PL172718B1 - Sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych PL PL PL PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL172718B1
PL172718B1 PL93317516A PL31751693A PL172718B1 PL 172718 B1 PL172718 B1 PL 172718B1 PL 93317516 A PL93317516 A PL 93317516A PL 31751693 A PL31751693 A PL 31751693A PL 172718 B1 PL172718 B1 PL 172718B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
adriamycin
formula
conjugate
antibody
adm
Prior art date
Application number
PL93317516A
Other languages
English (en)
Inventor
David Willner
Pamela A Trail
H Dalton King
Sandra J Hofstead
Robert S Greenfield
Gary R Braslawsky
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of PL172718B1 publication Critical patent/PL172718B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6881—Cluster-antibody conjugates, i.e. the modifying agent consists of a plurality of antibodies covalently linked to each other or of different antigen-binding fragments covalently linked to each other
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowych koniu- gatów tioeterowych o wzorze 1, w którym D oznacza ugrupowanie leku, n jest liczba calkowita 1-10, p jest liczba calkowita 1 -6 , Y oznacza O lub NH2+ Cl-, z jest równe 0 lub 1, q wynosi od okolo 1 do okolo 10, X ozna- cza ligand, A oznacza ugrupowanie adduktu Michaela, znam ienny tym, ze zwiazek o wzorze 2a, w którym D i n maja wyzej poda- ne znaczenie, a R oznacza receptor addycji Michaela poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym p, Y, z, q i X maja wyzej podane znaczenie, i ewentualnie wyodrebnia sie produkt. Wzór 1 PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych. Związki te znajdują zastosowanie w leczeniu nowotworów.
Bifunkcjonalne związki, łączące reagenty cytotoksyczne z przeciwciałami są znane. Związki te są szczególnie użyteczne w tworzeniu immunokoniugatów skierowanych przeciwko antygenom nowotworowym. Takie immunokoniugaty pozwalająna selektywne dostarczanie toksycznych leków do komórek nowotworowych. (Hermentin i Seiler, “Investigations with Monoclonal Antibody Drug Coniugates”, Behring. Insti. Mitl. 82: 197-215 (1988); Gallego i wsp., “Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates with Anti-Tumour Activity”. Int. J. Cancer 33: 737-44 (1984); Amon i wsp., “In Vitro and In Vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin with Anti-Tumour Antibodies”, Immunological Rev. 62: 5-27 (1982).
172 718
Greenfield i wsp. opisali ostatnio tworzenie wrażliwych na kwas immunokoniugatów zawierających związek acylohydrazynowy, 3-(2-pirydyloditio)propionylohydrazyd, sprzężony poprzez wiązanie acylohydrazynowe z 13-keto pozycją cząsteczki antracykliny, oraz sprzęganie tych pochodnych antracykliny z cząsteczką przeciwciała (Greenfield i wsp., publikacja patentu europejskiego nr 328147, odpowiadająca zgłoszeniu patentowemu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/270509 i zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/155181). Ostatnia publikacja ujawnia również specyficzne łączniki oraz koniugaty zawierające ugrupowanie tioeterowe, w tym immunokoniugaty zawierające ugrupowanie hydrazonotioeterowe.
Kaneko i wsp. (zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/522996, będące równoważnikiem europejskiego zgłoszenia patentowego nr 457250) opisali również tworzenie koniugatów zawierających antybiotyki antracyklinowe przyłączone do bifunkcjonalnego łącznika poprzez wiązanie acylohydrazonowe w pozycji C-13 cząsteczki antracykliny. W ich wynalazku łączniki zawierająreaktywmigrupę pirydynyloditio- lub ortonitrofenyloditio, poprzez którąłącznik reaguj e z odpowiednią grupaprzyłączoną do ligandu reaguj ącego z komórkami, tworząc gotowy koniugat.
Użyteczne byłby uzyskanie dodatkowych związków, zawierających wrażliwe na działanie kwasu połączenie między cząsteczkami kierującą i reaktywną, do stosowania w terapii in vivo. Zatem wynalazek niniejszy dostarcza nowej chemii do łączenia aktywnych terapeutycznie cząsteczek leku z ligandem zdolnym do rozpoznawania wybranej populacji komórek celowych. Ta chemia łącznika stosowana jest następnie do wytworzenia aktywnych terapeutycznie koniugatów.
Zgodnie z wynalazkiem wytwarza się koniugat tioeterowy w którym każda cząsteczka leku jest połączona z ligandem poprzez zawierające ugrupowanie tioeterowe ramię łącznika. Lek jest przyłączony do tego łącznika poprzez wiązanie acylohydrazonowe. Wiązanie tioeterowe tworzy się przez reakcję grupy sulfhydrylowej z ligandu lub krótkiego ugrupowania “przedłużacza” przyłączonego do ligandu, z receptorem addycji Michaela, który po reakcji staje się adduktem Michaela. W korzystnej postaci ligand kierujący jest przyłączony bezpośrednio do łącznika poprzez kowalencyjne wiązanie tioeterowe.
Wytworzony sposobem według wynalazku nowy koniugat ma ogólną strukturę przedstawionąwzorem 1, w którym D oznacza ugrupowanie leku; n jest równe 1 -10, p jest równe 1- 6; Y oznacza O lub NH2+Cl';zjest równe 0 lub 1; q wynosi od około 1 do około 10; X oznacza ligand; a A oznacza ugrupowanie adduktu Michaela.
Sposób według wynalazku polega na tym, że związek o wzorze 2a, w którym D, n mająwyżej podane znaczenie, a R oznacza receptor addycji Michaela poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 3, w którymp, Y, z, q i X mająwyżej podane znaczenie, i ewentualnie wyodrębnia się produkt.
Sposób według wynalazku polega korzystnie na tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym X oznacza immunoglobulinę lub j ej fragment, a p, Y, z i q mająwyżej podane znaczenie.
Korzystnie, sposób według wynalazku polega na tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym X oznacza immunoglobulinę, wybraną z grupy składającej się z BR96, BR64, L6, zrelaksowanego BR96, zrelaksowanego BR64, zrelaksowanego L6, chimerycznego BR96, chimerycznego BR64, chimerycznego L6, zrelaksowanego chimerycznego BR96, zrelaksowanego chimerycznego BR64, zrelaksowanego chimerycznego L6 i ich fragmentów, ap, Y, z i q mająwyżej podane znaczenie.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się związek o wzorze 3, w którym X oznacza chimeryczne BR96, zrelaksowane chimeryczne BR96 lub ich fragment, a p, Y, z i q mają wyżej podane znaczenie.
Korzystnie, sposób według wynalazku polega na tym, że stosuje się związek o wzorze 2a, w którym D oznacza antybiotyk antracyklinowy wybrany z grupy składającej się z adriamycyny, daunomycyny, detorubicyny, karminomycyny, idarubicyny, epirubicyny, AD-32, 4-morfolinylo-adriamycyny i 3'-deamino-3'-(3-cyjano-4-morfolinylo)-deoksorubicyny, a n i R mają wyżej podane znaczenie.
172 718
Sposób według wynalazku polega na tym, że stosuje się związek o wzorze 2a, w którym D oznacza antybiotyk antracyklinowy, korzystnie adriamycynę, a n i R maj ąwyżej podane znaczenie.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się związek o wzorze 2a, w którym n jest równe 5.
Sposób według wynalazku, korzystnie, polega na tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym z jest równe 0, a p, Y, q i X mają wyżej podane znaczenie.
Sposób według wynalazku, korzystnie, polega na tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym q jest równe od około 4 do około 8.
W jednej z postaci wynalazku ugrupowaniem leku jest antybiotyk antracyklinowy, a ligandem jest przeciwciało.
W korzystnej postaci antracyklina jest związana z częścią łącznikową koniugatu poprzez wiązanie acylohydrazonowe w pozycji 13-keto związku antracyklinowego. Następnie do związku antracyklinowego jest przyłączone poprzez łącznik przeciwciało. W szczególnie korzystnej postaci łączenie to odbywa się poprzez zredukowaną grupę disiarczkową(tó jest wolną grupę sulfhydrylową (-SH)) przeciwciała.
W najbardziej korzystnej postaci antracyklinowym ugrupowaniem leku jest adriamycyna, receptorem addycj i Michaela, z którego otrzymuj e się addukt Michaela, jest grupa maleimidowa, a przeciwciałem jest przeciwciało chimeryczne.
Nowe koniugaty zatrzymują zarówno specyficzność jak i aktywność leku terapeutycznego w działaniu na wybraną populację komórek celowych. Mogą być one stosowane w środkach farmaceutycznych, takich jak środki zawierające efektywną farmaceutycznie ilość związku o wzorze 1 w połączeniu z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub rozczynnikiem.
Wynalazek bliżej objaśniono na rysunku, na którym:
fig. 1(a) przedstawia schemat syntetyczny wytwarzania tiolowanego przeciwciała przy użyciu SDPP jako środka tiolującego;
fig. 1 (b) przedstawia schemat syntetyczny wytwarzania nowego immunokoniugatu, w którym ligandem jest przeciwciało tiolowane przy użyciu SDPP;
fig. 1 (c) przedstawia schemat syntetyczny wytwarzania nowego immunokoniugatu, w którym ligandem jest przeciwciało tiolowane iminotiolanem;
fig. 2 przedstawia sposób redukowania przeciwciała przy użyciu DTT w celu otrzymania przeciwciała “zrelaksowanego” i syntezę nowego immunokoniugatu;
fig. 3 przedstawia dane o aktywności cytotoksycznej in vitro nowych koniugatów adrimycyna-BR64 przeciwko nowotworom L2987;
fig. 4 przedstawia dane o aktywności cytotoksycznej in vivo nowych koniugatów adriamycyna-BR64 przeciwko nowotworom L2987;
fig. 5 przedstawia porównawcze dane o aktywności cytotoksycznej in vivo dla terapii łączonej przy użyciu BR64, adriamycyny i koniugatu niewiążącego (SN7-adriamycyna);
fig. 6 przedstawia dane o aktywności cytotoksycznej in vivo dla nowych koniugatów bombezyna-adriamycyna przeciwko nowotworom H345;
fig. 7 przedstawia dane o aktywności cytotoksycznej in vitro dla koniugatów adriamycyny ze zrelaksowanych chimerycznym BR96 i chimerycznym BR96 tiolowanym SDPP;
fig. 8 przedstawia dane o aktywności cytotoksycznej in vivo dla koniugatów adriamycyny ze zrelaksowanym BR64 i zrelaksowanym chimerycznym L6 przeciwko nowotworom L2987;
fig. 9 do 11 przedstawiają dane o aktywności cytotoksycznej in vivo przeciwko nowotworom L2987 dla koniugatów adriamycyny ze zrelaksowanym chimerycznym BR96 w porównaniu z wolną adriamycyną i koniugatami niewiążącymi;
fig. 12 przedstawia dane o aktywności cytotoksycznej in vivo dla koniugatów adriamycyny ze zrelaksowanym chimerycznym BR96 przeciwko ludzkiemu rakowi sutka MCF7;
fig. 13 przedstawia dane o aktywności cytotoksycznej in vivo dla koniugatów adriamycyny ze zrelaksowanym chimerycznym BR96 przeciwko ludzkiemu rakowi okrężnicy RCA;
172 718 fig. 14 przedstawia wykres miana -SH jako funkcji stosunku molowego DTT do przeciwciała w preparacie w atmosferze obojętnej, dla przeciwciała zrelaksowanego.
Dla pełniejszego zrozumienia wynalazku zamieszczono poniższy szczegółowy opis.
Sposobem według wynalazku wytwarza się nowe koniugaty leków, złożone z ligandu zdolnego do kierowania do wybranej populacji komórek, leku i łącznika zawierającego wiązanie tioeterowe, który łączy ligand z lekiem. Lek jest związany z łącznikiem poprzez wiązanie acylohydrazonowe. W korzystnej postaci ligand jest związany bezpośrednio z łącznikiem poprzez wiązanie tioeterowe. Zwykle wiązanie to tworzy się w reakcji reaktywnej grupy sulfhydrylowej (-SH) w ligandzie lub w ugrupowaniu przedłużacza (na przykład ugrupowaniu otrzymanym przy zastosowaniu opisanej poniżej chemii SDPP lub iminotiolanu) z receptorem addycji Michaela.
Koniugaty leków znajdujązastosowanie w leczeniu chorób takich jak rak, infekcje wirusowe lub inne infekcje patogenne, zaburzenia autoimmunologiczne lub inne stany chorobowe.
Koniugaty zawierają co najmniej jedną cząsteczkę leku, połączoną przez łącznik z cząsteczką ligandu ukierunkowującego, któryjest zdolny do reakcji z pożądanąpopulacjąkomórek celowych. Cząsteczką ligandu może być białko immunoreaktywne, takie jak przeciwciało lub jego fragment, białko immunoniereaktywne lub ligand peptydowy, taki jak bombezyna, lub ligand wiążący, rozpoznający receptor komórkowy, taki jak lektyna lub cząsteczka sterydu.
Dla lepszego zrozumienia wynalazku leki i ligandy zostanąprzedyskutowane indywidualnie. Następnie zostaną objaśnione związki pośrednie, stosowane w sposobie według wynalazku.
Jest zrozumiałe dla specjalisty, że wynalazek niniejszy wymaga połączenia leku i ligandu za pomocą wiązania acylohydrazonowego poprzez łącznik zawierający addukt Michaela i ugrupowanie tioeterowe. Ograniczeniem wynalazku nie jest ani szczególny lek ani szczególny ligand. Łączniki według wynalazku mogą być stosowane z dowolnym lekiem dla dowolnego żądanego celu terapeutycznego, modyfikacji aktywności biologicznej lub profilaktycznej, a jednym ograniczeniem jest to, aby lek stosowany do wytworzenia koniugatu był zdolny do tworzenia wiązania hydrazyno wego. Dla wytworzenia hydrazonu, lek korzystnie powinien posiadać dostępną do reakcji grupę karbonylową, takąjak na przykład reaktywne ugrupowanie aldehydowe lub ketonowe (przedstawiane tu jako “[D-(C=O)]”), zdolne do tworzenia hydrazonu (to jest połączenia -C=N=NH-). Hydrazonowe połączenie leku jest przedstawiane tu jako “[D=]N-NH”. Ponadto korzystnie reakcja tej dostępnej dla reakcji grupy z łącznikiem me może zniszczyć końcowej aktywności terapeutycznej koniugatu, zarówno gdy aktywność ta jest wynikiem uwolnienia leku w pożądanym miej scu działaniajak i gdy za taka aktywność odpowiedzialny jest sam nienaruszony koniugat.
Dla specjalisty zrozumiałe jest, że dla tych leków, które nie posiadają dostępnej dla reakcji grupy karbonylowej może być otrzymana pochodna zawierająca taką grupę karbonylową przy zastosowaniu procedur znanych w stanie techniki. Należy wziąć pod uwagę, że koniugat otrzymany z takiego derywatyzowanego leku musi zatrzymywać aktywność terapeutyczną w miejscu aktywnym, zarówno gdy jest za nią odpowiedzialny nietknięty koniugat jak i w innych przypadkach. Alternatywnie, derywatyzowany lek lub na przykład prolek musi być uwalniany w takiej formie, że przy miejscu aktywnym obecna jest aktywna terapeutycznie forma leku.
Łącznik może być zgodnie z wynalazkiem stosowany w połączeniu z lekami z zasadniczo wszystkich klas terapeutycznych, w tym na przykład z lekami przeciwbakteryjnymi, przeciwwirusami, przeciwgrzybicznymi, przeciwmikoplazmowymi i podobnych. Tak skonstruowane koniugaty leków są skuteczne dla zwykłych celów, dla których są skuteczne odpowiednie leki, a ich efektywność jest lepsza dzięki właściwej dla ligandu zdolności transportowania leku do żądanej komórki, gdzie jest on szczególnie korzystny.
Następnie, ponieważ nowe koniugaty mogąbyć stosowane do modyfikowania danej odpowiedzi biologicznej, ugrupowanie leku nie jest zaprojektowane jako ograniczone do klasycznych chemicznych środków terapeutycznych. Ugrupowanie leku może być na przykład białkiem lub polipeptydem posiadającym żądaną aktywność biologiczną. Do takich białek należą na przykład toksyny takie jak abryna, rycyna A, egzotoksyna pseudomonas lub toksyna dyfterytu; białka takie jak czynnik martwiczy nowotworu, α-interferon, β-interferon, czynnik wzrostu nerwu, czyn6
172 718 nik wzrostu pochodzenia płytkowego, aktywator plazminogenu tkankowego lub modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie:, jak na przykład limfokiny, interleukina-1, (“IL-1“), interleukina-2 (“IL-2“), interleukina-6 (“IL-6“), czynnik stymulujący kolonizację granulocytów i makrofagów (“GM-CSF“), czynnik stymulujący kolonizację granulocytów (“G-CSF“) lub inne czynniki wzrostu.
Korzystnymi lekami do stosowania w niniejszym wynalazku są leki cytotoksyczne, szczególnie leki stosowane w terapii nowotworów. Do leków takich należą generalnie środki alkilujące, środki antyproliferacyjne, środki wiążące etubulinę i podobne. Do korzystnych klas środków cytotoksycznych należą na przykład rodzina leków antracyklinowych, leki winka, mitomycyny, bleomycyny, cytotoksyczne nukleozydy, rodzina leków pterydynowych, diyneny i podofilotoksyny. W szczególności do użytecznych członków tych klas należą na przykład adriamycyna, karminomycyna, daunorubicyna, aminopteryna, metotreksat, metopteryna, dichlorometotreksat, mitomycyna C, porfiromycyna, 5-fluorouracyl, 6-merkaptopuryna, arabinozyd cytozyny, podofilotoksyna lub pochodne podofilotoksyny takie jak etopozyd lub fosforan etopozydu, melfalan, winblastyna, winkrystyna, leurozydyna, windezyna, leurozyna i podobne. Jak wspomniano poprzednio, specjalista może dokonać modyfikacji chemicznych żądanego związku tak, aby reakcje tego związku były bardziej dogodne dla celów wytwarzania nowych.
Grupa środków cytotoksycznych szczególnie korzystnych do stosowania zgodnie z wynalazkiem jako leki obejmuje następujące leki: pochodne metotreksatu o wzorze 10, w którym R)2 oznacza grupę aminową lub hydroksylową; R7 oznacza wodór lub grupę metylową; R8 oznacza wodór, fluor, chlor, brom lub jod; R9 oznacza grupę hydroksylową lub ugrupowanie uzupełniające dla soli kwasu karboksylowego; pochodne mitomycyny o wzorze 11, w którym R10 oznacza wodór lub metyl; pochodne bleomycyny o wzorze 12, w którym R11 oznacza grupę hydroksylową, aminową, Cj^alkiloaminową, di(Cr3alkilo)aminową, C4-C6polimetylenoaminową, grupę o wzorze 13 lub grupę o wzorze 14; melfalanu o wzorze 15; 6-merkaptopurynę o wzorze 16; cytozynoarabizyd o wzorze 17; podofilotoksyny o wzorze 18, w którym R13 oznacza wodór lub metyl; Ru oznacza metyl lub tienyl lub ich sole fosforanowe; pochodne leków alkaloidów winka o wzorze 19, w którym R15 oznacza H, CH3 lub CHO; gdy Rn i Rw są wzięte pojedynczo to R18 oznacza H, ajeden z podstawników R16 i Rn oznacza etyl, zaś drugi oznacza H lub OH; gdy R17 i R18 są wzięte razem z atomami węgla, do których sąprzyłączone, tworząpierścień oksiranowy, w którym to przypadku R1fi oznacza etyl; Rw oznacza wodór, grupę (C1-C3 alkilo)-CO-, lub chloropodstawioną grupę (C-C3 alkilo)-CO-; difluoronukleozydy o wzorze 2θ, w którym R21 oznacza zasadę przedstawioną wzorem 21, wzorem 22, wzorem 23, wzorem 24 lub wzorem
25, w których to wzorach R22 oznacza wodór, metyl, brom, fluor, chlor lub jod; R23 oznacza -OH lub -Nity R24 oznacza wodór, brom, chlor lub jod; lub antybiotyki antracyklinowe o wzorze 26, w którym R1 oznacza -CH3, CH2OH, -CH2OCO(CH2)3CH3 lub -CH2OCOCH(OC2H5)2, R3 oznacza -OCH3, -OH lub -H, R4 oznacza -NH2, -NHCOCF3, 4-morfolinyl, 3-cyjano-4-morfolinyl, ^|3ij^<ei-ydynyl, 4-metoksy-1-piperydyny! benzyloaminę, dibenzyloaminę, cyjanometyloaminę lub 1-cyjano-2-metoksyetyloaminę, R5 oznacza -OH, -OTHP, lub -H; a R6 oznacza -OH lub -H, pod warunkiem, że gdy R5 oznacza -OH lub -OTHP, to R6 ma inne znaczenie niż -OH.
Najkorzystniejszymi lekami są opisane uprzednio antybiotyki antracyklinowe o wzorze
26. Dla specjalisty zrozumiałe jest, że ten wzór strukturalny obejmuje związki będące lekami lub pochodnymi leków, które uzyskały różne nazwy generyczne lub pospolite. Poniższa tabela 1 przedstawia pewną liczbę leków antracyklinowych, które są szczególnie korzystne do stosowania w sposobie według wynalazku oraz ich nazwy generyczne lub pospolite.
Ze związków przedstawionych w tabeli 1 najbardziej korzystnym lekiem jest adriamycyna. Adriamycyna (określana również jako “ADM“) jest antracykliną o wzorze 26, w której R1 oznacza -CH2OH, R2 oznacza -OCH3, R4 oznacza -NH2, R5 oznacza -OH a R6 oznacza -H.
172 718
Tabela 1
Związek Ri R3 R4 R5 R6
Daunorubicyna ch3 OCH3 nh2 OH H
Adriamycyna ch2oh och3 nh2 OH H
Detorubicyna CH2OCOH(OC2H5)2 och3 nh2 OH H
Karminomycyna ch3 OH nh2 OH H
Idarubicyna ch3 H nh2 OH H
Epirubicyna CH2OH och3 nh2 H OH
Esorubicyna ch2oh och3 nh2 H H
THP ch2oh och3 nh2 OTHP H
AD-32 CH2OCO(CH2)3CH3 och3 NHCOCF3 OH H
aDaunorubicyna jest alternatywną nazwą daunorubicyny Doksorubicyna jest alternatywną nazwą adriamycyny
Dla specjalisty zrozumiałe jest, że zakres określenia “ligand“ obejmuje dowolną cząsteczkę wiążącą się specyficznie albo reagującą z utworzeniem asocjatu lub kompleksu z receptorem lub innym ugrupowaniem receptorowym związanym z daną populacją komórek celowych. Tą cząsteczkąreagującąz komórką, do której reagent lekowy jest przyłączony z koniugacie poprzez łącznik może być dowolna cząsteczka, która wiąże się, kompleksuje lub reaguje z populacjąkomórek, którą staramy się zmodyfikować terapeutycznie lub w jakikolwiek inny sposób biologicznie i która posiada wolną reaktywną grupę sulfydtr/l<^o^£ą(-SH) lub może być zmodyfikowana w taki sposób, aby zawierać taką grupę sulfydrylową. Cząsteczka reagująca z komórką działa dostarczając terapeutycznie czynne ugrupowanie leku do szczególnej populacji komórek celowych, z którą ligand reaguje. Do takich cząsteczek należą, bez ograniczania się do nich, białka o dużym ciężarze cząsteczkowym (generalnie wyższym niż 10000 daltonów) takie jak na przykład przeciwciała, białka o niższym ciężarze cząsteczkowym (generalnie niższym niż 10000 daltonów), polipeptydy lub ligandy peptydowe i ligandy niepeptydowe.
Do immunoniereaktywnych białek, polipeptydów lub ligandów peptydowych, które mogą być stosowane w sposobie według wynalazku należą, bez ograniczania się do nich, transferyna, czynniki wzrostu naskórka (“EGF“), bombenzyna, peptyd uwalniający gastrynę, czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego, IL-2, IL-6, czynniki wzrostu nowotworu (“TGF“), takie jak TGF-α i TGF-β, czynnik wzrostu krowianki (“VGF“), insulina i insulino-podobne czynniki wzrostu I i II. Do ligandów niepeptydowych należą na przykład sterydy, węglowodany i lektyny.
Ligandami immunoreaktywnymi są immunoglobuliny rozpoznające przeciwciała (określane również jako “przeciwciała“) lub ich fragmenty rozpoznające przeciwciała. Szczególnie preferowane są immunoglobuliny, które są zdolne do rozpoznawania antygenów nowotworowych. Stosowane tu określenie “immunoglubulina“ odnosi się do dowolnej znanej klasy lub podklasy immunoglobulin, takiej jak IgG, IgA, IgM, IgD lub IgE. Preferowane są immunoglobuliny należące do klasy immunoglobulin IgG. Immunoglobulina może pochodzić od dowolnej istoty. Korzystnie jednakże immunoglobulina jest pochodzenia ludzkiego, mysiego, szczurzego lub króliczego. Ponadto immunoglobuliny mogą być poliklonalne lub monoklonalne, korzystnie monoklonalne.
Wynalazek obejmuje również zastosowanie fragmentów immunoglobulin rozpoznających antygen. Do takich fragmentów immunoglobulin należą na przykład fragmenty Fab’, F(ab’)2, F lub Fab, lub inne fragmenty immunoglobulin rozpoznające antygen. Takie fragmenty immunoglobulin mogą być wytwarzane na przykład przez trawienie enzymami proteolitycznymi, na przykład trawienie pepsyną lub papainą, przez reduktywne alkilowanie lub technikami rekom8
172 718 binacyjnymi. Materiały i metody wytwarzania takich fragmentów są dobrze znane specjalistom. Patrz generalnie Parham, J. Immunology, 131, 2895 (1983); Lamoyi i wsp., J. Immunological Methods, 56, 235 (1983); Parham, id., 53, 133 (1982); iMatthews i wsp., id., 50, 239 (1982).
Immunoglobulinamoże być “przeciwciałem chimerycznym© jako że termin ten jest uznawany w stanie techniki. Immunoglobulina może być również przeciwciałem “^funkcjonalnym41 lub “hybrydowym© tojest przeciwciałem mającymjedno ramię specyficzne dlajednego miejsca antygenowego, takiego jak antygen nowotworowy, podczas gdy drugie ramię rozpoznaje inny cel, na przykład hapten, który jest czynnikiem śmiertelnym dla niosącej antygen komórki nowotworowej lub który jest związany z takim czynnikiem. Alternatywnie przeciwciałem bifunkcjonalnym może być przeciwciało, w którym każde z ramion ma specyficzność w stosunku do różnych epitopów antygenu nowotworowego komórki, która ma być modyfikowana terapeutycznie lub biologicznie. W każdym z przypadków przeciwciała hybrydowe mająpodwójną specyficzność, korzystnie w stosunku do jednego lub więcej miejsc wiążących specyficznych dla haptenu z wyrobu albo jednego lub więcej miejsc wiążących dla antygenu celowego, na przykład antygenu nowotworowego, antygenu organizmu infekującego lub innego stanu chorobowego.
Biologicznie ^funkcjonalne przeciwciała są opisane na przykład w europejskim opisie patentowym nr 105360. Takie hybrydy lub przeciwciała bifunkcjonalne mogą być otrzymane, jak wspomniano, zarówno na drodze biologicznej, przy użyciu technik fuzji komórkowej, jak i na drodze chemicznej, zwłaszcza przy użyciu czynników sieciujących lub reagentów tworzących mostki disiarczkowe, i mogą składać się z całych przeciwciał i/lub ich fragmentów. Metody otrzymywania takich przeciwciał hybrydowych są ujawnione na przykład w zgłoszeniu PCT W083/03679 i europejskim zgłoszeniu patentowym nr 217577. Szczególnie korzystnymi przeciwciałami bifunkcjonalnymi sąprzeciwciała otrzymane na drodze biologicznej z “polidom“ lub “kwadrom© lub przeciwciała otrzymane syntetycznie przy zastosowaniu czynników sieciujących, takich jak eter bis(maleimido)metylowy (“BMME“) lub innych czynników sieciujących, znanych specjalistom.
Ponadto immunoglobulina może być przeciwciałem o pojedynczym łańcuchu (“SCA“). Takie przeciwciała mogą składać się z fragmentów pojedynczych łańcucha Fv (“SCFV“), w których domena zmienna lekka (“VL“) i domena zmienna ciężka (“VH“) są połączone mostkiem peptydowym lub wiązaniami disiarczkowymi. Immunoglobulina może również składać się z pojedynczych domen Vh (dAbs), które posiadają czynność antywiążącą. Patrz na przykład G. Winter i C. Mikstein, Naturę, 349, 295 (1991); R. Glockshuber i wsp., Biochemistry 29, 1362 (1990); i E. S. Ward i wsp., Naturę 341, 544 (1989). ,
Szczególnie korzystne do stosowania w niniejszym wynalazku sąmonoklonalne przeciwciała chimeryczne, zwłaszcza te przeciwciała chimeryczne, które wykazują specyficzność w stosunku do antygenów nowotworowych. Stosowane tu określenie “przeciwciało chimeryczne44 odnosi się do przeciwciała monoklonalnego, zwykle otrzymanego technikami rekombinacji DNA, posiadającego region zmienny, tojest region wiążący, z jednego źródła oraz co najmniej część regionu stałego, pochodzącego z różnych źródeł lub gatunków. Szczególnie korzystne w niektórych zastosowaniach wynalazku, zwłaszcza w terapii ludzi, sąprzeciwciała chimeryczne, posiadające mysi region zmienny i ludzki region stały, ponieważ takie przeciwciała łatwo się otrzymuje i mogą one być mniej immunogenne niż czysto mysie przeciwciała monoklonalne. Takie chimeryczne przeciwciała ludzkie/mysie są produktem ekspresji genów immunoglobuliny, zawierających segmenty DNA kodujące zmienne regiony immunoglobuliny mysiej i segmenty DNA kodujące stałe regiony immunoglobuliny ludzkiej. Innymi formami przeciwciał chimerycznych objętymi przez wynalazek są takie przeciwciała, w których zmodyfikowano lub zmieniono klasę lub podklasę przeciwciała oryginalnego. Takie “chimeryczne44 przeciwciała są również określane jako “przeciwciała z przesuniętą klasą“. Do metod wytwarzania takich przeciwciał należą konwencjonalne techniki rekombinacji DNA i transfekcji genów, obecnie bardzo
172 718 dobrze znane w stanie techniki. Patrz na przykład Morrison S. L. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851 (1884).
Określenie “przeciwciało chimeryczne11 obejmuje koncepcję “przeciwciała humanizowanego“, to jest takiego przeciwciała, w którym szkielet lub “regiony określające komplementarność“ (“CDR“) zostały zmodyfikowane tak, że zawierają CDR immunoglobuliny o innej specyficzności w porównaniu z immunoglobuliną macierzystą. W korzystnej postaci CDR mysi jest szczepiony na regionie szkieletowym przeciwciała ludzkiego w celu otrzymania “przeciwciała humanizowanego© Patrz na przykład L. Riechmann i wsp., Nature 332,323 (1988); M. S. Neuberger i wsp., Nature 314,268 (1985). Szczególnie korzystne CDR odpowiadającą CDR reprezentującym sekwencje rozpoczynające antygeny wymienione powyżej dla przeciwciał chimerycznych i bifirnkcjonalnych. Przeciwciała ze zmodyfikowanymi CDR opisane są w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 239400 (opublikowanym 30 września 1987).
Można otrzymać przeciwciało bifi.mkcjonalno-chimeryczne, które posiadałoby korzystne cechy niższej immunogeniczności przeciwciała chimerycznego lub humanizowanego, jak również elastyczność, zwłaszcza w działaniu terapeutycznym, opisanych powyżej przeciwciał bifunkcjonalnych. Takie przeciwciała bifunkcjonalno-chimeryczne mogą być zsyntetyzowane na przykład poprzez syntezę chemiczną przy użyciu czynników sieciujących i/lub metod rekombinacyjnych w rodzaju opisanych powyżej. Zakres wynalazku nie jest w żadnym wypadku ograniczony jakąkolwiek szczególną metodą wytwarzania przeciwciała, czy to bifunkcjonalnego, chimerycznego, bifunkcjonalno-chimerycznego, humanizowanego, lub też jego fragmentu rozpoznającego antygen lub jego pochodnej.
Ponadto zakres wynalazku obejmuje immunoglobuliny (określone powyżej) lub fragmenty immunoglobulin, z którymi skondensowane są aktywne białka, na przykład enzym rodzaju ujawnionego przez Neubergera i wsp., w zgłoszeniu PCT nr W086/01533.
Jak wspomniano, konstrukcje przeciwciał “bifunkcjonalnych“, “skondensowanych^, “chimerycznych (w tym humanizowanych) i “bifunkcjonalno-chimerycznych“ (w tym humanizowanych) obejmują konstrukcje zawierają fragmenty rozpoznające antygen. Takie fragmenty mogą być otrzymane poprzez tradycyjne enzymatyczne rozszczepienie całych przeciwciał bifunkcjonalnych, chimerycznych, humanizowanych lub chimeryczno-bifunkcjonalnych. Jeśli jednakże niezmienione przeciwciała nie są podatne na takie rozszczepienie ze względu na naturę konstrukcji przeciwciała, wspomniane konstrukcje mogą być otrzymane przy użyciu fragmentów immunoglobulin jako materiałów wyjściowych; lub jeśli stosuje się techniki rekombinacyjne, sekwencje DNA mogąbyć dopasowywane w celu zakodowania żądanego “fragmentu“, który po ekspresji może być łączony in vivo lub in vitro, środkami chemicznymi lub biologicznymi, w celu otrzymania końcowego fragmentu · niezmienionej immunoglobuliny. W tym kontekście zatem stosowane jest określenie “fragment©
Ponadto, jak wspomniano powyżej, immunoglobuliną (przeciwciało) lub jej fragment stosowane w niniejszym sposobie według wynalazku mogą być z natury poliklonalne lub monoklonalne. Jednakże korzystnymi immunoglobulinami są przeciwciała monoklonalne. Wytwarzanie takich przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych jest obecnie dobrze znane tym specjalistom, którzy sąw pełni zdolni do wytworzenia użytecznych immunoglobulin, mogących znaleźć zastosowanie w wynalazku. Patrz na przykład G. Kohler i C. Milstein, Nature 256, 495 (1975). Ponadto hybrydy i/lub przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez takie hybrydy, które są użyteczne w praktycznej realizacji wynalazku są powszechnie dostępne z takich źródeł jak American Type Culture Collection (“ATCC“) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 lub dostępne w handlu na przykład z firmy Boehringer-Mannheim Biochemicals, P.O Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250.
172 718
Szczególnie korzystnymi przeciwciałami monoklonalnymi do stosowania w mniejszym wynalazku są przeciwciała rozpoznające antygeny nowotworowe. Do takich przeciwciał należą, bez ograniczania się do nich, na przykład następujące przeciwciała:
Rozpoznawane miejsce antygenowe Przeciwciała monoklonalne Odnośniki
Nowotwory płuc KS1/4 534,F8; 604A9 N. M. Varki i wsp., Cancer Res. 44:681, 1984 F. Cuttitta i wsp., w: G. L. Wright (ed) Monoclonal Antibodies and Cancer, Marcel Dekker, Inc., NY. str. 161, 1984.
Rak płaskokomórkowy płuc G1, LuCa2, LuCa3, LuCa4 Kyoizumi et al., Cancer Res. 45:3274,1985
Rak drobnokomórkowy płuc TFS-2 Okabe et al., Cancer Res. 45:1930,1985
Rak okrężnicy 11.285.14 14.95.55 NS-3a-22„NS-10 NS-19-9„NS-33a NS-52a„17-1A G Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother , 19:1,1985 Z. Stemplewski i wsp., Cancer Res., 41: 2723, 1981
Rak zarodkowy MoAb 35 lub ZCE025 Acolla R. S. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), 77:563, 1980
Czerniak 9 2.27 T. F Bumol i R. A. Reisfeld, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79.1245,1982
p97 96,5 K. E. Hellstrom i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer, loc. cit. str. 31
Antygen T65 T101 Boehringer-Mannheim, P.O.Box 50816, Indianapolis, IN 46250
Ferrytyna Antyferryna R24 Boehringer-Mannheim, P.O. Box 50816, Indianapolis, IN 46250 W. G. Dippold i wsp., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 77:6114,1980
Nerwiak niedojrzały P1 153/3 MIN 1 UJ13A R. H. Kennet i F. Gilbert, Science, 203:1120, 1979 J. T. Kemshead w Monoclonal Antibodies and Cancer, loc. cit. str. 49 Goldman i wsp., Pediatrics, 105:252, 1984
Glejak BF7, GE2, CG 12 N. de Tribolet et al., w Monoclonal Antibodies and Cancer, loc. cit. str. 81
Gangliozyd L6 I. Hellstrom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83- 7059(1986); Patenty USA nr 4906562, udzielony 6 marca 1990 i nr 4935495, udzielony 19 czerwca 1990.
Chimeryczne L6 Zgłoszenie patentowe USA nr 07/923244, zgłoszone 27 października 1986, odpowiednik publikacji PCT W088/03145, opublikowanej 5 maja 1988.
Lewis Y BR64 Zgłoszenia patentowe USA nr 07/289635, zgłoszone 22 grudnia 1988 i nr 07/443696, zgłoszone 29 listopada 1989, odpowiednik europejskiego zgłoszenia patentowego nr 375562, opublikowanego 27 czerwca 1990.
Fukozylowany Lewis Y BR96, chimeryczne BR96 Zgłoszenie patentowe USA nr 07/374947, zgłoszone 30 czerwca 1989 i nr 07/544246, zgłoszone 26 lipca 1990, odpowiednik zgłoszenia PCT nr WO 91/00295, opublikowanego 10 stycznia 1991.
Rak sutka B6.2,B72.3 D. Colcher i wsp , w Monoclonal Antibodies and Cancer, loc. cit. str. 121.
172 718 cd. ze strony 10
Kostniakomięsak 791T/48, 791T/36 M. J. Embleton, ibid, str. 181
Białaczka CALL 2 antyidiotypowe C. T. Teng i wsp., Lancet, 101, 1982 R. A. Miller i wsp., N. Eng. J. Med., 306.517, 1982
Rak jajnika OC 125 R C. Bast i wsp., J. Clin. Invest., 68.1331, 1981.
Rak prostaty D83.21, P6.2 Turp-27 J. J. Starling i wsp., w Monoclonal Antibodies and Cancer, loc. cit., str. 253.
Rak nerek A6H, D5D P H. Lange i wsp., Surgery, 98.143,1985
W najbardziej korzystnej postaci koniugat zawierający ligand otrzymuje się z chimerycznego przeciwciała BR96, “ChiBR96“, ujawnionego w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/544246, które jest odpowiednikiem opublikowanego zgłoszenia PCT nr WO 91/00295, opublikowanego 10 stycznia 1991. ChiBR96 jest internalizującym chimerycznym przeciwciałem mysim/ludzkim i reaguje, jak wspomniano, z fukozylowanym antygenem Lewis Y, powstającym w wyniku ekspresji w ludzkich rakowych, takichjak komórki pochodzące z raka sutka, płuc, okrężnicy i jajnika. Hybryda odpowiedzialna za ekspresję chimerycznego BR96, zidentyfikowana jako ChiBR96 została złożona do depozytu na mocy Porozumienia Budapeszteńskiego 23 maja 1990 w American Type Culture Collection (“ATCC“), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. Próbki tej hybrydy sądostępne pod numerem akcesyjnym ATCC HB 10460. ChiBR96 jest otrzymany częściowo z macierzystego źródła BR96. Hybryda odpowiedzialna za ekspresję BR96 została oddana do depozytu 21 lutego 1989 w ATCC na mocy Porozumienia Budapeszteńskiego i jest dostępna pod numerem akcesyjnym HB 10036. Żądanąhybrydę namnaża się, a uzyskane przeciwciała izoluje z supematanta hodowli komórkowej stosując standartowe techniki, obecnie dobrze znane w stanie techniki. Patrz na przykład “Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications“, Hurell (ed.) (CRC Press, 1982).
W drugiej wysoce korzystnej postaci wynalazku immunokoniugat otrzymuj e się z mysiego przeciwciała monoklonalnego BR64, ujawnionego w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/289635 i zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/443696, którego odpowiednikiem jest europejskie zgłoszenie patentowe nr 375562. Jak wspomniano powyżej, przeciwciało to jest również internalizujące i reaguje z antygenem Lewis Y, powstającym w wyniku ekspresji w komórkach rakowych otrzymanych z ludzkiej okrężnicy, sutka, jajnika i płuc. Hybryda odpowiedzialna za ekspresję przeciwciała BR64, zidentyfikowana jako BR64 została zdeponowana 3 listopada 1988 na mocy Porozumienia Budapeszteńskiego w ATCC i jest dostępna pod numerem akcesyjnym HB 9895. Hybryda jest namnażana, a żądane przeciwciało izolowane przy użyciu standartowych technik dobrze znanych w stanie techniki, takich jak opisane powyżej.
W trzeciej wysoce korzystnej postaci wynalazku immunokoniugat według wynalazku jest otrzymywany z przeciwciała mysiego L6, ujawnionego w patentach USA nr 4906562, udzielonym 6 marca 1990 i nr 4935495, udzielonym 19 czerwca 1990. L6 jest przeciwciałem nieinternalizującym, czynnym przeciwko antygenowi gangliozydowemu, uzyskiwanemu w wyniku ekspresji w ludzkich komórkach rakowych otrzymanych z ludzkiego raka niedrobnokomórkowego płuc, raka sutka, okrężnicy lub jajnika. Hybryda odpowiedzialna za ekspresję L6 i zidentyfikowana jako L6 została zdeponowana na mocy Porozumienia Budapeszteńskiego 6 grudnia 1984 w ATCC i jest dostępna pod numerem akcesyjnym 8677. Hybryda jest namnażana i żądane przeciwciało izolowane przy użyciu standartowych technik, na które powołano się powyżej. Cimeryczna postać przeciwciała L6 jest w razie potrzeby opisana w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/923244, będącym odpowiednikiem opublikowanego zgłoszenia PCT o numerze WO 88/03145.
Zatem znaczenie stosowanych tu określeń “immunoglobulina“ i “przeciwciało“ obejmuje wszystkie wspomniane powyżej formy lub konstrukcje immunoglobulin/przeciwciał.
172 718
W sposobie według wynalazku jako związki pośrednie zawierające receptor addycji Michaela i acylohydrazon pochodne leku o wzorze 2, w którym D jest ugrupowaniem leku, n jest liczbą całkowitą od 1do 10 a R jest receptorem addycji Michaela, a ich znaczenia są zdefiniowane powyżej.
Szczególnie korzystnym związkiem pośrednim objętym wzorem 2a, mającym zastosowanie do wytwarzania koniugatu według wynalazku jest związek zdefiniowany wzorem 2b, w którym R, oznacza -CH3, -CH2OH, -CH2OCO(CH2)3CH3 lub -CH2OCOCH(OC2H5)2; R3 oznacza -OCH3, -OH lub wodór; R oznacza -NH2, -NHCOCF3, 4-morfolinyl, 3-cyjano-4-morfolinyl, 1-piperydynyl, 4-metoksy-1-piperydynyl, benzyloaminę, dibenzyloaminę, cyjanometyloaminę lub 1-cyjano-2-metoksyetyloaminę. R5 oznacza -OH, -OTHP lub wodór; R6 oznacza -OH lub wodór, pod warunkiem że gdy R5 oznacza -OH lub -OTHP to R6 ma inne znaczenie niż -OH; n jest liczbą całkowitą od 1 do 10; a R jest ugrupowaniem receptora addycji Michaela.
Najbardziej korzystny związek pośredni według wynalazkujest zdefiniowany wzorem 2c, w którym Rb R3, R4, R5 i R6 mają znaczenia takie jak zdefiniowane dla wzoru 2b.
Jako związek pośredni stosowany jest również w wynalazku ligand ukierunkowujący, zawierający swobodnie reagującą grupę sulfhydrylową. Grupa sulfhydrylowa może być zawarta w natywnym ligandzie ukierunkowującym lub może być otrzymywana bezpośrednio z ligandu lub z derywatyzowanej pochodnej ligandu. W korzystnym sposobie wytwarzania koniugatów według wynalazku grupa sulfhydrylową w ligandzie lub zmodyfikowany ligand reaguje bezpośrednio z receptorem addycji Michaela w związku pośrednim o wzorze 2a z utworzeniem koniugatu końcowego. Przy zastosowaniu tego sposobu do każdego ligandu można na ogół przyłączyć od około jednej do około dziesięciu cząsteczek leku. Zatem we wzorze 1 q może być równe od około 1 do około 10.
Po utworzeniu koniugatu część określana jako receptor addycji Michaela staje się adduktem Michaela. Zatemjeśli na przykład ugrupowanie receptora Michaela w związku o wzorze 2a lub 2b jest ugrupowaniem maleimidowym, to odpowiadająca część końcowego koniugatu o wzorze 1 określana jako addukt Michaela będzie ugrupowaniem sukcynoimidowym. Zatem określenie “addukt Michaela“ odnosi się do ugrupowania, które otrzymuje się, gdy receptor addycji Michaela, szczegółowo zdefiniowany poniżej, ulega reakcji addycji Michaela.
Sposób wytwarzania związku o wzorze 1 zdefiniowanego powyżej, polegający na tym, że zdefiniowany powyżej związek o wzorze 2a poddaje się reakcji z ligandem, który zawiera reaktywną grupę sulfhydrylową lub jest zmodyfikowany albo derywatyzowany tak, że zawiera reaktywną grupę sulfhydrową i ewentualnie otrzymany produkt wyodrębnia się. Jest to korzystny sposób wytwarzania związków o wzorze 1. Sposób wytwarzania związku o wzorze 1, polega na tym, że związek o wzorze 2a poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 3 i ewentualnie wyodrębnia się otrzymany produkt.
Jest zrozumiałe dla specjalisty, że w sposobie wytwarzania według wynalazku konieczne może być zabezpieczenie lub zablokowanie różnych reaktywnych grup funkcyjnych w związkach wyjściowych i związkach pośrednich gdy reakcja pożądana jest prowadzona na innych częściach cząsteczki. Po zakończeniu pożądanych reakcji lub w każdym dowolnym czasie takie grupy zabezpieczające zwykle usuwa się na przykład przez hydrolizę lub hydrogenolizę. Takie etapy zabezpieczania i odbezpieczania są powszechnie stosowane w chemii organicznej. Wiadomości o grupach zabezpieczających, które mogą być użyteczne w wytwarzaniu nowych związków sązamieszczone w książkach “Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed., Plenum Press, N. Y., N. Y., (1973); i “Protective Groups in Organie Synthesis“, Greene, ed., John Wiley & Sons, New York, New York (1981).
Przykładowo do użytecznych grup zabezpieczających grupy aminowe należą grupy alkanoilowe C1-C1 takie jak formylowa, acetylowa, dichloroacetylowa, propionylowa, heksanoilowa, 3,3-dietyloheksanoilowa, γ-chlorobutyrylowa i podobne; grupy alkoksykarbonylowe CrC10 i aryloksykarbonylowe Ck-C^, takie jak tert-butoksykarbonylowa, benzyloksykarbonylowa, alliloksykarbonylowa, 4-nitrobenzyloksykarbonylowa i cynnamoiloksykarbonylowa; chlorowco-(CrC1o)-alkoksykarbonylowe, takie jak 2,2,2-trichloroetoksykarbonylowa; i grupy aryloal172 718 kilowe i alkenylowe CrCn, takie jak benzylowa, fenetylowa, allilowa, tritylowa i podobne. Do innych grup powszechnie stosowanychjako grupy zabezpieczające grupy aminowe należągrupy o postaci enamin, otrzymanych z β-ketoestrów, takich jak acetooctan metylu lub etylu.
Do użytecznych grup zabezpieczających grupy karboksylowe należą na przykład grupy CrC10alkilowe, takie jak metylowa, tert-butylowa, decylowa; chlorowco-C1-CK)alkilowe, takie jak 2,2,2-trichloroetylowa i 2-jodoetylowa; C5-C|5aryloalkilowe takie jak benzylowa, 4-metoksybenzylowa, 4-nitrobenzylowa, trifenylometylowa, difenylometylowa; ©C^lkanoiloksymetylowe takie jak acetoksymetylowa, propionoksymetylowa i podobne; oraz grupy takie jak fenacylowa, 4-chlorowcofenacylowa, allilowa, dimetyloallilowa, tri(CrC3-alkilo)sililowe takie jak trimetylosililowa, β-p-toluenosulfonyloetylowa, β-p-nitrofenylotioetylowa, 2,4,6-trimetylobenzylowa, β-metylotioetylowa, ftalimidometylowa, 2,4-di-nitrofenylosulfenylowa, 2-nitrobenzhydrylowa i grupy pokrewne.
Podobnie do użytecznych grup zabezpieczających grupy hydroksylowe należą na przykład grupa formylowa, grupa chloroacetylowa, grupa benzylowa, grupa benzhydrylowa, grupa tritylowa, grupa 4-nitrobenzylowa, grupa trimetylosililowa, grupa fenacylowa, grupa tert-butylowa, grupa metoksymetylowa, grupa tetrahydropiranylowa i podobne.
Generalnie pośredniąpochodnąhydrazonowąleku o wzorze 2a, 2b lub 2c, zawierającą receptor addycji Michaela można otrzymać, zależnie od ugrupowania receptora addycji Michaela, przez reakcję leku (lub leku derywatyzowanego) z hydrazydem zawierającym receptor addycji Michaela sposobem ogólnie przedstawionym na schemacie 1 (metoda A). Jak wspomniano poniżej, metoda A przedstawiona na schemacie 1 jest korzystna gdy receptor addycji Michaela jest ugrupowaniem maleimidowym.
Alternatywnie, związek o wzorze 2a może być otrzymany przez reakcję leku z hydrazydem z utworzeniem pośredniej hydrazonowej pochodnej leku, a następnie reakcję tego związku z ugrupowaniem zawierającym receptor addycji Michaela zgodnie z ogólnym sposobem przedstawionym na schemacie 2 (metoda B).
W metodach A i B, przedstawionych na schematach 1 i 2 D, n i R mają znaczenia podane poprzednio. W metodzie B przedstawionej na schemacie 2, L oznacza grupę odszczepialną, taką jak na przykład chlorowiec, grupa mezylanowa lub tozylanowa, zdolną do ulegania wymianie nukleofilowej, natomiast C oznacza grupę nadającąreceptorowi addycji Michaela R właściwości dobranego reagenta nukleofilowego. Do szczególnie użytecznych grup przedstawionych przez C należą przykładowo jony metali alkalicznych, takie jak Na+, K+ lub Li+.
Receptor addycji Michaela oznacza ugrupowanie, które jest zdolne do reagowania z reagentem nukleofilowym tak, aby zachodziła reakcja addycji nukleofilowej, charakterystyczna dla reakcji addycji Michaela. Jak wspomniano po zajściu addycji nukleofilowej ugrupowanie receptora addycji Michaela jest określane jako “addukt Michaela“.
Do receptorów Michaela stosowanych w sposobie przedstawionym na schemacie 1 należą na przykład kwasy cęieetylenowe lub α,β-tiokwasy, takie jak kwasy zawierające ugrupowania -C=C-COOH, -C=C-C(O)SH lub -C=C-C(S)OH; estry lub tioestry α,β-etylenowe, w których ugrupowanie alkilowe jest inne niż metyl lub etyl, na przykład zawierające ugrupowanie -C=C-COOR, -C=C-C(S)OR, -C=C-C(S)R lub -C=C-C(O)-SR, w których R oznacza grupę tworzącą ester inną niż metyl lub etyl; amidy, imidy, tioamidy i tioamidy α,β-etylenowe (cykliczne albo acykliczne), na przykład zawierające takie ugrupowania jak -C=C-CONR2, -C=C-CONHCO-, -O C-CSNR2, -C=C-CSNHO- lub -C=C-CSNHCS-, albo cykliczne albo acykliczne, w których -CONR2 lub -CSNR2 oznacza amid pierwszorzędowy, drugorzędowy lub trzeciorzędowy; kwasy lub tiokwasy α,β-acetylenowe, na przykład zawierające takie ugrupowania jak -CcC-COOH, -C=C(S)OH, -Cs=C-(S)SH lub -CcC-C(O)-SH; estry α,β-acetylenowe, na przykład zawierające ugrupowanie takie jak -C=C-COOR, -C-sC-C(S)OR, -C=C(S)SR lub -C=C-C(O)-SR, gdzie R oznacza grupę tworzącą ester inną niż metyl lub etyl; nitryle α,β-etylenowe, na przykład zawierające ugrupowanie takie jak -CC-CN; pochodne cyklopropanu reaktywne w addycji Michaela, na przykład 1-cyjano-1-etoksykarbonylocyklopropan o wzorze 4;
172 718 bromek winylodimetylosulfoniowy, na przykład zawierający ugrupowanie -C=C-C+(Me)2Br’; sulfon ο,β-etyłenowy, na przykład zawierający ugrupowanie o wzorze 5; nitrozwiązki α, β-etylenowe, na przykład zawierające ugrupowanie -C=C-NO2; fosfoniowe związki α,β-etylenowe, na przykład zawierające grupę o wzorze 6; związek zawierający grupę taką jak C-C-CON, którą można znaleźć na przykład w heterocyklach aromatycznych, takich jak 2- lub 4-winylopirydyna; lub związek zawierający ugrupowanie α,β-nienasyconego jonu tionowego, takie jak ugrupowanie o wzorze 7.
Do receptorów addycji Michaela stosowanych w metodzie B przedstawionej na schemacie 2 należą aldehydy α,β-etylenowe, na przykład związki zawierające ugrupowanie -C-C-CHO; ketony α,β-etylenowe, na przykład związki zawierające ugrupowanie o wzorze 8; estry lub tioestry α,β-etylenowe, takie jak związki zawierające ugrupowania -C-C-COOR, -C-C-C(S)OR, -C-C-C(S)SR lub -C=C-C(O)-SR, w których R oznacza ugrupowanie tworzące ester, którym j est metyl lub etyl, na przykład ugrupowanie o wzorze 9 aldehydy lub ketony α,β-acetylenowe, na przykład związki zawierające ugrupowanie -OC-CHO lub -C^C-CO-; estry lub tioestry α,β-acetylenowe, które jako ugrupowanie alkilowe posiadająmetyl lub etyl, na przykład związki zawierające grupę -CsC-COOR, -C^C-C(S)OR, -COC(0)SR lub -CsC-CSSR, w których R oznacza ugrupowanie tworzące ester, którym jest metyl lub etyl.
Specjalista może znać inne receptory Michaela, które mogą być stosowane w wynalazku. Ogólne omówienie reakcji addycji Michaela zamieszczone jest w książkach E. D. Bergman, D. Ginsberg i R. Pappo, Org. React. 10,179-555 (1959); oraz do D. A. Oare i C. H. Heathcock, Topics in Stereochemistry, tom. 20, wyd., E. L. Eliel i S. H. Wilen, John Wiley and Sons, Inc. (1991) oraz w pozycjach literaturowych tam cytowanych.
Dokładne warunki reakcji stosowane do wytworzenia związków pośrednich o wzorach 2a, 2b i 2c zależą od rodzaju leku i receptora Michaela zastosowanych do reakcji. Najbardziej korzystnym związkiem pośrednim według wynalazku jest związek przedstawiony powyżej wzorem 2c, w którym ugrupowaniem leku jest lek antracyklinowy, a receptorem addycji Michaela jest grupa maleimidowa. Jak wspomniano powyżej, w tej reakcji stosuje się opisaną powyżej metodę A, przedstawioną na schemacie 1. Po reakcji z ligandem (holowanym, modyfikowanym lub innym) maleimidowy receptor addycji Michaela staje się grupąsukcynoimidową(“addukt Michaela“) w końcowym koniugacie.
Ligandy zawierające grupy sulfhydrylowe występują naturalnie (to jest ligand nie jest modyfikowany) lub mogą być wytwarzane na przykład przez (a) tiolowanie ligandu przez reakcję z reagentem tiolującym, takim jak SMCC lub N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydylotio)propionian (“SPDP“) a następnie redukcję produktu; (b) tiolowanie natywnego ligandu przez reakcję z iminotiolanem (“IMT“); (c) addycję reszty aminokwasowej zawierającej grupę sulfhydrylową, na przykład reszty cysteinowej do ligandu, na przykład białka, peptydu lub polipeptydu nie posiadającego reaktywnego i dostępnego ugrupowania sulfhydrylowego; lub (d) redukcję wiązania disiarczkowego w natywnej cząsteczce przy użyciu stosowanego do takich celów środka redukującego, na przykład ditiotreitolu (“DTT“). Sposób (d) jest najbardziej korzystnym sposobem wytwarzania grup sulfhydrylowych w cząsteczkach przeciwciał stosowanych w koniugatach według wynalazku.
Jeśli do wytwarzania koniugatu według wynalazku stosuje się reagent holujący, taki jak SDPP lub iminotiolan, w koniugacie o wzorze 1 zostanie wprowadzona krótka reszta “przedłużacza“ między ugrupowaniem receptora addycji Michaela a ligandem. W takim przypadku w związku o wzorze 1 z będzie równe 1. W sytuacji, w której stosuje się bezpośrednio wolnągrupę sulfhydrylową w ligandzie, na przykład poprzez zastosowanie ligandu zredukowanego za pomocą DTT (w szczególności przeciwciała “zrelaksowanego otrzymanego z zastosowaniem na przykład DTT) lub gdy w część ligandową cząsteczki wprowadzona jest reaktywna reszta, na przykład cysteina, z we wzorze 1 będzie równe 0, a między ligandem wiążącym a częścią adduktu Michaela w cząsteczce istnieć będzie bezpośrednie wiązanie tioeterowe. W celu utworzenia koniugatu ligand holowany lub ligand mający wolną, reaktywną grupę sulfhydrylową poddaje się
172 718 reakcji z hydrazonem o wzorze 2a zawierającym receptor addycji Michaela. Na ogół warunki reakcji powinny być dobrane z uwzględnieniem stabilności ligandu, leku oraz żądanej liczby ugrupowań leku, które mają być przyłączone do ligandu. Średnia liczba cząsteczek leku połączonych z ligandem może być zmieniana na przez (1) modyfikowanie ilości pośrednich związków lek-hydrazon o wzorze 2a w stosunku do liczby reaktywnych grup sulfhydrylowych ugrupowania ligandu w immunokoniugacie; lub (2) (a) modyfikowanie liczby reaktywnych grup sulfhydrylowych w ligandzie przez na przykład jedynie częściowe zredukowanie ligandu (w przypadku białka, peptydu lub polipeptydu), (b) przez włączenie ograniczonej liczby ugrupowań na przykład cysteiny do białka, peptydu lub polipeptydu, lub (c) przez ograniczenie stopnia holowania przez użycie mniej szych niż maksymalne ilości czynników tioluj ących, na przykład SDPP lub iminotiolanu. Chociaż miano -SH może się zmieniać, korzystnym poziomem wolnych grup sulfhydrylowych, zwłaszcza dla przeciwciała zrelaksowanego, jest maksimum które może być uzyskane przy użyciu wchodzących w grę szczególnych reagentów. Stopień zmienności miana -SH w sposobie z wykorzystaniem przeciwciała zrelaksowanego jest łatwo kontrolowany. Na przykład fig. 14 przedstawia wpływ miana -SH dla przeciwciał BR64 i chimerycznego BR96 zależnie od stosunku molowego DTT do ligandu, w 37°C dla reakcji trwającej 1,5 h. Różne klasy lub podklasy immunoglobulin mogą mieć różne liczby mostków disiarczkowych podatnych na redukcję takimi reagentami jak DTT. Zatem następnym względem branym pod uwagę przy oznaczaniu żądanego poziomu koniugacji przeciwciała lub fragmentu przeciwciała jest liczba grup disiarczkowych dostępnych dla redukcji do wolnych grup -SH. Generalnie jednakże korzystny koniugat o wzorze 1 ma średnio w danej reakcji od około 1 do około 10 cząsteczek leku na cząsteczkę ligandu. Szczególnie korzystnyjest średni stosunek molowy leku do ligandu (“MR“) równy od około 4 do około 8.
Po zakończeniu reakcji koniugat może być wyodrębniany i oczyszczony przy użyciu powszechnie znanych metod dializy, metod chromatograficznych i/lub filtracyjnych. Roztwór końcowy, zawierający koniugat na życzenie może być liofilizowany w celu uzyskania koniugatu w suchej, trwałej postaci, która może być bezpiecznie przechowywania i transportowana. Produkt liofilizowany może być przed podaniem rozpuszczany w jałowej wodzie lub innym odpowiednim rozcieńczalniku. Alternatywnie końcowy produkt może być zamrażany, na przykład w ciekłym azocie, a przed podaniem rozmrażany i doprowadzany do temperatury pokojowej.
W pierwszej korzystnej postaci wynalazku hydrazon antracyklinowy o wzorze 2a wytwarza się przez reakcję antracykliny z hydrazynem maieimido-(Cl-Cl0)-aikiiowym lub jego solą. Reakcja ta jest przedstawiona w opisanej wcześniej metodzie A ze schematu 1. Reakcję generalnie prowadzi się w dwóch etapach. W etapie pierwszym wytwarza się hydrazyd maleimido-(CrC10)-alkilowy lub jego sól. Po oczyszczeniu, na przykład przez chromatografię i/lub krystalizację, wolnązasadę hydrazydu lub jego sól poddaje się reakcji z żądaną antracykliną lub solą antracykliny. Po zatężeniu roztworu poreakcyjnego hydrazonowy produkt reakcji o wzorze 2a zawierający maleimid zbiera się i ewentualnie oczyszcza za pomocą standartowych technik oczyszczania.
Następnie hydrazon o wzorze 2a poddaje się reakcji z przeciwciałem zawierającym grupę sulfhydrylową w sposób wcześniej opisany. Jeśli przeciwciało jest tiolowane, na przykład przy użyciu N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydyloditio)propionianu (“SDPP“), reakcję tiolowania generalnie przeprowadza się w dwóch etapach: (1) reakcja wolnej grupy aminowej przeciwciała z SDPP; i (2) redukcja disiarczku SDPP za pomocą DTT z otrzymaniem wolnej grupy -SH. W korzystnej procedurze w etapie (1) reakcji tiolowania stosunek molowy SDPP/przeciwciało zawarty jest w zakresie między około 7,5:1 do około 60:1, zależnie od liczby żądanych grup sulfhydrylowych, przy czym korzystny jest zakres od około 7,5 :1 do około 30:1, zwłaszcza dla BR64, a korzystnie około 20:1 dla BR96. Reakcję prowadzi się w,temperaturze między około 0°C a około 50°C, przy czym najbardziej korzystna jest temperatura - około 30°C. Reakcję można prowadzić w zakresie pH między około 6 a około 8, a najbardziej korzystnie, pH wynosi około 7,4. Redukcję w etapie (2) przy użyciu korzystnie DTT prowadzi się stosując stosunek molowy DTT/sDpP między około 2,5:1 do około 10:1. Najbardziej korzystnie stosunek molowy
172 718
DTT/SDPP wynosi około 5:1, a ilość moli SDPP jest taka, jaką wprowadzono w etapie (1) reakcji. Reakcję generalnie prowadzi się w temperaturze od około 0°C do około 40°C, korzystnie 0°C i zwykle jest ona zakończona po około 20 minutach. Po dializie i zatężeniu roztworu tiolowanego ligandu (w najbardziej korzystnej postaci przeciwciała) oznacza się stężenie molowe grup sulfhydrylowych w ligandzie i tiolowany ligand poddaje się reakcji z pochodną hydrazonową o wzorze 2a w żądanym stosunku molowym względem ilości reaktywnych grup sulfhydrylowych w ligandzie. Korzystnie stosunek ten wynosi co najmniej około 1:1. Reakcj ę tę generalnie prowadzi się w· temperaturze od około 0°C do około 25°C, korzystnie około 4°C. Uzyskany koniugat może być następnie oczyszczony za pomocą standartowych metod. Ten schemat reakcji jest przedstawiony na fig. 1a i 1b.
W drugiej· korzystnej postaci wytwarza się hydrazon o wzorze 2a w sposób opisany powyżej. Następnie hydrazon poddaje się reakcji z przeciwciałem uprzednio tiolowanym iminotiolanem (“IMT“), jak przedstawiono na fig. 1c. Tiolowanie ligandu (korzystnie przeciwciała) przy użyciu IMTjest na ogółjednym etapem reakcji. Stosunek IMT/przeciwciało może zawierać się w zakresie od około 30:1 do około 80:1, korzystnie około 50:1. Reakcję prowadzi się przez około 30 minut do około 2 godzin, korzystnie około 30 minut, przy pH równym od około 7 do około 9,5, korzystnie przy pH około 9, w temperaturze około 20°C do około 40°C, korzystnie około 30°C. Następnie produkt reakcji poddaje się reakcji z hydrazonem o wzorze 2a w temperaturze około 0°C do około 25°C, korzystnie około 4°C i przy pH równym około 7 do około 9,5, korzystnie około 7,4. Następnie koniugat oczyszcza się, stosując znane metody, na przykład dializę, filtrację lub chromatografię.
W trzeciej szczególnie korzystnej postaci wytwarza się w sposób opisany powyżej pośredni hydrazon o wzorze 2a. Następnie hydrazon poddaje się reakcji z ligandem, najbardziej korzystnie z przeciwciałem, w którym co najmniej jedną grupę disiarczkową zredukowano z utworzeniem co najmniej jednej grupy sulfhydrylowej. Szczególnie korzystnym ligandem jest “zrelaksowane przeciwciało“ opisane powyżej. Korzystnym środkiem redukującym do wytwarzania wolnej grupy sulfhydrylowej jest DTt, jakkolwiek zrozumiałe jest dla specjalistów, że do tego celu· mogą być odpowiednie inne środki redukujące.
“Przeciwciało zrelaksowane“ jest przeciwciałem, w którym zredukowano jeden lub więcej mostków disiarczkowych, korzystnie trzy lub więcej. Najbardziej korzystnie przeciwciałem zrelaksowanym jest przeciwciało, w którym zredukowano co najmniej cztery mostki disiarczkowe. W korzystnym sposobie wytwarzania przeciwciała zrelaksowanego (tojest zredukowanego) redukcję, korzystnie przy użyciu DTT, oraz oczyszczanie produktu reakcji prowadzi się w nieobecności tlenu, w atmosferze obojętnej, na przykład pod azotem lub argonem. Sposób ten, opisany szczegółowo poniżej, umożliwia ostrożną regulację stopnia zredukowania. Zatem sposób ten pozwala specjaliście na odtworzenie w dowolnym czasie żądanego stopnia zredukowania ligandu, a w związku z tym liczby wolnych grup -SH, dostępnych dla wytwarzania koniugatu według wynalazku.
W alternatywnej procedurze reakcję prowadzi się w warunkach otoczenia, jednakże stosuje się wystarczająco dużą ilość środka redukującego, korzystnie DTT, dla zrównoważenia ewentualnego ponownego utlenienia zredukowanych wiązań disiarczkowych, które może przebiegać. W każdym przypadku oczyszczanie produktu prowadzi się jak najszybciej po zakończeniu reakcji, a najbardziej korzystnie w atmosferze obojętnej, takiej jak na przykład płaszcz argonowy lub azotowy. Korzystnym sposobem wytwarzania ligandu zawierającego wolne grupy sulfhydrylowe jestjednakże sposób, w którym ze środowiska reakcji usuwa się tlen atmosferyczny. Przeciwciało wytworzone przy użyciu któregokolwiek ze sposobów określane jest jako przeciwciało “zrelaksowane© Produkt, niezależnie od sposobu wytworzenia, powinien być użyty do następnego etapu reakcji jak najszybciej lub przechowywany w warunkach pozwalających na uniknięcie ekspozycji na tlen, korzystnie w atmosferze obojętnej.
W sposobie, w którym tlen usuwa się ze środowiska reakcji (tojest reakcję prowadzi się w atmosferze obojętnej) ligand inkubuje się przez okres od około 30 minut do około 4 godzin, korzystnie przez 3 godziny, z nadmiarem molowym DTT. Stosunki molowe DTT/ligand mogą być
172 718 zawarte w zakresie między około 1:1 do około 20:1, korzystnie około 1:1 do około 10:1, najbardziej korzystnie około 7:1 do około 10:1, zależnie od żądanej liczby grup sulfhydrylowych. Przy prowadzeniu redukcji w obecności tlenu stosunek molowy DTT do ligandu zawarty jest w zakresie od około 50:1 do około 400:1, korzystnie od około 200:1 do około 300:1. W tym przypadku reakcję prowadzi się przez około 1 do około 4 godzin, korzystnie przez około 1,5 godziny, w temperaturze między około 20°C a około 50°C, korzystnie w temperaturze około 37°C. Reakcję prowadzi się przy pH między około 7 a 7,5. Następnie produkt oczyszcza się stosując standartowe techniki oczyszczania, takie jak dializa, filtracja i/lub chromatografia. Korzystną metodą oczyszczania jest diafiltracja. W celu zapobieżenia ponownemu utlenianiu grup -SH podczas oczyszczania i przechowywania produkt korzystnie utrzymuje się w atmosferze obojętnej, aby zapobiec eksponowaniu na działanie1 tlenu.
Różne ligandy, w szczególności przeciwciała, może charakteryzować różny stopień podatności na redukcję i/lub ponowne utlenienie. W konsekwencji może zaistnieć potrzeba modyfikacji opisanych powyżej warunków redukcji w celu uzyskania danego zredukowanego ligandu, takiego jak ligand opisany powyżej. Ponadto dla specjalisty ewidentne są alternatywne środki wytwarzania zredukowanego przeciwciała, użytecznego w sposobie wytwarzania koniugatu. Zatem koniugat o wzorze 1 jest objęty niniejszym wynalazkiem niezależnie od sposobu wytworzenia.
Jak wspomniano wcześniej, w celu wytworzenia koniugatu o wzorze 1 zredukowane przeciwciało poddaje się reakcji z hydrazonowym związkiem pośrednim o wzorze 2c. Korzystnie reakcję prowadzi się w atmosferze obojętnej w temperaturze od około 0°C do około 10°C, korzystnie w temperaturze około 4°C i przy pH od około 6 do około 8, korzystnie około 7,4. Immunokoniugat oczyszcza się stosując standartowe techniki takie jak dializa, filtracja lub chromatografia.
W następnej postaci wynalazku antracyklinę o wzorze 10 łączy się z ligandem, do którego przyłączono ugrupowanie zawierające wolną grupę sulfhydrylową. W jednej z takich postaci ligand nie jest przeciwciałem, jak na przykład bombezyna. Grupa sulfhydrylową może być na przykład częścią reszty cysteinowej, przyłączonej do natywnej cząsteczki bombezyny. Antracyklinę przyłącza się poprzez ugrupowanie hydrazonowe do ugrupowania zawierającego receptor addycji Michaela, które następnie reaguje ze zmodyfikowaną bombezyną, tworząc koniugat o wzorze 1. Następnie produkt oczyszcza się za pomocą standartowych technik jak dializa, wirowanie lub chromatografia.
Nowe koniugaty znajdują zastosowanie w metodzie leczenia choroby lub modyfikacji funkcji biologicznej, przy czym metoda ta polega na podawaniu zwierzęciu ciepłokrwistemu potrzebującemu tego koniugatu o wzorze 1 w ilości terapeutycznie skutecznej lub modyfikującej funkcję biologiczną. Rodzaj zastosowanego koniugatu zależeć będzie od leczonego stanu chorobowego lub rodzaju systemu biologicznego, który ma być modyfikowany. W szczególności specjalista będzie umiał dobrać szczególny ligand oraz lek do wytworzenia koniugatu o wzorze 1, posiadającego specyficzność leczenia choroby oraz zdolność modyfikowania żądanej funkcji biologicznej.
Nowe koniugaty nadają się szczególnie do leczenia choroby nowotworowej, polegającej na podawaniu potrzebującemu tego leczenia zwierzęciu ciepłokrwistemu cytotoksycznego koniugatu o wzorze 1 w ilości terapeutycznie skutecznej. Szczególnie korzystnym koniugatem do tego celujest immunokoniugat o wzorze 1 a, w którym n, pi, q, z, X, Rb R,, R4, R^-i R(, mająznaczenia podane poprzednio.
Szczególnie korzystny jest immunokoniugat o wzorze 1a, który jako ugrupowanie leku zawiera adriamycynę, a część stanowiąca ligand jest wybrana z grupy składającej się z BR64, BR96, L6, chimerycznego BR96, chimerycznego L6 oraz ich fragmentów rozpoznających antygen. Najbardziej korzystnym ligandem dla tej postaci wynalazku jest chimeryczny BR96, zwłaszcza zrelaksowany chimeryczny BR96 oraz jego fragmenty rozpoznające antygen.
Nowe koniugaty podawane sąpacjentowi w postaci preparatu farmaceutycznego, który zawiera koniugat o wzorze 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, wypełniacz lub rozcieńczal18
172 718 nik koniugatu. Stosowane tu określenie “farmaceutycznie dopuszczalny“ odnosi się do tych środków, które są użyteczne w leczeniu lub diagnostyce zwierząt ciepłokrwistych, w tym na przykład człowieka, koni, świń, bydła, gryzoni, psów, kotów i innych ssaków, jak również ptaków i innych zwierząt ciepłokrwistych. Korzystnym sposobem podawania jest podawanie pozajelitowe, w szczególności dożylne, domięśniowe, podskórne, dootrzewnowe lub dolimfatyczne. Takie preparaty mogąbyć wytworzone przy zastosowaniu nośników, rozcieńczalników lub zarobek znanych specjalistom. Patrz na przykład Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, 1980, Mack Publishing Company, edytor Osol i wsp. Środki takie mogą zawierać białka, takie jak białka osocza krwi, na przykład ludzką albuminę osocza, bufory lub substancje buforujące takie jak fosforany, inne sole lub elektrolity i podobne. Do odpowiednich rozcieńczalników należą na przykład jałowa woda, izotoniczna solanka, rozcieńczony wodny roztwór dekstrozy, alkohol wielowodorotlenowy lub mieszaniny takich alkoholi, na przykład gliceryna, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i podobne. Preparaty mogązawierać środki konserwujące, takie jak alkohol fenetylowy, parabeny metylowy i propylowy, timerosal i podobne. W razie potrzeby preparat może zawierać 0,05 do około 0,20 procent wagowych przeciwutleniacza, takiego jak pirosiarczyn sodowy lub wodorosiarczyn sodowy.
Preparat do podawania dożylnego korzystnie wytwarza się tak, że ilość podawana pacjentowi wynosi około 0,01 do około 1 g żądanego koniugatu. Koniugaty korzystnie podaje się w ilości zawartej w zakresie od około 0,2 g do około 1 g. Nowe koniugaty są efektywne w szerokim zakresie dawkowania, zależnie od czynników takich jak leczony stan chorobowy lub modyfikowany efekt biologiczny, sposób podawania koniugatu, wiek, waga i stan pacjenta, jak również inne czynniki, które ustala lekarz prowadzący. Zatem ilość podawana jakiemukolwiek danemu pacjentowi musi być ustalana indywidualnie.
Chociaż w poniższych przykładach preparatywnych i przykładach przedstawiono specyficzne reagenty i warunki reakcji, to można dokonać modyfikacji, które są objęte istotąi zakresem wynalazku. Poniższe przykłady preparatywne i przykłady przedstawiono zatem w celu dodatkowego zilustrowania wynalazku.
Przykładl (preparatywny). Hydrazyd kwasu 2,5-dihydro-2,5-diokso-1 H-piorolo-1 -heksanowego i jego sól z kwasem trifuorooctowym (“Hydrazyd maleimidokaproilowy“).
Kwas maleimidokapronowy (2,11 g, 10 mmoli) [Patrz na przykład D. Rich et al., J. Med. Chem., 18,1004, (1975); i O. Keller et al., Helv. Chim. Acta, 58 531 (1975)] rozpuszczono w suchym tetrahydrofuranie (200 ml). Roztwór mieszano pod azotem, ochłodzono do 4°C i podziałano N-metylomor fo llną(1,01 g, 10 mmoli), po czym wkroplono roztwór chloromrówczanu izobutylu (1,36 g, 10 mmoli) w THF (10 ml). Po 5 min. wkroplono roztwór karbazanu t-butylu (1,32 g, 10 mmoli) w THF (10 ml). Mieszaninę reakcyjną trzymano w 4°C przez pół godziny i w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość podzielono między octan etylu i wodę. Warstwę organiczną przemyto rozcieńczonym roztworem HCl, wodą i rozcieńczonym roztworem wodorowęglanu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano rozpuszczalnik. Materiał oczyszczono przez chromatografię podziałową przy użyciu gradientowego układu rozpuszczalników chlorek metylenu:metanol (100:1-2). Otrzymano zabezpieczony hydrazyd z wydajnością 70% (2,24 g).
Materiał ten (545 mg, 2,4 mmola) rozpuszczono i mieszano w kwasie trifluorooctowym w 0-4°C przez 8 min. Kwas usunięto pod wysoką próżnią w temperaturze pokojowej. Pozostałość roztarto z eterem, otrzymując krystaliczną sól hydrazydu maleimidokaproilowego z kwasem trifluorooctowym (384 mg, 70%). Próbkę analityczną przygotowano przez krystalizację z układu metanol-eter, otrzymując produkt o tt. 102-105°C. NMR i MS były zgodne ze strukturą.
Analiza:
obliczono dla C10H15N3O3 · 0,8CF3COOH: C, 44,02; H, 4,99; N, 13,28. znaleziono (analiza dwukrotna): C, 44,16, 44,13; H, 4,97, 5,00; N, 12,74, 12,75.
Sól (220 mg) przekształcono w wolną zasadę przez chromatografię na żelu krzemionkowym przy użyciu układu rozpuszczalnikowego chlorek metylenu:metanol:stężony NH4OH
172 718 (100:5:0,5). Otrzymany materiał (124 mg, 80%) krystalizowano z układu chlorek metylenu-eter, otrzymując produkt końcowy o tt. 92-93°C. nMr i MS były zgodne ze strukturą.
Analiza:
obliczono dla C10H15N3O3: C, 53,33; H, 6,67; N, 18,67. znaleziono: C, 53,12; H, 6,67; N, 18,44.
Przykład II (preparatywny). Maleimidokaproilohydrazon adriamycyny
Mieszaninę chlorowodorku adriamycyny (44 mg, 0,075 mmola), hydrazydu maleimidokaproilowego (23 mg, 0,102 mmola), otrzymanego zgodnie z procedurąprzedstawioną w przykładzie preparatywnym I i 2-3 krople kwasu trifluorooctowego w absolutnym metanolu (25 ml) mieszano przez 15 godzin pod azotem i zabezpieczono przed światłem. Pod koniec tego okresu nie wykrywano wolnej adriamycyny za pomocą HPLC (faza ruchoma 0,01 molowy roztwór octanu amonu:acetonitryl (70:30). Roztwór zatężono w temperaturze pokojowej pod próżnią do 10 ml i rozcieńczono acetonitrylem. Przezroczysty roztwór zatężono do małej objętości, substancję stałą zebrano przez wirowanie, a produkt wysuszono pod wysoką próżnią, otrzymując związek tytułowy. NMR był zgodny ze strukturą. MS wysokiej rozdzielczości, wyliczono dla C31H42N4O13: 751, 2827; znaleziono 751, 2804.
Hydrazon otrzymano również stosując adriamycynę i sól hydrazydu z kwasem trifluorooctowym. Zatem sól (40 mg, 0,12 mmola), otrzymaną zgodnie ze sposobem przedstawionym w procedurze 1 i chlorowodorek adriamycyny (50 mg, 0,086 mmola) mieszano w metanolu (30 ml) przez 15 godzin. Roztwór zatężono do 2 ml i rozcieńczono acetonitrylem. Czerwoną substancję stałą zebrano przez wirowanie i wysuszono pod próżnią. NMR i tLc produktu (28 mg, 43%) były identyczne jak dla produktu opisanego powyżej. MS wysokiej rozdzielczości, wyliczono dla C31H42N4O13: 751, 2827; znaleziono 751, 2819.
Przykład III. Koniugat przeciwciała monoklonalnego BR64 tiolowanego SDPP z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny.
Na roztwór przeciwciała BR64 (25 ml, 10,37 mg/ml; oznaczone za pomocą UV przy 280 nm, 1,4 jednostki absorbancji odpowiada 1 mg białka) podziałano roztworem SDPP w absolutnym etanolu (1,3 ml roztworu o stężeniu 10 mmoli). Roztwór inkubowano przez 1 godzinę w 31-32°C, następnie ochłodzono w lodzie i podziałano roztworem DTT w solance buforowanej fosforanem (“PBS“) (1,3 ml roztworu o stężeniu 50 mmoli). Roztwór trzymano w lodzie przez 1 godzinę, po czym przeniesiono do węża dializacyjnego i dializowano trzy razy przeciwko PBS (21 na dializę) przez okres co najmniej 8 godzin. Po dializie zmierzono stężenie białka takjak powyżej, a następnie oznaczono wolne grupy sulfhydrylowe metodą Ellmana.
Na tiolowane białko (3 ml) podziałano równoważną molowo w stosunku do tiolu ilością maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny, otrzymanego w sposób opisany w przykładzie preparatywnym II, rozpuszczonego w dimetyloformamidzie (DMF) (5 mg/ml, 0,131 ml) i mieszaninę inkubowano w 4°C przez 24 godziny. Roztwór dializowano trzy razy przeciwko PBS (1000 ml) przez okres co najmniej 8 godzin. Roztwór wirowano, a supernatant wytrząsano przez kilka godzin z Bio-beads™ SM-2 (niepolarne, obojętne perełki z makroporowatego polistyrenu, BioRad Laboratories, Richmond, CA 94804) i na końcu przesączono przez filtr Millex-GV o gęstości 0,22 pm (Millipore Corporation, Bedford, MA 01730). Średnią łączną liczbę cząsteczek adriamycyny na cząsteczkę przeciwciała (“MR“) oznaczono mierząc ilość adriamycyny z absorpcji przy 495 nm (ε=8030 cmAM4), a gość białka z absorpcji przy 280 nm, po skorygowaniu o absorpcję adriamycyny przy 280 nm zgodnie z następującym równaniem:
Pizeciwciało (Mg/ml) = A280 ( 0°2424 A-95)1.4
1,4
MR znalezione dla produktu było równe 5,38; dla wolnej adriamycyny 0,14%; wydajność białka 60%.
Przykład IV. Koniugat przeciwciała monoklonalnego BR64 tiolowanego SDPP z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny
172 718
Na roztwór przeciwciała BR64 (405 ml, 11,29 mg/ml) działano mieszając roztworem SDPP w absolutnym etanolu (22,3 ml roztworu o stężeniu 10 mmoli). Roztwór inkubowano przez 1 godzinę w 31-32°C wstrząsając łagodnie, po czym ochłodzono w lodzie do 4°C, podziałano mieszając roztworem DTT w PBS (22,3 ml roztworu o stężeniu 50 mmoli). Roztwór trzymano w lodzie przez 1 godzinę, po czym podzielono na 2 równe części, obie części przeniesiono do węży dializacyjnych i dializowano sześć razy przeciwko PBS (61 na dializę) przez okres co najmniej 8 godzin. Następnie zawartości węży połączono (400 ml) i oznaczono stężenie białka oraz wolnych grup tiolowych (stosunek molowy grup -SH do białka wyniósł ' 8,5).
Na roztwór holowanego białka podziałano mieszając równoważną molowo ilością maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny, rozpuszczonego w DMF (5 mg/ml, 35,7 ml) i inkubowano mieszaninę w 4°C przez 24- godziny. Roztwór podzielono na 2 równe części, przeniesiono do węży dializacyjnych i dializowano pięć razy przeciwko PBS (61 na dializę) przez okres co najmniej 8 godzin Zawartości węży dializacyjnych połączono, przesączono przez filtr z octanu celulozy o gęstości 0,22 pm, a przesącz wytrząsano przez 24 godziny z Bio-beads™ SM-2 (BioRad Laboratories, Richmond, CA 94804). Roztwór przesączono przez filtr z octanu celulozy o gęstości 0,22 pm. Oznaczono stężenie białka i adriamycyny (odpowiednio 6,26 mg/ml i 162,4 pm/ml), otrzymując stosunek molowy (MR) równy 7,18. Wydajność białka wyniosła 77%. Zawartość adriamycyny nieskoniugowanej wynosiła 0,07%.
PrzykładV. Koniugat SN7 tiolowanego SDPP z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny
W sposób -analogiczny do sposobu opisanego w przykładach I i II przeciwciało monoklonalne SN7, przeciwciało niewiążące się z antygenem rozpoznawanym przez BR64, tiolowano przy użyciu SDPP i poddano reakcji z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny, otrzymując koniugat o stosunku molowym (MR) równym 4. Wydajność białka wyniosła 51 %. Zawartość adriamycyny nieskoniugowanej wyniosła 0,36%.
Przykład VI. Koniugat ChiBR96 tiolowanego SDPP z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny
Na roztwór chimerycznego przeciwciała BR96, ChiBR96 (27,5 ml, 12,53 mg/ml) podziałano roztworem SDPP w absolutnym etanolu o stężeniu 10 mM (1,7 ml). Roztwór inkubowano w 31°C przez 35 minut, ochłodzono w lodzie i podziałano roztworem DTT w PBS o stężeniu 0,50 mM (1,7 ml) przez 15 minut w 4°C. Roztwór przeniesiono do węża dializacyjnego i dializowano cztery razy w buforze PBS-0,1 M histydyny (4,51 na dializę) przez okres co najmniej 8 godzin. Oznaczono ilość białka i stężenie molowe grup tiolowych (odpowiednio 9,29 mg/ml i 2,06 x 10'4M). Na roztwór (17 ml) podziałano równoważną molowo ilością maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny w DMF (5 mg/ml, 0,59 ml) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w 4°C przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną dializowano trzy razy w tym samym buforze (4,5 l na dializę) przez co najmniej 8 godzin. Roztwór po dializie wirowano, a supernatant wytrząsano łagodnie w Bio-beads™ SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) przez kilka godzin w 4°C. Roztwór odwirowano i oznaczono stężenie białka i adriamycyny w supernatancie (19 ml) (odpowiednio 6,5 mg/ml i 67,86 pg/ml). Stosunek molowy leku do białka wyniósł 2,9. Wydajność białka wyniosła 72%; zawartość adriamycyny nieskoniugowanej wynosi 1,2%.
Przykład VII. Koniugowanie modyfikowanej bombezyny z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny
Bombezyna nie zawiera wolnych, reaktywnych grup sulfhydrylowych, które mogą być wykorzystane do połączenia leku poprzez łącznik zawierający addycji receptor Michaela. W związku z tym przygotowano bombezynę modyfikowaną, która zawiera dodatkową resztę cysternową przy aminowym końcu bombezyny natywnej. Ponadto resztę 3 bombezyny natywnej zamieniono na lizynę. Modyfikowana bombezyna jest zatem oznaczona jako “Cys0-lys3-bombezyna“.
Cys0-lys3-bombezynę (11,3 mg) rozpuszczono w 1,1 ml wody dejonizowanej i ustawiono pH na 7-7,5 za pomocą 10 pl 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, po czym poddano reakcji z 0,45 ml maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny (15 mg/ml w wodzie dejonizowanej) w temperaturze poko172 718 jowej przez kilka godzin. Mieszaninę reakcyjną dializowano w wężach dializacyjnych przeciwko wodzie przez noc (obcięcie ciężaru cząsteczkowego: 1000). Precypitat oddzielono przez odwirowanie (12000 x g), zachowując supernatant. Zawartość adriamycyny (“ADM“) w koniugacie bombezyna-adriamycyna zmierzono przez rozcieńczanie 1:50 w buforze octanowym, pH 6,0. Zawartość adriamycyny wyliczono stosując wzór:
[O.D.495/8030] x 50 = ADM (M)
Dla tego preparatu O.D.^ = 0,116, a zatem zawartość adriamycynyj est równa 7,2 x 1 Cb4M.
Produkt chromatografowano za pomocą HPLC, stosując kolumnę C18 (Beckman Instruments, Ultrasphere 5 μ, 4,6 mm x 25 cm). Bufor A: 10 mMNH4OAc, pH 4,5; Bufor B: 90% acetonitryl/10% bufor A. Kolumnę równowagowano mieszanką 90% buforu A/10% buforu B, a warunki chromatografowania były następujące: 90% buforu A/10% buforu B do 60% buforu A/40% buforu B przez 2 minuty, gradient do 50% buforu A/50% buforu B przez 15 minut. W tych warunkach czas retencji produktu wynosił 9,3 minuty.
Przykład VIII. Koniugat przeciwciała chimerycznego BR96 tiolowanego iminotiolanem z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny
Przeciwciało chimeryczne BR96 (15 ml, 9,05 mg/ml) dializowano dwa razy przeciwko 4 litrom buforu węglan/wodorowęglan sodu o stężeniu 0,1M, pH 9,1. Roztwór przeciwciała następnie ogrzewano z iminotiolanem (0,75 ml, 20 mM) w 32°C przez 45 minut. Roztwór następnie dializowano przeciwko 4 litrom buforu węglan/wodorowęglan sodu o pH 9,1, a następnie dializowano przeciwko 4 litrom buforu 0,0095 M PBS-0,1 M L-histydyny, pH 7,4. Roztwór ten miał stosunek molowy -SH/białko równy 1,35. Następnie białko ponownie tiolowano w sposób opisany powyżej, otrzymując roztwór o stosunku molowym -SH/białko równym 5,0.
Mieszając do roztworu tiolowanego białka dodano w 4°C maleimidokaproilohydrazon adriamycyny (3,2 mg w 0,640 ml DMF). Koniugat inkubowano w 4°C przez 16 godzin, po czym dializowano przeciwko 4 litrom 0,0095 M PBS-0,1 M L-histydyny, pH 7,4. Dializowany koniugat przesączono przez membranę z octanu celulozy do sterylnego węża, do którego dodano małą ilość (>5% v/v) Bio-beads™ SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804). Po 24 godzinach łagodnego mieszania perełki odsączono, a koniugat zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. Z chimerycznego BR96 uzyskano z wydajnością 24% koniugat, który miał stosunek molowy 3,4 cząsteczek adriamycyny na 1 cząsteczkę białka.
Przykład IX. Koniugat maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny z ludzką IgG zredukowaną DTT (“zrelaksowana ludzka IgG“)
LudzkąIgG (otrzymanąz Rockland, Gilbertsville, PA) rozcieńczono 0,0095 M PBS do stężenia białka 10,98 mg/ml. Roztwór ten (350 ml) ogrzano do 37°C w łaźni wodnej w atmosferze azotu. Dodano ditiotreitol (16,8 ml, 10 mM) w PBS i mieszano roztwór przez 3 godziny w 37°C. Roztwór podzielono równo pomiędzy dwie komory do ultrafiltracji z mieszaniem Amicon model 8400 (Amicon Division of W. R. Grace and Co., Beverly, MA 01915), zaopatrzone każda w membranę do ultrafiltracji Amicon YM 30 (obcięcie MW 30000, średnica 76 mm) i połączone poprzez selektor stężenie/dializa Amicon model CDS 10 do minizbiornika Amicon Model rC800. Każdy zbiornik zawierał 700 ml 0,0095 M PBS-0,1M L-histydyny. Roztwory białek dializowano aż do osiągnięcia stężenia wolnego tiolu w filtracie równego 41 μM. Stosunek molowy -SH/białko w retentacie wyniósł 8,13.
Retentat przeniesiono z komór do sterylnego zbiornika utrzymywanego w atmosferze azotu i dodano mieszając roztwór maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny (36,7 ml, 5 mg/ml w wodzie). Koniugat inkubowano w 4°C przez 48 godzin, po czym przesączono poprzez błonę z octanu celulozy o gęstości 0,22 μιη. Bio-Rad Econocolumn™ (2,5 x 50 cm, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) zapakowano zawiesiną 100 g Bio-beads™ SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) w buforze 0,00095 M-0,1 M L-histydyny. Perełki przygotowano przez przemycie w metanolu a następnie w wodzie, po czym kilka razy w buforze. Przesączony koniugat filtrowano przez tę kolumnę z szybkością 2 ml/min. Po chromatografii koniugat przesączono przez membranę z octanu celulozy o gęstości 0,22 pm i zamrożono w ciekłym azo22
172 718 cie i przechowywano w -80°C. Koniugat otrzymany z ludzkiej IgG z wydajnością99% miał średni stosunek molowy 7,45 cząsteczek adriamycyny na cząsteczkę białka.
Przykład X. Koniugat zrelaksowanego BR64 z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny.
Na roztwór BR64 (435 ml; 11,31 mg/ml, 7,07 x 105M) podziałano DTT (947 mg) i łagodnie mieszając ogrzewano do 42 - 43°C przez 2 godziny. Roztwór ochłodzono w lodzie, przeniesienio do 2 węży dializacyjnych i każdy wąż dializowano 5 razy przeciwko PBS (141 na dializę) przez 8 godzin w 4°C. Zawartości węży połączono (400 ml) i oznaczono zawartość białka i -SH (odpowiednio 10,54 mg/ml, 6,58 x 105 M; 5,14 x W^M). Stosunek molowy -SH do białka wynosił 7,8.
Do roztworu przeciwciała dodano delikatnie mieszając roztwór maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny w DMF (5 mg/ml, 32,6 ml), po czym inkubowano w 4°C przez 24 godziny. Roztwór przesączono przez filtr z octanu celulozy o gęstości 0,22 pm, a następnie przeniesiono do dwóch węży dializacyjnych i dializowano w sposób opisany powyżej. Po dializie zawartości węży połączono, przefiltrowano i wytrząsano przez 24 godziny z Bio-beads™ SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) w 4°C. Perełki odsączono stosując filtr z octanu celulozy, otrzymując roztwór koniugatu. Oznaczono stężenia białka i adriamycyny (odpowiednio 8,66 mg/ml; 5,42 x 10‘5M; 168 pg/ml; 2,89 x 10* 4 M). Wydajność białka wynosiła 97%. Stosunek molowy adriamycyny do białka wyniósł 5,33, a zawartość nieskoniugowanej adriamycyny 0,5%.
Przykład XI. Ogólna procedura koniugowania maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny ze zrelaksowanym przeciwciałem 1.
1. Roztwór (300 ml) przeciwciała (3 g, 10 mg/ml) w buforze PBS (uwaga 1) trzymany w sposób ciągły pod płaszczem azotowym, zanurza się w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i miesza łagodnie mieszadłem magnetycznym. Na roztwór działa się 7 równoważnikami molowymi DTT (uwagi 2,3) przez 3 godziny. Stosunek molowy grup -SH do białka (“MR“) oznacza się na początku i następnie co godzinę, i powinien on dla produktu maksymalnie skoniugowanego pozostawać stały na poziomie około 14 (uwagi 2, 4).
2. Roztwór przenosi się jak najszybciej do komory diafiltracyjnej Amicon (Amicon, Division ofW. R. Grace and Co., Beverly, Ma, 01915) (uwaga 5), w której utrzymuj e się temperaturę około 4°C do 7°C. Układ utrzymuje się pod ciśnieniem azotu lub argonu i rozpoczyna diafiltrację, stosując bufor PBS, zawierający 0,1 M histydyny, wstępnie ochłodzony do temperatury około 4°C do 7°C. Początkowa temperatura odcieku bezpośrednio po rozpoczęciu diafiltracji wynosi 16 - 18°C i spada do 8 - 9°C w ciągu 90 minut. Wyciek monitoruje się na wartość MR -SH do białka, a gdy wartość ta jest < 1, diafiltrację kończy się (uwaga 6).
3. Roztwór przenosi się z powrotem do kolby okrągłodennej, wyposażonej w mieszadło magnetyczne i trzyma w lodzie. Roztwór utrzymuje się w sposób ciągły pod płaszczem azotowym. Notuje się objętość roztworu. W celu oznaczenia ilości białka w mg/ml (i również równoważnika molowego białka oraz stężenia molowego grup -SH (i przez to MR -SH do białka)) pobiera się próbki 0,1 ml i rozcieńcza buforem PBS do 1,0 ml. Przygotowuje się roztwór maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny w wodzie destylowanej (5 mg/ml, 6,3 x 10'3M) (uwaga 6). Ilość (w ml) tego roztworu, potrzebną do koniugowania oznacza się ze wzoru:
(stężenie molowe - SH) x (objętość roztworu białka) x 1,05
6,3 x 10’3 (uwaga 9) i ilość tę dodaje się powoli do mieszanego delikatnie roztworu białka. Roztwór utrzymuje się w 4°C przez 30 minut.
4. Przygotowuje się kolumnę Bio-beads™ SM-2,20-50 mesh (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) (uwaga 10) w 4°C. Czerwony roztwór białka filtruje się przez filtr z octanu celulozy o gęstości 0,22 pm, a następnie przepuszcza przez kolumnę z szybkością 2,5 ml/min i zbiera czerwony odciek. Na końcu na szczyt kolumny wylewa się bufor PBS- 0,1 M histydyny i zbiera odciek do momentu, gdy stanie się on bezbarwny. Notuje się objętość zebranego czerwonego roztworu. Próbkę 0,1 ml rozcieńcza się do 1 ml buforem PBS i mierzy ilość białka i adriamycyny. Ilość skoniugowanej adriamycyny oznacza się na podstawie absorbancji przy 495 nm
172 718 (ε-8030 cm^M'1) i wyraża w mikromolach i mikrogramach na ml. Ilość białka, wyrażoną w mg na ml i mikromolach oznacza się jak powyżej na podstawie absorbancji przy 280 nm z poprawką na absorbancję adriamycyny przy tej samej długości fali, zgodnie z następującym wzorem:
. . , . . A,80 -(0,724 x A495 )
Przeciwciało (mg/ml) -gdzie A jest obserwowaną absorbancjąprzy wspomnianej długości fali. Następnie oblicza się MR adriamycyny do białka.
5. Próbkę 5 ml koniugatu przepuszcza się przez kolumnę Econo-Pac™ 10 SM-2 (zapakowana kolumna Bio-beads™ SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804), objętość 10 ml, przemyta i równowagowana buforem PBS-0,1M histydyny) w sposób opisany powyżej. Oznacza się ilość białka i skoniugowanej adriamycyny oraz oznacza Mr. Wartość ta powinna być taka sama jak dla całości roztworu (uwaga 11).
6. Koniugat zamraża się w ciekłym azocie i przechowuje w -80°C. Pobiera się próbki w celu oznaczenia cytotoksyczności, wiązania i obecności wolnej adriamycyny (uwaga 12).
Uwagi do ogólnej procedury
1. Stężenie przeciwciała wynosi zwykle 7-10 mg/ml (6,25 x 10’5M) i j est to stężenie korzystne. Jeśli stężenie jest znacznie wyższe, roztwór może być rozcieńczony buforem. Jeśli stężenie jest mniejsze niż 10 mg/ml, roztwór jest stosowany bez zmian. Stężenie oznacza się na podstawie absorpcji UV przy 280 nm: 1 mg/ml - 1,4 jednostek absorbancji.
2. Stosuje się DTT pochodzący z Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana 46250, o tt. 42 - 43°C. Jeśli zaistnieją wątpliwości co do jakości, DTT powinien być rekrystalizowany (na przykład z mieszaniny eter-heksan). Czystość oznacza się na podstawie tt., NMR i zawartości -SH. Miareczkowanie grup sulfhydrylowych prowadzi się zgodnie z metodą Ellmana (Anal. Biochem. 94,75-81,1979) w sposób następujący: próbkę 0,1 ml rozcieńcza się do 1 ml PBS i działa 0,05 ml reagenta (50 nmolowy roztwór kwasu ditio-bis-(2-nitrobenzoesowego) w 100 nmolowym roztworze Na2HPO4; pH 7,04). W taki sam sposób działa się na ślepąpróbę 1 ml PBS. Po 5 minutach mierzy się absorbancję (A) próbki i ślepej próby przy 412 nm i oznacza stężenie molowe -SH (“MCSH“) zgodnie z następującym równaniem:
(A· próbC ~ Ή ś—( próby ) b 10 r ,xi5x 10 4
MCsh =
3. DTT może być dodany w postaci stałej lub w postaci roztworu. Korzystnie stosuje się świeżo sporządzony roztwór o stężeniu 10 mM. Dla celów reakcji w opisywanej skali stosuje się na ogół 13,13 ml.
4. MR -SH do białka oznacza się mierząc stężenie molowe SH zgodnie z metodą Ellmana (patrz uwaga 2) i dzieląc to stężenie przez stężenie molowe białka. Dla utrzymania tej wartości poniżej 14 podczas reakcji dodaje się dodatkową ilość DTT.
5. W skali 3 g/300 ml stosuje się dwie komory Amicon po 350 ml każda dzieląc roztwór na dwie części po 150 ml na komorę.
6. Dla podanej skali reakcji diafiltracja trwa zwykle 2-4 godziny. Czas trwania zależy od takich czynników jak wiek membrany, szybkość mieszania roztworu i ciśnienie w komorze.
7. Hydrazon nie jest dobrze rozpuszczalny w wodzie i szybko wytrąca się osad.
8. Zastosowanie przez krótki okres czasu źródła ultradźwięków ułatwia rozpuszczanie w wodzie destylowanej. Uzyskany roztwór jest stabilny.
9. Ilość ta zapewnia 5% nadmiar hydrazonu. Opisany proces trwa na ogół 15-20 minut.
10. Bio-Beads™ przygotowuje się do chromatografii przez spęcznienie ich w metanolu przez co najmniej jedną godzinę, korzystnie przez noc, przemycie wodą destylowaną i na końcu równowagowanie buforem PBS zawierającym 0,1 M histydyny. Na 3 g białka do utworzenia kolumny 2,5 cm x 30 cm stosuje się 100 g perełek.
11. Ze względu na 'błąd właściwy dla zastosowanych metod spektroskopowych zmienność MR w granicach jednej jednostki uznaje się za wynik zadowalający. Na ogół jednakże MR zmienia się o mniej niż o 0,5 jednostki.
172 718
12. Zawartości wolnej adriamycyny w koniugacie są na ogół mniejsze niż 1%.
Przykład IX. Koniugat zrelaksowanego chimerycznego przeciwciała BR96 z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny
Chimeryczne przeciwciało BR96, przygotowane w sposób poprzednio opisany rozcieńczono buforem PBS o stężeniu 0,0095 M do stężenia białka 10,49 mg/ml. Roztwór ten (500 ml) ogrzewano do 37°C w atmosferze azotu w łaźni wodnej. Dodano ditiotreitol (26,2 ml, 10 mM) w PBS, i mieszano roztwór przez 3 godziny w 37°C. Roztwór podzielono równo między dwie komory do ultrafiltracji z mieszaniem Amicon model 8400, zaopatrzone w ultrafiltr YM 30 (obcięcie Mw 30000, średnica 76 mm) i połączono poprzez selektor stężenie/dializa Model CDS 10 z minizbiomikiem Model RC800 (Amicon, Division of W. R. Grace and Co., Beverly MA 01915-9843). Każdy zbiornik zawierał 800 ml buforu PBS o stężeniu 0,0095 M z dodatkiem 0,1 M L-histydyny. Roztwory białek dializowano do osiągnięcia stężenia wolnego tiolu w dializacie 63 pm. Stosunek molowy -SH/białko oznaczony w retentacie wyniósł 8,16. Retentat przeniesiono z komór do sterylnego pojemnika pod azotem i dodano mieszając roztwór maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny (42,6 ml, 5 mg/ml w wodzie). Koniugat inkubowano w 4°C przez 48 godzin, po czym przefiltrowano przez membranę z octanu celulozy o gęstości 0,22 pm. BioRad Econocolum 2,5 cm x 50 cm zapakowano zawiesiną 100 g Bio-Beads™ SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond California 94804) w buforze PBS o stężeniu 0,0095 M z dodatkiem 0,1M L-histydyny. Perełki przygotowano przez przemycie metanolem, a następnie wodąi kilkoma objętościami buforu. Przesączony koniugat perkolowano przez tę kolumnę z szybkością 2 ml/min. Po chromatografii koniugat przefiltrowano przez membranę octanową o gęstości 0,22 μ, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. Otrzymano z przeciwciała chimerycznego BR96 z wydajnością 95% koniugat, mający stosunek molowy adriamycyny do białka równy 6,77.
Przykład XIII. Koniugat zrelaksowanego przeciwciała mysiego L6 z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny
Przeciwciało mysie L6, przygotowane w sposób opisany wcześniej, rozcieńczono buforem PBS o stężeniu 0,0095 M do stężenia białka 11,87 mg/ml. Roztwór ten (350 ml) ogrzewano do 37°C w atmosferze azotu w łaźni wodnej. Dodano ditiotreitol (18,2 ml, 10 mM) w PBS i mieszano roztwór przez 3 godziny w 37°C. Roztwór podzielono równo między dwie komory do ultrafiltracji z mieszaniem Amicon model 8400, zaopatrzone w ultrafiltry YM 30 (obcięcie Mw 30000, średnica 76 mm) i połączone poprzez selektor stężenie/dializa Model CDS 10 z minizbiornikiem Model RC800 (Amicon, Division of W. R. Grace and Co., Beverly MA 01915-9843). Każdy zbiornik zawierał 800 ml buforu PBS o stężeniu 0,0095 M z dodatkiem 0,1 M L-histydyny. Roztwory białek dializowano do osiągnięcia stężenia wolnego tiolu w filtracie 14 μιη. Stosunek molowy -SH/białko oznaczony w retentacie wyniósł 9,8. Retentat przeniesiono z komór do sterylnego pojemnika pod azotem i dodano mieszając roztwór maleimidokaproilohydrazonu adriamycyny (40,4 ml, 5 mg/ml w wodzie). Koniugat inkubowano w 4°C przez 48 godzin, po czym przefiltrowano przez membranę z octanu celulozy o gęstości 0,22 μιη. BioRad Econocolum 2,5 cm x 50 cm zapakowano zawiesiną 100 g Bio-Beads™ SM-2 (Bio-Rad Laboratories; Richmond California 94804) w buforze PBS o stężeniu 0,0095 M z dodatkiem 0,1 M L-histydyny. Perełki przygotowano przez przemycie metanolem, a następnie wodą i kilkoma objętościami buforu. Przesączony koniugat perkolowano przez tę kolumnę z szybkością 2 ml/min. Po chromatografii koniugat przefiltrowano przez membranę z octanu celulozy o gęstości 0,22 μ, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. Otrzymano z przeciwciała mysiego L6 z wydajnością 100% koniugat, mający stosunek molowy adriamycyny do białka równy 7,39.
W celu oznaczenia czynności biologicznej reprezentatywne koniugaty, otrzymane sposobem według wynalazku, przetestowano zarówno w układach in vitro i in vivo. W testach tych oznaczano siłę działania koniugatów leków cytotoksycznych mierząc cytotoksyczność koniugatów przeciwko komórkom rakowym pochodzenia ludzkiego. Poniżej opisano reprezentatywne stosowane testy oraz uzyskane wyniki. W zaprezentowanych danych koniugaty są określane przez podanie ligandu, leku i stosunku molowego ligandu do leku. Zatem na przykład “BR64-ADM-5,33“ odnosi się do koniugatu przeciwciała BR64 i adriamycyny w stosunku mo172 718 lowym 5,33. Zamiast szczególnych linii komórek nowotworowych zastosowanych w poniższych analizach może być użyta dowolna linia komórek rakowych, w której zachodzi ekspresja żądanego antygenu.
Test I
Czynność koniugatów BR64-adriamycyna in vitro
Immunokoniugaty z przykładów III i VI przetestowano in vitro przeciwko linii komórkowej ludzkiego raka płuc L2987 (otrzymanej odl. Hellstrom, Bristol-Myers Squibb Seattle; patrz również I. Hellstrom et al., Cancer Research 50:2183 (1990)], w której zachodzi ekspresja antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała monoklonalne BR64, L6 i BR96. Jednowarstwowe hodowle komórek L2987 ścinano, stosując trypsynę-EDTA (GIBCO, Grand Island, NY), zliczano komórki i ponownie zawieszano je do stężenia 1 x 105/ml w RPMI-1640, zawierającym 10% inaktywowaną termicznie cielęcą surowicę płodową. (“RPMI-10%FCS“). Komórki (0,1 ml/dołek) dodano do każdego dołka 96-dołkowej płaskiej płytki do mikromiareczkowań i inkubowano przez noc w 37°C w nawilgoconej atmosferze zawierającej 5% CO2. Pożywkę usunięto z płytek i do dołków dodawano kolejne rozcieńczenia adriamycyny lub koniugatów adriamycyny z przeciwciałem. Wszystkie rozcieńczenia przeprowadzano czterokrotnie. Po 2 godzinach ekspozycji leku lub koniugatu płytki wirowano (100 g, 5 minut), lek lub koniugat usuwano, a płytki przemywano trzy razy RPMI-10%FCS. Komórki hodowano w RPMI-10%FCS przez następne 48 godzin. Po tym czasie komórki przepłukiwano pulsowo 3H-tymidyną(New England Nuclear, Boston, MA) o aktywności 1,0 pCi/dołek. Komórki zebrano z płytek i mierzono liczbę zliczeń na minutę (“CPM“). Hamowanie proliferacji oznaczono przez porównanie średniej CPM dla prób badanych z próbkami kontrolnymi. Dane przedstawione na fig. 3 pokazują cytotoksyczność immunokoniugatu wiążącego (MR adriamycyny do BR64 równe 7,18, oznaczony “BR64-THADMHZN-7,18“) przeciwko komórkom raka płuc L2987 w porównaniu z niewiążącym immunokoniugatem SN7 i adriamycyny (MR adriamycyny do SN7 równe 4, oznaczony “SN7-THADMHZN-4“). Koniugaty BR64 otrzymane metodą opisaną w przykładzie III są czynne i wykazują w tym badaniu in vitro cytotoksyczność antygenospecyficzną.
Test II
Czynność koniugatów BR64-adriamycyna in vivo
Immunokoniugaty z przykładów III i IV zbadano na ich antygeno-specyficzną czynność przeciwnowotworową in vivo. W badaniach tych wykorzystano myszy samice z wrodzonym brakiem grasicy ze szczepu BALB/c (NBALB/c nu/nu; Harlan-Spraque-Dawley, Indianapolis, IN). Myszy hodowano w klatkach typu Thoren na sterylnej podściółce w kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Zwierzęta otrzymywałyjałowe pożywienie i wodę do woli. W badaniach wykorzystano linię komórkową ludzkiego raka płuc L287. Wykazano, że w linii tej po wielokrotnych pasażach in vivo zachodzi ekspresja antygenów BR64, BR96 i L6. Linie komórek rakowych utrzymywano przez kolejne pasaże w myszy pozbawionej grasicy jak opisano poprzednio (P. A. Trail, et al., in vivo 3:319 - 24 (1989)). Nowotwory mierzono stosując cyrkiel kalibrowy w 2 prostopadłych kierunkach w przedziałach tygodniowych lub dwutygodniowych.
Objętości nowotoworów obliczano według równania:
. (L x W2)
V(mm3)= 2 w którym V = objętość (mm3)
L = pomiar w najdłuższej osi (mm)
W = pomiar (mm) osi prostopadłej do L.
Dane są przedstawione jako średnia wielkość nowotworu dla grup badanych i kontrolnych. Każda grupa badana lub kontrolna składała się z 8 -10 zwierząt. Terapię rozpoczynano, gdy nowotwory osiągnęły średnią wielkość 50-100 cm3. Lekpodawano drogą dootrzewnowąlub dożylną zgodnie z różnymi schematami, jak podano. Adriamycynę do podawania rozcieńczano w normalnej solance, a natywne przeciwciało i koniugaty adriamycyny rozcieńczano w solance bu26
172 718 forowanej fosforanem (“PBS“). Wszystkie dawki podawano w przeliczeniu na wagę ciała (mg/kg) i były obliczane dla każdego zwierzęcia. W badaniach tych czynność przeciwnowotworowąwiążących immunokoniugatów BR64 porównywano z czynnością zoptymalizowanych dawek adriamycyny, mieszanek natywnego przeciwciała i adriamycyny oraz koniugatów niewiążących. Adriamycynę nieskoniugowaną podawano zgodnie ze schematem, który okazał się optymalny w modelu ksenograftu ludzkiego L2987. Nieskoniugowaną. adriamycynę podawano zatem w dawce 8 mg/kg wagi ciała drogą dożylną co cztery dni, podając w sumie trzy iniekcje (oznaczono “8 mg/kg, q4dx3, iv“). Immunokoniugaty wiążące (BR64) i niewiążące (SN7) podawano w kilku dawkach drogą dootrzewnową co cztery dni, podając w sumie trzy iniekcje (oznaczono “q4xd3“, ip“). Jak pokazano na figurze 4, znaczącą czynność przeciwnowotworową. obserwowano po podaniu tolerowanych dawek (10 i 15 mg/kg/iniekcję) koniugatu BR64-adriamycyna. Czynność przeciwnowotworowa obserwowana po terapii koniugatem BR64 była znacznie lepsza niż czynność w zoptymalizowanej terapii adriamycynąi w terapii odpowiadającymi dawkami koniugatu niewiążącego (SN7).
W eksperymencie tym całkowite regresje nowotworu obserwowano u 66% zwierząt po leczeniu koniugatem BR64 w ilości 15 mg/kg/iniekcję i u 50% zwierząt po leczeniu koniugatem BR64 w ilości 10 mg/kg/iniekcję. Częściowych lub całkowitych regresji ustalonych nowotworów L2987 nie obserwowano po zoptymalizowanym leczeniu adriamycyną, leczeniu mieszankami natywnego BR64 i adriamycyny, lub równoważnymi dawkami koniugatów niewiążących.
W celu wykazania, że obserwowana czynność wymaga kowalencyjnego sprzężenia przeciwciała z adriamycyną, przeprowadzono kilka eksperymentów kontrolnych stosując mieszanki natywnego BR64 i adriamycyny. Reprezentatywne dane dla kilku rodzajów terapii łączonej przedstawiono na fig. 5a - c. Czynność przeciwnowotworową, obserwowana dla różnych rodzajów terapii łączonej z przeciwciałem monoklonalnym i adriamycyną nie różniła się istotnie od czynności obserwowanej w zoptymalizowanej terapii samą adriamycyną. Dane te wzięte razem wykazują, że kowalencyjne sprzężenie BR64 z adriamycynąjest wymagane dla zaistnienia czynności przeciwnowotworowej opisanej na figurze 4.
Test III
Czynność koniugatów bombezyny in vivo
Zbadano czynność przeciwnowotworową koniugatu z przykładu VII in vivo. Nagim myszom BALB/c z wrodzonym brakiem grasicy implantowano podskórnie cząstki ludzkiego raka drobnokomórkowego płuc H345 (otrzymane od dr D. Chan, University of Colorado Medical School, CO), stosując trokary. Pozwolono na wyrośnięcie nowotworów do wielkości 50 100 mm3 przed rozpoczęciem leczenia. Na myszy działano w dniach 23,26,28 i 30 po implantacji i dożylnie samą adriamycynę (1,6 mg/kg) lub koniugatami bombezyna-adriamycyna (“BN-ADM(TH)“, w ilości równoważnej 1,6 mg/kg adriamycyny lub koniugatem P77=adriamycyna (“P77-ADM(TH)“, w ilości równoważnej 1,6 mg/kg adriamycyny). P77 jest peptydem złożonym z 12 aminokwasów, posiadającym wewnętrzną resztę cysteinową (sekwencja = KKLTCVQTRLKI), który nie wiąże się z komórkami H345 i został skoniugowany z maleimidokaproilohydrazonem adriamycyny zgodnie z procedurą przedstawioną w przykładzie IV. Zatem koniugat reprezentuje koniugat niewiążący w odniesieniu do komórek H345. Nowotwory mierzono cyrklami kalibrowanymi, a objętość nowotworów obliczano stosując wzór:
V(mm3) = (LxW2) w którym V, L i W są zdefiniowane w teście II.
Oznaczono średnie objętości nowotworów, a uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 6. Test IV
Dane cytotoksyczności in vitro dla koniugatów zrelaksowanego przeciwciała ChiBR96 Immunokoniugaty adrimycyny i przeciwciała ChBR96 przygotowano stosując ogólną metodę przygotowywania zrelaksowanych przeciwciał opisaną w przykładzie XI. Koniugaty badano stosując poniższy protokół na cytotoksyczność in vitro i porównano ich cytotoksyczność z
172 718 cytotoksycznością wolnej adriamycyny i immunokoniugatów tiolowanych SDPP, sporządzonych metodą opisaną w przykładzie Ib. Wyniki tych badań przedstawiono na fig. 7.
Monowarstwowe hodowle ludzkich komórek L2987 utrzymywano w pożywce RPMI-1640, zawierającej 10% inaktywowanej termicznie cielęcej surowicy płodowej (RPMI-10% FCS). Komórki zebrano stosując trypsynę-EDTA (GIBCO, Grand Island, NY), zliczono je i zawieszono ponownie w RPMI-10%fCs. Komórki dodano do każdego z dołków 96-dołkowych płytek do mikromiareczkowań w ilości 0,1 ml/dołek i inkubowano przez noc w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Pożywkę usunięto z płytek i do dołków dodawano kolejne rozieńczenia adriamycyny i koniugatów przeciwciało/adriamycyna. Wszystkie rozcieńczenia przeprowadzano czterokrotnie. Po 2 godzinach ekspozycji na lek lub koniugat płytki odwirowano (200 g, 5 minut), lek lub koniugat usunięto i płytki przemyto 3 x RPMI-10%FCS. Komórki namnażano w RPMI-10%FCS przez następne 48 godzin. Po tym czasie komórki przepłukiwano impulsowo przez 2 godziny 3H-tymidyną (New England Nuclear, Boston, MA) o aktywności 1,0 pCi/dołek. Komórki z płytek zebrano i oznaczono ilość zliczeń na minutę (“CPM“). Hamowanie proleferacji oznaczano przez porównanie średniej CPM dla próbek badanych z CPM dla próbek kontrolnych. Wartości IC^ podano jako pM równoważnika adriamycyny.
Test V
Czynność przeciwnowotworową in vivo konigatów BR64 i mysiego L6
Zbadano czynność przeciwnowotworową in vivo immunokoniugatów adriamycyny i zrelaksowanego BR64 lub zrelaksowanego L6. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 8.
Użyto myszy samicy BALB/c z wrodzonym brakiem grasicy (BALB/c nu/nu; Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN). Myszy hodowano w klatkach typu Thoren na jałowej podściółce w kontrolowanej wilgotności i temperaturze. Zwierzęta otrzymywałyjałowy pokarm i wodę do woli.
Linię ludzkiego nowotworu L2987 ustalono w postaci modeli ludzkich ksenograftów na myszach z wrodzonym brakiem grasicy. Linię nowotworu utrzymywano przez kolejne pasaże in vivo. Nowotwory mierzono w 2 prostopadłych kierunkach w odstępach tygodniowych lub dwutygodniowych, stosując cyrkiel kalibrowy. Objętość nowotworów obliczano stosując równanie:
V(mm’) = (LxW2) w którym:
V = objętość (mm3)
L = pomiar w najdłuższej osi (mm) W = pomiar w osi prostopadłej do L.
Na ogół w grupie kontrolnej lub badanej było 8-10 myszy. Dane przedstawiono jako średnią wielkość nowotworu w grupie kontrolnej lub badanej. Czynność przeciwnowotworową jest wyrażona jako współczynnik LCK (log cell kill), gdzie:
3,3 x XVDT
T-C jest zdefiniowane jako średni czas (w dniach), po którym nowotwory leczone osiągają celowąwielkość minus średni czas, po którym nowotwory kontrolne osiągąjącelową wielkość, a VVDT oznacza czas (w dniach), w którym nowotwory kontrolne zwiększają dwukrotnie objętość. Częściowa regresja nowotworu (“PR“) dotyczy zmniejszenia objętości nowotworu do <50% początkowej objętości nowotworu; całkowita regresja nowotworu (“CR“) dotyczy nowotworu, który nie jest wyczuwalny badaniem palpacyjnym przez pewien okres czasu; a wyleczenie jest zdefiniowane jako ustabilizowany nowotwór, który nie ·jest wyczuwalny w badaniu palpacyjnym przez okres czasu >TVDT.
Dla zwierząt noszących ludzki nowotwór płuc L2987 terapię rozpoczynano zwykle, gdy średnia wielkość guza wynosiła 75 mm3 (12 - 14 dni po implantacji nowotworu). Średni VVDT wynosił 4,8 + 0,9 dnia, a czynność przeciwnowotworową oceniano przy wielkości nowotworu
172 718
500 mm3. W kilku eksperymentach (opisanych poniżej w teście VI) terapię rozpoczynano gdy nowotwory L2987 miały wielkość 225 mm3.
Badane materiały podawano drogą dootrzewnową (ip) lub dożylną (iv). Adriamycynę rozcieńczano w zwykłej solance; przeciwciało oraz koniugaty adriamycyna/przeciwciało rozcieńczano w solance buforowanej fosforanem. Związki podawano w mg/kg wagi, obliczanych dla każdego zwierzęcia, a dawki podano w mg/kg równoważnika adriamycyny na iniekcję. Immunokoniugaty podawano zgodnie ze schematem q4dx3. Maksymalna dopuszczalna dawka (“MTD“) dla regulaminu leczenia jest określona jako najwyższa dawka w danym schemacie leczenia, która powoduje śmiertelność < 20%.
W danych przedstawionych na fig. 8 iniekcja zoptymalizowanej dawki adriamycyny wykazywała czynność przeciwnowotworową równoważną 1,1 LCK i nie obserwowano regresji nowotworu. Koniugat BR64-ADM wykazał czynność przeciwnowotworową równoważną >10 LCK we wszystkich badanych dawkach i obserwowano 89%, 78% i 100% wyleczeń odpowiednio dla dawek BR64 5 mg/kg, 8 mg/kg i 10 mg/kg. W dawkach 8 mg/kg lub 10 mg/kg koniugat L6-LCK wykazywał czynność przeciwnowotworową (odpowiednio 1,8 i 3,5 LCK), która była znacznie wyższa niż czynność zoptymalizowanej adriamycyny, ale niższa niż czynność równoważnych dawek koniugatów przeciwciała internalizującego 8R64 z ADM. Zatem dane pokazują, że czynność przeciwnowotworową wiążących, nieinternalizujących koniugatów L6-ADM jest lepsza od czynności nieskoniugowanej adriamycyny. Koniugat L6-adriamycyna wykazuje słabszą czynność przeciwnowotworową niż równoważne dawki internalizującego koniugatu przeciwciało BR64-adriamycyna.
Test VI
Czynność przeciwnowotworową in vivo koniugatów ChiBR96-ADM
Badano czynność przeciwnowotworową koniugatów ChiBR96-ADM przeciwko ustalonym liniom ludzkiego raka płuc (“L2987“) i sutka (“MCF7“), dostępnym z ATCC pod numerem akcesyjnym ATCC HTB 22; patrz również I. Hellstrom et al., Cancer Research 50:2183 (1990)), oraz raka okrężnicy (“RCA“ od M. Brattain, Baylor University; patrz również I. Hellstrom et al., Cancer Research 50:2183 (1990)).
Zwierzęta utrzymywano i ustalono modele ksenograftów nowotworów dla linii komórkowych ludzkich nowotworów MCF7, RCA i L2987 w sposób opisany dla L2987 w teście V.
Dla zwierząt noszących ludzki nowotwór płuc L2987 terapię rozpoczynano zwykle, gdy średnia wielkość guza wynosiła 75 mm3 (12 -14 dni po implantacji nowotworu). Średni TVDT wynosił 4,8 ± 0,9 dnia, a czynność przeciwnowotworową oceniano przy wielkości nowotworu 500 mm?3 W kilku eksperymentach terapię rozpoczynano, gdy nowotwory L2987 miały wielkość 225 mm).
Nowotwór MCF7 jest linią komórkową ludzkiego estrogeno-zależnego raka sutka. W dniu implantowania nowotworu myszom pozbawionym grasicy implantowano peletki estradiolu 0,65 mg (współczynnik uwalniania 65) (Innovative Research of America, Toledo, Ohio). Terapię rozpoczynano, gdy wielkość nowotworu wynosiła średnio 100 mm3 (typowo 13 dni po implantacji nowotworu). Nowotwór MCF7 miał średni TVDT 6,4 ± 2,0 dnia, a czynność przeciwnowotworową oceniano przy wielkości 500 mm3.
Dla zwierząt noszących nowotwór okrężnicy RCA terapię rozpoczynano 15 dni po implantacji nowotworu, gdy wielkość nowotworu wynosiła 75 mm3. Średni TVDT dla ksenograftów nowotworu RCA wynosił 9,5 ±1,5 dnia, a czynność przeciwnowotworową oceniano przy wielkości 400 mm3. Dane o czynności przeciwnowotworowej zoptymalizowanej adriamycyny w modelach ksenograftów L2987, MCF7 i RCA zebrano w poniższych tabelach i odnośnych figurach.
Czynność przeciwnowotworową koniugatów ChiBR96-ADM porównano z czynnością zoptymalizowanej adriamycyny oraz równoważnych dawek immunokoniugatów niewiążących (IgG). W każdym z modeli po podaniu tolerowanych dawek koniugatu ChiBR96-ADM obserwowano całkowite regresje nowotworu i/lub wyleczenia ustalonych nowotworów.
Reprezentatywne dane wykazujące antygeno-specyficzną czynność przeciwnowotworową koniugatów ChiBR96-ADM przedstawiono na fig. 9 i 10. Jak pokazano na fig. 9, podawanie (ip) koniugatu ChiBR96-ADM (MR = 4,19) w dawce 10 mg/kg równoważnika adriamycyny
172 718 wywoływało czynność przeciwnowotworową równoważną > 10 LCK. Przy tej dawce koniugatu ChiBR96-ADM 78% myszy wykazywało wyleczenie z nowotworu, a następnie 11% myszy całkowitą regresję nowotworu. Podawanie 5 mg/kg koniugatu ChiBR96-ADM również wywoływało czynność przeciwnowotworową równoważną >10 LCK przy 88% wyleczeń nowotworu i 12% całkowitych regresji. Czynność przeciwnowotworową obserwowana po podaniu koniugatów ChiBR96-ADM (>10 LCK) była znacznie wyższa niż dla zoptymalizowanej adriamycyny (1,0 LCK). Koniugat ChiBR96-ADM miał również, silniejsze działanie niż zoptymalizowana adriamycyna; to jest czynność przeciwnowotworową koniugatu ChiBR96-ADM, badana w dawce 5 mg/kg równoważnika adriamycyny była lepsza niż adriamycyny, badanej w dawce 8 mg/kg. Niewiążący koniugat ludzkiej IgG (MR = 7,16) w dawce 10 mg/kg równoważnika adriamycyny nie był aktywny przeciwko ksenogarftom L2987 co wskazuje, że doskonała czynność koniugatu ChiBR96-ADM była spowodowana antygeno-specyficznym wiązaniem immunokoniugatu do komórek nowotworu L2987.
Podobne dane przedstawiono na fig. 10. Jak pokazano, koniugat ChiBR96 (MR = 5,8) badany w dawce równoważnej 10 mg/kg adriamycyny wykazywał czynność przeciwnowotworową równoważną > 10 LCK. W dawce tej obserwowano 90% wyleczeń nowotworu i 10% całkowitych regresji nowotworu. Przy podawaniu 5 mg/kg koniugatu ChiBR96-ADM uzyskano czynność przeciwnowotworową równoważną 4,8 LCK przy 10% wyleczeń, 50% całkowitych regresji i 10% częściowych regresji. Czynność przeciwnowotworową koniugatu ChiBR96-ADM znacznie przewyższała czynność zoptymalizowanej adriamycyny (1,6 LCK) i, jak opisano powyżej, koniugat CHiBR96-ADM wykazywał silniejsze działanie niż adriamycyna nieskoniugowana. Niewiążący koniugat IgG-ADM (MR = 7,16) nie był czynny w dawce 10 mg/kg.
Czynność przeciwnowotworową różnych preparatów koniugatów ChiBR96-ADM, otrzymanych przy zastosowaniu techniki “zrelaksowanego przeciwciała i ocenianych przeciwko ustalonym ksenograftom ludzkiego nowotwora L2987 jest przedstawiona w tabeli 2.
Tabela 2
Czynność przeciwnowotworową koniugatów ChiBR96-ADM przeciwko ksenograftom ustalonego ludzkiego raka płuc
Koniugat Dawka (mg/kg) Droga LCK % regresji guza Liczba myszy
ADM Przeciw- ciało PR CR Wyle- czenie
1 2 3 4 5 6 7 8 9
ChiBR96-ADM-6,85 15 615 ip >10 10 0 80 10
10 410 ip >10 0 0 89 9
8 328 iv >10 0 0 100 9
5 205 iv >10 0 22 78 9
ChiBR96-ADM-4,19 15 980 ip >10 0 11 89 9
10 654 ip >10 11 11 66 9
5 327 iv >10 0 11 89 9
2,5 164 iv >10 0 22 78 9
ChiBR96-ADM-6,85 10 410 ip >10 11 11 78 9
8 328 iv >10 0 0 100 9
5 205 iv >10 0 11 89 9
ChiBR96-ADM 4,19 10 654 ip >10 0 0 100 9
5 327 iv >10 0 0 100 9
ChiBR96-ADM 4,19 10 654 ip >8 0 22 78 9
5 327 ip >8 0 11 89 9
ChiBR96-ADM 5,80 10 500 ip >10 0 10 90 10
5 200 ip > 4,8 10 50 10 10
172 718 cd. tabeli 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9
ChiBR96-.APM-6,82 5 204 iv >10 22 22 55 9
2 82 ip 3,5 44 33 0 9
1 41 ip 2,0 0 22 0 9
ChiBR96-ADM-6,82 10 400 ip >5,3 11 11 56 9
5 200 ip 4,8 30 10 40 10
2,5 100 ip 2,9 30 0 30 10
1,25 50 ip 1,1 11 0 11 9
0,62 25 ip 0 0 0 0 9
5 200 iv >5,3 10 20 70 10
2,5 100 iv 2,9 22 33 0 9
1,25 50 iv 1,5 11 11 0 9
0,62 25 iv 0,6 0 0 0 9
Adriamycyna 8 - iv 1-1,8 3,6 0 0 55
Wszystkie środki podawano zgodnie ze schematem q4dx3
Jak pokazano, czynność przeciwnowotworowa koniugatów ChiBR96-ADM jest lepsza niż z optymalizowanej adriamycyny i koniugaty ChiBR96-ADM mają6 - 8 razy silniejsze działanie od nieskoniugowanej adriamycyny.
Badano również czynność przeciwnowotworową koniugatów ChiBR96-ADM przeciwko dużym (225 mm3), ustalonym nowotworom L2987 (fig. 11). Przy podawaniu koniugatu ChiBR96-ADM (MR = 6,85) w dawce 10 mg/kg równoważnika adriamycyny uzyskano czynność przeciwnowotworową równoważną >10 LCK oraz 70% wyleczeń i 30% częściowych regresji nowotworu.
Czynność przeciwnowotworową nieskoniugowanego przeciwciała ChiBR96 badano stosując ustalone (50 -100 imrf) ksenografty ludzkiego nowotworu płuc L2987. Jak pokazano w tabeli 3, przeciwciało ChiBR96 podawane w dawkach 100, 200 lub 400 mg/kg me wykazywało czynności przeciwko ustalonym nowotworom L2987. Czynność przeciwnowotworową mieszanin ChiBR961 adriamycyny nie różnihi się od czynności podawanej pojedyrczo adriamycyny. Zatem, czynność przeciwnowotworową koniugatów ChiBR96-ADM jest odbiciem skuteczności samego koniugatu a nie synergistycznego efektu przeciwnowotworowego przeciwciała i adriamccyny
Tabela 3
Czynność przeciwnowotworowa adriamycyny, ChiBR96 oraz mieszanin ChiBR96 i adriamycyny przeciwko ksenograftom ustalonego ludzkiego raka płuc L2987
Leczenie Dawka (mg/kg)a Współ- czynnik LCK % regresji nowotworu Liczba myszy
ADM ChiBR96 PR CR Wyle- czenie
Adriamycyna 8 - 1,5 0 0 0 9
ChiBR96 - 400 0 0 0 0 8
- 200 0 0 0 0 8
- 100 0 0 0 0 8
Adriamycyna + 8 400 1,8 11 0 0 9
ChiBR96 8 200 1,6 0 0 0 9
8 100 1,9 0 0 0 8
aLeki podawano droga iv zgodnie ze schematem q4dx3
Podsumowując, koniugaty ChiBR96-ADM badane przeciwko ustalonym ludzkim nowotworom płuc L2987 wykazują antygeno-specyficzną czynność przeciwnowotworową. Czyn172 718 ność przeciwnowotworową koniugatów ChiBR96-ADM była lepsza niż czynność zoptymalizowanej adriamycyny, mieszanin ChBR96 i adriamycyny oraz równoważnych dawek koniugatów niewiążących. Koniugaty ChiBR96-ADM działały w przybliżeniu 6 razy silniej niż nieskoniugowana adriamycyna. Wyleczenia lub całkowite regresje ustalonych nowotworów zaobserwowano u 50% zwierząt leczonych >2,5 mg/kg koniugatu ChiBR96-ADM.
Jak pokazano na fig. 12, koniugaty ChiBR96-ADM (MR = 7,88) wykazywały antygenospecyficrnączynnośćprzeciwnowotworowąprzeciwko ustalonym (75 -125 mm3) nowotworom MCF7. Czynność koniugatu ChiBR96-ADM podawanego w dawce 5 mg/kg drogą ip lub iv (4,2 LCK) była lepsza niż czynność zoptymalizowanej adriamycyny (1,4 LCK) lub równoważnych dawek niewiążącego koniugatu IgG (1,2 LCK). Czynność przeciwnowotworową ChiBR96-ADM i niewiążących koniugatów IgG-ADM jest zestawiona w tabeli 4. MTD koniugatów ChiBR96-ADM, podobnie jak wolnej adriamycyny jest niższa w modelu MCF7 z powodu suplementacji estradiolem, wymaganej dla wzrostu nowotworu.
Tabela 4
Czynność przeciwnowotworową koniugatów tioeterowych ChiBR96-ADM przeciwko ksenograftom ustalonego ludzkiego raka sutka MCF7
Leczenie Dawka (mg/kg)a Droga Współ- czynnik LCK % regresji nowotworu Liczba myszy
ADM ChiBR96 PR CR Wyle- czenie
ChiBR96-ADM-7,88 10 350 ip b 10
5 175 ip 4,2 30 0 0 10
5 175 iv 4,2 50 10 0 10
IgG-ADM-7,16 5 225 ip 1,1 0 0 0 10
2,5 112 ip 0,6 0 0 0 10
Adriamycyna 2,5 112 iv 0,8 0 0 0 10
6 0 iv 1,4 0 0 0 10
aLeki podawano drogą iv zgodnie ze schematem q4dx3 Przy tej dawce immunokoniugatu wystąpiła śmiertelność 40%
Antygeno-specy ficznączyrmość przec-iwnowotworową i zależność dawka-odpowiedź dla koniugatów ChiBR96-ADM badano również w modelu ludzkiego raka okrężnicy RCA. Nowotwory RCA sąmniej wrażliwe na nieskoniugowanaadriamycynę niż nowotwory L2987 i MCF7. Ponadto, jak opisano poprzednio, nowotwory RCA mają dłuższy czas podwojenia objętości nowotworu niż L2987 i RCA, sąsłabiej unaczynione, i lokalizacja radioznakowanego przeciwciała BR64 w nowotworach RCA jest niższa niż w nowotworach L2987. Jak pokazano na fig. 13, czynność przeciwnowotworową koniugatu ChiBR96-ADM (MR = 7,88), podawanego w dawce 10 mg/kg była lepsza niż czynność adriamycyny i równoważnej dawki niewiążącego koniugatu IgG (MR = 7,16). Jak pokazano w tabeli 5, koniugat ChiBR96-ADM badany w dawce 10 mg/kg wykazywał czynność przeciwnowotworową równoważną > 3 LCK. Przy tej dawce koniugatu ChiBR96-ADM wystąpiło 89% wyleczeń i 11% częściowych regresji nowotworu. W eksperymencie tym nieskoniugowana adriamycyna wykazywała czynność przeciwnowotworową równoważną 0,4 LCK. Zatem w eksperymencie tym koniugat ChiBR96-ADM powodował 89% wyleczeń ustalonego nowotworu, natomiast adriamycyna nieskoniugowana była nieczynna.
172 718
Tabela 5
Czynność przeciwnowotworową koniugatów tioeterowych ChiBR96-ADM przeciwko ksenograftom ustalonego ludzkiego raka okrężnicy RCA
Leczenie Dawka (mg/kg/ Droga Współ- czynnik LCK % regresji nowotworu Liczba myszy
ADM ChiBR96 PR CR Wyle- czenie-
ChiBR96-ADM-7,88 10 350 ip >3 11 0 89 9
5 175 ip 0,6 11 22 11 9
2,5 85 ip 0,2 0 0 0 9
2,5 85 iv 0,6 11 0 0
IgG-ADM-7,16
Adriamycyna 10 405 ip 0 0 0 0 9
8 0 iv 0,4 0 0 0 9
aLeki podawano drogą iv zgodnie ze schematem q4dx3
Podsumowując, koniugat ChiBR96-ADM wykazywał antygeno-specyficzną czynność przeciwnowotworową w modelu ludzkiego nowotworu okrężnicy RCA. Po opadaniu koniugatu ChiBR96-ADM w dawkach 5-10 mg/kg obserwowano wyleczenia i całkowite regresje nowotworu.
Wynalazek opisano w odniesieniu do specyficznych przykładów, materiałów i danych. Jak przyzna specjalista, dostępne są alternatywne środki realizacji i stosowania różnych postaci wynalazku. Takie alternatywne środki wchodzą również w zakres istoty wynalazku.
172 718 [DjhN-NHCOCCH^- A-S((CI-9p-Ć-NH);
Wzór 1
Wzór 1a
172 718
s
Wzór 1c
172 718
Cd}n-nhco(ch^-r
Wzór 2a o OH t^-NHCO(CH^R
Ił I Λ
ΛίΤρ R1 YVyVoh r3 O OHÓ © Ri
Wzór 2b
172 718 ο OH N-NHOO(Cf^-tQ
Wzór 2c
HS((CH^p-Ć-NH):
Wzór- 3
172 718
NC 0 g 0
EtOOĆ>|> -c-c-s-o I -C-C-P-R |
Wzór 4 ch3 R
Wzór 5 Wzór 6
Α-Ί Ή 0 (1 -c-c-c- 0 -C-C-Ć-OR
o— + Wzór 7 Wzór 8 Wzór 9
Wzór 11
172 718
CM
172 718
Wzór 18
172 718
Wzór 23
Wzór 24
172 718 hH2
D- (O0)J+ hyj-NHCCKCF^ń R-[C^NHCO(CI^P Schemat 1 Wzór 2a [0(00)] - h[N -NHC0(Cl·^- L— [D}N-NHCO(C^)ńL
R-C [D>N-NHCO(CH^-R Wzór 2a
Schemat 2
172 718
172 718
MAb+ {j^NH2 łCl—MAb- NH
NH/Cl
Jq iDł=N-NHC0(CH2)n-A-S (CH2)3CNH (l) [DfN-NHCO(CH2)n-R MAb
MAb 7 DTT
FIG.1C ash
MAb + VSH
NH,łcr
Jq zrelaksowane MAb ^S-A-(CH2)n-CONH-N4D] [Dł= N-NHCO(CH2)n-R (Ila)
MAb
S-A-(CH2)n-CONH-N4D] (l) FIG.2
172 718
.—β AORIAMYCYNA .—α----BR64-THA0MHZN-7.18 .—Δ---SN7-THA0MHZN-4
FIG.3
-O-KONTROLA
-a ADRIAMYCYNA 8mg/kg q4d»3, iv
--BR64-THADNHZN-7d8 15mg/kg adria 583mg/kg BR64 q4dK 3, in —-a— -BR64-THAONHZN-7.18 10mg/kg adria 389mg/kg BR64 ip
-i SN7-THADMHZN-4 15mg/kg adria 1020mg/kg SN7 q4d«3, ip
----o—SN7-THADMHZN-4 lOmg/kg adria 680mg/kg SN7 q4d«3,ip
FIG. 4
172 718
WIELKOŚĆ NOWOTWORU (mm3) WIELKOŚĆ NOWOTWORU (mm3)
KONTROLA
AORIAMYCYNA 8mg/kg q4d*3, iv
MAD BR 64 ZODOmg/ko q4d«3, ip
MAD BR64 2000mg/kg q4d>3, ip+ADRIAMYCYNA 8mg/kg q4d«3, iv
FIG.5a
-·-KONTROLA
-β-AORIAMYCYNA 8mq/kg qW»3, iv
-*--MAD BR64 500mg/kg q4d*3, iv
-9-MAD BR 64 500mg/kg + AORIAMYCYNA 8mg/kg q4d«3, iv
FIG.5b
172 718
WIELKOŚĆ NOWOTWORU W)
800 i
600
400200
-1-1-1—i-1-1-1-1-1-1
20 30 40 50 60 70 80 90 „n ILOSC DNI PO IMPLANTACH
KONTROLA
-ADRIAMYCYNA 4mg/kg q4d*3, ip -MAb BR64 1000mg/kg q4d«3, ip
-MAb BR64 1Q00mg/kg* ADRIAMYCYNA 4mg/kg q4d«3, ip
FIG.5c
-·-KONTROLA
-«-ADM
P77-ADMITH) .—a---BN-ADM (TH)
1.6mg/kg ADM iv q2d»5 1.6mg/kg ADM iv q2d«5 1.6mg/kg ADM iv q2d«5
FIG. 6
172 718
ADRIAMYCYNA (gM)
-°-ADRIAMYCYNA
-a-CH96-ADM-5.6 (SPDP)
----o---CH96-ADM-6.0 (ZRELAKSOWANE)
FIG. 7
-O-KONTROLA . „ .
-— ADRIAMYCYNA Bmg/kg, iv
-i-BR64-ADM-5-33 10mg/kg, ip
-4-BR64-A0M-5.33 8mg/kg, ip .—a.— BR66-A0M-5.33 5mg/kg, iv
-»-L6-ADM-f»,89 lOmg/kg, ip
-’-L6-ADM-L.89 8mg/kg, ip
----T---L6-ADM-4.89 5mg/kg, iv
FIG. 8
172 718
---KONTROLA
--AORIAMYCYNA 6 mg/kg, i v
-a-Chi BR96-ADM-4.19 10mg/kg AOM 666 mg/kg ChiBR96, ip —ChiBR96-ADM-W9 Smfl/kg ADM 333mg/kg ChiBR96, ip
-·-lgG-ĄOM-7.16 1Omg/kg ADM 226mg/kg IgG, ip
----«----|gG-ADM-7.16 5mg/kg ADM 113mg/kg lgu,ip
FIG. 9
WIELKOŚĆ NOWOTWORU (mm^)
--KONTROLA •a-ADRIAMYCYNA 8mg/kg q4d»3, iv a-ChiBR96-ADM-5.80 TOmg/kg ADM 500mg/kg CHiBR96 q4d« 3, ip —ChiBR96-ADM-5.80 5mg/kg ADM 250mg/kg CHiBR96 q4d-3, ip
-<-lgG-ADM-7.16 10mg/kg ADM 380mg/kg q4d« 3, ip
FIG. 10
172 718
·<=-KONTROLA
-«-ADRIAMYCYNA 8mg/kg, iv
-a-ChjBR96-AOM-6.85 10mg/kg, ip
FIG. 11
-0-AORIAMYCYNA 6mg/kg, iv _—4_—ChiBR96-ADM-7.88 Smg/kg, ip
-A-ChiBR96~ADM-7.88 Smg/kg, iv
-v-IgG-ADM-7.16 Smg/kg, ip
FIG. 12
172 718
WIELKOŚĆ NOWOTWORU (mm3)
* -ADRIAMYCYNA β mg/kg, ql»d»3, iv * -ChiBR96-AOM-7.e8 10mg/kg ADM 350mg/kg ChiBR96, ip •4-lgG-ADM-7.16 lOmg/kg ADM feOOmg/kg IgG, ip
FIG. 13
a-ChiBR96
FIG. 4
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych o wzorze 1, w którym D oznacza ugrupowanie leku, n jest liczbą całkowitą 1 -10, p jest liczbą całkowitą 1 - 6, Y oznacza O lub NH2 +Ci', z jest równe 0 lub 1, q wynosi od około 1 do około 10, X oznacza ligand, A oznacza ugrupowanie adduktu Michaela, znamienny tym, że związek o wzorze 2a, w którym D i n mają wyżej podane znaczenie, a R oznacza receptor addycji Michaela poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 3, w którym p, Y, z, q i X mają wyżej podane znaczenie, i ewentualnie wyodrębnia się produkt.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym X oznacza immunoglobulinę lub jej fragment, a p, Y, z i q mają zdefiniowane w zastrz. 1 znaczenie.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuj e się związek o wzorze 3, w którym X oznacza immunoglobulinę, wybraną z grupy składającej się z BR96, BR64, L6, zrelaksowanego BR96, zrelaksowanego BR64, zrelaksowanego Ló, chimerycznego BR96, chimerycznego BR64, chimerycznego L6, zrelaksowanego chimerycznego BR96, zrelaksowanego chimerycznego BR64, zrelaksowanego chimerycznego L6 i ich fragmentów, a p, Y, z i q mają zdefiniowane w zastrz. 1 znaczenie.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym X oznacza chimeryczne BR96, zrelaksowane chimeryczne BR96 lub ich fragment, a p, Y, z i q mają zdefiniowane w zastrz. 1 znaczenie.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuj e się związek o wzorze 2a, w którym D oznacza antybiotyk antracyklinowy wybrany z grupy składającej się z adriamycyny, daunomycyny, detorubicyny, karminomycyny, idarubicyny, epirubicyny, AD-32, 4-morfolinylo-adriamycyny i 3'-deammo-3'-(3-cyjano-4-morfoimylo)-deoksorubicyny, a n i R majązdefiniowane w zastrz. 1 znaczenie.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 2a, w którym D oznacza antybiotyk antracyklinowy, korzystnie adriamycynę, a n i R mają zdefiniowane w zastrz. 1 znaczenie.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 2a, w którym n jest równe 5.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym z jest równe 0, a p, Y, q i X majązdefiniowane w zastrz. 1 znaczenie.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 3, w którym q jest równe od około 4 do około 8.
PL93317516A 1992-01-23 1993-01-22 Sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych PL PL PL PL PL PL172718B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/824,951 US5622929A (en) 1992-01-23 1992-01-23 Thioether conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL172718B1 true PL172718B1 (pl) 1997-11-28

Family

ID=25242736

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93317519A PL172715B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych PL PL PL PL PL
PL93317715A PL172824B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Nowe koniugaty tioeterowe PL PL PL PL PL
PL93317516A PL172718B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych PL PL PL PL PL
PL93317518A PL172827B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Nowe koniugaty tioeterowe PL PL PL PL PL
PL93297514A PL172828B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Nowe zwiazki, pochodne hydrazonu PL PL PL PL PL
PL93317517A PL172837B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Preparat farmaceutyczny zawierajacy koniugaty tioeterowe PL PL PL PL PL

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93317519A PL172715B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Sposób wytwarzania nowych koniugatów tioeterowych PL PL PL PL PL
PL93317715A PL172824B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Nowe koniugaty tioeterowe PL PL PL PL PL

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93317518A PL172827B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Nowe koniugaty tioeterowe PL PL PL PL PL
PL93297514A PL172828B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Nowe zwiazki, pochodne hydrazonu PL PL PL PL PL
PL93317517A PL172837B1 (pl) 1992-01-23 1993-01-22 Preparat farmaceutyczny zawierajacy koniugaty tioeterowe PL PL PL PL PL

Country Status (26)

Country Link
US (3) US5622929A (pl)
EP (1) EP0554708B9 (pl)
JP (1) JPH0625012A (pl)
CN (3) CN1040540C (pl)
AT (1) ATE294592T1 (pl)
AU (1) AU666903B2 (pl)
BG (1) BG61899B1 (pl)
CA (1) CA2087286C (pl)
CZ (1) CZ297409B6 (pl)
DE (1) DE69333800T2 (pl)
DK (1) DK0554708T3 (pl)
EG (1) EG20406A (pl)
ES (1) ES2240959T3 (pl)
FI (1) FI930240A (pl)
HU (1) HUT68345A (pl)
IL (1) IL104475A0 (pl)
MX (1) MX9300298A (pl)
MY (1) MY110526A (pl)
NO (1) NO930189L (pl)
NZ (1) NZ245725A (pl)
OA (1) OA09859A (pl)
PL (6) PL172715B1 (pl)
RO (1) RO112618B1 (pl)
TW (1) TW213921B (pl)
UY (1) UY23541A1 (pl)
ZA (1) ZA93444B (pl)

Families Citing this family (495)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214345B1 (en) * 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5637616A (en) * 1993-06-18 1997-06-10 Arcturus Pharmaceutical Corporation Method for treating diseases mediated by proteases
AU1140495A (en) * 1994-01-27 1995-08-03 Bristol-Myers Squibb Company Method for preparing thioether conjugates
US6303120B1 (en) * 1994-03-15 2001-10-16 Memorial Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of glycoconjugates of the lewis y epitope and uses thereof
US5708163A (en) * 1994-03-15 1998-01-13 Sloan-Kettering Institute Of Cancer Research Synthesis of the breast tumor-associated antigen defined by monoclonalantibody MBRL and uses thereof
US6544952B1 (en) 1994-03-15 2003-04-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of glycoconjugates of the globo-H epitope and uses thereof
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
US6143864A (en) * 1994-06-28 2000-11-07 Merck & Co., Inc. Peptides
US5599686A (en) * 1994-06-28 1997-02-04 Merck & Co., Inc. Peptides
US7597886B2 (en) * 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7820798B2 (en) * 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US5907030A (en) * 1995-01-25 1999-05-25 University Of Southern California Method and compositions for lipidization of hydrophilic molecules
US7429646B1 (en) 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US20030119724A1 (en) * 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
DK0871490T3 (da) * 1995-12-22 2003-07-07 Bristol Myers Squibb Co Forgrenede hydrazonlinkere
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
SE9601158D0 (sv) * 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
DE19636889A1 (de) * 1996-09-11 1998-03-12 Felix Dr Kratz Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel
CA2264610A1 (en) * 1996-11-05 1998-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
FR2766826B1 (fr) * 1997-08-04 2001-05-18 Pasteur Institut Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules
US6093692A (en) * 1997-09-25 2000-07-25 The University Of Southern California Method and compositions for lipidization of hydrophilic molecules
EP1093457B8 (en) 1998-03-19 2011-02-02 Human Genome Sciences, Inc. Cytokine receptor common gamma chain like
EP1098666B1 (en) * 1998-07-17 2013-01-16 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Water-soluble drugs and methods for their production
WO2000050620A2 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Human Genome Sciences, Inc. Human endokine alpha and methods of use
US6322980B1 (en) * 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US6673550B2 (en) 1999-04-30 2004-01-06 Aclara Biosciences, Inc. Electrophoretic tag reagents comprising fluorescent compounds
US6649351B2 (en) 1999-04-30 2003-11-18 Aclara Biosciences, Inc. Methods for detecting a plurality of analytes by mass spectrometry
US7001725B2 (en) 1999-04-30 2006-02-21 Aclara Biosciences, Inc. Kits employing generalized target-binding e-tag probes
DE19926154A1 (de) * 1999-06-09 2000-12-14 Ktb Tumorforschungs Gmbh Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren Arzneimittelzubereitung
US6706892B1 (en) 1999-09-07 2004-03-16 Conjuchem, Inc. Pulmonary delivery for bioconjugation
AU775373B2 (en) 1999-10-01 2004-07-29 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2002043660A2 (en) 2000-11-28 2002-06-06 Mediummune, Inc Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment
US7160735B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
US7771929B2 (en) * 2000-04-28 2010-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Tag library compounds, compositions, kits and methods of use
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
AU2001282856A1 (en) 2000-06-15 2001-12-24 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
CA2407910C (en) 2000-06-16 2013-03-12 Steven M. Ruben Antibodies that immunospecifically bind to blys
BR0114713A (pt) * 2000-10-16 2004-01-13 Neopharm Inc Formulação lipossÈmica de mitoxantrona
JP2004536027A (ja) 2000-12-01 2004-12-02 ジョーンズ・ホプキンス・ユニーバーシティー グリコシル化／ガラクトシル化ペプチドの接合体、二官能性リンカー、およびヌクレオチドのモノマー／ポリマー、および関連する組成物および使用方法
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
EP1683865A3 (en) 2001-02-02 2006-10-25 Eli Lilly &amp; Company Mammalian proteins and in particular CD200
AU2002250236A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-19 Medimmune, Inc. Cd2 antagonists for treatment of autoimmune or inflammatory disease
EP2228389B1 (en) 2001-04-13 2015-07-08 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against vascular endothelial growth factor 2
EP1389090A2 (en) * 2001-04-26 2004-02-18 Board of Regents, The University of Texas System Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US7589180B2 (en) 2001-05-11 2009-09-15 Abbott Laboratories Inc. Specific binding proteins and uses thereof
CA2446723C (en) 2001-05-25 2014-01-21 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
CN101671335A (zh) * 2001-05-31 2010-03-17 梅达莱克斯公司 细胞毒素、其有用的前体药物、连接基团和稳定剂
US6867189B2 (en) * 2001-07-26 2005-03-15 Genset S.A. Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders
RU2196604C1 (ru) * 2001-12-21 2003-01-20 Северин Евгений Сергеевич Полипептид, являющийся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста с 21-й по 31-ю аминокислоту, его конъюгат с доксорубицином и фармацевтическая композиция на его основе
US7261875B2 (en) 2001-12-21 2007-08-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
AU2003209340A1 (en) * 2002-01-18 2003-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Predictor sets for tyrosine kinase pathways
US8435529B2 (en) 2002-06-14 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US8877901B2 (en) * 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US9770517B2 (en) 2002-03-01 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Anti-Trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
US8361464B2 (en) 2002-03-01 2013-01-29 Immunomedics, Inc. Anthracycline-Antibody Conjugates for Cancer Therapy
CA2475516A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Aclara Biosciences, Inc. Multiplex analysis using membrane-bound sensitizers
AU2003218456A1 (en) * 2002-04-01 2003-10-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to gmad
US7371383B2 (en) 2002-04-12 2008-05-13 Medimmune, Inc. Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
ATE530577T1 (de) 2002-05-10 2011-11-15 Purdue Research Foundation Epha2 agonistische monoklonale antikörper und deren anwendungsverfahren
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
US7425618B2 (en) 2002-06-14 2008-09-16 Medimmune, Inc. Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations
AU2003259175B2 (en) * 2002-07-25 2010-08-12 Monogram Biosciences, Inc. Detecting receptor oligomerization
JP2006508907A (ja) * 2002-07-26 2006-03-16 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 親油性電気泳動プローブ
PT1545613E (pt) * 2002-07-31 2011-09-27 Seattle Genetics Inc Conjugados de auristatina e sua utilização para tratamento do cancro, de uma doença autoimune ou de uma doença infecciosa
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
EP1539234A4 (en) * 2002-09-05 2006-02-15 Medimmune Inc METHODS OF PREVENTING OR TREATING CELLULAR MALIGNITES BY ADMINISTERING CD2 ANTAGONISTS
PT2301965E (pt) 2002-10-16 2015-05-20 Purdue Pharma Lp Anticorpos que se ligam a ca 125/0722p associado a células e métodos para a sua utilização
US20040091850A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Travis Boone Single cell analysis of membrane molecules
EP1572242B1 (en) 2002-12-13 2014-04-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US8420086B2 (en) 2002-12-13 2013-04-16 Immunomedics, Inc. Camptothecin conjugates of anti-CD22 antibodies for treatment of B cell diseases
WO2004065551A2 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel acyl coenzyme a, monoacylglycerol acyltransferase-3 (mgat3), and uses thereof
CA2516455C (en) 2003-02-20 2012-05-01 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
EP2316487B1 (en) 2003-04-11 2014-06-11 MedImmune, LLC Recombinant IL-9 antibodies & uses thereof
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
US20060228350A1 (en) * 2003-08-18 2006-10-12 Medimmune, Inc. Framework-shuffling of antibodies
JP4934426B2 (ja) 2003-08-18 2012-05-16 メディミューン，エルエルシー 抗体のヒト化
EP1680666A4 (en) * 2003-10-27 2008-03-26 Monogram Biosciences Inc ANTI-THERAPEUTIC HUMAN ANTIBODY DETECTION
SG10201701737XA (en) 2003-11-06 2017-04-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005058961A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-30 Amgen Inc. Antibodies specific for human galanin, and uses thereof
GB0401008D0 (en) * 2004-01-17 2004-02-18 Univ Manchester Drug delivery system
US20050175619A1 (en) * 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
WO2005097184A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
RU2402548C2 (ru) * 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
NZ550934A (en) * 2004-05-19 2010-05-28 Medarex Inc Chemical linkers and conjugates thereof
US7541330B2 (en) * 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
US7700720B2 (en) 2004-09-21 2010-04-20 Medimmune, Llc Antibodies against and methods for producing vaccines for respiratory syncytial virus
EP2422811A2 (en) 2004-10-27 2012-02-29 MedImmune, LLC Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
US7939267B2 (en) * 2004-11-04 2011-05-10 Laboratory Corporation Of America Holdings Detection of activation of endothelial cells as surrogate marker for angiogenesis
EP2305716B1 (en) 2004-11-30 2014-10-22 Celldex Therapeutics, Inc. Antibodies directed to gpnmb and uses thereof
EP1851250B1 (en) * 2005-02-18 2012-06-06 Medarex, Inc. Human monoclonal antibody to prostate specific membrane antigen (psma)
US9707302B2 (en) 2013-07-23 2017-07-18 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
US10058621B2 (en) 2015-06-25 2018-08-28 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-HLA-DR antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers
JP5153613B2 (ja) 2005-03-18 2013-02-27 メディミューン，エルエルシー 抗体のフレームワーク・シャッフル
DK1864129T3 (da) * 2005-03-30 2010-11-29 Saladax Biomedical Inc Doxurubicin-immunassay
US7714016B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
EP2301969B1 (en) 2005-05-06 2015-12-23 ZymoGenetics, Inc. IL-31 monoclonal antibodies and methods of use
KR20080025174A (ko) 2005-06-23 2008-03-19 메디뮨 인코포레이티드 응집 및 단편화 프로파일이 최적화된 항체 제제
US7482124B2 (en) * 2005-07-08 2009-01-27 Bristol-Myers Squibb Company Method of identifying a PPARgamma-agonist compound having a decreased likelihood of inducing dose-dependent peripheral edema
US20070202512A1 (en) * 2005-08-19 2007-08-30 Bristol-Myers Squibb Company Human single nucleotide polymorphisms associated with dose-dependent weight gain and methods of use thereof
NZ566982A (en) * 2005-09-26 2011-06-30 Medarex Inc Duocarmycin drug conjugates
PL1940789T3 (pl) 2005-10-26 2012-04-30 Squibb & Sons Llc Metody i związki do otrzymywania analogów cc-1065
AU2006311661B2 (en) 2005-11-07 2011-05-26 The Scripps Research Institute Compositions and methods for controlling tissue factor signaling specificity
CA2627190A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
WO2007106435A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 University Of California Cleavable vaccines compositions and methods of making and using the same
WO2007127936A2 (en) 2006-04-27 2007-11-08 Pikamab, Inc. Methods and compositions for antibody therapy
LT2029173T (lt) 2006-06-26 2016-11-10 Macrogenics, Inc. Fc riib specifiniai antikūnai ir jų panaudojimo būdai
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
JP5209625B2 (ja) 2006-08-28 2013-06-12 協和発酵キリン株式会社 アンタゴニストのヒトｌｉｇｈｔ特異的ヒトモノクローナル抗体
RU2009111884A (ru) 2006-09-01 2010-10-10 Займоджинетикс, Инк. (Us) Последовательности вариабельных областей моноклональных антител против il-31 и способы использования
EP2407548A1 (en) 2006-10-16 2012-01-18 MedImmune, LLC Molecules with reduced half-lives, compositions and uses thereof
ES2523915T5 (es) 2006-12-01 2022-05-26 Seagen Inc Agentes de unión a la diana variantes y usos de los mismos
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
MX338185B (es) * 2007-01-25 2016-04-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Uso de anticuerpos anti-egfr en el tratamiento de enfermedad mediada por egfr mutante.
EP2121667B1 (en) 2007-02-21 2016-06-08 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
WO2008115404A1 (en) * 2007-03-15 2008-09-25 Ludwing Institute For Cancer Research Treatment method using egfr antibodies and src inhibitors and related formulations
MX2009009912A (es) 2007-03-27 2010-01-18 Sea Lane Biotechnologies Llc Constructos y colecciones que comprenden secuencias de cadena ligera sustitutas de anticuerpos.
AU2008232902B2 (en) 2007-03-30 2013-10-03 Medlmmune, Llc Antibody formulation
CA2685213C (en) 2007-05-04 2017-02-21 Technophage, Investigacao E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa Engineered rabbit antibody variable domains and uses thereof
SG10201503254TA (en) 2007-05-14 2015-06-29 Medimmune Llc Methods of reducing eosinophil levels
EP2152312B1 (en) * 2007-05-16 2014-12-31 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Low-viscous anthracycline formulation
SG183023A1 (en) 2007-07-16 2012-08-30 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
RU2557319C2 (ru) 2007-07-16 2015-07-20 Дженентек, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD79b И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
EP2188311B1 (en) 2007-08-14 2016-10-05 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
JP5496897B2 (ja) 2007-10-04 2014-05-21 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｂ７ファミリーメンバーのｚＢ７Ｈ６ならびに関連する組成物および方法
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
ES2660036T3 (es) 2007-12-07 2018-03-20 Zymogenetics, Inc. Moléculas de anticuerpo humanizadas específicas para IL-31
CA2711843C (en) * 2007-12-20 2018-11-13 Laboratory Corporation Of America Holdings Her-2 diagnostic methods
CN102083460A (zh) 2008-01-18 2011-06-01 米迪缪尼有限公司 用于位点特异性偶联的半胱氨酸工程化抗体
WO2009099728A1 (en) 2008-01-31 2009-08-13 Genentech, Inc. Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
JP5815403B2 (ja) 2008-08-05 2015-11-17 ノバルティス アーゲー 補体タンパク質ｃ５を標的とする抗体に関する組成物および方法
SG177252A1 (en) 2008-12-01 2012-03-29 Lab Corp America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
CN102460152B (zh) 2009-01-15 2014-11-26 美国控股实验室公司 通过测量Her-3确定患者反应的方法
US8852608B2 (en) 2009-02-02 2014-10-07 Medimmune, Llc Antibodies against and methods for producing vaccines for respiratory syncytial virus
WO2010093993A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Use of b lymphocyte stimulator protein antagonists to promote transplantation tolerance
PL3903829T3 (pl) 2009-02-13 2023-08-14 Immunomedics, Inc. Immunokoniugaty z połączeniem rozszczepialnym wewnątrzkomórkowo
EP2430047B1 (en) 2009-05-13 2018-03-28 i2 Pharmaceuticals, Inc. Neutralizing molecules to influenza viruses
ES2548030T3 (es) 2009-06-01 2015-10-13 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas y usos de las mismas
US20120213705A1 (en) 2009-06-22 2012-08-23 Medimmune, Llc ENGINEERED Fc REGIONS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION
AU2009350151B2 (en) 2009-07-20 2015-07-16 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-CTLA4 antibody with diverse therapeutic regimens for the synergistic treatment of proliferative diseases
WO2011018421A1 (en) 2009-08-10 2011-02-17 Morphosys Ag Novel screening strategies for the identification of binders
DK2464664T3 (da) 2009-08-13 2016-01-18 Crucell Holland Bv Antistoffer mod humant respiratorisk syncytialvirus (rsv) og fremgangsmåder til anvendelse deraf
AU2010282340B2 (en) 2009-08-13 2016-12-22 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011035205A2 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Calmune Corporation Antibodies against candida, collections thereof and methods of use
US20110076232A1 (en) * 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
EA201792376A3 (ru) 2009-10-23 2018-08-31 Милленниум Фармасьютикалз, Инк. Молекулы анти-gcc антитела и соответствующие композиции и способы
WO2011070443A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Monoclonal antibodies that bind b7h6 and uses thereof
AU2011213609B2 (en) 2010-02-08 2016-11-03 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (ADC) that bind to 161P2F10B proteins
JP2013527762A (ja) 2010-05-06 2013-07-04 ノバルティス アーゲー 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）抗体の組成物および使用方法
PE20130206A1 (es) 2010-05-06 2013-02-28 Novartis Ag Anticuerpos multivalentes antagonistas de lrp6 (proteina relacionada con lipoproteinas de baja densidad 6) y composiciones
NZ603488A (en) 2010-07-09 2015-02-27 Crucell Holland Bv Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use
KR20230156435A (ko) 2010-07-09 2023-11-14 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 인자 iｘ 폴리펩티드 및 이들의 사용 방법
US8871744B2 (en) 2010-07-21 2014-10-28 B & G Partyers, LLC Compounds and methods for selectively targeting tumor-associated mucins
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
CN103080134B (zh) 2010-08-20 2015-11-25 诺华股份有限公司 表皮生长因子受体3(her3)的抗体
SG10201506782XA (en) 2010-08-27 2015-10-29 Stem Centrx Inc Notum protein modulators and methods of use
KR20140014064A (ko) 2010-09-03 2014-02-05 스템 센트알엑스 인코포레이티드 신규한 조절 인자 및 사용 방법
IL311145A (en) 2010-09-29 2024-04-01 Seagen Inc Antibody drug conjugates (ADC) binding to 191P4D12 proteins
US9228023B2 (en) 2010-10-01 2016-01-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Anti-ROR1 antibodies and methods of use for treatment of cancer
CN103429620B (zh) 2010-11-05 2018-03-06 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
WO2012069466A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Novartis Ag Multispecific molecules
RS55843B1 (sr) 2010-12-06 2017-08-31 Seattle Genetics Inc Humanizovana antitela za liv-1 i upotreba istih u lečenju kancera
NZ611428A (en) 2010-12-08 2015-07-31 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
DK2668210T3 (da) 2011-01-26 2020-08-24 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antistoffer og anvendelser deraf
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
WO2012159115A1 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods for determining the likelihood of survival and for predicting likelihood of metastasis in cancer patients
LT3415531T (lt) 2011-05-27 2023-09-25 Glaxo Group Limited Bcma (cd269/tnfrsf17) – surišantys baltymai
US9244074B2 (en) 2011-06-07 2016-01-26 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
US9561274B2 (en) 2011-06-07 2017-02-07 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with HMGB1 antagonists
WO2012172495A1 (en) 2011-06-14 2012-12-20 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting tem8
US10300140B2 (en) 2011-07-28 2019-05-28 I2 Pharmaceuticals, Inc. Sur-binding proteins against ERBB3
WO2013022855A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
WO2013043071A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa Modified albumin-binding domains and uses thereof to improve pharmacokinetics
CA3182462A1 (en) 2011-10-10 2013-04-18 Xencor, Inc. A method for purifying antibodies
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
CN103071159B (zh) * 2011-10-25 2014-10-15 天津药物研究院 一种阿霉素-多肽复合物、药物组合物的制备方法和应用
JP2014533247A (ja) 2011-11-01 2014-12-11 バイオノミクス インコーポレイテッド 抗体および癌を治療する方法
EP2773664A1 (en) 2011-11-01 2014-09-10 Bionomics, Inc. Anti-gpr49 antibodies
ES2697674T3 (es) 2011-11-01 2019-01-25 Bionomics Inc Procedimientos para bloquear el crecimiento de células madre cancerosas
AU2012332593B2 (en) 2011-11-01 2016-11-17 Bionomics, Inc. Anti-GPR49 antibodies
KR102052774B1 (ko) 2011-11-04 2019-12-04 자임워크스 인코포레이티드 Ｆｃ 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이합체 항체 설계
ES2666856T3 (es) 2011-11-04 2018-05-08 Novartis Ag Proteína 6 relacionada con lipoproteínas de baja densidad (LRP6) - constructos extensores de la vida media
EP2785740A1 (en) 2011-12-02 2014-10-08 Eli Lilly and Company Anti-glucagon antibodies and uses thereof
TW201328707A (zh) 2011-12-05 2013-07-16 Novartis Ag 針對表皮生長因子受體３（ｈｅｒ３）之區域ｉｉ之ｈｅｒ３抗體
EP3590538A1 (en) 2011-12-05 2020-01-08 Novartis AG Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)
US9051365B2 (en) 2011-12-21 2015-06-09 Novartis Ag Antibodies that bind factor P
CA2859744A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Sea Lane Biotechnologies, Llc Surrogate binding proteins
CA3111357A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
US20150011736A1 (en) 2012-01-20 2015-01-08 Sea Lane Biotechnologies, Llc Binding molecule conjugates
CA2865415C (en) 2012-02-24 2022-06-21 Stem Centrx, Inc. Anti sez6 antibodies and methods of use
EP2817338B1 (en) 2012-02-24 2017-07-26 AbbVie Stemcentrx LLC Dll3 modulators and methods of use
EP3406347A3 (en) 2012-02-27 2019-02-13 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
AU2013258834B2 (en) 2012-05-10 2017-09-07 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the Fc domain
CA3131619A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Seagen Inc. Self-stabilizing linker conjugates
CN112587671A (zh) 2012-07-18 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
CN116574185A (zh) 2012-07-25 2023-08-11 塞尔德克斯医疗公司 抗kit抗体及其用途
US9382329B2 (en) 2012-08-14 2016-07-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
TR201900694T4 (tr) 2012-08-23 2019-02-21 Agensys Inc 158p1d7 proteinlerine bağlanan antikor ilaç konjugatları (adc).
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
WO2014053479A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Roche Diagnostics Gmbh Methods of specifically releasing a sub-group of objects
CA2887129A1 (en) 2012-10-09 2014-04-17 Igenica, Inc. Anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof
CA2891280C (en) 2012-11-24 2018-03-20 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
WO2014084859A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Novartis Ag Molecules and methods for modulating tmem16a activities
MX368067B (es) 2012-12-05 2019-09-18 Novartis Ag Composiciones y métodos para dirigir anticuerpos a la eritropoyetina (epo).
US9492566B2 (en) 2012-12-13 2016-11-15 Immunomedics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
US10137196B2 (en) 2012-12-13 2018-11-27 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and SN-38 for improved efficacy and decreased toxicity
US9107960B2 (en) 2012-12-13 2015-08-18 Immunimedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
US10744129B2 (en) 2012-12-13 2020-08-18 Immunomedics, Inc. Therapy of small-cell lung cancer (SCLC) with a topoisomerase-I inhibiting antibody-drug conjugate (ADC) targeting Trop-2
US9931417B2 (en) 2012-12-13 2018-04-03 Immunomedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
US10413539B2 (en) 2012-12-13 2019-09-17 Immunomedics, Inc. Therapy for metastatic urothelial cancer with the antibody-drug conjugate, sacituzumab govitecan (IMMU-132)
US10206918B2 (en) 2012-12-13 2019-02-19 Immunomedics, Inc. Efficacy of anti-HLA-DR antiboddy drug conjugate IMMU-140 (hL243-CL2A-SN-38) in HLA-DR positive cancers
BR112015013444B1 (pt) 2012-12-13 2022-11-01 Immunomedics, Inc Uso de um imunoconjugado
TW201427989A (zh) 2012-12-18 2014-07-16 Novartis Ag 長效性蛋白質之組合物及方法
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP2945969A1 (en) 2013-01-15 2015-11-25 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US8877202B2 (en) 2013-02-07 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Pro-drug form (P2PDOX) of the highly potent 2-pyrrolinodoxorubicin conjugated to antibodies for targeted therapy of cancer
KR20160037130A (ko) 2013-02-22 2016-04-05 스템센트알엑스 인코포레이티드 신규한 항체 접합체 및 이의 용도
EP4063389A3 (en) 2013-03-11 2022-12-28 Genzyme Corporation Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
WO2014159239A2 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Novartis Ag Antibodies against notch 3
SI2970473T1 (sl) 2013-03-14 2017-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Kombinacija dr5 agonista in anti-pd-1 antagonista in postopek uporabe
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
EP2968498A4 (en) 2013-03-15 2016-09-07 Biogen Ma Inc PREPARATIONS CONTAINING FACTOR IX POLYPEPTIDE
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102561553B1 (ko) 2013-03-15 2023-07-31 젠코어 인코포레이티드 이형이량체 단백질
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
MX368258B (es) 2013-03-15 2019-09-25 Zymeworks Inc Compuestos citotoxicos y antimitoticos y metodos de uso de los mismos.
WO2014165855A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Laboratory Corporation Of America Holdings Systems and methods for facilitating diagnosis, prognosis and treatment of cancer based on detection of her3 activation
SG11201509982UA (pl) 2013-06-06 2016-04-28 Igenica Biotherapeutics Inc
US9562101B2 (en) 2013-06-21 2017-02-07 Novartis Ag Lectin-like oxidized LDL receptor 1 antibodies and methods of use
AR096601A1 (es) 2013-06-21 2016-01-20 Novartis Ag Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso
US11253606B2 (en) 2013-07-23 2022-02-22 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, Bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
KR20160060634A (ko) 2013-08-01 2016-05-30 어젠시스 인코포레이티드 Ｃｄ37 단백질에 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트(ａｄｃ)
DK3041507T3 (da) 2013-08-26 2021-07-26 Biontech Res And Development Inc Nukleinsyrer, der koder for humane antistoffer mod sialyl-lewis a
WO2015031541A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Stem Centrx, Inc. Novel sez6 modulators and methods of use
CN105848671B (zh) 2013-08-28 2019-12-13 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 位点特异性抗体缀合方法和组合物
PT3055331T (pt) 2013-10-11 2021-04-05 Oxford Bio Therapeutics Ltd Anticorpos conjugados contra ly75 para o tratamento de cancro
JP6502931B2 (ja) 2013-10-11 2019-04-17 アメリカ合衆国 Ｔｅｍ８抗体およびその使用
MX2021008464A (es) 2013-10-15 2023-03-03 Seattle Genetics Inc Farmaco-enlazadores modificados con polietilenglicol para la farmacocinetica mejorada de conjugados de ligando-farmaco.
PE20161413A1 (es) 2013-11-04 2017-01-10 Stemcentrx Inc Conjugados de anticuerpo anti-efna4-farmaco
WO2015069922A2 (en) 2013-11-06 2015-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Alk antibodies, conjugates, and chimeric antigen receptors, and their use
US10457976B2 (en) 2013-11-25 2019-10-29 Seattle Genetics, Inc. Preparing antibodies from CHO cell cultures for conjugation
KR102384740B1 (ko) 2013-12-27 2022-04-07 자임워크스 인코포레이티드 약물 접합체를 위한 설폰아마이드-함유 연결 시스템
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
ES2916873T3 (es) 2014-01-10 2022-07-06 Birdie Biopharmaceuticals Inc Compuestos y composiciones para inmunoterapia
CN106662577B (zh) 2014-01-24 2020-07-21 恩格姆生物制药公司 结合蛋白及其使用方法
JP2017514143A (ja) 2014-02-21 2017-06-01 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー メラノーマに使用するための抗ｄｌｌ３抗体および薬物コンジュゲート
PT3122757T (pt) 2014-02-28 2023-11-03 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Ligantes carregados e as suas utilizações em conjugação
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9738702B2 (en) 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
US10995148B2 (en) 2014-03-19 2021-05-04 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
PE20211798A1 (es) 2014-03-21 2021-09-13 Abbvie Inc Anticuerpos y conjugados de anticuerpo y farmaco anti-egfr
CA2943609A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Metabolically-activated drug conjugates to overcome resistance in cancer therapy
UA119167C2 (uk) 2014-03-28 2019-05-10 Зенкор, Інк. Біспецифічне антитіло, яке зв'язується з cd38 та cd3
CA2944649C (en) 2014-04-04 2022-06-21 Bionomics, Inc. Humanized antibodies that bind lgr5
ES2913205T3 (es) 2014-05-13 2022-06-01 Bioatla Inc Proteínas biológicas activas condicionalmente
US20170267780A1 (en) 2014-05-16 2017-09-21 Medimmune, Llc Molecules with altered neonate fc receptor binding having enhanced therapeutic and diagnostic properties
KR102614642B1 (ko) 2014-06-04 2023-12-19 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 강글리오사이드 ｇｄ２에 대한 사람 단클론 항체
CA2953350C (en) 2014-06-23 2019-11-26 Placon Therapeutics, Inc. Platinum compounds, compositions, and uses thereof
WO2015198243A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
EP3161001A2 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Novartis AG Antibodies specific for il-17a fused to hyaluronan binding peptide tags
WO2015198240A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
CN105440135A (zh) 2014-09-01 2016-03-30 博笛生物科技有限公司 用于治疗肿瘤的抗-pd-l1结合物
AU2015292326A1 (en) 2014-07-24 2017-02-23 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
JP6956630B2 (ja) * 2014-07-24 2021-11-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 薬剤の少なくとも１つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法
WO2016020882A2 (en) 2014-08-07 2016-02-11 Novartis Ag Angiopoetin-like 4 (angptl4) antibodies and methods of use
CU24453B1 (es) 2014-08-07 2019-11-04 Novartis Ag Anticuerpos anti proteína similar a angiopoyetina 4
AU2015311911B2 (en) 2014-09-03 2019-01-24 Bioatla, Llc Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts
HUE057768T2 (hu) 2014-09-17 2022-06-28 Zymeworks Inc Citotoxikus és antimitotikus vegyületek és azok alkalmazásának módszerei
AU2015320678B2 (en) 2014-09-23 2021-07-22 Genentech, Inc. Method of using anti-CD79b immunoconjugates
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
ES2838680T3 (es) 2014-10-09 2021-07-02 Genzyme Corp Conjugados de anticuerpo-fármaco glucomodificados
RS61431B1 (sr) 2014-11-19 2021-03-31 Axon Neuroscience Se Humanizovana antitela na tau u alchajmerovoj bolesti
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CN107406512A (zh) 2014-11-26 2017-11-28 Xencor公司 结合cd3和cd38的异二聚体抗体
PT3333191T (pt) 2014-12-11 2020-12-15 Pf Medicament Anticorpos anti-c10orf54 e suas utilizações
UY36449A (es) 2014-12-19 2016-07-29 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
BR112017015880A2 (pt) 2015-03-03 2018-07-31 Kymab Ltd anticorpos, usos e métodos
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
TW201702260A (zh) 2015-03-05 2017-01-16 賽倫斯有限責任公司 環肽類似物及其共軛物
CN107614010A (zh) 2015-03-09 2018-01-19 艾更斯司股份有限公司 结合至flt3蛋白的抗体药物偶联物(adc)
JP6746845B2 (ja) 2015-04-22 2020-08-26 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． 循環ｔｒｏｐ−２陽性癌細胞の単離、検出、診断及び／または特徴付け
EP3091033A1 (en) 2015-05-06 2016-11-09 Gamamabs Pharma Anti-human-her3 antibodies and uses thereof
KR20180002782A (ko) 2015-05-06 2018-01-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 전립선 특이적 막 항원(psma) 이중특이성 결합제 및 그의 용도
US10047155B2 (en) 2015-06-05 2018-08-14 Novartis Ag Antibodies targeting bone morphogenetic protein 9 (BMP9) and methods therefor
US10639329B2 (en) 2015-06-12 2020-05-05 Lentigen Technology, Inc. Method to treat cancer with engineered T-cells
US10195175B2 (en) 2015-06-25 2019-02-05 Immunomedics, Inc. Synergistic effect of anti-Trop-2 antibody-drug conjugate in combination therapy for triple-negative breast cancer when used with microtubule inhibitors or PARP inhibitors
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
WO2017004330A1 (en) 2015-06-30 2017-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-ntb-a antibodies and related compositions and methods
EP3316885B1 (en) 2015-07-01 2021-06-23 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
EP3319936A4 (en) 2015-07-12 2019-02-06 Suzhou M-conj Biotech Co., Ltd. PLACES OF CONDUCT FOR THE CONJUGATION OF CELL BINDING MOLECULES
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
WO2017021893A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Novartis Ag Methods of treating fgf21-associated disorders
WO2017044803A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Service Expression vector delivery system and use thereof for inducing an immune response
CA2996635A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 Novartis Ag Thymic stromal lymphopoietin (tslp)-binding molecules and methods of using the molecules
AU2016320748B2 (en) 2015-09-09 2019-05-02 Novartis Ag Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)-binding antibodies and methods of using the antibodies
AR106184A1 (es) 2015-09-29 2017-12-20 Celgene Corp Proteínas de unión a pd-1 y sus métodos de uso
WO2017062748A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
WO2017062820A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Miltenyi Biotec Technology, Inc. Chimeric antigen receptors and methods of use
WO2017066714A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Compugen Ltd. Anti-vsig1 antibodies and drug conjugates
CN108473555B (zh) 2015-11-02 2022-10-25 生物蛋白有限公司 条件活性多肽
KR20210016479A (ko) 2015-12-04 2021-02-15 노파르티스 아게 항체 시토카인 그라프트된 조성물 및 면역조절을 위한 사용 방법
KR20180085800A (ko) 2015-12-07 2018-07-27 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체
UY37030A (es) 2015-12-18 2017-07-31 Novartis Ag Anticuerpos dirigidos a cd32b y métodos de uso de los mismos
ES2847155T3 (es) 2016-01-21 2021-08-02 Novartis Ag Moléculas multiespecíficas que fijan como objetivo CLL-1
US20170224837A1 (en) 2016-02-10 2017-08-10 Immunomedics, Inc. Combination of abcg2 inhibitors with sacituzumab govitecan (immu-132) overcomes resistance to sn-38 in trop-2 expressing cancers
US11191821B2 (en) 2016-02-27 2021-12-07 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Peptide vaccine formulations and use thereof for inducing an immune response
PE20181953A1 (es) 2016-03-02 2018-12-17 Eisai Randd Man Co Ltd Conjugados de anticuerpo y farmaco basados en eribulina y metodos para su uso
MA45324A (fr) 2016-03-15 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Polythérapie utilisant un adc-liv1 et un agent chimiothérapeutique
CA3016914C (en) 2016-03-15 2019-08-27 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of assessing protein interactions between cells
AU2017239038A1 (en) 2016-03-22 2018-10-04 Bionomics Inc Administration of an anti-LGR5 monoclonal antibody
KR102626498B1 (ko) 2016-03-25 2024-01-19 씨젠 인크. 페길화된 약물-링커 및 그의 중간체의 제조를 위한 공정
CA3021098A1 (en) 2016-04-21 2017-10-26 Abbvie Stemcentrx Llc Novel anti-bmpr1b antibodies and methods of use
US11016085B2 (en) 2016-04-25 2021-05-25 The Johns Hopkins University ZNT8 assays for drug development and pharmaceutical compositions
AU2017257254B2 (en) 2016-04-27 2022-02-24 Immunomedics, Inc. Efficacy of anti-Trop-2-SN-38 antibody drug conjugates for therapy of tumors relapsed/refractory to checkpoint inhibitors
CN109071647B (zh) 2016-04-27 2022-11-22 诺华股份有限公司 抗生长分化因子15的抗体及其用途
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
CN116284404A (zh) 2016-06-08 2023-06-23 艾伯维公司 抗b7-h3抗体和抗体药物偶联物
JP2019521973A (ja) 2016-06-08 2019-08-08 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｂｈ７−ｈ３抗体及び抗体薬物コンジュゲート
BR112018075653A2 (pt) 2016-06-08 2019-08-27 Abbvie Inc anticorpos anti-b7-h3 e conjugados anticorpo fármaco
MX2018015272A (es) 2016-06-08 2019-08-12 Abbvie Inc Anticuerpos anti-cd98 y conjugados de anticuerpo y farmaco.
CN109562169A (zh) 2016-06-08 2019-04-02 艾伯维公司 抗cd98抗体及抗体药物偶联物
MA45255A (fr) 2016-06-14 2019-04-17 Xencor Inc Anticorps inhibiteurs de points de contrôle bispécifiques
WO2017216724A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Novartis Ag Methods for treating disease using inhibitors of bone morphogenetic protein 6 (bmp6)
AU2017290086A1 (en) 2016-06-28 2019-01-24 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US11479601B2 (en) 2016-06-29 2022-10-25 The Regents Of The University Of California Antibodies specific to Sonic Hedgehog and method of use thereof
DK3478284T3 (da) 2016-06-29 2023-12-04 Univ California Forbindelser og sammensætninger til behandling af cancer
KR102602137B1 (ko) 2016-07-06 2023-11-13 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim-4 길항제 및 pd-1 길항제의 조합물 및 사용 방법
MX2019001302A (es) 2016-08-09 2019-06-12 Seattle Genetics Inc Conjugados de farmaco con enlazadores autoestabilizantes que tienen propiedades fisioquimicas mejoradas.
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018045245A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Sirenas Llc Cyclic peptide analogs and conjugates thereof
CN109843922B (zh) 2016-09-02 2023-10-03 莱蒂恩技术公司 用DuoCAR治疗癌症的组合物和方法
EP3515943A4 (en) 2016-09-19 2020-05-06 Celgene Corporation METHODS OF TREATING VITILIGO WITH PD-1 BINDING PROTEINS
EP3515944A4 (en) 2016-09-19 2020-05-06 Celgene Corporation METHODS OF TREATING IMMUNE DISORDERS WITH PD-1 BINDING PROTEINS
SG11201903302UA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Xencor Inc Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
JP7138350B2 (ja) 2016-11-14 2022-09-16 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ． 共役連結体、該連結体を含有する細胞結合分子－薬物共役体、並びに該共役体及び連結体の使用及び製造方法
WO2018116267A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Novartis Ag Methods of treatment with anti-factor xi/xia antibodies
CA3048156A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Novartis Ag Factor xi antibodies and methods of use
US10183993B2 (en) 2017-01-09 2019-01-22 Lentigen Technology Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-mesothelin immunotherapy
AU2018213823A1 (en) 2017-01-24 2019-06-27 Innate Pharma NKp46 binding agents
WO2018141959A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
MX2019009498A (es) 2017-02-08 2019-10-02 Novartis Ag Anticuerpos mimeticos de fgf21 y usos de los mismos.
CN110392697A (zh) 2017-03-02 2019-10-29 国家医疗保健研究所 对nectin-4具有特异性的抗体及其用途
GB201703876D0 (en) 2017-03-10 2017-04-26 Berlin-Chemie Ag Pharmaceutical combinations
EP3601356A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-cd33 immunotherapy
CA3056134A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Seattle Genetics, Inc. Process for the preparation of glucuronide drug-linkers and intermediates thereof
US10918734B2 (en) 2017-03-27 2021-02-16 Immunomedics, Inc. Treatment of high Trop-2 expressing triple negative breast cancer (TNBC) with sacituzumab govitecan (IMMU-132) overcomes homologous recombination repair (HRR) rescue mediated by Rad51
US10799597B2 (en) 2017-04-03 2020-10-13 Immunomedics, Inc. Subcutaneous administration of antibody-drug conjugates for cancer therapy
JP2020515629A (ja) 2017-04-04 2020-05-28 アヴィディア テクノロジーズ， インコーポレイテッド 免疫応答を誘導するためのペプチドベースのワクチン、それらの製造方法および使用
WO2018187791A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Juno Therapeutics, Inc Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (psma) or a modified form thereof and related methods
CA3064697A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Bluefin Biomedicine, Inc. Anti-vtcn1 antibodies and antibody drug conjugates
AU2018259856A1 (en) 2017-04-28 2019-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Compound having substance that has affinity for soluble protein, cleavable moiety, and reactive group, or salt thereof
WO2018215937A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Novartis Ag Interleukin-7 antibody cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer
WO2018215938A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
AU2018274216A1 (en) 2017-05-24 2019-12-12 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
WO2019014044A1 (en) 2017-07-12 2019-01-17 The Johns Hopkins University ZNT8 AUTO-ANTIGEN BASED ON PROTEOLIPOSOMES FOR THE DIAGNOSIS OF TYPE 1 DIABETES
CN111183156A (zh) 2017-07-31 2020-05-19 莱蒂恩技术公司 用于用抗cd19/cd20免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
US20190048049A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 Cerenis Therapeutics Holding Sa Cargomers
US10501539B2 (en) 2017-09-15 2019-12-10 Lentigen Technology Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD19 immunotherapy
US11707522B2 (en) 2017-10-13 2023-07-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human antibodies to Tn antigen
EP3697426B1 (en) 2017-10-16 2023-07-26 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-cd22 immunotherapy
JP7381478B2 (ja) 2017-10-23 2023-11-15 マブリンク ビオシオンス 単一分子量ポリサルコシンを含むリガンド－薬物－複合体
EP3700933A1 (en) 2017-10-25 2020-09-02 Novartis AG Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
EP3717518A1 (en) 2017-12-01 2020-10-07 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-liv1 antibodies for the treatment of breast cancer
US11180552B2 (en) 2017-12-01 2021-11-23 Seagen Inc. CD47 antibodies and uses thereof for treating cancer
WO2019125732A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
CN111954677A (zh) 2017-12-20 2020-11-17 莱蒂恩技术公司 用于用免疫治疗来治疗hiv/aids的组合物和方法
WO2019129054A1 (zh) 2017-12-27 2019-07-04 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
JP7438953B2 (ja) 2018-02-01 2024-02-27 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 完全ヒト化抗ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）の単鎖抗体およびその応用
WO2019180150A1 (en) 2018-03-22 2019-09-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for modulating innate lymphoid cell activity, antibody drug conjugates and uses in therapy
MA52135A (fr) 2018-03-23 2021-01-27 Seagen Inc Utilisation de conjugués anticorps-médicament comprenant des agents de rupture de tubuline pour traiter une tumeur solide
WO2019184909A1 (zh) 2018-03-27 2019-10-03 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途
BR112020018868A2 (pt) 2018-03-28 2021-01-26 Axon Neuroscience Se métodos baseados em anticorpo para detectar e tratar doença de alzheimer
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
AU2019272844A1 (en) 2018-05-22 2021-01-21 Barinthus Biotherapeutics North America, Inc. Improved methods of manufacturing peptide-based vaccines
AR126019A1 (es) 2018-05-30 2023-09-06 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
BR112020024351A2 (pt) 2018-06-01 2021-02-23 Novartis Ag moléculas de ligação contra bcma e usos das mesmas
CN112218663A (zh) 2018-06-01 2021-01-12 卫材R&D管理有限公司 剪接调节抗体-药物缀合物及其使用方法
CA3103151A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 Ajinomoto Co., Inc. Compound having affinity substance to antibody and bioorthogonal functional group, or salt thereof
GB201809746D0 (en) 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
AU2019285353A1 (en) 2018-06-14 2021-01-07 Ajinomoto Co., Inc. Compound comprising substance having affinity for antibody, cleavage site and reactive group, or salt thereof
WO2020010079A2 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Amgen Inc. Anti-steap1 antigen-binding protein
EP3824287A1 (en) 2018-07-20 2021-05-26 Pierre Fabre Médicament Receptor for vista
CN113260630B (zh) 2018-09-20 2024-05-24 莱蒂恩技术公司 用于用抗cd123免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
JP2022502043A (ja) 2018-09-26 2022-01-11 レンティジェン・テクノロジー・インコーポレイテッドLentigen Technology, Inc. 抗ｃｄ１９／ｃｄ２２免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
AU2019355926A1 (en) 2018-10-03 2021-04-22 Barinthus Biotherapeutics North America, Inc. Aromatic ring substituted amphiphilic polymers as drug delivery systems
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
JPWO2020090979A1 (ja) 2018-10-31 2021-09-24 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
AU2019387377A1 (en) 2018-11-30 2021-06-17 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD38 immunotherapy
TW202039007A (zh) 2018-12-13 2020-11-01 日商衛材R&D企管股份有限公司 荷伯希二烯(herboxidiene)剪接調節抗體-藥物結合物及其使用方法
AU2020219732A1 (en) 2019-02-05 2021-08-05 Seagen Inc. Anti-CD228 antibodies and antibody-drug conjugates
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
US11969443B2 (en) 2019-03-06 2024-04-30 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with self-driving chimeric antigen receptors
JP2022527151A (ja) 2019-03-20 2022-05-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア クローディン６抗体及び薬物複合体
WO2020191344A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 The Regents Of The University Of California Claudin-6 bispecific antibodies
CN113874392A (zh) 2019-03-28 2021-12-31 丹尼斯科美国公司 工程化抗体
AU2020260131A1 (en) 2019-04-17 2021-11-18 Barinthus Biotherapeutics North America, Inc. Compositions and methods of manufacturing star polymers for ligand display and/or drug delivery
AU2020263959A1 (en) 2019-04-24 2021-11-25 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
US20230071196A1 (en) 2019-05-21 2023-03-09 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
SG11202111281TA (en) 2019-05-21 2021-12-30 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
CN114364801B (zh) 2019-05-30 2024-04-19 莱蒂恩技术公司 用于用抗bcma免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
TW202112354A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 遮蔽抗體調配物
WO2020247574A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Seattle Genetics, Inc. Methods of purifying masked antibodies
WO2021003297A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind egfrviii and their use
WO2021016233A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Seagen Inc. Humanized anti-liv1 antibodies for the treatment of cancer
EP4031578A1 (en) 2019-09-18 2022-07-27 Novartis AG Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies
TW202124446A (zh) 2019-09-18 2021-07-01 瑞士商諾華公司 與ｅｎｔｐｄ２抗體之組合療法
JP2022550816A (ja) 2019-10-04 2022-12-05 シージェン インコーポレイテッド 抗ｐｄ－ｌ１抗体および抗体－薬物コンジュゲート
WO2021066869A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 TAE Life Sciences Antibody compositions comprising fc mutations and site-specific conjugation properties
EP3812008A1 (en) 2019-10-23 2021-04-28 Gamamabs Pharma Amh-competitive antagonist antibody
WO2021116119A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity to her4 and uses thereof
WO2021142086A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Synthis Therapeutics, Inc. Alk5 inhibitor conjugates and uses thereof
WO2021202473A2 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Danisco Us Inc Engineered antibodies
US20230167193A1 (en) 2020-05-01 2023-06-01 Novartis Ag Immunoglobulin variants
US20230242647A1 (en) 2020-05-01 2023-08-03 Novartis Ag Engineered immunoglobulins
WO2021224186A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Institut Curie New pyridine derivatives as radiosensitizers
EP4149558A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to treat cutaneous t-cell lymphomas and tfh derived lymphomas
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
JP2023528412A (ja) 2020-06-05 2023-07-04 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 抗ｂｃｍａ抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
JPWO2021251358A1 (pl) 2020-06-09 2021-12-16
AU2021296423A1 (en) 2020-06-22 2023-02-02 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with TSLPR-CD19 or TSLPR-CD22 immunotherapy
TW202221034A (zh) 2020-08-04 2022-06-01 美商西根公司 抗ｃｄ２２８抗體和抗體－藥物共軛體
EP3970752A1 (en) 2020-09-17 2022-03-23 Merck Patent GmbH Molecules with solubility tag and related methods
AU2021347147A1 (en) 2020-09-22 2023-05-18 Barinthus Biotherapeutics North America, Inc. Compositions and methods of manufacturing amphiphilic block copolymers that form nanoparticles in situ
JP2023543026A (ja) 2020-09-28 2023-10-12 シージェン インコーポレイテッド がんの処置のためのヒト化抗ｌｉｖ１抗体
IL301769A (en) 2020-10-01 2023-05-01 Abionyx Pharma Sa Methods for treating eye diseases by using complexes based on lipid-binding proteins
CA3195623A1 (en) 2020-10-19 2022-04-28 Geoffrey Martin Lynn Star polymer drug conjugates
US20230303604A1 (en) 2020-10-20 2023-09-28 Institut Curie Metallic trans-(n-heterocyclic carbene)-amine-platinum complexes and uses thereof for treating cancer
CA3171093A1 (en) 2020-11-05 2022-05-12 Dina SCHNEIDER Compositions and methods for treating cancer with anti-cd19/cd22 immunotherapy
IL302569A (en) 2020-11-06 2023-07-01 Novartis Ag CD19 binding molecules and their uses
WO2022147463A2 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Alamar Biosciences, Inc. Binder molecules with high affinity and/ or specificity and methods of making and use thereof
EP4279502A1 (en) 2021-01-18 2023-11-22 Ajinomoto Co., Inc. Compound or salt thereof, and antibody obtained therefrom
CN116829573A (zh) 2021-01-18 2023-09-29 味之素株式会社 化合物或其盐、及由它们得到的抗体
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
JP2024506381A (ja) 2021-02-16 2024-02-13 ヴァクシテック ノース アメリカ， インコーポレイテッド 両親媒性ペプチドに基づく自己集合ナノ粒子
WO2022192403A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
CA3212822A1 (en) 2021-03-11 2022-09-15 Ajinomoto Co., Inc. Compound or salt thereof, and antibody obtained by using the same
WO2022189618A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Institut Curie Nitrogen-containing heterocycles as radiosensitizers
WO2022196675A1 (ja) 2021-03-16 2022-09-22 味の素株式会社 複合体またはその塩、およびその製造方法
CA3208117A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Torsten HECHLER B-lymphocyte specific amatoxin antibody conjugates
EP4321180A1 (en) 2021-03-30 2024-02-14 LegoChem Biosciences, Inc. Antibody-drug conjugate including antibody against human cldn18.2, and use thereof
EP4319820A1 (en) 2021-04-10 2024-02-14 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
IL307670A (en) 2021-04-15 2023-12-01 Abionyx Pharma Sa Use of lipid-binding protein-based complexes in organ preservation solutions
CA3216459A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
TW202320857A (zh) 2021-07-06 2023-06-01 美商普方生物製藥美國公司 連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法
EP4370211A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Seagen Inc. Antibody masking domains
WO2023049825A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
CA3234692A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Ajinomoto Co., Inc. Conjugate of antibody and functional substance or salt thereof, and antibody derivative and compound used in production of the same or salts thereof
WO2023089314A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Oxford Biotherapeutics Limited Pharmaceutical combinations
WO2023092099A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
US20230227545A1 (en) 2022-01-07 2023-07-20 Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc. Materials and methods of il-1beta binding proteins
US11590169B1 (en) 2022-03-02 2023-02-28 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD123 immunotherapy
US20230338424A1 (en) 2022-03-02 2023-10-26 Lentigen Technology, Inc. Compositions and Methods for Treating Cancer with Anti-CD123 Immunotherapy
WO2023169896A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Astrazeneca Ab BINDING MOLECULES AGAINST FRα
WO2023170216A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Astrazeneca Ab A SCORING METHOD FOR AN ANTI-FRα ANTIBODY-DRUG CONJUGATE THERAPY
WO2023194797A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Abionyx Pharma Sa Methods for treating eye diseases using lipid binding protein-based complexes
US20230355792A1 (en) 2022-04-07 2023-11-09 Heidelberg Pharma Research Gmbh Methods of improving the therapeutic index
WO2023209568A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18
WO2024013727A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Janssen Biotech, Inc. Material and methods for improved bioengineered pairing of antigen-binding variable regions
WO2024015953A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Danisco Us Inc. Methods for producing monoclonal antibodies
WO2024026107A2 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Lentigen Technology, Inc. Chimeric antigen receptor therapies for treating solid tumors
US20240075142A1 (en) 2022-08-26 2024-03-07 Lentigen Technology, Inc. Compositions and Methods for Treating Cancer with Fully Human Anti-CD20/CD19 Immunotherapy
WO2024052503A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to ltbp2 and uses thereof
WO2024064714A2 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Seagen Inc. Antibodies that bind cd228
WO2024092030A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Vaccitech North America, Inc. Self-assembling nanoparticles
WO2024092028A2 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Vaccitech North America, Inc. Combination treatment regimes for treating cancer
US20240165257A1 (en) 2022-11-01 2024-05-23 Heidelberg Pharma Research Gmbh Anti-gucy2c antibody and uses thereof
WO2024097816A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 Seagen Inc. Anti-avb6 antibodies and antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2566271B1 (fr) * 1984-06-20 1986-11-07 Sanofi Sa Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention
US5055561A (en) * 1985-11-19 1991-10-08 The Johns Hopkins University Protein label and drug delivery system
US4981979A (en) * 1987-09-10 1991-01-01 Neorx Corporation Immunoconjugates joined by thioether bonds having reduced toxicity and improved selectivity
US5002883A (en) * 1987-10-30 1991-03-26 Abbott Laboratories Covalent attachment of antibodies and antigens to solid phases using extended length heterobifunctional coupling agents
FI102355B (fi) * 1988-02-11 1998-11-30 Squibb Bristol Myers Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjug aattien valmistamiseksi
US5066490A (en) * 1988-06-01 1991-11-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Protein crosslinking reagents cleavable within acidified intracellular vesicles
US5024834A (en) * 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
CA2016584C (en) * 1989-05-17 1999-06-29 Robert S. Greenfield Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production
US5208323A (en) * 1989-08-10 1993-05-04 Universite Laval Coupling of an anti-tumor to an antibody using glutaraldehyde preactivated anti-tumor agent
AU656518B2 (en) * 1990-02-20 1995-02-09 Coulter Corporation Improved antibody-enzyme direct conjugates and method of making same
US5137877B1 (en) * 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
US5196522A (en) * 1990-11-01 1993-03-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Anthracycline analogues bearing latent alkylating substituents

Also Published As

Publication number Publication date
EG20406A (en) 1999-02-28
MX9300298A (es) 1993-12-01
ZA93444B (en) 1993-07-21
DE69333800T2 (de) 2006-03-02
CN1180711A (zh) 1998-05-06
BG61899B1 (bg) 1998-09-30
EP0554708A1 (en) 1993-08-11
HUT68345A (en) 1995-06-28
CA2087286C (en) 2004-04-06
CN1074684A (zh) 1993-07-28
TW213921B (pl) 1993-10-01
UY23541A1 (es) 1993-06-28
HU9300156D0 (en) 1993-04-28
US5622929A (en) 1997-04-22
CN1155620C (zh) 2004-06-30
PL172837B1 (pl) 1997-12-31
NO930189D0 (no) 1993-01-21
ATE294592T1 (de) 2005-05-15
IL104475A0 (en) 1993-05-13
ES2240959T3 (es) 2005-10-16
US5606017A (en) 1997-02-25
DK0554708T3 (da) 2005-07-18
EP0554708B1 (en) 2005-05-04
US5708146A (en) 1998-01-13
NZ245725A (en) 1995-08-28
PL172827B1 (pl) 1997-12-31
CN1040540C (zh) 1998-11-04
NO930189L (no) 1993-07-26
CZ297409B6 (cs) 2006-12-13
MY110526A (en) 1998-07-31
PL172715B1 (pl) 1997-11-28
PL172828B1 (pl) 1997-12-31
FI930240A0 (fi) 1993-01-21
FI930240A (fi) 1993-07-24
EP0554708B9 (en) 2005-07-27
AU3188193A (en) 1993-07-29
CA2087286A1 (en) 1993-07-24
RO112618B1 (ro) 1997-11-28
PL172824B1 (pl) 1997-12-31
OA09859A (en) 1994-08-15
CZ5793A3 (en) 1994-01-19
CN1207946A (zh) 1999-02-17
DE69333800D1 (de) 2005-06-09
AU666903B2 (en) 1996-02-29
JPH0625012A (ja) 1994-02-01
PL297514A1 (en) 1993-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5606017A (en) Thioether conjugates
US6512101B1 (en) Branched hydrazone linkers
RU2753416C2 (ru) Новые конъюгаты аманитина
AU617380B2 (en) Drug-monoclonal antibody conjugates
EP0457250B1 (en) Novel bifunctional linking compounds, conjugates and methods for their production
US6214345B1 (en) Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
EP0328147B1 (en) Anthracycline immunoconjugates having a novel linker and methods for their production
EP0294294A2 (en) Amine derivatives of anthracycline antibiotics
CN107614488B (zh) 新型亲水连接体和其在配体-药物共轭偶联物上的应用
CA2239183C (en) Branched hydrazone linkers

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20090122