JP2740841B2 - 新規なリンカーを有するアントラサイクリン・イムノコンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents

新規なリンカーを有するアントラサイクリン・イムノコンジュゲート及びその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は新規なアントラサイクリン・イムノコンジュ
ゲート（immunoconjugates〔免疫学的結合体〕）及びそ
の製造方法に関する。より特には、本発明は絶滅すべき
対象に選ばれた細胞集団に対して反応性の抗体から成
り、而して抗体がその構造に共有結合的にリンクしてい
る複数個の細胞阻害性アントラサイクリン分子を有して
いることを特徴とするイムノコンジュゲートに関する。
各アントラサイクリン分子はリンカーアームを介して抗
体にコンジュゲートしており、アントラサイクリンは、
アントラサイクリンの13−ケト位置の（酸の作分で分裂
する）酸感受性アシルヒドラゾン結合を介して、そのリ
ンカーに結合している。本発明の好ましい態様は、アド
リアマイシンが13−ケト位置のアシルヒドラゾン結合を
介してリンカーアームに付着しているアドリアマイシン
・イムノコンジュゲートに関する。リンカーは、イムノ
コンジュゲートへの抗体付着部分として、ジスルフイド
又はチオエーテル結合を更に有している。更に本発明に
よれば、新規なアントラサイクリンのアシルヒドラゾン
誘導体が合成され、本発明のイムノコンジュゲートの製
造に用いられる。
本発明のイムノコンジュゲートの酸感受性のアシルヒ
ドラゾン結合は、標的細胞の酸性の外因性又は内在的環
境で、イムノコンジュゲートからアントラサイクリンの
放出を可能にしている。本発明のイムノコンジュゲート
及び方法は従つて、疾病例えば癌及び他の腫瘍、非細胞
破壊性ウイルス又は他の病原体的感染、及び自己免疫性
疾患の治療で、選ばれた細胞集団の選択的滅殺用の抗体
媒介医薬供給システムで有用である。
＜従来の技術及び発明が解決しようとする課題＞ アントラサイクリンは細胞阻害活性（細胞毒性）を有
する抗生物質化合物である。研究結果からアントラサイ
クリンは１）この薬の分子が細胞のDNA中にインターカ
レーションしてDNA依存性の核酸合成を阻害する;2）こ
の薬が遊離基を産出し、これが次に細胞の巨大分子と反
応して細胞を損害させる；又は３）この薬の分子と細胞
膜との相互作用を含めた多数のさまざまな機構で細胞を
滅殺するように作用することが示されている〔例えば、
C.Petersonet al.,“Transport and Storage of Anthra
cyclines in Experimental Systems and Human Leukemi
a",Anthracycline Antibiotics in Cancer Therapy,F.
M.Muggia et al.（ed.s）.132（Martinus Nijhoff Publ
ishers 1982）；及び、N.R.Bachur,“Free Radical Dam
age"id.pp.97−102参照〕。その細胞阻害能からアント
ラサイクリンはさまざまの癌例えば白血病、乳癌、肺
癌、卵巣腺癌、及び肉腫の治療に用いられている〔例え
ば、P.H.Wiernik,“Current Status of Adriamycin and
Daunomycin in Cancer Treatment",Anthracyclines：C
urrent Status and New Developments,S.T.Crooke et a
l.（eds.）,pp.273−94（Academic Press 1980）参
照〕。広く用いられているアントラサイクリンにはアド
リアマイシンとダウノマイシンがある。
絶滅すべき対象に選ばれた細胞集団がきまつている新
生物及び他の疾病の治療でこれらの化合物が有用である
が、その治療上の効能がしばしばその投与に関連する用
量に依存する毒性によつて制限される。例えば腫瘍の治
療では骨髄抑制と心筋毒性が典型的な有害な副作用であ
る〔S.T.Crooks,“Goais for Anthracycline Analog De
velopment at Bristol Laboratories",Anthracyclines:
Current Status and New Developments,supra,p.11参
照〕。従つて腫瘍の治療では腫瘍に付随する抗原に対抗
する抗体にアントラサイクリンを結合してこれらの化合
物の治療上の効能を改善する試みが行なわれている。こ
の方法で薬を腫瘍部位に供給又は“集中し”体内の正常
細胞へのその有害な副作用を低減できる。腫瘍に付随す
る抗原に対する多クローン性又は単クローン性抗体と結
合したアントラサイクリン、アドリアマイシン（ADM）
又はダウノマイシン（DAU）は当業者に知られている
〔例えば、J.Gallego et al.,“Preparation of Four D
aunomycin−Monoclonal Antibody 791T/36Conjugates W
ith Anti−Tumour Activity",Int.J.Cancer,33,pp.737
−44（1984）及びR.Arnon et al.,“in Vitro and in V
ivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin With Anti
−Tumor Antibodies",Immunological Rev.,62,pp.5−27
（1982）参照〕。
アントラサイクリンを抗体に付着させるのに最も多く
用いられる方法はアントラサイクリンのアミノ糖部分の
連鎖（結合）を利用することである。例えばアミノ糖を
過沃素酸ナトリウム処理で酸化して、シツフ塩基生成に
よつて抗体上のリシン残基に直接付着させる〔例えば、
E.Hurwitzet al.,“The Covalent Binding of Daunomyc
in and Adriamycin to Antibodies,With Retention of
Both Drug and Antibody Aetivities",Cancer Res.,35,
pp.1182−86（1975）参照〕。別の方法ではアントラサ
イクリンのアミノ酸の抗体のカルボキシル基へのカルボ
ジイミド媒介結合を介してアントラサイクリンを抗体に
結合する〔例えば、E.Hurmitz et al.,supra参照）。そ
してアントラサイクリンのアミノ酸と抗体上のアミノ基
のグルタルアルデヒドを用いた架橋結合でアントラサイ
クリンを抗体にリンクすることもできる〔例えば、M.Be
lles−Isles et al.,“in Vitro Aotivity of Daunomyc
in−Anti−Alpha−Fetoprotein Conjugate on Mouse He
patoma Cells",Br.J.Cancer.41,pp.841−42（1980）参
照〕。然し、抗体への結合でアントラサイクリンのアミ
ノ糖部分を修飾したイムノコンジュゲートについての研
究はコンジュゲートした薬（アントラサイクリン）の細
胞阻害活性が低下したことを示している〔例えば、R.Ar
nonet al.,supra,pp.7−８参照〕。更にアントラサイク
リン類似体の研究はそのアミノ糖でのアントラサイクリ
ンの修飾が母体の医薬に比して医薬類似体の細胞阻害活
性の減少を生ずることを示している〔例えば、K.Yamamo
to et al.,“Antitumor Activity of Some Derivatives
of Daunomycin at The Amino and Methyl Ketone Func
tions",J.Med.Chem.,15,pp.872−75（1972）参照〕。
アントラサイクリンの14−炭素（Ｃ−14）位置で直接
抗体に結合したアントラサイクリン、ダウノマイシンの
更に別のイムノコンジュゲートも製造されている。然
し、腫瘍細胞に対するこれらのイムノコンジュゲートの
選択的な細胞阻害活性は容易に再現できず、20μg/mlの
濃度においてのみ一貫して再現された〔J.Gallego et a
l.,supra参照〕。
日本特許出願昭59−274658号（特開昭61−155344号）
は13−ケイ−アシルヒドラゾン結合を介しての抗体への
アントラサイクリンのコンジュゲート形成を開示してい
る。このコンジュゲート形成は抗体の誘導体を形成して
次に誘導体をアントラサイクリンと反応させる方法によ
つて達成される。抗体の誘導体形成は望ましからざる非
特異的反応を伴ない、極めて低いアントラサイクリン：
抗体比が得られるのでこのような方法は望ましくない。
第１の方法では、ヒドラジンの共存下で抗体をカルボ
ジイミドで処理してヒドラジド抗体誘導体として、これ
を次にアントラサイクリンと反応させて、アントラサイ
クリンを抗体構造に直接リンクした。然し得られたイム
ノコンジュゲートは抗体分子が凝集する傾向がある。更
にこの方法は抗体分子上にカルボン酸基が必要である
が、その数が限られているので、これらのイムノコンジ
ュゲートは低い（約1.1−1.3）のアントラサイクリン：
抗体比を有している。
第２の方法は抗体を無水コハク酸と反応させて抗体の
アミド酸誘導体を得る。この誘導体を次にヒドラジンと
反応させて抗体ヒドラジド誘導体として、これを次にア
ントラサイクリン、ダウノマイシンと反応させた。抗体
誘導体とヒドラジンとの反応が特異的では無く、所望の
ヒドラジド誘導体以外に、異なつた抗体誘導体混合物を
生成するので、この第２の方法はめちやめちやである。
従つて、特願昭59−274658号に示されているように、抗
体に対するアントラサイクリンのモル比は極めて低い
（約１、日本特許出願公開公報合本264頁 第１欄参
照）。
最後に他のアントラサイクリンヒドラゾンがG.L.Tong
et al.,J.Med.Chem.,21,pp.732−37（1978）;T.Smith
et al.,J.Med.Chem.,21,pp.280−83（1978）；及びR.T.
C.Brownlee et al.,J.Chem.Soe.,pp.659−61（1986）に
開示されている。米国特許第4,112,217号も参照された
い、これはダウノマイシン及びアドリアマイシンのビス
ヒドラゾンを開示している。
他の研究では、細胞阻害活性の薬効を増し且つ薬の毒
性を低減するために、アントラサイクリンを高分子量キ
ヤリヤー例えばデキストラン又はポリグルタミン酸にリ
ンクさせている。〔例えばR.Arnon et al.,supra,p.5及
びE.Hurwitz et al.,“Soluble Macromoleculesas Carr
iera for Daunorubicin",.Appl.Biochem.,2,pp.25−35
（1980）参照〕。これらのキヤリヤーにリンクされたア
ントラサイクリンは腫瘍に付随する抗原に対抗する抗体
とも共有結合的に結合されていて、腫瘍細胞に特異性の
ある細胞阻害性医薬を目的とするイムノコンジュゲート
を形成している。例えばカルボキシメチル−デキストラ
ンヒドラジド橋を介してアドリアマイシンがかかる“抗
腫瘍”抗体にリンクされており、一方アドリアマイシン
のテトラサイクリン環のＣ−13カルボニル側鎖でアドリ
アマイシン分子がカルボキシメチルデキストランのヒド
ラジン誘導体にリンクされてヒドラゾンを形成してい
た。抗体は次にグルタルアルデヒドを用いて、デキスト
ランヒドラジド誘導体にリンクされてアドリアマイシン
−dex−抗体コンジュゲートが形成された〔R.Arnon et
al.,“Monoclonal Antibodies as Carriers for Immuno
targeting of Drugs",Monoclonal Antibodies for Canc
er Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.（ed
s.）,pp.365−83（1985）及びE.Hurwitz et al.,“A Co
njugate of Adriamycin and Monoclonal Antibodies to
Thy−1 Antigen Inhibits Human Neuroblastoma Cells
in Vitro",Ann.N.Y.Acad.Sci.,417,pp.125−36（198
3）参照〕。
然しキヤリヤーの使用はある種の不利益を必然的に伴
なう。例えばキヤリヤーを含有するイムノコンジュゲー
トはサイズが非常に大きくインビボで網内皮系によつて
迅速に除去される〔例えばR.O.Drillman et al.,“Prec
linical Trials With Combinations and Conjugates of
T101 Monoclonal Antibody and Doxorubicin",Cancer
Res.,46,pp.4886−91（1986）参照〕。キヤリヤーを含
有するイムノコンジュゲートがこのように迅速に除去さ
れることは、コンジュゲート形成した医薬が意図された
作用部位、即ち滅殺すべき対象の細胞群に全く到達しな
いので治療上役に立たない。更に、高分子量キヤリヤー
が存在するとイムノコンジュゲートの安定性に負の作用
を与え、そしてコンジュゲートの抗体の結合活性の低下
が示されている〔例えば、M.J.Embleton et al.,“Anti
body Targeting of Anti−Cancer Agents",Monoclonal
Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Ba
ldwin et al.（eds.）,pp.323−24（1985）参照〕。更
に腫瘍細胞について検討しても、高分子量キヤリヤーを
含有するイムノコンジュゲートがインビボの腫瘍細胞に
局存できるという確証が無い。直接的にコンジュゲート
した医薬−抗体コンジュゲートの腫瘍細胞へのインビボ
での局存化を示しているC.H.J.Ford et al.,“Localiza
tion and Toxicity Study of a Vindesine−Amti−CEA
Conjugate in Patients With Advanced Cancer",Br.J.C
ancer,47,35−42（1983）と比較されたい。
このように特異的結合及びキヤリヤーを使用する抗体
へのアントラサイクリンのコンジュゲート形成が開示さ
れている。上述したようにこれらのイムノコンジュゲー
トの使用は使用した特異的結合又はキヤリヤーに由来す
るはつきりとした不利益を必然的に伴なつている。
＜課題を解決するための手段＞ 本発明は、滅殺の対象に選ばれた標的細胞集団に対抗
するようになつている抗体１個当り、リンカーアームを
介して複数個の細胞阻害生のアントラサイクリン分子を
リンクさせる新規な化学機構を提供する。本発明によれ
ば、滅殺する対象に選ばれた細胞集団と反応する抗体に
結合した約４−10のアントラサイクリン分子からなり、
各アントラサイクリンがＣ−13位にケト基を有し且つ抗
体にリンカーアームを介して連結しており、リンカーア
ームはアントラサイクリンの13−ケト位でアシルヒドラ
ゾン結合を介してアントラサイクリンと共有結合し、そ
してさらにジスルフィド又はチオエーテル結合を介して
抗体と共有結合している新規なイムノコンジュゲートが
提供される。例えば本発明の好ましい態様は新規なアド
リアマイシン（“ADM"と略記する）ヒドラゾン誘導体
（“ADM−HZN"と略記する）の合成を伴ない、これが次
にチオール化した抗体と縮合して、アンカーアームを介
してのアントラサイクリンの抗体への付着を生じた。AD
MのＣ−13位置に形成されたアシルヒドラゾン結合はADM
のリンカーへの付着部位として働らく。更にリンカー内
には抗体の付着部位としてジスルフイド結合が存在して
いる。
第２の好ましい態様によれば、ADM−HZNが還元されて
スルフヒドリル基を生じ、得られた新規なヒドラゾン誘
導体がマレイミド誘導体となつた抗体と縮合した。これ
はADMのＣ−13位置にリンカー付着部位としてのアシル
ヒドラジン結合を有するリンカーアームの形成及びリン
カー内に抗体のリンカー付着部分としてのチオエーテル
結合の形成を生じる。これらの態様から明らかなよう
に、本発明は、本発明のイムノコンジュゲートの製造に
有用なアントラサイクリンの新規なアシルヒドラゾン誘
導体を提供する。
本発明のイムノコンジュゲートは約４−10のアントラ
サイクリン：抗体モル比を有し、且つ標的として選ばれ
た細胞を滅殺する抗体並びに細胞毒性医薬（アントラサ
イクリン）の活性を保持している。イムノコンジュゲー
トのリンカーアームへのアントラサイクリンの付着部位
にある酸感受性のヒドラゾン結合、及び更に本発明の好
ましい態様のリンカーアーム内のジスルフイド又はチオ
エーテル結合は、還元性及び酸性条件例えば細胞内例え
ばリソソーム小胞内で一般的に遭遇するかかる条件下
で、活性な医薬（アントラサイクリン）の放出に理想的
に適しているものである。
本発明のイムノコンジュゲートは医薬組成物、例えば
本発明のイムノコンジュゲートの少なくとも１の医薬上
有効量と医薬上許容し得るキヤリヤーより成る組成物と
して使用される。本発明は又、滅殺すべき所望の標的に
選ばれた細胞集団に細胞阻害性の医薬を選択的に供給す
る方法並びに医薬上許容し得る方法で本発明の組成物の
医薬上有効量を哺乳類の治療のために使用することも包
含するものである。
好ましくは、イムノコンジュゲート、医薬組成物及び
ここに開示された方法は、疾病例えば癌及び他の腫瘍、
非細胞破壊性のウイルス性又は他の病原体性感染、及び
自己免疫性疾患の治療で、標的細胞を優先的に滅殺する
対象に選ばれた細胞集団に細胞阻害性のアントラサイク
リン医薬を命中させるための有用な方法を提供する。
式１は本発明のイムノコンジュゲートの製造に使用す
る新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体（ADM−HZ
N）の合成スキームを示す。
式２は単クローン性抗体（“MAB"と略記）を先ず、Ｎ
−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（“SPDP"と略記）と２−イミノチオラン
（“２−IT"と略記）のいずれかでチオール化し、次にA
DM−HZNと反応させて、ADMの13−ケト位置にヒドラゾン
結合とリンカーアーム内にジスルフイド結合を有する本
発明のイムノコンジュゲートを形成する、本発明の第一
の態様のイムノコンジュゲートを合成するスキームを示
す。
式３は本発明の新規なADM−HZN（誘導体）を先ず還元
して、次にこれをスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（“SMPB"と略記）処理した
抗体と反応させて、その構造にチオエーテル結合のある
リンカーアームを有するイムノコンジュゲートを形成す
る本発明のイムノコンジュゲートの合成法のスキームを
示す。
ここに開示した発明をより完全に理解できるように、
以下の詳細な説明を加える。
本発明は新規なアントラサイクリン・イムノコンジュ
ゲート、新規なアントラサイクリンアシルヒドラゾン誘
導体、それらの製造方法、疾病例えば癌及び他の腫瘍、
非細胞破壊性のウイルス性又は他の病原体性感染、及び
自己免疫性疾患の治療で滅殺すべき所望の選ばれた細胞
集団に細胞阻害性のアントラサイクリンを供給する医薬
組成物及びその方法に関する。より特には本発明は、選
ばれた細胞集団に対抗するように定められた抗体で、そ
の構造にリンクしている複数個のアントラサイクリン分
子を有す抗体から成るイムノコンジュゲートに関する。
アントラサイクリン分子は共有結合的に抗体に結合され
ていて、各（アントラサイクリン）医薬分子と抗体との
間にリンカーアームが形成されていて、リンカーはアン
トラサイクリンの13−ケト位置のアシルヒドラゾン結合
でアントラサイクリンに付着されている。この形成は、
先ず新規なアントラサイクリンヒドラゾン誘導体を形成
し、次に適切な特異性を有する抗体と反応させる段階的
な方法で達成できる〔通常の抗体カツプリング法の詳細
については例えば、R.R.Hardy,“Purification and Cou
pling of Fluorescent Proteins for Use in Flow Cyto
metry",Handbook of Experimental Immunology,Volume
1:Immunochemistry,D.M.Weir et al.（eds.）,pp.31.4
−31.12（4th Ed.1986）参照〕。リンカーのアントラサ
イクリンへの付着点がアントラサイクリンのＣ−13位置
のアシルヒドラゾンの形である限り、イムノコンジュゲ
ートのアントラサイクリン及び抗体成分を結んでいるリ
ンカーアームの長さは変り得る。リンカーアームは更に
別の結合、例えばジスルフイド、チオエーテル、アミ
ド、カルバメート、エーテル又はエステル結合をアント
ラサイクリンを抗体に付着させている点の間の全長に沿
つて有し得る。
本発明のイムノコンジュゲートを形成するアントラサ
イクリンは13−炭素（Ｃ−13）位置にケト基を有してい
る如何なるアントラサイクリンとなり得る。かかるアン
トラサイクリンには、これに限定されるものでは無い
が、アドリアマイシン、ダウノマイシン、デトルビシン
（detorubicin）、カルミノマイシン、イーダルビシン
（idarubicin）、エピルビシン（epirubicin）、エソル
ビシン（esorubicin）、４′−THP−アドリアマイシ
ン、AD−32及び３′−デアミノ−３′−（３−シアノ−
４−モルホリニル）−デキソルビシン（doxorubicin）
がある〔A.M.Casazza,“Experimental Studies on New
Anthracyclines",Adriamycin:Its Expanding Role in C
ancer Treatment,M.Ogawa et al.（eds.）,pp.439−52
（Excerpta Medica 1984）参照〕 本発明のイムノコンジュゲートを形成する抗体は絶滅
又は滅殺を望む特定の細胞集団に対して反応性の如何な
る抗体ともなり得る。かかる抗体の例には、これに限定
されるものでは無いが腫瘍に付随する抗原例えば癌、黒
色腫、リンパ腫、骨及び軟質組織肉腫並びに他の腫瘍で
見出される抗原と結合する抗体、ウイルス又は他の病原
体に付随する抗原と結合する抗体及び異状細胞表面抗原
と結合する抗体が包含される。これらの抗体は多クロー
ン性又は好ましくは単クローン性であつて、当業界で充
分に確立されている方法で製造できる〔製造され、コン
ジュゲートに用いられる腫瘍特異性の多クローン性抗体
については）例えば、R.A.DeWeger et al.,“Eradicati
on of Murine Lymphoma and Melanoma Cells by Chlora
mbucil−Antibody Complexes",Immunological Rev.,62,
pp.29−45（1982）及び（製造された腫瘍特異性単クロ
ーン性抗体について）M.Yeh et al.,“Cell Surface An
tigens of Human Melanoma Identified by Monoclonal
Antibody,"Proc.Natl.Acad.Sci.,76,pp.2927−31（197
9）及びJ.P.Brown et al.,“Structural Characterizat
ion of Human Melanoma−Associated Antigen p97 With
Monoclonal Antibodies,“J.Immunol.,127（No.２）,p
p.539−46（1981）参照〕。例えばヒトの肺癌細胞に特
異性のある単クローン性抗体L6、及び骨原性肉腫細胞に
特異性のある単クローン性抗体、791T/36を使用する。
更にインターナリゼーシヨンされていない又は好ましく
はインターナリゼーシヨンされた抗体が用いられる。こ
こで使用する用語“抗体”には完全な抗体分子又は抗体
分子の活性な結合領域を有するフラグメント例えばFab
又はＦ（ab′）2を包含するものとする。単クローン性
抗体を用いる時は、これに限定されるものでは無いがマ
ウス又はヒト起源の又はキメラ抗体と抗体がある。
