CN105764503A - 用于改善配体-药物偶联物药代动力学的peg化的药物-接头 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含与所述药物单元平行取向的PEG单元的配体?药物偶联物。本发明尤其提供配体?药物偶联物(LDC)、其制备和使用方法、及其中间体。所述配体?药物偶联物在循环中稳定，一旦其药物被载物在靶细胞附近或内部释放，所述配体?药物偶联物还能造成靶向细胞的细胞死亡，或抑制靶向细胞增殖。在主要的实施方式中，本发明的LDC由式I的结构表示。

Description

用于改善配体-药物偶联物药代动力学的PEG化的药物-接头
相关申请的交叉引用
该非临时申请根据35USC§119(e)要求美国申请系列号：2013年10月15日提交的61/891,320、2014年2月19日提交的61/941,904、2014年3月4日提交的61/947,742和2014年4月4日提交的61/975,318的优先权，上述文件均通过引用其全文纳入本文。
序列表
名称为2700-00114PC-ST25.txt的13KB的序列表于2014年10月9日生成，其通过引用纳入本文。
发明背景
人们对用于向癌细胞靶向递送细胞毒剂的单克隆抗体(mAb)的应用有着极大的兴趣。通过将细胞毒剂与抗体连接(通常由接头连接)进行的抗体药物偶联物的设计涉及对于多种因素的考虑。这些因素包括：用于与细胞毒剂偶联的化学基团的特性与位置、试剂释放的机理、提供细胞毒剂的释放的结构元件(若存在)，和对于释放的游离试剂的结构修饰(若存在)。此外，如果所述细胞毒剂准备在抗体内化之后释放，则该试剂释放的结构元件和机理必须与所述偶联物的胞内运转相一致。
尽管已经评价了用于通过抗体递送的许多不同的药物种类，仅少数药物种类显示在抗体药物偶联物的形式下具有足够活性，同时具有合适的毒性特性，以确保临床开发。一种所述种类是奥瑞他汀(auristatin)，其与天然产物尾海兔素10相关。代表性的奥瑞他汀包括：MMAE(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脯氨酸-降麻黄碱)和MMAF(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脯氨酸-苯丙氨酸)。
MMAE是细胞毒剂的一个示例，其作为游离药物是具有活性的，并且在与单克隆抗体(mAb)偶联时高度有效，并在内化进入细胞之后释放。已通过组织蛋白酶B可切割的基于肽的接头，在MMAE的N-末端氨基酸处，将MMAE成功地偶联至mAb，其中所述接头包含马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(mc-vc-)和自分解型基团对氨基苄基-氨基甲酰基(PABC)，以产生具有如下结构的抗体药物偶联物：mAb-(mc-vc-PABC-MMAE)p。(在上式中，p表示每抗体(mc-vc-PABC-MMAE)单元的数量)。在切割了vc肽和自分解型PABC基团之间的键之后，PABC基团将其自身从MMAE释放，从而释放出游离MMAE。
另一种奥瑞他汀，MMAF，作为游离药物(相较于MMAE)相对活性较低，但在偶联至抗体并内化进入细胞时是高度有效的。已通过组织蛋白酶B可切割的基于肽的接头，在MMAF的N-末端氨基酸处，将MMAF成功地偶联至单克隆抗体(mAb)，其中所述接头包含马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(mc-vc-)和自分解型基团对氨基苄基-氨基甲酰基(PABC)，以产生具有如下结构的抗体-药物偶联物：mAb-(mc-vc-PABC-MMAF)p，其中p表示每抗体(mc-vc-PABC-MMAF)单元的数量。在切割肽接头之后，该自分解型PABC基团将其自身从MMAF释放，从而释放出游离MMAF。
还发现MMAF在包含药物-接头马来酰亚胺己酰基MMAF(mcMMAF)的不可切割的偶联物形式下也有活性。当该偶联物，mAb-(mcMMAF)p，被内化进入细胞时，释放的活性物质是cys-mcMMAF。因为所述接头是不可切割的，所以该抗体的马来酰亚胺己酰基和半胱氨酸残基仍保持与MMAF的N-末端连接。还有报道称MMAF在C-末端偶联物形式下也有活性，其中，其C-末端氨基酸(苯丙氨酸)连接至肽-马来酰亚胺己酰基接头。当该偶联物，(MMAF-肽-mc)p-mAb被内化进入细胞时，活性物质(MMAF)在切割MMAF(苯丙氨酸)-肽键之后释放。
在动物模型中，这些MMAE和MMAF偶联物的药代动力学性质显示载药量-依赖性降低。具体而言，随着连接至各抗体的药物-接头单元的数量的增加，所述偶联物的PK降低。
因此，偶联物设计中的另一项重要因素是，每靶向剂能够递送的药物的量(即，连接至各靶向剂(例如，抗体)的细胞毒剂的数量，称为药物载量(drugload)或载药量(drugloading))。曾经有假设认为，较高的药物载量将优于较低的药物载量(例如，8-单位载量对比4-单位载量)。该理论是，载药量更高的偶联物将向靶细胞递送更多的药物(细胞毒剂)。该理论由如下观察结果支持：具有较高载药量的偶联物在体外对于细胞系具有较高的活性。然而，后续某些研究揭示，该假设在动物模型中并没有得到证实。观察到，具有某种奥瑞他汀的4或8单位药物载量的偶联物在小鼠模型中具有相似活性。Hamblett等,ClinicalCancerRes.10:7063-70(2004)。Hamblett等进一步报道了，更高载药的ADC在动物模型中将被更快地清除出循环。该更快的清除表明，较高载量的物质相比较低载量的物质的PK倾向。Hamblett等。此外，在小鼠中，较高载量的偶联物具有较低的MTD，因此报道的治疗指数较低。同上。相反，报道称，在单克隆抗体的工程改造位点具有2单位的载药量的ADC相较于某些4-单位载量的ADC而言具有相同或更佳的PK和治疗指数。例如，参见Junutula等,ClinicalCancerRes.16:4769(2010)。因此，近期的趋势是开发具有低载药量的ADC。
因此，需要允许较高载药量，但保持较低载量的偶联物的其它特点(例如，有利的PK性质)的抗体药物偶联物形式(更具体地，其它偶联物形式)。本发明惊人地满足了这些需求。
附图的简要说明
图1.对应于异种移植L540cy模型(霍奇金淋巴瘤)的移植后天数的平均肿瘤体积，所述模型以较高单一剂量(2mg/kg)用非PEG化的ADC,cAC10-[mc-PAB(gluc)MMAE]p(cAC10-1)、平行取向的PEG化的ADC(cAC10-10)，和串联取向的PEG化的ADC(cAC10-4)组合物(平均载药量为8单位药物/Ab)给药。
图2.对应于异种移植Karpas299模型(ALCL)的移植后天数的平均肿瘤体积，所述模型以较高单一剂量(0.6mg/kg)用非PEG化的ADC(cAC10-1)、平行取向的PEG化的ADC(cAC10-10)，和串联取向的PEG化的ADC(cAC10-4)组合物(平均载药量为8单位药物/Ab)给药。
图3.对应于异种移植L540cy模型(霍奇金淋巴瘤)的移植后天数的平均肿瘤体积，所述模型以较低单一剂量(0.5mg/kg)用非PEG化的ADC(cAC10-1)、平行取向的PEG化的ADC(cAC10-10)，和串联取向的PEG化的ADC(cAC10-4)组合物给药。
图4.对应于异种移植Karpas299模型(ALCL)的移植后天数的平均肿瘤体积，所述模型以较低单一剂量(0.15mg/kg)用非PEG化的ADC(cAC10-1)、平行取向的PEG化的ADC(cAC10-10)，和串联取向的PEG化的ADC(cAC10-4)组合物(平均载药量为8单位药物/Ab)给药。
图5.对应于异种移植Karpas299模型(ALCL)的移植后天数的平均肿瘤体积，所述模型以单一剂量0.2mg/kg用非PEG化的ADC、cAC10-[MDpr-PAB(gluc)-MMAE]p(cAC10-14)，和平行取向的PEG化的ADC(cAC10-16)组合物(平均载药量为8单位药物/Ab(即，p是8))给药。
图6.对应于异种移植Ramos模型(伯基特淋巴瘤)的移植后天数的平均肿瘤体积，所述模型以单一剂量1mg/kg用非PEG化的ADC、hBU12-[MDpr-PAB(gluc)-MMAE]p(hBU12-14)，和平行取向的PEG化的ADC(hBU12-16)组合物(平均载药量为8单位药物/Ab(即，p是8))给药。
图7.静脉内给予单一3mg/Kg剂量的非偶联cAC10抗体、其非PEG化的ADC(cAC10-1)、平行取向的PEG化的ADC(cAC10-10)，和串联取向的PEG化的ADC(cAC10-4)组合物(平均载药量为8单位药物/Ab药物)的大鼠中的药代动力学概况(以μg/mL计的总Ab浓度对应以天计的时间)。
图8.cAC10ADC(具有非PEG化的药物接头和平行取向的PEG化的药物接头部分的8单位药物/Ab)的尺寸排阻色谱，其中所述药物-接头部分是MDpr-VC-PABA-MMAE，具有不同长度的PEG单元：cAC10-A(非PEG化的)、cAC10-B(PEG12)、cAC10-C(PEG24)、cAC10-D(PEG36)、cAC10-E(PEG12+PEG36)、cAC10-F(PEG24+PEG36)，和cAC10-G(PEG36+PEG36)。
图9.静脉内给予单一3mg/Kg剂量的cAC10ADC(具有非PEG化的药物接头的8单位药物/Ab)大鼠中的药代动力学概况(以μg/mL计的总Ab浓度对应以天计的时间)，其中，ADC偶联物是c-AC10-MDpr-VC-PAB-MMAE(cAC10-A)和cAC10-mc-VC-PABA-MMAE(cAC10-K)，以及平行取向的PEG化的药物接头部分，其中所述ADC有如下结构代表：cAC10-[MDpr(-X-D)-PEG24]p，并且–X-D是MDpr-VC-PAB-MMAE(cAC10-C)或mc-VC-PABA-MMAE(cAC10-L)，且p是8，并将其与具有采用n-乙基氨基马来酰亚胺加帽的PEG24支架(即，未连接的药物单元)的对照偶联物cAC10-NAEM(cAC10-I)做比较。
图10.静脉内给予单一3mg/Kg剂量的cAC10ADC(具有非PEG化的药物接头的8单位药物/Ab)之后的大鼠中的药代动力学概况(以μg/mL计的总Ab浓度对应以天计的时间)，其中ADC偶联物是c-AC10-[MDpr-VC-PAB-MMAE]p(cAC10-A)或平行取向的PEG化的药物接头部分，其中所述ADC由如下结构代表：cAC10-[MDpr(-X-D)-PEG]p，其中p是8，-X-D是MDpr-VC-PAB-MMAE且PEG是具有不同长度的PEG单元：PEG12(cAC10-B)、PEG24(cAC10-C)和PEG36(cAC10-D)，并将其与具有采用n-乙基氨基马来酰亚胺加帽的PEG支架(即，未连接的药物单元)的对照偶联物做比较：PEG12(cAC10-H)、PEG24(cAC10-I)和PEG36(cAC10-J)。
图11.对应于L540cy异种移植模型的肿瘤移植后天数的肿瘤体积(mm2)，所述模型用2mg/Kg的非PEG化的ADC：c-AC10-[MDpr-VC-PAB-MMAE]p(cAC10-A)静脉内给药一次，并与未处理的动物做比较。
图12.对应于L540cy异种移植模型的肿瘤移植后天数的肿瘤体积(mm2)，所述模型用2mg/Kg的平行取向的PEG化的ADC(cAC10-B)：cAC10-[MDpr(-X-D)-PEG12]p,(其中p是8，且–X-D是MDpr-VC-PAB-MMAE)静脉内给药一次，并与未处理的动物做比较。
图13.对应于L540cy异种移植模型的肿瘤移植后天数的肿瘤体积(mm2)，所述模型用2mg/Kg的平行取向的PEG化的ADC(cAC10-C)：cAC10-[MDpr(-X-D)-PEG24]p,(其中p是8，且–X-D是MDpr-VC-PAB-MMAE)静脉内给药一次，并与未处理的动物做比较。
图14.对应于异种移植乳腺癌模型的肿瘤移植后天数的平均肿瘤体积(mm2)，所述模型给予靶向抗原LIV-1的非PEG化的ADC：hLIV22-[mc-VC-PAB-MMAE)]p或hLIV22-[MDpr(-X-D)-PEG24]p(其中p是8，且–X-D是mc-VC-PAB-MMAE)，并与未处理的动物做比较。
图15：对应于L540cy异种移植模型的肿瘤移植后天数的平均肿瘤体积(mm2)，所述模型用1或0.5mg/Kg非PEG化的ADC：cAC10-[mc-PAB(gluc)-MMAE]p(cAC10-1)或其对应的平行取向的PEG化的ADC：cAC10-{mc-[PAB(gluc)-MMAE]-PEG24}p(cAC10-10)(其中p是4)静脉内给予一次，并与未处理的动物做比较。
图16：对应于Karpas299异种移植模型的肿瘤移植后天数的平均肿瘤体积(mm2)，所述模型用0.3或0.15mg/Kg非PEG化的ADC：cAC10-[mc-PAB(gluc)-MMAE]p(cAC10-1)或其对应的平行取向的PEG化的ADC：cAC10-{mc-[PAB(gluc)-MMAE]-PEG24}p(cAC10-10)(其中p是4)静脉内给予一次，并与未处理的动物做比较。
图17：针对一组非霍奇金淋巴瘤细胞系的具有PEG化的支架的载有8单位药物的hBU12ADC的剂量响应曲线，所述PEG化的支架具有不同长度的PEG单元，其中，药物-接头由如下结构代表：MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(glu))，其中Lp是作为平行连接物单元的赖氨酸，其中x是0(hBU12-14)，其中位于赖氨酸的ε氨基的PEG单元用乙酰基替代，x是2(hBU12-43)、4(hBU12-42)、8(hBU12-18)、12(hBU12-17)、24(hBU12-16)，或是PEG4-(PEG4)3(hBU12-19)的支化结构。
图18.静脉内单一给予1mg/Kg剂量的未偶联的非靶向抗体(h00)(其偶联物具有PEG单元长度不同的PEG化的支架和由如下结构代表的药物-接头：MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(glu))之后的大鼠中的药代动力学概况(以μg/mL计的总Ab浓度对应以天计的时间)，其中Lp是作为平行连接物单元的赖氨酸，其中x是0(h00-14)，其中位于赖氨酸的ε氨基的PEG单元被乙酰基替代，x是2(h00-43)、4(h00-42)、8(h00-18)、12(h00-17)或24(h00-16)。
图19：对应于用单一剂量的1或3mg/KghBU12ADC静脉给予之后，CD19-阳性RL弥散性大B细胞淋巴瘤模型的肿瘤移植后天数的平均肿瘤体积(mm2)，其中，所述hBU12ADC具有PEG单元长度不同的PEG化的支架，和由如下结构代表的药物-接头：MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc))，其中Lp是作为平行连接物单元的赖氨酸，其中x是0(hBU12-14)，其中位于赖氨酸的ε氨基处的PEG单元被乙酰基替代，x是2(hBU12-43)、4(hBU12-42)、8(hBU12-18)、12(hBU12-17)或24(hBU12-16)，并与未处理的动物做比较。
图20.在单一剂量给予1mg/Kg的：非PEG化的ADC、cAC10-[mc-PAB(gluc)MMAE]p(cAC10-1)、具有药物-接头mc-Lp-(PAB(gluc)-MMAE)PEG24(cAC10-10)、MDpr-Lp-(PAB(gluc)-MMAE)PEG24(cAC10-16)的平行取向的PEG化的ADC(其中平行连接物单元LP是赖氨酸)，或串联取向的PEG化的ADC(cAC10-4)之后，小鼠中CD30+L540cy霍奇金淋巴瘤的异种移植肿瘤中的药物浓度(nM)，其中ADC的平均载药量是8单位。
图21.相对于未处理动物，单一静脉内给予50mg/Kg的，具有PEG单元长度不同的PEG化支架和由MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc))结构所示的药物-接头的非靶向对照PEG化药物偶联物的随时间推移的以重量百分比变化所示的耐受性，其中Lp是作为平行连接物单元的赖氨酸，其中x是0(h00-43)，其中赖氨酸的ε氨基处的PEG单元被乙酰基替换，x是2(h00-43)、4(h00-42)、8(h00-18)、12(h00-17)或24(h00-16)，其中ADC的平均载药量是8单位。
图22.具有PEG单元长度不同的PEG化支架和由MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc))结构表示的药物-接头的非靶向对照PEG化的药物偶联物的尺寸排阻色谱(SEC)色谱图，其中Lp是作为平行连接物单元的赖氨酸，其中x是8(h00-18)、12(h00-17)或24(h00-16)。
图23.具有PEG单元长度不同的PEG化支架和由MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc))结构表示的药物-接头的非靶向对照PEG化的药物偶联物的拟合至双室模型的消除半衰期和分布，其中Lp是作为平行连接物单元的赖氨酸，其中x是8(h00-18)、12(h00-17)或24(h00-16)。
发明内容
本发明尤其提供配体-药物偶联物(LDC)、其制备和使用方法、及其中间体。所述配体-药物偶联物在循环中稳定，一旦其药物被载物在靶细胞附近或内部释放，所述配体-药物偶联物还能造成靶向细胞的细胞死亡，或抑制靶向细胞增殖。
在主要的实施方式中，本发明的LDC由下式I的结构表示：
其中，D是药物单元，PEG是遮蔽药物-接头的疏水性的聚乙二醇单元，Lp是允许PEG单元对于X-D平行取向的平行连接物单元，当m大于1时A是支化单元，任选地包含亚基，或者当m是1时A不存在，X是使各D从LDC释放的可释放组装单元(ReleasableAssemblyunit)，且Z是任选的间隔物单元，Lp通过其结合至靶向配体L。
在其它主要实施方式中，本发明的LDC由下式II的结构表示：
其中，AD是药物连接单元，其允许由t所示的X-D部分以平行取向另外连接至PEG单元，并且L、Lp、Z、A、X、D、m、p和s如式I所定义。
在其它主要实施方式中，本发明的LDC由下式III的结构表示：
其中AD、L、Lp、PEG、Z、A、X、D、m、p、s和t如式II所定义。
发明描述
概述
本发明部分基于以下出人意料的发现：配体-药物偶联物的聚乙二醇组分(PEG单元)的取向可对偶联物所具有的药代动力学具有深远的影响。具体而言，本发明的发明人发现：相较于不具有PEG单元或者具有相对于药物单元串联取向的PEG单元的偶联物而言，配体-药物偶联物的药物单元与PEG单元的平行设置能够改善所述偶联物的药代动力学。本发明的发明人还发现：PEG单元中存在的重复聚乙二醇亚基的数量会影响所述偶联物所具有的药代动力学。通过设计偶联物，使其具有与药物平行设置并且具有遮蔽所述药物(一些情况中，接头的组分)的疏水性的合适尺寸的PEG单元，能够制备允许较高载药量，同时保持较低负载偶联物的其它特点(例如，有利的PK性质)的配体-药物偶联物形式。进一步设计所述配体-药物偶联物以使其释放“游离”药物。
定义
除非另有说明，否则如本文所用的以下术语和短语旨在具有以下含义。当本文中使用商标名称时，除非上下文中另有指明，否则商标名称包括所述商标名称产品的产品配方、通用药物和活性药物成分。
本文中所用的“平行连接物单元”指的是：使PEG单元以平行取向连接至药物单元的支化的接头单元组分。本文中所用的短语“平行取向”、“平行设置”、“平行连接”等术语指的是这样一种构型，其中平行设置的或平行取向的或平行连接的组分以如下方式连接至平行连接单元(Lp)：其各自具有一个系连至Lp的末端，和一个游离末端。通常，Lp通过一个或多个接头单元组分连接药物单元(其中一个(或唯一的一个)是可释放组装单元)，和PEG单元，从而所述药物和PEG单元处于平行取向，从而所述药物单元的疏水性被PEG单元遮蔽。在一些方面中，经由连接至Lp的一个或多个药物连接单元(AD)提供进一步支化，从而，连接至AD的药物单元与该Lp上的PEG单元平行取向。仅对于遮蔽给定接头-药物部分的疏水性所需的那些PEG单元需要与其药物单元呈平行取向，不必要求所有药物和连接至Lp的聚乙二醇单元彼此平行取向。
本文中所用的术语“平行”指的是，始自包含配体-药物偶联物(LDC)的Lp的LDC的两个组分的支化，并非表示这两个组分在空间上并行，或在一定或其完整长度上具有相同距离。在平行取向的组分本身是支化的，并因而具有多个末端的情况下，其仍具有唯一一个系连末端。
具有相对于LDC的药物单元平行取向的PEG单元的LDC指的是，该LDC包含：具有连接至接头单元(即，平行连接物单元)的组分的一个末端和一个或多个游离的未约束的末端的PEG单元。所述PEG单元的游离的、未约束的末端可具有如下形式，例如，未反应的官能团，例如，烷氧基、羧酸、亚烷基羧酸、醇，或其它官能团。PEG单元相对于药物单元的平行取向的作用是，使配体单元和药物单元之间的原子数目最小化，这是因为PEG单元的原子不会介入所述药物单元和所述配体单元之间。在LDC中，接头单元包含能够从靶向位点处的LDC(例如，通过胞内切割)释放生物活性药物部分的可释放组装单元。在一些示例中，释放的药物部分是已被插入药物单元的母体药物，因此不保持连接至PEG单元或配体单元的降解产物。在其它示例中，释放的生物活性药物部分是母体药物，所述母体药物保留有接头单元(非PEG单元)的部分。
称为可释放组装单元的具有释放机理的接头单元组分插入Lp和药物单元之间。如同PEG单元一样，药物单元具有连接(虽然是间接地通过可释放组装单元)至平行连接物单元的一个末端，和一个或多个游离的、未约束的末端(或在一些环状药物的情况中，没有游离末端)。具有相对于药物单元呈平行(即，支化的)取向的PEG单元的LDC的示例性图示如下：
短语“串联取向”或“串联设置”或“串联连接”指的是LDC中组分的如下构型，其中该串联取向的组分以这样的方式连接：其具有两个系连末端，其中各末端连接至LDC的不同组分。具有相对于LDC的配体单元和药物单元呈串联取向的PEG单元的LDC指的是，包含在一个末端(通常间接地通过接头单元的组分)系连至配体，且在另一末端(通常间接地通过接头单元的其它组分)系连至药物单元的PEG单元的LDC。所述PEG单元的串联设置增加了配体单元和药物单元之间的原子数目，因为PEG单元的至少一些原子插入了药物单元和配体单元之间。例如，表征PEG单元的一个或多个(OCH2CH2)亚基插入药物单元和配体单元之间。具有相对于配体单元和药物单元呈串联取向的PEG单元的配体-药物偶联物的示例性图示如下：
配体-Z1-(OCH2CH2)n-Z2-药物其中Z1和Z2是接头单元的任选的延伸组分。
本文中所用的术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和显示所需生物活性的抗体片段，限制条件是，所述抗体片段具有药物-接头必需的连接位点数量。抗体天然形式是四聚体，并且包含两个相同对的免疫球蛋白链，其中各对具有一个轻链和一个重链。在各对中，轻链和重链可变区(VL和VH)一起在与抗原的结合中起主要作用。轻链和重链可变结构域包含掺杂有三个高变区(也称作“互补决定区”或”“CDR”)的框架区。恒定区可被识别，并可与免疫系统相互作用。(参见例如，Janeway等,2001,Immuno.Biology,第5版，加兰德出版社(GarlandPublishing)，纽约)。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。抗体可源自任何合适的物种。在一些方面中，抗体是人或鼠源性的。抗体可以是，例如，人、人源化或嵌合抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”指的是，获自基本均质的抗体群的抗体，即，除了可能以小量存在的天然产生的突变以外，构成该群的个体抗体是相同的。单克隆抗体具有针对某一抗原性位点的高度特异性。修饰语“单克隆”指示该抗体获自基本均质的抗体群这一特点，而不应被解释为需要通过任何特定的方法来产生抗体。
“完整抗体”是按抗体类别的需要包含抗原结合可变区，以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1、CH2、CH3和CH4)的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区(例如，人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，包含其抗原结合区域或可变区。为了用于本发明中，抗体片段必需具有药物-接头所必需的连接位点数量。所述连接位点可以是天然产生的，或非天然产生的。
“抗原”是被抗体特异性结合的实体。
术语“特异性结合”和“特异性地结合”指，所述抗体或抗体衍生物将以高度选择性的方式结合与其对应的靶抗原，并不与多数其它抗原结合。通常，所述抗体或抗体衍生物以至少约1x10-7M，且优选10-8M至10-9M、10-10M、10-11M，或10-12M的亲和性结合，并且，其与预确定的抗原结合的亲和性是其与除所述预确定的抗原或紧密相关抗原以外的、非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和性的至少两倍高。
术语"抑制"或"的抑制"指，减少了可检测的量，或完全防止。
术语“治疗有效量”指的是，有效治疗哺乳动物中的疾病或紊乱的偶联物的量。在癌症的情况中，治疗有效量的偶联物可减少癌细胞数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即，延缓至一定程度，优选终止)癌细胞浸润浸入周围器官；抑制(即，延缓至一定程度，优选终止)肿瘤转移；一定程度上抑制肿瘤生长；和/或一定程度上减轻与所述癌症相关联的一种或多种症状。就药物可抑制癌细胞生长和/或杀死现存的癌细胞的程度而言，其可能是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。就癌症治疗而言，功效可以，例如，通过评估疾病进展的时间(TTP)和/或确定响应率(RR)来检测。
除非上下文另有指明，术语“基本”或“基本上”指的是群体、混合物或样品的大多数，即>50％，优选多于群体的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％。
术语“胞内切割的”和“胞内切割”指，细胞内对于配体-药物偶联物(例如，抗体药物偶联物(ADC)等)的代谢过程或反应，由此，例如，通过可释放组装单元的作用，药物部分(D)和配体单元(例如，抗体(Ab))之间的共价连接断裂，导致游离药物在细胞内部从LDC(包括其降解产物)解离。因此，由所述解离产生的部分即是胞内代谢物。
术语“细胞毒性活性”指的是药物或配体-药物偶联物或配体-药物偶联物的胞内代谢物的杀细胞作用。细胞毒性活性可通过IC50值表示，其为暴露至细胞毒剂的细胞中的一半存活的每单位体积的浓度(摩尔或质量)。
术语“细胞生长抑制活性”指的是细胞生长抑制剂，或具有细胞生长抑制剂作为其药物单元的配体-药物偶联物，或其代谢物是细胞生长抑制剂的胞内代谢物的抗增殖作用而非杀细胞作用。
本文中所用的术语“细胞毒剂”指，具有细胞毒性活性并造成细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如，211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、60C和Lu的放射性同位素)、化疗剂，和毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素)，包括其合成的类似物及衍生物。
本文中所用的术语“细胞生长抑制剂”指的是，具有细胞生长抑制活性的物质，例如，抑制细胞的引起细胞生长或增殖或者有助于细胞生长或增殖的功能。细胞生长抑制剂包括，诸如蛋白质抑制剂(例如，酶抑制剂)的抑制剂。
术语“癌症”和“癌性”指的是，或描述哺乳动物中的，通常以失调的细胞生长为特点的生理病症或疾病。“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。
本文中，“自体免疫疾病”是源自并针对个体自身的组织或蛋白质的疾病或紊乱。
本文中所用的“患者”指的是，被给予LDC的对象。“患者”的示例包括但不限于，人、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类、猪、山羊、奶牛、马、狗、猫、鸟和家禽。通常地，患者是大鼠、小鼠、狗、非人灵长类，或人。在一些方面中，所述患者是需要有效量的LDC的人。
除非上下文中另有指明，术语“处理”或“治疗”指的是治疗性治疗和预防复发的预防性检测，其中，目标是抑制或减缓(减轻)不希望的生理变化或病症，例如，癌症的发展或扩散。出于本发明目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，症状的缓解、疾病程度减轻、疾病状况稳定(即，不恶化)、疾病进展的延缓或减慢、疾病状况的改善或减轻以及症状的缓解(部分或完全)，上述结果是可检测或不可检测的。“治疗”也可表示相对于不接受治疗的预期存活期而言的存活期延长。需要治疗的那些对象包括已患有病症或疾病的，以及倾向于患有病症或疾病的那些对象。
在癌症的情况中，术语“治疗”包括以下的任何或全部情况：抑制肿瘤细胞、癌细胞或肿瘤的生长、抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制、减轻总体肿瘤荷载，或减少癌细胞的数量，以及，改善与该疾病相关联的一种或多种症状。
在自体免疫疾病的情况中，术语“治疗”包括以下的任何或全部情况：抑制与自体免疫疾病状态相关联的细胞的复制(所述细胞包括但不限于产生自体免疫抗体的细胞)、减轻自体免疫-抗体负载，和改善自体免疫疾病的一种或多种症状。
本文中所用的短语“药学上可接受的盐”指的是，化合物(例如，药物、药物-接头，或配体-药物偶联物)的药学上可接受的有机或无机盐。该化合物可含有至少一个氨基，并且因此可与氨基形成酸加成盐。示例性的盐包括但不限于：硫酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1,1’-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以包含例如乙酸根离子、琥珀酸根离子、或其他抗衡离子的另一个分子。该抗衡离子可以是稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机部分。另外，药学上可接受的盐可在结构中具有超过一个的带电原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的示例能有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐能有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
除非另有指明，术语"烷基"，本身或作为其它术语的部分，指的是：具有所示数量的碳原子的取代或未取代的、直链或支化的、饱和或不饱和的烃(例如，“-C1-C8烷基”或“-C1-C10 ”烷基指的是分别具有1至8或1至10个碳原子的烷基基团)。未指示碳原子数量时，烷基基团具有1至8个碳原子。代表性的直链“-C1-C8烷基”基团包括但不限于，-甲基、-乙基、正丙基、-正丁基，-正戊基、-正己基，-正庚基和-正辛基；而支化的-C1-C8烷基包括但不限于，-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和-2-甲基丁基；不饱和的-C2-C8烷基包括但不限于，-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基、-3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基和-3-甲基-1丁炔基。在一些方面中，烷基基团是未取代的。烷基基团可被一个或多个基团取代。在其它方面中，烷基基团将是饱和的。
除非另有指明，"亚烷基”，本身或作为其它术语的部分，指的是：具有指定数量的碳原子(通常是1至10个碳原子)的，取代或未取代的、饱和或不饱和的、支化或直链或环状的烃基团，并且其具有源自母体烷烃的同一或两个不同碳原子的氢原子移除所产生的两个单价基团中心。典型的亚烷基基团包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。在优选的方面中，亚烷基是支化的或直链烃(即，其不是环状烃)。在本文提供的任何实施方式中，亚烷基可以是饱和亚烷基。
除非另有指明，"芳基"，其本身或作为其它术语的部分，指的是：具有6-20个碳(优选6-14个碳)原子的取代或未取代的单价碳环芳族烃基团，其源自母体芳环系统的单一碳原子上的氢原子的移除。示例性结构中，某些芳基用“Ar”表示。典型的芳基基团包括但不限于，源自苯、经取代的苯、萘、蒽，联苯基等的基团。示例性的芳基基团是苯基基团。
除非另有指明，“亚芳基”，其本身或作为其它术语的部分，是：如上定义的芳基基团，其中芳基基团的氢原子之一被键替换(即，其为二价的)并且可按如下结构中所示呈邻位、间位，或对位取向，以苯基作为示例性基团：
在所选实施方式中，例如，当平行连接物单元、支化单元或药物连接单元包含亚芳基时，该亚芳基是如上定义的芳基基团，其中所述芳基基团的氢原子中的一个或两个被键替换(即，该亚芳基可以是二价或三价的)。
除非另有指明，“C3-C8杂环”，其本身或作为其它术语的部分，指的是：具有3至8个碳原子(也称为环成员)和1至4个杂原子环成员的单价取代或未取代的芳族或非芳族单环或双环系统，所述杂原子环成员独立地选自N、O、P或S，并且，其通过从母体环系统的环原子移除一个氢原子来产生。可将杂环中的一个或多个N、C或S原子氧化。包含杂原子的环可以是芳族或非芳族环。除非另有说明，杂环在可产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接于其侧基。C3-C8杂环的代表性的示例包括但不限于，吡咯啶基、氮杂环丁烷基、哌啶基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢哌喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、嘧啶基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基和异噁唑基。
除非另有指明，“C3-C8杂环基”，其本身或作为其它术语的部分，指的是如上所述的C3-C8杂环基团，其中所述杂环基团的氢原子之一被键替换(即，其为二价的)。在所选实施方式中，例如，当平行连接物单元、支化单元或药物连接单元包含杂环基时，所述杂环基是如上定义的杂环基团，其中所述杂环基团的氢原子中的一个或两个被键替换(即，所述杂环基可以是二价或三价的)。
除非另有指明，“C3-C8碳环”，其本身或作为其它术语的部分，是3元、4元、5元、6元、7元或8元单价、取代或未取代的、饱和或不饱和的非芳族单环或双环碳环，其通过移除母环系统的环原子的一个氢原子而衍生。代表性的-C3-C8碳环包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基和环辛二烯基。
除非另有指明，“C3-C8碳环基”，其本身或作为其它术语的部分，指的是：如上定义的C3-C8碳环基团，其中碳环基团中的另一氢原子被键替换(即，其为二价的)。在所选实施方式中，例如，当平行连接物单元、支化单元或药物连接单元包含碳环基时，所述碳环基是如上定义的碳环基团，其中所述碳环基团的一个或两个氢原子被键替换(即，所述碳环可以是二价或三价的)。
除非另有指明，术语"杂烷基"，其本身或联合其它术语，指(除非另有声明)稳定的直链或支链烃或其组合，完全饱和或包含1至3不饱和度，包含说明数量的碳原子，所述碳原子的数量为1至10，优选1至3，杂原子选自下组：O、N、Si和S，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化，并且所述氮杂原子可任选地被季铵化。所述杂原子O、N和S可处于所述杂烷基基团的任何内部位置，或处于所述烷基基团与所述分子的剩余部分连接的位置。杂原子Si可位于杂烷基的任何位置上，包括烷基与该分子其余部分连接的位置。示例包括：–CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-O-CH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。在优选实施方式中，C1-C4杂烷基或杂亚烷基具有1-4个碳原子和1或2个杂原子，而C1-C3杂烷基或杂亚烷基具有1-3个碳原子和1或2个杂原子。在一些方面中，杂烷基或杂亚烷基是饱和的。
除非另有指明，术语"杂亚烷基"，其本身或作为另一种取代基的部分，指的是：源自杂烷基(如上所述)的二价基团，如–CH2-CH2-S-CH2-CH2-和–CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-示例。在杂亚烷基中，杂原子也可占据一个或两个链末端的位置。另外，在亚烷基和杂亚烷基连接基团中，不限定连接基团的取向。在所选实施方式中，例如，当平行连接物单元、支化单元或药物连接单元包含杂亚烷基时，所述杂亚烷基是如上定义的杂烷基基团，其中所述杂烷基基团的氢原子中的一个或两个被键替换(即，所述杂亚烷基可以是二价或三价的)。
"取代的烷基”和“取代的芳基"分别指烷基和芳基，其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基替换。典型的取代基包括但不限于，-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(＝S)OR、C(＝O)SR、C(＝S)SR、C(＝O)NR2、C(＝S)NR2，或C(＝NR)NR2，其中各X独立地是卤素：-F、-Cl、-Br或-I；并且各R独立地是-H、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基、-C3-C14杂环、保护基团或前药部分。典型的取代基还包括(＝O)。如上所述的的亚烷基、碳环(carbocycle)、碳环基(carbocyclo)、亚芳基、杂烷基、杂亚烷基、杂环和杂环基基团也可被类似地取代。
本文中所用的术语“游离药物”指的是：不通过直接或间接方式共价连接至PEG单元或配体单元的降解产物的生物活性药物部分。游离药物可以指这样的药物，其通过LDC中的可释放组装单元提供的释放机理从接头单元切割之后立即存在，或经历后续细胞内转化或代谢。在一些方面中，所述游离药物将具有H-D形式，或可以带电部分的形式存在。所述游离药物是能够发挥所需生物学作用的药学活性物质。在一些方面中，所述药学活性物质可以不是母体药物，并且可包括接头单元的组分，其尚未经历后续的胞内代谢。
配体-药物偶联物化合物和相关的中间体
本发明部分基于如下发现：具有不利的PK性质的配体-药物偶联物(LDC)可如本文所述地，通过设置相对于其药物单元平行取向的PEG单元来改善其PK性质。在一些方面中，该PEG化的偶联物的清除概况与未偶联的配体(即，靶向剂、例如抗体，或有关的抗原结合片段)的清除概况类似，即便在具有高载药量时也是如此。LDC包含配体单元(即，靶向配体)、接头单元和药物单元。接头单元在其连接至靶向配体之前或之后，将药物单元与配体单元连接，并且包含相对于所述药物单元呈平行构型的PEG单元。该平行构型通过可释放组装单元使药物单元和PEG单元连接至平行连接物单元而产生。接头单元在其与药物单元连接时可称作药物-接头。LDC的群的平均药物-接头载量将优选是每配体单元至少约6、约7或约8个药物-接头。
设计PEG单元以提供优化水平的药物-接头的疏水组分的疏水性遮蔽。由此，本文教导的PEG单元的引入特别适于这样的药物-接头：所述药物-接头在其它情况下将具有充足疏水性以不利影响所得偶联物的药代动力学(相比未偶联的配体)。那些较差的药代动力学包括较高的血浆清除率。因此，相对于未偶联的配体显示显著较高的血浆清除率和相应较低的血浆暴露率的配体药物偶联物将受益于本发明。
配体-药物偶联物具有更有利的药代动力学性质，这归因于药物单元的疏水药物-接头部分和PEG单元的平行取向，由此，所述药物单元和/或药物-接头部分的其它组分的疏水性对于血浆清除率的负面影响得到降低或消除(即，遮蔽了药物-接头部分的疏水性)。所述平行取向通过平行连接物单元(LP)来实现，因为所述平行连接物单元起到以合适支化构型连接药物单元、PEG单元和配体的作用，以提供所需的平行取向。平行连接物单元可被视作具有供于偶联物组分的连接位点的支架，其可以是多重的，以具有与PEG单元平行取向的多重药物单元，从而提供PEG化的多重支架。在一些实施方式中，通过平行取向的PEG单元而被遮蔽了疏水性的药物-接头部分中的疏水组分是疏水药物单元。
所述药物单元通过可释放组装单元连接至平行连接物单元。所述可释放组装单元允许在靶细胞处有效地释放药物，足以诱导，例如，细胞毒性或细胞生长抑制性(cytostaticity)。通常而言，设计所述可释放组装单元以在所述偶联物一旦被内化进入靶细胞时就有效地释放游离药物，但也可以设计成在靶细胞附近释放游离药物。供于切割的合适的识别位点是允许有效释放LDC的药物单元的那些。通常而言，所述识别位点是肽切割位点(例如，基于肽的可释放组装单元形式)、糖切割位点(例如，基于糖的可释放组装单元形式)，或二硫化切割位点(例如，基于二硫化物的可释放组装单元形式)。肽切割位点的示例包括被胞内蛋白酶识别的那些，例如溶酶体中存在的那些。糖切割位点的示例包括被糖苷酶(包括葡糖醛酸酶，例如β-葡糖醛酸酶)识别的那些。
