KR20150003162A - 항-lgr5 항체 및 면역접합체 - Google Patents

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웨이구앙 마오
폴 폴라키스
앤드류 폴슨
라제쉬 비즈
얀 유
웨이-칭 리앙
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Abstract

본 발명은 항-LgR5 항체 및 면역접합체 및 이들의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-LGR5 항체 및 면역접합체{ANTI-LGR5 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES}
본 발명은 항-LgR5 항체 및 면역접합체 및 이들의 사용 방법에 관한 것이다.
로이신-풍부 반복체-포함 G 단백질-커플링된 수용체 5 (LgR5)는 활발히 순환하는 장 줄기 세포 (ISC)의 표면에서 발견되는 7-막횡단 단백질이다. LgR5-발현 ISC는 Wnt 변형에 민감하며, 장 상피의 항상성 재생에 주된 책임이 있다. 그러나, 마우스에서 LgR5-발현 세포의 제거는 장 상피의 항상성에 영향을 끼치지 않으며, 이는 다른 세포 유형들이 이러한 세포군의 손실을 보완할 수 있다는 것을 제시한다. Tian 외, Nature 478: 255-259 (2011). R-스폰딘은 WNT3A에 의한 WNT 시그널링을 증진시키며, 4개의 R-스폰틴 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4 모두 LgR5에 결합할 수 있다. Lau 외, Nature 476: 293-297 (2011).
인간 LgR5는 907개 아미노산의 단백질이며, 이 중에서 아미노-말단 시그널 서열 절단 후 약 540개의 아미노산이 세포외 공간에 있는 것으로 예상된다. LgR5은 엑토도메인에 17개의 불완전 로이신-풍부 반복 모티프, 및 로이신-풍부 반복체와 제1 막횡단 도메인 사이에 위치된 시스테인-풍부 영역을 포함한다.
LgR5-관련 병태, 예를 들어, 암을 진단하고 치료하기 위해 LgR5를 표적하는 작용제가 당업계에 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키며 다른 이점들을 제공한다.
요약
본 발명은 항-LgR5 항체 및 면역접합체 및 이들의 사용 방법을 제공한다
일부 양태에서, LgR5에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 상기 항체는 하기 특징 중 적어도 하나 이상을 임의의 조합으로 갖는다: (a) 서열 67의 아미노산 22-555 내의 에피토프에 결합하고/하거나 서열 67의 아미노산 22-123 내의 에피토프에 결합하고/하거나 서열 67의 아미노산 22-323 내의 에피토프에 결합하고/하거나 서열 67의 아미노산 22-424 내의 에피토프에 결합하고/하거나 서열 67의 아미노산 324-555 내의 에피토프에 결합하고/하거나 서열 67의 아미노산 324-424 내의 에피토프에 결합한다; (b) ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 LgR5에 결합한다; (c) LgR5에 대한 R-스폰딘 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하지 않는다; (d) 베타-카테닌 시그널링을 유의하게 방해하지 않는다; (e) LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않는다; (f) 카스파제 3 절단을 활성화시킨다; (g) 인간 및 설치류 LgR5 모두를 인식한다; (h) 인간 LgR5는 인식하나 설치류 LgR5는 인식하지 않는다; (i) 비접합된 형태로는 종양 성장을 유의하게 억제하지 않는다; 및 (j) 줄기 세포 분화를 유도하지 않는다.
일부 양태에서, 단리된 항-LgR5 항체는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 서열 67의 아미노산 22-323 내의 에피토프에 결합한다..
일부 양태에서, 단리된 항-LgR5 항체는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 서열 67의 아미노산 22-123 내의 에피토프에 결합한다.
일부 양태에서, 단리된 항-LgR5 항체는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 서열 67의 아미노산 324-424 내의 에피토프에 결합한다.
임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 LgR5에 대한 R-스폰딘 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하지 않는다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 wnt/베타-카테닌 시그널링을 유의하게 방해하지 않는다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않는다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 카스파제 3 절단을 활성화시킨다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 인간 및 설치류 LgR5 모두를 인식한다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 인간 LgR5는 인식하나 설치류 LgR5는 인식하지 않는다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 비접합된 형태로는 종양 성장을 유의하게 억제하지 않는다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 줄기 세포 분화를 유도하지 않는다.
임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 모노클로날 항체이다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 인간, 인간화된, 또는 키메릭 항체이다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 항체이다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 항체 단편이다. 임의의 단리된 항-LgR5 항체에 대한 일부 양태에서, LgR5는 서열 67의 인간 LgR5이다.
일부 양태에서, LgR5에 결합하는 항체는 서열 67의 아미노산 22-323 내의 에피토프에 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 ≤ 5 nM의 친화도로 LgR5에 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 인간, 인간화된, 또는 키메릭 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 LgR5에 결합하는 항체 단편이다. 일부 양태에서, LgR5는 서열 67의 인간 LgR5이다.
일부 양태에서, 항체는 (a)서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 41의 중쇄 프레임워크 FR3 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 (a) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 35의 경쇄 프레임워크 FR3를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 8의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열 7의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 8의 VH 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 7의 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함한다.
일부 양태에서, LgR5에 결합하는 항체 (a) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 (a) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 추가로 (a) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다.
일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 24의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열 23의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 24의 VH 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 23의 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 서열 24의 VH 서열 및 서열 23의 VL 서열을 포함한다.
일부 양태에서, LgR5에 결합하는 항체는 (a) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 495의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 (a) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 추가로 (a) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다.
일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 22의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열 21의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 22의 VH 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 서열 22의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함한다.
일부 양태에서, LgR5에 결합하는 항체는 (a)서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 추가로 (a) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다.
일부 양태에서, 단리된 항체는 (a) 서열 26의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열 25의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 26의 VH 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 서열 25의 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항체는 서열 26의 VH 서열 및 서열 25의 VL 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에서 기재되는 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 양태에서, 본원에서 기재되는 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 면역접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 면역접합체는 항-LgR5 항체 및 세포독성제를 포함한다. 일부 양태에서, 면역접합체는 화학식 Ab-(L-D)p을 갖고, 상기 식에서 (a) Ab는 상술된 바와 같고; (b) L은 링커이고; (c) D는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀, 및 네모루비신 유도체 중에서 선택되는 약물이고; (d) p는 1 내지 8의 범위이다. 일부 양태에서, D는 아우리스타틴이다. 일부 이러한 양태에서, D는 화학식 DE를 갖는다.
Figure pct00001
상기 식에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 H이고, R7은 2급-부틸이고, R8은 각각 독립적으로 CH3, O-CH3, OH, 및 H 중에서 선택되고; R9는 H이고; R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴이다. 일부 양태에서, D는 하기 구조를 갖는 MMAE이다:
Figure pct00002
일부 양태에서, D는 화학식 A의 피롤로벤조디아제핀이다:
Figure pct00003
상기 식에서, 점선은 C1과 C2 사이 또는 C2와 C3 사이의 임의적인 이중 결합의 존재를 나타내고; R2는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR 중에서 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로 중에서 추가로 선택되고, 여기서 RD 는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로 중에서 선택되고; R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로 중에서 선택되고; R7은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로 중에서 선택되고; Q는 독립적으로 O, S 및 NH 중에서 선택되고; R11은 H 또는 R 또는, Q가 O인 경우, SO3M이고, 여기서 M은 금속 양이온이고; R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -8 알킬, C1 -12 알킬, C3-8 헤테로사이클릴, C3 -20 헤테로사이클릴, 및 C5 -20 아릴 그룹 중에서 선택되고, 임의로 그룹 NRR'에 대해 R 및 R'는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성하고; R12, R16, R19 및 R17은 각각 R2, R6, R9 및 R7에 대해 정의된 바와 같고; R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이고, 이 쇄는 하나 이상의 헤테로원자 및/또는 임의로 치환된 방향족 환에 의해 방해될 수 있으며; X 및 X'는 독립적으로 O, S 및 N(H) 중에서 선택된다. 일부 이러한 양태에서, D는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00004
n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, D는 네모루비신 유도체이다. 일부 양태에서, D는 하기 중에서 선택되는 구조를 갖는다:
Figure pct00005
; 및
Figure pct00006
일부 양태에서, 면역접합체는 프로테아제에 의해 절단가능한 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 val-cit 디펩타이드 또는 Phe-Lys 디펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 면역접합체는 산에 불안정한 링커를 포함한다. 일부 이러한 양태에서, 링커는 하이드라존을 포함한다.
일부 양태에서, 면역접합체는 하기 중에서 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00007
(상기 식에서, S는 황원자이다);
Figure pct00008
Figure pct00009
및
Figure pct00010
일부 양태에서, p는 2 내지 5의 범위이다.
일부 양태에서, 면역접합체는 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 면역접합체는 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
일부 양태에서, 약제학적 제제가 제공된다. 일부 이러한 양태에서, 약제학적 제제는, 예를 들어, 본원에서 기재되는 바와 같이, LgR5에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 약제학적 제제는 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 추가의 치료제는 Avastin® (베바시주마브)이다.
일부 양태에서, LgR5 양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 본원에서 기재되는 바와 같이, LgR5에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체를 포함하는 약제학적 제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5-양성 암은 결장직장암, 췌장암, 난소암, 및 자궁내막암 중에서 선택된다. 일부 양태에서, LgR5-양성 암은 소장암이다. 일부 양태에서, 소장암은 십이지장, 공장, 및/또는 장골의 암이다. 일부 양태에서, 소장암은 공장 및/또는 장골의 암이다. 일부 양태에서, LgR5-양성 암은 (예를 들어, 암세포의 적어도 일부에서) Kras 돌연변이, APC 돌연변이, 또는 Kras 돌연변이와 APC 돌연변이 모두를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 이러한 양태에서, 추가의 치료제는 Avastin® (베바시주마브)이다.
일부 양태에서, LgR5-양성 세포의 증식을 억제시키는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 세포를 세포 표면 상의 LgR5에 대한 면역접합체의 결합을 허용하는 조건 하에서 LgR5에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5에 결합하는 항체는 본원에서 기재되는 항체이다. 일부 양태에서, 이로써 세포의 증식이 억제된다. 일부 양태에서, 세포는 결장직장, 소장, 췌장, 난소, 또는 자궁내막의 암세포이다.
일부 양태에서, LgR5에 결합하는 항체는 표지에 접합된다. 일부 양태에서, LgR5에 결합하는 항체는 본원에서 기재되는 항체이다. 일부 양태에서, 표지는 양전자 방출체이다. 일부 양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
일부 양태에서, 생물학적 샘플 중의 인간 LgR5를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 천연 발생 인간 LgR5에 대한 항-LgR5 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항-LgR5 항체와 접촉시키고, 항-LgR 항체와 생물학적 샘플 중의 천연 발생 인간 LgR5 사이의 복합체 형성 여부를 검출하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 본원에서 기재되는 항체이다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플은 결장직장암 샘플, 소장암 샘플, 췌장암 샘플, 난소암 샘플, 또는 자궁내막암 샘플이다.
일부 양태에서, LgR5-양성 암을 검출하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 양태에서, 상기 방법은 (i) 표지된 항-LgR5 항체를 LgR5-양성 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 피험자에게 투여하고, (ii) 피험자에서 표지된 항-LgR5 항체를 검출하는 것을 포함하며, 표지된 항-LgR5 항체의 검출은 피험자에서 LgR5-양성 암을 나타낸다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 본원에서 기재되는 항체이다.
도 1은, 실시예 A에서 기재되는 바와 같이, 다양한 조직에서의 인간 LgR5 유전자의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다. 도 1의 삽입물은, 실시예 A에서 기재되는 바와 같이, 정상 결장 조직 및 결장 종양에서의 인간 LgR5 유전자의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는, 실시예 B에서 기재되는 바와 같이, 제자리 하이브리드화에 의한 결장 종양에서의 LgR5의 발현을 도시한다.
도 3은, 실시예 B에서 기재되는 바와 같이, 둘다 제자리 하이브리드화로 측정된, (A) 결장 종양 조직 마이크로어레이에서의 다양한 수준의 LgR5 발현 출현율 및 (B) 각각의 결장직장 선암종 샘플로부터의 3개의 코어에서의 LgR5 발현의 이질성을 도시한다.
도 4는, 실시예 C 내지 F에서 기재되는 바와 같이 생성되는 특정 항-LgR5 모노클로날 항체의 특성을 도시한다.
도 5는 뮤린 항체 mu8E11의 경쇄 가변 영역 서열 및 이의 인간화된 변이체 (hu8E11.v1 내지 hu8E11.v8)의 정렬을 도시한다. 3개의 초가변 영역 (HVR: HVR1, HVR2, HVR3)은 서열 내에서 박스로 표시된다.
도 6은 뮤린 항체 mu8E11의 중쇄 가변 영역 서열 및 이의 인간화된 변이체 (hu8E11.v1 내지 hu8E11.v8)의 정렬을 도시한다. 3개의 초가변 영역 (HVR: HVR1, HVR2, HVR3)은 서열 내에서 박스로 표시된다.
도 7은 뮤린 항체 3G12 및 2H6의 경쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 3개의 초가변 영역 (HVR: HVR1, HVR2, HVR3)은 서열 내에서 박스로 표시된다.
도 8은 뮤린 항체 3G12 및 2H6의 중쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 3개의 초가변 영역 (HVR: HVR1, HVR2, HVR3)은 서열 내에서 박스로 표시된다.
도 9는, 실시예 E에서 기재되는 바와 같이, 키메릭 항체 ch8E11 및 다양한 인간화된 변이체의 친화도 측정치를 도시한다.
도 10은 인간 항체 YW353의 경쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 3개의 초가변 영역 (HVR: HVR1, HVR2, HVR3)은 서열 내에서 박스로 표시된다.
도 11은 인간 항체 YW353의 중쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 3개의 초가변 영역 (HVR: HVR1, HVR2, HVR3)은 서열 내에서 박스로 표시된다.
도 12A-C는 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및 마우스로부터의 LgR5의 정렬을 도시한다.
도 13은, 실시예 L에서 기재되는 바와 같이, 항-LgR5 면역접합체가 LoVo 결장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 14는, 실시예 M에서 기재되는 바와 같이, 항-LgR5 면역접합체가 D5124 췌장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 15는, 실시예 M에서 기재되는 바와 같이, huYW353-vcMMAE 면역접합체가 D5124 췌장암 이종이식편에서 3, 6, 및 12 mg/kg으로 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 16은, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, AV 및 AKV 마우스의 결장으로부터의 정상 조직 및 폴립에서의 LgR5 mRNA 발현을 도시한다.
도 17은, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, 항-LgR5 항체 및 항-LgR5 항체-약물 접합체가 투여된 AKV 마우스의 생존이 대조군 AKV 마우스보다 긴 생존 시간을 갖는다는 것을 도시한다.
도 18은, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, 대조군 ADC, 항-LgR5 ADC, 또는 항-LgR5 항체가 투여된 AKV 마우스에서 절단된 카스파제 3에 대해 양성인 종양 면적의 백분율을 도시한다.
도 19는, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, 항-LgR5 항체-약물 접합체가 투여된 AKV 마우스가 비처리된 AKV 마우스 및 gp120-ADC 또는 항-LgR5가 투여된 AKV 마우스보다 긴 생존 시간을 갖는다는 것을 도시한다.
도 20은, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, AKV LgR5 DTR /+ 마우스의 소장 폴립 및 결장 폴립에서의 LgR5+ 면적을 도시한다.
도 21은 (A) 대조군 ADC 및 항-LgR5-ADC 처리된 AKV LgR5 DTR /+ 마우스에서의 세포 면적당 CC3+GFP+ 면적 및 (B) 대조군 ADC 및 항-LgR5-ADC 처리된 AKV LgR5 DTR /+ 마우스에서의 예시적인 면역조직화학 염색을 도시한다.
도 22는, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, 대조군 ADC 및 항-LgR5-ADC 처리된 AKV LgR5 DTR /+ 마우스에서의 세포 (GFP+ 세포 또는 GFP- 세포) 면적당 Ki67+ 면적을 도시한다.
도 23은, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, AKV LgR5 DTR /+ 마우스의 크립트 및 종양에서의 GFP+ 면적에 대한 GFP 강도의 비율을 도시한다.
도 24는, 실시예 O에서 기재되는 바와 같이, huYW353-vcMMAE, hu8E11v2-vcMMAE, 및 ch8E11-vcMMAE 면역접합체가 D5124 췌장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 25는, 실시예 O에서 기재되는 바와 같이, hu8E11v2-vcMMAE 면역접합체가 D5124 췌장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 26은, 실시예 P에서 기재되는 바와 같이, huYW353-vcMMAE 및 hu8E11v2-vcMMAE 면역접합체가 LoVoX1.1 결장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 27은, 실시예 P에서 기재되는 바와 같이, hu8E11v2-vcMMAE 면역접합체가 LoVoX1.1 결장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 28은, 실시예 Q에서 기재되는 바와 같이, huYW353-vcMMAE, huYW353-아세탈-PNU, 및 huYW353-vcPNU 면역접합체가 D5124 췌장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 29는, 실시예 R에서 기재되는 바와 같이, hu8E11v2-아세탈-PNU, hu8E11v2-vcPNU, 및 hu8E11v2-PNU 면역접합체가 D5124 췌장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 30은, 실시예 S에서 기재되는 바와 같이, LoVoX1.1 결장암 이종이식편에 특정 hu8E11v2 면역접합체 및 대조군 항체 면역접합체를 투여한 결과를 도시한다.
도 31은, 실시예 S에서 기재되는 바와 같이, hu8E11v2-아세탈-PNU 면역접합체가 과량의 대조군 항체가 공동 투여되는 마우스의 LoVoX1.1 결장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 32는, 실시예 T에서 기재되는 바와 같이, 항-LgR5 huYW353 PBD 면역접합체가 D5124 췌장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 33은, 실시예 T에서 기재되는 바와 같이, 항-LgR5 hu8E11v2 PBD 면역접합체 가 D5124 췌장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 34는, 실시예 U에서 기재되는 바와 같이, 항-LgR5 hu8E11v2 PBD 면역접합체가 LoVoX1.1 결장암 이종이식편에서 효능을 나타낸다는 것을 도시한다.
도 35는 (A) 항체-vcMMAE 면역접합체, (B) 항체-아세탈-PNU 면역접합체, (C) 항체-아세탈-PNU 면역접합체, (D) 항체-PNU 면역접합체, 및 (E) 항체-vcPBD 면역접합체의 구조를 도시한다.
발명의 특정 양태에 대한 상세한 설명
I. 정의
본원의 목적을 위해 "수용체 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같이 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 양태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 세기를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에서 기재되는 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 설명에 도움을 주는 예시적 양태를 하기에 기재한다.
"친화도 성숙" 항체는, 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는 변경을 갖지 않는 모항체와 비교하여, 하나 이상의 초가변 영역 (HVR) 내에 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-LgR5 항체" 및 "LgR5에 결합하는 항체"는 항체가 LgR5를 표적화하는데 있어 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 LgR5에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 양태에서, 관련되지 않은 비-LgR5 단백질에 대한 항-LgR5 항체의 결합의 정도는, 예를 들어, 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정시 LgR5에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양태에서, LgR5에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 Nm, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 양태에서, 항-LgR5 항체는 상이한 종으로부터의 LgR5 간에 보존된 LgR5의 에피토프에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다특이적 항체 (예를 들어, 이특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하고 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은, 온전한 항체의 일부를 포함하고 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 온전한 항체와 다른 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다특이적 항체를 포함하고 이에 제한되지 않는다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 차단하는 항체, 및 반대로 경쟁 검정에서 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 이상 차단하는 참조 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 소장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
용어 "키메릭" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래되고 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 저해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어, 뉴클레오타이드 분해 효소; 항생제; 독소, 예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 후술되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고 이에 제한되지 않는다.
"이펙터 기능"은, 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어, 약제학적 제제의 "유효량"은 필요한 용량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
용어 "예피토프"는 항체가 결합하는 항원 분자 상의 특정 부위를 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 하나의 양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재되는 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템을 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"는 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인인 FR1, FR2, FR3 및 FR4으로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에서 정의되는 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "글리코실화된 형태의 LgR5"는 탄수화물 잔기의 부가로 해독후 변형되는 LgR5의 천연 발생 형태를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭하며, 이러한 세포의 자손 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초에 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 명확하게 배제된다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 서브그룹은 문헌 Kabat 외, Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 서브그룹이다. 하나의 양태에서, VL의 경우에 서브그룹은 문헌 Kabat 외, 상기 문헌에서와 같은 서브그룹 카파 I이다. 하나의 양태에서, VH의 경우에 서브그룹은 문헌 [Kabat 외, 상기 문헌에서와 같은 서브그룹 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 특정 양태에서, 인간화된 항체는 실질적으로 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래되는 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"는 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)]를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식에 수반된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 아미노산 잔기 50-56, L3의 아미노산 잔기 89-97, H1의 아미노산 잔기 31-35B, H2의 아미노산 잔기 50-65 및 H3의 아미노산 잔기 95-102에서 발생한다. (Kabat 외., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. CDR은, VH 내의 CDR1을 제외하고는, 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"를 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 포함된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 아미노산 잔기 50-55, L3의 아미노산 잔기 89-96, H1의 아미노산 잔기 31-35B, H2의 아미노산 잔기 50-58 및 H3의 아미노산 잔기 95-102에서 발생한다. (참조: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 Kabat 외, 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하고 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 동물 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 양태에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해 하기 문헌을 참조한다. 참조: 예를 들어, Flatman 외, J. Chromatogr . B 848:79-87 (2007).
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 포함하는 세포에 포함되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외적으로 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-LgR5 항체를 암호화하는 단리된 핵산"는 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하고, 단일 벡터 또는 별개의 벡터 내의 이러한 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "LgR5"는 세포에서 LgR5 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 생성되는 임의의 천연적 성숙 LgR5를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 이 용어는 포유동물, 예를 들어, 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 LgR5를 포함한다. 이 용어는 또한 LgR5의 천연발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 시그널 서열 (아미노산 1-21)을 갖는 예시적인 인간 LgR5 전구체 단백질의 아미노산 서열이 서열 67에 나타나 있다. 예시적인 성숙한 인간 LgR5의 아미노산 서열이 서열 68에 나타나 있다. 예시적인 시노몰구스 원숭이 LgR5의 아미노산 33 내지 907에 대한 예측된 서열이 서열 69에 나타나 있다. 예시적인 래트 LgR5 전구체 (아미노산 1-21의 시그널 서열 포함)에 대한 아미노산 서열 및 성숙한 서열이 각각 서열 70 및 71에 나타나 있다. 예시적인 마우스 LgR5 전구체 (아미노산 1-21의 시그널 서열 포함)에 대한 아미노산 서열 및 성숙한 서열이 각각 서열 72 및 73에 나타나 있다.
용어 "LgR5-양성 암"은 표면 상에 LgR5를 발현하는 세포를 포함하는 암을 지칭한다. 세포가 LgR5를 표면에 발현하는지의 여부를 알아내기 위한 목적상, LgR5 mRNA 발현은 세포 표면 상에서의 LgR5 발현과 연관성이 있는 것으로 간주된다. 일부 양태에서, LgR5 mRNA의 발현은 제자리 하이브리드화 및 RT-PCR (정량적 RT-PCR 포함) 중에서 선택되는 방법으로 측정된다. 달리, 세포 표면 상의 LgR5의 발현은, 예를 들어, 면역조직화학, FACS 등과 같은 방법에서 LgR5에 대한 항체를 사용하여 측정될 수 있다.
용어 "LgR5-양성 세포"는 표면 상에 LgR5를 발현하는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체군으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 이러한 항체군을 구성하는 개별 항체는, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되고 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"는 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하고 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 잔기) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약제학적 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다 N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은, 적응증, 용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
"아미노산 서열 동일성 백분율 (%)"는, 참조 폴리펩타이드 서열과 관련하여, 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 백분율 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서, 참조 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 측정하기 위한 정렬은 당해 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc. 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에, 소정의 아미노산 서열 B와, 또는 소정의 아미노산 서열 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 소정의 아미노산 서열 B에, 소정의 아미노산 서열 B와, 또는 소정의 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 소정의 아미노산 서열 A라는 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 × X/Y의 분율
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 수 있을 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약제학적 제제"는 그 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 피험자에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 포함하지 않는 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 피험자에게 무독성인, 약제학적 제제 중의 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하고 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"와 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 천연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하며, 임상적 병변의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중새 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (참조: 예를 들어, Kindt 외 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다. 참조: 예를 들어, Portolano 외, J. Immunol . 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991).
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"알킬"은 직쇄상, 1차, 2차, 3차 또는 사이클릭 탄소 원자를 포함하는 C1-C18 탄화수소이다. 예는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3이다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-C8 알킬"은 탄소수 1 내지 8의 직쇄 또는 분지된 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-C8 알킬" 그룹은 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐 및 -n-데실을 포함하고 이에 제한되지 않으며, 분지된 C1-C8 알킬은 -이소프로필, -2급-부틸, -이소부틸, -3급-부틸, -이소펜틸, 2-메틸부틸을 포함하고 이에 제한되지 않으며, 불포화된 C1-C8 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, -아세틸레닐, -프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, -3-메틸-1 부티닐을 포함하고 이에 제한되지 않는다. C1-C8 알킬 그룹은 비치환되거나 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하고 이에 제한되지 않는 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있으며, 여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 독립적으로 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-C12 알킬"은 탄소수 1 내지 12의 직쇄 또는 분지된 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. C1-C12 알킬 그룹은 비치환되거나 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하고 이에 제한되지 않는 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있으며, 여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 독립적으로 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-C6 알킬"은 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분지된 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-C6 알킬" 그룹은 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -및 n-헥실을 포함하고 이에 제한되지 않으며, 분지된 C1-C6 알킬은 -이소프로필, -2급-부틸, -이소부틸, -3급-부틸, -이소펜틸, 및 2-메틸부틸을 포함하고 이에 제한되지 않으며, 불포화된 C1-C6 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, 및 -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 및 3-헥실을 포함하고 이에 제한되지 않는다. C1-C6 알킬 그룹은 비치환되거나, C1-C8 알킬 그룹에 대해 상술된 바와 같이, 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-C4 알킬"은 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지된 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-C4 알킬" 그룹은 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸을 포함하고 이에 제한되지 않으며; 분지된 C1-C4 알킬은 -이소프로필, -2급-부틸, -이소부틸, -3급-부틸을 포함하고 이에 제한되지 않으며; 불포화된 C1-C4 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, 및 -이소부틸레닐을 포함하고 이에 제한되지 않는다. C1-C4 알킬 그룹은 비치환되거나, C1-C8 알킬 그룹에 대해 상술된 바와 같이, 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있다.
"알콕시"는 산소에 단일 결합된 알킬 그룹이다. 예시적 알콕시 그룹은 메톡시 (-OCH3) 및 에톡시 (-OCH2CH3)을 포함하고 이에 제한되지 않는다. "C1-C5 알콕시"는 탄소수 1 내지 5의 알콕시 그룹이다. 알콕시 그룹은 비치환되거나, 알킬 그룹에 대해 상술된 바와 같이, 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있다.
"알케닐"은 하나 이상의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소 sp 2 이중 결합과 함께 직쇄상, 2급, 3급 또는 사이클릭 탄소 원자를 포함하는 C2-C18 탄화수소이다. 예는 에틸렌 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2), 사이클로펜테닐 (-C5H7), 및 5-헥세닐 (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2)을 포함하며 이에 제한되지 않는다. "C2-C8 알케닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소 sp 2 이중 결합을 갖는 2 내지 8개의 직쇄상, 2급, 3급 또는 사이클릭 탄소 원자를 포함하는 탄화수소이다.
"알키닐"은 하나 이상의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소 sp 삼중 결합과 함께 직쇄상, 2급, 3급 또는 사이클릭 탄소 원자를 포함하는 C2-C18 탄화수소이다. 예는 아세틸레닉 (-C≡CH) 및 프로파길 (-CH2C≡CH)을 포함하고 이에 제한되지 않는다. "C2-C8 알키닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소 sp 삼중 결합을 갖는 2 내지 8개의 직쇄상, 2급, 3급 또는 사이클릭 탄소 원자를 포함하는 탄화수소이다.
"알킬렌"은, 모 알칸의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거시킴으로써 유도되는 2개의 1가 라디칼 센터를 갖는, 탄소수 1 내지 18의 포화된 분지 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적 알킬렌 라디칼은 메틸렌 (-CH2 -) 1,2-에틸 (-CH2CH2-), 1,3-프로필 (-CH2CH2CH2 -), 1,4-부틸 (-CH2CH2CH2CH2 -) 등을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
"C1-C10 알킬렌"은 화학식 -(CH2)1-10-의 직쇄의 포화 탄화수소 그룹이다. C1-C10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데칼렌을 포함한다.
"알케닐렌"은, 모 알켄의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거시킴으로써 유도되는 2개의 1가 라디칼 센터를 갖는, 탄소수 2 내지 18의 불포화된 분지 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적 알케닐렌 라디칼은 1,2-에틸렌 (-CH=CH-)을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
"알키닐렌"은, 모 알킨의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거시킴으로써 유도되는 2개의 1가 라디칼 센터를 갖는, 탄소수 2 내지 18의 불포화된 분지 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적 알키닐렌 라디칼은 아세틸렌 (-C≡C-), 프로파길 (-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐 (-CH2CH2CH2C≡C-)을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
"아릴"은 카보사이클릭 방향족 그룹을 지칭한다. 아릴 그룹의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 카보사이클릭 방향족 그룹 또는 헤테로사이클릭 방향족 그룹은 비치환되거나 하기를 포함하고 이에 제한되지 않는 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 독립적으로 선택된다).
"C5-C20 아릴"은 카보사이클릭 방향족 환에 5 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 아릴 그룹이다. C5-C20 아릴 그룹의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하고 이에 제한되지 않는다. C5-C20 아릴 그룹은 비치환되거나 아릴 그룹에 대해 상술된 바와 같이 치환될 있다. "C5-C14 아릴"은 카보사이클릭 방향족 환에 5 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 아릴 그룹이다. C5-C14 아릴 그룹의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하고 이에 제한되지 않는다. C5-C14 아릴 그룹은 비치환되거나 아릴 그룹에 대해 상술된 바와 같이 치환될 있다.
"아릴렌"은 2개의 공유 결합을 갖고 하기 구조에서 보여지는 바와 같은 오르토, 메타 또는 파라 배치로 존재할 수 있는 아릴 그룹이다:
Figure pct00011