従つて本発明のイムノコンジュゲートの抗体は、抗体
が反応性である特定の細胞集団にアントラサイクリン分
子を運ぶ役割を果す。例えば腫瘍細胞面に見出された抗
原に対抗するようになつている抗体はこれらの腫瘍細胞
と結合し且つそのアントラサイクリンをこれらの腫瘍細
胞に供給するし、AIDSを起こすヒトの免疫欠損ウイルス
（HIV）の蛋白質に対抗するようになつている抗体はそ
の細胞阻害性アントラサイクリンをHIV感染細胞に供給
する。抗体が反応する特定の細胞集団の内部又は部位で
の医薬アントラサイクリンの放出はこれらの特定の細胞
の優先的滅殺を起こす。従つて本発明のイムノコンジュ
ゲートは、絶滅すべて特定の細胞集団が検出され、細胞
集団がイムノコンジュゲートと結合できる細胞面抗原を
有していると、如何なる疾病の治療にも有効である。本
発明のイムノコンジュゲートが有効な疾病には、これに
限定されるものでは無いが、癌及び他の腫瘍、非細胞破
壊性のウイルス性又は他の病源性感染例えばAIDS、ヘル
ペス、CMV（サイトロメガロウイルス）、EBV（エプスタ
イン−バーウイルス）、及びSSPE（亜急性硬化性汎脳
炎）、及び慢性関節リウマチが包含される。
理論付けられていないが、抗体にリンクされているア
ントラサイクリン分子、即ち本発明のイムノコンジュゲ
ートの形のアントラサイクリンは抗体特異性を媒介とし
て滅殺すべて標的細胞に運ばれ、そして次に膜に結合し
たコンジユゲート形成した抗体及びリガンドのインター
ナリゼーシヨンに到る同一のエンドサイトシス的経路で
細胞内に入ることができると考えられている〔例えば、
I.Pastan et al.,“Pathway of Endocytosis",Endocyto
sis,I.Pastan et al.,（eds.）,pp.1−44（Plenum Pres
s 1985）参照〕。細胞の内に入るや、イムノコンジュゲ
ートを含むエンドサイトシス小胞が１次リソソームと融
合して２次リソソームを形成する〔例えば、M.J.Emblet
on et al.,supra,p.334参照〕。
アントラサイクリン分子はイムノコンジュゲートの抗
体に酸感受性のアシルヒドラゾン結合を介して結合して
いるので、イムノコンジュゲートのエンドサイトシス小
胞及びリソソームの酸性環境はイムノコンジュゲートか
らのアントラサイクリンの放出を生じる。さらに放出さ
れたアントラサイクリンは完全な細胞阻害活性を発揮す
る殆んど変性されていない医薬（アントラサイクリン）
と考えられる。従つてイムノコンジュゲートの酸感受性
のヒドラゾン結合は標的細胞内で細胞阻害薬の放出にと
つて極めて好都合であり、イムノコンジュゲートのこれ
らの細胞に対する細胞阻害性を増進する。
別の方法では、ヒドラゾン結合が標的細胞のすぐ傍ら
の外部環境又はそれを取巻く酸性及び還元性条件、即ち
腫瘍の部位の条件で開裂して医薬アントラサイクリンを
放出して腫瘍細胞にとりこまれても良い。
本発明のイムノコンジュゲート及びその製造方法を、
アントラサイクリン、アドリアマイシンをさまざまの抗
体とコンジュゲート形成された好ましい態様で例示す
る。
先ず新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体を２段
反応で合成した。ヘテロ２官能性試薬SPDE（Ｎ−スクシ
ンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト）をヒドラジンと反応させて、３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオニルヒドラジドを形成し、次にヒドラジ
ドをアドリアマイシン・ハイドロクロライド（ADM−HC
l）と反応させて、ピリジルで保護したジスルフイド部
分を持つADMの新規なアシルヒドラゾン誘導体を形成し
た。酸触媒例えばトリフルオロ酢酸をヒドラゾンの形成
促進に使用できる。形成された誘導体はアドリアマイシ
ン13−｛３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル｝ヒ
ドラゾン・ハイドロクロライド（ADM−HZN）と命名され
た（式１参照）。得られたイムノコンジュゲートは、ア
シルヒドラゾン結合で各ADMのＣ−13位置に付着してい
て、更にリンカーアームがそれによつて抗体に付着して
いるジスルフイド結合を有しているリンカーアームによ
つて単クローン性抗体にコンジユゲートされている（複
数個の）ADM分子から成る。（式２参照）。
本発明の第２の態様は、上述のADM−HZNを更に還元剤
ジチオトレイトール（“DTT"と略称する）又はトリブチ
ルホスフインで還元して13−｛３−（メルカプトプロピ
オニル）｝アドリアマイシンヒドラゾンとした、第２の
新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体の合成を伴な
う。（式３参照）。この誘導体を例えば抗体とスクシン
イミジル−４−（ｐ−マレイミドフエニル）プチレート
（“SMPB"と略称する）との反応で、マレイミド基を付
着させてある単クローン性抗体と次に反応させた。式３
に示すように、ヒドラゾン結合で各ADMのＣ−13位置に
付着しており且つ抗体へのリンカーアームの付着部分と
してチオエーテル結合も有しているリンカーアームを有
するイムノコンジュゲートが形成された。従つて、結合
がアントラサイクリンの13−ケト位置の酸感受性のヒド
ラゾン結合を有している限り、医薬（アントラサイクリ
ン）と抗体を結合しているリンカーアームが複数個の構
成分を結合とから成ることができることは明らかであ
る。
本発明は又、式Ｉ、II又はIIIを有する13−ケトを有
するアントラサイクリンの新規なアシルヒドラゾン誘導
体も提供することが知られる： 但し： R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOCH(OC2H
5)2であり； R2は （上式中でＸ＝Ｈ、NO2又はハロゲン）であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4はNH2、NHCOCF3、４−モルホリニル、３−シアノ−
４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−
１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルアミ
ン、シアノメチルアミン又は１−シアノ−２−メトキシ
エチルアミであり； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOH又は水素であり、R5がOH又はＯ−THPの場合に
はR6はOHでは無いものとし；且つ ｎは１乃至10の整数である。
但し： R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOCH(OC2H
5)2であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4はNH2、NHCOCF3、４−モルホリニル、３−シアノ−
４−モルホリニル、１−ピペニジニル、４−メトキシ−
１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルアミ
ン、シアノメチルアミン又は１−シアノ−２−メトキシ
エチルアミンであり； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOH又は水素であり、R5がOH又はＯ−THPの場合に
はR6はOHでは無いものとし；且つ ｎは１乃至10の整数である。及び 但し； R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOCH(OC2H
5)2であり； R2は （上式中でＸ＝Ｈ、NO2又はハロゲン）であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4及びR7は独立して水素、アルキル、置換基を有する
アルキル、シクロアルキル、置換基を有するアルキル、
アリール、置換基を有するアリール、アラルキル又は置
換基を有するアラルキルであるか；又はR4，R7及びＮが
一緒になつて４−７員環を形成しており、而して該環は
場合によつては置換基を有し得るものとする； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOH又は水素であり、R5がOH又はＯ−THPの場合に
はR6はOHで無いものとし；且つ ｎは１乃至10の整数である。
上に開示したアントラサイクリンアシルヒドラゾン類
は本発明のイムノコンジュゲートの製造の新規な中間体
を表わしており、本明細書で述べる好ましい態様で示す
ように、ADM−HZN及び13−｛３−（メルカプトプロピオ
ニル）｝アドリアマイシンヒドラゾンでそれぞれ代表さ
れるものである。
上式から明らかなように、本発明のアシルヒドラゾン
中間体は多数の既知のアントラサイクリン例えばアドリ
アマイシン、ダウノマイシン及びカルミノマイシンのい
ずれのヒドラゾンも包含する。更に、この中間体にはア
ントラサイクリン構造の特定の部位を誘導体に変えたも
ののアシルヒドラゾン（例えば４′−THP−アドリアマ
イシンヒドラゾン及び３′−デアミノ−３′−（３−シ
アノ−４−モルホリニル）アドリアマイシンヒドラゾ
ン）を包含する。このような後者の中間体は、先ずアン
トラサイクリンを誘導して所望の類似体を形成し、次に
その類似体を用いて本発明のヒドラゾン中間体を製造し
て合成することができる。公知のアントラサイクリン類
似体には下記の特許に記載されたものが包含される：米
国特許第4,464,529号及び4,301,277号（３′−デアミノ
−３′−（４−モルホリニル）又は３′−デアミノ−
３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）アントラサイ
クリン類似体）、同第4,202,967号及び4,314,054号
（３′−デアミノ−３′−（１−ピペリジニル）又は
３′−デアミノ−３′−（４−メトキシ−１−ピペリジ
ニル）アントラサイクリン類似体）、同第4,250,303号
（Ｎ−ベンジル又はN,N−ジベンジルアントラサイクリ
ン類似体）、同第4,591,637号（Ｎ−メトキシメチル又
はＮ−シアノメチル−アントラサイクリン類似体）、及
び同第4,303,785号（アントラサイクリンのアセタール
類似体）。これらの公知のアントラサイクリン類似体は
上述のように（式１参照）反応させて新規なアシルヒド
ラゾンをつくることができ、次にこれを前記の所望の特
異性を有する抗体とコンジュゲートさせることができ
る。
別の方法では、誘導体でないアントラサイクリン例え
ばアドリアマイシン、ダウノマイシン又はアルミノマイ
シンから本発明の方法で誘導体の形になつていない本発
明のアントラサイクリンアシルヒドラゾン中間体を先ず
つくつて、次にこの新規な中間体から次に所望の置換基
を有する新規なアシルヒドラゾンを製造することができ
る。例えば、米国特許第4,464,529号記載の方法を用い
て、ADM−HZNを2,2′−オキシジアセトアルデヒドを用
いる還元的アミノ化によつて、そのアミノ糖部分を誘導
体に変えて、３′−デアミノ−３′−（３−シアノ−４
−モルホリニル）アドリアマイシンヒドラゾンをつくる
ことができる。同様にADM−HZNはアミノ糖部分を誘導体
にして新規なアシルヒドラゾン誘導体例えば３′−デア
ミノ−３′−（４−モルホリニル）ADMヒドラゾン（米
国特許第4,301,277号参照）、３′−デアミノ−３′−
（１−ピペリジニル）ADMヒドラゾン（同第4,202,967号
参照）、３′−デアミノ−３′−（４−メトキシ−１−
ピペリジニル）ADMヒドラゾン及びN,N−ジベンジルADM
ヒドラゾン（同第4,250,303号参照）、又はＮ−メトキ
シメチルADMヒドラゾン及びＮ−シアノメチルADMヒドラ
ゾン（同第4,591,637号参照）をつくることができる。
更にADM−HZNは式Ｉ−IIIのR5の位置を誘導化して、同
第4,303,785号記載のように、ヒドラゾンのアセタール
誘導体例えば４′−THP−ADMヒドラゾンをつくることが
できる。
本発明のアシルヒドラゾンを誘導体に変えるこれらの
新規な方法は、ADM以外のアントラサイクリン例えばダ
ウノマイシン又はカルミノマイシンのヒドラゾンを原料
物質として利用して本発明の範囲に属する新規な化合物
例えばＮ−ベンジルダウノマイシンヒドラゾン又は３′
−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）カルミノマイ
シンヒドラゾンの製造に利用できることを理解された
い。
本発明の方法で製造されたアントラサイクリン−抗体
イムノコンジュゲートは、さまざまな検定条件下でリン
パ腫及び癌細胞の両方に対してイムノコンジュゲートが
抗体結合活性を保持しており且つ抗体が指向する細胞の
滅殺力を有することを示していた。従つてコンジュゲー
トの抗体がそれに対抗するようになつている（指向して
いる）抗原を有している細胞はアントラサイクリンによ
つて効果的に滅殺されて、適応する抗原を有していない
細胞は滅殺されなかつた。事実、いくつかの実験では、
抗体によつて運搬されたアントラサイクリンは等量のコ
ンジュゲートを形成していないアントラサイクリンより
もより有効であることが判明した。腫瘍細胞への摂取機
構と細胞内輸送機構の差が遊離のアントラサイクリンと
抗体にコンジュゲートしたアントラサイクリンの間で認
められた効力の差に対応するとみられる。
更に、マウスへのヒトの腫瘍異種移植を用いる研究
は、ある場合には完全な腫瘍後退に到るインビボの腫瘍
生長を阻止する本発明のイムノコンジュゲートの能力を
示している。このイムノコンジュゲートはコンジュゲー
トしていないアントラサイクリンよりも、より大きな効
力を有しており且つより大巾に腫瘍生長を阻害すること
が示された。更にこのイムノコンジュゲートはコンジュ
ゲートしていない医薬（アントラサイクリン）単独より
も毒性が1/10以下であつて、遊離医薬よりも遥かに多量
を動物が耐えることができた。本発明のイムノコンジュ
ゲートの結合性及び細胞阻害性は、アントラサイクリン
のアミノ糖部分でアントラサイクリンが抗体に直接結合
（リンク）している文献に報告されているイムノコンジ
ュゲートよりも遥かにすぐれていることが判明してい
る。それらのアミノ糖結合イムノコンジュゲートは多く
は、遥かに低いアントラサイクリンの抗体に対するモル
比を有していて且つ遊離のものよりも低下した細胞阻害
性と低い抗体結合性を有していた。〔例えば、R.Arnon
et al.,Immunological Rev.,62,supra;E.Hurwitz et a
l.,Cancer Res.,35,supra；及びR.Yamamto et al.,stpr
a参照〕。更に本発明のイムノコンジュゲートについて
行なつた安定性試験は、細胞環境でみられる条件に類似
した還元性且つ酸性条件下でイムノコンジュゲートから
アントラサイクリンが放出されることを示した。従つて
本発明のイムノコンジュゲートで認められる高い細胞阻
害性医薬活性の保持は、標的細胞に殆んど変性されてい
ない医薬（アントラサイクリン）が与えられるという事
実で説明できる。
その上、反応条件を最適化して、異なるイソタイプの
いくつかの抗体を用いて、約４−10のアントラサイクリ
ン：抗体モル比に達することができた。10より大のモル
比を狙うと、ADM−HZN誘導体との縮合後に回収される蛋
白質の量が著るしく減る。10より大きいモル比を得る上
での主要な限界はコンジュゲートの水溶液中での低い溶
解度とアントラサイクリンの蛋白質との物理的会合によ
ることが判明した。
発明者のインビボ試験は、本発明のイムノコンジュゲ
ートが遊離の医薬よりも遥かに大きな抗腫瘍活性並びに
その低い全身性毒性を示し、コンジュゲートについての
増加した治療指数を示している。従つて本発明は疾病例
えば癌及び他の腫瘍、非細胞破壊性ウイルス性又は他の
病原体性感染及び自己免疫性疾患の治療用の医薬組成
物、複合体及び方法も対象としている。より特には、本
発明は少なくとも１のアントラサイクリンを含有するイ
ムノコンジュゲートの医薬的有効量を医薬上許容し得る
方法で客体哺乳類に投与する哺乳類の疾病の治療方法を
包含する。
本発明の方法の別の態様として、同時又は逐次的に、
複数の異なるイムノコンジュゲート即ち異なるアントラ
サイクリンか異なる抗体を有するイムノコンジュゲート
を、複合化学療法で用いるために、投与することを伴な
う。例えば、コンジュゲートの抗体成分の特異性を変え
て複数種のアントラサイクリン−イムノコンジュゲート
を使用する、即ちそれぞれが対象とする細胞集団上に存
在する異なる抗原又は同一の抗原の異なる部位又はエピ
トープに特異的に結合する抗体を有する複数種のイムノ
コンジュゲートを使用することを伴なう。これらのイム
ノコンジュゲートのアントラサイクリン成分は同一でも
異なつていても良い。例えば、腫瘍面上のさまざまの抗
原の量が不明又は腫瘍細胞集団が抗原発現が不均一であ
るか又は、腫瘍部位のすべての腫瘍細胞に充分な量の医
薬を向けられることを確認したい時のある種の腫瘍の治
療ではこの態様が特に有用である。腫瘍に対して異なる
抗原又はエピトープ特異性を持つ複数種のコンジュゲー
トの使用は、腫瘍部分に充分な医薬（アントラサイクリ
ン）を到達させる可能性を増す。正常な組織が腫瘍に付
随する抗原と同一の抗原をすべて有している可能性が小
さいので、更にこの態様は高度の特異性を得るために重
要である。〔I.Hellstrom et al.,“Monoclonal Antibo
dies to Two Determinants of Melanoma−Antigen p97
Act Synergistically in Complement−Dependent Cytot
oxicity",J.Immunol.127（No.１）,pp.157−60（1981）
参照〕。
別の方法として、コンジュゲートのアントラサイクリ
ン成分だけを変えた複数種の異なるイムノコンジュゲー
トを使用する。例えば特定の抗体をアドリアマイシンに
リンクさせて第１のイムノコンジュゲートを形成し、そ
してダウノマイシンにリンクさせて第２のイムノコンジ
ュゲートを形成する。両コンジュゲートを次に治療すべ
き客体に投与して、抗体の特異性によつて滅殺すべきも
のとされた対象の細胞集団の部位に局在化させる。両医
薬が次にその部位で放出される。特定の細胞集団例えば
腫瘍の医薬耐性が不確実である時には、この方法は標的
細胞部位又は内に複数種の異なつた医薬を放出できるの
で、この態様は重要である。更なる態様では、２種以上
のアントラサイクリンを特定の抗体にコンジュゲートさ
せて、13−ケトアシルヒドラゾン結合を介して抗体にす
べてリンクしている一複数種の異なつたアントラサイク
リン分子をその表面に沿つて有しているイムノコンジュ
ゲートを形成する。この態様のイムノコンジュゲートの
投与は標的細胞の部位又は内部に複数種の異なつた医薬
を放出する。
本発明のアントラサイクリン・イムノコンジュゲート
は、これに限定されるものでは無いが、静脈、腹腔内、
経口、リンパ内又は選定された細胞集団の部位例えば腫
瘍に直接投与することを含めた通常の投与方法を用いる
医薬組成物の形で投与できる。静脈投与が好ましい。さ
らにインビボの処置では抗体フラグメント例えばFab又
はＦ（ab′）2又はキメラ抗体から成るイムノコンジュ
ゲートを用いることも有効である。
アントラサイクリン・イムノコンジュゲートより成る
…本発明の医薬組成物はさまざまの用量形態で使用で
き、その形態には、これに限定されるものでは無いが、
固体、半固体及び液体の投与形態例えば錠剤、丸薬、粉
末、液体溶液又は懸濁液、坐薬、高分子マイクロカプセ
ル又はマイクロ小胞、リポゾーム、及び注射用又は輸液
用溶液がある。好ましい形態は投与形式及び治療上の用
途によつてきまる。
これらの医薬組成物は当業者に知られている通常の医
薬上許容されているキヤリヤー例えば血清蛋白質、例え
ばヒトの血清アルブミン、緩衝物質例えば燐酸塩、水又
は電界質の塩も包含されよう。
本発明のイムノコンジュゲートについての最も効果的
な投与方法及び用量指針は、疾病のはげしさとその期、
患者の健康状態と治療に対する応答及び主治医の判断に
よる。それに従つてイムノコンジュゲート及びその化合
物のきまつた用量が個々の患者に投与されよう。然し一
般に、本発明のアントラサイクリン・イムノコンジュゲ
ートの有効な用量は約１乃至約100mg/m2のアントラサイ
クリン及び約500−5000mg/m2の抗体の範囲である。
本明細書に記載した発明をより良く理解させるため
に、以下の実施例を示す。実施例は例示のためのみのも
のであつて、如何なる意味でも本発明の範囲を限定する
ためのものでは無い。
実施例1. 本実施例はアントラサイクリンの13−ケト位置のアシ
ルヒドラゾン結合を介してアントラサイクリンが直接
に、単クローン性抗体にリンク（結合）している本発明
による新規なアントラサイクリン・イムノコンジュゲー
トの製造法を示す。
本実施例に記載された態様は、ADM（アドリアマイシ
ン）が単クローン性抗体にコンジュゲートして、イムノ
コンジュゲートのADM分子への付着点としてアシルヒド
ラゾン結合を有するリンカーアームを有するイムノコン
ジュゲートであつて、リンカーが更に抗体への付着部分
としてジスルフイド結合を有しているイムノコンジュゲ
ートの形成を伴なう。この態様ではADMの新規なアシル
ヒドラゾン誘導体（ADM−HZN）も与える。
アドリアマイシンヒドラゾンの合成 本態様のイムノコンジュゲートの製造の第一歩とし
て、ADM−ヒドラゾン誘導体を下記のように先ず合成し
た。0.3mlの1Mヒドラジン、即ちNH2NH2、のイソプロピ
ルアルコール溶液を3mlのTHF（テトラヒドロフラン）中
のSPDP（70mg、0.22ミリモル（以下では“mM"と略記す
る）の冷溶液に加えた。０℃で20min撹拌後、生成物をC
H2Cl2で抽出し、ブラインで洗浄し、K2CO3で乾燥した。
溶媒蒸発後、得られた生成物を中性アルミナ上でクロマ
ト分離し（５％、M6OH、95％、CH2Cl2）、21mg（41％）
の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド
（式１の化合物２）を得た。このヒドラジドとアドリア
マイシンHCl（日本のSanraku Inc.から入手）（48mg、
0.083mM）を5mlのM6OHに溶解し、暗所、室温で６日間撹
拌した。反応は逆相薄膜クロマトグラフイー（TLC）（M
6OH：H2O＝2:1、３％w/v NH4OAc含有）で追跡した。こ
の後、溶媒を蒸発し、残渣をC18カラム上でクロマト分
離（M6OH：H2O＝3.2、３％ w/v NH4OAc含有）した。フ
ラクシヨンを合併して凍結乾燥し、過剰のNH4OAcを減圧
下で除去した。残渣をM6OHに溶かしてアセトニトリルを
加えて45mg（72％）のアドリアマイシン13−｛３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・ハイ
ドロクロライド、以後“ADM−HZN"（式１の化合物４）
と呼ぶ、を得た。ADM−HZNは次の特性を有していた:mp
＞125°色が暗化して明確に測定されず、NMR（アセトン
−d6，δ）1.25（s,3H,J＝6Hz）、1.77（m,1H）、2.06
（m,1H）、2.30（m,1H）、2.53（d,1H,J＝15Hz）、2.89
−3.18（m,6H）、3.71（m,1H）、3.85（m,1H）、3.97
（m,1H）、4.07（s,3H）、4.78（s,2H）、5.21（m.1
H）、5.58（t,1H,J＝7Hz）、7.12（m,1H）、7.64（d,1
H,J＝8Hz）、7.75（m,2H）、7.90（t,1H,J＝8Hz）、7.9
8（d,1H,J＝8Hz）、8.37（d,1H,J＝4Hz）、10.50（s,1
H）、10.52（s,1H）、14.19（bs,1H）;IR（KBr）3438、
1674、1618、1579、1419、1286、1016、988、698cm-1;F
ABMS（グリセロール）m/e755（Ｍ＋１-）、737、645、6
25、609。
単クローン性抗体のチオール化 上述のようにして調製したADM−HZN化合物を対象の単
クローン性抗体と反応させる前に、抗体をチオール化す
る、即ち抗体分子に反応性のスルフヒドリル基を導入す
る、必要があつた。
使用した単クローン性抗体は:1）5E9、すべての分裂
ヒト細胞上のトランスフエリン受容体と反応性で多種の
組織学的タイプの癌細胞と交叉反応性のIgG1抗体;2）T3
3A1（以後“3A1"と呼ぶ）、40KdヒトＴ細胞抗原と反応
性で、多数のＴ細胞白血病でも発見されたIgG1抗体;3）
G28.5、50KdヒトＢ細胞抗原と反応性で、ヒトＢ細胞リ
ンパ腫とも反応性のIgG1抗体;4）G28.1、50KdヒトＢ細
胞抗原と反応性で、Ｂ細胞リンパ腫とも反応性のIgG1抗
体；及び５）L6、ヒトの非小細胞肺癌腫上の糖脂質抗原
と反応性のIgG2aであつた。
5E9及びT33A1抗体から分泌されたハイブリツドーマは
the American Type Culture Collection（ATCC）から
入手した。C.Bruck et al.,“One−Step Purification
of Mouse Monoclonal Antibodies From Ascitic Fluid
by DEAE−ffigel Blue Chromatography",J,Immun.Met
hods,5b,pp.313−19（1982）の方法に従いBALB/cマウス
でつくられた腹水流体からそれぞれの抗体を精製した。
精製したG28.5、G28.1、及びL6はJ.Ledbetter及びI.Hel
lstrom博士（Oncogen,Seattle,WA）から提供された。L6
及びG28.5抗体から分泌されたハイブリツドーマは1984
年12月６日及び1986年５月22日にATCCアクセシヨン番号
HB8677及びHB9110の下にそれぞれATCCに寄託された。G2
8.1単クローン性抗体はCD37抗原の主要エピトープと反
応性であることが当業者に知られており、A.J.Michael
（ed.），Leukocyte Typing III,Oxford Uniuersity Pr
ess（U.K.1987）で特徴付けられている抗体の一つであ
る。多種のこのような抗−CD37抗体は市場で入手でき
る。
SPDPによるこれらの抗体のいずれのチオール化も次の
ようにして実施した：エタノールに溶かしたSPDP（Pier
ce Chemical Co.,IL）（50mM）をPBS（リン酸塩緩衝食
塩水pH7.2）中の対象の単クローン性抗体例えば5E9（５
−10mg/ml）、に５−10mMの最終濃度となるように加え
た。反応混合物を30℃で30min培養した。PD−10カラム
（Pharmacia）を用いるゲル過クロマトグラフイーで
未反応SPDPをSPDP誘導体化抗体から分離した。チオピリ
ジル保護基は過剰のDTTを用いる還元で除去した。還元
した抗体をPD−10カラムを通し、遊離のチオール含有抗
体をADM−HZN誘導体との縮合に用いた（式２参照）。
２−ITを用いても抗体蛋白質上に反応性チオール基が
導入された：（pH8.0の50mMトリエチルアミン、50mM Na
Cl中の５−10mg/mlの）抗体を５−10mMの最終濃度の２
−IT（Pierce Chemical Co.,IL）と混合した。反応は４
℃で90min進行させ、チオール化した抗体を2M NaCl/PBS
で平衡化したPD−10カラムで分離した。
抗体に包含された反応性チオール基の数はG.L.Ellma
n,Arch.Biochem.Biophys.,82,pp.70−77（1959）の方法
に従つて、DTNB（5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）（E412＝14150）を用いて測定した。
チオール化した単クローン性抗体とADM−HZNとのコンジ
ュゲート形成 上述のようにチオール化した単クローン性抗体をそれ
ぞれADM−HZNにリンクさせた、コンジュゲート形成を次
に実施した（式２参照）。
ADMをメタノールに溶かしPBS中のSPDP−チオール化抗
体又は2M NaCl/PBS中の２−IT−チオール化抗体に加え
た。代表的反応では10当量のADM−HZNを10−20個の反応
性チオール基を有する単クローン性抗体に加えた。コン
ジュゲート形成反応物は１晩４℃で培養した。反応混合
物を10,000×ｇで遠心分離し、次にコンジュゲート形成
