KR20240041969A - 접합 시약 및 이의 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체 접합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항체, 링커 및 적어도 하나의 활성제를 포함하는 접합체에 관한 것으로서,
i) 상기 링커는 적어도 하나의 활성제(들)를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며;
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성된다.

Description

접합 시약 및 이의 접합체
본 발명은 항체 접합체 (antibody conjugates) 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 항체, 링커 및 활성제, 예를 들어 약물 또는 라벨링 모이어티 (labelling moiety)를 제공하여 접합체를 생성하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 접합체에 사용하기 위한 개선된 링커 및 상기 링커를 상기 접합체에 도입하는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 상기 접합체는 항체 약물 접합체 (antibody drug conjugate: ADC)일 수 있다.
건강한 조직에 대한 바람직하지 않은 독성 없이 악성 세포에 약물을 선택적으로 전달하는 것은 현대 암 치료제 개발의 주요 목표들 중 하나이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 이러한 요구를 해결하는 것을 목표로 하는 표적 치료제의 유망한 부류이다 (Walsh 2021, Beck 2014, Teicher 2012). 암 세포에 의해 과발현되는 세포-표면 항원에 대한 항체의 정교한 특이성을 활용함으로써, ADC는 세포독성이 높은 페이로드 (payloads)를 종양 부위에 선택적으로 전달할 수 있다. 이러한 치료 전략의 유용성은 최근 식품의약국 (Food and Drug Administration: FDA)에서 엔포르투맙 베도틴 (enfortumab vedotin, PadcevTM), 트라스투주맙 데룩스테칸 (trastuzumab deruxtecan, EnhertuTM), 사시투주맙 고비테칸 (sacituzumab govitecan, TrodelvyTM), 및 벨란타맙 마포도틴 (belantamab mafodotin, BlenrepTM)에 대한 승인을 통해 입증되었고, 시판되는 ADC의 수는 10개로 증가하였다 (Challita-Eid 2016, Modi 2020, Kaplon 2020, Syed 2020 and Hamadani (2021)).
그러나, 현재 ADC 생산 방법은 여전히 다양한 단점을 갖고 있다. ADC 형성을 위한 한 가지 일반적인 전략은 페이로드를 표면-노출된 리신 잔기에 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 모티프를 경유하여 접합시키는 것을 포함한다. 다른 접근법은 항체 시스테인 잔기에 대한 접합을 포함한다. 인간 IgG1 항체는 4개의 사슬간 디설파이드를 함유하고, 이는 환원되어 말레이미드와 같은 친전자성 모티프를 함유하는 링커에 접합될 수 있는 8개의 친핵성 시스테인 잔기를 나타낼 수 있다. 항체에 반응성 리신 (＞50) 및 시스테인 (8) 잔기가 매우 풍부하기 때문에, 이러한 잔기들의 변형은 본질적으로 부위-선택성이 부족하여, 접합 부위 및 각 항체에 부착된 약물 분자의 수 (약물-대-항체 비율 (drug-to-antibody ratio, DAR))의 측면에서 다양한 고도로 이종인 ADC를 생성한다 (Kim 2014, Jackson 2016, Freedy 2016, Chudasama 2016). 접합 부위 및 DAR은 ADC의 안전성 및 효능 모두에 상당한 영향을 주는 것으로 나타났다 (Hamblett 2004, Shen 2012, Strop 2013). 현재 FDA-승인된 모든 ADC는 리신 또는 시스테인 접합을 통해 합성되며, DAR 분포가 0-8이고, 최대 70개의 서로 다른 접합 부위를 갖는 접합체들의 이종 혼합물로서 존재한다; 이로 인해 이들의 약동학적 프로파일이 과도하게 복잡해지고 예측하기 어려워진다 (Kim 2014, Agarwal 2015, Godwin 2017, Bross 2001, Hedrich 2018).
더욱이, 가장 일반적으로 사용되는 시스테인 변형 전략들 중 하나인 말레이미드 바이오접합 (maleimide bioconjugation)은 생리학적 조건하에 레트로-마이클 첨가 (retro-Michael additions)에 취약한 불안정한 연결을 생성하는 것으로 나타났다 (Alley 2008, Lyon 2014). 이러한 불안정성은 항체로부터 페이로드의 조기 분리 (premature dissociation)로 이어질 수 있으며, 건강한 조직에서 바람직하지 않은 독성을 초래할 수 있다.
생물직교 관능성 (bioorthogonal functionality)을 가진 비천연 아미노산의 혼입 또는 항체 글리칸의 변형을 통해 이러한 문제를 회피하기 위한 여러 전략들이 보고되었다 (Fang 2014, Amant 2019, Amant 2019*, Walker 2019, Axup 2012, Zimmerman 2014). 이러한 접근법들은 실제로 높은 안정성, 정의된 부착 지점 및 정확한 DAR을 갖춘 ADC를 생산하였지만, 이러한 비-천연 항체 형식의 생성은 일반적으로 어려운 작업이고, 수율이 낮으며, 면역원성 위험이 존재할 수 있다. 그러므로, 천연 항체를 사용한 부위-선택적 접합 전략을 수립하는 것이 바람직하다. 디설파이드 브릿징 링커 (disulfide bridging linkers)는 천연 항체로부터 균일한 ADC의 합성을 가능하게 하는 매력적인 종류의 시약으로서 대두되었다 (Forte 2018). 이러한 링커에는 IgG 분자에서 환원된 사슬간 디설파이드와 반응을 수행하여 항체 사슬들의 공유 재브릿징을 유도할 수 있는 2개의 시스테인-반응성 기를 함유한다. 디브로모말레이미드 (Behrens 2015, Smith 2010), 피리다진디온 (Robinson 2017), 바이설폰 (Badescu 2014) 및 아릴렌-디프로피올로니트릴 (Koniev 2018) 시약이 사용되어 인 비트로 및 인 비보 활성이 모두 입증된 ADC를 성공적으로 생성하였다. 또한 최근에는 디설파이드 재브릿징 디비닐피리미딘 (DVP) 링커의 개발이 보고되었다 (Walsh 2019, Walsh 2020). 상기 재브릿징 접근법 (rebridging approach)은 확률적 시스테인 변형 (stochastic cysteine modifications)과 비교하는 경우 균일성이 크게 개선되며 모든 합성 배치에서 정의된 DAR 4를 수득한다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 한계는 바이오접합 중에 "반-항체 (half-antibody)" 종의 형성이며, 이는 항체의 힌지 영역에 있는 시스테인 잔기의 비-천연 사슬내 가교의 결과이다. 모든 종류의 디설파이드 브릿징 링커에서 반-항체 형성이 관찰되었다 (Forte 2018). 이러한 비-천연 재브릿징으로 인한 항체 중쇄들 간의 공유 결합의 손실은 항체 안정성 감소와 관련이 있으며; 그러므로, 반-항체 형성의 억제 방법을 개발하는 것이 매우 바람직하다 (Bahou 2019).
본 발명은 보고된 안정성 문제를 해결하면서도, 활성제 및 항체 간의 정확한 비율, 및 활성제를 분배하는 능력의 이점을 보유하는 디설파이드 브릿징 링커 플랫폼 (disulfide bridging linker platform)을 제공하는 것을 목표로 한다. 또한, 본 발명은 반-항체 형성의 문제를 해결하고, 항체에 부가되는 약물 분자의 수를 보다 효과적으로 제어할 수 있는 디설파이드 브릿징 링커 플랫폼을 제공하는 것을 목표로 한다.
따라서, 본 발명의 제1 양상에서, 항체, 링커 및 적어도 하나의 활성제를 포함하는 접합체 (conjugate)가 제공되며, 여기서:
i) 상기 링커는 적어도 하나의 활성제(들)를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며; 및
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성된다.
본 발명은 항체-약물 접합체 (ADC) 분자를 제공하기 위해 항체 및 활성제, 예를 들어 항체 및 세포독소를 연결하는데 유용성을 갖는, 접합체에 사용하기 위한 링커를 제공한다. 상기 링커는 항체에 대한 활성제의 로딩을 제어하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 약물-대-항체 비율이 제어된 균일한 ADC를 제공하는데 사용하기 위한 링커를 제공한다.
상기 링커는 또한 활성제의 개선된 표적 페이로드를 제공하므로, 상기 활성제가 세포독성과 같은 생물학적 활성을 발휘하는 경우 접합체의 활성을 개선할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 상기 링커는 접합체에 사용하기 위한 현재 알려져 있는 링커 분자와 비교하여 안정성이 증가된 접합체를 제공한다. 이는 이러한 접합체의 내약성을 개선할 수 있다.
상기 링커는 항체에서 시스테인 잔기의 5 내지 8개의 티올기 (황 원자)에 직접 결합될 수 있다. 따라서, 상기 링커는 4개의 환원된 사슬간 디설파이드 결합과 관련된 황 원자들 중 하나 또는 둘 다를 경유하여 4개의 환원된 사슬간 디설파이드 결합에 연결된다. 따라서, 상기 링커는 항체에서 1개 내지 4개의 환원된 사슬간 디설파이드 결합들을 재-브릿지 (re-bridges)하는 역할을 한다. 따라서, 상기 링커는 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기들의 8개 티올기에 대한 5 내지 8개의 공유 결합을 통해 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에 연결될 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 항체의 힌지 영역에서 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기에 대한 5 내지 8개의 공유 결합을 통해 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에 연결될 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 항체에서 시스테인 잔기들의 6 내지 8개, 더 바람직하게는 7 내지 8개의 티올기 (황 원자)에 직접 결합된다.
따라서, 상기 링커는 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합 중 1 내지 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개의 티올기 (황 원자)에 5 내지 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지할 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커는 항체에서 시스테인 잔기의 6 내지 8개, 더 바람직하게는 7 내지 8개의 티올기 (황 원자)에 직접 결합된다. 따라서, 상기 링커는 바람직하게는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합 중 2 내지 4개, 더 바람직하게는 3 내지 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자)에 6 내지 8개 (또는 더 바람직하게는 7 내지 8개)의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다. 가장 바람직하게는, 상기 링커는 항체에서 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자)에 직접 결합된다. 따라서, 상기 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합 4개 모두를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올 기 (황 원자)에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다.
본 발명의 제2 양상에서, 항체와 반응할 수 있는 접합 시약 (conjugating reagent)이 제공되며, 상기 접합 시약은 링커, 적어도 하나의 활성제 및 항체 상의 5 내지 8개의 황 원자와 반응할 수 있는 8개의 관능기를 포함한다.
따라서, 적합하게는, 본 발명의 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물이다:
여기서:
FG'는 기능성 연결 모이어티 (functional linking moiety)이고;
n은 0 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
L 및 L1은 독립적으로 링커이고;
Z는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이고;
D는 활성제이다.
이러한 접합 시약은 항체와 반응하여 본 발명의 제1 양상의 접합체를 형성할 수 있다.
바람직하게는, 상기 접합 시약은 링커, 적어도 하나의 활성제 및 항체 상의 6 내지 8개, 더 바람직하게는 7 내지 8개, 가장 바람직하게는 8개의 황 원자와 반응할 수 있는 8개의 관능기를 포함한다.
본 발명의 제3 양상에서, 항체, 링커 및 다른 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 적어도 하나의 관능기를 포함하는 중간 접합체 (intermediate conjugate)가 제공되며, 여기서:
i) 상기 링커는 적어도 하나의 관능기를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며; 및
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성된다.
따라서, 상기 중간 접합체는 적어도 하나의 활성제와 반응하여 본 발명의 제1 양상의 접합체를 형성할 수 있다. 상기 중간 접합체 및 활성제(들) 간의 이러한 반응은 중간 접합체 상의 적어도 하나의 관능기 및 활성제 상의 또 다른 기능성 모이어티의 반응을 통해 일어날 수 있다. 이와 같이, 상기 중간 접합체를 활성제(들)에 연결하는 기능성 연결 모이어티가 형성된다.
본 발명의 제4 양상에서, 항체 및 적어도 하나의 활성제 모두와 반응할 수 있는 화합물이 제공되며, 상기 화합물은 링커, 항체 상의 5 내지 8개의 황 원자와 반응할 수 있는 8개의 관능기 및 다른 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 적어도 하나의 관능기를 포함한다. 상기 기능성 연결 모이어티는 적어도 하나의 활성제가 화합물에 부착될 수 있는 수단으로서 제공된다.
따라서, 적합하게는, 본 발명의 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물이다:
여기서:
FG는 다른 하나의 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 관능기이고;
n은 0 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
L은 링커이고; 및
Z는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이다.
제4 양상의 화합물은 본 발명의 제2 양상의 접합 시약의 전구체이다. 제4 양상의 화합물은 또한 본 발명의 제3 양상의 중간 접합체의 전구체이다. 상기 접합 시약은 화학식 (I)의 화합물을 이미 부착된 링커 기를 가질 수 있는 활성제와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 상기 중간 접합체는 화학식 (I)의 화합물을 항체 (사슬간 디설파이드 결합이 환원된 항체)와 반응시킴으로써 형성될 수 있다.
본 발명의 제5 양상에서, 활성제가 약물인 경우 본 발명의 제1 양상의 접합체, 및 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 제5 양상은 또한 활성제가 약물인 경우 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양상의 접합체를 제공한다.
본 발명의 제5 양상에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 제1 양상의 접합체들의 혼합물을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 즉, 상기 약학적 조성물은 링커가 5, 6, 7 또는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착된 접합체들의 혼합물을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 상기 약학적 조성물은 또한 링커가 1 내지 4개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착된 접합체를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 65%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다. 더 적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 70%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다. 더욱 적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 75%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다. 더욱 더 적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 80%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다. 더욱 더 적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 85%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다. 더욱 더 적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 90%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다. 더욱 더 적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 95%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다. 가장 적합하게는, 상기 약학적 조성물은 접합체들의 혼합물을 포함하고, 여기서 상기 접합체의 적어도 98%는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 링커를 포함한다.
따라서, 적합하게는, 상기 약학적 조성물에 존재하는 접합체의 적어도 65%는 본 발명의 제1 양상의 접합체이고, 여기서 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합들 중 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자) 각각에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다. 더 적합하게는, 상기 약학적 조성물에 존재하는 접합체의 적어도 70%는 본 발명의 제1 양상의 접합체이고, 여기서 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합들 중 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자) 각각에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다. 더욱 적합하게는, 상기 약학적 조성물에 존재하는 접합체의 적어도 75%는 본 발명의 제1 양상의 접합체이고, 여기서 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합들 중 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자) 각각에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다. 더욱 적합하게는, 상기 약학적 조성물에 존재하는 접합체의 적어도 85%는 본 발명의 제1 양상의 접합체이고, 여기서 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합들 중 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자) 각각에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다. 더욱 적합하게는, 상기 약학적 조성물에 존재하는 접합체의 적어도 90%는 본 발명의 제1 양상의 접합체이고, 여기서 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합들 중 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자) 각각에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다. 더욱 적합하게는, 상기 약학적 조성물에 존재하는 접합체의 적어도 95%는 본 발명의 제1 양상의 접합체이고, 여기서 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합들 중 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자) 각각에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다. 가장 적합하게는, 상기 약학적 조성물에 존재하는 접합체의 적어도 98%는 본 발명의 제1 양상의 접합체이고, 여기서 링커는 상기 항체 (예: 인간 IgG1 항체)에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합들 중 4개를 사슬간 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기의 8개 티올기 (황 원자) 각각에 8개의 공유 결합을 통해 재-브릿지한다.
본 발명의 제6 양상에서, 활성제가 세포독성 약물인 경우, 증식성 질환 (proliferative disease)을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 제1 양상의 접합체의 용도가 제공된다. 제6 양상은 또한 활성제가 세포독성 약물인 경우, 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양상의 접합체를 제공한다. 제6 양상은 또한 활성제가 세포독성 약물인 경우 본 발명의 제1 양상의 접합체의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
정의
본 명세서의 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다 (comprise)" 및 "함유하다 (contain)" 및 이들의 변형은 "포함하지만 이에 한정되지 않음"을 의미하며, 다른 모이어티, 첨가제, 구성 요소, 정수 또는 단계를 배제하지 않는 것을 의도한다. 본 명세서의 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단수형은 복수형을 포함한다. 구체적으로, 부정관사가 사용되는 경우, 본 명세서는 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단수뿐만 아니라 복수를 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 특정 양상, 구체예 또는 실시예와 관련하여 서술된 특징, 정수, 특성, 화합물, 화학적 모이어티 또는 기는 본원에 서술된 임의의 다른 양상, 구체예 또는 실시예에 부적합하지 않는 한, 이에 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 (첨부된 청구항, 요약 및 도면 포함)에 개시된 모든 특징, 및/또는 그와 같이 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는 임의의 조합으로 조합될 수 있으며, 단 이러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 경우의 조합은 제외된다. 본 발명은 본 명세서 (첨부된 청구항, 요약 및 도면 포함)에 개시된 특징 중 임의의 신규한 것 또는 임의의 신규한 조합으로 확장되거나, 또는 그와 같이 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계의 임의의 신규한 것 또는 임의의 신규한 조합으로 확장된다.
용어 "특이적으로 결합하다 (specifically binds)" 및 "특이적 결합 (specific binding)"은 미리 결정된 분자 (예: 항원)에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 상기 항체는 적어도 약 1x107 M-1의 친화도로 결합하고, 미리 결정된 분자 또는 밀접하게-관련된 분자 이외의 비-특이적 분자 (예: BSA, 카제인)에의 결합 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 미리 결정된 분자에 결합한다.
항체
본원에서 용어 "항체 (antibody)"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (예: 이중특이적 항체), 다가 항체 및 항체 단편을 포함한다 (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). 항체는 뮤린 (murine), 인간, 인간화, 키메라일 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 항체는 특정 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의해 생성되는 단백질이다 (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의해 인식되는 에피토프로도 불리는 수많은 결합 부위를 갖는다. 서로 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 각 항체는 구조가 상이하다. 따라서, 하나의 항원은 하나 초과의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전장 면역글로불린 분자 또는 전장 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적 항원 또는 이의 일부에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함하며, 이러한 표적은 암세포 또는 자가면역 질환과 관련된 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 임의의 타입 (예: IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 면역글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 기원을 포함하는, 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
"항체 단편 (antibody fragments)"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 항원 결합 또는 이의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 scFv 단편; 디아바디; 선형 항체; Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 암세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 이의 에피토프-결합 단편, 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체 (monoclonal antibody)"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 개별 항체 포함 집단은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 매우 특이적인 항체이다. 또한, 다양한 결정인자 (에피토프)에 대한 다양한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 관한 것이다. 이의 특이성에 추가하여, 상기 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날 (monoclonal)"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법으로 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 Kohler et al (1975) Nature 256:495에 처음 기재된 하이브리도마 방법 (hybridoma method)에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (US 4816567 참조). 상기 모노클로날 항체는 또한 Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597에 기재된 기술을 사용하는 파지 항체 라이브러리 (phage antibody libraries) 또는 완전한 인간 면역글로불린 시스템을 보유하는 유전자이식 마우스 (transgenic mice)로부터 단리될 수 있다 (Lonberg (2008) Curr. Opinion 20(4):450-459).