상기 식에서, 페닐 그룹은 비치환되거나 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하고 이에 제한되지 않는 4개 이하의 그룹으로 치환될 수 있고; 여기서, 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 독립적으로 선택된다.
"아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 아릴 라디칼로 대체되는 바이사이클릭 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적 아릴알킬 그룹은 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 아릴알킬 그룹은 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하며, 예를 들어, 아릴알킬 그룹의 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 그룹을 포함한 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자를 갖는다.
"헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 헤테로아릴 라디칼로 대체되는 바이사이클릭 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적 헤테로아릴알킬 그룹은 2-벤즈이미다졸릴메틸, 2-푸릴에틸 등을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 헤테로아릴알킬 그룹은 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하고, 예를 들어, 헤테로아릴알킬 그룹의 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 그룹을 포함한 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고, 헤테로아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자를 갖고 N, O, P 및 S 중에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖는다. 헤테로아릴알킬 그룹의 헤테로아릴 모이어티는 3 내지 7개의 환원을 갖는 모노사이클 (2 내지 6개의 탄소 원자) 또는 7 내지 10개의 환원을 갖는 바이사이클 (4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S 중에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자), 예를 들어, 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
"치환된 알킬," "치환된 아릴," 및 "치환된 아릴알킬"은 각각 하나 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환체로 대체되는 알킬, 아릴 및 아릴알킬을 의미한다. 전형적 치환체는 -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3, PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2 (여기서, 각각의 X는 독립적으로 할로겐: F, Cl, Br, 또는 I이고; 각각의 R은 독립적으로 -H, C2-C18 알킬, C6-C20 아릴, C3-C14 헤테로사이클, 보호 그룹 또는 프로드럭 모이어티다)를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 상술된 바와 같은 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌 그룹도 유사하게 치환될 수 있다.
"헤테로아릴" 및 "헤테로사이클"은 하나 이상의 환 원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소, 산소, 및 황인 환 시스템을 지칭한다. 헤테로사이클 라디칼은 3 내지 20개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S 중에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 환원을 갖는 모노사이클 (2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S 중에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자) 또는 7 내지 10개의 환원을 갖는 바이사이클 (4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S 중에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자), 예를 들어, 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
예시적 헤테로사이클은, 예를 들어, 문헌 [Paquette, Leo A., "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularly Chapters 1, 3, 4, 6, 7, and 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 Volumes 13, 14, 16, 19, and 28; and J. Am . Chem. Soc . (1960) 82:5566]에 기재된다.
헤테로사이클의 예는 피리딜, 디하이드로피리딜, 테트라하이드로피리딜 (피페리딜), 티아졸릴, 테트라하이드로티오페닐, 황 산화된 테트라하이드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 파라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 피롤리닐, 테트라하이드로푸라닐, 비스-테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 비스-테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥타하이드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 티아지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디타아지닐, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 4aH-카바졸릴, 카바졸릴, β-카볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴누클리디닐, 모폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸릴, 벤족사졸릴, 옥신돌릴, 벤족사졸리닐, 및 이사티노일을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
예시적인 것이지 제한하는 것이 아닌 것으로서, 탄소 결합된 헤테로사이클은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6, 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5, 옥사졸, 아미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5, 이소옥사졸, 피라졸 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8, 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에서 결합된다. 보다 전형적으로, 탄소 결합된 헤테로사이클은 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 또는 5-티아졸릴을 포함한다.
예시적인 것이지 제한하는 것이 아닌 것으로서, 질소 결합된 헤테로사이클은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 또는 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2, 모폴린의 위치 4, 및 카바졸, 또는 β-카볼린의 위치 9에서 결합된다. 보다 전형적으로, 질소 결합된 헤테로사이클은 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-파라졸릴, 및 1-피페리디닐을 포함한다.
"C3-C8 헤테로사이클"은 환 탄소 원자 중 1 내지 4개가 독립적으로 O, S 및 N으로 이루어진 그룹으로부터의 헤테로원자로 대체되는 방향족 또는 비-방향족 C3-C8 카보사이클을 지칭한다. C3-C8 헤테로사이클의 대표적인 예는 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조파라졸릴, 코우마리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 파라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함하고 이에 제한되지 않는다. C3-C8 헤테로사이클은 비치환되거나 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 선택된다)을 포함하고 이에 제한되지 않는 7개 이하의 그룹으로 치환될 수 있다.
"C3-C8 헤테로사이클로"는 헤테로사이클 그룹의 수소 원자 중 하나가 결합으로 대체되는 상기 정의된 C3-C8 헤테로사이클 그룹을 지칭한다. C3-C8 헤테로사이클로는 비치환되거나 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 선택된다)를 포함하고 이에 제한되지 않는 6개 이하의 그룹으로 치환될 수 있다.
"C3-C20 헤테로사이클"은 환 탄소 원자 중의 1 내지 4개가 독립적으로 O, S 및 N으로 이루어진 그룹으로부터의 헤테로원자로 대체되는 방향족 또는 비-방향족 C3-C8 카보사이클을 지칭한다. C3-C20 헤테로사이클은 비치환되거나 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 선택된다)를 포함하고 이에 제한되지 않는 7개 이하의 그룹으로 치환될 수 있다.
"C3-C20 헤테로사이클로"는 헤테로사이클 그룹의 수소 원자 중 하나가 결합으로 대체되는 상기 정의된 C3-C20 헤테로사이클 그룹을 지칭한다.
"카보사이클"은 모노사이클로서 3 내지 7개의 탄소 원자 또는 바이사이클로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화된 환을 의미한다. 모노사이클릭 카보사이클은 3 내지 6개의 환 원자, 보다 전형적으로 5 또는 6개의 환 원자를 갖는다. 카보사이클은, 예를 들어, 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 7 내지 12개의 환 원자, 또는 바이사이클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 9 또는 10개의 환 원자를 갖는다. 모노사이클릭 카보사이클의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸을 포함한다.
"C3-C8 카보사이클"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원의 포화 또는 불포화된 비-방향족 카보사이클릭 환이다. 대표적 C3-C8 카보사이클은 -사이클로프로필, -사이클로부틸, -사이클로펜틸, -사이클로펜타디에닐, -사이클로헥실, -사이클로헥세닐, -1,3-사이클로헥사디에닐, -1,4-사이클로헥사디에닐, -사이클로헵틸, -1,3-사이클로헵타디에닐, -1,3,5-사이클로헵타트리에닐, -사이클로옥틸, 및 -사이클로옥타디에닐을 포함하고 이에 제한되지 않는다. C3-C8 카보사이클 그룹은 비치환되거나 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴 중에서 선택된다)을 포함하고 이에 제한되지 않는 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있다.
"C3-C8 카보사이클로"는 카보사이클 그룹의 수소 원자중 하나가 결합으로 대체되는 상기 정의되는 C3-C8 카보사이클 그룹을 지칭한다.
"링커"는 항체를 약물 모이어티에 공유적으로 부착시키는 이중 결합 또는 원자의 쇄를 포함하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 다양한 양태에서, 링커는 이가 라디칼, 예를 들어, 일킬디일, 아릴디일, 헤테로아릴디일, 모이어티, 예를들어, -(CR2)nO(CR2)n-, 알킬옥시 (예를 들어, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, JeffamineTM)의 반복 단위; 및 석시네이트, 석신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트, 및 카프로라미드를 포함하는 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다. 다양한 양태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어, 발린, 페닐알라닌, 리신 및 호모리신을 포함할 수 있다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너에 대해 비-겹침 특성을 갖는 분자를 지칭하며, 용어 "비키랄"은 거울상 파트너에 대해 겹쳐질 수 있는 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성체"는 동일한 화학적 구성을 가지나 공간에서 원자 또는 그룹의 배열이 상이한 화합물을 지칭한다.
"부분입체이성체"는 2개 이상의 키랄 중심을 갖고 분자들이 서로 거울상이 아닌 입체이성체를 지칭한다. 부분입체이성체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어, 융점, 비점, 스텍트럼 특성 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고분해 분석 절차 하에서 분리될 수 있다.
"에난티오머"는 서로 결쳐질 수 없는 거울상인 화합물의 2개의 입체이성체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 입체화학적 정의 및 규칙은 일반적으로 문헌 S. P. Parker, Ed., McGraw - Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York을 따른다. 많은 유기 화합물들은 광학적 활성 형태로 존재한다. 즉, 이들은 평면-편광된 빛의 평면을 회전시키는 능력을 갖는다. 광학적으로 활성인 화합물을 기재하는데 있어, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S,는 키랄 중심(들)에 대한 분자의 절대적 배치를 나타내기 위해 사용된다. 접두어 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-편광된 빛의 회전 사인을 나타내기 위해 사용되며, (-) 또는 1은 화합물이 좌선성이라는 것을 의미한다. 접두어 (+) 또는 d를 갖는 화합물은 우선성이다. 소정의 화합물 구조에 대해, 이들 입체이성체는 이들이 서로 거울상이라는 것을 제외하고는 동일하다. 구체적인 입체이성체는 또한 에난티오머로 지칭될 수 있으며, 이러한 이성체의 혼합물은 종종 에난티오머 혼합물로 지칭된다. 에난티오머의 50:50 혼합물은 화학 반응 또는 공정에서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우 발생할 수 있는 라세믹 혼합물 또는 라세메이트로서 지칭된다. 용어 "라세믹 혼합물" 및 "라세메이트"는, 광학 활성이 없는, 2개의 에난티오머종의 등몰 혼합물을 지칭한다.
"이탈 그룹"은 또 다른 작용 그룹으로 치환될 수 있는 작용 그룹을 지칭한다. 특정 이탈 그룹은 당업계에 널리 알려져 있으며, 할라이드 (예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 메탄설포닐 (메실), p-톨루엔설포닐 (토실), 트리플루오로메틸설포닐 (트리플레이트) 및 트리플루오로메틸설포네이트을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
용어 "보호 그룹"은 화합물 상의 다른 작용성 그룹과 반응하면서 특정 작용성 그룹을 차단하거나 보호하기 위해 일반적으로 사용되는 치환체를 지칭한다. 예를 들어, "아미노-보호 그룹"은 화합물 내의 아미노 작용성 그룹을 차단하거나 보호하는 아미노 그룹에 부착되는 치환체이다. 적합한 아미노-보호 그룹은 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카보닐 (BOC), 벤질옥시카보닐 (CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카보닐 (Fmoc)를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 보호 그룹 및 이들의 이용에 관한 일반적 기술은 하기 문헌 또는 후속판을 참조한다. 참조: T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
II . 조성물 및 방법
하나의 양상에서, 본 발명은, 부분적으로, LgR5에 결합하는 항체 및 이러한 항체를 포함하는 면역접합체에 기초한다. 본 발명의 항체 및 면역접합체는 예를 들어, LgR5-양성 암의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적 항- LgR5 항체
일부 양태에서, 본 발명은 LgR5에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. LgR5는, 예를 들어, 활발히 순환하는 장 줄기 세포의 표면에서 발견되는 7개-막횡단 단백질이다. 본원에서 입증되는 바와 같이, LgR5는 조사된 결장 종양 절편의 약 77%에서 발현된다.
시그널 서열 (아미노산 1-21)을 갖는 예시적 천연 발생 인간 LgR5 전구체 단백질 서열은 서열 67에 제공되고, 상응하는 성숙한 LgR5 단백질 서열은 서열 68 (서열 67의 아미노산 22-907에 상응)에 나타나 있다.
특정 양태에서, 항-LgR5 항체는 하기 특징 중 적어도 하나 이상을 임의의 조합으로 갖는다: (a) 서열 67의 아미노산 22-555 내의 에피토프에 결합한다; (b) ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 LgR5에 결합한다; (c) LgR5에 대한 R-스폰딘 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하지 않는다; (d) 베타-카테닌 시그널링을 유의하게 방해하지 않는다; (e) LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않는다; (f) 카스파제 3 절단을 활성화시킨다; (g) 인간 및 설치류 LgR5 모두를 인식한다; (h) 인간 LgR5는 인식하나 설치류 LgR5는 인식하지 않는다; (i) 비접합된 형태로는 종양 성장을 유의하게 억제하지 않는다; 및 (j) 줄기 세포 분화를 유도하지 않는다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 8E11 및 이의 인간화된 변이체, 예를 들어, hu8E11.v2; YW353; 2H6; 및 3G12이다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5이다. 일부 양태에서, LgR5는 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및 래트 LgR5 중에서 선택된다.
(a) 서열 67의 아미노산 22-555 내의 에피토프에 결합한다
항-LgR5 항체가 LgR5의 에피토프에 결합하는지를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, LgR5 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 22-555 내)의 에피토프에 대한 항-LgR5 항체의 결합은 N- 및 C-말단 결실을 갖는 LgR5 폴리펩타이드를 293 세포에서 발현시키고 절두된 폴리펩타이드에 대한 항체의 결합을 실시예 I에서 기재되는 바와 같이 FACS로 시험함으로써 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 293 세포에서 발현되는 전장 LgR5에 대한 결합과 비교하여, 절두된 폴리펩타이드에 대한 항체의 결합의 실질적인 감소 (≥ 70% 감소) 또는 제거는 항체가 절두된 폴리펩타이드에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5이다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5 또는 시노몰구스 원숭이 LgR5이다.
일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 루이신 풍부 N-말단 도메인 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 25-66)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 하나 이상의 루이신 풍부 반복체 (LRR) (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 67-446; LgR5의 LRR 1-16)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 1 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 67-90)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 2 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 91-112)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 3 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 115-136)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 4 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 139-160)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 5 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 163-184)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 6 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 187-208)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 7 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 211-232)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 8 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 235-256)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 9 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 258-279)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 10 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 282-303)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 11 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 306-328)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 12 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 329-350)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 13 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 353-374)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 14 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 375-396)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 15 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 399-420)를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LgR5의 LRR 16 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 423-446)을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 LRR1 내지 LRR11, LRR2 내지 LRR11, LRR3 내지 LRR11, LLR1 내지 LLR3, LLR2 내지 LLR3, LLR2 내지 LLR8, LLR3 내지 LL7, 또는 LLR4 내지 LLR6 중 임의의 것을 포함한다.
일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-555 내의 에피토프를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-424 내의 에피토프를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-123 내의 에피토프를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-323 내의 에피토프를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 324-555 내의 에피토프를 포함한다. 일부 양태에서, LgR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 324-424 내의 에피토프를 포함한다.
본원에 기재되는 양상 및 양태들은 "이루어진" 및/또는 "필수적으로 이루어진" 양상 및 양태들을 포함하는 것으로 간주된다.
(b) ≤ 5 nM , 또는 ≤ 4 nM , 또는 ≤ 3 nM , 또는 ≤ 2 nM , 또는 ≤ 1 nM , 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM , 또는 ≥ 0.01 nM 의 친화도로 LgR5 에 결합한다
결합 친화도를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 결합 친화도는 실시예 E에서 기재되는 바와 같이 BIAcore® 검정에 따라 측정될 수 있다. 구체적으로, 일부 양태에서, Kd는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하여 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정된다. BIAcoreTM 연구용 등급 CM5 칩은 공급자의 지침에 따라 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 시약으로 활성화될 수 있다. 염소 항-인간 Fc IgG는 각각의 유동 셀에서 약 10,0000 반응 단위 (RU)를 달성하도록 칩에 커플링시킬 수 있다. 반응되지 않은 커플링 그룹은 1M 에탄올아민으로 차단될 수 있다. 동역학 측정을위해, 항-LgR5 항체는 약 300 RU를 달성하도록 포획될 수 있다. 인간 LgR5 ECD (배큘로바이러스 시스템에서 발현되는 His-Fc에 융합된 아미노산 22-557 (또는 유사한 단편, 예를 들어, 22-555) 또는 CHO 세포에서 발현되는 Fc에 융합된 아미노산 22-558 (또는 유사한 단편, 예를 들어, 22-555); 125 nM 내지 0.49 nM)의 2배 연속 희석물을 30 μl/min의 유속으로 25 ℃에서 HBS-P 완충액 (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중에 주입할 수 있다. 결합율 (kon) 및 해리율 (koff)을 1:1 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델 (BIAcoreTM 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산할 수 있다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산될 수 있다. 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의한 회합률 (on-rate)이 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 회합률은, 분광측정계, 예를 들어 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM- Aminco® 분광광도계 (ThermoSpectronic)로 측정시, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 약 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM 중 임의의 친화도로 LgR5에 결합한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 약 ≤ 5 nM의 친화도로 LgR5에 결합한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 약 ≤ 4 nM의 친화도로 LgR5에 결합한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 약 ≤ 3 nM의 친화도로 LgR5에 결합한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 약 ≤2 nM의 친화도로 LgR5에 결합한다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5이다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5 또는 시노몰구스 원숭이 LgR5이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "약"를 언급하는 값 또는 한도는 그 값 또는 한도 자체에 대한 양태를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
(c) LgR5 에 대한 R- 스폰딘 ( RSPO )의 결합을 유의하게 방해하지 않는다
LgR5에 대한 RSPO의 결합을 방해하는 항-LgR5 항체의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, LgR5에 대한 R-스폰딘 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하는 항-LgR5 항체의 능력은 유동 세포계로 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, LgR5를 발현하는 293 세포를 항-LgR5 항체의 존재 또는 부재하에서 형광-표지된 RSPO, 예를 들어, RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4와 접촉시킬 수 있다. 293 세포에 대한 RSPO의 결합은 형광-활성화된 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 양태에서, 대조군 항체 존재 하에서의 RSPO 결합에 비해, 항-LgR5 항체의 존재하에서 RSPO 결합이 약 25% 미만으로 감소하는 것은, 항-LgR5 항체가 LgR5에 대한 RSPO의 결합을 유의하게 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
일부 양태에서, LgR5에 대한 R-스폰딘 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하는 항-LgR5 항체의 능력은 BIAcore 검정으로 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, LgR5 세포외 도메인은, 예를 들어, 본원에서 기재되는 바와 같이, CM5 칩 상에 고정될 수 있으며; 고정된 LgR5에 대한 RSPO, 예를 들어, RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4의 결합은 항-LgR5 항체의 존재 및 부재 하에서 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 대조군 항체 존재 하에서의 RSPO 결합에 비해, 항-LgR5 항체의 존재하에서 RSPO 결합이 약 25% 미만으로 감소하는 것은, 항-LgR5 항체가 LgR5에 대한 RSPO의 결합을 유의하게 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
일부 양태에서, RSPO는 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및 RSPO4 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 항체는 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만으로 결합을 방해한다. 일부 양태에서, 항체는 LgR5에 대한 RSPO의 결합을 검출가능하게 방해하지 않는다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5이다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5 또는 시노몰구스 원숭이 LgR5이다.
(d) 베타- 카테닌 시그널링을 유의하게 방해하지 않는다
항-LgR5 항체가 wnt/베타-카테닌 시그널링을 방해하는 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, wnt/베타-카테닌 시그널링을 유의하게 방해하는 항-LgR5 항체의 능력은 리포터 유전자 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, wnt/베타-카테닌 반응성 프로모터 (예를 들어, 다량체화된 TCF/LEF DNA-결합 부위를 포함하는 프로모터)의 조절 하에서 리포터 유전자 (예를 들어, 루시페라제 유전자)를 포함하는 리포터 작제물을 LgR5를 발현하는 세포로 트랜스펙션시킬 수 있다. 이어서, 세포를 항-LgR5 항체의 존재 및 부재 하에서 Wnt 리간드, 예를 들어, Wnt3a, 및 RSPO, 예를 들어, RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4와 접촉시키고, 루시페라제 발현을 측정한다. 일부 양태에서, 대조군 항체 존재 하에서의 루시페라제 발현에 비해, 항체의 존재하에서 루시페라제 발현이 약 25% 미만으로 감소하는 것은, 항-LgR5 항체가 베타-카테닌 시그널링을 유의하게 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
일부 양태에서, 항체는 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만으로 베타-카테닌 시그널링을 방해한다. 일부 양태에서, 항체는 베타-카테닌 시그널링을 검출가능하게 방해하지 않는다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5이다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5 또는 시노몰구스 원숭이 LgR5이다.
(e) LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않는다
LgR5의 RSPO 활성화를 방해하는 항-LgR5 항체의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하는 항-LgR5 항체의 능력은 리포터 유전자 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, 베타-카테닌 반응성 프로모터 (예를 들어, 다량체화된 TCF/LEF DNA-결합 부위를 포함하는 프로모터)의 조절 하에서 리포터 유전자 (예를 들어, 루시페라제 유전자)를 포함하는 리포터 작제물을 LgR5를 발현하는 세포로 트랜스펙션시킬 수 있다. 이어서, 세포를 RSPO, 예를 들어, RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4의 존재 및 부재 하에서 Wnt 리간드, 예를 들어, Wnt3a와 접촉시킬 수 있으며, LgR5 시그널링의 활성화를 RSPO의 존재하에서 루시페라제 발현의 증가로 측정할 수 있다. LgR5 시그널링의 활성화는 또한 항-LgR5 항체의 존재 및 부재 하에서 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 세포를 대조군 항체와 접촉시켰을 때에 비해 세포를 항-LgR5 항체와 접촉시켰을 때 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4의 존재 하에서의 LgR5 시그널링의 활성화를 약 25% 미만으로 감소시킨다는 것은 항-LgR5 항체가 LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
일부 양태에서, RSPO는 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및 RSPO4 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 항체는 LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만으로 방해한다. 일부 양태에서, 항체는 LgR5 시그널링의 RSPO 활성화를 검출가능하게 방해하지 않는다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5이다. 일부 양태에서, LgR5는 인간 LgR5 또는 시노몰구스 원숭이 LgR5이다.
(f) 카스파제 3 절단을 활성화시킨다
카스파제 3을 활성화시키는 항-LgR5 항체의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 카스파제 3 절단을 활성화시키는 항-LgR5 항체의 능력은, 예를 들어, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, 설치류 이종이식편 모델에서 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 절단된 카스파제 3의 존재는, 예를 들어, 항-LgR5 항체가 투여된 장 종양형성 모델 마우스로부터 수집된 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 (FFPE) 소장 및 결장 조직에서 종양 면적의 함수로서 측정될 수 있다. 절단된 카스파제 3의 존재는, 일부 양태에서, 면역조직화학을 이용하여 측정될 수 있다. 또한, 일부 양태에서, 카스파제 3 절단은, 예를 들어, 실시예 N 및 도 18에 나타나 있는 바와 같이, 양성 종양 면역 백분율로서 측정될 수 있다.
일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 실시예 N에 기재된 검정에 따라 카스파제 3 양성 종양 면적의 백분율을 약 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% (즉, 양성 종양 면적 더블의 백분율) 중 임의의 백분율로 증가시킨다.
(g) 인간 및 설치류 LgR5 모두를 인식한다
인간 및 설치류 LgR5에 결합하는 항-LgR5 항체의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 인간 및 설치류 LgR5 폴리펩타이드는 293 세포에서 발현되며, LgR5-발현 293 세포에 대한 항체의 결합은 실시예 G에서 기재되는 바와 같이 FACS로 시험된다. 일부 양태에서, 설치류 LgR5는 마우스 또는 래트 LgR5이다. 일부 양태에서, 설치류 LgR5는 마우스 LgR5이다.
(h) 인간 LgR5 는 인식하나 설치류 LgR5 는 인식하지 않는다
인간 LgR5에는 결합하나 설치류 LgR5에 결합하지 않는 항-LgR5 항체의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 인간 및 설치류 LgR5 폴리펩타이드는 293 세포에서 발현되며, LgR5-발현 293 세포에 대한 항체의 결합은 실시예 G에서 기재되는 바와 같이 FACS로 시험된다. 일부 양태에서, 설치류 LgR5는 마우스 또는 래트 LgR5이다. 일부 양태에서, 설치류 LgR5는 마우스 LgR5이다.
(i) 비접합된 형태로는 종양 성장을 유의하게 억제하지 않는다
비접합된 형태로 종양 성장을 억제하는 항-LgR5 항체의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 설치류 이종이식편 모델, 예를 들어, 실시예 M에서 기재되는 D5124 췌장암 이종이식편 모델이 사용된다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는, 예를 들어, 실시예 L에서 기재되는 바와 같이, LoVo 결장암 세포주 이종이식편 모델에서 비접합된형태로는 종양 성장을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는, 예를 들어, 실시예 N에서 기재되는 바와 같이, 뮤린 장 종양형성 모델에서 비접합된 형태로는 종양 성장을 유의하게 억제하지 않는다. 이종이식편 모델 또는 뮤린 장 종양형성 모델에서의 종양 성장 억제는 비히클 대조군 또는 대조군 항체와 비교하여 측정된다.
일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 비접합된 형태로 종양 성장을 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만으로 억제시킨다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 비접합된 형태로는 종양 성장을 검출가능하게 억제하지 않는다.
(j) 줄기 세포 분화를 유도하지 않는다
줄기 세포 분화를 유도하는 항-LgR5 항체의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 줄기 세포 분화는 항-LgR5 항체의 존재 및 부재 하에서 LgR5를 발현하는 소장 내의 빠른-순환 줄기 세포인 크립트 기반 원주 세포 (crypt base columnar cell: CBC), 예를 들어, 소장세포, 배상 세포, 및/또는 장관내분비 세포의 분화 능력을 측정함으로써 검정될 수 있다. 일부 양태에서, 대조군 항체가 약 25% 미만의 CBC 세포군으로 줄기 세포 분화를 유도하는 조건 하에서, 항-LgR5 항체의 존재 하에서 약 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만의 CBC 세포군이 분화하는 경우, 항-LgR5 항체는 줄기 세포 분화를 유도하지 않는 것으로 여겨진다
일부 양태에서, 항-LgR5 항체 면역접합체는 줄기 세포 분화를 유도하지 않는 주요 기작을 통해 종양 성장을 억제시킨다. 일부 이러한 양태에서, 항-LgR5 항체 면역접합체는 면역접합체에서 항체에 접합된 세포독성제를 통해 매개되는 세포독성 활성을 통해 종양 성장을 억제시킨다.
항체 8 E11 및 다른 양태
일부 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-LgR5 항체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2을 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 양태에서, 항체는 (a) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
임의의 상기 양태에서, 항-LgR5 항체는 인간화된다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 인간 수용체 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다. 특정 양태에서, 인간 수용체 프레임워크는 인간 VL 카파 IV 공통 (VLKIV) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VH1이다. 특정 양태에서, 인간 수용체 프레임워크은 인간 VL 카파 IV 공통 (VLKIV) 프레임워크 및/또는 중쇄 프레임워크 영역 FR3에 R71S 돌연변이 및 A78V 돌연변이를 포함하는 VH 프레임워크 VH1이다.
일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열 40 내지 43 중에서 선택되는 중쇄 프레임워크 FR3 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열 41의 중쇄 프레임워크 FR3 서열을 포함한다. 일부 이러한 양태에서, 중쇄 가변 도메인 프레임워크은 서열 40 내지 43 중에서 선택되는 FR3 서열을 갖는 변형된 인간 VH1 프레임워크이다. 일부 이러한 양태에서, 중쇄 가변 도메인 프레임워크은 서열 41의 FR3 서열을 갖는 변형된 인간 VH1 프레임워크이다.
일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열 36의 경쇄 프레임워크 FR3 서열을 포함한다. 일부 이러한 양태에서, 중쇄 가변 도메인 프레임워크은 서열 36의 FR3 서열을 갖는 변형된 VL 카파 IV 공통 (VLKIV) 프레임워크이다.
또 다른 양상에서, 항-LgR5 항체는 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중에서 선택되는서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중에서 선택되는서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다.
일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 6의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 8의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 12의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 14의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 16의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다.
임의로, 항-LgR5 항체는 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중에서 선택되는 VH 서열 (이 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 서열 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 중에서 선택되는아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 중에서 선택되는 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다.
일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 7의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 9의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 11의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 13의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 15의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-LgR5 항체는 서열 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다.
임의로, 항-LgR5 항체는 서열 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 중에서 선택되는 아미노산 서열의 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다 특정 양태에서, VL은 (a) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VH 및 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VL을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 6 및 5의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 8 및 7의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 10 및 9의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 12 및 11의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 14 및 13의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 16 및 15의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 18 및 17의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 20 및 19의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 아미노산 22-323으로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 아미노산 1-312로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 68의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 모노클로날 항체 (키메릭, 인간화된 또는 인간 항체 포함)이다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2이다. 또 다른 양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어, IgG1 항체 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소형이다.
추가의 양상에서, 임의의 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 하기 단락 1-7에서 기재되는 바와 같은 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
항체 YW353 및 다른 양태
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-LgR5 항체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 양태에서, 항체는 (a) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 59로부터의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
임의의 상기 양태에서, 항-LgR5 항체는 인간 항체이다.
또 다른 양상에서, 항-LgR5 항체는 서열 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 서열 26의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 26에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 26에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다. 임의로, 항-LgR5 항체는 서열 26의 VH 서열 (이 서열의 해독후 변형 포함)을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 서열 25의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 25에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 25에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다. 임의로, 항-LgR5 항체는 서열 25의 VL 서열 (이 서열의 해독후 변형 포함)을 포함한다. 특정 양태에서, VL은 (a) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VH 및 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VL을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 26 및 25의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 서열 26의 VH 서열 및 서열 25의 VL 서열을 포함하는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 아미노산 22-123으로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 아미노산 1-102로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 68의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가의 양상에서, 임의의 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 모노클로날 항체 (인간 항체 포함)이다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2이다. 또 다른 양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어, IgG2a 항체 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소형이다.
추가의 양상에서, 임의의 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 하기 단락 1-7에서 기재되는 바와 같은 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
항체 3 G12 및 다른 양태
일부 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-LgR5 항체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 (a) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 양태에서, 항체는 (a) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 50으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
임의의 상기 양태에서, 항-LgR5 항체는 인간화된다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 인간 수용체 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다. 특정 양태에서, 인간 수용체 프레임워크는 인간 VL 카파 공통 (VLK) 프레임워크 및/또는 인간 VH 서브그룹 3 공통 (VH3) 프레임워크이다.
또 다른 양상에서, 항-LgR5 항체는 서열 22의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 서열 22의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 22의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 22의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다.
임의로, 항-LgR5 항체는 서열 22의 VH 서열 (이 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열 21의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 서열 21의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 21의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 21의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다.
임의로, 항-LgR5 항체는 서열 21의 VL 서열 (이 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 특정 양태에서, VL은 (a) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VH 및 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VL을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 22 및 21의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 서열 22의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함하는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 아미노산 324-423으로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 아미노산 303-402로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 68의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 아미노산 324-555로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 아미노산 303-534로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 68의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 모노클로날 항체 (키메릭, 인간화된 또는 인간 항체 포함)이다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2이다. 또 다른 양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어, IgG1 항체 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소형이다.
추가의 양상에서, 임의의 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 하기 단락 1-7에서 기재되는 바와 같은 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
항체 2 H6 및 다른 양태
일부 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-LgR5 항체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 항체는 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2을 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 (a) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 양태에서, 항체는 (a) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 56로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
임의의 상기 양태에서, 항-LgR5 항체는 인간화된다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 인간 수용체 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다. 특정 양태에서, 인간 수용체 프레임워크는 인간 VL 카파 공통 (VLK) 프레임워크 및/또는 인간 VH 서브그룹 3 (VH3) 프레임워크이다.
또 다른 양상에서, 항-LgR5 항체는 서열 24의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 서열 24의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 24의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 24의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다.
임의로, 항-LgR5 항체는 서열 24의 VH 서열 (이 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열 23의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 서열 23의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 이 서열을 포함하는 항-LgR5 항체는 LgR5에 결합하는 능력은 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 23의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열 23의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외의 영역 (즉, FR)에서 발생한다.
임의로, 항-LgR5 항체는 서열 23의 아미노산 서열의 VL 서열 (이 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다. 특정 양태에서, VL은 (a) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VH 및 상기에서 제공되는 임의의 양태에서와 같은 양태와 같은 VL을 포함하는 항-LgR5 항체가 제공된다. 하나의 양태에서, 항체는 각각 서열 24및 23의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 해독후 변형을 포함)을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 서열 24의 VH 서열 및 서열 23의 VL 서열을 포함하는 항-LgR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 아미노산 324-423으로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 아미노산 303-402로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 68의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 아미노산 324-555로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 아미노산 303-534로부터의 또는 이내의 또는 이와 겹치는 서열 68의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 모노클로날 항체 (키메릭, 인간화된 또는 인간 항체 포함)이다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2이다. 또 다른 양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어, IgG1 항체 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소형이다.
추가의 양상에서, 임의의 상기 양태에 따른 항-LgR5 항체는 하기 단락 1-7에서 기재되는 바와 같은 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
1. 항체 친화도
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수(Kd)를 갖고, 임의로 ≥ 10-13 M (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)이다.
하나의 양태에서, Kd는 하기 검정에서 기재되는 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (참조: 예를 들어, Chen 외, J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)). 검정 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 멀티-웰 플레이트 (Thermo Scientific)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 Presta 외, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997))의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20TM; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 TOPCOUNTTM 감마 계수기 (Packard)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 양태에 따라, Kd는 약 10의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하는 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정된다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)을 공급자의 지침에 따라 N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (약 0.2 μM)로 희석한 후에 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질이 달성되도록 5 μl/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 그룹을 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 μl/분의 유속으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 간단한 1:1 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon . 의 비로 계산한다.참조: 예를 들어, Chen 외, J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999). 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의한 회합률 (on-rate)이 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 회합률은, 분광측정계, 예를 들어 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정시, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25oC에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재되는 다른 단편을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 하기 문헌을 참조한다: 참조: Hudson 외 Nat . Med . 9:129-134 (2003). scFv 단편의 검토를 위해, 하기 문헌을 참조한다: 참조:: 예를 들어,
Figure pct00012
, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 참조: WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 하기 문헌을 참조한다: 참조: U.S. 특허 번호 5,869,046.
디아바디는 2가 또는 이특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 참조: 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등, Nat . Med . 9:129-134 (2003); and Hollinger 외, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 Hudson 외, Nat . Med . 9:129-134 (2003) 에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조: 예를 들어, U.S. 특허 번호 6,248,516 B1).
항체 단편은, 본원에서 기재되는 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해적 분해 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하고 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메릭 및 인간화된 항체
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 키메릭 항체이다. 특정 키메릭 항체는, 예를 들어, U.S. 특허 번호 4,816,567 및 문헌 Morrison 외, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메릭 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예시에서, 키메릭 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모항체의 것으로부터 변화된 "클래스 스위칭된" 항체이다. 키메릭 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 양태에서, 키메릭 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어, CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 양태에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들어, 문헌 Almagro and Fransson, Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되고 있으며, 예를 들어, 문헌 Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); Queen 외, Proc . Nat' l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri 등, Methods 36:25-34 (2005) (describing SDR (a-CDR) grafting); Padlan, Mol . Immunol. 28:489-498 (1991) (describing "resurfacing"); Dall'Acqua 외, Methods 36:43-60 (2005) (describing "FR shuffling"); 및 Osbourn 외, Methods 36:61-68 (2005) and Klimka 외, Br . J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)]에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 [참조: 예를 들어, Sims 외 J. Immunol . 151:2296 (1993)]; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래되는 프레임워크 영역 (참조: 예를 들어, Carter 외 Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 및 Presta 외 J. Immunol ., 151:2623 (1993)]; 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 [참조: 예를 들어, Almagro and Fransson, Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008)]; 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 [참조: 예를 들어, Baca 외, J. Biol . Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 외, J. Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996)]을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자자리를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자자리는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해 하기 문헌을 참조한다: 참조: Lonberg, Nat . Biotech . 23:1117-1125 (2005). 또한, 참조: 예를 들어, U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSETM 기술 설명; U.S. 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 설명); U.S. 특허 번호 7,041,870 (K-M MOUSE® 기술 설명), 및 U.S. 특허원 공개 번호 US 2007/0061900 (VelociMouse® 기술 설명). 이러한 동물에 의해 생성되는 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (참조: 예를 들어, Kozbor J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur 외, 모노클로날 항체 Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 외, J. Immunol., 147: 86 (1991)] 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성되는 인간 항체가 문헌 [Li 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 설명) 및 문헌 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마 설명)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005) 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술이 하기에 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 하기 문헌에서 검토된다 Hoogenboom 외 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어, 문헌 McCafferty 외, Nature 348:552-554; Clackson 외, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 외, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 외, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee 외, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)].
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 별도로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 Winter 외, Ann . Rev . Immunol ., 12: 433-455 (1994)]에서 기재되는 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 Griffiths 외, EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에서 기재되는 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브 레퍼토리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝할 수 있다. 최종적으로, 문헌 Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227: 381-388 (1992)]에서 기재되는 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 합성적으로도 제조할 수 있다 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다특이적 항체
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 다특이적 항체, 예를 들어 이특이적 항체이다. 다특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다 특정 양태에서, 결합 특이성 중 하나는 LgR5에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 양태에서, 결합 특이성 중 하나는 LgR5에 대한 것이고, 다른 것은 CD3에 대한 것이다. 참조 : 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,821,337. 특정 양태에서, 이특이적 항체는 LgR5의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이특이적 항체는 또한 LgR5를 발현하는 세포에 세포독성제를 위치시키는데 사용될 수 있다. 이특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (참조: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker 외, EMBO J. 10: 3655 (1991)), 및 "노브-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (참조: 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,731,168)을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 다특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (참조: 예를 들어, US 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan 외, Science, 229: 81 (1985)); 이특이적 항체를 생산하기 위한 루이신 지퍼의 사용 (참조: 예를 들어, Kostelny 외, J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)); 이특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 이용 (참조: 예를 들어, Hollinger 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 ((참조: 예를 들어 Gruber 외, J. Immunol., 152:5368 (1994)); 및 예를 들어, 문헌 Tutt 외 J. Immunol . 147: 60 (1991)]에서 기재되는 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (참조, 예를 들어, US 2006/0025576A1).
본원의 항체 또는 단편은 또한 LgR5 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (참조: 예를 들어, US 2008/0069820).
7. 항체 변이체
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 목적하는 특성, 예를 들어, 항원-결합을 보유하는 한, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 "바람직한 치환"의 표제 하에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 표 1에서 "예시적인 치환"의 표제 하의 제공되며, 아미노산 측쇄 클래스에 대해서는 이하에서 더욱 기재된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 목적하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
표 1
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 예를 들어, 본원에서 기재되는 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은, 예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은, 생성된 변이체 VH 또는 VL의 결합 친화도를 시험하면서, HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (참조: 예를 들어, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 작제 및 재선택에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어, 문헌 Hoogenboom 외 in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 양태, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 수개의 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화되는 HVR-유도된 접근법을 포함한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공되는 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
문헌 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에서 기재되는 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서는, 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예를 들어, 하전된 잔기, 예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu)을 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시켜 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조가 이용하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환에 대한 후보물로서 표적되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 포함하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합되는 것을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산되는 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 참조: 예를 들어, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노즈, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토즈 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착되는 푸코즈를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 본 발명의 항체에 올리고사카라이드 변형이 이루어질 수 있다.
하나의 양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코즈가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코즈의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코즈의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에서 기재되는 바와 같이, MALDI-TOF 매쓰 분광측정법으로 측정하여, Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예: 복합체, 하이브리드 및 고만노즈 구조물)의 합과 비교되는, Asn297에서 당 쇄 내의 푸코즈의 평균적인 양을 계산함으로써 결정된다. 297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치된 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체에서의 최소 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치될 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참조: 예를 들어, US 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 외 J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 외 Biotech . Bioeng . 87: 614 (2004). 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 Ripka 외 Arch . Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; and WO 2004/056312 A1, Adams 등, especially at Example 11], 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8 , 녹아웃 CHO 세포 (참조: 예를 들어, Yamane-Ohnuki 외 Biotech . Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); and WO2003/085107)를 포함한다.
예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착되는 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분되는, 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어, WO 2003/011878 (Jean-Mairet 외); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana 외); 및 US 2005/0123546 (Umana 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착되는 올리고사카라이드 내에 1개 이상의 갈락토즈 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087 (Patel 외); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공되는 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은, 모든 이펙터 기능이 아닌 일부 이펙터 기능을 보유함으로써 생체내 항체 반감기는 중요하나 특정의 이펙터 기능 (예를 들어 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용에 대해 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcgR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성 결핍), FcRn 결합 능력은 보유하고 있다는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 Fc(RIII을 발현하는 반면에, 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 U.S. 특허 번호 5,500,362 및 문헌 (참조: 예를 들어 Hellstrom, I. 외 Proc . Nat' l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I 외, Proc . Nat' l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (참조: Bruggemann, M. 외, J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987))에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 ACTITM 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)]. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 상체 내에서, 예를 들어, 문헌 Clynes 외 Proc . Nat' l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998) 에서 기재되는 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 참조: 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (참조: 예를 들어, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외, Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정도 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (참조: 예를 들어, Petkova, S.B. 외, Int' l. Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상에 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (참조: 예를 들어, U.S. 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, and Shields 외, J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001))
특정 양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 Idusogie 외 J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000) 에서 기재되는 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (Guyer 외, J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1(Hinton 외)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해 하기 문헌을 또한 참조한다 참조: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 번호 5,648,260; U.S. 특허 번호 5,624,821; and WO 94/29351.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환되는 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 그룹이 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 항체를 다른 모이어티, 예를 들어 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,521,541에 기재되는 바와 같이 생성될 수 있다.
예시적 hu8E11.v2 경쇄 (LC) V205C 티오mab은 각각 서열 64 및 74의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다. 예시적 hu8E11.v2 중쇄 (HC) A118C 티오mab은 각각 서열 75 및 63의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다. 예시적 hu8E11.v2 중쇄 (HC) S400C 티오mab은 각각 서열 76 및 63의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다.
예시적 YW353 경쇄 (LC) V205C 티오mab은 각각 서열 66 및 77의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다. 예시적 YW353 중쇄 (HC) A118C 티오mab은 각각 서열 78 및 65의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다. 예시적 YW353 중쇄 (HC) S400C 티오mab은 각각 서열 79 및 65의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다.
추가의 예시적 V205C 시스테인 조작된 티오mabs은 서열 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23 중에서 선택되는 가변 영역 및 서열 80의 불변 영역을 포함하는 경쇄 및 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24 중에서 선택되는 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgG1를 포함하는 중쇄를 포함한다. 추가의 예시적 A118C 시스테인 조작된 티오mabs은 서열 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23중에서 선택되는 가변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄 및 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24 중에서 선택되는 가변 영역 및 서열 81의 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 추가의 예시적 S400C 시스테인 조작된 티오mabs은 서열 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23 중에서 선택되는 가변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄 및 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24 중에서 선택되는 가변 영역 및 서열 82의 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
e) 항체 유도체
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 당업계에서 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 변할 수 있고, 1개를 초과하는 중합체가 부착되는 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 치료 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하고 이에 제한되지 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체와 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 하나의 양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567에 기재되어 있는 바와 같이 생산할 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에서 기재되는 항-LgR5 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 추가 양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염된다). 하나의 양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 양태에서, 상기에서 제공되는 바와 같은 항-LgR5 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로, 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함하여, 항-LgR5 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-LgR5 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 상기에서 기재되는 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에서 기재되는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서는, 참고, 예를 들면 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조한다. (참조: Charlton, Methods in Molecular Biology , Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 (이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재)) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예를 들어, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는 진균 및 효모 균주를 포함한, 사상 진균 또는 효모가 항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 참조: Gerngross, Nat . Biotech . 22:1409-1414 (2004), 및 Li 외, Nat . Biotech . 24:210-215 (2006).
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다 다수의 배큘로바이러스 스트레인이 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda ) 세포를 트랜스펙션시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기재).
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁 배양에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 Graham 외, J. Gen Virol . 36:59 (1977))에 기재되어 있는 바와 같은 293 또는 293 세포)tc "Graham 등, J. Gen Virol . 36\:59 (1977)) " \f D ; 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)tc "Mather, Biol . Reprod . 23\:243-251 (1980) " \f D 에 기재되어 있는 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들어, 문헌 Mather 외, Annals N.Y. Acad . Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재되어 있는 바와 같은 세포); MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub 외, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들어, Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 하기 문헌을 참조한다: 참조: 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology , Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., 인간a Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
C. 검정
본원에서 제공되는 항-LgR5 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 항체를, 예를 들어, ELISA,, BIACore®, FACS, 또는 웨스턴 블롯과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 양상에서, 경쟁 검정은 LgR5에 대한 결합에 대해 본원에서 기재되는 바와 같은 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 확인하는데 이용될 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 경쟁 항체는 본원에서 기재되는 항체에 의해 결합된 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적인 방법은 문헌 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) 에 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 LgR5를 LgR5에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 본원에서 기재되는 임의의 항체) 및 LgR5에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험할 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상등액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 LgR5를 제1 표지된 항체는 포함하고 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션한다. LgR5에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 과량의 미결합 항체를 제거하고, 고정된 LgR5과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 LgR5과 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이것은 제2 항체가 LgR5에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 본원의 항-LgR5 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
면역접합체는 약물 모이어티의 종양에의 표적 전달 및, 일부 양태에서, 비접합된 약물의 전신 투여가 정상 세포에 허용가능하지 않은 수준의 독성을 초래할 수 있는 경우, 세포내 축적을 가능하게 한다 (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
항체-약물 접합체 (ADC)는, 강력한 세포독성 약물을 항원-발현 종양 세포에 표적함으로써 (Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004] 효능을 최대화하고 표적을 벗어난 독성을 최소화하여 치료 지수를 향상시키는, 항체와 세포독성 약물 모두의 특성을 조합한 표적되는 화학요법 분자이다 (Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc . Chem . Res. 41:98-107.
본 발명의 ADC는 항암 활성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 양태에서, ADC 화합물은 약물 모이어티에 접합된, 즉 공유적으로 부착된 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 링커를 통해 약물 모이어티에 공유적으로 부착된다. 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 유효량의 약물을 종양 조직에 선택적으로 전달함으로써 치료 지수 ("치료 윈도우")를 증가시키면서 보다 높은 선택성, 즉 보다 낮은 유효량을 달성할 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 잔기 또는 그룹을 포함할 수 있다. 약물 모이어티는 투불린 결합, DNA 결합 또는 삽입, 및 RNA 폴리머라제, 단백질 합성, 및/또는 토포이소머라제의 억제를 포함하고 이에 제한되지 않는 기작에 의해 이들의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 부여할 수 있다. 예시적 약물 모이어티는 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 네모루비신 및 이의 유도체, PNU-159682, 안트라사이클린, 듀오카마이산, 빈카 알카로이드, 탁손, 트리초테센, CC1065, 캄포테신, 엘리나파이드, 및 세포독성 활성을 갖는 이의 입체이성체, 등배체 (isosteres), 동족체, 및 유도체를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 이러한 면역접합체의 비제한적 예가 하기에서 더욱 상세히 기재된다.
1. 예시적 항체-약물 접합체
항체-약물 접합체 (ADC) 화합물의 예시적 양태는 종양 세포를 표적하는 항체 (Ab), 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어, 리신 및/또는 시스테인을 통해 링커 모이어티 (L)에 부착된다.
예시적 ADC는 하기 화학식 I을 갖는다:
Ab-(L-D)p I
상기 식에서, p는 1 내지 약 20이다. 일부 양태에서, 항체에 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 유리 시스테인 잔기의 수에 의해 제한된다. 일부 양태에서, 유리 시스테인 잔기는 본원에서 기재되는 방법에 의해 항체 아미노산 서열로 도입된다. 화학식 I의 예시적 ADC는 1, 2, 3, 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함하고 이에 제한되지 않는다 (Lyon, R. 등 (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). 일부 양태에서, 하나 이상의 유리 시스테인 잔기가 조작 없이 항체에 이미 존재하며, 이 경우 기존의 유리 시스테인 잔기가 항체를 약물에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 하나 이상의 시스테인 잔기를 생성하기 위해 항체의 접합 전에 환원 조건에 노출된다.
a) 예시적 링커
"링커" (L)는 화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성하도록 하나 이상의 약물 모이어티 (D)를 항체 (Ab)에 연결시키는데 사용될 수 있는 이작용성 또는 다작용성 잔기이다. 일부 양태에서, 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물 및 항체에 대한 공유적으로 부착을 위한 반응적 작용기를 갖는 링커를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 링커 또는 ADC를 만들기 위한 약물-링커 중간체의 반응적 작용 그룹과 결합을 형성할 수 있다.
하나의 양상에서, 링커는 공유 결합을 형성하도록 항체 상에 존재하는 유리 시스테인과 반응할 수 있는 작용기를 갖는다. 이러한 반응적 작용기의 비제한적 에는 말레이미드, 할로아세타미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르, 예를 들어, 석신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 설포닐 클로라이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다. 참조: 예를 들어, 문헌 Klussman, 등 (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773]의 766 페이지에 있는 접합 방법 및 이의 예시.
일부 양태에서, 링커는 항체 그룹 상에 존재하는 친전자성 그룹과 반응할 수 있는 작용기를 갖는다. 예시적인 이러한 친전자성 그룹은 알데하이드 및 케톤 카보닐 그룹을 포함하고 이에 제한되지 안는다. 일부 양태에서, 링커의 반응적 작용기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 그룹과 반응하고 항체 단위에 대해 공유 결합을 형성할 수 있다. 이러한 반응적 작용기의 비제한적 예는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함하고 이에 제한되지 않는다.
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 및 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트 ("MCC")를 포함한다. 다양한 링커 성분이 당업계에 공지되어 있고, 일부를 하기에 기재한다.
링커는 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 비제한적인 예시적 절단가능 링커는 산 불안정 링커 (예를 들어, 하이드라존을 포함), 프로테아제-민감성 (예를 들어, 펩티다제-민감성) 링커, 광불안정 링커, 또는 디설파이드-포함 링커를 포함한다 (Chari 외, Cancer Research 52:127-131 (1992); US 5208020].
특정 양태에서, 링커는 하기 화학식 II를 갖는다:
Figure pct00014