したADMを未反応ADMからPD−10カラムを通して分離し
た。抗体に結合したコンジュゲート形成したアントラサ
イクリンの量は495nm（E495＝8030）の吸光度で測定し
た。抗体蛋白質の量は280nm（1mg/ml＝1.4ODユニツト）
の吸光度で測定した。280nmのADM吸光度のオーバラツプ
を補正するために次式を用いた： HPLP分析を用いてコンジュゲートしていないADM又はA
DM誘導体の存在についてイムノコンジュゲートを分析し
た。HPLPは５ミクロンIB−SILC18ビードを充填したPhen
omenexカラムを用いて行なつた。コンジュゲート形成し
ていないADM−HCl、ADM−HZN（0.1μＭ）、又は0.5−５
μＭのアントラサイクリン当量を有するイムノコンジュ
ゲートをカラムに加えてメタノール及び10mM燐酸アンモ
ニウム、pH4.5（70:30）を用い1.5ml/minで溶離させ
た。生成したイムノコンジュゲートはすべて目立たぬ程
度（＜１％）の未コンジュゲート・アントラサイクリン
しかHPLP分析では含んでいなかつた。
本発明のイムノコンジュゲートの特徴 かくして調製したイムノコンジュゲートはアントラサ
イクリンとそれぞれの単クローン性抗体との間のブリツ
ジを形成しているリンカーアームに13−ケト位置でコン
ジュゲートを形成している複数個のADM分子より成る。
更に遊離のチオール基を有する単クローン性抗体をチオ
ピリジルで保護したジスルフイド結合を有するADM−HZN
誘導体に加えると、ADMを抗体に結びつけているリンカ
ーにジスルフイド結合が形成される（式２参照）。本態
様に従つて調製されたイムノコンジュゲートには、これ
に限定されるものでは無いが、5E9−ADM−7.5、3A1−AD
M−7.0、L6−ADM−9.0及びG28.1−ADM−9.0があり、最
初の部分がコンジュゲートを形成した単クローン性抗体
を示し、次の部分が抗体にリンクしているアントラサイ
クリンを示し、数字はそれぞれのイムノコンジュゲート
のADM/抗体のモル比を示す。
この態様に従つて到達できるADM/抗体モル比は、単ク
ローン性抗体上に導入されたチオール基の数とチオール
化した抗体１個に対して加えたADM−HZN誘導体の量によ
つてきまつた。図１及び２の分散ダイヤグラムはほぼ８
個のチオール基を有する5E9又は3A1単クローン性抗体の
いずれかについてADM−HZNを導入した時に、３−４のAD
M/抗体モル比が達成されたことを示している。典型的に
はこれらの反応で蛋白質に対して10倍モル過剰のADM−H
ZNを加えた。18−25個のチオール基を持つたこれらの抗
体を用いるとADM/抗体比は８−10に増加した。単クロー
ン性抗体をチオール化するのにSPDPを用いても２−ITを
用いてもADM/抗体比に著るしい差は認められなかつた
（図１と２を比較）。然しアントラサイクリンの抗体へ
のコンジュゲート形成後の最終蛋白質収率は、２−IT−
チオール化抗体に比してSPDP−チオール化抗体の方が若
干高いことが判明した（図３参照）。SPDP−チオール化
抗体例えば5E9及び3A1について50−80％の蛋白質収率が
通常得られたが、一方２−ITを用いてチオール化した同
一の単クローン性抗体を用いると20−50％の収率が得ら
れた。さらにSPDP又は２−ITで行なつたコンジュゲート
形成についてIgG1イソタイプの単クローン性抗体例えば
5E9及び3A1を用いると若干良いイムノコンジュゲート収
率が得られた（図４及び５参照）。
本発明のイムノコンジュゲートの結合活性はI125標識
抗体を用いた競合的検定用いて決定した。代表的な抗原
陽性及び抗原陰性細胞（１×106）を２％ FBSを含むRP
MI 1640の0.1mlに懸濁し、２倍に引続き稀釈したコンジ
ュゲート形成していない単クローン性抗体の0.1ml又は5
0μg/mlとなるような濃度のイムノコンジュゲートと混
合した。二つの細胞懸濁液を混合しながら４℃で1hr培
養した。細胞を次に２回洗い、５μg/mlの125I−標識化
対応抗体（１−50×104cpm/μｇ抗体蛋白質からの特異
的活性）を含有する0.1mlに懸濁した。試料を４℃で1hr
培養し、４℃に冷却したジブチルフタレート：ジノニル
フタレートの1:1混合物の0.15mlにかぶせた。試料を10,
000×ｇで1min、４℃で遠心分離し、LKBガンマーカウン
ターを用いて細胞結合カウント（ペレツト）を測定し
た。本発明のイムノコンジュゲートの結合活性の保持は
次の表１に示されている。
表に示されるように、SPDPを用いて調製し、3.5乃至
8.5の範囲のモル比を有する5E9イムノコンジュゲート
は、コンジュゲートしていない5E9に比してその当初の
結合活性の80％以上を保持していた。２−ITを用いて調
製した5E9イムノコンジュゲートも高い結合活性を保持
していた。SPDPを用いて調製した3A1イムノコンジュゲ
ートは抗体結合活性が若干低下していることを示した。
一般に、これら及び他の抗体へのADMのコンジュゲート
形成は抗体結合活性の比較的僅かな低下しか生じなかつ
た。
図６は本発明の２種のイムノコンジュゲートの飽和曲
線を示す。コンジュゲートしていない5E9及び3A1単クロ
ーン性抗体の飽和曲線と5E9−ADM−7.5及び3A1−ADM−
7.0を比較した。これらの曲線を得るには、１×106抗原
陽性HSB−２標的細胞を含む0.mlの完全生長培地中でイ
ムノコンジュゲートを４℃で培養した。1hr後、細胞を
２回培地中で洗い、FITC−標識化山羊抗マウスIgG（Boe
hringer−Mannheim）の1:40の稀釈を含む培地の0.1ml中
で更に30min培養した。細胞をCoulter Epics V螢光細胞
分析計で分析した。細胞面螢光を同一に稀釈したコンジ
ュゲートしていない単クローン性抗体を用いて得た螢光
と比較した。図示のように、抗原陽性細胞を飽和するの
に必要なイムノコンジュゲートの濃度は、コンジュゲー
トしていない抗体が必要とする濃度よりも多くても1/2
の稀釈率よりも大きくはない事実から、それぞれのイム
ノコンジュゲートの結合活性が保持されていた。コンジ
ュゲートしていない抗体とイムノコンジュゲートの螢光
強度の高原（飽和）濃度の差は２次的なFITC山羊抗マウ
ス試薬の未コンジュゲート抗体に比して低いイムノコン
ジュゲートへの結合性に起因していることが判明してい
る。
本態様のイムノコンジュゲート……L6−ADMコンジュ
ゲートの……4.0乃至7.0の範囲のpHでの安定性をHPLC分
析を用いて検討した。L6−ADM−9.0コンジュゲートを指
示のpHの燐酸塩緩衝液中37℃で24hr培養した。各溶液を
次にHPLCカラムを通して、コンジュゲートしていない薬
（アントラサイクリン）を定量した。図７に示すよう
に、異なるpHで24hr培養後検知された単一の生成物はAD
M−HZN純品のカラム保持時間を有していた。24時間後に
イムノコンジュゲートから放出された物質の量はpHが７
から４に低下するにつれて増加した。“未処理”対照は
pH7.4の燐酸塩緩衝液中に−20℃で保存したコンジュゲ
ートのクロマトグラフを示す。イムノコンジュゲートが
酸感受性の結合基を有しており、これが抗体蛋白質から
ADMの放出を起こすことが明らかにされた。これらの結
果は、式２に記載したようなADMをリンカーアームに結
びつけているヒドラゾン結合の存在と一致している。
本実施例の態様によれば、ジスルフイド結合も有して
いるリンカーアームを介してADMは抗体に付着している
（式２参照）。従つてDTTを用いた本態様のイムノコン
ジュゲートの還元でADM部分の放出が可能なはずであ
る。そこでL6−ADMコンジュゲート、L6−ADM−9.0、を1
0倍過剰のDTTで処理し、室温で15min、培養しHPLCカラ
ムにかけた。ADM−HCl及びADM−HZN標準品を同時にカラ
ムにかけてクロマトグラフイーからのピークを図８に示
す。DTT添加前にはL6−ADM−9.0はコンジュゲートして
いない薬品の検知できるピークを有していなかつた。HP
LC分析はADM−HZN誘導体よりもADM−HClに同一のカラム
保持時間を有する単一ピークの出現を示した。（図８参
照）。DTT処理後、放出されたADMの量は抗体に結合して
いた原料ADM当量の約99％であつた。図７及び８に示し
た実験データは本態様のイムノコンジュゲートからADM
様の部分が、“生理的”条件、即ち細胞環境で典型的な
酸性及び還元性条件下で放出されることを示している。
本発明のイムノコンジュゲートの細胞阻害活性 本発明のイムノコンジュゲートをさまざまの検定系を
用いて細胞阻害性についてインビトロで試験した。軟寒
天コロニー形成検定によれば、ATTから入手したDaudi
（バーキツトリンパ腫）細胞（表現型:5E9＋、3A1−）
を完全培地〔RPMI 1640培地＋10％ウシ胎児血清）中で
生成させた。1mlの培地中の１×105細胞を逐次的に稀釈
した5E9−ADM又は3A1−ADMイムノコンジュゲート又はコ
ンジュゲートしていないADMに1.5hrさらした。各稀釈に
ついて３回の測定を行なつた。対照はアントラサイクリ
ン等にふれさせない同様に処理した細胞より成つてい
た。細胞を次に洗浄して、15％FBS及び0.3％アガロース
（Marine Colloid）を含むRPMI 1640培地に懸濁した。
細胞懸濁液の1ml（１×103細胞）で６ウエルのマイクロ
タイタープレート（Costar）の0.4％アガロース層を覆
つた。試料を７−10日37℃で培養し、得られたコロニー
を48hr、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレツト
（Sigma）の1mg/mlの0.5mlで染色した。コロニーをOpti
max40−10イメージアナライザーを用いて計数し、未処
理対照に対してADM処理した又はイムノコンジュゲート
処理した細胞を比較してコロニー形成の阻害を測定し
た。
図９は、5E9抗原陽性で3A1抗原陰性のバーキツトリン
パ腫細胞系、Daudiに1.5hr接触させた、5E9−ADMコンジ
ュゲート、5E9−ADM−7.5、及び3A1−ADMコンジュゲー
ト、3A1−ADM−7.0、の細胞阻害活性を比較している。
これらのイムノコンジュゲートはいずれも２−ITでのチ
オールで調製した。用量−反応曲線を比較すると、抗原
を持つ標的細胞に対して当初の結合活性の93％を保持し
ていた（図６参照）5E9−ADM−7.5が、非結合性の対照
コンジュゲート、3A1−ADM−7.0、よりも著しく薬効が
あることを示していた。
滅殺細胞数の対数（log cell kill）の尺度を与える
限界稀釈検定を、より長時間の接触法（24hr）を用い
て、上記の２種のイムノコンジュゲートの細胞阻害薬効
活性の試験に用いた。この検定はM.Colombatti et al.,
“Selective Killing of Target Cells by Antibody−R
icin A Chain or Antibody−Gelonin Hybrid Molecule
s:Comparison of Cytotoxic Potency and Use in Immun
oselection Procedures",J.Immunol.,131,pp.3091−95
（1983）で実質上記載されたようにしてNamalwa細胞
（表現型:5E9＋、3A1−）を用いて行なつた。ATCCから
入手した細胞をイムノコンジュゲートと22hr培養し、洗
浄してlog cell killを測定した。log cell killは限界
細胞濃度で生成しないウエルの部分で見積つた集落形成
率から算出した。
図10に示すように5E9−ADM−7.5は非結合性3A1−ADM
−7.0コンジュゲートに比して、比較した濃度で（対数
で１−２大きい）１−２大きいlog cell killを生じ
た。5E9−ADM−7.5の最高用量で５迄のlog cell killが
測定された。更に非結合性3A1イムノコンジュゲートに
ついて細胞阻害活性が検知されたが、細胞阻害性のレベ
ルは当量のコンジュゲートしていないADMより低かつ
た。然し5E9イムノコンジュゲートの活性は、かなりの
濃度で遊離ADMの当量用量より大であつた。
上述のように5E9−ADM−7.5及び3A1−ADM−7.0イムノ
コンジュゲートはチオール化剤として２−ITを用いて合
成した。チオール化剤としてSPDPを用いて調製したイム
ノコンジュゲートについても免疫特異性の細胞阻害性が
認められた。図11は上述の軟寒天コロニー形成（率）検
定を用いてDaudi細胞について行なつた、チオール化剤
としてSPDPを用いてつくつた、5E9−ADM及び3A1−ADMイ
ムノコンジュゲートの選択的細胞阻害活性を示す。更に
SPDPを用いて調製したイムノコンジュゲートについての
選択的細胞阻害性の証明として図12が示されており、G2
8.1−ADM−9.0イムノコンジュゲートが２種のG28.1抗原
陽性細胞系、Daudi及びNamalwa、及びG28.1抗原陰性ヒ
ト細胞白血病細胞系、HSB−２について軟寒天コロニー
形成検定で試験された。HSB−２細胞はATCCから入手し
た。図示のようにイムノコンジュゲートは２種の抗原陽
性細胞系に対して細胞阻害性があるが、抗原陰性細胞系
については細胞阻害性でなかつた。
イムノコンジュゲート、5E9−ADM−7.5、に依る抗原
陽性細胞の優先的滅殺はM.Brattain博士〔Bristol−Bay
lor Labs,Houston,Tx〕から提供された足場依存性ヒト
結腸癌腫細胞系、HCT116を用いたコロニー形成検定
（法）でも認められた。
癌腫細胞の単層培養をトリプシン−EDTA（GIBCO）を
用いて取出し、洗浄し、22−ゲージ（注射）針を通して
単一の細胞懸濁とした。5E9−ADM−7.5、3A1−ADM−7.0
又はコンジュゲートしていないADMを１×105癌腫細胞を
含む培地の0.2mlで逐次的に稀釈した。各稀釈は３回行
なつた。対照は未処理又は抗体処理細胞であつた。細胞
を3hr培養し、培地中１回洗浄し、1mlに１×103細胞を1
2ウエルのマイクロタイタープレート（Costar）に植え
た。プレートを37℃で７−10日培養して無水メタノール
で10min固定した。コロニーをクリスタルバイオレツト
で染色し、Optimax40−10イメージアナライザーでカウ
ントした。図13に示すように、癌腫細胞を5E9−ADM−7.