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 포함한다.
세포 결합제 (cell binding agents)의 예로는 본원에 통합된 WO　2007/085930에서 사용에 대해 기재된 활성제를 포함한다.
본 발명의 구체예에 사용하기 위한 종양-관련 항원 및 동족 항체가 하기에 열거되어 있으며, 본원에 통합된 WO 2017/186894에서 페이지 14 내지 86에 더 상세하게 서술되어 있다.
활성제
상기 활성제는 약물, 라벨링 모이어티 또는 표적화 모이어티일 수 있다. 바람직하게는, 상기 활성제는 약물 또는 라벨링제이다. 상기 활성제는 링커에 연결될 수 있는 관능기를 포함해야 한다. 이러한 기로는 예를 들어 아미노기, 이민기 또는 하이드록시기를 포함할 수 있다. 하나 초과의 활성제가 존재하는 상황에서, 2개 이상의 활성제는 동일하거나 또는 상이할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 2개 이상의 활성제가 존재하는 상황에서, 상기 2개 이상의 활성제는 독립적으로 약물, 라벨링 모이어티 또는 표적화 모이어티로부터 선택될 수 있다. 또한, 하나 초과의 약물, 라벨링 모이어티 또는 표적화 모이어티가 존재하는 상황에서, 각 약물, 라벨링 모이어티 및 표적화 모이어티는 동일하거나 또는 상이할 수 있음이 이해될 것이다.
약물
상기 약물은 세포독성 페이로드 또는 치료 화합물, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 약물은 바람직하게는 세포독소이다.
바람직하게는 상기 세포독소는 생물학적 활성 세포독성 물질이다. 상기 세포독소는 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 튜불리신, 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀 (구체적으로 피롤로벤조디아제핀 이량체), 캄프토테신 유사체 및 독소루비신을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
그러나, 추가로 또는 대안적으로, 상기 세포독소는 또한 리신 (ricin) 서브유닛 및 기타 펩티드 기반 세포독성 물질을 포함하는 다른 알려진 세포독소로부터 선택될 수도 있지만, 이러한 물질은 해당 분야에서 일반적으로 사용되지 않는다.
라벨링 모이어티
상기 라벨링 모이어티는 형광단일 수 있다. 적합한 형광단에는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 인도시카르보시아닌 (Cy5), 인도카르보시아닌 (Cy3)뿐만 아니라 상표명 Alexa Fluor (예컨대 350, 405, 488, 532, 546, 568, 594, 647, 680, 700, 750) 및 DyLight (예컨대 405, 488, 550, 650, 680, 755, 800)로 알려진 것을 포함한다.
상기 라벨링 모이어티는 또한 비오틴으로부터 유래된 비오틴 태그일 수 있다.
상기 라벨링 모이어티는 또한 방사성동위원소 또는 방사성동위원소 함유 모이어티일 수 있다. 적합하게는, 상기 라벨링 모이어티는 양전자 방출 단층촬영 (PET) 추적자이다. 적합한 PET 추적자로는 예를 들어 [18F] 플루데옥시글루코스 (18F) (FDG)-글루코스 유사체, [11C] 아세테이트, [11C] 메티오닌, [11C] 콜린, 구리 64Cu 도타테이트, [18F] EF5, [18F] 플루시클로빈, [18F] 플루오로콜린, [18F] 플루오로에틸-L-티로신, [18F] 플루오로미소니다졸, [18F] 플루오로티미딘 F-18, [64Cu] Cu-ETS2, [68Ga] DOTA-슈도펩티드, [68Ga] DOTA-TATE 및 [68Ga] 전립선-특이적 막 항원 (PSMA)을 포함한다.
표적화 모이어티
상기 표적화 모이어티는 접합체를 신체 내의 특정 위치로 유도하는데 도움이 되는 모이어티이다. 임의의 적합한 표적화 모이어티가 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 적합하게는, 상기 표적화 모이어티는 탄수화물, 예컨대 알파-D-갈락토-헥소피라노실-(1-＞3)-2-아세트아미도-2-데옥시-D-갈락토-헥소피라노스 (Gal-알파 1,3-GalNAc)이다.
본 발명의 접합체
본 발명의 일 양상에 따르면, 항체, 링커 및 적어도 하나의 활성제를 포함하는 접합체가 제공되며, 여기서:
i) 상기 링커는 적어도 하나의 활성제(들)를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며; 및
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성된다.
적합하게는, 상기 링커 및 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 친전자성 관능기 간의 반응으로부터 형성된다.
특정 구체예에서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 1개 내지 4개 포함한다:
여기서:
ZA는 기능성 연결 기이고;
Pep는 상기 모이어티가 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 위치를 나타내고, 상기 재-브릿징 모이어티는 항체에서 환원된 사슬간 디설파이드 결합을 재-브릿지하고;
는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
적합하게는, 상기 접합체는 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 2개 내지 4개 포함한다. 더 적합하게는, 상기 접합체는 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 3개 내지 4개 포함한다. 가장 적합하게는, 상기 접합체는 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 4개 포함한다.
상기 기능성 연결 기 ZA는 항체를 링커에 연결시킬 수 있는 임의의 관능기일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 상기 기능성 연결 기 ZA는 항체 상에 존재하는 황 원자에 대한 공유 부착을 형성할 수 있는 관능기이다. 적합하게는, 상기 황 원자는 항체 상의 시스테인 잔기로부터의 황 원자이고, 더 적합하게는 항체의 환원된 사슬간 디설파이드 결합으로부터의 시스테인 잔기로부터의 황 원자이다.
이러한 방식으로 항체를 링커에 연결시킬 수 있는 기능성 연결 기는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 기능성 연결 기를 선택할 수 있을 것이다. 적합한 기능성 연결 기 ZA의 예로는 예를 들어 Xu 2021, Stieger 2021, Walsh 2019, Walsh 2020, Badescu 2014, Koniev 2018, Robinson 2017, Behrens 2015 및 WO2019/011078에 기재된 것들을 포함한다.
특정 구체예에서, ZA는 하기에 나타낸 기능성 연결 기들 중 하나로부터 선택되고, 따라서 상기 접합체는 독립적으로 하기 그룹들 중 하나로부터 선택되는 재-브릿징 모이어티를 1 내지 4개 (바람직하게는 2 내지 4개, 더 바람직하게는 3 내지 4개, 가장 바람직하게는 4개) 포함한다:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 1개 또는 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 1개 또는 2개는 CH이거나, 또는 A1, A2 및 A3 중 3개 모두는 N 또는 C이고;
a 및 b는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
X는 N, NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R3은 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 부재하거나, 또는 O, NR4, C(=O), C(=O)NR4 또는 NR5C(=O)로부터 선택되고;
p 및 q는 독립적으로 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
Q는 CR6, N 또는 아릴이고;
R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Pep는 상기 모이어티가 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 위치를 나타내고;
는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
특정 구체예에서, A1, A2 및 A3 중 2개는 N이고 (예: A1 및 A2는 N임), A1, A2 및 A3 중 다른 것은 CH이다 (예: A3은 CH임). 적합하게는, 이러한 구체예에서, 정수 a 및 b는 1이다.
다른 구체예에서, A1, A2 및 A3 중 3개 모두는 N이다. 적합하게는, 이러한 구체예에서, 정수 a 및 b는 1이다.
일부 구체예에서, A1, A2 및 A3 중 하나는 N이고 (예: A3는 N임), A1, A2 및 A3 중 다른 2개는 CH이다 (예: A1 및 A2는 CH임). 적합하게는, 이러한 구체예에서, 정수 a 및 b는 0이다.
적합하게는, X는 NH 또는 O이다. 가장 적합하게는, X는 NH이다.
특정 구체예에서, R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬렌으로부터 선택된다. 적합하게는, R1 및 R2는 독립적으로 C1-C4 알킬렌으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R3은 C1-C4 알킬 (예: 메틸기)이다.
일부 구체예에서, Y1 및 Y2는 독립적으로 부재하거나, 또는 O, NR4 및 C(=O)로부터 선택된다. 적합하게는, Y1 및 Y2는 독립적으로 부재한다.
적합하게는, Q는 CR6 또는 N이다. 일부 구체예에서, Q는 CR6이다. 다른 구체예에서, Q는 N이다.
일부 구체예에서, R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택된다. 적합하게는, R4, R5 및 R6은 각각 수소이다.
특정 구체예에서, 상기 접합체는 하기 그룹으로부터 독립적으로 선택된 재-브릿징 모이어티를 1 내지 4개 (바람직하게는 2 내지 4개, 더 바람직하게는 3 내지 4개, 가장 바람직하게는 4개) 포함한다:
여기서 각 A1, A2, A3, X 및 Pep는 본원에 정의된 바와 같다.
다른 구체예에서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 일반식 (IIIa)의 재-브릿징 모이어티를 1 내지 4개 (바람직하게는 2 내지 4개, 더 바람직하게는 3 내지 4개, 가장 바람직하게는 4개) 포함한다:
여기서 각 A1, A2, A3, X, Pep 및 는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 구체예에서, A1 및 A2는 N이다.
다른 구체예에서, A1 및 A3은 N이다.
일부 구체예에서, X는 NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이다. 이러한 구체예들에서, 하나의 활성제만이 X에 링커를 경유하여 부착될 수 있다.
이러한 구체예들 중 일부에서, X는 NRN이다. X는 NH, NCH3 또는 NCH2CH3일 수 있다.
이러한 구체예들 중 다른 것에서, X는 O이다.
이러한 구체예들 중 다른 것에서, X는 S이다.
일부 구체예에서, X는 N이다. 이들 구체예에서, X는 하기에 나타낸 바와 같이 2개의 공유 결합을 통해 링커에 부착될 수 있다:
여기서 각 A1, A2, A3, Pep 및 는 본원에 정의된 바와 같다.
링커 (L)
상기 링커는 항체를 활성제(들)에 결합시키는 기 (관능기)이다. 상기 링커는 항체 상의 황 원자 및 링커 상의 관능기 (예: 친전자성 관능기) 간에 형성된 공유 결합 5 내지 8개 (적합하게는 6 내지 8개, 더 적합하게는 7 내지 8개, 가장 적합하게는 8개)를 통해 상기 항체에 부착된다. 상기 항체 상의 황 원자는 상기 항체 상의 시스테인 잔기 상의 황 원자, 예컨대 항체의 사슬간 디설파이드 연결에 관여하는 항체 상의 시스테인 잔기로부터의 황 원자 (즉, 항체의 사슬간 디설파이드 연결의 환원 후에 이용 가능한 시스테인 잔기로부터의 황 원자)일 수 있다.
그러므로, 상기 링커는 상기 항체에 기능성 연결 기 (ZA)를 경유하여 부착될 수 있다. 그러므로, 상기 링커는 기능성 연결 기 (ZA)를 적어도 하나의 활성제에 연결시킬 수 있다. 상기 링커는 적어도 하나의 활성제(들)에 하기에 정의된 바와 같은 기능성 연결 모이어티 (FG')를 경유하여 연결될 수 있다.
상기 링커는 적어도 하나의 활성제를 상기 항체에 연결할 수 있는 임의의 기 (관능기)일 수 있는 것으로 이해될 것이다.
특정 구체예에서, 상기 링커는 상기 재-브릿징 모이어티 (즉, 화학식 (III)의 그룹) 중 적어도 2개가 10 내지 60개의 원자에 의해 분리되는 것이다. 적합하게는, 상기 링커는 상기 재-브릿징 모이어티 (즉, 화학식 (III)의 그룹) 중 적어도 2개가 10 내지 50개의 원자에 의해 분리되는 것이다. 더 적합하게는, 상기 링커는 상기 재-브릿징 모이어티 (즉, 화학식 (III)의 그룹) 중 적어도 2개가 10 내지 40개의 원자에 의해 분리되는 것이다. 더욱 적합하게는, 상기 링커는 상기 재-브릿징 모이어티 (즉, 화학식 (III)의 그룹) 중 적어도 2개가 12 내지 40개의 원자에 의해 분리되는 것이다. 더욱 더 적합하게는, 상기 링커는 상기 재-브릿징 모이어티 (즉, 화학식 (III)의 그룹) 중 적어도 2개가 15 내지 40개의 원자에 의해 분리되는 것이다. 가장 적합하게는, 상기 링커는 상기 재-브릿징 모이어티 (즉, 화학식 (III)의 그룹) 중 적어도 2개가 16 내지 38개의 원자에 의해 분리되는 것이다.
일부 구체예에서, 상기 링커는 알킬렌디아민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기, 아릴렌-함유 모이어티, 헤테로아릴렌-함유 모이어티, 헤테로사이클릴-함유 모이어티, 사이클로알킬-함유 모이어티 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함한다. 적합하게는, 상기 링커는 전술한 기들 중 1 내지 20개를 포함한다. 더 적합하게는, 상기 링커는 전술한 기들 중 1 내지 15개를 포함한다. 더욱 적합하게는, 상기 링커는 전술한 기들 중 1 내지 10개를 포함한다.
적합하게는, 상기 링커는 알킬렌디아민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함한다.
상기 알킬렌디아민 모이어티는 알킬렌디아민 모이어티, 예컨대 에틸렌디아민을 함유하거나 또는 이로부터 유래된 관능기인 것으로 이해될 것이다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 하나 이상의 알킬렌 글리콜 모이어티, 예컨대 하나 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 관능기인 것으로 이해될 것이다. 특정 구체예에서, 상기 링커는 알킬렌 글리콜 모이어티 (예: 에틸렌 글리콜 모이어티)를 1 내지 10개 포함한다.
상기 아미노산 잔기는 천연 및 비천연 아미노산 잔기를 모두 구성하는 것으로 이해될 것이다. 적합하게는, 상기 아미노산 잔기는 천연 아미노산 잔기일 것이다. 상기 아미노산 잔기는 또한 2개 이상의 아미노산, 가령 예를 들어 디펩티드 및 트리펩티드 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 아미노산 잔기는 Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg, 및 Trp 잔기를 포함한다.
상기 아릴렌-함유 모이어티는 하나 이상의 아릴렌 기를 포함하는 관능기인 것으로 이해될 것이다. 적합하게는, 상기 아릴렌은 6원 아릴렌 예컨대 페닐렌일 것이다. 특정 구체예에서, 상기 아릴렌-함유 모이어티는 1,3,5-벤질기를 포함하는 관능기이다.
상기 헤테로아릴렌-함유 모이어티는 하나 이상의 헤테로아릴렌기를 포함하는 관능기인 것으로 이해될 것이다. 적합하게는, 상기 헤테로아릴렌은 6원 헤테로아릴 예컨대 트리아진을 포함하는 관능기일 것이다. 특정 구체예에서, 상기 아릴렌-함유 모이어티는 1,3,5-트리아진 기를 포함하는 관능기이다.
상기 헤테로사이클릴-함유 모이어티는 하나 이상의 헤테로사이클 기를 포함하는 관능기인 것으로 이해될 것이다. 적합하게는, 상기 헤테로사이클은 6원 헤테로사이클 예컨대 트리아지난이다. 특정 구체예에서, 상기 헤테로사이클릴-함유 모이어티는 1,3,5 트리아지난 기를 포함하는 관능기이다.
상기 사이클로알킬-함유 모이어티는 하나 이상의 사이클로알킬기를 포함하는 관능기인 것으로 이해될 것이다. 적합하게는, 상기 사이클로알킬은 6원 사이클로알킬 예컨대 사이클로헥산이다. 특정 구체예에서, 상기 사이클로알킬-함유 모이어티는 1,3,5 사이클로헥산을 포함하는 관능기이다.
바람직한 접합체
특정 구체예에서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)의 화합물이다:
여기서:
각 Z1은 상기 정의된 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (III)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
각 Q1은 독립적으로 결합 (bond) 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=O)NR7, C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 독립적으로 부재하거나, 또는 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
W1은 화학식 IVc 또는 화학식 IVe의 기이고:
여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미도, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 각 X1은 독립적으로 CH 또는 N으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C12 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C12 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
W1C는 화학식 WC1 또는 화학식 WC2로부터 선택되고:
여기서:
WQ1은 화학식 WC3의 기이고:
여기서:
QW1은 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
XW1은 O 또는 NH로부터 선택되고;
XW2는 수소, C1-C4 알킬, ORx1 및 NRx1Rx2로부터 선택되고, 여기서 Rx1 및 Rx2는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 XW1이 화학식 WQ2의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
는 WQ1이 화학식 R24의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
WQ2는 화학식 WC4의 기이고:
여기서:
QW1A는 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2A는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고; LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
XW3은 O 또는 NH로부터 선택되고;
는 XW4가 화학식 WQ2의 다른 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는 XW4가 수소 또는 -C(=O)RX3 중 하나에 부착되는 위치를 나타내고, 여기서 Rx3은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 QW2A가 화학식 WQ1의 기에 XW1 기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내고;
XW4는 O 또는 NH로부터 선택되고;
LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
t는 1 내지 8로부터 선택된 정수이고;
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 활성제이고;
W2는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미도, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C12 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C12 알킬렌으로부터 선택되고;
FG', L1 및 D는 상기 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
정수 v가 2인 경우 2개의 기는 동일하거나 또는 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
또한, 정수 m이 2인 경우 2개의 WB1 및 2개의 R24 기가 동일하거나 또는 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 적합하게는, 2개의 WB1 및 2개의 R24 기는 동일하다.
적합하게는, m은 1이다.
적합하게는, 고리 A는 페닐, 1,3,5-트리아진 또는 1,3,5 트리아지난으로부터 선택된다.
적합하게는, W1은 화학식 IVc의 기이다.
특정 구체예에서, W1은 화학식 IVc의 기이고, W1C는 화학식 WC1의 기이다.
다른 구체예에서, W1은 화학식 IVc의 기이고, W1C는 화학식 WC2의 기이다.
특정 구체예에서, LW는 부재하거나, 또는 C1-C6알킬렌 및 백본에 O 또는 N 중 하나 이상을 함유하는 C1-C6알킬렌으로부터 선택된다.
W1이 화학식 IVc의 기이고 W1C가 화학식 WC2의 기인 경우, 적합하게는 t는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고, 가장 적합하게는 t는 1 내지 4로부터 선택된 정수이다.
따라서, 본 발명의 제1 양상과 관련하여 상기 정의된 링커는 하기에 나타낸 화학식 LX1 또는 화학식 LX2의 형태를 채택할 수 있는 것으로 이해될 것이다:
여기서 각 Z1, Q1, Q2, Q3, W1A, W1B, W1C, W2A, W2B, W2C, WQ1, WQ2, R23, R24, R25, R26, R27, FG', L1, LW, L2W, LQ1, m, t, r 및 s는 본원에 정의된 바와 같고; 는 상기 링커가 활성제(들)에 부착되는 위치를 나타낸다.
따라서, 특정 구체예에서, 항체, 링커 및 적어도 하나의 활성제를 포함하는 접합체가 제공되며, 여기서:
i) 상기 링커는 적어도 하나의 활성제(들)를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며; 및
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성되고;
iv) 상기 링커는 화학식 LX1 또는 화학식 LX2의 링커이다.
