BR112020025565A2 - Combinações farmacêuticas - Google Patents

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Mario Bigioni
Monica BINASCHI
Andrea PELLACANI
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Abstract

combinações farmacêuticas. a presente divulgação se refere geralmente aos campos da imunologia e biologia molecular. mais especificamente, são fornecidas nesse documento combinações farmacêuticas compreendendo (a) anticorpos, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, direcionados contra ly75, e (b) venetoclax; métodos para preparar combinações farmacêuticas; e métodos para o tratamento de doenças, tais como cânceres mediados pela expressão ou atividade de ly75.

Description

COMBINAÇÕES FARMACÊUTICAS INTRODUÇÃO
[001]A presente divulgação se refere geralmente aos campos da imunologia e biologia molecular. Mais especificamente, são fornecidas nesse documento combinações farmacêuticas compreendendo (A) anticorpos, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, direcionados contra LY75, e (B) Venetoclax; métodos para preparar combinações farmacêuticas; e métodos para o tratamento de doenças, tais como, cânceres mediados pela expressão ou atividade de LY75.
ANTECEDENTES
[002]Leucemias e linfomas pertencem a um amplo grupo de tumores que afetam o sangue, a medula óssea e o sistema linfoide; esses são conhecidos como tumores dos tecidos hematopoiéticos e linfoides.
[003]Linfoma é um grupo de tumores de células sanguíneas que se desenvolvem a partir de linfócitos. Os sinais e sintomas podem incluir gânglios linfáticos aumentados, febre, suores intensos, perda de peso não intencional, coceira e sensação de cansaço constante. Existem vários subtipos de linfomas: as duas categorias principais de linfomas são os linfomas de Hodgkin (LH) e os linfomas não- Hodgkin (LNH). A Organização Mundial da Saúde (OMS) inclui duas outras categorias como tipos de linfoma: mieloma múltiplo e doenças imunoproliferativas. Cerca de 90% dos linfomas são linfomas não Hodgkin.
[004]A leucemia é um grupo de cânceres que usualmente começa na medula óssea e resulta em um grande número de leucócitos anormais. Os sintomas podem incluir sangramento e problemas com hematomas, sensação de cansaço, febre e aumento do risco de infecções. Esses sintomas ocorrem devido à falta de células sanguíneas normais. O diagnóstico tipicamente é feito por exames de sangue ou biópsia da medula óssea. Existem quatro tipos principais de leucemia: leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC) e leucemia mieloide crônica (LMC), bem como vários tipos menos comuns.
[005]O tratamento de leucemias e linfomas pode envolver um ou mais de quimioterapia, radioterapia, terapia direcionada e cirurgia (e transplante de medula óssea no caso de leucemias). O sucesso do tratamento da leucemia depende do tipo de leucemia e da idade da pessoa. O resultado do tratamento do linfoma depende do subtipo, com alguns sendo curáveis e o tratamento prolongando a sobrevida na maioria.
[006]Vários agentes quimioterápicos foram usados anteriormente para o tratamento de leucemias, incluindo prednisona, vincristina, antraciclinas, L-asparaginase, ciclofosfamida, metotrexato, 6-mercaptopurina, fludarabina, pentostatina e cladribina. Os agentes quimioterápicos para o tratamento de linfomas incluem ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina (também conhecida como doxorrubicina ou adriamicina), oncovina (vincristina), prednisona, prednisolona, bleomicina, dacarbazina, etoposídeo e procarbazina.
[007]A quimioterapia combinada envolve o tratamento de um paciente com dois ou mais fármacos diferentes simultaneamente. Os fármacos podem diferir em seu mecanismo e efeitos colaterais. A maior vantagem disso é minimizar as chances de desenvolvimento de resistência a qualquer agente. Além disso, os fármacos muitas vezes podem ser usados em doses mais baixas, reduzindo a toxicidade. As terapias combinadas para o tratamento da doença de Hodgkin incluem MOPP (mustina, vincristina, procarbazina, prednisolona) e ABVD (doxorrubicina, bleomicina, vinblastina, dacarbazina). As terapias combinadas para o tratamento do linfoma não Hodgkin incluem CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisolona). Dado o número de fármacos conhecidos para o tratamento de leucemias e linfomas, o número de permutações e combinações de possíveis terapias farmacológicas é claramente grande. Além disso, as terapias combinadas acima mencionadas não incluem anticorpos.
[008]Resta, no entanto, a necessidade de novos tratamentos de leucemias e linfomas e, particularmente, de terapias combinadas eficazes.
[009]O antígeno linfocitário 75 atua como um receptor endocítico para direcionar os antígenos capturados do espaço extracelular para um compartimento de processamento de antígeno especializado e acredita-se que cause uma redução na proliferação de linfócitos B. A expressão do antígeno linfocitário 75 foi observada em cânceres de pâncreas, ovário, mama, colorretal, esofágico, de pele, da tireoide e do pulmão (células não pequenas), bem como mieloma múltiplo e muitos subtipos diferentes de linfomas e leucemias. WO2009/061996 divulga anticorpos monoclonais isolados que se ligam a DEC-205 (LY75) humano e composições e moléculas baseadas em anticorpos relacionados. Também são divulgadas composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos, bem como métodos terapêuticos e de diagnóstico para usar os anticorpos. WO2008/104806 divulga reagentes de afinidade capazes de se ligarem a LY75 para uso no tratamento ou na profilaxia do câncer. WO2015/052537 divulga anticorpos isolados específicos capazes de se ligarem a LY75 e a seu uso no tratamento de vários cânceres.
[0010]Venetoclax é um fármaco oral de pequena molécula que bloqueia a proteína antiapoptótica do linfoma 2 de células B (Bcl-2), levando à morte celular programada. É indicado para leucemia linfocítica crônica (LLC) em pacientes com uma anormalidade cromossômica específica (deleção em 17p). Em 2015, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos concedeu a Designação de Terapia Inovadora para Venetoclax para indivíduos com CLL que tiveram recaída ou foram resistentes ao tratamento anterior e têm a mutação genética de deleção em 17p.
[0011]Verificou-se que combinações de certos anticorpos anti-LY75 com Venetoclax demonstram resultados sinergísticos no tratamento de linfomas.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012]Em um aspecto, a invenção fornece uma combinação farmacêutica que compreende: (A) um anticorpo anti-LY75, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, que compete pela ligação a LY75 com um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou um anticorpo anti-LY75, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, o referido anticorpo compreendendo: a) uma região variável da cadeia pesada que compreende: i) um primeiro vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 5; ii) um segundo vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 6; e iii) um terceiro vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 7; e b) uma região variável da cadeia leve que compreende: i) um primeiro vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 8; ii) um segundo vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 9; e iii) um terceiro vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 10; opcionalmente, em que qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs acima compreendem, independentemente, uma, duas, três, quatro ou cinco substituição(ões), adições ou deleções de aminoácidos; e (B) Venetoclax ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a combinação farmacêutica está na forma de uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial.
[0013]Em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 CDRs selecionadas do grupo que consiste em CDRs compreendendo SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo 1, 2 ou 3 CDRs selecionadas do grupo que consiste em CDRs compreendendo SEQ ID NOs: 8, 9 e 10.
[0014]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LY75 se ligam a LY75 (SEQ ID NO: 15) e são capazes de ser internalizados por uma célula que expressa LY75.
[0015]Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende as regiões determinantes de complementaridade da(s) cadeia(s) pesada e/ou leve (CDRs) ou regiões variáveis (VRs) do anticorpo particular descrito nesse documento (por exemplo, referido nesse documento como “LY75_A1”). Por conseguinte, em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo LY75_A1 tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 e/ou os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve (VL) de LY75_A1 tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2.
[0016]Em outra modalidade, os anticorpos anti-LY75 se ligam a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1, e/ou modificações de sequência conservadoras da mesma. O anticorpo pode incluir adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 2 e/ou modificações de sequência conservadoras da mesma.
[0017]Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-LY75 se ligam a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve incluindo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e/ou 2, respectivamente, e modificações de sequência conservadoras das mesmas.
[0018]Anticorpos que incluem regiões variáveis das cadeias pesada e leve tendo pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou mais identidade de sequência com qualquer uma das sequências acima também estão incluídas na presente invenção. Faixas intermediárias aos valores citados acima, por exemplo, regiões variáveis das cadeias pesada e leve tendo pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95% ou 95-100% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências acima também se destinam a ser abrangido pela presente invenção.
[0019]Em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO:
1. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende um região estrutural da cadeia que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica à estrutura da região variável da cadeia pesada capaz de SEQ ID NO: 1 como mostrado nas SEQ ID NOS: 16, 17, 18 e 19. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região estrutural de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica à estrutura da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 2 como mostrado nas SEQ ID NOS: 20, 21, 22 e 23.
[0020]Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 38 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO:
38. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 39 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 39. A cadeia pesada pode compreender as sequências de SEQ ID NOs: 5-7 ou
1. A cadeia leve pode compreender as sequências de SEQ ID NOs: 8-10 ou 2.
[0021]Em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 compete pela ligação a LY75 com um anticorpo compreendendo regiões variáveis da(s) cadeia(s) pesada e/ou leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente, ou sequências de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idênticas às mesmas. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compete pela ligação a LY75 com um anticorpo compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e 2 (LY75_A1).
[0022]Outros anticorpos da invenção ligam-se ao mesmo epítopo ou a um epítopo em LY75 reconhecido pelos anticorpos descritos nesse documento. Em outra modalidade particular,
o anticorpo se liga a um epítopo em LY75 reconhecido por um anticorpo compreendendo regiões variáveis da(s) cadeia(s) pesada e/ou leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente, ou sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas. Em outra modalidade, o anticorpo se liga a um epítopo em LY75 reconhecido por um anticorpo compreendendo regiões variáveis da(s) cadeia(s) pesada e/ou leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e 2 (LY75_A1).
[0023]Outros anticorpos da invenção ligam-se ao mesmo epítopo ou a um epítopo em LY75 reconhecido pelos anticorpos descritos nesse documento. Em outra modalidade particular, o anticorpo se liga a um epítopo em LY75 reconhecido por um anticorpo compreendendo regiões variáveis da(s) cadeia(s) pesada e/ou leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente, ou sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas. Em outra modalidade, o anticorpo se liga a um epítopo em LY75 reconhecido por um anticorpo compreendendo regiões variáveis da(s) cadeia(s) pesada e/ou leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e 2 (LY75_A1).
[0024]Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-LY75 se ligam especificamente a um ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, peptídeo(s) selecionado(s) do grupo que compreende SEQ ID NOs: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 ou fragmentos do(s) mesmo(s), em que os referidos fragmentos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos. Em uma outra modalidade, o epítopo reconhecido pelos anticorpos anti-LY75 compreende um ou mais peptídeo(s), dois ou mais ou três ou mais peptídeos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 27, 29, 30, 34, 35, 36 ou 37 ou seus fragmentos em que os referidos fragmentos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos. Em uma outra modalidade, o epítopo reconhecido pelos anticorpos anti-LY75 compreende um ou mais peptídeo(s), por exemplo, dois ou três peptídeos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 30, 36 e 37 ou fragmentos dos mesmos em que os referidos fragmentos compreendem em pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos.
[0025]Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-LY75 compreendem CDRs variáveis em comparação com os anticorpos parentais descritos nesse documento. Assim, os anticorpos variantes compreendendo regiões variáveis variantes de um anticorpo precursor, em que o anticorpo precursor compreende uma primeira vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 5, uma segunda vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 6, uma terceira vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 7, a primeiro vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 8, uma segunda vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 9 e uma terceira vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 10, e em que o anticorpo variante tem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituição(ões) de aminoácidos coletivamente no conjunto da primeira vhCDR, da segunda vhCDR, da terceira vhCDR, da primeira vlCDR, da segunda vlCDR e da terceira vlCDR, com de 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2 substituições de uso particular, e em que o anticorpo retém a ligação específica a LY75.
[0026]Todos os anticorpos divulgados nesse documento podem ser de comprimento total, por exemplo, qualquer um dos seguintes isotipos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos, tal como uma porção de ligação de antígeno ou um anticorpo de cadeia única (por exemplo, um Fab, F(ab’)2, Fv, um fragmento Fv de cadeia única, uma região determinante de complementaridade isolada (CDR) ou um combinação de duas ou mais CDRs isoladas). Os anticorpos podem ser qualquer tipo de anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos humanos, humanizados e quiméricos.
[0027]Em outras modalidades, os anticorpos anti-LY75 estão na forma de um imunoconjugado (isto é, eles incluem adicionalmente uma porção ligada covalentemente). Em uma modalidade particular, a porção é um fármaco, tal como um maitansinoide, uma dolastatina, uma auristatina, um tricoteceno, uma caliqueamicina, CC1065 ou derivados dos mesmos. Em uma modalidade preferida, a fração do fármaco é DM1 ou DM4.
[0028]Em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve codificadas por sequências de ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente, ou sequências de ácidos nucleicos tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as sequências de ácidos nucleicos acima mencionadas ou sequências que diferem de SEQ ID NOs: 3 e 4 devido à degenerescência do código genético.
[0029]Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de câncer em um paciente que compreende a administração simultânea, sequencial ou separada a um paciente em necessidade do mesmo, de quantidades terapeuticamente eficazes dos componentes (A) e (B) de uma combinação farmacêutica da invenção.
[0030]Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma combinação farmacêutica da invenção para uso no tratamento de câncer.
[0031]Também é fornecido o uso dos componentes (A) e (B) conforme definido nesse documento na fabricação de uma combinação farmacêutica para uso simultâneo, separado ou sequencial para o tratamento do câncer. Em uma modalidade, o câncer é, de preferência, leucemia ou linfoma.
[0032]Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), Linfoma de células B, Linfoma folicular, Linfoma de células do manto, Linfoma de tecido linfoide associado à mucosa (MALT), Linfoma de células B rico em células T/histiócitos, Linfoma de Burkitt, Linfoma linfoplasmocítico, Linfoma linfocítico pequeno, Linfoma de zona marginal, Linfoma de células T, Linfoma de células T periférico, Linfoma anaplásico de grandes células e mieloma de células grandes, Linfoma agudo de células grandes leucemia e leucemia linfocítica crônica. Mais de preferência, o câncer é DLBCL ou linfoma não-Hodgkin.
[0033]Também dentro do escopo da invenção estão kits que compreendem uma combinação farmacêutica da invenção e, opcionalmente, instruções de uso. O kit pode conter ainda pelo menos um reagente adicional ou um ou mais anticorpos adicionais.
[0034]Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0035]A Figura 1 representa o alinhamento da cadeia pesada LY75_A1 (SEQ ID NO: 1), a linha germinal VH 3-15 de humano (SEQ ID NO: 11) e a linha germinal JH4 de humano (SEQ ID NO: 12). As regiões CDR da cadeia pesada LY75_A1 estão sublinhadas.
[0036]A Figura 2 representa o alinhamento da cadeia leve LY75_A1 (SEQ ID NO: 2), a linha germinal VK O12 de humano (SEQ ID NO: 13) e a linha germinal JK4 de humano (SEQ ID NO: 14). As regiões CDR da cadeia leve LY75_A1 estão sublinhadas.
[0037]A Figura 3a descreve a atividade citotóxica de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 em HT- 29 e mostra enquanto a maioria dos anticorpos se ligam a LY75 apenas alguns apresentam eficácia.
[0038]A Figura 3b representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em HT-29.
[0039]A Figura 3c representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células RAJI.
[0040]A Figura 3d representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células Namalwa.
[0041]A Figura 3e descreve a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células Karpas 299.
[0042]A Figura 3f representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células BxPC3.
[0043]A Figura 3g representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células HupT4.
[0044]A Figura 3h representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células HPAFFII.
[0045]A Figura 3i representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células EHEB.
[0046]A Figura 3j representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células Mec-1.
[0047]A Figura 3k representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células AML-193.
[0048]A Figura 3l representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células HCC 70.
[0049]A Figura 3m representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células HCC 1806.
[0050]A Figura 3n representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células MDA-MB-468.
[0051]A Figura 3o representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células RT4.
[0052]A Figura 3p representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células
5637.
[0053]A Figura 3q representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células SW780.
[0054]A Figura 3r representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células SCC-9.
[0055]A Figura 3s representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células OE
19.
[0056]A Figura 3t representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células OVCAR-3.
[0057]A Figura 3u representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células SK-OV-3.
[0058]A Figura 3v representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células MOLP-8.
[0059]A Figura 3w representa a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em células RPMI8226.
[0060]A Figura 4a representa a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 no modelo de xenoenxerto de camundongo SCID com linfoma de Raji Burkitt.
[0061]A Figura 4b representa a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 no modelo de xenoenxerto de camundongo SCID com linfoma de Namalwa Burkitt.
[0062]A Figura 4c representa a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 no modelo de enxerto de camundongo nu atímico com adenocarcinoma pancreático HPAFII.
[0063]A Figura 4d representa a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 no modelo de xenoenxerto de camundongo SCID com carcinoma de bexiga de humano SW780.
[0064]A Figura 4e representa a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 no modelo de xenoenxerto de camundongo nu atímico MDA-MB-468.
[0065]A Figura 4f representa a eficácia de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 ou DM4 em modelo de xenoenxerto de camundongo nu atímico de adenocarcinoma colorretal COLO205.
[0066]A Figura 5a mostra a ligação competitiva de mAb anti-LY75 e um mAb anti-LY75 conjugado a MCC-DM1.
[0067]A Figura 5b mostra a ligação não competitiva de LY75_A1 e um mAb anti-LY75 conjugado com MCC-DM1.
[0068]As Figuras 6a-6j mostram representações gráficas da ligação do anticorpo LY75_A1 aos peptídeos LY75 em um microarranjo de peptídeo.
[0069]A Figura 7 mostra um alinhamento de aminoácidos de peptídeos ligados pelo anticorpo LY75_A1 no ensaio de microarranjo de peptídeo e no ensaio de imunoprecipitação de peptídeo. Os peptídeos destacados são aqueles que provavelmente formam o epítopo reconhecido pelo anticorpo LY75_A1.
[0070]A Figura 8 mostra um gráfico de estimativa algébrica: CI. vs Efeito fracionário de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha de células de ABC-DLBCL U2932.
[0071]A Figura 9 mostra um gráfico de estimativa algébrica: CI vs Efeito Fracional de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha de células de
ABC-DLBCL HBL-1.
[0072]A Figura 10 mostra um gráfico de estimativa algébrica: CI vs Efeito Fracional de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha celular de ABC-DLBCL HBL-1.
[0073]A Figura 11 mostra um gráfico de estimativa algébrica: CI vs Efeito fracionário de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha de células de ABC-DLBCL TMD8.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0074]A presente divulgação se refere a combinações farmacêuticas que compreendem os componentes (A) e (B), conforme definido nesse documento, em que a combinação farmacêutica está na forma de uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial. O componente (A) se refere a um anticorpo anti-LY75 conforme definido nesse documento. O componente (B) refere-se a Venetoclax ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0075]Um exemplo da proteína LY75 é dado em SEQ ID NO: 15 nesse documento. Os termos “anticorpos anti-LY75” e “anticorpos LY75” são usados indistintamente nesse documento.
[0076]Os anticorpos LY75 divulgados nesse documento podem ser internalizados quando contatados com células que expressam o receptor LY75. Como discutido nesse documento, o receptor LY75 é superexpressado e/ou expressado diferencialmente em certas células cancerígenas, incluindo, mas não se limitando a, leucemia, de preferência, leucemia mieloide aguda ou leucemia linfocítica crônica, linfoma, de preferência DLBCL Linfoma de células B, Linfoma folicular,
Linfoma de células do manto, Linfoma de tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma de células B rico em células T/histiócitos, Linfoma de Burkitt, Linfoma linfoplasmocítico, Linfoma linfocítico pequeno, Linfoma de células T/linfoma de células T grandes, linfoma de zona marginal, Linfoma de células T periféricas, Linfoma de células grandes anaplásicas e Linfoma de células T AngioImunoblásticas.
[0077]Como tal, quando os anticorpos LY75 divulgados nesse documento são conjugados a fármacos (às vezes referidos nesse documento como “conjugados anticorpo-fármaco” ou “ADCs”), a internalização dessas moléculas de ADC em células cancerígenas resulta em morte celular e, portanto, tratamento do tumor.
[0078]Os anticorpos anti-LY75 possuem características estruturais particulares, tais como regiões CDR com sequências de aminoácidos particulares. É descrito nesse documento um conjunto de CDRs que podem formar um reagente de afinidade, por exemplo, um anticorpo, que exibe ligação a LY75.
[0079]Qualquer um dos anticorpos anti-LY75 da invenção podem ser anticorpos isolados.
[0080]Assim, a divulgação fornece anticorpos, de preferência anticorpos isolados (que, como descrito abaixo, inclui uma ampla variedade de estruturas de anticorpos bem conhecidas, derivados, miméticos e conjugados), ácidos nucleicos que codificam combinações de anticorpos, células hospedeiras usadas para fazer as combinações de anticorpos, métodos de preparação das combinações de anticorpos e combinações farmacêuticas que compreendem os anticorpos e,
opcionalmente, um carreador farmacêutico, métodos de tratamento que compreendem o uso das combinações farmacêuticas e o uso das combinações farmacêuticas para o tratamento de cânceres.
[0081]O antígeno linfocitário 75 atua como um receptor endocítico para direcionar os antígenos capturados do espaço extracelular para um compartimento de processamento de antígeno especializado e acredita-se que cause uma redução na proliferação de linfócitos B.
[0082]De acordo com o SWISS-PROT, o antígeno linfocitário 75 é expressado no baço, timo, cólon e linfócitos do sangue periférico. Foi detectado em linhas de células mieloides e linfoides B. As isoformas designadas nesse documento OGTA076b e OGTA076c são expressadas em células de linfoma de Hodgkin malignas chamadas células de Hodgkin e Reed-Sternberg (HRS). O LY75 atua como um receptor endocítico para direcionar os antígenos capturados do espaço extracelular para um compartimento de processamento de antígeno especializado. Causa redução da proliferação de linfócitos B.
[0083]A expressão de LY75 foi observada em câncer de pâncreas, bexiga, ovário, mama (incluindo triplo negativo), colorretal, esofágico, pele, tireoide e pulmão (células não pequenas), bem como mieloma múltiplo e muitos subtipos diferentes de linfomas (incluindo DLBCL) e leucemias.
[0084]O anticorpo anti-LY75 pode, em certos casos, apresentar reação cruzada com o LY75 de outras espécies além da humana. Por exemplo, para facilitar o teste clínico, os anticorpos anti-LY75 podem apresentar reação cruzada com moléculas LY75 de murino ou de primata. Alternativamente, em certas modalidades, os anticorpos podem ser completamente específicos para LY75 de humano e não podem exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada de não humano.
[0085]Os anticorpos que encontram uso na presente invenção podem assumir uma série de formatos, como descrito nesse documento, incluindo anticorpos tradicionais, bem como derivados, fragmentos e miméticos de anticorpos, descritos abaixo. Em uma modalidade, a invenção fornece estruturas de anticorpos que contêm um conjunto de 6 CDRs conforme definido nesse documento (incluindo um pequeno número de alterações de aminoácidos como descrito abaixo).
[0086]“Anticorpo”, como usado nesse documento, inclui uma ampla variedade de estruturas, como será apreciado por aqueles na técnica, que em algumas modalidades contêm no mínimo um conjunto de 6 CDRs conforme definidas nesse documento; incluindo, mas não se limitando a, anticorpos tradicionais (incluindo anticorpos monoclonais e policlonais), anticorpos humanizados e/ou quiméricos, fragmentos de anticorpos, anticorpos manipulados (por exemplo, com modificações de aminoácidos como descrito abaixo), anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos) e outros análogos conhecidos na técnica.
[0087]As unidades estruturais do anticorpo tradicional tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada tetrâmero é tipicamente composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia “leve” (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 50-70 kDa). As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves capa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mi, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tem várias subclasses, incluindo, mas não se limitando a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tem subclasses, incluindo, mas não se limitando a, IgM1 e IgM2. Assim, “isotipo”, como usado nesse documento, significa qualquer uma das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas características químicas e antigênicas de suas regiões constantes. Os isotipos de imunoglobulina humana conhecidos são IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE. Deve ser entendido que os anticorpos terapêuticos também podem compreender híbridos de qualquer combinação de isotipos e/ou subclasses.
[0088]Em muitas modalidades, os isotipos de IgG são usados na presente invenção, com IgG1 encontrando uso particular em uma série de aplicações.
[0089]A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Na região variável, três enovelamentos são agrupados para cada um dos domínios V da cadeia pesada e da cadeia leve para formar um sítio de ligação de antígeno. Cada um dos enovelamentos é referido como uma região determinante de complementaridade (doravante referida como uma “CDR”), em que a variação na sequência de aminoácidos é mais significativa. “Variável” refere-se ao fato de que certos segmentos da região variável diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos. A variabilidade dentro da região variável não é uniformemente distribuída. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariáveis chamados regiões estruturais (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas “regiões hipervariáveis”, cada uma com 9-15 aminoácidos de comprimento ou mais.
[0090]Cada VH e VL é composto por três regiões hipervariáveis (“regiões determinantes complementares”, “CDRs”) e quatro FRs, arranjadas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4.
[0091]A região hipervariável geralmente abrange resíduos de aminoácidos de cerca de resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1; “L” indica cadeia leve), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) na região variável da cadeia leve e cerca de 31-35B (HCDR1; “H” indica cadeia pesada), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) na região variável da cadeia pesada; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) e/ou esses resíduos formando um enovelamento hipervariável (por exemplo, resíduos 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 91-96 (LCDR3) na região variável da cadeia leve e 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) e 96-101 (HCDR3) na região variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. CDRs específicas da invenção são descritas abaixo.
[0092]Ao longo do presente relatório descritivo, o sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1-107 da região variável da cadeia leve e resíduos 1-113 da região variável da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., supra (1991)).
[0093]As CDRs contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno ou, mais especificamente, do sítio de ligação ao epítopo dos anticorpos.
O termo “epítopo” ou “determinante antigênico” refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou um anticorpo se liga especificamente.
Os epítopos podem ser formados de aminoácidos contíguos como de aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína.
Os epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes.
Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única.
Como descrito nesse documento, os métodos para determinar quais epítopos estão ligados por um determinado anticorpo (isto é, mapeamento de epítopos) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, imunoblotting e ensaios de imunoprecipitação, em que peptídeos sobrepostos ou contíguos de LY75 são testados quanto à reatividade com o anticorpo anti-LY75 dado.
Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem tecnologias na técnica e aquelas descritas nesse documento, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional (ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.
E.
Morris, Ed. (1996)). O termo “mapeamento de epítopo” refere-se ao processo de identificação dos determinantes moleculares para o reconhecimento do antígeno-anticorpo.
[0094]A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora. Kabat et al. coletaram numerosas sequências primárias das regiões variáveis de cadeias pesadas e cadeias leves. Com base no grau de conservação das sequências, eles classificaram sequências primárias individuais na CDR e na estrutura e fizeram uma lista das mesmas (ver SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5ª edição, publicação NIH, N° 91- 3242, EA Kabat et al.)
[0095]Na subclasse IgG de imunoglobulinas, existem vários domínios de imunoglobulina na cadeia pesada. Por “domínio de imunoglobulina (Ig)” nesse documento entende-se uma região de uma imunoglobulina tendo uma estrutura terciária distinta. De interesse na presente invenção são os domínios de cadeia pesada, incluindo, os domínios constantes pesados (CH) e os domínios de dobradiça. No contexto dos anticorpos IgG, os isotipos IgG têm, cada um, três regiões CH. Consequentemente, os domínios “CH” no contexto de IgG são os seguintes: “CH1” refere-se às posições 118-220 de acordo com o índice da UE como em Kabat. “CH2” refere-se às posições 237-340 de acordo com o índice da UE como em Kabat, e “CH3” refere-se às posições 341-447 de acordo com o índice da UE como em Kabat.
[0096]Outro tipo de domínio de Ig da cadeia pesada é a região de dobradiça. Por “dobradiça” ou “região de dobradiça” ou “região de dobradiça do anticorpo” ou “região de dobradiça da imunoglobulina” aqui se entende o polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo. Estruturalmente, o domínio CH1 de IgG termina na posição UE 220 e o domínio CH2 de IgG começa no resíduo de posição 237 na UE. Assim, para IgG, a dobradiça do anticorpo é definida nesse documento para incluir as posições 221 (D221 em IgG1) a 236 (G236 em IgG1), em que a numeração está de acordo com o índice da UE como em Kabat. Em algumas modalidades, por exemplo, no contexto de uma região Fc, a dobradiça inferior está incluída, com a “dobradiça inferior” geralmente referindo- se às posições 226 ou 230.
[0097]De particular interesse na presente invenção são as regiões Fc. Por “Fc” ou “região Fc” ou “domínio Fc”, como usado nesse documento, entende-se o polipeptídeo que compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante e, em alguns casos, parte da dobradiça. Assim, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG, os últimos três domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM, e o terminal N de dobradiça flexível para esses domínios. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, o domínio Fc compreende domínios de imunoglobulina Cγ2 e Cγ3 (Cγ2 e Cγ3) e a região de dobradiça inferior entre Cγ1 (Cγ1) e Cγ2 (Cγ2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG de humano é usualmente definida para incluir os resíduos C226 ou P230 em seu terminal carboxila, em que a numeração está de acordo com o índice da UE como em Kabat. Em algumas modalidades, como é descrito mais completamente abaixo, as modificações de aminoácidos são feitas na região Fc, por exemplo, para alterar a ligação a um ou mais de receptores FcγR ou ao receptor FcRn.
[0098]Em algumas modalidades, os anticorpos são de comprimento total. Por “anticorpo de comprimento total” entende-se nesse documento que a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variável e constante, incluindo uma ou mais modificação(ões), como delineado nesse documento.
[0099]Alternativamente, os anticorpos podem ser uma variedade de estruturas, incluindo, mas não se limitando a, fragmentos de anticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (às vezes referidos nesse documento como “miméticos de anticorpos”), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fusões de anticorpos (às vezes chamadas de “conjugados de anticorpos”) e fragmentos de cada um, respectivamente. Estruturas que dependem do uso de um conjunto de CDRs estão incluídas na definição de “anticorpo”.
[00100]Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpo específicos incluem, mas não estão limitados a, (i) o fragmento Fab que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1, (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1, (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546, inteiramente incorporado por referência) que consiste em uma única região variável, (v) regiões CDR isoladas, (vi) fragmentos F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird et al., 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad.
Sci. EUA 85:5879-5883, inteiramente incorporado por referência), (viii) Fv de cadeia simples biespecífico (WO 03/11161, incorporado nesse documento por referência) e (ix) “diacorpos” ou “triacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão gênica (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6444- 6448, todos inteiramente incorporados por referência).
[00101]Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser uma mistura de diferentes espécies, por exemplo, um anticorpo quimérico e/ou um anticorpo humanizado. Isto é, na presente invenção, os conjuntos de CDR podem ser usados com regiões estruturais e constantes diferentes daquelas especificamente descritas por sequência nesse documento.
[00102]Em geral, “anticorpos quiméricos” e “anticorpos humanizados” referem-se a anticorpos que combinam regiões de mais de uma espécie. Por exemplo, “anticorpos quiméricos” tradicionalmente compreendem região(ões) variável(eis) de um camundongo (ou rato, em alguns casos) e região(ões) constante(s) de um humano. “Anticorpos humanizados” geralmente se referem a anticorpos não humanos que tiveram as regiões estruturais de domínio variável trocadas por sequências encontradas em anticorpos humanos. Geralmente, em um anticorpo humanizado, todo o anticorpo, exceto as CDRs, é codificado por um polinucleotídeo de origem humana ou é idêntico a esse anticorpo, exceto em suas CDRs. As CDRs, algumas ou todas as quais são codificadas por ácidos nucleicos originários de um organismo não humano, são enxertadas na estrutura da folha beta de uma região variável de anticorpo humano para criar um anticorpo, a especificidade do qual é determinada pelas CDRs enxertadas.
A criação de tais anticorpos é descrita em, por exemplo, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, todos inteiramente incorporados por referência.
A “retromutação” de resíduos da estrutura aceitadora selecionada para os resíduos doadores correspondentes é muitas vezes necessária para recuperar a afinidade que é perdida na construção enxertada inicial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; 6054297; US 6407213, todos totalmente incorporados por referência). O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana e, portanto, compreenderá tipicamente uma região Fc de humano.
Os anticorpos humanizados também podem ser gerados usando camundongos com um sistema imunológico geneticamente modificado.
Roque et al., 2004, Biotechnol.
Prog. 20:639-654, inteiramente incorporado por referência.
Uma variedade de técnicas e métodos para humanizar e remodelar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (Ver Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EUA), e referências citadas nesse documento, todas inteiramente incorporadas por referência). Os métodos de humanização incluem os, mas não estão limitados aos, métodos descritos em Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323- 329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J.
Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992,
Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8, todos inteiramente incorporados por referência. A humanização ou outros métodos de redução da imunogenicidade de regiões variáveis de anticorpos não humanos podem incluir métodos de recapeamento, como descrito por exemplo em Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973, inteiramente incorporado por referência. Em uma modalidade, o anticorpo precursor foi maturado por afinidade, como é conhecido na técnica. Métodos baseados em estrutura podem ser empregados para humanização e maturação por afinidade, por exemplo, como descrito em US NS 11/004.590. Métodos baseados em seleção podem ser empregados para humanizar e/ou maturar por afinidade regiões variáveis de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a, métodos descritos em Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759, todos inteiramente incorporados por referência. Outros métodos de humanização podem envolver o enxerto de apenas partes das CDRs, incluindo os, mas não se limitando aos, métodos descritos em US NS 09/810.510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084, todos inteiramente incorporados por referência.
[00103]Os anticorpos divulgados nesse documento podem ser isolados ou recombinantes. “Isolado”, quando usado para descrever os vários polipeptídeos divulgados nesse documento, significa um polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de uma célula ou cultura de células da qual foi expressado.
Assim, um anticorpo isolado se destina a referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a LY75 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos diferentes de LY75). Assim, um anticorpo “isolado” é aquele encontrado em uma forma não normalmente encontrado na natureza (por exemplo, de ocorrência não natural). Um anticorpo isolado, conforme definido nesse documento, pode, em uma modalidade, incluir pelo menos um aminoácido que não ocorre no anticorpo de ocorrência “natural”. Esse aminoácido pode ser introduzido por forma de uma adição ou substituição.
Será entendido que o aminoácido introduzido pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou não natural.
Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são proteínas recombinantes, proteínas isoladas ou proteínas substancialmente puras.
Uma proteína “isolada” não é acompanhada por pelo menos algum do material com o qual está normalmente associada em seu estado natural, por exemplo, constituindo pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 50% em peso da proteína total em uma determinada amostra.
Entende-se que a proteína isolada pode constituir de 5 a 99,9% em peso do conteúdo total de proteína dependendo das circunstâncias.
Por exemplo, a proteína pode ser feita em uma concentração significativamente mais alta através do uso de um promotor induzível ou promotor de alta expressão, de modo que a proteína seja feita em níveis de concentração aumentados. No caso de proteínas recombinantes, a definição inclui a produção de um anticorpo em uma ampla variedade de organismos e/ou células hospedeiras que são conhecidas na técnica nas quais não é produzido naturalmente. Normalmente, um polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. Um “anticorpo isolado” refere-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas. Por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a LY75 está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos além de LY75. O anticorpo anti-LY75 isolado pode, é claro, ser associado a Venetoclax.
[00104]Os anticorpos monoclonais isolados, tendo diferentes especificidades, podem ser combinados em uma composição bem definida. Assim, por exemplo, o anticorpo da invenção pode opcionalmente e individualmente ser incluído ou excluído em uma formulação, como é discutido mais adiante.
[00105]Os anticorpos anti-LY75 da presente invenção ligam-se especificamente a LY75 (por exemplo, SEQ ID NO: 15). “Ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um determinado antígeno ou um epítopo significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é semelhante ao alvo.
[00106]A ligação específica a um determinado antígeno ou epítopo pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo tendo um KD para um antígeno ou epítopo de pelo menos cerca de 10- 4 M, pelo menos cerca de 10-5 M, pelo menos cerca de 10-6 M, pelo menos cerca de 10-7 M, pelo menos cerca de 10-8 M, pelo menos cerca de 10-9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-10 M, pelo menos cerca de 10-11 M, pelo menos cerca de 10- 12 M, ou superior, em que KD se refere a uma taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. Tipicamente, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno terá um KD que é 20, 50, 100, 500, 1000, 5.000,
10.000 vezes maior ou mais para uma molécula de controle em relação ao antígeno ou epítopo. No entanto, na presente invenção, ao administrar ADCs dos anticorpos LY75 da invenção, o que é importante é que o KD seja suficiente para permitir a internalização e, portanto, a morte celular sem efeitos colaterais significativos.
[00107]Além disso, a ligação específica para um determinado antígeno ou epítopo pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo tendo um KA ou Ka para um antígeno ou epítopo de pelo menos 20, 50, 100, 50, 1000, 5.000, 10.000 vezes maior ou mais para o epítopo em relação a um controle, em que KA ou Ka se refere a uma taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular.
[00108]Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos para LY75 podem ser feitos no nível da proteína ou celular e são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs, ensaios BIAcore® e análise de citometria de fluxo. Os ensaios adequados são descritos em detalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como por análise do sistema Biacore®. Para avaliar a ligação a células tumorais Raji ou Daudi B, células Raji (Depósito ATCC N° CCL-86) ou Daudi (Depósito ATCC N° CCL-213) podem ser obtidas de fontes publicamente disponíveis, tais como American Type Culture Collection, e usado em ensaios padrão, tal como análise de citometria de fluxo.
[00109]Os anticorpos LY75 que se ligam a LY75 (SEQ ID NO: 15) podem ser internalizados quando em contato com células que expressam LY75 na superfície celular. Esses anticorpos são referidos nesse documento como anticorpos “anti-LY75” ou, para facilidade de descrição, “anticorpos LY75". Ambos os termos são usados indistintamente nesse documento.
[00110]Os anticorpos LY75 são internalizados em contato com células, particularmente células tumorais, que expressam LY75 na superfície. Ou seja, os anticorpos LY75, conforme definidos nesse documento, que também compreendem conjugados de fármacos, são internalizados por células tumorais, resultando na liberação do fármaco e subsequente morte celular, permitindo o tratamento de cânceres que exibem expressão de LY75. A internalização nesse contexto pode ser medida de várias maneiras. Em uma modalidade, os anticorpos LY75 são colocados em contato com células, tal como uma linha celular como descrito nesse documento, usando ensaios padrão, tal como MAbZap. Seria claro para a pessoa habilitada que o ensaio MabZap é representativo do efeito que seria esperado com um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Nesse último caso, o ADC seria internalizado, levando o fármaco para a célula. Um fármaco tóxico teria a capacidade de matar a célula, isto é, de matar a célula cancerígena alvo. Os dados dos ensaios MabZap são prontamente aceitos por pessoas habilitadas na técnica como representativos dos ensaios ADC (Kohls, M e Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, n° 1, 162-165).
[00111]Nessas modalidades de ensaio in vitro, os anticorpos LY75 são adicionados, juntamente com um anticorpo anti-LY75 compreendendo uma toxina; por exemplo, o anticorpo LY75 pode ser de murino ou humanizado e o anticorpo anti- LY75 pode ser anti-murino ou anti-humanizado e conter uma toxina tal como a saporina. Após a formação do complexo [anticorpo LY75][conjugado anticorpo anti-LY75-fármaco], o complexo é internalizado e o fármaco (por exemplo, saporina) é liberado, resultando na morte celular. Somente após a internalização o fármaco é liberado e, portanto, as células permanecem viáveis na ausência de internalização. Como descrito abaixo, sem estar limitado pela teoria, em aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-LY75 contém a toxina e, após internalização, a ligação entre o anticorpo e a toxina é clivada, liberando a toxina e matando a célula.
[00112]Em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende as regiões determinantes de complementaridade das cadeias pesada e leve (CDRs) ou regiões variáveis (VRs) do anticorpo particular descrito nesse documento (por exemplo, referido nesse documento como “LY75_A1”). Consequentemente, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo LY75_A1 tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 e os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo LY75_A1 tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2.
[00113]Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo um primeiro vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 5; um segundo vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 6; e um terceiro vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve compreendendo um primeiro vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 8; um segundo vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 9; e um terceiro vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 10.
[00114]Em outra modalidade, os anticorpos anti-LY75 ligam-se a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 1 e modificações de sequência conservadoras da mesma. O anticorpo pode adicionalmente incluir uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2 e modificações de sequência conservadoras.
[00115]Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-LY75 se ligam a LY75 humano e incluem uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e/ou 2, respectivamente, e modificações de sequência conservadoras das mesmas.
[00116]Em uma outra modalidade, os anticorpos anti-LY75 se ligam a LY75 humano e incluem uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 38 e/ou 39, respectivamente, e modificações de sequência conservadoras das mesmas.
[00117]Como usado nesse documento, o termo modificação de sequência conservadora refere-se, por exemplo, à substituição de um aminoácido por um aminoácido tendo características similares. É do conhecimento geral comum para um habilitado na técnica que tais substituições podem ser consideradas conservadoras. Outras modificações que podem ser consideradas modificações de sequência conservadoras incluem, por exemplo, glicosilação.
[00118]Opcionalmente, uma ou mais das SEQ ID NOs: 5-10 compreende(m) independentemente uma, duas, três, quatro ou cinco substituição(ões) conservadora(s) de aminoácidos; opcionalmente, uma ou mais das SEQ ID NOs: 5-10 compreende(m), independentemente, uma ou duas substituição(ões) conservadora(s) de aminoácidos.
[00119]De preferência, o termo “modificações de sequência conservadoras” pretende incluir modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Essas modificações conservadoras incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais de resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR de um anticorpo da invenção pode(m) ser substituído(s) por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida usando os ensaios funcionais descritos nesse documento.
[00120]Anticorpos isolados que incluem regiões variáveis das cadeias pesada e leve tendo pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou mais identidade de sequência com qualquer uma das sequências acima também estão incluídas na presente invenção. Faixas intermediárias aos valores citados acima, por exemplo, regiões variáveis das cadeias pesada e leve tendo pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95% ou 95-100% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências acima também se destinam a ser abrangido pela presente invenção. Em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos
99% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região estrutural da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à estrutura da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 compreendendo SEQ ID NOs: 16, 17 e 18. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma região estrutural da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à estrutura da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 2 compreendendo SEQ ID NOs: 19, 20 e 21.
[00121]Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 38 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO:
38. Em outra modalidade, o anticorpo anti-LY75 compreende uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 39 ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 39. A cadeia pesada pode compreender as sequências de SEQ ID NOs: 5-7 ou
1. A cadeia leve pode compreender as sequências de SEQ ID NOs: 8-10 ou 2.
[00122]Em uma modalidade, o anticorpo anti-LY75 é referido nesse documento como “anticorpo LY75_A1” compreendendo as seguintes CDRs, bem como variantes contendo um número limitado de variantes de aminoácidos: A1 SEQ ID NOs CDR1 variável da cadeia pesada 5 CDR2 variável da cadeia pesada 6 CDR3 variável da cadeia pesada 7 CDR1 variável da cadeia leve 8 CDR2 variável da cadeia leve 9 CDR3 variável da cadeia leve 10
[00123]São divulgadas aqui também cadeias pesadas e leves variáveis que compreendem os conjuntos de CDR da invenção, bem como cadeias pesadas e leves de comprimento total (por exemplo, compreendendo também regiões constantes). Como será apreciado por aqueles na técnica, os conjuntos de CDR do anticorpo anti-LY75 podem ser incorporados em regiões constantes de murino, humanizadas ou de humano (incluindo regiões estruturais). Por conseguinte, a presente divulgação fornece cadeias pesadas e leves variáveis e cadeias pesadas e leves de comprimento total que são pelo menos cerca de 90%-99% idênticas às SEQ IDs divulgadas nesse documento, com 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99%, todos encontrando uso na presente invenção.
[00124]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LY75 é aquele que compete pela ligação a LY75 humano com um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Os anticorpos que competem pela ligação podem ser identificados usando técnicas de rotina.
