PT89062B

PT89062B - Processo para a preparacao de conjugados de anticorpos monoclonais-farmacos com actividade antitumor

Info

Publication number: PT89062B
Application number: PT89062A
Authority: PT
Inventors: Peter D Senter
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1987-11-23
Filing date: 1988-11-23
Publication date: 1993-07-30
Also published as: AU2582488A; NO885199L; NO885199D0; NZ226955A; US4952394A; KR910005887B1; AU617380B2; NO169958B; FI885361A0; FI885361A; EP0317957B1; JPH02111731A; EP0317957A3; ATE81986T1; GR3006211T3; KR890007724A; PT89062A; ZA886811B; IL88428A0; DK651088A

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 89.062

REQUERENTE: BRISTOL-MYERS COMPANY, norte-americana, com sede em 345 Park Avenue, New York, New York 10154, Estados Unidos da América

EPÍGRAFE: Processo para a preparação de conjugados de anticorpos monoclonais-fármacos com actividade antitumor

INVENTORES:Peter D. Senter, _ Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

U.S.A., 23 de Novembro de 1987, sob ο N2.: 124,313

INPI MOO 113 RF 18732

-, ,-a λ ·>·ο ή -a Q ^ν*’' ⁷ Π 'ί ρ

Ο rresente pedido de patente de invenção está relacionado com c pedido de patente de invenção norte-air.erioa na intitulado Antitumor Prodarges (rrolármacos antitumorais) de nter D. Senter propriedade da Requerente do presente pedido de patente de invenção e denositado coneorrentemente com este pedido de patente de invenção.

Antecedentes da Invenção

A presente invenção descreve métodos para a liber cação de agentes citotóxicos es células tumorais.

A utilização de anticorpos monoclonais com tumores como veículo rara agentes citotóxicos recebeu considerável atenção há vários anos atrás (Moller, 1982). 0 oojectivo da maior parte deste estudo consistiu em melhorar a eficácia de fármacos anti-cancro, diminuindo simultaneamente os efeitos citotóxicos frequentes e indesejáveis. As investigações fo ram. iniciadas ou propostas para realizar este objectivo mediante utilização de conjugados anticorro-fármaco em que o anticorpo serve para libertar o fármaco ar.ticancro no tumor.

a nm de esoe método ser encaz, e necessário que o anticorpo seja altamente selectivo ^era o tumor e que o fármaco seja libertado sob uma forma oitotóxica activa. ?ármacos, tais como metotrexato (Endo, 1987), daunomicina (Galle

Contudo, outros problemas rociem aparecer quando um fármaco e libertado do anticorpo sob uma forma quimicamente modificada. Ainda que o fármaco nossa agora ter acesso ao seu sítio de actividade, o fármaco modificado quimicamente rode ser significativamente menos -potente.

Devido a estas considerações, existe uma necessiõa de de desenvolvimento de novas estratégias de ligação, isto á, novos conjugados de fármaco-anticorro que possam libertar o fármaco, não modificado do ponto de vista químico, do anti corro, de tal modo que o fármaco nossa exercer a sua actividade num nível máximo.

Estudos demonstraram que cocinostos rro-fármaco que constituem derivados do dissulfureto de carbamato de benzilo de rr.it o mi o ina C (MMO), mitomicina A (KMA), e daunomicina li bertam o fármaco sem modificação química quando a ligação dis sulfureto está reduzida (Senter, referência cruzada no redido te patente de invenção; ver Fig. 1).

Concebeu-se que uma estratégia de rro-fármaco que

reforçados de agentes de redução tais coec glutatião, NADH

e NADPH (Sartorelli, 1986). Estes agentes de redução rósea efectuar a libertação do fármaco livre a rartir dos conjugados de farmaco de dissulfureto de carbamato de ber.zilo medi ante redução da ligação dissulfureto.

A utilização dissulfureto de carbamato de benzilo como agentes de ligação para os conjugados de fármaco-antioorno node também ser útil rara a libertação entracelular de fármacos em casos em que o anticorro é aranhado no interior da célula relo endocitose mediado relo recertor.

Tióis intracelulares, tais como o glutatião, rodem então reduzir os conjugados ligados a dissulfureto.

Resumo da presente invenção

A presente invenção consiste em um conjugado anticorno-fármaoo em que o anticorro e o fármaco estão ligados utilizando carbamato de benzilo dissulfureto, '-•or exemrlo.

um conjugado anticorpo MMC, ou carbamato de benzilo dissulfureto, ror exemrlo conjugado de etorosido-anticorno.