任何生物活性化合物(即，药物)均可用作本发明中的药物单元。生物活性化合物可具有适合用于将其作为药物单元纳入LDC中的位点，或可经修饰以达到其目的，同时在从LDC释放可能保留或可能未保留接头单元的一部分的经修饰药物时实质上仍保留母体药物所需的生物活性。优选的药物单元提供母体生物活性化合物的释放。所述药物单元可以是奥瑞他汀(auristatin)或非奥瑞他汀药物，其为疏水性由平行取向的药物单元遮蔽了的药物-接头部分的疏水组分。本发明的作用在其中所述药物单元、可释放组装单元，或药物单元/可释放组装单元的组合具有天然疏水性，由此对所得偶联物的药代动力学具有不利影响的实施方式中更为显著。疏水药物的示例，包括单甲基奥瑞他汀E，和疏水性与单甲基奥瑞他汀E相当或大于单甲基奥瑞他汀E的药物。疏水可释放组装单元的示例包括：具有本文中具体示例的疏水自分解型组分的基于肽的和基于糖的可释放组装单元，以及疏水性相当于或大于这样的可释放组装单元的可释放组装单元。
疏水性可以采用SlogP检测。SlogP定义为辛醇/水分配系数(包括隐式氢)的对数，并且可以采用来自化学计算集团(化学Computinggroup)的程序MOETM计算(SlogP值采用如下方式计算：Wildman,S.A.，Crippen，G.M.；通过原子加和法进行生理化学参数的预测(PredictionofPhysio化学参数byAtomicContributions)；J.Chem.Inf.Comput.Sci.39第5号(1999)868–873)。当提及疏水性与参比药物单元或可释放组装单元相当的药物单元或可释放组装单元时，所述SlogP值将在参比药物单元或可释放组装单元的SlogP值的20％之内，优选10％之内。
鉴于上述内容，本发明在一组实施方式中提供配体-药物偶联物组合物，其包含配体-药物偶联物的群。所述配体-药物偶联物包含配体单元和与其连接的多个药物-接头单元。优选地，所述组合物中，每配体具有平均约6至约14、约6至约12、约6至约10、约8至约14、约8至约12、约8至约10个药物-接头单元。示例性地，通过硫醚连接与至所述配体连接。配体上的示例性的偶联位点是由引入所述配体的链间二硫残基和/或含巯基残基(例如，引入的半胱氨酸)的还原而获得的巯基基团。连接可以是，例如，通过源自链间二硫基和源自0-8个引入的半胱氨酸残基的巯基残基。
在一组相关的实施方式中，提供用于给予患者所述配体-药物偶联物来治疗疾病的方法。所述疾病可以是，例如，癌症或自体免疫疾病。所述配体-药物偶联物以治疗有效量且按照治疗有效的方案给予。
实施方式
下文描述本发明的多种实施方式，之后是对于组成所述配体-药物偶联物及其中间体的组分进行的更为详细的描述。如本文所述，任何关于所述配体-药物偶联物及其中间体的组分的所选实施方式均可适用于本文所述的本发明的各个和所有方面，或其可相关于单一方面。所选的实施方式可以任何组合方式联合在一起。
配体-药物偶联物化合物
在一组实施方式中，本文提供能够释放游离药物的LDC化合物或其药学上可接受的盐，其中所述LDC化合物由下式AA所示：
其中，
L是配体单元；
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z是延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化单元；
下标p是1至14的整数，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至约12)；
下标m是1至4的整数；并且优选是1或2；和
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
在另一组实施方式中，式AA不表示个体LDC化合物，而是LDC组合物(即，包含个体LDC化合物的群的组合物)。在所述实施方式中，p表示所述组合物中每配体的平均药物-接头数目。在所述实施方式中，p通常不是整数值，并且可在1至约14范围内，优选约2至约12(优选约6至约14、约6至约12、约8至约14或约8至约12)。其它变量(例如，L、Z、A、LP、PEG、X、D、s和m)保持不变。
在另一组实施方式中，LDC组合物包含LDC化合物的群，个体LDC化合物由式AA表示，其中对于各个体LDC化合物，p独立地选自1至14的整数，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至约12)，并且所述组合物中每配体的平均药物-接头数目是1至约14，优选约2至约12(优选约6至约14、约6至约12、约8至约14或约8至约12)。
在一些方面中，1至32，或2至32(优选6至32或8至32)个药物单元与各配体单元连接。配体-药物偶联物的群可具有：每配体平均1至32或约2至32(优选约6至32或约8至32)个药物单元。
由式AA表示的LDC化合物或LDC组合物的所选实施方式包括那些实施例，其中：
1)m是1且s是0；
2)m是2至4且s是1；
3)m是2且s是1；
4)m是1；s是0；并且，对于LDC化合物，p是6至14、8至14，或8至12的整数，或者对于LDC组合物，p是6至约14、约8至约14，或约8至约12的数字；
5)m是2-4；s是1；并且，对于LDC化合物，p是6至14、8至14，或8至12的整数，或者对于LDC组合物，p是6至约14、约8至约14，或约8至约12的数字；
6)m是2；s是1；并且，对于LDC化合物，p是6至14、8至14，或8至12的整数；或者对于LDC组合物，p是6至约14、约8至约14，或约8至约12的数字；
7)m是2；s是1；且p是8
8)m是1；s是0；且p是8
9)该段落中实施方式1-8中的任一项，其中有1至32或约2至32(优选约6至约32或约8至约32)个药物单元连接至配体单元。
10)该段落中实施方式1-9中的任一项，其中LP是天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺。
由式AA所示的LDC化合物或LDC组合物的所选实施方式具有下式AA1和AA2：
或其药学上可接受的盐，其中，
L是配体单元；
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z是延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是存在的支化单元；和
对于配体-药物偶联物化合物，下标p是1至14的整数，且优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至12)的范围，或者对于配体-药物偶联物组合物，p是1至约14的数字，且优选约2至约12(优选约6至约14，约6至约12，约8至约14或约8至约12)的范围。
在本文提供的对于LDC化合物的其中p值存在(包括上述那些)的任何所选实施方式中，p可以是1至14、2至14、2至10，4至12，6至14、6至12、8至12或8至10的整数。下标p可以是1，或2，或3，或4，或5，或6，或7，或8，或9，或10，或11，或12，或13，或14。
在本文提供的其中p值存在(包括上述那些)的LDC组合物的任何所选实施方式中，p的范围是1至约14、约2至约14、约2至约10、约4至约12、约6至约14、约6至约12、约8至约12或约8至约10。下标p可以是1或约1，或2或约2，或3或约3，或4或约4，或5或约5，或6或约6，或7或约7，或8或约8，或9或约9，或10或约10，或11或约11，或12或约12，或13或约13，或14或约14。
在另一组实施方式中，本文提供能够释放游离药物的配体-药物偶联物(LDC)，其中有1至32个药物单元(优选2至32个药物单元，6至32个药物单元，8至32个药物单元，6至14个药物单元，约8至约14个药物单元，或约8至约12个药物单元)通过接头单元偶联至LDC的靶向配体，其中药物-接头部分的各药物单元通过可切割组分(即，可释放组装单元)连接至其接头单元，所述可切割组分在通过配体(L)靶向的位点附近释放游离药物，并且其中所述LDC还包含连接有配体单元的平行连接物单元(Lp)和聚乙二醇(PEG)单元，其中所述PEG和接头-药物部分的药物单元彼此以平行取向连接。聚乙二醇单元具有4至72个(优选6至72个重复–OCH2CH2-单元，更优选6至36个，或8至24个)重复单元。所述配体可以是抗体单元，优选完整抗体单元。所述可切割接头可包含，例如，肽切割位点、糖切割位点，或二硫化切割位点。所述药物可以是奥瑞他汀或非奥瑞他汀。奥瑞他汀或非奥瑞他汀可具有与单甲基奥瑞他汀E相当的疏水性或大于单甲基奥瑞他汀E的疏水性。奥瑞他汀可以是单甲基奥瑞他汀E。在一些方面中，相较于缺乏所述PEG单元或包含所述PEG单元但相对于抗体和药物处于串联取向的相同或基本相同的ADC，所述ADC显示改善的药代动力学性质。在一些方面中，所述ADC显示与未偶联时的抗体组分相同或基本相同的药代动力学性质。
药物-接头化合物
在一些方面中，设计所述配体-药物偶联物时，希望在与所述配体单元偶联之前合成完整药物-接头。在所述实施方式中，药物-接头化合物起中间体化合物的作用。如下提供示例性药物-接头化合物或其药学上可接受的盐，所述药物-接头化合物的结构由式BB所示：
其中
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化单元；
下标m是1至4的整数；并且优选是1或2；
下标s是0或1，限制条件是当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2至4。
式BB的所选实施方式包括那些实施方式，其中：
1)m是1且s是0；
2)m是2、3或4且s是1；
3)m是2且s是1；
4)该段落中实施方式1-3中的任一项，其中LP是天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺。
式BB的所选实施方式包括下式：
或其药学上可接受的盐，其中
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；且
A是存在的支化单元。
中间体接头化合物
在一些方面中，当设计所述配体-药物偶联物时，希望先将所述接头的组分与所述配体单元(例如，抗体)偶联，然后连接所述配体-药物偶联物的-X-D组分。例如，在采用含巯基取代基(例如，半胱氨酸)来连接–X-D组分的实施方式中，可能希望先将所述接头的组分与所述配体单元(例如，抗体)偶联，然后连接所述配体-药物偶联物的-X-D组分。在一些所述实施方式中，平行连接物单元能够与可释放组装单元形成共价连接，但并非与之相连。所述平行连接物单元可由保护基团保护以便利合成。所述保护基团可以在与可释放组装单元连接之前移除。
如下提供具有式CC的示例性中间体接头化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
A是任选的支化单元；
LP'是能够与药物-释放单元形成共价连接的平行连接物单元；
下标m是1至4的整数；并且优选是1或2；和
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
式CC的所选实施方式包括下式：
或其药学上可接受的盐，其中
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元；
A是支化单元；且
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元。
在一些方面中，所述中间体接头化合物将偶联至所述配体单元，以形成中间体配体-接头化合物。中间体配体-接头化合物的示例性实施方式由下方显示的结构所示：
或其药学上可接受的盐，其中
L是配体单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z是延伸单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；
A是任选的支化单元；
下标p是1至14，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至12)的整数；
下标m是1至4的整数；优选1或2；和
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
在另一组实施方式中，式DD不表示个体中间体配体-接头化合物，而是包含个体中间体配体-接头化合物的群的组合物。在所述实施方式中，p表示所述组合物中每配体的平均中间体接头数目。在所述实施方式中，p通常不是整数值，并且可在1至约14范围内，优选约2至约12(优选约6至约14、约6至约12、约8至约14或约8至约12)。其它变量(例如，L、Z、A、LP、PEG、s和m)保持不变。
式DD的所选实施方式包括下式：
或其药学上可接受的盐，其中
L是配体单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z-是延伸单元；
-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；
A是支化单元；且
对于中间体配体-接头化合物，下标p是1至14，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至12)的整数，或者对于中间体配体-接头组合物，下标p是1至约14，优选约2至约12(优选约6至约14、约6至约12、约8至约14或约8至约12)的数字。
其它实施方式
式AA的偶联物及其中间体允许以1:1的比率在每个PEG单元包含一个药物单元。然而，可能希望提供具有1个药物/PEG单元或2个或更多个药物/PEG单元的药物偶联物。因此，本发明提供具有至少一个药物/PEG单元及其中间体的配体-药物偶联物。
本领域技术人员应理解，只要配体-药物偶联物的核心组分(即，配体单元、延伸单元、平行连接物单元、PEG单元、可释放组装单元和药物单元)存在，包含其它药物单元的配体-药物偶联物的合成可采用本文提供的教导而容易地实现。其它支化单元和/或药物连接单元的纳入允许每个PEG单元连接多个药物。其它–X-D单元通过支化单元或药物连接单元连接。
在一组实施方式中，所述能够释放游离药物的LDC化合物由式(I)、(II)或(III)表示：
或其药学上可接受的盐，其中，
L是配体单元；
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z是延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化单元；
AD是药物连接单元；
下标p是1至14，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至12)的整数
下标t是0至8的整数，且优选是0、1、2或3；
下标m是1至4的整数；且优选是1或2；和
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
在另一组实施方式中，式I、II和III不表示个体LDC化合物，而是LDC组合物(即，包含个体LDC化合物的群的组合物)。在所述实施方式中，p表示所述组合物中每配体的平均药物-接头数目。在所述实施方式中，p通常不是整数值，并且可在1至约14范围内，优选约2至约12(优选约6至约14、约6至约12、约8至约14或约8至约12)。其它变量(例如，L、Z、A、LP、PEG、X、D、AD、s、m和t)保持不变。
在另一组实施方式中，LDC组合物包含LDC化合物的群，个体LDC化合物由式I、II或II表示，其中对于各个体LDC化合物，p是独立地选自1至14的整数，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至约12)。
并且所述组合物中每配体的平均药物-接头数目是1至约14，优选约2至约12(优选约6至约14，约6至约12，约8至约14或约8至约12)个。
在一些方面中，1至32，或2至32(优选6至32或8至32)个药物单元与各配体单元连接。配体-药物偶联物的群可具有：每配体平均1至32或约2至32(优选约6至32或约8至32)个药物单元。
式I、II和III的所选实施方式包括那些实施方式，其中：
1)m是1且s是0；
2)m是2、3或4且s是1；
3)m是2且s是1；
4)m是1；s是0；且对于配体-药物偶联物化合物，p是2至12、4至12、8至14，或8至12的整数，或者，对于配体-药物偶联物组合物，p是约2至约12、约4至约12、约8至约14，或约8至约12的数字；
5)m是2、3或4；s是1；且对于配体-药物偶联物化合物，p是约2至约12、约4至约12、约8至约14，或约8至约12的整数，或者，对于配体-药物偶联物组合物，p是约2至约12、约4至约12、约8至约14，或约8至约12的数字；
6)m是2；s是1；且对于配体-药物偶联物化合物，p是2至12、4至12、6至14、6至12、8至14，或约8至约12的整数，或者，对于配体-药物偶联物组合物，p是约2至约12、约4至约12、约6至约14、约6至约12、约8至约14，或约8至约12的数字；
7)m是2；s是1；且p是8；
8)m是1；s是0；且p是8；
9)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是0；
10)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是1-8；
11)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是1；
12)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是2；
13)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是3；
14)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是4；
15)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是5；
16)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是6；
17)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是7；
18)在该段落实施方式1-8中任一项，其中t是8；
19)在该段落实施方式1-18中任一项，其中有1至32，或约2至32个药物单元连接至所述配体单元；
20)在该段落实施方式1-18中任一项，其中有6至32，或约8至32个药物单元连接至所述配体单元；和
21)该段落中实施方式1-20中的任一项，其中LP是天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺。
在本文提供的对于LDC化合物的其中p值存在(包括上述那些)的任何所选实施方式中，p可以是1至14、2至14、2至10，4至12，6至14、6至12、8至12或8至10的整数。下标p可以是1，或2，或3，或4，或5，或6，或7，或8，或9，或10，或11，或12，或13，或14。
在本文提供的其中p值存在(包括上述那些)的LDC组合物的任何所选实施方式中，p的范围是1至约14、约2至约14、约2至约10、约4至约12、约6至约14、约6至约12、约8至约12或约8至约10。下标p可以是1或约1，或2或约2，或3或约3，或4或约4，或5或约5，或6或约6，或7或约7，或8或约8，或9或约9，或10或约10，或11或约11，或12或约12，或13或约13，或14或约14。其它变量(例如，L、Z、A、LP、PEG、X、D、AD、s、m和t)保持不变。
式I、II和III的所选实施方式包括下式Ia、Ib、IIa、IIb、IIb、IIIa和IIIb。
或其药学上可接受的盐，其中，
L是配体单元；
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z是延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化单元；和
AD是药物连接单元；
对于配体-药物偶联物化合物，下标p是1至14，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14，或8至12)的整数，或者，对于配体-药物偶联物组合物，下标p是1至约14，优选约2至约12(优选约6至约14，约6至约12，约8至约14，或约8至约12)的数字；和
下标t是0至8的整数，且优选是0、1、2或3。
式Ia、Ib、IIa、IIb、IIb、IIc、IIIa和IIIb的所选实施方式包括那些实施方式，其中：
1)t是0；
2)t是1至8；
3)t是1；
4)t是2；
5)t是3；
6)t是4；
7)t是5；
8)t是7；
9)t是8；
10)该段落的实施方式1-10中任一项，其中有1至32、约2至32、6至32或约8至32个药物单元连接至配体单元；和
11)该段落中实施方式1-11中的任一项，其中LP是天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺。
对于LDC组合物，式Ia、Ib、IIa、IIb、IIb、IIc、IIIa和IIIb的实施方式包括那些实施方式，其中p是6至约12、约8至约12和约8至约10的数字。对于那些组合物，下标p可以是6或约6，或7或约7，或8或约8，或9或约9，或10或约10，或11或约11，或12或约12，或13或约13，或14或约14。在这些实施方式中任一项，t可以是0至8、1至8，或0、1、2、3、4、5、6、7，或8。
对于LDC化合物，式Ia、Ib、IIa、IIb、IIb、IIc、IIIa和IIIb的实施方式包括那些实施方式，其中p是6至12、8至12和8至10的整数。下标p可以是6、7、8、9、10、11、12、13或14。在这些实施方式中任一项，t可以是0至8、1至8，或0、1、2、3、4、5、6、7，或8。
药物-接头化合物
如下提供具有至少1个药物/PEG单元的示例性药物-接头化合物，其具有式IV、V、VI：
或其药学上可接受的盐，其中
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化；
AD是药物连接单元；
下标t是0至8的整数，且优选是0、1、2或3；
下标m是1至4的整数；并且优选是1或2；
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
式IV、V和VI的所选实施方式包括那些实施方式，其中：
1)m是1且s是0；
2)m是2至4且s是1；
3)m是2且s是1；
4)在该段落实施方式1-3中任一项，其中t是0；
5)在该段落实施方式1-3中任一项，其中t是1；
6)在该段落实施方式1-3中任一项，其中t是2；和
7)该段落中实施方式1-6中的任一项，其中LP是天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺。
式IV、V和VI的所选实施方式包括下式：
或其药学上可接受的盐，其中
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化；
AD是药物连接单元；和
下标t是0至8的整数；且优选是0、1、2或3。
中间体接头化合物
包含至少一个药物/PEG单元的示例性中间体接头化合物如下具有式VII、VIII或IX：
或其药学上可接受的盐，其中
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
A'是能够与2至4个X-D单元(优选两个X-D单元)形成共价连接的支化单元；
A是任选的支化单元；
AD'是能够与–X-D单元形成共价连接的药物连接单元；
LP是平行连接物单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；
下标t是0至8的整数，且优选是0、1、2或3；
下标m是1至4的整数；并且优选是1或2；
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4；和
其中，-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元。
式VIII或IX的所选实施方式包括如下结构：
或其药学上可接受的盐，其中
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
A是支化单元；
AD'是能够与–X-D单元形成共价连接的药物连接单元；
LP是平行连接物单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；和
下标t是0至8的整数，且优选是0、1、2或3；和
其中-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元。
所述中间体接头化合物和式VII、VIII、XI、VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa和IXb，所述延伸单元可偶联至配体单元(例如，抗体)以形成中间体配体-接头化合物，其提供连接至各配体单元的1至14个接头。下文显示示例性实施方式，其中p是1至14，并且所有其它可变基团如本文中关于中间体接头化合物所述。包含这些化合物(即，配体-接头组合物)的示例性配体-接头化合物和组合物如下，具有式X、XI、XII所示的结构
或其药学上可接受的盐，其中
L是配体单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z-是延伸单元；
-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；
A'是能够与2至4个X-D单元(优选两个X-D单元)形成共价连接的支化单元；
A是任选的支化单元；
AD'是能够与X-D单元形成共价连接的药物连接单元；
对于配体-接头化合物，下标p是1至14，优选2至12(优选6至约14，约6至约12，约8至约14或约8至约12)的整数，或
对于配体-接头组合物，下标p是1至约14，优选约2至约12(优选约6至约14，约6至约12，约8至约14或约8至约12)的数字；
下标t是0至8；并且优选是0、1、2或3；
下标m是1至4的整数；且优选是1或2；和
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
式XI和XII的所选实施方式包括下式。
或其药学上可接受的盐，其中
L是配体单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z-是延伸单元；
LP是平行连接物单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；
A是支化单元；
AD'是能够与X-D单元形成共价连接的药物连接单元；
对于配体-接头化合物，下标p是1至14，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14，或8至12)的整数，或
对于配体-接头组合物，下标p是1至约14，优选约2至约12(优选约6至约14，约6至约12，约8至约14或约8至约12)的数字；和
下标t是0至8；和
其中-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元。
组分基团
本文所述的配体-药物偶联物和中间体化合物的重要之处在于，使PEG单元与其药物单元平行取向设置，以影响所得的LDC的药代动力学。PEG单元的设置由平行连接物单元实现。平行连接物单元用于使配体连接至聚乙二醇单元和药物单元，使得PEG和药物单元呈平行构型，这让所述配体、PEG和药物单元以支化的构型排列。因此，所述平行连接物单元可被视作具有所述配体-药物偶联物和中间体化合物的组分的连接位点的支架，供于其制备。
为了起到平行连接物的作用，LP单元通过所述接头中的三个连接位点连接。所述连接位点之一将所述LP单元连接至PEG单元。第二个连接位点将所述LP单元连接至所述可释放组装单元(在一些示例中，通过支化单元A或药物连接单元AD)。第三个连接位点将所述LP单元连接至所述延伸单元(在一些示例中，通过药物连接单元、AD和/或支化单元A)。所述平行连接物单元是区分于PEG单元的单元，并且通过所述PEG单元的PEG连接单元组分与其连接。换言之，所述平行连接物单元不是PEG单元的亚基。
对于具有多于一个药物/PEG单元的配体-药物偶联物及其中间体，所述平行连接物单元与所述可释放组装单元的连接可通过支化单元或药物连接单元进行。所述平行连接物单元与所述延伸单元的连接可通过药物连接单元AD和/或任选的，其它支化单元来进行。在所有这些实施方式，所述LP单元可被视作是三功能性的化学部分，其能够将三个隔开的化学部分共价连接在一起。应理解，就选择中间体化合物而言，所述LP单元由LP'表示，并且尚未通过药物释放单元连接至药物，但具有用于连接至药物的任选地经保护的官能团(例如，通过药物释放单元)。应理解，术语三功能的用于表示三个连接位点，并非LP或LP'单元上存在的官能团的数量。
平行连接物单元可由一个或多个(通常是1至5或1至4或1至3或1或2个)天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺制备。
应理解，当述及本发明的偶联物或中间体中存在的天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺(其为LP单元或本文所述的偶联物或中间体的其它组分的部分)时，所述氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺将以残基形式存在，本文中也称为组装形式。例如，在实施方式中，其中所述平行连接物单元是两个氨基酸，该两个氨基酸将以残基形式存在，其间具有肽键。在其中平行连接物单元包含氨基醇的实施方式中，所述氨基醇将以残基形式存在，其中，例如，其氨基基团结合至所述平行连接物单元的另一个残基，或所述偶联物的另一个组分，通过该其它残基/组分的含羰基的官能团结合，而其羟基基团以醚形式结合至，或通过所述平行连接物单元的另一个残基或所述偶联物的另一个组分的含羰基官能团结合。在其中平行连接物单元包含氨基醛的实施方式中，所述氨基醛将以残基形式存在，其中，例如，其氨基基团结合至所述平行连接物单元的另一残基或所述偶联物的另一组分，通过该其它残基/组分的含羰基官能团结合，而其醛官能团被转化成亚氨基官能团，或者在结合至平行连接物单元的另一残基或偶联物的另一组分的氨基基团时，通过后续还原以提供氮-碳键。氨基醇或氨基醛可源自天然或非天然氨基酸，通过将其羧酸官能团还原成醛或羟基官能团来获得。
当平行连接物单元残基是该单元的支化残基时，应理解，该残基将具有第三官能团，其与平行连接物单元、–X-D部分或PEG单元的另一残基或接头单元的其它组分结合。例如，所述平行连接单元的氨基酸或其它含胺酸残基可具有或可以被官能化的侧链取代，以提供支化残基所需的三个必需连接点。例如，丝氨酸具有三个官能团，即，酸、氨基和羟基官能团，并且为了达到其纳入平行连接物单元中的目的可视为经联合的氨基酸和氨基醇残基。酪氨酸也包含羟基基团，在该情况中，处于其酚侧链中，并且为了达到其作为支化残基纳入平行连接物单元中的目的，也可视作与丝氨酸类似。
在另一个示例中，当平行连接物单元的支化残基是半胱氨酸时，其氨基和羧酸基团将以先前针对氨基酸或含胺酸所述的方式以残基形式存在，以提供用于支化残基的三个必需连接点中的两个，而其巯基基团在作为二硫键或硫-碳键结合至-X-D部分，或PEG单元或接头单元的其它组分时，例如，当巯基官能团与接头单元组分的包含马来酰亚胺的基团反应时，将以残基形式存在。在一些示例中，当结合至平行连接物单元的另一残基或接头单元的另一组分时，残基巯基基团是其氧化形式(即，–S(＝O)-或–S(＝O)2-)。在另一个示例中，赖氨酸的α氨基和羧酸基团将以其残基形式存在，以提供平行连接物单元的支化残基所需的三个必需连接点中的两个，而其呈其残基形式的ε氨基基团提供第三连接点。组氨酸也可视为具有两个氨基基团的氨基酸，其中第二氨基基团是含咪唑侧链的NH。
在另一个示例中，当平行连接物单元的支化残基是天冬氨酸或谷氨酸时，呈其残基形式的氨基酸的α氨基和C-末端羧酸基团提供平行连接物单元的支化残基所需的三个必需连接点中的两个，而呈其残基形式的β或γ羧酸基团提供第三连接点。在那些情况下，当天然产生的氨基酸被描述为平行连接物单元的残基，但并非天然含有官能化的氨基酸侧链，又必需是支化残基时，应理解，氨基酸结构在呈残基形式以提供第三必需连接点时经修饰以具有除其氨基和羧酸官能团以外的其它官能团。例如，具有脂族侧链的氨基酸可在其侧链的碳处被羟基、氨基、醛、巯基、羧酸基团或其它官能团取代或其它部分(例如，芳基或芳基烷基)被这些官能团中任一种取代，以提供具有三个必需连接点的非天然氨基酸。如上文针对氨基酸和残基形式的引入的官能团所述，将此类非天然氨基酸纳入平行连接物单元。
类似地，当氨基醛或氨基醇作为支化残基被纳入平行连接单元时，该氨基醛或氨基醇将具有第三官能团，以与其氨基和醛官能团一同提供三个必需连接点。在那些情况中，氨基醛或氨基醇可在结构上对应于具有官能化的侧链的天然氨基酸或具有引入到天然氨基酸的侧链中的官能团的非天然氨基酸，如上所述，其中天然或非天然氨基酸的羧酸被还原成羟基或醛官能团。
氨基酸可以是α、β或γ氨基酸或其它含胺酸化合物，并且，如果其包含结合天然或非天然氨基酸侧链的手性碳，则可以呈其D或L异构体。当平行连接物单元包含多于一种天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺时，所述氨基酸、氨基醇、氨基醛、多胺或其组合通过共价键连接在一起以形成平行连接物单元。
所述氨基酸、氨基醇或氨基醛可以是非天然的，并且可以经修饰以具有官能化的侧链，以供连接至所述偶联物或中间体化合物的组分(如上文关于平行连接物单元的支化残基所述)，视具体情况而定。示例性官能化的氨基酸，氨基醇，或氨基醛包括，例如，叠氮基或炔烃官能化的氨基酸、氨基醇或氨基醛(例如，用于采用点击化学连接的经修饰以具有叠氮基基团或炔基基团的氨基酸、氨基醇或氨基醛)。用于对氨基酸上存在的官能团(例如，胺部分、羧酸部分和侧链部分(例如，氨基部分、羟基基团、另一羧酸、巯基、叠氮基或炔基))进行独立活化和反应的方法是本领域熟知的。
平行连接物单元可包含一个或多个(通常为1至5或1至4或1至3或1或2个)氨基酸、任选被取代的C1-20杂亚烷基(优选任选被取代的C1-12杂亚烷基)、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基、任选被取代的C3-C8碳环基，或其组合。在一些方面中，平行连接物单元包含不多于两个或不多于一个任选被取代的C1-20杂亚烷基、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基。任选的取代基包括(＝O)、-X、-R、-OR、-SR、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO＝ 3、-PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2-、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2或-C(＝NR)NR2，其中各X独立地是卤素：-F、-Cl、-Br或-I；并且各R独立地是-H、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基、-C3-C14杂环、保护基团或前药部分。优选的任选的取代基是(＝O)、-X、-R、-OR、-SR和-NR2。
平行连接物单元可以是直链或支化的链，并且可以由式A表示：
其中
AA1是LP的亚基，其独立地选自：氨基酸、任选被取代的C1-20杂亚烷基(优选任选被取代的C1-12杂亚烷基)、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基；下标u独立地选自0至4；且波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体中的共价连接位点。任选被取代的杂亚烷基、杂环、亚芳基或碳环基将具有用于在亚基之间和配体-药物偶联物或其中间体内部连接的官能团。
在一些方面中，AA1的至少一个示例是氨基酸。下标u可以是0、1、2、3或4。在一些方面中，AA1是氨基酸且u是0。在一些方面中，平行连接物单元包含不多于两个任选被取代的C1-20杂亚烷基、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基。在一些方面中，其中所述平行连接物单元具有式A，所述平行连接物单元包含不多于1个任选被取代的C1-20杂亚烷基、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基。
平行连接物单元或其氨基酸亚基可以是α、β或γ氨基酸，可以是天然或非天然的。氨基酸可以是D或L异构体。平行连接物单元内的连接或与所述偶联物(或接头)的其它组分的连接可以，例如，通过氨基、羧基，或其它官能实现。用于官能团的独立活化和反应的方法是本领域熟知的。
平行连接物单元或其氨基酸亚基可独立地选自含巯基的氨基酸的D或L异构体。含巯基氨基酸可以是，例如，半胱氨酸、高半胱氨酸，或青霉胺。
平行连接物单元或其氨基酸亚基可独立地选自下组：如下氨基酸的L-或D-异构体：丙氨酸(包括β-丙氨酸)、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、B-丙氨酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸，及其衍生物。
优选的氨基酸包括：半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和丙氨酸。
示例性的LP或其AA1亚基包括：
其中R110是
R111独立地选自氢、对羟基苄基、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、
其中星号表示与标记了x的碳的连接；
R100独立地选自氢或-C1-C3烷基(优选氢或CH3)，
R13独立地选自下组：-C1-C6亚烃基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-和-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-(优选–CH2-CH2-)；
Y是-
Y'是–C(＝O)-、-O-,-S-、-NH-或-N(CH3)-，和
下标p、q和d是独立地选自0至5的整数；并且波浪线表示化合物内的共价连接、氢、OH或C1-3未取代的烷基基团，限制条件是波浪线中至少有一根指示化合物内的共价连接。在一些方面中，化合物内的所有波浪线表示共价连接(例如，当LP不包含任何亚基时)。
在一组实施方式中，LP是具有能够独立地与所示组分形成共价连接的官能团的杂环(例如，由三聚氯化氰形成的三唑杂环)。在另一组实施方式中，LP是具有如上所述的连接的官能团的烷烃。而在其它实施方式中，LP可以是氮原子。
在一些实施方式中，-LP-，一旦组装即具有下式：
其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的连接位点(例如，PEG，至–X(直接或间接通过A或AD)和Z(直接或间接通过A或AD)，并且其中R110是
其中星号表示与标记x的碳的连接，且波浪线表示三个连接位点之一；
R100独立地选自氢或-C1-C3烷基，优选氢或CH3，
Y独立地选自N或CH，
Y’独立地选自NH、O或S，并且
下标c是独立地选自1至10的整数，并且优选1、2或3。
在优选实施方式中，R110不是
平行连接物单元或其氨基酸亚基可具有下式：
其中，下标n是1至4的整数；
Xp选自下组：–O-、-NR-、-S-、-S(＝O)-、-C(＝O)-或-C2-C8杂环基-；和
R1和R2独立地选自下组：-H、-C1-3烷基、-苯基，或-C2-C5杂环(优选H或C1-3烷基)，其中波浪线表示化合物内的共价连接。
在一些实施方式中，XP通过天然或非天然氨基酸侧链提供。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自：赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、青霉胺、丝氨酸或苏氨酸的D或L异构体。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自：赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸，或青霉胺的D或L异构体。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组所示的氨基酸：精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸，及其衍生物。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：如下这些天然氨基酸的L-异构体：精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、半胱氨酸、青霉胺、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸和色氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：如下这些天然氨基酸的D-异构体：精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、青霉胺、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸和色氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自：含巯基氨基酸的D或L异构体。所述含巯基氨基酸可以是，例如，半胱氨酸、高半胱氨酸，或青霉胺。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：如下氨基酸的L-或D-异构体：丙氨酸(包括β-丙氨酸)、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、B-丙氨酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸，及其衍生物。
优选的氨基酸包括：半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：丙氨酸衍生物，限制条件是，存在合适数量的官能单元。丙氨酸衍生物的说明性示例包括但不限于：脱氢-丙氨酸、4-噻唑丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、β-(1-萘基)-丙氨酸、β-(2-萘基)-丙氨酸、α-氨基丁酸、β-氯-丙氨酸、β-氰基-丙氨酸、β-环戊基-丙氨酸、β-环己基-丙氨酸、β-碘-丙氨酸、β-环戊烯基-丙氨酸、β-tBu-丙氨酸、β-环丙基-丙氨酸、β-二苯基-丙氨酸、β–氟-丙氨酸、哌嗪环受保护或不受保护的β-哌嗪基-丙氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、β–脲基-丙氨酸、H-β-(3-苯并噻吩基)-Ala-OH和H-β-(2-噻吩基)-Ala-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：精氨酸及其精氨酸衍生物。精氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：精氨酸(Arg)、N-烷基-精氨酸、H-Arg(Me)-OH、H-Arg(NH2)-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Arg(Ac)2-OH、H-Arg(Me)2-OH(不对称)、H-Arg(Me)2-OH(对称)、2-氨基-4-(2’-羟基胍基)-丁酸(N-ω-羟基-降-精氨酸)和高精氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：天冬氨酸及其衍生物。天冬氨酸及其衍生物的的说明性示例包括但不限于：天冬氨酸(Asp)、N-烷基-天冬氨酸和H-Asp(OtBu)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：天冬酰胺及其衍生物。天冬酰胺及其衍生物的说明性示例包括但不限于：天冬酰胺(Asn)、N-烷基-天冬酰胺和异天冬酰胺(H-Asp-NH2)。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：半胱氨酸及其衍生物。半胱氨酸(Cys)及其衍生物(不包含游离SH基团)的说明性示例包括但不限于：Cys(StBu)、H-Cys(Acm)-OH、H-Cys(Trt)-OH、H-Cys(StBu)-OH、H-Cys(Bzl)-OH、H-Cys(S-Et)-OH、H-Cys(SO3H)-OH、H-Cys(氨基乙基)-OH、H-Cys(氨基甲酰基)-OH、H-Cys(S-苯基)-OH、H-Cys(Boc)-OH和H-Cys(羟乙基)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：组氨酸及其衍生物。组氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：组氨酸(His)、N-烷基-组氨酸、H-His(Boc)-OH、H-His(Bzl)-OH、H-His(1-Me)-OH、H-His(1-Tos)-OH、H-2,5-二碘-His-OH和H-His(3-Me)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：甘氨酸衍生物。甘氨酸衍生物的说明性示例包括但不限于：H-炔丙基甘氨酸()、α-氨基甘氨酸(受保护或未受保护)、β-环丙基-甘氨酸、α-烯丙基甘氨酸和新戊基甘氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：谷氨酸及其衍生物。谷氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：谷氨酸(Glu)、N-烷基-谷氨酸、H-Glu(OtBu)-OH、H-γ-羟基-Glu-OH、H-γ-亚甲基-Glu-OH、H-γ-羧基-Glu(OtBu)2-OH和焦谷氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：谷氨酰胺及其衍生物。谷氨酰胺及其衍生物的说明性示例包括但不限于：谷氨酰胺(Gln)、N-烷基-谷氨酰胺、异谷氨酰胺(H-Glu-NH2)、H-Gln(Trt)-OH和H-Gln(异丙基)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：苯丙氨酸(Phe)衍生物。苯丙氨酸衍生物的说明性示例包括但不限于：H-对氨基-Phe-OH、H-对氨基-Phe(Z)-OH、H-对溴-Phe-OH、HH-对羧基-Phe(OtBu)-OH、H-对羧基-Phe-OH、H-对氰基-Phe-OH、H-对氟-Phe-OH、H-3,4-二氯-Phe-OH、H-对碘-Phe-OH、H-对硝基-Phe-OH、氯-苯丙氨酸和β-高苯丙氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：赖氨酸及其衍生物。赖氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：赖氨酸(Lys)、N-烷基-赖氨酸、H-Lys(Boc)-OH、H-Lys(Ac)-OH、H-Lys(甲酰基)-OH、H-Lys(Me)2-OH、H-Lys(烟碱基)-OH、H-Lys(Me)3-OH、H-反-4,5-脱氢-Lys-OH、H-Lys(Alloc)-OH、H-H-δ-羟基-Lys-OH、H-δ-羟基-Lys(Boc)-OH、H-Lys(乙酰胺基)-OH和H-Lys(异丙基)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：亮氨酸衍生物。亮氨酸衍生物的说明性示例包括但不限于：4,5-脱氢亮氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：甲硫氨酸衍生物。甲硫氨酸衍生物的说明性示例包括但不限于：甲硫氨酸(Met)、H-Met(＝O)-OH和H-Met(＝O)2-OH，其中甲硫氨酸侧链的硫原子是氧化的形式。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：丝氨酸及其衍生物。丝氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：丝氨酸(Ser)、N-烷基-丝氨酸、H-Ser(Ac)-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Ser(Bzl)-OH、H-Ser(对氯-Bzl)-OH、H-β-(3,4-二羟基苯基)-Ser-OH、H-β-(2-噻吩基)-Ser-OH、异丝氨酸N-烷基-异丝氨酸和3-苯基异丝氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：酪氨酸及其衍生物。酪氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：酪氨酸(Tyr)、N-烷基-酪氨酸、H-3,5-二硝基-Tyr-OH、H-3-氨基-Tyr-OH、H-3,5-二溴-Tyr-OH、H-3,5-二碘-Tyr-OH、H-Tyr(Me)-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Tyr(Boc)-OH、H-Tyr(Bzl)-OH、H-Tyr(Et)-OH、H-3-碘-Tyr-OH和H-3-硝基-Tyr-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：苏氨酸及其衍生物。苏氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：苏氨酸(Thr)、N-烷基-苏氨酸、别苏氨酸、H-Thr(Ac)-OH、H-Thr(tBu)-OH和H-Thr(Bzl)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：色氨酸及其衍生物。色氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：色氨酸(Trp)、N-烷基-色氨酸、H-5-Me-Trp-OH、H-5-羟基-Trp-OH、H-4-Me-Trp-OH、H-α-Me-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-Trp(甲酰基)-OH和H-Trp(均三甲苯-2-磺酰基)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：脯氨酸及其衍生物。脯氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：脯氨酸(Pro)、N-烷基-脯氨酸、高脯氨酸、硫代脯氨酸、羟基脯氨酸(H-Hyp-OH)、H-Hyp(tBu)-OH、H-Hyp(Bzl)-OH、H-3,4-脱氢-Pro-OH、4-酮基-脯氨酸、α-Me-Pro-OH和H-4-氟-Pro-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：鸟氨酸及其衍生物。鸟氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：鸟氨酸(Orn)、N-烷基-鸟氨酸、H-Orn(Boc)-OH、H-Orn(Z)-OH、H-α-二氟-Me-Orn-OH(艾弗罗(Eflornitine))和H-Orn(Alloc)-OH。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：青霉胺及其衍生物。青霉胺及其衍生物的说明性示例包括但不限于：青霉胺、H-青霉胺(Acm)-OH(H-β,β-二甲基cys(Acm)-OH)和N-烷基-青霉胺。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：β-丙氨酸衍生物。β-丙氨酸衍生物的说明性示例包括但不限于：脱氢-丙氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：氨基链烷衍生物。氨基链烷衍生物的说明性示例包括但不限于：4-(新戊基氧基磺酰基)-氨基丁酸、哌啶基乙酸、3-氨基丙酸和3-氨基-3-(3-吡啶基)-丙酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：氨基炔酸及其衍生物。氨基炔酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：N-烷基氨基炔酸、6-氨基-4-己炔酸、6-(Boc-氨基)-4-己炔酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：氨基烷二酸及其衍生物。氨基烷二酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：N-烷基氨基烷二酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸(H-Asu-OH)。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：氨基-杂环基-链烷酸及其衍生物。氨基-杂环基-链烷酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：N-烷基氨基-杂环基-链烷酸、4-氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸、4-氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸、4-氨基-哌啶-4-羧酸(H-Pip-OH；受1-保护或未受保护)、3-氨基-3-(3-吡啶基)-丙酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：瓜氨酸及其衍生物。瓜氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：瓜氨酸(cit)、N-烷基-瓜氨酸、硫代瓜氨酸、S-甲基-硫代瓜氨酸和高瓜氨酸。
抑胃酶氨酸及其衍生物的说明性示例包括但不限于：抑胃酶氨酸、N-烷基-抑胃酶氨酸、环己基抑胃酶氨酸和苯基抑胃酶氨酸。
各平行连接物单元或其亚基可独立地选自下组：二氨基链烷酸及其衍生物。二氨基链烷酸(Dab)及其衍生物的说明性示例包括但不限于：N-烷基-二氨基-链烷酸、N,N-二烷基氨基-链烷酸、α,γ-二氨基丁酸(H-Dab-OH)、H-Dab(Alloc)-OH、H-Dab(Boc)-OH、H-Dab(Z)-OH、α,β-二氨基丙酸及其侧链保护形式。
示例性的LP单元或其亚基、赖氨酸或半胱氨酸或青霉胺，如下所示。波浪线表示与PEG、可释放组装单元(直接地或通过支化单元或药物连接单元)和延伸单元(直接地或通过支化单元或药物连接单元)连接的连接位点。氨基酸的L和D异构体适用于本文中。
具有赖氨酸作为LP单元的示例性的配体-药物偶联物或药物-接头化合物如下所示，其中Z、L、X、D、PEG、Z'、p和PEG如本文中所述。氨基酸的L和D异构体适用于本文中。
具有半胱氨酸或青霉胺作为LP单元的示例性的配体-药物偶联物如下所示，其中Z、L、X、D、Z'、PEG和p如本文中所述。氨基酸的L和D异构体适用于本文中。
应理解，在本发明的某些化合物(例如，中间体接头化合物和配体-接头化合物)中，所述平行连接物单元能够与–X-D形成共价连接，但不连接至–X-D，并且所述平行连接物单元将不完全组装成配体-药物偶联物，并且由此，将包含对可释放组装单元上存在的基团具有反应性的官能团。具有供于连接的官能团的示例性的平行连接物单元如下：
其中，
下标n是1至4；
Xp”选自下组：–O-、-NR-、-S-、-C(＝O)-和-S(＝O)-；和
R1和R2独立地选自下组：H、C1-3烷基、苯基或C2-C5杂环；
R6是保护基团、H、-C1-3烷基或–OH，
其中波浪线表示处于中间体接头化合物或配体-接头化合物的剩余部分内的共价连接。
特别优选的提供Xp”的反应性官能团是巯基基团，以形成二硫键或硫醚键。所述官能团可以被保护基团保护。LP可以是含巯基基团(例如，含巯基氨基酸)，并且由此，LP'可以是受保护的含巯基氨基酸，例如如下所示的受保护的半胱氨酸。尽管在下文中对半胱氨酸的L-异构体做代表性的描述，半胱氨酸的D-异构体也是合适的。此外，叔丁基巯基保护基团可以被任何其它合适的巯基保护基团替代。巯基保护基团包括叔丁基硫化物、正丁基硫化物，正丙基硫化物、甲基硫化物、苯基硫化物、硫吡啶基、异丙基硫化物、乙基硫化物和半胱氨酰基。
LP'可以是包含受保护的含巯基氨基酸的二肽，例如如下所示的受保护的半胱氨酸-丙氨酸二肽：
其中波浪线表示接头中间体化合物的剩余部分内的Lp’的共价连接。
在优选实施方式中，选择LP单元以使配体-药物偶联物的药物-接头部分的疏水性增加最小化，或不促使其增加。
在本发明优选的方面中，LP单元的质量不多于约500道尔顿，不多于约200道尔顿、约10至约500道尔顿，或约10至约200道尔顿。
在配体-药物偶联物的末端处是配体单元、药物单元和PEG单元。
配体单元：
在本发明的一些实施方式中，存在配体单元。配体单元(L-)是与靶标部分特异性结合的靶向剂。所述配体能够特异性结合至细胞组分(细胞结合剂)或结合至其它感兴趣的靶标分子。所述配体单元作用于将药物单元靶向和呈递至具体的靶细胞群，其与所述配体单元相互作用。配体包括但不限于，蛋白质、多肽和肽。合适的配体单元包括，例如，抗体，例如，全长抗体及其抗原结合片段、干扰素、淋巴因子、激素、生长因子和集落刺激因子、维生素、营养运输分子(例如但不限于，转铁蛋白)，或任何其它细胞结合分子或物质。所述配体可以是，例如，非抗体蛋白质靶向剂。或者，所述配体可以是，例如，抗体。优选的配体是较大分子量的蛋白质，例如，配体具有至少约80Kd的分子量。
配体单元可与延伸单元形成键。配体单元必需具有必需数量的连接位点供于药物-接头，无论其是天然产生还是非天然产生的(例如，工程改造的)。例如，为了使下标p的值是6至14，配体单元须能够与6至14个配体单元形成键。连接位点可天然产生或工程改造进入配体。配体单元可通过反应性或该配体的可活化的杂原子或含杂原子的官能团与接头单元的延伸单元形成键。配体单元上可能存在的反应性或可活化的杂原子或含杂原子的官能团包括硫(在一个实施方式中，来自配体的巯基基团)、C＝O或(在一个实施方式中，来自配体的羰基、羧基或羟基基团)和氮(在一个实施方式中，来自配体的伯氨基或仲氨基基团)。那些杂原子可以在配体的天然状态中存在于配体上，例如，天然产生的抗体，或可通过化学修饰或生物学工程改造引入所述配体。
在一个实施方式中，配体单元具有巯基基团并且该配体单元通过巯基基团的硫原子结合接头单元。
在另一个实施方式中，所述配体具有赖氨酸残基，其能与接头单元的延伸单元的活化的酯反应(所述酯包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯基和对硝基苯基酯)，并因此形成包含配体单元的氮原子和接头单元的C＝O基团的酰胺键。
在另一个方面，所述配体单元具有可被化学修饰的一个或多个赖氨酸残基，以引入一个或多个巯基基团。所述配体单元通过巯基基团的硫原子结合接头单元。可用于修饰赖氨酸的试剂包括但不限于，N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)和2-亚氨氢氯化硫醇(Traut试剂)。
在另一个实施方式中，所述配体单元可具有可被化学修饰以具有一个或多个巯基基团的一个或多个碳水化合物基团。所述配体单元通过巯基基团的硫原子结合接头单元的延伸单元。
在另一个实施方式中，所述配体单元可具有可经氧化以提供醛(-CHO)基团的一个或多个碳水化合物基团(参见例如，Laguzza等，1989，J.Med.Chem.32(3):548-55)。对应的醛可与延伸单元上的反应性位点形成键。能与配体上的羰基基团反应的延伸单元上的反应位点包括但不限于，肼和羟基胺。用于药物单元的连接或联合的蛋白质修饰的其它方案见述于Coligan等,《蛋白质科学》中的“现有方案”(CurrentProtocolsinProteinScience),第2卷,约翰威利父子出版社(JohnWiley&Sons)(2002)(通过引用纳入本文)。
配体单元与延伸单元上的反应性基团形成键。多种反应性基团是有用的，并且将取决于配体单元的性质。所述反应性基团可以是存在于延伸单元上的马来酰亚胺(在与L连接之前)，并且，L与延伸单元的共价连接通过配体单元的巯基基团完成，以形成硫-取代的琥珀酰亚胺。所述巯基可以在配体的天然状态中存在于配体上，例如，天然产生的残基，或可通过化学修饰引入所述配体。
在另一个实施方式中，所述配体是抗体且巯基基团通过还原链间二硫而产生。因此，在一些实施方式中，所述接头单元偶联至还原的链间二硫键的半胱氨酸残基。
在另一个实施方式中，所述配体是抗体并且巯基基团通过化学方式引入该抗体，例如通过引入半胱氨酸残基。因此，在一些实施方式中，所述延伸单元偶联至引入的半胱氨酸残基。
对于生物偶联物已经观察到，药物偶联的位点会影响许多参数，包括偶联的容易程度、药物-接头稳定性、对所得的生物偶联物的生物物理性质的影响和体外细胞毒性。关于药物-接头稳定性，药物-接头与配体的偶联的位点能影响经偶联的药物-接头进行消除反应的能力，并且对于药物接头而言，影响由生物偶联物的配体转移至存在于生物偶联物环境中的替代性反应性硫醇(例如，白蛋白、游离半胱氨酸，或谷胱甘肽(血浆中时)的反应性硫醇)的能力。此类位点包括，例如，链间二硫键，以及所选半胱氨酸工程改造位点。除了其它位点之外，本文所述的配体-药物偶联物可在对消除反应不敏感的位点偶联至巯基残基(例如，根据EU索引的位置239，如Kabat所示)。
当所述偶联物包含非免疫反应性蛋白质、多肽或肽配体而不是抗体时，有用的非免疫反应性蛋白质、多肽或肽配体包括但不限于，转铁蛋白、表皮生长因子(“EGF”)、铃蟾肽、胃泌激素、胃泌激素释放肽、血小板源性的生长因子、IL-2、IL-6、转型生长因子(“TGF”)，例如TGF-α和TGF-β、牛痘生长因子(“VGF”)、胰岛素和胰岛素样生长因子I和II、生长抑素、凝集素和来自低密度脂蛋白的脱辅基蛋白。
特别优选的配体是抗体，包括完整抗体。实际上，在本文所述的任何实施方式中，所述配体单元可以是抗体。有用的多克隆抗体是源自免疫的动物的血清的抗体分子的异质群。有用的单克隆抗体是针对特定抗原决定簇(例如，癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学品、核酸或其片段)的抗体的同质群。针对感兴趣的抗原的单克隆抗体(mAb)可通过使用通过培养连续细胞系来产生抗体分子的本领域已知的任何技术来制备。
有用的单克隆抗体包括但不限于、人单克隆抗体、人源化的单克隆抗体，或嵌合人-小鼠(或其它物种)单克隆抗体。所述抗体包括全长抗体及其抗原结合片段。人单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术中的任一种来制备(例如，Teng等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:7308-7312；Kozbor等，1983，ImmunologyToday4:72-79；和Olsson等，1982，Meth.Enzymol.92:3-16)。
所述抗体可以是功能活性片段，免疫特异性地结合至靶细胞(例如，癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的抗体的衍生物或类似物，或结合至肿瘤细胞或基质的其它抗体。就此而言，“功能活性”表示，所述片段、衍生物或类似物能够免疫特异性地结合至靶细胞。为了确定结合抗原的CDR序列，通过本领域抑制的任何结合分析方法，可采用包含CDR序列的合成的肽与抗原的结合分析(例如，BIA核心分析)(参见例如，Kabat等，1991，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第五版，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达；KabatE等，1980，J.Immunology125(3):961-969)。
其它有用的抗体包括抗体的片段，例如但不限于，F(ab’)2片段、Fab片段、Fvs、单链抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、scFv、scFv-FV，或与所述抗体具有相同特异性的任何其它分子。
此外，重组抗体，例如，同时包含人和非人人部分的、可以采用标准重组DNA技术制得的嵌合和人源化的单克隆抗体，是有用的抗体。嵌合抗体是这样一种分子：其中不同的部分源自不同动物物种，例如，具有源自鼠单克隆的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。(参见例如，美国专利号4,816,567；和美国专利号4,816,397，其通过引用其全文纳入本文)。人源化的抗体是来自非人物种且具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子。(参见例如，美国专利号5,585,089，其通过引用其全文纳入本文)。这类嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术生产，例如使用下述方法：PCT公开号WO87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开号WO86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等，1988,Science240:1041-1043；Liu等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu等，1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218；Nishimura等，1987,Cane.Res.47:999-1005；Wood等，1985,Nature314:446-449；和Shaw等，1988,J.Natl.CancerInst.80:1553-1559；Morrison,1985,Science229:1202-1207；Oi等，1986,BioTechniques4:214；美国专利5,225,539；Jones等，1986,Nature321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science239:1534；以及Beidler等，1988,J.Immunol.141:4053-4060；其各自通过引用全文纳入本文。
完全的人抗体是特别理想的，并且可以采用无法表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因，但可表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来产生。
抗体包括类似物和衍生物，其可经修饰，即，通过任何类型的分子的共价连接进行修饰，只要所述共价连接允许该抗体保留其抗原结合免疫特异性即可。例如，但不限于，抗体的衍生物和类似物，包括经进一步修饰的那些，所述修饰例如，糖基化、乙酰化，PEG化、磷酸化、酰胺化，用已知保护性/阻断性基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞抗体单元或其它蛋白质等。可通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，这些技术包括但不限于：特定化学切割、乙酰化、甲酰化、在衣霉素存在时代谢合成等。此外，所述类似物或衍生物可包含一个或多个非天然氨基酸。
抗体可在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如，取代、删除或添加)。具体而言，抗体可在鉴定为与抗Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用有关的氨基酸残基中具有修饰(参见例如，国际公开号WO97/34631，其通过引用其全文纳入本文)。
对于癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可通过市售获得，或通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，化学合成或重组表达技术。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可以，例如，从GenBank数据库或与其类似的数据库、文献公开物获得，或通过常规克隆和测序获得。
在一个特定实施方式中，可采用用于治疗癌症的已知抗体。对于癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可通过市售获得，或通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，重组表达技术。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可以，例如，从GenBank数据库或与其类似的数据库、文献公开物获得，或通过常规克隆和测序获得。
在另一个特定实施方式中，用于治疗自体免疫疾病的抗体与本发明的组合物和方法联用。对负责产生自体免疫抗体的细胞的抗原具有免疫特异性的抗体可以获自任何机构(例如，大学科研人员或公司)或通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，化学合成或重组表达技术。
在某些实施方式中，有用的抗体可结合至在活化的淋巴细胞上表达的受体或受体复合物。所述受体或受体复合物可包含免疫球蛋白基因超家族成员、TNF受体超家族成员、整合素、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素，或补体控制蛋白。
在一些方面中，所述抗体将特异性结合CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、α-v-β-6、Liv-1或路易斯Y(LewisY)抗原。
抗-CD30抗体可以是，例如，嵌合AC10抗体、贝伦妥单抗(brentuximab)。抗-CD30抗体可具有含有由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的重链可变区、含有由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区、含有由SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的人γI恒定区，和含有由SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的人κ恒定区。
所述抗-CD30抗体可以是，例如，人源化的AC10抗体。所述抗-CD30抗体可具有含有由SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的重链可变区，含有由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区。所述抗体还可包含具有由SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的人γI恒定区，在位置239任选地具有丝氨酸到半胱氨酸的取代(根据EU索引)，和具有由SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的人κ恒定区。
抗-CD70抗体可以是，例如，人源化的抗体(参见例如，US2009/0148942)。在一个示例性的实施方式中，所述抗-CD70抗体具有含有由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的重链可变区，和含有由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列所示的轻链可变区。
所述抗-CD19抗体可以是，例如，人源化的抗体(参见例如，US2009/0136526，通过引用其全文纳入本文供于所有目的)。在一个示例性的实施方式中，所述hBU12抗体具有含有由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的重链可变区，和含有由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的轻链可变区。
所述抗体可以是人源化的抗-CD33抗体(US2013/0309223，通过引用其全文纳入本文供于所有目的)、人源化的抗-β6抗体(参见例如，WO2013/123152，通过引用其全文纳入本文供于所有目的)、人源化的抗-Liv-1抗体(参见例如，US2013/0259860，通过引用其全文纳入本文供于所有目的)，或人源化的AC10抗体(参见例如，US8,257,706，通过引用其全文纳入本文供于所有目的)。
示例性地，通过硫醚连接与至所述配体连接。硫醚连接可以通过链间二硫键、引入的半胱氨酸残基及其组合形成。
药物单元：
本发明的效果在其中所述药物实质疏水的实施例中更为显著。因此，本发明的药物优选是实质疏水的。
药物单元(D)可以是细胞毒性的、细胞生长抑制性的或免疫抑制性药物，本文中也称为细胞毒性剂、细胞生长抑制剂或免疫抑制剂。所述药物单元具有能够与可释放组装单元(X)形成键的原子。在一些实施方式中，所述药物单元D具有能够与可释放组装单元(X)形成键的氮原子。在其它实施方式中，所述药物单元D具有能够与可释放组装单元(X)形成键的羧酸。在其它实施方式中，所述药物单元D具有能够与可释放组装单元X形成键的巯基基团。而在其它实施方式中，所述药物单元D具有能够与可释放组装单元X形成键的羟基基团或酮或醇。
有用的细胞毒性剂或免疫抑制剂的种类包括，例如，抗微管蛋白试剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化试剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢剂、化疗敏化剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。有用的细胞毒剂种类的具体示例包括，例如，DNA小沟结合剂、DNA烷基化剂和微管蛋白抑制剂。示例性细胞毒剂包括，例如，奥瑞他汀、喜树碱、多卡米星、依托泊苷、美登素和美登醇、紫杉烷、苯并二氮杂或包含药物的苯并二氮杂(例如，吡咯并[1,4]-苯并二氮杂(PBD)、吲哚啉并苯并二氮杂和噁唑啶并苯并二氮杂)和长春花生物碱。所选包含苯并二氮杂的药物描述于WO2010/091150、WO2012/112708、WO2007/085930和WO2011/023883。
在某些实施方式中，所述细胞毒剂是美登素或美登醇(例如，DM1、DM4)，另一组抗-微管蛋白试剂。(免疫原公司(ImmunoGen,Inc.)；还参见Chari等，1992，CancerRes.52:127-131和美国专利号8,163,888)。
在一些实施方式中，所述药物是苯并二氮杂(包括含苯并二氮杂的药物，例如，吡咯并[1,4]苯并二氮杂(PBD)、吲哚啉并苯并二氮杂和噁唑啶并苯并二氮杂)。
PBD具有以下通用结构：
但在其芳族A环和吡咯并C环中的取代基数目、类型和位置，和C环的饱和程度上可不同。在B-环中，在N10-C11位置处有亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其是负责烷基化DNA的亲电中心。所有已知的天然产物在手性C11a位置处有(S)-取向，其在从C环向A环观察时向它们提供了右手螺旋。这使它们与B-型DNA小沟产生异螺旋性的合适三维形状，导致在结合位点处的滑动配合。PBD在小沟中形成加合物的能力使得它们干扰DNA加工，因此可用作抗肿瘤剂。可通过，例如，将2个PBD单元接合在一起来强化这些分子的生物活性(通过柔性亚烷基接头的C8/C’-羟基官能团)。PBD二聚体被认为形成序列选择性DNA损伤，例如回文5’-Pu-GATC-Py-3’链间交联，其被认为主要负责它们的生物活性。
所述药物单元可以是，例如，疏水性相当于或大于单甲基奥瑞他汀E的奥瑞他汀或非奥瑞他汀药物。在一些方面中，所述药物是疏水性相当于或大于单甲基奥瑞他汀E的奥瑞他汀或MMAE。所述奥瑞他汀药物可以共价连接至可释放组装单元，例如，通过其N或C末端连接。MMAE的SlogP值为2.59。在一些方面中，本发明中所用的药物的SlogP值将是1.5或更大，2.0或更大，或2.5或更大。在一些方面中，本发明中所用的药物的SlogP值将是(a)约1.5、约2，或2.5至约7，(b)约1.5、约2，或2.5至约6，(c)约1.5、约2或约2.5至约5，(d)约1.5、约2，或2.5至约4，或(e)约1.5、约2或约2.5至约3。
所述药物单元可具有下式DE，其中通过N末端与可释放组装单元连接：
其中，在每个位置上独立地给出以下说明：
R2选自下组：H和C1-C8烷基；
R3选自下组：H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自下组：H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自下组：H和甲基；
或R4和R5接合形成碳环，并且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自下组：H、C1-C8烷基和C3-C8碳环，并且n选自下组：2、3、4、5和6；
R6选自下组：H和C1-C8烷基；
R7选自下组：H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
各R8独立地选自下组：H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
R9选自下组：H和C1-C8烷基；
R18选自下组：-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)。
通过其N末端偶联的MMAE如下所示：
在一些实施方式中，所述药物单元是长春花化合物、喜树碱或蒽环霉素细胞毒性的化合物。存在于X-D部分时的那些药物单元的示例结构如本文中关于药物-接头中间体所述。
存在可用于确定配体-药物偶联物是否对细胞系发挥细胞生长抑制性或细胞毒性作用的许多不同试验。在用于确定配体-药物偶联物是否对细胞系发挥细胞生长抑制性或细胞毒性作用的一个示例中，采用胸腺嘧啶纳入的试验。例如，密度为5,000个细胞/孔在96孔板铺板的细胞孵育72小时的时段，并在该72小时的时段的最后8小时暴露于0.5μCi的3H-胸腺嘧啶，并且在存在和不存在配体-药物偶联物的情况中检测3H-胸腺嘧啶在该培养物的细胞中纳入的情况。如果培养物的细胞的3H-胸腺嘧啶纳入相对于在相同条件下培养但没有接触该配体-药物偶联物的相同细胞系的细胞而言有所降低，则所述配体-药物偶联物对细胞系具有细胞生长抑制性或细胞毒性作用。
在另一个示例中，对于确定配体-药物偶联物是否对细胞系发挥细胞生长抑制性或细胞毒性作用，通过确定细胞中对染料(例如中性红、台盼蓝或ALAMARTM蓝)的摄取来检测细胞活力(参见例如，Page等，1993，Intl.J.ofOncology3:473-476)。在此类试验中，在含有染料的培养基中孵育细胞、洗涤细胞，并用分光光度法测定剩余染料来反映细胞对染料的摄取。也可利用蛋白质-结合染料磺基罗丹明B(SRB)测量细胞毒性(Skehan等，1990，J.Nat’lCancerInst.82:1107-12)。优选的配体-药物偶联物包括对于该细胞系的IC50值(定义为给出50％细胞杀伤的mAB浓度)小于1000ng/ml，优选小于500ng/ml，更优选小于100ng/ml，甚至最优选小于50或甚至小于10ng/ml的那些。
用于将药物连接至接头的一般方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号8,163,888，7,659,241，7,498,298，美国公开号US20110256157和国际公开号WO2011023883和WO2005112919。
聚乙二醇单元(PEG)
多分散PEG、单分散PEG和离散PEG可用于制备本发明的化合物。多分散PEG是多种尺寸和分子量的异质混合物，而单分散PEG通常是从异质混合物纯化的，因此提供单一链长和分子量。优选的PEG单元是离散PEG，其为以逐步方式且不通过聚合方法合成的化合物。离散PEG提供具有确定和特定链长度的单一分子。
本文提供的PEG单元包含一个或多个聚乙二醇链。聚乙二醇链可以连接在一起，例如，以线性、支化的或星形构型连接。通常，在一个末端衍生PEG链中至少一个以共价连接至平行连接物单元。与平行连接物单元的示例性连接通过非条件性可切割连接或通过条件性的可切割连接来进行。示例性连接通过酰胺键、醚键、酯键、腙键、肟键、二硫键、肽键或三唑连接实现。在一些方面中，与LP的连接通过非条件性可切割连接。在一些方面中，与LP的连接不通过酯键、腙键、肟键，或二硫键。在一些方面中，与LP的连接不通过腙键。
条件性可切割连接指的是，在血浆中循环时对切割不具有显著敏感性，但在细胞内或肿瘤内环境中对切割敏感的连接。非条件性可切割连接是在任何生物环境中对切割不具显著敏感性的连接。腙的化学水解、二硫键的还原和肽键或糖苷键的酶促切割是条件性可切割连接的示例。
PEG单元将在平行连接物单元处直接连接至配体-药物偶联物(或其中间体)。PEG单元的另一个末端(或末尾)将是游离且未约束的，并且可以是甲氧基、羧酸、醇或其它合适的官能团的形式。甲氧基、羧酸、醇或其它合适的官能团起到PEG单元的末端PEG亚基的帽的作用。述及未约束的，这意味着PEG单元将不在未约束的位点连接至药物单元、连接至配体单元，或连接至连接药物单元和/或配体单元的连接组分。对于那些实施方式其中所述PEG单元包含多于一个PEG链，多个PEG链可以是相同或不同化学部分(例如，不同分子量或亚基数量的PEG)。多个PEG链在单一连接位点连接至平行连接物单元。本领域技术人员应理解，PEG单元除了包含重复的聚乙二醇亚基以外，还可包含非PEG物质(例如，以促进多个PEG链彼此的偶联，或促进与平行连接物单元的偶联)。非PEG物质指的是PEG单元中的并非重复–CH2CH2O-亚基的部分的原子。在本文提供的实施方式中，所述PEG单元可包含两个单体的PEG链，其通过非PEG元件彼此连接。在本文提供的其它实施方式中，所述PEG单元可包含两个线性PEG链，其连接至中心核，该中心核连接至平行连接物单元(即，PEG单元本身是支化的)。
