NO178229B

NO178229B - Anthracyclinhydrazonderivater samt fremgangsmåte for fremstilling av anthracyclinimmunkonjugater ved anvendelse av disse

Info

Publication number: NO178229B
Application number: NO890593A
Authority: NO
Inventors: Robert S Greenfield; Gary R Braslawsky; Lee J Olech; Takushi Kaneko
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1988-02-11
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1995-11-06
Also published as: FI102355B; IL106992A0; IL89220A0; DE68915179T2; DK63989D0; IE64650B1; FI890599A0; DK175174B1; NO950099D0; FI890599A; NZ227911A; IL106992A; FI102355B1; JP2740841B2; PT89683B; NO890593D0; EP0328147A3; KR890012658A; EP0328147A2; KR960015398B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår hittil ukjente anthra-cyclinhydrazonderivater samt fremgangsmåter for fremstilling av nye anthracyclinimmunderivater ved anvendelse av disse. Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse fremstilling av immunkonjugater omfattende et antistoff som er reaktivt med en utvalgt cellepopulasjon som skal tilintetgjøres, hvilket antistoff har et antall cytotoksiske anthracyclinmolekyler kovalent bundet til dets struktur. Hvert anthracyclinmolekyl er konjugert til antistoffet via en linkerarm, idet anthracyclinet er bundet til linkeren via en syrefølsom acylhydrazonbinding i anthracyclinets 13-keto-stilling. En foretrukket utfør-elsesform ifølge foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et adriamycinimmunkonjugat hvor adriamycin er knyttet til linkerarmen via en acylhydrazonbinding i 13-ketostillingen.

Enn videre inneholder linkeren en disulfid- eller thioetherbinding som en del av antistoffbindingen til immunkonjugatet. Foreliggende oppfinnelse angår videre hittil ukjente acylhydrazonderivater av anthracyclinet som anvendes ved fremstillingen av immunkonjugatene.

Den syrefølsomme acylhydrazonbinding i de omhandlede immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen tillater fri-gjøring av anthracyclin fra immunkonjugatet i målcellenes syreholdige ytre eller indre miljø. Immunkonjugatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor nyttige i antistoff-formidlede legemiddelfremføringssystemer til preferensiell til-intetgjørelse av en utvalgt populasjon av celler ved behand-

ling av sykdommer, slik som cancer og andre tumorer, ikke-cytocide viralinfeksjoner eller andre patogene infeksjoner samt autoimmunsykdommer.

Anthracycliner er antibiotiske forbindelser som ut-

viser cytotoksisk aktivitet. Undersøkelser har vist at anthracycliner kan tilintetgjøre celler på forskjellig måte, herunder 1) innføyelse av legemiddelmolekylene i en celles DNA for inhibering av DNA-avhengig nucleinsyresyntese,

2) frembringelse ved hjelp av legemidlet av frie radikaler

som deretter reagerer med cellulære makromolekyler for øde-leggelse av cellene, eller 3) interaksjoner av legemiddel-

molekylene med cellemembranen (se f.eks. C. Peterson et al., "Transport and Storage of Anthracyclines in Experimental Systems and Human Leukemia", i Anthracycline Antibiotics in Cancer Therapy, F.M. Muggia et al. (red.), s. 132

(Martinus Nijhoff Publishers 1982) og N.R. Bachur, "Free Radical Damage", id. s. 9 7-102). På grunn av deres cytotoksiske potensial er anthracycliner blitt anvendt ved behandling av et utall cancersykdommer slik som leukemi, bryst-carcinom, lungecarcinom, ovarie-adenocarcinom og sarcomer (se f.eks. P.H. Wiernik, "Current Status of Adriamycin and Daunomycin in Cancer Treatment", i Anthracyclines: Current Status and New developments, S.T. Crooke et al. (red.), s. 273-294 (Academic Press 1980)). Vanlig anvendte anthracycliner omfatter adriamycin og daunomycin.

Selv om disse forbindelser kan være nyttige ved behandling av neoplasmer og andre sykdomstilstander hvor en utvalgt cellepopulasjon ønskes tilintetgjort, er deres terapeutiske virkning ofte begrenset av den dose-avhengige toksisitet som er forbundet med administrering derav. Ved behandling av tumorer er f.eks. myeloundertrykkelse og cardio-toksisitet typiske uønskede bivirkninger (se S.T. Crooke, "Goals for Anthracycline Analog Development at Bristol Laboratories",

i Anthracyclines: Current Status and New Developments, ovenfor, s. 11). Man har derfor ved behandlingen av tumorer gjort forsøk på å forbedre de terapeutiske virkninger av disse forbindelser ved å binde anthracyclinet til antistoffer rettet mot turnor-assosierte antigener. På denne måte kan legemidlet fremføres til eller "målrettes" mot tumorområdet,

og dets toksiske bivirkninger på normale celler i legemet

kan forminskes. Immunkonjugater omfattende anthracycliner, adriamycin (ADM) eller daunomycin (DAU) bundet til polyklonale eller monoklonale antistoffer rettet mot turnor-assosierte antigener, er kjent innen teknikken (se f.eks.

J. Gallego et al., "Preparation of Four Daunomycin-Monoclonai Antibody 791T/36 Conjugates with Anti-Tumor Activity", Int.

J. Cancer, 33, s. 737-744 (1984) og R. Arnon et al., "In

vitro and in vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin with Anti-Tumor Antibodies", Immunological Rev., 62, s. 5-27 (1982)).

De hyppigst anvendte måter for å binde et anthracyclin til et antistoff er benyttelse av en binding til anthracyclinets sukkerrest. Aminosukkeret er f.eks. blitt oxydert ved natriumperjodatbehandling og direkte knyttet til lysin-restene på antistoffet ved Schiff-basedannelse (se f.eks.

E. Hurwitz et al., "The Covalent Binding of Daunomycin and Adriamycin to Antibodies, with Retention of Both Drug and Antibody Activities", Cancer Res., 35, s. 1182-1186 (1975)). Alternativt er anthracycliner blitt bundet til antistoffer ved carbodiimid-formidlet binding av anthracyclinets amino-sukker til carboxylgrupper på antistoffet (se,f.eks.

E. Hurwitz et al., ovenfor). Anthracycliner er også blitt bundet til antistoffer ved tverrbinding av legemidlets amino-sukker og aminogrupper på antistoffet med glutaraldehyd (se f.eks. M. Belles-Isles et al., "In vitro Activity of Daunomycin-Anti-AlphaFetoprotein Conjugate on Mouse Hepatoma Cells", Br. J. Cancer, 41, s. 841-842 (1980)). Undersøk-elser med immunkonjugater hvor aminosukkerdelen i anthra-cyclinmolekylet er modifisert ved binding til antistoffet, indikerer imidlertid et tap i cytotoksisk aktivitet hos det konjugerte legemiddel (se f.eks. R. Arnon et al., ovenfor,

s. 7-8). Undersøkelser av anthracyclinanaloger indikerer enn videre at modifikasjoner av anthracycliner i deres amino-sukkerdel resulterer i et fall i cytotoksisk aktivitet hos legemiddelanalogene i forhold til stamlegemidlet (se f.eks. K. Yamamoto et al., "Antitumor Activity of some Derivatives of Daunomycin at the Amino and Methyl Ketone Functions",

J. Med. Chem., 15, s. 872-875 (1972)).

Ytterligere andre immunkonjugater er blitt fremstilt hvor anthracyclinet daunomycin er blitt bundet direkte til et antistoff i 14-carbon-(C-14)-stillingen i legemidlet.

Den cytotoksiske aktivitet rettet selektivt mot tumorceller hos disse immunkonjugater var imidlertid ikke lett å reprodusere og kunne påvises konsistent bare ved en konsentrasjon på 20 yg/ml (se J. Gallego et al., ovenfor).

I JP-patentsøknad nr. 274.658 beskrives konjugeringen av et anthracyclin til et antistoff via en 13-keto-acylhydrazonbinding. Denne konjugasjon ble utført ved metoder som omfattet derivatisering av antistoffet og etterfølgende omsetning av derivatet med anthracyclin. Disse metoder er ikke å foretrekke da derivatisering av antistoffet innbe-fatter uønskede ikke-spesifikke reaksjoner, og det oppnås meget lave anthracyclin:antistoff-forhold.

Ifølge den første metode behandles antistoffet med carbodiimid i nærvær av hydrazin under dannelse av et hydrazido-antistoffderivat som deretter omsettes med anthracyclinet slik at anthracyclinet bindes direkte til antistoff-strukturen. De resulterende immunkonjugater utviser imidlertid tendens til aggregering av antistoffmolekylene.

Da denne metode krever carboxylsyregrupper på antistoffmolekylet som er begrenset i antall, har disse immunkonjugater enn videre lave anthracyclin:antistoff-forhold

(ca. 1,1-1,3).

Den andre metode omfatter omsetning av antistoffet med ravsyreanhydrid under dannelse av et amidsyrederivat av antistoffet. Dette derivat omsettes deretter med hydrazin under dannelse av et antistoff-hydrazidderivat som deretter omsettes med anthracyclinet.. daunomycin. Denne andre metode har den ulempe at omsetningen av antistoffderivater med hydrazin ikke er spesifikk, hvilket fører til fremstilling av en blanding av forskjellige antistoffderivater utover det ønskede hydrazidderivat. Som beskrevet i ovennevnte JP-patentsøknad nr. 274.658, er molforholdet mellom anthracyclin og antistoff således meget lavt (ca. 1, se JP-patentsøknad nr. 274.658, s. 264, spalte 1).

Andre anthracyclinhydrazoner er blitt beskrevet av G.L. Tong et al., J. Med. Chem., 21, s. 732-737 (1978),

T. Smith et al., J. Med. Chem., 21, s. 280-283 (1978) og R.T.C. Brownlee et al., J. Chem. Soc, s. 659-661 (1986).

I US patentskrift nr. 4.112.217 beskrives bis-hydrazoner av daunomycin og adriamycin.

I andre undersøkelser er anthracycliner blitt bundet til bærere med høy molekylvekt, slik som dextran eller polyglutaminsyre, for å øke den cytotoksiske aktivitet og redusere toksisiteten av legemidlet (se f.eks. R. Arnon et al., ovenfor, s. 5, og E. Hurwitz et al., "Soluble Macro-molecules as Carriers for Daunorubicin", J. Appl. Biochem., 2, s. 25-35 (1980)). Disse bærer-bundne anthracycliner også blitt bundet covalent til antistoffene rettet mot tumorassosierte antigener under dannelse av immunkonjugater til målretting av det cytotoksiske legemiddel, i særdeleshet mot tumorceller. Adriamycin er eksempelvis blitt bundet til et slikt "antitumor"-antistoff via en carboxymethyl-dextranhydrazid-bro hvor adriamycinmolekylet var bundet til et hydrazinderivat av carboxymethyl-dextran ved hjelp av C-13-carbonylsidekjeden i adriamycins tetracyclinring under dannelse av et hydrazon.

Antistoffet ble deretter bundet til dextranhydrazid-derivatet med glutaraldehyd under dannelse av et adriamycin-dex-antistoffkonjugat (se R. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies as Carriers for Immunotargeting of Drugs", i Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,

R.W. Baldwin et al., (red.), s. 365-383 (1985), og E. Hurwitz et al., "A Conjugate of Adriamycin and Monoclonal Antibodies to Thy-1 Antigen Inhibits Human Neuroblastoma Cells in vitro", Ann. N.Y. Acad. Sei., 417, s. 125-136 (1983)).

Anvendelse av bærere medfører imidlertid visse ulemper. Bærerholdige immunkonjugater er eksempelvis temme-lig store og fjernes hurtig av det retikuloendotele system in vivo (se f.eks. R.O. Dillman et al., "Preclinical Trials with Combinations and Conjugates of T101 Monoclonal Antibody and Doxorubicin", Cancer Res., 46, s. 4886-4891 (1986)). Denne hurtige fjerning av de bærer-holdige immunkonjugater er muligens ikke fordelaktig ved behandling da det konjugerte legemiddel kanskje aldri når det tilsiktede virknings-område, dvs. den utvalgte cellegruppe som skal tilintet-gjøres. Enn videre kan tilstedeværelsen av bæreren med høy molekylvekt påvirke stabiliteten av immunkonjugatet i negativ retning, og det har vist seg at bæreren reduserer bindingsaktiviteten av antistoffet til konjugatet (se f.eks.