Tais técnicas incluem, por exemplo, um imunoensaio, que mostra a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo, isto é, um ensaio de ligação competitivo.
A ligação competitiva é determinada em um ensaio no qual a imunoglobulina em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como LY75. Numerosos tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (ver Kirkland et al., J.
Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio com rotulação direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de rotulação direta em fase sólida (ver Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de rotulação direta em fase sólida usando rotulação I-125 (ver Morel et al., Mol.
Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA biotina-avidina direto em fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); e RIA rotulado direto. (Moldenhauer et al., Scand.
J.
Immunol. 32:77 (1990)). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células contendo qualquer um desses, uma imunoglobulina de teste não rotulada e uma imunoglobulina de referência rotulada.
A inibição competitiva é medida determinando a quantidade de rótulo ligado à superfície sólida ou às células na presença da imunoglobulina de teste. Usualmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Usualmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% 75-80% 80-85% 85-90% 90-95% 95-99% ou mais.
[00125]Os anticorpos monoclonais podem ser caracterizados pela ligação a LY75 usando uma variedade de técnicas conhecidas. Geralmente, os anticorpos são inicialmente caracterizados por ELISA. Resumidamente, as placas de microtitulação podem ser revestidas com LY75 purificado em PBS, e depois bloqueadas com proteínas irrelevantes, tal como albumina de soro bovino (BSA) diluída em PBS. Diluições de plasma de camundongos imunizados com LY75 são adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween 20 e então incubadas com um reagente policlonal específico de Fc de IgG de cabra anti-humano conjugado com fosfatase alcalina por 1 hora a 37°C. Após a lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato ABTS e analisadas a DO de 405. De preferência, os camundongos que desenvolverem os títulos mais elevados serão usados para fusões.
[00126]Um ensaio ELISA como descrito acima pode ser usado para triar anticorpos e, assim, hibridomas que produzem anticorpos que mostram reatividade positiva com o imunogênio LY75. Os hibridomas que se ligam, de preferência com alta afinidade, a LY75 podem então ser subclonados e posteriormente caracterizados. Um clone de cada hibridoma,
que retém a reatividade das células precursoras (por ELISA), pode então ser escolhido para preparar um banco de células e para purificação de anticorpos.
[00127]Para purificar os anticorpos anti-LY75, os hibridomas selecionados podem ser cultivados em garrafas giratórias, frascos de centrifugação de dois litros ou outros sistemas de cultura. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia por afinidade com proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) para purificar a proteína. Após a troca do tampão para PBS, a concentração pode ser determinada por DO280 usando coeficiente de extinção de 1,43 ou de preferência por análise nefelométrica. IgG pode ser verificado por eletroforese em gel e por método específico do antígeno.
[00128]Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-LY75 selecionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). A ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda rotulada com estreptavidina. Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, ELISAs de isotipo podem ser realizados usando tecnologias reconhecidas na técnica. Por exemplo, poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 10 µg/ml de anti-Ig durante a noite a 4°C. Após o bloqueio com BSA a 5%, as placas são reagidas com 10 µg/ml de anticorpos monoclonais ou isotipos de controle purificados, em temperatura ambiente por duas horas. Os poços podem então reagir com IgGl ou outras sondas conjugadas específicas de isotipo. As placas são desenvolvidas e analisadas como descrito acima.
[00129]Para testar a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam LY75, pode ser usada citometria de fluxo. Resumidamente, as linhas celulares e/ou PBMCs de humano que expressam LY75 ligado à membrana (cultivadas sob condições de crescimento padrão) são misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo BSA 0,1% a 4°C por 1 hora. Após a lavagem, as células reagem com o anticorpo anti-IgG rotulado com fluoresceína sob as mesmas condições da coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por instrumento FACScan usando propriedades de dispersão lateral e luz para bloquear células individuais e a ligação dos anticorpos rotulados é determinada. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado (além ou em vez de) o ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência. Esse método permite a visualização de células individuais, mas pode ter sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.
[00130]IgGs anti-LY75 podem ser adicionalmente testados para reatividade com o antígeno LY75 por Western blotting. Resumidamente, os extratos celulares de células que expressam LY75 podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio. Após a eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueadas com soro de camundongo a 20% e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG pode ser detectada usando fosfatase alcalina anti-IgG e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St.
Louis, MO).
[00131]Métodos para analisar a afinidade de ligação, reatividade cruzada e cinética de ligação de vários anticorpos anti-LY75 incluem ensaios padrão conhecidos na técnica, por exemplo, análise de ressonância de plasmon de superfície Biacore (SPR) usando um instrumento e SPR Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia.
[00132]Em uma modalidade, o anticorpo se liga especificamente a LY75 de humano compreendendo SEQ ID NO: 15). De preferência, o anticorpo anti-LY75 liga-se a LY75 de humano com alta afinidade.
[00133]De preferência, o anticorpo anti-LY75 se liga a uma proteína LY75 com um KD de 5 x 10-8 M ou menos, se liga a uma proteína LY75 com um KD de 2 x 10-8 M ou menos, se liga a uma proteína LY75 com um KD de 5 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LY75 com um KD de 4 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LY75 com um KD de 3 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LY75 com um KD de 2 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LY75 com um KD de 1 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LY75 com um KD de 5 x 10-10 M ou menos, ou se liga a uma proteína LY75 com um KD de 1 x 10-10 M ou menos.
[00134]Em uma modalidade, os anticorpos anti-LY75 competem (por exemplo, competição cruzada) pela ligação a LY75 com os anticorpos anti-LY75 específicos descritos nesse documento (por exemplo, LY75_A1). Esses anticorpos competidores podem ser identificados com base na sua capacidade de inibir competitivamente a ligação a LY75 de um ou mais de mAbs em ensaios de ligação de LY75 padrão. Por exemplo, podem ser usados ensaios ELISA padrão nos quais uma proteína LY75 de humano recombinante é imobilizada na placa,
um dos anticorpos é rotulado com fluorescência e avalia-se a capacidade dos anticorpos não rotulados de competir pela ligação do anticorpo rotulado. Adicionalmente ou alternativamente, a análise BIAcore pode ser usada para avaliar a capacidade dos anticorpos de competir cruzadamente. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de um anticorpo anti-LY75 da invenção a LY75 de humano demonstra que o anticorpo de teste pode competir com o anticorpo pela ligação a LY75 de humano.
[00135]Em uma modalidade, o anticorpo competidor é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo no LY75 humano que os anticorpos monoclonais anti-LY75 específicos descritos nesse documento (por exemplo, LY75_A1). Técnicas de mapeamento de epítopo padrão, tal como cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional, podem ser usadas para determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo de referência (ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
[00136]Em uma modalidade, o anticorpo que compete pela ligação a LY75 e/ou se liga ao mesmo epítopo em LY75 humano é um anticorpo humano.
[00137]Uma vez que um único mAb anti-LY75 arquetípico que foi isolado tem as propriedades desejadas descritas nesse documento, outros mAbs com propriedades similares, por exemplo, tendo o mesmo epítopo podem ser gerados. Por exemplo, os camundongos podem ser imunizados com LY75 como descrito nesse documento, hibridomas produzidos e os mAbs resultantes triados quanto à capacidade de competir com o mAb arquetípico pela ligação a LY75. Os camundongos também podem ser imunizados com um fragmento menor de LY75 contendo o epítopo ao qual o mAb arquetípico se liga. O epítopo pode ser localizado por, por exemplo, triagem para ligação a uma série de peptídeos sobrepostos abrangendo LY75. Alternativamente, o método de Jespers et al., Biotechnology 12: 899, 1994 pode ser usado para guiar a seleção de mAbs tendo o mesmo epítopo e, portanto, propriedades similares ao mAb arquetípico. Usando a apresentação de fago, primeiro a cadeia pesada do anticorpo arquetípico é pareada com um repertório de cadeias leves (de preferência humanas) para selecionar um mAb de ligação a LY75 e, em seguida, a nova cadeia leve é pareada com um repertório de cadeias pesadas (de preferência humanas) para selecionar um mAb de ligação a LY75 (de preferência de humano) tendo o mesmo epítopo que o mAb arquetípico. Alternativamente, variantes do mAb arquetípico podem ser obtidas por mutagênese do cDNA que codifica as cadeias pesada e leve do anticorpo.
[00138]Para avaliar o nível de competição entre dois anticorpos, por exemplo, podem ser usados radioimunoensaios ou ensaios usando outros rótulos para os anticorpos. Por exemplo, um antígeno LY75 pode ser incubado com uma quantidade saturante de um primeiro anticorpo anti-LY75 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo conjugado a um composto rotulado (por exemplo, 3H, 125I, biotina ou rubídio) na presença da mesma quantidade de um segundo anticorpo anti- LY75 não rotulado. A quantidade de anticorpo rotulado que é ligado ao antígeno na presença do anticorpo de bloqueio não rotulado é então avaliada e comparada com a ligação na ausência do anticorpo de bloqueio não rotulado. A competição é determinada pela mudança percentual nos sinais de ligação na presença do anticorpo bloqueador não rotulado em comparação com a ausência do anticorpo bloqueador. Assim, se houver uma inibição de 50% da ligação do anticorpo rotulado na presença do anticorpo bloqueador em comparação com a ligação na ausência do anticorpo bloqueador, então há competição entre os dois anticorpos de 50%. Assim, a referência à competição entre um primeiro e segundo anticorpos de 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, como 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, significa que o primeiro anticorpo inibe a ligação do segundo anticorpo (ou vice-versa) ao antígeno em 50%, 60%, 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais (em comparação com a ligação do antígeno pelo segundo anticorpo na ausência do primeiro anticorpo). Assim, a inibição da ligação de um primeiro anticorpo a um antígeno por um segundo anticorpo de 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais indica que os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo.
[00139]A presente invenção abrange anticorpos variantes, às vezes referidos como “derivados de anticorpos” ou “análogos de anticorpos” também. Ou seja, há uma série de modificações que podem ser feitas nos anticorpos divulgados nesse documento, incluindo, mas não se limitando a, modificações de aminoácidos nas CDRs (maturação por afinidade), modificações de aminoácidos nas regiões estruturais, modificações de aminoácidos nas região Fc, variantes de glicosilação, modificações covalentes de outros tipos (por exemplo, para ligação de conjugados de fármacos, etc.).
[00140]Por “variante” nesse documento entende-se uma sequência polipeptídica que difere daquela de um polipeptídeo precursor em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Nesse caso, o polipeptídeo precursor é a cadeia pesada ou leve variável de comprimento total, por exemplo, como listado nas SEQ ID NOs: 1 ou 2, respectivamente, ou as regiões CDR ou as regiões estruturais das cadeias pesada e leve listadas nas SEQ ID NOs 5-10 e 16- 21 para LY75. As modificações de aminoácidos podem incluir substituições, inserções e deleções, as primeiras sendo preferidas em muitos casos. Será entendido que uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição conservadora ou não conservadora com substituições conservadoras sendo preferidas. Além disso, a referida substituição pode ser uma substituição com um aminoácido de ocorrência natural ou não natural.
[00141]Em geral, as variantes podem incluir qualquer número de modificações, desde que a função do anticorpo ainda esteja presente, como descrito nesse documento. Ou seja, LY75_A1, por exemplo, o anticorpo ainda deve se ligar especificamente a LY75 humano. Se as variantes de aminoácidos forem geradas com a região Fc, por exemplo, os anticorpos variantes devem manter as funções de ligação de receptor necessárias para a aplicação particular ou indicação do anticorpo.
[00142]As “variantes”, nesse caso, podem ser feitas nas sequências de CDR listadas, na estrutura ou nas regiões Fc do anticorpo.
[00143]No entanto, em geral, substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos são geralmente utilizadas,
pois muitas vezes o objetivo é alterar a função com um número mínimo de modificações. Em alguns casos, há de 1 a 5 modificações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções de aminoácidos individuais), com 1-2, 1-3 e 1-4 também encontrando uso em muitas modalidades. O número de modificações pode depender do tamanho da região que está sendo modificada; por exemplo, em geral, menos modificações são desejadas nas regiões CDR. Será entendido pela pessoa habilitada na técnica que mesmo dentro das regiões CDR, a localização da modificação pode alterar significativamente o efeito. Em uma modalidade, as modificações podem ser feitas em qualquer uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 das cadeias pesadas e/ou leves. Em uma outra modalidade, as modificações são feitas em qualquer uma de CDR1 ou CDR2 das cadeias pesadas e/ou leves. Em ainda outra modalidade, as modificações estão localizadas na CDR1 das cadeias pesadas e/ou leves.
[00144]Deve ser notado que o número de modificações de aminoácidos pode estar dentro de domínios funcionais: por exemplo, pode ser desejável ter de 1-5 modificações na região Fc de proteínas de tipo selvagem ou manipuladas, bem como de 1 a 5 modificações na região Fv, por exemplo. Uma sequência polipeptídica variante possuirá, de preferência, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as sequências precursoras (por exemplo, as regiões variáveis, as regiões constantes e/ou as sequências das cadeias pesada e leve e/ou as CDRs de LY75_A1). Deve ser notado que dependendo do tamanho da sequência, a identidade percentual dependerá do número de aminoácidos.
[00145]Por “substituição de aminoácido” ou
“substituição” nesse documento, entende-se a substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência polipeptídica precursora por outro aminoácido que pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou não natural. Por exemplo, a substituição S100A refere-se a um polipeptídeo variante no qual a serina na posição 100 é substituída por alanina. Por “inserção de aminoácido” ou “inserção”, como usado nesse documento, entende-se a adição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência polipeptídica precursora. Por “deleção de aminoácido” ou “deleção”, como usado nesse documento, entende-se a remoção de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência polipeptídica precursora.
[00146]Por “polipeptídeo precursor", “proteína precursora”, “polipeptídeo precursor” ou “proteína precursora”, como usado nesse documento, significa um polipeptídeo não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. Em geral, o polipeptídeo precursor nesse documento é LY75_A1. Consequentemente, por “anticorpo precursor”, como usado nesse documento, entende- se um anticorpo que é modificado para gerar um anticorpo variante.
[00147]Por “tipo selvagem” ou “WT” ou “nativo” significa nesse documento uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que é encontrada na natureza, incluindo variações alélicas. Um(a) proteína WT, polipeptídeo, anticorpo, imunoglobulina, IgG, etc. tem uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que não foi intencionalmente modificada.
[00148]Por “região Fc variante” nesse documento,
entende-se uma sequência Fc que difere daquela de uma sequência Fc de tipo selvagem em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. A variante Fc pode referir-se ao próprio polipeptídeo Fc, composições compreendendo o polipeptídeo variante Fc ou a sequência de aminoácidos.
[00149]Em algumas modalidades, uma ou mais modificação(ões) de aminoácidos é(são) feita(s) em uma ou mais das CDRs de LY75_A1. Em geral, apenas 1 ou 2 ou 3 aminoácido(s) é(são) substituído(s) em qualquer CDR isolada e, geralmente, não mais do que 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações são feitas dentro de um conjunto de 6 CDRs. No entanto, deve ser apreciado que qualquer combinação de nenhuma substituição, 1, 2 ou 3 substituição(ões) em qualquer CDR pode ser independentemente e opcionalmente combinada com qualquer outra substituição. Será evidente que as substituições podem ser feitas em qualquer uma das 6 CDRs. Em uma modalidade, as substituições são feitas em CDR1 das cadeias pesadas e/ou leves.
[00150]Em alguns casos, as modificações de aminoácidos nas CDRs são referidas como “maturação por afinidade”. Um anticorpo “maturado por afinidade” é aquele que tem uma ou mais de alterações em uma ou mais CDR(s) que resulta em uma melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com um anticorpo precursor que não possui essas alterações. Em alguns casos, embora raro, pode ser desejável diminuir a afinidade de um anticorpo para seu antígeno, mas isso geralmente não é preferido.
[00151]A maturação por afinidade pode ser feita para aumentar a afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno em pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150% ou mais, ou 1, 2, 3, 4 a 5 vezes em comparação com o anticorpo “precursor”. Os anticorpos maturados por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos. Ver, por exemplo, Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 que descreve a maturação por afinidade por embaralhamento de domínio de cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável (VL). A mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita em: Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, EUA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; e Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896, por exemplo.
[00152]Alternativamente, modificações de aminoácidos podem ser feitas em uma ou mais das CDRs dos anticorpos da invenção que são “silenciosas”, por exemplo, que não alteram significativamente a afinidade do anticorpo para o antígeno. Isso pode ser feito por uma série de razões, incluindo a otimização da expressão (como pode ser feito para os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da invenção).
[00153]Assim, incluídos na definição de CDRs e anticorpos divulgados nesse documento estão CDRs variantes e anticorpos; isto é, os anticorpos podem incluir modificações de aminoácidos em uma ou mais das CDRs de LY75_A1. Além disso, como delineado abaixo, as modificações de aminoácidos também podem ser feitas independentemente e opcionalmente em qualquer região fora das CDRs, incluindo as regiões estruturais e constantes, como descrito nesse documento.
[00154]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LY75 divulgados nesse documento são compostos por um domínio Fc variante. Como é conhecido na técnica, a região Fc de um anticorpo interage com uma série de receptores e ligandos de Fc, conferindo uma série de importantes capacidades funcionais referidas como funções efetoras. Esses receptores de Fc incluem, mas não estão limitados a, (em humanos) FcγRI (CD64) incluindo isoformas FcγRIa, FcγRIb e FcγRIc; FcγRII (CD32), incluindo isoformas FcγRIIa (incluindo alotipos H131 e R131), FcγRIIb (incluindo FcγRIIb-1 e FcγRIIb-2) e FcγRIIc; e FcγRIII (CD16), incluindo isoformas FcγRIIIa (incluindo alotipos V158 e F158, correlacionados à citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC)) e FcγRIIIb (incluindo alotipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRIIIb-NA2), FcRn (o receptor neonatal), C1q proteína do complemento envolvida na citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e FcRn (o receptor neonatal envolvido na meia-vida sérica). Modificações adequadas podem ser feitas em uma ou mais posição(ões), como é geralmente descrito, por exemplo, no Pedido de Patente US 11/841.654 e nas referências nele citadas, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, US NS 12/341.769, Patente US N° 6.737.056, Patente US N° 7.670.600, Patente US N° 6.086.875 todas expressamente incorporadas por referência em sua totalidade, e em particular para substituições de aminoácidos específicas que aumentam a ligação aos receptores de Fc.
[00155]Além das modificações descritas acima, outras modificações podem ser feitas. Por exemplo, as moléculas podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes dissulfeto ligando os domínios VH e VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14: 1239-1245, inteiramente incorporado por referência).
[00156]Além disso, as modificações nas cisteínas são particularmente úteis em aplicações de conjugado fármaco- anticorpo (ADC), descritas mais detalhadamente abaixo. Em algumas modalidades, a região constante dos anticorpos pode ser manipulada para conter uma ou mais de cisteínas que são particularmente “reativas a tiol”, de modo a permitir uma colocação mais específica e controlada da porção do fármaco. Ver, por exemplo, a Patente US N° 7.521.541, incorporada por referência na sua totalidade nesse documento.
[00157]Além disso, há uma variedade de modificações covalentes de anticorpos que podem ser feitas como descrito abaixo.
[00158]As modificações covalentes de anticorpos estão incluídas no escopo dessa invenção e são geralmente, mas nem sempre, feitas pós-tradução. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula pela reação de resíduos de aminoácidos específicos do anticorpo com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N- ou C-terminais.
[00159]Resíduos de cisteinila mais comumente reagem com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para resultar em derivados de carboximetila ou carboxiamidometila. Os resíduos de cisteinila também podem ser derivados por reação com bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5- imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N- alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila, dissulfeto de metila 2-piridila, p-cloromercuribenzoato, 2- cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol e semelhantes.
[00160]Os resíduos de histidila são derivados por reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5-7,0 porque esse agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidila. O brometo de para-bromofenacila também é útil; a reação é de preferência realizada em cacodilato de sódio 0,1 M a pH 6,0.
[00161]Os resíduos de lisinila e amino-terminais reagem com anidridos de ácido succínico ou outros anidridos carboxílicos. A derivação com esses agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos lisinila. Outros reagentes adequados para derivar resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres, tais como, picolinimidato de metila; fosfato de piridoxal; piridoxal; boridrato de cloro; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisoureia; 2,4- pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.
[00162]Os resíduos de arginila são modificados por reação com um ou vários reagente(s) convencional(ais), entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina. A derivação de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao alto pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina, bem como com o grupo epsilon-amino da arginina.
[00163]A modificação específica de resíduos tirosil pode ser feita, com particular interesse na introdução de rótulos espectrais em resíduos tirosil por reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais comumente, N- acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente. Resíduos de tirosil são iodados usando 125I ou 131I para preparar proteínas rotuladas para uso em radioimunoensaio, o método cloramina T descrito acima sendo adequado.
[00164]Os grupos laterais de carboxila (aspartil ou glutamil) são modificados seletivamente pela reação com carbodiimidas (R'—N=C=N--R'), em que R e R’ são grupos alquila opcionalmente diferentes, tal como 1-ciclo-hexil-3-(2- morfolinil-4-etil)carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4- dimetilpentil)carbodiimida. Além disso, os resíduos aspartil e glutamil são convertidos em resíduos asparaginil e glutaminil por reação com íons amônio.
[00165]A derivação com agentes bifuncionais é útil para reticular anticorpos a uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para uso em uma variedade de métodos, além dos métodos descritos abaixo. Os agentes de reticulação comumente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)- 2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N- hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4- azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de disuccinimidila, tais como 3,3’- ditiobis(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivação, tal como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato,
produzem intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, matrizes reativas insolúveis em água, tais como carboidratos ativados por brometo de cinomolgusogênio e os substratos reativos descritos na Patente U.S. Nos 3.969.287; 3.691.016;
4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440, todos inteiramente incorporados por referência, são empregados para a imobilização de proteínas.
[00166]Os resíduos glutaminil e asparaginil são frequentemente desamidados nos resíduos glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente. Alternativamente, esses resíduos são desamidados sob condições ligeiramente ácidas. Qualquer forma desses resíduos cai dentro do escopo dessa invenção.
[00167]Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de lisina, arginina e cadeias laterais de histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 [1983], inteiramente incorporado por referência), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C- terminal.
