ES2826398T3 - Enlazadores-fármacos pegilados para una mejor farmacocinética de los conjugados ligando-fármaco - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de conjugado ligando-fármaco en donde el compuesto de conjugado ligando-fármaco está compuesto por una unidad de ligando y una o más porciones de enlazador-fármaco unidas covalentemente a la unidad de ligando, en donde cada porción de enlazador-fármaco está compuesta por una unidad conectora en paralelo, en donde la unidad conectora en paralelo es una porción química trifuncional que conecta la unidad de ligando a una o más unidades de fármaco a través de una unidad de ensamblaje liberable para cada unidad de fármaco, y conecta una unidad de polietilenglicol en orientación paralela con respecto a las unidades de fármaco de cada porción de enlazador-fármaco, en donde cada una de las unidades de fármaco es hidrófoba, en donde la unidad de polietilenglicol comprende una o varias cadenas de polietilenglicol, y la unidad de polietilenglicol tiene un extremo que se conecta covalentemente a la unidad conectora en paralelo, en donde las unidades de ensamblaje liberable pueden liberar el fármaco libre en las proximidades de un sitio objetivo dirigido por la unidad de ligando, en donde las porciones de enlazador-fármaco proporcionan la carga de una a treinta y dos unidades de fármaco en el conjugado ligando-fármaco, en donde el compuesto de conjugado ligando-fármaco tiene la estructura representada por la fórmula (I), (II) o (III): **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde, L es la unidad de ligando, en donde la unidad de ligando se selecciona de un anticuerpo, un interferón, una linfocina, una hormona, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias, una vitamina o una molécula de transporte de nutrientes, en donde la unidad de ligando es un agente de direccionamiento que se une específicamente a una porción objetivo, en donde dicha unión presenta la unidad de fármaco del conjugado ligando-fármaco a la población de células objetivo en particular caracterizada por la porción objetivo con la que interactúa la unidad de ligando; D es la unidad de fármaco hidrófoba, en donde la unidad de fármaco es un fármaco citotóxico, citostático o inmunosupresor que tiene una hidrofobicidad mayor o dentro del 20 % de la monometil auristatina E cuando se mide mediante el uso de SlogP; PEG es la unidad de polietilenglicol, en donde la unidad de PEG comprende de 4 a 72 subunidades (OCH2CH2); Z es una unidad de extensión que actúa para unir la unidad de ligando a la unidad conectora en paralelo; X es la unidad de ensamblaje liberable, en donde X comprende un enlace peptídico, disulfuro o glucosídico; LP es la unidad conectora en paralelo, que sirve para conectar la unidad de ligando a la unidad de polietilenglicol y la unidad de fármaco hidrófoba de manera que la unidad de polietilenglicol y la unidad de fármaco estén en una orientación paralela, en donde la unidad de polietilenglicol en dicha orientación paralela enmascara la hidrofobicidad de la unidad de fármaco hidrófoba; A es una unidad de ramificación opcional, cuando está presente, cada A es de uno a 10 residuos de aminoácido, aminoalcohol o aminoaldehído o poliamina seleccionados independientemente, o una combinación de estos, unidos covalentemente entre sí; AD es una unidad de unión al fármaco, cuando está presente, cada AD es de uno a 10 residuos de aminoácido o aminoalcohol o aminoaldehído o poliamina seleccionados independientemente, o una combinación de estos, unidos covalentemente entre sí; el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente 2 a 12, preferentemente 6 a 14, 6 a 12, 8 a 14 u 8 a 12; el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8, preferentemente 0, 1, 2 o 3; el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4, preferentemente 1 o 2; y el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando el subíndice s es 0, el subíndice m es 1 y cuando el subíndice s es 1, el subíndice m es 2, 3 o 4, además, en donde cada unidad conectora en paralelo (Lp) es (i) o (ii) a continuación: (i) cada unidad conectora en paralelo (Lp) comprende un residuo de aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina, particularmente en donde cada unidad conectora en paralelo (Lp) tiene la estructura de: **(Ver fórmula)** en donde las líneas onduladas indican sitios de unión covalente de Lp dentro del compuesto de conjugado ligando-fármaco, particularmente en donde cada unidad conectora en paralelo (Lp) tiene la estructura de **(Ver fórmula)** en donde las líneas onduladas indican los sitios de unión covalente de Lp dentro del compuesto de conjugado ligando-fármaco; y en donde AA1 se selecciona independientemente de un aminoácido, heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido, cada uno con grupos funcionales para las uniones entre las subunidades de Fórmula A y dentro del conjugado ligando-fármaco; y el subíndice u es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 4; en donde al menos un AA1 de cada unidad Lp tiene una cadena lateral con adición de grupos funcionales que proporciona un sitio de unión a una unidad de PEG, AD, A o Z o una porción X-D, particularmente AA1 es un aminoácido seleccionado independientemente o es un heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido, siempre que no más de 2 de AA1 sean un heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido.
Description
DESCRIPCIÓN
Enlazadores-fármacos pegilados para una mejor farmacocinética de los conjugados ligando-fármaco
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud no provisional reivindica el beneficio de prioridad según 35 USC § 119(e) para los documentos de la solicitud de Estados Unidos núm. de serie 61/891,320, presentada el 15 de octubre de 2013, 61/941,904, presentada el 19 de febrero de 2014, 61/947,742, presentada el 4 de marzo de 2014 y 61/975,318, presentada el 4 de abril de 2014, todas las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad.
Listado de secuencias
Un listado de secuencias designado como 2700-00114PC-ST25.txt de 13 KB creado el 9 de octubre de 2014, se incorpora en la presente descripción como referencia.
Antecedentes de la invención
Ha surgido un gran interés en torno al uso de anticuerpos monoclonales (AcM) para la administración dirigida de agentes citotóxicos a las células cancerosas. El diseño de conjugados de anticuerpo-fármaco, mediante la unión de un agente citotóxico a un anticuerpo, generalmente a través de un enlazador, implica la consideración de una variedad de factores. Estos factores incluyen la identidad y la ubicación del grupo químico para la conjugación del agente citotóxico, el mecanismo de liberación del agente, el o los elementos estructurales (si los hay) que proporcionan la liberación del agente citotóxico y la modificación estructural del agente libre liberado, si la hay. Además, si el agente citotóxico se va a liberar después de la internalización del anticuerpo, los elementos estructurales y el mecanismo de liberación del agente deben estar en consonancia con el tráfico intracelular del conjugado.
Si bien se han evaluado varias clases de fármacos diferentes para su administración a través de anticuerpos, solo unas pocas clases de fármacos han demostrado ser suficientemente activas como conjugados de fármaco y anticuerpo, a la vez que tienen un perfil de toxicidad adecuado, para garantizar el desarrollo clínico. Una de esas clases son las auristatinas, relacionadas con el producto natural dolastatina 10. Las auristatinas representativas incluyen MMAE (N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-norefedrina) y MMAF (N-metilvalina-valinadolaisoleuina-dolaproína-fenilalanina).
MMAE es un ejemplo de un agente citotóxico que es activo como fármaco libre y es muy potente cuando se conjuga con un anticuerpo monoclonal (AcM) y se libera después de la internalización en las células. MMAE se ha conjugado con éxito a un AcM en el aminoácido N-terminal de MMAE mediante un enlazador basado en un péptido escindible de catepsina B que contiene maleimidocaproil-valina-citrulina (mc-vc-) y un grupo autoinmolativo p-aminobencilcarbamoilo (PABC) para producir conjugados de anticuerpo-fármaco de la siguiente estructura, AcM-(mc-vc-PABC-MMAE) p. (En la fórmula anterior, p se refiere al número de unidades (mc-vc-PABC-MMAE) por anticuerpo). Tras la ruptura del enlace entre el péptido vc y el grupo PABC autoinmolativo, el grupo PABC se libera de MMAe , dejando libre a la MMAE.
Otra auristatina, MMAF, es relativamente menos activa como fármaco libre (en comparación con MMAE), pero es muy potente cuando se conjuga con un anticuerpo y se internaliza en las células. MMAf se ha conjugado con éxito a un anticuerpo monoclonal (AcM) en el aminoácido N-terminal de MMAF a través de un enlazador basado en un péptido escindible de catepsina B que contiene maleimidocaproil-valina-citrulina (mc-vc-) y un grupo autoinmolativo p-aminobencil-carbamoilo (PABC) para producir conjugados anticuerpo-fármaco de la estructura AcM-(mc-vc-PABC-MMAF) p, en donde p se refiere al número de unidades (mc-vc-PABC-MMAF) por anticuerpo. Tras la escisión del enlazador peptídico, el grupo PABC autoinmolativo se libera del MMAF, dejando libre a la MMAF.
Se encontró, además, que MMAF es activa como un conjugado no escindible, que contiene el enlazador-fármaco maleimidocaproil MMAF (mcMMAF). Cuando este conjugado, AcM-(mcMMAF)p, se internaliza en las células, la especie activa liberada es cys-mcMMAF. Debido a que el enlazador no es escindible, el maleimidocaproilo y un residuo de cisteína del anticuerpo permanecen unidos al extremo N-terminal de MMAF. Se informó, además, que MMAF es activo como un conjugado en C-terminal, unido en su aminoácido C-terminal, fenilalanina, a un péptidoenlazador maleimidocaproilo. Cuando este conjugado, (MMAF-péptido-mc)p-AcM se internaliza en las células, la especie activa, MMAF, se libera después de la escisión del enlace MMAF(fenilalanina)-péptido.
En modelos animales, estos conjugados de MMAE y MMAF mostraron una disminución en las propiedades farmacocinéticas, de manera dependiente de la carga del fármaco. En particular, a medida que aumentó el número de unidades enlazador-fármaco unidas a cada anticuerpo, disminuyó la PK de los conjugados.
Por lo tanto, otro factor importante en el diseño de conjugados es la cantidad de fármaco que se puede administrar por agente de direccionamiento (es decir, el número de agentes citotóxicos unidos a cada agente de
direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo), denominado carga de fármaco o cargamento de fármaco). Históricamente, las suposiciones eran que las cargas de fármacos más altas eran superiores a las cargas de fármacos más bajas (por ejemplo, 8 cargas frente a 4 cargas). El fundamento era que los conjugados con mayor carga entregarían más fármaco (agentes citotóxicos) a las células objetivo. Este razonamiento fue respaldado por las observaciones de que los conjugados con mayores cargas de fármaco eran más activos contra las líneas celulares in vitro. Sin embargo, algunos estudios posteriores revelaron que esta suposición no se confirmó en modelos animales. Se observó que los conjugados que tenían cargas de fármaco de 4 u 8 de ciertas auristatinas tenían actividades similares en modelos de ratón. Hamblett y otros, Clinical Cancer Res. 10: 7063-70 (2004). Hamblett y otros, informaron además que los ADC con mayor carga se eliminaron más rápidamente de la circulación en los modelos animales. Esta eliminación más rápida sugirió un riesgo de PK para las especies con mayor carga en comparación con las especies con menor carga. Hamblett y otros. Además, los conjugados con mayor carga tenían MTD más bajos en ratones y, como resultado, tenían índices terapéuticos informados más estrechos. Id. Por el contrario, se informó que los ADC con una carga de fármaco de 2 en los sitios diseñados en un anticuerpo monoclonal tenían una farmacocinética e índices terapéuticos iguales o mejores en comparación con ciertos a Dc con 4 cargas. Por ejemplo, véase Junutula y otros, Clinical Cancer Res. 16: 4769 (2010). Por lo tanto, las tendencias recientes son desarrollar ADC con bajas cargas de fármaco.
Por lo tanto, existe la necesidad de formatos de conjugados de fármaco y anticuerpo (y más generalmente de formatos para otros conjugados), que permitan una carga de fármaco más alta, pero que mantengan otras características de los conjugados con menor carga, tales como las propiedades farmacocinéticas favorables. Sorprendentemente, la presente invención aborda esas necesidades.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Volumen tumoral medio con relación a los días posteriores al implante para el modelo de xenoinjerto de L540cy (linfoma de Hodgkin) dosificado en dosis única más alta (2 mg/kg) con composiciones de ADC no PEGilado, cAC10-[mc-PAB(gluc) MMAE]p, (cAC10-1), ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-10), y ADC PEGilado orientado en serie (cAC10-4) con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos/Ac.
Figura 2. Volumen tumoral medio con relación a los días después del implante para el modelo de xenoinjerto de Karpas299 (ALCL) dosificado en dosis única más alta (0,6 mg/kg) con composiciones de ADC no PEGilado (cAC10-1), ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-10), y ADC PEGilado orientado en serie (cAC10-4) con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos/Ac.
Figura 3. Volumen tumoral medio con relación a los días después del implante para el modelo de xenoinjerto de L540cy (linfoma de Hodgkin) dosificado en dosis única más baja (0,5 mg/kg) con composiciones de ADC no PEGilado (cAC10-1), ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-10), y ADC PEGilado orientado en serie (cAC10-4).
Figura 4. Volumen tumoral medio con relación a los días después del implante para el modelo de xenoinjerto de Karpas299 (ALCL) dosificado en dosis única más baja (0,15 mg/kg) con composiciones de ADC no PEGilado (cAC10-1), ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-10), y ADC PEGilado orientado en serie (cAC10-4) con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos/Ac.
Figura 5. Volumen tumoral medio con relación a los días posteriores al implante para el modelo de xenoinjerto de Karpas299 (ALCL) dosificado en dosis única a 0,2 mg/kg con composiciones de ADC no PEGilado, cAC10-[MDpr-PAB(gluc)-MMAE]p (cAC10-14), y ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-16) con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos/Ac (es decir, p es 8).
Figura 6. Volumen tumoral medio con relación a los días posteriores al implante para el modelo de xenoinjerto de Ramos (linfoma de Burkitt) dosificado en dosis única a 1 mg/kg con composiciones de ADC no PEGilado, hBU12-[MDpr-PAB(gluc)-MMAE]p (hBU12-14), y ADC PEGilado orientado en paralelo (hBU12-16) con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos/Ac (es decir, p es 8).
Figura 7. Perfil farmacocinético (concentración total de Ac en pg/ml con relación al tiempo en días) en ratas después de una dosis única intravenosa de 3 mg/kg de anticuerpo cAC10 no conjugado, su ADC no PEGilado (cAC10-1), composiciones de ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-10) y de ADC PEGilado orientado en serie (cAC10-4) con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos/Ac.
Figura 8. Cromatogramas de exclusión por tamaño de ADC de cAC10 con 8 fármacos/Ac que tienen enlazadores del fármaco no PEGilados y porciones de enlazador-fármaco PEGiladas orientadas en paralelo, en donde la porción de enlazador-fármaco es MDpr-VC-PABA-MMAE, con unidades de PEG de longitudes variables: cAC10-A (no PEGilado), cAC10-B (PEG12), cAC10-C (PEG24), cAC10-D (PEG36), cAC10-E (PEG12 PEG36), cAC10-F (PEG24 PEG36) y cAC10-G (PEG36 PEG36).
Figura 9. Perfil farmacocinético (concentración total de Ac en |jg/ml con relación al tiempo en días) en ratas después de una dosis única intravenosa de 3 mg/kg de a Dc de cAC10 con 8 fármacos/Ac que tienen enlazadores del fármaco no PEGilados, en donde el conjugado ADC es c-AC10-MDpr-VC-PAB-MMAE (cAC10-A) y cAC10-mc-VC-PABA-MMAE (cAC10-K), y porciones de enlazador-fármaco PEGiladas orientadas en paralelo en donde el ADC se representa por la estructura de cAC10-[MDpr (-X-D)-PEG24]p, y -X-D es MDpr-VC-PAB-MMAE (cAC10-C) o mc-VC-PABA-MMAE (cAC10-L) y p es 8 comparado con un conjugado control cAC10-NAEM (cAC10-I) que tiene un soporte de PEG24 bloqueado con n-etilaminomaleimida (es decir, sin unidad de fármaco adjunta).
Figura 10. Perfil farmacocinético (concentración total de Ac en jg/ml con relación al tiempo en días) en ratas después de una única dosis intravenosa de 3 mg/kg de ADC de cAC10 con 8 fármacos/Ac que tienen enlazadores del fármaco no PEGilados, en donde el conjugado ADC es c-AC10-[MDpr-VC-PAB-MMAE]p (cAC10-A) o porciones de enlazador-fármaco PEGiladas orientadas en paralelo, en donde el ADC se representa por la estructura de cAC10-[MDpr (-X-D)-PEG]p, en donde p es 8, -X-D es MDpr-VC-PAB-MMAE y PeG es una unidad de PEG que tiene longitudes variables: PEG12 (cAC10-B), PEG24 (cAC10-C) y PEG36 (cAC10-D) en comparación con los conjugados de control correspondientes que tienen un soporte de PEG bloqueado con netilaminomaleimida (es decir, sin unidad de fármaco adjunta): PEG12 (cACl0-H), PEG24 (cACl0-I) y PEG36 (cAC10-J).
Figura 11. Volumen tumoral (mm2) con relación a los días después del trasplante tumoral en un modelo de xenoinjerto de L540cy dosificado una vez por vía intravenosa con 2 mg/kg de ADC no PEGilado: c-AC10-[MDpr-VC-PAB-MMAE]p (cAC10-A), en comparación con los animales no tratados.
Figura 12. Volumen tumoral (mm2) con relación a los días después del trasplante tumoral en un modelo de xenoinjerto de L540cy dosificado una vez por vía intravenosa con 2 mg/kg de ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-B): cAC10-[MDpr (-X-D)-PEG12]p, en donde p es 8 y -X-D es MDpr-VC-PAB-MMAE, en comparación con los animales no tratados.
Figura 13. Volumen tumoral (mm2) con relación a los días después del trasplante tumoral en un modelo de xenoinjerto de L540cy dosificado una vez por vía intravenosa con 2 mg/kg de ADC PEGilado orientado en paralelo (cAC10-C): cAC10-[MDpr (-X-D)-PEG24]p, en donde p es 8 y -X-D es MDpr-VC-PAB-MMAE, en comparación con los animales no tratados.
Figura 14. Volumen tumoral medio (mm2) con relación a los días después del trasplante tumoral en un modelo de cáncer de mama por xenoinjerto tratado con ADC no PEGilado dirigido al antígeno LIV-1: hLIV22-[mc-VC-PAB-MMAE)]p o hLIV22-[MDpr (-X-D)-PEG24]p en donde p es 8 y -X-D es mc-VC-PAB-MMAE en comparación con los animales no tratados.
Figura 15. Volumen tumoral medio (mm2) con relación a los días después del trasplante de tumor en un modelo de xenoinjerto de L540cy dosificado una vez por vía intravenosa con 1 o 0,5 mg/kg de ADC no PEGilado: cAC10-[mc-PAB(gluc)-MMAE]p (cAC10-1) o su ADC PEGilado correspondiente orientado en paralelo: cAC10-{mc-[PAB(gluc)-MMAE]-PEG24}p (cAC10-10), en donde p es 4, en comparación con los animales no tratados.
Figura 16. Volumen tumoral medio (mm2) con relación a los días después del trasplante de tumor en un modelo de xenoinjerto de Karpas299 dosificado una vez por vía intravenosa con 0,3 o 0,15 mg/kg de ADC no PEGilado: cAC10-[mc-PAB(gluc)-MMAE]p (cAC10-1) o su AdC PEGilado correspondiente orientado en paralelo: cAC10-{mc-[PAB(gluc)-MMAE]-PEG24}p (cAC10-10), en donde p es 4, en comparación con los animales no tratados. Figura 17. Curvas de dosis-respuesta para ADC de hBU12 cargados con 8 fármacos que tienen soportes PEGilados con longitudes variables para sus unidades de PEG frente a un panel de líneas celulares de linfoma no Hodgkin con enlazador-fármaco representado por la estructura de MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(glu)), en donde Lp es lisina como la unidad conectora en paralelo, en donde x es 0 (hBU12-l4 ) en el que la unidad de PEG en el épsilon amino de la lisina se sustituye con acetilo, x es 2 (hBU12-43), 4 (hBu12-42), 8 (hBU12-18), 12 (hBU12-17), 24 (hBU12-16), o es la estructura ramificada de PEG4-(PEG4)3 (hBU12-19).
Figura 18. Perfil farmacocinético (concentración total de Ac en jg/ml con relación al tiempo en días) en ratas después de una dosis única intravenosa de 1 mg/kg de anticuerpo que no es de direccionamiento y no está conjugado (h00), sus conjugados que tienen soportes PEGilados con longitudes variables para su unidad de PEG con el enlazador-fármaco representado por la estructura de MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(glu)), en donde Lp es Lisina como Unidad conectora en paralelo, en donde x es 0 (h00-14) en el que la unidad de PEG en el épsilon amino de lisina se reemplaza con acetilo, x es 2 (h00-43), 4 (h00-42), 8 (h00-18), 12 (h00-17) o 24 (h00-16). Figura 19. Volumen tumoral medio (mm2) con relación a los días después del trasplante de tumor en un modelo de linfoma difuso de células B grandes RL positivas para CD19 después de la administración intravenosa de una dosis única de 1 o 3 mg/kg de ADC de hBU12 que tienen soportes PEGilados con longitudes variables para sus unidades de PEG con el enlazador-fármaco representado por la estructura de MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc)), en
donde Lp es lisina como la unidad Conectora en paralelo, en donde x es 0 (hBU12-14) en la que la unidad de PEG en el épsilon amino de lisina se reemplaza con acetilo, x es 2 (hBU12-43), 4 (hBU12-42), 8 (hBU12-18), 12 (hBU12-17) o 24 (hBU12-16) en comparación con los animales no tratados.
Figura 20. Concentraciones de fármaco (nM) en tumores de xenoinjerto de linfoma de Hodgkin L540cy CD30+ en ratones después de la administración de una dosis única de 1 mg/kg de ADC no PEGilado, cAC10-[mc-PAB(gluc) MMAE]p, (cAC10-1), ADC PEGilados orientados en paralelo con enlazador-fármaco mc-Lp-(PAB(gluc)-MMAE)PEG24 (cAC10-10), MDpr-Lp-(PAB(gluc)-MMAE)PEG24 (cAC10-16), en donde la unidad conectora en paralelo LP es lisina, o ADC PEGilado orientado en serie (cAC10-4), en donde los ADC tienen una carga de fármaco promedio de 8.
Figura 21. Tolerabilidad, que se muestra mediante el % de cambio de peso en el tiempo, para una sola dosis intravenosa de 50 mg/kg de conjugados de fármaco PEGilados, de control, no dirigidos que tienen soportes PEGilados con longitudes variables para sus unidades de PEG con el enlazador-fármaco representado por la estructura de MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc)), en donde Lp es lisina como la unidad conectora en paralelo, en donde x es 0 (h00-43) en la que la unidad de PEG en el épsilon amino de lisina se reemplaza con acetilo, x es 2 (h00-43), 4 (h00-42), 8 (h00-18), 12 (h00-17) o 24 (h00-16), en donde los ADC tienen una carga de fármaco promedio de 8, en comparación con los animales no tratados.
Figura 22. Cromatogramas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para conjugados de fármacos PEGilados de control, no dirigidos, que tienen soportes PEGilados con longitudes variables para sus unidades de PEG con el enlazador-fármaco representado por la estructura de MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc)), en donde Lp es lisina como la unidad conectora en paralelo, en donde x es 8 (h00-18), 12 (h00-17) o 24 (h00-16)
Figura 23. Tiempo de vida media de la eliminación y distribución ajustadas a un modelo de dos compartimentos para conjugados de fármacos PEGilados, de control, no dirigidos, que tienen soportes PEGilados con longitudes variables para sus unidades de PEG con el enlazador-fármaco representado por la estructura de MDpr-Lp-(PEG)x(PAB(gluc)), en donde Lp es lisina como la unidad conectora en paralelo, en donde x es 8 (h00-18), 12 (h00-17) o 24 (h00-16).
Breve resumen de la invención
La invención proporciona, entre otros, conjugados ligando-fármaco (LDC), compuestos enlazador-fármaco y métodos para prepararlos. Los conjugados ligando-fármaco son estables en circulación, pero capaces de causar la muerte celular en las células objetivo o inhibir la proliferación de las células objetivo una vez que su carga de fármaco se libera en las proximidades o dentro de las células objetivo.
En las modalidades principales, un LDC de la presente invención se representa por la estructura de la Fórmula I a continuación:
en donde D es una unidad de fármaco, PEG es la unidad de polietilenglicol que enmascara la hidrofobicidad del enlazador-fármaco, Lp es la unidad conectora en paralelo que permite que una unidad de PEG esté en una orientación paralela con respecto a X-D, A es una unidad de ramificación cuando m es mayor que 1, opcionalmente compuesta de subunidades, o A está ausente cuando m es 1, X es una unidad de ensamblaje liberable que proporciona la liberación de cada D del LDC y Z es una unidad espaciadora opcional a través de la cual Lp se une a L, que es el ligando de direccionamiento.
En otras modalidades principales, un LDC de la presente invención se representa por la estructura de la Fórmula II a continuación:
en donde AD es una unidad de unión al fármaco que permite la unión adicional de porciones X-D indicadas por t en orientación paralela a la unidad de PEG y L, Lp, Z, A, X, D, m, p y s son como se definen para la Fórmula I.
En otras modalidades principales, un LDC de la presente invención se representa por la estructura de la Fórmula III a continuación:
en donde AD, L, Lp, PEG, Z, A, X, D, m, p, s y t son como se definen para la Fórmula II.
Descripción de la invención
General
La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que la orientación de un componente de polietilenglicol (unidad de PEG) de un conjugado ligando-fármaco puede tener una profunda influencia sobre la farmacocinética resultante del conjugado. Específicamente, los presentes inventores han descubierto que una disposición en paralelo de una unidad de PEG en relación con la unidad de fármaco de un conjugado ligandofármaco puede mejorar la farmacocinética del conjugado en comparación con los conjugados que no tienen una unidad de PEG o tienen una unidad de PEG colocada en una orientación en serie con la unidad de fármaco. Los presentes inventores han descubierto además que el número de subunidades repetidas de polietilenglicol presentes en la unidad de PEG influye en la farmacocinética resultante del conjugado. Al diseñar los conjugados para que tengan una unidad de PEG en una ubicación paralela y de un tamaño apropiado para enmascarar la hidrofobicidad del fármaco y, en algunos casos, de los componentes del enlazador, se pueden preparar formatos de conjugados ligando-fármaco que permiten una mayor carga de fármaco, a la vez que se mantienen otras características de los conjugados de menor carga, como las propiedades PK favorables. Los conjugados ligando-fármaco se diseñan además de tal manera que liberan el fármaco "libre".
Definiciones
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases, tal como se utilizan en este documento, pretenden tener los siguientes significados. Cuando se utilizan nombres comerciales en el presente documento, el nombre comercial incluye la formulación del producto, el fármaco genérico y el (los) ingrediente(s) farmacéutico(s) activo(s) del producto con nombre comercial, a menos que el contexto indique lo contrario.
"Unidad conectora en paralelo", como se usa en el presente documento, se refiere a un componente de unidad enlazadora ramificada que conecta una unidad de PEG en orientación paralela a la unidad de fármaco. Como se usa
en este documento, la frase "orientación paralela", "disposición en paralelo", "conexión en paralelo" y términos similares se refieren a una configuración en donde los componentes colocados en paralelo, orientados en paralelo o conectados en paralelo están unidos a la unidad conectora en paralelo (Lp) de tal manera que cada uno tenga un extremo sujeto a Lp y un extremo libre. Generalmente, Lp conecta una unidad de fármaco a través de uno o más componentes de la unidad enlazadora, de los cuales uno (o el único) es una unidad de ensamblaje liberable, y una unidad de PEG de manera que las unidades de fármaco y de PEG estén en una orientación paralela de modo que la hidrofobicidad de la unidad de fármaco quede enmascarada por la unidad de PEG. En algunos aspectos, una o más unidades de unión a fármacos (AD) que están conectadas a una Lp proporcionan una ramificación adicional de modo que la unidad de fármaco conectada a AD está en orientación paralela a una unidad de PEG en esa Lp. Sólo las unidades de PEG necesarias para enmascarar la hidrofobicidad de una porción de enlazador-fármaco dada deben estar en orientación paralela a su unidad de fármaco, lo cual no requiere necesariamente que todas las unidades de fármaco y de polietilenglicol conectadas a Lp estén en orientaciones en paralelo una con respecto a la otra.
El término "paralelo" se usa en el presente documento para indicar la ramificación de dos componentes de un conjugado ligando-fármaco (LDC) a partir de una Lp que comprende el LDC y no se usa para indicar que los dos componentes están uno al lado del otro en el espacio, o que tienen la misma distancia entre ellos a lo largo de algunas o todas sus longitudes. En los casos en que un componente orientado en paralelo está ramificado en sí mismo y, por lo tanto, tiene varios extremos, todavía tiene solo un extremo unido.
Un LDC que tiene una unidad de PEG que está en una orientación paralela en relación con la unidad de fármaco del LDC se refiere a un LDC que comprende una unidad de PEG que tiene un terminal que está conectado a un componente de una unidad enlazadora (es decir, una unidad conectora en paralelo) y uno o más terminales libres sin uniones (terminales). El extremo libre, sin uniones, de la unidad de PEG puede tomar la forma, por ejemplo, de un grupo funcional sin reaccionar, por ejemplo, alcoxi, ácido carboxílico, ácido alquilencarboxílico, alcohol u otro grupo funcional. La orientación paralela de la unidad de PEG en relación con la unidad de fármaco actúa para minimizar el número de átomos entre la unidad de ligando y la unidad de fármaco, ya que los átomos de la unidad de PEG no se interponen entre la unidad de fármaco y la unidad de ligando. En los LDC, la unidad enlazadora se compone de una unidad de ensamblaje liberable capaz de liberar una porción farmacológica biológicamente activa del LDC en un sitio objetivo (por ejemplo, mediante escisión intracelular). En algunos casos, la porción farmacológica que se libera es el fármaco original que se había incorporado a la unidad de fármaco y, por tanto, no permanece unido a la unidad de PEG o un producto de degradación de la unidad de ligando. En otros casos, la porción farmacológica biológicamente activa que se libera es el fármaco original que retiene parte de la unidad enlazadora (distinta de la unidad de PEG).
El componente de la unidad enlazadora que tiene el mecanismo de liberación, que se denomina unidad de ensamblaje liberable, se interpone entre Lp y la unidad de fármaco. Al igual que con la unidad de PEG, la unidad de fármaco tiene un extremo que está conectado (aunque indirectamente a través de una unidad de ensamblaje liberable) a la unidad conectora en paralelo y uno o más terminales libres sin uniones (o en el caso de algunos fármacos cíclicos, sin terminales libres). Una representación gráfica ilustrativa de un LDC que tiene una unidad de PEG que está en una orientación paralela (es decir, ramificada) en relación con la unidad de fármaco es la siguiente:
"
Ligando------- Enlazador------Fármaco
La frase "orientación en serie" o "ubicación en serie" o "conexión en serie" se refiere a una configuración de un componente en un LDC en donde el componente orientado en serie está unido de tal manera que tiene dos extremos unidos, con cada extremo conectado a un componente diferente del LDC. Un LDC que tiene una unidad de PEG que está en una orientación en serie en relación con la unidad de ligando y la unidad de fármaco del LDC se refiere a un LDC que comprende una unidad de PEG que está unida al ligando en un extremo (por lo general de manera indirecta a través de componentes de una unidad enlazadora) y a la unidad de fármaco en otro terminal (por lo general de manera indirecta a través de otros componentes de una unidad enlazadora). La disposición en serie de la unidad de PEG aumenta el número de átomos entre la unidad de ligando y la unidad de fármaco, ya que al menos algunos de los átomos de la unidad de PEG se interponen entre la unidad de fármaco y la unidad de ligando. Por ejemplo, una o más subunidades (OCH2CH2), que caracterizan una unidad de PEG, se interponen entre la unidad de fármaco y la unidad de ligando. Una representación gráfica ilustrativa de un conjugado ligando-fármaco que tiene una unidad de PEG que está en una orientación en serie en relación con la unidad de ligando y la unidad de fármaco es la siguiente:
Ligando-Z1-(OCH2CH2)n-Z2-Fármaco,
en donde Z1 y Z2 son componentes de extensión opcionales de una unidad enlazadora.
El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos que muestran la actividad biológica deseada siempre que el fragmento de anticuerpo tenga el número necesario de sitios de unión para un enlazador-fármaco. La forma nativa de un anticuerpo es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de la cadena ligera y pesada (VL y VH) juntas son responsables principalmente de la unión a un antígeno. Los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada consisten en una región marco interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones constantes pueden ser reconocidas e interactuar con el sistema inmunitario. (ver, por ejemplo, Janeway y otros, 2001, Immuno. Biology, 5ta Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. El anticuerpo puede derivarse de cualquier especie adecuada. En algunos aspectos, el anticuerpo es de origen humano o murino. Un anticuerpo puede ser, por ejemplo, humano, humanizado o quimérico.
El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por algún método en particular.
Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende una región variable de unión al antígeno, así como un dominio constante de cadena ligera (Cl) y dominios constantes de cadena pesada, Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4, según sea apropiado para la clase de anticuerpos. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o una variante de la secuencia de aminoácidos de estos.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, que comprende la región variable o de unión al antígeno de este. Para que sea útil en la presente invención, el fragmento de anticuerpo debe tener el número requerido de sitios para la unión a un enlazador-fármaco. Los sitios de unión pueden ser de origen natural o no natural.
Un "antígeno" es una entidad a la que se une específicamente un anticuerpo.
Los términos "unión específica" y "que se une específicamente" significan que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se unirá, de una manera muy selectiva, con su correspondiente antígeno objetivo y no con una multitud de otros antígenos. Típicamente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 1x10-7 M, y preferentemente 10-8 M a 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M o 10-12 M y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado.
El término "inhibir" o "inhibición de" significa reducir en una cantidad medible o prevenir por completo.
El término "cantidad con eficacia terapéutica" se refiere a una cantidad de un conjugado que es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad con eficacia terapéutica del conjugado puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, desacelerar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, desacelerar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar, hasta cierto punto, uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco pueda inhibir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
A menos que el contexto indique lo contrario, el término "sustancial" o "sustancialmente" se refiere a una mayoría, es decir >50 % de una población, de una mezcla o una muestra, preferentemente más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de una población.
Los términos "escindido intracelularmente" y "escisión intracelular" se refieren a un proceso o reacción metabólica dentro de una célula en un conjugado ligando-fármaco (por ejemplo, un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) o similar), mediante la cual la unión covalente, entre la porción del fármaco (D) y la unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo (Ac)) se rompe, por ejemplo, por la acción de una unidad de ensamblaje liberable, lo que da como resultado que el fármaco libre se disocie del LDC, incluidos sus productos de degradación, dentro de la célula. Las porciones que resultan de esa disociación son, por tanto, metabolitos intracelulares.
El término "actividad citotóxica" se refiere a un efecto de destrucción celular de un fármaco o conjugado ligandofármaco o un metabolito intracelular de un conjugado ligando-fármaco. La actividad citotóxica puede expresarse por un valor de IC50, que es la concentración (molar o en masa) por unidad de volumen a la que la mitad de las células sobreviven a la exposición a un agente citotóxico.
El término "actividad citostática" se refiere a un efecto antiproliferativo distinto de la destrucción celular, de un agente citostático, o un conjugado ligando-fármaco que tiene un agente citostático como unidad de fármaco o un metabolito intracelular de este en donde el metabolito es un agente citostático.
El término "agente citotóxico" como se usa en este documento se refiere a una sustancia que tiene actividad citotóxica y causa la destrucción de las células. El término está destinado a incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos análogos sintéticos y derivados de estos.
El término "agente citostático", como se usa en este documento, se refiere a una sustancia que tiene actividad citostática, por ejemplo, inhibe una función de las células responsables del crecimiento o la multiplicación celular o que contribuye a estos. Los agentes citostáticos incluyen inhibidores tales como inhibidores de proteínas, por ejemplo, inhibidores de enzimas.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición o trastorno fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende una o más células cancerosas.
Una "enfermedad autoinmunitaria" en este documento es una enfermedad o trastorno que surge de y está dirigido contra los propios tejidos o proteínas de un individuo.
"Paciente", como se usa en este documento, se refiere a un sujeto al que se administra un LDC. Los ejemplos de un "paciente" incluyen, pero no se limitan a, un ser humano, una rata, un ratón, una cobaya, un primate no humano, un cerdo, una cabra, una vaca, un caballo, un perro, un gato, un pájaro y un ave. Generalmente, un paciente es una rata, un ratón, un perro, un primate no humano o un ser humano. En algunos aspectos, el paciente es un ser humano que necesita una cantidad eficaz de un LDC.
Los términos "tratar" o "tratamiento", a menos que el contexto indique lo contrario, se refieren a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas para evitar recaídas, en donde el objetivo es inhibir o desacelerar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, como por ejemplo el desarrollo o la propagación del cáncer. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, un estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeora), retraso o desaceleración de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o completa), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen la afección o trastorno, así como los propensos a tener la afección o trastorno.
En el contexto del cáncer, el término "tratar" incluye cualquiera o todos los siguientes: inhibir el crecimiento de células tumorales, células cancerosas o de un tumor; inhibir la replicación de células tumorales o células cancerosas, disminuir la carga tumoral general o disminuir el número de células cancerosas, y mejorar uno o más síntomas asociados con la enfermedad.
En el contexto de una enfermedad autoinmunitaria, el término "tratar" incluye cualquiera o todos los siguientes: inhibir la replicación de células asociadas con un estado de enfermedad autoinmunitaria que incluye, pero no se limita a, células que producen un anticuerpo autoinmunitario, disminuir la carga de anticuerpos autoinmunitarios y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad autoinmunitaria.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto (por ejemplo, un fármaco, enlazador-fármaco o un conjugado ligando-fármaco). El compuesto puede contener al menos un grupo amino y, por consiguiente, se pueden formar sales de adición de ácido con el grupo amino. Las sales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, sales de sulfato, trifluoroacetato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula, como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier porción orgánica o inorgánica que estabilice la carga en el compuesto original. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su
estructura. Los ejemplos donde múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
A menos que se indique lo contrario, el término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro término se refiere a un hidrocarburo sustituido o no sustituido de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado que tiene el número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, "-alquilo C1-C8" o "-alquilo C1-C10" se refieren a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 o de 1 a 10 átomos de carbono, respectivamente). Cuando no se indica el número de átomos de carbono, el grupo alquilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los grupos "alquilo C1-C8" de cadena lineal representativos incluyen, pero no se limitan a, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n- heptilo y -noctilo; mientras que -alquilos C1-C8 ramificados incluyen, pero no se limitan a, isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo, -isopentilo, y -2-metilbutilo; alquilos C2-C8 insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, alilo, -1-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, -1-hexilo, 2-hexilo, -3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1 -butinilo, -2-butinilo, -1 -pentinilo, -2-pentinilo y -3-metil-1 butinilo. En algunos aspectos, un grupo alquilo no está sustituido. Un grupo alquilo puede estar sustituido con uno o más grupos. En otros aspectos, un grupo alquilo estará saturado.
A menos que se indique lo contrario, "alquileno", en sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada o cíclico, saturado o insaturado, sustituido o no sustituido, del número indicado de átomos de carbono, típicamente de 1 a 10 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Los radicales alquileno típicos incluyen, pero no se limitan a: metileno (-CH2-), 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) y similares. En aspectos preferidos, un alquileno es un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada (es decir, no es un hidrocarburo cíclico). En cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento, el alquileno puede ser un alquileno saturado.
A menos que se indique lo contrario, "arilo", por sí mismo o como parte de otro término, significa un radical hidrocarburo aromático carbocíclico monovalente sustituido o no sustituido de 6-20 átomos de carbono (preferentemente 6-14 átomos de carbono) derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático original. Algunos grupos arilo están representados en las estructuras ilustrativas como "Ar". Los grupos arilo típicos incluyen, pero no se limitan a, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares. Un grupo arilo ilustrativo es un grupo fenilo.
A menos que se indique lo contrario, un "arileno", por sí mismo o como parte de otro término, es un grupo arilo como se definió anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se reemplaza con un enlace (es decir, es divalente) y puede estar en las orientaciones orto, meta o para, como se muestra en las siguientes estructuras, con fenilo como grupo ilustrativo:
En modalidades seleccionadas, por ejemplo, cuando una unidad conectora en paralelo, una unidad de ramificación o una unidad de unión al fármaco comprenden un arileno, el arileno es un grupo arilo definido anteriormente en donde uno o dos de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se reemplazan con un enlace (es decir, el arileno puede ser divalente o trivalente).
A menos que se indique lo contrario, un "heterociclo C3- por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un sistema de anillo monocíclico o bicíclico, aromático o no aromático, monovalente, sustituido o no sustituido, que tiene de 3 a 8 átomos de carbono (también denominado como miembros del anillo) y de uno a cuatro heteroátomos como miembros del anillo seleccionados independientemente de N, O, P o S, y derivados mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo del anillo de un sistema de anillo original. Uno o más átomos de N, Co S en el heterociclo se pueden oxidar. El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos que se indique lo contrario, el heterociclo se une a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable. Los ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, azetidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, pirrolilo, tiofenilo (tiofeno), furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, pirimidinilo, piridinilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo e isoxazolilo.
A menos que se indique lo contrario, "heterociclo C3-C8”, por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo se reemplaza con un enlace (es decir, es divalente). En modalidades seleccionadas, por ejemplo, cuando una unidad conectora en paralelo, una unidad de ramificación o una unidad de unión al fármaco comprende un heterociclo, el
heterociclo es un grupo heterociclo definido anteriormente en donde uno o dos de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo se reemplazan con un enlace (es decir, el heterociclo puede ser divalente o trivalente).
A menos que se indique lo contrario, un "carbociclo C3-C8”, por sí mismo o como parte de otro término, es un anillo carbocíclico, monocíclico o bicíclico, no aromático, saturado o insaturado, sustituido o no sustituido, monovalente, de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros, derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo del anillo de un sistema de anillo original. Los -carbociclos C3-C8 representativos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentadienilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 1,3-ciclohexadienilo, 1,4-ciclohexadienilo, cicloheptilo, 1,3-cicloheptadienilo, 1,3,5-cicloheptatrienilo, ciclooctilo y ciclooctadienilo.
A menos que se indique lo contrario, un "carbociclo C3-C8”, por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 definido anteriormente en donde otro de los átomos de hidrógeno de los grupos carbociclo se reemplaza con un enlace (es decir, es divalente). En modalidades seleccionadas, por ejemplo, cuando una unidad conectora en paralelo, una unidad de ramificación o una unidad de unión al fármaco comprende un carbociclo, el carbociclo es un grupo carbociclo definido anteriormente en donde uno o dos de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo se reemplazan con un enlace (es decir, el carbociclo puede ser divalente o trivalente).
A menos que se indique lo contrario, el término "heteroalquilo", por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, un hidrocarburo estable de cadena lineal o ramificada, o combinaciones de estos, completamente saturado o que contiene de 1 a 3 grados de insaturación, que consiste del número indicado de átomos de carbono y de uno a diez, preferentemente de uno a tres, heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede opcionalmente ser cuaternizado. El (Los) heteroátomo(s) O, N y S pueden ubicarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo se une al resto de la molécula. El heteroátomo Si se puede ubicar en cualquier posición del grupo heteroalquilo, incluida la posición en la que el grupo alquilo se une al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-O-CH3 y -CH=CH-N(CH3)-CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. En modalidades preferidas, un heteroalquilo o heteroalquileno C1 a C4 tiene de 1 a 4 átomos de carbono y 1 o 2 heteroátomos y un heteroalquilo o heteroalquileno C1 a C3 tiene 1 a 3 átomos de carbono y 1 o 2 heteroátomos. En algunos aspectos, un heteroalquilo o heteroalquileno está saturado.
A menos que se indique lo contrario, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un grupo divalente derivado de heteroalquilo (como se analizó anteriormente), como se ejemplifica por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena. Además, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, no se implica ninguna orientación del grupo enlazador. En modalidades seleccionadas, por ejemplo, cuando una unidad conectora en paralelo, una unidad de ramificación o una unidad de unión al fármaco comprende un heteroalquileno, el heteroalquileno es un grupo heteroalquilo definido anteriormente en donde uno o dos de los átomos de hidrógeno del grupo heteroalquilo se reemplazan con un enlace (es decir, el heteroalquileno puede ser divalente o trivalente).
"Alquilo sustituido" y "arilo sustituido" significan alquilo y arilo, respectivamente, en los que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan cada uno independientemente con un sustituyente. Los sustituyentes típicos incluyen, pero sin limitación, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO-3, -PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, C(=O)SR, C(=S)SR, c (=O)NR2, C(=S)NR2 o C(=NR)NR2, donde cada X es independientemente un halógeno: -F, -Cl, -Br o -I; y cada R es independientemente -H, -alquilo -C1-C20, arilo -C6-C20, heterociclo -C3-C14, un grupo protector o una porción de profármaco. Los sustituyentes típicos incluyen, además, (=O). Los grupos alquileno, carbociclo, carbociclilo, arileno, heteroalquilo, heteroalquileno, heterociclo y heterociclilo como se describieron anteriormente también pueden estar sustituidos de manera similar.
