BR112016007402B1 - Anticorpo isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, composição farmacêutica o compreendendo e seu uso, bem como ácido nucléico, vetor de expressão e método de produção de um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno deste - Google Patents

Anticorpo isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, composição farmacêutica o compreendendo e seu uso, bem como ácido nucléico, vetor de expressão e método de produção de um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno deste Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS CONJUGADOS CONTRA LY75 PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER. A invenção fornece anticorpos que se ligam a LY75. Moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para expressão dos anticorpos também são fornecidos. Os anticorpos podem ser usados para o tratamento de câncer, incluindo câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de mama, câncer cólon-retal, câncer esofágico, câncer de pele, câncer da tireóide, câncer do pulmão, câncer da bexiga, mieloma múltiplo e linfoma.

Description

[001] A presente revelação está relacionada geralmente aos campos de imunologia e biologia molecular. Mais especificamente, são aqui fornecidos anticorpos e outras proteínas terapêuticas dirigidas contra LY75, ácidos nucléicos que codificam esses anticorpos e proteínas terapêuticas, métodos para a preparação de anticorpos monoclonais e outras proteínas terapêuticas, e métodos para o tratamento de doenças, por exemplo, cânceres mediados por expressão/atividade de LY75 e/ou associados à expressão/atividade anormal de ligantes deste.
FUNDAMENTOS
[002] O antígeno de linfócito 75 atua como um receptor endocítico para dirigir antígenos capturados do espaço extracelular para um compartimento de processamento de antígeno especializado e acredita-se que cause uma redução na proliferação de linfócitos B. A expressão de antígeno de linfócito 75 foi observada em cânceres pancreáticos, ovarianos, de mama, cólon-retais, esofágicos, da pele, da tireóide e pulmão (célula não pequena), bem como Mieloma Múltiplo e muitos subtipos diferentes de linfomas e leucemias.
[003] WO 2009/061996 revela anticorpos monoclonais isolados que se ligam a DEC-205 humano (LY75) e composições e moléculas baseadas em anticorpo relacionado. Também são reveladas composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos, bem como métodos terapêuticos e diagnósticos para utilização dos anticorpos.
[004] WO 2008/104806 revela reagentes de afinidade capazes de se ligar a LY75 para uso no tratamento ou profilaxia de câncer.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] A presente invenção fornece anticorpos dirigidos contra LY75, ácidos nucléicos que codificam esses anticorpos, células hospedeiras que compreendem esses ácidos nucléicos que codificam os anticorpos da invenção, métodos para a preparação de anti-LY75, e métodos para o tratamento de doenças, por exemplo, os distúrbios mediados por LY75, por exemplo, cânceres humanos, incluindo câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de mama, câncer cólon- retal, câncer esofágico, câncer de pele, câncer da tireóide, câncer do pulmão, câncer da cabeça e pescoço, câncer da bexiga, câncer gástrico, leucemia, mieloma múltiplo e linfoma.
[006] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno deste, que: (a) se liga a um epitopo em LY75 que é reconhecido por um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada, que compreende a sequência de aminoácidos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 1 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 2, ou (b) compete pela ligação a LY75 com um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 1, e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada no ID. DE SEQ. N°: 2.
[007] Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste se liga a LY75 humano e compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende 1, 2 ou 3 CDRs selecionadas do grupo que consiste em CDRs que compreendem os IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6 e 7, e/ou uma região variável da cadeia leve que compreende 1, 2 ou 3 CDRs selecionadas do grupo que consiste em CDRs que compreendem os IDS. DE SEQ. Nos: 8, 9 e 10.
[008] Em modalidades preferidas, os referidos anticorpos são anticorpos isolados.
[009] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção se ligam a LY75 (ID. DE SEQ. N°: 15) e são internalizados por uma célula que expressa LY75, despertam uma resposta de citotoxicidade celular (ADCC) dependente de anticorpo na presença de células efetoras ou despertam uma resposta de célula T citotóxica na presença de células efetoras.
[010] Em outra modalidade, o anticorpo compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve (VRs) do anticorpo particular aqui descrito (por exemplo, aqui denominado “LY75_A1”). Consequentemente, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo LY75_A1 que possui a sequência mostrada no ID. DE SEQ. N°: 1, e/ou os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve (VL) de LY75_A1 que possui a sequência mostrada no ID. DE SEQ. N°: 2. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma primeira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 5; uma segunda vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 6; e uma terceira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7; e/ou uma região variável da cadeia leve que compreende uma primeira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 8; uma segunda vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9; e uma terceira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 10, opcionalmente em que qualquer uma ou mais das CDRs independentemente compreende uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou deleções de aminoácidos.
[011] Em outra modalidade, os anticorpos da invenção se ligam a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada que compreende o ID. DE SEQ. N°: 1, e/ou modificações de sequência conservadoras deste. O anticorpo pode ainda incluir uma região variável da cadeia leve que compreende o ID. DE SEQ. N°: 2, e/ou modificações de sequência conservadoras deste.
[012] Em uma modalidade adicional, os anticorpos da invenção se ligam a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve que incluem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e/ou 2, respectivamente, e modificações de sequência conservadoras destes.
[013] Anticorpos isolados que incluem regiões variáveis da cadeia pesada e leve que possuem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou mais de identidade de sequência para qualquer uma das sequências acima também estão incluídos na presente invenção. Faixas intermediárias aos valores citados acima, por exemplo, regiões variáveis da cadeia pesada e leve que possuem pelo menos 80-85%, 85 90%, 90-95% ou 95-100% de identidade de sequência para qualquer uma das sequências acima, também visam ser englobadas pela presente invenção. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende o ID. DE SEQ. N°: 1 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 1. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve que compreende o ID. DE SEQ. N° : 2 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região de treliças da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica às treliças da região variável da cadeia pesada do ID. DE SEQ. N°: 1, como mostrado nos IDS. DE SEQ. Nos: 16, 17, 18 e 19. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região de treliças de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica às treliças da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 2, como mostrado nos IDS. DE SEQ. Nos: 20, 21, 22 e 23.
[014] Também são englobados pela presente invenção anticorpos que competem pela ligação a LY75 com os anticorpos da invenção. Em uma modalidade particular, o anticorpo compete pela ligação a LY75 com um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2, respectivamente, ou sequências de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idênticas a eles. Em outra modalidade, o anticorpo compete pela ligação a LY75 com um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2 (LY75_A1).
[015] Outros anticorpos da invenção se ligam ao mesmo epitopo ou a um epitopo em LY75 reconhecido pelos anticorpos aqui descritos. Em outra modalidade particular, o anticorpo se liga a um epitopo em LY75 reconhecido por um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2, respectivamente, ou sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas a eles. Em outra modalidade, o anticorpo se liga a um epitopo em LY75 reconhecido por um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2 (LY75_A1).
[016] Em uma modalidade adicional, os anticorpos da invenção se ligam especificamente a um ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 peptídeos selecionados do grupo que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 ou fragmentos destes, em que os referidos fragmentos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos. Em uma modalidade adicional, o epitopo reconhecido pelos anticorpos da presente invenção compreende um ou mais peptídeos, dois ou mais, ou três ou mais peptídeos selecionados do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 27, 29, 30, 34, 35, 36 ou 37 ou fragmentos destes, em que os referidos fragmentos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos. Em uma modalidade adicional, o epitopo reconhecido pelos anticorpos da presente invenção compreende um ou mais peptídeos, por exemplo, dois ou três peptídeos selecionados do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 30, 36 e 37 ou fragmentos destes, em que os referidos fragmentos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos.
[017] Em uma modalidade adicional, os anticorpos da invenção compreendem CDRs variáveis, quando comparados com os anticorpos parentes aqui descritos. Dessa forma, a invenção fornece anticorpos variantes que compreendem regiões variáveis variantes de um anticorpo parente, em que o anticorpo parente compreende uma primeira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 5, uma segunda vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 6, uma terceira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7, uma primeira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 8, uma segunda vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9 e uma terceira vlCDR que compreende a ID. DE SEQ. N°: 10, e em que o anticorpo variante possui 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições de aminoácidos coletivamente no conjunto da primeira vhCDR, da segunda vhCDR, da terceira vhCDR, da primeira vlCDR, da segunda vlCDR e da terceira vlCDR, com de 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2 substituições de uso particular, e em que o anticorpo retém ligação específica a LY75.
[018] Os anticorpos da invenção podem ser de comprimento total, por exemplo, qualquer um dos seguintes isótipos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos como, por exemplo, uma porção de ligação de antígeno ou um anticorpo de cadeia única (por exemplo, um Fab, F(ab’)2, Fv, um fragmento Fv de cadeia única, uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada ou uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas). Os anticorpos podem ser qualquer tipo de anticorpo, incluindo, sem limitação, humanos, humanizados e anticorpos quiméricos.
[019] Em outras modalidades, os anticorpos da invenção estão na forma de um imunoconjugado (ou seja, ainda incluem uma porção covalentemente anexada). Em uma modalidade particular, a porção é um fármaco, por exemplo, um maitansinóide, uma dolastatina, uma auristatina, um tricoteceno, uma caliqueamicina, CC1065 ou derivados destes. Em uma modalidade preferida, a porção de fármaco é DM1 ou DM4.
[020] Em outras modalidades, os anticorpos da invenção ainda englobam uma molécula biespecífica e, como tal, podem despertar uma resposta de citotoxicidade celular (ADCC) dependente de anticorpo na presença de células efetoras matando, dessa forma, células que expressam LY75.
[021] Em outras modalidades, os anticorpos da invenção ainda englobam uma molécula biespecífica e, como tal, podem despertar uma resposta de célula T citotóxica na presença de células efetoras matando, dessa forma, células que expressam LY75.
[022] Em outro aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos que codificam as regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos da invenção. Em uma modalidade, é fornecido um ácido nucléico que compreende uma sequência que codifica a cadeia pesada do anticorpo da invenção ou a porção de ligação de antígeno deste. Em outra modalidade, é fornecido um ácido nucléico que compreende uma sequência que codifica a cadeia leve do anticorpo da invenção ou a porção de ligação de antígeno deste. Em uma modalidade adicional, é fornecido um ácido nucléico que compreende uma sequência que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e leve dos anticorpos da invenção.
[023] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga a LY75 humano, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve codificadas por sequências de ácidos nucléicos que compreendem os IDS. DE SEQ. Nos: 3 e 4, respectivamente, ou sequências de ácidos nucléicos que possuem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para as sequências de ácidos nucléicos mencionadas anteriormente ou sequências que diferem dos IDS. DE SEQ. Nos: 3 e 4 em função da degenerescência do código genético.
[024] Em outro aspecto da presente invenção, são fornecidos vetores de expressão que compreendem ácidos nucléicos que codificam regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos da invenção ligadas operacionalmente a um ou mais elementos reguladores.
[025] Em outro aspecto, a invenção fornece células hospedeiras que contêm ácidos nucléicos que codificam regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve ou as porções de ligação de antígeno destes dos anticorpos citados anteriormente. De preferência, em que a célula hospedeira expressa às referidas regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve ou as porções de ligação de antígeno destas quando a célula hospedeira é desenvolvida sob condições nas quais o(s) ácido(s) nucléico(s) é expresso.
[026] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira compreende: (i) um vetor de expressão de acordo com a presente invenção; ou (ii) um primeiro vetor de expressão que compreende a sequência de ácidos nucléicos que codifica a cadeia pesada do anticorpo da invenção ou a porção de ligação de antígeno deste, e um segundo vetor de expressão que compreende a sequência de ácidos nucléicos que codifica a cadeia leve do anticorpo da invenção ou a porção de ligação de antígeno deste.
[027] Em um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um método de produção de um anticorpo ou de uma porção de ligação de antígeno deste, que compreende o cultivo de uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção sob condições nas quais o anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno deste é expresso e, opcionalmente, isolamento do anticorpo ou de uma porção de ligação de antígeno deste.
[028] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de câncer, que compreende a administração a um paciente necessitado de um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção, em que o anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste é internalizado por uma célula que expressa LY75, o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno compreendendo um conjugado de fármaco anexado covalentemente. Será subentendido que o anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação de antígeno deste, é um que se liga a LY75 (ID. DE SEQ. N°: 15). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma primeira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 5; uma segunda vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 6; e uma terceira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7; e uma região variável da cadeia leve que compreende uma primeira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 8; uma segunda vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N° : 9; e uma terceira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 10 e um conjugado de fármaco anexado covalentemente.
[029] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de câncer, em que um paciente necessitado recebe a administração de um anticorpo ou anticorpos da invenção, ou uma porção de ligação de antígeno destes, e em que esse anticorpo ou anticorpos ou uma porção de ligação de antígeno destes da invenção despertam uma resposta de ADCC na presença de células efetoras. De preferência, o anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno deste compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma primeira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 5; uma segunda vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 6; e uma terceira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7; e uma região variável da cadeia leve que compreende uma primeira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 8; uma segunda vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9; e uma terceira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 10.
[030] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de câncer, em que um paciente necessitado recebe a administração de um anticorpo ou anticorpos da invenção, ou uma porção de ligação de antígeno destes, e em que esse anticorpo ou anticorpos ou uma porção de ligação de antígeno destes da invenção despertam uma resposta de célula T citotóxica na presença de células efetoras. De preferência, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma primeira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 5; uma segunda vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 6; e uma terceira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7; e uma região variável da cadeia leve que compreende uma primeira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 8; uma segunda vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9; e uma terceira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 10.
[031] Em um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um ou mais anticorpos da invenção para uso no tratamento de câncer.
[032] Também é fornecido o uso de um ou mais anticorpos da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
[033] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer pancreático, câncer renal, câncer hepático, câncer ovariano, câncer de mama, câncer cólon-retal, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer da tireóide, câncer da bexiga, câncer gástrico, câncer do pulmão, leucemia, mieloma, preferivelmente mieloma múltiplo, e linfoma. Cânceres particularmente preferidos incluem linfoma não Hodgkin, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de célula B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B rico em células T/histiócitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula grande anaplásica e linfoma de célula T angioimunoblástico, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônica, câncer da bexiga, câncer pancreático e câncer de mama triplo-negativo.
[034] De acordo ainda com outro aspecto adicional da invenção, é fornecido um método de detecção, diagnóstico e/ou seleção ou monitoramento da progressão de um câncer, em que LY75 é expresso no referido câncer, ou de monitoramento do efeito de um fármaco ou terapia para câncer dirigida ao referido câncer, em um indivíduo, que compreende a detecção da presença ou nível de anticorpos capazes de ligação imunoespecífica a LY75, ou um ou mais fragmentos destes.
[035] De preferência, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer pancreático, câncer renal, câncer hepático, câncer ovariano, câncer de mama, câncer cólon- retal, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer da tireóide, câncer da bexiga, câncer gástrico, câncer do pulmão, leucemia, mieloma, preferivelmente mieloma múltiplo, e linfoma. Cânceres particularmente preferidos incluem linfoma não Hodgkin, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de célula B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B rico em células T/histiócitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula grande anaplásica e linfoma de célula T angioimunoblástico, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônica, câncer da bexiga, câncer pancreático e câncer de mama triplo-negativo.
[036] Também dentro do escopo da invenção estão kits que compreendem as composições (por exemplo, anticorpos) da invenção e, opcionalmente, instruções para uso. O kit pode ainda conter pelo menos um reagente adicional ou um ou mais anticorpos da invenção adicionais.
[037] Outras características e vantagens da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada e reivindicações seguintes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[038] A Figura 1 retrata o alinhamento da cadeia pesada de LY75_A1 (ID. DE SEQ. N°: 1), da Linhagem germinativa humana VH 3-15 (ID. DE SEQ. N°: 11) e da Linhagem germinativa humana JH4 (ID. DE SEQ. N°: 12) . As regiões de CDR da cadeia pesada de LY75_A1 estão sublinhadas.
[039] A Figura 2 retrata o alinhamento da cadeia leve de LY75_A1 (ID. DE SEQ. N°: 2), da Linhagem germinativa humana VK 012 (ID. DE SEQ. N°: 13) e da Linhagem germinativa humana JK4 (ID. DE SEQ. N°: 14) . As regiões de CDR da cadeia leve de LY75_A1 estão sublinhadas.
[040] A Figura 3a retrata a atividade citotóxica de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 em HT- 29 e mostra, enquanto a maioria dos anticorpos se liga a LY75, somente poucos exibem eficácia.
[041] A Figura 3b retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em HT-29.
[042] A Figura 3c retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células RAJI.
[043] A Figura 3d retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células Namalwa.
[044] A Figura 3e retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células Karpas 299.
[045] A Figura 3f retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células BxPC3.
[046] A Figura 3g retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células HupT4.
[047] A Figura 3h retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células HPAFFII.
[048] Figura 3i retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células EHEB.
[049] A Figura 3j retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células Mec-1.
[050] Figura 3k retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células AML-193.
[051] A Figura 3l retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células HCC 70.
[052] A Figura 3m retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células HCC 1806.
[053] A Figura 3n retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células MDA-MB-468.
[054] A Figura 3o retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células RT4.
[055] A Figura 3p retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células 5637.
[056] A Figura 3q retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células SW780.
[057] A Figura 3r retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células SCC-9.
[058] A Figura 3s retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células OE 19.
[059] A Figura 3t retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células OVCAR-3.
[060] A Figura 3u retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células SK- OV-3.
[061] A Figura 3v retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células MOLP-8.
[062] A Figura 3w retrata a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células RPMI8226.
[063] A Figura 4a retrata a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células Raji de modelo de xenoenxerto em camundongo SCID de linfoma de Burkitt.
[064] A Figura 4b retrata a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células Namalwa de modelo de xenoenxerto em camundongo SCID de linfoma de Burkitt.
[065] A Figura 4c retrata a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células HPAFII de modelo de xenoenxerto em camundongo atímico nu de adenocarcinoma pancreático.
[066] A Figura 4d retrata a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células SW780 de modelo de xenoenxerto em camundongo SCID de carcinoma da bexiga humano.
[067] A Figura 4e retrata a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células MDA-MB-468 de modelo de xenoenxerto em camundongo atímico nu.
[068] A Figura 4f retrata a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 ou DM4 em células COLO205 de modelo de xenoenxerto em camundongo atímico nu de adenocarcinoma cólon-retal.
[069] A Figura 5a mostra ligação competitiva de anti- LY75-mAb e um anti-LY75-mAb conjugado a MCC-DM1.
[070] A Figura 5b mostra ligação não competitiva de LY75_A1 e um anti-LY75-mAb conjugado a MCC-DM1.
[071] As Figuras 6a-6j mostram representações gráficas da ligação de anticorpo LY75_A1 aos peptídeos de LY75 em um microarranjo de peptídeo.
[072] A Figura 7 mostra um alinhamento de aminoácidos de peptídeos ligados por anticorpo LY75_A1 tanto no ensaio de microarranjo de peptídeo quanto no peptídeo suspenso no ensaio. Peptídeos ressaltados são aqueles que provavelmente formam o epitopo reconhecido por anticorpo LY75_A1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[073] A presente revelação está relacionada aos anticorpos isolados que se ligam à proteína de LY75 descrita no ID. DE SEQ. N°: 15 como aqui descrito.
[074] Além disso, os anticorpos para LY75 da presente invenção podem ser uma molécula biespecífica e, como tal, podem despertar uma resposta de citotoxicidade celular (ADCC) dependente de anticorpo na presença de células efetoras matando, dessa forma, células que expressam LY75.
[075] Além disso, os anticorpos para LY75 da presente invenção podem ser uma molécula biespecífica e, como tal, podem despertar uma resposta de célula T citotóxica na presença de células efetoras matando, dessa forma, células que expressam LY75.
[076] Além disso, os anticorpos para LY75 da presente invenção podem ser internalizados quando colocados em contato com células que expressam o receptor de LY75. Como aqui discutido, o receptor de LY75 está superexpresso e/ou diferencialmente expresso em certas células de câncer incluindo, sem limitação, câncer renal, câncer hepático, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer da tireóide, câncer gástrico, câncer cólon- retal, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer da bexiga, leucemia, preferivelmente leucemia mielóide aguda ou leucemia linfocítica crônica, mieloma, preferivelmente mieloma múltiplo, linfoma, preferivelmente DLBCL linfoma de célula B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B rico em células T/histiócitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula grande anaplásica e linfoma de célula T angioimunoblástico, e câncer do pulmão.
[077] Dessa forma, quando os anticorpos para LY75 da presente invenção são conjugados a fármacos (algumas vezes aqui denominados “conjugados anticorpo-fármaco” ou “ADCs”), a internalização dessas moléculas de ADC em células de câncer resulta em morte celular e, dessa forma, tratamento do tumor.
[078] A presente invenção fornece anticorpos que possuem características estruturais particulares como, por exemplo, regiões de CDR com sequências de aminoácidos particulares. É aqui descrito um conjunto de CDRs que podem formar um reagente de afinidade, por exemplo, um anticorpo, que exibe ligação a LY75.
[079] Dessa forma, a revelação fornece anticorpos, preferivelmente anticorpos isolados (que, como descrito abaixo, incluem uma ampla variedade de estruturas de anticorpo bem conhecidas, derivados, miméticos e conjugados), ácidos nucléicos que codificam esses anticorpos, células hospedeiras usadas para produzir os anticorpos, métodos de produção dos anticorpos, e composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos e, opcionalmente, um carregador farmacêutico, métodos de tratamento e diagnóstico que compreendem o uso dos anticorpos e o uso dos anticorpos para o tratamento de cânceres. Proteínas de LY75
[080] O antígeno de linfócito 75 atua como um receptor endocítico para dirigir antígenos capturados do espaço extracelular para um compartimento de processamento de antígeno especializado e acredita-se que cause uma redução na proliferação de linfócitos B.
[081] De acordo com SWISS-PROT, o antígeno de linfócito 75 é expresso no baço, timo, cólon e linfócitos do sangue periférico. Ele foi detectado em linhagens de células mielóides e linfóides B.
[082] As isoformas aqui designadas OGTA076b e OGTA076c são expressas em células malignas de linfoma de Hodgkin denominadas células de Hodgkin e Reed-Sternberg (HRS). LY75 atua como um receptor endocítico para dirigir antígenos capturados do espaço extracelular para um compartimento de processamento de antígeno especializado. Ele causa proliferação reduzida de linfócitos B.
[083] A expressão de LY75 foi observada em cânceres pancreáticos, da bexiga, ovarianos, de mama (incluindo triplo negativo), cólon-retais, esofágicos, da pele, da tireóide e pulmão (célula não pequena), bem como mieloma múltiplo e muitos subtipos diferentes de linfomas (incluindo DLBCL) e leucemias.
[084] O anticorpo da invenção pode, em certos casos, reagir de forma cruzada com o LY75 de outras espécies que não a humana. Por exemplo, para facilitar teste clínico, os anticorpos da invenção podem reagir de forma cruzada com moléculas de LY75 murídeo ou de primata. Alternativamente, em certas modalidades, os anticorpos podem ser completamente específicos para LY75 humano e podem não exibir reatividade cruzada com outras espécies ou outros tipos de reatividade cruzada não humana.
Anticorpos
[085] A presente invenção fornece anticorpos anti-LY75, geralmente anticorpos terapêuticos e/ou diagnósticos, como aqui descrito. Os anticorpos que encontram utilidade na presente invenção podem assumir diversos formatos, como aqui descrito, incluindo anticorpos tradicionais, bem como derivados, fragmentos e miméticos de anticorpo, descritos abaixo. Em uma modalidade, a invenção fornece estruturas de anticorpo que contêm um conjunto de 6 CDRs, como aqui definido (incluindo números pequenos de alterações de aminoácidos, como descrito abaixo).
[086] O termo “anticorpo”, como aqui usado, inclui uma ampla variedade de estruturas, como será observado por aqueles habilitados na técnica, que, em algumas modalidades, contêm no mínimo um conjunto de 6 CDRs, como aqui definido; incluindo, sem limitação, anticorpos tradicionais (incluindo anticorpos tanto monoclonais quanto policlonais), anticorpos humanizados e/ou quiméricos, fragmentos de anticorpo, anticorpos modificados geneticamente (por exemplo, com modificações de aminoácidos, como descrito abaixo), anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), e outros análogos conhecidos na técnica.
[087] Unidades estruturais tradicionais de anticorpos tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada tetrâmero é tipicamente composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia “leve” (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa (4,1x10-23 kg)) e uma cadeia “pesada” (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 50-70 kDa (8,3x10—23-1,2x10 — 22kg)). Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kapa e lambda. Cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG possui várias subclasses, incluindo, sem limitação IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM possui subclasses, incluindo, sem limitação, IgM1 e IgM2. Dessa forma, “isótipo”, como aqui usado, significa qualquer uma das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas características químicas e antigênicas de suas regiões constantes. Os isótipos conhecidos de imunoglobulina humana são IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE. Deve ser subentendido que anticorpos terapêuticos também podem compreender híbridos de qualquer combinação de isótipos e/ou subclasses.
[088] Em muitas modalidades, isótipos de IgG são usados na presente invenção, com IgG1 achando uso particular em diversas aplicações.
[089] A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis por reconhecimento de antígeno. Na região variável, três alças são reunidas para cada um dos domínios V da cadeia pesada e cadeia leve para formar um sítio de ligação de antígeno. Cada uma das alças é citada como uma região determinante de complementaridade (daqui por diante denominada “CDR”), na qual a variação na sequência de aminoácidos é a mais significante. “Variável” se refere ao fato de que certos segmentos da região variável diferem intensamente em sequência entre anticorpos. A variabilidade dentro da região variável não é distribuída igualmente. Ao invés disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes denominados regiões de treliças (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de variabilidades extremas denominadas “regiões hipervariáveis” que possuem cada uma, 9-15 aminoácidos de comprimento ou mais.
[090] Cada VH e VL são compostas por três regiões hipervariáveis (“regiões determinantes de complementaridade”, “CDRs”) e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
[091] A região hipervariável geralmente engloba resíduos de aminoácidos em torno dos resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1; “L” representa cadeia leve), 50 56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) na região variável da cadeia leve e em torno de 31-35B (HCDR1; “H” representa cadeia pesada), 50-65 (HCDR2), e 95-102 (HCDR3) na região variável da cadeia pesada; Kabat e cols., “SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST”, 5a Edição, “Public Health Service”, “National Institutes of Health”, Bethesda, Md. (1991) e/ou aqueles resíduos que formam uma alça hipervariável (por exemplo, resíduos 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 91-96 (LCDR3) na região variável da cadeia leve e 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) e 96-101 (HCDR3) na região variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. As CDRs específicas da invenção são descritas abaixo.
[092] Ao longo do presente relatório descritivo, o sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1-107 da região variável da cadeia leve e resíduos 1-113 da região variável da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat e cols., supra (1991)).
[093] As CDRs contribuem para a formação do sítio ligação de antígeno ou, mais especificamente, do sítio de ligação de epitopo de anticorpos. O termo “epitopo” ou “determinante antigênico” se refere a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. Epitopos podem ser formados tanto por aminoácidos contíguos quanto por aminoácidos não contíguos justapostos por dobradiças terciárias de uma proteína. Epitopos formados por aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto epitopos formados por dobradiças terciárias são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Como aqui descritos, métodos para determinação de quais epitopos são ligados por certo anticorpo (ou seja, mapeamento de epitopo) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de imunoblotting e imunoprecipitação, em que peptídeos superpostos ou contíguos de LY75 são testados quanto à reatividade com certo anticorpo anti-LY75. Métodos de determinação da conformação espacial de epitopos incluem metodologias na técnica e aquelas aqui descritas, por exemplo, cristalografia com raios-X e ressonância nuclear magnética bidimensional (veja, por exemplo, “Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology”, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996)). O termo “mapeamento de epitopo” se refere ao processo de identificação dos determinantes moleculares para reconhecimento de anticorpo- antígeno.
[094] A porção do terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. Kabat e cols. coletaram diversas sequências primárias das regiões variáveis de cadeias pesadas e cadeias leves. Com base no grau de conservação das sequências, eles classificaram sequências primárias individuais na CDR e na treliça e fizeram uma lista destas (veja “SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST”, 5a Edição, publicação do NIH, N° 91-3242, E.A. Kabat e cols.) .
[095] Na subclasse de IgG de imunoglobulinas, há vários domínios de imunoglobulina na cadeia pesada. O termo “domínio de imunoglobulina (Ig)” aqui significa uma região de uma imunoglobulina que possui uma estrutura terciária distinta. De interesse na presente invenção são os domínios da cadeia pesada, incluindo, os domínios da cadeia pesada constante (CH) e os domínios de dobradiça. No contexto de anticorpos IgG, cada um dos isótipos de IgG possui três regiões CH. Consequentemente, domínios “CH” no contexto de IgG são os seguintes: “CH1” se refere às posições 118-220 de acordo com o índice de EU como em Kabat. “CH2” se refere às posições 237-340 de acordo com o índice de EU como em Kabat, e “CH3” se refere às posições 341-447 de acordo com o índice de EU como em Kabat.
[096] Outro tipo de domínio de Ig da cadeia pesada é a região de dobradiça. O termo “dobradiça” ou “região de dobradiça” ou “região de dobradiça do anticorpo” ou “região de dobradiça de imunoglobulina” significa nesse relatório descritivo o polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e segundo domínios constantes de um anticorpo. Estruturalmente, o domínio CH1 de IgG termina na posição de EU 220, e o domínio CH2 de IgG começa na posição de resíduo de EU 237. Dessa forma, para IgG, a dobradiça do anticorpo é aqui definida para incluir as posições 221 (D221 em IgG1) a 236 (G236 em IgG1), em que a numeração está de acordo com o índice de EU como em Kabat. Em algumas modalidades, por exemplo, no contexto de uma região Fc, a dobradiça inferior está incluída, com a “dobradiça inferior” geralmente se referindo às posições 226 ou 230.
[097] De interesse particular na presente invenção são as regiões Fc. O termo “Fc” ou “região Fc” ou “domínio Fc”, como aqui usado, significa o polipeptídeo que compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio da região constante de imunoglobulina e, em alguns casos, parte da dobradiça. Dessa forma, Fc se refere aos últimos dois domínios da região constante de imunoglobulina de IgA, IgD, e IgG, aos últimos três domínios da região constante de imunoglobulina de IgE e IgM, e à dobradiça flexível N-terminal para esses domínios. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, o domínio Fc compreende domínios de imunoglobulina Cy2 e Cy3 (Cy2 e Cy3) e a região de dobradiça inferior entre Cy1 (Cy1) e Cy2 (Cy2) . Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é normalmente definida para incluir os resíduos C226 ou P230 ao seu terminal carboxil, em que a numeração é de acordo com o índice de EU como em Kabat. Em algumas modalidades, como é mais totalmente descrito abaixo, modificações de aminoácidos são feitas à região Fc, por exemplo, para alterar a ligação a um ou mais receptores de FcyR ou ao receptor de FcRn.
[098] Em algumas modalidades, os anticorpos são de comprimento total. O termo “anticorpo de comprimento total” significa nesse relatório descritivo a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variáveis e constantes, incluindo uma ou mais modificações como aqui descritas.
[099] Alternativamente, os anticorpos podem estar em diversas estruturas, incluindo, sem limitação, fragmentos de anticorpo, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes aqui denominados “miméticos de anticorpo”), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fusões de anticorpo (algumas vezes denominadas “conjugados de anticorpo”), e fragmentos de cada um, respectivamente. Estruturas que se baseiam no uso de um conjunto de CDRs estão incluídas dentro da definição de “anticorpo”.
[100] Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpo específicos incluem, sem limitação, (i) o fragmento Fab que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1, (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1, (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um anticorpo único; (IV) o fragmento dAb (Ward e cols., 1989, Nature 341: 544-546, inteiramente incorporado por referência), que consiste em uma região variável única, (v) regiões de CDR isoladas, (vi) fragmentos F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um vinculador peptídico, o que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird e cols., 1988, Science 242: 423-426, Huston e cols., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5.879-5.883, inteiramente incorporados por referência), (viii) Fv de cadeia única biespecífico (WO 03/11161, aqui incorporado por referência) e (ix) “diabodies” ou “triabodies”, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (TomLinson e cols., 2000, Methods Enzymol. 326: 461 479; WO 94/13804; Holliger e cols., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6.444-6.448, todos inteiramente incorporados por referência).
Anticorpos quiméricos e humanizados
[101] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser uma mistura de espécies diferentes, por exemplo, um anticorpo quimérico e/ou um anticorpo humanizado. Ou seja, na presente invenção, os conjuntos de CDRs podem ser usados com regiões de treliças e constantes, além daquelas especificamente aqui descritas por sequência.
[102] Em geral, tanto “anticorpos quiméricos” quanto “anticorpos humanizados” se referem aos anticorpos que combinam regiões de mais de uma espécie. Por exemplo, “anticorpos quiméricos” tradicionalmente compreendem região variável (ou regiões variáveis) de um camundongo (ou rato, em alguns casos) e a região constante (ou regiões constantes) de um humano. “Anticorpos humanizados” geralmente se referem a anticorpos não humanos que tiveram as regiões de treliças do domínio variável trocadas por sequências encontradas em anticorpos humanos. Geralmente, em um anticorpo humanizado, todo o anticorpo, exceto as CDRs, é codificado por um polinucleotídeo de origem humana ou é idêntico a um anticorpo desse tipo, exceto dentro de suas CDRs. As CDRs, algumas ou todas as quais são codificadas por ácidos nucléicos que se originam em um organismo não humano, são enxertadas na treliça de lâmina beta de uma região variável de anticorpo humano para criar um anticorpo, cuja especificidade é determinada pelas CDRs enxertadas. A criação desses anticorpos é descrita, por exemplo, em WO 92/1 1018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen e cols., 1988, Science 239: 1.534-1.536, todos inteiramente incorporados por referência. “Retromutação” de resíduos de treliças aceptoras selecionadas para os resíduos doadores correspondentes é frequentemente necessária para recuperar a afinidade que é perdida na construção enxertada inicial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, todos inteiramente incorporados por referência). O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana e, dessa forma, tipicamente compreenderá uma região Fc humana. Anticorpos humanizados também podem ser gerados com o uso de camundongos com um sistema imune geneticamente modificado. Roque e cols., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639 654, inteiramente incorporado por referência. Diversas técnicas e métodos para humanização e remodelagem de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (veja Tsurushita & Vasquez, 2004, “Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells”, 533-545, Elsevier Science (USA), e referências nele citadas, todos inteiramente incorporados por referência). Métodos de humanização incluem, sem limitação, métodos descritos em Jones e cols., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann e cols., 1988; Nature 332: 323-329; Verhoeyen e cols., 1988, Science, 239: 1.534-1.536; Queen e cols., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 86: 10.029-33; He e cols., 1998, J. Immunol. 160: 1.029-1.035; Carter e cols., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4.285-9, Presta e cols., 1997, Cancer Res. 57 (20): 4.593-9; Gorman e cols., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 4.181-4.185; O’Connor e cols., 1998, Protein Eng. 11: 321-8, todos inteiramente incorporados por referência. Métodos de humanização ou outros métodos de redução da imunogenicidade de regiões variáveis de anticorpo não humano podem incluir métodos de modelagem de superfície, como descrito, por exemplo, em Roguska e cols., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 969-973, inteiramente incorporado por referência. Em uma modalidade, o anticorpo parente teve a afinidade maturada, como é conhecido na técnica. Métodos baseados na estrutura podem ser empregados para humanização e maturação de afinidade, por exemplo, como descrito em USSN 11/004.590. Métodos baseados em seleção também podem ser empregados para humanizar e/ou maturar a afinidade de regiões variáveis de anticorpo, incluindo, sem limitação, métodos descritos em Wu e cols., 1999, J. Mol. Biol. 294: 151-162; Baca e cols., 1997, J. Biol. Chem. 272 (16): 10.678-10.684; Rosok e cols., 1996, J. Biol. Chem. 271 (37): 2.2611 22.618; Rader e cols., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 8.910-8.915; Krauss e cols., 2003, Protein Engineering 16 (10): 753-759, todos inteiramente incorporados por referência. Outros métodos de humanização podem envolver o enxerto de somente partes das CDRs, incluindo, sem limitação, métodos descritos em USSN 09/810.510; Tan e cols., 2002, J. Immunol. 169: 1.119-1.125; De Pascalis e cols., 2002, J. Immunol. 169: 3.076-3.084, todos inteiramente incorporados por referência.
[103] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser anticorpos multiespecíficos, e notavelmente anticorpos biespecíficos, também algumas vezes denominados “diabodies”. Estes são anticorpos que se ligam a dois (ou mais) antígenos diferentes, ou epitopos diferentes no mesmo antígeno. Diabodies podem ser fabricados de diversas formas na técnica (Holliger e Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449, inteiramente incorporado por referência), por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos.
[104] Em uma modalidade, o anticorpo é um minicorpo. Minicorpos são como proteínas minimizadas de anticorpo que compreendem um scFv unido a um domínio CH3. Hu e cols., 1996, Cancer Res. 56: 3.055-3.061, inteiramente incorporado por referência. Em alguns casos, o scFv pode ser unido à região Fc, e pode incluir uma parte ou toda a região de dobradiça. Deve ser observado que minibodies estão incluídos dentro da definição de “anticorpo”, apesar do fato de não ter um conjunto completo de CDRs.
[105] Os anticorpos da presente invenção são geralmente isolados ou recombinantes. O termo “isolado”, quando usado para descrever os vários polipeptídeos aqui revelados, significa um polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de uma célula ou cultura de células da qual foi expresso. Dessa forma, um anticorpo isolado visa se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos que possuem especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao LY75 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes do LY75). Dessa forma, um anticorpo “isolado” é aquele encontrado em uma forma não encontrada normalmente na natureza (por exemplo, de ocorrência não natural). Um anticorpo isolado, como aqui definido, pode, em uma modalidade, incluir pelo menos um aminoácido que não ocorre no seu anticorpo de ocorrência “natural”. Esse aminoácido pode ser introduzido por meio de uma adição ou uma substituição. Será subentendido que o aminoácido introduzido pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são proteínas recombinantes, proteínas isoladas ou proteínas substancialmente puras. Uma proteína “isolada” não é acompanhada por pelo menos uma parte do material com a qual está normalmente associada em seu estado natural, por exemplo, constituindo pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 50% por peso da proteína total em certa amostra. Subentende-se que a proteína isolada pode constituir de 5 a 99,9% por peso do teor de proteína total dependendo das circunstâncias. Por exemplo, a proteína pode ser feita em uma concentração significantemente maior por meio do uso de um promotor indutível ou promotor de expressão elevada, de tal forma que a proteína seja feita em níveis de concentração aumentados. No caso de proteínas recombinantes, a definição inclui a produção de um anticorpo em uma ampla variedade de organismos e/ou células hospedeiras que são conhecidos na técnica nos quais ela não é naturalmente produzida. Normalmente, um polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. Um “anticorpo isolado” se refere a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos que possuem especificidades antigênicas diferentes. Por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a LY75 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes de LY75.
[106] Anticorpos monoclonais isolados, que possuem especificidades diferentes, podem ser combinados em uma composição bem definida. Dessa forma, por exemplo, o anticorpo da invenção pode opcionalmente e individualmente ser incluído ou excluído em uma formulação, como ainda discutidos abaixo.
[107] Os anticorpos anti-LY75 da presente invenção se ligam especificamente a LY75 (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 15). “Ligação específica” ou “se liga especificamente a” ou é “específico para” um antígeno ou um epitopo particular significa ligação que é diferente de forma mensurável de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por determinação da ligação de uma molécula comparada com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não possui atividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é similar ao alvo.
[108] A ligação específica para um antígeno ou um epitopo particular pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo que possui uma KD para um antígeno ou epitopo de pelo menos cerca de 10-4 M, pelo menos cerca de 10-5 M, pelo menos cerca de 10-6 M, pelo menos cerca de 10-7 M, pelo menos cerca de 10-8 M, pelo menos cerca de 10-9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-10 M, pelo menos cerca de 10-11 M, pelo menos cerca de 10-12 M, ou maior, em que KD se refere a uma taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. Tipicamente, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno terá uma KD que é 20-, 50-, 100-, 500-, 1.000-, 5.000-, 10.000- ou mais vezes maior para uma molécula de controle em relação ao antígeno ou epitopo. No entanto, na presente invenção, quando se administra ADCs dos anticorpos para LY75 da invenção, o que é importante é que a KD seja suficiente para permitir internalização e, dessa forma, morte celular, sem efeitos colaterais significantes.
[109] Além disso, a ligação específica para um antígeno ou um epitopo particular pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo que possui uma KA ou Ka para um antígeno ou epitopo de pelo menos 20-, 50-, 100-, 500-, 1.000-, 5.000-, 10.000- ou mais vezes maior para o epitopo em relação a um controle, em que KA ou Ka se refere a uma taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular.
[110] Ensaios padronizados para avaliar a habilidade de ligação dos anticorpos em direção a LY75 podem ser feitos no nível de proteína ou celular e são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs, ensaios BIAcore® e análise por citometria de fluxo. Ensaios adequados são descritos em detalhe nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios padronizados conhecidos na técnica, por exemplo, por análise pelo sistema Biacore®. Para avaliar a ligação às células de tumor de célula B Raji ou Daudi, células Raji (Depósito ATCC N° CCL-86) ou Daudi (Depósito ATCC N° CCL- 213) podem ser obtidas de fontes publicamente disponíveis, por exemplo, a “American Type Culture Collection”, e usadas em ensaios padronizados, por exemplo, análise citométrica de fluxo.
Anticorpos para LY75
[111] A presente invenção fornece anticorpos para LY75 que se ligam a LY75 (ID. DE SEQ. N°: 15) e podem ser internalizados quando colocados em contato com células que expressam LY75 na superfície da célula ou podem despertar uma resposta de ADCC na presença de células efetoras ou despertar uma resposta de célula T citotóxica na presença de células efetoras. Esses anticorpos são aqui denominados anticorpos “anti-LY75” ou, para facilitar a descrição, “anticorpos para LY75”.
[112] Os anticorpos para LY75 são internalizados mediante contato com células, particularmente células tumorais, que expressam LY75 na superfície. Ou seja, anticorpos para LY75, como aqui definidos, que também compreendem conjugados de fármaco, são internalizados por células tumorais, resultando na liberação do fármaco e morte celular subsequente, permitindo o tratamento de cânceres que exibem expressão de LY75. A internalização nesse contexto pode ser medida de várias formas. Em uma modalidade, os anticorpos para LY75 da invenção são colocados em contato com células, por exemplo, uma linhagem de células como aqui descritas, usando ensaios padronizados como, por exemplo, MAbZap. Seria evidente para aqueles habilitados na técnica que o ensaio MAbZap é representativo do efeito que seria esperado ser observado com um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). No último caso, o ADC seria internalizado levando, dessa forma, o fármaco para dentro da célula. Um fármaco tóxico teria a capacidade de matar a célula, ou seja, matar a célula de câncer visada. Dados de ensaios MAbZap são facilmente aceitos por aqueles habilitados na técnica como sendo representativos de ensaios de ADC (Kohls, M e Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, N° 1, 162-165).
[113] Nessas modalidades de ensaio in vitro, os anticorpos para LY75 da invenção são adicionados, juntamente com um anticorpo anti-LY75 que compreende uma toxina; por exemplo, o anticorpo para LY75 pode ser murídeo ou humanizado e o anticorpo anti-LY75 pode ser anti-murídeo ou anti-humanizado e conter uma toxina como, por exemplo, saporina. Após formação do complexo [anticorpo para LY75 da invenção]-[conjugado do anticorpo anti-LY75-fármaco], o complexo é internalizado e o fármaco (por exemplo, saporina) é liberado, resultando em morte celular. Somente mediante internalização o fármaco é liberado e, dessa forma, as células permanecem viáveis na ausência de internalização. Como descrito abaixo, sem se prender a uma teoria, em aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-LY75 contém a toxina e, mediante internalização, a ligação entre o anticorpo e a toxina é clivada, liberando a toxina e matando a célula.
[114] Além disso, os anticorpos para LY75 despertam uma resposta de ADCC na presença de células efetoras, particularmente células tumorais, que expressam LY75 na superfície.
[115] Em uma modalidade, o anticorpo compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da cadeia pesada e leve ou regiões variáveis (VRs) do anticorpo particular aqui descrito (por exemplo, aqui denominado “LY75_A1”). Consequentemente, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável (VH) da cadeia pesada do anticorpo LY75_A1 que possui a sequência mostrada no ID. DE SEQ. N°: 1, e os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável (VL) da cadeia leve do anticorpo LY75_A1 que possui a sequência mostrada no ID. DE SEQ. N°: 2.
[116] Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma primeira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 5; uma segunda vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 6; e uma terceira vhCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 7; e uma região variável da cadeia leve que compreende uma primeira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 8; uma segunda vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 9; e uma terceira vlCDR que compreende o ID. DE SEQ. N°: 10.
[117] Em outra modalidade, os anticorpos da invenção se ligam a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende o ID. DE SEQ. N°: 1, e modificações de sequência conservadoras deste. O anticorpo pode ainda incluir uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende o ID. DE SEQ. N°: 2, e modificações de sequência conservadoras deste.
[118] Em uma modalidade adicional, os anticorpos da invenção se ligam a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e/ou 2, respectivamente, e modificações de sequência conservadoras destes. Como aqui usado, o termo “modificação de sequência conservadora” se refere a, por exemplo, substituição de um aminoácido com um aminoácido que possui características similares. É de conhecimento geral comum para aqueles habilitados na técnica que essas substituições podem ser consideradas conservadoras. Outras modificações que podem ser consideradas como sendo modificações de sequência conservadoras incluem, por exemplo, glicosilação.
[119] Anticorpos isolados que incluem regiões variáveis da cadeia pesada e leve que possuem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou mais de identidade de sequência para qualquer uma das sequências acima também estão incluídos na presente invenção. Faixas intermediárias aos valores citados acima, por exemplo, regiões variáveis da cadeia pesada e leve que possuem pelo menos 80-85%, 85 90%, 90-95% ou 95-100% de identidade de sequência para qualquer uma das sequências acima, também visam ser englobadas pela presente invenção. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende o ID. DE SEQ. N°: 1 ou uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 1. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve que compreende o ID. DE SEQ. N°: 2 ou uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região de treliça da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica à treliça da região variável da cadeia pesada do ID. DE SEQ. N°: 1 que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 16, 17 e 18. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região de treliça da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica à treliça da região variável da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 2 que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 19, 20 e 21.
[120] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo anti-LY75 (aqui denominado “anticorpo LY75_A1”) que compreende as seguintes CDRs, bem como variantes que contêm um número limitado de variantes de aminoácidos:
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[121] São aqui reveladas cadeias pesadas e leves variáveis que compreendem os conjuntos de CDRs da invenção, bem como cadeias pesadas e leves de comprimento total (por exemplo, que também compreendem regiões constantes). Como será observado por aqueles habilitados na técnica, os conjuntos de CDRs da invenção podem ser incorporados em regiões constantes murídeas, humanizadas ou humanas (incluindo regiões de treliças). Consequentemente, a presente invenção fornece cadeias pesadas e leves variáveis que são pelo menos cerca de 90%-99% idênticas aos IDS. DE SEQ. aqui revelados, com 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99%, todos encontram utilidade na presente invenção. Anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que os anticorpos para LY75 da invenção
[122] Em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo no LY75 humano como qualquer um dos anticorpos monoclonais para LY75 da invenção. O termo “se liga ao mesmo epitopo” com referência a dois ou mais anticorpos, significa que os anticorpos competem pela ligação a um antígeno e se ligam aos mesmos segmentos, a segmentos sobrepostos ou que englobam segmentos de aminoácidos contínuos ou descontínuos. Aqueles habilitados na técnica compreendem que a frase “se liga ao mesmo epitopo” não significa necessariamente que os anticorpos se ligam exatamente aos mesmos aminoácidos, embora, em uma modalidade, ela possa ser definida como tal. Em outra modalidade, os aminoácidos precisos aos quais os anticorpos se ligam podem diferir. Por exemplo, um primeiro anticorpo pode se ligar a um segmento de aminoácidos que está completamente englobado pelo segmento de aminoácidos ligados por um segundo anticorpo. Em outro exemplo, um primeiro anticorpo se liga a um ou mais segmentos de aminoácidos que se sobrepõem significantemente a um ou mais segmentos ligados pelo segundo anticorpo. Para os objetivos do relatório descritivo, esses anticorpos são considerados como “se ligam ao mesmo epitopo”.
[123] Consequentemente, também são englobados pela presente invenção, em uma modalidade, anticorpos que se ligam a um epitopo em LY75 que compreende todos ou uma porção de um epitopo reconhecido pelos anticorpos particulares aqui descritos (por exemplo, a mesma região ou uma região sobreposta ou uma região entre ou que transpõe a região). Também são englobados pela presente invenção anticorpos que se ligam especificamente a pelo menos um, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 peptídeos selecionados do grupo que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 ou um fragmento destes, em que o referido fragmento compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos. Em uma modalidade adicional, o epitopo reconhecido pelos anticorpos da presente invenção compreende pelo menos um peptídeo, pelo menos dois ou pelo menos três peptídeos selecionados do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 27, 29, 30, 34, 35, 36 ou 37 ou fragmentos destes, em que os referidos fragmentos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos. Em uma modalidade adicional, o epitopo reconhecido pelos anticorpos da presente invenção compreende pelo menos um peptídeo, por exemplo, um, dois ou três peptídeos selecionados do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 30, 36 e 37 ou fragmentos destes, em que os referidos fragmentos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos.
[124] Também são englobados pela presente invenção anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo e/ou anticorpos que competem pela ligação a LY75 humano com os anticorpos aqui descritos. Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo ou competem pela ligação podem ser identificados usando técnicas de rotina. Essas técnicas incluem, por exemplo, um imunoensaio, que mostra a habilidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno-alvo, ou seja, um ensaio de ligação competitiva.
[125] A ligação competitiva é determinada em um ensaio no qual a imunoglobulina sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, por exemplo, LY75. Diversos tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto (RIA) de fase sólida, imunoensaio de enzima (EIA) direto ou indireto de fase sólida, ensaio de competição em sanduiche (veja Stahli e cols., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); EIA direto de biotina-avidina de fase sólida (veja Kirkland e cols., J. Immunol. 137: 3.614 (1986)); ensaio marcado direto de fase sólida, ensaio em sanduiche marcado direto de fase sólida (veja Harlow e Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA marcado direto de fase sólida usando marcador de I-125 (veja Morel e cols., Mol. Immunol. 25 (1): 7 (1988)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (Cheung e cols., Virology 176: 546 (1990)); e RIA marcado direto (Moldenhauer e cols., Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990)). Tipicamente, um ensaio desse tipo envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que abrigam um desses, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva é medida por determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Normalmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum por pelo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% 75-80% 80-85% 85-90% 90-95% 95-99% ou mais.
[126] Outras técnicas incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epitopo, por exemplo, análises por raios-X de cristais de complexos antígeno/anticorpo que fornecem resolução atômica do epitopo. Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo aos fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno, em que a perda de ligação em função de uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência do antígeno é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epitopo. Além disso, métodos combinatórios computacionais para mapeamento de epitopo também podem ser usados. Esses métodos se baseiam na habilidade do anticorpo de interesse para isolar por afinidade peptídeos curtos específicos por bibliotecas combinatórias de peptídeos por exibição em fago. Os peptídeos são então considerados como pistas para a definição do epitopo que corresponde ao anticorpo usado para avaliar a biblioteca de peptídeos. Para mapeamento de epitopo, também foram desenvolvidos algoritmos computacionais que comprovadamente mapeiam epitopos conformacionais descontínuos.
[127] Em uma modalidade particular, o anticorpo compete pela ligação a LY75 com um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2, respectivamente, ou sequências de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas a eles. Em outra modalidade, o anticorpo compete pela ligação a LY75 com um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2 (LY75_A1).
[128] Outros anticorpos da invenção se ligam a um epitopo em LY75 reconhecido pelos anticorpos aqui descritos. Em outra modalidade particular, o anticorpo se liga a um epitopo em LY75 reconhecido por um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2, respectivamente, ou sequências de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas a eles. Em outra modalidade, o anticorpo se liga a um epitopo em LY75 reconhecido por um anticorpo que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2 (LY75). Caracterização de anticorpos monoclonais para LY75
[129] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser caracterizados pela ligação a LY75 com o uso de diversas técnicas conhecidas. Geralmente, os anticorpos são inicialmente caracterizados por ELISA. Resumidamente, placas de microtitulação podem ser revestidas com LY75 purificado em PBS, e depois bloqueadas com proteínas irrelevantes como, por exemplo, albumina sérica bovina (BSA) diluída em PBS. As diluições de plasma de camundongos imunizados com LY75 são adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas a 37 °C. As placas são lavadas com PBS/Tween 20 e depois incubadas com um reagente policlonal de cabra- anti-IgG humana Fc-específico conjugado à fosfatase alcalina por 1 hora a 37 °C. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato de ABTS, e analisadas em OD de 405. De preferência, camundongos que desenvolvem as maiores titulações serão usados para fusões.
[130] Um ensaio ELISA como descrito acima pode ser usado para avaliar anticorpos e, dessa forma, hibridomas que produzem anticorpos que mostram reatividade positiva com o imunógeno de LY75. Hibridomas que se ligam, preferivelmente com afinidade elevada, a LY75 podem então ser subclonados e adicionalmente caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células parentes (por ELISA), pode então ser escolhido para a produção de uma banco de células, e para purificação de anticorpo.
[131] Para a purificação de anticorpos anti-LY75, hibridomas selecionados podem ser desenvolvidos em garrafas de cilindro, frascos giratórios de dois litros ou outros sistemas de cultura. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia por afinidade com proteína A-Sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ) para purificar a proteína. Após troca de tampão para PBS, a concentração pode ser determinada por OD280 usando coeficiente de extinção de 1,43 ou, preferivelmente, por análise nefelométrica. IgG pode ser verificada por eletroforese em gel e por método antígeno-específico.
[132] Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-LY75 selecionados se ligam a epitopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). A ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda marcada com estreptavidina. Para determinar o isótipo de anticorpos purificados, ELISAs de isótipo podem ser realizados usando metodologias reconhecidas na técnica. Por exemplo, os poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 10 μg/mL de anti-Ig de um dia para o outro a 4 °C. Após bloqueio com BSA 5%, as placas são reagidas com 10 μg/mL de anticorpos monoclonais ou controles de isótipo purificados, em temperatura ambiente por duas horas. Os poços podem então ser reagidos com IgG1 ou outras sondas conjugadas isótipo-específicas. As placas são desenvolvidas e analisadas como descrito acima.
[133] Para testar a ligação de anticorpos monoclonais para células vivas que expressam LY75, pode ser usada citometria de fluxo. Resumidamente, linhagens de células e/ou PBMCs humanas que expressam LY75 ligado à membrana (desenvolvidas sob condições de crescimento padronizadas) são misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo BSA 0,1% a 4 °C por 1 hora. Após lavagem, as células são reagidas com anticorpo anti- IgG marcado com fluoresceína sob as mesmas condições que a coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas pelo instrumento FACScan usando as propriedades de dispersão luminosa e lateral para separar células únicas e a ligação dos anticorpos marcados é determinada. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado em adição ou ao invés do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência. Esse método permite a visualização de células individuais, mas pode ter sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.
[134] IgGs anti-LY75 podem ainda ser testadas quanto à reatividade com o antígeno de LY75 por Western blotting. Resumidamente, extratos de células de células que expressam LY75 podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio. Após eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro de camundongo 20%, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG pode ser detectada usando anti-IgG fosfatase alcalina e desenvolvida com comprimidos de substrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
[135] Métodos para análise da afinidade de ligação, reatividade cruzada e cinética de ligação de vários anticorpos anti-LY75 incluem ensaios padronizados na técnica, por exemplo, análise por ressonância de plasmônio de superfície (SPR) Biacore™ usando um instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suécia).
[136] Em uma modalidade, o anticorpo se liga especificamente a LY75 humano que compreende o ID. DE SEQ. N°: 15. De preferência, um anticorpo da invenção se liga a LY75 humano com afinidade elevada.
[137] De preferência, um anticorpo da invenção se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 5 x 10-8 M ou menos, se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 2 x 10-8 M ou menos, se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 5 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 4 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 3 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 2 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 1 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 5 x 10-10 M ou menos, ou se liga a uma proteína de LY75 com uma KD de 1 x 10-10 M ou menos.
[138] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção competem (por exemplo, competem de forma cruzada) pela ligação a LY75 com os anticorpos anti-LY75 particulares aqui descritos (por exemplo, LY75_A1). Esses anticorpos de competição podem ser identificados com base em sua habilidade para inibir competitivamente a ligação a LY75 de um ou mais dos mAbs em ensaios de ligação de LY75 padronizados. Por exemplo, ensaios ELISA padronizados podem ser usados, nos quais uma proteína de LY75 humano recombinante é imobilizada na placa, um dos anticorpos é marcado de forma fluorescente e a habilidade de anticorpos não marcados para competir pela ligação do anticorpo marcado é avaliada. Adicional ou alternativamente, análise BIAcore pode ser usada para avaliar a habilidade dos anticorpos para competir de forma cruzada. A habilidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de um anticorpo anti-LY75 da invenção ao LY75 humano demonstra que o anticorpo de teste pode competir com o anticorpo pela ligação a LY75 humano.
[139] Em uma modalidade, o anticorpo de competição é um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo em LY75 humano que os anticorpos monoclonais anti-LY75 particulares aqui descritos (por exemplo, LY75_A1). Técnicas padronizadas de mapeamento de epitopo, por exemplo, cristalografia com raios-X e ressonância nuclear magnética bidimensional, podem ser usadas para determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo de referência (veja, por exemplo, “Epitope Mapping Protocols” em “Methods in Molecular Biology”, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996)).
[140] Em uma modalidade, o anticorpo que compete pela ligação a LY75 e/ou se liga ao mesmo epitopo em LY75 humano é um anticorpo humano.
[141] Após ter sido isolado um mAb anti-LY75 único, arquetípico, que possui as propriedades desejadas aqui descritas, outros mAbs com propriedades similares, por exemplo, que possuem o mesmo epitopo, podem ser gerados. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com LY75 como aqui descrito, hibridomas produzidos e os mAbs resultantes avaliados quanto à habilidade para competir com o mAb arquetípico pela ligação a LY75. Os camundongos também podem ser imunizados com um fragmento menor de LY75 contendo o epitopo ao qual o mAb arquetípico se liga. O epitopo pode ser localizado, por exemplo, por avaliação da ligação a uma série de peptídeos sobrepostos que transpõem LY75. Alternativamente, o método de Jespers e cols., Biotechnology 12: 899, 1994, pode ser usado para guiar a seleção de mAbs que possuem o mesmo epitopo e, portanto, propriedades similares ao mAb arquetípico. Com o uso de exibição em fago, primeiro a cadeia pesada do anticorpo arquetípico é pareada com um repertório de cadeias leves (preferivelmente humanas) para selecionar um mAb de ligação a LY75, e depois a nova cadeia leve é pareada com um repertório de cadeias pesadas (preferivelmente humanas) para selecionar um mAb de ligação a LY75 (preferivelmente humano) que possui o mesmo epitopo que o mAb arquetípico. Alternativamente, variantes do mAb arquetípico podem ser obtidas por mutagênese de cDNA que codifica as cadeias pesadas e leves do anticorpo.
[142] O mapeamento de epitopo, por exemplo, como descrito em Champe e cols. (1995) J. Biol. Chem. 270: 1.388-1.394 pode ser realizado para determinar se o anticorpo se liga a um epitopo de interesse. A “mutagênese por varredura de alanina”, como descrita por Cunningham e Wells (1989) Science 244: 1.081-1.085, ou alguma outra forma de mutagênese pontual de resíduos de aminoácidos em LY75 humano, também pode ser usada para determinar o epitopo funcional para um anticorpo anti-LY75 da presente invenção. Estudos de mutagênese, no entanto, também podem revelar resíduos de aminoácidos que são cruciais para a estrutura tridimensional global de LY75, mas que não estão envolvidos diretamente em contatos anticorpo-antígeno e, dessa forma, outros métodos podem ser necessários para confirmar um epitopo funcional determinado usando esse método.
[143] O epitopo ligado por um anticorpo específico também pode ser determinado por avaliação da ligação do anticorpo a peptídeos que compreendem fragmentos de LY75 humano. Uma série de peptídeos sobrepostos que englobam a sequência de LY75 pode ser sintetizada e avaliada quanto à ligação, por exemplo, em um ELISA direto, um ELISA competitivo (em que o peptídeo é avaliado quanto à sua habilidade para evitar a ligação de um anticorpo ao LY75 ligado a um poço de uma placa de microtitulação), ou em um chip. Esses métodos de avaliação de peptídeos podem não ser capazes de detectar alguns epitopos funcionais descontínuos, ou seja, epitopos funcionais que envolvem resíduos de aminoácidos que não são contíguos ao longo da sequência primária da cadeia polipeptídica de LY75.
[144] O epitopo ligado por anticorpos da presente invenção também pode ser determinado por métodos estruturais, por exemplo, determinação da estrutura cristal por raios-X (por exemplo, WO 2005/044853), modelagem molecular e espectroscopia por ressonância nuclear magnética (RNM), incluindo determinação por RNM das taxas de troca de H-D de hidrogênios de amida lábeis em LY75 quando livres e quando ligados em um complexo com um anticorpo de interesse (Zinn-Justin e cols. (1992) Biochemistry 31, 11.335-1.1347; Zinn-Justin e cols. (1993) Biochemistry 32, 6.884-6.891).
[145] Com relação à cristalografia por raios-X, a cristalização pode ser obtida com o uso dos métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Giege e cols. (1994) Acta Crystallogr. D50: 339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189: 1-23), incluindo microbatelada (por exemplo, Chayen (1997) Structure 5: 1.269-1.274), difusão de vapor hanging-drop (por exemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251: 6.300-6.303), semeadura e diálise. É desejável usar uma preparação de proteína que possua uma concentração de pelo menos cerca de 1 mg/mL e, preferivelmente, cerca de 10 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. A cristalização pode ser mais bem obtida em uma solução precipitante contendo polietileno glicol 1.000-20.000 (PEG; peso molecular médio variando de cerca de 1000 até cerca de 20.000 Da (cerca de 1,7x10-24 até cerca de 3,3x10-23 kg)), preferivelmente cerca de 5.000 até cerca de 7.000 Da (cerca de 8,3x10-23 até cerca de 1,2x10-23 kg), mais preferivelmente cerca de 6.000 Da (cerca de 10x10-24 kg), com concentrações variando de cerca de 10% até cerca de 30% (p/v). Também pode ser desejável incluir uma agente estabilizante de proteína, por exemplo, glicerol, em uma concentração que varia de cerca de 0,5% até cerca de 20%. Um sal adequado, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de lítio ou citrato de sódio, também pode ser desejável na solução precipitante, preferivelmente em uma concentração que varia de cerca de 1 mM até cerca de 1.000 mM. O precipitante é preferivelmente tamponado até um pH de cerca de 3,0 até cerca de 5,0, preferivelmente cerca de 4,0. Tampões específicos úteis na solução precipitante podem variar e são bem conhecidos na técnica (Scopes, “Protein Purification: Principles and Practice”, Terceira Edição, (1994) Springer-Verlag, Nova York). Exemplos de tampões úteis incluem, sem limitação, HEPES, Tris, MES e acetato. Cristais podem ser desenvolvidos em uma ampla faixa de temperaturas, incluindo 2 °C, 4 °C, 8 °C e 26 °C.
[146] Cristais de anticorpo:antígeno podem ser estudados usando técnicas bem conhecidas de difração de raios-X e podem ser refinados usando software de computador como, por exemplo, X-PLOR (Yale University, 1992, distribuído por Molecular Simulations, Inc.; veja, por exemplo, Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 e 115, H.W. Wyckoff e cols., eds., Academic Press; Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 2004/0014194), e BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49: 37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A: 361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi e cols. (2000) Acta Cryst. D56: 1.313-1.323), cujas revelações são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
[147] Ensaios de competição de anticorpo, como aqui descritos, podem ser usados para determinar se um anticorpo “se liga ao mesmo epitopo” que outro anticorpo. Tipicamente, competição de 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de um anticorpo que sabidamente interage com o epitopo por um segundo anticorpo sob condições nas quais o segundo anticorpo está em excesso e o primeiro satura todos os sítios, é indicativa de que os anticorpos “se ligam ao mesmo epitopo”. Para avaliar o nível de competição entre dois anticorpos, por exemplo, radioimunoensaios ou ensaios que utilizam outros marcadores para os anticorpos, podem ser usados. Por exemplo, um antígeno de LY75 pode ser incubado com uma quantidade saturante de um primeiro anticorpo anti-LY75, ou fragmento de ligação de antígeno deste, conjugado a um composto marcado (por exemplo, 3H, 125I, biotina ou rubídio) na presença da mesma quantidade de um segundo anticorpo anti- LY75 não marcado. A quantidade de anticorpo marcado que está ligada ao antígeno na presença do anticorpo de bloqueio não marcado é então avaliada e comparada com a ligação na ausência do anticorpo de bloqueio não marcado. A competição é determinada pela alteração porcentual nos sinais de ligação na presença do anticorpo de bloqueio não marcado, comparada com a ausência do anticorpo de bloqueio. Dessa forma, caso haja uma inibição de 50% da ligação do anticorpo marcado na presença do anticorpo de bloqueio comparada com a ligação na ausência do anticorpo de bloqueio, então há competição entre os dois anticorpos de 50%. Dessa forma, referência à competição entre um primeiro e segundo anticorpo de 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, significa que o primeiro anticorpo inibe a ligação do segundo anticorpo (ou vice-versa) ao antígeno por 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais (comparada com a ligação do antígeno pelo segundo anticorpo na ausência do primeiro anticorpo). Dessa forma, a inibição da ligação de um primeiro anticorpo a um antígeno por um segundo anticorpo de 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais indica que os dois anticorpos se ligam ao mesmo epitopo.
Modificações de anticorpos
[148] A presente invenção ainda fornece anticorpos variantes, algumas vezes denominados “derivados de anticorpo” ou também “análogos de anticorpo”. Ou seja, há diversas modificações que podem ser feitas aos anticorpos da invenção, incluindo, sem limitação, modificações de aminoácidos nas CDRs (maturação de afinidade), modificações de aminoácidos nas regiões de treliças, modificações de aminoácidos na região Fc, variantes de glicosilação, modificações covalentes de outros tipos (por exemplo, para adesão de conjugados de fármaco etc.).
[149] O termo “variante” significa nesse relatório descritivo uma sequência de polipeptídeos que difere daquela de um polipeptídeo parente em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos. Nesse caso, o polipeptídeo parente consiste nas cadeias pesadas ou leves variáveis de comprimento total, listadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 ou 2, respectivamente, ou nas regiões de CDR ou nas regiões de treliças das cadeias pesadas e leves listadas nos IDS. DE SEQ. Nos 5-10 e 16-21. Modificações de aminoácidos podem incluir substituições, inserções e deleções, com as primeiras sendo preferidas em muitos casos. Será subentendido que uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição conservadora ou não conservadora, com substituições conservadoras sendo preferidas. Além disso, a referida substituição pode ser uma substituição com um aminoácido de ocorrência ou com um aminoácido de ocorrência não natural.
[150] Em geral, variantes podem incluir diversas modificações, desde que a função do anticorpo ainda esteja presente, como aqui descrito. Ou seja, LY75_A1, por exemplo, o anticorpo ainda deve se ligar especificamente ao LY75 humano. Similarmente, se são geradas variantes de aminoácidos com a região Fc, por exemplo, os anticorpos variantes devem manter as funções necessárias de ligação ao receptor para a aplicação ou indicação particular do anticorpo.
[151] “Variantes”, nesse caso, podem ser feitas nas sequências de CDR listadas, nas regiões de treliças ou Fc do anticorpo.
[152] No entanto, em geral, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos são geralmente utilizadas, na medida em que frequentemente o objetivo é alterar a função com um número mínimo de modificações. Em alguns casos, há de 1 a 5 modificações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções de aminoácidos individuais), com de 1-2, 1-3 e 1-4 também tendo utilidade em muitas modalidades. O número de modificações pode depender do tamanho da região que está sendo modificada; por exemplo, em geral, menos modificações são desejadas em regiões de CDR. Será subentendido por aqueles habilitados na técnica que até mesmo dentro das regiões de CDR, a localização da modificação pode alterar significantemente o efeito. Em uma modalidade, as modificações podem ser feitas em qualquer uma da CDR1, CDR2 ou CDR3 das cadeias pesadas e/ou leves. Em uma modalidade adicional, as modificações são feitas em qualquer uma da CDR1 ou CDR2 das cadeias pesadas e/ou leves. Ainda em outra modalidade adicional, as modificações estão localizadas na CDR1 das cadeias pesadas e/ou leves.
[153] Deve ser observado que o número de modificações de aminoácidos pode estar dentro de domínios funcionais: por exemplo, pode ser desejável ter de 1-5 modificações na região Fc de proteínas do tipo selvagem ou modificadas geneticamente, bem como de 1 a 5 modificações na região Fv, por exemplo. Uma sequência de polipeptídeos variante possuirá preferivelmente pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para as sequências parentes (por exemplo, as regiões variáveis, as regiões constantes e/ou as sequências da cadeia pesada e leve e/ou as CDRs de LY75_A1). Deve ser observado que, dependendo do tamanho da sequência, a identidade percentual dependerá do número de aminoácidos.
[154] O termo “substituição de aminoácido” ou “substituição” significa nesse relatório descritivo a troca de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de polipeptídeos parente por outro aminoácido que pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou não natural. Por exemplo, a substituição S100A se refere a um polipeptídeo variante no qual a serina na posição 100 é substituída com alanina. O termo “inserção de aminoácido” ou “inserção”, como aqui usado, significa a adição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de polipeptídeos parente. O termo “deleção de aminoácido” ou “deleção”, como aqui usado, significa a remoção de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de polipeptídeos parente.
[155] O termo “polipeptídeo parente”, “proteína parente”, “polipeptídeo precursor” ou “proteína precursora”, como aqui usado, significa um não polipeptídeo modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. Em geral, os polipeptídeos parentes nesse relatório descritivo são LY75_A1. Consequentemente, o termo “anticorpo parente”, como aqui usado, significa um anticorpo que é modificado para gerar um anticorpo variante.
[156] O termo “do tipo selvagem” ou “WT” ou “nativo” significa nesse relatório descritivo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que é encontrada na natureza, incluindo variações alélicas. Uma proteína, polipeptídeo, anticorpo, imunoglobulina, IgG etc. WT possui uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que não foi modificada intencionalmente.
[157] O termo “região Fc variante” significa nesse relatório descritivo uma sequência Fc que difere daquela de uma sequência Fc do tipo selvagem em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos. Variante de Fc pode se referir ao próprio polipeptídeo Fc, composições que compreendem o polipeptídeo de Fc variante, ou a sequência de aminoácidos.
[158] Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos são feitas em uma ou mais das CDRs de LY75_A1. Em geral, somente 1 ou 2 ou 3 aminoácidos são substituídos em uma única CDR e, geralmente, no máximo de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações são feitas dentro de um conjunto de 6 CDRs. No entanto, deve ser observado que qualquer combinação de nenhuma substituição, 1, 2 ou 3 substituições em qualquer CDR pode ser independentemente e, opcionalmente, combinada com qualquer outra substituição. Ficará evidente que podem ser feitas substituições em qualquer uma das 6 CDRs. Em uma modalidade, são feitas substituições na CDR1 das cadeias pesadas e/ou leves.
[159] Em alguns casos, modificações de aminoácidos nas CDRs são denominadas “maturação de afinidade”. Um anticorpo com “afinidade maturada” é aquele que possui uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs, o que resulta em um aumento da afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com um anticorpo parente que não possui aquela alteração (ou alterações). Em alguns casos, embora raro, pode ser desejável diminuir a afinidade de um anticorpo ao seu antígeno, mas isso geralmente não é preferido.
[160] A maturação da afinidade pode ser feita para aumentar a afinidade de ligação do anticorpo pelo antígeno por pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150% ou mais, ou 1, 2, 3, 4 a 5 vezes, comparado com o anticorpo “parente”. Anticorpos com afinidade maturada preferido terão afinidades nanomolares ou até mesmo picomolares pelo antígeno-alvo. Anticorpos com afinidade maturada são produzidos por procedimento conhecidos. Veja, por exemplo, Marks e cols., 1992, Biotechnology 10: 779-783, que descreve maturação de afinidade por embaralhamento do domínio da cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável (VL). A mutagênese aleatória de resíduos da CDR e/ou treliça é descrita em: Barbas, e cols. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3.809-3.813; Shier e cols., 1995, Gene 169: 147-155; Yelton e cols., 1995, J. Immunol. 155: 1.994-2.004; Jackson e cols., 1995, J. Immunol. 154 (7): 3.310-9; e Hawkins e cols., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896, por exemplo.
[161] Alternativamente, podem ser feitas modificações de aminoácidos em uma ou mais das CDRs dos anticorpos da invenção que são “silenciosas”, por exemplo, que não alteram significantemente a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Estas podem ser feitas por diversas razões, incluindo otimização da expressão (como pode ser feita para os ácidos nucléicos que codificam os anticorpos da invenção).
[162] Dessa forma, estão incluídos dentro da definição das CDRs e anticorpos da invenção CDRs e anticorpos variantes; ou seja, os anticorpos da invenção podem incluir modificações de aminoácidos em uma ou mais das CDRs de LY75_A1. Além disso, como descrito abaixo, modificações de aminoácidos também podem ser feitas independentemente e, opcionalmente, em qualquer região fora das CDRs, incluindo regiões de treliças e constantes, como aqui descritos.
[163] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LY75 da invenção são compostos por um domínio Fc variante. Como é sabido na técnica, a região Fc de um anticorpo interage com diversos receptores e ligantes de Fc, transmitindo um arranjo de capacidades funcionais importantes denominadas funções efetoras. Esses receptores Fc incluem, sem limitação (em humanos) FcyRI (CD64), incluindo isoformas FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc; FcyRII (CD32), incluindo isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 e R131), FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16), incluindo isoformas FcyRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158, correlacionados com citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC)) e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2), FcRn (o receptor neonatal), C1q (proteína do complemento envolvida na citotoxicidade dependente de complemento (CDC)) e FcRn (o receptor neonatal envolvido na meia-vida sérica). Modificações adequadas podem ser feitas em uma ou mais posições como é geralmente descrito, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. 11/841.654 e referências nele citadas, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, USSN 12/341.769, Patente U.S. N° 6.737.056, Patente U.S. N° 7.670.600, Patente U.S. N° 6.086.875, todos os quais são expressamente incorporados por referência em sua totalidade e, em particular, para substituições de aminoácidos específicas que aumentam a ligação a receptores Fc.
[164] Além das modificações descritas acima, outras modificações podem ser feitas. Por exemplo, as moléculas podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes dissulfeto que ligam os domínios VH e VL (Reiter e cols., 1996, Nature Biotech. 14: 1.239-1.245, inteiramente incorporado por referência).
[165] Além disso, modificações em cisteínas são particularmente úteis em aplicações de conjugado anticorpo- fármaco (ADC), descritas adicionalmente abaixo. Em algumas modalidades, a região constante dos anticorpos pode ser modificada geneticamente para conter uma ou mais cisteínas que são particularmente “reativas ao tiol”, de modo a permitir a colocação mais específica e controlada da porção de fármaco. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.521.541, aqui incorporada por em sua totalidade. Além disso, há diversas modificações covalentes de anticorpos que podem ser fitas como descritas abaixo.
[166] Modificações covalentes de anticorpos estão incluídas dentro do escopo dessa invenção, e são geralmente, mas nem sempre, feitas pós-tradução. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula por reação de resíduos de aminoácidos específicos do anticorpo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos do terminal N ou C.
[167] Os resíduos de cisteinil mais comumente usados são reagidos com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), por exemplo, ácido cloroacético ou cloroacetamida, para gerar derivados de carboximetil ou carboxiamidometil. Resíduos de cisteinil também podem ser derivatizados por reação com bromotrifluoracetona, ácido α-bromo-β-(5- imidozoil) propiônico, fosfato de cloroacetila, N- alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridil, dissulfeto de metil 2-piridil, p-cloromercuribenzoato, 2- cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol e semelhantes.
[168] Resíduos de histidil são derivatizados por reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5-7,0, pois esse agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. Brometo de para-bromofenacil também é útil; a reação é preferivelmente realizada em 0,1 M de cacodilato de sódio em pH 6,0.
[169] Resíduos de lisinil e amino terminais são reagidos com succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. A derivatização com esses agentes possui o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinil. Outros reagentes adequados para derivatização de resíduos que contêm alfa-amino incluem imidoésteres, por exemplo, metil picolinimidato; piridoxal fosfato; piridoxal; cloroborohidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico; O- metilisouréia; 2,4-pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.
[170] Resíduos de arginil são modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginina exige que a reação seja realizada em condições alcalinas, por causa do pKa elevado do grupo funcional guanidina. Além disso, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina, bem como com o grupo de arginina épsilon-amino.
[171] A modificação específica de resíduos de tirosil pode ser feita, com interesse particular na introdução de marcadores espectrais em resíduos de tirosil por reação com compostos aromáticos de diazônio ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosil e derivados de 3- nitro, respectivamente. Resíduos de tirosil são iodados usando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio, no método de cloramina T descrito acima sendo adequado.
[172] Grupos laterais carboxil (aspartil ou glutamil) são modificados seletivamente por reação com carbodiimidas (R’—N=C=N-R’), em que R e R’ são opcionalmente grupos alquil diferentes, por exemplo, 1-ciclohexil-3-(2- morfolinil-4-etil)carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azônia-4,4- dimetilpentil)carbodiimida. Além disso, resíduos de aspartil e glutamil são convertidos em resíduos de asparaginil e glutaminil por reação com íons de amônio.
[173] A derivatização com agentes bifuncionais é útil para a reticulação de anticorpos em uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para uso em diversos métodos, além dos métodos descritos abaixo. Agentes de reticulação comumente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidil como, por exemplo, 3,3’-ditiobis (succinimidilpropionato), e maleimidas bifuncionais como, por exemplo, bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivatização como, por exemplo, metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato, geram intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, matrizes reativas insolúveis em água como, por exemplo, carboidratos ativados por brometo de cinomolgusogeno e os substratos reativos descritos nas Patentes U.S. Nos 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 e 4.330.440, todas inteiramente incorporadas por referência, são empregadas para imobilização de proteína.
[174] Resíduos de glutaminil e asparaginil são frequentemente diamidados nos resíduos de glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente. Alternativamente, esses resíduos são diamidados sob condições levemente ácidas. Qualquer forma desses resíduos está englobada dentro do escopo dessa invenção.
[175] Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxil de resíduos de seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, “Proteins: Structure and Molecular Properties”, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 [1983], inteiramente incorporado por referência), acetilação da amina do terminal N, e amidação de qualquer grupo carboxil do terminal C.
[176] Além disso, como será observado por aqueles habilitados na técnica, todos os marcadores (incluindo marcadores fluorescentes, enzimáticos, magnéticos, radioativos etc.) podem ser adicionados aos anticorpos (bem como às outras composições da invenção).
Moléculas biespecíficas
[177] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta moléculas biespecíficas que compreendem um anticorpo anti- LY75, ou um fragmento deste, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções de ligação de antígeno deste, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas-alvo diferentes. O anticorpo da invenção pode, na verdade, ser derivatizado ou ligado a mais de uma (outra) molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação e/ou moléculas-alvo diferentes; essas moléculas multiespecíficas também visam ser englobadas pelo termo “molécula biespecífica”, como aqui usado. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, por exemplo, outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de tal forma que resulte uma molécula biespecífica.
[178] Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação para um primeiro epitopo-alvo (ou seja, LY75) e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo-alvo. O segundo epitopo- alvo pode estar presente na mesma proteína-alvo que aquela ligada pela primeira especificidade de ligação; ou o segundo epitopo-alvo pode estar presente em uma proteína- alvo diferente daquela proteína ligada pela primeira especificidade de ligação. O segundo epitopo-alvo pode estar presente na mesma célula que o primeiro epitopo-alvo (ou seja, LY75); ou o segundo epitopo-alvo pode estar presente em um alvo que não é exibido pela célula que exibe o primeiro epitopo-alvo. Como aqui usado, o termo “especificidade de ligação” se refere a uma porção que compreende pelo menos um domínio variável de anticorpo.
[179] Em uma modalidade da invenção, o segundo epitopo- alvo é um receptor Fc, por exemplo, FcyRI humano (CD64) ou um receptor Fcα humano (CD89). Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligação a células efetoras que expressam tanto FcyR quanto FcαR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)), e a células-alvo que expressam LY75. Essas moléculas biespecíficas visam células que expressam LY75 para atividade de célula efetora e desencadeiam atividades de célula efetora mediadas por receptor Fc, por exemplo, fagocitose de células que expressam LY75, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocina ou geração de ânion de superóxido.
[180] Em outra modalidade da invenção, o segundo epitopo-alvo é CD3 ou CD5. Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligação a células efetoras que expressam tanto CD3 quanto CD5 (por exemplo, células T citotóxicas que expressam CD3 ou CD5), e a células-alvo que expressam LY75. Essas moléculas biespecíficas visam células que expressam LY75 para atividade de célula efetora e desencadeiam atividades de célula efetora mediadas por CD3 ou CD5, por exemplo, expansão clonal de células T e citotoxicidade de células T. Nessa modalidade, o anticorpo biespecífico da invenção pode ter um total de dois ou três domínios variáveis de anticorpo, em que a primeira porção do anticorpo biespecífico é capaz de recrutar a atividade de uma célula imune efetora humana por ligação específica a um antígeno efetor localizado na célula imune efetora humana, em que o antígeno efetor é o antígeno de CD3 humano ou o antígeno de CD5 humano, a referida primeira porção consistindo em um domínio variável de anticorpo, e uma segunda porção do anticorpo biespecífico que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno-alvo diferente do antígeno efetor, por exemplo, LY75, o referido antígeno-alvo estando localizado em uma célula-alvo diferente da referida célula imune efetora humana, e a referida segunda porção compreendendo um ou dois domínios variáveis de anticorpo.
[181] Em uma modalidade da invenção na qual a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, em adição a uma especificidade de ligação anti-Fc ou a uma especificidade de ligação anti-CD3 ou anti-CD5 e uma especificidade de ligação anti-LY75. Em uma modalidade, a terceira especificidade de ligação é uma porção anti-fator de aumento (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e, dessa forma, aumenta a resposta imune contra a célula-alvo. A “porção anti-fator de aumento” pode ser um anticorpo, fragmento funcional de anticorpo ou um ligante que se liga a certa molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor e, dessa forma, resulta em um aumento do efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou antígeno da célula-alvo. A “porção anti-fator de aumento” pode se ligar a um receptor Fc ou a um antígeno da célula-alvo. Alternativamente, a porção anti-fator de aumento pode se ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção anti-fator de aumento pode se ligar a uma célula T citotóxica (por exemplo, por meio de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que resulte em uma resposta imune aumentada contra a célula- alvo). Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo deste, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fd, dAb ou um Fv de cadeia única. O anticorpo também pode ser um dímero da cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo deste como, por exemplo, um Fv ou uma construção de cadeia única, como descrito na Patente U.S. N° 4.946.778, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência.
[182] Em uma modalidade, a especificidade de ligação para um receptor Fcy é fornecida por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina humana G (IgG). Como aqui usado, o termo “receptor de IgG” se refere a qualquer um dos oito genes da cadeia y localizados no cromossomo 1. Esses genes codificam um total de doze isoformas de receptor transmembrana ou solúveis que são agrupados em três classes de receptor Fcy: FcyRI (CD64), FcyRI I(CD32) e FcyRIII (CD16). Em uma modalidade preferida, o receptor Fcy é um FcyRI humano de afinidade elevada. O FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa (1,2x10-22 kg), que mostra afinidade elevada por IgG monomérica (108-109 M-1).
[183] A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonais anti-Fcy preferidos são descritas na Publicação PCT WO 88/00052 e na Patente U.S. N° 4.954.617, cujos ensinamentos são aqui totalmente incorporados por referência. Esses anticorpos se ligam a um epitopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII em um sítio que é distinto do sítio de ligação de Fcy do receptor e, dessa forma, sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis nessa invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma que produz mAb 32 está disponível pela “American Type Culture Collection”, N° de Acesso ATCC HB9469. Em outras modalidades, o anticorpo anti-receptor Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritas em Graziano, R.F. e cols. (1995) J. Immunol. 55 (10): 4.996-5.002 e Publicação PCT WO 94/10332. A linhagem de células que produz o anticorpo H22 foi depositada na “American Type Culture Collection” sob a designação HA022CL1 e possui o N° de Acesso CRL 11177.
[184] Ainda em outras modalidades preferidas, a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana, por exemplo, um receptor Fc-alfa [FcαRI (CD89)], cuja ligação preferivelmente não é bloqueada por imunoglobulina humana A (IgA). O termo “receptor de IgA” visa incluir o produto gênico de um α-gene (FcαRI) localizado no cromossomo 19. Esse gene sabidamente codifica várias isoformas transmembrana alternativamente unidas de 55 a 110 kDa (9,1x10-23 a 1,8x10-22 kg). FcαRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de células não efetoras. FcαRI possui afinidade média («5x107 M-1) tanto para IgA1 quanto para IgA2 que é aumentada mediante exposição às citocinas como, por exemplo, G-CSF ou GM-CSF [Morton, H.C. e cols. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440]. Quatro anticorpos monoclonais FcaRI-específicos, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcαRI fora do domínio ligação de ligante de IgA, foram descritos [Monteiro, R.C. e cols. (1992) J. Immunol. 148: 1.764].
[185] FcαRI e FcyRI são receptores desencadeadores preferidos para uso nas moléculas biespecíficas da invenção, pois eles são: (1) expressos primariamente em células imunes efetoras, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) expressos em níveis elevados (por exemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); e (4) medeiam apresentação de antígeno aumentada de antígenos, incluindo auto-antígenos, dirigido a eles.
[186] Anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murídeos, humanos, quiméricos e humanizados.
[187] As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por conjugação das especificidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR, anti-CD3 anti-CD5 e anti-LY75, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a especificidade de ligação de cada molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugadas umas às outras. Quando a especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, diversos agentes de acoplamento ou reticulação podem ser usados para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB), o- fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossuccinimidil 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) [veja, por exemplo, Karpovsky e cols. (1984) J. Exp. Med. 160: 1.686; Liu, MA e cols. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 8.648]. Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N° 78, 118-132; Brennan e cols. (1985) Science 229: 81-83, e Glennie e cols. (1987) J. Immunol. 139: 2.367-2.375. Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis por Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[188] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados por meio de ligação sulfidrila das regiões de dobradiça do terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, preferivelmente um, antes da conjugação.
[189] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2 ou ligante x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única que compreende um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única que compreende dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para a preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Números 5.260.203, 5.455.030, 4.881.175, 5.132.405, 5.091.513, 5.476.786, 5.013.653, 5.258.498 e 5.482.858, todas as quais são aqui expressamente incorporadas por referência.
[190] Os anticorpos da invenção podem ser participantes biespecíficos de célula T (BiTEs). BiTEs são uma classe de anticorpos monoclonais biespecíficos artificiais. Eles dirigem o sistema imune do hospedeiro, mais especificamente a atividade citotóxica de células T, contra células de câncer. BiTEs são geralmente proteínas de fusão que consistem em dois fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs) de anticorpos diferentes, ou sequências de aminoácidos de quatro genes diferentes, em uma única cadeia peptídica, preferivelmente de cerca de 55 quilodáltons (9,1x10-23 kg). De preferência, um dos scFvs se liga às células T por meio do receptor CD3, e o outro a uma célula tumoral por meio de uma molécula tumor-específica.
[191] A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise por FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular por emprego de um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados usando, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado à enzima que reconhece e se liga especificamente aos complexos de anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados com o uso de qualquer um de vários outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioativamente e usado em um radioimunoensaio (RIA) (veja, por exemplo, Weintraub, B., “Principles of Radioimmunoassays”, “Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques”, “The Endocrine Society”, Março de 1986, que é aqui incorporado por referência). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios como, por exemplo, o uso de um contador y ou um contador de cintilação ou por autorradiografia.
Glicosilação
[192] Outro tipo de modificação covalente consiste em alterações na glicosilação. Em algumas modalidades, os anticorpos aqui revelados podem ser modificados para incluir uma ou mais glicoformas modificadas geneticamente. O termo “glicoforma modificada geneticamente”, como aqui usado, significa uma composição de carboidrato que é anexada covalentemente ao anticorpo, em que a composição de carboidrato difere quimicamente daquela de um anticorpo parente. Glicoformas modificadas geneticamente podem ser úteis para diversas finalidades, incluindo, sem limitação, aumento ou redução da função efetora. Por exemplo, pode ser feito um anticorpo aglicosilado (ou seja, o anticorpo que não possui glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Essas modificações de carboidrato podem ser obtidas, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, pode ser feita uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação da treliça da região variável para, dessa forma, eliminar a glicosilação naquele sítio. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Uma abordagem desse tipo é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos 5.714.350 e 6.350.861 por Co e cols., e pode ser obtida por remoção da asparagina na posição 297.
[193] Uma forma preferida de glicoforma modificada geneticamente é a afucosilação, que demonstrou estar correlacionada com um aumento na função de ADCC, presumivelmente por meio de uma ligação mais apertada ao receptor FcyRIIIa. Nesse contexto, “afucosilação” significa que a maioria dos anticorpos produzidos nas células hospedeiras é substancialmente desprovida de fucose, por exemplo, 90-95-98% dos anticorpos gerados não possuem fucose apreciável como um componente da porção de carboidrato do anticorpo (geralmente anexada em N297 na região Fc). Definidos funcionalmente, anticorpos afucosilados geralmente exibem pelo menos a 50% ou mais afinidade para o receptor FcyRIIIa.
[194] Glicoformas modificadas geneticamente podem ser geradas por diversos métodos conhecidos na técnica (Umana e cols., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies e cols., 2001, Biotechnol. Bioeng. 74: 288-294; Shields e cols., 2002, J. Biol. Chem. 277: 26.733-26.740; Shinkawa e cols., 2003, J. Biol. Chem. 278: 3.466-3.473; US 6.602.684; USSN 10/277.370; USSN 10/113.929; PCT WO 00/61739 A1; PCT WO 01/29246 A1; PCT WO 02/31140 A1; PCT WO 02/30954 A1, todos inteiramente incorporados por referência; tecnologia POTELLIGENT® [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; tecnologia de glicosilação por engenharia genética GlycoMAb® [Glycart Biotechnology AG, Zurique, Suíça]). Muitas dessas técnicas se baseiam no controle do nível de oligossacarídeos fucosilados e/ou de bissecção que são anexados covalentemente à região Fc, por exemplo, por expressão de uma IgG em vários organismos ou linhagens de células, por engenharia genética ou de outra forma (por exemplo, células CHO Lec-13 ou células de hibridoma de rato YB2/0, por regulação de enzimas envolvidas na via de glicosilação (por exemplo, FUT8 [α1,6-fucosiltranserase] e/ou β1-4-N- acetilglucosaminiltransferase III [Gn TIII]), ou por modificação de carboidrato(s) após a IgG ter sido expressa. Por exemplo, o “anticorpo modificado geneticamente com açúcar” ou “tecnologia SEA” de “Seattle Genetics” funciona por adição de sacarídeos modificados que inibem a fucosilação durante a produção; veja, por exemplo, US2009/0317869, aqui incorporado por referência em sua totalidade. “Glicoforma modificada geneticamente” tipicamente se refere ao carboidrato ou oligossacarídeo diferente, quando comparado com o anticorpo feito na ausência da tecnologia de glicosilação; dessa forma, um anticorpo pode incluir uma glicoforma modificada geneticamente.
[195] Alternativamente, “glicoforma modificada geneticamente” pode se referir à variante de IgG que compreende o carboidrato ou oligossacarídeo diferente. Como é conhecido na técnica, os padrões de glicosilação podem depender tanto da sequência da proteína (por exemplo, da presença ou ausência de resíduos de aminoácidos de glicosilação particulares, discutidos abaixo), quanto da célula ou organismo hospedeiro no qual a proteína é produzida. Sistemas de expressão particulares são discutidos abaixo.
[196] A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ligada ao N ou ligada ao O. Ligada ao N se refere à adesão da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para adesão enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Dessa forma, a presença de uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação ligada ao O se refere à adesão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose, a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina também possam ser usados.
[197] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida por alteração da sequência de aminoácidos de tal forma que ela contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação ligada ao N). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência de partida (para sítios de glicosilação ligada ao O). Para facilitar, a sequência de aminoácidos do anticorpo é preferivelmente alterada por meio de alterações no nível de DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o polipeptídeo-alvo em bases pré-selecionadas, de tal forma que sejam gerados códons que se traduzirão nos aminoácidos desejados.
[198] Outro meio de aumentar o número de porções de carboidrato no anticorpo é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos à proteína. Esses procedimentos são vantajosos, na medida em que não necessitam da produção da proteína em uma célula hospedeira que possui capacidades de glicosilação para glicosilação ligada ao N e ao O. Dependendo do modo de acoplamento usado, o açúcar (ou açúcares) pode ser anexado: (a) à arginina e histidina, (b) aos grupos carboxil livres, (c) aos grupos sulfidrila livres como, por exemplo, aqueles de cisteína, (d) aos grupos hidroxil livres como, por exemplo, aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) aos resíduos aromáticos como, por exemplo, aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) ao grupo amida de glutamina. Esses métodos são descritos em WO 87/05330 e em Aplin e Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306, ambos inteiramente incorporados por referência.
[199] A remoção de porções de carboidrato presentes no anticorpo de partida (por exemplo, pós-tradução) pode ser obtida quimicamente ou enzimaticamente. A deglicosilação química exige a exposição da proteína ao composto ácido trifluormetanossulfônico, ou a um composto equivalente. Esse tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina) deixando, ao mesmo tempo, o polipeptídeo intacto. A deglicosilação química é descrita por Hakimuddin e cols., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 e por Edge e cols., 1981, Anal. Biochem. 118: 131, ambos inteiramente incorporados por referência. A clivagem enzimática de porções de carboidrato em polipeptídeos pode ser obtida pelo uso de diversas endo- e exoglicosidases, como descrito por Thotakura e cols., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350, inteiramente incorporado por referência, incluindo a remoção de resíduos de fucose com o uso de uma enzima fucosidase, como é conhecido na técnica. A glicosilação em sítios de glicosilação potenciais pode ser evitada pelo uso do composto tunicamicina, como descrito por Duskin e cols., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3.105, inteiramente incorporado por referência. A tunicamicina bloqueia a formação de ligações proteína-N-glicosídeo.
[200] Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a vários polímeros não proteináceos, incluindo, sem limitação, vários polióis como, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da forma descrita, por exemplo, no Catálogo de PEG de 2005-2006 de Nektar Therapeutics (disponível no website de Nektar), Patentes U.S. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337, todos inteiramente incorporados por referência. Além disso, como é conhecido na técnica, podem ser feitas substituições de aminoácidos em várias posições dentro do anticorpo para facilitar a adição de polímeros como, por exemplo, PEG. Veja, por exemplo, a Publicação U.S. N° 2005/01 14037 A1, inteiramente incorporada por referência.
[201] Em modalidades adicionais, por exemplo, no uso dos anticorpos da invenção para fins diagnósticos ou de detecção, os anticorpos podem compreender um marcador. O termo “marcado” significa nesse relatório descritivo que um composto possui pelo menos um elemento, isótopo ou composto químico anexado para permitir a detecção do composto. Em geral, marcadores se enquadram em três classes: a) marcadores isotópicos, que podem ser isótopos radioativos ou pesados; b) magnéticos, elétricos, térmicos; e c) corantes coloridos ou luminescentes; embora marcadores incluam enzimas e partículas como, por exemplo, também partículas magnéticas. Marcadores preferidos incluem, sem limitação, complexos fluorescentes de lantanídeo (incluindo aqueles de európio e térbio), e marcadores fluorescentes incluindo, sem limitação, pontos quânticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarelo Lucifer, azul Cascata, vermelho Texas, os corantes Alexa, os corantes Cy, e outros descritos na 6a Edição do “Molecular Probes Handbook” por Richard P. Haugland, aqui expressamente incorporado por referência.
Conjugados anticorpo-fármaco
[202] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LY75 da invenção são conjugados com fármacos para formar conjugados anticorpo-fármaco (ADCs). Em geral, ADCs são usados em aplicações em oncologia, nas quais o uso de conjugados anticorpo-fármaco para a liberação local de agentes citotóxicos ou citostáticos permite a liberação direcionada da porção de fármaco a tumores, o que pode permitir eficácia maior, menor toxicidade etc. Uma visão geral dessa tecnologia é fornecida em Ducry e cols., Bioconjugate Chem., 21: 5-13 (2010), Carter e cols., Cancer J. 14 (3): 154 (2008) e Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13: 235-244 (2009), todos aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[203] Dessa forma, a invenção fornece anticorpos anti- LY75 conjugados a fármacos. Geralmente, a conjugação é feita por adesão covalente ao anticorpo, como adicionalmente descrito abaixo, e geralmente se baseia em um vinculador, frequentemente uma ligação peptídica (que, como descrito abaixo, pode ser designada para ser sensível à clivagem por proteases no local-alvo ou não). Além disso, como descrito acima, a ligação da unidade vinculador- fármaco (LU-D) pode ser feita por adesão a cisteínas dentro do anticorpo. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, o número de porções de fármaco por anticorpo pode alterar, dependendo das condições da reação, e podem variar de 1:1 a 10:1 de fármaco:anticorpo. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, o número real é uma média.
[204] Dessa forma, a invenção fornece anticorpos anti- LY75 conjugados a fármacos. Como descrito abaixo, o fármaco do ADC pode ser qualquer número de agentes, incluindo, sem limitação, agentes citotóxicos como, por exemplo, agentes quimioterápicos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, ou fragmentos destas), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado). Em outras modalidades, a invenção ainda fornece métodos de utilização dos ADCs.
[205] Fármacos para uso na presente invenção incluem fármacos citotóxicos, particularmente aqueles que são usados para terapia do câncer. Esses fármacos incluem, em geral, agentes que danificam o DNA, antimetabólitos, produtos naturais e seus análogos. Classes exemplares de agentes citotóxicos incluem os inibidores de enzima como, por exemplo, inibidores da diidrofolato redutase, e inibidores da timidilato sintase, intercaladores de DNA, clivadores de DNA, inibidores da topoisomerase, a família de fármacos da antraciclina, os fármacos da vinca, as mitomicinas, as bleomicinas, os nucleosídeos citotóxicos, a família de fármacos de pteridina, diinenos, as podofilotoxinas, dolastatinas, maitansinóides, indutores de diferenciação e taxóis.
[206] Membros dessas classes incluem, por exemplo, taxol, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5- fluoruracil, 6-mercaptopurina, citosina arabinosídeo, melfalan, leurosina, leurosideina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, mitomicina A, caminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina e derivados de podofilotoxina como, por exemplo, etoposida ou fosfato de etoposida, vinblastina, vincristina, vindesina, taxanos, incluindo taxol, taxotere ácido retinóico, ácido butírico, N8-acetil espermidina, camptotecina, caliqueamicina, esperamicina, eno-diinos, duocarmicina A, duocarmicina SA, caliqueamicina, camptotecina, hemiasterlinas, maitansinóides (incluindo DM1), monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF), e maitansinóides (DM4) e seus análogos.
[207] Toxinas podem ser usadas como conjugados de anticorpo-toxina e incluem toxinas bacterianas como, por exemplo, toxina diftérica, toxinas de plantas como, por exemplo, ricina, toxinas de pequena molécula como, por exemplo, geldanamicina (Mandler e cols. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1.573-1.581; Mandler e cols. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1.025-1.028; Mandler e cols. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu e cols., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 8.618-8.623), e caliqueamicina (Lode e cols. (1998) Cancer Res. 58: 2.928; Hinman e cols. (1993) Cancer Res. 53: 3.336-3.342), hemiasterlinas (WO 2004/026293; Zask e cols., (2004) J. Med. Chem., 47: 4.774 4.786). Toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem ligação de tubulina, ligação de DNA, ou inibição de topoisomerase.
[208] Conjugados de um anticorpo anti-LY75 e uma ou mais toxinas de pequena molécula, por exemplo, maitansinóides, dolastatinas, auristatinas, um tricoteceno, caliqueamicina, e CC1065, e os derivados dessas toxinas que possuem atividade de toxina, também podem ser usados.
Maitansinóides
[209] Compostos de maitansina adequados para uso como porções de fármaco de maitansinóide são bem conhecidos na técnica, e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos, produzidos com o uso de técnicas de engenharia genética (veja Yu e cols. (2002) PNAS 99: 7.968 7.973), ou maitansinol e análogos de maitansinol preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos. Como descrito abaixo, fármacos podem ser modificados pela incorporação de um grupo funcionalmente ativo como, por exemplo, um grupo tiol ou amina para conjugação ao anticorpo.
[210] Porções de fármaco de maitansinóide exemplares incluem aquelas que possuem um anel aromático modificado, por exemplo: C-19-decloro (Patente U.S. N° 4.256.746) (preparado por redução com hidreto de lítio alumínio de ansamitocina P2); C-20-hidróxi (ou C-20-demetil) +/-C-19- decloro (Patentes U.S. Nos 4.361.650 e 4.307.016) (preparado por desmetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração usando LAH); e C-20-demetoxi, C- 20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (Patente U.S. N° 4.294.757) (preparado por acilação usando cloretos de acila) e aquelas que possuem modificações em outras posições.
[211] Porções de fármaco de maitansinóide exemplares também incluem aquelas que possuem modificações como, por exemplo: C-9-SH (Patente U.S. N° 4.424.219) (preparado pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5); C-14-alcoximetil (demetoxi/CH2OR) (Patente U.S. N° 4.331.598); C-14-hidróxi metil ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAC) (Patente U.S. N° 4.450.254) (preparado por Nocardia); C-15-hidróxi/aciloxi (Patente U.S. N° 4.364.866) (preparado pela conversão de maitansinol por Streptomyces); C-15-metóxi (Patentes U.S. Nos 4.313.946 e 4.315.929) (isolado de Trewia nudlflora); C-18-N-demetil (Patentes U.S. Nos 4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces); e 4,5-desóxi (Patente U.S. N° 4.371.533) (preparado pela redução com tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
[212] De uso particular são DM1 (revelado na Patente U.S. N° 5.208.020, incorporada por referência) e DM4 (revelado na Patente U.S. N° 7.276.497, incorporada por referência). Veja também diversos derivados de maitansinóide adicionais e métodos em 5.416.064, WO/01/24763, 7.303.749, 7.601.354, USSN 12/631.508, WO 02/098883, 6.441.163, 7.368.565, WO 02/16368 e WO 04/1033272, todos os quais são expressamente incorporados por referência em sua totalidade.
[213] ADCs contendo maitansinóides, métodos de produção dos mesmos e seu uso terapêutico são revelados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.208.020, 5.416.064, 6.441.163 e Patente Européia EP 0 425 235 B1, cujas revelações são aqui expressamente incorporadas por referência. Liu e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 8.618-8.623 (1996) descreveram ADCs que compreendem um maitansinóide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra câncer cólon-retal humano. Foi constatado que o conjugado é altamente citotóxico contra células cultivadas de câncer do cólon, e mostrou atividade antitumoral em um ensaio de crescimento tumoral in vivo.
[214] Chari e cols., Cancer Research 52: 127-131 (1992) descrevem ADCs nos quais um maitansinóide foi conjugado por meio de um vinculador dissulfeto ao anticorpo murídeo A7 por ligação a um antígeno em linhagens de células de câncer do cólon humano, ou a outro anticorpo monoclonal murídeo TA.1 que se liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado de TA.1-maitansinóide foi testada in vitro na linhagem de células de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de fármaco obteve um grau de citotoxicidade similar ao fármaco maitansinóide livre, que podia ser aumentada por aumento do número de moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado de A7- maitansinóide mostrou citotoxicidade sistêmica baixa em camundongos.
Auristatinas e dolastatinas
[215] Em algumas modalidades, o ADC compreende um anticorpo anti-LY75 conjugado às dolastatinas ou análogos e derivados peptídicos de dolastatina, às auristatinas (Patentes U.S. Nos 5.635.483; 5.780.588). Foi demonstrado que dolastatinas e auristatinas interferem com a dinâmica do microtúbulo, hidrólise de GTP, e divisão nuclear e celular (Woyke e cols. (2001) Antimicrob. Agents e Chemother. 45 (12): 3.580-3.584) e possuem atividade anticâncer (Patente U.S. N° 5.663.149) e antifúngica (Pettit e cols. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2.961-2.965). A porção de fármaco de dolastatina ou auristatina pode ser anexada ao anticorpo por meio do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxil) da porção peptídica de fármaco (WO 02/088172).
[216] Modalidades de auristatina exemplares incluem as porções de fármaco de monometilauristatina ligadas ao terminal-N DE e DF, reveladas em Senter e cols., “Proceedings of the American Association for Cancer Research”, Volume 45, Número do Resumo 623, apresentado em 28 de março de 2004 e descrito na Publicação de Patente U.S. N° 2005/0238648, cuja revelação é expressamente incorporada por referência em sua totalidade.
[217] Uma modalidade de auristatina exemplar é MMAE (mostrado na Figura 10, na qual a linha ondulada indica a adesão covalente a um vinculador (L) de um conjugado de anticorpo-fármaco; veja a Patente U.S. N° 6.884.869 expressamente incorporada por referência em sua totalidade).
[218] Outra modalidade de auristatina exemplar é MMAF, mostrado na Figura 10, na qual a linha ondulada indica a adesão covalente a um vinculador (L) de um conjugado de anticorpo-fármaco (US 2005/0238649, 5.767.237 e 6.124.431, expressamente incorporados por referência em sua totalidade).
[219] Modalidades exemplares adicionais que compreendem MMAE ou MMAF e vários componentes vinculadores (aqui descritos posteriormente) possuem as seguintes estruturas e abreviações (em que Ab significa anticorpo e p é 1 até cerca de 8).
[220] Tipicamente, porções de fármaco baseadas em peptídeo podem ser preparadas por formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Essas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (veja E. Schroder e K. Lubke, “The Peptides”, volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. As porções de fármaco de auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos da Patente U.S. N° 5.635.483; Patente U.S. N° 5.780.588; Pettit e cols. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5.463-5.465; Pettit e cols. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G.R., e cols. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit e cols. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863; e Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21 (7) 778 784.
Caliqueamicina
[221] Em outras modalidades, o ADC compreende um anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. Por exemplo, Mylotarg é o primeiro fármaco de ADC comercial e utiliza caliqueamicina Y1 como a carga útil (veja a Patente U.S. N° 4.970.198, incorporada por referência em sua totalidade). Derivados de caliqueamicina adicionais são descritos nas Patentes U.S. Nos 5.264.586, 5.384.412, 5.550.246, 5.739.116, 5.773.001, 5.767.285 e 5.877.296, todas expressamente incorporadas por referência. A família de caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de fita dupla em concentrações subpicomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, veja as Patentes U.S. Nos 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, sem limitação, Y11, α21, α21, N-acetil- Y11, PSAG e θI1 (Hinman e cols., Cancer Research 53: 3.336 3.342 (1993), Lode e cols., Cancer Research 58: 2.925-2.928 (1998) e as Patentes U.S. mencionadas anteriormente para American Cyanamid). Outro fármaco antitumoral com o qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Caliqueamicina e QFA possuem locais de ação intracelulares e não atravessa facilmente a membrana plasmática. Portanto, a captação celular desses agentes por meio da internalização mediada por anticorpo aumenta acentuadamente seus efeitos citotóxicos.
Duocarmicinas
[222] CC-1065 (veja 4.169.888, incorporada por referência) e duocarmicinas são membros de uma família de antibióticos antitumorais utilizados em ADCs. Parece que esses antibióticos funcionam por alquilação sequência- seletivamente de DNA no N3 de adenina na fenda menor, o que inicia uma cascata de eventos que resultam em apoptose.
[223] Membros importantes das duocarmicinas incluem duocarmicina A (Patente U.S. N° 4.923,990, incorporada por referência) e duocarmicina SA (Patente U.S. N° 5.101.038, incorporada por referência), e um grande número de análogos, como descrito nas Patentes U.S. Nos 7.517.903, 7.691.962, 5.101.038, 5.641.780, 5.187.186, 5.070.092; 5.070.092, 5.641.780, 5.101.038, 5.084.468, 5.475.092, 5.585.499, 5.846.545, WO 2007/089149, WO 2009/017394 A1, 5.703.080, 6.989.452, 7.087.600, 7.129.261, 7.498.302 e 7.507.420, todas as quais são expressamente incorporadas por referência.
Pirrolobenzodiazepinas
[224] Pirrolobenzodiazepina (PBD) (Journal of Medicinal Chemistry 2001, 44, 737-748) são agentes DNA-interativos com citotoxicidade significante. Treze estruturas dessa família foram isoladas, incluindo compostos como, por exemplo, antramicina, mazetramicina, porotramicina, protracarcina, sibanomicina, tomaimicina, sibiromicina, quicamicina A, neotramicina A, B e DC-81 (“Medicinal Chemistry and Drug Design”, ISBN: 978-953-51-0513-8, Ahmed Kamal e cols. DOI: 10.5772/38869). Outros análogos dessa família foram preparados e foram conjugados a anticorpos, como descrito nas Patentes Nos WO 2011/130598 e WO 2011/130616, que são expressamente incorporadas por referência.
Outros agentes citotóxicos
[225] Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados aos anticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluoruracil, a família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL-E33288 descrita nas Patentes U.S. Nos 5.053.394, 5.770.710, bem como esperamicinas (Patente U.S. N° 5.877.296).
[226] Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação da toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa- sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de Diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, WO 93/21232. Publicada em 28 de outubro de 1993.
[227] A presente invenção ainda contempla um ADC formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease como, por exemplo, uma desoxirribonuclease; DNase).
[228] Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Diversos isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu.
[229] Os marcadores radioativos ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado por formas conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácido usando precursores de aminoácidos adequados que envolvem, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores como, por exemplo, Tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111, podem ser anexados por meio de um resíduo de cisteína no peptídeo. Ítrio-90 pode ser anexado por meio de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker e cols. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar Iodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.
[230] Para composições que compreendem diversos anticorpos, a carga de fármaco é representada por p, o número médio de moléculas de fármaco por Anticorpo. A carga de fármaco pode variar de 1 a 20 fármacos (D) por Anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo na preparação de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais como, por exemplo, espectroscopia de massa, ensaio ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de Conjugados Anticorpo-Fármaco em termos de p também pode ser determinada.
[231] Em alguns casos, separação, purificação e caracterização de conjugados anticorpo-fármaco homogêneos, em que p é certo valor de Conjugados Anticorpo-Fármaco com outras cargas de fármaco podem ser obtidas por meios como, por exemplo, HPLC de fase reversa ou eletroforese. Em modalidades exemplares, p é 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, ou uma fração destes.
[232] A geração de compostos de conjugado anticorpo- fármaco pode ser obtida por qualquer metodologia conhecida por aqueles habilitados na técnica. Resumidamente, os compostos de conjugado anticorpo-fármaco podem incluir um anticorpo anti-LY75 como a unidade de anticorpo, um fármaco e, opcionalmente, um vinculador que une o fármaco e o agente de ligação.
[233] Diversas reações diferentes estão disponíveis para adesão covalente de fármacos e/ou vinculadores aos agentes de ligação. Isso pode ser obtido por reação dos resíduos de aminoácidos do agente de ligação, por exemplo, molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina de lisina, os grupos ácido carboxílico livres de ácido glutâmico e aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e as várias porções dos aminoácidos aromáticos. Um método não específico comumente usado de adesão covalente é a reação de carbodiimida para ligar um grupo carbóxi (ou amino) de um composto aos grupos amino (ou carbóxi) do anticorpo. Adicionalmente, agentes bifuncionais como, por exemplo, dialdeídos ou imidoésteres, foram usados para ligar o grupo amino de um composto aos grupos amino de uma molécula de anticorpo.
[234] Também está disponível para a adesão de fármacos aos agentes de ligação a reação de base de Schiff. Esse método envolve a oxidação de periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidróxi formando, dessa forma, um aldeído, que é então reagido com o agente de ligação. A adesão ocorre por meio da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para aderir covalentemente fármacos aos agentes de ligação. Outras metodologias são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e dentro do escopo da presente invenção.
[235] Em algumas modalidades, um intermediário, que é o precursor do vinculador, é reagido com o fármaco sob condições apropriadas. Em outras modalidades, grupos reativos são usados no fármaco e/ou no intermediário. O produto da reação entre o fármaco e o intermediário, ou o fármaco derivatizado, é subsequentemente reagido com um anticorpo anti-LY75 da invenção sob condições apropriadas.
[236] Será subentendido que também podem ser feitas modificações químicas ao composto desejado a fim de tornar as reações daquele composto mais convenientes para fins de preparação de conjugados da invenção. Por exemplo, um grupo funcional, por exemplo, amina, hidroxil ou sulfidrila, pode ser anexado ao fármaco em uma posição que possui efeito mínimo ou aceitável sobre a atividade ou outras propriedades do fármaco.
Unidades vinculadoras
[237] Tipicamente, os compostos de conjugado anticorpo- fármaco compreendem a unidade vinculadora entre a unidade de fármaco e a unidade de anticorpo. Em algumas modalidades, o vinculador é clivável sob condições intracelulares ou extracelulares, de tal forma que a clivagem do vinculador libera a unidade de fármaco do anticorpo no ambiente apropriado. Por exemplo, tumores sólidos que secretam certas proteases podem servir como o alvo do vinculador clivável; em outras modalidades, são utilizadas as proteases intracelulares. Ainda em outras modalidades, a unidade vinculadora não é clivável e o fármaco é liberado, por exemplo, por degradação do anticorpo em lisossomos.
[238] Em algumas modalidades, o vinculador é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossomo ou endossomo ou cavéolas). O vinculador pode ser, por exemplo, um vinculador de peptidil que é clivado por uma enzima peptidase ou protease intracelular, incluindo, sem limitação, uma protease lisossômica ou endossômica. Em algumas modalidades, o vinculador de peptidil possui pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento ou mais. Agentes de clivagem podem incluir, sem limitação, catepsinas B e D e plasmina, todas sabidamente hidrolisam derivados de fármaco dipeptídico resultando na liberação de fármaco ativo dentro de células-alvo (veja, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). Vinculadores de peptidil são cliváveis por enzimas que estão presentes em células que expressam LY75. Por exemplo, um vinculador de peptidil que é clivável pela protease tiol-dependente catepsina-B, que é altamente expressa em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um vinculador de Phe-Leu ou um vinculador de Gly-Phe-Leu-Gly (ID. DE SEQ. N°: X)). Outros exemplos desses vinculadores são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 6.214.345, aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todas as finalidades.
[239] Em algumas modalidades, o vinculador de peptidil clivável por uma protease intracelular é um vinculador de Val-Cit ou um vinculador de Phe-Lys (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.214.345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o vinculador de val-cit).
[240] Em outras modalidades, o vinculador clivável é sensível ao pH, ou seja, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Tipicamente, o vinculador sensível ao pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, um vinculador ácido-lábil que é hidrolisável no lisossomo (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiossemicarbazona, amida cis-aconítico, ortoéster, acetal, cetal, ou semelhantes) pode ser usado (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville e cols., 1989, Biol. Chem. 264: 14.653-14.661). Esses vinculadores são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, por exemplo, aquelas no sangue, mas são instáveis em pH abaixo de 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossomo. Em certas modalidades, o vinculador hidrolisável é um vinculador de tioéter (como, por exemplo, um tioéter anexado ao agente terapêutico por meio de uma ligação acil- hidrazona, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.622.929).
[241] Ainda em outras modalidades, o vinculador é clivável sob condições redutoras (por exemplo, um vinculador de dissulfeto). Diversos vinculadores de dissulfeto são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3- (2- piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2- piridilditio) butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil- alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno)-, SPDB e SMPT (veja, por exemplo, Thorpe e cols., 1987, Cancer Res. 47: 5.924-5.931; Wawrzynczak e cols., Em “Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer” (C.W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987; veja também a Patente U.S. N° 4.880.935).
[242] Em outras modalidades, a vinculador é um vinculador de malonato (Johnson e cols., 1995, Anticancer Res. 15: 1.387-93), um vinculador de maleimidobenzoil (Lau e cols., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1.299-1.304), ou um análogo de 3’-N-amida (Lau e cols., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1.305-12).
[243] Ainda em outras modalidades, a unidade vinculadora não é clivável e o fármaco é liberado por degradação do anticorpo (veja a Publicação U.S. N° 2005/0238649, aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todas as finalidades).
[244] Em muitas modalidades, o vinculador é auto- rearranjável (self-immolative). Como aqui usado, o termo “espaçador auto-rearranjável” se refere a uma porção química bifuncional que é capaz de ligar covalentemente em conjunto duas porções químicas espaçadas em uma molécula tripartite estável. Ela irá se separar espontaneamente da segunda porção química se sua ligação à primeira porção for clivada. Veja, por exemplo, WO 2007/059404A2, WO 06/110476A2, WO 05/112919A2, WO 2010/062171, WO 09/017394, WO 07/089149, WO 07/018431, WO 04/043493 e WO 02/083180, que são dirigidas aos conjugados fármaco-substrato clivável, em que o fármaco e o substrato clivável são opcionalmente ligados por meio de um vinculador auto- rearranjável, e que são, todas, expressamente incorporadas por referência.
[245] Frequentemente o vinculador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Como aqui usado, o termo “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular”, no contexto de um vinculador, significa que no máximo cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, ou no máximo cerca de 1% dos vinculadores, em uma amostra de composto de conjugado anticorpo-fármaco são clivados quando o composto de conjugado anticorpo-fármaco se apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma).
[246] Se um vinculador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, por incubação com plasma do composto de conjugado anticorpo-fármaco por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas), e depois quantificação da quantidade de fármaco livre presente no plasma.
[247] Em outras modalidades, não mutualmente exclusivas, o vinculador promove internalização celular. Em certas modalidades, o vinculador promove internalização celular quando conjugado ao agente terapêutico (ou seja, no ambiente do vinculador-porção de agente terapêutico do composto de conjugado anticorpo-fármaco como aqui descrito). Ainda em outras modalidades, o vinculador promove internalização celular quando conjugado tanto ao composto de auristatina quanto aos anticorpos anti-LY75 da invenção.
[248] Diversos vinculadores exemplares, que podem ser usados com as presentes composições e métodos, são descritos em WO 2004/010957, Publicação U.S. N° 2006/0074008, Publicação U.S. N° 20050238649 e Publicação U.S. N° 2006/0024317 (cada uma delas aqui incorporada por referência em sua totalidade e para todas as finalidades).
Carga de fármaco
[249] A carga de fármaco é representada por p e é o número médio de porções de fármaco por anticorpo em uma molécula. A carga de fármaco (“p”) pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais porções (D) por anticorpo, embora frequentemente o número médio seja uma fração ou um decimal. Geralmente, uma carga de fármaco de 1 a 4 é frequentemente útil, e de 1 a 2 também é útil. Os ADCs da invenção incluem coleções de anticorpos conjugados com uma gama de porções de fármaco, de 1 a 20, por exemplo, 1-15, 1-10, 2-9, 3-8, 4-7, 5-6. O número médio de porções de fármaco por anticorpo em preparações de ADC por reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais como, por exemplo, espectroscopia de massa e ensaio ELISA.
[250] A distribuição quantitativa de ADC em termos de p também pode ser determinada. Em alguns casos, separação, purificação e caracterização de ADC homogêneo em que p é certo valor de ADC com outras cargas de fármaco podem ser obtidas por meios como, por exemplo, eletroforese.
[251] Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de adesão no anticorpo. Por exemplo, quando a adesão é um tiol de cisteína, como nas modalidades exemplares acima, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um vinculador pode ser anexado. Em certas modalidades, uma carga de fármaco maior, por exemplo, p>5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo- fármaco. Em certas modalidades, a carga de fármaco para um ADC da invenção varia de 1 até cerca de 8; de cerca de 2 até cerca de 6; de cerca de 3 até cerca de 5; de cerca de 3 até cerca de 4; de cerca de 3,1 até cerca de 3,9; de cerca de 3,2 até cerca de 3,8; de cerca de 3,2 até cerca de 3,7; de cerca de 3,2 até cerca de 3,6; de cerca de 3,3 até cerca de 3,8; ou de cerca de 3,3 até cerca de 3,7. Na verdade, foi demonstrado que, para certos ADCs, a proporção ótima de porções de fármaco por anticorpo pode ser menor do que 8, e pode ser cerca de 2 até cerca de 5. Veja US 2005/0238649 A1 (aqui incorporada por referência em sua totalidade).
[252] Em certas modalidades, menos do que o máximo teórico de porções de fármaco são conjugados a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o fármaco-intermediário vinculador ou reagente vinculador, como discutido abaixo. Geralmente, anticorpos não contêm muitos grupos tiol de cisteína livres e reativos que possam estar ligados a uma porção de fármaco; na verdade, a maioria dos resíduos de tiol de cisteína em anticorpos existe como pontes dissulfeto. Em certas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor como, por exemplo, ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições redutoras parciais ou totais, para gerar grupos tiol de cisteína reativos. Em certas modalidades, um anticorpo é submetido às condições desnaturantes para revelar grupos nucleofílicos reativos como, por exemplo, lisina ou cisteína.
[253] A carga (proporção de fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes formas, por exemplo, por: (i) limitação do excesso molar de fármaco- intermediário vinculador ou reagente vinculador em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação de conjugação, (iii) condições redutivas parciais ou limitadas para modificação do tiol de cisteína, (IV) modificação genética por técnicas recombinantes da sequência de aminoácidos do anticorpo, de tal forma que o número e a posição de resíduos de cisteína sejam modificados para controle do número e/ou posição de adesões vinculador-fármaco (por exemplo, tioMab ou tioFab preparados como aqui revelado e em WO 2006/034488 (aqui incorporada por referência em sua totalidade)).
[254] Deve ser subentendido que, quando mais de um grupo nucleofílico reage com um fármaco-intermediário vinculador ou reagente vinculador, seguido por reagente de porção de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de uma ou mais porções de fármaco anexadas a um anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado da mistura por um ensaio ELISA de anticorpo duplo, que é específico para o anticorpo e específico para o fármaco. Moléculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia por interação hidrofóbica.
[255] Em algumas modalidades, um ADC homogêneo com um único valor de carga pode ser isolado da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia.
Métodos de determinação do efeito citotóxico de ADCs
[256] Métodos para determinar se um fármaco ou conjugado anticorpo-fármaco exerce um efeito citostático e/ou citotóxico em uma célula são conhecidos. Geralmente, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado anticorpo-fármaco pode ser medida por: exposição de células mamíferas que expressam uma proteína-alvo do conjugado anticorpo-fármaco em um meio de cultura de células; cultivo das células por um período de cerca de 6 horas até cerca de 5 dias; e medição da viabilidade celular. Ensaios in vitro baseados em células podem ser usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade e indução de apoptose (ativação de caspase) do conjugado anticorpo- fármaco.
[257] Para determinar se um conjugado anticorpo-fármaco exerce um efeito citostático, um ensaio de incorporação de timidina pode ser usado. Por exemplo, células de câncer que expressam um antígeno-alvo em uma densidade de 5.000 células/poço de uma placa de 96 poços podem ser cultivadas por um período de 72 horas e expostas a 0,5 μCi de 3H- timidina durante as 8 horas finais do período de 72 horas. A incorporação de 3H-timidina em células da cultura é medida na presença e ausência do conjugado anticorpo- fármaco.
[258] Para determinação da citotoxicidade, necrose ou apoptose (morte celular programada) podem ser medidas. A necrose é tipicamente acompanhada por permeabilidade aumentada da membrana plasmática; inchação da célula, e ruptura da membrana plasmática. A apoptose é tipicamente caracterizada por bolhas na membrana, condensação do citoplasma, e pela ativação de endonucleases endógenas. A determinação qualquer um desses efeitos em células de câncer indica que um conjugado anticorpo-fármaco é útil no tratamento de cânceres.
[259] A viabilidade celular pode ser medida por determinação em uma célula da captação de um corante como, por exemplo, vermelho neutro, azul tripano ou azul ALAMAR™ (veja, por exemplo, Page e cols., 1993, Intl. J. Oncology 3: 473-476). Em um ensaio desse tipo, as células são incubadas em meios que contêm o corante, as células são lavadas, e o corante restante, que reflete a captação celular do corante, é medido espectrofotometricamente. O corante de ligação de proteína sulforrodamina B (SRB) também pode ser usado para medir a citoxicidade (Skehan e cols., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1.107-12).
[260] Alternativamente, um sal tetrazólio, por exemplo, MTT, é usado em um ensaio colorimétrico quantitativo para sobrevida e proliferação de células mamíferas por detecção de células vivas, mas não de células mortas (veja, por exemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
[261] A apoptose pode ser quantificada por medição, por exemplo, da fragmentação de DNA. Métodos fotométricos comerciais para a determinação quantitativa in vitro da fragmentação de DNA estão disponíveis. Exemplos desses ensaios, incluindo TUNEL (que detecta a incorporação de nucleotídeos marcados em DNA fragmentado) e ensaios baseados em ELISA, são descritos em Biochemica, 1999, N° 2, páginas 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
[262] A apoptose também poder ser determinada por medição de alterações morfológicas em uma célula. Por exemplo, como ocorre com necrose, a perda da integridade da membrana plasmática pode ser determinada por medição da captação de certos corantes (por exemplo, um corante fluorescente como, por exemplo, laranja de acridina ou brometo de etídio). Um método para medição do número de células apoptóticas foi descrito por Duke e Cohen, “Current Protocols in Immunology” (Coligan e cols. eds., 1992, páginas 3.17.1-3.17.16). As células também podem ser marcadas com um corante de DNA (por exemplo, laranja de acridina, brometo de etídio ou iodeto de propídio) e as células observadas quanto à condensação e marginalização de cromatina ao longo da membrana nuclear interna. Outras alterações morfológicas que podem ser medidas para determinar apoptose incluem, por exemplo, condensação citoplasmática, formação aumentada de bolhas na membrana e encolhimento celular.
[263] A presença de células apoptóticas pode ser medida tanto nos compartimentos anexados quanto “flutuantes” das culturas. Por exemplo, ambos os compartimentos podem ser coletados por remoção do sobrenadante, tripsinização das células anexadas, combinação das preparações após uma etapa de lavagem por centrifugação (por exemplo, 10 minutos a 2.000 rpm), e detecção de apoptose (por exemplo, por medição da fragmentação de DNA) (veja, por exemplo, Piazza e cols., 1995, Cancer Research 55: 3.110-16).
[264] In vivo, o efeito de uma composição terapêutica do anticorpo anti-LY75 da invenção pode ser avaliado em um modelo animal adequado. Por exemplo, modelos xenogênicos de câncer podem ser usados, em que os explantes de câncer ou tecidos de xenoenxerto com múltiplas passagens são introduzidos em animais imunocomprometidos, por exemplo, camundongos nus ou SCID (Klein e cols., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). A eficácia pode ser medida com o uso de ensaios que medem a inibição da formação de tumor, regressão ou metástase do tumor, e semelhantes.
[265] As composições terapêuticas usadas na prática dos métodos citados anteriormente podem ser formuladas em composições farmacêuticas que compreendem um carregador adequado para o método de liberação desejado. Carregadores adequados incluem qualquer material que, quando combinado com a composição terapêutica, retenha a função antitumoral da composição terapêutica e seja geralmente não reativo com o sistema imune do paciente. Exemplos incluem, sem limitação, qualquer um entre vários carregadores farmacêuticos padronizados como, por exemplo, soluções salinas estéreis tamponadas com fosfato, água bacteriostática, e semelhante (veja, geralmente, “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 16a Edição, A. Osal., Ed., 1980).
Métodos para a produção dos anticorpos da invenção
[266] A presente invenção ainda fornece métodos para a produção dos anticorpos anti-LY75 revelados. Esses métodos englobam o cultivo uma célula hospedeira que contém ácido nucléico (ou ácidos nucléicos) isolado que codifica os anticorpos da invenção. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, isso pode ser feito de diversas formas, dependendo da natureza do anticorpo. Em algumas modalidades, quando os anticorpos da invenção são anticorpos tradicionais de comprimento total, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, sob condições tais que um anticorpo seja produzido e possa ser isolado.
[267] As cadeias pesadas e leves variáveis de LY75_A1 são aqui reveladas (sequências tanto de proteínas quanto de ácidos nucléicos); como será observado na técnica, essas podem ser facilmente aumentadas para produzir cadeias pesadas e leves de comprimento total. Ou seja, que receberam os fragmentos de DNA que codificam os segmentos VH e VK como aqui descritos, e esses fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados por técnicas padronizadas de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes da cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab, ou em um gene de scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VK ou VH é ligado operacionalmente a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, por exemplo, uma região constante de anticorpo ou um vinculador flexível. O termo “ligado operacionalmente”, como usado nesse contexto, visa significar que os dois fragmentos de DNA estão unidos de tal forma que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam em um molde.
[268] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene da cadeia pesada de comprimento total ligando-se operacionalmente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes da região constante da cadeia pesada murídea são conhecidas na técnica [veja, por exemplo, Kabat, E.A., e cols. (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a Edição, “US Department of Health and Human Services”, Publicação do NIH N° 91-3.242] e fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padronizada. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas, mais preferivelmente ainda, é uma região constante de IgG1 ou IgG4. Para um gene da cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode estar ligado operacionalmente a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante da cadeia pesada CH1.
[269] O DNA isolado que codifica a região VL/VK pode ser convertido em um gene da cadeia leve de comprimento total (bem como em um gene da cadeia leve de Fab) ligando- se operacionalmente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve, CL. As sequências de genes da região constante da cadeia leve murídea são conhecidas na técnica [veja, por exemplo, Kabat, E.A., e cols. (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a Edição, “US Department of Health and Human Services”, Publicação do NIH N° 91-3.242] e fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padronizada. Em modalidades preferidas, a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kapa ou lambda.
[270] Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL/VK são ligados operacionalmente a outro fragmento que codifica um vinculador flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4- Ser)3, de tal forma que as sequências de VH e VL/VK possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL/VK e VH unidas pelo vinculador flexível [veja, por exemplo, Bird e cols. (1988) Science 242: 423 426; Huston e cols. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5.879-5.883; McCafferty e cols., (1990) Nature 348: 552-554].
[271] Em geral, são fornecidos ácidos nucléicos que codificam os anticorpos da invenção. Esses polinucleotídeos codificam tanto as regiões variáveis quanto as constantes de cada uma das cadeias pesadas e leves, embora outras combinações também sejam contempladas pela presente invenção de acordo com as composições aqui descritas. A presente invenção também contempla fragmentos de oligonucleotídeos derivados dos polinucleotídeos revelados e sequências de ácidos nucléicos complementares àqueles polinucleotídeos.
[272] Os polinucleotídeos podem estar na forma de RNA ou DNA. Polinucleotídeos na forma de DNA, cDNA, DNA genômico, análogos de ácido nucléico e DNA sintético estão dentro do escopo da presente invenção. O DNA pode ser de fita dupla ou de fita simples e, se de fita simples, pode ser a fita codificadora (senso) ou a fita não codificadora (anti-senso). A sequência codificadora que codifica o polipeptídeo pode ser idêntica à sequência codificadora aqui fornecida ou pode ser uma sequência codificadora diferente, cuja sequência, como resultado da redundância ou degenerescência do código genético, codifica os mesmos polipeptídeos que o DNA aqui fornecido.
[273] Em algumas modalidades, o ácido nucléico (ou ácidos nucléicos) que codifica os anticorpos da invenção é incorporado em vetores de expressão, que podem ser extracromossômicos ou designados para se integrar no genoma da célula hospedeira na qual é introduzido. Vetores de expressão podem conter qualquer número de sequências reguladoras apropriadas (incluindo, sem limitação, sequências de controle da transcrição e tradução, promotores, sítios de ligação ribossômica, intensificadores, origens de replicação etc.) ou outros componentes (genes de seleção etc.), todos os quais são ligados operacionalmente, como é bem conhecido na técnica. Em alguns casos, são usados dois ácidos nucléicos, e cada um deles colocado em um vetor de expressão diferente (por exemplo, cadeia pesada em um primeiro vetor de expressão, cadeia leve em um segundo vetor de expressão) ou, alternativamente, eles podem ser colocados no mesmo vetor de expressão. Será observado por aqueles habilitados na técnica que o design do vetor de expressão (ou vetores), incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira, o nível de expressão de proteína desejado etc.
[274] Em geral, os ácidos nucléicos e/ou os vetores de expressão podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada para criar uma célula hospedeira recombinante com o uso de qualquer método adequado à célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), de tal forma que as moléculas de ácido nucléico sejam ligadas operacionalmente a um ou mais elementos de controle da expressão (por exemplo, em um vetor, em uma construção criada por processos na célula, integrados no genoma da célula hospedeira). A célula hospedeira recombinante resultante pode ser mantida sob condições adequadas à expressão (por exemplo, na presença de um indutor, em um animal não humano adequado, em meios de cultura adequados suplementados com sais apropriados, fatores de crescimento, antibióticos, suplementos nutricionais etc.), pelos quais os polipeptídeos codificados são produzidos. Em alguns casos, as cadeias pesadas são produzidas em uma célula e a cadeia leve em outra.
[275] Linhagens de células mamíferas disponíveis como hospedeiras para expressão são conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de células imortalizadas disponíveis pela “American Type Culture Collection” (ATCC), Manassas, VA incluindo, sem limitação, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HEK 293, células NSO, células HeLa, células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), e várias outras linhagens de células. Células não mamíferas incluindo, sem limitação, células bacterianas, de leveduras, insetos e plantas, também podem ser usadas para expressar anticorpos recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgênicos, por exemplo, vacas ou galinhas.
[276] Métodos gerais para biologia molecular, expressão, purificação e avaliação de anticorpos são bem conhecidos; por exemplo, veja as Patentes U.S. Nos 4.816.567, 4.816.397, 6.331.415 e 7.923.221, bem como “Antibody Engineering”, editado por Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 e 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2: 339-76; e Morrison, S. (1985) Science 229: 1.202.
Composições farmacêuticas
[277] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que contém um ou uma combinação de anticorpos para LY75, ou porção (ou porções) de ligação de antígeno destes, da presente invenção, formulada junto com um carregador farmaceuticamente aceitável. Essas composições podem incluir um ou uma combinação de anticorpos (por exemplo, dois ou mais anticorpos diferentes), ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a epitopos diferentes no antígeno-alvo ou que possuem atividades complementares.
[278] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia combinada, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir um anticorpo da presente invenção combinado com pelo menos (um) outro agente antitumoral, ou um agente antiinflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia combinada são descritos em mais detalhes abaixo na seção sobre usos dos anticorpos da invenção.
[279] Como aqui usado, “carregador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, e semelhantes, que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o carregador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, ou seja, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
[280] Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parente e não transmite quaisquer efeitos toxicológicos indesejados [veja, por exemplo, Berge, S.M., e cols. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19]. Exemplos desses sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, por exemplo, ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiódico, fosforoso e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos atóxicos como, por exemplo, ácidos alifáticos mono- e dicarboxílico, ácidos alcanóicos fenil- substituídos, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Sais de adição básica incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas atóxicas, por exemplo, N,N’-dibenziletilenodiamina, N- metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
[281] Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes hidrossolúveis, por exemplo, ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes lipossolúveis, por exemplo, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, por exemplo, ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.
[282] Exemplos de carregadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, por exemplo, azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, por exemplo, oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, por exemplo, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.
[283] Essas composições também podem conter adjuvantes como, por exemplo, conservantes, agentes umidificantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, supra, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e semelhantes. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser produzida pela inclusão de agentes que retardam a absorção como, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[284] Carregadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto quando quaisquer meios ou agentes convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o uso destes nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[285] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo, ou outra estrutura ordenada adequada à concentração elevada do fármaco. O carregador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhante), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como, por exemplo, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso de dispersão, e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como, por exemplo, manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser produzida por inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.
[286] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguida por esterilização por microfiltração. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e por congelamento (liofilização) que geram um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente esterilizada por filtração deste.
[287] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carregador para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do indivíduo que está sendo tratado e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carregador para produzir uma forma de dosagem única geralmente será aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de 100 por cento, essa quantidade irá variar de cerca de 0,01 por cento até cerca de 99 por cento de ingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1 por cento até cerca de 70 por cento, mais preferivelmente de cerca de 1 por cento até cerca de 30 por cento de ingrediente ativo, em combinação com um carregador farmaceuticamente aceitável.
[288] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer uma resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade de dosagem. O termo “forma de unidade de dosagem”, como aqui usado, se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carregador farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é ditada e diretamente dependente: (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido, e (b) das limitações inerentes na técnica de produção de compostos, por exemplo, um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
[289] Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, por exemplo, 0,001 a 50 mg/kg, 0,005 a 20 mg/kg, 0,01 a 10 mg/kg e, mais normalmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,05 mg/kg de peso corporal, 0,1 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg de peso corporal, 0,5 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 2 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 4 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal, 6 mg/kg de peso corporal, 7 mg/kg de peso corporal, 8 mg/kg de peso corporal, 9 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, 12 mg/kg de peso corporal, 15 mg/kg de peso corporal, 20 mg/kg de peso corporal, 25 mg/kg de peso corporal, 30 mg/kg de peso corporal, ou dentro da faixa de 0,1-20 mg/kg, 0,5-15 mg/kg, 1-10 mg/kg, 2-8 mg/kg, 3-7 mg/kg, 4-6 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar consiste na administração uma vez por dia, uma vez a cada 2 dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez ao mês, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-LY75 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por meio de administração intravenosa, com o anticorpo sendo dado com o uso de uma das seguintes posologias de dosagem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, e depois a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez, seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
[290] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, quando então a dosagem de cada anticorpo administrado se enquadra dentro das faixas indicadas. O anticorpo é normalmente administrado em várias ocasiões. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, diariamente, duas vezes por semana, semanalmente, mensalmente, a cada três meses, a cada seis meses, ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares, como indicado por medição dos níveis sanguíneos de anticorpo para o antígeno-alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para obter uma concentração plasmática de anticorpo de cerca de 1-1.000 μg/mL, 5-750 μg/mL, 10-600 μg/mL, 15-500 μg/mL, 20-400 μg/mL e, em alguns métodos, cerca de 25-300 μg/mL.
[291] Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, quando então é necessária administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes ao longo de um período de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é algumas vezes necessária, até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada e, preferivelmente, até que o paciente mostre melhora parcial ou completa de sintomas de doença. Posteriormente, o paciente pode receber a administração de um regime profilático.
[292] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados, de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração, particulares, sem serem tóxicos para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de diversos fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições da presente invenção, empregadas em particular, ou do éster, sal ou amida destas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular que está sendo empregado, da duração do tratamento, de outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica prévia do paciente que está sendo tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos na técnica médica.
[293] Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” de um anticorpo anti-LY75 da invenção preferivelmente resulta em uma diminuição na severidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração de períodos livres de sintomas de doença, ou uma prevenção dos déficits ou incapacidades em função da doença. Por exemplo, para o tratamento dos tumores mediados por LY75, uma “dosagem terapeuticamente eficaz” preferivelmente inibe o crescimento celular ou o crescimento tumoral por pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% e, ainda mais preferivelmente, por pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90%, em relação aos indivíduos não tratados. A habilidade de um composto para inibir o crescimento tumoral pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada por exame da habilidade do composto para inibir o crescimento celular, e essa inibição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos por profissionais habilitados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de algum outro modo melhorar os sintomas em um indivíduo. Aqueles habilitados na técnica seriam capazes de determinar essas quantidades com base em fatores como, por exemplo, o tamanho do indivíduo, a severidade dos sintomas do indivíduo, e da composição ou via de administração em particular, selecionadas.
[294] Uma composição da presente invenção pode ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração com o uso de um ou mais de diversos métodos conhecidos na técnica. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a via e/ou o modo de administração irão variar dependendo dos resultados desejados. Vias de administração preferidas para os anticorpos da invenção incluem as vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outra via parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase “administração parenteral”, como aqui usada, significa modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, normalmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbitária, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinhal, epidural e intra-esternal.
[295] Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado por meio de uma via não parenteral, por exemplo, uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
[296] Os compostos ativos podem ser preparados com carregadores que protegerão o composto contra a liberação rápida, por exemplo, uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, podem ser usados, por exemplo, etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação dessas formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica [veja, por exemplo, “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems” (1978), J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y].
[297] As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, por exemplo, os dispositivos revelados nas Patentes U.S. Nos 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: a Patente U.S. N° 4.487.603, que revela uma bomba de microinfusão implantável para a dispensa de medicação em uma taxa controlada; a Patente U.S. N° 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; a Patente U.S. N° 4.447.233, que revela uma bomba de infusão de medicação para liberação de medicação em uma taxa de infusão precisa; a Patente U.S. N° 4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para liberação contínua de fármacos; a Patente U.S. N° 4.439.196, que revela um sistema de liberação osmótica de fármacos que possui compartimentos multicâmaras; e a Patente U.S. N° 4.475.196, que revela um sistema de liberação osmótica de fármacos. Essas patentes são aqui incorporadas por referência. Muitos outros implantes, sistemas de liberação e módulos desse tipo são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[298] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais da invenção podem ser formulados para assegurar a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomos. Para métodos de fabricação de lipossomos, veja, por exemplo, as Patentes U.S. 4.522.811, 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomos podem compreender uma ou mais porções que são transportadas seletivamente em células ou órgãos específicos aumentando, dessa forma, a liberação direcionada do fármaco [veja, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685]. Porções de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (veja, por exemplo, a Patente U.S. 5.416.016.); manosídeos [Umezawa e cols. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1.038]; anticorpos [P.G. Bloeman e cols. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais e cols. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180]; receptor de proteína A tensoativo [Briscoe e cols. (1995) Am. J. Physiol. 1.233: 134]; p120 [Schreier e cols. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9.090]; veja também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.
Usos e métodos
[299] Os anticorpos, composições de anticorpo e métodos da presente invenção possuem diversas utilidades diagnósticas e terapêuticas in vitro e in vivo que envolvem o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados por LY75.
[300] Em algumas modalidades, essas moléculas podem ser administradas às células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, evitar e diagnosticar diversos distúrbios. Como aqui usado, o termo “indivíduo” visa incluir humanos e animais não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, por exemplo, primatas não humanos, carneiros, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e repteis. Indivíduos preferidos incluem pacientes humanos que possuem distúrbios mediados por atividade de LY75. Os métodos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanos que possuem um distúrbio associado à expressão aberrante de LY75. Quando anticorpos para LY75 são administrados em conjunto com outro agente, os dois podem ser administrados em ordem ou simultaneamente.
[301] Considerando a ligação específica dos anticorpos da invenção por LY75, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar especificamente a expressão de LY75 na superfície de células e, além disso, podem ser usados para purificar LY75 por meio de purificação por imunoafinidade.
[302] Além disso, considerando a expressão de LY75 em células tumorais, os anticorpos, composições de anticorpo e métodos da presente invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais que expressam LY75 ou na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio desse tipo incluindo, por exemplo, câncer gástrico, câncer renal, câncer da tireóide, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer hepático, câncer pancreático, câncer cólon- retal, câncer da bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, incluindo câncer de mama triplo negativo, câncer ovariano, câncer do pulmão, mieloma, leucemia, incluindo leucemia linfocítica crônica e leucemia mielóide aguda, linfoma não Hodgkin, incluindo DLBCL, linfoma de célula B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B rico em células T/histiócitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula grande anaplásica e linfoma de célula T angioimunoblástico. Foi demonstrado que LY75 é internalizado na ligação com anticorpo, como ilustrado nos Exemplos 5 e 7 abaixo, permitindo, dessa forma, que os anticorpos da invenção sejam usados em qualquer mecanismo de ação de carga útil, por exemplo, uma abordagem de ADC, radioimunoconjugado, ou abordagem de ADEPT.
[303] Em uma modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpo, Nanobody®, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições etc.) da invenção podem ser usados para detectar níveis de LY75, ou níveis de células que contêm LY75 na superfície da sua membrana, cujos níveis podem então ser ligados a certos sintomas de doença. Alternativamente, os anticorpos, geralmente administrados como ADCs, podem ser usados para inibir ou bloquear a função de LY75, o que, por sua vez, pode estar ligado à prevenção ou melhora de certos sintomas de doença implicando, dessa forma, o LY75 como um mediador da doença. Isso pode ser obtido por contato de uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-LY75 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e LY75. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e o LY75 são detectados e comparados na amostra e no controle.
[304] Em outra modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições) da invenção podem inicialmente ser testados quanto à atividade de ligação associada ao uso terapêutico ou diagnóstico in vitro. Por exemplo, as composições da invenção podem ser testadas usando os ensaios citométricos de fluxo descritos nos Exemplos abaixo.
[305] Os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas, imunoconjugados e composições) da invenção possuem utilidade adicional em terapia e diagnóstico de doenças relacionadas ao LY75. Por exemplo, os anticorpos monoclonais, as moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e os imunoconjugados podem ser usados para despertar in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: para inibir o crescimento e/ou matar uma célula que expressa LY75; para mediar fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa LY75 na presença de células efetoras humanas, ou para bloquear ligação de ligante de LY75 a LY75.
[306] Em uma modalidade particular, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições) são usados in vivo para tratar, evitar ou diagnosticar diversas doenças relacionadas ao LY75. Exemplos de doenças relacionadas ao LY75 incluem, entre outras, tecidos de câncer humano que representam câncer gástrico, câncer cólon-retal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano, câncer renal, câncer da tireóide, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer hepático, câncer pancreático, câncer da bexiga, mieloma, leucemia, incluindo leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda, linfoma não Hodgkin, incluindo DLBCL, linfoma de célula B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B rico em células T/histiócitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula grande anaplásica e linfoma de célula T angioimunoblástico e câncer do pulmão.
[307] Vias de administração adequadas das composições de anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). Dosagens adequadas das moléculas usadas dependerão da idade e do peso do indivíduo e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpo.
[308] Como descrito previamente, os anticorpos anti- LY75 da invenção podem ser co-administrados com um ou mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. O anticorpo pode estar ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou concomitantemente com o agente, ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, radiação. Esses agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos como, por exemplo, doxorrubicina (adriamicina), sulfato de cisplatina bleomicina, carmustina, clorambucil e ciclofosfamida hidroxiuréia, os quais, por eles mesmos, só são eficazes em níveis que são tóxicos ou subtóxicos para um paciente. A cisplatina é administrada intravenosamente como uma dose de 100 mg/kg uma vez a cada quatro semanas e a adriamicina é administrada intravenosamente como uma dose de 60-75 mg/mL uma vez a cada 21 dias. Outros agentes adequados para co- administração com os anticorpos da invenção incluem outros agentes usados para o tratamento de cânceres, por exemplo, câncer gástrico, câncer cólon-retal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano ou câncer do pulmão, por exemplo, Avastin®, 5FU e gencitabina. A co-administração dos anticorpos anti-LY75 ou fragmentos de ligação de antígeno destes, da presente invenção com agentes quimioterápicos fornece dois agentes anticâncer que operam por meio de mecanismos diferentes, o que gera um efeito citotóxico às células tumorais humanas. Essa co- administração pode solucionar problemas causados pelo desenvolvimento de resistência aos fármacos ou uma alteração na antigenicidade das células tumorais, o que as tornaria não reativas com o anticorpo.
[309] Células efetoras alvo-específicas, por exemplo, células efetoras ligadas a composições (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser usadas como agentes terapêuticos. Células efetoras para direcionamento podem ser leucócitos humanos como, por exemplo, macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células mortíferas naturais e outras células que abrigam receptor de IgG ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem ser obtidas do indivíduo a ser tratado. As células efetoras alvo-específicas podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode estar na ordem de 108-109, e irá variar dependendo da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter localização na célula-alvo, por exemplo, uma célula tumoral que expressa LY75, e para produzir a morte da célula, por exemplo, por fagocitose. As vias de administração também podem variar.
[310] A terapia com células efetoras alvo-específicas pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção de células visadas. Por exemplo, a terapia antitumoral com o uso das composições (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção e/ou células efetoras armadas com essas composições pode ser usada em conjunto com quimioterapia. Adicionalmente, imunoterapia combinada pode ser usada para direcionar duas populações efetores citotóxicas distintas em direção à rejeição da célula tumoral. Por exemplo, anticorpos anti-LY75 ligados a anti- Fc-gama RI ou anti-CD3 podem ser usados em conjunto com agentes de ligação específica ao receptor de IgG ou IgA.
[311] As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção também podem ser usadas para modular os níveis de FcyR ou FcyR em células efetoras, por exemplo, por cobertura e eliminação de receptores na superfície da célula. Misturas de anti-receptores Fc também podem ser usadas para essa finalidade.
[312] As composições (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção que possuem sítios de ligação de complemento, por exemplo, porções de IgG1, -2, ou -3 ou IgM que se ligam ao complemento, também podem ser usadas na presença de complemento. Em uma modalidade, o tratamento ex vivo de uma população de células que compreende células- alvo com um agente de ligação da invenção e células efetoras apropriadas pode ser suplementado pela adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células-alvo revestidas com um agente de ligação da invenção também pode ser aumentada por ligação de proteínas do complemento. Em outra modalidade, células-alvo revestidas com as composições (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser lisadas por complemento. Ainda em outra modalidade, as composições da invenção não ativam complemento.
[313] As composições (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção também podem ser administradas junto com complemento. Em certas modalidades, a presente revelação fornece composições que compreendem anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Essas composições podem ser vantajosas quando o complemento está localizado muito próximo aos anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas. Alternativamente, os anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas da invenção e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.
[314] Também estão incluídos no escopo da presente invenção kits que compreendem as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpos monoclonais, biespecífico ou moléculas multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções para uso. O kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, por exemplo, um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos da invenção adicionais (por exemplo, um anticorpo que possui uma atividade complementar que se liga a um epitopo no antígeno de LY75 distinto do primeiro anticorpo).
[315] Consequentemente, pacientes tratados com composições de anticorpo da invenção podem receber adicionalmente a administração (antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo da invenção) com outro agente terapêutico, por exemplo, um agente citotóxico ou radiotóxico, o que intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos.
[316] Em outras modalidades, o indivíduo pode ser tratado adicionalmente com um agente que modula, por exemplo, aumenta ou inibe, a expressão ou atividade de Fcy ou receptores Fcy, por exemplo, por tratamento do indivíduo com uma citocina. Citocinas preferidas para administração durante o tratamento com a molécula multiespecífica incluem fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferon-Y (IFN-Y), e fator de necrose tumoral (TNF).
[317] As composições (por exemplo, anticorpos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser usadas para células-alvo que expressam FcyR ou LY75, por exemplo, para marcação dessas células. Para tal uso, o agente de ligação pode ser ligado a uma molécula que pode ser detectada. Dessa forma, a invenção fornece métodos para localização ex vivo ou in vitro de células que expressam receptores Fc, por exemplo, FcyR, ou LY75. O marcador detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima.
[318] Em uma modalidade particular, a invenção fornece métodos para detecção da presença do antígeno de LY75 em uma amostra, ou medição da quantidade do antígeno de LY75, que compreendem o contato da amostra, e de uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal, ou uma porção de ligação de antígeno deste, que se liga especificamente a LY75, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção deste e LY75. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa da presença do antígeno de LY75 na amostra. Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para tratamento de um distúrbio mediado por LY75 em um indivíduo, por exemplo, cânceres humanos, incluindo câncer gástrico, câncer renal, câncer da tireóide, câncer esofágico, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer hepático, câncer pancreático, câncer cólon-retal, câncer da bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, incluindo câncer de mama triplo negativo, câncer ovariano, câncer do pulmão, mieloma, leucemia, incluindo leucemia linfocítica crônica e leucemia mielóide aguda, e linfoma não Hodgkin, incluindo DLBCL, linfoma de célula B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B rico em células T/histiócitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula grande anaplásica e linfoma de célula T angioimunoblástico.
[319] Em todas as modalidades da invenção, cânceres preferidos incluem linfoma não Hodgkin, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônica e câncer de mama triplo-negativo, câncer da bexiga e câncer pancreático.
[320] Todas as referências citadas nesse relatório descritivo incluindo, sem limitação, todos os artigos, publicações, patentes, pedidos de patente, apresentações, textos, relatos, manuscritos, brochuras, livros, postagens na Internet, artigos científicos, periódico, bulas de produtos, e semelhantes, são aqui incorporadas por referência nesse relatório descritivo em suas totalidades. A discussão das referências aqui apresentadas visa simplesmente resumir as asserções feitas pelos autores e não é feita nenhuma admissão de que qualquer referência constitua técnica estabelecida, e os requerentes se reservam ao direito de questionar a precisão e pertinência das referências citadas.
[321] Embora a invenção apresentada anteriormente tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplo para fins de clareza de sua compreensão, será facilmente evidente para aqueles habilitados na técnica à luz dos ensinamentos dessa invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas a ela, sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações em anexo.
[322] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes, que não devem ser considerados como limitantes.
Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais humanos contra antígeno de LY75
[323] Seguindo procedimentos padronizados, camundongos (IgG1 xenomouse) foram imunizados com células CHO transfectadas com LY75 de comprimento total.
[324] A especificidade de anticorpos despertados contra o LY75 foi testada por citometria de fluxo em células HEK293 transfectadas com LY75 e subsequentemente em células HT29 que expressam LY75. Para testar a habilidade dos anticorpos para se ligar à proteína de LY75 da superfície celular, os anticorpos foram incubados com as células que expressam LY75. As células foram lavadas em tampão FACS (DPBS, FBS 2%), centrifugadas e ressuspensas em 100 μL do anticorpo primário para LY75 diluído (também diluído em tampão FACS). O complexo de anticorpo-linhagem de células foi incubado no gelo por 60 min e depois lavado duas vezes com tampão FACS, como descrito acima. O pélete de célula- anticorpo foi ressuspenso em 100 μL do anticorpo secundário diluído (também diluído em tampão FACS) e incubado no gelo por 60 min no gelo. O pélete foi lavado como anteriormente e ressuspenso em 200 μL de tampão FACS. As amostras foram carregadas no BD citômetro de fluxo FACScanto II e os dados analisados usando o software BD FACSdiva (resultados não mostrados).
Exemplo 2: Caracterização estrutural de anticorpos monoclonais para LY75
[325] As sequências de cDNA que codificam as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo monoclonal LY75_A1 foram obtidas usando técnicas padronizadas de PCR e foram sequenciadas usando técnicas padronizadas de sequenciamento de DNA.
[326] As sequências de anticorpo podem ser mutagenizadas para reverter para resíduos da linhagem germinativa em um ou mais resíduos.
[327] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de LY75_A1 são mostradas nos IDS. DE SEQ. Nos: 3 e 1, respectivamente.
[328] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de LY75_A1 são mostradas nos IDS. DE SEQ. Nos: 4 e 2, respectivamente.
[329] A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada de LY75_A1 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunoglobulina da linhagem germinativa humana demonstrou que a cadeia pesada de LY75_A1 utiliza um segmento VH de VH 3-15 da linhagem germinativa humana e um segmento JH de JH JH4 da linhagem germinativa humana. Análise adicional da sequência de VH de LY75_A1 usando o sistema de Kabat de determinação da região da CDR levou à delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, como mostrado nos IDS. DE SEQ. Nos: 5, 6 e 7, respectivamente. Os alinhamentos das sequências da VH de CDR1, CDR2 e CDR3 de LY75_A1 para a sequência de VH 3-15 da linhagem germinativa e de JH JH4 da linhagem germinativa são mostrados na Figura 1.
[330] A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve de LY75_A1 com as sequências da cadeia leve de imunoglobulina da linhagem germinativa humana demonstrou que a cadeia leve de LY75_A1 utiliza um segmento VK de VK O12 da linhagem germinativa humana e um segmento JK de JK JK4 da linhagem germinativa humana. Análise adicional da sequência de VK de LY75_A1 usando o sistema de Kabat de determinação da região da CDR levou à delineação das regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve, como mostrado nos IDS. DE SEQ. Nos: 8, 9 e 10, respectivamente. Os alinhamentos das sequências de VK de CDR1, CDR2 e CDR3 de LY75_A1 com as sequências de VK O12 da linhagem germinativa e de JK JK4 da linhagem germinativa são mostrados na Figura 2.
Exemplo 3: Imunoistoquímica usando anticorpo monoclonal para LY75
[331] Usando os anticorpos humanos monoclonais específicos para LY75, foi realizada imunoistoquímica em péletes de células HT-29 e A549 FFPE, arranjos FFPE de linfoma não Hodgkin e câncer pancreático, e tumores de linfoma/leucemia frescos congelados, cortes de câncer ovariano, câncer pancreático e câncer de mama e um arranjo de tecido normal.
Materiais e métodos Materiais
[332] Xilenos (X5P-1 gal) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[333] Histoprep etanol 100% (HC-800-1 GAL) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[334] Tampão de citrato 10x para recuperação de epitopo induzida por aquecimento (AP9003125) de Thermo Scientific, MA, EUA.
[335] Supressor de Peroxidase Thermo Scientific* Pierce* (35000) de Thermo Scientific, MA, EUA.
[336] Bloco de proteína isento de soro (X0909) de Dako, CA, EUA.
[337] Anticorpo secundário: Fab-FITC de cabra anti-IgG humana conjugado (109-097-003) de Jackson Immunoresearch, PA, EUA.
[338] IgG humana pura-Cromo, molécula inteira (09-000 003) de Jackson Immunoresearch, PA, EUA.
[339] Anticorpo terciário: anti-FITC de camundongo (ab10257) de Abeam, MA, EUA.
[340] Controle de isótipo de IgG humana purificada (1 001 A) de R&D Systems, MN, EUA.
[341] Tween-20 (BP337-100) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[342] Acetona (BP2403-4) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[343] Polímero Dual Link EnVision+ conjugado à HRP, Camundongo e Coelho (K4063) de Dako, CA, EUA.
[344] Kit DAB 2-solução (882014) de Invitrogen, NY, EUA.
[345] Hematoxilina de Harris (23-245-677) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[346] Meios de montagem Faramount (S302580) de Dako, CA, EUA.
[347] Cortes e arranjos de tecido foram adquiridos de US Biomax Inc., MD, EUA ou Origene, MD, EUA.
Preparação de lâminas de FFPE: Desparafinação e Reidratação
[348] As lâminas de FFPE foram desparafinizadas em xileno (2 x 3 minutos), e depois reidratadas por meio de xileno: etanol 100% 1:1 (1 x 3 minutos), etanol 100% (2 x 3 minutos), etanol 95% (1 x 3 minutos), etanol 70% (1 x 3 minutos), etanol 50% (1 x 3 minutos), e água corrente (1 x 3 minutos). Preparação de lâminas de FFPE: recuperação de antígeno (Microondas).
[349] O antígeno de LY75 foi recuperado usando aquecimento por microondas, potência alta até ebulição, depois potência baixa por 10 minutos em 50 mL de 1x tampão citrato em uma jarra de Coplin. As lâminas foram então deixadas para resfriar até a temperatura ambiente por mais 15 min, e depois lavadas em água corrente, 3 minutos. Foram desenhados círculos em torno de cada corte de tecido/TMA com uma caneta de barreira hidrofóbica e lâminas foram então lavadas 3 vezes em PBS, 3 minutos cada lavagem.
Preparação de laminas de FF
[350] As lâminas foram removidas do armazenamento a -80 °C e foi permitido que secassem em temperatura ambiente na capela de exaustão por 20-30 minutos. As lâminas foram fixadas por 10 min em acetona gelada a -20 °C, e depois foi permitido que secassem por 20 min na capela de exaustão em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas e reidratadas em PBS, 3 lavagens por 3 min cada. Os cortes foram delineados com uma caneta de barreira hidrofóbica.
Preparação de complexos de anticorpo
[351] O anticorpo primário anti-LY75 foi diluído em bloco de proteína isento de soro (SFPB) para obter uma solução com uma concentração 20 vezes maior do que a concentração final desejada (20 μg/mL para 1 μg/mL final). O anticorpo secundário, fragmento de ligação de antígeno (Fab) anti-imunoglobulina G humana (IgG) de cabra, foi preparado similarmente em SFPB para criar uma solução de concentração igual. Volumes iguais de anticorpos primários e secundários foram combinados em um tubo rotulado, gentilmente misturados, e incubados por 3 minutos em temperatura ambiente, resultando em uma concentração de anticorpo primário 10 vezes maior do que a concentração final desejada (10 μg/mL para 1 μg/mL final). Essa mistura foi diluída 1:5 com SFPB, gentilmente misturada, e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente, resultando em uma concentração de anticorpo primário duas vezes aquela da concentração final desejada (2 μg/mL para 1 μg/mL final).
[352] Para produzir os complexos de coloração finais, uma solução a 1% (10 μg/μl) de IgG humana foi preparada em SFPB e um volume igual adicionado à mistura de anticorpo primário/secundário. Essa combinação foi gentilmente misturada e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos, diluindo peia metade a concentração de anticorpo primário da mistura de anticorpo primário/secundário e resultando na concentração final desejada de anticorpo primário (1 μg/mL).
Imunocoloração
[353] Enquanto isso, a atividade de peroxidase do tecido endógeno foi bloqueada por incubação de tecidos com supressor de peroxidase por 5-10 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. As lâminas foram então lavadas em PBS 3 x 3 minutos cada lavagem. Os tecidos foram incubados em SFPB por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Os complexos de coloração finais foram aplicados a cada corte e/ou microarranjo de tecido, e as lâminas foram incubadas por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. As lâminas foram então lavadas uma vez em PBS e uma vez em PBST (PBS + Tween-20 0,125%), 3 minutos cada lavagem. O anticorpo terciário anti-FITC de camundongo, foi aplicado em uma concentração de 2 μg/mL por 30 min, em temperatura ambiente, em uma câmara umidificada. Os cortes foram então lavados uma vez em PBS e uma vez em PBST, 3 min cada lavagem. Polímero anti-camundongo/coelho-conjugado à HRP Dual Link EnVision+ foi então aplicado aos tecidos e as lâminas foram incubadas por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. As lâminas foram então lavadas uma vez em PBS, uma vez em PBST, 3 minutos cada lavagem. Os tecidos foram incubados em solução DAB preparada de acordo com as instruções do fabricante em temperatura ambiente por 10 min. As lâminas foram então lavadas uma vez em água corrente por 2 minutos e uma vez em PBS por 3 minutos. As lâminas foram contra-coradas com Hematoxilina por 30 segundos em temperatura ambiente, e lavadas com água corrente. As lâminas foram secas em temperatura ambiente por 30 minutos e as lamínulas foram então montadas sobre as lâminas usando meio de montagem Faramount.
Resultados
[354] LY75_A1 mostrou positividade em amostras FFPE de câncer de mama triplo negativo, em que 77% dos cortes mostraram coloração positiva e 55% exibiram coloração robusta (+++).
[355] A coloração para LY75 em tecidos normais FF era geralmente ausente a baixa. O epitélio ductal da mama, glândula salivar e pâncreas exibia coloração marcada baixa a moderada, e o baço corou pouco positivo. Portanto, anticorpos dirigidos para LY75 podem ter utilidade como substâncias terapêuticas e diagnósticas em alguns dos cânceres testados e possivelmente em outros tipos de câncer que exibem expressão de LY75.
Exemplo 4: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados a DM1 em células HT-29 Materiais
[356] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[357] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[358] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[359] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[360] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[361] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços.
[362] Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[363] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[364] Os resultados descritos na Figura 3a mostram uma subpopulação de anticorpos, que sabidamente se ligam a LY75, que podem induzir morte celular de células HT-29. Isso sugere que, embora os anticorpos possam se ligar a LY75, somente poucos exibem eficácia quando conjugados a DM1. Foram então escolhidos anticorpos da subpopulação para análise da atividade citotóxica posterior.
Exemplo 5: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em células de câncer colón-retal Materiais
[365] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[366] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[367] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[368] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[369] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL. Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[370] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[371] A Figura 3b mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células HT-29. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo e outros anticorpos anti-LY75 conjugados a uma toxina (selecionada do Exemplo 1).
Exemplo 6: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de linfoma Materiais
[372] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[373] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[374] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[375] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[376] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[377] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[378] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[379] A Figura 3c mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células RAJI. A Figura 3d mostra A atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células Namalwa. A Figura 3e mostra A atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células Karpas 299. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo e outros anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 (selecionados do Exemplo 1).
Exemplo 7: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de câncer pancreático Materiais
[380] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[381] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[382] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[383] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[384] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[385] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[386] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[387] A Figura 3f mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células BxPC3. A Figura 3g mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células HupT4. A Figura 3h mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células HPAFFII. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo e outros anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 (selecionados do Exemplo 1).
Exemplo 8: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de leucemia linfocítica crônica Materiais
[388] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[389] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[390] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[391] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[392] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[393] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[394] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[395] A Figura 3i mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células EHEB. A Figura 3j mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células Mec-1. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo e outros anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 (selecionados do Exemplo 1).
Exemplo 9: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de leucemia monocítica aguda Materiais
[396] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[397] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[398] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[399] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[400] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[401] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[402] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[403] A Figura 3k mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células AML-193. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo e outros anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 (selecionados do Exemplo 1).
Exemplo 10: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de câncer de mama Materiais
[404] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[405] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[406] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[407] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[408] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[409] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[410] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[411] A Figura 31 mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células HCC 70 (ER negativas, PR negativas e Her2 negativas). A Figura 3m mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células HCC 1806 (ER negativas, PR negativas e Her2 negativas). A Figura 3n mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células MDA-MB-468. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo.
Exemplo 11: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de câncer de bexiga Materiais
[412] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[413] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[414] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[415] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[416] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[417] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[418] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[419] A Figura 3o mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células RT4. Figura 3p mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células 5637. A Figura 3q mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células SW780. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo.
Exemplo 12: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de câncer da cabeça e pescoço Materiais
[420] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[421] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[422] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[423] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[424] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[425] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[426] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[427] A Figura 3r mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células SCC-9. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo.
Exemplo 13: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de câncer esofágico Materiais
[428] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[429] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[430] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[431] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[432] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[433] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[434] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[435] A Figura 3s mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células OE 19. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo.
Exemplo 14: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de câncer ovariano Materiais
[436] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[437] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[438] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[439] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[440] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[441] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[442] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[443] A Figura 3t mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células OVCAR-3. A Figura 3u mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células SK-OV-3. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo.
Exemplo 15: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em linhagens de células de mieloma múltiplo Materiais
[444] Extrator de células (dissociação de células não enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[445] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[446] Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EUA.
[447] Cell Titer Glo (G7572) de Promega, WI, EUA.
Método
[448] As células foram dissociadas usando extrator de células e contadas. 5e3 células/poço foram centrifugadas em um pélete (para células em suspensão, mais células podem ser usadas, dependendo do tempo de duplicação das células, por exemplo, 10e3 células/poço). O pélete foi ressuspenso em meio de cultura até uma concentração de 1e5 células/mL.
[449] Uma suspensão de células de 50 μL/poço foi adicionada aos poços de uma placa de fundo transparente e lateral branca de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos e titulados até 8 pontos (titulações de 3 vezes) que correspondem a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meio (para amostras não tratadas) (50 μL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Meio em excesso (200 μL/poço) foi adicionado às fileiras e colunas de fora da placa para evitar evaporação. A placa foi incubada por 72 h a 37 °C.
[450] A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi sacudida e lavada 1x com 100 μL/poço de PBS (para células em suspensão, primeiramente a placa é centrifugada para peletizar as células). Foram adicionados 100 μL/poço de PBS e 100 μL de Cell Titer Glo a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para assegurar que tenha ocorrido lise eficiente das células. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[451] A Figura 3v mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células MOLP-8. A Figura 3w mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados a DM1 e DM4 em direção às células RPMI8226. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo.
Exemplo 16: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em modelos de xenoenxerto de Raji
[452] A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada em modelo de xenoenxerto subcutâneo de Raji em camundongo SCID de linfoma de Burkitt.
[453] Camundongos SCID imunodeficientes foram inoculados por via subcutânea com células tumorais de Raji (linfoma de Burkitt humano). Foi permitido que os tumores se estabelecessem e os camundongos foram separados em cinco grupos de tratamento de 3-6 camundongos por grupo. Quando o volume médio do tumor alcançava um tamanho médio de 129-132 mm3 por grupo, cada grupo era tratado com um dos seguintes compostos, administrados intravenosamente nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Controle de isótipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Controle de isótipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Uma segunda dose foi administrada uma semana mais tarde. Os pesos corporais (BW) foram monitorados, os camundongos foram examinados frequentemente quanto à saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores alcançaram o ponto final do volume tumoral de 2.000 mm3 ou após 60 dias, o que acontecesse primeiro. A eficácia foi determinada a partir do retardo do crescimento tumoral (TGD), do aumento no tempo até o ponto final mediano (TTE) e a partir de análise log-rank de diferenças em curvas de sobrevida de Kaplan-Meier em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os primeiros cinco camundongos de controle tratados com veículo a alcançar o ponto final tiveram amostras dos tumores coletadas que foram processadas por fixação em formalina e embebidas em parafina.
Resultados
[454] A Figura 4a mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 demonstraram atividade antitumoral significante e estenderam significantemente a sobrevida no modelo de xenoenxerto de Raji em camundongo SCID de linfoma de Burkitt, comparados com controles; no entanto, as doses de LY75_DM4 de 5 mg/kg foram significantemente mais eficazes do que as doses de 10 mg/kg de LY75_DM1, resultando em 5 de 6 camundongos com regressão tumoral completa, mas transitória. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs dirigidos contra LY75, por exemplo, LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes de câncer com linfoma não Hodgkin humano.
Exemplo 17: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em modelos de xenoenxerto de Namalwa
[455] A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada em modelo de xenoenxerto subcutâneo de Namalwa em camundongo SCID de linfoma de Burkitt.
[456] Camundongos SCID imunodeficientes foram inoculados por via subcutânea com células tumorais de Namalwa (linfoma de Burkitt humano). Foi permitido que os tumores se estabelecessem e os camundongos foram separados em cinco grupos de tratamento de 6 camundongos por grupo. Quando o volume médio do tumor alcançava um tamanho médio de 114 mm3 por grupo, cada grupo era tratado com um dos seguintes compostos, administrados intravenosamente nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Controle de isótipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Controle de isótipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Os pesos corporais (BW) foram monitorados, os camundongos foram examinados frequentemente quanto à saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores alcançaram o ponto final do volume tumoral de 2.000 mm3 ou após 60 dias, o que acontecesse primeiro. A eficácia foi determinada a partir do retardo do crescimento tumoral (TGD), do aumento no tempo até o ponto final mediano (TTE), e a partir da análise log-rank de diferenças em curvas de sobrevida de Kaplan-Meier em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os primeiros cinco camundongos de controle tratados com veículo a alcançar o ponto final tiveram amostras dos tumores coletadas que foram processadas por fixação em formalina e embebidas em parafina.
Resultados
[457] A Figura 4b mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 demonstraram atividade antitumoral significante e extensão da sobrevida no modelo de xenoenxerto de Namalwa em camundongo SCID de linfoma de Burkitt, comparados com controles; no entanto, a dose de LY75_DM4 de 5 mg/kg foi significantemente mais eficaz do que a dose de 10 mg/kg de LY75_DM1, causando uma breve redução no volume do tumor. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs dirigidos contra LY75, por exemplo, LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes de câncer com linfoma não Hodgkin humano.
Exemplo 18: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em modelos de xenoenxerto de câncer pancreático.
[458] A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto subcutâneo em camundongo atímico nu de adenocarcinoma pancreático HPAFII.
[459] Camundongos imunodeficientes atímicos nu foram inoculados por via subcutânea com células tumorais HPAFII (adenocarcinoma pancreático humano). Foi permitido que os tumores se estabelecessem e os camundongos foram separados em cinco grupos de tratamento de 6 camundongos por grupo. Quando o volume médio tumor alcançava um tamanho médio de aproximadamente 114 mm3/grupo, cada grupo era tratado com um dos seguintes compostos, administrados intravenosamente nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Controle de isótipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Controle de isótipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Os pesos corporais (BW) foram monitorados, os camundongos foram examinados frequentemente quanto à saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos três vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores alcançaram o ponto final do volume do tumor de 2.000 mm3 ou após 90 dias, o que acontecesse primeiro. A eficácia foi determinada a partir do efeito do tratamento sobre o volume do tumor e a partir da análise log-rank de diferenças em curvas de sobrevida de Kaplan- Meier em camundongos tratados com ADC ou camundongos tratados com PBS. Foram coletadas amostras de tumores de camundongos de controle tratados com veículo e elas foram processadas por fixação em formalina e embebidas em parafina.
Resultados
[460] A Figura 4c mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 exibiram atividade antitumoral significante e similarmente potente e extensão da sobrevida no modelo de xenoenxerto em camundongo nu de HPAFII, comparados com controles. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs dirigidos contra LY75, por exemplo, LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer pancreático humano.
Exemplo 19: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em modelos de xenoenxerto de câncer de bexiga
[461] A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto subcutâneo em camundongo SCID de carcinoma da bexiga humano SW780.
[462] Camundongos imunodeficientes atímicos nu foram inoculados por via subcutânea com células tumorais HPAFII (adenocarcinoma pancreático humano). Foi permitido que os tumores se estabelecessem e os camundongos foram separados em cinco grupos de tratamento de 6 camundongos por grupo. Quando o volume médio tumor alcançava um tamanho médio de aproximadamente 114 mm3/grupo, cada grupo era tratado com um dos seguintes compostos, administrados intravenosamente nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 1 mg/kg), Grupo 3 (LY75_DM1; 2,5 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupo 5 (LY75_DM4; 1 mg/kg)), Grupo 6 (LY75_DM4; 2,5 mg/kg)), Grupo 7 (LY75_DM4; 5 mg/kg)), Grupo 8 (Controle de isótipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Os pesos corporais (BW) foram monitorados, os camundongos foram examinados frequentemente quanto à saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos três vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores alcançaram o ponto final do volume do tumor de 2.000 mm3 ou após 90 dias, o que acontecesse primeiro. A eficácia foi determinada a partir do efeito do tratamento sobre o volume do tumor e a partir da análise log-rank de diferenças em curvas de sobrevida de Kaplan-Meier em camundongos tratados com ADC ou camundongos tratados com PBS. Foram coletadas amostras de tumores de camundongos de controle tratados com veículo e elas foram processadas por fixação em formalina e embebidas em parafina.
Resultados
[463] A Figura 4d mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 exibiram atividade antitumoral significante e similarmente potente e extensão da sobrevida no modelo de xenoenxerto em camundongo nu de SW780, comparados com controles. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs dirigidos contra LY75, por exemplo, LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer da bexiga humano.
Exemplo 20: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em modelos de xenoenxerto de câncer de mama
[464] A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto subcutâneo de MDA-MB-468 em camundongo atímico nu.
[465] Camundongos imunodeficientes atímicos nu foram inoculados por via subcutânea com células tumorais MDA-MB- 468 (adenocarcinoma da mama humano triplo negativo). Foi permitido que os tumores se estabelecessem e os camundongos foram separados em sete grupos de tratamento de 10 camundongos por grupo. Quando o volume médio do tumor alcançava um tamanho médio de 167 mm3 por grupo, cada grupo era tratado com um dos seguintes compostos, administrados intravenosamente nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; 20 mM de succinato de sódio, pH 5,0, trehalose 6%, polissorbato 0,04%); Grupo 2 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupo 3 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (LY75_DM4; 2,5 mg/kg), Grupo 6 (LY75_DM4; 1 mg/kg), Grupo 7 (Controle de isótipo-DM4; 5 mg/kg). Os pesos corporais (BW) foram monitorados, os camundongos foram examinados frequentemente quanto à saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados 82 dias após inoculação do tumor. A eficácia foi determinada a partir da atividade antitumoral (tamanho médio do tumor no grupo de tratamento/tamanho médio do tumor no grupo de controle x 100) e do aumento no tempo médio até o ponto final (TTE) em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os cinco maiores tumores em camundongos de controle tratados com veículo no dia 71 pós-inoculação tiveram amostras coletadas e processadas por fixação em formalina e embebidas em parafina.
Resultados
[466] A Figura 4e mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 demonstraram atividade antitumoral dramática no modelo de xenoenxerto em camundongo nu de MDA-MB-468, comparados com controles. Atividade dose-dependente foi observada com LY75_DM4, em que 2,5 e 5 mg/kg foram bem mais potentes do que 1 mg/kg. A 5 mg/kg, LY75_DM1 e LY75_DM4 foram similarmente eficazes. Regressões sustentadas no volume médio do tumor foram observadas para LY75_DM1 a 10 e 5 mg/kg e LY75_DM4 a 5 e 2,5 mg/kg. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs dirigidos contra LY75, por exemplo, LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer de mama humano triplo negativo.
Exemplo 21: Eficácia de anticorpos monoclonais anti- LY7 5 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em modelos de xenoenxerto de câncer colón-retal
[467] A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto subcutâneo em camundongo atímico nu de adenocarcinoma cólon-retal COLO205.
[468] Camundongos imunodeficientes atímicos nu foram inoculados por via subcutânea com células tumorais COLO205 (adenocarcinoma cólon-retal humano). Foi permitido que os tumores se estabelecessem e os camundongos foram separados em cinco grupos de tratamento de 6 camundongos por grupo. Quando o volume médio tumor alcançava um tamanho médio de 117 mm3 por grupo, cada grupo era tratado com um dos seguintes compostos, administrados intravenosamente nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Controle de isótipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Controle de isótipo-DM4; 5 mg/kg). Uma segunda dose foi administrada doze dias após a primeira. Os pesos corporais (BW) foram monitorados, os camundongos foram examinados frequentemente quanto à saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores alcançaram o ponto final do volume do tumor de 1.000 mm3 ou após 60 dias, o que acontecesse primeiro. A eficácia foi determinada a partir do retardo do crescimento tumoral (TGD), do aumento no tempo até o ponto final mediano (TTE) e a partir da análise log-rank de diferenças em curvas de sobrevida de Kaplan-Meier em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os primeiros cinco camundongos de controle tratados com veículo a alcançar o ponto final tiveram amostras dos tumores coletadas que foram processadas por fixação em formalina e embebidas em parafina.
Resultados
[469] A Figura 4f mostra LY75_DM1 e LY75_DM4 exibiram pequena similaridade à atividade antitumoral e extensão sobrevivente no modelo de xenoenxerto em camundongo nu de adenocarcinoma cólon-retal COLO205, comparados com controles. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs dirigidos contra LY75, por exemplo, LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer cólon-retal humano.
Exemplo 22: Toxicidade de anticorpos monoclonais anti- LY75 conjugados a DM1 e conjugados a DM4 em macacos Cynomolgus
[470] Seis macacos machos foram designados para o estudo, com 2 macacos/grupo. Veículo (PBS), LY75_DM4 (clivável) ou LY75_DM1 (não clivável) foi administrado duas vezes (no Dia 1 e Dia 29) por uma infusão intravenosa de 15 minutos a 0 mg/kg/dose (PBS, veículo), 5 mg/kg/dose (LY75_DM4, clivável) ou 10 mg/kg/dose (LY75_DM1, não clivável). Amostras de sangue foram coletadas para avaliações toxicocinéticas antes do início da dose (Dia 1), e 1, 2, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após cada dose. Amostras de sangue para análises de patologia clínica foram coletadas antes do início da dose (Dia 1), e 1, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após cada dose (28 dias após a 1a dose também serviu como o ponto do tempo pré-dose para a 2a dose) . Todos os animais do estudo foram sacrificados e necropsiados após a coleta de sangue final no Dia 57. O plasma separado de cada sangue retirado foi isolado, congelado e enviado para Oxford BioTherapeutics, Inc. para ser analisado quanto à concentração de ADC por ELISA.
[471] Os achados de patologia clínica relacionados ao tratamento incluíram uma anemia regenerativa leve e diminuições transitórias no perfil de leucócitos no sangue, mais notavelmente em contagens de neutrófilos. Anemia foi observada em ambos os animais tratados com 5 mg/kg de LY75_DM4 e em um dos dois animais tratados com 10 mg/kg de LY75_DM1. Neutropenia severa com um mínimo em uma semana pós-dose, e uma recuperação rápida nas contagens foi observada em todos os animais; o mínimo na contagem absoluta de neutrófilos foi menor em animais tratados com LY75_DM4. Não houve efeitos relacionados ao artigo de teste nos parâmetros de coagulação APTT e PT. Alterações na química do soro incluíram aumentos transitórios em AST, CK, LDH (em 1 de 2 animais em cada grupo de tratamento) e globulina após administração de 5 mg/kg de LY75_DM4 e 10 mg/kg de LY75_DM1. Além disso, um aumento transitório na enzima específica do fígado ALT foi observado somente nos animais tratados com LY75_DM4. A duração curta e/ou a magnitude dos aumentos nos parâmetros da química do soro sugerem que não eram adversos. Não houve achados na análise da urina relacionados ao artigo de teste. Após exame na necropsia após um período de recuperação de 4 semanas, não havia achados patológicos macroscópicos relacionados ao tratamento ou alterações nos pesos absolutos e relativos dos órgãos. Os achados histopatológicos somente na glândula tireóide (uma alteração na morfologia colóide em folículos) e no rim (túbulos dilatados no córtex externo) foram classificados como severidade mínima; não associados com alterações em outros parâmetros do estudo; e, não adversos e de significância toxicológica mínima. Conclusão: o tratamento com dose repetida com duas doses de 5 mg/kg de LY75_DM4 ou 10 mg/kg de LY75_DM1 foi bem tolerado em macacos Cynomolgus. Todos os achados de toxicidade relacionados ao tratamento eram reversíveis após um período de recuperação de 4 semanas.
Exemplo 23: Caracterização de epitopo de LY75 A1 por análise de ligação por separação competitiva de células ativada por fluorescência (FACS) Método
[472] Células COLO205 (ATCC, N° de Catálogo CCL-222) foram destacadas de frascos de cultura de tecido com Cell Stripper (Cellgro, N° de Catálogo MT-25-056CI). As células foram lavadas e ressuspensas em tampão FACS (PBS + FBS 2%), neutralizadas com meio de crescimento, e contadas. As células foram plaqueadas a 50.000 células por poço em uma placa de 96 poços de fundo em “V”. As células foram lavadas uma vez com tampão FACS (PBS (Fisher, N° de Catálogo SH30028-03) + FBS 2%). Um anti-LY75-mAb (Selecionado do Exemplo 1) ou LY75_A1 foi adicionado aos poços partindo a 250 nM e diluído serialmente 3 vezes e aplicado aos poços relevantes por 45 minutos no gelo. Os poços de teste que necessitavam de etapas de coloração únicas ou múltiplas foram deixados em tampão FACS como apropriado para assegurar que a coloração final era completada simultaneamente para todas as condições testadas. Dois poços foram deixados não corados em tampão FACS como controles.
[473] Após a incubação com anticorpo de bloqueio, as células foram lavadas duas vezes em tampão FACS. As células foram ressuspensas em tampão FACS contendo o anti-LY75-mAb conjugado a MCC-DM1 (1 nM) e incubadas no gelo por 45 minutos. As células foram lavadas como acima e ressuspensas em tampão FACS mais 1 μg/mL de anticorpo anti-maitansina de camundongo e incubadas no gelo por 45 minutos. As células foram lavadas como acima e ressuspensas em tampão FACS contendo 2 μg/mL de RPE de cabra anti-kapa de camundongo. As células foram incubadas no gelo por 45 minutos, e depois lavadas como acima. As células foram ressuspensas em tampão FACS a 200 μL por poço. A intensidade de fluorescência média de cada amostra foi determinada usando um Citômetro de Fluxo Guava EasyCyte Plus HT (formatos de placa de 96 poços) e os dados brutos foram analisados usando o Guava Cytosoft.
Resultados
[474] A Figura 5a mostra que o bloqueio com o anti- LY75-mAb-MCC-DM1 reduziu a ligação de anti-LY75-mAb. A análise da ligação de LY75_A1 às células COLO205 mostrou que LY75_A1 é incapaz de bloquear a ligação de anti-LY75- mAb-MCC-DM1 (veja a Figura 5b). Pode ser determinado, portanto que o anti-LY75-mAb e LY75_A1 são anticorpos que não competem e LY75_A1 reconhece um epitopo diferente e único de LY75 daquele de outros anticorpos anti-LY75.
Exemplo 24 Caracterização de epitopo de LY75 A1 por ensaio de microarranjo de peptídeo. Método
[475] A análise de microarranjo de peptídeo foi realizada por LC Sciences, Houston TX e, em resumo, o método compreendeu as seguintes etapas: - Peptídeos de 8mer contíguos de proteína de LY75 que possuem uma superposição de aminoácido que transpõe os resíduos 216 a 1.666 da proteína de LY75 de comprimento total foram sintetizados e imobilizados em um chip de microarranjo. O chip compreendia em três painéis, de tal forma que o experimento fosse realizado em triplicata. O microarranjo foi endereçado com LY75_A1 para identificar os peptídeos aos quais o anticorpo se ligou. O ensaio de ligação foi realizado sob as seguintes condições: - O microarranjo que compreende os peptídeos contíguos em triplicata foi lavado com 1 mL de tampão de ligação a 4 °C por 20 min. Ele foi então incubado com 1 μg/mL LY75_A1 em tampão de ligação (pH 70) a 4 °C por 2 horas. O arranjo foi novamente lavado com 0,5 mL de tampão de lavagem a 4 °C por 30 min, e depois incubado com 25 ng/mL de conjugado de Alexa 647 anti-IgG humana em tampão de ligação (pH 7,0) a 4 °C por 1 hora. O arranjo foi novamente lavado com 0,5 mL de tampão de lavagem a 4 °C por 30 min.
[476] O arranjo foi então escaneado a 635 nm e PMT 500 e a intensidade do sinal foi registrada. O peptídeo foi classificado como detectável caso estivesse presente em pelo menos 2/3 de duplicatas legais. A intensidade de sinal média das réplicas foi registrada como a intensidade de sinal final.
Resultados
[477] Como pode ser observado pela Figura 6, o anticorpo LY75_A1 mostrou ligação específica a diversos peptídeos localizados no arranjo. O sinal máximo observado para ligação de LY75_A1 foi de 25.000 (escala 1-65.535), com o sinal médio para todos os spots no arranjo sendo de cerca de 885. Uma intensidade de sinal de 3.000 foi ajustada como o ponto de corte do nível de fundo para ligação não específica. Com base no nível de intensidade de sinal de ligação de anticorpo observado, foram identificadas sequências potenciais que formam o epitopo para LY75_A1. Essas regiões são mostradas nas Figuras 6a-6j e como IDS. DE SEQ. Nos: 22-31.
Exemplo 25: Ensaio de suspensão do peptídeo de LY75 A1 Método 1.1 Ensaio de suspensão
[478] Proteína de LY75 recombinante foi digerida por proteólise tríptica on-bead (Promega, EUA). Os peptídeos do digesto resultantes foram recuperados com o uso de uma coluna de captura C18 (Thermo Fisher Scientific). Os peptídeos purificados foram então incubados com 200 μL de glóbulos de proteína A reticulados com anticorpo LY75_A1 de um dia para o outro a 4 °C. No dia seguinte, os peptídeos não ligados foram coletados e os glóbulos foram lavados com 1 mL de PBS duas vezes. Os peptídeos ligados ao anticorpo foram eluídos dos glóbulos por seu aquecimento a 90 °C em 100 μL de PBS por 5 minutos. Essa etapa de eluição foi repetida.
1.2 Espectrometria de massa
[479] As amostras foram analisadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa usando um Sistema Waters nanoACQUITY UPLC adaptado com uma coluna C18 nanoACQUITY UPLC BEH 130, 75 μm x 250 mm (186003545) e um LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). Os peptídeos foram eluídos com uma gradiente de 300 nL/min, aumentando de 3% para 35% de acetonitrila ao longo de 120 min. Espectros de massa de varredura completa foram adquiridos a 60.000 de potência de resolução entre 400-2.000 m/z de faixa de massa no Orbitrap. Em cada ciclo, os vinte peptídeos mais intensos foram selecionados para varreduras CID MS/MS na captura de íon linear com fonte de íon nanospray adaptada no instrumento.
1.3 Análise de sequência de aminoácidos de peptídeos
[480] Os dados brutos gerados pelo LTQ Orbitrap Velos foram processados por meio do software Mascot (Matrix Science), que usa o algoritmo Mowse (Curr. Biol., 1° de junho de 1993; 3 (6): 327-3) para inferir as sequências de aminoácidos das listas de pico por pesquisa contra uma base de dados de sequências que consiste em Ensembl (http://www.ensembl.org/index.htmL), IPI (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.htmL) e SwissProt (http://www.uniprot.org), juntamente com sequências de proteína contaminantes. Os critérios para identificação de peptídeo incluíram digestão por tripsina, até 2 sítios de clivagem perdidos e várias modificações biológicas e químicas (metionina oxidada, modificação de cisteína por MMTS ou iodoacetamida e fosforilação de serina, treonina e tirosina). Os peptídeos classificados como 1 com um valor de expectativa de 0,05% ou menos, uma pontuação de íon de 28 ou maior foram carregados em nossa base de dados OGAP.
1.4 Discriminação de peptídeos associados a LY75
[481] O processo para identificar LY75 usou as sequências peptídicas obtidas experimentalmente por espectrometria de massa, como descrito acima, de proteínas humanas de ocorrência natural para identificar e organizar éxons codificadores na sequência publicada do genoma humano. Essas sequências determinadas experimentalmente foram comparadas com a base de dados OGAP®, que foi compilada por processamento e integração de massas de peptídeos, assinaturas de peptídeos, ESTs e “Public Domain Genomic Sequence Data”, como descrito no Pedido de Patente Internacional WO 2009/087462.
Resultados
[482] Os resultados do ensaio de suspensão de peptídeo usando o anticorpo LY75_A1 são mostrados na Tabela 1 abaixo e na Figura 7. Os peptídeos que foram identificados em ambas as eluições de peptídeos 1a e 1b no ensaio de suspensão e no ensaio de microarranjo foram considerados como sendo os candidatos mais prováveis para formação do epitopo. Tabela 1. Comparação de experimentos de microarranjo de peptídeo e de suspensão de peptídeo.
Figure img0002
[483] A Tabela 1 mostra que diversas regiões superpostas do peptídeo de LY75 foram identificadas tanto no ensaio de microarranjo de peptídeos quanto em ambas as eluições 1a e 1b do ensaio de suspensão de peptídeos. Essas regiões são consideradas como sendo as que mais provavelmente contêm o epitopo reconhecido por anticorpo LY75_A1, na medida em que são ligadas por LY75_A1 testado por ambas as técnicas empregadas.

Claims (22)

1. Anticorpo isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a LY75, o referido anticorpo caracterizado por compreendendo: a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo: i) um primeiro vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 5; ii) um segundo vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 6; e iii) um terceiro vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 7; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: i) um primeiro vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 8; ii) um segundo vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 9; e iii) um terceiro vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 10.
2. Anticorpo isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado por compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 2.
3. Anticorpo isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma fração ligada covalentemente.
4. Anticorpo isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida fração é um fármaco.
5. Anticorpo isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em um maitansinóide, uma dolastatina, uma hemiasterlina, uma auristatina, um tricoteceno, uma caliqueamicina, CC1065 e derivados dos mesmos.
6. Anticorpo isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido fármaco é um maitansinoide selecionado a partir do grupo que consiste em DM4 e DM1.
7. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo induz citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
8. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é internalizado por uma célula que expressa LY75.
9. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno compreende um conjugado de fármaco covalentemente ligado.
10. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado de fármaco covalentemente ligado é um maitansinóide.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, juntamente com um ou mais diluentes, excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
12. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que codifica uma cadeia pesada do anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o referido ácido nucleico isolado compreende a SEQ ID NO:3 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO :3 como resultado da degeneração do código genético.
13. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que codifica uma cadeia leve do anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o referido ácido nucleico isolado compreende a SEQ ID NO:4 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:4 como resultado da degeneração do código genético.
14. Vetor de expressão, caracterizado por compreender o ácido nucleico, como definido na reivindicação 12, operacionalmente ligado a um ou mais elementos reguladores e/ou o ácido nucleico, como definido na reivindicação 13, operacionalmente ligado a um ou mais elementos reguladores.
15. Método para preparar um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira isolada, sob condições em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo é expressa e, opcionalmente, isolamento do anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo.
16. Uso do anticorpo ou de uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer que expressa LY75.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é internalizado por uma célula que expressa LY75.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno compreende um conjugado de fármaco covalentemente ligado.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o conjugado de fármaco covalentemente ligado é um maitansinóide, de preferência DM4.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo induz citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer de fígado , câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de estômago, leucemia, de preferência leucemia mieloide aguda ou leucemia linfocítica crônica, mieloma, de preferência mieloma múltiplo e linfoma, de preferência linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), Linfoma de células B, Linfoma folicular, Linfoma de células do manto, Linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de células B 86 rico em células T/histiócitos, Linfoma de Burkitt, Linfoma linfoplasmocítico, Linfoma linfocítico pequeno, Linfoma de células T/células B rico em histiócitos, linfoma de Burkitt, Linfoma Linfoplasmocítico, Linfoma Linfocítico Pequeno, Linfoma da Zona Marginal, Linfoma de Células T, Linfoma Periférico de Células T, Linfoma Anaplásico de Grandes Células e Linfoma Angiolmunoblástico de Células T.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os cânceres são selecionados do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de mama triplo-negativo e DLBCL.
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