상기 식에서, A는 "스트레쳐 (stretcher) 단위"이고, a는 0 내지 1의 정수이고, W는 "아미노산 단위"이고, w는 0 내지 12의 정수이고, Y는 "스페이서 단위"이고, y는 0, 1, 또는 2이다. 화학식 II의 링커를 포함하는 ADC는 화학식 I(A): Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p (여기서, Ab, D, 및 p는 화학식 I에 대해 상기 정의된 바와 같다)을 갖는다. 이러한 링커의 예시적 양태가 미국 특허 번호 7,498,298 (명백히 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 링커 성분은 항체를 또 다른 링커 성분 또는 약물 모이어티에 연결하는 "스트레쳐 단위" (A)를 포함한다. 비제한적인 예시적 스트레쳐 단위가 하기에 나타나 있다 (여기서, 물결선은 항체, 약물 또는 추가의 링커 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타낸다):
Figure pct00015

일부 양태에서, 링커 성분은 "아미노산 단위" (W)를 포함한다. 일부 이러한 양태에서, 아미노산 단위는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 가능하게 함으로써 리포좀 효소와 같은 세포내 프로테아제에 노출시 면역접합체로부터 약물의 방출을 촉진시킨다 (Doronina 외 (2003) Nat . Biotechnol. 21:778-784). 예시적 아미노산 단위는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 및 펜타펩타이드를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 예시적 디펩타이드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-리신 (fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모리신 (phe-homolys); 및 N-메틸-발린-시트룰린 (Me-val-cit)을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 예시적 트리 펩타이드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 아미노산 단위는 천연 발생 아미노산 잔기 및/또는 소수 아미노산 및/또는 비-천연 발생 아미노산 동족체, 예를 들어, 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 특정 효소, 예를 들어, 종양-관련된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위해 고안되고 최적화될 수 있다.
전형적으로, 펩타이드-유형 링커는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩타이드 단편 사이에 펩타이드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩타이드 결합은, 예를 들어, 액상 합성법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, E.
Figure pct00016
and K.
Figure pct00017
(1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press).
일부 양태에서, 링커 성분은 직접적으로 또는 스트레쳐 단위 및/또는 아미노산 단위를 통해 약물 모이어티에 항체를 연결하는 "스페이서 단위" (Y)를 포함한다. 스페이서 단위는 "자가-희생적" 또는 "비-자가-희생적"일 수 있다. "비-자가-희생적" 스페이서 단위는 스페이서 단위의 일부 또는 전부가 ADC의 절단시 약물 모이어티에 결합된 상태로 남아있는 것이다. 비-자가-희생적 스페이서 단위의 예는 글리신 스페이서 단위 및 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 종양-세포 관련 프로테아제에 의한 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함하는 ADC의 효소적 절단으로 ADC의 나머지로부터 글리신-글리신-약물 모이어티가 방출된다. 일부 이러한 양태에서, 글리신-글리신-약물 모이어티는 종양 세포에서 가수분해 단계를 거침으로써 약물 모이어티로부터 글리신-글리신 스페이서 단위를 절단시킨다.
"자가-희생적" 스페이서 단위는 약물 모이어티를 방출시킨다. 특정 양태에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 일부 이러한 양태에서, p-아미노벤질 알코올은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되며, 카바메이트, 메틸카바메이트, 또는 카보네이트가 벤질 알코올과 약물 사이에 형성된다 (Hamann 외 (2005) Expert Opin . Ther . Patents (2005) 15:1087-1103). 일부 양태에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카보닐 (PAB)을 포함한다. 일부 양태에서, 자가-희생적 링커를 포함하는 ADC는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00018

상기 식에서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로, 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 정수이고; X는 하나 이상의 추가의 스페이서 단위일 수 있거나 부재할 수 있으며; p는 1 내지 약 20의 범위이다. 일부 양태에서, p는 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4의 범위이다. 비제한적인 예시적 X 스페이서 단위는 하기를 포함한다:
Figure pct00019
및
Figure pct00020
; 상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬 중에서 선택된다. 일부 양태에서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.
자가-희생적 스페이서의 다른 예는 PAB 그룹과 전자적으로 유사한 방향족 화합물, 예를 들어, 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (U.S. 특허 번호 7,375,078; Hay 외 (1999) Bioorg . Med . Chem . Lett. 9:2237) 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 아미드 결합 가수분해시 사이클화를 겪는 스페이서, 예를 들어, 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 [Rodrigues 등 (1995) Chemistry Biology 2:223], 적절히 치환된 바이사이클로[2.2.1] 및 바이사이클로[2.2.2] 환 시스템 (Storm 등 (1972) J. Amer . Chem . Soc . 94:5815] 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 [(Amsberry, 등 (1990) J. Org. Chem. 55:5867)가 사용될 수 있다. 글리신 잔기의 α-탄소에 대한 약물의 결합도 ADC에 유용할 수 있는 자가-희생적 스페이서의 또 다른 예이다 (Kingsbury 등 (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
일부 양태에서, 링커 L은 분지된 다작용성 링커 모이어티를 통해 하나 초과의 약물 모이어티를 항체에 공유적으로 부착시키기 위한 수지상 링커일 수 있다 [Sun 등 (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun 등 (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768]. 수지상 링커는 ADC의 효능과 관련된 약물 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체가 단지 하나의 반응적 시스테인 티올 그룹을 갖는 경우, 다수의 약물 모이어티가 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다.
화학식 I의 ADC와 관련하여 비제한적 예시적 링커가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00021

Figure pct00022

Figure pct00023
; 상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬 중에서 선택된다. 일부 양태에서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.
Figure pct00024
Phe-Lys-PAB-Ab;
상기 식에서, n은 0 내지 12이다. 일부 양태에서, n은 2 내지 10이다. 일부 양태에서, n은 4 내지 8이다.
추가의 비제한적인 예시적 ADC는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00025

Figure pct00026

상기 식에서, X는
Figure pct00027

Figure pct00028
또는
Figure pct00029
이고;
Y는
Figure pct00030
또는
Figure pct00031
이고;
각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다.
일부 양태에서, 링커는 용해도 및/또는 반응성을 조절하는 그룹으로 치환된다. 비제한적 예시로서, 설포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄과 같은 하전된 치환체는 링커 시약의 수용해도를 증가시키고 링커 시약과 항체 및/또는 약물 모이어티와의 커플링 반응을 용이하게 하거나, ADC를 제조하는데 이용되는 합성 경로에 따라, Ab-L (항체-링커 중간체)과 D 또는 D-L (약물-링커 중간체)과 Ab와의 커플링 반응을 촉진시킬 수 있다. 일부 양태에서, 링커의 일부는 항체에 커플링되고 링커의 일부는 약물에 커플링됨으로써 Ab-(링커 일부)a가 약물-(링커 일부)b에 커플링되어 화학식 I의 ADC를 형성한다.
본 발명의 화합물은 특별히 하기 링커 시약으로 제조되는 ADC를 고려하고 이에 제한되지 않는다: 비스-말레이미도-트리옥시에틸렌 글리콜 (BMPEO), N-(β-말레이미도프로필옥시)-N-하이드록시 석신이미드 에스테르 (BMPS), N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 석신이미드 에스테르 (EMCS), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 에스테르 (GMBS), 1,6-헥산-비스-비닐설폰 (HBVS), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르 (MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드 (MPBH), 석신이미딜 3-(브로모아세타미도)프로피오네이트 (SBAP), 석신이미딜 요오도아세테이트 (SIA), 석신이미딜 (4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 석신이미딜 6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH), 이미노티올란 (IT), 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트 (SVSB), 및 비스-말레이미드 시약 포함: 디티오비스말레이미도에탄 (DTME), 1,4-비스말레이미도부탄 (BMB), 1,4 비스말레이미딜-2,3-디하이드록시부탄 (BMDB), 비스말레이미도헥산 (BMH), 비스말레이미도에탄 (BMOE), BM(PEG)2 (하기에 나타냄), 및 BM(PEG)3 (하기에 나타냄); 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예: 디석신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예: 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디오소시아네이트), 및 이-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠). 일부 양태에서, 비스-말레이미드 시약은 항체의 시스테인의 티올 그룹을 티올-포함 약물 모이어티, 링커, 또는 링커-약물 중간체에 부착시킨다. 티올 그룹과 반응하는 다른 작용성 그룹은 요오도아세타미드, 브로모아세타미드, 비닐 피리딘, 디설파이드, 피리딜 디설파이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함하고 이에 제한되지 않는다.
Figure pct00032

특정한 유용한 링커 시약은 다양한 시판 공급원, 예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO)로부터 입수하거나, 당업계에 공지된 절차, 예를 들어, 문헌 Toki 등 (2002) J. Org . Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, 외 (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org . Chem. 60:5352-5355; Frisch 등 (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; and WO 04/032828]에 기재된 절차에 따라 합성될 수 있다.
탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토 벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오타이드를 접합시키기 위한 예시적 킬레이트화제이다. 참조: 예를 들어, WO94/11026.
b) 예시적 약물 모이어티
(1) 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 메이탄신이 유도체이며, 투불린 중합화를 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrate)로부터 처음으로 단리되었다 (U.S. 특허 번호 3896111). 이어서, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성한다는 것이 발견되었다 (U.S. 특허 번호 4,151,042). 합성적 메이탄시노이드가 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 기재되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, (i) 발효 또는 발효 생성물의 화학적 변형 또는 유도체화로 제조하기가 비교적 용이하고, (ii) 항체에 대해 비-디설파이드 링커를 통해 접합하는데 적합한 작용 그룹으로 유도체화할 수 있으며, (iii) 혈장에서 안정하며 (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기에 적합한 특정 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리하거나 유전자 조작 기술을 이용하여 생성할 수 있다 (참조: 예를 들어, Yu 등 (2002) PNAS 99:7968-7973). 메이탄시노이드는 또한 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조될 수 있다.
예시적 메이탄시노이드 약물 모이어티는 C-19-데클로로 (U.S. 특허 번호 4256746) (예를 들어, 안사미토신 P2의 수소화알루미늄리튬 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (US 특허 번호. 4361650 및 4307016) (예를 들어, 스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (U.S. 특허 번호 4,294,757) (예를 들어, 아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨)와 같이 변형된 방향족 환을 갖는 것들, 및 방향족 환의 다른 위치에서 변형을 갖는 것들을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
예시적 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 C-9-SH (U.S. 특허 번호 4424219) (예를 들어, 메이탄시놀을 H2S 또는 P2S5와 반응시켜 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2 OR)(US 4331598); C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (U.S. 특허 번호 4450254) (예를 들어, 노카르디아로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시 (US 4364866) (예를 들어, 스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); C-15-메톡시 (US 특허 번호 4313946 및 4315929) (예를 들어, 트레위아 누들플로라로부터 분리됨); C-18-N-데메틸 (US 특허 번호 4362663 및 4322348) (예를 들어, 스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시 (US 4371533) (예를 들어, 메이탄시놀의 삼염화티탄/LAH 환원에 의해 제조됨)와 같은 변형을 갖는 것들을 포함한다.
메이탄시노이드 화합물 상의 많은 위치가 연결 위치로서 유용하다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상의 커플링 기술을 이용하여 하이드록실 그룹과 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 일부 양태에서, 반응은 하이드록실 그룹을 갖는 C-3 위치에서, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치에서, 하이드록실 그룹으로 변형된 C-15 위치에서 및 하이드록실 그룹을 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 일부 양태에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 동족체의 C-3 위치에서 형성된다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 구조를 갖는 것들을 포함한다:
Figure pct00033

상기 식에서, 물결선은 ADC의 링커에 대한 메이탄시노이드 약물 모이어티의 황원자의 공유적 부착을 나타낸다. 각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다. 황 원자에 아미드 그룹을 부착시키는 알킬렌쇄는 메타닐, 에타닐, 또는 프로필일 수 있으며, 즉 m은 1, 2, 또는 3이다 (US 633410; US 5208020; Chari 등 (1992) Cancer Res . 52:127-131; Liu 등 (1996) Proc . Natl . Acad . Sci USA 93:8618-8623).
메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성체가 본 발명의 ADC에 대해 고려되며, 즉 키랄 탄소에서 R 및 S 배치의 임의의 조합이 고려된다 (US 7276497; US 6913748; US 6441163; US 633410 (RE39151); US 5208020; Widdison 등 (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408, 전부 참조로 포함됨). 일부 양태에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 입체화학을 갖는다:
Figure pct00034

메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적 양태는 하기 구조를 갖는 DM1; DM3; 및 DM4를 포함하고 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00035

Figure pct00036

상기 식에서, 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 약물의 황원자의 공유적 부착을 나타낸다.
다른 예시적 메이탄시노이드 항체-약물 접합체는 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기서 Ab는 항체이고 p는 1 내지 약 20이고, 일부 양태에서, p는 1 내지 10이거나, p는 1 내지 7이거나, p는 1 내지 5이거나, 또는 p는 1 내지 4이다):
Figure pct00037

Figure pct00038

DM1이 항체의 티올 그룹에 BMPEO 링커를 통해 연결되는 예시적 항체-약물 접합체는 하기 구조 및 약어를 갖는다:
Figure pct00039

상기 식에서, Ab는 항체이고; n은 0, 1, 또는 2이고; p는 1 내지 약 20이다. 일부 양태에서, p는 1 내지 10이거나, p는 1 내지 7이거나, p는 1 내지 5이거나, p는 1 내지 4이다.
메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체, 이를 제조하는 방법, 및 이의 치료학적 이용이, 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,208,020 및 5,416,064; US 2005/0276812 A1; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 기재되어 있고, 이들의 기재가 본원에 명백히 참조로 포함된다. 또한, 참조: Liu 외 Proc . Natl . Acad. Sci . USA 93:8618-8623 (1996); 및 Chari 외 Cancer Research 52:127-131 (1992).
일부 양태에서, 항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 참조: 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,208,020 (이의 기재가 본원에 명백히 참조로 포함됨). 일부 양태에서, 항체 분자당 평균 3 내지 4개의 메이탄시노이드 분자가 접합된 ADC가 항체의 기능 또는 용해도에 부정적으로 영향을 끼치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 증진시키는데 효과적인 것으로 나타났다. 일부 예에서는, 심지어 한 분자의 독소/항체가 네이키드 항체의 사용 이상으로 세포독성을 증진시키는 것으로 예상된다.
항체-메이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한 예시적 연결 그룹은, 예를 들어, 본원에 기재되어 있는 것들 및 문헌 [U.S. 특허 번호 5208020; EP Patent 0 425 235 B1; Chari 외 Cancer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 A1; and US 2005/016993 A1, 이들의 기재가 본원에 명백히 참조로 포함된다]에 기재되어 있는 것들을 포함한다.
(2) 아우리스타틴 및 돌라스타틴
약물 모이어티는 돌라스타틴, 아우리스타틴, 및 이들의 동족체 및 유도체를 포함한다 (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431). 아우리스타틴은 해양 연체동물 화합물인 돌라스타틴-10의 유도체이다. 어떠한 특정 이론에도 구애됨이 없이, 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세관 동역학, GTP 가수분해 및 핵 및 세포 분열을 방해하고 (Woyke 등 (2001) Antimicrob . Agents and Chemother. 45(12):3580-3584], 항암 활성 (US 5663149) 및 항진균 활성 [Pettit 등 (1998) Antimicrob . Agents Chemother. 42:2961-2965)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 돌라스타틴/아우리스타틴 약물 모이어티는 펩타이드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172; Doronina 등 (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco 등 (2003) Blood 102(4):1458-1465).
예시적 아우리스타틴 양태는, US 7498298 및 US 7659241 (이의 기재가 명백히 전부 참조로 포함됨)에 기재되어 있는, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다:
Figure pct00040

상기 식에서, DE 및 DF의 물결선은 항체 또는 항체-링커에 대한 공유적 부착 부위를 나타내고, 독립적으로 각각의 위치에서:
R2는 H 및 C1-C8 알킬 중에서 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클) 중에서 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클) 중에서 선택되고;
R5는 H 및 메틸 중에서 선택되거나;
R4 및 R5는 함께 카보사이클릭 환을 형성하고 화학식 -(CRaRb)n-을 가지며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카보사이클 중에서 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6 중에서 선택되고;
R6은 H 및 C1-C8 알킬 중에서 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클) 중에서 선택되고;
각각의 R8은 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클 및 O-(C1-C8 알킬) 중에서 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬 중에서 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로사이클 중에서 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12 중에서 선택되고, 여기서 R12는 C1-C8 알킬이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2 중에서 선택되고;
m은 1 내지 1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14 는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
각각의 R15는 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
각각의 R16은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카보사이클) 중에서 선택되고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
하나의 양태에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 2급-부틸이고, R5는 -H 또는 메틸이다. 예시적 양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 -H이고, R7은 2급-부틸이다.
또 다른 양태에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 양태에서, 각각의 R8은 -OCH3이다.
예시적 양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R5 는 -H이고, R7은 2급-부틸이고, 각각의 R8은 -OCH3이고, R9는 -H이다.
하나의 양태에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
하나의 양태에서, R10은 아릴이다.
예시적 양태에서, R10은 -페닐이다.
예시적 양태에서, Z가 -O-인 경우, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
하나의 양태에서, Z가 -NH인 경우, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15은 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
또 다른 양태에서, Z가 -NH인 경우, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
화학식 DE의 예시적 아우리스타틴 양태는 MMAE이고, 여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 공유적 부착을 나타낸다:
Figure pct00041

화학식 DF의 예시적 아우리스타틴 양태는 MMAF이고, 여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 공유적 부착을 나타낸다:
Figure pct00042

다른 예시적 양태는 펜타펩타이드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에 페닐알라닌 카복시 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물 (WO 2007/008848) 및 펜타펩타이드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에 페닐알라닌 측쇄 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물 (WO 2007/008603)을 포함한다.
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 비제한적인 예시적 양태는 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기서, "Ab"는 항체이고; p는 1 내지 약 8이고, "Val-Cit"는 발린-시트룰린 디펩타이드이고; "S"는 황원자이다):
Figure pct00043

Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Figure pct00044

Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Figure pct00045

Ab-MC-MMAE
Figure pct00046

Ab-MC-MMAF
MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 비제한적인 예시적 양태는 추가로 단백질분해로 절단가능하지 않은 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체는 단백질분해로 절단가능한 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체와 필적하는 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Doronina 외 (2006) Bioconjugate Chem . 17:114-124). 일부 이러한 양태에서, 약물 방출은 세포에서 항체 분해에 의해 수행될 수 있는 것으로 믿어진다.
전형적으로, 펩타이드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩타이드 단편 사이에 펩타이드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩타이드 결합은, 예를 들어, 액상 합성법에 따라 제조될 수 있다 (참조: 예를 들어, E.
Figure pct00047
and K.
Figure pct00048
, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press). 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는, 일부 양태에서, 문헌 US 7498298; US 5635483; US 5780588; Pettit 등 (1989) J. Am . Chem . Soc. 111:5463-5465; Pettit 외 (1998) Anti - Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., 외 Synthesis, 1996, 719-725; Pettit 등 (1996) J. Chem . Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; and Doronina (2003) Nat . Biotechnol. 21(7):778-784] 의 방법에 따라 제조될 수 있다.
일부 양태에서, 화학식 DE의 아우리스타틴/돌리스타틴 약물 모이어티, 예를 들어, MMAE, 및 화학식 DF의 아우리스타틴/돌리스타틴 약물 모이어티, 예를 들어, MMAF, 및 이의 약물-링커 중간체 및 유도체, 예를 들어, MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, 및 MC-vc-PAB-MMAE는, 문헌 US 7498298; Doronina 외 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; 및 Doronina 외 (2003) Nat . Biotech. 21:778-784에 기재된 방법을 이용하여 제조된 후 관심 항체에 접합될 수 있다.
(3) 칼리케아미신
일부 양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 부류의 항생제 및 이의 동족체는 피코몰 이하의 농도에서 이중-가닥 DNA를 파괴할 수 있다 (Hinman 외, (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode 외, (1998) Cancer Research 58:2925-2928). 칼리케아미신은 세포내 작용 부위를 가지나, 특정한 경우, 혈장막을 용이하게 가로지르지 않는다. 따라서, 항체-매개된 내화를 통한 이들 작용제의 세포내 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다. 칼리케아미신 약물 모이어티를 갖는 항체-약물 접합체를 제조하는 비제한적인 예시적 방법은 예를 들어, US 5712374; US 5714586; US 5739116; 및 US 5767285에 기재되어 있다.
(4) 피롤로벤조디아제핀
일부 양태에서, ADC는 피롤로벤조디아제핀 (PBD)을 포함한다. 일부 양태에서, PDB 이량체는 특정한 DNA 서열을 인식하고 이에 결합한다. 천연 생성물 안트라마이신인 PBD는 1965년에 문헌 (Leimgruber, 외, (1965) J. Am . Chem . Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, 외, (1965) J. Am . Chem . Soc., 87:5791-5793)에 처음으로 보고되었다. 이후, 천연-발생인 다수의 PBD 및 동족체가 보고되었으며 Thurston, 외, (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465] 트리사이클릭 PBD 스캐폴드의 이량체를 포함한다 (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099). 어떠한 특정 이론에도 구애됨이 없이, 이량체 구조는 B-형태 DNA의 미세한 홈과 함께 이소나사선성을 위한 적합한 3차원 형태를 부여하여 결합 부위에서 스누그 (snug) 피트를 이끄는 것으로 믿어진다 (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, (1986) Acc . Chem . Res., 19:230-237). C2 아릴 치환체를 갖는 이량체 PBD 화합물이 세포독성제로서 유용한 것으로 밝혀졌다 (Hartley 등 (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927-2941; Howard 등 (2009) Bioorganic and Med . Chem. Letters 19(22):6463-6466).
PBD 이량체가 항체에 접합되었으며, 생성된 ADC가 항-암 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. PBD 이량체 상의 비제한적인 예시적 연결 부위는 5-원 피롤로 환, PBD 단위 사이의 테더 (tether), 및 N10-C11 이민 그룹을 포함한다 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
ADC의 비제한적인 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A 및 이의 염 및 용매화물이다:
Figure pct00049

상기 식에서:
물결선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
점선은 C1과 C2 사이 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 임의적 존재를 나타내고;
R2는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR 중에서 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로 중에서 추가로 선택되고, 여기서 RD 는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로 중에서 선택되고;
R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로 중에서 선택되고;
R7은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로 중에서 선택되고;
Q는 독립적으로 O, S 및 NH 중에서 선택되고;
R11은 H 또는 R 또는, Q가 O인 경우, SO3M이고, 여기서 M은 금속 양이온이고;
R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -8 알킬, C1 -12 알킬, C3 -8 헤테로사이클릴, C3 -20 헤테로사이클, 및 C5 -20 아릴 그룹 중에서 선택되고, 임의로 그룹 NRR'에 대해 R 및 R'는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성하고;
R12, R16, R19 및 R17은 각각 R2, R6, R9 및 R7에 대해 정의된 바와 같고;
R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이고, 이 쇄는 하나 이상의 헤테로원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 치환되는 방향족 환, 예를 들어 벤젠 또는 피리딘에 의해 방해될 수 있으며;
X 및 X'는 독립적으로 O, S 및 N(H) 중에서 선택된다.
일부 양태에서, R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20 헤테로사이클, 및 C5 -20 아릴 그룹 중에서 선택되고, 임의로 그룹 NRR'에 대해 R 및 R'는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성한다.
일부 양태에서, R9 및 R19는 H이다.
일부 양태에서, R6 및 R16은 H이다.
일부 양태에서, R7 및 R17은 둘다 OR7A이고, 여기서 R7A는 임의로 치환된 C1-4 알킬이다. 일부 양태에서, R7A는 Me이다. 일부 양태에서, R7A는 Ch2Ph이고, 여기서 Ph는 페닐 그룹이다.
일부 양태에서, X는 O이다.
일부 양태에서, R11은 H이다.
일부 양태에서, 각각의 단량체 단위의 C2와 C3 사이에는 이중 결합이 있다.
일부 양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 H 및 R 중에서 선택된다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 R이다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴 또는 C5 -7 아릴 또는 C8 -10 아릴이다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 임의로 치환된 페닐, 티에닐, 나프틸, 피리딜, 퀴놀리닐, 또는 이소퀴놀리닐이다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 =O, =CH2, =CH-RD, 및 =C(RD)2 중에서 선택된다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 각각 =CH2이다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 각각 H이다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 각각 =O이다. 일부 양태에서, R2 및 R12는 각각 =CF2이다. 일부 양태에서, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =C(RD)2이다. 일부 양태에서, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =CH-RD이다.
일부 양태에서, R2 및/또는 R12가 =CH-RD인 경우, 각각의 그룹은 독립적으로 하기에 나타내는 배치를 가질 수 있다:
Figure pct00050

일부 양태에서, =CH-RD는 배치 (I)로 존재한다.
일부 양태에서, R"는 C3 알킬렌 그룹 또는 C5 알킬렌 그룹이다.
일부 양태에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(I)의 구조를 갖는다:
Figure pct00051

n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(II)의 구조를 갖는다:
Figure pct00052

n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(III)의 구조를 갖는다:
Figure pct00053

상기 식에서, RE 및 RE"는 각각 독립적으로 H 또는 RD 중에서 선택되고, 여기서 RD는 상기 정의된 바와 같고;
n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, n은 0이다. 일부 양태에서, n은 1이다. 일부 양태에서, RE 및/또는 RE"는 H이다. 일부 양태에서, RE 및 RE"는 H이다. 일부 양태에서, RE 및/또는 RE"는 RD이고, 여기서 RD는 임의로 치환된 C1-12 알킬이다. 일부 양태에서, RE 및/또는 RE"는 RD이고, 여기서 RD은 메틸이다.
일부 양태에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00054

상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이고; 여기서 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 상이할 수 있으며;
n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(V)의 구조를 갖는다:
Figure pct00055

상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이고; 여기서 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 상이할 수 있으며;
n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 페닐, 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜 중에서 선택된다. 일부 양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 페닐이다. 일부 양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 티엔-2-일 또는 티엔-3-일이다. 일부 양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다. 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 그룹은 임의의 이용가능한 환 위치를 통해 PBD 코어에 결합될 수 있다. 예를 들어, 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4-일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일일 수 있다. 일부 양태에서, 퀴놀리닐을 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일 중에서 선택된다. 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4-일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 및 이소퀴놀린-8-일일 수 있다. 일부 양태에서, 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일 중에서 선택된다.
ADC의 추가의 비제한적인 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 B 및 이의 염 및 용매화물의 것이다:
Figure pct00056

상기 식에서:
물결선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
OH에 연결된 물결선은 S 또는 R 배치를 나타내고;
RV1 및 RV2는 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (여기서, 페닐은 특히 4 위치에서 플루오로로 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴 중에서 선택되고; 여기서 RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있으며;
n은 0 또는 1이다.
일부 양태에서, RV1 및 RV2는 독립적으로 H, 페닐, 및 4-플루오로페닐 중에서 선택된다.
일부 양태에서, 링커는 PBD 이량체 약물 모이어티의 다양항 부위 중 하나에 부착될 수 있으며, B 환의 N10 이민, C 환의 C-2 엔도/엑소 위치, 또는 A 환을 연결하는 테더 단위를 포함한다 (참조: 하기 구조 C(I) 및 C(II)).
ADC의 비제한적인 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 C(I) 및 C(II)를 포함한다:
Figure pct00057

화학식 C(I) 및 C(II)는 N10-C11 이민 형태로 보여진다. 예시적 PBD 약물 모이어티는 또한 하기 표에 나타난 바와 같이 카비놀라민 및 보호된 카비놀라민 형태도 포함한다:
Figure pct00058

상기 식에서:
X는 CH2 (n = 1 내지 5), N, 또는 O이고;
Z 및 Z'는 독립적으로 OR 또는 및 NR2 중에서 선택되고, 여기서 R은 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 1급, 2급 또는 3급 알킬쇄이고;
R1, R'1, R2 및 R'2는 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5 -20 아릴 (치환된 아릴을 포함), C5 -20 헤테로아릴 그룹, -NH2, -NHMe, -OH, 및 -SH 중에서 선택되고, 여기서, 일부 양태에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐쇄는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하고;
R3 및 R'3은 독립적으로 H, OR, NHR, 및 NR2 중에서 선택되고, 여기서 R은 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 1급, 2급 또는 3급 알킬쇄이고;
R4 및 R'4는 독립적으로 H, Me, 및 OMe 중에서 선택되고;
R5는 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5 -20 아릴 (할로, 니트로, 시아노, 알콕시, 알킬, 헤테로사이클릴로 치환된 아릴을 포함) 및 C5-20 헤테로아릴 그룹 중에서 선택되고, 여기서, 일부 양태에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐쇄는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하고;
R11은 H, C1-C8 알킬, 또는 보호 그룹 (예: 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카보닐 (BOC), 벤질옥시카보닐 (CBZ), 9-플루오레닐 메틸렌옥시카보닐 (Fmoc), 또는 자가-희생 단위르 포함하는 모이어티, 예를 들어, 발린-시트룰린-PAB)이고
R12는 H, C1-C8 알킬, 또는 보호 그룹이고
여기서, R1, R'1, R2, R'2, R5, 또는 R12 중 하나의 수소 또는 A 환 사이의 OCH2CH2(X)nCH2CH2O- 스페이서의 수소는 ADC의 링커에 연결된 결합으로 대체된다.
ADC의 예시적 PDB 이량체 부분은 하기 PBD 이량체를 포함하고 이에 제한되지 않는다 (물결선을 링커에 대한 공유적 부착 부위를 나타낸다):
Figure pct00059
PBD 이량체.
PBD 이량체를 포함하는 ADC의 비제한적인 예시적 양태는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00060

PBD 이량체-val-cit-PAB-Ab;
Figure pct00061

PBD 이량체-Phe-Lys-PAB-Ab:
상기 식에서, n은 0 내지 12이다. 일부 양태에서, n은 2 내지 10이다. 일부 양태에서, n은 4 내지 8이다. 일부 양태에서, n은 4, 5, 6, 7, 및 8 중에서 선택된다.
PBD 이량체-val-cit-PAB-Ab 및 PBD 이량체-Phe-Lys-PAB-Ab의 링커는 프로테아제로 절단가능하고, PBD 이량체-말레이미드-아세탈의 링커는 산에 불안정하다.
PBD 이량체 및 PBD 이량체를 포함하는 ADC는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 참조, 예: WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598.
(5) 안트라사이클린
일부 양태에서, ADC는 안트라사이클린을 포함한다. 안트라사이클린은 세포독성 활성을 나타내는 항생제 화합물이다. 어떠한 특정한 이론에도 구애됨이 없이, 연구 결과 안트라사이클린은 1) 약물 분자가 세포의 DNA로 삽입되어 DNA-의존적 핵산 합성을 억제; 2) 세포에 손상을 일으키도록 세포 마크로분자와 반응하는 유리 라디칼의 약물의 생성, 및/또는 3) 약물 분자의 세포막과의 상호작용을 포함한 다수의 상이한 기작에 의해 세포를 죽이도록 작용할 수 있는 것으로 나타났다 (참조: 예를 들어, C. Peterson 외, "Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. at pp.97-102). 안트라사이클린은 이들의 세포독성 잠재력 때문에 백혈병, 유방 암종, 폐 암종, 난소 선암종 및 육종과 같은 다수의 암의 치료에 사용되어 왔다 (참조 : 예를 들어, P.H- Wiernik, in Anthracycline : Current Status And New Developments p 11).
비제한적인 예시적 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 다우노마이신, 네모루비신, 및 이의 유도체를 포함한다. 다우노루비신 및 독소루비신의 면역접합체 및 프로드럭이 제조되고 연구되어 왔다 (Kratz 등 (2006) Current Med . Chem. 13:477-523; Jeffrey 등 (2006) Bioorganic & Med . Chem . Letters 16:358-362; Torgov 등 (2005) Bioconj. Chem. 16:717-721; Nagy 등 (2000) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 97:829-834; Dubowchik 등 (2002) Bioorg . & Med . Chem . Letters 12:1529-1532; King 등 (2002) J. Med . Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; US 6630579). 항체-약물 접합체 BR96-독소루비신은 종양-관련된 항원 루이스-Y와 특이적으로 반응하며, 제I상 및 제II상 연구로 평가되었다 (Saleh 등 (2000) J. Clin . Oncology 18:2282-2292; Ajani 등 (2000) Cancer Jour. 6:78-81; Tolcher 등 (1999) J. Clin . Oncology 17:478-484).
PNU-159682은 네모루비신의 강력한 대사물 (또는 유도체)이다 (Quintieri, 외 (2005) Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617). 네모루비신은 독소루비신의 글리코사이드 아미노 상에 2-메톡시모폴리노 그룹을 갖는 독소루비신의 반합성 동족체이고 임상 평가 중에 있으며 (Grandi 등 (1990) Cancer Treat . Rev. 17:133; Ripamonti 등 (1992) Brit . J. Cancer 65:703], 임상 평가는 간세포 암종에 대한 제II/III상 시험을 포함한다 (Sun 등 (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44:1st Ed, Abs 4649; Pacciarini 등 (2006) Jour . Clin . Oncology 24:14116].
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 비제한적인 예시적 ADC가 화학식 Ia에 제시된다:
Figure pct00062

상기 식에서, R1은 수소 원자, 하이드록시 또는 메톡시 그룹이고, R2는 C1-C5 알콕시 그룹, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고;
L1 및 Z는 함께 본원에서 기재되는 바와 같은 링커 (L)이고;
T는 본원에서 기재되는 바와 같은 항체 (Ab)이고;
M은 1 내지 약 20이다. 일부 양태에서, m은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4이다.
일부 양태에서, R1 및 R2는 모두 메톡시 (-OMe)이다.
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 추가의 비제한적인 예시적 ADC가 화학식 Ib에 제시된다:
Figure pct00063

상기 식에서, R1은 수소 원자, 하이드록시 또는 메톡시 그룹이고, R2는 C1-C5 알콕시 그룹, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고;
L2 및 Z는 함께 본원에서 기재되는 바와 같은 링커 (L)이고;
T는 본원에서 기재되는 바와 같은 항체 (Ab)이고;
M은 1 내지 약 20이다. 일부 양태에서, m은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4이다.
일부 양태에서, R1 및 R2는 모두 메톡시 (-OMe)이다.
일부 양태에서, 네모루비신-포함 ADC의 네모루비신 성분은 PNU-159682이다. 일부 이러한 양태에서, ADC의 약물 부분은 하기 구조 중 하나를 가질 수 있다:
Figure pct00064
; 또는
Figure pct00065

상기 식에서, 물결선은 링커 (L)에 대한 부착을 나타낸다.
PNU-159682를 포함한 안트라사이클린은 수개의 연결 부위 및 본원에서 기재되는 바와 같은 링커를 포함한 다양한 링커 (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124]를 통해 항체에 접합될 수 있다.
네모루비신 및 링커를 포함하는 예시적 ADC는 하기를 포함하고 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00066

PNU-159682 말레이미드아세탈-Ab;
Figure pct00067

PNU-159682-val-cit-PAB-Ab;
Figure pct00068

PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서-Ab;
Figure pct00069

PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서(R1R2)-Ab (여기서,
R1 및 R2는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬 중에서 선택된다); 및
Figure pct00070
PNU-159682-말레이미드-Ab.
PNU-159682 말레이미드아세탈-Ab의 링커는 산에 불안정하고, PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서-Ab, 및 PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서(R1R2)-Ab의 링커는 프로테아제에 의해 절단가능하다.
(6) 다른 약물 모이어티
약물 모이어티는 또한 겔다나마이신 (Mandler 등 (2000) J. Nat . Cancer Inst . 92(19):1573-1581; Mandler 등 (2000) Bioorganic & Med . Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler 등 (2002) Bioconjugate Chem . 13:786-791]; 및 디프테리아 A쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄 (from Pseudomonas aeruginosa), 리신 A쇄, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파-사르신, 알로이리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안딘 (dianthin) 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하고 이에 제한되지 않는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편을 포함한다. 참조: 예를 들어, WO 93/21232.
약물 모이어티는 또한 핵분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제)을 포함한다.
특정 양태에서, 면역접합체는 고방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합된 항체의 제조에 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 일부 양태에서, 면역접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc99 또는 I123을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)용 스핀 (spin) 표지, 예를 들어, 지르코늄-89, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다. 지르코늄-89는 금속 착화제에 착화되고, 예를 들어, PET 영상화를 위해 항체에 접합될 수 있다 (WO 2011/056983).
방사성 표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 면역접합체 내에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 생합성되거나, 예를 들어, 하나 이상의 수소 대신에 하나 이상의 불소-19원자를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 양태에서 Tc99, I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 항체의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 양태에서, 이트륨-90은 항체의 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 양태에서, 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (Fraker 등 (1978) Biochem . Biophys. Res . Commun . 80: 49-57)을 이용하여 요오드-123을 삽입시킬 수 있다. 문헌 ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 특정한 다른 방법이 기재되어 있다.
특정 양태에서, 면역접합체는 프로드럭-활성화 효소에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 일부 이러한 양태에서, 프로드럭-활성화 효소는 프로드럭 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, 참조: WO 81/01145)을 항-암 약물과 같은 활성 약물로 전환시킨다. 이러한 면역접합체는, 일부 양태에서, 항체-의존적 효소-매개된 프로드럭 요법 ("ADEPT")에서 유용하다. SEQ CHAPTER \h \r 1항체에 접합될 수 있는 효소는 포스페이트-포함 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-포함 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴설파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 디아미나제; 펩타이드-포함 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어, 세라티아 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 포함하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화된 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소가 각각 페녹시아세틸 그룹 또는 페닐아세틸 그룹으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어, 페니실린 V 아미다제 및 페니실린 G 아미다제를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 효소는 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 항체에 공유 결합될 수 있다. 참조: 예를 들어, Neuberger 외, Nature 312:604-608 (1984).
c) 약물 로딩
약물 로딩은 화학식 I의 분자에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수인 p로 표시된다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개의 약물 모이어티 (D)일 수 있다. 화학식 I의 ADC는 1 내지 20개의 약물 모이어티와 접합된 항체의 집합체를 포함한다. 접합 반응에 의한 ADC의 제조에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 통상적인 수단, 예를 들어, 매쓰 분광분석, ELISA 검정, 및 HPLC에 의해 규정될 수 있다. 또한, p의 측면에서 ADC의 정량적 분포가 측정될 수 있다. 일부 경우에, p가 다른 약물 로딩을 갖는 ADC로부터의 특정 값인 균질 ADC의 분리, 정제 및 특성분석은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 접합체에 대해, p는 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 특정한 예시적 양태에서와 같이 부착이 시스테인 티올인 경우에, 항체는 단지 하나 또는 수개의 시스테인 티올 그룹을 가질 수 있거나, 또는 링커가 부착될 수 있는, 충분히 반응성인 티올 그룹을 단지 하나 또는 여러 개 가질 수 있다. 특정 양태에서, 보다 높은 약물 로딩, 예를 들어, p>5는 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성 상실을 일으킬 수 있다. 특정 양태에서, ADC에 대한 평균 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5이다. 실제로, 특정 ADC에 대해, 항체당 약물 모이어티의 최적비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 밝혀졌다 (US 7498298).
특정 양태에서, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는, 예를 들어, 하기에서 논의되는 바와 같이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올 그룹을 포함하지 않으며; 실제로 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디설파이드 브릿지로서 존재한다. 특정 양태에서, 항체를 부분 또는 완전 환원 조건 하에 환원제, 예를 들어, 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원시켜 반응성 시스테인 티올 그룹을 생성할 수 있다. 특정 양태에서, 항체는 리신 또는 시스테인과 같은 친핵성 그룹이 드러나도록 변성 조건 하에 놓인다.
ADC의 로딩 (약물/항체 비)은 상이한 방식, 예를 들어 (i) 항체에 비해 몰 과량의 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 부분 또는 제한적 환원 조건에 의해 조절될 수 있다.
하나 초과의 친핵성 그룹이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하는 경우, 생성되는 산물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC 화합물들의 혼합물임을 이해하여야 한다. 항체당 약물의 평균 수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개별 ADC 분자는 매쓰 분광분석에 의해 혼합물 중에서 확인되고, HPLC, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다 (참조: 예를 들어, McDonagh 등 (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett 등 (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., 등 "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate" Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., 등 "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). 특정 양태에서, 단일 로딩 값을 갖는 균질 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
d) 면역접합체의 특정 제조 방법
화학식 I의 ADC는 하기를 포함하는 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하는 몇몇 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 항체의 친핵성 그룹을 이가 링커 시약과 반응시켜 공유결합을 통해 Ab-L을 형성한 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 그룹을 이가 링커 시약과 반응시켜 공유결합을 통해 D-L을 형성한 후, 이를 항체의 친핵성 그룹과 반응시키는 방법. 후자의 경로를 통해 화학식 I의 ADC를 제조하는 예시적인 방법은 본원에 참조로 명백하게 포함되는 US 7498298에 기재되어 있다.
항체 상의 친핵성 그룹은 (i) N-말단 아민 그룹; (ii) 측쇄 아민 그룹, 예를 들어, 리신; (iii) 측쇄 티올 그룹, 예를 들어, 시스테인; 및 (iv) 당 하이드록실 또는 아미노 그룹 (여기서, 항체는 글리코실화된다)를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 하이드록실 그룹은 친핵성이며, 반응하여 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세타미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실 및 말레이미드 그룹을 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 그룹과 공유결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 완전히 또는 부분적으로 환원되도록 환원제, 예를 들어, DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카보닐에틸포스핀 (TCEP)로 처리함으로써 링커 시약과의 접합에 반응적이게 될 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 그룹은 리신 잔기의 변형을 통해, 예를 들어, 리신 잔기와 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)을 반응시켜 아민을 티올로 전환시킴으로써 항체 내로 도입될 수 있다. 반응성 티올 그룹은 또한 1, 2, 3, 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조함으로써) 항체 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 또한 항체 상의 친전자성 그룹, 예를 들어 알데하이드 또는 케톤 카보닐 그룹과 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 그룹 사이의 반응에 의해 생성될 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 친핵성 그룹은 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 항체를 변형시켜 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입한다. 또 다른 양태에서, 글리코실화 항체의 당을, 예를 들어, 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜, 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민 그룹과 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤 그룹을 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 (Schiff) 염기 그룹은 안정한 연결기를 형성할 수 있거나, 예를 들어, 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결기를 형성할 수 있다. 하나의 양태에서, 글리코실화 항체의 탄수화물 부분을 갈락토즈 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적절한 그룹과 반응할 수 있는 카보닐 (알데하이드 및 케톤) 그룹을 항체 내에 생성할 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 항체를 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데하이드를 생성할 수 있다 (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem . 3:138-146; US 5362852). 이러한 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응될 수 있다.
약물 모이어티 상의 예시적 친핵성 그룹은, (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세타미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실 및 말레이미드 그룹을 포함하는 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 그룹과 공유결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드 그룹을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
ADC를 제조하는데 이용될 수 있는 비제한적인 예시적 가교-링커 시약은 본원에서 "예시적 링커"의 표제가 있는 단락에 기재되어 있다. 단백질성 잔기 및 화학적 잔기를 포함하는 2개의 잔기를 연결하기 위한 이러한 가교-링커 시약을 사용하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 양태에서, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질이, 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 분자는 서로 인접하거나 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩타이드를 암호화하는 영역에 의해 분리되는 접합체의 항체 및 세포독성 부분을 암호화하는 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체는 종양 예비-표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 접합될 수 있으며, 이때 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여된 다음, 소실제를 사용한 결합되지 않은 접합체의 순환계로부터 제거 후, 세포독성제 (예를 들어, 약물 또는 방사성 뉴클레오타이드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)의 투여가 이어진다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 양태에서, 본원에서 제공되는 임의의 항-LgR5 항체는 생물학적 샘플 중의 LgR5의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"는 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. "생물학적 샘플"는, 예를 들어, 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 결장, 소장, 자궁내막, 췌장, 또는 난소 조직을 포함한 생검 물질)을 포함한다.
하나의 양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-LgR5 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플 중의 LgR5의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 LgR5에 대한 항-LgR5 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 본원 발명에서 기재되는 바와 같은 항-LgR5 항체와 접촉시키고, 항-LgR 항체와 생물학적 샘플 중의 LgR5 사이의 복합체 형성 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 양태에서, 항-LgR5 항체는, 예를 들어, LgR5이 환자의 선별을 위한 바이오마커인 경우에 항-LgR5 항체를 사용하는 요법에 적격인 피험자를 선별하는데 사용된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 결장, 결장직장, 소장, 자궁내막, 췌장, 또는 난소 조직을 포함한 생검 물질)이다.
추가의 양태에서, 항-LgR5 항체는, 예를 들어, 암을 진단, 예측, 또는 단계화하거나, 적합한 치료 경로를 결정하거나, 치료에 대한 암의 반응을 모니터링하기 위해, 예를 들어, 피험자에서 LgR5-양성 암을 생체내 영상화에 의해 생체내에서 검출하는데 사용된다. 생체내 검출을 위해 당업계에 공지된 하나의 방법은 예를 들어, 문헌 van Dongen 외, The Oncologist 12:1379-1389 (2007) 및 Verel 외, J. Nucl . Med . 44:1271-1281 (2003)에 기재되어 있는 바와 같은 면역-양전자 방출 단층 촬영 (면역-PET)이다. 이러한 양태에서, 표지된 항-LgR5 항체를 LgR5-양성 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 피험자에게 투여하고, 피험자에서 표지된 항-LgR5 항체를 검출하는 것을 포함하고, 표지된 항-LgR5 항체의 검출이 피험자에서 LgR5-양성 암을 나타내는 것인, LgR5-양성 암을 검출하는 방법이 제공된다. 특정한 이러한 양태에서, 표지된 항-LgR5 항체는 양전자 방출체, 예를 들어, 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, and 124I에 접합된 항-LgR5 항체를 포함한다. 특정 양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
추가의 양태에서, 진단 또는 검출 방법은 기체에 고정된 제1 항-LgR5 항체를 LgR5의 존재에 대해 시험될 생물학적 샘플과 접촉시키고, 기체를 제2 항-LgR5 항체에 노출시키고, 제2 항-LgR5가 제1 항-LgR5 항체와 생물학적 샘플 중의 LgR5 간의 복합체에 결합되었는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 기체는 임의의 지지 매질, 예를 들어, 유리, 금속, 세라믹, 중합체성 비드, 슬라이드, 칩, 및 기타 기체일 수 있다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 결장, 결장직장, 소장, 자궁내막, 췌장, 또는 난소 조직을 포함한 생검 물질)을 포함한다 특정 양태에서, 제1 또는 제2 항-LgR5 항체는 본원에서 기재되는 항체 중 임의의 것이다. 일부 이러한 양태에서, 제2 항-LgR5 항체는 8E11이거나, 예를 들어, 본원에서 기재되는 바와 같이, 8E11로부터 유래되는 항체일 수 있다. 일부 이러한 양태에서, 제2 항-LgR5 항체는 YW353이거나, 예를 들어, 본원에서 기재되는 바와 같이, YW353으로부터 유래되는 항체일 수 있다. 일부 양태에서, 제1 및 제2 항-LgR5 항체는 3G12 및 2H6이거나, 예를 들어, 본원에서 기재되는 바와 같이, 3G12 및 2H6으로부터 유래되는 항체일 수 있다.
임의의 상기 양태에 따라 진단 또는 검출될 수 있는 예시적 질환은 LgR5-양성 암, 예를 들어, LgR5-양성 결장직장암 (선암종 포함), LgR5-양성 소장암 (선암종, 육종 (예를 들어, 평활근육종), 카르시노이드 종양, 위장 간질 종양, 및 림프종 포함), LgR5-양성 난소암 (난소 장액 선암종 포함), LgR5-양성 췌장암 (췌장관 선암종 포함), 및 LgR5-양성 자궁내막암을 포함한다. 일부 양태에서, LgR5-양성 암은 본원의 실시예 B에서 기재되는 조건 하에 90% 초과의 종양 세포가 매우 약하게 염색되거나 염색되지 않는 것에 상응하는 "0"보다 큰 항-LgR5 면역조직화학 (IHC) 또는 제자리 하이브리드화 (ISH) 스코어를 갖는 암이다. 또 다른 양태에서, LgR5-양성 암은 본원의 실시예 B에서 기재되는 조건 하에서 정의되는 바와 같이 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 LgR5를 발현한다. 일부 양태에서, LgR5-양성 암은 LgR5 mRNA를 검출하는 역-전사효소 PCR (RT-PCR) 검정에 따라 LgR5를 발현하는 암이다. 일부 양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
특정 양태에서, 표지된 항-LgR5 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예: 형광, 발색단, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어. 효소 또는 리간드를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코즈 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예를 들어, HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 또 다른 양태에서, 표지는 양전자 방출체이다. 양전자 방출체는 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
F. 약제학적 제제
본원에서 기재되는 바와 같은 항-LgR5 항체 또는 면역접합체의 약제학적 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체 또는 면역접합체를 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) 와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨; 염 형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 본원에서의 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 침입형 약물 분산제, 예를 들어 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 배합된다.
예시적인 동결건조 항체 또는 면역접합체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 또는 면역접합체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재되는 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원에서의 제제는 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유래한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, 예를 들어, LgR5-양성 결장암 또는 LgR5-양성 결장직장암과 같은 LgR5-양성 암을 치료하기 위해, Avastin® (베바시주마브)을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
활성 성분은, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체 또는 면역접합체를 포함하는 고형의 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공되는 임의의 항-LgR5 항체 또는 면역접합체는 방법, 예를 들어, 치료 방법에 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, LgR5-양성 세포를 세포 표면 상의 LgR5에 대한 항-LgR5 항체 또는 면역접합체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항-LgR5 항체 또는 면역접합체에 노출시켜 상기 세포의 증식을 억제시키는 것을 포함하는, LgR5-양성 세포의 증식 억제 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법이다. 추가의 양태에서, 세포는 결장, 결장직장, 소장, 난소, 췌장, 또는 자궁내막 세포이다.
일부 양태에서, 본원에서 제공되는 항-LgR5 항체 또는 면역접합체는 암세포의 적어도 일부에서 Kras 유전자 돌연변이 및/또는 선종성 결장 폴립증 (APC) 유전자 돌연변이를 포함하는 암을 치료하는 방법에 사용된다. 다양한 양태에서, 암은 결장암, 결장직장암, 소장암, 난소암, 췌장암, 및 자궁내막암 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 본원에서 제공되는 항-LgR5 항체 또는 면역접합체는 암세포의 적어도 일부에서 APC 유전자 돌연변이 및/또는 APC 유전자 돌연변이를 포함하는 결장 또는 결장직장 암을 치료하는 방법에 사용된다. 암 (결장암 및 결장직장암 포함)에서 발견되는 비제한적인 예시적 Kras 돌연변이는 Kras 코돈 12 (예를들어., G12D, G12V, G12R, G12C, G12S, 및 G12A), 코돈 13 (예를들어., G13D 및 G13C), 코돈 61 (예를들어., G61H, G61L, G61E, 및 G61K), 및 코돈 146에서 돌연변이를 포함한다. 참조,예: Yokota, Anticancer Agents Med . Chem ., 12: 163-171 (2012); Wicki 외, Swiss Med . Wkly, 140: w13112 (2010). 암에서 발견되는 비제한적인 예시적 APC 돌연변이는 돌연변이 클러스터 영역 (MCR), 예를 들어, 정지 코돈에서의 돌연변이 및 절두된 APC 유전자 생성물을 초래하는 프레임쉬프트 돌연변이를 포함한다. 참조: 예를 들어, Chandra 외, PLoS One, 7: e34479 (2012); 및 Kohler 외, Hum . Mol . Genet ., 17: 1978-1987 (2008).
일부 양태에서, 암을 치료하는 방법은 암세포의 적어도 일부에서 Kras 돌연변이 및/또는 APC 돌연변이를 포함하는 암을 갖는 피험자에게 항-LgR5 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 암은 결장암, 결장직장암, 소장암, 난소암, 췌장암, 및 자궁내막암 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 암은 결장 및/또는 결장직장 암이다. 일부 양태에서, 피험자는 암세포의 적어도 일부에서 Kras 돌연변이 및/또는 APC 돌연변이를 갖는 것으로 이미 결정되었다. 일부 양태에서, 암은 LgR5-양성이다.
샘플 중 다양한 바이오마커의 존재는 면역조직화학 ("IHC"), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성화된 세포 분류 ("FACS"), MassARRAY, 단백질체학, 정량적 혈액 기반 검정 (예: 혈청 ELISA), 생화학적 효소 활성 검정, 제자리 하이브리드화, 서던 분석, 노던 분석, 전체 게놈 서열분석, 정량적 실시간 PCR ("qRT-PCR") 및, 예를 들어, 분지된 DNA, SISBA, TMA 등과 같은 다른 증폭 유형 검출 방법을 포함한 폴리머라제 연쇄 반응 ("PCR"), RNA-Seq, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 프로파일링, 및/또는 유전자 발현의 연속 분석 ("SAGE")뿐만 아니라 단백질, 유전자, 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 다양한 검정 중 임의의 것을 포함하고 이에 제한되지 않는, 다수의 방법론에 의해 분석될 수 있으며, 이중 많은 방법들이 당업계에 공지되고 당업자에 의해 이해되는 것이다. 유전자 및 유전자 생성물을 평가하기 위한 전형적 프로토콜은, 예를 들어, 문헌 Ausubel 외, eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis) 에서 찾을 수 있다. 또한, Rules Based Medicine 또는 Meso Scale Discovery ("MSD")로부터 입수가능한 것과 같은 다중 면역검정이 이용될 수 있다.
시험관내 세포 증식의 억제는 Promega (Madison, WI)에서 시판되는 CellTiter-GloTM 형광 세포 생존성 검정을 이용하여 검정될 수 있다. 상기 검정은, 대사적 활성 세포임을 나타내는 존재하는 ATP의 정량화에 기초하여, 배양물 중의 생존가능 세포수를 측정한다. 참조: Crouch 외 (1993) J. Immunol. Meth . 160:81-88, U.S. 특허 번호 6602677. 상기 검정은 자동화 대용량 처리 스크리닝 (HTS)를 할 수 있는 96- 또는 384-웰 포맷으로 수행될 수 있다. 참조: Cree 외 (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. 상기 검정 절차는 배양된 세포에 직접적으로 단일 시약 (CellTiter-Glo® 시약)을 가하는 것을 포함한다. 이는 세포 용해 및 루시페라제 반응에 의해 생성되는 발광 시그널을 생성한다. 발광 시그널은, 배양물 중에 존재하는 생존가능한 세포의 수에 직접적으로 비례하는, 존재하는 ATP의 양에 비례한다. 데이터는 발광계 또는 CCD 카메라 영상 디바이스로 기록될 수 있다. 발광 산출량은 상대적 광 단위 (RLU)로 표현된다.
또 다른 양상에서, 의약으로 사용하기 위한 항-LgR5 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 추가의 양상에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-LgR5 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 양태에서, LgR5-양성 암을 치료하는데 사용하기 위한 항-LgR5 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 양태에서, 본 발명은 LgR5-양성 암을 갖는 개체에게 유효량의 항-LgR5 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-LgR5 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 하나의 이러한 양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 하기에서 기재되는 바와 같이, 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 의약의 생산 또는 제조에서의 항-LgR5 항체 또는 면역접합체의 용도를 제공한다. 하나의 양태에서, 의약은 LgR5-양성 암을 치료하기 위한 것이다. 추가의 양태에서, 의약은 유효량의 의약을 LgR5-양성 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 LgR5-양성 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 하기에서 기재되는 바와 같이, 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 LgR5-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 유효량의 항-LgR5 항체 또는 면역접합체를 이러한 LgR5-양성 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 양태에서, 상기 방법은, 하기에서 기재되는 바와 같이, 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 상기 양태에 따른 LgR5-양성 암은, 예를 들어, LgR5-양성 결장 또는 결장직장암 (선암종 포함), LgR5-양성 소장암 (선암종, 육종 (예를 들어, 평활근육종), 카르시노이드 종양, 위장 간질 종양, 및 림프종 포함), LgR5-양성 난소암 (난소 장액 선암종 포함), LgR5-양성 췌장암 (췌장관 선암종 포함), 및 LgR5-양성 자궁내막암일 수 있다. 일부 양태에서, LgR5-양성 암은 본원의 실시예 B에서 기재되는 조건 하에 90% 초과의 종양 세포가 매우 약하게 염색되거나 염색되지 않는 것에 상응하는 "0"보다 큰 항-LgR5 면역조직화학 (IHC) 또는 제자리 하이브리드화 (ISH) 스코어를 갖는 암이다. 또 다른 양태에서, LgR5-양성 암은 본원의 실시예 B에서 기재되는 조건 하에서 정의되는 바와 같이 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 LgR5를 발현한다. 일부 양태에서, LgR5-양성 암은 LgR5 mRNA를 검출하는 역-전사효소 PCR (RT-PCR) 검정에 따라 LgR5를 발현하는 암이다. 일부 양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
임의의 상기한 양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한 본원에서 제공되는 임의의 항-LgR5 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 하나의 양태에서, 약제학적 제제는 본원에서 제공되는 임의의 항-LgR5 항체 또는 면역접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 양태에서, 약제학적 제제는, 예를 들어, 하기에서 기재되는 바와 같이, 본원에서 제공되는 항-LgR5 항체 또는 면역접합체 및 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 치료시 단독으로 사용되거나 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 양태에서, 추가의 치료제는, 예를 들어, LgR5-양성 결장암 또는 LgR5-양성 결장직장암과 같은 LgR5-양성 암을 치료하기 위한 Avastin® (베바시주마브)이다.
상기 언급된 이러한 병용 요법은 병용 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 또한 방사선 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국부 치료가 필요한 경우, 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하고 이에 제한되지 않는 다양한 투여 스케쥴이 고려된다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 적절한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정 장애, 치료받을 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 전문의에게 공지된 다른 요인들을 포함한다. 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로, 항체 또는 면역접합체는 해당 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의되는 다른 요인들에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 본원에서 기재되는 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에서 기재되는 투여량의 약 1 내지 99％로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 병용하여 사용될 때)은 치료할 질환의 유형, 항체 또는 면역접합체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체 또는 면역접합체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체 또는 면역접합체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체 또는 면역접합체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체 또는 면역접합체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상이 바람직한 수준으로 저해될 때까지 지속된다. 항체 또는 면역접합체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 매3 주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여될 수 있다). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1 이상 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 용량 요법도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법이 본 발명의 면역접합체 및 항-LRP5 항체를 사용하여 수행될 수 있다고 믿어진다.
H. 제조품
본 발명의 또 다른 양상에서, 상기 기재되는 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 보유하거나 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥주사 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 항체 또는 면역접합체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 내부에 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 (b) 내부에 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 약제학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어, 정균 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
III . 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물에 대한 실시예이다. 상기 제공된 일반적 기술을 고려해 볼 때, 다양한 다른 양태들이 실시될 수 있다는 것을 알 수 있다.
A. 인간 LgR5 유전자 발현
인간 LgR5 유전자 발현을 유전자 발현 정보를 포함하는 사설 데이터베이스 (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD)을 사용하여 분석하였다. GeneExpress® 데이터베이스의 그래프적 분석을 마이크로어레이 프로필 뷰어를 사용하여 수행하였다. 도 1는 다양한 조직에서의 인간 LgR5 유전자 발현을 그래프로 나타낸 것이다. y-축 상의 스케일은 하이브리드화 시그널 강도에 기초한 유전자 발현 수준을 나타낸다. 각각의 열거된 조직의 이름에서 뻗은 선의 좌측과 우측 모두에 점이 보인다. 상기 선의 좌측에 보이는 점은 정상 조직에서의 유전자 발현을 나타내고, 우측에 보이는 점은 종양 및 질환에 걸린 조직에서의 유전자 발현을 나타낸다. 도 1은, 정상 상대 조직에서와 비교하여, 특정 종양 또는 질환에 걸린 조직에서의 증가된 LgR5 유전자 발현을 도시한다. 특히, LgR5는 결장직장, 자궁내막 및 난소 종양에서 실질적으로 과발현된다. 도 1의 삽입물은, LgR5가 적어도 하기 결장 종양: 선암종, 양성 종양 및 전이성 결장 종양에서 과발현되며, 또한 50% 미만의 결장 종양 함량을 갖는 (도 1 삽입물에서 "낮은 종양") 조직에서도 과발현되나; 정상적 결장, 크론 질환 또는 궤양성 결장염에서는 과발현되지 않는다는 것을 도시한다. 인간 LgR5 발현은 정상 조직에서 훨씬 낮아서, 정상적 뇌, 근육, 난소 및 태반 조직에서 낮은 수준을 갖는다.
B. 결장 종양에서 인간 LgR5 의 출현율 ( prevalence )
결장직장암에서의 LgR5의 발현을 평가하기 위해서, 57개의 원발성 결장직장 선암종을 다수의 공급원으로부터 입수하였다 (Asterand, Detroit, MI; Bio-Options, Fullerton, CA; University of Michigan, Ann Arbor, MI; Cytomyx, Rockville, MD; Cooperative Human Tissue Network, Nashville, TN; Indivumed, Hamburg, Germany; ProteoGenex, Culver City, CA). 샘플 중 44%는 남성으로부터의 것이며, 환자의 평균 연령은 66세였다 (31세 내지 93세 범위). 조직 마이크로어레이 (TMA)를 문헌 Bubendorf L, 외, J Pathol. 2001 Sep;195(1):72-9에 기술된 바와 같이 중복 코어를 사용하여 어셈블링하였으며, 이는 대응 케이스로부터 5개의 정상적 결장직장 점막 샘플을 포함하였다.
LgR5 발현을 표 2에 제시되는 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 제자리 하이브리드화로 측정하였다. 참조: 예를 들어, Jubb AM, 외, Methods Mol Biol 2006; 326:255-64. β-액틴에 대한 ISH를 사용하여 분석 전 결장직장암 조직에서의 mRNA의 온전성을 확인하였다.
Figure pct00071

LgR5 하이브리드화 강도는 훈련된 병리학자가, 강도 (실버 그레인) 및 염색 폭을 고려하여, 하기 계획에 따라 스코어를 정하였다.
0 (음성): 90% 초과의 종양 세포에서 매우 약한 하이브리드화 또는 하이브리드화 없음
1+ (약함): 두드러진 하이브리드화 패턴이 약하다
2+ (중간): 두드러진 하이브리드화 패턴이 대다수 (50% 초과)의 신생물 세포에서 중간 정도로 강하다
3+ (강함): 뚜렷한 하이브리드화 패턴이 대다수 (50% 초과)의 신생물 세포에서 강하다
센스 프로브를 사용여 하이브리드화의 특이성을 조절하였다.
도 2는 1+, 2+ 및 3+의 염색 수준을 갖는 예시적인 결장 종양 절편을 도시한다. 상단 패널은 암시야 상을 도시하고, 하단 패널은 명시야 상을 도시한다. 암시야 상에서의 실버 그레인의 축적은 프로브의 하이브리드화 및 LgR5 mRNA의 발현을 나타낸다. 분석된 결장 종양 절편의 약 77% (41/53)가 LgR5 양성이었으며, 1+, 2+ 또는 3+ 수준의 염색을나타내었고, 34% (18/53)는 2+ 또는 3+ 염색을 나타내었다. 분석된 57개의 샘플 중 4개는 LgR5 발현에 대해 정보를 제공하지 않았다.
결장 종양에서의 Lgr5 발현의 의미를 평가하기 위해서, 결장직장 선암종에 대해 외과적 절제술을 받은 환자의 모집단-기반 시리즈를 1988년부터 2003년까지 세인트 제임스 대학 병원 (St James' University Hospital) (Leeds, UK)의 병리학 기록보관소로부터 소급해서 편집하였다. 환자당 정상 점막에 대해 하나의 코어 및 선암종에 대해 3개의 코어를 갖는 조직 마이크로어레이 (TMA)를 문헌 Bubendorf L, 외, J Pathol. 2001 Sep;195(1):72-9에 기술되어 있는 바와 같이 제작하였다. ISH를 수행하고 상술된 바와 같이 스코어를 정하였다. 또한, 동일한 종양으로부터의 3개의 코어에서 이질성 발현을 측정하였으며, 3개의 코어 중 하나에서 특정 수준의 불일치를 보이는 종양의 비율로 나타내었다. 예를 들어, 3개의 코어가 +1, +3 및 +3의 스코어를 가지면, 그 종양으로부터의 3개의 코어 중 하나가 2의 불일치를 갖는다.
도 3a는, 제자리 하이브리드화로 측정된, 결장 종양 조직 마이크로어레이에서의 0, 1+, 2+ 및 3+ 수준의 LgR5 염색의 출현율을 도시한다. 75%의 결장 종양 조직이 1+, 2+, 또는 3+ 수준의 염색을 나타내었으며, 37%는 2+ 또는 3+ 염색을 나타내었다. 도 3b는 LgR5 발현의 이질성을 도시한다. 67%의 종양이 3개의 코어에서 이질성을 나타내지 않았다. 32%가 3개의 코어 중 하나에서 1의 불일치를 나타내었으며, 단지 1%만이 1 초과의 불일치를 나타내었다.
C. 마우스 모노클로날 항체 생성
인간 LgR5에 대한 모노클로날 항체를 하기 절차를 이용하여 제조하였다. C-말단 His-택 Fc을 갖는 인간 LgR5 세포외 도메인 (ECD; 아미노산 22-557)을 배큘로바이러스 발현 시스템으로부터 발현시키고, Ni-NTA 컬럼 (Qiagen) 상에서 정제한 후, 문헌 (Kirchhofer 외., 2003)에서 전술된 바와 같이 20mM MES pH 6.0, 6M 구아니딘 HCl 중에서 Superdex 200 컬럼 상의 겔 여과로 정제하고, -80℃에서 저장하기 위해 PBS로 투석하였다.
15마리의 Balb/c 마우스 (Charles River Laboratories International, Inc., Hollister, CA, USA)에 락테이트 처리된 링거 용액 중의 huLgR5 플라스미드 DNA를 (꼬리 정맥을 통해) 주사하거나 대사가능한 스쿠알렌 (4% v/v), Tween 80 (0.2 % v/v), 트레할로즈 6,6-디마이콜레이트 (0.05% w/v) 및 모노포스포릴 지질 A (0.05% w/v; Sigma Aldrich, USA)을 포함하는 아주방트 중의 상술된 바와 같은 재조합 인간 LgR5 ECD를 주사하였다. 혈청 역가를 6 내지 9번 주사후 표준 효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 및 FACS로 평가하였다. 총 5마리의 마우스로부터 수집된 비장 B 세포를 전기융합 (Hybrimune; Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA, USA)에 의해 마우스 골수종 세포 (X63.Ag8.653; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)와 융합시켰다. 10 내지 14일 후, 하이브리도마 상등액을 ELISA에 의해 항체 분비에 대해 스크리닝하였다. 이어서, 모든 양성 클론을 증대시키고, ELISA 및 FACS에 의해 huLgR5 및 muLgR5에 대한 결합에 대해 (즉, 293-huLGR5 및 293-muLGR5 세포에 대한 결합에 대해) 재스크리닝하였다. 하이브리도마 클론 8E11.1.1 (DNA 면역화된 마우스로부터 확인됨) 및 2H6.3.5 및 3G12.2.1 (둘다 단백질 면역화된 마우스로부터 확인됨)는 (제한 희석에 의한) 2 라운드의 서브클로닝 후 높은 면역결합을 나타내었으며, INTEGRA CELLine 1000 바이오반응기 (INTEGRA Biosciences AG, Zizers, Switzerland)에서 정제를 위해 규모를 확대하였다. 이어서, 상등액을 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 멸균-여과시킨 후, PBS 중에서 4℃에서 저장하였다. mAB의 이소형은 이소스트립 마우스 mAb 이소타이핑 키트 (Roche Applied Biosciences, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 IgG1 (kapp 경쇄)인 것으로 밝혀졌다.
도 4는 특정 특성에 따라 생성된 특정 모노클로날 항체를 도시하며, 이중 일부가 하기에서 더욱 상세히 기술될 것이다.
D. 마우스 모노클로날 항체의 클로닝 및 키메라화
모노클로날 항체 8E11, 3G12, 및 2H6을 하기와 같이 클로닝하고 키메라화하였다.
총 RNA를 표준 방법을 이용하여 뮤린 8E11, 뮤린 3G12, 또는 뮤린 2H6를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 도메인을 중쇄 및 경쇄에 대한 축퇴성 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 이용하여 증폭시켰다. 전방 프라이머는 VL 및 VH 영역의 N-말단 아미노산 서열에 대해 특이적이었다. 각각, LC 및 HC 역 프라이머를, 종간에 고도로 보존된 불병 경쇄 (CL) 및 불변 중쇄 도메인 1 (CH1) 내의 영역에 어닐링하도록 고안하였다. 삽입물의 폴리뉴클레오타이드 서열을 통상의 서열분석 방법을 이용하여 측정하였다. 8E11 VL 및 VH 아미노산 서열이 각각 도 5 및 6 (각각 서열 3 및 4)에 도시되어 있다. 3G12 및 2H6 VL 및 VH 아미노산 서열이 각각 도 7 및 8에 도시되어 있다. 항체 3G12의 VL 및 VH 서열이 각각 서열 21 및 22에 나타나 있으며, 항체 2H6의 VL 및 VH 서열이 각각 서열 23 및 24에 나타나 있다.
마우스 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역으로 클로닝하고 경쇄 가변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역으로 클로닝함으로써 각각의 항체를 키메라화하였다.
E. 8 E11 의 인간화
모노클로날 항체 8E11을 하기에 기술하는 바와 같이 인간화하였다. 잔기 번호는 하기 문헌에 따른다: Kabat 등, Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
수용체 인간 공통 프레임워크로 직접적인 초가변 영역 이식
8E11의 인간화 동안 작제된 변이체를 IgG의 형태로 평가하였다. 뮤린 8E11로부터의 VL 및 VH 도메인을 인간 VL 카파 IV (VLKIV) 및 인간 VH 서브그룹 I (VHI) 공통 서열과 함께 정렬하였다. 뮤린 8E11 (mu8E11) 항체로부터의 초가변 영역을 VLKIV 및 VHI 수용체 프레임워크로 조작하여 8E11.v1을 생성하였다. 구체적으로, mu8E11 VL 도메인으로부터 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)을 VLKIV로 이식하였다. mu8E11 VH 도메인으로부터, 위치 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 95-102 (H3)를 VHI로 이식하였다. 또한, VH의 프레임워크 III의 위치 71 및 78은 8E11.v1에서의 마우스 서열로부터 유지되었다. 이들 잔기는 CDR 구조를 조절하고 항원 맞춤을 미세-조정하는 "버니어 (Vernier)" 존으로 작용하는 프레임워크 잔기의 일부인 것으로 밝혀졌다. 참조: 예를 들어, Foote and Winter, J. Mol . Biol . 224: 487-499 (1992) (도 5 및 6). 이들 CDR 정의는 이들의 초가변성 (Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970)], 이들의 구조적 위치 (Chothia, C. & Lesk, A M. (1987)) 및 항원-항체 접촉시 이들의 관여 [MacCallum 외 . J. Mol . Biol . 262: 732-745 (1996)) 에 의해 규정되는 위치를 포함한다.
경쇄의 위치 68및 중쇄의 위치 67 및 69와 같은 다른 버니어 위치의 기여를 평가하기 위해 추가의 8E11 변이체를 생성하였다. 중쇄 가변 영역의 위치 67 및 69에서 2개의 추가의 마우스 잔기를 유지시킴으로써 인간화된 8E11.v2를 생성하였다. 8E11.v2 및 다른 변이체에 대한 경쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 가변 영역 서열이 각각 도 5 및 6에 도시되어 있다.
8E11의 인간화된 변이체를 각각의 초가변 영역에 대한 별개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 쿤겔 (Kunkel) 돌연변이유발로 생성하였다. 정확한 클론을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
변이체 평가
스크리닝 목적 상, 먼저 IgG 변이체를 293 세포에서 생성하였다. VL 및 VH를 암호화하는 벡터를 293 세포에 트랜스펙션시켰다. IgG를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 세포 배양 배지로부터 정제하였다.
인간 LgR5에 대한 각각의 8E11 IgG 변이체의 친화도를 BIAcoreTM-3000을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다. BIAcoreTM 리써치 등급 CM5 칩을 공급자의 교시에 따라 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 시약으로 활성화시켰다. 각각의 유동 셀에서 약 10,000 반응 유니트 (RU)가 달성되도록 염소 항-인간 Fc IgG를 칩에 커플링시켰다. 비반응된 커플링 그룹을 1M 에탄올아민으로 차단하였다. 동력학 측정을 위해, 약 300 RU가 달성되도록 항-LgR5 항체를 포획하였다. 인간 LgR5 ECD (배큘로바이러스 시스템에서 발현되는 His-Fc에 융합된 아미노산 22-557 또는 CHO 세포에서 발현되는 Fc에 융합된 아미노산 22-558; 125 nM 내지 0.49 nM)의 2배 연속 희석물을 30 μl/min의 유속으로 25 ℃에서 HBS-P 완충액 (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중에 주입하였다. 결합율 (kon) 및 해리율 (koff)을 1:1 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델 (BIAcoreTM Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)를 koff/kon의 비율로 계산하였다.
결과
인간화된 8E11에 대해 사용되는 인간 수용체 프레임워크는 인간 VL 카파 IV 공통 (VLKIV) 및 수용체 VH 프레임워크 VHI에 기초한다. mu8E11의 8개의 인간화된 변이체를 생성하고 BIAcoreTM에 의해 LgR5 친화도를 시험하였다. 각각의 변이체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이 각각 도 5 및 6에 도시되어 있다. 친화도 측정 결과가 도 9에 도시되어 있다.
8E11.v1의 결합 친화도를 개선하기 위해서, 경쇄의 위치 68 및 중쇄의 위치 67 및 69를 mu8E11에서의 이들 위치에서 발견되는 잔기로 교체하였다. 중쇄의 위치 71 및 78을 인간 프레임워크 VHI에서의 이들 위치에서 발견되는 잔기로 교체하였다. 이들 변경된 경쇄 및 중쇄의 조합물을 IgG로서 발현시키고, 상술된 바와 같이 정제한 후, Biacore에 의해 인간 LgR5에 대한 결합을 평가하였다 (도 9).
hu8E11.v1 중쇄의 위치 67 및 69를 mu8E11에서의 이들 위치에서 발견되는 잔기로 교체함으로써 변이체 hu8E11.v2를 생성하였다. hu8E11.v2의 친화도 (KD)는 모 ch8E11 항체와 대략적으로 동일한 것을 밝혀졌다.
인간화된 8 E11 . v2 를 위한 변화의 요약
6개의 뮤린 8E11 CDR [위치 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 93-102 (H3)로 정의됨]을 인간 공통 VLKIV 및 VHI 수용체 도메인으로 이식하였다. 위치 67, 69, 71, 및 78을 mu8E11로부터의 뮤린 잔기로 다시 교체하였다. 인간화된 8E11.v2는 키메릭 8E11에 필적하는 LgR5에 대한 친화도를 갖는다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 마우스 모노클로날 항체 8E11, 2H6, 및 3G12는 달리 각각 8E11, m8E11, 또는 mu8E11; 및 2H6, m2H6 또는 mu2H6; 및 3G12, m3G12, 또는 mu3G12로 지칭된다. 키메릭 모노클로날 항체 8E11, 2H6, 및 3G12는 각각 키메릭 8E11 또는 ch8E11; 키메릭 2H6 또는 ch2H6; 및 키메릭 3G12 또는 ch3G12로 지칭된다. 인간화된 모노클로날 항체 8E11.v2도 또한 8E11v2, h8E11v.2, 또는 hu8E11v.2로 지칭될 수 있다.
F. 파지 디스플레이에 의한 인간 모노클로날 항체의 생성
N-말단 FLAG를 갖는 인간 LgR5 ECD (아미노산 22-555)를 CHO 세포에서 발현시키고, 밤새 항-FLAG 수지 상에서 정제한 후, 0.1M 아세트산, pH 2.7으로 용출시켰다. 이어서, 단백질을 PBS 중의 Superdex 200 컬럼 상에서 겔 여과로 정제한 후, -80℃에서 저장하기 위해 PBS로 투석하였다.
선택된 상보성 결정 영역 (H1, H2, H3)에서 합성적 다양성을 지녀 인간 IgG 레퍼토리의 천연적 다양성을 모방하는 인간 파지 항체 라이브러리를 패닝 (panning)에 사용하였다. Fab 단편이 M13 박테리오파지 입자의 표면에 이가로 디스플레이되었다 (Lee 외 (2004) J Mol Biol 340, 1073-93). 상술된 바와 같이 생성된 인간 LgR5 ECD (아미노산 22-555)를 항원으로 사용하였다. Nunc 96-웰 MaxiSorp 면역플레이트 (Nunc)를 밤새 4oC에서 LgR5 ECD 단백질 (10 μg/ml)로 코팅하고, 1시간 동안 1% BSA로 보충된 PBST 완충액 (PBS, 0.05% Tween 20)으로 차단하였다. 항체 파지 라이브러리를 부가하고, 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST 완충액으로 세척하고, 결합된 파지를 50 mM HCL/500 mM NaCl로 30분 동안 용출시킨 후, 등용적의 1M 트리스 염기로 중화시켰다. 회수된 파지를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다. 후속적 선별 라운드 동안, 파지 항체의 인큐베이션 시간은 2시간으로 줄었으며, 플레이트 세척의 엄중함은 점점 증가되었다 (Liang 외 (2007) J Mol Biol 366, 815-829). 인간 LgR5 ECD에 결합하는 독특하고 특이적인 파지 항체를 파지 ELISA 및 DNA 서열분석으로 확인하였다. VL 및 VH 영역을 각각 LPG3 및 LPG4 벡터에 클로닝함으로써 YW353을 포함하는 특정 클론을 전장 IgG로 새로 포맷하였다. 항체를 포유동물 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 컬럼 상에서 정제하였다 (Carter 외 (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89, 4285-9).
인간 항체 YW353에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열이 각각 도 10 및 11 (서열 26 및 25)에 도시되어 있다. 인간 항체 YW353에 대한 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 서열이 각각 서열 66 및 65에 나타나 있다. YW353은 인간 항체 파지 라이브러리로부터 생성되므로, 본원에서 용어 "YW353" 및 "huYW353"는 상호교환적으로 사용된다.
G. 종 교차-반응성
모노클로날 항체가 인간과 다른 종으로부터의 LgR5와 교차-반응하는 지의 여부를 알아내기 위해 시험하였다. 도 12a 내지 c는 인간 (서열 67), 시노몰구스 원숭이 (서열 69), 래트 (서열 70) 및 마우스 (서열 72) LgR5 사이의 정렬을 도시한다. 4개의 종 모두 간에 동일한 잔기는 별표 (*)로 표시된다. 도 4는 gD 에피토프-택 LgR5 (인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 또는 마우스 LgR5)로 안정하게 트랜스펙션되고; 10 μg/ml YW353, ch8E11, hu8E11.v2, 2H6, 또는 3G12 항체로 염색되고; R-피코에리트린 접합된 염소 항-인간 항체로 검출된 293 세포에 대한 FACS 분석의 결과를 도시한다. 트랜스펙션되지 않은 293 세포는 LgR5를 정상적으로 발현하지 않는다. YW353 항체는 인간 및 시노몰구스 원숭이 LgR5에는 결합하나, 래트 또는 마우스 LgR5에는 결합하지 않는다. Ch8E11 및 hu8E11.v2 항체는, 비록 래트 LgR5에 대한 결합이 인간, 시노몰구스 원숭이, 또는 마우스 LgR5에 대한 결합만큼 강력하지는 않지만, 모든 4종의 LgR5에 결합한다. 2H6 항체는 인간 및 마우스 LgR5에 결합하며, 시노몰구스 원숭이 또는 래트 LgR5에 대한 결합은 시험되지 않았다. 3G12 항체는 인간 LgR5에 대해서는 강한 결합을 나타내고, 마우스 LgR5에 대해서는 덜 강한 결합을 나타내며, 시노몰구스 원숭이 또는 래트 LgR5에 대한 결합은 시험되지 않았다.
H. 항체 친화도
인간 LgR5에 대한 각각의 항체의 친화도를 실질적으로 실시예 E에서 상술된 바와 같이 BIAcoreTM-3000를 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다.
도 4에 도시되는 바와 같이, YW353 항체는 1.6 nM의 친화도로 인간 LgR5에 결합하였다. Ch8E11 및 hu8E11.v2 항체는 각각 2.4 nm 및 3.1 nm의 친화도로 인간 LgR5에 결합하였다. 2H6 및 3G12 항체는 각각 208 nM 및 72 nM의 친화도로 인간 LgR5에 결합하였다.
스캐챠드 (Scatchard) 분석을 표준 절차 (Holmes 외, Science 256:1205-1210 (1992))에 따라 수행하여 YW353, ch8E11 및 hu8E11v2 항체의 상대적 결합 친화도를 측정하였다.
항-Lgr5 항체를 간접적 요오드발생 방법을 이용하여 [I125]로 라벨링하였다. [I125] 라벨링된 항-Lgr5 항체를 NAP-5 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하는 겔 여과에 의해 유리 125I-Na로부터 정제하였으며; 정제되고 요오드처리된 항-Lgr5 항체는 13.92 내지 19.01 μCi/μg의 특이적 활성 범위를 가졌다. 고정 농도의 [I125] 라벨링된 항체 및 감소되는 농도의 일련의 희석된 라벨링되지 않은 항체를 포함하는 50 μL 용적의 경쟁 분석 혼합물을 96-웰 플레이트에 배치시켰다. 인간, 래트, 또는 마우스 Lgr5를 안정하게 발현하는 293 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 성장 배지 중에서 배양하였다. 세포를 Sigma 세포 분리 용액을 사용하여 플라스크로부터 탈착시키고, 2% 우태 혈청 (FBS), 50 mM HEPES (pH 7.2) 및 0.1% 아지드화나트륨을 갖는 듈베코 변형 이글 배지 (DMEM)로 이루어진 결합 완충액으로 세척하였다. 세척된 세포를 0.2 mL의 결합 완충액 중에 250,000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 가하였다. 각각이 웰 중의 [I125] 라벨링된 항체의 최종 농도는 200 pM이었다. 경쟁 검정물 중의 라벨링되지 않은 항체의 최종 농도는 10번의 2배 희석 단계를 통한 500 nM부터 단지 검정을 위한 0 nM 완충액의 범위였다. 경쟁 검정은 삼중으로 수행하였다. 경쟁 검정물을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션한 후, 경쟁 검정물을 Millipore 멀티스크린 필터 플레이트 (Billerica, MA)에 옮기고, 결합 완충액으로 4회 세척하여 결합된 [I125] 라벨링된 항체로부터 유리물을 분리시켰다. 필터를 Wallac Wizard 1470 감마 카운터 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.; Wellesley, MA) 상에서 계수하였다. 결합 데이터는 항체의 결합 친화도를 측정하기 위한 문슨 (Munson) 및 로버드 (Robard)의 피팅 알고리즘 (Munson 및 Robard 1980)을 이용하는 NewLigand 소프트웨어 (Genentech)를 이용하여 평가하였다.
도 4에 도시되는 바와 같이, gD-택 인간 LgR5에 결합된 YW353가 0.2 nM의 친화도로 안정하게 트랜스펙션된 293 세포에서 발현된 gD-택 인간 LgR5에 결합하였다. Ch8E11은 각각 0.4 nM 및 0.2 nM의 친화도로 안정하게 트랜스펙션된 293 세포에서 발현된 gD-택 인간 LgR5 및 gD-택 마우스 LgR5에 결합하였다. Hu8E11v2는 각각 0.3-0.7 nM, 0.5-0.6 nM, 및 2.4-2.8 nM의 친화도로 안정하게 트랜스펙션된 293 세포에서 발현된 gD-택 인간 LgR5, gD-택 마우스 LgR5, 및 gD-택 래트 LgR5에 결합하였다. 이들 Kd 값은 일반적으로 BIAcore®로 측정된 것보다 낮았다.
I. 에피토프 매핑
각각의 항체에 의해 결합된 LgR5의 영역을 알아내기 위해서, 다양한 N- 및/또는 C-말단 결실을 갖는 gD 에피토프-택 LgR5로 일시적으로 트랜스펙션된 293 세포를 10 μg/ml YW353, ch8E11, hu8E11v2, 2H6, 또는 3G12 항체로 염색하고; R-피코에리트린 접합된 염소 항-인간 항체로 결합을 검출하였다. 항체 YW353, 8E11, 2H6, 및 3G12 모두 gD 에피토프-택 전장 LgR5에 결합하였다. 항체 2H6 및 3G12는 gD 에피토프-택 LgR5324 -907 (서열 67의 아미노산 324-907)에 결합하였다. 항체 YW353 및 8E11은 gD 에피토프-택 LgR5324-907에 결합하지 않았다. 항체 YW353만이 C-말단 GPI 앵커를 갖는 gD 에피토프-택 LgR522 -123 (서열 67의 아미노산 22-123)에 결합하였다. 항체 YW353 및 8E11은 모두 C-말단 GPI 앵커를 갖는 gD 에피토프-택 LgR522 -323 (서열 67의 아미노산 22-323)에 결합하였으나, 항체 2H6 및 3G12는 결합하지 않았다. 마지막으로, 어떠한 항체도 gD 에피토프-택 LgR5424 -907 (서열 67의 아미노산 424-907)에 결합하지 않았다.
도 4는 표제 "에피토프 영역"의 컬럼에서 이들 결과를 요약한다. 이 도면에서 도시되는 바와 같이, 항체 YW353은 서열 67의 아미노산 22 내지 123의 영역에 있는 에피토프에 결합하고; 항체 8E11 및 이의 인간화된 변이체는 서열 67의 아미노산 22 내지 323의 영역에 있는 에피토프에 결합하고; 항체 2H6 및 3G12는 서열 67의 아미노산 324 내지 423의 영역에 있는 에피토프에 결합한다.
J. 항- LgR5 항체 약물 접합체의 제조
대규모 항체 제조를 위해, 항체를 CHO 세포에서 제조하였다. VL 및 VH를 암호화하는 벡터를 CHO 세포에 트랜스펙션시키고, IgG를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 세포 배양 배지로부터 정제하였다.
항- LgR5 항체 MMAE 접합체
YW353 (각각 서열 66 및 65에 도시된 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 서열), hu8E11v2 (각각 서열 64 및 63에 도시된 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 서열), mu8E11, ch8E11, 2H6, ch2H6, 3G12, 및 ch3G12를 본원에 기재된 약물-링커 잔기 MC-vc-PAB-MMAE에 접합시킴으로써 항-LgR5 항체-약물 접합체 (ADC)를 제조하였다. 편의상, 약물-링커 잔기 MC-vc-PAB-MMAE는 가끔씩 본 실시예 및 도면에서 "vcMMAE" 또는 "VCE"로 지칭된다. 항체를 접합시키기 전에 WO 2004/010957 A2에 기술되는 방법에 따라 표준 방법을 이용하여 TCEP로 부분적으로 환원시켰다. 부분적으로 환원된 항체를, 예를 들어, 문헌 [Doronina 외 (2003) Nat . Biotechnol . 21:778-784 and US　2005/0238649　A1. 간단히, 부분적으로 환원된 항체를 약물-링커 잔기와 조합하여 약물-링커 잔기를 항체의 환원된 시스테인 잔기에 접합시켰다. 접합 반응물을 퀀칭시키고, ADC를 정제하였다. 각각의 ADC에 대한 약물 로드 (항체당 약물 잔기의 평균수)를 측정하였으며, 항-LgR5 항체에 대해 3.3 내지 4.0이었다. 항체-vcMMAE 면역접합체의 구조가 도 35A에 도시되어 있다 (p = 약물 로드).
항- LgR5 항체 PNU 접합체
YW353 A118C 티오Mab (각각 서열 78 및 65의 IgG1 A118C 중쇄 및 카파 경쇄 서열) 또는 hu8E11v2 티오Mab (각각 서열 75 및 63의 IgG1 A118C 중쇄 및 카파 경쇄 서열)를 PNU 약물-링커 잔기에 접합시킴으로써 항-LgR5 항체-PNU 약물 접합체 (ADC)를 제조하였다. 항체를 접합시키기 전에 디티오트레이톨 (DTT)로 환원시켜 티오-항체의 조작된 시스테인으로부터 차단 그룹 (예를 들어, 시스테인)을 제거하였다. 이러한 공정은 또한 항체의 쇄간 디설파이드 결합도 환원시킨다. 환원된 항체를 정제하여 방출된 차단 그룹을 제거시키고, 디하이드로-아스코르브산 (dhAA)를 사용하여 쇄간 디설파이드를 재산화시켰다.
val-cit 링커 및 PNU를 포함하는 항체-약물 접합체를 위해, 온전한 항체를 약물-링커 잔기 MC-val-cit-PAB-스페이서-PNU-159682 ("val-cit"는 본원에서 "vc"로도 지칭될 수있다)와 조합하여 약물-링커 잔기를 항체의 조작된 시스테인 잔기에 접합시켰다. 임의의 유리 링커-약물 잔기와 반응하도록 과량의 N-아세틸-시스테인을 부가함으로써 접합 반응물을 퀀칭시키고, ADC를 정제하였다. ADC에 대한 약물 로드 (항체당 약물 잔기의 평균수)는 약 1.8 내지 2의 범위였다. 항체-vcPNU 면역접합체의 구조가 도 35B에 도시되어 있다 (p = 약물 로드).
아세탈 링커 및 PNU를 포함하는 항체 약물 접합체를 위해, 온전한 항체를 약물-링커 잔기 MC-아세탈-PNU-159682와 조합하여 약물-링커 잔기를 항체의 조작된 시스테인 잔기에 접합시켰다. 임의의 유리 링커-약물 잔기와 반응하도록 과량의 N-아세틸-시스테인을 부가함으로써 접합 반응물을 퀀칭시키고, ADC를 정제하였다. ADC에 대한 약물 로드 (항체당 약물 잔기의 평균수)는 약 1.8 내지 2의 범위였다. 항체-아세탈-PNU 면역접합체의 구조가 도 35C에 도시되어 있다 (p = 약물 로드).
절단불가능한 링커 및 PNU를 포함하는 항체 약물 접합체를 위해, 온전한 항체를 약물-링커 잔기 MC-PNU-159682와 조합하여 약물-링커 잔기를 항체의 조작된 시스테인 잔기에 접합시켰다. 임의의 유리 링커-약물 잔기와 반응하도록 과량의 N-아세틸-시스테인을 부가함으로써 접합 반응물을 퀀칭시키고, ADC를 정제하였다. ADC에 대한 약물 로드 (항체당 약물 잔기의 평균수)는 약 1.8 내지 2의 범위였다. 항체-아세탈-PNU 면역접합체의 구조가 도 35D에 도시되어 있다 (p = 약물 로드).
항- LgR5 항체 PBD 접합체
YW353 A118C 티오Mab (각각 서열 78 및 65의 IgG1 A118C 중쇄 및 카파 경쇄 서열) 또는 hu8E11v2 티오Mab (각각 서열 75 및 63의 IgG1 A118C 중쇄 및 카파 경쇄 서열)를 PBD 약물-링커 잔기에 접합시킴으로써 항-LgR5 항체-PBD 약물 접합체 (ADC)를 제조하였다. 항체를 접합시키기 전에 디티오트레이톨 (DTT)로 환원시켜 티오-항체의 조작된 시스테인으로부터 차단 그룹 (예를 들어, 시스테인)을 제거하였다. 이러한 공정은 또한 항체의 쇄간 디설파이드 결합도 환원시킨다. 환원된 항체를 정제하여 방출된 차단 그룹을 제거시키고, 디하이드로-아스코르브산 (dhAA)를 사용하여 쇄간 디설파이드를 재산화시켰다.
val-cit 링커 및 PBD를 포함하는 항체-약물 접합체를 위해, 온전한 항체를 약물-링커 잔기 MC-val-cit-PAB-PBD ("val-cit"는 본원에서 "vc"로도 지칭될 수있다)와 조합하여 약물-링커 잔기를 항체의 조작된 시스테인 잔기에 접합시켰다. 임의의 유리 링커-약물 잔기와 반응하도록 과량의 N-아세틸-시스테인을 부가함으로써 접합 반응물을 퀀칭시키고, ADC를 정제하였다. ADC에 대한 약물 로드 (항체당 약물 잔기의 평균수)는 약 1.8 내지 2의 범위였다. 항체-vcPBD의 구조가 도 35E에 도시되어 있다 (p = 약물 로드).
K. 래트에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 독성
항-LgR5 항체 8E11.v2-vcMMAE의 잠재적 독성을 평가하기 위해서, 6마리의 수컷 스프라그-둘리 (Sprague-Dawley) 래트에게 4주 동안 주당 1회씩 12 mg/kg 8E11.v2-vcMMAE를 투여하고, 6마리의 수컷 스프라그-둘리 래트에게 2주 동안 주당 1회씩 20 mg/kg 8E11.v2-vcMMAE를 투여하였다. 4마리의 수컷 스프라그-둘리 대조군 래트에게 2주 동안 주당 1회씩 비히클만을 투여하고, 4마리의 수컷 스프라그-둘리 대조군 래트에게 4주 동안 주당 1회씩 비히클만을 투여하였다. 2-주 그룹의 래트는 12일에 부검하고, 4-주 그룹의 래트는 26일에 부검하였다.
간단히, 8E11.v2-vcMMAE가 투여된 모든 래트는, 대조군 래트에 비해, 감소된 레드 세포 매쓰 (적혈구, 헤마토크릿, 헤모글로빈 및 망상적혈구), 호중구 및 혈소판을 나타내었다. 20 mg/kg 8E11.v2-vcMMAE가 투여된 래트도, 대조군 래트에 비해, 감소된 백혈구수 및 림프구를 나타내었다. 또한, 8E11.v2-vcMMAE가 투여된 모든 래트는 간 효소 ALT, AST, ALP, 및 GGT에 있어 증가를 보였으며, 대조군에 비해 총 빌리루빈이 증가하였다.
본 연구로부터 수집된 조직의 조직병리학적 분석 결과, 8E11.v2-vcMMAE가 투여된 래트의 림프 및 조혈 조직에서 세포 결핍이 나타났으며, 빠르게 분열하는 조직에서 유사분열율이 증가하였다. 20 mg/kg 8E11.v2-vcMMAE이 투여된 래트에서도 매우 적은 간 괴사, 매우 적은 증가된 유사분열율 및 단일 세포 크립트 (cryptal) 괴사/아폽토시스 및 매우 적은 약한 폐포 (alveolar) 조직구증 및 제II형 세포 과다형성을 나타내었다.
관측된 병변 변화는 다른 vcMMAE 항체-약물 접합체가 투여된 래트에서 관측된 병변과 유사하였다. GI 관에서 LgR5 항원-의존적 독성에 대한 어떠한 증거도 나타나지 않았다.
L. LoVo 결장암 세포주 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
항-LgR5 ADC의 효능을 LoVo 결장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LoVo 세포는 APC 돌연변이를 갖는 결장직장 선암종 세포주이다 (ATCC #CCL 229). LgR5는 LoVo 세포에서 고도로 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. HBSS-마트리겔 중의 5,000,000개 LoVo 세포 (YW353를 사용한 FACS로 LgR5-양성)를 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 주사하고, 접종후 6일에 마우스에 5 mg/kg 뮤린 항-gp120-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체, 인간 항-gD 5B6-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체, huYW353-vcMMAE 항체-약물 접합체, mu8E11-vcMMAE 항체-약물 접합체, mu2H6-vcMMAE 항체-약물 접합체, 또는 mu3G12-vcMMAE 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (PBS) 단독을 단일 정맥 주사하였다. 항체의 존재를 주사후 1일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 13에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 시험된 4개의 항-LgR5 항체-약물 접합체 모두로 달성되었다.
M. D5124 췌장암 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
항-LgR5 ADC의 효능을 β-카테닌 돌연변이를 갖는 D5124 췌장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LgR5는 D5124 종양에서 고도로 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편 (YW353 및 8E11를 사용한 FACS로 LgR5-양성)을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 18일에 마우스에 6 mg/kg 인간 항-gD 5B6-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg huYW353-vcMMAE 항체-약물 접합체, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ch8E11-vcMMAE 항체-약물 접합체, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ch2H6-vcMMAE 항체-약물 접합체, 또는 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ch3G12-vcMMAE 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5; 도 14에서 "HB#8") 단독을 단일 정맥 주사하였다. 항체의 존재를 주사후 1일 및 8일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 14에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 huYW353-vcMMAE, ch8E11-vcMMAE, 및 ch3G12-vcMMAE의 두 용량 모두에서 달성되었다. 실질적인 종양 성장 억제도 6 mg/kg ch2H6-vcMMAE에서 달성되었다.
이어서, 다양한 용량의 YW353-vcMMAE의 효능을 상술된 D5124 췌장암 이종이식편 모델에서 시험하였다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편 (YW353 및 8E11를 사용한 FACS로 LgR5-양성)을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 23일에 마우스에 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 또는 12 mg/kg huYW353-vcMMAE 항체-약물 접합체; 또는 12 mg/kg huYW353; 또는 7.2 mg/kg 또는 14.4 mg/kg 인간 항-gD 5B6-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5; 도 15에서 "HB#8") 단독을 단일 정맥 주사하였다. 항체의 존재를 주사후 1일, 4일 및 14일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 15에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 3 mg/kg huYW353-vcMMAE에서 달성되었으며, 거의 완전한 종양 성장 억제가 6 mg/kg 및 12 mg/kg huYW353-vcMMAE에서 달성되었다.
N. 뮤린 장 종양형성 모델에서 mu8E11 및 mu8E11 - vcMMAE 의 효능
mu8E11 및 mu8E11-vcMMAE의 효능을 뮤린 장 종양형성 모델인 APCmin /+; LSL-KrasG12D; VillinCre ("AKV 마우스")에서 조사하였다. AKV 마우스는 APCmin /+; VillinCre ("AV 마우스")를 LSL-KrasG12D 마우스와 교배시킨 결과이다. AV 마우스는 결장에서 0 내지 4개의 선종 및 소장에서 100개의 선종을 발병시킨 반면, AKV 마우스는 결장에서 평균 140개의 선종 및 소장에서 평균 100개의 선종을 발병시킨다 (자료 제시되지 않음). LgR5 mRNA 발현을 AV 및 AKV 마우스의 정상 조직 및 폴립에서 측정하였으며, LgR5는 AKV 마우스의 소장 및 결장 모두로부터의 폴립에서 상당히 과발현되는 것으로 나타났다 (도 16). AKV 마우스의 소장 및 결장에서 LgR5의 발현을 가시화하기 위해서, AKV 마우스를, LgR5 유전자에 위치된 인간 디프테리아 독소 수용체 cDNA에 프레임으로 연결된 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 포함하는 카세트를 갖는 마우스와 교배시켰다. 참조: Tian 외, Nature, 478: 255-260 (2011). 소장 폴립 및 대장 폴립에서의 EGFP 발현 면적이 AKV Lgr5 DTR/+ 마우스에서 가시화되었다. 실험 결과가 도 20에 도시되어 있다. LgR5 발현은 소장 폴립과 결장 폴립 사이에 유의하게 다르지 않으며, 종양 크기와 LgR5+ 면적 사이에 연관이 없는 것으로 밝혀졌다. 종양의 평균 LgR5+ 면적은 8%였으나, 종양 간에 크게 달랐다. 예비 결과, 인간의 결장직장 종양에서 LgR5+ 면적은 마우스에서보다 상당히 높을 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 인간에서의 항-LgR5 ADC 요법의 치료 지수가 마우스에서보다 훨씬 좋을 수 있다는 것을 제시한다.
이들 동물들에서 장 크립트와 종양 사이의 Lgr5 발현 차이를 평가하기 위해서, AKV Lgr5 DTR /+ 마우스 로부터 장관을 취하고 조직 절편 상에서 GFP의 직접적 가시화를 수행하였다. 이후, 종양 및 정상 크립트에서 각각의 GFP 양성 픽셀의 강도를 정량하였다. 상대적 GFP 강도를 측정하기 위해서, 강도 스코어를 GFP+ 면적으로 나눈다. 도 23에 도시되는 바와 같이, LgR5 발현은 AKV Lgr5 DTR /+ 마우스의 장 크립트에서보다 종양에서 더 높다.
항-LgR5 항체가 생존을 증가시킬 수 있는지를 알아내기 위해 AKV 마우스를 사용하여 전반적인 생존 연구를 수행하였다. 10마리의 AKV 마우스에 15 mg/kg mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE를 투여하고; 6마리의 AKV 마우스에 15 mg/kg mu8E11를 투여하고, 9마리의 마우스에 15 mg/kg 대조군 항체 항-gp120-MC-vc-MMAE를 투여하였다. 6주령부터 시작하여, 마우스가 죽거나 빈사 상태 (심각한 무기력, 체중 손실 및 빈혈 증상과 관련된 표준 기준으로 측정됨) (이 경우, 마우스를 희생시켰다)로 간주될 때까지, 매주 항체 및 ADC를 투여하였다.
전반적인 생존 연구 결과가 도 17에 도시되어 있다. 비처리된 대조군 데이터는 22마리의 AKV 마우스에 대한 기왕 (historical) 생존율을 나타낸다. 본 실험에서, mu8E11 또는 mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE가 투여된 AKV 마우스는 비처리된 AKV 마우스 또는 대조군 ADC가 투여된 AKV 마우스보다 상당히 긴 생존 시간을 가졌다. 이들 결과에 기초하여, 추가의 동물을 상술된 바와 같이 평가하였다. 실험 결과가 도 19에 도시되어 있다. 대규모 실험에서, mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE가 투여된 AKV 마우스는 비처리된 AKV 마우스 또는 대조군 ADC가 투여된 AKV 마우스보다 상당히 긴 생존 시간을 가졌으며, mu8E11가 투여된 마우스보다 긴 생존 시간을 가졌다. 사망시, 대조군 ADC 및 항-LgR5-ADC가 투여도니 AKV 마우스는 유사한 수와 크기의 폴립을 가졌으며, 이는 항-LgR5-ADC가 질환을 느리게 하고 이로써 생존을 연장시킨다는 것을 제시한다.
항-LgR5 항체 및/또는 항-LgR5 ADC가 AKV 마우스의 위장 종양에서 아폽토시스를 유발하는지를 알아내기 위해, 절단된 카스파제 3의 존재를 종양 면적에 대한 함수로서 평가하였다. 사망시 수집된 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 (FFPE) 소장 및 결장 조직을 절단된 카스파제 3에 대해 면역조직화학 염색을 수행하였다 (Cell Signaling Technologies; Danvers, MA, cat# 9661L). 염색된 슬라이드의 상을 Olympus Nanozoomer 자동화된 슬라이드 스캐닝 플랫폼으로 입수하고 수동으로 확인되는 종양-특이적 면역을 Matlab 소프트웨어 패키지 (Mathworks, Natick, MA)에서 분석하였다. 양성으로 염색되는 면적 및 총 종양 면역을 정량하였다. 절단된 카스파제 3이, 비록 드물게 항-LgR5 ADC로 처리한 후 크립트에서 볼 수 있었으나, 대조군의 ADC 처리된 동물에서는 관측되지 않았으며, 이는 LgR5-발현 세포가 특이적으로 표적된다는 것을 제시한다.
실험 결과가 도 18에 도시되어 있다. 항-LgR5 항체 및 항-LgR5 ADC 투여 모두, 대조군의 AKC-처리된 AKV 마우스에 비해, 절단된 카스파제 3의 존재에 대해 양성이었던 AKV 마우스에서 종양 면적 백분율을 통계학적으로 유의하게 증가시켰다.
아폽토시스가 LgR5+ 세포에서 일어나고 있는지를 알아내기 위해서, AKV Lgr5 DTR /+ 마우스에 15 mg/kg mu8E11-MC-vc-PAB-MMAE 또는 15 mg/kg 대조군 항체 항-gp120-MC-vc-MMAE를 투여하였다 (1일). 4일에, 마우스를 죽이고, 위장관 (소장 및 대장)으로부터의 종양을 EGFP 및 절단된 카스파제 3의 발현으로 가시화하였다. 이어서, 총 세포 면적당 CC3+GFP+ 면적의 양을 측정하였다. 도 21a에 도시되는 바와 같이, 항-LgR5-ADC 처리된 마우스는, 비록 본 실험에서 통계학적으로 유의하지는 않았지만, 대조군의 처리된 마우스보다 더 큰 비율의 CC3+GFP+ 면적을 갖는 경향을 보였다. 도 21b은 대조군의 ADC 처리된 마우스 (좌측 패널) 및 항-LgR5-ADC 처리된 마우스 (우측 패널)로부터의 예시적인 면역조직화학 염색을 도시한다. 이들 결과는 항-LgR5-ADC 처리시 LgR5-발현 세포에서 아폽토시스의 증가 경향을 입증한다.
LgR5 발현 세포의 세포 증식이 항-LgR5 처리에 의해 영향을 받는지를 알아내기 위해, 세포 면적당 Ki67+ 면적을 대조군의 ADC 처리 및 항-LgR5-ADC 처리된 AKV Lgr5 DTR /+ 마우스의 위장관으로부터의 EGFP+ 세포군 및 EGFP- 세포군에서 측정하였다. Ki67은 세포 증식과 관련된 핵 단백질이다. 면역조직화학 염색을 위한 Ki67 항체는 Neomarker로부터 입수하였다. 실험 결과가 도 22에 도시되어 있다. 대조군 ADC에 비해 항-LgR5-ADC로 처리된 AKV Lgr5 DTR /+ 마우스로부터의 종양에서, GFP+ 및 GFP- 세포군 모두에서, Ki67 염색으로 측정시, 증식 세포 면적이 상당히 좁았다. 이들 결과는 항-LgR5-ADC가 증식을 저하시키고/시키거나 증식 자손의 형성을 억제한다는 것을 제시한다.
O. D5124 췌장암 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
항-LgR5 ADC의 효능을 β-카테닌 돌연변이를 갖는 D5124 췌장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LgR5는 D5124 종양에서 고도로 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 22일에 마우스에 2.62 mg/kg 또는 5.23 mg/kg huYW353-vcMMAE 항체-약물 접합체, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ch8E11-vcMMAE 항체-약물 접합체, 또는 3 mg/kg 또는 6 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체; 또는 6 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 8 마우스/그룹). 항체의 존재를 주사후 1일 및 8일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 24에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 huYW353-vcMMAE 두 용량 모두, hu8E11v2-vcMMAE 두 용량 모두 및 6 mg/kg ch8E11v2-vcMMAE에서 달성되었다.