Como se usa en el presente documento, el término "fármaco libre" se refiere a una porción farmacológica biológicamente activa que no está unida covalentemente ni directa ni indirectamente a una unidad de PEG ni a un producto de degradación de una unidad de ligando. Un fármaco libre puede referirse al fármaco, de la forma en que existe inmediatamente después de la escisión de la unidad enlazadora a través del mecanismo de liberación, proporcionado por la unidad de ensamblaje liberable en el LDC, o para la conversión o metabolismo intracelular posterior. En algunos aspectos, el fármaco libre tendrá la forma H-D o puede existir como una porción cargada. El fármaco libre es una especie farmacológicamente activa que puede ejercer el efecto biológico deseado. En algunos aspectos, la especie farmacológicamente activa puede no ser el fármaco original y puede incluir un componente de la unidad enlazadora, que no ha sufrido un metabolismo intracelular posterior.
Compuestos de conjugados ligando-fármaco e intermediarios relacionados
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los conjugados ligando-fármaco (LDC) que tienen propiedades PK desfavorables pueden mejorar sus propiedades PK mediante la disposición de una unidad de PEG en una orientación paralela con respecto a su unidad de fármaco como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el perfil de eliminación de los conjugados PEGilados es similar al del ligando no conjugado (es decir, el agente de direccionamiento, como un anticuerpo o un fragmento relacionado de unión al antígeno) incluso con una carga de fármaco elevada. Los LDC comprenden una unidad de ligando (es decir, un ligando de direccionamiento), una unidad enlazadora y una unidad de fármaco. Una unidad enlazadora antes o después de su unión a un ligando de direccionamiento conecta la unidad de fármaco a una unidad de ligando y comprende una unidad de PEG en configuración paralela con respecto a la unidad de fármaco. Esa configuración paralela resulta de la unión de la unidad de fármaco, a través de una unidad de ensamblaje liberable, y la unidad de PEG a una unidad conectora en paralelo. Una unidad enlazadora cuando está conectada a una unidad de fármaco puede denominarse enlazador-fármaco. Una población de LDC tendrá preferentemente una carga promedio de enlazador-fármaco de al menos aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8 enlazadores-fármacos por unidad de ligando.
Las unidades de PEG están diseñadas para impartir un nivel optimizado de enmascaramiento de la hidrofobicidad de los componentes hidrofóbicos del enlazador-fármaco. Por esa razón, la incorporación de la unidad de PEG como se enseña en el presente documento es particularmente adecuada para enlazadores-fármacos que de otro modo tendrían suficiente hidrofobicidad para afectar negativamente la farmacocinética del conjugado resultante en comparación con el ligando no conjugado. Las farmacocinéticas más deficientes incluyen una mayor eliminación plasmática. Por tanto, los conjugados ligando-fármaco que muestran una eliminación plasmática significativamente mayor y una exposición plasmática correspondientemente menor en relación con el ligando no conjugado se beneficiarán de la presente invención.
Los conjugados ligando-fármaco tienen propiedades farmacocinéticas más favorables debido a la orientación paralela dentro de una porción de enlazador-fármaco hidrófoba de una unidad de fármaco y una unidad de PEG, por lo que el efecto negativo de la hidrofobicidad de la unidad de fármaco y/u otros componentes de la porción de enlazador-fármaco sobre la eliminación plasmática se reduce o se elimina (es decir, se enmascara la hidrofobicidad de una porción de enlazador-fármaco). La orientación paralela se logra mediante la unidad conectora en paralelo (LP) ya que la unidad conectora en paralelo actúa para conectar una unidad de fármaco, una unidad de PEG y un Ligando en la configuración de ramificación apropiada para proporcionar la orientación paralela requerida. La unidad conectora en paralelo puede considerarse un soporte que tiene sitios de unión para los componentes de los conjugados, que se pueden multiplexar para tener múltiples unidades de fármaco en orientación paralela con las unidades de PEG para proporcionar un soporte multiplexado PEGilado. En algunas modalidades, el componente hidrófobo en una porción de enlazador-fármaco cuya hidrofobicidad está enmascarada por la unidad de PEG orientada en paralelo es una unidad de fármaco hidrófoba.
La unidad de fármaco se une a la unidad conectora en paralelo a través de una unidad de ensamblaje liberable. La unidad de ensamblaje liberable permite la liberación eficiente del fármaco en la célula objetivo, suficiente para inducir, por ejemplo, citotoxicidad o efecto citostático. Por lo general, la unidad de ensamblaje liberable se diseña para una liberación eficiente del fármaco libre una vez que el conjugado se internaliza en la célula objetivo, pero también puede diseñarse para liberar el fármaco libre en la vecindad de las células objetivo. Los sitios de reconocimiento adecuados para la escisión son aquellos que permiten la liberación eficaz de la(s) unidad(es) de fármaco de un LDC. El sitio de reconocimiento es un sitio de escisión peptídico (como en unidades de ensamblaje liberables basadas en péptido), un sitio de escisión de azúcar (como en unidades de ensamblaje liberables basadas en azúcar) o un sitio de escisión disulfuro (como en unidades de ensamblaje liberables basadas en disulfuro). Los ejemplos de sitios de escisión peptídicos incluyen los reconocidos por proteasas intracelulares, tales como las presentes en los lisosomas. Los ejemplos de sitios de escisión de azúcar incluyen los reconocidos por glicosidasas, incluidas las glucuronidasas, como la beta-glucuronidasa.
En la presente invención, un compuesto bioactivo citotóxico, citostático o inmunosupresor (fármaco) se usa como unidad de fármaco. Un compuesto bioactivo puede tener un sitio adecuado para su incorporación como una unidad de fármaco en un LDC o puede modificarse para ese propósito a la vez que retiene sustancialmente la actividad biológica deseada del fármaco original cuando el fármaco modificado, que puede o no retener parte de la unidad enlazadora, se libera del LDC. Las unidades de fármaco preferidas proporcionan la liberación del compuesto bioactivo original. La unidad de fármaco puede ser un fármaco del tipo auristatina o diferente de auristatina, que es el componente hidrófobo de una porción de enlazador-fármaco cuya hidrofobicidad debe ser enmascarada por la unidad de fármaco orientada en paralelo. Los efectos de la presente invención serán más pronunciados en modalidades en donde la combinación de la unidad de fármaco, la unidad de ensamblaje liberable o la unidad de fármaco/unidad de ensamblaje liberable son de naturaleza hidrófoba, lo que repercute negativamente en la farmacocinética del conjugado resultante. Los ejemplos de fármacos hidrófobos incluyen monometil auristatina E y fármacos que tienen una hidrofobicidad comparable o superior a la monometil auristatina E. Ejemplos de unidades de ensamblaje liberables hidrófobas incluyen las unidades de ensamblaje liberables basadas en péptidos y basadas en azúcar que tienen un componente autoinmolativo hidrófobo ejemplificado específicamente en este documento, así como las unidades de ensamblaje liberables que tienen una hidrofobicidad comparable o mayor que dichas Unidades de ensamblaje liberables.
La hidrofobicidad se puede medir mediante el uso de SlogP. SlogP se define como el logaritmo del coeficiente de reparto octanol/agua (incluidos los hidrógenos implícitos) y se puede calcular mediante el uso del programa MOE™ del grupo de Computación Química (los valores SlogP se calculan con el uso de Wildman, S.A., Crippen, G.M.; Prediction of Physiochemical Parameters by Atomic Contributions; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 39 núm. 5 (1999) 868 873). Cuando se hace referencia a una unidad de fármaco o una unidad de ensamblaje liberable que tiene una hidrofobicidad comparable a una unidad de fármaco de referencia o unidad de ensamblaje liberable, el valor SlogP estará dentro del 20 %, preferentemente dentro del 10 %, del valor de SlogP de la unidad de fármaco de referencia o unidad de ensamblaje liberable.
En vista de lo anterior, la presente invención proporciona en un grupo de modalidades, una composición de conjugados ligando-fármaco que comprende una población de conjugados ligando-fármaco. Los conjugados ligandofármaco comprenden una unidad de ligando y múltiples unidades enlazador-fármaco unidas a esta. Preferentemente, hay un promedio de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, aproximadamente 6 a aproximadamente 12, aproximadamente 6 a aproximadamente 10, aproximadamente 8 a aproximadamente 14, aproximadamente 8 a aproximadamente 12, aproximadamente 8 a aproximadamente 10 unidades de enlazador-fármaco por ligando en la composición. Una unión ilustrativa al ligando es mediante enlaces tioéter. Ejemplos de sitios de conjugación en un ligando son los grupos tiol obtenidos a partir de la reducción de residuos disulfuro intercatenarios y/o residuos que contienen tiol introducidos en el ligando tales como cisteínas introducidas. La unión puede ser, por ejemplo, a través de residuos de tiol derivados de un disulfuro intercatenario y de 0 a 8 residuos de cisteína introducidos.
Los conjugados ligando-fármaco de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de cáncer o enfermedad autoinmunitaria.
Modalidades
A continuación, se describen varias modalidades de la invención, seguidas de un análisis más detallado de los componentes que forman los conjugados ligando-fármaco y sus intermediarios. Cualquiera de las modalidades seleccionadas para los componentes de los conjugados ligando-fármaco e intermediarios de estos puede aplicarse a todos y cada uno de los aspectos de la invención como se describe en este documento o pueden referirse a un solo aspecto. Las modalidades seleccionadas se pueden combinar juntas en cualquier combinación.
Compuestos de conjugados ligando-fármaco
En un grupo de modalidades, en la presente descripción se proporcionan compuestos LDC capaces de liberar el fármaco libre en donde el compuesto LDC se representa por la Fórmula AA a continuación:
enlazador-fármaco (a a )
o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde,
L es una unidad de ligando;
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z es una unidad de extensión;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo;
A es una unidad de ramificación opcional;
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 14 o de 8 a aproximadamente 12);
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; y preferentemente es 1 o 2; y
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es 2, 3 o 4.
En otro grupo de modalidades, la Fórmula AA no representa compuestos LDC individuales sino una composición de LDC (es decir, una composición que comprende una población de compuestos LDC individuales). En tales
modalidades, p representa el número promedio de enlazadores-fármacos por ligando en la composición. En tales modalidades, p no es típicamente un valor entero y puede variar de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12). Las otras variables (por ejemplo, L, Z, A, LP, PEG, X, D, s y m) permanecen iguales.
En otro grupo de modalidades, una composición de LDC comprende una población de compuestos LDC, los compuestos LDC individuales representados por la Fórmula AA donde para cada compuesto LDC individual, p se selecciona independientemente de un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 14 o de 8 a aproximadamente 12) y el número promedio de enlazadores-fármacos por ligando en la composición es de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12).
En algunos aspectos, de 1 a 32, o de 2 a 32 (preferentemente de 6 a 32 o de 8 a 32) Unidades de fármaco se unen a cada unidad de ligando. Una población de conjugados ligando-fármaco puede tener un promedio de 1 a 32 o de aproximadamente 2 a 32 (preferentemente de aproximadamente 6 a 32 o de aproximadamente 8 a 32) unidades de fármaco por ligando.
Las modalidades seleccionadas de compuestos LDC o composiciones de LDC representadas por la Fórmula AA incluyen aquellas en donde:
1) m es 1 y s es 0;
2) m es de 2 a 4 y s es 1;
3) m es 2 y s es 1;
4) m es 1; s es 0; y p es un número entero que varía de 6 a 14, de 8 a 14, o de 8 a 12 para un compuesto LDC, o p es un número que varía de 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 para una composición de LDC;
5 ) m es 2-4; s es 1; y p es un número entero que varía de 6 a 14, de 8 a 14, o de 8 a 12 para un compuesto LDC, o p es un número que varía de 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 de una composición de LDC;
6) m es 2; s es 1; y p es un número entero que varía de 6 a 14, de 8 a 14, o de 8 a 12 para un compuesto LDC o; p es un número que varía de 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 para una composición de LDC;
7 ) m es 2; s es 1; y p es 8
8) m es 1; s es 0; y p es 8
9) Cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde existen de 1 a 32 o de aproximadamente 2 a 32 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 32 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 32) Unidades de fármaco unidas a la unidad de ligando.
10) Cualquiera de las modalidades expuestas en 1-9 de este párrafo en donde LP es un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina naturales o no naturales.
Las modalidades seleccionadas de compuestos LDC o composiciones de LDC que están representadas por la Fórmula AA tienen las fórmulas AA1 y AA2 a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde,
L es una unidad de ligando;
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z es una unidad de extensión;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo;
A es una unidad de ramificación que está presente; y
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, y preferentemente varía de 2 a 12 (preferentemente 6 a 14, 6 a 12, 8 a 14 o de 8 a 12) para un compuesto de conjugado ligando-fármaco, o p es un número que varía de 1 a aproximadamente 14, y preferentemente varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12) para una composición de conjugado ligando-fármaco.
En cualquiera de las modalidades seleccionadas para los compuestos LDC proporcionados en este documento donde está presente un valor de p, incluidos los anteriores, p puede ser un número entero que varía de 1 a 14, de 2 a 14, de 2 a 10, de 4 a 12, de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 12 o de 8 a 10. El subíndice p puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14.
En cualquiera de las modalidades seleccionadas para las composiciones de LDC proporcionadas en el presente documento, donde está presente un valor de p, incluidos los anteriores, p varía de 1 a aproximadamente 14, de aproximadamente 2 a aproximadamente 14, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 10. El subíndice p puede ser 1 o aproximadamente 1, o 2 o aproximadamente 2 o 3 o aproximadamente 3 o 4, o aproximadamente 4 o 5, o aproximadamente 5 o 6, o aproximadamente 6 o 7, o aproximadamente 7 u 8, o aproximadamente 8 o 9, o aproximadamente 9 o 10, o aproximadamente 10 u 11, o aproximadamente 11 o 12, o aproximadamente 12 o 13, o aproximadamente 13 o 14 o aproximadamente 14.
En otro grupo de modalidades, en la presente descripción se proporcionan conjugados ligando-fármaco (LDC) capaces de liberar fármaco libre, en donde de una a treinta y dos unidades de fármaco (preferentemente de 2 a 32 unidades de fármaco, de 6 a 32 unidades de fármaco, de 8 a 32 unidades de fármaco, de 6 a 14 unidades de fármaco, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 unidades de fármaco, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 unidades de fármaco) se conjugan con el ligando de direccionamiento de un LDC a través de unidades enlazadoras en donde cada unidad de fármaco de una porción de enlazador-fármaco está unida a su unidad enlazadora a través de un componente escindible (es decir, la unidad de ensamblaje liberable) que libera el fármaco libre en las proximidades de un sitio objetivo del ligando (L), y en donde los LDC comprenden además una unidad conectora en paralelo (Lp) a la que la unidad de ligando está conectada, y una unidad de polietilenglicol (PEG), en donde las unidades de fármaco y de PEG de una porción de enlazador-fármaco están conectadas en orientación paralela entre sí. La unidad de polietilenglicol tiene de 4 a 72 (preferentemente de 6 a 72 unidades repetidas -OCH2CH2-, con mayor preferencia de 6 a 36, o de 8 a 24) unidades repetidas. El ligando puede ser una unidad de anticuerpo, preferentemente una unidad de anticuerpo intacto. El enlazador escindible puede comprender, por ejemplo, un sitio de escisión peptídico, un sitio de escisión de azúcar o un sitio de escisión disulfuro. El fármaco puede ser una auristatina o puede ser distinto de auristatina. La auristatina o no auristatina puede tener una hidrofobicidad comparable o mayor que la monometil auristatina E. La auristatina puede ser monometil auristatina E. En algunos aspectos, el ADC exhibe mejores propiedades farmacocinéticas en comparación con el mismo o sustancialmente el mismo ADC que carece de la unidad de PEG o que contiene la unidad de PEG, pero ubicada en una orientación en serie en relación con el anticuerpo y el fármaco. En algunos aspectos, el ADC exhibe propiedades farmacocinéticas similares o sustancialmente similares que el componente de anticuerpo cuando no está conjugado.
Compuestos enlazador-fármaco
En algunos aspectos, al diseñar los conjugados ligando-fármaco, será conveniente sintetizar el enlazador-fármaco completo antes de la conjugación a la unidad de ligando. En tales modalidades, los compuestos enlazador-fármaco actúan como compuestos intermediarios. Se proporcionan ejemplos de compuestos enlazador-fármaco a continuación, cuya estructura se representa por la fórmula BB:
o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo;
A es una unidad de ramificación opcional;
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; y preferentemente es 1 o 2;
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es de 2 a 4.
Las modalidades seleccionadas de la Fórmula BB incluyen aquellas en las que:
1) m es 1 y s es 0;
2) m es 2, 3 o 4 y s es 1;
3) m es 2 y s es 1;
4) Cualquiera de las modalidades expuestas en 1-3 de este párrafo en donde LP es un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina naturales o no naturales.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas BB incluyen las siguientes fórmulas:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas, en donde
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo; y
A es una unidad de ramificación que está presente.
Compuestos enlazadores intermediarios
En algunos aspectos, al diseñar los conjugados ligando-fármaco, puede ser conveniente conjugar componentes del enlazador a la unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo) antes de unir el componente -X-D del conjugado ligando-fármaco. Por ejemplo, en modalidades en donde se usa un sustituyente que contiene tiol, por ejemplo, cisteína, para unir el componente -X-D, puede ser conveniente conjugar componentes del enlazador a la unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo) antes de unir el componente -X-D del conjugado ligando-fármaco. La unidad conectora en paralelo se puede proteger mediante grupos protectores para facilitar la síntesis. El grupo protector se puede eliminar justo antes de la unión a la unidad de ensamblaje liberable.
Se proporcionan ejemplos de compuestos enlazadores intermediarios como sigue que tienen la fórmula CC:
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
A es una unidad de ramificación opcional;
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente a una unidad de liberación de fármaco;
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; y preferentemente es 1 o 2; y
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es 2, 3 o 4.
Las modalidades seleccionadas de la Fórmula CC incluyen las siguientes fórmulas.
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas en donde
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
-X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco;
A es una unidad de ramificación; y
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente a -X-D.
Los compuestos de fórmula CC, CC1 o CC2 no están dentro del alcance de la presente invención.
En algunos aspectos, los compuestos enlazadores intermediarios se conjugarán con la unidad de ligando para formar compuestos ligando-enlazador intermediarios. Las modalidades ilustrativas de compuestos ligando-enlazador intermediarios se representan por la estructura que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable de esta en donde
L es una unidad de ligando;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z es una unidad de extensión;
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente con -X-D;
A es una unidad de ramificación opcional;
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, 6 a 12, 8 a 14 u 8 a 12);
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; preferentemente 1 o 2; y
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es 2, 3 o 4.
En otro grupo de modalidades, la Fórmula DD no representa compuestos ligando-enlazador intermediarios individuales sino una composición que comprende una población de compuestos ligando-enlazador intermediarios individuales. En tales modalidades, p representa el número promedio de enlazadores intermediarios por ligando en la composición. En tales modalidades, p no es típicamente un valor entero y puede variar de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12). Las otras variables (por ejemplo, L, Z, A, LP, PEG, s y m) permanecen iguales.
Las modalidades seleccionadas de la Fórmula DD incluyen las siguientes fórmulas.
0 una sal farmacéuticamente aceptable de estas en donde
L es una unidad de ligando;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z- es una unidad de extensión;
-X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco;
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente con -X-D;
A es una unidad de ramificación; y
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, 6 a 12, 8 a 14 u 8 a 12) para un compuesto ligando-enlazador intermediario, o el subíndice p es un número que varía de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12) para una composición de ligando-enlazador intermediario.
Las composiciones de fórmulas DD, DD1 o DD2 no están dentro del alcance de la presente invención.
Modalidades adicionales
Los conjugados de fórmula AA y sus intermediarios permiten la inclusión de una unidad de fármaco por unidad de PEG, una proporción de 1:1. Sin embargo, puede ser conveniente proporcionar conjugados de fármacos que tengan 1 fármaco por unidad de PEG o 2 o más fármacos por unidad de PEG. Por consiguiente, la presente invención proporciona conjugados ligando-fármaco que tienen al menos un fármaco por unidad de PEG e intermediarios de este.
Un experto en la técnica apreciará que siempre que estén presentes los componentes principales de los conjugados ligando-fármaco (es decir, unidad de ligando, unidad de extensión, unidad conectora en paralelo, unidad de PEG, unidad de ensamblaje liberable y unidad de fármaco), la síntesis de conjugados ligando-fármaco que comprenden unidades de fármaco adicionales puede lograrse fácilmente mediante el uso de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. La inclusión de unidades de ramificación y/o unidades de unión al fármaco adicionales permite la unión de varios fármacos por unidad de PEG. Las unidades -X-D adicionales se unen a través de las unidades de ramificación o las unidades de unión a fármacos.
En un grupo de modalidades, tales compuestos LDC capaces de liberar fármaco libre, se representan por las fórmulas (i), (II) o (III):
o
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde,
L es una unidad de ligando;
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z es una unidad de extensión;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo;
A es una unidad de ramificación opcional;
AD es una unidad de unión al fármaco;
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, 6 a 12, 8 a 14 u 8 a 12)
el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8, y preferentemente es 0, 1, 2 o 3;
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; y preferentemente es 1 o 2; y
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es 2, 3 o 4.
En otro grupo de modalidades, las fórmulas I, II y III no representan compuestos LDC individuales sino una composición de LDC (es decir, una composición que comprende una población de compuestos LDC individuales). En tales modalidades, p representa el número promedio de enlazadores-fármacos por ligando en la composición. En tales modalidades, p no es típicamente un valor entero y puede variar de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12). Las otras variables (por ejemplo, L, Z, A, LP, PEG, X, D, AD, s, m y t) siguen siendo las mismas.
En otro grupo de modalidades, una composición de LDC comprende una población de compuestos LDC, los compuestos LDC individuales representados por la Fórmula I, II o II, donde para cada compuesto LDC individual, p se selecciona independientemente de un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 14 o de 8 a aproximadamente 12) y el número promedio de enlazadores-fármacos por ligando en la composición es de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12).
En algunos aspectos, de 1 a 32, o de 2 a 32 (preferentemente de 6 a 32 o de 8 a 32) Unidades de fármaco se unen a cada unidad de ligando. Una población de conjugados ligando-fármaco puede tener un promedio de 1 a 32 o de aproximadamente 2 a 32 (preferentemente de aproximadamente 6 a 32 o de aproximadamente 8 a 32) unidades de fármaco por ligando.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas I, II y III incluyen aquellas en las que:
1) m es 1 y s es 0;
2) m es 2, 3 o 4 y s es 1;
3) m es 2 y s es 1;
4) m es 1; s es 0; y p es un número entero que varía de 2 a 12, 4 a 12, 8 a 14, u 8 a 12 para un compuesto de conjugado ligando-fármaco o p es un número que varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 para una composición de conjugados ligando-fármaco;
5) m es 2, 3 o 4; s es 1; y p es un número entero que varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de
aproximadamente 8 a aproximadamente 12 para un compuesto de conjugado ligando-fármaco, o p es un número que varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 de la composición de conjugados ligando-fármaco;
6) m es 2; s es 1; y p es un número entero que varía de 2 a 12, de 4 a 12, de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 para un compuesto de conjugado ligando-fármaco, o p es un número que varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 para una composición de conjugados ligando-fármaco;
7) m es 2; s es 1; y p es 8;
8) m es 1; s es 0; y p es 8;
9) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 0;
10) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 1-8;
11 ) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 1;
12) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 2;
13) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 3;
14) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 4;
15) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 5;
16) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 6;
17) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 7;
18) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-8 de este párrafo en donde t es 8;
19) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-18 de este párrafo en donde existen de 1 a 32, o de aproximadamente 2 a 32 Unidades de fármaco unidas a la unidad de ligando;
20) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-18 de este párrafo en donde existen de 6 a 32 o de aproximadamente 8 a 32 Unidades de fármaco unidas a la unidad de ligando; y
21) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-20 de este párrafo en donde LP es un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina naturales o no naturales.
En cualquiera de las modalidades seleccionadas para los compuestos LDC proporcionados en este documento donde está presente un valor de p, incluidos los anteriores, p puede ser un número entero que varía de 1 a 14, de 2 a 14, de 2 a 10, de 4 a 12, de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 12 o de 8 a 10. El subíndice p puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13 o 14.
En cualquiera de las modalidades seleccionadas para las composiciones de LDC proporcionadas en el presente documento, donde está presente un valor de p, incluidos los anteriores, p varía de 1 a aproximadamente 14, de aproximadamente 2 a aproximadamente 14, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente
12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 10. El subíndice p puede ser 1 o aproximadamente 1, o 2 o aproximadamente 2 o 3 o aproximadamente 3 o 4, o aproximadamente 4 o
5, o aproximadamente 5 o 6, o aproximadamente 6 o 7, o aproximadamente 7 u 8, o aproximadamente 8 o 9, o aproximadamente 9 o 10, o aproximadamente 10 u 11, o aproximadamente 11 o 12, o aproximadamente 12 o 13, o aproximadamente 13 o 14 o aproximadamente 14. Las otras variables (por ejemplo, L, Z, A, LP, PEG, X, D, AD, s, m y t) siguen siendo las mismas.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas I, II y III incluyen las fórmulas Ia, Ib, IIa, IIb, IIb, IIIa y IIIb a continuación.
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas, en donde,
L es una unidad de ligando;
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z es una unidad de extensión;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo;
A es una unidad de ramificación opcional; y
AD es una unidad de unión al fármaco;
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 14 o de 8 a 12) para un compuesto de conjugado ligando-fármaco, o el subíndice p es un número que varía de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12) para una composición de conjugados ligando-fármaco; y
el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8; y preferentemente es 0, 1, 2 o 3.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas Ia, Ib, IIa, IIb, IIb, IIc, IIIa y IIIb incluyen aquellas en las que:
1) tes 0;
2 ) t es de 1 a 8;
3) t es 1;
4) t es 2;
5) t es 3;
6) t es 4;
7 ) t es 5;
8) t es 7;
9) t es 8;
10) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-10 de este párrafo en donde existen de 1 a 32, de aproximadamente 2 a 32, de 6 a 32 o de aproximadamente 8 a 32 Unidades de fármaco unidas a una unidad de ligando; y
11) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-11 de este párrafo en donde LP es un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina naturales o no naturales.
Las modalidades de las fórmulas Ia, Ib, IIa, IIb, IIb, IIc, IIIa y IIIb para una composición de LDC incluyen aquellas en las que p es un número que varía de 6 a aproximadamente 12; de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 y de aproximadamente 8 a aproximadamente 10. Para esas composiciones, el subíndice p puede ser 6 o aproximadamente 6 o 7, o aproximadamente 7 u 8, o aproximadamente 8 o 9, o aproximadamente 9 o 10, o aproximadamente 10 u 11, o aproximadamente 11 o 12, o aproximadamente 12 o 13 o aproximadamente 13 o 14, o aproximadamente 14. En cualquiera de estas modalidades, t puede ser de 0 a 8, de 1 a 8, o 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.
Las modalidades de las fórmulas Ia, Ib, IIa, IIb, IIb, IIc, IIIa y IIIb para un compuesto LDC incluyen aquellas en donde p es un número entero que varía de 6 a 12; 8 a 12 y 8 a 10. El subíndice p puede ser 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14. En cualquiera de estas modalidades, t puede ser de 0 a 8, de 1 a 8, o 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.
Compuestos enlazador-fármaco
Los compuestos enlazador-fármaco ilustrativos que tienen al menos 1 fármaco por unidad de PEG se proporcionan como sigue con las fórmulas IV, V, VI:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo;
A es una ramificación opcional;
AD es una unidad de unión al fármaco;
el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8; y preferentemente es 0, 1,2 o 3;
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; y preferentemente es 1 o 2;
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es 2, 3 o 4.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas IV, V y VI incluyen aquellas en las que:
1) m es 1 y s es 0;
2) m es de 2 a 4 y s es 1;
3) m es 2 y s es 1;
4) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-3 de este párrafo en donde t es 0
5 ) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-3 de este párrafo en donde t es 1
6) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-3 de este párrafo en donde t es 2; y
7 ) cualquiera de las modalidades expuestas en 1-6 de este párrafo en donde LP es un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina naturales o no naturales.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas IV, V y VI incluyen las siguientes fórmulas:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas, en donde
D es una unidad de fármaco;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
X es una unidad de ensamblaje liberable;
LP es una unidad conectora en paralelo;
A es una ramificación opcional;
AD es una unidad de unión al fármaco; y
el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8; y preferentemente es 0, 1,2 o 3.
Compuestos enlazadores intermediarios
Los ejemplos de compuestos enlazadores intermediarios que comprenden al menos un fármaco por unidad de PEG son los siguientes que tienen las fórmulas VII, VIII o IX:
PEG
Z'------- Lp A' (V il)
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos en donde
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
A' es una unidad de ramificación capaz de formar una unión covalente con dos a cuatro unidades X-D, preferentemente dos unidades X-D;
A es una unidad de ramificación opcional;
AD’ es una unidad de unión a fármacos capaz de formar una unión covalente con una unidad -X-D;
LP es una unidad conectora en paralelo;
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente con -X-D;
el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8, y preferentemente es 0, 1,2 o 3;
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; y preferentemente es 1 o 2;
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es 2, 3 o 4; y en donde -X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas VIII o IX incluyen las siguientes:
Z'-LP'-PEG VIIIa
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas en donde
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z' es una unidad de extensión capaz de formar una unión covalente con una unidad de ligando;
A es una unidad de ramificación;
AD’ es una unidad de unión a fármacos capaz de formar una unión covalente con una unidad -X-D;
LP es una unidad conectora en paralelo;
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente con -X-D; y el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8; y preferentemente es 0, 1, 2 o 3; y en donde -X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco.
Los compuestos enlazadores intermediarios y las fórmulas VII, VIII, XI, Villa, VlIIb, VlIIc, VlIId, IXa y IXb, la unidad de extensión se puede conjugar con la unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo) para formar compuestos ligando-enlazador intermediarios que proporcionan de 1 a 14 enlazadores unidos a cada unidad de ligando. A continuación, se muestran modalidades ilustrativas en donde p es de 1 a 14 y todos los demás grupos variables son como se describen en el presente documento para los compuestos enlazadores intermediarios. Los ejemplos de compuestos ligando-enlazador y composiciones que comprenden estos compuestos (es decir, composiciones de ligandos-enlazadores) son los siguientes con estructuras representadas por las fórmulas X, XI, XII
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos en donde
L es una unidad de ligando;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z- es una unidad de extensión;
-X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco;
LP es una unidad conectora en paralelo;
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente con -X-D;
A es una unidad de ramificación capaz de formar una unión covalente con dos a cuatro unidades X-D, preferentemente dos unidades X-D;
A es una unidad de ramificación opcional;
AD’ es una unidad de unión a fármacos capaz de formar una unión covalente con una unidad X-D;
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12) para un compuesto ligando-enlazador, o el subíndice p es un número que varía de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12) para una composición de ligando-enlazador;
el subíndice t es de 0 a 8; y preferentemente es 0, 1, 2 o 3;
el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4; y preferentemente es 1 o 2; y
el subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando s es 0, m es 1 y cuando s es 1, m es 2, 3 o 4.
Las modalidades seleccionadas de las fórmulas XI y XII incluyen las siguientes fórmulas.
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas en donde
L es una unidad de ligando;
PEG es una unidad de polietilenglicol;
Z- es una unidad de extensión;
LP es una unidad conectora en paralelo;
LP' es una unidad conectora en paralelo capaz de formar una unión covalente con -X-D;
A es una unidad de ramificación;
AD’ es una unidad de unión a fármacos capaz de formar una unión covalente con una unidad X-D;
el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12 (preferentemente de 6 a 14, de 6 a 12, de 8 a 14 o de 8 a 12) para un compuesto ligando-enlazador, o
el subíndice p es un número que varía de 1 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 (preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12) para una composición ligando-enlazador; y
el subíndice t es de 0 a 8; y
en donde -X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco.
Grupos de componentes
Para los conjugados ligando-fármaco y los compuestos intermediarios descritos en este documento es fundamental la ubicación de una unidad de PEG en orientación paralela con su unidad de fármaco para influir en la farmacocinética del LDC resultante. La ubicación de la unidad de PEG se realiza mediante la unidad conectora en paralelo. La unidad conectora en paralelo sirve para conectar un Ligando, a una unidad de polietilenglicol y una unidad de fármaco de modo que las unidades de fármaco y PEG estén en una configuración paralela, lo que organiza las unidades de fármaco, PEG y Ligando en una configuración ramificada. Por consiguiente, la unidad conectora en paralelo puede considerarse un soporte que tiene sitios de unión para los componentes de los conjugados ligando-fármaco y los compuestos intermediarios para su preparación.
Para actuar como un conector en paralelo, la unidad LP se une a través de tres sitios de unión dentro del enlazador. Uno de los sitios de unión conecta la unidad LP a la unidad de PEG. Un segundo sitio de unión conecta la unidad LP a la unidad de ensamblaje liberable (en algunos casos, a través de la unidad de ramificación A o la unidad de unión al fármaco AD). Un tercer sitio de unión conecta la unidad LP a la unidad de extensión (en algunos casos a través de la unidad de unión al fármaco, AD y/o la unidad de ramificación, A). La unidad conectora en paralelo es una unidad distinta de la unidad de PEG y se conecta a esta mediante el componente de la unidad de unión de PEG de la unidad de PEG. En otras palabras, la unidad conectora en paralelo no es una subunidad de la unidad de PEG.
Para los conjugados ligando-fármaco e intermediarios de estos que tienen más de un fármaco por unidad de PEG, la unión de la unidad conectora en paralelo a la unidad de ensamblaje liberable puede ser a través de una unidad de ramificación o una unidad de unión al fármaco. La unión de la unidad conectora en paralelo a la unidad de extensión se puede realizar mediante una unidad de unión al fármaco AD y/o, de manera opcional, una unidad de ramificación adicional. En todas estas modalidades, la unidad LP puede considerarse una porción química trifuncional que es capaz de unir covalentemente tres porciones químicas separadas. Como se apreciará, para compuestos intermediarios seleccionados, la unidad LP se representa por LP' y aún no está unida al fármaco a través de la unidad de liberación del fármaco, pero tiene un grupo funcional opcionalmente protegido para unirse al fármaco (por ejemplo, a través de la unidad de liberación del fármaco). Como también se apreciará, el término trifuncional se utiliza para indicar los tres sitios de unión y no el número de grupos funcionales presentes en la unidad LP o LP'.
Se puede preparar una unidad conectora en paralelo a partir de uno o más (típicamente de 1 a 5 o 1 a 4 o 1 a 3 o 1 o 2) aminoácidos, aminoalcoholes, aminoaldehídos o poliaminas naturales o no naturales.
Se apreciará que cuando se hace referencia a que el aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliaminas naturales o no naturales están presentes en el conjugado o los intermediarios de la presente invención (ya sea que formen parte de una unidad LP u otro componente de los conjugados o intermediarios descritos en el presente documento), el aminoácido, el aminoalcohol, el aminoaldehído o las poliaminas existirán en forma residual, también denominada en el presente documento como forma ensamblada. Por ejemplo, en las modalidades, en donde la unidad conectora en paralelo es de dos aminoácidos, los dos aminoácidos existirán como residuos con un enlace peptídico entre ellos. En las modalidades donde la unidad conectora en paralelo está compuesta por un aminoalcohol, el aminoalcohol existirá como un residuo donde, por ejemplo, su grupo amino está unido a otro residuo de la unidad conectora en paralelo u otro componente del conjugado a través de un grupo funcional que contiene un carbonilo de ese otro residuo/componente mientras que su grupo hidroxilo está unido como un éter a, o está unido a través de un grupo funcional que contiene carbonilo, de otro residuo más de la unidad conectora en paralelo u otro componente del conjugado. En las modalidades en donde la unidad conectora en paralelo está compuesta por un aminoaldehído, el aminoaldehído existirá como un residuo donde, por ejemplo, su grupo amino está unido a otro residuo de la unidad conectora en paralelo u otro componente del conjugado a través de un grupo funcional que contiene carbonilo de ese otro residuo/componente, mientras que su grupo funcional aldehído se convierte en un grupo funcional imino o mediante la reducción posterior para proporcionar un enlace nitrógenocarbono cuando se une a un grupo amino de otro residuo más de la unidad conectora en paralelo u otro componente del conjugado. Un aminoalcohol o aminoaldehído puede derivarse de un aminoácido natural o no natural mediante la reducción de su grupo funcional ácido carboxílico a un grupo funcional aldehído o un hidroxilo.
Cuando un residuo de la unidad conectora en paralelo es el residuo de ramificación para esa unidad, se entenderá que el residuo tendrá un tercer grupo funcional al que se une otro residuo de la unidad conectora en paralelo, una porción -X-D, o una unidad de PEG u otro componente de una unidad enlazadora. Por ejemplo, un aminoácido, u otro residuo ácido que contenga un amino, de la unidad conectora en paralelo pueden tener o pueden estar sustituidos con una cadena lateral con adición de grupos funcionales para proporcionar los tres puntos de unión requeridos para un residuo de ramificación. Por ejemplo, la serina tiene tres grupos funcionales, es decir, grupos funcionales ácido, amino e hidroxilo, y puede verse como un residuo de aminoácido y aminoalcohol combinado con el propósito de su incorporación a una unidad conectora en paralelo. La tirosina también contiene un grupo hidroxilo, en este caso en su cadena lateral fenólica, y también se puede ver de manera similar a la serina con el propósito de su incorporación como un residuo de ramificación a una unidad conectora en paralelo.
En otro ejemplo, cuando el residuo de ramificación de una unidad conectora en paralelo es cisteína, su grupo amino y ácido carboxílico existirán en forma residual de una manera previamente analizada para los aminoácidos o ácidos que contienen amino para proporcionar dos de los tres puntos de unión requeridos para un residuo de ramificación mientras que su grupo tiol existirá en forma residual cuando esté unido a una porción -X-D, o una unidad de PEG u otro componente de una unidad enlazadora como un disulfuro o en un enlace azufre-carbono como, por ejemplo, cuando el grupo funcional tiol reacciona con un grupo que contiene maleimido de un componente de la unidad enlazadora. En algunos casos, el grupo tiol residual está en su forma oxidada (es decir, -S(=O)- o -S(=O)2-) cuando se une a otro residuo de la unidad conectora en paralelo o a otro componente de la unidad enlazadora. En otro ejemplo más, el grupo alfa amino y ácido carboxílico de una lisina existirán en forma residual para proporcionar dos de los tres puntos de unión requeridos de un residuo de ramificación de una unidad conectora en paralelo mientras que su grupo épsilon amino en su forma residual proporciona el tercer punto de unión. La histidina también puede verse como un aminoácido con dos grupos amino, donde el segundo grupo amino es el NH de la cadena lateral que contiene imidazol.
En otro ejemplo, cuando el residuo de ramificación de una unidad conectora en paralelo es ácido aspártico o glutámico, los grupos alfa amino y ácido carboxílico C-terminal del aminoácido en sus formas residuales proporcionan dos de los tres puntos de unión necesarios para un residuo de ramificación de una unidad conectora en paralelo, mientras que su grupo ácido beta o gamma carboxílico en su forma residual proporciona el tercer punto de unión. En aquellos casos en los que se menciona un aminoácido natural como un residuo de una unidad conectora en paralelo, pero naturalmente la cadena lateral del aminoácido no contiene grupos funcionales, pero se requiere que sea un residuo de ramificación, se entiende que la estructura del aminoácido se modifica para que tenga un grupo funcional adicional además de sus grupos funcionales amino y ácido carboxílico cuando está en forma residual para proporcionar el tercer punto de unión requerido. Por ejemplo, un aminoácido que tiene una cadena lateral alifática puede estar sustituido en un carbono de esa cadena lateral con un grupo hidroxilo, amino, aldehído, tiol, ácido carboxílico u otro grupo funcional u otra porción (por ejemplo, un arilo o arilalquilo) sustituida con cualquiera de estos grupos funcionales para proporcionar un aminoácido no natural que tenga los tres puntos de unión necesarios. Dichos aminoácidos no naturales se incorporan en una unidad conectora en paralelo como se describió anteriormente para los aminoácidos y las formas residuales de los grupos funcionales introducidos.
De manera similar, cuando un aminoaldehído o aminoalcohol se incorpora en una unidad conectora en paralelo como un residuo de ramificación, ese aminoaldehído o aminoalcohol tendrá un tercer grupo funcional para proporcionar, junto con sus grupos funcionales amino y aldehído, los tres puntos de unión necesarios. En esos casos, un aminoaldehído o aminoalcohol puede corresponder en estructura a un aminoácido natural que tiene una cadena lateral con adición de grupos funcionales o un aminoácido no natural que tiene un grupo funcional que se
introdujo en la cadena lateral de un aminoácido natural como se describió anteriormente en el que un ácido carboxílico del aminoácido natural o no natural se reduce a un grupo funcional hidroxilo o aldehido.
El aminoácido puede ser un aminoácido alfa, beta o gamma u otro compuesto ácido que contenga amino y puede estar en su isómero D o L si contiene un carbono quiral al que se une una cadena lateral de aminoácido natural o no natural. Cuando la unidad conectora en paralelo se compone de más de un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina naturales o no naturales, los aminoácidos, aminoalcoholes, aminoaldehídos, poliaminas o combinaciones de estos se unen mediante enlaces covalentes para formar la unidad conectora en paralelo.
El aminoácido, aminoalcohol o aminoaldehído pueden ser no naturales y pueden modificarse para tener una cadena lateral con adición de grupos funcionales para unirse a los componentes de los conjugados o compuestos intermediarios (como se describió anteriormente para un residuo de ramificación de una unidad conectora en paralelo), según sea el caso. Los ejemplos de aminoácidos, aminoalcoholes o aminoaldehídos con adición de grupos funcionales incluyen, por ejemplo, aminoácidos, aminoalcoholes o aminoaldehídos con adición de grupos funcionales azido o alquino (por ejemplo, aminoácido, aminoalcohol o aminoaldehído modificado para tener un grupo azida o un grupo alquino para unir mediante el uso de química clic). Los métodos para la activación y reacción independientes de los grupos funcionales presentes en un aminoácido, por ejemplo, la porción de amina, la porción de ácido carboxílico y la porción de la cadena lateral (ya sea, por ejemplo, una porción amino, un grupo hidroxilo, otro ácido carboxílico, tiol, azida o alquino) se conocen bien en la técnica.
La unidad conectora en paralelo puede comprender 1 o más (típicamente de 1 a 5 o 1 a 4 o 1 a 3 o 1 o 2) aminoácidos, heteroalquilenos C1-20 opcionalmente sustituidos (preferentemente heteroalquileno C1-12 opcionalmente sustituido), heterociclos C3-8 opcionalmente sustituidos, arilenos C6-14 opcionalmente sustituidos, carbociclos C3-C8 opcionalmente sustituidos, o combinaciones de estos. En algunos aspectos, la unidad conectora en paralelo comprende no más de 2 o no más de un heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido. Los sustituyentes opcionales incluyen (=O), -X, -R, -OR, -SR, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, - NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, - S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, - P(=O)(OR)2, -PO=3, -PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -c (=s )o R, -C(=O)Sr , -C(=S)Sr , -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, o -C(=NR)n R2, donde cada X es independientemente un halógeno: -F, -Cl, -Br o -I; y cada R es independientemente -H, -alquilo C1 C20, -arilo C6 C20, heterociclo C3 C14, un grupo protector o una porción de profármaco. Los sustituyentes opcionales preferidos son (=O), -X, -R, -OR, -SR y -NR2.
Una unidad conectora en paralelo puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada y se puede representar mediante la fórmula A:
En donde
AA1 es una subunidad de LP seleccionada independientemente de un aminoácido, heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido (preferentemente heteroalquileno C1-12 opcionalmente sustituido), heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido; y el subíndice u se selecciona independientemente de 0 a 4; y la línea ondulada indica sitios de unión covalente dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediario de este. El heteroalquileno, heterociclo, arileno o carbociclo opcionalmente sustituidos tendrán grupos funcionales para las uniones entre las subunidades y dentro de un conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este.
En algunos aspectos, al menos un caso de AA1 es un aminoácido. El subíndice u puede ser 0, 1, 2, 3 o 4. En algunos aspectos, AA1 es un aminoácido y u es 0. En algunos aspectos, la unidad conectora en paralelo comprende no más de 2 heteroalquilenos C1-20 opcionalmente sustituidos, heterociclos C3-8 opcionalmente sustituidos, arilenos C6-14 opcionalmente sustituidos o carbociclos C3-C8 opcionalmente sustituidos. En algunos aspectos, en donde la unidad conectora en paralelo tiene la fórmula A, la unidad conectora en paralelo comprende no más de 1 heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido.
Una unidad conectora en paralelo o una subunidad de aminoácidos de esta puede ser un aminoácido alfa, beta o gamma que puede ser natural o no natural. El aminoácido puede ser un isómero D o L. La unión dentro de la unidad conectora en paralelo o con los otros componentes del conjugado (o enlazador) puede ser, por ejemplo, a través de
grupos funcionales amino, carboxi u otros. Los métodos para la activación y reacción independientes de los grupos funcionales se conocen bien en la técnica.
