KR20230002672A - 항체-약물 접합체 - Google Patents

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KR20230002672A
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amino
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수민 류
수창 인
위 원
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선전 엔듀어링 바이오테크 리미티드
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Abstract

본원에서는, 높은 효능 및 낮은 독성을 갖는 균질한 접합체를 제공하기 위해 부위 특이적 접합으로 제조된 항체-약물 접합체(ADC), 특히 페길화된 단일특이적 또는 이중특이적 항체-약물 접합체(BsADC)가 제공된다. 또한, 본 발명은 ADC를 제조하는 방법, ADC를 포함하는 조성물, 및 질병 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항체-약물 접합체
본 출원은 2020년 4월 15일에 출원된 PCT 출원 PCT/CN2020/084880의 출원일의 이점을 주장하며, 이의 전체 내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate: ADC), 특히 높은 효능 및 낮은 독성을 갖는 균질한 접합체를 제공하기 위해 부위 특이적 접합으로 제조된 다중특이성 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단일특이적 또는 이중특이적 항체에 대한 페길화된 약물 접합체의 부위 특이적 접합에 의해 제조된 장기간 작용하는 페길화된 단일특이적 또는 이중특이적 단일 사슬 항체 약물 접합체에 관한 것이다.
암 치료는 수술(1800년대 후반)에서 방사선 요법(1900년대 초반)으로, 화학요법과 호르몬 치료(1900년대 중반)에서 표적 약물(1990년대)로, 표적 약물과 화학요법 및 호르몬의 병용(2000년대 초반)에서 최근의 항체 약물 접합체(ADC) 등으로 서서히 진행되어 왔다. 항체를 운반체로 사용하여 종양 세포에 직접 매우 강력한 물질을 전달하는, ADC로 암을 치료하는 개념은 50년 이상 전으로 거슬러 올라갈 수 있다(Decarvalho, S. et al. Nature, 1964, 202, 255-258). 초기 ADC는 획득 및 작업이 어려운 그 자체가 항원성 베타 방출 방사성 핵종 페이로드인 비인간화 항체와 조기에 세포독성 페이로드를 방출하는 불안정한 링커를 사용했다. 오늘날의 ADC 기술은 표적에 도달하여 전체 ADC 분자가 세포에 내재화될 때까지 세포 살해제(cell-killing agent)의 통합성(integrity)을 유지하도록 설계된 인간화 항체, 높은 세포독성 유기 페이로드, 및 상대적으로 안정적인 링커를 사용한다.
미국 FDA에서 승인한 ADC는 10개로, 모두 암 치료용이며, 현재 100개 이상의 ADC 후보가 임상 시험 중에 있다(Beacon Targeted Therapies의 연구 보고서 | hansonwade). 승인된 ADC 10개 모두 치료 기간 동안 심각한 부작용을 보였다. 실제로 승인된 ADC 10개 중 8개는 블랙박스 경고(black box warning) 라벨을 부착해야 하므로 다양한 암 적응증에서 이들의 적용이 제한된다. 오늘날 IgG 기반 ADC의 가장 큰 난제는 치료의 이점을 나타내기 위해 최대 허용 용량(MTD)에 매우 가까운 용량으로 투여해야 하며, 이로 인해 치료 범위(therapeutic window)가 매우 좁아진다(Beck, A. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 2017, 16, 315-337; Vankemmelbeke, M. et al. Ther. Deliv., 2016, 7, 141-144; Tolcher A. W. et al. Ann. Oncol., 2016, 27, 2168-2172). 더욱이, 이러한 ADC에서 발견되는 독성 프로파일은 세포독성 워헤드(cytotoxic warhead)와 관련된 용량 제한적 독성으로 인해 표준 치료(standard-of-care) 화학요법의 독성 프로파일과 유사하다(Coats, S. et al. Clin. Cancer Res., 2019, 25, 5441-5448). 임상 시험에서 종료된 약 80개의 기존 ADC들 중에서, 이들 대부분은 기존 치료법과 비교하여 좋지 못한 치료 범위 또는 치료 지수로 인해 종료되었다. 접합 부위 및 링커/약물 소수성은 ADC의 안정성, 효능 및 치료 지수에 상당한 영향을 미치며, 친수성 링커를 사용한 항체에 대한 세포독성 분자의 부위 특이적 접합은 치료 지수를 향상시킬 수 있다는 것이 문서로 잘 입증되어 있다(Junutula, J. R. et al. Nat. Biotechnol., 2008, 26, 925-932; Lyon, R. P. et al. Nat. Biotechnol., 2015, 33, 733-735). 그러나 현재 임상 개발 중이거나 시판되고 있는 많은 ADC들은 높은 DAR을 얻기 위해 전장 항체의 2개 이상의 사슬간 디설파이드 결합의 절단을 필요로 한다. 불행히도, 이러한 접근 방식은 단백질의 불안정화로 이어질 수 있다. 이는 Fc 함유 BsADC의 경우 특히 그러한데, 그 이유는 이중특이적 항체가 비천연 항체이고, 높은 DAR을 갖는 Fc 함유 BsADC를 제조하는 것이 훨씬 더 어렵기 때문이다. 개발 중이거나 승인된 다른 많은 ADC들은 항체의 시스테인 잔기 또는 라이신 잔기 중 하나에 무작위로 접합하여 제조되며, 본질적으로 불균질하여 임상 환경에서 분석 및 정확한 투여가 어렵다. 더욱이 전장 항체로 구성된 ADC 분자는 치밀한 고형 종양을 깊숙이 침투하기에 너무 커서 중기 및 말기 암을 치료하기 어려운 것으로 생각된다. 또한, Fc를 갖는 기존 ADC들은 모두 거핵구(megakaryocyte: MK) 상의 FcγRIIa에 대한 Fc 결합, 및 후속 내재화 후 MK의 사멸로 인한 고유한 독성을 가지며, 이는 궁극적으로 혈소판 생성을 중단시키고, 혈소판 감소증(Uppal, H. et al. Clin Cancer Res; 21(1) January 1, 2015), 및 항체-약물 접합체에 대해 관찰되는 많은 표적외 독성도 ADC의 Fc 성분과 직접적으로 관련된 만노스 수용체 흡수에 의해 유발된다(Gorovits, B. et.al. 2013, Cancer Immunol Immunother 62, 217-223).
따라서, 향상된 효능과 개선된 독성 프로파일을 갖는 새로운 ADC 기술이 시급히 필요하다.
본 발명은 부위 특이적 접합을 위해 조작된 부위(예를 들어, 시스테인)가 있는, 단일특이적 또는 다중특이적 항체 단편; 또는 단일특이적 또는 다중특이적 단일 사슬 항체에 대한 폴리머 변형된(예를 들어, 페길화된) 약물 접합체의 부위 특이적 접합에 의해 제조된 비면역원성 폴리머 변형된 항체 약물 접합체를 제공함으로써 상기 언급된 충족되지 않은 요구를 해결한다. 상기 항체 단편 또는 단일 사슬 항체는 항원에 대해 1가 또는 다가일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 화학식 Ia
Figure pct00001
의 폴리머 항체 약물 접합체 분자를 제공한다. P는 비면역원성 폴리머일 수 있다. T는 다작용성(예를 들어, 삼작용성) 소분자 링커 모이어티일 수 있고, 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 단백질에 부위 특이적 접합이 가능한 적어도 하나의 작용기를 가질 수 있다. A는 임의의 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 단백질일 수 있다. D는 임의의 세포독성 소분자 또는 펩티드(n ≥1)일 수 있으며, 각 D는 동일하거나 상이할 수 있다.
특히, 본 발명의 일 측면은 하기 화학식 Ib의 접합체를 제공한다:
[화학식 Ib]
Figure pct00002
상기 화학식 Ib에서,
P는 비면역원성 폴리머일 수 있으며;
M은 H 또는 C1-50 알킬 및 아릴로부터 선택된 말단 캡핑기(capping group)이며, 이때 상기 알킬의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자로 대체되거나 대체되지 않고;
y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택된 정수일 수 있으며;
T는 삼작용성 또는 사작용성 또는 임의의 다른 사이클릭 또는 비사이클릭(noncyclic) 다작용성 모이어티(예를 들어, 라이신)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 2개 이상의 작용기를 갖는 다작용성 링커일 수 있으며, 이때 T와 (L1)a 사이의 연결, 및 T와 (L2)b 사이의 연결은 동일하거나 상이할 수 있고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 이작용성 링커일 수 있으며;
a 및 b는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되는 정수일 수 있고;
B는 분지형 링커(branched linker)일 수 있고, 이때 각각의 분지는 연장 스페이서(extension spacer), 트리거 유닛(trigger unit), 자기 희생 스페이서(self-immolating spacer), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 이때 트리거 유닛은 효소에 의해 절단 가능한 아미노산 서열 또는 트리거 모이어티, 산성 pH 조건에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 pH 불안정 링커(pH liable linker), 또는 화학적 또는 효소적 절단에 의해 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 디설파이드 결합 링커, 또는 특정 절단 메커니즘에 의해 약물 D를 방출할 수 있는 절단 가능한 결합일 수 있고;
A는 항원에 대해 1가 또는 다가일 수 있는, 항체 단편, 단일 사슬 항체, 나노바디, 또는 임의의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항원 결합 단백질일 수 있다.
D는 임의의 세포독성 소분자 또는 펩티드 또는 이의 유도체일 수 있으며, 효소적 절단 및/또는 자기 희생 메커니즘 또는 자기 희생 메커니즘이 있거나 없는 pH 유도된 가수분해를 통해 B로부터 방출될 수 있으며; 각 D는 동일하거나 상이할 수 있고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 및 25로부터 선택된 정수일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식 Ic의 접합체를 제공한다:
[화학식 Ic]
Figure pct00003
상기 화학식 Ic에서,
각 변수는 화학식 Ib에 대해 정의된 것과 같다.
일부 구현예에서, B의 각 분지는 예를 들어, 카텝신 B, 플라스민, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 글루타티온, 티오레독신, 티오 환원효소에 의해 절단 가능한, 자기 희생 스페이서를 통해 약물 D에 연결되거나 약물 D에 직접 연결된, 아미노산 서열 또는 디설파이드 모이어티 또는 β-글루코로나이드 또는 β-갈락토사이드와 같은 트리거 모이어티를 포함한다(Arunachalam, B. et. al. 2000, PNAS, 97 (2) 745-750). 자기 희생 스페이서의 예시는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00004
이때 R1, R2, R3, R4는 H, 또는 C1-10 알킬일 수 있다. 이러한 구현예에서, D는 활성 O 또는 N 또는 S 작용기를 함유하는 임의의 소분자 또는 펩티드 또는 이의 유도체일 수 있다.
일부 구현예에서, B의 각 분지는 종양 부위에서 및/또는 종양 세포 내부의 산성 pH 조건에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 pH 불안정 링커일 수 있다. 산에 불안정한 링커의 예에는 다음 포맷이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다:
-CR1=N-NR1-, -CR1=N-O-, -CR1=N-NR2-CO-, -N=N-CO-, -OCOO-, -NR1-COO-.
일부 구현예에서, B의 각 분지는 글루타티온, 티오레독신 계열 구성원(WCGH/PCK) 또는 티오 환원효소와 같은 화학적 또는 효소적 절단에 의해 종양 부위에서 및/또는 종양 세포 내부에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 디설파이드 결합 링커일 수 있다.
일부 구현예에서, A는 항원에 대해 1가 또는 2가인 단일특이적 항체, 예를 들어, 항원에 대해 1가 또는 2가인 단일특이적 단일 사슬 항체이다.
일부 구현예에서, A는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 단일 사슬 항체이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 2개의 결합 도메인은 2개의 동일한 종양 관련 항원(tumor associated antigen: TAA) 분자들에, 그러나 2개의 서로 다른 에피토프에 결합하거나, 2개의 상이한 TAA 분자에 결합한다.
추가 구현예에서, A는 암세포에서 발현되는 Her2에 결합하는 단일 사슬 항-Her2x항-Her2 항체(SCAHer2xSCAHer2)이다. SCAHer2xSCAHer2 항체의 2개의 결합 도메인들은 2개의 Her2 분자들 상의 동일한 에피토프에 또는 2개의 Her2 분자들 상의 2개의 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 이때 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 모이어티, 예를 들어, 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, D는 임의의 DNA 가교제, 미세소관 억제제, DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, D는 MMAE, MMAF, SN38, DM1, DM4, 칼리케아미신(calicheamycin), 피롤로벤조디아제핀, 두오카르마이신(duocarmycin) 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합 등으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, D는 항유사분열 약물인 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E: MMAE), 또는 이의 유도체, 또는 강력한 토포이소머라제 I 억제제인 SN38, 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합이다.
추가 구현예에서, D는 MMAE이고, 4-아미노벤질 알코올(PAB)과 같은 자기 희생 스페이서 및 발린-시트룰린과 같은 트리거 모이어티에 연결된다.
임의의 상기 측면들 및 구현예들에서, 비면역원성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 덱스트란, 탄수화물 폴리머, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리비닐 알코올, 하이드록시프로필-메타크릴아미드(HPMA), 및 이들의 코폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 비면역원성 폴리머는 분지형 PEG 또는 선형 PEG와 같은 PEG이다. PEG의 총 분자량은 5000 내지 100,000 달톤, 예를 들어, 5000 내지 80,000, 10,000 내지 60,000, 및 20,000 내지 40,000 달톤의 범위일 수 있다. PEG는 영구 결합 또는 절단 가능한 결합을 통해 다작용성 모이어티 T에 연결될 수 있다.
(L1)a와 단백질 A 간의 연결부를 형성하는 부위 특이적 접합을 위한 작용기는 티올, 말레이미드, 2-피리딜디티오 변이체, 방향족 설폰 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 요오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 카보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 하이드라지드, 옥심, 칼륨 아실트리플루오로보레이트, O-카바모일하이드록실아민, 트랜스-사이클로옥텐, 테트라진, 트리아릴포스핀, 보론산 요오드, 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, (L1)a 중 하나는 아지드 및 알킨, 또는 말레이미드 및 티올로부터 형성된 연결부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO)일 수 있다.
일부 구현예에서, T는 라이신일 수 있고, P는 PEG일 수 있으며, y는 1일 수 있는 한편, 알킨은 디벤조사이클로옥틸(DBCO)일 수 있다.
일부 구현예에서, A는 항체 단편, 단일 사슬 항체, 나노바디 또는 이들의 임의의 항원 결합 단편, 또는 이들의 조합을 포함하는 아지드 태그된 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항원 결합 단백질로부터 유래될 수 있으며, 이때 아지드는 각각의 (L1)a에서 알킨에 접합될 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질 A는 항체 단편, 단일 사슬 항체, 나노바디 또는 이들의 임의의 항원 결합 단편, 또는 이들의 조합을 포함하는 티올 태그된 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항원 결합 단백질로부터 유래될 수 있으며, 이때 티올은 각각의 (L1)a에서 말레이미드에 접합될 수 있다.
상기 기재된 항체 약물 접합체는 (i) 항체 또는 단백질 또는 이의 변형된 형태에 부위 특이적 접합이 가능한 말단 작용기를 갖는 고부하 비면역원성 폴리머 약물 접합체를 제조하는 단계; 및 (ii) 비면역원성 폴리머 약물 접합체를 항체 또는 단백질 또는 이의 변형된 구조에 부위 특이적으로 접합시켜 화학식 Ia, Ib 또는 Ic의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 일부 예시에서, 항체 또는 단백질은 접합 단계 전에 소분자 링커로 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 항체 약물 접합체, 예를 들어, 항원에 대해 1가 또는 다가인 페길화된 단일특이적 또는 이중특이적 단일 사슬 항체 약물 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 상기 기재된 항체 약물 접합체, 예를 들어, 항원에 대해 1가 또는 다가인 페길화된 단일특이적 또는 이중특이적 단일 사슬 항체 약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 질병의 치료가 필요한 대상체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 아래의 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 도면, 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
본 발명은 하기 구현예들을 추가로 제공한다.
구현예 1. 화학식 Ib의 화합물
[화학식 Ib]
Figure pct00005
상기 화학식 Ib에서,
P는 비면역원성 폴리머이고;
M은 H 또는 C1-50 알킬 및 아릴로부터 선택된 말단 캡핑기이며, 이때 상기 알킬의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자로 대체되거나 대체되지 않고;
y는 1 내지 10, 예를 들어, 1 내지 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택된 정수이며;
A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
T는 다작용성 소분자 링커 모이어티이며;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 헤테로 또는 호모이작용성 링커이고;
a 및 b는 각각 0 내지 10, 예를 들어, 0 내지 5, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택되는 정수이며;
B는 분지형 링커이고, 이때 각각의 분지에는 자기 희생 스페이서에 연결된 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 있어, 효소에 의해 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 절단되면 D를 방출하는 자기 희생 메커니즘이 촉발되거나, 각각의 분지에는 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 있어, 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 절단되면 D 또는 이의 유도체가 방출되며;
D는 각각 독립적으로 세포독성 소분자 또는 펩티드이고;
n은 1 내지 25, 예를 들어, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, 10-15, 15-25, 15-20 or 20-25, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25로부터 선택된 정수이다.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, T는 하이드록실, 아미노, 하이드라지닐, 아지드, 알켄, 알킨, 카복실(알데히드, 케톤, 에스테르, 카복실산, 무수물, 아실 할라이드), 티올, 디설파이드, 니트릴, 에폭사이드, 이민, 니트로 및 할라이드로부터 독립적으로 선택된 3개의 작용기를 갖는 분자로부터 유래된 삼작용성 링커이고, T와 (L1)a 간의 연결부와 T와 (L2)b 간의 연결부는 동일하거나 상이한 것인, 화합물.
구현예 3. 구현예 2에 있어서, T는 라이신이거나 라이신으로부터 유래되는 것인, 화합물.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, L1의 링커 말단에 있는 작용기는 A와 부위 특이적 접합이 가능하고, 티올, 말레이미드, 2-피리딜디티오 변이체, 방향족 설폰 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 요오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 카보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 하이드라지드, 옥심, 칼륨 아실트리플루오로보레이트, O-카바모일하이드록실아민, 트랜스-사이클로옥텐, 테트라진, 트리아릴포스핀, 보론산 및 요오드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 전장 항체, 단일 사슬 항체, 나노바디, 또는 이의 항원 결합 도메인인 것인, 화합물.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 단일 사슬 항체인 것인, 화합물.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 Her2와 같은 종양 관련 항원(TAA)에 결합하는 것인, 화합물.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 Her2에 결합하는 2개의 결합 도메인들을 갖는 것인, 화합물.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 서열 번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
구현예 10. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 단일 사슬 항체인 것인, 화합물.
구현예 11. 구현예 10에 있어서, 상기 이중특이적 항체의 2개의 결합 도메인들은 동일한 종양 관련 항원(TAA)에 결합하거나, 서로 다른 2개의 TAA들에 결합하거나, T 세포(예를 들어, T 세포 수용체의 구성요소) 또는 NK 세포 상에서 발현되는 항원 및 TAA에 결합하는 것인, 화합물.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, 상기 항체는 항-Her2x항-Her2 단일 사슬 이중특이적 항체인 것인, 화합물.
구현예 13. 구현예 12에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
구현예 14. 구현예 6 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 모이어티, 예를 들어, 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
구현예 15. 구현예 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 모이어티, 예를 들어, 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
구현예 16. 구현예 14 또는 15에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 유전적으로 인코딩된 알켄 라이신(예를 들어, N6-(헥스-5-에노일)-L-라이신), 2-아미노-8-옥소노난산, m 또는 p-아세틸-페닐알라닌, β-디케톤 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 2-아미노-3-(4-(3-옥소부타노일)페닐)프로판산), (S)-2-아미노-6-(((1R,2R)-2-아지도사이클로펜틸옥시)카보닐아미노)헥산산, 아지도호모알라닌, 피롤리신 유사체 N6-((프로프-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, (S)-2-아미노-6-펜트-4-인아미도헥산산, (S)-2-아미노-6-((프로프-2-이닐옥시)카보닐아미노)헥산산, (S)-2-아미노-6-((2-아지도에톡시)카보닐아미노)헥산산, p-아지도페닐알라닌, 파라-아지도페닐알라닌, Nε-아크릴로일-l-라이신, Nε-5-노르보르넨-2-일옥시카보닐-l-라이신, N-ε-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, N-ε-(2-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)에틸)카보닐-L-라이신, 유전적으로 인코딩된 테트라진 아미노산(예를 들어, 4-(6-메틸-s-테트라진-3-일)아미노페닐알라닌)으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, D는 DNA 가교제, 미세소관 억제제, DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 18. 구현예 17에 있어서, D는 MMAE, MMAF, SN38, DM1, DM4, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀, 두오카르마이신 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 19. 구현예 17에 있어서, D는 빈카 알칼로이드(Vinca alkaloid), 라우리말리드(laulimalide), 탁산, 콜키신(colchicine), 튜불리신(tubulysin), 크립토피신(Cryptophycin), 헤미아스텔린(Hemiasterlin), 세마도틴(Cemadotin), 리족신(Rhizoxin), 디스코더몰리드(Discodermolide), 타칼로놀리드(taccalonolide) A 또는 B 또는 AF 또는 AJ, 타칼로놀리드 AI-에폭사이드, CA-4, 에포틸론(epothilone) A 및 B, 라우리말리드, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 캄프토테신(Camptothecin), iSGD-1882, 센타나마이신(centanamycin), PNU-159682, 운시알라마이신(uncialamycin), 인돌리노벤조디아제핀 이량체, β-아마니틴(amanitin), 아마톡신(Amatoxin), 타이란스타틴(thailanstatin) 또는 이의 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 비면역원성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 것인, 화합물.
구현예 21. 구현예 20에 있어서, 상기 PEG는 선형 PEG 또는 분지형 PEG인 것인, 화합물.
구현예 22. 구현예 20 또는 21에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 적어도 하나의 말단은 메틸 또는 저분자량 알킬로 캡핑되는 것인, 화합물.
구현예 23. 구현예 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG의 총 분자량은 100 내지 80000인 것인, 화합물.
구현예 24. 구현예 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG는 영구 결합 또는 절단 가능한 결합을 통해 삼작용성 또는 사작용성 또는 임의의 다른 사이클릭 또는 비사이클릭 다작용성 모이어티 T(예를 들어, 라이신)에 연결되는 것인, 화합물.
구현예 25. 하기 화학식 Ic의 화합물:
[화학식 Ic]
Figure pct00006
상기 화학식 Ic에서,
P는 선형 PEG이고;
A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 이작용성 링커이고;
a 및 b는 각각 0 내지 10, 예를 들어, 0 내지 5, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택되는 정수이며;
B는 분지형 링커이고, 이때 각각의 분지에는 자기 희생 스페이서에 연결된 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 있어, 효소에 의해 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 절단되면 D를 방출하는 자기 희생 메커니즘이 촉발되거나, 각각의 분지에는 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 있어, 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 절단되면 D 또는 이의 유도체가 방출되고;
D는 각각 독립적으로 세포독성 소분자 또는 펩티드이며;
n은 1 내지 25, 예를 들어, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, 10-15, 15-25, 15-20 또는 20-25, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25로부터 선택된 정수이다.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, L1의 링커 말단에 있는 작용기는 A와 부위 특이적 접합이 가능하고, 티올, 말레이미드, 2-피리딜디티오 변이체, 방향족 설폰 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 요오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 카보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 하이드라지드, 옥심, 칼륨 아실트리플루오로보레이트, O-카바모일하이드록실아민, 트랜스-사이클로옥텐, 테트라진, 트리아릴포스핀, 보론산 및 요오드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 27. 구현예 25 또는 26에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 전장 항체, 단일 사슬 항체, 나노바디, 또는 이의 항원 결합 도메인인 것인, 화합물.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 단일 사슬 항체이고, 선택적으로 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 종양 관련 항원(TAA), 예를 들어, Her2에 결합하는 것인, 화합물.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 Her2에 결합하는 2개의 결합 도메인들을 갖는 것인, 화합물.
구현예 30. 구현예 29에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 서열 번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
구현예 31. 구현예 27에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 단일 사슬 항체인 것인, 화합물.
구현예 32. 구현예 31에 있어서, 상기 이중특이적 항체의 2개의 결합 도메인들은 동일한 종양 관련 항원(TAA)에 결합하거나, 서로 다른 2개의 TAA들에 결합하거나, T 세포(예를 들어, T 세포 수용체의 구성요소) 또는 NK 세포 상에서 발현되는 항원 및 TAA에 결합하는 것인, 화합물.
구현예 33. 구현예 32에 있어서, 상기 항체는 항-Her2x항-Her2 단일 사슬 이중특이적 항체인 것인, 화합물.
구현예 34. 구현예 33에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
구현예 35. 구현예 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 모이어티, 예를 들어, 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
구현예 36. 구현예 31 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 모이어티, 예를 들어, 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
구현예 37. 구현예 35 또는 36에 있어서, L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 비천연 아미노산 잔기는 유전적으로 인코딩된 알켄 라이신(예를 들어, N6-(헥스-5-에노일)-L-라이신), 2-아미노-8-옥소노난산, m 또는 p-아세틸-페닐알라닌, β-디케톤 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 2-아미노-3-(4-(3-옥소부타노일)페닐)프로판산), (S)-2-아미노-6-(((1R,2R)-2-아지도사이클로펜틸옥시)카보닐아미노)헥산산, 아지도호모알라닌, 피롤리신 유사체 N6-((프로프-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, (S)-2-아미노-6-펜트-4-인아미도헥산산, (S)-2-아미노-6-((프로프-2-이닐옥시)카보닐아미노)헥산산, (S)-2-아미노-6-((2-아지도에톡시)카보닐아미노)헥산산, p-아지도페닐알라닌, 파라-아지도페닐알라닌, Nε-아크릴로일-l-라이신, Nε-5-노르보르넨-2-일옥시카보닐-l-라이신, N-ε-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, N-ε-(2-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)에틸) 카보닐-L-라이신, 유전적으로 인코딩된 테트라진 아미노산(예를 들어, 4-(6-메틸-s-테트라진-3-일)아미노페닐알라닌)으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 38. 구현예 25 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, D는 DNA 가교제, 미세소관 억제제, DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, D는 MMAE, MMAF, SN38, DM1, DM4, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀, 두오카르마이신 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 40. 구현예 38에 있어서, D는 빈카 알칼로이드, 라우리말리드, 탁산, 콜키신, 튜불리신, 크립토피신, 헤미아스텔린, 세마도틴, 리족신, 디스코더몰리드, 타칼로놀리드 A 또는 B 또는 AF 또는 AJ, 타칼로놀리드 AI-에폭사이드, CA-4, 에포틸론 A 및 B, 라우리말리드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 캄프토테신, iSGD-1882, 센타나마이신, PNU-159682, 운시알라마이신, 인돌리노벤조디아제핀 이량체 β-아마니틴, 아마톡신, 타이란스타틴 또는 이의 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 41. 구현예 25 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG의 총 분자량은 100 내지 80000인 것인, 화합물.
구현예 42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 하기로부터 선택되고:
-(CH2)aXY(CH2)b-,
-X(CH2)aO(CH2CH2O)c(CH2)bY-,
-(CH2)a헤테로사이클릴-,
-(CH2)aX-,
-X(CH2)aY-,
-W1-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dC(O)-,
-C(O)(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)cW2C(O)(CH2)dNR1-,
-W3-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dW2C(O)(CH2)eC(O)-,
이때 a, b, c, d 및 e는 각각 0 내지 25, 예를 들어, 0-20, 0-15, 0-10, 0-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, 10-15, 15-25, 15-20 또는 20-25, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; X 및 Y는 각각 C(=O), NR1, S, O, CR2R3 또는 부재(Null)로부터 독립적으로 선택되며; R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-10 알킬 또는 (CH2)1-10C(=O)를 나타내고; W1 및/또는 W3은 말레이미도-기반 모이어티로부터 유도되며, W2는 트리아졸릴 또는 테트라졸릴 함유 기를 나타내고; 헤테로사이클릴 기는 말레이미도-유도된 모이어티 또는 테트라졸릴-기반 또는 트리아졸릴-기반 모이어티로부터 선택되는 것인, 화합물.
구현예 43. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, (L1)a 및 (L2)b는 각각 독립적으로 하기로부터 선택되고:
Figure pct00007
Figure pct00008
이때 n 및 m은 정수이고, 0 내지 20, 예를 들어, 0-15, 0-10, 0-5, 5-20, 5-15, 5-10, 10-20, 10-15, 또는 15-20, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 화합물.
구현예 44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 분지 링커 B는 연장 스페이서, 트리거 유닛, 자기 희생 스페이서 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 선택적으로 상기 트리거 유닛은 카텝신 B, 플라스민, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), β-글루쿠로니다제, β-갈락토시다제와 같은 효소에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열 또는 β-글루쿠로나이드(β-glucoronide) 또는 β-갈락토사이드 트리거 모이어티; 산성 pH 조건에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 pH 불안정 링커, 또는 글루타티온, 티오레독신 계열 구성원(WCGH/PCK) 또는 티오 환원효소에 의해 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 디설파이드 결합 링커인 것인, 화합물.
구현예 45. 구현예 44에 있어서, 상기 분지 링커 B는 하기로부터 선택되고:
Figure pct00009
이때,
a, b, c, d, e 및 f는 각각 정수이며, 1 내지 25, 예를 들어, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, 10-15, 15-25, 15-20 또는 20-25, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25로부터 독립적으로 선택되고;
(A)n은 Val-Cit, al-Ala, Val-Lys, Phe-Lys, Phe-Cit, Phe-Arg, Phe-Ala, Ala-Lys, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, D-Phe-LPhe-Lys, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly, 또는 Ala-Leu-Ala-Leu와 같은 아미노산 서열의 트리거 유닛이며;
PAB는 파라-아미노벤질 알코올이고;
각각의 Ex는 하기로부터 독립적으로 선택되는 링커 사슬을 포함하는 연장 스페이서이고:
-NR1(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zC(O)-,
-C(O)(CH2)xNR1-,
-NR1(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zNR2-,
-NR1(CH2)xNR2-,
-NR1(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zO-,
-O(CH2)xNR1-,
-C(O)(CH2)xO-,
-O(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zC(O)-,
-C(O)(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zC(O)-,
-C(O)(CH2)xC(O)-,
또는 부재,
이때 x, y, 및 z는 각각 정수이고, 0 내지 25, 예를 들어, 0-20, 0-15, 0-10, 0-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, 10-15, 15-25, 15-20 or 20-25, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25로부터 독립적으로 선택되며; R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬 기를 나타내는 것인, 화합물.
구현예 46. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 분지 링커 B는 하기로부터 선택되는 것인, 화합물:
Figure pct00010
Figure pct00011
.
구현예 47. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식의 화합물들, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염들로부터 선택되는, 화합물:
Figure pct00012
Figure pct00013
.
구현예 48. 구현예 25에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식의 화합물들로부터 선택되는, 화합물:
Figure pct00014
.
구현예 49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 기재된 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
a) 부위 특이적 접합을 위한 유리 작용기를 갖는 비-면역원성 변형된(예를 들어, 페길화된) 약물 접합체를 제조하는 단계;
b) 비-면역원성 변형된(예를 들어, 페길화된) 약물 접합체를 항체에 부위 특이적으로 접합시켜 화학식 Ib 또는 Ic의 화합물을 제공하는 단계
를 포함하는, 방법.
구현예 50. 유효량의 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 기재된 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 염, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제형.
구현예 51. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 신장암, 방광암, 위암, 결장암, 결장직장암, 침샘암, 갑상선암, 및 자궁내막암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암의 치료에 사용하기 위한 것인, 화합물.
구현예 52. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 신장암, 방광암, 위암, 결장암, 결장직장암, 침샘암, 갑상선암, 및 자궁내막암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암의 치료에서 유효량의 또 다른 항암제, 면역억제제와 병용하여 사용하기 위한 것인, 화합물.
도 1은 실시예 1에 기재된 분지형 링커 중간체 화합물 7을 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1에 기재된 화합물 14 Val-Cit-PAB-MMAE를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1에 기재된 화합물 19 30kmPEG-Lys(Mal)-(Val-Cit-PAB-MMAE)4를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 실시예 3에 기재된 화합물 20 30kmPEG-Lys(SCAHer2/SCAHer2)-(Val-Cit-PAB-MMAE)4를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 실시예 4에서 화합물 7 Val-Cit-PABC-MMAE를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 실시예 5에서 화합물 13(2XMMAE를 갖는 분지 링커 B)을 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 실시예 6에서 화합물 18(2XMMAE를 갖는 분지 링커 B)을 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 8은 실시예 7에서 화합물 22(4XMMAE를 갖는 분지 링커 B)를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 9는 실시예 8에서 화합물 27(4XMMAE를 갖는 분지 링커 B)을 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 10은 실시예 9에서 화합물 32(30kmPEG(말레이미드)-2MMAE)를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 11은 실시예 10에서 화합물 35(20kmPEG(말레이미드)-4MMAE)를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 12는 실시예 11에서 화합물 39(말레이미드-20mPEG-4MMAE)를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 13은 실시예 12에서 화합물 41(DBCO-20mPEG-4MMAE)을 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것이다.
도 14는 실시예 13에서 정제된 화합물 42(SCAHer2II × SCAHer2IV)의 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석.
도 15는 실시예 14에서 화합물 43[30kmPEG-(SCAHer2II/SCAHer2IV)-2MMAE]을 제조하는 반응식, 및 SDS-PAGE 분석을 개략적으로 도시한 것이다.
도 16은 실시예 15에서 화합물 44[SCAHer2II/SCAHer2IV-20kPEG-4MMAE]를 제조하는 반응식, 및 SDS-PAGE 분석을 개략적으로 도시한 것이다.
도 17은 화합물 43(JY201)이 실시예 16에서 강력한 시험관내 세포독성을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 18은 동일한 페이로드를 갖는 화합물 44(JY201b)가 실시예 16에서 종양 세포에 대한 시험관내 세포독성을 유도함에 있어서 T-DM1보다 더 강력하다는 것을 보여준다.
도 19는 페길화된 BsADC 43(JY201)이 실시예 14에서 표적 세포에 의한 증가된 내재화를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 20은 페길화된 BsADC 43(JY201)이 실시예 15에서 내재화 후 표적 세포에 유지된다는 것을 보여준다.
도 21은 페길화된 BsADC 43(JY201)이 실시예 16에서 거핵구에 독성을 나타내지 않는다는 것을 보여준다.
본 발명에서, 페길화된 단일특이적 또는 다중특이적 항체 약물 접합체가 제공된다. 본 발명을 이용하면 높은 DAR을 얻기 위해 항체의 2개 이상의 디설파이드 결합을 끊을 필요가 없고, 균질한 ADC를 얻을 수 있어 독성, 효능, 규제 관리 및 제조, 특히 다중특이적 ADC 제조 측면에서 불균질한 ADC에 비해 상당한 이점이 있다.
또한, 본 발명은, 거핵구 또는 기타 정상 세포에 대한 독성이 없고, 치료 범위를 증가시킬 뿐만 아니라, 증가된 내재화, 및 고형 종양으로의 깊은 침투를 달성하기 위한 단일 사슬 항체 분자의 상대적으로 작은 크기로 접합체의 항종양 효과가 향상된 페길화된 단일특이적 또는 이중특이적 단일 사슬 항체 약물 접합체의 신규한 구조 포맷을 제공한다. 따라서, 본 발명은 현재 ADC 기술의 문제를 해결하고, 신규한 페길화된 단일특이적 또는 다중특이적 단일 사슬 항체 약물 접합체로 암 치료를 개선한다.
I. 접합체
본 발명의 일 측면에서, 하기 화학식 Ia의 화합물이 제공된다.
[화학식 Ia]
Figure pct00015
상기 화합물에서, P는 비면역원성 폴리머일 수 있다. T는 삼작용성 소분자 링커 모이어티와 같은 다작용성 모이어티일 수 있고, 항체 또는 단백질과 부위 특이적 접합이 가능한 적어도 하나의 작용기를 가질 수 있다. A는 전장 항체, 단일 사슬 항체, 나노바디 또는 이들의 임의의 항원 결합 단편, 또는 이들의 조합과 같은 임의의 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 단백질일 수 있다. D는 임의의 세포독성 소분자 또는 펩티드(n = 1 내지 25)일 수 있으며, 각 D는 동일하거나 상이할 수 있다.
특히, 본 발명의 일 측면은 하기 화학식 Ib 또는 Ic의 접합체를 제공한다.
[화학식 Ib]
Figure pct00016
[화학식 Ic]
Figure pct00017
화학식 Ib 또는 화학식 Ic의 접합체에서, P는 비면역원성 폴리머, 예를 들어, PEG일 수 있으며;
M은 H 또는 C1-50 알킬 및 아릴로부터 선택된 말단 캡핑기일 수 있으며, 이때 상기 알킬의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자로 대체되거나 대체되지 않고;
y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택된 정수일 수 있으며;
T는 2개 이상의 작용기를 갖는 모이어티일 수 있으며, 이때 T와 (L1)a 간의 연결부 및 T와 (L2)b 간의 연결부는 동일하거나 상이할 수 있고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 이작용성 링커일 수 있으며;
a 및 b는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터 선택되는 정수일 수 있고;
B는 분지형 링커일 수 있으며, 이때 각각의 분지는 연장 스페이서, 트리거 유닛, 자기 희생 스페이서, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 이때 트리거 유닛은 카텝신 B, 플라스민, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), β-글루쿠로니다제, 또는 β-갈락토시다제와 같은 효소에 의해 절단 가능한 아미노산 서열 또는 β-글루쿠로나이드 또는 β-갈락토사이드 트리거 모이어티; 산성 pH 조건에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 pH 불안정 링커, 또는 글루타티온, 티오레독신 계열 구성원(WCGH/PCK) 또는 티오 환원효소에 의해 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 디설파이드 결합 링커일 수 있다.
A는 항체 단편, 단일 사슬 항체, 나노바디 또는 항원에 대해 1가 또는 다가인 임의의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 단일특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항원 결합 단백질일 수 있고;
D는 임의의 세포독성 소분자 또는 펩티드 또는 이의 유도체일 수 있고, 효소적 절단 및/또는 자기 희생 메커니즘 또는 pH 유도 가수분해를 통해 B로부터 방출될 수 있으며; 각 D는 동일하거나 상이할 수 있으며;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 및 25로부터 선택된 정수일 수 있다.
일부 구현예에서, B의 각 분지에는 자기 희생 스페이서를 통해 약물 D에 연결되거나 약물 D에 직접 연결된 트리거 모이어티, 예를 들어, 아미노산 서열 또는 디설파이드 모이어티 또는 β-글루쿠로나이드 또는 β-갈락토사이드가 포함된다. 자기 희생 스페이서의 예에는 다음이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00018
이때 R1, R2, R3, R4는 H, 또는 C1-10 알킬일 수 있다. 이러한 구현예에서, D는 활성 O 또는 N 또는 S 작용기를 함유하는 임의의 소분자 또는 펩티드 약물 또는 이의 유도체일 수 있다.
일부 구현예에서, B의 각 분지는 종양 부위에서 및/또는 종양 세포 내부의 산성 pH 조건에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 pH 불안정 링커를 포함할 수 있다. 산성 불안정 링커의 예에는 다음 포맷이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다:
-CR1=N-NR1-, -CR1=N-O-, -CR1=N-NR2-CO-, -N=N-CO-, -OCOO-, -NR1-COO-.
일부 구현예에서, B의 각 분지는 예를 들어, 글루타티온, 티오레독신 계열 구성원(WCGH/PCK) 또는 티오 환원효소에 의한 효소 절단에 의해 종양 부위에서 및/또는 종양 세포 내부에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 디설파이드 결합 링커를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, A는 2개의 Her2 항원(SCAHer2IIxSCAHer2IV) 상의 2개의 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있는 단일 사슬 이중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, SCAHer2IIxSCAHer2IV의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTGGSGGSGGSGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGCGSGGSGGSGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTHHHHHH(서열 번호: 1)
일부 구현예에서, A는 2개의 Her2 항원 상의 2개의 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 단일 사슬 항-Her2x항-Her2 단일특이적 항체이다.
일부 구현예에서, SCAHer2IV/SCAHer2IV의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGGSGGSGGSGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGCGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGGSGGSGGSGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(서열 번호: 2)
일부 구현예에서, A는 2개의 서로 다른 항원 Her2 및 Her3에 결합할 수 있는 단일 사슬 이중특이적 항체(SCAHer2xSCAHer3)이다.
일부 구현예에서, SCAHer2IVxSCAHer3의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGGSGGSGGSGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGCGSGGSGGSGGSGGQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNTNPSLKSRVTISVETSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDKWTWYFDLWGRGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGDIEMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSVLYSSSNRNYLAWYQQNPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPRTFGQGTKVEIKHHHHHH(서열 번호: 3)
일부 구현예에서, A는 Met1 및 Met2에 결합하는 단일 사슬 이중특이적 항체(SCAc-Met1xSCAc-Met2)이다.
일부 구현예에서, SCAc-Met1xSCAc-Met2의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCIQYSGYPLTFGGGTKVEIKGGSGGSGGSGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRGGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTNWLDYWGQGTTVTVSGCGSGGSGGSGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRHHHHHH(서열 번호: 4)
일부 구현예에서, D는 효소 및/또는 자기 희생 메커니즘 또는 PH 유도 가수분해에 의해 종양 부위에 또는 종양 세포 내부에 방출될 수 있다.
일부 구현예에서, D는 임의의 DNA 가교제, 미세소관 억제제, DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, D는 아우리스타틴(MMAE, MMAF), 빈카 알칼로이드, 라우리말리드, 탁산, 콜키신, 메이탄신(maytansine)(DM1, DM4), 튜불리신, 크립토피신, 헤미아스텔린, 세마도틴, 리족신, 디스코더몰리드, 타칼로놀리드 A 또는 B 또는 AF 또는 AJ, 타칼로놀리드 AI-에폭사이드, CA-4, 에포틸론 A 및 B, 라우리말리드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 피롤로벤조디아제핀, 두오카르마이신, 독소루비신, 칼리케아미신, 캄프토테신, SN38, iSGD-1882, 센타나마이신, PNU-159682, 운시알라마이신, 인돌리노벤조디아제핀 이량체 β-아마니틴, 아마톡신, 타이란스타틴 또는 이의 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, D는 항유사분열 약물인 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 또는 이의 유도체, 또는 강력한 토포이소머라제 I 억제제인 SN38, 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합이다.
추가 구현예에서, D는 4-아미노벤질 알코올(PAB)과 같은 자기 희생 스페이서 및 발린-시트룰린과 같은 트리거 모이어티에 연결되어 Val-Cit-PAB-D를 형성한다.
본 발명의 일 측면에서, 항체 단편 또는 단일 사슬 단일특이적 또는 다중특이적 항체를 포함하는 단백질 또는 항체에 부위 특이적 접합이 가능한 페길화된 약물 접합체를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 페길화된 단일 사슬 BsADC를 제조하는 방법이 제공된다.
페길화된 단일 사슬 BsADC를 합성하기 위해, 1 내지 5의 원자가를 갖는 단일특이적 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 이중특이적 항체의 코딩 서열 또는 상기 코딩 서열을 보유하는 벡터를 합성하고, 예를 들어, CHO 발현 시스템 내로 도입할 수 있다. 단백질은 이전에 설명된 바와 같이 발현되고 정제될 수 있다(WO2018075308).
부위 특이적 접합 작용기를 갖는 측쇄를 갖는 페길화된 약물 접합체를 합성하기 위해, 하이드록실 또는 카복실 기 등과 같은 PEG의 말단 작용기가 활성화되고, Boc 또는 Fmoc 보호된 라이신과 같은 삼작용성 소분자 모이어티와 접합되어 말단 분지된 헤테로이작용성 PEG를 형성할 수 있다. 새로 형성된 카복실 기는 분지 스페이서와 결합하여 PEG-Lys(Boc)-B를 형성할 수 있다. 커플링 후, 보호기가 제거될 수 있고, 보호되지 않은 페길화된 분지 링커는 말레이미드 또는 DBCO와 같은 부위 특이적 접합 작용기를 갖는 소분자 링커와 결합되어 PEG-Lys(Mal)-B 또는 PEG-Lys(DBCO)-B를 형성할 수 있다. PEG-Lys(Mal)-B 또는 PEG-Lys(DBCO)-B와 Val-Cit-PAB-MMAE의 커플링 반응을 통해 PEG-lys(Mal)-B-(Val-Cit-PAB-MMAE)n 또는 PEG-lys(DBCO)-B-(Val-Cit-PAB-MMAE)n과 같은 페길화된 약물 접합체가 제조될 수 있으며, 이때 n은 정수, 예를 들어, 2이다. 합성의 마지막 단계는 티올 또는 아지드 태그된 단일 사슬 이중특이적 항체에 대한 페길화된 약물 접합체의 부위 특이적 접합이다.
대안적으로, 부위 특이적 접합 작용기를 갖는 측쇄를 갖는 페길화된 약물 접합체의 합성을 위해, 하이드록실 또는 카복실 기 등과 같은 PEG의 말단 작용기를 활성화시키고, Boc 또는 Fmoc 보호된 라이신과 같은 삼작용성 소분자 모이어티와 접합시켜 말단 분지된 헤테로이작용성 PEG를 형성한 후 보호기를 제거할 수 있다. 탈보호 후 PEG 화합물을 말레이미드 또는 DBCO와 같은 부위 특이적 접합 작용기를 갖는 소분자 링커와 결합시켜 PEG-Lys(Mal)-OH 또는 PEG-Lys(DBCO)-OH를 형성할 수 있다. 이어서 PEG-Lys(Mal)-OH 또는 PEG-Lys(DBCO)-OH는 분지 모이어티와 결합될 수 있으며, 상기 분지 모이어티의 각 분지는 연장 스페이서, 트리거 유닛 및/또는 자기 희생 스페이서를 통해 약물 D와 연결되어 PEG-lys(Mal)-B-(Val-Cit-PAB-MMAE)n 또는 PEG-lys(DBCO)-B-(Val-Cit-PAB-MMAE)n과 같은 페길화된 약물 접합체를 형성하며, 이때 n은 정수, 예를 들어, 2이다. 합성의 마지막 단계는 화학식 Ia 및 Ib의 화합물을 형성하기 위한 티올 또는 아지드 태그된 단일 사슬 이중특이적 항체에 대한 페길화된 약물 접합체의 부위 특이적 접합이다. 대안적으로, 페길화된 약물 접합체는 화학식 Ic의 화합물을 형성하기 위해 유사한 절차를 사용하여 상업적으로 입수가능한 헤테로이작용성 PEG로부터 합성될 수 있다.
II. PEG 링커
본 발명의 일 구현예에서, PEG는 하기 식의 구조를 나타낼 수 있다.
[식]
Figure pct00019
상기 식에서, n은 바람직하게는 5000 내지 40000 또는 경우에 따라 그 이상의 총 분자량을 갖는 폴리머를 제공하기 위해 1 내지 약 2300의 정수일 수 있다. M은 H, 메틸, 또는 기타 저분자량 알킬일 수 있다. M의 비제한적인 예에는 H, 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필, 부틸 또는 F1(CH2)qCH2가 포함된다. F 및 F1은 독립적으로 하이드록실, 카복실, 티올, 할라이드, 아미노 기 등과 같은 말단 작용기일 수 있으며, 이는 작용화, 활성화 및/또는 소분자 스페이서 또는 링커에 접합될 수 있다. q 및 m은 0에서 10 사이의 임의의 정수일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 방법은 또한 대안적인 분지형 PEG로 수행될 수 있다. 분지형 PEG는 하기 식의 구조를 나타낼 수 있다.
[식]
Figure pct00020
상기 식에서, PEG는 폴리에틸렌 글리콜이다. m은 바람직하게는 5000 내지 80000 또는 경우에 따라 그 이상의 총 분자량을 갖는 분지형 PEG를 제공하기 위해 2 내지 10의 정수일 수 있다. M은 메틸 또는 기타 저분자량 알킬일 수 있다. L은 2개 이상의 PEG가 부착되는 기능적 연결 모이어티일 수 있다. 이러한 연결 모이어티의 비제한적인 예로는 글리신, 알라닌, 라이신, 또는 1,3-디아미노-2-프로판올과 같은 임의의 아미노산, 트리에탄올아민, 2개 초과의 작용기가 부착된 임의의 5원 또는 6원 방향족 고리 또는 지방족 고리가 있다. S는 임의의 절단 불가능한 스페이서이다. F는 하이드록실, 카복실, 티올, 아미노 기와 같은 말단 작용기일 수 있다. i는 0 또는 1이다. i가 0인 경우, 다음과 같은 식으로 표시된다.
[식]
Figure pct00021
상기 식에서, PEG, m, M 또는 L의 각 변수는 위와 동일한 정의를 갖는다.
본 발명의 방법은 또한 덱스트란, 탄수화물 폴리머, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리비닐 알코올, 또는 말단기가 작용화되거나 활성화될 수 있는 기타 유사한 비면역원성 폴리머와 같은 대안적인 폴리머 물질로 수행될 수 있다. 상기 목록은 단지 예시적인 것이며 본 명세서에서 사용하기에 적합한 비항원성 폴리머의 유형을 제한하려는 것은 아니다.
III. 삼작용성 링커 T
T는 P, (L1)a 및 (L2)b와 연결되는 삼작용성 링커를 나타낸다. T는 3개의 작용기들의 임의의 조합을 갖는 분자들로부터 유도될 수 있으며, 이의 비제한적 예로는 하이드록실, 아미노, 하이드라지닐, 아지드, 알켄, 알킨, 카복실(알데히드, 케톤, 에스테르, 카복실산, 무수물, 아실 할라이드), 티올, 디설파이드, 니트릴, 에폭사이드, 이민, 니트로 및 할라이드가 포함된다. 삼작용성 링커의 작용기는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 작용기들 중 1개 또는 2개는 다른 반응 파트너와의 선택적 접합을 달성하기 위해 보호될 수 있다. 예를 들어, 문헌(참조: Advanced Organic Chemistry by March, Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)에 나타난 것을 포함하는 다양한 보호기가 당업계에 알려져 있다. 작용기는 또한 T와 다른 반응 파트너 사이의 반응 전 또는 후에 다른 기로 전환될 수 있다. 예를 들어, 하이드록실 기는 메실레이트 또는 토실레이트 기로 전환될 수 있다. 할라이드는 아지도 기로 대체될 수 있다. T의 산 작용기는 말단 알킨을 갖는 아미노 기와 결합함으로써 알킨 작용기로 전환될 수 있다.
예시적인 구현예에서, T는 라이신, 1,3-디아미노-2-프로판올, 또는 트리에탄올아민으로부터 유도된다. 이들 분자에 있는 하나 이상의 작용기는 선택적 반응을 위해 보호될 수 있다. 일부 구현예에서, T는 Boc-보호된 라이신으로부터 유래된다.
IV. 이작용성 링커 L 1 및 L 2
링커 L1 및 L2는 둘 다 -(CH2)aXY(CH2)b-, -X(CH2)aO(CH2CH2O)c(CH2)bY-, -(CH2)a헤테로사이클릴-, -(CH2)aX-, 및 -X(CH2)aY-로부터 독립적으로 선택될 수 있는 링커 사슬을 포함하며, 이때 a, b 및 c는 각각 0 내지 25로부터 선택되는 정수이며, 모든 서브유닛이 포함되고; X 또는 Y는 C(=O), NR1, S, O, CR2R3 또는 부재로부터 독립적으로 선택되며; R1, R2 및 R3은 수소, C1-10 알킬 또는 (CH2)1-10C(=O)를 나타낸다.
링커 L1 및 L2 내의 헤테로사이클릴 연결기(내부 위치에 있든 말단 위치에 있든)는 말레이미도-기반 모이어티로부터 유도될 수 있다. 적합한 전구체의 비제한적 예로는 N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스테르(KMUA), γ-말레이미도부티르산 N-석신이미딜 에스테르(GMBS), ε-말레이미드카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스테르(AMAS), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트(SMPB), 및 N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(PMPI)가 포함된다.
일부 다른 비제한적인 예시적 구현예에서, 각각의 링커 단위는 또한 N-석신이미딜-4-(요오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 요오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 또는 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)로부터 선택되는 할로아세틸-기반 모이어티로부터 유도될 수 있다.
대안적으로, 링커의 헤테로사이클릴 연결기는 DBCO 및 아지드와 같은 상이한 링커 모이어티의 접합으로부터 형성된 테트라졸릴 또는 트리아졸릴일 수 있다. 따라서, 헤테로사이클릴 기는 연결점 역할을 한다.
일부 구현예에서, (L1)a 및 (L2)b 각각은 하기를 포함할 수 있으며:
-X1-(CH2)aC(O)NR(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dC(O)- 또는
-C(O)(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)c X2C(O)(CH2)dNR- 또는
-X3-(CH2)aC(O)NR(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)d X2C(O)(CH2)eC(O)-,
이때 X1, X2 및 X3은 동일하거나 상이할 수 있고, 독립적으로 헤테로사이클릴 기를 나타내며;
a, b, c, d 및 e는 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25로부터 선택된 정수이고;
R은 수소 또는 C1-10 알킬을 나타낸다.
일부 구현예에서, X1 및/또는 X3은 말레이미도-기반 모이어티로부터 유래된다. 일부 구현예에서, X2는 트리아졸릴 또는 테트라졸릴 함유 기를 나타낸다. 일부 구현예에서, R은 수소를 나타낸다. 일부 구현예에서, a, b, c, d 및 e는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로부터 선택된다.
일부 예시적인 구현예에서, (L1)a 및 L2)b는 하기로부터 선택될 수 있으며:
Figure pct00022
이때 n 및 m은 정수이고, 0 내지 20으로부터 독립적으로 선택된다.
V. 분지형 링커 B
분지형 링커 B는 분지 유닛(branching unite), 연장 스페이서, 트리거 유닛, 자기 희생 스페이서 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 분지 유닛은 하기로부터 독립적으로 선택될 수 있는 구조를 포함하며:
Figure pct00023
X, Y, Z, W는 C(O), NR1, NR2, O, N 또는 부재이고,
a, b, c는 0 내지 10이며,
R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬 기를 나타낸다.
다른 구현예에서, 분지 유닛은 하기로부터 독립적으로 선택될 수 있는 구조를 포함하며:
Figure pct00024
X, Y, Z, U, V, W는 C(O), NR1, NR2, O, N 또는 부재이고,
a, b, c, d, e는 0 내지 10이며,
R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬 기를 나타낸다.
일부 구현예에서, 각 분지의 연장 스페이서는 하기로부터 독립적으로 선택될 수 있는 링커 사슬:
Figure pct00025
또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 이때 a, b, 및 c는 각각 0 내지 25로부터 선택되는 정수이며, 모든 서브유닛이 포함되고; X 및 Y는 NR1, NR2, C(O), O, 또는 부재로부터 독립적으로 선택될 수 있고; R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬 기를 나타낸다.
다른 구현예에서, 트리거 유닛은 효소적으로 또는 화학적으로 절단될 수 있는 임의의 아미노산 서열 또는 임의의 탄수화물 모이어티 또는 설파이드 또는 임의의 절단 가능한 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, 자기 희생 스페이서는 하기로부터 선택될 수 있는 구조를 포함하며:
Figure pct00026
이때 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬을 나타내고; X 및 Y는 NH 또는 O 또는 S일 수 있으며, c는 1 또는 2로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 자기 희생 스페이서는 하기와 같다:
Figure pct00027
일부 구현예에서, 분지 링커 B는 하기로부터 선택될 수 있으며:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
여기서,
a, b, c, d, e 및 f는 각각 1 내지 25로부터 선택된 정수이고;
(A)n은 아미노산 서열의 트리거 유닛이고, A는 각각 독립적으로 아미노산이고, n은 1 내지 25로부터의 임의의 정수이며;
PAB는 파라-아미노벤질 알코올이고;
Ex는 하기로부터 독립적으로 선택될 수 있는 링커 사슬을 포함하는 연장 스페이서이며:
-NR1(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)cC(O)-,
-C(O)(CH2)aNR1-,
-NR1(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)cNR2-,
-NR1(CH2)aNR2-,
-NR1(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)cO-,
-O(CH2)aNR1-,
-C(O)(CH2)aO-,
-O(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)cC(O)-
-C(O)(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)cC(O)-,
-C(O)(CH2)aC(O)-,
또는 부재;
이때 a, b, 및 c는 각각 0 내지 25로부터 선택되는 정수이며, 모든 서브유닛이 포함되고; R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬 기를 나타낸다.
일부 다른 구현예에서, 아미노산 서열의 트리거 유닛은 Val-Cit, al-Ala, Val-Lys, Phe-Lys, Phe-Cit, Phe-Arg, Phe-Ala, Ala-Lys, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, D-Phe-LPhe-Lys, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly, 또는 Ala-Leu-Ala-Leu; 또는 이들의 보호된 형태들일 수 있다.
바람직한 구현예의 경우, 아미노산 서열은 Val-Cit, Phe-Lys, 또는 Val-Lys일 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 분지형 링커 B는 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00031
.
VI. 연결기
본 발명의 접합체의 상이한 모이어티들은 다양한 화학적 결합을 통해 연결될 수 있다. 예로는 아미드, 에스테르, 디설파이드, 에테르, 아미노, 카바메이트, 하이드라진, 티오에테르, 및 카보네이트가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, PEG 모이어티(P)의 말단 하이드록실 기가 활성화된 다음 화학식 Ia 또는 Ib의 P와 T 사이에 바람직한 연결점을 제공하기 위해 라이신(T)과 결합될 수 있다. T와 L1 사이 또는 T와 L2 사이 또는 L2와 B 사이의 연결기는 링커 L2의 아미노 기와 라이신(T)의 카복실 기, 또는 L1의 카복실 기와 T의 아미노 기, 또는 L2의 카복실 기와 B의 아미노 기 사이의 반응으로부터 생성된 아미드일 수 있다. 접합체의 바람직한 특성에 따라, 항체 모이어티(A)와 인접한 링커 L1 사이, 또는 임의의 2개의 아미노산들 사이, 또는 아미노산과 파라-아미노벤질 알코올 사이에 적합한 연결기가 또한 혼입될 수 있다.
일부 구현예에서, 접합체의 상이한 모이어티들 사이의 연결기는 서로에 대한 고유한 화학적 친화성 또는 선택성을 갖는 한 쌍의 작용기들의 결합으로부터 유도될 수 있다. 이러한 유형의 결합 또는 고리 형성은 단백질 또는 항체 모이어티의 도입을 위한 부위 특이적 접합을 허용한다. 부위 특이적 접합을 유발하는 이러한 작용기의 비제한적인 예로는 티올, 말레이미드, 2'-피리딜디티오 변이체, 방향족 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 요오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 카보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 하이드라지드, 옥심, 칼륨 아실트리플루오로보레이트, O-카바모일하이드록실아민, 트랜스-사이클로옥텐, 테트라진, 및 트리아릴포스핀, 보론산, 알킨이 포함된다.
VII. 세포독성 화합물 D
일부 구현예에서, D는 메이탄시노이드(maytansinoid)(DM1, DM4)(US 5208020; US 5416064; EP 0425235), 아우리스타틴 유도체, 예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 F(MMAF)(US 5635483; US 5780588; US 7498298), 피롤로벤조디아제핀, 세마도틴, SN38, 디스코더몰리드, 타칼로놀리드 A 또는 B 또는 AF 또는 AJ, 타칼로놀리드 AI-에폭사이드, CA-4, 빈카 알칼로이드, iSGD-1882, 인돌리노벤조디아제핀 이량체, 운시알라마이신, 센타나마이신, 라우리말리드, 돌라스타틴, 타이란스타틴, 아마톡신, β-아마니틴, 헤미아스텔린, 두오카르마이신, PNU-159682, 콜키신, 튜불리신, 칼리키아미신(calicheamicin) 또는 이의 유도체(US 5712374; US 5714586; US 5739116; US 5767285; US 5770701; US 5770710; US 5773001; US 5877296; Hinman, L. M. et al. Cancer Res., 1993, 53, 3336-3342; Lode, H. N. et al. Cancer Res., 1998, 58, 2925-2928), 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노마이신 또는 독소루비신(Kratz, F. et al. Curr. Med. Chem., 2006, 13, 477-523; Jeffrey, S. C. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 358-362; Torgov, M. Y. et al. Bioconjug. Chem., 2005, 16 717-721; Nagy, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 829-834; Dubowchik, G. M. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 1529-1532; King, H. D. et al. J. Med. Chem., 2002, 45, 4336-4343; US 6630579), 메토트렉세이트, 빈데신, 탁산, 예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀(larotaxel), 테세탁셀(tesetaxel), 및 오르타탁셀(ortataxel), 트리코테센(trichothecene) 및 CC-1065를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, D는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, α-사르신, 알레우리테스 포르디(aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin) 및 에노마이신(enomycin)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편일 수 있다.
또 다른 일부 구현예에서, D는 방사성 원자일 수 있다. 다양한 방사성 동위원소는 방사성 접합체(radioconjugate) 생산에 사용할 수 있다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성 접합체가 검출에 사용되는 경우, 섬광조영술(scintigraphic) 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc99 또는 I123, 또는 자기공명영상(MRI)용 스핀 라벨, 예를 들어, 다시 I123, I131, In111, F19, C13, N15, O17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
일부 추가 구현예에서, D는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파, 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 합성 유사체, 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘루테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 엔디인(enediyne) 항생제, 예를 들어, 칼리키아미신(Nicolaou, K. C. et al. Agnew Chem. Intl. Ed., 1994, 33, 183-186), 다이네미신, 에스페라미신, 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 엔디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데놉테린, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항아드레날(anti-adrenal), 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민(defofamine); 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK®.; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘(anguidine)); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드; 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(TAXOL®) 및 독세탁셀(TAXOTERE®); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 루비테칸(9-니트로캄프토테신 또는 RFS-2000); 디플루오로메틸오르니틴; 레틴산; 카페시타빈; 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜을 포함한 항에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항안드로겐; 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
VIII. 항체 및 표적
세포 표면 분자들 및/또는 이들의 리간드에 대해 유도되는 다수의 치료 항체들이 공지되어 있다. 이러한 항체들은 단일특이적 또는 다중특이적 ADC에서 맞춤형 특이적 인식 결합 모이어티의 선택 및 구축을 위해 사용될 수 있다. 예로는 블리나투모맙/BLINCYTO(CD3/CD19), 리툭산/맙테라/리툭시맙(CD20), H7/오크렐리주맙(CD20), 제발린/이브리주모맙(CD20), 아르제라/오파투무맙(CD20), HLL2/에프라투주맙, 이노투조맙(CD22), 제나팍스/다클리주맙, 시무렉트(Simulect)/바실릭시맙(CD25), 허셉틴/트라스투주맙, 퍼투주맙(Her2/ERBB2), 마일로타르그(Mylotarg)/젬투주맙(CD33), 랩티바/에팔리주맙(Cd11a), 어비툭스/세툭시맙(EGFR, 표피 성장 인자 수용체), IMC-1121B(VEGF 수용체 2), 타이사브리/나탈리주맙(α4β1 및 α4β7 인테그린의 α4-서브유닛), ReoPro/압식시맙(Abciximab)(gpIIb-gpIIa 및 αvβ3-인테그린), 오르토클론 OKT3/무로모납-CD3(CD3), 벤리스타/벨리무맙(BAFF), 톨렉스(Tolerx)/오텔릭시맙(CD3), 솔리리스/에쿨리주맙(C5 보체 단백질), 악템라/토실리주맙(IL-6R), 파노렉스/에드레콜로맙(EpCAM, 상피 세포 부착 분자), CEA-CAM5/라베투주맙(CD66/CEA, 암배아 항원), CT-11(PD-1, 프로그램된 사멸-1 T 세포 억제 수용체, CD-d279), H224G11(c-Met 수용체), SAR3419(CD19), IMC-A12/시수투무맙(Cixutumumab)(IGF-1R, 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체), MEDI-575(PDGF-R, 혈소판 유래 성장 인자 수용체), CP-675, 206/트레멜리무맙(세포독성 T 림프구 항원 4), RO5323441(태반 성장 인자 또는 PGF), HGS1012/마파투무맙(TRAIL-R1), SGN-70 (CD70), 베도틴(SGN-35)/브렌툭시맙(CD30), 및 ARH460-16-2(CD44)가 포함된다.
본원에 개시된 단일특이적 또는 다중특이적 ADC는 종양학적 질병, 심혈관 질병, 감염성 질병, 염증성 질병, 자가면역 질병, 대사성(예를 들어, 내분비계) 질병, 또는 신경학적(예를 들어, 신경퇴행성) 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 질병들의 예시적인 비제한적 예로는 알츠하이머병, 비호지킨 림프종, B 세포 급성 및 만성 림프성 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 모발상 세포 백혈병, 급성 및 만성 골수성 백혈병, T 세포 림프종 및 백혈병, 다발성 골수종, 신경교종, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 암종(예를 들어, 구강, 위장관, 결장, 위, 폐관, 폐, 유방, 난소, 전립선, 자궁, 자궁내막, 자궁경부, 방광, 췌장, 뼈, 간, 담낭, 신장, 피부, 및 고환의 암종), 흑색종, 육종, 신경교종, 및 피부암, 급성 특발성 혈소판 감소성 자반병, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반병, 피부근염, 시드넘 무도병(Sydenham's chorea), 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 류마티스열, 다선성 증후군(polyglandular syndrome), 수포성 유사천포창, 진성 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 연쇄상 구균 후 신염(post-streptococcal nephritis), 결절성 홍반, 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 애디슨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병증, 결절성 다발동맥염, 강직성 척추염, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 폐쇄성 혈전혈관염, 쇼그렌 증후군, 원발성 담즙성 간경변증, 하시모토 갑상선염, 갑상선중독증, 경피증, 만성 활동성 간염, 다발근염/피부근염, 다발연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병증, 근위축성 측삭 경화증, 척수로(tabes dorsalis), 거대 세포 동맥염/다발성근육통, 악성 빈혈, 급속 진행성 사구체신염, 건선, 또는 섬유화 폐포염(fibrosing alveolitis)이 있다.
다수의 세포 표면 마커들 및 이들의 리간드들이 알려져 있다. 예를 들어, 암세포는 탄산무수화효소 IX, α-태아단백질, α-액티닌-4, A3(A33 항체에 특이적인 항원), ART-4, B7, Ba-733, BAGE, BrE3-항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-1A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-1-α, 결장 특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, 엽산 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모막 성선자극호르몬(HCG) 및 이의 서브유닛, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유발 인자(HIF-1), HSP70-2M, HST-2 또는 1a, IGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), KC4-항원, KS-1-항원, KS 1-4, Le-Y, LDR/FUT, 대식세포 이동 억제 인자(MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 전립선 산 포스파타제, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, 5100, 서바이빈(survivin), 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신(tenascin), TRAIL 수용체, TNF-α, Tn-항원, 톰슨-프리덴라이히(Thomson-Friedenreich) 항원, 종양 괴사 항원, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-1A-항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관신생 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, c-Met, 종양유전자 마커 및 종양유전자 산물(Sensi, M. et al. Clin. Cancer Res., 2006, 12, 5023-5032; Parmiani, G. et al. J. Immunol., 2007, 178, 1975-1979; Castelli, C. et al. Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54, 187-207)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포 표면 마커들 및/또는 리간드들 중 적어도 하나를 발현시키는 것으로 보고되었다. 따라서, 이들 특이적 세포 표면 수용체들 또는 이들의 리간드들을 인식하는 항체들은, 질병과 관련된 다수의 세포 표면 마커들 또는 리간드들을 표적화하고 이들에 결합하면서, 본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 ADC에서 특이적 및 선택적 인식 결합 모이어티에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 암/종양 치료를 위해 단일특이적 또는 다중특이적 ADC는 문헌[참조: Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher ed., "The Clinical Biochemistry of Cancer", page 347 (American Association of Clinical Chemists, 1979)] 및 US 4150149; US 4361544; US 4444744에 보고된 것과 같은 종양 관련 항원(TAA)을 표적화하는 데 사용된다.
종양 관련 항원에 대한 보고서는 문헌(참조: Mizukami et al., Nature Med. 2005 11, 992-997; Hatfield et al., Curr. Cancer Drug Targets 2005, 5229-248; Vallbohmer et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 3536-3544; 및 Ren et al., Ann. Surg. 2005, 242, 55-63)을 포함하며, 각각은 확인된 TAA와 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 질병이 림프종, 백혈병 또는 자가면역 질환과 관련된 경우, 표적 항원은 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, B7, MUC1 또는 1a, HM1.24, HLA-DR, 테나신, VEGF, P1GF, ED-B 피브로넥틴, 종양유전자, 종양유전자 산물(예를 들어, c-Met 또는 PLAGL2), CD66a-d, 괴사 항원, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1(DR4) 및 TRAIL-R2(DR5)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기 언급된 항원에 대한 항체는 본 발명의 ADC 또는 BsADC를 만들기 위한 결합 도메인 또는 모이어티로서 사용될 수 있다. 다양한 BsADC가 두 개의 서로 다른 표적에 대해 만들어질 수 있다.
항원 쌍의 예로는 CD19/CD3, BCMA/CD3, 서로 다른 HER 계열 항원 조합(EGFR, HER2, HER3), IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1-β/IL-8, IL-6 또는 IL-6R/IL-21 또는 IL-21R, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-β, VEGF 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3; VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, c-FMS/CSF1R, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, integrin 및 MMP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원과 VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 및 안지오포이에틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 수용성 리간드의 조합; ERBB-3cC-Met, ERBB-2/c-Met, EGF 수용체 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, c-Met/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-1R, IL 17A/F, EGF 수용체 1/CD3, 및 CD19/CD16이 포함된다. 이중특이적 ADC의 추가 예로는 (i) 루이스 x-구조, 루이스 b-구조, 및 루이스 y-구조, Globo H-구조, KH1, Tn-항원, TF-항원 및 뮤신의 탄수화물 구조, CD44, 당지질 및 글리코스핑고리피드, 예를 들어, Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 및 시알릴테트라오실세라마이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원의 당에피토프(glycoepitope)에 대한 제1 특이성, 및 (ii) EGFR, HER2, HER3 및 HER4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 ErbB 수용체 티로신 키나제에 대한 제2 특이성을 가질 수 있다. 제2 항원 결합 부위와 조합된 GD2는 T-림프구 NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역 세포와 회합된다.
단일특이적 또는 이중특이적 항체는 다중특이적 ADC를 제조하기 위해 본원에 개시된 방법을 사용하여 다른 단일특이적 또는 이중특이적 항체와 함께 결합될 수 있다. 상기 기재된 치료 항체와 같은 이미 이용가능한 단일특이적 또는 이중특이적 치료 결합 물질을 사용함으로써, 필요한 다중특이적 결합 분자의 빠르고 쉬운 생산이 달성될 수 있다. 2개 이상의 서로 다른 에피토프를 동시에 표적화하고 결합하기 위해 2개 이상의 단일 치료 분자들을 조합하여 다중특이적 ADC를 맞춤형으로 생성함으로써 단일 표적화 ADC에 비해 부가/상승 효과를 기대할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 ADC는 하기 표적 쌍과 특이적으로 상호작용하고, 하기 표적 쌍에 대해 측정가능한 친화성을 나타내는 항체 쌍을 사용하여 제조된다.
Figure pct00032
Figure pct00033
일부 구현예에서, BsADC는 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하며, 이때 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 비면역원성 폴리머 약물 접합체, 예를 들어, 페길화된 약물 접합체에 대한 항체의 부위 특이적 접합에 사용될 수 있는 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기와 같은 모이어티를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 이중특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들 중 하나 또는 둘 다는 비면역원성 폴리머 약물 접합체, 예를 들어, 페길화된 약물 접합체에 대한 항체의 부위 특이적 접합에 사용될 수 있는 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 구현예에서, BsADC는 Her2의 서로 다른 2개의 에피토프에 대해 특이적으로 상호작용하고, 이에 대해 측정가능한 친화성을 나타내는 2개의 항체들 또는 이들의 항원-결합 단편들(예컨대 Fab, scFv 등)의 접합체이다.
IX. 합성
PEG의 원하는 크기 및 분지 수가 선택되면, 하이드록실, 카복실 기 등과 같은 PEG의 말단 작용기를 임의의 당업계에서 인정되는 공정을 사용하여 말단 분지된 헤테로이작용기로 전환시킬 수 있다(WO2018075308). 광범위하게 말해서, 말단 분지된 헤테로이작용성 PEG는 활성화된 PEG를 형성하기 위해 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 피리딘 등과 같은 염기의 존재 하에 말단 하이드록실 기의 경우 디(N-석신이미딜) 카보네이트(DSC), 트리포스겐 등과 같은 시약을 사용하여, 또는 말단 카복실 기의 경우 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIPC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 등과 같은 커플링 시약을 사용하여 PEG의 말단 하이드록실 또는 카복실 기를 N-하이드록시석신이미드로 활성화함으로써 제조될 수 있다.
다음으로, 활성화된 PEG는 디이소프로필아민(DIPEA)과 같은 염기의 존재 하에 라이신 유도체 H-Lys(Boc)-OH와 같은 삼작용성 소분자와 반응하여 유리 카복실 기 및 Boc 보호된 아미노 기 PEG-Lys(Boc)-COOH가 있는 말단 분지된 헤테로이작용성 PEG를 형성할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 할라이드, 아미노, 티올 기 등과 같은 PEG의 기타 말단 작용기, 및 -NH2, -NHNH2, -COOH, -OH, -C(O)X(X=할라이드), -N=C=O, -SH, 무수물, 할라이드, 말레이미도, C=C, C≡C 등의 목록으로부터 선택된 3개의 작용기들의 임의의 조합을 포함하는 기타 삼작용성 소분자, 또는 이들의 보호된 버전이 원하는 경우 동일한 목적을 위한 대안으로 사용될 수 있다.
TFA에 의한 Boc의 제거에 이어 NHS-PEG2-말레이미드와 같은 말레이미드 태그된 스페이서와의 반응은 PEG-Lys(Mal)-COOH를 생성한다.
별도로, 트리거(예를 들어, val-cit) 및 자기 희생 스페이서(예를 들어, PABC)와 연결된 세포독성 약물(예를 들어, MMAE)은 하기와 같은 B-D를 생성하기 위해 EDC/HOBT와 같은 커플링 시약과 함께 분지 유닛에 결합된다.
Figure pct00034
표적 생성물은 DCC와 같은 커플링 시약을 사용하여 PEG-Lys(Mal)-COOH를 B-D와 결합시켜 페길화된 약물 접합체 PEG-Lys(Mal)-(Val-Cit-PAB-MMAE)2를 형성함으로써 형성될 수 있다.
항원에 대해 2가인 단일특이적 항체 또는 SCAHer2IIxSCAHer2IV와 같은 이중특이적 항체는 발현 시스템의 유전자 조작을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 scFv를 인코딩하는 DNA는 합성되어 발현 시스템(예를 들어, CHO 세포)에 도입될 수 있다. 이어서, 목적하는 단백질을 발현시키고, 크로마토그래피 기술을 통해 정제한다.
항원에 대해 2가인 페길화된 단일 사슬 ADC 또는 BsADC를 제조하기 위해, 작용기 말레이미드 또는 DBCO를 갖는 페길화된 약물 접합체는 유전적으로 삽입되거나 유도체화를 통해 SCAHer2IVxSCAHer2IV 또는 SCAHer2IIxSCAHer2IV와 같은 이작용성 항체의 유리 티올 또는 아지드 작용기와 부위 특이적으로 반응하여 PEG-Lys(SCAHer2IVxSCAHer2IV)-(Val-Cit-PAB-MMAE)2 또는 PEG-Lys(SCAHer2IIxSCAHer2IV)-(Val-Cit-PAB-MMAE)2를 형성할 수 있다.
페길화된 다중특이적 항체는 단일특이적 또는 이중특이적 항체 대신 다중특이적 항체를 사용하여 유사하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 예시된 티올/말레이미드 또는 DBCO/아지드 부위 특이적 접합기 쌍(conjugation group pair) 이외에, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 트랜스-사이클로옥텐/테트라진 쌍; 카보닐/하이드라지드; 카보닐/옥심; 스즈키 미야우라 교차 결합 시약 쌍(Suzuki-Miyaura Cross-Coupling reagent pair); 소노가시라 교차 결합 시약 쌍(Sonogashira Cross-Coupling reagent pair); 슈타우딩거 결찰 시약 쌍(Staudinger Ligation reagent pair); 크뇌페나겔-인트라 마이클 부가 시약 쌍(Knoevenagel-Intra Michael addition reagent pair), 활성 아민/아크릴레이트 쌍 등과 같은 기타 공지된 부위 특이적 접합기 쌍이 유사하게 설계되어 원하는 경우 동일한 목적을 위한 대안으로 사용될 수 있다. 전술한 부위 특이적 접합기 쌍의 목록은 단지 예시적이며, 본 명세서에서 사용하기에 적합한 부위 특이적 접합기 쌍의 유형을 제한하려는 것은 아니다.
X. 조성물
본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 Her2 수용체의 서로 다른 2개의 에피토프에 결합하는 화합물(예를 들어, 이중특이적 항체-약물 접합체)을 포함할 수 있다.
본 발명의 치료 제형은 동결건조 제형 또는 수용액 형태로 원하는 수준의 순도를 갖는 단일특이적 또는 다중특이적 분자 약물 접합체를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 저분자량(약 10개 미만의 아미노산 잔기) 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 Tween, Pluronics 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
상기 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 제형은 또 다른 항체 또는 다중특이적 항체, 세포독성제, 화학요법제 또는 ADC를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
활성 성분들은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술(coacervation technique) 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 단일특이적 또는 다중특이적 분자를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출 가능한 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(US 3773919), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예를 들어, Lupron Depot(락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구체) 및 폴리-d(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 폴리머들은 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 체내에 장기간 남아 있으면, 37℃에서 습기에 노출되어 변성되거나 응집되어 생물학적 활성이 손실되고 면역원성의 변화가 발생할 수 있다. 관련된 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액에서 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 폴리머 매트릭스 조성을 개발하여 안정화를 달성할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 병용 요법으로, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 병용 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예시는 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 멸균 상태여야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 멸균 주사용 용액은, 필요에 따라, 위에 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 후 멸균 정밀여과(sterilization microfiltration)를 통해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 염기성 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조(동결건조)이다.
XI. 투여량
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 가져오는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이러한 양은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 투여 요법을 조정한다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 시간이 지남에 따라 여러 분할 용량이 투여될 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 따라 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태(dosage unit form)로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 결합하여 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 개인의 감수성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술 분야에 내재된 한계에 좌우되고, 직접적으로 의존한다.
본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 분자 약물 접합체의 투여를 위해, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로 0.01 내지 50 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 체중 1kg당 0.3 mg, 체중 1kg당 1 mg, 체중 1kg당 3 mg, 체중 1kg당 5 mg, 또는 체중 1kg당 10 mg, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위 내에 있을 수 있다. 예시적인 치료 요법은 매일, 주 2회, 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 월 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 약물 접합체에 대한 바람직한 투여 요법은 정맥내 투여를 통한 체중 1kg당 1 mg 또는 체중 1kg당 3 mg을 포함하며, 단일특이적 또는 다중특이적 약물 접합체는 다음 투여 일정들 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6회 투여에 대해 4주마다, 그 다음에는 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 체중 1kg당 3 mg 1회 이어서 3주마다 체중 1kg당 1 mg.
대안적으로, 단일특이적 또는 다중특이적 약물 접합체는 지속 방출 제형으로 투여될 수 있으며, 이 경우 더 낮은 빈도의 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자의 단일특이적 또는 다중특이적 약물 접합체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체는 반감기가 가장 길며, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드물게 투여된다. 일부 환자는 평생 동안 계속 치료를 받는다. 치료적 적용에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방 요법을 투여받을 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분들의 실제 투여 수준은, 환자에게 유독하지 않으면서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 달라질 수 있다. 선택된 투여 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 기타 약물, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 상태, 치료받는 환자의 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 요인들을 비롯한 다양한 약동학적 요인들에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 분자의 "치료적 유효량"은 바람직하게는 질병 증상의 중증도 감소, 질병 무증상 기간의 빈도 및 기간 증가, 또는 질병의 고통으로 인한 손상(impairment) 또는 장애(disability) 예방을 야기한다. 예를 들어, 종양의 치료를 위해, "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는, 치료되지 않은 대상체에 비해, 세포 성장 또는 종양 성장 또는 전이를 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 억제한다. 종양 성장을 억제하는 제제 또는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 화합물의 억제 능력을 조사함으로써 평가될 수 있으며, 이러한 억제는 숙련된 의사에게 알려진 검정에 의해 시험관내에서 평가된다. 치료적 유효량의 치료 화합물은 대상체에서 종양 크기, 전이를 감소시키거나 그렇지 않으면 증상을 개선할 수 있다. 당업자는 대상체의 사이즈, 대상체 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인들에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
XII. 투여
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법들 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체 약물 접합체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에 사용된 "비경구 투여"라는 문구는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 분자 약물 접합체는 비경구 경로를 통해, 예를 들어, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질내, 직장, 설하 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이 빠른 방출로부터 화합물을 보호할 수 있는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌(참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)을 참고한다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 조성물은 US 5399163, US 5383851, US 5312335, US 5064413, US 4941880, US 4790824, 및 US 4596556에 개시된 장치와 같은 바늘 없는 피하 주사 장치와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로는 US 4487603, US 4486194, US 4447233, US 4447224, US 4439196, 및 US 4475196에 기재된 것들이 포함된다. 이러한 특허들은 본원에 참조로 포함되어 있다. 기타 많은 이러한 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 당업자에게 알려져 있다.
XIII. 치료 방법
일 측면에서, 본 발명은 암성 종양의 성장 및/또는 전이가 억제되도록 상기 기재된 단일특이적 또는 다중특이적 분자 약물 접합체를 사용한 대상체의 생체내 치료에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 단일특이적 또는 다중특이적 분자 약물 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하고/하거나 전이성 확산을 제한하는 방법을 제공한다.
치료를 위한 바람직한 암의 비제한적 예로는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 유방암, 난소암, 흑색종(예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 결장암 및 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암)이 포함된다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 난치성 또는 재발성 악성종양(malignancy)을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예로는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추신경계(CNS) 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양(spinal axis tumor), 뇌간교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암(epidermoid cancer), 편평세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발된 암을 포함하는 환경적으로 유발된 암, 및 상기 암들의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함하도록 의도된다. 비인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비포유류, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류가 포함되지만, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 및 말과 같은 포유류가 바람직하다. 바람직한 대상체는 면역 반응의 향상이 필요한 인간 환자를 포함한다. 본 방법은 면역 반응을 증강함으로써 치료될 수 있는 질환을 갖는 인간 환자를 치료하는 데 특히 적합하다.
상기 치료는 표준 암 치료와 병용될 수도 있다. 예를 들어, 이는 화학요법적 요법과 효과적으로 병용될 수 있다. 이러한 경우에는 투여되는 화학요법제의 용량을 줄이는 것이 가능할 수 있다(Mokyr, M. et al. Cancer Res., 1998, 58, 5301-5304).
숙주 면역 반응성을 활성화하기 위해 사용될 수 있는 다른 항체들이 본 발명의 다중특이적 분자 약물 접합체에서 또는 이와 함께 사용될 수 있다. 여기에는 DC 기능 및 항원 제시를 활성화하는 수지상 세포 표면을 표적으로 하는 분자가 포함된다. 예를 들어, 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성을 효과적으로 대체할 수 있고(Ridge, J. et al. Nature, 1998, 393, 474-478), 본 발명의 다중특이적 분자 약물 접합체와 함께 사용될 수 있다(Ito, N. et al. Immunobiology, 2000, 201, 527-540). 유사하게, T 세포 공동자극 분자를 표적으로 하는 항체, 예를 들어, CTLA-4(US 5811097), CD28(Haan, J. et al. Immunol. Lett., 2014, 162, 103-112), OX-40(Weinberg, A. et al. J. Immunol., 2000, 164, 2160-2169), 4-1BB(Melero, I. et al. Nature Med., 1997, 3, 682-685), 및 ICOS(Hutloff, A. et al. Nature, 1999, 397, 262-266) 또는 PD-1(US 8008449) 및 PD-L1(US 7943743; US 8168179)을 표적으로 하는 항체들도 T 세포 활성화 수준을 증가시킬 수 있다. 또 다른 예로, 본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 분자 약물 접합체는 항신생물 항체들, 예를 들어, RITUXAN(리툭시맙), HERCEPTIN(트라스투주맙), BEXXAR(토시투모맙), ZEVALIN(이브리투모맙), CAMPATH(알렘투주맙), LYMPHOCIDE(에프르투주맙(eprtuzumab)), AVASTIN(베바시주맙), 및 TARCEVA(엘로티닙) 등과 함께 사용될 수 있다.
용어의 정의
본원에 사용된 용어 "알킬"은 통상적으로 길이가 약 1 내지 25개의 원자 범위인 탄화수소 사슬을 지칭한다. 이러한 탄화수소 사슬은 바람직하게는 포화된 것이지만 반드시 포화될 필요는 없으며, 분지쇄 또는 직쇄일 수 있지만, 통상적으로 직쇄가 바람직하다. 용어 C1-10 알킬은 탄소수가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개인 알킬기를 포함한다. 유사하게 C1-25 알킬은 탄소수가 1 내지 25개인 모든 알킬을 포함한다. 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, 이소프로필, n-부틸, n-펜틸, 2-메틸-1-부틸, 3-펜틸, 3-메틸-3-펜틸 등을 포함한다. 본원에 사용된 "알킬"은 3개 이상의 탄소 원자가 언급되는 경우에 사이클로알킬을 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 알킬은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작용기"는, 일반적인 유기 합성 조건 하에, 그것이 부착되어 있는 개체와 통상적으로 추가 작용기를 보유하는 또 다른 개체 사이에 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 기를 지칭한다. "이작용성 링커"는 2개의 작용기가 접합체의 다른 모이어티와 함께 2개의 연결부를 형성하는 링커를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유도체"는 새로운 작용기를 도입하거나 원래 화합물의 특성을 조정하기 위한 목적으로 추가적인 구조적 모이어티로 화학적으로 변형된 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "보호기"는 특정 반응 조건 하에서 분자 내의 특정 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하거나 차단하는 모이어티를 지칭한다. 다양한 보호기가 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌(참조: T. W. Greene and G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999, and in P. J. Kocienski, Protecting Groups, Third Ed., Thieme Chemistry, 2003), 및 그 안에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜을 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 PEG는 통상적으로 -(CH2CH2O)n-의 구조를 포함한다. PEG는 다양한 분자량, 구조 또는 기하학적 구조를 가질 수 있다. PEG 기는 통상적인 합성 반응 조건 하에 쉽게 화학적 변형을 겪지 않는 캡핑기를 포함할 수 있다. 캡핑기의 예에는 -OC1-25 알킬 또는 -O아릴이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "페길화(PEGylate)"는 폴리에틸렌 글리콜에 의한 화학적 변형을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 항체 및 폴리머 모이어티와 같은 상호연결 모이어티들을 연결하는 데 사용되는 원자 또는 원자들의 집합을 지칭한다. 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 접합체에 대한 다양한 링커의 제조법은, 예를 들어, 문헌[참조: Goldmacher et al., Antibody-drug Conjugates and Immunotoxins: From Pre-clinical Development to Therapeutic Applications, Chapter 7, in Linker Technology and Impact of Linker Design on ADC properties, Edited by Phillips GL; Ed. Springer Science and Business Media, New York (2013)]을 포함하는 문헌에 기재되어 있다. 절단 가능한 링커는 특정 생물학적 또는 화학적 조건 하에 절단될 수 있는 기 또는 모이어티를 포함한다. 예에는 효소적으로 절단 가능한 디설파이드 링커, 1,4-벤질 또는 1,6-벤질 제거, 트리메틸 잠금 시스템(trimethyl lock system), bicine-기반 자가 절단 가능 시스템, 산 불안정(acid-labile) 실릴 에테르 링커, 및 기타 광 불안정(photo-labile) 링커가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "연결 기(linking group)" 또는 "연결기(linkage group)"는 화합물 또는 접합체의 상이한 모이어티들을 연결하는 작용기 또는 모이어티를 지칭한다. 연결 기의 예로는 아미드, 에스테르, 카바메이트, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 하이드라존, 옥심, 및 세미카바지드, 카보디이미드, 산 불안정기, 광불안정기, 펩티다아제 불안정기 및 에스테라아제 불안정기가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 링커 모이어티와 폴리머 모이어티는 아미드 또는 카바메이트 연결기를 통해 서로 연결될 수 있다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 폴리머에서 아미노산 잔기들의 배열을 설명하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 희귀 아미노산 및 합성 아미노산 유사체 외에도 표준 20개의 자연 발생 아미노산으로 구성될 수 있다. 이들은 길이나 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)에 관계없이 임의의 아미노산 사슬일 수 있다.
"재조합" 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭하며; 즉, 원하는 펩티드를 인코딩하는 외인성 DNA 작제물로 형질전환된 세포로부터 생산된다. "합성" 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 화학적 합성에 의해 제조된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭한다. 용어 "재조합"은, 예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용되는 경우, 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 네이티브 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되거나, 또는 세포가 이와 같이 변형된 세포로부터 유래된 것임을 나타낸다. 본 발명의 범위 내에는 하나 이상의 상기 언급된 서열 및 이종 서열을 함유하는 융합 단백질이 있다. 이종 폴리펩티드, 핵산, 또는 유전자는 외래 종에서 유래하거나, 동일한 종에서 유래하는 경우, 원래 형태에서 실질적으로 변형된 것이다. 2개의 융합된 도메인들 또는 서열들은, 이들이 천연 발생 단백질 또는 핵산에서 서로 인접하지 않은 경우, 서로 이종성이다.
"단리된" 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 이와 자연적으로 결합되어 있는 다른 단백질, 지질, 및 핵산으로부터 분리된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭한다. 폴리펩티드/단백질은 정제된 제제의 건조 중량을 기준으로 적어도 10%(즉, 10%와 100% 사이의 임의의 백분율, 예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 및 99%)를 구성할 수 있다. 순도는 임의의 적절한 표준 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 기재된 단리된 폴리펩티드/단백질은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 화학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
"항원"은 면역학적 반응을 유발하거나 면역학적 반응의 생성물에 결합하는 물질을 지칭한다. 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다.
본원에 언급된 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬을 포함한다. 전체 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성되며, 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 가변 영역 CDR 및 FR은 HFRl, HCDRl, HFR2, HCDR2, HFR3, HCDR3, HFR4이다. 경쇄 가변 영역 CDR 및 FR은 LFRl, LCDRl, LFR2, LCDR2, LFR3, LCDR3, LFR4이다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(CIq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 "항체 단편"은 일반적으로 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역 및/또는 FcR 결합 능력을 보유하는 항체의 Fc 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함할 수 있다. 항체 단편의 예에는 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편 또는 부분"(또는 간단히 "항체 단편 또는 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 단편 또는 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) 힌지 영역의 일부를 갖는 본질적으로 Fab인 Fab' 단편; (iv) VH 및 CHI 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb; (vii) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디. 또한, Fv 단편의 두 도메인인, VL 및 VH가 별도의 유전자들에 의해 코딩되어 있지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들어, Bird et al. Science 1988, 242, 423-426; 및 Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 단편 또는 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편들은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편들은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 용어 "Fc 단편" 또는 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 또한, 서로 다른 결정인자(determinant)(에피토프)들에 대해 유도되는 서로 다른 항체들을 통상적으로 포함하는 전형적인(폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 본원에 참조로 포함된 Kohler 및 Milstein(Kohler, G. et al. Nature, 1975, 256, 495-497)에 의해 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(US 4816567, 본원에 참조로 포함됨)에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어, 문헌(참조: Clackson et al., Nature, 1991, 352, 624-628 및 Marks et al., J Mol Biol, 1991, 222, 581-597, 각각 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 기술들을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다,
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체를 포함하는데, 이때 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체들의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 나머지 사슬(들)은 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체들, 및 이러한 항체들의 단편들의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이되, 단 상기 단편들은 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다(참조: 미국 특허 번호 제4,816,567호; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81, 6851-6855; Neuberger et al., Nature, 312, 1984, 604-608; Takeda et al., Nature, 1985, 314, 452-454; 국제 특허 출원 번호 제PCT/GB85/00392호, 각각은 본원에 참조로 포함됨).
"인간화" 형태의 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체는 비인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체의 초가변 영역의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여체 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 통상적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 서열의 것에 상응한다. 인간화 항체는 또한 선택적으로, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 자세한 내용은 문헌(참조: Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-329; Presta, Curr Op Struct Biol, 1992, 2, 593-596); 및 미국 특허 번호 제5,225,539호를 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함되어 있다.
"인간 항체"는 인간 하이브리도마, 인간 파지 디스플레이 라이브러리, 또는 인간 항체 서열을 발현시키는 형질전환 마우스로부터 얻어질 수 있는 것과 같이 완전한 인간 서열을 갖는 임의의 항체를 지칭한다.
용어 "약제학적 조성물"은 조성물을 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료 용도에 특히 적합하게 만드는, 활성제와 불활성 또는 활성 담체의 조합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 대상체에게 또는 대상체 위에(upon) 투여된 후, 바람직하지 않은 생리학적 효과를 일으키지 않는다. 약제학적 조성물 내의 담체는 활성 성분과 양립가능하고, 이를 안정화시킬 수 있다는 의미에서 또한 "허용가능"해야 한다. 하나 이상의 가용화제가 활성제의 전달을 위한 약제학적 담체로서 이용될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 투여 형태로 사용될 수 있는 조성물을 달성하기 위한 생체적합성 비히클, 보조제, 첨가제, 및 희석제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 담체의 예에는 콜로이드성 산화규소, 스테아르산마그네슘, 셀룰로오스, 및 나트륨 라우릴 설페이트가 포함된다. 이러한 사용을 위해 추가로 적합한 약제학적 담체 및 희석제와 약제학적 필수품은 Remington's Pharmaceutical Sciences에 설명되어 있다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의한)에 적합하다. 치료 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 유지하고, 원하지 않는 임의의 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예를 들어, Berge, S. M., et al. J. Pharm. Sci. 1997, 66,1-19 참조).
본원에 사용된 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 질환, 질환의 증상, 질환에 이차적인 질병 상태, 또는 질환에 대한 소인의 치료(cure), 완화(alleviate), 경감(relieve), 교정(remedy), 발병 지연, 예방 또는 개선(ameliorate)을 목적으로 질환이 있거나 질환이 발병할 위험이 있는 대상체에게 화합물 또는 제제를 투여하는 것을 지칭한다.
"유효량"은 치료 대상에게 치료 효과를 부여하는 데 필요한 활성 화합물/활성제의 양을 지칭한다. 유효 용량은 치료되는 상태의 유형, 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 치료적 치료와의 공동 사용 가능성에 따라 당업자가 인식하는 바와 같이 다양할 것이다. 신생물 상태(neoplastic condition)를 치료하기 위한 조합물의 치료적 유효량은 치료되지 않은 동물과 비교하여, 예를 들어, 종양 크기의 감소, 종양 병소 수의 감소, 또는 종양 성장의 둔화를 야기할 수 있는 양이다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 다수의 값 범위가 제공된다. 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 범위의 상한과 하한 사이에 있는, 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 중간 값이 또한 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 명시된 범위 내의 임의의 명시된 값 또는 중간 값과, 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위도 본 발명에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 범위에 포함되거나 배제될 수 있으며, 더 작은 범위에 경계값들 중 어느 하나, 또는 둘 다가 포함되거나 더 작은 범위에 경계값들 중 어느 것도 포함되지 않는 각 범위도, 명시된 범위에서 구체적으로 배제된 임의의 경계값에 따라, 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 상한 및 하한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 상한 및 하한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
"약"이라는 용어는 일반적으로 표시된 숫자의 플러스 또는 마이너스 10%를 나타낸다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낼 수 있고, "약 1"은 0.9 내지 1.1을 의미할 수 있다. "약"의 다른 의미는 반올림과 같이, 문맥에서 명백할 수 있으므로, 예를 들어, "약 1"은 또한 0.5 내지 1.4를 의미할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 추가적인 이해를 제공하는 역할을 하지만, 어떤 식으로도 본 발명의 효과적인 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
실시예 1. 30kmPEG-Lys(Mal)-(Val-Cit-PAB-MMAE) 4 의 제조
분지형 링커 중간체 화합물 7의 제조(도 1)
실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(50 mL) 중의 화합물 1(3.1 g, 10 mmol)의 용액에 화합물 2(2.6 g, 12 mmol, 1.2 eq), EDCI(2.87 g, 15 mmol, 1.5 eq) 및 HOBt(0.27 g, 2 mmol, 0.2 eq)를 첨가하였다. TLC에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 혼합물을 교반하였다. 반응이 완료된 후, 상기 혼합물을 CH2Cl2로 추출하고, 유기층을 식염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시킨다. 조 반응 혼합물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 통해 정제하여 생성물 3을 얻는다.
실온에서 아르곤 하에 THF(50 mL) 중의 생성물 3의 용액에 1M LiOH(20 mL, 20 mmol, 4.0 eq)를 첨가한다. TLC에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 혼합물을 교반한다. 반응이 완료된 후, 상기 혼합물을 CH2Cl2로 추출하고, 유기층을 식염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시킨다. 조 반응 혼합물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 통해 정제하여 생성물 4를 얻는다.
실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(50 mL) 중의 생성물 4의 용액에 화합물 5(1.6 g, 6 mmol, 1.2 eq), EDCI(1.4 g, 7.5 mmol, 1.5 eq) 및 HOBt(0.14 g, 1 mmol, 0.2 eq)를 첨가한다. TLC에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 혼합물을 교반한다. 반응이 완료된 후, 상기 혼합물을 CH2Cl2로 추출하고, 유기층을 식염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시킨다. 조 반응 혼합물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 통해 정제하여 생성물 6을 얻는다.
디에틸아민(1.0 ml)을 DMF(10 ml) 중의 생성물 6(0.97 g, 1.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응을 실온에서 1.5시간 동안 진행되도록 한다. 디에틸아민과 용매를 30℃ 이하의 배쓰 온도에서 진공에서 제거한다. 잔류물을 에테르(25 ml)로 연화(triturate)한다. 침전된 고체를 수집하고, 여과하고, 에테르로 2회(2×20 ml) 세척하고, 진공에서 건조시켜 생성물 7을 얻는다.
화합물 14 Val-Cit-PAB-MMAE의 제조(도 2)
Fmoc-Val-OH 8(3.4 g, 10 mmol, 1.0 eq) 및 N-하이드록시석신이미드(1.5g, 13 mmol, 1.3 eq)를 0℃에서 CH2Cl2(60 ml)와 THF(20 ml)의 혼합물에 용해하고, 상기 용액에 EDCI(2.5 g, 13 mmol, 1.3 eq)를 첨가한다. 이어서, 용액을 실온으로 천천히 가온한다. 반응 혼합물을 반응이 완료될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축한다. 농축된 잔류물을 THF로 용해하고 여과하여 EDU를 제거한다. 여액을 농축하고, 12시간 동안 5 내지 10℃에서 n-헵탄으로 재슬러리화한다. 고체를 여과하고, 세척하고, 진공 하에 건조시켜 Fmoc-Val-OSu를 얻는다.
Fmoc-Val-OSu(4.4 g, 10 mmol, 1.0 eq)를 실온에서 아세토니트릴(50 mL)에 용해한 다음 물(50 ml) 중의 탄산나트륨(1.2 g, 11 mmol, 1.1 eq) 및 L-시트룰린(1.9 g, 11 mmol, 1.1 eq)의 용액을 첨가한다. 반응 혼합물을 반응이 완료될 때까지 몇 시간 동안 35℃에서 교반한다. 상기 혼합물을 20℃로 냉각시키고, 15% 시트르산(150 mL)으로 켄칭하고, EtOAc/ i -PrOH (9:1)(200 mL×2)로 추출한다. 합한 유기상을 물(140 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 농축시킨다. 잔류물을 메틸 3급-부틸 에테르로 세척하여 Fmoc-Val-Cit-OH 9를 얻는다.
Fmoc-Val-Cit-OH 9(3.0 g, 6.0 mmol, 1.0 eq) 및 4-아미노벤질 알코올(1.5 g, 12.1 mmol, 2.0 eq)을 CH2Cl2(70 mL)와 MeOH(30 mL)의 용액에 용해한다. EEDQ(3.0 g, 12.1 mmol, 2.0 eq)를 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 1일 동안 교반한다. 추가 EEDQ(1.5 g, 6.0 mmol, 1.0 eq)를 첨가하고, 상기 용액을 12시간 동안 계속 교반한다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 메틸 3급-부틸 에테르로 세척하여 FFmoc-Val-Cit-PAB-OH 10을 얻는다.
DMF(20 mL) 중 Fmoc-Val-Cit-PAB-OH 10(2.0 g, 3.3 mmol, 1.0 eq)의 용액에 p-니트로벤조일 클로라이드 11(1.2 g, 6.6 mmol, 2.0 eq) 및 피리딘(0.4 mL, 5.0 mmol, 1.5 eq)을 첨가한다. 상기 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음, 농축한다. 잔류물을 EtOAc/메틸 3급-부틸 에테르로 세척하여 생성물 12를 얻는다.
실온에서 DMF(3.4 mL) 중의 생성물 12(1.3 g, 1.7 mmol, 1.0 eq)의 용액에 HOBt(376 mg, 2.78 mml, 1.6 eq) 및 피리딘(0.85 mL)을 첨가한 다음, MMAE(1.0 g, 1.39 mmol)를 첨가한다. 상기 용액을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 상기 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 통해 정제하여 생성물 Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAE 13을 얻는다.
DMF(20 mL) 중의 Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAE 13(1.4 g, 1.1 mmol)의 용액에 Et2NH(5 mL)를 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 12시간 동안 교반한다. 상기 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 EtOAc/메틸 3급-부틸 에테르로 세척하여 생성물 14를 얻는다.
화합물 19 30k mPEG-Lys(Mal)-(MMAE) 4 의 제조(도 3)
H-Lys(boc)-OH(369 mg, 1.5 mmol, 3.0 eq)를 무수 DMF 100 mL에 첨가한 다음 DIEA(5.0 mmol, 10.0 eq), 화합물 15(15 g, 0.5 mmol, 1.0 eq) 및 무수 CH2Cl2 150 mL를 첨가한다. 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반한다. 불용성 물질을 여과한다. 용매를 제거하고 잔류물을 CH2Cl2/메틸 3급-부틸 에테르로부터 재결정화한다. 단리된 고체는 ACN/2-프로판올로부터 다시 재결정화된다. 생성물을 진공 하에 4시간에 걸쳐 40℃에서 건조시켜 생성물 16을 얻는다.
실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(150 mL) 중의 생성물 16(15 g, 0.5 mmol)의 용액에 화합물 7(1.1 g, 1.5 mmol, 3.0 eq), EDCI(0.58 g, 3.0 mmol, 6.0 eq) 및 HOBt(0.61 g, 4.5 mmol, 9.0 eq)를 첨가한다. 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반한다. 용매를 제거하고 잔류물을 CH2Cl2/메틸 3급-부틸 에테르로부터 재결정화한다. 침전된 고체는 ACN/2-프로판올로부터 다시 재결정화된다. 생성물을 진공 하에 4시간에 걸쳐 40℃에서 건조시켜 생성물 17을 얻는다.
생성물 17(9.0 g, 0.3 mmol)을 CH2Cl2(90 mL)에 용해한 다음 TFA(45 mL)를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한다. 35℃ 미만의 온도에서 가능한 한 많은 용매를 진공 하에 제거한다. 잔류물을 CH2Cl2/메틸 3급-부틸 에테르로부터 2회 재결정화한다. 생성물을 40℃에서 진공 하에 건조시켜 중간체를 생성한다. 이어서, 건조된 중간체(6.0 g, 0.2 mmol, 1.0 eq)를 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(60 mL)에 용해한다. 상기 용액을 0 내지 5℃로 냉각하고, DIPEA(517 mg, 4 mmol, 20 eq) 및 NHS-PEG2-Mal(0.22 g, 0.5 mmol, 2.5 eq)을 0 내지 5℃에서 첨가한다. 상기 혼합물을 0 내지 5℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 실온으로 천천히 가온하고, 아르곤 하에 실온에서 밤새 유지한다. 반응 후, 용매를 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2/메틸 3급-부틸 에테르로부터 재결정화한다. 침전된 고체는 ACN/2-프로판올로부터 다시 재결정화된다. 단리된 생성물을 진공 하에 4시간에 걸쳐 40℃에서 건조시켜 생성물 18을 얻는다.
실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(30 mL) 중의 생성물 18(3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 화합물 14(0.9 g, 0.8 mmol, 8.0 eq), EDCI(0.46 g, 2.4 mmol, 24 eq) 및 HOBt(0.49 g, 3.6 mmol, 36 eq)를 첨가한다. 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반한다. 용매를 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2/메틸　3급-부틸 에테르로부터 재결정화한다. 침전된 고체는 ACN/2-프로판올로부터 다시 재결정화된다. 단리된 생성물을 진공 하에 4시간에 걸쳐 40℃에서 건조시켜 생성물 19를 얻는다.
실시예 2 SCAHer2xSCAHer2의 제조:
항-Her2(SCAHer2)-1 및 항-Her2(SCAHer2)-2의 이중특이적 단일 사슬 항체(SCA) 단편은 포유류 세포(예를 들어, EasySelect™을 사용하는 CHO) 또는 효모(예를 들어, pPICZ 벡터를 함유하는 피치아 파스토리(Pichia pastori) 발현 키트)에서 재조합 DNA 기술을 통해 제조될 수 있다. 하기 아미노산 서열(서열 번호: 1)에 상응하는 SCAHer2-1xSCAH2-2의 DNA 서열을 합성하고 발현 벡터에 클로닝하고 숙주 세포에서 형질전환시킨다. 발현된 단백질을 Ni-킬레이트 수지 또는 단백질 L 수지로 정제한다. 후속 접합을 용이하게 하기 위해, 부위 특이적 접합 작용기 티올이 재조합 DNA 기술을 통해 2개의 Her2 SCA들 사이의 링커에 삽입된다.
SCAHer2IIxSCAHer2IV의 아미노산 서열(서열 번호: 1):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTGGSGGSGGSGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGCGSGGSGGSGGSGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTHHHHHH
실시예 3 30kmPEG-(SCAHer2xSCAHer2)-(Val-Cit-PAB-MMAE) 4 의 제조(도 4)
단백질 SCAHer2/SCAHer2는 PBS 버퍼(pH = 7.4) 중에서 실온에서 30분 동안 환원제 TCEP-HCl로 처리된 후 500 mM 인산나트륨의 pH = 4.12 스톡 용액을 사용하여 pH를 pH 6.8로 조정한다. 처리된 단백질은 페길화 전에 5 mg/mL로 농축된다. SCAHer2/SCAHer2의 페길화는 5 내지 10몰 당량의 화합물 19[30k mPEG-Lys(Mal)-(Val-Cit-PAB-MMAE)4]를 사용하여 실온에서 3시간 동안 수행된다. 반응을 실온에서 10분 동안 10 mM의 L-시스틴으로 켄칭한다. 최종 생성물 PEG-Lys(SCAHer2/SCAHer2)-(Val-Cit-PAB-MMAE)4를 20 mM 포스페이트 버퍼에서 pH 6.5의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(CM Fast Flow)으로 정제한다. SEC-HPLC 및 세포 기반 활성 검정을 통해 표적 화합물 20이 확인된다.
실시예 4. Val-Cit-PABC-MMAE의 제조(도 5)
Fmoc-Val-OSu (화합물 2): Fmoc-Val-OH(20.3 g, 60.0 mmol) 및 N-하이드록시석신이미드(9.0 g, 78.0 mmol)를 CH2Cl2(120 mL)와 THF(40 mL)의 혼합물에 용해하였다. 별도로 EDCI(13.8 g, 72.0 mmol)를 CH2Cl2(200 mL)에 용해하고 0 내지 5℃로 냉각하였다. 이어서, Fmoc-Val-OH/NHS 용액을 EDCI 용액에 첨가한 다음, 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 반응이 완료될 때까지 실온에서 교반하였다. 이어서, 감압 하에 가능한 한 많은 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물 CH2Cl2를 THF(2×100 mL)로 대체(chased out)하였다. 농축된 잔류물을 THF(800 mL)로 용해하고, 여과하여 EDU를 제거하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 잔류물을 5 내지 10℃에서 12시간 동안 n-헵탄(800 mL)으로 슬러리화하였다. 고체를 여과하고, 세척하고, 진공 하에 건조시켜 백색 분말로서 Fmoc-Val-OSu(2)(23.8 g, 91%)를 얻었다. HRMS (ESI) C24H24N2O6Na [M+Na]+에 대한 계산치 459.1532, 실측치 459.1523.
Fmoc-Val-Cit (화합물 3): Fmoc-Val-Osu(9.8 g, 22.5 mmol)를 실온에서 DME(150 mL)에 용해하였다. 별도로, 중탄산나트륨(2.1 g, 24.7 mmol)을 실온에서 물(150 mL)에 용해한 후 L-시트룰린(4.3 g, 24.7 mmol)을 첨가하여 균일하고 투명한 용액을 얻었다. 이어서, 제조된 L-시트룰린 용액을 Fmoc-Val-Osu 용액에 첨가하였다. THF(75 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 반응이 완료될 때까지 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 15% 시트르산(200 mL)으로 산성화하고, 회전 증발기(Rotavapor)로 농축하였다. 잔류물을 물(500 mL)에 2시간 동안 현탁시킨 후 여과하고 진공에서 건조시켰다. 건조된 고체를 메틸 3급-부틸 에테르(500 mL)에 재현탁하고, 12시간 동안 교반한 후 여과하고, 세척하고, 진공 하에 건조시켜 백색 분말로서 Fmoc-Val-Cit(3)(6.8 g, 61%)를 얻었다. HRMS (ESI) C26H33N4O6 [M+H]+에 대한 계산치 497.2400, 실측치 497.2388.
Fmoc-Val-Cit-PABOH (화합물 4): CH2Cl2(350 mL) 및 MeOH(150 mL) 중의 화합물 3(4.96 g, 10.0 mmol) 및 4-아미노벤질 알코올(2.46 g, 20.0 mmol)의 용액에 EEDQ(4.95 g, 20.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 추가의 EEDQ(2.5 g, 10.0 mmol)를 반응물에 첨가하고, 혼합물을 추가로 24시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 생성된 잔류물을 12시간 동안 메틸 3급-부틸 에테르(800 mL)에 슬러리화하였다. 고체를 여과하고, 세척하고, 진공 하에 건조시켜 화합물 4(4.1 g, 69%)를 백색 분말로서 얻었다. HRMS (ESI) C33H40N5O6 [M+H]+에 대한 계산치 602.2979, 실측치 602.2969.
Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP (화합물 5): 실온에서 DMF(52 mL) 중 화합물 4(5.2 g, 8.6 mmol) 및 비스(4-니트로페닐)카보네이트(4.9 g, 16.1 mmol)의 용액에 DIPEA(2.5 mL, 15.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 반응이 완료될 때까지 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 무수 에틸 아세테이트(250 mL) 및 메틸 3급-부틸 에테르(250 mL)를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 30분 동안 교반하였다. 고형물을 여과에 의해 단리하고, 세척하고, 진공 하에 건조시켜 Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP(5)(4.7 g, 72%)를 담황색 분말로서 얻었다. HRMS (ESI) C40H43N6O10 [M+H]+에 대한 계산치 767.3041, 실측치 767.3045.
Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE (화합물 6): 화합물 MMAE(2.0 g, 1.8 mmol) 및 Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP(5)(2.8 g, 3.6 mmol)를 DMF(20 mL)에 용해하였다. 이어서, HOBt(0.75 g, 5.6 mmol) 및 피리딘(1.7 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시킨 다음, 메틸 3급-부틸 에테르(180 mL)를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 슬러리를 3 내지 5시간 동안 교반하고, 여과하고, 세척하고, 진공하에 건조시켰다. 조 생성물을 컬럼 정제로 정제하여 Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE(6)(3.0 g, 80%)를 황색 분말로 얻었다. HRMS (ESI) C73H105N10O14 [M+H]+에 대한 계산치 1345.7812, 실측치 1345.7820.
Val-Cit-PABC-MMAE (화합물 7): 화합물 6(3.0 g, 2.2 mmol)을 무수 DMF(40 mL)에 현탁하고, 균일한 현탁액이 형성될 때까지 실온에서 교반하였다. 이어서, 디에틸아민(10 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 메틸 3급-부틸 에테르(100 mL) 및 에틸 아세테이트(50 mL)를 60분에 걸쳐 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. 고형물을 여과하고, 진공하에 건조시켜 Val-Cit-PABC-MMAE(7)(2.3 g, 92%)를 담황색 분말로 얻었다. HRMS (ESI) C58H95N10O12 [M+H]+에 대한 계산치 1123.7131, 실측치 1123.7142.
실시예 5. 화합물 13의 제조(2XMMAE가 있는 분지 링커 B)(도 6)
화합물 10: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(15 mL) 중의 화합물 8(0.62 g, 2.0 mmol)의 용액에 디-3급-부틸 3,3'-아잔디일디프로파노에이트(9)(0.62 mL, 2.2 mmol), EDCI(0.58 g, 3.0 mmol), 및 HOBt(54 mg, 0.4 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 교반하고, TLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 상기 혼합물을 CH2Cl2(30 mL x 2)로 추출하고, 유기층을 합하고, 식염수(20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 상기 용액을 회전 증발기로 농축하였다. 조 반응 혼합물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 통해 정제하여 화합물 10(1.1 g, 96%)을 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C32H43N2O7 [M+H]+에 대한 계산치 567.3070, 실측치 567.3062.
화합물 11: 화합물 10(5.2 g, 9.2 mmol)을 CH2Cl2(100 mL)에 용해한 다음 TFA(25 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 35℃ 미만의 온도에서 진공 하에 가능한 한 많은 용매를 제거하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 통해 정제하여 화합물 11(3.4 g, 83%)을 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C24H27N2O7 [M+H]+에 대한 계산치 455.1818, 실측치 455.1824.
화합물 12: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(2 mL) 및 DMF(2 mL) 중 화합물 11(41 mg, 0.091 mmol)의 교반된 용액에 Val-Cit-PABC-MMAE(7)(224 mg, 0.2 mmol), EDCI(52 mg, 0.27 mmol) 및 HOBt(5 mg, 0.04 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, TLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 Welch Ultimate XB-C18 컬럼을 사용하는 분취용 HPLC(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)로 정제하여 화합물 12(74 mg, 31%)를 담황색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) C140H212N22O29 [M+2H]2+에 대한 계산치 1333.2912, 실측치 1333.2907.
화합물 13: 디에틸아민(0.6 ml)을 DMF(3 ml) 중 화합물 12(73 mg)의 용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 4시간 동안 진행시켰다. 반응 혼합물을 회전 증발기로 농축하고, 잔류물을 Welch Ultimate XB-C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 13(71 mg, 99%)을 담황색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) C125H202N22O27 [M+2H]2+에 대한 계산치 1222.2572, 실측치 1222.2560.
실시예 6. 화합물 18(2XMMAE가 있는 분지 링커 B)의 제조(도 7)
화합물 15: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(10 mL) 중의 화합물 14(0.68 g, 2.0 mmol)의 용액에 디-3급-부틸 3,3'-아잔디일디프로파노에이트(9)(0.64 mL, 2.2 mmol), EDCI(0.58 g, 3.0 mmol) 및 HOBt(54 mg, 0.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고 TLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 CH2Cl2(2×30 mL)로 추출하고, 합한 유기층을 식염수(20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발기로 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 화합물 15(1.2 g, 99%)를 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C34H47N2O7 [M+H]+에 대한 계산치 595.3383, 실측치 595.3380.
화합물 16: 화합물 15(0.5 g, 0.84 mmol)를 CH2Cl2(6.0 mL)에 용해한 다음 TFA(3.0 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 35℃ 미만의 온도에서 진공 하에 가능한 한 많은 용매를 제거하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 화합물 16(0.34 g, 85%)을 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C26H31N2O7 [M+H]+에 대한 계산치 483.2131, 실측치 483.2127.
화합물 17: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(8 mL)와 DMF(8 mL)의 혼합물 중의 화합물 16(185 mg, 0.383 mmol)의 용액에 Val-Cit-PABC-MMAE(7)(947 mg, 0.843 mmol), EDCI(238 mg, 1.23 mmol) 및 HOBt(26 mg, 0.19 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, HPLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 회전 증발기로 농축하였다. 잔류물을 Welch Ultimate XB-C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 17(0.56 g, 54%)을 담황색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) C142H216N22O29 [M+H]+에 대한 계산치 2694.6137, 실측치 2694.6146.
화합물 18: 디에틸아민(2.0 ml)을 DMF(5 ml) 중의 화합물 17(0.62 g)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진행시켰다. 반응 혼합물을 회전 증발기로 농축하고, 잔류물을 Welch Ultimate XB-C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 18(0.51 g, 89%)을 담황색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) C127H205N22O27 [M+H]+에 대한 계산치 2471.5378, 실측치 2471.5369; C127H206N22O27 [M+2H]2+에 대한 계산치 1236.2728, 실측치 1236.2744.
실시예 7. 화합물 22(4XMMAE가 있는 분지 링커 B)의 제조(도 8)
화합물 20: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(10 mL) 중의 화합물 19(0.76 g, 2.0 mmol)의 용액에 디-3급-부틸 3,3'-아잔디일디프로파노에이트(9)(0.64 mL, 2.2 mmol), EDCI(0.58 g, 3.0 mmol) 및 HOBt(54 mg, 0.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, TLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 CH2Cl2(2×30 mL)로 추출하고, 합한 유기층을 식염수(20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발기로 농축하였다. 조 반응 혼합물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 화합물 20(1.2 g, 99%)을 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C29H55N4O11 [M+H]+에 대한 계산치 635.3867, 실측치 635.3860.
화합물 21: 화합물 20(0.3 g, 0.47 mmol)을 CH2Cl2(4.0 mL)에 용해한 다음 TFA(2.0 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 35℃ 미만의 온도에서 진공 하에 가능한 한 많은 용매를 제거하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 화합물 21(0.34 g, 85%)을 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C21H39N4O11 [M+H]+에 대한 계산치 523.2615, 실측치 523.2607.
화합물 22: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(2 mL)와 DMF(2 mL)의 혼합물 중의 화합물 21(39 mg, 0.076 mmol)의 교반된 용액에, 화합물 18(0.41 g, 0.17 mmol), EDCI(43 mg, 0.23 mmol) 및 HOBt(4.0 mg, 0.03 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 HPLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 회전 증발기로 농축하였다. 잔류물을 Welch Ultimate XB-C18 컬럼을 사용하는 분취용 HPLC(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)로 정제하여 화합물 22(81 mg, 20%)를 담황색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) C275H445N48O63 [M+3H]3+에 대한 계산치 1810.1053, 실측치 1810.1061; C275H446N48O63 [M+4H]4+에 대한 계산치 1357.8310, 실측치 1357.8346.
실시예 8. 화합물 27(4XMMAE가 있는 분지 링커 B)의 제조(도 9)
화합물 24: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(10 mL) 중의 화합물 21(0.57 g, 1.1 mmol)의 용액에 화합물 23(0.51 g, 2.4 mmol), EDCI(0.67 g, 3.5 mmol), HOBt(74 mg, 0.55 mmol) 및 DIPEA(0.78 mL, 4.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, TLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 상기 혼합물을 CH2Cl2(2x30 mL)로 추출하고, 합한 유기층을 식염수(20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발기로 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 화합물 24(0.7 g, 79%)를 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C39H73N6O13 [M+H]+에 대한 계산치 833.5236, 실측치 833.5231.
화합물 25: 화합물 24(0.52 g, 0.62 mmol)를 CH2Cl2(5.0 mL)에 용해한 다음 TFA(2.0 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 35℃ 미만의 온도에서 진공 하에 가능한 한 많은 용매를 제거하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 화합물 25(0.42 g, 93%)를 무색 오일로 얻었다. HRMS (ESI) C31H57N6O13 [M+H]+에 대한 계산치 721.3984, 실측치 721.3997.
화합물 26: 실온에서 아르곤 하에 DMF(5 mL) 중의 화합물 25(77 mg, 0.11 mmol)의 용액에 화합물 18(0.58 g, 0.24 mmol), EDCI(82 mg, 0.43 mmol) 및 HOBt(14 mg, 0.11 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, HPLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 회전 증발기로 농축하였다. 조 반응 혼합물을 Welch Ultimate XB-C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 26(0.23 g, 38%)을 담황색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) C285H463N50O65 [M+3H]3+에 대한 계산치 1876.4854, 실측치 1876.4851; C285H464N50O65 [M+4H]4+에 대한 계산치 1407.6160, 실측치 1407.6158.
화합물 27: 린들러 촉매(Lindlar catalyst)(130 mg, 5 중량%)를 메탄올(10 mL) 중의 아지드 26(180 mg, 0.03 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 플라스크를 배기하고, 수소 가스로 플러싱하였다. 반응 혼합물을 수소 분위기(풍선) 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 촉매를 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 케이크를 메탄올(10 mL)로 세척하고, 여액을 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 Welch Ultimate XB-C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 27(130 mg, 74%)을 담황색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) C285H465N48O65 [M+3H]3+에 대한 계산치 1867.8219, 실측치 1867.8217; C285H466N48O65 [M+4H]4+에 대한 계산치 1401.1184, 실측치 1401.1181.
실시예 9. 화합물 32(30kmPEG(말레이미드)-2MMAE)의 제조(도 10)
화합물 29: H-Lys(boc)-OH(369 mg, 1.5 mmol)를 무수 DMF(100 mL)에 첨가한 다음 DIPEA(0.83 mL, 5.0 mmol), 화합물 28(15 g, 0.5 mmol) 및 무수 CH2Cl2(150 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 물질을 여과하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 CH2Cl2/메틸　3급-부틸 에테르(45 mL/300 mL)로부터 재결정화하였다. 단리된 고체를 MeCN/2-프로판올(30 mL/450 mL)로부터 재결정화하였다. 생성물을 진공 하에 40℃에서 4시간에 걸쳐 건조시켜 화합물 29(13.6 g, 91%)를 백색 분말로 얻었다. 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 172.74, 155.65, 155.55, 78.41, 70.13 (PEG), 63.66, 58.55, 52.99, 39.90, 31.70, 29.17 , 28.08, 21.97.
화합물 30: TFA(29.5 mL)를 무수 CH2Cl2(57 mL) 57 ml 중의 화합물 29(5.7 g, 0.19 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 35℃ 미만의 온도에서 진공 하에 가능한 한 많은 용매를 제거하였다. 잔류물을 CH2Cl2/메틸　3급-부틸 에테르(14.5 mL/115 mL)로부터 2회 재결정화하였다. 단리된 생성물을 40℃에서 진공 하에 건조시켜 화합물 30(4.7 g, 84%)을 백색 분말로 얻었다.
화합물 31: 0℃에서 DIPEA(473 mg, 3.6 mmol)를 무수 CH2Cl2(55 mL) 중의 화합물 30(5.5 g, 0.18 mmol)의 교반된 용액에 첨가한 다음, NHS-PEG2-Mal(0.2 g, 0.47 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 용액을 0℃에서 실온으로 천천히 가온시킨 다음 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2/메틸　3급-부틸 에테르(13.8 mL/110 mL)로부터 재결정화하였다. 단리된 고체를 MeCN/2-프로판올(11 mL/165 mL)로부터 다시 재결정화하였다. 고형물을 진공 하에 건조시켜 화합물 31(5.0 g, 90%)을 백색 분말로 얻었다. 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ 172.76, 171.46, 170.01, 169.94, 155.55, 133.82, 71.37, 70.01 (PEG), 69.05, 68.92, 66.49, 63.53, 58.44, 52.92, 38.65, 36.01, 33.84, 33.71, 31.36, 28.21, 21.85.
화합물 32: 실온에서 아르곤 하에 DMF/CH2Cl2(5 mL/5 mL)의 용매 혼합물 중의 화합물 31(0.76 g, 0.025 mmol)의 교반된 용액에 화합물 13(0.12 g, 0.05 mmol), DCC(31 mg, 0.15 mmol) 및 DMAP(28 mg, 0.23 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고, HPLC로 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 회전 증발기로 농축하였다. 잔류물을 Phenomenex Jupiter® C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 32(0.36 g, 47%)를 백색 고체로 얻었다. MS (MALDI-TOF) m/z 33863.
실시예 10. 화합물 35(20kmPEG(말레이미드)-4MMAE)의 제조(도 11)
화합물 33: 화합물 33을 합성하기 위해 화합물 31의 제조법을 참고한다.
화합물 34: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(20 mL) 중의 화합물 33(2.0 g, 0.1 mmol)의 교반된 용액에 DBCO-NH2(83 mg, 0.3 mmol), EDCI(115 mg, 0.6 mmol) 및 HOBt(122 mg, 0.9 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, HPLC로 모니터링하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2/ 메틸　3급-부틸 에테르(5 mL/40 mL)로부터 재결정화하였다. 단리된 고체를 MeCN/2-프로판올(4 mL/60 mL)로부터 다시 재결정화하였다. 고형물을 진공 하에 40℃에서 4시간에 걸쳐 건조시켜 화합물 34(1.9 g, 89%)를 백색 분말로 얻었다. 13C-NMR (214 MHz, CDCl3) δ 171.12, 171.08, 170.05, 169.75, 155.64, 150.59 (d, J = 21.4 Hz), 147.54 (d, J = 6.6 Hz), 133.82, 131.69 (d, J = 13.8 Hz), 128.70, 128.27 (d, J = 11.3 Hz), 127.93 (d, J = 5.4 Hz), 127.79, 127.39 (d, J = 8.3 Hz), 126.66, 125.04 (d, J = 6.0 Hz), 122.46 (d, J = 4.9 Hz), 121.85 (d, J = 11.3 Hz), 114.21 (d, J = 9.8 Hz), 107.38 (d, J = 33.6 Hz), 70.06 (PEG), 66.59, 63.64 (d, J = 7.3 Hz), 58.50, 54.97 (d, J = 13.3 Hz), 54.23 (d, J = 59.1 Hz), 38.61, 38.40, 36.31, 34.86 (d, J = 18.0 Hz), 34.05 (d, J = 20.8 Hz), 33.89, 33.78, 31.76 (d, J = 40.2 Hz), 28.31 (d, J = 9.8 Hz), 21.99 (d, J = 17.1 Hz).
화합물 35: 화합물 34(147 mg, 0.007 mmol)를 무수 MeOH(3 mL)에 용해한 다음, 화합물 22(40 mg, 0.007 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 회전 증발기로 농축하고, 잔류물을 Phenomenex Jupiter® C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 35(41 mg, 22%)를 백색 고체로 얻었다. MS (MALDI-TOF) m/z 25963.
실시예 11. Preparation of 화합물 39 (말레이미드-20mPEG-4MMAE) (Figure 12)
화합물 37: 0℃에서 무수 CH2Cl2(10 mL) 중의 아민-PEG20k-CO2H(36)(1.0 g, 0.05 mmol)의 교반된 용액에 DIPEA(83 μL, 0.5 mmol)를 첨가한 다음 6-말레이미도헥산산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(46 mg, 0.15 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 0℃에서 실온으로 천천히 가온시키고, 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2/메틸　3급-부틸 에테르(2.5 mL/20 mL)로부터 재결정화하였다. 단리된 고형물을 MeCN/2-프로판올(2 mL/30 mL)로부터 다시 재결정화하였다. 잔류물을 진공 하에 건조시켜 화합물 37(0.95 g, 95%)을 백색 분말로 얻었다.
화합물 38: 실온에서 아르곤 하에 무수 CH2Cl2(9 mL) 중의 화합물 37(0.9 g, 0.045 mmol)의 교반된 용액에 DBCO-NH2(37 mg, 0.14 mmol), EDCI(52 mg, 0.27 mmol) 및 HOBt(55 mg, 0.41 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, HPLC로 모니터링하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2/ 메틸　3급-부틸 에테르(2.5 mL/20 mL)로부터 재결정화하였다. 단리된 고형물을 MeCN/2-프로판올(2 mL/30 mL)로부터 다시 재결정화하였다. 생성물을 진공 하에 40℃에서 4시간에 걸쳐 건조시켜 화합물 38(0.86 g, 89%)을 백색 분말로 얻었다.
화합물 39: 화합물 38(166 mg, 0.008 mmol)을 무수 MeOH(3 mL)에 용해한 다음, 화합물 22(30 mg, 0.006 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발기로 제거하고, 잔류물을 Phenomenex Jupiter® C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 39(37 mg, 27%)를 백색 고체로 얻었다. HRMS (ESI) 또는 NMR
실시예 12. 화합물 41(DBCO-20kPEG-4MMAE)의 제조(도 13)
화합물 40: 0℃에서 무수 CH2Cl2(10 mL) 중의 아민-PEG20k-CO2H(36)(1.0 g, 0.05 mmol)의 교반된 용액에 DIPEA(83 μL, 0.5 mmol)를 첨가한 다음 DBCO-NHS(60 mg, 0.15 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 0℃에서 실온으로 천천히 가온시키고, 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2/ 메틸　3급-부틸 에테르(2.5 mL/20 mL)로부터 재결정화하였다. 단리된 고형물을 MeCN/2-프로판올(2 mL/30 mL)로부터 다시 재결정화하였다. 잔류물을 진공 하에 건조시켜 화합물 40(0.91 g, 91%)을 백색 분말로 얻었다.
화합물 41: 아르곤 분위기 하에, 화합물 40(120 mg, 0.006 mmol)을 CH2Cl2/DMF (2 mL/2 mL)의 용매 혼합물에 용해한 다음 화합물 27(50 mg, 0.009 mmol), EDCI(6.9 mg, 0.036 mmol) 및 HOBt(7.3 mg, 0.054 mmol)를 연속적으로 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 회전 증발기로 농축하고, 잔류물을 Phenomenex Jupiter® C18 컬럼(용리액: A= 물 중 0.1% TFA, B= MeCN)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하여 화합물 41(53 mg, 36%)을 백색 고체로 얻었다. MS (MALDI-TOF) m/z 25450 Da.
실시예 13. SCAHer2IIxSCAHer2IV(화합물 42)의 제조(도 14)
서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 SCAHer2II×SCAHer2IV를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하고 정제하였다. 특히, SCAHer2II×SCAHer2IV를 발현시키는 숙주 세포의 배양 배지의 상청액 약 1.6 L를 원심분리 후에 수집하고, 50 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl, pH 7.0로 미리 평형화된 Ni 충전 컬럼(2.6 cm×13 cm)(Cat# AA207311, BestChrome, Shanghai, China)에 로딩하였다. 단백질을 50 mM 인산나트륨, 250 mM 이미다졸, 100 mM NaCl, pH 7.0의 버퍼로 용리하고, 15 mL 튜브에 분획화하였다. 얻어진 82 mg의 포획된 단백질을 CaptoL 컬럼(Cat#17-5478-02, GE Healthcare, NJ)으로 추가로 정제하였다. CaptoL 컬럼(1.6 cm x 8 cm)을 50 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl, pH 7.0으로 미리 평형화하고, 단백질을 75 mM 아세트산, pH 3.0으로 용리하여 58.3 mg의 단백질을 얻었다. 도 14는 정제된 화합물 42(SCAHer2II × SCAHer2IV)의 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 보여주었다.
실시예 14. 30kmPEG-(SCAHer2IIxSCAHer2IV)-2MMAE(화합물 43, JY201)의 제조(도 15)
단백질 SCAHer2II×SCAHer2IV 42를 PBS 버퍼(pH = 7.4) 중의 환원제 TCEP-HCl로 실온에서 30분 동안 처리한 다음, 500 mM 인산나트륨의 pH = 4.12 스톡 용액을 사용하여 pH를 6.8로 조정하였다. 처리된 단백질을 접합 전에 5 mg/mL로 농축시켰다. SCAHer2II×SCAHer2IV의 접합은 5 내지 10몰 당량의 화합물 32(30kmPEG(말레이미드)-2MMAE)를 사용하여 실온에서 3시간 동안 수행되었다. 상기 반응을 실온에서 10분 동안 10 mM의 L-시스틴으로 켄칭하였다. 최종 생성물 30kmPEG-(SCAHer2IIxSCAHer2IV)-2MMAE, JY201을 20 mM 포스페이트 버퍼에서 pH 6.5의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(CM Fast Flow, Cat#17-0719-01, GE Healthcare, NJ)으로 정제하였다. 도 15a는 화합물 43을 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것으로, 생성된 화합물 43은 SDS-PAGE로 확인되었다(도 15b).
실시예 15. SCAHer2IIxSCAHer2IV-20kPEG-4MMAE(화합물 44, JY201b)의 제조(도 16)
단백질 SCAHer2II×SCAHer2IV 42를 PBS 버퍼(pH = 7.4) 중의 환원제 TCEP-HCl로 실온에서 30분 동안 처리한 다음, 500 mM 인산나트륨의 pH = 4.12 스톡 용액을 사용하여 pH를 6.8로 조정하였다. 처리된 단백질을 접합 전에 5 mg/mL로 농축시켰다. SCAHer2II×SCAHer2IV의 접합은 5 내지 10몰 당량의 화합물 41(DBCO-20kPEG-4MMAE)과 함께 실온에서 3시간 동안 수행되었다. 상기 반응물을 실온에서 10분 동안 10 mM의 L-시스틴으로 켄칭하였다. 최종 생성물을 20 mM 포스페이트 버퍼 중에서 pH 6.5에서 크기 배제 크로마토그래피 컬럼, HiPrep™ 16/60, Sephacryl™ S-300HR(Cat#17-1167-01, GE Healthcare, NJ)로 정제하였다. 도 16a는 화합물 44(SCAHer2II×SCAHer2IV-20kPEG-4MMAE, JY201b)를 제조하는 반응식을 개략적으로 도시한 것으로, 최종 화합물 44는 SDS-PAGE에 의해 확인되었다(도 16b).
실시예 16. 화합물 43(JY201) 및 화합물 44(JY201b)의 시험관내 세포독성(도 17, 18)
페길화된 BsADC JY201 및 JY201b의 시험관내 세포독성에 대한 페길화의 효과를 평가하기 위해, 세포를 화합물 43(JY201) 또는 화합물 44(JY201b), 또는 대조군과 인큐베이션한 후 세포 생존력 검정을 수행하였다. 특히, 4×104개 세포/웰을 평평한 바닥 96웰 플레이트에 시딩하여 세포가 부착되도록 하였다. 6시간 후, 세포를 37℃에서 72시간 동안 표시된 용량의 JY201로 처리한 다음, 제조업체의 프로토콜에 따라 각 웰에 MTS 20 μl를 첨가하였다. 이어서, OD490 nm에서의 흡광도를 검출하고, 세포독성 백분율을 계산하였다.
도 17은 SKBR-3 및 HCC-827 세포에 대한 JY201의 EC50이 각각 2.23 nM 및 75.55 nM임을 보여주었다. HCC827 세포가 SKBR-3보다 훨씬 낮은 수준의 Her2를 발현시켰기 때문에(Kayatani, H. et al. 2020, Biochem Biophys Res Commun 532, 341-346), 이러한 결과는 JY201이 매우 낮은 Her2 발현으로 종양 세포에 강력한 세포독성을 유도할 수 있음을 입증하였다. 더욱이, 도 17의 좌측 패널의 결과는, 단일 사슬 항체 Her2II×Her2IV가 SKBR-3에 대해 검출가능한 독성을 유도하지 않았으며, 따라서 JY201의 세포독성이 페이로드 MMAE에 의해 야기되었음을 나타내었다.
상기 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여, JIMT-1 세포에 대한 JY201의 시험관내 세포독성을 테스트하고, 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine)(T-DM1)과 비교하였다. 놀랍게도, 도 18a의 결과는 JY201에 대한 EC50이 T-DM1에 대한 EC50과 매우 유사한 것(각각 3.29 μg/ml 및 3.74 μg/ml)으로 나타났지만, DAR(약물 대 항체 비율(Drug to Antibody Ratio))은 JY201의 경우 2에 불과했지만 T-DM1의 경우 DAR은 4이다. 이러한 결과는 종양 세포에 대한 시험관내 세포독성을 유도하는데 있어서 단 2개의 페이로드를 갖는 페길화된 BsADC JY201의 효능이 4개의 페이로드를 갖는 T-DM1과 유사했음을 입증하였다.
JY201b(DAR이 4임)의 시험관내 세포독성을 테스트하고, JY201 및 T-DM1(도 18b, 18c, 18d 및 18e)과 비교하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 결과는 4개의 페이로드를 갖는 페길화된 BsADC JY201b가 2개의 페이로드를 갖는 JY201보다 더 강력했으며(도 18a 및 18d), 지시된 테스트 농도에서 종양 세포주의 패널에 대해 T-DM1보다 유사하거나 더 강력하다는 것을 보여주었다. 테스트된 샘플의 농도가 낮은 하위 집합에서, JY201b가 표적 항원 발현이 낮은 종양 세포에 강력한 세포독성을 유도하는 데 있어서 T-DM1보다 훨씬 우수한 성능을 보였다는 점은 주목할 가치가 있다(Her2 발현 수준: SKBR-3 > JIMT-1 > ZR75-1, 하기 표 참조). 이 장점은 더 나은 독성 프로파일과 함께, JY201b가 현재 치료법을 사용할 수 없는 Her2 발현이 낮은 암 환자를 치료할 수 있는 큰 희망을 제공한다.
Figure pct00035
실시예 17. 표적 세포에 의한 JY201의 내재화(도 19)
실시예 16에서 입증된 세포독성 효과의 메커니즘을 조사하기 위해, SKBR-3 세포에 의한 페길화된 BsADC JY201의 내재화를 Matsuzaki(Matsuzaki, S. et al. 2018, International Journal of Cancer 142, 1056-1066)에 기재된 유세포 분석법을 사용하여 조사하였다. 트립신 처리 후, SKBR-3 세포를 세척하고, 2% FBS를 함유하는 PBS를 사용하여 1×107/mL의 농도로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 100 μl/튜브로 분취하였다. SKBR-3 세포를 Flour647 표지된 T-DM1 또는 JY201 10 μg/ml로 4℃에서 밤새 처리하였다. 미리 냉각된 PBS로 2회 세척한 후, T-DM1 및 JY201이 내재화되도록 세포를 지시된 기간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 세포를 3 × 200μl FACS 버퍼로 세척하였다. 최종 세척 후, FACS 버퍼 100 ul를 첨가하여 세포를 재현탁시킨 후 유세포 분석을 수행하였다. 내재화율(internalization rate)은 하기 공식을 사용하여 계산되었다:
(4℃에서 총 MFI - 37℃에서 총 MFI) / 4℃에서 총 MFI × 100%.
도 19의 결과는, SKBR-3 세포에 의한 JY201의 내재화율이 테스트된 모든 시점에서 T-DM1보다 약 2배 더 높았지만, 표적에 대한 JY201의 친화도는 T-DM1보다 훨씬 약했음(데이터는 표시되지 않음)을 보여주었다. 이러한 결과는 기존의 Fc 보유 ADC에 의해 채택된 동적 내재화(dynamic internalization) 및 유출 메커니즘이 본 명세서에 개시된 페길화된 ADC에 적용되지 않을 수 있음을 암시한다. 주목할 만한 것은, 예를 들어, 정상 조직 또는 세포 상의 FcγR 또는 만노스 수용체에 대한 기존 ADC의 Fc 성분의 결합과 관련된 내재화 메커니즘이 종종 ADC 약물의 표적외 독성 또는 심지어 용량 제한 독성에 기여한다는 점이다(Krop IE, et. al. J Clin Oncol, 30, 3234-41, 2012; Uppal, H. et al. 2015, Clin Cancer Res 21, 123-133; Gorovits, B. e. al. 2013, Cancer Immunol Immunother 62, 217-223).
실시예 18. JY201의 내재화 후 표적 세포 밖으로의 유출이 없음(도 20)
내재화 후 표적 세포 밖으로의 유출은 Fc-보유 Adc에 대해 일반적으로 관찰되었다. 이는 표적외 독성, 감소된 효능, 및 약물 내성을 초래할 수 있다. 이 현상은 FcRn 매개된 재순환에 기인하였다(Junghans, R. P. et. al. 1996, Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512-5516; Ryman, J. T. et. al. 2017, CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol 6, 576-588). 50% 내재화된 트라스투주맙이 내재화 후 5분 이내에 표적 세포 밖으로 유출되는 것으로 보고되었으며, 이 수치는 내재화 후 30분 이내에 85%로 증가하였다(Barok, M., Joensuu, et. al. 2014, Breast Cancer Res 16, 209-209).
JY201이 내재화 후 표적 세포 밖으로 유출되는지 여부를 조사하기 위해, HRP(호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase))를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 JY201에 접합시켰다. 3×104개의 SK-BR3 세포를 평평한 바닥 96웰 플레이트에 밤새 시딩하여 세포가 부착되도록 하였다. 둘째 날, 세포를 세척하고, JY201 0.25 ug/mL와 함께 실온에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 완전 배지로 3회 세척한 후, 세포를 37℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 세포 용해물과 상청액을 다른 시점에서 수집하였다. TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액 50 μl/웰을 첨가하여 세포 용해물 및 세포 상청액에서 JY201-HRP의 함량을 테스트하였다. 0.2 M 황산 50 μl/웰로 반응을 종료시킨 후 마이크로플레이트 분석기에서 OD450을 얻었다. T-DM1-HRP 0.25 μg/ml를 상기 세포와 함께 4시간 동안 인큐베이션한 후 세척하고, 배지를 교체하고, 2시간 및 24시간 동안 추가로 인큐베이션한다는 점에서 동일한 실험이 T-DM1에 대해 수행되었다.
도 20a는, 0시간과 비교하여, 상청액 중의 JY201이 3시간 및 6시간 동안의 추가 인큐베이션에 의해 유의하게 증가하지 않았음을 보여주었다. 한편, 세포 용해물 내의 JY201은 3시간 및 6시간에서 감소하지 않았다(도 20b). 또한, 0시간에서의 세포 용해물의 OD450은 상청액의 OD450보다 적어도 2배 더 높았다. 이로부터 JY201이 내재화되어 있고, 내재화된 JY201이 상청액으로 유출되지 않았음을 알 수 있다.
비교를 위해 상청액 중의 T-DM1의 수준도 측정했는데, 이는 2시간 인큐베이션 후 유의하게 증가하였다(p<0.001)(도 20c). 또한, 24시간 인큐베이션 후 T-DM1의 수준은 2시간 인큐베이션보다 유의하게 높아졌으며, 이는 T-DM1의 지속적인 유출을 나타낸다. 일관되게, 세포 용해물 중의 T-DM1은 24시간에 유의하게 감소하였다(p<0.001)(도 20d). T-DM1의 유출 메커니즘은 약물의 임상 효능을 감소시키고 독성을 증가시킬 수 있다.
전반적으로, 도 20의 데이터는 JY201에 대한 재순환 또는 유출 메커니즘이 없다는 놀라운 결과를 보여주며, 이는 아마도 JY201의 Fc 성분이 없기 때문일 것이다.
실시예 19. 거핵구에 대해 세포독성을 나타내지 않는 JY201(도 21)
낮은 혈소판 수를 특징으로 하는 혈소판 감소증은 ADC로 치료받은 암 환자의 주요 부작용으로(Uppal, H. et al. 2015, Clin Cancer Res 21, 123-133; Donaghy, H. 2016, MAbs 8, 659-671; de Goeij, B. E. et. al. 2016, Curr Opin Immunol 40, 14-23), 이는 T-DM1의 용량 제한 독성을 유발한다((Krop IE, et. al. J Clin Oncol, 30, 3234-41, 2012)). 혈소판 감소증과 관련된 JY201의 세포독성을 조사하기 위해, JY102의 DAMI(말단 분화된 혈소판의 모세포(parental cell)인 거핵구의 세포주(Lev, P. R. et al. 2011，Platelets 22, 28-38))에 대한 결합 및 세포독성을 테스트했다.
결합 실험을 위해, DAMI 세포를 수집하고, 2% FBS를 함유하는 빙냉 PBS에서 대략 5 × 106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 JY201 또는 대조군과 함께 인큐베이션하고, 실시예 17에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 유세포 분석을 실시하였다. 실시예 16에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 DAMI 세포에 대한 시험관내 세포독성을 평가하였다.
도 21c에 나타낸 결과는, 페길화된 BsADC JY201이 놀랍게도 50 μg/ml의 고농도에서도 DAMI 세포에 대한 세포독성을 유발하지 않은 반면, T-DM1은 테스트된 농도에서 유의한 약물 특이적 세포독성을 유발하였음을 입증하였다. 예상치 못한 결과는 도 21a 및 21b의 결과와 일치하며, 여기서 FITC 표지된 T-DM1은 DAMI 세포에 결합하는 반면, JY201은 결합하지 않았는데, 아마도 Fc 영역이 없기 때문일 것이다.
요약하면, 현재 데이터는 JY201의 세포독성이 조직 특이적이어서, 종양 세포에만 세포독성을 발휘하고 거핵구에는 영향을 미치지 않는다는 것을 암시한다. JY201의 예상치 못한 우수한 특성은 ADC로 인한 혈소판 감소증 및 기타 임상에서 발생하는 몇몇 주요 부작용을 해결할 수 있는 큰 기회를 제공한다.
바람직한 구현예에 대한 전술한 실시예 및 설명은 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 기재된 특징들의 수많은 변형 및 조합이 청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명을 벗어나지 않고 이용될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 범위를 벗어나는 것으로 간주되지 않으며, 이러한 모든 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
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Claims (52)

  1. 하기 화학식 Ib의 화합물:
    [화학식 Ib]
    Figure pct00036

    상기 화학식 Ib에서,
    P는 비면역원성 폴리머이고;
    M은 H 또는 C1-50 알킬 및 아릴로부터 선택된 말단 캡핑기(capping group)이며, 이때 상기 알킬의 하나 이상의 탄소는 헤테로원자로 대체되거나 대체되지 않고;
    y는 1 내지 10으로부터 선택된 정수이며;
    A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
    T는 다작용성 소분자 링커 모이어티이며;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 헤테로 또는 호모이작용성 링커이고;
    a 및 b는 각각 0 내지 10으로부터 선택되는 정수이며;
    B는 분지형 링커(branched linker)이고, 이때 각각의 분지에는 자기 희생 스페이서(self-immolating spacer)에 연결된 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 있어, 효소에 의해 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 절단되면 D를 방출하는 자기 희생 메커니즘이 촉발되거나, 각각의 분지에는 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 있어, 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 절단되면 D 또는 이의 유도체가 방출되며;
    D는 각각 독립적으로 세포독성 소분자 또는 펩티드이고;
    n은 1 내지 25로부터 선택된 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, T는 하이드록실, 아미노, 하이드라지닐, 아지드, 알켄, 알킨, 카복실(알데히드, 케톤, 에스테르, 카복실산, 무수물, 아실 할라이드), 티올, 디설파이드, 니트릴, 에폭사이드, 이민, 니트로 및 할라이드로부터 독립적으로 선택된 3개의 작용기를 갖는 분자로부터 유래된 삼작용성 링커이고, T와 (L1)a 간의 연결부와 T와 (L2)b 간의 연결부는 동일하거나 상이한 것인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서, T는 라이신이거나 라이신으로부터 유래되는 것인, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L1의 링커 말단에 있는 작용기는 A와 부위 특이적 접합이 가능하고, 티올, 말레이미드, 2-피리딜디티오 변이체, 방향족 설폰 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 요오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 카보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 하이드라지드, 옥심, 칼륨 아실트리플루오로보레이트, O-카바모일하이드록실아민, 트랜스-사이클로옥텐, 테트라진, 트리아릴포스핀, 보론산, 및 요오드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 전장 항체, 단일 사슬 항체, 나노바디, 또는 이의 항원 결합 도메인인 것인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 단일 사슬 항체인 것인, 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 Her2와 같은 종양 관련 항원(tumor associated antigen: TAA)에 결합하는 것인, 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 Her2에 결합하는 2개의 결합 도메인들을 갖는 것인, 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 서열 번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 단일 사슬 항체인 것인, 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이중특이적 항체의 2개의 결합 도메인들은 동일한 종양 관련 항원(TAA)에 결합하거나, 서로 다른 2개의 TAA들에 결합하거나, T 세포(예를 들어, T 세포 수용체의 구성요소) 또는 NK 세포 상에서 발현되는 항원 및 TAA에 결합하는 것인, 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체는 항-Her2×항-Her2 단일 사슬 이중특이적 항체인 것인, 화합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
  14. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
  15. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 유전적으로 인코딩된 알켄 라이신(예를 들어, N6-(헥스-5-에노일)-L-라이신), 2-아미노-8-옥소노난산, m 또는 p-아세틸-페닐알라닌, β-디케톤 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 2-아미노-3-(4-(3-옥소부타노일)페닐)프로판산), (S)-2-아미노-6-(((1R,2R)-2-아지도사이클로펜틸옥시)카보닐아미노)헥산산, 아지도호모알라닌, 피롤리신 유사체 N6-((프로프-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, (S)-2-아미노-6-펜트-4-인아미도헥산산, (S)-2-아미노-6-((프로프-2-이닐옥시)카보닐아미노)헥산산, (S)-2-아미노-6-((2-아지도에톡시)카보닐아미노)헥산산, p-아지도페닐알라닌, 파라-아지도페닐알라닌, Nε-아크릴로일-l-라이신, Nε-5-노르보르넨-2-일옥시카보닐-l-라이신, Nε-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, N-ε-(2-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)에틸)카보닐-L-라이신, 유전적으로 인코딩된 테트라진 아미노산(예를 들어, 4-(6-메틸-s-테트라진-3-일)아미노페닐알라닌)으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, D는 DNA 가교제, 미세소관 억제제(microtubule inhibitor), DNA 알킬화제(DNA alkylator), 토포이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  18. 제17항에 있어서, D는 MMAE, MMAF, SN38, DM1, DM4, 칼리케아미신(calicheamycin), 피롤로벤조디아제핀, 두오카르마이신(duocarmycin) 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  19. 제17항에 있어서, D는 빈카 알칼로이드(Vinca alkaloid), 라우리말리드(laulimalide), 탁산, 콜키신(colchicine), 튜불리신(tubulysin), 크립토피신(Cryptophycin), 헤미아스텔린(Hemiasterlin), 세마도틴(Cemadotin), 리족신(Rhizoxin), 디스코더몰리드(Discodermolide), 타칼로놀리드(taccalonolide) A 또는 B 또는 AF 또는 AJ, 타칼로놀리드 AI-에폭사이드, CA-4, 에포틸론(epothilone) A 및 B, 라우리말리드, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 캄프토테신(Camptothecin), iSGD-1882, 센타나마이신(centanamycin), PNU-159682, 운시알라마이신(uncialamycin), 인돌리노벤조디아제핀 이량체, β-아마니틴(amanitin), 아마톡신(Amatoxin), 타이란스타틴(thailanstatin) 또는 이의 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비면역원성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 것인, 화합물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 PEG는 선형 PEG 또는 분지형 PEG인 것인, 화합물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 적어도 하나의 말단은 메틸 또는 저분자량 알킬로 캡핑되는 것인, 화합물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG의 총 분자량은 100 내지 80000인 것인, 화합물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 영구 결합 또는 절단 가능한 결합을 통해 삼작용성 또는 사작용성 또는 임의의 다른 사이클릭 또는 비사이클릭(noncyclic) 다작용성 모이어티 T(예를 들어, 라이신)에 연결되는 것인, 화합물.
  25. 하기 화학식 Ic의 화합물:
    [화학식 Ic]
    Figure pct00037

    상기 화학식 Ic에서,
    P는 선형 PEG이고;
    A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 이작용성 링커이며;
    a 및 b는 각각 0 내지 10으로부터 선택되는 정수이며;
    B는 분지형 링커이고, 이때 각각의 분지에는 자기 희생 스페이서에 연결된 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 있어, 효소에 의해 아미노산 서열 또는 탄수화물 모이어티가 절단되면 D를 방출하는 자기 희생 메커니즘이 촉발되거나, 각각의 분지에는 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 있어, 디설파이드 결합 또는 절단 가능한 결합이 절단되면 D 또는 이의 유도체가 방출되며;
    D는 각각 독립적으로 세포독성 소분자 또는 펩티드이고;
    n은 1 내지 25로부터 선택된 정수이다.
  26. 제25항에 있어서, L1의 링커 말단에 있는 작용기는 A와 부위 특이적 접합이 가능하고, 티올, 말레이미드, 2-피리딜디티오 변이체, 방향족 설폰 또는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 브로모 또는 요오도 아세트아미드, 아지드, 알킨, 디벤조사이클로옥틸(DBCO), 카보닐, 2-아미노-벤즈알데히드 또는 2-아미노-아세토페논 기, 하이드라지드, 옥심, 칼륨 아실트리플루오로보레이트, O-카바모일하이드록실아민, 트랜스-사이클로옥텐, 테트라진, 트리아릴포스핀, 보론산, 및 요오드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 전장 항체, 단일 사슬 항체, 나노바디, 또는 이의 항원 결합 도메인인 것인, 화합물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체는 단일특이적 단일 사슬 항체이고, 선택적으로 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 종양 관련 항원(TAA), 예를 들어, Her2에 결합하는 것인, 화합물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 Her2에 결합하는 2개의 결합 도메인들을 갖는 것인, 화합물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체는 서열 번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 단일 사슬 항체인 것인, 화합물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 이중특이적 항체의 2개의 결합 도메인들은 동일한 종양 관련 항원(TAA)에 결합하거나, 서로 다른 2개의 TAA들에 결합하거나, T 세포(예를 들어, T 세포 수용체의 구성요소) 또는 NK 세포 상에서 발현되는 항원 및 TAA에 결합하는 것인, 화합물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 항체는 항-Her2×항-Her2 단일 사슬 이중특이적 항체인 것인, 화합물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 화합물.
  35. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
  36. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 2개의 결합 도메인들은 링커를 통해 연결되고, 상기 링커는 L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 화합물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, L1에 대한 상기 항체의 부위 특이적 접합을 위한 비천연 아미노산 잔기는 유전적으로 인코딩된 알켄 라이신(예를 들어, N6-(헥스-5-에노일)-L-라이신), 2-아미노-8-옥소노난산, m 또는 p-아세틸-페닐알라닌, β-디케톤 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 2-아미노-3-(4-(3-옥소부타노일)페닐)프로판산), (S)-2-아미노-6-(((1R,2R)-2-아지도사이클로펜틸옥시)카보닐아미노)헥산산, 아지도호모알라닌, 피롤리신 유사체 N6-((프로프-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, (S)-2-아미노-6-펜트-4-인아미도헥산산, (S)-2-아미노-6-((프로프-2-이닐옥시)카보닐아미노)헥산산, (S)-2-아미노-6-((2-아지도에톡시)카보닐아미노)헥산산, p-아지도페닐알라닌, 파라-아지도페닐알라닌, Nε-아크릴로일-l-라이신, Nε-5-노르보르넨-2-일옥시카보닐-l-라이신, N-ε-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)카보닐)-L-라이신, N-ε-(2-(사이클로옥트-2-인-1-일옥시)에틸)카보닐-L-라이신, 유전적으로 인코딩된 테트라진 아미노산(예를 들어, 4-(6-메틸-s-테트라진-3-일)아미노페닐알라닌)으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  38. 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, D는 DNA 가교제, 미세소관 억제제, DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  39. 제38항에 있어서, D는 MMAE, MMAF, SN38, DM1, DM4, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀, 두오카르마이신 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  40. 제38항에 있어서, D는 빈카 알칼로이드, 라우리말리드, 탁산, 콜키신, 튜불리신, 크립토피신, 헤미아스텔린, 세마도틴, 리족신, 디스코더몰리드, 타칼로놀리드 A 또는 B 또는 AF 또는 AJ, 타칼로놀리드 AI-에폭사이드, CA-4, 에포틸론 A 및 B, 라우리말리드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 캄프토테신, iSGD-1882, 센타나마이신, PNU-159682, 운시알라마이신, 인돌리노벤조디아제핀 이량체 β-아마니틴, 아마톡신, 타이란스타틴 또는 이의 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG의 총 분자량은 100 내지 80000인 것인, 화합물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 하기로부터 선택되고:
    -(CH2)aXY(CH2)b-,
    -X(CH2)aO(CH2CH2O)c(CH2)bY-,
    -(CH2)a헤테로사이클릴-,
    -(CH2)aX-,
    -X(CH2)aY-,
    -W1-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dC(O)-,
    -C(O)(CH2)aO(CH2CH2O)b(CH2)cW2C(O)(CH2)dNR1-,
    -W3-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dW2C(O)(CH2)eC(O)-,
    이때 a, b, c, d 및 e는 각각 0 내지 25로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; X 및 Y는 각각 C(=O), NR1, S, O, CR2R3 또는 부재로부터 독립적으로 선택되며; R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-10 알킬 또는 (CH2)1-10C(=O)를 나타내고; W1 및/또는 W3은 말레이미도-기반 모이어티로부터 유도되며, W2는 트리아졸릴 또는 테트라졸릴 함유 기를 나타내고; 헤테로사이클릴 기는 말레이미도-유도된 모이어티 또는 테트라졸릴-기반 또는 트리아졸릴-기반 모이어티로부터 선택되는 것인, 화합물.
  43. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, (L1)a 및 (L2)b는 각각 독립적으로 하기로부터 선택되고:
    Figure pct00038

    이때 n 및 m은 정수이고, 0 내지 20으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 화합물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지 링커 B는 연장 스페이서(extension spacer), 트리거 유닛(trigger unit), 자기 희생 스페이서, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 선택적으로 상기 트리거 유닛은 카텝신 B, 플라스민, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), β-글루쿠로니다제, β-갈락토시다제와 같은 효소에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열 또는 β-글루쿠로나이드(β-glucoronide) 또는 β-갈락토사이드 트리거 모이어티; 산성 pH 조건에서 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 pH 불안정 링커(pH liable linker), 또는 글루타티온, 티오레독신 계열 구성원(WCGH/PCK) 또는 티오 환원효소에 의해 약물 D 또는 이의 유도체를 방출할 수 있는 디설파이드 결합 링커인 것인, 화합물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 분지 링커 B는 하기로부터 선택되고:
    Figure pct00039

    이때,
    a, b, c, d, e 및 f는 각각 정수이며, 1 내지 25로부터 독립적으로 선택되고;
    (A)n은 Val-Cit, al-Ala, Val-Lys, Phe-Lys, Phe-Cit, Phe-Arg, Phe-Ala, Ala-Lys, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, D-Phe-LPhe-Lys, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly, 또는 Ala-Leu-Ala-Leu와 같은 아미노산 서열의 트리거 유닛이며;
    PAB는 파라-아미노벤질 알코올이고;
    각각의 Ex는 하기로부터 독립적으로 선택되는 링커 사슬을 포함하는 연장 스페이서이고:
    -NR1(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zC(O)-,
    -C(O)(CH2)xNR1-,
    -NR1(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zNR2-,
    -NR1(CH2)xNR2-,
    -NR1(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zO-,
    -O(CH2)xNR1-,
    -C(O)(CH2)xO-,
    -O(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zC(O)-,
    -C(O)(CH2)xO(CH2CH2O)y(CH2)zC(O)-,
    -C(O)(CH2)xC(O)-,
    또는 부재,
    이때 x, y, 및 z는 각각 정수이고, 0 내지 25로부터 독립적으로 선택되며; R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬 기를 나타내는 것인, 화합물.
  46. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지 링커 B는 하기로부터 선택되는 것인, 화합물:
    Figure pct00040
    ;
    Figure pct00041
    .
  47. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식의 화합물들, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염들로부터 선택되는, 화합물:
    Figure pct00042

    Figure pct00043
    .
  48. 제25항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식의 화합물들로부터 선택되는, 화합물:
    Figure pct00044

    Figure pct00045
    .
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    a) 부위 특이적 접합을 위한 유리 작용기를 갖는 비-면역원성 변형된(예를 들어, 페길화된) 약물 접합체를 제조하는 단계; 및
    b) 비-면역원성 변형된(예를 들어, 페길화된) 약물 접합체를 항체에 부위 특이적으로 접합시켜 화학식 Ib 또는 Ic의 화합물을 제공하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  50. 유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 기재된 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 염, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 제형.
  51. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 신장암, 방광암, 위암, 결장암, 결장직장암, 침샘암, 갑상선암, 및 자궁내막암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암의 치료에 사용하기 위한 것인, 화합물.
  52. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 신장암, 방광암, 위암, 결장암, 결장직장암, 침샘암, 갑상선암, 및 자궁내막암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암의 치료에서 유효량의 또 다른 항암제, 면역억제제와 병용하여 사용하기 위한 것인, 화합물.
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