UA119047C2 - Кон'юговане антитіло до ly75 для лікування раку - Google Patents

Кон'юговане антитіло до ly75 для лікування раку Download PDF

Info

Publication number
UA119047C2
UA119047C2 UAA201604040A UAA201604040A UA119047C2 UA 119047 C2 UA119047 C2 UA 119047C2 UA A201604040 A UAA201604040 A UA A201604040A UA A201604040 A UAA201604040 A UA A201604040A UA 119047 C2 UA119047 C2 UA 119047C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
cancer
antibodies
cells
peptides
Prior art date
Application number
UAA201604040A
Other languages
English (en)
Inventor
Джонатан Александер Терретт
Джеймс Едвард Акройд
Original Assignee
Берлін-Хемі Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Берлін-Хемі Аг filed Critical Берлін-Хемі Аг
Publication of UA119047C2 publication Critical patent/UA119047C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Винахід стосується виділеного антитіла або його антигензв'язувальної частини, які зв'язуються з LY75, та містять ковалентно приєднаний цитотоксичний лікарський засіб. Винахід також стосується фармацевтичної композиції та способу лікування раку, опосередкованого LY75.

Description

ВСТУП
Дане розкриття в цілому стосується галузей імунології та молекулярної біології.
Конкретніше, у даному документі наведено антитіла та інші терапевтичні білки, спрямовані проти ГМ75, нуклеїнові кислоти, які кодують такі антитіла і терапевтичні білки, способи одержання моноклональних антитіл та інших терапевтичних білків і способи лікування захворювань, таких як форми раку, опосередковані експресією/активністю /М75 і/або асоційовані з аномальною експресією/активністю його лігандів.
ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ
Лімфоцитарний антиген 75 діє як ендоцитозний рецептор, що спрямовує захоплені антигени з позаклітинного простору у спеціалізований антиген-процесуючий компартмент, і, як вважають, викликає зниження проліферації В-лімфоцитів. Експресія лімфоцитарного антигену 75 спостерігалася при формах раку підшлункової залози, яєчника, молочної залози, ободової і прямої кишки, стравоходу, шкіри, щитоподібної залози і легені (недрібноклітинному), а також при множинній мієломі і багатьох різних підтипах лімфоми і лейкозу.
У УМО 2009/061996 розкриті виділені моноклональні антитіла, що зв'язуються з ОЕС-205 (М75) людини, і споріднені композиції і молекули на основі антитіл. Також розкриті фармацевтичні композиції, що містять антитіла, а також терапевтичні і діагностичні способи застосування антитіл.
У УМО 2008/104806 розкриті афінні реагенти, здатні до зв'язування з І У75, для застосування в лікуванні або профілактиці раку.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
У даному винаході представлені антитіла, спрямовані проти І У75, нуклеїнові кислоти, які кодують такі антитіла, клітини-хазяї, що містять такі нуклеїнові кислоти, які кодують антитіла за даним винаходом, способи одержання антитіл до І У75 і способи лікування захворювань, таких як порушення, опосередковані ГУ75, наприклад, форми раку у людини, що включають рак підшлункової залози, рак яєчника, рак молочної залози, рак ободової і прямої кишки, рак стравоходу, рак шкіри, рак щитоподібної залози, рак легені, рак голови і шиї, рак сечового міхура, рак шлунка, лейкоз, множинну мієлому і лімфому.
В одному аспекті у даному винаході представлені антитіло або його антигензв'язувальна
Зо частина, які: (а) зв'язуються з епітопом на І М75, що розпізнається антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, наведену під
ЗЕО ІЮ МО:1, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, наведену під ЗЕО ІЮ МО:2, або (Б) конкурують за зв'язування з І У75 з антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, наведену під
ЗЕО ІЮ МО:1, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, наведену під БЕО ІЮ МО:2.
В одному варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язувальна частина зв'язуються з
ЇМ75 людини і містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить 1, 2 або 3 СОК, вибрані з групи, що включає СОК, що містять ЗЕО ІЮ МО:5, 6 і 7, або варіабельну область легкого ланцюга, що містить 1, 2 або З СОК, вибрані з групи, що включає СОК, що містять ЗЕО
ІО МО:8, 9 і 10.
У переважних варіантах здійснення вказані антитіла є виділеними антитілами.
У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом зв'язуються з І 75 (5ЕО ІЮ МО: 15) і інтерналізуються клітиною, що експресує ІМ75, викликають реакцію антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АЮСС) у присутності ефекторних клітин або викликають цитотоксичну Т-клітинну реакцію у присутності ефекторних клітин.
В іншому варіанті здійснення антитіло містить області, які визначають комплементарність (СОК), або варіабельні області (МК) важких і/або легких ланцюгів конкретного антитіла, описаного у даному документі (наприклад, згадуваного у даному документі як "І! М75 А17").
Відповідно, в одному варіанті здійснення антитіло містить домени СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (УН) антитіла І! У75 Ат, що має послідовність, показану під 5БЕО ІЮ МО:1, і/або домени СОКІ, СОМ2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ)
ЇМ75 АТ, що має послідовність, показану під 5ЕО ІЮ МО:2. В іншому варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить першу мисом, що містить
ЗЕО ІЮ МО:5; другу МАСОК, що містить ЗЕО ІО МО:6; і третю мисок, що містить ЗЕО ІЮ МО:7; і/або варіабельну область легкого ланцюга, що містить першу міСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО:8; другу мІСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО:9; і третю міСОК, що містить ЗЕБЕО ІЮО МО:10, де необов'язково будь-яка одна або більше СОК незалежно містять одну, дві, три, чотири або п'ять амінокислотних замін, додавань або делецій. 60 В іншому варіанті здійснення антитіла за даним винаходом зв'язуються з І 75 людини і містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить ХЕО ІЮ МО:1 і/або її консервативні модифікації послідовності. Антитіло може додатково містити варіабельну область легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО 2 і/або її консервативні модифікації послідовності.
У додатковому варіанті здійснення антитіла за даним винаходом зв'язуються з І 75 людини і містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, відповідно наведені під ЗЕО І МО:1 і/або 2, і їхні консервативні модифікації послідовності.
Виділені антитіла, що містять варіабельні області важких і легких ланцюгів, що характеризуються щонайменше 80 95, або щонайменше 85 95, або щонайменше 90 95, або щонайменше 91 95, або щонайменше 92 95, або щонайменше 93 95, або щонайменше 94 95, або щонайменше 95 95, або щонайменше 96 95, або щонайменше 97 95, або щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95, або більшою ідентичністю послідовності з будь-якої з вищенаведених послідовностей, також включені у даний винахід. Проміжні діапазони вищевказаних значень, наприклад, варіабельні області важких і легких ланцюгів, що характеризуються щонайменше 80-85 965, 85-90 95, 90-95 95 або 95-100 95 ідентичністю послідовності з будь-якої з вищенаведених послідовностей, також маються на увазі як такі, які охоплені даним винаходом.
В одному варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить ЗЕО І МО:1 або послідовність щонайменше на 80 956, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичну ЗЕО І МО:1. В іншому варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО:2 або послідовність, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичну ЗЕО ІО МО:2. В іншому варіанті здійснення антитіло містить каркасну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95,
Зо щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичну каркасній області варіабельної області важкого ланцюга з 5ЕО ІЮ МО: 1, як показано під БЕО ІЮО МО: 16, 17, 18 і 19. В іншому варіанті здійснення антитіло містить каркасну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 96, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичну каркасній області варіабельної області легкого ланцюга з ЗЕО ІО МО:2, як показано під ЗЕО ІЮ МО: 20, 21,22 і 23.
Також даним винаходом охоплюються антитіла, які конкурують за зв'язування з І У75 з антитілами за даним винаходом. У конкретному варіанті здійснення антитіло конкурує за зв'язування з І 75 з антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, відповідно наведені під ЗЕО ІЮ МО:1 і 2, або амінокислотні послідовності, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичні їм. В іншому варіанті здійснення антитіло конкурує за зв'язування з І У75 з антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, наведені під БЕО ІЮ МО:1 і 2 (175 АТ).
Інші антитіла за даним винаходом зв'язуються з тим же епітопом або епітопом на І У75, що розпізнається антитілами, описаними у даному документі. В іншому конкретному варіанті здійснення антитіло зв'язується з епітопом на ГУ75, що розпізнається антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, відповідно наведені під 5ЕО ІЮО МО:1 і 2, або амінокислотні послідовності, щонайменше на 80 95 ідентичні їм. В іншому варіанті здійснення антитіло зв'язується з епітопом на ГМ75, що розпізнається антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, наведені під БЕО ІЮ МО:1 і 2 (175 АТ).
У додатковому варіанті здійснення антитіла за даним винаходом специфічно зв'язуються з одним або більше, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, пептидами, вибраними з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 або 37, або їхніми фрагментами, де вказані фрагменти містять щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, бо щонайменше 5, щонайменше б, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9 або щонайменше 10 суміжних амінокислот. У додатковому варіанті здійснення епітоп, що розпізнається антитілами за даним винаходом, містить один або більше пептидів, два або більше або три або більше пептидів, вибраних з групи, що включає 5ЕО ІЮО МО: 27, 29, 30, 34, 35, 36 або 37, або їхніми фрагментами, де вказані фрагменти містять щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9 або щонайменше 10 суміжних амінокислот. У додатковому варіанті здійснення епітоп, що розпізнається антитілами за даним винаходом, містить один або більше пептидів, наприклад, два або три пептиди, вибрані з групи, що включає 5ЕО ІО МО: 30, 36 і 37, або їхніми фрагментами, де вказані фрагменти містять щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше б, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9 або щонайменше 10 суміжних амінокислот.
У додатковому варіанті здійснення антитіла за даним винаходом містять відмінні СОВА порівняно з вихідними антитілами, описаними у даному документі. Таким чином, у даному винаході представлені варіанти антитіл, що містять варіанти варіабельних областей вихідного антитіла, де вихідне антитіло містить першу мМаИСОк, що містить 5ЕО ІЮ МО:5, другу масок, що містить ЗЕО ІО МО:б6, третю масок, що містить 5ЕО ІЮ МО:7, першу міСоОК, що містить 5ЕО ІЮ
МО:8, другу МСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО:9, і третю мМСОК, що містить зЕО ІЮО МО:10, ї де варіант антитіла у сукупності має 1, 2, 3, 4, 5 або 6 амінокислотних замін у наборі з першої
МАСОК, другої МАСОК, третьої МАСОК, першої міСОК, другої мІСОК і третьої мІСОК, при цьому 1- 4, 1-3 або 1-2 заміни є особливо застосовуваними, і де антитіло зберігає специфічне зв'язування з І 75.
Антитіла за даним винаходом можуть бути антитілами повної довжини, наприклад, будь- якого з наступних ізотипів: ІДО1, Ід2, дез, Ід, ІМ, ДА, ІдДА2, секреторний компонент ІдДА,
ЧО і ЗЕ. В альтернативному випадку антитіла можуть являти собою фрагменти, такі як антигензв'язувальна частина або одноланцюгове антитіло (наприклад, Еар, Е(аб)», Ем, одноланцюговий Ем-фрагмент, виділена область, що визначає комплементарність (СОК), або комбінація двох або більше виділених СОК). Антитіла можуть бути антитілами будь-якого типу, в тому числі, без обмежень, людськими, гуманізованими і химерними антитілами.
В інших варіантах здійснення антитіла за даним винаходом знаходяться у формі
Зо імунокон'югата (тобто додатково містять ковалентно приєднаний компонент). У конкретному варіанті здійснення компонент являє собою лікарський засіб, такий як майтанзиноїд, доластатин, ауристатин, трихотецен, каліхеаміцин, СС1065 або їхні похідні. У переважному варіанті здійснення компонент-лікарський засіб являє собою ЮОМІ1 або ОМА.
В інших варіантах здійснення антитіла за даним винаходом додатково охоплюють біспецифічну молекулу і у такій якості можуть викликати реакцію антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АЮОСС) у присутності ефекторних клітин, знешкоджуючи, таким чином, клітини, які експресують І У75.
В інших варіантах здійснення антитіла за даним винаходом додатково охоплюють біспецифічну молекулу і у такій якості можуть викликати цитотоксичну Т-клітинну реакцію у присутності ефекторних клітин, знешкоджуючи, таким чином, клітини, які експресують І У75.
В іншому аспекті у даному винаході представлені нуклеїнові кислоти, які кодують варіабельні області важких і/або легких ланцюгів антитіл за даним винаходом. В одному варіанті здійснення представлена нуклеїнова кислота, що містить послідовність, яка кодує важкий ланцюг антитіла за даним винаходом або його антигензв'язувальну частину. В іншому варіанті здійснення представлена нуклеїнова кислота, що містить послідовність, яка кодує легкий ланцюг антитіла за даним винаходом або його антигензв'язувальну частину. У додатковому варіанті здійснення представлена нуклеїнова кислота, що містить послідовність, яка кодує варіабельні області важких і легких ланцюгів антитіл за даним винаходом.
В одному варіанті здійснення у даному винаході представлено виділене моноклональне антитіло, що зв'язується з ЇУ75 людини, де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, які кодуються послідовностями нуклеїнової кислоти, що відповідно включають в себе 5ЕО ІЮО МО:3 і 4, або послідовностями нуклеїнової кислоти, які характеризуються щонайменше 85 95, 86 905, 87 90, 88 90, 89 90, 90 905, 91 95, 92 905, 93
Фо, 94 95,95 95, 96 965, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичністю з вищезгаданими послідовностями нуклеїнової кислоти або послідовностями, відмінними від 5ЕО ІЮ МО: 3 їі 4 внаслідок виродженості генетичного коду.
В іншому аспекті даного винаходу представлені вектори експресії, що містять нуклеїнові кислоти, які кодують варіабельні області важких і/або легких ланцюгів антитіл за даним винаходом, функціонально зв'язані з одним або більше регуляторними елементами. бо В іншому аспекті у даному винаході представлені клітини-хазяї, що містять нуклеїнові кислоти, які кодують варіабельні області важких і/або легких ланцюгів вищезгаданих антитіл або їхніх антигензв'язувальних частин. Переважно, при цьому клітина-хазяїн експресує вказані варіабельні області важких і/або легких ланцюгів або їхніх антигензв'язувальних частин, якщо клітину-хазяїна вирощують в умовах, у яких експресується (експресуються) нуклеїнова(нуклеїнові) кислота(кислоти).
У переважному варіанті здійснення клітина-хазяїн містить: (ії) вектор експресії згідно з даним винаходом або (і) перший вектор експресії, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла за даним винаходом або його антигензв'язувальну частину, і другий вектор експресії, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла за даним винаходом або його антигензв'язувальну частину.
У додатковому аспекті даного винаходу представлено одержання антитіла або його антигензв'язувальної частини, що включає культивування клітини-хазяїна згідно з даним винаходом в умовах, у яких експресуються антитіло або його антигензв'язувальна частина, і необов'язково виділення антитіла або його антигензв'язувальної частини.
У додатковому аспекті представлений спосіб лікування раку, що включає введення пацієнту, який потребує цього, антитіла або його антигензв'язувальної частини згідно з даним винаходом, де антитіло або його антигензв'язувальна частина інтерналізуються клітиною, що експресує
ЇМ75, при цьому вказане антитіло або його антигензв'язувальна частина містять ковалентно приєднаний кон'югований лікарський засіб. Буде зрозуміло, що антитіло або його антигензв'язувальна частина за даним винаходом зв'язуються з І У75 (5ЕО ІО МО:15). В одному варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить першу
МАСОм, що містить 5ЕО ІЮ МО:5; другу МАИСОм, що містить 5ЕО ІЮ МО:6; і третю МАСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО:7; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить першу міІСОК, що містить ЗЕО ІО МО:8; другу мМІСОК, що містить БЕО ІЮ МО:9; і третю міІСоОК, що містить 5ЕО 10
МО:10, а також ковалентно приєднаний кон'югований лікарський засіб.
У додатковому аспекті представлений спосіб лікування раку, де пацієнту, який потребує цього, вводять антитіло або антитіла або їхні антигензв'язувальні частини за даним винаходом, і де таке антитіло або антитіла або їхні антигензв'язувальні частини за даним винаходом
Зо викликають реакцію АЮСС у присутності ефекторних клітин. Переважно, антитіло або його антигензв'язувальна частина містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить першу
МАСОм, що містить 5ЕО ІЮ МО:5; другу МАИСОм, що містить 5ЕО ІЮ МО:6; і третю МАСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО:7; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить першу міСОК, що містить ЗЕО ІО МО:8; другу мМІСОК, що містить БЕО ІЮ МО:9; і третю міІСоОК, що містить 5ЕО 10
МО:10.
У додатковому аспекті представлений спосіб лікування раку, де пацієнту, який потребує цього, вводять антитіло або антитіла або їхні антигензв'язувальні частини за даним винаходом, і де таке антитіло або антитіла або їхні антигензв'язувальні частини за даним винаходом викликають цитотоксичну Т-клітинну реакцію у присутності ефекторних клітин. Переважно, антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить першу мисом, що містить
ЗЕО ІОЮ МО:5; другу масок, що містить ЗЕО ІЮ МО:6; і третю МАСОК, що містить ЗЕО ІО МО:7; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить першу міСсОм, що містить 5ЕО ІЮ МО:8; другу
МОСК, що містить ЗЕО ІЮО МО:9; і третю мІСОК, що містить ЗЕО ІЮО МО:10.
У додатковому аспекті даного винаходу представлені одне або більше антитіл за даним винаходом для застосування в лікуванні раку.
Також представлено застосування одного або більше антитіл за даним винаходом у виробництві лікарського препарату для лікування раку.
У деяких варіантах здійснення рак вибраний з групи, що включає рак підшлункової залози, рак нирки, рак печінки, рак яєчника, рак молочної залози, рак ободової і прямої кишки, рак стравоходу, рак голови і шиї, рак шкіри, рак щитоподібної залози, рак сечового міхура, рак шлунка, рак легені, лейкоз, мієлому, переважно множинну мієлому, і лімфому. Особливо переважні форми раку включають неходжкінську лімфому, дифузну великоклітинну В-клітинну лімфому (0 ВСІ), В-клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мантійноклітинну лімфому, лімфому з лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАГ Т), В-клітинну лімфому, збагачену Т- клітинами/гістіоцитами, лімфому Беркітта, лімфоплазмоцитарну лімфому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, лімфому з клітин маргінальної зони, Т-клітинну лімфому, периферійну
Т-клітинну лімфому, анапластичну великоклітинну лімфому і ангіоїмунобластну Т-клітинну лімфому, гострий мієлоїдний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, рак сечового міхура, рак підшлункової залози і тричі негативний рак молочної залози. 60 Згідно з ще одним додатковим аспектом даного винаходу представлений спосіб виявлення,
діагностики і/або скринінгу або спостереження прогресування раку, де при вказаному раку експресується І У75, або спостереження ефекту протиракового лікарського засобу або терапії, спрямованих на вказаний рак, у суб'єкта, що включає виявлення наявності або рівня антитіл, здатних до імуноспецифічного зв'язування з І 75, або одного або більше їхніх фрагментів.
Переважно, рак вибраний з групи, що включає рак підшлункової залози, рак нирки, рак печінки, рак яєчника, рак молочної залози, рак ободової і прямої кишки, рак стравоходу, рак голови і шиї, рак шкіри, рак щитоподібної залози, рак сечового міхура, рак шлунка, рак легені, лейкоз, мієлому, переважно множинну мієлому, і лімфому. Особливо переважні форми раку включають неходжкінську лімфому, дифузну великоклітинну В-клітинну лімфому (ОІ ВСІ), В- клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мантійноклітинну лімфому, лімфому з лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАЇГЇТ), В-клітинну лімфому, збагачену Т-клітинами/гістіоцитами, лімфому Беркітта, лімфоплазмоцитарну лімфому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, лімфому з клітин маргінальної зони, Т-клітинну лімфому, периферійну Т-клітинну лімфому, анапластичну великоклітинну лімфому і ангіоїмунобластну Т-клітинну лімфому, гострий мієлоїдний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, рак сечового міхура, рак підшлункової залози і тричі негативний рак молочної залози.
Також у межах обсягу даного винаходу знаходяться набори, що містять композиції (наприклад, антитіла) за даним винаходом і необов'язково інструкції щодо застосування. Набір може додатково містити щонайменше один додатковий реагент або одне або більше додаткових антитіл за даним винаходом.
Інші ознаки і переваги даного винаходу будуть очевидними з наступного детального опису і формули винаходу.
КОРОКТИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
На фігурі 1 представлено вирівнювання важкого ланцюга І М75 АТ (5ЕО ІЮ МО:1), МН 3-15 людини зародкового типу (ЗЕО ІЮ МО:11) ї УН4 людини зародкового типу (ЗЕО ІЮ МО:12). СОК- області важкого ланцюга І У75 А! підкреслені.
На фігурі 2 представлено вирівнювання легкого ланцюга ГМ75 А1 (ЗЕО ІЮ МО:2), МК 012 людини зародкового типа (5ЕО ІЮО МО:13) і УК4 людини зародкового типа (5ЕО ІЮ МО:14). СОК- області легкого ланцюга І 75 А! підкреслені.
Зо На фігурі За представлена цитотоксична активність моноклональних антитіл до /У75, кон'югованих з ОМ, по відношенню до НТ-29 і показано, що при тому, що більшість антитіл зв'язуються з І У75, тільки деякі з них проявляють ефективність.
На фігурі ЗБ представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до НТ-29.
На фігурі Зс представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 або
ОМА, по відношенню до клітин КАХІ.
На фігурі За представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин Матаїма.
На фігурі Зе представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'югованих з ЮОМІ1 або ОМА, по відношенню до клітин Каграх 299.
На фігурі ЗІ представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 або
ОМА, по відношенню до клітин ВХРС3.
На фігурі Зд представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ЮОМІ1 або ОМА, по відношенню до клітин Нирт4.
На фігурі Зп представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин НРАЕРІЇ.
На фігурі Зі представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 або
ОМА, по відношенню до клітин ЕНЕВ.
На фігурі 3) представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 або
ОМА, по відношенню до клітин Мес-1.
На фігурі ЗК представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 або
ОМА, по відношенню до клітин АМІ -193.
На фігурі ЗІ представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 або
ОМА, по відношенню до клітин НСС 70.
На фігурі Зт представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин НСС 1806.
На фігурі Зп представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин МОА-МВ-468.
На фігурі Зо представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ЮОМІ1 60 або ОМА, по відношенню до клітин ЕТ4.
На фігурі Зр представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин 5637.
На фігурі Зд представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин 5УУ780.
На фігурі Зг представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 або
ОМА, по відношенню до клітин 5СС-9.
На фігурі 35 представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 або
ОМА, по відношенню до клітин ОЕ 19.
На фігурі Зі представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 або
ОМА, по відношенню до клітин ОМСАК-3.
На фігурі Зи представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин 5К-ОМ-3.
На фігурі Зм представлена цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 або
ОМА, по відношенню до клітин МОЇ Р-8.
На фігурі Зм/ представлена цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'югованих з ОМ1 або ОМА, по відношенню до клітин ЕРМІ8226.
На фігурі 4а представлена ефективність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ або ОМА, по відношенню до клітин Каїї лімфоми Беркітта в ксенотрансплантатній моделі на мишах з ЗСІЮ.
На фігурі 45 представлена ефективність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 або ОМА, по відношенню до клітин Матама лімфоми Беркітта в ксенотрансплантатній моделі на мишах з
ЗО.
На фігурі 4с представлена ефективність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ або ОМА, по відношенню до клітин НРАРІЇ аденокарциноми підшлункової залози в ксенотрансплантатній моделі на безтимусних "голих" мишах.
На фігурі 44 представлена ефективність антитіл до І 75, кон'югованих з ОМІ1 або ОМА, по відношенню до клітин 5УУ780 карциноми сечового міхура людини в ксенотрансплантатній моделі на мишах з 5СІЮ.
На фігурі 4е представлена ефективність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ або ОМА, по відношенню до клітин МОА-МВ-468 в ксенотрансплантатній моделі на безтимусних "голих"
Зо мишах.
На фігурі 47 представлена ефективність антитіл до ЇУ75, кон'юЮгованих з ОМІ або ОМА, по відношенню до клітин СОГО205 аденокарциноми ободової і прямої кишки в ксенотрансплантатній моделі на безтимусних "голих" мишах.
На фігурі 5а показано конкурентне зв'язування тАб до І У75 і тАБб до І У75, кон'югованого з
МОоС-ОМ'І1.
На фігурі 506 показано неконкурентне зв'язування І М75 А1 і тАБ до ІУ75, кон'югованого з
МОоС-ОМ'І1.
На фігурах ба-б| показані графічні представлення зв'язування антитіла ІМ75 АТ з пептидами І У75 в пептидній мікроматриці.
На фігурі 7 показано вирівнювання амінокислотних послідовностей пептидів, 3 якими зв'язується антитіло І У75 АТ, як у мікроматричному аналізі пептидів, так і в аналізі пептидів за методом соосадження. Виділені пептиди, ймовірно, утворюють епітоп, що розпізнається антитілом І У75 А1.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Дане розкриття стосується виділених антитіл, що зв'язуються з білком І 75, які описані під
ЗЕО ІЮ МО:15, як стисло викладено у даному документі.
На додаток, антитіла до ЇМ75 за даним винаходом можуть являти собою біспецифічну молекулу і у такій якості можуть викликати реакцію антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АОСС) у присутності ефекторних клітин, знешкоджуючи, таким чином, клітини, які експресують
І М75.
На додаток, антитіла до ЇМ75 за даним винаходом можуть являти собою біспецифічну молекулу і у такій якості можуть викликати цитотоксичну Т-клітинну реакцію у присутності ефекторних клітин, знешкоджуючи, таким чином, клітини, які експресують І У75.
На додаток, антитіла до І У75 за даним винаходом можуть інтерналізуватися при контакті з клітинами, які експресують рецептор ГМ75. Як обговорюється у даному документі, рецептор
ЇУ75 надекспресується і/або диференціально експресується у визначених ракових клітинах, у тому числі, без обмежень, при раку нирки, раку печінки, раку стравоходу, раку голови і шиї, раку шкіри, раку щитоподібної залози, раку шлунка, раку ободової і прямої кишки, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, раку молочної залози, раку яєчника, раку сечового міхура, бо лейкозі, переважно гострому мієлоїдному лейкозі або хронічному лімфоцитарному лейкозі, (с;
мієломі, переважно множинній мієломі, лімфомі, переважно ОІ ВСІ, В-клітинній лімфомі, фолікулярній лімфомі, мантійноклітинній лімфомі, лімфомі з лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАГ Т), В-клітинній лімфомі, збагаченій Т-клітинами/гістіоцитами, лімфомі Беркітта, лімфоплазмоцитарній лімфомі, дрібноклітинній лімфоцитарній лімфомі, лімфомі з клітин маргінальної зони, Т-клітинній лімфомі, периферійній Т-клітинній лімфомі, анапластичній великоклітинній лімфомі і ангіоїмунобластній Т-клітинній лімфомі, а також раку легені.
У зв'язку з цим, якщо антитіла до ЇУ75 за даним винаходом кон'юговані з лікарськими засобами (як іноді називаються у даному документі "кон'югатами антитіло-лікарський засіб" або "АрС"), то інтерналізація цих молекул АОС раковими клітинами призводить до загибелі клітин і, таким чином, лікування пухлини.
У даному винаході представлені антитіла, які мають конкретні структурні особливості, такі як
СОВ-області з конкретними амінокислотними послідовностями. У даному документі описаний набір СОК, які можуть утворювати афінний реагент, наприклад, антитіло, який характеризується зв'язуванням з І 75.
Таким чином, у даному розкритті представлені антитіла, переважно виділені антитіла (які, як стисло викладено нижче, включають велику різноманітність добре відомих структур, похідних, міметиків і кон'югатів антитіл), нуклеїнові кислоти, які кодують ці антитіла, клітини-хазяї, застосовувані для одержання антитіл, способи одержання антитіл і фармацевтичні композиції, що містять антитіла і необов'язково фармацевтичний носій, способи лікування і діагностики, що включають застосування антитіл, і застосування антитіл для лікування форм раку.
Білки І У75
Лімфоцитарний антиген 75 діє як ендоцитозний рецептор, що спрямовує захоплені антигени з позаклітинного простору у спеціалізований антиген-процесуючий компартмент, і, як вважають, викликає зниження проліферації В-лімфоцитів.
Згідно з ЗММІЗ5-РКОТ лімфоцитарний антиген 75 експресується в селезінці, тимусі, товстій кишці і лімфоцитах периферійної крові. Він був виявлений у лініях мієлоїдних клітин і лімфоїдних В-клітин. Ізоформи, позначені у даному документі як ОСТА07бр і ОстТАО7бс, експресуються у злоякісних клітинах лімфоми Ходжкіна, які називаються клітинами Ходжкіна і
Рид-Штернберга (НЕ). І У75 діє як ендоцитозний рецептор, що спрямовує захоплені антигени з
Зо позаклітинного простору у спеціалізований антиген-процесуючий компартмент. Він викликає зниження проліферації В-лімфоцитів.
Експресія І У75 спостерігалася при раку підшлункової залози, сечового міхура, яєчника, молочної залози (у тому числі тричі негативному), ободової і прямої кишки, стравоходу, шкіри, щитоподібної залози і легені (недрібноклітинному), а також при множинній мієломі і багатьох різних підтипах лімфоми (у тому числі СІ ВСІ) ї лейкозу.
Антитіло за даним винаходом у деяких випадках може перехресно реагувати з І У75 від виду, відмінного від людини. Наприклад, для полегшення проведення клінічного випробування антитіла за даним винаходом можуть перехресно реагувати з молекулами ЇУ75 мишей або приматів. В альтернативному випадку у деяких варіантах здійснення антитіла можуть мати повну специфічність до ЇМ75 людини і можуть не характеризуватися видовою перехресною реактивністю або іншими її типами по відношенню до молекул, відмінних від людських.
Антитіла
У даному винаході представлені антитіла до І У75, зазвичай терапевтичні і/або діагностичні антитіла, описані у даному документі. Антитіла, що знаходять застосування у даному винаході, можуть приймати ряд форматів, описаних у даному документі, що включають традиційні антитіла, а також похідні, фрагменти і міметики антитіл, описані нижче. В одному варіанті здійснення у даному винаході представлені структури антитіл, що містять набір з 6 СОК, визначених у даному документі (що містять невелику кількість амінокислотних змін, описаних нижче). "Антитіло" як використовується у даному документі, включає велику різноманітність структур, зрозумілих фахівцям у даній галузі, які у деяких варіантах здійснення містять як мінімум набір з 6 СОЖК, визначених у даному документі; що включають, без обмежень, традиційні антитіла (у тому числі як моноклональні, так і поліклональні антитіла), гуманізовані іабо химерні антитіла, фрагменти антитіл, сконструйовані антитіла (наприклад, які мають амінокислотні модифікації, стисло викладені нижче), поліспецифічні антитіла (у тому числі біспецифічні антитіла) і інші аналоги, відомі з рівня техніки.
Структурні одиниці традиційних антитіл зазвичай включають в себе тетрамер. Кожний тетрамер зазвичай містить дві ідентичні пари поліпептидних ланцюгів, при цьому кожна пара має один "легкий" (який зазвичай має молекулярну масу приблизно 25 кДа) і один "важкий" бо ланцюг (який зазвичай має молекулярну масу приблизно 50-70 кДа). Легкі ланцюги людини класифікуються як легкі каппа- і лямбда-ланцюги. Важкі ланцюги класифікуються як мю, дельта, гамма, альфа або епсилон і відповідно визначають ізотип антитіла як І9М, дО, Іде, ІдА і ЧЕ. до має декілька підкласів, що включають, без обмежень, ІдО1, Ідс2, ІдсЗ і ді. ІДМ має підкласи, що включають, без обмежень, І9МІ1 і І(дМ2. Таким чином, "ізотип", як використовується у даному документі, означає будь-який з підкласів імуноглобулінів, визначуваних хімічними і антигенними характеристиками їхніх константних областей. Відомими ізотипами імуноглобулінів людини є
ІЧО1, Ідс2, ІдЗ, дя, ІА, ІДА2, І9М1, ІдМм2, дО і дЧЕ. Слід розуміти, що терапевтичні антитіла також можуть включати гібриди з будь-якої комбінації ізотипів і/або підкласів.
У багатьох варіантах здійснення у даному винаході застосовуються ізотипи Ід, при цьому у ряді шляхів застосування особливе застосування знаходить Ідс1.
Амінокінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну область з приблизно 100-110 або більше амінокислот, які несуть основну відповідальність за розпізнавання антигену. У варіабельній області в у кожному з М-доменів важкого ланцюга і легкого ланцюга три петлі зібрані разом з утворенням антигензв'язувальної ділянки. Кожна з петель називається областю, що визначає комплементарність (далі у даному документі згадуваної як "СОК"), у якій мінливість амінокислотної послідовності є найбільш значною. "Варіабельний" стосується того факту, що визначені сегменти варіабельної області істотно відрізняються за послідовністю серед антитіл.
Варіабельність у межах варіабельної області розподілена нерівномірно. Насправді М-області містять відносно інваріантні ділянки, названі каркасними областями (ЕК), з 15-30 амінокислот, розділені більш короткими областями надзвичайної варіабельності, званими "гзіперваріабельними областями", кожна з яких має довжину 9-15 амінокислот або більше.
Кожна МН і Мі містить три гіперваріабельні області ("області що визначають комплементарність", "СОК") ії чотири ЕК, розміщені від амінокінця до карбоксильного кінця у наступному порядку: ЕК1-СО81-ЕН2-СОВ2-ЕНЗ-СОВЗ-ЕВА.
Гіперваріабельна область зазвичай охоплює амінокислотні залишки з амінокислотних залишків приблизно 24-34 (І СОК1; "І" означає легкий ланцюг), 50-56 (І СОМК2) і 89-97 (І. СОКЗ) у варіабельній області легкого ланцюга і десь приблизно 31-358 (НСОМК1; "Н" означає важкий ланцюг), 50-65 (НСОК2) і 95-102 (НСОКЗ) у варіабельній області важкого ланцюга; Кабаї еї аї.,
ЗЕОШЕМСЕВ ОЄ РАОТЕІЇМ5 ОРГ ІММОМОЇ ОСІСАЇ ІМТЕВЕ5Т, Бій Еа. Рибіїс Неайй 5Зегмісе,
Зо Маїйопаї! Іпзійшщез ої Неайй, Веїпезаа, Ма. (1991), або залишки, що утворюють гіперваріабельну петлю (наприклад, залишки 26-32 (І СОВ1), 50-52 (І СОК2) і 91-96 (1 СОР3) у варіабельній області легкого ланцюга і 26-32 (НСОВІ1), 53-55 (НСОК2) і 96-101 (НСОКЗ) у варіабельній області важкого ланцюга; Споїйіа апа І е5К (1987) 9. Мої. Віої. 196:901-917). Конкретні СОК за даним винаходом описані нижче.
У всьому даному описі при посиланні на залишок у варіабельному домені (приблизно залишки 1-107 варіабельної області легсого ланцюга і залишки 1-113 варіабельної області важкого ланцюга) зазвичай застосовується система нумерації за Кабаї (наприклад, Кабаї еї аї., вище (1991)).
СОК вносять вклад в утворення антигензв'язувальної або, більш конкретно, епітопзв'язувальної ділянки антитіл. Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" стосується ділянки на антигені, з якою специфічно зв'язується імуноглобулін або антитіло. Епітопи можуть бути утворені як суміжними амінокислотами, так і несуміжними амінокислотами, розміщеними поряд завдяки згортанню білка у третинну структуру. Епітопи, утворені суміжними амінокислотами, зазвичай зберігаються під впливом денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, утворені завдяки згортанню в третинну структуру, зазвичай втрачаються при обробці денатуруючими розчинниками. Епітоп зазвичай містить щонайменше 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Описані у даному документі способи визначення того, з якими епітопами зв'язується вказане антитіло (тобто картування епітопів), добре відомі з рівня техніки і включають, наприклад, аналізи за методами імуноблотингу і імунопреципітації, де пептиди, які перекриваються, або суміжні пептиди І М75 досліджують по відношенню до реактивності з вказаним антитілом до 1М75. Способи визначення просторової конформації епітопів включають методики, відомі з рівня техніки, і методики, описані у даному документі, наприклад, рентгенівську кристалографію і 2-мерну спектроскопію ядерного магнітного резонансу (див., наприклад, Ерйоре Марріпд Ргоїосої5 іп
Меїпоа5 іп Моїесшаг Віоіоду, Мої. 6б, с. Е. Моітіз, Еа. (1996)). Термін "картування епітопів" стосується способу ідентифікації молекулярних детермінант розпізнавання антигену антитілом.
Карбоксикінцева частина кожного ланцюга визначає константну область, яка несе основну відповідальність за ефекторну функцію. Караї і соавт. зібрали дані про ряд первинних послідовностей варіабельних областей важких ланцюгів і легких ланцюгів. На основі ступеня 60 консервативності послідовностей вони віднесли окремі первинні послідовності до СОК і каркасних ділянок і склали їхній перелік (див. ЗЕООШЕМСЕВ ОЄ ІММОМОГОСІСАГ ІМТЕКЕ5Т,
БП еайоп, МІН рибіісайоп, Мо. 91-3242, Е.А. Кабаї еї аї.).
У підкласі імуноглобулінів дос у важкому ланцюзі знаходиться декілька доменів імуноглобулінів. Під "доменом імуноглобуліну (1д)" у даному документі мається на увазі область імуноглобуліну, яка має чітко виражену третинну структуру. У даному винаході інтерес становлять домени важких ланцюгів, що включають константні домени важких ланцюгів (СН) і шарнірні домени. Стосовно антитіл до кожний з ізотипів (ДО має три СН-області. Відповідно, "бН"-домени стосовно дб є наступними: "СНІ" стосується положень 118-220 згідно з БИО- індексом за Кабваї. "СН2" стосується положень 237-340 згідно з ЕО-індексом за Кабаї, а "СН3" стосується положень 341-447 згідно з ЕО-індексом за Кабаї.
Іншим типом домену важкого ланцюга Ід є шарнірна область. Під "шарнірною ділянкою", або "шарнірною областю", або "шарнірною областю антитіла"? або "шарнірною областю імуноглобуліну" у даному документі мається на увазі гнучкий поліпептид, що містить амінокислоти між першим і другим константними доменами антитіла. У структурному плані СН1- домен до закінчується положенням 220 згідно з БО, а СН2-домен до починається з положення залишку 237 згідно з ЄЮ. Таким чином, для антитіла дос шарнірна ділянка у даному документі визначається як така, що включає положення з 221 (0221 в Ідш1) до 236 (5236 в ІдС1), де нумерація відповідає ЕО-індексу за Кабаї. У деяких варіантах здійснення, наприклад, стосовно
Ес-області, включена нижня шарнірна ділянка, при цьому "нижня шарнірна ділянка" зазвичай стосується положень 226 або 230.
Особливий інтерес у даному винаході становлять Ес-області. Під "Ес", або "Гс-областю", або "Ес-доменом", як використовується у даному документі, мається на увазі поліпептид, що містить константну область антитіла, за виключенням першого домену константної області імуноглобуліну і у деяких випадках частини шарнірної ділянки. Таким чином, Ес стосується останніх двох доменів константної області імуноглобулінів ІдА, дО і до, останніх трьох доменів константної області імуноглобулінів ІДЕ і дм і гнучкої шарнірної ділянки, розміщеної у напрямку
М-кінця від цих доменів. У випадку ІдА і (ДМ Ес може містити у-ланцюг. У випадку До Ес-домен містить домени імуноглобулінів Су2 і СузЗ (Су2 і СузЗ) і нижню шарнірну область між Су! (СУ) і
Су2 (Суг). Хоча межі Ес-області можуть варіювати, Ес-область важкого ланцюга до людини зазвичай визначається як така, що включає залишки від С226 або Р230 до її карбоксильного кінця, де нумерація відповідає ЕО-індексу за Караї. У деяких варіантах здійснення, як більш детально описано нижче, амінокислотні модифікації виробляють в Ес-область, наприклад, зі змінюванням зв'язування з одним або більше Есук-рецепторами або з ЕсКп-рецептором.
У деяких варіантах здійснення антитіла є антитілами повної довжини. Під "антитілом повної довжини" у даному документі мається на увазі структура, що є природною біологічною формою антитіла, що містить варіабельні і константні області, що містять одну або більше модифікацій, стисло викладених у даному документі.
В альтернативному випадку антитіла можуть являти собою ряд структур, що включають, без обмежень, фрагменти антитіл, моноклональні антитіла, біспецифічні антитіла, мініантитіла, доменні антитіла, синтетичні антитіла (іноді звані у даному документі "міметиками антитіл"), химерні антитіла, гуманізовані антитіла, продукти злиття антитіл (іноді звані у даному документі "кон'югатами антитіл") і відповідно фрагменти кожного з них. Структури, засновані на застосуванні набору СОК, включені у визначення "антитіла".