许多PEG连接方法是本领域技术人员可获得的，[参见例如，Goodson等(1990)Bio/Technology8:343(定点诱变之后，白介素-2在其糖基化位点处的PEG化(PEGylationofinterleukin-2atitsglycosylationsiteaftersite-directedmutagenesis))；EP0401384(偶联PEG至G-CSF(couplingPEGtoG-CSF))；Malik等，(1992)Exp.Hematol.20:1028-1035(采用三氟乙基磺酰基氯的GM-CSFPEG化(PEGylationofGM-CSFusingtresylchloride))；ACT公开号WO90/12874(包含重组引入的半胱氨酸残基的采用半胱氨酸特异性mPEG衍生物的促红细胞生成素的PEG化(PEGylationoferythropoietincontainingarecombinantlyintroducedcysteineresidueusingacysteine-specificmPEGderivative))；美国专利号5,757,078(EPO肽的PEG化(PEGylationofEPOpeptides))；美国专利号5,672,662(用于生物技术应用的用丙酸或丁酸单取代的(聚乙二醇)和相关的聚合物及其功能性衍生物(Poly(ethyleneglycol)andrelatedpolymersmonosubstitutedwithpropionicorbutanoicacidsandfunctionalderivativesthereofforbiotechnicalapplications))；美国专利号6,077,939(肽的N-末端α.-碳的PEG化(PEGylationofanN-terminal.alpha.-carbonofapeptide))；Veronese等，(1985)Appl.Biochem.Bioechnol11:141-142(采用PEG-硝基苯基碳酸酯("PEG-NPC")或PEG-三氯苯基碳酸酯的肽的N-末端α-碳的PEG化(PEGylationofanN-terminalα-carbonofapeptidewithPEG-nitrophenylcarbonate("PEG-NPC")orPEG-trichlorophenylcarbonate))；和Veronese(2001)Biomaterials22:405-417(对肽与蛋白质PEG化的综述论文(ReviewarticleonpeptideandproteinPEGylation))]。
例如，PEG可通过反应性基团共价连接至氨基酸残基。反应性基团是可结合活化的PEG分子的那些(例如，游离氨基或羧基基团)。例如，N-末端氨基酸残基和赖氨酸(K)残基具有游离氨基基团；且C-末端氨基酸残基具有游离羧基基团。巯基基团(例如，在半胱氨酸残基上发现)也可用作用于连接PEG的反应性基团。此外，用于特定地在多肽的C-末端引入活化的基团(例如，酰肼、醛和芳族-氨基基团)的酶辅助方法已描述于(参见Schwarz等(1990)MethodsEnzymol.184:160；Rose等.(1991)BioconjugateChem.2:154；和Gaertner等.(1994)J.Biol.Chem.269:7224]。
在一些实施方式中，可采用具有不同反应部分的甲氧基化的PEG("mPEG")将PEG分子连接至氨基基团。所述反应部分的非限制性示例包括，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、mPEG-酰亚胺酯、对硝基苯基碳酸酯(NPC)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)和三聚氯化氰。所述mPEG的非限制性示例包括，mPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)、mPEG2-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG2-SS)；mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG2-琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG2-SC)；mPEG-酰亚胺酯、mPEG-对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-酰亚胺酯；mPEG2-对硝基苯基碳酸酯(mPEG2-NPC)；mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)；mPEG2-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG、--SPA)；mPEG-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)；mPEG2-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG2--NHS)；mPEG-三聚氯化氰；mPEG2-三聚氯化氰；mPEG2-赖氨醇-NPC和mPEG2-Lys-NHS。
一般而言，形成PEG单元的PEG链中的至少一个是官能化的，从而其能够连接至平行连接物单元。官能化可以，例如，通过胺、巯基、NHS酯、马来酰亚胺、炔、叠氮、羰基，或其它官能团实现。PEG单元还可包含非PEG物质(即，不包含–CH2CH2O-的物质)以促进对平行连接物单元的偶联或促进两个或更多个PEG链偶联。
可采用众多聚乙二醇(PEG)种类，并且可采用几乎任何合适的反应性PEG试剂。在一些实施方式中，所述反应性PEG试剂将导致在与LP连接后形成氨基甲酸酯或酰胺键。在不同实施方式中，可采用如下PEG试剂：mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、多臂PEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-双酯、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、杂官能PEG(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITETM系列的多臂PEG、包括通过本领域技术人员所选化学物质活化的基于甘油的PEG的GL系列、任何经SUNBRITE活化的PEG(包括但不限于羧基-PEG、对NP-PEG、三氟乙磺酰基-PEG、醛PEG、缩醛-PEG、氨基-PEG、巯基-PEG、马来酰亚胺-PEG、羟基-PEG-胺、氨基-PEG-COOK羟基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、官能化的PEG-磷脂和本领域技术人员根据其具体应用和用途所选的其它类似的和/或合适的反应性PEG。
PEG单元的添加对所得的配体-药物偶联物的药代动力学有两种可能的影响。希望的影响是降低清除率(和伴随的增加暴露度)，其由暴露的药物-接头的疏水性元件诱导的非特异性相互作用的减少所致。第二种影响是不希望的影响，即可由配体-药物偶联物的分子量的增加引起的体积和分布率下降。PEG亚基的数量的增加使偶联物的流体动力学半径增加，导致降低的扩散性。进而，降低的扩散性可能会削弱配体-药物偶联物穿透进入肿瘤的能力(Schmidt和Wittrup，MolCancerTher2009；8:2861-2871)。由于这两种竞争性药代动力学效应，希望使用足够大以降低LDC清除率由此增加血浆暴露，但又不可以大至大幅削弱其扩散性的PEG，其可能会降低配体-药物偶联物到达预定的靶细胞群的能力。参见关于对特定药物-接头选择最优的PEG尺寸的方法的实施例(例如，实施例1、18和21)。
在一组实施方式中，所述PEG单元包含至少6个亚基、至少7个亚基、至少8个亚基、至少9个亚基、至少10个亚基、至少11个亚基、至少12个亚基、至少13个亚基、至少14个亚基、至少15个亚基、至少16个亚基、至少17个亚基、至少18个亚基、至少19个亚基、至少20个亚基、至少21个亚基、至少22个亚基、至少23个亚基或至少24个亚基。当述及PEG单元时，本文中所用的亚基指的是具有下式的聚乙二醇亚基
在一些所述实施方式中，所述PEG单元包含不多于约72个亚基。
在一组实施方式中，所述PEG单元包含一个或多个线性PEG链，其各自具有至少2个亚基，至少3个亚基，至少4个亚基，至少5个亚基，至少6个亚基，至少7个亚基，至少8个亚基，至少9个亚基，至少10个亚基，至少11个亚基，至少12个亚基，至少13个亚基，至少14个亚基，至少15个亚基，至少16个亚基，至少17个亚基，至少18个亚基，至少19个亚基，至少20个亚基，至少21个亚基，至少22个亚基，至少23个亚基，或至少24个亚基。在优选实施方式中，所述PEG单元包含联合的总计至少6个亚基、至少8、至少10个亚基，或至少12个亚基。在一些所述实施方式中，所述PEG单元包含不多于联合的总计约72个亚基，优选不多于联合的总计约36个亚基。
在另一组实施方式中，所述PEG单元包含联合的总计4至72、4至60、4至48、4至36或4至24个亚基、5至72、5至60、5至48、5至36或5至24个亚基、6至72、6至60、6至48、6至36或6至24个亚基、7至72、7至60、7至48、7至36或7至24个亚基、8至72、8至60、8至48、8至36或8至24个亚基、9至72、9至60、9至48、9至36或9至24个亚基、10至72、10至60、10至48、10至36或10至24个亚基、11至72、11至60、11至48、11至36或11至24个亚基、12至72、12至60、12至48、12至36或12至24个亚基、13至72、13至60、13至48、13至36或13至24个亚基、14至72、14至60、14至48、14至36或14至24个亚基、15至72、15至60、15至48、15至36或15至24个亚基、16至72、16至60、16至48、16至36或16至24个亚基、17至72、17至60、17至48、17至36或17至24个亚基、18至72、18至60、18至48、18至36或18至24个亚基、19至72、19至60、19至48、19至36或19至24个亚基、20至72、20至60、20至48、20至36或20至24个亚基、21至72、21至60、21至48、21至36或21至24个亚基、22至72、22至60、22至48、22至36或22至24个亚基、23至72、23至60、23至48、23至36或23至24个亚基、或24至72、24至60、24至48、24至36或24个亚基。
在另一组实施方式中，所述PEG单元包含一个或多个线性PEG链，其具有联合的总计4至72、4至60、4至48、4至36或4至24个亚基、5至72、5至60、5至48、5至36或5至24个亚基、6至72、6至60、6至48、6至36或6至24个亚基、7至72、7至60、7至48、7至36或7至24个亚基、8至72、8至60、8至48、8至36或8至24个亚基、9至72、9至60、9至48、9至36或9至24个亚基、10至72、10至60、10至48、10至36或10至24个亚基、11至72、11至60、11至48、11至36或11至24个亚基、12至72、12至60、12至48、12至36或12至24个亚基、13至72、13至60、13至48、13至36或13至24个亚基、14至72、14至60、14至48、14至36或14至24个亚基、15至72、15至60、15至48、15至36或15至24个亚基、16至72、16至60、16至48、16至36或16至24个亚基、17至72、17至60、17至48、17至36或17至24个亚基、18至72、18至60、18至48、18至36或18至24个亚基、19至72、19至60、19至48、19至36或19至24个亚基、20至72、20至60、20至48、20至36或20至24个亚基、21至72、21至60、21至48、21至36或21至24个亚基、22至72、22至60、22至48、22至36或22至24个亚基、23至72、23至60、23至48、23至36或23至24个亚基、或24至72、24至60、24至48、24至36或24个亚基。
在另一组实施方式中，所述PEG单元是衍生的线性单一PEG链、其具有至少2个亚基、至少3个亚基、至少4个亚基、至少5个亚基、至少6个亚基、至少7个亚基、至少8个亚基、至少9个亚基、至少10个亚基、至少11个亚基、至少12个亚基、至少13个亚基、至少14个亚基、至少15个亚基、至少16个亚基、至少17个亚基、至少18个亚基、至少19个亚基、至少20个亚基、至少21个亚基、至少22个亚基、至少23个亚基或至少24个亚基。
在另一组实施方式中，所述PEG单元是衍生的线性单一PEG链，其具有6至72、6至60、6至48、6至36或6至24个亚基、7至72、7至60、7至48、7至36或7至24个亚基、8至72、8至60、8至48、8至36或8至24个亚基、9至72、9至60、9至48、9至36或9至24个亚基、10至72、10至60、10至48、10至36或10至24个亚基、11至72、11至60、11至48、11至36或11至24个亚基、12至72、12至60、12至48、12至36或12至24个亚基、13至72、13至60、13至48、13至36或13至24个亚基、14至72、14至60、14至48、14至36或14至24个亚基、15至72、15至60、15至48、15至36或15至24个亚基、16至72、16至60、16至48、16至36或16至24个亚基、17至72、17至60、17至48、17至36或17至24个亚基、18至72、18至60、18至48、18至36或18至24个亚基、19至72、19至60、19至48、19至36或19至24个亚基、20至72、20至60、20至48、20至36或20至24个亚基、21至72、21至60、21至48、21至36或21至24个亚基、22至72、22至60、22至48、22至36或22至24个亚基、23至72、23至60、23至48、23至36或23至24个亚基，或24至72、24至60、24至48、24至36或24个亚基。
在另一组实施方式中，所述PEG单元是衍生的线性单一PEG链，其具有2至72、2至60、2至48、2至36或2至24个亚基、2至72、2至60、2至48、2至36或2至24个亚基、3至72、3至60、3至48、3至36或3至24个亚基、3至72、3至60、3至48、3至36或3至24个亚基、4至72、4至60、4至48、4至36或4至24个亚基、5至72、5至60、5至48、5至36或5至24个亚基。
可用于本文提供的任何实施方式中的示例性线性PEG单元如下：
其中波浪线表示连接至平行连接物单元的位点，
R20是PEG连接单元，
R21是PEG加帽单元；
R22是PEG偶联单元(即，用于将多个PEG亚基链偶联在一起)
n独立地选自2至72(优选4至72，更优选6至72、8至72、10至72、12至72或6至24)；
e是2至5
各n'独立地选自1至72。在优选实施方式中，所述PEG单元中有至少6，优选至少8，至少10，或至少12个PEG亚基。在一些实施方式中，所述PEG单元中有不多于72或36个PEG亚基。
在优选实施方式中，n是8或约8、12或约12、24或约24。
PEG连接单元是PEG单元的部分，并且其作用是将PEG单元连接至平行连接物单元。就此而言，所述平行连接物单元具有能与PEG单元形成键的官能团。用于将PEG单元连接至平行连接物单元的官能团包括：形成二硫键或硫醚键的巯基基团、形成腙键的醛、酮或肼基团、形成肟键的羟基胺、形成肽键的羧基或氨基基团、形成酯键的羧基或羟基基团、形成磺酰胺键的磺酸、形成氨基甲酸酯键的醇和形成磺酰胺键或氨基甲酸酯键或酰胺键的胺。因此，所述PEG单元可通过如下方式连接至平行连接物单元，例如，通过二硫键、硫醚、腙、肟、肽、酯、磺酰胺、氨基甲酸酯，或酰胺键。一般而言，所述PEG连接单元是当使PEG单元连接至平行连接物单元时发生的环加成、加成、加成/消除反应或取代反应的产物。
PEG偶联单元是PEG单元的部分，并且是非PEG物质，其作用是连接重复的CH2CH2O-亚基的两个或更多个链。在示例性实施方式中，所述PEG偶联单元R22是-C1-10烷基-C(O)-NH-、-C1-10烷基-NH-C(O)-、-C2-10烷基-NH-、-C2-10烷基-O-、-C1-10烷基-S-，或–C2-10烷基-NH-。
在示例性实施方式中，所述PEG连接单元R20是–C(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-NH-、-C(O)O-、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基-O-、-C(O)C1-10烷基-CO2-、-C(O)C1-10烷基-NH-、-C(O)C1-10烷基-S-、-C(O)C1-10烷基-C(O)-NH-、-C(O)C1-10烷基-NH-C(O)-、-C1-10烷基、-C1-10烷基-O-、-C1-10烷基-CO2-、-C1-10烷基-NH-、-C1-10烷基-S-、-C1-10烷基-C(O)-NH-、-C1-10烷基-NH-C(O)-、-CH2CH2SO2-C1-10烷基-、-CH2C(O)-C1-10烷基-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-O-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-NH-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-CO2-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-S-、
各R21独立地是-C1-10烷基、-C2-10烷基-CO2H、-C2-10烷基-OH、-C2-10烷基-NH2、C2-10烷基-NH(C1-3烷基)，或C2-10烷基-N(C1-3烷基)2；和
各R22独立地是-C1-10烷基-C(O)-NH-、-C1-10烷基-NH-C(O)-、-C2-10烷基-NH-、-C2-10烷基-O-、-C1-10烷基-S-，或–C2-10烷基-NH-。
在一些实施方式中，R20是–NH-、-C(＝O)-、三唑-连接的基团，或-S-，或马来酰亚胺-连接的基团，例如其中波浪线表示连接至平行连接物单元的位点且星号表示PEG单元内连接的位点。在一些所述方面中，R21是C1-10烷基、-C2-10烷基-CO2H、-C2-10烷基-OH，或-C2-10烷基-NH2。
可用于本文提供的任何实施方式中的说明性的线性PEG单元如下：
其中波浪线表示连接至平行连接物单元的位点且各n独立地选自4至72、6至72、8至72、10至72、12至72、6至24，或8至24。在一些方面中，n是约8、约12或约24。
如本文中所述，选择PEG单元，从而其改善所得配体-药物偶联物的清除率，但不显著影响所述偶联物穿透进入肿瘤的能力。在其中所述配体-药物偶联物的可释放组装单元和药物单元具有与马来酰亚胺葡糖苷酸MMAE药物-接头(如实施例中所示)相当的疏水性的实施方式中，选择所用的PEG单元将优选具有8个亚基至约24个亚基，更优选约12个亚基。在其中所述偶联物的药物单元和可释放组装单元具有大于马来酰亚胺葡糖苷酸MMAE药物-接头的疏水性的实施方式中，可选择具有更多亚基的PEG单元。实施例部分中所示的方法可用于鉴定用于具体药物-接头的理想的亚基数量。
在本发明的优选实施方式中，所述PEG单元是约300道尔顿至约5千道尔顿；约300道尔顿，至约4千道尔顿；约300道尔顿，至约3千道尔顿；约300道尔顿，至约2千道尔顿；或约300道尔顿，至约1千道尔顿。在一些所述方面中，所述PEG单元具有至少6个亚基或至少8、10或12个亚基。在一些所述方面中，所述PEG单元具有至少6个亚基或至少8、10或12个亚基，但不多于72个亚基，优选不多于36个亚基。
在本发明的优选实施方式中，除了PEG单元以外，不存在其它存在于药物-接头中的PEG亚基(即，在本文提供的偶联物和接头的任何其它组分中不含PEG亚基)。在本发明的其它方面中，除了PEG单元以外，有不多于8，不多于7，不多于6，不多于5，不多于4，不多于3，不多于2或不多于1个其它聚乙二醇亚基存在于药物-接头中(即，本文提供的偶联物和接头的其他组分中有不多于8、7、6、5、4、3、2或1个其它聚乙二醇亚基)。组分包括延伸单元、平行连接物单元、药物单元、支化单元和可释放组装单元。
应理解，当述及PEG亚基并根据上下文时，亚基的数目可代表平均数目，例如，当述及配体-药物偶联物或中间体化合物的群和使用多分散PEG时。
延伸单元：
延伸单元(-Z-)的作用是将配体单元连接至平行连接物单元。就此而言，延伸单元具有能与配体单元的官能团形成键的官能团。延伸单元还具有能与任选的支化单元，或平行连接物单元的官能团形成键的官能团。在具有多于一个药物单元/PEG单元的配体-药物偶联物和中间体中，延伸单元将具有能与配体单元的官能团形成键的官能团，以及能与支化单元、平行连接物单元或药物连接单元形成键的官能团。可以天然地或通过化学操作存在于配体单元上的有用的官能团，包括但不限于，巯基(-SH)、氨基、羟基、羧基、碳水化合物的异头羟基基团和羧基。在一方面中，配体单元的官能团是巯基和氨基。延伸单元可包含例如，马来酰亚胺基团、醛、酮、羰基，或卤乙酰胺，用于连接至配体单元。
在一些方面中，药物-接头化合物或中间体接头化合物的延伸单元具有与配体单元(例如，抗体)上存在的亲核基团具有反应性的亲电子基团。配体上有用的亲核基团包括但不限于，巯基，羟基和氨基基团。配体的亲核基团的杂原子对延伸单元上的亲电子基团具有反应性，并且与延伸单元形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于，马来酰亚胺和卤乙酰胺基团。对于作为配体的抗体，亲电子基团提供方便抗体连接的位点，用于具有可及亲核基团的那些抗体。
在另一个实施方式中，延伸单元具有反应性位点，其具有对配体单元(例如，抗体)上存在的亲电子基团具有反应性的亲核基团。配体上有用的亲电子基团包括但不限于，醛和酮和羰基基团。延伸单元的亲核基团的杂原子可与配体上的亲电子基团反应，并与抗体形成共价键。延伸单元上有用的亲核基团包括但不限于，酰肼、羟基胺、氨基、肼、硫半卡巴腙、肼羧酸酯和芳基酰肼。对于作为配体的抗体，抗体上的亲电子基团提供方便与亲核延伸单元连接的位点。
在一些方面中，所述偶联物可以采用具有反应性位点的延伸单元的部分制备，所述反应性位点供于结合至平行连接物单元并引入具有针对配体单元的反应性位点的延伸单元的另一个部分。在一方面中，延伸单元具有反应性位点，所述反应性位点具有对配体单元(例如抗体)上存在的亲核基团具有反应性的亲电子基团。所述亲电子基团提供对于配体(例如，抗体)连接方便的位点。抗体上有用的亲核基团包括但不限于，巯基、羟基和氨基基团。抗体的亲核基团的杂原子对延伸单元上的亲电子基团具有反应性，并且与延伸单元形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于，马来酰亚胺和卤乙酰胺基团和NHS酯。
在另一个实施方式中，延伸单元具有反应性位点，该反应性位点具有与配体单元上存在的亲电子基团有反应性的亲核基团。配体单元(例如，抗体)上的亲电子基团提供方便连接至延伸单元的位点。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于，醛和酮羰基基团。延伸单元的亲核基团的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应，并与抗体形成共价键。延伸单元上有用的亲核基团包括但不限于，酰肼、肟、氨基、肼、硫半卡巴腙、肼羧酸酯和芳基酰肼。
在一些实施方式中，所述延伸单元通过延伸单元的马来酰亚胺基团与配体单元的硫原子形成键。硫原子可以源自配体单元的巯基基团。该实施方式的代表性的延伸单元包括式XVa和XVb的方括号内的那些单元，其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的连接，且R17是-C1-C10亚完基-、C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-,-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10杂亚烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10杂亚烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-，或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-。任何R17取代基可以是取代的或非取代的。在一些方面中，R17取代基是未取代的。在一些方面中，R17取代基是任选地被取代的。在一些方面中，R17基团任选被碱性单元取代，例如，–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa和–(CH2)xNRa 2，其中x是1-4的整数，且各Ra独立地选自下组：C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或两个Ra基团与其连接的氮联合形成吖丁啶基(azetidinyl)、吡咯烷基或哌啶基基团。应理解甚至在未明确指示的情况下，p是1至14。
说明性的延伸单元是式XVa的单元，其中R17是-C2-C5亚烷基-C(＝O)-，其中亚烷基任选被碱性单元取代，例如，–(CH2)xNH2，–(CH2)xNHRa和–(CH2)xNRa 2，其中x是1-4的整数，且各Ra独立地选自下组：C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或两个Ra基团与其连接的氮联合形成吖丁啶基(azetidinyl)、吡咯烷基或哌啶基基团。示例性实施方式如下：
应理解，取代的琥珀酰亚胺可以如下所示的水解形式存在：
偶联至配体前的说明性的延伸单元，包括如下这些：
应理解，延伸单元的氨基基团可在合成过程中通过氨基保护基团(例如，酸不稳定保护基团(例如，BOC))来合适地保护。
另一个说明性的延伸单元是式XVb的单元，其中R17是-(CH2)5-：
在另一个实施方式中，所述延伸单元通过配体单元的硫原子和延伸单元的硫原子之间的二硫键连接至所述配体单元。该实施方式的代表性的延伸单元描述于式XVI的方括号中，其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的连接，并且R17如上文关于式XVa和XVb所述。
在另一个实施方式中，延伸子的反应性基团包含能与配体的伯氨基基团或仲氨基基团形成键的反应性位点。这些反应位点的实施例包括但不限于，活化的酯，例如，琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰基氯物、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。该实施方式的代表性的延伸单元示于式XVIIa、XVIIb和XVIIc的方括号中，其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的连接，且R17如上文关于式XVa和XVb所述。
在另一个实施方式中，延伸子的反应性基团包含与配体上可能存在的经修饰的碳水化合物的(-CHO)基团具有反应性的反应性位点。例如，可利用诸如高碘酸钠等试剂温和氧化碳水化合物，所得的氧化碳水化合物的(-CHO)单元可与含有官能团如酰肼、肟、伯或仲胺、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼的延伸单元缩合，如Kaneko,T.等，1991，BioconjugateChem.2:13341所述。该实施方式的代表性的延伸单元示于式XVIIIa、XVIIIb和XVIIIc的方括号中，其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的连接，且R17如上文关于式XVa和XVb所述。
在本发明的一些实施方式中，可能希望延伸所述延伸单元的长度。因此，延伸单元可包含额外的组分。例如，延伸单元可包括式XVa1的方框中的那些，
其中波浪线表示与配体-药物偶联物或其中间体的剩余部分的连接；
R17如上所述，优选R17是-C2-C5亚烷基-C(＝O)-，其中亚烷基任选被碱性单元取代，例如，–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa和–(CH2)xNRa 2，其中x是1-4的整数，且各Ra独立地选自下组：C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或两个Ra基团与其相连的氮联合形成吖丁啶基、吡咯烷基或哌啶基基团；和
R13是-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-。在优选实施方式中，R13是-C1-C6亚烷基-。
在本发明的优选方面中，所述延伸单元的质量不多于约1000道尔顿，不多于约500道尔顿，不多于约200道尔顿，约30、50或100道尔顿至约1000道尔顿，约30、50或100道尔顿至约500道尔顿，或约30、50或100道尔顿至约200道尔顿。
任选的支化单元(A)
在希望将其它药物加成至药物-接头且最终加成至配体的情况中，支化单元包含在配体-药物偶联物中。支化单元能够与2至4个平行连接物单元，与2至4个药物连接单元，或与2至4个–X-D单元形成共价键。由此，在诸如的结构中，在m大于1的情况下，支化单元允许连接多个部分。技术人员应理解，支化单元经该方式设计以允许接头内的支化。为了起到支化单元的作用，所述支化单元具有用于配体-药物偶联物或其中间体内的连接的至少第一、第二和第三连接位点。换言之，支化单元必需是至少三官能的。在其中m是3或4的实施方式中，支化单元将具有四个或五个位点供于配体-药物偶联物或其中间体内的共价连接。在一些方面中，支化单元是单一单元或具有两个或更多个亚基(例如，2至10，优选2至5，例如，2、3、4或5)以提供必需数量的连接位点，其中所述支化单元或其亚基独立地选自天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或多胺或其组合。若需要具有必需数量的连接，氨基酸、氨基醇、氨基醛或多胺中至少一个将具有官能化的侧链，以为LP单元，和/或Z单元，和/或AD单元和/或X-D部分提供连接位点。在一些方面中，一个或多个氨基酸、氨基醇，或氨基醛将是非天然的，并且将经修饰以具有供于连接位点的一个或多个官能化的侧链。示例性官能化的氨基酸、氨基醇或氨基醛包括，例如，叠氮基或炔烃官能化的氨基酸、氨基醇或氨基醛(例如，用于采用点击化学连接的经修饰以具有叠氮基基团或炔基基团的氨基酸、氨基醇或氨基醛)。
各氨基酸、氨基醇、氨基醛或多胺可以是天然或非天然的。类似地，各氨基酸可以是D-或L-异构体。在其中所述支化单元能够连接两个平行连接物单元的一些实施方式中，两个X-D单元或两个药物连接单元、支化单元，一旦组装，即具有下方所示的式：
其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的三个连接位点中的两个或三个，并且其中R110是
其中星号表示与标记x的碳的连接，且波浪线表示支化单元的三个连接位点之一；
各R100独立地选自氢或-C1-C3烷基，优选氢或CH3，
Y独立地选自N或CH，
各Y’独立地选自NH、O或S，
下标c独立地是1至10的整数，优选1至3。
在优选实施方式中，R110不是
在其中所述支化单元能够连接至两个平行连接物单元或两个药物连接单元的一些实施方式中，配体-药物偶联物或其中间体中的各支化单元，一旦组装，即独立地具有下方所示的式：
其中，下标n是1至4；
Xb选自下组：–O-、-NR-、-S-、-C(＝O)-和-S(＝O)-；和
R1和R2独立地选自下组：H、C1-3烷基、苯基和C2-C5杂环(优选H或C1-3烷基)，其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的支化单元的共价连接。
支化单元的氨基酸、氨基醇、氨基醛或多胺可任选地被任选被取代的C1-20杂亚烷基(优选任选被取代的C1-12杂亚烷基)、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基替换，如本文中所述。任选地被取代的杂亚烷基、杂环、亚芳基或碳环基将具有供于配体-药物偶联物或其中间体内的连接的官能团。
任选的取代基包括：(＝O)、-X、-R、-OR、-SR、、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2，或-C(＝NR)NR2，其中各X独立地是卤素：-F、-Cl、-Br或-I；和，各R独立地是-H、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基、-C3-C14杂环、保护基团或前药部分。优选的任选的取代基是(＝O)、-X、-R、-OR、-SR和-NR2。
示例性的支化单元是如下所示的赖氨酸，其中波浪线和星号指示配体-药物偶联物或其中间体内的共价连接：
应理解，在本文提供的某些中间体化合物的式中，任选的支化单元能够与–X-D部分形成2至4个共价连接，但并非连接于其上。在所述实施方式中，所述支化单元将处于部分组装形式，并且由此，将包含对–X-D部分的可释放组装单元上的基团具有反应性的两个或更多个官能团。特别优选的反应性官能团包括能够形成二硫键或硫醚的巯基基团。
在本发明的优选方面中，支化单元的质量不多于约1000道尔顿，不多于约500道尔顿，不多于约200道尔顿，约10、50或100道尔顿至约1000道尔顿，约10、50或100道尔顿至约500道尔顿，或约10、50或100道尔顿至约200道尔顿。
药物连接单元(AD)
如同支化单元，在需要加成额外的–X-D部分(即，共价连接至药物单元的可释放组装单元)至药物-接头部分中且最终加成至配体的情况中，药物连接单元包括在配体-药物偶联物内。药物连接单元，根据配体-药物偶联物或其中间体中的设置，将具有供于连接至配体-药物偶联物或其中间体的组分的两个连接位点或三个连接位点。本领域技术人员应理解，药物连接单元可以是用于连接药物-接头部分内的额外–X-D单元且最终连接至配体单元的任何基团。在一些实施方式中，各药物连接单元是单一单元或具有两个或更多个亚基(例如，2至10，优选2至5，例如，2、3、4或5)，其中所述药物连接单元或其亚基独立地选自天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，二胺，或多胺或其组合。若需要具有必需数量的连接，氨基酸、氨基醇、氨基醛或多胺中至少一个将具有官能化的侧链，以为LP单元，和/或Z单元，和/或AD单元和/或X-D部分提供连接位点。所述氨基酸、氨基醇或氨基醛可以是非天然的，并且可以经修饰以具有供于连接至可释放组装单元的一个或多个官能化的侧链。示例性官能化的氨基酸，氨基醇，或氨基醛包括，例如，叠氮基或炔烃官能化的氨基酸、氨基醇或氨基醛(例如，用于采用点击化学连接的经修饰以具有叠氮基基团或炔基基团的氨基酸、氨基醇或氨基醛)。
在其中AD单元具有三个连接位点的一些方面中，所述AD单元，以其组装的形式，具有下方所示的式：
其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的三个AD连接位点中的两个或三个，并且其中R110是
其中星号表示与标记x的碳的连接，且波浪线表示三个连接位点之一；
R100独立地选自氢或-C1-C3烷基，优选氢或CH3，
Y独立地选自N或CH，
Y’独立地选自NH，O，或S，且
下标c独立地选自1至10，优选1至3。
在优选的方面中，R110不是
在其中AD单元具有两个连接位点(即，末端AD单元)的实施方式中，如上所示的连接位点之一可被，例如，H、OH或C1-3未取代的烷基基团替换。
在其中AD单元具有三个连接位点的一些实施方式中，所述AD单元，以其组装的形式，独立地具有下方所示的式：
其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的连接位点，并且其中x、R100和R110如上文先前所述，并且其中
R111是氢、对羟基苄基、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、
在其中AD单元具有三个连接位点的一些实施方式中，所述AD单元包含两个或更多个氨基酸。示例性的氨基AD单元是如下所示的半胱氨酸-丙氨酸，其中波浪线和星号指示配体-药物偶联物或其中间体内的连接：
在一些实施方式中，星号表示与可释放组装单元的共价连接。
在其中AD单元具有两个连接位点的一些实施方式中，所述AD单元包含两个或更多个氨基酸。示例性的氨基AD单元是如下所示的半胱氨酸-丙氨酸，其中波浪线和星号指示配体-药物偶联物或其中间体内的连接：
在一些实施方式中，星号表示与可释放组装单元的共价连接。
AD单元的氨基酸、氨基醇、氨基醛或多胺可任选地被任选被取代的C1-20杂亚烷基(优选任选被取代的C1-12杂亚烷基)、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基替换，如本文中所述。任选地被取代的杂亚烷基、杂环、亚芳基或碳环基将具有供于配体-药物偶联物或其中间体内的连接的官能团。任选的取代基包括(＝O)、-X、-R、-OR、-SR、、-NR2、-NR3、＝NR、CX3、CN、OCN、SCN、N＝C＝O、NCS、NO、NO2、＝N2、N3、NRC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、SO3 -、SO3H、S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、PO- 3、PO3H2、AsO2H2、C(＝O)R、C(＝O)X、C(＝S)R、CO2R、CO2-、C(＝S)OR、C(＝O)SR、C(＝S)SR、C(＝O)NR2、C(＝S)NR2，或C(＝NR)NR2，其中各X独立地是卤素：-F、-Cl、-Br或-I；并且各R独立地是-H、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基、-C3-C14杂环、保护基团或前药部分。优选的任选的取代基是(＝O)、X、R、OR、SR和NR2。
药物连接单元，可以是直链或支化的，并且可由式B代表：
其中，
BB1独立地选自氨基酸、任选被取代的C1-20杂亚烷基(优选任选被取代的C1-12杂亚烷基)、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基；
并且下标u独立地选自0至4；其中波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的共价连接位点。任选被取代的杂亚烷基、杂环、亚芳基或碳环基将具有用于在BB亚基之间和配体-药物偶联物或其中间体内部连接的官能团。
在一些实施方式中，BB1的至少一个示例是用于限定氨基药物连接单元的氨基酸。下标u可以是0、1、2、3或4。在一些方面中，BB1是氨基酸且u是0。在一些实施方式中，AD单元包含不多于两个任选被取代的C1-20杂亚烷基、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基。在一些实施方式中，所述AD单元包含不多于1个任选被取代的C1-20杂亚烷基、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基。任选被取代的杂亚烷基、杂环、亚芳基或碳环基将具有用于在BB亚基之间和配体-药物偶联物或其中间体内部连接的官能团。
氨基药物连接单元的氨基酸可以是α、β或γ氨基酸，可以是天然或非天然的氨基酸。所述氨基酸可以是D或L异构体。氨基药物连接单元内的连接或与所述偶联物(或接头)的其它组分的连接可以，例如，通过氨基、羧基，或其它官能实现。任选地被取代的杂亚烷基将具有供于配体-药物偶联物或其中间体内的连接的官能团。用于官能团的独立活化和反应的方法是本领域熟知的。
在本文提供的任何实施方式中，药物连接单元(包括氨基药物连接单元)的氨基酸可独立地选自含巯基氨基酸的D或L异构体。所述含巯基氨基酸可以是，例如，半胱氨酸、高半胱氨酸，或青霉胺。
在另一个实施方式中，包含药物连接单元(包括氨基药物连接单元)的氨基酸可独立地选自下组：如下氨基酸的L-或D-异构体：丙氨酸(包括β-丙氨酸)、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺苯基丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、B-丙氨酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸，及其衍生物。
优选的氨基酸包括：半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和丙氨酸。
应理解，本文所述的某些化合物的式中，例如其中所述药物连接单元能够与–X-D形成共价连接但不连接至–X-D的那些，药物连接单元将处于部分组装的形式，并且，由此，将包含对可释放组装单元上存在的基团具有反应性的官能团。特别优选的反应性官能团包括用以形成二硫键或硫醚键的巯基基团。在一些方面中，反应性硫原子将由保护基团保护。巯基保护基团或在偶联化学中的应用是本领域熟知的，并且包括，例如，烷基巯基(例如，叔丁基巯基、乙巯基、2-丙巯基、2-吡啶巯基)保护基团，芳族巯基保护基团(例如，2-吡啶巯基)和乙酰基保护基团。
在本发明的优选方面中，药物连接单元的质量不多于约1000道尔顿，不多于约500道尔顿，不多于约200道尔顿，约10、50或100道尔顿至约1000道尔顿，约10、50或100道尔顿至约500道尔顿，或约10、50或100道尔顿至约200道尔顿。
可释放组装单元(X)
可释放组装单元(-X-)将药物单元连接至配体-药物偶联物的剩余部分。可释放组装单元的主要功能是在由配体靶向的位点处释放游离药物。本着该精神，可释放组装单元能够与药物单元形成可切割连接，或包含可切割连接以释放药物(例如，在抗原介导的内化之后)。在优选实施方式中，可释放组装单元的释放机理是酶促释放机理或二硫键消除机理。用于酶促释放机理的识别位点可以是，例如，肽切割位点或糖切割位点(例如，葡糖苷酸切割位点)。
可释放组装单元可包含1至3个组分，可切割单元(QCL)、任选的间隔物单元(QSP)和任选的共价连接单元(QCO)。间隔物单元存在时的作用是将可切割单元与药物单元连接。因此，在其中所述间隔物单元存在的实施方式中，所述间隔物单元将直接连接至所述药物单元，并且所述可切割单元将通过间隔物单元连接至所述药物单元。在其中所述间隔物单元不存在的实施方式中，所述可切割单元将直接连接至所述药物单元。
因此，可释放组装单元可由下式代表，其中QCO是共价连接单元，QSP是间隔物单元和QCL是可切割单元。共价连接单元可存在或不存在，并且间隔物单元可存在或不存在。星号表示与药物单元共价连接的位点，并且波浪线表示配体-药物偶联物或其中间体内的共价连接(视情况可连接至LP、A或AD)：
在其中所述间隔物单元不存在并且共价连接单元存在的实施方式中，-X-D可以由式XIX表示，其中共价连接单元附近的波浪线指示与接头的剩余部分的共价连接(视情况可连接至LP、A或AD)。
在其中所述共价连接单元不存在且间隔物单元不存在的实施方式中，-X-D可以由式XX表示，其中可切割单元附近的波浪线指示与接头的剩余部分的共价连接(视情况可连接至LP、A或AD)：
在其中所述间隔物单元存在且共价连接单元存在的实施方式中，-X-D可以是由式XXI表示，其中共价连接单元附近的波浪线指示与接头的剩余部分的共价连接(视情况可连接至LP、A或AD)：
在其中所述间隔物单元存在且共价连接单元不存在的实施方式中，-X-D可以由式XXII表示，其中可切割单元附近的波浪线或间隔物单元指示与接头的剩余部分的共价连接(视情况可连接至LP、A或AD)。
本领域技术人员应理解上述关于-X-D(式XIX-XXIV)的任何定义均可用于本文提供的任何式和实施方式以及其任何所选实施方式中。各X、D和各QCO、QCL或QSP单元可以相同或不同。
在本发明的优选方面中，可释放组装单元的质量不多于约5000道尔顿，不多于约4000道尔顿，不多于约3000道尔顿，不多于约2000道尔顿，不多于约1000道尔顿，不多于约800道尔顿，或不多于约500道尔顿。在一些方面中，可释放组装单元的质量是从约100道尔顿，或从约200道尔顿，或从约300道尔顿至约5000道尔顿，从约100道尔顿，或从约200道尔顿，或从约300道尔顿至约4000道尔顿，从约100道尔顿，或从约200道尔顿，或从约300道尔顿至约3000道尔顿，约从100道尔顿，或从约200道尔顿，或从约300道尔顿至约2000道尔顿，从约100道尔顿，或从约200道尔顿，或从约300道尔顿至约1000道尔顿，从约100道尔顿，或从约200道尔顿，或从约300道尔顿至约800道尔顿，或从约100道尔顿，或从约200道尔顿，或从约300道尔顿至约500道尔顿。
本领域技术人员应理解中间体接头或药物-接头化合物的组分可以与其中所述配体单元缺失的配体-药物偶联物相同的方式连接。
可切割单元(QCL)
可切割单元是可释放组装单元的唯一必需存在的组分。在一些方面中，可切割单元与药物单元形成可切割键。在一些方面中，可切割单元与间隔物单元形成可切割键。在一些方面中，可切割键位于可切割单元内，但允许释放游离药物(例如，通过切割后的1,6-消除反应)。用于形成可切割键的官能团可包括，例如，形成二硫键的巯基基团、形成腙键的醛、酮或肼基团，形成肟键的羟基胺基团、形成肽键的羧基或氨基基团、形成酯键的羧基或羟基基团，和形成糖苷键的糖。
可切割单元的性质可广泛变化。例如，可切割接头包括可通过二硫键交换来切割的含二硫键的接头，可通过酸性pH来切割的酸不稳定接头，和可通过水解酶切割的接头(例如，肽酶、酯酶和葡糖醛酸酶)。
可切割单元的结构和序列可以使该单元由靶位点处存在的酶的作用而切割。在其它方面中，可切割单元可通过其它机理被切割。所述可切割单元可包含一个或多个切割位点。
在一些实施方式中，所述可切割单元将包含一个氨基酸或一种或多种序列的氨基酸。可切割单元可包含，例如，单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。
可切割单元的各氨基酸可以是天然或非天然的，和/或D-或L-异构体，限制条件当然是其中存在可切割的键。在一些实施方式中，所述可切割单元将仅包含天然氨基酸。在一些实施方式中，所述可切割单元将包含连续序列中的1至12个氨基酸。
在一些实施方式中，可切割单元的各氨基酸独立地选自下组：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、硒半胱氨酸、鸟氨酸、青霉胺、β-丙氨酸、氨基链烷酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、氨基苯甲酸、氨基-杂环-链烷酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸，及其衍生物。在一些实施方式中，各氨基酸独立地选自下组：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和硒半胱氨酸。在一些实施方式中，各氨基酸独立地选自下组：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。在一些实施方式中，各氨基酸选自蛋白质或非蛋白质氨基酸。
在另一个实施方式中，可切割单元的各氨基酸独立地选自下组：如下L-(天然)氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸和缬氨酸。
在另一个实施方式中，可切割单元的各氨基酸独立地选自下组：这些天然氨基酸的如下D-异构体：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸和缬氨酸。
在一些实施方式中，可切割单元和药物单元或间隔物单元之间的键可被一种或多种酶(包括肿瘤相关的蛋白酶)通过酶促反应切割，以释放药物单元(-D)，其在一个实施方式中在释放后体内质子化以提供药物(D)。
有用的可切割单元可作设计并优化其对特定酶如肿瘤相关蛋白酶的酶切选择性。在一个实施方式中，可切割单元和药物单元或间隔物单元之间的连接(或键)是，其切割由组织蛋白酶B、C和D或胞浆素蛋白酶催化的连接(或键)。
在某些实施方式中，所述可切割单元可仅包含天然氨基酸。在其它实施方式中，所述可切割单元可仅包含非天然氨基酸。在一些实施方式中，所述可切割单元可包含连接至非天然氨基酸的天然氨基酸。在一些实施方式中，所述可切割单元可包含连接至天然氨基酸的D-异构体的天然氨基酸。
示例性的可切割单元是二肽-Val-Cit-、-Phe-Lys-或–Val-Ala。
在一些实施方式中，所述可切割单元将包含肽，并且将包含1至12个氨基酸。在一些所述实施方式中，所述肽将直接偶联至药物单元，并且间隔物单元将不存在。在一些所述实施方式中，所述肽将是二肽。
在一些实施方式中，所述可切割单元–CU-将由-(–AM-)1-12-或(–AM-AM-)1-6表示，其中AM每次出现时独立地选自天然或非天然氨基酸。在一方面中，AM每次出现时独立地选自天然氨基酸。本领域技术人员应理解，氨基酸通常通过氨基酸中存在的官能单元(例如，其羧酸或氨基末端)连接至所述药物单元或间隔物单元。
在其它方面中，可切割单元将包含糖切割位点。在一些所述实施方式中，所述可切割单元包含通过氧糖苷键连接至自分解型基团的糖部分(Su)。在所述方面中，认为自分解型基团是可切割单元，QCL的部分。“自分解型基团”是三官能化学部分，其能够将三个分开的化学部分共价连接到一起(即，糖部分(通过糖苷键)、药物单元(直接或间接通过间隔物单元QSP)和LP单元，A单元或AD单元(直接或间接通过共价连接单元QCO)。糖苷键是能够在靶位点被切割以起始导致药物释放的自分解型反应次序。
因此，可切割单元可包含通过糖苷键(-O'-)连接至下式的自分解型基团(K)的糖部分(Su)：
其中所述自分解型基团K与药物单元形成共价键(直接或间接通过间隔物单元)，并且与LP、AD或A形成共价键(直接或间接通过共价连接单元)，视情况而定。
可切割单元可以是，例如，由下式所示：
其中Su是糖部分，-O'-代表氧糖苷键；各R独立地是氢、卤素、-CN，或-NO2；并且，其中波浪线表示连接至LP、AD或A(直接或间接通过共价连接单元)且星号表示连接至药物单元(直接或间接通过间隔物单元–所述间隔物单元，存在时，可以是，例如–C(＝O)-)。
在一些所述实施方式中，所述糖切割位点被β-葡糖醛酸酶识别，并且可切割单元包含葡糖苷酸单元。葡糖苷酸单元可包含通过糖苷键(-O'-)连接至下式的自分解型基团(K)的葡糖醛酸：
其中所述自分解型基团K与药物单元形成共价键(直接或间接通过间隔物单元)，并且与LP、AD或A形成共价键(直接或间接通过共价连接单元)，视情况而定。
葡糖苷酸单元可以是，例如，由下式所示：
其中波浪线表示与LP、AD或A的共价连接(直接或间接通过共价连接单元)，且星号表示与药物单元的共价连接(直接或间接通过间隔物单元)。
在一些实施方式中，可切割单元包含糖切割位点、-X-D如下式所示：
其中Su是糖部分，-O'-代表氧糖苷键；各R独立地是氢或卤素、-CN、-NO2或其它吸电子基团，QCO是共价连接单元；其中波浪键指示与接头单元的剩余部分的共价连接(LP、A或AD，视情况而定)。
当可切割单元包含葡糖苷酸单元时，-X-D可以是，例如，如下式所示：
其中波浪键指示与接头单元的剩余部分的共价连接(LP、A或AD，视情况而定)；且QCO是共价连接单元。
在一些其它实施方式中，可切割单元其本身将包含能够与间隔物单元或药物单元的硫原子形成键以形成二硫键或受阻的二硫键的硫原子。二硫键的两个硫原子之间发生切割。在一些所述实施方式中，所述硫原子之一从药物单元中切割，并且，限制条件是没有其它的释放机理，另一个硫原子保持连接至药物单元，并成为药物单元的部分。
本领域已知多种二硫化物接头，并且其能够适用于本发明，其包括例如，可用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯)、SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)甲苯)和SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯)形成的那些接头。(参见例如Thorpe等，1987，CancerRes.47:5924-5931；Wawrzynczak等，刊于Immunoconjugates:AntibodyConjugatesinRadioimageryandTherapyofCancer(《免疫偶联物：放射成像和癌症治疗中的抗体偶联物》)(C.W.Vogel编，牛津大学出版社(OxfordU.Press)，1987，也参见美国专利号4,880,935)。
在一些实施方式中，所述可切割单元是pH-敏感性的，并且将包含，例如，能使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺(cis-aconiticamide)、原酸酯、缩醛或缩酮基团)。(参见例如美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics83:67-123；Neville等，1989，Biol.Chem.264:14653-14661)。这类接头在中性pH条件下(例如在血液中)相对稳定，但在低于pH5.5或5.0的条件(接近溶酶体的pH)下不稳定。
在一些实施方式中，所述可切割单元将直接偶联至药物单元，并且可切割单元将通过可切割的肽或二硫键连接至所述药物单元。
间隔物单元(QSP)
间隔物单元存在时的作用是将药物单元与可切割单元连接。间隔物单元具有两种一般类型：自分解型和非自分解型。非自分解型单元是，切割之后，其中间隔物单元的部分或全部保持与药物单元结合的单元，并且可以进一步降解或自发分解以产生‘游离药物’或可成为药物单元本身的部分。非自分解型单元的示例包括但不限于，甘氨酸-甘氨酸单元和单甘氨酸单元(均描述于方案A中)(见下文)。包含甘氨酸-甘氨酸单元或单甘氨酸单元的配体-药物偶联物经历酶促切割(通过肿瘤细胞相关的-蛋白酶、癌细胞相关的蛋白酶或淋巴细胞相关的蛋白酶)时，从所述偶联物切割甘氨酸-甘氨酸-药物单元或甘氨酸-药物单元。在一个实施方式中，在靶细胞中发生独立的水解反应，切割甘氨酸-药物单元键并释放药物。
方案A
在一个实施方式中，非自分解型单元是-Gly-Gly-。在另一个实施方式中，非自分解型单元是-Gly-。
在另一个实施方式中，所述间隔物单元包含对氨基苄基醇(PAB)单元(参见方案B和C，见下文)其中所述亚苯基部分用Qm取代，其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)，或其它供电子基团或-卤素、-硝基、–氰基或其它吸电子基团；且m是0-4的整数。
或者，包含自分解型间隔物单元的偶联物无需独立的水解步骤即能够释放-D。在一些方面中，所述延伸单元包含PAB基团，该PAB基团通过所述PAB基团的氨基氮原子连接至肽可切割单元，并且通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接连接至药物单元。PAB基团和附近的羰基组成间隔物单元。不希望受任何具体理论或机理的限制，方案B描述了通过氨基甲酸酯或碳酸酯基团直接连接于-D的PAB基团的药物释放的可能机理，如Toki等，2002，J.Org.Chem.67:1866-1872所述。
方案B
方案B
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；且m是0-4的整数。
不受任何具体理论或机理限制，方案C描述了通过醚或胺连接直接连接至-D的PAB基团的药物释放的可能的机理。
方案C
方案C
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；且m是0-4的整数。
不受任何具体理论或机理限制，方案D描述了通过羰基直接连接至-D的葡糖苷酸单元的PAB基团的药物释放的可能的机理。
方案D
方案D
自分解单元的其它示例包括：包含电学性质类似于PAB基团的芳族化合物的那些，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(参见例如，Hay等，1999，Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻或对-氨基苄基缩醛。可以使用在酰胺键水解时发生环化的间隔物，例如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(参见例如，Rodrigues等，1995，ChemistryBiology2:223)、合适取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(参见例如，Storm等，1972，J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(参见例如，Amsberry等，1990，J.Org.Chem.55:5867)。甘氨酸α-位上取代的含胺药物的消除(参见例如，Kingsbury等，1984，J.Med.Chem.27:1447)也是示例性偶联物中有用的自分解间隔物的示例。
在本发明的优选实施方式中，所述间隔物单元包含1、2或3个自分解型或非自分解型基团。
在本发明的优选实施方式中，所述间隔物单元的质量不多于约1000道尔顿，不多于约500道尔顿，不多于约400道尔顿，不多于约300道尔顿，或约10、50或100至约1000道尔顿，约10、50或100至约500道尔顿，约10，50或100道尔顿至约400道尔顿，约10、50或100道尔顿至约300道尔顿或约10，50或100道尔顿至约200道尔顿。
共价连接单元(QCO)
存在时，所述共价连接单元使可释放接头组装单元的框架延伸，以在LP和药物单元之间提供更大的距离。就此而言，共价连接单元具有能够与任选的支化单元A或LP或所述药物连接单元AD的官能团在一个末端形成键的官能团，和能够与可切割单元的另一端的官能团形成键的官能团。在一些方面中，示例性的键通过非条件性可切割连接实现。
技术人员应理解，共价连接单元可以是能够作用以提供可切割单元与所述分子的剩余部分的连接的任何基团或部分。在一些方面中，在组装之前，共价连接单元将具有两个能够形成键且连接至配体-药物偶联物或其中间体的组分的官能团。本领域技术人员应理解，在组装前，所述共价连接单元可具有多于两个官能团；然而，出于本发明目的，将仅通过所述官能团中的两个连接至配体-药物偶联物或其中间体的组分。所述共价连接单元可以是一个或多个(例如，1-10，优选地，1、2、3或4个)天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛、二胺，或天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或二胺。在一些方面中，所述共价连接单元是天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛，或二胺。能够起到共价连接单元的作用的示例性氨基酸包括β-丙氨酸。
在一些实施方式中，所述共价连接单元具有如下所示的式：
其中R111是对羟基苄基、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、
各R100独立地选自氢或-C1-C3烷基，优选氢或CH3；
且
c是独立地选自1至10的整数，优选1至3
具有用于连接至可切割单元的羰基基团的代表性的共价连接单元如下：
其中R13是-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-，或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-。在优选实施方式中，R13是-C1-C6亚烷基。
具有用于连接至可切割单元的NH基团的代表性的共价连接单元如下：
其中R13是-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-，或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-。在优选实施方式中，R13是-C1-C6亚烷基。
具有用于连接至可切割单元的NH基团的代表性的共价连接单元如下：
其中R13是-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环-、-亚芳基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-，或-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-。在优选实施方式中，R13是-C1-C6亚烷基。
具有用于连接至可切割单元的NH基团的代表性的共价连接单元如下：
其中R13是-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-，或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-。在优选实施方式中，R13是-C1-C6亚烷基。
共价连接单元的所选实施方式包括如下结构，其中氮附近的波浪线指示与LP(或AD或A)的共价连接，而羰基附近的波浪线指示与可切割单元的共价连接，且m是1-6的整数，优选2至6，更优选2至4。
在一些方面中，所述共价连接单元是任选被取代的C1-8杂亚烷基。
在一些方面中，尤其是其中所述共价连接单元与平行连接物单元、支化单元，或药物连接单元的硫原子形成键的那些，所述共价连接单元将通过共价连接单元的马来酰亚胺基团与硫原子形成键。该实施方式的代表性的共价连接单元包括式XXIII和XXIV的方括号中所示的那些，其中波浪线表示与本文所述的可切割单元的连接，且星号表示与平行连接物单元、支化单元，或药物连接单元的硫原子的连接，并且R17'是-C1-C10亚烷基-、C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10杂亚烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10杂亚烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-，或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-。R17'取代基可以是任选地取代的。在一些方面中，R17'取代基将是未取代的。在一些方面中，R17'基团任选被碱性单元取代，例如，–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa和–(CH2)xNRa 2，其中x是1-4的整数，且各Ra独立地选自下组：C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或两个Ra基团与其连接的氮联合形成吖丁啶基(azetidinyl)、吡咯烷基或哌啶基基团。
说明性的共价连接单元是式XXIII的结构，其中R17'是-C2-C5亚烷基-C(＝O)-其中亚烷基任选被碱性单元取代，例如，–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa和–(CH2)xNRa 2，其中x是1-4的整数，且各Ra独立地选自下组：C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或两个Ra基团与其相连的氮联合形成吖丁啶基(azetidinyl)、吡咯烷基或哌啶基基团。示例性实施方式如下：
应理解，上述取代的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。
应理解，延伸单元的氨基基团可被氨基保护基团(例如，酸不稳定保护基团(例如，BOC))保护。
在本发明的优选方面中，共价连接单元的质量不多于约1000道尔顿，不多于约500道尔顿，不多于约400道尔顿，不多于约300道尔顿，约10、50或100道尔顿至约500道尔顿，约10、50或100道尔顿至约500道尔顿，约10、50或100道尔顿至约400道尔顿，约10、50或100道尔顿至约300道尔顿或约10、50或100道尔顿至约200道尔顿。
PEG化的偶联支架
本领域技术人员应理解，所选用于本发明的PEG单元的尺寸将取决于加成PEG单元之前药物及其药物-接头部分的接头组分的疏水性。式DD、X、XI或XII的中间体化合物能够作为PEG化的偶联支架，其可用于筛选产生具有改善的PK参数和/或最小凝集的ADC的药物和PEG单元的组合。PEG化的偶联支架能够实现用于给定药物-接头的PEG亚基数量的优化的平台。
PEG化的偶联支架经特殊设计以允许不同药物和PEG部分的平行偶联，以检验PEG对于宽范围的传统药物-接头(即，不包含本发明的平行连接的PEG单元的药物-接头)遮蔽疏水性和改善PK参数的能力。优选选择具有将遮蔽药物-接头的疏水性的足够尺寸，但不会过大以对配体-药物偶联物扩散至靶位点或进入靶细胞并释放药物的能力产生负面影响的PEG单元。
在特别优选的实施方式中，待用于PEG优化的传统药物-接头是具有用于偶联至抗体的巯基基团的反应性基团的那些，例如，包含马来酰亚胺的药物-接头和可通过蛋白酶切割的可释放组装单元X。因此，伴随偶联支架使用的，具有可通过蛋白酶切割的可释放组装单元X的示例性X-D单元包括如下结构，其中D是本文所述的任何药物单元：
在其它特别优选的实施方式中，待用于PEG优化的传统药物-接头是具有用于偶联至抗体的巯基基团的反应性基团的那些，例如，包含马来酰亚胺的药物-接头和可通过糖苷酶切割的可释放组装单元X。因此，伴随偶联支架使用的，具有可通过糖苷酶切割的可释放组装单元X的示例性X-D单元包括如下结构，其中D是本文所述的任何药物单元：
在其中用于PEG优化的药物-接头是具有用于偶联至巯基接受基团(例如马来酰亚胺部分)的反应性基团的那些时，所述偶联支架将具有受保护的含巯基残基，其在去保护时能够共价连接至药物-接头的巯基接受基团。受保护的含巯基残基可以是平行连接物单元(或支化单元或药物连接单元)的组分。示例性的PEG化的偶联物支架具有式DD，其中所述LP'单元包含具有下式的氨基酸：
其中：
下标n是1至4的整数；
R1和R2独立地选自下组：H、C1-3烷基、苯基或C2-C5杂环(优选氢、甲基、乙基或丙基)；和
RPR是合适的巯基-保护基团。
示例性的PEG化的偶联物支架具有式DD，其中所述LP'单元包含受保护的半胱氨酸、高半胱氨酸，或青霉胺。所述氨基酸的D或L异构体是合适的。示例性的用作LP'单元的氨基酸是如下所示具有叔丁基硫作为合适的保护基团的半胱氨酸。
被合适地保护的配体-接头中间体化合物中，示例性PEG化的偶联支架包括如下结构：
被合适地保护的配体-接头中间体化合物中，其它示例性PEG化的偶联支架包括如下结构：
在与药物-接头偶联之后，示例性PEG化的偶联支架提供如下的配体-药物偶联物：
示例性中间体偶联支架具有式(CC)，其中所述LP'单元包含具有下式的氨基酸：
其中：
下标n是1至4的整数；
R1和R2独立地选自下组：H、C1-3烷基、苯基或C2-C5杂环(优选氢、甲基、乙基或丙基)；和
RPR是合适的巯基-保护基团。
被合适地保护的接头中间体化合物中，示例性中间体PEG化的偶联物支架如下所示：
示例性的PEG化的偶联物支架可以具有式XI，其中所述LP'单元和药物连接单元AD'各包含具有下式的独立选择的氨基酸：
其中：
下标n是1至4的整数；
R1和R2独立地选自下组：H、C1-3烷基、苯基或C2-C5杂环(优选氢、甲基、乙基或丙基)；和
RPR是合适的巯基-保护基团。
被合适地保护的配体-接头中间体化合物中，式XI的示例性PEG化的偶联物支架如下所示：
在与药物-接头偶联之后，示例性PEG化的偶联支架提供式II的配体-药物偶联物：
对于PEG化的偶联支架和中间体，延伸单元、Z或Z'、PEG、配体、保护基团RPR和下标p如本文提供的任何实施方式中所述。在示例性方面，延伸单元是如本文中所述的包含马来酰亚胺的延伸单元。在示例性实施方式中，所述PEG单元具有6至72、10至72，或12至72个亚基，并且该延伸单元是如本文中和本文提供的关于XVa的任何实施方式中所述的包含马来酰亚胺的延伸单元。
因此，本发明提供选择PEG单元用于配体-药物偶联物的方法，所述方法包括如下步骤：(i)提供具有式(DD)的偶联支架，其中所述平行连接物单元包含巯基保护的半胱氨酸，(ii)从巯基保护的半胱氨酸移除保护基团以形成具有游离巯基的去保护的偶联支架，(iii)使该去保护的偶联支架与药物-接头接触，所述药物-接头具有与游离巯基在条件下共价连接以形成配体-药物偶联物的官能团。所述方法还可包括，测试所得配体-药物偶联物的PK参数(参见例如，实施例8或21)。还提供通过所述方法产生的配体药物偶联物。
还提供选择用于配体-药物偶联物的PEG单元的方法，所述方法包括如下步骤：(i)提供具有式XI或XII的偶联支架，其中所述平行连接物单元和药物连接单元包含巯基保护的半胱氨酸，(ii)从巯基保护的半胱氨酸移除保护基团以形成具有游离巯基的去保护的偶联支架，(iii)使去保护的偶联支架与药物-接头接触，所述药物-接头具有与游离巯基在条件下形成共价连接以形成配体-药物偶联物的官能团。所述方法还可包括，测试所得配体-药物偶联物的PK参数(参见例如，实施例21)。还提供通过所述方法产生的配体药物偶联物。
药物载量
一般提及式I、II、III和AA的配体-药物偶联物，每配体的药物-接头单元的数量由p表示。当述及所述偶联物的群中的个体配体-药物偶联物时，p是表示每配体药物-接头分子的数目的整数。当述及包含多重偶联物的组合物(即，LDC组合物)时，p代表每配体药物-接头的平均数目，并且更通常地是非整数数字。在那些情况中，在描述包含抗体-药物偶联物(ADC)的LDC组合物的实验中，其中提及指定数量的药物单元/抗体的载药量(例如，8单位载药量、16单位载药量或32单位载药量)，该值指的是平均药物载量以及组合物中起主要作用的ADC的药物载量，其取决于将与接头-药物化合物或在适当情况下与配体中间体反应，随后引入–X-D的抗体上的反应位点的数量。在配体-药物偶联物的群中，可以存在平均1至14个药物-接头/配体，平均约6至约14、约6至约12、约6至约10、约8至约14、约8至约12，或约8至约10个药物-接头单元/配体。示例性地，通过硫醚连接至所述配体。配体上示例性偶联位点是引入配体的链间二硫键残基和/或残基的巯基(例如，引入的半胱氨酸)。当述及其中所述平均载药量是约8、10、12、14、16或32的实施方式时，8、10、12、14、16或32的值通常也指组合物中主要配体药物偶联物的药物载量。类似地，当述及其中存在平均约8至约14、约8至约12，或约8至约10个药物-接头单元/配体的实施方式，该值通常也指组合物中主要ADC的药物-接头载量。
偶联反应的制备物中每配体单元的药物-接头单元的平均数目可通过传统方式表征，例如质谱、ELISA试验，HIC和HPLC。也可以p的形式确定配体-接头-药物偶联物的定量分布。在某些情况下，可通过诸如反相HPLC或电泳等方式将具有某一确定p值的同质配体-药物偶联物与其它药物载量的配体-药物偶联物分离、纯化，并鉴定。
组合物
本发明提供包含任何本文所述配体-药物偶联物的组合物。例如，本发明提供包含式AA、I、II或III及其任何所选实施方式的配体-药物偶联物的组合物。变量如本文在任何实施方式中所定义。
当式AA、I、II或III不代表个体LDC化合物而是LDC组合物(即，包含配体药物偶联物的群的组合物时)，下标p代表组合物中每配体分子(例如，抗体分子)的药物-接头分子的平均数目。类似地，当式DD、X、XI和XII不代表个体配体-接头中间体化合物而代表配体接头中间体组合物(即，包含配体接头中间体化合物的群的组合物)时，下标p代表组合物中每配体分子(例如，抗体)的接头分子的平均数目。应理解，所述组合物可包含其上连接有不同数量(例如，1至14个、2至12个、4至12个、6至12个、8至12个)以获得平均p值的药物-接头的配体-药物偶联物的集合(或群)。或者，所述组合物可包含其上连接有相同或基本相同的数量(1至14个)的药物-接头以获得平均p值的配体-药物偶联物的集合(或群)。术语集合或群在本文中同义使用。组合物中可存在小百分比的未偶联的抗体，其也反应在平均p值中。对于包含本发明的配体-药物偶联物的群的组合物，可以存在平均1至14个药物-接头/配体，平均约6至约14、约6至约12、约6至约10、约8至约14、约8至约12，或约8至约10个药物-接头单元/配体。PEG如本发明教导的应用特别适合于具有高载药量的配体-药物偶联物，例如，平均药物载量为至少约6，更优选至少约8个药物-接头/配体，其中各药物-接头具有一个或多个–X-D部分，优选1、2或4。因此，本文提供的组合物的平均药物-接头载量优选是组合物中至少约8个药物-接头分子/配体，并且优选具有约8、10、12或16至约32个药物单元/配体单元。
在一些方面中，所述组合物是包含本文所述的配体-药物偶联物和药学上可接受的载体的药物组合物。例如，本发明提供包含式I、II或III及其任何所选实施方式的偶联物的药物组合物。在一些方面中，所述药物组合物是液体形式。在一些方面中，其将是冻干粉末。
所述组合物，包括药物组合物，可以纯化的形式提供。本文中所用的“纯化的”指，分离时，分离物包含至少95％(且在另一方面至少98％)的偶联物，以所述分离物的重量计。
药代动力学
如前所述，发明人发现，某些配体-药物偶联物的药代动力学概况可以通过PEG单元的加成而显著改变。在某些情况中，PEG与配体单元和药物单元呈平行取向的设置能够降低该配体-药物偶联物的血浆清除率，并提高血浆暴露率，这改善所述偶联物的所需的药学活性。惊人地，PEG单元与配体单元和药物单元呈串联取向的设置不提供药代动力学效应的相同改善，并且，在某些情况中，相对于其非PEG化的对应物而言，这实际上会提高清除率并降低相对暴露度。直至本发明之前，对通过疏水性化合物的PEG化而减少疏水性的努力尚未考虑PEG单元的取向效应。
有许多方式能够测量配体-药物偶联物的药代动力学参数。一种方法是确定配体-药物偶联物浓度，即，在某一时间点，在给定体积的血浆或血清中配体-药物偶联物的量。另一种方法是确定药物清除率，即，每单位时间清除配体-药物偶联物的血浆(或血清)体积。第三种方法是确定曲线下面积(AUC)，即，浓度-时间曲线的积分。浓度、清除率和AUC可以通过在向对象给予感兴趣的试剂之后，沿纵坐标(Y轴)的总抗体的血清(或血浆)浓度(μg/ml)对沿横坐标(X轴)的时间(天数)作图来确定。例如，在一个方法中，药代动力学参数通过对小鼠注射一定剂量的：(i)未偶联的配体，(ii)本发明的配体-药物偶联物，和(iii)比较配体-药物偶联物，并在注射之后的多个时间点(例如，1、2、3、7、14、21、28、35、42、49和56天)收集血液样品，并分离血清来测量。血清(或血浆)浓度可以通过本领域已知的方法测量。例如，可以利用合适的检测原理，通过夹心ELISA来检测总配体(例如，抗体)的血清(或血浆)浓度。各动物的血清(或血浆)浓度数据可采用合适的软件分析，以获得某些时间点的浓度、药物清除率和AUC值。在另一个实施方式中，药代动力学数据可以采用带放射性标记的偶联物来产生。例如，可对动物给予带放射性标记的配体或配体-药物偶联物，并通过液体闪烁计数法来检测血浆(或血清)浓度。在一些实施方式中，所用的动物模型是大鼠模型。
在一些实施方式中，本发明的配体-药物偶联物的药代动力学概况与其未偶联的配体相似。因此，本文提供的配体-药物偶联物的清除率值在未偶联的配体的清除率值的约3倍内或在约2倍内，和/或其AUC值是未偶联的配体的AUC值的至少25％或至少30％(例如，参见表2)。
在一些实施方式中，本发明的配体-药物偶联物的药代动力学概况相较于比较偶联物有所改善。因此，本文提供相较于比较偶联物(即，不具有与药物-接头部分平行取向的PEG单元)，具有改善的浓度值、清除率值和/或AUC值的配体-药物偶联物。术语改善的清除率值意味着所述配体-药物偶联物的清除率比比较偶联物的清除率值好至少2倍或至少3倍(例如，14.2mL/天/kg的值相较于48.6或57.8mL/天/kg的值)。术语改善的AUC值意味着所述配体-药物偶联物的AUC值比比较偶联物的AUC值好至少2倍或至少3倍(例如，229.7天*μg/ml的值，相较于67或52天*μg/ml的值)。
比较偶联物可以是缺乏所述PEG单元的相同或基本类似的偶联物，缺乏相对于配体单元和药物单元呈平行取向的PEG单元但包含呈串联取向的PEG单元的相同或基本类似的偶联物。在一些实施方式中，所述比较偶联物是包含相同药物单元但不具有PEG单元(即，缺乏PEG单元的相同或基本类似的偶联物)或具有相对于配体单元和药物单元呈串联取向设置的PEG单元的偶联物(即，具有不以平行取向设置的PEG单元的相同或基本相同的偶联物)。一般而言，所述配体-药物偶联物和比较偶联物具有相同药物载量(组合物中每配体单元的平均药物数目)。
本文中所用的短语“缺乏PEG单元的相同或基本类似的偶联物”一般指的是包含相同或基本相同的配体单元、药物单元和接头单元(例如，延伸单元和可释放组装单元)但缺乏平行连接物单元LP和PEG单元的偶联物。对于与本发明配体-药物偶联物最紧密相似的缺乏PEG单元的比较偶联物，该比较偶联物将包含相同配体单元、药物单元、可释放组装单元、延伸单元和平行连接物单元(合适时，还包括AD或A单元)。然而，所述平行连接物单元，将不连接至PEG单元但将止于官能团，例如，乙酰基基团(参见例如，实施例中的化合物44)。
本文中所用的短语“缺乏相对于配体单元和药物单元以平行取向设置的PEG单元但包含以串联取向设置的PEG单元的相同或基本相同的偶联物”(即，具有PEG单元但非以平行取向设置的PEG单元的相同或基本相同的偶联物)一般指的是包含相同或基本相同的配体单元、药物单元和接头单元(例如，延伸单元和可释放组装单元)但缺乏平行连接物单元LP和以平行构型连接于其上的PEG单元的偶联物，并且该偶联物在接头中包含与配体单元和药物单元呈串联取向的PEG单元。
上下文中的术语“基本相同的”指，可存在一些较小变化，但所述变化主要易于偶联物的多个组分的化学合成和连接。对于相较于PEG单元平行取向的本发明的偶联物，不具有PEG或PEG单元以串联取向的对照偶联物的示例，参见实施例部分。
相对于未偶联的配体显示显著更大的血浆清除率和相应较低的血浆暴露率的配体-药物偶联物将受益于本发明，因为其可经如本文中所述的修饰以包含PEG单元。相对于未偶联的配体的显著更大的血浆清除率指的是清除率值是未偶联的配体的血浆清除率值的2倍以上、3倍以上或4倍以上(参见例如表2)。相对于未偶联的配体的较低血浆暴露率指的是AUC值是未偶联的配体的AUC的30％或更少，25％或更少，或20％或更少(参见例如表2)。
在一些实施方式中，本文提供的配体-药物偶联物的清除率值在未偶联的配体的清除率值的约3x内或在约2x内，和/或其AUC值是未偶联的配体的AUC值的至少25％或至少30％。
在一些实施方式中，待用于本发明中作为药物单元的药物是，当作为缺乏PEG或包含串联取向的PEG的配体药物偶联物偶联至配体时，产生显示相对于未偶联的配体而言显著更大的血浆清除率和相应较低的血浆暴露率的药物。相对于未偶联的配体的显著更大的血浆清除率指的是清除率值是未偶联的配体的血浆清除率值的2倍以上、3倍以上或4倍以上(参见例如表2)。相对于未偶联的配体的较低血浆暴露率指的是AUC值是未偶联的配体的AUC的30％或更少，25％或更少，或20％或更少(参见例如表2)。
具有疏水药物单元或疏水药物-接头的配体-药物-偶联物将受益于本发明，因为其可经如本文中所述的修饰以包含PEG单元，并且可观察到其药代动力学参数通过本发明的应用而增强。
在优选实施方式中，所述配体是抗体。
聚集
发明人还发现，某些配体-药物偶联物的聚集可通过对疏水药物接头部分以平行取向加成PEG单元而显著减少。
在一些实施方式中，待用于本发明的药物是，当偶联至配体成为缺乏PEG或包含串联取向的PEG并平均具有4、8或16个药物/配体的配体药物偶联物时，产生SEC所测聚集水平为4％或更大、5％或更大，或10％或更大的配体-药物偶联物。
本发明提供平均具有8个药物/配体单元或更大，10个药物/抗体或更大，12个药物/抗体或更大，16个药物/抗体或更大，或32个药物/抗体的配体-药物偶联物，其聚集水平为约1％或约2％或约3％(例如，式1或II，其中p是4或8，m是1，s是0且t是0；式II，其中p是8，m是2，s是1且t是0)的配体-药物偶联物的群。
在优选的方面中，所述配体单元是抗体。
所选实施方式
本发明的示例性–X-D单元包括如下那些，其中波浪线表示共价连接至LP、A或AD单元，是情况而定：
应理解，上述取代的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。
本发明的示例性药物-接头化合物包括由如下结构所示的那些：
或其药学上可接受的盐，其中所述PEG单元如本文提供的任何实施方式中所述，并且可以是分散性或非分散性的，并且n是6至72、8至72、10至72、12至72、12至38、12至36、6至24，或最优选8至24或12至24的整数；RPR是氢或保护基团，例如，酸不稳定保护基团，例如，BOC。在一些实施方式中，n是8、10、12或24。对于采用分散的PEG单元前体制备的配体-药物偶联物(即，LDC组合物)的群，前体优选具有对应于具有约6至72、8至72、10至72、12至72、12至38、12至36、6至24，或最优选8至约24个亚基或约12至约38个亚基的PEG单元的峰平均MW。当PEG是非分散性的，则LDC组合物的各LDC将通常具有含有相同数量的PEG亚基(-OCH2CH2)，即，相同整数值n的PEG单元。非分散性的PEG单元可以，例如，具有如下结构其中R21是PEG加帽单元，优选–CH3或–CH2CH2CO2H，且n是整数8至12、8至24或12至38的整数。
提供2倍药物载量的本发明的示例性药物-接头化合物包括由如下结构所示的那些
以及其中mc-VC-PAB-D被mc-VA-PAB-D或mc-VA-D或任何其它X-D单元替换的那些结构；
其中RPR是氢或保护基团，例如，酸不稳定保护基团，例如，BOC；
mc-VC-PAB-D具有如下结构：
mc-VA-PAB-D具有如下结构：
mc-VA-D具有如下结构：
MDpr-PAB(gluc)-D具有如下结构：
其中mc-VC-PAB-D、mc-VA-PAB-D、mc-VA-D和MDpr-PAB(gluc)-D是结合至PEG化的支架的示例性–X-D部分，并且其中波浪线表示mc或MDpr的琥珀酰亚胺环与PEG化的支架的硫的共价结合；
并且PEG如本文提供的任何实施方式中所述，并且，当描述采用分散的PEG单元前体制备的LDC的群时，可以是分散的，其中所述分散的PEG单元前体优选具有对应于具有n个，即约8至约24个亚基或约12至约38个亚基的的PEG单元的峰平均MW，或非分散性的(如n为整数值的PEG单元所限定，其中其中LDC组合物的各LDC将具有相同整数值n的PEG单元)。在一些实施方式中，非分散性的PEG单元具有如下结构其中R21是PEG加帽单元，优选–CH3或–CH2CH2CO2H，波浪线表示PEG单元与PEG化的支架的共价结合，并且n是8至24或12至38的整数。
在一些实施方式中，在存在mc部分的mc-VC-PAB-D、mc-VA-D和mc-VA-PAB-D中任意一种，以上结构的mc部分经MDpr部分替换，在这些结构中，其中mc部分具有如下结构：其中对于琥珀酰亚胺部分的波浪线指示与PEG化的支架的共价连接，并且对于羰基的波浪线指示共价连接至–X-D的剩余部分，该MDpr部分具有如下结构：
其中RPR是氢或保护基团，以提供MDpr-VC-PAB-D、MDpr-VA-D和MDpr-VA-PAB-D，其为进一步示例性的–X-D部分。
应理解，在任一含MDpr的–X-D部分中，MDpr中的取代的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。包含mc的–X-D部分也可具有水解形式的琥珀酰亚胺环。
提供2倍药物载量的本发明的其它示例性药物-接头化合物包括以下
其中mc-VA-D、mc-VC-PABA-D、mc-VA-PABA-D和MDpr-PAB(gluc)-D是对于上述2倍药物载量结构所述的示例性–X-D部分，并且其中，独立地选择的PEGA和PEGB如对于本文提供的PEG单元的任何实施方式中所述，并且，当述及用分散的PEG单元前体制备的配体-药物偶联物的群(即，LDC组合物)时可以是分散的，其中所述分散的PEG单元前体优选具有对应于具有n为约8至约24个亚基或约12至约38个亚基的PEG单元的峰平均MW，或PEGA是非分散性的(即，具有通过整数值鉴定的离散数量的PEG亚基的PEG单元，从而LDC组合物的各LDC包含将具有含有相同整数值n的PEG单元的ADC)。在一些实施方式中，PEGA是具有以下结构的非分散性的PEG单元
和/或，PEGB是具有结构的非分散的PEG单元，其中各R21是独立选择的PEG加帽单元，独立选择的各情况的n是8至24或12至38的整数。在优选的实施方式中，一个R21是–CH3且另一个是–CH2CH2CO2H。
在一些实施方式中，在存在mc部分的以上结构中的任一中，mc部分被MDpr部分替换，该mc部分具有如下结构：该MDpr部分具有如下结构：其中RPR是氢或保护基团，以提供MDpr-VC-PAB-D、MDpr-VA-D和MDpr-VA-PAB-D作为–X-D，
在其它实施方式中，存在MDpr部分的上述结构中的该部分被mc部分替换，以提供mc-PAB(gluc)D作为–X-D。
应理解，在任一含MDpr的–X-D部分中，MDpr中的取代的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。包含mc的–X-D部分也可具有水解形式的琥珀酰亚胺环。
提供4倍药物载量的本发明的示例性药物-接头化合物包括以下
其中mc-VC-PAB-D是对于上述2倍药物载量结构所述，并且PEG如对于本文提供的任何实施方式中所述，并且，当述及用分散的PEG单元前体制备的配体-药物偶联物的群(即，LDC组合物)时可以是分散的，其中所述分散的PEG单元前体优选具有对应于具有n为约8至约24个亚基或约12至约38个亚基的PEG单元的峰平均MW，或是非分散性的(即，具有通过整数值鉴定的离散数量的PEG亚基的PEG单元，从而LDC组合物的各LDC包含将具有含有相同整数值n的PEG单元的ADC)。在一些实施方式中，非分散性的PEG单元具有如下结构
其中R21是PEG加帽单元，波浪线表示与PEG化的支架的共价结合，且n是8至24或12至38的整数。优选R21是–CH3或–CH2CH2CO2H。
在一些实施方式中，mc-VC-PAB-D作为–X-D部分被本文所述的任一–X-D部分替换，包括MDpr-VC-PAB-D、mc-VA-PAB-D和MDpr-VA-PAB-D。
应理解，在任一含MDpr的–X-D部分中，MDpr中的取代的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。包含mc的–X-D部分也可具有水解形式的琥珀酰亚胺环。
提供4倍药物载量的本发明的其它示例性药物-接头化合物包括以下
其中MDpr-PAB(gluc)-D是对于上述2倍药物载量结构所述，并且PEG如对于本文提供的任何实施方式中所述，并且，当述及用分散的PEG单元前体制备的配体-药物偶联物的群(即，LDC组合物)时可以是分散的，其中所述分散的PEG单元前体优选具有对应于具有n为约8至约24个亚基或约12至约38个亚基的PEG单元的峰平均MW，或PEGA是非分散性的(即，具有通过整数值鉴定的离散数量的PEG亚基的PEG单元，从而LDC组合物的各LDC包含将具有含有相同整数值n的PEG单元的ADC)。在一些实施方式中，非分散性的PEG单元具有如下结构
其中R21是PEG加帽单元，波浪线表示与PEG化的支架的共价结合，且n是8至24或12至38的整数。优选R21是–CH3或–CH2CH2CO2H。
在一些实施方式中，MDpr-PAB(gluc)-D作为–X-D部分被mc-PAB(gluc)-D替换。
应理解，在任一含MDpr的–X-D部分中，MDpr中的取代的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。包含mc的–X-D部分也可具有水解形式的琥珀酰亚胺环。
本发明的示例性配体-药物偶联物包括由如下结构所示的那些：
或其药学上可接受的盐，其中p是是1至14的整数，优选2至12、6至12、8至12，或8至10，Ab是抗体，优选、单克隆抗体，D是药物单元且n是6至72、8至72、10至72、12至72、12至36或38、6至24，或最优选8至24的整数。PEG如本文提供的任何实施方式中关于PEG单元所述。应理解，Ab-取代的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)，特别是对于包含如下部分的那些抗体-药物偶联物：
其中波浪线表示共价结合至所述抗体-药物偶联物的药物-配体部分的剩余部分。
应理解，上述代表性结构也代表其中p代表所述组合物中每配体的平均药物-接头数目的组合物。在所述实施方式中，p通常不是整数值并且范围可以是1至14，优选2至12、6至12、8至12，或8至10。
提供2倍药物载量的本发明的示例性配体-药物偶联物包括由如下结构所示的那些：
以及其中所述–X-D部分mc-VC-PAB-D被本文所述的任一–X-D部分替换的那些结构，包括mc-VA-PAB-D和MDpr-VA-PAB-D
或其药学上可接受的盐，其中p是是1至14的整数，优选2至12、6至12、8至12，或8至10，Ab是抗体，优选、单克隆抗体，D是药物单元且n是6至72、8至72、10至72、12至72、12至36或38、6至24，或最优选8至24的整数。PEG如本文提供的任何实施方式中关于PEG单元所述。应理解，结合至Ab或S的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。
应理解，用Ab取代的MDpr部分中的琥珀酰亚胺或–X-D部分中的琥珀酰亚胺可以水解形式存在(即，横跨一个而非两个羰基-氮键加成水分子)。用Ab取代的mc部分中的琥珀酰亚胺或–X-D部分中的琥珀酰亚胺还可以水解形式存在。
在上述任何实施方式中，所述药物单元D可以是如下MMAE，其中波浪线表示连接至药物-接头部分的剩余部分的位点。
在一些优选的方面，包括其中D是MMAE的那些，p是6、7、8、9、10、11或12。在一些实施方式中，包括其中D是MMAE的那些，抗体通过所述抗体的半胱氨酸残基的硫原子偶联至接头。半胱氨酸残基可以是天然或非天然产生的。例如，在一些方面中，所述半胱氨酸将形成链间二硫键。在其它方面中，半胱氨酸残基将来自引入的半胱氨酸(例如，在位置239引入的半胱氨酸)。在一些方面中，抗体将通过其链间二硫键且通过引入的半胱氨酸连接至药物-接头。
在上述任何实施方式中，所述药物单元D可以是如下MMAF，其中波浪线表示连接至药物-接头部分的剩余部分的位点。
在上述任何实施方式中，所述药物单元D可以是如下方对于喜树碱本身作为示例的喜树碱化合物，其中波浪线表示连接至药物-接头部分的剩余部分的位点：
在上述任何实施方式中，所述药物单元D可以是如下方对于长春碱酰肼所示例的长春花化合物，其中波浪线表示连接至药物-接头部分的剩余部分的位点：
在上述任何实施方式中，所述药物单元D可以是如下所示例的蒽环霉素化合物，其中波浪线表示连接至药物-接头部分的剩余部分的位点：
本发明的巯基保护的接头中间体化合物和对应的配体-接头化合物中，示例性PEG化的支架包括以下：
或其药学上可接受的盐，其中
n是2至72，优选4至72或8至72或8至24；
p是1至14，优选约2至约12；和
Ab是抗体，优选单克隆抗体。
应理解，在上式中，配体-取代的琥珀酰亚胺可以其水解形式存在(即横跨一个而非两个琥珀酰亚胺的C-N键加成水分子)。此外，在上述任何实施方式中，所述叔丁基巯基保护基团可以被任何其它合适的巯基保护基团替换。
作为本发明的接头中间体化合物和对应的配体-接头化合物的示例性多重PEG化的支架包括以下：
其中波浪线指示与配体单元的共价连接，R21独立地选自PEG加帽基团，优选甲基或3-丙酸和n独立地表示2至72，优选4至72或8至72或8至24，更优选24。巯基-保护基团可以由另一个合适的巯基保护基团替换。
在一些优选的实施方式，p是6、7、8、9、10、11，或12。在一些实施方式中，所述抗体通过所述抗体的半胱氨酸残基的硫原子偶联至接头。半胱氨酸残基可以是天然或非天然产生的。例如，在一些实施方式中，所述半胱氨酸将形成链间二硫键。在其它实施方式中，半胱氨酸残基将来自引入的半胱氨酸(例如，在位置239引入的半胱氨酸)。在一些实施方式中，抗体将通过其链间二硫键且通过引入的半胱氨酸连接至药物-接头。
在本发明的一些方面中，配体-药物偶联物的配体单元和药物单元之间存在不多于50，不多于45，不多于40，不多于35，不多于30，或不多于25个间插原子。在本发明的一些方面中，在配体-药物偶联物的配体单元和可切割单元之间存在不多于40，不多于35，不多于30，或不多于25个间插原子。
在一些实施方式中，配体-药物偶联物的配体和药物单元之间的间插原子少于PEG单元中的原子。在一些实施方式中，配体-药物偶联物的配体和可切割单元之间的间插原子少于PEG单元中的原子。
在一些实施方式中，配体-药物偶联物的配体和药物单元之间的间插原子少于PEG单元的远端和平行连接物单元之间的间插原子。在一些实施方式中，配体-药物偶联物的配体和可切割单元之间的间插原子少于PEG单元的远端和平行连接物单元之间的间插原子。
在本发明的优选实施方式中，药物优选奥瑞他汀(例如，MMAE或疏水性与MMAE相当或更大的奥瑞他汀)，可释放组装单元包含可被β-葡糖醛酸酶切割的葡糖苷酸单元；并且，PEG单元包含至少6，至少8，至少10，或至少12个亚基，但不多于72个亚基，优选不多于36或24个亚基。在优选的方面中，PEG单元将包含约8至约24个亚基，最优选约12个亚基。配体-药物偶联物或其中间体的其它组分可以如本文提供的任何实施方式中所述。
本发明优选的组合物包含配体-药物偶联物的群，其中所述配体单元是抗体(例如，完整抗体)，所述药物单元是奥瑞他汀或非奥瑞他汀(优选奥瑞他汀，例如，MMAE或疏水性相当于MMAE或比MMAE更大的奥瑞他汀)，可释放组装单元包含可被β-葡糖醛酸酶切割的葡糖苷酸单元；所述PEG单元包含至少6个，至少8个，至少10个，或至少12个亚基，但不多于72个亚基，优选不多于36或24个亚基；并且所述组合物中每抗体的平均药物-接头部分数目是至少6个，或至少约8个。在优选的方面中，PEG单元将包含约8至约24个亚基，最优选约12个亚基。配体-药物偶联物的其它组分可以如本文提供的任何实施方式中所述。
使用方法
癌症治疗
配体-药物偶联物可用于抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖，从而在肿瘤或癌细胞中引起细胞凋亡，或用于治疗患者的癌症。因此，所述配体-药物偶联物可用于癌症治疗的多种设定中。配体-药物偶联物可用于将药物递送至肿瘤细胞或癌细胞。不受理论限制，在一个实施方式中，配体-药物偶联物的配体单元与癌细胞或肿瘤细胞相关的抗原结合或相联，并且该配体-药物偶联物可以通过受体介导的内吞作用或其它内化机理被摄入(内化)进入肿瘤细胞或癌细胞内部。抗原可以连接至肿瘤细胞或癌细胞，或可以是与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白质。一旦进入细胞内，通过可切割机理，所述药物在细胞内释放。在一个替代性实施方式中，所述药物或药物单元在肿瘤细胞或癌细胞外从配体-药物偶联物上被切割，并且药物或药物单元随后穿透细胞。
在一个实施方式中，所述配体单元结合至肿瘤细胞或癌细胞。
在另一个实施方式中，所述配体单元结合至位于肿瘤细胞或癌细胞的表面上的肿瘤细胞或癌细胞抗原。
在另一个实施方式中，所述配体单元结合至肿瘤细胞或癌细胞抗原，所述肿瘤细胞或癌细胞抗原是与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。
配体单元对于特定肿瘤细胞或癌细胞的特异性可能对于确定最有效地被治疗的那些肿瘤或癌症而言是重要的。例如，靶向造血系统癌症中存在的癌细胞抗原的配体-药物偶联物可用于治疗血液恶性病(例如，抗-CD30、抗-CD70、抗-CD19、抗-CD33结合性配体单元(例如，抗体)可用于治疗血液恶性病)。靶向存在于实体肿瘤上的癌细胞抗原的配体-药物偶联物可用于治疗所述实体肿瘤。
可采用配体-药物偶联物治疗的癌症包括但不限于，造血系统癌症，例如，淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)和白血病以及实体肿瘤。造血系统癌症的示例包括，滤泡性淋巴瘤、多形性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性骨髓母细胞白血病、慢性骨髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、弥散性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。实体肿瘤的示例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、咽喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓性癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞癌、胚胎癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经管胚细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜胚细胞瘤。
癌症的多形式治疗。
癌症，包括但不限于，特征为失控细胞生长的肿瘤、转移，或其它疾病或紊乱，可通过给予配体-药物偶联物来治疗或抑制。
在其它实施方式中，提供治疗癌症的方法，包括给予有此需要的患者有效量的配体-药物偶联物和化疗剂。在一个实施方式中，所述化疗剂是尚未发现难以治疗癌症的那些。在另一个实施方式中，所述化疗剂是已发现较难治疗癌症的那些。所述配体-药物偶联物可以给予已经历手术作为癌症治疗的患者。
在一些实施方式中，所述患者还接受其它治疗，例如放疗。在一个特定实施方式中，所述配体-药物偶联物与化疗剂或放疗同时施予。在另一个特定实施方式中，所述化疗剂或放疗是在给予配体-药物偶联物之前或之后进行。
化疗剂可经一系列阶段给予。可给予任一化疗剂或其组合，例如护理化疗剂的标准品。
此外，提供采用配体-药物偶联物治疗癌症的方法，作为化疗或放疗的替代疗法，其中所述化疗或放疗已证实或可被证实为毒性过高，例如，对于被治疗的对象导致不可接受或不希望的副作用。被治疗的患者可任选地用其它癌症治疗(例如手术、放疗或化疗)来治疗，这取决于发现哪种治疗是可接受或可忍耐的。
自体免疫疾病的治疗
所述配体-药物偶联物可用于杀伤或抑制产生自体免疫疾病的细胞的复制，或用于治疗自体免疫疾病。因此，所述配体-药物偶联物可用于治疗患者中的自体免疫疾病的多种设定中。所述配体-药物偶联物可用于将药物递送至靶细胞。不受理论限制，在一个实施方式中，所述配体-药物偶联物与靶细胞表面上的抗原相联，然后，所述配体-药物偶联物通过受体介导的内吞作用被摄入靶细胞内部。一旦进入细胞，接头单元被切割，导致药物或药物单元的释放。然后，释放的药物在胞液中游离迁移，并诱导细胞毒性或细胞生长抑制活性。在一个替代性实施方式中，所述药物在靶细胞外从配体-药物偶联物上切割，并且药物或药物单元随后穿透细胞。
在一个实施方式中，所述配体单元结合至自体免疫抗原。在一方面中，所述抗原位于涉及自体免疫病症的细胞的表面上。
在另一个实施方式中，所述配体单元结合至处于细胞表面上的自体免疫抗原。
在一个实施方式中，所述配体单元结合至与自体免疫疾病状态相关的活化的淋巴细胞。
在另一个实施方式中，所述配体-药物偶联物杀伤或抑制产生与具体自体免疫疾病相关的自体免疫抗体的细胞的增殖。
可用所述配体-药物偶联物治疗的自体免疫疾病的具体类型包括但不限于，Th2淋巴细胞相关的病症(例如，异位性皮炎、异位性哮喘、鼻粘膜炎、过敏性鼻炎、欧门氏综合征、全身性硬化症和移植物抗宿主疾病)；Th1淋巴细胞相关的病症(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、休格连氏综合征、桥本氏甲状腺炎、格雷弗氏病、原发性胆汁性肝硬化、魏格纳氏肉芽肿病和肺结核)；和，活化的B淋巴细胞相关的病症(例如，全身性红斑狼疮、古巴士德氏综合征、类风湿性关节炎和I型糖尿病)。
自体免疫疾病的多药物治疗
还公开了用于治疗自体免疫疾病的方法，所述方法包括给予有此需要的患者有效量的配体-药物偶联物和已知用于治疗自体免疫疾病的另一种治疗剂。
给予的组合物和方法
本发明提供包含本文所述的配体-药物偶联物和药学上可接受的载体的药物组合物。配体-药物偶联物可以是允许将化合物给予患者用于治疗与所述配体单元结合的抗原的表达相关联的病症的任何形式。例如，所述偶联物可以是液体或固体形式。优选的给予途径是胃肠外给予。胃肠外给予包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。在一方面中，胃肠外给予所述组合物。在一方面中，静脉内给予所述偶联物。给予可通过任何方便的途径进行，例如通过输注或快速注射。
药物组合物可经配制，从而允许化合物在给予患者所述组合物之后具有生物可及性。组合物可以是一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单一剂量单位。
用于配制所述药物组合物的物质在其用量内可以是无毒的。本领域普通技术人员应明了，所述药物组合物中活性成分的最优的剂量将取决于多种因素。相关的因素包括但不限于，动物类型(例如，人)、化合物的具体形式、给予的方式和所用的组合物。
组合物可以是，例如，液体形式。液体可用于通过注射给予。在用于通过注射给予的组合物中，还可包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等张剂中的一种或多种。
液体组合物(无论其是溶液、悬液还是其它类似形式)还可包含如下的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等张氯化钠、固定油(例如合成的甘油单酯或甘油二酯，其可作为溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、环糊精、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，例如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如氨基酸、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，例如非离子型表面活性剂、多元醇；和用于调节张力的试剂，例如，氯化钠或右旋糖。胃肠外组合物可以封装于由玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是示例性佐剂。可注射的组合物优选是无菌的。
有效治疗具体病症或状况的偶联物的量取决于病症或状况的性质并且由已知的标准临床技术确定。此外，可任选地进行体外或体内试验以助于鉴别最优的剂量范围。组合物所用的准确剂量也取决于给药途径和疾病或病症的严重程度，应该按照实施人员的判断和各患者的情况决定。
所述组合物包含有效量的化合物，从而可获得合适的剂量。通常，该量是至少约0.01％的化合物，以组合物的重量计。
对于静脉内给予，组合物可包含约0.01至约100mg的配体-药物偶联物/kg动物体重。在一方面中，组合物可包含约1至约100mg的配体-药物偶联物/kg动物体重。在另一个方面中，给予的量将在约0.1至约25mg/kg体重的化合物的范围内。
一般而言，给予患者的偶联物的剂量通常是约0.01mg/kg至约100mg/kg对象体重。在一些实施方式中，给予患者的剂量是约0.01mg/kg至约15mg/kg对象体重。在一些实施方式中，给予患者的剂量是约0.1mg/kg至约15mg/kg对象体重。在一些实施方式中，给予患者的剂量是约0.1mg/kg至约20mg/kg对象体重。在一些实施方式中，给予的剂量是约0.1mg/kg至约5mg/kg或约0.1mg/kg至约10mg/kg对象体重。在一些实施方式中，给予的剂量是约1mg/kg至约15mg/kg对象体重。在一些实施方式中，给予的剂量是约1mg/kg至约10mg/kg对象体重。在一些实施方式中，在治疗周期中，给予的剂量是约0.1至4mg/kg，甚至更优选0.1至3.2mg/kg，或甚至更优选0.1至2.7mg/kg对象体重。
术语“载体”指的是伴随化合物给予的稀释剂、佐剂或赋形剂。这类药物载体可以是液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油。所述载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊剂、滑石、角蛋白、硅胶、尿素。此外，助剂，稳定剂，增稠剂，润滑剂和着色剂也可能使用。在一个实施方式中，给予患者时，所述化合物或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当静脉内给予化合物时，水是示例性载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别适用于注射液。合适的药物载体包括赋形剂，如：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇。如果需要，本发明组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
在一个实施方式中，按照常规方法将该偶联物配制成适合静脉内给予动物，尤其是人类的药物组合物。用于静脉内给予的载体或载剂通常是无菌的等张水性缓冲溶液。必要时，组合物还可包含溶解剂。用于静脉注射的组合物可以任选地包括诸如利多卡因的局部麻醉剂，以减轻在注射部位的疼痛。通常，各成分单独提供或混合在一起以单位剂型的形式提供，例如作为标明活性物质含量的密封容器(如安瓿或药囊)中的冻干粉末或无水浓缩物。通过输液给予该偶联物时，例如，可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分散该组合物。通过注射给予该偶联物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前与药物成分混合。
药物组合物一般配制成无菌的、基本等张并且完全符合美国食品与药品管理局的药品生产质量管理规范(GMP)规定。
示例性方法
本文提供制备由本文中所述的式(IV)、(V)，或(VI)的结构代表的药物-接头化合物的方法，所述方法包括，步骤(a)：将本文中所述的式VII、VIII或IX的结构代表的中间体接头化合物与足够量的X'-D部分接触，以与Lp'或AD'反应，从而对于Lp'和AD'的情况分别形成Lp-X-D或AD-X-D部分，其中-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元；'且X'-D是连接至药物单元的可释放组装单元前体，其中X'能够与Lp'和/或AD'反应。
在一些方面中，如此制备的药物-接头将具有本文中所述的式IVa、IVb、Va、Vb、Vc、VIa或VIb表示的结构，并且用于步骤(a)的中间体接头化合物具有本文中所述的式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa或IXb表示的结构。
所述方法还可包括步骤(a')：将式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa或IXb的结构中对应的被合适地保护的中间体接头化合物去保护，其中t是0，和其中被合适地保护的AD'或Lp'具有如下结构
其中，R111独立地选自氢、对羟基苄基、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、
必要时，具有合适的保护，
其中RPR是合适的巯基保护基团，且波浪线表示中间体接头化合物内合适保护的AD'或Lp'部分的共价连接；
并且，在步骤(a)中，使步骤(a')所得的去保护的式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa或IXb产物与X'-D部分接触，其中X'包含能够与AD'或Lp'的游离巯基基团反应以形成硫-取代的琥珀酰亚胺部分的马来酰亚胺部分。
或者，所述方法还可包括步骤a'：将具有式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa或IXb结构的中间体接头化合物前体去保护，其中t是1，且AD'-AD'或AD'-Lp'被合适地保护，其中该被合适地保护的AD'-AD'或AD'-Lp'具有如下结构
其中R111是氢或甲基，且RPR是去保护的合适的巯基保护基团，且波浪线表示中间体接头化合物中合适保护的AD'部分的共价连接；并且在步骤(a)中，使步骤(a’)所得的去保护的式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa或IXb产物与X'-D部分接触，其中X'包含能够与AD'-AD'或AD'-Lp'的游离巯基基团反应以形成含硫-取代的琥珀酰亚胺部分的含马来酰亚胺部分。
本文提供制备本文中所述的式I、II或III的结构表示的配体-药物偶联物的方法，所述方法包括步骤(a)：将本文中所述的式X、XI或XII的结构代表的配体-接头化合物与足够量的X'-D部分接触，以与Lp'或AD'反应，从而对于Lp'和AD'的情况分别形成Lp-X-D或AD-X-D部分，其中-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元；且X'-D是连接至药物单元的可释放组装单元前体，其中X'能够与Lp'和/或AD'反应。
如此制备的示例性的配体-药物偶联物具有本文中所述的式Ia、Ib、IIa、IIb、IIb、IIIa，或IIIb表示的结构，并且所述配体-接头化合物具有由本文所述的式XIa、XIb、XIc、XId、XIIa或XIIb表示的结构。
所述方法还可包括步骤a'：将本文所述的式X、XI、XII、XIa、XIb、XIc、XId、XIIa或XIIb结构中对应的被合适地保护的配体-接头化合物去保护，其中t是0，并且其中被合适地保护的AD'或Lp'具有如下结构
其中R111独立地选自氢、对羟基苄基、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、
其中RPR是合适的巯基保护基团，且波浪线表示中间体配体-接头化合物内合适保护的AD'或Lp'部分的共价连接；
并且，在步骤(a)中，使步骤(a')所得的去保护的式X、XI、XII、XIa、XIb、XIc、XId、XIIa或XIIb产物与X'-D部分接触，其中X'包含能够与AD'或Lp'的游离巯基基团反应以形成硫-取代的琥珀酰亚胺部分的马来酰亚胺部分。
或者，所述方法还可包括步骤(a')：将式XIa、XIb、XIc、XId、XIIa或XIIb结构中对应的配体-接头化合物去保护，其中t是1且AD'-AD'或AD'-Lp被合适地保护，其中所述被合适地保护的AD'-AD'部分具有如下结构
其中R111是氢或甲基，且RPR是去保护的合适的巯基保护基团，且波浪线表示中间体配体-接头化合物中合适保护的AD'部分的共价连接；并且在步骤(a)中，使步骤(a’)所得的去保护的式XIa、XIb、XIc、XId、XIIa或XIIb产物与X'-D部分接触，其中X'包含能够与AD'-AD'或AD'-Lp'的游离巯基基团反应以形成含硫-取代的琥珀酰亚胺部分的含马来酰亚胺部分。
能够与步骤(a')所得的游离巯基反应的示例性的马来酰亚胺部分具有下式结构
其中R17是-(CH2)5C(＝O)-且波浪线表示X’-D部分内的连接或具有如下结构：
其中波浪线表示X’-D部分内的连接，并且氨基基团任选地被在对RPR保护的巯基基团去保护的条件下稳定的氨基保护基团保护。
实施例
概述.所有市售可得的无水溶剂均直接使用无需进一步纯化。PEG试剂购自量子生物设计公司(QuantaBioDesign)(俄亥俄州鲍威尔)。分析型薄层色谱在硅胶60F254铝薄片(EMD化学公司，新泽西州吉布斯镇)上进行。径向色谱在Chromatotron仪器(哈瑞丝研究公司(HarrisResearch)，加利福尼亚州帕洛阿尔托)上进行。柱色谱在BiotageIsoleraOne快速纯化系统(北卡罗来州夏洛特)上进行。分析型HPLC在配备有VarianProStar330PDA检测仪的VarianProStar210溶剂递送系统上进行。样品通过C12PhenomenexSynergi2.0x150mm，4μm，反相柱洗脱。酸性流动相包含乙腈和水，其均包含0.05％三氟乙酸或0.1％甲酸(各化合物所示)。化合物采用5％(注射后1分钟)到95％(11分钟)线性梯度酸性乙腈，随后采用等度95％乙腈至15分钟(流速＝1.0mL/分钟)来洗脱。LC-MS在两种不同的系统上进行。LC-MS系统1包含接合至配有C12PhenomenexSynergi2.0x150mm，4μm，反相柱的HPAgilent1100HPLC仪的ZMDMicromass质谱仪。酸洗脱剂包含0.1％水性甲酸中5％-95％的线性梯度的乙腈(进行10分钟)，随后是等度95％乙腈(进行5分钟)(流速＝0.4mL/分钟)。LC-MS系统2包含接合至Waters2695分离模块和Waters2996光电二极管阵列检测仪的WatersXevoG2Tof质谱仪；柱、流动相、梯度和流速与LC-MS系统1相同。
在耦合至WatersAcquityH-ClassUPLC系统的WatersXevoGS-SQTOF上获得抗体-药物偶联物的LC-MS数据。样品在分析型反相柱(安捷伦技术公司(AgilentTechnologies)，PLRP-S，2.1mmIDx50mm，8μm)在80℃下进行色谱分析，并用12.5分钟以水性TFA中的25％至65％的线性梯度的具有0.01％TFA的乙腈，随后用1.5分钟以乙腈中的等度65％0.01％TFA洗脱，流速1mL/分钟。轻链和重链的质谱数据在ESI+模式采用质量范围500-4000m/z获取，并采用MaxEnt1去卷积，以确定所得偶联物的质量。
制备型HPLC在配备有VarianProStar330PDA检测仪的VarianProStar210溶剂递送系统上进行。产物在C12PhenomenexSynergi10.0x250mm，4μm，反相柱上纯化，采用水中的0.1％甲酸(溶剂A)和乙腈中的0.1％甲酸(溶剂B)洗脱。该纯化方法包含如下梯度的溶剂A和溶剂B：90:10，持续0-5分钟；90:10至10:90，持续5分钟-80分钟；随后是等度10:90，持续5分钟。在254nm监测流速为4.6mL/分钟。用于方案3和4的化合物的制备型HPLC采用两种流动相中的0.1％三氟乙酸(而不是0.1％甲酸)进行。NMR谱数据在VarianMercury400MHz波谱仪上收集。偶联常数(J)以赫兹报告。
实施例1：包含串联取向的PEG单元的葡糖苷酸-MMAE药物-接头的合成。
方案1
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(3):化合物2的合成已于先前描述(美国专利公开号2008/0241128)，其通过引用纳入本文。向包含葡糖苷酸-MMAE中间体2(40mg，26.8μmol)的烧瓶添加0.9mL甲醇和0.9mL四氢呋喃。该溶液随后在冰浴中冷却，并向其中逐滴加入0.9mL水中的一水合氢氧化锂(6.8mg，161μmol)溶液。该反应随后在冰上搅拌1.5小时，此时LC/MS显示完全转化成产物。然后添加冰醋酸(9.2μL，161μmol)，并且使反应浓缩至干。制备型HPLC得到油状残余物形式的完全去保护的葡糖苷酸-MMAE接头中间体3(26mg，87％)。分析型HPLC(0.1％甲酸)：tR9.3分钟。LC-MS系统1:tR11.10分钟，m/z(ES+)实验值1130.48(M+H)+，m/z(ES-)实验值1128.63(M-H)-。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)-2-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四氧杂-4,80-二氮杂八十三烷酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(4):向包含溶解于无水DMF(0.94mL)的去保护的葡糖苷酸-MMAE中间体3(26mg，23μmol)的烧瓶添加二甲基乙酰胺(200mg/mL)中的马来酰亚胺-PEG24-NHS酯(32mg，23μmol)溶液。添加二异丙基乙基胺(20μL，115μmol)，并使反应在常温下于氮气下搅拌6小时，此时LC/MS显示转化成所需产物。反应通过制备型HPLC纯化以提供油状残余物形式的线性马来酰亚胺-PEG24-葡糖苷酸-MMAE接头4(31mg，55％)。1HNMR(CD3OD)δ(ppm)0.92(m,16H),1.15(m,6H),1.42(m,2H),1.60(m,2H),1.91(m,4H),2.20(m,3H),2.48(m,6H),2.66(m,3H),2.96(m,4H),3.10(s,2H),3.27(s,2H),3.31(s,8H),3.38(m,5H),3.44(m,2H),3.57(m,6H),3.62(m,79H),3.77(m,5H),3.87(t,J＝9.6Hz,2H),4.05(m,1H),4.21(m,3H),4.53(m,2H),4.61(m,2H),4.80(m,2H),5.14(m,3H),6.82(s,2H),7.10(m,2H),7.21(m,2H),7.35(m,2H),7.39(m,2H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),7.94(m,2H),8.10(m,1H),8.27(m,2H).分析型HPLC(0.1％甲酸):tR9.9分钟。LC-MS系统1:tR11.94分钟，m/z(ES+)实验值1205.34(M+2H)2+。LC-MS系统2:tR10.38分钟，m/z(ES+)实验值2410.3225(M+H)+。
实施例2：包含平行取向的PEG单元的葡糖苷酸-MMAE药物-接头的合成。
方案2
(S)-80-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂八十一碳-81-烯酸(6):向包含Nα-Fmoc-赖氨酸5(30mg，81.5μmol)的烧瓶添加1.6mL无水二氯甲烷，然后添加甲氧基-PEG24-OSu(100mg，81.5μmol)。然后添加DIPEA(71μL，408μmol)，并使反应在室温下的氮气下搅拌，然后进行TLC和LC/MS。2小时后，LC/MS显示转化成产物。反应溶液在二氯甲烷中稀释，并直接加样至1mmChromatotron板上供于纯化。该板用含有递增量的甲醇(0％至15％)的二氯甲烷洗脱，以提供所需产物6(63mg，53％)。TLC:Rf＝0.17，CH2Cl2中的10％MeOH。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.48(m，6H)，2.47(m，5H)，3.20(m，2H)，3.38(s，3H)，3.63(m，86H)，4.16(m，2H)，4.36(m，1H)，7.26(m，3H)，7.35(m，2H)，7.60(m，2H)，7.71(m，3H)。分析型HPLC(0.1％甲酸):tR10.8分钟。LC-MS系统1:tR11.95分钟，m/z(ES+)实验值1468.40(M+H)+，m/z(ES-)实验值1466.36(M-H)-。
(S)-2,5-二氧代吡咯啶-1-基80-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂八十一碳-81-酯(7):烧瓶装入Nα-Fmoc-赖氨酸(PEG24)-OH6(63mg，43μmol)和0.43mL无水四氢呋喃。添加N-羟基琥珀酰亚胺(5.5mg，47μmol)，然后添加二异丙基碳二亚胺(7.3μL，47μmol)。反应在氮气下密封，并搅拌过夜。18小时后，添加额外的N-羟基琥珀酰亚胺(5.5mg，47μmol)和二异丙基碳二亚胺(7.3μL，47μmol)，并另持续搅拌4小时，此时LC/MS显示完全转化成产物。粗反应物在二氯甲烷中稀释并通过径向色谱在1mm板上纯化，所述板用含有递增量的甲醇(0％至10％)的二氯甲烷洗脱，以提供所需的活化的酯7(36mg)。物质无需进一步表征直接使用。TLC:Rf＝0.43，CH2Cl2中的10％MeOH。分析型HPLC(0.1％甲酸):tR11.4分钟。LC-MS系统2:tR11.01分钟，m/z(ES+)实验值1564.8379(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-74,81-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82-二氮杂八十五烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(8):去保护的葡糖苷酸-MMAE接头中间体3(26mg，23μmol)溶解于无水二甲基甲酰胺(0.58mL)，并添加至包含Nα-Fmoc-赖氨酸(PEG)-OSu7(36mg，23μmol)的烧瓶。然后添加二异丙基乙基胺(20μL，115μmol)，反应随后在室温下于氮气下搅拌。4.5小时后，LC-MS显示转化成产物。产物通过制备型HPLC纯化，以提供油状残余物形式的Fmoc-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE中间体8(30mg，50％，通过两步)。分析型HPLC(0.1％甲酸):tR11.4分钟。LC-MS系统1:tR12.31分钟，m/z(ES+)实验值1291.05(M+2H)2+。LC-MS系统2:tR11.30分钟，m/z(ES+)实验值2580.2515(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-氨基-74,81-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82-二氮杂八十五烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(9):Fmoc-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE中间体8(30mg，12μmol)溶解于0.46mL无水二甲基甲酰胺，然后添加0.12mL的哌啶。反应在氮气下搅拌3小时，然后浓缩至干。产物通过制备型HPLC纯化，以提供油状残余物形式的H-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE中间体9(24mg，87％)。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)0.92(m,14H),1.14(m,6H),1.42(m,5H),1.79(m,8H),2.22(m,3H),2.42(t,J＝6.4Hz,2H),2.47(m,2H),2.65(m,2H),2.76(m,2H),2.95(m,3H),3.10(m,3H),3.31(m,8H),3.35(m,6H),3.54(m,5H),3.63(s,70H),3.72(t,J＝6.0Hz,3H),3.85(m,2H),4.07(m,1H),4.22(m,3H),4.52(d,J＝7.2Hz,1H),4.61(d,J＝6.4Hz,1H),4.71(m,2H),5.11(m,3H),7.12(m,1H),7.21(m,1H),7.31(m,3H),7.37(m,2H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.95(d,J＝8.8Hz,1H),8.26(m,2H).分析型HPLC(0.1％甲酸):tR8.9分钟。LC-MS系统1:tR11.18分钟，m/z(ES+)实验值1178.97(M+2H)2+。LC-MS系统2:tR9.50分钟，m/z(ES+)实验值2358.2341(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)-2-((S)-80-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-74,81-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82-二氮杂八十五烷酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(10):马来酰亚胺己酸NHS酯(4.2mg，14μmol)溶解于0.6mL无水二甲基甲酰胺，并转移至包含H-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE中间体9(24mg，10μmol)的烧瓶。然后添加二异丙基乙基胺(10μL，58μmol)，反应随后在室温下于氮气下搅拌过夜。反应混合物通过制备型HPLC直接纯化，以提供油状残余物形式的MC-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE接头10(23mg，90％)。1HNMR(CD3OD)δ(ppm)0.87(m,13H),1.12(t,J＝7.6Hz,2H),1.17(d,J＝6.8Hz,2H),1.24(m,2H),1.48(m,9H),1.80(m,5H),2.19(m,4H),2.42(t,J＝6.4Hz,2H),2.48(m,2H),2.64(m,2H),2.96(m,3H),3.10(s,1H),3.12(m,2H),3.15(s,1H),3.27(s,6H),3.35(m,3H),3.43(m,3H),3.54(m,3H),3.58(m,2H),3.63(m,64H),3.70(m,4H),3.92(m,2H),4.22(m,4H),4.54(m,1H),4.61(t,J＝6.4Hz,1H),4.83(m,1H),5.13(m,3H),6.80(s,2H),7.10(m,1H),7.20(m,2H),7.29(m,2H),7.38(m,2H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),7.90(m,3H),8.08(s,1H),8.26(m,2H).分析型HPLC(0.1％甲酸):tR10.6分钟。LC-MS系统1:tR11.88分钟，m/z(ES+)实验值1276.23(M+2H)2+。LC-MS系统2:tR10.54分钟，m/z(ES+)实验值2551.2871(M+H)+。
实施例3：mDPR(马来酰亚胺-二氨基丙酸)葡糖苷酸-MMAE药物-接头的合成
方案3a
在50ml圆底烧瓶中，将H-DPR(boc)-OH和马来酸酐溶解于4体积乙酸中，并使该溶液室温搅拌3小时。使反应混合物在旋转蒸发器上浓缩成油状，并通过添加约10ml二氯甲烷来沉淀产物。沉淀物通过真空过滤收集，用二氯甲烷洗涤，并在真空烘箱中干燥过夜。
马来酰基-DPR(boc)-OH经分子筛悬浮于配有冷凝器的50ml圆底烧瓶中的甲苯(3ml)和三乙胺(224uL)中。添加DMA(约150uL)以辅助溶解。溶液加热至125℃并回流4小时，之后，LCMS显示反应完全。反应混合物在旋转蒸发器上浓缩至干，再溶解于DMSO，并通过制备型HPLC纯化。产物分离为白色粉末。
方案3b
(S)3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸-2,5-二氧代吡咯啶-1-酯(12):(S)-Nα-马来酰亚胺-Nβ-Boc-二氨基丙酸11(方案3a)(400mg，1.4mmol)溶解于7mL无水二甲基甲酰胺。添加N-羟基琥珀酰亚胺(178mg，1.5mmol)，然后添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(298mg，1.5mmol)。在室温和氮气条件下将该反应搅拌3小时。通过稀释到120mL水中实现水性处理；水性层随后用60mL乙酸乙酯萃取三次。合并的有机层随后用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩至干。产物通过快速柱色谱纯化，己烷:乙酸乙酯(50:50至0:100)为洗脱混合物以产生(S)-Nα-马来酰亚胺-Nβ-Boc-二氨基丙酸NHS酯[MDpr(Boc)-OSu]12(297mg，55％)。LC-MS系统1:tR12.23分钟，m/z(ES+)实验值282.0599(M+H-Boc基团)+。LC-MS系统2:tR11.30分钟，m/z(ES+)实验值2580.2515(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(13):MDpr(Boc)-OSu12(33mg，86μmol)溶解于1.1mL的无水二甲基甲酰胺，并添加至包含去保护的葡糖苷酸-MMAE接头中间体3(49mg，43μmol)的烧瓶。然后添加二异丙基乙基胺(37μL，220μmol)，反应随后在室温下于氮气下搅拌30分钟。反应用37μL冰醋酸淬灭，并通过制备型HPLC纯化以获得MDpr(Boc)-葡糖苷酸-MMAE中间体13(39mg，65％)。LC-MS系统2:tR11.09分钟，m/z(ES+)实验值1396.7321(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(14):包含MDpr(Boc)-葡糖苷酸-MMAE中间体13(18mg，13μmol)的烧瓶在氮气下于冰浴中冷却至0℃。逐滴添加二氯甲烷(1.3mL)中的10％三氟乙酸溶液。然后，反应在0℃搅拌2小时，此时LC-MS显示完全Boc去保护。然后，反应浓缩至粗制残余物，并通过制备型HPLC纯化，以提供MDpr-葡糖苷酸-MMAE接头14(15mg，92％)。LC-MS系统2:tR9.13分钟，m/z(ES+)实验值1296.6697(M+H)+。
实施例4：包含平行取向的PEG单元的mDPR(马来酰亚胺-二氨基丙酸)葡糖苷酸-MMAE药物-接头的合成
方案4
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-((S)-3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-74,81-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82-二氮杂八十五烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(15):MDpr(Boc)-OSu12(33mg，86μmol)溶解于0.66mL的无水二甲基甲酰胺,并添加至包含H-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE接头中间体9(135mg，57μmol)的烧瓶。添加二异丙基乙基胺(50μL，290μmol)，然后使反应在室温下于氮气下搅拌2.5小时。反应用50μL冰醋酸淬灭，并通过制备型HPLC纯化以获得MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE中间体15(86mg，58％)。LC-MS系统2:tR11.71分钟，m/z(ES+)实验值2624.2004(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-((S)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-74,81-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82-二氮杂八十五烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(16):包含MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE中间体15(86mg，33umol)的烧瓶在氮气下于冰浴中冷却至0℃。逐滴添加二氯甲烷(3.3mL)中的10％三氟乙酸溶液。然后，反应在0℃搅拌2小时，此时LC-MS显示完全Boc去保护。然后使反应浓缩成粗制残余物，并通过制备型HPLC纯化，以提供MDpr-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE接头16(38mg，46％)。LC-MS系统2:tR10.54分钟，m/z(ES+)实验值2524.2256(M+H)+。
实施例5：包含平行取向的PEG12、PEG8或PEG4-(PEG4)3单元的mDPR(马来酰亚胺-二氨基丙酸)葡糖苷酸-MMAE药物-接头的合成
方案5
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-44-((R)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-38,45-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂-39,46-二氮杂四十九烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(17):MDpr-Lys(PEG12)-葡糖苷酸-MMAE接头17以与16(描述于方案2和4)相同的方式制备。LC-MS系统2:tR9.88分钟，m/z(ES+)实验值1996.1001(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-32-((R)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-26,33-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,34-二氮杂三十七烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(18):MDpr-Lys(PEG8)-葡糖苷酸-MMAE接头17以与16(描述于方案2和4)相同的方式制备。LC-MS系统2:tR10.50分钟，m/z(ES+)实验值1818.8678(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-48-((R)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-15,22,38,42,49-五氧代-20,20-双(15-氧代-2,5,8,11,18-五氧杂-14-氮杂十九烷-19-基)-2,5,8,11,18,25,28,31,34-九氧杂-14,21,37,43,50-五氮杂五十三烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(19):MDpr-Lys(PEG4[PEG4]3)-葡糖苷酸-MMAE接头19以与16(描述于方案2和4)相同的方式制备。LC-MS系统2:tR9.92分钟，m/z(ES+)实验值2674.3813(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-20-((R)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-14,21-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,22-二氮杂五十烷基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(42):MDpr-Lys(PEG4)-葡糖苷酸-MMAE接头42以与16(描述于方案2和4)相同的方式制备。LC-MS系统2:tR10.18分钟，m/z(ES+)实验值1642.8586(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-14-((R)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-8,15-二氧代-2,5-二氧杂-9,16-二氮杂十九烷酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(43):MDpr-Lys(PEG2)-葡糖苷酸-MMAE接头43以与16(描述于方案2和4)相同的方式制备。LC-MS系统2:tR10.10分钟，m/z(ES+)实验值1554.8093(M+H)+。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-6-乙酰胺基-2-((R)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)己酰胺基)丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-2-氧代乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮十四基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(44):MDpr-Lys(Ac)-葡糖苷酸-MMAE接头44以与16(描述于方案2和4)相同的方式制备。LC-MS系统2:tR10.38分钟，m/z(ES+)实验值1466.8109(M+H)+。
实施例6：包含平行取向的PEG单元的mDPR(马来酰亚胺-二氨基丙酸)缬氨酸-瓜氨酸-MMAE药物-接头的合成
方案6
4-((80S,83S,86S)-80-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-83-异丙基-74,81,84-三氧代-86-(3-脲基丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82,85-三氮杂八十七烷酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚基-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(21):ValCit-PAB-MMAE接头(按照美国专利号7,659,241所述合成)中间体20(16mg，14μmol)溶解于无水二甲基甲酰胺(0.28mL)，并添加至包含Nα-Fmoc-赖氨酸(PEG)-OSu7(25mg，17μmol)的烧瓶。然后添加二异丙基乙基胺(12μL，70μmol)，反应随后在室温下于氮气下搅拌。6小时后，LC-MS显示转化成产物。产物通过制备型HPLC纯化，以提供油状残余物形式的Fmoc-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE中间体21(15mg，42％)。分析型HPLC(0.1％甲酸):LC-MS系统2:tR11.67分钟，m/z(ES+)实验值2573.2493(M+H)+。
4-((80S,83S,86S)-80-氨基-83-异丙基-74,81,84-三氧代-86-(3-脲基丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82,85-三氮杂八十七烷酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚基-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(22):Fmoc-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE中间体21(15mg，6μmol)溶解于0.16mL无水二甲基甲酰胺，然后添加0.04mL的哌啶。反应在氮气下搅拌1.5小时，然后浓缩至干。产物通过制备型HPLC纯化，以油状残余物形式的提供H-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE中间体22(13mg，93％)。LC-MS系统2:tR9.72分钟，m/z(ES+)实验值2351.1787(M+H)+。
4-((80S,83S,86S)-80-((S)-3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-83-异丙基-74,81,84-三氧代-86-(3-脲基丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82,85-三氮杂八十七烷酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚基-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(23):MDpr(Boc)-OSu12(4mg，11μmol)溶解于0.12mL的无水二甲基甲酰胺，并添加至包含H-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE接头中间体22(13mg，5.5μmol)的烧瓶。然后添加二异丙基乙基胺(5μL，28μmol)，然后，使反应在室温下于氮气下搅拌1小时。反应用5μL冰醋酸淬灭，并通过制备型HPLC纯化以获得MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE中间体23(10mg，69％)。LC-MS系统2:tR11.25分钟，m/z(ES+)实验值2617.3203(M+H)+。
4-((80S,83S,86S)-80-((S)-3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-83-异丙基-74,81,84-三氧代-86-(3-脲基丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,82,85-三氮杂八十七烷酰胺基)苄基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚基-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(24):包含MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE中间体23(10mg，4umol)在氮气下于冰浴中冷却至0℃。逐滴添加二氯甲烷(0.4mL)中的10％三氟乙酸溶液。然后，反应在0℃搅拌3小时。然后使反应浓缩成粗制残余物，并通过制备型HPLC纯化，以提供MDpr-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE接头24(4mg，40％)。LC-MS系统2:tR9.81分钟，m/z(ES+)实验值2517.2930(M+H)+。
实施例7：包含平行取向的PEG的ADC显示与其非PEG化的对应物或包含串联取向的PEG的ADC相似的体外活性
将培养为对数期生长的细胞接种于包含补充有20％FBS的150μLRPMI1640的96孔板中，维持24小时。用细胞培养基以4倍工作浓度制备ADC的连续稀释液；将50μL各稀释液添加至96孔板。添加ADC之后，细胞用测试物质在37℃下孵育4天。96小时后，生长抑制通过CellTiterGlo(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊)评价，并在酶标仪上测量发光。本文中，以三个重复检测的IC50值定义为相对于未处理对照导致细胞生长降低50％的浓度。
以8单位药物/抗体的平均药物载量，将化合物1、4和10通过其链间巯基偶联至美国专利号7,090,843所述的嵌合cAC10抗体。化合物4和10如上所述。化合物1如下：
对CD30+和CD30-细胞系测量所得ADC的体外细胞毒性活性。PEG的加成或其构型均不对体外活性产生任何显著影响；仅观察到可忽略的ADC功效差异，且在两种细胞系(L540cy和Karpas-299)中，活性基本相同(表1)。
表1抗-CD30ADC的体外细胞毒性活性；值表示IC50(ng/mL)。
实施例8：相较于包含串联取向的PEG的ADC，包含平行取向的PEG的ADC显示有利的药代动力学
采用带放射性标记物的抗体或ADC进行抗体和ADC放射性标记-药代动力学(PK)实验。PK测试物质采用如下方法进行放射性标记。向补充有额外50mM磷酸钾(pH8.0)和50mM氯化钠的PBS中的抗体或ADC溶液添加55μCiN-琥珀酰亚胺基丙酸酯、[丙酸酯-2,3-3H]-(Moravek化学公司，目录号：MT919，80Ci/mmol、1mCi/mL、9:1己烷:乙酸乙酯溶液)/mg抗体或ADC。所得的混合物经涡旋处理，并室温放置2小时。混合物以4,000xg离心5分钟，并移除下方水层，并分离至AmiconUltra-15离心滤器单元(密理博(Millipore)，目录号：UFC903024,30kDaMWCO)。未偶联的放射活性通过4轮稀释并以4,000xg离心来移除。所得的产物无菌过滤通过0.22μmUltrafree-MC离心滤器单元(密理博，目录号UFC30GV0S)，并通过分光光度法测量最终的抗体或ADC浓度。各产物的比活(μCi/mg)采用液体闪烁计数测定。
药代动力学实验–未偶联的抗体或ADC的药代动力学性质在若干啮齿动物模型中检测。在各实验中，1-3mg的放射性标记的抗体或ADC/kg动物重量通过尾静脉注射。各测试物质在重复动物中给予一次。在多个时间点，经隐静脉或通过心脏穿刺针使末端流血将血液采集至K2EDTA管。血浆通过在10,000xg离心10分钟来分离。来自各时间点的10-20μL的血浆样品添加至4mLEcoscint-A液体闪烁混合物(国家诊断公司(NationalDiagnostics))并通过液体闪烁计数来检测总放射活性。所得的每分钟崩解值转换成μCi，并使用放射性标记的测试物质的比活计算各时间点保留于血浆中的抗体或ADC的浓度。从所得的血浆浓度数据确定药代动力学参数(清除率和AUC)。用PhoenixWinNonlinv6.3(Pharsight公司，加利福尼亚州山景城)，采用静脉内单次剂量选项，通过非间隔分析，计算估计的药代动力学参数。
化合物1、4和10通过其链间巯基以8个药物/抗体的平均药物载量偶联至美国专利号7,090,843(通过引用纳入本文)所述的嵌合cAC10抗体。如同预期，采用非PEG化的药物-接头1的8个重复制备的ADC显示相对于未结合抗体的极快的清除率和低暴露度(图7)。惊人地，采用串联构型的PEG的PEG化的药物-接头4，产生的ADC具有甚至比非PEG化形式更快的清除率和更低的暴露度。鉴于根据该设计制备的ADC方面的实施例数目，这一结果是出人意料的。相反，采用平行构型的PEG用药物-接头10制备的ADC产生的ADC具有与非PEG化形式相比显著更慢的清除率和更大的暴露度(参见图7和表2)。
表2
配体-药物偶联物 清除率(mL/天/kg) AUC0-inf(天*μg/ml)
cAC10 8.6 604.1
cAC10-1 48.6 67.0
cAC10-4 57.8 52.0
cAC10-10 14.2 229.7
或者，基于ELISA的总抗体(Tab)试验可用于获得药代动力学测量结果。0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6，西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)，蒙拿大州圣路易斯)中的100μL的抗-人IgGκ抗体溶液(0.5mg/mL，抗体溶液公司(AntibodySolutions)，加利福尼亚州山景城CA)添加至用MaxiSorpTM(西格玛奥德里奇公司，蒙拿大州圣路易斯)被覆的96孔聚苯乙烯板的各孔中。4℃孵育该板过夜。孵育后，该板用包含0.05％吐温-20的PBS(PBS-T)清洗三次。然后，所述孔用包含1％牛血清白蛋白的PBS-T在室温下封闭至少1小时。封闭后，板用PBS-T清洗三次。抗体或ADC标准品(40x浓度)的储液在大鼠或小鼠血浆中制备以产生标准曲线。然后，血浆样品和标准品以1:40在PBS-T中稀释。稀释的样品和标准品(100μL)添加至ELISA板的孔，并在室温孵育1小时。孵育后，样品被移出，并且板用PBS-T清洗三次。用PBS-T1:30,000稀释Fcγ片段特异性的过氧化物酶-亲和纯F(ab')2片段山羊抗-人IgG(杰克逊免疫研究实验室公司(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.)，宾夕法尼亚州西格罗夫)的溶液，并将100μL添加至各孔中。板在室温下孵育1小时。孵育后，样品被移出，并且板用PBS-T清洗三次。SureBlueTMB微孔过氧化物酶底物(KPL公司，马里兰州盖瑟斯堡)的溶液添加至各孔(100μL)。该板在室温下孵育11-12分钟，并且反应用100μL1NHCl淬灭。板在450nm于MolecularDevicesSpectromax酶标仪上读数。
实施例9：相较于包含串联取向的PEG的ADC或缺乏PEG单元的ADC，包含平行取向的PEG的ADC具有改善的体内活性
体内异种移植模型–全部实验按照动物饲养和使用委员会(AnimalCareandUseCommittee)用国际实验动物评估和认可委员(AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCare)会完全认可的设备进行。功效实验在Karpas299多形性大细胞淋巴瘤、L540cy霍奇金氏淋巴瘤、拉莫斯伯基特氏淋巴瘤和MCF-7乳腺癌的异种移植模型中进行。细胞悬液或肿瘤片段植入免疫功能不全的小鼠的皮下。荷载MCF-7肿瘤的小鼠皮下共同给予17β-雌二醇的缓释片剂。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分组成研究组。腹膜内给予ADC或对照一次。使用式(LxW2)/2确定随时间变化的肿瘤体积。肿瘤体积达到1000mm3时，对动物处以安乐死。植入后约100天时，显示持久消退的小鼠终止。
对给药2mg/kg(单剂量)的各ADC的L540cy模型(图1)和对给药0.6mg/kg(单剂量)的各ADC的Karpas-299模型(图2)进行初始研究。肿瘤体积随时间的变化图示于图1和2。所有药物-接头通过其链间巯基以8个药物/抗体的平均药物载量偶联至美国专利号7,090,843(通过引用纳入本文)所述的嵌合cAC10抗体。两种模型中，用1(cAC10-mc-PAB(gluc)，非PEG化的)和10(方案2的PEG化设计)制备的ADC治愈了在其给药组中的所有动物(5/5)，而用4制备的ADC没有产生治愈结果，而是仅仅中度延迟肿瘤生长。cAC10-4的减少的活性与PK研究中观察到的其大幅降低的暴露度相一致，示于图7。猜想药代动力学的活性驱动方面的差异也将在cAC10-1和cAC10-10之间观察到，但需要较低的剂量。因此，用两种模型以初始研究中所用剂量的1/2和1/4的剂量水平进行重复研究。对于L540cy，剂量为1mg/kg，cAC10-10产生完全治愈(6/6)，cAC10-1仅有2/6的治愈(图3)。在0.5mg/kg，各组均没有观察到治愈；然而，相较cAC10-1，cAC10-10提供较长的肿瘤生长延迟(图3)。在两个剂量水平下，cAC10-10的L540cy抗肿瘤活性大于cAC10-1，与其相应的药代动力学性质一致。对于Karpas-299，0.3mg/kg的剂量，cAC10-10产生6/6的治愈，而cAC10-1产生5/6的治愈(图4)。在0.15mg/kg，cAC10-10观察到5/6的治愈，而cAC10-1仅观察到2/6的治愈(图4)。因此对于Karpas-299，cAC10-10在最低剂量水平观察到较大的抗肿瘤活性，高于该水平的两种ADC均显示较高的治愈率。
方案3和4分别描述非PEG化的接头1和PEG化的接头10的类似物的合成，纳入Nα-马来酰亚胺-二氨基丙酸(MDpr)酸基团作为偶联点。在Karpas299ALCL和拉莫斯伯基特氏淋巴瘤模型中评价这两种接头。对于Karpas299，14(非PEG化)和16(平行PEG化)的cAC10偶联物以0.2mg/kg给药一次，并且观察到肿瘤生长的类似延缓(图5)。相反，在拉莫斯模型中，两种不同剂量下，hBU12-16发挥的抗肿瘤活性大于hBU12-14。单次给药2mg/kg后，hBU12-16产生5/5的治愈，相比之下，hBU12-14是0/5(图6)。
实施例10：mDPR-cys(StBu)-PEG2-36-OH偶联支架和mDPR-cys(StBu)-PEG48-72-OH偶联支架的合成
方案7：MDpr-Cys(StBu)-PEG2-36-OH的合成
方案8：MDpr-Cys(StBu)-PEG48-72-OH的合成
2-氯三苯甲基-氯树脂荷载:配有多孔聚丙烯盘的聚丙烯注射器加载2-氯三苯甲基-氯树脂。将无水DCM(10mL/克树脂)中的Fmoc-PEGn-OH(1当量)和DIEA(1当量)溶液吸入注射器中。注射器用橡胶塞加盖，并搅拌5分钟，此时再添加额外的DIEA(1.5当量)。振荡额外的30分钟之后，MeOH(至少0.8mL/克树脂)被吸入注射器以淬灭未反应的树脂。振荡5分钟之后，将溶液从注射器吹出，并用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和二乙醚(6x5mL)洗涤树脂。真空下干燥树脂。
瑞克(Rink)酰胺树脂荷载:向无水DMF(10mL/克树脂)中的Fmoc保护的PEG或氨基酸(4当量)溶液添加HATU(4当量)和DIEA(8当量)。溶液搅拌5分钟并吸入装有多孔聚丙烯盘的加载有瑞克酰胺树脂的聚丙烯注射器。反应混合物搅拌至少2小时，并且通过Kaiser测试确定反应完成。树脂用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和二乙醚(6x5mL)清洗并真空干燥。
Fmoc去保护：装有多孔聚丙烯盘的聚丙烯注射器中的Fmoc-PEGn-2-氯三苯甲基树脂用DCM(10mL/克树脂)膨胀30分钟。吹出DCM并用DMF(6x5mL)清洗树脂。搅拌下，树脂用DMF中的20％哌啶溶液清洗(3次x2分钟和1次x60分钟)。通过Kaiser测试确认反应完成，并且所得的Fmoc去保护的树脂用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和二乙醚(6x5mL)清洗并真空干燥。
氨基酸偶联:向无水DMF(10mL/克树脂)中的Fmoc保护的PEG酸、氨基酸或MDpr(Boc)-OH(3当量)溶液添加HATU(3当量)和DIEA(6当量)。溶液搅拌5分钟，并吸入包含Fmoc去保护的氨基酸2-氯三苯甲基-树脂的聚丙烯注射器中。反应混合物搅拌至少2小时，并且通过Kaiser测试确定反应完成。树脂用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和二乙醚(6x5mL)清洗并真空干燥。
IvDde保护基团的去除:为了去除IvDde保护基团，肽树脂在搅拌下用DMF中的2％肼溶液清洗(2次x30分钟)。通过Kaiser测试确认反应完成，并且所得的IvDde去保护的树脂用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和二乙醚(6x5mL)清洗并真空干燥。
肽-树脂切割:最终的肽通过用DCM中的TFA处理15分钟从树脂切割(对于2-氯三苯甲基树脂是30％v/v，或对于瑞克酰胺树脂是95％v/v)。切割后，溶液另放置60分钟，以确保从MDpr残基完全脱除Boc保护基团。所得的溶液用氮流蒸发，并且，所得的肽通过LC-MS分析。肽以粗制物使用，或通过制备型反相HPLC纯化，然后用LC-MS分析。
实施例11：PEG化的偶联支架与抗体和药物-接头的偶联。
方案9：PEG化的支架与完全还原的抗体链间二硫键的偶联
方案10：PEG化的偶联支架的去保护
方案11：与PEG化的支架的药物偶联
其中XR是X’-D部分中的可释放组装单元前体X’的剩余部分，或–X-D部分中的可释放组装单元X的剩余部分。
抗体链间二硫键的完全还原:向包含二亚乙基三胺五乙酸(1mM)的PBS中的浓度为约10mg/mL的抗体溶液(用额外的磷酸钾(100mM，pH7.4)缓冲)添加12当量的三(2-羧基乙基)-膦(TCEP)。溶液经涡旋处理并在37℃孵育1小时。链间二硫键的完全还原由反相色谱证实。若还原不完全，添加额外的TCEP。还原后，抗体溶液通过3轮稀释和4,000xg下离心通过30kDaMWCO滤器脱盐进入包含2mMEDTA的PBS。所得的完全还原的抗体(34，过滤通过无菌0.22μm离心滤器并立即使用或贮存于-80℃。
含马来酰亚胺的PEG化的支架的偶联:向包含EDTA(2mM)的PBS中的浓度为约10mg/mL的完全还原的抗体(34)的溶液(用额外磷酸钾(100mM，pH7.4)缓冲)添加来自5–20mMDMSO储液的12摩尔当量的MDpr-PEGn-OH。所得的溶液在室温下放置30分钟。通过反相色谱确认完全偶联。如果偶联不完全，添加额外的PEG试剂。偶联后，抗体溶液通过3轮稀释和4,000xg下离心通过30kDaMWCO滤器脱盐进入PBS。所得的PEG化的抗体溶液(36和37)过滤通过无菌0.22μm离心滤器，并立即使用或贮存于-80℃。
从PEG化的偶联支架去除叔丁基巯基保护基团:向包含二亚乙基三胺五乙酸(1mM)的PBS中的浓度为约10mg/mL的PEG化的抗体(36和37)溶液(用额外的磷酸钾(100mM，pH7.4)缓冲)添加20-30当量的TCEP。溶液经涡旋处理并在37℃孵育3小时。叔丁基巯基保护基团的完全脱除通过反相色谱确认。如果还原不完全，添加额外的TCEP并继续在37℃孵育。还原后，抗体溶液通过3轮稀释和4,000xg下离心通过30kDaMWCO滤器脱盐进入包含2mMEDTA的PBS。所得的去保护的PEG化的抗体溶液(38和39)过滤通过无菌0.22μm离心滤器，并立即使用或贮存于-80℃。
包含马来酰亚胺的药物接头的偶联:向包含EDTA(2mM)的PBS中的浓度为约10mg/mL的去保护的PEG化的抗体(38和39)的溶液(用额外磷酸钾(100mM，pH7.4)缓冲)添加来自5–20mMDMSO储液的12摩尔当量的包含马来酰亚胺的药物-接头。所得的溶液在室温下放置30分钟。通过反相色谱确认完全偶联。如果偶联不完全，添加额外的药物-接头。偶联后，抗体溶液通过3轮稀释和4,000xg下离心通过30kDaMWCO滤器脱盐进入PBS。所得的PEG化的抗体-药物偶联物溶液(40和41)过滤通过无菌0.22μm离心滤器，通过尺寸排阻色谱(SEC)分析，并贮存于-80℃。
实施例12：包含平行取向的PEG的ADC显示低聚集水平
偶联物的SEC分析:PEG化的ADC样品的抗体、ADC(50μg)在PBS中稀释至1mg/mL，并且注射30μL在分析型SEC柱(TOSOHTSK凝胶G3000SWXL，7.8mmIDx30cm，5μm)于Waters2695HPLC系统上进行色谱分析。样品用92.5％25mM磷酸钠(pH6.8)、350mMNaCl和7.5％异丙醇以1mL/分钟的流速等度洗脱。
为了检验PEG长度对ADC聚集的影响，具有8个药物/抗体的cAC10-MDpr-vcMMAEADC采用或不采用用不同尺寸的PEG单元组装的PEG化的偶联支架制备。SEC结果示于图8。不纳入PEG化的偶联支架(cAC10-A)时，ADC聚集是10.4％。添加PEG化的支架产生的ADC具有较低聚集水平。聚集随PEG长度的增加(增加至PEG36(cAC10-D))而减少，其中聚集峰是总信号的2.0％。在cAC10-MDpr-vcMMAE的情况中，比PEG36(cAC10-D–cAC10-G)长的PEG单元不进一步减少聚集。
SEC研究中包括的药物-接头的结构:ADC通过链间巯基偶联至抗体。抗体-取代的琥珀酰亚胺可以其水解形式存在(即，横跨一个而非两个琥珀酰亚胺的C-N键加成水分子)。
实施例13：包含平行取向的PEG的ADC显示与其非PEG化的对应物相似的体外活性
采用PEG化的偶联支架制备的ADC的体外细胞毒性
导向CD30的MDpr-vcMMAE-型ADC采用和不采用PEG化的偶联支架的加成来制备。针对CD30阳性细胞系，Karpas299和L540cy测试化合物A(非PEG化的)、B(PEG12)、C(PEG24)和D(PEG36)的偶联物。PEG的纳入和PEG长度的增加导致可忽略的体外细胞毒性差异(表3)。采用正乙基氨基马来酰亚胺(NAEM)而不是MDpr-vcMMAE制备的对照ADC(非PEG化的和PEG化的)(cAC10-H，cAC10-I和cAC10-J)在该试验中显示无活性，指示PEG化的支架不造成体外细胞毒性。
表3采用PEG化的偶联支架制备的抗-CD30ADC的体外细胞毒性活性；值表示IC50(ng/mL)。
与具有4单位药物载量的非PEG化的偶联物cAC10-A比较时，8单位载药的cAC10-A对Karpas299和L540cy具有2-4倍的体外细胞毒性；然而，在体内异种移植模型中，相对于4单位载药的ADC而言，8单位载药的ADC表现并不突出，这归因于8单位载药的ADC的更快速的清除率(参见实施例14)。
具有mc-PABA(gluc)-MMAE的–X-D的PEG24cAC10偶联物，cAC10-10，其由实施例2的接头-药物中间体制备，并具有相对于药物平行取向的PEG24单元(8单位药物/Ab)，在异种移植模型中，相较于对应的8-单位载药的非PEG化的ADC(cAC10-1)和具有串联取向的PEG24单元的8-单位载药的ADC(cAC10-4)，也具有更大活性，其中，上述后者由实施例1中的接头-药物中间体制备(参见图1和2)。
NAEM加帽的偶联支架用作对照:ADC通过链间巯基偶联至抗体。抗体-取代的琥珀酰亚胺可以其水解形式存在(即，横跨一个而非两个琥珀酰亚胺的C-N键加成水分子)。
实施例14：相较于不包含PEG的ADC，包含平行取向的PEG的ADC改善药代动力学
用单次3mg/kg静脉剂量的以8单位药物/mAb载药的各ADC对小鼠给药。如同预期，采用mc-vcMMAE(K)或MDpr-vcMMAE(A)制备的非PEG化的ADC从循环中的清除比采用NAEM制备的对照偶联物快得多。对应的PEG化的ADCC和L显示改善的PK，即较慢的清除率(图9)。
小鼠PK中包含的额外化合物–ADC通过链间巯基偶联至抗体。抗体取代的琥珀酰亚胺可以其水解形式存在(即，横跨一个而非两个琥珀酰亚胺的C-N键加成水分子)。
在第二实验中，用单次3mg/kg静脉剂量的以8单位药物/mAb载药的各ADC对小鼠给药。如上所示(图9)，用非PEG化的MDpr-vcMMAEA制备的ADC显示从循环加速的清除(图10)。采用PEG化的偶联支架B、C和D制备的三种ADC显示改善的清除率(图10)。在该试验中，采用不同PEG长度，PEG12(B)、PEG24(C)和PEG36(D)制备的ADC显示可忽略的彼此差异。如同预期，由NAEM加帽的PEG化支架(H，I和J)制备的对照偶联物显示与NAEM加帽的抗体近似的PK(图10)。
实施例15：相较于不包含PEG的ADC，包含平行取向的PEG的ADC改善药代动力学
在L540cy异种移植模型中分析采用PEG化的偶联支架(B，C和D)和不采用PEG化的偶联支架(A)制备的基于cAC10的ADC。采用2mg/kg(单剂量)的各ADC对动物给药，并随时间测量肿瘤体积。在研究的第25天，未处理动物中的肿瘤体积达到1,000mm3。采用非PEG化的药物接头(A)制备的ADC治愈了5只小鼠中的两只，在未治愈的动物中，肿瘤体积用平均57.3天的时间达到1,000mm3(图11)。采用与PEG12(B)组装的PEG化的偶联支架制备的ADC显示的活性与采用A制备的ADC相似(图12)。在该情况中，5只动物中的1只被治愈，并且对于未治愈的动物，需要68.5天的时间，肿瘤体积达到1,000mm3。采用包含支架的PEG24制备的ADC(C)优于A的改善，其治愈了5只小鼠中的4只，并且剩余的一只的肿瘤在第53天达到1,000mm3(图13)。
在第二实验中，采用带有(L)且不带有允许PEG24偶联的支架(K)的mc-vcMMAE制备靶向乳腺癌抗原LIV-1的基于hLIV22的ADC(hLIV22抗体描述于PCT公开号WO2012/078688，其通过引用纳入本文)。用3mg/kg(单剂量)的各ADC对动物给药。在该研究的未处理组中，肿瘤体积达到1,000mm3的平均时间是39.2天。采用hLIV22-K的治疗将该时间延迟至57.6天，并且PEG化的ADC，hLIV22-L进一步将该平均时间延迟至71.4天(图14)。
实施例16：相较于不包含PEG的ADC，包含平行取向的PEG和16单位药物/抗体的ADC显示较少聚集
为了检验PEG对16单位载药的ADC的影响，采用MDpr-葡糖苷酸-喜树碱作为–X-D单元制备抗-转铁蛋白受体偶联物。ADC制备为标准8单位载药(8单位药物/抗体)或16单位载药(16单位药物/抗体)，纳入或不纳入PEG单元。偶联通过链间二硫键进行。用于制备16单位药物载量的ADC的PEG化的和对照非PEG化的偶联支架(分别为PEG支架A和对照支架A)如下
抗体药物偶联物由n＝23的PEG支架A(代表示例性的配体中间体化合物)和实施例11中所述的对照支架A，通过如下方式制备，(a)使所述支架与具有能够偶联加成至支架的马来酰亚胺单元的巯基基团的抗体接触，以形成抗体-取代的琥珀酰亚胺部分，(b)移除巯基保护基团，和(c)使所得产物与–X-D部分接触，其中X是包含马来酰亚胺单元和可切割单元的可释放组装单元，其中X-D马来酰亚胺单元能够与获自步骤(b)的游离巯基基团通过在合适条件下的偶联加成进行反应，所述合适条件将X-D的马来酰亚胺单元转换成加成的取代的琥珀酰亚胺部分，同时避免源自该支架和X-D部分的琥珀酰亚胺部分的过早水解，和(d)通过对从MDpr部分引入的作为马来酰亚胺单元的各琥珀酰亚胺部分横跨一个而非两个琥珀酰亚胺的C-N键加成水分子，使获自步骤(c)的接头-药物化合物的集合的取代的琥珀酰亚胺水解。
PEG支架A由(即，式VIIIb)涵盖，其中Z’是含MDpr的部分，A是中心赖氨酸残基，并且两个Lp是侧接的半胱氨酸残基。
提供16单位药物载药的偶联物的另一个合适地保护的支架是PEG支架B，其结构是
其中n是36。
PEG支架B由(即，式VIIId)涵盖，其中Z’是MDpr部分，t是1且AD和LP各是半胱氨酸残基。
不纳入PEG化的偶联支架，16单位载药的ADC的聚集水平是22％。加和具有与药物单元平行取向的PEG单元的PEG化的支架，将聚集水平降低至8单位载药的聚集水平，即，2％聚集。
针对一组TfR+癌细胞系测试具有MDpr-PABA(gluc)-喜树碱的–X-D的8单位载药和PEG化的16单位载药的抗-转铁蛋白受体ADC(cOKT9)。在大多数情况中，载药量的加倍使ADC效力提高约2倍。在若干情况中，甚至通过载药量仅增加2倍，ADC效力提高3-10倍或更高。最值得注意的是，16单位载药的偶联物对于结肠直肠细胞系HT-29(TfR拷贝数23K)和黑素瘤细胞系SK-MEL-5(TfR拷贝数21K)具有活性，而8单位载药偶联物被视为无活性(IC50>1μM)。
实施例17：相对于其非PEG化的对应物，具有平行取向的PEG24的4单位药物/抗体的ADC显示降低的体内活性。
当ADC载药量减小至4单位药物/抗体时，发现具有PEG化的葡糖苷酸-MMAE接头10的偶联物的PK暴露度与具有接头1的非PEG化的偶联物类似。因此，PEG化在体内异种移植模型中不提供增强的活性。
抗-CD30嵌合抗体cAC10以4单位药物/抗体的平均载药量与非PEG化的接头1或PEG化的接头10偶联，并在L540cy霍奇金淋巴瘤和Karpas299多形性大细胞淋巴瘤肿瘤模型中进行评价。对于L540cy(图13)，以单次腹膜内剂量为0.5和1mg/kg向动物给予ADC。在较高剂量1mg/kg，PEG化的(cAC10-10)和非PEG化的(cAC10-1)是等力的，治愈5/6的小鼠。然而，在较低剂量0.5mg/kg，非PEG化的接头(cAC10-1)提供更加延长的平均肿瘤生长延迟，有2/6小鼠治愈。然而，PEG化的接头(cAC10-10)效力较差，无小鼠治愈。类似结果在Karpas299异种移植模型中获得(图16)。
这些发现表明在不存在偶联物PK增强的情况下，采用24个PEG单元的PEG化会导致微小衰减的体内活性。该可归因于受影响的酶促药物释放，或因PEG化之后偶联物大小的增大而降低的渗透性。
实施例18：载有PEG化的葡糖苷酸药物接头的ADC显示与偶联物PK性质一致的体内活性。
为了确定对于葡糖苷酸和MMAE的组合是否存在最优的PEG尺寸，制备并评估了一系列PEGx接头，涉及非PEG化、PEG2、PEG4、PEG8、PEG12、PEG24和支化的PEG4-(PEG4)3。分别列于表4和5的，非PEG化的ADCcAC10-14和hBU12-14，其结构类似于PEG化的ACD，但缺乏LP单元，这在PEG化的支架的情况中是赖氨酸残基。
最初的体外工作证明PEG尺寸对大多数测试的细胞系的活性影响最小。抗-CD30和抗-CD19抗体，即分别cAC10和hBU12，以8单位药物/抗体偶联，且针对一组淋巴瘤细胞系进行评估。如表4中所示，CD30阳性L540cy和L428霍奇金淋巴瘤细胞系和Karpas299多形性大细胞淋巴瘤对所有cAC10偶联物均高度敏感，这与PEG尺寸无关。
表4体外细胞毒性-CD30偶联物(IC50，ng/mL)
aADC以8单位药物/Ab荷载
如表5中所示，对于一组非霍奇金淋巴瘤细胞系，带有PEGx-葡糖苷酸-MMAE接头的hBU12(抗-CD19)偶联物的活性的变化性较大。PEG尺寸对于ADC对莫斯伯基特氏淋巴瘤的效力无影响。然而，在弥散性大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-4、WSU-DLCL-2和RL中，偶联物效力似乎随PEG的尺寸而改变。如IC50所测，似乎PEG尺寸与活性之间并无相关性。然而，剂量反应曲线的更仔细的检验揭示，PEG尺寸与最大生长抑制之间明显呈反向相关。这些数据示于图17。
表5体外细胞毒性-αCD19偶联物(IC50，ng/mL)
aADC以8单位药物/Ab荷载
如上所示评估整个PEGx系列的偶联物的药代动力学性质。对大鼠单次静脉内给予1mg/kg偶联物，其包含携带8单位药物/Ab的MDpr-PEGx-葡糖苷酸-MMAE接头的非结合人源化的IgG(h00)。在多个时间点采集血浆样品，且如上定量总循环抗体。如图16所示，抗体清除率显示与PEG尺寸直接相关。具有PEG8、PEG12和PEG24的PEG化的偶联物显示接近裸抗体的清除率性质；而，较短的PEG和非PEG化的对应物从循环的清除更快速。
在异种移植模型中体内评估PEGx接头。在CD19阳性RL弥散性大B细胞淋巴瘤模型和CD30阳性L540cy霍奇金淋巴瘤模型中进行研究。一旦平均肿瘤体积达到100mm3，以1和3mg/kg腹膜内给予不带PEG，带PEG4，PEG8，PEG12和PEG24的接头上的抗-CD19(hBU12)偶联物一次；RL模型的结果示于图17。在1mg/kg，所有组仅适度肿瘤生长延缓，并且未观察到PEG尺寸与活性之间的显著相关。在较高剂量3mg/kg下，不带有PEG且带有PEG4的偶联物均实现肿瘤生长延缓，在约第35天肿瘤才过大生长。相反，具有带PEG8、PEG12和PEG24的接头的偶联物在3mg/kg下实现完全缓解，在PEG24组中1/5小鼠经历肿瘤再生长。相对于PEG4和非PEG化的对应物，较高剂量的PEG8、PEG12和PEG24下，活性增强与图18中的PK观察结果一致。
实施例19：MMAE的肿瘤内递送与偶联物的PK性质相关。
向带有约200mm3的CD30阳性L540cy霍奇金淋巴瘤肿瘤的小鼠给予1mg/kg的单次剂量的8单位药物/Ab负载的mc-葡糖苷酸-MMAE(接头1)、mc-Lys(PEG24)葡糖苷酸-MMAE(接头10)、马来酰亚胺-PEG24-葡糖苷酸-MMAE(接头4)或MDpr-Lys(PEG24)-葡糖苷酸-MMAE(接头16)的cAC10偶联物。给药后3天收集肿瘤，且通过质谱评估瘤内浓度。如图20中所示，与偶联物PK一致，相对于非PEG化的偶联物(cAC10-1)，具有平行构型的PEG24(连接物接头10和16)的ADC向肿瘤递送显著较高的MMAE。此外，与其对应物(cAC10-10)相比，马来酰亚胺和葡糖苷酸(cAC10-4)之间含有串联的PEG24作为延伸子的偶联物(cAC10-4)递送1/4MMAE。最后，优于含有马来酰亚胺己酰基的对应物(cAC10-10)，纳入mDPR马来酰亚胺(cAC10-16)进一步增加了MMAE的递送。
实施例20：以8单位药物/抗体负载维持母抗体PK的PEG化接头的ADC相对于其较短PEG和非PEG化的对应物的体内耐受较佳
在第0天向Balb/c小鼠(n＝3)给予50mg/kg的单次腹膜内剂量的偶联物。每天观察小鼠的外部发病迹象，并检测体重；若动物的体重减少大于20％，或发现其濒死，则使其安乐死。在图21中，将相对于第0天的体重变化相对于时间作图。在将至少一只动物处死时，停止对各组进行作图。向小鼠给予无PEG(IgG-14和-44)、PEG2(IgG-43)和PEG4(IgG-42)的偶联物显示显著体重减轻或外部毒性迹象，并在第5天与第7天之间实施安乐死。相反，接受带有PEG8(IgG-18)、PEG12(IgG-17)和PEG24(IgG-16)的偶联物的小鼠显示最小体重减轻，并且无外部濒死迹象。这些数据以及图18中的PK概况表明，具有降低的PK暴露的偶联物产生较大的急性毒性。
实施例21：最大化PEG长度
药物-接头上PEG链的长度增加时，偶联物的总尺寸和流体动力学的半径也将增加。该情况示于图22中，其显示分别具有8、12和24个PEG单元的药物接头18、17和16制备的ADC的分析型尺寸排阻色谱痕迹。根据第一原理，ADC的表观尺寸增加时，可预期其在体内系统中的扩散率会降低。这可具有减小ADC能够穿透至实体肿瘤中的速率或程度的不利作用。在血浆药代动力学中通过将数据与二室模型拟合也可观察到该降低的扩散性，该模型包括分布和消除阶段的速率项。收集药物-接头18、17和16(分别具有8、12和24个PEG单元)制备的ADC的药代动力学数据21天，并拟合至二室模型，两种方法(分布和消除)的半衰期示于图23。
由这些数据可明显观察到，PEG链由8个增加至12个单元导致血浆消除减慢(t1/2增加约2天)，但PEG由12个加倍至24个单元的额外PK改善极小。相反，分布t1/2以几乎线性方式增至超过该范围，因此PEG链由12个加倍至24个单元使分布至组织室中的半数时间几乎加倍。这些数据表明，对于该药物-接头，12个PEG单元可能是最优的长度，因为更大的PEG具有减小分布速率的作用，而不会显著影响消除速率。该实施例显示可使用PK数据来选择任何特定药物-接头的最优的PEG尺寸。
实施例22：多重PEG化的支架的制备。
方案12-14描述使用提供4和8个药物单元/抗体的PEG化支架所述的肽偶联方法合成提供具有16个药物单元/抗体的ADC的多重PEG化支架A和B，以及多重PEG化支架C，其结构如下所示。
PEG支架C涵盖于如下结构
其中Z’是含马来酰亚胺的部分，A是支化赖氨酸-赖氨酸残基，t是1且各AD和各Lp是半胱氨酸残基。
方案12。MDpr-Cys(StBu)-Ala-Cys(StBu)-PEG36-OH(支架B)的合成
方案13：mPEG24-Cys(StBu)-Lys(MDpr)-Cys(SBu)-PEG24-OH(支架A)的合成
方案13(续):mPEG24-Cys(StBu)-Lys(MDpr)-Cys(SBu)-PEG24-OH的合成
方案14：
支化的PEG化的药物-载体支架(支架C)
方案14(续):支化的PEG化的药物-载体支架(支架C)
方案14(续):支化的PEG化的药物-载体支架(支架C)
方案14(续):支化的PEG化的药物-载体支架(支架C)
按照方案12-14制备的支架A、B和C的MS数据示于表6
表6多重PEG化的支架的质谱数据
实施例23.纳入了多重PEG化的支架的ADC的制备。
方案15-16描述PEG化支架与抗体和药物-接头的偶联。向包含EDTA(2mM)的PBS中的浓度为约10mg/mL的完全还原的抗体(34)的溶液(用额外磷酸钾(100mM，pH7.4)缓冲)添加来自5–20mMDMSO储液的12摩尔当量的PEG化、支化的药物载体支架。所得的溶液在室温下放置30分钟。通过反相色谱确认完全偶联。如果偶联不完全，添加额外的PEG试剂。偶联后，采用注射器泵使抗体溶液结合至1mLHiTrapMabSelectSuRe柱(GE医疗集团生物科学公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡)并用含EDTA(2mM)的10mL的PBS以1mL/分钟洗涤。为了去除叔丁基巯基保护基团，所述柱用3mL的10mMTCEP(用额外的磷酸钾(100mM，pH7.4)缓冲)在37℃冲洗1小时。然后，所述柱用10mL的包含EDTA(2mM)的PBS以1mL/分钟清洗，并且纯化的抗体-支架偶联物用50mM甘氨酸(pH3.0)洗脱。将含蛋白质的组分合并并用10％(v/v)800mM磷酸钾、500mMNaCl和500mMEDTA(pH7.4)中和。所得的溶液(36)过滤通过无菌0.22μm离心滤器，并立即使用或贮存于-80℃。
向含EDTA(2mM)的PBS中的浓度为约5mg/mL的去保护的PEG化的抗体(35)的溶液(用额外磷酸钾(100mM，pH7.4)缓冲)添加来自5–20mMDMSO储液的48摩尔当量的含马来酰亚胺的药物-接头。所得的溶液在室温下放置30分钟。通过反相色谱确认完全偶联。如果偶联不完全，添加额外的药物-接头。偶联后，抗体溶液通过3轮稀释和4,000xg下离心通过30kDaMWCO滤器脱盐进入PBS。所得的PEG化的抗体-药物偶联物溶液(37)过滤通过无菌0.22μm离心滤器，通过尺寸排阻色谱(SEC)和反相色谱分析，并贮存于-80℃。
方案15：含马来酰亚胺的PEG化、支化的药物载体支架的偶联和叔丁基巯基保护基团的移除
方案16:含马来酰亚胺的药物接头与支化的药物载体的偶联:
实施例24.具有多重PEG化的支架的ADC的制备和生物活性
采用实施例23所述的方法，从PEG化的多重支架C制备32单位载药的奥瑞他汀和喜树碱ADC(其中n＝37)。聚集的量在定量水平之下，但尺寸排阻色谱显示32单位载药MMAE的ADC可以二聚形式存在。
相较于8单位载药的ADC，具有mc-VC-PABA-MMAE的–X-D部分的cAC1032单位载药的偶联物显示对于L540cy的细胞毒性有>5倍的改善(CD30拷贝数433K)，尽管载药量只增加了4倍。32单位载药的偶联物对于L-428(其为另一种霍奇金淋巴瘤细胞系)的活性甚至更显著，尽管该细胞系具有低得多的靶抗原拷贝数(CD30拷贝数77K)，而8单位载药偶联物视为无活性(IC50>1μM)。并且，32单位载药的MMAE偶联物对CD30+多药物抗性ALCL细胞系具有细胞毒性活性。相反，8单位载药的MMAE偶联物被视为对于多药物抗性细胞系无活性，尽管其对于母细胞系具有与32单位载药偶联物相似的活性。
相较于8单位载药的偶联物，具有MDpr-PAB(gluc)喜树碱的–X-D部分的cAC1032单位载药偶联物显示对于L540cy的细胞毒性的3-4倍改善，但如同8单位载药的偶联物，被视为对L-428无活性。相较于8单位载药偶联物，32单位载药偶联物针对ALCL多药物抗性细胞系具有>5倍的细胞毒性。
对于Raj和拉莫斯，相较于8单位载药偶联物，还具有MDpr-PAB(gluc)-喜树碱的–X-D部分的hBU1232单位载药偶联物也显示>5倍改善的细胞毒性，并且对RL有活性，其具有最低C19拷贝数。相反，8单位载药偶联物无活性。
表7具有多重PEG化的支架的ADC的质谱数据
1:采用mPEG24-Cys(StBu)-Lys(MDpr)-Cys(StBu)-PEG24-OH制备
2:采用PEG37支化的药物载体支架制备
3:采用MDpr-Cys(StBu)-Ala-Cys(StBu)-PEG36-OH制备

Claims (102)

1.一种配体-药物偶联物化合物，其中，所述配体-药物偶联物化合物包含配体单元和共价连接至所述配体单元的一个或多个接头-药物部分，其中，各接头-药物部分包含平行连接物单元，所述平行连接物单元使所述配体单元通过针对各药物单元的可释放组装单元的居间与一个或多个药物单元连接，并且连接相对于各接头-药物部分的药物单元呈平行取向的聚乙二醇单元，其中，所述可释放组装单元能够在所述配体单元靶向的靶位点附近释放游离药物，其中，所述接头-药物部分在所述配体-药物偶联物上提供1至32个药物单元的载量。
2.如权利要求1所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体-药物具有式(I)、(II)或(III)所示的结构：
或其药学上可接受的盐，其中，
L是配体单元；
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z是延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化单元；
AD是药物连接单元；
下标p是如下范围内的整数：1至14，优选2至12(优选6至14、6至12、8至14或8至12)；
下标t是0至8，优选0、1、2或3；
下标m是1至4的整数，优选1或2；和
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
3.如权利要求2所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体-药物偶联物由如下结构所示：
或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求2或3所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，下标s是0。
5.如权利要求2或3所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，下标s是1，且下标m是2、3或4。
6.如权利要求2所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体-药物偶联物具有式Ia、Ib、IIa、IIb、IIb、IIIa或IIIb所示的结构：
或其药学上可接受的盐。
7.如权利要求1-6中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，各平行连接物单元(Lp)包含氨基酸、氨基醇、氨基醛或多胺。
8.如权利要求1-6中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，各平行连接物(Lp)单元独立地具有如下结构：
其中，波浪线指示所述配体-药物偶联物内的Lp的共价连接位点；并且，其中R110是：
其中，星号表示该R110部分共价连接至以x标记的碳，并且该R110部分中的波浪线指示所述配体-药物部分内的Lp的三个连接位点之一；
各R100独立地选自氢或-C1-C3烷基，优选H或CH3；
Y独立地选自N或CH；
各Y’独立地选自NH、O或S；和
下标c独立地选自1至10的整数，优选1、2或3。
9.如权利要求7所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，各平行连接物(Lp)单元的结构对应于下式中所示的D/L-赖氨酸：
其中，波浪线指示所述配体-药物偶联物内的Lp的共价连接位点。
10.如权利要求7所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，各平行连接物(Lp)单元的结构对应于下式中所示的D/L-半胱氨酸或D/L-青霉胺：
其中，波浪线指示所述配体-药物偶联物内的Lp的共价连接位点。
11.如权利要求10所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，各平行连接物(Lp)单元具有结构：
其中，硫原子附近的波浪线指示与可释放组装单元的共价连接。
12.如权利要求2-6中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，各平行连接物(Lp)单元的结构独立地由式A表示：
其中，
AA1独立地选自氨基酸、任选被取代的C1-20杂亚烷基(优选任选被取代的C1-12杂亚烷基)、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基；
并且下标u独立地选自0至4的整数；其中，各Lp单元的至少一个AA1具有官能化的侧链，其提供与PEG、AD、A或Z单元或X-D部分的连接位点，
其中，波浪线指示所述配体-药物偶联物内的Lp的共价连接位点。
13.如权利要求12所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，各平行连接物单元(Lp)的各AA1是独立选择的氨基酸，或是任选被取代的C1-20杂亚烷基、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基，限制条件是，不多于2个AA1是任选被取代的C1-20杂亚烷基、任选被取代的C3-8杂环基、任选被取代的C6-14亚芳基，或任选被取代的C3-C8碳环基。
14.如权利要求2-13中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，当A存在时，各A是1-10个彼此共价结合的氨基酸、氨基醇或氨基醛或多胺或其组合。
15.如权利要求2-14中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，当AD存在时，各AD是彼此共价结合的1-10个独立地选择的氨基酸或氨基醇或氨基醛或多胺或其组合。
16.如权利要求2-15中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，Z具有如下结构
其中，R17是-(CH2)5C(＝O)-，星号表示各Z与所述配体单元的共价连接，并且波浪线表示各Z与所述配体-药物偶联物内的接头-药物部分的剩余部分的共价连接。
17.如权利要求2-15中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，Z具有如下结构
其中，星号表示各Z与所述配体单元的连接，并且波浪线表示各Z与所述配体-药物偶联物内的接头-药物部分的剩余部分的共价连接。
18.如权利要求2-17中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，下标t是0、1或2。
19.如权利要求2-18中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，下标p是6至14的整数。
20.如权利要求2、16或17所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体-药物偶联物由如下结构所示：
或其药学上可接受的盐。
21.如权利要求1-18中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，有6至32或8至32个药物单元连接至所述配体单元。
22.如权利要求1-21中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，PEG包含不多于约72个(OCH2CH2)亚基，优选不多于约36个(OCH2CH2)亚基。
23.如权利要求1-23中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，PEG包含联合的总计8至72、8至60、8至48、8至36或8至24个(OCH2CH2)亚基，10至72、10至60、10至48、10至36或10至24个(OCH2CH2)亚基，或12至72、12至60、12至48、12至36或12至24个(OCH2CH2)亚基。
24.如权利要求1-23中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述PEG单元包含一个或多个线性PEG链。
25.如权利要求1-21中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述PEG单元具有结构：
其中波浪线表示所述PEG单元与所述平行连接物单元的连接位点，
R20是PEG连接单元，
R21是PEG加帽单元；
R22是PEG偶联单元
n独立地选自4至72，优选6至72、8至72、10至72或12至72；
e是2至5
各n'独立地选自1至72，限制条件是所述PEG单元中有至少4个，优选至少6、至少8、至少10或至少12个PEG(OCH2CH2)亚基。
26.如权利要求25所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于
R20是–C(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-NH-、-C(O)O-、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基-O-、-C(O)C1-10烷基-CO2-、-C(O)C1-10烷基-NH-、-C(O)C1-10烷基-S-、-C(O)C1-10烷基-C(O)-NH-、-C(O)C1-10烷基-NH-C(O)-、-C1-10烷基、-C1-10烷基-O-、-C1-10烷基-CO2-、-C1-10烷基-NH-、-C1-10烷基-S-、-C1-10烷基-C(O)-NH-、-C1-10烷基-NH-C(O)-、-CH2CH2SO2-C1-10烷基-、-CH2C(O)-C1-10烷基-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-O-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-NH-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-CO2-、＝N-(O或N)-C1-10烷基-S-、
各R21独立地是-C1-10烷基、-C2-10烷基-CO2H、-C2-10烷基-OH、-C2-10烷基-NH2、C2-10烷基-NH(C1-3烷基)，或C2-10烷基-N(C1-3烷基)2；和
各R22独立地是-C1-10烷基-C(O)-NH-、-C1-10烷基-NH-C(O)-、-C2-10烷基-NH-、-C2-10烷基-O-、-C1-10烷基-S-，或–C2-10烷基-NH-。
27.如权利要求26所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，R20是-NH-或-C(O)-。
28.如权利要求25所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，PEG单元具有结构：
其中波浪线表示与平行连接物单元的连接位点，且各n独立地选自4至72的整数。
29.如权利要求28所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，n独立地选自6至24或8至24。
30.如权利要求1-29中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述PEG单元具有至少6个–CH2CH2O-亚基。
31.如权利要求1-30中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述PEG单元具有至少8个-CH2CH2O-亚基和不多于约36个-CH2CH2O-亚基。
32.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述药物单元是疏水的。
33.如权利要求32所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述药物单元是SlogP值为2.5或更大的药物的药物单元。
34.如权利要求32所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述药物单元是奥瑞他汀。
35.如权利要求34所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述奥瑞他汀药物单元由式DE结构所示：
其中，在每个位置上独立地给出以下说明：
R2选自下组：H和C1-C8烷基；
R3选自下组：H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自下组：H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自下组：H和甲基；
或R4和R5接合地形成碳环，并且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自下组：H、C1-C8烷基和C3-C8碳环，并且n选自下组：2、3、4、5和6；
R6选自下组：H和C1-C8烷基；
R7选自下组：H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
各R8独立地选自下组：H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
R9选自下组：H和C1-C8烷基；
R18选自下组：-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)。
36.如权利要求1-35中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述可释放组装单元包含通过所述药物单元结合的糖苷键连接至自分解型基团的糖部分，从而所述糖苷键在由所述配体靶向的位点处被糖苷酶切割，导致从所述配体-药物偶联物释放游离药物。
37.如权利要求36所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述可释放组装单元包含葡糖苷酸单元，并且由下式所示：
其中Su是葡糖苷酸部分，-O'-代表氧糖苷键；各R独立地是氢、卤素、-CN或-NO2；并且其中波浪线表示所述自分解型基团与LP、AD或A的连接(直接或间接通过共价连接单元)，并且星号表示所述自分解型基团与所述药物单元的连接(直接或间接通过间隔子单元)。
38.如权利要求1-35中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述可释放组装单元包含能通过组织蛋白酶B切割的肽。
39.如权利要求1-35所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，–X-D具有如下结构：
其中，QCO是任选的共价连接单元，并且波浪线表示与所述配体-药物偶联物的药物接头部分的剩余部分的共价连接。
40.如权利要求39所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，–X-D是
其中波浪线表示共价连接至所述配体-药物偶联物的药物接头部分的剩余部分。
41.如权利要求1-35中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，–X-D具有如下结构：
其中波浪线表示与所述配体-药物偶联物的药物接头部分的剩余部分的共价连接。
42.如权利要求1-41中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体单元是单克隆抗体。
43.如权利要求1-42中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体是抗体且所述抗体通过所述抗体的半胱氨酸残基的硫原子偶联至各延伸单元(Z)。
44.如权利要求43所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述半胱氨酸残基是天然产生的，并且来自链间二硫键。
45.如权利要求43所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述半胱氨酸残基是非天然产生的，并且来自引入所述抗体的半胱氨酸。
46.如权利要求45所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述引入的半胱氨酸位于根据EU索引的残基239。
47.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，有6至14个药物单元连接至所述配体单元。
48.如权利要求2-47中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体单元是抗体，下标p是8，且所述抗体通过所述抗体的链间二硫键的硫原子偶联至延伸单元(Z)。
49.如权利要求2-47中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体是抗体，下标p是10至14或10至12的整数，并且所述抗体同时通过引入所述抗体的半胱氨酸残基和所述抗体的链间二硫键的硫原子偶联至各延伸单元。
50.如权利要求49所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述半胱氨酸残基位于根据EU索引的位置239。
51.如权利要求1至50中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体单元的分子量是至少约80Kd。
52.如权利要求2-51中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述平行连接物单元的质量不多于约500道尔顿，优选不多于约200道尔顿。
53.如权利要求2-52中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述延伸单元的质量不多于约1000道尔顿，优选不多于约200道尔顿。
54.如权利要求2-53中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，当所述支化单元存在时，所述支化单元的质量不多于约1000道尔顿，优选不多于约500道尔顿。
55.如权利要求2-54中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，当所述药物连接单元存在时，所述药物连接单元的质量不多于约1000道尔顿，优选不多于约500道尔顿。
56.如权利要求2-55中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述可释放组装单元的质量不多于约5000道尔顿，优选质量为约100道尔顿至约1000道尔顿，或约200道尔顿至约1000道尔顿，或约300道尔顿至约1000道尔顿。
57.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，除所述PEG单元以外，所述配体-药物偶联物存在不多于4，不多于3，不多于2或不多于1个其它聚乙二醇亚基。
58.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，在所述配体单元和所述药物单元之间，存在不多于50，不多于45，不多于40，不多于35，不多于30，或不多于25个间插原子。
59.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，在所述可释放组装单元的可切割单元和所述配体单元之间存在不多于40，不多于35，不多于30，或不多于25个间插原子。
60.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，在所述配体和所述药物单元之间存在的间插原子少于所述PEG单元中存在的原子。
61.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述可释放组装单元的可切割单元与所述配体之间的间插原子少于所述PEG单元中的原子。
62.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述配体与所述药物单元之间的间插原子少于所述PEG单元的远端与所述平行连接物单元之间的间插原子。
63.如前述权利要求中任一项所述的配体-药物偶联物化合物，其特征在于，所述可释放组装单元的可切割单元与所述配体之间的间插原子少于所述PEG单元的远端与所述平行连接物单元之间的间插原子。
64.一种药物组合物，其包含权利要求1-63中任一项所述的配体-药物偶联物化合物的群，和，药学上可接受的载体；其中，所述组合物中的每配体单元的药物-接头部分的平均数量范围是约4至约14个。
65.如权利要求64所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物中的每配体单元的药物-接头部分的平均数量范围是约6至约14个。
66.如权利要求64所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物中的每配体单元的药物-接头部分的平均数量范围是约8至约14个。
67.如权利要求64所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物中的每配体的药物-接头分子的平均数量范围是约8至约12个。
68.如权利要求66所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物中的每配体的药物-接头分子的平均数量是约8个。
69.一种药物-接头化合物，其中，所述药物-接头化合物由式IV、V或VI的结构表示：
或其药学上可接受的盐，其中
D是药物单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
X是可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
A是任选的支化单元；
AD是药物连接单元；
下标t是整数并且是0至8，优选0、1、2或3；
下标m是1至4的整数，优选1或2；和
下标s是0或1，限制条件是，当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2、3或4。
70.如权利要求69所述的药物-接头化合物，其特征在于，所述药物-接头化合物具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
71.如权利要求69或70所述的药物-接头化合物，其特征在于，s是0(即，A不存在)。
72.如权利要求69或70或71所述的药物-接头化合物，其特征在于，s是1且m是2至4。
73.如权利要求69所述的药物-接头化合物，其特征在于，所述药物-接头具有式IVa、IVb、Va、Vb、Vc、VIa或VIb所示的结构：
或其药学上可接受的盐。
74.如权利要求69-73中任一项所述的药物-接头化合物，其特征在于，LP是氨基酸、氨基醇、氨基醛或多胺。
75.如权利要求69-73中任一项所述的药物-接头化合物，其特征在于，各LP独立地具有如下结构：
其中波浪线表示所述化合物内的共价连接位点，其中R110具有如下结构
其中，星号表示所述R110部分连接至以x标记的碳，并且所述R110部分中的波浪线指示所述配体-药物偶联物内的Lp的三个连接位点之一；
其中，各R100独立地选自氢或-C1-C3烷基，优选氢或CH3，
Y独立地选自N或CH，
各Y’独立地选自NH、O或S，且
下标c独立地选自1至10的整数，优选1、2或3。
76.如权利要求74所述的药物-接头化合物，其特征在于，各LP的结构对应于下式所示的D/L赖氨酸：
77.如权利要求70-76中任一项所述的药物-接头化合物，其特征在于，当A存在时，A是1-10个氨基酸、氨基醇、氨基醛、多胺，或其组合。
78.如权利要求70-77中任一项所述的药物-接头化合物，其特征在于，当AD存在时，AD是1-10个氨基酸、氨基醇、氨基醛、多胺，或其组合。
79.如权利要求69-78中任一项所述的药物-接头化合物，其特征在于，Z'具有如下结构
其任选地被胺保护基团保护，
其中波浪线表示共价连接至所述药物-接头结构的剩余部分。
80.如权利要求69所述的药物-接头化合物，其特征在于，所述药物-接头化合物具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
81.如权利要求69所述的药物-接头化合物，其特征在于，所述药物-接头化合物具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
82.如权利要求69所述的药物-接头化合物，其特征在于，所述药物-接头化合物具有如下结构：
或其药学上可接受的盐。
83.如权利要求69所述的药物-接头化合物，其特征在于，所述药物-接头化合物具有如下结构：
或其药学上可接受的盐，其中R21是PEG加帽单元，且n是6至72、8至72或8至24的整数。
84.如权利要求69所述的药物-接头化合物，其特征在于，所述药物-接头化合物具有如下结构：
或其药学上可接受的盐，其中R21是PEG加帽单元，且n是6至72，或8至72，或8至24。
85.如权利要求83或84所述的药物-接头化合物，其特征在于，n是8、12或24。
86.如权利要求83或84或85所述的药物-接头化合物，其特征在于，R21是甲基、乙基或丙基。
87.一种药物组合物，其包含具有偶联至配体单元的、与权利要求69-86中任一项所述的药物-接头化合物的结构相对应的药物-接头部分的配体-药物偶联物的群；和，药学上可接受的载体，其中，所述组合物中的每配体的药物-接头分子的平均数量范围是约8至约14个。
88.如权利要求64–68和87中任一项所述的药物组合物，其特征在于，配体-药物偶联物的各平行取向的PEG单元具有至少8至不多于24个PEG亚基。
89.如权利要求64–68和87中任一项所述的药物组合物，其特征在于，配体-药物偶联物的各平行取向的PEG单元具有至少12至不多于24个PEG亚基。
90.如权利要求64–69和87-89中任一项所述的药物组合物，其特征在于，平均药物-接头载量的值也代表所述组合物中主要配体-药物偶联物的药物-接头的载量。
91.如权利要求1-63中任一项所述的配体-药物偶联物，其特征在于，除所述PEG单元以外，所述配体-药物偶联物中不存在其它PEG亚基。
92.具有式VII、VIII或IX的接头化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
PEG是聚乙二醇单元；
Z'是能够与配体单元形成共价连接的延伸单元；
-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元；
A'是能够与2至4个X-D单元(优选两个X-D单元)形成共价连接的支化单元；
A是任选的支化单元；
AD'是能够与–X-D单元形成共价连接的药物连接单元；
LP是平行连接物单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；
下标t是整数并且是0至8，优选0、1、2或3；
下标m是整数并且是1至4；优选1或2；
下标s是整数并且是0或1，限制条件是当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2至4。
93.如权利要求92所述的接头化合物，其特征在于，LP'是由下式所示的受保护的半胱氨酸或青霉胺：
其中波浪线表示化合物内的共价连接，且RPR是巯基保护基团。
94.如权利要求92所述的接头化合物，其具有式VIII，其中t是1，且其中AD'是
其中RPR是巯基保护基团，且波浪线表示所述化合物内的共价连接。
95.如权利要求92所述的接头化合物，其具有下式：
或其药学上可接受的盐，其中，RPR是巯基保护基团。
96.如权利要求92所述的接头化合物，其具有下式
或其药学上可接受的盐，其中RPR是巯基保护基团。
97.具有下式X、XI、XII的配体-接头化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
L是配体单元；
PEG是聚乙二醇单元；
Z-是延伸单元；
-X-D是连接至药物单元的可释放组装单元；
LP是平行连接物单元；
LP'是能够与-X-D形成共价连接的平行连接物单元；
A'是能够与2至4个X-D单元(优选两个X-D单元)形成共价连接的支化单元；
A是任选的支化单元；
AD'是能够与X-D单元形成共价连接的药物连接单元；
下标p是整数并且是1至14，优选约2至约12(优选约6至约14、约6至约12、约8至约14或约8至约12)；
下标t是整数并且是0至8；优选0、1、2或3
下标m是整数并且是1至4；优选1或2；且
下标s是整数并且是0或1，限制条件是当s是0时，m是1，且当s是1时，m是2至4。
98.如权利要求97所述的配体-接头化合物，其特征在于，所述接头-配体接头化合物具有如下结构：式XIa、XIb、XIc、XId、XIIa或XIIb：
或其药学上可接受的盐。
99.如权利要求64-68和87-90中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物，相较于包含缺乏所述PEG单元的配体-药物偶联物的药物组合物或包含含PEG单元但该PEG单元相对于所述抗体和药物呈串联取向的配体-药物偶联物的药物组合物，显示改善的药代动力学性质。
100.如权利要求64-68和87-90中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物显示与包含对应的未偶联的配体的药物组合物相同或基本相同的药代动力学性质。
101.一种治疗癌症的方法，所述方法包括，给予有此需要的对象有效量的权利要求1-63中任一项所述的配体-药物偶联物，或权利要求64-68、87-90或99-100中任一项所述的药物组合物，其中，所述配体-药物偶联物的配体单元特异性地结合至癌细胞表达的靶抗原。
102.如权利要求1-63中任一项所述的配体-药物偶联物，其特征在于，所述配体是特异性结合至CD19的单克隆抗体、特异性结合至CD20的单克隆抗体、特异性结合至CD30的单克隆抗体(优选嵌合的或人源化的AC10抗体)、特异性结合至CD33的单克隆抗体、特异性结合至CD70的单克隆抗体、特异性结合至α-v-β-6的单克隆抗体或特异性结合至Liv-1抗原的单克隆抗体。
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