적합하게는, 화학식 LX1 및 화학식 LX2의 각 Z1은 상기 정의된 바와 같은 화학식 IIIa, 화학식 IIIb, 화학식 IIIc, 화학식 IIId, 화학식 IIIe, 화학식 IIIf 및 화학식 IIIg로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 재-브릿징 모이어티이다. 더 적합하게는, 각 Z1은 상기 정의된 바와 같은 화학식 IIIa, 화학식 IIIb 및 화학식 IIIe로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 재-브릿징 모이어티이다. 가장 적합하게는, 각 Z1은 상기 정의된 바와 같은 화학식 IIIa의 재-브릿징 모이어티이다.
또한, 접합체가 5 내지 7개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되는 경우, 화학식 (III)의 각 재-브릿징 모이어티의 ZA 기능성 연결 기는 상기 나타낸 결합 중 하나 또는 모두를 통해 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
적합하게는, r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 10, 더 적합하게는 1 내지 8, 가장 적합하게는 1 내지 4가 되도록 선택된다.
적합하게는, r 및 s는 접합체 1개당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 활성제가 존재하도록 선택된다.
일부 구체예에서, Q1은 결합이다.
다른 구체예에서, Q1은 화학식 IVa의 기이다:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=O)NR7, C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이다.
적합하게는, Q1은 화학식 IVa의 기이고, 여기서:
Q1A는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=O)NR7 및 C(=NR8)로부터 선택되고;
Q1B는 N 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이다.
더 적합하게는, Q1은 화학식 IVa의 기이고, 여기서:
Q1A는 C(=O), NR7C(=O) 및 C(=O)NR7로부터 선택되고;
Q1B는 N 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 1 또는 2, 바람직하게는 1이다.
일부 구체예에서, Q2는 N이다. 다른 구체예에서, Q2는 CR11이고, 여기서 R11은 수소 및 메틸로부터 선택된다.
일부 구체예에서, Q3은 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12 및 O로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택된다.
일부 구체예에서, Q3은 화학식 IVb1의 기이다:
여기서:
Q3A는 NR12 및 O로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌이다.
일부 구체예에서, Q3은 화학식 IVb1의 기이고, 여기서:
Q3A는 O이고;
Q3B는 결합이고;
Q3C는 NR13이고;
R13은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 C1-C6 알킬렌이다.
일부 구체예에서, W1은 화학식 IVc의 기이고, 여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나 또는 백본에 O를 선택적으로 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W1B는 -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15- 및 -NR15C(=O)NR16-으로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합 및 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W1C는 화학식 WC1의 기이고;
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 활성제이다.
다른 구체예에서, W1은 화학식 IVc의 기이고, 여기서:
W1A는 N이고;
LW는 부재하거나 또는 C1-C6알킬렌이고;
W1B는 -NR15C(=O)- 및 -C(=O)NR15-로부터 선택된 기이고;
R15는 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합 및 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W1C는 화학식 WC1의 기이고;
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 활성제이다.
다른 구체예에서, W1은 화학식 IVc의 기이고, 여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나 또는 백본에 O를 선택적으로 함유하는 C1-C6알킬렌으로부터 선택되고;
W1B는 -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15- 및 -NR15C(=O)NR16-으로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W1C는 화학식 WC2의 기이고;
WQ1은 화학식 WC3의 기이고:
여기서:
XW1은 NH이고;
XW2는 NRx1Rx2이고, 여기서 Rx1 및 Rx2는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
QW1은 부재하거나, 또는 C1-C6알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6알킬렌으로부터 선택되고;
QW2는 -NHC(=O)- 및 -C(=O)NH-로부터 선택됨;
WQ2는 화학식 WC4의 기이고:
여기서:
XW4는 NH이고;
XW3은 NH이고;
는 XW4가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 XW4가 -C(=O)RX3 기에 부착되는 위치를 나타내고, 여기서 Rx3은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
QW1A는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
QW2A는 -C(=O)-이고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
LQ1은 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
t는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고;
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 활성제이다.
추가 구체예에서, W1은 화학식 IVc의 기이고, 여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나 또는 백본에 O를 선택적으로 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W1B는 -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15- 및 -NR15C(=O)NR16-으로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W1C는 화학식 WC2의 기이고;
WQ1은 화학식 WC3A의 기이고:
여기서:
QW1은 부재하거나 또는 C1-C6알킬렌이고;
QW2는 -NHC(=O)- 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수임;
WQ2는 화학식 WC4A의 기이고:
여기서:
QW1A는 백본에 O를 선택적으로 함유하는 C1-C6알킬렌이고;
QW2A는 -C(=O)-이고;
는 NH가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 NH가 -C(=O)CH3에 부착되는 위치를 나타내고;
LQ1은 화학식 LQ1의 기이고;
여기서:
Y는 O 또는 NH이고;
a는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 a는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고);
b는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 b는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고, 가장 적합하게는 b는 4이고);
t는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고;
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 활성제이다.
W1C가 화학식 WC2의 기인 경우, 적합하게는 LQ1은 화학식 LQ2의 기이다:
.
일부 구체예에서, W2는 화학식 IVd의 기이고, 여기서:
W2A는 N으로부터 선택되고;
L2W는 부재하거나, 또는 백본에 O 또는 N을 선택적으로 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W2B는 N 및 CR18로부터 선택된 기이고;
W2C는 -NR17C(=O)- 또는 -C(=O)NR17-로부터 선택된 기이고;
R17은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R18은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합 및 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
FG', L1 및 D는 본원에 정의된 바와 같다.
다른 구체예에서, W2는 화학식 IVd의 기이고, 여기서:
W2A는 N으로부터 선택되고;
L2W는 부재하거나 또는 C1-C6알킬렌이고;
W2B는 N이고;
W2C는 -C(=O)NH-이고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합 및 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
FG', L1 및 D는 본원에 정의된 바와 같다.
특정 구체예에서, FG'는 i) 케톤 또는 알데히드 및 알콕시아민 (예: 하이드록실아민) 또는 하이드라진; ii) 아지드 및 알킨; iii) 아민 및 아실 할라이드 또는 카복실산; iv) 전자-풍부 친디엔체 (electron-rich　dienophile) (예: 1,3-니트론 알켄) 및 전자-부족 디엔 (electron-poor　diene) (예: 테트라진); 및 iii) 변형된 알켄 또는 알킨 (예: 노르보르넨 또는 사이클로옥틴) 및 테트라진 간의 반응으로부터 형성된 결합 또는 관능기이다. 적합하게는, FG'는 아지드 및 알킨 간의 반응 또는 아민 및 아실 할라이드 또는 카복실산 간의 반응으로부터 형성된 결합 또는 관능기이다. 가장 적합하게는, FG'는 아지드 및 알킨 간의 반응으로부터 형성된 관능기이다.
따라서, 일부 구체예에서, FG'는 결합, 로부터 선택된 관능기이다.
다른 구체예에서, FG'는 결합, , , -NH(=O)C- 및 -C(=O)NH-로부터 선택된 관능기이다.
일부 구체예에서, FG'는 이다.
적합하게는, FG'는 이다.
가장 적합하게는, FG'는 이고, 여기서 N은 L1에 결합된다.
링커 L 1
링커 L1은 기능성 연결 모이어티 FG'를 활성제(들) D에 부착시키는 링커이다.
임의의 적합한 링커는 기능성 연결 모이어티 FG'를 활성제 D에 연결하는데 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
특정 구체예에서, 상기 링커 L1은 효소적 절단 (예: 단백질분해 또는 펩티다제 절단, 설파타제 절단 또는 갈락토시다제 절단)에 취약한 하나 이상의 기를 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 링커 L1은 하나 이상의 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기, 하나 이상의 아릴 설페이트, 하나 이상의 아릴 갈락토시드 또는 이들의 조합을 포함한다. 적합하게는, 상기 링커 L1은 하나 이상의 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기를 포함하고, 여기서 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기는 하기에 정의된 바와 같다.
특정 구체예에서, 상기 링커 L1은 화학적 절단에 취약한 하나 이상의 기 (예: 디설파이드 또는 하이드라존)를 포함한다.
일부 구체예에서, 링커 L1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함한다.
특정 구체예에서, L1은 결합, C1-C10 알킬렌, 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌 및 화학식 Va의 기로부터 선택된다:
여기서:
LQ는 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O 또는 NH를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
Q4는 단일 결합 또는 이고, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 활성제에 부착하기 위한 기이다.
적합하게는, LQ는 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, LQ는 결합으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, LQ는 C1-C10알킬렌 또는 백본에 O를 함유하는 C1-C10알킬렌이다. 적합하게는, LQ는 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌이다.
특정 구체예에서, L1은 결합, C1-C10 알킬렌, 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌 및 화학식 Va1의 기로부터 선택된다:
여기서:
Q4는 단일 결합 또는 이고, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 활성제에 부착하기 위한 기이다.
특정 구체예에서, L1은 C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, L1은 화학식 Va 또는 화학식 Va1의 기이다.
일부 구체예에서, Q4는 단일 결합이다.
다른 구체예에서, Q4는 이다.
Q X
일 구체예에서, Qx는 아미노산 잔기이다. 상기 아미노산은 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산일 수 있다.
일 구체예에서, Qx는 Phe, Lys, Val, Ala, Cit, Leu, Ile, Arg 및 Trp로부터 선택되고, 여기서 Cit는 시트룰린이다.
일 구체예에서, Qx는 디펩티드 잔기를 포함한다. 상기 디펩티드에서의 아미노산은 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 디펩티드는 천연 아미노산을 포함한다. 상기 링커가 카텝신 불안정 링커 (cathepsin labile linker)인 경우, 상기 디펩티드는 카텝신-매개 절단에 대한 작용 부위이다. 상기 디펩티드는 카텝신에 대한 인식 부위이다.
일 구체예에서, Qx는 하기로부터 선택되고:
NH -Phe-Lys-C=O,
NH Val-Ala- C=O,
NH Val-Lys- C=O,
NH Ala-Lys- C=O,
NH-Val-Cit- C=O,
NH-Phe-Cit- C=O,
NH-Leu-Cit- C=O,
NH-Ile-Cit- C=O,
NH-Phe-Arg- C=O, 및
NH-Trp-Cit- C=O;
여기서 Cit는 시트룰린이다.
바람직하게는, Qx는 하기로부터 선택된다:
NH-Phe-Lys- C=O,
NH-Val-Ala- C=O,
NH-Val-Lys- C=O,
NH-Ala-Lys- C=O, 및
NH-Val-Cit- C=O.
가장 바람직하게는, Qx는 NH-Phe-Lys- C=O, NH-Val-Cit- C=O 또는 NH-Val-Ala- C=O로부터 선택된다.
다른 관심 있는 디펩티드 조합은 하기를 포함한다:
NH -Gly-Gly- C=O,
NH -Pro-Pro- C=O, 및
NH -Val-Glu- C=O.
본원에 참조로 통합된 Dubowchik et　al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869에 기재된 것을 포함하는, 다른 디펩티드 조합을 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, Qx는 트리펩티드 잔기이다. 상기 트리펩티드에서의 아미노산은 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 트리펩티드는 천연 아미노산을 포함한다. 상기 링커가 카텝신 불안정 링커인 경우, 상기 트리펩티드는 카텝신-매개 절단에 대한 작용 부위이다. 상기 트리펩티드는 카텝신에 대한 인식 부위이다.
일 구체예에서, 상기 아미노산 측쇄는 적합한 경우 화학적으로 보호된다. 상기 측쇄 보호기는 상기 논의된 바와 같은 기일 수 있다. 보호된 아미노산 서열은 효소에 의해 절단 가능하다. 예를 들어, Boc 측쇄-보호된 Lys 잔기를 포함하는 디펩티드 서열은 카텝신에 의해 절단 가능하다.
아미노산의 측쇄에 대한 보호기는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, Novabiochem Catalog에 기재되고, 상기 기재된 바와 같다.
일부 구체예에서, LD는 하기로부터 선택된다:
(a) 단일 결합;
(b) -C(=O)-;
(c) -NH-; 및
(d) .
이들 구체예들 중 일부에서, LD는 단일 결합이다. Q4가 또한 단일 결합인 경우, FG'는 상기 활성제에 직접 부착된다.
이들 구체예들 중 다른 구체예에서, LD는 -C(=O)- 또는 -NH-이다.
이들 구체예들 중 다른 구체예에서, LD는 이다. 이러한 기는 절단 가능한 연결 기과 함께 자가-희생 기 (self-immolative group)로서 작용할 수 있다.
특정 추가 구체예들
일부 구체예에서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)의 화합물이다:
여기서:
각 Z1은 상기 정의된 화학식 (IIIa)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (IIIa)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
각 Q1은 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 C(=O), NR7C(=O) 및 C(=O)NR7로부터 선택되고;
Q1B는 N 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 1 또는 2, 바람직하게는 1이고;
각 Q2는 N이고;
각 Q3은 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 O이고;
Q3B는 결합이고;
Q3C는 NR13이고;
R13은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 C1-C6알킬렌이고;
W1은 화학식 IVc1의 기이고:
여기서:
W1A는 N이고;
LW는 부재하거나 또는 C1-C4알킬렌이고;
W1B는 -NR15C(=O)- 및 -C(=O)NR15-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W2는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N으로부터 선택되고;
L2W는 부재하거나 또는 C1-C4 알킬렌이고;
W2B는 N이고;
W2c는 C(=O)NH이고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
FG'는 이고, 여기서 N은 L1에 결합되고;
L1은 결합, C1-C10 알킬렌, 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌 및 화학식 Va1의 기로부터 선택되고:
여기서:
Q4는 단일 결합 또는 이고, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 상기 활성제에 부착하기 위한 기이고;
D는 본원에 정의된 바와 같은 활성제이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 8이 되도록 선택된다.
다른 구체예에서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)의 화합물이다:
여기서:
각 Z1은 상기 정의된 화학식 (IIIa)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (IIIa)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
각 Q1은 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 C(=O), NR7C(=O) 및 C(=O)NR7로부터 선택되고;
Q1B는 N 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 1 또는 2, 바람직하게는 1이고;
각 Q2는 N이고;
각 Q3은 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 O이고;
Q3B는 결합이고;
Q3C는 NR13이고;
R13은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌이고;
W1은 화학식 IVc의 기이고:
여기서:
W1A는 N이고;
LW는 부재하거나 또는 C1-C4알킬렌이고;
W1B는 -NR15C(=O)- 및 -C(=O)NR15-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W1C는 화학식 W2C의 기이고;
WQ1은 화학식 WC3A의 기이고;
여기서:
QW1은 부재하거나 또는 C1-C6알킬렌이고;
QW2는 -NHC(=O)- 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
WQ2는 화학식 WC4A의 기이고:
여기서:
QW1A는 백본에 O를 선택적으로 함유하는 C1-C6알킬렌이고;
QW2A는 -C(=O)-이고;
는 XW1이 또 다른 WQ2의 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 XW4가 -C(=O)CH3에 부착되는 위치를 나타내고;
LQ1은 화학식 LQ1의 기이고;
여기서:
Y는 O 또는 NH이고;
a는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
b는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
t는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고;
FG'는 이고, 여기서 N은 L1에 결합되고;
L1은 결합, C1-C10 알킬렌, 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌 및 화학식 Va1의 기로부터 선택되고:
여기서:
Q4는 단일 결합 또는 이고, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 활성제에 부착하기 위한 기이고;
D는 본원에 정의된 바와 같은 활성제이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 8이 되도록 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 접합체는 하기 중 하나로부터 선택된다:
여기서:
는 항체가 부착되는 위치를 나타내고;
상기 항체는 바람직하게는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 가장 바람직하게는 트라스투주맙이다.
일부 구체예에서, 상기 접합체는 하기 중 하나로부터 선택된다:
여기서:
X=
FG=
L=
D=
는 항체가 부착되는 위치를 나타내고;
상기 항체는 바람직하게는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 가장 바람직하게는 트라스투주맙이다.
일부 구체예에서, 상기 접합체는 하기 중 하나로부터 선택된다:
X=
FG=
L=
D=
는 항체가 부착되는 위치를 나타내고;
상기 항체는 바람직하게는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 가장 바람직하게는 트라스투주맙이다.
일부 구체예에서, 상기 접합체는 하기 기재된 ADC 1 내지 ADC 20으로부터 선택된다.
본 발명의 접합 시약
또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 하기에 나타낸 화학식 (II)의 접합 시약, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 제공한다:
여기서:
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
n은 1 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
L 및 L1은 독립적으로 링커이고;
Z는 항체의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이고;
D는 활성제이다.
적합하게는, Z는 항체의 황 원자와 반응할 수 있는 친전자성 관능기이다.
적합하게는, n은 1 내지 12, 더 적합하게는 1 내지 10, 더욱 적합하게는 1 내지 8, 가장 적합하게는 1 내지 4로부터 선택된 정수이다.
특정 구체예에서, Z는 접합체 첨가 (Michael 반응)를 통해 항체의 황 원자와 반응할 수 있는 Michael 수용체 (예: 전형적으로 전자 끄는 기 (electron withdrawing group)를 갖는 알켄 또는 알킨)이다. 접합체 첨가 반응 및 Michael 반응은 화학 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 당업자는 본 발명의 접합 시약에 사용하기에 적합한 마이클 수용체 (Michael Acceptors)를 선택할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서, Z는 알켄, 알킨, 비닐아렌 (예: 디비닐피리미딘), 말레이미드, 할로-말레이미드, 설폰, 아릴렌-프로피올로니트릴, 피리다진디온, 할로-(헤트로)아렌, 벤질 할라이드, β-불포화 케톤을 포함하는 기, SNAr 반응할 수 있는 기 또는 황을 알킬화할 수 있는 기로부터 선택된 항체 상의 황 원자와 반응하는 관능기이다.
특정 구체예에서, Z는 알켄, 알킨, 비닐아렌 (예: 디비닐피리미딘), 말레이미드, 할로-말레이미드, 설폰, 아릴렌-프로피올로니트릴, 피리다진디온 또는 β-불포화 케톤을 포함하는 기로부터 선택된 항체 상의 황 원자와 반응하는 관능기이다.
특정 구체예에서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIa)를 갖는다:
여기서:
각 Z2는 항체 상의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기 (Z)를 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
D, L, L1, FG' 및 n은 각각 본원에 정의된 바와 같다.
각 D, L, L1, FG' 및 n에 대한 바람직하고 적합한 치환기는 전술한 본 발명의 접합체에 대한 각 D, L, L1, FG' 및 n에 대한 바람직하고 적합한 치환기와 유사한 것으로 이해될 것이다.
특정 구체예에서, 각 Z2는 하기 기들 중 하나로부터 독립적으로 선택된 재-브릿징 연결 기이다:
여기서 각 A1, A2, A3, X, R1, R2, R3, Q, Y1, Y2, p 및 q는 상기 정의된 바와 같고;
Ts는 토실레이트이고;
는 모이어티가 링커 L에 부착되는 위치를 나타낸다.
특정 구체예에서, 각 Z2는 화학식 IIZA, 화학식 IIZB, 화학식 IIZE 및 화학식 IIZH의 그룹으로부터 독립적으로 선택된 재-브릿징 연결 기이다. 적합하게는, 각 Z2는 화학식 IIZA, 화학식 IIZB 및 화학식 IIZE의 그룹으로부터 독립적으로 선택된 재-브릿징 연결 기이다. 더 적합하게는, 각 Z2는 화학식 IIZA의 재-브릿징 연결 기이다.
특정 구체예에서, 하기 중 하나로부터 선택된 접합 시약이 제공된다:
여기서 각 D, L, L1, FG', A1, A2, A3, X, R1, R2, R3, Q, Y1, Y2, p, q 및 n은 상기 정의된 바와 같다.
다른 구체예에서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIB)를 갖는다:
여기서 각 Z2, Q1, Q2, Q3, W1, W2, r 및 s는 상기 정의된 바와 같다.
각 D, Q1, Q2, Q3, W1, W2, r 및 s에 대한 바람직하고 적합한 치환기는 전술한 본 발명의 접합체에 대한 각 D, Q1, Q2, Q3, W1, W2, r 및 s에 대한 바람직하고 적합한 치환기와 유사한 것으로 이해될 것이다. 바람직하고 적합한 Z2 기는 전술한 것으로 이해될 것이다.
특정 추가 구체예들
특정 구체예에서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIB)의 화합물이다:
여기서:
각 Z2는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (IIZA)의 재-브릿징 모이어티이고;
각 Q1은 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 C(=O), NR7C(=O) 및 C(=O)NR7로부터 선택되고;
Q1B는 N 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 1 또는 2, 바람직하게는 1이고;
각 Q2는 N이고;
각 Q3은 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 O이고;
Q3B는 결합이고;
Q3C는 NR13이고;
R13은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 또는 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌이고;
W1은 화학식 IVc1의 기이고:
여기서:
W1A는 N이고;
LW는 부재하거나 또는 C1-C4알킬렌이고;
W1B는 -NR15C(=O)- 및 -C(=O)NR15-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W2는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N으로부터 선택되고;
L2W는 부재하거나 또는 C1-C4알킬렌이고;
W2B는 N이고;
W2C는 -NHC(=O)- 또는 -C(=O)NH-이고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합 및 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
FG'는 이고, 여기서 N은 L1에 결합되고;
L1은 결합, C1-C10 알킬렌, 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌 및 화학식 Va1의 기로부터 선택되고:
여기서:
Q4는 단일 결합 또는 이고, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 활성제에 부착하기 위한 기이고;
D는 본원에 정의된 바와 같은 활성제이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 8이 되도록 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIB)의 화합물이다:
여기서:
각 Z2는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (IIZA)의 재-브릿징 모이어티이고;
각 Q1은 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 C(=O), NR7C(=O) 및 C(=O)NR7로부터 선택되고;
Q1B는 N 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 1 또는 2, 바람직하게는 1이고;
각 Q2는 N이고;
각 Q3은 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 O이고;
Q3B는 결합이고;
Q3C는 NR13이고;
R13은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 또는 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌이고;
W1은 화학식 IVc의 기이고:
여기서:
W1A는 N이고;
LW는 부재하거나 또는 C1-C4알킬렌이고;
W1B는 -NR15C(=O)- 및 -C(=O)NR15-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
WQ1은 화학식 WC3A의 기이고:
여기서:
QW1은 부재하거나 또는 C1-C6알킬렌이고;
QW2는 -NHC(=O)- 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
WQ2는 화학식 WC4A의 기이고:
여기서:
QW1A는 백본에 O를 선택적으로 함유하는 C1-C6 알킬렌이고;
QW2A는 -C(=O)-이고;
는 NH가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 NH가 -C(=O)CH3에 부착되는 위치를 나타내고;
LQ1은 화학식 LQ1의 기이고;
여기서:
Y는 O 또는 NH이고;
a는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
b는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
t는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고;
FG'는 이고, 여기서 N은 L1에 결합되고;
L1은 결합, C1-C10 알킬렌, 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌 및 화학식 Va1의 기로부터 선택되고:
여기서:
Q4는 단일 결합 또는 이고, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 활성제에 부착하기 위한 기이고;
D는 본원에 정의된 바와 같은 활성제이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 8이 되도록 선택된다.
다른 구체예에서, 상기 접합 시약은 하기 중 하나로부터 선택된다:
.
일부 구체예에서, 상기 접합 시약은 하기 중 하나로부터 선택된다:
여기서:
X=
FG=
L=
D=
본 발명의 화합물
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 하기에 나타낸 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물이 제공된다:
여기서:
FG는 다른 하나의 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 관능기이고;
n은 0 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
L은 링커이고;
Z는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이다.
각 FG, n, L 및 Z에 대한 바람직하고 적합한 치환기는 상기 기재된 본 발명의 접합체 및 접합 시약에 대한 각 FG, n, L 및 Z에 대한 바람직하고 적합한 치환기와 유사한 것으로 이해될 것이다.
따라서, 특정 구체예에서, FG는 알켄, 알킨, 아지드, 하이드록실, 아민, 카복실산, 알데히드, 아실 할라이드, 테트라진, 알콕시아민 (예: 하이드록실아민), 하이드라진, 전자-풍부 친디엔체 (예: 1,3-니트론 알켄) 및 전자-부족 디엔 (예: 테트라진), 니트론, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트로부터 선택된 관능기이다.
적합하게는, FG는 알켄, 알킨, 아지드, 하이드록실, 아민, 카복실산, 알데히드, 아실 할라이드, 테트라진, 알콕시아민 (예: 하이드록실아민) 및 하이드라진으로부터 선택된 관능기이다. 더 적합하게는, FG는 알킨, 아지드, 하이드록실, 아민, 카복실산, 알데히드 및 아실 할라이드로부터 선택된 관능기이다. 가장 적합하게는, FG는 알킨 및 아지드로부터 선택된 관능기이다.
특정 구체예에서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ia)를 갖는다:
여기서 Z2, L, FG 및 n은 각각 상기 정의된 바와 같다.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기 그룹들 중 하나로부터 선택된다:
여기서 각 A1, A2, A3, X, L, FG, n, Q, Y1, Y2, R1, R2, R3, q 및 p는 상기 정의된 바와 같다.
특정 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 Ib, 화학식 Ib, 화학식 If 또는 화학식 Ij의 화합물이다. 적합하게는, 상기 화합물은 화학식 Ib, 화학식 Ib, 화학식 If 또는 화학식 Ij의 화합물이다. 더 적합하게는, 상기 화합물은 화학식 Ib의 화합물이다.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ic)를 갖는다:
여기서:
Z2, Q1, Q2, Q3, r 및 s는 본원에 정의된 바와 같고;
W1'은 화학식 IVc 또는 IVc2의 기이고:
여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Lw는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는, m은 1이고);
W1C는 화학식 WC2의 기이고;
WQ1은 화학식 WC3A의 기이고:
여기서:
QW1은 부재하거나 또는 C1-C6알킬렌이고;
QW2는 -NHC(=O)- 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
WQ2는 화학식 WC4A의 기이고:
여기서:
QW1A는 백본에 O를 선택적으로 함유하는 C1-C6알킬렌이고;
QW2A는 -C(=O)-이고;
는 NH가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 NH가 -C(=O)CH3에 부착되는 위치를 나타내고;
LQ1은 화학식 LQ1의 기이고;
여기서:
Y는 O 또는 NH이고;
a는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
b는 1 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
t는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고;
FG는 본원에 정의된 바와 같고;
W2'는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고, 여기서 R17은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6알킬렌으로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
FG는 본원에 정의된 바와 같다.
다른 구체예에서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ic)를 갖는다:
여기서:
Z2, Q1, Q2, Q3, r 및 s는 본원에 정의된 바와 같고;
W1'은 화학식 IVc2의 기이고:
여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Lw는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는, m은 1이고);
FG는 본원에 정의된 바와 같고;
W2'는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고, 여기서 R17은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
FG는 본원에 정의된 바와 같다.
다른 구체예에서, 상기 화합물은 하기 중 하나로부터 선택된다:
.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기 중 하나로부터 선택된다:
.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기 중 하나로부터 선택된다:
.
본 발명의 중간 접합체
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 항체, 링커 및 또 다른 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 적어도 하나의 관능기를 포함하는 중간 접합체 (intermediate conjugate)가 제공되며, 여기서:
i) 상기 링커는 적어도 하나의 관능기를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며; 및
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성된다.
특정 구체예에서, 상기 중간 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 1 내지 4개 (바람직하게는 2 내지 4개, 더 바람직하게는 3 내지 4개, 가장 바람직하게는 4개) 포함한다:
여기서:
ZA는 본원에 정의된 바와 같은 기능성 연결 기이고;
Pep는 상기 모이어티가 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 위치를 나타내고;
는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
바람직하고 적합한 ZA 기는 상기 기재된 본 발명의 접합체에 대한 바람직하고 적합한 ZA 기와 유사한 것으로 이해될 것이다.
다른 구체예에서, 상기 중간 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (VI)의 화합물이다:
여기서, Z1, Q1, Q2, Q3, W1', W2', r 및 s는 상기 정의된 바와 같다.
다른 구체예에서, 상기 중간 접합체는 하기 중 하나로부터 선택된다:
여기서:
는 항체가 부착되는 위치를 나타내고;
상기 항체는 바람직하게는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 가장 바람직하게는 트라스투주맙이다.
다른 구체예에서, 상기 중간 접합체는 하기 중 하나로부터 선택된다:
여기서:
는 항체가 부착되는 위치를 나타내고;
상기 항체는 바람직하게는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 가장 바람직하게는 트라스투주맙이다.
다른 구체예에서, 상기 중간 접합체는 하기에 기재된 ALC 1 내지 12로부터 선택된다.
치료 방법
활성제가 약물인 경우 본 발명의 접합체는 치료 방법에 사용될 수 있다. 또한, 활성제가 약물인 경우, 본 발명의 제1 양상에 따른 접합체의 치료적으로 유효한 양을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다. 용어 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 환자에게 유익을 주기에 충분한 양이다. 이러한 유익은 적어도 하나의 증상이 적어도 개선되는 것일 수 있다. 투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료 대상의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료 처방, 예컨대 투여량 결정은 일반의 및 기타 의사의 책임하에 있다.
접합체는 단독으로 투여되거나 또는 치료할 병태에 따라 다른 치료와 조합하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 치료 및 요법의 예로는 화학요법 (예를 들어 약물을 포함하는 활성제의 투여; 수술; 및 방사선 요법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물, 및 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 활성 성분, 즉 활성제가 약물인 경우 본 발명의 제1 양상에 따른 접합체에 추가하여, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 잘 알려진 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 상기 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 이는 경구, 또는 주사, 예컨대 피부, 피하 또는 정맥으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 산제 또는 액제 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체 또는 아쥬반트를 포함할 수 있다. 액제 약학적 조성물은 일반적으로 액체 담체 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액 또는 글리콜 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 캡슐은 고체 담체 예컨대 젤라틴을 포함할 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 환부에 주사하는 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구로 허용 가능한 수용액의 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트화 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 접합체는 증식성 질환 및 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "증식성 질환 (proliferative disease)"은 인 비트로 또는 인 비보로 신생물 (neoplastic) 또는 과형성 (hyperplastic) 성장과 같은 바람직하지 않은 과도하거나 또는 비정상적인 세포의 원치 않거나 또는 제어되지 않는 세포의 증식에 관한 것이다.
증식성 질환의 예로는 양성, 전-악성 및 악성 세포 증식을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이는 신생물 및 종양 (예: 조직구종, 신경교종, 성상세포종, 골종), 암 (예: 폐암, 소세포 폐암, 위장암, 대장암, 결장암, 유방 암종, 난소 암종, 전립선암, 고환암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 뇌암, 육종, 골육종, 카포시 육종, 흑색종), 백혈병, 건선, 골 질환, 섬유증식성 장애 (예: 결합 조직) 및 죽상경화증을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다른 관심 있는 암에는 혈액암; 악성 종양 예컨대 백혈병 및 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종, 및 서브타입 예컨대 DLBCL, 변연부, 외투부, 여포, 호지킨 림프종, AML, 및 B 또는 T 세포 기원의 기타 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 폐, 위장관 (예: 장, 결장 포함), 유방 (mammary), 난소, 전립선, 간 (hepatic), 신장 (renal), 방광, 췌장, 뇌 및 피부를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 세포 타입을 치료할 수 있다.
자가면역 질환의 예로는 하기를 포함한다: 류마티스 관절염, 자가면역 탈수초성 질환 (예: 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염), 건선성 관절염, 내분비 안구병증 (endocrine ophthalmopathy), 포도막염, 전신성 홍반 루푸스, 중증 근무력증, 그레이브스병 (Graves' disease), 사구체신염, 자가면역 간 장애, 염증성 장 질환 (예: 크론병), 아나필락시스, 알레르기 반응, 쇼그렌 증후군 (Sjoegren's syndrome), 제1형 당뇨병, 원발성 담즙성 간경변, 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 섬유근육통, 다발성근염, 피부근염, 다발성 내분비부전, 슈미트 증후군 (Schmidt's syndrome), 자가면역 포도막염, 애디슨병 (Addison's disease), 부신염, 갑상선염, 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 자가면역 갑상선 질환, 악성빈혈, 위 위축, 만성간염, 루포이드 간염 (lupoid hepatitis), 죽상동맥경화증, 아급성 피부 홍반 루푸스, 부갑상선기능저하증, 드레슬러 증후군 (Dressler's syndrome), 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 보통 천포창 (pemphigus vulgaris), 천포창, 포진성 피부염 (dermatitis herpetiformis), 원형 탈모증, 유사천포창 (pemphigoid), 공피증 (scleroderma), 진행성 전신 경화증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상 (Raynaud's phenomenon), 식도 운동장애 (esophageal dysmotility), 가락피부경화증 (sclerodactyly) 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 강직성 척추염 (ankylosing spondolytis), 궤양성 결장염, 혼합 결합 조직 질환, 결절 다발동맥염 (polyarteritis nedosa), 전신 괴사성 혈관염, 아토피성 피부염, 아토피성 비염, 굿파스처 증후군 (Goodpasture's syndrome), 샤가스병 (Chagas' disease), 사코이드증 (sarcoidosis), 류마티스열, 천식, 재발 유산 (recurrent abortion), 항-인지질 증후군, 농부 폐증 (farmer's lung), 다형 홍반 (erythema multiforme), 심절개술 후 증후군 (post cardiotomy syndrome), 쿠싱 증후군 (Cushing's syndrome), 자가면역 만성 활동성 간염, 조류-팬시어 폐 (bird-fancier's lung), 독성 표피 괴사용해 (toxic epidermal necrolysis), 알포트 증후군 (Alport's syndrome), 폐포염, 알레르기성 폐포염, 섬유화 폐포염, 간질성 폐질환, 결절 홍반, 괴저 농피증, 수혈 부작용 (transfusion reaction), 타카야스 동맥염 (Takayasu's arteritis), 류마티스 다발근통, 측두 동맥염 (temporal arteritis), 주혈흡충증 (schistosomiasis), 거대세포 동맥염, 회충증, 아스페르길루스증 (aspergillosis), 삼프터 증후군 (Sampter's syndrome), 습진, 림프종성 육아종증 (lymphomatoid granulomatosis), 베체트병 (Behcet's disease), 카플란 증후군 (Caplan's syndrome), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 뎅기열, 뇌척수염, 심내막염, 심내심근 섬유증, 안구내염 (endophthalmitis), 장기 융기성 홍반 (erythema elevatum et diutinum), 건선, 태아 적모구증 (erythroblastosis fetalis), 호산구 근막염 (eosinophilic faciitis), 슐만 증후군 (Shulman's syndrome), 펠티 증후군 (Felty's syndrome), 사상충증 (filariasis), 섬모체염 (cyclitis), 만성 섬모체염, 비동시성 섬모체염 (heterochronic cyclitis), 훅스 섬모체염 (Fuch's cyclitis), IgA 신장병증, 헤노흐-숀라인 자반증 (Henoch-Schonlein purpura), 이식편대 숙주 질환, 이식 거부반응, 심근병증, 이튼-람베르트 증후군 (Eaton-Lambert syndrome), 재발성 다발성 연골염 (relapsing polychondritis), 저온글로불린혈증 (cryoglobulinemia), 발덴스트롬 거대글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulemia), 에반 증후군 (Evan's syndrome) 및 자가면역 성선 부전증 (autoimmune gonadal failure).
일부 구체예에서, 상기 자가면역 질환에는 B 림프구 장애 (예: 전신 홍반성 루푸스, 굿파스처 증후군, 류마티스 관절염 및 제I형 당뇨병), Th1-림프구 장애 (예: 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 원발성 담즙성 간경변, 베게너 육아종증, 결핵 또는 이식편대 숙주 질환) 또는 Th2-림프구 장애 (예: 아토피성 피부염, 전신 홍반 루푸스, 아토피성 천식, 비결막염 (rhinoconjunctivitis), 알레르기성 비염, 오멘 증후군 (Omenn's syndrome), 전신 경화증, 또는 만성 이식편대 숙주 질환)가 있다. 일반적으로, 수지상 세포와 관련된 장애에는 Th1-림프구 또는 Th2-림프구의 장애를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 자가면역 장애는 T 세포-매개 면역학적 장애이다.
특정 구체예에서, 상기 접합체는 미생물 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 적합하게는, 상기 접합체는 박테리아 질병 예컨대 결핵 (TB) 및 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)를 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 상기에서 상세히 설명한 본 발명의 양상들 중 어느 하나 (예: 본 발명의 접합체)와 관련하여 선택적, 적합하고 바람직한 특징을 포함하는 특징은 또한 본 발명의 임의의 다른 양상 (예: 본 발명의 접합체의 용도)과 관련하여 선택적, 적합하고 바람직한 특징을 포함하는 특징일 수 있음이 이해될 것이다.
도 1은 SDS-PAGE에 의한 접합체의 분석을 보여준다; (A) 트라스투주맙 접합체 36-39의 분석; (B) 트라스투주맙 접합체 40-46의 분석; (C) 브렌툭시맙 접합체 47-50의 분석; M = 분자량 마커.
도 2는 접합체 36을 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 1 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적 (LC-MS trace)을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적 (non-deconvoluted mass spectrometry trace)을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적 (deconvoluted mass spectrometry trace)을 보여준다. 예상된 MW = 146,536 Da, 관찰된 MW = 146,537 Da.
도 3은 접합체 37을 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 8 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,674 Da, 관찰된 MW = 146,615 Da.
도 4는 접합체 38을 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 11 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,812 Da, 관찰된 MW = 146,749 Da.
도 5는 접합체 39를 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 14 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 147,096 Da, 관찰된 MW = 147,107 Da.
도 6은 접합체 40을 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 19 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,369 Da, 관찰된 MW = 146,369 Da.
도 7은 접합체 41을 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 21 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,507 Da, 관찰된 MW = 146,508 Da.
도 8은 접합체 42를 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 22 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,605 Da, 관찰된 MW = 146,611 Da.
도 9는 접합체 43을 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 24 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,838 Da, 관찰된 MW = 146,845 Da.
도 10은 접합체 44를 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 28 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 147,077 Da, 관찰된 MW = 147,069 Da.
도 11은 접합체 45를 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 31 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 147,524 Da, 관찰된 MW = 147,526 Da.
도 12는 접합체 46을 생성하기 위한 트라스투주맙 및 화합물 33 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 147,295 Da, 관찰된 MW = 147,301 Da.
도 13은 접합체 47을 생성하기 위한 브렌툭시맙 및 화합물 1 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,549 Da, 관찰된 MW = 146,550 Da.
도 14는 접합체 48을 생성하기 위한 브렌툭시맙 및 화합물 8 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,687 Da, 관찰된 MW = 146,688 Da.
도 15는 접합체 49를 생성하기 위한 브렌툭시맙 및 화합물 19 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,393 Da, 관찰된 MW = 146,395 Da.
도 16은 접합체 50을 생성하기 위한 브렌툭시맙 및 화합물 21 간의 반응으로부터의 LC-MS 추적을 보여주며, 여기서: A)는 비-디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여주고; B)는 디컨볼루션 질량 분광분석 추적을 보여준다. 예상된 MW = 146,531 Da, 관찰된 MW = 146,533 Da.
도 17은 (A) 트라스투주맙 및 트라스투주맙 접합체 36-39의 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 분석; 및 (B) 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)을 통한 트라스투주맙 및 접합체 36-39의 결합 친화도 비교를 보여준다. 오차 막대는 생물학적 4중체 (biological quadruplicates)의 표준 편차를 나타낸다.
도 18은 접합체 51-54의 UV/vis 스펙트럼을 보여준다. 흡광도는 280 nm에서 정규화하였다. 495 nm에서의 흡광도를 사용하여 형광단-대-항체 비율 (fluorophore-to-antibody ratio: FAR)을 계산하였다.
도 19는 SDS-PAGE에 의한 인간 혈장내 접합체 51-54의 안정성 분석을 보여준다; 대표 레인 위의 M = 분자량 마커, P = 인간 혈장, 인큐베이션 일수. 14-일의 인큐베이션 기간 동안 AlexaFluor™ 488의 인간 혈청 알부민 (66.5 kDa) 또는 임의의 다른 혈장 단백질로의 전달은 관찰되지 않았다.
도 20은 ADC 58-61의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (hydrophobic interaction chromatography: HIC) 분석을 보여준다.
도 21은 ADC 62-65의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 분석을 보여준다.
도 22는 HER2-양성 SKBR3 세포, HER2-양성 BT474 세포, HER2-음성 MDA-MB-468 세포 및 HER2-음성 MCF7 세포에서 ADC 62-65의 세포독성을 보여준다. 생존율 데이터는 3가지 독립 실험들의 평균을 보여주고, 오차 막대는 상기 평균의 표준 오차 (standard error of the mean: SEM)를 나타낸다.
도 23은 접합체 51 및 52, 트라스투주맙 또는 비히클 대조군으로 처리한 후에 HER2-양성 SKBR3 세포 및 HER2-음성 MCF7 세포의 생세포 현미경 이미지 (live cell microscopy images)를 보여준다.
실시예
일반 실험 세부사항
모든 용매 및 시약은 달리 명시하지 않는 한 입수한 대로 사용하였다. 에틸 아세테이트, 메탄올, 디클로로메탄, 아세토니트릴 및 톨루엔은 수소화칼슘으로부터 증류하였다. 디에틸 에테르는 수소화리튬알루미늄 및 수소화칼슘의 혼합물로부터 증류하였다. 석유 에테르 (PE)는 증류 시 40 - 60 ℃ 사이의 분획물을 나타낸다. 테트라하이드로푸란을 Na 와이어 (Na wire)를 사용하여 건조시키고, 트리페닐메탄을 지시약으로 사용하여 수소화리튬알루미늄 및 수소화칼슘의 혼합물로부터 증류하였다.
비-수성 반응은 오븐-건조된 유리 제품을 사용하여 건조 질소의 스트림하에 수행하였다. 빙수조를 사용하여 0℃의 온도를 유지하였다. 실온 (rt)은 주위 온도를 나타낸다.
수율은 달리 명시하지 않는 한 분광학적 및 크로마토그래피로 순수한 화합물을 나타낸다. 반응은 박층 크로마토그래피 (TLC) 또는 액체 크로마토그래피 질량 분광분석 (LC-MS)으로 모니터링하였다. TLC는 Merck 실리카겔 60 F254로 사전-코팅된 유리판을 사용하여 수행하였고, UV 형광 (λmax = 254 nm)의 켄칭 또는 과망간산칼륨으로 염색하여 시각화하였다. 체류 계수 (Retention factors: Rf)는 0.01로 표시된다. LC-MS는 MassLynx 4.1 소프트웨어를 사용하는 ESCi Multi-Mode Ionisation Waters SQ Detector 2 분광분석계를 구비한 Waters ACQUITY H-Class UPLC를 사용하여 수행하였고; ESI는 전기분무 이온화 기술 (electrospray ionisation technique)을 나타내고; LC 시스템: 용매 A: H2O/MeCN (95:5) 중 2 mM NH4OAc; 용매 B: MeCN; 용매 C: 2% 포름산; 컬럼: 40℃에서 ACQUITY UPLC® CSH C18 (2.1 mm Х 50 mm, 1.7 μm, 130 Å); 구배: 0.6 mL/min의 유속으로 1분에 걸쳐 일정한 5% C로 5 - 95% B; 검출기: PDA eλ 검출기 220 - 800 nm, 간격 1.2 nm.
플래시 컬럼 크로마토그래피 (Flash column chromatography)는 슬러리-패킹된 Merck 9385 Kieselgel 60 SiO2 (230-400 메시) 또는 Redisep® 역상 C18-실리카 플래시 컬럼 (20-40 μm)을 사용하는 Combiflash Rf200 자동 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다.
HPLC 정제는 20 mL/min의 유속으로 20분에 걸쳐 선형 구배 시스템 (용매 A: 수중 0.1% (v/v) TFA, 용매 B: 아세토니트릴 중 0.05% (v/v) TFA)으로 용리하는 Supelcosil ABZ+PLUS 컬럼 (250 mm × 21.2 mm, 5 μm)을 사용하는 Agilent 1260 Infinity에서 반-분취 역상 HPLC를 통해 수행하였다.
분석 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 1 mL/min의 유속으로 20분에 걸쳐 선형 구배 시스템 (용매 A: H2O 중 0.05% (v/v) TFA; 용매 B: MeCN 중 0.05% (v/v) TFA), 및 UV 검출 (λmax = 220 - 254nm)을 갖춘 Supelcosil™ ABZ+PLUS 컬럼 (150 mm × 4.6 mm, 3 μm)을 사용하여, Agilent 1260 Infinity 장치에서 수행하였다.
적외선 (IR) 스펙트럼은 내부 참조를 사용하여 Perkin-Elmer Spectrum One 분광분석계에서 순수하게 (neat) 기록하였다. 선택된 흡수 최대값 (νmax)은 파수 (cm-1)로 보고한다.
1H 및 13C 핵자기공명 (NMR)은 Bruker DPX-400 (400 MHz, 101 MHz), Bruker Avance 400 QNP (400 MHz, 101 MHz) 및 Bruker Avance 500 Cryo Ultrashield (500 MHz, 126 MHz)에서 내부 중수소 잠금 (internal deuterium lock)을 사용하여 기록하였다. 테트라메틸실란은 내부 표준으로 사용하였다. 1H NMR에서, 화학적 이동 (δH)은 ppm (parts per million)으로, 가장 가까운 0.01 ppm까지 보고하고, 잔류 비-중수소화 용매 피크 (CDCl3: 7.26, DMSO-d6: 2.50, CD3OD: 3.31, D2O: 4.79)를 참조한다. 커플링 상수 (J)는 Hz (Hertz)로, 가장 가까운 0.1 Hz까지 보고한다. 데이터는 하기와 같이 보고한다: 화학적 이동, 다중도 (s = singlet; d = doublet; t = triplet; q = quartet; quint = quintet; m = multiplet; 또는 이들의 조합, 예컨대 dd, dt 등), 적분 및 커플링 상수(들). 13C NMR에서, 화학적 이동 (δC)은 ppm으로, 가장 가까운 0.1 ppm까지 표시하고, 잔류 비-중수소화 용매 피크 (CDCl3: 77.16, DMSO-d6, 39.52, CD3OD: 49.00)를 참조한다.
달리 명시하지 않는 한, HRMS (high resolution mass spectrometry) 측정은 Micromass Q-TOF 질량 분광분석계 또는 Waters LCT Premier Time of Flight 질량 분광분석계를 사용하여 기록하였다. 질량 값은 ±5 ppm 질량 단위의 오차 한계 내에서 보고한다. ESI는 전기분무 이온화 기술을 나타낸다.
UV-Vis 분광분석을 사용하여 단백질 농도를 결정하고, nanodrop ND-1000 분광분석계를 사용하여 형광단-대-항체 비율 (FAR)을 결정하였다. 샘플 버퍼를 기준선 보정을 위한 블랭크 (blank)로서 사용하고, 소광 계수 (extinction coefficients)는 트라스투주맙의 경우 ε280 = 215,380 M-1 cm-1, 및 AlexaFluor 488™ (AF488)의 경우 ε495 = 71,000 M-1 cm-1이었다. 280 nm에서 AF488 흡수에 대한 보정 계수는 0.11이다. FAR은 하기 식을 사용하여 계산하였다:
단백질 LC-MS는 Acquity UPLC BEH300 C4 컬럼 (1.7 μm, 2.1 × 50 mm)을 사용하여 Acquity UPLC 시스템에 커플링된 Xevo G2-S TOF 질량 분광분석계에서 수행하였다. 0.1% 포름산이 포함된 H2O (용매 A) 및 95% MeCN 및 0.1% 포름산이 포함된 5% H2O (용매 B)를 이동상으로서 0.2 mL/min의 유속으로 사용하였다. 구배는 하기와 같이 프로그래밍하였다: 0.93분 동안 95% A, 그 다음에 4.28분에 걸쳐 100% B로 구배, 그 다음에 1.04분 동안 100% B, 그 다음에 1.04에 걸쳐 95% A로 구배. 전기분무 소스 (electrospray source)는 2.0 kV의 모세관 전압 (capillary voltage) 및 190 V의 콘 전압 (cone voltage)으로 작동하였다. 전체 흐름 850 L/h로 탈용매화 기체 (desolvation gas)로서 질소를 사용하였다. 전체 질량 스펙트럼 (total mass spectra)은 제조자의 지침에 따라 MassLynx 소프트웨어 (Waters, v4.2)에 사전 설치된 MaxEnt 알고리즘을 사용하여 이온 계열로부터 재구성하였다. 트라스투주맙 샘플은 LC-MS 분석 전에 PNGase F (New England Biolabs)로 데글리코실화 (deglycosylate)하였다.
실시예 1 - 접합 시약 1의 제조
단계 1: 4-((4,6-디비닐피리미딘-2-일)아미노)부탄산 (2)의 합성
4-((4,6-디비닐피리미딘-2-일)아미노)부탄산 (2)은 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다 (Bargh et al, Chem. Sci., 2020, 11, 2375-2380).
단계 2: 디-tert-부틸(아잔디일비스(에탄-2,1-디일))디카바메이트 (3)의 합성
0℃에서 THF (25 mL) 중 디에틸렌트리아민 (2.16 mL, 20.0 mmol)의 용액에 THF (25 mL) 중 Boc-ON (9.92 g, 40.0 mmol)의 용액을 서서히 부가하였다. 반응을 질소하에 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하였다. 조질의 황색 오일을 CH2Cl2에 용해시키고, 10% aq. NaOH, 물 및 브라인으로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (5.61 g, 18.5 mmol, 92% 수율). R f 0.08 (SiO2, 10% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3336 (m, N-H), 2975 (m, C-H), 1687 (s, C=O); δ H (400 MHz, CDCl3) 4.93 (br s, 2H), 3.24-3.19 (m, 4H), 2.73 (t, 4H, J = 5.7 Hz), 1.44 (s, 18H); δ C (101 MHz, CDCl3) 156.3, 79.4, 49.0, 40.4, 28.6; HRMS (ESI) m/z 실측치 (found) [M+H]+ 304.2221, C14H30O4N3 + 계산치 (required) 304.2231.
단계 3: 메틸 비스(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)에틸)글리시네이트 (4)의 합성
DMF (80 mL) 중 디-tert-부틸 (아잔디일비스(에탄-2,1-디일))디카바메이트 (3) (5.61 g, 18.5 mmol)의 용액에 DIPEA (3.86 mL, 22.2 mmol) 및 메틸 브로모아세테이트 (2.61 mL, 27.8 mmol)를 부가하였다. 반응을 실온에서 6시간 동안 교반한 다음에, 질소 스트림하에 농축하였다. 조질의 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (40-50% EtOAc/PE)로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (6.56 g, 17.5 mmol, 94% 수율). R f 0.28 (SiO2, 50% EtOAc/PE); ν max (neat/cm-1) 3345 (m, N-H), 2979 (m, C-H), 1740 (s, C=O), 1688 (s, C=O); δ H (400 MHz, CDCl3) 5.13 (br s, 2H, NH), 3.70 (s, 3H), 3.37 (s, 2H), 3.15 (q, 4H, J = 5.6 Hz), 2.72 (t, 4H, J = 5.9 Hz), 1.44 (s, 18H); δ C (101 MHz, CDCl3) 172.3, 156.3, 79.3, 55.1, 54.3, 51.8, 38.7, 28.6; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 376.5.
단계 4: 2-브로모-N-(프로프-2-인-1-일)아세트아미드 (5)의 합성
CH2Cl2 (33 mL) 및 sat. NaHCO3 (33 mL) 중 프로파르길아민 (1.16 mL, 18.2 mmol)의 용액을 최대로 교반하면서 -10℃로 냉각시키고, 2-브로모아세틸 브로마이드 (2.42 mL, 27.2 mmol)를 15분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물이 서서히 실온에 도달하도록 하고, 완료 시에 반응 혼합물을 농축하였다. 물 (30 mL)을 부가한 후에, 수용액을 EtOAc (2x80 mL)로 추출하고, 유기상들을 조합하고, sat. NaHCO3 (30 mL), 5% HCl (30 mL) 및 브라인 (30 mL)으로 세척하였다. 유기상들을 조합하고, Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축하여 표제 화합물을 연황색 고체로서 제공하였다 (2.97 g, 16.9 mmol, 93%). R f 0.69 (SiO2, 20% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3289 (m, N-H), 3071 (m, C-H), 2120 (w, C≡C), 1645 (s, C=O); δ H (400 MHz, CDCl3) 6.68 (s, 1H), 4.09 (dd, J = 5.3, 2.6 Hz, 2H), 3.90 (s, 2H), 2.28 (t, J = 2.6 Hz, 1H); δ C (100 MHz, CDCl3) 165.1, 78.5, 72.3, 30.0, 28.7; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 178.0.
단계 5: 화합물 6의 합성
건조 MeOH (0.3 mL)에 용해된 메틸 비스(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)에틸)글리시네이트 (4) (200 mg, 0.53 mmol)를 함유하는 사전-건조된 마이크로웨이브 바이알에 디에틸렌트리아민 (10.7 μL, 0.098 mmol)을 부가하고, 바이알을 캡핑 (capping)하고, 질소로 플러싱 (flushing)하고, 110℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 컬럼 크로마토그래피 (0-10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일로서 제공하였다 (60.6 mg, 0.077 mmol, 78%). R f 0.14 (SiO2, 10% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3316 (m, N-H), 2974 (m, C-H), 1687 (s, C=O); δ H (400 MHz, CD3OD) 3.48 (t, 4H, J = 5.8 Hz), 3.21 (s, 4H), 3.14 (t, 8H, J = 6.3 Hz), 3.06 (t, 4H, J = 5.7 Hz), 2.61 (t, 8H, J = 6.3 Hz), 1.45 (s, 36H); δ C (101 MHz, CD3OD) 175.6, 158.6, 80.2, 59.9, 56.4, 49.5, 39.7, 38.4, 28.9; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 790.5425, C36H72O10N9 + 계산치 790.5402.
단계 6: 화합물 7의 합성
사전-건조된 마이크로웨이브 바이알에서, 무수 MeCN (0.15 mL) 중 화합물 6 (59.3 mg, 0.075 mmol) 및 K2CO3 (20.7 mg, 0.15 mmol)의 현탁액을 아이스-배스 (ice-bath)을 통해 0℃로 냉각시켰다. MeCN (0.5 mL) 중 화합물 5 (16.5 mg, 0.094 mmol)의 용액을 교반 중인 현탁액에 서서히 부가한 후에, 반응을 실온으로 만들고, 질소하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (0-10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다 (35.9 mg, 0.041 mmol, 54%). R f 0.30 (SiO2, 10% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3359 (m, N-H), 2985 (m, C-H), 2101 (m, C≡C), 1724 (s, C=O); δ H (600 MHz, CDCl3) 7.79 (s, 2H), 5.70 (s, 4H), 4.04 (dd, 2H, J = 2.4, 5.4 Hz), 3.37-3.32 (m, 4H), 3.24 (s, 2H), 3.20-3.14 (m, 8H), 3.14 (s, 4H), 2.75-2.70 (m, 4H), 2.60-2.55 (m, 8H), 2.25-2.22 (m, 1H), 2.10 (s, 1H), 1.42 (s, 36H); δ C (101 MHz, CDCl3) 172.2, 171.5, 156.7, 80.0, 79.4, 71.5, 59.5 (2개의 피크), 55.8 (2개의 피크), 38.8, 37.9, 29.0, 28.6; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 885.5760, C41H77O11N10 + 계산치 885.5768.
단계 7: 접합 시약 1의 합성
0℃에서 CH2Cl2 (0.5 mL) 중 화합물 7 (69.0 mg, 0.078 mmol)의 용액에 HCl (디옥산 중 4M, 1.0 mL)을 부가하였다. 반응을 질소하에 6시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하여 목적하는 아민 염산염을 백색 고체로서 수득하였다. 아민 염산염을 CH2Cl2 (1 mL)에 재용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에, CH2Cl2 (2 mL) 중 4-((4,6-디비닐피리미딘-2-일)아미노)부탄산 (2) (72.8 mg, 0.312 mmol), 트리에틸아민 (217 μL, 1.56 mmol) 및 HBTU (118 mg, 0.312 mmol)의 용액을 0℃에서 부가하였다. 반응을 질소하에 18시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (2.5-10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (29.6 mg, 0.022 mmol, 2단계에 걸쳐 28%). R f 0.15 (SiO2, 10% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3290 (m, N-H), 2944 (m, C-H), 2187 (m, C≡C), 1633 (s, C=O); δ H (600 MHz, CD3OD) 6.67 (s, 4H), 6.59 (dd, 8H, J = 10.7, 17.4 Hz), 6.35 (d, 8H, J = 17.4 Hz), 5.55 (dd, 8H, J = 1.5, 10.7 Hz), 3.97 (d, 2H, J = 2.5), 3.45 (t, 8H, J = 6.8 Hz), 3.27 (t, 4H, J = 6.5 Hz), 3.24 (t, 8H, J = 6.3 Hz), 3.21 (s, 2H), 3.18 (s, 4H), 2.65 (t, 4H, J = 6.4 Hz), 2.62-2.59 (m, 1H), 2.60 (t, 8H, J = 6.2 Hz), 2.28 (t, 8H, J = 7.5 Hz), 1.90 (quint, 8H, J = 7.2 Hz); δ C (101 MHz, CD3OD) 175.9, 174.1, 173.7, 165.3, 164.0, 137.1, 122.1, 105.8, 80.8, 72.5, 59.7, 59.3, 55.9, 55.8, 44.0, 38.7, 38.5, 34.7, 29.4, 27.0; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1345.7930, C69H97O7N22 + 계산치 1345.7905.
실시예 2 - 접합 시약 8의 제조
단계 1: 화합물 9의 합성
건조 MeOH (0.3 mL)에 용해된 메틸 비스(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)에틸)글리시네이트 (4) (203 mg, 0.54 mmol)를 함유하는 사전-건조된 마이크로웨이브 바이알에 트리에틸렌테트라민 (14.9 μL, 0.100 mmol)을 부가하고, 바이알을 캡핑하고, 질소로 플러싱하고, 110℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 컬럼 크로마토그래피 (0-30% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 목적하는 화합물을 무색 오일로서 제공하였다 (40.8 mg, 0.049 mmol, 49%). R f 0.38 (SiO2, 20% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3335 (m, N-H), 2980 (m, C-H), 1690 (s, C=O); δ H (600 MHz, CD3OD) 3.38 (t, 4H, J = 6.3 Hz), 3.17 (s, 4H), 3.13 (t, 8H, J = 6.1 Hz), 2.80-2.77 (m, 4H), 2.76 (s, 4H), 2.60 (t, 8H, J = 5.7 Hz), 1.45 (s, 36H); δ C (101 MHz, CD3OD) 174.5, 158.6, 80.2, 60.1, 56.4, 49.7, 49.4, 39.7, 39.7, 28.9; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 833.5843, C38H77O10N10 + 계산치 833.5824.
단계 2: 화합물 10의 합성
사전-건조된 마이크로웨이브 바이알에서, 무수 MeCN (0.1 mL) 중 화합물 9 (39.2 mg, 0.047 mmol) 및 K2CO3 (26.0 mg, 0.188 mmol)의 현탁액을 아이스-배스를 통해 0℃로 냉각시켰다. MeCN (0.4 mL) 중 화합물 5 (20.8 mg, 0.118 mmol)의 용액을 교반 중인 현탁액에 서서히 부가한 후에, 반응을 실온으로 만들고 질소하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (0-10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다 (30.0 mg, 0.029 mmol, 62%). R f 0.18 (SiO2, 10% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3296 (m, N-H), 2978 (m, C-H), 2157 (m, C≡C), 1654 (s, C=O); δ H (600 MHz, CD3OD) 4.20 (s, 4H), 4.08 (d, 4H, J = 2.5 Hz), 3.80 (s, 4H), 3.57 (t, 4H, J = 6.0 Hz), 3.51-3.44 (m, 16H), 3.27 (s, 4H), 3.21-3.17 (m, 4H), 2.72 (t, 2H, J = 2.5 Hz), 1.47 (s, 36H); δ C (101 MHz, CD3OD) 169.8, 166.3, 159.1, 81.3, 80.3, 73.2, 57.0, 56.1, 56.0, 55.9, 53.3, 37.0, 36.7, 30.0, 28.8; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1023.6547, C48H87O12N12 + 계산치 1023.6566.
단계 3: 접합 시약 8의 합성
0℃에서 CH2Cl2 (0.5 mL) 중 화합물 10 (79.8 mg, 0.078 mmol)의 용액에 HCl (디옥산 중 4M, 1.0 mL)을 부가하였다. 반응을 질소하에 6시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하여 목적하는 아민 염산염을 백색 고체로서 수득하였다. 아민 염산염을 CH2Cl2 (1 mL)에 재용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 0℃에서 CH2Cl2 (2 mL) 중 4-((4,6-디비닐피리미딘-2-일)아미노)부탄산 (2) (72.8 mg, 0.312 mmol), 트리에틸아민 (217 μL, 1.56 mmol) 및 HBTU (118 mg, 0.312 mmol)의 용액을 부가하였다. 반응을 질소하에 18시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하였다. 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피 (용매 A 중 35-70% 용매 B. 용매 A: 100 mM NH4OH (aq). 용매 B: MeCN)에 의한 정제 및 동결건조로 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (46.1 mg, 0.031 mmol, 2단계에 걸쳐 40%). ν max (neat/cm-1) 3289 (m, N-H), 2938 (m, C-H), 2186 (m, C≡C), 1637 (s, C=O); δ H (600 MHz, CD3OD) 6.67 (s, 4H), 6.59 (dd, 8H, J = 10.6, 17.4 Hz), 6.35 (d, 8H, J = 17.3 Hz), 5.56 (dd, 8H, J = 1.2, 10.7 Hz), 3.98 (d, 4H, J = 2.3), 3.45 (t, 8H, J = 6.7 Hz), 3.27 (t, 4H, J = 6.8 Hz), 3.24 (t, 8H, J = 6.4 Hz), 3.18 (s, 4H), 3.17 (s, 4H), 2.64-2.57 (m, 4H), 2.64-2.57 (m, 2H), 2.64-2.57 (m, 8H), 2.60 (s, 4H), 2.29 (t, 8H, J = 7.5 Hz), 1.91 (quint, 8H, J = 7.1 Hz); δ C (101 MHz, CD3OD) 175.9, 174.1, 173.7, 165.3, 164.0, 137.1, 122.1, 105.8, 80.9, 72.4, 59.7, 59.3, 55.8 (2개의 피크), 54.4, 41.7, 38.7, 38.4, 34.7, 29.4, 27.0; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1483.8687, C76H107O8N24 + 계산치 1483.8698.
실시예 3 - 접합 시약 11의 제조
단계 1: 화합물 12의 합성
건조 MeOH (1 mL)에 용해된 메틸 비스(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)에틸)글리시네이트 (4) (964 mg, 2.57 mmol)를 함유하는 사전-건조된 마이크로웨이브 바이알에 테트라에틸렌펜타민 (90 μL, 0.475 mmol)을 부가하고, 바이알을 캡핑하고, 질소로 플러싱하고, 110℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 컬럼 크로마토그래피 (0-20% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 목적하는 화합물을 백색 폼 (foam)으로서 제공하였다 (184 mg, 0.21 mmol, 44%). R f 0.06 (BuOH:H2O:MeCN, 0.8/0.1/0.1); ν max (neat/cm-1) 3330 (m, N-H), 2980 (m, C-H), 1689 (s, C=O); δ H (400 MHz, CDCl3) 3.40 - 3.30 (m, 4H), 3.16 - 3.09 (m, 8H), 3.07 (s, 4H), 2.83 - 2.66 (m, 12H), 2.60 - 2.52 (m, 8H), 1.40 (s, 36H); δ C (100 MHz, CDCl3) 171.5, 156.6, 79.3, 59.2, 55.4, 48.6 (3개의 피크), 38.7, 38.6, 28.6; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 876.6284, C40H82N11NaO10 + 계산치 876.6246.
단계 2: 화합물 13의 합성
사전-건조된 마이크로웨이브 바이알에서, 무수 MeCN (0.26 mL) 중 화합물 12 (184 mg, 0.21 mmol) 및 K2CO3 (174 mg, 1.26 mmol)의 현탁액을 아이스-배스를 통해 0℃로 냉각시켰다. 화합물 5 (anh. MeCN, 0.5 M, 1.58 mL)의 용액을 교반 중인 현탁액에 서서히 부가한 후에, 반응을 실온으로 만들고 질소하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, CH2Cl2 (40 mL)에 재용해시키고, 유기상을 물 (2x10 mL), 브라인 (1x20 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 플래시 크로마토그래피 (5-10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 표제 화합물을 백색 폼으로서 제공하였다 (119 mg, 0.102 mmol, 49%). R f 0.5 (SiO2, 20% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3309 (m, N-H), 2928 (m, C-H), 2158 (m, C≡C), 1658 (s, C=O); δ H (400 MHz, CD3OD) 4.05 (d, J = 2.6 Hz, 4H), 4.03 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 3.39 - 3.32 (m, 7H), 3.27 (s, 4H), 3.25 (s, 2H), 3.20 (s, 4H), 3.17 - 3.13 (m, 8H), 2.77-2.67 (m, 8H), 2.66-2.58 (m, 8H), 1.47 (s, 36H); δ C (100 MHz, CD3OD) 174.3, 173.7, 173.6, 158.4, 80.9, 80.8, 80.1, 72.6, 72.3, 60.2, 59.3, 59.2, 56.5, 55.7, 54.4, 54.3, 39.7, 38.5, 29.5, 29.3, 28.9; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1161.7365, C55H97O13N14 + 계산치 1161.7360.
단계 3: 접합 시약 11의 합성
0℃에서 CH2Cl2 (150 μL) 중 화합물 13 (25 mg, 22 μmol)의 용액에 HCl (디옥산 중 4M, 270 uL)을 부가하였다. 반응을 실온으로 만들고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하여 목적하는 아민 염산염을 백색 고체로서 제공하였다. 아민 염산염 (23.0 mg, 22.0 μmol)을 CH2Cl2 (150 μL)에 현탁시키고, 아이스-배스를 통해 0℃로 냉각시키고, 먼저 DIPEA (74.0 μL, 0.42 mmol)를 부가한 다음에 2 (25.0 mg, 0.11 mmol)를 부가하였다. 용액을 실온에서 10분 동안 교반한 후에, CH2Cl2 중 BTFFH 용액 (0.6 M, 205 μL)을 최대 교반 중에 3시간에 걸쳐 적가하였다. BTFFH를 완전히 부가한 후에, 반응을 추가로 12시간 동안 실온에서 교반하고, 농축하고, 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피 (용매 A 중 35-70% 용매 B. 용매 A: 100 mM NH4OH (aq). 용매 B: MeCN)로 정제하고, 동결건조 후에 목적하는 생성물을 담황색 고체로서 수득하였다 (6.70 mg, 41.4 μmol, 2단계에 걸쳐 20%). ν max (neat/cm-1) 3305 (m, N-H), 2970 (m, C-H), 2156 (m, C≡C), 1637 (s, C=O); δ H (400 MHz, CD3OD) 6.68 (s, 4H), 6.60 (dd, J = 17.4, 10.7 Hz, 8H), 6.36 (d, J = 17.3 Hz, 8H), 5.56 (dd, J = 10.6, 1.6 Hz, 8H), 4.02 - 3.96 (m, 6H), 3.45 (t, J = 6.8 Hz, 8H), 3.35 (s, 4H), 3.29 - 3.15 (m, 21H), 2.67 - 2.56 (m, 20H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 8H), 1.91 (quint, J = 7.0 Hz, 8H); δ C (126 MHz, CD3OD) 175.9, 174.1, 173.8, 173.7, 165.3, 164.0, 137.1, 122.1, 105.8, 81.0 (2개의 피크), 72.5, 72.4, 59.8, 59.4, 59.3, 55.9, 55.8, 54.5 (2개의 피크), 54.3 (2개의 피크), 41.7, 38.7, 38.4, 34.7, 29.4, 29.3, 27.0; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1621.9491, C83H117N26O9 + 계산치 1621.9497.
실시예 4 - 접합 시약 14의 제조
단계 1: tert-부틸 비스(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에틸)카바메이트 (15)의 합성
CH2Cl2 (25 mL) 중 디에탄올아민 (2.44 g, 23.0 mmol)의 용액을 아이스-배스를 통해 0℃로 냉각시키고, 무수 CH2Cl2 (5 mL) 중 디-tert-부틸 디카보네이트 (6.33 g, 29.0 mmol)의 용액을 서서히 부가하였다. 반응을 실온에서 12시간 동안 교반하고, CH2Cl2 (40 mL)에 희석하고, 물 (40 mL)을 부가하고, 수성상을 CH2Cl2 (2x20 mL)로 2회 추출하였다. 유기상들을 조합하고, 브라인으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축하여 tert-부틸 비스(2-하이드록시에틸)카바메이트를 투명한 오일로서 제공하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다. 50% NaOH(aq) 용액 (11 mL)에 톨루엔 (11 mL) 중 tert-부틸 비스(2-하이드록시에틸)카바메이트, 테트라부틸암모늄 바이설페이트 (16.0 mg, 47.0 μmol) 및 프로파르길 브로마이드 (톨루엔 중 80 w%, 8.7 mL, 78.0 mmol)를 순차적으로 부가하고, 반응을 질소 대기하에 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고, 농축하고, 목적하는 화합물을 플래시 크로마토그래피 (50% EtOAc/헥산)로 정제하여 표제 화합물을 황색 점성 오일로서 제공하였다 (2.30 g, 7.57 mmol, 2단계에 걸쳐 35%). R f 0.60 (SiO2, 50% EtOAc/헥산); ν max (neat/cm-1) 2975 (m, C-H), 2117 (m, C≡C), 1686 (s, C=O); δ H (400 MHz, CDCl3) 4.13 (d, J = 2.4 Hz, 4H), 3.66 - 3.57 (m, 4H), 3.52 - 3.38 (m, 4H), 2.41 (t, J = 2.4 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H); δ C (100 MHz, CDCl3) 155.6, 79.9, 79.8, 74.5, 68.7, 58.3, 47.9, 28.6; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+Na]+ 304.2.
단계 2: tert-부틸 (5-(비스(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에틸)아미노)펜틸)카바메이트 (16)의 합성
CH2Cl2 (1.5 mL) 중 화합물 15 (281 mg, 1.00 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시킨 후에, HCl (디옥산 중 4M, 3 mL)을 부가하였다. 반응을 실온으로 만들고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하여 목적하는 아민 염산염을 백색 고체로서 제공하였다. 상기 고형물을 MeCN (10 mL)에 재현탁시켰다. 탄산나트륨 (1.06 g, 10.0 mmol)을 부가하였다. 5분 동안 교반한 후에, MeCN (2 mL) 중 tert-부틸(5-브로모펜틸)카바메이트 (399 mg, 1.50 mmol)의 용액을 부가하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 70℃에서 48시간 동안 환류시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 브라인으로 희석하고, EtOAc (3x)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축하고, 플래시 크로마토그래피 (30-50% EtOAc/헥산)로 정제하여 표제 화합물을 담황색 오일로서 제공하였다 (242 mg, 2단계에 걸쳐 66%). R f 0.21 (SiO2, 80% EtOAc/PE); ν max (neat/cm-1) 3342 (m, N-H), 2938 (m, C-H), 2111 (m, C≡C), 1676 (s, C=O); δ H (400 MHz, CDCl3) 4.54 (br s, 1H), 4.16 (d, J = 2.3 Hz, 4H), 3.60 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.14 - 3.06 (m, 2H), 2.73 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 2.55 - 2.49 (m, 2H), 2.42 (t, J = 2.2 Hz, 2H), 1.51 - 1.42 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.30 (quint, J = 7.6 Hz, 2H); δ C (100 MHz, CDCl3) 156.0, 79.9, 79.0, 74.3, 68.3, 58.2, 55.0, 53.8, 40.5, 29.9, 28.4, 26.7, 24.5; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 367.2587, C20H34O4N2 + 계산치 367.2597.
단계 3: N-(5-(비스(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에틸)아미노)펜틸)-2-브로모아세트아미드 (17)의 합성
0℃에서 CH2Cl2 (0.5 mL) 중 화합물 16 (100 mg, 0.27 mmol)의 용액에 HCl (디옥산 중 4M, 1 mL)을 부가하였다. 반응을 질소하에 2시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하여 목적하는 아민 염산염을 백색 고체로서 수득하였다. 염산염을 CH2Cl2 (1 mL) 및 sat. NaHCO3 (1 mL)의 혼합물에 재용해시키고, -10℃로 냉각시킨 후에, 2-브로모아세틸 브로마이드 (35.3 μL, 0.405 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음에, 브라인으로 희석하고, CH2Cl2 (x3)로 추출하였다. 유기상들을 조합하고, Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 플래시 크로마토그래피 (0-5% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 표제 화합물을 담황색 오일로서 수득하였다 (57.3 mg, 0.148 mmol, 2단계에 걸쳐 55%). R f 0.41 (SiO2, 10% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3219 (m, N-H), 2928 (m, C-H), 2111 (m, C≡C), 1672 (s, C=O); δ H (400 MHz, CDCl3) 6.55 (br s, 1H), 4.15 (d, J = 2.4 Hz, 4H), 3.87 (s, 2H), 3.62 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 3.27 (q, 2H, J = 6.7 Hz), 2.78 - 2.75 (m, 4H), 2.58 - 2.54 (m, 2H), 2.43 (t, J = 2.4 Hz, 2H), 1.55 (quint, J = 7.4 Hz, 2H), 1.50 (quint, J = 7.4 Hz, 2H), 1.33 (quint, J = 7.6 Hz, 2H); δ C (100 MHz, CDCl3) 165.5, 79.7, 74.8, 67.8, 58.4, 55.0, 53.9, 40.2, 29.8, 29.5, 29.1, 24.5; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 387.1273, C17H28O3N2Br+ 계산치 387.1283.
단계 4: 화합물 18의 합성
MeCN (1 mL) 중 화합물 9 (49.3 mg, 59.2 μmol)의 용액에 무수 K2CO3 (32.7 mg, 237 μmol), 그 다음에 MeCN (0.5 mL) 중 N-(5-(비스(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에틸)아미노)펜틸)-2-브로모아세트아미드 (17) (57.3 mg, 148 μmol)의 용액을 부가하였다. 반응을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 목적하는 화합물을 플래시 크로마토그래피 (0%-15% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 표제 화합물을 투명한 오일로서 제공하였다 (38.8 mg, 26.6 μmol, 45%). R f 0.35 (15% MeOH/CH2Cl2); ν max (neat/cm-1) 3283 (m, N-H), 2936 (m, C-H), 2155 (m, C≡C), 1654 (s, C=O); δ H (400 MHz, CD3OD) 4.17 (s, 4H), 3.66 (t, J = 5.5 Hz, 8H), 3.32 - 3.29 (m, 8H), 3.26 - 3.21 (m, 4H), 3.20 (s, 4H), 3.16 (s, 4H), 3.13 (t, J = 5.8 Hz, 8H), 2.89 - 2.84 (m, 8H), 2.70 - 2.65 (m, 12H), 2.59 (t, J = 5.7 Hz, 8H), 1.61 - 1.50 (m, 8H), 1.44 (s, 36H), 1.38 - 1.30 (m, 4H); δ C (126 MHz, CD3OD) 174.3, 173.8, 158.5, 80.7, 80.2, 76.2, 68.3, 60.2, 59.6, 59.0, 56.5 (2개의 피크), 56.0 (2개의 피크), 54.6, 40.3, 39.7, 38.6, 30.5, 29.0, 26.8, 25.8; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1445.9692, C72H129N14O16 + 계산치 1445.9711.
단계 5: 접합 시약 14의 합성
0℃에서 CH2Cl2 (0.25 mL) 중 화합물 18 (13.0 mg, 8.99 μmol)의 용액에 HCl (디옥산 중 4M, 0.5mL)을 부가하였다. 반응을 질소하에 2시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하여 목적하는 아민 염산염을 백색 고체로서 수득하였다. 아민 염산염을 CH2Cl2 (0.25 mL)에 재용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 0℃에서 CH2Cl2 (0.25 mL) 중 4-((4,6-디비닐피리미딘-2-일)아미노)부탄산 (2) (12.6 mg, 53.9 μmol), 트리에틸아민 (25 μL, 180 μmol) 및 HBTU (20.5 mg, 53.9 μmol)의 용액을 부가하였다. 반응을 질소하에 18시간 동안 교반한 다음에, 진공에서 농축하였다. 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피 (용매 A 중 35-70% 용매 B. 용매 A: 100 mM NH4OH (aq). 용매 B: MeCN)에 의한 정제 및 동결건조로 생성물을 백색 고체로서 수득하였다 (1.80 mg, 0.94 μmol, 2단계에 걸쳐 10%). ν max (neat/cm-1) 3299 (m, N-H), 2928 (m, C-H), 2153 (m, C≡C), 1645 (s, C=O); δ H (400 MHz, CD3OD) 6.69 (s, 4H), 6.60 (dd, J = 17.4, 10.7 Hz, 8H), 6.36 (d, J = 17.3 Hz, 8H), 5.57 (dd, J = 10.7, 1.5 Hz, 8H), 4.23 (d, J = 2.4 Hz, 8H), 3.83 (t, J = 4.9 Hz, 8H), 3.45 (t, J = 6.8 Hz, 8H), 3.30 - 3.15 (m, 32H), 3.00 (t, J = 2.3 Hz, 4H), 2.65 - 2.60 (m, 24H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 8H), 1.91 (quint, J = 7.1 Hz, 8H), 1.56 (quint, J = 7.5 Hz, 4H), 1.39 - 1.30 (m, 8H); δ C (126 MHz, CD3OD) 175.9, 174.2 (2개의 피크), 165.3, 164.0, 137.2, 122.2, 105.9, 89.9, 77.2, 68.8, 59.9 (2개의 피크), 59.2, 56.1, 56.0, 55.3, 54.0, 47.1, 41.8, 40.4, 38.8 (2개의 피크), 34.7, 30.2, 26.8, 27.1, 25.0; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1906.1851, C100H149N26O12 + 계산치 1906.1848.
실시예 5 - 접합 시약 19의 제조
단계 1: 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(4,5-디브로모-2-메틸-3,6-디옥소-3,6-디하이드로피리다진-1(2H)-일)프로파노에이트 (20)의 합성
디브로모피리다진디온 (20)은 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다 (Bahou et al, Org. Biomol. Chem., 2018, 16, 1359-1366).
단계 2: 접합 시약 19의 합성
화합물 7 (3.90 mg, 4.40 μmol)을 CH2Cl2 (0.25 mL) 및 1,4-디옥산 중 4M HCl (0.25 mL)에 용해시키고, 이 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하였다. 조질의 잔류물에 CH2Cl2 DMF (1:1, 1 mL) 중 디브로모피리다진디온 20 (10.0 mg, 22.0 μmol)에 이어서 K2CO3 (3.00 mg, 22.0 μmol)을 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하고, 분취용 RP-HPLC (5-95% B)로 정제하여 표제 화합물 (2.50 mg, 1.36 μmol, 31%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (20분에 걸쳐 5-95% MeCN/H2O) 체류 시간 7.433분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1837.0, C53H69Br8N18O15 + 계산치 1837.5, m/z 실측치 [M+HCOO]- 1881.1, C54H69Br8N18O17 - 계산치 1881.5.
실시예 6 - 접합 시약 21의 제조
단계 1: 접합 시약 21의 합성
화합물 10 (10.0 mg, 9.80 μmol)을 CH2Cl2 (0.25 mL) 및 1,4-디옥산 중 4M HCl (0.25 mL)에 용해시키고, 이 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하였다. 조질의 잔류물에 CH2Cl2 DMF (1:1, 1 mL) 중 디브로모피리다진디온 20 (22.0 mg, 48.9 μmol)에 이어 K2CO3 (6.80 mg, 48.9 μmol)을 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하고, 분취용 RP-HPLC (5-95% B)로 정제하여 표제 화합물 (4.20 mg, 2.13 μmol, 22%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (20분에 걸쳐 5-95% MeCN/H2O) 체류 시간 7.507분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1976.7, C60H79Br8N20O16 + 계산치 1975.7, m/z 실측치 [M+HCOO]- 2018.8, C61H79Br8N20O18 - 계산치 2019.7.
실시예 7 - 접합 시약 22의 제조
단계 1: 디비닐트리아진 23의 합성
디비닐트리아진 (23)은 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다 (Counsell et al, Org. Biomol. Chem., 2020, 18, 4739-4743).
단계 2: 접합 시약 22의 합성
HCl (1,4-디옥산 중 4M, 0.5 mL) 및 CH2Cl2 (0.5 mL) 중 화합물 10 (20.0 mg, 19.5 μmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 이 탈보호된 잔류물에 HBTU (41.7 mg, 110 μmol), 디비닐트리아진 23 (24.2 mg, 110 μmol) 및 DMF (1 mL)를 부가한 다음에 DIPEA (76.6 μL, 440 μmol)를 부가하고, 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 자동 역상 FCC (용매 A 중 10-60% 용매 B; 용매 A: 0.1 M NH4OH/H2O, 용매 B: MeCN)로 정제하여 표제 화합물 (12.2 mg, 8.52 μmol, 44%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 8.257분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1432.9, C68H95N28O8 + 계산치 1431.8, m/z 실측치 [M+HCOO]- 1477.1, C69H95N28O10 - 계산치 1475.8.
실시예 8 - 접합 시약 24의 제조
단계 1: (9H-플루오렌-9-일)메틸(6-(2-브로모아세트아미도)헥실)카바메이트 (25)의 합성
CH2Cl2 (2 mL) 중 Fmoc-헥사메틸렌디아민 염산염 (200 mg, 0.533 mmol) 및 브로모아세틸 브로마이드 (116 μL, 1.33 mmol)의 용액에 포화 수성 NaHCO3 (2 mL)를 부가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 H2O로 희석하고, CH2Cl2 (3×50 mL)로 추출하였다. 유기 분획물들을 조합하고, 1M HCl (2×50 mL)로 세척하고, 건조시킨 (MgSO4) 후에 진공에서 농축하였다. 조질의 잔류물을 FCC (50-100% EtOAc/PE)를 통해 정제하여 표제 화합물 (107 mg, 0.233 mmol, 44%)을 백색 고체로서 제공하였다. R f 0.16 (SiO2; 50% EtOAc/PE); δ H (400 MHz, DMSO-d 6 ) 8.24 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 7.89 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.68 (d, 2H, J = 7.4 Hz), 7.41 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 7.31 (td, 2H, J = 11.1, 0.7 Hz), 7.25 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 4.29 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 4.22-4.18 (m, 1H), 3.82 (s, 2H), 3.05 (q, 2H, J = 6.6 Hz), 2.96 (q, 2H, J = 6.6 Hz), 1.41-1.36 (m, 4H), 1.25-1.23 (m, 4H); δ C (101 MHz, DMSO-d 6 ) 165.8, 156.1, 143.9, 140.7, 127.6, 127.0, 125.1, 120.1, 65.1, 46.8, 29.6, 29.3, 28.8, 26.0, 25.9. LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 459.3, C23H28Br1N2O3 + 계산치 459.1.
단계 2: 화합물 26의 합성
DMF (0.5 mL) 중 화합물 6 (30.0 mg, 38.0 μmol), 화합물 25 (29.0 mg, 63.0 μmol) 및 DIPEA (8.60 μL, 49.4 μmol)의 용액을 실온에서 21시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하였다. 조질의 잔류물을 FCC (0-8% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 표제 화합물 (40.0 mg, 34.0 μmol, 90%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 10.824분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1169.1, C59H98N11O13 + 계산치 1168.7, m/z 실측치 [M+HCOO]- 1213.1, C60H98N11O15 - 계산치 1212.7.
단계 3: 화합물 27의 합성
DMF (1 mL) 중 화합물 26 (44.0 mg, 38.0 μmol) 및 피페리딘 (7.50 μL, 76.0 μmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하였다. 이러한 조질의 잔류물에 HBTU (28.8 mg, 76.0 μmol) 및 DMF (1 mL)를 부가한 다음에 N3-PEG4-COOH (114 μL, 57.0 μmol, TBME 중 0.5 M) 및 DIPEA (13.2 μL, 76.0 μmol)를 부가하고, 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하고, 조질의 물질을 FCC (0-10% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 표제 화합물 (38.0 mg, 31.5 μmol, 83%)을 투명한 오일로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 10.471분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1205.8, C54H105N14O16 + 계산치 1205.8, m/z 실측치 [M+HCOO]- 1250.7, C55H105N14O18 - 계산치 1249.8.
단계 4: 접합 시약 24의 합성
HCl (1,4-디옥산 중 4M, 0.5 mL) 및 CH2Cl2 (0.5 mL) 중 화합물 27 (29.0 mg, 24.0 μmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 이러한 탈보호된 잔류물에 HBTU (45.5 mg, 120 μmol), 화합물 2 (28.0 mg, 120 μmol) 및 DMF (1 mL)를 부가한 다음에, DIPEA (83.8 μL, 480 μmol)를 부가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 자동 역상 FCC (용매 A 중 10-100% 용매 B; 용매 A: 0.1 M NH4OH/H2O, 용매 B: MeCN)로 정제하여 표제 화합물 (12.0 mg, 7.20 μmol, 30%)을 담황색 고체로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 8.401분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+Na]+ 1689.2, C82H124N26 23Na1O12 + 계산치 1689.0, m/z 실측치 [M+HCOO]- 1711.1, C83H125N26O14 - 계산치 1711.0.
실시예 9 - 접합 시약 28의 제조
단계 1: Fmoc-Lys(PEG 4 -N 3 )-OH (29)의 합성
Fmoc-Lys-OH·HCl (500 mg, 1.23 mmol)을 DMF/CH2Cl2 (1:1, 3 mL)에 현탁시키고, DMF/CH2Cl2 (1:1, 3 mL) 중 N3-dPEG4-NHS 에스테르 (480 mg, 1.23 mmol)의 용액을 교반하면서 적가하였다. K2CO3 (324 mg, 2.35 mmol)을 부가하고, 혼합물을 23시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고, 수성 LiCl (3M, 2×15 mL)로 세척하였다. 수성층들을 조합하고, CH2Cl2 (15 mL)로 추출하고, 유기 추출물들을 조합하고, 진공에서 농축하였다. 조질의 유기 분획물을 자동 역상 FCC (용매 A 중 10-60% 용매 B; 용매 A: 0.5% 포름산/H2O, 용매 B: MeCN)로 정제하여 생성물 Fmoc-Lys(COdPEG4-N3)-OH (560 mg, 0.810 mmol, 66%)을 무색 오일로서 수득하였다. δ H (400 MHz, CDCl3) 7.72 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.58 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 7.36 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 7.27 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 6.90 (br s, 1H), 6.23 (br s, 1H), 5.90 (d, 1H, J = 7.1 Hz), 4.44-4.30 (m, 3H), 4.18 (t, 1H, J = 6.9 Hz), 3.72-3.63 (m, 2H), 3.60 (s, 10H), 3.56 (s, 4H), 3.34 (t, 2H, J = 4.9 Hz), 3.23 (qt, 2H, J = 6.1 Hz), 2.45 (t, 2H J = 5.5 Hz), 1.94-1.82 (m, 1H), 1.81-1.72 (m, 1H), 1.58-1.30 (m, 4H); δ c (101 MHz, CDCl3) 174.5, 172.6, 171.0, 156.3, 144.0, 143.8, 141.3, 127.7, 127.1, 125.2, 125.2, 120.0, 80.6, 70.6, 70.5, 70.5, 70.3, 70.2, 70.1, 70.0, 67.2, 66.9, 53.8, 50.6, 47.2, 38.9, 36.7, 36.3, 31.7, 28.8, 28.1, 22.1; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 642.5, C32H43N5O9 + 계산치 642.3.
단계 2: Ahx-Lyz-Gly-Lys(PEG 4 -N 3 )-Gly-Lys-Lys-CONH 2 (30)의 합성
일반적인 Fmoc 고체상 펩티드 합성 절차를 사용하여 0.1 mmol 스케일로 펩티드를 합성하여 목적하는 펩티드 30 (40.5 mg, 30.0 μmol, 27%)을 무색 점성 오일로서 생성하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 4.313분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1031.3, C45H87N15O12 + 계산치 1030.7.
단계 3: 접합 시약 28의 합성
화합물 30 (35.0 mg, 24.0 μmol)을 DMF/CH2Cl2 (1:1, 0.4 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시켰다. DMF/CH2Cl2 (1:1, 0.4 mL) 중 화합물 2 (27.5 mg, 120 μmol), HBTU (44.7 mg, 120 μmol) 및 NEt3 (66.0 uL, 470 μmol)의 현탁액을 부가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 자동 역상 FCC (용매 A 중 10-60% 용매 B; 용매 A: H2O, 용매 B: MeCN)로 정제하여 표제 화합물 (18.3 mg, 9.70 μmol, 40%)을 무색 점성 오일로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 8.084분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+Na]+ 1914.2, C93H139 23Na1N27O16 + 계산치 1914.1, m/z 실측치 [M+ HCOO-]- 1936.3, C94H140N27O18 - 계산치 1936.1.
실시예 10 - 접합 시약 31의 제조
단계 1: Ahx-Lyz-Gly-Lys(PEG 4 -N 3 )-Gly-Lys(PEG 4 -N 3 )-Gly-Lys-Lys-CONH 2 (32)의 합성
일반적인 펩티드 합성 절차를 사용하여 0.1 mmol 스케일로 펩티드를 합성하여, 생성물 (30.6 mg, 16.0 μmol, 5%)을 무색 점성 오일로서 생성하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 5.942분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1489.8, C64H122N21O19 + 계산치 1488.9, m/z 실측치 [M+ HCOO-]- 1532.9, C65H122N21O21 - 계산치 1533.7.
단계 2: 접합 시약 31의 합성
화합물 32 (23.3 mg, 12.0 μmol)를 DMF (0.5 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시켰다. DMF (0.5 mL) 중 화합물 2 (14.0 mg, 60.0 μmol), HBTU (22.7 mg, 60.0 μmol) 및 NEt3 (33.4 uL, 240 μmol)의 현탁액을 부가하고, 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 자동 역상 FCC (H2O 중 40-55% MeCN)로 정제하여 표제 화합물 (1.81 mg, 0.770 μmol, 5%)을 무색 점성 오일로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 8.376분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+2H]2+ 1176.3, C112H175N33O23 2+ 계산치 1175.7.
실시예 11 - 접합 시약 33의 제조
단계 1: Ac-Lys(PEG 4 N 3 )-PEG 2 Glu-CONH 2 (34)의 합성
일반적인 펩티드 합성 절차를 사용하여 0.3 mmol 스케일로 펩티드를 합성하여, 목적하는 생성물 (44.1 mg, 60.0 μmol, 60%)을 무색 점성 오일로서 생성하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 5.985분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 735.5, C30H54N8O13 + 계산치 735.4.
단계 2: 화합물 35의 합성
화합물 26 (20.0 mg, 17.0 μmol)을 DMF (0.5 mL)에 용해시키고, 피페리딘 (3.40 uL, 34.0 μmol)을 부가하였다. 혼합물을 90분 동안 교반한 다음에, N2하에 농축하였다. 조질의 혼합물을 DMF (0.5 mL)에 재용해시키고, 화합물 34 (18.9 mg, 26.0 μmol), HBTU (13.0 mg, 34.0 μmol) 및 DIPEA (6.00 μL, 34.0 μmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 자동 역상 FCC (용매 A 중 10-100% 용매 B; 용매 A: 0.1 M NH4OH/H2O, 용매 B: MeCN)로 정제하여 표제 화합물 (11.4 mg, 6.90 μmol, 40%)을 담황색 분말로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 8.538분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+2H]2+ 832.4, C74H139N19O23 + 계산치 832.0.
단계 3: 접합 시약 33의 합성
화합물 35 (7.00 mg, 4.20 μmol)를 CH2Cl2 (0.3 mL)에 용해시키고, HCl (Et2O 중 2M, 0.3 mL)을 부가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음에, 농축하였다. 조질의 혼합물을 DMF (0.5 mL)에 재용해시키고, 화합물 2 (7.00 mg, 30.0 μmol), HBTU (11.4 mg, 30.0 μmol) 및 DIPEA (10.5 μL, 60.0 μmol)를 부가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음에, 자동 역상 FCC (H2O 중 40-70% MeCN)를 통해 2회 정제하여 목적하는 생성물 (0.120 mg, 0.600 μmol, 1.3%)을 황색 잔류물로서 생성하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 7.66분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+Na]+ 2124.4, C102H160N31O19 + 계산치 2124.3, m/z 실측치 [M+HCOO-]- 2169.0, C103H160N31O21 - 계산치 2168.2.
실시예 12 - 접합체 36 - 39의 제조
TBS (25 mM Tris HCl pH 8, 25 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 중 트라스투주맙 (198 μL, 17 μM, 2.5 mg/mL)의 용액에 TCEP (10당량)를 부가하였다. 혼합물을 와동시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 접합 시약 1, 8, 11 또는 14의 용액 (DMSO 중 10 mM)을 부가하고 (최종 농도 34 μM, 2당량), 반응 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (40,000 MWCO, Thermo Fisher Scientific)을 사용한 다음에, Amicon-Ultra 원심분리 필터 (10,000 MWCO, Merck Millipore)를 사용하여 PBS로의 정용여과를 반복하여 과량의 시약을 제거하였다. 샘플은 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다. LC-MS 및 SDS-PAGE 분석으로 해당하는 브릿지 접합체 36, 37, 38 및 39로의 전환율은 ＞95%로 입증되었다.
도 1 (A)는 접합체 36, 37, 38 및 39에 대한 SDS-PAGE 추적을 보여준다. 도 2 내지 5는 접합체 36, 37, 38 및 39에 대한 LC-MS 추적을 보여준다.
실시예 13 - 접합체 40 - 46의 제조
TBS (25 mM Tris HCl pH 8, 25 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 중 트라스투주맙 (50 μL, 17 μM, 2.5 mg/mL)의 용액에 TCEP (10당량)를 부가하였다. 혼합물을 와동시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 접합 시약 19, 21, 22, 24, 28, 31 또는 33의 용액 (DMSO 중 5 mM)을 부가하고 (최종 농도 34 μM, 2당량), 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (40,000 MWCO, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 과량의 시약을 제거하였다. 샘플은 분석할 때까지 4℃에서 보관하거나 또는 급속 동결시키고 -20℃에서 보관하였다. LC-MS 및 SDS-PAGE 분석으로 해당하는 브릿지 접합체 40, 41, 42, 43, 44, 45 및 46으로의 전환율은 ＞95%로 입증되었다.