Una unidad conectora en paralelo o una subunidad de aminoácidos de esta se puede seleccionar independientemente del isómero D o L de un aminoácido que contiene tiol. El aminoácido que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína, homocisteína o penicilamina.
Una unidad conectora en paralelo o una subunidad de aminoácidos de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en los isómeros L o D de los siguientes aminoácidos: alanina (incluida la p-alanina), arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, histidina, glicina, ácido glutámico, glutamina fenilalanina, lisina, leucina, metionina, serina, tirosina, treonina, triptófano, prolina, ornitina, penicilamina, B-alanina, ácido aminoalquinoico, ácido aminoalcanodioico, ácido heterociclocarboxílico, citrulina, estatina, ácido diaminoalcanoico y derivados de estos.
Los aminoácidos preferidos incluyen cisteína, homocisteína, penicilamina, ornitina, lisina, serina, treonina, glutamina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, selenocisteína, prolina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, valina y alanina.
Las subunidades LP o AA1 ilustrativas de estos incluyen:
en donde R110 es
R111 se selecciona independientemente de hidrógeno, p-hidroxibencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, -CH2OH, -CH(OH)CHs, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)sNHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-,
en donde el asterisco indica la unión al carbono marcado con x;
R100 se selecciona independientemente de hidrógeno o alquilo C1-C3 (preferentemente hidrógeno o CH3), R13 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -alquileno C1-C6-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heteroalquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, alquileno C1-C10-arileno-, arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)- y -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-(preferentemente -CH2-CH2-);
Y es -
Y' es -C(=O)-, -O-, -S-, -NH-, o -N(CH3)-, y
los subíndices p, q y d son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 5; y la línea ondulada indica una unión covalente dentro del compuesto, hidrógeno, OH o un grupo alquilo C1-3 no sustituido, siempre que al menos una de las líneas onduladas indique una unión covalente dentro del compuesto. En algunos aspectos, todas las líneas onduladas indican unión covalente dentro del compuesto (por ejemplo, cuando LP no comprende ninguna subunidad).
En un grupo de modalidades, LP es un anillo heterocíclico que tiene grupos funcionales que pueden formar de forma independiente enlaces covalentes con los componentes indicados (por ejemplo, un anillo heterocíclico de triazol formado a partir de cloruro cianúrico). En otro grupo de modalidades, LP es un alcano que tiene grupos funcionales unidos como se indicó anteriormente. En otras modalidades más, LP puede ser un átomo de nitrógeno.
En algunas modalidades, -LP-, una vez ensamblado, tiene la fórmula que se indica a continuación:
en donde la línea ondulada indica los sitios de unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediario de este (por ejemplo, PEG, a -X (directa o indirectamente a través de A o AD) y a Z (directa o indirectamente a través de A o AD) y en donde R110 es
en donde el asterisco indica una unión al carbono marcado con x y la línea ondulada indica uno de los tres sitios de unión;
R100 se selecciona independientemente de hidrógeno o alquilo C1-C3, preferentemente hidrógeno o CH3, Y se selecciona independientemente de N o CH,
Y’ se selecciona independientemente de NH, O o S, y
el subíndice c es un número entero seleccionado independientemente de 1 a 10, y preferentemente 1, 2 o 3. En modalidades preferidas, R110 no es
Una unidad conectora en paralelo o una subunidad de aminoácidos de esta puede tener la siguiente fórmula
en donde el subíndice n es un número entero que varía de 1 a 4;
Xp se selecciona del grupo que consiste en -O-, -NR-, -S-, -S(=O)-, -C(=O)-, o -heterociclo C2-C8-; y
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -alquilo C1-3, -fenilo o -heterociclo C2-C5 (preferentemente H o alquilo C1-3), en donde la línea ondulada indica la unión covalente dentro del compuesto. En algunas modalidades, XP deriva de una cadena lateral de aminoácido natural o no natural.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del isómero D o L de lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, penicilamina, serina o treonina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del isómero D o L de lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína o penicilamina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en los siguientes aminoácidos: arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, ácido glutámico, glutamina, lisina, serina, tirosina, treonina, triptófano, ornitina, penicilamina, ácido aminoalquinoico, ácido aminoalcanodioico, ácido heterociclocarboxílico, citrulina, estatina, ácido diaminoalcanoico y derivados de estos.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en los siguientes isómeros L de estos aminoácidos naturales: arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, ácido glutámico, glutamina, lisina, cisteína, penicilamina, serina, tirosina, treonina y triptófano.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en los siguientes isómeros D de estos aminoácidos naturales: arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, ácido glutámico, glutamina, fenilalanina, lisina, cisteína, penicilamina serina, tirosina, treonina y triptófano. Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del isómero D o L de un aminoácido que contiene tiol. El aminoácido que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína, homocisteína o penicilamina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en los isómeros L o D de los siguientes aminoácidos: alanina (incluida la p-alanina), arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, histidina, glicina, ácido glutámico, glutamina fenilalanina, lisina, leucina, metionina, serina, tirosina, treonina, triptófano, prolina, ornitina, penicilamina, B-alanina, ácido aminoalquinoico, ácido aminoalcanodioico, ácido heterociclocarboxílico, citrulina, estatina, ácido diaminoalcanoico y derivados de estos. Los aminoácidos preferidos incluyen cisteína, homocisteína, penicilamina, ornitina, lisina, serina, treonina, glutamina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, selenocisteína, prolina, glicina, isoleucina, leucina, metionina y valina. Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en derivados de alanina siempre que esté presente el número apropiado de unidades funcionales. Ejemplos ilustrativos de derivados de alanina incluyen, pero no se limitan a: deshidroalanina, 4-tiazolilalanina, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-piridilalanina, p-(1-naftil)-alanina, p-(2-naftil)-alanina, ácido a-aminobutírico, p-cloro-alanina, pciano-alanina, p-ciclopentil-alanina, p-ciclohexil-alanina, p-yodo-alanina, p-ciclopentenil-alanina, p-tBu-alanina, pciclopropil-alanina, p-difenil-alanina, p-fluoro-alanina, p-piperazinil-alanina con el anillo de piperazina protegido o no, p-(2-quinolil)-alanina, p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina, p-ureido-alanina, H-p-(3-benzotienil)-Ala-OH y H-p-(2-tienil)-Ala-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en arginina y derivados de arginina. Ejemplos ilustrativos de arginina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: arginina (Arg), N-alquil-arginina, H-Arg(Me)-OH, H-Arg(NH2)-OH, H-Arg(NO2)-OH, H-Arg(Ac)2-OH, H-Arg(Me)2-OH (asimétrico), H-Arg(Me)2-OH (simétrico), ácido 2-amino-4-(2'-hidroxiguanidino)-butírico (N-w-hidroxinor-arginina) y homoarginina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en ácido aspártico y derivados de este. Ejemplos ilustrativos de ácido aspártico y derivados de este incluyen, pero no se limitan a: ácido aspártico (Asp), ácido N-alquil-aspártico y H-Asp(OtBu)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en asparagina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de asparagina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: asparagina (Asn), N-alquil-asparagina e isoasparagina (H-Asp-NH2).
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en cisteína y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de derivados de cisteína (Cys) (que no contienen grupo SH libre) incluyen, pero no se limitan a: Cys (StBu), H-Cys(Acm)-OH, H-Cys(Trt)-OH, H-Cys(StBu)-OH, H-Cys(Bzl)-OH, H-Cys(S-Et)-OH, H-Cys(SOaH)-OH, H-Cys(aminoetil)-OH, H-Cys(carbamoil)-OH, H-Cys(S-fenil)-OH, H-Cys(Boc)-OH y H-Cys(hidroxietil)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en histidina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de histidina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: histidina (His), N-alquil-histidina, H-His(Boc)-OH, H-His(Bzl)-OH, H-His(1-Me)-OH, H-His(1-Tos)-OH, H-2,5-diyodo-His-OH y H-His(3-Me)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en derivados de glicina. Ejemplos ilustrativos de derivados de glicina incluyen, pero no se limitan a: H-propargilglicina
a-aminoglicina (protegida o no), p-ciclopropil-glicina, a-alilglicina y neopentilglicina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en ácido glutámico y derivados de este. Ejemplos ilustrativos del ácido glutámico y derivados de este incluyen pero no se limitan a: ácido glutámico (Glu), ácido N-alquil-glutámico, H-Glu(OtBu)-OH, H-Y-hidroxi-Glu-OH, H-Y-metilen-Glu-OH, H-Y-carboxi-Glu(OtBu)2-OH y ácido piroglutámico.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en glutamina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de glutamina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: glutamina (Gln), N-alquil-glutamina, isoglutamina (H-Glu-NH2), H-Gln(Trt)-OH y H-Gln(isopropil)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en derivados de fenilalanina (Phe). Ejemplos ilustrativos de derivados de fenilalanina incluyen pero no se limitan a: Hp-amino-Phe-OH, Hp-amino-Phe(Z)-OH, Hp-bromo-Phe-OH, HH-p-carboxi-Phe(OtBu)-OH, Hp-carboxi-Phe-OH, Hp-ciano-Phe-OH, Hp-fluoro-Phe-OH, H-3,4-dicloro-Phe-OH, Hp-yodo-Phe-OH, Hp-nitro-Phe-OH, clorofenilalanina y p-homofenilalanina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en lisina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de lisina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: lisina (Lys), N-alquil-lisina, H-Lys(Boc)-OH, H-Lys(Ac)-OH, H-Lys(Formil)-OH, H-Lys(Me)2-OH, H-Lys(nicotinoil)-OH, H-Lys(Me)3-OH, H-trans-4,5-dehidro-Lys-OH, H-Lys(Alloc)-OH, H- H-8-hidroxi-Lys-OH, H-8-hidroxi-Lys(Boc)-OH, H-Lys(acetamidoil)-OH, y H-Lys(isopropil)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en derivados de leucina. Ejemplos ilustrativos de derivados de leucina incluyen, pero no se limitan a: 4,5-deshidroleucina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en derivados de metionina. Ejemplos ilustrativos de derivados de metionina incluyen, pero no se limitan a: metionina (Met), H-Met(=O)-OH y H-Met(=O)2-OH en los que el átomo de azufre de la cadena lateral de metionina está en forma oxidada.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en serina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de serina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: serina (Ser), N-alquil-serina, H-Ser(Ac)-OH, H-Ser(tBu)-OH, H-Ser(Bzl)-OH, H-Ser(p-cloro-Bzl)-OH, H-p-(3,4-dihidroxifenil)-Ser-OH, H-p-(2-tienil)-Ser-OH, isoserina N-alquil-isoserina y 3-fenilisoserina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en tirosina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de tirosina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: tirosina (Tyr), N-alquil-tirosina, H-3,5-dinitro-Tyr-OH, H-3-amino-Tyr-OH, H- 3,5-dibromo-Tyr-OH, H-3,5-diyodo-Tyr-OH, H-Tyr(Me)-OH, H-Tyr(tBu)-OH, H-Tyr(Boc)-OH, H -Tyr(Bzl)-OH, H-Tyr(Et)-OH, H-3-yodo-Tyr-OH y H-3-nitro-Tyr-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en treonina y derivados de esta. Los ejemplos ilustrativos de treonina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: treonina (Thr), N-alquil-treonina, alotreonina, H-Thr(Ac)-OH, H-Thr(tBu)-OH y H-Thr(Bzl)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en triptófano y derivados de este. Ejemplos ilustrativos de triptófano y derivados de este incluyen pero no se limitan a: triptófano (Trp), N-alquil-triptófano, H-5-Me-Trp-OH, H-5-hidroxi-Trp-OH, H-4-Me-Trp-OH, H-a-Me-Trp-OH, H-Trp(Boc)-OH, H-Trp(formil)-OH y H-Trp(mesitilen-2-sulfonil)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en prolina y derivados de esta. Los ejemplos ilustrativos de prolina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: prolina (Pro), N-alquil-prolina, homoprolina, tioprolina, hidroxiprolina (H-Hyp-OH), H-Hyp(tBu)-OH, H-Hyp(Bzl)-OH, H-3,4-dehidro-Pro-OH, 4-ceto-prolina, a-Me-Pro-OH y H-4-fluoro-Pro-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en ornitina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de ornitina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: ornitina (Orn), N-alquil-ornitina, HOrn(Boc)-OH, H-Orn(Z)-OH, H-a-difluoro-Me-Orn-OH (Eflornitina) y H-Orn(Alloc)-OH.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en penicilamina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de penicilamina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: penicilamina, H-penicilamina(Acm)-OH (H-p,p-dimetilcis(Acm)-OH) y N-alquilpenicilamina. Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en derivados de p-alanina. Ejemplos ilustrativos de derivados de p-alanina incluyen, pero no se limitan a: deshidro-alanina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en derivados aminoalcanoicos. Ejemplos ilustrativos de derivados aminoalcanoicos incluyen, pero no se limitan a: ácido 4-(neopentiloxisulfonil)-aminobutírico, ácido piperidilacético, ácido 3-aminopropiónico y ácido 3-amino-3-(3-piridil)-propiónico.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en ácido aminoalquinoico y derivados de este. Ejemplos ilustrativos de un ácido aminoalquinoico y
derivados de este incluyen, pero no se limitan a: ácido N-alquilaminoalquinoico, ácido 6-amino-4-hexinoico, ácido 6-(Boc-amino)-4-hexinoico.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en ácido aminoalcanodioico y derivados de este. Ejemplos ilustrativos de un ácido aminoalcanodioico y derivados de este incluyen, pero no se limitan a: ácido N-alquilaminoalcanodioico, ácido 2-aminohexanodioico, ácido 2-aminoheptanodioico, ácido 2-aminooctanodioico (H-Asu-OH).
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en ácido amino-heterociclo-alcanoico y derivados de este. Ejemplos ilustrativos de un ácido aminoheterociclo-alcanoico y derivados de este incluyen, pero no se limitan a: ácidos N-alquilamino-heterociclo-alcanoicos, ácido 4-amino-1-metil-1H-imidazol-2-carboxílico, ácido 4-amino-1-metil-1H-pirrol-2-carboxílico, ácido 4-aminopiperidin-4-carboxílico (H-Pip-OH; protegido en 1 o no), ácido 3-amino-3-(3-piridil)-propiónico.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en citrulina y derivados de esta. Ejemplos ilustrativos de citrulina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: citrulina (cit), N-alquil-citrulina, tiocitrulina, S-metil-tiocitrulina y homocitrulina.
Ejemplos ilustrativos de estatina y derivados de esta incluyen, pero no se limitan a: estatina, N-alquil-estatina, ciclohexilestatina y fenilestatina.
Cada unidad conectora en paralelo o subunidad de esta se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en ácido diaminoalcanoico y derivados de este. Ejemplos ilustrativos de ácido diaminoalcanoico (Dab) y derivados de este incluyen, pero no se limitan a: ácidos N-alquil-diamino-alcanoicos, ácidos N,N-dialquilaminoalcanoicos, ácido a,Y-diaminobutírico (H-Dab-OH), H-Dab(Alloc)-OH, H-Dab(Boc)-OH, H-Dab(Z)-OH, ácido a,pdiaminopropiónico y sus versiones protegidas de la cadena lateral.
A continuación, se muestra una unidad LP ilustrativa o una subunidad de esta, lisina o cisteína o pencilamina. La línea ondulada indica los sitios de unión a PEG, la unidad de ensamblaje liberable (directamente o mediante una unidad de ramificación o unidad de unión a fármacos) y a la unidad de extensión (directamente o mediante una unidad de ramificación o unidad de unión a fármacos). Los isómeros L y D de los aminoácidos son adecuados para su uso en la presente descripción.
A continuación, se muestra un conjugado ligando-fármaco o un compuesto enlazador-fármaco ilustrativo que tiene lisina como la unidad LP, en donde Z, L, X, D, PEG, Z', p y PEG son como se describen en el presente documento. Los isómeros L y D de los aminoácidos son adecuados para su uso en la presente descripción.
A continuación, se muestra un conjugado ligando-fármaco ilustrativo que tiene cisteína o pencilamina como la unidad LP, en donde Z, L, X, D, Z', PEG y p son como se describen en el presente documento. Los isómeros L y D de los aminoácidos son adecuados para su uso en la presente descripción.
Se entenderá que para los compuestos enlazadores intermediarios y los compuestos ligando-enlazador, la unidad conectora en paralelo es capaz de formar una unión covalente a -X-D pero aún no está conectada a -X-D, y la
unidad conectora en paralelo aún no estará completamente ensamblada en un conjugado ligando-fármaco y, como tal, comprenderá un grupo funcional que es reactivo con un grupo presente en la unidad de ensamblaje liberable. Una unidad conectora en paralelo ilustrativa que tiene un grupo funcional para la unión es la siguiente:
en donde,
el subíndice n es de 1 a 4;
Xp" se selecciona del grupo que consiste en -O-, -NR-, -S-, -C(=O)- y -S(=O)-; y
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-3, fenilo o heterociclo C2-C5; R6 es un grupo protector, H, alquilo C1-3, u -OH,
en donde las líneas onduladas indican una unión covalente dentro del resto de un compuesto enlazador intermediario o un compuesto ligando-enlazador.
Los grupos funcionales reactivos particularmente preferidos que proporcionan Xp" son los grupos sulfhidrilo para formar enlaces disulfuro o enlaces tioéter. El grupo funcional puede protegerse mediante un grupo protector. LP puede ser un grupo que contiene tiol (por ejemplo, un aminoácido que contiene tiol) y, como tal, LP' puede ser un aminoácido que contiene tiol protegido, tal como una cisteína protegida como se muestra a continuación. Aunque en la siguiente representación se representa el isómero L de la cisteína, el isómero D de la cisteína es adecuado. Además, el grupo protector t-butiltiol puede reemplazarse por cualquier otro grupo protector de tiol adecuado. Los grupos protectores de tiol incluyen t-butil sulfuro, n-butil sulfuro, n-propil sulfuro, metil sulfuro, fenil sulfuro, tiopiridilo, isopropil sulfuro, etil sulfuro y cisteinilo.
LP' puede ser un dipéptido que comprende un aminoácido que contiene tiol protegido, tal como un dipéptido de cisteína-alanina protegido como se muestra a continuación:
en donde las líneas onduladas indican una unión covalente de Lp ' dentro del resto de un compuesto enlazador intermediario
En modalidades preferidas, la unidad LP se selecciona para minimizar o no contribuir a la adición de hidrofobicidad a las porciones fármaco-enlazador de los conjugados ligando-fármaco.
En aspectos preferidos de la presente invención, la unidad LP tiene una masa de no más de aproximadamente 500 daltons, no más de aproximadamente 200 daltons, de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 daltons, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 daltons.
En los extremos de los conjugados ligando-fármaco se encuentran las unidades de ligando, las unidades de fármaco y las unidades de PEG.
Unidades de ligando:
En algunas modalidades de la invención, está presente una unidad de ligando. La unidad de ligando (L-) es un agente de direccionamiento que se une específicamente a una porción objetivo. El ligando puede unirse específicamente a un componente celular (un agente de unión celular) o a otras moléculas objetivo de interés. La unidad de ligando actúa para dirigir y presentar la unidad de fármaco a la población de células objetivo en particular con la que interactúa la unidad de ligando. Las unidades de ligando adecuadas son anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa y sus fragmentos de unión al antígeno, interferones, linfocinas, hormonas, factores de crecimiento y factores estimulantes de colonias, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tales como, pero sin limitarse a, transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión a las células. El ligando puede ser, por ejemplo, un agente dirigido a una proteína que no es un anticuerpo. Alternativamente, el ligando puede ser, por ejemplo, un anticuerpo. Los ligandos preferidos son proteínas de mayor peso molecular, por ejemplo, ligandos que tienen un peso molecular de al menos aproximadamente 80 Kd.
Una unidad de ligando puede formar un enlace con una unidad de extensión. La unidad de ligando debe tener el número requerido de sitios de unión para el enlazador-fármaco, ya sean de origen natural o no natural (por ejemplo, modificados genéticamente). Por ejemplo, para que el valor del subíndice p sea de 6 a 14, la unidad de ligando tiene que ser capaz de formar un enlace con 6 a 14 unidades de ligando. Los sitios de unión en el ligando pueden ser de origen natural o modificarse genéticamente. Una unidad de ligando puede formar un enlace con la unidad de extensión de la unidad enlazadora a través de un heteroátomo reactivo o activable o un grupo funcional del ligando que contiene un heteroátomo. Los heteroátomos reactivos o activables o un grupo funcional que contiene un heteroátomo que pueden estar presentes en una unidad de ligando incluyen azufre (en una modalidad, de un grupo sulfhidrilo de un ligando), C=O o (en una modalidad, de un grupo carbonilo, carboxilo o hidroxilo de un ligando) y nitrógeno (en una modalidad, de un grupo amino primario o secundario de un ligando). Estos heteroátomos pueden estar presentes en el ligando en el estado natural del ligando, por ejemplo, un anticuerpo de origen natural, o pueden introducirse en el ligando mediante modificación química o ingeniería biológica.
En una modalidad, una unidad de ligando tiene un grupo sulfhidrilo y la unidad de ligando se une a la unidad enlazadora a través del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otra modalidad, el ligando tiene residuos de lisina que pueden reaccionar con ésteres activados (tales ésteres incluyen, pero no se limitan a, ésteres de N-hidroxisuccinimida, pentafluorofenilo y p-nitrofenilo) de la unidad de extensión de la unidad enlazadora y así formar un enlace amida que consiste en el átomo de nitrógeno de la unidad de ligando y el grupo C=O de la unidad enlazadora.
En otro aspecto más, la unidad de ligando tiene uno o más residuos de lisina que pueden modificarse químicamente para introducir uno o más grupos sulfhidrilo. La unidad de ligando se une a la unidad enlazadora a través del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo. Los reactivos que se pueden usar para modificar las lisinas incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) e hidrocloruro de 2-imminotiolano (reactivo de Traut).
En otra modalidad, la unidad de ligando puede tener uno o más grupos carbohidrato que pueden modificarse químicamente para tener uno o más grupos sulfhidrilo. La unidad de ligando se une a la unidad de extensión de la unidad enlazadora a través del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otra modalidad adicional, la unidad de ligando puede tener uno o más grupos carbohidrato que pueden oxidarse para proporcionar un grupo aldehído (-CHO) (ver, por ejemplo, Laguzza y otros, 1989, J. Med. Chem. 32(3): 548-55). El aldehído correspondiente puede formar un enlace con un sitio reactivo en una unidad de extensión. Los sitios reactivos en una unidad de extensión que pueden reaccionar con un grupo carbonilo en un ligando incluyen, pero no se limitan a, hidrazina e hidroxilamina. Otros protocolos para la modificación de proteínas para la unión o asociación de unidades de fármaco se describen en Coligan y otros, Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002) (incorporado en la presente descripción como referencia).
Una unidad de ligando forma un enlace con el grupo reactivo en la unidad de extensión. Una variedad de grupos reactivos es útil y dependerá de la naturaleza de la unidad de ligando. El grupo reactivo puede ser una maleimida que está presente en la unidad de extensión (antes de la unión a L) y la unión covalente de L a la unidad de extensión se logra a través de un grupo sulfhidrilo de la unidad de ligando para formar una succinimida sustituida con tio. El grupo sulfhidrilo puede estar presente en el ligando en el estado natural del ligando, por ejemplo, un residuo de origen natural, o puede introducirse en el ligando mediante modificación química.
En otra modalidad adicional, el ligando es un anticuerpo y el grupo sulfhidrilo se genera por reducción de un disulfuro intercatenario. Por consiguiente, en algunas modalidades, la unidad enlazadora se conjuga con un residuo de cisteína de los disulfuros intercatenarios reducidos.
En otra modalidad adicional, el ligando es un anticuerpo y el grupo sulfhidrilo se introduce químicamente en el anticuerpo, por ejemplo, mediante la introducción de un residuo de cisteína. Por consiguiente, en algunas modalidades, la unidad de extensión se conjuga con un residuo de cisteína introducido.
Se ha observado para los bioconjugados que el sitio de conjugación del fármaco puede afectar a varios parámetros que incluyen la facilidad de conjugación, la estabilidad del enlazador-fármaco, los efectos sobre las propiedades biofísicas de los bioconjugados resultantes y la citotoxicidad in vitro. Con respecto a la estabilidad del enlazadorfármaco, el sitio de conjugación de un enlazador-fármaco a un ligando puede afectar la capacidad del enlazadorfármaco conjugado para experimentar una reacción de eliminación y para que el fármaco enlazador se transfiera del ligando de un bioconjugado a un tiol reactivo alternativo presente en el medio del bioconjugado, tal como, por ejemplo, un tiol reactivo en albúmina, cisteína libre o glutatión cuando está en plasma. Dichos sitios incluyen, por ejemplo, los disulfuros intercatenarios, así como sitios seleccionados diseñados con cisteína. Los conjugados ligando-fármaco descritos en este documento se pueden conjugar con residuos de tiol en sitios que no son susceptibles a la reacción de eliminación (por ejemplo, posiciones 239 según el índice EU como se establece en Kabat) además de otros sitios.
Cuando los conjugados comprenden ligandos peptídicos, polipeptídicos o proteicos que no son inmunorreactivos en lugar de un anticuerpo, los ligandos de proteína, polipéptido o péptido no inmunorreactivos útiles incluyen, pero no se limitan a, transferrina, factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, factores de crecimiento transformantes ("TGF"), como TGF-a y TGF-p, factor de crecimiento de vaccinia ("VGF"), insulina y factores de crecimiento similares a la insulina I y II, somatostatina, lectinas y apoproteína de lipoproteína de baja densidad.
Los ligandos particularmente preferidos son los anticuerpos, incluidos los anticuerpos intactos. De hecho, en cualquiera de las modalidades descritas en este documento, la unidad de ligando puede ser un anticuerpo. Los anticuerpos policlonales útiles son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de sueros de animales inmunizados. Los anticuerpos monoclonales útiles son poblaciones homogéneas de anticuerpos contra un determinante antigénico particular (por ejemplo, un antígeno de célula cancerosa, un antígeno viral, un antígeno microbiano, una proteína, un péptido, un carbohidrato, una sustancia química, un ácido nucleico o fragmentos de estos). Un anticuerpo monoclonal (AcM) contra un antígeno de interés puede prepararse mediante el uso de cualquier técnica conocida en la materia que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo.
Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados o anticuerpos monoclonales quiméricos humano-ratón (u otras especies). Los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa y sus fragmentos de unión al antígeno. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, Teng y otros, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. Us a . 80: 7308-7312; Kozbor y otros, 1983, Immunology Today 4: 72-79; y Olsson y otros, 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).
El anticuerpo puede ser un fragmento, derivado o análogo funcionalmente activo de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a células objetivo (por ejemplo, antígenos de células cancerosas, antígenos virales o antígenos microbianos) u otros anticuerpos unidos a células o matriz tumorales. A este respecto, "funcionalmente activo" significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de unirse inmunoespecíficamente a las células objetivo. Para determinar qué secuencias de CDR se unen al antígeno, se pueden usar péptidos sintéticos que contienen las secuencias de CDR en ensayos de unión con el antígeno mediante cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica (por ejemplo, el ensayo de BIA core) (ver, por ejemplo, Kabat y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, National Institute of Health, Bethesda, Md; Kabat E y otros, 1980, J. Immunology 125(3):961-969).
Otros anticuerpos útiles incluyen fragmentos de anticuerpos tales como, entre otros, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, Fvs, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, scFv, scFv-FV o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo.
Además, los anticuerpos recombinantes, como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que pueden prepararse mediante el uso de técnicas estándar de ADN recombinante, son anticuerpos útiles. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, como, por ejemplo, aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y regiones constantes de una inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,816,567; y patente de los Estados Unidos núm. 4,816,397, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 5,585,089, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad). Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de
ADN recombinante conocidas en la materia, por ejemplo, mediante el uso de métodos descritos en la publicación internacional núm. WO 87/02671; publicación de patente Europea núm. 0184187; publicación de patente Europea núm. 0 171 496; publicación de patente Europea núm. 0 173 494; publicación internacional núm. WO 86/01533; patente de Estados Unidos núm. 4,816,567; publicación de patente Europea núm. 012 023; Berter y otros, 1988, Science 240: 1041-1043; Liu y otros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu y otros, 1987, J. Immunol.
139: 3521-3526; Sun y otros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura y otros, 1987, Cancer. Res.
47: 999-1005; Wood y otros, 1985, Nature 314: 446-449; y Shaw y otros, 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202-1207; Oi y otros, 1986, BioTechniques 4:214; patente de Estados Unidos núm.
5,225,539; Jones y otros, 1986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan y otros, 1988, Science 239:1534; y Beidler y otros, 1988, J. Immunol. 141: 4053-4060; cada uno de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente convenientes y se pueden producir mediante el uso de ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina endógenas, pero que pueden expresar genes de cadenas ligeras y pesadas humanas.
Los anticuerpos incluyen análogos y derivados que se modifican, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula siempre que dicha unión covalente permita que el anticuerpo retenga su inmunoespecificidad de unión al antígeno. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de los anticuerpos incluyen aquellos que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, PEGilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una unidad de anticuerpo celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas que incluyen, entre otras, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. Además, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales.
Los anticuerpos pueden tener modificaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones) en los residuos de aminoácidos que interactúan con los receptores de Fc. En particular, los anticuerpos pueden tener modificaciones en los residuos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, la publicación internacional núm. WO 97/34631, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad).
Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas pueden obtenerse comercialmente o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica tal como, por ejemplo, síntesis química 0 técnicas de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o una base de datos similar, las publicaciones bibliográficas o mediante clonación y secuenciación rutinarias.
En una modalidad específica, se pueden usar anticuerpos conocidos para el tratamiento del cáncer. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas pueden obtenerse comercialmente o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica tal como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o una base de datos similar, las publicaciones bibliográficas o mediante clonación y secuenciación rutinarias.
En otra modalidad específica, se usan anticuerpos para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria de acuerdo con las composiciones y métodos de la invención. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de una célula que es responsable de producir anticuerpos autoinmunitarios pueden obtenerse de cualquier organización (por ejemplo, un científico universitario o una empresa) o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, como, por ejemplo, técnicas de síntesis química o de expresión recombinante.
En determinadas modalidades, los anticuerpos útiles pueden unirse a un receptor o un complejo receptor expresado en un linfocito activado. El receptor o complejo receptor puede comprender un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, un miembro de la superfamilia del receptor de TNF, una integrina, un receptor de citocina, un receptor de quimiocina, una proteína de histocompatibilidad principal, una lectina o una proteína de control del complemento.
En algunos aspectos, el anticuerpo se unirá específicamente al CD19, CD20, CD30, CD33, CD70, alfa-v-beta-6, Liv-1 o el antígeno Y de Lewis.
El anticuerpo anti-CD30 puede ser, por ejemplo, el anticuerpo quimérico AC10, brentuximab. El anticuerpo anti-CD30 puede tener una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 1, una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 2, una región constante de gamma I humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 7 y una región constante de kappa humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 8.
El anticuerpo anti-CD30 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo AC10 humanizado. El anticuerpo anti-CD30 puede tener una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 9, una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 10. El anticuerpo puede comprender además una región constante de gamma I humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 7 opcionalmente tiene una sustitución de serina a cisteína en la posición 239 (según el índice EU) y una región constante de kappa humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 8.
El anticuerpo anti-CD70 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humanizado (ver, por ejemplo, el documento US 2009/0148942). En una modalidad ilustrativa, el anticuerpo anti-CD70 tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 4.
El anticuerpo anti-CD19 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humanizado (ver, por ejemplo, el documento US 2009/0136526 incorporado en la presente descripción como referencia en su totalidad y para todos los propósitos). En una modalidad ilustrativa, el anticuerpo hBU12 tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 6.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-CD33 humanizado (documento US 2013/0309223 incorporado como referencia en la presente descripción en su totalidad y para todos los propósitos), un anticuerpo anti-Beta6 humanizado (ver, por ejemplo, el documento WO 2013/123152 incorporado en la presente descripción como referencia en su totalidad y para todos los propósitos), un anticuerpo anti-Liv-1 humanizado (ver, por ejemplo, el documento US 2013/0259860 incorporado como referencia en la presente descripción en su totalidad y para todos los propósitos), o un anticuerpo AC10 humanizado (ver, por ejemplo, el documento US 8,257,706 incorporado en la presente descripción como referencia en su totalidad y para todos los propósitos).
La unión ilustrativa al ligando es mediante enlaces tioéter. Los enlaces tioéter pueden ser mediante enlaces disulfuro intercatenarios, residuos de cisteínas introducidos y combinaciones de estos.
Unidades de fármacos:
Los efectos de la presente invención serán más pronunciados en modalidades en donde los fármacos son de naturaleza hidrófoba. Por consiguiente, los fármacos de la presente invención son de naturaleza hidrófoba.
La unidad de fármaco (D) es un fármaco citotóxico, citostático o inmunosupresor, también denominado en el presente documento como agente citotóxico, citostático o inmunosupresor. La unidad de fármaco tiene un átomo que puede formar un enlace con la unidad de ensamblaje liberable (X). En algunas modalidades, la unidad de fármaco D tiene un átomo de nitrógeno que puede formar un enlace con la unidad de ensamblaje liberable (X). En otras modalidades, la unidad de fármaco D tiene un ácido carboxílico que puede formar un enlace con la unidad de ensamblaje liberable (X). En otras modalidades, la unidad de fármaco D tiene un grupo sulfhidrilo que puede formar un enlace con la unidad de ensamblaje liberable X. En otras modalidades, la unidad de fármaco D tiene un grupo hidroxilo o cetona o alcohol que puede formar un enlace con la unidad de ensamblaje liberable X.
Las clases útiles de agentes citotóxicos o inmunosupresores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, ligandos del surco menor de ADN, inhibidores de la replicación de ADN, agentes alquilantes, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de la vinca o similares. Particularmente, ejemplos de clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, ligandos del surco menor de ADN, agentes alquilantes de ADN e inhibidores de tubulina. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etopósidos, maitansinas y maitansinoides, taxanos, benzodiazepinas o fármacos que contienen benzodiazepinas (por ejemplo, pirrolo[1,4]-benzodiazepinas (PBD), indolinobenzodiazepinas y oxazolidinobenzodiazepinas) y alcaloides de la vinca. Algunos fármacos que contienen benzodiazepinas se describen en los documentos WO 2010/091150, WO 2012/112708, WO 2007/085930 y WO 2011/023883.
En determinadas modalidades, el agente citotóxico es maitansina o un maitansinoide (por ejemplo, DM1, DM4), otro grupo de agentes anti-tubulina. (ImmunoGen, Inc.; ver también Chari y otros, 1992, Cancer Res. 52: 127-131 y patente de Estados Unidos núm. 8,163,888).
En algunas modalidades, el fármaco es una benzodiazepina (que incluye fármacos que contienen benzodiazepinas, por ejemplo, pirrolo[1,4]benzodiazepinas (PBD), indolinobenzodiazepinas y oxazolidinobenzodiazepinas).
Las PBD son de estructura general:
pero pueden diferir en la cantidad, el tipo y la posición de los sustituyentes, tanto en sus anillos aromáticos A como en los anillos pirrolo C, y en el grado de saturación del anillo C. En el anillo B hay una imina (N=C), una carbinolamina (NH-CH(OH)) o un metil éter de carbinolamina (NH-CH(OMe)) en la posición N10-C11, que es el centro electrofílico responsable de la alquilación del ADN. Todos los productos naturales conocidos tienen una orientación (S) en la posición quiral C11a que les proporciona un giro hacia la derecha cuando se ven desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les da la forma tridimensional apropiada para la isohelicidad con el surco menor del ADN en forma B, lo que porta a un ajuste perfecto en el sitio de unión. La capacidad de las PBD para formar un aducto en el surco menor les permite interferir con el procesamiento del ADN, de ahí su uso como agentes antitumorales. La actividad biológica de estas moléculas se puede potenciar, por ejemplo, uniendo dos unidades PBD a través de sus grupos funcionales C8/C'-hidroxilo mediante un enlazador de alquileno flexible. Se cree que los dímeros de PBD forman lesiones en el ADN que son selectivas de la secuencia, como el entrecruzamiento palindrómico 5'-Pu-GATC-Py-3' intercatenarios, que se cree que es el principal responsable de su actividad biológica.
La unidad de fármaco puede ser, por ejemplo, un fármaco del tipo de auristatina o diferente de la auristatina que tenga una hidrofobicidad comparable o superior a la monometil auristatina E. En algunos aspectos, el fármaco es MMAE o una auristatina que tenga una hidrofobicidad comparable o superior a la monometil auristatina. E. El fármaco auristatina se puede unir covalentemente a la unidad de ensamblaje liberable, por ejemplo, a través de su terminal N o C. MMAE tiene un valor SlogP de 2,59. En algunos aspectos, los fármacos que se utilizarán en la presente invención tendrán un valor de SlogP de 1,5 o mayor, 2,0 o mayor, o 2,5 o mayor. En algunos aspectos, los fármacos que se utilizarán en la presente invención tendrán un valor de SlogP de (a) aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, o 2,5 a aproximadamente 7, (b) aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, o 2,5 a aproximadamente 6, (c) aproximadamente 1,5, aproximadamente 2 o aproximadamente 2,5 a aproximadamente 5, (d) aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, o 2,5 a aproximadamente 4, o (e) aproximadamente 1,5, aproximadamente 2 o aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3.
La unidad de fármaco puede tener la Fórmula De a continuación, en donde la unión a la unidad de ensamblaje liberable se realiza a través del extremo terminal N:
en donde, independientemente en cada ubicación:
R2 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona del grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la
fórmula -(CRaRb)n, en donde Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
R9 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R18 se selecciona del grupo que consiste en -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8).
MMAE conjugado por medio de su extremo terminal N se muestra a continuación:
En algunas modalidades, la unidad de fármaco es un compuesto de vinca, una camptotecina o un compuesto citotóxico de antraciclina. Las estructuras ilustrativas de esas unidades de fármaco cuando están presentes en una porción X-D se describen en el presente documento para intermediarios de fármaco-enlazador.
Existen varios ensayos diferentes que se pueden usar para determinar si un conjugado ligando-fármaco ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular. En un ejemplo para determinar si un conjugado ligando-fármaco ejerce un efecto citostático o citotóxico sobre una línea celular, se usa un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, las células a una densidad de 5000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos se cultivan durante un período de 72 horas y se exponen a 0,5 ^Ci de 3H-timidina durante las 8 horas finales del período de 72 horas, y la incorporación de 3H-timidina en las células del cultivo se mide en presencia y ausencia del conjugado ligandofármaco. El conjugado ligando-fármaco tiene un efecto citostático o citotóxico sobre la línea celular si las células del cultivo tienen una incorporación reducida de 3H-timidina en comparación con las células de la misma línea celular cultivadas en las mismas condiciones, pero no en contacto con el conjugado ligando-fármaco.
En otro ejemplo, para determinar si un conjugado ligando-fármaco ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular, la viabilidad celular se mide determinando en una célula la absorción de un colorante como rojo neutro, azul tripán o azul ALAMAR™ (ver, por ejemplo, Page y otros, 1993, Intl. J. of Oncology 3:473-476). En dicho ensayo, las células se incuban en un medio que contiene el colorante, las células se lavan y el colorante restante, que refleja la absorción celular del colorante, se mide espectrofotométricamente. El colorante de unión a proteínas sulforrodamina B (SRB) también se puede utilizar para medir la citotoxicidad (Skehan y otros, 1990, J. Nat'l Cancer Inst. 82:1107-12). Los conjugados ligando-fármaco preferidos incluyen aquellos con un valor de IC50 (definida como la concentración de mAB que produce un 50 % de muerte celular) de menos de 1000 ng/ml, preferentemente menos de 500 ng/ml, con mayor preferencia menos de 100 ng/ml, incluso con la máxima preferencia de menos de 50 o incluso menos de 10 ng/ml en la línea celular.
Los procedimientos generales para unir un fármaco a los enlazadores se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 8,163,888, 7,659,241, 7,498,298, publicación de Estados Unidos Núm. US20110256157 y solicitudes internacionales núms. WO2011023883 y WO2005112919.
Unidad de polietilenglicol (PEG)
Pueden usarse PEG polidispersos, PEG monodispersos y PEG discretos para preparar los Compuestos de la presente invención. Los PEG polidispersos son una mezcla heterogénea de tamaños y pesos moleculares, mientras que los PEG monodispersos se purifican típicamente de mezclas heterogéneas y, por lo tanto, proporcionan una longitud de cadena y un peso molecular únicos. Las unidades de PEG preferidas son los PEG discretos, compuestos que se sintetizan por etapas y no a través de un proceso de polimerización. Los PEG discretos proporcionan una sola molécula con una longitud de cadena definida y especificada.
La unidad de PEG proporcionada en este documento comprende una o múltiples cadenas de polietilenglicol. Las cadenas de polietilenglicol se pueden unir juntas, por ejemplo, en una configuración lineal, ramificada o en forma de estrella. Generalmente, al menos una de las cadenas de PEG se derivatiza en un extremo para la unión covalente a la unidad conectora en paralelo. Las uniones ilustrativas a la unidad conectora en paralelo se realizan por medio de enlaces incondicionalmente escindibles o mediante enlaces condicionalmente escindibles. Los enlaces ilustrativos son mediante enlaces amida, enlaces éter, enlaces éster, enlaces hidrazona, enlaces oxima, enlaces disulfuro, enlaces peptídicos o enlaces triazol. En algunos aspectos, la unión a LP se realiza por medio de un enlace incondicionalmente escindible. En algunos aspectos, la unión a LP no se realiza mediante un enlace éster, enlace hidrazona, enlace oxima o enlace disulfuro. En algunos aspectos, la unión a LP no se realiza mediante un enlace hidrazona.
Un enlace condicionalmente escindible se refiere a un enlace que no es sustancialmente sensible a la escisión mientras circula en el plasma, pero es sensible a la escisión en un entorno intracelular o intratumoral. Un enlace incondicionalmente escindible es uno que no es sustancialmente sensible a la escisión en ningún entorno biológico. La hidrólisis química de una hidrazona, la reducción de un disulfuro y la escisión enzimática de un enlace peptídico o enlace glucosídico son ejemplos de enlaces condicionalmente escindibles.
La unidad de PEG se unirá directamente al conjugado ligando-fármaco (o intermediario de este) en la unidad conectora en paralelo. El otro extremo terminal (o terminales) de la unidad de PEG estará libre y sin ataduras y puede tomar la forma de un grupo metoxi, ácido carboxílico, alcohol u otro grupo funcional adecuado. El grupo metoxi, ácido carboxílico, alcohol u otro grupo funcional adecuado actúa como un cierre para la subunidad terminal de PEG de la unidad de PEG. Sin ataduras significa que la unidad de PEG no se unirá en ese sitio sin ataduras a una unidad de fármaco, a una unidad de ligando, o a un componente de enlace que une una unidad de fármaco y/o una unidad de ligando. Para aquellas modalidades en donde la unidad de PEG comprende más de una cadena de PEG, las múltiples cadenas de PEG pueden ser porciones químicas iguales o diferentes (por ejemplo, PEG de diferente peso molecular o número de subunidades). Las múltiples cadenas de PEG se unen a la unidad conectora en paralelo en un solo sitio de unión. El experto en la materia entenderá que la unidad de PEG además de comprender subunidades repetidas de polietilenglicol también puede contener material diferente de PEG (por ejemplo, para facilitar el acoplamiento de múltiples cadenas de PEG entre sí o para facilitar el acoplamiento a la unidad conectora en paralelo). El material diferente de PEG se refiere a los átomos de la unidad de PEG que no forman parte de las subunidades -CH2CH2O- repetidas. En las modalidades proporcionadas en el presente documento, la unidad de PEG puede comprender dos cadenas de PEG monoméricas unidas entre sí mediante elementos diferentes de PEG. En otras modalidades proporcionadas en este documento, la unidad de PEG puede comprender dos cadenas de PEG lineales unidas a un núcleo central que se une a la unidad conectora en paralelo (es decir, la propia unidad de PEG está ramificada).
Hay varios métodos de unión de PEG disponibles para los expertos en la técnica, [ver, por ejemplo, Goodson y otros (1990) Bio/Technology 8: 343 (PEGilación de interleucina 2 en su sitio de glicosilación después de mutagénesis dirigida a un sitio); documento núm. EP 0401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF); Malik, y otros, (1992) Exp. Hematol. 20:1028-1035 (PEGilación de GM-CSF con el uso de cloruro de tresilo); Pub. ACT núm. WO 90/12874 (PEGilación de eritropoyetina que contiene un residuo de cisteína introducido de forma recombinante mediante el uso de un derivado de mPEG específico de cisteína); patente de Estados Unidos núm. 5,757,078 (PEGilación de péptidos de EPO); patente de Estados Unidos núm. 5,672,662 (Poli(etilenglicol) y polímeros relacionados monosustituidos con ácidos propiónico o butanoico y derivados funcionales de estos para aplicaciones biotecnológicas); patente de Estados Unidos núm. 6,077,939 (PEGilación de un carbono alfa N-terminal de un péptido); Veronese y otros, (1985) Appl. Biochem. Bioechnol 11: 141-142 (PEGilación de un carbono a N-terminal de un péptido con PEG-nitrofenilcarbonato ("PEG-NPC") o PEG-triclorofenilcarbonato); y Veronese (2001) Biomaterials 22: 405-417 (Artículo de revisión sobre PEGilación de péptidos y proteínas)].
