PT98545B - Processo para a preparacao de novos conjugados de antraciclinas utilizados como ligantes de agentes bioactivos - Google Patents

Processo para a preparacao de novos conjugados de antraciclinas utilizados como ligantes de agentes bioactivos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 98.545
REQUERENTE: FARMITALIA CARLO ERBA S.R.L., italiana, com sede em Via Cario Imbonati 24, 20159 Milão, Itália
EPÍGRAFE: Processo para a preparação de novos conjugados de antraciclinas utilizados como ligantes de agentes bioactivos”
INVENTORES: Francesco Angelucci,
Laura Bersani,
Michele Caruso,
Marina Ripamonti,
Daniela Ruggieri,
Antonino Suarato,
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Grã-Bretanha, 3 de AGosto de 1990, sob o NQ.: 9017024.2
INPI. MOD. 113 R F 18732
FARMITALIA CARLO ERBA, S.R.L.
PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE NOVOS CONJUGADOS DE
ANTRACICLINAS UTILIZADOS COMO LIGANTES DE AGENTES BIOACTIVOS
A presente invenção refere-se a conjugados de antraciclinas cora utilidade terapêutica com veículos, tais como anticorpos policlonais ou monoclonais ou proteínas ou pêptidos de origem sintética ou natural; a métodos para a sua preparação, a composições farmacêuticas que os contêm e à sua aplicação no tratamento de certos tumores de mamíferos. A presente invenção também se refere a novos derivados de antraciclina e à sua preparação.
Recentemente, têm sido sintetizadas muitas antraciclinas altamente citotóxicas. Por exemplo, as que contêm um núcleo morfolino ou morfolino substituído ligado à posição carbono 3' do radical açúcar mostraram uma actividade antitumoral promissora, em experiências de tumores murinos [ ver: Bioactive molecules. 55-101, vol. 6, editado por J. William Lown,
Elveiser, 1988 ] .
A presente invenção diz respeito a novos ligantes para a libertação de fármacos com utilidade terapêutica a partir de agentes bioactivos com o objectivo de melhorar a eficácia terapêutica dos fármacos e reduzir os seus efeitos tóxicos, após a administração a seres humanos. Mais particularmente, os agentes bioactivos que contêm fármacos contendo grupos hidroxilo primários ou secundários livres e pertencendo a classes terapêuticas tais como antibióticos, compostos antitumorais ou antivirais, conjugados com veículos como, por exemplo, anticorpos reactivos com uma população celular escolhida ou com proteínas, péptidos ou polímeros de origem sintética ou natural reactivos com tecidos receptores.
Cada fármaco que contêm pelo menos um grupo hidroxilo primário ou secundário liga-se por covalência a um veículo através de um adaptador e liga-se a esse adaptador através de uma ligação acetálica sensível a ácido na sua posição hidroxilo primário ou secundário. A ligação acetálica sensível a ácido do agente bioactivo da presente invenção permite a libertação do fármaco activo no meio externo ou interno ácido do tecido alvejado.
De acordo com a presente invenção, proporcionam-se conjugados de fórmula geral [A-O-W-Z] - T a (1_) na qual o grupo A-0- representa um resto de fármaco de fórmula geral A-O-H na qual -0-H representa um grupo hidroxilo primário ou secundário; a representa um número inteiro de 1 a 30; W representa um grupo de fórmula geral
CHa)te-C(O)na qual b representa um número inteiro de 1 a 4, B representa um grupo alquileno C e R e R representam,
1-3 1 2
cada ura, independentemente, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo, um grupo alquilo ou fenilo eventualmente substituído; Z representa um grupo espaçador; e T representa o radical de um veículo.
De preferência, a representa um número inteiro de 1 a 5. B representa um grupo (CH ) - apropriado. Na definição de R e R
1 2 halogéneo significa tipicamente cloro, bromo ou iodo e alquilo pode ser um grupo alquilo C como metilo ou etilo. Fenilo
1-4 substituído pode ser um grupo fenilo que comporta como substituinte um átomo de halogéneo ou um grupo alquilo e, neste caso, o halogéneo ou alquilo podem ser como definidos antes.
Grupos preferidos para Z são:
(i) -NH-;
(ii) -NH-(CH 2) -S-S- em que C representa um número inteiro de 1 a 4;
(iii) -NH-[C] -N=CH-em que:
d
a) d representa zero,
b) d representa 1 e [C] representa um grupo de fórmula geral -NH-CO(CH ) -O-(CH_ ) - em que e representa e 2 e um número inteiro de 2 a 4;
c) d representa um número inteiro de 1 a 4 e [C] representa um grupo de fórmula geral -(CH )^-0-(CH^) na qual f representa 1 ou 2, ou
d) d representa um número inteiro de 2 a 6 e [C] representa um grupo CH2 ;
(iv) um grupo de fórmula geral-NH~[C]d -NH-CO- na qual [C] e d têm os signidificados definidos antes;
(v) um grupo de fórmula geral -[DJ-NH- na qual [D] representa um grupo de fórmula geral -NH-[CH2]g-CO- na qual g representa um número inteiro de 2 a 6;
(vi) -[EJ-CO- na qual [E] representa um grupo de fórmula geral
-NH-(CH ) -NH- na qual g representa um número inteiro de £ 'g a 6, ou (vii) um grupo piperazinilcarbonilo de fórmula geral ch2-ch2 >N-COCH2-CH2
Na fórmula geral 1_ o fármaco de fórmula geral A-O-H representa de preferência um agente antitumoral pertencente à classe de antraciclinas como, por exemplo, a doxorrubicina, os seus derivados 3’-desamino-3'-morfolinilo em que o núcleo
1, 1 morfolino é eventualmente substituído na posição 2 com restos
como, por exemplo, 5-fluorodesoxiuridina ou arabinofuranosilcitosina (citarabina); derivados dos alcaloides da vinca como, por exemplo, 4-desacetilvinilblastina, ou outros agentes antitumorais como a podofilotoxina ou iludinas. Alternativamente, o fármaco de fórmula geral A-O-H pode ser um agente antiviral como, por exemplo, 3'-azido-3'-desoxi-timidina (AZT), bromovinildesoxiuridina (BVDU), 9-[(2-hidroxietoxi-)-metil]-guanina (aciclovir) ou 9-[(1,3-di-hidroxi-2-propoxi)-metil]-guanina (ganciclovir) ou um antibiótico como, por exemplo, a tienamicina ou novos derivados penémicos como, por exemplo, o ácido (5R, 6S)-2-carbomoiloximetil-6-[(IR)-hidroxietil]-2-penem-3-carboxílico e (5R,6S)-2-carbamoiloximetil-6-[ (IR)-hidroxietil]-2-penem-3-carboxilato de acetoximetilo, da Requerente.
Quando o grupo A-0- é derivado de uma antraciclina A-O-H, tipicamente o grupo A-0 é um grupo de fórmula geral
na qual R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou metoxi e um dos símbolos R e R representa um 11 12 átomo de hidrogénio e o outro representa um grupo hidroxi ou
R representa um átomo de hidrogénio ou de iodo e R 11 12 representa um átomo de hidrogénio e R representa um grupo amino ou um átomo de azoto encerrado no núcleo morfolino.
núcleo morfolino pode ser, por exemplo, um morfolino (MO),
3-ciano-4-morfolino (CM) ou 2-metoxi-4-morfolino (MM) em que o átomo de azoto se liga ao átomo de carbono na posição 3' do seguinte modo:
CH, (MO) (CM) (MM) radical veículo representado por T é habitualmente escolhido entre os anticorpos policlonais ou os seus fragmentos contendo um sítio de ligação a um antigénio, capaz de se ligar a um antigénio associado a um tumor; um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento contendo um sítio de ligação a um antigénio, capaz de ligação a um antigénio preferencial ou selectivamente expresso nas populações celulares dos tumores; um péptido ou proteína capaz de se ligar preferencial ou selectivamente a uma célula tumoral; e um veículo polimérico.
radical veículo, de preferência um radical veículo derivado de uma substância que possa ser representado pela fórmula geral T-[NH ] na qual x representa o número do grupo <6 X amino disponíveis para condensação, pode ser escolhido entre anticorpos policlonais originados contra antigénios associados a tumores; ou anticorpos monoclonais ligados a antigénios expressos preferencial ou selectivamente nas populações das células de tumor; ou de péptidos naturais ou recombinantes de proteínas ou factores de crescimento que se ligam preferencial ou selectivamente às células tumorais; ou veículos poliméricos naturais ou sintéticos como, por exemplo, a polilisina. A porção veículo pode também derivar de porções de veículos mencionados anteriormente, como, por exemplo, os fragmentos Fab ou F (ab') dos anticorpos, ou de porções dos péptidos mencionados antes ou de proteínas obtidas através de técnicas de recombinação de ADN.