M.J. Embleton et al., "Antibody Targeting of Anti-Cancer

Agents.", i Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (red.), s. 323-324 (1985)). Undersøkelser med tumorceller har enn videre vist at det er ikke noe bevis for at immunkonjugater inneholdende bærere med høy molekylvekt, er i stand til å lokalisere seg til tumorceliene in vivo, se f.eks. C.H.J. Ford et al., "Localization and Toxicity Study of a Vindesine-Anti-CEA Conjugate in Patients with Advanced Cancer", Br. J. Cancer, 47, 35-42 (1983), som beskriver lokalisering av direkte konjugerte legemiddel-antistoffkonjugater til tumorceller in vivo.

Konjugering av anthracycliner til antistoffer ved bruk av spesifikke bindinger og bærere er således blitt beskrevet. Som ovenfor beskrevet, medfører anvendelsen av disse immunkonjugater klare ulemper avhengig av den spesifikke binding eller bærer som anvendes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en hittil ukjent kjemi for binding av et antall cytotoksiske anthracyclinmolekyler via en linkerarm til et antistoff rettet mot en utvalgt målcellepopulasjon som skal tilintetgjøres.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for fremstilling av et immunkonjugat omfattende et antall anthracyclinmolekyler bundet til et antistoff som kan reagere med en utvalgt cellepopulasjon som skal tilintet-gjøres, idet hvert anthracyclin inneholder en ketogruppe i C-13-stillingen og er knyttet til antistoffet via en linkerarm som er covalent bundet til anthracyclinet ved en acylhydrazonbinding i 13-keto-stillingen i anthracyclinet, kjennetegnet ved at man

a) omsetter antistoffet med et thioleringsmiddel, og b) omsetter det thiolerte antistoff med et acylhydrazon med formel I

hvori

A er -S-R2 eller -SH,

A<1> er R4 eller -NR7R8,

R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO( CH2 )3CH3 eller CH2OCOCH( OC2H5 )2, R<2> er

hvori

X er hydrogen, N02 eller halogen,

R<3> er OCH3, OH eller hydrogen,

R<4> er NH2, NHCOCF3, 4-morfolinyl, 3-cyano-4-morfolinyl, 1-piperidinyl, 4-methoxy-l-piperidinyl, benzylamin, dibenzyl-amin, cyanomethylamin eller l-cyano-2-methoxyethylamin,

R<5> er OH, O-THP eller hydrogen,

R<6> er OH eller hydrogen, under den forutsetning at R<6> ikke er OH når R<5> er OH eller O-THP,

R<7> og R<8> uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, substituert alkyl, sykloalkyl, aryl, substituert aryl, aralkyl eller substituert aralkyl, eller R7 og R<8> danner sammen en 4-7 leddet ring som eventuelt kan være substituert, og

n er et helt tall fra 1-10.

En annen foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter syntese av et hittil ukjent adriamycin-hydrazonderivat (ADM-HZN) som deretter kondenseres med et thiolert antistoff, hvilket resulterer i binding av anthracyclinet til antistoffet via en linkerarm. En acylhydrazonbinding dannet i C-13-stillingen av ADM, tjener som bindingsplass for ADM til linkeren. Enn videre finnes en disulfidbinding i linkeren som plass ^or binding av antistoffet. Ifølge en annen foretrukket utførelsesform reduseres ADM-HZN under dannelse av en sulfhydrylgruppe, og det resulterende, hittil ukjent hydrazonderivat kondenseres med et maleimidderivatisert antistoff. Dette fører til dannelse av en linkerarm med en acylhydrazonbinding som plass for linkerbinding til C-13-stillingen i ADM og en thioetherbinding i linkeren som de av linkerbindingen til antistoffet. Som det fremgår av disse utførelsesformer, tilveiebringes også ifølge oppfinnelsen hittil ukjente acylhydrazonderivater av anthracycliner, hvilke derivater er nyttige som mellomprodukter ved fremstilling av immunkonjugatene.

Anthracyclinhydrazonderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at de har formelen (I)

hvori

A er -S-R<2> eller -SH,

A<1> er R4 eller -NR7R8,

R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO( CH2 )3CH3 eller CH2OCOCH( OC2H5 )2, R<2> er

hvori

X er hydrogen, N02 eller halogen,

R<3> er OCH3, OH eller hydrogen,

R<5> er OH, O-THP eller hydrogen,

R<6> er OH eller hydrogen, under den forutsetning at R6 ikke er

OH når-R<5> er OH eller O-THP,

n er et helt tall fra 1-10.

Immunkonjugatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse utviser anthracyclin:antistoff-molforhold på ca. 4-10 og bibeholder både antistoffaktivitet og cytotoksisk legemiddelaktivitet for tilintetgjørelse av utvalgte målceller. Den syrefølsomme hydrazonbinding som er til stede på plassen for binding av anthracyclin til immunkonjugatets linkerarm og enn videre disulfid- eller thioetherbindingene i linkerarmen ifølge foretrukne utførelsesformer er ideelle til frigjørelse av det aktive legemiddel under like reduksjons- og syrebeting-elser som typisk forekommer i celler, eksempelvis i lyosomale vesikler.

De omhandlede immunkonjugat er kan anvendes i farma-søytiske preparater, eksempelvis preparater inneholdende en farmasøytisk virksom mengde av minst ett immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Foreliggende oppfinnelse beskrives i det etterfølg-ende nærmere under henvisning til tegningene hvori

fig. 1 avbilder skjematisk syntesen av det hittil ukjent ADM-HZN-hydrazonderivat anvendt ved fremstilling av immunkonjugatene,

fig. 2 viser skjematisk syntesen av immunkonjugatene ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen hvor et monoklonalt antistoff først thioleres under anvendelse av enten SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat) eller 2-IT (2-iminothiolan), og hvor det thiolbehandlede antistoff deretter ble omsatt med ADM-HZN under dannelse av et immunkonjugat med en hydrazonbinding i 13-keto-stillingen av ADM og en disulfidbinding i linkerarmen,

fig. 3 viser et punktdiagram som sammenligner antallet av reaktive thiolgrupper substituert på det monoklonale antistoff (SH:MAB-forhold) med det sluttelige ADM:MAB-molforhold oppnådd i immunkonjugater fremstilt ved kondensering av de SDSP-thiolerte, monoklonale SE9 og 3Al-antistoffer

med ADM-HZN,

fig. 4 viser et punktdiagram som sammenligner SH:MAB-forholdet med det sluttelig ADM:MAB-molforhold erholdt i immunkonjugater fremstilt ved omsetning av 2-lT-thiolerte 5E9 og 3Al-antistoffer med ADM-HZN,

fig. 5 viser et punktdiagram som viser forholdet mellom ADM:MAB-molforholdet og proteinutbyttet av immunkonjugater fremstilt under anvendelse av enten SPDP-thiolerte antistoffer eller 2-IT-thiolerte antistoffer,

fig. 6 viser et punktdiagram som sammenligner ADM:MAB-molforholdet overfor proteinutbyttet oppnådd ved immunkonjugatfremstillinger under anvendelse av monoklonale antistoffer av enten IgG^isotypen (f.eks. 5E9 eller 3A1) eller IgG2-isotypen (f.eks. L6), hvilke antistoffer var blitt thiolert med SPDP,

fig. 7 viser også et punktdiagram som sammenligner ADM:MAB-molforholdet overfor proteinutbyttet av immunkonjugater med antistoffer av IgG^ eller IgG2-isotypen (som i fig. 6), bortsett fra at disse antistoffer var blitt thiolert under anvendelse av 2-IT,

fig. 8 i grafisk form viser bindingskurvene for to immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen sammenlignet med bindingskurvene for de respektive ukonjugerte monoklonale antistoffer,

fig. 9 viser en HPLC kromatografisk kurve som viser stabiliteten av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen i et pH-område på 4-7, hvilken kromatografiske kurve viser syrefølsomheten av acylhydrazonbindingen som indikert ved den stigende frigjørelse av fritt ADM fra immunkonjugatet idet pH-verdien blir surere,

fig. 10 viser en HPLC kromatografisk kurve som viser frigjørelsen av en ADM-rest fra et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen etter behandling med DTT,

fig. 11 viser i grafisk form den selektive cytotoksisitet av immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen overfor Daudi-cellelinjen ved anvendelse av en kolonidannelsesprøve i myk agar, hvilke immunkonjugater ble fremstilt under anvendelse av 2-IT-thiolerte antistoffer,

fig. 12 viser i grafisk form den selektive cytotoksisitet av immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen overfor Namalwa-celler og den stigende styrke av immunkonjugatene sammenlignet med fritt ADM under anvendelse av et grensefor-tynningsforsøk,

fig. 13 viser i grafisk form den selektive cytotoksisitet av immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen overfor Daudi-celler under anvendelse av en kolonidannelsesbestemmelse i myk agar, idet immunkonjugatene i dette tilfelle var fremstilt under anvendelse av SPDP-thiolerte antistoffer,

fig. 14 viser i grafisk form den selektive cytotoksitet av et annet immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen fremstilt med SPDP som det thiolerende middel, idet dette immunkonjugat var cytotoksisk overfor antigen-positive Daudi-og Namalwa-celler, men ikke overfor antigen-negative HSB-2-celler under anvendelse av kolonidannelses-utprøvning i myk agar,

fig. 15 viser den selektive cytotoksitet av 5E9 og 3A1-immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen overfor en human kolon-carcinocellelinje (5E9+, 3A1-) under anvendelse av en kolonidannelsesbestemmelse,

fig. 16 viser i grafisk form mangelen på cytotoksisitet overfor Daudi-celler av immunkonjugater fremstilt ved binding av ADM til monoklonale antistoffer på ADM's amino-sukkerrest via en leu-ala-dipeptidlinker,

fig. 17 viser i skjematisk form syntesen av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen hvor det hittil ukjente ADM-HZN derivat ifølge oppfinnelsen reduseres og omsettes med et SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)-butyrat)-behandlet antistoff under dannelse av et immunkonjugat med en linkerarm med en thioetherbinding i dets struktur,

fig. 18 viser i grafisk form cytotoksisiteten av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen med en thioetherbinding i linkerarmen i tillegg til 13-keto-acylhydrazonbindingen, hvilket immunkonjugat utviste større styrke i forhold til det frie ADM overfor Namalwa-celler ved anvendelse av en <3>H-thymidin-inkorporeringsbestemmelse,

fig. 19 viser i grafisk form cytotoksisiteten av immunkonjugatet ifølge fig. 18 overfor HSB-2-celler under

anvendelse av samme <3>H-thymidin-inkorporeringsbestemmelse,

fig. 20 viser i grafisk form den selektive cytotoksisitet av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen mot antigenpositive celler overfor antigen-negative celler ved anvendelse av angitte <3>H-thymidin-inkorporeringsbestemmelse, idet immunkonjugatet i tillegg til 13-keto-acylhydrazonbindingen også har en thioetherbinding i dets linkerarm,

fig. 21 viser i grafisk form in vivo anti-tumoraktiviteten av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen på humane Daudi-tumor-xenotransplantater i mus, hvilket immunkonjugat utviste større anti-tumoraktivitet enn observert ved anvendelse av en ekvivalent dose av fritt ADM,

fig. 22 viser i grafisk form in vivo anti-tumoraktiviteten av ADM på humane Daudi-tumor-xenotransplantater i mus mot tiden og ved forskjellige doser ADM under anvendelse av et Q7Dx3-behandlingsskjema og i.v. administrering,

fig. 23 viser i grafisk form in vivo anti-tumoraktiviteten av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen på humane Daudi-tumor-xenotransplantater i mus sammenlignet med anti-tumoraktiviteten av optimert fritt ADM (gitt i.v. under anvendelse av et Q7Dx3-behandlingsskjema ved en dose på 10-11 mg/kg/injeksjon), hvilket immunkonjugat utviste størst anti-tumoraktivitet,

fig. 24 viser i tabellform in vivo anti-tumoraktiviteten av ADM på humane Ramos-tumor-xenotransplantater i mus ved i.v. administrering, men ved varierende behandlingskjemaer og -doser,

fig. 25 viser i grafisk form in vivo anti-tumoraktiviteten av ADM på humane Ramos-tumor-xenotransplantater i mus mot tiden og ved forskjellige doser av ADM ved anvendelse av et behandlingsskjerna med en enkel injeksjon og i.v. administrering,

fig. 26A viser i grafisk form in vivo anti-tumoraktiviteten av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen på humane Ramos-tumor-xenotransplantater i mus sammenlignet med anti-tumoraktiviteten av optimert, fritt ADM (gitt i.v. under anvendelse av et QlDxl-behandlingsskjema ved 16-18 mg/kg/injeksjon), hvilket immunkonjugat utviste større anti-tumoraktiviteten det frie ADM, og

fig. 26B viser in vivo anti-tumoraktiviteten av immunkonjugatet mot tiden ved forskjellige doser av konjugatet, hvilket viser den doseavhengige art av konjugatets anti-tumorvirkning, idet dosemengdene av de i fig. 26A og 26B testede immunkonjugater er angitt som input av konjugert anthracyclin, og antistoff-input er angitt i parentes.

Foreliggende oppfinnelse belyses nærmere i det etter-følgende.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av hittil ukjente anthracyclin-immunkonjugater, samt hittil ukjente anthracyclinacylhydrazonderivater anvendt som mellomprodukter ved fremstilling av disse. Foreliggende oppfinnelse angår nærmere bestemt fremstilling av immunkonjugater omfattende et antistoff rettet mot en utvalgt cellepopulasjon, hvilket antistoff har et antall anthracyclinmolekyler bundet til sin struktur. Anthracyclinmolekylene er bundet covalent til antistoffet slik at det dannes en linkerarm mellom hvert legemiddelmolekyl og antistoffet, idet linkeren er bundet til anthrasyclinet via en acylhydrazonbinding i 13-keto-stillingen på anthracyclinet. Dette kan oppnås på trinnvis måte ved innledningsvis dannelse av et hittil ukjent anthracyclin-hydrazonderivat som deretter omsettes med et antistoff med passende spesifisitet (se f.eks. R.R. Hardy, "Purification and Coupling of Fluorescent Proteins for use in Flow Cytometry", i Handbook of Experimental Immunology, vol. 1, Immunochemistry, D.M. Weir et al., (red.), s. 31.4-31.12 (4. utgave, 1986) for beskrivelse av konvensjonell antistoff-koblingsteknikk). Lengden av den linkerarm som forbinder anthracyclin- og antistoffkomponentene i immunkonjugatet, kan variere så lenge bindingsplassen for linkere til anthracyclinet er i form av et acylhydrazon i C-13-stillingen på anthracyclinet. Linkerarmen kan enn videre inneholde en annen binding slik som en disulfid-, thioether, amid-, carbamat-, ether- eller esterbinding, et sted mellom bindingsstedet for legemidlet til bindingsstedet for antistoffet.

De anthracycliner som inngår i immunkonjugatene ifølge oppfinnelsen, kan være vilkårlige anthracycliner som inneholder en ketogruppe i 13-carbon (C-13)-stillingen. Slike anthracycliner omfatter adriamycin, daunomycin, detorubicin, carminomycin, idarubicin, epirubicin, esorubicin, 4'-THP-adriamycin, AD-32 og 3'-deamino-3'-(3-cyano-4-morfolinyl)-doxorubicin (se A.M. Casazza, "Experimental studies on New Anthracyclines", i Adriamycin: Its Expanding Role in Cancer Treatment, M. Ogawa et al. (red.), s. 439-52 (Excerpta Medica 1984)).

De antistoffer som inngår i immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan være vilkårlige antistoffer som reagerer med en spesifikk cellepopulasjon som ønskes eliminert eller tilinetgjort. Eksempler på slike antistoffer omfatter antistoffer som binder til tumorassosierte antigener, slik som antigener som finnes på carcinomer, melanomer, lymfomer, ben-eller mykvevsarcomer samt andre tumorer, antistoffer som binder virus-antigener eller andre patogen-assosierte antigener, samt antistoffer som binder til unormale celleoverflate-antigener. Disse antistoffer kan være polyklonale eller fortrinnsvis monoklonale, og kan fremstilles ved kjente metoder innen faget (se f.eks. R.A. DeWeger et al., "Eradi-cation of Murine Lumphoma and Melanoma Cells by Chlorambucil-Antibody Complexes", Immunological Rev., 62, s. 29-45 (1982)

(fremstilling av tumor-spesifikke polyklonale antistoffer og anvendelse derav i konjugater), og M. Yeh et al., "Cell Surface Antigens of Human Melanoma Identified by Monoclonal Antibody", Proe. Nati. Acad. Sei., 76, s. 2927-2931 (1979) samt J.P. Brown et al., "Structural Characterization of Human Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies", J. Immunol., 127 (nr. 2), s. 539-546 (1981) (fremstilling av tumorspesifikke monoklonale antistoffer). Eksempelvis kan det monoklonale antistoff L6 som er spesifikt overfor humane lunge-carcinomceller, eller det monoklonale antistoff 791T/36 som er spesifikt overfor osteogene sarcomceller, anvendes. Ikke-internaliserende eller fortrinnsvis internaliserende antistoffer kan anvendes. Uttrykket "antistoff" omfatter slik det anvendes i foreliggende beskrivelse, intakte anti-stoffmolekyler eller -fragmenter inneholdende det aktive bindingsområde for antistoffmolekylet, f.eks. Fab eller F(ab')2« Hvis det anvendes monoklonale antistoffer, kan disse være av murin eller human opprinnelse eller være kimære antistoffer.

Antistoffene i immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen fremfører således anthracyclinmolekylene til den bestemte celleproliferasjon med hvilken antistoffet er reaktivt. Et antistoff rettet mot et antigen som finnes på over-flaten av tumorceller, vil f.eks. binde til og fremføre dets anthracycliner til disse tumorceller, eller et antistoff rettet mot et protein hos humant immunsvekkende virus (HIV) som forårsaker AIDS, vil fremføre dets cytotoksiske anthracycliner til HIV-infiserte celler. Frigjørelse av legemidlet i eller på stedet for den bestemte cellepopulasjon hvormed antistoffet reagerer, resulterer i preferensiell tilintetgjørelse av disse bestemte celler. Det er således åpenbart at immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen er nyttige ved behandling av en vilkårlig sykdom hvor en spesifikk cellepopulasjon søkes tilintetgjort, idet cellepopulasjonen har et celleover-flateantigen som tillater binding av immunkonjugatet. De sykdommer som de angjeldende immunkonjugater er nyttige for, omfatter cancer og andre tumorer, ikke-cytocide viralinfeksjoner eller andre patogene infeksjoner, slik som AIDS, herpes, CMV (cytomegalovirus), EBV (Epstein Barr-virus) og SSPE (subakutt sklerose panencefalitis) samt rheumatoid arthiritis.

Uten å være bundet til teorien antas det at de anti-stof fbundne anthracyclinmolekyler, dvs. i form av det angjeldende immunkonjugat, fremføres til de målceller som skal tilintetgjøres via antistoffspesifisitet og trenger deretter inn i cellen via den samme endocytiske vei som fører til internalisering av de membranbundne, ukonjugerte antistoffer og ligander (se f.eks. I. Pastan et al., "Pathway of Endocytosis", i Endocytosis, I. Pastan et al., (red.), s. 1-44 (Plenum Press 1985)). Når de er inne i cellen, smelter

de endocyte vesikler inneholdende immunkonjugatet med primære lysosomer under dannelse av sekundære lysosomer (se eksempelvis M.J. Embleton et al., ovenfor, s. 334). Da anthracyclinmolekylene er bundet til immunkonjugatets antistoff via syre-følsomme acylhydrazonbindinger, resulterer utsettelse av immunkonjugatet for det sure miljø i de endocyte vesikler og lysosomer i frigivelse av anthracyclinet fra immunkonjugatet. Det frigjorte anthracyclin antas enn videre å være et relativt umodifisert legemiddel som er i stand til å utvise full

cytotoksisk aktivitet. Den syrefølsomme hydrazonbinding i immunkonjugatet er således meget fordelaktig for frigivelsen av det cytotoksiske legemiddel i målcellene, idet den øker cytotoksisiteten av immunkonjugatet overfor disse celler. Alternativt kan hydrazonbindingen spaltes under sure og reduserende betingelser i de umiddelbare omgivelser utenfor eller omkring målcellene, f.eks. i området for en tumor, og det frigjorte legemiddel kan opptas av tumorcellene.

Fremgangsmåter for fremstilling av immunokonjugatene ifølge oppfinnelsen er eksemplifisert ved foretrukne utfør-elsesformer hvor anthracyclinet, adriamycin, ble konjugert med forskjellige antistoffer.

Først ble et hittil ukjent adriamycin-hydrazonderivat syntetisert ved en totrinnsreaksjon. Det heterobifunksjonelle reagens SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat ble omsatt med hydrazin under dannelse av et 3-(2-pyridyl-dithio) -propionyl-hydrazid som deretter ble omsatt med adriamycin-hydroklorid (ADM-HC1) under dannelse av et hittil ukjent acylhydrazonderivat av ADM inneholdende en pyridyl-beskyttet disulfidrest. En syrekatalysator slik som tri-fluoreddiksyre, kan anvendes for å lette dannelsen av hydrazon. Det dannede derivat betegnes som adriamycin-13- 3-(2-pyridyldithio)-propionyl -hydrazon-hydroklorid (ADM-HZN)

(se fig. 1).

Dette hittil ukjente ADM-hydrazonderivat ble deretter omsatt med et monoklonalt antistoff som på forhånd var thiolert med SDSP, og ble deretter redusert eller thiolert med 2-IT (2-iminothiolan) (se fig. 2). Det resulterende immunkonjugat besto av ADM-molekyler konjugert med det monoklonale antistoff ved hjelp av en linkerarm bundet til C-13-stillingen i hvert ADM via en acylhydrazonbinding, idet linkerarmen enn videre inneholdt en disulfidbinding ved hjelp av hvilken det var bundet til antistoffet (se fig. 2).

En annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse omfattet syntesen av et annet hittil ukjent adriamycin-hydrazonderivat hvor ovennevnte ADM-HZN i tillegg ble behandlet med reduksjonsmidlene DTT (dithiotreitol) eller tributylfosfin under dannelse av 13-{3-(mercaptopropionyl)} - adriamycin-hydrazon (se fig. 17). Dette derivat ble deretter omsatt med et monoklonalt antistoff hvortil maleimidgruppene var bundet, eksempelvis ved omsetning av antistoffet med SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)-butyrat). Som vist i fig. 17, ble det dannet et immunkonjugat med en linkerarm som via en hydrazonbinding var bundet til C-13-stillingen i hvert ADM, og enn videre med en thioetherbinding som en del av bindingen til antistoffet. Det er således åpenbart at den linkerarm som forbinder legemidlet og antistoffet, kan bestå av et antall komponenter og bindinger så lenge disse bindinger omfatter den syrefølsomme hydrazonbinding i 13-keto-stillingen i anthracyclinet.

Det er også åpenbart at det ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes hittil ukjente acylhydrazonderivater av 13-keto-holdige anthracycliner med formel (I),

hvori

A er -S-R<2> eller -SH,

A<1> er R4 eller -NR7R8,

R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO( CH2 )3CH3 eller CH2OCOCH( OC2H5 )2, R<2> er

hvori

X er hydrogen, N02 eller halogen,

R<3> er OCH3, OH eller hydrogen,

R<5> er OH, O-THP eller hydrogen,

R6 er OH eller hydrogen, under den forutsetning at R<6> ikke er OH når R<5> er OH eller O-THP,

R7 og R<8> uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, substituert alkyl, sykloalkyl, aryl, substituert aryl, aralkyl eller substituert aralkyl, eller R7 og R<8> danner sammen en 4-7 leddet ring som eventuelt kan være substituert, og

n er et helt tall fra 1-10.

