KR20150103656A - 새로운 약물-단백질 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 오리스타틴(auristatin) 및 결합 단백질(binding protein) 또는 펩타이드(peptide), 및 상기 물질을 만드는 제조 방법에 관한 것이다. 상기 접합체는 알려진 항체-약물 접합체를 능가하는 장점을 제공하는 특정 링커(linker) 과학 기술을 사용한다. 또한 현재 약물의 복제본이 하나 이상 존재하는 약물 및 결합 단백질 또는 펩타이드의 특정 접합체에 관한 것이다.

Description

새로운 약물-단백질 접합체{Novel Drug-Protein Conjugates}
본 발명은 새로운 약물-단백질 접합체에 관한 것이다.
표적 세포 및 분자의 표면의 특이적인 항원에 대한 항체의 특이성은 다양한 진단 및 치료 약물(reagent)의 담체(carrier)로서 광범위하게 사용될 수 있도록 한다. 예를 들면, 형광발생단(fluorophores), 방사성 동위원소(radioisotopes), 및 효소들과 같은 라벨과 리포터 그룹들에 결합 된 단백질은, 라벨링(labelling)과 시각화 용도에 사용될 수 있고, 반면 세포독성 물질(cytotoxic agents)이나 화학치료 약물(chemotherapy drugs)과 결합이 된 것은, 특정한 세포 또는 성장 인자들과 같은 물질들이 특정 조직이나 구조물에 목표하여 운반될 수 있도록 하여, 정상인 건강한 세포에 대한 영향을 최소화하고 화학요법 치료들에 관련된 부작용을 상당히 감소시킬 수 있도록 한다. 이러한 접합체들은 여러 질병, 특히 암에서 광범위하고 잠재적인 치료적 용도를 가지고 있다.
수용성의 합성된 고분자들, 특히 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycols)은 펩타이드(peptide) 또는 항체를 포함하는 단백질 리간드(ligand)와 같은 치료적으로 활동적인 분자들에 결합하는 데에 넓게 사용되고 있다. 이러한 치료성 접합체들은 순환 시간을 지연시키고 제거되는 속도를 감소시켜, 전신의 독성을 감소시키며, 몇 몇의 경우에는 임상적인 효험이 증가 되어 나타나도록 함으로써, 약물동력학(pharmacokinetics)을 우호적으로 변환함을 나타내었다. 단백질에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 공유결합으로 결합 되는 과정은 일반적으로 "PEGylation"으로 알려져 있다.
결합 단백질 당 결합 된 모이어티(moiety)의 숫자가 같도록 하는 것 및 각 모이어티가 각 결합 단백질에 있는 같은 아미노산 잔기에 특이적으로 접합하도록 하는 것은 최적의 효험 및 도스 대 도스 일관성(dose to dose consistency)를 보장하기 위해 중요하다. 그런 이유로, 각 접합체들의 동질성(homoggeneity)을 증가시키기 위해 다수의 방법이 개발되고 있다. Liberatore et al, Bioconj. Chem, 1990, 1, 36-50, 및 del Rosario et al, Bioconj. Chem, 1990, 1, 51-59에서는 단백질 내에 있는 이황화 결합에 교차결합을 하기 위해 사용되는 항체를 포함하는 시약에 관하여 설명하였다. WO 2005/007197은 단백질 내에 있는 이황화 결합으로부터 유래 된 두 개의 황 원소와 결합하여 새로운 티오에테르(thioether) 접합체를 제공하는 능력이 있는, 새로운 결합 시약을 사용하여 고분자가 단백질에 결합하는 과정에 관해 기술되어 있다.
오리스타틴(auristatin)은 항종양성(antineoplastic)의 시약으로, 강력한 효능을 가진, 세포-살해 분류의 약물이다. 이 분류에는 다음의 다양한 물질들이 포함되는 데, Dolabella auricularia에서 분리된 자연 제품인 돌라스타틴 10(dolastatin 10), 모노메틸오리스타틴 E(monomethylauristatin E), 모노메틸오리스타틴 F(monomethylauristatin F), 모노메틸오리스타틴 D(monomethylauristatin D), 오리스타틴 PYE, 및 오리스타틴 PHE가 암을 포함하는 다양한 종류의 질병의 치료에 사용되기 위해 개발되고 있다. 이들은 매우 독성이 강하고, 대부분의 연구는 현재 직접적으로 오리스타틴을 포함하고 있는 접합체로 개발이 되고 있다. WO 2009/117531은 C-말단(terminus)을 통해 링커로 결합하고 그 뒤에 항체에 결합하는 오리스타틴을 가지고 있는 약물 접합체에 관한 것이다. 이러한 접합체들은 약물체를 분리하기 위한 자기희생적인(self-immolative) 그룹의 필요 없이 효능을 보인다는 것이 명시되어 있다. WO 2009/052431은 CD19 결합 시약과 연관이 있고, 오리스타틴 접합체에 대해 밝혔다.
두 개의 항체 약물 접합체들이 규제 승인을 받았다. 하나는 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)으로, 그 약물은 오리스타틴이고, 하나는 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine)으로, 그 약물은 메이탄신(maytansine)이다. 상기 두 개의 상업적으로 이용가능 한 접합체들은, 항체와 그 약을 연결할 때 말레이미드(maleimide)에 기초한 링커를 사용한다. 말레이미드는 접합체 시약으로 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 다수의 접합체 시약들과 같이, 말레이미드의 사용은 수많은 어려움을 나타낸다: 결합 반응 조절이 어려워서, 제품이 낮은 동질성을 갖게 되고, 최종 접합체의 안정성이 문제가 될 수 있다.
그러므로 효과적으로 준비될 수 있고, 필요한 효능을 입증할 수 있는 향상된 안정성과 동질성을 가진, 개선된 오리스타틴-항체 접합체에 대한 필요성이 있다.
도 1은 모항체(parent mAb) 및 항체-약물 접합체(IgGC226S 및 IgGC229S)의 40℃에서의 접합에 대한 DAR(약물:항체 비율(drug:antibody ratio)) 분포를 나타낸 도이다.
도 2은 모항체(parent mAb) 및 항체-약물 접합체(IgGC226S 및 IgGC229S)의 22℃에서의 접합에 대한 DAR 분포를 나타낸 도이다.
도 3은 말레이미드(maleimide) DAR2 및 비스-설폰(bis-sulfone) DAR2 또는 말레이미드 DAR4 및 비스-설폰 DAR4의 시간에 따른 약물 항체 비율의 평균을 나타낸 도이다.
도 4는 IgG 결여 혈청(serum)에서 배양한 비스-설폰 시약 1 접합체 또는 말레이미드 접합체에 대한 HIC(소수성 작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography)) 크로마토그램(chromatogram)을 나타낸 도이다.
도 5는 약물 및 항체에 대한 UV 흡광도(absorbance)의 최대치의 비율 및 피크(peak) 용리의 순서에 의해 식별된, 분리된 각 DAR 이형에 대한 면적을 나타낸 도이다.
도 6은 SK-BR-3 또는 BT-474 둘 중 하나의 세포 내에서 항체-시약 1 접합체의 처리에 대한 세포 생존율의 반응을 나타낸 도이다:
MMAE: 모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E).
도 7은 SK-BR-3 또는 BT-474 둘 중 하나의 세포 내에서 시약 6 접합체 또는 시약 9 접합체의 처리에 대한 세포 생존율의 반응을 나타낸 도이다:
MMAE: 모노메틸 오리스타틴 E.
도 8은 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 시약 1 을 이용하여 생성된 항체 약물 접합체에 대한 생체 내 제노그라프트(xenograft) 시험의 결과를 나타낸 도이다:
vehicle: 대조군.
도 9는 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1과 모항체 및 항체 이형 IgGC226S의 접합에 대한 SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 일렉트로포레시스(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrosis)) 결과를 나타낸 도이다:
M: 단백질 마커(marker);
H: 중 사슬(heavy chain);
L: 경 사슬(light chain).
본 발명은 하기 일반식으로 기재되는 오리스타틴(auristatin)을 함유한 접합체를 제공한다:
(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab (I)
여기서, D는 오리스타틴 모이어티(moiety)를 나타내고;
q는 1부터 10까지의 정수를 나타내며;
Lk1은 링커(linker)를 나타내고;
m은 1부터 10까지의 정수를 나타내며;
P는 결합 또는 z가(valent) 그룹 -P1-NH-z를 나타내고, 상기 z는 2부터 11이고 P1은 적어도 하나의 에틸렌 유닛(ethylene unit) -CH2-CH2- 또는 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 유닛 -O-CH2-CH2-을 포함하며;
p는 1부터 10까지의 정수를 나타내고;
Lk2는 결합 또는 y가 링커이고, 상기 y는 2부터 11이고 이것은 1에서 9개의 아스파테이트(aspartate) 및/또는 글루타메이트(glutamate) 잔기로 구성되고;
Lk3는 하기 일반식의 링커로 나타내며;
-CO-Ph-X-Y- (II)
여기서, Ph는 선택적으로 페닐(phenyl) 그룹으로 대체될 수 있고;
X는 CO 그룹 또는 CH.OH 그룹으로 나타내고; Y는 하기 화학식의 그룹으로 나타내며;
Figure pct00001
(III) 또는
Figure pct00002
(IV)
여기서, A와 B 각각은 C1 - 4알킬렌 또는 알케닐렌(alkenylene) 그룹으로 나타내고;
Ab는 표적(target)에 있는 결합 파트너에 결합할 수 있는 결합 단백질 또는 펩타이드(peptide)를 나타내며, 상기 결합 단백질 또는 펩타이드는 결합 단백질 또는 펩타이드에 있는 이황화 결합으로부터 유래 된 두 개의 황 원자를 통해 Lk3에 결합하고; 및
n은 1부터 s까지의 정수를 나타내며, 여기서 s는 Lk3에 결합에 앞선 결합 단백질 또는 펩타이드에 있는 이황화 결합의 개수이고;
m,n,p,q,y와 z의 의미는 접합체가 1에서 10의 D그룹을 함유하도록 선택된다.
D는 오리스타틴의 모이어티를 나타낸다(즉, Lk1 그룹은 오리스타틴의 한 잔기에 결합 되어 있다). 오리스타틴이라는 용어는 오리스타틴 D, 오리스타틴 E, 오리스타틴 F, 모노메틸오리스타틴 D, 모노메틸오리스타틴 E, 모노메틸오리스타틴 F, 오리스타틴 PYE, 오리스타틴 PHE, 돌라스타틴 10과 연관된 자연 물질, 및 그것의 유도체들을 포함한다.
오리스타틴은 하기의 하부구조 (A)를 포함하는 것이 바람직하다.
Figure pct00003
(A),
Ra는 C1 - 8알킬을 나타내고; Rb는 H, C1 - 8알킬, C3 - 8싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐(cycloalkenyl), 아릴(aryl), -X-아릴(-X-aryl), -X-C3 -8싸이클로알킬(-X-C3-8cycloalkyl) 또는 싸이클로알케닐(cycloalkenyl), C3 -8헤테로싸이클릴(C3 -8heterocyclyl) 또는 -X-C3 - 8헤테로싸이클릴(-X-C3 -8heterocyclyl)을 나타내며; Rc는 H 또는 메틸(methyl)을 나타내고; Rd는 H, C1 - 8알킬, C3 - 8싸이클로알킬, 또는 싸이클로알케닐, 아릴, -X-아릴, -X-C3 - 8헤테로싸이클릴, C3 - 8헤테로싸이클릴, -X-C3 - 8헤테로싸이클릴, -X-S-C1 - 8알킬(-X-S-C1 -8alkyl)을 나타내고; 또는 Rc와 Rd는 함께 -(CRaRb)r-의 형태의 카르복실릭 링(carbocyclic ring)을 형성하는데, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 C1 - 8알킬 및 r은 2부터 6의 정수를 나타내고; Re는 H 또는 C1-8알킬을 나타내고; Rf는 H, C1 - 8알킬, C3 - 8싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, 아릴, -X-아릴, -X-C3 - 8싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, C3 - 8헤테로싸이클릴 또는 -X-C3-8헤테로싸이클릴을 나타내며; Rg는 H, -OH, -C1 - 8알킬, C3 - 8싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, 또는 -O-(C1 - 8알킬)(-O-(C1 -8alkyl))을 나타내며; Rh는 H, -OH, -C1-8알킬, C3 - 8싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, 또는 -O-(C1 - 8알킬)을 나타내며; 및 각 X는 독립적으로 C1 - 10알킬렌(C1 -10alkylene)이다.
Ra는 C1 - 4알킬(C1 -4alkyl)을 나타내는 것이 바람직하며, 특히 메틸을 나타낸다. Rb는 C1 - 4알킬을 나타내는 것이 바람직하고, 특히 이소프로필(isopropyl)을 나타낸다. Rc는 H를 나타내는 것이 바람직하다. Rd는 C1 - 4알킬 또는 -CH2CH2SCH3을 나타내는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 -CH2CH(CH3)2-, CH(CH3)2 또는 -CH2CH2SCH3-, 가장 바람직하게는 -CH(CH3)2를 나타낸다. Re는 H 또는 C1 - 4알킬을 나타내는 것이 바람직하고; 가장 바람직하게는 Re는 메틸을 나타낸다. Rf는 C1 - 4알킬을 나타내는 것이 바람직하고, 특히 1-메킬프로필(1-methylpropyl)이 바람직하다. Rg는 -OH 또는 -O-(C1 - 4알킬)(-O-(C1 -4alkyl))을 나타내는 것이 바람직하고; 메톡시(methoxy)가 가장 바람직하다. Rh는 -OH 또는 -O-(C1 - 4알킬)을 나타내는 것이 바람직하고; 메톡시가 가장 바람직하다.
오리스타틴은 하기의 하부구조 (B)를 포함하는 것이 더 바람직하다.
Figure pct00004
(B),
여기서, Ra-Rh는 상기의 의미를 갖는다.
오리스타틴은 하기의 하부구조 (C)를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
Figure pct00005
(C),
여기서, Rd는 -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, 또는 -CH2CH2SCH3를 나타낸다.
어떤 바람직한 실시예에서, 오리스타틴 N-말단은 H 또는 C1 - 8알킬이고, 더 바람직하게 수소(hydrogen) 또는 메틸이다. 예를 들면, 오리스타틴은 하기의 (D) 및 (E)의 하부구조를 포함하는 화합물이다:
Figure pct00006
(D),
Figure pct00007
(E).
어떤 바람직한 실시예에서, 오리스타틴 C-말단 그룹은:
Figure pct00008
,
Figure pct00009
,
Figure pct00010
, 또는
Figure pct00011
;
여기서, Ri는 수소 또는 C1 - 8알킬을 나타내고; Rj는 C6 - 10아릴(C6 -10aryl) 또는 C5-10헤테로아릴(C5 -10heteroaryl)을 나타내며, 상기 아릴 또는 헤테로아릴은 선택적으로 할로겐(halogen), C1 - 4알킬(C1 -4alkyl)로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로 3개까지의 치환체로 치환이 될 수 있고, 선택적으로 3개까지의 할로겐, 하이드록시(hydroxy), C1 - 4알콕시(C1 -4alkoxy) 및 시아노(cyano)로 치환되며; Rk는 수소 또는 C1 - 8알킬을 나타내며; Rl은 수소 또는 하이드록시를 나타내고; Rm은 -CO2H, -CO2C1-8알킬(-CO2C1 -8alkyl), -CONH-C6 - 10아릴(-CONH-C6 -10aryl), -CONH-C5 -10헤테로아릴(-CONH-C5 -10heteroaryl) 및 C5 - 10헤테로아릴(C5 -10heteroaryl)을 나타내고, 상기 아릴 또는 헤테로아릴 그룹은 선택적으로 할로겐, C1 - 4알킬로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 3개까지의 치환체로 치환되고, 선택적으로 3개까지의 할로겐, 하이드록시, C1 - 4알콕시 및 시아노로 치환된다.
어떤 바람직한 실시예에서 오리스타틴의 C-말단 그룹은
Figure pct00012
,
더 바람직하게는
Figure pct00013
,
Ri는 수소를 나타내고; Rj는 페닐 또는 C5 - 10헤테로아릴을 나타내며, 상기 페닐 또는 헤테로아릴은 선택적으로 할로겐, C1 - 4알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 3개까지의 치환체로 치환되며 선택적으로 3개까지의 할로겐, 하이드록시, C1 - 4알콕시 및 시아노로 치환된다; 또한 Rk 및 Rl은 할로겐이거나, 또는 Rk는 메틸이고 Rj는 하이드록시이다.
어떤 바람직한 실시예에서 오리스타틴 C-말단 그룹은
Figure pct00014
,
더 바람직하게
Figure pct00015
,
Ri는 수소를 나타내고; Rj는 페닐 또는 C5 - 10헤테로아릴을 나타내며, 상기 페닐 또는 헤테로아릴은 선택적으로 할로겐, C1 - 4알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 3개까지의 치환체로 치환되며 선택적으로 3개까지의 할로겐, 하이드록시, C1 - 4알콕시 및 시아노로 치환되며; Rm은 -CO2H, -CO2C1 - 8알킬, 및 C5 - 10헤테로아릴을 나타내고, 상기 헤테로아릴은 선택적으로 할로겐, C1 - 4알킬로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 3개까지의 치환체로 치환되고, 선택적으로 3개까지의 할로겐, 하이드록시, C1 - 4알콕시 및 시아노로 치환된다.
예를 들어, 오리스타틴은 하기 (F) 또는 (G)의 하부구조를 포함한다:
Figure pct00016
(F),
Figure pct00017
(G).
보다 구체적으로 바람직한 오리스타틴은 하기를 포함한다;
Figure pct00018
(돌라스타틴 10),
Figure pct00019
(모노메틸 돌라스타틴 10),
Figure pct00020
(오리스타틴 E),
Figure pct00021
(모노메틸 오리스타틴 E),
Figure pct00022
(오리스타틴 F),
Figure pct00023
(모노메틸 오리스타틴 F),
Figure pct00024
(오리스타틴 PYE),
Figure pct00025
(오리스타틴 PE),
Figure pct00026
(오리스타틴 PHE),
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
,
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
및
Figure pct00034
.
오리스타틴의 구조에 따라서, 오리스타틴은 자유 염 또는 자유 산, 또는 약학적으로 수용 가능한 염, 및/또는 용매화합물(solvate)로서의 형태로 존재할 수 있다. 화학식 I의 접합체는 하기의 형태로 존재할 수 있다.
Lk1은 어떠한 적절한 포인트에 있는 오리스타틴 모이어티에 결합될 수 있다. N-말단 수소를 가지는 오리스타틴에 대응하는 오리스타틴 모이어티에서, 바람직하게 Lk1은 N-말단 질소에 결합되는데, 예를 들면
Figure pct00035
,
Figure pct00036
.
Rm이 -CO2H를 나타내는 오리스타틴에 대응하는 오리스타틴 모이어티의 경우, Lk1은 하기 예와 같은 C-말단 탄소에 결합할 수 있다;
Figure pct00037
,
Figure pct00038
.
Lk1은 링커, 결합, 또는 오리스타틴 모이어티 D를 P 그룹에 연결하는 그룹이다. 이것은 1 내지 10 D 그룹을 가질 수 있다. Lk1은 바람직하게 분해가능한 그룹을 포함하는데, 즉 Lk1은 바람직하게 항체로부터 D를 분리시키는 물리적인 환경하에 끊어지는 링커이다. 그렇지 않으면, Lk1은 물리적인 환경에서 끊어지지 않는 링커일 수 있다. Lk1이 물리적인 환경에서 끊어질 수 있는 링커일 경우, 이것은 바람직하게 세포 내(intracellular) 환경에서 절단 될 수 있다. 표적이 세포 내 일 경우, 바람직하게 Lk1은 세포 밖(extracellular) 환경에 상당히 둔감하다(즉 충분한 도스의 치료 물질의 세포 내 표적으로의 전달이 금지되지 않는다).
Lk1이 분해 가능한 링커일 경우, 이것은 가수분해성(hydrolytic)의 환경에 민감한 그룹을 가질 수 있다. Lk1은 특정 pH 값(예를 들어, 산성 환경)에서 분해되는 그룹을 가질 수 있다. 가수분해성/산성 환경은 엔도좀(endosome) 또는 리소좀(lysosome)에서 발견된다. 산성 환경에서 가수분해에 민감한 그룹의 예로는 히드라존(hydrazone), 세미카바존(semicarbazones), 티오세미카보아존(thiosemicarboazones), 시스-아코토닉 아미드(cis-acotinic amides), 올소에스터(orthoesters) 및 아세탈/케탈(acetals/ketals) 등이 있다. 가수분해성 환경에 민감한 그룹의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00039
및
Figure pct00040
.
또한 Lk1은 환원 환경(reducing conditions)에서 분해에 민감할 수 있다. 예를 들면, Lk1은 싸이올(thiol)과 같은 생물학적 환원제(reducing agent)에 노출되면 절단되는 이황화 그룹을 포함한다. 이황화 그룹의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00041
,
여기서, R, R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 또는 C1 - 4알킬, 및
Figure pct00042
.
또한 Lk1은 효소적 분해에 민감한 그룹을 포함할 수 있는데, 예를 들면 프로테아제(protease, 예를 들어, 리소조말 또는 엔도조말 프로테아제) 또는 펩티다제(peptidase)이다. 예를 들어, Lk1은 최소 하나, 또는 최소 둘, 또는 최소 세개의 아미노 산 잔기(예, Phe-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Cit, Phe-Lys)로 구성되는 펩티딜(peptidyl) 그룹을 갖는다. 예를 들면, Lk1은 1 내지 5, 또는 2 내지 4의 아미노산을 갖는 아미노산 사슬이다. 또 다른 효소적 분해에 민감한 그룹의 예는 하기와 같다:
Figure pct00043
,
여기서 AA는 Val-Cit와 같은 프로테아제 특이적인 아미노산 서열(sequence)을 나타낸다.
어떤 바람직한 실시예에서, Lk1은 하기 이거나 또는 하기 화학식을 포함한다:
Figure pct00044
(V).
예를 들어, Lk1은 하기 화학식이다
Figure pct00045
(Va)
여기서, 상기 화합물은 바람직하게 하기 화학식의 D 및 P 그룹에 결합 된다:
Figure pct00046
(Vb).
상기 실시예에서, 오리스타틴 모이어티 D는 바람직하게 N-말단 질소에 결합된다.
한 실시예에서, Lk1은 하나의 오리스타틴 모이어티 D(즉, q=1)를 가진다. 상기의 특이 링커 V는 이러한 형태이다. 또 다른 실시예에서, q는 1보다 크고, 예를 들면 2, 3 또는 4이고, Lk1은 본 발명의 접합체에 하나 이상의 오리스타틴 모이어티를 포함시키는 방법으로서 사용된다. 한 실시예에서, 상기 방법은 예를 들어 아스파테이트(aspartate) 또는 글루타메이트(glutamate) 또는 비슷한 잔기를 포함시키는 분기(branching) 링커 Lk1을 사용함으로써 달성할 수 있다. 이는 하기 구조를 갖는 분기 요소를 제시한다:
Figure pct00047
(VI)
여기서, b는 1, 2 또는 3 이고, b=1은 아스파테이트이고 b=2는 글루타메이트, 및 b=3은 한 바람직한 실시예를 나타낸다. 화학식 VI에 있는 각 아실 모이어티는 적합한 링커 Lk1a를 통하여 그룹 D에 연결되는데, 상기 Lk1a는 어떠한 적합한 링커인데, 예를 들면 상기 Lk1에 대해 언급한 연결 중 하나에 포함되는 분해 가능한 링커이다. 한 특정 실시예에서, Lk1a는 상기의 그룹 V를 나타낸다. 아스파테이트 또는 글루타메이트 또는 비슷한 잔기의 아미노 그룹은 어떤 적합한 방법으로 P에 결합되는데, 예를 들면 아미드(amide) 결합을 통한 연결, 그 예는 상기 분기 그룹은 -CO.CH2-그룹을 통해 P에 결합되는 것으로써, 하기와 같다:
Figure pct00048
(VIa)
가능하면, 상기 아스파테이트 또는 글루타메이트 또는 비슷한 잔기는 더 많은 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 및/또는 비슷한 잔기들과 결합되는데, 예를 들면 하기와 같다:
Figure pct00049
(VIIa) 또는
Figure pct00050
(VIIb)
계속하여, 10 개의 D 그룹까지 포함하는 잠재력을 제공하며, 최대 9개까지 상기 잔기들이 계속된다. 상기 서술된 바와 같이, 각 D는 어느 적합한 링커 Lk1a를 통해 아스파테이트/글루타메이트 또는 비슷한 잔기에 결합한다.
P가 -P1-NH- 그룹을 나타내는 경우, P1은 최소 한개의 에틸렌(ethylene) 또는 에틸렌 글리콜 유닛(ethylene glycol unit)(-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-)을 포함한다. 만약 상기 유닛이 많이 존재한다면, P1은 폴리에틸렌, PE 또는 폴리에틸렌 글리콜, PEG를 나타낸다. 이러한 중합체들은 하나의 직선형의 사슬을 포함할 수 있고, 또는 작거나 큰 많은 사슬들로 구성된 가지 형태일 수 있으며, 이 경우 -(CH2CH2)2-CH- 또는 -(O-CH2-)2CH-의 예와 같이, 특징적으로 >CH-를 포함하는 분기 그룹을 포함할 수 있다. 상기 중합체들은 어떠한 원하는 방식으로든지 선택적으로 유도되거나 작용할 수 있다. 이것들은 추가적인 치료적 물질, 또는 라벨링 물질을 포함한다. 하나 이상의 치료적 물질을 포함하는 다중 결합(multimeric)의 접합체들, 예를 들면 한 분자 이상의 오리스타틴, 또는 한 분자의 오리스사틴에 추가적인 한 분자의 치료적 물질,은 시너지적(synergistic) 및 추가적인 이득의 결과를 나타낼 수 있다.
P1이 PE 또는 PEG를 나타내는 경우, 상기 중합체의 최적의 분자 중량(molecular weight)은 당연히 의도한 활용에 좌우될 것이다. 일반적으로, P1이 PE를 나타내는 경우, 바람직하게 평균 분자 중량은 2kDa까지 이며, 1kDa까지가 바람직하다. P1이 PEG를 나타내는 경우, 더 큰 분자 중량이 사용될 수 있는데, 예를 들면 평균 분자 중량이 75kDa까지 이거나 60kDa까지이고, 평균 분자 중량의 최소 숫자는 최소 0.5kDa 이거나 1kDa 또는 2kDa이다. 한 바람직한 실시예에서, 평균 분자 중량이 0.5 내지 2kDa의 PEG가 사용될 수 있다. 반면, 어떤 바람직한 실시예에서, P는 결합이고 또는 P는 -P1-NH-를 나타내는데, 여기서 P1은 적은 숫자의 별개의 에틸렌 또는 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하는데, 예를 들면 2 내지 10, 2 또는 3개의 에틸렌 또는, 바람직하게, 에틸렌 글리콜 유닛이다.
화학식 I의 접합체가 하나 이상의 -(CH2-CH2-)a- 또는 -(O-CH2-CH2)a 사슬(여기서 a는 어느 직선형의 사슬에 있는 에틸렌 또는 에틸렌 글리콜의 갯수)을 갖도록 요구된다면, 상기 요구는 예를 들어 각 사슬이 Dq-Lk1 그룹을 포함하는, 하나 이상의 이러한 사슬이 Lk2에 결합하거나 또는 오직 하나의 P 그룹이 Lk2에 결합되는 가지형태의 PE 또는 PEG를 사용함으로써 달성될 수 있으나, 이것은 하나 이상의 분기, 예를 들면 1 내지 9개의 분기(2 내지 10의 D-Lk1 그룹을 위한 결합 지점을 제공하는)를 포함할 수 있다.
P가 -P1-NH-일 경우, 그 또는 각 P 그룹은 아미드 결합을 통해서 인접한 Lk1 및/또는 Lk2에 결합된다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면 PEG(일반적으로 -OH 그룹으로 끝나는 것)는 가령, Lk2의 -CO2 그룹과 아미드 결합을 형성하기 위하여 -NH2 그룹으로 끝나는, 상응하는 PEG amine으로 전환될 수 있고; 또는 -OH 그룹은 상기에 기술한 것처럼 Lk1과 함께 -NH.CO.CH2O- 결합을 형성하기 위해 반응된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, P1은 PEG, 수용성, 합성 중합체를 나타내고 또한 본 명세서 전체에 걸쳐서, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, PEG에 대한 구체적인 참조를 포함하기 위해 P1에 대한 어떠한 일반적인 참조라도 인지해야 한다.
Lk2는 y가 링커이고 상기 y는 2 내지 11을 나타낸다. 상기 Lk2는 1 내지 10 그룹의 P 또는 Lk1과 결합이 가능하다. 가장 간단한 형태에서, Lk2는 결합으로 -P1-NH- 그룹에 직접적으로 결합되고, 또는 만약 P가 결합인 경우, D-Lk1 그룹에 직접적으로 결합한다. 반면, Lk2는 본 발명의 접합체에 포함하는 하나 이상의 D 그룹(오리스타틴 모이어티)의 의미로서 사용될 수 있다. 상기는 아미드 결합을 통해 Lk3의 -CO- 그룹에 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기와의 연결을 통해 달성된다(예를 들면, Lk3에 대응하는 적절한 카르복실릭산 유도체와 함께 아스파테이트 또는 글루타메이트 아민 그룹과의 반응). 이것은 상기에 기술한 화학식 VI의 분기 요소를 제시한다. 이 경우, 각각의 아실 모이어티는 아미드 결합을 통해서 -P1-NH- 그룹에 결합될 수 있고, 또는 P가 결합인 경우, D-Lk1 그룹으로 결합한다. 대안적으로 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기는 상기 기술한 화학식 VIIa 및 VIIb에 보여진 바와 같이, 더 많은 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 잔기들과 결합할 수 있는데 이것은 Lk2에 있는 다른 결합 부위에 있는 다수의 D-Lk1-P 그룹의 결합을 통해 10개까지의 D 그룹을 포함하기 위한 가능성을 준다. Lk2의 원자가(valency)는 D-Lk1-P 그룹에 존재하는 숫자와 연관된다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들면, P가 -P1-NH- 일 때, 각 D-Lk1-P 그룹에 대해, Lk2의 원자가는 -P1-NH- 그룹에 존재하는 숫자와 연관되어 있는데, 즉 p는 y-1과 같을 것이다. P가 결합일 경우, 각 D-Lk1-P 그룹에 대하여, Lk2의 원자가는 D-Lk1에 존재하는 그룹의 숫자와 연관이 되어 있는데, 즉 m은 y-1일 것이다.
Lk3는 결합 단백질의 이황화 결합으로부터 파생된 두 개의 황 그룹을 통해 결합 단백질과 결합 가능한 특이적 링커이다. Lk3의 페닐 그룹 Ph는 치환되지 않거나 또는 치환될 수 있다. 선택적으로 페닐 그룹 Ph에 존재할 수 있는 치환기는 예로 알킬(바람직하게는 C1 - 4알킬, 구체적으로 메틸, 선택적으로 OH 또는 CO2H 에 의해 치환된 것), -CN, -NO2, -CO2R4, -COH, -CH2OH, -COR4, -OR4, -OCOR4, -OCO2R4, -SR4, -SOR4, -SO2R4, -NHCOR4, -NR4COR4, 　NHCO2R4, -NR4.CO2R4, -NO, -NHOH, -NR4.OH, -C=NNHCOR4, -C=N-NR4.COR4, -N+R4 3, -N+H3, -N+HR4 2, -N+H2R4, 할로겐, 예를 들면 플루오린(fluorine) 또는 클로린(chlorine), -C=CR4, -C=CR4 2 및 -C=CHR4으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 같거나 다른 치환을 포함하고, 여기서 각각의 R4은 독립적으로 수소 원자 또는 알킬(바람직하게는 C1 - 6알킬), 아릴(바람직하게는 페닐), 또는 알킬-아릴 (바람직하게는 C1 - 6알킬-페닐)기를 나타낸다. 전자 회수(electron withdrawing) 치환체(susstituents)의 존재는 특히 바람직하다. 바람직한 치환체는 예를 들면 CN, NO2, -OR4, -OCOR4, -SR4, -NHCOR4, -NR.COR4, -NHOH 및 -NR4.COR4을 포함한다. 반면, 페닐 그룹 Ph는 치환되지 않는 것이 바람직하다.
Y가 그룹 Ⅲ를 나타낼 때, 단일 탄소 가교(single carbon bridge)는 Lk3 링커와 결합 단백질 Ab의 이황화 결합으로부터 파생된 두 개의 황 전자 사이에 형성되며, 및 Y가 그룹 IV를 나타낼 때, 그룹 A 및 B의 본질은 Lk3 링커와 결합 단백질 Ab의 이황화 결합으로부터 파생된 두 개의 황 원자 사이에 형성된 교상 결합의 길이를 결정한다. 바람직하게, 3-탄소 교상 결합은 형성되며, 즉 Y는 하기 일반식을 가지는 것이 바람직하다:
Figure pct00051
(IVa)
상기 언급처럼, 하나 이상의 오리스타틴 모이어티를 포함하는 접합체는 이점을 가진다. 하나 이상의 오리스타틴 모이어티의 존재는 다양한 다른 방법으로 달성될 수 있으며, 예를 들어 상기 설명된 분기 PEG의 사용에 의해, 다가(multivalent) 그룹 Lk2의 사용에 의해, 또는 다가 그룹 Lk1의 사용에 의해서 이다. 또한 결합 단백질 Ab로 하나 이상의 링커 Lk3를 접합하는 것에 의해서도 달성될 수 있다. 일반적으로 정상의 전장 항체(full-length antibodies)는 4개의 내부사슬 이황화 결합(interchain disulfide bonds)(전체 IgG1 항체에 대한 중-중(heavy-heavy) 사슬 또는 중-경(heavy-light) 사슬, 및 그것들의 일부 또는 전체는 본 발명에 따라 링커 Lk3에 의해 연결될 수 있다. 또한, 항체 내의 하나 혹은 이상의 사슬 간(intrachain) 이황화 결합이 링커 Lk3에 의해 연결될 수 있음을 예상할 수 있다. 하나 이상의 접합체 그룹이 존재할 때, n은 1보다 크며, n은 예를 들어 2, 3, 또는 4일 수 있다.
대안적 또는 추가적으로, 하나 또는 이상의 추가적인 오리스타틴 모이어티는 Lk1 링커를 통해 결합인 P로 연결될 수 있고, 또는 직접적으로 Lk2 에 연결될 수 있다. 이 경우, m은 1보다 크고, 예로 2, 3 또는 4이며, 최대 10까지이다. 만약 하나 이상의 링커 Lk1가 존재한다면, 이것은 서로 같거나, 또는 다를 수 있다.
대안적 또는 추가적으로, 하나 또는 이상의 추가적인 오리스타틴 모이어티는 다가 링커 Lk1에 연결되어 존재할 수 있다. 이 경우, q는 1보다 크고, 예를 들면 2, 3 또는 4이며, 최대 10까지이다.
본 발명의 접합체가 10개까지의 D 그룹을 가질 수 있다는 것을 예상할 수 있다(오리스타틴 모이어티). 화학식 I의 접합체에 대하여 하나 이상의 D 그룹을 갖는 것이 요구될 때(즉, 하나 이상의 오리스타틴 모이어티), 이는 다수의 방법 중 어느 하나에 의해서 달성될 수 있다. 예를 들면, 다수의 (((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)- 그룹은 하나의 항체에 결합될 수 있다(즉 n은 2 내지 s이다). 이러한 결합 형태의 유형은 하나 이상의 그룹 D를 포함하는 접합체를 제공하는 첫 번째 바람직한 방법이다. 하나 이상의 그룹 D를 포함하는 접합체를 제공하는 두 번째 바람직한 방법은 다가 링커인 Lk1을 사용하는 것인데, 예를 들면 상기 링커 Lk1은 다수의 D 그룹이 존재하도록 하는(즉, q는 2 내지 10이다), 상기에 기술한 바와 같이(화학식 VI, VIIa 및 VIIb의 예시처럼) 하나 또는 그 이상의 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 또는 비슷한 잔기들을 포함한다. 특히 P=1, q=2, m=1 및 Lk2가 결합인 상기 화학식 VI를 포함하는, Lk1이 다가 링커인 접합체는 부분적으로 효과적이라고 여겨지며, 이러한 접합체들이 본 발명의 바람직한 실시예를 형성한다.
대안적으로 또는 추가적으로, Lk2가 1 내지 9의 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 잔기로 구성되는 그룹일 경우, 다수의 ((Dq-Lk1)m-P)- 그룹은 Lk2 그룹에 있는 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기의 카르복실 그룹과 아민 모이어티를 통한 각 그룹의 아미드 결합에 의해 Lk2의 다른 위치에 결합 될 수 있다(즉 p는 2 내지 10 이다). P1이 최소 하나의 에틸렌 또는 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하고 또한 최소 하나의 분기 유닛을 포함할 때, 다수의 (Dq-Lk1)- 그룹은 첨가적으로 또는 대안적으로 P1 그룹의 다른 위치에 결합할 수 있다(즉 m은 2 내지 10 이다).
상기의 조합을 가지는 접합체 또한 본 발명에 포함된다. 예시의 방법에 의해, 접합체는 두 개의 ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3- 그룹에 결합하는 Ab 그룹을 포함할 수 있는데, 여기서 ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3- 그룹 각각에 대해, Lk2는 두개의 (D-Lk1)m-P에 결합 된 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기이고, 상기 (D-Lk1)m-P 그룹에서, P는 -P1-NH- 이고, 여기서 P1은 최소 하나의 에틸렌 또는 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하며 또한 최소 하나의 분기 유닛을 포함하여, 총 8개의 D-Lk1 그룹이 접합체내에 존재하게 된다. 추가 예시에 따르면, 접합체는 두 개의 ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3- 그룹에 결합하는 Ab 그룹을 포함할 수 있는데, 여기서 ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3- 그룹 각각에 대해, Lk2는 결합이고, P는 -P1-NH-이고 여기서 P1은 최소 하나의 에틸렌 또는 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하고 또한 최소 하나의 분기 유닛을 포함하며, 또한 각 Lk1은 두 개의 D 그룹에 결합된 아스파테이트 또는 글루타메이트 또는 비슷한 잔기를 포함하여, 총 8개의 D-Lk1 그룹이 접합체 내에 존재하게 된다.
다른 Lk3, Lk2, P, Lk1 및 D 그룹 역시 같은 접합체 내에 존재할 수 있는데, 예를 들면, 두 개의 (D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3- 그룹에 결합된 Ab 그룹을 포함하는 접합체의 경우, (D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3- 그룹 하나에서 Lk2는 결합일 수 있고 다른 (D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3- 그룹에서는 Lk2가 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기일 수 있다. 비슷하게 Lk2 그룹에 결합하는 다수의 (D-Lk1)m-P 그룹을 포함하는 접합체의 경우, 이러한 그룹의 하나에 대해 P는 결합일 수 있고, 또 다른 그룹에서 P는 -P1-NH-일 수 있다.
가장 간단한 실시예에서, 본 발명은 하나의 오리스타틴 모이어티(n=m= q=p=1)를 갖는 접합체와 연관된다. 상기 접합체는 10개까지의 오리스타틴 모이어티를 포함할 수 있는데, 예를 들면 8개까지의 오리스타틴 모이어티를 가질 수 있다. 4개까지 포함하는 예시일 수 있고, 예를 들면 1, 2, 3 또는 4의 오리스타틴 모이어티를 포함할 수 있다. 두 개의 D 그룹이 존재할 때, 하기의 화학식을 갖는 접합체들로 예시할 수 있다:
Figure pct00052
(Ia) 또는
Figure pct00053
(Ib),
여기서 Lk1은 바람직하게 상기에 기술된 화학식 (Va)의 그룹을 포함한다.
대안적으로, 두 개의 D 그룹이 존재하는 경우에는 하기 화학식의 접합체로 예시할 수 있다:
Figure pct00054
(Ic), 또는
Figure pct00055
, (Id)
여기서, Lk1a는 바람직하게 상기 기술된 화학식 (V)의 그룹을 포함한다.
상기 화학식들은 Ab에 존재하는 이황화 결합의 하나를 가로지르는 X의 결합을 나타낸다. 항체는 4개까지의 내부-사슬 이황화 결합을 포함하고, 또한 만약 이러한 결합들 각각이 하나의 오리스타틴 분자를 가지고 있는 시약(reagent)에 의해 형성된다면, 결과적인 접합체는 4의 약물:항체 비율(drug:antibody ratio, DAR)을 가질 것이다. 만약 두 개의 오리스타틴 분자를 가지는 시약이 4개의 이황화 결합 모두에 결합한다면, 예를 들면 두 개의 PE 또는 PEG 사슬을 가지거나 PE 또는 PEG 분기를 가지거나 링커 Lk1 분기를 가지는 시약일 경우에, DAR은 8이 된다. 이러한 높은 DAR을 가지는 접합체는 상당한 임상적 장점을 가질 수 있다. 상기 화학식 Ia 내지 Ie의 접합체이나, Ab가 2, 3 또는 특히 4개의 ~X- 그룹의 복제본을 가지는 경우는 본 발명의 바람직한 하나의 실시예를 형성한다.
편의상, "결합 단백질(binding protein)"이라는 용어는 본 명세서에서 결합 단백질 및 펩타이드를 모두 포함하고, 또한 문맥상 특별한 내용이 요구될 때를 제외하고, 펩타이드는 물론 단백질도 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 접합체에 사용되는 결합 단백질은 표적에 존재하는 결합 파트너를 위한 결합 물질로서 작용할 수 있는 어떠한 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드를 포함한다. 상기 표적은 예를 들면, 미세 생물(micro-organism), 바이러스, 또는 암 또는 면역 세포인 세포이다. 따라서 결합 단백질은 오리스타틴을 특정 표적으로 겨냥하도록 한다. 이러한 결합 단백질의 예로는 전장 항체, 항체 절편, 합리적인(rational) 또는 조합적인(combinatorial) 단백질 공학 기술들에 의해 얻어지는 면역글로블린(immunoglobulin, Ig) 및 비-Ig 단백질 부위(non-Ig protein scaffolds) 스카폴드(scaffolds) 및 렉틴(lectin)을 포함한다. 단백질-약물 접합체에서 가장 일반적인 결합 단백질로 사용되는 것은 항체이고, 결합 단백질 또는 그룹 Ab에 대한 어떠한 참조는, 문맥상 특별한 내용이 요구될 때를 제외하고, 항체에 대한 특정한 참조를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, "항체(antibody)"라는 용어는 면역글로불린 분자의 가변 지역(variable region) 내의 적어도 하나의 항원인식 부위에서 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질(lipid) 또는 이들의 조합과 같은, 표적 항원을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어 "항체"는 다클론항체(polyclonal antibodies), 단일클론(monoclonal) 항체, 이중특이적(bispecific) 항체, 키메라(chimeric) 항체, 인간화(humanised) 항체, 인간(human) 항체, 항체의 항원 결정 부위(antigen determination portion)를 포함하는 융합 단백질(fusion protein)과 같은 다가특이적(multispecific) 항체 및 항체가 바랐던 생물학적 활성을 나타내는 것처럼 오랫동안 항원 인식 부위를 포함하는 어떠한 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 면역글로불린의 5가지 주요 클래스 중 어떠한 것일 수 있다: 각각 알파(alpha), 베타(beta), 입실론(epsilon), 감마(gamma), 및 뮤(mu)로서 나타내지는 이들의 중-사슬 불변 도메인(heavy-chin constant domain)의 특징Iidentity)을 기반으로, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이들의 하위그룹(subclasse)(동형(isotype))(예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 면역글로불린의 다른 클래스는 각기 다르고 잘 알려진 서브유닛(subunit) 구조 및 3차원 구조(configuration)를 가진다. IgG1 또는 IgG4의 사용이 특히 바람직하다.
나아가, 문맥상 특별한 내용이 요구될 때를 제외하고, "항체"라는 용어는 전장 항체(full length antibodies) 및 항원-결합 지역(antigen-binding region)을 포함하는 전장 항체 및 항체 단편(antibody fragments)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 항체 단편은 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, 2가항체(diabody), 미니바디(minibody) 또는 항체 절편으로부터 형성된 다가특이적 항체, 예를 들면 scFv 단편 또는 2가항체의 다른 순열(permutation)로 구성된 미니바디 및 선택적으로 scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, Fab-scFv, (Fab'ScFv)2, scDiabodies, scDiabody-Fc, scDiabody-CH3, scFv-CH3, scFv-CH2-CH3 융합 단백질과 같은 Fc 단편 또는 CH 도메인 등 일 수 있다. 항체 단편은 효소적인 절단(enzymatic cleavage), 합성 기술 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
결합 단백질은 수용체, 항체, 또는 예를 들어, 증식(proliferation), 자가면역(autoimmune) 또는 감염성 질병(infectious disease)에 연관되는 세포 또는 바이러스와 같은 표적의 표면에 존재하는 다른 모이어티를 위한 결합 시약으로서 작용한다. 예를 들어, 결합 단백질은 암 세포에 존재하는 세표 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 암 세포를 겨냥하는 항체를 위한 세포 표면 항원의 식별 및 검증의 방법은 알려진 바 있는데, Carter P, et al., Endocr, Relat. Cancer, 2004, Dec;11(4):659-87의 예시에서, 암을 치료하기 위한 수많은 항체-약물 접합체가 현재 임상적 개발에 있다고 한다. 암 치료를 위해 이용 가능한 항체의 예시 및 특정 항체의 종양 표지자(tumour marker)는 당 업계에 공지되어있고 사용되고 있다. 대안적으로, 표적은 면역 세포일 수 있는데, 예를 들면 자가면역 항체를 생산하는데 책임이 있는 세포이거나, 자가면역 질병과 연관된 활성화된 림프구(lymphocyte)이다. 다른 실시예에서, 표적은 미세-생물이거나 또는 세균성 또는 바이러스 감염 또는 질병과 연관된 바이러스 일 수 있다.
본 발명의 접합체는 결합 단백질에 있는 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 제거하고, 하기의 일반적인 화학식을 갖는 접합 시약과 반응하여 준비될 수 있다:
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII)
여기서, D, Lk1, P, Lk2 및 m, p 및 q는 화학식 I에 주어진 의미이며, Lk3a는 하기의 일반적인 화학식을 나타낸다:
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
여기서 Ph는 상기의 의미를 가지며, Xa는 CO 그룹을 나타내고, Ya는 다음의 그룹을 나타낸다:
Figure pct00056
(X),
Figure pct00057
(XI),
Figure pct00058
(XII) 또는
Figure pct00059
(XIII)
여기서, A와 B는 상기의 의미를 갖고, 각 L은 독립적인 잔여 그룹, 및 x는 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
상기 화학식 X, XI, XII 및 XIII의 그룹은 서로의 화학적 당량으로, 화학식 X와 XI의 그룹은 항체의 이황화 결합을 가로지르는 하나의 탄소 가교(bridge)로 연결되고, 화학식 XII 및 XIII의 그룹은 더 긴 탄소 가교로 연결되는데, 이는 하기의 n=1인 경우이다:
Figure pct00060
(XIV) 또는
Figure pct00061
(XV)
그룹 X 또는 XII를 포함하는 접합 시약과 항체가 반응할 때, 반응 경로에서 즉각적인 단계는 각각 그룹 XI 또는 XIII를 포함하는 접합 시약으로 연결되는 하나의 잔여 그룹(leaving group) L을 잃는 것이다. 그러므로, 화학식 XI 또는 XIII의 접합 시약은 원 위치에서(in situ) 또는 처음부터(ab initio) 준비된다. X, XI, XII 또는 XIII의 어느 그룹을 포함하는 접합 시약을 사용하는 주 특징은 Michael 활성 모이어티로 작용하는 전자 회수 기능과 함께, 알파-메틸렌(α-methylene) 잔여 그룹과 이중 결합이 교차-접합(cross-conjugated)된다는 것이다. 만약 잔여 그룹이 직접적으로 재배열하는 것보다 교차-기능적 시약에서의 제거가 쉽다면, 또한 전자-회수 그룹이 Michael 반응을 위한 적절한 활성 모이어티라면 순차적인 분자내의(intramolecular) 비스-알킬레이션(bis-alkylation)이 연이은 Michael 및 역(reverse) Michael 반응에 의해 일어날 수 있다. 잔여 모이어티는 첫 번째의 알킬레이션이 일어나기 전에는 노출되지 않는 잠재적 결합성 이중 결합 및 순차적이고 상호 작용적인 Michael 및 역-Michael 반응으로 나타나는 비스-알킬레이션을 감추기 위해 작용한다. 전자 회수 그룹 및 잔여 그룹은 비스-알킬레이션이 순차적인 Michael 및 retro-Michael 반응에 의해 발생하도록 최적으로 선택될 수 있다. 이중 결합 또는 잔여 그룹 및 전자 회수 그룹 사이에 접합 된 추가적인 다결합(multiple bond)과 함께 교차-기능적인 알킬레이팅(alkylating) 시약을 준비하는 것이 가능하다.
잔여 그룹 L은 예를 들어, -SR4, -SO2R4, -OSO2R4, -N+R4 3, -N+HR4 2, -N+H2R4, 할로겐 또는 -OØ, 여기서 R4는 상기 주어진 의미를 갖고, Ø은 치환된 아릴, 특히 페닐, 그룹, 하나 이상의 전자 회수 치환체, 예를 들면 -CN, NO2, -CO2R4, -COH, -CH2OH, -COR4, -OR4, -OCOR4, -OCO2R4, -SR4, -SOR4, -SO2R4, -NHCOR4, -NR4COR4, -NHCO2R4, -NR4CO2R4, -NO, -NHOH, -NR4OH, -C=N-NHCOR4, -C=N-NR4COR4, -N+R4 3, -N+HR4 2, -N+H2R4, 할로겐, 특히 클로린 또는 특히, 플루오린, -C≡CR4, -C=CR4 2 및 -C=CHR4, 여기서 각 R4는 독립적으로 상기에 제시된 의미들 중 하나를 갖는다. 특히 바람직한 잔여 그룹 L은 -SR4 또는 -SO2R4, 특히 -SO2R4, 여기서 R4는 페닐 또는, 특히, 토실(tosyl) 그룹을 나타낸다. 따라서, 특히 바람직한 Ya는 하기와 같다:
Figure pct00062
(XIIa).
바람직한 접합 시약의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00063
(VIIIa), 및
Figure pct00064
(VIIIb),
여기서 Lk1은 상기에 기술한 화학식 (Va)의 그룹, 여기서 Ya는 바람직하게 화학식 (XII) 이며, 특히 A 및 B가 각각 -CH2-인 것이 바람직하다.
더 바람직한 접합 시약의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00065
(VIIIc), 및
Figure pct00066
(VIIId),
여기서, Lk1은 바람직하게 상기 기술한 화학식 (V)의 그룹, 여기서 Ya는 바람직하게 화학식 (XII)의 그룹이고, 특히 여기서 A와 B는 각각 -CH2- 인 화학식 (V)의 그룹을 구성한다.
또 다른 더 바람직한 접합 시약의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00067
여기서, b는 1, 2 또는 3이다. Ya는 바람직하게 화학식 (XII)의 그룹이고, 특히 A와 B가 각각 -CH2-인 것이다. P1은 바람직하게 PEG이고, 특히 상기에 언급된 것들 중 하나이고, 또한 바람직하게 15 내지 35개의 반복되는 -O-CH2-CH2- 유닛을 가지는 것이다.
상기에 기술한 시약 중 하나를 사용하는 결합 과정의 즉각적인 생산물은 오리스타틴-항체 결합물로서, 여기서 X는 케토(keto) 그룹 CO를 나타낸다. 반면, 본 발명의 과정은 적절한 환경에서 가역적이다. 이것은 몇몇의 적용을 위해 바람직할 수 있는데, 예를 들면 항체로부터 오리스타틴의 급격한 분리가 요구될 때 바람직하며, 반면 다른 적용에 대해서는 급격한 분리가 바람직하지 않을 수 있다. 그러므로 이것은 CH.OH 그룹 X를 수득하기 위한 CO 그룹 X의 환원에 의해서 접합체를 안정화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 상기에 서술된 과정은 Lk3에 있는 CH.OH 그룹 X를 가지는 접합체를 제공하기 위해 Lk3에 있는 초기에-형성된 CO 그룹 X를 환원하는 추가적인 선택적 과정을 포함할 수 있다. 환원제(reducing agent)로서 보로하이드리드(borohydride), 예를 들어 소듐 보로하이브리드(sodium borohydride), 소듐 시아노보로하이드리드(sodium cyanoborohydride), 포타슘 보로하이드리드(potassium borohydride) 또는 소듐 트리아세토시보로하이드리드(sodium triacetoxyborohydride), 등의 사용이 특별히 바람직하다. 다른 환원제로는, 예를 들어 틴(II) 클로라이드(tin(II) chloride), 알루미늄 알콕사이드(aluminium alkoxide)와 같은 알콕사이드(alkoxide), 및 리튬 알루미늄 하이드리드(lithium aluminium hydride)가 사용될 수 있다.
상기에 기술된 과정을 위한 적절한 반응 환경은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함되어 있는 WO 2005/007197 및 WO 2010/100430로부터 인용되었다. 상기 과정은 예를들어 모든 시약이 용해가능 할 때, 용매(solvent) 또는 용매 혼합물에서 시행될 수 있다. 상기 항체는 수용성 반응 배지(medium)에 있는 결합 시약에 직접적으로 반응하도록 용납된다. 또한 상기 반응 배지는 친핵성(nucleophile)의 pH 요구에 따라서, 완충되어있다(buffered). 상기 반응을 위한 최적의 pH는 일반적으로 최소 4.5이고, 전형적으로 약 5.0 내지 약 8.5 사이이며, 바람직하게 약 6.0 내지 8.2이다. 최적의 반응 환경은 물론 사용되는 특정 시약에 따라 달라진다.
반응 온도는 3 내지 37℃가 일반적으로 적당하다. 유기농 배지(예를 들면, THF, 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone))에서 수행하는 반응은 특징적으로 대기 온도내에서 수행한다.
결합 단백질은 화학양론적(stoichiometric)으로 등가이거나 또는 초과된 시약을 이용하여 원하는 시약(reagent)과 효과적으로 접합 될 수 있다. 초과 시약과 생성물(product)는 일반 정제 과정 중 쉽게 분리될 수 있고, 예로 기본 크로마토그래피(standard chromatography), 예를 들어 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 또는 사이즈배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 디아필트레이션(diafiltration), 또는 폴리히스티딘 택(polyhistidine tag)이 존재할 경우, 메탈친화 크로마토크래피(metal affinity chromatography), 즉 니켈(nickel) 또는 아연(zinc)을 사용하여 분리할 수 있다. 결합 단백질 내 특정 이황화 결합의 타겟팅은 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다; 예를 들어, 단백질의 부분 환원에 의한 것은, 다음의 예시로 확인하면 된다 Liu et al, Anal. Chem. 2010, 82, 5219-5226.
일반적인 화학식 Ⅷ의 결합 시약은 하기 일반적인 화학식의 화합물과 오리스타틴의 반응에 의해 준비될 수 있다:
(( Lk 1b ) m -P) p - Lk 2 - Lk 3a
여기서 m, P, L, p, Lk2 및 Lk3는 일반적인 화학식 Ⅷ의 의미를 가지고, Lk1b는 오리스타틴내에 존재하는 그룹과 반응하는 그룹을 포함하도록 변경된 화학식 Lk1 식의 그룹이다. 특징적으로, Lk1b는 모노메틸 오리스타틴의 말단 질소 원자와 반응할 수 있다. 전형적인 그룹 및 적합한 반응은 숙달된 사람에게 알려져 있다.
일반적인 화학식 Ⅷ의 접합 시약은 신규하고, 그러므로 본 발명은 시약 그 자체(per se)를 제공한다. 상기 신규한 시약에서 Lk1, P, Lk2, m, p 및 q의 의미는 상기 일반적인 화학식 I에 대해 주어진 의미가 바람직하다. 본 발명은 더 나아가, 본 발명에 따른 오리스타틴-단백질 결합을 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 약학적 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하며, 선택적으로 추가적인 치료 시약(therapeutic agent)을 포함하고; 이러한 치료에 사용하기 위한 결합은, 특히, 증식(proliferative), 자가면역(autoimmune) 또는 감염(infections) 질환, 예를 들어 암(cancer)과 같은 질병의 약제로서 사용하기 위함이며; 또한 접합체 또는 약학적 조성물을 환자에게 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 예를 들어 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's Lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukaemia), 다발성 골수증(multiple myeloma), 림프성 백혈병(lymphocytic leukaemias) 및 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenousleukaemia)을 포함하는 백혈병(leukaemia); 위암(gastric cancer); 유방암(breast cancer); 난소암(ovarian cancer); 간암(liver cancer); 장암(intestinal cancer); 대장암(colon cancer); 신장암(renal cancer), 예를 들어 신장 세포 암종(renal cell carcinoma); 폐암(lung cancer), 예를 들어 소 세포 폐암(small cell lung cancer); 흑색종(melanoma); 방광암(bladder cancer); 및 육종(sarcomas)을 포함하는 특정 조건에 대한 효용을 찾을 수 있다.
상기 서술된 바와 같이, 본 발명의 어떤 바람직한 실시예는 하나 이상의 오리스타틴 분자를 갖는 특정 접합체와 연관되어 있다. 특별한 분기 구조를 가지고 있거나 넓은 범위의 약물을 포함하는 특정 약물 접합체는 신규하며, 다른 실시예에서는, 본 발명은 또한 상기 접합체 그 자체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 하기 일반적인 화학식을 갖는 접합체를 제공한다.
(((D'q-LkI')m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab (I')
여기서, D'는 약물 모이어티를 나타내고;
q'는 2 내지 10의 정수를 나타내며;
LkI'는 링커를 나타내고;
m은 1 내지 10의 정수를 나타내고;
P는 결합 또는 z-가 그룹 -P1-NH-를 나타내고, 여기서 z는 2 내지 11이고 P1은 최소 하나의 에틸렌 유닛 -CH2-CH2- 또는 에틸렌 글리콜 유닛 -O-CH2-CH2-을 포함하는 그룹을 나타낸다;
p는 1내지 10의 정수를 나타내고;
Lk2는 결합 또는 y-가 링커를 나타내는데, 여기서 y는 2 내지 11인 1 내지 9개의 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 잔기를 구성한다;
Lk3는 하기 일반적인 화학식의 링커를 나타낸다:
-CO-Ph-X-Y- (II)
여기서 Ph는 선택적으로 페닐 그룹으로 치환될 수 있다; X는 CO 그룹 또는 CH.OH 그룹을 나타내고; Y는 하기 화학식의 그룹을 나타낸다:
Figure pct00068
(III) 또는
Figure pct00069
(IV)
여기서 A 및 B는 각각 C1 - 4알킬렌 또는 알케닐렌 그룹을 나타낸다;
Ab는 표적에 있는 결합 파트너에 결합할 수 있는 능력을 가진, 결합 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 상기 결합 단백질은 결합 단백질 또는 펩타이드에 있는 이황화 결합으로부터 유래된 두개의 황 원자를 통해 Lk3에 결합한다; 또한
n은 1 내지 s를 나타내고, 여기서 s는 Lk3로의 결합보다 전에 결합 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 이황화 결합의 숫자를 나타낸다;
m,n,p,q',y와 z의 의미는 접합체가 1에서 10의 D'그룹을 함유하도록 선택된다.
본 발명의 이러한 양상에서, m, P, p, Lk2, Lk3, n 및 Ab는 의미를 가지는데 바람직하게 D가 오리스타틴 모이어티인 것을 나타내는 본 발명의 상기 양상에서 주어지는 의미를 갖는다.
D'는 결합 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것이 바람직한 어떠한 약물을 나타낼 수 있다. 예를 들면 세포 독성(cytotoxic) 약물일 수 있다. 예를 들면, 상기 기술된 것처럼, 오리스타틴일 수 있고, 또는 메이스타신일 수 있다. 용어 메이스타신은 메이스타신 그 자체거나, 15-메톡시안사미토신 P-3(15-methoxyansamitocin P-3)과 같은 메이탄시노이드(maytansinoids)거나, 및 상기 물질들의 유도체이다.
바람직하게 메이탄신은 하기의 하부구조 (A)를 포함하는 화합물이다:
Figure pct00070
(A),
여기서 X는 O 또는 S를 나타내고; Ra는 수소 또는 C1 - 4알킬을 나타내며; Rb는 수소, 하이드록시, C1 - 4알콕시 또는 C1 - 4알킬C(O)O-를 나타내고; Rc는 수소, 하이드록시, C1 - 4알콕시 또는 C1 - 4알킬C(O)o-를 나타내며; Rd는 수소 또는 C1 - 4알킬을 나타내고; Re는 할로겐 또는 수소를 나타내며, Rf는 수소 또는 C1 - 4알킬을 나타낸다.
바람직하게 X는 O를 나타낸다. 바람직하게 Ra는 C1 - 4알킬을 나타내고, 특히 메틸을 나타낸다. 바람직하게 Rb는 수소를 나타낸다. 바람직하게 Rc는 수소 또는 메톡시(methoxy)를 나타내고, 더 바람직하게 수소이다. 바람직하게 Rd는 C1 - 4알킬이고, 특히 메틸을 나타낸다. 바람직하게 Re는 클로린 또는 수소를 나타내고, 특히 클로린을 나타낸다. 바람직하게 Rf는 C1 - 4알킬을 나타내고, 특히 메틸을 나타낸다.
더 바람직하게, 메이탄신은 하기 하부구조 (B)를 포함한다:
Figure pct00071
(B),
여기서 X 및 Ra-Rf는 상기 기술된 의미를 갖는다.
더더욱 바람직하게, 메이탄신은 하기 하부구조 (C) 또는 (D)를 포함한다:
Figure pct00072
(C),
Figure pct00073
(D),
(C)가 가장 바람직하다.
메이탄신은 하부구조 (A), (B), (C) 또는 (D)의 에스터 카보닐(ester carbonyl) 탄소 원자에 결합되는 하기의 그룹 (E)를 포함할 수 있다.
Figure pct00074
(E),
예를 들어, 메이탄신은 하기 하부구조 (F)를 포함할 수 있다:
Figure pct00075
(F).
어떤 바람직한 실시예에서, 메이탄신은 하부구조 (A), (B), (C) 또는 (D)의 에스터 카보닐 탄소 원자에 결합된 그룹 중 하나를 포함한다:
Figure pct00076
(G),
Figure pct00077
(H),
Figure pct00078
(I),
Figure pct00079
(J),
Figure pct00080
(K).
어떤 실시예에서, 메이탄신은 하부구조 (A), (B), (C) 또는 (D)의 에스터 카보닐 탄소 원자에 결합된 하기 그룹 (L)을 포함한다:
Figure pct00081
(L).
구체적인 메이탄신의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00082
(M) (메이탄신),
Figure pct00083
(N),
Figure pct00084
(O) (안사미토신 P-3),
Figure pct00085
(P) (머탄신(Mertansine, DM1)),
Figure pct00086
(Q) (S-메틸 DM1),
Figure pct00087
(R) (DM4), 및
Figure pct00088
(S) (15-메톡시안사미토신 P-3).
Lk1'는 어떠한 적절한 위치에 있는 약물 모이어티에 결합할 수 있다. 예를 들면 상기에 보여진것과 같이 오리스타틴에 결합된 링커 Lk1이다. D'가 그룹 (E)를 포함하는 메이탄신에 대응하는 메이탄신 모이어티일 경우, Lk1'는 예를 들면 그룹 (E)의 질소 원자에 결합된 것이고, 하기의 예이다:
Figure pct00089
(T).
Lk1'는 두 개 이상의 약물 모이어티 D'를 P 그룹에 연결하는 링커이다. 상기 Lk1'는 2 내지 10 D' 그룹을 가질 수 있다. Lk1'는 바람직하게 분해 가능한 그룹을 갖는데, 즉 Lk1'는 바람직하게 Ab로부터 D'를 분리하는, 생리적 환경(physiological conditions)에서 분해되는 링커이다. 대안적으로, Lk1'은 생리적 환경에서 끊어질 수 없는 링커일 수 있다. Lk1'가 생리적 환경에서 끊어질 수 있는 링커인 경우, 세포내 환경에서 절단되는 것이 바람직하다. 표적이 세포 내에 있는 경우, Lk1'는 그 후에 세포 외부 환경에 둔감한 것이 바람직하다(즉, 이로 인해 치료 물질의 충분한 도스로 세포 내 표적에 전달되는 것이 방해되지 않는다).
Lk1'가 분해 가능한 링커인 경우, 이것은 가수분해성 환경에 민감한 그룹을 가질 수 있다. Lk1'는 특정 pH 값(예를 들어, 산성 환경)에서 분해되는 그룹을 가진다. 가수분해성/산성 환경은 엔도좀 또는 리소좀에서 발견된다. 산성 환경에서 가수분해에 민감한 그룹의 예로는 히드라존, 세미카바존, 티오세미카보아존, 시스-아코토닉 아미드, 올소에스터 및 아세탈/케탈 등이 있다. 가수분해성 환경에 민감한 그룹의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00090
및
Figure pct00091
.
또한 Lk1'는 환원 환경에서 분해에 민감할 수 있다. 예를 들면, Lk1'는 싸이올과 같은 생물학적 환원제에 노출되면 절단되는 이황화 그룹을 포함한다. 이황화 그룹의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00092
,
여기서, R, R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 또는 C1 -4alkyl, 및
Figure pct00093
.
또한 Lk1'는 효소적 분해에 민감한 그룹을 포함할 수 있는데, 예를 들면 프로테아제(protease, 예를 들어, 리소조말 또는 엔도조말 프로테아제) 또는 펩티다제(peptidase)이다. 예를 들어, Lk1'는 최소 하나, 또는 최소 둘, 또는 최소 세개의 아미노 산 잔기(예, Phe-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Cit, Phe-Lys)로 구성되는 펩타이드(peptidyl) 그룹을 갖는다. 예를 들면, Lk1'는 1 내지 5, 또는 2 내지 4의 아미노산을 갖는 아미노산 사슬이다. 또 다른 효소적 분해에 민감한 그룹의 예는 하기이다:
Figure pct00094
,
여기서 AA는 Val-Cit와 같은 프로테아제 특이적인 아미노산 서열을 나타낸다.
Lk1'는 하기를 포함한다:
Figure pct00095
(V)
예를 들면, Lk1'는 하기를 포함한다
Figure pct00096
(Va)
화학식 I'로 제시되는 본 발명의 어떤 실시예에서, q'는 1보다 크고, 예를 들면 2,3, 또는 4 이고, Lk1'는 본 발명의 접합체로 결합하는 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하는 의미로서 사용된다. Lk1'는 분기 링커인데, 예를 들면 아스파테이트 또는 글루타민 또는 비슷한 잔기에 포함하는 것이다. 이것은 하기 화학식의 분기 요소를 제시한다:
Figure pct00097
(VI)
여기서 b는 1, 2 또는 3 이고, b=1은 아스파테이트이고 b=2는 글루타메이트, 및 b=3은 한 바람직한 실시예를 나타낸다. 화학식 VI에 있는 각각의 아실 모이어티는 적합한 링커 Lk1a를 통하여 그룹 D에 연결되는데, 상기 Lk1a는 어떠한 적합한 링커인데, 예를 들면 상기 Lk1'에 대해 언급한 연결 중 하나에 포함되는 분해 가능한 링커이다. 한 특정 실시예에서, Lk1a는 상기의 그룹 V를 나타낸다. 아스파테이트 또는 글루타메이트 또는 비슷한 잔기의 아미노 그룹은 어떤 적합한 방법으로 P에 결합되는데, 예를 들면 아미드 결합을 통한 연결, 그 예로써 상기 분기 그룹은 -CO.CH2-그룹을 통해 P에 결합되는 것으로써, 하기와 같다:
Figure pct00098
(VIa)
만약 원한다면, 아스파테이트 또는 글루타메이트 또는 비슷한 잔기는 추가의 아스파테이트, 글루타메이트 및/또는 비슷한 잔기들과 연결될 수 있는데, 예를 들면:
Figure pct00099
(VIIa)
또는
Figure pct00100
(VIIb)
계속하여, 10 개의 D 그룹까지 포함하는 잠재력을 제공하며, 최대 9개까지 상기 잔기들이 계속된다. 상기 서술된 바와 같이, 각 D'는 어느 적합한 링커 Lk1a를 통해 아스파테이트/글루타메이트 또는 비슷한 잔기에 결합된다.
바람직한 화학식 I'의 접합체는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure pct00101
여기서 a, b 및 Ab는 상기 기술된 의미를 갖는다. D'는 예를 들어 상기 기술된 메이탄신 또는, 특별히, 오리스타틴 이다.
화학식 I'의 접합체는 상기 기술된 바대로 준비될 수 있고, 필요한 변화는 생길 수 있으며(mutatis mutandis), 화학식 I의 접합체에 대해서, Lk1'는 LK1으로 대체되는 것이 고정되고, D'는 D로 대체되며, q는 1보다 크다.
접합 시약은 하기의 화학식을 갖는다:
(((D'q-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII')
여기서 D', q', Lk1', m, P, p, Lk2 및 Lk3은 의미를 갖고 바람직하게 상기 주어진 의미이며, 신규하고, 본 발명의 부분을 구성한다. 상기 물질들은 화학식 VIII의 시약을 위해 상기 기술된 방법으로 준비될 수 있으며, 필요한 변화는 생길 수 있다(mutatis mutandis). 본 발명의 상기 양상에 따르는 특별히 바람직한 접합체 시약은 하기의 화학식을 갖는다:
Figure pct00102
여기서 b는 1, 2, 또는 3이다. Ya는 화학식 (XII)의 그룹인 것이 바람직하고, 특히 A 및 B가 각각 -CH2-인 것이 바람직하다. 바람직하게 P1은 PEG이고, 특히 상기 언급한 것 중 하나인 것이 바람직하며, 또한 바람직하게 15 내지 35의 반복적인 -O-CH2-CH2- 유닛을 갖는다. 또한 바람직하게 상기 화학식의 Ab가 2, 3 또는 바람직하게 4개의 -X-그룹을 가지는 당량 구조이다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 화학식 I'의 접합체를 구성하는 약학적 조성물 및 약학적으로 용인되는 담체(carrier), 선택적으로 추가적인 치료적 시약; 치료에 사용하기 위해서, 또는 증식, 자가면역 또는 감염성 질병, 예를 들면 암과 같은 질병의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 접합체; 및 환자에게 상기 접합체 또는 약학적 조성물의 약학적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 접합체가 사용될 수 있는 특정 조건은 상기 언급한 것을 포함한다.
놀랍게도, Lk1이 분기 링커가 아니고 q'가 1인, 반면 분기 링커 Lk2를 이용하여 분기가 분자에 제시되는 약물 분자 D'를 같은 개수로 포함하고 있는 접합체에 해당하는 것과 비교하여 향상된 활성을 가지고 있는 화학식 I'의 화합물이 발견되었다.
화학식 I'의 접합체에 연관된 본 발명의 구체적인 특징은 하기와 같다.
1. 화학식 I'의 접합체는 상기 기술된 접합체.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 D'가 세포 독성 약물인 접합체.
3. 제 1항에 있어서, 상기 D'가 오리스타틴 또는 메이스타신인 접합체.
4. 제 3항에 있어서, 상기 D'가 그것의 질소 원자 말단을 통해 모노에틸오리스타틴 E 또는 모노메틸오리스타틴 F와 결합되어 있는 접합체.
5. 제 4항에 있어서, 상기 오리스타틴은 그것의 질소 원자 말단을 통해 모노에틸오리스타틴 E와 결합되어 있는 접합체.
6. 상기 중 어느 한 항에 있어서, Lk1'는 분해가능한 링커.
7. 제 6항에 있어서, 상기 접합체는 Lk1'가 하기의 그룹 중 하나를 갖는 접합체:
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
여기서 R, R', R'' 및 R'''은 각각 수소 원소 및 알킬 그룹을 나타내고 AA는 프로테아제-특이적인 아미노산 서열을 나타냄.
8. 제 7항에 있어서, 상기 Lk1'가 하기를 포함하는 접합체:
Figure pct00108
(V).
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Lk1'가 하기 화학식의 구성요소를 포함하는 접합체:
Figure pct00109
(VI)
여기서 b는 1, 2 또는 3.
10. 제 1항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 접합체:
Figure pct00110
여기서 b는 1, 2 또는 3이고; Ab가 2, 3 또는 4의 ~X-그룹을 갖는 당량 구조.
11. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, P는 결합을 나타내고 또는 P는 -P1-NH-를 나타내는데 여기서 P1은 2 내지 10의 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하는 접합체.
12. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, P가 폴리에틸렌 글리콜을 나타내는 접합체.
13. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, Lk3에 있는 페닐 그룹 Ph가 대체되지 않은 접합체.
14. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 하기 화학식을 갖는 접합체:
Figure pct00111
15. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 전장 항체 또는 전장 항체의 항원-결합 지역을 포함하는 항체 단편을 나타내는 접합체.
16. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 IgG1 또는 IgG4 또는 IgG1 또는 IgG4의 단편을 나타내는 접합체.
17. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질에 있는 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 감소시키고 및 그 후에 하기의 일반적인 화학식의 접합체 시약과 반응하는 것을 포함하는 과정:
((D'q-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII')
여기서 D', Lk1', P, Lk2 및 m, p, q'는 제 1항에서 제시된 의미를 갖고, 또한 Lk3a는 하기 화학식의 그룹을 나타냄:
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
여기서 Ph는 제 1항에서 제시된 의미를 갖고, Xa는 CO 그룹, 및 Ya는 하기의 그룹을 나타냄:
Figure pct00112
(X),
Figure pct00113
(XI),
Figure pct00114
(XII) 또는
Figure pct00115
(XIII)
여기서 A 및 B는 제 1항에서 제시된 의미를 갖고, X는 CO로 나타내는 화학식 I'의 접합체를 생산하기 위해; 및 선택적으로 CH.OH 그룹 X를 가지는 접합체를 제공하여 이미 형성된 CO 그룹 X를 감소시키기 위해, 각 L은 독립적인 잔여 그룹을 나타내고, x는 1부터 4까지의 정수를 나타냄.
18. 제 17항에 있어서, Ya는 하기를 나타냄:
Figure pct00116
(XIIa).
19. 하기 일반적인 화학식을 갖는 화합물:
((D'q-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII')
여기서 D'는 제 1항 내지 제 5항에서 제시된 의미를 갖고; Lk1'는 제 1항 및 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 제시된 의미를 갖고; P는 제 1항, 제 10항 및 제 11항 중 어는 한 항에 제시된 의미를 가지며; Lk2, m, p 및 q는 제 1항에 제시된 의미를 갖고, 또한 Lk3a는 하기 화학식의 그룹을 나타냄:
-CO-Ph-Xa-Ya (IX)
여기서 Ph는 제 1항 또는 제 10항에 제시된 의미를 갖고, Xa는 CO 그룹을 나타내며, Ya는 하기 그룹을 나타냄:
Figure pct00117
(X),
Figure pct00118
(XI),
Figure pct00119
(XII) 또는
Figure pct00120
(XIII)
여기서 A 및 B는 제 1항에 제시된 의미를 갖고, 각 L은 독립적으로 잔여 그룹, 및 X는 1 내지 4의 정수를 나타냄.
19. 제 18항에 있어서, 상기 화합물은 Ya가 하기를 나타내는 화합물:
Figure pct00121
(XIIa)
20. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 선택적으로 추가적인 치료적 시약을 포함하는 약학적 조성.
21. 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 15항의 어느 한 항의 접합체 또는 제 20항의 성분의 용도.
22. 환자에게 약학적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는 제 1항 내지 제 15항의 어느 한 항의 환자를 치료하는 방법 또는 제 20항의 약학적 성분.
본 발명의 접합체는 이전까지 그 존재를 예측할 수 없었던 몇 개의 중요한 장점을 입증하였다. 현재 상업적으로 이용 가능한 접합체로 사용중인, 말레이미드 시약을 사용하여 준비된 등가의 약물-항체 접합체와 비교하여, 본 발명의 접합체는 현저하게 증가 된 안정성을 입증한다. 더 나아가, 상기 접합체를 합성하는 방법은 약물-항체 비율 면에서 말레이미드를 사용한 것과 비교하여 현저하게 개선된 동질성을 가진 생성물을 만들어낸다. 동질성은 약물 물질(drug substance) 생성의 규칙성에 대해서 약물 물질을 위한 장점이 된다. 단일 DAR 종의 높은 수득을 발생하는 과정은 높은 효율을 통해 비용이 적게 들 것이다. 이질적인 혼합물로부터 정제된 DAR 종에 의해 만들어진 단일 DAR 종의 생성물인 약물은 많은 양을 생산하기 위해서 비용이 많이 들기 때문에 금지될 수 있다.
더 나아가, 다르게 또는 다른 속도로 대사되어 더 많은 이질성의 분해 생성물을 제공하는 혼합된 DAR에 대비하여, 모든 약물 물질이 비슷한 방법으로 대사되어야 같은 생성물을 제공하는 것처럼, 단일 DAR 종은 더 예상 가능한 약동력학, 안전성, 독성 및 내성을 입증할 것이다.
이하, 본 발명의 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
실험예 1: 말단 비스-설폰(bis-sulfone) 기능(functionality)을 가진 24개의 반복적인 유닛 PEG를 갖고 있는 발린(valine)-시트룰린(citrulline)-파라아미노벤질(paraaminobenzyl)-모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E)(val-cit-PAB-MMAE) 시약 1 의 합성.
Figure pct00122

단계 1: 4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤조익 산-N-하이드록시 숙시니미딜 에스터(비스-설폰)(4-2,2-bis[(p-tosylsulfonyl)-methyl]acetyl]benzoic acid-N-hydroxy succinimidyl ester(bis-solfone))을 H2N-PEG(24)-CO-OtBu에 접합.
H2N-dPEG(24)-CO-OtBu(1.057g, Iris Biotech)의 톨루엔(toluene)(3 mL) 용액은 건조를 위해 증발되어 그 잔여물은 디클로로메탄(dichloromethane)(25 mL)에 재용해하였다. 교반 하에서, 4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤조익 산-N-하이드록시 숙시니미딜 에스터(1.0 g; Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252)를 첨가하고, 상기 최종 용액은 아르곤 대기(argon atmosphere)하의 실온에서 72시간 더 교반하였다. 휘발류(volatile)는 진공(in vacuo)에서 제거되어 고형 잔여물은 따뜻한 아세톤(acetone)(30 mL)에 용해되어 비-흡수성 탈지면(non-absorbent cotton wool)을 통해서 여과하였다. 여과물은 -80℃에서 냉각하고 -9℃, 4000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 분리된 고형물을 제조하였다. 상층액을 제거하고 침전/분리 과정을 2회 추가로 반복하였다. 최종적으로 상층액은 제거하고 결과적으로 남은 고형물은 진공에서 건조하여, 무색의 무정형 고체로서 비스-설폰 보호된 산(protected acid) 2P 를 얻었다(976 mg, 68%). 1HNMR∂H(400MHz CDCl3)1.45(9H, s, OtBu), 2.40-2.45(8H, m, Ts-Me 및 CH 2 COOtBu), 3.40-3.46(2H, m, CH 2 -Ts), 3.52-3.66(m, PEG 및 CH 2 -Ts), 4.27(1H, q, J6.3, CH-COAr), 7.30(4H, d, J8.3, Ts), 7.58(2H, d, J8.6, Ar), 7.63(4H, d, J8.3, Ts), 7.75(2H, d, J8.6, Ar).
단계 2: 터트-부틸(tert-butyl) 보호 그룹의 제거:
Figure pct00124
디클로로메탄(4 mL) 내 단계 1의 산물(976 mg)을 교반하는 용액에 트리플루오로아세틱 산(trifluoroacetic acid)(4 mL)을 첨가하고 결과된 용액을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 휘발류는 진공에서 제거되어 잔여물은 따뜻한 아세톤(30 mL)에 용해하였다. 상기 생성물은 단계 1에 기재된 바에 따라 아세톤으로 침전시킨 뒤 분리하여 흰색 가루(powder)로서 생성물 2 를 제공하도록 하였다(816 mg, 85%). 1HNMR∂H(400 MHz CDCl3) 2.42(6H, s, Ts-Me), 2.52(2H, t, J6.1, CH 2 -COOH), 3.42(4H, dd, J6.3&14.5, CH 2 -Ts), 3.50-3.64(m, PEG), 3.68-3.73(4H, m, PEG), 4.23-4.31(1H, m, CH-COAr), 7.29(2H, d, J8.1, Ar), 7.55-7.65(6H, m, Ar 및 Ts), 7.77(2H, d, J8.2, Ar).
단계 3: H2N-val-cit-PAB-MMAE를 산 말단의 PEG화 된 비스-설폰 2 에 접합.
N-메틸 몰포린(N-methyl morpholine)(7.5 mg)은 디클로로메탄-디메틸포름아미드(dimethylformamide)(85:15 v/v, 6 mL) 내 비스-설폰-PEG-COOH(45 mg) 및 HATU(13 mg)의 교반되는 용액(45 mg)에 가하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 뒤, H2N-val-cit-PAB-MMAE(38 mg, Concortis, WO 2005/081711에 기재된 대로 제조함)을 가하고 추가로 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물은 디클로로메탄으로 희석하여 1 M HCl, NaHCO3 10% w/v 수용액, 소금저장액(brine)으로 세척한 다음 MgSO4로 건조하였다. 미가공 물질(crude material)은 추가로 디클로로메탄-메탄올(90:10 v/v)로 용리하는 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 통해 정제하였고, 용매는 진공 하에서 제거하여, 투명한 무색 고형(31 mg, 41%)으로 비스-설폰-PEG(24)-MMAE 생성물 1 을 분리하였다 m/z M+Na 2758.5; 1HNMR∂H에 대한 진단 신호(diagnostic signal)(400 MHz CDCl3) 0.60-0.99(m, 지방족 측쇄(aliphatic side chains)), 2.43(s, Me-Ts), 3.36-3.66(m, PEG), 7.15-7.28(m, Ar), 7.31(d, J8.3, Ar), 7.54-7.62(m, Ar), 7.79(d, J8.3, Ar).
실험예 2: 말단 비스-설폰 기능과 5 kDa PEG를 가진 모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E, MMAE) 시약 3 의 합성.
Figure pct00125

단계 1: 4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤조익 산-N-하이드록시 숙시니미딜 에스터(비스-설폰)을 5 kDa HCl.H2N-PEG-COOH 4 에 접합.
Figure pct00126
N-메틸 몰포린(0.004 mL)은 디클로로메탄(5 mL)에 있는 5 kDa HCl.H2N-PEG-COOH(100 mg, Iris Biotech) 및 4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤조익 산-N-하이드록시 숙시니미딜 에스터(49 mg)의 교반 용액에 첨가하였고 실온의 아르곤 대기에서 48시간 동안 교반하였다. 휘발류는 진공에서 제거되어 고형 잔여물은 따뜻한 아세톤(7 mL)에 용해하여 비-흡수성 탈지면을 통해서 여과하였다. 여과물은 -80℃에서 냉각하고 -9℃, 4000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 분리된 고형물을 제조하였다. 상층액을 제거하고 침전/분리 과정을 2회 추가로 반복하였다. 최종적으로 상층액은 제거하고 결과적으로 남은 고형물은 진공상태에서 건조하여 흰색 가루로서 5 kDa PEG 시약 4 를 제공하도록 하였다(90 mg, 80%) 1HNMR∂H(400 MHz CDCl3) 2.36(2H, t, J7.0, CH 2 -COOH), 2.42(6H, s, Ts-Me), 3.40-3.75(m, PEG 및 CH 2 -Ts), 4.24-4.28(1H, m, CH-COAr), 7.30(4H, d, J8.2, Ts), 7.57(2H, d, J8.3, Ar), 7.62(4H, d, J8.2, Ts), 7.77(2H, d, J8.3, Ar).
단계 2: H2N-val-cit-PAB-MMAE를 단계 1로부터 산성 말단의 5 kDa PEG화된 비스-설폰에 접합.
HATU(5 mg)은 Na2CO3(3 mg), H2N-val-cit-PAB-MMAE(11 mg)의 교반된 부유액 및 디클로로메탄 및 DMF(1 mL)의 무수(anhydrous) 혼합물 내의 단계 1의 생성물(35 mg)에 첨가하였고 아르곤 대기 하에서 2일 동안 교반하였다. 디클로로메탄은 진공 하에서 제거되었고 단계 1에 기재한 방법과 유사한 방식으로 차가운 아세톤(3 x 5 mL)로 침전하여 정제하였다. 결과적으로 남은 고형물은 무색의 무정형 고체(42 mg, 95%)로서 비스-설폰-PEG(5 kDa)-MMAE 3 를 얻기 위해 진공상태에서 건조하였다. 1HNMR∂H에 대한 진단 신호(diagnostic signal)(400 MHz CDCl3) 0.65-0.99(m, 지방족 측쇄), 3.48-3.71(m, PEG), 7.15-7.34(m, Ar), 7.62-7.69(m, Ar), 7.72(d, J8.3, Ar), 7.81(d, J8.3, Ar).
실험예 3: 직접적으로 말단 비스-설폰 기능과 결합된 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE) 시약 5 의 합성.
Figure pct00127

단계 1: 4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤조익 산-N-하이드록시 숙시니미딜 에스터(비스-설폰)는 DCM-DMF(3:1, 1 mL)의 무수 혼합물에 존재하는 소듐 카보네이트(sodium carbonate)(3 mg) 및 H2N-val-cit-PAB-MMAE이 교반된 부유물에 첨가하였고 아르곤 대기 하에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 생성물은 디클로로메탄-메탄올(95:5, v/v)으로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하였고 무색의 무정형 고체(22 mg, 33%)로서 비스-설폰-MMAE 5 를 제공하였다 M+Na 1629.5; 1HNMR∂H에 대한 진단 신호(diagnostic signal)(400 MHz CDCl3) 0.56-0.97(m, 지방족 측쇄) 2.36(s, Me-Ts), 7.10-7.32(m, Ar), 7.48-7.64(m, Ar), 7.68(d, J8.22, Ar), 7.74-7.90(m, Ar).
실험예 4: 항체-약물 접합체의 이형(variant) 제조.
하나의 내부-중 사슬(inter-heavy chain) 이황화 결합을 가진 두 개의 조작된 항체 이형은, 높은 수준의 동질성을 가지고 낮은 평균 DAR을 가진 항체 접합체가 생성될 수 있다는 것을 입증하기 위하여, 모항체 서열에서 PCR-기반의 부위-특이적 돌연변이 유도(PCR-based site-directed mutagenesis)를 이용하여 생성하였다. 이러한 항체 이형 및 모항체는, 이황화 결합으로부터 유래 된 두 개의 시스테인(cyctein) 잔기 사이에 가교를 형성하는, 실험예 1에 따라 준비된 접합 시약(비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1 )에 반응하였다.
모항체 및 항체 이형( IgGC226S 및 IgGC229S )의 제조.
인간 IgG1(κ) 골조(framework)에 기반하여 만들어진, 인간화(humanised) 항-Her2 수용체 단일클론 항체 이형(트라스투주맙(trastuzumab))을 암호화하는 모항체 DNA 서열의 구축은, Carter P. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289(1992)에 기재되어 있으며, 상기 항체는 humAb4D5-8로 언급된다. 본 발명의 실험예의 목적을 위해서, 중 사슬 아미노산 서열의 359 및 361번째 서열의 아미노산은 Asp 및 Leu로 각각 치환하였다(E359D 및 M361L). 또한 본 발명 실험예에서 사용된 모항체의 경 사슬 및 중 사슬 아미노산 서열은 본 명세서에서 각각 서열번호: 1 및 2로 나타난다. 모항체의 경첩 영역(경첩영역 서열: PKSCDKTHTCPPCP)에 있는 2개의 시스테인은 항체의 두 개의 중 사슬 간의 내부-사슬 이황화 결합을 형성한다. 이러한 시스테인 잔기는 EU-지표 번호화 시스템에 따라 IgG1의 226번 및 229번 위치에 대응하며, 서열번호: 2의 229번 및 232번 잔기 이다.
2개의 조작된 항체 이형(IgGC226S 및 IgGC229S)은 모항체의 중 사슬 서열의 PCR-기반의 위치-특이적 돌연변이에 의해 경첩 영역의 내부-중 사슬 시스테인 잔기 중 하나를 아미노 산 Ser로 치환하여 만들어졌다. 사용된 PCR 방법은 Ho et al. Gene, 77(1989) 51-59에서 기재된 바와 같은 프라이머 중첩 연장(primer overlapping extension)이며, 경첩 영역 서열에 변형(modification)을 생성하였다. PCR 프라이머 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)는 항체 개체의 암호화 서열 내부로 뉴클레오티드 변화가 포함되도록 만들어졌다. Cys226Ser 이형에서, 코돈(codon)의 변화는 TGC(Cys)로부터 AGC(Ser)이었다. Cys229Ser 이형에 있어서, 코돈의 변화는 TGC(Cys)로부터 AGT(Ser)이었다. 새로운 서열은 중 사슬의 다른 부분을 포함하는, 중 사슬 발현 벡터(vector) 내로 클로닝하였다. 최종 구축제(construct)(돌연변이 이후)는 삽입체(insert)의 전장 서열로 검증하였다.
새롭게 생성된 중 사슬 구축체는 대응하는 경 사슬 구축체와 함께 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)을 사용하여 HEK293 세포 내로 공동-형질주입(co-transfec)하여, 6일 동안의 일시적 배양으로 발현하여, "Trasient Expression in HEK293-EBNA1 Cells, Chapter 12, in Expression Systems (eds, Dyson and Durocher). Scion Publishing Ltd., Oxfordshire, UK, 2007의 프로토콜(protocol)을 따라서, 단백질 A 및 크기 배제(Size Exclusion) 크로마토그래피의 조합을 통해 정제하였다.
비스 - 설폰 -PEG(24)-val-cit- PAB - MMAE1 과 모항체 및 항체 이형의 접합.
내부-사슬 이황화 결합 당 1, 1.5 또는 2 당량의 중합체적 접합 시약 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1 과 항체 이형의 접합은 항체 환원(reduction) 이후에 수행하였다. 상기 환원 반응은 22℃ 또는 40℃ 중 어느 하나의 온도에서, 10 mM
DTT를 사용하여 4.7 mg/mL의 항체 농도를 갖도록 수행하였다. 완충 용액 교환은 각 항체 이형의 과도한 환원제를 제거하기 위해 수행하였다. 상기 중합체적 접합 시약은 pH8의 50% 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액에서 접합 바로 직전에 제조하였다. 접합 동안의 항체 농도는 3 mg/mL이고 반응은 40℃ 또는 22℃ 중 하나의 온도에서 밤새도록(16시간) 수행하였다. 접합 반응에 대한 반응 조건은 하기 표 1에 요약하였다:
:결합 조건.

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mAb IgGC226S IgGC226S IgGC226S IgGC226S IgGC226S IgGC226S
S-S당 시약 당량(eq.) 1 eq. 1.5 eq. 2 eq. 1 eq. 1.5 eq. 2 eq.
온도/℃ 40℃ 40℃ 40℃ 22℃ 22℃ 22℃

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mAb IgGC229S IgGC229S IgGC229S IgGC229S IgGC229S IgGC229S
S-S당 시약 당량(eq.) 1 eq. 1.5 eq. 2 eq. 1 eq. 1.5 eq. 2 eq.
온도/℃ 40℃ 40℃ 40℃ 22℃ 22℃ 22℃
"IgGC226S" 이형은 226번 위치에서 Cys에서 Ser로의 치환을 가지며, 따라서 229번 위치에서 단일 내부 중 사슬 이황화결합을 가진다. "IgGC229S" 이형은 229번 위치에서 Cys에서 Ser로의 치환을 가지며, 따라서 226번 위치에서 단일 내부 중 사슬 이황화 결합을 가진다.
완충 용액 교환 이후에, 각각의 반응은 280 nm에서의 피크(peak)의 %면적을 이용하는 약물 투여량의 화학양론(stoichiometry)을 결정하기 위해, 이전에 기재된 바에 따라 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)로 분석하였다. 제조된 항체-약물 접합체의 약물 대 항체의 평균(Drug to antibody ration, DAR) 및 약물 접합체 종류의 분포(DAR 1-3)는 표 2에 나타나있다.
:IgGC226S(반응 1 내지 6) 및 IgGC229S(반응 7 내지 12)-약물 접합에 대한 평균 DAR 및 종류 분포.

반응
평균 DAR
DAR 1-3
반응
평균 DAR
DAR 1-3

1
1.41
80%
7
1.43
78%

2
1.99
89%
8
1.76
83%

3
2.42
87%
9
2.65
76%

4
1.33
79%
10
1.26
76%

5
1.96
90%
11
2.11
88%

6
2.40
89%
12
2.50
83%
표 2에서 나타난 결과와 같이, 본 발명의 가정은 항체가 높은 수준의 균일성에서, 낮은 평균 DAR을 가지도록 효과적으로 접합 될 수 있게 한다. 낮은 평균 DAR을 가지는 항체-약물 접합체는, 높은 평균 DAR을 가지는 접합체에 비해, 감소 된 제거 비율(clearance rate), 높은 치료 지표 및 낮은 독성을 포함하는, 약간의 유익한 장점을 지닌다.
실험예 5: DAR 분포의 분석.
실험예 4에서, 하나의-경첩 이황화 이형에 대한 가장 낮은 평균의 DAR은 40℃(반응 1 내지 7) 및 22℃(반응 4 내지 10) 모두에서 내부-사슬 이황화 결합 당 1 당량의 중합체적 접합 시약을 사용했을 때 나타났다. 상기 결과를 모항체를 사용했을 때의 결과와 비교하기 위하여, 실험예 4의 조건 대로 이황화 결합 당 1 당량의 중합체적 접합 시약을 사용하여 모항체를 접합하였다.
모항체, IgGC226S 및 IgGC229S에 대한 평균 DAR은 하기 표 3과 같다.

접합 온도
모항체
IgGC226S
IgGC229S

40℃
1.91
1.41
1.43

22℃
1.89
1.33
1.26
표 3의 결과에서 나타난 바와 같이, 모항체에 대한 평균 DAR은, 40℃ 또는 22℃ 모두에서 단일-경첩 이황화물 이형인 IgGC226S 및 IgGC229S에 비해 유의적으로 높았다.
접합 반응에 의해 생산된 항체-약물 접합체 종류의 분포 곡선 또한 DAR 분포를 결정하기 위해 분석하였다. 낮은 평균 DAR에 추가하여, 상기 제조 방법으로 생산한 항체-약물 접합체(IgGC226S 및 IgGS229S)은 모항체를 사용하여 제조된 것보다 감소된 이질성(heterogeneity) 및 증진된 수율을 갖는다는 것을 도 1(40℃에서의 접합) 및 도 2(22℃에서의 접합)에서 확인할 수 있다. 향상된 균일성을 가지는 항체-약물 접합체는 가능한 화학양론의 혼합물보다 적은 정제를 요구하고, 낮은 독성 및/또는 개선된 약물동력학을 나타내고, 그렇게 함으로써 높은 약물-투여(drug-load) 종의 부재에 따른 개선된 효능을 나타낸다.
실험예 6: 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1 로부터 만들어진 항체 약물 접합체와, 비교 가능한 말레이미드(maleimide) 기반 시약으로부터 만들어진 항체 약물 접합체의 인공적인 혈청(serum) 안정성의 비교.
네 개의 트라스투주맙-MMAE 접합체가 제조되었다. 두 개의 접합체는 트라스투주맙 항체(Herceptin®)을 사용하여, 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1(실험예 1)로부터 제조되어 정제된 후에 DAR-2 및 DAR44 접합체를 제공하였다. 남은 두 개의 접합체는 비교 가능한 말레이미드 기반의 시약(mal-val-cit-PAB-MMAE, H2N-val-cit-PAB-MMAE로부터의 1과 비슷한 방법으로 제조된)으로 제조되어 정제된 DAR-2 및 DAR-4 접합체를 제공하였다.
네 개의 접합체 각각은 20 mg/mL의 농도의 사람 혈청 알부민(albumin)을 포함하는 pH 7.4의 포스페이트로 완충된 살린(phosphate buffered saline) 용액에 1 mg/mL의 농도로 준비하였다. 소듐 아자이드(sodium azide)가 첨가되었고(최종 농도 1 mM) 상기 혼합물은 4개의 동일한 부분표본(aliquot)으로 나누었다. 하나의 부분표본은 즉시 -80℃에 동결하였다. 남겨진 부분표본은 37℃에서 보관하였다. 37℃의 부분표본은 24, 48 및 120시간 뒤에 -80℃ 냉동고로 옮겨졌다. 최종 시간 포인트 이후에, 상기 혼합물은 ProPac® 2.1 mm × 100 mm HIC-10 컬럼 (Fisher Scientific)을 사용하여 분석적인 소수성 작용(hydrophobic interaction) 크로마토그래피를 통해 분석하였다. 실험 방법은 50분 동안 100% 완충용액 A(50 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0, 1.5 M 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)) 부터 100% 완충용액 B(50 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0, 20% 이소프로파놀(isopropanol))까지 직선 변화도로 구성되었다. 흐름 속도는 1 mL/min이고, 온도는 30℃로 설정하였다. 검출은 다음의 248 및 280 nm에서 UV 흡수에 의해 수행하였다. 각 샘플에 대한 약물 항체 비율의 평균이 결정되었고 배양 시간에 대해 그래프로 나타내었다. 상기 실험의 결과는 도 3에 나타나있고, 비스-설폰 시약 1 로 제조된 DAR-2 및 DAR-4 접합체에 대한 약물 대 항체 비율에서의 특별한 감소는 없었는데, 이는 상기 접합체가 인공적인 혈청에서의 배양이 안정하다는 것을 뜻한다. 반면, 말레이미드 기반의 접합체는 시간에 대한 DAR 분포에서 상당한 감소를 나타내었다.
실험예 7: IgG 결핍 혈청에서의 안정성
트라스투주맙-MMAE 결합체는 비스-설폰 시약 1 또는 비교 가능한 말레이미드 시약(실험예 6) 중 어느 하나로부터 제조되었고, 두 개의 접합체 모두 정제되어서 항체 당 4개의 약물 분자를 갖도록(DAR 4) 제공하였다. 상기 접합체는 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 IgG가 결여된 혈청(BBi solutions, SF142-2)과 혼합하였다. 소듐 아자이드를 첨가하였고(최종 농도 1 mM), 상기 혼합물은 부분표본으로 나누었다. 두 개의 부분표본은 즉시 -80℃에서 동결하였다. 남겨진 부분표본은 37℃에 보관하였고 120시간 이후에, 두 개의 부분표본은 분석 전까지 -80℃ 냉동고로 옮겼다. 얼린 부분표본은 ProPac® 2.1 mm × 100 mm HIC-10 컬럼 (Fisher Scientific)에 대해 실험예 6에 기술한 방법으로 분석적인 소수성 상호결합 크로마토그래피로 분석되었다.
IgG 결여 혈청에서 배양한 접합체에 대한 HIC 크로마토그램(chromatogram)은 도 4에 나타나있다. 비스-설폰 및 말레이미드 접합체에 대해서, 주요한 피크(peak) 시리즈가 30 내지 55분 사이의 용리에서 확인되었다. 제로 타임에서(at time zero), 비스-설폰 접합체는 52.2분(피크 1)의 용리에서 피크를 관찰하였다. 상기 피크 이후에 120시간 동안 특이한 차이는 없었는데 이는 상기 실험 동안 접합체가 분해되지 않았다는 것을 나타낸다. 반면, 말레이미드 DAR 4 접합체의 경우, 제로 타임에서, 49.1분의 용리에서 피크를 확인하였고(피크 1) 상기 피크 사이즈는 120시간이 지난 후에 현저하게 감소하였는데 이는 접합체가 분해된 것을 나타낸다. 120시간의 크로마토그람에서 말레이미드 접합체에 대한 새로운 피크는 44.8분(피크 2), 40.9분(피크 3) 및 34.0분(피크 4)에 관찰되었고, 이는 DAR-3, DAR22 및 자유 mAb(free mAb) 각각의 기준과 같은 정체시간으로, 말레이미드 접합체가 시간이 흐르면서 약물의 손실을 겪는다는 것을 입증하는 것이다.
실험예 8: 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1과 높은 DAR 4 수율을 가진 항체와의 접합.
트라스투주맙 용액(pH 7.5, 20 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA의 농도 5.2 mg/mL인 혼합 용액 0.768 mL) 5 mM 의 TCEP 용액(0.032 mL)을 첨가하고 상기 최종 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 배양하였다. TCEP 처리된 항체는 실내 온도로 냉각시켰고 pH 7.5, 20 mM 소듐 포스페이트와 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA의 용액으로 4.44 mg/mL의 농도로 희석하였다. 50%(v/v) MeCN에 있는 비스-설폰-dPEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 용액(0.001 mL, 4.4 mg/mL) 및 50%(v/v) 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.5, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 항체 용액에 첨가하였다. 결과적(resulting) 접합체 반응 혼합물은 22℃에서 22시간 동안 배양하였다. 22시간 후, 50 mM N-아세틸(acetyl)-L-시스테인(cyctein)(0.064 mL, 3.0 mM)을 상기 결과적 혼합물에 첨가하였고 22℃에서 1시간 동안 더 배양하였다. 상기 반응 샘플은 TOSOH TSK-gel 부틸(Buthyl)-NPR 35 x 4.6 mm 컬럼(column)을 이용하여 분석적 HIC로 분석하였다. 약물 및 항체에 대한 UV 흡광도(absorbance)의 최대치의 비율 및 피크 용리의 순서에 의해 식별된, 분리된 각 DAR 이형에 대한 면적은 막대 차트(bar chart)로 표현하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서, 주요 생산물(>73%)은 DAR-4 접합체이다.
실험예 9: 비스-설폰-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 시약 1 로부터 준비된 트라스투주맙 MMAE의 시험관 내(in vitro) 분석
트라스투주맙 MMAE 접합체는 실험예 8의 방법으로 하되, 트라스투주맙 5 mg으로 스케일을 늘리고 N-아세틸-L-시스테인 배양 과정을 포함하지 않고 만들어졌다. 상기 반응 혼합물은 AKTA 프라임(prime) 시스템에 연결된 ToyoPearl Phenyl 650S 레진(resin)으로 채워진 1 mL 컬럼을 사용하는 예비 HIC에 의해 정제되었고 완충용액 A: 50 mM 소듐 포스페이트, 2.0 M NaCl, pH 7.0 및 완충용액 B: 80% 50 mM 소듐 포스페이트, 20% 이소프로파놀, pH 7.0으로 균형을 맞추었다(equilibriated). 접합 혼합물은 동일한 용량의 50 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0안에 있는 4.0 M NaCl과 혼합하였고, 완충용액 A의 컬럼에 1 mL/min로 주입하였다. DAR 4 샘플은 0-100%의 완충용액 B 변화도를 이용하여 용리하였다. 상기 변화도는 DAR 4 종(species)이 용리되기 시작했을 때 고정되어, 변화도가 계속되는 지점인 기준측정치(baseline)로 UV 추적(UV trace)이 돌아갔을 때까지 고정되었다. 용리된 피크의 일부는 모은 후, 선택하여 TOSOH TSK-gel 부틸-NPR 35 x 4.6 mm 컬럼을 이용하여 분석적인 HIC에 의해 분석되었다. DAR 4(순도>90%)를 포함하고 있는 부분은 취합하였고, HiPrep™ 26/10 Desalting 컬럼을 이용하여 완충용액을 PBS pH 7.4로 교환하였고 VivaSpin 20(10 kDa MWCO PES 멤브레인) 농축기를 사용하여 4000 ×g, 실내 온도에서 농축하였다. 농축된 DAR 4 샘플은 멸균 조건에서 여과하였고 -80℃의 냉동고에서 급속 냉동하였다. 최종 샘플은 브래드포드 분석(Bradford assay)를 이용하여 정량하였고 비-환원(non-reducing) SDS-PAGE 및 분석적인 HIC를 이용하여 분석하였고 시험관 내 평가를 위해 사용하였다.
mAb-시약 1 접합체의 시험관 내 효율은 HER-2 수용체(receptor) 과발현(over-expressing) 암 세포주의 세포 성장에 대한 억제 효과를 측정하는 것으로 결정하였다.
시험관 내에서 세포 독성 약물 또는 ADCs를 사용하는 치료 이후에 암 세포 생존율의 손실은 CellTiterGlo® Luminescence 시약(Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D, Cancer Res 2008; 68:9280-9290)을 사용하여 약물 또는 ADCs의 증가하는 농도의 존재하에서 세포주의 성장 및 세포 증식 또는 대사적 활성의 손실을 수량화하여 측정할 수 있다. 상기 프로토콜은 세포 뿌리기(seeding), 약물 처리 및 웰(well)안에 존재하는 세포의 숫자와 직접적으로 연결되어 있는 ATP합성을 기초로, 처리 안 한(untreated) 세포에 관한 세포 생존율의 결정에 관해 개시하고 있다.
HER2-양성 SK-BR-3 및 BT-474 세포는 트립신(Trypsin) EDTA 3 mL로 5 분간 트립신화(trypsinise)하였다. 트립시니제이션(trypsinisation)은 10 mL의 완전한 배양액을 첨가하여 정지하였고, 세포는 50 mL Falcon 튜브에 옮겼다. 세포는 Neubauer 헤모사이토미터(haemocytometer)를 이용하여 수치화하였고 BT-474는 1×105/mL 및 SK-BR-3는 5×104/mL로 세포 밀도를 조절하였다. 세포는 폴리-D-리신(lysine) 코팅된 오파크(opaque)-벽(walled)의 96웰 배양 접시에 뿌려진(100 μL/웰) 후, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 종양 세포주 SK-BR-3(ATCC-HTB-30) 및 BT-474(ATCC-HTB-20)은 American Type Culture Collection에서 구입하였다. SK-BR-3 세포는 10% 어린 소 혈청, 100 u/mL 페니실린(Penicillin) 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Streptomycin)을 포함하는 McCoy's 5A 배양액(Life Technologies®)에서 배양하였다. BT-474는 10% 어린 소 혈청, 100 u/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F-12 배양액(Life Technologies®)에서 배양하였다.
세포 배양의 방법은 ATCC의 상품 정보 시트(product information sheet) 및 상기 정보 시트에 인용된 문헌, 예를 들면, Alan R, Liss, N.Y. 1994에 의해 게재된 Culture of Amimal Cells: A Mannual of Basic Technique by R. Ian Freshney 3번째 판, 또는 Wiley-Liss, N.Y. 2005에 의해 게재된 5번째 판에서 유래하였다. 적당한 세포 배양액을 희석액으로 사용하여 세포를 2배 희석하고 96웰 배양 접시의 컬럼 3-10에 파이펫팅하여 ADC 또는 자유 약물(MMAE)의 순차적인 희석을 3배수(triplicate)로 만들었다. HER2-양성 세포주, BT-474 및 SK-BR-3는 표 4에 나타낸 약물 농도대로 처리하였다.
약물 처리 후, 세포는 약물(총 용량 200 μL/웰)과 함께 37℃, 5% CO2에서 96시간 더 배양하였다.
세포주 약물/약물-접합체 농도 범위
SK-BR-3 MMAE 2.5-0.02 nM
SK-BR-3 DAR 4 항체-시약 1 접합체 0.625 nM-5 pM
BT-474 MMAE 2.5-0.02 nM
BT-474 DAR 4 항체-시약 1 접합체 1.25 nM-0.01 nM
세포 생존율 분석은 Cell-Titer Glo® Luminescence 시약을 이용하여 제조자의 안내(Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D, Cancer Res 2008;68:9280-9290)에 따라 수행하였다. 배양 시간, 예를 들면 세포 분쇄 및 발광체(luminescent) 시약과의 배양,은 최적의 발광 신호를 위해서 각각 3분 및 20분으로 확장하였다. 발광정도(Luminescence)는 배양접시 기록기(예를들면, MD Spectramax M3 배양접시 기록기(plate reader))를 이용하여 기록하였고, 상기 데이터는 곧바로 네 개의 매개 변수(parameter)의 비-직선(non-linear) 회귀(regression) 모델을 이용하여 분석하였다.
SK-BR-3 또는 BT-474 둘 중 하나의 세포 내에서 항체-시약 1 접합체의 처리에 대한 세포 생존율의 반응을 나타내는 상기 실험의 결과는, 도 6에 나타나있다. 생존율은 처리하지 않은 세포에 대한 %로 나타내었다. 상기 % 생존율(Y-축)은 모든 접합체뿐만아니라 자유 약물에 대한 IC50 값을 결정하기 위하여 nM의 약물농도(x-축)의 로그에 투영하여 나타내었다. 상기 IC50값은 표 5에 나타내었다.
샘플 SK-BR-3
IC50 (nM)		 BT-474
IC50 (nM)

MMAE
0.2
0.75

DAR-4 항체-시약 1 접합체
0.035
0.12
도 6 및 표 5에 나타낸 바처럼, 항체-시약 1 접합체는 HER2-양성 세포주에서 활성이 있다.
실험예 10: 말단 비스-설폰 기능을 갖고 있는 모노(mono) 24 반복 유닛 PEG를 포함하는 비스-(발린-시트룰린-파라아미노벤질-모노메틸 오리스타틴 E)(bis-(valine-citrulline-paraaminobenzyl-monomethyl auristatin E, val-cit-PAB-MMAE)2 시약 6 의 합성.
Figure pct00128
6
단계 1: H2N-val-cit-PAB-MMAE와 Fmoc-L-α-아미노 아디핀 산(Fmoc-L-α-amino adipic acid)의 접합.
Figure pct00129
7
무수 디메틸포름아미드(dimethylformamide)(1.5 mL)에 있는 H2N-val-cit-PAB-MMAE.TFA 염, Fmoc-L-α-아미노 아디핀 산 및 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리마졸로[4,5-b]피리디니움 3-옥시드헥사플루오로포스페이트(1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate,HATU)의 교반 용액에 0℃의 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine)을 첨가한 후 상기 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하고 16시간 이상 실내 온도만큼 따뜻해지도록 하였다. 상기 반응 혼합물은 아세토니트릴(100:0 v/v 내지 0:100)에 있는 완충용액 A(v/v): 물: 5% 아세토니트릴: 0.1% TFA 및 완충용액 B(v/v): 0.1% TFA로 용리하는 역-상태 C18-컬럼 크로마토그래피(reverse-phase C18-column chromatography)를 이용하여 직접적으로 정제하였다. 유기 용매는 진공상태에서 제거하였고 수용성 용매는 리오필리자시옹(lyophilisation)으로 제거하였다. Fmoc-L-α-아미노 아디핀 산-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 7 을 백색 고체로서 분리하였다(99.0 mg), m/z[M+H]+2593.
단계 2: Fmoc-L-α-아미노 아디핀 산-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 7 의 디프로텍션(deprotection).
Figure pct00130
8
Fmoc-L-α-아미노 아디핀 산-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 7 (15 mg)은 무수 디메틸포름아미드(1 mL)에 용해하였고 피페리딘을 첨가하였다(0.1 mL). 실내 온도에서 16시간 동안의 교반 이후, 상기 반응 혼합물은 아세트 산(acetic acid, 0.2 mL)으로 산성화 하였고, 아세토니트릴(100:0 v/v 내지 0:100)에 있는 완충용액 A(v/v): 물: 5% 아세토니트릴: 0.1% TFA 및 완충용액 B(v/v): 0.1% TFA로 용리하는 역-상태 C18-컬럼 크로마토그래피(reverse-phase C18-column chromatography)를 이용하여 직접적으로 정제하고, 유기 용매는 진공상태에서 제거하였으며 수용성 용매는 리오필리자시옹(lyophilisation)으로 제거하여 H2N-L-α-아미노 아디핀 산-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 8 을 백색 고체로서 분리하였다(7.0 mg), m/z[M+H]+2374.
단계 3: H2N-L-α-아미노 아디핀 산-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 8 과 산성 말단화 PEG화 된 비스-설폰 2 의 접합.
무수 디메틸포름아미드(0.5 mL)에 있는 H2N-L-α-아미노 아디핀 산-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 5c(7 mg) 및 알려진 4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤조익 산(4-[2,2-bis[(p-tolylsulfonyl)-methyl]acetyl]benzoic acid)(6 mg)을 포함하는 교반된 용액에 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디니움 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate, HATU)(1.4 mg, 100 μL에 14 mg이 있는 DMF 저장 용액의 10 μL)를 첨가하고, 상기 용액은 0℃에서 5분 동안 교반하였다. 그 후 N-메틸몰포린(N-methylmorpholine,NMM)(0.37 μL, (963 μL의 DMF 저장 용액에 37 μL가 있는 용액의 10 μL)을 첨가하였고, 교반하였다. 1시간 간격에, HATU(1.4 mg(저장 용액의 10 μL)) 및 NMM(0.37 μL, (저장 용액의 10 μL))의 추가적 부분을 첨가하였고 총 3번의 추가가 될 때까지 첨가하였다. 상기 물질은 아세토니트릴(100:0 v/v 내지 0:100)에 있는 완충용액 A(v/v): 물: 5% 아세토니트릴: 0.1% TFA 및 완충용액 B(v/v): 0.1% TFA로 용리하는 역-상태 C18-컬럼 크로마토그래피(reverse-phase C18-column chromatography)를 이용하여 직접적으로 정제하고, 유기 용매는 진공상태에서 제거하였고 수용성 용매는 리오필리자시옹(lyophilisation)으로 제거하여, 비스-설폰-PEG(24)-H2N-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 6 (bis-sulfone-PEG(24)-H2N-bis-[val-cit-PAB-MMAE])를 무색의 필름으로서 분리하였다(3.3 mg, 31%),m/z [M+H]2+ 1992.
실험예 11: 말단 비스-설폰 기능을 갖는 비스-(모노 24 반복 유닛 PEG-발린-시트룰린-파라아미노벤질-모노메틸 오리스타틴 E)(PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)2 시약 9 의 합성.
Figure pct00131
9
단계 1: 아스파르트 산(aspartic acid)과 아세틸벤조익 산(acetylbenzoic acid)의 접합.
Figure pct00132
10
L-아스파르트 산 β-t.-부틸 α-t.-부틸 에스터 하이드로클로라이드(L-aspartic acid β-t.-butyl α-t.-butyl ester hydrochloride)(3.43 g) 및 무수 디클로로메탄(30 mL)의 교반된 용액에 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, DMAP)(1.786 g)을 첨가하였다. 2시간 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDCI)(2.80 g) 및 4-아세틸벤조익 산(2.00 g)을 첨가하고 상기 반응은 실내 온도에서 교반하였다. 28시간 후, 상기 용액은 물(100 mL)을 이용하여 나누었고 수용액 층은 디클로로메탄(2 × 10 mL)으로 추출하였다. 혼합된 유기 용액 층은 물(2 × 50 mL), 브린(100 mL)으로 씻겨졌고, 마그네슘 설페이트로 건조되고, 진공상태에서 여과되고 농축하였다. 고체 잔여물은 디클로로메탄-메탄올(99.5:0.5, v/v)으로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하였고, 용매는 진공상태에서 제거되었으며 황백색의 고체로서 디-터트-부틸 2-[(4-아세틸벤조일)아미노]부테인디오에이트(di-tert-butyl 2-[(4-acetylbenzoyl)amino]butanedioate) 10 을 분리하였다(3.856 g, 81%). 1H NMR H (400 MHz CDCl3) 1.45 (9H, s, t-Bu), 1.48 (9H, s, t-Bu), 2.52 (3H, s, CH 3-COAr), 2.80 (2H, dd, CH 2 CO2tBu), 4.80 (1H, m, CH-CH2), 7.25 (1H, m, NH), 7.85 (2H, d, Ar), 8.00 (2H, d, Ar).
단계 2: 비스-톨릴설파닐 부테인디오에이트(bis-tolylsulfanyl butanedioate) 11 의 합성.
Figure pct00133
11
무수 에탄올(20 mL)에 있는 디-터트-부틸 2-[(4-아세틸벤조일)아미노]부테인디오에이트 10(1.00 g)의 교반된 부유액에 4-메틸벤젠싸이올(4-methylbenzenethiol)(635 mg)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 포름알데히드(formaldehyde)(37% 수용성 용액)(0.3 mL)(Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252)을 첨가하고 환류기(reflux)에서 가열하였다. 2시간 및 8시간 후에 포름알데히드(37% 수용성 용액, 0.3 mL)의 더 많은 부분을 첨가하였다. 16시간이 더 흐른 뒤, 상기 반응 혼합물은 실내 온도까지 온도를 낮추었고, 진공 상태에서 농축되었으며, 디클로로메탄(50 mL)에 희석되고, 물로 씻은 후(3 x 25 mL), 마그네슘 설페이트로 건조되고, 진공 상태에서 여과되고 농축되었다. 미가공의 물질은 디클로로메탄-메탄올(99.5:0.5, v/v 내지 98:2 v/v)을 이용하여 용리하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 용매는 진공상태에서 제거되었으며, 옅은 황색의 고체로서 디-터트-부틸 2-[[4-[3-(p-톨릴설파닐)-2-(p-톨릴설파닐메틸)프로파노일]벤조일]아미노]부테인디오에이트(di-tert-butyl 2-[[4-[3-(p-tolylsulfanyl)-2-(p-tolylsulfanylmethyl)propanoyl]benzoyl]amino]butanedioate)(0.594 g, 35%) 11 을 분리하였다. 1H NMR H (400 MHz CDCl3) 1.45 (9H, s, t-Bu), 1.48 (9H, s, t-Bu), 2.35 (6H, s, CH 3 -Ar), 2.85 (2H, dd, CH 2 CO2tBu), 3.15 (2H, dd, CH 2 - SAr), 3.75 (1H, m, CHCH2S), 4.80 (1H, m, CH-CH2), 7.10 (4H, d, SAr), 7.15 (4H, d, SAr), 7.25 (1H, m, NH), 7.55 (2H, d, Ar), 75 (2H, d, Ar).
단계 3: 터트-부틸 보호 그룹의 제거.
Figure pct00134
12
무수 디클로로메탄에 있는 디-터트-부틸 2-[[4-[3-(p-톨릴설파닐)-2-(p-톨릴설파닐메틸)프로파노일]벤조일]아미노]부테인디오에이트 11 (527 mg)의 교반된 용액(2.5 mL)에 비활성의 대기 하의 실내 온도에서 트리플루오로아세트 산(trifluoroacetic acid)(2.5 mL)을 조심스럽게 첨가하였다. 16.5 시간 후에, 상기 반응은 진공상태에서 농축되었고 잔여 트리플루오로아세트 산은 톨루엔(toluene)으로(2 × 3 mL) 공비 혼합물 증류(azeotrope distillation)에 의해 제거되었다. 미가공의 생성물은 진공상태에서 농축되어, 더 이상의 정제가 필요하지 않은 옅은 황색의 오일로서 2-(4-(3-(p-톨릴싸이오)-2-((p-톨릴싸이오)메틸)프로파노일)벤즈아미도)숙신 산(2-(4-(3-(p-tolylthio)-2-((p-tolylthio)methyl)propanoyl)benzamido)succinic acid) 12 (490 mg, 추청되는 양적인 수율)을 제공하였다. 1H NMR ∂H (400 MHz CDCl3) 2.25 (6H, s, CH 3 -Ar), 2.80-3.15 (6H, m, CH 2 CO2H and CH 2 -SAr), 3.65 (1H, m, CHCH2S), 5.00 (1H, m, CH-CH2), 6.85 (4H, d, SAr), 6.95 (4H, d, SAr), 7.50 (2H, d, Ar), 7.55 (1H, br s, NH), 7.65 (2H, d, Ar), 10.95 (2H, br s, CO2 H).
단계 4: 비스-톨릴싸이오-Asp-산과 H2N.dPEG(24)-CO-OtBu의 접합.
Figure pct00135
13
H2N.dPEG(24)-CO-OtBu(240 mg, Iris Biotech)의 톨루엔 용액(3 mL)은 건조하도록 증발되었고 잔여물은 디클로로메탄(15 mL)에 재용해하였다. 교반하는 상황에서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDCI)(17.4 mg) 및 2-(4-(3-(p-톨릴싸이오)-2-((p-톨릴싸이오)메틸)프로파노일)벤즈아미도)숙신 산 12 (50 mg)을 첨가하고 상기 반응 혼합물은 비활성의 대기 하의 실내 온도에서 교반하였다. 16시간 후에, H2N.dPEG(24)-CO-OtBu(240 mg) 및 EDCI(17.4 mg)을 더 첨가하였다. 총 96시간 후에, 상기 고체 잔여물은 디클로로메탄-메탄올(99:1 v/v 내지 90:10 v/v)로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 직접적으로 정제하였고, 용매는 진공상태에서 제거되었으며 왁스같은 황색 고체로서 비스-톨릴-비스 PEG(bis-tolyl-bis PEG) 13 을 분리하였다(179.5 mg, 68%). 1H NMR ∂H (400 MHz CDCl3) 1.45 (18H, s, t-Bu), 2.30 (6H, s, CH 3 -Ar), 2.75 (2H, dd, CH 2 CON), 3.20 (2H, dd, CH 2 - SAr), 3.45-3.80 (m, PEG 및 CHCH2S), 4.85 (1H, m, CH-CH2), 7.05 (4H, d, SAr), 7.10 (4H, d, SAr), 7.55 (2H, d, Ar), 7.85 (2H, d, Ar), 7.90 (1H, m, NH), 8.50 (1H, m, NH).
단계 5: 터트-부틸 보호 그룹의 제거.
Figure pct00136
14
무수 디클로로메탄에 있는 비스-톨릴-비스 PEG-에스터 13 (179.5 mg)의 교반된 용액(3.0 mL)에 트리플루오로아세트 산(3.0 mL)을 비활성 대기 하의 실내 온도에서 조심스럽게 첨가하였다. 2시간 45분 후, 상기 반응은 진공상태에서 농축되었고 잔여 트리플루오로아세트 산은 톨루엔(toluene)으로(2 × 7 mL) 공비 혼합물 증류(azeotrope distillation)에 의해 제거되었다. 미가공 생성물은 진공상태에서 농축되었고 디클로로메탄-메탄올(98:2 v/v 내지 85:15 v/v)로 용리하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 용매는 진공상태에서 제거되었고 옅은 황색 오일로서 비스-톨루일-비스 PEG-산(bis-toluyl-bis PEG-acid) 14 를 분리하였다(102 mg, 59%). 1H NMR ∂H (400 MHz CDCl3) 2.05 (6H, s, CH 3 -Ar), 2.60 (2H, t, CH 2 CO2H), 2.80 (2H, dd, CH 2 CON), 3.20 (2H, dd, CH 2 -SAr), 3.45-3.80 (m, PEG 및 CHCH2S), 4.95 (1H, m, CH-CH2), 7.05 (4H, d, SAr), 7.10 (4H, d, SAr), 7.55 (2H, d, Ar), 7.70 (1H, m, NH), 7.75 (1H, m, NH), 7.85 (2H, d, Ar), 8.75 (1H, m, NH).
단계 6: 비스-톨릴설파닐-비스-PEG-산(bis-tolylsulfanyl-bis-PEG-acid)의 산화.
Figure pct00137
15
물(3 mL)은 Oxone®(67.1 mg) 부분-방향(portion-wise)의 첨가 후 메탄올(3 mL)에 있는 비스-톨루일-비스 PEG-산 14 (102 mg)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 결과적인 부유액은 실내 온도에서 교반하였고 18시간 후 상기 반응 혼합물은 탈지면의 플러그(plug)를 통과하였고 메탄올/물 1:1(2 mL)로 세척하였다. 상기 혼합된 유기성(organic) 세척물은 진공상태에서 응축되어 메탄올을 제거하였고 수용성 층은 디클로로메탄(3 x 7 mL)으로 추출되었다. 상기 혼합된 유기성 층은 수용성 HCl(1 x 5 mL, pH 3)로 세척되었고, 마그네슘 설페이트로 건조되어, 진공상태에서 여과되고 응축되어 옅은 황책 고체로서(79 mg, 76%), 비스-설폰-비스-PEG-산(bis-sulfone-bis-PEG-acid) 15 를 생성하였다. 1H NMR ∂H (400 MHz CDCl3) 2.45 (6H, s, CH 3 -Ar), 2.55 (2H, t, CH 2 CO2H), 2.80 (2H, dd, CH 2 CON), 3.25-3.80 (m, PEG 및 CH 2 -Ts), 4.25 (1H, m, CH-CH2-Ts), 4.85 (1H, m, CH-CH2), 7.35 (4H, d, Ts), 7.60 (1H, m, NH), 7.65 (2H, d, Ar), 7.70 (4H, d, Ts), 7.85 (2H, d, Ar), 7.95 (1H, m, NH), 8.75 (1H, m, NH).
단계 7: H2N-val-cit-PAB-MMAE와 비스-산 말단화 PEG화 된 비스-설폰의 접합.
비스-설폰-비스-PEG-산 15 (24.0 mg)의 교반 용액에 비활성의 대기 하에서 H2N-val-cit-PAB-MMAE.TFA 염(37.2 mg) 및 무수 디클로로포름아미드(0.8 mL)에 있는 무수 소듐 카보네이트(2.7 mg)를 첨가하였다. 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디니움 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(9.6 mg)을 첨가하고 상기 반응 혼합물은 실내 온도에서 교반하였다. 42시간 후, 상기 반응 혼합물은 아세트 산(50 μL)에 의해 산성화되었고 아세토니트릴(100:0 v/v 내지 0:100)에 있는 완충용액 A(v/v): 물:5% 아세토니트릴:0.1% TFA 및 완충용액 B(v/v): 0.1% TFA로 용리하는 역-상태 C18-컬럼 크로마토그래피로 직접적으로 정제되었다. 생성물 분획을 위해, 상기 유기 용매는 진공상태에서 제거되었고 수용성 용매는 리오필리자시옹(lyophilisation)으로 제거되었다. 에틸 아세테이트-이소프로파놀(ethyl acetate-isopropanol)(100:0 v/v 내지 0:100 v/v)로 용리하는 역-상태 실리카-디올-컬럼 크로마토그래피(reverse-phase silica-diol-column)를 이용하여 추가인 정제를 수행하였다. 상기 용매는 진공상태에서 제거되었고 무색의 오일로서 비스-설폰-PEG(24)-비스-[val-cit-PAB-MMAE] 9 를 분리하였다(8.0 mg, 21%). m/z M+Na 5104.
실험예 12: 디로디드(diloaded) 비스-설폰 MMAE 시약 8 및 디로디드 비스-설폰 MMAE 시약 9 와 항체 단편(Fab)의 접합.
트라스투주맙의 파파인(papain) 소화로부터 얻어진 Fab(PBS에 있는 2.14 mg/mL)의 두 개의 5 mL 부분표본은 22℃에서 1시간동안 DTT(1 M DTT 용액의 50μL 첨가)로 환원되었다. 여분의 DTT를 제거하기 위해, 환원된 Fab 용액은 두개의 PD-10 컬럼을 이용하여 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.4(150 mM NaCl 및 20 mM EDTA)로 완충용액을 교환하였다. 완충용액 교환 이후, 상기 샘플의 농도는 UV로 측정하였다. 완충용액 교환된 Fab 용액은 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.4(150 mM NaCl 및 20 mM EDTA)로 1.1 mg/mL(3.6 mL 최종의 양)로 희석되었다.
50:50 v/v 아세토니트릴에 있는 비스-설폰-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE2(1.2 mg/mL, 0.4 mL) 및 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 환원된 Fab의 하나의 부분표본에 첨가하였다. 50:50 v/v 아세토니트릴에 있는 비스-설폰-[PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE]2(0.4 mL, 1.5 mg/mL) 및 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA의 용액에 두번째 Fab 부분표본을 첨가하였다. 상기 두 개의 반응 혼합물은 22시간동안 22℃에서 배양하였다. 배양의 완성에서, 상기 반응 혼합물(4.0 mL)은 10 mL Zeba™ 스핀(spin) 컬럼을 이용하여 PBS로 완충용액을 교환하였다. 두 개의 최종 Fab-MMAE 접합체는 Toyopearl Phenyl HIC 컬럼(1 mL)을 이용하는 제조용 HIC에 의해서 93%보다 큰 순도로 정제되었다. 각 샘플은 2 M NaCl, 50 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0에 로드하였고 20% 프로판-2-올, 50 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0의 0-100% 변화도에서 용리되었다.
실험예 13: 시험관 내 세포 생존율 분석을 통한 항체 약물 접합체(ADCs)의 분석.
실험예 12에서 준비된 시약 6 및 시약 9 항체 접합체의 시험관 내 효험은, 실험예 9의 방법에 의한 HER-2 수용체가 과발현된 암 세포 주의 세포 성장에 대한 억제 효과를 측정하는 것으로 결정되었다.
HER2-양성 SK-BR-3 및 BT-474 세포는 5-15분 동안 3 mL의 트립신 EDTA로 트립신화하였다. 상기 트립시니제이션은 10 mL의 완전한 배지를 첨가하는 것으로 정지하였고, 세포는 50 mL 팔콘 튜브(Falcon tube)에 옮겼다. 상기 세포는 Neubauer 헤모사이토미터를 이용하여 수치화하였고 BT-474는 1×105/mL 및 SK-BR-3는 5×104/mL로 세포 밀도를 조절하였다. 세포는 폴리-D-리신(lysine) 코팅된 오파크(opaque)-벽(walled)의 96웰 배양접시에 뿌려진(100 μL/웰) 후, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 종양 세포주 SK-BR-3(ATCC-HTB-30) 및 BT-474(ATCC-HTB-20)은 American Type Culture Collection에서 구입하였다. SK-BR-3 세포는 10% 어린 소 혈청(fetal bovine serum), 100 u/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 McCoy's 5A 배양액(Life Technologies®)에서 배양하였다. BT-474는 10% 어린 소 혈청, 100 u/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F-12 배양액(Life Technologies®)에서 배양하였다.
상기 HER2-양성 세포 주, BT-474 및 SK-BR-3는 하기 표 6에 나타낸 약물 농도로 처리되었다. 그 후 상기 세포는 약물과 함께(총 용량 200 μL/웰), 37℃ 및 5% CO2에서 96시간 더 배양하였다.
세포주 물/약물-접합체 농도 범위 (nM)
SK-BR-3 MMAE 2.5-0.02
시약 6 접합체 1.25-0.01
시약 9 접합체 2.5-0.02
BT-474 MMAE 5-0.04
시약 6 접합체 2.5-0.02
시약 9 접합체 5-0.04
세포 생존율 분석은 Cell-TiterGlo® Luminescence 시약을 이용하여 제조자의 안내(Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D, Cancer Res 2008;68:9280-9290)에 따라 수행하였다. 배양 시간, 예를 들면 세포 분쇄 및 발광체(luminescent) 시약과의 배양은 최적의 발광 신호를 위해서 각각 3분 및 20분으로 확장하였다. 발광정도(Luminescence)는 배양 접시 기록기(예를 들면, MD Spectramax M3 배양 접시 기록기(plate reader))를 이용하여 기록하였고, 상기 데이터는 곧바로 네 개의 매개 변수(parameter)의 비-직선(non-linear) 회귀(regression) 모델을 이용하여 분석하였다.
SK-BR-3 또는 BT-474 내의 시약 6 접합체 또는 시약 9 접합체의 처리에 대한 세포 생존율 반응을 보여주는 상기 결과는 도 7에 나타나있다. 생존율은 처리하지 않은 세포에 대한 %로 나타내었다. 상기 % 생존율(Y-축)은 모든 접합체뿐만 아니라 자유 약물에 대한 IC50 값을 결정하기 위하여 nM의 약물농도(x-축)의 로그에 투영하여 나타내었다. 상기 IC50값은 표 7에 나타내었다.
샘플 SK-BR-3
IC50 (nM)		 BT-474
IC50 (nM)
시약 6 접합체 0.14 0.32
시약 9 접합체 0.2 0.42

MMAE
0.27
0.85
도 7 및 표 7에서 확인할 수 있듯이, 두 개의 항체 접합체 모두 HER2-양성 세포 주에서 활성이 있다. 시약 6 접합체의 효능은 시약 9 접합체에 비해 증가하였다. 두 개의 접합체 모두 자유 약물보다 증식을 더 효과적으로 감소시켰다.
실험예 14: 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 시약 1 을 이용하여 생성된 항체 약물 접합체에 대한 생체 내(in-vivo) 제노그라프트(xenograft) 시험.
DAR=1, DAR=2, DAR=3, 및 DAR=4를 갖는 네 개의 항체 약물 접합체(ADCs)는 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 시약 1 과 트라스투주맙의 접합으로부터 생성되었고 각각 95% 이상의 단일 DAR 순도를 갖도록 HIC에 의해 정제되었다.
각 접합체는 하기 대로 제노그라프트 시험에 사용하였다.
암컷의 중증 복합 면역결핍 마우스(Fox Chase SCID®, C.B-17/Icr-Prkdcscid, Charles River Laboratories)는 11 주령이고, 시험의 1일에 18.0 내지 23.1 그람의 몸 무게(body weight, BW)를 가지고 있었다. 상기 동물은 물(역 삼투압, 1 ppm CI), 및 18.0% 미가공 단백질, 5.0% 미가공 지방, 및 5.0% 미가공 섬유질로 구성된 NIH 31 Modified 및 Irradiated Lab Diet®을 임의로 공급받았다. 상기 마우스는 20-22℃(68-72℉) 및 40-60% 습도의 12-시간 빛 사이클인 고정된 마이크로-분리기(static micro-isolator) 내의 방사선 조사된(irradiated) Enrich-o'cobs™ Laboratory Animal Bedding에서 키웠다.
제노그라프트는 SCID 마우스에서 BT-474 인간 유방암에 의해 개시되었고, 연속적인 피하(subcutaneous) 이식(transplantation)으로 유지하였다. 종양 이식의 날에는, 각 시험 마우스는 오른쪽 옆구리에 있는 피하에 1-mm3 BT-474 절편을 받았고, 종양의 성장이 평균 사이즈가 90 내지 120 mm의 목표 범위에 들도록 관찰하였다. 종양은 캘리퍼스(calipers)를 이용하여 2차원으로 측정하였고, 크기(volume)는 하기의 식으로 계산하였다:
Figure pct00138
여기서, w = 종양의 넓이 및 l = 종양의 길이, mm 단위.
종양 이식의 날, 상기 시험의 1일로 명시된 날로부터 28일이 지난 후, 상기 동물은 각각 개별적인 종양의 크기 범위가 63 내지 126 mm3 인 10마리의 마우스 및 그룹 평균 종양 크기가 99 내지 101 mm3 로 구성된 그룹으로 나누었다.
치료는 피하에 BT-474 종양(63-126 mm3)이 생성되어 있는 모든 그룹의 마우스(n=10)에서 첫째 날 실시하였다. 그룹 1은 비히클(vehicle)-처리 대조 군. 그룹 2 내지 5는 각각 DAR=1, DAR=2, DAR=3 및 DAR=4를 갖는 ADCs를 20 mg/kg 정맥주사로 1일, 8일 및 15일에 받았다. 종양은 본 시험이 끝나는 날인 61일까지 주당 두번 측정하였다. 마우스는 개별적으로 관찰되었고, 각 동물은 종양의 크기가 종점인 1500 mm3에 도달하거나 마지막 날이 되었을 때 중 더 먼저 오는 날에 안락사하였다. 종점에 대한 시간(TTE)은 각 마우스에 대해 계산하였다. 치료 결과는 치료 대 대조 마우스에 대해 중앙(median) TTE의 백분율 증가로 명시하고 로그순위(logrank) 생존 분석을 이용하여 P≤0.05에서 통계학적으로 의미있다고 여겨지는 그룹간의 차이를 갖는, 백분율 종양 성장 지연(tumor growth delay, %TGD)으로부터 결정되었다. 마우스는 완전 회귀(complete regression, CR) 및 부분 회귀(partial regression, PR) 반응에 대해서도 관찰하였다. 시험의 마지막에 CR를 갖는 동물은 종양 자유 생존자로서 추가적으로 분류하였다. 치료 내성은 몸 무게 측정 및 치료-연관된 부작용의 임상적 징후에 대한 빈번한 관찰로 측정되었다.
61일의 시험에 대해 26.1일(75%)의 최장 가능한 TGD를 수립하며, 비히클-처리 대조군에 대한 중앙 TTE는 34.9 일이었다. 모든 양생법(regimen)은 잘 용인되었고 효험에 대하여 평가할 수 있었다. DAR=1 및 DAR=2를 갖는 ADCs는 각각 14.4일(41%) 및 16.9일(48%)의 측정 가능한 TGDs를 생성하였으나, 대조군과의 의미 있는 생존 차이는 없었다(P>0.05). DAR=1 그룹은 세 개의 그룹 중에 유일한 회귀로 기록되는 하나의 종양 자유 생존자를 가졌다. DAR=3 및 DAR=4를 갖는 ADCs는 최대 TGD(26.1일, 75%)를 생성하였고, 대조군에 대하여 의미 있는 생존 차이(P<0.001)를 나타냈으나, 두 개의 양생법은 회귀 반응에 기초해서는 뚜렷이 구분되었다. DAR=3 치료는 세 개의 PR을 생성하였고, 반면 DAR=4는 10/10 종양 자유 생존자를 생성하였다. 상기 결과는 도 8에 나타나있다.
실험예 15: 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1과 모항체 및 항체 이형 IgGC226S의 접합: IgGC226S와의 내부사슬 가교의 더 높은 유지.
실험예 4에 기술된 모항체 및 단일-경첩 이형 IgGC226S와 내부-사슬 이황화 결합 당 1 몰 당량의 비스-설폰-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE 1의 접합은 항체 환원(TCEP, 내부사슬 이황화 당 1 몰 당량, 15 분, 40℃) 후에 수행하였다. 상기 접합 시약은 접합 바로 직전에 DMSO(반응 용액에서 5%(v/v) DMSO를 제공하도록)에 준비되었다. 접합 동안 항체의 농도는 4 mg/mL이었다. 반응은 40℃에서 밤새도록(16시간) 수행되었고, 그 후 상기 반응 혼합물에 실내 온도에서 1시간 동안 10 mM DHA를 처리하였고 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE 젤은 InstantBlue™으로 염색되었고 레인(lane)내에 존재하는 각 종(species)의 %를 결정하기 위해 IMAGEQUANT™LAS 4010 기기(GE Healthcare)를 이용하여 이미지 화하였다. 상기 SDS-PAGE의 결과는 도 9에 나타나있다. 도 9에서, M으로 표시 한 레인은 Novex Protein Standards(Invitrogen)을 나타낸다. 레인 1 및 레인 2는 각각 IgGC226S와의 접합 전 및 후 반응의 이동의 윤곽(profile)을 나타낸다. 레인 3 및 레인 4는 모 항체에 대한 동량의 반응을 나타낸다. 접합으로 인하여, 예를 들면 이황화 결합의 혼합 때문에 항체의 중 대 중(heavy to heavy) 내부 사슬 이황화 결합이 공유결합으로 연결되지 않았을 때, 80 kDa 마커의 바로 아래에 중-경 사슬 2량체(heavy-light chain dimer, H+L)의 밴드를 SDS-PAGE로 확인할 수 있다. 반면, 접합으로 인하여 항체의 중 대 중 내부사슬 이황화 결합이 공유결합으로 연결되었을 때, 160 kDa 마커의 위쪽에 중-경 사슬 4량체(tetramer, 2H+2L)의 밴드를 확인할 수 있다. 레인 2 및 레인 4를 비교하였을 때, 하나의 내부 중-사슬 이황화 결합을 포함하고 있는 IgGC226S와의 접합은, 두 개의 내부 중-사슬 이황화 결합(각각 항체의 중-경 사슬 4량체의 80% 대 67%) 및 더 낮은 정도의 중-경 사슬 2량체를 형성(각각 17% 대 31%)하여, 모 항체에 비교했을 때 두 개의 중 사슬 사이에 더 높은 규모의 연결을 하도록 한다. 그러므로 상기 방법은 내부-중 사슬 이황화 결합의 효율적인 연결을 통해 항체 접합의 안정성을 증가시킨다.
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Claims (22)

  1. 하기 일반식으로 기재되는 오리스타틴(auristatin)을 함유한 접합체:
    (((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab (I)
    여기서, D는 오리스타틴 모이어티(moiety)를 나타내고;
    q는 1부터 10까지의 정수를 나타내며;
    Lk1은 링커(linker)를 나타내고;
    m은 1부터 10까지의 정수를 나타내며;
    P는 결합 또는 z가(valent) 그룹 -P1-NH-z를 나타내고, 상기 z는 2부터 11이고 P1은 최소 하나의 에틸렌 유닛(ethylene unit) -CH2-CH2- 또는 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 유닛 -O-CH2-CH2-을 포함하여;
    p는 1부터 10까지의 정수를 나타내고;
    Lk2는 결합 또는 y가 링커이고, 상기 y는 2부터 11이고 이것은 1에서 9개의 아스파테이트(aspartate) 및/또는 글루타메이트(glutamate)잔기로 구성되고;
    Lk3는 하기 일반식의 링커로 나타내며;
    -CO-Ph-X-Y- (II)
    여기서, Ph는 선택적으로 페닐(phenyl) 그룹으로 대체될 수 있고;
    X는 CO 그룹 또는 CHOH 그룹으로 나타내고; Y는 하기 화학식의 그룹으로 나타내며;
    Figure pct00139
    (III) 또는
    Figure pct00140
    (IV)
    여기서, A와 B 각각은 C1 -4 알킬렌(alkylene) 또는 알케닐렌(alkenylene) 그룹을 나타내고;
    Ab는 표적(target)에 있는 결합 파트너에 결합할 수 있는 결합 단백질 또는 펩타이드(peptide)를 나타내며, 상기 결합 단백질 또는 펩타이드는 결합 단백질 또는 펩타이드에 있는 이황화 결합으로부터 유래 된 두 개의 황 원자를 통해 Lk3에 결합하고; 및
    n은 1부터 s까지의 정수를 나타내며, 여기서 s는 Lk3와의 접합 이전의 결합 단백질 또는 펩타이드에 있는 이황화 결합의 개수이고;
    m,n,p,q,y와 z의 의미는 접합체가 1에서 10의 D그룹을 함유하도록 선택됨.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 오리스타틴은 이의 말단 질소 원자를 통해 결합된 모노메틸오리스타틴 E(monomethylauristatin E) 또는 모노메틸오리스타틴 F(monomethylauristatin F)인 접합체.
  3. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오리스타틴은 이의 말단 질소 원자를 통해 결합 된 모노메틸오리스타틴 E인 접합체.
  4. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Lk1은 분해 가능한 링커인 접합체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 Lk1은 하기 그룹들 중 하나를 포함하는 접합체:
    Figure pct00141
    Figure pct00142
    Figure pct00143

    Figure pct00144
    Figure pct00145

    상기 각각의 R, R', R'' 및 R''' 은 수소 원자 또는 알킬(alkyl) 그룹을 나타내고, 및 AA는 프로테아제(protease)에 특이성을 가지는 아미노산 서열을 나타냄.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 Lk1은 하기를 포함하는 접합체:
    Figure pct00146
    (V).
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 q는 2부터 10까지의 정수 및 Lk1은 하나 또는 그 이상의 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기를 포함하고 있는 다가(multivalent)의 링커인 접합체.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, P는 결합 또는 -P1-NH-를 나타내며, 상기 P1은 2에서 10개의 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하는 접합체.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 P는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)인 접합체.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Lk3에 있는 페닐 그룹 Ph가 치환되지 않은 접합체.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Y는 하기 화학식을 가지는 접합체:
    Figure pct00147
    .
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ab는 전장 항체(full length antibody) 또는 전장 항체의 항원 결합 지역(antigen-binding region)을 포함하고 있는 항체 단편(antibody fragments)인 접합체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 Ab는 IgG1 또는 IgG4, 또는 IgG1 또는 IgG4의 단편인 접합체.
  14. 결합 단백질에 있는 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 감소시키고, 하기 일반식의 결합 시약과 반응하는 것을 포함하는 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 접합체의 제조 방법:
    ((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII)
    여기서 D,Lk1,P,Lk2 및 m,p,q는 제 1항에서 제시된 의미를 갖고, 및 Lk3는 하기 화학식 그룹을 나타내며:
    -CO-Ph-Xa-Ya (IX)
    여기서, Ph는 제 1항에서 제시된 의미를 갖고, Xa는 CO 그룹을 나타내고, Ya는 다음의 그룹을 나타내며:
    Figure pct00148
    (X),
    Figure pct00149
    (XI),
    Figure pct00150
    (XII) 또는
    Figure pct00151
    (XIII)
    여기서, A와 B는 제 1항에서 제시된 의미를 갖고, X는 CO로 나타내는 화학식 I의 접합체를 생산하기 위해; 및 선택적으로 CH.OH 그룹 X를 가지는 접합체를 제공하여 이미 형성된 CO 그룹 X를 감소시키기 위해, 각 L은 독립적인 잔여 그룹을 나타내고, x는 1부터 4까지의 정수를 나타냄.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 Ya는 하기와 같이 나타낸 제조방법:
    Figure pct00152
    (XIIa).
  16. 하기의 일반식을 갖는 화합물:
    ((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII)
    여기서, D는 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 제시된 의미를 갖고; Lk1은 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항의 어느 한 항에 제시된 의미를 가지며; P는 제 1항, 제 8항 및 제 9항의 어느 한 항에 제시된 의미를 가지며; Lk2, m, p 및 q는 제 1항에 제시된 의미를 갖고, 및 Lk3a는 하기 화학식의 그룹으로 나타냄:
    -CO-Ph-Xa-Ya (IX)
    여기서, Ph는 제 1항 또는 제 10항에서 제시된 의미를 갖고, Xa는 CO 그룹, 및 Ya는 하기의 그룹을 나타냄:
    Figure pct00153
    (X),
    Figure pct00154
    (XI),
    Figure pct00155
    (XII) 또는
    Figure pct00156
    (XIII)
    여기서, A 및 B는 제 1항에서 제시된 의미를 갖고, 각 L은 독립적인 잔여 그룹을 나타내고, x는 1부터 4까지의 정수를 나타냄.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 Ya는 하기로 나타내는 화합물:
    Figure pct00157
    (XIIa).
  18. 제 1항 내지 제 13항의 어느 한 항의 접합체를 약학적으로 허용가능 한 담체, 선택적으로는 추가적인 치료적 물질을 포함하는 약학적 조성물.
  19. 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 13항의 어느 한 항의 접합체 또는 제 18항의 조성물의 용도.
  20. 약학적으로 유용한 양의 제 1항 내지 제 13항의 어느 한 항의 접합체, 또는 제 18항의 약학적 성분을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자 치료 방법.
  21. 하기 일반식을 갖는 접합체:
    (((D'q'-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab (I')
    여기서, D'는 약물 모이어티이고;
    q'는 2부터 10까지의 정수이며;
    Lk1'은 링커를 나타내고;
    m은 1부터 10까지의 정수를 나타내며;
    P는 결합 또는 z가 그룹 -P1-NH-를 나타내고, 상기 z는 2부터 11이고 P1은 최소 한 개의 에틸렌 유닛 -CH2-CH2- 또는 에틸렌 글리콜 유닛 -O-CH2-CH2-을 가지고 있는 그룹을 나타내며;
    p는 1부터 10까지의 정수를 나타내고;
    Lk2는 결합 또는 y가 링커이고, 상기 y는 2부터 11이고 1에서 9개의 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 잔기들로 구성되며;
    Lk3는 하기 일반식으로 나타나는 링커를 나타냄:
    -CO-Ph-X-Y- (II)
    여기서, Ph는 선택적으로 페닐 그룹으로 치환되고; X는 CO 그룹 또는 CH.OH. 그룹을 나타내고; 및 Y는 하기 화학식의 그룹을 나타냄:
    Figure pct00158
    (III) 또는
    Figure pct00159
    (IV)
    여기서, A 및 B는 C1 -4 알킬렌 또는 알케닐렌 그룹;
    Ab는 표적에 있는 결합 파트너에 결합할 수 있는 결합 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 상기 결합 단백질은 결합 단백질 또는 펩타이드에 있는 이황화 결합으로부터 유래 된 두 개의 황 원소를 통해 Lk3에 결합되고; 및
    n은 1부터 s까지의 정수를 나타내고, 상기 s는 Lk3에 결합하기 이전에 결합 단백질이나 펩타이드에 존재하는 이황화 결합의 개수이고;
    m, n, p, q, y와 z의 의미는 접합체가 1에서 10의 D'그룹을 함유하도록 선택됨.
  22. 하기 화학식의 화합물:
    ((D'q'-Lk1')m-P)p-Lk2-Lk3a (VIII')
    여기서, D', q', Lk1', m, P, p, Lk2 및 Lk3는 제 21항에 제시된 의미를 갖고, Lk3a는 제 16항에 제시된 의미를 가짐.

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