Por ejemplo, el PEG puede unirse covalentemente a residuos de aminoácidos a través de un grupo reactivo. Los grupos reactivos son aquellos a los que se puede unir una molécula de PEG activada (por ejemplo, un grupo amino o carboxilo libre). Por ejemplo, los residuos de aminoácidos N-terminales y los residuos de lisina (K) tienen un grupo amino libre; y los residuos de aminoácidos C-terminales tienen un grupo carboxilo libre. Los grupos sulfhidrilo (por ejemplo, los que se encuentran en los residuos de cisteína) también se pueden usar como grupo reactivo para unir PEG. Además, se han descrito métodos asistidos por enzimas para introducir grupos activados (por ejemplo, grupos hidrazida, aldehído y amino aromático) específicamente en el extremo C-terminal de un polipéptido (ver Schwarz y otros (1990) Methods Enzymol. 184:160; Rose y otros (1991) Bioconjugate Chem. 2: 154; y Gaertner y otros (1994) J. Biol. Chem. 269:7224].
En algunas modalidades, las moléculas de PEG pueden unirse a grupos amino mediante el uso de PEG metoxilado ("mPEG") que tiene diferentes porciones reactivas. Los ejemplos no limitantes de tales porciones reactivas incluyen succinimidil succinato (SS), succinimidil carbonato (SC), mPEG-imidato, para-nitrofenilcarbonato (NPC), succinimidil propionato (SPA) y cloruro cianúrico. Los ejemplos no limitantes de tales mPEG incluyen mPEG-succinimidil succinato (mPEG-SS), mPEG2-succinimidil succinato (mPEG2-SS); mPEG-succinimidil carbonato (mPEG-SC), mPEG2-succinimidil carbonato (mPEG2-SC); mPEG-imidato, mPEG-para-nitrofenilcarbonato (mPEG-NPC), mPEG-imidato; mPEG2-para-nitrofenilcarbonato (mPEG2-NPC); mPEG-succinimidil propionato (mPEG-SPA); mPEG2-succinimidil propionato (mPEG,-SPA); mPEG-N-hidroxisuccinimida (mPEG-NHS); mPEG2-N-hidroxisuccinimida (mPEG2 -NHS); mPEG-cloruro cianúrico; mPEG2-cloruro cianúrico; mPEG2-Lisinol-NPC y mPEG2-Lys-NHS.
Generalmente, al menos a una de las cadenas de PEG que componen la unidad de PEG se le han agregado grupos funcionales para que pueda acoplarse a la unidad conectora en paralelo. La funcionalización puede ser, por ejemplo, a través de una amina, tiol, éster NHS, maleimida, alquino, azida, carbonilo u otro grupo funcional. La unidad de PEG puede comprender además material diferente de PEG (es decir, material que no comprende -CH2CH2O-) para facilitar el acoplamiento a la unidad conectora en paralelo o para facilitar el acoplamiento de dos o más cadenas de PEG.
Puede usarse una amplia variedad de especies de polietilenglicol (PEG), y puede usarse sustancialmente cualquier sustancia de PEG reactiva adecuada. En algunas modalidades, la sustancia de PEG reactiva dará como resultado la formación de un enlace carbamato o amida tras la unión a LP Los siguientes reactivos de PEG son útiles en diversas modalidades: mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, PEG de brazos múltiples, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-tioésteres, mPEG-ésteres dobles, mPEG-BTC, mPEG-ButirALD, mPEG-ACET, PEG heterofuncionales (NH2-PEG-COOH, Boc-PEG-NHS, Fmoc-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL), acrilatos de PEG (ACRL-PEG-NHS), PEG-fosfolípidos (por ejemplo, MPEG-DSPE), PEG de brazos múltiples de la
serie SUNBRITE™, incluida la serie GL de PEG a base de glicerina activados por una química elegida por los expertos en la técnica, cualquiera de los PEG activados por SUNBRITE (incluidos, entre otros, carboxil-PEG, p-NP-PEG, Tresil-PEG, aldehído PEG, acetal-PEG, amino-PEG, tiol-PEG, maleimido-PEG, hidroxil-PEG-amina, amino-PEG-COOK hidroxil-PEG-aldehído, PEG de tipo anhídrido carboxílico, PEG-fosfolípido con grupos funcionales y otros PEG reactivos similares y/o adecuados seleccionados por los expertos en la técnica para su aplicación y uso particulares.
La adición de la unidad de PEG puede tener dos posibles efectos sobre la farmacocinética del conjugado ligandofármaco resultante. El efecto deseado es la disminución de la eliminación (y el consiguiente aumento de la exposición) que surge de la reducción de las interacciones no específicas inducidas por los elementos hidrófobos expuestos del fármaco-enlazador. El segundo efecto es un efecto no deseado y es la disminución del volumen y la velocidad de distribución que puede surgir del aumento del peso molecular del conjugado ligando-fármaco. El aumento del número de subunidades de PEG aumenta el radio hidrodinámico de un conjugado, lo que da como resultado una menor capacidad de difusión. A su vez, la disminución de la capacidad de difusión puede disminuir la capacidad del conjugado ligando-fármaco para penetrar en un tumor (Schmidt y Wittrup, Mol Cancer Ther 2009; 8 : 2861-2871). Debido a estos dos efectos farmacocinéticos en competencia, es conveniente usar un PEG que sea lo suficientemente grande para disminuir la eliminación del LDC aumentando así la exposición plasmática, pero no tan grande como para disminuir en gran medida su capacidad de difusión, lo que puede reducir la capacidad del conjugado ligando-fármaco para alcanzar la población de células objetivo prevista. Véanse los ejemplos (por ejemplo, ejemplos 1, 18 y 21) para conocer la metodología para seleccionar un tamaño de PEG óptimo para un enlazadorfármaco en particular.
En un grupo de modalidades, la unidad de PEG comprende al menos 6 subunidades, al menos 7 subunidades, al menos 8 subunidades, al menos 9 subunidades, al menos 10 subunidades, al menos 11 subunidades, al menos 12 subunidades, al menos 13 subunidades, al menos 14 subunidades, al menos 15 subunidades, al menos 16 subunidades, al menos 17 subunidades, al menos 18 subunidades, al menos 19 subunidades, al menos 20 subunidades, al menos 21 subunidades, al menos 22 subunidades, al menos 23 subunidades, o al menos 24 subunidades. Como se usa en este documento, una subunidad cuando se hace referencia a la unidad de PEG se refiere a una subunidad de polietilenglicol que tiene la fórmula
En algunas de tales modalidades, la unidad de PEG comprende no más de aproximadamente 72 subunidades.
En un grupo de modalidades, la unidad de PEG comprende una o más cadenas de PEG lineales, cada una con al menos 2 subunidades, al menos 3 subunidades, al menos 4 subunidades, al menos 5 subunidades, al menos 6 subunidades, al menos 7 subunidades, al menos 8 subunidades, al menos 9 subunidades, al menos 10 subunidades, al menos 11 subunidades, al menos 12 subunidades, al menos 13 subunidades, al menos 14 subunidades, al menos 15 subunidades, al menos 16 subunidades, al menos 17 subunidades, al menos 18 subunidades, al menos 19 subunidades, al menos 20 subunidades, al menos 21 subunidades, al menos 22 subunidades, al menos 23 subunidades o al menos 24 subunidades. En modalidades preferidas, la unidad de PEG comprende un total combinado de al menos 6 subunidades, al menos 8 , al menos 10 subunidades o al menos 12 subunidades. En algunas de tales modalidades, la unidad de PEG comprende no más de un total combinado de aproximadamente 72 subunidades, preferentemente no más de un total combinado de aproximadamente 36 subunidades.
En todas las modalidades, la unidad de PEG comprende un total combinado de 4 a 72, 4 a 60, 4 a 48, 4 a 36 o 4 a 24 subunidades, de 5 a 72, 5 a 60, 5 a 48, 5 a 36 o 5 a 24 subunidades, de 6 a 72, 6 a 60, 6 a 48, 6 a 36 o de 6 a 24 subunidades, de 7 a 72, 7 a 60, 7 a 48, 7 a 36 o 7 a 24 subunidades, de 8 a 72, 8 a 60, 8 a 48, 8 a 36 u 8 a 24 subunidades, de 9 a 72, 9 a 60, 9 a 48, 9 a 36 o 9 a 24 subunidades, de 10 a 72, 10 a 60, 10 a 48, 10 a 36 o 10 a 24 subunidades, de 11 a 72, 11 a 60, 11 a 48, 11 a 36 u 11 a 24 subunidades, de 12 a 72, 12 a 60, 12 a 48, 12 a 36 o 12 a 24 subunidades, de 13 a 72, 13 a 60, 13 a 48, 13 a 36 o 13 a 24 subunidades, de 14 a 72, 14 a 60, 14 a 48, 14 a 36 o 14 a 24 subunidades, de 15 a 72, 15 a 60, 15 a 48, 15 a 36 o 15 a 24 subunidades, de 16 a 72, 16 a 60, 16 a 48, 16 a 36 o 16 a 24 subunidades, de 17 a 72, 17 a 60, 17 a 48, 17 a 36 o 17 a 24 subunidades, de 18 a 72, 18 a 60, 18 a 48, 18 a 36 o 18 a 24 subunidades, de 19 a 72, 19 a 60, 19 a 48, 19 a 36 o 19 a 24 subunidades, de 20 a 72, 20 a 60, 20 a 48, 20 a 36 o 20 a 24 subunidades, de 21 a 72, 21 a 60, 21 a 48, 21 a 36 o 21 a 24 subunidades, de 22 a 72, 22 a 60, 22 a 48, 22 a 36 o 22 a 24 subunidades, de 23 a 72, 23 a 60, 23 a 48, 23 a 36 o 23 a 24 subunidades, o de 24 a 72, 24 a 60, 24 a 48, 24 a 36 o 24 subunidades.
En otro grupo de modalidades, la unidad de PEG comprende una o más cadenas de PEG lineales que tienen un total combinado de 4 a 72, 4 a 60, 4 a 48, 4 a 36 o 4 a 24 subunidades, de 5 a 72, 5 a 60, 5 a 48, 5 a 36 o 5 a 24 subunidades, de 6 a 72, 6 a 60, 6 a 48, 6 a 36 o 6 a 24 subunidades, de 7 a 72, 7 a 60, 7 a 48, 7 a 36 o 7 a 24 subunidades, de 8 a 72, 8 a 60, 8 a 48, 8 a 36 u 8 a 24 subunidades, de 9 a 72, 9 a 60, 9 a 48, 9 a 36 o 9 a 24 subunidades, de 10 a 72, 10 a 60, 10 a 48, 10 a 36 o 10 a 24 subunidades, de 11 a 72, 11 a 60, 11 a 48, 11 a 36 u 11 a 24 subunidades, de 12 a 72, 12 a 60, 12 a 48, 12 a 36 o 12 a 24 subunidades, de 13 a 72, 13 a 60, 13 a 48, 13
a 36 o 13 a 24 subunidades, de 14 a 72, 14 a 60, 14 a 48, 14 a 36 o 14 a 24 subunidades, de 15 a 72, 15 a 60, 15 a 48, 15 a 36 o 15 a 24 subunidades, de 16 a 72, 16 a 60, 16 a 48, 16 a 36 o 16 a 24 subunidades, de 17 a 72, 17 a 60, 17 a 48, 17 a 36 o 17 a 24 subunidades, de 18 a 72, 18 a 60, 18 a 48, 18 a 36 o 18 a 24 subunidades, de 19 a 72, 19 a 60, 19 a 48, 19 a 36 o 19 a 24 subunidades, de 20 a 72, 20 a 60, 20 a 48, 20 a 36 o 20 a 24 subunidades, de 21 a 72, 21 a 60, 21 a 48, 21 a 36 o 21 a 24 subunidades, de 22 a 72, 22 a 60, 22 a 48, 22 a 36 o 22 a 24 subunidades, de 23 a 72, 23 a 60, 23 a 48, 23 a 36 o 23 a 24 subunidades, o de 24 a 72, 24 a 60, 24 a 48, 24 a 36 o 24 subunidades.
En otro grupo de modalidades, la unidad de PEG es una cadena de PEG simple lineal derivatizada que tiene al menos 4 subunidades, al menos 5 subunidades, al menos 6 subunidades, al menos 7 subunidades, al menos 8 subunidades, al menos 9 subunidades, al menos 10 subunidades, al menos 11 subunidades, al menos 12 subunidades, al menos 13 subunidades, al menos 14 subunidades, al menos 15 subunidades, al menos 16 subunidades, al menos 17 subunidades, al menos 18 subunidades, al menos 19 subunidades, al menos 20 subunidades, al menos 21 subunidades, al menos 22 subunidades, al menos 23 subunidades o al menos 24 subunidades.
En otro grupo de modalidades, la unidad de PEG es una cadena de PEG simple lineal derivatizada que tiene de 6 a 72, 6 a 60, 6 a 48, 6 a 36 o 6 a 24 subunidades, de 7 a 72, 7 a 60, 7 a 48, 7 a 36 o 7 a 24 subunidades, de 8 a 72, 8 a 60, 8 a 48, 8 a 36 u 8 a 24 subunidades, de 9 a 72, 9 a 60, 9 a 48, 9 a 36 o 9 a 24 subunidades, de 10 a 72, 10 a 60, 10 a 48, 10 a 36 o 10 a 24 subunidades, de 11 a 72, 11 a 60, 11 a 48, 11 a 36 u 11 a 24 subunidades, de 12 a 72, 12 a 60, 12 a 48, 12 a 36 o 12 a 24 subunidades, de 13 a 72, 13 a 60, 13 a 48, 13 a 36 o 13 a 24 subunidades, de 14 a 72, 14 a 60, 14 a 48, 14 a 36 o 14 a 24 subunidades, de 15 a 72, 15 a 60, 15 a 48, 15 a 36 o 15 a 24 subunidades, de 16 a 72, 16 a 60, 16 a 48, 16 a 36 o 16 a 24 subunidades, de 17 a 72, 17 a 60, 17 a 48, 17 a 36 o 17 a 24 subunidades, de 18 a 72, 18 a 60, 18 a 48, 18 a 36 o 18 a 24 subunidades, de 19 a 72, 19 a 60, 19 a 48, 19 a 36 o 19 a 24 subunidades, de 20 a 72, 20 a 60, 20 a 48, 20 a 36 o 20 a 24 subunidades, de 21 a 72, 21 a 60, 21 a 48, 21 a 36 o 21 a 24 subunidades, de 22 a 72, 22 a 60, 22 a 48, 22 a 36 o 22 a 24 subunidades, de 23 a 72, 23 a 60, 23 a 48, 23 a 36 o 23 a 24 subunidades, o de 24 a 72, 24 a 60, 24 a 48, 24 a 36 o 24 subunidades.
En otro grupo de modalidades, la unidad de PEG es una cadena de PEG simple lineal derivatizada que tiene de 4 a 72, 4 a 60, 4 a 48, 4 a 36 o 4 a 24 subunidades, de 5 a 72, 5 a 60, 5 a 48, 5 a 36 o 5 a 24 subunidades.
Unidades de PEG lineales ilustrativas que se pueden usar en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento son las siguientes:
-S -R
R
2
¿
0
u— (CH2CH20)n--R
21
— §— R20— (CH2CH20)n>— R2^2-.(CH2CH20)n.— R ?2 : 1
en donde la línea ondulada indica el sitio de unión a la unidad conectora en paralelo,
R20 es una unidad de unión a PEG,
R21 es una unidad de bloqueo de PEG;
R22 es una unidad de acoplamiento de PEG (es decir, para acoplar múltiples cadenas de subunidades de PEG juntas)
n se selecciona independientemente de 2 a 72 (preferentemente de 4 a 72, con mayor preferencia de 6 a 72, de 8 a 72, de 10 a 72, de 12 a 72 o de 6 a 24);
e es de 2 a 5
cada n' se selecciona independientemente de 1 a 72. En modalidades preferidas, hay al menos 6, preferentemente al menos 8, al menos 10, o al menos 12 subunidades de PEG en la unidad de PEG. En algunas modalidades, no hay más de 72 o 36 subunidades de PEG en la unidad de PEG.
En modalidades preferidas, n es 8 o aproximadamente 8, 12 o aproximadamente 12, 24 o aproximadamente 24.
La unidad de unión de PEG es parte de la unidad de PEG y actúa para unir la unidad de PEG a la unidad conectora en paralelo. En este sentido, la unidad conectora en paralelo tiene un grupo funcional que forma un enlace con la unidad de PEG. Los grupos funcionales para la unión de la unidad de PEG a la unidad conectora en paralelo incluyen grupos sulfhidrilo para formar enlaces disulfuro o enlaces tioéter, grupos aldehído, cetona o hidrazina para formar enlaces hidrazona, hidroxilamina para formar enlaces oxima, grupos carboxílicos o amino para formar enlaces peptídicos, grupos carboxílicos o hidroxi para formar enlaces éster, ácidos sulfónicos para formar enlaces sulfonamida, alcoholes para formar enlaces carbamato y aminas para formar enlaces sulfonamida o enlaces carbamato o enlaces amida. En consecuencia, la unidad de PEG se puede unir a la unidad conectora en paralelo, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro, tioéter, hidrazona, oxima, péptido, éster, sulfonamida, carbamato o amida. Generalmente, la unidad de unión de PEG es un producto de la reacción de cicloadición, adición, adición/eliminación o sustitución que se produce al unir la unidad de PEG a la unidad conectora en paralelo.
La unidad de acoplamiento de PEG es parte de la unidad de PEG y es un material que no es PEG que actúa para conectar dos o más cadenas de subunidades CH2CH2O- repetidas. En modalidades ilustrativas, la unidad de acoplamiento de PEG R22 es -alquil C-mci-C(O)-NH-, -alquil C-i-10-NH-C(O)-, -alquil C2-10-NH-, -alquil C2-10-O-, -alquil C1-10-S-, o -alquil C2-10-NH-.
En modalidades ilustrativas, la unidad de unión a PEG R20 es -C(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -NH-, -C(O)O-, -C(O)alquilo C1-10, -C(O)alquil C1-10-O-, -C(O)alquil C1-10-CO2-, -C(O)alquil C1-10-NH-, -C(O)alquil C1-10-S-, -C(O)alquil C1-10-C(O)-NH-, -C(O)alquil C1-10-NH-C(O)-, -alquilo C1-10, -alquil C1-10-O-, -alquil C1-10-CO2-, -alquil C1-10-NH-, -alquil C1-10-S-, -alquil C1-10-C(O)-NH-, -alquil C1-10-NH-C(O)-, -CH2CH2SO2alquilo C1-10-, -CH2C(O)-alquil C1-10-, =N-(O o N)-alquil C1-10-O-, =N-(O o N)-alquil C1-10-NH-, =N-(O o N)-alquil C1-10-CO2-, =N-(O o N)-alquil C1-10-S-,
cada R21 es independientemente -alquilo C1-10, - alquil C2-10-CO2H, -alquil C2-10-OH, -alquil C2-10-NH2, alquil C2-10-NH(alquil C1-3) o alquil C2-10-N(alquil C1-3) 2; y
cada R22 es independientemente -alquil C1-10-C(O)-NH-, -alquil C1-10-NH-C(O)-, -alquil C2-10-NH-, -alquil C2-10-O-, -alquil C1-10-S-, o -alquil C2-10-NH-.
En algunas modalidades, R20 es -NH-, -C(=O)-, grupos unidos a triazol o -S-, o grupos unidos a maleimido tales como
en donde la línea ondulada indica el sitio de unión a la unidad conectora en paralelo y el asterisco indica el sitio de unión dentro de la unidad de PEG. En algunos de estos aspectos, R21 es alquilo C1-10, -alquil C2-10-CO2H, -alquil C2-10-OH, o -alquil C2-10-NH2.
Las unidades de PEG lineales ilustrativas que se pueden usar en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento son las siguientes:
-5 NH-(CH2CH20)n-CH2CH2C02H
-?-NH-(CH2CH20)n-CH2CH2C(=0)NH-(CH2CH20)-CH2CH2C02H
->-NH-(CH2CH20)n-CH2CH2N H -(C H 2CH20)-CH2CH2C02H
en donde la línea ondulada indica el sitio de unión a la unidad conectora en paralelo, y cada n se selecciona independientemente de 4 a 72, 6 a 72, 8 a 72, 10 a 72, 12 a 72, 6 a 24 u 8 a 24. En algunos aspectos, n es aproximadamente 8, aproximadamente 12 o aproximadamente 24.
Como se describe en el presente documento, la unidad de PEG se selecciona de modo que mejore la eliminación del conjugado ligando-fármaco resultante pero no afecte significativamente la capacidad del conjugado para penetrar en el tumor. En modalidades en donde la unidad de fármaco y la unidad de ensamblaje liberable del conjugado ligando-fármaco tienen una hidrofobicidad comparable a la del enlazador-fármaco maleimido glucurónido MMAE (como se muestra en los ejemplos), la unidad de PEG que se seleccionará para su uso tendrá preferentemente de 8 subunidades a aproximadamente 24 subunidades, con mayor preferencia aproximadamente 12 subunidades. En modalidades en donde la unidad de fármaco y la unidad de ensamblaje liberable del conjugado tienen una hidrofobicidad mayor que la de un enlazador-fármaco maleimido glucurónido MMAE, se puede seleccionar una unidad de PEG con más subunidades. La metodología que se muestra en la sección de ejemplos puede usarse para identificar el número ideal de subunidades para un enlazador-fármaco particular.
En modalidades preferidas de la presente invención, la unidad de PEG es de aproximadamente 300 dalton a aproximadamente 5 kilodaltons; de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 4 kilodaltons; de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 3 kilodaltons; de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 2 kilodaltons; o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 1 kilodalton. En algunos de estos aspectos, la unidad de PEG tiene al menos 6 subunidades o al menos 8, 10 o 12 subunidades. En algunos de estos aspectos, la unidad de PEG tiene al menos 6 subunidades o al menos 8, 10 o 12 subunidades, pero no más de 72 subunidades, preferentemente no más de 36 subunidades.
En modalidades preferidas de la presente invención, además de la unidad de PEG, no hay otras subunidades de PEG presentes en el enlazador-fármaco (es decir, no hay subunidades de PEG en ninguno de los otros componentes de los conjugados y enlazadores proporcionados en la presente descripción). En otros aspectos de la presente invención, además de la unidad de PEG, no hay más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 subunidad de polietilenglicol adicional presente en el enlazadorfármaco (es decir, no más de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 subunidades de polietilenglicol adicional en otros componentes de los conjugados y enlazadores proporcionados en la presente descripción). Los componentes incluyen la unidad de extensión, la unidad conectora en paralelo, la unidad de fármaco, la unidad de ramificación y la unidad de ensamblaje liberable.
Se apreciará que cuando se hace referencia a subunidades de PEG, y según el contexto, el número de subunidades puede representar un número promedio, por ejemplo, cuando se hace referencia a una población de conjugados ligando-fármaco o compuestos intermediarios, y se utilizan PEG polidispersos.
La unidad de extensión:
La unidad de extensión (-Z-) actúa para unir la unidad de ligando a la unidad conectora en paralelo. En este sentido, una unidad de extensión tiene un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de una unidad de ligando. La unidad de extensión tiene, además, un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de la unidad de ramificación opcional o la unidad conectora en paralelo. En el conjugado ligando-fármaco y los intermediarios que tienen más de unidad de fármaco por unidad de PEG, la unidad de extensión tendrá un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de una unidad de ligando y un grupo funcional que puede formar un enlace con una unidad de ramificación, una unidad conectora en paralelo o una unidad de unión a fármacos. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en una unidad de ligando, ya sea de forma natural o mediante manipulación química incluyen, pero no se limitan a, sulfhidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato y carboxilo. En un aspecto, los grupos funcionales de la unidad de ligando son sulfhidrilo y amino. La unidad de extensión puede comprender, por ejemplo, un grupo maleimida, un aldehído, una cetona, un carbonilo o una haloacetamida para la unión a la unidad de ligando.
En algunos aspectos, la unidad de extensión de un compuesto fármaco-enlazador o un compuesto enlazador intermediario tiene un grupo electrofílico que reacciona con un grupo nucleofílico presente en una unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo). Los grupos nucleofílicos útiles en un ligando incluyen, pero no se limitan a, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleofílico de un ligando es reactivo con un grupo
electrofílico en una unidad de extensión y forma un enlace covalente con la unidad de extensión. Los grupos electrofílicos útiles incluyen, pero no se limitan a, grupos maleimida y haloacetamida. Para un anticuerpo como ligando, el grupo electrofílico proporciona un sitio conveniente para la unión al anticuerpo para aquellos anticuerpos que tienen un grupo nucleofílico accesible.
En otra modalidad, una unidad de extensión tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleofílico que es reactivo con un grupo electrofílico presente en una unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo). Los grupos electrofílicos útiles en un ligando incluyen, pero no se limitan a, grupos aldehído y cetona y carbonilo. El heteroátomo de un grupo nucleofílico de una unidad de extensión puede reaccionar con un grupo electrofílico en un ligando y formar un enlace covalente con el anticuerpo. Los grupos nucleofílicos útiles en una unidad de extensión incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, hidroxilamina, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. Para un anticuerpo como ligando, el grupo electrofílico de un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión a una unidad de extensión nucleofílica.
En algunos aspectos, los conjugados se pueden preparar mediante el uso de una sección de la unidad de extensión que tiene un sitio reactivo para unirse a la unidad conectora en paralelo y la introducción de otra sección de la unidad de extensión que tiene un sitio reactivo para una unidad de ligando. En un aspecto, una unidad de extensión tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrofílico que es reactivo con un grupo nucleofílico presente en una unidad de ligando, tal como un anticuerpo. El grupo electrofílico proporciona un sitio conveniente para la unión del ligando (por ejemplo, un anticuerpo). Los grupos nucleofílicos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleofílico de un anticuerpo es reactivo con un grupo electrofílico en una unidad de extensión y forma un enlace covalente con una unidad de extensión. Los grupos electrofílicos útiles incluyen, pero no se limitan a, grupos maleimida y haloacetamida y ésteres de NHS.
En otra modalidad, una unidad de extensión tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleofílico que es reactivo con un grupo electrofílico presente en una unidad de ligando. El grupo electrofílico en una unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo) proporciona un sitio conveniente para la unión a una unidad de extensión. Los grupos electrofílicos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, grupos aldehído y cetona carbonilo. El heteroátomo de un grupo nucleofílico de una unidad de extensión puede reaccionar con un grupo electrofílico en un anticuerpo y formar un enlace covalente con el anticuerpo. Los grupos nucleofílicos útiles en una unidad de extensión incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
En algunas modalidades, la unidad de extensión forma un enlace con un átomo de azufre de la unidad de ligando a través de un grupo maleimida de la unidad de extensión. El átomo de azufre puede derivarse de un grupo sulfhidrilo de una unidad de ligando. Las unidades de extensión representativas de esta modalidad incluyen aquellas dentro de los corchetes de las Fórmulas XVa y XVb, en donde la línea ondulada indica una unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de estos y R17 es -alquileno C1-C10-, heteroalquileno C1-C10-, -carbociclo C3-C8-, -O-(C1-C8 alquil)-, -arileno-, -alquileno C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-C(=O)-, heteroalquileno C1-C10-C(=O)-, -carbociclo C3-C8-C(=O)-, -O-(alquil C1-C8)-C(=O)-, -arileno-C(=O)-, -alquileno C1-C10-arileno-C(=O)-, -arileno-alquileno C1-C10-C(=O)-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-C(=O)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-C(=O)-, -heterociclo C3-C8-C(=O)-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-C(=O)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-C(=O)-, -alquileno C1-C10-NH-, heteroalquileno C1-C10-NH-, -carbociclo C3-C8-NH-, -O-(alquil C1-C8)-NH-, -arileno-NH-, -alquileno C1-C10-arileno-NH-, -arileno-alquileno C1-C10-NH-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-NH-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-NH-, -heterociclo C3-C8 -NH-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-NH-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-NH-, -alquileno C1-C10-S-, heteroalquileno C1-C10-S -, -carbociclo C3-C8-S -, -O-(alquilo C1-C8)-S -, -arileno-S-, -alquileno C1-C10-arileno-S-, -arileno-alquileno C1-C10-S-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-S-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-S-, -heterociclo C3-C8 -S-, -alquileno C1-C10 -(heterociclo C3-C8)-S-, o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-S-. Cualquiera de los sustituyentes R17 puede estar sustituido o no sustituido. En algunos aspectos, los sustituyentes R17 no están sustituidos. En algunos aspectos, los sustituyentes R17 están opcionalmente sustituidos. En algunos aspectos, los grupos R17 están opcionalmente sustituidos por una unidad básica, por ejemplo, -(CH2)xNH2, -(CH2)xNHRa, y -(CH2)xNRa2, en donde x es un número entero de 1-4 y cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6, o dos grupos Ra se combinan con el nitrógeno al que están unidos para formar un grupo azetidinilo, pirrolidinilo o piperidinilo. Debe entenderse que incluso cuando no se indique expresamente, p es de 1 a 14.
Una unidad de extensión ilustrativa es la de Fórmula XVa en donde R17 es -alquileno C2-C5-C(=O)- en donde el alquileno está opcionalmente sustituido con una unidad básica, por ejemplo -(CH2)xNH2, -(CH2)xNHRa, y -(CH2)xNRa2, en donde x es un número entero de 1-4 y cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6 o dos grupos Ra se combinan con el nitrógeno al que están unidos para formar un grupo azetidinilo, pirrolidinilo o piperidinilo. Las modalidades ilustrativas son las siguientes:
Se entenderá que la succinimida sustituida puede existir en forma hidrolizada como se muestra a continuación:
Las unidades de extensión ilustrativas antes de la conjugación con el ligando incluyen lo siguiente:
Se entenderá que el grupo amino de la unidad de extensión puede protegerse adecuadamente mediante un grupo protector de amino durante la síntesis, por ejemplo, un grupo protector lábil a los ácidos (por ejemplo, BOC).
Aún otra unidad de extensión ilustrativa es la de Fórmula XVb en donde R17 es -(CH2)5-:
En otra modalidad, la unidad de extensión se une a la unidad de ligando mediante un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad de ligando y un átomo de azufre de la unidad de extensión. Una unidad de extensión representativa de esta modalidad se representa dentro de los corchetes de la fórmula XVI, en donde la línea ondulada indica una unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este y R17 es como se describió anteriormente para las fórmulas XVa y XVb.
En otra modalidad adicional, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que puede formar un enlace con un grupo amino primario o secundario de un ligando. Los ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, pero sin limitación, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Las unidades de extensión representativas de esta modalidad se representan entre los corchetes de las Fórmulas XVIIa,
XVIIb, y XVIIc en donde la línea ondulada indica una unión dentro del dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de estos y R17 es como se describió anteriormente para la Fórmula XVa y xVb.
En otra modalidad adicional, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que es reactivo con un grupo de carbohidrato modificado (-CHO) que puede estar presente en un ligando. Por ejemplo, un carbohidrato se puede oxidar levemente mediante el uso de un reactivo como el peryodato de sodio y la unidad (-CHO) resultante del carbohidrato oxidado se puede condensar con un extensor que contenga una funcionalidad como una hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un carboxilato de hidrazina y una arilhidrazida como se describe en Kaneko, T. y otros (1991) Bioconjugate Chem. 2:133-41. Las unidades de extensión representativas de esta modalidad se representan entre los corchetes de las Fórmulas XVIIIa, XVIIIb, y XVIIIc, en donde la línea ondulada indica una unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de estos y R17 es como se describió anteriormente para la Fórmula XVa y XVb.
En algunas modalidades de la presente invención, será conveniente extender la longitud de la unidad de extensión. Por consiguiente, una unidad de extensión puede comprender componentes adicionales. Por ejemplo, una unidad de extensión puede incluir aquellas dentro de los corchetes de las fórmulas XVa1,
en donde la línea ondulada indica una unión al resto del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este;
R17 es como se describió anteriormente, preferentemente R17 es -alquileno C2-C5-C(=O)- en donde el alquileno está opcionalmente sustituido con una unidad básica, por ejemplo -(CH2)xNH2, -(CH2))xNHRa, y -(CH2)xNRa2, en donde x es un número entero de 1-4 y cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6, o dos grupos Ra se combinan con el nitrógeno al que están unidos para formar un grupo azetidinilo, pirrolidinilo o piperidinilo; y
R13 es -alquileno C1-C6-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heteroalquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-arileno-, arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-. En modalidades preferidas R13 es -alquileno C1-C6-.
En aspectos preferidos de la presente invención, la unidad de extensión tiene una masa de no más de aproximadamente 1000 daltons, no más de aproximadamente 500 daltons, no más de aproximadamente 200 daltons, de aproximadamente 30, 50 o 100 daltons a aproximadamente 1000 daltons, de aproximadamente 30, 50 o 100 daltons a aproximadamente 500 daltons, o de aproximadamente 30, 50 o 100 daltons a aproximadamente 200 daltons.
Unidad de ramificación opcional (A)
La unidad de ramificación se incluye en los conjugados ligando-fármaco en los casos en los que es conveniente añadir fármacos adicionales al fármaco-enlazador y, en última instancia, al ligando. La unidad de ramificación es capaz de formar un enlace covalente con dos a cuatro unidades conectoras en paralelo, con dos a cuatro unidades de unión a fármacos o con dos a cuatro unidades -X-D. Como tal, la unidad de ramificación permite la unión de múltiples
porciones en estructuras tales como
en los casos en que m es mayor que uno. El experto en la materia apreciará que la unidad de ramificación se diseña de tal manera que permite la ramificación dentro del enlazador. Para actuar como una unidad de ramificación, la unidad de ramificación tiene al menos un primer, segundo y tercer sitio de unión para la unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este. En otras palabras, la unidad de ramificación debe ser al menos trifuncional. En modalidades en donde m es 3 de 4, la unidad de ramificación tendrá cuatro o cinco sitios para la unión covalente dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este. La unidad de ramificación es una sola unidad o tiene dos o más subunidades (por ejemplo, De 2 a 10, preferentemente de 2 a 5, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) para proporcionar el número requerido de sitios de unión, en donde la unidad de ramificación o sus subunidades son aminoácidos, aminoalcoholes, aminoaldehídos o poliaminas naturales o no naturales seleccionados independientemente, o combinaciones de estos. Si es necesario para tener el número requerido de uniones, al menos uno de los aminoácidos, aminoalcoholes, aminoaldehídos o poliaminas tendrá una cadena lateral con adición de grupos funcionales para proporcionar sitios de unión para la unidad LP y/o la unidad Z y/o las unidades AD y/o las porciones X-D. En algunos aspectos, uno o más aminoácidos, aminoalcoholes o aminoaldehídos no serán naturales y se modificarán para tener una o más cadenas laterales con grupos funcionales para los sitios de unión. Los ejemplos de aminoácidos, aminoalcoholes o aminoaldehídos con adición de grupos funcionales incluyen, por ejemplo, aminoácidos, aminoalcoholes o aminoaldehídos con adición de grupos funcionales azido o alquino (por ejemplo, aminoácido, aminoalcohol o aminoaldehído modificado para tener un grupo azida o un grupo alquino para unir mediante el uso de química clic).
Cada aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina puede ser natural o no natural. De manera similar, cada aminoácido puede ser un isómero D o L. En algunas modalidades en donde la unidad de ramificación es capaz de conectar dos unidades de conexión en paralelo, dos unidades X-D o dos unidades de unión a fármacos, la unidad de ramificación, una vez ensamblada, tiene la fórmula indicada a continuación:
en donde la línea ondulada indica dos o tres de los tres sitios de unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este y en donde R110 es
en donde el asterisco indica la unión al carbono marcado con x y la línea ondulada indica uno de los tres sitios de unión de la unidad de ramificación;
cada R100 se selecciona independientemente de hidrógeno o alquilo C1-C3, preferentemente hidrógeno o CH3, Y se selecciona independientemente de N o CH,
cada Y’ se selecciona independientemente de NH, O o S,
el subíndice c es independientemente un número entero que varía de 1 a 10, preferentemente de 1 a 3.
En modalidades preferidas, R110 no es
En algunas modalidades en donde la unidad de ramificación puede conectarse a dos unidades conectoras en paralelo o dos unidades de unión a fármacos, cada unidad de ramificación en un conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este, una vez ensamblada, tiene independientemente la fórmula que se indica a continuación:
en donde, el subíndice n es de 1 a 4;
Xb se selecciona del grupo que consiste en -O-, -NR-, -S- -C(=O)- y -S(=O)-; y
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-3, fenilo y heterociclo C2-C5 (preferentemente H o alquilo C1-3), en donde la línea ondulada indica una unión covalente de la unidad de ramificación dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediario de este.
Una unidad de ramificación ilustrativa es lisina como se muestra a continuación, en donde la línea ondulada y el asterisco indican un enlace covalente dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este:
Se apreciará que, en las fórmulas para algunos de los compuestos intermediarios proporcionados en este documento, la unidad de ramificación opcional puede formar de dos a cuatro uniones covalentes a las porciones -X-D pero aún no está unida a ellos. En tales modalidades, la unidad de Ramificación estará en una forma parcialmente ensamblada y, como tal, comprenderá dos o más grupos funcionales que son reactivos con los grupos presentes en las unidades de ensamblaje liberables de las porciones -X-D. Los grupos funcionales reactivos particularmente preferidos incluyen grupos sulfhidrilo que pueden formar enlaces disulfuro o tioéteres.
En aspectos preferidos de la presente invención, la unidad de ramificación tiene una masa de no más de aproximadamente 1000 daltons, no más de aproximadamente 500 daltons, no más de aproximadamente 200 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 1000 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 500 daltons, o de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 200 daltons.
Unidad de unión a fármacos (AD)
Al igual que con la unidad de ramificación, la unidad de unión a fármacos se incluye en los conjugados ligandofármaco en los casos en donde es conveniente agregar porciones -X-D adicionales (es decir, una unidad de ensamblaje liberable unida covalentemente a una unidad de fármaco) a una porción de enlazador-fármaco y, en última instancia, al ligando. Una unidad de unión al fármaco, según la ubicación dentro del conjugado ligandofármaco o intermediarios de este, tendrá dos sitios de unión o tres sitios de unión para la unión a los componentes de un conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este. El experto en la materia apreciará que la unidad de unión al fármaco puede ser cualquier grupo que sirva para proporcionar la unión de una unidad -X-D adicional dentro de una porción de enlazador-fármaco y finalmente a una unidad de ligando. En la presente invención, cada unidad de unión al fármaco es una sola unidad o tiene dos o más subunidades (por ejemplo, 2 a 10, preferentemente de 2 a 5, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) en donde la unidad de unión al fármaco o subunidades de esta se seleccionan independientemente entre aminoácidos, aminoalcoholes, aminoaldehídos, diaminas o poliaminas naturales o no naturales o combinaciones de estos. Si es necesario para tener el número requerido de uniones, al menos uno de los aminoácidos, aminoalcoholes, aminoaldehídos o poliaminas tendrá una cadena lateral con adición de grupos funcionales para proporcionar sitios de unión para la unidad LP y/o la unidad Z y/o las unidades AD y/o las porciones X-D. El (los) aminoácido(s), aminoalcohol(es) o aminoaldehído(s) pueden no ser naturales y pueden modificarse para tener una o más cadenas laterales con adición de grupos funcionales para la unión a la unidad de ensamblaje liberable. Los ejemplos de aminoácidos, aminoalcoholes o aminoaldehídos con adición de grupos funcionales incluyen, por ejemplo, aminoácidos, aminoalcoholes o aminoaldehídos con adición de grupos funcionales azido o alquino (por ejemplo, aminoácido, aminoalcohol o aminoaldehído modificado para tener un grupo azida o un grupo alquino para unir mediante el uso de química clic).
En algunos aspectos, en donde una unidad AD tiene tres sitios de unión, la unidad AD, en su forma ensamblada, tiene la fórmula que se indica a continuación:
o
en donde la línea ondulada indica dos o tres de los tres sitios de unión de AD dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este y en donde R110 es
en donde el asterisco indica una unión al carbono marcado con x y la línea ondulada indica uno de los tres sitios de unión;
R100 se selecciona independientemente de hidrógeno o alquilo C1-C3, preferentemente hidrógeno o CH3, Y se selecciona independientemente de N o CH,
Y’ se selecciona independientemente de NH, O o S, y
el subíndice c se selecciona independientemente de 1 a 10, preferentemente de 1 a 3.
En aspectos preferidos, R110 no es
En modalidades en donde una unidad AD tiene dos sitios de unión (es decir, una unidad AD terminal), uno de los sitios de unión mostrados anteriormente puede reemplazarse, por ejemplo, por H, OH o un grupo alquilo C1-3 no sustituido.
En algunas modalidades, en donde una unidad AD tiene tres sitios de unión, la unidad AD, en su forma ensamblada, tiene independientemente la fórmula que se indica a continuación:
en donde la linea ondulada indica los sitios de unión dentro del conjugado ligando-farmaco o intermediarios de este y en donde x, R100 y R110 son como se describieron justo anteriormente y en donde
R111 es p-hidroxibencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, - CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2 , -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2 , -(CH2)4NH2 , -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-,
En algunas modalidades, en donde una unidad AD tiene tres sitios de unión, la unidad AD esta compuesta por dos o más aminoácidos. Dicha unidad de amino AD ilustrativa es cisteína-alanina como se muestra a continuación, en donde la línea ondulada y el asterisco indican unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este:
En algunas modalidades, el asterisco indica una unión covalente a la unidad de ensamblaje liberable.
En algunas modalidades, en donde una unidad AD tiene dos sitios de unión, la unidad AD está compuesta por dos o más aminoácidos. Dicha unidad de amino AD ilustrativa es cisteína-alanina como se muestra a continuación, en donde la línea ondulada y el asterisco indican unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este:
En algunas modalidades, el asterisco indica una unión covalente a la unidad de ensamblaje liberable. heteroalquileno C1-12 sustituido), heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido como se describe en el presente documento. El heteroalquileno, heterociclo, arileno o carbociclo opcionalmente sustituidos tendrán grupos funcionales para la unión dentro de un conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este. Los sustituyentes opcionales incluyen (=O), -X, -R, -OR, -SR, -NR2, -NR3, =NR, CX3, CN, OCN, SCN, N=C=O, NCS, NO, NO2, =N2, N3, NRC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, SO3-, SO3H, S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, PO-3, PO3H2, AsO2H2, C(=O)R, C(=O)X, C(=S)R, CO2R, CO2-, C(=S)OR, C(=O)SR, C(=S)SR, C(=O)NR2, C(=S)NR2, o C(=NR)NR2, donde cada X es independientemente un halógeno: -F, -Cl, -Br o -I; y cada R es independientemente -H, -alquilo C1 C20, -arilo C6 C20, -heterociclo C3 C14, un grupo protector o una porción de profármaco. Los sustituyentes opcionales preferidos son (=O), X, R, OR, SR y NR2.
Una unidad de unión a fármacos puede ser de cadena lineal o ramificada y puede representarse mediante la Fórmula B:
en donde
BB1 se selecciona independientemente de un aminoácido, heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido (preferentemente heteroalquileno C1-12 opcionalmente sustituido), heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido, o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido;
y el subíndice u se selecciona independientemente de 0 a 4; en donde la línea ondulada indica los sitios de unión covalente dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediario de este. El heteroalquileno, heterociclo, arileno o carbociclo opcionalmente sustituidos tendrán grupos funcionales para las uniones entre las subunidades BB y dentro de un conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este.
En algunas modalidades, al menos un caso de BB1 es un aminoácido para definir una unidad amino de unión a fármacos. El subíndice u puede ser 0, 1, 2, 3 o 4. En algunos aspectos, BB1 es un aminoácido y u es 0. En algunas modalidades, la unidad AD comprende no más de 2 opcionalmente
El aminoácido de la unidad amino de unión a fármacos puede ser un aminoácido alfa, beta o gamma que puede ser natural o no natural. El aminoácido puede ser un isómero D o L. La unión dentro de la unidad amino de unión a fármacos o con los otros componentes del conjugado (o enlazador) puede ser, por ejemplo, a través de grupos funcionales amino, carboxi u otros. El heteroalquileno opcionalmente sustituido tendrá grupos funcionales para la unión dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este. Los métodos para la activación y reacción independientes de los grupos funcionales se conocen bien en la técnica.
En cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento, un aminoácido de una unidad de unión al fármaco (incluida la unidad amino de unión al fármaco) se puede seleccionar independientemente del isómero D o L de un aminoácido que contiene tiol. El aminoácido que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína, homocisteína o penicilamina.
En otra modalidad, un aminoácido que comprende una unidad de unión al fármaco (incluida la unidad amino de unión al fármaco) se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en los isómeros L o D de los siguientes aminoácidos: Alanina (incluida p-alanina), arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, histidina, glicina,
ácido glutámico, glutamina fenilalanina, lisina, leucina, metionina, serina, tirosina, treonina, triptófano, prolina, ornitina, penicilamina, B-alanina, ácido aminoalquinoico, ácido aminoalcanodioico, ácido heterociclo-carboxílico, citrulina, estatina, ácido diaminoalcanoico y derivados de estos.
Los aminoácidos preferidos incluyen cisteína, homocisteína, penicilamina, ornitina, lisina, serina, treonina, glutamina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, selenocisteína, prolina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, valina y alanina.
Se entenderá que, en las fórmulas para algunos de los compuestos descritos en el presente documento, tales como aquellos en los que la unidad de unión al fármaco puede formar una unión covalente a -X-D pero aún no está conectada a -X-D, la unidad de unión al fármaco estará en una forma parcialmente ensamblada y, como tal, comprenderá un grupo funcional que es reactivo con un grupo presente en la unidad de ensamblaje liberable. Los grupos funcionales reactivos particularmente preferidos incluyen grupos sulfhidrilo para formar enlaces disulfuro o enlaces tioéter. En algunos aspectos, un átomo de azufre reactivo estará protegido por un grupo protector. Los grupos protectores de tiol o su uso en la química de conjugación se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, grupos protectores alquitiol (por ejemplo, t-butiltiol, etanotiol, 2-propanotiol, 2-piridinotiol), grupos protectores de tiol aromático (por ejemplo, 2-piridinotiol) y grupos protectores acetilo.
En aspectos preferidos de la presente invención, la unidad de unión a fármacos tiene una masa de no más de aproximadamente 1000 daltons, no más de aproximadamente 500 daltons, no más de aproximadamente 200 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 1000 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 500 daltons, o de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 200 daltons.
Unidad de ensamblaje liberable (X)
La unidad de ensamblaje liberable (-X-) une la unidad de fármaco con el resto del conjugado ligando-fármaco. La función principal de la unidad de ensamblaje liberable es liberar el fármaco libre en el sitio objetivo del ligando. En ese sentido, la unidad de ensamblaje liberable puede formar un enlace escindible con una unidad de fármaco o contiene un enlace escindible para liberar el fármaco (por ejemplo, tras la internalización mediada por el antígeno). En modalidades preferidas, el mecanismo de liberación para la unidad de ensamblaje liberable es un mecanismo de liberación enzimático o un mecanismo de eliminación de disulfuro. El sitio de reconocimiento para el mecanismo de liberación enzimático puede ser, por ejemplo, un sitio de escisión peptídico o un sitio de escisión de azúcar (por ejemplo, un sitio de escisión de glucurónidos).
Una unidad de ensamblaje liberable puede comprender de 1 a 3 componentes, una unidad escindible (QCL), una unidad espaciadora opcional (QSP) y una unidad de unión covalente opcional (QCO). La unidad espaciadora, cuando está presente, actúa para unir la unidad escindible y la unidad de fármaco. Por consiguiente, en las modalidades en donde está presente la unidad espaciadora, la unidad espaciadora se unirá directamente a la unidad de fármaco y la unidad escindible se unirá a la unidad de fármaco a través de la unidad espaciadora. En las modalidades en donde la unidad espaciadora está ausente, la unidad escindible se unirá directamente a la unidad de fármaco.
En consecuencia, la unidad de ensamblaje liberable se puede representar mediante la fórmula siguiente, en donde QCO es una unidad de unión covalente, QSP es una unidad espaciadora y QCL es una unidad escindible. La unidad de unión covalente puede estar presente o ausente y la unidad espaciadora puede estar presente o ausente. El asterisco indica el sitio de unión covalente a la unidad de fármaco y la línea ondulada indica una unión covalente dentro del conjugado ligando-fármaco o intermediario de este (a LP, A o AD, según sea el caso):
En modalidades en donde la unidad espaciadora está ausente y la unidad de unión covalente está presente, -X-D se puede representar mediante la fórmula XIX en donde la línea ondulada adyacente a la unidad de unión covalente indica una unión covalente al resto del enlazador (a LP, A, o AD según sea el caso).
H -Q co-Q cl- d XIX
En modalidades en donde la unidad de unión covalente está ausente y la unidad espaciadora está ausente, -X-D se puede representar mediante la fórmula XX en donde la línea ondulada adyacente a la unidad escindible indica una unión covalente al resto del enlazador (a LP, A o AD según sea el caso):
En modalidades en donde la unidad espadadora está presente y la unidad de unión covalente está presente, -X-D puede representarse mediante la fórmula XXI en donde la línea ondulada adyacente a la unidad de unión covalente indica una unión covalente al resto del enlazador (a LP, A, o AD según sea el caso):
- | - q co- qcl— QSP-D X X I
En las modalidades en donde la unidad espaciadora está presente y la unidad de unión covalente está ausente, -X-D se puede representar mediante la fórmula XXII en donde la línea ondulada adyacente a la unidad escindible o la unidad espaciadora indica la unión covalente al resto del enlazador (LP, A, o AD según sea el caso).
Un experto en la técnica entenderá que cualquiera de las definiciones anteriores para -X-D (fórmulas XIX-XXIV) puede usarse en cualquiera de las fórmulas y modalidades proporcionadas en este documento, y cualquiera de sus modalidades seleccionadas. Cada unidad X, D y cada QCO, QCL o QSP puede ser igual o diferente.
En los aspectos preferidos de la presente invención, la unidad de ensamblaje liberable tiene una masa de no más de aproximadamente 5000 daltons, no más de aproximadamente 4000 daltons, no más de aproximadamente 3000 daltons, no más de aproximadamente 2000 daltons, no más de aproximadamente 1000 daltons, no más de aproximadamente 800 daltons, o no más de aproximadamente 500 daltons. En algunos aspectos, la unidad de ensamblaje liberable tiene una masa de aproximadamente 100 daltons, o de aproximadamente 200 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 5000 daltons, de aproximadamente 100 daltons o de aproximadamente 200 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 4000 daltons, de aproximadamente 100 daltons, o de aproximadamente 200 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 3000 daltons, de aproximadamente 100 daltons, o de aproximadamente 200 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 2000 daltons, de aproximadamente 100 daltons, o de aproximadamente 200 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 1000 daltons, de aproximadamente 100 daltons, o de aproximadamente 200 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 800 daltons, o de aproximadamente 100 daltons, o de aproximadamente 200 daltons, o de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 500 daltons.
Un experto en la técnica comprenderá que los componentes de los compuestos de enlazador-fármaco se pueden unir de la misma manera que los conjugados ligando-fármaco en donde falta la unidad de ligando.
Unidad escindible (QCL)
La unidad escindible es el único componente de la unidad de ensamblaje liberable que debe estar presente. En algunos aspectos, la unidad escindible forma un enlace escindible con la unidad de fármaco. En algunos aspectos, la unidad escindible forma un enlace escindible con la unidad espaciadora. En algunos aspectos, el enlace escindible está dentro de la unidad escindible, pero permite la liberación del fármaco libre (por ejemplo, mediante una reacción de eliminación 1,6 después de la escisión). Los grupos funcionales para formar enlaces escindibles son grupos sulfhidrilo para formar enlaces disulfuro, grupos carboxílicos o amino para formar enlaces peptídicos y azúcares para formar enlaces glucosídicos.
La naturaleza de la unidad escindible puede variar ampliamente. Por ejemplo, los enlazadores escindibles incluyen enlazadores que contienen disulfuro que se pueden escindir mediante intercambio de disulfuro, enlazadores lábiles a ácidos que se pueden escindir a pH ácido y enlazadores que se pueden escindir por hidrolasas (por ejemplo, peptidasas, esterasas y glucuronidasas).
La estructura y secuencia de la unidad escindible puede ser tal que la unidad sea escindida por la acción de enzimas presentes en el sitio objetivo. En otros aspectos, la unidad escindible puede escindirse mediante otros mecanismos. La unidad escindible puede comprender uno o varios sitios de escisión.
En algunas modalidades, la unidad escindible comprenderá un aminoácido o una o más secuencias de aminoácidos. La unidad escindible puede comprender, por ejemplo, una unidad monopéptido, dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido.
Cada aminoácido de una unidad escindible puede ser natural o no natural y/o un isómero D o L siempre que, por supuesto, exista un enlace escindible. En algunas modalidades, la unidad escindible comprenderá solo aminoácidos naturales. En algunas modalidades, la unidad escindible comprenderá de 1 a 12 aminoácidos en secuencia contigua. En algunas modalidades, cada aminoácido de una unidad escindible se selecciona independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutámico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, prolina, triptófano, valina, cisteína, metionina, selenocisteína, ornitina, penicilamina, p-alanina, ácido aminoalcanoico, ácido aminoalquinoico, ácido aminoalcanodioico, ácido aminobenzoico, ácido amino-heterociclo-alcanoico, ácido heterociclocarboxílico, citrulina, estatina, ácido diaminoalcanoico y derivados de este. En algunas modalidades, cada aminoácido se selecciona independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutámico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, prolina, triptófano, valina, cisteína, metionina y selenocisteína. En algunas modalidades, cada aminoácido se selecciona independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutámico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, prolina, triptófano y valina. En algunas modalidades, cada aminoácido se selecciona entre los aminoácidos proteinogénicos o no proteinogénicos.
En otra modalidad, cada aminoácido de una unidad escindible se selecciona independientemente del grupo que consiste en los siguientes aminoácidos L-(naturales): alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutámico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, triptófano y valina.
En otra modalidad, cada aminoácido de una unidad escindible se selecciona independientemente del grupo que consiste en los siguientes isómeros D de estos aminoácidos naturales: alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutámico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, triptófano y valina.
En algunas modalidades, el enlace entre la unidad escindible y la unidad de fármaco o unidad Espaciadora se puede escindir enzimáticamente por una o más enzimas, incluida una proteasa asociada al tumor, para liberar la unidad de fármaco (-D), que en una modalidad está protonada in vivo tras su liberación para proporcionar un fármaco (D). Las unidades escindibles útiles se pueden diseñar y optimizar en cuanto a su selectividad para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor. En una modalidad, una unión (o enlace) entre la unidad escindible y la unidad de fármaco o unidad espaciadora es aquella cuya escisión es catalizada por catepsina B, C y D, o una plasmina proteasa.
En ciertas modalidades, la unidad escindible puede comprender solo aminoácidos naturales. En otras modalidades, la unidad escindible puede comprender solo aminoácidos no naturales. En algunas modalidades, la unidad escindible puede comprender un aminoácido natural unido a un aminoácido no natural. En algunas modalidades, la unidad escindible puede comprender un aminoácido natural unido a un isómero D de un aminoácido natural.
Una unidad escindible ilustrativa es el dipéptido -Val-Cit-, -Phe-Lys- o -Val-Ala.
En algunas modalidades, la unidad escindible comprenderá un péptido y comprenderá de 1 a 12 aminoácidos. En algunas de tales modalidades, el péptido se conjugará directamente con la unidad de fármaco y la unidad espaciadora estará ausente. En algunas de estas modalidades, el péptido será un dipéptido.
En algunas modalidades, la unidad escindible -CU- estará representada por -(-AM-)1-12-, o (-AM-AM-)1-6 en donde AM en cada aparición se selecciona independientemente de los aminoácidos naturales o no naturales. En un aspecto, AM se selecciona independientemente en cada caso de los aminoácidos naturales. Un experto en la técnica apreciará que los aminoácidos generalmente están unidos a la unidad de fármaco o la unidad espaciadora por medio de unidades funcionales presentes en el aminoácido, por ejemplo, su ácido carboxílico o amino terminales. En otros aspectos, la unidad escindible comprenderá un sitio de escisión de azúcar. En algunas de tales modalidades, la unidad escindible comprende una porción de azúcar (Su) unida mediante un enlace glucosídico de oxígeno a un grupo autoinmolativo. En tales aspectos, el grupo autoinmolativo se considera parte de la unidad escindible, QCL. El "grupo autoinmolativo" es una porción química trifuncional que es capaz de unir covalentemente tres porciones químicas separadas (es decir, la porción de azúcar (por medio de un enlace glucosídico), una unidad de fármaco (directa o indirectamente por medio de la unidad espaciadora QSP), y una unidad LP, una unidad A o una unidad AD (directa o indirectamente por medio de una unidad de unión covalente QCO). El enlace glucosídico será uno que pueda escindirse en el sitio objetivo para iniciar una secuencia de reacción autoinmolativa que conduce a la liberación del fármaco.
En consecuencia, la unidad escindible puede comprender una porción de azúcar (Su) unida mediante un enlace glucósido (-O'-) a un grupo autoinmolativo (K) de fórmula:
Azúcar
en donde el grupo autoinmolativo K forma un enlace covalente con la unidad de fármaco (directa o indirectamente por medio de la unidad espadadora) y un enlace covalente con LP, AD o A (directa o indirectamente mediante una unidad de unión covalente), según sea el caso.
La unidad escindible se puede representar, por ejemplo, por la fórmula:
en donde Su es una porción de azúcar, -O'- representa un enlace glucosídico con oxígeno; cada R es independientemente hidrógeno, un halógeno, -CN, o -NO2; y en donde la línea ondulada indica una unión a LP, AD o A (ya sea directa o indirectamente por medio de la unidad de unión covalente) y el asterisco indica una unión a la unidad de fármaco (ya sea directa o indirectamente por medio de la unidad espaciadora; la unidad espaciadora, cuando está presente, puede ser, por ejemplo,-C(=O)-).
En algunas de tales modalidades, el sitio de escisión de azúcar es reconocido por la beta-glucuronidasa y la unidad escindible comprende una unidad de Glucurónido. La unidad de glucurónido puede comprender ácido glucurónico unido mediante un enlace glucósido (-O'-) a un grupo autoinmolativo (K) de fórmula:
Ácido glucurónico
en donde el grupo autoinmolativo K forma un enlace covalente con la unidad de fármaco (directa o indirectamente por medio de la unidad espaciadora) y un enlace covalente con LP, AD o A (directa o indirectamente mediante una unidad de unión covalente), según sea el caso.
La unidad de glucurónido se puede representar, por ejemplo, por la fórmula:
en donde la línea ondulada indica una unión covalente a LP, AD o A (ya sea directa o indirectamente por medio de la unidad de unión covalente) y el asterisco indica una unión covalente a la unidad de fármaco (ya sea directa o indirectamente por medio de la unidad espaciadora)
En algunas modalidades, la unidad escindible comprende un sitio de escisión de azúcar, -X-D se representa por la siguiente fórmula:
en donde Su es una porción de azúcar, -O'- representa un enlace glucosídico con oxígeno; cada R es independientemente hidrógeno o un halógeno, -CN, -NO2 u otro grupo de extracción de electrones, QCO es una unidad de unión covalente; en donde el enlace ondulado indica una unión covalente al resto de la unidad enlazadora (LP, A o AD según sea el caso).
Cuando la unidad escindible comprende una unidad de Glucurónido, -X-D puede representarse, por ejemplo, por la siguiente fórmula:
o
en donde el enlace ondulado indica una unión covalente al resto de la unidad enlazadora (LP, A o AD según sea el caso); y QCO es una unidad de unión covalente.
En algunas otras modalidades, la propia unidad escindible comprenderá un átomo de azufre que puede formar un enlace con un átomo de azufre de una unidad espaciadora o unidad de fármaco para formar un disulfuro o disulfuro impedido. La escisión se produce entre los dos átomos de azufre del disulfuro. En algunas de tales modalidades, uno de los átomos de azufre se escinde de la unidad de fármaco y, siempre que no haya más mecanismos de liberación, el otro átomo de azufre permanece unido a la unidad de fármaco y pasa a formar parte de la unidad de fármaco.
Se conocen en la técnica una variedad de enlazadores disulfuro y se pueden adaptar para su uso en la presente invención, incluidos, por ejemplo, aquellos que se pueden formar mediante el uso de SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) butirato), SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno) y SPP (4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo). (Ver, por ejemplo, Thorpe y otros, 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak y otros, En Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (CW Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver, además, la patente de Estados Unidos núm. 4,880,935).
En algunas modalidades, la unidad escindible se conjugará directamente a la unidad de fármaco y la unidad escindible se unirá a la unidad de fármaco mediante un péptido escindible o un enlace disulfuro.
Unidad espaciadora (QSP)
La unidad espaciadora, cuando está presente, actúa para unir la unidad de fármaco a la unidad escindible. La unidad espaciadora, es de dos tipos generales: autoinmolativa y no autoinmolativa. Una unidad no autoinmolativa es aquella en la que parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida a la unidad de fármaco después de la escisión, y puede degradarse más o descomponerse espontáneamente para producir un “fármaco libre” o puede convertirse en parte de la unidad de fármaco en sí. Los ejemplos de una unidad no autoinmolativa incluyen, pero no se limitan a, una unidad de glicina-glicina y una sola unidad de glicina (ambas representadas en el esquema A) (más abajo). Cuando un conjugado ligando-fármaco que contiene una unidad de glicina-glicina o una sola unidad de glicina se somete a escisión enzimática mediante una proteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a células cancerosas o una proteasa asociada a linfocitos, una unidad de glicina-glicina-fármaco o una unidad de glicina-fármaco se escinde del conjugado. En una modalidad, tiene lugar una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula objetivo, que escinde el enlace de la unidad glicina-fármaco y libera el fármaco.
En una modalidad, una unidad no autoinmolativa es -Gly-Gly-. En otra modalidad, una unidad no autoinmolativa es -Gly-.
En otra modalidad, la unidad espaciadora comprende una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB) (véanse los Esquemas B y C, más adelante) en donde la porción de fenileno está sustituida con Qm en donde Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), u otro grupo donante de electrones o -halógeno, -nitro, -ciano u otro grupo de extracción de electrones; y m es un número entero que varía de 0 a 4.
Alternativamente, un conjugado que contiene una unidad espaciadora autoinmolativa puede liberar -D sin la necesidad de una etapa de hidrólisis separada. En algunos aspectos, la unidad de extensión comprende un grupo PAB que se une a una unidad escindible peptídica por medio del átomo de nitrógeno del amino del grupo PAB, y se conecta directamente a la unidad de fármaco a través de un grupo carbonato, carbamato o éter. El grupo PAB y el carbonilo adyacente forman la unidad espaciadora. Sin estar limitados a ninguna teoría o mecanismo en particular, el esquema B describe un posible mecanismo de liberación del fármaco de un grupo PAB que está unido directamente a -D por medio de un grupo carbamato o carbonato, adoptado por Toki y otros, 2002, J Org. Chem. 67: 1866-1872.
en donde Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, nitro o ciano; y m es un número entero que varía de 0 a 4.
Sin estar limitados a ninguna teoría o mecanismo en particular, el esquema C representa un posible mecanismo de liberación del fármaco de un grupo PAB que está unido directamente a -D mediante un enlace éter o amina.
en donde Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o ciano; y m es un número entero que varía de 0 a 4.
Sin estar limitados a ninguna teoría o mecanismo en particular, el esquema D representa un posible mecanismo de liberación del fármaco de un grupo PAB de una unidad de glucurónido que se une directamente a -D por medio de un carbonilo.
Esquem a D
Otros ejemplos de unidades autoinmolativas incluyen aquellas que comprenden compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (ver, por ejemplo, Hay y otros, 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237) y orto o para-aminobencilacetales. Se pueden usar espaciadores que se someten a ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas del ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (ver, por ejemplo, Rodrigues y otros, 1995, Chemistry Biology 2: 223), sistemas de anillo biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] apropiadamente sustituidos (ver, por ejemplo, Storm y otros, 1972, J. Amer. Chem. Soc.
94: 5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (ver, por ejemplo, Amsberry y otros, 1990, J. Org. Chem. 55: 5867). La eliminación de fármacos que contienen aminas que se sustituyen en la posición a de la glicina (ver, por
ejemplo, Kingsbury y otros, 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) también son ejemplos de espaciadores autoinmolativos útiles en conjugados ilustrativos.
En modalidades preferidas de la presente invención, la unidad espadadora está compuesta por 1, 2 o 3 grupos autoinmolativos o no autoinmolativos.
En modalidades preferidas de la presente invención, la unidad espaciadora tiene una masa de no más de aproximadamente 1000 daltons, no más de aproximadamente 500 daltons, no más de aproximadamente 400 daltons, no más de aproximadamente 300 daltons, o de aproximadamente 10, 50 o 100 a aproximadamente 1000 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 a aproximadamente 500 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 400 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 300 daltons o de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 200 daltons.
Unidad de unión covalente (QCO)
La unidad de unión covalente, cuando está presente, amplía el marco de la unidad de ensamblaje del enlazador liberable para proporcionar más distancia entre LP y la unidad de fármaco. En este sentido, la unidad de unión covalente tiene un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de la unidad de ramificación opcional A o LP o la unidad de unión al fármaco AD en un extremo y un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de una unidad escindible en los otros extremos. En algunos aspectos, los enlaces ilustrativos son enlaces incondicionalmente escindibles.
El experto en la materia apreciará que la unidad de unión covalente puede ser cualquier grupo o porción que sirva para proporcionar la unión de la unidad escindible al resto de la molécula. En algunos aspectos, la unidad de unión covalente antes del ensamblaje tendrá dos grupos funcionales capaces de formar un enlace y unirse a componentes del conjugado ligando-fármaco o intermediario de este. El experto comprenderá que la unidad de unión covalente, antes del ensamblaje, puede tener más de dos grupos funcionales; sin embargo, para los propósitos de la presente invención, solo se unirá a través de dos de los grupos funcionales a los componentes del conjugado ligando-fármaco o intermediario de este. La unidad de unión covalente puede ser de uno o más (por ejemplo, 1-10, preferentemente, 1, 2, 3 o 4) aminoácidos, aminoalcoholes, aminoaldehídos, diaminas naturales o no naturales o un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o diamina natural o no natural. En algunos aspectos, la unidad de unión covalente es un aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o diamina natural o no natural. Los aminoácidos ilustrativos que pueden actuar como unidades de unión covalente incluyen la p-alanina.
En algunas modalidades, la unidad de unión covalente tiene la fórmula que se indica a continuación:
en donde R111 es p-hidroxibencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2 , -(CH2)4NH2 , -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-,
cada R100 se selecciona independientemente de hidrógeno o -alquilo C1-C3, preferentemente hidrógeno o CH3; y
c es un número entero seleccionado independientemente de 1 a 10, preferentemente de 1 a 3
Una unidad de unión covalente representativa que tiene un grupo carbonilo para la unión a la unidad escindible es la siguiente:
en donde R13 es -alquileno C1-C6-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heteroalquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-. En modalidades preferidas R13 es -alquileno C1-C6.
Una unidad de unión covalente representativa que tiene un grupo carbonilo para la unión a la unidad escindible es la siguiente:
en donde R13 es -alquileno C1-C6-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heteroalquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-. En modalidades preferidas R13 es -alquileno C1-C6.
Una unidad de unión covalente representativa que tiene un grupo NH para unirse a una unidad escindible es la siguiente:
en donde R13 es -alquileno C1-C6-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heteroalquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-. En modalidades preferidas R13 es -alquileno C1-C6.
Una unidad de unión covalente representativa que tiene un grupo NH para la unión a la unidad escindible es la siguiente:
en donde R13 es -alquileno C1-C6-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heteroalquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-. En modalidades preferidas R13 es -alquileno C1-C6.
Las modalidades seleccionadas de unidades de unión covalente incluyen las siguientes, en donde la línea ondulada adyacente al nitrógeno indica la unión covalente a LP (o AD o A) y la línea ondulada adyacente al carbonilo indica la unión covalente a la unidad escindible y m es un número entero que varía de 1 a 6 , preferentemente de 2 a 6 , con mayor preferencia de 2 a 4.
En algunos aspectos, la unidad de unión covalente es un heteroalquileno C1-8 opcionalmente sustituido.
En algunos aspectos, particularmente aquellos en donde la unidad de unión covalente forma un enlace con un átomo de azufre de una unidad conectora en paralelo, una unidad de ramificación o una unidad de unión al fármaco, la unidad de unión covalente formará un enlace con el átomo de azufre a través de un grupo maleimida de la unidad de unión covalente. Las unidades de unión covalente representativas de esta modalidad incluyen aquellas dentro de los corchetes de las Fórmulas XXIII y XXIV, en donde la línea ondulada indica una unión a la unidad escindible como se define en este documento y el asterisco indica una unión al átomo de azufre de la unidad conectora en paralelo, la unidad de ramificación, o la unidad de unión al fármaco, y R17' es -alquileno C1-C10-, heteroalquileno C1-C10-, -carbociclo C3-C8-, -O-(alquilo C1-C8)-, -arileno-, -alquileno C1-C10-arileno, arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-C(=O)-, heteroalquileno C1-C10-C(=O)-, -carbociclo C3-C8-C(=O)-, -O-(alquilo C1-C8)-C(=O)-, -arileno-C(=O)-, -alquileno C1-C10-arileno-C(=O)-, -arileno-alquileno C1-C10-C(=O)-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-C(=O)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-C(=O)-, -heterociclo C3-C8-C(=O)-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-C(=O)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-C(=O)-, -alquileno C1-C10 -NH-, heteroalquileno C1-C10 -NH-, -carbociclo C3-C8-NH-, -O-(alquilo C1-C8)-NH-, arileno-NH-, -alquileno C1-C10-arileno-NH-, arileno-alquileno C1-C10-NH-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-NH-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-NH-, -heterociclo C3-C8 -NH-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-NH-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-NH-, -alquileno C1-C10-S-, heteroalquileno C1-C10-S -, -carbociclo-C3-C8 -S -, -O-(alquilo C1-C8)-S-, -arileno-S-, -alquileno C1-C10-arileno-S-, arileno-alquileno C1-C10-S-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-S-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10 -S-, -heterociclo C3-C8 -S-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-S-, o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-S-. Los sustituyentes R17' pueden estar opcionalmente sustituidos. En algunos aspectos, los sustituyentes R17' no estarán sustituidos. En algunos aspectos, los grupos R17' están opcionalmente sustituidos con una unidad básica, por ejemplo -(CH2)xNH2, -(CH2)xNHRa, y -(CH2)xNRa2, en donde x es un número entero de 1 a 4 y cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6, o dos grupos Ra se combinan con el nitrógeno al que están unidos para formar un grupo azetidinilo, pirrolidinilo o piperidinilo.
Una unidad de unión covalente ilustrativa es la de fórmula XXIII en donde R17' es -alquileno C2-C5-C(=O)- en donde el alquileno está opcionalmente sustituido con una unidad básica, por ejemplo -(CH2)xNH2, -(CH2)xNHRa’ y -(CH2)xNRa2, en donde x es un número entero que varía de 1 a 4, y cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-6 y haloalquilo C1-6, o dos grupos Ra se combinan con el nitrógeno al que están unidos para formar un grupo azetidinilo, pirrolidinilo o piperidinilo. Las modalidades ilustrativas son las siguientes:
Se entenderá que la succinimida sustituida representada anteriormente puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua mediante uno de los enlaces carbonilo-nitrógeno y no de ambos).
Se entenderá que el grupo amino de la unidad de extensión puede estar protegido por un grupo protector de amino, por ejemplo, un grupo protector lábil en ácido (por ejemplo, BOC).
En aspectos preferidos de la presente invención, la unidad de unión covalente tiene una masa de no más de aproximadamente 1000 daltons, no más de aproximadamente 500 daltons, no más de aproximadamente 400 daltons, no más de aproximadamente 300 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 500 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 500 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 400 daltons, de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 300 daltons o de aproximadamente 10, 50 o 100 daltons a aproximadamente 200 daltons.
Soportes de conjugación PEGilados
Como apreciará el experto en la técnica, el tamaño de la unidad de PEG que se seleccionará para su uso en la presente invención dependerá de la hidrofobicidad de los componentes del fármaco y los enlazadores de su porción de enlazador-fármaco antes de la adición de la unidad de PEG. Los compuestos intermediarios de las fórmulas DD, X, XI o XII pueden actuar como soportes de conjugación PEGilados que se pueden usar para seleccionar combinaciones de fármacos y unidades de PEG que dan como resultado ADC que tienen mejores parámetros PK y/o una mínima agregación. Los soportes de conjugación PEGilados permiten una plataforma para la optimización del número de subunidades de PEG para un enlazador-fármaco dado.
Los soportes de conjugación PEGilados se diseñan específicamente para permitir la conjugación paralela de diferentes porciones de fármaco y PEG para examinar la capacidad de PEG para enmascarar la hidrofobicidad y mejorar los parámetros PK para una amplia variedad de enlazadores-fármacos convencionales (es decir, enlazadores-fármacos que no contienen una unidad de PEG conectada en paralelo según la presente invención). Es conveniente seleccionar una unidad de PEG de tamaño suficiente que enmascare la hidrofobicidad del enlazadorfármaco pero que no sea demasiado grande como para afectar negativamente la capacidad del conjugado ligandofármaco para difundirse al sitio objetivo o para entrar en las células objetivo y liberar el fármaco.
En modalidades particularmente preferidas, los enlazadores-fármacos convencionales que se usarán para la optimización de PEG son aquellos que tienen un grupo reactivo para conjugar con un grupo tiol de un anticuerpo, por ejemplo, enlazadores-fármacos que contienen maleimido y una unidad de ensamblaje liberable X que puede ser escindida por una proteasa. En consecuencia, las unidades X-D ilustrativas que tienen una unidad de ensamblaje liberable X que puede ser escindida por una proteasa para su uso con los soportes de conjugación incluyen las siguientes, en donde D es cualquier unidad de fármaco como se describe en el presente documento:
y
En otras modalidades particularmente preferidas, los enlazadores-fármacos convencionales que se utilizarán para la optimización de PEG son aquellos que tienen un grupo reactivo para conjugar con un grupo tiol y un anticuerpo, por ejemplo, enlazadores-fármacos que contienen maleimido y una unidad de ensamblaje liberable X que puede ser escindida por una glicosidasa. Por consiguiente, las unidades X-D ilustrativas que tienen una unidad de ensamblaje liberable X que puede ser escindida por una glicosidasa para su uso con los soportes de conjugación incluyen las siguientes, en donde D es cualquier unidad de fármaco como se describe en el presente documento:
En modalidades en donde los enlazadores-fármacos que se utilizarán para la optimización de PEG son aquellos que tienen un grupo reactivo para conjugar con un grupo aceptor de tiol tal como una porción de maleimida, el soporte de conjugación tendrá un residuo que contiene tiol protegido que cuando se desprotege puede producir una unión covalente con el grupo aceptor de tiol del enlazador-fármaco. El residuo que contiene tiol protegido puede ser un componente de la unidad conectora en paralelo (o la unidad de ramificación o la unidad de unión a fármacos). Un soporte de conjugado PEGilado ilustrativo tiene fórmula DD en donde la unidad LP' comprende un aminoácido que tiene la siguiente fórmula:
en donde,
el subíndice n es un número entero que varía de 1 a 4;
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-3, fenilo o heterociclo C2-C5 (preferentemente hidrógeno, metilo, etilo o propilo); y
Rpr es un grupo protector de tiol adecuado.
Un soporte de conjugado PEGilado ilustrativo tiene fórmula DD en donde la unidad LP' comprende cisteína, homocisteína o penicilamina protegidas. Son adecuados los isómeros D o L de los aminoácidos. Un aminoácido ilustrativo para su uso como unidad de LP' es la cisteína, como se muestra a continuación, con t-butiltio como grupo protector adecuado.
Ejemplos de soportes de conjugación PEGilados en un compuesto intermediario ligando-enlazador adecuadamente protegido incluyen lo siguiente:
Otros ejemplos de soportes de conjugación PEGilados en un compuesto intermediario ligando-enlazador adecuadamente protegido incluyen los siguientes:
Los soportes de conjugación PEGilados ilustrativos, después de la conjugación con enlazadores-fármacos, proporcionan conjugados ligando-fármaco de la siguiente manera:
Los soportes de conjugación intermediarios ilustrativos tienen fórmula (CC) en donde la unidad LP' comprende un aminoácido que tiene la siguiente fórmula:
en donde,
el subíndice n es un número entero que varía de 1 a 4;
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-3, fenilo o heterociclo C2-C5 (preferentemente hidrógeno, metilo, etilo o propilo); y
Rpr es un grupo protector de tiol adecuado.
A continuación, se muestran ejemplos de soportes de conjugados PEGilados intermediarios en compuestos intermediarios enlazadores adecuadamente protegidos:
Un soporte de conjugado PEGilado ilustrativo puede ser de fórmula XI en donde la unidad LP' y la unidad AD' de unión al fármaco comprenden cada una un aminoácido seleccionado independientemente que tiene la siguiente fórmula:
en donde,
el subíndice n es un número entero que varía de 1 a 4;
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-3, fenilo o heterociclo C2-C5 (preferentemente hidrógeno, metilo, etilo o propilo); y
Rpr es un grupo protector de tiol adecuado.
A continuación, se muestran ejemplos de soportes de conjugados PEGilados de Fórmula XI en un compuesto intermediario ligando-enlazador adecuadamente protegido:
Los soportes de conjugación PEGilados ilustrativos, después de la conjugación con enlazadores-fármacos, proporcionan conjugados ligando-fármaco de fórmula II:
Para los soportes e intermediarios de conjugación PEGilados, la unidad de extensión, Z o Z, PEG, el Ligando, el grupo protector RPR y el subíndice p son como se describe en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento. En aspectos ilustrativos, la unidad de extensión es una unidad de extensión que contiene maleimido como se describe en el presente documento. En modalidades ilustrativas, la unidad de PEG tiene de 6 a 72, 10 a 72 o 12 a 72 subunidades y la unidad de extensión es una unidad de extensión que contiene maleimido como se describe en este documento y cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento para XVa.
Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para seleccionar una unidad de PEG para su uso en un conjugado ligando-fármaco, los métodos comprenden las etapas de (i) proporcionar un soporte de conjugación que tiene la fórmula (DD) en donde la unidad conectora en paralelo comprende una cisteína con tiol protegido, (ii) eliminar el grupo protector de la cisteína con tiol protegido para formar un soporte de conjugación desprotegido que tiene un tiol libre, (iii) poner en contacto el soporte de conjugación desprotegido con un enlazador-fármaco que tiene un grupo funcional para la unión covalente con el tiol libre en condiciones para formar un conjugado ligando-fármaco. Los métodos pueden comprender además analizar los parámetros PK del conjugado ligando-fármaco resultante (ver, por ejemplo, los ejemplos 8 o 21). Se proporcionan, además, conjugados ligando-fármaco producidos mediante tales métodos.
Se proporcionan, además, métodos para seleccionar una unidad de PEG para su uso en un conjugado ligandofármaco, los métodos comprenden las etapas de (i) proporcionar un soporte de conjugación que tiene la fórmula XI o XII en donde la unidad conectora en paralelo y la(s) unidad(es) de unión al fármaco comprenden una cisteína con tiol protegido, (ii) eliminar el grupo protector de la cisteína con tiol protegido para formar un soporte de conjugación desprotegido que tiene un tiol libre, (iii) poner en contacto el soporte de conjugación desprotegido con un enlazadorfármaco que tiene un grupo funcional para la unión covalente con el tiol libre en condiciones para formar un conjugado ligando-fármaco. Los métodos pueden comprender además analizar los parámetros PK del conjugado ligando-fármaco resultante (véase, por ejemplo, el ejemplo 21). Se proporcionan, además, conjugados ligandofármaco producidos mediante tales métodos.
Carga de fármacos
Con referencia en general a los conjugados ligando-fármaco de fórmulas I, II, III y AA, el número de unidades enlazador-fármaco por ligando se representa por p. Cuando se hace referencia a conjugados ligando-fármaco
individuales en una población de tales conjugados, p es un número entero que representa el número de moléculas de enlazador-fármaco por ligando. Cuando se hace referencia a una composición que contiene múltiples conjugados (es decir, una composición de LDC), p representa el número promedio de enlazadores-fármacos por ligando y es más típicamente un número no entero. En aquellos casos en los experimentos que describen composiciones de LDC compuestas por conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) donde se hace referencia a una carga de fármaco de un número específico de unidades de fármaco/anticuerpo (por ejemplo, 8 cargas, 16 cargas o 32 cargas), ese valor se refiere a la carga promedio de fármaco, así como a la carga de fármaco del ADC predominante en la composición, que depende del número de sitios reactivos en el anticuerpo que reaccionarán con un compuesto enlazador-fármaco o, cuando corresponda, con un ligando intermediario seguido de la introducción de -X-D. En una población de conjugados ligando-fármaco, puede haber un promedio de 1 a 14 enlazadores-fármacos por ligando, un promedio de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, aproximadamente 6 a aproximadamente 12, aproximadamente 6 a aproximadamente 10, aproximadamente 8 a aproximadamente 14, aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o aproximadamente 8 a aproximadamente 10 unidades de enlazador-fármaco por ligando. Una unión ilustrativa al ligando es mediante enlaces tioéter. Los sitios de conjugación ilustrativos en un ligando son el tiol de residuos con disulfuro intercatenarios y/o residuos introducidos en el ligando como las cisteínas introducidas. Cuando se hace referencia a modalidades en donde la carga de fármaco promedio es de aproximadamente 8 , 10, 12, 14, 16 o 32, el valor de 8, 10, 12, 14, 16 o 32 también se refiere típicamente a la carga de fármaco del conjugado ligando-fármaco predominante en la composición. De manera similar, cuando se hace referencia a modalidades en donde hay un promedio de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o aproximadamente 8 a aproximadamente 10 unidades de enlazador-fármaco por ligando, ese valor típicamente también se refiere a la carga de enlazador-fármaco del ADC predominante en la composición.
El número promedio de unidades enlazador-fármaco por unidad de ligando en una preparación a partir de una reacción de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA, HIC y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los conjugados ligandoenlazador-fármaco en términos de p. En algunos casos, la separación, la purificación y la caracterización de los conjugados ligando-fármaco homogéneos, en donde p es un cierto valor del conjugado ligando-fármaco con otras cargas de fármaco, puede lograrse por medios como HPLC de fase inversa o electroforesis.
Composiciones
La presente invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los conjugados ligando-fármaco descritos en el presente documento. Por ejemplo, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un conjugado ligando-fármaco de fórmula AA, I, II o III, y cualquiera de sus modalidades seleccionadas. Las variables son como se definen en el presente documento en cualquiera de las modalidades.
Cuando las fórmulas AA, I, II o III no representan compuestos LDC individuales sino una composición de LDC (es decir, una composición que comprende una población de conjugados ligando-fármaco), el subíndice p representa el número promedio de moléculas de enlazador-fármaco por molécula de ligando (por ejemplo, molécula de anticuerpo) en la composición. Se entenderá que las composiciones pueden comprender una colección (o una población) de conjugados ligando-fármaco que tienen varios números de enlazadores-fármacos unidos a ellos (por ejemplo, de 1 a 14, 2 a 12, 4 a 12, 6 a 12, 8 a 12) para alcanzar un valor p promedio. Alternativamente, la composición puede comprender una colección (o una población) de conjugados ligando-fármaco que tienen el mismo o sustancialmente el mismo número de enlazadores-fármacos unidos a ellos (de 1 a 14) para alcanzar un valor p promedio. Los términos colección o población se utilizan como sinónimos en este contexto. Dentro de una composición puede haber un pequeño porcentaje de anticuerpo no conjugado que también se refleja en el valor p promedio. Para una composición que comprende una población de conjugados ligando-fármaco de la presente invención, puede haber un promedio de 1 a 14 enlazadores-fármacos por ligando, un promedio de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, aproximadamente 6 a aproximadamente 12, aproximadamente 6 a aproximadamente 10, aproximadamente 8 a aproximadamente 14, aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o aproximadamente 8 a aproximadamente 10 unidades de enlazador-fármaco por ligando. El uso de PEG como se enseña en la presente invención es particularmente adecuado para conjugados ligando-fármaco que tienen altas cargas de fármaco, por ejemplo, una carga de fármaco promedio de al menos aproximadamente 6 , con mayor preferencia al menos aproximadamente 8 enlazadores-fármacos por ligando en donde cada enlazador-fármaco tiene una o más porciones -X-D, preferentemente 1, 2 o 4. Por consiguiente, las composiciones proporcionadas en el presente documento tendrán preferentemente una carga promedio de enlazador-fármaco de al menos aproximadamente 8 moléculas de enlazador-fármaco por ligando en la composición y preferentemente tendrán de aproximadamente 8, 10 , 12 o 16 a aproximadamente 32 unidades de fármaco por unidad de ligando.
Las composiciones son composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados ligando-fármaco descritos en la presente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado de fórmula I, II o III y cualquiera de sus modalidades seleccionadas. En algunos aspectos, la composición farmacéutica estará en forma líquida. En algunos aspectos, será un polvo liofilizado.
Las composiciones, incluidas las composiciones farmacéuticas, se pueden proporcionar en forma purificada. Como se usa en el presente documento, "purificado" significa que cuando se aísla, el aislado contiene al menos 95 %, y en otro aspecto, al menos 98 % de conjugado en peso del aislado.
Farmacocinética
Como se señaló anteriormente, los presentes inventores han descubierto que el perfil farmacocinético de ciertos conjugados ligando-fármaco puede modificarse significativamente por la adición de una unidad de PEG. En ciertos casos, la disposición de PEG en una orientación paralela con la unidad de ligando y la unidad de fármaco disminuye la eliminación plasmática del conjugado ligando-fármaco y aumenta la exposición en plasma, lo que mejora la actividad farmacológica que se desea de tales conjugados. Sorprendentemente, la disposición de una unidad de PEG en una orientación en serie con la unidad de ligando y la unidad de fármaco no proporcionó la misma mejora en los efectos farmacocinéticos y, en ciertos casos, en realidad aumentó la eliminación y disminuyó la exposición relativa en relación con su contraparte no PEGilada. Hasta la presente invención, los esfuerzos para disminuir la hidrofobicidad a través de la PEGilación de un compuesto hidrófobo no han tenido en cuenta los efectos de orientación de la unidad de PEG.
Hay muchas formas de medir los parámetros farmacocinéticos de un conjugado ligando-fármaco. Un método consiste en determinar la concentración de conjugado ligando-fármaco, es decir, la cantidad de conjugado ligandofármaco en un volumen dado de plasma o suero en un determinado momento. Otro método es determinar la eliminación del fármaco, es decir, el volumen de plasma (o suero) donde se ha eliminado el conjugado ligandofármaco por unidad de tiempo. Un tercer método consiste en determinar el área bajo la curva (AUC), es decir, la integral de la curva de concentración-tiempo. La concentración, la eliminación y el AUC se pueden determinar mediante un gráfico de la concentración sérica (o plasmática) de anticuerpo total (|jg/ml) a lo largo de la ordenada (eje Y) con relación al tiempo (días) a lo largo de la abscisa (eje X) después de la administración del agente de interés a un sujeto. Por ejemplo, en un método, los parámetros farmacocinéticos se miden al inyectar a los ratones una dosis de (i) ligando no conjugado, (ii) un conjugado ligando-fármaco de la presente invención, y (iii) un conjugado de comparación ligando-fármaco, y extraer muestras de sangre en varios puntos de tiempo después de la inyección (por ejemplo, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 y 56 días) y aislar el suero. Las concentraciones en suero (o plasma) se pueden medir mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las concentraciones en suero (o plasma) se pueden medir mediante ELISA sándwich para el ligando total (por ejemplo, anticuerpo) mediante el uso de un mecanismo de detección apropiado. Los datos de concentración en suero (o plasma) para cada animal se pueden analizar mediante el uso del software apropiado para obtener los valores de concentración, eliminación del fármaco y AUC en ciertos puntos de tiempo. En otra modalidad, los datos farmacocinéticos pueden generarse mediante el uso de conjugados radiomarcados. Por ejemplo, se puede dosificar a los animales con ligando o conjugado ligando-fármaco radiomarcados y las concentraciones plasmáticas (o séricas) se miden mediante conteo de centelleo líquido. En algunas modalidades, el modelo animal utilizado será un modelo de rata.
En algunas modalidades, el perfil farmacocinético de un conjugado ligando-fármaco de la presente invención se parece al de su ligando no conjugado. En consecuencia, en la presente se proporcionan conjugados ligandofármaco que tienen un valor de eliminación dentro de aproximadamente 3x o dentro de aproximadamente 2x el valor de eliminación del ligando no conjugado y/o un valor de AUC que es al menos 25 % o al menos 30 % del valor de AUC del ligando no conjugado (por ejemplo, ver la tabla 2).
En algunas modalidades, el perfil farmacocinético de un conjugado ligando-fármaco de la presente invención mejora con relación a un conjugado de comparación. Por consiguiente, en la presente descripción se proporcionan conjugados ligando-fármaco que tienen un valor de concentración, un valor de eliminación y/o un valor de AUC mejorados con relación a un conjugado de comparación (es decir, que no tiene una unidad de PEG en orientación paralela a una porción de enlazador-fármaco). El término valor de eliminación mejorado, quiere decir que el conjugado ligando-fármaco tiene una eliminación que es al menos 2 veces o al menos 3 veces mejor que el valor de eliminación del conjugado de comparación (por ejemplo, un valor de 14,2 ml/día/kg en comparación con un valor de 48,6 o 57,8 ml/día/kg). El término valor de AUC mejorado, quiere decir que el conjugado ligando-fármaco tiene un valor de AUC que es al menos 2 veces o al menos 3 veces mejor que el valor de AUC del conjugado de comparación (por ejemplo, un valor de 229,7 días*pg/ml en comparación con un valor de 67 o 52 días*pg/ml).
El conjugado de comparación puede ser el mismo conjugado o sustancialmente similar que carece de la unidad de PEG, el mismo conjugado o sustancialmente similar que carece de una unidad de PEG colocada en una orientación paralela pero que contiene una unidad de PEG colocada en una orientación en serie en relación con la unidad de ligando y la unidad de fármaco. En algunas modalidades, el conjugado de comparación es un conjugado que comprende la misma unidad de fármaco y que no tiene unidad de PEG (es decir, un conjugado igual o sustancialmente similar sin la unidad de PEG) o que tiene una unidad de PEG que se coloca en una orientación en serie en relación con la unidad de ligando y la unidad de fármaco (es decir, el mismo conjugado o sustancialmente el mismo conjugado con una unidad de PEG pero no colocado en una orientación paralela) Generalmente, el conjugado ligando-fármaco y el conjugado de comparación tienen la misma carga de fármaco (número promedio de fármacos por unidad de ligando en la composición).
Como se usa en este documento, la frase "conjugado igual o sustancialmente similar que carece de la unidad de PEG" generalmente se refiere a un conjugado que comprende la misma o sustancialmente la misma unidad de ligando, unidad de fármaco y unidad enlazadora (por ejemplo, unidad de extensión y unidad de ensamblaje liberable) pero falta la unidad conectora en paralelo LP y la unidad de PEG. Para que un conjugado de comparación que carece de la unidad de PEG se asemeje más a un conjugado ligando-fármaco de la presente invención, el conjugado de comparación comprenderá la misma unidad de ligando, unidad de fármaco, unidad de ensamblaje liberable, unidad de extensión y unidad conectora en paralelo (y unidad AD o A si es apropiado). Sin embargo, la unidad conectora en paralelo no se unirá a una unidad de PEG, sino que terminará en un grupo funcional, como, por ejemplo, un grupo acetilo (ver, por ejemplo, el compuesto 44 en los ejemplos).
Como se usa en el presente documento, la frase "el mismo conjugado o sustancialmente el mismo que carece de una unidad de PEG colocada en una orientación paralela pero que contiene una unidad de PEG colocada en una orientación en serie en relación con la unidad de ligando y la unidad de fármaco" (es decir, el mismo conjugado o sustancialmente el mismo que tiene una unidad de PEG pero no colocada en una orientación paralela) generalmente se refiere a un conjugado que comprende la misma o sustancialmente la misma unidad de ligando, unidad de fármaco y unidad enlazadora (por ejemplo, unidad de extensión y unidad de ensamblaje liberable) pero que carece de la unidad conectora en paralelo LP y la unidad de PEG unida a ella en configuración en paralelo e incluye una unidad de PEG en el enlazador en una orientación en serie con la unidad de ligando y la unidad de fármaco.
El término "sustancialmente el mismo" en este contexto significa que puede haber algunas variaciones menores, pero tales variaciones son principalmente para facilitar la síntesis química y la unión de los diversos componentes del conjugado. Consulte la sección de ejemplos para ver ejemplos de conjugados de comparación que no tienen PEG o que tienen una unidad de PEG en una orientación en serie en comparación con un conjugado de la presente invención que tiene una unidad de PEG en una orientación paralela.
Los conjugados ligando-fármaco que muestran una eliminación plasmática significativamente mayor y una exposición plasmática correspondientemente menor en relación con el ligando no conjugado se beneficiarán de la presente invención, ya que pueden modificarse como se describe en el presente documento para incluir una unidad de PEG. La eliminación plasmática significativamente mayor en relación con el ligando no conjugado se refiere a un valor de eliminación que es mayor que 2x, mayor que 3x o mayor que 4x del valor de eliminación plasmática para el ligando no conjugado (ver, por ejemplo, la tabla 2). Una menor exposición plasmática en relación con el ligando no conjugado se refiere a un valor de AUC que es 30 % o menos, 25 % o menos, o 20 % o menos que el AUC del ligando no conjugado (ver, por ejemplo, la tabla 2 ).
En algunas modalidades, en la presente descripción se proporcionan conjugados ligando-fármaco que tienen un valor de eliminación dentro de aproximadamente 3x o dentro de aproximadamente 2x del valor de eliminación del ligando no conjugado y/o un valor de AUC que es al menos 25 % o al menos 30 % del valor de AUC del ligando no conjugado.
En algunas modalidades, un fármaco que se utilizará como unidad de fármaco en la presente invención es uno que cuando se conjuga con un ligando como un conjugado ligando-fármaco que carece de PEG o que comprende PEG en una orientación en serie produce un conjugado ligando-fármaco que muestra una eliminación plasmática significativamente mayor y una exposición plasmática correspondientemente menor en relación con el ligando no conjugado. La eliminación plasmática significativamente mayor en relación con el ligando no conjugado se refiere a un valor de eliminación que es mayor que 2x, mayor que 3x o mayor que 4x del valor de eliminación plasmática para el ligando no conjugado (ver, por ejemplo, la tabla 2). Una menor exposición plasmática en relación con el ligando no conjugado se refiere a un valor de a Uc que es 30 % o menos, 25 % o menos, o 20 % o menos que el AUC del ligando no conjugado (ver, por ejemplo, la tabla 2 ).
Los conjugados ligando-fármaco que tienen una unidad de fármaco hidrófoba o enlazadores-fármacos hidrófobos se beneficiarán de la presente invención ya que pueden modificarse como se describe en este documento para incluir una unidad de PEG y sus parámetros farmacocinéticos pueden mejorar por la aplicación de la presente invención. En modalidades preferidas, el ligando es un anticuerpo.
Agregación
Los presentes inventores también han descubierto que la agregación de ciertos conjugados ligando-fármaco puede reducirse significativamente mediante la adición de una unidad de PEG en una orientación paralela a una porción de enlazador-fármaco hidrófoba.
En algunas modalidades, un fármaco que se utilizará en la presente invención es uno que cuando se conjuga con un ligando como un conjugado ligando-fármaco que carece de PEG o que comprende PEG en una orientación en serie y que tiene un promedio de 4, 8 o 16 fármacos por ligando produce un conjugado ligando-fármaco que tiene niveles de agregación medidos por SEC de 4 % o más, 5 % o más, o 10 % o más.
La presente invención proporciona poblaciones de conjugados ligando-fármaco que tienen un promedio de 8 fármacos por unidad de ligando o más, 10 fármacos por anticuerpo o más, 12 fármacos por anticuerpo o más, 16 fármacos por anticuerpo o más, o 32 fármacos por anticuerpo, que tienen un nivel de agregación de aproximadamente 1 % o aproximadamente 2 % o aproximadamente 3 % (por ejemplo, fórmula de 1 o II en donde p es 4 u 8 , m es 1, s es cero y t es cero; fórmula II en donde p es 8 , m es 2, s es 1 y t es cero)
En aspectos preferidos, la unidad de ligando es un anticuerpo.
Modalidades seleccionadas
Las unidades -X-D ilustrativas de la presente invención incluyen las siguientes, en donde la línea ondulada indica un covalente unido a la unidad LP, A o Ad , según sea el caso:
Se entenderá que la succinimida sustituida representada anteriormente puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua mediante uno de los enlaces carbonilo-nitrógeno y no de ambos).
Los ejemplos de compuestos enlazador-fármaco de la presente invención incluyen los representados por las siguientes estructuras:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde la unidad de PEG es como se describe en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento y puede ser dispersiva o no dispersiva, y n es un número entero que varía de 6 a 72, 8 a 72, 10 a 72, 12 a 72, 12 a 38, 12 a 36, 6 a 24, o con la máxima preferencia 8 a 24 o 12 a 24; RPR es hidrógeno o un grupo protector, por ejemplo, un grupo protector lábil en ácido, por ejemplo, BOC. En algunas modalidades, n es 8 , 10, 12 o 24. Para una población de conjugados ligando-fármaco (es decir, una composición de LDC) preparada mediante el uso de un precursor de unidad de PEG dispersiva, ese precursor tiene preferentemente un PM promedio máximo correspondiente a una unidad de PEG que tiene de aproximadamente 6 a 72, 8 a 72, 10 a 72, 12 a 72, 12 a 38, 12 a 36, 6 a 24, o con la máxima preferencia de 8 a aproximadamente 24 subunidades o de aproximadamente 12 a aproximadamente 38 subunidades. Cuando PEG no es dispersivo, entonces cada LDC de una composición de LDC tendrá típicamente una unidad de PEG que tiene el mismo número de subunidades de PEG (-OCH2CH2), es decir, el mismo valor entero de n. Una unidad de PEG no dispersiva puede, por ejemplo, tener la estructura de
en donde R21 es una unidad de bloqueo de PEG, preferentemente -CH3 o -CH2CH2CO2H, y n es un número entero que varía de 8 a 12, de 8 a 24 o de 12 a 38.
Ejemplos de compuestos enlazador-fármaco de la presente invención que proporcionan 2X la carga de fármaco incluyen los representados por las siguientes estructuras
y aquellas estructuras en las que mc-VC-PAB-D se reemplaza con mc-VA-PAB-D o mc-VA-D o cualquier otra unidad X-D;
en donde RPR es hidrógeno o un grupo protector, por ejemplo, un grupo protector lábil en ácido, por ejemplo, BOC; mc-VC-PAB-D tiene la estructura de
mc-VA-PAB-D tiene la estructura de
mc-VA-D tiene la estructura de
; y
MDpr-PAB(gluc)-D tiene la estructura de
en donde mc-VC-PAB-D, mc-VA-PAB-D, mc-VA-D y MDpr-PAB(gluc)-D son porciones -X-D ilustrativas unidas a un soporte PEGilado, y en donde la línea ondulada indica una unión covalente del anillo de succinimida de mc o MDpr al azufre del soporte PEGilado;
y PEG es como se describe en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento y puede ser dispersivo cuando se describe una población de LDC preparada con el uso de un precursor de una unidad de PEG dispersiva, en donde el precursor de unidades de PEG dispersivas tiene preferentemente un PM promedio máximo correspondiente a una unidad de PEG con n de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 subunidades o de aproximadamente 12 a aproximadamente 38 subunidades o no es dispersiva (como se define por una unidad de PEG que tiene un valor entero de n
en donde cada LDC de una composición de LDC tendrá una unidad de PEG que tiene el mismo valor entero de n). En algunas modalidades, una unidad de PEG no dispersiva tiene la estructura de
, en donde R21 es una unidad de bloqueo de PEG, preferentemente -CH3 o -CH2CH2CO2H, la línea ondulada indica una unión covalente de la unidad de PEG al soporte PEGilado y n es un número entero que varía de 8 a 24 o de 12 a 38.
En algunas modalidades, una porción mc en mc-VC-PAB-D, mc-VA-D y mc-VA-PAB-D, en donde la porción mc tiene la estructura de
en donde la línea ondulada a la porción de succinimida indica una unión covalente al soporte PEGilado y la línea ondulada al carbonilo indica una unión covalente al resto de -X-D, en cualquiera de las estructuras anteriores donde está presente esa porción mc se reemplaza con la porción MDpr, que tiene la estructura de
en donde RPR es hidrógeno o un grupo protector, para proporcionar MDpr-VC-PAB-D, MDpr-VA-D y MDpr-VA-PAB-D, que son porciones -X-D ilustrativas adicionales.
Se entenderá que la succinimida sustituida en MDpr en cualquiera de las porciones -X-D que contienen MDpr puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno y no de ambos enlaces carbonil-nitrógeno). Una porción -X-D compuesta por mc también puede tener su anillo de succinimida en forma hidrolizada.
Otros ejemplos de compuestos enlazador-fármaco de la presente invención que proporcionan 2X la carga de fármaco incluyen los siguientes
en donde mc-VA-D, mc-VC-PABA-D, mc-VA-PABA-D y MDpr-PAB(gluc)-D son porciones -X-D ilustrativas como se describe para las estructuras con carga de fármaco 2X anteriores y en donde PEGa y PEGb, seleccionados independientemente, son como se describen en cualquiera de las modalidades para las unidades de PEG proporcionadas en este documento y pueden ser dispersivas cuando se hace referencia a una población de conjugados ligando-fármaco (es decir, una composición de LDC) preparados mediante el uso de un precursor de unidades de PEG dispersivas, en donde el precursor de la unidad de PEG dispersiva tiene preferentemente un PM promedio máximo correspondiente a una unidad de PEG con n de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 subunidades o de aproximadamente 12 a aproximadamente 38 subunidades, o PEGa no es dispersiva (es decir, una unidad de PEG que tiene un número discreto de subunidades de PEG identificadas por un valor entero de modo que cada LDC de una composición de LDC compuesta por ese ADC tendrá una unidad de PEG que tiene el mismo valor entero de n). En algunas modalidades, PEGa es una unidad de PEG no dispersiva que tiene la estructura de
y/o PEGb es una unidad de PEG no dispersiva que tiene la estructura de
en donde cada R21 es una unidad de bloqueo de PEG seleccionada independientemente, y cada caso de n seleccionado independientemente es un número entero que varía de 8 a 24 o de 12 a 38. En una modalidad preferida, un R21 es -CH3 y el otro es -CH2CH2CO2H.
En algunas modalidades, la porción mc, que tiene la estructura de
en cualquiera de las estructuras anteriores donde esa porción está presente se reemplaza con la porción MDpr, que tiene la estructura de
Rpr
donde RPR es hidrógeno o un grupo protector, para proporcionar MDpr-VC-PAB-D, MDpr-VA-D y MDpr-VA-PAB-D como -X-D,
En otras modalidades, la porción MDpr en la estructura anterior donde esa porción está presente se reemplaza con la porción mc para proporcionar mc-PAB(gluc)D como -X-D.
Se entenderá que la succinimida sustituida en MDpr en cualquiera de las porciones -X-D que contienen MDpr puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno y no de ambos enlaces carbonil-nitrógeno). Una porción -X-D compuesta por mc también puede tener su anillo de succinimida en forma hidrolizada.
Ejemplos de compuestos enlazador-fármaco de la presente invención que proporcionan 4X la carga de fármaco incluyen los siguientes
en donde mc-VC-PAB-D se describe para las estructuras con carga de fármaco 2X anteriores; y PEG es como se describe en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento y puede ser dispersivo cuando se hace referencia a una población de conjugados ligando-fármaco (es decir, una composición de LDC) preparada mediante el uso de un precursor de unidades de PEG dispersivas en donde el precursor de unidades de PEG dispersivas preferentemente tiene un PM promedio máximo correspondiente a una unidad de PEG con n de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 subunidades o de aproximadamente 12 a aproximadamente 38 subunidades, o no es dispersiva (es decir, una unidad de PEG que tiene un número discreto de subunidades de PEG identificadas por un valor entero de modo que cada LDC de una composición de LDC compuesta por ese ADC tendrá una unidad de PEG con el mismo valor entero si existe n). En algunas modalidades, una unidad de PEG no dispersiva tiene la estructura de
en donde R21 es una unidad de bloqueo de PEG, la línea ondulada indica una unión covalente al soporte PEGilado y n es un número entero que varía de 8 a 24 o de 12 a 38. Preferentemente R21 es -CH3 o -CH2CH2CO2H.
En algunas modalidades, el mc-VC-PAB-D como la porción -X-D se reemplaza con cualquiera de las porciones -X-D descritas en este documento, incluidos MDpr-VC-PAB-D, mc-VA-PAB-D y MDpr-VA-PAB-D.
Se entenderá que la succinimida sustituida en MDpr en cualquiera de las porciones -X-D que contienen MDpr puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno y no de ambos enlaces carbonil-nitrógeno). Una porción -X-D compuesta por mc también puede tener su anillo de succinimida en forma hidrolizada.
Otros compuestos enlazador-fármaco ilustrativos de la presente invención que proporcionan 4X la carga de fármaco incluyen los siguientes
en donde MDpr-PAB(gluc)-D es como se describe para las estructuras con carga de fármaco 2X anteriores; y PEG es como se describe en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento y puede ser dispersivo cuando se hace referencia a una población de conjugados ligando-fármaco (es decir, una composición de LDC) preparada mediante el uso de un precursor de unidades de PEG dispersivas en donde el precursor de unidades de PEG dispersivas preferentemente tiene un PM promedio máximo correspondiente a una unidad de PEG con n de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 subunidades o de aproximadamente 12 a aproximadamente 38 subunidades, o PEGa no es dispersivo (es decir, una unidad de PEG que tiene un número discreto de subunidades de PEG identificadas por un valor entero de modo que cada LDC de una composición de LDC compuesta por ese
ADC tendrá una unidad de PEG que tiene el mismo valor entero si existe n). En algunas modalidades, una unidad de PEG no dispersiva tiene la estructura de
en donde R21 es una unidad de bloqueo de PEG, la línea ondulada indica una unión covalente al soporte PEGilado y n es un número entero que varía de 8 a 24 o de 12 a 38. Preferentemente R21 es -CH3 o -CH2CH2CO2H.
En algunas modalidades, MDpr-PAB(gluc)-D como la porción -X-D se reemplaza con mc-PAB(gluc)-D.
Se entenderá que la succinimida sustituida en MDpr en cualquiera de las porciones -X-D que contienen MDpr puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno y no de ambos enlaces carbonil-nitrógeno). Una porción -X-D compuesta por mc también puede tener su anillo de succinimida en forma hidrolizada.
Los ejemplos de conjugados ligando-fármaco de la presente invención incluyen los representados por las siguientes estructuras:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, donde p es un numero entero que varia de 1 a 14, preferentemente 2 a 12, 6 a 12, 8 a 12 u 8 a 10, Ab es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal, D es una unidad de fármaco y n es un número entero que varía de 6 a 72, 8 a 72, 10 a 72, 12 a 72, 12 a 36 o 38, 6 a 24, o con la máxima preferencia de 8 a 24. PEG es como se describe en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento para las unidades de PEG. Se entenderá que una succinimida sustituida con Ab puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno de los enlaces carbonilo-nitrógeno y no de ambos), particularmente para aquellos conjugados anticuerpo-fármaco compuestos por porciones tales como:
en donde la línea ondulada indica una unión covalente al resto de una porción fármaco-ligando del conjugado anticuerpo-fármaco.
Se entenderá que las estructuras representativas anteriores también pueden representar composiciones, en cuyo caso p representa el número promedio de enlazadores-fármaco por ligando en la composición. En tales modalidades, p no es típicamente un valor entero y puede variar de 1 a 14, preferentemente de 2 a 12, 6 a 12, 8 a 12 u 8 a 10.
Ejemplos de conjugados ligando-fármaco de la presente invención que proporcionan 2X la carga de fármaco incluyen los representados por las siguientes estructuras:
y aquellas estructuras en donde la porción -X-D mc-VC-PAB-D se reemplaza con cualquiera de las porciones -X-D descritas en el presente documento, incluidas mc-VA-PAB-D y MDpr-VA-PAB-D
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas, donde p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente 2 a 12, 6 a 12, 8 a 12 u 8 a 10, Ab es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal, D es una unidad de fármaco y n es un número entero que varía de 6 a 72, 8 a 72, 10 a 72, 12 a 72, 12 a 36 o 38, 6 a 24, o con la máxima preferencia 8 a 24. PEG es como se describe en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento para las unidades de PEG. Se entenderá que la succinimida sustituida que se une a Ab o S puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno de los enlaces carbonilnitrógeno y no de ambos).
Se entenderá que la succinimida en una porción MDpr sustituida con Ab o en una porción -X-D puede existir en forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno de los enlaces carbonil-nitrógeno y no de ambos). La succinimida en una porción mc sustituida con Ab o en una porción -X-D o también puede existir en forma hidrolizada.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la unidad de fármaco D puede ser MMAE a continuación, en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al resto de una porción de enlazador-fármaco.
En algunos aspectos preferidos, incluidos aquellos en donde D es MMAE, p es 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. En algunas modalidades, incluidas aquellas en donde D es MMAE, el anticuerpo se conjuga con el enlazador mediante un átomo de azufre de un residuo de cisteína del anticuerpo. El residuo de cisteína puede ser de origen natural o no natural. Por ejemplo, en algunos aspectos, la cisteína será de un disulfuro intercatenario. En otros aspectos, el residuo de cisteína será de una cisteína introducida (por ejemplo, una cisteína introducida en la posición 239). En algunos aspectos, el anticuerpo se unirá a los enlazadores-fármacos a través de sus disulfuros intercatenarios y mediante cisteínas introducidas.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la unidad de fármaco D puede ser MMAF a continuación, en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al resto de una porción de enlazador-fármaco.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la unidad de fármaco D puede ser un compuesto de camptotecina como se ejemplifica para la propia camptotecina de la siguiente manera en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al resto de una porción de enlazador-fármaco:
En cualquiera de las modalidades anteriores, la unidad de fármaco D puede ser un compuesto de vinca como se ejemplifica para la hidrazida de vinblastina a continuación, en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al resto de una porción de enlazador-fármaco:
En cualquiera de las modalidades anteriores, la unidad de fármaco D puede ser un compuesto de antraciclina como se ejemplifica a continuación, en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al resto de una porción de enlazador-fármaco:
Los ejemplos de soportes PEGilados en compuestos intermediarios enlazadores con tiol protegido y los compuestos ligando-enlazador correspondientes incluyen los siguientes:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde
n es 2 a 72, preferentemente 4 a 72 u 8 a 72 u 8 a 24;
p es de 1 a 14, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12; y
Ab es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal.
Se entenderá en las fórmulas anteriores que las succinimidas sustituidas con ligando pueden existir en su forma hidrolizada (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno y no de ambos enlaces C-N de la succinimida). Además, en cualquiera de las modalidades anteriores, el grupo protector t-butiltiol puede reemplazarse por cualquier otro grupo protector de tiol adecuado.
Los ejemplos de soportes PEGilados multiplexados como compuestos intermediarios enlazadores y los compuestos ligando-enlazador correspondientes incluyen los siguientes:
en donde la línea ondulada indica una unión covalente con una unidad de ligando, R21 son grupos de bloqueo de PEG seleccionados independientemente, preferentemente metilo o ácido 3-propiónico, y n varía independientemente de 2 a 72, preferentemente de 4 a 72 o de 8 a 72 o de 8 a 24, donde 24 se prefiere más. El grupo protector de tiol se puede reemplazar por otro grupo protector de tiol adecuado.
En algunas modalidades preferidas, p es 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. En algunas modalidades, el anticuerpo se conjuga con el enlazador mediante un átomo de azufre de un residuo de cisteína del anticuerpo. El residuo de cisteína puede ser de origen natural o no natural. Por ejemplo, en algunas modalidades, la cisteína será de un disulfuro intercatenario. En otras modalidades, el residuo de cisteína será de una cisteína introducida (por ejemplo, una cisteína introducida en la posición 239). En algunas modalidades, el anticuerpo se unirá a los enlazadores-fármacos mediante sus disulfuros intercatenarios y mediante cisteínas introducidas.
En algunos aspectos de la presente invención, no hay más de 50, no más de 45, no más de 40, no más de 35, no más de 30 o no más de 25 átomos intermedios entre la unidad de ligando y la unidad de fármaco de los conjugados ligando-fármaco. En algunos aspectos de la presente invención, no hay más de 40, no más de 35, no más de 30 o no más de 25 átomos intermedios entre la unidad de ligando y la unidad escindible de los conjugados ligandofármaco.
En algunas modalidades, hay menos átomos intermedios entre el ligando y la unidad de fármaco de los conjugados ligando-fármaco que átomos en la unidad de PEG. En algunas modalidades, hay menos átomos intermedios entre el ligando y la unidad escindible de los conjugados ligando-fármaco que átomos en la unidad de PEG.
En algunas modalidades, hay menos átomos intermedios entre el ligando y la unidad de fármaco de los conjugados ligando-fármaco que los átomos intermedios entre el extremo distal de la unidad de PEG y la unidad conectora en paralelo. En algunas modalidades, hay menos átomos intermedios entre el ligando y la unidad escindible de los conjugados ligando-fármaco que los átomos intermedios entre el extremo distal de la unidad de PEG y la unidad conectora en paralelo.
En modalidades preferidas de la presente invención, el fármaco es preferentemente una auristatina (por ejemplo, MMAE o una auristatina que tiene una hidrofobicidad comparable o mayor que la MMAE), la unidad de ensamblaje liberable comprende una unidad de glucurónido que se puede escindir mediante una beta-glucuronidasa; y la unidad
de PEG comprende al menos 6, al menos 8, al menos 10 o al menos 12 subunidades, pero no más de 72 subunidades, preferentemente no más de 36 o 24 subunidades. En aspectos preferidos, la unidad de PEG comprenderá de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 subunidades, con la máxima preferencia aproximadamente 12 subunidades. Los otros componentes del conjugado ligando-fármaco o intermediarios de este pueden ser como se describen en cualquiera de las modalidades proporcionadas en el presente documento.
Las composiciones preferidas de la presente invención comprenden una población de conjugados ligando-fármaco en donde la unidad de ligando es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo intacto) la unidad de fármaco es una auristatina o no es una auristatina (preferentemente una auristatina, por ejemplo, MMAE o una auristatina que tiene una hidrofobicidad comparable o mayor que MMAE), la unidad de ensamblaje liberable comprende una unidad de glucurónido que se puede escindir mediante una beta-glucuronidasa; la unidad de PEG comprende al menos 6, al menos 8, al menos 10, o al menos 12 subunidades, pero no más de 72 subunidades, preferentemente no más de 36 o 24 subunidades; y el número promedio de porciones de enlazador-fármaco por anticuerpo en la composición es al menos 6, o al menos aproximadamente 8. En aspectos preferidos, la unidad de PEG comprenderá de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 subunidades, con la máxima preferencia aproximadamente 12 subunidades. Los otros componentes del conjugado ligando-fármaco pueden ser como se describen en cualquiera de las modalidades proporcionadas en este documento.
Tratamiento para el cáncer
Los conjugados ligando-fármaco son útiles para inhibir la multiplicación de una célula tumoral o cancerosa, provocando apoptosis en una célula tumoral o cancerosa, o para tratar el cáncer en un paciente. Los conjugados ligando-fármaco se pueden utilizar en consecuencia en una variedad de situaciones para el tratamiento de cánceres. Los conjugados ligando-fármaco se pueden usar para administrar un fármaco a una célula tumoral o cancerosa. Sin estar limitados por la teoría, la unidad de ligando de un conjugado ligando-fármaco se une o se asocia con un antígeno asociado a una célula cancerosa o a una célula tumoral, y el conjugado ligando-fármaco se puede introducir (internalizar) dentro de una célula tumoral o célula cancerosa a través de endocitosis mediada por receptores u otro mecanismo de internalización. El antígeno puede estar unido a una célula tumoral o cancerosa o puede ser una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o cancerosa. Una vez dentro de la célula, a través de un mecanismo de escisión, el fármaco se libera dentro de la célula. Alternativamente, la unidad de fármaco o el fármaco se escinde del conjugado ligando-fármaco fuera de la célula tumoral o de la célula cancerosa, y la unidad de fármaco o el fármaco penetra posteriormente en la célula.
La unidad de ligando puede unirse a la célula tumoral o la célula cancerosa.
La unidad de ligando puede unirse a un antígeno de una célula tumoral o célula cancerosa que se encuentra en la superficie de la célula tumoral o cancerosa.
La unidad de ligando puede unirse a un antígeno de la célula tumoral o de la célula cancerosa que es una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o la célula cancerosa.
La especificidad de la unidad de ligando para una célula tumoral o una célula cancerosa en particular puede ser importante para determinar los tumores o cánceres que se tratan con mayor eficacia. Por ejemplo, los conjugados ligando-fármaco que se dirigen a un antígeno de células cancerosas presente en cánceres hematopoyéticos pueden ser útiles en el tratamiento de neoplasias hematológicas (por ejemplo, una unidad de ligando con unión anti-CD30, anti-CD70, anti-CD19, anti-CD33 (por ejemplo, un anticuerpo) puede ser útil para el tratamiento de neoplasias hematológicas). Los conjugados ligando-fármaco que se dirigen a un antígeno de células cancerosas presente en tumores sólidos pueden ser útiles para tratar tales tumores sólidos.
Los cánceres que se pueden tratar con un conjugado ligando-fármaco incluyen, pero no se limitan a, cánceres hematopoyéticos tales como, por ejemplo, linfomas (linfoma de Hodgkin y linfomas no Hodgkin) y leucemias y tumores sólidos. Los ejemplos de cánceres hematopoyéticos incluyen linfoma folicular, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma de células del manto, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, linfoma difuso de células B grandes y mieloma múltiple. Los ejemplos de tumores sólidos incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer óseo, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer bucal, cáncer nasal, cáncer de garganta, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, cáncer de piel, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Terapia multimodal para el cáncer
Los cánceres, incluidos, entre otros, un tumor, metástasis u otra enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular descontrolado, pueden tratarse o inhibirse mediante la administración de un conjugado ligandofármaco.
Los conjugados ligando-fármaco de la presente invención pueden usarse en el tratamiento del cáncer. En particular, se pueden usar en el tratamiento administrando a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un conjugado ligando-fármaco con o sin un agente quimioterapéutico, en donde el agente quimioterapéutico es aquel con el que no se ha encontrado que el tratamiento del cáncer sea refractario o con el que se ha encontrado que el tratamiento del cáncer es refractario. Los conjugados ligando-fármaco se pueden usar en el tratamiento de un paciente que también se ha sometido a una cirugía como tratamiento para el cáncer.
Tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
Los conjugados ligando-fármaco son útiles para matar, o inhibir la replicación, de una célula que produce una enfermedad autoinmunitaria o para tratar una enfermedad autoinmunitaria. Los conjugados ligando-fármaco se pueden utilizar en consecuencia en una variedad de situaciones para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un paciente. Los conjugados ligando-fármaco se pueden usar para administrar un fármaco a una célula objetivo. Sin estar limitados a la teoría, el conjugado ligando-fármaco se asocia con un antígeno en la superficie de una célula objetivo, y el conjugado ligando-fármaco después se introduce dentro de una célula objetivo a través de endocitosis mediada por receptor. Una vez dentro de la célula, la unidad enlazadora se escinde, lo que da como resultado la liberación de la unidad de fármaco o el fármaco. El fármaco liberado queda libre para migrar en el citosol e inducir actividades citotóxicas o citostáticas. Alternativamente, el fármaco se escinde del conjugado ligando-fármaco fuera de la célula objetivo y, posteriormente, la unidad de fármaco o el fármaco penetra en la célula. La unidad de ligando puede unirse a un antígeno autoinmunitario. El antígeno puede estar en la superficie de una célula involucrada en una afección autoinmunitaria.
La unidad de ligando puede unirse a un antígeno autoinmunitario que se encuentra en la superficie de una célula. La unidad de ligando puede unirse a linfocitos activados que se asocian con el estado patológico autoinmunitario. El conjugado ligando-fármaco puede matar, o inhibir la multiplicación de células que producen un anticuerpo autoinmunitario asociado con una enfermedad autoinmunitaria en particular.
Los tipos particulares de enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar con los conjugados ligando-fármaco incluyen, pero no se limitan a, trastornos relacionados con los linfocitos Th2 (por ejemplo, dermatitis atópica, asma atópica, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica y enfermedad del injerto contra el huésped); trastornos relacionados con los linfocitos Th1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener y tuberculosis); y trastornos relacionados con linfocitos B activados (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes tipo I).
Terapia con múltiples fármacos para enfermedades autoinmunitarias
Los conjugados ligando-fármaco de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria mediante la administración, a un paciente que lo necesite, de una cantidad eficaz de un conjugado ligando-fármaco y otro agente terapéutico conocido para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.
Composiciones y métodos de administración
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados ligando-fármaco descritos en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los conjugados ligando-fármaco pueden estar en cualquier forma que permita que el compuesto se administre a un paciente para el tratamiento de un trastorno asociado con la expresión del antígeno al que se une la unidad de ligando. Por ejemplo, los conjugados pueden estar en forma de líquido o sólido.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para permitir que un compuesto esté biodisponible tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una única unidad de dosificación.
Los materiales usados para preparar las composiciones farmacéuticas pueden no ser tóxicos en las cantidades usadas. Será evidente para los expertos en la técnica que la dosis óptima del (de los) ingrediente(s) activo(s) en la composición farmacéutica dependerá de una variedad de factores. Los factores de interés incluyen, sin limitación, el
tipo de animal (por ejemplo, un ser humano), la forma particular del compuesto, la forma de administración y la composición empleada.
La composición puede estar, por ejemplo, en forma líquida. El líquido puede ser útil para administrarlo mediante inyección. En una composición para administración por inyección, también se pueden incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.
Las composiciones líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir, además, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como aminoácidos, acetatos, citratos o fosfatos; detergentes tales como tensioactivos no iónicos, polioles; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composición parenteral puede envasarse en una ampolla, una jeringa desechable o un frasco de dosis múltiples fabricado de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un adyuvante ilustrativo. Una composición inyectable es preferentemente estéril.
La cantidad del conjugado que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en las composiciones también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debería decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un compuesto de modo que se obtenga una dosis adecuada. Generalmente, esta cantidad es al menos aproximadamente 0,01 % de un compuesto en peso de la composición. Para la administración intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de un conjugado ligando-fármaco por kg de peso corporal del animal. En un aspecto, la composición puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de un conjugado ligando-fármaco por kg de peso corporal del animal. En otro aspecto, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal de un compuesto.
Generalmente, la dosis de un conjugado que se administra a un paciente es típicamente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg o aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la dosis administrada está entre aproximadamente 0,1 a 4 mg/kg, incluso con mayor preferencia de 0,1 a 3,2 mg/kg, o incluso con mayor preferencia de 0,1 a 2,7 mg/kg del peso corporal del sujeto durante un ciclo de tratamiento.
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el que se administra un compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo. Los vehículos pueden ser solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En una modalidad, cuando se administra a un paciente, el compuesto o las composiciones y los vehículos farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un vehículo ilustrativo cuando los compuestos se administran por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados incluyen, además, excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol. Las presentes composiciones, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.
En una modalidad, los conjugados se formulan de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a animales, particularmente seres humanos.
Generalmente, los portadores o vehículos para la administración intravenosa son soluciones tampón acuosas isotónicas y estériles. Cuando sea necesario, las composiciones pueden incluir, además, un agente solubilizante. Las composiciones para la administración intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestésico local como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando se va a administrar un conjugado por infusión, se puede dispensar, por ejemplo, con una botella de infusión que contenga agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando el conjugado se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en total conformidad con todas las normativas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos.
Métodos ilustrativos
En este documento se proporcionan métodos para preparar un compuesto fármaco-enlazador representado por la estructura de fórmula (IV), (V) o (VI) como se describe en el presente documento, el método comprende la etapa (a): poner en contacto un compuesto enlazador intermediario representado por la estructura de fórmula VII, VIII o IX como se describe en este documento con una cantidad suficiente de porciones X’-D para reaccionar con Lp' o AD' para formar una porción Lp-X-D o AD-X-D para cada caso de Lp' y AD', en donde -X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco; y X'-D es un precursor de la unidad de ensamblaje liberable unido a una unidad de fármaco en donde X' puede reaccionar con Lp 'y/o AD'.
En algunos aspectos, el enlazador-fármaco así preparado tendrá la estructura representada por la fórmula IVa, IVb, Va, Vb, Vc, VIa o VIb como se describe en este documento y el compuesto enlazador intermediario utilizado en la etapa (a) tiene la estructura representada por la fórmula VIIIa, VIIIb, VIIIc, VIIId, IXa o IXb como se describe en este documento.
El método puede comprender además la etapa de (a'): desproteger un compuesto enlazador intermediario adecuadamente protegido correspondiente en estructura a la fórmula VIIIa, VIIIb, VIIIc, VIIId, IXa o IXb en donde t es 0 y en donde AD' o Lp' adecuadamente protegidos tiene la estructura de
en donde R111 se selecciona independientemente de hidrógeno, p-hidroxibencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, secbutilo, -CH2OH, -CH(OH)CHs , -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2 , -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-
con protección adecuada cuando sea necesario,
en donde RPR es un grupo protector de tiol adecuado y la línea ondulada indica una unión covalente de la porción AD’ o Lp' protegida adecuada dentro del compuesto enlazador intermediario;
y en la etapa (a) poner en contacto el producto desprotegido resultante de fórmula Villa, VlIIb, VIIIc, VlIId, IXa o IXb de la etapa (a') con una porción X’-D en donde X' está compuesto por una porción maleimida que puede reaccionar con el grupo tiol libre de AD' o Lp' para formar una porción succinimida con tio sustituido.
Alternativamente, el método puede comprender además la etapa de a': desproteger un precursor de un compuesto enlazador intermediario para la fórmula Villa, VlIIb, VIIIc, VlIId, IXa o IXb que tiene esa estructura en donde t es 1 y AD'-AD' o AD'-Lp' está adecuadamente protegido donde el AD'-AD' o AD'-Lp' adecuadamente protegido tiene la estructura de
en donde R111 es hidrógeno o metilo y RPR es un grupo protector de tiol adecuado que se desprotege y la línea ondulada indica una unión covalente de la porción AD’ protegida adecuada dentro del compuesto enlazador intermediario; y en la etapa (a) poner en contacto el producto desprotegido resultante de fórmula VIIIa, VIIIb, VIIIc, VIIId, IXa o IXb de la etapa (a’) con una porción X’-D en donde X' está compuesto por una porción que contiene maleimida que puede reaccionar con los grupos tiol libres de AD’-AD’ o AD'-Lp' para formar porciones que contienen succinimida con tio sustituidos.
En el presente documento se proporcionan métodos para preparar un conjugado ligando-fármaco representado por la estructura de fórmula I, II o III como se describe en el presente documento, el método comprende las etapas (a): poner en contacto un compuesto ligando-enlazador representado por la estructura de fórmula X, XI o XII como se describe en el presente documento con una cantidad suficiente de porciones X’-D para reaccionar con Lp’ o AD’ para formar una porción Lp-X-D o AD-X-D para cada caso de Lp’ y AD', en donde X-D es una unidad de ensamblaje liberable unida a una unidad de fármaco; y X'-D es un precursor de la unidad de ensamblaje liberable unido a una unidad de fármaco en donde X' es capaz de reaccionar con Lp' y/o AD'.
Un conjugado ligando-fármaco ilustrativo así preparado tiene la estructura representada por la fórmula Ia, Ib, IIa, IIb, IIb, IIIa o IIIb como se describe en el presente documento y el compuesto ligando-enlazador tiene la estructura representada por la fórmula XIa, XIb, XIc, XId, XIIa o XIIb como se describe en este documento
El método puede comprender además la etapa a': desproteger un compuesto ligando-enlazador adecuadamente protegido correspondiente en estructura a la fórmula X, XI, XII, XIa, XIb, XIc, XId, XIIa o XIIb como se describe en el presente documento en donde t es 0 y en donde AD' o Lp' adecuadamente protegido tiene la estructura de
en donde R111 se selecciona independientemente de hidrógeno, p-hidroxibencilo, metilo, isopropilo, isobutilo, secbutilo, -CH2OH, -CH(OH)CHs, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2) 3NHCHO, -(CH2) 4NHC(=NH)NH2 , -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2 , -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil- con protección adecuada cuando sea necesario,
en donde RPR es un grupo protector de tiol adecuado y la línea ondulada indica una unión covalente de la porción AD’ o Lp' protegida adecuada dentro del compuesto ligando-enlazador intermediario;
y en la etapa (a) poner en contacto el producto desprotegido de fórmula X, XI, XII, Xla, Xlb, XIc, Xld, XIla o XlIb resultante de la etapa (a’) con una porción X’-D en donde X' está compuesta por una porción maleimida que puede reaccionar con el grupo tiol libre de AD’ o Lp' para formar una porción succinimida con tio sustituido.
Alternativamente, el método puede comprender además la etapa (a’): desproteger un compuesto ligando-enlazador correspondiente en estructura a la fórmula XIa, XIb, XIc, XId, XIIa o XIIb en donde t es 1 y AD'-AD' o AD'-Lp' está adecuadamente protegido en donde la porción AD'-AD' adecuadamente protegida tiene la estructura de
en donde R111 es hidrógeno o metilo y RPR es un grupo protector de tiol adecuado que está desprotegido y la línea ondulada indica una unión covalente de la porción a D’ protegida adecuada dentro del compuesto ligando-enlazador intermediario; y en la etapa (a) poner en contacto el producto desprotegido resultante de la fórmula XIa, XIb, XIc, XId, XIIa o XIIb de la etapa (a’) con una porción X’-D en donde X' está compuesta por una porción que contiene maleimida que puede reaccionar con los grupos tiol libres de AD’-AD’ o AD'-Lp' para formar porciones que contienen succinimida con tio sustituidos.
Una porción de maleimida ilustrativa que puede reaccionar con el (los) tiol(es) libre(s) que resulta(n) de la etapa
tiene la estructura de
en donde R17 es -(CH2)sC(=O)- y la línea ondulada indica una unión dentro de la porción X’-D o tiene la estructura de:
en donde la linea ondulada indica una unión dentro de la porción X’-D y el grupo amino esta opcionalmente protegido por un grupo protector de amino estable en condiciones para la desprotección de los grupos tiol protegidos RPR
Ejemplos
Información general. Todos los solventes anhidros comercialmente disponibles se usaron sin purificación adicional. Los reactivos de PEG se obtuvieron de Quanta BioDesign (Powell, OH). La cromatografía analítica en capa fina se realizó sobre láminas de aluminio de gel de sílice 60 F254 (Em D Chemicals, Gibbstown, NJ). La cromatografía radial se realizó en un aparato de Chromatotron (Harris Research, Palo Alto, CA). La cromatografía en columna se realizó en un sistema de purificación rápido de Biotage Isolera One (Charlotte, NC). La HPLC analítica se realizó en un sistema de suministro de disolvente Varian ProStar 210 configurado con un detector Varian ProStar 330 PDA. Las muestras se eluyeron de una columna de fase inversa C12 Phenomenex Synergi 2,0 x 150 mm, 4 ^m, 80 Á. La fase móvil acida consistió en acetonitrilo y agua que contenían ácido trifluoroacético al 0,05 % o ácido fórmico al 0,1 % (indicado para cada compuesto). Los compuestos se eluyeron con un gradiente lineal de acetonitrilo ácido desde el 5 % a 1 min después de la inyección, hasta el 95 % a los 11 min, seguido de acetonitrilo isocrático al 95 % a los 15 min (velocidad de flujo = 1,0 ml/min). La LC-MS se realizó en dos sistemas diferentes. El sistema de LC-MS 1 consistió en un espectrómetro de masas ZMD Micromass conectado a un instrumento de HPLC HP Agilent 1100 equipado con una columna de fase inversa C12 Phenomenex Synergi 2,0 x 150 mm, 4 ^m, 80 Á. El eluyente ácido consistió en un gradiente lineal de acetonitrilo del 5 % al 95 % en ácido fórmico acuoso al 0,1 % durante 10 min, seguido de acetonitrilo isocrático al 95 % durante 5 min (velocidad de flujo = 0,4 ml/min). El sistema de LC-MS 2 consistió en un espectrómetro de masas Waters Xevo G2 Tof conectado a un módulo de separaciones Waters 2695 con un detector de matriz de fotodiodos Waters 2996; la columna, las fases móviles, el gradiente y la velocidad de flujo fueron los mismos que para el sistema de LC-MS 1.
Los datos de LC-MS de los conjugados de anticuerpo-fármaco se adquirieron en un QTOF Waters Xevo GS-S acoplado a un sistema de UPLC Waters Acquity H-Class. Las muestras se sometieron a cromatografía en una columna analítica de fase inversa (Agilent Technologies, PLRP-S, 300Á, 2,1 mm ID x 50 mm, 8 ^m) a 80 °C y se eluyeron con un gradiente lineal de TFA al 0,01 % en acetonitrilo desde el 25 % hasta el 65 % en TFA acuoso al 0,05 % durante 12,5 minutos, seguido de TFA isocrático al 65 % al 0,01 % en acetonitrilo durante 1,5 min a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Los datos de espectrometría de masas para las cadenas ligeras y pesadas se adquirieron en modo ESI+ mediante el uso de un intervalo de masas de 500-4000 m/z y se deconvolucionaron mediante el uso de MaxEnt1 para determinar las masas de los conjugados resultantes.
La HPLC preparativa se realizó en un sistema de suministro de disolvente Varian ProStar 210 configurado con un detector Varian ProStar 330 PDA. Los productos se purificaron en una columna de fase inversa C12 Phenomenex Synergi 10,0 x 250 mm, 4 ^m, 80 Á eluyendo con ácido fórmico al 0,1 % en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (disolvente B). El método de purificación consistió en el siguiente gradiente de disolvente A al disolvente B: 90:10 de 0 a 5 min; 90:10 a 10:90 de 5 min a 80 min; seguido de isocrático 10:90 durante 5 min. La velocidad de flujo fue de 4,6 ml/min con monitorización a 254 nm. La HPLC preparativa para los compuestos en los Esquemas 3 y 4 se realizó con ácido trifluoroacético al 0,1 % en ambas fases móviles, en lugar de ácido fórmico al 0,1 %. Los datos espectrales de RMN se recogieron en un espectrómetro Varian Mercury de 400 MHz. Las constantes de acoplamiento (J) se expresan en hercios.
Ejemplo 1. Síntesis de un enlazador-fármaco glucurónido-MMAE que comprende una unidad de PEG en una orientación en serie
Acido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-ammopropanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1 -il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (3): La síntesis del Compuesto 2 se ha descrito previamente (publicación de patente de Estados Unidos 2008/0241128), que se incorpora en la presente descripción como referencia. En un matraz que contiene el intermediario 2 de glucurónido-MMAE (40 mg, 26,8 |jmol) se añadió 0,9 ml de metanol y 0,9 ml de tetrahidrofurano. La solución se enfrió después en un baño de hielo y se añadió gota a gota hidróxido de litio monohidrato (6,8 mg, 161 jmol) como solución en 0,9 ml de agua. La reacción se agitó después en hielo durante 1,5 h, momento en el que la LC/MS reveló la conversión completa en producto. Después se añadió el ácido acético glacial (9,2 jL, 161 jmol) y la reacción se concentró hasta la sequedad. La HPLC preparativa proporcionó el intermediario 3 enlazador glucurónido-MMAE completamente desprotegido (26 mg, 87 %) como un residuo oleoso. HPLC analítica (ácido fórmico al 0,1 %): tR 9,3 min. Sistema de LC-MS 1: tR 11,10 min, m/z (ES+) encontrada 1130,48 (M+H)+, m/z (ES-) encontrada 1128,63 (M-H)v
Acido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,l3-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)-2-(1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,79-dioxo-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-tetracosaoxa-4,80-diazatrioctacontanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (4): A un matraz que contenía el intermediario 3 glucurónido-MMAE desprotegido (26 mg, 23 pmol) disuelto en DMF anhidro (0,94 ml) se añadió maleimido-PEG24- éster NHS (32 mg, 23 pmol) como una solución en dimetilacetamida (200 mg/ml). Se añadió diisopropiletilamina (20 pl, 115 pmol) y la reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 6 h, momento en que la LC/MS reveló la conversión al producto deseado. La reacción se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el enlazador 4 maleimido-PEG24-glucurónido-MMAE lineal (31 mg, 55 %) como un residuo oleoso. 1H NMR (CD3OD) 8 (ppm) 0,92 (m, 16H), 1,15 (m, 6H), 1,42 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 1,91 (m, 4H),
2,20 (m, 3H), 2,48 (m, 6H), 2,66 (m, 3H), 2,96 (m, 4H), 3,10 (s, 2H), 3,27 (s, 2H), 3,31 (s, 8H), 3,38 (m, 5H), 3,44 (m, 2H), 3,57 (m, 6H), 3,62 (m, 79H), 3,77 (m, 5H), 3,87 (t, J = 9,6 Hz, 2H), 4,05 (m, 1H), 4,21 (m, 3H), 4,53 (m, 2H), 4,61 (m, 2H), 4,80 (m, 2H), 5,14 (m, 3H), 6,82 (s, 2H), 7,10 (m, 2H), 7,21 (m, 2H), 7,35 (m, 2H), 7,39 (m, 2H), 7,74 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,94 (m, 2H), 8,10 (m, 1H), 8,27 (m, 2H). HPLC analítica (ácido fórmico al 0,1 %): tR 9,9 min. Sistema de LC-MS 1: tR 11,94 min, m/z (ES+) encontrada 1205,34 (M+2H)2+. Sistema de LC-MS 2: tR 10,38 min, m/z (ES+) encontrada 2410,3225 (M+H)+.
Ejemplo 2. Síntesis de un enlazador-fármaco glucurónido-MMAE que comprende una unidad de PEG en orientación paralela
Es uema
Ácido (S)-80-((((9H-fluoren-9-N)metoxi)carboml)ammo)-74-oxo-2.5.8.11.14.17.20.23.26.29.32.35.38.41.44.47.50.53.56.59.62.65.68.71- tetracosaoxa-75-azahenoctacontan-81-oico (6): En un matraz que contenía Na-Fmoc-lisina 5 (30 mg, 81,5 jmol) se añadió 1,6 ml de diclorometano anhidro, seguido de metoxi-PEG24-OSu (100 mg, 81,5 jmol). Después se añadió DIPEA (71 j L, 408 jmol) y la reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente y se siguió mediante TLC y LC/MS. Después de 2 h, LC/MS reveló la conversión al producto. La solución de reacción se diluyó en diclorometano y se cargó directamente en una placa de cromatotrón de 1 mm para su purificación. La placa se eluyó con diclorometano con cantidades crecientes de metanol (0 % a 15 %) para proporcionar el producto deseado 6 (63 mg, 53 %). TLC: Rf = 0,17, 10 % MeOH en CH2Cl2.1H NMR (CDCla) 8 (ppm) 1,48 (m, 6H), 2,47 (m, 5H), 3,20 (m, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,63 (m, 86H), 4,16 (m, 2H), 4,36 (m, 1H), 7,26 (m, 3H), 7,35 (m, 2H), 7,60 (m, 2H), 7,71 (m, 3H). HPLC analítica (ácido fórmico al 0,1 %): tR 10,8 min. Sistema de LC-MS 1: tR 11,95 min, m/z (ES+) encontrada 1468,40 (M+H)+, m/z (ES') encontrada 1466,36 (M-H)'.
(S)-2,5-dioxopirrolidin-1-il 80-((((9H-fluoren-9-N)metoxi)carbonM)ammo)-74-oxo-2.5.8.11.14.17.20.23.26.29.32.35.38.41.44.47.50.53.56.59.62.65.68.71- tetracosaoxa-75-azahenoctacontan-81-oato (7): Un matraz se cargó con Na-Fmoc-lisina(PEG24)-OH 6 (63 mg, 43 pmol) y 0,43 ml de tetrahidrofurano anhidro. Se añadió N-hidroxoisuccinimida (5,5 mg, 47 jmol), seguido de diisopropilcarbodiimida (7,3 j L, 47 jmol).
La reacción se selló en atmósfera de nitrógeno y se agitó durante la noche. Después de 18 h, se añadieron más N-hidroxisuccinimida (5,5 mg, 47 |jmol) y diisopropilcarbodiimida (7,3 jl, 47 |jmol) y se continuó agitando durante 4 horas más, momento en el que la LC/MS reveló una conversión completa al producto. La reacción cruda se diluyó en diclorometano y se purificó mediante cromatografía radial en una placa de 1 mm, se eluyó con diclorometano con cantidades crecientes de metanol (0 % a 10 %) para proporcionar el éster 7 activado deseado (36 mg). El material se llevó adelante sin caracterización adicional. TLC: Rf = 0,43, MeOH al 10 % en CH2CI2. HPLC analítica (ácido fórmico al 0,1 %): tR 11,4 min. Sistema de LC-MS 2: tR 11,01 min, m/z (ES+) encontrada 1564,8379 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-((((9H-fluoren-9-N)metoxi)carbonM)ammo)-74,81-dioxo-2.5.8.11.14.17.20.23.26.29.32.35.38.41.44.47.50.53.56.59.62.65.68.71- tetracosaoxa-75,82-diazapentaoctacontanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1 -h idroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3.6.9- trioxo-2,l3-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (8): El intermediario 3 enlazador glucurónido-MMAE desprotegido (26 mg, 23 jmol) se disolvió en dimetilformamida anhidra (0,58 ml) y se añadió a un matraz que contenía Na-Fmoc-lisina(PEG)-OSu 7 (36 mg, 23 jmol). Después se añadió diisopropiletilamina (20 j L, 115 jmol), la reacción se agitó después en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Después de 4,5 h, LC-Ms reveló la conversión al producto. El producto se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el intermediario 8 Fmoc-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (30 mg, 50 % en dos etapas) como un residuo oleoso. HPLC analítica (ácido fórmico al 0,1 %): tR 11,4 min. Sistema de LC-MS 1: tR 12,31 min, m/z (ES+) encontrada 1291,05 (M+2H)2+. Sistema de LC-MS 2: tR 11,30 min, m/z (ES+) encontrada 2580,2515 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-amino-74,81-dioxo-2.5.8.11.14.17.20.23.26.29.32.35.38.41.44.47.50.53.56.59.62.65.68.71- tetracosaoxa-75,82-diazapentaoctacontanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1 -h idroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3.6.9- trioxo-2,l3-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (9): El intermediario 8 Fmoc-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (30 mg, 12 jmol) se disolvió en 0,46 ml de dimetilformamida anhidra, seguido de la adición de 0,12 ml de piperidina. La reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 3 horas y después se concentró hasta la sequedad. El producto se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el intermediario 9 H-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (24 mg, 87 %) como un residuo oleoso. 1H NMR (CdC|3) 8 (ppm) 0,92 (m, 14H), 1,14 (m, 6H), 1,42 (m, 5H), 1,79 (m, 8H), 2,22 (m, 3H), 2,42 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,47 (m, 2H), 2,65 (m, 2H), 2,76 (m, 2H), 2,95 (m, 3H), 3,10 (m, 3H), 3,31 (m, 8H), 3,35 (m, 6H), 3,54 (m, 5H), 3,63 (s, 70H), 3,72 (t, J = 6,0 Hz, 3H), 3,85 (m, 2H), 4,07 (m, 1H), 4,22 (m, 3H), 4,52 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 4,71 (m, 2H), 5,11 (m, 3H), 7,12 (m, 1H), 7,21 (m, 1H), 7,31 (m, 3H), 7,37 (m, 2H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 8,26 (m, 2H). HPLC analítica (ácido fórmico al 0,1 %): tR 8,9 min. Sistema de LC-MS 1: tR 11,18 min, m/z (ES+) encontrada 1178,97 (M+2H)2+. Sistema de LC-MS 2: tR 9,50 min, m/z (ES+) encontrada 2358,2341 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1- il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3.6.9- trioxo-2,l3-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)-2-((S)-80-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-74,81-dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-tetracosaoxa-75,82-diazapentaoctacontanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (10): Se disolvió éster NHS del ácido maleimidocaproico (4,2 mg, 14 jmol) en 0,6 ml de dimetilformamida anhidra y se transfirió a un matraz que contenía el intermediario 9 de H-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (24 mg, 10 jmol). Después se añadió diisopropiletilamina (10 j L, 58 jmol), la reacción se agitó después en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC preparativa para proporcionar el enlazador 10 MC-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (23 mg, 90 %) como un residuo oleoso. 1H NMR (CD3OD) 8 (ppm) 0,87 (m, 13H), 1,12 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 1,17 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 1,24 (m, 2H), 1,48 (m, 9H), 1,80 (m, 5H), 2,19 (m, 4H), 2,42 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,48 (m, 2H), 2,64 (m, 2H), 2,96 (m, 3H), 3,10 (s, 1H), 3,12 (m, 2H), 3,15 (s, 1H), 3,27 (s, 6H), 3,35 (m, 3H), 3,43 (m, 3H), 3,54 (m, 3H), 3,58 (m, 2H), 3,63 (m, 64H), 3,70 (m, 4H), 3,92 (m, 2H), 4,22 (m, 4H), 4,54 (m, 1H), 4,61 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 4,83 (m, 1H), 5,13 (m, 3H), 6,80 (s, 2H), 7,10 (m, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,29 (m, 2H), 7,38 (m, 2H), 7,74 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,90 (m, 3H), 8,08 (s, 1H), 8,26 (m, 2H). HPLC analítica (ácido fórmico al 0,1 %): tR 10,6 min. Sistema de LC-MS 1: tR 11,88 min, m/z (Es ) encontrada 1276,23 (M+2H)2+. Sistema de LC-MS 2: tR 10,54 min, m/z (ES+) encontrada 2551,2871 (M+H)+.
Ejemplo 3. Síntesis de un enlazador-fármaco mDPR (maleimido-diaminopropanoico) glucurónido-MMAE
En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se disolvieron H-DPR(boc)-OH y anhídrido maleico en 4 vol. de ácido acético y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró hasta un aceite en un rotavapor y el producto se precipitó mediante la adición de ~ 10 ml de diclorometano. El precipitado se recogió mediante filtración al vacío, se lavó con diclorometano y se secó durante la noche en el horno al vacío.
Se suspendió maleil-DPR(boc)-OH en tolueno (3 ml) y trietilamina (224 uL) sobre tamices moleculares en un matraz de fondo redondo de 50 ml equipado con un condensador. Se añadió DMA (~ 150 uL) para ayudar a la solubilidad. La solución se calentó a 125 °C y se mantuvo a reflujo durante 4 horas, después de lo cual se demostró que la reacción se había completado mediante LCMS. La mezcla de reacción se concentró hasta la sequedad en un rotavapor, se redisolvió en DMSO y se purificó por HPLC preparativa. El producto se aisló como un polvo blanco.
(S)-2,5-dioxopirrolidin-1-il 3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) propanoato (12): solvió ácido (S)-Na-maleimido-Np-boc-diaminopropanoico 11 (Esquema 3a) (400 mg, 1,4 mmol) en 7 ml de dimetilformamida anhidra. Se añadió N-hidroxisuccinimida (178 mg, 1,5 mmol), seguido de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (298 mg, 1,5 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 3 horas. El tratamiento acuoso se logró mediante dilución en 120 ml de agua; la capa acuosa se extrajo después tres veces con 60 ml de acetato de etilo. La capa orgánica combinada se lavó después con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró hasta la sequedad. El producto se purificó por cromatografía rápida en columna, mediante la elución de mezclas de hexanos:acetato de etilo (50:50 a 0:100) para proporcionar el éster NHS del ácido (S)-Na-maleimido-Np-Boc-diaminopropanoico [MDpr(Boc)-OSu] 12 (297 mg,
55 %). Sistema de LC-MS 1: tr 12,23 min, m/z (ES+) encontrada 282,0599 (grupo M+H-Boc)+. Sistema de LC-MS 2: tR 11,30 min, m/z (ES+) encontrada 2580,2515 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-3-((terc-butoxicarboml)ammo)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3.6.9- trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecN)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxflico (13): MDpr(Boc)-OSu 12 (33 mg, 86 |jmol) se disolvió en 1,1 ml de dimetilformamida anhidra y se añadió a un matraz que contenía el intermediario 3 enlazador glucurónido-MMAE desprotegido (49 mg, 43 |jmol). Después se añadió diisopropiletilamina (37 pl, 220 pmol), la reacción se agitó después en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción se inactivó con 37 pl de ácido acético glacial y se purificó por HPLC preparativa para producir el intermediario 13 MDpr(Boc)-glucurónido-MMAE (39 mg, 65 %). Sistema de LC-MS 2: tR 11,09 min, m/z (ES+) encontrada 1396,7321 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-3-ammo-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-il)propanamido)propanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3.6.9- trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (14): Un matraz que contenía el intermediario 13 MDpr(Boc)-glucurónido-MMAE (18 mg, 13 umol) se enfrió a 0 °C en un baño de hielo en atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de ácido trifluoroacético al 10 % en diclorometano (1,3 ml). La reacción se agitó después a 0 °C durante 2 h, momento en el cual la LC-MS reveló la desprotección completa de Boc. La reacción se concentró después a un residuo crudo y se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el enlazador 14 MDpr-glucurónido-MMAE (15 mg, 92 %). Sistema de LC-MS 2: tR 9,13 min, m/z (ES+) encontrada 1296,6697 (M+H)+.
Ejemplo 4. Síntesis de un enlazador-fármaco mDPR (maleimido-diaminopropanoico) glucurónido-MMAE que comprende una unidad de PEG en una orientación paralela
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-74,81-dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-tetracosaoxa-75,82-diazapentaoctacontanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1 -metoxi-2-metM-3-oxopropN)pirroNdm-1-N)-2-oxoetM)-5,8-dMsopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (15): MDpr(Boc)-OSu 12 (33 mg, 86 |jmol) se disolvió en 0,66 ml de dimetilformamida anhidra y se añadió a un matraz que contenía el intermediario 9 enlazador H-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (135 mg, 57 jmol). Después se añadió diisopropiletilamina (50 jL, 290 jmol), la reacción se agitó después en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 2,5 h. La reacción se inactivó con 50 jL de ácido acético glacial y se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el intermediario 15 MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (86 mg, 58 %). Sistema de LC-MS 2: tR 11,71 min, m/z (ES+) encontrada 2624,2004 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-80-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-74,81-dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71 - tetracosaoxa-75,82-diazapentaoctacontanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1 -h idroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecN)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxflico (16): Un matraz que contenía el intermediario 15 MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (86 mg, 33 umol) se enfrió a 0 °C en un baño de hielo en atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de ácido trifluoroacético al 10 % en diclorometano (3,3 ml). La reacción se agitó después a 0 °C durante 2 h, momento en el cual la LC-MS reveló la desprotección completa de Boc. La reacción se concentró después a un residuo crudo y se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el enlazador 16 MDpr-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (38 mg, 46 %). Sistema de LC-MS 2: tR 10,54 min, m/z (ES+) encontrada 2524,2256 (M+H)+.
Ejemplo 5. Síntesis de un enlazador-fármaco mDPR (maleimido-diaminopropanoico) glucurónido-MMAE que comprende una unidad de PEG12, PEG8 o PEG4-(PEG4)3 en una orientación paralela
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-44-((R)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-38,45-dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-dodecaoxa-39,46-diazanonatetracontanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R))-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il) amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil) pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil) fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (17): El enlazador 17 MDpr-Lys(PEG12)-glucurónidoMMAE se preparó de una manera idéntica a 16, que se describe en los esquemas 2 y 4. Sistema de LC-MS 2: tR 9,88 min, m/z (ES+) encontrada 1996,1001 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-32-((R)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) propanamido)-26,33-dioxo-2,5,8,11,14,17,20,23-octaoxa-27,34-diazaheptatriacontanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1 -hidroxi-1-femlpropan-2-il)ammo)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidm-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (18): El enlazador 17 MDpr-Lys(PEG8)-glucurónido-MMAE se preparó de una manera idéntica a 16, que se describe en los esquemas 2 y 4. Sistema de LC-MS 2: tR 10,50 min, m/z (ES+) encontrada 1818,8678 (M+H)+.
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-48-((R)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-15,22,38,42,49-pentaoxo-20,20-bis (15-oxo-2,5,8,11,18-pentaoxa-14-azanonadecan-19-il)-2,5,8,11,18,25,28,31,34-nonaoxa-14,21,37,43,50-pentaazatripentacontanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-secbutil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil) pirrolidm-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (19): El enlazador 19 MDpr-Lys(PEG4[PEG4]3)-glucurónido-MMAE se preparó de manera idéntica a 16, que se describe en los esquemas 2 y 4. Sistema de LC-MS 2: tR 9,92 min, m/z (ES+) encontrada 2674,3813 (M+H)+. Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-20-((R)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1-pirrol-1-il)propanamido)-14,21-dioxo-2,5,8,11-tetraoxa-15,22-diazapentacosanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil) pirrolidm-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (42): El enlazador 42 MDpr-Lys(PEG4)-glucurónido-MMAE se preparó de una manera idéntica a 16, que se describe en los esquemas 2 y 4. Sistema de LC-MS 2: tR 10,18 min, m/z (ES+) encontrada 1642,8586 (M+H)+. Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((S)-14-((R)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- pirrol-1-il) propanamido)-8,15-dioxo-2,5-dioxa-9,16-diazanonadecanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il) amino)-1-metoxi -2-metil-3-oxopropil) pirrolidm-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (43): El enlazador 43 MDpr-Lys(PEG2)-glucurónido-MMAE se preparó de una manera idéntica a 16, que se describe en los esquemas 2 y 4. Sistema de LC-MS 2: tR 10,10 min, m/z (ES+) encontrada 1554,8093 (M+H)+. Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-6-acetamido-2-((R)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido) hexanamido)propanamido)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-butil)-12-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il) amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (44): El enlazador 44 MDpr-Lys(Ac) glucurónido-MMAE se preparó de una manera idéntica a 16, que se describe en los esquemas 2 y 4. Sistema de LC-MS 2: tR 10,38 min, m/z (ES+) encontrada 1466,8109 (M+H)+.
Ejemplo 6. Síntesis de un enlazador-fármaco mDPR (maleimido-diaminopropanoico) valina-citrulina-MMAE que comprende una unidad de PEG en una orientación paralela
4-((80S,83S,86S)-80-(((((9H-fluoren-9-il) metoxi) carbonil) amino)-83-isopropil-74,81,84-trioxo-86-(3-ureidopropil)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71- tetracosaoxa-75,82,85-triazaheptaoctacontanamido)bencil ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R))-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il) amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil) pirrolidin-1-il)-3-metoxi- 5-metil-1-oxoheptan-4-il) (metil) amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) (metil) carbamato (21): El intermediario 20 enlazador ValCit-PAB-MMAE (sintetizado como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 7,659,241) (16 mg, 14 |jmol) se disolvió en dimetilformamida anhidra (0,28 ml) y se añadió a un matraz que contenía Na-Fmoclisina(PEG)-OSu 7 (25 mg, 17 jmol). Después se añadió diisopropiletilamina (12 j L, 70 jmol), y la reacción se agitó después en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Después de 6 h, LC-MS reveló la conversión al producto. El producto se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el intermediario 21 Fmoc-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE (15 mg, 42 %) como un residuo oleoso. Hp Lc analítica (ácido fórmico al 0,1 %): Sistema de LC-MS 2: tR 11,67 min, m/z (ES+) encontrada 2573,2493 (M+H)+.
4-((80S,83S,86S)-80-ammo-83-isopropil-74,81,84-trioxo-86-(3-ureidopropM)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-tetracosaoxa-75,82,85-triazaheptaoctacontanamido)bencil ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)(metil)carbamato (22): El intermediario 21 Fmoc-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE (15 mg, 6 jmol) se disolvió en 0,16 ml de dimetilformamida anhidra, seguido de la adición de 0,04 ml de piperidina. La reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 1,5 horas y después se concentró hasta la sequedad. El producto se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el
intermediario 22 H-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE (13 mg, 93 %) como un residuo oleoso. Sistema de LC-MS 2: tr 9,72 min, m/z (ES+) encontrada 2351,1787 (M+H)+.
4-((80S,83S,86S)-80-((S)-3-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)propanamido)-83-isopropN-74,81,84-trioxo-86-(3-ureidopropN)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71 -tetracosaoxa-75,82,85-triazaheptaoctacontanamido)bencil ((S)-1 -(((S)-1 -(((3R,4S,5S)-1 -((S)-2-((1 R,2R)-3-(((1 S,2R)-1 -hidroxi-1 -fenilpropan-2-il)amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1 -il)-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)(metil)carbamato (23): Se disolvió MDpr(Boc)-OSu 12 (4 mg, 11 ^mol) en 0,12 ml de dimetilformamida anhidra y se añadió a un matraz que contenía el intermediario 22 enlazador H-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE (13 mg, 5,5 ^mol). Después se añadió diisopropiletilamina (5 ^L, 28 ^mol), la reacción se agitó después en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se inactivó con 5 ^L de ácido acético glacial y se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el intermediario 23 MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE (10 mg, 69 %). Sistema de LC-MS 2: tR 11,25 min, m/z (ES+) encontrada 2617,3203 (M+H)+.
4-(80S,83S,86S)-80-((S)-3-amino-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -N)propanamido)-83-isopropil-74,81,84-trioxo-86-(3-ureidopropil)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71 -tetracosaoxa-75,82,85-triazaheptaoctacontanamido)bencil ((S)-1 -(((S)-1 -(((3R,4S,5S)-1 -((S)-2-((1 R,2R)-3-(((1 S,2R)-1 -hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1 -il)-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)(metil)carbamato (24): Un matraz que contenía el intermediario 23 MDpr(Boc)-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE (10 mg, 4 umol) se enfrió a 0 °C en un baño de hielo en atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de ácido trifluoroacético al 10 % en diclorometano (0,4 ml). La reacción se agitó después a 0 °C durante 3 h. La reacción se concentró después a un residuo crudo y se purificó por HPLC preparativa para proporcionar el enlazador 24 MDpr-Lys(PEG24)-ValCit-PAB-MMAE (4 mg, 40 %). Sistema de LC-MS 2: tR 9,81 min, m/z (ES+) encontrada 2517,2930 (M+H)+.
Ejemplo 7. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela muestran una actividad in vitro similar a sus contrapartes no PEGiladas o ADC que comprenden PEG en una orientación en serie
Las células cultivadas en crecimiento en fase logarítmica se sembraron durante 24 h en placas de 96 pocillos que contenían 150 ^l de RPMI 1640 complementado con FBS al 20 %. Se prepararon diluciones en serie de ADC en medios de cultivo celular a una concentración de trabajo 4x; se añadieron 50 ^l de cada dilución a las placas de 96 pocillos. Después de la adición de ADC, las células se incubaron con los compuestos de prueba durante 4 días a 37 °C. Después de 96 h, se evaluó la inhibición del crecimiento mediante Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI) y se midió la luminiscencia en un lector de placas. El valor de IC50, determinado por triplicado, se define aquí como la concentración que da como resultado una reducción del 50 % en el crecimiento celular con respecto a los controles no tratados.
Los compuestos 1, 4 y 10 se conjugaron mediante sus tioles intercatenarios con el anticuerpo cAC10 quimérico descrito en la patente de Estados Unidos núm. 7,090843 con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos por anticuerpo. Los compuestos 4 y 10 se describen anteriormente. El compuesto 1 es el siguiente:
Se midió la actividad citotóxica in vitro de los ADC resultantes contra líneas celulares CD30+ y CD30-. Ni la adición de PEG ni su configuración tuvieron ningún efecto significativo sobre la actividad in vitro; sólo se observaron diferencias insignificantes en la potencia del ADC, y en dos líneas celulares (L540cy y Karpas-299) las actividades fueron esencialmente idénticas (Tabla 1).
Tabla 1. Actividad citotóxica in vitro de ADC anti-CD30; los valores representan la IC50 en ng/ml.
Líneas celulares CD30+ CD30-ADC fármacos/Ac ---------------------------------------------------------------- ---------------------Karpas 299 L540cy L428 WSU-NHL
Ejemplo 8. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela muestran una farmacocinética favorable en comparación con los ADC que comprenden PEG en una orientación en serie
Radiomarcaje de anticuerpos y ADC: se realizaron experimentos farmacocinéticos (PK) mediante el uso de anticuerpo o ADC radiomarcados. Los compuestos de prueba PK se marcaron radiactivamente mediante el uso del siguiente procedimiento. A una solución de anticuerpo o ADC en PBS suplementado con fosfato de potasio 50 mM adicional (pH 8,0) y cloruro sódico 50 mM se añadió 55 pCi de propionato de N-succinimidilo, [propionato-2,3-3H]-(Moravek Biochemicals, cat. núm.: MT 919, 80 Ci/mmol, 1 mCi/ml, solución 9:1 de hexano:acetato de etilo) por mg de anticuerpo o ADC. La mezcla resultante se agitó con vórtice y se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se centrifugó a 4000 x g durante 5 minutos y la capa acuosa inferior se retiró y se dividió en unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore, cat. núm.: UFC903024, MWCO de 30 kDa). La radiactividad no conjugada se eliminó mediante 4 rondas de dilución y centrifugación a 4000 x g. Los productos resultantes se filtraron a través de unidades de filtro centrífugo Ultrafree-MC estériles de 0,22 pm (Millipore, cat. núm.: UFC30GV0S) y la concentración final de anticuerpo o ADC se midió mediante espectrofotometría. La actividad específica (pCi/mg) de cada producto se determinó mediante conteo de centelleo líquido.
Experimentos farmacocinéticos: se examinaron las propiedades farmacocinéticas del anticuerpo no conjugado o el ADC en varios modelos de roedores. En cada experimento, se inyectaron 1-3 mg de ADC o anticuerpo radiomarcado por kg de peso del animal a través de la vena de la cola. Cada compuesto de prueba se dosificó una vez en animales replicados. Se extrajo sangre en tubos con K2EDTA a través de la vena safena o mediante punción cardíaca para las hemorragias terminales en varios momentos. El plasma se aisló mediante centrifugación durante 10 minutos a 10000 x g. Se añadió una muestra de 10-20 pl de plasma de cada punto de tiempo a 4 ml de cóctel de centelleo líquido Ecoscint-A (National Diagnostics) y se midió la radiactividad total mediante conteo de centelleo líquido. Los valores resultantes de desintegraciones por minuto se convirtieron a pCi y se usó la actividad específica de los compuestos de prueba radiomarcados para calcular la concentración de anticuerpo o ADC que quedaba en el plasma en cada momento. Los parámetros farmacocinéticos (eliminación y AUC) se determinaron a partir de los datos de concentración plasmática resultantes. Los parámetros farmacocinéticos estimados se calcularon mediante un análisis no compartimental en Phoenix WinNonlin v6.3 (Pharsight, Mountain View, CA) mediante el uso de la opción de dosis en bolo intravenoso.
Los compuestos 1, 4 y 10 se conjugaron mediante sus tioles intercatenarios con el anticuerpo cAC10 quimérico descrito en la patente de Estados Unidos núm. 7,090,843, que se incorpora en la presente descripción como referencia, con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos por anticuerpo. Como era de esperar, un ADC preparado con 8 copias del enlazador-fármaco no PEGilado 1 mostró una eliminación muy rápida y una exposición baja en relación con el anticuerpo no conjugado (Figura 7). Sorprendentemente, el enlazador-fármaco PEGilado 4, con PEG en una configuración en serie, produjo un ADC con una eliminación aún más rápida y una exposición más baja que el formato no PEGilado. Este resultado fue inesperado dado el número de ejemplos en la técnica de ADC preparados de acuerdo con este diseño. Por el contrario, el ADC preparado con enlazador-fármaco 10, con PEG en una configuración paralela, produjo un ADC con una eliminación considerablemente más lenta y mayor exposición que el formato no PEGilado (ver la figura 7 y la tabla 2).
Tabla 2
Alternativamente, se puede utilizar un ensayo de anticuerpos totales (Tab) basado en ELISA para obtener medidas farmacocinéticas. Una solución de 100 pl de un anticuerpo anti-kappa de IgG humana (0,5 mg/ml, soluciones de
anticuerpos, Mountain View CA) en tampón de carbonato-bicarbonato 0,05 M (pH 9,6, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) se añadió a cada pocillo de una placa de poliestireno de 96 pocillos recubiertos con MaxiSorp™ (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las placas se incubaron a 4 °C durante la noche. Después de la incubación, la placa se lavó 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % (PBS-T). A continuación, los pocillos se bloquearon con PBS-T que contenía albúmina de suero bovino al 1 % a temperatura ambiente durante al menos 1 hora. Después del bloqueo, la placa se lavó 3 veces con PBS-T. Se prepararon reservas concentradas de patrones de anticuerpos o ADC (concentraciones 40 x) en plasma de rata o ratón para generar una curva patrón. A continuación, las muestras de plasma y los patrones se diluyeron 1:40 en PBS-T. Las muestras diluidas y los patrones (100 jl) se agregaron a los pocillos de la placa ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, las muestras se retiraron y la placa se lavó 3 veces con PBS-T. Una solución de peroxidasa-AffiniPure fragmento F(ab')2 de cabra anti-IgG humana, fragmento específico de Fcy (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) se diluyó 1:30000 en PBS-T y se añadieron 100 jL a cada pocillo. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, las muestras se retiraron y la placa se lavó 3 veces con PBS-T. Se añadió a cada pocillo una solución de sustrato de peroxidasa de SureBlueTMB Microwell (KPL, Inc. Gaithersburg, MD) (100 jl). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 11 a 12 minutos y las reacciones se inactivaron con 100 j l de HCl 1 N. Las placas se leyeron a 450 nm en un lector de placas Spectromax de Molecular Devices.
Ejemplo 9. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela tienen una actividad ¡n vivo mejorada en comparación con los ADC que comprenden PEG en una orientación en serie o los ADC que carecen de una unidad de PEG
Modelos de xenoinjerto in vivo: todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité para el uso y cuidado de animales en una instalación totalmente acreditada por la Asociación para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio. Los experimentos de eficacia se llevaron a cabo en modelos de xenoinjerto de linfoma anaplásico de células grandes Karpas 299, linfoma de Hodgkin L540cy, linfoma de Burkitt Ramos y cáncer de mama MCF-7. Las suspensiones celulares o los fragmentos tumorales se implantaron por vía subcutánea en ratones inmunodeprimidos. A los ratones que portaban tumores MCF-7 se les administró conjuntamente un comprimido de liberación lenta de 17p-estradiol implantado por vía subcutánea. Los ratones se asignaron al azar a los grupos de estudio cuando el volumen tumoral promedio alcanzó aproximadamente 100 mm3 El ADC o los controles se dosificaron por vía ip una vez. El volumen tumoral en función del tiempo se determinó mediante la fórmula (L x W2)/2. Los animales se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 1000 mm3. Los ratones que mostraron regresiones duraderas se sacrificaron alrededor del día 100 después del implante.
Los estudios iniciales se realizaron con el modelo L540cy (Figura 1) dosificado a 2 mg/kg (dosis única) de cada ADC, y a 0,6 mg/kg (dosis única) para el modelo Karpas-299 (Figura 2). Las gráficas del volumen del tumor a lo largo del tiempo se muestran en las figuras 1 y 2. Todos los enlazadores-fármacos se conjugaron mediante sus tioles intercatenarios al anticuerpo cAC10 quimérico descrito en la patente de Estados Unidos núm. 7,090,843, que se incorpora en la presente descripción como referencia, con una carga de fármaco promedio de 8 fármacos por anticuerpo. En ambos modelos, los ADC preparados con 1 (cAC10-mc-PAB(gluc), no PEGilado) y 10 (diseño PEGilado en el esquema 2) curaron a todos los animales (5/5) en sus grupos de dosis, mientras que el ADC preparado con 4 no produjo curaciones y solo retrasos modestos en el crecimiento del tumor. La actividad disminuida de cAC10-4 es consistente con su exposición muy reducida que se observó en el estudio de PK, que se muestra en la figura 7. Se sospechaba que las diferencias farmacocinéticas en cuanto a la actividad también se observarían entre cAC10-1 y cAC10-10, pero se necesitarían dosis más bajas. En consecuencia, los estudios se repitieron con ambos modelos a niveles de dosis A y % de las dosis utilizadas en los estudios iniciales. Para L540cy, una dosis de 1 mg/kg produjo curas completas (6/6) para cAC10-10, y sólo 2/6 curas para cAC10-1 (Figura 3). A 0,5 mg/kg, no se observaron curas para ninguno de los grupos; sin embargo, cAC10-10 produjo un retraso del crecimiento tumoral más prolongado que cAC10-1 (Figura 3). En ambos niveles de dosis, la actividad antitumoral en L540cy para cAC10-10 es mayor que para cAC10-1, en línea con sus respectivas propiedades farmacocinéticas. Para Karpas-299, una dosis de 0,3 mg/kg produjo 6/6 curas para cAC10-10 y 5/6 curas para cAC10-1 (Figura 4). A 0,15 mg/kg, se observaron 5/6 curas para cAC10-10 y sólo 2/6 curas para cAC10-1 (Figura 4). Así, para Karpas-299, se observó una mayor actividad antitumoral al nivel de dosis más bajo para cAC10-10, donde los dos ADC mostraron altas tasas de curación por encima de este nivel.
Los esquemas 3 y 4 describen la síntesis de análogos del enlazador 1 no PEGilado y del enlazador PEGilado 10, respectivamente, que incorpora el grupo ácido Na-maleimido-diaminopropiónico (MDpr) como el punto de conjugación. Los dos enlazadores se evaluaron en los modelos de linfoma de Burkitt Karpas299 ALCL y Ramos. Para Karpas299, los conjugados con cAC10 de 14 (no PEGilado) y 16 (PEGilación paralela) se dosificaron una vez a 0,2 mg/kg y se observó un retraso similar en el crecimiento del tumor (Figura 5). En contraste, en el modelo Ramos, hBU12-16 ejerce una mayor actividad antitumoral que hBU12-14 en dos dosis diferentes. Tras una dosis única de 2 mg/kg, hBU12-16 produjo 5/5 curas en comparación con 0/5 para hBU12-14 (Figura 6).
Ejemplo 10. Síntesis de un soporte de conjugación mDPR-cys(StBu)-PEG2-36-OH y un soporte de conjugación mDPR-cys(StBu)-PEG48-72-OH
Esquema 7: Síntesis de MDpr-Cys(StBu)-PEG
2
-
36
-OH
Carga de resina de cloruro de 2-clorotritilo: Se cargó una jeringa de polipropileno equipada con un disco de polipropileno poroso con resina de cloruro de 2-clorotritilo. Se introdujo en la jeringa una solución de Fmoc-PEGn-OH (1 equiv.) y DIEA (1 equiv.) en DCM anhidro (10 ml/gramo de resina). La jeringa se cerró con un tapón de goma y se agitó durante 5 min, momento en el que se añadió DIEA adicional (1,5 equiv.). Después de agitar durante 30 min más, se introdujo MeOH (al menos 0,8 ml/gramo de resina) en la jeringa para inactivar la resina que no había reaccionado. Después de agitar durante 5 min, la solución se sacó de la jeringa y la resina se lavó con DMF (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml) y éter dietílico (6 x 5 ml). La resina se secó al vacío.
Carga de resina de amida de Rink: A una solución de un PEG o aminoácido protegido con Fmoc (4 equiv.) en DMF anhidra (10 ml/gramo de resina) se le añadió HATU (4 equiv.) y DIEA (8 equiv.). La solución se agitó durante 5 min y se introdujo en una jeringa de polipropileno equipada con un disco de polipropileno poroso cargado con resina de amida de Rink. La mezcla de reacción se agitó durante un mínimo de 2 horas y la terminación de la reacción se confirmó mediante la prueba de Kaiser. La resina se lavó con DMF (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml) y éter dietílico (6 x 5 ml) y se secó al vacío.
Desprotección de Fmoc: La resina de Fmoc-PEGn-2-clorotritilo en una jeringa de polipropileno equipada con un disco de polipropileno poroso se hinchó durante 30 min con DCM (10 ml/gramo de resina). El DCM se retiró y la resina se lavó con DMF (6 x 5 ml). La resina se lavó con una solución de piperidina al 20 % en DMF (3 x 2 min y 1 x 60 min) con agitación. La terminación de la reacción se confirmó mediante la prueba de Kaiser y la resina desprotegida de Fmoc resultante se lavó con DMF (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml) y éter dietílico (6 x 5 ml) y se secó al vacío.
Acoplamiento de aminoácidos: A una solución de un aminoácido, MDpr(Boc)-OH (3 equiv.) o ácido PEG protegido con Fmoc en DMF anhidro (10 ml/gramo de resina) se le añadió HATU (3 equiv.) y DIEa (6 equiv). La solución se agitó durante 5 min y se introdujo en la jeringa de polipropileno que contenía el aminoácido desprotegido de Fmoc 2-clorotritil-resina. La mezcla de reacción se agitó durante un mínimo de 2 horas y la terminación de la reacción se confirmó mediante la prueba de Kaiser. La resina se lavó con DMF (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml) y éter dietílico (6 x 5 ml) y se secó al vacío.
Eliminación del grupo protector IvDde: Para eliminar el grupo protector IvDde, la resina peptídica se lavó con una solución de hidrazina al 2 % en DMF (2 x 30 min) con agitación. La terminación de la reacción se confirmó mediante la prueba de Kaiser y la resina desprotegida de IvDde resultante se lavó con DMF (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml) y éter dietílico (6 x 5 ml) y se secó al vacío.
Escisión péptido-resina: los péptidos finales se escindieron de la resina mediante tratamiento con TFA en DCM (30 % v/v para resina de 2-clorotritilo o 95 % v/v para resina de amida de Rink) durante 15 min. Después de la escisión, la solución se dejó durante 60 minutos más para asegurar la eliminación completa del grupo protector Boc del residuo MDpr. La solución resultante se evaporó con una corriente de nitrógeno y los péptidos resultantes se analizaron por LC-MS. Los péptidos se usaron crudos o se purificaron mediante HPLC preparativa de fase inversa seguida de análisis LC-MS.
Ejemplo 11. Conjugación del soporte de conjugación pegilado con anticuerpo y enlazador-fármaco.
Esquema 11: Conjugación del fármaco a soportes PEGilados
en donde XR es el resto del precursor de la unidad de ensamblaje liberable X' en una porción X'-D o el resto de la unidad de ensamblaje liberable X en una porción -X-D.
Reducción completa de los enlaces disulfuro intercatenarios del anticuerpo: a una solución de anticuerpo a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml en PBS que contiene ácido dietilentriaminopentaacético (1 mM) y tamponado con fosfato de potasio adicional (100 mM, pH 7,4) se le añadieron 12 equivalentes de tris (2-carboxietil)-fosfina (TCEP). La solución se agitó con vórtice y se incubó a 37 °C durante 1 hora. La reducción completa de los enlaces disulfuro intercatenarios se confirmó mediante cromatografía de fase inversa. Se agregó TCEP adicional si la reducción era incompleta. Después de la reducción, la solución de anticuerpo se desaló en PBS que contenía EDTA 2 mM mediante 3 rondas de dilución y centrifugación a 4000 x g a través de un filtro de MWCO de 30 kDa. El anticuerpo totalmente reducido resultante (34) se filtró a través de un filtro centrífugo estéril de 0,22 pm y se usó inmediatamente o se almacenó a -80 °C.
Conjugación de soporte pegilado que contiene maleimida: A una solución de anticuerpo completamente reducido (34) a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml en PBS que contenía EDTA (2 mM) y tamponado con fosfato de potasio adicional (100 mM, pH 7,4) se añadió 12 equivalentes molares de MDpr-PEGn-OH de una solución madre de DMSO 5-20 mM. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 30 min. La conjugación completa se confirmó mediante cromatografía de fase inversa. Se añadió reactivo de PEG adicional si la conjugación era incompleta. Después de la conjugación, la solución de anticuerpo se desaló en PBS mediante 3 rondas de dilución y centrifugación a 4000 x g a través de un filtro de MWCO de 30 kDa. La solución de anticuerpo PEGilado resultante (36 y 37) se filtró a través de un filtro centrífugo estéril de 0,22 pm y se usó inmediatamente o se almacenó a -80 °C.
Eliminación de grupos protectores de t-butiltiol del soporte de conjugación PEGilado: a una solución de anticuerpo PEGilado (36 y 37) a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml en PBS que contenía ácido dietilentriaminopentaacético (1 mM) y tamponado con fosfato de potasio adicional (100 mM, pH 7,4) se añadieron 20-30 equivalentes de TCEP. La solución se agitó con vórtice y se incubó a 37 °C durante 3 horas. La eliminación completa de los grupos protectores de t-butiltiol se confirmó mediante cromatografía de fase inversa. Se añadió TCEP adicional y se continuó la incubación a 37 °C si la reducción era incompleta. Después de la reducción, la solución de anticuerpo se desaló en PBS que contenía EDTA 2 mM mediante 3 rondas de dilución y centrifugación a 4000 x g a través de un filtro de MWCO de 30 kDa. La solución de anticuerpo PEGilado desprotegido resultante (38 y 39) se filtró a través de un filtro centrífugo estéril de 0,22 pm y se usó inmediatamente o se almacenó a -80 °C.
Conjugación de enlazadores-fármacos que contienen maleimida: a una solución de anticuerpo PEGilado desprotegido (38 y 39) a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml en PBS que contenía EDTA (2 mM) y tamponado con fosfato de potasio adicional (100 mM, pH 7,4) se añadieron 12 equivalentes molares de un enlazador-fármaco que contiene maleimida de una solución madre de DMSO 5-20 mM. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 30 min. La conjugación completa se confirmó mediante cromatografía de fase inversa. Se añadió enlazador-fármaco adicional si la conjugación era incompleta. Después de la conjugación, la solución de anticuerpo se desaló en PBS mediante 3 rondas de dilución y centrifugación a 4000 x g a través de un filtro de MWCO de 30 kDa. La solución de conjugado anticuerpo-fármaco PEGilado resultante (40 y 41) se filtró a través de un filtro centrífugo estéril de 0,22 pm, se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y se almacenó a -80 °C.
Ejemplo 12. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela mostraron bajos niveles de agregación
Análisis SEC de conjugados: Se diluyeron muestras de anticuerpo, ADC, de ADC PEGilado (50 pg) a 1 mg/ml en PBS y se cromatografiaron inyecciones de 30 pL en una columna de SEC analítica (TOSOH TSKgel G3000SWxl, 7,8 mm DI x 30 cm, 5 pm) en un sistema de HPLC Waters 2695. Las muestras se eluyeron isocráticamente con fosfato de sodio 25 mM al 92,5 % (pH 6,8), NaCl 350 mM y alcohol isopropílico al 7,5 % a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
Para examinar el efecto de la longitud de PEG sobre la agregación de ADC, se prepararon ADC de cAC10-MDprvcMMAE con 8 fármacos por anticuerpo con o sin soportes de conjugaciones PEGilados que se ensamblaron mediante el uso de unidades de PEG de tamaño variable. Los resultados de SEC se muestran en la Figura 8. Sin la inclusión del soporte de conjugación PEGilado (cAC10-A), la agregación de ADC fue del 10,4 %. Agregar el soporte PEGilado genera ADC con niveles de agregación más bajos. La agregación disminuyó con el aumento de la longitud de PEG hasta PEG36 (cAC10-D), donde el máximo agregado fue de 2,0 % de la señal total. En el caso de cAC10-MDpr-vcMMAE, las unidades de PEG más largas que PEG36 (cAC10-D -cAC10-G) no disminuyen más la agregación.
Estructuras de enlazadores-fármacos incluidos en el estudio de SEC: Los ADC se conjugan con el anticuerpo a través de los tioles intercatenarios. Las succinimidas sustituidas con anticuerpos pueden existir en sus formas hidrolizadas (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno de los enlaces C-N de la succinimida y no de ambos).
Ejemplo 13. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela muestran una actividad in vitro similar a sus contrapartes no pegiladas
Citotoxicidad in vitro de ADC preparados con soportes de conjugación PEGilados Se prepararon ADC basados en MDpr-vcMMAE dirigidos hacia CD30 con y sin la adición de un soporte de conjugación PEGilado. Se ensayaron los conjugados de compuestos A (no PEGilados), B (PEG12), C (PEG24) y D (PEG36) contra las líneas celulares positivas para CD30, Karpas 299 y L540cy. La inclusión de PEG y el aumento de la longitud de PEG conducen a una diferencia insignificante en ¡a citotoxicidad in vitro (Tabla 3). Los ADC de control (no PEGilados y PEGilados) preparados con n-etilaminomaleimida (NAEM) en lugar de MDpr-vcMMAE (cAC10-H, cAC10-I y cAC10-J) no mostraron actividad en este ensayo, lo que indica que los soportes PEGilados no contribuyen a la citotoxicidad in vitro.
Tabla 3 Actividad citotóxica in vitro de ADC anti-CD30 preparados con soportes de conjugación PEGilados; los valores representan IC50 s en ng/ml.
Cuando se comparó con el conjugado no PEGilado cAC10-A con carga de 4 fármacos, el cAC10-A cargado con 8 fármacos tenía 2-4 veces la citotoxicidad in vitro contra Karpas 299 y L540cy; sin embargo, el ADC con 8 cargas no superó al ADC con 4 cargas en modelos de xenoinjerto in vivo debido a una eliminación más rápida del ADC con 8 cargas (véase el ejemplo 14).
El conjugado cAC10 PEG 24, cAC10-10 que tiene -X-D de mc-PABA(gluc)-MMAE, que se preparó a partir del intermediario enlazador-fármaco del Ejemplo 2 y tiene la unidad de PEG24 en orientación paralela (fármaco/Ac de 8) al fármaco, también tenía una mayor actividad en modelos de xenoinjerto en comparación con el correspondiente ADC no PEGilado con 8 cargas (cAC10-1) y el ADC con 8 cargas que tiene la unidad PEG24 en orientación en serie
(cAC10-4), en donde este último se preparó a partir del intermediario enlazador-fármaco del ejemplo 1 (véanse las figuras 1 y 2).
Soportes de conjugación bloqueados con NAEM utilizados como controles: los ADC se conjugan con el anticuerpo a través de los tioles intercatenarios. Las succinimidas sustituidas con anticuerpos pueden existir en sus formas hidrolizadas (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno de los enlaces C-N de la succinimida y no de ambos).
Ejemplo 14. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela mejoraron la farmacocinética en comparación con los ADC que no comprenden PEG
A los ratones se les administró una única dosis iv de 3 mg/kg de cada ADC cargado a 8 fármacos/AcM. Como se esperaba, los ADC no PEGilados preparados con mc-vcMMAE (K) o MDpr-vcMMAE (A) se eliminaron de la circulación mucho más rápidamente que el conjugado de control preparado con NAEM. Los correspondientes ADC PEGilados C y L mostraron una PK mejorada, es decir, una eliminación más lenta (Figura 9).
Compuestos adicionales incluidos en la PK de ratón - Los ADC se conjugan con el anticuerpo a través de los tioles intercatenarios. Las succinimidas sustituidas con anticuerpos pueden existir en sus formas hidrolizadas (es decir, se añade una molécula de agua a través de uno y no de ambos enlaces C-N de la succinimida).
En un segundo experimento, a los ratones se les administró una única dosis intravenosa de 3 mg/kg de cada ADC cargado a 8 fármacos/AcM. Como se señaló anteriormente (Figura 9), el ADC preparado con MDpr-vcMMAE A no PEGilado mostró una eliminación acelerada de la circulación (Figura 10). Los tres ADC preparados con los soportes de conjugación PEGilados B, C y D mostraron una eliminación mejorada (Figura 10). En este ensayo, los ADC preparados con las diferentes longitudes de PEG, PEG12 (B), PEG24 (C) y PEG36 (D) mostraron diferencias insignificantes entre sí. Como se anticipó, los conjugados de control preparados a partir de soportes de PEGilación bloqueados con NAEM (H, I y J) mostraron una p K muy parecida al anticuerpo bloqueado con NAEM (Figura 10).
Ejemplo 15. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela mejoraron la farmacocinetica en comparación con los ADC que no comprenden PEG
Los ADC basados en cAC10 preparados con (B, C y D) y sin soportes de conjugación PEGilados (A) se analizaron en un modelo de xenoinjerto de L540cy. Los animales recibieron una dosis de 2 mg/kg (dosis única) de cada ADC y se midió el volumen del tumor a lo largo del tiempo. El volumen tumoral en los animales no tratados alcanzó 1000 mm3 el día 25 del estudio. El ADC preparado con el enlazador-fármaco no PEGilado (A) curó a 2 de 5 ratones y un tiempo medio de 57,3 días para que los volúmenes tumorales alcanzaran 1000 mm3 en los animales no curados
(Figura 11). El ADC preparado con el soporte de conjugación PEGilado ensamblado con PEG12 (B) mostró una actividad similar al ADC preparado con A (Figura 12). En este caso, se curó 1 de 5 animales y se requirió un tiempo medio de 68,5 días para que los volúmenes tumorales alcanzaran 1000 mm3 en los animales no curados. El ADC preparado con el soporte que contiene PEG24 (C) mostró una mejora con respecto a A ya que curó 4 de 5 ratones, y el tumor restante alcanzó 1000 mm3 el día 53 (Figura 13).
En un segundo experimento, los ADC basados en hLIV22 (el anticuerpo hLIV22 se describe en la publicación PCT núm. WO 2012/078688, que se incorpora en la presente descripción como referencia) dirigido al antígeno del carcinoma de mama, LIV-1, se prepararon con mc-vcMMAE con (L) y sin el soporte de conjugación habilitado con PEG24 (K). A los animales se les administró una dosis de 3 mg/kg (dosis única) de cada ADC. En el brazo del estudio sin tratamiento, el tiempo medio para que los volúmenes de los tumores alcanzaran los 1000 mm3 fue de 39,2 días. El tratamiento con hLIV22-K retrasó este tiempo a 57,6 días y el ADC PEGilado, hLIV22-L desplazó aún más esta media a 71,4 días (Figura 14).
Ejemplo 16. Los ADC que comprenden PEG en una orientación paralela y 16 fármacos por anticuerpo mostraron menos agregación en comparación con los ADC que no comprenden PEG
Para examinar el efecto de PEG sobre la agregación de ADC con 16 cargas, se prepararon conjugados contra el receptor de la transferrina mediante el uso de MDpr-glucurónido-camptotecina como la unidad -X-D. Los ADC se prepararon como 8 cargas estándar (8 fármacos por anticuerpo) o 16 cargas (16 fármacos por anticuerpo) con o sin inclusión de una unidad de PEG. La conjugación se realizó a través de los disulfuros intercatenarios. Los soportes de conjugación PEGilados y no PEGilados de control (Armazón de PEG A y Armazón de control A, respectivamente) que se utilizaron para preparar ADC con carga de 16 fármacos son los siguientes
Se prepararon conjugados de anticuerpo-fármaco a partir del soporte de PEG A con n = 23, que representa un compuesto intermediario de ligando ilustrativo, y el soporte de control A como se describe en el Ejemplo 11 de la siguiente manera: (a) poner en contacto el soporte con un anticuerpo que tiene grupos tiol que pueden conjugar la adición a la unidad de maleimida del soporte para formar porciones de succinimida sustituidas con anticuerpos (b) eliminar los grupos protectores de tiol y (c) poner en contacto el producto resultante con porciones -X-D en donde X es una unidad de ensamblaje liberable compuesta por una unidad de maleimida y una unidad escindible en donde las unidades de maleimida de X-D pueden reaccionar con los grupos tiol libres obtenidos de la etapa (b) mediante la adición de conjugado en condiciones adecuadas que convierten las unidades de maleimida de X-D en porciones de succinimida sustituidas adicionales a la vez que evita la hidrólisis prematura de las porciones de succinimida derivadas del soporte y porciones X-D y (d) hidrólisis de las succinimidas sustituidas en colectivo del compuesto enlazador-fármaco obtenido de la etapa (c) mediante la adición de una molécula de agua a través de uno y no de ambos enlaces C-N de succinimida para cada una de las porciones de succinimida introducidas a partir de una porción MDpr como la unidad de maleimida.
El soporte de PEG A se incluye en
(es decir, fórmula VIIIb), en donde Z’ es la porción que contiene MDpr, A es el residuo de lisina central y los dos Lp son los residuos de cisteína flanqueantes.
Otro soporte adecuadamente protegido que proporciona un conjugado con carga de 16 fármacos es el soporte de PEG B cuya estructura es
en donde n es 36.
El soporte de PEG B se incluye en
(es decir, fórmula VlIId), en donde Z’ es la porción MDpr, t es 1 y AD y LP son residuos de cisteína.
Sin la inclusión del soporte de conjugación PEGilado, el nivel de agregación del ADC de 16 cargas fue del 22 %. La adición del soporte PEGilado, que tiene la unidad de PEG en orientación paralela a la unidad de fármaco, redujo el nivel de agregación al de 8 cargas, es decir, 2 % de agregado.
Los ADC anti-receptor de transferrina con 8 cargas y PEGilado con 16 cargas (cOKT9) que tienen -X-D de MDpr-PABA(gluc)-camptotecina se analizaron contra un panel de líneas celulares de cáncer TfR+. En la mayoría de los casos, duplicar la carga de fármaco aumentó la potencia del ADC en aproximadamente 2 veces. En varios casos, la potencia del ADC aumentó de 3 a 10 veces o más, incluso aunque la carga de fármaco solo aumentó 2 veces. Lo más notable es que el conjugado de 16 cargas fue activo contra la línea celular colorrecta1HT-29 (número de copia de TfR 23K) y la línea celular de melanoma SK-MEL-5 (número de copia de TfR 21K), mientras que el conjugado de 8 cargas se consideró inactivo (IC50 > 1 ^M).
Ejemplo 17. Los ADC cargados con 4 fármacos por anticuerpo con PEG24 en una orientación paralela muestran una actividad disminuida in vivo con respecto a sus homólogos no PEGilados.
Cuando la carga de fármaco del ADC se redujo a 4 fármacos por anticuerpo, se encontró que los conjugados que portaban el enlazador 10 de glucurónido-MMAE PEGilado tenían una exposición PK similar al conjugado no PEGilado que porta el enlazador 1. Por consiguiente, la PEGilación no proporcionó una mejora en la actividad en modelos de xenoinjerto in vivo.
El anticuerpo quimérico anti-CD30 cAC10 se conjugó con el enlazador 1 no PEGilado o el enlazador PEGilado 10 con una carga promedio de 4 fármacos/anticuerpo y se evaluó en modelos tumorales de linfoma de Hodgkin L540cy y linfoma anaplásico de células grandes Karpas 299. Para L540cy (Figura 13), a los animales se les administró una sola dosis ip de ADC a 0,5 y 1 mg/kg. A la dosis más elevada de 1 mg/kg, tanto el PEGilado (cAC10-10) como el no pegilado (cAC10-1) eran equipotentes, proporcionando curas en 5/6 ratones. Sin embargo, a la dosis inferior de 0,5 mg/kg el enlazador no pegilado (cAC10-1) produjo un retraso del crecimiento tumoral promedio más prolongado con 2/6 ratones curados. En tanto, el enlazador PEGilado (cAC10-10) fue menos potente, sin ratones curados. Se obtuvieron resultados análogos en el modelo de xenoinjerto de Karpas299 (Figura 16).
Estos hallazgos sugieren que. en ausencia de la mejora de la PK del conjugado, la PEGilación con 24 unidades de PEG provoca una atenuación diminuta de la actividad in vivo. Esto puede deberse a una alteración en la liberación enzimática del fármaco o una disminución de la permeabilidad debido al aumento del tamaño del conjugado tras la PEGilación.
Ejemplo 18. Los ADC cargados con enlazadores-fármacos glucurónidos PEGilados muestran una actividad in vivo coherente con las propiedades PK del conjugado.
Para determinar si existe un tamaño de PEG óptimo para la combinación de glucurónido y MMAE, se prepararon y evaluaron una serie de enlazadores PEGx, que incluyen no PEGilados, PEG2, PEG4, PEG8, PEG12, PEG24 y PEG4-(PEG4)3 ramificado. Los ADC no pegilados cAC10-14 y hBU12-14 de las Tablas 4 y 5, respectivamente, son similares en estructura a los ACD PEGilados, pero carecen de una unidad de LP’ mientras que en el caso de los soportes PEGilados es un residuo de lisina.
El trabajo in vitro inicial demostró un efecto mínimo del tamaño de PEG sobre la actividad en la mayoría de las líneas celulares analizadas. Los anticuerpos anti-CD30 y anti-CD19, cAC10 y hBU12, respectivamente, se conjugaron con 8 fármacos/anticuerpo y se evaluaron frente a un panel de líneas celulares de linfoma. Las líneas de linfoma de Hodgkin L540cy y L428 positivas para CD30 y el linfoma anaplásico de células grandes Karpas 299 fueron muy sensibles a todos los conjugados de cAC10 independientemente del tamaño de PEG como se muestra en la tabla 4.
Tabla 4. Citotoxicidad in vitro; conjugados para aCD30 (IC50 en ng/ml)
Líneas celulares CD30+ CD30-ADCa PEGx
Karpas 299 L540cy L428 RL cAC10-14 sin PEG 0,3 3 85 >1000 cAC10-43 PEG2 0,3 2 10 >1000 cAC10-42 PEG4 0,4 3 16 >1000 cAC10-18 PEG8 0,3 2 18 >1000 cAC10-17 PEG12 0,3 2 19 >1000 cAC10-16 PEG24 0,4 3 8 >1000 cAC10-19 PEG4-(PEG4)3 0,1 1 8 >1000 aADC cargados con 8 fármacos/Ac
La actividad de los conjugados con hBU12 (anti-CD19) que portan enlazadores PEGx-glucurónido-MMAE en un panel de líneas celulares de linfoma no Hodgkin fue más variable, como se muestra en la tabla 5. El tamaño de PEG no tuvo ningún efecto sobre la potencia del ADC en el linfoma de Burkitt Ramos. Sin embargo, la potencia del conjugado pareció variable en función del tamaño de PEG en las líneas celulares de linfoma difuso de células B grandes SU-DHL-4, WSU-DLCL-2 y RL. Según se midió por IC50, no parece haber una correlación entre el tamaño de PEG y la actividad. Sin embargo, un examen más detenido de las curvas dosis-respuesta reveló una aparente correlación inversa entre el tamaño de PEG y la inhibición máxima del crecimiento. Estos datos se muestran en la figura 17.
Tabla 5. Citotoxicidad in vitro - conjugados para aCD19 (IC50 en ng/ml)
Líneas celulares CD19+ CD19-ADCa PEGx Ramos S U-DHL-4 WSU-DLCL-2 RL L540cy hBU12-14 Sin PEG 2 22 5 61 >1000 hBU12-43 PEG2 2 >1000 12 229 >1000 hBU12-42 PEG4 3 >1000 5 >1000 >1000 hBU12-18 PEG8 2 16 211 >1000 >1000 hBU12-17 PEG12 2 >1000 129 >1000 >1000 hBU12-16 PEG24 4 >1000 3 >1000 >1000 hBU12-19 PEG4-(PEG4)3 2 >1000 247 >1000 >1000 aADC cargados con 8 fármacos/Ac
Las propiedades farmacocinéticas de los conjugados que abarcan la serie PEGx se evaluaron como se describió anteriormente. A las ratas se les administró una única dosis intravenosa de 1 mg/kg de conjugado compuesto de IgG humanizada que no es capaz de unirse (h00) que porta enlazadores MDpr-PEGx-glucurónido-MMAE cargados con 8 fármacos/Ac. Se tomaron muestras de plasma en varios puntos de tiempo y se cuantificó el anticuerpo circulante total como se señaló anteriormente. La eliminación de anticuerpos mostró una correlación directa con el tamaño de PEG, como se muestra en la figura 16. Los conjugados PEGilados con PEG8, PEG12 y PEG24 mostraron propiedades de eliminación que se aproximaban al anticuerpo desnudo; mientras que los PEG más cortos y las contrapartes no PEGiladas se eliminaron más rápidamente de la circulación.
Los enlazadores PEGx se evaluaron in vivo en modelos de xenoinjerto. Los estudios se llevaron a cabo en modelos de linfoma difuso de células B grandes RL positivo para CD19 y modelos de linfoma de Hodgkin L540cy positivo a CD30. Los conjugados anti-CD19 (hBU12) que abarcan enlazadores sin PEG, PEG4, PEG8, PEG12 y PEG24 se dosificaron una vez por vía ip a 1 y 3 mg/kg una vez que el volumen tumoral promedio alcanzó 1 O0 mm3; los resultados del modelo RL se muestran en la figura 17. A 1 mg/kg, todos los grupos ejercieron sólo un modesto retraso en el crecimiento del tumor y no se observó una correlación significativa entre el tamaño de PEG y la actividad. A la dosis más alta de 3 mg/kg, los conjugados que no tenían PEG y los que portaban PEG4 lograron un
retraso en el crecimiento del tumor con un incremento tumoral alrededor del día 35. Por el contrario, los conjugados con enlazadores que portan PEG8, PEG12 y PEG24 lograron remisiones completas a 3 mg/kg, y 1/5 ratones experimentó un nuevo crecimiento tumoral en el grupo PEG24. La actividad mejorada a la dosis más alta de PEG8, PEG12 y PEG24 en relación con las contrapartes p EG4 y no PEGiladas es coherente con las observaciones de PK en la figura 18.
Ejemplo 19. La administración intratumoral de MMAE se correlaciona con las propiedades PK del conjugado.
A los ratones que tenían tumores de linfoma de Hodgkin L540cy positivos para CD30, de aproximadamente 200 mm3, se les administró una dosis única de 1 mg/kg de conjugados con cAC10 cargados con 8 fármacos/Ac con mcglucurónido-MMAE (enlazador 1), mc-Lys(PEG24)glucurónido-MMAE (enlazador 10), maleimido-PEG24-glucurónido-MMAE (enlazador 4) o MDpr-Lys(PEG24)-glucurónido-MMAE (enlazador 16). Los tumores se extrajeron 3 días después de la dosis y se evaluó la concentración intratumoral mediante espectrometría de masas. Coherente con la PK de los conjugados, los ADC con PEG24 en una configuración en paralelo (enlazadores 10 y 16) suministran significativamente mayor MMAE al tumor, en relación con el conjugado no pegilado (cAC10-1), como se muestra en la figura 20. Además, los conjugados que contienen PEG24 como un extensor en serie entre la maleimida y el glucurónido (cAC10-4) suministraron 4 veces menos MMAE que su contraparte (cAC10-10). Por último, la incorporación de maleimida MDpr (cAC10-16) aumentó aún más el suministro de MMAE con relación a la contraparte que contiene maleimidocaproilo (cAC10-10).
Ejemplo 20. Los ADC cargados con 8 fármacos por anticuerpo con enlazadores PEGilados que mantienen la PK del anticuerpo original se toleran mejor in vivo en comparación con sus contrapartes PEG más cortas y no PEGiladas. A los ratones Balb/c (n = 3) se les administró una única dosis ip de 50 mg/kg de conjugado el día 0. Los ratones se observaron diariamente para detectar signos externos de morbilidad y se midió la masa corporal; los animales fueron sacrificados si perdían más del 20 % de la masa corporal o se encontraban moribundos. El cambio de peso corporal en relación con el día 0 se representa como una función del tiempo en la figura 21. El trazado se interrumpió para cada grupo tras el sacrificio de al menos un animal. Los ratones administrados con conjugados sin PEG (IgG 14 y -44), PEG2 (IgG-43) y PEG4 (IgG-42) mostraron pérdida de peso significativa o signos externos de toxicidad y se sacrificaron entre los días 5 y 7. Por el contrario, los ratones que recibieron conjugados con PEG8 (IgG-18), PEG12 (IgG-17) y PEG24 (IgG-16) mostraron una pérdida de peso mínima y no mostraron signos externos de casos moribundos. Estos datos, junto con los perfiles PK en la figura 18, sugieren que los conjugados con menor exposición PK ejercen una mayor toxicidad aguda.
Ejemplo 21. Maximización de la longitud de PEG
A medida que aumenta la longitud de la cadena de PEG en el enlazador-fármaco, aumentarán, además, el tamaño total y el radio hidrodinámico del conjugado. Esto se ilustra en la figura 22, que muestra trazas de cromatografía analítica de exclusión por tamaño de los ADC preparados con enlazadores-fármacos 18, 17 y 16, que tienen 8, 12 y 24 unidades de PEG, respectivamente. A partir de los principios iniciales, a medida que aumenta el tamaño aparente del ADC, se puede esperar que disminuya su capacidad de difusión en un sistema in vivo. Esto puede tener el efecto indeseable de disminuir la velocidad o el grado en que un ADC puede penetrar en un tumor sólido. Esta capacidad de difusión disminuida también se puede observar en la farmacocinética plasmática mediante el ajuste de los datos a un modelo de dos compartimentos que incluye términos de velocidad para las fases de distribución y eliminación. Los datos farmacocinéticos de los ADC preparados con los enlazadores-fármacos 18, 17 y 16 (que tienen 8, 12 y 24 unidades de PEG, respectivamente) se registraron durante 21 días y se ajustaron a un modelo de dos compartimentos; los tiempos de vida media para los dos procesos (distribución y eliminación) se muestran en la figura 23.
Es evidente a partir de estos datos que el aumento de la cadena de PEG de 8 a 12 unidades da como resultado una desaceleración de la eliminación plasmática (aumento de t1/2 de aproximadamente 2 días), pero la duplicación de PEG de 12 a 24 unidades produce poca mejora adicional de la PK. Por el contrario, el t1/2 de distribución aumenta de forma casi lineal en este intervalo, de modo que duplicar la cadena de PEG de 12 a 24 unidades casi duplica el tiempo medio necesario para la distribución en el compartimento tisular. Estos datos sugieren que 12 unidades de PEG pueden ser la longitud óptima para este enlazador-fármaco, ya que PEG más grandes tienen el efecto de disminuir la velocidad de distribución sin un efecto significativo en la velocidad de eliminación. Este ejemplo muestra cómo se pueden utilizar los datos de PK para seleccionar un tamaño de PEG óptimo para cualquier enlazadorfármaco en particular.
Ejemplo 22. Preparación de soportes PEGilados multiplexados.
Los esquemas 12-14 representan la síntesis de los soportes PEGilados multiplexados A y B, que proporcionan un ADC con 16 unidades de fármaco/anticuerpo y el soporte PEGilado multiplexado C, cuya estructura se presenta a continuación, mediante el uso de métodos de acoplamiento de péptidos descritos para soportes PEGilados que proporcionan 4 y 8 unidades de fármaco/anticuerpo.
El soporte de PEG C se incluye en la estructura
en donde Z’ es la porción que contiene maleimida, A es el residuo de lisina-lisina de ramificación, t es 1 y cada AD y cada Lp es un residuo de cisteína.
Esquema 13: Síntesis de mFEGa^ys{S©u)4_ysíMDpr)-Cys(Sbu)43EG24-QH (Soporte A)
Esquema 13 (cont.): Síntesis de mPEG2*-Cys(SiBuKys(MDpr)-Cysí3bu}-PEGM-OH
SO p o p o ríe A)
Esquema 14: Soporte portador dé férmaco PEGilado ramificado (Soporté C)
E sq u em a 14 (cont.): Soporte portador de fárm aco PEGilado ramificado (Soporte C)
KrOdft
Esquema 14 (conU: Soporte portador de fármaco PEGilado ramificado (Soporte C)
M3de
Esquema 14 (cont.): Soporte portador de fármaco PEGilado ramificado (Soporte C)
Los datos de MS para los soportes A, B y C preparados de acuerdo con los esquemas 12-14 se proporcionan en la tabla 6.
Tabla 6. Datos de espectrometría de masas para soportes pegilados multiplexados
Ejemplo 23. Preparación de ADC que incorporan soportes PEGilados multiplexados.
Los esquemas 15-16 representan la conjugación de soportes PEGilados con el anticuerpo y el enlazador-fármaco. A una solución de anticuerpo completamente reducido (34) a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml en PBS que contenía EDTA (2 mM) y tamponado con fosfato de potasio adicional (100 mM, pH 7,4) se le añadieron 12 equivalentes molares de soporte portador fármaco ramificado PEGilado a partir de una solución madre de DMSO 5 20 mM. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 30 min. La conjugación completa se confirmó mediante cromatografía de fase inversa. Se añadió reactivo de PEG adicional si la conjugación era incompleta. Después de la conjugación, la solución de anticuerpo se unió a una columna HiTrap MabSelect SuRe de 1 ml (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) mediante el uso de una bomba de jeringa y se lavó con 10 ml de PBS que contenía EDTA (2 mM) a 1 ml/min. Para eliminar los grupos protectores de t-butiltiol, la columna se lavó con 3 ml de TCEP 10 mM tamponado con fosfato de potasio adicional (100 mM, pH 7,4) durante 1 hora a 37 °C. Después, la columna se lavó con 10 ml de PBS que contenía EDTA (2 mM) a 1 ml/min y el conjugado anticuerpo-soporte purificado se eluyó con glicina 50 mM (pH 3,0). Las fracciones que contienen proteínas se combinaron y neutralizaron con fosfato de potasio 800 mM al 10 % (v/v), NaCl 500 mM y EDTA 500 mM (pH 7,4). La solución resultante (36) se filtró a través de un filtro centrífugo estéril de 0,22 gm y se usó inmediatamente o se almacenó a -80 °C.
A una solución de anticuerpo PEGilado desprotegido (35) a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml en PBS que contenía EDTA (2 mM) y tamponado con fosfato de potasio adicional (100 mM, pH 7,4) se le añadieron 48 equivalentes molares de un fármaco-enlazador que contenía maleimida de una solución madre de DMSO 5 - 20 mM. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 30 min. La conjugación completa se confirmó mediante cromatografía de fase inversa. Se añadió enlazador-fármaco adicional si la conjugación era incompleta. Después de la conjugación, la solución de anticuerpo se desaló en PBS mediante 3 rondas de dilución y
centrifugación a 4000 x g a través de un filtro de MWCO de 30 kDa. La solución de conjugado anticuerpo-fármaco PEGilado resultante (37) se filtró a través de un filtro centrífugo estéril de 0,22 pm, se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y cromatografía de fase inversa, y se almacenó a -80 °C.
Esquema 15: Conjugación del soporte portador de fármaco PEGliado ramificado que conliene mafeimda y eliminación de los grupos prole clores t-bulilto
Esquema 16: Conjugación de enlazadores de fármacos que contienen maleimida al
portador de fármaco ramificado:
Ejemplo 24. Preparación y actividad biológica de ADC que tienen soportes PEGilados multiplexados
Se prepararon ADC de auristatina y camptotecina de 32 cargas a partir del soporte multiplexado PEGilado C, en donde n = 37, mediante el uso de los procedimientos del Ejemplo 23. La cantidad de agregación estaba por debajo del nivel de cuantificación, pero la cromatografía de exclusión por tamaño mostró que los ADC de MMAE de 32 cargas pueden existir en forma dimérica.
El conjugado con cAC10 de 32 cargas que tiene la porción -X-D de mc-VC-PABA-MMAE mostró una mejora >5X en la citotoxicidad hacia L540cy (número de copias de CD30433K) en comparación con el ADC de 8 cargas, aunque la carga de fármaco solo aumentó 4X. Aún más significativamente, el conjugado de 32 cargas tuvo actividad contra L-428, que es otra línea celular de linfoma de Hodgkin, a pesar de que esa línea celular tiene un número de copias mucho más bajo del antígeno objetivo (número de copias de CD3077K) mientras que el conjugado de 8 cargas se consideró inactivo (IC50 >1 pM). Además, el conjugado de MMAE de 32 cargas tenía actividad citotóxica contra una línea celular de ALCL resistente a múltiples fármacos CD30+. En contraste, el conjugado de MMAE de 8 cargas se consideró inactivo contra ambas líneas celulares resistentes a múltiples fármacos, aunque tenía una actividad similar al conjugado de 32 cargas contra la línea celular original.
El conjugado de cAC10 de 32 cargas que tiene la porción -X-D de MDpr-PAB(gluc) camptotecina mostró una mejora de 3-4x en la citotoxicidad contra L540cy en comparación con el conjugado de 8 cargas, pero al igual que el conjugado de 8 cargas se consideró inactivo contra L-428. El conjugado de 32 cargas tenía >5X la citotoxicidad contra líneas celulares resistentes a múltiples fármacos ALCL en comparación con los conjugados de 8 cargas. El conjugado de 32 cargas hBU12 que también tiene la porción -X-D de MDpr-PAB(gluc)-camptotecina también mostró una mejora >5X en la citotoxicidad en comparación con el conjugado de 8 cargas contra Raj y Ramos y fue activo contra RL, que tiene el menor número de copias de C19. Por el contrario, el conjugado de 8 cargas resultó inactivo.
Claims (1)
- REIVINDICACIONESUn compuesto de conjugado ligando-fármaco en donde el compuesto de conjugado ligando-fármaco está compuesto por una unidad de ligando y una o más porciones de enlazador-fármaco unidas covalentemente a la unidad de ligando, en donde cada porción de enlazador-fármaco está compuesta por una unidad conectora en paralelo, en donde la unidad conectora en paralelo es una porción química trifuncional que conecta la unidad de ligando a una o más unidades de fármaco a través de una unidad de ensamblaje liberable para cada unidad de fármaco, y conecta una unidad de polietilenglicol en orientación paralela con respecto a las unidades de fármaco de cada porción de enlazador-fármaco, en donde cada una de las unidades de fármaco es hidrófoba, en donde la unidad de polietilenglicol comprende una o varias cadenas de polietilenglicol, y la unidad de polietilenglicol tiene un extremo que se conecta covalentemente a la unidad conectora en paralelo, en donde las unidades de ensamblaje liberable pueden liberar el fármaco libre en las proximidades de un sitio objetivo dirigido por la unidad de ligando, en donde las porciones de enlazador-fármaco proporcionan la carga de una a treinta y dos unidades de fármaco en el conjugado ligando-fármaco,en donde el compuesto de conjugado ligando-fármaco tiene la estructura representada por la fórmula (I), (II) o (III):a sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde,L es la unidad de ligando, en donde la unidad de ligando se selecciona de un anticuerpo, un interferón, una linfocina, una hormona, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias, una vitamina o una molécula de transporte de nutrientes, en donde la unidad de ligando es un agente de direccionamiento que se une específicamente a una porción objetivo, en donde dicha unión presenta la unidad de fármaco del conjugado ligando-fármaco a la población de células objetivo en particular caracterizada por la porción objetivo con la que interactúa la unidad de ligando;D es la unidad de fármaco hidrófoba, en donde la unidad de fármaco es un fármaco citotóxico, citostático o inmunosupresor que tiene una hidrofobicidad mayor o dentro del 20 % de la monometil auristatina E cuando se mide mediante el uso de SlogP;PEG es la unidad de polietilenglicol, en donde la unidad de PEG comprende de 4 a 72 subunidades (OCH2CH2);Z es una unidad de extensión que actúa para unir la unidad de ligando a la unidad conectora en paralelo; X es la unidad de ensamblaje liberable, en donde X comprende un enlace peptídico, disulfuro o glucosídico;LP es la unidad conectora en paralelo, que sirve para conectar la unidad de ligando a la unidad de polietilenglicol y la unidad de fármaco hidrófoba de manera que la unidad de polietilenglicol y la unidad de fármaco estén en una orientación paralela, en donde la unidad de polietilenglicol en dicha orientación paralela enmascara la hidrofobicidad de la unidad de fármaco hidrófoba;A es una unidad de ramificación opcional, cuando está presente, cada A es de uno a 10 residuos de aminoácido, aminoalcohol o aminoaldehído o poliamina seleccionados independientemente, o una combinación de estos, unidos covalentemente entre sí;AD es una unidad de unión al fármaco, cuando está presente, cada AD es de uno a 10 residuos de aminoácido o aminoalcohol o aminoaldehído o poliamina seleccionados independientemente, o una combinación de estos, unidos covalentemente entre sí;el subíndice p es un número entero que varía de 1 a 14, preferentemente 2 a 12, preferentemente 6 a 14, 6 a 12, 8 a 14 u 8 a 12;el subíndice t es un número entero que varía de 0 a 8, preferentemente 0, 1, 2 o 3;el subíndice m es un número entero que varía de 1 a 4, preferentemente 1 o 2; yel subíndice s es 0 o 1, con la condición de que cuando el subíndice s es 0, el subíndice m es 1 y cuando el subíndice s es 1, el subíndice m es 2, 3 o 4,además, en donde cada unidad conectora en paralelo (Lp) es (i) o (ii) a continuación:(i) cada unidad conectora en paralelo (Lp) comprende un residuo de aminoácido, aminoalcohol, aminoaldehído o poliamina,particularmente en donde cada unidad conectora en paralelo (Lp) tiene la estructura de:en donde las líneas onduladas indican sitios de unión covalente de Lp dentro del compuesto de conjugado ligando-fármaco,particularmente en donde cada unidad conectora en paralelo (Lp) tiene la estructura deen donde la línea ondulada adyacente al átomo de azufre indica una unión covalente a una unidad de ensamblaje liberable;(ii) la estructura de cada unidad conectora en paralelo (Lp) se representa independientemente por la Fórmula A:en donde las líneas onduladas indican los sitios de unión covalente de Lp dentro del compuesto de conjugado ligando-fármaco; yen dondeAA1 se selecciona independientemente de un aminoácido, heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido, cada uno con grupos funcionales para las uniones entre las subunidades de Fórmula A y dentro del conjugado ligando-fármaco; yel subíndice u es un número entero seleccionado independientemente de 0 a 4; en donde al menos un AA1 de cada unidad Lp tiene una cadena lateral con adición de grupos funcionales que proporciona un sitio de unión a una unidad de PEG, AD, A o Z o una porción X-D, particularmente AA1 es un aminoácido seleccionado independientemente o es un heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido, siempre que no más de 2 de AA1 sean un heteroalquileno C1-20 opcionalmente sustituido, heterociclo C3-8 opcionalmente sustituido, arileno C6-14 opcionalmente sustituido o carbociclo C3-C8 opcionalmente sustituido.El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con la reivindicación 1, en donde Z tiene la estructura deen donde R17 es -(CH2)5C(=O)-, el asterisco indica la unión covalente de cada Z a la unidad de ligando y la línea ondulada indica la unión covalente de cada Z al resto de una porción de enlazador-fármaco dentro del compuesto de conjugado ligando-fármaco,o en donde Z tiene la estructura deen donde el asterisco indica la unión de cada Z a la unidad de ligando y la línea ondulada indica la unión covalente de cada Z al resto de una porción de enlazador-fármaco dentro del compuesto de conjugado ligando-fármaco.El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el subíndice t es 0, 1 o 2, y el subíndice p es un número entero que varía de 6 a 14.El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el compuesto de conjugado ligando-fármaco se representa por la estructura de:o una sal farmacéuticamente aceptable de este.El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde existen de 6 a 32, de 8 a 32 o de 6 a 14 unidades de fármaco conjugadas a la unidad de ligando. El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la unidad de polietilenglicol (PEG) es (i), (ii), (iii) o (iv) a continuación:(i) PEG comprende no más de 72 subunidades (OCH2CH2), preferentemente no más de 36 subunidades (OCH2CH2),particularmente en donde la unidad de polietilenglicol (PEG) comprende una o más cadenas lineales de polietilenglicol que tienen un total combinado de 8 a 72, 8 a 60, 8 a 48, 8 a 36 u 8 a 24 subunidades (OCH2CH2), un total combinado de 10 a 72, 10 a 60, 10 a 48, 10 a 36 o 10 a 24 subunidades (OCH2CH2), o un total combinado de 12 a 72, 12 a 60, 12 a 48, 12 a 36 o 12 a 24 subunidades (OCH2CH2);(ii) PEG tiene la estructura de:-$-R 20— (CH2CH20)n----R21en donde la línea ondulada indica el sitio de unión de la unidad de polietilenglicol (PEG) a la unidad conectora en paralelo,R20 es una unidad de unión de PEG;R21 es una unidad de bloqueo de PEG;R22 es una unidad de acoplamiento de PEG;el subíndice n se selecciona independientemente de 4 a 72, preferentemente de 6 a 72, de 8 a 72, de 10 a 72 o de 12 a 72;el subíndice e se selecciona independientemente de 2 a 5; ycada subíndice n' se selecciona independientemente de 1 a 72, siempre que existan al menos 4, preferentemente al menos 6, al menos 8, al menos 10 o al menos 12 subunidades de polietilenglicol (OCH2CH2) en la unidad de polietilenglicol,particularmente en dondeR20 es -C(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -NH-, -C(O)O-, -C(O)alquilo C1-10, -C(O)alquil C1-10-O-, -C(O)alquil C1-10-CO2-, -C(O)alquil C1-10-NH-, -C(O)alquil C1-10-S-, -C(O)alquil Cm 0-C(O)-NH-, -C(O)alquil C1-10-NH-C(O)-, -alquilo C1-10, -alquil C1-10-O-, -alquil C1-10-CO2-, -alquil C1-10-NH-, -alquil C1-10-S-, -alquil C1-10-C(O)-NH-, -alquil Cm 0-NH-C(O)-, -CH2CH2SO2-alquil C1-10-, -CH2C(O)-alquil C1-10-, =N-(O o N)-alquil C1-10-O-, =N-(O o N)-alquil C1-10-NH-, =N-(O o N)-alquil C1-10-CO2-, =N-(O o N)-alquil C1-10-S-,o R20 es -NH- o -C(O)-;ycada R21 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -alquilo C1-10, -alquil C2-10-CO2H, -alquil C2-10-OH, -alquil C2-10-NH2, alquil C2-10-NH(alquilo C1-3) y alquil C2-10-N(alquilo C1-3)2; y cada R22 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -alquil Cm 0-C(O)-NH-, -alquil C1-10-NH-C(O)-, -alquil C2-10 -NH-, -alquil C2-10-O-, -alquil C1-10-S- y -alquil C2-10-NH-;(iii) PEG tiene la estructura de:-S NH-(CH2CH20)n-CH2CH2C02HoJ-NH-(CH2CH20)n-CH2CH2N H -(C H 2CH20)-C H 2CH2C02Hen donde la línea ondulada indica el sitio de unión a la unidad conectora en paralelo, y cada subíndice n se selecciona independientemente de un número entero que varía de 4 a 72, o cada subíndice n es independientemente un número entero que varía de 6 a 24, o de 8 a 24;(iv) en donde la unidad de polietilenglicol (PEG) tiene al menos 6 subunidades -CH2CH2O- y no más de 72 subunidades -CH2CH2O-, y preferentemente tiene al menos 8 subunidades -CH2CH2O- y no más de 36 subunidades -CH2CH2O-.El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la unidad de fármaco es la de un fármaco que tiene un valor de SlogP de 2,5 o mayor, preferentemente en donde la unidad de fármaco es una auristatina,preferentemente en donde la unidad de fármaco de auristatina se representa por la estructura de fórmula De :en donde, independientemente en cada ubicación:R2 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8);R4 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8);R5 se selecciona del grupo que consiste en H y metilo,o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en donde Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;R6 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8);cada R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);R9 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; yR18 se selecciona del grupo que consiste en -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8).El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la unidad de ensamblaje liberable comprende una porción de azúcar unida a un grupo autoinmolativo mediante un enlace glucosídico al que se une la unidad de fármaco de manera que la escisión del enlace glucosídico por una glicosidasa en el sitio objetivo de la unidad de ligando da como resultado la liberación del fármaco libre del compuesto de conjugado ligando-fármaco,particularmente en donde la unidad de ensamblaje liberable comprende una unidad de glucurónido representada por la fórmula:en donde Su es la porción de azúcar, -O'- representa un átomo de oxígeno de un enlace glucosídico; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un halógeno, -CN y -NO2; y en donde la línea ondulada indica la unión del grupo autoinmolativo a LP, AD o A, ya sea directa o indirectamente a través de una unidad de unión covalente; yel asterisco indica la unión del grupo autoinmolativo a la unidad de fármaco, ya sea directa o indirectamente a través de una unidad espaciadora,o en donde la unidad de ensamblaje liberable comprende un péptido escindible por la catepsina B;o en donde -X-D tiene la estructura de:en donde QCO es una unidad de unión covalente opcional y la línea ondulada indica una unión covalente al resto de una porción de enlazador-fármaco del compuesto de conjugado ligando-fármaco, particularmente en donde -X-D tiene la estructura de:en donde la línea ondulada indica covalente al resto de una porción de enlazador-fármaco del compuesto de conjugado ligando-fármaco,o en donde -X-D tiene la estructura de:oen donde la línea ondulada indica una unión covalente al resto de una porción de enlazador-fármaco del compuesto de conjugado ligando-fármaco.9. El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la unidad de ligando es un anticuerpo monoclonal unido covalentemente a cada unidad de extensión (Z) a través de un átomo de azufre de un residuo de cisteína del anticuerpo, en donde el residuo de cisteína es de origen natural y es de un disulfuro intercatenario del anticuerpo monoclonal o el residuo de cisteína es de origen no natural y es de una cisteína introducida en el anticuerpo,particularmente en donde la cisteína introducida está en el residuo 239 de acuerdo con el índice EU.10. El compuesto de conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el subíndice p es 8 o el subíndice p es un número entero que varía de 10 a 14 o de 10 a 12, en donde la unidad de ligando es un anticuerpo y en donde el anticuerpo se conjuga con unidades de extensión (Z) a través de los átomos de azufre de las cisteínas de los disulfuros intercatenarios del anticuerpo y los átomos de azufre de las cisteínas introducidas en el anticuerpo.11. Una composición farmacéutica que comprende una población de compuestos de conjugados ligando-fármaco de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el número promedio de porciones de enlazador-fármaco por unidad de ligando en la composición varía de aproximadamente 4 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, o el número promedio de moléculas de porciones de enlazador-fármaco por unidad de ligando en la composición es de aproximadamente 8; y un portador farmacéuticamente aceptable.12. Un compuesto enlazador-fármaco en donde el compuesto enlazador-fármaco se representa por la estructura de la fórmula IV, V o VI:o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en dondeD, PEG, X, LP, A, AD, el subíndice t, el subíndice m y el subíndice s se definen como en la reivindicación 1, Z' es una unidad de extensión que puede formar una unión covalente con una unidad de ligando; particularmente en donde el compuesto enlazador-fármaco tiene la estructura de:este,sto enlazador-fármaco tiene la estructura de:o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde R21 es una unidad de bloqueo de PEG y el subíndice n es un número entero que varía de 6 a 72, de 8 a 72 o de 8 a 24, particularmente el subíndice n es 8, 12 o 24 y R21 es una unidad de bloqueo de PEG, en donde la unidad de bloqueo de PEG es metilo, etilo o propilo,o particularmente en donde el compuesto enlazador-fármaco tiene la estructura deo una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde R21 es una unidad de bloqueo de PEG y el subíndice n varía de 6 a 72, de 8 a 72, o de 8 a 24, particularmente el subíndice n es 8, 12 o 24 y R21 es una unidad de bloqueo de PEG, en donde la unidad de bloqueo de PEG es metilo, etilo o propilo.13. Un conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11 que comprende una población de compuestos de conjugados ligando-fármaco, para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la administración de una cantidad eficaz del compuesto de conjugado ligando-fármaco o la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, en donde la unidad de ligando del conjugado ligando-fármaco se une específicamente a un antígeno objetivo expresado por las células cancerosas.14. El conjugado ligando-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la unidad de ligando es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al antígeno CD19, CD20, CD30, CD33, CD70, alfa-v-beta-6 o Liv-1,particularmente en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo AC10 quimérico o humanizado.
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