5と触れさせた方が、3A1−ADM−7.0の場合よりも大きい
細胞阻害性が認められた。
ADMのアミノ糖で抗体に結合（リンク）しているADMは
医薬活性の著るしい低下を示すイムノコンジュゲートが
形成されると多くの報文が示しているので、抗体にleu
−alaジペプチドリンカーを介してADMのアミノ糖部分で
ADMを付着させて調製したイムノコンジュゲートの細胞
阻害性を軟寒天コロニー形成検定系で試験した。図14に
示すように5E9−ADM−4.0及び3A1−ADM−3.9ペプチド結
合コンジュゲートはいずれもDaudi細胞に対して細胞阻
害性でなかつた。コンジュゲート形成に用いたADM−leu
−ala誘導体はコンジュゲートしていない当量用量のADM
よりも対数で約２薬効が低かつた。
実施例２ この実施例は、ADM分子への付着部位としてアシルヒ
ドラゾン結合を有しており且つ更に抗体への付着部分と
してチオエーテル結合を有するリンカーアームを介し
て、ADMが単クローン性抗体にコンジュゲートしてい
る、本発明のアントラサイクリンイムノコンジュゲート
の製造法を記載している。この態様はADMの新規なアシ
ルヒドラジド誘導体も提供する。
リンカーアーム内にチオエーテル結合を有するイムノコ
ンジュゲートの製造 単クローン性抗体、5E9（2.5ml燐酸塩緩衝食塩水中の
2.5mg）をSMPB（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート）（100μｌテトラヒドロフ
ラン中の59.5μｇ）と30℃で30min反応させた。pHはク
エン酸ナトリウム緩衝剤で6.0に調節した。混合物をPD
−10ゲル過カラム（Pharmacia）を通して未反応物質
からマレイミド含有抗体を分離した。実施例１と同様に
調製したADM−HZN誘導体（1mg）を1mlMeOH/H2O（9:1）
に溶かした、0.5μＭのADM−HZNを4:1アセトン：H2O中
の0.5μＭのトリ−ｎ−ブチルホスフインと反応させて
新規な還元ADM−HZNをつくつた。（式３参照）。10min
後、硫黄の0.1Mトルエン溶液を加えて残つたホスフイン
をこわした。還元ADM−HZNを次に5E9マレイミド含有抗
体と混合した。得られたイミノコンジュゲートをPD−10
ゲル過カラムを通して精製した。トルエン溶媒の除去
が完全でない場合には、有機溶媒層が分離して反応混合
物から若干の蛋白質が浮遊した。溶媒の除去にゆつくり
とした空気流を用い、変性蛋白質は2min、16,000×ｇの
遠心分離で除去した。イムノコンジュゲートを含む透明
上澄み液を次にゲル過し、PBS中pH7.4で分析した。AD
M/抗体モル比は実施例１と同様にOD280及びOD495を用い
分光光度定量した。典型的な反応は３乃至４のモル比を
有するイムノコンジュゲートを生じた。
チオエーテル結合を有するイムノコンジュゲートの細胞
阻害活性 本実施例の態様で調製したイムノコンジュゲートを、
DNA合成の阻害を測る3H−チミジン包含検定を用いて、
抗原陽性対抗原陰性腫瘍細胞系に対しての細胞阻害性に
ついて試験した。この検定法によれば、イムノコンジュ
ゲートはコンジュゲートしていないADMの稀釈を完全培
地中で行ない、各稀釈の100μｌを96−ウエルのマイク
ロタイタープレートのウエルに加えた。各稀釈は３回行
なつた。腫瘍細胞を培地に懸濁し、１×105個の細胞を
含む100μｌを次に各ウエルに加えた。細胞は24hr、37
℃で５％CO2湿度雰囲気で培養した。１μ Ci〔６−3H〕
−チミジン（New England Nuclear,15Ci/mM）の50マイ
クロリツトルを各ウエルに加え、4hr、37℃で培養し
た。細胞をMillititer sv plates（Millipore）に移し2
5％冷トリクロロ酢酸（TCA）で沈でんさせた。沈でんを
10回５％TCAで洗つた。フイルターを乾燥し、パンチし
てEconofluor液体シンチレーシヨン流体（New England
Nuclear）でカウントした。カウント数はすべてバツク
グランドカウントを引いて補正した。
本態様のイムノコンジュゲート……5E9−ADM−3.9…
…は5E9抗原陽性Namalwa及びHSB−２細胞に対して高度
に細胞阻害性であつた（図15参照）。イムノコンジュゲ
ートは当量濃度のコンジュゲートしていないADMよりも
薬効が大きかつた。別の実験では3A1−ADM−6.0イムノ
コンジュゲートは0.1μ/ml ADMよりも低い濃度では3A1
−抗原陽性なHSB−２細胞に対しては細胞阻害性であつ
たが、3A1抗原陰性のNamalwa細胞に対しては細胞阻害性
でなかつたことが判明した（図17参照）。より高い濃度
ではイムノコンジュゲートの細胞阻害性は両細胞系に対
してほぼ同一であつた。
実施例3. 本発明のイムノコンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性 本発明のイムノコンジュゲートを次にインビボで抗腫
瘍活性について試験した。より特にはイムノコンジュゲ
ートをマウス中でのヒトＢリンパ腫腫瘍の生長阻止能に
ついて試験した。
組織培養維持リンパ球細胞の皮下的（s.c.）接種でBA
LB/cヌードマウスに原発性Daudi及びRamos（パーキツト
リンパ腫）の固い腫瘍をつくり出した。Ramos細胞系はA
TCCから入手できる。Daudi及びRamos腫瘍は20−25gの体
重の４−６週の年令のメスのBALB/c（nu/nu）マウス（H
arlan Sprague−Dawley）中を、マウスの側腹位への皮
下移植に１×107腫瘍細胞/0.1ml PBSを用いて、インビ
ボで逐次的に通過させた。両腫瘍系は200乃至4000mm3の
直線的生長速度を示した。指数的生長時の中位の腫瘍の
容積倍化時間はDaudi腫瘍については6.9±0.8日、Ramos
腫瘍については4.4±0.6日であつた。腫瘍容積（Ｖ）は
次式で求めた： 但しＬは長さ（mm）、そしてＷは巾（mm）である。
腫瘍容積がDawdi腫瘍で400−600mm3に、Ramos腫瘍で2
50−400mm3に達した時、５−10匹の群にランダムに区分
して、ADM−HCl（即ち遊離薬）、本発明のADM−イムノ
コンジュゲート、コンジュゲートしていない単クローン
性抗体及び単クローン性抗体＋ADMの混合物を用いる処
置に用いた。細胞滅殺の特異性は試験したイムノコンジ
ュゲート（即ちその抗体成分が滅殺すべき腫瘍細胞と反
応性である）を用いて得られた抗腫瘍活性を、非結合性
コンジュゲート（即ち、腫瘍集団と反応性では無いコン
ジュゲート）を用いた時のものと比較して示された。
処理群の生長曲線を未接種対照と比較した時の腫瘍容
積倍化時間の遅れ（TVDT）から見積つた腫瘍生長阻害
（Ｔ−Ｃ）又は腫瘍倍化の遅れ（TDD）として結果を示
した。TDDは次式を用いて算出した： 但しＴ＝時間（処理群の腫瘍が3000mm3に達するため
の日数）、Ｃ＝時間（対照群の腫瘍が3000mm3に達する
ための日数）、及びTVDT（腫瘍溶積倍化時間）＝時間
（対照（未処理）のマウスの腫瘍容積が1500から3000mm
3に増加するための日数）であつた。各点は実験群の中
位の腫瘍容積を示している。
これらの試験では、Daudi又はRamos腫瘍についてのAD
M−イムノコンジュゲートの抗腫瘍活性をａ）当量用
量、（同じ）投与方法及びスケジュールで遊離の薬（AD
M）を用いて得られた結果、及びｂ）最適用量、投与方
法及びスケジュールで与えた遊離の薬で得られた活性と
比較した。
ここに示したすべての試験で、ADM−HClでの処理では
注射する日に粉末のADM−HClに50−100λDMSOを加え特
定された用量のmg/kg/inj（“inj"とは１回の注射量を
指す）にPBSに溶解、稀釈して腫瘍を持つたマウスに静
脈的に（i.v.尾静脈）又は腹腔内に（i.p.）接種した。
これらの試験に用いたADM−イムノコンジュゲートは実
施例１の方法で調製し、当初の抗体結合活性の90％以上
すべて保持していた。特には単クローン性抗体5E9及びG
28.1をこれらの試験のイムノコンジュゲートの抗体成分
として使用した。ADM−イムノコンジュゲートはPBS中４
℃で保存し、調製後２週間以内に用いた。すべての試験
したイムノコンジュゲート並びにコンジュゲートしてい
ない対照抗体はi.p.投与した。
更に使用した処置スケジュールの記号“Q7Dx3”はこ
の群の各マウスは３回注射を受け、各注射は７日おき、
即ち週に１回注射を受けた。同様に“Q5Dx2”はマウス
が５日おいて２回薬又はコンジュゲートの注射を全体と
して受ける処置スケジュールを示している。Q1Dx1は１
回の注射を指す。従つてここで定義した処置スケジュー
ルでは、最初の数字が注射の間隔（日数）を示し、終り
の数字がスケジュール当りの全体の注射回数を示してい
る。
それで本発明のADM−イムノコンジュゲートの抗腫瘍
活性を先ず、対応する又は当量用量、投与方法及びスケ
ジュールで遊離のADM−HClと比較した。5E9−ADMイムノ
コンジュゲート、5E9−ADM−1.8（モル比＝MR＝1.8ADM
分子/MAB）のDaudi腫瘍への抗腫瘍活性を、ａ）対応す
る薬用量での（4.1mg/kg/inj）のコンジュゲートしてい
ないADM−HCl、ｂ）対応する抗体用量（630mg/kg/inj）
での5E9単クローン性抗体、ｃ）5E9抗体＋ADM−HClの混
合物（4.1mg ADM＋630mg 5E9）、及びｄ）対照としての
非結合性イムノコンジュゲート、L6−ADM−8.6（4.1mg/
kg/inj ADM）の活性と比較した。
当初の腫瘍サイズが800乃至1100mm3の範囲の時の、腫
瘍移植後20日と25日に、マウス（５マウス／群）に（即
ちQ5Dx2スケジュールで）i.p.投与した。この実験に用
いた用量は遊離の薬についての最大許容用量（MTD）、
i.p.即ち所定のルート又はスケジュールで投与した用量
がLD10（動物の10％の死亡）を招く（表２参照）。
図18に示すように、5E9−ADMコンジュゲートで著るし
い抗腫瘍活性が得られた。更にこの抗腫瘍活性は遊離の
薬の当量用量で認められるものよりも大きかつた。そし
て表４に示すようにコンジュゲートで処置した５匹のマ
ウスのうちの３匹は完全な腫瘍の後退（治癒）を有して
いて、これは＞1.5TDDに相当した。これに反して、ADM
−HCl及びコンジュゲートしていない5E9並びにL6−ADM
非結合性コンジュゲートは抗腫瘍活性を示さなかつた。
ADM−HCl＋5E9混合物を用いると若干の腫瘍生長阻害が
認められた。然しこの結果は一時的なもので、統計上不
充分な0.2TDDを示していた。
この実験では４−5mg/kg以上の用量での遊離薬のi.p.