Num outro aspecto, a rresente invenção, descreve um método rara a libertação no sitio de células tumorais de um mamífero de um fármaco anti-tumoral activo mediante administração a esse mamífero de conjugados de f ármaco-anticomo monoclonal de acordo com a presente invenção.

n e α 1 ω

:tiva pod s e co do pedido de crit patente

U o no tiva do descooriu-se eóodou.

J ligação de z

que fármacos z

-0>

útil nara d e sdissuliureto

S ub st an c i aIment e estérico se verifica rerda de activida gru.ros da, n

OPUZúfármacos que contenham ecuivalente e t o i na s nroteinicas, para anticorros de imuno eraria tio diri~ido

Desci las ? -i - Ί . -L ¢- , · _L açao de z

T — maoo-antioorpo monoclonal de inven çao

Fig. j - representa	o s resulta i o s	analític	'OS	de
HPLC comparativa de	derivados sob	a forma	θ	rro-
-fúrmacos de acordo	com esta inven	ão.

Descrição pormenorizada da presente invenção

A presente invenção refere-se a conjugados de anticorpos monoclonais-rro-farmacos anti-tumorais com a formu(I) geral

na qual:

D renresenta uq radical de um fármaco anti-tumor comportando na sua estrutura rrinciral um gruno funcional quimicamente reactivo nor meio do qual se lima a estrutura nrinciral ao gruno dissulfu reto benxiloxicarbonilo, derivado de um gruno constituído ror um gruno ammo nrimario renresentado nela fórmula geral R-,ΝΗ-, um gru-o amino se cundário representado nela fórmula geral R-jPm-T- e um grupo álcool renresentado ^ela fórmula geral

- C- :

fármaco citado antes cuando D deriva do gruno -re /

consiste r.um grupo ammo nrirario, um gruno ammo

secundário e um	grupo álcool, em	que ,	no caso	de
um gruno amino	secundário, quand	⁰ 1	e R^ são	in-
dependentes;
R_? representa,	inderendentemente	d o s	f , V-, imoom	5
gruros alauilo	de cadeia linear	’ l· 1? °	mifiçada	com

nortando 1 a 10 átomos d.e carbono e eventualmente substituinte(s) escolhido(s) entre 1 a 3 gruros alcoxi com 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de nalogéneo; gruro fenil comrortando, eventualmen te, substituinte(s) escolhido(s) entre 1 a 3 gru-

abonos de halogeneo e um grupo fenil-alcuilo cccrortanâc evenbualmenbe ue substibuinbe, caso era que c gru.ro fenilo tem c significado definido antes oara o grupo fenilo substituído e o gruro alquilo consiste num grupo polialquileno cora 1 a átmos de carbono; ou R^ e R_? , considerados conjuntamente em ura gruno funcional derivado de uma araina secundária, renresentam a estrutura rrincir>al do radical do farmaco rerresenbado nelo símbo lo D citado antes, comportando urr. grupo livalente ligado por via química ao átomo de azoto que integra o referido grupo araino secundário; e e R^ representam cada ura, índepender.bemente, f f um átomo de .ndrogenio ou um ermo °lquilo de ca deia linear ou ramificada cora d a 10 átomos de carbor.o e tendo eventualraenbe subsiibuinbes escolhidos entre 1 a 3 grupos alccxi, com 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogenéo; gruros fenilo comrorbando eventualmente su.bsbituinbe (s) escolhido(s) entre 1 a 3 gruros alquilo com 1 a 3 átomos de carbono, 1 a 3 grunos alcoxi cora 1 a 3 átomos de carbono e 1 ou um gruro fenil-alquilo te um substituinte em cue substituído, se encontra a 3 átomos de iialogáneo;

comportando, eventualmen o gruno fenilo, quando substituído tal como defi nido antes no caso do grupo fenilo substituído e o grupo alquilo renresenta ura grupo rolialquilánico m representa ura rzisero inteiro de 1 ate 10 e com 1 a átomos de carbono;

Ab rerresenta um anticorrO conoclonal cocncrtanío e ^ara- -cara a nosioão da sub íárraacos representativos dos fármacos cue os reteridos grupos aminicos, seus derivados;

e ura fárraaco representativo dos fármacos cue contêm os referidos grupos álcool é o stopos do

As abreviaturas utilizadas são as seguintes

EMC, mitomicina

EMA, mitomicina A;

DAU, daunomicina; ^r'3S, o de cloreto de sodio tamronada em i ase líquida de alta ditiotreitol e Ab anticorpo monoclonal.

Num outro aspecto da presente invenção, descreve-se um método para a libertação no sítio das células tumorais de um mamífero cora niveis reforçados de agentes de re dução endógenos que incluem nelo menos um membro do gruro de NADH, NADPH e glutatião, ura fármaco anti-turaor activo ten do ligado à sua estrutura princinal ura grupo funcional reactivo quimicamente, escolhido entre um grupo constituído ror ura gruro

R^NH-, um grupo araino secundário representado pela fórmula geral R^P^N- e um. grupo

a) administração ao mamífero de uma quantidade efi caz de anti-tumor de um anticorpo monoclonal li gado a um fármaco anti-tumor de fórmula geral I,

b) contacto do conjugado anticorpo monoclonal-fármaco anti-tumor, com condições de redução endógenas e

c) cisão redutora do conjugado anticorno monoclonal-fármaco anti-tumor para libertar do conjugado o fármaco sob a forma livre.

C conjugado de acordo com a presente invenção node ser proporcionado rara utilização de acordo com o método cesta invenção rara tratar um hospedeiro, narticularmente um hospedeiro mamífero tal como, nor exemnlo um .aosnedeiro animal de exreriêr.cia, afectado ^or um tumor, sob a forma duma composição farmacêutica. A composição farmacêutica incorpora uma quantidade eficaz anti-tumor, isto é, uma quantidade inibidora do desenvolvimento dc· tumor, do conjugado . f ^f de acordo com a presente invenção e um veiculo aceitavel sob o ponto de vista farmacêutico e eventualmente excinien tes e agentes adjuvantes convencionais aceitáveis em farmáC componente anticorpo do imunoconjugado desta in venção inclui qualquer anticorpo que se ligue esrecificamen te a um antigénio associado a um tumor.

Exemplos destes anticorpos incluem, mas não estão que se ligam especificamente com os ar.ti limitados, aqueles to •a res. Ar.

soes anticorpos

preferência, dera ser produzidos mediante utilização de técnicas bera

0nr.ecidas (ver por exemplo, R.A. EeVeger

Eradication Of Murine Limnhoma And Melanoma Cells 3y Oí nt ibo dv

Oorarlexes, Immunological ?.ev, , PP.

29-45 (1992) de anticorpos policlonais específicos utilização em conjugados) e M. Yeh et

Ceil

Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibodies, Proc. Natl. Acad. Sei. 72, n. 2y27 (1979) e J.

P. Brown et al., Structural Characterization Of Human Mela noraa-Associated Antigen p97 With Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (n^ 2), pp. 539-546 (1981) (nrodução de an ticorpos raonoclonais específicos para tumores).

Os veículos farmacêuticos rodem ser vulgarmente líquidos para proporcionar composições líquidas ainda que as coravosiçbes líquidas se esperem ser preferidas devido a que as composições sólidas poderão apresentar uma absorção menor no trato gastrointestinal. Os conjugados de acordo cora esta invenção nodem apresentar-se sob a forma de conjugados solúveis estéreis ou sob a forma de composições que podem ser dissolvidas ou suspensas em água estéril ou outro meio líquido rara proporcionar soluções, suspensões e emulsões rara administração oral ou para administração narentérica.

f / oral, abrangem a agua, álcool, poliurorilenoglicol, nolieti ante s.

zação parentérica, incluem água para in.jectáveis, solução ii estéreis apropriados

Tampões apropriados para utilizar com veículos lítónica tamponada adequada incluem o ortcfosfato trissódico, carbonato de hidrogénio e alguns exemplos de agentes tampão

As composições farmacêuticas deverão conter uma quantidade de relo menos um conjugado de fórmula geral I ou uma mistura de um. ou mais dos referidos compostos com outros agentes anti-tumor. A quantidade eficaz anti-tumor de um com posto de fórmula geral I, pode variar ou ser ajustada largamente, dependendo da aplicação particular, forma, potência do conjugado especial utilizado e da concentração desejada do conjugado na composição. Geralmente, a quantidade do componente activo variará entre cerca de 0,5 e 90/ em peso do peso total da composição.

No uso terapêutico para o tratamento de um hospedeiro mamífero para, por exemplo, o hospedeiro animal de ex periêr.cia, afectado por um tumor, maligno ou benigno, os con jugados desta invenção deverão ser administrados numa quantidade eficaz para inibir o desenvolvimento do tumor, isto é, desenvolvimento dc tumor coonreuue. cuantidade sue inibe, o endida entre oerca de 0,1 e 15 mg/lg de ^eso corporal do animal e ror dia. Compreende-se que, na prática, a dose ore ferida do conjugado ooderá variar largamente derendendo das exigências do animal em tratamento, da ccmncsição a utilizar e da via de administração. Muitos faotores que modificam a acção do agente anti neo-plasico têm que ser considerados pelos especialistas na matéria relacionados com a rre sente invenção, ror exemplo, idade, reso e sexo do animal hosnedeiro; dieta, tempo de administração, velocidade de ex ereção; condição do hospedeiro, gravidade da doença e outros factores. A administração pode realizar-se simultaneamente ou periodicamente dentro da dose máxima tolerada. Cs valores para a administração óptima (ou aplicação) relativamente a um dado conjunto de condições, pode ser facilmente determina do pelos técnicos utilizando ensaios convencionais rara a de terminação de doses.

Os exemplos que se seguem são ilustrativos do âmbi. to e utilidade da presente invenção e não são concebidos como limitativos do âmbito da presente invenção. Salvo indicação em contrário, todas as partes e percentagens são expressas em peso e as temperaturas em graus Celsius. Os compostos e conjugados estão numerados com referência às figuras 1 e2.

Secção Experimental

Um anticorpo monoclonal purificado de rroteína A designado ror L6 (lgG2a), que reage com um antigenio glicolinido do carcinoma do pulmão humano (Hellstrom et al.,29c6)

foi fornecido meios Ers f'¹ <_L -j da

Ensaio de ligação de conjugado se

célv	las	CO	r 10
ra,	e s	cél	ulas
η ηη	_A:1	de	meio
dilu	lídO	o	1 ;

(Boehringer-Mannheim) durante 20 minutos

Coulter Enics se r.Ab diluída de um modo idêntico como um não conjugado que constituía o controlo de ligação positivo las A549 em 0,4 ml de meio comnleto de McCoys na proporç de 1000 células/cavidade em placas de cultura de tecidos de cavidades e em seguida deixaram-se a incubar durante a noite à temperatura de 37°C. As células foram lavadas com meio de REMI e adicionadas com conjugado em 0,4 ml de meio McCoys. A intervalos periódicos (1, 3, 4 e 24 horas), as cé lulas foram lavadas com RPMI para remover todo o onjugado não ligado ou o fármaco e adicionadas em meio recente mcOoys após o que se continuou a incubação à temperatura de 37°C du rante um total de 24 horas. As colónias foram coradas com violeta de cristal e contadas com um Optimax 40.10 Image Am lyser.

Processo C-eral

- Preraração de 1 e

de álcool rare-mercartobeizílico zilico, respectivamente, e 0,044 ml de riridina (2,c5 r-mole) em 1 ml de dioxano anidro durante um período de 3 minutos a uma solução homogénea de 0,032 ml (0,275 mmole) de cloroformato de triclorometilo em 0,5 ml de dioxano. Arós agitação durante 15 minutos, adicionou-se rapidamente uma solução de RíC (92 mg, 0,275 mmole) e trietilamina (0,153 ml,

1,1 mmole) em 4 ml de dioxano. Após 5 minutos evaporaram-se os dissolventes e submeteu-se a extracçãc uma solução de re síduo em cloreto de metileno com solução saturada de carbonato de hidrogénio e sódio, cloreto de sódio e secou-se sobre sulfato de magnésio. 0 produto foi purificado ror croma tografia rápida numa coluna de sílica de 2x20 ca rara rrimeiro separar o produto não polar com acetato de etilo a 30% em éter te petróleo (300 ml) e em seguida se eluir o carbamato coa metanol a 5% em clorofórmio. Os rrodutos 1 e 2, re_s pectivamente, foram obtidos sob a forma de um sólido azul amorfo que se dissolveu em 3 ml de cloreto de metileno e se

Z / adicionou, gota a gota, a 30 nil de eter de petroleo. Em cual quer dos casos 1 e 2, respectivamente, obteve-se um produto sólido com as propriedades seguintes:

MKC Dissulfureto de Carbamato de benzilo 1: rendimento 92% ró azul; PF 99° (dec); (rir-d^) <$ 1,95 (s,

3H,CH₃), 3,15 (s,3H,OCH₃), 3,4-4,2 (m,6H), 4,6-5,0 (m,2H), 5,20 (s,2H,ArCH₂), 5,6 (dd,lH), 6,9-7,8 (m,7H,ArH), 8,35-8,5 (m,lH,ArH); IR (KBr)^34O, 2920, 1890, 1600, 1552 cm’¹;

rer.di-

ie Caroamato

J O

3,07 (s,3H,OCH₃), 3,4-3,55 U,2H), 3,8-4,05 (m,3K),

4,6-5,0 (m,3H), 4,85 (s,3H), 5,35-5,70 (m,3H), 6,8-7,7 (m, 7H,ArH), 8,35 (d,lH,ArH); IR (KBr)O34C0, 1692, 1600, 1552 cm“\ uv/vis (OHPOH) λ máx 365 nm (lOg € = 1,32).

Preparação de ester de hidroxissuccinimida, 6

A uma solução de 125 mg (0,205 mmole) de 1 em 5ml de acetona adicionaram-se 18^11 (0,205 mmole) de ácido 3-mercatorroriónico. Adicionou-se mais uma quantidade de 18 ^.1 de ácido 3-mercatopror>iónico arós uma nora e comnletou-se a reacção arós um total de uma a uma nora e meia. 0 di_s solvente foi eliminado sob vazio e o resíduo rurificado ror cr-ima to grafia ranida (S1O2) usando-se como eluer.te metanol a 10/ em cl oreto de metileno. 0 ácido 2 Ooi utilizado na fa se seguinte sem mais purificação.

Agitou-se durante 3 horas uma solução de 0,186 mmole de ácido 5, 43 mg. (0,372 mmole) de N-hidroxissuccini mida e 77 mg (0,372 mmole) de diciclohexilcarbodimida em 2 ml de dimetilformamida anidra. 0 preciritado foi. filtrado e lavado com acetato de etilo. Após remoção do dissolvente sob vazio, 0 resíduo foi purificado por cromatografia prepa rativa em camada fina (SiO^), utilizando-se como eluente iso propanol a 10/ em cloreto de metileno. Obteve-se 0 éster de hidroxissuccinimida 6, sob a forma de um -produto sólido fino azul (26 mg ). ¹H-RMN ( 360 MHz , OBCl ) £1,75 (s, 3H, ,

2,85(s,4H, succinimida CH₂), 2,8-3,1 (m,4H), 3,81 (s,3H,OCH₃),

3,27-3^5 (m,3H), 3,7C (q,lH),

4,33 (t,lH),

4,40 (d,lH), 4,6-5,4 (m,6h), 7,4 (q,-H,Arl).

tilrroriónico com o descrito rara a síntese do rroduto 6 >e

Oroduto sólido azul wj.ro, na quantidade de 55 mg, tendc-se de 100 mg de 1.

£>1,68 da CHj

20H₃), 1,77 (s,3H,CH₃) (s,3H,OCH₃), 3,25-3,75 , succinimi7,40 (q

Preraração do éster de hidroxissuccinimida 10 éster de hidroxissucinimida 10 foi rreparado a partir de dissulfureto de piridilo 2_ e do ácido 2-mercarto-2-metilrroriónico como descrito para a síntese do rroduto 6. Obteve-se o rroduto 10, sob a forma de um rroduto solido azul na quantidade de 10 mg, tendo-se rartido de 71 mg de 2.

220 MHz, C101₃)£ 1,53 (s,3H,CH₃), 1,61 (s,3H,CH₃), 1,78 (s,3H»CH-)» 2,90 (s,4H, succinimida 0H_p), 3,20 (s,3H, C0H₃), 3,4-3,8 (m,6H), 4,21 (t,lH), 4,4C (d,lH), 4,50 (largo s, 4,90 (q,ln) , 5,2-5,4 (m,4H), 7,2-7,4 (m,2H,Arn),

7,80 (d,2H,ArH).

conjugados antic

Soluções dos esteres de hidroxissuccinimida _o, o, 10, (2,9 - 3,7 mmoles) em acetonitrilo foram adicionadas ao anticorpo 16 (2,61 mg/ml) em 1,5 ml de tampão de borato 50 mK de pH 8,5 que continha 100 mM de NaCl, à temreratura de

tal de 20 vezes) foram adicionados a porções iguais a intervalos de 10 minutos, encuar.to o éster de succinimida 6 foi adicionado (um excesso molar total de 10 vezes) em duas porções iguais aos 0 e 10 minutos. ApÓs -Q. minuoos, retirou -se o nrecinitado nor centrifugação e dializou-se as fases sobrenadantes durante a noite contra ·°Β3 à temperatura de 4°'O. Os produtos dializados foram misturados cuidadosamente que não estivesse ligado de modo covalente ao anticorpo. As livre. A composição dos conjugados obtidos deste modo foi determinada nela absorvância do fárma(£=21086) e pela absorvância do anticorpo a