[00168]Além disso, como será apreciado por aqueles na técnica, rótulos (incluindo composições fluorescentes, enzimáticas, magnéticas, radioativas, etc. podem ser todas adicionadas aos anticorpos (bem como as outras composições da invenção).
[00169]Outro tipo de modificação covalente são as alterações na glicosilação. Em algumas modalidades, os anticorpos divulgados nesse documento podem ser total ou parcialmente aglicosilados, por exemplo, afucosilados.
[00170]Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a vários polímeros não proteicos, incluindo, mas não se limitando a, vários polióis, tais como, polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, da maneira apresentada em, por exemplo, Catálogo PEG 2005-2006 da Nektar Therapeutics (disponível no site da Nektar) Patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337, todos inteiramente incorporadas por referência. Além disso, como é conhecido na técnica, as substituições de aminoácidos podem ser feitas em várias posições dentro do anticorpo para facilitar a adição de polímeros, tal como PEG. Ver, por exemplo, a Publicação U.S. N° 2005/0114037A1, inteiramente incorporada por referência.
[00171]Em modalidades adicionais, os anticorpos podem compreender um rótulo. Por “rotulado” significa nesse documento que um composto tem pelo menos um elemento, isótopo ou composto químico ligado para permitir a detecção do composto. Em geral, os rótulos se enquadram em três classes: a) rótulos isotópicos, que podem ser radioativos ou isótopos pesados; b) magnético, elétrico, térmico; e c) corantes coloridos ou luminescentes; embora os rótulos incluam enzimas e partículas, tais como partículas magnéticas também. Os rótulos preferidos incluem, mas não estão limitados a, complexos de lantanídeos fluorescentes (incluindo aqueles de Európio e Térbio) e rótulos fluorescentes incluindo, mas não se limitando a, pontos quânticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina,
eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarelo lúcifer, Azul Cascade, Vermelha Texas, os corantes Alexa, os corantes Cy e outros descritos na 6ª Edição do Manual de Sondas Moleculares de Richard P. Haugland, expressamente incorporados nesse documento por referência. Conjugados Anticorpo-Fármaco
[00172]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LY75 divulgados nesse documento são conjugados com fármacos para formar conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs). Em geral, os ADCs são usados em aplicações oncológicas, onde o uso de conjugados anticorpo-fármaco para a dispensação local de agentes citotóxicos ou citostáticos permite a dispensação direcionada da fração do fármaco a tumores, o que pode permitir maior eficácia, menor toxicidade, etc. Uma visão geral dessa tecnologia é fornecida em Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21: 5-13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14(3):154 (2008) e Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13: 235-244 (2009), todos os quais são incorporados nesse documento por referência em sua totalidade.
[00173]Assim, a invenção fornece combinações farmacêuticas compreendendo, inter alia, anticorpos anti- LY75 conjugados com fármacos. Geralmente, a conjugação é feita por ligação covalente ao anticorpo, como descrito abaixo, e geralmente depende de um ligante, muitas vezes uma ligação peptídica (que, conforme descrito abaixo, pode ser concebida para ser sensível à clivagem por proteases no sítio alvo ou não). Além disso, como descrito acima, a ligação da unidade ligante-fármaco (LU-D) pode ser feita por afixação a cisteínas dentro do anticorpo. Como será apreciado por aqueles na técnica, o número de porções de fármaco por anticorpo pode mudar, dependendo das condições da reação, e pode variar de 1:1 a 10:1 de fármaco:anticorpo. Como será apreciado por aqueles na técnica, o número real é uma média.
[00174]Assim, os anticorpos anti-LY75 podem ser conjugados com fármacos. Como descrito abaixo, o fármaco do ADC pode ser qualquer número de agentes, incluindo, mas não se limitando a agentes citotóxicos, tais como, agentes quimioterápicos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de bactérias, fungos, plantas ou de origem animal ou fragmentos dos mesmos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). Em outras modalidades, a invenção fornece adicionalmente métodos de uso de ADCs.
[00175]Os fármacos para uso na presente invenção incluem fármacos citotóxicos, particularmente aqueles que são usados para a terapia do câncer. Tais fármacos incluem, em geral, agentes danificadores do DNA, antimetabólitos, produtos naturais e seus análogos. Classes exemplificativas de agentes citotóxicos incluem os inibidores de enzimas, tais como, inibidores de di-hidrofolato redutase e inibidores de timidilato sintase, intercaladores de DNA, clivadores de DNA, inibidores de topoisomerase, a família de antraciclina de fármacos, os medicamentos vinca, as mitomicinas, as bleomicinas, os nucleosídeos citotóxicos, a família de fármacos de pteridina, diinenos, as podofilotoxinas, dolastatinas, maitansinoides, indutores de diferenciação e taxóis.
[00176]Os membros dessas classes incluem, por exemplo, taxol, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-
fluorouracila, 6-mercaptopurina, citosina arabinosídeo, melfalano, leurosina, leurosideina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, mitomicina A, caminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina e derivados de podofilotoxina, tais como, etoposídeo ou fosfato de etoposídeo, vinblastina, vincristina, vindesina, taxanos incluindo taxol, ácido taxotere retinoico, ácido butírico, N8-acetil espermidina, camptotecina, caliqueamicina, esperamicina, eno-diinas, duocarmicina A, duocarmicina SA, caliqueamicina, camptotecina, hemiasterlinas, maitansinoide (incluindo DM1), monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF) e maitansinoides (DM4) e seus análogos.
[00177]As toxinas podem ser usadas como conjugados de anticorpo-toxina e incluem toxinas bacterianas, tal como toxina da difteria, toxinas de plantas, tal como ricina, toxinas de moléculas pequenas, tal como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), hemiasterlinas (WO2004/026293; Zask et al., (2004) J. Med. Chem, 47: 4774-4786). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem ligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição da topoisomerase.
[00178]Conjugados de um anticorpo anti-LY75 e uma ou mais de toxinas de moléculas pequenas, tais como,
maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, tricoteceno, caliqueamicina, duocarmicinas, pirrolbenzadiazepinas e CC1065, e os derivados dessas toxinas que têm atividade de toxina, também podem ser usados.
[00179]De preferência, o anticorpo anti-LY75 é conjugado com DM1 ou DM4, mais de preferência com DM4. Os compostos de maitansina adequados para uso como frações de fármaco maitansinoide são bem conhecidos na técnica, e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos, produzidos usando técnicas de engenharia genética (ver Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973), ou maitansinol e análogos de maitansinol preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos. Como descrito abaixo, os fármacos podem ser modificados pela incorporação de um grupo funcionalmente ativo, tal como um grupo tiol ou amina, para conjugação ao anticorpo.
[00180]Porções de fármaco maitansinoide exemplificativas incluem aquelas com um anel aromático modificado, tais como: C-19-decloro (Pat. U.S. N° 4.256.746) (preparado por redução de hidreto de alumínio e lítio de ansamitocina P2); C-20- hidroxi (ou C-20-desmetil) +/-C-19-decloro (Patentes U.S. Nos 4.361.650 e 4.307.016) (preparado por desmetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração usando LAH); e C- 20-desmetoxi, C-20-aciloxi (--OCOR), +/-decloro (Pat. U.S. N° 4.294.757) (preparado por acilação usando cloretos de acila) e aqueles tendo modificações em outras posições.
[00181]Porções de fármaco maitansinoide exemplificativas também incluem aquelas com modificações, tais como: C-9-SH (Pat. U.S. N° 4.424.219) (preparada pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5); C-14-
alcoximetil(desmetoxi/CH2OR) (Pat. U.S. N° 4.331.598); C-14- hidroximetil ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAc) (Pat. U.S. N°
4.450.254) (preparado de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (Pat. U.S. N° 4.364.866) (preparado pela conversão de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (Patentes U.S. Nos 4.313.946 e 4.315.929) (isolado de Trewia nudlflora); C- 18-N-desmetil (Pat. U.S. Nos 4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces); e 4,5-desoxi (Pat. U.S. N° 4.371.533) (preparado pela redução tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
[00182]De uso particular são DM1 (divulgado na Patente US N° 5.208.020, incorporado por referência) e DM4 (divulgado na Patente US N° 7.276.497, incorporado por referência). Ver também uma série de derivados de maitansinoides e métodos adicionais em 5.416.064, WO/01/24763, 7.303.749, 7.601.354, US NS 12/631.508, WO02/098883, 6.441.163, 7.368.565, WO02/16368 e WO04/1033272, todos os quais são expressamente incorporados por referência na sua totalidade.
[00183]ADCs contendo maitansinoides, métodos de prepará- los e seu uso terapêutico são divulgados, por exemplo, na Patente US Nos 5.208.020; 5.416.064; 6,441,163 e Patente Europeia EP 0 425 235 B1, cujas divulgações são expressamente incorporadas nesse documento por referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 93: 8618-8623 (1996) descreveram ADCs compreendendo um maitansinoide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 direcionado contra câncer colorretal humano. O conjugado foi considerado altamente citotóxico para células de câncer de cólon em cultura e mostrou atividade antitumoral em um ensaio de crescimento tumoral in vivo.
[00184]Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) descrevem ADCs em que um maitansinoide foi conjugado por meio de um ligante dissulfeto ao anticorpo de murino A7 que se liga a um antígeno em linhas de células de câncer de cólon de humano ou a outro anticorpo monoclonal de murino TA .1 que se liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansonoide foi testada in vitro na linha de células de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3x105 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de fármaco atingiu um grau de citotoxicidade similar ao do fármaco maitansinoide livre, que poderia ser aumentada aumentando o número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinoide apresentou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.
[00185]Para composições que compreendem uma pluralidade de anticorpos, a carga de fármaco é representada por p, o número médio de moléculas de fármaco por anticorpo. A carga de fármacos pode variar de 1 a 20 fármacos (D) por Anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo na preparação de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tal como espectroscopia de massa, ensaio ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de Conjugados Anticorpo-Fármaco em termos de p também pode ser determinada.
[00186]Em alguns casos, a separação, a purificação e a caracterização de conjugados de fármaco-anticorpo homogêneos, onde p é um certo valor de conjugados de fármaco- anticorpo com outras cargas de fármaco, podem ser alcançadas por meio de HPLC de fase reversa ou eletroforese. Em modalidades exemplificativas, p é 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou uma fração do mesmo.
[00187]A geração de compostos de conjugado de anticorpo- fármaco pode ser realizada por qualquer técnica conhecida do técnico habilitado. Resumidamente, os compostos de conjugado de anticorpo-fármaco podem incluir um anticorpo anti-LY75 como a unidade de anticorpo, um fármaco e, opcionalmente, um ligante que se junta ao fármaco e ao agente de ligação.
[00188]Uma série de reações diferentes estão disponíveis para a ligação covalente de fármacos e/ou ligantes a agentes de ligação. Isso pode ser realizado por reação dos resíduos de aminoácidos do agente de ligação, por exemplo, molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina de lisina, os grupos de ácido carboxílico livre de ácido glutâmico e aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e as várias porções dos aminoácidos aromáticos. Um método não específico comumente usado de afixação covalente é a reação de carbodiimida para ligar um grupo carboxi (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carboxi) do anticorpo. Adicionalmente, agentes bifuncionais, tais como dialdeídos ou imidoésteres, têm sido usados para ligar o grupo amino de um composto a grupos amino de uma molécula de anticorpo.
[00189]Também disponível para afixação de fármacos a agentes de ligação está a reação de base de Schiff. Esse método envolve a oxidação de periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidróxi, formando assim um aldeído que é então reagido com o agente de ligação. A afixação ocorre através da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Os isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para afixar covalentemente fármacos a agentes de ligação. Outras técnicas são conhecidas do técnico habilitado e estão dentro do escopo da presente invenção.
[00190]Em algumas modalidades, um intermediário, que é o precursor do ligante, é reagido com o fármaco sob condições apropriadas. Em outras modalidades, os grupos reativos são usados no fármaco e/ou no intermediário. O produto da reação entre o fármaco e o intermediário, ou o fármaco derivado, é subsequentemente reagido com um anticorpo anti-LY75 da invenção sob condições apropriadas.
[00191]Será entendido que modificações químicas também podem ser feitas no composto desejado a fim de tornar as reações desse composto mais convenientes para fins de preparação de conjugados da invenção. Por exemplo, um grupo funcional, por exemplo, amina, hidroxila ou sulfidrila, podem ser anexados ao fármaco em uma posição que tem um efeito mínimo ou aceitável sobre a atividade ou outras propriedades do fármaco.
[00192]Tipicamente, os compostos de conjugado anticorpo- fármaco compreendem uma unidade de ligação entre a unidade de fármaco e a unidade de anticorpo. Em algumas modalidades, o ligante é clivável sob condições intracelulares ou extracelulares, de modo que a clivagem do ligante libera a unidade de fármaco do anticorpo no ambiente apropriado. Por exemplo, tumores sólidos que secretam certas proteases podem servir como o alvo do ligante clivável; em outras modalidades, são as proteases intracelulares que são utilizadas. Em ainda outras modalidades, a unidade ligante não é clivável e o fármaco é liberado, por exemplo, por degradação de anticorpos em lisossomas.
[00193]Em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossomo ou caveolas). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante peptidil que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo, mas não se limitando a, uma protease lisossomal ou endossomal. Em algumas modalidades, o ligante de peptidil tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento ou mais.
[00194]Os agentes de clivagem podem incluir, sem limitação, catepsinas B e D e plasmina, todos os quais são conhecidos por hidrolisar derivados de fármacos dipeptídicos, resultando na liberação de fármaco ativo dentro das células alvo (ver, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). Os ligantes peptidil podem ser cliváveis por enzimas que estão presentes nas células que expressam LY75. Por exemplo, um ligante de peptidil que é clivável pela protease dependente de tiol catepsina-B, que é altamente expressado em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um ligante Phe-Leu ou Gly-Phe- Leu-Gly (SEQ ID NO: 46)). Outros exemplos de tais ligantes são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 6.214.345, incorporada nesse documento por referência em sua totalidade e para todos os fins.
[00195]Em algumas modalidades, o ligante peptidil clivável por uma protease intracelular é um ligante Val-Cit ou um ligante Phe-Lys (ver, por exemplo, a Patente US
6.214.345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o ligante val-cit).
[00196]Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Tipicamente, o ligante sensível ao pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, um ligante instável em ácido que é hidrolisável no lisossoma (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou semelhantes) pode ser usado. (Ver, por exemplo, Patentes US Nos 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661.) Esses ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tais como aqueles no sangue, mas são instáveis abaixo de pH 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma. Em certas modalidades, o ligante hidrolisável é um ligante tioéter (tal como, por exemplo, um tioéter afixado ao agente terapêutico por meio de uma ligação de acil-hidrazona (ver, por exemplo, Patente US 5.622.929).
[00197]Em ainda outras modalidades, o ligante é clivável sob condições de redução (por exemplo, um ligante dissulfeto). Uma variedade de ligantes dissulfeto são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N-succinimidil-5- acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2- piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil- alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)tolueno), SPDB e SMPT. (Ver, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (CW Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver também Patente US N° 4.880.935).
[00198]Em outras modalidades, o ligante é um ligante malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387- 93), um ligante maleimidobenzoil (Lau et al., 1995, Bioorg- Med-Chem. 3(10):1299-1304), ou um análogo 3’-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
[00199]Em ainda outras modalidades, a unidade de ligação não é clivável e o fármaco é liberado por degradação do anticorpo. (Ver a Publicação U.S. N° 2005/0238649 incorporada nesse documento por referência em sua totalidade e para todos as finalidades).
[00200]Em muitas modalidades, o ligante é autoimolativo. Tal como usado nesse documento, o termo “espaçador autoimolativo” refere-se a uma porção química bifuncional que é capaz de ligar covalentemente duas porções químicas espaçadas em uma molécula tripartida estável. Ele se separará espontaneamente da segunda porção química se sua ligação à primeira porção for clivada. Ver, por exemplo, WO 2007/059404A2, WO06/110476A2, WO05/112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 e WO02/083180, que são direcionados a conjugados de fármaco- substrato clivável, em que o fármaco e o substrato clivável são opcionalmente ligados através de um ligante autoimolativo e que são todos expressamente incorporados por referência.
[00201]Frequentemente, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Como usado nesse documento, “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular”, no contexto de um ligante, significa que não mais do que cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 3% ou não mais do que cerca de 1% dos ligantes, em uma amostra de composto de conjugado de anticorpo-fármaco, são clivados quando o composto de conjugado de anticorpo-fármaco se apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma).
[00202]Se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, incubando com plasma o composto de conjugado de anticorpo- fármaco por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e em seguida, quantificando a quantidade de fármaco livre presente no plasma.
[00203]Em outras modalidades não mutuamente exclusivas, o ligante promove a internalização celular. Em certas modalidades, o ligante promove a internalização celular quando conjugado com o agente terapêutico (isto é, no meio da porção ligante-agente terapêutico do composto conjugado de anticorpo-fármaco, como descrito nesse documento). Em ainda outras modalidades, o ligante promove a internalização celular quando conjugado com o composto de auristatina e os anticorpos anti-LY75 da invenção.
[00204]Uma variedade de ligantes exemplificativos que podem ser usados com a(o)s presentes composições e métodos é descrita em WO 2004/010957, Publicação US N° 2006/0074008, Publicação US N° 20050238649 e Publicação US N° 2006/0024317 (cada um dos quais é incorporado por referência nesse documento em sua totalidade e para todos as finalidades). De preferência, o ligante é SPDB (N-succinimidil-3-(2- piridilditio)butirato).
[00205]A carga do fármaco é representada por p e é o número médio de frações da fármaco por anticorpo em uma molécula. A carga de fármacos (“p”) pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais porções (D) por anticorpo, embora frequentemente o número médio seja uma fração ou um decimal. Geralmente, a carga de fármaco de 1 a 4 é frequentemente útil, e de 1 a 2 também é útil. ADCs da invenção incluem coleções de anticorpos conjugados com uma faixa de porções de fármacos, de 1 a 20, por exemplo, 1-15, 1-10, 2-9, 3-8, 4-7, 5-6. O número médio de porções de fármaco por anticorpo em preparações de ADC de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massa e ensaio ELISA.
[00206]A distribuição quantitativa de ADC em termos de p também pode ser determinada. Em alguns casos, a separação, a purificação e a caracterização de ADC homogêneo, em que p é um determinado valor de ADC com outras cargas de fármaco, podem ser obtidas por meio de eletroforese.
[00207]Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Por exemplo, onde a afixação é um tiol de cisteína, como nas modalidades exemplificativas acima, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser anexado. Em certas modalidades, maior carga de fármaco, por exemplo, p>5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo- fármaco. Em certas modalidades, a carga de fármaco para um ADC da invenção varia de 1 a cerca de 8; de cerca de 2 a cerca de 6; de cerca de 3 a cerca de 5; de cerca de 3 a cerca de 4; de cerca de 3,1 a cerca de 3,9; de cerca de 3,2 a cerca de 3,8; de cerca de 3,2 a cerca de 3,7; de cerca de 3,2 a cerca de 3,6; de cerca de 3,3 a cerca de 3,8; ou de cerca de 3,3 a cerca de 3,7. Na verdade, foi demonstrado que para certos ADCs, a razão ideal de porções de fármaco por anticorpo pode ser menor que 8 e pode ser cerca de 2 a cerca de 5. Ver US 2005/0238649 A1 (nesse documento incorporado por referência em sua totalidade).
[00208]Em certas modalidades, menos do que o máximo teórico de frações de fármaco é conjugado a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o intermediário de fármaco-ligante ou reagente ligante, como discutido abaixo. Geralmente, os anticorpos não contêm muitos grupos tiol de cisteína livres e reativos que podem estar ligados a uma porção de fármaco; de fato, a maioria dos resíduos de tiol de cisteína em anticorpos existem como pontes dissulfeto. Em certas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições de redução parcial ou total, para gerar grupos tiol de cisteína reativos. Em certas modalidades, um anticorpo é submetido a condições desnaturantes para revelar grupos nucleofílicos reativos, tal como lisina ou cisteína.
[00209]A carga (razão fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes maneiras, por exemplo: (i) limitando o excesso molar de intermediário de fármaco- ligante ou reagente de ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitando o tempo de reação de conjugação ou temperatura, (iii) condições redutivas parciais ou limitantes para modificação de tiol de cisteína, (iv) manipulação por técnicas recombinantes da sequência de aminoácidos do anticorpo de modo que o número e a posição dos resíduos de cisteína sejam modificados para controle do número e/ou da posição de afixações ligante-fármaco (tal como thioMab ou thioFab preparado como divulgado nesse documento e em WO2006/034488 (incorporado nesse documento por referência na sua totalidade)).
[00210]Deve ser entendido que, onde mais de um grupo nucleofílico reage com um intermediário de fármaco-ligante ou reagente de ligante seguido por um reagente de fração de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de uma ou mais de porções de fármaco afixadas a um anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por um ensaio de anticorpos ELISA duplo, que é específico para o anticorpo e específico para o fármaco. As moléculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica.
[00211]Em algumas modalidades, um ADC homogêneo com um único valor de carga pode ser isolado da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia. Métodos de Determinação do Efeito Citotóxico de ADCs
[00212]Os métodos para determinar se um conjugado de fármaco ou anticorpo-fármaco exerce um efeito citostático e/ou citotóxico em uma célula são conhecidos. Geralmente, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado de anticorpo-fármaco pode ser medida por: exposição de células de mamífero que expressam uma proteína alvo do conjugado de anticorpo-fármaco em um meio de cultura de células; cultivar as células por um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias; e medir a viabilidade celular. Os ensaios in vitro baseados em células podem ser usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade e indução de apoptose (ativação de caspase) do conjugado de anticorpo-fármaco.
[00213]Para determinar se um conjugado de anticorpo- fármaco exerce um efeito citostático, um ensaio de incorporação de timidina pode ser usado. Por exemplo, as células cancerígenas que expressam um antígeno alvo a uma densidade de 5.000 células/poço de uma placa de 96 poços podem ser cultivadas por um período de 72 horas e expostas a 0,5 μCi de 3H-timidina durante as 8 horas finais do período de 72 período de horas. A incorporação de 3H-timidina nas células da cultura é medida na presença e na ausência do conjugado de anticorpo-fármaco.
[00214]Para determinar a citotoxicidade, a necrose ou apoptose (morte celular programada) pode ser medida. A necrose é tipicamente acompanhada por aumento da permeabilidade da membrana plasmática; inchaço da célula e ruptura da membrana plasmática. A apoptose é tipicamente caracterizada por formação de bolhas na membrana, condensação do citoplasma e ativação de endonucleases endógenas. A determinação de qualquer um desses efeitos nas células cancerígenas indica que um conjugado de anticorpo- fármaco é útil no tratamento de cânceres.
[00215]A viabilidade celular pode ser medida determinando em uma célula a absorção de um corante, tal como vermelho neutro, azul de tripano ou azul ALAMAR™ (ver, por exemplo, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3: 473- 476). Em tal ensaio, as células são incubadas em meio contendo o corante, as células são lavadas e o corante restante, refletindo a absorção celular do corante, é medido espectrofotometricamente. O corante de ligação de proteína sulforodamina B (SRB) também pode ser usado para medir a citotoxicidade (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-12).
[00216]Alternativamente, um sal de tetrazólio, tal como MTT, é usado em um ensaio colorimétrico quantitativo para a sobrevivência e a proliferação de células de mamíferos por meio da detecção de células vivas, mas não mortas (ver, por exemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
[00217]A apoptose pode ser quantificada medindo, por exemplo, a fragmentação do DNA. Métodos fotométricos comerciais para a determinação quantitativa in vitro da fragmentação de DNA estão disponíveis. Exemplos de tais ensaios, incluindo TUNEL (que detecta a incorporação de nucleotídeos rotulados em DNA fragmentado) e ensaios baseados em ELISA, são descritos em Biochemica, 1999, n° 2, págs. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
[00218]A apoptose também pode ser determinada medindo as mudanças morfológicas em uma célula. Por exemplo, tal como acontece com a necrose, a perda de integridade da membrana plasmática pode ser determinada medindo a absorção de certas corantes (por exemplo, um corante fluorescente, tal como, por exemplo, laranja de acridina ou brometo de etídio). Um método para medir o número de células apoptóticas foi descrito por Duke e Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. Eds., 1992, págs. 3.17.1-3.17.16). As células também podem ser rotuladas com um corante de DNA (por exemplo, laranja de acridina, brometo de etídio ou iodeto de propídio) e as células observadas quanto à condensação da cromatina e marginação ao longo da membrana nuclear interna. Outras alterações morfológicas que podem ser medidas para determinar a apoptose incluem, por exemplo, condensação citoplasmática, aumento da formação de bolhas da membrana e encolhimento celular.
[00219]A presença de células apoptóticas pode ser medida nos compartimentos fixos e “flutuantes” das culturas. Por exemplo, ambos os compartimentos podem ser coletados removendo o sobrenadante, tripsinizando as células anexadas, combinando as preparações após uma etapa de lavagem por centrifugação (por exemplo, 10 minutos a 2000 rpm) e detectando a apoptose (por exemplo, medindo a fragmentação de DNA). (Ver, por exemplo, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16).
[00220]In vivo, o efeito de uma composição terapêutica do anticorpo anti-LY75 da invenção pode ser avaliado em um modelo animal adequado. Por exemplo, modelos de câncer xenogênico podem ser usados, em que explantes de câncer ou tecidos de xenoenxerto passados são introduzidos em animais imunocomprometidos, tais como camundongos nus ou SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). A eficácia pode ser medida usando ensaios que medem a inibição da formação do tumor, regressão do tumor ou metástase e semelhantes.
[00221]As composições terapêuticas usadas na prática dos métodos anteriores podem ser formuladas em composições farmacêuticas compreendendo um carreador adequado para o método de dispensação desejado. Os carreadores adequados incluem qualquer material que quando combinado com a composição terapêutica retém a função antitumoral da composição terapêutica e é geralmente não reativo com o sistema imunológico do paciente. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, qualquer um de uma série de carreadores farmacêuticos padrão, tais como soluções salinas tamponadas com fosfato estéreis, água bacteriostática e semelhantes (ver, geralmente, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a Edição, A. Osal., Ed., 1980). Métodos para produção de anticorpos
[00222]Os anticorpos divulgados nesse documento podem ser produzidos por qualquer método adequado. Esses métodos incluem a cultura de uma célula hospedeira contendo ácido(s) nucleico(s) isolado(s) que codifica(m) os anticorpos. Como será apreciado por aqueles na técnica, isso pode ser feito de várias maneiras, dependendo da natureza do anticorpo. No caso em que os anticorpos são anticorpos tradicionais de comprimento total, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve sob condições tais que um anticorpo seja produzido e possa ser isolado.
[00223]As cadeias pesadas e leves variáveis de LY75_A1 são divulgadas nesse documento (sequências de proteínas e de ácidos nucleicos); como será apreciado na técnica, elas podem ser facilmente aumentadas para produzir cadeias pesadas e leves de comprimento total. Isto é, tendo fornecido os fragmentos de DNA que codificam os segmentos VH e VK como descrito nesse documento, esses fragmentos de DNA podem ser ainda manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab ou a um gene scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VK ou VH é operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo “operativamente ligado”, como usado nesse contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam em-fase.
[00224]O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento completo ligando operacionalmente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes da região constante da cadeia pesada de murino são conhecidas na técnica [ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, US Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242] e fragmentos de DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais de preferência é uma região constante de IgG1 ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 da cadeia pesada.
[00225]O DNA isolado que codifica a região VL/VK pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de cadeia leve Fab) ligando operacionalmente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve, CL. As sequências de genes da região constante da cadeia leve de murino são conhecidas na técnica [ver, por exemplo, Kabat,
E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, US Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242] e fragmentos de DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. Em modalidades preferidas, a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.
[00226]Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL/VK são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que as sequências VH e VL/VK podem ser expressadas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL/VK e VH unidas pelo ligante flexível [ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554].
[00227]São fornecidos ácidos nucleicos que codificam os anticorpos divulgados nesse documento. Esses polinucleotídeos codificam as regiões variáveis e constantes de cada uma das cadeias pesada e leve, embora outras combinações também sejam contempladas de acordo com as composições descritas nesse documento.
[00228]Os polinucleotídeos podem estar na forma de RNA ou DNA. Polinucleotídeos na forma de DNA, cDNA, DNA genômico, análogos de ácido nucleico e DNA sintético também são utilizáveis. O DNA pode ser de fita dupla ou de fita simples e, se for de fita simples, pode ser a fita codificadora (sentido) ou a fita não codificante (antissentido). A sequência de codificação que codifica o polipeptídeo pode ser idêntica à sequência de codificação fornecida nesse documento ou pode ser uma sequência de codificação diferente, cuja sequência, como um resultado da redundância ou degenerescência do código genético, codifica os mesmos polipeptídeos que o DNA fornecido nesse documento.
[00229]Em algumas modalidades, o(s) ácido(s) nucleico(s) que codifica(m) os anticorpos divulgados nesse documento é(são) incorporado(s) em vetores de expressão, que podem ser extracromossômicos ou concebidos para se integrar no genoma da célula hospedeira na qual são introduzidos. Os vetores de expressão podem conter qualquer número de sequências regulatórias adequadas (incluindo, mas não se limitando a, sequências de controle transcricional e translacional, promotores, sítios de ligação ribossômica, intensificadores, origens de replicação, etc.) ou outros componentes (genes de seleção, etc.), todos os quais estão operacionalmente ligados como é bem conhecido na técnica. Em alguns casos, dois ácidos nucleicos são usados e cada um colocado em um vetor de expressão diferente (por exemplo, cadeia pesada em um primeiro vetor de expressão, cadeia leve em um segundo vetor de expressão) ou, alternativamente, eles podem ser colocados no mesmo vetor de expressão. Será apreciado por aqueles habilitados na técnica que o projeto do(s) vetor(es) de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, pode(m) depender de fatores como a escolha da célula hospedeira, o nível de expressão da proteína desejada, etc.
[00230]Em geral, os ácidos nucleicos e/ou a expressão pode(m) ser introduzido(s) em uma célula hospedeira adequada para criar uma célula hospedeira recombinante usando qualquer método apropriado para a célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), de modo que a(s) molécula(s) de ácido nucleico é (são) operacionalmente ligada(s) a um ou mais de elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em uma construção criada por processos na célula, integrado no genoma da célula hospedeira). A célula hospedeira recombinante resultante pode ser mantida sob condições adequadas para expressão (por exemplo, na presença de um indutor, em um animal não humano adequado, em meio de cultura adequado suplementado com sais apropriados, fatores de crescimento, antibióticos, suplementos nutricionais, etc.), em que o(s) polipeptídeo(s) codificado(s) é(são) produzido(s). Em alguns casos, as cadeias pesadas são produzidas em uma célula e a cadeia leve em outra.
[00231]As linhas de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são conhecidas na técnica e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA incluindo, mas não se limitando a, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HEK 293, células NSO, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular de humano (por exemplo, Hep G2) e várias outras linhas de células. As células de não mamíferos, incluindo, mas não se limitando a, bactérias, leveduras, insetos e plantas também podem ser usadas para expressar anticorpos recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgênicos, tais como vacas ou galinhas.
[00232]Os métodos gerais para biologia molecular, expressão, purificação e triagem de anticorpos são bem conhecidos, por exemplo, ver as Patentes US Nos 4.816.567,
4.816.397, 6.331.415 e 7.923.221, bem como Antibody Engineering, editado por Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 e 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5: 683-689; Maynard e Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2: 339-76; e Morrison, S. (1985) Science 229:
1202.
[00233]O componente (B) da combinação farmacêutica é Venetoclax ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Venetoclax é um fármaco oral de pequena molécula que bloqueia a proteína antiapoptótica do linfoma 2 de células B (Bcl-2), levando à morte celular programada. É indicado para leucemia linfocítica crônica (LLC) em pacientes com uma anormalidade cromossômica específica (deleção 17p). Em 2015, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos concedeu a Designação de Terapia Inovadora para Venetoclax para indivíduos com CLL que tiveram recaída ou foram resistentes ao tratamento anterior e têm a mutação genética de deleção em 17p.
[00234]A fórmula estrutural de Venetoclax é dada abaixo: seu nome IUPAC é 4-(4-{[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetil- 1-ciclo-hexen-1-il]metil}-1-piperazinil)-N-({3-nitro-4- [(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-
(1H-pirrol[2,3-b]piridin-5-iloxi)benzamida. Venetoclax é vendido sob os nomes comerciais Venclexta® nos Estados Unidos e Venclyxto® na Europa. Composições Farmacêuticas
[00235]A combinação farmacêutica da invenção está na forma de uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial. De forma similar, nos métodos da invenção, os componentes (A) e (B) da combinação farmacêutica podem ser administrados a um paciente simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00236]O termo “preparação combinada” inclui combinações fixas e combinações não fixas.
[00237]O termo “combinação fixa” significa que os ingredientes ativos (por exemplo, componentes (A) e (B)) estão na forma de uma única entidade ou dosagem. Em outras palavras, os ingredientes ativos estão presentes em uma única composição ou formulação.
[00238]O termo “combinação não fixa” significa que os ingredientes ativos (por exemplo, componentes (A) e (B)) estão presentes em diferentes entidades ou dosagens (por exemplo, como composições ou formulações separadas), por exemplo, como um kit de partes. Os componentes independentes (A) e (B) (em suas composições ou formulações desejadas) podem então ser administrados separadamente ou sequencialmente, no mesmo momento ou em pontos de tempo diferentes.
[00239]Quando a administração é sequencial, o retardo na administração do segundo componente não deve ser de forma a perder o benefício do efeito decorrente do uso da combinação. Portanto, em uma modalidade, o tratamento sequencial envolve a administração de cada componente da combinação em um período de 11 dias. Em outra modalidade, esse período é de 10 dias. Em outra modalidade, esse período é de 9 dias. Em outra modalidade, esse período é de 8 dias. Em outra modalidade, esse período é de 7 dias. Em outra modalidade, esse período é de 6 dias. Em outra modalidade, esse período é de 5 dias. Em outra modalidade, esse período é de 4 dias. Em outra modalidade, esse período é de 3 dias. Em outra modalidade, esse período é de 2 dias. Em outra modalidade, esse período é de 24 horas. Em outra modalidade, esse período é de 12 horas.
[00240]Os componentes (A) e (B) podem ser administrados em qualquer ordem, por exemplo, o componente (A) primeiro e depois o componente (B); ou o componente (B) primeiro e depois o componente (A).
[00241]A razão das quantidades totais do componente (A) para o componente (B) a serem administrados na preparação combinada pode ser variada, por exemplo, para fazer face às necessidades de uma subpopulação de pacientes a serem tratados ou às necessidades de um único paciente, cujas necessidades podem ser diferentes devido à(ao) idade, sexo, peso corporal, etc. dos doentes.
[00242]Os componentes (A) e (B), estejam presentes em uma única composição ou em composições separadas, podem ser formulados independentemente com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. As combinações farmacêuticas da invenção também podem incluir pelo menos um outro agente antitumoral ou um agente anti-inflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia combinada são descritos em mais detalhes abaixo na seção sobre os usos dos anticorpos divulgados nesse documento.
[00243]Como usado nesse documento, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o carreador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido com um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
[00244]Os componentes (A) e/ou (B) podem estar na forma de um ou mais de sais farmaceuticamente aceitáveis. Um “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto precursor e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados [ver, por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19]. Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como, ácidos clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fósforo e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos substituídos por fenila, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino- terrosos, tais como, sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como, N,N’-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
[00245]Uma combinação farmacêutica da invenção ou parte da mesma também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como, ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, tais como, ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.
[00246]Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas combinações farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como, azeite e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.
[00247]Essas combinações ou partes das mesmas também podem conter adjuvantes, tais como, conservantes, agentes umectantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada por procedimentos de esterilização, supra, e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como, açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00248]Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00249]As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e misturas dos mesmos adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como, manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00250]As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por microfiltração por esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.
[00251]A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de 100 porcento, essa quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de 99 porcento do ingrediente ativo, de preferência de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, mais de preferência de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento de ingrediente ativo em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00252]Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma combinação sinérgica, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitária para facilitar a administração e a uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária como usada nesse documento refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas por e diretamente dependentes (a) (d)as características únicas do composto ativo e (d)o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.
[00253]Para a administração do anticorpo anti-LY75, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, por exemplo, 0,001 a 50 mg/kg, 0,005 a 20 mg/kg, 0,01 a 10 mg/kg e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,05 mg/kg de peso corporal, 0,1 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg de peso corporal, 0,5 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 2 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 4 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal, 6 mg/kg de peso corporal, 7 mg/kg de peso corporal, 8 mg/kg de peso corporal, 9 mg/kg de peso corporal peso, 10 mg/kg de peso corporal, 12 mg/kg de peso corporal, 15 mg/kg de peso corporal, 20 mg/kg de peso corporal, 25 mg/kg de peso corporal, 30 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 0,1-20 mg/kg, 0,5-15 mg/kg, 1-10 mg/kg, 2-8 mg/kg, 3-7 mg/kg, 4-6 mg/kg. Um regime de tratamento de exemplo envolve a administração uma vez por dia, uma vez a cada 2 dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Os regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-LY75 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por administração intravenosa, com o anticorpo sendo dado usando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas durante seis doses, depois a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
[00254]Em algumas modalidades, a dosagem do anticorpo anti-LY75 (por exemplo, LY75_DM4) é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de 10 a 1500 nm ou 18 a 1200 nM (por exemplo, cerca de 18,75; 37,5; 75; 150; 300; 600 ou 1200 nM). De preferência, o anticorpo anti-LY75 (por exemplo, LY75_DM4) é ajustado para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de 15 nM a 50 nM, 50 a 100 nM, 100-500 nM ou 500-1200 nm.
[00255]Em algumas modalidades, a dosagem de Venetoclax (ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo) é ajustada para atingir uma concentração plasmática de 0,5 a 500 nm ou 0,64 a 400 nM (por exemplo, cerca de 0,64; 3,2; 16; 80; 400 ou 2000 nM). De preferência, Venetoclax (ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo) é ajustado para atingir uma concentração plasmática de 0,5 nM a 20 nM, 20 a 50 nM, 50-100 nM ou 100-500 nm. Pode ser administrado por via oral. Em algumas modalidades, a dose de Venetoclax (ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo) é de cerca de 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg ou 500 mg. Venetoclax ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser administrado com um ou mais de ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina e predisona ou prednisolona (ou seja, terapia com CHOP).
[00256]De preferência, a combinação de componentes (A) e (B) é uma combinação sinérgica. A pessoa habilitada na técnica entenderá que uma combinação sinérgica é aquela em que o efeito da combinação é maior do que a soma dos efeitos dos componentes individuais. O sinergismo pode ser quantificado usando o índice de combinação de Chou-Talalay (IC) (ver “Evaluation of combination chemotherapy: integration of nonlinear regression, curve shift, isobologram, and combination index analyses”, Zhao L, et al. Clin Cancer Res. (2004) 1 de dez;10(23):7994-8004; e “Computerized quantitation of synergism and antagonism of taxol, topotecan, and cisplatin against human teratocarcinoma cell growth: a rational approach to clinical protocol design”, Chou TC, Motzer RJ, Tong Y, Bosl GJ., J. Natl. Cancer Inst. (1994) 19 de out; 86(20):1517-24). Esse método de índice de combinação (CI) é baseado na equação de efeito de múltiplos fármacos derivada do princípio de efeito mediano da lei de ação em massa. Isso fornece uma definição quantitativa para forte sinergismo (IC <0,3), sinergismo (IC = 0,3-0,9), efeito aditivo (IC = 0,9-1,1) ou antagonismo/nenhum benefício (IC> 1,1) e fornece o algoritmo para software de computador para simulação automatizada de combinações de fármacos. Ele leva em consideração a potência (o valor D(m)) e a forma da curva dose-efeito (o valor m) de cada fármaco isoladamente e sua combinação. O índice de combinação Chou-Talalay (CI) pode ser estimado usando o pacote Synergy R (ver “Preclinical versus Clinical Drugs Combination Studies”, Chou TC. Leuk. Lymphoma. (2008);49(11):2059-2080, e referências no mesmo, todos os quais são especificamente incorporados nesse documento por referência). O CI da combinação pode ser testado em uma linha celular adequada, por exemplo, em linhas celulares ABC-DLBLC (tais como TMD8 ou HBL1), por exemplo, sob as condições usadas no Exemplo 26.
[00257]De preferência, a combinação farmacêutica da invenção é uma combinação sinérgica em que o índice de combinação Chou-Talalay (CI) é menor que 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4, 0,3 ou 0,2. De preferência, o CI é 0,1-0,5; 0,1- 0,3 ou 0,1-0,2.
[00258]Em particular, é fornecido um método de tratamento de câncer em um paciente compreendendo a administração simultânea, sequencial ou separada a um paciente em necessidade do mesmo de quantidades sinérgicas terapeuticamente eficazes dos componentes (A) e (B) de uma combinação farmacêutica da invenção. Também é fornecida uma combinação farmacêutica da invenção para uso no tratamento do câncer, em que as quantidades sinérgicas dos componentes (A) e (B) são administradas simultaneamente, separadamente ou sequencialmente ao paciente para o tratamento do câncer. De preferência, as quantidades dos componentes (A) e (B) são administradas ao paciente a fim de fornecer as concentrações plasmáticas divulgadas acima.
[00259]Também é fornecido o uso de quantidades sinérgicas dos componentes (A) e (B) da combinação farmacêutica da invenção na fabricação de uma combinação farmacêutica para uso simultâneo, separado ou sequencial para o tratamento do câncer. Também é fornecida uma combinação farmacêutica sinérgica da invenção para uso em terapia ou para uso como medicamento.
[00260]Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais anti-LY75 com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro das faixas indicadas. O anticorpo é usualmente administrado em várias ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, diários, duas vezes por semana, semanais, mensais, a cada três meses, a cada seis meses ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares, como indicado pela medição dos níveis sanguíneos de anticorpos para o antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 μg/ml, 5-750 μg/ml, 10-600 μg/ml, 15-500 μg/ml, 20-400 μg/ml e em alguns métodos cerca de 25-300 μg/ml.
[00261]Alternativamente, os anticorpos anti-LY75 podem ser administrados como formulações de liberação sustentada, caso em que a administração menos frequente é necessária. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam recebendo tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, às vezes é necessária uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e de preferência até que o paciente apresente melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, o paciente pode receber um regime profilático.
[00262]Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas combinações farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um(a) determinado paciente, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou o(a) éster, sal ou amida do mesmo, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outras fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a(o) idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
[00263]Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” de um anticorpo anti-LY75 resulta preferencialmente em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e na duração dos períodos sem sintomas da doença, ou uma prevenção de deficiência ou incapacidade devido à aflição da doença. Por exemplo, para o tratamento dos tumores mediados por LY75, uma “dosagem terapeuticamente eficaz” de preferência, inibe o crescimento celular ou tumoral em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, mais de preferência em pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% e ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, em relação a indivíduos não tratados. A capacidade de um composto para inibir o crescimento do tumor pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto para inibir o crescimento celular, tal inibição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos do profissional habilitado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou, de outra forma, melhorar os sintomas em um indivíduo. Um habilitado comum na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo e a composição particular ou via de administração selecionada.
[00264]Uma combinação farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por meio de uma ou mais de vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Os componentes (A) e (B) podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Como será apreciado pelo técnico habilitado, a via e/ou o modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. As vias de administração preferidas para os anticorpos da invenção incluem as vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras vias parentéricas, por exemplo, por injeção ou infusão. A expressão “administração parenteral”, como usada nesse documento, significa modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal.
[00265]Alternativamente, o anticorpo anti-LY75 pode ser administrado por uma via não parenteral, como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
[00266]De preferência, Venetoclax ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral, por exemplo, em um comprimido.
[00267]Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores que irão proteger o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de dispensação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como, etileno-acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos dos habilitados na técnica [ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y].
[00268]As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma forma de realização preferida, o componente (A) e/ou (B) pode ser administrado com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos divulgados nas Patentes US Nos 5.399.163;
5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou
4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente US N° 4.487.603, que divulga uma bomba de microinfusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; Patente US N°
4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente US N°
4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para dispensar medicação a uma taxa de infusão precisa; Patente US N° 4.447.224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para dispensação contínua de fármacos; Patente US N° 4.439.196, que divulga um sistema de dispersação osmótica de fármaco tendo compartimentos de múltiplas câmaras; e Patente US N° 4.475.196, que divulga um sistema de dispersação osmótica de fármacos. Essas patentes são incorporadas nesse documento por referência. Muitos outros implantes, sistemas de dispersação e módulos são conhecidos dos habilitados na técnica.