投与に付随する毒性のために遊離の薬は4.1mg/kg/injで
投与した。この低い用量で遊離ADM及びADM＋単クローン
性抗体の混合物はいずれも不活性であつた。然し図18が
明らかにするように、このような低い用量でもADMイム
ノコンジュゲートは腫瘍生長阻止になお活性であつた。
次に、最適の用量、投与方法及びスケジュールで投与
したコンジュゲートしていない薬を用いて得られた抗腫
瘍活性と比較したDaudi腫瘍でのADM−イムノコンジュゲ
ートの抗腫瘍活性を求めることとした。従つて先ずDaud
i細胞に対して最大の抗腫瘍活性となる遊離ADM−HClの
用量、投与方法及びスケジュールをきめる必要があつ
た。この最適化検討のために異なる投与方法、用量及び
スケジュールでマウスにADM−HClを用いた。接種間隔は
使用した処置スケジュールによつてきまつた。次に上述
のようにしてTDD値を求めた。
この最適化検討の結果は表２に要約されている。表２
から明らかなように、i.v.投与Q7Dx3スケジュールが、
腫瘍生長遅れ及び腫瘍後退速度の両方で示した最適の抗
腫瘍応答を11mg/kg/injで与え、これはQ7Dx3スケジュー
ル、i.v.を用いたこの薬についてのMTDでもあつた。
遊離の薬ADM−HClのDaudi腫瘍細胞での抗腫瘍活性は
図19にも示してある。i.v.投与Q7Dx3スケジュールを用
いると、ADM−HClで処置後、９、10又は11mg/kg/injで
用量に依存した形でDaudi腫瘍異種移植の生長が著るし
く阻害された。対照マウスは未処置であつた。MTD、11m
g/kg/inj、での腫瘍生長阻害（Ｔ−Ｃ）は28日であり、
これは1.1TDDに相当していた。
i.p投与を用いるスケジュールについても検討した。
上述のようにADM−HCl、i.p.,のMTDは４−5mg/kg/injで
あるときめられた。表2B）から明らかなように、i.p.投
与ではそのMTDで遊離ADM−HClはDaudi細胞に不活性であ
つた。従つてi.v.投与ではMDTが11mg/kg/injである、Da
udi腫瘍細胞の生長阻害を示す用量、が遊離ADM−HClの
最適抗腫瘍活性が得られるものときめた。
従つて、これらの実験からDaudi腫瘍についての抗腫
瘍活性上の最適ADM−HCl用量は約11mg/kg/injであり、
最適スケジュールはQ7Dx3であり、最適投与ルートはi.
v.であるときまつた。
次に本発明のADM−イムノコンジュゲートのDaudi腫瘍
についての抗腫瘍活性を、上できめた最適条件下で投与
した遊離薬ADM−HClの抗腫瘍活性と比較した。G28.1−A
DMイムノコンジュゲートG28.1−ADM−7.6（MR＝7.6医薬
（ADM）/MAB）、Q5Dx2スケジュール、i.p.で投薬して、
Q7Dx3スケジュール、i.v.で10、11及び12mg/kg/injで投
与したADM−HClと比較した。図20及び表３に示すよう
に、遊離薬ADM−HClは活性で、11mg/kg（そのMTD）では
８匹のマウス中２匹が完全な腫瘍後退（治癒）を生じ、
28日の腫瘍生長の遅れを示した。最高の試験用量（18.7
mg ADM、Q5Dx2、i.p.）でイムノコンジュゲートは良好
な耐性であつて（死亡無く、体重減少無く）、処置した
８匹のうち３匹が完全な腫瘍後退を示して遊離薬よりも
若干高い抗腫瘍活性を示した。更に非結合性L6−イムノ
コンジュゲート、コンジュゲートしていないG28.1又は
コンジュゲートしていないG28.1＋ADM−HClの混合物に
ついては抗腫瘍活性がなかつた。それでADM−イムノコ
ンジュゲートは、最適用量及びスケジュール、i.v.又は
i.p.でのコンジュゲートしていない医薬（ADM−HCl）を
用いて達成されるよりもより大きな程度に腫瘍生長を阻
害すると結論した。
無胸腺マウスのDaudi腫瘍異種移植での異なる製法の5
E9及びG28.1イムノコンジュゲートを用いて得られた抗
腫瘍活性を表４に要約する。最高の反応速度は一貫して
500mg/kg以上の抗体用量であつた。この用量で、1.8乃
至8.6のモル比を有するコンジュゲートを用いて抗腫瘍
活性が得られた。単クローン性抗体用量を増すと、TD
D、即ち腫瘍生長阻害、及び腫瘍後退速度の両方でそれ
に対応する増加があることから、抗腫瘍活性はコンジュ
ゲートした医薬の用量よりも抗体用量に左右されるよう
に見えた。（表示していないが）等しい抗体及びコンジ
ュゲートした医薬の用量で平行的に試験した非結合性L6
−ADMコンジュゲートについてはすべての実験で抗腫瘍
活性が認められなかつた。更にこの表は等量の医薬用量
では不活性の（表２参照）遊離医薬（ADM−HCl）に比し
て本発明のイムノコンジュゲートの増大した薬効を示し
ている。
表５はコンジュゲートしていない医薬に比して、本発
明のADM−イムノコンジュゲートを用いて達成された低
下した毒性を示している。表から明らかなようにイムノ
コンジュゲートはi.p.投与した遊離ADMの1/10以下の毒
性であつた。
図22A及び表６はヒトRamos腫瘍についてのG28.1−ADM
コンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。さらにRamos腫瘍
についてのイムノコンジュゲートの抗腫瘍作用を、16−
18mg/kg/injの用量での単一注射投与であると先に定め
た（表７及び図21参照）最適の結果を与える条件下で遊
離のADM−HClを用いて得られるものと比較した。表７は
マウスでのヒトRamos腫瘍異種移植でのADMのインビボ抗
腫瘍活性をi.v.投与で処置スケジュールと用量を変えて
試験した結果を示している。試験した最高のイムノコン
ジュゲート用量（10.6mg/kg）では、コンジュゲートの
抗腫瘍活性は0.5TDDで18mg/kg（25％致死率）での遊離
薬を用いて得られる活性及び1.0TDDで16mg/kg（12％致
死率）でのADM−HClの活性よりもすぐれていた。この用
量でコンジュゲートは処置動物は耐性があり、体重減少
及び死亡を示さなかつた。図22Bに示すようにG28.1−AD
Mの抗腫瘍活性も用量依存的であることが判明した。従
つてコンジュゲート用量を減らすと、TDD及び完全後退
数の減少を生じた。比較用量（10.6mg/kg）でL6−ADM
（非結合性）は不活性であつた。
上記実施例は細胞阻害性医薬アントラサイクリンが新
規な酸感受性のアシルヒドラゾン結合を介して抗体にコ
ンジュゲートしている新規なアントラサイクリン・イム
ノコンジュゲートの製造法を示している。このイムノコ
ンジュゲートは抗体結合活性（即ち標的細胞特異性）及
び細胞阻害性医薬の活性の両方を保持しており、標的細
胞の細胞環境で代表的な酸性及び還元性条件下で遊離の
未変性医薬（アントラサイクリン）を放出する。これら
のコンジュゲートの抗腫瘍活性はインビトロ及びインビ
ボの両方で示されており、そして遊離のコンジュゲート
していないアントラサイクリンで得られた活性よりも大
であることが示されている。更にコンジュゲートしてい
ないアントラサイクリンに比してイムノコンジュゲート
はインビボで遥かに大きな耐性があつた。従つて本発明
のイムノコンジュゲートは増加した治療指数（抗腫瘍活
性／毒性）を示し、疾病例えば癌及び他の腫瘍、非細胞
破壊性のウイルス性又は他の病原体性感染及び自己免疫
性疾患の処置で、優先的に滅殺すべく選ばれた細胞集団
に対して細胞阻害性医薬を供給するのに特に有用であ
る。
本発明の態様のいくつかを示したが、本発明のイムノ
コンジュゲートと方法を利用する他の態様を本発明の基
本構成から与えることができるのは明白である。従つて
本発明の範囲は特許請求の範囲によつて限定されるもの
であつて、例示として示した態様から判断すべきでな
い。
【図面の簡単な説明】
図１は単クローン性抗体上に置換された反応性チオール
基の数（SH/MAB比）をSPDPチオール化5E9及び3A1単クロ
ーン性抗体とADN−HZNの縮合で製造したイムノコンジュ
ゲートが最終的に到達したADM−MABモル比とを比較した
分散ダイヤグラムである。 図２は２−IT−チオール化5E9及び3A1抗体とADM−MABの
反応で製造したイムノコンジュゲートが最終的に到達し
たADM−MABモル比とSH/MABモル比とより成る分散ダイヤ
グラムである。 図３はSPDP−チオール化抗体か２−IT−チオール化抗体
かを用いて製造した本発明のイムノコンジュゲートのAD
M−MABモル比と蛋白質収率との関係を示す分散ダイヤグ
ラムである。 図４はIgG1イソタイプ（例えば5E9及び3A1）かIgG2イソ
タイプ（例えばL6）のいずれかの単クローン性抗体を用
いて製造したイムノコンジュゲートで得られたADM−MAB
モル比対蛋白質収率から成る分散ダイヤグラムを示す。 図５は抗体が２−ITを用いてチオール化されている以外
は図４と同様なIgG1及びIgG2イソタイプの抗体を有する
イムノコンジュゲートのADM−MABモル比対蛋白質収率よ
り成る分散ダイヤグラムを示す。 図６は本発明の２種のイムノコンジュゲートの結合曲線
をそれぞれコンジュゲートしていない単クローン性抗体
の結合曲線と比較したグラフである。 図７はpH範囲４−７について本発明のイムノコンジュゲ
ートの安定性を示すHPLCクロマトグラフである。このク
ロマトグラフは本発明のアシルヒドラゾン結合の酸感受
性がpHがより酸性になるにつれてイムノコンジュゲート
から放出される遊離ADMが増加することで示されること
を明らかにしている。 図８はDTT処理後、本発明のイムノコンジュゲートから
のADM部分の放出を示すHPLCクロマトグラムである。 図９は軟寒天コロニー形成検定を用いた、本発明のイム
ノコンジュゲートのDaudi細胞系に対する選択的細胞阻
害性を示すグラフである。これらのイムノコンジュゲー
トは２−IT−チオール化抗体を用いて製造した。 図10は限界稀釈検定を用いた、本発明のイムノコンジュ
ゲートのNamalwaの細胞に対する選択的細胞阻害性と、
遊離ADMと比較してイムノコンジュゲートの増加した薬
効を示すグラフである。 図11は軟寒天コロニー形成検定を用いた本発明のイムノ
コンジュゲートのDaudi細胞に対する選択的細胞阻害性
を示すグラフである。この場合、イムノコンジュゲート
はSPDP−チオール化抗体を用いて製造した。 図12は軟寒天コロニー形成検定を用いた本発明のSPDPを
チオール化剤として用いて製造した別のイムノコンジュ
ゲートの選択的細胞阻害性を示すグラフである。このイ
ムノコンジュゲートは抗原陽性のDaudi及びNamalwa細胞
に対しては細胞阻害性であつたが、抗原陰性のHSB−２
細胞には阻害性では無かつた。 図13はヒトの結腸癌腫細胞系（5E9＋、3A1-）に対する
本発明の5E9及び3A1イムノコンジュゲートの、コロニー
形成検定を用いた。選択的細胞阻害性を示すグラフであ
る。 図14はleu−alaジペプチドリンカーを介してADMのアミ
ノ糖残基で単クローン性抗体にADMを付着させてつくつ
たイムノコンジュゲートのDaudi細胞に対して細胞阻害
性が欠けていることを示すグラフである。 図15は13−ケトアシルヒドラゾン結合以外に、そのリン
カーアーム内にチオエーテル結合を有する本発明のイム
ノコンジュゲートの細胞阻害性を示すグラフである。3H
−チミジン包含検定を用いるとイムノコンジュゲートは
遊離ADMよりもNamalwa細胞に対してより大きな効力を示
した。 図16は図15のイムノコンジュゲートの、同一の3H−チミ
ジン包含検定を用いた、HSB−２細胞に対する細胞阻害
性を示す。 図17は、3H−チミジン包含検定を用いた、本発明のイム
ノコンジュゲートの、抗原陽性対抗原陰性の細胞に対す
る細胞阻害性を示すグラフである。イムノコンジュゲー
トは13−ケトアシルヒドラゾン結合の外に、そのリンカ
ーアームにチオエーテルを有している。 図18はマウスのヒトDaudi腫瘍異種移植への本発明のイ
ムノコンジュゲートのインビボ活性を示すグラフであ
る。イムノコンジュゲートは当量用量の遊離ADMを用い
た時よりも遥かに大きい抗腫瘍活性を示した。 図19はQ7Dx3処置スケジュール及びi.v.投与を用いたADM
用量を変えた経時的なマウスのヒトDaudi腫瘍異種移植
についてのADMのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフであ
る。 図20は最適化した遊離ADM（Q7Dx3スケジュールで10−11
mg/kg/injの用量でi.v.投与）の抗腫瘍活性と比較し
た。本発明のイムノコンジュゲートのマウスでのヒトDa
udi腫瘍異種移植についてのインビボ抗腫瘍活性を示す
グラフである。イムノコンジュゲートの方が遥かに大き
な抗腫瘍活性を示した。 図21は単一注射スケジュール及びi.v.投与を用いて、AD
Mの用量を変えたマウスのヒトRamos腫瘍異種移植につい
ての経時的なADMのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフで
ある。 図22Aは最適化した遊離ADM（Q1Dx1スケジュールで16−1
8mg/kg/injでi.v.投与）の抗腫瘍活性と比較した、本発
明のADM−G28.1イムノコンジュゲートのマウスへのヒト
Ramos（ヒトＢ細胞リンパ腫）腫瘍異種移植に対するイ
ンビボ抗腫瘍活性を示すグラフである。 図22Bは本発明のADM−G28.1コンジュゲートの抗腫瘍作
用の用量依存性を示す、コンジュゲートの異なる用量で
のイムノコンジュゲートの経時的なインビボ抗腫瘍活性
を示すグラフである。図22A及び22Bで用いたイムノコン
ジュゲートはカツコ内に与えた抗体を示してあり、コン