São exemplos representativos dos anticorpos citados antes e das suas aplicações terapêuticas respectivas possíveis:
- anticorpos anticélulas T como o anticorpo T 101 [Royston, I. et al., J. Immunol.. 125 (1980) 725 ]
- anticorpo anti-CD5 como o anticorpo OKT1 (Ostho) ATCC CRL 8000 (leucemias linfocíticas crónicas)
- anticorpo do receptor antitrasferrina como o anticorpo OKT9 (Ortho) ATCC CRL 8021 (tumores ováricos e outros)
- anticorpo antimelanoma como, por exemplo, o anticorpo MAb
9.2.27 [Bummol, TF et. al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79 (1982) 1245 ] (melanomas)
- anticorpos marcadores anticarcinoma como, por exemplo:
- anti-CEA 1116NS-3d ATCC CRL 8019
- fetoproteína anti-alfa,l OM 3-1.1 ATCC HB 134 (também hepatomas)
- 791T/36 [Embleton, M.J. et.al., Br. J. Câncer, 43. (1981) 582] (também sarcoma osteogénico)
- Β 72.3 [patente de invenção norte-americana A-4.522.918 (1985)(carcinomas colo-rectais e outros tumores)
- anticorpo anticarcinoma ovariano como o anticorpo 0VB3
ATCC HB 9 147
- anticorpo anticarcinoma da mama como o anticorpo (antigénio HMGF) [Abond-Pirak, E - et. al., Câncer Res., 48 (1988) 3188]
- anticorpo anticarcinoma da bexiga como o anticorpo 1G3.10 [Yu, D.S. et.al., Eur. J, Urol, 13 (1987) 198].
São exemplos representativos dos factores de crescimento mencionados anteriormente e de proteínas de origem recombinante ou natural FGF, EGF, PDGF, TGF-a, α-MS, interleucinas, interferons, TNF, melanotropina (MSH), etc.
radical do veículo derivado de uma substância que pode ser representada pela fórmula geral T-[SH] , na qual XI representa x1 um número de grupos tiol disponíveis para condensação, de preferência derivados de anticorpos policlonais ou monoclonais tiolados que se obtêm utilizando, por exemplo, N-succinimidil-Sacetiltioacetato (SATA), N-succinimidil-3-(210
-piridiltio)-propionato (SPDP), D, L - homocisteína-tiolactona,
N-acetil-D,L-homocisteína-tiolactona ou 2-imino-tiolactona.
radical do veículo derivado de uma substância que pode ser representada pela fórmula geral T-[CHO] , na qual X2 representa x2 o número total de grupos formilo disponíveis para condensação, deriva de preferência de anticorpos policlonais ou monoclonais contendo um radical hidrato de carbono, preferencialmente localizado na região Fc, oxidado para a forma de grupos aldeído selectivamente por meio de métodos químicos ou enzimáticos, tal como se descreve na patente de invenção norte-americana A-4.671.958. Um veículo de fórmula geral T-[CHO] pode também x2 derivar da formilação ou da oxidação de veículos poliméricos apropriados ou da oxidação para grupos aldeído dos restos hidrato de carbono de glicoproteínas apropriadas.
radical do veículo derivado de uma substância que pode ser representada pela fórmula geral T-[COOH] , na qual X3 representa x3 o número total de grupos carboxilo disponíveis para condensação, deriva de preferência do ácido poliaspártico ou do ácido poliglutâmico ou de copolímeros sintéticos solúveis e biodegradáveis como, por exemplo, os derivados de N-(2- hidroxipropil)-metacrilamida (HMPA) com a fórmula de estrutura seguinte:
Μ. —η _ ι·ι»ιι t
CH] CHj 1
1 1
CHa ~C 'vila 1
1 CO 1 CO 1
1 NH IX]
1 CHa ) IP)
| CHOH
1 CHj
1— — X L— ——1
HMPA na qual [X] representa um grupo - Gly-Phe-Leu-Gly; ou um grupo de fórmula geral -HN- (CH^ ) -C0-; na qual n representa um número de 1 a 5; [P] representa ura grupo OH ou ura grupo de fórmula geral O-C^H, pNO .
4 2
X/Y (90/10 + 95/5 mole/mole %); peso molecular 10 000-40 000, de preferência 12 000 - 20 000 [ ver: J. Kopecek,
Biodegradation of polymers for biomedical use em I UP AC Macromolecules, H. Benoit & P. Rempp, Ed: 505 - 520 (1982) Pergamon Press. Oxford, Inglaterra] de copolímeros de poli(aminoácido) como, por exemplo, poli(GluNa, Ala, Tyr) ou peso molecular de 25 000 a 50 000 daltons que são úteis como veículos de fármacos alvejáveis para tecido pulmonar (em seguida) [R. Duncan et.al., ver Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 4., Julho 1989] ou de grupos carboxilo presentes naturalmente nos anticorpos monoclonais ou policlonais ou introduzidos quimicamente por tratamento do anticorpo com anidridos bifuncionais (por exemplo, com anidrido maleico).
Estrutura do copolímero poli (GluNa, Ala, Tyr) x:y:Z - 1:1:1
-N—Ç—C«
I I
H CH3 ^K3 COO“Na
N—C—(
I
H CH3
Η O
I I
N—C—C·
I I
H CH3
Φ
OH
A presente invenção proporciona também um processo para a preparação de um conjugado de fórmula geral X que consiste em condensar um derivado de fórmula geral.
A-O-W-OH (3) na qual A-0- e W têm os significados definidos antes, com uma substância ou substâncias capazes de proporcionarem o grupo espaçador referido representado pelo símbolo Z e um radical do veículo representado pelo símbolo T no referido conjugado de fórmula geral X, formando, assim, o conjugado de fórmula geral χ.
A condensação pode realizar-se através de um derivado activado, tal como um anidrido misto, uma azida ou um éster activado do derivado de fórmula geral 3., ou por reacção directa na presença de um agente de condensação como, por exemplo, a diciclo-hexilcarbodiimida. Um processo apropriado consiste em converter um derivado de fórmula geral 3, em um derivado activado de fórmula geral
A-O-W-L (4)
na qual A-O- e W têm os significados definidos antes e L representa um grupo de activação para se obter uma ligação amídica como, por exemplo, N-oxissuccinimido, o seu derivado solúvel na água N-oxissulfossuccinimido ou um grupo 2,4dinitrofenoxi, 2,3,4,5,6 - pentafluorofenoxi ou t-butoxicarboniloxi; e (i’ ) condensar o composto resultante de fórmula geral 4. com uma substância de fórmula geral T-[NH ] , definida antes para x
se obter ura agente bioactivo de fórmula geral 1. com ligações amídicas, ou (ii') condensar o composto de fórmula geral com um derivado tiol de fórmula geral NH -(CH ) -SH como, por exemplo, 22 2 c
-amino-etanotiol, na qual c representa 2, e condensar o composto resultante de fórmula geral
A-O-W-NH-(CH ) -SH (5) c
na qual A-0-, W e C têm os significados definidos antes, com uma substância de fórmula geral T-fSH] , definida anteriormente, para se obter um conjugado de fórmula geral 1. contendo ligação ou ligações dissulfureto; ou (iii') fazer reagir um composto de fórmula geral 4. com hidrazina, um derivado succínico ou di-hidrazido adípico ou um composto diamino e condensar o composto resultante de fórmula geral
A-O-W-NH-[CL-NH (6) d 2 na qual A-0-, W, [C] e d têm os significados definidos antes, com uma substância de fórmula geral T-[CHO] , definida anteriormente, para se obter um agente bioactivo de fórmula geral 1. contendo ligação ou ligações oxima.
Um processo útil consiste em (iv') condensar um composto de fórmula geral 6. descrita anteriormente, com uma substância de fórmula geral
T-[CO-L'] (7)
Y — que é derivada por uma reacção que envolve um veículo de fórmula geral T-[COOH] , definida antes e na qual y representa um
número inteiro de 1 a 30 e representa o número total de grupos carboxilo activados, T representa o radical do veículo no conjugado resultante de fórmula geral J, e L' representa um grupo hidroxi ou um grupo de activação para formar a ligação amida, eventualmente na presença de um agente de condensação, para se obter um conjugado de fórmula geral X na qual os grupos carboxilo activados presentes que eventualmente não reagiram podem ser extintos com uma amina aceitável sob o ponto de vista famacêutico como, por exemplo, l.-amino-2-propanol.
Outros processos úteis (ν') consistem em condensar um composto de fórmula geral 4. com um derivado amino de fórmula geral
-COOH, na qual g tem o significado definido antes, g
formando-se assim um derivado de fórmula geral
A-O-W- [ D ] -OH (_8) na qual A-O-, W e [D] têm os significados definidos antes; e eventualmente converter o composto de fórmula geral 8. num derivado activado de fórmula geral
A-O-W-[D]-L (9) h2n-(C^)
na qual A-O-, W, [D] e L têm os significados definidos antes; e condensar o composto resultante de fórmula geral 9. ou um composto de fórmula geral 8., na presença de um agente de condensação, com uma substância de fórmula geral T-[NH ] , definida antes, para x
se obter um agente bioactivo de fórmula geral 1..
Outros processos (vi1) consistem em fazer reagir um composto de fórmula geral 4. com um derivado amino de fórmula geral , na qual g tem o significado definido antes, para deste modo se formar um derivado de fórmula geral
A-O-W-[E]-H (10) na qual [E] tem o significado definido antes; ou (vii') fazer reagir um composto de fórmula geral 4. com piperazina para se formar um derivado de fórmula geral
A-O-W-[piperazina]-H (11) e condensar o composto de fórmula geral 10 ou 11. descritos anteriormente, com uma substância de fórmula geral J_, descrita anteriormente, para se obter um conjugado de fórmula geral 1.