[00269]Em certas modalidades, os anticorpos anti-LY75 podem ser formulados para garantir a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, ver, por exemplo, Patentes US 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais de porções que são transportadas seletivamente para células ou órgãos específicos, intensificando assim a distribuição direcionada do fármaco [ver, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685]. Porções de direcionamento exemplificativas incluem folato ou biotina (ver, por exemplo, Patente US 5.416.016); manosídeos [Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comum. 153:1038]; anticorpos [P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]; receptor de proteína A do tensoativo [Briscoe et al. (1995) Am. J.
Physiol. 1233:134]; p120 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090]; ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Usos e Métodos
[00270]Como usado nesse documento, o termo “indivíduo” pretende incluir animais humanos e não humanos. Os animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como, primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis. Os indivíduos preferidos incluem pacientes humanos tendo distúrbios mediados pela atividade de LY75.
[00271]Em algumas modalidades preferidas, o indivíduo é um indivíduo humano que tem uma deleção em 17p, por exemplo, um que é característico da leucemia linfocítica crônica.
[00272]Os métodos são particularmente adequados para o tratamento de pacientes humanos tendo um distúrbio associado à expressão aberrante de LY75. Dada a expressão de LY75 em células tumorais, as combinações e os métodos da presente invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais que expressam LY75 ou na fabricação de um medicamento para o tratamento de tal distúrbio incluindo, por exemplo, leucemia, incluindo leucemia linfocítica crônica e leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin, incluindo DLBCL, Linfoma de células B, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma de células T/células B rico em histiócitos, linfoma de Burkitt, Linfoma Linfoplasmocítico, Linfoma
Linfocítico Pequeno, Linfoma de Zona Marginal, Linfoma de Células T, Linfoma de Células T Periféricas, Linfoma Anaplásico de Grandes Células e Linfoma de Células T Angioimunoblástico. Foi demonstrado que LY75 é internalizado na ligação do anticorpo como ilustrado nos Exemplos 5 e 7 abaixo, permitindo assim que os anticorpos anti-LY75 sejam usados em qualquer mecanismo de ação de carga útil, por exemplo, uma abordagem ADC, radioimunoconjugado ou abordagem ADEPT.
[00273]Os anticorpos anti-LY75, geralmente administrados como ADCs, podem ser usados para inibir ou bloquear a função LY75 que, por sua vez, pode estar ligada à prevenção ou melhora de certos sintomas da doença, implicando assim o LY75 como um mediador da doença. Isso pode ser conseguido contactando uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-LY75 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e LY75. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e o LY75 são detectados e comparados na amostra e no controle.
[00274]As vias adequadas de administração das composições de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e imunoconjugados) in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as composições de anticorpos podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). As dosagens adequadas das moléculas usadas dependerão da idade e do peso do indivíduo e da concentração e/ou formulação da composição do anticorpo.
[00275]Como descrito anteriormente, os anticorpos anti- LY75 podem ser coadministrados com um ou outros agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor.
O anticorpo pode ser ligado ao agente (tal como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separadamente do agente.
No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou simultaneamente com o agente ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, radiação.
Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como, doxorrubicina (adriamicina), cisplatina, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucila e ciclofosfamida hidroxiureia que, por si só, são eficazes apenas em níveis tóxicos ou subtóxicos para um paciente.
A cisplatina é administrada por via intravenosa na dose de 100 mg/kg uma vez a cada quatro semanas e a adriamicina é administrada por via intravenosa na dose de 60-75 mg/ml uma vez a cada 21 dias.
Outros agentes adequados para coadministração com os anticorpos da invenção incluem outros agentes usados para o tratamento de cânceres, por exemplo, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário ou câncer de pulmão, tal como Avastin®, 5FU e gencitabina.
A coadministração dos anticorpos anti-LY75 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, da presente invenção com agentes quimioterapêuticos, fornece dois agentes anticâncer que operam por meio de diferentes mecanismos que produzem um efeito citotóxico para células tumorais humanas.
Essa coadministração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma alteração na antigenicidade das células tumorais que as tornaria não reativas com o anticorpo.
[00276]As combinações farmacêuticas da invenção também podem ser administradas juntamente com soro e/ou complemento. Essas composições podem ser vantajosas quando o complemento está localizado próximo aos anticorpos. Alternativamente, os anticorpos e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.
[00277]Também estão dentro do escopo da presente invenção kits que compreendem os componentes (A) e (B), juntamente com as instruções de uso. O kit pode conter ainda um ou mais reagentes adicionais, como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos adicionais (por exemplo, um anticorpo tendo uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno LY75 distinto do primeiro anticorpo).
[00278]Consequentemente, os pacientes tratados com combinações farmacêuticas da invenção podem ser administrados adicionalmente (antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo divulgado nesse documento) com outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos.
[00279]Em outras modalidades, o indivíduo pode ser tratado adicionalmente com um agente que modula, por exemplo, intensifica ou inibe a expressão ou atividade dos receptores Fcγ ou Fcγ, por exemplo, tratando o indivíduo com uma citocina. Citocinas preferidas para administração durante o tratamento com a molécula multiespecífica incluem fator de estimulação de colônia de granulócitos (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF),
interferon-γ (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF).
[00280]Todas as referências citadas nesse relatório descritivo, incluindo, sem limitação, todos o(a)s artigos, publicações, patentes, pedidos de patentes, apresentações, textos, relatórios, manuscritos, brochuras, livros, publicações na Internet, artigos de jornal, periódicos, fichas técnicas de produtos e semelhantes, incorporados por referência a esse relatório descritivo em sua totalidade. A discussão das referências nesse documento tem a intenção de meramente resumir as afirmações feitas por seus autores e nenhuma admissão é feita de que qualquer referência constitui técnica anterior e os requerentes se reservam o direito de contestar a exatidão e a pertinência das referências citadas.
[00281]Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será prontamente aparente para aqueles habilitados na técnica à luz dos ensinamentos dessa invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações dependentes.
[00282]A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como uma limitação adicional. Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais humanos contra o antígeno LY75
[00283]Seguindo procedimentos padrão, os camundongos (IgG1 xenocamundongo) foram imunizados com células CHO transfectadas com LY75 de comprimento total.
[00284]A especificidade dos anticorpos criados contra o LY75 foi testada por citometria de fluxo em células HEK293 transfectadas com LY75 e subsequentemente em células HT29 que expressam LY75. Para testar a capacidade dos anticorpos de se ligarem à proteína LY75 da superfície celular, os anticorpos foram incubados com as células que expressam LY75. As células foram lavadas em tampão FACS (DPBS, FBS a 2%), centrifugadas e recolocadas em suspensão em 100 µl do anticorpo LY75 primário diluído (também diluído em tampão FACS). O complexo anticorpo-linha celular foi incubado em gelo por 60 min e depois lavado duas vezes com tampão FACS como descrito acima. O sedimento célula-anticorpo foi recolocado em suspensão em 100 µl do anticorpo secundário diluído (também diluído em tampão FACS) e incubado em gelo por 60 min em gelo. O sedimento foi lavado como antes e recolocado em suspensão em 200 µl de tampão FACS. As amostras foram carregadas no citômetro de fluxo BD FACScanto II e os dados analisados usando o software BD FACSdiva (resultados não mostrados). Exemplo 2: Caracterização Estrutural de Anticorpos Monoclonais para LY75
[00285]As sequências de cDNA que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal LY75_A1 foram obtidas usando técnicas de PCR padrão e foram sequenciadas usando técnicas de sequenciamento de DNA padrão.
[00286]As sequências de anticorpos podem ser mutagenizadas para reverter para resíduos da linha germinal em um ou mais resíduo(s).
[00287]As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de LY75_A1 são mostradas nas SEQ ID NOs: 3 e 1, respectivamente. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de LY75_A1 são mostradas na SEQ ID NO: 4 e 2, respectivamente.
[00288]As sequências de aminoácidos e nucleotídeos da cadeia pesada de LY75_A1 são mostradas em SEQ ID NOs: 38 e 202, respectivamente. As sequências de aminoácidos e nucleotídeos da cadeia leve de LY75_A1 são mostradas em SEQ ID NOs: 39 e 203, respectivamente.
[00289]A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada LY75_A1 com as sequências da cadeia pesada da imunoglobulina da linha germinal humana conhecidas demonstrou que a cadeia pesada LY75_A1 utiliza um segmento VH da linha germinal humana VH 3-15 e um segmento JH da linha germinal humana JH JH4. Uma análise adicional da sequência VH LY75_A1 usando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada como mostrado nas SEQ ID NOS: 5, 6 e 7, respectivamente. Os alinhamentos das sequências VH de CDR1, CDR2 e CDR3 LY75_A1 com a linha germinal VH 3-15 e a sequência JH JH4 de linha germinal são mostrados na Figura 1.
[00290]A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve LY75_A1 com as sequências da cadeia leve da imunoglobulina da linha germinal de humano conhecidas demonstrou que a cadeia leve LY75_A1 utiliza um segmento VK da linha germinal de humano VK O12 e um segmento JK da linha germinal de humano JK JK4. Uma análise adicional da sequência VK de LY75_A1 usando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve como mostrado nas SEQ ID NOS: 8, 9 e 10, respectivamente. Os alinhamentos das sequências VK de CDR1,
CDR2 e CDR3 de LY75_A1 com as sequências da linha germinal VK O12 e da linha germinal JK JK4 são mostrados na Figura 2. Exemplo 3: Imuno-histoquímica usando Anticorpo Monoclonal para LY75
[00291]Usando os anticorpos monoclonais humanos específicos para LY75, a imunohistoquímica foi realizada em sedimentos de células FFPE HT-29 e A549, linfoma não-Hodgkin FFPE e matrizes de câncer de pâncreas e tumores recém congelados de linfoma/leucemia, câncer de ovário, câncer de pâncreas e seções de câncer de mama e uma matriz de tecido normal. Materiais e métodos Materiais
[00292]Xilenos (X5P-1gal) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00293]Histoprep 100% etanol (HC-800-1GAL) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00294]Tampão de citrato 10x para recuperação de epítopo induzida por calor (AP9003125) da Thermo Scientific, MA, EUA.
[00295]Thermo Scientific * Pierce * Supressor de Peroxidase (35000) da Thermo Scientific, MA, EUA.
[00296]Bloco de proteína sem soro (X0909) de Dako, CA, EUA.
[00297]Anticorpo secundário: Fab-FITC de IgG anti-humano de cabra conjugado (109-097-003) da Jackson Immunoresearch, PA, EUA.
[00298]IgG Humano Chrome pure, molécula inteira (09-000- 003) da Jackson Immunoresearch, PA, EUA.
[00299]Anticorpo terciário: anti-FITC de camundongo (ab10257) da Abcam, MA, EUA.
[00300]Controle de isotipo de IgG humano purificado (1- 001A) da R&D Systems, MN, EUA.
[00301]Tween-20 (BP337-100) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00302]Acetona (BP2403-4) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00303]Polímero conjugado Dual Link EnVision + HRP, Camundongo e Coelho (K4063) de Dako, CA, EUA.
[00304]Kit de 2 soluções DAB (882014) da Invitrogen, NY, EUA.
[00305]Hematoxilina de Harris (23-245-677) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00306]Meio de montagem Faramount (S302580) de Dako, CA, EUA.
[00307]As seções e matrizes de tecido foram adquiridas da US Biomax Inc., MD, USA ou Origene, MD, EUA. Preparação de lâminas de FFPE: Desparafinização e Reidratação
[00308]As lâminas de FFPE foram desparafinizadas em xileno (2 x 3 minutos), em seguida, reidratadas através de 1:1 de xileno:100% de etanol (1 x 3 minutos), 100% de etanol (2 x 3 minutos), 95% de etanol (1 x 3 minutos), Etanol a 70% (1 x 3 minutos), etanol a 50% (1 x 3 minutos) e água da torneira (1 x 3 minutos). Preparação de lâminas de FFPE: Recuperação de Antígeno (Micro-ondas).
[00309]O antígeno LY75 foi recuperado usando calor de micro-ondas, de alta potência até ebulição e depois baixa potência por 10 minutos em 50 mL de tampão citrato 1x em um frasco de Coplin. As lâminas foram então deixadas esfriar até a temperatura ambiente por mais 15 minutos e, em seguida,
lavadas em água da torneira, 3 minutos. Círculos foram desenhados em torno de cada seção de tecido/TMA com uma caneta de barreira hidrofóbica e as lâminas foram então lavadas 3 vezes em PBS, 3 minutos cada lavagem. Preparação de lâminas de FF
[00310]As lâminas foram removidas do armazenamento a - 80°C e deixadas secar em temperatura ambiente na capela por 20-30 minutos. As lâminas foram fixadas por 10 min em acetona gelada a -20°C e, em seguida, deixadas secar por 20 min na capela em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas e reidratadas em PBS, 3 lavagens de 3 min cada. As seções foram delineadas com uma caneta de barreira hidrofóbica. Preparação de complexos de anticorpos
[00311]O anticorpo anti-LY75 primário foi diluído em bloco de proteína sem soro (SFPB) para obter uma solução com uma concentração 20 vezes maior do que a concentração final desejada (20 µg/ml para 1 µg/ml final). O anticorpo secundário, fragmento de ligação de antígeno de cabra anti- imunoglobulina G de humano (IgG) (Fab), foi preparado de forma similar em SFPB para criar uma solução de concentração igual.
[00312]Volumes iguais de anticorpos primários e secundários foram combinados em um tubo rotulado, suavemente misturados e incubados por 3 minutos em temperatura ambiente, resultando em uma concentração de anticorpo primário 10 vezes maior do que a concentração final desejada (10 µg/ml para 1 µg/ml final). Essa mistura foi diluída 1:5 com SFPB, suavemente misturada e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente, resultando em uma concentração de anticorpo primário duas vezes maior que a concentração final desejada
(2 µg/ml para 1 µg/ml final).
[00313]Para produzir os complexos de coloração finais, uma solução de 1% (10 µg/µL) de IgG humana foi preparada em SFPB e igual volume adicionado à mistura de anticorpo primário/secundário. Essa combinação foi suavemente misturada e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos, diluindo pela metade da concentração de anticorpo primário da mistura de anticorpo primário/secundário e resultando na concentração de anticorpo primário final desejada (1 µg/ml). Imunocoloração
[00314]Enquanto isso, a atividade da peroxidase do tecido endógeno foi bloqueada pela incubação de tecidos com supressor de peroxidase por 5-10 minutos em TA em uma câmara umidificada. As lâminas foram então lavadas em PBS 3 x 3 minutos em cada lavagem. Os tecidos foram incubados em SFPB por 30 minutos em temperatura ambiente em câmara umidificada. Os complexos de coloração final foram aplicados a cada seção de tecido e/ou microarranjo, e as lâminas foram incubadas por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. As lâminas foram então lavadas uma vez em PBS e uma vez em PBST (PBS + 0,125% Tween-20), 3 minutos cada lavagem. O anticorpo terciário anti-FITC de camundongo, foi aplicado na concentração de 2 µg/ml por 30 min, temperatura ambiente, em câmara umidificada. As seções foram então lavadas uma vez em PBS e uma vez em PBST, 3 min cada lavagem. O polímero conjugado Dual Link EnVision + anti-camundongo/HRP de coelho foi então aplicado aos tecidos e as lâminas foram incubadas por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. As lâminas foram então lavadas uma vez em PBS, uma vez em PBST, 3 minutos cada lavagem. Os tecidos foram incubados em solução de DAB preparada de acordo com as instruções do fabricante em temperatura ambiente por 10 min. As lâminas foram então lavadas uma vez em água corrente por 2 minutos e uma vez em PBS por 3 minutos. As lâminas foram contrastadas com corante Hematoxilina por 30 segundos em temperatura ambiente e lavadas em água corrente. As lâminas foram secas em temperatura ambiente por 30 minutos e as lamínulas foram então montadas nas lâminas usando meios de montagem Faramount. Resultados
[00315]LY75_A1 mostrou positividade em amostras de câncer de mama FFPE Triplo Negativo, onde 77% das seções apresentaram coloração positiva e 55% exibiram coloração robusta (+++).
[00316]A coloração para LY75 em tecidos normais FF foi geralmente ausente a baixa. O epitélio ductal da mama, glândula salivar e pâncreas exibiu coloração marcada de baixa a moderada e o baço com coloração positiva baixa. Portanto, os anticorpos direcionados para LY75 podem ter utilidade como terapêutica e diagnóstico em alguns dos cânceres testados e possivelmente outros tipos de câncer que mostram a expressão de LY75. Exemplo 4: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 em células HT-29 Materiais
[00317]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00318]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00319]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher
Scientific, PA, EUA.
[00320]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00321]As células foram dissociadas usando cellstripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tal como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00322]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00323]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente durante 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[00324]Os resultados apresentados na Figura 3a mostram uma subpopulação de anticorpos, que se sabe se ligar a LY75, que pode induzir a morte celular de células HT-29. Isso sugere que, embora os anticorpos possam se ligar a LY75, apenas alguns apresentam eficácia quando conjugados com DM1. Os anticorpos foram então escolhidos da subpopulação para posterior análise da atividade citotóxica. Exemplo 5: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 em células de câncer colorretal Materiais
[00325]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00326]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00327]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00328]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00329]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tais como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00330]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00331]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente durante 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00332]A Figura 3b mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células HT-29. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpo e outros anticorpos anti-LY75 conjugados a uma toxina (selecionada do Exemplo 1). Exemplo 6: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 e conjugados com DM4 em Linhas Celulares de Linfoma Materiais
[00333]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00334]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific,
PA, EUA.
[00335]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00336]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00337]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tal como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00338]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00339]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente durante 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00340]A Figura 3c mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células RAJI. A Figura 3d mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células Namalwa. A Figura 3e mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti- LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células Karpas 299. Estes resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos e outros anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 (selecionados a partir do Exemplo 1). Exemplo 7: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 e conjugados com DM4 em linhas celulares de câncer de pâncreas Materiais
[00341]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00342]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00343]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00344]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00345]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tais como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00346]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00347]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente durante 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00348]A Figura 3f mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células BxPC3. A Figura 3g mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células HupT4. A Figura 3h mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células HPAFFII. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos e outros anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 (selecionados a partir do Exemplo 1). Exemplo 8: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 em linhas celulares de leucemia linfocítica crônica Materiais
[00349]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00350]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00351]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00352]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00353]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00354]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação.
A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00355]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00356]A Figura 3i mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células EHEB. A Figura 3j mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células Mec-1. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos e outros anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 (selecionados a partir do Exemplo 1). Exemplo 9: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 em linhas celulares de leucemia monocítica aguda Materiais
[00357]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00358]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00359]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher
Scientific, PA, EUA.
[00360]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00361]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tais como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00362]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00363]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente durante 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax.
Resultados
[00364]A Figura 3k mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células AML-193. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos e outros anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 (selecionados do Exemplo 1). Exemplo 10: Eficácia de anticorpos monoclonais anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 em Linhas Celulares de Câncer de Mama Materiais
[00365]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00366]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00367]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00368]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00369]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tais como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00370]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00371]A placa foi removida da incubadora e incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00372]A Figura 3l mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células HCC 70 (ER negativo, PR negativo e Her2 negativo). A Figura 3m mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células HCC 1806 (ER negativo, PR negativo e Her2 negativo). A Figura 3n mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células MDA-MB-468. Esses resultados demonstram um aumento da atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos. Exemplo 11: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 conjugados com DM1 e conjugados com DM4 em Linhas Celulares de Câncer de Bexiga
Materiais
[00373]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00374]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00375]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00376]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00377]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00378]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00379]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células).
100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00380]A Figura 3o mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células RT4. A Figura 3p mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células 5637. A Figura 3q mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti- LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células SW780. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos. Exemplo 12: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Linhas Celulares de Câncer de Cabeça e Pescoço Materiais
[00381]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00382]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00383]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00384]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00385]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00386]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00387]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00388]A Figura 3r mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células SCC-9. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos. Exemplo 13: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75
Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Linhas Celulares de Câncer Esofágico Materiais
[00389]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00390]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00391]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00392]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00393]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00394]Uma suspensão de células de 50 µL/poço foi adicionada a poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00395]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00396]A Figura 3s mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células OE 19. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos. Exemplo 14: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Linhas Celulares de Câncer De Ovário Materiais
[00397]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00398]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00399]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00400]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00401]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tais como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00402]Adicionou-se uma suspensão de células de 50 µl/poço aos poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00403]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µL/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µL de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorreu uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00404]A Figura 3t mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células OVCAR-3. A Figura 3u mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células SK-OV-3. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos. Exemplo 15: Eficácia dos Anticorpos Monoclonais Anti-LY75
Conjugados com DM1 e DM4 em Linhas Celulares de Mieloma Múltiplo Materiais
[00405]Cell stripper (dissociação de células não enzimáticas) (MT-25-056CI) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00406]PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00407]Meio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) da Fisher Scientific, PA, EUA.
[00408]Cell Titer Glo (G7572) da Promega, WI, EUA. Método
[00409]As células foram dissociadas usando cell stripper e contadas. As células 5e3/poço foram centrifugadas em um sedimento (para células em suspensão, mais podem ser usadas dependendo do tempo de duplicação das células, tais como células 10e3/poço). O sedimento foi recolocado em suspensão em meio de cultura a uma concentração de 1e5 células/mL.
[00410]Adicionou-se uma suspensão de células de 50 µl/poço aos poços de uma placa de 96 poços de lado branco e fundo transparente. Os anticorpos foram diluídos e titulados em 8 pontos (titulações de 3 vezes) correspondendo a concentrações entre 0-20 nM (duas vezes as concentrações de teste). Anticorpos diluídos ou meios (para amostras não tratadas) (50 µL/poço) foram adicionados aos poços apropriados. Excesso de meio (200ul/poço) foi adicionado às linhas e colunas externas da placa para evitar a evaporação. A placa foi incubada por 72h a 37°C.
