2：细胞转接结构介导T淋巴细胞特异性识别杀伤癌细胞示意图。
图3A：抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)活性检测。
图3B：抗前列腺癌细胞特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)活性检测。
图4A：通过SDS-PAGE凝胶电泳检测抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)的聚乙二醇脂质衍生物的合成效率结果图。
图4B：抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物的合成效率结果图。
图5A：荧光纳米粒因表面连接了抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)后与T淋巴细胞的亲和性流式结果图。
图5B：荧光纳米粒因表面连接了抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)后与T淋巴细胞的亲和性平均荧光强度图。
图6A：荧光纳米粒因表面连接了抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMAscFv)后与前列腺癌细胞亲和性流式结果图。
图6B：荧光纳米粒因表面连接了抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMAscFv)后与前列腺癌细胞亲和性平均荧光强度图。
图7A：表示荧光纳米粒表面无单链抗体时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图。
图7B：表示荧光纳米粒表面只连接了anti-PSMA scFv时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图。
图7C：表示荧光纳米粒表面只连接了anti-CD3 scFv时；如图7D表示荧光纳米粒表面连接了anti-CD3 scFv和anti-PSMA scFv时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图。
图7D：表示荧光纳米粒表面连接了anti-CD3 scFv和anti-PSMA scFv时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图。
图8：细胞转接结构介导的人T淋巴细胞对于癌细胞杀伤结果。
图9：不同剂量下脂质纳米粒制剂上anti-PSMA scFv个数对制剂和LNCaP细胞结合效率的影响。
图10：不同剂量下脂质纳米粒制剂上anti-CD3 scFv个数对制剂和Jurkat细胞结合效率的影响。
图11：当后插scFv个数为200时，不同剂量下，各组实验制剂孵育的T细胞对LNCAP癌细胞的杀伤作用。
图12：包载药物后不同组别孵育的T细胞对LNCaP癌细胞的杀伤作用。
图13：包载药物后不同组别孵育的T细胞对LNCaP癌细胞的杀伤作用。
图14：载药浓度的唑来膦酸脂质体促进gamma delta T细胞亚群扩展。
图15：加了转接头的gamma delta T对靶细胞的杀伤作用大大提高。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验试剂和细胞
抗分化簇3单链抗体anti-CD3 scFv(Atagenix公司)，抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(杭州高田生物医药有限公司)，胆固醇(日本TCI公司，C0318)，HSPC(德国lipoid公司)，EPC(日本油脂公司)，DSPE-PEG2000(德国lipoid公司)，DSPE-PEG2000-Maleimide(日本油脂公司)，Tcep(美国Pierce公司)，DiI荧光染料(美国Sigma公司)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)(碧云天生物技术研究所)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所)，考马斯亮蓝染色液(碧云天生物技术研究所)，预染蛋白质分子量标准(美国ThermoFisher Scientific公司)，DMSO(美国Sigma公司)，。RPMI1640高糖培养基(BI公司)，胎牛血清(BI公司)，胰酶(GIBCO公司)，青霉素-链霉素双抗试剂(GIBCO公司)，Ficoll-PaquePREMIUM试剂(美国GE Healthcare公司)，MojoSortTMHuman CD3 T Cell Isolation Kit(美国Biolegend公司)，Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(美国Promega公司)。
人前列腺癌细胞LNCaP clone FGC细胞、人前列腺癌细胞PC-3细胞和人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat Clone E6-1细胞均购自中国科学院上海细胞所。
实验仪器
SDS-PAGE电泳仪(美国Bio-Rad公司)
100KD超滤管(美国Millipore公司)
细胞培养瓶、培养板(美国BD FALCON公司)
恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)
微量进样针(上海高鸽工贸有限公司)
旋转蒸发设备(上海鲁伊工贸有限公司)
Extruder挤出仪：美国Avanti公司
ZetaSizer 3000HAS激光散射粒度分析仪：美国Malvern公司
脱色摇床：海门市其林贝尔仪器制造有限公司
恒温混匀仪：德国Eppendorf公司
Milli-Q型纯水仪：美国Millipore公司
BS2101S电子天平：Sartorius公司
JA2002天平：上海精天电子仪器厂
CyberScan 510pH计：上海科学仪器公司
水浴超声仪：昆山市超声仪器有限公司
酶标仪：美国Bio-Tek Instrument公司
低温-30℃冰箱：青岛海尔特种电器有限公司
灭菌锅：上海博迅实业有限公司
移液器(2μl～1ml)(美国Thermo Fisher Scientific公司)
倒置显微镜：中国江南仪器厂
Eppendorf离心机(德国Eppendorf公司)
实施例1
脂质体(liposomes)是人工制备的由脂质分子形成的双分子层囊泡。脂质分子的结构通常由亲水头部、疏水尾部及连接部分三个部分组成。在水的介质中，由于疏水相互作用，脂质分子的疏水尾部相互靠近，亲水头部面向水相定向排列，形成双分子层。基于这样的结构，既可以在脂质体内部水相中(内水相)包载亲水性药物，也可以在脂质双层膜中嵌入疏水性药物。
1、HSPC/CHOL普通脂质纳米粒和荧光HSPC/CHOL脂质纳米粒的制备
1)取氢化大豆卵磷脂(HSPC)5.9mg，胆固醇(Chol)2.1mg，DSPE-PEG(2000)1.2mg溶于1ml氯仿中，若制备荧光脂质纳米粒，需另加DiI荧光染料氯仿储备液(2mg/ml)0.1mg(50ul)，采用薄膜分散法，使用旋转蒸发仪在60℃水浴中挥干氯仿，此处方用于制备含3％(摩尔比)聚乙二醇结构的脂质纳米粒，后续会后插2％(摩尔比)的DSPE-PEG2000-scFv胶束从而使得制备的脂质纳米粒的表面含有5％(摩尔比)聚乙二醇结构从而达到脂质纳米粒体内长循环的目的。
2)加入1ml的PBS缓冲液，水合1h，60℃水浴下超声0.5h，形成均匀的的乳状液体。
3)水浴超声至半透明后，使用Avanti挤出仪将脂质体分别过100nm聚碳酸酯膜30次和50nm聚碳酸酯膜40次，以控制粒径，制得HSPC/CHOL普通/荧光脂质纳米粒。
2、单链抗体活性检测
1)抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)活性检测
准备Jurkat细胞(细胞数为2×105个/管)实验组(Jurkat细胞2×105个/管)、正对照组(Jurkat细胞2×105个/管)、Control组(Jurkat细胞2×105个/管)，实验组加入2ug抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)，4℃孵育0.5小时后加入1test的Anti-his FITC，4℃再孵育0.5小时后上流式；正对照组加入1test的anti-his FITC后4℃孵育0.5小时后上流式；Control组加入等体积的PBS缓冲液4℃孵育0.5小时后上流式。检测结果如图3A所示，相比于Control组，正对照组与实验组均显示阳性结果，说明抗分化簇3单链抗体(anti-CD3scFv)活性符合要求。
2)抗前列腺癌细胞特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)活性检测
准备LNCaP细胞(细胞数为2×105个/管)实验组(LNCaP细胞2×105个/管)、正对照组(LNCaP细胞2×105个/管)、阴性对照组(PC-3细胞2×105个/管)、Control组(LNCaP细胞2×105个/管)，实验组加入2ug抗前列腺癌细胞特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)，4℃孵育0.5小时后加入1test的Anti-his PE，4℃再孵育0.5小时后上流式；正对照组加入1test的anti-his PE后4℃孵育0.5小时后上流式；阴性对照组加入1test的anti-his PE后4℃孵育0.5小时后上流式；Control组加入等体积的PBS缓冲液4℃孵育0.5小时后上流式。检测结果如图3B所示，相比于Control组，正对照组与实验组均显示阳性结果，而阴性组与Control组无显著差别，说明抗前列腺癌细胞特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)活性符合要求。
3、抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物的制备
1)取适量抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)；
2)加入还原剂TCEP还原anti-CD3 scFv上用于连接的巯基(anti-CD3 scFv与TCEP之间的摩尔比例为1：5)，室温下还原45min。
3)将还原后的anti-CD3 scFv与DSPE-PEG2000-Maleimide胶束溶液(300mM)按照摩尔比1：10的比例混合，在混匀仪10℃混匀16小时，从而制备成抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物。
4)如图4A所示，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)的聚乙二醇脂质衍生物的合成效率。
4、抗前列腺癌特异性膜抗原(anti-PSMA scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物的制备
1)取适量抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)。
2)加入还原剂TCEP用于还原anti-PSMA scFv上用于连接的巯基(anti-PSMA scFv与TCEP之间的摩尔比例为1：15)，室温下还原45min。
3)将还原后的anti-PSMA scFv与DSPE-PEG2000-Maleimide胶束溶液(300mM)按照摩尔比1：3的比例混合，在混匀仪10℃混匀16小时，从而制备成抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物。
4)如图4B所示，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物的合成效率。
5、抗分化簇3单链抗体修饰的荧光脂质纳米粒的制备与活性检测
1)将上述3中制备的抗分化簇3单链抗体修饰的聚乙二醇脂质衍生物(anti-CD3scFv)按照2％的摩尔比例后插入至上述1中制备的荧光脂质纳米粒中，另外加入未修饰的聚乙二醇脂质衍生物使最终后插到脂质体上的聚乙二醇脂质衍生物的量占脂质体的5％(摩尔比)，从而起到体内长循环脂质体的目的。将此三者混合后，在混匀仪上37℃混匀24小时。
2)之后用0.5ml，100KD超滤管超滤5次以除去多余的游离的单链抗体(anti-CD3scFv)以及少量未后插到脂质体上的单链抗体(anti-CD3 scFv)修饰和未修饰的聚乙二醇脂质衍生物，从而制备出抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)修饰的荧光脂质体。
3)取不同量的2)中制备的抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)修饰的荧光脂质纳米粒(按照其中所含质纳米粒的质量分为不同组：0.1ug组、0.2g组、0.5ug组、1ug组、2ug组、5ug组)和对照组荧光脂质纳米粒分别与Jurkat细胞孵育0.5小时，之后用PBS洗三次上流式细胞仪。流式结果图如图5A所示，实验组的荧光纳米粒因表面连接了抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)可以和Jurkat细胞结合，从而实现细胞与荧光脂质纳米粒的间接结合，而对照组纳米粒上并没有单链抗体，所以通过流式就可以检测出结合了荧光纳米粒的实验组细胞相比于对照组发生了荧光偏移，且如图5B所示，平均荧光强度更高。
6、抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)修饰的荧光脂质纳米粒的制备与活性检测
1)采用后插的方法，将上述4中制备的抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物按照1％的摩尔比例后插入至上述1中制备的荧光脂质体，另外加入未修饰的聚乙二醇脂质衍生物使最终后插到脂质体上的聚乙二醇脂质衍生物的量占脂质体的5％(摩尔比)，从而起到体内长循环的脂质体的目的。将此三者混合后，在混匀仪上37℃混匀24小时。
2)之后用0.5ml，100KD超滤管超滤5次以除去多余的游离的单链抗体以及少量未后插到脂质体上的单链抗体修饰的和未修饰的聚乙二醇脂质衍生物，从而制备出抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)修饰的荧光脂质纳米粒。
3)取不同量的2)中制备的抗前列腺癌细胞特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMAscFv)修饰的荧光脂质纳米粒(按照其中所含质纳米粒的质量分为不同组：0.1ug组、0.2g组、0.5ug组、1ug组、2ug组、5ug组)和对照组荧光脂质纳米粒分别与LNCaP细胞孵育0.5小时，之后用PBS洗三次上流式细胞仪。流式结果图如图6A所示，实验组的荧光纳米粒因表面连接了抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体(anti-PSMA scFv)可以和LNCaP细胞结合，从而实现细胞与荧光脂质纳米粒的间接结合，而对照组纳米粒上并没有单链抗体，所以通过流式就可以检测出结合了荧光纳米粒的实验组细胞相比于对照组发生了荧光偏移，且如图6B所示，平均荧光强度更高。
7、抗分化簇3单链抗体修饰/抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体修饰脂质纳米粒的制备--亦即，T细胞转接结构的制备
1)将制备的抗分化簇3单链抗体修饰的脂质衍生物、抗前列腺癌细胞特异性膜抗原单链抗体修饰的脂质衍生物与上述1中制备的荧光脂质纳米粒混合，混匀仪37℃混匀24小时。
2)用0.5ml，100KD超滤管超滤5次以除去多余的游离的单链抗体以及少量未后插到脂质体上的单链抗体修饰的和未修饰的聚乙二醇脂质衍生物。
8、结合了T细胞转接结构的T细胞与LNCaP细胞结合
1)提前一天将LNCaP细胞制成细胞悬液，而后将细胞悬液铺在激光共聚焦显微镜专用的培养皿中，第二天细胞即能贴壁待用。
2)取适量Jurkat细胞，用CFSE染色后制备成细胞悬液，加入上述7中制备的荧光T细胞转接结构，4℃孵育2小时，孵育的过程即T细胞上的分化簇3抗原和T细胞转接结构上的抗分化簇单链抗体(anti-CD3 scFv)结合，而T细胞转接结构仍具有未结合的抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体，从而结合PSMA阳性的前列腺癌细胞LNCaP细胞，所以此时T细胞和T细胞转接结构连接成的组合物既有已激活的T细胞的作用又具有靶向前列腺癌细胞的作用，而后用PBS洗两次后成细胞悬液待用。
3)将2)中得到的T细胞-双靶向脂质体组合物加入到事先铺板的LNCaP细胞中，在激光共聚焦显微镜下观察T细胞-T细胞转接结构组合物与LNCaP细胞结合，细胞结合图像如图7A表示荧光纳米粒表面无单链抗体时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图；如图7B表示荧光纳米粒表面只连接了anti-PSMA scFv时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图；如图7C表示荧光纳米粒表面只连接了anti-CD3 scFv时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图；如图7D表示荧光纳米粒表面连接了anti-CD3 scFv和anti-PSMA scFv时与T淋巴细胞及癌细胞的结合图，所有荧光纳米粒均用DiI标记在图中显示为红色，而T细胞用CFSE染色在图中显示为绿色。可以看到图7A中荧光纳米粒表面无单链抗体时无法与两种细胞结合，图7B中荧光纳米粒表面只连接了anti-PSMA scFv时无法与T细胞结合，在与T细胞孵育后被PBS洗掉无法与第二步孵育中的LNCaP细胞结合。图7C中荧光纳米粒表面只连接了anti-CD3 scFv时可以与T细胞结合，但是在第二步和LNCaP细胞的孵育中因表面无anti-PSMA scFv所以不能与LNCaP细胞结合，而只发生T细胞之间的相互结合。图7D中荧光纳米粒表面连接了anti-CD3 scFv和anti-PSMA scFv时，因表面连接有两种抗体，所以在第一步和T细胞的孵育中得以和T细胞结合，PBS洗后又可以和第二步孵育的LNCaP细胞结合，正如图中绿色细胞边缘为红色且和为染色的LNCaP细胞结合。
9、在抗分化簇3单链抗体修饰/抗前列腺癌特异性膜抗原单链抗体修饰的T细胞转接结构介导下，人T淋巴细胞对于前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用
1)制备T细胞转接结构制剂，共准备4组，分别为无单链抗体组、anti-CD3组、anti-PSMA组、anti-CD3 anti-PSMA(T细胞转接结构)组，本实施例中，无单链抗体组中每个脂质纳米粒上含0个scFv，anti-CD3组中每个脂质纳米粒上含60个anti-CD3 scFv，anti-PSMA组中每个脂质纳米粒上含有60个anti-PSMA scFv，anti-CD3 anti-PSMA组(T细胞转接结构)为组系，在此组系中设置了不同anti-CD3 scFv与anti-PSMA scFv比例组，以120个为总连接数，按照如下个数比例anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv＝1:4，1:1，4:1，9:1，23:1以探究每个脂质纳米粒上两种scFv的最佳比例组合。补充说明：对于每个纳米粒上连接多少个单链抗体，本发明在前期做过探索，在本实施例中按照每个脂质体上单链抗体连接120个为基准，单种单链抗体转接头单链抗体连接数按照60个为基准，具体计算方法按照脂质纳米粒粒径参照脂质纳米粒个数计算方法，这里不再赘述。
2)抽取新鲜血液样品，用Ficoll试剂分离出人外周血细胞(PBMC)，而后用MojoSortTMHuman CD3 T Cell Isolation Kit(美国Biolegend公司)分离出T淋巴细胞，备用。
3)将前列腺癌细胞制成细胞悬液，铺96孔板，每孔10000个LNCaP细胞，过夜培养使前列腺癌细胞充分贴壁，备用。
4)将2)中分离的的T淋巴细胞分组，每组5 104个T淋巴细胞，然后各组T淋巴细胞加入10ug/1ug不同组别的T细胞转接结构共孵育，在4℃下孵育2小时，而后用PBS洗三次，全程在4℃下操作，即得到结合了T细胞转接结构的T淋巴细胞，备用。
5)将制备好的结合了T细胞转接结构的T淋巴细胞按照组别和剂量加入铺好LNCaP细胞的96孔板中，每孔加入5×104的结合了T细胞转接结构的人T淋巴细胞，之后37℃培养24小时。
6)按照CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒的要求，测量经过24小时培养后每组实验中LDH的释放量，从而可以得到相同数目的T淋巴细胞在结合了相同数量但不同组别的转接头后对于杀伤前列腺癌细胞的效果，结果如图8所示，无单链抗体组即(0×0)Peg×peg组基本无杀伤效果；anti-PSMA组即(0×60)aPSMA×peg组基本无杀伤效果；anti-CD3组即(60×0)aPSMA×peg组因激活了T淋巴细胞而具有一定的杀伤效果；anti-CD3×anti-PSMA组系列即(*×*)aPSMA×aCD3组系列既激活了T淋巴细胞，又对癌细胞具有靶向识别作用，所以杀伤效果最好。具体地，均以10ug的脂质纳米粒来看：当每个脂质纳米粒上anti-CD3scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为0:0时，杀伤率为0.99％；当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为60:0时，杀伤率为33.65％；当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为0:60时，杀伤率为19.41％；当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为1:4时，杀伤率为28.53％；当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为1:1时，杀伤率为40.62％；当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为4:1时，杀伤率为39.45％；当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为9:1时，杀伤率为35.89％；当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为23:1时，杀伤率为32.87％。
亦即，当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为(1～23)：(1～4)时，杀伤率均在28.53％以上。当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMAscFv的个数比例为(1～23):1时，杀伤率均在32.87％以上。当每个脂质纳米粒上anti-CD3scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为(1～9)：1时，杀伤率均在35.89％以上。当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为(1～4)：1时，杀伤率均在39.45％以上。当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为(1～9)：(1～4)时，杀伤率均在28.53％以上。当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMA scFv的个数比例为(1～4)：(1～4)时，杀伤率均在28.53％以上。当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv:anti-PSMAscFv的个数比例为1：(1～4)时，杀伤率均在28.53％以上。当每个脂质纳米粒上anti-CD3 scFv和anti-PSMA scFv的个数比为1：1(也就是分别60个)时候的杀伤效果最好，杀伤率为40.62％。
10、关于每个脂质体上后插scFv总个数对于该细胞转接结构的影响考察
(1)通过粒径计算每个脂质体含有的脂质分子数，进而计算一定质量的脂质对应制备成的脂质体的个数，本实施例中使用的scFv的相对分子质量为32KD，进行可以计算一定质量的scFv对应的总个数；
(2)将制备的连有单链抗体的脂质衍生物后插到带有荧光标记的脂质体中，按照不同的后插比例，分别制备各实验组，使各实验组中脂质纳米粒上后插的scFv的总个数分别是0个，15个，30个，60个，120个；
(3)将制备的不同组别的制剂分别与靶细胞在37℃孵育0.5h，用PBS洗三次后通过流式检测不同组别的荧光制剂和靶细胞的结合情况，如图9和图10。
根据流式检测的不同组别的平均荧光强度，确定每个脂质纳米粒上连接的scFv的适宜总个数。在实验中选用120个总scFv后插个数，收到了较好的效果；另外，还尝试了总后插个数为200个的实验，实验结果如图11所示。
11、通过在脂质纳米粒中包载药物，协助T细胞杀伤癌细胞
(1)制备包载了熊果酸的脂质纳米粒，在脂质纳米粒表面后插anti-CD3 scFv和anti_PSMA scFv，按照脂质纳米粒上的scFv的后插情况，将制剂分为四组，第一组为对照组：脂质纳米粒表面未连接scFv，只含有5％的DSPE-PEG2000,第二组实验组：每个脂质纳米粒表面连接了60个anti-CD3 scfv，第三组为实验组：每个脂质纳米粒表面连接了60个anti-PSMA scfv，第四组为实验组：制剂中每个脂质纳米粒表面了既连接了60个anti-CD3scfv又连接了60个anti-PSMA scFv；
(2)按照上述9中的方法，这次的孵育时间为34h，得到如图12以及图13所示的细胞杀伤图。
由此可知，相比于不载药的制剂，杀伤率更高，杀伤效果更好。
本发明的发明人继续研究发现，采用了其他组分及配比的脂质纳米粒，只要粒径范围为50-1000nm范围，进一步为80-100nm，均取得了与本实施例相一致的试验结论。
实施例2 gamma delta T细胞为效应细胞
冻干水合法制备唑来膦酸Zoledronic acid脂质体制剂：
称取处方量比例的EPC/HSPC/PA、Chol溶于叔丁醇中并置于冻干瓶中，70度水浴加热充分混合溶解，再置于冷冻干燥机中冻干24h，得到各处方比例的冻干粉，使用时加入唑来膦酸进行水合，调节pH为7－8左右，在70度水浴加热下依次通过400nm、200nm、100nm、80nm的聚餐脂膜挤出仪，控制粒径，得到120nm左右的脂质体，通过超速离心法分离游离未被包裹在脂质体内的药物溶液。
取适量抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)，加入还原剂TCEP还原anti-CD3scFv上用于连接的巯基(anti-CD3 scFv与TCEP之间的摩尔比例为1：5)，室温下还原45min，将还原后的anti-CD3 scFv与DSPE-PEG2000-Maleimide胶束溶液(300mM)按照摩尔比1：10的比例混合，在混匀仪10℃混匀16小时，从而制备成抗分化簇3单链抗体(anti-CD3 scFv)修饰的聚乙二醇脂质衍生物。通过SDS-PAGE凝胶电泳检测抗分化簇3单链抗体(anti-CD3scFv)的聚乙二醇脂质衍生物的合成效率。
取适量抗人血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)的单链抗体(anti-VEGFR scFv)，加入还原剂TCEP还原N端用于连接的巯基，室温下孵育45min后，与DSPE-PEG2000-Maleimide胶束溶液(300mM)按照摩尔比1：2的比例混合，孵育10小时，制备成VEGFR抗体修饰的聚乙二醇脂质衍生物。
将上述修饰的聚乙二醇脂质衍生物按照各1％的摩尔比例后插入至唑来膦酸脂质体中，即获得gamma delta T细胞的增效纳米转接头。
如图14所示，载药浓度的唑来膦酸脂质体(亦即gamma delta T细胞的增效纳米转接头)，与健康志愿者PBMC中的CD3+细胞共孵育后，其促进其中的gamma delta T细胞亚群扩展的作用。
gamma delta T细胞是人体自身防御中非常重要的免疫效应细胞，本发明中装载的唑来膦酸能够促进其扩增，VEGFR抗体则能提高其与体内新生血管组织和高表达细胞的作用。如图15所示，加了转接头的gamma delta T细胞对靶细胞的杀伤作用大大提高，达到了近100％。
与现有技术中的用于修饰T细胞的方法例如Cart技术相比，本发明的技术方案只需要将细胞转接结构与T细胞结合即可提高T细胞的活性如提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，不仅操作简单安全，而且具有与现有技术相比更好的对肿瘤细胞的杀伤效果。
实施例3诱导性多能干细胞为效应细胞
诱导性多能干细胞(IPS细胞)在生物治疗中的应用日益广泛，是一种由哺乳动物成体细胞经转入转录因子等手段脱分化形成的多能干细胞，我们在细胞的培养液中加入了分别连接了LGR5抗体片段和转铁蛋白受体的抗体片段的纳米脂质体，并且在脂质体中载入GSK—2抑制剂CHIR99021。
乙醇注入法制备CHIR99021脂质体制剂：EPC/Chol/CHIR99021以6:2:1的比例溶于乙醇，70度水浴加热充分混合溶解，缓慢滴入水溶液中，调节pH为7－8左右，在70度水浴加热下依次通过200nm、100nm、50nm的膜挤出仪，控制粒径，得到100nm左右的脂质体。
取适量anti-LGR5scFv，加入还原剂TCEP还原巯基(anti-LGR5scFv与TCEP之间的摩尔比例为1：10)，将还原后的anti-LGR5scFv与DSPE-PEG2000-Maleimide胶束溶液(300mM)按照摩尔比1：10的比例混合，4℃孵育16小时，通过SDS-PAGE凝胶电泳验证anti-LGR5scFv聚乙二醇脂质衍生物的合成效率。同理，取适量转铁蛋白受体抗体TfR抗体，与DSPE-PEG2000-Maleimide胶束溶液(300mM)按照摩尔比1：3的比例混合，孵育10小时，制备成TfR-聚乙二醇脂质衍生物。
将上述修饰的聚乙二醇脂质衍生物按照各1％的摩尔比例后插入至CHIR99021脂质体中，用100K分子量的超滤膜透析纯化纳米转接头，冻干后4度保存。
为了检测纳米转接头的活性，我们采用MG-63成骨前体细胞系作为模型，将纳米制剂用DMEM培养液水合后，加入MG63培养板，使CHIR9902的浓度为1uM，在37℃,5％CO2,100％湿度的条件下孵育1小时和6小时后，分别收获细胞加入TRIZOL试剂，按试剂盒要求操作提取mRNA，反转录成cDNA，PCR检测Axin2的表达，并用Beta-actin的表达作为对照。
在纳米粒的作用下，Axin2作为WNT通路活化的指标，其mRNA的表达相对Beta-actinmRNA都有明显的增加，在一小时孵育后的增加值平均为6.7倍，6小时后平均为4.8倍。
进一步地，我们还用Lipofetamine转染MG63细胞获得了GFP表达的MG63细胞，并将其与纳米粒共赋予后加入Transwell细胞培养板的上层，在细胞培养板的下层为表面高表达转铁蛋白受体的脑胶质瘤细胞系LN229，孵育4小时，8小时，12小时，24小时后观察下层LN229细胞腔中的GFP荧光强度。初步研究结果显示，相对于没有加入纳米粒的MG63和LN229共孵育的细胞板，加入纳米粒后，Transwell下层的GFP荧光强度有显著的增加。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<120> 细胞和药物靶向转接结构及其制备与应用
<130> 181120
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctgtattc ccctccatcg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagttggta acaatgcctg t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgactctcct tccagatccc a 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcccacact aggctgaca 19

Claims (18)

1.一种细胞转接结构，其特征在于，为能特异性结合效应细胞的纳米粒，所述细胞转接结构以纳米粒为主体，所述纳米粒上连接有结合效应细胞表面抗原的蛋白。
2.根据权利要求1所述的细胞转接结构，其特征在于，所述效应细胞为T细胞或干细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞转接结构，其特征在于，所述结合效应细胞表面抗原的抗体为抗分化簇3抗体。
4.根据权利要求1所述的细胞转接纳米粒，其特征在于，所述结合效应细胞表面抗原的抗体为细胞表面LGR5抗体或RSPO蛋白。
5.根据权利要求1所述的细胞转接结构，其特征在于，所述纳米粒上除了连接有结合效应细胞表面抗原的蛋白，还连接有具有识别和靶向作用的抗体。
6.根据权利要求5所述的细胞转接结构，其特征在于，所述具有识别和靶向作用特异性的抗体为肿瘤组织中高表达抗原的抗体。
7.根据权利要求5所述的细胞转接结构，其特征在于，所述具有识别和靶向作用特异性的抗体为人转铁蛋白受体(transferrin receptor)的抗体。
8.根据权利要求5所述的细胞转接结构，其特征在于，所述具有识别和靶向作用特异性的抗体为抗前列腺癌细胞表面特异性膜抗原的抗体。
9.根据权利要求1所述的细胞转接结构，其特征在于，每个纳米粒上连接具有识别和靶向作用特异性的抗体的个数范围是1-60。
10.根据权利要求1所述的细胞转接纳米粒，其特征在于，所述纳米粒还包载了提高效应细胞活性的药物。
11.根据权利要求10所述的细胞转接结构，其特征在于，所述纳米粒包载的提高效应细胞活性的药物选自双磷酸盐化合物阿伦磷酸、帕米磷酸、内皮细胞受体激酶抑制尼达尼布nintedanib、转化生长因子-beta分泌抑制剂橙皮素Hesperetin、糖原合成激酶3抑制剂CHIR-99021或唑来膦酸。
12.如权利要求1～11之任一项所述细胞转接结构在制备效应细胞活性促进剂中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述细胞转接结构用于制备T细胞活性促进剂或干细胞活性促进剂。
14.如权利要求1～11之任一项所述细胞转接结构用于提高效应细胞活性的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述细胞转接结构用于提高T细胞活性或用于提高干细胞活性。
16.一种提高效应细胞活性的方法，包括步骤：将如权利要求1～11之任一项所述细胞转接结构与效应细胞混合孵育，制备具有细胞治疗作用的细胞。
17.一种提高效应细胞活性的方法，包括步骤：将如权利要求1～11之任一项所述细胞转接结构注射入体内，在体内提高效应细胞的活性。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述细胞转接结构与T细胞结合从而提高T细胞活性，或所述细胞转接结构与干细胞结合从而提高干细胞活性。
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