ジュゲートしたアントラサイクリンとして示してある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー ジエイ オレク アメリカ合衆国カリフオルニア州 94801 リツチモンド ナインテイーン ス ストリート 570 (72)発明者 タクシ カネコ アメリカ合衆国コネチカツト州 06437 ギルフオード ノースウツド ドライ ブ 398 (56)参考文献 特開 昭61−155334（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−500480（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500749（ＪＰ，Ａ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】滅殺する対象に選ばれた細胞集団と反応す
    る抗体に結合した４−10のアントラサイクリン分子から
    成り、各アントラサイクリンが−13位にケト基を有し且
    つ抗体にリンカーアームを介して連結しており、リンカ
    ーアームはアントラサイクリンの13−ケト位でアシルヒ
    ドラゾン結合を介してアントラサイクリンと共有結合
    し、そしてさらにジスルフィド又はチオエーテル結合を
    介して抗体と共有結合していることを特徴とするイムノ
    コンジュゲート。
  2. 【請求項２】滅殺する対象に選ばれた細胞集団と反応す
    る抗体にリンカーアームを介して連結しているＣ−13位
    のケト基を有する少なくとも１のアントラサイクリン分
    子から成り、リンカーアームはアントラサイクリンの13
    −ケト位でアシルヒドラゾン結合を介してアントラサイ
    クリンと共有結合し、そしてさらにジスルフィド又はチ
    オエーテル結合を介して抗体と共有結合していることを
    特徴とするイムノコンジュゲート。
  3. 【請求項３】アントラサイクリンが、アドリアマイシ
    ン、ダウノマイシン、デトルビシン、カルミノマイシ
    ン、イーダルビシン、エピルビシン、エソルビシン、
    ４′−THP−アドリアマイシン、AD−32及び３′−デア
    ミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）−デキ
    ソルビシンより成る群から選ばれる請求項１記載のイム
    ノコンジュゲート。
  4. 【請求項４】アントラサイクリンがアドリアマイシン又
    はダウノマイシンである請求項１又は２記載のイムノコ
    ンジュゲート。
  5. 【請求項５】抗体が腫瘍細胞と反応する請求項１又は２
    記載のイムノコンジュゲート。
  6. 【請求項６】抗体が、癌腫、黒色腫、リンパ腫、骨又は
    軟質組織肉腫に関連する抗原と反応する請求項５記載の
    イムノコンジュゲート。
  7. 【請求項７】抗体が、Ｂ細胞リンパ腫で見出されるCD37
    抗原と反応する請求項１又は２記載のイムノコンジュゲ
    ート。
  8. 【請求項８】抗体が単クローン性抗体である請求項１記
    載のイムノコンジュゲート。
  9. 【請求項９】抗体が単クローン性抗体5E9,3A1,L6,G28,1
    又はG28.5であり且つアントラサイクリンがアドリアマ
    イシンである請求項１又は２記載のイムノコンジュゲー
    ト。
  10. 【請求項１０】式： （式中、R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOC
    H(OC2H5)2であり； R2は （ここでＸはＨ、NO2又はハロゲンである）であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4はNH2、NHCOCF3、４−モルホリニル、３−シアノ−４
    −モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１
    −ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルアミン、
    シアノメチルアミン又は１−シアノ−２−メトキシエチ
    ルアミンであり； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOHは水素であり、ただしR5がOH又はＯ−THPのときR
    6はOHではなく；そして ｎは１〜10の整数である） を有する化合物。
  11. 【請求項１１】式： （式中、R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOC
    H(OC2H5)2であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4はNH2、NHCOCF3、４−モルホリニル、３−シアノ−４
    −モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１
    −ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルアミン、
    シアノメチルアミン又は１−シアノ−２−メトキシエチ
    ルアミンであり； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOH又は水素であり、ただしR5がOH又はＯ−THPのと
    きR6はOHではなく；そして ｎは１〜10の整数である） を有する化合物。
  12. 【請求項１２】式： （式中、R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOC
    H(OC2H5)2であり； R2は （ここでＸはＨ、NO2又はハロゲンである）であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4及びR7は独立して水素、アルキル、置換基を有するア
    ルキル、シクロアルキル、置換基を有するシクロアルキ
    ル、アリール、置換基を有するアリール、アルアルキル
    又は置換基を有するアルアルキルであるか；又はR4，R7
    及びＮが一緒になって４−７員環を形成しており、而し
    て該環は場合によっては置換基を有し得るものとする； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOH又は水素であり、ただしR5がOH又はＯ−THPのと
    きR6はOHではなく；そして ｎは１〜10の整数である） を有する化合物。
  13. 【請求項１３】アドリアマイシン13−｛３−（２−ピリ
    ジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・ハイドロク
    ロライド（ADM−HZN）。
  14. 【請求項１４】13−｛３−（メルカプトプロピオニル｝
    アドリアマイシンヒドラゾン。
  15. 【請求項１５】式： （式中、R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOC
    H(OC2H5)2であり； R2は （ここでＸはＨ、NO2又はハロゲンである）であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4及びR7は独立して水素、アルキル、置換基を有するア
    ルキル、シクロアルキル、置換基を有するシクロアルキ
    ル、アリール、置換基を有するアリール、アルアルキル
    又は置換基を有するアルアルキルであるか；又はR4，R7
    及びＮが一緒になって４−７員環を形成しており、而し
    て該環は場合によっては置換基を有し得るものとする； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOH又は水素であり、ただしR5がOH又はＯ−THPのと
    きR6はOHではなく；そして ｎは１〜10の整数である） を有する化合物を製造する方法に於いて、 ａ）ω−（R2ジチオ）カルボン酸のＮ−ヒドロキシスク
    シンイミドエステルをヒドラジンと反応させてω−（R2
    ジチオ）カルボン酸ヒドラジドを形成し（但しR2は前記
    定義の通りである）；次いで ｂ）該ヒドラジドを式： （式中、R1はCOCH3，COCH2OH，COCH2OCOCH(OC2H5)2又は
    COCH2OCO(CH2)3CH3であり； R3，R4，R5，R6及びR7は前記定義のとおりである） を有するアントラサイクリンと反応することを特徴とす
    る式： を有する前記化合物を製造する方法。
  16. 【請求項１６】式： （式中、R1はCH3，CH2OH，CH2OCO(CH2)3CH3又はCH2OCOC
    H(OC2H5)2であり； R3はOCH3、OH又は水素であり； R4及びR7は独立して水素、アルキル、置換基を有するア
    ルキル、シクロアルキル、置換基を有するシクロアルキ
    ル、アリール、置換基を有するアリール、アルアルキル
    又は置換基を有するアルアルキルであるか；又はR4，R7
    及びＮが一緒になって４−７員環を形成しており、而し
    て該環は場合によっては置換基を有し得るものとする； R5はOH、Ｏ−THP又は水素であり； R6はOH又は水素であり、ただしR5がOH又はＯ−THPのと
    きR6はOHではなく；そして ｎは１〜10の整数である） を有する化合物を製造する方法に於いて、 式： （式中、R2は （ここでＸはＨ、NO2又はハロゲンである）であり； R1，R3，R4，R5，R6，R7及びｎは前記定義のとおりであ
    る）を有する化合物を還元剤で処理することを特徴とす
    る式： を有する前記化合物を製造する方法。
  17. 【請求項１７】ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−
    ピリジルジチオ）プロピオネートをヒドラジンと反応さ
    せて３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジ
    ドを形成し；次いで ｂ）アドリアマイシン−ハイドロクロライドを該ヒドラ
    ジドと反応させることを特徴とするアドリアマイシン13
    −｛３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル｝−ヒド
    ラゾン・ハイドロクロライドを製造する方法。
  18. 【請求項１８】ａ）抗体をチオール化剤と反応させて；
    次いで ｂ）チオール化した抗体を請求項10,11又は12に記載の
    アシルヒドラゾンと反応させることを特徴とする請求項
    １又は２に記載のイムノコンジュゲートを製造する方
    法。
  19. 【請求項１９】アシルヒドラゾンがアドリアマイシンヒ
    ドラゾンである請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】チオール化剤がＮ−スクシンイミジル−
    ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート又は２−イ
    ミノチオランである請求項18記載の方法。
  21. 【請求項２１】ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−
    ピリジルジチオ）プロピオネートをヒドラジンと反応さ
    せて３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジ
    ドを形成し； ｂ）アドリアマイシン−ハイドロクロライドを該ヒドラ
    ジドと反応させてアドリアマイシン13−｛３−（２−ピ
    リジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・ハイドロ
    クロライド（ADM−HZN）を形成し；次いで ｃ）滅殺する対象に選ばれた細胞集団と反応する、チオ
    ール基が結合されている抗体とADM−HZNとを反応させる
    ことを特徴とする請求項１又は２記載のイムノコンジュ
    ゲートを製造する方法。
  22. 【請求項２２】ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−
    ピリジルジチオ）プロピオネートをヒドラジンと反応さ
    せて、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラ
    ジドを形成し； ｂ）アドリアマイシン−ハイドロクロライドを該ヒドラ
    ジドと反応させて、アドリアマイシン13−｛３−（２−
    ピリジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・ハイド
    ロクロライド（ADM−HZN）を形成し； ｃ）該ADM−HZNを還元剤で処理して、13−｛３−（メル
    カプトプロピオニル）｝アドリアマイシンヒドラゾンを
    形成し；次いで ｄ）滅殺する対象に選ばれた細胞集団と反応する、マレ
    イミド基が結合されている抗体と該ヒドラゾンとを反応
    させることを特徴とする請求項１又は２記載のイムノコ
    ンジュゲートを製造する方法。
  23. 【請求項２３】請求項１又は２に記載の少なくとも１の
    イムノコンジュゲートの医薬的有効量及び医薬上許容し
    得るキリヤーより成ることを特徴とする癌、非悪性腫
    瘍、非細胞破壊性ウイルス又は他の病原体的感染、及び
    自己免疫性疾患より成る群から選ばれた疾病の治療用医
    薬組成物。
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