CN107614488B - 新型亲水连接体和其在配体-药物共轭偶联物上的应用 - Google Patents

新型亲水连接体和其在配体-药物共轭偶联物上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供亲水性链接体。此链接体用在配体‑药物偶联物上，如抗体‑药物偶联物上连接药物到细胞结合配体。配体‑药物偶联物包含能够同特定细胞密度结合的细胞‑结合配体和通过亲水链接体链接的药物。亲水链接体包含一个或多个使链接体亲水的亲水基团。此亲水连接体同时在两末端包含能够分别偶联药物和细胞‑结合配体的功能基团。

Description

新型亲水连接体和其在配体-药物共轭偶联物上的应用
技术领域
本发明描述了一类可应用于连接药物(如细胞毒素分子)和细胞结合配体(如抗体)的新型亲水连接体。应用此类亲水连接体可以提高细胞结合配体－药物共轭偶联物(如抗体-药物共轭偶联物)的效能与治疗指数，特别当其用作非可断裂型连接体时效果更加显著。本发明还描述了此类新型亲水连接体和相应的配体-药物共轭偶联物的制备方法。
技术背景
为了降低药物的人体系统毒性，人们利用抗体-药物共轭偶联物(ADCs)或其它类型的配体-药物共轭偶联物的自我导向作用，获得了一类有效的靶向转递细胞毒性分子进入肿瘤细胞的肿瘤靶向药物。这种集单克隆抗体的靶向特异性与细胞毒性小分子的高效优点于一身的抗体-药物共轭偶联物三十年来受到了强烈的追捧。最近两种ADC药物，治疗霍杰金淋巴瘤的brentuximabvedotin及治疗转移性乳腺癌的ado－trastuzumabemtansine的批准上市将该领域的研究热度提高到了一个新的水平。生物科技或制药公司在抗体-药物共轭偶联物领域开展项目变得普通起来。
但是，即使是ADC药物，仍然存在一个老问题。众所周知，癌症病人在经过多次化疗之后会对药物产生抗药性(Szakacs et al.Nat Rev Drug Discov.2006,5,219–34)。肿瘤细胞产生抗药性有多种机制，其中之一就是通过一种重要的细胞膜泵，多重抗药性蛋白(MDR)，将化疗药物转运出细胞。一种普遍存在的MDR是MDR1，也被称作P-糖蛋白1(PGP1)或ATP-结合盒式亚族B蛋白1(ABCB1),它也是最常见的抗癌药物外排泵。MDR1的表达与其对化疗反应不佳之间的相关性已在多种类型的癌症中得到了证实(Takara et al.Curr PharmDes 2006,12,273–86；Leonard et al.Oncologist 2003,8,411–24)。然而，绝大多数已在ADC药物中使用的细胞毒性小分子如美登素、海兔毒素、卡奇霉素、阿霉素、紫杉烷类和倍癌霉素都是MDR1转运蛋白的底物，许多ADC药物在MDR1表达的细胞中活性很低(Takeshita etal.Br J Haematol.2009,146,34–43；Hamann et al.Bioconjug Chem.2005,16,346–53)。
MDR1通过两种机制产生对化疗药物的抗药性。第一种，将从胞外空间扩散进细胞质膜的药物排出，在这种情况下化合物被阻止进入细胞质；第二种，将进入细胞质的化合物排出细胞外(Sharom.Pharmacogenomics.2008,9,105–27；Lehne.Curr DrugTargets.2000,1,85–99)。由于ADC药物是通过抗原介导的内吞作用传递细胞毒性小分子到细胞质的，所以第一种类型的抗药性是不会发生的(Hamann et al.Bioconjug Chem.2005,16,346–53；Guillemard et al.Oncogene.2004,23,3613–21)。但是，在共轭偶联物进入细胞后被裂解成片段，细胞毒性药物小分子仍然会受第二种机制的作用，从细胞质排出到胞外空间。
对于ADC药物来说，MDR1不仅降低细胞毒性小分子药物的效力，还降低药物治疗指数，因为细胞毒性小分子一旦被MDR1转运出胞外空间，将会伤害正常健康细胞，严重地损害靶向抗肿瘤治疗的效果。
因此，即便是抗体-药物共轭偶联物，仍然有耐药性问题需要克服。耐药性的克服将有助于提高抗体-药物共轭偶联物的效力和治疗窗口，并使其在更高的水平上达到靶向抗肿瘤治疗的预期目标。
发明总结
本发明通过应用包含多种极性基团或带电官能团的亲水连接体来提高细胞结合配体-药物共轭偶联物的效力和治疗指数。以亲水连接体制备的配体-药物共轭偶联物对杀灭肿瘤细胞非常有效。
本发明中的亲水连接体可以表达为结构式(I)：
Figure BDA0001391351060000021
其中：
V是一种极性或带电基团；结构式(I)中合适的极性或带电基团包括但不限于：氨基[-N(R)-],脲[-N(R1)CON(R2)-或-N(CONR1R2)-],羧基[-Q(COOH)-或–Q(ZCOOH)-],氨基甲酸酯基{[-N(R)COO-]或[-N(COOR)-]},胍[-N(R1)C＝N(COOR2)N(R3)-],磺酰胺[-N(SO2R)-],砜(-SO2-),亚砜(-SO-),磺酸[-Q(ZSO2OH)-],氨基磺酸[-N(SO2OH)-],膦酸酯{-Q[ZPO(OR)2]-},膦酸{-Q[ZPO(OH)2]-},氨基磷酸{-N[PO(OH)2]-},二氨基磷酸{-N[PO(NH2)(OH)]-},和三氨基磷酸{-N[PO(NH2)2]-},其中R,R1,R2和R3各自独立地为H或者C1-C8烷基；Q是CH或N；Z是1-5亚甲基单元。
U是一种能以共价键和细胞毒性小分子药物结合的活性官能团；此活性官能团包括但不限于：硫醇、二硫化物、氨基、羧基、醛、酮、马来酰亚胺、卤代乙酰基、烯基、炔基、肼和羟基。连接细胞毒性小分子的共价键可以是二硫键、硫醚键、硫酯键、酰胺键、酯键、碳-氮键、碳碳键、肼键、酰肼键、腙键、醚键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键。
W是一种能以共价键和细胞结合配体(例如单克隆抗体)结合的活性官能团。该官能团包括两类。第一类是指能以共价键和细胞结合配体上的氨基结合的官能团，此类包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-巯基琥珀酰亚胺酯酯类、硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酰氯、酸酐、磺酰氯、氯甲酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、醛、酮。共价键可以是酰胺键、氨基甲酸键、脲键或其他类型的碳氮键。第二类是指能以共价键和细胞结合配体上的巯基结合的官能团，此类包括但不限于：二硫化物如吡啶二硫化物和硝基吡啶二硫化物、马来酰亚胺、酰氯、卤代乙酰基如碘乙酰胺和溴乙酰胺、烯基吡啶、异氰酸酯、异硫氰酸酯。共价键可以是二硫键、硫醚键、硫代氨基甲酸酯键，二硫代氨基甲酸酯键或硫酯键。
X是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
Y是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
n是一个1至100之间的整数。若n>1，结构式(I)重复括号中的V、X、Y的数目是各自独立的，可以互不相同。n通常是从1到50之间的整数。更优选的是从1到10，最好是从1到4之间的整数。
另一个方面，本发明涉及新型的配体-药物共轭偶联物。该共轭偶联物包括一种结合于特定细胞群的细胞结合配体、一种高效的细胞毒性小分子药物和一种将配体和小分子连接在一起的亲水连接体。本发明中的配体-药物共轭偶联物和含非亲水连接体的配体-药物共轭偶联物相比具有更高的有效性和安全性。
本发明中的抗体-药物共轭偶联物可以表达为结构式(II)：
Figure BDA0001391351060000031
其中：
D是细胞毒性药物小分子；
L是细胞-结合配体；
V是一种极性或带电基团；在结构式(II)中合适的极性或带电基团包括但不限于：氨基[-N(R)-],脲[-N(R1)CON(R2)-或-N(CONR1R2)-],羧基[-Q(COOH)-或–Q(ZCOOH)-],氨基甲酸酯基{[-N(R)COO-]或[-N(COOR)-]},胍[-N(R1)C＝N(COOR2)N(R3)-],磺酰胺[-N(SO2R)-],砜(-SO2-),亚砜(-SO-),磺酸[-Q(ZSO2OH)-],氨基磺酸[-N(SO2OH)-],膦酸酯{-Q[ZPO(OR)2]-},膦酸{-Q[ZPO(OH)2]-},氨基磷酸{-N[PO(OH)2]-},二氨基磷酸{-N[PO(NH2)(OH)]-},和三氨基磷酸{-N[PO(NH2)2]-},其中R,R1,R2和R3各自独立地为H或者C1-C8烷基；Q是CH或N；Z是1-5亚甲基单元。
U’是一种能以共价键和细胞毒性小分子药物结合的活性官能团；此活性官能团包括但不限于：硫醇、二硫化物、氨基、羧基、醛、酮、马来酰亚胺、卤代乙酰基、烯基、炔基、肼和羟基。连接细胞毒性小分子药物的共价键可以是二硫键、硫醚键、硫酯键、酰胺键、酯键、碳-氮键、碳碳键、肼键、酰肼键、腙键、醚键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键。
W’是一种能以共价键和细胞结合配体(例如单克隆抗体)结合的活性官能团。该官能团包括两类。第一类是指能以共价键和细胞结合配体上的氨基结合的官能团，此类包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-巯基琥珀酰亚胺酯酯类、硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酰氯、酸酐、磺酰氯、氯甲酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、醛、酮。共价键可以是酰胺键、氨基甲酸键、脲键或其他类型的碳氮键。第二类是指能以共价键和细胞结合配体上的巯基结合的官能团，此类包括但不限于：二硫化物如吡啶二硫化物和硝基吡啶二硫化物、马来酰亚胺、酰氯、卤代乙酰基如碘乙酰胺和溴乙酰胺、烯基吡啶、异氰酸酯、异硫氰酸酯。共价键可以是二硫键、硫醚键、硫代氨基甲酸酯键，二硫代氨基甲酸酯键或硫酯键。
X是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
Y是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
n是一个1至100之间的整数。若n>1，结构式(I)重复括号中的V、X、Y的数目是各自独立的，可以互不相同。n通常是从1到50之间的整数。更优选的是从1到10，最好是从1到4之间的整数。
附图说明
图1显示了在靶向阳性异种移植肿瘤模型上三个抗体-药物共轭偶联物的体内试验结果。
具体实施方式
虽然MDR1外排多种化合物，但一般而言，MDR1优先运送疏水性化合物，大多数MDR1的底物是疏水性的(Looet al.J Membr Biol.2005,206,173–85)。亲水性化合物通常对MDR1介导的外排敏感性较低，可以大部分保留在细胞内。因此，在药物分子中引入亲水基团通常被用作是一种抗击MDR1、克服多重耐药性的方法(Szokacs et al.Nature Reviews.5,219-235,2006；Kovtunet al.Cancer Res.2010,70,2528–2537；Zhao et al.J MedChem.2011,54,3606–3623)。本发明通过使用亲水连接体构建抗体-药物共轭偶联物来解决多药耐药性的问题。亲水连接体赋予它们克服MDR1介导的耐药性的能力。当亲水连接体为不可断裂连接体时，其效果特别明显，原因在于亲水连接体将总是连接在细胞毒性小分子药物上(Szakacs et al.Nature Reviews Drug Discovery.2006,5,219-234)。连接体的亲水性可以永久地使小分子药物对MDR1介导的外排更具抗性，使它保留在靶细胞内并发挥其细胞毒性作用。
此外，高度亲水的连接体也可以避免一些抗体－药物共轭偶联物由于连接体或/和细胞毒性小分子药物的疏水性而导致的聚集问题(Jeffrey et al.J Med Chem.2005,48,1344–1358)。通过增加抗体-药物共轭偶联物的溶解度，高度亲水的连接体有效地减少聚集。此外，它还允许在每种抗体上接更多的药物，从而进一步提高抗体-药物共轭偶联物的效力(Zhao et al.J Med Chem.2011,54,3606–3623)。
亲水连接体
本发明通过使用含各种极性或带电基团的亲水连接体，提高了配体-药物共轭偶联物的效力和治疗指数。由这样的亲水连接体制成的配体-药物共轭偶联物，如抗体－药物共轭偶联物对于多药耐药肿瘤细胞是非常有效的。
本发明亲水连接体的结构通式如(I)：
Figure BDA0001391351060000051
其中：
V是极性或带电基团；结构式(I)中合适的极性或带电基团包括但不限于氨基[-N(R)-],脲[-N(R1)CON(R2)-或-N(CONR1R2)-],羧基[-Q(COOH)-或–Q(ZCOOH)-],氨基甲酸酯基{[-N(R)COO-]或[-N(COOR)-]},胍[-N(R1)C＝N(COOR2)N(R3)-],磺酰胺[-N(SO2R)-],砜(-SO2-),亚砜(-SO-),磺酸[-Q(ZSO2OH)-],氨基磺酸[-N(SO2OH)-],膦酸酯{-Q[ZPO(OR)2]-},膦酸{-Q[ZPO(OH)2]-},氨基磷酸{-N[PO(OH)2]-},二氨基磷酸{-N[PO(NH2)(OH)]-},和三氨基磷酸{-N[PO(NH2)2]-},其中R,R1,R2和R3各自独立地为H或者C1-C8烷基；Q是CH或N；Z是1-5亚甲基单元。
U是一种能以共价键和细胞毒性小分子药物结合的活性官能团；此活性官能团包括但不限于：硫醇、二硫化物、氨基、羧基、醛、酮、马来酰亚胺、卤代乙酰基、烯基、炔基、肼和羟基。连接细胞毒性小分子药物的共价键可以是二硫键、硫醚键、硫酯键、酰胺键、酯键、碳-氮键、碳碳键、肼键、酰肼键、腙键、醚键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键。
W是一种能以共价键和细胞结合配体(例如单克隆抗体)结合的活性官能团。该官能团包括两类。第一类是指能以共价键和细胞结合配体上的氨基结合的官能团，此类包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-巯基琥珀酰亚胺酯酯类、硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酰氯、酸酐、磺酰氯、氯甲酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、醛、酮。共价键可以是酰胺键、氨基甲酸键、脲键或其他类型的碳氮键。第二类是指能以共价键和细胞结合配体上的巯基结合的官能团，此类包括但不限于：二硫化物如吡啶二硫化物和硝基吡啶二硫化物、马来酰亚胺、酰氯、卤代乙酰基如碘乙酰胺和溴乙酰胺、烯基吡啶、异氰酸酯、异硫氰酸酯。共价键可以是二硫键、硫醚键、硫代氨基甲酸酯键，二硫代氨基甲酸酯键或硫酯键。
X是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
Y是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
n是一个1至100之间的整数。若n>1，结构式(I)重复括号中的V、X、Y的数目是各自独立的，可以互不相同。
作为本发明的示例性实施方案，化合物(1)至(15)是可用于制备本发明中配体-药物偶联物的一些亲水连接体。
Figure BDA0001391351060000061
化合物1
在化合物(1)中，连接体中间的脲基使其具有亲水性。连接体左端的马来酰亚胺基团为连接配体或小分子药物的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯，经常用作活化羧酸的反应性官能团，可以与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000062
化合物2
在化合物(2)中，连接体中间的脲基使其具有亲水性。使用连接体左端的马来酰亚胺基团作为连接点，连接于配体或药物分子。马来酰亚胺基团容易与配体上硫醇基团反应或与含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000071
化合物3
在化合物(3)中，连接体中间的脲基使其具有亲水性。连接体左端的溴乙酰胺基团是连接于配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体或含硫醇的药物上的硫醇基团反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可以与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000072
化合物4
在化合物(4)中，连接体中间的砜基使其具有亲水性。连接体左端的马来酰亚胺基团是连接配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇反应药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000073
化合物5
在化合物(5)中，连接体中间的砜基使其具有亲水性。连接体左端的烯基是连接于配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可以与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000074
化合物6
在化合物(6)中，连接体中间的磺酰胺基使其具有亲水性。连接体左端的马来酰亚胺基团是连接配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含有硫醇药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000081
化合物7
在化合物(7)中，连接体中间的脲基使其具有亲水性。连接体左端的烯基是连接于配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右侧的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000082
化合物8
在化合物(8)中，连接体中间的脲基团和磺酰胺基团使其具有亲水性。连接体左端的烯基是连接到配体或药物分子的连接点。它容易与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000083
化合物9
在化合物(9)中，连接体中间的甘氨酸基团使其具有亲水性。连接体左端的马来酰亚胺基团是连接配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体或含硫醇的药物上的硫醇基团反应形成稳定的硫醚键。接头右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000091
化合物10
在化合物(10)中，连接体中间的氨基磺酸基使其具有亲水性。连接体左端的碘乙酰胺基团是连接于配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000092
化合物11
在化合物(11)中，连接体中间的氨基磷酸基使其具有亲水性。连接体左端的马来酰亚胺基团是连接配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体或含硫醇的药物上的硫醇基团反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000093
化合物12
在化合物(12)中，连接体中间的氨基磷酸基团使其具有亲水性。连接体左端的溴乙酰胺基团是连接于配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000094
化合物13
在化合物(13)中，连接体中间的砜基和酰胺基使其具有亲水性。连接体左端的溴乙酰胺基团是连接于配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
Figure BDA0001391351060000101
化合物14
在化合物(14)中，连接体中间的砜基使其具有亲水性。连接体左端的马来酰亚胺基团是连接配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体或含硫醇的药物上的硫醇基团反应形成稳定的硫醚键。连接体右端的烯基也是连接于配体或药物分子的连接点。它可以很容易地与配体上的硫醇基团或含硫醇的药物反应形成稳定的硫醚键。
Figure BDA0001391351060000102
化合物15
在化合物(15)中，连接体中间的脲基和酰胺基使其具有亲水性。连接体左端的二硫键是连接于配体或药物分子的连接点。二硫键容易与配体或含硫醇的药物上的硫醇基团反应形成新的二硫键。连接体右端的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)也用于连接配体或药物分子。NHS酯可与配体或药物上的氨基反应形成稳定的酰胺键。
更多的亲水连接体结构示例如化合物[(16)至(26)]：
Figure BDA0001391351060000103
化合物16
Figure BDA0001391351060000104
化合物17
Figure BDA0001391351060000111
化合物18
Figure BDA0001391351060000112
化合物19
Figure BDA0001391351060000113
化合物20
Figure BDA0001391351060000114
化合物21
Figure BDA0001391351060000115
化合物22
Figure BDA0001391351060000116
化合物23
Figure BDA0001391351060000121
化合物24
Figure BDA0001391351060000122
化合物25
Figure BDA0001391351060000123
化合物26
上述示例性实施例仅用于说明本发明，并不旨在限制本发明的范围。事实上，本发明旨在涵盖所有替代方案,修改和这些实施例的等同物。不应该理解为本发明仅限于所示示例。
亲水连接体的制备
本发明的另一个方面是亲水连接体的制备。本专利的亲水连接体可以通过多种合成方法制备。举例来说，亲水连接体的一般合成路线如方案示意图(1)到(11)所示：
在方案1中，制备具有脲基的亲水连接体。第一步，三光气与氨基反应来引入异氰酸酯基团。接下来，异氰酸酯与另一个氨基结合很轻易在亲水连接体中间形成一个脲基团。与此同时，在亲水连接体的左端引入一个马来酰亚胺基团。在最后一步，右端引入一个NHS基团。
Figure BDA0001391351060000131
示意图1
在方案2中，制备具有脲基基团的亲水连接体。第一步，用一个溴乙酰胺的衍生物来制备带氨基的化合物。接下来，用三光气与另一个带氨基的化合物反应生成异氰酸酯基团，它与第一步得到的溴乙酰胺衍生物反应，在亲水连接体的中部生成脲基。在合成中，连接体的左端引入了一个带溴的活性基团，最后一步在右端引入带NHS的活性基团。
Figure BDA0001391351060000141
示意图2
在方案3中，制备了具有磺基的亲水连接体。第一步，制备硫醚衍生物。接下来氧化，使亲水连接体中的硫醚基团转换为磺基。最后，两个反应官能团(碘乙酰胺和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000151
示意图3
在方案4中，用另一种方法制备带磺基的亲水连接体。第一步，制备硫醚衍生物。接下来氧化，使亲水连接体中的硫醚基团转换为磺基。最后，两个反应官能团(马来酰亚胺和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000152
示意图4
在方案5中，另外一种方法制备带磺基的亲水连接体。磺基在亲水连接体中间生成后，两个反应官能团(烯基团和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000161
示意图5
在方案6中，用另外一种方法制备带磺基的亲水连接体。第一步，制备硫醚衍生物。接下来氧化，使亲水连接体中的硫醚基团转换为磺基。最后，两个反应官能团(马来酰亚胺和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000162
示意图6
在方案7中，制备具有氨基磺酸基团的亲水连接体。在第一步，由简单的亲核取代生成所需要的胺。接下来，在亲水连接体中间通过氯磺酸引入氨磺酰基。最后，两个反应官能团(马来酰亚胺和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000171
示意图7
在方案8中，制备具有氨基磷酸基团的亲水连接体。在第一步，由简单的迈克尔加成反应生成所需要的胺。接下来，在亲水连接体中间，通过与磷酰氯或者氯磷酸二乙酯反应引入氨基磷酸基团。最后，两个反应官能团(马来酰亚胺和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000172
示意图8
在方案9中，制备具有磺酰胺基团的亲水连接体。在第一步，由简单的亲核取代产生所需要的胺，接下来，在亲水连接体中间通过甲磺酰氯引入磺酰胺基。最后，两个反应官能团(马来酰亚胺和NHS的活化酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000181
示意图9
在方案10中，制备具有脲基的亲水连接体。第一步，由简单的亲核取代生成所需要的胺，接下来，在亲水连接体中间引入通过与苄基氨基甲酸酯的反应生成脲基，苄基氨基甲酸酯由苄胺和对硝基苯甲酸反应所得。然后，两个反应官能团(马来酰亚胺和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000191
示意图10
在方案11中，制备一个含简单氨基的亲水连接体。第一步，用一个简单亲核取代反应制备所需要的胺，接下来，与甲醛或多聚甲醛进行还原胺化。最后，两个反应官能团(马来酰亚胺和NHS酯)分别在亲水连接体的末端被引入。
Figure BDA0001391351060000192
示意图11
上述示例性实施例仅用于说明本发明，并不旨在限制亲水连接体的合成方法，这些亲水连接体的制备也可以通过其他的不同方法实现。事实上，本发明旨在涵盖所有替代方案,修改和这些实施例的等同物。不应该理解为本发明仅限于所示示例。
配体-药物共轭偶联物
本发明的另一方面涉及新型的配体-药物共轭偶联物。本发明中的配体-药物共轭偶联物,包含与特定细胞群结合的细胞结合配体、具有高效力的细胞毒性小分子药物和连接细胞结合配体和小分子药物的亲水连接体。本发明的配体-药物共轭偶联物与含疏水性连接体的共轭偶联物相比具有更优越的功效和安全性。
本发明抗体-药物共轭偶联物的结构通式如(II)所示:
Figure BDA0001391351060000201
其中：
D是一种细胞毒性小分子药物；
L是一个可与细胞结合的配体；
V是一种极性或带电基团；结构式(II)中合适的极性或带电基团包括但不限于：氨基[-N(R)-],脲[-N(R1)CON(R2)-或-N(CONR1R2)-],羧基[-Q(COOH)-或–Q(ZCOOH)-],氨基甲酸酯基{[-N(R)COO-]或[-N(COOR)-]},胍[-N(R1)C＝N(COOR2)N(R3)-],磺酰胺[-N(SO2R)-],砜(-SO2-),亚砜(-SO-),磺酸[-Q(ZSO2OH)-],氨基磺酸[-N(SO2OH)-],膦酸酯{-Q[ZPO(OR)2]-},膦酸{-Q[ZPO(OH)2]-},氨基磷酸{-N[PO(OH)2]-},二氨基磷酸{-N[PO(NH2)(OH)]-},和三氨基磷酸{-N[PO(NH2)2]-},其中R,R1,R2和R3各自独立地为H或者C1-C8烷基；Q是CH或N；Z是1-5亚甲基单元。
U’是一种能以共价键和细胞毒性小分子药物结合的活性官能团；此活性官能团包括但不限于：硫醇、二硫化物、氨基、羧基、醛、酮、马来酰亚胺、卤代乙酰基、烯基、炔基、肼和羟基。连接细胞毒性小分子药物的共价键可以是二硫键、硫醚键、硫酯键、酰胺键、酯键、碳-氮键、碳碳键、肼键、酰肼键、腙键、醚键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键。
W’是一种能以共价键和细胞结合配体(例如单克隆抗体)结合的活性官能团。该官能团包括两类。第一类是指能以共价键和细胞结合配体上的氨基结合的官能团，此类包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-巯基琥珀酰亚胺酯酯类、硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酰氯、酸酐、磺酰氯、氯甲酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、醛、酮。共价键可以是酰胺键、氨基甲酸键、脲键或其他类型的碳氮键。第二类是指能以共价键和细胞结合配体上的巯基结合的官能团，此类包括但不限于：二硫化物如吡啶二硫化物和硝基吡啶二硫化物、马来酰亚胺、酰氯、卤代乙酰基如碘乙酰胺和溴乙酰胺、烯基吡啶、异氰酸酯、异硫氰酸酯。共价键可以是二硫键、硫醚键、硫代氨基甲酸酯键，二硫代氨基甲酸酯键或硫酯键。
X是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
Y是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
n是一个1至100之间的整数。若n>1，结构式(II)重复括号中的V、X、Y的数目是各自独立的，可以互不相同。n通常是从1到50之间的整数。更优选的是从1到10，最好是从1到4之间的整数。
细胞毒性药物
