HUT61898A - Process for producing conjugates of anthracyclines formed with carriers, as well as pharmaceutical compositions comprising same viscoelastic dentifrice - Google Patents

Process for producing conjugates of anthracyclines formed with carriers, as well as pharmaceutical compositions comprising same viscoelastic dentifrice Download PDF

Info

Publication number
HUT61898A
HUT61898A HU9201146A HU114692A HUT61898A HU T61898 A HUT61898 A HU T61898A HU 9201146 A HU9201146 A HU 9201146A HU 114692 A HU114692 A HU 114692A HU T61898 A HUT61898 A HU T61898A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
compound
derivative
group
antibody
Prior art date
Application number
HU9201146A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9201146D0 (en
Inventor
Francesco Angelucci
Laura Bersani
Michele Caruso
Marina Ripamonti
Daniela Ruggieri
Antonino Suarato
Original Assignee
Erba Carlo Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Erba Carlo Spa filed Critical Erba Carlo Spa
Publication of HU9201146D0 publication Critical patent/HU9201146D0/hu
Publication of HUT61898A publication Critical patent/HUT61898A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/24—Heterocyclic radicals containing oxygen or sulfur as ring hetero atom

Description

A találmány terápiásán alkalmazható antraciklinek hordozóanyagokkal, igy természetes vagy szintetikus eredetű poliklonális vagy monoklonális antitestekkel, fehérjékkel vagy peptidekkel kialakított konjugátumaira, ezek előállítására, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyek bizonyos emlős tumorok kezelésére alkalmazhatók. A találmány kiterjed uj antraciklin-származékokra és ezek előállítására is.
Az utóbbi években sok erősen citotoxikus antraciklin-származékot szintetizáltak. így például, a cukorrész 3' helyzetű szénatomjához kapcsolódó morfolino vagy szubsztituált morfolino gyűrűt hordozó származékok az egereken végzett kísérleti vizsgálatok szerint antitumor hatással rendelkeznek (Bioactive Molecules, 55-101, 6. kötet, J. William Lown kiadó, Elveiser, (1988)).
A találmány olyan uj linkerekre vonatkozik, amelyek lehetővé teszik a terápiásán hatékony anyagnak a bioaktiv szerből történő felszabadulását, és igy a hatóanyag terápiás hatékonyságának növelését, és a humán adagolás során jelentkező toxikus hatás csökkentését.
Közelebbről, a találmány olyan bioaktiv szerekkel foglalkozik, amelyek szabad primer vagy szekunder hidroxilcsoportot hordozó és az antibiotikumok, antitumorális és antivirális vegyületek csoportjába tartozó hatóanyagot tartalmaznak, amelyek valamely hordozóhoz, igy adott sejtpopulációra szelektív antitesthez, vagy természetes vagy szintetikus eredetű, és a receptor szövetekre specifikus proteinhez, peptidhez, vagy polimerhez kapcsolódnak.
A legalább egy primer vagy szekunder hidroxilcsoportot tartalmazó hatóanyag kovalens kötéssel kapcsolódik a hordozóanyaghoz. A kovalens kötést egy linker kar biztosítja, amely egy savra érzékeny acetálos kötéssel kötődik a primer vagy szekunder hidroxil pozícióhoz. A találmány szerinti bioaktiv szer savra érzékeny acetálos kötése lehetővé teszi, hogy a célszövet savas külső vagy belső környezetében a hatóanyag felszabaduljon.
A találmány tárgya tehát (1) általános képletü konjugátum, a képletben
A-0- jelentése valamely -A-O-H általános képletü hatóanyag maradéka, ahol
-0-H jelentése egy primer vagy szekunder hidroxilcsoport, a értéke 1-30,
W jelentése egy (2) általános képletü csoport, ahol b értéke 1-4,
B jelentése 1-3 szénatomos alkilénlánc,
Rj és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, alkilcsoport, fenilcsoport vagy szubsztituált fenilcsoport,
Z jelentése valamely távtartó csoport,
T jelentése valamely hordozó csoport.
A fenti értelmezésben a előnyös értéke 1-5, B előnyös jelentése -(CH2)2- képletü csoport. R^ és R2 jelentésében a halogénatom előnyösen klór-, bróm- vagy jódatom, az alkil• · · · · • · · · · · · «
- 4 csoport 1-4 szénatomot tartalmaz, és lehet metilcsoport vagy etilcsoport. A szubsztituált fenilcsoport szubsztituense lehet például halogénatom vagy alkilcsoport, ahol a halogénatom vagy alkilcsoport előnyösen a fenti. Z előnyös jelentése
i) -NH- képletü csoport, ii) -NH-(CH2)C“s-s- képletü csoport, ahol c értéke 1-4, iii) -NH-[C]<j-N=CH- képletü csoport, ahol
a) d értéke 0,
b) d értéke 1, és
[C] jelentése -NH-CO(CH2)e-CO-NH- képletü
csoport, ahol
e értéke 2-4,
c) d értéke 1-4, és
[C] jelentése -(CH2)f-0-(CH2)f- képletü
csoport, ahol
f értéke 1-2, vagy
d) d értéke 2-6, és
[C] jelentése -CH2- képletü csoport,
iv) -NH-[CJjj-NH-CO- képletü csoport, ahol [C] és d jelentése a fenti,
v) -[D]-NH- képletü csoport, ahol [D] jelentése -NH-[CH2]g-CO- képletü csoport, ahol g értéke 2-6, vi) -[E]-CO- képletü csoport, ahol • · · · [E] jelentése -ΝΗ-(CH2)g-NH- képletü csoport, ahol g értéke 2-6, vagy vii) (b) képletü piperazinil-karbonil-csoport.
Az (1) általános képletben A-O-H hatóanyag előnyösen valamely antitumorális szer, amelyre példaként említhetők az antraciklinek, igy doxorubicin, ennek 3'-dezamino-3·-morfolinil-származékai, ahol a morfolino gyűrű 2 helyzetben adott esetben alkoxicsoporttal, igy 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituálva lehet; a pirimidin analógok, igy 5-fluor-dezoxi-uridin vagy arabino-furanozil-citozin (citarabin); vinkaalkaloid-származékok, igy 4-dezacetil-vinil-blasztin; valamint más antitumorális szerek, igy podofillotoxin vagy illudinok. Az A-O-H hatóanyag lehet továbbá valamely antivirális szer, igy 3’-azido-3’-dezoxi-timidin (AZT), bróm-vinil-dezoxi-uridin (BVDU), 9-[(2-hidroxi-etoxi)-metil]-guanin (aciklovir) vagy 9-[(1,3-dihidroxi-2-propoxi)-metil]-guanin (ganciklovir) , továbbá valamely antibiotikum, igy tiénamicin vagy penem-származékok, igy (5R, 6S) -2-karbamoil-oxi-metil-6-[ (ÍR) -hidroxi-etil]-2-peném-3-karbonsav és acetoxi-metil-(5R, 6S)-2-karbamoil-oxi-metil-6-[ (ÍR) -hidroxi-etil]-2-peném-3-karboxilát.
Ha az A-0- csoport valamely A-O-H általános képletü antraciklin-származékból származik, akkor az A-0- csoport előnyösen valamely (a) általános képletü csoportot jelent, a képletben R10 jelentése hidrogénatom, hidroxilesöpört vagy ·«····· · metoxicsoport,
Rn és R12 közül az egyik jelentése hidrogénatom és a másik jelentése hidroxilesöpört, vagy R11 jelentése hidrogénatom vagy jódatom, és r12 jelentése hidrogénatom,
Rj3 jelentése aminocsoport vagy egy morfolino gyűrűbe zárt nitrogénatom.
A morfolino gyűrű lehet például egy morfolino-csoport (MO), 3-ciano-4-morfolino-csoport (CM) vagy 2-metoxi-4-morfolino-csoport (MM), amelyek nitrogénatomjukon keresztül a 3' helyzetű szénatomhoz kötődnek.
A T hordozó csoport előnyös jelentése valamely poliklonális antitest vagy ennek fragmense, amely egy antigén kötő helyet hordoz, és tumorral összefüggő antigén megkötésére alkalmas; egy monoklonális antitest vagy annak fragmense, amely antigén kötő helyet hordoz, és valamely tumorsejt populáció által preferenciálisan vagy szelektíven kifejezett antigén megkötésére képet; valamely peptid vagy fehérje, amely preferenciálisan vagy szelektíven valamely tumorsejthez kötődhet, vagy valamely polimer hordozó.
A hordozó csoport, előnyösen a T-[NH2)X általános képlettel ábrázolható hordozó csoport, ahol x a kondenzációra alkalmas aminocsoportok számát jelenti, lehet például valamely tumorral összefüggő antigén elleni poliklonális antitest, preferenciálisan vagy szelektíven tumorsejt populáció által kifejezett antigénhez kötődő monoklonális antitest, preferenciálisan vagy szelektíven tumorsejthez
• · •··· ·· kötődő természetes vagy rekombináns peptid, fehérje vagy növekedési faktor, valamint természetes vagy szintetikus polimer hordozó, igy polilizin. Hordozó csoportként alkalmazható a fent említett hordozók kisebb része is, igy az antitest FAB vagy F(ab')2 fragmense vagy az említett, és rekombináns DNS technikával előállítható peptid vagy fehérje fragmensek.
Az említett antitestekre, a lehetséges terápiás alkalmazást is megemlítve, az alábbi példákat adjuk meg:
- anti-T-sejt antitest, igy T101 antitest (Royston I. és munkatársai: J. Immunoi. 125, 725, (1980)) ;
- anti-CD5 antitest, igy OKT1 (orto) antitest (krónikus limfocita leukémia), ATCC CRL 8000;
- anti-transzferin receptor antitest, igy OKT9 (orto) antitest (petefészek és más tumor), ATCC CRL 8021;
- anti-melanoma antitest, igy MAb 9.2.27 antitest (Bumol T.F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci USA
79, 1245 (1982) [melanoma]);
- anti-karcinoma marker antitestek, igy — anti-CEA 1116 NS-3d antitest, ATCC CRL 8019, — anti-alfa-fetoprotein OM 3-1.1 antitest,
ATCC HB 134 (hepatoma), — 791T/36 antitest (Embleton M.J. és munkatársai: Br. J. Cancer 43., 582 (1981) [oszteogén szarkoma ]) , — B 72.3 antitest (4 522 918 számú USA-beli sza> « badalmi leírás) (vastagbél karcinoma és más tumorok),
- anti-petefészek karcinoma antitest, igy OVB3 antitest, ATCC HB 9147;
- anti-tüdő karcinoma antitest, igy (HMGF antigén) antitest (Aboud-Pirak E. és munkatársai: Cancer Rs. 48, 3188 (1988));
- anti-hólyag karcinoma antitest, igy 1G3.10 antitest (Yu D.S. és munkatársai: Eur. J. Urol. 13., 198 (1987)) .
Az említett természetes vagy rekombináns eredetű növekedési faktorokra és fehérjékre példaként említhető az FGF, EGF, PDGF, TGF-α, a-MS, interleukin, interferon, TNF melanotropin (MSH), és hasonló vegyületek.
Hordozó csoportként alkalmazhatók továbbá T-[SH]xi általános képletü anyagból származó csoportok, ahol xl a kondenzációra alkalmas tiolcsoportok számát jelenti. Ezekre példaként említhetők a tiolozott poliklonális vagy monoklonális antitestek, amelyek előállithatők például N-szukcinimidil-S-acetil-tioacetát (SATA), N-szukcinimidil-3-(2-piridil-tio)-propionát (SPDP), D,L-homocisztein-tiolakton, N-acetil-D,L-homocisztein tiolakton vagy 2-imino-tiolakton segítségével.
A hordozó csoport lehet továbbá valamely T-[CHO]x2 általános képletü anyagból származó csoport, ahol x2 a kondenzációra alkalmas forrnilesöpörtök számát jelöli, és amely előnyösen valamely szénhidrát csoportot tartalmazó • 44 · · 4 • 4 « 4 « · · • · 4 4 «4444444· ·· 4 4 4 . · 4 4 · poliklonális vagy monoklonális antitestből származik, ahol a szénhidrát csoport előnyösen az Fc szakaszban található, és kémiai vagy enzimatikus módszerekkel aldehiddé van oxidálva (4 671 958 számú USA-beli szabadalmi leírás). A T-[CHO]x2 általános képletü hordozó származhat továbbá valamely megfelelő polimer horodzó formilezéséből vagy oxidálásából, vagy megfelelő glikoproteinek szénhidrát csoportjainak aldehiddé történő oxidálásából.
A hordozó csoport származhat továbbá valamely T-[COOH]X3 általános képletü anyagból, ahol x3 a kondenzációra alkalmas karboxilesöpörtök számát jelöli, és amely előnyösen poliaszpartámsavból vagy poliglutámsavból vagy oldható és biológiailag lebontható szintetikus kopolimerekből, igy (c) képletü csoportokból felépített N-(2-hidroxi-propil)-metakrilamidból (HMPA) származik, a képletben [X] jelentése -Gly-Phe-Leu-Gly vagy -HN-(CH2)n-C0, ahol n értéke 1-5, [P] jelentése hidroxilcsoport vagy -O-C6H4PNO2, x/y értéke 90/10 + 95/5 mól/mól%, amelynek móltömege 10 000-40 000, előnyösen 12 000-20 000 (J. Kopecek: Biodegradation of polymers fór biomedical use, IUPAC Macromolecules, H. Benőit és P.Rempp, Pergamon Press, Oxford, Anglir, 505-520 (1982)).
Az említett hordozó csoport származhat továbbá poli(aminosav) kopolimerekből, igy poli(GluNa,Ala,Tyr) polimerből, amelynek móltömege általában 25 000-50 000, és amely célzott hatóanyag/hordozó rendszerként alkalmazható tüdőszövetek vo• · · · *·······« ·· · ♦ · · ·· * ·
- 11 x a kondenzációban résztvevő aminocsoportok számát jelöli, vagy ii') a (4) általános képletü vegyülettel egy -NH2~(CH2)C~SH általános képletü tiol-származékkal kondenzáljuk, a képletben c értéke 1-4, és a kapott (5) általános képletü vegyületet, a képletben A-O—, W és c jelentése a fenti,
T-[SH]xi általános képletü vegyülettel kondenzáljuk, a képletben
T jelentése a fenti, xl a kondenzációban résztvevő tiolcsoportok számát jelöli, vagy iii') A (4) általános képletü vegyületet hidrazinnal, szukcinsav vagy adipinsav dihidrazid-származékkal vagy valamely diamino-vegyülettel reagáltatjuk, és a kapott (6) általános képletü vegyületet, a képletben
A-0- és W jelentése az 1. igénypontban megadott, [C] és d jelentése a 6. igénypontban megadott,
T-[CHO]x2 általános képletü vegyülettel kondenzáljuk, a képletben
T jelentése valamely hordozó csoport, és x2 a kondenzációban résztvevő forrnilesöpörtök számát jelenti.
Az eljárás egy másik előnyös megvalósítása szerint « · 4 4 • ···· ···· • 4 4 *
- 13 és a kapott (9) általános képletü vegyületet vagy a (8) általános képletü vegyületet kondenzálószer jelenlétében T-[NH2]X általános képletü vegyülettel kondenzáljuk.
Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint vi’) egy (4) általános képletü vegyületet NH2N-(CH2)g-NH2 képletü amino-származékkal reagáltatunk, ahol g értéke a fenti, igy (10) általános képletü származékot kapunk, ahol [E] jelentése a fenti, vagy vii') egy (4) általános képletü vegyületet piperazinnal (11) általános képletü származékká alakítunk és a (10) vagy (11) általános képletü vegyületet a fent leirt módon (7) általános képletü vegyülettel kondenzáljuk.
A (3) vagy (8) általános képletü vegyületnek a (4) vagy (9) általános képletü aktivált származékká történő átalakítása megvalósithatő például úgy, hogy a (3) vagy (8) általános képletü vegyületet N-hidroxi-szukcinimiddel vagy annak vízben oldódó 3-szubsztituált nátrium-szulfonát sójával reagáltatjuk N,N'-diciklohexil-karbodiimid jelenlétében oldószerben, igy etil-acetátban vagy N,N-dimetil-formamidban. Ebben az esetben a (4) és (9) általános képletben L jelentése (e) általános képletü csoport, ahol Ra jelentése hidrogénatom vagy nátrium-szulfát csoport.
Egy T-[COOH]X3 általános képletü hordozónak egy (7) általános képletü vegyületté tröténő aktiválása megvalósítható úgy, hogy a hordozót p-nitrofenollal reagáltatjuk · · ········· ·· ···« ·· · ·
Ν,Ν'-diciklohexil-karbodiimid jelenlétében oldószerben, igy dimetil-formamidban, amikoris L' jelentése pNO2C6H5-Oképletü csoport, vagy N-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinonnal (EEDQ) (B. Belleau és munkatársai: JACS, 90, 1651 (1968)) reagáltatjuk oldószerben, igy tetrahidrofuránban vagy dimetil-formamidban, amikoris L' jelentése (f) képletü csoport.
Eljárhatunk úgy is, hogy a T-[COOH]X3 általános képletü hordozó alkálisóját, igy nátriumsóját alkil-halogén-karbonáttal, igy 1-4 szénatomos alkil-halogén-karbonáttal, előnyösen etil-klór-karbonáttal (C2H5O-COCI) reagáltatjuk oldószerben, igy vízben vagy dimetil-formamidban, amikoris L' jelentése -COOC2H5 képletü csoport.
Az (1) általános képletü konjugátumok előállításához alkalmazott kondenzálást a (3) vagy (8) általános képletü származékokból és T-[NH2]X általános képletü hordozóból kiindulva amid tipusu kovalens kötés kialakítására alkalmas és a hordozó szerkezetével kompatibilis körülmények között végezzük. A hordozó vizes vagy szerves oldószerben mutatott kémiai stabilitása alapján különböző eljárások alkalmazhatók a (4), (5), (6), (9), (10) és (11) általános képletü köztitermékek kapcsolási reakcióiban. A szerves oldószerre érzékeny hordozó esetén előnyösen pufferolt vizes oldatot (pH = = 7-9,5), 4-37 °C közötti hőmérsékletet, és néhány óra és néhány nap közötti reakcióidőt alkalmazunk.
Az (5) általános képletü származék, és a T-[SH]xj általános képletü hordozó kondenzálását pufferolt vizes oldó• · «
-lőszerben (pH = 6-7) 4 °C hőmérsékleten néhány óra és néhány nap közötti reakcióidővel végezzük.
A (6) általános képletü származék és a T-[CHO]X2 általános képletü hordozó kondenzálását oxim vagy hidrazon tipusu kovalens kötés kialakítására alkalmas és a hordozó szerkezetével kompatibilis körülmények között végezzük. Előnyösen pufférőit vizes oldatban (pH = 4-7,5) 4-37 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk néhány óra és néhány nap közötti reakcióidővel.
A (6), (10) vagy (11) általános képletü származék és a T-[CO-L']y általános képletü hordozó kondenzálását amid tipusu kovalens kötés kialakítására alkalmas és a hordozó szerkezetével kompatibilis körülmények között dolgozunk. A kondenzálást előnyösen pufférőit vizes oldatban (pH = 7-9,5) és 4-37 °c közötti hőmérsékleten végezzük néhány óra és néhány nap közötti reakcióidővel.
A kondenzálás megvalósítható továbbá száraz dimetil-szulfoxid vagy dimetil-formamid alkalmazásával szobahőmérsékleten 1-3 óra közötti reakcióidővel is.
A fenti értelmezésben a néhány óra és néhány nap közötti reakcióidő előnyösen 4 óra és 5 nap közötti reakcióidőt jelent.
A (4) és (9) általános képletü kiindulási anyagok és a T-[NH2]X általános képletü antitestek kondenzálása megvalósítható például vizes 0,1 mól/1 nátrium-foszfát és vizes 0,1 mól/1 nátrium-klorid oldatban pH = 8 értéken, amikoris 1 mg/ml monoklonális antitestet harmincszoros • · · · · 9»·« · · • · · 9 · · • · * · · · · * · · · ·«··«···· • · ···« ·· · · moláris feleslegben alkalmazott (4) vagy (9) általános képletü vegyülettel reagáltatunk N,N-dimetil-formamidban felvett 10 vegyes%-os oldat formájában 20 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül. A konjugátumot Sephadex G25 oszlopon (Pharmacia Fine Chemical, Piscatawa, NH, US) foszfát pufférőit sóoldattal (PBS) eluálva gélszüréssel tisztítjuk.
Az (5) általános képletü vegyületet és a tiolcsoportot hordozó funkcionalizált antitestet például vizes 0,1 mól/1 nátrium-acetát és vizes 0,1 mól/1 nátrium-klorid oldatban pH = 6 értéken kondenzáljuk, amikoris 1 mg/ml monoklonális antitestet harmincszoros moláris feleslegben alkalmazott (5) általános képletü vegyülettel reagáltatunk azonos pufferben felvett 5 vegyes%-os oldat formájában 4 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül. A konjugátumot a fent leirt módon gélszüréssel tisztítjuk.
A (6) általános képletü kiindulási anyagot és a T-[CHO]x2 általános képletü hordozót vizes 0,1 mól/1 nátrium-acetát és vizes 0,1 mól/1 nátrium-klorid oldatban pH = 6-7 értéken kondenzáljuk, amikoris 1 mg/ml monoklonális antitestet harmincszoros moláris feleslegben alkalmazott (6) általános képletü vegyülettel kondenzálunk azonos pufferben felvett 5 vegyes%-os oldat formájában 20 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül. A konjugátumot a fent leirt módon gélszüréssel tisztítjuk.
A (6), (10) és (11) általános képletü vegyületeket és a (7) általános képletü aktivált hordozót vízmentes poláros oldószerben, igy dimetil-formamidban kondenzáljuk, amikoris • · · «
- 17 5-50 mg/ml (6), (10) vagy (11) általános képletű vegyületet ekvivalens mennyiségű (7) általános képletű vegyülettel kezelünk 20 ’C hőmérsékleten 1-24 órán keresztül.
A (3) általános képletű vegyületek, valamint a (4), (5), (6), (9), (10) és (11) általános képletű aktivált származékok uj anyagok, és a találmány oltalmi körébe esnek.
A (3), (5), (6), (10) és (11) általános képletű vegyületek alkalmazhatók mind köztitermékként, mind terápiásán hatékony szerként. Közelebbről, a (3) általános képletű köztitermékek alkalmazhatók A-O-H általános képletű hatóanyag előhatóanyagaként. A (3) általános képletű származékok előállíthatok az A reakcióvázlatban ábrázolt módon. Ennek értelmében egy A-O-H általános képletű hatóanyagot megfelelő enoléter-származékkal kondenzálunk, amely védett karboxilcsoportot hordoz. Példaként említhető a (12) általános képletű vegyület, ahol
B, b, Rí és R2 jelentése a fenti,
R3 jelentése védőcsoport, igy metilcsoport vagy etilcsoport.
A kondenzálás után a védőcsoportot a szokásos módon eltávolítjuk.
Az (1) általános képletű bioaktiv konjugátumok előállításához antitumor hatású antraciklin-származékként előnyösen alkalmazhatók a hidroxilezett hatóanyagok (A-O-H képlet). Az antraciklin-származékokra példaként említhetők a (13) általános képletű 3'-dezamino-3'-morfolinil-származékok, közelebbről a 31-dezamino-3'-(4-morfolinil)-doxorubicin (a (13) • ·· ♦ · · · ·
- 18 általános képletben R4 jelentése hidroxilcsoport és R5 jelentése hidrogénatom, [13a vegyület]), valamint a 3'-dezamino-3'-(2-metoxi-4-morfolinil)-doxorubicin (a (13) általános képletben R4 jelentése hidroxilcsoport és R5 jelentése metoxicsoport, [13b vegyület] (E.M. Acton és munkatársai: Morpholinyl Anthracyclines, Bioactive Molecules, 6. kötet, J.W. Lown kiadó, Elseiver (1988)).
A (13) általános képletű antraciklin-származékok a fent leirt módon (3) általános képletű uj savérzékeny származékokká alakíthatók. Ehhez a kiindulási anyagot (12) általános képletű vegyülettel kezeljük a fent leirt módon, a képletben Rx jelentése például etilcsoport. A (12) általános képletű vegyület előállítható, ha a megfelelő, ketoncsoportot hordozó vegyületet etil-diazo-acetáttal reagáltatjuk (J.A. Landgrebe és munkatársai: J. Org. Chem. 4.3, 1244 (1975)). Az antraciklin-származék, valamint a többi, primer vagy szekunder hidroxilcsoportot hordozó vegyület és (12) általános képletű vegyület reakcióját szulfonsav tipusu katalizátor, igy p-toluol-szulfonsav vagy kámfor-szulfonsav jelenlétében poláros oldószerben, igy dimetil-formamidban szobahőmérsékleten néhány óra és 1 nap közötti reakcióidővel végezzük. Az antraciklin-származékhoz kapcsolódó savra érzékeny egység védett karboxilcsoportját a (3) általános képletű vegyületben aktivált karbonilcsoporttá alakítva (4) általános képletű vegyületet kapunk, amelyből az uj bioaktiv hatóanyagot a megfelelő hordozóval kondenzálva állítjuk elő. Kívánt esetben a (4) általános képletű antraciklin-származék ·♦♦♦ · *··« · · • « · «4 « • · ······· · ··*· · · · · (5), (6), (8), (9), (10) és (11) általános képletü vegyületté alakítható, amelyekből a megfelelő hordozóval kondenzálva kapjuk az (1) általános képletü uj bioaktiv hatóanyagot.
Az antraciklin-származékokhoz hasonlóan más terápiás hatóanyagok is reagáItathatok a (12) általános képletü vegyületekkel, és igy bizonyos emlős betegségek kezelésére alkalmas bioaktiv hatóanyagokat kapunk.
A találmány szerinti (1) általános képletü bioaktiv anyagok előnyösen alkalmazhatók terápiás szerként, mivel olyan acetálos kötést tartalmaznak, amely hidronium ionnal katalizált hidrolízis vagy in vivő enzimatikus hasítás során felszabadítja az A-O-H képletü hatóanyagot. így például, ismert, hogy a rosszindulatú tumorokban a normális szövethez viszonyítva fokozódik a glikolizis. Ez megnöveli a laktát termelését és igy csökkenti a pH értéket (H.M. Rauen és munkatársai: Z. Naturforsch. B rész, 23., 1461 (1968)).
A fent leirt eljárással előállított konjugátumok különböző fizikai-kémiai módszerekkel jellemezhetők. így például, az eredeti móltömeg megőrzése és az aggregátum képzés elmaradása kimutatható kromatográfiás gélszüréssel (Yu D.S. és munkatársai: J. Urol. 140. 415 (1988)), mig az antraciklin és az antitest emellett vagy ettől függetlenül különböző hullámhosszúságokon detektálható, és gélelektroforetikus módszerekkel kimutatható. A kapott vegyületek általános töltés eloszlása kromatográfiás ioncserés módszerekkel vizsgálható. Az antraciklin koncentrációt spektrofotometriás ·♦·· · *««4 * · • · · · · · • · · · · · · • · · · ·······# ···♦···· · · titrálással mérjük az eredeti antraciklin-származékkal felvett standard kalibrációs görbe alapján. A fehérjekoncentrációt kolorimetriás vizsgálattal, igy bicinkonsawal végzett vizsgálattal (Smith P.K. és munkatársai: Anal. Biochem. 150. 76 (1985)) vagy Bradford festéses módszerrel (Bradford M.M.: Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) határozzuk meg. Az antitest antigén kötő aktivitását a konjugációs folyamat lejátszódása után ELISA módszerrel (Yu D.S. és munkatársai: J. Urol. 140. 415 (1988)) és citofluorimetriás módszerrel (Gallego J. és munkatársai: Int. J. Cancer, 33, 737 (1984)) mérhetjük. A konjugátum citotoxikus hatását az eredeti hatóanyaghoz viszonyítva a 3H-timidin felvételének a célzott sejtekben kiváltott gátlásának vizsgálatával határozzuk meg a maximális citotoxikus hatás kifejtéséhez szükséges inkubálási idő után (Dillmann R.O. és munkatársai: Cancer. Rés. 48. 6096 (1988)).
A konjugátum szelektív citotoxicitását antigén pozitív sejtvonalon határozzuk meg antigén negatív sejtvonalhoz viszonyítva. Ennek során egy rövid inkubálási idő után mérjük a 3H-timidin felvétel gátlását az antigén pozitív, illetve antigén negatív sejtvonalon (Dillmann R.O. és munkatársai: Cancer Rés. 48, 6096 (1988)).
A konjugátum savérzékenységét a fent említett kromatográfiás módszerrel határozzuk meg megfelelő puffer oldatban végzett inkubálás után.
A plazmában mérhető stabilitás meghatározásához az antitest egységben 225I-vel és/vagy az antraciklin egységben • · · · · · • · · · · · · * · · · ·······«* ** ···« ·· · 14C-vel jelölt konjugátumot HPLC módszerrel analizáljuk.
Az 1. példa szerint előállított 3' vegyületet in vitro körülmények között LoVO sejtekben (humán vastagbél adenokarcinoma) és LoVo-Doxo-rezisztens (LoVO/DX) sejtekben vizsgáljuk doxorubicinnel és 3’-dezamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicinnel ((13b) vegyület) összehasonlítva. A vizsgálatot 4 órás kezelés után az úgynevezett egysejtes lemeztechnikával (telepvizsgálat) végezzük. Az 50 %-os gátláshoz szükséges koncentrációt (IC50) a koncentráció/válasz görbe alapján határozzuk meg. Az 1. táblázatban megadott adatok alapján a 3’ vegyület erősebb citotoxikus hatással rendelkezik, mint a doxorubicin, mind az érzékeny, mind a rezisztens sejtvonalon, de 10-20-szor kevésbé citotoxikus, mint az eredeti (13b) vegyület. A (3) vegyület in vivő vizsgálatát P388-doxorubicin rezisztens leukémiát (P388/DX Johnson) hordozó CDF-1 egereken végeztük, a doxorubicin és a (13b) vegyület hatásával összehasonlítva. A 2. táblázatban megadott adatok szerint a 3' vegyület napi egy 0,22 mg/kg dózisu ip adagolással igen hatékony (T/C = = 184 %).
Az 1', 1, lv, lvi és ivü konjugátumokat (lásd 5., 6., 9., 11. és 12. példa), amelyekben a citotoxikus hatóanyagként alkalmazott 3'-dezamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin egy savérzékeny linkerhez kapcsolódik, in vivő P388/DX Johnson leukémián vizsgáltuk, és doxorubicin és a szabad 13b hatóanyag hatásához hasonlítottuk. A 3. táblázatban megadott adatok szerint a napi egy iv dózisban ···· · ··«· · · * · · · · · • · · · · · · • · · · ·«······ •· ···· ·« · ·
- 22 adagolt uj konjugátumok a szabad 13b hatóanyaggal azonos hatást mutatnak. A terápiás index, amelyet az LDsq-kjo és az optimális dózis arányában fejezünk ki, az uj konjugátumoknál magasabb, mint a szabad 13b hatóanyagnál.
A 4. táblázatban a 3'-dezamino-3'-[2(S) -metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin (13b vegyület) pH = 3 értékű acetát pufferben 37 ’C hőmérsékleten kezelt konjugátumból történő felszabadulásának t5Q% értékeit adjuk meg.
1. táblázat
Citotoxikus hatás 4 órás kezelés után
Hatóanyag L0V0 IO50(ng/ml) L0V0/DX ID50 (ng/ml) R.I.
Doxorubicin 60 2180 36,3
13b 16 33 2
3 ' 240 745 3
*: R.I. = rezisztencia index = IC5Q L0V0/DX/IC5Q L0V0
- 23 2, táblázat
Antitumor hatás P388/DX Johnson leukémia ellen
Hatóanyag Dózis (mg/kg) T/C* (%) Toxikus i
Doxorubicin 10 100 0/10
15 100 0/10
22 100 10/10
13b 0,1 136 0/10
0,125 155 1/10
3' 0,22 184 0/10
*: Közepes túlélési idő, a kezeletlen kontrolihoz viszonyított százalék.
**: Elpusztult egereken végzett autopszia alapján meghatározva.
···« · • · · · · · * · · · · · · * · · · ·······'· ·· ·««« ·· · «
3. táblázat Antitumor hatás P388/DX Johnson leukémia ellen
Hatóanyag Dózis* (mg/kg) T/C** (%) Toxikus halál
Doxorubicin 16,9 105 0/10
22 100 3/10
13b 0,076 177 0/28
0,09 192 0/39
1' 0,16 144 0/10
0,25 175 0/20
0,5 167 0/10
1 0,16 156 0/10
0,25 200 0/10
0,5 133 0/10
lv 0,25 111 0/10
0,5 144 0/10
1 205 0/20
1,25 200 0/10
ívi 0,66 172 0/10
1 194 0/10
ívii 0,66 233 0/10
1 177 0/10
*: a dózist a konjugátumban található 13b hatóanyag mennyiségében fejezzük ki.
**: Közepes túlélési idő, a kezeletlen kontrolihoz viszonyított százalék.
***: Elpusztult egereken végzett autopszia alapján ···· · ···«· · • · · · · · • · · · · · · • · · · ······· 4 «4 ···· ·· · «
- 26 csoportok között összehasonlítottuk.
A konjugátumok gyógyszerészetben alkalmazható hordozóanyaggal vagy hígítóanyaggal és egyéb gyógyszerészeti segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé alakíthatók. Ennek során bármely szokásos hordzóanyag vagy higitóanyag alkalmazható. Ezekre példaként említhető a fiziológiás sóoldat és a Ringer féle dextróz oldat.
A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
1. példa
14-0-(1-Karboxi-metil-oxi-ciklohexil)-3 *-dezamino-31-Γ2(S)-metoxi-4-morfolinill-doxorubicin (3' vegyület, a (3) általános képletben A-0- jelentése a (13) képletnek felel meg, ahol R4 jelentése 0-,
R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése
-(CH2)2“ képletü csoport, R^ és R2 jelentése hidrogénatom)
0,68 g (1 mmól) 3'-dezamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicint (13b vegyület, előállítható a 89 28 654.6 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés szerint) 20 ml vízmentes dimetil-formamidban oldunk, és 6 g (32 mmól) etil-2-ciklohexén-l-il-oxi-acetáttal (12' vegyület, a (12) képletben b értéke 1, R3 jelentése etilcsoport, B jelentése -(CH2)2“ képletü csoport, Rj és R2 jelentése hidrogénatom) ···♦ reagáltatjuk 50 mg megolvasztott p-toluol-szulfonsav jelenlétében. Az elegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük, majd vizes nátrium-hidrogén-karbonátra öntjük, és metilén-kloriddal extraháljuk. A szerves fázist vizzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és szűrjük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a maradékot szilikagéllel töltött oszlopon metilén-klorid/metanol 98:2 térfogatarányu elegyével eluálva flesh kromatográfiásan tisztítjuk. így a 3' vegyület észter-származékát (R3 jelentése etilcsoport) kapjuk.
Ezt a vegyületet 200 ml 0,1 n vizes nátrium-hidroxiddal kevertetjük nitrogén atmoszférában 0 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül. Ezután az elegyet ecetsavval pH = 8,2 értékre állítjuk, és n-butanollal extraháljuk. A szerves fázist vizzel mossuk, csökkentett nyomáson kis térfogatra bepároljuk, és szilikagéllel töltött oszlopon metilén-klorid/metanol 80:20 térfogatarányu eleggyel eluálva kromatografáljuk. így 0,35 g (43 %) cim szerinti vegyületet kapunk szabad sav formájában, amit ekvivalens mennyiségű vizes sósavval kezelünk, és liofilizálunk.
Vékonyrétegkromatográfia: Kiesel-gél F254 (Merek) lemezen metilén-klorid/metanol 95:5 térfogatarányu eleggyel eluálva Rf: 0,13, MS-FD: m/e 783 (M+).
ÍH-NMR (200 MHz, DMSO d6) : δ = 1,12 (d, J=6,4 Hz, 3H, CH3-5'), 1,3-1,9 (m, 12H, ciklohexil, 10H, CH2-2'), 2,0-2,7 (m, 7H, CH2-8, O-CH2CH2-N, 0-CH-CH2“N, ···· · • · • · · ·· ····
- 28 Η-3') , 2,94 (S, 2Η, CH2-10), 3,24 (s, 3Η, CH-OCH3),
3,40, 3,73 (két m, 2H, NCH2CH2O), 3,57 (m, 1H,
H-4’), 3,91 (s, 2H, OCH2COOH), 3,97 (s, 3H, OCH3-4) , 4,04 (dq, J = 6,4, 1,0 Hz, 1H, H-5'), 4,35 (dd, J = = 2,2, 5,2 HZ, 1H, OCH-COH3), 4,61 (s, 2H,CH2-14), 4,92 (m, 1H, H-7), 5,24 (m, 1H, H-l'), 7,6-7,9 (m, 3H, H-l, H-2, H-3), 13,20 (bs, 1H, OH-11), 14,02 (s, 1H, OH-6).
2. példa
14-O-íl-Karboxi-metil-oxi-ciklohexil)-3'-dezamino-3 *-Γ2(S)-metoxi-4-morfolinill-doxorubicin N-oxi-szukcinimidil-származéka (4' vegyület, a (4) általános képletben A-O- jelentése a 13 képletnek megfelelő, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2képletü csoport, R^ és R2 jelentése hidrogénatom, L jelentése N-oxi-szukcinimidil-csoport)
0,2 g (0,25 mmól) 1. példa szerint előállított 3' vegyületet 8 ml vízmentes dimetil-formamidban oldunk, 0 °C hőmérsékletre hütjük, és 0,2 g N-hidroxi-szukcinimiddel és 0,4 g diciklohexil-karbodiimiddel reagáltatjuk. Az elegyet 2 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten, majd egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután csökkentett nyomáson kis térfogatra bepároljuk, és szilikagéllel töltött oszlopon metilén-klorid/metanol 97:3 térfogatarányu eleggyel eluálva « « · ·
- 29 flesh kromatográfiásan tisztítjuk. A cim szerinti vegyületet tartalmazó eluátumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, a maradékot etil-acetátban felvesszük, szűrjük, és csökkentett nyomáson kis térfogatra bepároljuk. Ezután etil-étert adunk hozzá, és a cim szerinti vegyületet (0,130 g) zsugorított üvegszürőn szűrjük, etil-éterrel mossuk, és nitrogén atmoszférában tároljuk.
Vékonyrétegkromatográfia: Kiesel-gél F254 (Merek) lemezen metilén-klorid/metanol 95:5 térfogatarányu eleggyel eluálva Rf: 0,37, MS-FD: m/e 864 (M+) .
3. példa
14-0-(1-Hidrazino-karbonil-metil-oxi-ciklohexil)-31-dezamino-r2(S)-metoxi-4-morfolinill-doxorubicin (6' vegyület, a (6) képletben A-0- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxiesoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2képletü csoport, R^ és R2 jelentése hidrogénatom, d értéke 0) mg 2. példa szerint előállított 4' vegyületet 5 ml tetrahidrofuránban oldunk, és 1 mól/1 koncentrációjú, izopropanolban felvett hidrazin-hidrát oldatot adunk hozzá. Az elegyet 70 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten tartjuk, majd metilén-kloriddal hígítjuk, és hideg vízzel háromszor mossuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, és az oldószert vákuumban ····
- 30 eltávolítjuk. A maradékot szilikagéllel töltött oszlopon metilén-klorid/metanol 99:1 térfogatarányu eleggyel eluálva kromatografáljuk. Etil-éterrel kicsapva 20 mg cim szerinti vegyületet kapunk.
Vékonyrétegkromatográfia: Kiesel-gél F254 (Merek) lemezen metilén-klorid/metanol 95:5 térfogatarányu eleggyel eluálva Rf: 0,25, MS-FD: m/e 797 (M+).
iH-NMR (200 MHz, DMSO d6): δ = 1,36 (d, J = 6,6 Hz, 3H, CH3-5'), 1,4-1,7 (m, 10H, ciklohexil, 10H), 1,76 (m, 2H, CH2k2'), 2,30 (m, 2H, CH2-8),
2,50 (m, 1H, H-3’), 2,55 (m, 4H, N-CH2-CH(OCH3),
N-CH2-CH2-O), 2,98 (d, J = 18,8 Hz, 1H,
H-IOax), 3,22 (dd, J = 1,0, 18,8 Hz, 1H, H-lOe),
3,39 (S, 3H, CH(OCH3)), 3,55, 3,95 (két m, 2H, NCH2CH2O), 3,70 (m, 1H, H-4'), 3,95 (m, 1H,
H-5'), 4,09 (s, 3H, CH3-O-4), 4,10 (m, 2H,
O-CH2CONH), 4,50 (m, 1H, NCH2-CH(OCH3), 4,67 (s, 2H, CH2-14), 5,28 (m, 1H, H-7), 5,54 (m, 1H,
H-l'), 7,64 (bs, 1H, (CONHNH2), 7,78 (t, J = 7,9
Hz, 1H, H-2), 8,04 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-l), 13,32 (s, 1H, OH-11), 13,98 (s, 1H, OH-6).
4. példa
14-0-Γ1-(4-Karboxi-l-n-butil)-karbamoil-metil-oxi-1-ciklohexil)1-31-dezamino-r2(S)-metoxi-4-morfolinill·♦♦· » • 4 .· · «·*·· • · ·» * · ·44· · ·· ··-*· «· * β
- 31 -doxorubicin (8' vegyület, a (8) képletben A-0- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2“ képletü csoport, Rí és R2 jelentése hidrogénatom, g értéke 4) mg (0,15 mmól) gamma-amino-vajsavat 2,5 ml 0,05 mól/1 foszfát pufferben (pH =7,6) oldunk, és 30 mg (0,033 mmól)
2. példa szerint előállított 4' vegyület 3 ml acetonitrilben felvett oldatával elegyítjük. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd ecetsavval pH = 6 értékre állítjuk, és n-butanollal extraháljuk. A szerves fázist elválasztjuk, és vákuumban bepároljuk. A maradékot szilikagéllel töltött oszlopon metilén-klorid/metanol 95:5 térfogatarányu eleggyel eluálva kromatografáljuk. így 20 mg 8' vegyületet kapunk.
Vékonyrétegkromatográfia: Kiesel-gél F254 (Merek) lemezen metilén-klorid/metanol 95:1 térfogatarányu eleggyel eluálva Rf: 0,55, MS-FD: m/e 884 (M+).
5. példa l1 veqvülettel képzett poliqlutámsav koniugátum (1' vegyület, az (1) képletben A-O- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2képletü csoport, R^ és R2 jelentése hidrogénatom,
Z jelentése -NH-NH-CO- képletű csoport, a értéke 2,
T jelentése poli-L-glutámsav) mg 2000-15000 móltömegü poli-L-glutámsavat (Sigma) és 20 mg 3. példa szerint előállított 6' vegyületet 2 ml dimetil-formamidban oldunk, és 3 órán keresztül kevertetjük. Ezután 25 mg N-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinolint adunk hozzá, és egy éjszakán keresztül kevertetjük. Az elegyet etil-éter és petroléter elegyére öntjük, a csapadékot zsugorított üvegszürőn szűrjük, etil-éterrel mossuk, és 8 ml 2,5 tömeg%-os, vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldatban oldjuk. Az oldatot fordított fázisú RP-8, 40-63 pm (Merek) oszlopon (30 x 1,8 cm) 0-20 tömeg%-os, vizes acetonitrillel eluálva kromatografáljuk. A konjugátumot tartalmazó eluátumot liofilizáljuk, majd zsugorított üvegszürőn szűrjük, metanollal és etil-éterrel mossuk. így 45 mg 1' vegyületet kapunk. A konjugátum spektroszkopiás vizsgálatok szerint 13 tömeg% 13b vegyületet tartalmaz.
6. példa vegyület poli(GluNa.Ala-Tvr) koniugátuma (1 vegyület, az (1) képletben A-0- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxiesoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2 képletű csoport, R^ és R2 jelentése hidrogénatom, Z jelentése -NH-NH-CO- képletű csoport, a értéke 2, T jelentése poli(GluNa,Ala-Tyr)) ···· 9 9999 9 9 • · · 9 9 · „· · 9 · « 9 ·
Az 5. példában leirt módon 60 mg 25000-50000 móltömegü poli(GluNa,Alá,Tyr) 1:1:1 polimert (Sigma) és 20 mg 3. példa szerint előállított 6' vegyületet 2 ml dimetil-formamidban oldunk, 3 órán keresztül kevertetjük, 25 mg N-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinolinnal kezeljük, és reverz fázisú oszlopon tisztítjuk. így 35 mg 1 vegyületet kapunk.
7. példa
11 vegyület anti-melanoma koniugátuma (1' vegyület, az (1) képletben A-0- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2“ képletü csoport, és R2 jelentése hidrogénatom, Z jelentése -NH- képletü csoport, T jelentése Epl)
37,5 cl 10-2 mól/1 koncentrációjú, N,N-dimetil-formamidban felvett 2. példa szerint előállított 4' vegyület oldatát lassan 1 ml 2 mg/ml koncentrációjú, tisztított egér monoklonális antihumán melanoma Epl antitest (Giacomini P. és munkatársai: Int. J. Cancer, 39, 729 (1978)) oldathoz adagoljuk, ahol az antitest oldószere 0,1 mól/1 nátrium-dihidrogén-foszfát, és 0,1 mól/1 nátrium-klorid (pH = 8). Az elegyet egy éjszakán keresztül sötétben szobahőmérsékleten kevertetjük, majd centrifugáljuk. A konjugátumot gélszüréses kromatográfiával Sephadex G25 oszlopon (PD-10 Pharmacia) PBS oldattal (Gibco, 10X, katalógusszám: 042-04200M) pH = 7,3 értéken eluálva izoláljuk. A megfelelő frakcióban (1,5 ml) 480 nm-en spektrofotometriásán vizsgáljuk az antraciklin-tartalmat. A fehérjetartalmat kolorimetriás fehérjeanalizissel (BCA, Pierce) vizsgáljuk. A konjugátum 1,27 mg/ml antitestet tartalmaz, ahol az antraciklin/fehérje arány 11,4:1,0. A termék fizikai-kémiai profilját HPLC gélszüréses analízissel (BioSil SEC-250 oszlop, 0,1 mól/1 nátrium-dihidrogén-foszfát, 0,1 mól/1 nátrium-klorid, pH = 7,0) határozzuk meg 280 nm-nél és 480 nm-nél detektálva. Hasonló vizsgálatot vizsgálatot végzünk SDS-PAGER módszerrel.
A HPLC vizsgálat szerint 50 %-os fehérje aggregátum képződés mutatható ki, amely az oszlop üres térfogatánál eluálódik.
SDS-PAGE vizsgálatnál mind az antraciklin abszorpció, mind a Coomassie-festéssel megjelölt fehérje reakciója a 160 kD mültömegnél jelentkezik, ami igazolja a kovalens kötések kialakulását, és a nem-kovalens jellegű kölcsönhatások eredményeként az aggregátum képződést.
8. példa
11V vegyület anti-vastagbél karcinoma konjugátuma (liv vegyület, az (1) képletben A-0- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2“ képletü csoport, Rj és R2 jelentése hidrogénatom, Z jelentése -NH-NH- képletü csoport, T jelentése ···* ·
- 35 Β 72.3 antitest)
A Β 72.3 antitest (4 522 918 számú USA-beli szabadalmi leírás) 2,6 mg/ml koncentrációjú, és 0,1 mól/1 nátrium-dihidrogén-foszfát pufferben (pH =6) (1 ml) felvett oldatát 0,1 ml 0,1 mól/1 koncentrációjú, vizes NaI04 oldattal kezeljük 4 °C hőmérsékleten sötétben. Egy óra elteltével a terméket gélszüréses kromatográfiával Sephadex G25 oszlopon (PD-10, Pharmacia) 0,1 mól/1 nátrium-dihidrogén-foszfát pufferrel (pH = 6) eluálva tisztítjuk.
A fehérjét tartalmazó frakciót (1,7 mg, 2 ml) 30 mólekvivalens 10 vegyes% koncentrációjú, és azonos pufferben felvett 3. példa szerint előállított 6’ vegyülettel reagáltatjuk. Az elegyet 24 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten sötétben tartjuk, majd 7. példában leirt módon tisztítjuk.
A konjugátum 0,48 mg/ml antitestet tartalmaz, ahol az antraciklin/fehérje arány 2,4:1, és amely 85 %-ban monomer.
9. példa
3-Metakriloil-amino-2-hidroxi-propán és 14-0-{1-Γ4-(Ν-metakriloil-qlicil-fenil-alanil-leucil-qlicil)-hidrazjjiolj£kaxbpnil^metjJj^oxircjJ<lphe>dJJji32j^ezaminor^_!_z -Γ2(S)-metoxi-4-morfolinil1-doxorubicin kopolimerie (lv vegyület, az (1) képletben A-0- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2képletű csoport, Rj és R2 jelentése hidrogénatom, • ·
- 36 Z jelentése -NH-NH-CO- képletü csoport, T jelentése ΗΡΜΑ, X jelentése Gly-Phe-Leu-Gly)
0,58 g HPMA kopolimert (X jelentése Gly-Phe-Leu-Gly,
4,2 mól% P = OC6H4PNO2 tartalom) (előállítható: J. Kopecek és munkatársai: Makromol. Chem. 177. 2833-2848 (1976) alapján) 3-metakroil-amino-2-hidroxi-propán és N-metakriloil-glicil-fenil-alanil-leucil-glicin 4-nitro-fenil-észterének gyökös polimerizálásával) 15 ml száraz dimetil-szulfoxid és 0,1 g 3. példa szerint előállított 6' vegyület elegyében oldunk, 2 napon keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd 0,4 ml l-amino-2-propanolt adunk hozzá, és 300 ml aceton/etil-éter 1:1 térfogatarányu elegyre öntjük. A csapadékot elválasztjuk, 10 ml 95 tömeg%-os etanolban oldjuk, és 80 ml acetonnal kicsapjuk. Az lv terméket elválasztjuk, és éterrel mossuk.
Kitermelés: 0,51 g.
Antraciklin-tartalom 3'-dezamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin-hidrokloriáként kifejezve 3,3 tömeg%, mólarány (r:s:t) = 95,7:0,79:3,52.
10. példa
14-0-(1-Piperazino-karbonil-metil-oxi-ciklohexil)-31 -dezamino-31-Γ2(S)-metoxi-4-morfolinill-doxorubicin (11' vegyület, a (11) képletben A-O- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(0¾)2“ ···· · ··· · · .
• · · · · · Μ.....0 0 • · · · ········· ·· ··· ·· · ,
- 37 képletü csoport, R3 és R2 jelentése hidrogénatom)
100 mg 2. példa szerint előállított 4' vegyületet 20 ml vízmentes tetrahidrofuránban oldunk, 0 °C hőmérsékletre hütjük, és 50 mg piperazin 2 ml vízmentes tetrahidrofuránban felvett oldatával elegyítjük. A reakcióelegyet 15 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten kevertetjük, majd 100 ml metilén-kloriddal hígítjuk, és háromszor 50 ml vízzel mossuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A nyers terméket szilikagéllel töltött oszlopon metilén-klorid/metanol 80:20 térfogatarányu eleggyel eluálva kromatografáljuk. Etil-éterrel kicsapva 80 mg 11' vegyületet kapunk.
Vékonyrétegkromatográfia: Kiesel-gél F254 (Merek) lemezen metilén-klorid/metanol 70:30 térfogatarányu eleggyel eluálva Rf: 0,60, FD-MS: m/e 868 (100, (M+H)+).
ÍH-NMR (200 MHz, CDC13): & = 1,35 (d, J = 6,6 Hz, 2H, 5'-CH3), 1,3-1,9 (m, 12H, 2'-CH2, ciklohexán), 2,11 (dd, J = 4,2, 14,6 Hz, 1H, 8ax-H),
2,3-2,5 (m, 5H, 8eq-H, 3'-H, 3ax-H, 5-CH2), 2,60 (dd, J = 3,9, 11,2 Hz, 1H, 3eq-H), 2,86 (m, 4H, CH2-NH-CH2), 3,00 (d, J = 18,9 Hz, 1H, lOax-H), 3,23 (dd, J = 1,2, 18,9 Hz, 1H, lOeq-H),
3,37 (s, 3H, 2-OCH3), 3,4-3,6 (m, 5H, CON(CH2)2, 6ax-H), 3,90 (m, 1H, 6eq-H), 3,98 (q, J = 6,6 Hz,
1H, 5'-H), 4,07 (s, 3H, 4-OCH3), 4,18 (s, 2H,
OCH2CON), 4,48 (dd, J = 2,5, 3,9 Hz, 1H, 2eq-H), 4,79 (m, 2H, 14-CH2), 5,24 (m, 1H, 7-H), 5,53 (m, 1H, l'-H), 7,37 (d, J = 7,7 Hz, 1H, 3-H), 7,6 (dd, J = 7,7, 6,8 HZ, 1H, 2-H) , 8,02 (d, J = 6,8 Hz, 12H, 1-H), 13,30 (bs, 1H, 11-OH), 13,98 (s, 1H, 6-OH).
11. példa
3-Metakriloil-amino-2-hidroxi-propán és 14-0-{1-Γ4-(Ν-metakriloil-qlicil) -piperazin-l-il'l -karbonil-metil-oxi-ciklohexil>-31-dezamino-3'-Γ2(S)-metoxi-4-morfolinill-doxorubicin kopolimerie (lvi vegyület, az (1) képletben A-O- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése 0-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2~ képletü csoport, R]_ és R2 jelentése hidrogénatom, Z jelentése 1,4-piperazinil-CO- képletü csoport, T jelentése ΗΡΜΑ, X jelentése -HN-CH2-CO- képletü csoport)
0,42 g HPMA kopolimert (X jelentése -HN-CH2-CO- képletü csoport, 7,6 mól% P = OCgH4pNO2 tartalom, előállítható J.Kopecek és munkatársai: Macromol. Chem. 177, 2833-2848 (1976) szerint 3-metakriloil-amino-2-hidroxi-propán és N-metakriloil-glicin-4-nitrofenil-észter gyökös polimerizálásával) 2,2 ml száraz dimetil-szulfoxidban oldunk, és 0,07 g
10. példa szerint előállított 11' vegyülettel reagáltatjuk. Az elegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd • · · • · · · · · · * · · · ········« ·· ···« ·· · ·
- 39 0,05 ml l-amino-2-propanolt adunk hozzá, és 200 ml aceton/etil-éter 1:1 térfogatarányu elegyre öntjük. A csapadékot elválasztjuk, és 10 ml 95 tömeg%-os etanolban oldjuk. Az 1V1 vegyületet 80 ml acetonnal kicsapjuk, elválasztjuk, és éterrel mossuk.
Kitermelés: 0,39 g.
Antraciklin-tartalom 3'-dezamino-3'-[2(S) -metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin-hidrokloridként kifejezve 9,74 tömeg%, mólarány (r:s:t) = 92,4:2,15:5,45.
12. példa
3-Metakriloil-amino-2-hidroxi-propán és 14-Ο-ϊ1-Γ4-(6-metakriloil-amino-kaproil)-piperazin-l-ill-karbonil-ιι^ί1-οχί-σί^οΗ6χί1]·-3 1-dezamino-3 '-[2(5) -metoxi-4-morfolínil1-doxorubicin kopolimerje (ívii vegyület, az (1) képletben A-O- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése O-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2képletü csoport, R^ és R2 jelentése hidrogénatom, Z jelentése 1,4-piperazinil-CO- képletü csoport, T jelentése ΗΡΜΑ, X jelentése -HN-(CH2)5-CO- képletü csoport)
0,6 g HPMA kopolimert (X jelentése -HN-(CH2)5-COképletü csoport, 5,3 mól% P = OCgH4pNO2 tartalom, előállítható J.Kopecek és munkatársai: Macromol. Chem. 177, 2833-2848 (1976) szerint 3-metakriloil-amino-2-hidroxi···· · ····· • · · · · • · · · · • · · · ····· • · ···· » · · • ·
-propán és 4-nitrofenil-N-metakriloil-amino-kapronát gyökös polimerizálásával) 3 ml száraz dimetil-szulfoxidban oldunk, és 0,1 g 10. példa szerint előállított 11' vegyülettel reagáltatjuk. Az elegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd 0,1 ml l-amino-2-propanolt adunk hozzá, és 200 ml aceton/etil-éter 1:1 térfogatarányu elegyre öntjük. A 11. példában leirt módon feldolgozva 0,58 g ívix vegyületet kapunk.
Antraciklin-tartalom 3'-dezamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin-hidrokloriáként kifejezve 9,2 tömeg%, mólarány (r:s:t) = 94,7:2,05:3,31.
13. példa
Poli(GluNa,Alá,Tvr)(1:1:1) és 14-0-(1-piperazino-karbonil-metil-oxi-ciklohexil)-31-dezamino-31 -Γ 2(S)-metoxi-4-morfolinil1-doxorubicin konjuqátuma (ívűi vegyület, az (1) képletben A-0- jelentése a (13) képletben megadott, R4 jelentése O-, R5 jelentése metoxicsoport, b értéke 1, B jelentése -(CH2)2~ képletü csoport, Rj és R2 jelentése hidrogénatom, Z jelentése 1,4-piperazinil-CO- képletü csoport, T jelentése poli(GluNa,Ala,Tyr))
0,2 g 25000-40000 móltömegü poli(GluNa,Alá,Tyr) (1:1:1) polimert (Sigma) 5 ml vízben oldunk szobahőmérsékleten kevertetve. A megfelelő szabad sav kicsapásához vizes oldatot 0,1 n sósavval pH = 3 értékre állítjuk. így 0,17 g poli(Glu• · ······· · ···· ·· · ·
-OH,Ala,Tyr) polimert kapunk, és vákuumban szárítjuk. 10 ml száraz dimetil-formamidban oldjuk, és hozzáadunk 0,035 g 10. példa szerint előállított 11' vegyületet és 0,08 g N-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinolint (EEDQ). További 0,08 g EEDQ-t adunk hozzá 3 óra elteltével. A reakcióelegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük, majd 300 ml etil-éterre öntjük. A csapadékot 10 ml vízben szuszpendáljuk, és 14 ml 0,1 n nátrium-hidroxid oldattal kezeljük. Az oldatot 0,1 n sósavval pH = 8,5 értékre állítjuk, és Sephadex G10 oszlopra visszük. A vizes oldatot liofilizálva 0,16 g ívűi vegyületet kapunk.
Antraciklin-tartalom 31-dezamino-31-(2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin-hidrokloriáként kifejezve 10 tömeg%, mólarány (r:s:t:u) = 31,33:2,01:33,33:33,33).

Claims (31)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. (1) általános képletü konjugátumok, a képletben
    A-O- jelentése valamely -A-O-H általános képletü hatóanyag maradéka, ahol
    -0-H jelentése egy primer vagy szekunder hidroxilcsoport, a értéke 1-30,
    W jelentése egy (2) általános képletü csoport, ahol b értéke 1-4,
    B jelentése 1-3 szénatomos alkilénlánc, és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, alkilcsoport, fenilcsoport vagy szubsztituált fenilcsoport,
    Z jelentése valamely távtartó csoport,
    T jelentése valamely hordozó csoport.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az A-O csoport egy A-O-H általános képletü antraciklinből származik.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti konjugátum, a képletben
    A-O- jelentése (a) általános képletü csoport, ahol
    Rxo jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport vagy metoxicsoport,
    Rll és Rj2 közül az egyik jelentése hidrogénatom és a másik jelentése hidroxilcsoport, vagy R11 jelentése hidrogénatom vagy jódatom, és R12 jelentése hidrogénatom, • · ···· · ··· • · · • · · ♦ · · · · • · ···· »·
    - 43 r13 jelentése aminocsoport vagy egy morfolino gyűrűbe zárt nitrogénatom.
  4. 4. Az
    1. igénypont szerinti konjugátum, képletben jelentése
    1-5.
  5. 5. Az
    1. igénypont szerinti konjugátum, képletben jelentése ~(H2)2_ képletü csoport.
  6. 6. Az
    1. igénypont szerinti konjugátum, képletben jelentése
    i) -NH- képletü csoport, ii) -NH-(CH2)c-S-S- képletü csoport, ahol c értéke 1-4, iii) -NH-[C]d-N=CH- képletü csoport, ahol
    a) d értéke 0,
    b) d értéke 1, és [C] jelentése -NH-CO(CH2)e-CO-NH- képletü csoport, ahol e értéke 2-4,
    c) d értéke 1-4, és [C] jelentése -(CH2)f-0-(CH2)f- képletü csoport, ahol f értéke 1-2, vagy
    d) d értéke 2-6, és [C] jelentése -CH2~ képletü csoport, iv) -NH-[C^-NH-CO- képletü csoport, ahol [C] és d jelentése a fenti,
    v) -[D]-NH- képletü csoport, ahol [D] jelentése -NH-[CH2]g-CO- képletü csoport, • · · · • · · · ·
    - 44 ahol g értéke 2-6, vi) -[EJ-CO- képletü csoport, ahol [E] jelentése -NH-(CH2)g-NH- képletü csoport, ahol g értéke 2-6, vagy vii) (b) képletü piperazinil-karbonil-csoport.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti konjugátum, a képletben T jelentése valamely poliklonális antitest vagy ennek fragmense, amely egy antigén kötő helyet hordoz, és tumorral összefüggő antigén megkötésére alkalmas; egy monoklonális antitest vagy annak fragmense, amely antigén kötő helyet hordoz, és valamely tumorsejt populáció által preferenciálisan vagy szelektíven kifejezett antigén megkötésére képet; valamely peptid vagy fehérje, amely preferenciálisan vagy szelektíven valamely tumorsejthez kötődhet, vagy valamely polimer hordozó.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti konjugátum, a képletben T jelentése egy anti-T-sejt antitest, anti-CD5 antitest, anti-transzferin receptor antitest, anti-melanoma antitest, anti-karcinoma marker antitest, anti-petefészek karcinoma antitest, anti-tüdő karcinoma antitest vagy anti-hólyag karcinoma antitest.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti konjugátum, a képletben T jelentése valamely növekedési faktor.
  10. 10. Eljárás 1. igénypont szerinti (I) általános képletü konjugátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy • · ·
    - 45 egy (3) általános képletü származékot, a képletben A-O- és W jelentése az 1. igénypontban megadott, Z jelentésébe eső távtartó csoport és T jelentésébe eső hordozó csoport bevitelére alkalmas egy vagy több vegyülettel kondenzálunk.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kondenzálást a (3) általános képletü vegyület aktivált származékával, vagy valamely kondenzálószer jelenlétében végrehajtott közvetlen reakcióval végezzük.
  12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (3) általános képletü vegyületet (4) általános képletü aktivált származékká alakítjuk, a képletben
    A-O- és W jelentése a 10. igénypontban megadott,
    L jelentése valamely amidkötés kialakítására alkalmas aktiváló csoport, és i·) a (4) általános képletü vegyületet T-[NH2]X általános képletü vegyülettel kondenzáljuk, a képletben
    T jelentése valamely hordozócsoport, x a kondenzációban résztvevő aminocsoportok számát jelöli, vagy ii') a (4) általános képletü vegyülettel egy -NH2-(CH2)C-SH általános képletü tiol-származékkal kondenzáljuk, a képletben c értéke 1-4, és a kapott (5) általános képletü vegyületet, a képletben « · · e
    - 46 A-Ο-, W és c jelentése a fenti,
    T-[SH]X1 általános képletü vegyülettel kondenzáljuk, a képletben
    T jelentése a fenti, xl a kondenzációban résztvevő tiolcsoportok számát jelöli, vagy iii') A (4) általános képletü vegyületet hidrazinnal, szukcinsav vagy adipinsav dihidrazid-származékkal vagy valamely diamino-vegyülettel reagáltatjuk, és a kapott (6) általános képletü vegyületet, a képletben
    A-O- és W jelentése az 1. igénypontban megadott, [C] és d jelentése a 6. igénypontban megadott,
    T—[CHO]X2 általános képletü vegyülettel kondenzáljuk, a képletben
    T jelentése valamely hordozó csoport, és x2 a kondenzációban résztvevő forrnilesöpörtök számát jelenti.
  13. 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy iv') a 12. igénypont szerint előállított (6) általános képletü vegyületet egy (7) általános képletü vegyülettel kondenzáljuk, a képletben
    T jelentése valamely hordozó csoport, y értéke 1-30, és a hordozó csoportban található karboxilesöpörtök számát adja meg,
    L' jelentése hidroxilcsoport vagy amidkötés kialakítására • · • * · · · · · • · · · ·*«····· • · ·♦· · ·· · ·
    - 47 alkalmas aktiváló csoport, ahol a kondenzációt valamely kondenzálószer jelenlétében végezzük.
  14. 14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ν') a (3) általános képletű vegyületet H2N-[CH2]g-COOH képletű amino-származékkal kondenzáljuk, a képletben g értéke 2-6, a kapott (8) általános képletű származékot,
    A-O- és W jelentése az 1. igénypontban megadott, [D] jelentése a 6. igénypontban megadott, adott esetben (9) általános képletű aktivált származékká alakítjuk, a képletben
    A-Ο-, W és [D] jelentése a fenti,
    L jelentése valamely amidkötés kialakítására alkalmas aktiváló csoport, és a (9) vagy (8) általános képletű vegyületet valamely kondenzálószer jelenlétében T-[NH2]X általános képletű vegyülettel kondenzáljuk, a képletben
    T és x jelentése a 12. igénypontban megadott.
  15. 15. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vi’) a (4) általános képletű vegyületet NH2N-(CH2)g-NH2 képletű amino-származékkal reagáltatjuk, a képletben g értéke 6. igénypontban megadott, amelynek során (10) általános képletű vegyületet kapunk, a képletben
    A-O- és W jelentése a 10. igénypontban megadott, • *9 « [E] jelentése a 6. igénypontban megadott, vagy vii’) a (4) általános képletü vegyületet piperazinnal (11) általános képletü származékká alakítjuk, és a (10) vagy (11) általános képletü vegyületet a 13. példában leirt módon (7) általános képletü vegyülettel kondenzáljuk.
  16. 16. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely, a 10-15. igénypontok bármelyike szerint előállított vagy 1. igénypont szerinti konjugátumot tartalmaz gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyagok és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyagok mellett.
  17. 17. (3) általános képletü származék, a képletben A-O- és W jelentése a 10. igénypontban megadott.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti származék szükebb körét képező 14-0-(1-karboxi-metil-oxi-ciklohexil)-3'-dezamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin.
  19. 19. Eljárás a 17. igénypont szerinti (3) általános képletü származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy A-O-H általános képletü hatóanyagot, a képletben A-0- jelentése az 1. igénypontban megadott, egy (12) általános képletü vegyülettel kondenzálunk, a képletben B, b, R3 és R2 jelentése az 1. igénypontban megadott, és R3 jelentése védőcsoport, és a kapott vegyületről a védőcsoportot eltávolítjuk.
  20. 20. (4) általános képletü származék, a képletben A-0- és W jelentése a 12. igénypontban megadott.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti származék szükebb körét « ·««· Λ • « *
    - 49 képező N-oxi-szukcinimidil-14-0-(1-karboxi-metil-oxi-ciklohexil)-3'-dezamino-3'-[2(S)-metoxi-4-morfolinil]-doxorubicin.
  22. 22. Eljárás a 20. igénypont szerinti (4) általános képletü származék előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 19. igénypont szerinti (3) általános képletü származékot (4) általános képletü származékká alakítunk.
  23. 23. (5) általános képletü származék, a képletben
    A-Ο-, W és c jelentése a 12. igénypontban megadott.
  24. 24. Eljárás 23. igénypont szerinti (5) általános képletü származék előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (3) általános képletü származékot az 1. igénypont szerint (5) általános képletü származékká alakítunk.
  25. 25. (6) általános képletü származék, a képletben A-Ο-, W, [C] és d jelentése a 12. igénypontban megadott.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti származék szükebb körét képező 14-0-(1-hidrazino-karbonil-metil-oxi-ciklohexil)-3'-dezamino-3 ' - [2 (S) -metoxi-4-morfolinil] -doxorubicin.
  27. 27. Eljárás 25. igénypont szerinti (6) általános képletü származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (3) általános képletü származékot a 12. igénypont szerint (6) általános képletü származékká alakítunk.
  28. 28. (9) általános képletü származék, a képletben A-Ο-, W, [D] és L jelentése a 14. igénypontban megadott.
  29. 29. Eljárás 28. igénypont szerinti (9) általános képletü származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (3) általános képletü származékot a 14. igénypont szerint (9) általános képletű származékká alakítunk.
  30. 30. (10) vagy (11) általános képletű származék, a képletben
    A-Ο-, W és [EJ jelentése a 15. igénypontban megadott.
  31. 31. Eljárás 30. igénypont szerinti (10) vagy (11) általános képletű származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (4) általános képletű származékot a 15. igénypont szerint (10) vagy (11) általános képletű származékká alakítunk.
HU9201146A 1990-08-03 1991-08-01 Process for producing conjugates of anthracyclines formed with carriers, as well as pharmaceutical compositions comprising same viscoelastic dentifrice HUT61898A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB909017024A GB9017024D0 (en) 1990-08-03 1990-08-03 New linker for bioactive agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9201146D0 HU9201146D0 (en) 1992-07-28
HUT61898A true HUT61898A (en) 1993-03-29

Family

ID=10680097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201146A HUT61898A (en) 1990-08-03 1991-08-01 Process for producing conjugates of anthracyclines formed with carriers, as well as pharmaceutical compositions comprising same viscoelastic dentifrice

Country Status (28)

Country Link
US (2) US5387578A (hu)
EP (1) EP0495053B1 (hu)
JP (1) JP3169222B2 (hu)
KR (1) KR920702234A (hu)
CN (1) CN1058598A (hu)
AT (1) ATE135919T1 (hu)
AU (1) AU650900B2 (hu)
CA (1) CA2067184C (hu)
CS (1) CS241491A3 (hu)
DE (1) DE69118350T2 (hu)
DK (1) DK0495053T3 (hu)
ES (1) ES2088013T3 (hu)
FI (1) FI100697B (hu)
GB (1) GB9017024D0 (hu)
GR (1) GR3019449T3 (hu)
HU (1) HUT61898A (hu)
IE (1) IE76467B1 (hu)
IL (2) IL98986A (hu)
MY (1) MY106526A (hu)
NO (1) NO921287L (hu)
NZ (1) NZ239165A (hu)
PH (1) PH31048A (hu)
PT (1) PT98545B (hu)
RU (1) RU2116087C1 (hu)
TW (1) TW211572B (hu)
WO (1) WO1992002255A1 (hu)
YU (1) YU48441B (hu)
ZA (1) ZA916025B (hu)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5439936A (en) * 1989-10-03 1995-08-08 The Regents Of The University Of California Method of treating certain tumors using illudin analogs
GB9017024D0 (en) * 1990-08-03 1990-09-19 Erba Carlo Spa New linker for bioactive agents
DE4236237A1 (de) * 1992-10-27 1994-04-28 Behringwerke Ag Prodrugs, ihre Herstellung und Verwendung als Arzneimittel
GB9309663D0 (en) * 1993-05-11 1993-06-23 Erba Carlo Spa Biologically active compounds
GB9416007D0 (en) * 1994-08-08 1994-09-28 Erba Carlo Spa Anthracyclinone derivatives
US5783178A (en) * 1994-11-18 1998-07-21 Supratek Pharma. Inc. Polymer linked biological agents
US6030941A (en) * 1996-05-01 2000-02-29 Avi Biopharma, Inc. Polymer composition for delivering substances in living organisms
CA2252706A1 (en) * 1996-05-01 1997-11-06 Antivirals Inc. Polypeptide conjugates for transporting substances across cell membranes
US5932553A (en) * 1996-07-18 1999-08-03 The Regents Of The University Of California Illudin analogs useful as antitumor agents
US5723632A (en) 1996-08-08 1998-03-03 Mgi Pharma, Inc. Total synthesis of antitumor acylfulvenes
DE19636889A1 (de) 1996-09-11 1998-03-12 Felix Dr Kratz Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel
AU7124598A (en) * 1997-04-18 1998-11-13 Access Pharmaceuticals, Inc. Polymer-platinum compounds
US5965118A (en) * 1997-04-18 1999-10-12 Access Pharmaceuticals, Inc. Polymer-platinum compounds
US6306993B1 (en) * 1997-05-21 2001-10-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University Method and composition for enhancing transport across biological membranes
US6531230B1 (en) * 1998-01-13 2003-03-11 3M Innovative Properties Company Color shifting film
US6025328A (en) 1998-02-20 2000-02-15 The Regents Of The University Of California Antitumor agents
US7141603B2 (en) * 1999-02-19 2006-11-28 The Regents Of The University California Antitumor agents
ES2222719T3 (es) * 1998-07-30 2005-02-01 Oakville Trading Hong Kong Limited Procedimiento para preparar conjugados reticulados solubles en agua.
US6706892B1 (en) 1999-09-07 2004-03-16 Conjuchem, Inc. Pulmonary delivery for bioconjugation
EP2266607A3 (en) 1999-10-01 2011-04-20 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
CZ20031262A3 (en) * 2000-10-16 2004-03-17 Neopharm, Inc. Liposomal formulation of mitoxantrone
IL157993A0 (en) * 2001-03-23 2004-03-28 Napro Biotherapeutics Inc Molecular conjugates for use in cancer treatment and methods for the preparation thereof
CA2445985A1 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 University Of Utah Research Foundation Hyaluronic acid containing bioconjugates: targeted delivery of anti-cancer drugs to cancer cells
US7129261B2 (en) * 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
US20050169883A1 (en) * 2002-05-06 2005-08-04 Prestwich Glenn D. Preblocking with non-ha gags increases effectiveness of ha conjugated anticancer agents
RU2402548C2 (ru) * 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
CA2564076C (en) * 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
US20060105941A1 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Allergan, Inc. Mixed antibiotic codrugs
US7714016B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
WO2007019308A2 (en) * 2005-08-03 2007-02-15 The Regents Of The University Of California Illudin analogs useful as anticancer agents
WO2007038658A2 (en) * 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and methods of use
JP5116686B2 (ja) 2005-10-26 2013-01-09 メダレックス インコーポレイテッド Ｃｃ−１０６５類似体の調製方法及び調製用化合物
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
JP2010519310A (ja) * 2007-02-21 2010-06-03 メダレックス インコーポレイテッド 単一のアミノ酸を有する化学リンカーおよびその複合体
US8742076B2 (en) * 2008-02-01 2014-06-03 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
AR072804A1 (es) * 2008-07-15 2010-09-22 Genentech Inc Conjugados derivados de antraciclina,proceso para su preparacion,composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso como agentes antitumorales.
JP6008864B2 (ja) 2010-12-02 2016-10-19 ナーヴィアノ メディカル サイエンシズ エス．アール．エル． モルホリニルアントラサイクリン誘導体の調製方法
US9556192B2 (en) 2012-10-30 2017-01-31 Nerviano Medical Sciences S.R.L. Functionalized 9-bromo-camptothecin derivatives
CN105849086B (zh) 2012-11-24 2018-07-31 杭州多禧生物科技有限公司 亲水性链接体及其在药物分子和细胞结合分子共轭反应上的应用
CN105358174B (zh) 2013-03-15 2019-03-15 酵活有限公司 具细胞毒性和抗有丝分裂的化合物以及其使用方法
AU2014373574B2 (en) 2013-12-27 2020-07-16 Zymeworks Bc Inc. Sulfonamide-containing linkage systems for drug conjugates
DK3122757T3 (da) 2014-02-28 2023-10-09 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Ladede linkere og anvendelse deraf til konjugering
KR102494557B1 (ko) 2014-09-17 2023-02-02 자임워크스 비씨 인코포레이티드 세포독성 및 항유사분열성 화합물, 그리고 이를 이용하는 방법
EP3319936A4 (en) 2015-07-12 2019-02-06 Suzhou M-conj Biotech Co., Ltd. PLACES OF CONDUCT FOR THE CONJUGATION OF CELL BINDING MOLECULES
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
BR112018071105A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Macrogenics, Inc. conjugado de droga e anticorpo, molécula de ligação, composição farmacêutica e uso
WO2018086139A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers
US10386338B2 (en) 2017-10-30 2019-08-20 Cynthia Rena Wright DNA/RNA PEMS microcantilever probe for detection of viral infection and detection of genetic variants

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2098219A (en) * 1981-05-08 1982-11-17 Erba Farmitalia Daunorubicin-protein conjugates
JPS63241541A (ja) * 1987-03-30 1988-10-06 Konica Corp 感光性組成物および感光性平版印刷版
IL89220A (en) * 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them
US5066490A (en) * 1988-06-01 1991-11-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Protein crosslinking reagents cleavable within acidified intracellular vesicles
GB9017024D0 (en) * 1990-08-03 1990-09-19 Erba Carlo Spa New linker for bioactive agents

Also Published As

Publication number Publication date
US5387578A (en) 1995-02-07
PT98545B (pt) 1999-01-29
US5547667A (en) 1996-08-20
CA2067184C (en) 2002-11-26
MY106526A (en) 1995-06-30
IL98986A (en) 1995-12-08
AU8311391A (en) 1992-03-02
CA2067184A1 (en) 1992-02-04
IE912757A1 (en) 1992-02-12
ES2088013T3 (es) 1996-08-01
IL113101A0 (en) 1995-06-29
DK0495053T3 (da) 1996-04-22
FI921451A (fi) 1992-04-02
NZ239165A (en) 1993-09-27
WO1992002255A1 (en) 1992-02-20
DE69118350T2 (de) 1996-08-22
JPH05501726A (ja) 1993-04-02
PT98545A (pt) 1992-06-30
FI100697B (fi) 1998-02-13
IL98986A0 (en) 1992-07-15
EP0495053B1 (en) 1996-03-27
CS241491A3 (en) 1992-02-19
KR920702234A (ko) 1992-09-03
YU48441B (sh) 1998-07-10
RU2116087C1 (ru) 1998-07-27
FI921451A0 (fi) 1992-04-02
PH31048A (en) 1998-02-03
HU9201146D0 (en) 1992-07-28
IE76467B1 (en) 1997-10-22
NO921287D0 (no) 1992-04-02
AU650900B2 (en) 1994-07-07
DE69118350D1 (de) 1996-05-02
JP3169222B2 (ja) 2001-05-21
ZA916025B (en) 1992-04-29
YU134691A (sh) 1994-06-10
GB9017024D0 (en) 1990-09-19
NO921287L (no) 1992-04-02
EP0495053A1 (en) 1992-07-22
GR3019449T3 (en) 1996-06-30
TW211572B (hu) 1993-08-21
CN1058598A (zh) 1992-02-12
ATE135919T1 (de) 1996-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT61898A (en) Process for producing conjugates of anthracyclines formed with carriers, as well as pharmaceutical compositions comprising same viscoelastic dentifrice
AU687795B2 (en) Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
AU617380B2 (en) Drug-monoclonal antibody conjugates
US5475092A (en) Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of CC-1065
KR100359005B1 (ko) 중합체결합된캠프토테신유도체,이의제조방법및이를함유하는약제학적조성물
CN106267225B (zh) 三马来酰亚胺型连接子及其应用
US5010176A (en) Antibody-drug conjugates
CN109790178B (zh) 新颖细胞毒性剂和其缀合物
EP0944400A1 (en) Bioactive derivatives of camptothecin
US5776458A (en) Anthracycline-conjugates
EP0514515B1 (en) Anthracycline-conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal