KR100359005B1 - 중합체결합된캠프토테신유도체,이의제조방법및이를함유하는약제학적조성물 - Google Patents

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Abstract

중합체성 공액결합물은 필수적으로
구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일아마드 단위 60내지 99몰(ⅰ),
일반식(2)의 20-0-(N-메타크릴로일글리실아미노아실)캠프토테신 단위 1 내지 40몰%(ⅱ) 및
일반식(3)의 N-메타크릴로일글리신 또는 N-(2-하이드록시-프로필)메타크릴로일글리신아미드 단위 0 내지 10몰% (ⅲ)로 이루어진다.
상기 식에서,
[A]는 3개 이상의 원자에 의해 분리된, 각각의 말단 아미노 그룹과 카보닐그룹을 갖는 스페이서 그룹이며;
O-CPT는 캠프토테신의 잔기를 나타내며, 캠프토테신의 C-20 하이드록시 그룹은 스케이서 그룹[A]의 말단 카보닐 그룹에 결합되어 있고;
Z는 하이드록시 또는 구조식 -NH-CH2-CH(OH)-CH3의 잔기이다.

Description

중합체 결합된 캠프토테신 유도체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물{Polymer-bound camptothecin derivatives}
본 발명은 항암 활성이 있는 수용성 중합체 결합된 캠프토테신 및 수용성 중합체 결합된 캠프토테신 유도체, 이들의 제조방법 및 이들을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
캠프토테신은 캠프토테카 아쿠미나타(Camptotheca acuminata)의 잎 및 껍질로부터 분리된 알칼로이드이며, 기타의 캠프토테신 동족체는 공지되어 있고, 이는 캠프토테신으로부터 반합성법으로 또는 완전합성법으로 제조된다[참조예 : J. Amer. Chem. Soc. 94(10), 3631 (1972); J. Chem. Soc. D. (7), 404 (1970); US-A-4,981,969(Jan. 1, 1991); US-A-5,049,668 (Sep. 17, 1991)].
캠프토테신은 퀴놀린 환(환 A 및 B), 피롤리딘 환(환 C), 피리돈 환(환 D) 및 α-하이드록시-σ-락톤 잔기(환 E)를 형성하는 융합 환 시스템으로 이루어진 5환 구조를 갖는다. 캠프토테신 및 A환 치환된 이의 다양한 유도체는 임상적으로 이용 가능한 화학적 치료제에 대해 내성이 있는 세포주를 포함하여 각종 고형 암주에 대해 항암 활성을 나타낸다[참조예: J. Clin. Pharmacol. 30, 770 (1990); Cancer Chemother. Pharmacol. 28, 192 (1991)].
캠프토테신 뿐만 아니라 이의 유도체의 대부분은 실제로 퀴논 질소 원자의약염기성으로 인해 비경구 투여에 적합한 비히클에 대해 불용성이다. 캠프토테신을 가용화하기 위해, 무기산으로 양성자화하여 수용성을 제공할 수 있는, 20-0-포스페이트 또는 20-0-아실아미노 유도체와 같은 다수의 수용성 프로드럭이 제안된 바 있다[참조예: US-A-4,943,597 (1990. 7. 24.)]. 이들 약제를 투여하면 혈액 및 위장관 부작용을 포함하여 유독성 부작용이 수반된다. 캠프토테신의 구조를 변형 시켜 이의 치료학적 지수를 증진시키려는 다수의 시도가 이루어져 왔다.
본 발명 수용성이며, 생체내에서 항암활성을 나타내고 독성이 감소된 캠프토테신의 중합체성 켄쥬게이트(conjugate)를 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 필수적으로
구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일아미드 단위 60 내지 99 몰%(ⅰ); 및
일반식(2)의 20-0-(N-메타크릴로일글리실아미노아실)캠프토테신 단위 1 내지 40몰%(ⅱ); 및
일반식(3)의 N-메타크릴로일글리신 또는 N-(2-하이드록시-프로필)메타크릴로 일글리신아미드 단위 0 내지 10몰%(ⅲ)로 이루어진 중합체성 켄쥬게이트(A)를제공한다.
상기 식에서,
[A]는 3개 이상의 원자에 의해 분리되는 각각의 말단 아미노 그룹 및 카보닐 그룹을 갖는 스테이서 그룹(spacer group)이며;
O-CPT는 캠프토테신의 잔기를 나타내며, 캠프토테신의 C-20 그룹은 스페이서 그룹[A]의 말단 카보닐 그룹에 결합되어 있고;
Z는 하이드록시 또는 구조식 -NH-CH2-CH(OH)-CH3의 잔기이다.
본 발명은 또한, 일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체를, 필수적으로 구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일아미드 단위 60 내지 99 몰%(ⅰ)와 일반식(4)의 N-메타크릴로일글리신 단위 40 내지 1몰%(ⅳ)로 이루어진 중합체와 반응시키고, 임의로는 잔류 활성 에스테르 그룹을 1-아미노-2-프로판올로 대체시킴을 포함하여 위에서 정의한 바와 같은 중합체성 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다.
H[A]-O-CPT (7)
상기 식에서,
[A] 및 O-CPT는 위에서 정의한 바와 같고,
R2는 활성 에스테르의 잔기(a) 또는 하이드록시(b)이다.
중합체성 컨쥬게이트(A)는 구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일아미드 단위를 60몰% 이상의 비율로, 예를 들면 80몰% 이상 또는 85몰% 이상으로 함유한다. 당해 단위는 91 내지 98몰%의 양으로 존재할 수 있다. 당해 컨쥬게이트는 일반식(2)의 20-0-(N-메타크릴로일글리실-아미노아실)캠프토테신 단위를 1 내지 40몰%로, 예를 들어 1 내지 20몰%로 함유할 수도 있다. 당해 컨쥬게이트는이들 단위를 1 내지 8몰%, 예를 들면 2 내지 6몰%의 양으로 함유할 수 있다.
스페이서 그룹[A]은 3 내지 12개, 예를 들면, 6 내지 9개의 원자를 가질 수 있다. 전형적으로는, 이 그룹은 세포내 가수분해되기가 쉽다. 바람직하게는, 이는 세포외 가수분해에 대한 내성을 갖는다. 스페이서 그룹은 예를 들면 1 내지 4 개 또는 2 내지 4개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 스페이서일 수 있다. 따라서, 당해 스페이서는 디펩티드, 트리펩티드 또는 테트라펩티드일 수 있다.
바람직하게는, 스페이서 그룹[A]은 Ala-Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Pha-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly, 및 Phe-Leu-Gly-Phe로부터 선택된다. 또는, 스페이서 그룹[A]은 일반식 HN-Y-CO-의 그룹[여기서, Y는 직쇄형 또는 측쇄형 C3-C6알킬, 예를 들면 n이 3, 4, 5 또는 6인 -(CH2)n-이다]이다.
또한, 스페이서[A]는 일반식 Ala-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Gly-NH-Y-CO-, Val-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Ala-NH-Y-CO-, Leu-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-, Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Try--Ala-NH-Y-CO, Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO- 또는 Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-의 그룹(여기서, Y는 위에서 정의한 바와 같다)이다.
캠프토테신 잔기는 O-CPT로 표시된다. 캠프토테신은 캠프토테신 자체이거나 또는 A환 동족체와 같은 이의 동족체일 수 있다. 따라서, 이러한 A환 동족체는A환에서 치환된 캠프토테신이다. 이 캠프토테신은 자발적 S형 또는 R형 또는 R형과 S형 혼합물(라세미 혼합물)일 수 있다. 적합한 캠프토테신 잔기 O-CPT는 일반식(5)로 표시된다.
상기 식에서,
R1은 예를 들어 수소, 하이드록시, 니트로 또는 아미노이거나 A환상의 인접한 2개의 탄소원자에 결합된 메틸렌디옥시 그룹이다.
바람직하게, R1은 수소, 9-, 10-, 11- 또는 12-하이드록시, 9- 또는 10-니트로, 9- 또는 10-아미노 또는 10, 11-메틸렌디옥시이다. 일반식(6)의 캠프토테신 잔기가 보다 바람직하다.
상기 식에서,
R1은 위에서 정의한 바와 같다.
바람직하게는, 일반식(2)의 단위는 1 내지 10몰%, 예를 들면 0.5 내지 5몰%의 양으로 존재한다. 또한 바람직하게는, 캠프토테신 함량은 중합체성 컨쥬게이트를 기준으로 하여 1 내지 10%(w/w), 보다 바람직하게는 4 내지 8%(w/w)이다.
본 발명은 또한 상기 일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 캠프토테신을 4-디메틸아미노피리딘과 같은 활성화제의 존재하에 일반식(8)의 N-보호된 아미노아실 유도체와 축합시켜 일반식(9)의 N-보호된-20-0-(아실아미노) 화합물을 수득하고, 생성된 화합물로부터 N-보호그룹을 제거함을 포함하여, 일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
R3-[A]-P (8)
R3-[A]-[O-CPT] (9)
상기 식에서,
[A] 및 O-CPT는 위에서 정의한 바와 같고,
R3은 아미노 보호 그룹, 예를 들면 t-boc, CBZ, FMOC, 트리페닐실릴, 디페닐메틸렌 또는 트리페닐메틸이며,
P는 p-니트로페녹시, 펜타플루오로페녹시 또는 N-하이드록시숙신이미도와 같은 활성화 에스테르 잔기이다.
일반식(8)의 화합물을 제조하는 방법은 문헌에 공지된 표준합성 과정에 따른다. 일반식(8)의 적합한 N-보호된-아미노아실 유도체에는 N-트리틸-L-페닐알라닐-L-로이실-글리실 p-니트로페닐 에스테르(8a), N-트리틸-글리실-L-로이실-글리실 p-니트로페닐 에스테르(8b) 또는 6-N-트리틸-헥사노일 p-니트로페닐 에스테르(8c)가 포함된다. 일반식(8)의 몇몇 유도체 및 이들의 제조방법은 또한 본 출원인에 의해 출원되어 계류중인 국제특허출원 제PCT/EP94/01100호에 기술되어 있다.
따라서, 예를 들면, 캠프토테신은 4-디메틸아미노피리딘과 같은 활성화제의 존재하에 무수 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭사이드와 같은 무수 용매중에서 몰과량, 예를 들면 5배 몰과량 이하 또는 그 이상, 특히 2몰 과량의 일반식(5)의 N-보호된 아미노아실 유도체와 후속적으로 반응시킬 수 있다. 이러한 방법으로, 보호된 아미노산은 캠프토테신 분자상 C-20 위치에서 도입된다. 당해 반응은 전형 적으로는 8 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 당해 반응은 전형적으로는 15 내지 40℃에서 수행된다. 이러한 반응조건에 따르면, 9-아미노캠프토테신이 9-아미노 그룹의 약염기성으로 인해 C-20-하이드록시 위치에서 부분특이적으로 반응한다.
아미노 보호그룹 R3은 적합한 탈보호제에 의해 제거되어 일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체를 제공한다. 따라서, 탈보호는 약산처리, 예를 들면 아세트산 처리에 의해 또한 환원에 의해 성취될 수 있다. 따라서, 가수소분해를 사용할 수 있다.
일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체와 필수적으로 구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴로일아미드 단위 60 내지 99몰% 및 일반식(4)의 N-메타크릴로일아미드 유도체 단위 40 내지 1몰%로 이루어진 중합체를 축합시킨 후, 임의로 잔류 활성 에스테르 그룹을 대체시키는 반응은 캠프토테신과스페이서[A]와의 결합 특성 뿐만 아니라 컨쥬게이트의 특성을 보존할 수 있는 조건하에서 수행한다.
구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴로일아미드 단위 60 내지 99몰%와 일반식(4)의 N-메타크릴로일글리신 단위 40 내지 1몰%로 필수적으로 이루어진 중합체는 문헌[참조: Makromol. Chem. 178, 2159 (1977)]에 기술된 바와 같이 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드를 N-메타크릴로일글리신 또는 N-메타크릴로일글리신 활성 에스테르 유도체와 공중합시켜 제조한다. R2는 페닐 환에서 하나 이상의 전자 수용성 그룹에 의해 치환된 페닐옥시 그룹을 나타낼 수 있다. 적합한 전자 수용성 그룹의 예에는 니트로(-NO2) 및 할로겐이 포함된다. R2는 바람직하게는 하기 일반식의 이탈그룹이다;
상기 식에서,
L은 전자 수용성 그룹, 예를 들면 -NO2또는 할로겐(예: 불소 또는 염소)이며,
m은 1 내지 5, 전형적으로는 1 내지 3의 정수이며 바람직하게는 1 또는 2이다.
R2는 바람직하게는 p-니트로페녹시 그룹 또는 2,4-디클로로페녹시 그룹이다.
바람직하게는, 본 발명의 중합체 컨쥬게이트를 제조하기 위한, 일반식(7)의 화합물과 R2가 활성 에스테르 잔기(a)인 중합체와의 반응은 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭사이드와 같은 무수 극성 유기 용매 중에서 수행한다. 당해 반응은 전형적으로는 8 내지 24시간 동안 수행할 수 있다. 당해 반응은 전형적으로는 15 내지 30℃, 바람직하게는 실온에서 15시간 동안 수행하며, 이 후 잔류 활성 에스테르의 가아미노분해반응이 0.5 내지 1시간 동안 1-아미노-2프로판올의 존재하에 실온에서 수행될 수 있다. 컨쥬게이트는 적합하게는 아세톤으로 침전시키고 에탄올에 용해시키고 아세톤으로 재침전시킨다.
또 다른 방법에 있어서, 본 발명의 중합체 컨쥬게이트를 제조하기 위해, R2가 하이드록시 그룹(b)인 중합체와 일반식(7)의 화합물과의 반응을 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린과 같은 축합제의 존재하에 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭사이드와 같은 무수 극성 용매 중에서 수행한다. 당해 반응은 전형적으로는 8 내지 24시간 동안 수행할 수 있다. 당해 반응은 전형적으로는 15 내지 30℃, 바람직하게는 실온에서 15시간 동안 수행하며, 이 후 컨쥬게이트를 아세톤으로 침전시키고 에탄올에 용해시키고 아세톤으로 재침전시킬 수 있다.
예를 들면, R2가 활성 에스테르 잔기(a)인 중합체를 무수 디메틸설폭사이드 중 15%(w/v)의 농도로, 실온에서 15시간 3%(w/v)의 일반식(7)의 20-0-아미노아실 캠프토테신 유도체로 처리한다. 이어서, 0.1%(w/v)의 1-아미노-2-프로판올을 가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 유지시킨다. 컨쥬게이트를 아세톤으로 침전시킨 후 컨쥬게이트를 10%(w/v)의 무수 에탄올로 용해시키고 아세톤으로 재침전시켜 본 발명에 따른 중성 캠프토테신 컨쥬게이트를 수득한다.
또 다른 실례에서는, 무수 디메틸설폭사이드 중 농도가 15%(w/v)이고 R2가 하이드록시(b)인 중합체를 실온에서 15시간 동안 1.3%(w/v)의 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린의 존재하에 3%(w/v)의 일반식(7)의 20-0-아미노아실캠프토테신 유도체로 처리한다. 이어서, 아세톤을 가하여 침전시키고, 침전물을 10%(w/v)의 농도로 무수 에탄올을 사용하여 용해시키고 아세톤을 가하여 재침전시켜 본 발명에 따른 중합체성 컨쥬게이트를 수득한다.
본 발명의 중합체성 컨쥬게이트 중 캠프토테신 또는 이의 A환 동족체와 같은 활성 약제의 함량은 HPLC 또는 흡수 분광법으로 분석하여 측정한다.
본 발명에 기술된 캠프토테신 및 이의 A환 동족체의 중합체 컨쥬게이트는 수용성이 증진되고 독성이 감소된다. 컨쥬게이트는 수용성과 생체내 적합성이 양호하고 혈장 내에서 또는 효소적 분해에 의해 세포내로 내재화된 후 캠프토테신을 방출한다.
생물학적 활성
N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드, 20-0-[N-메타크릴로일글리실-L-페닐알라닐-L-로이실글리실]캠프토테신 및 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일글리신 아미드(A2)의 공중합체를 유리 캠프토테신(CPT)와 비교하여 HT29/콜론 카시노마 (Colon Carcinoma)를 이식시킨 누드 마우스(표 1) 및 초기 및 중증의 M5076 쥐과의아성 림프종을 갖는 마우스(표 2 및 3)에서 시험한다.
캠프토테신과 비교하는 경우, 모든 실험에서 중합체 결합된 캠프토테신 유도체 A2에 대한 활성이 현저히 더 높은 것으로 관찰되었다. HT29/콜론 카시노마에 대한 실험에서 마우스가 치료된 것으로 밝혀진 사실은 주목할만 하다.
항암 활성은 A2 및 CPT에 대해 동일한 치료 스케쥴로 치료하였다.
중합체 결합된 캠프토테신 A2는 고도로 수용성이며 생리적 식염수에 가용성이고 정맥내 투여된 반면 CPT는 물과 트윈(Tween) 80의 혼합물에 용해되었음에 주의해야 한다.
약제 제조 및 투여
화합물 A2을 사용 직전에 증류수에 용해시키고 농도를 370nm(E1% 57.18)에서 분광법으로 점검한다. 캠프토테신(CPT)은 10% 트윈 농도의 멸균수에 용해시킨다. 치료 처리군은 체중 kg당 10ml의 용량으로 정맥내 투여하고 대조용 마우스는 멸균수로 처리한다.
종양
HT29 콜론 카시노마를 15 내지 20mg의 암수질을 이용하여 의식 불명의 스위스 누드 마우스에게 경피적으로 이식시킨다.
M5076의 쥐과의 악성 림프종을 적합한 C57B1/6 마우스에 연속적으로 근육내로 통과 투여함으로써 유지시켜 경피적으로 이식(5 ×105개의 세포/마우스)시킨다.
모든 동물은 이탈리아공화국 코모 챨스 리버 칼코산이다. 정상적인 경우 1그룹당 10마리의 마우스를 사용하며 의식불명의 경우 8마리를 사용한다. 정상적인 마우스의 체중은 20 내지 22g이며 표준 시험 조건하에서 적용시킨다. 마우스 콜로니를 마우스 헤파타이티(Mouse Hepatitis), 센다이 바이러스(Sendai Virus) 및 마이코플라즈마 풀모니스(Mycoplasma Pulmonis)를 포함하는 병원체 패널에 대한 항체 부재의 경우에 대해 통상적으로 시험한다.
항암 활성 및 독성 평가
종양 성장률은 칼리퍼 측정법으로 분석하고 종양 중량은 제란(Geran) 등에 의한 방법[참조예: Cancer Chem. Rep., Part 3,3 (2) ed. 3, pp 1-103, 1972]에 따라 평가한다. 항암 활성은 하기 식을 사용하여 종양 성장 억제율 %(% T/Ⅰ)로서 표시한다.
생존기간중 평균치 증가율(T/C%)은 하기식을 사용하여 계산한다.
실험 말기에 종양이 없는 마우스가 치료된 마우스이다. 독성을 체중 감소 및 총체적 검시 사항등을 기준으로 하여 주로 비장 및 간 크기 감소면에서 평가한다.
[표 1]
캠프토테신(CPT)과 비교하여 나타낸 HT29/콜론
카시노마에 대한 화합물 A2의 항암활성
(1) CPT 당량으로 나타냄.
(2) 독성으로 죽은 마우스 수/마우스 총수.
(3) 종양이식 90일 후 종양이 없는 마우스.
[표 2]
캠프토테신(CPT)과 비교하여 나타낸 초기 M5076의
쥐과의 악성 림프종에 대한 화합물 A2의 항암활성
(1) CPT 당량으로 나타냄.
(2) 독성으로 죽은 마우스 수/마우스 총수.
(3) 종양 억제율 %은 최종 치료 1주일 후 평가함.
[표 3]
캠프토테신(CPT)과 비교하여 나타낸 M5076의 쥐과의 악성 림프종에 대한
화합물 A1의 항암활성(치료스케쥴; 16, 20, 24, 28, 31 및 35일째 정맥내 투여)
(1) CPT 당량으로 나타냄.
(2) 독성으로 죽은 마우스 수/마우스 총수.
(3) % 종양 억제율은 34일 후 평가함.
독성
N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드, 20-0-[N-메타크릴로일글리실-L-페닐알라닐-L-로이실글리실]캠프토테신 및 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일글리신아미드(A2)의 공중합체의 독성을 캠프토테신(CPT)과 비교하여 정맥내 투여치료한 건강한 C57B1/F 마우스에서 평가한다.
C57B1/F 마우스에서의 LD10(1) 및 LD50(2) 값은 하기와 같다:
(1) LD10: 10%의 마우스 치사율을 유도하는 투여량.
(2) LD50: 50%의 마우스 치사율을 유도하는 투여량.
중합체 결합되 캠프토테신 유도체 A2는 낮은 독성으로 인해 캠프토테신보다 높은 투여량으로 약제가 투여될 수 있으며, 동등한 효과 또는 보다 우수한 효과를 제공할 수 있다.
중합체 결합된 캠프토테신은 항암 활성을 갖는다. 이들은 토포이소머라제 Ⅰ를 억제 한다. 이들은 특히 백혈병 및 결장암과 직장암과 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명의 중합체성 컨쥬게이트를 치료학적 유효량으로 사람 또는 동물에게 투여함으로써 질환을 치료할 수 있다. 따라서, 사람 또는 동물인 환자의 상태가 호전될 수 있다.
사용되는 투여량은 치료중인 환자의 나이, 체중 및 상태와 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 중합체성 컨쥬게이트는 전형적으로는 비경구적으로, 예를 들면 근육내 투여, 정맥내 투여 또는 농축괴 주입등에 의해 투여된다. 적합한 투여량 범위는 체표면 1m2당 1 내지 1000mg의 캠프토테신 당량, 예를 들면 10 내지 50mg/m2이다.
중합체성 컨쥬게이트는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다. 전형적으로는, 중합체성 컨쥬게이트를 비경구적 투여용으로, 예를 들면 주사용 물 또는 생리적 식염수에 용해시킴으로써 제형화한다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 이에 이로써 제한되지는 않는다. 명세서 전반에 걸쳐서, 아미노산 잔기는 문헌[참조예: Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984]에 따라 3개의 문자 코드로 나타낸다.
쥐과의 혈장 또는 사람의 혈장에 대한 중합체성 컨쥬게이트의 용해도를 하기의 방법으로 평가한다: 쥐과 또는 사람의 혈장 1ml에 본 발명의 중합체성 컨쥬게이트(A)를 각종 농도로 가하고 적절한 시점(24,48,72,96시간)에서 100㎕의 샘플을 수집하여 -70℃에서 추가의 공정때까지 보관한다.
각각의 샘플을, 100㎕의 0.25M 인산, 500㎕의 CH3CN 및 700㎕의 에틸 아세테이트를 가하고 4℃에서 20분 동안 격렬하게 진탕시킴으로써 추출한다. 이어서, 샘플을 10분 동안 15000xg에서 회전시키고 상등액을 분리한다. 잔사에 CH3CN 300㎕를 가하고 500㎕를 10분 동안 15000xg에서 회전시킨다. 상등액을 분리시킨다. 유기/상을 풀링하고 고진공 원심분리법을 사용하여 증발시킨다. pH2의 MeOH/물(70/30의 용적비) 500㎕를 가함으로써 샘플을 회수하고 전체 약제 함량%를 측정하기 위한 장치로 주입한다.
HPLC 시스템
칼 럼 : μ본다팍(Bondapak) C10 (물) 3.9 × 300㎜
유 속 : 1.5ml/min
검출기 : 형광성 분광광도계 650-40(Perkin Elmer); 방출 434㎜ (슬릿 5);
여기 370nm (슬릿 5)
주입량 : 10㎕
이동상 : 51.5% MeOH, 47.5% 물, 1% 인산
[실시예 1]
6-N-트리틸-헥사노일 p-니트로페닐 에스테르(8c)
(C6H5)3C-NH(HC2)5CO-OC6H4pNO2(8c)
무수 클로로포름(75ml) 및 무수 아세토니트릴(15ml)의 혼합물에 현탁시킨 6-아미노카프로산(6.5g, 50mmol)을 트리메틸실릴클로라이드(6.3ml, 50mmol)와 함께 가하고 환류하에 2시간 동안 격렬하게 교반시킨다. 이어서, 혼합물을 냉각시키고 무수 클로로포름(100ml)에 용해시킨 트리에틸아민(13.7ml, 100mmol) 및 트리틸 클로라이드(14g, 50mmol)를 순서대로 가한다. 혼합물을 밤새도록 실온에서 방치시킨 후 메탄올(10ml)을 가하고 반응 혼합물을 감압하에 농축시킨다. 잔사를 냉각된 5% 냉수성 시트르산 수용액(200ml)으로 용해시키고 에틸 아세테이트(200ml)으로 추출한다. 유기 상을 분리하고 냉각된 1N 수산화나트륨 수용액(200ml)으로 추출한다. 수성 상을 분리시키고 얼음으로 냉각시키고 아세트산을 사용하여 pH가 5가 되도록 하고 에틸 아세테이트(2×10ml)로 추출한다. 유기 용매를 감압하에 제거하고 에틸아세테이트로부터 결정화한 후 6-N-트리틸-헥산산(16g)을 수득한다. 이 물질을 무수 테트라하이드로푸란(150ml)에 용해시키고 교반하에 0℃에서 1시간 동안과 8℃에서 밤새도록 p-니트로페놀(5.6g, 400mmol) 및 디사이클로헥실카보디이미드(8.4g, 40mmol)로 처리한다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고, 0℃에서 2시간 동안 냉각시키고 다시 여과한다. 최종적으로, 유기용매를 감압하에 제거하고 잔사를 에틸아세테이트로 결정화하여 표제 화합물(8c)(16.4g)을 수득한다. 키젤겔(Kieselgel) 플레이트 F245(Merck)에서의 TLC, 용출계 에틸 에테르/n-헥산(1:1 용적비)
Rf=0.6; FD-MS: m/z [M+H]+495 H1NMR (90MHz, CDCl3) δ 1.1-1.9 (m, 6H); 2-2.5(m, 4H); 5.7-5.9 (m, 2H, NH, -COOH); 7.2-7.7 (m, 15H).
[실시예 2]
20-0-(6-아미노헥사노일)캠프토테신(7c)
캠프토테신(6a, R1=7, 0.7g, 2mmol)을 무수 디메틸설폭사이드(100ml)에 용해 시키고 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조한 6-N-트리틸-헥사노일 p-니트로페닐에스테르(8c, 2g, 4mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.24g, 2mmol)과 함께 가한다.반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 유지시킨 후, 클로로포름(400ml)으로 희석하고 물(3×100ml)로 세척한다. 유기 상을 분리시키고 무수 황산나트륨으로 건조시키고 감압하에 적은 용적이 되도록 농축시킨다. 조 물질을 클로로포름으로 용출시키는 규산 칼럼에서 섬광 크로마토그래피하여 20-0-(6-N-트리틸-헥사노일)캠프토테신(0.6g)을 수득한다. 클로로포름/메탄올(95:5 용적비)을 용출계로 사용하여 키젤겔플레이트 F245(Merck)에서 TLC하면 Rf값이 0.4이다. N-보호된 유도체는 실온에서 50분 동안 95% 트리플루오로아세트산(10ml)으로 처리한다. 감압하에 산을 제거한 후 표제 화합물(7c)을 에틸 에테르로 수집한다. 수득량 0.4g. 메틸렌 클로라이드/메탄올/아세트산/물(80:20:7:3)을 용출계로 사용한 키젤겔 플레이트 F245(Merck)에서의 TLC; Rf=0.6. FD-MS: m/z [M+H]+462.
[실시예 3]
20-0-(L-페닐알라닐-L-로이실-글리실)캠프토테신(7b)
영국 특허원 제9309663.4호에 이미 기술된 바와 같이 제조한 N-트리틸-L-페닐알라닐-L-로이실글리신 p-니트로페닐 에스테르(8a, 1.4g, 2mmol),캠프토테신(6a, R1=H, 0.35g, 1mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.12g, 1mmol)을 무수 디메틸설폭사이드(50ml)에 용해시키고 실온에서 20시간 동안 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 클로로포름(400ml)으로 희석하고 물(3×100ml)로 세척한다. 유기 상을 분리하고 무수 황산 나트륨에서 세척하고 감압하에 적은 용적이 되도록 농축시킨다. 조 물질을 클로로포름/메탄올(99.5/0.5 용적비)의 혼합물을 사용하여 용출시키는 규산 칼럼에서 섬광 크로마토그래피한다. 표제 화합물의 N-보호된 유도체를 함유하는 분획을 풀링시키고 건조 농축시키고 75% 수성 아세트산(30ml)으로 용해시키고 실온에서 1시간 동안 유지시킨다. 반응 혼합물을 고체 탄산수소나트륨을 사용하여 pH7이 되도록 처리하고 클로로포롬(400ml)으로 추출한다. 유기 용매를 제거하고 표제 화합물(7b)을 에틸에테르로부터 결정화한다. 수득량 0.16g. 클로로포름/메탄올(9:1 용적비) 용출계를 사용한 키젤겔 플레이트 F245(Merck)상에서의 TLC; Rf=H, 0.35.
FD-MS: m/z [M+H]+667;1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ : 0.81 (d, J=6.5Hz, 3H, δ-Leu); 0.82 (d, J=6.6Hz, 3H, δ'- Leu); 0.98 (t, J=7.6Hz, 3H, CH3CH2); 1.25 (m, 1H, β-Leu); 1.39 (m, 1H, -Leu); 1.56 (m, 1H, β'-Leu); 1.98 (dd, J=6.4Hz, J=13.5Hz, 1H, β-Phe); 2.1-2.4 (m, 2H, CH2CH3); 2.48 (d, J=7.0Hz, 1H, NH-Phe); 2.77 (dd, J=4.7Hz, J=13.5Hz, 1H, β'-Phe); 3.41 (m, 1H, α-Phe); 4.0-4.3 (m, 3H, α-Gly+α'-Gly+α-Leu); 5.20-5.27 (2개의 d, J=19.9Hz, 2H, 5-CH2); 5.41-5.68 (2개의 d, J=17.3Hz, 2H, 17-Ch2); 6.35 (t, J=5.3Hz, 1H, NH-Gly); 6.76 (d, J=7.6Hz, 1H, NH-Leu); 6.8-7.3 (m, 21H, 4×(C6H4)+14-H).
[실시예 4]
9-아미노-20-0-(L-페닐알라닐-L-로이실-글리신)캠프토테신(7d)
N-트리틸-L-페닐알라닐-L-로이실글리신 p-니트로페닐에스테르(8a, 1.14g, 2mmol), 9-아미노-캠프토테신(6b, R1=NH2, 0.363g, 1mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (0.12g, 1mmol)을 실시예 3에서 기술한 바와 같이 실온에서 무수 디메틸설폭사이드 (20ml) 중에서 반응시켜서 표제 화합물(7c)(0.31g)을 수득한다. 용출계 클로로포름/메탄올(9:1 용적비)을 사용한 키젤겔 플레이트 F245(Merck)에서의 TLC; Rf=0.2.
FD-MS: m/z [M+H]+682;1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ : 0.82 (d, J=6.5Hz, 6H, δ-Leu+δ'- Leu); 1.00 (t, J=7.6Hz, 3H, CH2CH3); 1.25 (m, 1H, β-Leu); 1.41 (m, 1H, -Leu); 1.59 (m, 1H, β'-Leu); 1.99 (dd, J=6.2Hz, J=13.5Hz, 1H, β-Phe); 2.1-2.4 (m, 2H, CH2CH3); 2.47 (d, J=6.5Hz, 1H, NH-Phe); 2.79 (dd,J=4.7Hz, J=13.5Hz, 1H, β'-Phe); 3.43 (m, 1H, α-Phe); 4.0-4.3 (m, 5H, 9-NH2+α-Leu+-Gly+α'-Gly); 5.04+5.15 (2개의 d, J=19.9Hz, 2H, CH2); 5.39-5.66 (2개의 d, J=17.0Hz, 2H, 17-CH2); 6.44 (t, J=5.3Hz, 1H, NH-Gly); 6.81 (d, J=7.6Hz, 1H, NH-Leu); 6.85 (m, 3H, 10-H+); 7.0-7.4 (m, 19H, 3×(C6H5)++14-H)' 7.51 (m, 1H, 11-H).
[실시예 5]
N-(2-하이트록시프로필)메타크릴아미드, 20-0-[N-메타크릴로일글리실-(6-아미노헥사노일)]캠프토테신과 N-(2-하이드록시-프로필)메타크릴로일글리신아미드의 공중합체(A1:x=96, y=3, z=1)
p-니트로페닐에스테르 2.7×103당량을 함유하는 문헌[참조: Makromal.Chem., 178, 2159(1977)]에 기술된 바와 같이 제조한 N-메타크릴로일글리신 p-니트로페닐에스테르(0.15g)와 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드의 공중합체를, 실온에서 18시간 동안 무수 디메틸설폭사이드(1ml)에서 실시예 2에 기술한 바와 같이 제조한 20-0-(6-아미노헥사노일)캠프테토신(7c, 18mg)과 반응시킨 후, 실온에서 1 시간 동안 1-아미노-2프로판올(2㎕)과 반응시킨다. 이서서, 반응 혼합물을 아세톤 (70ml)으로 처리한다. 침전물을 수집하고 무수 에탄올(5ml)로 재용해시키고 아세톤 (50ml)으로 재침전시켜 5%(w/w)의 캠프토테신을 함유하는 표제 컨쥬게이트 A1(0.14g)을 수득한다. 혈장 배양 후, 컨쥬게이트(A1)는 10%의 캠프토테신을 120 시간 후에 제공한다.
[실시예 6]
N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드와 20-0[N-메타크릴로일글리실-L-페닐알라닐-L-로이실글리실]캠프토테신과 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일글리신아미드의 공중합체(A2: x=96, y=2.2, z=1.8)
N-(2-하이드록시프로필)메틸아크릴아미드 및 N-메타크릴로일글리신 p-니트로페닐에스테르(0.15g, p-니트로페닐에스테르 2.7×103당량을 함유함)의 공중합체 및 실시예 3에서 기술한 바와 같이 제조한 20-0-(글리실-L-로이실-L-페닐알라닐)캠프토테신(7b, 20mg)을 무수 디메틸설폭사이드(1ml) 중에서 실시예 6에서와 같이 1-아미노-2-프로판올과 반응시켜 4.8%w/w의 캠프토테신을 함유하는 표제 컨쥬게이트 (A2)(0.14g)을 수득한다. 혈장 배양 후, 컨쥬게이트(A2)는 100%의 캠프토테신을 60시간 후에 방출한다.
[실시예 7]
N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드와 9-아미노-20-0-[N-메타크릴로일글리실-L-페닐알라닐-L-로이실글리실]캠프토테신과 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일글리신아미드의 공중합체(A3: x=96, y=3, z=1)
표제 컨쥬게이트를 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 및 N-메타크릴로일글리신 p-니트로페닐에스테르(0.15g, 2.7×10-3당량의 p-니트로페닐에스테르를 함유함)의 공중합체와 실시예 4에서 기술한 바와 같이 제조한 9-아미노-20-0-(글리실-L-로이실-L-페닐알라닐)캠프토테신(7d, 20mg)을 반응시킨 후 실시예 5에서 기술한 바와 같이 1-아미노-2-프로판올과 반응시킨다. 수득량 0.14g, 6.3% w/w의 9-아미노-캠프토테신을 함유함. 혈장 배양 후, 컨쥬게이트(A3)는 50시간 후에 100%의 캠트토테신을 방출한다.

Claims (10)

  1. 구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일아미드 단위(ⅰ) 60 내지 99 몰%,
    일반식(2)의 20-0(N-메타크릴로일글리실아미노아실)캠프토테신 단위(ⅱ) 1 내지 40몰% 및
    일반식(3)의 N-메타크릴로일글리신 또는 N-(2-하이드록시-프로필)메타크릴로일글리신아미드 단위(ⅲ) 0 내지 10몰%로 필수적으로 이루어진 중합체성 컨쥬게이트.
    상기 식에서,
    [A]는 3개 이상의 원자에 의해 분리되며 각각의 말단 아미노 그룹과 카보닐 그룹을 갖는 스페이서 그룹이며,
    O-CPT는 캠프토테신의 C-20 하이드록시 그룹이 스페이서 그룹[A]의 말단 카보닐 그룹에 결합되어 있는 캠프토테신의 잔기를 나타내며,
    Z는 하이드록시 또는 구조식 -NH-CH2-CH(OH)-CH3의 잔기이다.
  2. 제1항에 있어서, 스페이서 그룹[A]이 Ala-Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Pha-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly, 및 Phe-Leu-Gly-Phe로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 스페이서 그룹[A]이 일반식 -HN-Y-CO-의 그룹, Ala-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Gly-NH-Y-CO-, Val-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Ala-NH-Y-CO-, Leu-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-, Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO, Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO- 또는 Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO-(여기서, Y는 직쇄 또는 측쇄 C3-C8알킬 그룹이다)로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, O-CPT가 일반식(6)의 캠프토테신 잔기인 컨쥬게이트
    상기식에서,
    R1은 수소, 하이드록시, 니트로 또는 아미노이거나, A환의 2개의 인접한 탄소원자에 결합된 메틸렌디옥시 그룹이다.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 일반식(2)의 단위가 1 내지 10몰%의 양으로 존재하는 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 캠프토테신 함량이 1 내지 10%(w/w)인 컨쥬게이트.
  7. 일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체를 필수적으로 구조식(1)의 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴로일아미드 단위(ⅰ) 60 내지 99몰%와 일반식(4)의 N-메타크릴로일글리신 단위(ⅳ) 40 내지 1몰%로 이루어진 중합체와 반응시키는 단계와 임의로 잔류 활성 에스테르 그룹을 1-아미노-2-프로판올로 대체시키는 단계를포함하는, 제1항에서 정의한 중합체성 컨쥬게이트이 제조방법.
    상기 식에서,
    [A] 및 O-CPT는 제1항에서 정의한 바와 같고,
    R2는 활성 에스테르의 잔기(a) 또는 하이드록시(b)이다.
  8. 제7항에서 정의한 일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체.
  9. 캠프토테신을 활성화제의 존재하에 일반식(8)의 N-보호된 아미노아실 유도체와 축합시켜 일반식(9)의 N-보호된-20-0-(아실아미노) 화합물을 수득하는 단계와 생성된 화합물로부터 N-보호 그룹을 제거하는 단게를 포함하는, 제7항에서 정의한 일반식(7)의 20-0-아실아미노-캠프토테신 유도체의 제조방법.
    R3-[A]-P (8)
    R3-[A]-[O-CPT] (9)
    상기 식에서,
    [A] 및 O-CPT는 제1항에서 정의한 바와 같고,
    R3은 아미노 보호 그룹이며,
    P는 활성 에스테르의 잔기이다.
  10. 항암제로서 유용한, 활성 성분으로서의 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 중합체성 컨쥬게이트와 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함 하는 약제학적 조성물.
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