Ovennevnte anthracyclin-acylhydrazoner utgjør hittil ukjente mellomprodukter anvendt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av immunkonjugater, og er eksemplifisert ved ADM-HZN hhv. 13-{3-(mercaptopropio-nyl)}-adriamycin-hydrazon som beskrevet i forbindelse med de foretrukne utførelsesformer.

Som det fremgår av de ovennevnte formler, omfatter acylhydrazon-mellomproduktene ifølge oppfinnelsen hydrazoner med et vilkårlig anthracyclin blant et antall kjente anthracycliner, siik som adriamycin, daunomycin og carminomycin. Enn videre omfatter mellomproduktene acylhydrazoner som er derivatisert ved spesifikke plasser i anthracyclin-strukturen (f.eks. 4<1->THP-adriamycin-hydrazon og 3<1->deamino-3'-(3-cyano-4-morfolinyl)-adriamycin-hydrazon. Sistnevnte mellomprodukter kan fremstilles ved først å derivatisere anthracyclinet under dannelse av en ønsket analog og deretter anvende denne analog til fremstilling av hydrazon-mellomproduktet ifølge oppfinnelsen. Kjente anthracyclinanaloger omfatter de som er beskrevet i US patentskrift nr. 4.464.529 og 4.301.277 31-deamino-31 -(4-morfolinyl)- eller 3'-deamino-31 -(3-cyano-4-morfolinyl)-anthracyclin-analoger,

de i US patentskrift nr. 4.202.967 og 4.314.054 beskrevne 3'-deamino-3'-(1-piperidinyl)- eller 3'-deamino-3<1->(4-methoxy-l-piperidinyl)-anthracyclin-analoger, de i US patentskrift nr. 4.250.303 beskrevne N-benzyl- eller N,N-dibenzyl-anthracyclin-analoger, de i US patentskrift nr. 4.591.637 beskrevne N-methoxymethyl- eller N-cyanomethyl-anthracyclinanaloger samt de i US patentskrift nr. 4.303.785 beskrevne acetal-analoger av anthracycliner. Disse kjente anthracyclin-

analoger kan således omsettes som beskrevet ovenfor (se fig. 1) under dannelse av hittil ukjente acylhydrazoner som deretter kan konjugeres med et antistoff med ønsket spesifisitet som beskrevet i det foreliggende.

Alternativt kan et uderivatisert acylhydrazon-mellomprodukt ifølge oppfinnelsen først fremstilles som beskrevet i det foreliggende ut fra det uderivatiserte anthracyclin slik som adriamycin, daunomycin eller carminomycin, og dette hittil ukjente mellomprodukt kan deretter derivatiseres under dannelse av et hittil ukjent acylhydrazon som er substituert som ønsket. ADM-HZN kan eksempelvis derivatiseres i aminosukkerresten ved reduktiv aminering med 2,2'-oxydiacetaldehyd under anvendelse av den i US patentskrift nr. 4.464.529 beskrevne metode under dannelse av 3<1->deamino-3'-(3-cyano-4-morfolinyl)-adriamycin-hydrazon. På lignende måte kan ADM-HZN derivatiseres på aminosukkerdelen under dannelse av hittil ukjente acylhydrazonderivater slik som 3'-deamino-3'-(4-morfolinyl)-ADM-hydrazon (se US patentskrift nr. 4.301.277), 3'-deamino-3'-(1-piperidinyl)-ADM-hydrazon (se US patentskrift nr. 4.202.967), 3'-deamino-3'-(4-methoxy-l-piperidinyl)-ADM-hydrazon (se US patentskrift

nr. 4.314.054), N-benzyl-ADM-hydrazon og N,N-dibenzyl-ADM-hydrazon (se US patentskrift nr. 4.250.303) eller N-methoxymethyl-ADM-hydrazon og N-cyanomethyl-ADM-hydrazon (se US patentskrift nr. 4.591.637). Enn videre kan ADM-HZN derivatiseres i R<5->stillingen i formel (I) som beskrevet i US patentskrift nr. 4 303 785 under dannelse av acetalderivater av hydrazonet, slik som 4 *-THP-ADM-hydrazon.

Vurdering av de ifølge oppfinnelsen fremstilte anthracyclin-antistoff-immunkonjugater, viste at immunkonjugatene bibeholdt antistoff-bindingsaktivitet og utviste antistoff-rettet celletilintetgjørelse av både lymfom- og carcinomceller under forskjellige forsøksbetingelser.

Celler som utviste det antigen mot hvilket antistoffet i konjugatet var rettet, ble således effektivt tilintetgjort av anthracyclinet, mens celler som ikke utviste vedkommende antigen, ikke ble tilintetgjort. I flere forsøk har det antistoff-fremførte anthracyclin faktisk vist seg å være kraftigere enn ekvivalente mengder av ukonjugert anthracyclin. Forskjeller i opptagelsesmekanismer i tumorceller og intra-cellulære transportmekanismer kan være ansvarlige for de styrkeforskjeller som kan iakttas mellom det frie legemiddel og det antistoff-konjugerte legemiddel.

Undersøkelser under anvendelse av humane tumor-xenotransplantater i mus har enn videre påvist de angjeldende immunkonjugaters evne til å inhibere tumorvekst in vivo som i enkelte tilfeller fører til fullstendig tumorregresjon. Det viste seg at immunkonjugatene var i besittelse av større styrke og inhiberte tumorvekst i større utstrekning enn det ukonjugerte anthracyclin. Immunkonjugatene ble enn videre tolerert av dyrene i meget større utstrekning enn det frie legemiddel, idet det var minst 10 ganger mindre toksisk enn det ukonjugerte anthracyclin alene.

Bindingsegenskapene og de cytotoksiske egenskaper hos immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen synes å utgjøre en forbedring i forhold til de i litteraturen beskrevne immunokonjugater hvor anthracycliner er bundet direkte til antistoffet via aminosukkerresten i anthracyclinet. Disse aminosukkerbundne immunkonjugater inneholder ofte lavere anthracyclin:antistoff-molforhold og utviser redusert cytotoksisitet i forhold til det frie legemiddel samt reduserte anti-stof f bindingsegenskaper (se f.eks. R. Arnon et al., Immunological Rev., 62, ovenfor, E. Hurwitz et al., Cancer Res., 35, ovenfor og R. Yamamoto et al., ovenfor). Stabilitetsundersøk-elser utført på immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, indikerer videre at anthracyclinet ble frigjort fra immunkonjugatene under reduserende og sure betingelser svarende til de betingelser som forekommer i et cellulært miljø. Bibeholdelsen av høy cytotoksisk legemiddelaktivitet som ble iakttatt med de her beskrevne immunkonjugater, kan forklares ved den kjensgjerning at et relativt umodifisert legemiddel fremføres til målcellene.

Enn videre har det vært mulig å gjøre reaksjons-betingelsene optimale slik at det oppnås anthracyclin:anti-stof f-molf orhold på ca. 4-10 ved anvendelse av flere antistoffer av forskjellige isotyper. Mengden av protein ut-vunnet etter kondensering med ADM-HZN-derivatet, falt bemerkelsesverdig når molforhold på mer enn 10 ble forsøkt oppnådd. Det forekom at den største begrensning for å oppnå immunkonjugater med molforhold større enn 10 skyldtes den reduserte oppløselighet av konjugatene i vandig løsning og anthracyclinets fysiske assosiasjon med protein.

Undersøkelser in vivo som viser den økte anti-tumoraktivitet av immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen i forhold til det frie legemiddel, samt deres reduserte system-iske toksisitet, indikerer en økt terapeutisk indeks for

konjugatene.

Oppfinnelsen belyses nærmere i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

I foreliggende eksempel beskrives fremstillingen av et hittil ukjent anthracyclin-immunkonjugat, i hvilket legemidlet er bundet direkte til et monoklonalt antistoff via en hydrazonbinding i 13-keto-stillingen på legemidlet.

Den bestemte utførelsesform som beskrives i dette eksempel, omfatter konjugeringen av ADM med et monoklonalt antistoff under dannelse av et immunkonjugat inneholdende en linkerarm med en acylhydrazonbinding som bindingspunkt til ADM-molekylet i immunkonjugatet, idet linkeren enn videre inneholder en disulfidbinding som del av bindingen derav

til antistoffet. Ifølge denne utførelsesform tilveiebringes enn videre et hittil ukjent acylhydrazonderivat av ADM

(ADM-HZN).

Syntese av et adriamycin- hydrazon

Som det innledende trinn ved fremstillingen av immunkonjugatet ifølge denne utførelsesform ble først et ADM-hydrazonderivat syntetisert som følger: 0,3 ml av en 1 M hydrazinoppløsning, dvs. NH2NH2 i isopropylalkohol ble tilsatt til en avkjølt løsning av 70 mg (0,22 mmol) SPDP i 3 ml THF (tetrahydrofuran). Etter omrøring i 20 minutter ved 0°C ble produktet ekstrahert med C^C^, vasket med saltvann og tørket over I^CO^. Residuet som ble erholdt etter av-dampning av løsningsmidlene, ble kromatografert på nøytralt aluminiumoxyd (5% MeOH, 95% CI^Cl,,) under dannelse av 21 mg (41%) 3-(2-pyridyldithio)-propionylhydrazid (forbindelse 2

i fig. 1). Hydrazidet og adriamycin-HCl (erholdt fra Sanraku Inc., Japan) (48 mg, 0,083 mmol) ble oppløst i 5 ml MeOH og omrørt i mørke ved romtemperatur i 6 dager. Omsetningen ble etterfulgt av omvendt fase-tynnskiktskromatografi (TLC) (MeOH:H20 = 2,1, inneholdende 3 vekt/volum% NH40Ac). Etter dette tidsrom ble løsningsmidlet avdampet og residuet ble kromatografert på en C^g-kolonne (MeOH:H20 = 3,2, inneholdende 3 vekt/volum% NH40Ac). Fraksjonene ble kombinert og lyofilisert, og overskytende NH40Ac ble fjernet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i MeOH og utfelt ved tilsetning av acetonitril under dannelse av 45 mg (72%) adriamycin-13-{3-(2-pyridyldithio)-propionyl}-hydrazon-hydroklorid, heretter angitt som ADM-HZN (forbindelse 4 i fig. 1). ADM-HZN ble karakterisert på følgende måte:

smp. >125°C gir mørkere farve og er ikke veldefinert.

NMR (aceton - dg) 6: 1,25 (s, 3H, J=6Hz), 1,77 (m, 1H), 2,06 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,53 (d, 1H, J=15Hz), 2,89-3,18 (m, 6H), 3,71 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,97 (m, 1H), 4,07 (s, 3H), 4,78 (s, 2H), 5,21 (m,lH), 5,58 (t, 1H, J=7Hz), 7,12 (m, 1H), 7,64 (d, 1H, J=8Hz), 7,75 (m, 2H), 7,90 (t, 1H, J=8Hz), 7,98 (d, 1H, J=8Hz), 8,37 (d, 1H, J=4HZ), 10,50 (s, 1H), 10,52 (s, 1H), 14,19 (bs, 1H).

IR (KBr): 3438, 1674, 1618, 1579, 1419, 1286, 1016, 988, 698 cm"<1>. FABMS (glycerol) m/e: 755 (M+l), 737, 645, 625, 609.

Thiolering av monoklonale antistoffer

Før omsetning av ADM-HZN-forbindelsen fremstilt som beskrevet ovenfor med et monoklonalt antistoff av interesse, må antistoffet thioleres, dvs. reaktive sulfhydrylgrupper skal innføres i antistoffmolekylet.

De anvendte monoklonale antistoffer var 1) 5E9, et IgG^-antistoff som er reaktivt med transferrin-reseptoren på alle delende humane celler og kryssreaktivt med forskjellige histologiske typer av cancerceller, 2) T33A1 (heretter angitt som "3A1"), et IgG^-antistoff som er reaktivt med det humane 40 kd T-celleantigen som også finnes på et antall T-celleleukemi-typer, 3) G28f5, et IgG^-antistoff som er reaktivt med det humane 50 kd B-celleantigen, og som også er reaktivt med humane B-cellelymfomer, 5) G28,l, et IgG^-antistoff som er reaktivt med det humane 39 kd B-celleantigen,

og som også er reaktivt med B-cellelymfomer, og 5) L6, et IgG £ 0 cl-antistoff som er reaktivt med et glycolipid-antigen på humane ikke-småcellede lungecarcinomer.

Hybridomer som utskiller monoklonale 5E9 og T33A1-antistoffer, ble erholdt fra "American Type Culture Collection (ATCC)". De respektive antistoffer ble renset fra ascites-væske dannet i BALB/c-mus i henhold til metoden beskrevet av C. Bruck et al., i "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid by DEAE-Affigel Blue Chromatography", J. Immun. Methods, 5b,

s. 313-319 (1982). Renset G28,5, G28,l og L6 ble tilveiebrakt av dr. J. Ledbetter og dr. I. Hellstrom (Oncogen, Seattle, WA). Hybridomer som utskiller monoklonale L6 og G28,5-antistoffer, er blitt deponert ved ATCC den 6. des-ember 1984 og 22 mai 1986, under ATCC deponeringsnr. HB 8677 og HB 9110. Det monoklonale G28,1-antistoff er ett av en rekke antistoffer som er kjent for å være reaktive med en hovedepitop på CD37-antigenet, og som er blitt karakterisert i A.J. Michael (red.), Leukocyte Typing III, Oxford Uni-versity Press (UK 1987). Et antall av disse anti-CD37-antistoffer er kommersielt tilgjengelige.

Thiolering av hvert av disse antistoffer med SPDP ble utført som følger: SPDP (Pierce Chemical Co., IL) (50 mM) oppløst i ethanol, ble tilsatt til det valgte monoklonale antistoff, f.eks. 5E9 (5-10 mg/ml) i PBS (fosfatbufret saltvann, pH 7,2) under dannelse av en sluttkonsentrasjon på 5-10 mM. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 30 minutter ved 30°C. Uomsatt SPDP ble separert fra SPDP-derivatisert antistoff ved gelfiltreringskromatografi under anvendelse av en PD-10-kolonne (Pharmacia). De thiopyridylbeskyttende grupper ble fjernet ved reduksjon med overskudd av DTT. De reduserte antistoffer ble ført gjennom en PD-10-kolonne, og de frie thiolholdige antistoffer ble anvendt til kondensering med ADM-HZN-derivatet (se fig. 2) .

Reaktive thiolgrupper ble likeledes innført i anti-stof f proteinet under anvendelse av 2-IT: antistoffet

(5-10 mg/ml i 50 mM triethylamin, 50 mM NaCl og 1 mM EDTA

ved pH 8,0) ble blandet med 2-IT (Pierce Chemical Co., IL)

til en sluttkonsentrasjon på 5-10 mM. Omsetningen forløp i 90 minutter ved 4°C, og de thiolerte antistoffer ble fra-skilt på en PD-10-kolonne ekvilibrert med 2 M NaCl/PBS.

Antallet av reaktive thiolgrupper inkorporert i antistoffene, ble bestemt under anvendelse av DTNB (5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzosyre)) (E4^2 = 1^150) i overensstemmelse med metoden ifølge G.L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82, s. 70-77 (1959).

Konjugering av thiolerte monoklonale antistoffer med ADM- HZN

Et antall konjugasjoner hvor de monoklonale antistoffer thiolert som beskrevet ovenfor hver især ble bundet til ADM-HZN (se fig. 2), ble deretter utført.

ADM-HZN ble oppløst i methanol og tilsatt til SPDP-thiolerte antistoffer i PBS eller til 2-IT-thiolerte antistoffer i 2 M NaCl/PBS. I et typisk forsøk ble 10 ekvival-enter ADM-HZN tilsatt til monoklonale antistoffer inneholdende 10-20 rekative thiolgrupper. Konjugeringsreaksjonsblandingen ble inkubert over natten ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble sentrifugert ved 10000 x g og konjugert ADM ble deretter separert fra uomsatt ADM ved å føre blandingen gjennom en PD-10-kolonne. Mengden av konjugert anthracyclin bundet til antistoff, ble bestemt ved absorbans ved 495 nm ( E. nr. = 8<0>30).

495 Mengden av antistoffprotein ble bestemt ved absorbans ved

280 nm (1 mg/ml = 1,4 OD-enheter). Til korreksjon for over-lapning av ADM-absorbans ved 280 nm ble følgende formel anvendt:

Immunkonjugater ble analysert med hensyn til til-stedeværelse av ukonjugert ADM eller ADM-derivater ved HPLC-analyse. HPLC ble utført under anvendelse av en "Phenomenex"-kolonne pakket med 5 p "IB-SIL C18"-perler. Ukonjugert ADM, HC1, ADM-HZN (0/1 ymol) eller immunkonjugater inneholdende 0,5-5 ymol legemiddelekvivalenter ble overført til kolonnen og eluert med methanol og 10 mM ammoniumfosfat, pH 4,5 (70:30) ved 1,5 ml/minutt. Ingen av de fremstilte immunkonjugater inneholdt signifikante mengder (<1%) av ukonjugert legemiddel ved HPLC-analyse.

Karakterisering av immunkoniugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen

De således fremstilte immunkonjugater besto av ADM-molekyler konjugert i 13-keto-stillingen til en linkerarm som dannet en bro mellom legemidlet og det angjeldende monoklonale antistoff. Enn videre førte tilsetningen av det monoklonale antistoff med frie thiolgrupper til ADM-HZN-derivatet som inneholdt en thiopyridylbeskyttet disulfidbinding for dannelse av en disulfidbinding i linkeren som for-bandt ADM med antistoffene (se fig. 2). Immunkonjugater fremstilt ifølge denne utførelsesform, omfatter 5E9-ADM-7,5, 3Al-ADM-7,0, L6-ADM-9,0 og G28,l-ADM-9,0 hvor første del av uttrykket betegner det monoklonale antistoff som anvendes under dannelse av konjugatet, den andre del av uttrykket betegner anthracyclinet bundet til antistoffet, og tallet i uttrykket beskriver molforholdet mellom ADM og antistoff i det angjeldende immunkonjugat.

ADM:antistoff-molforholdet erholdt i overensstemmelse med denne utførelsesform, avhenger av det antall thiolgrupper som innføres i det monoklonale antistoff og den mengde ADM-HZN-derivat som tilsettes til det thiolerte antistoff. Punktdiagrammene i fig. 3 og 4 viser at det oppnås ADM:anti-stof f-forhold på 3-4 ved kondensering av ADM-HZN med enten det monoklonale 5E9 eller 3Al-antistoff inneholdende ca.

8 thiolgrupper. Et moloverskudd av ADM-HZN på typisk

10 ganger i forhold til protein ble tilsatt ved disse reaksjoner. ADM:antistoff-forholdet steg til 8-10 ved anvendelse av antistoffer med 18-25 thiolgrupper. Ingen signifikante forskjeller i ADM:antistoff-forholdene ble iaktatt ved anvendelse av SPDP sammenlignet med 2-IT til thiolering av det monoklonale antistoff (sammenlign fig. 3 og 4). De endelige proteinutbytter etter konjugering av legemiddel med antistoff forekom imidlertid å være noe høyere med SPDP-thiolerte antistoffer sammenlignet med 2-IT thiolerte antistoffer (se fig. 5). Proteinutbytter på 50-80% ble oppnådd generelt for SPDP-thiolerte antistoffer slik som 5E9 og 3A1, mens utbytter på 20-50% ble oppnådd for de samme antistoffer thiolert med 2-IT. Noe bedre immunkonjugatutbytter ble enn videre oppnådd under anvendelse av monoklonale antistoffer av IgGl-isotypen, slik som 5E9 og 3A1, for konjugasjoner ut-ført med SPDP eller 2IT (se fig. 6 og 7) . Bindingsaktiviteten hos immunkonjugatene ble bestemt ved et konkurranseforsøk omfattende anvendelse av I<125->merket antistoff. Antigen-positive hhv. antigen-negative celler (lx IO<6>) ble suspendert i 0,1 ml "RPMI 640" inneholdende 2 % FBS og ble blandet med 0,1 ml dobbelt-seriefortynnet, ukonjugert, monoklonalt antistoff eller immunkonjugat i konsentrasjoner fra 50 pg/ml. Doble cellesuspensjoner ble inkubert under blanding ved 4 °C i 1 time. Cellene ble deretter vasket to ganger og ble suspendert i 0,1 ml inneholdende 5 ug/ml 125i-merket, homologt antistoff (spesifikk aktivitet fra 1-50 x IO<4> cpm/ug antistoffprotein). Prøver ble inkubert ved 4 °C i 1 time og ble anbrakt på 0,15 ml av en 1:1 blanding av dibutyl:dinonylfthalat som var avkjølt til 4 °C. Prøvene ble sentrifugert ved 10000 x g i 1 minutt ved 4 °C, og de celle-bundne tellinger (pellet) ble bestemt ved anvendelse av en "LKB"-Y-teller.

Bibeholdelsen av bindingsaktivitet hos immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen er vist i tabell 1.

K , er likevektskonstanten for det ukonjugerte MAb ifølge bestemmelse ved Scatchard-analyse.

Som vist i tabellen, bibeholdt 5E9-immunkonjugatene fremstilt under anvendelse av SPDP og med molforhold mellom 3,5 og 8,5, mer enn 80% av deres opprinnelige bindingsaktivitet sammenlignet med ukonjugert 5E9. 5E9-immunkonjugater fremstilt under anvendelse av 2-IT, bibeholdt likeledes høye bindingsaktiviteter. 3Al-immunkonjugater fremstilt under anvendelse av SPDP, viste noe tap med hensyn til antistoff-bindingsaktivitet. Konjugasjon av ADM med disse og andre antistoffer resulterte vanligvis i tap av en relativt liten grad av antistoff-bindingsaktivitet.

Fig. 8 viser bindingskurvene for to immunkonjugater ifølge oppfinnelsen 5E9-ADM-7,5 og 3Al-ADM-7,0, sammenlignet med bindingskurvene for de ukonjugerte, monoklonale 5E9 og 3Al-antistoffer. For oppnåelse av disse kurver ble immun-kon jugatene inkubert ved 4°C i 0,1 ml komplett vekstmedium inneholdende 1 x 10^ antigen-positive HSB-2-målceller. Etter 1 time ble cellene vasket to ganger i mediet og ble inkubert i ytterligere 30 minutter i 0,1 ml medium inneholdende 1:40 fortynning av FITC-merket geite-anti-muse-IgG (Boehringer-Mannheim). Cellene ble analysert på et "Coulter Epics V"-fluorescens-celleanalyseapparat. Celleoverflate-fluorescens ble sammenlignet med fluorescensen oppnådd for på lignende måte fortynnet, ukonjugert, monoklonalt antistoff. Som vist i figuren, ble bindingsaktiviteten av hvert av immunkonjugatene bibeholdt, hvilket fremgår av det faktum at den konsentrasjon av immunkonjugat som var nødvendig til metning av de antigen-positive celler, høyst var en dobbeltfortynning større enn den konsentrasjon som var nødvendig for det ukonjugerte antistoff. Forskjellene i platå-nivåene for fluorescens-intensitet mellom ukonjugerte antistoffer og immunkonjugatene skyldtes redusert binding av det sekundære FITC-geite-anti-muse-reagens til immunkonjugatet sammenlignet med det ukonjugerte antistoff.

Stabiliteten av et immunkonjugat ifølge denne ut-førelsesform av foreliggende oppfinnelse - et L6-ADM-konjugat - ved forskjellige pH-verdier fra 4,0 til 7,0, ble undersøkt ved HPLC-analyse. L6-ADM-9,0-konjugatet ble inkubert i fosfatbuffere ved hver av de indikerte pH-verdier i 24 timer ved 37°C. Hver oppløsning ble deretter overført til en HPLC-kolonne, og mengden av ukonjugert legemiddel ble bestemt. Som vist i fig. 9, hadde det enkelte produkt som kunne påvises etter 24 timers inkubering ved forskjellige pH-verdier, en kolonneretensjonstid som svarte til retensjons-tiden for ADM-HCl-standarden. Den mengde materiale som ble frigjort fra immunkonjugatet etter 24 timer, steg ettersom pH-verdien falt fra 7 til 4. "Ubehandlet" kontroll angir kromatogrammet for konjugatet oppbevart ved -20°C i fosfat-

buffer med pH 7,4. Det forekom således at immunkonjugatet var i besittelse av en syrefølsom bindingsgruppe, hvilket resulterte i frigjørelse av ADM fra antistoffproteinet.

Disse resultater stemmer overens med forekomsten av en hydrazonbinding som forbinder ADM til linkerarmen som beskrevet i fig. 2.

I overensstemmelse med utførelsesformen ifølge dette eksempel ble ADM bundet til antistoffet via en linkerarm som også inneholdt en disulfidbinding (se fig. 2). Det skulle således være mulig å frigjøre en ADM-rest ved reduksjon av et immunkonjugat med denne utformning med DTT. L6-ADM-konjugatet, L6-ADM-9,0, ble derfor behandlet med et 10-dobbelt overskudd av DTT, ble inkubert ved romtemperatur i 15 min-

utter og overført til en HPLC-kolonne. ADM-HC1- og ADM-HZN-standarder ble undersøkt på samme tid, og toppene fra kromatogrammene er vist i fig. 10. L6-ADM-9,0 hadde ingen påviselig topp for ukonjugert legemiddel før tilsetning av DTT. HPLC-analyse viste tilsynekomsten av en enkelt topp

som hadde en kolonneretensjonstid svarende til retensjons- t tiden for ADM-HCl-derivatet fremfor ADM-HZN-derivatet (se fig. 10). Mengden av ADM frigjort etter DTT-behandling, var ca. 99% av utgangs-ADM-ekvivalentene bundet til antistoffet. Forsøksdata i fig. 9 og 10 viser at en ADM-lignende rest frigjøres fra immunkonjugatene under "fysiologiske" beting-

elser, dvs. sure og reduserte betingelser som er typiske for de cellulære omgivelser.

Cytotoksisk aktivitet av immunkoniugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen

Immunkonjugatene ble testet in vitro med hensyn til cytotoksisitet ved hjelp av en rekke analysesysterner. Ifølge en kolonidannelses-bestemmelse i myk agar ble Daudi- (Burkitts lymfom) celler (fenotype: 5E9+, 3A1-) erholdt fra ATCC dyrket i komplett medium ("RPMI 1640"-medium pluss 10 % kalvefoster-serum) 1 x 10<5> celler i 1 ml medium ble utsatt i 1,5 time for seriefortynnede 5E9-ADM eller 3A1-ADM-immunkonjugater eller ukonjugert ADM. Tredoble bestemmelser ble foretatt for hver fortynning. Kontroll-grupper besto av celler behandlet på lignende måte som ikke var utsatt for legemidler. Cellen ble deretter vasket og suspendert i "RPMI 1640"-medium inneholdende 15 % FBS og 0,3 % agarose (Marine Colloid). 1 ml av cellesuspensjonen (1 x 10<3> celler) ble anbrakt deretter på et 0,4 % agaroselag i mikrotiterplater med 6 brønner (Costar). Prøvene ble inkubert i 7-10 dager ved 37 °C, og de resulterende kolonier ble farvet med 0,5 ml 1 mg/ml p-jodnitrotetra-zolium-fiolett (Sigma) i 48 timer. Kolonier ble tellet ved hjelp av et "Optimax 40-10 image analyzer"-apparat, og inhiberingen av kolonidannelse ble bestemt ved sammenligning av legemiddelbehandlede eller immunkojugatbehandlede celler med den ubehandlede kontrollgruppe.

I fig. 11 sammenlignes den cytotoksiske aktivitet

av 5E9-ADM-konjugatet 5E9-ADM-7,5, og 3Al-ADM-konjugatet 3Al-ADM-7,0, etter eksponering i 1,5 time på den 5E9-antigen-positive og 3Al-antigen-negative Burkitts lymfomcellelinje, Daudi. Begge disse immunkonjugater var blitt fremstilt via thiolering med 2-IT. Sammenligning av doseresponskurvene viste at 5E9-ADM-7,5-konjugatet som bibeholdt 95% av den opprinnelige bindingsaktivitet for antigenbærende målceller (se fig. 8), var signifikant kraftigere enn 3Al-ADM-7,0 -

det ikke-bindende kontrollkonjugat.

Et grensefortynningsforsøk som tilveiebringer et

mål for den logaritmiske verdi for celletilintetgjørelse,

ble anvendt til avprøvning av den cytotoksiske legemiddelaktivitet av ovennevnte to immunkonjugater ved anvendelse av

et lengre eksponeringsformat (24 timer). Dette forsøk ble utført med Namalwa-celler (fenotype: 5E9+, 3A1-) hoved-sakelig som beskrevet av M. Colombatti et al., "Selective Killing of Target Cells by Antibody-Ricin A Chain or Antibody-Gelonin Hybrid Molecules: Comparison of Cytotoxic Potency and Use in Immunoselection Procedures", J. Immunol., 131,

s. 3091-3095 (1983). Cellene erholdt fra ATCC, ble inkubert med immunkonjugatene i 22 timer, ble vasket, og den logaritmiske verdi for celletilintetgjørelse ble bestemt. Den logaritmiske verdi for celletilintetgjørelse ble beregnet på grunnlag av platedyrkningseffektiviteten som ble bestemt som andelen av brønner uten vekst ved begrensende cellekonsentra-sjoner.

Som vist i fig. 12, frembrakte 5E9-ADM-7,5 celle-tilintetgjørelse som var 1-2 logaritmiske verdier større ved avprøvede konsentrasjoner i sammenligning med det ikke-bindende 3A1-ADM-7,0-konjugat. Celletilintetgjørelse av størrelsesordenen inntil 5 logaritmiske verdier ble målt ved den høyeste dose 5E9-ADM-7,5. Selv om den cytotokiske aktivitet for det ikke-bindende 3A1-immunkonjugat ble påvist,

var nivået for cytotoksisitet mindre enn for en ekvivalent mengde av ukonjugert ADM. Aktiviteten av 5E9-immunkonjugatet var imidlertid større ved flere konsentrasjoner enn en ekvivalent dose av fritt ADM.

Som ovenfor angitt, ble 5E9-ADM-7,5 og 3Al-ADM-7,0-immunkonjugatene syntetisert med 2-IT som thioleringsmidlet. Immunspesifikk cytotoksisitet ble iakttatt også med immunkonjugater som var fremstilt med SPDP som thioleringsmiddel.

I fig. 13 vises den selektive cytotoksiske aktivitet av 5E9-ADM- og 3Al-ADM-immunkonjugater fremstilt med SPDP som thioleringsmidlet, på Daudi-celler ved anvendelse av den ovenfor angitte kolonidannelses-bestemmelse ved myk. agar. Ytterligere tegn på selektiv cytotoksisitet hos immunkonjugater fremstilt med SPDP, er vist i fig. 14, hvori G28,l-ADM-9,0-immunkonjugatet ble avprøvet på to G28,1-antigen-positive cellelinjer, Daudi og Namalwa, og på en G28,l-antigen-negativ, human T-celle-leukemicellelinje HSB-2, ved kolonidannelsesbestemmelse i myk agar. HSB-2-cellene ble erholdt fra ATCC. Som vist i figuren, var immunkonjugatet cytotoksisk overfor de to antigen-positive cellelinjer, men ikke overfor den antigen-negative cellelinje.

Preferensiell tilintetgjørelse av antigen-positive celler med immunkonjugatet 5E9-ADM-7,5 ble også iakttatt ved en kolonidannelses-bestemmelse under anvendelse av den for-ankrings-avhengige, humane kolon-carcinomcellelinje HCT116 erholdt som en gave fra dr. M. Brattain (Bristol-Baylor Labs, Houston, Tx) .

Monolagskulturer av carcinomcellene ble fjernet fra kulturkolber med trypsin-EDTA (Gibco), ble vasket og ført gjennom en 22 gauge kanyle under dannelse av en enkeltcelle-suspensjon. 5E9-ADM-7,5, 3Al-ADM-7,0 eller ukonjugert ADM ble seriefortynnet i 0,2 ml medium inneholdende 1 x 10<5 >carcinomceller. Hver fortynning ble foretatt tre ganger. Kontrollforsøk omfattet ubehandlede eller antistoff-behandlede celler. Cellene ble inkubert i 3 timer, vasket én gang i mediet, og 1 x 10 3 celler i 1 ml ble anbrakt på mikrotiterplater med 12 brønner (Costar). Platene ble inkubert i 7-10 dager ved 37°C og fiksert med absolutt methanol i 10 minutter. Koloniene ble farvet med krystallfiolett og tellet ved hjelp av et "Optimax 40-10 image analyzer"-apparat. Som vist i fig. 15, ble det iakttatt større cytotoksisitet ved eksponering av carcinomcellene overfor 5E9-ADM-7,5 enn ved eksponering overfor 3Al-ADM-7,0.

Da mange rapporter har vist at ADM bundet til antistoff på aminosukkerdelen i legemidlet resulterer i immunkonjugater med et signifikant tap av legemiddelaktivitet, ble cytotoksisiteten av immunkonjugater fremstilt ved å binde ADM til antistoffet via aminosukkerresten i legemidlet ved hjelp av en leu-ala-dipeptidlinker undersøkt under anvendelse av kolonidannelses-bestemmelsessystemet i myk agar. Som vist i fig. 16, var hverken de 5E9-ADM-4,0 eller 3Al-ADM-3,9-peptidbundne konjugater cytotoksiske overfor Daudi-celler. ADM-leu-ala-derivatet som ble anvendt til fremstilling av konjugater, var ca. 2 logaritmiske verdier mindre kraftige enn ekvivalente mengder ukonjugert ADM.

Eksempel 2

I det etterfølgende eksempel beskrives fremstillingen av et anthracyclin-immunkonjugat hvori ADM konjugeres med et monoklonalt antistoff via en linkerarm med en acylhydrazonbinding som bindingssted til ADM-molekylet, og enn videre en thioetherbinding som en del av bindingen til antistoffet. Denne utførelsesform tilveiebringer likeledes et hittil ukjent acylhydrazidderivat av ADM.

Fremstilling av immunkonjugater med en thioetherbinding i linkerarmen

Monoklonalt antistoff, 5E9 (2,5 mg i 2,5 ml fosfat-bufferinnstilt saltvann) ble omsatt med SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)-butyrat) (59,5 yg i 100 yliter tetrahydrofuran) ved 30°C i løpet av 30 minutter. pH-verdien ble inn-stilt til 6,0 med natriumcitratbuffer. Blandingen ble ført gjennom en "PD-10"-gelfiltreringskolonne (Pharmacia) for separering av maleimidholdig antistoff fra uomsatt materiale. ADM-HZN-derivatet (1 mg) fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble deretter oppløst i 1 ml MeOH:H20 (9:1), og 0,5 ymol ADM-HZN ble omsatt med 0,5 ymol tri-n-butylfosfin i 4:1 aceton:H20 under dannelse av et hittil ukjent redusert ADM-HZN (se fig. 17). Etter 10 minutter ble 0,1 ml svovel i toluen tilsatt til destruksjon av det resterende fosfin. Det reduserte ADM-HZN ble deretter blandet med det 5E9 maleimid-holdige antistoff. De således fremstilte immunkonjugater ble renset ved passasje gjennom en "PD-l0"-gelfiltrerings-kolonne. Hvis toluenoppløsningsmidlet ikke var fullstendig fjernet, utskiltes i enkelte tilfeller et organisk løsnings-middellag som inneholdt noe protein, som derved var fjernet fra reaksjonsblandingen. En svak luftstrøm ble anvendt til fjerning av løsningsmidlet, og det denaturerte protein ble fjernet ved sentrifugering av blandingen i 2 minutter ved 16000 x g. Den klare supernatant inneholdende immunkonjugatene, ble deretter gelfiltrert og analysert i PBS ved.pH 7,4. ADM:antistoff-molforholdet ble bestemt spektrofoto-metrisk under anvendelse av OD280°^ OD495 som keskrevet i eksempel 1. En typisk omsetning ga immunkonjugater med molforhold mellom 3 og 4.

Cytotoksisk aktivitet av immunkonjugater inneholdende en thioetherbinding

Et antall immunkonjugater ; fremstilt i overensstemmelse med en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse, ble avprøvet med hensyn til cytotoksisitet mot antigen-positive tumorcellelinjer sammenlignet med antigen-negative tumorcellelinjer under anvendelse av en <3>H-thymidin-inkorporerings-bestemmelse som måler inhibering av DNA-syntese. I overensstemmelse med denne bestemmelse ble det foretatt fortynninger av immunkonjugater eller ukonjugert ADM i komplett medium,

og 100 yliter av hver fortynning ble tilsatt til brønner i mikrotiterplater med 96 brønner. Hver fortynning ble foretatt tre ganger. Tumorceller ble suspendert i mediet, og 100 yliter inneholdende 1 x 10 celler ble deretter tilsatt til hver brønn. Cellene ble inkubert i 24 timer ved 37°C i en fuk3 tig 5% CO^~-atmosfære. 50 yliter inneholdende 1 y Ci[6- H]-thymidin (New England Nuclear, 15 Ci/mmol), ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37°C. Cellene ble overført til "Millititer sv"-plater (Millipore) og utfelt med 25% kald trikloreddiksyre (TCA). Utfellingene ble vasket 10 ganger med 5% kald TCA. Filtrene ble tørket, hullet og tellet i "Econofluor liquid"-scintillasjonsvæske (New England Nuclear). Alle tellinger ble korrigert ved subtraksjon av bakgrunnstellinger.

Et immunkonjugat tilveiebrakt i overensstemmelse med denne utførelsesform - 5E9-ADM-3,9 - var meget cytotoksisk overfor 5E9-antigen-positive Namalwa- og HSB-2-celler (se fig. 18). Immunkonjugatet var kraftigere enn ekvivalente konsentrasjoner av ukonjugert ADM. I et annet forsøk viste det seg at et 3A1-ADM-6,0-immunkonjugat ved konsentrasjoner under 0,1 yg/ml ADM var cytotoksisk overfor 3Al-antigen-positive HSB-2-celler, men ikke overfor 3Al-antigen-negative Namalwa-celler (se fig. 20). Cytotoksisiteten av immunkon-jugatei var ved høyere konsentrasjoner omtrent den samme overfor begge cellelinjer.

Eksempel 3

In vivo anti- tumoraktivitet av immunkoniugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen

Immunkonjugater ble deretter avprøvet med hensyn til deres anti-tumoraktivitet in vivo. Nærmere bestemt ble immun-kon jugatene avprøvet med hensyn til deres evne til å inhibere veksten av humane B-lymfomtumorer i mus.

Primære, faste Daudi- og Ramos- (Burkitts lymfom) tumorer ble etablert i BALB/c nakne mus ved subkutan (s.c.) inokulering av vevskultur-opprettholdte lymfoide celler. Ramos-cellelinjen kan erholdes fra ATCC. Daudi- og Ramos-tumorer ble deretter overført i rekkefølge in vivo til 4-6 uker gamle BALB/c (nu/nu) hunnmus som veide 20-25 g (Harlan Sprague-Dawley) under anvendelse av 1 x 10 7 tumorceller/0,1 ml i PBS til subkutan implantering i musens side. Begge tumorlinjer viste en lineær vekstrate mellom 200 og 4000 mm 3. Den midlere fordoblingstid for tumorvolunet under eksponensiell vekst var 6,9 - 0,8 dager for Daudi-tumorer og 4,4 - 0,6 dager for Ramos-tumorer. Tumorvolumer (V) ble beregnet ved følgende formel:

hvori L = lengde (mm) og W = bredde (mm).

Når tumorvolumene nådde 400-600 mm 3 for Daudi-tumorer og 250-400 mm 3 for Ramos-tumorer, ble musene anbrakt vilkårlig i grupper på 5-10 dyr til behandling med ADM-HC1 (dvs. fritt legemiddel), ADM-immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen, ukonjugert, monoklonalt antistoff eller en blanding av det monoklonale antistoff pluss ADM. Spesifisiteten av celle-tilintetgjørelse ble vist ved sammenligning av anti-tumoraktiviteten oppnådd med de prøvede immunkonjugater (dvs.

hvor antistoffkomponenten er reaktiv med de tumorceller som skal tilintetgjøres), overfor den aktivitet som ble oppnådd med ikke-bindende konjugater (dvs. konjugater som ikke er reaktive med denne tumorpopulasjon). Blandingen av antistoff pluss fritt legemiddel var et kontrollforsøk som viste behovet for en kovalent kobling av legemiddel til antistoff.

Resultatene ble uttrykt som inhibering av tumorvekst (T-C) eller tumor-fordoblingsforsinkelse (TDD) som ble bestemt ut fra forsinkelsen i fordoblingstiden for tumorvolumet (TVDT) ved sammenligning av vekstkurver for behandlede grupper med uinokulerte kontrollgrupper. TDD ble beregnet ved følgende formel:

hvor T = tiden, (dager) for at tumorene i en behandlet gruppe når 3000 mm , C = tiden, (dager) for at tumorene i en kontrollgruppe når 3000 mm , og TVDT (fordoblingstid for tumorvolumet) = tiden (dager) for at tumorvolumet i kontrollmus (ikke-behandlede mus) ble øket fra 1500 til 3000 mm 3. Hvert punkt angir middeltumorvolumet i forsøksgruppen. Ved disse undersøkelser ble anti-tumoraktiviteten av ADM-immunkonjugatene på Daudi- eller Ramos-tumorer sammenlignet med: a) aktiviteten oppnådd under anvendelse av fritt legemiddel ved ekvivalent dose, administreringsmåte og -skjema, og b) aktiviteten oppnådd under anvendelse av det frie legemiddel ved optimal dose, administreringsmåte og

-skjema.

Ved alle undersøkelser i det foreliggende ble lege-middelbehandlingen med ADM-HC1 utført ved tilsetning av 50-100 ADMSO til det pulveriserte legemiddel, fortynning av det oppløste legemiddel i PBS til en bestemt mg/kg/injeksjons-dose på injeksjonsdagen og inokulering dermed av den tumor-bærende mus enten intravenøst (i.v. halevene) eller intraperi-tonealt (i.p.). ADM-immunkonjugatene anvendt ved disse undersøkelser, ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1, og alle bibeholdt mere enn 90% av den opprinnelige antistoff-bindingsaktivitet. I særdeleshet ble de monoklonale antistoffer 5E9 og G28.1 anvendt som antistoffkomponenten i immunkonjugatet ved disse undersøkelser. ADM-immunkonjugatene ble oppbevart ved 4°C i PBS og ble anvendt ikke senere enn to uker etter fremstillingen. Alle prøvede immunkonjugater som ukonjugerte antistoff-kontrollgrupper ble administrert i.p.

Behandlingsskjemaangivelsen "Q7Dx3" angir i det foreliggende et behandlingsskjerna hvor hver mus i legemiddel-gruppen ble gitt 3 injeksjoner, hver injeksjon med 7 dagers mellomrom, dvs. én injeksjon ukentlig i 3 uker. På lignende måte betegner "Q5Dx2" et behandlingsskjerna hvor musen i den gruppe gis i alt 2 injeksjoner av legemidlet eller konjugatet med 5 dagers mellomrom. "QlDxl" betegner en enkelt injeksjon. I behandlingsskjemabetegnelsene definerer således det første tall i betegnelsen avstanden (i dager) mellom injeksjoner, og det siste tall det samlede antall injeksjoner pr. skjema.

Anti-tumoraktiviteten av ADM-immunkonjugatene ble derfor vurdert først i sammenligning med det frie ADM-HC1-legemiddel ved overensstemmende eller ekvivalente doser, administreringsmåte og -skjema. Anti-tumoraktiviteten overfor Daudi-tumorer hos et 5E9-ADM-immunkonjugat, 5E9-ADM-1,8 (molforhold = MR = 1,8 ADM-molekyler/MAB) ble sammenlignet med aktiviteten av a) ukonjugert ADM-HC1 ved en tilsvarende legemiddeldose (4,1 mg/kg/injeksjon), b) 5E9 monoklonalt antistoff ved en tilsvarende antistoffdose (630 mg/kg/injeksjon), c) en blanding av 5E9-antistoffet pluss ADM-HC1 (4,1 mg ADM +

630 mg 5E9) og d) et ikke-bindende immunkonjugat L6-ADM-8,6 (4,1 mg/kg/injeksjon ADM) som kontroll.

Musene (5 mus pr. gruppe) ble gitt doser i.p. på

dag 20 og 25 etter tumorimplantasjon (dvs. et Q5Dx2-skjema) ved innledningsvise tumorstørrelser på mellom 800 og 1100 mm . Dosen anvendt ved dette forsøk, utgjorde den maksimalt

tolererte dose (MTD) i.p. for fritt legemiddel, dvs. den via en vilkårlig gitt vei eller et vilkårlig skjema administrert legemiddeldose som resulterer i en LD^Q-verdi (10% av dyrene dør) (se tabell 1 ovenfor).

Som angitt i fig. 21, ble det oppnådd signifikant anti-tumoraktivitet med 5E9-ADM-konjugatet. Denne anti-tumoraktivitet var i tillegg større enn aktiviteten iakttatt for en ekvivalent dose av det frie legemiddel. Som angitt nedenfor i tabell 4, utviste 3 av de 5 mus behandlet med konjugatet, fullstendige tumorregresjoner (helbredelse), hvilket svarer til en >1,5 TDD. Derimot utviste ADM-HC1 og ukonjugert 5E9 så vel som det ikke-bindende L6-ADM-konjugat, ingen anti-tumoraktivitet. En viss tumorvekstinhibering kunne iakttas med ADM-HC1 pluss 5E9-blandingen, men denne virkning var kortvarig og utgjorde bare en statistisk usignifikant 0,2 TDD.

Ved dette forsøk ble det frie legemiddel dosert i en mengde på 4,1 mg/kg/injeksjon på grunn av toksisiteten forbundet med i.p.-administrert, fritt legemiddel ved doser over 4-5 mg/kg. Ved disse lave doser var både fritt ADM og bland-inger av ADM pluss monoklonalt antistoff inaktive. Som det tydelig fremgår fra fig. 21, utviste ADM-immunkonjugatet imidlertid stadig inhibering av tumorvekst selv ved denne lave dose.

Anti-tumoraktiviteten av ADM-immunkonjugatene på Daudi-tumorer sammenlignet med anti-tumoraktiviteten oppnådd ved det ukonjugerte legemiddel under iakttagelse av optimal dose, administreringsmåte og -skjema, ble forsøkt bestemt. Innledningsvis var det derfor nødvendig å bestemme dose, administreringsmåte og skjema for fritt ADM-HC1 som førte til en maksimal anti-tumoraktivitet på Daudi-celler. Til denne optimeringsundersøkelse ble mus behandlet med ADM-HC1 under anvendelse av forskjellige administreringsmåter, dosemengder og skjemaer. Avstanden mellom inokuleringer var avhengig av det anvendte behandlingsskjerna. TDD-verdier ble deretter bestemt som beskrevet ovenfor.

Resultatene av denne optimeringsundersøkelse er oppsummert i tabell 2 nedenfor. Som det fremgår fra tabell 2, ga Q7Dx3-skjemaet ved i.v. administrering en optimal anti-tumorreaksjon, både med hensyn til tumorvekstforsinkelse og tumorregresjonshastigheter ved en dose på 11 mg/kg/injeksjon, hvilket også var MTD for legemidlet ved anvendelse av Q7Dx3-skjemaet i.v.

Anti-tumoraktiviteten av fritt legemiddel på Daudi-tumorceller er ytterligere avbildet i fig. 22. Ved anvendelse av Q7Dx3-skjemaet og i.v.-administrering ble veksten av Daudi-tumor-xenotransplantater signifikant inhibert på en doseavhengig måte etter behandling med ADM-HC1 ved hhv. 9, 10 eller 11 mg/kg/injeksjon. Kontrollmus var ubehandlet. Inhibering av tumorvekst (T-C) ved MTD, som var 11 mg/kg/injeksjon, var 28 dager, hvilket svarer til en 1,1 TDD.

Forskjellige skjemaer i forbindelse med i.p.-administrering ble likeledes prøvet. Som beskrevet ovenfor, ble

MTD for ADM-HC1 ved i.p.-administrering bestemt til mellom

4 og 5 mg/kg/injeksjon. Som det fremgår fra tabell 2B, er det frie legemiddel inaktivt på Daudi-celler ved dets MTD via i.p.-veien. Det ble således bestemt at optimal anti-tumoraktivitet for det frie legemiddel kan oppnås ved i.v.-administrering hvor MTD er 11 mg/kg/injeksjon, en legemiddeldose som viser vekstinhibering av Daudi-tumorceller.

Ut fra disse forsøk ble det derfor bestemt at den optimale ADM-HCl-dose for anti-tumoraktivitet på Daudi-tumorer var ca. 11 mg/kg/injeksjon, det optimale skjema var Q7Dx3, og den optimale administreringsmåte var i.v.

Anti-tumoraktiviteten av ADM-immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen på Daudi-tumorer ble deretter sammenlignet med anti-tumoraktiviteten av det frie ADM-HC1-legemiddel under de ovenfor beskrevne optimale betingelser. Et G28.1-ADM-immunkonjugat, G28.l-ADM-7,6 (MR =7,6 legemidler /MAB), dosert ifølge et Q5Dx2-skjema ved i.p.-administrering, ble sammenlignet med ADM-HC1 dosert som 10, 11 og 12 mg/kg/injeksjon ifølge et Q7Dx3-skjema ved i.v.-administrering. Som vist i fig. 23 og nedenfor i tabell 3, var det frie legemiddel aktivt idet det ga en 28-dagers forsinkelse i tumorvekst ved 11 mg/kg (MTD), og idet 2 av 8 mus utviste fullstendig tumorregresjon (helbredelse). Immunokonjugatet ble godt tolerert (ingen dødsfall, intet vekttap) ved den høyeste prøvede dose (18,7 mg ADM, Q5Dx2, i.p.) og utviste en noe høyere antitumoraktivitet enn det frie legemiddel, idet 3 av 8 behandlede dyr utviste fullstendig tumorregresjon. Heller ikke denne gang ble noen anti-tumoraktivitet forbundet med ikke-bindende L6-immunkonjugat, ukonjugert G28.1 eller en blanding av ukonjugert G28.1 og ADM-HC1. Det fremgår således at ADM-immunkonjugatene inhiberte tumorvekst i større utstrekning enn det var oppnåelig med det ukonjugerte legemiddel ved optimal dose og skjema under i.v.- eller i.p.-administrering.

Tabell 4 oppsummerer anti-tumoraktiviteten oppnådd med forskjellige preparater av 5E9- og G28.1-immunkonjugater på Daudi-tumor-xenotransplantater i atymiske mus. Den høyeste reaksjonshyppighet ble oppnådd konsekvent med anti-stoffdoser på 500 mg/kg eller mer. Ved disse doser ble det oppnådd anti-tumoraktivitet under anvendelse av konjugater med molforhold på 1,8 til 8,6. Anti-tumoraktiviteten syntes å være avhengig av antistoffdosen fremfor dosen av det konjugerte legemiddel, hvilket kan ses ved at når dosen av det monoklonale antistoff steg, var det en tilsvarende økning i både TDD, dvs. inhibering av tumorvekst og tumorregresjons-hyppigheter. I ikke noe forsøk ble det iakttatt anti-tumoraktivitet med de ikke-bindende L6-ADM-konjugater som ble prøvet parallelt med ekvivalente doser av antistoff og konjugert legemiddel (resultatene er ikke vist). Tabell 4 illustrerer enn videre den økede styrke av immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen sammenlignet med det frie legemiddel som var inaktivt ved ekvivalente doser av legemiddel (sammenlign med tabell 2 ovenfor).

Tabell 5 nedenfor viser den reduserte toksisitet oppnådd under anvendelse av ADM-immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen overfor det ukonjugerte legemiddel. Som det fremgår, var immunkonjugatene minst 10 ganger mindre toksiske enn det frie ADM ved i.p.-dosering.

Sluttelig viser fig. 26A og tabell 6 anti-tumoraktiviteten av G28.1-ADM-konjugater på humane Ramos-tumorer. Anti-tumorvirkningen av immunkonjugatene på Ramos-tumorer ble igjen sammenlignet med aktiviteten iakttatt for fritt ADM-HC1 under betingelser som ga optimale resultater, og som tidligere var bestemt til å være en enkeltdoseinjeksjon ved en dose på 16-18 mg/kg/injeksjon (se fig. 24 og 25). Ved den høyeste, prøvede dose av immunkonjugater (10,6 mg/kg) utviste konjugatet en overlegen anti-tumoraktivitet i forhold til aktiviteten oppnådd under anvendelse av fritt legemiddel i en dose på 18 mg/kg (25% dødelig) ved oppnåelse av O,5 TDD og i forhold til aktiviteten av ADM-HC1 i en dose på 16 mg/kg (12% dødelighet) ved oppnåelse av 1,0 TDD. Konjugatet ved denne dose ble tolerert godt, idet ingen av de behandlede dyr viste vekttap eller døde. Anti-tumoraktiviteten av G28.1-ADM viste seg også å være doseavhengig som det fremgår fra fig. 26B. Reduksjon av konjugatdosen resulterte således i reduksjon i TDD og antallet av fullstendige regresjoner. L6-ADM (ikke-bindende)-konjugatet ved en sammenlignende dose (10,6 mg/kg) var inaktivt.

De ovenfor angitte eksempler belyser således fremstillingen av hittil ukjente anthracyclin-immunkonjugater hvorved et cytotoksisk anthracyclin-legemiddel konjugeres med et antistoff via en hittil ukjent syrefølsom acylhydrazonbinding. Immunkonjugatene bibeholder både antistoff-bindingsaktivitet (dvs. målcellespesifisitet) og cytotoksisk legemiddelaktivitet og tillater frigjørelse av fritt, umodifisert legemiddel under sure og reduserende betingelser som er typiske for det cellulære miljø hos en målcelle. Anti-tumoraktiviteten av disse konjugater er blitt vist både in vitro og in vivo og har vist seg å være større enn aktiviteten oppnådd med det frie, ukonjugerte anthracyclin. Immunkonjugatene ble enn videre tolerert in vivo i meget større utstrekning enn det ukonjugerte legemiddel. Immunkonjugatene fremstilt ifølgeoppfinnelsen utviser således en øket, terapeutisk indeks (for anti-tumoraktivitet overfor toksisitet), og de er derfor særlig nyttige ved fremføring av cytotoksiske legemidler til en utvalgt cellepopulasjon til preferensiell tilintetgjørelse av disse celler ved behandling av sykdommer, slik som cancer og andre tumorer, ikke-cytocide viralinfeksjoner eller andre patogene infeksjoner samt autoimmunsykdommer.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunkonjugat omfattende et antall anthracyclinmolekyler bundet til et antistoff som kan reagere med en utvalgt cellepopulasjon som skal tilintetgjøres, idet hvert anthracyclin inneholder en ketogruppe i C-13-stillingen og er knyttet til antistoffet via en linkerarm som er covalent bundet til anthracyclinet ved en acylhydrazonbinding i 13-keto-stillingen i anthracyclinet, karakterisert ved at man a) omsetter antistoffet med et thioleringsmiddel, og b) omsetter det thiolerte antistoff med et acyl hydrazon med formel I hvori A er -S-R2 eller -SH, A<1> er R4 eller -NR7R8, R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO( CH2 )3CH3 eller CH2OCOCH( OC2H5 )2, R<2> er hvori X er hydrogen, N02 eller halogen, R3 er OCH3, OH eller hydrogen, R4 er NH2, NHCOCF3, 4-mor f olinyl, 3-cyano-4-mor f olinyl, 1-piperidinyl, 4-methoxy-l-piperidinyl, benzylamin, dibenzyl-amin, cyanomethylamin eller l-cyano-2-methoxyethylamin, R<5> er OH, O-THP eller hydrogen, R6 er OH eller hydrogen, under den forutsetning at R<6> ikke er OH når- R5 er OH eller O-THP, R7 og R<8> uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, substituert alkyl, sykloalkyl, aryl, substituert aryl, aralkyl eller substituert aralkyl, eller R7 og R<8> danner sammen en 4-7 leddet ring som eventuelt kan være substituert, og n er et helt tall fra 1-10.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at acylhydrazonet er adriamycin-13-3-{(2-pyridyldithio)-propionyl}-hydrazon-hydroklorid (ADM-HZN).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at thioleringsmidlet er N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP), eller 2-iminothiolan (2 IT).

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunkonjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at man a) omsetter SPDP med hydrazin under dannelse av et 3-(2-pyridylthio)-propionyl-hydrazid, b) omsetter adriamycin-hydrokloridet med hydrazidet under dannelse av ADM-HZN, og c) omsetter ADM-HZN med et antistoff som kan reagere med en utvalgt cellepopulasjon som skal tilintetgjøres, til hvilket antistoff det er bundet thiolgrupper.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunkonjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at man a) omsetter SPDP med hydrazin under dannelse av et 3-(2-pyridylthio)-propionyl-hydrazid, b) omsetter adriamycin-hydrokloridet med hydrazidet under dannelse av ADM-HZN, c) behandler ADM-HZN med et reduksjonsmiddel under dannelse av 13-{3-(mercaptopropionyl) }-adriamycin-hydrazon, og d) omsetter hydrazonet med et antistoff som kan reagere med en utvalgt cellepopulasjon som skal tilintet-gjøres-, til hvilket antistoff det er bundet maleimidgrupper.

6. Anthracyclinhydrazonderivat, karakterisert ved at det har formelen (I) hvori A er -S-R2 eller -SH, A<1> er R<4> eller -NR<7>R<8>, R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 eller CH2OCOCH(OC2H5)2, R<2> er hvori X er hydrogen, N02 eller halogen, R3 er OCH3, OH eller hydrogen, R4 er NH2, NHCOCF3, 4-morfolinyl, 3-cyano-4-morfolinyl, 1-piperidinyl, 4-methoxy-l-piperidinyl, benzylamin, dibenzyl-amin, cyanomethylamin eller l-cyano-2-methoxyethylamin, R5 er OH, O-THP eller hydrogen, R6 er OH eller hydrogen, under den forutsetning at R<6> ikke er OH når R<5> er OH eller O-THP, R7 og R<8> uavhengig av hverandre er hydrogen, alkyl, substituert alkyl, sykloalkyl, aryl, substituert aryl, aralkyl eller substituert aralkyl, eller R7 og R<8> danner sammen en 4-7 leddet ring som eventuelt kan være substituert, og n er et helt tall fra 1-10.

7. - Anthracyclinhydrazoderivat ifølge krav 6, karakterisert ved at ved A er -SH.

8. Anthracyclinhydrazoderivat ifølge krav 6, karakterisert ved at ved A<1> er -NR<7>R<8>, hvor R<7 >og R<8> er som definert i krav 1, og A er -SR<2>, hvor R2 er som definert ovenfor.

9. Anthracyclinhydrazonderivat ifølge krav 6, karakterisert ved at det er adriamycin-13-{3-(2-pyridyldithio)-propionyl}-hydrazon-hydroklorid (ADM-HZN) .

10. Anthracyclinhydrazonderivat ifølge krav 7, karakterisert ved at det er adriamycin-13-{3-(mercaptopropionyl)}-adriamycin-hydrazon.