Por exemplo, um método de activação para a conversão de um composto de fórmula geral 3. ou 8 num derivado de fórmula geral 4. ou 9., consiste em fazer reagir o composto de fórmula geral 2 ou I com N-hidroxissuccinimida ou com um seu sal sulfonato de sódio
3-substituído, solúvel na água, na presença de N,N'-diciclo-hexilcarcodiimida, no seio de um dissolvente como acetato de etilo ou a Ν, N—dimetilf ormamida . Neste caso, no composto de fórmula geral 4. ou 9_, L representa o residuo de fórmula geral.
L =-0-N na qual R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo
3.
sulfato de sódio.
Um método de activação para a conversão de veículos do tipo de fórmula geral T-[COOH] , em compostos de fórmula geral 7., consiste em fazer reagir esse veículo com p.-ni trof enol, na presença de Ν,N'-diciclo-hexi1carbodiimida, no seio de um dissolvente como, por exemplo, a dimetilformamida, representando
L', neste caso, um grupo de fórmula geral pNO C H 0-, ou com N2 6 5 etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-di-hidroquinona (EEDQ) [ver: B.Belleau et. al., JACS, 90 (1968) 1651] no seio de ura dissolvente como o tetra-hidrofurano ou a dimetilformamida, caso em que no composto de fórmula geral J_ L' representa um resto de fórmula geral
Outro processo consiste em fazer reagir um sal alcalino do veículo de fórmula geral T-[COOH] , como, por exemplo, um sal de sódio, com um halogeno-carbonato de alquilo, como, por exemplo um halogeno-carbonato de alquilo (C1_4 ), de preferência clorocarbonato de etilo (CnH_O - C0C1), no seio de um
Δ O dissolvente, como a água ou a dimetilformamida. Neste caso, no composto de fórmula geral 7. o resíduo representado por L' é um grupo -COOC H .
Os métodos de condensação para a preparação de conjugados de fórmula geral 1. iniciam-se a partir de um derivado de fórmula geral 3_ ou 8_ e de um veículo de fórmula geral T-[NH„] , £ X realizando-se em condições susceptiveis da formação de ligações covalentes do tipo araídioo e compatíveis com a estrutura do veículo. De acordo com a estabilidade química do veículo em dissolventes aquosos ou orgânicos, podem ser utilizados diversos procedimentos para a reaeção de acoplamento com compostos entermédios de fórmulas gerais 4., 5, 6. 9. 10 e
11. Para veículos sensíveis aos dissolventes orgânicos, as condições preferidas abrangem a aplicação de soluções aquosas tamponadas a pH compreendido entre 7 e 9,5, a temperaturas compreendidas entre 4® e 37° C, durante algumas horas até vários dias.
Os métodos para a preparação de conjugados de fórmula geral X pela condensação de um derivado de fórmula geral 5., com um veículo de fórmula geral T-[SH] , realizam-se em condições que incluem a aplicação de soluções aquosas tamponadas a pH compreendido entre 6 e 7, à temperatura de 4° C e durante algumas horas até vários dias.
Os métodos para a preparação de conjugados de fórmula geral
X por meio de condensação de um derivado de fórmula geral 6, com um veículo de fórmula geral Τ-[ΟΗΟ]χ2 > realizam-se sob condições capazes de criarem ligações covalentes do tipo oxima ou hidrazona e compatíveis com a estrutura do veículo. As condições preferidas incluem a utilização de soluções aquosas tamponadas a pH compreendido entre 4 e 7,5 a uma temperatura compreendida entre 4° e 37° C, durante algumas horas até vários dias.
Os métodos para a preparação de conjugados de fórmula geral
X, mediante a condensação de um derivado de fórmula geral 6_, 10 ou XI, com um veículo de fórmula geral T-fCO-L'] , realizam-se y sob condições capazes de criarem ligações cpvalentes do tipo amídico e compatíveis com a estrutura do veículo. As condições preferidas incluem o uso de soluções aquosas tamponadas a pH compreendido entre 7 e 9,5, a uma temperatura compreendida entre 4° e 37cC, durante algumas horas até vários dias.
Outras condições abrangem a utilização de dimetilsulfóxido ou dimetilformamida anidros, à temperatura ambiente durante 1 a 3 horas.
Aqui, a expressão durante algumas horas até vários dias pode referir-se a períodos de 4 horas até 5 dias.
Por exemplo, são condições apropriadas para a condensação entre compostos de fórmula geral 4. e 9. e anticorpos de fórmula geral T-[NH2]X : solução aquosa de fosfato de sódio O,1M e solução aquosa de cloreto de sódio a O,1M, a pH8, contendo um anticorpo monoclonal a lmg/ml, tratado com um excesso molar 30 vezes superior de uma solução a 10% (p/v) de 4 ou 9 em N,N-dimetilformamida, durante 24 horas, à temperatura de 20°C. 0 conjugado é purificado por filtração por gel numa coluna Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemical, Piscataway, N.Y), e eluição com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS).
Sao condições apropriadas para a ligação entre compostos de fórmula geral 5. e anticorpos com funções comportando grupos tiol: solução aquosa de acetato de sódio O,1M e solução aquosa de cloreto de sódio O,1M, a ph6, contendo um anticorpo monoclonal a 1 mg/ml, tratada com um excesso molar 30 vezes superior de uma solução a 5% (p/v) de 5. no mesmo tampão, durante 24 horas à o
temperatura de 4 C: Purifica-se o conjugado por filtração em gel do modo anteriormente referido.
São condições apropriadas para a ligação entre compostos de fórmula geral 6. e veículos de tipo Τ-[ΟΗΟ]χ2: solução aquosa de acetato de sódio O,1M e solução aquosa de cloreto de sódio Ο,ΙΜ, a pH compreendido entre 6 e 7, contendo um anticorpo monoclonal a 1 mg/ml, tratada com um excesso molar 30 vezes superior de uma solução a 5% (p/v) de no mesmo tampão durante 24 horas à temperatura de 20° C. Purifica-se o conjugado por filtração em gel, do modo descrito anteriormente.
São condições apropriadas para a condensação entre compostos de fórmulas gerais 6., 10 e 11 e um veículo activado de fórmula 7_: um dissolvente polar anidro como, por exemplo, a dimetilformamida, contendo 5 a 50 mg/ml do composto 6., 10 ou 11, tratado com uma quantidade equivalente de composto J_, durante 1 a 24 horas à temperatura de 20® C.
Os compostos de fórmula geral 3., assim como os compostos activados de fórmulas gerais 4,, 5, 6, 9, 10 e 11 são novos e, portanto, incluem-se no âmbito da presente invenção.
Os compostos de fórmulas gerais 3_, 5_, 6., 10 e 11 são utilizáveis como compostos intermédios e/ou agentes com actividade terapêutica. Mais particularmente, os compostos intermédios de fórmula geral 3. são utilizáveis como pró-fármaco de compostos de fórmula geral A-O-H, descrita anteriormente. Os derivados de fórmula geral 3, podem ser preparados pelos processos ilustrados no Esquema 1. Este processo consiste em condensar um fármaco de fórmula geral A-O-H com um derivado éter enólico comportando um grupo carboxilo bloqueado, como, por exemplo, um composto de fórmula geral
na qual B, b, R^ e R^ têm os significados definidos antes e R representa um grupo protector como, por exemplo, um grupo metilo ou etilo; e remoção do grupo protector do composto resultante.
Esquema 1
0-(CH2)bCOORx > A-O-C-O-{CHa)bCOOH
Sem limitação da presente invenção, as antraciclinas antitumorais representam fármacos hidroxilados apropriados (A-OH) para se obterem derivados bioactivos de fórmula geral 1..
Entre a classe das antraciclinas, representam compostos de escolha os derivados de fórmula geral (13. tais como, por exemplo, 3'-desamino-3'-morfolinilo , tais como 3'-desamino-3'-(4morfolinil)-doxorrubicina (13a) ou 3'-desamino-3'-(2-metoxi-4morfolinil)-doxorrubicina (13b) [consultar: E.M. Acton et al. , Morpholinyl Antracyclines, em Bioactive Molecules, 1988, vol.6, Ed. por J.W.Lown, Elsevier).
A conversão de antraciclinas de fórmula geral 13 a,b em derivados sensíveis ao ácido de fórmula geral 3., definida anteriormente, pode realizar-se mediante tratamento com um composto de fórmula geral 12. anteriormente definido, em que R representa um resíduo de um grupo tal como, por exemplo, um grupo etilo, preparado de modo descrito por J.A. Landgrebe et. al., em J. Org. Chem. , 4 3 (1975) 1244 por reacção de um composto apropriado comportando um grupo cetona, com diazoacetato de etilo. As condições preferidas para realizar a reacção de t
antraciclinas, assim como de outros compostos contendo grupos hidroxilo primários ou secundários com compostos de fórmula geral
12. incluem a utilização de um catalisador de ácido sulfónico, tal, como, por exemplo, o ácido p-toluenossulfónico ou o ácido canforassulfónico no seio de um dissolvente polar, como a dimetilformamida, à temperatura ambiente, durante algumas horas até um dia. 0 grupo carboxilo protegido do radical sensível ao ácido ligado a antraciclinas nos compostos de fórmula geral 2. é convertido num grupo carbonilo activado de compostos de fórmula geral 4. a partir dos quais os novos agentes bioactivos são preparados por acoplamento com veículos apropriados. Eventualmente, os derivados de antraciclina de fórmula geral 4. podem ser convertidos em derivados de fórmulas gerais 5., 6., 8., 9., 10 e 11 seguido de reacção com veículos apropriados para se obterem os novos agentes bioactivos de fórmula geral .1.
Também se pode fazer reagir fármacos utilizáveis como agentes terapêuticos, tais como os descritos anteriormente, com os compostos de fórmula geral 1 2 . do modo descrito para antraciclinas convertendo-se em agentes bioactivos para cura de certas doenças de mamíferos.
\
Os agentes bioactivos de fórmula geral X da presente invenção são utilizáveis como agentes terapêuticos uma vez que contêm uma ligação acetálica que liberta o fármaco original de fórmula geral A-OH, após hidrólise catalisada pelo ião hidrónio ou in vivo por cisão enzimãtica. Por exemplo, é bem conhecido o facto de os tumores malignos apresentarem uma alta taxa de glicólise comparativamente aos tecidos normais. Esta provoca um aumento na produção de lactato e, portanto, diminui o pH no tumor [consultar; H.M. Rauen et al., Z.Naturforsch, Teil B., 23. (1968) 1461 ].
Os conjugados obtidos de acordo com os métodos descritos, são caracterízados por diferentes métodos físico-químicos. Por exemplo, avalia-se a retenção do peso molecular original e ausência da formação de agregados, por técnicas cromatográficas de filtração por gel [Yu, D.S. et al., J. Urol. , 140. (1988) 415] com detecção simultânea e independente de antraciclina e anticorpos a diferentes comprimentos de onda e por métodos de electroforese sobre gel. A distribuição global de carga dos compostos obtidos avalia-se por métodos cromatográficos de permuta iónica. A concentração em antraciclina é avaliada por titulação espectrofotométrica em relação a uma curva de
calibração padrão, obtida a partir da antraciclina progenitora. A concentração em proteína avalia-se por ensaios colorimétricos, como, por exemplo, o ensaio com o ácido bicincónico [Smith, P.K. et al. , Anal. Biochem, , 150, (1985) 76] ou o ensaio de corante de Bradford [Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72. (1976) 248]. A retenção da actividade de ligação ao antigénio dos anticorpos, após os procedimentos de conjugação, avalia-se pelo método ELISA [Yu, D.S. et al., J. Urol.. 140. (1988) 415] e por métodos citofluorimétricos [Gallego, J. et al., Int. J, Câncer, 33 . (1984) 737]. A avaliação da retenção da citotoxicidade de conjugados em comparação com o fármaco progenitor é avaliada pelo teste de inibição da absorção de 3 H-timidina por células alvo, após um tempo de incubação suficientemente longo para se obter o efeito citotóxico máximo [Dillmann, R.O. et. al., Câncer Res. 48, (1988) 6097].
A citotoxicidade selectíva dos conjugados para uma linha de
células positiva ao antigénio, em comparação com uma linha de
células negativa ao antigénio, é avaliada por um teste de
inibição de absorção de 3H-tiraidina por linhas de células positivas ao antigénio versus linhas de células antigénio-negativas, após um curto período de incubação [Dillmann, R.O. et al., Câncer Res.. 48. (1988) 6096]. A sensibilidade do conjugado aos ácidos é avaliada pelos métodos cromatográficos anteriormente referidos, após incubação dos compostos em soluções tamponadas apropriadas.
Alternativamente, utiliza-se a marcação com radioactividade •i oc dos conjugados no radical anticorpo ( I) e/ou no radical antraciclina ( 14C) e por métodos analíticos de HPLC para a avaliação da estabilidade no plasma.
Actividade Biológica
Testou-se in vitro o composto 3' (preparado do modo descrito no Exemplo 1) contra células LOVO, (de adenocarcinoma de cólon humano) e células LOVO - DOXO - resistentes (LOVO/DX), em comparação com Doxorrubicina e 3'-desamino-3'-[2(S)-metoxi-4morfolinil]-doxorrubicina (13b). aplicando uma técnica de plaqueamento de uma célula após 4 horas de tratamento (ensaio de colónias). Calculou-se a concentração para a inibição de 50% (CI ) sobre curvas de concentração - resposta. Os dados apresentados no Quadro 1 demonstram que o composto 3' apresenta
maior çitotoxiçidade do que a doxorrubicina, tanto para as linhas de células sensíveis como para as resistentes, mas 15 a 20 vezes inferior à çitotoxiçidade do seu composto progenitor, de fórmula geral 13b.
composto 31 foi testado in vivo em murganhos CDF-1 contendo leucemia resistente a (388-doxorrubicina (p388/DX Johnson) comparando-se com doxorrubicina e com o composto 13b. Os dados apresentados no Quadro 2 demonstram que o composto 3 1 administrado por via intraperitoneal no dia 1 após a inoculação do tumor, a 0,22 mg / kg, é muito activo (T/C % 184).
Os conjugados de fórmulas gerais 1 ' . 1 1 ' . ¥ . 1V1 e 1V11 (preparados, respectivamente, nos Exemplos 5, 6, 9, 11 e 12), nos quais o resíduo do fãrmaco citotóxico
3'-desamino-3'-[2(S)-metõxi-4-morfoiinil]-doxorrubicina está ligado através de uma ligação sensível aos ácidos, foram testados in vivo em leucemia P388/DX Johnson em comparação com doxorrubicina e com o fãrmaco livre 13b. Os dados apresentados no Quadro 3 demonstraram que todos os novos compostos administrados por via endovenosa no dia 1 após a inoculação do tumor conservam actividade igual ao do fármaco livre de fórmula geral 13b. 0 índice terapêutico, expresso como a relação entre DL50 _100 e a dose óptima, é maior em todos os conjugados versus fármaco livre 13b.
50%
No Quadro 4 estão apresentados os t de libertação de 3'desamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorrubicina (13b) dos conjugados a pH3 (tampão de acetato, à temperatura de 37° C.
Quadro 1: Citotoxicidade após 4 horas de tratamento (D
Cl =ng/ml 50
Composto LOVO LOVO/DX I
DI50 (ng/ml) DI (ng/ml) 50
Doxorrubicina 60 2180 36.3
13b 16 33 2
3 1 2 240 745 3
(1) Cl - concentração que inibe o desenvolvimento de coló50 nias em 50% (2) IR = índice de resistência = (Cl LOVO/DX)/(CI LOVO)
50
Quadro 2: Actividade antitumoral sobre leucemia P388/DX Johnson.
tratamento no dia 1
Composto Dose (mg/kg) t/c^ Q. 0 Mortes por Toxici dade (4)
Doxorrubicina 10 100 0/10
15 100 0/10
22 100 10/10
13b 0.1 136 0/10
0.125 155 1/10
11 0.22 184 0/10
(3) Tempo médio de sobrevivência; % sobre controlos não tratados .
(4) Avaliado com base nos achados na autópsia nos ratos.
Quadro 3: Actividade antitumoral sobre leucemia P388/DX Johnson tratamento no dia 1
Composto Dose(5) (mg/kg) T/C(3) % Mortes por toxici dade (4)
Doxorrubicina 16.9 105 0/10
22 100 3/10
13b 0.076 177 0/28
0.09* 192 0/39
1' 0.16 144 0/10
0.25* 175 0/20
0.5 167 0/10
1' ' 0.16 156 0/10
0.25* 200 0/10
0.5 133 0/10
ll 0.25 111 0/10
0.5 144 0/10
1 * 205 0/20
1.25 200 0/10
vi
1_ 0.66 172 0/10
1 * 194 0/10
vil
1 0.66 * 233 0/10
1 177 0/10
* Dose óptima
Dose:(ng/kg) : expressa de acordo com o teor de 13b no
conjugado.
Quadro 4: Libertação de 13b de conjugados a pH5 e à temperatura de 37° C em tampão de acetato (7)
Composto (6) T50% (horas)
2,5
3,5 vm
3,5 (5)Tempo necessário para a libertação de 50% do fármaco livre 13b. Determinado por HPLC frente a uma curva de calibração. do composto 13b (7)Força iónica 0,05M.
efeito terapêutico dos compostos e o aperfeiçoamento da sua eficácia terapêutica em comparação com o composto progenitor foram avaliados em tumores humanos transplantados para modelos animais. Trataram-se murganhos nús portadores de enxertos de tumores humanos com doses apropriados de conjugados, de fármaco livre, de anticorpo e de uma mistura física de fármaco e anticorpo, em doses equivalentes, e registou-se o desenvolvimento do tumor comparando-se com os grupos de tratamento diferente.
Os conjugados foram formulados em composições farmacêuticas conjuntamente com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou com um diluente. Pode utilizar-se qualquer veículo ou dissolvente apropriado. Os veículos e dissolventes apropriados incluem a solução fisiológica de cloreto de sódio e a solução de dextrose de Ringer.
Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção sem contudo, a limitar.
Exemplo 1
Preparação de 14-0-(1-carboximetiloxi-ciclo-hexil)-31-desamino—3' — í 2 f S)-metoxi-4-morfolinil1doxorrubiclna [3’;
A-O-=13b’ . b=l, B=-[CH2]2-, R,=R2=H
preparou-se 0,68 g (1 mmole) de 31-desamino-3'-[2-(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorrubicina (13b) pelo processo descrito no pedido de patente de invenção britânica ns 8 928 654.6, dissolveu-se em ml de dimetilformamida anidra e tratou-se com
2-(ciclo-hexen-l-il)-oxi-acetato de etilo [12'; b=l, R =C Η ,
2 5
B=“(CH2)2~z R-|=R2=H] (6g, 32 mmoles) na presença de 50 mg de ácido p-toluenossulfónico fundido. Agitou-se a mistura durante 2 horas à temperatura ambiente, após o que se verteu sobre uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio e se extraiu com cloreto de metileno. Lavou-se a fase orgânica com água, secou-se sobre sulfato de sódio anidro e filtrou-se. Removeu-se o dissolvente sob pressão reduzida e cromatografou-se o resíduo numa coluna de ácido silícico rápida utilizando um sistema de eluição constituído por uma mistura de cloreto de metileno/metanol (98/2 em volume), para se obter o derivado éster (R3=C2H5) do composto 3' .
Tratou-se este composto com solução aquosa de hidróxido de sódio O,1N (200 ml), à temperatura de o’ C, sob agitação e na presença de azoto, durante 1 hora. Decorrido este tempo, ajustou-se o pH da mistura para 8,2 com ácido acético e extraiu-se com n-butanol. Lavou-se a fase orgânica com água, concentrou-se até um pequeno volume sob pressão reduzida e cromatografou-se sobre uma coluna de ácido silícico utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/metanol (80/20 em volume), para se obter o composto em título 3' (0,35 g rendimento de 43%) sob a forma do derivado ácido livre que se tratou com uma
quantidade equivalente de ácido clorídrico aquoso e se liofilizou.
CCF sobre placa de Kieselgel (Merck) F254 , eluição com cloreto de metileno/metanol (95/5 em volume), R =0,13
EM-FD:m/e 783 (M+) RMN1 H (200 MHz DMSO, 1,12 (d, J=6,4Hz, 3H, 2,0-2,7 (m, 7H, ÇH2-8 όθ ) :
Çí^-5'); 1,3-1,9 (m, , ÇH2-2';
O-CH2ÇH2-N, Q-CH-CH2 -N. H-3');2,94 (s,
2H,
ÇH2-10); 3,24 (S, 3H, CH-OÇH3) ; 3,40, 3,73 (two m, 2H, NC^ÇH2O); 3,57 (m, 1H, H-4' ) ; 3,91 (s, 2H, OÇH^COOH) ; 3,97 (s, 3H OÇH.3-4); 4,04 (dq, J=6,4, Ι,ΟΟΗζ, 1H, H-5’); 4,35 (dd, J=2,2, 5,2Hz, 1H, OÇH-OCH3); 4,61 (s, 2H, ÇH -14); 4,92 (m, 1H, H-7); 5,24 (m, 1H, H-l’); 7,6-7,9 (m, 3H, H-l, H-2, H-3); 13,20 (bs, 1H, OH-11); 14,02 (s, 1H, OH-6).
Exemplo 2
Preparação do derivado N-oxissuccinimidilo de 14-0-(1-carboximetoxi-ciclo-hexil)-31-desamino-3' — Γ 2(S)-metoxi-4-morfolinil]doxorrubicina [41; A-Q-=13b' . b=l, Rj =R2=H, ]
Preparou-se 0,2 descrito no Exemplo anidra, arrefeceu-se g (0,25 mmole), do composto 3' do modo 1, dissolveu-se em 8 ml de dimetilformamida até à temperatura de O4 C e tratou-se com
0,2 g de N-hidroxissuccinimida e 0,4 g de dicicloo hexilcarbodiimida. Manteve-se a mistura à temperatura de 0 C durante 2 horas e, em seguida, deixou-se retomar a temperatura ambiente durante a noite. Decorrido este tempo, concentrou-se a mistura até um pequeno volume sob pressão reduzida e cromatografou-se sobre uma coluna de ácido silícico rápida utilizando um sistema de eluição constituído por uma mistura de cloreto de metileno/metanol (97/3 em volume).Concentrou-se o eluído contendo o composto de título até à secura sob pressão reduzida e em seguida retomou-se o resíduo com acetato de etilo, filtrou-se e concentrou-se até um pequeno volume sob pressão reduzida. Finalmente, adicionou-se éter dietílico e recolheu-se 0, 130 g do composto 4' num funil de vidro, lavou-se com éter dietílico e conservou-se sob atmosfera de azoto.
CCF em placa de Kieselgel (Merck) F
254 sistema cloreto de metileno/metanol (95/5 em EM-TD: m/e 864 (M+) .
, eluição com o volume ) : =0,3 7
Exemplo 3
Preparação de 14-0-(1-hidrazinocarbonilmetiloxi-ciclo-hexil1 3'-desamino-f 2(S)-metoxi-4-morfolinilldoxorrubicina [âl, A-O-=13bl, b=l, B=-(CH2)2-, R,=^=h, a=0]
Prepararam-se 20 mg do composto 4 1 , de acordo com o método descrito no Exemplo 2, dissolveram-se em 5 ml de tetrahidrofurano e adicionou-se uma solução 1M de hidrato de
hidrazina em isopropanol. Manteve-se a mistura à temperatura de ô
C durante 70 minutos. Decorrido este tempo, adicionou-se cloreto de metileno e lavou-se a mistura por três vezes com água fria. Separou-se a fase orgânica, secou-se sobre sulfato de sódio anidro, filtrou-se e retirou-se o dissolvente sob vazio. Cromatográfou-se o resíduo numa coluna de ácido silícico com um sistema de eluição constituído por uma mistura de cloreto de metileno/metanol (99/1 em volume). Precipitaram 20 mg do composto 6 1 . com éter dietílico.
volume) R^=0,25
CCF em placa de Kieselgel (Merck) F , eluição com o sistema cloreto de metileno/metanol (95/5 em
EM-FD: m/e 797 (M+)
RMn'h (200 MHz, DMSO ) 6 :
IH, H-3'); 2,55 (m,
1,36 (d, J=6,6Hz, 3H, ÇH -5'); 1,4-1,7 (m,
2H, ÇH -2') 2,30 (m, 2H, ÇH -8); 2,50 (m,
4H, N-ÇH2~CH(OCH3), N-ÇH2 ~Cl·^-O); 2,98 (d, J=18,8Hz, IH, H-lOax)
3,22 (dd, J=l,0, 18,8Hz, IH, H-lOe); 3,39 (s, 3H, CH(OÇH.3));
3,55, 3,95 (two m, 2H, NC^Çt^O); 3,70 (m, IH, H-4’); 3,95 (m,
IH, H.-5 * ) ; 4,09 (s, 3H, ÇH-0-4); 4,10 (m, 2H, O-ÇH-CONH) ; 4,50 3 (m, IH, NCH2ÇH(OCH3) ) ; 4,67 (s, 2H, ÇH.214); 5,28 (m, IH, H-7);
IH, OH-6).
Exemplo 4
Preparação de 14—0— Γ1-(4-carboxl-l-n-butll)carbamoilmetiloxi-l-ciclo-hexil)1-3'-desamino-31 -í 2(5)-metoxi-4-morfolinil1-doxorrubicina [8', A-0-=13b1. b=l, B=(CH ) -, R =R =H,
C
^CO-NH-fc H^-COOH
8'
Dissolveram-se 15 mg (0,15 mmoles) de ácido *?Γ -amino-butírico em tampão de fosfato 0,05M de pH 7,6 (2,5 ml) e adicionaram-se 30 mg (0, 033 mmole) do composto 4J_, preparado do modo descrito no Exemplo 2, dissolvido em 3 ml de acetonitrilo. Manteve-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente e depois lavou-se a pH6 com ácido acético e extraiu-se com n-butanol. Separou_.se a fase orgânica e evaporou-se sob vácuo. Cromatografou-se o resíduo numa coluna de ácido silicico com uma mistura eluente de cloreto de metileno/metanol (95/5 em volume), para se obterem 20 mg do composto em título 8 ’ . CCF em placa Kieselgel (Merck) F eluição com o sistema cloreto de metileno/metanol (95/1 em volume Rf=0,55 EM-FD: m/e 884 (M+).
Exemplo 5
Preparação do conjugado de fórmula geral 1'-ácido poliglutâmico [li: A-0-=13b'. b=l, B=-(CH ) -, R =R =H, Z=NH-NH-CO-, a=2, 2 2 12
T=ácido poli-L-glutâmico].
Dissolveram-se ácido poli-glutâmico (85 mg) de peso molecular 2 000 a 15 000 (Sigma) e 20 mg do composto 6 1 . preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 3, em 2 ml de dimetilformamida e agitou-se durante 3 horas. Decorrido este período, adicionaram-se 25 mg de N-etoxilcarbonil-2-etoxi-1,2-di-hidroquinolina. Manteve-se a mistura sob agitação durante a noite e em seguida verteu-se numa mistura de éter dietílico e éter do petróleo. Recolheu-se o precipitado num filtro de vidro sinterizado, lavou-se com éter dietílico e dissolveu-se com uma solução aquosa a 2,5% de hidrogenocarbonato de sódio (8 ml). Fez-se passar a solução através de uma coluna de fase inversa RP-8, 40-63 pm (Merck) (30x1,8 cm) e eluiu-se com uma mistura de água e acetonitrilo de 0 a 20% de acetonitrilo. Liofilizou-se o eluído contendo o conjugado e, em seguida, recolheu-se num filtro de vidro sinterizado, lavou-se com metanol e éter dietílico para se obter o composto em título 11 (45 mg).
Por análise espectroscópica verificou-se que o conjugado continha 13% de raetoxi-morfolino de fórmula geral 13b.
<·
Exemplo 6
Preparação de poli-(GluNa, Ala, Tyr)-conjugado de fórmula geral 11 ' ri' ' : A-0-=13b’ . b=l, R^ =R =H, Z=-NH-NH-CO-, a=2, T=poli(GluNa, Ala, Tyr)].
Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 5, dissolveram-se poli(GluNa, Ala, Tyr) (1:1:1) de peso molecular 25 000 a 50 000 (Sigma) (60 mg) e 20 mg do composto 6 ' . preparado do modo descrito no Exemplo 3, em 2 ml de dimetil-formamida. agitou-se durante 3 horas e tratou-se com 25 mg de N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-di-hidroquinolina, para se obterem, após purificação por coluna de fase inversa, 35 mg do composto em título 1’1.
Exemplo 7
Preparação do conjugado anti-melanoma de fórmula geral 1''' [1''': A-O-=13b'. b=l, B=-(CH ) -, R=R=H, Z=-NH-, T=Epl]
U ά I Lã
Adicionou-se lentamente uma solução 10 M do composto 4'. descrito no Exemplo 2, em 37,5 mel de N,N-dimetil-formamida, a 1 ml de uma solução a 2 mg/ml de anticorpo Epl de anti-melanoma humano monoclonal de murganho purificado [Giacomini, P. et al.,
Int. J, Câncer, 39. (1978) 729 ] em Na P04 O,1M, NaCl O,1M, a pH8 e à temperatura ambiente, sob agitação.
Agitou-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente na ausência da luz e centrifugou-se. Isolou-se o conjugado por cromatografia de filtração por gel sobre uma coluna Sephadex-G25 (PD-10 Pharmacia) e eluição com PBS (Gibco, 10X, Cat. N.042 - 04200M) a pH7,3. Recolheu-se o peco excluído (1,5 ml) para determinação por via espectrofotométrica do teor de antraciclina, a 480 nm. Determinou-se o teor de proteína por uma análise colorimétrica de proteína (BCA Pierce). 0 conjugado continha 1,27 mg/ml de anticorpo com uma relação antraciclina/ /proteína de 11,4/1,0. 0 perfil físico-químico do produto foi determinado por filtração em gel HPLC (coluna Biosil SEC-250,
NaH PO O,1M, NaCl O,1M, a pH7,0) com detecção de comprimento de
4 onda duplo (280 a 480 nm) e por SDS-PAGE. Por HPLC detectou-se a formação de um agregado proteína de 50% que eluiu no volume vazio da coluna.
Por SDS-PAGE, localizarara-se a absorção de antraciclina e a reacção da proteína corada com coomassie a um peso molecular de
160 KD, confirmando a formação de ligações covalentes e indicando a formação de agregados devido a uma interacção não covalente.
Exemplo 8
Preparação do conlucrado anti-carcinoma de cólon de fórmula geral . iv [11V :A-O-=13bl, b=l, B=-(CH ) -, R =R =H, Z=-NH-NH-, T=B72,3 2 2 12
Tratou-se uma solução de anticorpo B72 invenção norte-americana A -4 522 918) a 2,6 O,1M, tampão de pH6 (1 ml), com 0,1 ml de uma 0,1M em água, à temperatura de 4C Ce ao Decorrida 1 hora, purificou-se o produto por filtração de gel sobre uma coluna Sephadex-G25 eluindo com tampão de NaH^ PO^ O,1M de pH6.
,3 (patente de mg/ml em NaH PO 2 4 solução de NalO v 4 abrigo da luz. cromatografia de (PD-10 Pharmacia)
Tratou-se a fracção que continha a proteína (1,7 mg, 2 ml) com 30 equivalentes molares de uma solução a 10% (p/v) do composto 6 1 . descrito no exemplo 3, no mesmo tampão. Decorridas 24 horas à temperatura de 37° C e na ausência da luz, purificou50 se a mistura reaccional do modo descrito no Exemplo 7.
O conjugado continha 0,48 mg/ml de anticorpo com uma relação antraciclina/proteína de 2,4/1 e era 85% monomérico.
Exemplo 9
Preparação do copolímero de 3-metacrilollamino-2-hidroxi-r)ropano e 14-0-{1-í4-(N-metacriloilglicilfenilalanil-leucilglicil)hidrazinoí-carbonilmetiloxí-ciclo-hexil}-3 ' -desamino-3 ' [2(S)-metoxi-4-morfolinil1doxorrubicina () [ lv: A-0-=13b', b=l, B=-(CH ) -, R =R =H, Z= -NHNH-CO-,
2 1 2
T=HPMA X=Gly-Phe-Leu-Gly].
a t
Dissolveu-se 0,58 g do copolímero HPMA[X=Gly-Phe-Lue-Gly, 4,2% (mole/mole) do teor P=0C H pNO ], preparado como descrito por J. 6 4 2
Kopecek et al., Makromol. Chem. 177 (1976) 2833-2848 por polimerização por radicais de 3-metacriloilamino-2-hidroxipropano e éster 4-nitrofenílico de N-metacriloíglicil52
-fenilalanilleucilglicina, em 15 ml de dimetilsulfóxido anidro com 0,1 g do derivado 6' preparado pelo processo descrito no Exemplo 3. Decorridos dois dias à temperatura ambiente, adicionou-se 0,4 ml de l-amino-2-propanol e verteu-se a mistura reaccional numa mistura a 1/1 (v/v) de acetona e éter dietílico (300 ml).
Recolheu-se o precipitado e resolveu-se em 10 ml de etanol a 95% em que precipitou o composto em título iv com 80 mi de acetona, recolhendo-se e lavando-se com éter dietílico.
Rendimento: 0,51 g
Teor de antraciclina (p/v %) calculado sob a forma de cloridrato de 3'-desamino-3'[2(S)-metoxi-4-morfolinil]doxorrubicina (13a): 3,3% relação molar em %, na fórmula geral jY (r:s:t) = = (95,7:0,79:3,52).
Exemplo 10
Preparação de 14-0-(1-piperazinocarbonilmetiloxi-ciclo-hexil)-31-desamino-f 2 (S)-metoxl-4-morfolinil1doxorrubicina
Dissolveram-se 100 mg do composto 4., preparado pelo processo descrito no Exemplo 2, era 20 ml de tetra-hidrofurano anidro, arrefeceu-se até à temperatura de 0 Ce adicionou-se uma solução de 50 mg de piperazina em 2 ml de tetra-hidrofurano anidro. Agitou-se a mistura reaccional à temperatura de 0° C
I
... y,'' i
durante 15 minutos, em seguida diluiu-se com 100 ml de cloreto de metileno e lavou-se por 3x50 ml de água. Separou-se a fase orgânica, secou-se sobre sulfato de sódio anidro removeu-se o dissolvente sob pressão reduzida. Cromatografou-se o produto impuro sobre uma coluna de ácido silícico utilizando como eluente um sistema constituído por uma mistura de cloreto de metileno/metanol (80/20 em volume). Precipitou-se o composto 11' (80 mg) com éter dietílico. CCF sobre placa de Kieselgel (Merck) ^254 eluição com o sistema cloreto de metileno/metanol (70/30 em volume) R =0,60.
FD-EM: m/z 868 (100, [M+H]+ )
RMN1 H (200 MHz, CDC13 ) :
1,35 (d, J=6,6Hz, 3H, 5'-CH ; 1,3-1,9 (m, 12H, 2'-ÇH ,
2 ciclohexane); 2,11 (dd, J=4,2, 14,6Hz, IH, 8ax-H); 2,3-2,5 (m,
5H, 8eq-H, 3’-H. 3''ax-H, 5''-CH2); 2,60 (dd, J=3,9, 11,2Hz,
IH, 3''eq-H); 2,86 (m, 4H, ÇH -NH-ÇH ); 3,00 (d, σ=18,9Ηζ, IH 2 2 lOax-H); 3,23 (dd, J=l,2, 18,9Hz, IH, 10 eq-H); 3,37 (s, 3H, ' '-OÇH ); 3,4-3,6 (m, 5H, CON(CH ) , 6''ax-H); 3,90 (m, IH, 3 2 2
6'1eq-H); 3,98 (q, J=6,6Hz, IH, 5'-H); 4,07 (s, 3H, 4-OCH^); 4,18 (s, 2H, o-CH^ CON); 4,48 (dd, J=2,5, 3,9Hz, IH, 2 ' 'eq-H); 4,79 (m,
2H, 14-CH ); 5,24 (m, IH, 7-H); 5,53 (m, IH, 1'-H); 7,37 (d, 2
J=7,7Hz, IH, 3-H); 7,76 (dd, J=7,7, 6,8Hz, IH, 2-H); 8,02 (d,
J=6,8Hz, IH, 1-H); 13,30 (bs, IH, 11-OH); 13,98 (S,1H,6-OH)
Exemplo 11
Preparação do copolímero de 3-metacriloilamino-2-hidroxipropano e 14-0- {1- [ 4- (N-metacriloilcrlicil) piperazin-lil 1 -carbonilmetiloxi-ciclo-hexill-3'-desamino-31 Γ 2(S)-metoxi-4vi morfolinilldoxorrubicina (1 ).
vi [1 : A-Q-=13b’. b=l, B=-(CH ) -, R=R =H,Z=[1,4-piperazinil]£ £ \ £
-CO-, T=HPMA e X=HN-CH2-co-].
Dissolveu-se em 2,2 ml de dimetilsulfóxido anidro, 0,42 g do copolímero HPMA [X=HN-CH -C0-7,6% (mole/mole)de teor de P=OC Η ,
6 4 pNO^], preparado de acordo com o método descrito por J. Kopecek et al., Mackgromol. Chem., 177, (1976) 833 - 2848], por polimerização por radicais de 3-metacriloílamino-2-hidroxipropano e éster 4-nitro-fenílico de N-metacriloílglicina e fez-se reagir com 0,07 g do derivado 111, preparado do modo descrito no Exemplo 10. Decorridas duas horas à temperatura ambiente, adicionaram-se 0,05 ml de 1 amino-2-propanol e verteu-se a mistura reaccional numa mistura a 1/1 (v/v) de acetona e éter dietílico (200 ml). Recolheu-se o precipitado e resolveu-se com
L·, ' ml de etanol a 95%, onde se precipitou o composto em título ivi cora 80 ml de acetona, recolhendo-se e lavando-se com éter dietílico.
Rendimento: 0,39 g.
Teor de antraciclina (p/p%) calculado sob a forma de cloridrato de 3'-desamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorrubicina (13a): 9,74%.
vi
Relaçao molar em % na formula geral 1 (r:s:t)=(92,4:2,15:
:5,45).
i
Exemplo 12
Preparação do copolímero de 3-metacrlloílamlno-2-hldroxl-propano e 14-0-íl-f 4-(6-metacriloílantinocaproinpiperazinlil1-carbonilmetiloxi-ciclo-hexil)-3'-desamino-3'-[2(5)-metoxi-4-morfolinilldoxorrubicina f 1V11) .
[1 : A-O-=13b', b=l, B=-(CH ) -, R =R =H 2 '2 1 2
Z=[1,4-piperazinil]-CO-, T=HPMA e X=HN-(CH ) -CO-].
5
Dissolveu-se em 3 ml de dimetilsulfóxido anidro 0,6 g do copolímero HPMA [X=HN-(CH ) - CO-, 5,3% (mole/mole %) de teor de 2 5
P=OC H pNO ], preparado do modo descrito por J. Kopecek et al.,
4 2
Makromol. Chem., 177. (1976) 2833 - 2848] por polimerização por radicais de 3-metacriloílamino-2-hidroxi-propano e N-metacriloílaminocapronato de 4«.nitrof enilo, e fez-se reagir com o derivado 11' (0,lg), preparado do modo descrito no Exemplo 10.
Decorridas 2 horas à temperatura ambiente adicionou-se 0,1 ml de l-amino-2-propanol e verteu-se a mistura reaccional em 200 ml de uma mistura a 1/1 (v/v) de acetona e éter dietílico.
Seguindo-se o procedimento descrito no Exemplo 11, recolheu-se 0,58 g do composto em título, XV11.
Calculou-se o teor de antraciclina (p/p%) sob a forma do cloridrato de 3'-desamino-32(S)-metoxi-4-morfolinil]doxorrubicina (13a); 9,2%.
Relação molar em % na fórmula geral _iV11 (r:S:t) = 94,7: :2,05:3,31)
Exemplo 13
Preparação do conjugado de Poli-Glu-Na,Ala,Tyr 1 (1:1:1) e
14-0-(l-ciperazinocarbonilmetiloxi-ciclo-hexil)-3’-desamlno[2(S)-metoxi-4-morfolinil1doxorrubicina (Γ11^ wiii [1 : A-0-=,13b' b=l, B=-(CH2)2-, =H,
Z=[lz4-piperazinil]-CO-, T=poli(Glu-Na,Ala, Tyr)].
Dissolveu-se em 5 ml de água 0,2 g de poli(GluNa, Ala, Tyr), (1:1:1) de peso molecular 25 000 - 40 000 (Sigma), sob agitação à temperatura ambiente. Precipitou-se o ácido livre correspondente na solução aquosa acidificando-se esta até pH3 com ácido clorídrico O,1N.
Recolheu-se 0,17 g de poli(Glu-OH,Ala,Tyr) e secou-se sob vazio, dissolveu-se em 10 ml de dirnetilformamida anidra e adicionaram-se 0,035g do composto (11'). 14-0-(1piperazinocarbonilmetiloxi-ciclo-hexil)-3'-desamino-[2-(S) -metoxi-4-morfolinil]-doxorrubicina, preparado como descrito no Exemplo 10, e 0,08 g de N-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-di-hidroquinoiina (EEDQ).
Decorridas 3 horas adicionou-se outra alíquota de EEDQ (0,08g). Agitou-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente e, em seguida, verteu-se sobre 300 ml de +eter etílico. Suspendeu-se o precipitado em 10 ml de água e tratou.se com 14 ml de hidróxido de sódio 0,lN, ajustou-se o pH da solução para 8,5 com ácido clorídrico 0,lN e fez-se passar através de uma coluna Sephadex—G10 . Liofilizou-se a solução aquosa obtendo-se 0,16 g do composto em título
Calculou-se o teor de antraciclina (p/p%) sob a forma de cloridrato de 3'-desamino-3'—[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorrubicina (13a): 10%.
Percentagem da relação molar no composto de fórmula geral í7111 (r:s:t:u), (31,33: 2,01; 33,33: 33,33).

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1.- Processo para a prçaração de conjugados de fórmula geral [A-O-W-Z] -T 1
    3.
    na qual
    A-0- representa um resto de um composto de fórmula geral -A-O-H na qual -0-H representa um grupo hidro xi primário ou secundário;
    a representa um número inteiro de 1 a 30;
    W representa um grupo de fórmula geral na qual b representa um número inteiro de 1 a 4;
    B representa um grupo alquileno C^-3 e e R2 representam, cada um, independentemente, um áto mo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo ou fenilo eventualmente substituído;
    Z representa um grupo espaçador; e T representa o radical de um veículo, caracterizado pelo facto de se condensar um derivado de fórmula geral
    A-O-W-OH 3 na qual
    A-0- e W tem os significados definidos antes, com uma substância ou substâncias capaz ou capazes de fornecer o referido frupo espaçador representado pelo símbolo Z e o radical de um veículo representado pelo símbolo T, para se formar o conjugado pretendido.
  2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar a condensação através de um derivado activado do derivado de fórmula geral 3 definido na reivindicação 1 ou através de uma reacção directa na presença de um agente de condensação.
  3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se converter um derivado activado de fórmula geral
    3, definido na reivindicação 1, em um derivado activado de fórmula geral
    A-O-W-L 4 na qual
    A-o- e W têm os significados definidos antes na reivindicação 1, e
    L representa um grupo activador capaz de formar uma ligação amida, e
    (i')de se condensar o composto resultante de fórmula geral 4, definida antes, com uma substância de fórmula geral T-[NH9] na qual T representa o radical de um veículo e x representa o número de grupos amino disponíveis para condensação, ou (ii') de se condensar o composto resultante de fórmula geral
  4. 4, definida antes, com um derivado de um tiol de fórmula geral NH2-(CH2)cSH na qual c representa um número inteiro de 1 a 4 e de se condensar o composto resultante de fórmula geral
    A-O-W-NH-(CH2)c-SH 5 na qual A-O-, W e c têm os significados definidos antes, com uma substância de fórmula geral Τ-[δΗ]χ^ na qual T tem os significados definidos antes e xl representa o número de grupos tiol disponíveis para condensação, ou (iii') de se fazer reagir um composto de fórmula geral 4, definida antes, com hidrazina, um derivado succínico ou adípico de di-hidrazida ou um composto diamino e de se condensar o composto resultante de fórmula geral . A-O-W-NH-[C]d-NH2 g na qual A-0- e W têm os significados definidos antes e (a) d representa zero; (b) representa o número inteiro 1 e [C] representa um grupo de fórmula geral -NH-CO(CH2)e-CO-NH- na qual e representa um número inteiro de 2 a 4; (c)d representa um número inteiro de 1 a 4 e [C] representa um grupo de fórmula geral
    -(CH2)f-O-(CH2)f“ na qual f representa o número inteiro 1 ou 2; ou (d) d representa um número inteiro de 2 a 6 e [C] representa um grupo CH2, com uma substância de fórmula geral Τ-[ΟΗΟ]χ2 na qual T representa o radical de um veículo e x2 representa o número de grupos formilo disponíveis para a condensação.
    4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto (iv1) de se condensar um composto de fórmula geral 6, preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 3, com uma substância de fórmula geral
    T-[CO-L’] 7 y Z na qual T- representa o radical de um veículo, y representa um número inteiro de 1 a 30 e consequentemente representa o número total de grupos carboxilicos no radical do veículo e L' representa um-grupo hidroxi ou um grupo activador que permite a ligação amídica, eventualmente na presença de um agente de condensação.