[00411]A placa foi removida da incubadora e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, a solução de Cell Titer Glo foi descongelada. A placa foi agitada e lavada 1x com 100 µl/poço de PBS (para células em suspensão, a placa é centrifugada primeiro para sedimentar células). 100 µL/poço de PBS e 100 µl de Cell Titer Glo foram adicionados a cada poço e triturados para misturar. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos e visualizada por microscopia para garantir que ocorresse uma lise celular eficiente. A placa foi então lida em um luminômetro Glomax. Resultados
[00412]A Figura 3v mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células MOLP-8. A Figura 3w mostra a atividade citotóxica de anticorpos anti-LY75 conjugados com DM1 e DM4 para células RPMI8226. Esses resultados demonstram um aumento na atividade citotóxica proporcional à concentração de anticorpos. Exemplo 16: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em modelos de xenoenxerto Raji
[00413]A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada em modelo de xenoenxerto de camundongo SCID com linfoma de Raji Burkitt subcutâneo.
[00414]Camundongos SCID imunodeficientes foram inoculados por via subcutânea com células tumorais Raji (linfoma de Burkitt humano). Os tumores foram autorizados a estabelecer e os camundongos foram classificados em cinco grupos de tratamento de 3-6 camundongos por grupo. Quando o volume médio do tumor atingiu um tamanho médio de 129-132 mm3 por grupo, cada grupo foi tratado com um dos seguintes compostos, administrado por via intravenosa nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Isotipo de controle-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (isotipo de controle-SPBDDM4; 5 mg/kg). Uma segunda dose foi administrada uma semana depois. Pesos corporais (PC) foram monitorados, os camundongos foram examinados com frequência para saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores atingiram o ponto terminal de volume tumoral de 2.000 mm3 ou após 60 dias, o que ocorrer primeiro. A eficácia foi determinada a partir do retardo do crescimento do tumor (TGD), o aumento no tempo médio até o ponto terminal (TTE) e da análise de log-rank das diferenças nas curvas de sobrevivência Kaplan Meier em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os primeiros cinco camundongos de controle tratados com veículo para atingir o ponto terminal foram amostrados para tumores que foram processados por fixação em formalina e embebidos em parafina. Resultados
[00415]A Figura 4a mostra LY75_DM1 e LY75_DM4, cada um demonstrou atividade antitumoral significativa e sobrevida significativamente estendida no modelo de xenoenxerto de camundongo SCID de linfoma de Raji Burkitt em comparação com os controles; no entanto, as doses de 5 mg/kg de LY75_DM4 foram significativamente mais eficazes do que as doses de 10 mg/kg de LY75_DM1, resultando em 5 de 6 camundongos com regressão tumoral completa, mas transitória. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs direcionados para LY75, por exemplo, LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer de linfoma não Hodgkin humano. Exemplo 17: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Modelos De Xenoenxerto de Namalwa
[00416]A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada em modelo de xenoenxerto de camundongo SCID de linfoma de Namalwa Burkitt subcutâneo.
[00417]Camundongos SCID imunodeficientes foram inoculados por via subcutânea com células tumorais Namalwa (linfoma de Burkitt humano). Os tumores foram autorizados a se estabelecer e os camundongos foram classificados em cinco grupos de tratamento de 6 camundongos por grupo. Quando o volume médio do tumor atingiu um tamanho médio de 114 mm3 por grupo, cada grupo foi tratado com um dos seguintes compostos, administrado por via intravenosa nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Isotipo de controle-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Isotipo de controle-SPBDDM4; 5 mg/kg). Pesos corporais (PC) foram monitorados, os camundongos foram examinados com frequência para saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores atingiram o ponto terminal de volume tumoral de 2.000 mm3 ou após 60 dias, o que ocorrer primeiro. A eficácia foi determinada a partir do retardo do crescimento do tumor (TGD), do aumento no tempo médio até o ponto terminal (TTE) e da análise de log-rank das diferenças nas curvas de sobrevivência Kaplan Meier em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os primeiros cinco camundongos de controle tratados com veículo para atingir o ponto terminal foram amostrados para tumores que foram processados por fixação em formalina e embebidos em parafina. Resultados
[00418]A Figura 4b mostra LY75_DM1 e LY75_DM4, cada um demonstrou atividade antitumoral significativa e extensão de sobrevivência no modelo de xenoenxerto de camundongo SCID de linfoma de Namalwa Burkitt em comparação com os controles; no entanto, a dose de 5 mg/kg de LY75_DM4 foi significativamente mais eficaz do que a dose de 10 mg/kg de LY75_DM1, causando uma breve redução no volume do tumor. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs direcionados para LY75, por exemplo LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer de linfoma não Hodgkin humano. Exemplo 18: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Modelos De Xenoenxerto de Câncer de Pâncreas
[00419]A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto de camundongo nu atímico de adenocarcinoma pancreático HPAFII subcutâneo.
[00420]Camundongos nus atímicos imunodeficientes foram inoculados subcutaneamente com células tumorais HPAFII (adenocarcinoma pancreático humano). Os tumores foram autorizados a se estabelecer e os camundongos foram classificados em cinco grupos de tratamento de 6 ratos por grupo. Quando o volume médio do tumor atingiu um tamanho médio de ~ 114 mm3/grupo, cada grupo foi tratado com um dos seguintes compostos, administrados por via intravenosa nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Isotipo de controle-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Isotipo de controle-SPBDDM4; 5 mg/kg). Os pesos corporais (PC) foram monitorados, os camundongos foram examinados com frequência para a saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos três vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores atingiram o ponto terminal de volume tumoral de
2.000 mm3 ou após 90 dias, o que ocorrer primeiro. A eficácia foi determinada a partir do efeito do tratamento no volume do tumor e da análise de log-rank das diferenças nas curvas de sobrevivência Kaplan-Meier em camundongos tratados com ADC ou tratados com PBS. Os tumores foram amostrados em camundongos de controle tratados com veículo e processados por fixação em formalina e embebidos em parafina. Resultados
[00421]A Figura 4c mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 exibiram atividade antitumoral significativa e similarmente potente e extensão de sobrevivência no modelo de xenoenxerto de camundongo nu HPAFII em comparação com os controles. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado.
[00422]Estes dados sugerem o potencial para ADCs direcionados a LY75, por exemplo LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer pancreático humano.
Exemplo 19: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados Com DM1 e Conjugados Com DM4 em Modelos de Xenoenxerto de Câncer de Bexiga
[00423]A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto de camundongo SCID de carcinoma de bexiga humano subcutâneo SW780.
[00424]Camundongos nus atímicos imunodeficientes foram inoculados subcutaneamente com células tumorais HPAFII (adenocarcinoma pancreático humano). Os tumores foram autorizados a se estabelecer e os camundongos foram classificados em cinco grupos de tratamento de 6 ratos por grupo. Quando o volume médio do tumor atingiu um tamanho médio de ~ 114 mm3/grupo, cada grupo foi tratado com um dos seguintes compostos, administrado por via intravenosa nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 1 mg/kg), Grupo 3 (LY75_DM1; 2,5 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupo 5 (LY75_DM4; 1 mg/kg)), Grupo 6 (LY75_DM4; 2,5 mg/kg)), Grupo 7 (LY75_DM4; 5 mg/kg)), Grupo 8 (Isotipo de controle- SPBDDM4; 5 mg/kg). Os pesos corporais (PC) foram monitorados, os camundongos foram examinados com frequência para a saúde e os efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos três vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores atingiram o ponto terminal de volume tumoral de 2.000 mm3 ou após 90 dias, o que ocorrer primeiro. A eficácia foi determinada a partir do efeito do tratamento no volume do tumor e da análise de log-rank das diferenças nas curvas de sobrevivência Kaplan-Meier em camundongos tratados com ADC ou tratados com PBS. Os tumores foram amostrados em camundongos de controle tratados com veículo e processados por fixação em formalina e embebidos em parafina. Resultados
[00425]A Figura 4d mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 exibiram atividade antitumoral significativa e similarmente potente e extensão de sobrevivência no modelo de xenoenxerto de camundongo nu SW780 em comparação com os controles. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs direcionados para LY75, por exemplo LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer de bexiga humana. Exemplo 20: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Modelos de Xenoenxerto de Câncer de Mama
[00426]A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto de camundongo nu atímico MDA-MB-468 subcutâneo.
[00427]Ratinhos nus atímicos imunodeficientes foram inoculados subcutaneamente com células tumorais MDA-MB-468 (adenocarcinoma de mama humano triplo-negativo). Os tumores foram autorizados a se estabelecer e os camundongos foram classificados em sete grupos de tratamento de 10 camundongos por grupo. Quando o volume médio do tumor atingiu um tamanho médio de 167 mm3 por grupo, cada grupo foi tratado com um dos seguintes compostos, administrado por via intravenosa nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; succinato de sódio 20 mM, pH 5, trealose a 0, 6% , polissorbato a 0,04%); Grupo 2 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupo 3 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (LY75_DM4; 2,5 mg/kg), Grupo
6 (LY75_DM4; 1 mg/kg), Grupo 7 (Isotipo de controle-DM4; 5 mg/kg). Pesos corporais (PC) foram monitorados, os camundongos foram examinados com frequência para saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados 82 dias após a inoculação do tumor. A eficácia foi determinada a partir da atividade antitumoral (tamanho médio do tumor no grupo de tratamento/tamanho médio do tumor no grupo de controle x 100) e o aumento no tempo médio até o ponto terminal (TTE) em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os cinco maiores tumores em camundongos de controle tratados com veículo no dia 71 após a inoculação foram amostrados processados por fixação em formalina e embebidos em parafina. Resultados
[00428]A Figura 4e mostra LY75_DM1 e LY75_DM4, cada um demonstrando atividade antitumoral dramática no modelo de xenoenxerto de camundongo nu MDA-MB-468 em comparação com os controles. A atividade dependente da dose foi observada com LY75_DM4, onde 2,5 e 5 mg/kg foram muito mais potentes do que 1 mg/kg. A 5 mg/kg, LY75_DM1 e LY75_DM4 foram similarmente efetivos. Regressões sustentadas no volume médio do tumor foram observadas para LY75_DM1 a 10 e 5 mg/kg e LY75_DM4 a 5 e 2,5 mg/kg. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Esses dados sugerem o potencial para ADCs direcionados a LY75, por exemplo LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes humanos com câncer de mama triplo negativo. Exemplo 21: Eficácia de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75
Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Modelos de Xenoenxerto de Câncer Colorretal
[00429]A eficácia de LY75_DM1 e LY75_DM4 foi testada no modelo de xenoenxerto de camundongo nu atímico de adenocarcinoma colorretal COLO205 subcutâneo.
[00430]Camundongos nus atímicos imunodeficientes foram inoculados subcutaneamente com células tumorais COLO205 (adenocarcinoma colorretal humano). Os tumores foram autorizados a se estabelecer e os camundongos foram classificados em cinco grupos de tratamento de 6 camundongos por grupo. Quando o volume médio do tumor atingiu um tamanho médio de 117 mm3 por grupo, cada grupo foi tratado com um dos seguintes compostos, administrados por via intravenosa nas dosagens indicadas: Grupo 1 (Veículo; solução salina tamponada com fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Isotipo de controle-DM1; 10mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Isotipo de controle-DM4; 5 mg/kg). Uma segunda dose foi administrada doze dias após a primeira. Pesos corporais (PC) foram monitorados, os camundongos foram examinados com frequência para saúde e efeitos colaterais adversos, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados quando seus tumores atingiram o ponto terminal do volume tumoral de 1000 mm3 ou após 60 dias, o que ocorrer primeiro. A eficácia foi determinada a partir do retardo do crescimento do tumor (TGD), do aumento no tempo médio até o ponto terminal (TTE) e da análise de log-rank das diferenças nas curvas de sobrevivência Kaplan Meier em camundongos tratados com ADC versus camundongos tratados com PBS. Os primeiros cinco camundongos de controle tratados com veículo para atingir o ponto terminal foram amostrados para tumores que foram processados por fixação em formalina e embebidos em parafina. Resultados
[00431]A Figura 4f mostra que LY75_DM1 e LY75_DM4 exibiram atividade antitumoral modesta similar e extensão de sobrevivência no modelo de xenoenxerto de camundongo nu de adenocarcinoma colorretal COLO205 em comparação com controles. Todos os tratamentos foram bem tolerados e nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Estes dados sugerem o potencial para ADCs direcionados para LY75, por exemplo LY75_DM1 e LY75_DM4, para fornecer benefício clínico no tratamento de pacientes com câncer colorretal humano. Exemplo 22: Toxicidade de Anticorpos Monoclonais Anti-LY75 Conjugados com DM1 e Conjugados com DM4 em Macacos Cynomolgus
[00432]Seis macacos machos foram atribuídos ao estudo com 2 macacos/grupo. O veículo (PBS), LY75_DM4 (clivável) ou LY75_DM1 (não clivável) foi administrado duas vezes (no Dia 1 e no Dia 29) por uma infusão intravenosa de 15 minutos a 0 mg/kg/dose (PBS, veículo), 5 mg/kg/dose (LY75_DM4, clivável) ou 10 mg/kg/dose (LY75_DM1, não clivável). Amostras de sangue foram coletadas para avaliações toxicocinéticas antes do início da dose (Dia 1) e 1, 2, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após cada dose. Amostras de sangue para análises de patologia clínica foram coletadas antes do início da dose (Dia 1) e 1, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após cada dose (28 dias após a 1ª dose também foi servido como o momento pré-dose para a 2ª dose). Todos os animais do estudo foram sacrificados e necropsiados após a coleta de sangue final no Dia 57. O plasma separado de cada coleta de sangue foi isolado, congelado e enviado para Oxford BioTherapeutics,
Inc. para ser analisado quanto à concentração de ADC por ELISA.
[00433]As verificações da patologia clínica relacionadas ao tratamento incluíram uma anemia regenerativa leve e diminuições transitórias no perfil de leucócitos sanguíneos, principalmente na contagem de neutrófilos. A anemia foi observada em ambos os animais tratados com 5 mg/kg de LY75_DM4 e em um dos dois animais tratados com 10 mg/kg de LY75_DM1. Neutropenia grave com um nadir em uma semana após a dose e uma rápida recuperação nas contagens foi observada em todos os animais; o nadir na contagem absoluta de neutrófilos foi menor nos animais tratados com LY75_DM4. Não houve efeitos relacionados com o artigo de teste nos parâmetros de coagulação APTT e PT. As alterações da química do soro incluíram aumentos transitórios em AST, CK, LDH (em 1 de 2 animais em cada grupo de tratamento) e globulina após administração de 5 mg/kg LY75_DM4 e 10 mg/kg LY75_DM1. Além disso, um aumento transitório na enzima ALT específica do fígado foi observado apenas nos animais tratados com LY75_DM4. A curta duração e/ou a magnitude dos aumentos nos parâmetros químicos do soro sugerem que não foram adversos. Não houve verificações de urinálise relacionadas ao artigo de teste. Após o exame na necropsia após um período de recuperação de 4 semanas, não houve verificações patológicas grosseiras relacionadas ao tratamento ou a alterações nos pesos absolutos e relativos dos órgãos. As verificações histopatológicas apenas na glândula tireoide (uma alteração na morfologia do coloide nos folículos) e no rim (túbulos dilatados no córtex externo) foram classificadas como gravidade mínima; não associadas a alterações em outros parâmetros do estudo; e, não adversas e de significado toxicológico mínimo. Conclusão: O tratamento de dose repetida com duas doses de 5 mg/kg LY75_DM4 ou 10 mg/kg LY75_DM1 foi bem tolerado em macacos cynomologus. Todos as verificações de toxicidade relacionadas ao tratamento foram reversíveis após um período de recuperação de 4 semanas. Exemplo 23: Caracterização de epítopo de LY75_A1 por análise de ligação por Classificação de Células Ativada por Fluorescência (FACS) competitiva Método
[00434]Células COLO205 (ATCC, catálogo # CCL-222) foram separadas de frascos de cultura de tecidos com Cell stripper (Cellgro, catálogo #MT-25-056CI). As células foram lavadas e recolocadas em suspensão em tampão FACS (PBS + FBS a 2%), neutralizadas com meio de crescimento e contadas. As células foram plaqueadas a 50.000 células por poço em uma placa de 96 poços de Fundo em V. As células foram lavadas uma vez com tampão FACS (PBS (Fisher, catálogo #SH30028-03) + FBS a 2%). Um mAb anti-LY75 (selecionado do Exemplo 1) ou LY75_A1 foi adicionado aos poços começando em 250 nM e diluído em série 3 vezes e aplicado aos poços relevantes por 45 minutos em gelo. Os poços de teste que exigiam uma ou várias etapa(s) de coloração foram deixados em tampão FACS conforme apropriado para garantir que a coloração final fosse concluída simultaneamente para todas as condições testadas. Dois poços foram deixados sem corar em tampão FACS como controles.
[00435]Após a incubação com o anticorpo bloqueador, as células foram lavadas duas vezes em tampão FACS. As células foram recolocadas em suspensão em tampão FACS contendo o mAb anti-LY75 conjugado com MCC-DM1 (1 nM) e incubadas em gelo por 45 minutos. As células foram lavadas como acima e recolocadas em suspensão em tampão FACS mais 1 µg/ml de anticorpo anti-maitansina de camundongo e incubadas em gelo por 45 minutos. As células foram lavadas como acima e recolocadas em suspensão em tampão FACS contendo 2 ug/ml de RPE capa de cabra anti-camundongo. As células foram incubadas em gelo durante 45 minutos e depois lavadas como acima. As células foram recolocadas em suspensão em tampão FACS a 200 µl por poço. A intensidade média de fluorescência de cada amostra foi determinada usando um citômetro de fluxo Guava EasyCyte Plus HT (formatos de placa de 96 poços) e os dados brutos foram analisados usando o Guava Cytosoft. Resultados
[00436]A Figura 5a mostra que o bloqueio com o mAb anti- LY75 MCC-DM1 reduziu a ligação de mAb anti-LY75. A análise da ligação de LY75_A1 a células COLO205 mostrou que LY75_A1 é incapaz de bloquear a ligação de mAb anti-LY75 MCC-DM1 (ver Figura 5b). Portanto, pode ser determinado que o mAb anti-LY75 e LY75_A1 são anticorpos não competidores e LY75_A1 reconhece um epítopo diferente e único de LY75 daquele de outros anticorpos anti-LY75. Exemplo 24: Caracterização do Epítopo de LY75_A1 por ensaio de microarranjo de peptídeos. Método
[00437]A análise de microarranjo de peptídeo foi realizada por LC Sciences, Houston TX, em resumo, o método compreendeu as seguintes etapas: -Peptídeos contíguos de 8 meros da proteína LY75 tendo uma sobreposição de aminoácidos abrangendo os resíduos 216 a 1666 da proteína LY75 de comprimento total foram sintetizados e imobilizados em um microarranjo de chip. O chip compreendia três painéis, de modo que o experimento foi realizado em triplicata. O microarranjo foi endereçado com LY75_A1 para identificar os peptídeos aos quais o anticorpo se ligou. O ensaio de ligação foi realizado nas seguintes condições:
[00438]O microarranjo compreendendo os peptídeos contíguos em triplicata foi lavado com 1 mL de tampão de ligação a 4ºC por 20 min. Foi então incubado com 1 µg/mL de LY75_A1 em tampão de ligação (pH 7,0) a 4ºC por 2 horas. A matriz foi novamente lavada com 0,5 mL de tampão de lavagem a 4ºC por 30 min, em seguida, incubada com 25 ng/mL de conjugado IgG anti-humano Alexa 647 em tampão de ligação (pH 7,0) a 4ºC por 1 h. A matriz foi novamente lavada com 0,5 mL de tampão de lavagem a 4ºC por 30 min.
[00439]A matriz foi então digitalizada a 635 nm e PMT 500 e a intensidade do sinal foi registrada. O peptídeo foi classificado como detectável se estivesse presente em pelo menos 2/3 duplicatas legais. A intensidade média do sinal das réplicas foi relatada como a intensidade final do sinal. Resultados
[00440]Como pode ser visto na Figura 6, o anticorpo LY75_A1 mostrou ligação específica a uma série de peptídeos localizados na matriz. O sinal máximo visto para a ligação LY75_A1 foi 25000 (escala 1-65535), com o sinal médio para todos os pontos na matriz sendo cerca de 885. Uma intensidade de sinal de 3000 foi definida como o ponto de corte de referência para ligação não específica. Com base no nível de intensidade do sinal de ligação do anticorpo, foram identificadas as sequências potenciais que formam o epítopo para LY75_A1. Essas regiões são mostradas nas Figuras 6a-6j e como SEQ ID NOs: 22-31. Exemplo 25: Ensaio de imunoprecipitação do peptídeo LY75_A1 Método
1.1 Ensaio de imunoprecipitação
[00441]A proteína LY75 recombinante foi digerida por proteólise tríptica em contas (Promega, EUA). Os peptídeos de digestão resultantes foram recuperados usando uma coluna de captura C18 (Thermo Fisher Scientific). Os peptídeos purificados foram então incubados com 200 µl de esferas de proteína A reticuladas com anticorpo LY75¬A1 durante a noite a 4°C. No dia seguinte, os peptídeos não ligados foram coletados e as contas foram lavadas com 1 ml de PBS duas vezes. Os peptídeos ligados ao anticorpo foram eluídos das contas por aquecimento a 90°C em 100 µl de PBS por 5 minutos. Essa etapa de eluição foi repetida.
1.2 Espectrometria de massa
[00442]As amostras foram analisadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa usando um sistema Waters nanoACQUITY UPLC equipado com uma coluna nanoACQUITY UPLC BEH 130 C18, 75 µm x 250 mm (186003545) e um LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). Os peptídeos foram eluídos com um gradiente de 300 nl/min aumentando de 3% a 35% de acetonitrila ao longo de 120 min. Os espectros de massa de varredura completa foram adquiridos em potência de resolução de 60000 entre faixa de massa de 400-2000 m/z no Orbitrap. Em cada ciclo, os vinte peptídeos mais intensos foram selecionados para varreduras CID MS/MS na armadilha de íons linear com fonte de íons nanospray instalada no instrumento.
1.3 Análise da sequência de aminoácidos do peptídeo
[00443]Os dados brutos gerados a partir do LTQ Orbitrap Velos foram processados através do software Mascot (Matrix Science) que usa o algoritmo Mowse (Curr Biol. 1 de junho de 1993; 3(6):327-3) para inferir as sequências de aminoácidos das listas de picos pesquisando em um banco de dados de sequência que consiste em Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), IPI (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) e SwissProt (http: // www. uniprot.org) junto com sequências de proteínas contaminantes. Os critérios para a identificação do peptídeo incluíram digestão com tripsina, até 2 sítios de clivagem perdidos e várias modificações biológicas e químicas (metionina oxidada, modificação de cisteína por MMTS ou iodoacetamida e fosforilação de serina, treonina e tirosina). Os peptídeos classificados como 1 com um valor esperado de 0,05% ou menos, uma pontuação de íon de 28 ou mais foram carregados no banco de dados OGAP.
1.4 Discriminação de peptídeos associados a LY75
[00444]O processo para identificar LY75 usou as sequências peptídicas obtidas experimentalmente por espectrometria de massa, como descrito acima, de proteínas humanas de ocorrência natural para identificar e organizar éxons codificantes na sequência do genoma humano publicada. Essas sequências determinadas experimentalmente foram comparadas com a base de dados OGAP® que foi compilado por processamento e integração de massas de peptídeos, assinaturas de peptídeos, ESTs e Dados de Sequência Genômica de Domínio Público como descrito no Pedido de Patente Internacional WO2009/087462. Resultados
[00445]Os resultados do ensaio de redução de peptídeo usando o anticorpo LY75_A1 são mostrados na Tabela 1 abaixo e na Figura 7. Os peptídeos que foram identificados em ambas as eluições de peptídeo 1a e 1b no ensaio de redução e no ensaio de microarranjo foram considerados os mais prováveis candidatos para formar o epítopo. Tabela 1: Comparação de experimentos de microarranjo de peptídeo e imunoprecipitação de peptídeo SEQ Peptídeo Identificado por Peptídeo Identificado por ID Ensaio de Microarranjo Ensaio de NO: Imunoprecipitação Região 1 (aa609-618) - Região 2 (aa651-662) - 40 Região 3 (aa761-780) GWHFYDDR (765-772) 41 Região 4 (aa883-901) ISEWPIDDHFTYSR(877 to 890) 42 FPVTFGEECLYMSAK(896-910) 43 Região 5 (aa1029-1040) ELTYSNFHPLLVSGR(1030-1044) 44 Região 6 (aa1077-1093) HFVSLCQK (1084-1091) 45 Região 7 (aa1107-1118) QTLQNASETVK (1099-1109) Região 8 (aa1368-1378) - Região 9 (aa1518-1528) - Região 10 (aa1535-1554) -
[00446]A Tabela 1 mostra que várias regiões de peptídeo LY75 sobrepostas foram identificadas no Ensaio de Microarranjo de Peptídeo e em ambas as eluições 1a e 1b no Ensaio de Imunoprecipitação de Peptídeo. Essas regiões são consideradas as mais prováveis de conterem o epítopo reconhecido pelo anticorpo LY75_A1, uma vez que são ligadas por LY75_A1 testadas por ambas as técnicas empregadas. Exemplo 26: Combinações sinérgicas de LY75_DM4 e Venetoclax
[00447]Várias linhas de células de linfoma difuso de células B ativadas (ABC-DLBCL) (isto é, U2932, HBL1, OCI- Ly10, linhas de células TMD8) foram expostas por 72 horas a doses crescentes de LY75_DM4 (isto é, 18,75 -37,5 -75 -150 -300 -600 -1200 nM) sozinhas ou em combinação com doses crescentes de Venetoclax (0,64 - 3,2 - 16 - 80 - 400 - 2000 -10000 nM). Isto foi seguido por um ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazólio].
[00448]O índice de combinação Chou-Talalay (I.C.) foi estimado usando o pacote Synergy R (Estudos de Combinação de Fármacos Pré-clínicos versus Clínicos. Chou TC. Leuk. Lymphoma. 2008; 49(11):2059-2080). Isso fornece uma definição quantitativa para forte sinergismo (<0,3), sinergismo (0,3-0,9), efeito aditivo (0,9-1,1) ou antagonismo/nenhum benefício (> 1,1).
[00449]Gráficos de estimativa algébrica de CI. vs Efeito fracional de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax em várias linhas de células ABC-DLBCL são mostrados nas Figuras 8-11.
[00450]Os dados de apoio são fornecidos nas Tabelas 2-5 abaixo. (O “efeito fracional” é o efeito de uma dose de fármaco ou, nesse caso, uma combinação de duas doses diferentes de fármaco na viabilidade celular. Ver “Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method”, Chou TC Cancer Res. 15 de jan de 2010;70(2):440-6. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-1947. Epub 12 de Jan de 2010; “Evaluation of combination chemotherapy: integration of nonlinear regression, curve shift, isobologram, and combination index analyses”, Zhao L1, Wientjes MG, Au JL. Clin Cancer Res. 1 de dez de 2004;10(23):7994-8004; e “Computerized quantitation of synergism and antagonism of taxol, topotecan, and cisplatinagainst human teratocarcinoma cell growth: a rational approach to clinical protocol design”, Chou TC1, Motzer RJ, Tong Y, Bosl GJ. J Natl Cancer Inst. 19 de out de 1994;86(20):1517-24). Tabela 2: Índice de combinação Chou-Talalay (CI) de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha de células de ABC-DLBCL U2932. N° Venetoclax (nM) LY75_DM4 (nM) CI 1 0,64 18,75 0,228628 2 3,2 18,75 48390,23 3 16 18,75 0,832871 4 80 18,75 48571,11 5 400 18,75 1,283932 6 2000 18,75 4,300007 7 0,64 37,5 0,20187 8 3,2 37,5 0,158138 9 16 37,5 0,162302 10 80 37,5 0,359423 11 400 37,5 1,063934 12 2000 37,5 4,016023 13 0,64 75 0,240453 14 3,2 75 0,318658 15 16 75 0,269793 16 80 75 0,449203 17 400 75 1,319344 18 2000 75 4,535702 19 0,64 150 0,668392 20 3,2 150 0,503223 21 16 150 0,368141 22 80 150 0,78697 23 400 150 1,229211 24 2000 150 4,080756 25 0,64 300 0,674222 26 3,2 300 0,614852 27 16 300 0,471318 28 80 300 0,612392 29 400 300 1,0508 30 2000 300 2,887408 31 0,64 600 0,398468 32 3,2 600 0,269578 33 16 600 0,215265 34 80 600 0,262392 35 400 600 0,482253 36 2000 600 1,556613 37 0,64 1200 0,311401 38 3,2 1200 0,201658
N° Venetoclax (nM) LY75_DM4 (nM) CI 39 16 1200 0,131998 40 80 1200 0,143223 41 400 1200 0,264552 42 2000 1200 0,889985
Tabela 3: Índice de combinação Chou-Talalay (CI) de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha de células de ABC-DLBCL HBL-1. Venetoclax N° LY75_DM4 (nM) CI (nM) 1 0,64 18,75 0,060475 2 3,2 18,75 0,066231 3 16 18,75 0,072936 4 80 18,75 0,103875 5 400 18,75 0,2431 6 2000 18,75 0,723887 7 10000 18,75 2,513073 8 0,64 37,5 0,2091 9 3,2 37,5 0,126913 10 16 37,5 0,130206 11 80 37,5 0,181304 12 400 37,5 0,257498 13 2000 37,5 0,723106 14 10000 37,5 2,455379 15 0,64 75 0,307332 16 3,2 75 0,251612 17 16 75 0,235462 18 80 75 0,185182 19 400 75 0,304787 20 2000 75 0,717305 21 10000 75 2,213852 22 0,64 150 0,429262 23 3,2 150 0,324116 24 16 150 0,379524 25 80 150 0,276266 26 400 150 0,341981 27 2000 150 0,641475 28 10000 150 1,688396 29 0,64 300 0,530256 30 3,2 300 0,558872 31 16 300 0,48397
Venetoclax N° LY75_DM4 (nM) CI (nM) 32 80 300 0,427943 33 400 300 0,411042 34 2000 300 0,581318 35 0,64 600 0,81368 36 3,2 600 0,7166 37 16 600 0,688208 38 80 600 0,539914 39 400 600 0,447228 40 2000 600 0,576687 41 10000 600 0,927968 42 0,64 1200 1,462271 43 3,2 1200 1,463631 44 16 1200 1,240995 45 80 1200 0,962969 46 400 1200 0,699419 47 2000 1200 0,834858 48 10000 1200 1,20449
Tabela 4: Índice de combinação Chou-Talalay (CI) de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha de células de ABC-DLBCL OCI-LY10. Venetoclax N° LY75_DM4 (nM) CI (nM) 1 0,64 18,75 0,358713 2 3,2 18,75 0,390664 3 16 18,75 0,528223 4 80 18,75 0,519535 5 400 18,75 0,48347 6 2000 18,75 0,449909 7 0,64 37,5 0,76338 8 3,2 37,5 0,792829 9 16 37,5 0,863246 10 80 37,5 0,849432 11 400 37,5 0,842251 12 2000 37,5 0,83696 13 0,64 75 1,620332 14 3,2 75 1,497024 15 16 75 1,52695 16 80 75 1,247205 17 400 75 1,03465 18 2000 75 0,679064
Venetoclax N° LY75_DM4 (nM) CI (nM) 19 0,64 150 2,591237 20 3,2 150 2,543499 21 16 150 2,319816 22 80 150 2,028179 23 400 150 1,529779 24 2000 150 1,245879
Tabela 5: Índice de combinação Chou-Talalay (CI) de diferentes doses de LY75_DM4 em combinação com Venetoclax na linha de células de ABC-DLBCL TMD8. Venetoclax N° LY75_DM4 (nM) CI (nM) 1 0,64 18,75 3,857478 2 3,2 18,75 0,280543 3 16 18,75 0,384029 4 80 18,75 0,317572 5 400 18,75 0,746108 6 2000 18,75 1,517033 7 10000 18,75 5,015455 8 0,64 37,5 0,563791 9 3,2 37,5 0,501728 10 16 37,5 0,518688 11 80 37,5 0,54784 12 400 37,5 0,769738 13 2000 37,5 1,419712 14 10000 37,5 5,250996 15 0,64 75 1,002662 16 3,2 75 0,925877 17 16 75 0,941806 18 80 75 0,952971 19 400 75 1,073273 20 2000 75 1,592762 21 10000 75 4,559974 22 0,64 150 1,564785 23 3,2 150 1,540005 24 16 150 1,522806 25 80 150 1,396608 26 400 150 1,273743 27 2000 150 1,376175 28 10000 150 0,217978
SEQUÊNCIAS
SEQ ID Descrição Sequência No
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTYSNAWMSWVRQAPGKGLE 1 A1_VH aa WVGRIKSKTDGGTTDYAAPVQGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTED
TAVYYCTIFGVVSFDYWGQGTLVTVSS
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDYLSWYQQRPGKAPNL 2 A1_VL aa LIYAASNLKTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYCQQSY
RSPWTFGQGTKVEIKR gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtaaagccggggg ggtcccttagactctcctgtgcagcctctggcttcacttacagtaa cgcctggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggag tgggttggccgtattaaaagcaaaactgatggtgggacaacagact 3 A1_VH nt acgctgcacccgtgcaaggcagattcaccatctcaagagatgattc aaaaaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggac acagccgtgtattactgtacgatttttggagtggttagctttgact actggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca gacgtccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgttg gagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcga ctatttaagttggtatcagcagagaccagggaaagcccctaacctc ctgatctatgctgcatccaatttaaagactggggtcccatcaaggt 4 A1_VL nt tcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcac tctgcaacctgaagattttgcaacgtactactgtcaacagagttac aggtccccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaac ga A1_VH_CDR1 5 NAWMS aa A1_VH_CDR2 6 RIKSKTDGGTTDYAAPVQG aa A1_VH_CDR3 7 FGVVSFDY aa A1_VL_CDR1 8 RASQSISDYLS aa A1_VL_CDR2 9 AASNLKT aa A1_VL_CDR3 10 QQSYRSPWT aa
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLE VH3|3- 11 WVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTED 15/D4|411
TAVYYCTTTTVT 12 JH4 YFDYWGQGTLVTVSS
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKL 13 O12 LIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSY
S 14 JK1 WTFGQGTKVEIKR
MRTGWATPRRPAGLLMLLFWFFDLAEPSGRAANDPFTIVHGNTGKC IKPVYGWIVADDCDETEDKLWKWVSQHRLFHLHSQKCLGLDITKSV NELRMFSCDSSAMLWWKCEHHSLYGAARYRLALKDGHGTAISNASD VWKKGGSEESLCDQPYHEIYTRDGNSYGRPCEFPFLIDGTWHHDCI LDEDHSGPWCATTLNYEYDRKWGICLKPENGCEDNWEKNEQFGSCY
QFNTQTALSWKEAYVSCQNQGADLLSINSAAELTYLKEKEGIAKIF LY75 (DEC- WIGLNQLYSARGWEWSDHKPLNFLNWDPDRPSAPTIGGSSCARMDA 15 205) ESGLWQSFSCEAQLPYVCRKPLNNTVELTDVWTYSDTRCDAGWLPN
NGFCYLLVNESNSWDKAHAKCKAFSSDLISIHSLADVEVVVTKLHN EDIKEEVWIGLKNINIPTLFQWSDGTEVTLTYWDENEPNVPYNKTP NCVSYLGELGQWKVQSCEEKLKYVCKRKGEKLNDASSDKMCPPDEG WKRHGETCYKIYEDEVPFGTNCNLTITSRFEQEYLNDLMKKYDKSL RKYFWTGLRDVDSCGEYNWATVGGRRRAVTFSNWNFLEPASPGGCV AMSTGKSVGKWEVKDCRSFKALSICKKMSGPLGPEEASPKPDDPCP
SEQ ID Descrição Sequência No
EGWQSFPASLSCYKVFHAERIVRKRNWEEAERFCQALGAHLSSFSH VDEIKEFLHFLTDQFSGQHWLWIGLNKRSPDLQGSWQWSDRTPVST IIMPNEFQQDYDIRDCAAVKVFHRPWRRGWHFYDDREFIYLRPFAC DTKLEWVCQIPKGRTPKTPDWYNPDRAGIHGPPLIIEGSEYWFVAD LHLNYEEAVLYCASNHSFLATITSFVGLKAIKNKIANISGDGQKWW IRISEWPIDDHFTYSRYPWHRFPVTFGEECLYMSAKTWLIDLGKPT DCSTKLPFICEKYNVSSLEKYSPDSAAKVQCSEQWIPFQNKCFLKI KPVSLTFSQASDTCHSYGGTLPSVLSQIEQDFITSLLPDMEATLWI GLRWTAYEKINKWTDNRELTYSNFHPLLVSGRLRIPENFFEEESRY HCALILNLQKSPFTGTWNFTSCSERHFVSLCQKYSEVKSRQTLQNA SETVKYLNNLYKIIPKTLTWHSAKRECLKSNMQLVSITDPYQQAFL SVQALLHNSSLWIGLFSQDDELNFGWSDGKRLHFSRWAETNGQLED CVVLDTDGFWKTVDCNDNQPGAICYYSGNETEKEVKPVDSVKCPSP VLNTPWIPFQNCCYNFIITKNRHMATTQDEVHTKCQKLNPKSHILS IRDEKENNFVLEQLLYFNYMASWVMLGITYRNKSLMWFDKTPLSYT HWRAGRPTIKNEKFLAGLSTDGFWDIQTFKVIEEAVYFHQHSILAC KIEMVDYKEEYNTTLPQFMPYEDGIYSVIQKKVTWYEALNMCSQSG GHLASVHNQNGQLFLEDIVKRDGFPLWVGLSSHDGSESSFEWSDGS TFDYIPWKGQTSPGNCVLLDPKGTWKHEKCNSVKDGAICYKPTKSK KLSRLTYSSRCPAAKENGSRWIQYKGHCYKSDQALHSFSEAKKLCS KHDHSATIVSIKDEDENKFVSRLMRENNNITMRVWLGLSQHSVDQS WSWLDGSEVTFVKWENKSKSGVGRCSMLIASNETWKKVECEHGFGR VVCKVPLGPDYTAIAIIVATLSILVLMGGLIWFLFQRHRLHLAGFS
SVRYAQGVNEDEIMLPSFHD 16 A1_VH_FR1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTYS 17 A1_VH_FR2 WVRQAPGKGLEWVG 18 A1_VH_FR3 RFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTI 19 A1_VH_FR4 WGQGTLVTVSS 20 A1_VL_FR1 DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 21 A1_VL_FR2 WYQQRPGKAPNLLIY 22 A1_VL_FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYC 23 A1_VL_FR4 FGQGTKVEIKR 24 LY75 609-618 WEVKDCRSFK 25 LY75 651-662 PASLSCYKVFHA 26 LY75 761-780 PWRRGWHFYDDREFIYLRPF 27 LY75 883-901 DDHFTYSRYPWHRFPVTFG LY75 1029- 28 RELTYSNFHPLL 1040 LY75 1077- 29 FTSCSERHFVSLCQKYS 1093 LY75 1107- 30 TVKYLNNLYKII 1118 LY75 1368- 31 EAVYFHQHSIL 1378 LY75 1518- 32 KKLSRLTYSSC 1528 LY75 1535- 33 NGSRWIQYKGHCYKSDQALH 1554 34 LY75 877-901 ISEWPIDDHFTYSRYPWHRFPVTFG LY75 1099- 35 QTLQNASETVKYLNNLYKII 1118 36 LY75 883-892 DDHFTYSRYP LY75 1077- 37 FTSCSERHFVSLCQK 1091
SEQ ID Descrição Sequência No
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGF TYSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKT DGGTTDYAAPVQGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTIF GVVSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT A1_H 38 KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR (aminoácido)
TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSISDYLSWYQQRPGKAPNLLIYAASN
LKTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYCQQSYRSPWTFG A1_L 39 QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT (aminoácido)
ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC 40 (765-772) GWHFYDDR
ISEWPIDDHFTYSR 41 (877 to 890) 42 (896-910) FPVTFGEECLYMSAK 43 (1030-1044) ELTYSNFHPLLVSGR 44 (1084-1091) HFVSLCQK 45 (1099-1109) QTLQNASETVK 46 Ligante Gly-Phe-Leu-Gly Texto livre da listagem de sequências: SEQ ID NO: 38 <223> Cadeia pesada A1 SEQ ID NO: 39 <223> Cadeia leve A1 SEQ ID NO: 46 <223> Vinculador SEQ ID NOs: 47-157 <223> Peptídeo SEQ ID NOs: 159-201 <223> Peptídeo

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES
1. Combinação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (A) um anticorpo anti-LY75, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, que compete pela ligação a LY75 com um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou um anticorpo anti-LY75, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, o(a) referido(a) anticorpo ou porção compreendendo: a) uma região variável da cadeia pesada que compreende: i) uma primeira vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 5; ii) uma segunda vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 6; e iii) uma terceira vhCDR compreendendo SEQ ID NO: 7; e b) uma região variável da cadeia leve que compreende: i) uma primeira vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 8; ii) uma segunda vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 9; e iii) uma terceira vlCDR compreendendo SEQ ID NO: 10; opcionalmente, em que qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs acima compreende(m), independentemente, uma, duas, três, quatro ou cinco substituição(ões), adição(ões) ou deleção(ões) de aminoácidos; e (B) Venetoclax ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a combinação farmacêutica está na forma de uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial, de preferência para o tratamento de câncer.
2. Combinação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 5-10 compreende, independentemente, uma, duas, três, quatro ou cinco substituição(ões) conservadora(s) de aminoácidos.
3. Combinação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 5-10 compreende, independentemente, uma ou duas substituição(ões) conservadora(s) de aminoácidos.
4. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo compreende: (i) uma região variável da cadeia pesada com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1; e (ii) uma região variável da cadeia leve com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 2.
5. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 compreende: (i) uma cadeia pesada tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 38; e (ii) uma cadeia leve tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 39.
6. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 é um anticorpo monoclonal IgG1 humano.
7. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo compreende adicionalmente uma fração afixada covalentemente.
8. Combinação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida porção é um fármaco.
9. Combinação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o referido fármaco é um maitansinoide ou um derivado do mesmo.
10. Combinação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido fármaco é DM4 ou DM1.
11. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que (A) e/ou (B) compreende adicionalmente um ou mais de diluentes, excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
12. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a combinação farmacêutica está na forma de uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial para o tratamento de linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) ou Linfoma não Hodgkin.
13. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente instruções para o tratamento do câncer em um paciente em necessidade desse tratamento pela administração de (A) e (B) ao paciente.
14. Método de tratamento de câncer em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende a administração simultânea, sequencial ou separada a um paciente em necessidade do mesmo de quantidades terapeuticamente eficazes dos componentes (A) e (B) de uma combinação farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou porção de ligação de antígeno do mesmo é internalizado por uma célula que expressa LY75.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou porção de ligação de antígeno compreende um conjugado de fármaco covalentemente ligado.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o conjugado de fármaco covalentemente ligado é um maitansinoide, de preferência DM4.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) ou linfoma não-Hodgkin.
19. Combinação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer, em que os componentes (A) e (B) são administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente ao paciente para o tratamento do câncer.
20. Combinação farmacêutica para uso, de acordo com a a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou porção de ligação de antígeno do mesmo é internalizado por uma célula que expressa LY75.
21. Combinação farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou porção de ligação de antígeno compreende um conjugado de fármaco covalentemente afixado.
22. Combinação farmacêutica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizada pelo fato de que o conjugado de fármaco ligado covalentemente é um maitansinoide, de preferência DM4.
23. Combinação farmacêutica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que o câncer é linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) ou linfoma não-Hodgkin.
24. Uso de componentes (A) e (B) da combinação farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma combinação farmacêutica para uso simultâneo, separado ou sequencial para o tratamento de câncer.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou porção de ligação de antígeno do mesmo é internalizado por uma célula que expressa LY75.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-LY75 ou porção de ligação de antígeno compreende um conjugado de fármaco ligado covalentemente.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o conjugado de fármaco covalentemente ligado é um maitansinoide, de preferência DM4.
28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que o câncer é linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) ou linfoma não-Hodgkin.
29. Combinação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia ou como um medicamento.
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