이어서, 다양한 용량의 hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체의 효능을 상술된 D5124 췌장암 이종이식편 모델에서 시험하였다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 26일에 마우스에 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 또는 12 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체; 또는 15 mg/kg hu8E11v2; 또는 6.37 mg/kg 또는 12.73 mg/kg 인간 항-gD 5B6-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체; 또는 15 mg/kg 인간화된 항-gD 대조군 항체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 8 마우스/그룹).
도 25에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 3 mg/kg 및 6 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE에서 달성되었으며, 종양 퇴화가 12 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE에서 달성되었다.
P. LoVoX1 .1 결장암 세포주 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
항-LgR5 ADC의 효능을 LoVo 결장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LoVo 세포는 APC 돌연변이를 갖는 결장직장 선암종 세포주 (ATCC #CCL 229)이고, 서브세포주 LoVoX1.1은 마우스에서의 최적 성장을 위해 유도되었다. 간단히, 마우스에 LoVo 세포를 접종하였다. 일단 종양이 성장하면, 목적하는 성장율을 갖는 종양을 수거하였다. 종양을 잘게 썰고, 배양하여 세포주 LoVoX1.1를 확립하였다. LgR5는 LoVoX1.1 세포에서 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. HBSS-마트리겔 중의 5,000,000개 LoVoX1.1 세포를 C.B-17 SCID 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 주사하고, 접종후 13일에 마우스에 3 mg/kg 또는 6 mg/kg huYW353-vcMMAE 항체-약물 접합체, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체; 15 mg/kg hu8E11v2 항체; 15 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6 대조군 항체; 또는 6 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 10 마우스/그룹).
도 26에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 6 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 및 6 mg/kg huYW353-vcMMAE에서 달성되었다.
이어서, 다양한 용량의 hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체의 효능을 상술된 LoVoX1.1 결장직장 선암종 이종이식편 모델에서 시험하였다. HBSS-마트리겔 중의 5,000,000개 LoVoX1.1 세포를 C.B-17 SCID 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 주사하고, 접종후 10일에 마우스에 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 15 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체; 또는 15 mg/kg hu8E11v2; 또는 6 mg/kg 또는 15 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcMMAE 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 9 마우스/그룹). 항체의 존재를 주사후 1일, 7일 및 14일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 27에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 6 mg/kg, 10 mg/kg, 및 15 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE에서 달성되었다.
Q. D5124 췌장암 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
항-LgR5 ADC의 효능을 β-카테닌 돌연변이를 갖는 D5124 췌장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LgR5는 D5124 종양에서 고도로 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 26일에 마우스에 1 mg/kg huYW353-vcMMAE 항체-약물 접합체, 1 mg/kg huYW353-vcPNU 항체-약물 접합체, 1 mg/kg huYW353-PNU 항체-약물 접합체, 1 mg/kg huYW353-아세탈-PNU 항체-약물 접합체; 또는 1 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcPNU 대조군 항체-약물 접합체, 1 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-PNU 대조군 항체-약물 접합체, 또는 1 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-아세탈-PNU 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다(n = 9 마우스/그룹). 항체의 존재를 주사후 3일, 7일 및 14일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 28에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 1 mg/kg huYW353-vcMMAE 및 1 mg/kg huYW353-아세탈-PNU에서 달성되었으며, 거의 완전한 종양 성장 억제가 1 mg/kg huYW353-vcPNU에서 달성되었다. 1 mg/kg huYW353-아세탈-PNU로 처리된 마우스 중 1마리가 완전한 반응을 나타내었다 (즉, 이 마우스는 연구말에 종양을 검출할 수 없었다). 또한, 1 mg/kg huYW353-vcPNU로 처리된 마우스 중 2마리는 부분적인 반응 (즉, 0일째의 초기 종양 용적의 50% 초과 감소)을 나타내었다.
R. D5124 췌장암 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
다양한 용량의 hu8E11v2 항체-약물 접합체의 효능을 상술된 D5124 췌장암 이종이식편 모델에서 시험하였다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 22일에 마우스에 2 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체; 또는 2 mg/kg hu8E11v2-vcPNU; 또는 2 mg/kg 또는 10 mg/kg hu8E11v2-아세탈-PNU; 또는 2 mg/kg 또는 10 mg/kg hu8E11v2-PNU; 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcPNU 대조군 항체-약물 접합체, 10 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-아세탈-PNU 대조군 항체 약물 접합체, 또는 10 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-PNU 대조군 항체 약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 8 마우스/그룹).
도 29에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 2 mg/kg hu8E11v2-아세탈-PNU에서 달성되었으며, 거의 완전한 종양 성장 억제가 10 mg/kg hu8E11v2-아세탈-PNU, 2 mg/kg hu8E11v2-vcPNU, 및 2 mg/kg 및 10 mg/kg hu8E11v2-PNU에서 달성되었다.
S. LoVo 결장암 세포주 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
항-LgR5 ADC의 효능을 LoVo 결장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LoVo 세포는 APC 돌연변이를 갖는 결장직장 선암종 세포주 (ATCC #CCL 229)이고, 서브세포주 LoVoX1.1은 마우스에서의 최적 성장을 위해 유도되었다. 간단히, 마우스에 LoVo 세포를 접종하였다. 일단 종양이 성장하면, 목적하는 성장율을 갖는 종양을 수거하였다. 종양을 잘게 썰고, 배양하여 세포주 LoVoX1.1를 확립하였다. LgR5는 LoVoX1.1 세포에서 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. HBSS-마트리겔 중의 5,000,000개 LoVoX1.1 세포를 C.B-17 SCID 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 주사하고, 접종후 11일에 마우스에 2 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체, 2 mg/kg hu8E11v2-vcPNU, 2 mg/kg hu8E11v2-아세탈-PNU, 또는 2 mg/kg hu8E11v2-PNU; 또는 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcPNU 대조군 항체-약물 접합체, 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-아세탈-PNU 대조군 항체 약물 접합체, 또는 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-PNU 대조군 항체 약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 10 마우스/그룹). 항체의 존재를 주사후 1일, 7일 및 14일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 30에 도시되는 바와 같이, 본 실험에서, 특정한 대조군 항체는 실질적인 종양 성장 억제를 보이는 것으로 나타났다 (참조: 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcPNU 및 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-아세탈-PNU 대조군 항체 약물 접합체).
이전 실험에서 대조군 항체의 분명한 비-특이적 효과 때문에, LoVoX1.1 결장직장 선암종 모델은 (LoVo 세포 표면 상에서 발현되지 않는 상이한 항원에 결합하는) 상이한 대조군 항체-약물 접합체를 사용하고, 종양 세포 상의 가능한 비특이적 항체 결합 부위를 차단시키기 위해 과량의 항-gD 대조군 항체를 투여하면서 시험하였다. HBSS-마트리겔 중의 5,000,000개 LoVoX1.1 세포를 C.B-17 SCID 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 주사하고, 접종후 7일에 마우스에 10 mg/kg hu8E11v2-아세탈-PNU 항체-약물 접합체; 또는 10 mg/kg 티오Ab-아세탈-PNU 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (50 mM 인산나트륨, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween20, pH 7) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 5 마우스/그룹). 또한, 마우스에 30 mg/kg 인간화된 항-gD 대조군 항체를 시험 항체의 투여와 같은 날에, 단 투여하기 4시간 전에, 투여를 개시하여 연구가 끝날 때까지 주 1회 복강내 투여하였다.
도 31에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 10 mg/kg hu8E11v2-아세탈-PNU에서 달성되었으며, 대조군 항체는 종양 성장을 억제하지 않았다.
T. D5124 췌장암 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
YW353 항-LgR5 ADC의 효능을 β-카테닌 돌연변이를 갖는 D5124 췌장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LgR5는 D5124 종양에서 고도로 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 26일에 마우스에 1 mg/kg huYW353-vcMMAE 항체-약물 접합체, 1 mg/kg huYW353-vcPBD 항체-약물 접합체; 또는 1 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcPBD 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 9 마우스/그룹). 항체의 존재를 주사후 1일, 7일 및 14일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 32에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 1 mg/kg huYW353-vcMMAE 및 1 mg/kg huYW353-vcPBD에서 달성되었다. 1 mg/kg huYW353-vcPBD로 처리된 마우스 중 1마리가 완전한 반응을 나타내었다 (즉, 이 마우스는 연구말에 종양을 검출할 수 없었다).
별도의 실험으로, hu8E11v2 항-LgR5 ADC의 효능을 D5124 췌장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. 20 내지 30 mm3 D5124 종양 단편을 NCR 누드 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 이식하고, 이식후 22일에 마우스에 2 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체, 2 mg/kg hu8E11v2-vcPBD 항체-약물 접합체; 또는 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcPBD 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n= 8 마우스/그룹).
도 33에 도시되는 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제가 2 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE에서 달성되었으며, 종양 퇴화가 2 mg/kg hu8E11v2-vcPBD에서 달성되었다.
U. LoVoX1 .1 결장암 세포주 이종이식편에서 항- LgR5 항체 약물 접합체의 효능
항-LgR5 ADC의 효능을 LoVoX1.1 결장암 이종이식편 모델을 사용하여 조사하였다. LoVo 세포는 APC 돌연변이를 갖는 결장직장 선암종 세포주 (ATCC #CCL 229)이고, 서브세포주 LoVoX1.1은 마우스에서의 최적 성장을 위해 유도되었다. 간단히, 마우스에 LoVo 세포를 접종하였다. 일단 종양이 성장하면, 목적하는 성장율을 갖는 종양을 수거하였다. 종양을 잘게 썰고, 배양하여 세포주 LoVoX1.1를 확립하였다. LgR5는 LoVoX1.1 세포에서 발현되며, 마이크로어레이, TaqMan® 정량적 RT-PCR, 제자리 하이브리드화, FACS 및 웨스턴 블롯으로 확인되었다. HBSS-마트리겔 중의 5,000,000개 LoVoX1.1 세포를 C.B-17 SCID 마우스의 등쪽 옆구리로 피하 주사하고, 접종후 11일에 마우스에 2 mg/kg hu8E11v2-vcMMAE 항체-약물 접합체, 2 mg/kg hu8E11v2-vcPBD 항체-약물 접합체; 또는 2 mg/kg 인간화된 항-gD 5B6-vcPBD 대조군 항체-약물 접합체; 또는 비히클 (히스티딘 완충액: 20mM 히스티딘 아세테이트, 240 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20, pH5.5) 단독을 단일 정맥 주사하였다 (n = 10 마우스/그룹). 항체의 존재를 주사후 1일, 7일 및 14일에 PK 출혈로 확인하였다.
도 34에 도시되는 바와 같이, 완전한 종양 성장 억제가 2 mg/kg hu8E11v2-vcPBD로 달성되었다.
본 발명의 명확한 이해를 위해 설명 및 예시를 들어 다소 상세히 기술하였으나, 이러한 기술과 예시가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에서 인용되는 모든 특허 및 과학 문헌에 대한 기술은 명백히 전부 참조로 포함된다.
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<110> GENENTECH, INC. <120> ANTI-LGR5 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES <130> GENE-32548/WO-1/ORD <150> US 61/618,232 <151> 2012-03-30 <150> US 61/683,048 <151> 2012-08-14 <150> US 61/778,710 <151> 2013-03-13 <160> 86 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hukIV <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huVH1 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: mu8E11 light chain variable region <400> 3 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 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Val Leu Leu Arg Gly Cys Pro Thr His 1 5 10 15 Cys His Cys Glu Pro Asp Gly Arg Met Leu Leu Arg Val Asp Cys Ser 20 25 30 Asp Leu Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Asn Leu Ser Val Phe Thr Ser 35 40 45 Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn Ile Ser Gln Leu Leu Pro Asn Pro 50 55 60 Leu Pro Ser Leu Arg Phe Leu Glu Glu Leu Arg Leu Ala Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Thr Tyr Ile Pro Lys Gly Ala Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Leu Lys 85 90 95 Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg His Val Pro Thr Glu Ala 100 105 110 Leu Gln Asn Leu Arg Ser Leu Gln Ser Leu Arg Leu Asp Ala Asn His 115 120 125 Ile Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser Gly Leu His Ser Leu Arg 130 135 140 His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Leu Thr Glu Ile Pro Val Gln Ala 145 150 155 160 Phe Arg Ser Leu Ser Ala Leu Gln Ala Met Thr Leu Ala Leu Asn Lys 165 170 175 Ile His His Ile Pro Asp Tyr Ala Phe Gly Asn Leu Ser Ser Leu Val 180 185 190 Val Leu His Leu His Asn Asn Arg Ile His Ser Leu Gly Lys Lys Cys 195 200 205 Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp Leu 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Ala Leu Val 835 840 845 Thr Phe Thr Ser Ser Ser Ile Thr Tyr Asp Leu Pro Pro Ser Ser Val 850 855 860 Pro Ser Pro Ala Tyr Pro Val Thr Glu Ser Cys His Leu Ser Ser Val 865 870 875 880 Ala Phe Val Pro Cys Leu 885 <210> 69 <211> 875 <212> PRT <213> M. cynomolgus <220> <221> UNSURE <222> (1)..(875) <223> Cynomolgus monkey LgR5 partial sequence, predicted; predicted to correspond to amino acids 33 to 907 of full-length precursor <400> 69 Gly Cys Pro Thr His Cys His Cys Glu Pro Asp Gly Arg Met Leu Leu 1 5 10 15 Arg Val Asp Cys Ser Asp Leu Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Asn Leu 20 25 30 Ser Val Phe Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn Ile Ser Gln 35 40 45 Leu Leu Pro Asn Pro Leu Pro Ser Leu Arg Phe Leu Glu Glu Leu Arg 50 55 60 Leu Ala Gly Asn Ala Leu Thr Tyr Ile Pro Lys Gly Ala Phe Thr Gly 65 70 75 80 Leu Tyr Ser Leu Lys Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg Gln 85 90 95 Val Pro Thr Glu Ala Leu Gln Asn Leu Arg Ser Leu Gln Ser Leu Arg 100 105 110 Leu Asp Ala Asn His Ile Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser Gly 115 120 125 Leu His Ser Leu Arg His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Leu Thr Glu 130 135 140 Ile Pro Val Gln Ala Phe Arg Ser Leu Ser Ala Leu Gln Ala Met Thr 145 150 155 160 Leu Ala Leu Asn Lys Ile His His Ile Pro Asp Tyr Ala Phe Gly Asn 165 170 175 Leu Ser Ser Leu Val Val Leu His Leu His Asn Asn Arg Ile His Ser 180 185 190 Leu Gly Lys Lys Cys Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp 195 200 205 Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Asp Glu Phe Pro Thr Ala Ile Arg Thr Leu 210 215 220 Ser Asn Leu Lys Glu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Ile Arg Ser Ile 225 230 235 240 Pro Glu Lys Ala Phe Val Gly Asn Pro Ser Leu Ile Thr Ile His Phe 245 250 255 Tyr Asp Asn Pro Ile Gln Phe Val Gly Arg Ser Ala Phe Gln His Leu 260 265 270 Pro Glu Leu Arg Thr Leu Thr Leu Asn Gly Ala Ser Gln Ile Thr Glu 275 280 285 Phe Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ala Asn Leu Glu Ser Leu Thr Leu Thr 290 295 300 Gly Ala Gln Ile Ser Ser Leu Pro Gln Thr Val Cys Asn Gln Leu Pro 305 310 315 320 Asn Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Glu Asp Leu Pro 325 330 335 Ser Phe Ser Val Cys Gln Lys Leu Gln Lys Ile Asp Leu Arg His Asn 340 345 350 Glu Ile Tyr Glu Ile Lys Val Asp Thr Phe Gln Gln Leu Leu Ser Leu 355 360 365 Arg Ser Leu Asn Leu Ala Trp Asn Lys Ile Ala Ile Ile His Pro Asn 370 375 380 Ala Phe Ser Thr Leu Pro Ser Leu Ile Lys Leu Asp Leu Ser Ser Asn 385 390 395 400 Leu Leu Ser Ser Phe Pro Val Thr Gly Leu His Gly Leu Thr His Leu 405 410 415 Lys Leu Thr Gly Asn His Ala Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ser Glu Asn 420 425 430 Phe Pro Glu Leu Lys Ile Ile Glu Met Pro Tyr Ala Tyr Gln Cys Cys 435 440 445 Ala Phe Gly Val Cys Glu Asn Ala Tyr Lys Ile Ser Asn Gln Trp Asn 450 455 460 Lys Gly Asp Asn Ser Ser Met Asp Asp Leu His Lys Lys Asp Ala Gly 465 470 475 480 Met Phe Gln Val Gln Asp Glu Arg Asp Leu Glu Asp Phe Leu Leu Asp 485 490 495 Phe Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu His Ser Val Gln Cys Ser Pro Ser 500 505 510 Pro Gly Pro Phe Lys Pro Cys Glu His Leu Leu Asp Gly Trp Leu Ile 515 520 525 Arg Ile Gly Val Trp Thr Ile Ala Val Leu Ala Leu Thr 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Val Ala Phe 740 745 750 Leu Ser Phe Ser Ser Leu Leu Asn Leu Thr Phe Ile Ser Pro Glu Val 755 760 765 Ile Lys Phe Ile Leu Leu Val Ile Val Pro Leu Pro Ala Cys Leu Asn 770 775 780 Pro Leu Leu Tyr Ile Leu Phe Asn Pro His Phe Lys Glu Asp Leu Val 785 790 795 800 Ser Leu Gly Lys Gln Thr Tyr Phe Trp Thr Arg Ser Lys His Pro Ser 805 810 815 Leu Met Ser Ile Asn Ser Asp Asp Val Glu Lys Gln Ser Cys Asp Ser 820 825 830 Thr Gln Ala Leu Val Thr Phe Thr Ser Ser Ser Ile Ala Tyr Asp Leu 835 840 845 Pro Pro Ser Ser Val Pro Ser Pro Ala Tyr Pro Val Thr Glu Ser Cys 850 855 860 His Leu Ser Ser Val Ala Phe Val Pro Cys Leu 865 870 875 <210> 70 <211> 907 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(907) <223> Rat LgR5 precursor; LGR5_rat NP_001100254 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(21) <400> 70 Met Asp Thr Ser Arg Val Arg Met Leu Leu Ser Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Gln Leu Val Ala Ala Gly Ser Pro Pro Arg Pro Asp Thr Met Pro Arg 20 25 30 Gly Cys Pro Ser Tyr Cys His Cys Glu Leu Asp Gly Arg Met Leu Leu 35 40 45 Arg Val Asp Cys Ser Asp Leu Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Asn Leu 50 55 60 Ser Val Phe Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn Ile Ser Gln 65 70 75 80 Leu Pro Ala Ser Leu Leu His Arg Leu Arg Phe Leu Glu Glu Leu Arg 85 90 95 Leu Ala Gly Asn Ala Leu Thr His Ile Pro Lys Gly Ala Phe Ala Gly 100 105 110 Leu His Ser Leu Lys Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg Gln 115 120 125 Val Pro Glu Glu Ala Leu Gln Asn Leu Arg Ser Leu Gln Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Asp Ala Asn His Ile Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser Gly 145 150 155 160 Leu His Ser Leu Arg His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Leu Thr Asp 165 170 175 Val Pro Val Gln Ala Phe Arg Ser Leu Ser Ala Leu Gln Ala Met Thr 180 185 190 Leu Ala Leu Asn Lys Ile His His Ile Ala Asp His Ala Phe Gly Asn 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Val Val Leu His Leu His Asn Asn Arg Ile His Ser 210 215 220 Leu Gly Lys Lys Cys Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp 225 230 235 240 Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Asp Glu Phe Pro Thr Ala Ile Lys Thr Leu 245 250 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Phe Pro Glu Leu Lys Ile Ile Glu Met Pro Tyr Ala Tyr Gln Cys Cys 465 470 475 480 Ala Phe Gly Gly Cys Glu Asn Val Tyr Lys Ile Pro Asn Gln Trp Asn 485 490 495 Lys Asp Asp Ser Ser Ser Val Asp Asp Leu Arg Lys Lys Asp Ala Gly 500 505 510 Leu Phe Gln Val Gln Asp Glu Arg Asp Leu Glu Asp Phe Leu Leu Asp 515 520 525 Phe Glu Glu Asp Leu Lys Val Leu His Ser Val Gln Cys Ser Pro Pro 530 535 540 Pro Gly Pro Phe Lys Pro Cys Glu His Leu Phe Gly Ser Trp Leu Ile 545 550 555 560 Arg Ile Gly Val Trp Thr Thr Ala Val Leu Ala Leu Ser Cys Asn Ala 565 570 575 Leu Val Ala Phe Thr Val Phe Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Ser Ser Ile 580 585 590 Lys Leu Leu Ile Gly Val Ile Ala Val Val Asp Ile Leu Met Gly Val 595 600 605 Ser Ser Ala Ile Leu Ala Val Val Asp Thr Phe Thr Phe Gly Ser Phe 610 615 620 Ala Gln His Gly Ala Trp Trp Glu Gly Gly Ile Gly Cys Gln Ile Val 625 630 635 640 Gly Phe Leu Ser Ile Phe Ala Ser Glu Ser Ser Val Phe Leu Leu Thr 645 650 655 Leu Ala Ala Leu Glu Arg Gly Phe Ser Val Lys Cys Ser Ser Lys Phe 660 665 670 Glu Met Lys Ala Pro Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Cys 675 680 685 Val Leu Leu Ala Leu Thr Ile Ala Thr Val Pro Leu Leu Gly Gly Ser 690 695 700 Glu Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Cys Leu Pro Leu Pro Phe Gly Glu Pro 705 710 715 720 Ser Thr Thr Gly Tyr Met Val Ala Leu Val Leu Leu Asn Ser Leu Cys 725 730 735 Phe Leu Ile Met Thr Ile Ala Tyr Thr Arg Leu Tyr Cys Ser Leu Glu 740 745 750 Lys Gly Glu Leu Glu Asn Leu Trp Asp Cys Ser Met Val Lys His Thr 755 760 765 Ala Leu Leu Leu Phe Thr Asn Cys Ile Leu Tyr Cys Pro Val Ala Phe 770 775 780 Leu Ser Phe Ser Ser Leu Leu Asn Leu Thr Phe Ile Ser Pro Glu Val 785 790 795 800 Ile Lys Phe Ile Leu Leu Val Ile Val Pro Leu Pro Ala Cys Leu Asn 805 810 815 Pro Leu Leu Tyr Ile Val Phe Asn Pro His Phe Lys Glu Asp Met Gly 820 825 830 Ser Leu Gly Lys Gln Thr Arg Phe Trp Thr Arg Ala Lys His Pro Ser 835 840 845 Leu Leu Ser Ile Asn Ser Asp Asp Val Glu Lys Arg Ser Cys Asp Ser 850 855 860 Thr Gln Ala Leu Val Ser Phe Thr His Ala Ser Ile Ala Tyr Asp Leu 865 870 875 880 Pro Ser Asp Ser Gly Ser Ser Pro Ala Tyr Pro Met Thr Glu Ser Cys 885 890 895 His Leu Ser Ser Val Ala Phe Val Pro Cys Leu 900 905 <210> 71 <211> 886 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(886) <223> Rat LgR5 mature, without signal sequence; amino acids 22 to 907 <400> 71 Gly Ser Pro Pro Arg Pro Asp Thr Met Pro Arg Gly Cys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Cys His Cys Glu Leu Asp Gly Arg Met Leu Leu Arg Val Asp Cys Ser 20 25 30 Asp Leu Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Asn Leu Ser Val Phe Thr Ser 35 40 45 Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn Ile Ser Gln Leu Pro Ala Ser Leu 50 55 60 Leu His Arg Leu Arg Phe Leu Glu Glu Leu Arg Leu Ala Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Thr His Ile Pro Lys Gly Ala Phe Ala Gly Leu His Ser Leu Lys 85 90 95 Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg Gln Val Pro Glu Glu Ala 100 105 110 Leu Gln Asn Leu Arg Ser Leu Gln Ser Leu Arg Leu Asp Ala Asn His 115 120 125 Ile Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser Gly Leu His Ser Leu Arg 130 135 140 His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Leu Thr 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Ile Lys Leu Leu Ile Gly 565 570 575 Val Ile Ala Val Val Asp Ile Leu Met Gly Val Ser Ser Ala Ile Leu 580 585 590 Ala Val Val Asp Thr Phe Thr Phe Gly Ser Phe Ala Gln His Gly Ala 595 600 605 Trp Trp Glu Gly Gly Ile Gly Cys Gln Ile Val Gly Phe Leu Ser Ile 610 615 620 Phe Ala Ser Glu Ser Ser Val Phe Leu Leu Thr Leu Ala Ala Leu Glu 625 630 635 640 Arg Gly Phe Ser Val Lys Cys Ser Ser Lys Phe Glu Met Lys Ala Pro 645 650 655 Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Cys Val Leu Leu Ala Leu 660 665 670 Thr Ile Ala Thr Val Pro Leu Leu Gly Gly Ser Glu Tyr Asn Ala Ser 675 680 685 Pro Leu Cys Leu Pro Leu Pro Phe Gly Glu Pro Ser Thr Thr Gly Tyr 690 695 700 Met Val Ala Leu Val Leu Leu Asn Ser Leu Cys Phe Leu Ile Met Thr 705 710 715 720 Ile Ala Tyr Thr Arg Leu Tyr Cys Ser Leu Glu Lys Gly Glu Leu Glu 725 730 735 Asn Leu Trp Asp Cys Ser Met Val Lys His Thr Ala Leu Leu Leu Phe 740 745 750 Thr Asn Cys Ile Leu Tyr Cys Pro Val Ala Phe Leu Ser Phe Ser Ser 755 760 765 Leu Leu Asn Leu Thr Phe Ile Ser Pro Glu Val 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Val Ala Phe Val Pro Cys Leu 900 905 <210> 73 <211> 886 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(886) <223> Mouse LgR5 mature, without signal sequence; amino acids 22 to 907 <400> 73 Gly Ser Ser Pro Gly Pro Asp Ala Ile Pro Arg Gly Cys Pro Ser His 1 5 10 15 Cys His Cys Glu Leu Asp Gly Arg Met Leu Leu Arg Val Asp Cys Ser 20 25 30 Asp Leu Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Asn Leu Ser Val Phe Thr Ser 35 40 45 Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn Ile Ser Gln Leu Pro Ala Ser Leu 50 55 60 Leu His Arg Leu Cys Phe Leu Glu Glu Leu Arg Leu Ala Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Thr His Ile Pro Lys Gly Ala Phe Thr Gly Leu His Ser Leu Lys 85 90 95 Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg Gln Val Pro Glu Glu Ala 100 105 110 Leu Gln Asn Leu Arg Ser Leu Gln Ser Leu Arg Leu Asp Ala Asn His 115 120 125 Ile Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser Gly Leu His Ser Leu Arg 130 135 140 His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Leu Thr Asp Val Pro Val Gln Ala 145 150 155 160 Phe Arg Ser Leu Ser Ala Leu Gln Ala Met Thr Leu Ala Leu Asn Lys 165 170 175 Ile His His Ile Ala Asp Tyr Ala Phe Gly Asn Leu Ser Ser Leu Val 180 185 190 Val Leu His Leu His Asn Asn Arg Ile His Ser Leu Gly Lys Lys Cys 195 200 205 Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp Leu Asn Tyr Asn Asn 210 215 220 Leu Asp Glu Phe Pro Thr Ala Ile Lys Thr Leu Ser Asn Leu Lys Glu 225 230 235 240 Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Ile Arg Ser Ile Pro Glu Arg Ala Phe 245 250 255 Val Gly Asn Pro Ser Leu Ile Thr Ile His Phe Tyr Asp Asn Pro Ile 260 265 270 Gln Phe Val Gly Val Ser Ala Phe Gln His Leu Pro Glu Leu Arg Thr 275 280 285 Leu Thr Leu Asn Gly Ala Ser His Ile Thr Glu Phe Pro His Leu Thr 290 295 300 Gly Thr Ala Thr Leu Glu Ser Leu Thr Leu Thr Gly Ala Lys Ile Ser 305 310 315 320 Ser Leu Pro Gln Ala Val Cys Asp Gln Leu Pro Asn Leu Gln Val Leu 325 330 335 Asp Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Glu Asp Leu Pro Ser Leu Ser Gly Cys 340 345 350 Gln Lys Leu Gln Lys Ile Asp Leu Arg His Asn Glu Ile Tyr Glu Ile 355 360 365 Lys Gly Ser Thr Phe Gln Gln Leu Phe Asn Leu Arg Ser 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chain (IgG1) <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Ala Thr Phe Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly His Tyr Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 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20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: primer <400> 84 accgagtttc acctcagctc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: primer <400> 85 acattgccct gttgctcttc 20 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: primer <400> 86 actgctctga tatactcaat c 21

Claims (59)

  1. LgR5에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 서열 67의 아미노산 22-323 또는 서열 67의 아미노산 22-123 내의 에피토프에 결합하고, 5 nM 이하의 친화도로 LgR5에 결합하는 것인, 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 모노클로날 항체인, 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 인간, 인간화된, 또는 키메릭 항체인, 항체.
  4. 청구항 1에 있어서, LgR5에 결합하는 항체 단편인, 항체.
  5. 청구항 1에 있어서, LgR5가 서열 67의 인간 LgR5인, 항체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는 것인, 항체:
    a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 또는
    b) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는 것인, 항체:
    a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
    b) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 항체가 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 하기를 포함하는 것인, 항체:
    a) 서열 40의 중쇄 프레임워크 FR3 서열;
    b) 서열 41의 중쇄 프레임워크 FR3 서열;
    c) 서열 42의 중쇄 프레임워크 FR3 서열; 또는
    d) 서열 43의 중쇄 프레임워크 FR3 서열.
  9. 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는 것인, 항체:
    a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
    b) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 서열 HVR-L2, 및 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는 것인, 항체:
    a) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
    b) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서, 상기 항체가 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함하고, 서열 35의 경쇄 프레임워크 FR3 서열을 추가로 포함하는 것인, 항체.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함하는 것인, 항체:
    a) 서열 6의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    b) 서열 5의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열;
    d) 서열 8의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    e) 서열 7의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    f) (d)에서와 같은 VH 서열 및 (e)에서와 같은 VL 서열;
    g) 서열 10의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    h) 서열 9의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    i) (g)에서와 같은 VH 서열 및 (h)에서와 같은 VL 서열;
    j) 서열 12의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    k) 서열 11의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    l) (j)에서와 같은 VH 서열 및 (k)에서와 같은 VL 서열;
    m) 서열 14의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    n) 서열 13의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    o) (m)에서와 같은 VH 서열 및 (n)에서와 같은 VL 서열;
    p) 서열 16의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    q) 서열 15의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    r) (p)에서와 같은 VH 서열 및 (q)에서와 같은 VL 서열;
    s) 서열 18의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    t) 서열 17의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    u) (s)에서와 같은 VH 서열 및 (t)에서와 같은 VL 서열;
    v) 서열 20의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    w) 서열 19의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
    x) (v)에서와 같은 VH 서열 및 (w)에서와 같은 VL 서열;
    y) 서열 26의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
    z) 서열 25의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는
    aa) (y)에서와 같은 VH 서열 및 (z)에서와 같은 VL 서열.
  13. 청구항 12에 있어서, 서열 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 26 중에서 선택되는 VH 서열을 포함하는, 항체.
  14. 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서, 서열 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 25 중에서 선택되는 VL 서열을 포함하는, 항체.
  15. 하기를 포함하는 항체:
    a) 서열 6의 VH 서열 및 서열 5의 VL 서열;
    b) 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열;
    c) 서열 10의 VH 서열 및 서열 9의 VL 서열;
    d) 서열 12의 VH 서열 및 서열 11의 VL 서열;
    e) 서열 14의 VH 서열 및 서열 13의 VL 서열;
    f) 서열 16의 VH 서열 및 서열 15의 VL 서열;
    g) 서열 18의 VH 서열 및 서열 17의 VL 서열;
    h) 서열 20의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열; 또는
    i) 서열 26의 VH 서열 및 서열 25의 VL 서열.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 항체인, 항체.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  18. 청구항 17의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  19. 청구항 18의 숙주 세포를 배양하여 항체를 생성하는 것을 포함하는, 상기 항체의 제조 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  21. 청구항 20에 있어서, 화학식 Ab-(L-D)p를 갖고, 상기 화학식에서,
    (a) Ab는 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항의 항체이고;
    (b) L은 링커이고;
    (c) D는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀, 및 네모루비신 유도체 중에서 선택되는 약물이고;
    (d) p는 1 내지 8의 범위인 것인, 면역접합체.
  22. 청구항 21에 있어서, D가 아우리스타틴인, 면역접합체.
  23. 청구항 22에 있어서, D가 하기 화학식 DE를 갖는 것인, 면역접합체:
    Figure pct00081

    상기 식에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 H이고, R7은 2급-부틸이고, R8은 각각 독립적으로 CH3, O-CH3, OH, 및 H 중에서 선택되고; R9는 H이고; R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴이다.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 약물이 MMAE인, 면역접합체.
  25. 청구항 21에 있어서, D가 화학식 A의 피롤로벤조디아제핀인, 면역접합체:
    Figure pct00082

    상기 식에서, 점선은 C1과 C2 사이 또는 C2와 C3 사이의 임의적인 이중 결합의 존재를 나타내고;
    R2는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR 중에서 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로 중에서 추가로 선택되고, 여기서 RD 는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로 중에서 선택되고;
    R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로 중에서 선택되고;
    R7은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로 중에서 선택되고;
    Q는 독립적으로 O, S 및 NH 중에서 선택되고;
    R11은 H 또는 R 또는, Q가 O인 경우, SO3M이고, 여기서 M은 금속 양이온이고;
    R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -8 알킬, C3 -8 헤테로사이클릴 및 C5 -20 아릴 그룹 중에서 선택되고, 임의로 그룹 NRR'에 대해 R 및 R'는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성하고;
    R12, R16, R19 및 R17은 각각 R2, R6, R9 및 R7에 대해 정의된 바와 같고;
    R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이고, 이 쇄는 하나 이상의 헤테로원자 및/또는 임의로 치환된 방향족 환에 의해 방해될 수 있으며;
    X 및 X'는 독립적으로 O, S 및 N(H) 중에서 선택된다.
  26. 청구항 25에 있어서, D가 하기 화학식을 갖는 것인, 면역접합체:
    Figure pct00083

    n은 0 또는 1이다.
  27. 청구항 25에 있어서, D가 하기 중에서 선택되는 구조를 갖는 것인, 면역접합체:
    Figure pct00084

    Figure pct00085
    및
    Figure pct00086

    상기 식에서, RE 및 RE"는 각각 독립적으로 H 또는 RD 중에서 선택되고, RD는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로 중에서 선택되고;
    Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이고;
    n은 0 또는 1이다.
  28. 청구항 21에 있어서, D가 화학식 B의 피롤로벤조디아제핀인, 면역접합체:
    Figure pct00087

    상기 식에서, 가로 물결선은 링커에 대한 공유적 부착 부위를 나타내고;
    RV1 및 RV2는 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 페닐, 플루오로-치환된 페닐, 및 C5 -6 헤테로사이클릴 중에서 선택되고;
    n은 0 또는 1이다.
  29. 청구항 21에 있어서, D가 네모루비신 유도체인, 면역접합체.
  30. 청구항 29에 있어서, D가 하기로부터 선택되는 구조를 갖는 것인, 면역접합체:
    Figure pct00088
    및
    Figure pct00089
  31. 청구항 21 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 프로테아제에 의해 절단가능한 것인, 면역접합체.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 링커가 val-cit 디펩타이드 또는 Phe-Lys 디펩타이드를 포함하는 것인, 면역접합체.
  33. 청구항 21 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 산에 불안정한 것인, 면역접합체.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 링커가 하이드라존을 포함하는 것인, 면역접합체.
  35. 청구항 23에 있어서, 하기 화학식을 갖는, 면역접합체:
    Figure pct00090

    상기 식에서, S는 황원자이다.
  36. 청구항 26에 있어서, 하기 화학식을 갖는, 면역접합체:
    Figure pct00091
  37. 청구항 30에 있어서, 하기 중에서 선택되는 화학식을 갖는, 면역접합체:
    Figure pct00092

    Figure pct00093

    및
    Figure pct00094
  38. 청구항 21 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서, p가 2 내지 5의 범위인 것인, 면역접합체.
  39. 청구항 21 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 9의 항체를 포함하는, 면역접합체.
  40. 청구항 21 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 15의 항체를 포함하는, 면역접합체.
  41. 청구항 21 내지 청구항 40 중 어느 한 항의 면역접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제.
  42. 청구항 41에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 제제.
  43. 청구항 42에 있어서, 추가의 치료제가 Avastin® (베바시주마브)인, 약제학적 제제.
  44. 청구항 21 내지 청구항 40 중 어느 한 항의 면역접합체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, LgR5-양성 암을 갖는 개체의 치료 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 LgR5-양성 암이 결장직장암, 췌장암, 난소암, 및 자궁내막암 중에서 선택되는 것인, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 개체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 추가의 치료제가 Avastin® (베바시주마브)인, 방법.
  48. LgR5-양성 세포를 상기 세포 표면 상의 LgR5에 대한 청구항 21 내지 청구항 40 중 어느 한 항의 면역접합체의 결합을 허용하는 조건 하에서 상기 면역접합체에 노출시켜 상기 세포의 증식을 억제시키는 것을 포함하는, 상기 LgR5-양성 세포의 증식 억제 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 세포가 결장직장, 췌장, 난소, 또는 자궁내막 암세포인, 방법.
  50. 표지에 접합된 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 항체.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 표지가 양전자 방출체인, 항체.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 양전자 방출체가 89Zr인, 항체.
  53. 생물학적 샘플 중에서 인간 LgR5를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 천연 발생 인간 LgR5에 대한 항-LgR5 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 항-LgR5 항체와 접촉시키고, 항-LgR 항체와 상기 생물학적 샘플 중의 천연 발생 인간 LgR5 사이의 복합체 형성 여부를 검출하는 것을 포함하는, 검출 방법.
  54. 청구항 53에 있어서, 상기 항-LgR5 항체가 청구항 9 또는 청구항 15의 항체인, 방법.
  55. 청구항 53에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 결장직장암 샘플, 췌장암 샘플, 난소암 샘플, 또는 자궁내막암 샘플인 방법.
  56. LgR5-양성 암을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 항-LgR5 항체를 포함하는 표지된 항-LgR5 항체를 LgR5-양성 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 피험자에게 투여하고, (ii) 상기 피험자에서 상기 표지된 항-LgR5 항체를 검출하는 것을 포함하고, 상기 표지된 항-LgR5 항체의 검출이 상기 피험자에서 LgR5-양성 암을 나타내는 것인, 검출 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 표지된 항-LgR5 항체가 표지된 청구항 8 또는 청구항 14의 항체인, 방법.
  58. 청구항 56 또는 청구항 57에 있어서, 상기 표지된 항-LgR5 항체가 양전자 방출체에 접합된 항-LgR5 항체를 포함하는 것인, 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 양전자 방출체가 89Zr인, 방법.
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