280 nm (Abs 2tíC mg/ml

1,4) e se guintes: 11,

0,86

Ab (1,29 farmaco/Ab

0,70 mg/ml

Ab (1,05 fármaco/Ab

5,

13,

1,07 mg/ml Ab (1,65 mg total

5,25/1 antique o fármaco componente era um gruro álcool que continha etorosido estando o etoposido ligado ao radical

dissulfureto	de benzilo por uma ligação ror um gruro carbo-
nato, em vez	de uma ligação por um gruro carbamato, median-
te anlicação	substancialmente dos processos anteriores, nro

rorcionando-se primeiro um dissulfureto de benzil carbonato-etoposido por substituição do etoposido (162 mg, 0,275 mmo-

le) ror LliC e em seguida utilizar.do-se o dissulfureto cie ben zilcarbcna.to-etorosido resultante em vez do dissulfureto de

nas

do

Evidentemente que MIA, daunomicina, .adriamicina e outros fármacos contendo gruros amina, rodem ser utilizados em vez de MMO nos exemrlos anteriores.

Estabilidade dos Conjugados

Os conjurados 11-13 foram diluídos com igual volume de meio de desenvolvimento contendo REMI e soro de vitela fetal a 10%. As soluções foram incubadas à temperatura de 37°C. Fraoções de 0,25 ml foram introduzidas em colunas de rroteína A (0,25 ml) em intervalos periódicos e as colunas foram lavadas com PBS para eliminar qualquer produto não ligado. Os conjugados ligados foram eluídos com ácido acético 100 mfi contendo 0,5 ml de NaCl 150 mM e raridamente neutralizados. Para determinar as comrosições dos conjugados utilizou-se análise esrectrofotométrica.

Reacção de conjugados com ditiotreitol

Uma solução de conjugados anticorpo-fármaco, 11-13 em PBS, foi adicionada com ditiotreitol numa concentração fi nal de 0,2 mH. Arós 19 horas à temreratura ambiente, analisa, ram-se alíquiotas por EPLC, utilizando-se uma coluna de fase inversa (C-18) com 10 cm Whatman Partasil 5 OOS-3 e em segui da um sistema de gradiente: álcool metílico a 30% em acetato a 0,1% de nH6, rara álcool metílico a 95% durante 6 minutos; continuação durante 8 minutos, com um débito de 2 ml/min; controlado a 340 nm.

Resultados e Discussão

-18Precaração de conjugados

Os f

esteres de partir de mitomicina C niridil-dissulfuretos de benzilcarbamato 1 e 2 com um processo ie Tuas fases oue

envolveu a substituição do grupo dissulfureto	^cr um ácido
tiol-substituído, seguido de esterificação do	ácido com N-

-hidroxissuccinimida (fig. 2).

A reacção dos ésteres de hidroxissuccinimida com o anticorpo Ló a pH8,5 resultou na formação de conjugados de MMC-anticorro 11-13· Os conjugados apresentaram-se isentos de qualquer ligação não covalente com MMC e foram carac terizados por HPLC e UV/esnectrosconia visível. Foi possível ligar seis moléculas de MMC a 16 mediante a utilização dos métodos químicos descritos. Presumivelmente, os grunos amino do anticorpo deslocam os grunos ésteres de xhidroxissu ccinimida nos fármacos activados e as ligações amida formam -se entre o anticorpo e os derivados do fármaco.

libertação de Mitomicina C dos Conjugados

A capacidade de derivados de fármacos de dissulfu reto benzilcarbamato para sofrerem eliminação do fármaco anós a redução da ligação dissulfureto foi estudada com algum normenor (Senter supra). 0 mecanismo presumido para a reacção de fragmentação da ligação dissulfureto dos conjugados, 11-13, conduzirá à libertação de MNC.

conjugado 16-MMC, 11, foi reduzido com excesso de ditiotreitol e a reacção foi seguida nor HPLC. Observoueito na antes que imunotoxinas de cadeia de

ricina A com dissulfuimunoto?:inas não impedidas idênticas (Worrel, et al.,

1986).

de

37°C em solu.ções 1:1 de

PBS e meio de cone en do .PMI e soro fetal de

Vitela a 10/.