  5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto (ν') de se condensar um composto de fórmula geral 3, definida na reivindicação 1, com um derivado amino de fórmula geral ^N-tCELjlg-COOH na qual g representa um número inteiro de 2 a 6, para se obter um composto de fórmula geral
    A-O-W-[D]-OH 8 na qual A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1 e [D] representa um grupo de fórmula geral -NH-[CH? ] -CO- na qual g representa um número inteiro de 2 a 6; de se converter, eventualmente, o composto resultante de fórmula geral 8 em um derivado activado de fórmula geral
    A-O-W-[D]-L 9 na qual A-0-, W e [D] têm os significados definidos antes e L re68 presenta um grupo activador para se obter uma ligação amídica; e de se condensar o composto resultante de fórmula geral 9, definida antes, ou o composto de fórmula geral 8, também definida antes, ns presença de um agente de condensação com uma substância de fórmula geral T-CNH^] definida na eivindicação 3.
  6. 6.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto (vi') de se fazer reagir um composto de fórmula geral 4, definida na reivindicação 3, com um derivado amino de fórmula geral ^N-(, na qual g representa um número inteiro de 2 a 6, para se obter um derivado de fórmula geral
    A-O-W-[E]-H 10 na qual A-0 e W tem os significados definidos na reivindicação 1 e [E] representa um grupo de fórmula geral -NH-(CH?) -NH-, na qual g representa um número inteiro de 2 a 6, ou (vii1) de se fazer reagir um composto de fórmula geral 4, definida na reivindicação 3, com piperazina para se obter um derivado de fórmula geral
    A-O-W-[piperazina]-H 11 e de se condensar um composto de fórmula geral 10 ou 11, definidas antes, com uma substância de fórmula geral 7 definida na reivindicação 4.
  7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como composto inicial de fórmula geral 3 a 14-0-(l-carboximetiloxi-ciclo-hexil)-3’-desamino-3’-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicina.
  8. 8. - Processo para a preparação de compostos iniciais de fór mula geral
    A-O-W-OH 3 na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se condensar um composto de fórmula geral
    A-O-H na qual
    A-0- tem os significados definidos na reivindicação 1, com um composto de fórmula geral
    CH3)teCODRx na qual
    B, b, R^ e R2 t®m os si§nificados definidos na reivindicação 1 e
    3 representa um grupo protector, e de se remover o referido grupo protector do composto resultante.
  9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se utilizar como composto inicial de fórmula geral 4 a N-oxisuccinimidil-14-0-(1-carboximetiloxi-ciclo-hexil)-3’-desamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinilJ-doxorubicina.
  10. 10. - Processo para a preparação de compostos iniciais de fórmula geral
    A-O-W-L- 4 na qual
    A-O- e W têm os significados definidos na reivindicação 1 e
    L representa um grupo activador capaz de formar uma ligação amida, caracterizado pelo facto de se converter um derivado de fórmula geral
    A-O-W-OH 3 na qual
    A-O- e W tem os significados definidos na reivindicação 1, no composto pretendido.
  11. 11.- Processo para a preparação de compostos intermédios de fórmula geral
    A-O-W-NH-(CH2)c-SH 5 na qual
    A-0-, W e c têm os significados definidos na reivin dicação 3, caracterizado pelo facto de se converter um derivado de fórmula geral
    A-O-W-OH 3 na qual
    -A-0 e W têm os significados definidos antes, em um derivado activado de fórmula geral
    A-O-W-L 4 na qual
    A-0 e W têm os significados definidos antes e L representa um grupo activador capaz de formar uma ligação amida, e
    de se condensar o composto resultante de fórmula geral 4 com um tiol de fórmula geral nh2-(ch2)c-sh na qual c tem os significados definidos na reivindicação
    3.
  12. 12.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se utilizar como composto intermédio de fórmula geral 6 a 14-0-(1-hidrazinocarbonilmetiloxi-ciclo-hexil)-3'-desamino-3 '-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicina.
  13. 13.- Processo para a preparação de compostos intermédios de fórmula geral
    A-O-W-NH-[C]d-NH2 6 na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1 e [C] e d têm os significados definidos na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se converter um composto de fórmula geral A-O-W-OH 3 na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1, em um derivado activado de fórmula geral A-O-W-L- 4 na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1 e
    L representa um grupo activador capaz de formar uma ligação amida, e
    de se fazer reagir o composto resultante de fórmula geral 4 com hidrazina, um derivado succínico ou adípico de di-hidrazida ou um composto diaminado.
  14. 14,- Processo para a preparação de compostos intermédios de fórmula geral
    A-O-W-[D]-L g na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1 e [D] e L têm os significados definidos na reivindica ção 5, caracterizado pelo facto de se condensar um composto de fórmula geral
    A-O-W-OH 3 na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1, com um derivado amino de fórmula geral
    H0N-[CH0] -COOH
    2 2 g na qual g tem os significados definidos na reivindicação 5 para se obter um composto de fórmula geral
    A-O-W-[D]-OH 8 na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1 e
    D tem os significados definidos na reivindicação 5, e de se converter o composto resultante de fórmula geral 8 no composto pretendido.
  15. 15.- Processo para a preparação de compostos intermédios de fórmula geral
    A-O-W-[E]-H IQ ou A-O-W-[piperazina]-H H em que
    A-0 e W têm os significados definidos na reivindicação I.e [E] tem os significados definidos na reivindicação 6, caracterizado pelo facto (a) para a preparação de compostos de fórmula geral 10, de se fazer reagir um composto de fórmula geral
    A-O-W-L 4 na qual
    A-0- e W têm os significados definidos na reivindicação 1, com um derivado de fórmula geral
    H2N-(CH2)g-NH2 na qual g tem o significado definido na reivindicação 6, ou (b) para a preparação de fazer reagir um composto piperazina.
    compostos de fórmula geral 11, de se de fórmula geral 4 definida em (a) com
  16. 16.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepa ração de conjugados de fórmula geral 1 na qual o radical definido por A-0- deriva de uma antraciclina de fórmula geral A-O-H, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais corres pondentemente substituídos.
  17. 17.- Processo de acordo com a reivindicação 16, para a preparação de conjugados de fórmula geral 1 na qual o radical definido por A-0- representa um grupo de fórmula geral na qual R-^θ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou metoxi, um dos símbolos R^^e ^12 rePresenta 11111 átomo de hidrogénio e o outro representa um grupo hidroxi ou R^ representa um átomo de hidrogénio ou de iodo e R^ representa um átomo de hidrogénio, e R^^ representa um átomo de azoto incluso no núcleo morfolino ou um grupo amino, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
  18. 18.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, para a preparação de conjugados de fórmula geral 1 na qual a representa um número inteiro de 1 a 5, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
  19. 19. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, para a preparação de conjugados de fórmula geral 1 na qual B representa um grupo caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
  20. 20. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, para a preparação de conjugados de fórmula geral 1 na qual Z representa um grupo;
    (i) -NH-;
    ou um grupo de fórmula geral;
    (ii) - NH-ÍCH^c-S-S- na qual c representa um número inteiro de 1 a 4;
    (iii) -NH-[C]d-N=CH- na qual (a) d representa zero, (b) d representa o número inteiro 1 e [C] representa um grupo de fórmula geral - NH-CO(CH2)e-CO-NH- na qual e representa um número inteiro de 2 a 4, (c) d representa um número inteiro de 1 a 4 e [C] representa um grupo de fórmula geral - (CH2)£-0- (C^)£- na qual f representa o número inteiro 1 ou 2, ou (d) d representa um número inteiro de 2 a 6 e [C] representa um grupo CH2;
    (iv) -NH-[C]d-NH-C0- na qual [C] e d têm os significados definidos antes;
    (v) -[D]-NH- na qual [D] representa um grupo de fórmula geral -NH-[CH9] -CO- na qual g representa um número inteiro de 2 a 6;
    (vi) -[E]-CO- na qual [E] representa um grupo de fórmula geral
    -NH-(CH?) -NH- na qual g representa um número inteiro de 2 a 6; ou z g (vii) o radical piperazinilcarbonilo de fórmula
    C0caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
    te
  21. 21. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se escolher o veículo representado pelo símbolo T entre um anticorpo policlonal, ou um seu fragmento que inclui um sítio de ligação ao antigénio, capaz de se ligar a um antigénio associado a um tumor; um anticorpo monoclonal, ou um seu fragmento que inclui um sítio de ligação ao antigénio, capaz de se ligar a um antigénio preferencialmente ou selectivamente expresso nas populações de células tumorais; um péptido ou uma proteína capaz de se ligar preferencialmente ou selectivamente a uma célula tumoral; e um veículo polimérico.
  22. 22, - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se escolher o veículo representado pelo símbolo T entre um anticorpo anti-célula T, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-receptor da transferrina, um anticorpo anti-melanoma, um anticorpo anti-marcador de um carcinoma, um anticorpo anti-carcinoma do ovário, um anti-carcinoma mamário ou um anticorpo anti-carcinoma da bexiga.
  23. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se utilizar, como veículo representado pelo símbolo T, um factor de crescimento.
  24. 24, - Processo para a preparação de composições farmacêuticas com acção terapêutica, caracterizado pelo facto de se associar
    V uma quantidade efectiva de um conjugado, como ingrediente activo, preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 16 a 23, com um veículo ou um diluente aceitável em farmácia,
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