本发明配体-药物共轭偶联物中的药物部分是一个能用于癌症治疗的高效的细胞毒性药物。细胞毒性药物包括烷基化药物、抗代谢药物、抗微管蛋白剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素、DNA嵌入剂和其他任何有高细胞毒性并能导致细胞死亡的分子。典型的细胞毒性药物有氮芥类、蒽环类、长春碱类、丝裂霉素类、博来霉素类、核苷类似物、碟啶类、二炔烯(也称烯二炔、双环二炔烯或者双环烯二炔)、足叶草毒素、海兔毒素(包括阿里他汀)、美登木素生物碱、tubulysins、吡咯开苯并吖庚三烯(PBD)、紫衫类化合物。具体的细胞毒性小分子有氮芥、环磷酰胺、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、二甲磺酸丁酯、亚硝脲氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、甲基环己亚硝脲(MeCCNU)、福莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、米托唑胺、丝裂霉素、噻替哌、地吖醌(AZQ)、顺铂、卡铂、奥沙利铂、甲基苄肼、六甲蜜胺、奈达铂、沙铂、四硝酸酯三铂、苯达莫司汀、尿嘧啶氮芥、嘌呤类似物、嘧啶类似物、核苷类似物、核苷酸类似物、氨甲喋呤、培美曲塞、雷替曲塞、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、5-氮胞苷、福达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、喷司他丁、硫鸟嘌呤、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁、紫杉醇、多西他赛、多拉司他汀A、多拉司他汀B、多拉司他汀10、多拉司他汀13、多拉司他汀14、多拉司他汀15、多拉司他汀16、多拉司他汀17、多拉司他汀18、阿里他汀E、阿里他汀EB(AEB)、阿里他汀EFP(AEFP)、单甲基阿里他汀E(MMAE)、单甲基阿里他汀F(MMAF)、DM1、DM3、DM4、tubulysins、多卡米星、埃博霉素、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊甙，磷酸依托泊苷、伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、米托蒽醌、替尼泊苷、美巴龙、阿柔比星、新生霉素、普卡霉素、克拉霉素片螺素、玫瑰树碱、铝酸、安吖啶、丝裂霉素、博莱霉素、丝裂霉素A、丝裂霉素C、红比霉素、阿霉素、表阿霉素、去甲氧柔红霉素、克拉霉素A、吡喃阿霉素，放线菌素、放线菌素D、米托蒽醌、阿糖胞苷、甲基叶酸、二氯甲胺嘌呤、环氧长春碱、异长春碱、洋红霉素、氨基蝶呤、他利霉素、鬼臼毒素、丁酸、喜树碱、卡奇霉素、拉霉素、dynemicin、新制癌菌素(NCS)，卡达西叮，C1027，及其类似物。每个抗体-药物共轭偶联物中的药物分子的平均数目为1～8个，优选为2～6个。
根据配体-药物共轭偶联物的合成要求，可能需要修改小分子药物的结构，使其更可行、更方便地被用于制备共轭偶联体药物。例如在对药效和其他性能影响很小的情况下，可以在小分子药物的适当位置引入一个反应性官能团，如氨基、羟基、硫醇、或者羧基。
有些药物已经具有这些官能团，在制备配体-药物共轭偶联物时，可以利用来连接亲水连接体。例如，以下药物包含固有的可用于连接的氨基：丝裂霉素、海兔毒素、(包括阿里他汀)、红比霉素、阿霉素、氨嘌呤、博来霉素、放线菌素、塔利霉素、9-氨基喜树碱和阿糖胞苷。同样的，下面这些药物具有固有的羟基基团来连接亲水连接体，制备配体-药物共轭偶联物：紫杉醇、依托泊苷、足叶草毒素、喜树碱、拉霉素、长春花碱、长春新碱、阿霉素；下面药物或者包含固有的硫醇基团或者一个可以很容易转化为硫醇的官能团，可以用来制备共轭偶联物：拉霉素、卡奇霉素和6-巯基嘌呤。
优选地，用于本发明的配体-药物共轭偶联物中的细胞毒性药物的体外活性高于传统化疗的药物。这些细胞毒性药物最好是稳定的，且在水中溶解性好。
更优选地，本发明中使用的细胞毒性药物是美登素、海兔毒素(尤其是阿里他汀)、卡奇霉素、tubulysins、丝裂霉素、长春花生物碱、蒽环类药物、倍癌霉素、吡咯并苯二氮卓(PBD)。这些细胞毒性药物活性强，可用于本发明中的配体-药物共轭偶联物，如抗体-药物共轭偶联物。
美登素：
美登素是第一个从埃塞俄比亚美登木灌木树皮中分离的比传统化疗药物强100-1000倍的细胞毒性药物。美登素和美登素类生物碱通过与微管蛋白结合，从而有效抑制微管蛋白的有丝分裂。这个强有力的抑制可以导致细胞凋亡。
优选的美登素生物碱如式(III)所示，其中R1和R2各自独立为H或C1-C8烷基，m是1,2或3。硫醇基团用于和亲水连接体共价连接，后者又连接到本发明的配体-药物偶合物中的细胞结合配体，如抗体。优选的美登素生物碱包括DM1、DM3、DM4。
Figure BDA0001391351060000231
当美登素生物碱作为本发明的配体-药物共轭偶联物，如抗体-药物偶联物上的细胞毒性药物时，偶联物上的亲水连接体最好是不可断裂的。当抗体-药物偶联物与癌症细胞表面抗原结合，并由内吞作用进入细胞后，抗体部分在溶酶体中降解直到仅有一个氨基酸和亲水连接体相连。这个氨基酸是抗体连接到亲水连接体的连接点。最方便连接的氨基酸是赖氨酸和半胱氨酸。这样的氨基酸-连接体-美登素降解物，如赖氨酸-连接体-美登素降解物或者半胱氨-连接体-美登素降解物，通过与细胞质中的微管蛋白结合从而导致细胞凋亡。因为亲水连接体和相连的氨基酸的亲水性，这样的氨基酸-连接体-美登素降解物高度亲水，对MDR1具有高度抗性。
海兔毒素
海兔毒素第一次是从海兔Dolabella auricularia上被发现。海兔毒素和它的多肽类似物由于抑制微管蛋白依赖的GTP结合和微管动力学，而具有高效的抗肿瘤活性。高活性使海兔毒素包括阿里他汀，成为本发明中用于配体-药物共轭偶联物的非常有效的小分子药物。
用于本发明中配体-药物共轭偶联物的优选海兔毒素包括单甲基阿里他汀E(MMAE)和单甲基阿里他汀F(MMAF)。MMAE和MMAF都是可以通过N端(氨基)或者C端(羰基)连接到亲水连接体上。
当MMAF作为本发明的配体-药物共轭偶联物，如抗体-药物共轭偶联物上的细胞毒性药物时，偶联物上的亲水连接体最好是不可断裂的。当抗体-药物偶联物由于内吞作用进入细胞后，抗体部分在溶酶体中降解成包含MMAF、亲水连接体、和抗体的一个氨基酸残基的降解物。这个氨基酸是抗体连接到亲水连接体的连接点。例如，如果是半胱氨酸作为连接点氨基酸，那么三个部分构成的降解物就是半胱氨酸-连接体-MMAF。这个降解物通过与细胞质中的微管蛋白结合并阻断微管动力学导致细胞凋亡。这个代谢产物因为亲水性链接子和附着的氨基酸的缘故，具有高度亲水性，从而使它对MDR1具有抗性。
细胞结合配体：
本发明中的配体-药物共轭偶联物的配体部分是能选择性地结合于目标癌细胞的细胞结合分子。细胞结合配体可以是任何能特异性地与目标细胞的受体或抗原相结合的分子。细胞结合配体通过固有或人为引入的官能团如硫醇、氨基、醛基或羧基，与配体-药物共轭偶联物的连接体相连。细胞结合配体起到将连接的细胞毒性药物运送到癌细胞中的作用。与目标细胞结合后，配体-药物共轭偶联物首先内化进入细胞。它在细胞内被分解后，细胞毒性药物在细胞质中被释放进而杀死癌细胞。细胞结合配体可以是任何能与目标细胞的受体与抗原结合、复合或反应的蛋白或是蛋白类似物。能特异性地结合于癌细胞上的目标受体和抗原的免疫球蛋白或非免疫球蛋白都是可以的。例如，完整抗体、抗体片段、抗体模拟物、多肽、肽配体和非肽配体都可以应用于本发明的配体-药物共轭偶联物。
具体地，细胞结合配体包括以下分子：
(1)表面、嵌合、人源化和完整人源抗体：抗体，多克隆抗体，尤其是单克隆抗体是本发明中配体-药物共轭偶联物很好的细胞结合配体。表面、嵌合、人源化和完整人源抗体因在人体中极少产生免疫原性而成为优选的抗体。本发明的配体-药物共轭偶联物的抗体也可以是一个双功能抗体：其中一支对一个抗原位点具有特异性，而另一支能够识别不同的目标。或者，双功能抗体的每一支分别对相同癌细胞相关抗原的不同表位具有特异性。这样的双特异性使得配体-药物共轭偶联物在治疗上具有更多的益处。
本发明中的配体-药物共轭偶联物使用的特异性抗体包括，但不仅限于：抗HER2的单克隆抗体如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，抗CD20的单克隆抗体如利妥昔单抗，奥法木单抗，托西莫单抗和异贝莫单抗，抗CA125的单克隆抗体如奥戈伏单抗，抗EpCAM(17-1A)的单克隆抗体如依决洛单抗，抗EGFR的单克隆抗体如西妥昔单抗，帕尼单抗和尼妥珠单抗，抗CD30的单克隆抗体如本妥昔单抗，抗CD33的单克隆抗体例如吉妥单抗和huMy9-6，抗血管整合素α-vβ-3的单克隆抗体如达珠单抗，抗CD52的单克隆抗体如阿仑单抗，抗CD22的单克隆抗体如依帕珠单抗，抗CEA的单克隆抗体如拉贝珠单抗，抗CD44v6的单克隆抗体如比伐单抗，抗FAP的单克隆抗体如西罗珠单抗，抗CD19的单克隆抗体如huB4，抗CanAg的单克隆抗体如huC242，抗CD56的单克隆抗体如huN901，抗CD38的单克隆抗体如daratumumab，抗CA6的单克隆抗体如DS6,抗IGF-IR的单克隆抗体如西妥木单抗和3B7，抗整联蛋白单克隆抗体如CNTO95，抗syndecan-1单克隆抗体如B-B4。
(2)抗体的抗原结合片段：相较于完整的抗体，抗体的抗原结合片段的体积小，具有肿瘤穿透效果更好的优势。另外，它们在肿瘤实体内的分布也更均一。能用于本发明中的配体-药物共轭偶联物的抗体的抗原结合片段，包括但不仅限于：单链可变片段(sFv或scFv)，单域抗体(sdAb)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段和其他类型的抗原可识别的免疫球蛋白片段。免疫球蛋白片段能够通过不同的方法制备，例如用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等蛋白水解酶消化，还原烷基化，或重组技术。
(3)非免疫反应蛋白和多肽：除抗体和抗体片段外，其他能与细胞表面受体和抗原结合的任意配体都能用作本发明中的配体-药物共轭偶联物的细胞结合配体。它们包括但不仅限于：干扰素如IFN-α，IFN-β，和IFN-γ，转铁蛋白，表皮生长因子(EGF)和EGF类似物，胃泌素释放肽(GRP)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子(TGF)，牛痘生长因子(VGF)，胰岛素和类胰岛素生长因子(IGF)如IGF-1和IGF-2，其他合适的激素例如促甲状腺激素释放激素(TRH)，黑素细胞刺激激素(MSH)，类固醇激素(例如，雌激素和雄激素)和生长抑制素，淋巴因子如IL-2，IL-3，IL-4，和IL-6，克隆刺激激素(CSF)如G-CSF，M-CSF和GM-CSF，蛙皮素，胃泌素和叶酸。
决定配体-药物共轭偶联物性能的一个关键因素是所选择的细胞结合配体所特异性结合的靶标，细胞受体或表面抗原。这些受体或抗原包括但不仅限于：肿瘤相关抗原如HER2，HER3和HER4，表皮生长因子受体(EGFR)，天冬氨酸释放肽受体(GRPR)，骨形态发生蛋白受体IB(BMPR1B)，叶酸受体，金属还原酶STEAP1，钠依赖性磷酸运输蛋白2B(Napi3b或SLC34A2)，短蛋白聚糖，ephrin受体(Ephs)如EphB2R和EphA，前列腺干细胞抗原(PSCA)，TNF家族受体的B细胞激活因子(BAFF-R)，C-X-C趋化因子受体5型(CXC-R5，CD185，或BLR1)，HLAII类组织相容性抗原-DOβ链(HLA-DOB)，P2X嘌呤受体5(P2X5或P2RX5)，转铁蛋白受体(TfR)，激素受体，生长激素释放激素受体(GHRHR)，上皮细胞粘附分子如LFA-1，Mac1，VLA-4，ICAM-1，VCAM，和EpCAM，CD3等神经节苷脂，类FMS酪氨酸激酶3(FLT3)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，粘蛋白1(MUC1)，粘蛋白16(MUC16或CA-125)，前列腺的六个跨膜上皮抗原(STEAP)，癌胚抗原(CEA)，衰变加速因子(DAF或CD55)，叶酸受体如叶酸受体1(FOLR1)，间皮素，神秘家族蛋白1B(Cripto)，整合蛋白如αvβ6和α4β1(VLA-4)，VEGF等生长因子，VEGF受体(VEGFR)，转铁蛋白受体，运输蛋白质，归巢受体，内皮糖蛋白等内皮细胞连接的抗原，IGF-IR，CanAg和C242抗原，和许多CD分子如CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD8,CD11a,CD11b,CD11c,CD14,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD25,CD26,CD28,CD30,CD33,CD36,CD37,CD38,CD40,CD44,CD52,CD56,CD59,CD70,CD72,CD79a,CD79b,CD80,CD81,CD103,CD105,CD134,CD137,CD138,和CD152。
本发明中优选的细胞结合配体是单克隆抗体。表面的，嵌合的，人源化的和完整人源抗体因为极少于人体产生免疫原性而更优。
本发明中优选的抗体-药物共轭偶联物如结构式(IV)和(V)所示：
Figure BDA0001391351060000261
Figure BDA0001391351060000262
其中:
DM1是美登木素生物素DM1；
MMAF是单甲基阿里他汀F；
mAb是细胞结合单克隆抗体；
V是一种极性或带电基团；结构式(IV)和(V)中合适的极性或带电基团包括但不限于：氨基[-N(R)-],脲[-N(R1)CON(R2)-或-N(CONR1R2)-],羧基[-Q(COOH)-或–Q(ZCOOH)-],氨基甲酸酯基{[-N(R)COO-]或[-N(COOR)-]},胍[-N(R1)C＝N(COOR2)N(R3)-],磺酰胺[-N(SO2R)-],砜(-SO2-),亚砜(-SO-),磺酸[-Q(ZSO2OH)-],氨基磺酸[-N(SO2OH)-],膦酸酯{-Q[ZPO(OR)2]-},膦酸{-Q[ZPO(OH)2]-},氨基磷酸{-N[PO(OH)2]-},二氨基磷酸{-N[PO(NH2)(OH)]-},和三氨基磷酸{-N[PO(NH2)2]-},其中R,R1,R2和R3各自独立地为H或者C1-C8烷基；Q是CH或N；Z是1-5亚甲基单元。
U'是一种能以共价键和细胞毒性小分子药物结合的活性官能团；此活性官能团包括但不限于：硫醇、二硫化物、氨基、羧基、醛、酮、马来酰亚胺、卤代乙酰基、烯基、炔基、肼和羟基。连接细胞毒性小分子药物的共价键可以是二硫键、硫醚键、硫酯键、酰胺键、酯键、碳-氮键、碳碳键、肼键、酰肼键、腙键、醚键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键。
W'是一种能以共价键和细胞结合配体(例如单克隆抗体)结合的活性官能团。该官能团包括两类。第一类是指能以共价键和细胞结合配体上的氨基结合的官能团，此类包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-巯基琥珀酰亚胺酯酯类、硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酰氯、酸酐、磺酰氯、氯甲酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、醛、酮。共价键可以是酰胺键、氨基甲酸键、脲键或其他类型的碳氮键。第二类是指能以共价键和细胞结合配体上的巯基结合的官能团，此类包括但不限于：二硫化物如吡啶二硫化物和硝基吡啶二硫化物、马来酰亚胺、酰氯、卤代乙酰基如碘乙酰胺和溴乙酰胺、烯基吡啶、异氰酸酯、异硫氰酸酯。共价键可以是二硫键、硫醚键、硫代氨基甲酸酯键，二硫代氨基甲酸酯键或硫酯键。
X是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
Y是一种由1个、2个或3个亚甲基单元组成的组分。亚甲基单元可以可选地被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代。
n是一个1至100之间的整数。若n>1，结构式(I)重复括号中的V、X、Y的数目是各自独立的，可以互不相同。n通常是从1到50之间的整数。更优选的是从1到10，最好是从1到4之间的整数。
本发明中的一些抗体-药物共轭偶联物结构示例如下(化合物(27)到(98))：
Figure BDA0001391351060000271
化合物27
Figure BDA0001391351060000272
化合物28
Figure BDA0001391351060000273
化合物29
Figure BDA0001391351060000274
化合物30
Figure BDA0001391351060000275
化合物31
Figure BDA0001391351060000276
化合物32
Figure BDA0001391351060000281
化合物33
Figure BDA0001391351060000282
化合物34
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化合物35
Figure BDA0001391351060000284
化合物36
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化合物37
Figure BDA0001391351060000286
化合物38
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化合物39
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化合物40
Figure BDA0001391351060000289
化合物41
Figure BDA00013913510600002810
化合物42
Figure BDA0001391351060000291
化合物43
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化合物44
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化合物45
Figure BDA0001391351060000294
化合物46
Figure BDA0001391351060000295
化合物47
Figure BDA0001391351060000296
化合物48
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化合物49
Figure BDA0001391351060000298
化合物50
Figure BDA0001391351060000299
化合物51
Figure BDA00013913510600002910
化合物52
Figure BDA0001391351060000301
化合物53
Figure BDA0001391351060000302
化合物54
Figure BDA0001391351060000303
化合物55
Figure BDA0001391351060000304
化合物56
Figure BDA0001391351060000305
化合物57
Figure BDA0001391351060000306
化合物58
Figure BDA0001391351060000307
化合物59
Figure BDA0001391351060000311
化合物60
Figure BDA0001391351060000312
化合物61
Figure BDA0001391351060000313
化合物62
Figure BDA0001391351060000314
化合物63
Figure BDA0001391351060000315
化合物64
Figure BDA0001391351060000316
化合物65
Figure BDA0001391351060000317
化合物66
Figure BDA0001391351060000321
化合物67
Figure BDA0001391351060000322
化合物68
Figure BDA0001391351060000323
化合物69
Figure BDA0001391351060000324
化合物70
Figure BDA0001391351060000325
化合物71
Figure BDA0001391351060000326
化合物72
Figure BDA0001391351060000327
化合物73
Figure BDA0001391351060000328
化合物74
Figure BDA0001391351060000331
化合物75
Figure BDA0001391351060000332
化合物76
Figure BDA0001391351060000333
化合物77
Figure BDA0001391351060000334
化合物78
Figure BDA0001391351060000335
化合物79
Figure BDA0001391351060000336
化合物80
Figure BDA0001391351060000337
化合物81
Figure BDA0001391351060000338
化合物82
Figure BDA0001391351060000341
化合物83
Figure BDA0001391351060000342
化合物84
Figure BDA0001391351060000343
化合物85
Figure BDA0001391351060000344
化合物86
Figure BDA0001391351060000345
化合物87
Figure BDA0001391351060000346
化合物88
Figure BDA0001391351060000347
化合物89
Figure BDA0001391351060000348
化合物90
Figure BDA0001391351060000349
化合物91
Figure BDA0001391351060000351
化合物92
Figure BDA0001391351060000352
化合物93
Figure BDA0001391351060000353
化合物94
Figure BDA0001391351060000354
化合物95
Figure BDA0001391351060000355
化合物96
Figure BDA0001391351060000356
化合物97
Figure BDA0001391351060000357
化合物98
上述示例性实施例仅用于说明本发明，并不旨在限制本发明的范围。事实上，本发明旨在涵盖所有替代方案,修改和这些实施例的等同物。不应该理解为本发明仅限于所示示例。
配体-药物共轭偶联物的制备
本发明中的配体-药物共轭偶联物是通过运用多种合成技术将小分子药物部分、亲水连接体部分和配体部分连接在一起而制备。在所有方法中，在亲水连接体两末端预置反应性官能团最为有利。亲水连接体两末端所预置的官能团分别共价连接药物部分和细胞结合配体部分，能使配体-药物共轭偶联物的制备更容易实现。
相应地，本发明中的配体-药物偶联物可以通过首先制备亲水连接体来构造。然后，将亲水连接体与细胞毒性药物上自带的或引入的官能团，如氨基或巯基相连接，构成药物-连接体复合物。药物-连接体复合物接着与细胞结合配体，如其上带有赖氨酸氨基或半胱氨酸巯基的抗体，共价结合得到预期的配体-药物共轭偶联物。
或者，也可以先将亲水连接体与细胞结合配体，如其上带有赖氨酸氨基或半胱氨酸巯基的抗体连接，构成配体-连接体复合物。此配体-连接体复合物再和细胞毒性药物上自带的或引入的官能团，如氨基或巯基相连接，最后形成配体-药物共轭偶联物。
可用来和亲水连接体连接的细胞结合配体(如抗体)上的官能团包含，但不仅限于，巯基、氨基、羟基和羰基等。为使细胞结合配体(如抗体)适于制备配体-药物共轭偶联物，有必要对它进行一定的修饰，生成合适的官能团，再与亲水连接体连接。例如，抗体本身一般不带游离的巯基，但可以通过以下方式来获得：用较温和的试剂(如DTT)来还原天然分子内的半胱氨酸二硫键或者用化学方式引入的二硫键(如SPDP氧化)；将赖氨酸上的氨基用2-亚胺基硫烷(Traut's试剂)、3-巯基丙酰胺甲酯或其他巯基试剂衍生化；运用分子生物技术在抗体上引入非天然半胱氨酸基团。
细胞结合配体(如抗体)上可用来连接亲水连接体的官能团还可以是糖基化抗体糖基上的醛、缩醛或缩酮。用高碘酸钠将糖基氧化成羰基，从而可以和含有如氨基、肼、酰肼、缩氨基硫脲或乙酰肼等合适官能团的亲水连接体相结合。
本发明中的配体-药物共轭偶联物中，以硫醚键相连接的亲水连接体-配体可以通过配体上的巯基和亲水连接体上的巯基反应基(如卤代乙酰胺、马来酰亚胺、烯硫基、或活性二硫基)偶联而制得。例如，在以MMAF作为细胞毒性药物的抗体-药物共轭偶联物的制备时，还原抗体上的游离巯基和亲水连接体上的马来酰亚胺基团反应，生成抗体和连接体之间的硫醚键。接着，抗体-连接体复合物若含有一个活性NHS酯，可以与MMAF反应，得到所要的抗体-药物共轭偶联物。
本发明中的配体-药物共轭偶联物中，以酰胺键连接的亲水连接体-配体可通过配体中的游离氨基和亲水连接体上的羧基偶联而制得。例如羧基可以用NHS活化，与赖氨酸上的游离氨基来进行偶联反应，从而生成配体和连接体之间的酰胺键。
在抗体-药物共轭偶联物制备中使用赖氨酸或半胱氨酸的好处是其便利性。当然，除了利用抗体上固有的反应基团，本发明中抗体-药物共轭偶联物制备也可以利用抗体上引入的官能团。有许多种方法可以在抗体合适的位置引入适当的官能团。这些方法包括，但不仅限于，通过基因工程引入非天然氨基酸(例如，引入含羰基的氨基酸，然后在这个位置偶联)；引入改造的谷氨酰胺，应用转谷氨酰胺酶(mTG)处理使其连接到连接体上；经过内含子的融合对重链C末端来进行定点修饰；基因工程定点引入半胱氨酸。
通常，细胞结合配体(如抗体)与亲水连接体在合适位置(如赖氨酸上的氨基或半胱氨酸上的巯基等)共价连接后，都需要进一步纯化(如透析或凝胶过滤)，把得到的配体-连接体复合物和未反应的亲水连接体分离。细胞毒性药物通过合适的官能团与前面所得的配体-连接体复合物偶联后，也需要进一步纯化(如透析、凝胶过滤、离子交换层析、疏水层析或其组合使用)，从最终配体-药物共轭偶联物中分离去除开未反应的小分子药物和反应副产物。
由于像DM1和DM4等细胞毒性小分子具有疏水性，把它们连接到细胞结合配体(如抗体)的偶联反应必须在水相缓冲液和有机溶剂的混合液中进行。其目的是保证在偶联过程中小分子药物完全溶解。合适的有机溶剂包括甲醇、乙醇、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)。有机溶剂在缓冲液中的比例最好是0-30％(体积比)。偶联反应在pH 5-9，最好是6-8进行，缓冲液的pKa值应在此pH附近。为使抗体上连接设定数目的小分子药物，反应中小分子药物的用量一般是细胞结合配体(如抗体)用量的5-50倍。
本发明中配体-药物共轭偶联物(配体为抗体)的一种制备方法示例如下：首先，将一端为NHS酯基和另一端为马来酰亚胺基的亲水连接体溶在DMA中，浓度为约20mM。接着，5-50倍的亲水连接体在磷酸钠缓冲液(pH＝6–8,含5％v/v DMA)与抗体溶液(8mg/mL)反应。室温反应10分钟到24小时。未反应的亲水连接体通过凝胶过滤去除(Sephadex G25色谱柱，用含有100mM氯化钠的150mM磷酸钾缓冲液平衡)。偶联反应时，首先将含有巯基的美登素(如DM1或DM4)溶于DMA中，浓度为约10mM。接着，在搅拌下将美登素(亲水连接体的1-2当量)缓慢加到抗体-连接体复合物(2.5mg/mL)的磷酸钠缓冲液溶液(pH＝6.5–7.0,含3％v/v DMA)中。室温反应2到12小时。所得到的抗体-药物共轭偶联物用磷酸钠缓冲液(pH＝6.5)平衡的Sephadex G25柱纯化。抗体-药物共轭偶联物中每个抗体分子上连接的美登素的数目通过分光光度法(A252和A280)来确定(Zhao,et al.,J.Med.Chem.,2011,54,3606-3623).
本发明中一步法制备配体-药物共轭偶联物(配体为抗体)的一种制备过程示例如下：将一端为NHS酯基和另一端为马来酰亚胺基的亲水连接体(1.0当量)的DMA溶液加到含有美登素药物(如DM1或DM4，1.5当量)的PBS缓冲液中(pH＝6.0)。此混合物在4–20℃反应45-120分钟。然后，将含有单克隆抗体(0.1-0.25当量)的PBS缓冲液(pH＝7.0-8.0)加到药物-连接体复合物中。室温反应2-24小时后，得到的抗体-药物共轭偶联物用PBS缓冲液(pH＝6.5)平衡的Sephadex G25柱纯化。抗体-药物共轭偶联物中每个抗体分子上连接的美登素的数目通过分光光度法(A252和A280)来确定。
在本发明的另一个具体的实施例中，第一步，含有巯基的美登素药物(DM1)与亲水连接体反应形成硫醚键，得到药物-连接体复合物。然后，药物-连接体复合物和抗体(MAB)赖氨酸的氨基反应得到目标物抗体-药物共轭偶联物(示意图12)。
Figure BDA0001391351060000381
示意图12
或者，抗体(MAB)先通过酰胺键和亲水连接体连接，然后，美登素药物(DM1)与亲水连接体另外一端的马来酰亚胺官能团反应，得到同样的抗体-药物共轭偶联物(示意图13)。
Figure BDA0001391351060000391
示意图13
在本发明的另外一个实施例中(示意图14)，首先阿里他汀药物(MMAF)通过酰胺键和亲水连接体相连，然后，单克隆抗体(MAB)偶联到药物-连接体复合物上，得到目标抗体-药物共轭偶联物。
Figure BDA0001391351060000392
示意图14
在本发明的另外一个实施例中(示意图15)，美登素药物(DM1)先与亲水连接体一端反应。接着，在亲水连接体的另外一端引入需要的官能团(NHS酯)，药物-连接体复合物通过赖氨酸的氨基和单克隆抗体(MAB)相结合，从而得到目标抗体-药物共轭偶联物。
Figure BDA0001391351060000401
示意图15
有经验的专业人士还可以通过许多不同的方法来制备本发明里的配体-药物共轭偶联物。例如，亲水连接体可以在偶联过程中，从细胞毒性药物或细胞结合配体出发逐步构建，而非直接利用已经具备合适的一个或两个官能团的连接体进行偶联。或者，亲水连接体可以从细胞毒性药物和细胞结合配体两部分同时构建。连接体的两个增长部分连接在一起后，配体-药物共轭偶联物的制备也就完成了。
实例
以下实施例仅用于说明本发明，并不旨在限制本发明的范围。
例1 3-(2-氯-乙磺酰基)-丙酸
Figure BDA0001391351060000411
步骤1：在2L圆底烧瓶中加入亚硫酸氢钠(83g,0.80mol)和水(400mL)，置于冰浴中。在搅拌下，1小时内，同时缓慢加入2-氯乙磺酰氯(120g,0.74mol)和氢氧化钠(83g,2.08mol)的水溶液(210mL)。搅拌0.5小时后，加入50％硫酸(70mL,0.37mol)。反应在0-5℃搅拌1小时，然后将反应混合物过滤，滤液用于下一步反应。
步骤2：将丙烯酸(55g,0.76mol)溶于水(100mL)，加入到上述滤液中，然后搅拌10分钟。在4℃冰箱放置3天。过滤，滤饼用热水重结晶得到白色粉末(50g,0.25mol,33.7％收率)。1H NMR(500MHz,MeOD):δ3.96(dd,J＝8.6,5.4Hz,2H),3.63(t,J＝7.0Hz,2H),3.49(t,J＝7.3Hz,2H),2.87-2.82(m,2H).
例2 3-(2-氯-乙磺酰基)-丙酰氯
Figure BDA0001391351060000412
向3-(2-氯-乙磺酰基)丙酸(16.0g,80.0mmol)的氯化亚砜(100mL)溶液中加入DMF(0.5mL)。将混合物加热至回流。2小时后浓缩得到目标化合物(15.8g,90.2％收率)，为黄色固体，不经进一步纯化，直接可用。
例3 3-(2-氯-乙磺酰基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0001391351060000413
在冰浴下将N-羟基琥珀酰亚胺(6.0g,52.1mmol)加入到三乙胺(5.5mL,44mmol)和丙酮(150mL)中。然后滴加3-(2-氯乙基磺酰基)丙酰氯(9.5g，43.3mmol)的丙酮溶液(50mL)，将所得悬浮液搅拌3小时。移除冰浴后，再搅拌30分钟。将反应液浓缩至约100mL，倒入冰水(1000mL)中，搅拌3分钟。通过过滤收集沉淀物，真空干燥，得到目标化合物，为白色粉末(10.3g,80％收率).1H NMR(500MHz,MeOD):δ3.94(d,J＝6.9Hz,2H),3.66(d,J＝6.9Hz,2H),3.59(d,J＝7.5Hz,2H),3.23(d,J＝7.5Hz,2H),2.84(s,4H).
例4 3-乙烯磺酰基-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0001391351060000421
在冰浴中，向3-(2-氯-乙磺酰基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(2.41g，8.1mmol)的丙酮溶液(50mL)中加入三乙胺(1.5mL，10.8mmol)。将所得反应混合物缓慢温热至室温并搅拌过夜。将混合物减压浓缩，残余物通过柱色谱纯化(从二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇＝15:1洗脱)，得到目标化合物(2.01g，7.69mmol，95.0％收率)，为白色粉末。1H NMR(500MHz,MeOD):δ6.86(dd,J＝16.6,10.0Hz,1H),6.42(d,J＝16.6Hz,1H),6.28(d,J＝9.9Hz,1H),3.50(t,J＝7.4Hz,2H),3.12(t,J＝4.2Hz,2H),2.84(s,4H).MS m/z+[C9H11NO6S](M+H)计算值262.03；实测值262.02.
例5 3-乙烯磺酰基-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0001391351060000422
在冰浴中，向3-(2-氯乙基磺酰基)丙酸(3.59g，17.9mmol)的DMF溶液(50mL)中加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.09g，26.8mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(6.80g，35.8mmol)。将所得溶液在15分钟内升温至室温。搅拌3小时后，将混合物减压浓缩，残余物通过柱色谱(由二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇＝15:1洗脱)纯化，得到3-乙烯磺酰基-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(2.87g，11.0mmol，61.5％收率)，为白色粉末。该反应还生成作为副产物的3-(2-氯-乙磺酰基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(0.84g，2.82mmol，15.8％收率，参照例3)。
例6 2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-甲酸甲酯
Figure BDA0001391351060000431
在250mL圆底烧瓶中将马来酰亚胺(12.0g，123.7mmol)溶于乙酸乙酯(150mL)，将溶液冷却至约0℃。在15分钟内滴加N-甲基吗啉(14.1mL，12.8g，126.2mmol)的乙酸乙酯溶液(10mL)。然后，滴加氯甲酸甲酯(9.60mL，11.5g，123.7mmol)的乙酸乙酯溶液(50mL)，将溶液温热至室温并搅拌2小时。反应液用乙酸乙酯(100mL)稀释，饱和碳酸氢钠水溶液，水和饱和氯化钠溶液洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤。将滤液减压浓缩，得到目标化合物，为白色固体(15.9g，102.5mmol，82.9％收率)。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ6.84(s,2H),3.97(s,3H).
例7[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0001391351060000432
将N-Boc-乙二胺(2.0g，12.48mmol)溶于饱和碳酸氢钠溶液(50mL)中并冷却至0℃。将N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(1.9g，12.25mmol)加入到搅拌的溶液中。10分钟后，将反应混合物用水(100mL)稀释，并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物冷却至0℃，过滤并用冰水(100mL)洗涤滤饼。在高真空下干燥，得到目标化合物(2.35g，9.78mmol，78.4％收率)，为白色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.71(s,2H),4.72(s,1H),3.69-3.62(m,2H),3.34(d,J＝5.1Hz,2H),1.41(s,9H).
例8 1-(2-氨基-乙基)-吡咯-2,5-二酮盐酸盐
Figure BDA0001391351060000433
将N-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)马来酰亚胺(750mg，3.12mmol)溶于4M盐酸的乙酸乙酯(20mL)溶液中，室温下搅拌8小时。然后，在0℃下加入乙醚，产生白色沉淀，过滤得到目标化合物(524mg，2.97mmol，95.2％收率)。1H NMR(500MHz,MeOD):δ6.90(s,2H),3.83-3.79(m,2H),3.17-3.13(m,2H).
例9 3-异氰酸-丙酸叔丁酯
Figure BDA0001391351060000441
将三光气(940mg，3.20mmol)加入到3-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(82 0mg，4.50mmol)在二氯甲烷(20mL)和饱和碳酸氢钠(20mL)的混合物中。将反应在0℃下搅拌30分钟。分离有机相，水相用二氯甲烷萃取(2×20mL)。将合并的有机相干燥(硫酸钠)，过滤并真空浓缩，得到稀油状物，不经纯化用于下一步反应。
例10 3-{3-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-乙基]-脲基}-丙酸叔丁酯
Figure BDA0001391351060000442
将N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(635.7mg，3.60mmol)溶于二氯甲烷(20mL)和DIPEA(1.5mL，88.1mmol)中，将溶液冷却至约0℃。加入3-异氰酸-丙酸叔丁酯(前述步骤中制备)的二氯甲烷溶液(10mL)。将所得混合物在室温下搅拌10分钟后真空浓缩。残余物用柱色谱(由二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇＝15:1洗脱)纯化，得到目标化合物(910mg，2.93mmol，71.4％产率)，为白色粉末。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.71(s,2H),3.68-3.64(m,2H),3.41-3.38(m,2H),3.37(t,J＝5.9Hz,2H),2.42(t,J＝5.7Hz,2H),1.44(s,9H).MS m/z+[C14H21N3O5](M+H)计算值312.33；实测值312.15.
例11 3-{3-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-乙基]-脲基}-丙酸
Figure BDA0001391351060000443
将3-{3-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-乙基]-脲基}-丙酸叔丁酯(458mg，1.47mmol)溶于4M盐酸的二氯甲烷溶液(10mL)中，并在室温下搅拌8小时。将混合物真空浓缩后，在0℃下加入二氯甲烷，产生白色沉淀。过滤得到目标化合物(352mg，1.38mmol，93.9％收率)，不经纯化用于下一步反应。
例12 3-{3-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-乙基]-脲基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0001391351060000451
向N-[[(3-马来酰亚氨基)乙基]氨基]羰基-β-丙氨酸(55mg，0.216mmol)的DMA溶液(5mL)中加入N-羟基琥珀酰亚胺(25mg，0.217mmol)和EDC(0.526mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩。残余物通过柱色谱(由二氯甲烷至二氯甲烷/乙酸乙酯＝9:1洗脱)纯化，得到目标产物(69.7mg，198mmol，91.7％收率)，为白色固体。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ6.70(s,2H),3.64-3.59(m,2H),3.53(t,J＝5.8Hz),3.38(t,J＝5.6Hz,2H),2.86(s,4H),2.78(t,J＝5.8Hz,2H).MS m/z+[C14H16N4O7](M+H)计算值353.30；实测值353.10.
例13(3-羟基-丙基硫烷基)-乙酸叔丁酯
Figure BDA0001391351060000452
在氮气保护下将溴乙酸叔丁酯(3.0g，15.4mmol)和三乙胺(3.2g，31.8mol)溶于二氯甲烷(30mL)中并冷却至0℃。将3-巯基-1-乙醇(1.48g，16.0mol)缓慢加入到混合物中，将反应混合物温热至室温，搅拌1小时。通过TLC(乙酸乙酯/己烷＝1:1(v/v)，Rf＝0.80)监测反应至完成。反应液用饱和碳酸氢钠水溶液(2×30mL)，水和饱和氯化钠溶液洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤。将滤液减压浓缩，得到目标化合物，为无色油状物(2.53g，收率79.8％)。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)3.74(t,J＝6.0Hz,2H),3.13(s,2H),2.74(t,J＝7.1Hz,2H),1.87-1.82(m,2H),1.45(s,9H).
例14(3-羟基-丙烷-1-磺酰基)-乙酸叔丁酯
Figure BDA0001391351060000453
将(3-羟基-丙基硫烷基)-乙酸叔丁酯(3.70g，17.96mmol)溶于无水二氯甲烷(70mL)中，冷却至-10℃。在30分钟内向搅拌的反应混合物中缓慢加入mCPBA(7.4g，42.88mmol)，再在室温下搅拌48小时。然后，向反应液中加入饱和硫代亚硫酸钠(10mL)和饱和碳酸钠(10mL)，在室温下搅拌2小时。溶液用1N氢氧化钠溶液(2×30mL)，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥。蒸发溶剂后，将粗品通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50:1洗脱)纯化，得到目标化合物，为无色油状物(3.85g，89.8％收率)。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)3.84(s,2H),3.61(t,J＝6.0Hz,2H),3.30-3.23(m,2H),1.99-1.90(m,2H),1.38(s,9H).
例15[3-(3,5-二氧代-10-氧杂-4-氮杂-三环[5.2.1.0 2,6]癸-8-烯-4-基)-丙烷-1-磺酰基]-乙酸叔丁酯
Figure BDA0001391351060000461
在氮气保护下，-78℃时将三苯基膦(1.57g，6.0mmol)，2,2-二甲基丙-1-醇(0.3g，3.5mmol)，(3-羟基-丙烷-1-磺酰基)-乙酸叔丁酯(1.50g，6.3mmol)和7-氧杂双环(2.2.1)庚-5-烯-2,3-二甲酰亚胺(1.00g，5.7mmol)溶于四氢呋喃(20mL)中，搅拌5分钟。向反应混合物中加入DIAD(1.9M甲苯溶液，3.0mL)。搅拌15分钟后，将反应混合物缓慢升温至室温，并搅拌过夜。然后将混合物减压浓缩。柱色谱(由二氯甲烷至二氯甲烷/乙酸乙酯＝10:1洗脱)纯化，得到目标化合物(1.03g，46.9％收率)，为白色固体。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.47(s,2H),5.22(s,2H),3.83(s,2H),3.60(t,J＝6.7Hz,2H),3.23–3.18(m,2H),2.84(s,2H),2.14–2.07(m,2H),1.46(s,9H).
例16[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙烷-1-磺酰基]-乙酸叔丁酯
Figure BDA0001391351060000462
将[3-(3,5-二氧代-10-氧杂-4-氮杂-三环[5.2.1.0 2,6]癸-8-烯-4-基)-丙-1-磺酰基]-乙酸叔丁酯(0.50g，1.30mmol)的甲苯(20mL)溶液加热回流过夜。将混合物减压浓缩，柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝10:1洗脱)纯化，得到目标产物(0.38g，92.1％收率)，为白色固体。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.73(s,2H),3.85(s,2H),3.69(t,J＝6.7Hz,2H),3.29–3.24(m,2H),2.84(s,2H),2.20–2.14(m,2H),1.49(s,9H).
例17[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙-1-磺酰基]-乙酸
Figure BDA0001391351060000471
将[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙烷-1-磺酰基]-乙酸叔丁酯(0.35g，1.10mmol)溶于三氟乙酸(5mL)和二氯甲烷(10mL)中，室温下搅拌8小时。将混合物真空浓缩后，在0℃下加入二氯甲烷，生成白色沉淀，过滤得到目标化合物(0.27g，94.0％收率)，不经纯化用于下一步反应。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.85(s,2H),4.16(s,2H),3.68(t,J＝6.7Hz,2H),3.39–3.35(m,2H),2.61–2.10(m,2H).
例18[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙烷-1-磺酰基]-乙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0001391351060000472
向[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙烷-1-磺酰基]-乙酸(130mg，0.50mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)中加入羟基琥珀酰亚胺(69mg，0.60mmol)和EDC(190mg，1.00mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩后，柱色谱(从二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇＝10:1洗脱)纯化，得到目标产物(151mg，84.6％收率)，为白色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)6.71(s,2H),3.65(t,J＝6.8Hz,2H),3.38(t,J＝5.6Hz,2H),3.32–3.26(m,2H),2.71(s,4H),2.16–2.07(m,2H).
例19抗体-药物共轭偶联物(DX-111)
Figure BDA0001391351060000473
3-{3-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-乙基]-脲基}-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(例12)溶解在DMA(N，N-二甲基乙酰胺)中，浓度约为10mM。将曲妥珠单抗(赫赛汀)透析至缓冲液(缓冲液A：50mM磷酸二氢钠，50mM氯化钠，2mM EDTA，pH 6.5)。先将连接体连接到抗体上，向搅拌的5mg/mL抗体溶液中加入7倍当量的连接体，最终DMA浓度为5％(v/v)。反应在环境温度下进行90分钟。未反应的连接体用在pH 6.5下用缓冲液A平衡的Sephadex G25柱凝胶过滤除去。然后，将10mM DM1的DMA溶液(1.5倍于亲水连接体当量)缓慢加入抗体-连接体复合物的浓度为2.5mg/ml的缓冲液A(pH7.4)中，最终DMA浓度为3％(v/v)。反应在环境温度下进行4小时。通过用PBS(100mM磷酸二氢钠，50mM氯化钠，pH 6.5)平衡的Sephadex G25柱纯化得到抗体-药物共轭偶联物。通过分光光度法(A254和A280)测定，可知每个抗体上连接的药物平均数目为3.5。(Zhao,et al.,J.Med.Chem.,2011,54,3606-3623)。
例20抗体-药物共轭偶联物(DX-112)
Figure BDA0001391351060000481
将3-乙磺酰基-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(例5)以约10mM的浓度溶于DMA(N，N-二甲基乙酰胺)中。曲妥珠单抗(赫赛汀)透析至缓冲液(缓冲液A：50mM磷酸二氢钠，50mM氯化钠，2mM EDTA，pH 6.5)。在搅拌下向5mg/mL的抗体溶液中加入7倍当量的连接体，DMA终浓度为5％(v/v)。反应在环境温度下进行90分钟。使用以含100mM氯化钠，pH 7.4的100mM磷酸钠缓冲液平衡的Sephadex G25柱，通过凝胶过滤除去未反应的连接体。然后，在搅拌下将10mM DM1的DMA溶液(1.5倍于亲水连接体当量)缓慢加入抗体–连接体复合物的缓冲液A(pH7.4)溶液中(浓度为2.5mg/ml)，最终DMA浓度为3％(v/v)。反应在环境温度下进行4小时。通过以PBS(100mM磷酸二氢钠，50mM氯化钠，pH 6.5)平衡的Sephadex G25柱纯化制得的抗体-药物偶联物。通过分光光度法(A254和A280)测定，可知每个抗体上连接的药物平均数目为2.0。(Zhao,et al.,J.Med.Chem.,2011,54,3606～3623)。
例21体外细胞毒性测定
用于细胞毒性测定的细胞系是HL-60，一种人早幼粒细胞白血病细胞系；NCI-N87，人胃癌细胞系；BT-474，一种人浸润性导管癌细胞系和SKOV3，人卵巢癌细胞系。HL-60，NCI-N87和BT-474细胞在含10％FBS的RPMI-1640中生长。SKOV3细胞在含10％FBS的McCoy's 5A培养基中生长。为了进行测定，将细胞(180μL，6000个细胞)加入到96孔板中的各孔中，并在37℃下在5％二氧化碳中孵育24小时。接下来，在合适的细胞培养基(总体积0.2mL)中，以各种浓度的测试化合物(20μL)处理细胞。对照孔含有细胞和培养基，但无测试化合物。将各板在37℃下在5％二氧化碳中孵育120小时。然后将MTT(5mg/mL)加入到各孔(20μL)中，并将板在37℃下孵育1.5小时。仔细取出培养基，之后加入DMSO(180μL)。振荡15分钟后，在490nm和570nm处用620nm的参考滤光片测量吸光度。抑制百分数按照下式计算：抑制率＝[1-(测定-空白)/(对照-空白)]×100。对于DX-111，DX-112和T-DM1，体外细胞毒性测定的结果示于表1中。
表1体外细胞毒性测定IC50(nM)
T-DM1 DX-111 DX-112
Her2- HL-60 >10,000 >10,000 >10,000
Her2++ N87-3 0.89 0.78 0.82
Her2++ BT474 0.78 0.53 0.72
Her2++ SKOV3 0.20 0.20 0.16
例22体内测定：
在裸鼠皮下接种源自人胃癌的N87细胞，建立靶向阳性异种移植瘤模型。当肿瘤体积达到约125mm3时，根据肿瘤大小将动物随机分组(n＝5)。对照组中的5只动物用PBS注射作为载体对照。试验组中的小鼠通过外侧尾静脉单次推注5mg/kg剂量的ADC。每周两次测量肿瘤体积，计算公式如下：长×宽×高×1/2。DX-111，DX-112和T-DM1体内测定的结果示于图1中。

Claims (6)

1.下式的抗体-药物共轭偶联物：
Figure FDA0003018317890000011
其中，MAB是单克隆抗体，DM1是美登素药物。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物共轭偶联物，其中所述单克隆抗体选自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、异贝莫单抗、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、本妥昔单抗、吉妥单抗、huMy9-6、达珠单抗、阿仑单抗、依帕珠单抗、拉贝珠单抗、比伐单抗、西罗珠单抗、huB4、huC242、huN901、daratumumab、DS6、西妥木单抗、3B7、CNTO95和B-B4。
3.根据权利要求2所述的抗体-药物共轭偶联物，其中所述单克隆抗体选自曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
4.根据权利要求3所述的抗体-药物共轭偶联物，其是
Figure FDA0003018317890000012
5.连接体，其是
Figure FDA0003018317890000013
6.抗体-药物共轭偶联物，其选自：
Figure FDA0003018317890000014
Figure FDA0003018317890000021
Figure FDA0003018317890000031
Figure FDA0003018317890000041
。
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