В одному варіанті здійснення антитіло являє собою фрагмент антитіла. Конкретні фрагменти антитіл включають, без обмежень, (ї) Раб-фрагмент, що містить МІ -, МН-, СІ - і СНІ1- домени, (ії) а-фрагмент, що містить УН- і СН1-домени, (ії) Ем-фрагмент, що містить Мі- і МН- домени окремого антитіла; (ім) ЧАБ-фрагмент (Умага еї а!., 1989, Майшге 341:544-546, включений шляхом посилання у всій своїй повноті), що містить окрему варіабельну область, (м) виділені
СОВ-області, (мі) Е(ар)2-фрагменти, бівалентний фрагмент, що містить два зв'язаних Еабр- фрагменти, (мії) одноланцюгові молекули Ем (зсЕм), де МН-домен і МіІ--домен зв'язані пептидним лінкером, що забезпечує об'єднання двох доменів з утворенням антигензв'язувальної ділянки (Віка єї аї., 1988, бсіепсе 242:423-426, Нивіюп еї аї., 1988, Ргос. Маї). Асад. Зсі. 0О.5.А. 85:5879- 5883, включений шляхом посилання у всій своїй повноті), (мії) біспецифічні одноланцюгові Ем (УМО 03/11161, включена шляхом посилання у всій своїй повноті) і (їх) "діатіла" або "триатіла", полівалентні або поліспецифічні фрагменти, сконструйовані шляхом злиття генів (Топтіїп5оп еї. а!., 2000, МеїшШод5 Епгутої. 326:461-479; МО 94/13804; Ноїїїдег еї а!., 1993, Ргос. Маї)!. Асай. 5сі.
И.5.А. 90:6444-6448, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті).
Химерні і гуманізовані антитіла
У деяких варіантах здійснення антитіло може являти собою комбінацію від різних видів, бо наприклад, химерне антитіло і/або гуманізоване антитіло. Інакше кажучи, у даному винаході набори СОК можна застосовувати з каркасними і константними областями, відмінними від конкретно описаних у даному документі за послідовністю.
У цілому, як "химерні антитіла", так ї "гуманізовані антитіла" стосуються антитіл, у яких об'єднані області від більше ніж одного виду. Наприклад, "химерні антитіла" традиційно містять варіабельну(варіабельні) область(області) від миші (або, у деяких випадках, пацюка) і константну(константні) область(області) від людини. "Гуманізовані антитіла" зазвичай стосуються антитіл, відмінних від людських, у яких каркасні області варіабельних доменів були замінені на послідовності, виявлені в антитілах людини. Як правило, у гуманізованому антитілі все антитіло, за виключенням СОР, кодується полінуклеотидом людського походження або за виключенням своїх СОК ідентично такому антитілу. СОК, деякі або всі з яких кодуються нуклеїновими кислотами, що походять від організму, відмінного від людини, трансплантують у каркасну ділянку зі структурою бета-листа у варіабельній області антитіла людини з одержанням антитіла, специфічність якого визначається трансплантованими СОК. Одержання таких антитіл описано, наприклад, в УМО 92/11018, допез, 1986, Майшге 321:522-525, Метоевеуєп еї аї., 1988, бсіепсе 239:1534-1536, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті. "Зворотна мутація" за типом заміни вибраних залишків акцепторних каркасних ділянок на відповідні донорні залишки часто необхідна для відновлення афінності, що втрачається конструктом після початкової трансплантації (5 5530101; 05 5585089; 05 5693761; 05 5693762; 05 6180370; 005 5859205; 05 5821337; 5 6054297; 05 6407213, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті). Гуманізоване антитіло в оптимальному випадку також містить щонайменше частину константної області імуноглобуліну, зазвичай імуноглобуліну людини, і, відповідно, зазвичай містить Ес-область людини. Гуманізовані антитіла також можна одержувати із застосуванням мишей з імунною системою, підданою генній інженерії. Кодие еї аІ., 2004, Віоїесппої. Ргоа. 20:639-654, включений шляхом посилання у всій своїй повноті. З рівня техніки добре відомий ряд методик і способів гуманізації і реконструювання антитіл, відмінних від людських (див. Т5иги5пйа 5 Маздие, 2004, Нитапі?айоп ої Мопосіопаї! Апііродієв5,
Моїесшіаг Віоіоду ої В СеїІв, 533-545, ЕІбеміег 5сіепсе (ОА), і літературні джерела, згадувані там, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті). Способи гуманізації включають, без обмежень, способи, описані в допез еї аї., 1986, Майшге 321:522-525; Вівєсптапп
Зо еї аї., 1988; Маїште 332:323-329; Метоеуеєп еї аї., 1988, Зсієпсе, 239:1534-1536; О!йееп еї аї., 1989, Ргос Маї! Асай 5сі, ОБА 86:10029-33; Невіа)!., 1998, У). Іттипої. 160: 1029-1035; Сапег вї аї., 1992, Ргос Маї! Асад 5сі ОБА 89:4285-9, Ргезіа вї а!., 1997, Сапсег Вев. 57(20):4593-9; Сх0тппап еї а!., 1991, Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА 88:4181-4185; О'Соппог еї аї., 1998, Ргоївіп Епд 11:321-8, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті. Гуманізація або інші способи зниження імуногенності варіабельних областей антитіл, відмінних від людських, може включати способи зміни поверхні, описані, наприклад, в КодихкКа еї аї., 1994, Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 91:969-973, включеному шляхом посилання у всій своїй повноті. В одному варіанті здійснення вихідне антитіло було піддане дозріванню афінності, відомому з рівня техніки. Для гуманізації і дозрівання афінності можна використовувати структурні способи, наприклад, описані в Ю55М 11/004590. Для гуманізації і/або дозрівання афінності варіабельних областей антитіл можна використовувати способи на основі відбору, у тому числі, без обмежень, способи, описані в УМи еї аї., 1999, У. Мої. Віої. 294:151-162; Васа евї а!., 1997, У. Віої. Спет. 272 (16): 10678-10684;
Возок еї аї!., 1996, 9. Вісі. Снет. 271 (37):22611-22618; Надег єї а!., 1998, Ргос. Маї). Асай. 5сі.
ИБА 95: 8910-8915; Ктайзвз єї аї., 2003, Ргоїєїп Епдіпеегіпуд 16 (10) 753-759, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті. Інші способи гуманізації можуть включати трансплантацію лише частин СО, у тому числі, без обмежень, способи, описані в 055М 09/810510; Тап єї аї., 2002, 9. Іттипої. 169:1119-1125; Ое Равзсаїв еї а!., 2002, 9. Іттипої. 169:3076-3084, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті.
В одному варіанті здійснення антитіла за даним винаходом можуть являти собою поліспецифічні антитіла, і зокрема, біспецифічні антитіла, також іноді звані "діатілами". Ці антитіла, які зв'язуються з двома (або більше) різними антигенами або різними епітопами на одному і тому ж антигені. Діатіла можна одержувати за допомогою ряду способів, відомих з рівня техніки (Ноїїїдегапа Уміпіег, 1993, Ситепі Оріпіоп Віоїесппої. 4:446-449, включений шляхом посилання у всій своїй повноті), наприклад, одержувати хімічним шляхом або з міжвидової гібридоми.
В одному варіанті здійснення антитіло являє собою мініантитіло. Мініантитіла являють собою мінімізовані антитілоподібні білки, що містять 5сЕм, з'єднаний з СНЗ-доменом. Ни еї аї., 1996, Сапсег Не. 56:3055-3061, включений шляхом посилання у всій своїй повноті. У деяких випадках 5сбм може бути з'єднаний з Ес-областю і може містити деяку частину шарнірної 60 області або всю її. Слід відмітити, що мініантитіла включені у визначення "антитіла", не дивлячись на те, що вони не мають повний набір СОМ.
Антитіла за даним винаходом зазвичай є виділеними або рекомбінантними. "Виділений", використовуваний для опису різних поліпептидів, розкритих у даному документі, означає поліпептид, який був ідентифікований і відокремлений від і/або вилучений з клітини або культури клітин, у якій він експресувався. Таким чином, виділене антитіло призначено для позначення антитіла, практично вільного від інших антитіл з іншою специфічністю до антигенів (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з І 75, практично вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від І М75). Таким чином, "виділене" антитіло знаходиться у формі, яка зазвичай не виявляється у природі (наприклад, яка не зустрічається у природі). Виділене антитіло, визначене у даному документі, може в одному варіанті здійснення містити щонайменше одну амінокислоту, яка не зустрічається в антитілі, "яке зустрічається у природі". Ця амінокислота може бути введена шляхом додавання або заміни. Буде зрозуміло, що введена амінокислота може бути амінокислотою, яка зустрічається у природі або не зустрічається у природі. У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом являють собою рекомбінантні білки, виділені білюим або практично чисті білки. "Виділений" білок не супроводжується щонайменше деякою частиною матеріалу, з яким він зазвичай зв'язаний у своєму природному стані, наприклад, що становить щонайменше приблизно 5 96 або щонайменше приблизно 50 95 за вагою від загального білка у вказаному зразку. Зрозуміло, що виділений білок може становити від 5 до 99,9 95 за вагою від вмісту загального білка залежно від обставин. Наприклад, білок може бути одержаний у значно більш високій концентрації шляхом застосування індукованого промотора або промотора, що забезпечує високу експресію, завдяки чому білок одержують при підвищених рівнях концентрації. У випадку рекомбінантних білків визначення включає одержання антитіла у більшій різноманітності організмів і/або клітин-хазяїв, відомих у даній галузі техніки, у яких воно не визначається у природних умовах. Зазвичай виділений поліпептид одержують за допомогою щонайменше одного етапу очищення. "Виділене антитіло" стосується антитіла, практично вільного від інших антитіл з іншою специфічністю до антигенів. Наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з І 75, практично вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від І М 75.
Зо Виділені моноклональні антитіла з різною специфічністю можна об'єднувати у чітко визначену композицію. Таким чином, наприклад, антитіло за даним винаходом можна необов'язково і окремо включити або не включити у склад, як додатково обговорюється нижче.
Антитіла до І У75 за даним винаходом специфічно зв'язуються з І 75 (наприклад, ЗЕО ІЮ
МО:15). "Специфічне зв'язування", або "специфічно зв'язується з", або "специфічний до" по відношенню до конкретного антигену або епітопа означає зв'язування, яке вимірюваним чином відмінне від неспецифічної взаємодії. Специфічне зв'язування можна виміряти, наприклад, шляхом визначення зв'язування молекули порівняно зі зв'язуванням контрольної молекули, яка зазвичай являє собою молекулу вихідної структури, яка не має активності зв'язування.
Наприклад, специфічне зв'язування можна визначити за конкуренцією з контрольною молекулою, подібною до цільової.
Специфічне зв'язування з конкретним антигеном або епітопом може проявлятися, наприклад, антитілом, яке має Ко для антигену або епітопа, що становить щонайменше приблизно 107 М, щонайменше приблизно 105 М, щонайменше приблизно 105 М, щонайменше приблизно 10-7 М, щонайменше приблизно 108 М, щонайменше приблизно 109 М, в альтернативному випадку щонайменше приблизно 1079 М, щонайменше приблизно 10! М, щонайменше приблизно 10-72 М або більше, де Ко стосується константи швидкості дисоціації при конкретній взаємодії антитіла й антигену. Антитіло, яке специфічно зв'язується з антигеном, зазвичай буде мати Ко, в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 або більше разів більшу для контрольної молекули порівняно з антигеном або епітопом. Однак, у даному винаході при введенні АОС на основі антитіл до І 75 за даним винаходом важливо, щоб Ко була достатньою для забезпечення інтерналізації і, отже, загибелі клітин без значних побічних ефектів.
Специфічне зв'язування з конкретним антигеном або епітопом також може проявлятися, наприклад, антитілом, яке має КА або Ка для антигену або епітопа, щонайменше в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 або більше разів більшу для епітопа порівняно з контролем, де КА або Ка стосується константи швидкості асоціації при конкретній взаємодії антитіла і антигену.
Стандартні аналізи для оцінки здатності антитіл до зв'язування з І 75 можуть виконуватися на рівні білків або клітин і відомі з рівня техніки, у тому числі, наприклад, різновиди ЕГІЗА, вестерн-блотингу, КІА, аналізи на ВіІАсогеф і аналіз за методом проточної цитометрії. Підходящі аналізи детально описані у розділі "Приклади". Кінетику зв'язування (наприклад, афінність бо зв'язування) антитіл також можна оцінювати за допомогою стандартних аналізів, відомих з рівня техніки, як, наприклад, за допомогою аналізу на системі Віасоге?9. Для оцінки зв'язування з клітинами Каїї або Обацаї В-клітинної пухлини клітини Каїї (номер депонування в АТС ССІ -86) або Юацаї (номер депонування в АТСС ССІ-213) можна одержувати із загальнодоступних джерел, таких як Американська колекція типових культур, і застосовувати у стандартних аналізах, таких як аналізи за методом проточної цитометрії.
Антитіла до І 75
У даному винаході представлені антитіла до І У75, які зв'язуються з І 75 (ЗЕО ІЮО МО:15) і можуть інтерналізуватися при контакті з клітинами, на клітинній поверхні яких експресується
ЇМ75, або можуть викликати реакцію АЮСС у присутності ефекторних клітин або викликати цитотоксичну Т-клітинну реакцію у присутності ефекторних клітин. Ці антитіла згадуються у даному документі як "антитіла, які зв'язуються з І У75" або, для простоти опису, "антитіла до
І М75".
Антитіла до 1ІМ75 інтерналізуються при контакті з клітинами, зокрема, пухлинними клітинами, на поверхні яких експресується І У75. Інакше кажучи, антитіла до І У75, визначені у даному документі, які також містять кон'юговані лікарські засоби, інтерналізуються пухлинними клітинами, що призводить до вивільнення лікарського засобу і наступної загибелі клітин, забезпечуючи лікування форм раку, що характеризуються експресією І У75. Інтерналізацію у даному випадку можна виміряти декількома способами. В одному варіанті здійснення антитіла до ГУ75 за даним винаходом приводять у контакт з клітинами, такими як лінія клітин, стисло описана у даному документі, за допомогою стандартних аналізів, як, наприклад, з використанням Мабр7ар. Для фахівця у даній галузі буде очевидно, що аналіз з використанням
Мар7ар ілюструє очікуваний ефект, який можна спостерігати для кон'югата антитіло-лікарський засіб (АБС). В останньому випадку АЮС буде інтерналізуватися, подаючи таким чином лікарський засіб в клітину. Токсичний лікарський засіб буде мати здатність до знешкодження клітини, тобто до знешкодження цільової ракової клітини. Дані аналізів Маблар легко приймаються фахівцями у даній галузі як ілюстративні для аналізів АОС (Копі5, М апа І аррі, 0., (20001 Віотесппідиев, мої. 28, по. 1, 162-165).
У цих варіантах здійснення аналізів іп міго антитіла до І У75 за даним винаходом додають разом з антитілом до антитіл до І У75, що містить токсин; наприклад, антитіло до ЇМ75 може бути мишиним або гуманізованим, а антитіло до антитіл до ЇМ75 може бути антитілом до мишиних антитіл або антитілом до гуманізованих антитіл і містити токсин, такий як сапорин.
Після утворення комплексу (антитіло до ЇМ75 за даним винаходом|і-(кон'югат антитіло до антитіла до І У75-лікарський засіб| комплекс інтерналізується, і лікарський засіб (наприклад, сапорин) вивільняється, викликаючи загибель клітин. Лікарський засіб вивільняється тільки після інтерналізації, і тому клітини за відсутності інтерналізації залишаються життєздатними. Як стисло викладено нижче, без обмеження будь-якою теорією, у терапевтичних шляхах застосування антитіло до антитіла до І У75 містить токсин, і після інтерналізації зв'язок між антитілом і токсином розщеплюється з вивільненням токсину і знешкодженням клітини.
На додаток, антитіла до І У75 у присутності ефекторних клітин викликають реакцію АОСС, зокрема, по відношенню до пухлинних клітин, на поверхні яких експресується І 75.
В одному варіанті здійснення антитіло містить області, які визначають комплементарність (СОК), або варіабельні області (МК) важких і легких ланцюгів конкретного антитіла, описаного у даному документі (наприклад, згадуваного у даному документі як "І! М75 АТ"). Відповідно, в одному варіанті здійснення антитіло містить домени СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН) антитіла І М75 А1, що має послідовність, показану під 5ЕО ІЮ МО-1, і домени СОКІ, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ) антитіла І М75 А1, що має послідовність, показану під 5ЕО ІЮ МО:2.
В іншому варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить першу мисок, що містить БЕО ІЮ МО:5; другу масок, що містить 5ЕО ІЮ МО:6; і третю
МАСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО:7; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить першу
МСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО:8; другу мМІСОК, що містить ЗЕО ІЮО МО:9; і третю мІСОК, що містить БЕО ІЮ МО:10.
В іншому варіанті здійснення антитіла за даним винаходом зв'язуються з І 75 людини і містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО", ї її консервативні модифікації послідовності. Антитіло може додатково містити варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, що містить зЕО ІЮ МО:2, і її консервативні модифікації послідовності.
У додатковому варіанті здійснення антитіла за даним винаходом зв'язуються з І 75 людини і містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що 60 містять амінокислотні послідовності, відповідно наведені під ЗЕО ІЮ МО:1 і/або 2, і їхні консервативні модифікації послідовності. Як використовується у даному документі, термін "консервативна модифікація послідовності" стосується, наприклад, заміни амінокислоти амінокислотою, яка має аналогічні характеристики. Для фахівця у даній галузі зазвичай є загальновідомим, які з цих замін можуть вважатися консервативними. Інші модифікації, які можуть вважатися консервативними модифікаціями послідовності, включають, наприклад, глікозилювання.
Виділені антитіла, що містять варіабельні області важких і легких ланцюгів, що характеризуються щонайменше 80 95, або щонайменше 85 95, або щонайменше 90 95, або щонайменше 91 95, або щонайменше 92 95, або щонайменше 93 95, або щонайменше 94 95, або щонайменше 95 95, або щонайменше 96 95, або щонайменше 97 95, або щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95, або більшою ідентичністю послідовності з будь-якої з вищенаведених послідовностей, також включені у даний винахід. Проміжні діапазони вищевказаних значень, наприклад, варіабельні області важких і легких ланцюгів, що характеризуються щонайменше 80-85 965, 85-90 95, 90-95 95 або 95-100 95 ідентичністю послідовності з будь-якої з вищенаведених послідовностей, також маються на увазі як такі, які охоплені даним винаходом.
В одному варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить ЗЕО І МО:1 або послідовність щонайменше на 90 956, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 905 ідентичну ЗЕО ІЮ МО:1. В іншому варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІО МО:2 або послідовність, щонайменше на 90 9б, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичну 5БЕО ІЮ МО:2. В іншому варіанті здійснення антитіло містить каркасну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 до, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичну каркасній області варіабельної області важкого ланцюга з ЗЕО
ІЮО МО:1, що містить 5ЕО ІО МО:16, 17 і 18. В іншому варіанті здійснення антитіло містить
Зо каркасну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 до, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 ідентичну каркасній області варіабельної області легкого ланцюга з ЗЕО
ІО МО:2, що містить 5ЕО ІЮ МО:19, 20 і 21.
В одному варіанті здійснення антитіло за даним винаходом являє собою антитіло до І! 75 (зване у даному документі "антитілом І М75 А1"), що містить наступні СОК, а також його варіанти, що містять невелику кількість амінокислотних варіантів:
СОковорабельної ділян венюютаня 11165
Сонтзаравельі ян лелоютня | 116
ТОК ворабельної ділян етоютанюя 1118
У даному документі також розкриті варіабельні області важких і легких ланцюгів, які містять набори СОР за даним винаходом, а також важкі і легкі ланцюги повної довжини (наприклад, що також містять константні області). Як буде зрозуміло фахівцям у даній галузі, набори СОК за даним винаходом можна вбудувати у мишині, гуманізовані або людські константні області (у тому числі каркасні області). Відповідно, у даному винаході представлені варіабельні області важких і легких ланцюгів, щонайменше приблизно на 90 95-99 95 ідентичні ЗЕО І0, розкритим у даному документі, при цьому всі з 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 і 99 95 знаходять застосування у даному винаході.
Антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що і антитіла до І У75 за даним винаходом
В іншому варіанті здійснення у даному винаході представлені антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом на ЇМ75 людини, що і будь-яке з моноклональних антитіл до 75 за даним винаходом. Термін "зв'язується з тим же епітопом" по відношенню до двох або більше антитіл означає, що антитіла конкурують за зв'язування з антигеном і зв'язуються з тими ж безперервними або переривчастими сегментами, що перекриваються або охоплюються, з амінокислот. Фахівці у даній галузі розуміють, що фраза "зв'язується з тим же епітопом" не обов'язково означає, що антитіла зв'язуються саме з тими ж амінокислотами, хоча в одному варіанті здійснення вона може бути визначена таким чином. В іншому варіанті здійснення точно визначені амінокислоти, з якими зв'язуються антитіла, можуть відрізнятися. Наприклад, перше антитіло може зв'язуватися з сегментом з амінокислот, повністю охоплених сегментом з амінокислот, з яким зв'язується друге антитіло. В іншому прикладі перше антитіло зв'язується з одним або більше сегментами з амінокислот, що значно перекриваються з одним або більше сегментами, з якими зв'язується друге антитіло. Для цілей даного документа такі антитіла вважаються "такими, що зв'язуються з тим же епітопом".
Відповідно, даний винахід в одному варіанті здійснення також охоплює антитіла, які зв'язуються з епітопом на І 75, що включає у себе весь епітоп, що розпізнається конкретними антитілами, описаними у даному документі, або його частину (наприклад, ту ж або область, що перекривається, або область, що знаходиться у межах даної області або охоплює її). Даний винахід також охоплює антитіла, які специфічно зв'язуються щонайменше з одним, наприклад, з 2,3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, пептидом(пептидами), вибраними з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36 або 37, або їхніми фрагментами, де вказані фрагменти містять щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9 або щонайменше 10 суміжних амінокислот. У додатковому варіанті здійснення епітоп, що розпізнається антитілами за даним винаходом, містить щонайменше один пептид, щонайменше два або щонайменше три пептиди, вибрані з групи, що включає 5ЕО ІЮО МО: 27, 29, 30, 34, 35, 36 або 37, або їхні фрагменти, де вказані фрагменти містять щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9 або щонайменше 10 суміжних амінокислот. У додатковому варіанті здійснення епітоп, що розпізнається антитілами за даним винаходом, містить щонайменше один пептид, наприклад, один, два або три пептиди, вибрані з
Зо групи, що включає ЗЕО ІЮ МО:30, 36 і 37, або їхні фрагменти, де вказані фрагменти містять щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9 або щонайменше 10 суміжних амінокислот.
Даний винахід також охоплює антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, і/або антитіла, які конкурують за зв'язування з ЇМ75 людини з антитілами, описаними у даному документі.
Антитіла, які розпізнають той же епітоп або конкурують за зв'язування, можна ідентифікувати із застосуванням стандартних методик. Такі методики включають, наприклад, імунологічний аналіз, що демонструє здатність одного антитіла до блокування зв'язування іншого антитіла з цільовим антигеном, тобто аналіз конкурентного зв'язування. Конкурентне зв'язування визначають в аналізі, у якому досліджуваний імуноглобулін інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла із загальним антигеном, таким як ГМ75. Відомо ряд типів аналізів конкурентного зв'язування, наприклад, твердофазний прямий або непрямий радіоіїмунологічний аналіз (КІА), твердофазний прямий або непрямий імуноферментний аналіз (ЕІА), конкурентний сандвіч-аналіз (див. еапії еї аї., Меїпоавз іп Еплутоїоду 9:242 (1983)); твердофазний прямий ЕІА з використанням комплексу біотин-авідин (див. КігКіапа еї аї., У. Іттипої. 137:3614 (1986)); твердофазний прямий аналіз з міченням, твердофазний прямий сандвіч-аналіз з міченням (див.
Напом апа іІапе, Апіїродіеєє: А Іарогаїюту Мапиаі), Соїй Ббріпуд Натог Ргез5 (1988)); твердофазний прямий КІА з міченням з використанням мітки І-125 (див. Могеї! еї аї, Мо)1.
Ітітипої. 25(1):7 (1988)); твердофазний прямий ЕІА з використанням комплексу біотин-авідин (Спешпа еї аї., Мігоїосду 176:546 (1990)) і прямий КІА з міченням (Моїідепнацег єї аї., Зсапа. 4).
Ітітипої. 32:77 (1990)). Зазвичай такий аналіз включає застосування очищеного антигену, зв'язаного з твердою поверхнею або клітинами, які несуть будь-який з них, неміченого досліджуваного імуноглобуліну і міченого еталонного імуноглобуліну. Конкурентне інгібування вимірюють шляхом визначення кількості мітки, зв'язаної з твердою поверхнею або з клітинами, у присутності досліджуваного імуноглобуліну. Досліджуваний імуноглобулін зазвичай присутній у надлишку. Якщо конкуруюче антитіло присутнє у надлишку, воно зазвичай буде інгібувати специфічне зв'язування еталонного антитіла із загальним антигеном щонайменше на 50-55 95, 55-60 95, 60-65 95, 65-70 У, 70-75 95, 75-80 95, 80-85 95, 85-90 95, 90-95 95, 95-99 95 або більше.
Інші методики включають, наприклад, способи картування епітопів, такі як рентгенівські аналізи кристалів комплексів антиген:антитіло, що забезпечують атомне розділення епітопа. В бо інших способах відслідковують зв'язування антитіла з фрагментами антигенів або мутантними варіантами антигенів, де втрата зв'язування внаслідок модифікації амінокислотного залишку у послідовності антигену часто вважається вказівкою на компонент епітопа. На додаток, також можна застосовувати обчислювальні комбінаторні способи для картування епітопів. Ці способи засновані на здатності антитіл, які становлять інтерес, до афінного виділення специфічних коротких пептидів з комбінаторних фаг-дисплейних бібліотек пептидів. Пептиди потім розглядають як лідерні для визначення епітопа, що відповідає антитілу, застосовуваному для скринінгу бібліотеки пептидів. Для картування епітопів також були розроблені обчислювальні алгоритми, які, як було показано, забезпечують картування конформаційних переривчастих епітопів.
У конкретному варіанті здійснення антитіло конкурує за зв'язування з І 775 з антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, відповідно наведені під 5ЕО ІЮ МО:1 і 2, або амінокислотні послідовності, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 9565, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичні їм. В іншому варіанті здійснення антитіло конкурує за зв'язування з І У75 з антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, наведені під «ХЕО ІЮ МО і12(1 75 АТ).
Інші антитіла за даним винаходом зв'язуються з епітопом на І М75, що розпізнається антитілами, описаними у даному документі. В іншому конкретному варіанті здійснення антитіло зв'язується з епітопом на І М75, що розпізнається антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, відповідно наведені під
ЗЕО ІЮ МО 1 і 2, або амінокислотні послідовності, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичні їм. В іншому варіанті здійснення антитіло зв'язується з епітопом на І М75, що розпізнається антитілом, що містить варіабельні області важких і/або легких ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, наведені під ЗЕО
ІЮО МО:Т11і2 (175).
Встановлення характеристик моноклональних антитіл до І 75
Моноклональні антитіла за даним винаходом можна охарактеризувати за зв'язуванням з
Зо ГМ75 за допомогою ряду відомих методик. Як правило, антитіла спочатку характеризують за допомогою ЕГІЗА. Стисло, титраційні мікропланшети можна покривати очищеним І У75 в РВ5, а потім блокувати нерелевантними білками, такими як бичачий сироватковий альбумін (В5А), розведений у РВ5. У кожну лунку додають розведення плазми крові мишей, імунізованих за допомогою І МУ75, і інкубують протягом 1-2 годин при 37 "С. Планшети промивають за допомогою РВ5З/Гмееп 20 і потім інкубують з поліклональним реагентом, антитілом кози до Ідс людини, специфічним до Ес, кон'югованим з лужною фосфатазою, протягом 1 години при 37 "С.
Після промивання планшети проявляють за допомогою субстрату АВТ5 і аналізують при 00 405. Переважно, для процедур злиття будуть використовувати мишей, у яких розвиваються найбільш високі титри.
Аналіз ЕГІЗА, описаний вище, можна застосовувати для скринінгу з виявленням антитіл і, отже, гібридом, які утворюють антитіла, які демонструють позитивну реактивність по відношенню до імуногена І У75. Гібридоми, які зв'язуються, переважно з високою афінністю, з
ГУ75, можна потім пересіяти і додатково охарактеризувати. Один клон з кожної гібридоми, що зберігає реактивність вихідних клітин (за ЕГІ5А), можна потім вибрати для одержання клітинного банку і для очищення антитіл.
Для очищення антитіл до І 75 вибрані гібридоми можна вирощувати в обертових флаконах, дволітрових обертових колбах або інших системах культивування. Зразки надосадової рідини можна фільтрувати і концентрувати перед афінною хроматографією з білком А на сефарозі (Рпаптасіа, Піскатауей, Нью-Джерсі) для очищення білка. Після заміни буфера на РВ5 концентрацію можна визначити за ОЮгво із застосуванням коефіцієнта екстинкції 1,43 або, переважно, за допомогою нефелометричного аналізу. (33 можна перевірити за допомогою гель-електрофорезу і за допомогою антиген-специфічного способу.
Для визначення того, чи зв'язуються вибрані моноклональні антитіла до І У75 з унікальними епітопами, кожне антитіло можна біотинілювати за допомогою комерційно доступних реагентів (Ріегсе, Рокфорд, Іллінойс). Зв'язування біотинільованих тАбБ можна виявити за допомогою зонда, міченого стрептавідином. Для визначення ізотипу очищених антитіл можна проводити ізотипуючий ЕГІЗА із застосуванням методик, прийнятих у даній галузі техніки.
Наприклад, лунки титраційних мікропланшетів можна покрити 10 мкг/мл антитіла до Ід на ніч при 4 "С. Після блокування за допомогою 5 95 ВЗА в планшетах проводять реакцію з 10 мкг/мл бо моноклональних антитіл або очищених ізотипових контролів при температурі навколишнього середовища протягом двох годин. У лунках потім можна провести реакцію з кон'югованими зондами, специфічними до Ідс1 або інших ізотипів. Планшети проявляють і аналізують, як описано вище.
Для дослідження зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують
ГУ75, можна застосовувати проточну цитометрію. Стисло, лінії клітин і/або РВМС людини, які експресують мембранозв'язаний І У75 (вирощувані у стандартних умовах росту), змішують з моноклональними антитілами у різних концентраціях у РВ5, що містить 0,1 95 ВБА при 4 с, протягом 1 години. Після промивання проводять реакцію клітин з антитілом до Ідс, міченим флуоресцеїном, у тих же умовах, що і при забарвленні первинним антитілом. Зразки можна аналізувати за допомогою приладу ЕАСзсап з використанням властивостей світлорозсіювання і бічного розсіювання для введення логічного обмеження за окремими клітинами і визначення зв'язування мічених антитіл. Можна застосовувати альтернативний аналіз із застосуванням флуоресцентної мікроскопії на додаток до аналізу за методом проточної цитометрії або замість нього. Клітини можна забарвлювати точно так, як описано вище, і вивчати за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Даний спосіб забезпечує візуалізацію окремих клітин, але може мати знижену чутливість залежно від щільності антигену.
Можна додатково досліджувати реактивність антитіл (дб до ЇМ75 по відношенню до антигену ГУ75 за допомогою вестерн-блотингу. Стисло, можна одержувати клітинні екстракти з клітин, які експресують ГІ У75, і піддавати електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію. Після електрофорезу відділені антигени переносять на нітроцелюлозні мембрани, блокують 20 95 мишиною сироваткою крові і зондують моноклональними антитілами, які підлягають дослідженню. Зв'язування до можна виявити за допомогою антитіла до дО, кон'югованого з лужною фосфатазою, і проявити за допомогою таблеток субстрату ВСІР/МВТ (Зідта Спет. Со., Сент-Луїс, Міссурі).
Способи аналізу афінності зв'язування, перехресної реактивності і кінетики зв'язування різних антитіл до І У75 включають стандартні аналізи, відомі у даній галузі техніки, наприклад, аналіз поверхневого плазмонного резонансу (РЕ) Віасоге "мМ із застосуванням приладу для 5РК
Віасоге м 2000 (Віасоге АВ, Уппсала, Швеція).
В одному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з І 75 людини, що містить
ЗЕО ІЮ МО:15. Переважно, антитіло за даним винаходом зв'язується з І 75 людини з високою афінністю.
Переважно, антитіло за даним винаходом зв'язується з білком /М75 з Ко 5 х 108 М або менше, зв'язується з білком І У75 з Ко 2 х 108 М або менше, зв'язується з білком І 75 з Ко 5 х 109 М або менше, зв'язується з білком І М75 з Ко 4 х 109 М або менше, зв'язується з білком
ЇМ75 з Ко З х 109 М або менше, зв'язується з білком І 75 з Ко 2 х 109 М або менше, зв'язується з білком ЇМ75 з Ко 1 х 109 М або менше, зв'язується з білком І 75 з Ко 5 х 1070 М або менше або зв'язується з білком І 75 з Ко 1 х 1079 М або менше.
В одному варіанті здійснення антитіла за даним винаходом конкурують (наприклад, перехресно конкурують) за зв'язування з І У75 з конкретними антитілами до І У75, описаними у даному документі (наприклад, І М75 АТ). Такі конкуруючі антитіла можна ідентифікувати на основі їхньої здатності до конкурентного інгібування зв'язування одного або більше тАБ з І ї75 у стандартних аналізах зв'язування з І 75. Наприклад, можна застосовувати стандартні аналізи
ЕГІ5А, у яких рекомбінантний білок І У75 людини іммобілізований на планшеті, одне з антитіл є флуоресцентно міченим, і оцінюється здатність немічених антитіл до виведення міченого антитіла з конкуренції за зв'язування. Додатково або в альтернативному випадку можна застосовувати аналіз ВіАсоге для оцінки здатності антитіл до перехресної конкуренції. Здатність досліджуваного антитіла до інгібування зв'язування антитіла до ЇУ75 за даним винаходом з
ЇЖМ75 людини демонструє, що досліджуване антитіло може конкурувати з антитілом за зв'язування з І 75 людини.
В одному варіанті здійснення конкуруюче антитіло являє собою антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом на І У75 людини, що і конкретні моноклональні антитіла до І У75, описані у даному документі (наприклад, І М75 А1). Стандартні методики картування епітопів, такі як рентгенівська кристалографія і 2-мерна спектроскопія ядерного магнітного резонансу, можна застосовувати для визначення того, чи зв'язується антитіло з тим же епітопом, що й еталонне антитіло (див., наприклад, Ерйоре Марріпд Ргоїосо!5 іп Меїйподз іп МоїІесшаг Віоіоду, Мої. 66, 0.
Е. Моїтіз, Еа. (1996)).
В одному варіанті здійснення антитіло, яке конкурує за зв'язування з І У75 і/або зв'язується з тим же епітопом на І У75 людини, являє собою антитіло людини.
Після виділення одного вихідного тАб до І М75, що має бажані властивості, описані у 60 даному документі, можуть бути одержані інші тАбр з аналогічними властивостями, наприклад,
що мають той же епітоп. Наприклад, можна імунізувати мишей за допомогою І У75, як описано у даному документі, одержувати гібридоми і піддавати одержані тАб скринінгу з виявленням здатності до конкуренції з вихідним ІтАб за зв'язування з І 75. Мишей також можна імунізувати меншим фрагментом І М75, що містить епітоп, з яким зв'язується вихідне тАбБ. Локалізацію епітопа можна визначати шляхом, наприклад, скринінгу з виявленням зв'язування з рядом пептидів, що перекриваються і охоплюють І!М75. В альтернативному випадку можна застосовувати спосіб з дезрег5 еї аї., Віотесппоіоду 12:899, 1994, для керування відбором тАБб, які мають той же епітоп і, отже, аналогічні властивості порівняно з вихідним тАбр. За допомогою фагового дисплея спочатку важкий ланцюг вихідного антитіла спарюють з сукупністю (переважно людських) легких ланцюгів для відбору тАБ, які зв'язуються з І 75, а потім новий легкий ланцюг спарюють з сукупністю (переважно людських) важких ланцюгів для відбору (переважно людських) тАБ, які зв'язуються з І 75, що мають той же епітоп, що і вихідне тАб. В альтернативному випадку варіанти вихідного тАбБ можна одержувати шляхом мутагенезу кДНК, яка кодує важкі і легкі ланцюги антитіла.
Картування епітопів, наприклад, описане в Спатре еї аї. (1995) У. ВіоїЇ. Спет. 270:1388-1394, можна проводити для визначення того, чи зв'язується антитіло з епітопом, який становить інтерес. "Аланін-сканувальний мутагенез", описаний в Сиппіпоапат апа Ууеїїз (1989) Зсієпсе 244: 1081-1085, або будь-яку іншу форму точкового мутагенезу амінокислотних залишків в І М75 людини також можна застосовувати для визначення функціонального епітопа для антитіла до
ЇЖМ75 за даним винаходом. У дослідженнях мутагенезу, однак, також можуть виявляти амінокислотні залишки, критично важливі для загальної тривимірної структури ГУ75, але які безпосередньо не беруть участь у контактах антитіла і антигену, і тому для підтвердження функціонального епітопа, визначуваного за допомогою даного способу, можуть бути необхідні інші способи.
Епітоп, з яким зв'язується специфічне антитіло, також можна визначити шляхом оцінки зв'язування антитіла з пептидами, що містять фрагменти ЇМ75 людини. Ряд пептидів, що перекриваються і охоплюють послідовність ЇМ75, можна синтезувати і піддавати скринінгу з виявленням зв'язування, наприклад, у прямому ЕГІЗА, конкурентному ЕГІЗА (де пептид оцінюють за його здатністю до попередження зв'язування антитіла з І 75, зв'язаним з лункою
Зо титраційного мікропланшета) або на чипі. Такі способи скринінгу пептидів можуть бути нездатними виявити деякі переривчасті функціональні епітопи, тобто функціональні епітопи, що містять амінокислотні залишки, які не є суміжними уздовж первинної послідовності поліпептидного ланцюга І У75.
Епітоп, з яким зв'язуються антитіла за даним винаходом, також можна визначити за
З5 допомогою структурних способів, таких як рентгенівське визначення структури кристалів (наприклад, УМО 2005/044853), молекулярне моделювання і спектроскопія ядерного магнітного резонансу (ЯМР), у тому числі визначення швидкостей обміну Н-ЮО за допомогою ЯМР для активних атомів водню в амідній групі ГУ75 у вільному стані і зв'язаного у комплекс з антитілом, яке становить інтерес (2іпп-Чивійп еї аї. (1992) Віоспетівігу 31, 11335-11347; іпп-Чивійп еї аї. (1993) Віоспетівігу 32, 6884-6891).
Що стосовно рентгенівської кристалографії, кристалізацію можна здійснювати за допомогою будь-якого із способів, відомих з рівня техніки (наприклад, Сіеде еї аї. (1994) Асіа СгтгувіайвПодг. 0р50:339-350; МеРПегзоп (1990) Ек. 9. Віоспет. 189:1-23), у тому числі метода мікросерій (наприклад, Спауєп (1997) Бігисіиге 5:1269-1274), метода висячої краплини шляхом дифузії у парах (наприклад, МеоРпегзоп (1976) У. Віої. Спет. 251:6300-6303), протравлювання і діалізу.
Бажано застосовувати білковий препарат, який має концентрацію щонайменше приблизно 1 мг/мл і переважно від приблизно 10 мг/мл до приблизно 20 мг/мл. Найкращої кристалізації можна досягнути в осаджувальному розчині, що містить поліетиленгліколь 1000-20000 (РЕС; середня молекулярна маса варіює у діапазоні від приблизно 1000 до приблизно 20000 Да, переважно від приблизно 5000 до приблизно 7000 Да, більш переважно становить приблизно 6000 Да, при цьому концентрації варіюють у діапазоні від приблизно 10 95 до приблизно 30 905 (вага/об'єм)). Також може бути бажаним включення стабілізатора білка, наприклад, гліцерину, у концентрації, що варіює у діапазоні від приблизно 0,5 95 до приблизно 20 95. В осаджувальному розчині також може бути бажаною підходяща сіль, така як хлорид натрію, хлорид літію або цитрат натрію, переважно у концентрації, що варіює у діапазоні від приблизно 1 мМ до приблизно 1000 мМ. Осаджувач переважно забуферений до рН від приблизно 3,0 до приблизно 5,0, переважно приблизно 4,0. Конкретні буфери, застосовувані в осаджувальному розчині, можуть відрізнятися і добре відомі з рівня техніки (5сорев5, Ргоївіп Ригійсайіоп: Ргіпсіріеє5 апа
Ргасіїсе, Тік ей. (1994) бргіпадег-Мегіад, Мемж/ Могк). Приклади застосовуваних буферів бо включають, без обмежень, НЕРЕ5, Ттгі5, МЕЗ і ацетат. Кристали можуть рости у широкому діапазоні температур, у тому числі при 2 "С,47С,87С 12676.
Кристали комплексів антитіло-:антиген можна вивчати за допомогою добре відомих методик рентгенівської дифракції і можна деталізувати за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення, такого як Х-РІ ОК (Єльський університет, 1992, що розповсюджується МоїІесціаг
Зітшиайноп5, Іпс.; див., наприклад, Віспаеїї 5 доппзоп (1985) Мей. Еплутої. 114 8 115, Н. МУ.
УМуской еї аї., ед5., Асадетіс Рге55; публікацію заявки на патент США Мо 2004/0014194) і
ВОИБТЕВ (Вгісодпе (1993) Асіа Стгуві. 049:37-60; Віісодпе (1997) Мей. Епгутої. 276А:361-423,
Сапег б Змевї, єд5.; Вомегзі еї аї. (2000) Асіа Стузі. 056:1313-1323), розкриття яких включені у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті.
Конкурентні аналізи антитіл, описані у даному документі, можна застосовувати для визначення того, чи зв'язується антитіло "з тим же епітопом", що й інше антитіло. Як правило, конкуренція, що становить 50 95 або більше, 60 95 або більше, 70 95 або більше, як, наприклад, 70 96,71 95,72 95, 73 905, 74 90, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше, антитіла, про яке відомо, що воно взаємодіє з епітопом, з другим антитілом в умовах, у яких друге антитіло знаходиться у надлишку, а перше насичує всі ділянки, свідчить про те, що антитіла "зв'язуються з тим же епітопом". Для оцінки рівня конкуренції між двома антитілами можна застосовувати, наприклад, радіоімунологічні аналізи або аналізи з використанням інших міток для антитіл. Наприклад, антиген ЇМ75 можна інкубувати з насичувальною кількістю першого антитіла до Ї!М75 або його антигензв'язувального фрагмента, кон'югованих зі сполукою-міткою (наприклад, ЗН, "29»І, біотином або рубідієм), у присутності такої ж кількості другого неміченого антитіла до І 75.
Потім оцінюють кількість міченого антитіла, що зв'язується з антигеном у присутності неміченого блокувального антитіла, і порівнюють зі зв'язуванням за відсутності неміченого блокувального антитіла. Конкуренцію визначають за відсотковою зміною сигналів зв'язування у присутності неміченого блокувального антитіла порівняно з відсутністю блокувального антитіла.
Таким чином, якщо має місце 50 95 інгібування зв'язування міченого антитіла у присутності блокувального антитіла порівняно зі зв'язуванням за відсутності блокувального антитіла, то має місце конкуренція між двома антитілами, що становить 50 95. Таким чином, посилання на конкуренцію між першим і другим антитілами, що становить 50 95 або більше, 60 95 або більше, 70 95 або більше, як, наприклад, 70 95, 71 У, 72 90, 73 У, 74 90, 75 Уо, 80 У, 85 Ус, 90 Фо, 95 95, 96
Фо, 97 95, 98 90, 99 95 або більше, означає, що перше антитіло інгібує зв'язування другого антитіла (або навпаки) з антигеном на 50 95, 60 90, 70 905, 71 905, 72 905, 73 95, 74 90, 75 95, 80 90, 85 сто, 90 96, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше (порівняно зі зв'язуванням з антигеном другого антитіла за відсутності першого антитіла). Таким чином, інгібування зв'язування першого антитіла з антигеном другим антитілом, що становить 50 95, 60 905, 70 90, 71 95, 72 90, 7З со, 74 9в, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше, означає, що два антитіла зв'язуються з тим же епітопом.
Модифікації антитіл
У даному винаході додатково представлені варіанти антитіл, іноді також звані "похідними антитіл" або "аналогами антитіл". Інакше кажучи, існує ряд модифікацій, які можна здійснювати по відношенню до антитіл за даним винаходом, у тому числі, без обмежень, амінокислотні модифікації СОК (дозрівання афінності), амінокислотні модифікації каркасних областей, амінокислотні модифікації Ес-області, варіанти глікозилювання, ковалентні модифікації інших типів (наприклад, для приєднання кон'югованих лікарських засобів тощо).
Під "варіантом" у даному документі мається на увазі поліпептидна послідовність, відмінна від такої у вихідного поліпептиду за рахунок щонайменше однієї амінокислотної модифікації. У даному випадку вихідний поліпептид являє собою або варіабельну область важкого або легкого ланцюга повної довжини, відповідно наведену під ЗЕО ІЮ МО:1 або 2, або СОК-області, або каркасні області важких і легких ланцюгів, наведені під ЗЕО ІЮ МО:5-10 їі 16-21. Амінокислотні модифікації можуть включати заміни, вставки і делеції, при цьому перші у багатьох випадках є переважними. Буде зрозуміло, що амінокислотна заміна може являти собою консервативну або неконсервативну заміну, при цьому консервативні заміни є переважними.
Додатково, вказана заміна може являти собою заміну на амінокислоту, що зустрічається або не зустрічається у природі.
В цілому, варіанти можуть включати будь-яку кількість модифікацій, за умови, що функція антитіла буде все ще бути відсутньою, як описано у даному документі. Інакше кажучи, у випадку
ЇМ75 АТ, наприклад, антитіло повинно все ще специфічно зв'язуватися з /М75 людини.
Аналогічно, якщо амінокислотні варіанти одержують з Есо-областю, наприклад, то варіанти антитіл повинні зберігати функції зв'язування з рецепторами, необхідні для конкретного 60 застосування антитіла або показання до нього.
"Варіанти" у даному випадку можна одержувати в наведених послідовностях СОК, каркасних або Ес-областях антитіла.
Однак, у цілому зазвичай використовують 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислотних замін, оскільки часто метою є зміна функції з мінімальною кількістю модифікацій. У деяких випадках має місце від 1 до 5 модифікацій (наприклад, окремих амінокислотних замін, вставок або делецій), при цьому 1-2, 1-3 і 1-4 також знаходять застосування у багатьох варіантах здійснення. Кількість модифікацій може залежати від розміру модифікованої області; наприклад, як правило, у СОК-областях бажаною є менша кількість модифікацій. Фахівцю у даній галузі буде зрозуміло, що навіть у СОК-областях місце розташування модифікації може значно змінювати ефект. В одному варіанті здійснення модифікації можна здійснювати у будь- якій з СОК1, СОК2 або СОКЗ важких і/або легких ланцюгів. У додатковому варіанті здійснення модифікації здійснюють у будь-якій з СОМКІ або СОМК2 важких і/(або легких ланцюгів. У ще одному додатковому варіанті здійснення модифікації розташовані у СОКІ1 важких і/або легких ланцюгів.
Слід відмітити, що ряд амінокислотних модифікацій може знаходитися у функціональних доменах: наприклад, може бути бажаним наявність 1-5 модифікацій у Ес-області білків дикого типу або сконструйованих білків, а також від 1 до 5 модифікацій у Ем-області, наприклад.
Варіант поліпептидної послідовності переважно буде мати щонайменше приблизно 80 95, 85 95, 90 95,91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичність з вихідними послідовностями (наприклад, варіабельними областями, константними областями, і/або послідовностями важких і легких ланцюгів, і/або СОМ І М75 АТ). Слід відмітити, що залежно від розміру послідовності, відсоткова ідентичність буде залежати від кількості амінокислот.
Під "амінокислотною заміною" або "заміною" у даному документі мається на увазі заміщення амінокислоти у конкретному положенні вихідної поліпептидної послідовності іншою амінокислотою, яка може бути природною або амінокислотою, що не зустрічається у природі.
Наприклад, заміна 5100А стосується варіанта поліпептиду, у якому серин у положенні 100 заміщений аланіном. Під "амінокислотною вставкою" або "вставкою", що використовується у даному документі, мається на увазі додавання амінокислоти у конкретне положення вихідної поліпептидної послідовності. Під "амінокислотною делецією" або "делецією", що
Зо використовується у даному документі, мається на увазі вилучення амінокислоти у конкретному положенні вихідної поліпептидної послідовності.
Під "вихідним поліпептидом", "вихідним білком", "поліпептидом-попередником" або "білком- попередником", що використовується у даному документі, мається на увазі немодифікований поліпептид, який згодом модифікують з одержанням варіанта. Як правило, вихідні поліпептиди у даному документі являють собою 175 А1. Відповідно, під "вихідним антитілом", що використовується у даному документі, мається на увазі антитіло, яке модифікують з одержанням варіанта антитіла.
Під "диким типом", або "МУТ", або "нативним" у даному документі мається на увазі амінокислотна послідовність або нуклеотидна послідовність, виявлена у природі, у тому числі алельні варіанти. Білок, поліпептид, антитіло, імуноглобулін, (9 тощо УУТ мають амінокислотну послідовність або нуклеотидну послідовність, яка не була навмисно модифікована.
Під "варіантом Ес-області" у даному документі мається на увазі послідовність Ес, відмінна від послідовності Ес дикого типу за рахунок щонайменше однієї амінокислотної модифікації.
Варіант Ес може стосуватися поліпептиду Ес як такого, композицій, що містять варіант поліпептиду Ес, або амінокислотної послідовності.
У деяких варіантах здійснення в одній або білеше СОК ІМ75 АТ здійснюють одну або більше амінокислотних модифікацій. Як правило, у будь-якій окремій СОК заміняють лише 1, або 2, або З амінокислоти, і у наборі з 6 СОК зазвичай здійснюють не більше 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 змін.
БО Однак, слід розуміти, що будь-яку комбінацію з відсутністю замін, 1, 2 або З замін у будь-якій
СОК можна незалежно і необов'язково поєднувати з будь-якою іншою заміною. Буде очевидно, що заміни можна здійснювати у будь-якій з 6 СОК. В одному варіанті здійснення заміни здійснюють у СОКІ1 важких і/або легких ланцюгів.
У деяких випадках амінокислотні модифікації у СОК називають "дозріванням афінності".
Антитіло, піддане "дозріванню афінності", має одну або більше змін в одній або більше СОК, які призводять до покращення афінності антитіла до антигену порівняно з вихідним антитілом, яке не має цю(цих) зміну(змін). У деяких випадках, хоча і рідких, може бути бажаним зниження афінності антитіла до його антигену, але це зазвичай не є переважним.
Дозрівання афінності можна здійснювати для підвищення афінності зв'язування антитіла з 60 антигеном щонайменше на приблизно 10 95, приблизно 20 95, приблизно 30 95, приблизно 40 95,
приблизно 50 95, приблизно 60 95, приблизно 70 95, приблизно 80 95, приблизно 90 95, приблизно 100 95, приблизно 110 95, приблизно 120 95, приблизно 130 95, приблизно 140 95, приблизно 150 до або більше або у величину від 1, 2, 3, 4 до 5 разів порівняно з "вихідним" антитілом.
Переважні антитіла, піддані дозріванню афінності, будуть характеризуватися наномолярними або навіть пікомолярними значеннями афінності до цільового антигену. Антитіла, піддані дозріванню афінності, одержують за допомогою відомих процедур. Див., наприклад, Магкз еї аї., 1992, Віотесппоіоду 10:779-783, у якому описано дозрівання афінності шляхом перетасування доменів варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ).
Випадковий мутагенез залишків СОР. і/або каркасних ділянок описаний у Вагбрав, еї аї. 1994,
Ргос. Маї. Асай. 5сі, ОБА 91:3809-3813; ЗПіег єї а!., 1995, Сепе 169:147-155; Меюп єї а)!., 1995, у.
Іттипої. 155:1994-2004; даскзвоп еї аї., 1995, 9. Іттипої. 154(7):3310-9; ії Науукіпз еї аї, 1992, у.
МОЇ. Віої. 226:889-896, наприклад.
В альтернативному випадку в одній або більше СОР. антитіл за даним винаходом можна здійснювати амінокислотні модифікації, які є "мовчазними", наприклад, які незначно змінюють афінність антитіла до антигену. Їх можна виробляти з ряду причин, що включають оптимізацію експресії (яку можна здійснювати для нуклеїнових кислот, які кодують антитіла за даним винаходом).
Таким чином, у визначення СОК і антитіл за даним винаходом включені варіанти СОК і антитіл; інакше кажучи, антитіла за даним винаходом можуть містити амінокислотні модифікації в одній або більше СОМ І М75 АТ. На додаток, як стисло викладено нижче, амінокислотні модифікації можна також незалежно і необов'язково здійснювати у будь-якій області за межами
СОК, у тому числі у каркасних і константних областях, описаних у даному документі.
У деяких варіантах здійснення антитіла до ЇУ75 за даним винаходом містять варіант Ес- домену. Як відомо у даній галузі техніки, Ес-область антитіла взаємодіє з рядом Ес-рецепторів і лігандів, надаючи цілий ряд важливих функціональних здатностей, званих ефекторними функціями. Ці Ес-рецептори включають, без обмежень, (у людей) ЕсукІ (СОб4), у тому числі ізоформи ЕсукКіІа, ЕсСуУКІЬ і ЕсукКіІс; ЕсукІ! (2032), у тому числі ізоформи ЕсукКІа (у тому числі алотипи НІ131 ії К131), ЕсуКІІЬ (у тому числі ЕсуКІБ-1 ї ЕсукПБ-2) і ЕсуКіс; і сук (СО16), у тому числі ізоформи ЕсукіШа (у тому числі алотипи М158 і Е158, пов'язані з антитілозалежною
Зо клітинною цитотоксичністю (АЮСС)) ії сук (у тому числі алотипи ЕСуКПВБ-МАТ1 ї ЕсукПШбБ-
МА2), РсКп (неонатальний рецептор), С1д (білок системи комплементу, що бере участь у комплементзалежній цитотоксичності (СОС)) і ЕсКп (неонатальний рецептор, що бере участь у регуляції періоду напіввиведення з сироватки крові). Підходящі модифікації можна здійснювати в одному або більше положеннях, як у цілому викладено, наприклад, у заявці на патент США 11/841654 і літературних джерелах, згадуваних там, 5 2004/013210, О5 2005/0054832, 5 2006/0024298, 05 2006/0121032, 05 2006/0235208, 05 2007/0148170, 0554 12/341769, патенті
США Мо 6737056, патенті США Мо 7670600, патенті США Мо 6086875, всі з яких явним чином включені шляхом посилання у всій своїй повноті, зокрема, що стосується конкретних амінокислотних замін, які підвищують зв'язування з Ес-рецепторами.
На додаток до модифікацій, викладених вище, можна здійснювати інші модифікації.
Наприклад, молекули можна стабілізувати шляхом включення у їхній склад дисульфідних містків, які зв'язують МН- і Мі-домени (Кейег еї аї., 1996, Маїшге Віоїесп. 14:1239-1245, включений шляхом посилання у всій своїй повноті).
На додаток, модифікації цистеїнових залишків є особливо застосовуваними у шляхах застосування кон'югатів антитіло-лікарський засіб (АОС), додатково описаних нижче. У деяких варіантах здійснення константна область антитіла може бути сконструйована такою, що містить один або більше особливо "тіол-реактивних" цистеїнових залишків з метою забезпечення більш специфічного і регульованого розміщення компонента-лікарського засобу. Див., наприклад, патент США Мо 7521541, включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті.
На додаток, існує ряд ковалентних модифікацій антитіл, які можна здійснювати, як стисло викладено нижче.
Ковалентні модифікації антитіл включені в обсяг даного винаходу і зазвичай, але не завжди, здійснюються посттрансляційно. Наприклад, деякі типи ковалентних модифікацій антитіла вбудовують у молекулу шляхом реакції конкретних амінокислотних залишків антитіла з органічним дериватизуючим засобом, здатним до реакції з визначеними бічними ланцюгами або
М- або С-кінцевими залишками.
Цистеїнільні залишки частіше всього піддають реакції з с-галогенацетатами (і відповідними амінами), такими як хлороцтова кислота або хлорацетамід, з одержанням карбоксиметильних або карбоксіамідометильних похідних. Цистеїнільні залишки також можна дериватизувати бо шляхом реакції з бромтрифторацетоном, а-бром-В-(5-імідазолілупропіоновою кислотою,
хлорацетилфосфатом, М-алкілмалеїмідами, З-нітро-2-піридилдисульфідом, метил-2- піридилдисульфідом, п-хлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нітрофенолом або хлор-7- нітробензо-2-окса-1,3-діазолом тощо.
Гістидильні залишки дериватизують шляхом реакції з діетилпірокарбонатом при рН 5,5-7,0, оскільки даний засіб є відносно специфічним до бічного ланцюга гістидилу. Також застосовуваним є пара-бромфенацилбромід; реакцію переважно здійснюють у 0,1 М какодилаті натрію при рН 6,0.
Лізинільні й амінокінцеві залишки піддають реакції з ангідридами бурштинової або інших карбонових кислот. Дериватизація за допомогою цих засобів має ефект зміни заряду лізинільних залишків на протилежний. Інші підходящі реагенти для дериватизації залишків, що містять альфа-аміногрупи, включають імідоестери, такі як метилпіколінімідат; піридоксальфосфат; піридоксаль; хлорборогідрид; тринітробензолсульфонову кислоту; О- метилізосечовину; 2,4-пентандіон і гліоксилат у реакції, яку каталізують трансаміназою.
Аргінільні залишки модифікують шляхом реакції з одним або більше традиційними реагентами, серед яких фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон, 1,2-циклогександіон і нінгідрин.
Дериватизація аргінінових залишків потребує, щоб реакцію проводили у лужних умовах, у зв'язку з високою рКа гуанідинової функціональної групи. Крім того, ці реагенти можуть реагувати з групами лізину, а також з епсилон-аміногрупою аргініну.
Можна здійснювати конкретні модифікації тирозильних залишків, при цьому особливий інтерес становить введення спектральних міток у тирозильні залишки шляхом реакції з ароматичними сполуками діазонію або тетранітрометаном. Для утворення --О- ацетилтирозильних молекул і З-нітропохідних частіше всього відповідно застосовують М- ацетилімідазол і тетранітрометан. Тирозильні залишки йодують за допомогою 125І або 1311 з одержанням мічених білків для застосування у радіоімунологічному аналізі, при цьому спосіб із застосуванням хлораміну Т, описаний вище, є переважним.
Карбоксильні бічні групи (аспартил або глутаміл) вибірково модифікують шляхом реакції з карбодиіїмідами (БА -М-0-М--К, де К і Е" необов'язково являють собою різні алкільні групи, такі як 1-циклогексил-3-(2-морфолініл-4-етил)карбодиімід або 1-етил-3-(4-азоній-4,4- диметилпентил)карбодиімід. Крім того, аспартильні і глутамільні залишки перетворюють в
Зо аспарагінільні і глутамінільні залишки шляхом реакції з іонами амонію.
Дериватизація за допомогою біфункціональних засобів застосовувана для зшивання антитіл з нерозчинною у воді матрицею-підкладкою або поверхнею для застосування у ряді способів на додаток до способів, описаних нижче. Широко використовувані зшивальні засоби включають, наприклад, 1,1-біс(діазоацетил)-2-фенілетан, глутаровий альдегід, М-гідроксисукцинімідні естери, наприклад, естери 4-азидосаліцилової кислоти, гомобіфункціональні імідоестери, що включають дисукцинімідилові естери, такі як 3,3'-дитіобіс(сукцинімідилпропіонат), (« біфункціональні малеїміди, такі як біс-М-малеїмідо-1,8-октан. Дериватизуючі засоби, такі як метил-3-Кп-азидофеніл)дитіо|пропіоімідат, забезпечують одержання фотоактивованих проміжних сполук, здатних утворювати поперечні зв'язки у присутності світла. В альтернативному випадку для іммобілізації білків використовують реакційноздатні нерозчинні у воді матриці, такі як активовані бромистим ціаногеном вуглеводні і реакційноздатні субстрати, описані у патентах США МоМо 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 і 4330440, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті.
Глутамінільні і аспарагінільні залишки часто дезамідують з одержанням відповідних глутамільних і аспартильних залишків, відповідно. В альтернативному випадку ці залишки дезамідують у слабокислих умовах. Будь-яка форма цих залишків знаходиться у межах обсягу даного винаходу.
Інші модифікації включають гідроксилювання проліну і лізину, фосфорилювання гідроксильних груп серильних або треонільних залишків, метилування са-аміногруп бічних ланцюгів лізину, аргініну і гістидину (Т. Е. Стеідпіоп, Ргоїеїп5: Бігисіиге апа Моїесшаг Ргорегіієв,
МУ. Н. Егеєтап 45 Со., Зап Егапсізсо, рр. 79-86 (1983), включений шляхом посилання у всій своїй повноті), адцетилювання М-кінцевої аміногрупи і амідування будь-якої С-кінцевої карбоксильної групи.
На додаток, як буде зрозуміло фахівцям у даній галузі, до антитіл (а також до інших композицій за даним винаходом) можна додавати будь-які мітки (у тому числі флуоресцентні, ферментні, магнітні, радіоактивні тощо).
Біспецифічні молекули
В іншому аспекті у даному винаході представлені біспецифічні молекули, що містять антитіло до І М75 або його фрагмент за даним винаходом. Антитіло за даним винаходом або бо його антигензв'язувальні частини можна дериватизувати або зв'язати з іншою функціональною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, іншим антитілом або лігандом рецептора), з одержанням біспецифічної молекули, яка зв'язується щонайменше з двома різними ділянками зв'язування або цільовими молекулами. Антитіло за даним винаходом дійсно можна дериватизувати або зв'язати більш ніж з однією іншою функціональною молекулою з одержанням поліспецифічних молекул, які зв'язуються більш ніж з двома різними ділянками зв'язування і/або цільовими молекулами; такі поліспецифічні молекули також маються на увазі як такі, які охоплені терміном "біспецифічна молекула", що використовується у даному документі. Для одержання біспецифічної молекули за даним винаходом можна утворювати функціональний зв'язок антитіла за даним винаходом (наприклад, шляхом сполучення хімічним шляхом, злиття генів, нековалентного об'єднання або іншим способом) з однією або більше іншими зв'язувальними молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пептид або зв'язувальний міметик, у результаті чого одержують біспецифічну молекулу.
Відповідно, даний винахід включає біспецифічні молекули, що містять щонайменше один перший фактор специфічності зв'язування з першим цільовим епітопом (тобто І М75) і другий фактор специфічності зв'язування з другим цільовим епітопом. Другий цільовий епітоп може бути присутнім на тому ж цільовому білку, що і зв'язуваний з першим фактором специфічності зв'язування; або другий цільовий епітоп може бути присутній на цільовому білку, відмінному від зв'язуваного першого білка, який зв'язується з першим фактором специфічності зв'язування.
Другий цільовий епітоп може бути присутнім на тій же клітині, що і перший цільовий епітоп (тобто І М75); або другий цільовий епітоп може бути присутнім на цільовій молекулі, яка не представлена на клітині, на якій представлений перший цільовий епітоп. Як використовується у даному документі, термін "фактор специфічності зв'язування" стосується компонента, що містить щонайменше один варіабельний домен антитіла.
В одному варіанті здійснення даного винаходу другий цільовий епітоп являє собою Ес- рецептор, наприклад, ЕсуКІ (СО64) людини або Еса-рецептор (СО89) людини. Таким чином, даний винахід включає біспецифічні молекули, здатні до зв'язування з ефекторними клітинами, які експресують як сук, так і ЕсоК (наприклад, з моноцитами, макрофагами або поліморфноядерними клітинами (РММ)), і з цільовими клітинами, які експресують І М75. Ці біспецифічні молекули спрямовують клітини, які експресують І! М75, до ефекторної клітини і
Зо запускають види активності ефекторних клітин, опосередковані Ес-рецепторами, такі як фагоцитоз клітин, які експресують ЇМ75, антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність (АОСС), вивільнення цитокінів або утворення супероксид-аніону.
В іншому варіанті здійснення даного винаходу другий цільовий епітоп являє собою СОЗ або
СО5. Таким чином, даний винахід включає біспецифічні молекули, здатні до зв'язування з ефекторними клітинами, які експресують як СОЗ, так і СО5 (наприклад, цитотоксичними Т- клітинами, які експресують СОЗ або СО5), і з цільовими клітинами, які експресують І м75. Ці біспецифічні молекули спрямовують клітини, які експресують І М75, до ефекторної клітини і запускають види активності ефекторних клітин, опосередковані СОЗ або СО5, такі як клональна експансія Т-клітин і Т-клітинна цитотоксичність. У даному варіанті здійснення біспецифічне антитіло за даним винаходом може мати загалом або два, або три варіабельних домени антитіла, де перша частина біспецифічного антитіла здатна мобілізувати активність імунної ефекторної клітини людини шляхом специфічного зв'язування з ефекторним антигеном, розташованим на імунній ефекторній клітині людини, при цьому ефекторний антиген являє собою антиген СОЗ людини або антиген СО5 людини, при цьому вказана перша частина містить один варіабельний домен антитіла, а друга частина біспецифічного антитіла здатна до специфічного зв'язування з цільовим антигеном, відмінним від ефекторного антигену, наприклад, ГМ75, при цьому вказаний цільовий антиген розташований на цільовій клітині, відмінній від вказаної імунної ефекторної клітини людини, і вказана друга частина містить один або два варіабельних домени антитіла.
У варіанті здійснення даного винаходу, у якому біспецифічна молекула є поліспецифічною, молекула може додатково містити третій фактор специфічності зв'язування на додаток до фактора специфічності зв'язування з Ес-рецептором або фактора специфічності зв'язування з
СОЗ або СО5 і фактора специфічності зв'язування з І 75. В одному варіанті здійснення третій фактор специфічності зв'язування являє собою частину антитіла до фактора підсилення (ЕР), наприклад, молекулу, яка зв'язується з поверхневим білком, що бере участь у цитотоксичній активності, і, таким чином, підвищує імунну відповідь проти цільової клітини. "Частина антитіла до фактора підсилення" може являти собою антитіло, функціональний фрагмент антитіла або ліганд, які зв'язуються з вказаною молекулою, наприклад, антигеном або рецептором, і, таким чином, призводять до підсилення ефекту детермінант зв'язування для Ес-рецептора або бо антигену цільової клітини. "Частина антитіла до фактора підсилення" може зв'язуватися з Ес-
рецептором або антигеном цільової клітини. В альтернативному випадку частина антитіла до фактора підсилення може зв'язуватися з об'єктом, відмінним від об'єкта, з яким зв'язуються перший і другий фактори специфічності зв'язування. Наприклад, частина антитіла до фактора підсилення може зв'язуватися з цитотоксичною Т-клітиною, наприклад, шляхом СО2, СОЗ, СОВ8,
Сор2г8, 204, СО40, ІСАМ-1, або з іншою імунною клітиною, що призводить до підвищення імунної відповіді проти цільової клітини.
В одному варіанті здійснення біспецифічні молекули за даним винаходом містять як фактор специфічності зв'язування щонайменше одне антитіло або фрагмент цього антитіла, що включає, наприклад, Раб, Раб", Е(аб)», Ем, га, аАБ або одноланцюговий Ру. Антитіло також може являти собою димер легких ланцюгів або важких ланцюгів або будь-який його мінімальний фрагмент, такий як Ем або одноланцюговий конструкт, описаний у патенті США Мо 4946778, зміст якого явним чином включено шляхом посилання.
В одному варіанті здійснення специфічність зв'язування з Есу-рецептором забезпечується моноклональним антитілом, зв'язування якого не блокується імуноглобуліном б людини (Ід).
Як використовується у даному документі, термін "рецептор Ід" стосується будь-якого з восьми генів у-ланцюга, локалізованих у хромосомі 1. Ці гени кодують загалом дванадцять трансмембранних або розчинних ізоформ рецепторів, розподілених на три класи Есу- рецепторів: Есук! (СО64), ЕсуУКІІ (2032) і ЕсУКкП (СО016). В одному переважному варіанті здійснення Есу-рецептор являє собою високоафінний ЕсукіІ людини. Есукі людини являє собою молекулу розміром 72 кДа, що демонструє високу афінність до мономерного Іде (108-109 М").
Одержання і встановлення характеристик деяких переважних моноклональних антитіл до
Есу описано у публікації за РСТ УМО 88/00052 і у патенті США Мо 4954617, ідеї яких у повній мірі включені у даний документ шляхом посилання. Ці антитіла зв'язуються з епітопом ЕсуКІ, ЕсуКІЇ або ЕсуРІІІ у ділянці, відмінній від ділянки зв'язування Есу-рецептора, і тому блокування їхнього зв'язування фізіологічними рівнями до є незначним. Конкретні антитіла до Есукі, застосовувані у даному винаході, являють собою ІтАб 22, тАб 32, тАбБ 44, тА 62 і тАБ 197. Гібридома, що утворює тАр 32, доступна з Американської колекції типових культур, Мо доступу в АТОоС
НВО469. В інших варіантах здійснення антитіло до Есу-рецептора є гуманізованою формою моноклонального антитіла 22 (Н2г2). Одержання і встановлення характеристик антитіла Н22
Зо описано в Сгаліапо, К.Р. еї аї. (1995) 9. Іттипої 155 (10): 4996-5002 і публікації за РСТ УМО 94/10332. Лінія клітин, які утворюють антитіло Н22, була депонована в Американській колекції типових культур під позначенням НАО22СІ 1 і має номер доступу СК. 11177.
У ще інших переважних варіантах здійснення специфічність зв'язування з Ес-рецептором забезпечується антитілом, яке зв'язується з рецептором ІДА людини, наприклад, з Ес-альфа- рецептором (ЕсоКІ (СО89)), зв'язування з яким переважно не блокується імуноглобуліном А (ІдДА) людини. Термін "рецептор ІдА" мається на увазі як такий, що включає продукт гена одного а-гена (ЕсСОКІ), локалізованого у хромосомі 19. Даний ген, як відомо, кодує декілька підданих альтернативному сплайсингу трансмембранних ізоформ розміром 55-110 кДа. РсоКкІ (СО89) характеризується конститутивною експресією на моноцитах/макрофагах, еозинофільних і нейтрофільних гранулоцитах, але не у популяціях неефекторних клітин. ЕсаК! має середню афінність («г 5 х 107 М") як до ІДАТ, так і до ІдДА2, яка підвищується під впливом цитокінів, таких як 6-С5Е або СМ-С5Е (Мопоп, Н.С. еї а!. (1996) Стііса! Неміємув іп Іттипоіоду 16:423-440). Були описані чотири специфічні до ЕсаКіІ моноклональні антитіла, ідентифіковані як АЗ, АБО, Аб2 і
А77, які зв'язуються з ЕСОаКіІ за межами ліганд-зв'язувального домену для ІдА ІМопіевїго, К.С. еї а!. (1992) 9. Ііттипої. 148:1 764).
ЕсогІ ії ЕсуКІ є переважними рецепторами для запуску для застосування з біспецифічними молекулами за даним винаходом, оскільки вони (1) експресуються головним чином на імунних ефекторних клітинах, наприклад, моноцитах, РММ, макрофагах і дендритних клітинах; (2) експресуються на високих рівнях (наприклад, 5000-100000 на клітину); (3) є медіаторами видів цитотоксичної активності (наприклад, АОСС, фагоцитозу) і (4) опосередковують покращену презентацію антигену для антигенів, у тому числі аутоантигенів, спрямованих до них.
Антитіла, які можна використовувати у біспецифічних молекулах за даним винаходом, є мишиними, людськими, химерними і гуманізованими моноклональними антитілами.
Біспецифічні молекули за даним винаходом можна одержувати шляхом кон'югування складових факторів специфічності зв'язування, наприклад, факторів специфічності зв'язування з СК, СОЗ, СО5 і 1 75, із застосуванням способів, відомих з рівня техніки. Наприклад, фактори специфічності зв'язування кожної біспецифічної молекули можна одержувати окремо, а потім кон'югувати один з одним. Якщо фактори специфічності зв'язування являють собою білки або пептиди, то для ковалентного кон'югування можна застосовувати ряд засобів сполучення або 60 зшивальних засобів. Приклади зшивальних засобів включають білок А, карбодиїімід, М-
сукцинімідил-5-ацетилтіоацетат (ЗАТА), 5,5'-дитіобіс(2-нітробензойну кислоту) (ОТМВ), о- фенілендималеїімід (ОРОМ), М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5БРОР) і сульфосукцинімідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-і-карбоксилат (сульфо-ЗМСС) |див., наприклад, Кагроу5кКу еї аї. (1984) У. Ехр. Мей. 160:1686; І іш, МА еї аї. (1985) Ргос. Маї!. Асаа.
Зсі. ОБА 82:8648)|. Інші способи включають описані в Рашиз (1985) Вейгіпу Іп5. Мій. Мо. 78, 118- 132; Вгеппап есеї аї. (1985) бсіепсе 229:81-83, і Сіеппіє еї аї. (1987) 9. Іттипої. 139: 2367-2375.
Переважними кон'югованими засобами є ЗАТА і сульфо-ЗМСОСС, обидва з яких доступні від
Ріегсе Спептісаї Со. (Рокфорд, Іллінойс).
Якщо фактори специфічності зв'язування являють собою антитіла, вони можуть бути кон'юговані шляхом утворення зв'язків між сульфгідрильними групами С-кінцевих шарнірних областей двох важких ланцюгів. В особливо переважному варіанті здійснення шарнірну область модифікують з тим, щоб вона містила непарну кількість сульфгідрильних залишків, переважно один, перед кон'югуванням.
В альтернативному випадку обидва фактори специфічності зв'язування можуть кодуватися в одному і тому ж векторі і експресуватися і збиратися в одній і тій же клітині-хазяїні. Цей спосіб особливо застосовуваний, якщо біспецифічна молекула являє собою тАБр х тАб, тАб х Раб,
Раб х Р(аб)» або ліганд х білок злиття на основі Раб. Біспецифічна молекула за даним винаходом може являти собою одноланцюгову молекулу, що містить одне одноланцюгове антитіло і детермінанту зв'язування, або одноланцюгову біспецифічну молекулу, що містить дві детермінанти зв'язування. Біспецифічні молекули можуть містити щонайменше дві одноланцюгові молекули. Способи одержання біспецифічних молекул описані, наприклад, у патентах США МоМо 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 і 5482858, всі з яких явним чином включені у даний документ шляхом посилання.
Антитіла за даним винаходом можуть бути біспецифічними активаторами Т-клітин (ВІіТЕ).
ВіТЕ являють собою клас штучних біспецифічних моноклональних антитіл. Вони керують імунною системою реципієнта, більш конкретно, цитотоксичною активністю Т-клітин по відношенню до ракових клітин. ВІТЕ зазвичай являють собою білки злиття, що містять два одноланцюгових варіабельних фрагменти (5сЕм) різних антитіл, або амінокислотні послідовності з чотирьох різних генів, в одному пептидному ланцюгу, переважно розміром приблизно 55
Зо кілодальтон. Переважно, один з 5сЕм зв'язується з Т-клітинами шляхом СОЗ-рецептора, а інший - з ПУхлИННОЮю клітиною шляхом пухлинноспецифічної молекули.
Зв'язування біспецифічних молекул з їхніми специфічними мішенями можна підтвердити за допомогою, наприклад, твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА), радіоїмунологічного аналізу (КІА), РАСзЗ-аналізу, біологічного аналізу (наприклад, інгібування росту) або вестерн- блот-аналізу. У кожному з цих аналізів зазвичай виявляють наявність комплексів білок-антитіло, що становлять особливий інтерес, шляхом використання міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного до комплексу, що представляє інтерес. Наприклад, комплекси Еск- антитіло можна виявити за допомогою, наприклад, мічених ферментом антитіла або фрагмента антитіла, які розпізнають комплекси антитіло-СК і специфічно зв'язуються з ними. В альтернативному випадку комплекси можна виявити за допомогою будь-якого з ряду інших імунологічних аналізів. Наприклад, антитіло можна мітити радіоактивним ізотопом і застосовувати у радіоїмунологічному аналізі (КІА) (див., наприклад, У/еїіпігацб, В., Ргіпсіріеє5 ої
Вадіоїттипоаззауз, бемепій Тгаіпіпд Соцгзе оп Вадіоїдапа Авзау Тесппідое5, Те Епадостіпе зосіеїу, Магсп, 1986, включений у даний документ шляхом посилання). Радіоактивний ізотоп можна виявити за допомогою таких способів, як застосування лічильника у-опромінення або сцинтиляційного лічильника, або шляхом авторадіографії.
Глікозилювання
Іншим типом ковалентної модифікації є зміни глікозилювання. У деяких варіантах здійснення антитіла, розкриті у даному документі, можна модифікувати з тим, щоб вони містили одну або більше сконструйованих глікоформ. Під "сконструйованою глікоформою", як використовується у даному документі, мається на увазі вуглеводнева композиція, ковалентно приєднана до антитіла, де вуглеводнева композиція за хімічним складом відмінна від такої у вихідного антитіла. Сконструйовані глікоформи можуть бути застосовуваними для ряду цілей, у тому числі, без обмежень, підсилення або послаблення ефекторної функції. Наприклад, можна одержувати аглікозильоване антитіло (тобто антитіло, яке не має глікозилювання).
Глікозилювання можна змінити для, наприклад, підвищення афінності антитіла до антигену. Такі вуглеводневі модифікації можна здійснити шляхом, наприклад, зміни однієї або більше ділянок глікозилювання у послідовності антитіла. Наприклад, можна здійснити одну або більше амінокислотних замін, що призводить до усунення однієї або більше ділянок глікозилювання бо каркасної ділянки варіабельної області з усуненням, таким чином, глікозилювання у даній ділянці. Таке аглікозилювання може підвищувати афінність антитіла до антигену. Такий підхід більш детально описаний у патентах США МоМо 5714350 і 6350861 Со еї аїЇ., і може здійснюватися шляхом вилучення аспарагіну у положенні 297.
Переважною формою сконструйованої глікоформи є афукозилювання, яке, як було показано, корелює з підсиленням функції АОСС, переважно шляхом міцного зв'язування з
ЕсукШа-рецептором. У даному контексті "афукозилювання" означає, що більшість антитіл, утворених у клітинах-хазяях, практично не мають фукозу, наприклад, 90-95-98956 одержаних антитіл не мають значної кількості фукози як складову вуглеводневого компонента антитіла (зазвичай приєднаного у М297 в Ро-області). Згідно з функціональним визначенням афукозильовані антитіла зазвичай проявляють щонайменше 50 95 або більш високу афінність до ЕсукКПа-рецептора.
Сконструйовані глікоформи можуть бути одержані за допомогою ряду способів, відомих з рівня техніки (Штапа еї а!., 1999, Маї Віотесппої 17:176-180; Оамієзв єї а!., 2001, Віоїесппої! Віоепд 74:288-294; Півд» еї аї., 2002, у) Віої Снет 277:26733-26740; ЗпіпКауа еї аї., 2003, У Віої Снет 278:3466-3473; 5 6602684; О55М 10/277370; БОМ 10/113929; РСТ МО 00/61739 АТ; РСТ МО 01/29246 А1; РСТ УМО 02/31140 А1; РСТ УМО 02/30954 АТ, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті; технологія РОТЕ ІСЕМТФ |Віоуга, Іпс., Принстон, Нью-ДжерсіЇ; інженерна технологія глікозилювання сіусомМАБФ |СіІусагі ВіотесппоЇїоду АС, Цюріх, Швейцарія)). Багато з цих методик засновані на регуляції рівня фукозильованих олігосахаридів і/або олігосахаридів, що мають М-ацетилглюкозамін у точках розгалуження, ковалентно приєднаних до Ес-області, наприклад, шляхом експресії дС у різних організмах або лініях клітин, сконструйованих або інших (наприклад, у клітинах СНО Іес-13 або клітинах гібридоми пацюка УВ2/0), шляхом регуляції активності ферментів, що беруть участь у шляху глікозилювання (наприклад, РОТ (а- 1,6-фукозилтрансферази)| і/або Д-1,4-М-ацетилглюкозамінілтрансферази ПІ (Сп ТІ) або шляхом модифікації вуглеводню(вуглеводнів) після експресії дб. Наприклад, технологія "антитіл, одержуваних з використанням інженерії цукрів" або "ЗЕА" бБеаше Сепеїїс5 функціонує шляхом додавання модифікованих сахаридів, які інгібують фукозилювання під час утворення; див., наприклад, 5 2009/0317869, включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті. "Сконструйована глікоформа" зазвичай стосується іншого вуглеводню або олігосахариду порівняно з антитілом, одержаним за відсутності технології глікозилювання; таким чином, антитіло може містити сконструйовану глікоформу.
В альтернативному випадку сконструйована глікоформа може стосуватися варіанта дос, що містить інший вуглеводень або олігосахарид. Як відомо з рівня техніки, профілі глікозилювання можуть залежати як від послідовності білка (наприклад, наявності або відсутності конкретних глікозильованих амінокислотних залишків, які обговорюються нижче), так і від клітини-хазяїна або організму, у яких утворюється білок. Конкретні системи експресії обговорюються нижче.
Глікозилювання поліпептидів зазвичай є М-зчепленим або О-зчепленим. М-зчеплене стосується приєднання вуглеводневого компонента до бічного ланцюга аспарагінового залишку.
Послідовності трипептидів аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де Х являє собою будь-яку амінокислоту, за виключенням проліну, є послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводневого компонента до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність будь-якої з цих послідовностей трипептидів у поліпептиді утворює потенційну ділянку глікозилювання. О-зчеплене глікозилювання стосується приєднання одного з цукрів М- ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксіамінокислоти, частіше всього серину або треоніну, хоча також можна застосовувати 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин.
Додавання ділянок глікозилювання до антитіла з метою зручності здійснюють шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, щоб вона містила одну або більше з вищеописаних послідовностей трипептидів (для ділянок М-зчепленого глікозилювання). Зміну також можна здійснювати шляхом додавання одного або більше серинових або треонінових залишків до вихідної послідовності або заміни на них (для ділянок О-зчепленого глікозилювання). Для простоти амінокислотну послідовність антитіла переважно змінюють шляхом змін на рівні ДНК, зокрема, шляхом мутації ДНК, яка кодує цільовий поліпептид, у попередньо вибраних основах, так що одержують кодони, трансльовані у бажані амінокислоти.
Іншими способами збільшення кількості вуглеводневих компонентів в антитілі є з'єднання глікозидів з білком хімічним або ферментативним шляхом. Ці процедури є переважними, оскільки вони не потребують одержання білка у клітині-хазяїні що має можливості глікозилювання для М- ії О-зчепленого глікозилювання. Залежно від застосовуваного способу з'єднання цукор(цукри) можуть бути приєднані до (а) аргініну і гістидину, (Б) вільних карбоксильних груп, (с) вільних сульфгідрильних груп, таких як у цистеїну, (4) вільних бо гідроксильних груп, таких як у серину, треоніну або гідроксипроліну, (є) залишків ароматичних амінокислот, таких як у фенілаланіну, тирозину або триптофану, або (1) амідної групи глутаміну.
Ці способи описані у М/О 87/05330 і в Аріїп апа Умгівїоп, 1981, САС Стій. Кеу. Віоспет., рр. 259-306, обидва з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті.
Вилучення вуглеводневих компонентів, які присутні у вихідному антитілі (наприклад, посттрансляційне), можна здійснювати хімічним або ферментативним шляхом. Хімічне деглікозилювання потребує здійснення впливу на білок сполукою трифторметансульфоновою кислотою або еквівалентною сполукою. Дана обробка призводить до відщеплення більшості або всіх цукрів, за виключенням зв'язувального цукру (М-ацетилглюкозаміну або /-М- ацетилгалактозаміну), залишаючи при цьому поліпептид незайманим. Хімічне деглікозилювання описано у НаКітиадаїйп еї аї., 1987, Агсп. Віоспет. Віорпув5. 259:52, і в Едде еї аї., 1981, Апа).
Віоспет. 118:131, обидва з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті.
Ферментативне відщеплення вуглеводневих компонентів від поліпептидів можна здійснювати шляхом застосування ряду ендо- і екзоглікозидаз, описаних у Тпоїакига еї аї., 1987, Мей.
Еплутої. 138:350, включеному шляхом посилання у всій своїй повноті, у тому числі вилучення залишків фукози із застосуванням ферменту фукозидази, відомого з рівня техніки.
Глікозилювання у потенційних ділянках глікозилювання можна попередити шляхом застосування сполуки тунікаміцину, описаної у Юи5Кіп еї аї., 1982, 9. ВіоїЇ. Спет. 257:3105, включеному шляхом посилання у всій своїй повноті. Тунікаміцин блокує утворення М- глікозидних зв'язків з білком.
Інший тип ковалентної модифікації антитіла включає зв'язування антитіла з різними небілковими полімерами, у тому числі, без обмежень, різні поліоли, такі як поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь або поліоксіалкілени, згідно з викладеним у, наприклад, каталозі РЕС 2005- 2006 від МеКіаг ТПпегареціїс5 (доступному на веб-сайті МеКіаг), патентах США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 або 4179337, всі з яких включені шляхом посилання у всій своїй повноті. На додаток, як відомо з рівня техніки, амінокислотні заміни можна здійснювати у різних положеннях в антитілі для полегшення додавання полімерів, таких як РЕС. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США Мо 2005/0114037 А1, включену шляхом посилання у всій своїй повноті.
У додаткових варіантах здійснення, наприклад, у випадку застосування антитіл за даним винаходом з метою діагностики або виявлення, антитіла можуть містити мітку. Під "міченим" у даному документі мається на увазі, що сполука має щонайменше один елемент, ізотоп або хімічну сполуку, приєднані для забезпечення виявлення сполуки. Як правило, мітки підрозділяються на три класи: а) ізотопні мітки, які можуть являти собою радіоактивні або важкі ізотопи; Б) магнітні, електричні, температурні мітки ії с) кольорові або люмінесцентні барвники; хоча мітки також включають ферменти і частинки, такі як магнітні частинки. Переважні мітки включають, без обмежень, флуоресцентні комплекси лантаноїдів (у тому числі європію і тербію) і флуоресцентні мітки, що включають, без обмежень, квантові точки, флуоресцеїн, родамін, тетраметилродамін, еозин, еритрозин, кумарин, метилкумарини, пірен, малахітовий зелений, стильбен, люциферовий жовтий, Сазсаде синій, техаський червоний, барвники АїЇеха, ціанові барвники й інші, описані у б-му випуску МоІесшаг Ргобе5 НапдроокК під редакцією Кіснага Р.
Нацадіапа, явним чином включеному у даний документ шляхом посилання.
Кон'югати антитіло-лікарський засіб
У деяких варіантах здійснення антитіла до /М75 за даним винаходом кон'югують з лікарськими засобами з утворенням кон'югатів антитіло-лікарський засіб (АОС). Як правило,
АОС застосовують у шляхах застосування в онкології, де застосування кон'югатів антитіло- лікарський засіб для локальної доставки цитотоксичних або цитостатичних засобів забезпечує цілеспрямовану доставку компонента-лікарського засобу у пухлину, що може забезпечити більш високу ефективність, більш низьку токсичність тощо. Огляд даної технології наведений у ЮБисгу еї а!., Віосопійдаїє Спет., 21:5-13 (2010), Сапегеї аї., Сапсег у). 14(3): 154 (2008) і Бепієг, Сигепі
Оріп. Снет. Віої. 13:235-244 (2009), всі з яких включені у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті.
Таким чином, у даному винаході представлені антитіла до І У75, кон'юговані з лікарськими засобами. Як правило, кон'югування виконується шляхом ковалентного приєднання до антитіла, як детально описано нижче, і зазвичай засноване на застосуванні лінкеру, часто пептидного зв'язку (який, як описано нижче, може бути передбачений чутливим або нечутливим до розщеплення протеазами у цільовій ділянці). На додаток, як описано вище, зв'язування структурної одиниці лінкер-лікарський засіб (0-0) можна виконувати шляхом приєднання до цистеїнових залишків в антитілі. Як буде зрозуміло фахівцям у даній галузі, кількість компонентів-лікарських засобів на антитіло може змінюватися залежно від умов реакції, і бо співвідношення лікарський засіб:антитіло може варіювати від 1:11 до 10:1. Як буде зрозуміло фахівцям у даній галузі, фактична кількість є середнім значенням.
Таким чином, у даному винаході представлені антитіла до І У75, кон'юговані з лікарськими засобами. Як описано нижче, лікарський засіб АЮС може являти собою будь-яку кількість засобів, у тому числі, без обмежень, представлені цитотоксичні засоби, такі як хіміотерапевтичні засоби, інгібітори росту, токсини (наприклад, ферментативно активні токсини бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження або його фрагменти), або радіоактивні ізотопи (інакше кажучи, у радіокон'югаті). В інших варіантах здійснення у даному винаході додатково представлені способи застосування АОС.
Лікарські засоби для застосування у даному винаході включають цитотоксичні лікарські засоби, зокрема, застосовувані для терапії раку. Такі лікарські засоби включають, як правило, засоби, які пошкоджують ДНК, антиметаболіти, натуральні продукти і їхні аналоги. Ілюстративні класи цитотоксичних засобів включають інгібітори ферментів, такі як інгібітори дигідрофолатредуктази і інгібітори тимідилатсинтази, ДНК-інтеркалятори, засоби, які розщеплюють ДНК, інгібітори топоіїзомерази, лікарські засоби родини антрациклінів, лікарські засоби з барвінка, мітоміцини, блеоміцини, цитотоксичні нуклеозиди, лікарські засоби родини птеридинів, діїінени, подофілотоксини, доластатини, майтанзиноїди, індуктори диференціювання і таксоли.
Представники цих класів включають, наприклад, таксол, метотрексат, метоптерин, дихлорметотрексат, 5-фторурацил, б-меркаптопурин, арабінозид цитозину, мелфалан, лейрозин, лейросидеїн, актиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, мітоміцин С, мітоміцин А, карміноміцин, аміноптерин, талізоміцин, подофілотоксин і похідні подофілотоксину, такі як етопозид або фосфат етопозиду, вінбластин, вінкристин, віндезин, таксани, у тому числі таксол, таксотер, ретиноєву кислоту, масляну кислоту, М8в-ацетилспермідин, камптотецин, каліхеаміцин, еспераміцин, ендіїни, дуокарміцин А, дуокарміцин 5А, каліхеаміцин, камптотецин, геміастерліни, майтанзиноїди (у тому числі ОМІ1), монометилауристатин Е (ММАЕ), монометилауристатин Е (ММАРЕ) і майтанзиноїди (ОМА) і їхні аналоги.
Токсини можуть застосовуватися у складі кон'югатів антитіло--оксин і включають бактеріальні токсини, такі як дифтерійний токсин, рослинні токсини, такі як рицин, низькомолекулярні токсини, такі як гелданаміцин (Мапаїег ей аіІ. (2000) 9. Маї. Сапсег Іпв5і.
Зо 92(19):1573-1581; Мапаїег єї аї. (2000) Віоогдапіс 5. Мед. Спет. І енег5 10:1025-1028; Мапаїег єї аІ. (2002) Віосопіпдаїє Спет. 13:786-791), майтанзиноїди (ЕР 1391213; Гм еї аї., (1996) Ргос.
Майї. Асад. 5сі. ОБА 93:8618-8623) і каліхеаміцин (І оде еї аї. (1998) Сапсег Ке5. 58:2928; Ніптап еї аіІ. (1993) Сапсег Ве5. 53:3336-3342), геміастерліни (ММО 2004/026293; 7азкК еї аї., (2004) У.
Мед. Спет, 47: 4774-4786). Токсини можуть чинити свої цитотоксичні і цитостатичні ефекти за допомогою механізмів, що включають зв'язування тубуліну, зв'язування ДНК або інгібування топоіїзомерази.
Також можна застосовувати кон'югати антитіла до 1М75 і одного або більше низькомолекулярних токсинів, таких як майтанзиноїди, доластатини, ауристатини, трихотецен, каліхеаміцин і СС1065, і похідні цих токсинів, які мають активність токсинів.
Майтанзиноїди
Сполуки майтанзину, підходящі для застосування як майтанзиноїдні компоненти-лікарські засоби, добре відомі у даній галузі техніки і можуть бути виділені з природних джерел згідно з відомими способами, бути одержані за допомогою методик генної інженерії (див. Ми еї аї. (2002)
РМАБб 99:7968-7973), або являти собою майтанзинол і аналоги майтанзинолу, одержувані синтетично згідно з відомими способами. Як описано нижче, лікарські засоби можна модифікувати шляхом включення у їхній склад функціонально активної групи, такої як тіольна група або аміногрупа, для кон'югування з антитілом.
Ілюстративні майтанзиноїдні компоненти-лікарські засоби включають ті, які мають модифіковане ароматичне кільце, такі як С-19-дехлорпохідні (патент США Мо 4256746) (одержувані шляхом відновлення ансамітоцину Р2 алюмогідридом літію); С-20-гідрокси- (або С- 20-деметил-) -4/-С0-19-дехлорпохідні (патенти США МоМо 4361650 і 4307016) (одержувані шляхом деметилування за допомогою Зігеріоптусе5 або Асііпотусе5 або дехлорування за допомогою
ІАН) ї С-20-деметокси-, Сб-20-ацилокси- (-ОСОМВ) -/-дехлорпохідні (патент США Мо 4294757) (одержувані шляхом ацилювання за допомогою хлорангідридів), і ті, які мають модифікації в інших положеннях.
Ілюстративні майтанзиноїдні компоненти-лікарські засоби також включають ті, які мають такі модифікації, як С-9-5Н (патент США Мо 4424219) (одержувані шляхом реакції майтанзинолу з
Н25З або Р255); С-14-алкоксиметил(ідеметокси/СН2ОК) (патент США Мо 4331598); С-14- гідроксиметил або ацилоксиметил (СН2ОН або СНгОАс) (патент США Мо 4450254) (одержувані з 60 Мосагаїа); С-15-гідроксілацилоксі (патент США Мо 4364866) (одержувані шляхом перетворення майтанзинолу під дією Бігеріотусе5); С-15-метоксі (патенти США МоМо 4313946 і 4315929) (виділені з Тгем/іа пиайога); С-18-М-деметил (патенти США МеМо 4362663 і 4322348) (одержувані шляхом деметилування майтанзинолу під дією 5ігеріотусев5) і 4,5-дезоксі (патент США Мо 4371533) (одержувані шляхом відновлення майтанзинолу трихлоридом титану/Г АН).
Особливе застосування мають ЮМІ1 (розкритий у патенті США Мо 5208020, включеному шляхом посилання) і ОМА (розкритий у патенті США Ме 7276497, включеному шляхом посилання). Див. також ряд додаткових майтанзиноїдних похідних і способів у 5416064,
МУО/01/24763, 7303749, 7601354, И55М 12/631508, УУОО02/098883, 6441163, 7368565,
УО02/16368 ії УУМО04/1033272, всі з яких явним чином включені шляхом посилання у всій своїй повноті.
АОС, що містять майтанзиноїди, способи їхнього одержання і їхнє терапевтичне застосування розкриті, наприклад, у патентах США МоМо 5208020; 5416064; 6441163 і європейському патенті ЕР 0 425 235 В1, розкриття яких явним чином включені у даний документ шляхом посилання. В ім еї а!., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 93:8618-8623 (1996), описані АОС, що містять майтанзиноїд, позначений як ОМ'І, зв'язаний з моноклональним антитілом С242, спрямованим проти раку ободової і прямої кишки людини.
Було виявлено, що кон'югат є досить цитотоксичним по відношенню до культивованих ракових клітин товстої кишки і демонструє протипухлинну активність в аналізі росту пухлини іп мімо.
У Спагі еї аІ., Сапсег Кезеагсп 52:127-131 (1992) описані АОС, у яких майтанзиноїд був кон'югований за допомогою дисульфідного лінкеру з мишиним антитілом А7, що зв'язується з антигеном у лініях ракових клітин товстої кишки, або з іншим мишиним моноклональним антитілом ТА. 1, що зв'язується з онкогеном НЕК-2/пеи. Цитотоксичність кон'югата ТА.1- майтанзиноїд досліджували іп міїго у лінії ракових клітин молочної залози людини З5К-ВВ-3, у якій експресується З х 105 поверхневих антигенів НЕК-2 на клітину. Кон'югований лікарський засіб досягав ступеня цитотоксичності, схожого з таким у вільного майтанзиноїдного лікарського засобу, який можна підвищити шляхом збільшення кількості молекул майтанзиноїдів на молекулу антитіла. Кон'югат А7-майтанзиноїд демонстрував низьку системну цитотоксичність у мишей.
Зо Ауристатини і доластатини
У деяких варіантах здійснення АОС містить антитіло до І У75, кон'юговане з доластатинами або пептидними аналогами долостатинів і їхніми похідними ауристатинами (патенти США МоМо 5635483; 5780588). Було показано, що доластатини і ауристатини порушують динамічні властивості мікротрубочок, гідроліз ГТФ і поділ ядра і клітини (УусуКе еї аї. (2001) Апійтісгоб.
Адепіз апа Спетоїнег. 45(12):3580-3584) і мають протиракову (патент США Мо 5663149) і протигрибкову активність (Рені еї аї. (1998) Апійтісгоб. Адепі5 Спетоїйег. 42:2961-2965).
Компонент-лікарський засіб доластатин або ауристатин може бути приєднаний до антитіла через М-кінець (аміно-) або С-кінець (карбоксильний) пептидного компонента-лікарського засобу (МО 02/088172).
Ілюстративні варіанти здійснення ауристатину включають зв'язані через М-кінець монометилауристатинові компоненти-лікарські засоби ОЕ і ОР, розкриті у бепіег еї аї,
Ргосеєдіпдв ої Ше Атегісап Авзосіайоп ог Сапсег Везеагсі, Моїште 45, Арвігасі Митбег 623, опублікованому 28 березня 2004 р., і описані у публікації заявки на патент США Мо 2005/0238648, розкриття якої явним чином включене шляхом посилання у всій своїй повноті.
Ілюстративний варіант здійснення ауристатину являє собою ММАЕ (показаний на фігурі 10, де хвиляста лінія вказує на ковалентне приєднання до лінкеру (І) кон'югата антитіло-лікарський засіб; див. патент США Мо 6884869, явним чином включений шляхом посилання у всій своїй повноті).
Інший ілюстративний варіант здійснення ауристатину являє собою ММАРЕ, показаний на фігурі 10, де хвиляста лінія вказує на ковалентне приєднання до лінкеру (І) кон'югата антитіло- лікарський засіб (005 2005/0238649, 5767237 і 6124431, явним чином включені шляхом посилання у всій своїй повноті).
Додаткові ілюстративні варіанти здійснення, що містять ММАЕ або ММАБЕ і різні лінкерні складові (додатково описані у даному документі), мають наступні структури і скорочення (де АБ означає антитіло, а р дорівнює від 1 до приблизно 8).
Зазвичай пептидні компоненти-лікарські засоби можна одержувати шляхом утворення пептидного зв'язку між двома або більше амінокислотами і/або фрагментами пептидів. Такі пептидні зв'язки можна одержувати, наприклад, згідно зі способом рідкофазового синтезу (див.
Е. Зспгодег апа К. І ибКе, "Тпе Реріїдев5", моїште 1, рр. 76-136, 1965, Асадетіс Ргез5), добре бо відомим у галузі хімії пептидів. Ауристатинові/доластатинові компоненти-лікарські засоби можна одержувати згідно зі способами з патенту США Мо 5635483; патенту США Мо 5780588; Реції єї аї. (1989) У. Ат. Спет. бос. 111:5463-5465; Рецйії єї а!. (1998) Апії-Сапсег Огид Оевзідп 13:243-277;
Ренії, са. В., єї аі. З5упіпевів, 1996, 719-725; Ренції вї а. (1996) У. Снет. бос. Рекіп Тгапв. 1 5:859- 863 і Оогопіпа (2003) Маї Віоїтесппої 21(7)778-784.
Каліхеаміцин
В інших варіантах здійснення АЮС містить антитіло за даним винаходом, кон'юговане з однією або більше молекулами каліхеаміцину. Наприклад, мілотарг є першим комерційним лікарським засобом за типом АОС, і як навантаження у ньому використовується каліхеаміцин у1 (див. патент США Мо 4970198, включений шляхом посилання у всій своїй повноті). Додаткові похідні каліхеаміцину описані у патентах США МоМо 5264586, 5384412, 5550246, 5739116, 5773001, 5767285 і 5877296, всі з яких явним чином включені шляхом посилання. Антибіотики родини каліхеаміцинів здатні викликати двониткові розриви ДНК у субпікомолярних концентраціях. Стосовно одержання кон'югатів родини каліхеаміцинів див. патенти США МоМо 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (всі з яких належать компанії Атегісап Суапатійд). Структурні аналоги каліхеаміцину, які можна застосовувати, включають, без обмежень, у, а21І, «2І, М-ацетил-уї1І, РАС і 8611 (Ніптап еї аі!., Сапсег Кезеагсп 53:3336-3342 (1993), І оде єї а!Ї., Сапсег Везєагси 58:2925-2928 (1998) і вищезгадані патенти
США Атегісап Суапатід). Іншим протипухлинним лікарським засобом, з яким може бути кон'юговано антитіло, є ОБРА, який являє собою антифолат. Як каліхеаміцин, так ії ОБА мають внутрішньоклітинні місця прикладення дії і з труднощами перетинають плазматичну мембрану.
Тому поглинання клітинами цих засобів шляхом опосередкованої антитілами інтерналізації значно підсилює їхні цитотоксичні ефекти.
Дуокарміцини
СО-1065 (див. 4169888, включений шляхом посилання) і дуокарміцини є представниками родини протипухлинних антибіотиків, використовуваних у АЮС. Ці антибіотики, певно, діють шляхом вибіркового за послідовністю алкілування ДНК у М3З аденіну у малій борозенці, що ініціює каскад подій, що призводить до апоптозу.
Важливі представники дуокарміцинів включають дуокарміцин А (патент США Мо 4923990, включений шляхом посилання) і дуокарміцин ЗА (патент США Мо 5101038, включений шляхом посилання), а також велика кількість аналогів, описаних у патентах США МоМо 7517903, 7691962, 5101038; 5641780; 5187186; 5070092; 5070092; 5641780; 5101038; 5084468, 5475092, 5585499, 5846545, МО 2007/089149, МО 2009/017394 Ат, 5703080, 6989452, 7087600, 7129261, 7498302 і 7507420, всі з яких явним чином включені шляхом посилання.
Піролобензодіазепіни
Піролобензодіазепіни (РВО) (дошигпаї ої Медісіпа! Спетівігу 2001, 44, 737-748) є засобами, які взаємодіють з ДНК, які мають значну цитотоксичність. Було виділено тринадцять структур з цієї родини, у тому числі такі сполуки, як антраміцин, мазетраміцин, поротраміцин, протракарцин, сибаноміцин, томаїміцин, сибіроміцин, хікаміцин А, неотраміцин А, В ї ОС-81 (Медісіпаї!
Спетівзігу апа Огид Оеєвзідп, ІБВМ: 978-953-51-0513-8, Антей Катаї еї аІ. БОЇ: 10.5772/38869).
Інші аналоги з цієї родини були одержані і були кон'юговані з антитілами, як описано у патентах
МоМо УМО 2011/130598 і УМО 2011/130616, явним чином включених шляхом посилання.
Інші цитотоксичні засоби
Інші протипухлинні засоби, які можуть бути кон'юговані з антитілами за даним винаходом, включають ВСМИ, стрептозоцин, вінкристин і 5-фторурацил, родину засобів, відомих під загальною назвою "комплекс ГГ -Е33288", описану у патентах США МоМо 5053394, 5770710, а також еспераміцини (патент США Мо 5877296).
Ферментативно активні токсини і їхні фрагменти, які можна застосовувати, включають А- ланцюг дифтерійного токсину, незв'язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг екзотоксину А (з Рзейдотопа5 аегидіпоза), А-ланцюг рицину, А-ланцюг абрину, А-ланцюг
БО модесину, альфа-сарцин, білки АїІеигіез гогаї, діантинові білки, білки Рпушїаса атегісапа (РАРІ,
РАРІЇ ї РАР-5), інгібітор з Мотогаїса спагапійа, курцин, кротин, інгібітор з Заропагіа ойісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трихотецени. Див., наприклад, УУМО 93/21232, опубліковану 28 жовтня 1993 р.
Даний винахід додатково передбачає АЮС, що утворюється між антитілом і сполукою з нуклеолітичною активністю (наприклад, рибонуклеазою або ДНК-ендонуклеазою, такою як дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).
Для вибіркового руйнування пухлини антитіло може містити високорадіоактивний атом. Для одержання радіокон'юЮюгованих антитіл доступний ряд радіоактивних ізотопів. Приклади включають Аї211, 1131, 1125, 90, Ке186, Ке188, Зт153, Ві212, РЗ32, РЬ212 і радіоактивні ізотопи бо и.
Радіоактивні або інші мітки можуть бути включені у склад кон'югата відомими способами.
Наприклад, пептид можна одержувати шляхом біосинтезу або можна синтезувати шляхом хімічного синтезу амінокислот із застосуванням підходящих попередників амінокислот, що містять, наприклад, фтор-19 замість водню. Мітки, такі як Тс99т або 1123, Ке186, Ке188 і Іп111, можуть бути приєднані шляхом цистеїнового залишку у пептиді. Ітрій-90 можна приєднати шляхом лізинового залишку. Спосіб з використанням йодогена (ЕгакКег еї аїІ. (1978) Віоспет.
Віорпуз. Нез. Соттип. 80: 49-57) можна застосовувати для включення йоду-123. У "Мопосіопаї!
Апііродієв іп Іттипозсіпіідгарпу" (СпазаІ, СЕС Ргез5 1989) детально описані інші способи.
Для композицій, що містять ряд антитіл, навантаження лікарським засобом представлене у вигляді р, середньої кількості молекул лікарського засобу на антитіло. Навантаження лікарським засобом може варіювати від ї до 20 молекул лікарського засобу (0) на антитіло. Середню кількість молекул лікарського засобу на антитіло у препараті, одержаному шляхом реакцій кон'югування, можна охарактеризувати за допомогою традиційних способів, таких як мас- спектроскопія, аналіз ЕГІЗА і НРІС. Також можна визначити кількісний розподіл кон'югатів антитіло-лікарський засіб за р.
У деяких випадках відділення, очищення однорідних кон'югатів антитіло-лікарський засіб, де р являє собою визначене значення, від кон'югатів антитіло-лікарський засіб з іншим навантаженням лікарським засобом і встановлення їхніх характеристик можна здійснювати за допомогою таких способів, як зворотно-фазова НРІС або електрофорез. В ілюстративних варіантах здійснення р дорівнює 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 або є їхнім дробом.
Одержання сполук-кон'югатів антитіло-лікарський засіб можна здійснювати згідно з будь- якою методикою, відомою фахівцю у даній галузі. Стисло говорячи, сполуки-кон'югати антитіло- лікарський засіб можуть містити антитіло до І У75 як структурну одиницю-антитіло, лікарський засіб і необов'язково лінкер, який з'єднує лікарський засіб і зв'язувальний засіб.
Ряд різних реакцій доступний для ковалентного приєднання лікарських засобів і/або лінкерів зі зв'язувальними засобами. Це можна здійснити шляхом реакції з амінокислотними залишками зв'язувального засобу, наприклад, молекули антитіла, що включають аміногрупи лізину, вільні групи карбонової кислоти глутамінової і аспарагінової кислот, сульфгідрильні групи цистеїну і різні компоненти ароматичних амінокислот. Широко застосовуваним неспецифічним способом
Зо ковалентного приєднання є карбодиімідна реакція зв'язування карбоксильної (або аміно-) групи сполуки з аміно- (або карбоксильними) групами антитіла. Додатково, біфункціональні засоби, такі як діальдегіди або імідоестери, застосовувалися для зв'язування аміногрупи сполуки з аміногрупами молекули антитіла.
Також для приєднання лікарських засобів до зв'язувальних засобів доступна реакція утворення основи Шиффа. Даний спосіб включає окиснення періодатом лікарського засобу, що містить гліколеві групи або гідроксигрупи, з утворенням, таким чином, альдегіду, який потім піддають реакції зі зв'язувальним засобом. Приєднання виникає шляхом утворення основи
Шиффа з аміногрупами зв'язувального засобу. Ізотіоціанати також можна застосовувати як засоби сполучення для ковалентного приєднання лікарських засобів до зв'язувальних засобів.
Інші методики відомі фахівцю у даній галузі і знаходяться у межах обсягу даного винаходу.
У деяких варіантах здійснення проміжну сполуку, що являє собою попередник лінкеру, піддають реакції з лікарським засобом у відповідних умовах. В інших варіантах здійснення застосовують реакційноздатні групи у лікарському засобі і/або проміжній сполуці. Продукт реакції між лікарським засобом і проміжною сполукою, або дериватизований лікарський засіб, потім піддають реакції з антитілом до І 75 за даним винаходом у відповідних умовах.
Буде зрозуміло, що у бажаній сполуці також можна здійснювати хімічні модифікації, щоб зробити реакції цієї сполуки більш придатними з метою одержання кон'югатів за даним винаходом. Наприклад, функціональну групу, наприклад, аміногрупу, гідроксильну або сульфгідрильну групу, можна приєднати до лікарського засобу у положенні, що здійснює мінімальний або допустимий ефект на активність або інші властивості лікарського засобу.
Лінкерні структурні одиниці
Як правило, сполуки-кон'югати антитіло-лікарський засіб містять лінкерну структурну одиницю між структурною одиницею-лікарським засобом і структурною одиницею-антитілом. У деяких варіантах здійснення лінкер розщеплюється у внутрішньоклітинних або позаклітинних умовах, так що при розщепленні лінкеру з антитіла вивільняється структурна одиниця- лікарський засіб у відповідне середовище. Наприклад, солідні пухлини, які секретують визначені протеази, можуть слугувати як цільові для лінкеру, що розщеплюється; в інших варіантах здійснення використовуються саме внутрішньоклітинні протеази. У ще декількох інших варіантах здійснення лінкерна структурна одиниця не є такою, що розщеплюється, і лікарський бо засіб вивільняється, наприклад, шляхом руйнування антитіл у лізосомах.
Зо
У деяких варіантах здійснення лінкер розщеплюється за допомогою розщеплювального засобу, присутнього у внутрішньоклітинному середовищі (наприклад, у лізосомі, або ендосомі, або у кавеолі). Лінкер може являти собою, наприклад, пептидильний лінкер, що розщеплюється під дією внутрішньоклітинного ферменту пептидази або протеази, у тому числі, без обмежень, лізосомальної або ендосомальної протеази. У деяких варіантах здійснення пептидильний лінкер має довжину щонайменше дві амінокислоти або має довжину щонайменше три амінокислоти або більше.
Розщеплювальні засоби можуть включати, без обмежень, катепсини В і О і плазмін, про всі з яких відомо, що вони гідролізують дипептидні похідні лікарських засобів, що призводить до вивільнення активного лікарського засобу всередині цільових клітин (див., наприклад,
МБиБромспікК апа УУаїКег, 1999, РІрапт. ТПнегарешісв 83:67-123). Пептидильні лінкери розщеплюються ферментами, присутніми у клітинах, які експресують І У75. Наприклад, можна застосовувати пептидильний лінкер, що розщеплюється тіол-залежною протеазою катепсином
В, що характеризується високим рівнем експресії у раковій тканині (наприклад, лінкер Рпе-їЇ еи або сіу-Ріе-І еи-СІу (ЗЕО ІЮ МО: Х)). Інші приклади таких лінкерів описані, наприклад, у патенті
США Мо 6214345, включеному у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті і у всіх відношеннях.
У деяких варіантах здійснення пептидильний лінкер, що розщеплюється внутрішньоклітинною протеазою, являє собою лінкер МаІ-Сй або лінкер РПе-Гув (див., наприклад, патент США Мо 6214345, у якому описаний синтез доксорубіцину за допомогою лінкеру Ма!-Сію.
В інших варіантах здійснення лінкер, що розщеплюється, є рН-чутливим, інакше кажучи, чутливим до гідролізу при визначених значеннях рН. Як правило, рН-чутливий лінкер гідролізується у кислих умовах. Наприклад, можна застосовувати кислотонестійкий лінкер, що гідролізується у лізосомі (наприклад, гідразон, семікарбазон, тіосемікарбазон, амід цис- аконітової кислоти, ортоестер, ацеталь, кеталь тощо). (Див., наприклад, патенти США МоМо 5122368; 5824805; 5622929; Вироміспік апа УаїКег, 1999, Рпапт. ТПнегарешісв 83:67-123; МемШе еї аї,, 1989, Віої. Спет. 264:14653-14661.) Такі лінкери є відносно стабільними в умовах нейтрального рН, як, наприклад, у крові, але є нестабільними при рН нижче 5,5 або 5,0,
Зо приблизному рН у лізосомі. У визначених варіантах здійснення лінкер, що гідролізується, являє собою тіоетерний лінкер (такий як, наприклад, тіоетер, приєднаний до терапевтичного засобу за допомогою ацилгідразонового зв'язку (див., наприклад, патент США Мо 5622929).
У ще декількох інших варіантах здійснення лінкер розщеплюється у відновлювальних умовах (наприклад, дисульфідний лінкер). З рівня техніки відомий ряд дисульфідних лінкерів, у тому числі, наприклад, тих, які можуть утворюватися із застосуванням 5АТА (М-сукцинімідил-5- ацетилтіоацетату), 5РОР (М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)упропіонату), 508 (М-сукцинімідил- 3-(2-піридилдитіо)бутирату) і ЗМРТ (М-сукцинімідилоксикарбоніл-альфа-метил-альфа-(2- піридилдитіо)толуолу), 5РОВ і ЗМРТ. (Див., наприклад, Погре еї аї., 1987, Сапсег Кев5. 47:5924- 5931; Мамлтгупслак еї аї., іп Іттипосопійдаїев: Апіїроду Сопійдаїез іп Радіоітадегу апа Тнегару ої Сапсег (С. М. Модеї ед., Охіога |). Ргез5, 1987. Див. також патент США Мо 4880935).
В інших варіантах здійснення лінкер являє собою малонатний лінкер (Чоппзоп еї аї., 1995,
Апіїсапсег Нез. 15:1387-93), малеіїмідобензоїльний лінкер (Іа еї аї., 1995, Віоога-Мед-Снет.
З(10): 1299-1304) або 3'-М-амідний аналог (І ам еї аї., 1995, Віоогау-Мед-Снет. 3(10): 1305-12).
У ще декількох інших варіантах здійснення лінкерна структурна одиниця не є такою, що розщеплюється, і лікарський засіб вивільняється шляхом руйнування антитіл. (Див. публікацію заявки на патент США Мо 2005/0238649, включену у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті і у всіх відношеннях).
У багатьох варіантах здійснення лінкер є таким, що сам розщеплюється. Використовуваний у даному документі термін "спейсер, що сам розщеплюється" стосується біфункціонального хімічного компонента, здатного до ковалентного з'єднання двох рознесених хімічних компонентів у стабільну молекулу з трьох частин. Він буде самовільно відділятися від другого хімічного компонента при розщепленні його зв'язку з першим компонентом. Див., наприклад,
МО 2007/059404 Аг, МО 06/110476 Аг, МО 05/112919 Аг, МО 2010/062171, МО 09/017394, МО 07/089149, УМО 07/018431, УМО 04/043493 і УМО 02/083180, які стосуються кон'югатів лікарський засіб-субстрат, що розщеплюється, де лікарський засіб і субстрат, що розщеплюється, необов'язково зв'язані за допомогою лінкеру, що сам розщеплюється, і всі з яких явним чином включені шляхом посилання.
Лінкер часто є практично нечутливим до дії позаклітинного середовища. Як використовується у даному документі, "практично нечутливий до дії позаклітинного бо середовища" стосовно лінкеру означає, що у зразку сполуки-кон'югата антитіло-лікарський засіб розщеплюється не більш ніж приблизно 20 95, 15 95, 10 95, 5 95, З 95 або не більш ніж приблизно 1 95 лінкерів, якщо сполука-кон'югат антитіло-лікарський засіб присутній у позаклітинному середовищі (наприклад, у плазмі крові).
Те, чи є лінкер практично нечутливим до дії позаклітинного середовища, можна визначити, наприклад, шляхом інкубування сполуки-кон'югата антитіло-лікарський засіб з плазмою крові протягом попередньо визначеного періоду часу (наприклад, 2, 4, 8, 16 або 24 годин) і наступної кількісної оцінки кількості вільного лікарського засобу, присутнього у плазмі крові.
В інших варіантах здійснення, які взаємно не виключають один одного, лінкер сприяє клітинній інтерналізації У визначених варіантах здійснення лінкер сприяє клітинній інтерналізації, будучи кон'югованим з терапевтичним засобом (інакше кажучи, у середовищі компонента лінкер-терапевтичний засіб сполуки-кон'югата антитіло-лікарський засіб, описаного у даному документі). У ще декількох варіантах здійснення лінкер сприяє клітинній інтерналізації, будучи кон'юЮюгованим як з ауристатиновою сполукою, так і з антитілами до ЇМ75 за даним винаходом.
Ряд ілюстративних лінкерів, які можна застосовувати у композиціях і способах за даним винаходом, описаний у УМО 2004/010957, публікації заявки на патент США Мо 2006/0074008, публікації заявки на патент США Мо 2005/0238649 і публікації заявки на патент США Мо 2006/0024317 (кожна з яких включена у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті і у всіх відношеннях).
Навантаження лікарським засобом
Навантаження лікарським засобом представлене у вигляді р і є середньою кількістю компонентів-лікарських засобів на антитіло у молекулі. Навантаження лікарським засобом ("р") може становити 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше компонентів (0) на антитіло, хоча часто середня кількість є дробовим числом або десятковим дробом. Зазвичай навантаження лікарським засобом від 1 до 4 є часто застосовуваним, і від 1 до 2 також є застосовуваним. АОС за даним винаходом включають групи антитіл, кон'югованих з рядом компонентів-лікарських засобів у кількості від 1 до 20, наприклад, 1-15, 1-10, 2-9, 3-8, 4- 7, 5-6. Середню кількість компонентів-лікарських засобів на антитіло у препаратах АОС, одержаних у результаті реакцій кон'югування, можна охарактеризувати за допомогою
Зо традиційних способів, таких як мас-спектроскопія і аналіз ЕГІЗА.
Також можна визначити кількісний розподіл АЮС за р. У деяких випадках відділення, очищення однорідних АОС, де р являє собою визначене значення, від АЮС з іншим навантаженням лікарським засобом і встановлення їхніх характеристик можна здійснювати за допомогою таких способів, як електрофорез.
Для деяких кон'югатів антитіло-лікарський засіб р може бути обмежено кількістю ділянок приєднання в антитілі. Наприклад, якщо приєднання виникає за тіольною групою цистеїну, як у вищеописаних ілюстративних варіантах здійснення, антитіло може мати тільки одну або декілька тіольних груп цистеїну або може мати тільки одну або декілька достатньо реакційноздатних тіольних груп, за допомогою яких може бути приєднаний лінкер. У визначених варіантах здійснення більш високе навантаження лікарським засобом, наприклад, р » 5, може викликати агрегацію, нерозчинність, токсичність визначених кон'югатів антитіло-лікарський засіб або втрату клітинної проникності для них. У визначених варіантах здійснення навантаження лікарським засобом для АОС за даним винаходом варіює у діапазоні від 1 до приблизно 8; від приблизно 2 до приблизно 6; від приблизно З до приблизно 5; від приблизно З до приблизно 4; від приблизно 3,1 до приблизно 3,9; від приблизно 3,2 до приблизно 3,8; від приблизно 3,2 до приблизно 3,7; від приблизно 3,2 до приблизно 3,6; від приблизно 3,3 до приблизно 3,8 або від приблизно 3,3 до приблизно 3,7. У дійсності було показано, що для визначених АОС оптимальний показник кількості компонентів-лікарських засобів на антитіло може становити менше 8 і може становити від приблизно 2 до приблизно 5. Див. 05 2005/0238649 А!1 (включений у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті).
У визначених варіантах здійснення у ході реакції кон'югування з антитілом кон'югують компоненти-лікарські засоби у кількості, меншій, ніж теоретичний максимум. Антитіло може містити, наприклад, лізинові залишки, які не реагують з проміжною сполукою лікарський засіб- лінкер або лінкерним реагентом, як обговорюється нижче. Антитіла зазвичай містять небагато вільних і реакційноздатних тіольних груп цистеїну, які можуть бути зв'язані з компонентом- лікарським засобом; у дійсності більшість тіольних груп цистеїнових залишків в антитілах існують як дисульфідні містки. У визначених варіантах здійснення антитіло можна відновити за допомогою відновлювача, такого як дитіотреїтол (ОТ) або трикарбонілетилфосфін (ТСЕР), в умовах часткового або повного відновлення з утворенням реакційноздатних тіольних груп бо цистеїну. У визначених варіантах здійснення антитіло піддають впливу денатуруючих умов з виявленням реакційноздатних нуклеофільних груп, таких як у лізині або цистеїні.
Навантаження (співвідношення лікарський засіб/антитіло) в АОС можна регулювати різними способами, наприклад, шляхом: () обмеження молярного надлишку проміжної сполуки лікарський засіб-лінкер або лінкерного реагенту порівняно з антитілом, (ії) обмеження тривалості або температури реакції кон'югування, (ії) застосування умов часткового або обмеженого відновлення для модифікації тіольних груп цистеїну, (їм) конструювання за допомогою рекомбінантних методик амінокислотної послідовності антитіла таким чином, щоб модифікувати кількість і положення цистеїнових залишків для регулювання кількості і/або положення приєднуваних компонентів лінкер-лікарський засіб (як, наприклад, у випадку тіо-Маб або тіо-Габ, одержуваних згідно з розкритим у даному документі і в УМО 2006/034488 (включеній у даний документ шляхом посилання у всій своїй повноті)).
Слід розуміти, що у випадку, якщо більш ніж одна нуклеофільна група реагує з проміжною сполукою лікарський засіб-лінкер або лінкерним реагентом, а потім з реагентом компонентом- лікарським засобом, то одержуваний продукт являє собою суміш сполук АОС з розподілом одного або більше компонентів-лікарських засобів, приєднаних до антитіла. У суміші можна розрахувати середню кількість лікарських засобів на антитіло за допомогою подвійного аналізу антитіл ЕГІЗА, специфічного для антитіла і специфічного для лікарського засобу. Окремі молекули АОС можна ідентифікувати у суміші за допомогою мас-спектроскопії і розділити за допомогою НРІ С, наприклад, хроматографії гідрофобних взаємодій.
У деяких варіантах здійснення однорідний АОС з єдиним значенням навантаження можна виділити з суміші кон'югатів за допомогою електрофорезу або хроматографії.
Способи визначення цитотоксичного ефекту АОС
Відомі способи визначення того, чи викликає лікарський засіб або кон'югат антитіло- лікарський засіб цитостатичний і/або цитотоксичний ефект по відношенню до клітини. Як правило, цитотоксичну або цитостатичну активність кон'югата антитіло-лікарський засіб можна виміряти шляхом здійснення впливу на клітини ссавців, які експресують цільовий білок, кон'югата антитіло-лікарський засіб у середовищі для культури клітин; культивування клітин протягом періоду від приблизно б годин до приблизно 5 днів і вимірювання життєздатності клітин. Клітинні аналізи іп мійго можна застосовувати для вимірювання життєздатності
Зо (проліферації), цитотоксичності й індукції апоптозу (активації каспаз) кон'югатом антитіло- лікарський засіб.
Для визначення того, чи викликає кон'югат антитіло-лікарський засіб цитостатичний ефект, можна застосовувати аналіз включення тимідину. Наприклад, ракові клітини, які експресують цільовий антиген при (щільності 5000 клітин/лунка в 9б-лункових планшетах, можна культивувати протягом періоду 72 годин і піддавати впливу 0,5 мкКі ЗН-тимідину протягом останніх 8 годин 72-годинного періоду. Включення ЗН-тимідину у клітини культури вимірюють у присутності і за відсутності кон'югата антитіло-лікарський засіб.
Для визначення цитотоксичності можна виміряти некроз або апоптоз (запрограмовану загибель клітин). Некроз зазвичай супроводжується підвищенням проникності плазматичної мембрани; набряком клітини і розривом плазматичної мембрани. Апоптоз зазвичай характеризується утворенням пузирів мембрани, конденсацією цитоплазми і активацією ендогенних ендонуклеаз. Визначення будь-якого з цих ефектів по відношенню до ракових клітин вказує на те, що кон'югат антитіло-лікарський засіб є застосовуваним у лікуванні форм раку.
Життєздатність клітин можна виміряти шляхом визначення у клітині поглинання барвника, такого як нейтральний червоний, трипановий синій або АГАМАК "М синій (див., наприклад, Раде еї а!., 1993, Іпіо. У. Опсоіоду 3:473-476). У такому аналізі клітини інкубують у середовищі, що містить барвник, клітини промивають, і барвник, що залишився, який відбиває поглинання клітинами барвника, вимірюють спектрофотометрично. Зв'язувальний з білками барвник сульфородамін В (ЗКВ) також можна застосовувати для вимірювання цитотоксичності (5Кепап еїаї., 1990, у. Маї). Сапсег Іпві. 82:1107-12).
В альтернативному випадку сіль тетразолію, таку як МТТ, застосовують у кількісному колориметричному аналізі виживання і проліферації клітин ссавців шляхом визначення живих, але не мертвих, клітин (див., наприклад, Мозтапп, 1983, 9. Іпптипої. Меїйоаз 65:55-63).
Апоптоз можна оцінити кількісним шляхом вимірювання, наприклад, фрагментації ДНК.
Доступні комерційно фотометричні способи кількісного визначення фрагментації ДНК іп міїго.
Приклади таких аналізів що включають ТИОМЕЇ (у якому виявляють включення мічених нуклеотидів у фрагментовану ДНК) і аналізи на основі ЕГІ5А, описані у Віоспетіса, 1999, по. 2, рр. 34-37 (Носпе Моїесшіаг Віоспетіса!5).
Апоптоз також можна визначити шляхом вимірювання морфологічних змін у клітині. бо Наприклад, як і у випадку некрозу, втрату цілісності плазматичної мембрани можна визначити шляхом вимірювання поглинання визначених барвників (наприклад, флуоресцентного барвника, такого як, наприклад, акридиновий жовтогарячий або бромід етидію). Спосіб вимірювання кількості апоптозних клітин був описаний у ЮикКе апа Сойеп, Сиггепі Ргоїосої5 іп
Іттипоїіоду (Соїїдап еї аї. едв., 1992, рр. 3.17.1-3.17.16). Також можна мітити клітини барвником для ДНК (наприклад, акридиновим жовтогарячим, бромідом етидію або йодидом пропідію) і спостерігати у клітинах конденсацію хроматину і його крайове розташування уздовж внутрішньої ядерної мембрани. Інші морфологічні зміни, які можна виміряти для визначення апоптозу, включають, наприклад, конденсацію цитоплазми, підвищене утворення пузирів мембрани і стиснення клітини.
Наявність апоптозних клітин можна виміряти як у закріпленому, так і в "плаваючому" компартментах культур. Наприклад, обидва компартменти можна зібрати шляхом вилучення надосадової рідини, трипсинізації закріплених клітин, об'єднання препаратів після етапу промивання шляхом центрифугування (наприклад, протягом 10 хвилин при 2000 об./хв.) і виявлення апоптозу (наприклад, шляхом вимірювання фрагментації ДНК). (Див., наприклад,
Ріагла єї а!., 1995, Сапсег Незеєагсп 55:3110-16).
Іп мімо ефект терапевтичної композиції антитіла до І 75 за даним винаходом можна оцінити у підходящій тваринній моделі. Наприклад, можна застосовувати ксеногенні моделі раку, де експлантати ракових пухлин або пасировані ксенотрансплантатні тканини вводять тваринам з послабленим імунітетом, таким як "голі" або які мають 5СІЮ миші (Кієїп еї аїЇ., 1997, Машге
Меадісіпе 3: 402-408). Ефективність можна виміряти за допомогою аналізів, у яких вимірюють інгібування утворення пухлини, регресії пухлини або метастазування тощо.
Терапевтичні композиції, застосовувані у практичному здійсненні вищеописаних способів, можна складати у фармацевтичні композиції, що містять носій, підходящий для бажаного способу доставки. Підходящі носії включають будь-який матеріал, який при об'єднанні з терапевтичною композицією зберігає протипухлинну функцію терапевтичної композиції і на який зазвичай не реагує імунна система пацієнта. Приклади включають, без обмежень, будь-який з ряду стандартних фармацевтичних носіїв, таких як стерильні забуферені фосфатом фізіологічні розчини, бактеріостатична вода тощо (див. у загальному плані Кептіпдіоп'є Ріпаптасешіісаї
Осієпсевз 16!" Еайоп, А. Озаї!., Ед., 1980).
Способи одержання антитіл за даним винаходом
У даному винаході додатково представлені способи одержання розкритих антитіл до І 75.
Ці способи охоплюють культивування клітини-хазяїна, що містить виділену(виділені) нуклеїнову(нуклеїнові) кислоту(кислоти), які кодують антитіла за даним винаходом. Як буде зрозуміло фахівцям у даній галузі, це можна виконувати рядом способів залежно від природи антитіла. У деяких варіантах здійснення у тому випадку, коли антитіла за даним винаходом являють собою традиційні антитіла повної довжини, наприклад, варіабельна область важкого ланцюга і варіабельна область легкого ланцюга знаходяться у таких умовах, що антитіло утворюється і може бути виділено.
Варіабельні ділянки важких і легких ланцюгів ЇМ75 Аї розкриті у даному документі (послідовності як білка, так і нуклеїнової кислоти); як буде зрозуміло у даній галузі, їх можна легко збільшувати з одержанням важких і легких ланцюгів повної довжини. Інакше кажучи, за наявності фрагментів ДНК, які кодують МУн- і Мк-сегменти, стисло описані у даному документі, ці фрагменти ДНК можна піддати додатковим маніпуляціям за допомогою стандартних методик рекомбінантних ДНК, наприклад, для перетворення генів варіабельних областей у гени ланцюгів антитіл повної довжини, у гени Габ-фрагментів або у ген 5сЕм. У ході цих маніпуляцій утворюють функціональний зв'язок фрагмента ДНК, який кодує Мк або Мн, з іншим фрагментом
ДНК, який кодує інший білок, такий як константна область антитіла або гнучкий лінкер. Термін "функціонально зв'язаний", як використовується у даному контексті, мається на увазі як такий, що означає, що два фрагменти ДНК з'єднані таким чином, що амінокислотні послідовності, які кодуються двома фрагментами ДНК, залишаються всередині рамки зчитування.
Виділену ДНК, яка кодує Мн-область, можна перетворити у ген важкого ланцюга повної довжини шляхом утворення функціонального зв'язку ДНК, яка кодує Мн, з іншою молекулою
ДНК, яка кодує константні області важкого ланцюга (Сні, Сн2 і Сн3). Послідовності генів мишиних константних областей важких ланцюгів відомі з рівня техніки (див., наприклад, Кабаї,
Е. А., єї аї. (1991) Зедиепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, ГИ Еайіоп, 05 Оерапйтепі ої
Неайй апа Нитап 5бегмісе5, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242), і фрагменти ДНК, які охоплюють ці області, можна одержувати шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації.
Константна область важкого ланцюга може являти собою константну область Ідс1, Ідсг2,
ІЧО3, Ідс4, ІдДА, ЧЕ, І9М або дО, але найбільш переважно являє собою константну область бо ІС91 або Ід054. У випадку гена важкого ланцюга ЕРаб-фрагмента можна утворювати функціональний зв'язок ДНК, яка кодує Мн, з іншою молекулою ДНК, яка кодує тільки константну область Сні важкого ланцюга.
Виділену ДНК, яка кодує МІ ЛУ/К-область, можна перетворити у ген легкого ланцюга повної довжини (а також ген легкого ланцюга Раб) шляхом утворення функціонального зв'язку ДНК, яка кодує Мі, з іншою молекулою ДНК, яка кодує константну область легкого ланцюга Сі.
Послідовності генів мишиних константних областей легких ланцюгів відомі з рівня техніки Ідив., наприклад, КарБбаї, Е. А., еї а. (1991) Зедиепсез ої Ргоїеіп5 ої Іттипоїодісаї Іпсегеві, Гійп Еайіоп, 5 Оерайтетпі ої Неайй апа Нитап 5егмісе5, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-32421, і фрагменти ДНК, які охоплюють ці області, можна одержувати шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. У переважних варіантах здійснення константна область легкого ланцюга може являти собою константну область каппа- або лямбда-ланцюга.
Для одержання гена 5сЕм утворюють функціональний зв'язок фрагментів ДНК, які кодують
Мн- і Мі/Ук, з іншим фрагментом, який кодує гнучкий лінкер, наприклад, який кодує амінокислотну послідовність (СіІу«-5ег)з, так що послідовності Мн і М/Мк можуть експресуватися у вигляді безперервного одноланцюгового білка, при цьому Мі//Мк- і Мн-області з'єднані гнучким лінкером |Ідив., наприклад, Віга еї аї. (1988) 5сіепсе 242:423- 426; Нивюп еї а!. (1988) Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. ОБА 85:5879-5883; МсСанепу вї а!., (1990) Майшге 348:552-554).
Зазвичай представлені нуклеїнові кислоти, які кодують антитіла за даним винаходом. Такі полінуклеотиди кодують як варіабельні, так і константні області кожного з важкого і легкого ланцюгів, хоча інші комбінації також передбачені даним винаходом згідно з композиціями, описаними у даному документі. Даний винахід також передбачає олігонуклеотидні фрагменти, одержані з розкритих полінуклеотидів і послідовностей нуклеїнових кислот, комплементарних цим полінуклеотидам.
Полінуклеотиди можуть знаходитися у формі РНК або ДНК. Полінуклеотиди у формі ДНК,
КДНК, геномної ДНК, аналогів нуклеїнових кислот і синтетичних ДНК знаходяться у межах обсягу даного винаходу. ДНК може бути двонитковою або однонитковою, і у випадку однониткової може являти собою кодуючу (смислову) нитку або некодуючу (антисмислову) нитку. Кодуюча послідовність, яка кодує поліпептид, може бути ідентична кодуючій послідовності, представленій у даному документі або може бути іншою кодуючою послідовністю, чия послідовність внаслідок надлишковості або виродженості генетичного коду кодує ті ж поліпептиди, що і ДНК, представлена у даному документі.
У деяких варіантах здійснення нуклеїнова(нуклеїнові) кислота(кислоти), які кодують антитіла за даним винаходом, включені у склад векторів експресії, які можуть бути позахромосомними або призначеними для інтегрування у геном клітини-хазяїна, у яку їх вводять. Вектори експресії можуть містити будь-яку кількість відповідних регуляторних послідовностей (що включають, без обмежень, послідовності для контролю транскрипції і трансляції, промотори, сайти зв'язування рибосоми, енхансери, точки початку реплікації тощо) або інші компоненти (селектовані гени тощо), всі з яких функціонально зв'язані, як добре відомо з рівня техніки. У деяких випадках застосовують дві нуклеїнові кислоти, і кожну поміщають в окремий вектор експресії (наприклад, важкий ланцюг у перший вектор експресії, легсий ланцюг у другий вектор експресії) або, в альтернативному випадку, їх можна помістити в один і той же вектор експресії. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що конструкція вектора(векторів) експресії, у тому числі вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна, бажаний рівень експресії білка тощо.
Нуклеїнові кислоти і/або системи експресії зазвичай можна вводити у підходящу клітину- хазяїна з одержанням рекомбінантної клітини-хазяїна за допомогою будь-якого способу, підходящого для вибраної клітини-хазяїна (наприклад, трансформації, трансфекції, електропорації, інфікування), таким чином, що молекула(молекули) нуклеїнової кислоти функціонально зв'язані з одним або більше елементами контролю експресії (наприклад, у векторі, у конструкті, одержаному за допомогою процесів у клітині, інтегрованому у геном клітини-хазяїна). Одержану у результаті рекомбінантну клітину-хазяїна можна витримувати в умовах, підходящих для експресії (наприклад, у присутності індуктора, у підходящій відмінній від людини тварині, у підходящому культуральному середовищі, доповненому відповідними солями, карбодиімідами росту, антибіотиками, харчовими добавками тощо), у результаті чого утворюються кодований(кодовані) поліпептид(поліпептиди). У деяких випадках важкі ланцюги утворюються в одній клітині, а легкі ланцюги - в іншій.
Лінії клітин ссавців, доступних як хазяїв для експресії, відомі з рівня техніки і включають велику кількість імморталізованих ліній клітин, доступних з Американської колекції типових культур (АТСС), Манассас, Вірджинія, у тому числі, без обмежень, клітини яєчника китайського 60 хом'яка (СНО), клітини НЕК293, клітини МО, клітини НегГа, клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК), клітини нирки мавпи (СО5), клітини гепатоцелюлярної карциноми людини (наприклад, Нер 02) і ряд інших ліній клітин. Клітини, відмінні від клітин ссавців, що включають, без обмежень, клітини бактерій, дріжджів, комах і рослин, також можна застосовувати для експресії рекомбінантних антитіл. У деяких варіантах здійснення антитіла можна одержувати у трансгенних тварин, таких як корови або курки.
Загальні способи молекулярної біології, експресії, очищення і скринінгу антитіл добре відомі, див., наприклад, патенти США МоМо 4816567, 4816397, 6331415 і 7923221, а також Апіїбоду
Епдіпеегіпд під редакцією Копіепгтапп 5 Юибеї, Зргіпдег, НеїдеІрего, 2001 ї 2010, Наупигвї 8
Сьеогдіоц, 2001, СитОріп Снет Віої! 5:683-689; Маупага 4. Сеогдіом, 2000, Аппи Вем Віотеєд Епд 2:339-76; і Моіїтізоп, 5. (1985) 5сіепсе 229:1202.
Фармацевтичні композиції
В іншому аспекті у даному винаході представлена композиція, наприклад, фармацевтична композиція, що містить одне або комбінацію з антитіл до І У75 або їхніх антигензв'язувальних частин за даним винаходом, складені разом з фармацевтично прийнятним носієм. Такі композиції можуть містити одне або комбінацію з (наприклад, два або більше різних) антитіл, або імунокон'югатів, або біспецифічних молекул за даним винаходом. Наприклад, фармацевтична композиція за даним винаходом може містити комбінацію антитіл (або імунокон'югатів, або біспецифічних молекул), які зв'язуються з різними епітопами на цільовому антигені або які мають взаємодоповнюючі види активності.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом також можна вводити у ході комбінованої терапії, тобто у комбінації з іншими засобами. Наприклад, комбінована терапія може передбачати антитіло за даним винаходом у комбінації щонайменше з одним іншим протипухлинним засобом або протизапальним або імунодепресивним засобом. Приклади терапевтичних засобів, які можна застосовувати у комбінованій терапії, більш детально описані нижче у розділі, що стосується шляхів застосування антитіл за даним винаходом.
Як використовується у даному документі, "фармацевтично прийнятний носій" включає будь- які можливі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні засоби і засоби, що сповільнюють всмоктування тощо, які є фізіологічно сумісними. Носій переважно підходить для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спінального або епідермального введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). Залежно від шляху введення активна сполука, тобто антитіло, імунокон'югат або біспецифічна молекула, можуть бути покриті матеріалом для захисту сполуки від дії кислот і інших природних умов, які можуть інактивувати сполуку.
Фармацевтичні сполуки за даним винаходом можуть включать у себе одну або більше фармацевтично прийнятних солей. "Фармацевтично прийнятна сіль" стосується солі, яка зберігає бажану біологічну активність вихідної сполуки і не викликає ніяких небажаних токсичних ефектів І(див., наприклад, Вегде, 5.М., еї аї. (1977) 9. Ріагт. бсі. 66:1-19). Приклади таких солей включають солі приєднання кислоти і солі приєднання основи. Солі приєднання кислоти включають солі, одержані з нетоксичних неорганічних кислот, таких як хлористоводнева, азотна, фосфорна, сірчана, бромистоводнева, йодистоводнева, фосфориста тощо, а також з нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, фенілзаміщені алканові кислоти, гідроксіалканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні й ароматичні сульфонові кислоти тощо. Солі приєднання основи включають солі, одержані з лужноземельних металів, таких як натрій, калій, магній, кальцій тощо, а також з нетоксичних органічних амінів, таких як М,М'-дибензилетилендіамін, М-метилглюкамін, хлорпрокаїн, холін, діетаноламін, етилендіамін, прокаїн тощо.
Фармацевтична композиція за даним винаходом також може містити фармацевтично прийнятний антиоксидант. Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію тощо; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксіанізол (ВНА), бутильований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол тощо; і (3) засоби, які хелатують метали, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота тощо.
Приклади підходящих водних і неводних носіїв, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях за даним винаходом, включають воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь тощо) і їхні підходящі суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і ін'єкційні органічні естери, такі як етилолеат. Відповідну текучість можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування матеріалів покриття, таких як лецитин, шляхом бо підтримування потрібного розміру частинок у випадку дисперсій і шляхом застосування поверхнево-активних речовин.
Ці композиції також можуть містити допоміжні засоби, такі як консерванти, змочувальні засоби, емульгатори і диспергатори. Попередження наявності мікроорганізмів можна забезпечувати як за допомогою процедур стерилізації, описаних вище, так і шляхом включення різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти тощо. Також може бути бажаним включення у композиції ізотонічних засобів, таких як цукри, хлорид натрію тощо. На додаток, пролонгованого всмоктування ін'єкційної фармацевтичної форми можна досягти шляхом включення засобів, які сповільнюють всмоктування, таких як моностеарат алюмінію і желатин.
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії та стерильні порошки для одержання стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій для негайного прийому. Застосування таких середовищ та засобів для фармацевтично активних речовин відомо з рівня техніки. За винятком випадків, коли які-небудь традиційні середовища або засоби несумісні з активною сполукою, передбачається їхнє застосування у фармацевтичних композиціях за даним винаходом. У склад композицій також можуть бути включені додаткові активні сполуки.
Терапевтичні композиції, як правило, повинні бути стерильними і стабильними в умовах виробництва і зберігання. Композицію можна скласти у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, підходящої для високої концентрації лікарського засобу.
Носій може являти собою розчинник або дисперсійне середовище, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь тощо) і їхні підходящі суміші. Відповідну текучість можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування покриття, такого як лецитин, шляхом підтримування потрібного розміру частинок у випадку дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках буде переважним включення у композицію ізотонічних засобів, наприклад, цукрів, багатоатомних спиртів, таких як маніт, сорбіт, або хлориду натрію. Пролонгованого всмоктування ін'єкційних композицій можна досягти шляхом включення у композицію засобу, який сповільнює всмоктування, наприклад, моностеаратних солей і желатину.
Стерильні ін'єкційні розчини можна одержувати шляхом включення активної сполуки у необхідній кількості у відповідному розчиннику з одним або комбінацією з інгредієнтів, перерахованих вище, при необхідності, з наступною стерилізаційною мікрофільтрацією.
Дисперсії як правило, одержують шляхом включення активної сполуки у стерильний наповнювач, що містить основне дисперсійне середовище й інші необхідні інгредієнти з перерахованих вище. У випадку стерильних порошків для одержання стерильних ін'єкційних розчинів переважними способами одержання є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), за допомогою яких одержують порошкову форму активного інгредієнта, а також будь-якого додаткового бажаного інгредієнта з їхнього розчину, раніше підданого стерилізуючій фільтрації.
Кількість активного інгредієнта, яку можна об'єднати з матеріалом носія з одержанням одиничної лікарської форми, буде варіювати залежно від суб'єкта, якого піддають лікуванню, і конкретного способу введення. Кількість активного інгредієнта, яку можна об'єднати з матеріалом носія з одержанням одиничної лікарської форми, як правило, буде являти собою таку кількість композиції, яка викликає терапевтичний ефект. Зі 100 відсотків ця кількість зазвичай буде варіювати у діапазоні від приблизно 0,01 відсотка до приблизно 99 відсотків активного інгредієнта, переважно від приблизно 0,1 відсотка до приблизно 70 відсотків, найбільш переважно від приблизно 1 відсотка до приблизно 30 відсотків активного інгредієнта у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм.
Режими дозування коректують для одержання оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити одноразову болюсну дозу, можна вводити декілька розділених доз протягом деякого часу, або дозу можна пропорційно знизити або підвищити, на що вказують потреби терапевтичної ситуації. Особливо переважним є складання парентеральних композицій у стандартній лікарській формі для простоти введення і рівномірності дозування. Стандартна лікарська форма, як використовується у даному документі, стосується фізично дискретних одиниць, підходящих як одноразові дози для суб'єктів, яких піддають лікуванню; кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активної сполуки, розраховану для одержання бажаного терапевтичного ефекту, спільно з необхідним фармацевтичним носієм. Технічні вимоги до стандартних лікарських форм за даним винаходом обумовлені (а) унікальними характеристиками активної сполуки і конкретним терапевтичним ефектом, якого слід дося!ти, і (б) властивими обмеженнями у галузі приготування такої активної 60 сполуки по відношенню до лікування індивідуумів з чутливістю, і безпосередньо залежать від них.
Для введення антитіла доза варіює у діапазоні від приблизно 0,0001 до 100 мг/кг, наприклад, від 0,001 до 50 мг/кг, від 0,005 до 20 мг/кг, від 0,01 до 10 мг/кг і частіше від 0,01 до 5 мг/кг маси тіла реципієнта. Наприклад, дози можуть становити 0,05 мг/кг маси тіла, 0,1 мг/кг маси тіла, 0,3 мг/кг маси тіла, 0,3 мг/кг маси тіла, 0,5 мг/кг маси тіла, 1 мг/кг маси тіла, 2 мг/кг маси тіла, З мг/кг маси тіла, 4 мг/кг маси тіла, 5 мг/кг маси тіла, 6 мг/кг маси тіла, 7 мг/кг маси тіла, 8 мг/кг маси тіла, 9 мг/кг маси тіла, 10 мг/кг маси тіла, 12 мг/кг маси тіла, 15 мг/кг маси тіла, 20 мг/кг маси тіла, 25 мг/кг маси тіла, 30 мг/кг маси тіла або знаходитися у діапазоні 0,1-20 мг/кг, 0,5-15 мг/кг, 1-10 мг/кг, 2-8 мг/кг, 3-7 мг/кг, 4-6 мг/кг. Ілюстративний режим лікування включає у себе введення один раз на день, один раз у 2 дні, один раз на тиждень, один раз у два тижні, один раз у три тижні, один раз у чотири тижні, один раз на місяць, один раз у 6 тижнів, один раз у З місяці або один раз у три-6 місяців. Переважні режими дозування антитіла до І 75 за даним винаходом включають 1 мг/кг маси тіла або З мг/кг маси тіла за допомогою внутрішньовенного введення, при цьому антитіло приймають з використанням однієї з таких схем дозування: (Її) кожні чотири тижні для шести доз, потім кожні три місяці; (ії) кожні три тижні; (ії) З мг/кг маси тіла одноразово, а потім 1 мг/кг маси тіла кожні три тижні.
У деяких способах одночасно вводять два або більше моноклональних антитіла з різними специфічностями зв'язування, і у цьому випадку доза кожного введеного антитіла входить у вказані діапазони. Антитіло зазвичай вводять декілька разів. Інтервали між прийомами окремих доз можуть відповідати, наприклад, введенню раз у день, два рази на тиждень, раз на тиждень, раз на місяць, кожні три місяці, кожні шість місяців або один раз на рік. Інтервали можуть бути нерегулярними, на що вказує вимірювання рівнів антитіла до цільового антигену у крові пацієнта. У деяких способах дозу коригують для досягнення концентрації антитіла у плазмі крові, що становить приблизно 1-1000 мкг/мл, 5-750 мкг/мл, 10-600 мкг/мл, 15-500 мкг/мл, 20-400 мкг/мл і у деяких способах приблизно 25-300 мкг/мл.
В альтернативному випадку антитіло можна вводити як склад зі сповільненим вивільненням, і у цьому випадку потрібно менш часте введення. Доза і частота варіюють залежно від періоду напіввиведення антитіла з організму пацієнта. Як правило, найбільш тривалий період напіввиведення демонструють антитіла людини, за якими слідують гуманізовані антитіла, химерні антитіла і антитіла, відмінні від людських. Доза і частота введення може варіювати залежно від того, чи лікування є профілактичним або терапевтичним. У профілактичних шляхах застосування відносно низьку дозу вводять з відносно нечастими інтервалами протягом тривалого періоду часу. Деякі пацієнти продовжують одержувати лікування до кінця свого життя.
У терапевтичних шляхах застосування іноді потрібно введення відносно високих доз з відносно короткими інтервалами до зменшення або припинення прогресування захворювання і переважно до тих пір, поки пацієнт не продемонструє часткового або повного зменшення інтенсивності симптомів захворювання. Після цього у відношенні пацієнта можна застосовувати профілактичний режим.
Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях за даним винаходом можна змінювати для того, щоб одержати кількість активного інгредієнта, ефективну для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретних пацієнта, композиції та способу введення без токсичності для пацієнта. Вибраний рівень дози буде залежати від ряду фармакокінетичних факторів, що включають активність конкретних використовуваних композицій за даним винаходом або їхніх естеру, солі або аміду, шляху введення, часу введення, швидкості екскреції конкретної використовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук та/або матеріалів, застосовуваних у комбінації з конкретними використовуваними композиціями, віку, статі, маси, стану, загального стану здоров'я та анамнезу пацієнта, якого піддають лікуванню, і подібних факторів, добре відомих у галузі медицини. "Терапевтично ефективна доза" антитіла до ЇМ75 за даним винаходом переважно призводить до зменшення тяжкості симптомів захворювання, збільшення частоти і тривалості безсимптомних періодів захворювання або попередження погіршення стану або втрати працездатності у зв'язку з ураженням захворюванням. Наприклад, для лікування пухлин, опосередкованих І У75, "терапевтично ефективна доза" переважно інгібує ріст клітин або ріст пухлини щонайменше на приблизно 20 95, щонайменше на приблизно 30 95, більш переважно щонайменше на приблизно 40 956, щонайменше на приблизно 50 95, ще більш переважно щонайменше на приблизно 60 95, щонайменше на приблизно 70 95 і навіть ще більш переважно щонайменше на приблизно 80 95 або щонайменше приблизно на 90 95 порівняно зі суб'єктами, які не одержували лікування. Здатність сполуки до інгібування росту пухлини можна оцінити у бо тваринній модельній системі, що пророкує ефективність по відношенню до пухлин людини. В альтернативному випадку дану властивість композиції можна оцінити шляхом вивчення здатності сполуки до інгібування росту клітин, при цьому таке інгібування можна виміряти іп міго за допомогою аналізів, відомих практикуючому фахівцю. Терапевтично ефективна кількість терапевтичної сполуки може забезпечувати зменшення розміру пухлини або іншим чином зменшувати інтенсивність симптомів у суб'єкта. Середній фахівець у даній галузі буде здатний визначити такі кількості на основі таких факторів, як габарити суб'єкта, тяжкість симптомів суб'єкта і конкретна композиція або вибраний шлях введення.
Композицію за даним винаходом можна вводити за допомогою одного або більше шляхів введення за допомогою одного або більше з ряду способів, відомих з рівня техніки. Як буде зрозуміло фахівцю у даній галузі, шлях і/або спосіб введення будуть варіювати залежно від бажаних результатів Переважні шляхи введення антитіл за даним винаходом включають внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньошкірний, внутрішньоочеревинний, підшкірний, спінальний або інші парентеральні шляхи введення, наприклад, за допомогою ін'єкції або інфузії. Фраза "парентеральне введення", як використовується у даному документі, означає способи введення, відмінні від ентерального та місцевого введення, зазвичай за допомогою ін'єкції і включає, без обмежень, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньокапсулярну, внутрішньоочну, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуглобову, субкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, епідуральну і внутрішньогрудну ін'єкцію й інфузію.
В альтернативному випадку антитіло за даним винаходом можна вводити за допомогою непарентерального шляху, такого як місцевий, епідермальний або черезслизовий шлях введення, наприклад, інтраназально, перорально, вагінально, ректально, сублінгвально або місцево.
Активні сполуки можна одержувати з носіями, які будуть захищати сполуку від швидкого вивільнення, як, наприклад, у складі з контрольованим вивільненням, у тому числі імплантатах, трансдермальних пластирах і мікроїнкапсульованих системах доставки. Можна застосовувати біосумісні полімери, які біорозкладаються, такі як сополімер етилену та вінілацетату, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоестери і полімолочна кислота. Багато
Зо способів одержання таких складів запатентовані або загальновідомі фахівцям у даній галузі
Ідив., наприклад, Зивіаіпеа апа Сопігоїїей Кеїеазе Огид Оеїїмегу Зубзіетв5 (1978) 9У.К. Кобіпзоп, ей., Магсеї! Оеккег, Іпс., М.М.
Терапевтичні композиції можна вводити за допомогою медичних пристроїв, відомих з рівня техніки. Наприклад, у переважному варіанті здійснення терапевтичну композицію за даним винаходом можна вводити за допомогою безголкового пристрою для підшкірних ін'єкцій, такого як пристрої, розкриті у патентах США МоМо 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 або 4596556. Приклади добре відомих імплантатів і модулів, застосовуваних у даному винаході, включають: придатну для імплантації мікроїінфузійну помпу для дозування ліків з контрольованою швидкістю, розкриту у патенті США Мо 4487603; терапевтичний пристрій для введення лікарських препаратів через шкіру, розкритий у патенті США Мо 4486194; помпу для інфузії ліків для доставки ліків з точною швидкістю інфузії, розкриту у патенті США Мо 4447233; придатний для імплантації інфузійний прилад зі змінним об'ємом подачі для безперервної доставки лікарського засобу, розкритий у патенті США Мо 4447224; осмотичну систему доставки лікарських засобів, яка має багатокамерні відділи, розкриту у патенті США Мо 4439196; і осмотичну систему доставки лікарських засобів, розкриту у патенті США Мо 4475196. Ці патенти включені у даний документ шляхом посилання. Фахівцям у даній галузі відомо багато інших таких імплантатів, систем доставки і модулів.
У визначених варіантах здійснення моноклональні антитіла за даним винаходом можна скласти для забезпечення належного розподілу іп мімо. Наприклад, гематоенцефалічний бар'єр (ВВВ) не пропускає багато високогідрофільних сполук. Для забезпечення перетинання ВВВ терапевтичними сполуками за даним винаходом (за бажанням) їх можна скласти, наприклад, у ліпосомах. Стосовно способів одержання ліпосом див., наприклад, патенти США 4522811; 5374548 і 5399331. Ліпосоми можуть містити один або більше компонентів, які вибірково транспортуються у конкретні клітини або органи, що, таким чином, підвищує якість цілеспрямованої доставки лікарських засобів див., наприклад, М.М. Кападе (1989) У. Сііп.
РПапгтасої. 29:685). Ілюстративні націлюючі компоненти включають фолат або біотин (див., наприклад, патент США 5416016); манозиди |Отеламжма еї аї. (1988) Віоспет. Віорпуб5. Кев.
Соттоп. 153:10381|; антитіла (Р.О. Віоетап еї аІ. (1995) РЕВЗ Гей. 357:140; М. Оулаї5 єї аї. (1995) Апійтісгоб. Адепі5 Спетоїпег. 39:1801); рецептор поверхнево-активного білка А |Вгізсоє єї 60 аІ. (1995) Ат. 9. Рпузіої. 1233:134); р120 |ЗсНгеїег еї аї. (1994) 3. ВіоЇ. Спет. 269:9090)|; див. також
К. Кеїпапеп; М.М. ІашкКапеп (1994) РЕВ5 Іей. 346123; 9.9. Кійоп; 1.3. Рідіеєг (1994)
Іттипотеїйнодвв 4:273.
Шляхи застосування і способи
Антитіла, композиції антитіл і способи за даним винаходом мають численні види діагностичної і терапевтичної корисності іп міїго та іп мімо, що включають діагностику і лікування порушень, опосередкованих І У75.
У деяких варіантах здійснення ці молекули можна вводити в клітини у культурі іп міго або ех мімо або суб'єктам-людям, наприклад, іп мімо, для лікування, попередження і діагностики ряду порушень. Як використовується у даному документі, термін "суб'єкт" розуміється як такий, що включає людину і відмінних від людини тварин. Відмінні від людини тварини включають всіх хребетних тварин, наприклад, ссавців і не ссавців, таких як відмінні від людини примати, вівці, собаки, кішки, корови, коні, курки, земноводні і плазуни. Переважні суб'єкти включають пацієнтів-людей, які мають порушення, опосередковані активністю І М75. Способи особливо підходять для лікування пацієнтів-людей, які мають порушення, асоційоване з аномальною експресією І У75. Якщо антитіла до ЇМ75 вводять разом з іншим засобом, то ці два засоби можна вводити у будь-якому порядку або одночасно.
З урахуванням специфічного зв'язування антитіл за даним винаходом з І У75 антитіла за даним винаходом можна застосовувати для специфічного виявлення експресії І У75 на поверхні клітин і, більш того, можна застосовувати для очищення І 75 шляхом імуноафінного очищення.
Крім того, з урахуванням експресії ГУ75 на пухлинних клітинах антитіла, композиції антитіл і способи за даним винаходом можна застосовувати для лікування суб'єкта з онкогенним порушенням, наприклад, порушенням, що характеризується наявністю пухлинних клітин, які експресують І У75, або у виробництві лікарського препарату для лікування такого порушення, що включає, наприклад, рак шлунка, рак нирки, рак щитоподібної залози, рак стравоходу, рак голови і шиї, рак шкіри, рак печінки, рак підшлункової залози, рак ободової і прямої кишки, рак сечового міхура, рак передміхурової залози, рак молочної залози, у тому числі тричі негативний рак молочної залози, рак яєчника, рак легені, мієлому, лейкоз, у том числі хронічний лімфоцитарний лейкоз і гострий мієлоїдний лейкоз, неходжкінську лімфому, у тому числі
РІ ВС, В-клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мантійноклітинну лімфому, лімфому з
Зо лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАТ), В-клітинну лімфому, збагачену Т- клітинами/гістіоцитами, лімфому Беркітта, лімфоплазмоцитарну лімфому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, лімфому з клітин маргінальної зони, Т-клітинну лімфому, периферійну
Т-клітинну лімфому, анапластичну великоклітинну лімфому і ангіоїмунобластну Т-клітинну лімфому. Було продемонстровано, що І У75 інтерналізується при зв'язуванні з антитілом, як проілюстровано у прикладах 5 і 7 нижче, що, таким чином, забезпечує застосування антитіл за даним винаходом у будь-якому механізмі дії з навантаженням, наприклад, у підході з АОС, у радіоїмунокон'югаті або у підході АОЕРТ.
В одному варіанті здійснення антитіла (наприклад, моноклональні антитіла, фрагменти антитіл, МапобродуФ, поліспецифічні і біспецифічні молекули і композиції тощо) за даним винаходом можна застосовувати для виявлення рівнів І 75 або рівнів клітин, які містять І У75 на поверхні своєї мембрани, для рівнів яких може бути потім встановлений зв'язок з визначеними симптомами захворювань. В альтернативному випадку антитіла, які зазвичай вводять у вигляді АОС, можна застосовувати для інгібування або блокування функції І 75, для якого, у свою чергу, може бути встановлений зв'язок з попередженням або зменшенням інтенсивності визначених симптомів захворювання, що, таким чином, має на увазі І М75 як медіатор захворювання. Цього можна досягти шляхом приведення зразка і контрольного зразка у контакт з антитілом до І У75 в умовах, які забезпечують утворення комплексу між антитілом і
ЇМ75. У зразку і контрольному зразку виявляють і порівнюють будь-які комплекси, які утворюються між антитілом і І 75.
В іншому варіанті здійснення антитіла (наприклад, моноклональні антитіла, поліспецифічні і біспецифічні молекули і композиції) за даним винаходом можна спочатку досліджувати по відношенню до активності зв'язування, пов'язаної з терапевтичним або діагностичним застосуванням іп міго. Наприклад, композиції за даним винаходом можна досліджувати із застосуванням аналізів за методом проточної цитометрії, описаних у прикладах нижче.
Антитіла (наприклад, моноклональні антитіла, поліспецифічні і біспецифічні молекули, імунокон'югати і композиції) за даним винаходом мають додаткову корисність у терапії і діагностиці захворювань, пов'язаних з ЇМ75. Наприклад, моноклональні антитіла, поліспецифічні або біспецифічні молекули і імунокон'югати можна застосовувати для того, щоб викликати іп мімо або іп міго один або більше з наступних видів біологічної активності: бо інгібування росту і/або знищення клітин, які експресують І У75; опосередкування фагоцитозу або АрСС клітин, які експресують ЇМ75, у присутності ефекторних клітин людини, або блокування зв'язування ліганду! 753175.
У конкретному варіанті здійснення антитіла (наприклад, моноклональні антитіла, поліспецифічні і біспецифічні молекули і композиції) застосовують іп мімо для лікування, попередження або діагностики ряду захворювань, пов'язаних з І У75. Приклади захворювань, пов'язаних з І У75, включають, серед інших, представлені раковими тканинами людини рак шлунка, рак ободової і прямої кишки, рак передміхурової залози, рак молочної залози, рак яєчника, рак нирки, рак щитоподібної залози, рак стравоходу, рак голови і шиї, рак шкіри, рак печінки, рак підшлункової залози, рак сечового міхура, мієлому, лейкоз, у тому числі хронічний лімфоцитарний лейкоз, гострий мієлоїдний лейкоз, неходжкінську лімфому, у тому числі РІ ВС,
В-клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мантійноклітинну лімфому, лімфому з лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАЇГЇТ), В-клітинну лімфому, збагачену Т-клітинами/гістіоцитами, лімфому Беркітта, лімфоплазмоцитарну лімфому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, лімфому з клітин маргінальної зони, Т-клітинну лімфому, периферійну Т-клітинну лімфому, анапластичну великоклітинну лімфому і ангіоїмунобластну Т-клітинну лімфому, а також рак легені.
Підходящі шляхи введення композицій антитіл (наприклад, моноклональних антитіл, поліспецифічних і біспецифічних молекул і імунокон'югатів) за даним винаходом іп мімо і іп міго добре відомі з рівня техніки і можуть бути вибрані середніми фахівцями у даній галузі.
Наприклад, композиції антитіл можна вводити шляхом ін'єкції (наприклад, внутрішньовенної або підшкірної). Підходящі дози застосовуваних молекул будуть залежати від віку і маси суб'єкта, а також концентрації і/або складу композиції антитіла.
Як було описано раніше, антитіла до ЇМ75 за даним винаходом можна вводити разом з одним або більше іншими терапевтичними засобами, наприклад, цитотоксичним засобом, радіотоксичним засобом або імунодепресантом. Антитіло може бути пов'язано із засобом (у вигляді імунного комплексу) або може вводитися окремо від засобу. В останньому випадку (роздільне введення) антитіло можна вводити до, після введення засобу або одночасно з ним або можна вводити разом із застосуванням інших відомих видів терапії, наприклад, протиракової терапії, наприклад, променевої терапії. Такі терапевтичні засоби включають,
Зо серед інших, протипухлинні засоби, такі як доксорубіцин (адріаміцин), цисплатин, сульфат блеоміцину, кармустин, хлорамбуцил, а також циклофосфамід і гідроксисечовина, які самі по собі є ефективними тільки на рівнях, які є токсичними або субтоксичними для пацієнта.
Цисплатин вводять внутрішньовенно у вигляді дози 100 мг/кг один раз в чотири тижні, а адріаміцин вводять внутрішньовенно у вигляді дози 60-75 мг/мл один раз на 21 день. Інші засоби, підходящі для сумісного введення з антитілами за даним винаходом, включають інші засоби, застосовувані для лікування форм раку, наприклад, раку шлунка, раку ободової і прямої кишки, раку передміхурової залози, раку молочної залози, раку яєчника або раку легені, такі як
АмавійїпФ, 5РШ і гемцитабін. Сумісне введення антитіл до І У75 або їхніх антигензв'язувальних фрагментів за даним винаходом з хіміотерапевтичними засобами забезпечує два протиракових засоби, що діють за допомогою різних механізмів, які забезпечують досягнення цитотоксичного ефекту відносно пухлинних клітин людини. Таке спільне введення може вирішувати проблеми, зумовлені розвитком стійкості до лікарських засобів або зміною антигенності пухлинних клітин, що може зробити їх такими, що не реагують з антитілом.
Мішень-специфічні ефекторні клітини, наприклад, ефекторні клітини, пов'язані з композиціями (наприклад, моноклональними антитілами, поліспецифічними і біспецифічними молекулами) за даним винаходом, також можна застосовувати як терапевтичні засоби.
Ефекторні клітини для здійснення цілеспрямованого впливу можуть являти собою лейкоцити людини, такі як макрофаги, нейтрофіли або моноцити. Інші клітини включають еозинофіли, природні клітини-кілери й інші клітини, що несуть рецептори Ідс або ІдА. При бажанні ефекторні клітини можна одержати від суб'єкта, який підлягає лікуванню. Мішень-специфічні ефекторні клітини можна вводити у вигляді суспензії клітин у фізіологічному прийнятному розчині. Кількість клітин, які вводять, може становити порядку 108-109, але буде варіювати залежно від терапевтичної мети. Як правило, кількість буде достатньою для досягнення цільової локалізації у клітині, наприклад, у пухлинній клітині, яка експресує І М75, і для здійснення знищення клітин за допомогою, наприклад, фагоцитозу. Шляхи введення також можуть варіювати.
Терапію за допомогою мішень-специфічних ефекторних клітин можна проводити у поєднанні з іншими методиками для усунення цільових клітин. Наприклад, протипухлинну терапію із застосуванням композицій (наприклад, моноклональних антитіл, поліспецифічних (Іі біспецифічних молекул) за даним винаходом і/або ефекторних клітин, "озброєних" цими 60 композиціями, можна застосовувати у поєднанні з хіміотерапією. Додатково, можна застосовувати комбіновану імунотерапію для спрямування двох різних популяцій цитотоксичних ефекторних клітин на відторгнення пухлинних клітин. Наприклад, антитіла до І У75, пов'язані з антитілом до Ес-гамма-КІ або антитілом до СОЗ, можна застосовувати у поєднанні зі зв'язувальними засобами, специфічними до рецепторів Іде або ІдА.
Біспецифічні і поліспецифічні молекули за даним винаходом також можна застосовувати для модулювання ЕсукК або рівнів сук на ефекторних клітинах, як, наприклад, шляхом кепінгу і усунення рецепторів на клітинній поверхні. З цієї метою також можна застосовувати суміші антитіл до Ес-рецепторів.
Композиції (наприклад, моноклональні антитіла, поліспецифічні і біспецифічні молекули і імунокон'югати) за даним винаходом, які мають ділянки зв'язування з компонентами системи комплементу, такі як частини Ідс1, -2 або -3 або ІдМ, які зв'язуються з компонентами системи комплементу, також можна застосовувати у присутності системи комплементу. В одному варіанті здійснення обробку ех мімо популяції клітин, що включає цільові клітини, зв'язувальним засобом за даним винаходом і відповідними ефекторними клітинами можна доповнювати додаванням системи комплементу або сироватки крові, що містить систему комплементу.
Фагоцитоз цільових клітин, покритих зв'язувальним засобом за даним винаходом, можна покращити шляхом зв'язування з білками системи комплементу. В іншому варіанті здійснення цільові клітини, покриті композиціями (наприклад, моноклональними антитілами, поліспецифічними і біспецифічними молекулами) за даним винаходом, також можуть піддаватися лізису під дією системи комплементу. У ще одному варіанті здійснення композиції за даним винаходом не активують систему комплементу.
Композиції (наприклад, моноклональні антитіла, поліспецифічні і біспецифічні молекули і імунокон'югати) за даним винаходом також можна вводити разом з системою комплементу. У визначених варіантах здійснення у даному розкритті представлені композиції, що містять антитіла, поліспецифічні або біспецифічні молекули і сироватку крові або систему комплементу.
Ці композиції можуть бути переважними, якщо система комплементу знаходиться у безпосередній близькості до антитіл, поліспецифічних або біспецифічних молекул. В альтернативному випадку антитіла, поліспецифічні або біспецифічні молекули за даним винаходом і систему комплементу або сироватку крові можна вводити окремо.
Зо Також у межах обсягу даного винаходу знаходяться набори, що містять композиції антитіл за даними винаходом (наприклад, моноклональні антитіла, біспецифічні або поліспецифічні молекули або імунокон'югати) та інструкції щодо застосування. Набір може додатково містити один або більше додаткових реагентів, таких як імунодепресивний реагент, цитотоксичний засіб або радіотоксичний засіб, або одне або більше додаткових антитіл за даним винаходом (наприклад, антитіло, що має доповнюючу активність, яке зв'язується з епітопом на антигені
І Х75, відмінному від такого для першого антитіла).
Відповідно, пацієнтам, які одержують лікування за допомогою композицій антитіл за даним винаходом, можна додатково вводити (до введення антитіла за даним винаходом, одночасно з ним або після нього) інший терапевтичний засіб, такий як цитотоксичний або радіотоксичний засіб, що посилює або збільшує терапевтичний ефект антитіл.
В інших варіантах здійснення суб'єкт може одержувати додаткове лікування засобом, що модулює, наприклад, посилює або інгібує, експресію або активність Есу або Есу-рецепторів, за допомогою, наприклад, обробки суб'єкта цитокіном. Переважні цитокіни для введення у ході лікування поліспецифічною молекулою включають гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (5-С5Е), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (СМ-С5БЕ), інтерферон-у (ІЕМ-у) і фактор некрозу пухлини (ТМЕ).
Композиції (наприклад, антитіла, поліспецифічні і біспецифічні молекули) за даним винаходом також можна застосовувати по відношенню до цільових клітин, що експресують Есук або І У75, наприклад, для мічення таких клітин. Для такого застосування зв'язувальний засіб може бути зв'язаний з молекулою, яку можна виявити. Таким чином, у даному винаході представлені способи визначення локалізації ех мімо або іп міго клітин, що експресують Ес- рецептори, такі як Есук, або І 75. Мітка, яку можна виявити, може являти собою, наприклад, радіоактивний ізотоп, рлуоресцентну сполуку, фермент або кофактор ферменту.
У конкретному варіанті здійснення у даному винаході представлені способи виявлення наявності антигену ЇМ75 у зразку або вимірювання кількості антигену ЇМ75, що включають приведення зразку і контрольного зразку у контакт з моноклональним антитілом або його антигензв'язувальною частиною, які специфічно зв'язуються з І 775, в умовах, що забезпечують утворення комплексу між антитілом або його частиною і ЇУ75. Потім виявляють утворення комплексу, де відмінність в утворенні комплексу при порівнянні між зразком і контрольним бо зразком свідчить про наявність антигену І У75 у зразку.
В інших варіантах здійснення у даному винаході представлені способи лікування порушення, опосередкованого І У75, у суб'єкта, наприклад, форм раку людини, що включають рак шлунка, рак нирки, рак щитоподібної залози, рак стравоходу, рак голови і шиї, рак шкіри, рак печінки, рак підшлункової залози, рак ободової і прямої кишки, рак сечового міхура, рак передміхурової залози, рак молочної залози, у тому числі тричі негативний рак молочної залози, рак яєчника, рак легені, мієлому, лейкоз, у том числі хронічний лімфоцитарний лейкоз і гострий мієлоїдний лейкоз, неходжкінську лімфому, у тому числі ОІГВСІ, В-клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мантійноклітинну лімфому, лімфому з лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАГ Т), В-клітинну лімфому, збагачену Т-клітинами/гістіоцитами, лімфому Беркітта, лімфоплазмоцитарну лімфому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, лімфому з клітин маргінальної зони, Т-клітинну лімфому, периферійну Т-клітинну лімфому, анапластичну великоклітинну лімфому і ангіоїмунобластну Т-клітинну лімфому.
У всіх варіантах здійснення даного винаходу переважні форми раку включають неходжкінську лімфому, гострий мієлоїдний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, а також тричі негативний рак молочної залози, рак сечового міхура і рак підшлункової залози.
Всі літературні джерела, що згадуються у даному описі, включають, без обмежень, всі документи, публікації, патенти, заявки на патенти, презентації, тексти, звіти, рукописи, брошури, книги, інтернет-публікації, журнальні статті, періодичні видання, інформаційні бюлетені про продукти тощо, які включені у даний опис за допомогою посилання у всій своїй повноті.
Обговорення літературних джерел у даному документі призначене лише для узагальнення тверджень, зроблених їхніми авторами, і не робиться визнання того факту, що будь-яке літературне джерело складає частину попереднього рівня техніки, а заявники зберігають за собою право заперечувати достовірність і значущість згаданих літературних джерел.
Хоча вищезазначений винахід було досить детально описано за допомогою ілюстрації і прикладу з метою ясності розуміння, середнім фахівцям у даній галузі у світлі ідей даного винаходу буде легко зрозуміло, що у його відношенні можна здійснювати визначені зміни і модифікації без відступу від суті або обсягу залежних пунктів формули винаходу.
Даний винахід додатково проілюстровано за допомогою наступних прикладів, які не слід тлумачити як такі, що додатково обмежують.
Зо Приклад 1. Одержання людських моноклональних антитіл проти антигену ГУ75
Відповідно до стандартних методик, мишей (хепотоизе Ідс1) імунізували клітинами СНО, трансфікованими І .У75 повної довжини.
Специфічність антитіл, вироблених проти І М75, досліджували за допомогою проточної цитометрії з використанням клітин НЕК293, трансфікованих І Х75, і, згодом, з використанням клітин НТ29, що експресують І У75. Для того щоб досліджувати здатність антитіл зв'язуватись з білком І У75 на клітинній поверхні, антитіла інкубували з клітинами, що експресують ІМУ75.
Клітини промивали буфером ЕАС5 (ОРВ5, 2 95 ЕВ5), центрифугували і ресуспендували в 100 мкл розведеного первинного антитіла до І У75 (також розведеного в буфері ЕАС5). Комплекс антитіло-лінія клітин інкубували на льоду протягом 60 хв. і потім двічі промивали буфером
ЕАС5, описаним вище. Осад клітина-антитіло ресуспендували в 100 мкл розведеного вторинного антитіла (також розведеного в буфері РАС) та інкубували на льоду протягом 60 хв. на льоду. Осад промивали, як описано вище, і ресуспендували в 200 мкл буфера ГАС5. Зразки завантажували у проточний цитометр ВО ЕБАСбЗсапіо ІІ, і при цьому дані аналізували за допомогою програмного забезпечення ВО ЕАСзаїма (результати не наведені).
Приклад 2. Установлення структурних характеристик моноклональних антитіл до І 75
Послідовності кКДНК, що кодують варіабельні області важких і легких ланцюгів моноклонального антитіла ЇМ75 АТ, одержували за допомогою стандартних методик ПЦЕ і секвенували за допомогою стандартних методик секвенування ДНК.
Послідовності антитіла можна піддати мутагенезу для повернення до залишків зародкового типу у положенні одного або більше залишків.
Нуклеотидна й амінокислотна послідовності варіабельної області важкого ланцюга І 75 А1 наведені відповідно під ЗЕО ІЮ МО: З і 1.
Нуклеотидна і амінокислотна послідовності варіабельної області легкого ланцюга І 75 А наведені відповідно під ЗЕО ІЮ МО: 4 і2.
Порівняння послідовності важкого ланцюга імуноглобуліну 1М75 Аї7 з відомими послідовностями зародкового типу важкого ланцюга імуноглобуліну людини продемонструвало, що у важкому ланцюзі ГМ75 А1 використовується Мн-сегмент з Мн 3-15 людини зародкового типу і Ун-сегмент з дн УН4 людини зародкового типу. Подальший аналіз послідовності Мн
ЇМ75 А1ї за допомогою системи Караї для визначення області СОМ привів до виявлення 60 областей СОМКІ1, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга, наведених під ЗЕО ІО МО: 5, 6 і 7 відповідно.
Вирівнювання послідовностей СОКІ, СОМК2 і СОКЗ Мн о ГМ75 Аї1 з послідовністю Мн 3-15 зародкового типу і Он Уні4 зародкового типу показані на фігурі 1.
Порівняння послідовності легкого ланцюга імуноглобуліну І1/М75 Аї з відомими послідовностями зародкового типу легкого ланцюга імуноглобуліну людини продемонструвало, що в легкому ланцюзі ГУ75 А1 використовується Мк-сегмент з Мк 012 людини зародкового типу і Ук-сегмент з дк УКі4 людини зародкового типу. Подальший аналіз послідовності Мк 75 А! за допомогою системи Кабаї для визначення області СОК привів до виявлення областей СОК!1,
СОК2 ї СОКЗ легкого ланцюга, наведених під ЕС ІЮ МО:8, 9 ї 10 відповідно. Вирівнювання послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ Мк ГУ75 АТ з послідовностями Мк 012 зародкового типу і
Ун УКА зародкового типу показані на фігурі 2.
Приклад 3. Імуногістохімічне дослідження за допомогою моноклонального антитіла до І 75
За допомогою людського моноклонального антитіла, специфічного відносно 175, здійснювали імуногістохімічне дослідження з використанням клітинних осадів ЕЕРЕ НТ-29 і
АБ49, матриць з БЕРЕ зразками неходжкінської лімфоми і раку підшлункової залози і свіжозаморожених пухлинних зразків лімфоми/лейкозу, зрізів раку яєчника, раку підшлункової залози і раку молочної залози і матриці з нормальними тканинами.
Матеріали і способи
Матеріали
Ксилоли (Х5Р-1даї) від Різпег зЗсієепійіс, Пенсильванія, США. 100 95 етанол Нізіоргер (НС-800-10АЇ) від Різпег Зсіепійіс, Пенсильванія, США. 10х цитратний буфер для термічного демаскування епітопів (АРО003125) від Тпегто зсіепійіс, Массачусетс, США.
Інгібітор пероксидази Тпегто Зсіепійіс" Ріегсе" (35000) від Тпегто Зсіепійіс, Массачусетс,
США.
Безсироватковий білковий блокувальний розчин (ХО909) від бако, Каліфорнія, США.
Вторинне антитіло: Раб кози до дО людини, кон'югований з РІТС, (109-097-003), від даскзоп
Ітітипогезеагсі, Пенсильванія, США.
Ід людини СПготРиге, ціла молекула (09-000-003), від Часкбзоп Іттипогезеагсі,
Пенсильванія, США.
Третинне антитіло: антитіло миші до РІТС (аб10257) від Абеат, Массачусетс, США.
Очищений дО людини для ізотопічного контролю (1-001 А) від КО Зу«етв, Міннесота,
США.
Тмееп-20 (ВРЗЗ37-100) від Різпег Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
Ацетон (ВР2403-4) від Різпег зсіепійіс, Пенсильванія, США. риа! Ск Епмівіоп-- НАР -сопіцдатейд роїутег, Моизе апа Каррії (К4063) від бако, Каліфорнія,
США. Набор ДАВ з 2 розчинами (882014) від Іпмігодеп, Нью-Йорк, США.
Гематоксилін Гарріса (23-245-677) від Еізпег Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
Заливальне середовище Рагатоишпі (5302580) від Сбако, Каліфорнія, США.
Тканинні зрізи і матриці придбавали від О5 Віотах Іпс., Меріленд, США або Огідепе,
Меріленд, США.
Одержання мікропрепаратів ЕЕРЕ. Видалення парафіну і регідратація
Здійснювали видалення парафіну з мікропрепаратів ЕЕРЕ у ксилолі (2х3 хвилини), а потім здійснювали регідратацію з використанням 1:11 ксилол: 100 95 етанол (1х3 хвилини), 100 90 етанол (2х3 хвилини), 95 95 етанол (1х3 хвилини), 70 95 етанол (1х3 хвилини), 50 95 етанол (1х3 хвилини) і водопровідна вода (1х3 хвилини).
Одержання мікропрепаратів ЕЕРЕ. демаскування антигену (мікрохвильове випромінювання)
Антиген І У75 демаскували з використанням нагрівання мікрохвильовим випромінюванням з високою потужністю до кипіння, потім з низькою потужністю протягом 10 хвилин в 50 мл їх цитратного буфера у посудині Копліна. Мікропрепарати потім залишали охолоджуватись до кімнатної температури протягом додаткових 15 хв., потім промивали водопровідною водою З хвилини. Кожний тканинний зріз/ЛІМА обводили колом за допомогою олівця для створення гідрофобного бар'єру, і потім мікропрепарати З рази промивали в РВ5, протягом З хвилин для кожного промивання.
Одержання мікропрепаратів ЕЕ
Мікропрепарати виймали зі сховища при -80 "С і забезпечували сушіння за кімнатної температури у витяжній шафі протягом 20-30 хвилин. Мікропрепарати фіксували протягом 10 хв. у льодяному ацетоні при -20 "С, потім забезпечували сушіння протягом 20 хв. у витяжній шафі за кімнатної температури. Мікропрепарати промивали і здійснювали регідратацію в РВ5, причому з З промиваннями, кожна протягом З хв. Зрізи обводили по контуру за допомогою 60 олівця для створення гідрофобного бар'єру.
Одержання комплексів антитіл
Первинне антитіло до ЇМ75 розводили в безсироватковому білковому блокувальному розчині (ЗЕРВ) з одержанням розчину з концентрацією, що в 20 разів перевищує необхідну кінцеву концентрацію (20 мкг/мл для кінцевої концентрації 1 мкг/мл). Вторинне антитіло, антигензв'язувальний фрагмент (Бар) кози до імуноглобуліну З людини (Ід), одержували аналогічним чином в 5ЕРВ для створення розчину з однаковою концентрацією.
Однакові об'єми первинного і вторинного антитіла об'єднували у пробірці з етикеткою, обережно перемішували і інкубували протягом З хвилин за кімнатної температури, у результаті чого одержували концентрацію первинного антитіла, що в 10 раз перевищує необхідну кінцеву концентрацію (10 мкг/мл для кінцевої концентрації 1 мкг/мл). Дану суміш розводили 1:5 за допомогою 5ЕРВ, обережно перемішували і інкубували протягом 30 хвилин за кімнатної температури, у результаті чого одержували концентрацію первинного антитіла, що в два рази перевищує необхідну кінцеву концентрацію (2 мкг/мл для кінцевої концентрації 1 мкг/мл).
Для одержання кінцевих забарвлювальних комплексів 1 95 (10 мкг/мкл) розчин ЇДО людини одержували в ЗЕРВ, і при цьому однаковий об'єм додавали до суміші первинного/вторинного антитіла. Дану комбінацію обережно перемішували та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин з розведенням суміші первинного/вторинного антитіла до половини концентрації первинного антитіла, і у результаті одержували необхідну кінцеву концентрацію первинного антитіла (1 мкг/мл).
Імунозабарвлювання
При цьому ендогенну тканинну пероксидазну активність бокували шляхом інкубування тканин з інгібітором пероксидази протягом 5-10 хвилин за кімнатної температури у зволожувальній камері. Потім мікропрепарати промивали в РВЗ З рази протягом З хвилин для кожного промивання. Тканини інкубували в 5ЕРВ протягом 30 хвилин за кімнатної температури у зволожувальній камері. Кінцеві забарвлювальні комплекси наносили на кожний тканинний зріз мМабо мікроматрицю, і при цьому мікропрепарати інкубували протягом 30 хв. за кімнатної температури у зволожувальній камері. Потім мікропрепарати промивали один раз в РВ5 їі один раз в РВ5Т (РВБ5шО,12595 Гуєеп-20) протягом З хвилин для кожного промивання. Третинне антитіло миші до РІТС застосовували при концентрації 2 мкг/мл протягом 30 хв. за кімнатної
Зо температури у зволожувальній камері. Потім зрізи промивали один раз у РВ5 і один раз у РВ5Т протягом З хв. для кожного промивання. Потім на тканини наносили полімер на основі кон'югованого з НЕР антитіла кроля до Ід миші Юиаї СіпкК Епмізіоп'ь, і при цьому мікропрепарати інкубували протягом 30 хв. за кімнатної температури у зволожувальній камері. Потім мікропрепарати промивали один раз у РВ5, один раз у РВБТ протягом З хв. для кожного 35 промивання. Тканини інкубували у розчині ЮАВ, одержаному відповідно до інструкцій виробника, за кімнатної температури протягом 10 хв. Потім мікропрепарати один раз промивали проточною водопровідною водою протягом 2 хвилин і один раз у РВ5 протягом З хвилин.
Здійснювали контрастне забарвлювання мікропрепаратів за допомогою гематоксиліну протягом секунд за кімнатної температури і промивали проточною водопровідною водою.
Мікропрепарати сушили за кімнатної температури протягом 30 хвилин і потім мікропрепарати заключали під накривне скло з використанням заливального середовища Рагатоипі.
Результати
ІГх75 А1 характеризувалося позитивним результатом при використанні зразків ЕЕРЕ тричі негативного раку молочної залози, причому 77 905 зрізів характеризувалися позитивним забарвленням і 55 95 демонстрували інтенсивне (ї---) забарвлення.
Забарвлювання відносно ЇУ75 нормальних тканин ЕЕ, як правило, було у діапазоні від відсутнього до низького рівня. Епітелій проток молочної залози, слинна залоза і підшлункова залоза демонстрували від вираженого низького рівня до помірного рівня забарвлення, і при цьому спостерігався низький рівень позитивного забарвлення селезінки. Таким чином, антитіла, спрямовані на І 75, можна використовувати як терапевтичні засоби і діагностичні засоби при деяких з досліджуваних форм раку і, можливо, інших типах раку, що характеризуються експресією І 75.
Приклад 4. Ефективність моноклональних антитіл до І У75, кон'юЮгованих з ОМІ1, відносно клітин НТ-29
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище ЕРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Ріхпег Зсіепійс, Пенсильванія, США. 60 Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували в культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Планшет виймали з інкубатора і інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег Сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
Результати наведені на фігурі За, на якій показана субпопуляція антитіл, які, як відомо, зв'язуються з І У75, що може індукувати цитоліз клітин НТ-29. Це дозволяє припустити, що при тому, що ці антитіла можуть зв'язуватись з І У75, лише деякі з них виявляють ефективність будучи кон'югованими з ОМ. Потім з субпопуляції вибирали антитіла для подальшого аналізу цитотоксичної активності.
Приклад 5. Ефективність моноклональних антитіл до 175, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно клітин раку ободової та прямої кишки
Зо Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою Сеї! Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5езЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег Сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі З3р показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин НТ-29. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, бо пропорційне концентрації антитіл, порівняно з іншими антитілами до І У75, кон'югованими з токсином (вибраними з прикладу 1).
Приклад 6. Ефективність моноклональних антитіл до 175, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин лімфоми
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37 76.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеїї Тег біо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на
Зо люмінометрі Сіотах.
Результати
На фігурі Зс показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 і ОМА, відносно клітин КАШІ. На фігурі За показана цитотоксична активність антитіл до /М75, кон'юЮгованих з ЮОМІ і ОМА, відносно клітин Матаїма. На фігурі Зе показана цитотоксична активність антитіл до ЇМ75, кон'югованих з ЮМІ і ОМА, відносно клітин Кагра5 299. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл, порівняно з іншими антитілами до ЇМ75, кон'югованими з ОМІ ї ОМА (вибраними з прикладу 1).
Приклад 7. Ефективність моноклональних антитіл до 175, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин раку підшлункової залози
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10еЗ клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37. бо Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег біо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
Сеї! Тег Со і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі З показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'юЮгованих з ОМ1 і ОМА, відносно клітин ВхРСЗ3. На фігурі 39 показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'юЮгованих з ЮМІ і ОМА, відносно клітин НирТ4. На фігурі Зп показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ і ОМА, відносно клітин НРАЕНІЇ. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл, порівняно з іншими антитілами до І У75, кон'югованими з ОМ'І і ОМА (вибраними з прикладу 1).
Приклад 8. Ефективність моноклональних антитіл до 175, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин хронічного лімфоцитарного лейкозу
Матеріали
Се Зпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 7,4 (1Х) (5НЗОО0281І 5) від Різпег зЗсієпійіс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
СеїІ Тнег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і
Зо прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 376.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
СеїІ Тег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі Зі показана цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'юЮгованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин ЕНЕВ. На фігурі З| показана цитотоксична активність антитіл до /М75, кон'югованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин Мес-1. дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл, порівняно з іншими антитілами до
ЇМ75, кон'югованими з ОМ'І і ОМА (вибраними з прикладу 1).
Приклад 9. Ефективність моноклональних антитіл до І/М75, кон'юЮтованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин острого моноцитарного лейкозу
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 7,4 (1Х) (ЗНЗОО281І 5) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5ез бо клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 376.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
СеїІ Тіег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі ЗК показана цитотоксична активність антитіл до ГУ75, кон'югованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин АМІ-193. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл, порівняно з іншими антитілами до І У75, кон'югованими з ОМ1 і ОМА (вибраними з прикладу 1).
Приклад 10. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин раку молочної залози
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег осіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою Сеї! Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5езЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі ЗІ показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'юЮгованих з ОМ1 і ОМА, відносно клітин НСС 70 (ЕК-негативних, РК-негативних і Нег2-негативних). На фігурі Зт показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'юЮгованих з ОМІ ії ОМА, відносно клітин
НОС 1806 (ЕВ-негативних, РЕ-негативних і Нег2-негативних). На фігурі Зп показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин МОА-МВ- 468. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне бо концентрації антитіл.
Приклад 11. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин раку сечового міхура
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег зЗсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10еЗ3 клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 9б-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег біо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВЗ5 ії 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі Сіотах.
Зо Результати
На фігурі Зо показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин КТ4. На фігурі Зр показана цитотоксична активність антитіл до /ІМ75, кон'югованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин 5637. На фігурі Зд показана цитотоксична активність антитіл до ГМ75, кон'юЮтгованих з ОМІ ії ОМ4, відносно клітин 5УМ780. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл.
Приклад 12. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин раку голови і шиї
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег зЗсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 9б-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Планшет виймали з інкубатора і інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку бо центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВЗ5 ії 100 мкл 5О0
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі Зг показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМІ1 і ОМА, відносно клітин 5СС-9. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл.
Приклад 13. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин раку стравоходу
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище ЕРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Зо Планшет виймали з інкубатора і інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВ5 і 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі 35 показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 і ОМА, відносно клітин ОЕ 19. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл.
Приклад 14. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин раку яєчника
Матеріали
Се! Зпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег
Зсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище КРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Сеї! Тег Спо (47572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл. 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) 60 додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВЗ5 і 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі Сіотах.
Результати
На фігурі ЗІ показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'юЮгованих з ОМ1 і ОМА, відносно клітин ОМСАК-3. На фігурі Зи показана цитотоксична активність антитіл до І М75, кон'югованих з ОМІ і ОМА, відносно клітин ЗК-ОУ-3. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл.
Приклад 15. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно ліній клітин множинної мієломи
Матеріали
Се Зіпгіррег (неферментативний засіб для дисоціації клітин) (МТ-25-056СІ) від Різпег зЗсіепійіс, Пенсильванія, США.
РВ5, рН 74 (І1Х) (ЗНЗОО0281І 5) від Ріхпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Середовище ЕРМІ 1640 (МТ-10-041-СМ) від Різпег Зсіепіййс, Пенсильванія, США.
Се Тйег СіІо (57572) від Рготеда, Вісконсин, США.
Спосіб
Здійснювали дисоціацію клітин за допомогою СеїЇ Зігіррег і підрахунок їх кількості. 5еЗ клітин/лунка центрифугували з одержанням осаду (у випадку клітин у суспензії можна використовувати більшу кількість залежно від часу подвоєння кількості клітин, наприклад, 10ез клітин/лунка). Осад ресуспендували у культуральному середовищі з одержанням концентрації 1е5 клітин/мл.
Зо 50 мкл/лунка суспензії клітин додавали в лунки 96-лункового планшета з білими стінками і прозорим дном. Антитіла розводили і титрували в 8 точках (титрування з З-кратними розведеннями), що відповідають концентраціям 0-20 нМ (які вдвічі перевищують досліджувані концентрації). Розведені антитіла або середовище (для необроблених зразків) (50 мкл/лунка) додавали у відповідні лунки. Надлишок середовища (200 мкл/лунка) додавали у зовнішні ряди і стовпці планшета для запобігання випаровуванню. Планшет інкубували протягом 72 год. при 37.
Планшет виймали з інкубатора та інкубували за кімнатної температури протягом 30 хвилин.
Тим часом піддавали розморожуванню розчин Сеї! Тег сіо. Планшет струшували і промивали 1 раз з використанням 100 мкл/лунка РВ5 (у випадку клітин у суспензії планшет спочатку центрифугували для осадження клітин). У кожну лунку додавали 100 мкл/лунка РВЗ5 ії 100 мкл
Сеїї Тйег Сіо і ретельно перемішували з одержанням суміші. Планшет інкубували у темряві за кімнатної температури протягом 15 хвилин і відслідковували шляхом мікроскопування, для того щоб впевнитись у тому, що відбувся ефективний лізис клітин. Потім планшет зчитували на люмінометрі сіотах.
Результати
На фігурі Зм показана цитотоксична активність антитіл до І У75, кон'югованих з ОМ1 і ОМА, відносно клітин МОЇ Р-8. На фігурі Зм/у показана цитотоксична активність антитіл до ІМ75, кон'югованих з ОМІ і ОМА, відносно клітин КРМІ8226. Дані результати демонструють підвищення цитотоксичної активності, пропорційне концентрації антитіл.
Приклад 16. Ефективність моноклональних антитіл до !М75, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, у ксенотрансплантатних моделях Каїі
Ефективність ГМ75 ОМІ1 ії 1м75 ОМ4 досліджували у ксенотрансплантатній моделі з підшкірним введенням мишам з ЗСІЮО клітин Каїї лімфоми Беркітта.
Імунодефіцитних мишей з 5СІО підшкірно інокулювали пухлинними клітинами Каїї (лімфоми
Беркітта людини). Пухлинам давали можливість розвитись і мишей розподіляли на п'ять груп обробки по 3-6 мишей на групу. Коли середнє значення об'єму пухлини досягало середнього показника 129-132 мм3 на групу, кожну групу оброблювали однією з наступних сполук, що вводили внутрішньовенно при вказаних дозах: група 1 (наповнювач; фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5Б)); група 2 (175 ОМ'І; 10 мг/кг), група З (ізотипічний контроль-ОМ1; 10 бо мг/кг), група 4 (75 ОМА; 5 мг/кг), група 5 (ізотипічний контроль--БРВОЮОМАЕА; 5 мг/кг). Другу дозу вводили через один тиждень. Відслідковували показники маси тіла (ВМ), мишей часто оглядали для визначення стану здоров'я і небажаних побічних реакцій, і при цьому пухлини вимірювали два рази на тиждень. Мишей піддавали евтаназії, коли їх пухлини досягали кінцевого показника об'єму пухлини 2000 мм" або через 60 днів, залежно від того, що відбувалося першим.
Ефективність визначали виходячи з затримки росту пухлини (ТО), збільшення медіанного значення часу до кінцевого показника (ТТЕ) і виходячи з аналізу за допомогою логарифмічного рангового критерію відмінностей за кривими виживаності Каплана-Мейера для мишей, оброблених АОС, порівняно з мишами, обробленими РВ5. У перших п'яти контрольних мишей, оброблених наповнювачем, у яких був досягнутий кінцевий показник, відбирали зразки пухлин, які оброблювали шляхом фіксації в формаліні і заливки парафіном.
Результати
На фігурі 4а показано, що кожний з /М75 ОМІ ї ГМ75 ОМ4 продемонстрував значну протипухлинну активність і значно пролонговану виживаність у ксенотрансплантатній моделі з клітинами Каїї лімфоми Беркітта на мишах з ЗСІО порівняно з контролями; проте, дози 5 мг/кг
Гм75 ОМА були значно ефективнішими, ніж дози 10 мг/кг І 75 ОМІ, у результаті чого у 5 з 6 мишей спостерігалася повна, але тимчасова регресія пухлини. Всі обробки легко переносились і не спостерігалися клінічні ознаки токсичності. Ці дані дозволяють припустити, що АОС, спрямовані на І У75, наприклад, ЇМ75 ОМ1 ії м75 ОМА, можуть забезпечувати клінічну користь при лікуванні ракових пацієнтів з неходжкінською лімфомою людини.
Приклад 17. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, у ксенотрансплантатних моделях Матама
Ефективність ГМ75 ОМ1 ії ГМ75 ОМ4 досліджували у ксенотрансплантатній моделі з підшкірним введенням мишам з ЗСІО клітин Матам'а лімфоми Беркітта.
Імунодефіцитних мишей з СІЮ підшкірно інокулювали пухлинними клітинами Матаїма (лімфоми Беркітта людини). Пухлинам давали можливість розвитись і мишей розподіляли на п'ять груп обробки по б мишей на групу. Коли середнє значення об'єму пухлини досягало середнього показника 114 мм? на групу, кожну групу оброблювали однією з наступних сполук, що вводили внутрішньовенно при вказаних дозах: група 1 (наповнювач; фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5Б)); група 2 (175 ОМ'І; 10 мг/кг), група З (ізотипічний контроль-ОМ1; 10
Зо мг/кг), група 4 (1М75 ОМ4; 5 мг/кг), група 5 (ізотипічний контрол-5РВОЮОМА4; 5 мг/кг).
Відслідковували показники маси тіла (ВУМУ), мишей часто оглядали для визначення стану здоров'я і небажаних побічних реакцій, і при цьому пухлини вимірювали два рази на тиждень.
Мишей піддавали евтаназії, коли їх пухлини досягали кінцевого показника об'єму пухлини 2000 мм або через 60 днів, залежно від того, що відбувалося першим. Ефективність визначали виходячи з затримки росту пухлини (ТОО), збільшення медіанного значення часу до кінцевого показника (ТТЕ) і виходячи з аналізу за допомогою логарифмічного рангового критерію відмінностей за кривими виживаності Каплана-Мейера для мишей, оброблених АОС, порівняно з мишами, обробленими РВ5. У перших п'яти контрольних мишей, оброблених наповнювачем, у яких був досягнутий кінцевий показник, відбирали зразки пухлин, які оброблювали шляхом фіксації в формаліні і заливки парафіном.
Результати
На фігурі 4656 показано, що кожний з /М75 ОМІ ї ГМ75 ОМ4 продемонстрував значну протипухлинну активність і пролонговану виживаність у ксенотрансплантатній моделі з клітинами Матаїма лімфоми Беркітта на мишах з 5СІЮ порівняно з контролями; проте, доза 5 мг/кг ГМ75 0ОМ4 була значно ефективнішою, ніж доза 10 мг/кг М75 ОМІ, причому вона приводила до того, що спостерігалося короткочасне зменшення об'єму пухлини. Все обробки легко переносились і не спостерігалися клінічні ознаки токсичності. Ці дані дозволяють припустити, що АОС, спрямовані на І М75, наприклад, !М75 ОМІ і ГМ75 ОМ4, можуть забезпечувати клінічну користь при лікуванні ракових пацієнтів з неходжкінською лімфомою людини.
Приклад 18. Ефективність моноклональних антитіл до 1М75, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, у ксенотрансплантатних моделях раку підшлункової залози
Ефективність ГМ75 ОМІ1 ії 1м75 ОМ4 досліджували у ксенотрансплантатній моделі з підшкірним введенням безтимусним голим мишам клітин НРАКРКІЇ аденокарциноми підшлункової залози.
Імунодефіцитних безтимусних голих мишей підшкірно інокулювали пухлинними клітинами
НРАРІЇ (аденокарциноми підшлункової залози людини). Пухлинам давали можливість розвитись, і мишей розподіляли на п'ять груп обробки по б мишей на групу. Коли середнє значення об'єму пухлини досягало середнього показника «114 мм на групу, кожну групу 60 оброблювали однією з наступних сполук, що вводили внутрішньовенно при вказаних дозах:
група 1 (наповнювач; фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5)); група 2 (ІМ75 ОМ'1; 10 мг/кг), група З (ізотипічний контроль-ЮОМ1; 10 мг/кг), група 4 (175 ОМ4; 5 мг/кг), група 5 (ізотипічний контроль--5ЗРВОЮОМА; 5 мг/кг). Відслідковували показники маси тіла (ВУ), мишей часто оглядали для визначення стану здоров'я і небажаних побічних реакцій, і при цьому пухлини вимірювали три рази на тиждень. Мишей піддавали евтаназії, коли їх пухлини досягали кінцевого показника об'єму пухлини 2000 мм" або через 90 днів, залежно від того, що відбувалося першим. Ефективність визначали виходячи з ефекту обробки на об'єм пухлини і виходячи з аналізу за допомогою логарифмічного рангового критерію відмінностей за кривими виживаності Каплана-Мейера для мишей, оброблених АОС, порівняно з мишами, обробленими
РВ5. Відбирали зразки пухлин у контрольних мишей, оброблених наповнювачем, і оброблювали шляхом фіксації в формаліні і заливки парафіном.
Результати
На фігурі 4с показано, що ГМ75 ОМ і 175 ОМА виявляли значну і аналогічну за силою протипухлинну активність, і при цьому спостерігалася пролонгована виживаність у ксенотрансплантатній моделі НРАНІЇ на голих мишах порівняно з контролями. Всі обробки легко переносилися і не спостерігалися клінічні ознаки токсичності. Ці дані дозволяють припустити, що АОС, спрямовані на ЇМ75, наприклад, ГМ75 ОМІ їі 1М75 ОМ4, можуть забезпечувати клінічну користь при лікуванні пацієнтів-людей з раком підшлункової залози.
Приклад 19. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, у ксенотрансплантатних моделях раку сечового міхура
Ефективність ГМ75 ОМІ1 ії 1м75 ОМ4 досліджували у ксенотрансплантатній моделі з підшкірним введенням мишам з ЗСІО клітин 5МУ780 карциноми сечового міхура людини.
Імунодефіцитних безтимусних голих мишей підшкірно інокулювали пухлинними клітинами
НРАРІЇ (аденокарциноми підшлункової залози людини). Пухлинам давали можливість розвитись, і мишей розподіляли на п'ять груп обробки по б мишей на групу. Коли середнє значення об'єму пухлини досягало середнього показника «114 мм" на групу, кожну групу оброблювали однією з наступних сполук, що вводили внутрішньовенно при вказаних дозах: група 1 (наповнювач; фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5)); група 2 (М75 ОМ'; 1 мг/кг), група 3 (75 ОМТ'І; 2,5 мг/кг), група 4 (ІМ75 ОМ'І; 5 мг/кг), група 5 (75 ОМА; 1 мг/кг)), група 6
Зо (м75 ОМА; 2,5 мг/кг)), група 7 (75 ОМА; 5 мг/кг)), група 8 (ізотипічний контроль-БРВОЮОМАа; 5 мг/кг). Відслідковували показники маси тіла (ВУ), мишей часто оглядали для визначення стану здоров'я і небажаних побічних реакцій, і при цьому пухлини вимірювали три рази на тиждень.
Мишей піддавали евтаназії, коли їх пухлини досягали кінцевого показника об'єму пухлини 2000 мм або через 90 днів, залежно від того, що відбувалося першим. Ефективність визначали виходячи з ефекту обробки на об'єм пухлини і виходячи з аналізу за допомогою логарифмічного рангового критерію відмінностей за кривими виживаності Каплана-Мейера для мишей, оброблених АБС, порівняно з мишами, обробленими РВ5. Відбирали зразки пухлин у контрольних мишей, оброблених наповнювачем, і оброблювали шляхом фіксації в формаліні і заливки парафіном.
Результати
На фігурі 44 показано, що ГМ75 ОМ'І1 і М75 ОМА виявляли значну і аналогічну за силою протипухлинну активність, і при цьому спостерігалася пролонгована виживаність у ксенотрансплантатній моделі 5МУ780 на голих мишах порівняно з контролями. Всі обробки легко переносилися і не спостерігалися клінічні ознаки токсичності. Ці дані дозволяють припустити, що АОС, спрямовані на ЇМ75, наприклад, ЇМ75 ОМІ1 і 1 М75 ОМ4, можуть забезпечувати клінічну користь при лікуванні пацієнтів-людей з раком сечового міхура.
Приклад 20. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, у ксенотрансплантатних моделях раку молочної залози
Ефективність ГМ75 ОМІ1 ї 1М75 ОМ4 досліджували у ксенотрансплантатній моделі з підшкірним введенням безтимусним голим мишам клітин МОА-МВ-468.
Імунодефіцитних безтимусних голих мишей підшкірно інокулювали пухлинними клітинами
МОА-МВ-468 (тричі негативної аденокарциноми молочної залози людини). Пухлинам давали можливість розвитись, і мишей розподіляли на сім груп обробки по 10 мишей на групу. Коли середнє значення об'єму пухлини досягало середнього показника 167 мм3 на групу, кожну групу оброблювали однією з наступних сполук, що вводили внутрішньовенно при вказаних дозах: група 1 (наповнювач; 20 мМ сукцинат натрію, рН 5,0, 6 95 трегалоза, 0,04 95 полісорбат); група 2 (М75 ОМ; 5 мг/кг), група З (175 ОМ'1; 10 мг/кг), група 4 (ІМ75 ОМ4; 5 мг/кг), група 5 (м75 ОМА; 2,5 мг/кг), група 6 (1475 ОМА; 1 мг/кг), група 7 (ізотипічний контроль-ЮМА; 5 мг/кг).
Відслідковували показники маси тіла (ВМУ), мишей часто оглядали для визначення стану бо здоров'я і небажаних побічних реакцій, і при цьому пухлини вимірювали два рази на тиждень.
Мишей піддавали евтаназії через 82 дня після інокуляції пухлини. Ефективність визначали виходячи з протипухлинної активності (середнє значення розміру пухлини у групі обробки/середнє значення розміру пухлини у контрольній групі х 100) і збільшення середнього значення часу до кінцевого показника (ТТЕ) у мишей, оброблених АОС, порівняно з мишами, обробленими РВ5. Відбирали зразки п'яти найбільших пухлин у контрольних мишей, оброблених наповнювачем, у день 71 після інокуляції і оброблювали шляхом фіксації в формаліні і заливки парафіном.
Результати
На фігурі 4е показано, що кожний з /М75 ОМІ1 ї ГМ75 ОМ4 продемонстрував значну протипухлинну активність у ксенотрансплантатній моделі МОА-МВ-468 на голих мишах порівняно з контролями. При використанні І М75 ОМА спостерігали залежну від дози активність, причому 2,5 і 5 мг/кг характеризувалися набагато сильнішим ефектом, ніж 1 мг/кг. При 5 мг/кг їм75 0ОМ1 ї ГМм75 0ОМ4 характеризувалися аналогічною ефективністю. Тривалі регресії середнього значення об'єму пухлини спостерігали у випадку ГМ75 ОМІ при 10 і 5 мг/кг і
Їх75 ОМА при 5 і 2,5 мг/кг. Всі обробки легко переносилися і не спостерігалися клінічні ознаки токсичності. Ці дані дозволяють припустити, що АОС, спрямовані на ІМ75, наприклад, їм75 ОМ1 і м75 ОМА, можуть забезпечувати клінічну користь при лікуванні пацієнтів-людей з тричі негативним раком молочної залози.
Приклад 21. Ефективність моноклональних антитіл до І!М75, кон'Югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, у ксенотрансплантатних моделях раку ободової і прямої кишки
Ефективність ГМ75 ОМІ1 ї 1М75 ОМ4 досліджували у ксенотрансплантатній моделі з підшкірним введенням безтимусним голим мишам клітин СОЇ 0205 аденокарциноми ободової і прямої кишки.
Імунодефіцитних безтимусних голих мишей підшкірно інокулювали пухлинними клітинами
СО 0205 (аденокарциноми ободової і прямої кишки людини). Пухлинам давали можливість розвитись і мишей розподіляли на п'ять груп обробки по б мишей на групу. Коли середнє значення об'єму пухлини досягало середнього показника 117 мм" на групу, кожну групу оброблювали однією з наступних сполук, що вводили внутрішньовенно при вказаних дозах: група 1 (наповнювач; фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5)); група 2 (75 ОМ'І1; 10
Зо мг/кг), група З (ізотипічний контроль-ЮМ1; 10 мг/кг), група 4 (М75 ОМа4; 5 мг/кг), група 5 (ізотипічний контроль-ЮМА4; 5 мг/кг). Другу дозу вводили через дванадцять днів після першої.
Відслідковували показники маси тіла (ВМУ), мишей часто оглядали для визначення стану здоров'я і небажаних побічних реакцій, і при цьому пухлини вимірювали два рази на тиждень.
Мишей піддавали евтаназії, коли їх пухлини досягали кінцевого показника об'єму пухлини 1000 мм або через 60 днів, залежно від того, що відбувалося першим. Ефективність визначали виходячи з затримки росту пухлини (ТОЮ), збільшення медіанного значення часу до кінцевого показника (ТТЕ) і виходячи з аналізу за допомогою логарифмічного рангового критерію відмінностей за кривими виживаності Каплана-Мейера для мишей, оброблених АОС, порівняно з мишами, обробленими РВ5. У перших п'яти контрольних мишей, оброблених наповнювачем, у яких був досягнутий кінцевий показник, відбирали зразки пухлин, які оброблювали шляхом фіксації в формаліні і заливки парафіном.
Результати
На фігурі 4ї показано, що ГМ75 ОМІ1 ї ГМ75 ОМ4 демонстрували аналогічно незначну протипухлинну активність і пролонговану виживаність у ксенотрансплантатній моделі СО 0205 на голих мишах з аденокарциномою ободової і прямої кишки порівняно з контролями. Всі обробки легко переносилися і не спостерігалися клінічні ознаки токсичності. Ці дані дозволяють припустити, що АОС, спрямовані на І М75, наприклад, ГМ75 ОМІ ї ГМ75 ОМ4, можуть забезпечувати клінічну користь при лікуванні пацієнтів-людей з раком ободової і прямої кишки.
Приклад 22. Токсичність моноклональних антитіл до 175, кон'югованих з ОМІ і кон'югованих з ОМА, відносно макак-крабоїдів
Шість самців мавпи рандомізували у дослідженні з 2 мавпами/група. Наповнювач (РВ5), або
ГмМ75 ОМА (що розщеплюється), або ЇМ75 ОМ'І1 (що не розщеплюється) вводили два рази (в день 1 і день 29) шляхом внутрішньовенної інфузії тривалістю 15 хвилин при 0 мг/кг/доза (РВ5, наповнювач), 5 мг/кг/ доза (75 ОМА, що розщеплюється) або 10 мг/кг/доза (75 ОМ'1, що не розщеплюється). Відбирали зразки крові для токсикокінетичних досліджень перед початком введення доз (день 1) і через 1, 2, 3, 7, 14, 21 і 28 днів після кожної дози. Відбирали зразки крови для аналізів відносно клінічної патології перед початком введення доз (день 1) і через 1, 3, 7, 14, 21 ії 28 днів після кожної дози (момент часу 28 днів після 1-0ї дози також використовували як момент часу перед введенням дози для 2-ої дози). Всіх експериментальних бо тварин піддавали евтаназії і проводили некропсію після останнього забору крові в день 57.
Виділяли плазму, відділену з кожного зразка крові, заморожували і транспортували в ОхТога
ВіоТегарецшісв, Іпс. для аналізу відносно концентрації АОС за допомогою ЕГІЗА.
Дані клінічної патології, пов'язаної з обробкою, включали слабковиражену регенеративну анемію і тимчасові зменшення кількості клітин лейкоцитарного профілю крові, найбільш значні для кількості нейтрофілів. Анемію спостерігали як у тварин, оброблених 5 мг/кгІ/ 75 ОМА, такі у однієї з двох тварин, оброблених 10 мг/кг ЇМ75 ЮОМ1. Важку нейтропенію з максимальним зниженням кількості нейтрофілів через один тиждень після введення дози і швидке відновлення їх кількості спостерігали у всіх тварин; при цьому максимальне зниження абсолютної кількості нейтрофілів було меншим у тварин, оброблених ЇМ75 ОМ4. Не спостерігали впливу на параметри коагуляції АРТТ ї РТ, пов'язаного з досліджуваним препаратом. Зміни хімічного складу сироватки включали тимчасове підвищення рівня А5Т, СК, І ОН (у 1 з 2 тварин у кожній групі обробки) і глобуліну після введення 5 мг/кг 75 ОМА і 10 мг/кг ГМ75 ОМ'. Крім того, спостерігали тимчасове підвищення рівня ферменту АТ, специфічного для печінки, тільки у тварин, оброблених ЇМ75 ОМ4. Невелика тривалість і/або величина підвищень параметрів хімічного складу сироватки дозволяли припустити, що вони не стосувалися небажаних явищ.
Були відсутніми дані, пов'язані з досліджуваним препаратом, одержані за допомогою аналізу сечі. У ході обстеження при некропсії після 4-тижневого періоду відновлення були відсутніми дані клінічної патології, пов'язані з обробкою, або зміни абсолютних і відносних значень маси органів. Дані гістопатології лише для щитоподібної залози (зміна морфології колоїдного вмісту у фолікулах) і нирки (розширені канальці у зовнішньому шарі коркової речовини) класифікували як мінімальної важкості; не пов'язані зі змінами інших досліджуваних параметрів, і як такі, що не стосуються небажаних явищ, і як такі, що мають мінімальну токсикологічну значущість.
Висновок: обробка багатократними дозами при двох дозах - 5 мг/кг ЇМ75 ОМ4 або 10 мг/кг
ЇМ75 ОМІ1 добре переносилася макаками-крабоїдами. Всі дані для токсичності, пов'язаної з обробкою, одержані після 4-тижневого періоду відновлення, вказували на її оборотний характер.
Приклад 23. Установлення характеристик епітопа для І! У75 Аї за допомогою аналізу конкурентного зв'язування з використанням сортування клітин з активованою флуоресценцією (ЕАС5)
Коо) Спосіб
Клітини СОГО205 (АТСС, Мо у каталозі ССІ -222) відділяли від матрасів для тканинних культур за допомогою СеїЇ Зігіррег (Сеїдсго, Мо у каталозі МТ-25-056С1І). Клітини промивали і ресуспендували в буфері (РВ5 я 295 ЕВ5), нейтралізовували поживним середовищем і рахували. Клітини висівали при 50000 клітин на лунку в 96-лунковий планшет з лунками з МУ- подібним дном. Клітини промивали один раз буфером БАС5 (РВЗ (Різпег, Мо у каталозі
ЗНЗОО28-03) я 295 ЕВ5). Додавали тАБ до І 75 (вибране з прикладу 1) або І 75 А1 у лунки при вихідній концентрації 250 нМ, і здійснювали З3-кратні серійні розведення, і вносили у відповідні лувки протягом 45 хвилин на льоду. Досліджуваний вміст лунок, для якого було потрібно один або декілька етапів забарвлення, за необхідності витримували в буфері ЕАС5 для забезпечення одночасного завершення останнього забарвлення для всіх досліджуваних умов. Вміст двох лунок з буфером ЕАС5 залишали незабарвленим як контролі.
Після інкубації з блокувальним антитілом клітини два рази промивали буфером ЕАС5.
Клітини ресуспендували в буфері ЕАС5, який містить тАБб до І У75, кон'юговане з МСС-ОМІ1 (1
НМ), та інкубували на льоду протягом 45 хвилин. Клітини промивали, як описано вище, і ресуспендували в буфері БЕАСЗ з додаванням 1 мкг/мл антитіла миші до майтансину, і інкубували на льоду протягом 45 хвилин. Клітини промивали, як описано вище, і ресуспендували в буфері ЕАС5, який містить 2 мкг/мл антитіла кози до каппа-ланцюга Ід миші, кон'югованого з КРЕ. Клітини інкубували на льоду протягом 45 хвилин, потім промивали, як описано вище. Клітини ресуспендували в буфері ЕАСЗ при 200 мкл на лунку. Середнє значення інтенсивності флуоресценції для кожного зразка визначали за допомогою проточного цитометра
Сцуама ЕазуСубе Ріиз НТ (формати 9б-лункового планшета), і при цьому первинні дані аналізували за допомогою Сцама Суїозоїй.
Результати
На фігурі 5а показано, що блокування з використанням тАБ до І У75, кон'югованого з МСС-
ОМІ, приводило до зниження зв'язування тАр до І1ІУ75. Аналіз зв'язування І У75 АТ з клітинами СОЇ 0205 продемонстрував, що І У75 А1 є нездатним блокувати зв'язування тАб до
ГЖ75, кон'югованого з МСС-ЮОМ'І1 (див. фігуру 55). Таким чином, можна визначити, що тАб до
ЇМ75 і 1М75 АТ не є конкуруючими антитілами, і при цьому ГУ75 АТ розпізнає відмінний і унікальний епітоп І У75 порівняно з іншими антитілами до І У75. 60 Приклад 24. Установлення характеристик епітопа для 175 Аї за допомогою мікроматричного аналізу з використанням пептидів
Спосіб
Мікроматричний аналіз з використанням пептидів здійснювали в С Зсіепсе5, Хьюстон,
Техас, при цьому, стисло, спосіб включав наступні етапи: синтезували безперервні 8-мерні пептиди білка І У75, що перекриваються за однією амінокислотою, які охоплюють залишки 216- 1666 білка І У75 повної довжини, і іммобілізували на мікроматричному чипі. Чип містив три панелі, так що експеримент проводили в трьох повторностях. Мікроматрицю досліджували з використанням ГМ75 АТ для ідентифікації пептидів, з якими зв'язувалось антитіло. Аналіз зв'язування здійснювали за наступних умов: мікроматрицю, що містить безперервні пептиди в трьох повторностях, промивали за допомогою 1 мл буфера для зв'язування при 4 "С протягом 20 хв. Потім її інкубували з 1 мкг/мл ЇМ75 Аї в буфері для зв'язування (рН 7,0) при 4 С протягом 2 год. Матрицю ще раз промивали за допомогою 0,5 мл промивального буфера при 4 "С протягом 30 хв., потім інкубували з 25 нг/мл кон'югату антитіла до ЇдДО людини з АЇІеха 647 в буфері для зв'язування (рН 7,0) при 4 "С протягом 1 год. Матрицю ще раз промивали за допомогою 0,5 мл промивального буфера при 4 "С протягом 30 хв.
Потім матрицю сканували при 635 нм і з РМТ 500 ї реєстрували інтенсивність сигналу.
Пептид класифікували як виявлюваний, якщо він був присутній щонайменше в 2/3 припустимих дублюючих проб. Середню інтенсивність сигналу для повторностей представляли як кінцеву інтенсивність сигналу.
Результати
Як показано на фігурі 6, антитіло ЇУ75 А1 характеризувалося специфічним зв'язуванням з рядом пептидів, розміщених на матриці. Максимальний рівень сигналу, що спостерігається для зв'язування з І У75 А1, становив 25000 (шкала 1 - 65535), при цьому середній рівень сигналу для всіх плям на матриці становив приблизно 885. Інтенсивність сигналу, що дорівнює 3000, встановлювали як точку відсікання фону, зумовленого неспецифічним зв'язуванням. Виходячи зі спостережуваного рівня інтенсивності сигналу зв'язування з антитілом ідентифікували послідовності, що утворюють епітоп для І У75 А1. Дані області показані на фігурах ба - б| і під
ЗЕО І МО: 22-31.
Приклад 25. Аналіз /М75 А1 з використанням пептидів за допомогою методики співосадження
Спосіб 1.11 Аналіз за допомогою методики співосадження
Рекомбінантний білок І 75 розщеплювали шляхом триптичного протеолізу білка, зв'язаного з гранулами (Рготеда, США). Одержані у результаті розщеплення пептиди одержували за допомогою колонки С18 для виділення (Тпепто Різпег зЗсіепійіс). Потім очищені пептиди інкубували з 200 мкл гранул білка А, зшитих з антитілом ЇМ75А1, протягом ночі при 4 "6.
Наступного дня відбирали незв'язані пептиди, і при цьому гранули два рази промивали 1 мл
РВ5. Пептиди, зв'язані з антитілом, елюювали з гранул шляхом їх нагрівання при 90 "С в 100 мкл РВЗ протягом 5 хвилин. Цей етап елюювання повторювали. 1.2 Мас-спектрометрія
Зразки аналізували за допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії з використанням системи Умаїег5 палодсСОШІТМУ ОРІ С, обладнаної колонкою палодсСоОШІТУ РІ С
ВЕН 130 С18, 75 мкм х 250 мм (186003545) і ТО Огрігар Меюз (Тпепто Різпег Зсієпійіс).
Пептиди елюювали з використанням градієнта зі збільшенням кількості ацетонітрилу від 395 до
З5 90 зі швидкістю 300 нл/хв. протягом 120 хв. Одержували мас-спектри в режимі повного сканування при роздільній здатності 60000 у діапазоні маси 4400-2000 маса/заряд з використанням Огрігар. У кожному циклі відбирали двадцять пептидів, що характеризуються найбільшою інтенсивністю, для СІЮ сканувань М5/М5 у лінійній іонній пастці з джерелом іонів наноспрею, яким обладнано пристрій. 1.3 Аналіз амінокислотної послідовності пептиду
Первинні дані, одержані з використанням ТО Огрігар Меіо5, оброблювали за допомогою програмного забезпечення Мабзсої (Маїгіх Зсіепсе), в якому використовується алгоритм Момж/5е (Ст Віої. 1993 дип 1; 3(6):327-3) для виділення послідовностей амінокислот виходячи з набору піків шляхом пошуку по базі даних послідовностей, що складається з Епзетрі (пиру/лллмли.епзетбі.огд/Іпаєх.піті), ІРІ (мимлу.ері.ас.иКк/РІЛРІпитап. піті) і зміз5Ргої (пер/Ляимлму. ипіргоїогу) разом з послідовностями білків-контамінантів. Критерії ідентифікації пептидів включали розщеплення трипсином, до 2 відсутніх сайтів розщеплення і різні біологічні і хімічні модифікації (окиснений метіонін, модифікація цистеїну ММТ5 або йодацетамідом і фосфорилування серину, треоніну і тирозину). Пептиди, яким присвоювали ранг 1 при 60 очікуваному значенні 0,05 95 або менше, ступені збігу спектрів 28 або більше, завантажували в базу даних ОСАР. 1.4 Розпізнавання пептидів, асоційованих з І 75
У способі ідентифікації /М75 використовували пептидні послідовності, одержані експериментальним шляхом за допомогою мас-спектрометрії, як описано вище, білків людини, що зустрічаються в природі, для ідентифікації і упорядковування кодуючих екзонів в опублікованій геномній послідовності людини. Ці експериментально визначені послідовності порівнювали з базою даних ОСАРФ), яка була зкомпільована шляхом обробки та інтеграції множини пептидів, сигнатурних послідовностей пептидів, ЕТ і загальнодоступних даних геномних послідовностей, як описано у міжнародній патентній заявці УМО 2009/087462.
Результати
Результати аналізу пептидів за допомогою методики співосадження з використанням антитіла ЇУ75 А1 показані у таблиці 1 нижче і на фігурі 7. Пептиди, які були ідентифіковані при обох елююваннях пептидів Та і 16 в аналізі за допомогою методики співосадження і в мікроматричному аналізі, вважалися найбільш імовірними кандидатами для утворення епітопа.
Таблиця 1
Порівняння експериментів з мікроматричним аналізом пептидів і співосадженням пептидів
Пептид, ідентифікований за допомогою Пептид, ідентифікований за допомогою аналізу мікроматричного аналізу з використанням методики співосадження
Область З (амінокислоти 761-780) СМ/НЕМООВ (765-772)
Область 4 (амінокислоти 883-901) ІЗЕЖМРІООНЕТУЗА (877-890)
ЕРМТЕРСЕЕСІ УМ5АК (896-910)
Область 5 (амінокислоти 1029-1040) ЕСТУЗМЕНРІ УЗИ (1030-1044)
Область 6 (амінокислоти 1077-1093) НЕМ5І СОК (1084-1091)
Область 7 (амінокислоти 1107-1118) ОТГ ОМАБЕТУК (1099-1109)
У таблиці 1 показано, що ряд областей, що перекриваються, пептидів ЇМ75 були ідентифіковані як у мікроматричному аналізі пептидів, так і при обох елююваннях а і 16 в аналізі пептидів за допомогою методики співосадження. Вважалося, що дані області, найімовірніше, містять епітоп, розпізнаваний антитілом І М75 АТ, оскільки вони зв'язуються з
ЇМ75 А1 при дослідженні за допомогою обох використовуваних методик.
Коо)
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ШІ
ЕМО МЕЗССІОЇ МКРОСІБІ ВІ БСААЗИагєТУЗМАМ МОУ УВОАРО 1 АТ УН, кагеємуУавІікЗКктраатТрмААРМОСАВЕТІЗАВОБКМТІ М ОММ амінокислотна |5ЇКТЕОТАУМУСТІРЄМУЗЕрУМУСОСТІ МТУЗ5
РМОМтТО5РББІ БАБМОаОВМТІТ СВАБОБІБОМІ БМУООВРОКАР 2 АТ МІ, МІ ІМААЗМІ КТамРЗАЕЗаБазатовТІ ТІЗТ ОРЕОБАТУМСО амінокислотна | ОБУВ5РМУТРООСТКМБІКА даддідсадсіддідададісюдддададасподіааадссддеадададісссНадасісі
З АТ УН, ссідідсадссісіюдсісаснасадіаасассідаїдадсідддіссдссадасісса нуклеотидна дадааддддасіддачюдонддссдіайаааадсаааасюацдаідадасаасада сіасдсідсасссдідсааддсадайсассаїсісаададаїдансаааааасасосід іаїссааадаасадссідаааассдаддасасадссдііанасідіасдантдаа дідаНадстодасіасюдддадссадддаасссіддісассадісіссіса дасдіссададасссадісіссаїссісссідісідсаїісюнддадасададісассаїс 4 АТ МІ, аскдссдддсаадісададсайадсдасіашааднддіаїсадсададассаддда нуклеотидна аадссссіаассіссідаісіаюдсідсаїссаашааадасюдаодісссаїсаадайнса дідасадддаїсідддасаданісасісісассаїсадсасісідсаассідааданнд саасдіасіасіцісаасададнасаддіссссоіддасдйсддассаадддассаадд тддаааїсааасуа
АТ УнН СОН, МАМУМ5 амінокислотна
А1 УНН СОН, ВІКОКТОСИатТТроУААРУОС амінокислотна
А1 УнН СОВ3З, ЕаУУ5ЕрУ 7 амінокислотна
АТ МІ СОВІ, ВАБОБІБЗОМІ 5 амінокислотна
А1 МІ СОВг, ААБМІ КТ амінокислотна
АТ МІ СОВЗ, ООБУВЗРМТ амінокислотна
МНЗІ|3- 15/04|411| ЕМОЇ МЕЗОССОЇ УКРОСБІ ВІ БСААЗИЕТЕЗМАМУ МОУ УВОАРИ 11 кагеємуУавІікЗКктраатТрмААРУКОаВЕТІЗАВОЗКМТІ М ОММ
ЗІ КТЕОТАУМУСТТТТУТ
РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТ СААБОВІЗЗМІ МУ МООКРОКАР 13 012 КОПМААББІ ОБОУРЗНЕЗОВОБаИТОЕТІ ТЗІ ОРЕОБАТУМСО
ОБУ
МАТОУАТРААРАСІІ МІРУ ЕБЕОГАЕРБИВААМОРЕТІ НОМ
ГМ75 (ОЕС- 205) | ЯКСІКРИМСОУМАВОСОЕТЕОКІ МКУМЗОНАГГЕНІ НЗОКСІ СІ.
РІТК5УМЕЇ! АМЕЗСОЗАМІ МММ/КСЕНН5ЗІ УХИААВУВІ А КОС Н
СТАІЗМАБОУМУККИасавзЕЕБІ СРОРУНЕМТАрамемавРСЕЕРЕ
ПратмнНнорсі рЕонЗаРМСАТТІ ММЕМОВКУ ІСІ КРЕМОСЕ
ОМ ЕКМЕОРОЗСМОЄМТОТАЇ ЗМУКЕАУУЗСОМОСАОІ 5ІМЗА
АЕГ ТУ КЕКЕСІАКІРМ/ЛОЇ МОЇ М5АВСОМ ЕМ ЗОНКРІ МЕРІ МУ ОР
ОАРБЗАРТІССЗОСАВМОАЕБОГМОБЕЗСЕАОЇ РУМСАКРІ ММТ
МЕСТОУМ/ ТУБОТАСОАСУ РММИаРСМИ ММЕЗМЗУ ОКАНАКСК
АРББОГІЗІНБІ АОМЕМУМУТКІНМЕВІКЕЕМУЛИЇ КМІМІР ТЕО ратЕМТ ТтУМмОєЕМЕРММРУМКТРМСУБМІ СЕ ЯОМКМОЗСЕЕК
ГКУУСКАКИаєЕкІі МмрАЗЗОКМСРРОЄСУМКАНОЕТСУКІМЕОЕМР гатМмсмМі ТІТ5АРЕОЕМІ МОЇ МККМОоКВІ АКУРУТОГ роса
ЕУММАТУССААВВАМТЕЗМУУ МЕ ЕРАБРОССМАМТОКВМИакМ
ЕМКОСВА5ЗЕКАЇ БІСККМЗОРІ аРЕБЕАЗРКРООРСРЕСУМОЗЕРА
ЗІ ЗСУКМЕНАЕВІМАКАМУ/ЕЕАЕНЕСОАЇ САНІ 55ЕЗНМОБІКЕ
ГНЕСТрОгЗаИаОнНУУлЛаї МкАЗРОЇГОСБУОМЗОАТРУЗТІИМР
МЕРООСООЮМОІВОСААУКМЕНА РМ АВОМНЕМООРЕРІМІ АРЕАСО
ТКГЕМУМСОІРКЕВТРКТРОМ УМРОВАС ІННИ РР ПЕСЗЕММ МАО
ІГНЕМУМЕЕАМІ МСАЗМНЗЕГАТІТЗЕМаї КАІКМКІАМІЗСОЮСОКУУМ
ІВІЗЕМРІООНЕТУЗАУРМУНАЕРМТРСЕЕСІ УМЗАКТУЛ ОЇ СКР
ТОСЗТКІ РЕІСЕКУМУМЗБІ ЕКУЗРОБААКМОСЗЕОМЛРЕОМКСРІ.
КІКРИБТЕБОАБОТОНЗУСИТІ Р2ОМІ БОТЕООРІТ5І І РОМЕАТІ.
МЛОГАМ/ТАМЕКІМКУ ТОМА ЄСТМЗМЕНРІ УБИВ ВІРЕМЕРЕЕЕ
ЗАУНСАГІ МОКЗРЕТаТтММЕТСЗЕВНЕМ5І СОКУЗЕМКВНО
ТГОМАБЕТМКМІ ММІ МКПРКТСТУУНЗАКАЕСІ КЗММОЇ МБІТОРУ
ООАРІ ЗМОАГІ НМЗБІ МИ Е5ОВОБЇ МЕсУМУуЗраквВІ НЕЗАУМА
ЕТМСОЇ ЕОСУМІ ОТрИагмуУКТУОСМОМОРСОАІСУУБаИМЕТЕКЕМ
КРУОБУМКОРЗРМІ МТ РУЛРЕОМССУМЕПТКМАНМАТТОРЕМНТК
СОКІМРКБНІЇ ЗІВОЕКЕММЕМІ ОС МЕМУМАБУ УМ СІТМАМК
ЗІ МУ РОКТРІ БУТНУ ВАСАРТІКМЕКР ГГ А, ЗТОСЕМОІЮТЕКМІ
ЕЕАМУМЕНОНБЗІ АСКІЕММОУКЕЕУМТТ РОЄЕМРМЕрСІМЗМІОКК
МІМУЕАЇ ММОБОЗИасНІ АБУНМОМСИОЇ РГЕОІМКАОСЕРІ ММС
І 5БНООЗЕЗЗЕЕМЗравзтеОМмРУКООТ5РОМСМИ ОРКИАТУУК
НЕКСМУЗУКОСАЇІСУКРТК5ККІ 5ВІ ТУ55ВСРААКЕМОЗВУМОУ
КансуквроАі НЗЕЗЕАККІ СЗКНОН5ОЗАТІМЗІКОЕОЕМКЕМ5ВІ.
МАВЕМММІТМАУМЛ/ Са ЗОНУ РОБМ ЗУ ВСЗЕМТЕУМКМЕМКОК
ЗСаМаВСЗ5МИАЗМЕТМККМЕСЕНОЕГОЯВМУМУСКУРІ СРОМУТАЇАПМ
АТІ ЗІ М ІМОСІ М/БЇ ЄОВНВІ НІ АСЕ55УВУАОСМУМЕОЕЇМІ РОЗ ЕНО
АТ МН ЕВІ ЕМОЇ МЕБОСОІ МКРОСБІ ВІ БСААбОЕТУ5
АТ МН ЕВ2 МУВОАРОКОЇ ЕМ УС
АТ МН ЕВЗ ВЕТІБВОО5КМТІ МІ ОММ5І КТЕОТАММУСТІ
АТ МН ЕВА МСОСТІ УТУ55
АТ МІ ЕВ! ОМОМТО5РББІ вАЗМОаОЮВМТІТС
АТ МІ ЕВ? МУООВРОКАРМИ ЇМ
АТ МІ ЕВЗ СМРУОВЕ5О5О5ОТОЕТІ ТІСТІ ОРЕОБАТУУС
АТ МІ ЕВА ЕСОСТКУБІКВ
І м75609-618 | МЕМКОСВ5ЕК
ІЇм75651-662 |РАБІ 5СУКМЕНА
І м75 761-780. | РУВВОМ/НЕМООВЕРІМІ ВРЕ
І У75883-901 | ООНЕТУЗВУРМНВЕРМТЕС 28 І У75 1029- ВЕЇ ТУ5МЕНРІ ЇЇ. 1040 29 І У751077- ЕТ5С5ЕВНЕМ5І СОКУ5 1093
І м751107- ТУКМІ ММІ УКІЇ 1118 31 І У75 1368- ЕАМУЕНОНЗІЇ. 1378 32 І м75 1518- ККІ 5ВІ ТУ55С 1528 33 І У75 1535- МОЗВУЛОУКОаНСУКОООАІ Н 1554
І м75 877-901 | ІЗЕМ/РІОНЕТУЗВУРМНВЕРМТЕС
І 75 1099- ОТГ ОМАБЕТУКУІ ММІ УКІЇ 1118
ІЇм75883-892 |ООНЕТУ5ВУР
І У751077- 37 1091 ЕТ5С5ЗЕВНЕМ5І СОК

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло або його антигензв'язувальна частина, які зв'язуються з І У75, причому вказане антитіло або частина містить: а) варіабельну область важкого ланцюга, що містить: її першу МАСОК, що містить 5ЕО ІЮО МО: 5; ії) другу МАСОК, що містить ЗЕО ІЮО МО: 6; і ії) третю масок, що містить 5ЕО ІЮ МО: 7; і р) варіабельну область легкого ланцюга, що містить: її першу мСОРм, що містить ЗЕО ІЮ МО: 8; ії) другу МСОК, що містить ЗЕО ІО МО: 9; і ії) третю міСОК, що містить ЗЕО ІЮ МО: 10; де виділене антитіло або його антигензв'язувальна частина містить ковалентно приєднаний цитотоксичний лікарський засіб.
2. Виділене антитіло або його антигензв'язувальна частина за п. 1, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка характеризується щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю амінокислотної послідовності з зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну область легкого ланцюга, яка характеризується щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю амінокислотної послідовності з ФЕО ІО МО: 2.
3. Виділене антитіло або його антигензв'язувальна частина за п. 1 або п. 2, де вказаний цитотоксичний лікарський засіб вибраний з групи, що включає майтанзиноїд, доластатин, геміастерлін, ауристатин, трихотецен, каліхеаміцин, СС1065 та їхні похідні.
4. Виділене антитіло або його антигензв'язувальна частина за п. 3, де вказаний цитотоксичний лікарський засіб являє собою майтанзиноїд, вибраний з групи, що включає ОМА і ОМ1.
5. Фармацевтична композиція, що містить антитіло або його антигензв'язувальну частину за будь-яким з попередніх пунктів разом з одним або більше фармацевтично прийнятними розріджувачами, наповнювачами або носіями.
6. Спосіб лікування раку, опосередкованого експресією І У75, що включає введення пацієнту, який потребує цього, антитіла або його антигензв'язувальної частини за будь-яким з пп. 1-4.
7. Спосіб за п. 6, де антитіло або його антигензв'язувальна частина інтерналізується клітиною, яка експресує І У75.
8. Спосіб за п. б або п. 7, де вказаний рак, вибраний з групи, що включає рак підшлункової залози, рак яєчника, рак молочної залози, рак ободової і прямої кишки, рак стравоходу, рак шкіри, рак щитоподібної залози, рак легені, рак нирки, рак печінки, рак голови і шиї, рак сечового міхура, рак шлунка, лейкоз, переважно гострий мієлоїдний лейкоз або хронічний лімфоцитарний лейкоз, мієлому, переважно множинну мієлому, і лімфому, переважно дифузну великоклітинну В-клітинну лімфому (0 ВСІ), В-клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мантійноклітинну лімфому, лімфому з лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАТ), В-клітинну лімфому, збагачену Т-клітинами/гістіоцитами, лімфому Беркітта, лімфоплазмоцитарну лімфому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, лімфому з клітин маргінальної зони, Т-клітинну лімфому, периферійну Т-клітинну лімфому, анапластичну великоклітинну лімфому та ангіоїмунобластну Т-клітинну лімфому.
9. Спосіб за п. 8, де рак вибраний з групи, що включає рак сечового міхура, рак підшлункової залози, тричі негативний рак молочної залози і СІ ВСІ.
10. Застосування антитіла або його антигензв'язувальної частини за будь-яким з пп. 1-4 у виробництві лікарського препарату для лікування раку, опосередкованого експресією І 75.
11. Застосування за п. 10, де антитіло або його антигензв'язувальна частина інтерналізується клітиною, яка експресує І 75.
12. Застосування за п. 10 або п. 11, де вказаний рак вибраний з групи, що включає рак підшлункової залози, рак яєчника, рак молочної залози, рак ободової і прямої кишки, рак стравоходу, рак шкіри, рак щитоподібної залози, рак легені, рак нирки, рак печінки, рак голови і шиї, рак сечового міхура, рак шлунка, лейкоз, переважно гострий мієлоїдний лейкоз або хронічний лімфоцитарний лейкоз, мієлому, переважно множинну мієлому, і лімфому, переважно дифузну великоклітинну В-клітинну лімфому (ОВС), В-клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мантійноклітинну лімфому, лімфому з лімфоїдної тканини слизових оболонок (МАЇ Т), В-клітинну лімфому, збагачену Т-клітинами/гістіоцитами, лімфому Беркітта, лімфоплазмоцитарну лімфому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, лімфому з клітин маргінальної зони, Т-клітинну лімфому, периферійну Т-клітинну лімфому, анапластичну великоклітинну лімфому та ангіоїмунобластну Т-клітинну лімфому.
13. Застосування за п. 12, де рак вибраний з групи, що включає рак сечового міхура, рак підшлункової залози, тричі негативний рак молочної залози і СІ ВСІ.
БО ІВ Мо: 11 нМОгБУвБассТУКРОСЬ ЕТ 5СААВОСЕТЕБМНАЙМБИУВОАРОСКОГВИМОВІКЬКІ ПОСТ.
ЗВО ІВ оОМОої 1 БУОГУВОоОО ТП уКРОСВ ВО СААВСЕ ТУ ЗМАЙМОИУВОАРОКОТЕМУСВІКВКТОССТ ЗВО ІВ Мос: 12 нини нн кн на пи и
ЩЕОЯЯЕ З СЯЄ Я Я У ЯЗ ЖК че СУК ЯК ЯК ЯК НЕ ее Я че А ЯК СД ЧЕ Ж КОКО ЯК Зк Я ЯК КО ЯК Я Че Як Че ЗЕМ Як ЧТ Ве ЧЯЕОСЖ 5ЕО ІП о Мої: ТІ ПУААРУКСВЕТІВВООБЕМТТУГОММОІКТЕВТАУУУСТІТТУТ ня ЗВО ІП Мо: 1 рУААРМОСВЕТІЗВОВОВКМТІХТОММВІКТЕОТАУУУСТІВОУУВЕрУТСОСТІУТУВ В ЗЕО ІВ ОМОоЇ: 12 чт трлн тт тт о ХУ ЕПОС МИТИ
ЖЕ т Се сЖКО т Е жЖ ЖК е Жов Ж ЗК ЖЕ КО ЖЖ ЯК Вк ЖЖ те КОЖ ск Жокою Ен вве Ве В я
Фігура 1
5ЕО І оМої: 2 ПУОМТОБРББТБАВУСВЕМТІТСВАВОВІВО ВИ ООВБЕОКАРМСІТУААВНІЕТОМР 5 5БЕО ІВ Мо: ІЗ ПРІОМТОБРОЗБІБАВУОПЕМТІТСКАБОВБІВО МИТО ОКРОКАРКІТІчІТААВВІОВОСУР ФЕО ІВ МО: ТА нин
Кот Я яко Ж жо о Теж Ж Ж зесю ж ЖЖ Я ок ек ж жов: ЕКО во кож я ЖЖ жожСкоКОк, ж косою БО 10 Мої: 2 ЕЕБСОСООТОЕТІТЕ5БТТОРЕПЕАТУУСООБУВОРИТЕСОСТКМЕТКЕ, 5КО І Мо: ІЗ вЕЕБСеСеСТРЕТІТІБВБОРЕПЕАТУТСООДТУО т ЗВО І Мо: 14 ситет Пон т С ЗО ОТЕОСТКМЕТКЕ,
ЯКОЮ Ж жк Ж С ж ж Ж Ж Ж ж ж ж Ж вк жи ни ак в я Я Же Я
Фігура 2 г в 2 щу - яр ося ї- Я-ш -8 в. - щ о Е мо Е Е що В Е, во у ою ко й ре в - В Фе Кк ' : ' | се ! даху ! | ! | 8 шо : ! | р ! не еу : | ! | ' ше яе ж я
Б. а А | ' ! ! а ЧИ 15 ! | ше ши РЕ ДИ | 5 «В о лм | я Ше є ЛІД В Фе Гай з Я І а і ! рт ! р Н І ; ! Н Ши" Ин х и ун | | вав рік СУД | і ! В р я і Ф і і оф сах 4 Фе ! Н ! Н п ря ще ваш ; І Ї 5 ря с, г | те | | Є ж й Як з : Фо | і І 5 КУ і ! | ! | | Бе ! і 5 ЧЕ Шьш Е ! дов ф ч Е | -а Ше ! ! ! | Гв ше че Я шиьш Н к : | Н ! і «ай З о в Шо ж чайну. 5 « | -В шк 0 Щ | ' | 7 ШЕ БМ ові і и і є і і ! я Фе І і ! і шк чАЧчУчЛнНнИ | я 7" «й кі шЬьш за ЖЕ ж. Я ва ! Несе о ЗННКННННН НН ка щш г щ р ня е : 5 5 5 : с 5 ща Ф - із 5 ої. чех омзахо имени онЕнНЯщОн ниця поонІВІЕЗМИЖ ЖННІвЕНЕ Зоо Фігура За ї Фо 175 АТОМІ й че ; о1у75 АІ-ОМА о Контрольне антитіло до 1.75, сх що о ж кон'юговане з МІ Б М Контрольне антитіло до МУ 75, І кон'юговане з ОМА вою ще и чи ї 00001 9001 001 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура З 120» т ж 1у75 А1-ОМІ1 вд чк Ше шо у75 АІ-оМА 8 й " сні у й Ж Контрольне антитіло до 1.7 75, іс во я ї і кон'юговане з ОМІ А 3 т Контрольне антитіло до І У 75, й хА кон'юговане з ОМА їж ; ; - іх ї 5 40 ч як о І ; 00001 0,091 0,01 01 І 19 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зс
Фе 175 АТ-ОМІ ня 00 чаш жк у шоїу75 А1-ОоМА я : ' Контрольне антитіло до ГУ75, їх що хі Ї й кон'юговане з ОМІ В щі ! У Контрольне антитіло до 175, г до ; ; Я кон'юговане з ОМА з 5 я 40 а - і Фе й ; оч 00001 0,001 Щ 001 0,1 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура За
140. в 1575 АТОМІ ж ие еоу що я 75 АІ-0МА4 о ; У Контрольне антитіло до 1.75, се 50 ; і а кон'юговане з ОМІ З З т ц я Контрольне антитіло до МУ 75, і ' ! їх кон'юговане з ОМА я о . ! 0,0001 0,001 0,01 0.1 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зе у й ЧЕ ЧИ е 1у75 А-ОМІ но о «І У ЖЖ ОУ75 АТ- Ома
- . с Ь Контрольне антитіло до І/Л75, в 8 се а кон'юговане з ОМІ е й Ь Контрольне антитіло до 11/75, ке г ; і кон'юговане з ОМА «в ! то » 00001 0001 Щ 001 0.1 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура З 12В ФО1У75 А-9ОМІ1 Ь панна Чак ; Ж О175 АТ МА в у " ; Й Контрольне антитіло до 1.75, ш БЕН : " М Я З конюгованез ОМІ я Ь ; Ж Контрольне антитіло до 1,75; - У кон'юговане з ОМА р й оч ту 00001 0,001 001. 01 1 10. 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зо ж 1075 АТБМІ в ес Ж ; ; шо 1775 А1-0М4 2 З ; Контрольне антитіло до 1.75, ш В Е Фо конюгованез ОМІ | Що Контрольне антитіло ло У75, й з кон'юговане з ОМА ї шк 5 яв Шо Кї Ех і А ж 00001 0,001 0,01 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура ЗП А а 1575 АБОМІ т. зе щем щу Як я, ; жк шо у75 дІ-ОМА з І че З й Контрольне антитіло до 175, Е ро У КУ з 7 конюгованез ОМІ В х У З ж Контрольне антитіло до 1175, в 3 Кк 3 кон'юговане з ОМА ж Я "ча й фін реннрнкрннннння 00001 9001 001 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура 31 ев.
й а 175 АТОМІ що а зе вн жо їу75 А1-ОМА Б і І ї Контрольне антитіло до 75, о 86 ії: ж і Йо кон'югованез ОМІ ія х У Її Що Контрольне антитіло до МДУ 75, - У м ї кон'юговане з ОМА -2 У Я 5. Фе Е- ЧИ
00001 0,001 001 01 1 10 100 Кенцентрація (нмоль/л) «Фігура Зі Ти ж а ! і їхУ5 А1-ОМІ1 з | ооо що я ! МОУ АІ- Ма З | й о дл Контрольне антитіло до І/ї75, тт Я Зх кон'юговане з МІ рі | А Зк Контрольне антитіло до І/Х 75, де | "б. х кончоговане з ОМА ; й | я оч ; 00001 0,001 001 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура ЗК
Ж.
і. жо 1475 АОМИІ ня енннеконенен ! ЩО 1у75 А-ОМА » в з Е за ЧІ в ЕХ й: вй І З ' З «а в о : 00001 0001 0.01 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура 31 5 ак 1Уут75 АЗ-ОМИ ІЗ рю яОу?5 ді-оМА в я кі. ; Її з 00001 0001 0,01 0 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зт я 175 АВМ зо 175 А1-О0М4 в ло і ь в З в Гей а Х, -- В ї ін с З ; чен 00001 0001 0,01 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зп мо ще зе 75 АБОМІ 2 ж - Д» Яся й я хх з жх : хв - ЕВ БЯ х я хх Фе ов і ЕЕ - - ; : 000010,001 001 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зо о щ 175 АТ-ЮМІ -- Аа, е тек, ж 1575 А1-ЮМА о ше ж с т а т Кк: - Ше о : : 0,00010,001 901 о 1 19 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зр 120 я 175 А1-0МІ1 : ц Ж Оу75 АТ1-0МА4 ЕЕ ї ї х Е 40 й з й і 00001 0,001 0,01 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура За
1 з 1У75 А-0МІ1 в ! ж 1575 АТ-0МА З ; що Ва - ї (зі -Е Ж ш в що 0 щ У КЕ 0,00010,001 щЩ 001 01 1 10 1600 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зг й 175 АТОМІ те що ' шо 1775 А1-ОМА о т Во ; ЕЗ Е ЕТ ; : З чо й ке а ; ; 0,00010,001 0,01 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура 55
15 -а ЇХ75 А-ОМІ «ше 1775 А-ПІМА ї З З ЗИ Я ОО Х й Й щ - я ЕС Що) їй З - 50 ,
5 . В 00001 0001 001 Щ 01 І 10 то Концентрація (нмоль/л) Фігура 3ї 1809 ее 175 А-іОМІ с- Я ОгУ?75 ді ЮМА - о й ! Я в ЕЕ х лин щі Ех ше - Е , яв хе Енн вини пики нин мини нини 00091 0,001 щЩ 001 01 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура Зи
«ан 175 А-ОМІ «Ще 075 А1-0МА -
(2 8 чо6 остов, ; я во 50. х Е: к о 9,001 0,01 91 1 10 1600 Концентрація (нмоль/л) Фігура ЗУ 150
«фе |у75 АХАЮМІ і: ЗО у75 АЗ-ОМА о Ге ; ро 3 е ; зи Е у в ; ко во с 8 - 5 о нн б,оо01 ФО о 1 10 100 Концентрація (нмоль/л) Фігура ЗУ що Ж - Як - Е БЕ В ях БЕ БЕ в ЕЕ т ге чу ш ВОшООЕСЕ щоб шо. х Ж вт бом в БОБ о- ж -- М Б : : Н : НЕ : : Н : пит В ! ! ! чо ЩЕ ех я ії : : і : Тщ ве : ! ша : Пт енлення : : чо : : : КОС ож : : 4 і х, яру : ше ? 5 ос : р і ! Ше в М с : ! | ! " шо : : : : те я ВИШ Ех Що : : Я : о: я в Ж а їх г х -х га г. ка «я (ок) НН хи Хр дОо ЕнННнавене знігадоу Фігува а ях - З - х В я шОООв - яв щ що Єож - їх пе що тя о ОЛЕЇЖ - ОО Ж ЖЕ Е Б БВВА в об що А в ж Ж вк ов щ З р-ні т кл ша; : Я : : Е ; : : : ще ; | | | Ш- ! Ще : ; ! | : ! : що : ЩІ : : - Я ! : : : ж ! : : чщ : : з ! й-ч : - : Н : » ї : тобщі В тощо : : ото : : : ож Я : ! Праннеь : На : їв : | па: ше АВ Н Н : : Н : т 4 т тоже т ! : | ! : Б ше Н : : ; : : : с : : -ш- Я : : | Я : : ! НИ.
ЧЕ МНЕ Я : : | Я Я : ! я ж ! Н : : Н : : : : еВ Н : : : і : : Н : М БЕ -Е ! : : : Я : : ! ша ше : : | : Я : : : ЕОМ: од Н : Н ; Н : : Н І БІ : Н Н : : : : : : М: ш ! : : | Я : : ! Вк ж - Ф ш У ш 5 ш ш ю - К-Я Ф -- - с Те к - Ск) нн хли Амздо Енновене знгзбау «Фігура 4
- дж ра д ЕВ нг е щ НКУ я В Ех що ЗЕ МОН ШИШОК шої ал Б В ю сшоя Мох вот йон оВвоВ о б в ввнборш во о-ви М 1 , Е ; ! Ї |! І : те | гов : : А ТО ; : їдь І НУ ї а : ще їх Н ньо Ве : : ! м. тю : : й : іч БО : й в хі г. : ; о ої : Н є : ї Но Б І : х ; | гово Н : м 5 ї НИК ав у, | ЕЕ ча даже : : то : - І ож поем : ' ее іш ! фея : ше: ія : : й | З ше : : : ще.
Не їж : : ! ово Чи ШУ : Е ше ШИ: п Гая ца ш їй сі г У тт Семи) ннигхи ХРіздо ЕННОвеНЕе ЗНЕОЧОУ Фігура 4є в Б.В ЕЕ в я ї її я у є, й А ух в - тром нт а - вен а ж вд шт хх та БЕН еЕ ТЕС Е пила пелилилек чаги ша ШИ у : : і гоже : я і : : Я о ше: : НУ і : : Я : Зв Моя : ! : | Я ІЗ : ! : : Не і : Ша: ЩЕ : : ше : ! сні ! ! в ЩЕ ! : : : : : т: і і : : «що : 1 І ! : Ь : : пе : - мс : : Ша р : о: і : : : : : МВА Ше 5 : ! : в ЖК в ! : У, йо а У. : У: : : : : : : о Ной ше ще С(кк) иннхХн лико ЕННОвоНЕ ЗНІПадЧаЗ «Фігура ча
ЕЕ жоожосвоя ско вд жав що Чт чу с В, ткож А ія ще В ЕІ жов т вм Ве я що. В она он нок КР и ше 2 Зк ВН ; Ї 2 у я сте ЩЕ Ь : Мер є ї Лі У Кі ля і Мих Щі Кк х ц є зу ях . ше ше ; во ш з 1 «
і. 4 Ок Ех: т ; в во-нА СК і Бог га: я ь Со я кл і: (хм) нннихлн лк оо ЕННЗвЕНЕ ЗНІГО Фігура че ва а -; шов в за
2. ш- Но ож М ш е ХЕ я дов що БО Я щи ВЖЕ дБ БУ В ЕлвлАЯ і г ІЗ а яв | | ЕЕ ж Н ші те с : с : й 17 : : ) «54 ! ! і хож Н : з ч ' : їттш : ! і : й тож Ж ше Й : Н ї Н : Тоді їз ! | : са | і. : ! Я ! 5 | і» ш : : : : Вр : ї- В с ат Н і : : - В : лі ще З Б т У Но тю (лек) нникХАп АМо до ЕнНнавенЕЗзНиКадЧаЗ Фігура ЗЕ щ ЕС Б" з Р33 ів. ; Я 8 Во 8 ко й. 8 їй 20 з б їй 0,0001 0,01 І 100 10000 НМ неміченого блокувального піль до 1175 Фігура ба 8 Зоо "шк як 2 8 А т че В зо 5 0 Фе 00001 0,01 І 100 10000 НМ неміченого блокувального 175. А1 Фігура 5Ь
! Область. 1 ! луною оо зоою ОВ суда на В отрОМКв - : 5 ММ : е з хе тех жк ЖЖ ож ! в и не пе: І : Пептиди
Фігура ба : Область 2 ! Е сво ТЕ В свои : «ав Ж М вк т 1 с я я є « сх. й - : п ни В Й как шк ви М А : Пептиди
Фігура 65
Область З ВНУ : В щ Ми 2 - ГУ КУ що оібою : : З 31: ши мк Ж 5 ЗК х ш «353 5 3 35553 З х ЗЕ З х5 1555 а з "їх їХхщ 53:53:53. 35,35 55 ев по же шко же нс нн НИ НН НН НИ: й а ко Й вк к. є ще шк АКОТ рин НС - с ЗІ За Й Пептиди Фігура бс : Область 4 : : Мою В : Н е КУ : що шщКюю | х : В Ш бо маю ще : ро шк ШЕ: : В й І а лем Ум МХ КЗ Х : ІЕЕ шк ШЕ: ЩЕ ще : ШЕ ОО Мих МОЖ ЖК ЕНЕЙ І в ші щі ши І щі й Ба : чини чи жи чи и чини чне : ие а НН : КО м НН В НО : : і и в о а СО ЗМ С ЗЕ ВИК -Ж : : Пептиди : Фігура ва
Область 5 : «оба : Я вд в : бооідях - : В 18пИд ГУ : ж ,|: 5 М 5 ХЕ : В хх 5 5 : Щ ово Жде М ол б б ок ов : о ши в о й с о хо В А С о о а ВК : Пептиди : Фігура бе ! Область 6 Бе АТМ в КУ 8 НН ХУ т ТММ У Е КУ в «(З 5 Її 5 З сАЕ-А ПІНИ т І роз нн: с НН С НА С НН Са ! о й й цк : м В З ВЕ З МО В ЗО В М ЕОМ : Пептиди Фігура б
Область 7 Еш й ІЗ т т Воюме В БЯ ї ї ; ї жо Мом жо В : : о зн ЗІ жо : Пептиди
Фігура бе Область 8 з хнНю : в здох : ВаАУХКИОМ Ки ЕНОВНУ пептиди УКЛ НС е Фігура 6
: Область 9 : опа : і : тому : В : о І во їЇЗооо : : НАВИ : ООН : о І Б : : чім : Я : з : : ККУ ДРТ». БК ВЕУ, ВІКО : : Пептиди : Фігура бі : Область 10 : вх ЗМО : Ви : Ва ! : Б : по роопе : В : Во сопло У Ж Кк х КУ З : я Ш НЕ ШЕ в.
В : В М В хх ЖК ХВ КЗ : : : КВК де же де ів б о р ки ее ШЕ : се З З В В и В В М : : Пептиди : Фігура бі хвоімепан це ЛЮКИ МЕГУМТКМ КУ ую КУЛІ ЕсСИВАМЬКІТІМЧЦОМ КОТУ КУМ В ОО тміспелемимМ СДЛЮюкаєня Ма на аа а а а п а а п а в в В кв снеки НЕзлицеМмКе соки кех 1; оно ово о нон оо в о В Но КК ТИНИ мисі уУкоди «Иикжноєма й дет тт вет тю юю ж кю юю т кю я юю тютюн міольиммим замов имя ХЕ питні юні іт я ви км тю нюх зроїзщаЗ: цтУ ДИЛКИЕ ЕЖТНРЕЦЧКИУВЦНК КК ІМЗО МИНЕ ШИ ЗАМКОВИХ ак УлЕ Млеценпхули оламнаемло м ЖТКИКІДМ ення я ЖЕД МУ ШЕ
М сеУдлміє слрхихнеях ЛЕ нач нн нн НН м ни а Місцпецтеци суююьання їх нин п м а п в п п п п п п в а МішостпметямАм елевинмл ДЕ чн а а а а а шрот ЯУ Сх ПИДУМА ТЕТ ТА БЕН ЛИВО КОВКА ТАКЕ ОКРУЮЕИК ЦИМ ВИ Ммієценуоди еикжкаєма Ах тес ТКА МА ЛИКУ ІТК ет ння Миспепеиим сяюувиацня З пк ню кн ЕЕ СТВ ЕДЕД М Т тт ння ме-даецеици слюгваний їй ен ння ян кн «ПІД ВИКЦЕХН ЕК АК нн нн МлоцімУЄДМ МІХ КОКМО ДЕ иа в в в а о од в м а п а ідо кх ПОХеЦЮМ, ни СН м с в п п п п п о п п п п п «рого зі Мет ЛЮДИНА убір найинкь ум Ер Кк ЕД ВИМ ПИТИ КУТУ я Млецтепуюди зикжванца Мх тя тт тя ля тт линяння тяж ятати тліти тних миспелтиим емдиживимя М нн КДЖ тт ння цпе-лецімцо спюсоднух ТЕ мих клетанх ешанту чити пт ит пт ілі шину уночі млецемУЄМИ ЄМИХнобМо ДЕ нн а а а а и а а і о м кроспаодлзі фр ЛЮДИНА МКЕЛУУЕТУНО МТУ НЕЗАВИ ТТ КЕКИТМЕТЛМЕНЛОМУ АК ВЛМИВИВи 0 Мгопецтмцю елюбьанвя тд пт т т нт тн т ня тн ДВІ КУКА тт тн Миспейтнкм ехиюканмя 1 нн а а а а Пшслнцтмню Фахюиноя ТИ нн С поси ВН Мо-пемтими оспюомвмищо 2 нин а ви но о в о в о п п в в о в о о м в по о а тво податі Бут» ДюЩИНА МЕНЕМАЗАКТ ІК ЕМО РЕ РУМЯТУКу ТМ НИ 10 мЕзлЕЦЕІМЦІ слюФОХКОХ ТИЙ вих лента ех ну их інки чих ин шим нічия МлецинУЄєКИ енкжнОоюМІ ЩЕ нн о а и Мисзнитимо есуюткхнех тя по няння ння т т я т я т тя нт Млецеммани емежзнио ПЕ А МЕ М А М п а ап а и А и и А а а А а о А п м Ач Мозпемтеди сибюванна де хропе БЖ МИНА СЕМИ ТП ТИТ КИ ЕКО АКТ ВОГ ТЗІ ТАКУ УТІК ІК О Я МЕ еЗнІНМИЄ «ВХ ОХ ТИ нини нини нн нн а нн в НВ Я Мосценйкоди єикжнанмо З пиляти и и я жи я т тт т я ЗІДДМАЛІНЕХ Мтедецтмції спумаачия ЇВ ни а а а а а я хо сПпвЗадя БУРИ ДЕШИНУ ОН МІДТКТУК КЕ ЕК УВІ ХК ВМ ВИК ВЖИ МЕлдімимєю елухиюмиом їх УМ ТЕДДІ я хни я ДДТУ я Млопецтуади зикюрвлних Ще УКЕДФК зи нт ин нн нн нин КОДИ УТ ДК міЕЗптлтмАМ ЄлЕшиОВИХ дах пенні км мання ня ння ни ня ян имя маже цмикеа лужним ТЕ нн и р м а р п п М хроібспаажі вже пууинА ПКМУ КЕ МАЕ МОВ ЕКО К Ким ТТ КТ МЕЖ РИМ УТ ЕЕЕОХ КАЄ МІленпестмкамМ о виммисих їх нн а в а в о в п в а в п м в в п о п в в в в зшоуеммми кижювамия 1 пи АН А хХлепмімММ МЗюМеоММЯ 1 ке ин п в в в в о в в п в миснесткдм ткисжнотх п нин о туоіпемяуч: тт ХКИКМА ХВрІМКХИУйі КУуМ НИ Кр ІЩЕ КУ АЕН АОМОСІЧЬМ б МІеМмссмаМм емітент Кн У МЛ АЛИИХА В УМА пн нн ння муспетткуй слмитхних У и в А м ос нив ВВ МлетпмІМОМИ хПЖЮВОМИУ 7 мин па В и С С ВК вс КК ою па о в п ах МоепетекдМм смпкеиєМия п ння У КДД МВА КВ ння пропити дет МИЛА ТТЗКЕШУТКИЦУТЕСКІ КИ ВІСК МшО гі ЕЕвНТК ув РЕВЕ ОК хисіжцемиМ зм лЛима зи ША ЕУКИ Н ДМД ДЕ и них чими Мпенпсетохам спіхжхамя Мі нн нн ня нн нн ння МЕ рЯпУМУє олюбеиних їЗ пи А НИ МистмІй НИМ сежюВоМНа нн а п п в п в в в й п м п о в о в вм ісепесткдх вел МУКУ УК тн нн тн нт ню нн нн ХАЩІАДТКЧЕ пори маЯятч дугу хюдинаА Щи УВДИНМУИПЕ ЕКО ТІК ВИХ ИНУПКІ МЕНЕ КАК ЗИ шОжеМмІиЄрМи шижювОоМмиХ 5 НН НВК ВДК кН нн нн нн ння и ВЕ МлепмімЖжММ МОМ МцЯ МЕ пит ЕДДІ А ут тт ит яти тити тити яти т птн ти МИ хаспсаєкох сх икмонх їх пн о п й в о а п п о п п не МЕстУлиМих киююваМия її по п а звО1сеоі4й БУТ ВКА ПОКИ КУЦ ТЕМЕ ТІСНО Е ОО ВАЧИУЕНАВНАКЧМНЕ ВЕЖ ЖІ ТО Ммосмтетмом екмєям їх пити РУД ТАМИ Му им т Мисгєптмуй хиюювоМцЯ 1 ПДЗШМОКМ СІ ТЕУЕТХ ІМ ВС т нт ни няння Хаспептийи спюЮюВОММу бо нн а п о о п в Ло п Меслсптмуй злюЕеИКНЯ я нина па аа а а а и п а а п о а а о о а аа зем х жк жи юю юю ж юю юю жи М ОКДЕНЕТІТККЕТ ХЕ мІотолишамі ТТЛ вл шеУу де ЕК Кум ПМ НКУ МТ ТАТА МУ ТОМАУМУХЕАУЛТХ ХУ хаспстемам ткмкшномя їх п а а я пполецтмци епюбедких ї мона нн ни и о о нм нн а о п м о м а о а а в а Мом єми спжювеМмий ох и и а нн м о Міснветехам Фхмхиснх п; нн в о в о в п м в п п п м м о о в в п п п в в в в в а ткоібммЯзо пут ЯКДКЯХ ДаЕЗНЕРОУТИТЕМаОКАІКМКІАМІШСТОИЦМАХКІСЕЖРІСЬКНЕТУШЬУРУНКРЕЖТХ Зо МаепліитиМм схо мМм З кими м мм ми мим ик я ДМЕ ТАКИ ТЛА с АТХ МмІенпесемамМ симсямекх нн в а п п в в о п п В о п В з п а Мисититими плюиелних її нини в а м м м м м в п і п п п п в п в МаспшелтияХі чІидюВенмЯ г она а и аа о и о п п о п п п о о п п п о п п п п о о п о о п п п п в и р о в в а імемстУках тини пн п п и п п в о п о а ххх ха хготулаят МГУ МАЛКНА ВЕКТУХМІАМТЕНИ МАХИ ТУЛИЕТНИЕУТ ПКТ ЕЛ Ву ПАКТ АЦТ ЕМ И Мисскіитмує хикмвамих З ЗАДУМАТИСЬ ОМ МмасциптилМм слюювенмї М птн т МТ БЕН ТЕТУ тт ТЕЛ ит т МИТИ МмиепстехлУ Фиужжмимх пд нан в ин кВ о в ал м нн и ни в м в Миссемихимй хмемеамих зи я ЛИТІ М НЕТУ и ххх т хи жах хообйчблачі цу пюДИНЕ ви со кв КК ОА М ОО ОКО Зо АК о УНК ОВ писпептмми «любейким 15 вав оо о п о п в о о п о в п в п в в по п п о а о р о п о о п а п в вва м-снпетовммо кажужемно ЛЕ ен а в вн в в в в в п в в в п в в писпецтини спюююаиня ба пола а а а в в а о п о п по п о п о п о п о п о п п в п п о о п пп п вва Мизожуикели семеро ПУ п і р в в п і п о р в р і п п п п о в п п м тротожоє я їх ДКЛИНА кімнкитьмЕхутОльЕньцьскс Ві вЕктиЕЕЕКаТНоАівиоКоКЕуТМНитИ опо Мдспептейм о емрекмхм я Шен зим ДТ ОМ ТИ ВК НА ВЖЕ ЕЕ МВТ МІК пит ит Мленсттомию соютезниє 1 дент нення тн не нт яня няня ТМ ОКИТІДІДЮет няння мисоивииви «пюМБаМня йх Мотя я ліття тут іх тля тя литяя тля тля яд ліття тт лиття тя тт МиспмлтваМм миски ицях 1 вимити им мим тини тим мими іепоУ гм мен ВЕЛИ Буття тя тт тт ня УЖ со псбатя: ПУТ» ХИДИЗА ПЕВНЕМЕЦСКУВЕХЕ ЕРА ТУ МНМА УКВ ТИМ М МІеспесскую Фоюмеонна АК НН ЕМ НН ДТ ДМЕ ТКЕЖНЕДК ння ня Мисперпткиці смюування АК НЕЗМІННА т пЕзеєнкеди бМмежкхнолх тя нин и п м м п п м п п п п п м п п п п п п п п м п п а п в в МосипзитилМм слюшехний С на а и а а о м п п п п м В п п м п м в п в п о а о пелпестицо ПЕКИ ТЕ ен КО ДИДУ ХУ няння ян ння шеосОпебляці Деу МИХ ІТ УА ММОМ ЖИМ МІХ МЛК, ДИ хмиспергтмдіи шВвкемема їх бум и им и их их мли лит или мли ит и ик ями тля мисом ня яки сиехмснх т» На а а А А А А А А Маспалтккм слежихния СА п Удепествимо соююезМмно ЛЕ жи ж и и ж ж гИи-лецтнци нн и р в п а в п хвоя Би лених СТІК МЕТУ МІОМИ ХУ ПТ ТЕКЕУК УПМ ВЕА М ЛИХО МЕ поМумцИи Миски ЗИМи ЩА ПА п и п Мзаєптени мкм нинем о Л о а а а о а а а Моптуткиє спююеакиа З ння тая кн а нт я тт кн нт нн ню ан ння кн Маспжітико тпюмБоммо ЛЬ пли ями я тт ля ми т м т ті тя ли мк т п ин т кт яво0ЕОЯЯЯІ УЧИ ПЮПИНА ТЕМИ МУт тону Кок РихНЕ ІКЦ КЕНнкУ ОВУ УМОВУ Й міт мтали смежжоце ла пн аа в в В ЦО, о в м в в в а Мосспелтисю Фоаюгтааний 1 М КОД ко дав в За и свв о о в о и о ов а а Ммислпестице сбаживоМмна Ди шини попки тю я міння мотка тя ни мя МФ пи емркоимя пе пи а а а а а а роб БУ» МЮДИБА МЕН ЕСКТОВУ ТЕ рАСКИТАКЛЕКЕ КЛ ЬЕТУТКМОЛО ТИКИ ЕЕМУХ ЕН ИХИ КИЙ МлоційтнаМ слюковнза їз «ДІЖВЕСКТУ ВО ТІ опитати ниття ниття тити тя Жаепермгх аююсвлМмицх ЗОМ ния ня ж т Мшфолецумюци схахжоння да оду на в В а п п п Мизоєнтєди ихжЕнняМ ЧТ вжи и и хх и яю юю кю я іпемалвмих п нм п п п а в о о НКИ моє пут МЮлуМА мікнУстТмЕЖсП троха ДУМКИ У ТМ КИ ХИХ Мосепессхню союювомне 1 па а в п а а я хижолепакци зпюмотТиНя ДЕ Мт пит пиття пиття тя піт плит петля пт тт тт тот тт тт тт Мизоєптеди сеижнезх ле пива на о о в А а в п в в о о в п в в в а о В маейслтисм сдюхмойний ТУ фінан ват тові та тіні тні вн тні тіні тн кін тіні нт іт їепессико трогобмав: дуУТ ЯБЛИМА ПЕРТУКЕЛЄ Ву УС НОВЕ ПТО ТАКИ ДУВ КИТИ Й МіІспегттиую саютвакня із на а а а а п а а м а а мпсопецтици Ємююванни М Пт тт тт тт тт тт тт тт тт тих тт тт тт тт МітемазУдМм сем я ман в в в в о в в в в в в в а в Ми спейтким еоюмохкнай З она а а о о в а а о і в о а о в о о в о п о п о в а вро ГО604491 175 ЛЮДИНА КСМБУКОСАТСУКРТКВККЬОКЬТУЗБВСРААКЕМОБВВМІОУКОНСТКОРОАТНВЕВЕАК 1550 МБ-пептиди. елюювання 18: яння ян Ме-пептиди елюювання 10 плини и о в в о и п п о и а и М5-пептиди елюювання а пн нн п о по п по по п п п по п п п по п М5-пептиди елюювання 2 нн нн і п п п п п п о і і п п п и нн пс-пептиди пл УККОБВОТуУВВ- СО - - МОВИ ТОУКОНСУКВПОАБН-- 5 вро ГО604451 рУ75 ЛЮДИНА.
КЬСБКНОНВАТІУВІТКОЕрЕМКЕУВВСМЕЕМИМІТМВУШЬСТвОНВУВОБИБИТОСВЕУТ 1620 Мб-пептиди елюювання їа ----НІНБАТІУБІКОЕРЕМКЕУБЕ---- нн Мб-пептиди елюювання 15 -----НІНБАТІУБІКРЕРЕМКЕМБА- -- з тик Ме -пептиди елюювання а ----НІНБАТІУБІКОЕОЕМКЕУБВ---- Нв Мо-пептиди елюювання 72 нин нан п п а а о п п а о в па и Пс-нпептиди пяляпплляттятчтоттт тт вро 1060449; БуУ75 ЛЮДИНА ЕУЕМЕМКИКВСУСВСОМІТАБМЕТИККУВСЕНОСКСВУУСКУВІСРОХТАТАТІУАТІВТІ: 1680 Мб-пептиди елюювання Та Ялти С МЕСЕНОКСВ- -- Я Мб-пептиди елюювання 1 пляяятятияяттт нн З МЕСЕНСЕВВ- 5-5 пх Мб-пептиди: елюювання а яння плин пп М8-пептиди елюювання 2р. пн п п по і о п в о и и о о а о и о п ан с-пептиди ттллятяттяптяляптляттлттл тт тп ллптя тля вро ГО60449| ТУт5 ЛЮДИНА, МММОСТІМЕСЕОВНЕСНІАСЕБОУВУАОСУМЕСЕТМОРБЕНІ 1722 Ме-пептиди елюювання Та нини нин нин п и і п о п о и а и М5-пептиди елюювання То пиття лятитллятя тт Мб-пептиди, елюювання га я І Піт Ток т о тт Мо-пептиди елюювання р печити пс-пептиди тля тт
UAA201604040A 2013-10-11 2014-10-10 Кон'юговане антитіло до ly75 для лікування раку UA119047C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361890104P 2013-10-11 2013-10-11
US201361890098P 2013-10-11 2013-10-11
PCT/GB2014/053057 WO2015052537A1 (en) 2013-10-11 2014-10-10 Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119047C2 true UA119047C2 (uk) 2019-04-25

Family

ID=51795649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201604040A UA119047C2 (uk) 2013-10-11 2014-10-10 Кон'юговане антитіло до ly75 для лікування раку

Country Status (33)

Country Link
US (3) US10081682B2 (uk)
EP (1) EP3055331B1 (uk)
JP (1) JP6657075B2 (uk)
KR (1) KR102357173B1 (uk)
CN (1) CN105745224B (uk)
AU (1) AU2014333563B9 (uk)
BR (1) BR112016007402B1 (uk)
CA (1) CA2926324C (uk)
CL (1) CL2016000770A1 (uk)
CR (1) CR20160156A (uk)
CU (1) CU24320B1 (uk)
CY (1) CY1124006T1 (uk)
DK (1) DK3055331T3 (uk)
DO (1) DOP2016000072A (uk)
EA (1) EA036927B1 (uk)
ES (1) ES2859604T3 (uk)
HK (1) HK1222869A1 (uk)
HR (1) HRP20210410T1 (uk)
HU (1) HUE055190T2 (uk)
IL (1) IL244884B (uk)
LT (1) LT3055331T (uk)
MX (1) MX365742B (uk)
MY (1) MY174562A (uk)
PE (1) PE20160561A1 (uk)
PH (1) PH12016500580B1 (uk)
PL (1) PL3055331T3 (uk)
PT (1) PT3055331T (uk)
RS (1) RS61620B1 (uk)
SG (1) SG11201602460QA (uk)
SI (1) SI3055331T1 (uk)
TW (1) TWI649334B (uk)
UA (1) UA119047C2 (uk)
WO (1) WO2015052537A1 (uk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3055331T (pt) 2013-10-11 2021-04-05 Oxford Bio Therapeutics Ltd Anticorpos conjugados contra ly75 para o tratamento de cancro
US10260109B2 (en) 2015-05-29 2019-04-16 Universiteit Maastricht Method for identifying subjects with aggressive melanoma skin cancer at diagnosis
GB201703876D0 (en) * 2017-03-10 2017-04-26 Berlin-Chemie Ag Pharmaceutical combinations
US20200347138A1 (en) * 2017-10-27 2020-11-05 Indian Institute Of Science Dendritic cells-targeting vaccine
GB201809746D0 (en) 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
IL308545A (en) 2021-05-26 2024-01-01 Oxford Biotherapeutics Ltd A medical preparation that includes an anti-CD205 antibody and an immune checkpoint inhibitor
WO2023089314A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Oxford Biotherapeutics Limited Pharmaceutical combinations
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4169888A (en) 1977-10-17 1979-10-02 The Upjohn Company Composition of matter and process
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
WO1987006265A1 (en) 1986-04-17 1987-10-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel compounds dc-88a and dc-89a1 and process for their preparation
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
US5084468A (en) 1988-08-11 1992-01-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-88a derivatives
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991017158A1 (en) 1990-05-07 1991-11-14 Scripps Clinic And Research Foundation Intermediates in the formation of the calicheamicin and esperamicin oligosaccharides
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
DE69434136T2 (de) 1993-10-01 2005-12-01 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin-derivate
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5641780A (en) 1994-04-22 1997-06-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrrolo-indole derivatives
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
JP3865418B2 (ja) * 1994-07-13 2007-01-10 中外製薬株式会社 ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体
US6048972A (en) * 1994-07-13 2000-04-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant materials for producing humanized anti-IL-8 antibodies
US5550246A (en) 1994-09-07 1996-08-27 The Scripps Research Institute Calicheamicin mimics
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US20040258688A1 (en) 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
EP0808366A1 (en) * 1995-01-31 1997-11-26 The Rockefeller University IDENTIFICATION OF DEC, (DENTRITIC AND EPITHELIAL CELLS, 205 kDa), A RECEPTOR WITH C-TYPE LECTIN DOMAINS, NUCLEIC ACIDS ENCODING DEC, AND USES THEREOF
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
JP2000503639A (ja) 1995-12-22 2000-03-28 ブリストル―マイヤーズ スクイブ カンパニー 分枝ヒドラゾンのリンカー類
ATE332372T1 (de) 1996-05-29 2006-07-15 Derek Nigel John Hart Rezeptor von dendritischen zellen.
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6939545B2 (en) 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
AU3087801A (en) 2000-02-04 2001-08-14 Molecular Dynamics Inc Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of geneexpression in human breast and hbl 100 cells
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6900016B1 (en) 2000-09-08 2005-05-31 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with inflammatory autoimmune disease, methods of detection and uses thereof
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
IT1320715B1 (it) 2000-10-19 2003-12-10 Cselt Centro Studi Lab Telecom Modulo generatore di circuiti per la decodifica di codiciconvoluzionali, metodo per la generazione di tale tipo di circuito e
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2444661A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Use of cd23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
JP4588296B2 (ja) 2001-04-05 2010-11-24 ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ キメラワクチン
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
CA2451465A1 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
CA2453822C (en) 2001-08-03 2011-02-22 Tyco Healthcare Group Lp Tissue marking apparatus and method
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2005536186A (ja) 2002-03-07 2005-12-02 ルードビッヒ、インスティテュート、フォー、キャンサー、リサーチ リンパ管および血管内皮細胞遺伝子
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2003256240A1 (en) 2002-08-29 2004-03-19 National University Of Singapore Recombinant nucleic acid useful for inducing protective immune response against allergens
EP2444409A2 (en) 2002-09-16 2012-04-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
AU2003275126A1 (en) 2002-09-20 2004-04-08 Wyeth Holdings Corporation Hemiasterlin derivatives for treating resistant tumors
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
US20040146948A1 (en) 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
EP1560599A1 (en) 2002-11-14 2005-08-10 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
AU2002953223A0 (en) 2002-12-06 2003-01-02 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Novel therapeutic molecules and uses thereof
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
CA2526339A1 (en) 2003-05-19 2005-02-24 Duke University Polyvalent immunogen
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
FR2855046B1 (fr) 2003-05-23 2005-07-22 Oreal Composition tinctoriale comprenant au moins un precurseur de colorant et un coplolymere sequence amphiphile
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
WO2005067667A2 (en) 2004-01-07 2005-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
EP1747021B1 (en) 2004-05-19 2015-09-09 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Self-immolative linkers and drug conjugates
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
US8273357B2 (en) 2004-07-16 2012-09-25 Massachusetts Institute Of Technology Antigen-carbohydrate conjugates
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP1695981A1 (de) 2005-02-25 2006-08-30 Forschungsverbund Berlin e.V. Verfahren zum Redox-Potential-abhängigen Nachweis von Targetmolekülen durch wechselwirkende Polypeptide
US7608413B1 (en) 2005-03-25 2009-10-27 Celera Corporation Kidney disease targets and uses thereof
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
WO2007018431A2 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
WO2007030571A2 (en) 2005-09-06 2007-03-15 Molecular Image Inc. Identification of targets and development of reagents for testing and molecular imaging of human disease
US7842466B1 (en) 2005-09-16 2010-11-30 Celera Corporation Colon disease targets and uses thereof
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
RU2489423C2 (ru) 2006-02-02 2013-08-10 Синтарга Б.В. Водорастворимые аналоги сс-1065 и их конъюгаты
GB0611116D0 (en) 2006-06-06 2006-07-19 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Proteins
WO2008016356A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 Genizon Biosciences Genemap of the human genes associated with psoriasis
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
US8680293B2 (en) 2007-08-01 2014-03-25 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
NZ585556A (en) * 2007-11-07 2012-07-27 Celldex Therapeutics Inc Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (dec-205)
AU2013201417B2 (en) 2007-11-07 2015-05-21 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (DEC-205)
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
US8540998B2 (en) 2007-12-24 2013-09-24 Oxford Biotherapeutics Ltd. Methods for treating cancer using ephrin type-A receptor 10 antibodies conjugated to cytotoxic agents
ES2458541T3 (es) 2008-05-02 2014-05-06 Seattle Genetics, Inc. Métodos y composiciones para elaborar anticuerpos y derivados de anticuerpos con fucosilación del núcleo reducida
EP2159291A1 (en) 2008-09-01 2010-03-03 Agendia B.V. Means and method for determining tumor cell percentage in a sample
HUE035798T2 (en) 2008-11-03 2018-05-28 Syntarga Bv CC-1065 analogues and conjugates
JP2013500474A (ja) 2009-07-23 2013-01-07 アデランス リサーチ インスティテュート，インコーポレイティド 発毛性真皮細胞を検出する／富化する方法、毛髪脱落を処置する方法における細胞およびその使用
WO2011044452A2 (en) 2009-10-08 2011-04-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for amelioration of autoimmune disease using fusion proteins of anti-dendritic cell receptor antibody to peptide sequences
KR101738203B1 (ko) 2010-04-15 2017-05-19 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
AU2011239525B2 (en) 2010-04-15 2015-04-09 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases
AR085633A1 (es) 2011-03-08 2013-10-16 Baylor Res Inst Coadyuvantes basados en anticuerpos que son dirigidos directamente a las celulas presentadoras en antigenos
GB201220010D0 (en) 2012-11-07 2012-12-19 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic amd diagnostic target
CN103044552B (zh) 2012-12-11 2019-01-29 中国医学科学院病原生物学研究所 人源化的抗树突状细胞表面dec-205分子的单克隆抗体
PT3055331T (pt) 2013-10-11 2021-04-05 Oxford Bio Therapeutics Ltd Anticorpos conjugados contra ly75 para o tratamento de cancro
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Also Published As

Publication number Publication date
BR112016007402B1 (pt) 2023-03-28
CA2926324C (en) 2023-10-03
PH12016500580A1 (en) 2016-05-30
TW201605898A (zh) 2016-02-16
EA036927B1 (ru) 2021-01-15
AU2014333563B2 (en) 2020-03-05
SG11201602460QA (en) 2016-04-28
AU2014333563B9 (en) 2020-04-02
CY1124006T1 (el) 2022-05-27
DK3055331T3 (da) 2021-03-22
US20190106506A1 (en) 2019-04-11
CN105745224B (zh) 2019-11-05
PH12016500580B1 (en) 2016-05-30
MX365742B (es) 2019-06-12
JP6657075B2 (ja) 2020-03-04
US20210371541A1 (en) 2021-12-02
US20160257760A1 (en) 2016-09-08
MX2016004304A (es) 2016-11-10
KR20160065872A (ko) 2016-06-09
CU24320B1 (es) 2018-02-08
PE20160561A1 (es) 2016-06-03
HRP20210410T1 (hr) 2021-04-30
CR20160156A (es) 2016-11-01
AU2014333563A1 (en) 2016-04-28
PL3055331T3 (pl) 2021-09-06
IL244884B (en) 2021-12-01
KR102357173B1 (ko) 2022-01-27
DOP2016000072A (es) 2016-06-15
LT3055331T (lt) 2021-03-25
SI3055331T1 (sl) 2021-04-30
CU20160042A7 (es) 2016-08-31
ES2859604T8 (es) 2022-01-11
CA2926324A1 (en) 2015-04-16
PT3055331T (pt) 2021-04-05
ES2859604T3 (es) 2021-10-04
RS61620B1 (sr) 2021-04-29
WO2015052537A1 (en) 2015-04-16
BR112016007402A2 (pt) 2017-09-12
JP2016533711A (ja) 2016-11-04
EA201690599A1 (ru) 2016-07-29
EP3055331A1 (en) 2016-08-17
EP3055331B1 (en) 2021-02-17
HUE055190T2 (hu) 2021-12-28
CN105745224A (zh) 2016-07-06
HK1222869A1 (zh) 2017-07-14
MY174562A (en) 2020-04-26
CL2016000770A1 (es) 2017-01-27
NZ718617A (en) 2022-03-25
TWI649334B (zh) 2019-02-01
US10081682B2 (en) 2018-09-25
IL244884A0 (en) 2016-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7222024B2 (ja) 上皮増殖因子受容体変異体ｉｉｉおよびｃｄ３の単一および二重特異性抗体およびそれらの使用
JP6425644B2 (ja) 結合抗ｃｄ３８抗体
KR101960509B1 (ko) 클라우딘 6 특이적 항체
UA119047C2 (uk) Кон'юговане антитіло до ly75 для лікування раку
EP3219731A1 (en) Anti-ror1 antibodies
UA120247C2 (uk) Антитіло до ceacam5 і його застосування
JP2017500028A (ja) 新規の抗ｄｐｅｐ３抗体および使用方法
UA128081C2 (uk) Фармацевтична комбінація, яка містить антитіло до ly75, для лікування дифузної великоклітинної в-клітинної лімфоми
US9932411B2 (en) Antibodies
JP2021527646A (ja) 医薬組合せ
EA042216B1 (ru) Фармацевтические комбинации, содержащие антитело к ly75
NZ718617B2 (en) Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer