CN104870021B - 药物‑蛋白质缀合物 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了包含澳瑞他汀和结合蛋白或肽的特异性缀合物以及制备其的方法。所述缀合物使用特异性接头技术，其给出了优于已知抗体‑药物缀合物的优势。本申请还描述了其中存在多于一个拷贝的药物的药物与结合蛋白或肽的特异性缀合物。

Description

药物-蛋白质缀合物
本发明涉及新的药物-蛋白质缀合物。
结合蛋白对靶细胞和分子的表面上的特定标志物的特异性已经导致了它们作为多种诊断和治疗试剂的载体的广泛用途。例如，发现这类缀合至标记物和报告基团(例如荧光基团、放射性同位素和酶)的蛋白质可用于在标记和成像应用中，而与细胞毒性试剂和化疗药物的缀合使得能够将这类试剂靶向递送至特定的组织或结构(例如特定的细胞类型或生长因子)，从而将对正常健康组织的影响降到最低并显著降低与化疗治疗相关的副作用。这类缀合物在一些疾病领域尤其在癌症领域中具有广泛的潜在的治疗性应用。
水溶性的合成的聚合物，尤其是聚烷二醇(polyalkarlene glycol)，被广泛用于缀合治疗活性分子，例如肽或蛋白配体，包括抗体。这些治疗性缀合物已被证明可通过延长循环时间和降低清除率而有利地改变药物代谢动力学，从而降低全身毒性并且在一些情况下展示出增加的临床效力。将聚乙二醇(PEG)共价缀合至蛋白质的过程通常被称为“PEG化”。
对于最佳效力和保证剂量间的一致性来说重要的是：每个结合蛋白的缀合部分的数目是相同的，并且每个部分被特异性地缀合至每个结合蛋白中相同的氨基酸残基。因此，已经开发了很多方法来提高这类缀合物的均一性。Liberatore et al,Bioconj.Chem1990,1,36-50,和del Rosario et al,Bioconj.Chem.1990,1,51-59描述了可用于交联蛋白质(包括抗体)中的二硫键的试剂的用途。WO 2005/007197描述了将聚合物缀合至蛋白质的方法，其使用能够与源自蛋白质中二硫键的两个硫原子缀合以产生新硫醚缀合物的新缀合试剂。
澳瑞他汀(auristatins)是抗肿瘤剂，是一种高效的细胞杀伤类药物。这类的多个成员，包括天然产品多拉司他汀10(dolastatin 10)(分离自截尾海兔(Dolabellaauricularia))、一甲基澳瑞他汀E、一甲基澳瑞他汀F、一甲基澳瑞他汀D、澳瑞他汀PYE和澳瑞他汀PHE，正在被开发以用于多种疾病(包括癌症)的治疗。它们是高毒性的，因而许多研究目前正致力于开发包含澳瑞他汀的缀合物。WO 2009/117531涉及具有包括通过C-末端与接头连接从而与抗体连接的澳瑞他汀的药物缀合物。据称这些缀合物不需要自消基团(self-immolative group)来释放药物就可显示出效力。WO 2009/052431涉及CD19结合试剂，并公开了澳瑞他汀缀合物。
两种抗体药物缀合物已经得到监管机构批准：一种是贝伦妥单抗-维多汀(brentuximab vedotin)，其中的药物为澳瑞他汀；一种是曲妥珠单抗-美坦辛(trastuzumab emtansine)，其中的药物为美登素(maytansine)。在这两种市售缀合物中，药物与抗体的连接都使用了基于马来酰亚胺的接头。马来酰亚胺在缀合试剂中被广泛使用。然而，与许多其他缀合试剂相同的是，马来酰亚胺的使用存在许多困难：缀合反应的控制是困难的，导致具有低均一性的产物，并且所得到的缀合物的稳定性可能是一个问题。
因此，仍然需要可被有效制备并证明具有所需效力的，具有改善的稳定性和均一性的改良澳瑞他汀-抗体缀合物。
因此，本发明提供了一种含有澳瑞他汀的缀合物，其具有以下通式：
(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab (I)
其中D代表澳瑞他汀部分；
q代表从1至10的整数；
Lk1代表接头；
m代表从1至10的整数；
P代表键或z价基团-P1-NH-，其中z为2-11，并且P1为含有至少一个亚乙基单元–CH2-CH2-或乙二醇(ethylene glycol)单元-O-CH2-CH2-的基团；
p代表从1至10的整数；
Lk2代表键或y价接头，其中y为2-11，并且其由1-9个天冬氨酸和/或谷氨酸残基组成；
Lk3代表具有以下通式的接头：
-CO-Ph-X-Y- (II)
其中Ph为任选地取代的苯基；X代表CO基团或CH.OH基团；并且Y代表具有下式的基团：
其中A和B各自代表C1-4亚烷基或亚烯基基团；
Ab代表能够结合靶标上的结合伴侣(binding partner)的结合蛋白或肽，所述结合蛋白经由源自所述结合蛋白或肽中的二硫键的两个硫原子被键合至Lk3上；并且
n代表一个从1至s的整数，其中s是缀合至Lk3之前存在于所述结合蛋白或肽中的二硫键的数目；
选择m、n、p、q、y和z的含义使得缀合物含有1至10个D基团。
D代表一个澳瑞他汀部分(即，Lk1基团键合至澳瑞他汀的残基上)。术语澳瑞他汀包括化合物，例如澳瑞他汀D、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、一甲基澳瑞他汀D、一甲基澳瑞他汀E、一甲基澳瑞他汀F、澳瑞他汀PYE、澳瑞他汀PHE、相关的天然产品多拉司他汀10及它们的衍生物。
优选地，所述澳瑞他汀为含有亚结构(A)的化合物
其中Ra代表C1-8烷基；Rb代表H、C1-8烷基、C3-8环烷基或环烯基、芳基、-X-芳基、-X-C3-8环烷基或环烯基、C3-8杂环基或–X-C3-8杂环基；Rc代表H或甲基；Rd代表H、C1-8烷基、C3-8环烷基或环烯基、芳基、-X-芳基、-X-C3-8杂环基、-C3-8杂环基、–X-C3-8杂环基、-X-S-C1-8烷基；或Rc和Rd一起形成具有式(CRaRb)r-的碳环，其中Ra和Rb独立地代表H或C1-8烷基并且r为从2至6的整数；Re代表H或C1-8烷基；Rf代表H、C1-8烷基、C3-8环烷基或环烯基、芳基、-X-芳基、-X-C3-8环烷基或环烯基、C3-8杂环基或–X-C3-8杂环基；Rg代表H、-OH、-C1-8烷基、C3-8环烷基或环烯基、或-O-(C1-8烷基)；Rh代表H、-OH、-C1-8烷基、C3-8环烷基或环烯基、或-O-(C1-8烷基)；以及每个X独立地为C1-10亚烷基。
优选地，Ra代表C1-4烷基，尤其是甲基。优选地，Rb代表C1-4烷基，尤其是异丙基。优选地，Rc代表H。优选地，Rd代表C1-4烷基或-CH2CH2SCH3，更优选-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)2或–CH2CH2SCH3，最优选-CH(CH3)2。优选地，Re代表H或C1-4烷基；最优选地，Re代表甲基。优选地，Rf代表C1-4烷基，尤其是1-甲基丙基。优选地，Rg代表–OH或-O-(C1-4烷基)；最优选地，Rg代表甲氧基。优选地，Rh代表–OH或-O-(C1-4烷基)；最优选地，Rh代表甲氧基。
更优选地，所述澳瑞他汀包含亚结构(B)
其中Ra-Rh具有上文所述的含义。
仍更优选地，所述澳瑞他汀包含亚结构(C)
其中Rd代表–CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2或–CH2CH2SCH3。
在一些优选的实施方案中，所述澳瑞他汀的N-末端基团为氢或C1-8烷基，更优选氢或甲基。例如，澳瑞他汀可为含有亚结构(D)或(E)的化合物：
在一些优选的实施方案中，所述澳瑞他汀的C-末端基团为：
其中Ri代表氢或C1-8烷基；Rj代表C6-10芳基或C5-10杂芳基，所述芳基或杂芳基任选地被最高达3个取代基取代，每一个所述取代基均独立地选自：卤素、任选地被最高达3个卤原子取代的C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基和氰基；Rk代表氢或C1-8烷基；Rl代表氢或羟基；并且Rm代表-CO2H、-CO2C1-8烷基、-CONH-C6-10芳基、-CONH-C5-10杂芳基和C5-10杂芳基，所述芳基或杂芳基基团任选地被最高达3个取代基取代，每一个所述取代基均独立地选自：卤素、任选地被最高达3个卤原子取代的C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基和氰基。
在一些优选的实施方案中，澳瑞他汀C-末端基团为
更优选
其中Ri代表氢；Rj代表苯基或C5-10杂芳基，所述苯基或杂芳基任选地被最高达3个取代基取代，每一个所述取代基均独立地选自：卤素、任选地被最高达3个卤原子取代的C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基和氰基；并且Rk和Rl二者都为氢，或者Rk为甲基而Rj为羟基。
在一些优选的实施方案中，澳瑞他汀的C-末端基团为
更优选
其中Ri代表氢；Rj代表苯基或C5-10杂芳基，所述苯基或杂芳基任选地被最高达3个取代基取代，每一个所述取代基均独立地选自：卤素、任选地被最高达3个卤原子取代的C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基和氰基；并且Rm代表-CO2H、-CO2C1-8烷基或C5-10杂芳基，所述杂芳基任选地被最高达3个取代基取代，每一个所述取代基均独立地选自：卤素、任选地被最高达3个卤原子取代的C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基和氰基。
例如，澳瑞他汀可包含亚结构(F)或(G)：
优选的具体的澳瑞他汀的实例包括：
(多拉司他汀10)，
(一甲基多拉司他汀10)，
(澳瑞他汀E)，
(一甲基澳瑞他汀E)，
(澳瑞他汀F)，
(一甲基澳瑞他汀F)，
(澳瑞他汀PYE)，
(澳瑞他汀PE)，
(澳瑞他汀PHE)，
根据澳瑞他汀的结构，其可以游离碱或游离酸的形式或以药学上可接受的盐的形式和/或作为溶剂化物存在。式I的缀合物也可以这些形式存在。
Lk1可在任意合适的位点被键合至澳瑞他汀部分。当澳瑞他汀部分对应于具有N-末端氢的澳瑞他汀时，Lk1优选地被键合至N-末端的氮，例如
当澳瑞他汀部分对应于其中Rm代表-CO2H的澳瑞他汀时，Lk1可例如被键合至其C-末端的碳上，例如
Lk1为连接澳瑞他汀部分D与P基团的接头、键或基团。其可带有1至10个D基团。Lk1优选地包含可降解基团(degradable group)，即Lk1优选地为在生理条件下断裂从而将D从Ab上分离的接头。或者，Lk1可为在生理条件下不可切割(cleavable)的接头。当Lk1为在生理条件下断裂的接头时，其优选地可在细胞内的条件下切割。当靶标在细胞内时，优选地Lk1基本上对细胞外条件不敏感(即，使得能够允许向细胞内靶标递送充足剂量的治疗试剂)。
其中Lk1为可降解的接头，其可包含对水解条件敏感的基团。Lk1可包含在特定pH值(例如酸性条件)下降解的基团。例如水解/酸性条件可存在于内体或溶酶体中。在酸性条件下易水解的基团的实例包括腙、缩氨基脲、硫代缩氨基脲、顺式-乌头酰胺(cis-acotinicamide)、原酸酯和缩醛/缩酮。易受水解条件影响的基团的实例包括：
Lk1也可在还原条件下易降解。例如，Lk1可包含二硫化物基团(disulfide group)，所述二硫化物基团在暴露于生物还原剂如硫醇时是可切割的。二硫化物基团的实例包括：
其中R、R′、R″和R″′均独立地为氢或C1-4烷基，和
Lk1也可包含易被酶降解的基团，例如它可易被蛋白酶(例如溶酶体的或内体的蛋白酶)或肽酶切割。例如，Lk1可包含肽基，所述肽基包含至少一个、例如至少两个或至少三个氨基酸残基(例如Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Cit、Phe-Lys)。例如，Lk1可为含有1至5个(例如2至4个)氨基酸的氨基酸链。另一个易被酶降解的基团的实例为：
其中AA代表蛋白酶特异性的氨基酸序列，例如Val-Cit。
在一个优选的实施方案中，Lk1是或包含：
例如，Lk1可为
在这种情况下，其优选地按照下面所示方式被键合至D和P基团：
在该实施方案中，澳瑞他汀部分D优选地是通过N-末端的氮键合。
在一个实施方案中，Lk1带有单独一个澳瑞他汀部分D(即q＝1)。上面所示的特异性接头V是属于此类型。在另一个实施方案中，q大于1，例如为2、3或4，并且Lk1被用作将多于一个澳瑞他汀部分整合到本发明的缀合物中的一种方法。在一个实施方案中，这可通过使用分支接头Lk1来实现，所述分支接头Lk1例如可纳入天冬氨酸或谷氨酸或类似的残基。这引进了具有下式的分支成分(element)：
其中b为1、2或3，b＝1时为天冬氨酸，b＝2时为谷氨酸，b＝3时代表一个优选的实施方案。式VI中每个酰基部分均可经由合适的接头Lk1a被偶联至基团D上，其中Lk1a为任何合适的接头，例如纳入上文中针对Lk1提到的连接之一的可降解的接头。在一个具体的实施方案中，Lk1a代表上面所示的基团V。天冬氨酸或谷氨酸或类似残基的氨基基团可通过任何合适的方法键合至P上，例如该连接可以是经由酰胺键，举例来说上述分支基团可经由-CO.CH2-基团被连接至P，因此：
如果需要的话，天冬氨酸或谷氨酸或类似残基可被偶联至其他天冬氨酸和/或谷氨酸和/或类似残基上，例如：
等，最高达9个此类的残基，给出了整合最高达10个D基团的潜力。如上所述，每个D均可经由任何合适的接头Lk1a被连接至天冬氨酸/谷氨酸或类似残基。
当P代表-P1-NH-基团时，P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元(-CH2-CH2-或-O-CH2-CH2-)。如果存在许多这样的单元，则P1代表聚乙烯(PE)或聚乙二醇(PEG)。这些聚合物可包含单独一个直链，或可具有包含许多小的或大的链的分支形态，在这种情况下它们将包含分支基团，通常包含>CH-，如例如在-(CH2CH2)2-CH-或-(O-CH2-)2CH-中。它们可以任选地以任何需要的方式被衍生化或官能化。例如它们可携带额外的治疗试剂，或标记试剂。包含多于一个的治疗试剂分子的多聚缀合物可产生协同和加成效应，所述多于一个的治疗试剂分子例如为多于一个的澳瑞他汀分子或者除了一个澳瑞他汀分子之外还包含一个治疗试剂分子。
当P1代表PE或PEG时，该聚合物最佳分子量将当然取决于预期的应用。通常，当P1代表PE时，优选地，数均分子量最高达2kDa，优选最高达1kDa。当P1代表PEG时，可使用更高的分子量，例如数均分子量可最高达75kDa，例如最高达60kDa，同时最小数均分子量为例如至少0.5kDa，例如至少1kDa，例如2kDa。在一个优选的实施方案中，可使用数均分子量为0.5至2kDa的PEG。然而，在某些优选的实施方案中，P可为键，或P可代表–P1-NH-，其中P1包含少量单个亚乙基或乙二醇单元，例如，2-10个，例如2个或3个亚乙基或优选的乙二醇单元。
如果希望式I的缀合物包含多于一个-(CH2-CH2)a-或-(O-CH2-CH2)a-链(其中a是在任何直链中亚乙基或乙二醇单元的数目)，例如以使每个这类链可带有Dq-Lk1基团，那么这可通过将多于一个(即2-10个)这类链键合至Lk2来实现，或通过使用分支的PE或PEG来实现(在这种情况下，只有一个基团P将被连接至Lk2，但是这将包含多于一个支链，例如1-9个支链(为D-Lk1基团提供2-10个连接点))。
应理解，当P是-P1-NH-时，该P基团或每个P基团是通过酰胺键被偶联至相邻基团Lk1和/或Lk2上。例如PEG(其通常以–OH基团封端)可被转化为相应的以–NH2基团封端的PEG胺，所述–NH2基团用于与所述Lk2中的-CO2基团形成酰胺键；或OH基团可被反应以与上文所述的Lk1形成连接-NH.CO.CH2.O-。
在本发明的一个优选的实施方案中，P1代表PEG，PEG是一种水溶性的合成的聚合物，并且在本说明书全文中，除非上下文另有要求，任何对P1的一般性提及都应被理解为包括对PEG的具体提及。
Lk2代表一个y-价接头，其中y为2-11。因此其能够键合1-10个基团P或Lk1。在其最简单的形式中，Lk2是一个键，在这种情况下Lk1直接键合至-P1-NH-基团，或者如果P是一个键，Lk2就直接键合至D-Lk1基团。然而，Lk2可被用作将多于一个D基团(澳瑞他汀部分)纳入本发明的缀合物中的手段。这可通过经由酰胺连接将天冬氨酸或谷氨酸残基偶联至Lk3的-CO-基团而实现(例如使天冬氨酸或谷氨酸氨基基团与对应于Lk3的合适的羧酸衍生物反应)。这引入了上文所示的式VI的分支成分。在那种情况下，每个酰基部分可通过酰胺连接被偶联至-P1-NH-基团，或当P是一个键时偶联至D-Lk1基团。或者，如上文所示的式VIIa和VIIb中所示，天冬氨酸或谷氨酸残基可被偶联至其他的天冬氨酸和/或谷氨酸残基上，等等，最高可达9个此类残基，这给出了通过在Lk2中的不同连接点键合多个D-Lk1-P基团而纳入最高达10个D基团的潜力。应理解，Lk2的化合价与存在的D-Lk1-P基团的数目相关。例如，当P为-P1-NH-时，对于每个D-Lk1-P基团，Lk2的化合价与存在的-P1-NH-基团的数目有关，即p等于y-1。当P为一个键时，对于每个D-Lk1-P基团，Lk2的化合价与存在的D-Lk1基团的数目相关，即m等于y-1。
Lk3是一种能够通过源自结合蛋白中二硫键的两个硫基团结合至结合蛋白上的特异性接头。在Lk3中，苯基基团Ph可为未取代的或取代的。可任选存在于苯基基团Ph上的取代基包括例如一个或多个相同或不同的选自下述基团的取代基：烷基(优选C1-4烷基，尤其是甲基，任选地被OH或CO2H取代)、-CN、-NO2、-CO2R4、-COH、-CH2OH、-COR4、-OR4、-OCOR4、-OCO2R4、-SR4、-SOR4、-SO2R4、-NHCOR4、-NR4COR4、NHCO2R4、-NR4.CO2R4、-NO、-NHOH、-NR4.OH、-C＝N-NHCOR4、-C＝N-NR4.COR4、-N+R4 3、-N+H3、-N+HR4 2、-N+H2R4、卤素如氟或氯、-C≡CR4、-C＝CR4 2和-C＝CHR4，其中每个R4独立地代表氢原子或烷基(优选C1-6烷基)、芳基(优选苯基)或烷基-芳基(优选C1-6烷基-苯基)基团。特别优选存在吸电子取代基。优选的取代基包括例如-CN、-NO2、-OR4、-OCOR4、-SR4、-NHCOR4、-NR.COR4、-NHOH和–NR4.COR4。然而，优选地，苯基基团Ph是未取代的。
当Y代表基团III时，在接头Lk3与源自结合蛋白Ab中的二硫键的两个硫原子之间形成单个碳桥，而当Y代表基团IV时，基团A和B的性质决定了在接头Lk3与源自结合蛋白Ab中的二硫键的两个硫原子之间形成的桥的长度。优选形成3-碳桥，即优选Y具有下式：
如上所述，包含多于一个澳瑞他汀部分的缀合物可具有优势。可用许多不同的方法实现存在多于一个澳瑞他汀部分，例如如上文所述通过使用支链PEG、通过使用多价基团Lk2或通过使用多价基团Lk1。然而，其也可通过将多于一个接头Lk3连接至结合蛋白Ab而实现。一般而言，常见的全长抗体具有4个链间二硫键(对于整个IgG1抗体来说，重链-重链或重链-轻链)，并且这些二硫键中的任何或者全部都可根据本发明通过接头Lk3被桥接。也应想到的是，抗体中的一个或多个链内二硫键可通过接头Lk3被桥接。当存在多于一个缀合基团时，n大于1。n可为例如2、3或4。
替代地或额外地，可存在一个或多个其他澳瑞他汀部分，其可经由接头Lk1连接至P，或者当P是一个键时，直接连接至Lk2。在这种情况下，m大于1，例如为2、3或4，最高达最大数10。如果存在多于一个接头Lk1，这些可彼此相同或不同。
替代地或额外地，可存在一个或多个其他澳瑞他汀部分，其可连接至多价接头Lk1上。在这种情况下，q大于1，例如为2、3或4，最高达最大数10。
应想到的是，本发明的缀合物可带有最高达10个D基团(澳瑞他汀部分)。当需要式I的缀合物包含多于一个D基团(即多于一个澳瑞他汀部分)时，这可通过许多方法中的任何一个方法实现。例如，多个(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)-基团可被键合至单个抗体上(即n为2至s)。这个连接模式形成了一个提供包含多于一个基团D的缀合物的优选方法。第二个提供包含多于一个基团D的缀合物的优选方法是通过使用多价接头Lk1，例如包含上文所述的一个或多个天冬氨酸和/或谷氨酸或类似残基(例如式VI、VIIa和VIIb)的接头Lk1，以允许多个D基团存在(即q为2-10。可以相信的是，这样的缀合物是特别有效的：在该缀合物中Lk1是多价接头，尤其一个包括上式VI的接头，p＝1，q＝2，m＝1并且Lk2是一个键，此类缀合物形成了本发明的一个优选的实施方案。
替代地或额外地，当Lk2是由1-9个天冬氨酸和/或谷氨酸残基组成的基团时，多个((Dq-Lk1)m-P)-基团可在Lk2基团上的不同位置被键合(即p为2-10)，通过每个基团的胺部分与Lk2基团中的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基基团之间的酰胺键合。当P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元并且还包含至少一个分支单元时，多个(Dq-Lk1)-基团可额外地或替代地被键合至P1基团上的不同位置(即m为2-10)。
具有上述组合的缀合物也涵盖在本发明中。例如，缀合物可包含与两个((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团键合的一个Ab基团，其中，对于那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的每个来说，Lk2为与两个(D-Lk1)m-P基团键合的一个天冬氨酸或谷氨酸残基，并且其中，对于那些(D-Lk1)m-P基团中的每个来说，P为-P1-NH-，其中P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元并且还包含至少一个分支单元，以使得所述缀合物中存在共计8个D-Lk1基团。又例如，缀合物可包含与两个((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团键合的一个Ab基团，其中对于那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的每个来说，Lk2是一个键，P是-P1-NH-，其中P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元并且还包含至少一个分支单元，并且每个Lk1包含一个与两个D基团键合的天冬氨酸或谷氨酸或类似残基，以使得所述缀合物中存在共计8个D-Lk1基团。
不同的Lk3、Lk2、P、Lk1和D基团也可在相同的缀合物中存在，例如当缀合物包含一个与两个((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3基团键合的Ab基团时，在那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的一个基团中，Lk2可为键，而在那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的另一个基团中，Lk2可为天冬氨酸或谷氨酸残基。类似地，当缀合物包含键合至一个Lk2基团上的多个(D-Lk1)m-P基团时，对于那些基团中的一个基团来说，P可为键，而对于那些基团中的另一个来说，P可为–P1-NH-。
在本发明的最简单的实施方案中，本发明涉及包含单个澳瑞他汀部分(n＝m＝q＝p＝1)的缀合物。所述缀合物可包含最高达10个澳瑞他汀部分，例如最高达8个澳瑞他汀部分。它们可例如包含最高达4个(例如1、2、3或4个)澳瑞他汀部分。当存在两个D基团时，这些可在例如具有下式的缀合物中：
其中Lk1优选地包含一个上述式(Va)的基团。
或者，当存在两个D基团时，这些可以在例如具有下式的缀合物中：
其中Lk1a优选地包含一个上述式(V)的基团。
上述式显示了X通过存在于Ab中的一个二硫键的键合。抗体可包含最高达4个链间二硫键，而如果这些键中的每个都被带有单个澳瑞他汀分子的试剂桥接，那么得到的缀合物的药物:抗体比例(DAR)将为4。如果一个带有两个澳瑞他汀部分的试剂被用于桥接所有的4个二硫键，例如一个带有两个PE或PEG链或具有一个分支的PE或PEG链或具有一个分支的接头Lk1的试剂，那么DAR将会是8。具有如此高DAR的缀合物可具有明显的临床优势。其中Ab带有2、3或尤其4个拷贝的～X-基团的上述式Ia-Ie的缀合物形成本发明的一个优选的实施方案。
为方便起见，在本说明书的全文中使用的术语“结合蛋白”同时包括结合蛋白和肽，并且除了上下文另有明确要求之外，所述结合蛋白应该理解为包括肽以及蛋白质。可用于本发明的缀合物中的结合蛋白包括可用作针对靶标上的结合伴侣的结合试剂的任何蛋白质、多肽或肽。该靶标可为例如微生物、病毒或细胞(如癌细胞或免疫细胞)。因此结合蛋白的作用是将澳瑞他汀靶向特定的靶标。这类结合蛋白的实例包括全长抗体、抗体片段、免疫球蛋白(Ig)和通过合理的或组合的蛋白质工程技术得到的非-Ig蛋白支架以及凝集素。在蛋白质-药物缀合物中使用的最常用的结合蛋白为抗体，并且除了当本文另有明确要求以外，任何对结合蛋白或基团Ab的提及，应该被理解为包括对抗体的具体提及。
在本说明书的全文中，术语“抗体”应该理解为意指通过在免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标抗原的免疫球蛋白分子，所述靶标抗原例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或它们的结合。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体例如二特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白、以及任何其他经修饰的包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展示所需的生物活性。抗体可为五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的任一种或其亚类(同种型)(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)，基于它们的分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的种类。不同类的免疫球蛋白具有不同的且众所周知的亚单位结构和三维构型。特别优选使用IgG1或IgG4。
此外，除了上下文另有要求，术语“抗体”应理解为涵盖全长抗体和包含全长抗体的抗原结合区域的抗体片段。抗体片段可为例如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、双抗体、微抗体(minibody)或由抗体片段形成的多特异性抗体，例如包含scFv片段或双抗体以及任选的Fc片段或CH结构域的不同排列的微抗体，例如scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、Fab-scFv、(Fab’ScFv)2、单链双抗体(scDiabody)、scDiabody-Fc、scDiabody-CH3、scFv-CH3、scFv-CH2-CH3融合蛋白等等。抗体片段可通过酶切割、合成或重组技术制备。
结合蛋白可用作针对靶标表面上的受体、抗原或其他部分的结合试剂，所述靶标为例如与增殖性、自身免疫性或感染性疾病相关的细胞或病毒。例如，结合蛋白可为特异性结合癌细胞的细胞表面抗原的抗体。用于癌细胞的抗体靶向的细胞表面抗原的鉴定和验证方法是已知的，例如Carter P,et al.,Endocr.Relat.Cancer.2004Dec；11(4)：659-87，并且许多用于治疗癌症的抗体-药物缀合物目前正处于临床开发中。可用于治疗癌症的抗体以及特定癌症的肿瘤标志物的实例也是本技术领域中众所周知的并且可被使用。或者，靶标可为免疫细胞，例如负责生成自身免疫性抗体的细胞或与自身免疫性疾病相关的活化的淋巴细胞。在其他实施方案中，靶标可为与微生物或病毒感染或疾病相关的微生物或病毒。
本发明的缀合物可通过还原结合蛋白质中的一个或多个二硫键并随后与以下通式的缀合试剂反应而制备：
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII)
其中D、Lk1、P、Lk2和m、p和q具有针对通式I给出的含义，并且Lk3a代表具有下式的基团：
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
其中Ph具有上文给出的含义，Xa代表一个CO基团，以及Ya代表以下基团：
其中A和B具有上文给出的含义，每个L独立地代表一个离去基团，并且x代表1-4的整数。
上式X、XI、XII和XIII的基团是彼此的化学等价物，并且式X和XI的基团与抗体的二硫键生成单个碳桥，以及式XII和XIII的基团生成更长的碳桥，下面示出了当n＝1时的情况：
当包含基团X或XII的缀合试剂与抗体反应时，在反应途径中的紧邻步骤是失去一个离去基团L而分别产生包含基团XI或XIII的缀合试剂。因此，式XI或XIII的缀合试剂为原位制备或者从头开始使用。使用包含X、XI、XII或XIII基团中的任一个的缀合试剂的一个关键特点是：α-亚甲基离去基团和双键与用作迈克尔活化(Michael activating)部分的吸电子官能团交叉缀合。如果离去基团倾向于在交叉功能(cross-functional)试剂中消除而不是直接置换并且吸电子基团是合适的用于迈克尔反应的活化部分，那么可通过连续的迈克尔和逆迈克尔反应发生相继的分子内的双-烷基化作用。离去部分的作用是掩蔽潜在的缀合双键，所述缀合双键直至第一次烷基化发生之后才暴露，双烷基化是相继的交互式迈克尔和逆迈克尔反应导致的。最佳地选择吸电子基团和离去基团，以使得可通过相继的迈克尔和逆迈克尔反应而发生双烷基化。也可以用缀合至双键上的或在离去基团和吸电子基团之间的额外多重键来制备交叉官能烷基化试剂。
离去基团L可代表例如–SR4、-SO2R4、-OSO2R4、-N+R4 3、-N+HR4 2、-N+H2R4、卤素或其中R4具有上文给出的含义，并且代表包含至少一个吸电子取代基的取代的芳基、尤其是苯基基团，所述吸电子取代基例如-CN、-NO2、-CO2R4、-COH、-CH2OH、-COR4、-OR4、-OCOR4、-OCO2R4、-SR4、-SOR4、-SO2R4、-NHCOR4、-NR4COR4、-NHCO2R4、-NR4CO2R4、-NO、-NHOH、-NR4OH、-C＝N-NHCOR4、-C＝N-NR4COR4、-N+R4 3、-N+HR4 2、-N+H2R4、卤素(尤其是氯或尤其是氟)、-C≡CR4、-C＝CR4 2和–C＝CHR4，其中每个R4独立地具有上文给出的含义之一。尤其优选的离去基团L为–SR4或-SO2R4，尤其是-SO2R4，其中R4代表苯基或者，尤其是甲苯磺酰基基团。因此，特别优选的基团Ya为：
优选的缀合试剂的实例包括：
其中Lk1优选地包含如上所述的式(Va)的基团，并且其中Ya优选地为式(XII)的基团，尤其是其中A和B中均为–CH2-。
其他优选的缀合试剂的实例包括：
其中Lk1优选地包含如上所述的式(V)的基团，并且其中Ya优选地为式(XII)的基团，尤其是其中A和B均为–CH2-。
其他优选的缀合试剂的实例包括：
其中b为1、2或3。Ya优选地为式(XII)的基团，尤其是其中A和B均为-CH2-。P1优选地为PEG，尤其是上文所述的那些中的一个，并且优选具有15-35个重复–O-CH2-CH2-单元的PEG。
使用上述试剂之一的缀合方法的直接产物为澳瑞他汀-抗体缀合物，其中X代表一个酮基基团CO。然而，本发明的方法在合适的条件下是可逆的。这对于某些应用是有利的，例如当需要将澳瑞他汀从抗体中快速分离时，但是对于其他应用，可能不需要快速分离。因此，令人满意的是通过还原CO基团X生成CH.OH基团X来稳定该缀合物。因此，上述方法可包括一个额外的任选步骤：还原Lk3中的最初形成的CO基团X以生成Lk3中具有CH.OH基团X的缀合物。特别优选使用硼氢化物作为还原剂，所述硼氢化物例如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾或三乙酰氧基硼氢化钠。其他可使用的还原剂包括例如氯化锡(II)、醇盐例如醇铝、和氢化铝锂。
适用于上述方法的反应条件在WO 2005/007197和WO 2010/100430中给出，其内容以引用的方式纳入本文。例如该方法可在所有的试剂都可溶于其中的溶剂中或溶剂混合物中进行。使得抗体可以在水性反应介质中与缀合试剂直接反应。该反应介质也可以是被缓冲的，这取决于亲核反应的pH需求。所述反应的最适pH一般为至少4.5，通常在约5.0与约8.5之间，优选约6.0至8.2。当然，最佳反应条件将取决于使用的具体反应剂。
在3-37℃之间的反应温度通常是合适的。在有机介质(例如THF、乙酸乙酯、丙酮)中进行的反应通常是在最高达室温的温度下进行。
结合蛋白可使用化学计算当量的或过量的试剂与所需试剂有效缀合。过量的试剂和产物可在常规纯化过程中容易地分离，例如通过标准色谱方法，如离子交换色谱法或尺寸排阻色谱法；渗滤；或者，当存在多组氨酸标签时，通过使用金属亲和色谱法进行分离，例如基于镍或锌的金属亲和色谱法。对结合蛋白中的特定二硫键的靶向可通过已知方法进行；例如通过蛋白质的部分还原，参见例如Liu et al，Anal.Chem.2010,82,5219-5226。
上述通式VIII的缀合试剂可通过使澳瑞他汀与具有以下通式的化合物反应来制备：
((Lk1b)m-P)p-Lk2-Lk3a
其中m、P、L、p、Lk2和Lk3a具有针对通式VIII给出的含义并且Lk1b是被修饰以包括可与存在于澳瑞他汀中的基团反应的基团的式Lk1的基团。通常，Lk1b可与一甲基澳瑞他汀的末端氮原子反应。典型的基团和合适的反应是技术人员熟知的。
通式VIII的缀合试剂是新的，因此本发明提供这些试剂本身。在这些新的试剂中，Lk1、P、Lk2、m、p和q的优选的含义与针对上述通式中给出的含义相同。本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的澳瑞他汀-蛋白质缀合物，以及可药用载体，以及任选的额外的治疗试剂；这类缀合物用于治疗，具体而言，用作治疗增生性、自身免疫性或感染性疾病(例如癌症)的药物；以及治疗患者的方法，其包括给予患者药学有效量的这类缀合物或药物组合物。本发明可用于的具体病症包括例如白血病(包括非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病以及慢性骨髓性白血病)；胃癌；乳腺癌；卵巢癌；肝癌；肠癌；结肠癌；肾癌(例如肾细胞癌)；肺癌(例如小细胞肺癌)；黑素瘤；膀胱癌；以及肉瘤。
如上文所述，本发明的一个优选实施方案涉及包含多于一个的澳瑞他汀分子的特异性缀合物。具有特定的分支结构并包含大范围的药物的某些药物缀合物是新的，并且在一个独立的实施方案中，本发明还提供了这些缀合物本身。因此，本发明还提供了具有以下通式的缀合物：
(((D′q′-Lk1′)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab (I′)
其中D'代表药物部分；
q'代表2至10的整数；
Lk1'代表接头；
m代表1至10的整数；
P代表键或z-价基团-P1-NH-，其中z为2-11并且P1为包含至少一个亚乙基单元–CH2-CH2-或乙二醇单元-O-CH2-CH2-的基团；
p代表1至10的整数；
Lk2代表键或y-价接头，其中y为2-11并且其由1至9个天冬胺酸和/或谷氨酸残基组成；
Lk3代表具有以下通式的接头：
-CO-Ph-X-Y- (II)
其中Ph为任选地取代的苯基基团；X代表CO基团或CH.OH基团；并且Y代表具有下式的基团：
其中A和B均代表C1-4亚烷基或亚烯基基团；
Ab代表能够结合靶标上的结合伴侣的结合蛋白或肽，所述结合蛋白经由源自结合蛋白或肽中的二硫键的两个硫原子被键合至Lk3；并且
n代表1至s的整数，其中s是缀合至Lk3之前存在于所述结合蛋白或肽中的二硫键的数目；
选择m、n、p、q'、y和z的含义以使缀合物包含1至10个D'基团。
在本发明的这个方面中，m、P、p、Lk2、Lk3、n和Ab具有上面给出的针对其中D代表澳瑞他汀部分的本发明方面的含义和优选的含义。
D'可代表任何需要缀合至结合蛋白或肽上的药物。其可为例如细胞毒性药物。其可为例如如上所述的澳瑞他汀，或其可为美登素。术语美登素包括化合物，例如美登素本身、类美登素例如15-甲氧基安丝菌素(15-methoxyansamitocin)P-3，及它们的衍生物。
优选地，美登素为一个包含亚结构(A)的化合物
其中X代表O或S；Ra代表氢或C1-4烷基；Rb代表氢、羟基、C1-4烷氧基或C1-4烷基C(O)O-；Rc代表氢、羟基、C1-4烷氧基或C1-4烷基C(O)O-；Rd代表氢或C1-4烷基；Re代表卤素或氢，并且Rf代表氢或C1-4烷基。
X优选地代表O。Ra优选地代表C1-4烷基，尤其是甲基。Rb优选地代表氢。Rc优选地代表氢或甲氧基，更优选地为氢。Rd优选地代表C1-4烷基，尤其是甲基。Re优选地代表氯或氢，尤其是氯。Rf优选地代表C1-4烷基，尤其是甲基。
更优选地，美登素包含亚结构(B)
其中X和Ra-Rf具有上文所示的含义。
仍更优选地，美登素包含亚结构(C)或(D)
最优选(C)。
美登素可包括键合至亚结构(A)、(B)、(C)或(D)的酯羰基碳原子上的下述基团(E)：
例如美登素可包含亚结构(F)：
在一些优选的实施方案中，美登素包括键合至亚结构(A)、(B)、(C)或(D)的酯羰基碳原子上的以下基团之一：
在一些实施方案中，美登素包含键合至亚结构(A)、(B)、(C)或(D)的酯羰基碳原子上的基团(L)：
具体的美登素的实例包括：
Lk1'可在任何合适的位点被键合至所述药物部分。例如其可如上文针对接头Lk1所示的那样被键合至澳瑞他汀上。当D'是一个对应于包含基团(E)的美登素的美登素部分时，Lk1'例如可被键合至基团(E)的氮原子上，例如：
Lk1'是将两个或更多个药物部分D'连接至P基团的接头。它可带有2至10个D'基团。Lk1'优选地包含可降解的基团，即Lk1'优选地为在生理条件下断裂从而将D'从Ab上分离的接头。或者，Lk1'可为在生理条件下不可切割的接头。当Lk1'为在生理条件下断裂的接头时，其优选地可在细胞内的条件下切割。当靶标在细胞内时，Lk1'优选地基本上对细胞外条件不敏感(即，使得能够允许向细胞内靶标递送充足剂量的治疗试剂)。
当Lk1'是可降解的接头时，其可包含对水解条件敏感的基团。Lk1'可包含在特定pH值(例如酸性条件)下降解的基团。水解条件/酸性条件可存在于例如内体或溶酶体中。在酸性条件下易水解的基团的实例包括腙、缩氨基脲、硫代缩氨基脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯和缩醛/缩酮。易受水解条件影响的基团的实例包括：
Lk1'也可在还原条件下易降解。例如，Lk1'可包含二硫化物基团，所述二硫化物基团在暴露于生物还原剂如硫醇时是可切割的。二硫化物基团的实例包括：
其中R、R′、R″和R″′均独立地为氢或C1-4烷基，以及
Lk1'也可包含易被酶降解的基团，例如它可易被蛋白酶(例如溶酶体的或内体的蛋白酶)或肽酶切割。例如，Lk1'可包含肽基基团，所述肽基包含至少一个、例如至少两个或至少三个氨基酸残基(例如Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Cit、Phe-Lys)。例如，Lk1'可为含有1至5个(例如2至4个)氨基酸的氨基酸链。另一个易被酶降解的基团的实例为：
其中AA代表蛋白酶-特异性的氨基酸序列，例如Val-Cit。
Lk1'可包括：
例如，Lk1'可包括
在式I'代表的本发明的实施方案中，q'大于1，例如为2、3或4，并且Lk1'被用作将多于一个药物部分纳入本发明的缀合物中的方法。Lk1'为分支的接头，其可例如纳入天冬氨酸或谷氨酸或类似残基。这引入了具有下式的分支成分：
其中b为1、2或3，b＝1时为天冬氨酸，b＝2时为谷氨酸，b＝3时形成本发明的一个优选的实施方案。式VI中每个酰基部分均可经由合适的接头Lk1a被偶联至基团D上，其中Lk1a为任何合适的接头，例如纳入上文针对Lk1'提到的连接之一的可降解的接头。在一个具体的实施方案中，Lk1a代表上面所示的基团V。天冬氨酸或谷氨酸或类似残基的氨基基团可通过任何合适的方法键合至P上，例如该连接可以是经由酰胺键，例如上述分支基团可以是经由-CO.CH2-基团被连接至P，因此：
如果需要的话，天冬氨酸或谷氨酸或类似残基可被偶联至其他天冬氨酸和/或谷氨酸和/或类似残基上，例如：
等，最高达9个这类残基，给出了纳入最高达10个D'基团的潜力。如上文所述，每个D'均可经由任何合适的接头Lk1a被连接至天冬氨酸/谷氨酸或类似残基。
一个优选的式I'的缀合物具有下式：
其中a、b和Ab具有上文给出的含义。D'可为例如美登素或，尤其是如上文详述的澳瑞他汀。
式I'的缀合物可按照上面针对式I的缀合物的描述(作适当修改)来制备，只是Lk1'代替LK1，D'代替D，并且q大于1。
具有下式的缀合试剂是新的并形成了本发明的一部分：
((D'q'-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII')
其中D'、q'、Lk1'、m、P、p、Lk2和Lk3具有上文给出的含义和优选含义。它们可通过上文描述的用于制备式VIII试剂的方法(作适当修改)来制备。本发明这个方面的一个特别优选的缀合试剂具有下式：
其中b为1、2或3。Ya优选地为式(XII)的基团，尤其是其中A和B中均为-CH2-的基团。P1优选地为PEG，尤其是上面提及的那些之一，并且优选具有15至35个重复的–O-CH2-CH2-单元的PEG。还优选其中Ab携带2、3或优选4个拷贝的上式中的～X-基团的等效结构。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的式I'的缀合物，以及药学上可接受的载体，以及任选的额外的治疗试剂；这类缀合物用于治疗，具体而言，用作治疗增生性、自身免疫性或感染性疾病例如癌症的药物；以及一种治疗患者的方法，其包括给予患者药学上有效量的这类缀合物或药物组合物。可使用这类缀合物的具体病症包括上文提及的那些。
令人意外的是，现已发现式I'的化合物与包含同样数目的药物分子D'的相应缀合物相比具有改善的活性，其中Lk1'不是分支接头并且q'为1，但是其中通过使用分支接头Lk2而向所述分子中引入分支。
本发明的涉及式I'缀合物的方面的具体特征如下。
1.具有上文限定的式I'的缀合物。
2.条款1中限定的缀合物，其中D'是细胞毒性药物。
3.条款1中限定的缀合物，其中D'是澳瑞他汀或美登素。
4.条款3中限定的缀合物，其中D'是通过其末端氮原子键合的一甲基澳瑞他汀E或一甲基澳瑞他汀F。
5.条款4中限定的缀合物，其中所述澳瑞他汀为通过其末端氮原子键合的一甲基澳瑞他汀E。
6.前述条款中任一项限定的缀合物，其中Lk1'是可降解的接头。
7.条款6中限定的缀合物，其中Lk1'包含下述基团中的一个：
其中R、R′、R″和R″′中的每一个均代表氢原子或烷基基团并且AA代表蛋白酶特异性的氨基酸序列。
8.条款7中限定的缀合物，其中Lk1'包含：
9.条款1至8中任一项限定的缀合物，其中Lk1'包括下式的成分：
其中b为1、2或3。
10.条款1至5中任一项限定的缀合物，其具有下式：
其中b为1、2或3；以及其中Ab携带2、3或4个拷贝～X-基团的等效结构。
11.上述条款中任一项限定的缀合物，其中P代表键；或P代表–P1-NH-，其中P1包含2至10个乙二醇单元。
12.上述条款中任一项限定的缀合物，其中P代表聚乙二醇。
13.上述条款中任一项限定的缀合物，其中Lk3中的苯基基团Ph是未取代的。
14.上述条款中任一项限定的缀合物，其中Y具有下式：
15.上述条款中任一项限定的缀合物，其中Ab代表全长抗体或包含全长抗体的抗原结合区的抗体片段。
16.上述条款中任一项限定的缀合物，其中Ab代表IgG1或IgG4或者IgG1或IgG4的片段。
17.制备上述条款中任一项限定的缀合物的方法，其包括还原结合蛋白中的一个或多个二硫键并随后与下述通式的缀合试剂反应：
((D′q′-Lk1′)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII′)
其中D'、Lk1'、P、Lk2以及m、p和q'具有条款1中给出的含义，并且Lk3a代表下式基团：
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
其中Ph具有条款1中给出的含义，Xa代表CO基团,并且Ya代表以下基团：
其中A和B具有条款1中给出的含义，每个L均独立地代表一个离去基团，并且x代表1至4的整数，从而产生其中X代表CO的式I'的缀合物；以及任选地还原所述最初形成的CO基团X而产生具有CH.OH基团X的缀合物。
18.条款17中限定的方法，其中Ya代表：
19.具有以下通式的化合物：
((D′q′-Lk1′)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII′)
其中D'具有条款1至5中任一项给出的含义；Lk1'具有条款1和6-9中任一项给出的含义；P具有条款1、10和11中任一项给出的含义；Lk2、m、p和q具有条款1中给出的含义，并且Lk3a代表下式基团：
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
其中Ph具有条款1或条款10中给出的含义，Xa代表CO基团，并且Ya代表以下基团：
其中A和B具有条款1中给出的含义，每个L均独立地代表离去基团，并且x代表1-4的整数。
19.条款18中限定的化合物，其中Ya代表：
20.药物组合物，其包含：条款1至15中任一项限定的缀合物，以及药学上可接受的载体，以及任选的额外的治疗试剂。
21.条款1至15中任一项限定的缀合物或条款20中限定的组合物用于治疗。
22.治疗患者的方法，其包括给予患者药学上有效量的条款1至15中任一项限定的缀合物或条款20中限定的药物组合物。
本发明的缀合物显示出许多重要的优点，这些优点的存在是不可预期的。与使用目前市售缀合物中使用的马来酰亚胺试剂制备的等同的药物-抗体缀合物相比较，它们显示出显著提高的稳定性。此外，与使用马来酰亚胺相比，它们的合成方法生产的产品在药物-抗体比例方面具有显著改善的均一性。由于对药品生产的规定，均一性对于药品是有利的。产生更高产率的单个DAR种类的方法凭借更高的效率将更廉价。通过将该DAR种类从异质性混合物中纯化而制备的单一DAR种类的药物产品在大量生产时成本会难以承受的高。
此外，单一DAR种类将表现出更加可预测的药代动力学、安全性、毒性和耐受性，因为所有药品都应该以类似的方式代谢，生成相同的产物，这与混合的DAR物质相反，其可被差异性代谢或以不同速率代谢，生成更加异质性的分解产物。
下述实施例阐明了本发明。
实施例1：具有末端双砜官能度的带有24个重复单元PEG的缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基-一甲基澳瑞他汀E(val-cit-PAB-MMAE)试剂1的合成。
步骤1：4-[2,2-双[(对甲苯基磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(双砜)与H2N-dPEG(24)-CO-OtBu的缀合
将H2N-dPEG(24)-CO-OtBu(1.057g,Iris Biotech)的甲苯(3mL)溶液蒸发至干燥并将所得残余物重溶于二氯甲烷(25mL)中。在搅拌下，加入4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(1.0g；Nature Protocols,2006,1(54),2241-2252)，并将所得溶液在室温下于氩气气氛下再搅拌72小时。在真空中移除挥发物并将固体残余物溶于温热丙酮(30mL)中，并过滤通过非吸收性脱脂棉。将滤液冷却至-80℃以沉淀出固体，其是通过在-9℃下以4000rpm离心30分钟而分离的。移除上清液并将沉淀/分离过程再重复两次。最终移除上清液并且将所得到的固体在真空中干燥以得到双砜保护的酸2P，其为无色非晶形固体(976mg，68％)。1HNMR(400MHz CDCl3)1.45(9H，s，OtBu)，2.40-2.45(8H，m，Ts-Me and CH2 COOtBu)，3.40-3.46(2H，m，CH2-Ts)，3.52-3.66(m，PEG and CH2-Ts)，4.27(1H，q，J 6.3，CH-COAr)，7.30(4H，d，J 8.3，Ts)，7.58(2H，d，J 8.6，Ar)，7.63(4H，d，J 8.3，Ts)，7.75(2H，d，J 8.6，Ar).
步骤2：叔丁基保护基团的移除：
向步骤1产物(976mg)的搅拌的二氯甲烷(4mL)溶液中加入三氟乙酸(4mL)并将所得溶液再搅拌2小时。然后在真空下移除挥发物并将残余物溶于温热的丙酮(30mL)中。如步骤1中所述通过沉淀从丙酮中分离产物以得到白色粉末状的产物2(816mg,85％)。1HNMR(400MHz CDCl3)2.42(6H,s,Ts-Me)，2.52(2H，t，J 6.1，CH2-COOH)，3.42(4H，dd，J 6.3&14.5，CH2-Ts)，3.50-3.64(m，PEG)，3.68-3.73(4H，m，PEG)，4.23-4.31(1H，m，CH-COAr)，7.29(2H，d，J 8.1，Ar)，7.55-7.65(6H，m，Ar and Ts)，7.77(2H，d，J 8.2，Ar)
步骤3：H2N-val-cit-PAB-MMAE与酸封端的PEG化的双砜2的缀合
将N甲基吗啉(7.5mg)加入至双砜-PEG-COOH(45mg)和HATU(13mg)的搅拌的二氯甲烷-二甲基甲酰胺(85：15v/v,6mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟后，加入H2N-val-cit-PAB-MMAE(38mg,Concortis，按照WO 2005/081711制备)并将混合物在室温下再搅拌24小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释并用1M HCl、水性NaHCO310％w/v、盐水洗涤然后用MgSO4干燥。该粗品再通过用二氯甲烷-甲醇(90:10v/v)洗脱的柱色谱法纯化，在真空下移除溶剂而分离出透明的无色固体状的双砜-PEG(24)-MMAE产物1(31mg,41％)m/z M+Na 2758.5；特征信号：1HNMR(400MHz CDCl3)0.60-0.99(m,脂肪族侧链),2.43(s,Me-Ts),3.36-3.66(m,PEG),7.15-7.28(m,Ar),7.31(d,J 8.3,Ar),7.54-7.62(m,Ar),7.79(d,J 8.3,Ar)。
实施例2：拥有末端双砜官能度的5kDa PEG的一甲基澳瑞他汀E(MMAE)试剂3的合成
步骤1：4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(双砜)与5kDa HCl.H2N-PEG-COOH 4的缀合。
将N-甲基吗啉(0.004mL)加入5kDa HCl.H2N-PEG-COOH(100mg,Iris Biotech)和4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(49mg)的搅拌的二氯甲烷(5mL)溶液中并在室温下于氩气气氛下搅拌48小时。在真空中移除挥发物并将固体残余物溶于温热的丙酮(7mL)中并过滤通过非吸收性脱脂棉。将滤液冷却至-80℃以沉淀出固体，其是通过在-9℃下以4000rpm离心30分钟而分离的。移除上清液并将沉淀/分离过程再重复2次。最终移除上清液并将所得固体在真空中干燥以得到白色粉末状5kDa PEG试剂4(90mg,80％)。
1H NMR(400MHz CDCl3)2.36(2H，t，J 7.0，CH2-COOH)，2.42(6H，s，Ts-Me)，3.40-3.75(m，PEG and CH2-Ts)，4.24-4.28(1H，m，CH-COAr)，7.30(4H，d，J 8.2，Ts)，7.57(2H，d，J 8.3，Ar)，7.62(4H，d，J 8.2，Ts)，7.77(2H，d，J 8.3，Ar)
步骤2：H2N-val-cit-PAB-MMAE与来自步骤1的酸封端的5kDa PEG化的双砜的缀合
将HATU(5mg)加入Na2CO3(3mg)、H2N-val-cit-PAB-MMAE(11mg)和来自步骤1的产物(35mg)的在二氯甲烷和DMF无水混合物(1mL)中的搅拌的悬浮液中，并在氩气气氛下搅拌2天。在真空下移除二氯甲烷，并通过与步骤1中所述方法类似的方式通过沉淀从冷的丙酮中纯化出反应混合物。在真空中干燥固体而得到无色非晶形固体状的双砜-PEG(5kDa)-MMAE3(42mg,95％)。特征信号1HNMR(400MHz CDCl3)0.65-0.99(m,脂肪族侧链),3.48-3.71(m,PEG),7.15-7.34(m,Ar),7.62-7.69(m,Ar)7.72(d,J 8.3,Ar),7.81(d,J 8.3,Ar)。
实施例3：直接连接至末端双砜官能度的一甲基澳瑞他汀E(MMAE)试剂5的合成
步骤1：4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(双砜)与NH2-val-cit-PAB-MMAE的缀合
将4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(35mg)加入到碳酸钠(3mg)和NH2-val-cit-PAB-MMAE(35mg)的在DCM-DMF(3:1,1mL)无水混合物中的搅拌的悬浮液中并在氩气气氛下搅拌24小时。所得产物是通过使用二氯甲烷-甲醇(95:5,v/v)洗脱的柱色谱法纯化，得到无色非晶形固体状的双砜-MMAE 5(22mg,33％)m/z M+Na 1629.5；特征信号1HNMR(400MHz CDCl3)0.56-0.97(m,脂肪族侧链)2.36(s,Me-Ts),7.10-7.32(m,Ar),7.48-7.64(m,Ar),7.68(d,J 8.22,Ar),7.74-7.90(m,Ar)。
实施例4：变体抗体-药物缀合物的制备
为了证明能够以高水平的均一性和低平均DAR制备抗体缀合物，通过对亲本抗体序列进行基于PCR的定点诱变而构建了两种工程化抗体变体，其中每个抗体变体都有一个重链间二硫键。将这些抗体变体和亲本抗体与根据实施例1制备的缀合试剂(双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1)反应，这在源自二硫键的两个半胱氨酸残基之间形成桥。
亲本抗体和抗体变体(IgGC226S和IgGC229S)的制备。
此前Carter P.et al.Proc.Natl Acad.Sci.USA,89,4285-4289(1992)中已经记载了亲本抗体DNA序列构建，所述亲本抗体DNA序列编码基于人IgG1(κ)框架产生的人源化抗-Her2受体的单克隆抗体变体(曲妥珠单抗)，在此文献中所述抗体被称为humAb4D5-8。为了本实验的目的，重链氨基酸序列的第359和361位氨基酸分别用Asp和Leu替代(E359D和M361L)。本实验中使用的亲本抗体的轻链和重链氨基酸序列在本文中也分别由SEQ ID NO：1和2示出。亲本抗体铰链区(铰链区序列：PKSCDKTHTCPPCP)的两个半胱氨酸在抗体的两条重链之间形成链间二硫键。这些半胱氨酸残基对应于根据EU-索引编号系统(EU-indexnumbering system)的IgG1的第226和229位，并且为SEQ ID NO：2的第229和232位残基。
通过对亲本抗体重链序列进行基于PCR的定点诱变以用氨基酸Ser置换铰链区中重链间半胱氨酸残基中的一个，以构建两种工程化抗体变体(IgGC226S和IgGC229S)。为了在铰链区序列中产生修饰，使用的PCR方法为Ho et al.Gene,77(1989)51-59记载的引物重叠延伸。设计PCR引物寡核苷酸以将核苷酸改变纳入所述抗体的编码序列中。在Cys226Ser变体中，密码子从TGC(Cys)变为AGC(Ser)。在Cys229Ser变体中，密码子从TGC(Cys)变为AGT(Ser)。将新序列克隆回包含重链其他部分的重链表达载体中。通过对插入片段进行全长测序，以验证最终构建体(在诱变之后)。
基于来自“Transient Expression in HEK293-EBNA1 Cells,”Chapter 12，inExpression Systems(eds.Dyson and Durocher)，Scion Publishing Ltd.，Oxfordshire，UK，2007的方法，使用聚乙烯亚胺(PEI)将新制备的重链构建体与相应的轻链构建体共转染进HEK293细胞中，在6天短暂培养物中表达，并通过蛋白A和尺寸排阻色谱法的组合进行纯化。
双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE1与亲本抗体和抗体变体的缀合。
在抗体还原后，进行抗体变体与1、1.5或2当量的聚合性缀合试剂双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1/链间二硫键的缀合。在22℃或40℃下，在4.7mg/mL的抗体浓度下使用10mM DTT进行还原反应1小时。对每个抗体变体进行缓冲液更换以移除过量还原剂。在临缀合前在50％乙腈水溶液中于pH8下制备所述聚合性缀合试剂。缀合期间的抗体浓度为3mg/mL并所述反应在40℃或22℃下进行过夜(16h)。所述缀合反应的反应条件总结于下表1：
表1：缀合条件。
“IgGC226S”变体在位点226处具有Cys至Ser的置换，因此在位点229处具有单个重链间二硫键。“IgGC229S”在位点229处具有Cys至Ser的置换，因此在位点226处具有单个重链间二硫键。
在更换缓冲液之后，对每个反应进行疏水作用色谱法(HIC)分析，以使用280nm处的％面积测定载药量的化学计量，如前所述。所制备的抗体-药物缀合物的平均药物与抗体比例(DAR)和药物缀合物种类分布(DAR 1-3)示于表2。
表2：IgGC226S和(反应1至6)和IgGC229S(反应7至12)-药物缀合物的平均DAR和种 类分布。
反应 平均DAR DAR 1-3 反应 平均DAR DAR 1-3
1 1.41 80％ 7 1.43 78％
2 1.99 89％ 8 1.76 83％
3 2.42 87％ 9 2.65 76％
4 1.33 79％ 10 1.26 76％
5 1.96 90％ 11 2.11 88％
6 2.40 89％ 12 2.50 83％
如表2中数据所示，抗体能够以高水平的均一性被有效地缀合，并且具有低的平均DAR。具有低平均DAR的抗体-药物缀合物与具有更高平均DAR的缀合物相比具有许多有益的特性，包括降低的清除率、更高的治疗指数和降低的毒性。
实施例5：DAR分布的分析
在实施例4中，当在40℃(反应1和7)和22℃(反应4和10)下使用1个当量的聚合性缀合试剂/链间二硫键时得到单铰链的二硫化物变体的最低平均DAR。为将这些结果与使用亲本抗体得到的结果作比较，利用实施例4中示出的条件，使用1个当量的聚合性缀合试剂/二硫键，对亲本抗体进行缀合。
亲本抗体、IgGC226S和IgGC229S的平均DAR示于表3。
表3：
缀合温度 亲本mAb IgGC226S IgGC229S
40℃ 1.91 1.41 1.43
22℃ 1.89 1.33 1.26
如表3中的数据所示，在40℃或22℃下，亲本抗体的平均DAR明显高于单铰链二硫化物变体IgGC226S和IgGC229S的平均DAR。
也分析了缀合反应生成的抗体-药物缀合种类的分布曲线以测定DAR分布。除了更低的平均DAR之外，从图1(在40℃缀合)和图2(在22℃缀合)还可看出与使用亲本抗体生成的那些缀合物相比，该方法生成了具有降低的异质性和提高的产率的抗体-药物缀合物(IgGC226S和IgGC229S)。具有提高的均一性的抗体-药物缀合物与不同化学计量的混合物相比需要更少的纯化，并由于不存在高载药种类而展示出降低的毒性，和/或改善的药代动力学，籍此显示出改善的效力。
实施例6：由双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1与由相当的基于马来酰亚胺的试剂制备的抗体药物缀合物的人造血清稳定性的比较。
制备了四个曲妥珠单抗-MMAE缀合物。使用曲妥珠单抗抗体从双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1(实施例1)制备了两个缀合物并在纯化后得到DAR-2和DAR44缀合物。从相当的基于马来酰亚胺的试剂(mal-val-cit-PAB-MMAE，以与1类似的方式从H2N-val-cit-PAB-MMAE制备)制备剩余的两种缀合物，得到纯化的DAR-2和DAR-4缀合物。
将四个缀合物全部制备成1mg/mL的磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4，所述溶液中包含浓度为20mg/mL的人血清白蛋白。加入叠氮化钠(终浓度1mM)然后将混合物分成四个相等的等分试样。一个等分试样立即在-80℃下冷冻。剩余的等分试样保持在37℃下。将37℃的等分试样在24小时、48小时和120小时后移走并转移至-80℃的冰箱中。在最后的时间点后，通过使用2.1mm×100mmHIC-10柱(Fisher Scientific)的分析型疏水作用色谱法分析混合物。该方法由在50分钟内从100％缓冲液A(50mM磷酸钠pH 7.0，1.5M硫酸铵)至100％缓冲液B(50mM磷酸钠pH 7.0，20％异丙醇)的线性梯度组成。流速为1mL/min并且温度设定为30℃。通过在248和280nm下进行紫外吸收来进行检测。测定每个样品的平均药物抗体比例并相对于孵育时间作图。结果见于图3。在图3中，用双砜试剂1制备的DAR-2和DAR-4缀合物中没有观察到明显的药物与抗体比例的降低，表明该缀合物对于在人造血清中的孵育是稳定的。然而，对于基于马来酰亚胺的缀合物，观察到DAE分布随时间的降低。
实施例7：在IgG耗尽血清中的稳定性
从双砜试剂1或相当的马来酰亚胺试剂制备曲妥珠单抗-MMAE缀合物(实施例6)，纯化两种缀合物以而得到每个抗体载有四个药物分子(DAR 4)。将缀合物与IgG耗尽血清(BBI溶液，SF142-2)混合，缀合物的最终浓度为1mg/mL。加入叠氮化钠(终浓度1mM)然后将混合物分成等分试样。两个等分试样立即在-80℃下冷冻。其余等分试样保持在37℃下，并且在120小时之后将两个等分试样转移至-80℃的冰箱中直到分析。实施例6中针对2.1mm×100mm HIC-10柱(Fisher Scientific)描述的方法通过分析型疏水作用色谱法对冷冻的等分试样进行分析。
图4中示出了在IgG耗尽血清中孵育的缀合物的HIC色谱图。对于双砜和马来酰亚胺缀合物两者，可观察到30和55分钟之间洗脱的一系列主峰。在零时间点，观察到双砜缀合物为52.2min处的洗脱峰(峰1)。在120小时后此峰没有明显变化，表明该缀合物在研究过程中没有降解。然而，对于马来酰亚胺DAR 4缀合物，其在零时间点被观察到为49.1min处的洗脱峰(峰1)，该峰大小在120小时后明显下降，表明该缀合物已经降解。对于马来酰亚胺缀合物，在120小时的色谱图中观察到44.8min(峰2)、40.9min(峰3)和34.0min(峰4)处的新峰，其洗脱的保留时间分别与DAR-3、DAR22和游离mAb的标准品相同，证明马来酰亚胺缀合物的药物随着时间损失。
实施例8：具有高DAR 4产率的双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-
MMAE 1与抗体的缀合
向曲妥珠单抗的溶液(0.768mL，5.2mg/mL，在20mM磷酸钠中，pH 7.5，150mM NaCl，20mM EDTA)中加入5mM TCEP溶液(0.032mL)并将所得混合物在40℃下孵育1小时。将TCEP处理的抗体冷却至室温并用20mM磷酸钠(pH 7.5)、150mM NaCl和20mM EDTA稀释至4.44mg/mL。然后向抗体溶液中加入溶于50％(v/v)MeCN-50％和(v/v)20mM磷酸钠，pH 7.5，150mMNaCl和20mM EDTA中的双砜-dPEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE溶液(0.100mL,4.4mg/mL)。将得到的缀合反应混合物混合并在22℃下孵育22小时。22小时之后，加入50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(0.064mL，3.0mM)并将所得混合物在22℃下再孵育1小时。通过使用TOSOH TSK-gelButhyl-NPR 35x 4.6mm柱的分析型HIC分析该反应样品。通过药物和抗体的紫外最大吸收的比率和峰洗脱顺序鉴定出每个分离的DAR变体，将所述每个分离的DAR变体的面积绘制成棒状图，结果示于图5。在图5中，主要产物(>73％)是DAR-4缀合物。
实施例9：从双砜-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE试剂1制备的曲妥珠单抗MMAE缀合物的体外分析
除了规模增加至5mg曲妥珠单抗并且不包括N-乙酰基-L-半胱氨酸孵育步骤之外，按照实施例8制备曲妥珠单抗MMAE缀合物。该反应混合物是通过使用1mL柱的制备型HIC进行纯化，所述1mL柱与AKTA Prime系统连接并装填有ToyoPearl Phenyl 650S树脂，并用缓冲液A(50mM磷酸钠，2.0M NaCl，pH 7.0)和缓冲液B(80％50mM磷酸钠，20％异丙醇，pH 7.0)平衡。将缀合混合物与等体积的溶于50mM磷酸钠(pH 7.0)中的4.0M NaCl混合并以1mL/min的缓冲液A注入到柱中。然后使用0-100％的缓冲液B梯度洗脱DAR 4样品。当DAR4种类开始洗脱时保持该梯度，并保持直到UV迹线归于基线，在此时间点继续梯度。收集洗脱峰的级分，并通过使用TOSOH TSK-gel Buthyl-NPR 35x 4.6mm柱的分析型HIC对选择的级分进行分析。合并含有DAR 4的级分(纯度>90％)，使用HiPrepTM 26/10脱盐柱将缓冲液更换为PBSpH 7.4并在VivaSpin 20(10kDa MWCO PES膜)浓缩机中以4000xg在室温下浓缩。然后在无菌条件下过滤浓缩的DAR 4样品并在-80℃冰箱中迅速冷冻。通过Bradford测定对最终样品进行定量，并通过非还原性SDS-PAGE和分析型HIC进行分析，并用于体外评估。
通过检测对HER-2受体过表达的癌细胞系的细胞生长的抑制作用来测定mAb-试剂1缀合物的体外效力。
可通过在存在逐渐提高的药物或ADC浓度的情况下培养细胞系并使用CellTiter发光试剂(Promega Corp.Technical Bulletin TB288；Lewis Phillips G.D,Cancer Res 2008；68：9280-9290)对增殖或代谢活性的损失进行定量，来测量用细胞毒性药物或ADC进行体外处理后肿瘤细胞存活率的损失。该方案描述了细胞接种、药物处理和基于ATP合成测定以未处理的细胞作为参考的细胞存活率，所述ATP合成与存在于孔中的细胞数目直接相关。
使用3mL胰蛋白酶EDTA对HER2-阳性SK-BR-3和BT-474细胞进行胰蛋白酶消化5-15min。通过加入10mL完全培养基终止胰蛋白酶消化，并且将细胞转移至50mL Falcon管中。使用Neubauer血球计数器计数细胞并将BT-474和SK-BR-3的细胞密度分别调整至1x105/mL和5x104/mL。将细胞接种至(100μL/孔)多聚-D-赖氨酸包被的不透明壁96孔板中并在37℃和5％CO2下孵育24小时。肿瘤细胞系SK-BR-3(ATCC-HTB-30)和BT-474(ATCC-HTB-20)购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。SK-BR-3细胞培养在McCoy’s 5A培养基(Life)、10％胎牛血清、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素中。BT-474细胞培养在DMEM/F-12培养基(Life)、10％胎牛血清、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素中。
用于细胞培养的方法来源于ATCC的产品信息表以及其中引用的参考文献，例如Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique by R.Ian Freshney，3rdedition，published by Alan R.Liss N.Y.1994，或5th edition published by Wiley-Liss N.Y.2005。通过以下方式制备将ADC或游离药物(MMAE)的系列稀释物(设三个重复)：使用相关细胞培养的培养基作为稀释剂，通过移液在96孔板中从第3-10列做2倍稀释。使用表4中示出的药物浓度处理HER2-阳性细胞系、BT-474和SK-BR-3。
然后将细胞与药物(总体积200μL/孔)在37℃和5％CO2下再孵育96小时。
细胞系 药物/药物-缀合物 浓度范围
SK-BR-3 MMAE 2.5-0.02nM
SK-BR-3 DAR 4抗体-试剂1缀合物 0.625nM-5pM
BT-474 MMAE 2.5-0.02nM
BT-474 DAR 4抗体-试剂1缀合物 1.25nM-0.01nM
表4
使用Cell-Titer发光试剂按照制造商的说明书(Promega Corp.TechnicalBulletin TB288；Lewis Phillips G.D,Cancer Res 2008；68：9280-9290)中所述进行细胞存活率测定。为得到最佳发光信号，将例如细胞裂解和用发光试剂孵育的孵育时间分别延长至3分钟和20分钟。使用平板读数器(plate reader)(例如MD Spectramax M3平板读数器)记录发光，随后使用四参数非线性回归模型分析数据。
结果见于图6，其阐明了在SKBR-3或BT-474细胞中对使用抗体-试剂1缀合物进行的处理的细胞存活率反应。存活率表示为未处理细胞的％。％存活(Y-轴)是相对于单位为nM的药物浓度的对数(x-轴)绘制，以确定所有缀合物以及游离药物的IC50值。IC50值见于表5。
表5
如图6和表5所示，抗体-试剂1缀合物在HER2-阳性细胞系中是有活性的。
实施例10：具有末端双砜官能度的带有单24个重复单元PEG双-(缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基-一甲基澳瑞他汀E)(val-cit-PAB-MMAE)2试剂6的合成。
步骤1：H2N-val-cit-PAB-MMAE与Fmoc-L-α-氨基己二酸的缀合。
0℃下，向H2N-val-cit-PAB-MMAE.TFA盐(120mg,Concortis)、Fmoc-L-α-氨基己二酸(16.9mg)和1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)(34.2mg)的搅拌的无水二甲基甲酰胺(1.5mL)溶液中加入二异丙基乙胺(51mL)并将反应混合物搅拌2小时，并在16小时内将其升温至室温。然后通过使用缓冲液A(水：5％乙腈：0.1％TFA，v/v)和缓冲液B(含0.1％TFA的乙腈，v/v)洗脱(100:0至0:100，v/v)的反相C18柱色谱法将反应混合物直接纯化。在真空中移除有机溶剂并通过冷冻干燥法移除水性溶剂。分离出白色固体状的Fmoc-L-α-氨基己二酸-双-[val-cit-PAB-MMAE]7(99.0mg)。m/z[M+H]+2593。
步骤2：Fmoc-L-α-氨基己二酸-双-[val-cit-PAB-MMAE]7的去保护
将Fmoc-L-α-氨基己二酸-双-[val-cit-PAB-MMAE]7(15mg)溶于无水二甲基甲酰胺(1mL)中并加入哌啶(0.1mL)。室温下搅拌16小时后，通过加入乙酸(0.2mL)将反应混合物酸化，然后通过使用缓冲液A(水:5％乙腈:0.1％TFA，v/v)和缓冲液B(含0.1％TFA的乙腈，v/v)洗脱(100:0至0:100，v/v)的反相C18-柱色谱法直接纯化，在真空中移除有机溶剂，并通过冷冻干燥法移除水性溶剂，并分离出白色固体状的H2N-L-α-氨基己二酸-双-[val-cit-PAB-MMAE]8(7.0mg)。m/z[M+H]+2374。
步骤3：L-α-氨基己二酸-双-[val-cit-PAB-MMAE]8与酸封端的PEG化的双砜2的缀合
向包含H2N-L-α-氨基己二酸-双-[val-cit-PAB-MMAE]5c(7mg)和已知的4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸(6mg)的搅拌的无水二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中加入1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)(1.4mg,14mg HATU的100μL DMF储液中的10μL),并将此溶液在0℃下搅拌5分钟。然后加入N-甲基吗啉(NMM)(0.37μL，37μL NMM的963μL DMF储液中的10μL)并搅拌该溶液。1小时时间间隔后，加入另外一份HATU(1.4mg(10μL的储液))和NMM(0.37μl，(10μL的储液))，一共添加3次。然后通过使用缓冲液A(水:5％乙腈:0.1％TFA，v/v)和缓冲液B(含0.1％TFA的乙腈，v/v)洗脱(100:0至0:100，v/v)的反相C18-柱色谱法直接纯化该材料，真空中移除有机溶剂并通过冷冻干燥移除水性溶剂，并分离出无色薄膜状的双砜-PEG(24)-H2N-双-[val-cit-PAB-MMAE]6(3.3mg,31％)。m/z[M+H]2+1992。
实施例11：具有末端双砜官能度的双-(单24重复单元PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基-一甲基澳瑞他汀E)(PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)2试剂9的合成。
步骤1：天冬氨酸与乙酰基苯甲酸的缀合。
向L-天冬氨酸β-叔丁基α-叔丁基酯盐酸化物(3.43g)和无水二氯甲烷(30mL)的搅拌的溶液中加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(1.786g)。2h后，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDCI)(2.80g)和4-乙酰基苯甲酸(2.00g)，并在室温下搅拌该反应。28小时后，用水(100mL)将此溶液分层并用二氯甲烷(2×10mL)萃取水相。将合并的有机相用水(2×50mL)、盐水(100mL)清洗，用硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。通过使用二氯甲烷-甲醇(99.5:0.5，v/v)洗脱的柱色谱法来纯化该固体残余物，真空中移除溶剂并分离出灰白色(off-white)固体状的2-[(4-乙酰基苄基)氨基]丁二酸二叔丁酯10(3.856g，81％)。
1H NMR(400MHz CDCl3)1.45(9H，s，t-Bu)，1.48(9H，s，t-Bu)，2.52(3H，s，CH3-COAr)，2.80(2H，dd，CH2CO2tBu)，4.80(1H，m，CH-CH2)，7.25(1H，m，NH)，7.85(2H，d，Ar)，8.00(2H，d，Ar).
步骤2：双-甲苯基硫基丁二酸酯11的形成
向2-[(4-乙酰基苄基)氨基]丁二酸二叔丁酯10(1.00g)在纯乙醇(20mL)中的搅拌混悬液中加入4-甲基苯硫醇(635mg)。向反应混合物中加入甲醛(37％水溶液)(0.3mL)(Nature Protocols,2006,1(54),2241-2252)然后加热回流。在2小时和8小时后加入另一份甲醛(37％水溶液，0.3mL)。再过16小时后，将该反应混合物冷却至室温，真空下浓缩，用二氯甲烷(50mL)稀释，用水清洗(3x 25mL)，用硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩。此粗品是通过使用二氯甲烷-甲醇(99.5:0.5v/v至98:2v/v)洗脱的柱色谱法纯化，真空下移除溶剂并分离得到浅黄色固体状的2-[[4-[3-(对甲苯基硫基)-2-(p-对甲苯基硫基甲基)丙酰基]苄基]氨基]丁二酸二叔丁酯11(0.594g,35％)。1H NMR(400MHz CDCl3)1.45(9H,s,t-Bu)，1.48(9H，s，t-Bu)，2.35(6H，s，CH3-Ar)，2.85(2H，dd，CH2CO2tBu)，3.15(2H，dd，CH2-SAr)，3.75(1H，m，CHCH2S)，4.80(1H，m，CH-CH2)，7.10(4H，d，SAr)，7.15(4H，d，SAr)，7.25(1H，m，NH)，7.55(2H，d，Ar)，75(2H，d，Ar).
步骤3：叔丁基保护基团的移除。
在室温和惰性气氛下，向2-[[4-[3-(对甲苯基硫基)-2-(对甲苯基硫基甲基)丙酰基]苄基]氨基]丁二酸二叔丁酯11(527mg)的搅拌的无水二氯甲烷(2.5mL)溶液中小心地加入三氟乙酸(2.5mL)。16.5小时后，在真空下浓缩该反应物并通过与甲苯(2 x 3mL)共沸蒸馏移除残余的三氟乙酸。在真空下浓缩该粗品以得到浅黄色油状的2-(4-(3-(对甲苯基硫)-2-((对甲苯基硫)甲基)丙酰基)苯甲酰氨基)琥珀酸12(490mg,认为是定量产率)，其不经进一步纯化就使用。
1H NMR(400MHz CDCl3)2.25(6H，s，CH3-Ar)，2.80-3.15(6H，m，CH2CO2H and CH2-SAr)，3.65(1H，mCHCH2S)，5.00(1H，m，CH-CH2)，6.85(4H，d，SAr)，6.95(4H，d，SAr)，7.50(2H，d，Ar)，7.55(1H，br s，NH)，7.65(2H，d，Ar)，10.95(2H，br s，CO2H).
步骤4：双-甲苯基硫-Asp-酸与H2N.dPEG(24)-CO-OtBu的缀合。
将H2N-dPEG(24)-CO-OtBu(240mg,Iris Biotech)的甲苯(3mL)溶液蒸发至干燥并将残余物重溶于二氯甲烷(15mL)中。在搅拌下，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDCI)(17.4mg)和2-(4-(3-(对甲苯基硫)-2-((对甲苯基硫)甲基)丙酰基)苯甲酰氨基)琥珀酸12(50mg)，并在室温和惰性气氛下搅拌该反应混合物。16小时后，加入另一份量的H2N.dPEG(24)-CO-OtBu(240mg)和EDCI(17.4mg)。共计96小时后，通过使用二氯甲烷-甲醇(99:1v/v至90:10v/v)洗脱的柱色谱法直接纯化固体残余物，在真空下移除溶剂并分离蜡黄色固体状的双-甲苯基-双PEG 13(179.5mg，68％)。1H NMR(400MHz CDCl3)1.45(18H，s，t-Bu)，2.30(6H，s，CH3-Ar)，2.75(2H，dd，CH2CON)，3.20(2H，dd，CH2-SAr)，3.45-3.80(m，PEG and CHCH2S)，4.85(1H，m，CH-CH2)，7.05(4H，d，SAr)，7.10(4H，d，SAr)，7.55(2H，d，Ar)，7.85(2H，d，Ar)，7.90(1H，m，NH)，8.50(1H，m，NH).
步骤5：叔丁基保护基团的移除
在室温下和氩气气氛下，向双-甲苯酰基-双PEG-酯13(179.5mg)的搅拌的无水二氯甲烷(3.0mL)溶液中小心地加入三氟乙酸(3.0mL)。在2小时45分钟后，在真空下浓缩该反应物并通过与甲苯(2 x 7mL)共沸蒸馏移除残余的三氟乙酸。在真空下浓缩该粗品，然后通过使用二氯甲烷-甲醇(98:2v/v至85:15v/v)洗脱的柱色谱法进行纯化，在真空下移除溶剂并分离得到浅黄色油状的双-甲苯酰基-双PEG-酸14(102mg，59％)。1H NMR(400MHzCDCl3)2.05(6H，s，CH3-Ar)，2.60(2H，t，CH2CO2H)，2.80(2H，dd，CH2CON)，3.20(2H，dd，CH2-SAr)，3.45-3.80(m，PEG and CHCH2S)，4.95(1H，m，CH-CH2)，7.05(4H，d，SAr)，7.10(4H，d，SAr)，7.55(2H，d，Ar)，7.70(1H，m，NH)，7.75(1H，m，NH)，7.85(2H，d，Ar)，8.75(1H，m，NH).
步骤6：双-甲苯基硫基-双-PEG-酸的氧化。
将水(3mL)加入双-甲苯酰基-双PEG-酸14(102mg)的搅拌的甲醇(3mL)溶液中，随后分批加入(67.1mg)。将得到的混悬液在室温下搅拌并在18小时后将此反应混合物通过脱脂棉塞并用甲醇/水1:1(2mL)清洗。将合并的有机清洗液在真空下浓缩以移除甲醇并用二氯甲烷(3 x 7mL)萃取水层。将合并的有机层用水性HCl(1 x 5mL,pH 3)清洗，用硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩以产生浅黄色固体状的双砜-双-PEG-酸15(79mg,76％)。1HNMR(400MHz CDCl3)2.45(6H，s，CH3-Ar)，2.55(2H，t，CH2CO2H)，2.80(2H，dd，CH2CON)，3.25-3.80(m，PEG and CH2-Ts)，4.25(1H，m，CH-CH2-Ts)，4.85(1H，m，CH-CH2)，7.35(4H，d，Ts)，7.60(1H，m，NH)，7.65(2H，d，Ar)，7.70(4H，d，Ts)，7.85(2H，d，Ar)，7.95(1H，m，NH)，8.75(1H，m，NH).
步骤7：H2N-val-cit-PAB-MMAE与双-酸封端的PEG化的双砜的缀合。
在惰性气氛下，向双砜-双-PEG-酸15(24.0mg)的搅拌的溶液中加入溶于无水二甲基甲酰胺(0.8mL)中的H2N-val-cit-PAB-MMAE.TFA盐(37.2mg)和无水碳酸钠(2.7mg)。然后加入1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)(9.6mg)并在室温下搅拌该反应混合物。42小时后，将该反应混合物用乙酸(50μL)酸化，然后通过使用缓冲液A(水:5％乙腈:0.1％TFA，v/v)和缓冲液B(含0.1％TFA的乙腈，v/v)洗脱(100:0v/v至0:100)的反相C18-柱色谱法直接纯化。对于产物级分，在真空下移除有机溶剂并通过冷冻干燥移除水性溶剂。使用以乙酸乙酯-异丙醇(100:0v/v至0:100v/v)洗脱的反相硅烷化硅胶-二醇-柱色谱法实现进一步纯化。在真空下移除溶剂并分离得到无色油状的双砜-PEG(24)-双-[val-cit-PAB-MMAE]9(8.0mg，21％)。m/z M+Na 5104。
实施例12：双载的(diloaded)双砜MMAE试剂8和双载的双砜MMAE试剂9与抗体片段(Fab)的缀合
在22℃下用DTT(50μL的1M DTT溶液被加入)将源自对曲妥珠单抗的木瓜蛋白酶消化的Fab的两个5mL等分试样(在PBS中2.14mg/mL)还原1小时。为移除过量的DTT，然后使用两个PD-10柱将还原的Fab溶液的缓冲液交换为20mM磷酸钠(pH 7.4，150mM NaCl和20mMEDTA)。在缓冲液交换之后，通过UV测量样品浓度。将经过缓冲液交换的Fab溶液用20mM磷酸钠(pH 7.4，150mM NaCl和20mM EDTA)稀释至1.1mg/mL(3.6mL终体积)。
向还原的Fab的一个等分试样中加入双砜-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE2(1.2mg/mL,0.4mL)的50:50v/v的乙腈-20mM磷酸钠(pH 7.4，150mM NaCl和20mM EDTA)溶液。向第二个Fab的等分试样中加入双砜-[PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE]2(0.4mL,1.5mg/mL)的50:50v/v的乙腈-20mM磷酸钠(pH 7.4，150mM NaCl和20mM EDTA)的溶液。两种反应混合物都在22℃下孵育22h。在孵育完成后，使用10mL ZebaTM纯化柱将反应混合物(4.0mL)缓冲液交换到PBS中。通过使用Toyopearl苯基HIC柱(1mL)的制备型HIC将得到的两种Fab-MMAE缀合物都纯化至大于93％的纯度。每个样品在2M NaCl、50mM磷酸钠(pH 7.0)中上样，并在20％丙-2-醇、50mM磷酸钠(pH 7.0)的0-100％梯度中洗脱。
实施例13：通过体外细胞存活率测定进行抗体药物缀合物(ADC)的分析
实施例12中制备的试剂6和试剂9抗体缀合物的体外效力是通过以下方式测定：使用实施例9的方法测量对过表达HER-2受体的癌细胞系的细胞生长的抑制作用。
用3mL胰蛋白酶EDTA对HER2-阳性SK-BR-3和BT-474细胞进行胰蛋白酶消化，持续5-15min。通过加入10mL完全培养基来终止胰蛋白酶消化，并将细胞转移至50mL Falcon管中。使用Neubauer血球计数器计数细胞，并将BT-474和SK-BR-3的细胞密度分别调整至为1x105/mL和5x104/mL。将细胞接种至(100μL/孔)聚-D-赖氨酸包被的不透明壁的96-孔板中并在37℃和5％CO2下孵育24小时。肿瘤细胞系SK-BR-3(ATCC-HTB-30)和BT-474(ATCC-HTB-20)购自美国典型培养物保藏中心。将SK-BR-3细胞培养于McCoy’s 5A培养基(Life)、10％胎牛血清、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素中。将BT-474细胞培养于DMEM/F-12培养基(Life)、10％胎牛血清、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素中。
用表6所示的药物浓度处理HER2-阳性细胞系、BT-474和SK-BR-3。然后将细胞与药物(总体积200μL/孔)在37℃和5％CO2下再孵育96小时。
细胞系 药物/抗体药物缀合物 浓度范围(nM)
SK-BR-3 MMAE 2.5-0.02
试剂6缀合物 1.25-0.01
试剂9缀合物 2.5-0.02
BT-474 MMAE 5-0.04
试剂6缀合物 2.5-0.02
试剂9缀合物 5-0.04
表6
使用Cell-Titer发光试剂按照制造商的说明书(Promega Corp.TechnicalBulletin TB288；Lewis Phillips G.D,Cancer Res 2008；68：9280-9290)描述的进行细胞存活率测定。为得到最佳发光信号，将例如细胞裂解和用发光试剂孵育的孵育时间分别延长至3分钟和20分钟。使用平板读数器(例如MD Spectramax M3平板读数器)记录发光，随后使用四参数非线性回归模型分析数据。
结果见于图7，其阐明了在SKBR-3或BT-474细胞内对使用试剂6缀合物或试剂9缀合物进行的处理的细胞存活率反应。存活率表示为未处理细胞的％。％存活率(Y-轴)是相对于单位为nM的药物浓度的对数(x-轴)绘制，以测定所有缀合物以及游离药物的IC50值。IC50值见于表7。
表7
如图7和表7中所示，两种抗体缀合物在HER2-阳性细胞系中都有活性。与试剂9缀合物相比，试剂6缀合物的效力增加。两种缀合物都比游离药物更有效地减少了增殖。
实施例14：使用双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE试剂1制备的抗体药物缀合物的体内异种移植物研究
从双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE试剂1与曲妥珠单抗的缀合物制备了DAR＝1、DAR＝2、DAR＝3和DAR＝4的四种抗体药物缀合物(ADC)并用HIC纯化以使每种的单一DAR纯度大于95％。然后将每种缀合物用于如下所述的异种移植物研究。
雌性重症复合性免疫缺陷小鼠(Fox Chase,C.B-17/Icr-Prkdcscid,Charles River Laboratories)在研究的第一天时是11周龄，体重(BW)范围为18.0至23.1g。动物自由摄取水(反渗透,1ppm Cl)和由18.0％粗蛋白质、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31改良和辐照的实验室膳食(NIH 31Modified and Irradiated Lab)。将小鼠饲养在静态微隔离器中的经辐照的Enrich-o’cobsTM实验室动物垫料中，该环境具有12-小时光照周期、20–22℃(68–72°F)以及40–60％湿度。
使用通过在SCID小鼠中连续皮下移植维持的BT474人类乳腺癌而开始进行异种移植。在肿瘤植入的当天，每个测试小鼠都接受在右胁腹皮下植入1-mm3的BT474碎片，并当平均尺寸接近90至120mm3的目标范围时监测肿瘤生长。使用卡尺在二维中测量肿瘤，并且其体积使用下式计算：
其中w＝以mm计的肿瘤的宽度，l＝以mm计的肿瘤的长度。
将肿瘤植入后的第28天指定为该研究的第1天，将动物分组，每一组由10只小鼠组成，各个肿瘤体积的范围为63至126mm3并且组平均肿瘤体积为99至101mm3。
在第1天，在具有已建立的皮下BT474肿瘤(63–126mm3)的所有组的小鼠(n＝10)中进行治疗。第1组为赋形剂(vehicle)治疗对照组。第2–5组分别接受DAR＝1、DAR＝2、DAR＝3和DAR＝4的ADC，在第1天、第8天和第15天对每个小鼠以20mg/kg静脉给药。每周两次测量肿瘤直到第61天研究终止。小鼠被单独监控，并且当其肿瘤达到1500mm3的终点体积时或在最后一天(以最先达到的为准)，对每个动物进行安乐死。对每个小鼠计算到达终末点的时间(TTE)。治疗结果是由肿瘤生长延迟百分数(％TGD)确定，定义为治疗组相比于对照组的中位数TTE的百分数增加，使用对数秩存活率分析P≤0.05时，认为组间的差异在统计学上是显著的。还对小鼠进行监控以用于完全回归(CR)和偏回归(PR)响应。在研究结束时具有CR的动物被额外归类为无肿瘤幸存者。治疗耐受性是通过体重测量和频繁观察治疗相关副作用的临床征象来评估。
对于61天的研究，赋形剂治疗对照组的中位数TTE是34.9天，建立了最大的可能的TGD为26.1天(75％)。所有方案都是耐受良好的并且可用于评估效力。DAR＝1和DAR＝2的ADC产生了可测量的TGD，分别为14.4天(41％)和16.9天(48％)，但是与对照组相比没有显著的存活差异(P>0.05)。DAR＝1组有一个无肿瘤存活者，其是三组中记录的唯一的回归。DAR＝3和DAR＝4的ADC都产生了最大TGD(26.1天，75％)，相对于对照组具有显著的存活率差异(P<0.001)，但是基于回归响应，两种方案是有区别的。DAR＝3治疗产生了三个PR，然而DAR＝4产生了10/10个无肿瘤存活者。结果见于图8。
实施例15：双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1与亲本抗体和抗体变体IgGC226S的缀合：与IgGC226S的链间桥接的更大保留。
记载于实施例4中的亲本抗体和单铰链二硫化物变体IgGC226S与1个摩尔当量的缀合试剂双砜-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE/链间二硫键的缀合是在抗体还原(TCEP，1摩尔当量/链间二硫化物，15min,40℃)后进行。临缀合前在DMSO中制备缀合试剂(以在反应溶液中产生5％(v/v)DMSO)。缀合期间的抗体浓度为4mg/mL。反应是在40℃下过夜(16小时)进行，然后将反应混合物用10mM DHA在室温下处理1小时，然后通过SDS-PAGE分析。该SDS-PAGE凝胶是用InstantBlueTM染色并且使用IMAGEQUANTTM LAS 4010仪器(GE Healthcare)成像，以测定泳道内存在的每个种类的％。SDS-PAGE结果见于图9。在图9中，M标记的泳道显示Novex蛋白质标准品(Novex Protein Standard)(Invitrogen)。泳道1和2分别显示IgGC226S在缀合反应前和缀合反应后的迁移谱图。泳道3和4显示亲本抗体的相同反应。当抗体的重链-重链链间二硫化物在缀合后不是共价桥接时，例如由于二硫键错配(scrambling)，通过SDS-PAGE可见到恰好低于重链-轻链二聚物(H+L)的80kDa标记的条带。相反，当重链-重链的链间二硫化物在缀合后桥接时，可见到恰好高于重链-轻链四聚物(2H+2L)的160kDa标记的条带。比较条带2和4，可以发现与带有两个重链间二硫化物的亲本抗体相比，与拥有单个重链间二硫化物的IgGC226S的缀合导致两个重链间更高程度的桥接(抗体重链-轻链四聚物分别为80％vs 67％)以及低程度的重链-轻链二聚物形成(分别为17％v 31％)。因而该方法通过重链间二硫键的有效桥接来提高抗体缀合物的稳定性。
序列表：

Claims (17)

1.一种具有以下通式的包含澳瑞他汀的缀合物：
(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab (I)
其中D代表澳瑞他汀部分；
q代表1至10的整数；
Lk1代表接头，其包含基团
其中AA代表蛋白酶特异性的氨基酸序列；
m代表1至10的整数；
P代表键或z-价基团-P1-NH-，其中z为2-11并且P1是包含至少一个亚乙基单元-CH2-CH2-或乙二醇单元-O-CH2-CH2-的基团；
p代表1至10的整数；
Lk2代表键或y-价接头，其中y为2-11并且其是由1至9个天冬氨酸和/或谷氨酸残基组成；
Lk3代表具有以下通式的接头：
-CO-Ph-X-Y- (II)
其中Ph是任选地取代的苯基基团；X代表CO基团或CH.OH基团；并且Y代表具有下式的基团：
其中A和B中的每一个均代表C1-4亚烷基或亚烯基基团；
Ab代表能够结合靶标上的结合伴侣的结合蛋白或肽，所述结合蛋白或肽经由源自所述结合蛋白或肽中的二硫键的两个硫原子被键合至Lk3上；并且
n代表从1至s的整数，其中s是缀合至Lk3之前存在于所述结合蛋白或肽中的二硫键的数目；
选择m、n、p、q、y和z的含义使得所述缀合物包含多于1个最高达10个D基团。
2.权利要求1所述的缀合物，其中所述澳瑞他汀为经由其末端氮原子键合的一甲基澳瑞他汀E或一甲基澳瑞他汀F。
3.权利要求2所述的缀合物，其中所述澳瑞他汀为经由末端氮原子键合的一甲基澳瑞他汀E。
4.权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中Lk1包含：
5.权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中q为2至10的整数，并且Lk1为纳入一个或多个天冬氨酸或谷氨酸残基的多价接头。
6.权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中P代表键，或P代表–P1-NH-，其中P1包含2至10个乙二醇单元。
7.权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中P1代表聚乙二醇。
8.权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中Lk3中的苯基基团Ph是未取代的。
9.权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中Y具有下式：
10.权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中Ab代表全长抗体或包含全长抗体的抗原结合区的抗体片段。
11.权利要求10所述的缀合物，其中Ab代表IgG1或IgG4或者IgG1或IgG4的片段。
12.一种制备权利要求1至11中任一项所述的缀合物的方法，其包括还原结合蛋白中的一个或多个二硫键并随后与具有以下通式的缀合试剂反应：
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII)
其中D、Lk1、P、Lk2以及m、p和q具有权利要求1中给出的含义，并且Lk3a代表下式的基团：
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
其中Ph具有权利要求1中给出的含义，Xa代表CO基团，并且Ya代表下述基团：
其中A和B具有权利要求1中给出的含义，每个L独立地代表离去基团，并且x代表1至4的整数，从而制备其中X代表CO的式I缀合物；并且任选地还原所述最初形成的CO基团X以生成具有CH.OH基团X的缀合物。
13.权利要求12所述的方法，其中Ya代表：
14.一种具有以下通式的化合物：
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII)
其中D具有权利要求1至3中任一项给出的含义；Lk1具有权利要求1或4给出的含义；P具有权利要求1、6和7中任一项给出的含义；Lk2、m、p和q具有权利要求1给出的含义，并且Lk3a代表具有下式的基团：
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
其中Ph具有权利要求1或权利要求8给出的含义，Xa代表CO基团，并且Ya代表以下基团：
其中A和B具有权利要求1给出的含义，每个L独立地代表离去基团，并且x代表1至4的整数。
15.权利要求14所述的化合物，其中Ya代表：
16.一种药物组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的载体，以及任选的额外的治疗试剂。
17.权利要求1至11中任一项所述的缀合物或权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗增生性、自身免疫性或感染性疾病的药物中的用途。
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