A quantidade de co que permaneceu ligada ao anticorpo apo s

11, 12 e 13 li estabilidade conjugada aumentada pode ser cor.se guida ror aumento do grau de impedimento da ligação dissulLigação e oitotcxicidade in vitro dos conjugados

Os conjugados foram ensaiados relativamente à sua capacidade para se ligarem a receptores nas linhas de células do carcinoma do pulmão A549·

A distribuição de células activadas por fluorescên cia indicou que todos os três conjugados se ligavam às oélulas exactamente como o anticorpo não modificado. Os métodos químicos utilizados para a ligação do fármaco não afectam aparentemente a avidez do anticorpo.

Ώ11 lir.áas de cos

-er.tou riva rente

co .	AÇO Ξ
cito	tóxí
(CI	50)
ras	de e

n!4 citotoxicas dos aros uma exnosição irr.nedido s, tétano antes eue

13, ·□ conjugados 11, 12 e 33 ano s no

55nM, loras ae contacto, foi de 50 nM. Portanto a conjugação química ore/ serva a actividade do íarmaco.

Endo, N. , Kato, Y. , Takeda, Y. , Saito, M., Vmemoto, 3·., Kishida, K., e Hara, T. In vitro cytotoxicity of a numam serum-albumin-mediated conjugate of methotrexate with ar.ti-UP.3-6 monoclone.1 antibody, Câncer Research -7 , 1076-1080 (1987).

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Peroentagem. de inibição da fomaç	SÓ : dos	de colcnias 11-1J a 10	de células j;g/ml de
A549 arós contacto com L6. Efeito do temno de	os conjuga exposição
Conjugado		cí /-	de inibição	da fomação
		de	colónias
(lOug/ml de anticorpo)	Ih	3h	6h	2 4h

15%	45%	1	o
12%	2 5%	0%	95%
10%	10%	0%	95%

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparaçao de conjugados de anticor pos monoclonais-fármacos com actividade antitumor de fórmula geral

S

-(CR-.R.) -C-NHAb

3 4 m na qual

D representa um radical de um fármaco antitumor comportando na sua estrutura principal um grupo funcional quimicamente reactivo, por meio do qual a estrutura principal se liga ao grupo dissulfureto benziloxicar bonilo, derivado de um grupo constituído por um grupo amino primário representado pela fórmula oeral um grupo amino secundário representado pela fórmula geral ^{e um} grupo álcool representado pela fórmula geral R^O-;

representa a estrutura principal do radical do fármaco citado antes quando D deriva do grupo que consiste num grupo amino primário, um grupo amino secundário e um grupo álcool, em que, no caso de um grupo amino secundário, quando e R₂ são independentes, R2 representa, independentemente do símbolo , grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada comportando 1 a 10 átomos de carbono e, eventualmente, substituinte(s) escolhido(s) entre 1 a 3 grupos alcoxi comportando 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogéneo; grupos fenilo comportando, eventualmente, substituinte(s) escolhido(s) entre 1 a 3 grupos alquilo com 1 a 3 átomos de carbono, 1 a 3 grupos alcoxi com 1 a 3 átomos de carbono ela 3 átomos de halogéneo; e um grupo fenil-alquilo comportando, eventualmente, um substituinte, em que o grupo fenilo, quando substituído, tem o significado definido antes para o grupo fenilo substituído e o grupo alquilo representa um grupo polialquilénico comportando 1 a 3 átomos de carbono;

e R₂ representam, considerados conjuntamente em um grupo funcional derivado de uma amina secundária, a estrutura principal do radical do fármaco, repre-26sentado pelo símbolo D citado antes, comportando um grupo divalente ligado por via química ao átomo de azoto que integra o grupo amino secundário; e e representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio, grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada comportando 1 a 10 átomos de carbono, tendo eventualmente, como substituinte (s) 1 a 3 grupos alcoxi com 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogéneo; ou um grupo fenilo tendo, eventualmente, como substituinte(s) grupos escolhidos entre 1 a 3 grupos alquilo comportando 1 a 3 átomos de carbono, 1 a 3 grupos alcoxi com 1 a 3 átomos de carbono ela 3 átomos de halogéneo; ou um grupo fenil-alquilo comportando, eventualmente, um substituinte em que o grupo fenilo, quando substituído, se encontra substituído tal como definido antes no caso do grupo fenilo substituído, e o grupo alquilo repre senta um grupo polialquilénico comportando 1 a 3 átomos de carbono;

m representa um número inteiro de 1 até 10; e

Ab representa um anticorpo monoclonal comportando na sua estrutura um grupo amino; e a orientação do grupo de fórmula geral

O j

- S - S - (CR,R,) - C - NHAb no núcleo fenílico do radical

J 4 m benzilcarbamato é escolhida entre a posição orto e a posição para, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um éster hidroxisuccinimídico de fórmula geral na qual D, R^, R^, R^> R^ e m têm os significados definidos antes, com um anticorpo monoclonal Ab comportando um grupo amino pendente, no seio de um meio dissolvente inerte.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como radical de fármaco representa do pelo símbolo D, um membro escolhido entre um grupo que consiste em fármacos que contêm um grupo amina primária e um grupo amina secundária.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se utilizar como radical de um fármaco representado pelo símbolo D, um membro escolhido entre mitomicina-C, mitomicina-A, daunomicina, adriamicina, aminopterina, actinomicina, bleomicina e os seus derivados.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como radical do fármaco representado pelo grupo D, um fármaco que contém um grupo álcool.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se utilizar como radical do fármaco representado pelo símbolo D, um etoposido.
6.- Método para a libertação em mamíferos no sítio de cé28 lulas tumorais que possuem níveis reforçados de agentes de redução endógenos, que incluem pelo menos um membro do gru po constituído por NADH, NADPH e glutationa, um fármaco com actividade antitumor comportando na sua estrutura principal um grupo funcional quimicamente reactivo, escolhido entre um grupo constituído por um grupo amino primário representado pe la fórmula geral R^NH-, um grupo amino secundário representado pela fórmula geral > ^ou um grupo álcool representado pela fórmula geral R^O-, em que R^ e R₂ têm os significados definidos antes na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes fases:

a) administração a um mamífero de uma quantidade an titumor eficaz de um profármaco antitumoral preparado de acordo com a reivindicação 1;

b) contacto do conjugado anticorpo monoclonal-fármaco antitumor obtido na fase a) sob condições de redução endóge nas em uma concentração compreendida entre 0,1 e 15 miligramas/quilograma de peso do corpo e por dia; e

c) libertação do fármaco a partir do conjugado sob a forma livre mediante cisão redutora do conjugado anticorpo monoclonal-fármaco antitumor.

J

28A endógenos , que incluem pelo menos um memoro do grupo constituí, do por NADH, NADPH e glutationa, um fármaco com actividade antitumor comportando na sua estrutura principal um grupo funci£ nal quimicamente reactivo, escolhido entre um grupo constituído por um grupo amino primário representado pela fórmula geral R^NH-, um grupo amino secundário representado pela fórmula geral , ou um grupo álcool representado pela fórmula geral R^O-, em que R^ e R₂ têm os significados definidos antes na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender as se guintes fases:

a) administração a um mamífero de uma quantidade antitumor eficaz de um profármaco antitumoral preparado de acordo com a reivindicação 1;

b) contacto do conjugado anticorpo monoclonal-fármaco antitumor obtido na fase a) sob condiçoes de redução endóg£ nas em uma concentração compreendida entre 0,1 e 15 miligra mas/quilograma de peso do corpo e por dia; e

c) libertação do fármaco a partir do conjugado sob a forma livre mediante cisão redutora do conjugado anticorpo monoclonal-fármaco antitumor.

RESUMO de em de

-29Processo para a preparação de conjugados de anticorpos monoclonais-fármacos com actividade antitumor

Descreve-se um processo para a preparação de conjugados anticorpos monoclonais-fármacos de fórmula geral ⁰ °

C rp -^s - ^s-KW.-™¹⁵ que o anticorpo estã ligado a um fármaco antitumor através uma ligação de um grupo dissulfureto de benzilcarbamato ou dissulfureto de benzilcarbamato como elemento de ligação. Também se descreve um método para a libertação de um fármaco com actividade antitumor a um mamífero no local das células tumorais mediante administração do conjugado de anticorpo monoclonal-fármaco.

0 processo consiste em fazer reagir um éster hidroxisuccinimídico de fórmula geral ° y

S-S-(CR,R.)

3 4 m z

na qual D, R^,R₂,R₃,R^ e m têm os significados definidos antes, com um anticorpo monoclonal Ab comportando no seio de um meio dissolvente inerte.