도 1 (B)는 접합체 40, 41, 42, 43, 44, 45 및 46에 대한 SDS-PAGE 추적을 보여준다. 도 6 내지 12는 접합체 40, 41, 42, 43, 44, 45 및 46에 대한 LC-MS 추적을 보여준다.
실시예 14 - 접합체 47 - 50의 제조
TBS (25 mM Tris HCl pH 8, 25 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 중 브렌툭시맙 (50 μL, 17 μM, 2.5 mg/mL)의 용액에 TCEP (10당량)를 부가하였다. 혼합물을 와동시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 접합 시약 1, 8, 19 또는 21의 용액 (DMSO 중 5 mM)을 부가하고 (최종 농도 34 μM, 2당량), 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (40,000 MWCO, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 과량의 시약을 제거하였다. 샘플은 분석할 때까지 4℃에서 보관하거나 또는 급속 동결시키고 -20℃에서 보관하였다. LC-MS 및 SDS-PAGE 분석으로 해당하는 브릿지 접합체 47, 48, 49 및 50으로의 전환율은 ＞95%로 입증되었다.
도 1 (C)는 접합체 47, 48, 49 및 50에 대한 SDS-PAGE 추적을 보여준다. 도 13 내지 16은 접합체 47, 48, 49 및 50에 대한 LC-MS 추적을 보여준다.
실시예 15 - 크기-배제 크로마토그래피
크기-배제 크로마토그래피 (SEC)는 Superdex 200 10/300 GL 컬럼을 사용하여 수행하였다. 샘플을 1 mg/mL의 농도로 주입하고, TBS 버퍼 (25 mM Tris HCl pH 8, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA)를 사용하여 0.5 mL/min의 유속으로 용리하였다.
접합체 36, 37, 38 및 39에 대한 크기 배제 크로마토그램은 도 17(A)에 나타낸다.
실시예 16 - 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)
96-웰 플레이트를 HER2 (Sino Biological, His-tagged)의 0.25 μg/mL 용액 100 μL로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 용액을 제거하고, 각 웰을 PBS (2 x 200 μL)로 세척하였다. 그 다음에 각 웰을 PBS 중 1% BSA (200 μL)로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 그 다음에 차단 용액을 제거하고, 각 웰을 PBS (3 x 200 μL)로 세척하였다. 웰을 PBS 중 트라스투주맙 및 트라스투주맙 접합체 36, 37, 38 및 39의 계열 희석물 (100 μL의 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3.33 nM, 1.11 nM, 0.37 nM, 0.12 nM, 0 nM)로 처리하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 접합체 용액을 제거하고, 각 웰을 PBS 중 0.1% Tween 20 (2 x 200 μL)으로 세척한 다음에 PBS (3 x 200 μL)로 세척하였다. 다음, PBS 중 검출 항체 (마우스 항-인간 IgG-HRP (ThermoFisher)의 1:500 희석) 100 μL를 각 웰에 부가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 PBS 중 0.1% Tween 20 (2 x 200 μL)으로 세척한 다음에, PBS (3 x 200 μL)로 세척하였다. 마지막으로, OPD 용액 (1개의 캡슐을 9 mL의 H2O 및 1 mL의 안정한 퍼옥시드 기질 버퍼 (10x), ThermoFisher에 용해시켜서 제조한 용액 100 μL)을 각 웰에 부가하였다. 15분 후에, 4M HCl (aq.) (50 μL)을 각 웰에 부가하여 반응을 켄칭하였다. 490 nm 및 590 nm에서의 흡광도는 CLARIOstar Microplate Reader를 사용하여 측정하였다. 측정은 4중으로 수행하였고, 3회의 독립적 반복을 수행하였다.
접합체 36, 37, 38 및 39에 대한 ELISA 결과를 도 17(B)에 나타내었다.
실시예 17 - 항체-형광단 접합체 51 - 54의 제조
PBS 중 트라스투주맙 접합체 36, 37, 38 또는 39의 용액에 CuSO4·5H2O (알킨당 20 당량), THPTA (알킨당 100 당량), 소듐 아스코르베이트 (알킨당 150 당량) 및 AlexaFluor™ 488 아지드 (Thermo Fisher Scientific) (DMSO 중 5 mM, 알킨당 12 당량)를 부가하였다. 혼합물을 와동시키고, 37℃에서 4시간 (36 및 37의 경우) 또는 6시간 (38 및 39의 경우) 동안 인큐베이션하였다. Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (7,000 MWCO, Thermo Fisher Scientific)을 사용한 다음에, Amicon-Ultra 원심분리 필터 (10,000 MWCO, Merck Millipore)를 사용하여 PBS로의 정용여과를 반복하여 과량의 시약을 제거하였다. UV-vis 분석으로 36, 37, 38 및 39는 항체-형광단 접합체 51, 52, 53 및 54로의 전환을 나타내었고, 평균 형광단 대 항체 비율 (FAR)은 각각 1.0, 2.0, 2.9 및 4.0이었다. 각 반응은 적어도 3회 반복하였고, 상기 보고된 값의 ±0.1 단위 이내의 FAR 값으로 일관된 결과를 제공하였다.
도 18은 접합체 51, 52, 53 및 54에 대해 측정된 형광단 대 항체 비율 (FAR)을 보여준다.
실시예 18 - 안정성 분석
PBS 중 트라스투주맙-AlexaFluor488 접합체 51, 52, 53 및 54 (138 μL, 3.75 μM)의 용액에 12 μL의 재구성된 인간 혈장 (Sigma)을 부가하였다. 혼합물을 37℃에서 14일 동안 인큐베이션하였다. 분취량을 2일마다 채취하고, 급속 동결시키고, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. SDS-PAGE에 이어 겔내 형광 (in-gel fluorescence) 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 (coomassie brilliant blue staining)을 수행하였다.
도 19는 SDS-PAGE에 의한 인간 혈장 중 접합체 51, 52, 53 및 54의 안정성 분석을 보여준다. 전체 연구 기간 동안 형광 페이로드의 혈장 단백질로의 전달은 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명의 접합체가 생리학적 조건하에 안정하다는 것을 보여준다.
실시예 19 - 페이로드 55의 제조
단계 1: 페이로드 55의 합성
페이로드 55는 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다 (Walsh et al, Chem. Sci., 2019, 10 (3), 694-700).
실시예 20 - 페이로드 56의 제조
단계 1: Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE (57)의 합성
DMF (1 mL) 중 Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP (21.6 mg, 30.1 μmol), MMAE (30.0 mg, 39.1 μmol), HOBt.H2O (10.1 mg, 60.0 μmol), DIPEA (15.7 μL, 90.0 μmol) 및 피리딘 (24.3 μL, 300 μmol)의 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 자동 역상 FCC (용매 A 중 10-70% 용매 B. 용매 A: 0.1M NH4OH (aq). 용매 B: MeCN))로 정제하고, 동결건조하여 목적하는 화합물 (39.0 mg, 29.0 μmol, 96%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 13.189분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+Na]+ 1368.6, C73H104N10 23Na1O14 + 계산치 1367.8.
단계 2: 페이로드 56의 합성
DMF (2 mL) 중 Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE (57) (20.0 mg, 14.9 μmol)의 용액에 피페리딘 (7.30 μL, 74.3 μmol)을 부가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하였다. 유리 아민에 HBTU (11.3 mg, 29.8 μmol) 및 DMF (2 mL)를 부가한 다음에, N3-PEG4-CO2H (TBME 중 0.5 M 용액 50 μL, 22.4 μmol) 및 DIPEA (7.80 μL, 44.7 μmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하고, 자동 역상 FCC (용매 A 중 10-100% 용매 B. 용매 A: 0.1M NH4OH (aq). 용매 B: MeCN)로 정제하고, 동결건조하여 표제 화합물 (13.6 mg, 9.80 μmol, 66%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (용매 A 중 5-95% 용매 B) 체류 시간 11.319분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1282.8, C68H112N13O17 + 계산치 1382.8, m/z 실측치 [M+HCOO]- 1428.0, C69H112N13O19 - 계산치 1426.8.
실시예 21 - 비-절단 가능한 항체-약물 접합체 58 - 61의 제조
PBS 중 트라스투주맙 접합체 36, 37, 38 또는 39의 용액에 CuSO4·5H2O (150 당량), THPTA (600 당량), 소듐 아스코르베이트 (1000 당량) 및 화합물 55 (DMSO 중 20 mM, 100 당량)를 부가하였다. 혼합물을 와동시키고, 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (40,000 MWCO, Thermo Fisher Scientific)을 사용한 다음에, Amicon-Ultra 원심분리 필터 (10,000 MWCO, Merck Millipore)를 사용하여 PBS로의 정용여과를 반복하여 과량의 시약을 제거하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 36, 37, 38 및 39는 항체-약물 접합체 58, 59, 60 및 61로의 전환을 나타내었고, 평균 약물 대 항체 비율 (DAR)은 각각 0.8, 1.4, 2.1 및 2.8이었다.
접합체 58, 59, 60 및 61에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램은 도 20에 나타낸다.
실시예 22 - 절단 가능한 항체-약물 접합체 62 - 65의 제조
PBS 중 트라스투주맙 접합체 36, 37, 38 또는 39의 용액에 CuSO4·5H2O (150 당량), THPTA (600 당량), 소듐 아스코르베이트 (1000 당량) 및 화합물 56 (DMSO 중 20 mM, 100 당량)을 부가하였다. 혼합물을 와동시키고, 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (40,000 MWCO, Thermo Fisher Scientific)을 사용한 다음에, Amicon-Ultra 원심분리 필터 (10,000 MWCO, Merck Millipore)를 사용하여 PBS로의 정용여과를 반복하여 과량의 시약을 제거하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 36, 37, 38 및 39는 항체-약물 접합체 62, 63, 64 및 65로의 전환을 나타내었고, 평균 약물 대 항체 비율 (DAR)은 각각 0.5, 1.0, 1.6 및 2.4였다.
접합체 62, 63, 64 및 65에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램은 도 21에 나타낸다.
실시예 23 - 인 비트로 세포독성
세포주
HER2-양성 SKBR3 및 BT474 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 입수하였고, HER2-음성 MCF7 및 MDA-MB-468 세포는 각각 ECACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures) 및 ATCC로부터 입수하였다. SKBR3 세포는 10% 열-불활성화 우태아 혈청 (FBS), GlutaMAX™, 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 고글루코스 McCoy's 5A 배지 (high glucose McCoy's 5A medium)에서 유지하였다. MCF7 및 MDA-MB-468 세포는 10% 열-불활성화 우태아 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 유지하였다. BT474 세포는 10% 열-불활성화 우태아 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지에서 유지하였다. 모든 세포주는 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다.
세포 생존율
세포를 5% CO2로 37℃에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에 시딩하였다. SKBR3 세포를 15,000개 세포/웰로 시딩하고, BT474 세포를 20,000개 세포/웰로 시딩하고, MCF7 세포를 7,500개 세포/웰로 시딩하고, MDA-MB-468 세포를 10,000개 세포/웰로 시딩하였다. 62, 63, 64, 65 및 트라스투주맙의 계열 희석물을 완전 성장 배지 중의 세포에 부가하고, 37℃, 5% CO2에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율은 제조자의 지침에 따라 CellTiter-Glo 생존율 분석 (Promega)을 사용하여 측정하였다. 세포 생존율은 미처리 세포의 퍼센트로서 플로팅하였다. 각 측정은 3중으로 수행하고, 3회의 독립적 반복을 수행하였다.
도 22는 접합체 62, 63, 64, 65 및 트라스투주맙의 세포독성을 보여준다.
각 접합체는 트라스투주맙 단독과 비교하여 HER2-양성 세포에서 세포독성이 유의미하게 증가한 것으로 나타났다. 반면에, HER2-음성 세포의 증식은 비히클 대조군과 비교하여 영향을 받지 않았으므로, HER2-양성 세포에 대한 선택성을 확인하였다. 또한, 더 높은 DAR 접합체 (접합체 64 및 65)는 더 낮은 DAR 접합체 (접합체 62 및 63)에 비해 세포독성의 증가를 나타내었다. 이는 본 발명이 제공하는 DAR 값의 조정 가능성 (tunability)을 보여준다.
실시예 24 - 생세포 현미경 검사
SKBR3 또는 MCF7 세포를 5% CO2로 37℃에서 48시간 동안 8-웰 챔버 μ-슬라이드 (Ibidi, 80826)에 40,000개 세포/웰로 시딩하였다. 그 다음에 슬라이드를 얼음 위에 놓고, 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 (3 x 200 μL)을 함유하는 Ham's F12 영양 혼합 배지 (Ham's F12 Nutrient Mix media)로 세척하였다. 항체 접합체 51 및 52 (50 nM), 트라스투주맙 (50 nM) 또는 비히클 (PBS)을 완전 F12 성장 배지 중의 세포에 부가하고, 어두운 곳에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 얼음 위에 놓고, 완전 F12 성장 배지 (3 x 200 μL)로 세척하였다. 완전 F12 성장 배지 (200 μL)를 부가하고, 세포를 5% CO2로 37℃에서 3.5시간 동안 인큐베이션하였다. 3시간 인큐베이션한 후에, Hoechst 33342 삼염산염 삼수화물 (1 μg/mL, Invitrogen, H3570)을 부가하였다. 생세포 현미경 검사는 40× 물 대물렌즈 (water objective)를 갖춘 Operetta CLS 공초점 현미경 (Perkin Elmer)에서 수행하였다. 세포는 분석 전반에 걸쳐 37℃ 및 5% CO2의 가습된 분위기에서 유지하였다. 데이터 분석은 ImageJ (Fiji)를 사용하여 수행하였다.
현미경 이미지는 도 23에 나타낸다. 접합체들 모두는 HER2-양성 SKBR3 세포에 선택적으로 라벨링되고 내재화되는 것을 볼 수 있다. HER2-음성 MCF7 세포의 경우에는 라벨링이 관찰되지 않았다.
실시예 25 - TetraDVP 스캐폴드 A의 합성
단계 1: 화합물 202의 합성
화합물 3 (4.43 g, 14.6 mmol)을 DMF (49 mL)에 용해시키고, 벤질 브로모아세테이트 (3.47 mL, 21.9 mmol) 및 DIPEA (3.05 mL, 17.5 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (850 mL)로 희석하고, EtOAc (3 x 300 mL)로 추출하였다. 유기 추출물들을 조합하고, 브라인 (5 x 350 mL) 및 수성 LiCl (3M, 2 x 350 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 진공에서 농축하였다. 조질의 혼합물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (0-50% EtOAc/석유 에테르 40-60)에 적용하여 생성물인 벤질 비스(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)에틸)글리시네이트 (4.99 g, 11.1 mmol, 76%)를 무색 오일로서 수득하였다. R f : 0.39 (50% EtOAc/석유 에테르 40-60); 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25 ℃): δ (ppm) = 7.39-7.31 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 3.49 (br s, 2H), 3.20 (br s, 4H), 2.81 (br s, 4H), 1.44 (s, 18H); HRMS (ESI) C22H35N3O6 m/z: [M+Na]+ 474.2576 (계산치 474.2574).
단계 2: 화합물 203의 합성
벤질 에스테르 202 (7.78 g, 17.2 mmol)를 MeOH (170 mL)에 용해시키고, N2로 15분 동안 탈기시켰다. 탄소상 팔라듐 (10 wt% Pd, 340 mg)을 부가하고, 현탁액을 H2로 10분 동안 플러싱하였다. 벤트 니들 (vent needle)을 제거하고, 새로운 H2 벌룬을 적용하고, 현탁액을 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 Super-Cel®을 통해 여과하고, MeOH (2 x 125 mL)로 세척하고, 진공에서 농축하여 생성물인 비스(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)에틸)글리신 (5.81 g, 16.1 mmol, 93%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 ℃): δ (ppm) = 6.64 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.27 (s, 2H), 2.95 (q, J = 6.0 Hz, 4H), 2.60 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 1.37 (s, 18H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 172.6, 155.6, 77.5, 54.9, 53.4, 38.4, 28.2; HRMS (ESI) C16H31N3O6 m/z: [M+H]+ 362.2271 (계산치 362.2286).
단계 3: 화합물 204의 합성
산 203 (100 mg, 0.28 mmol)을 DMF (1 mL)에 용해시켰다. 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸아민 (55 μL, 0.28 mmol), HBTU (105 mg, 0.28 mmol) 및 DIPEA (96 μL, 0.55 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 71시간 동안 교반하였다. 혼합물을 수성 HCl (1M, 25 mL)로 희석하고, EtOAc (3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인 (25 mL)으로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 진공에서 농축하였다. 조질의 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (0-6% MeOH/CH2Cl2)에 적용하여 생성물 204 (94 mg, 0.17 mmol, 60%)를 무색 잔류물로서 수득하였다. R f : 0.27 (6% MeOH/CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, CDCl3, 25 ℃): δ (ppm) = 7.47 (br s, 1H), 5.68 (br s, 2H), 3.68-3.57 (m, 12H), 3.46 (q, J = 3.2 Hz, 2H), 3.37 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.26-2.99 (m, 5H), 2.58 (br s, 3H), 1.44 (s, 18H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 171.0, 156.7, 79.5, 70.8, 70.7, 70.6, 70.2, 70.1, 69.6, 55.3, 50.8, 39.2, 38.3, 28.6; HRMS (ESI) C24H47N7O8 m/z: [M+Na]+ 584.3401 (계산치 584.3378).
단계 4: 화합물 205의 합성
N-Boc 아민 204 (64 mg, 0.11 mmol)를 HCl/디옥산 (4M, 1 mL)에 현탁시키고, 1.5시간 동안 교반하였다. 질소 스트림하에 용매를 제거하여 백색 고체를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. 중간체를 DMF (0.5 mL)에 현탁시키고, DIPEA (119 μL, 0.68 mmol), 산 203 (103 mg, 0.28 mmol) 및 HBTU (108 mg, 0.28 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 22시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고, EtOAc (2 x 20 mL)로 추출하였다. 유기 추출물들을 조합하고, 브라인 (4 x 50 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (0-8% MeOH/CH2Cl2)에 적용하여 생성물 205 (53.5 mg, 0.051 mmol, 46%)를 무색 잔류물로서 수득하였다. R f : 0.15 (8% MeOH/CH2Cl2); 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25 ℃): δ (ppm) = 6.77 (s, 3H), 3.61 (t, J = 5.0 Hz, 3H), 3.58-3.51 (m, 8H), 3.47 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.39 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.28 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.24 (s, 1H), 3.12 (s, 1H), 1.39 (s, 36H).; 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 155.7, 78.2, 69.8, 69.8, 69.7, 69.6, 69.3, 68.9, 54.1, 50.0, 28.2; LRMS (ESI) C46H89N13O14 m/z: [M+H]+ 1048.7 (계산치 1048.7).
단계 5: 화합물 206 (스캐폴드 A)의 합성
테트라-N-Boc 아민 205 (20 mg, 0.019 mmol)를 CH2Cl2 (1.5 mL)에 용해시키고, 디옥산 중 HCl (4M, 0.5 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 교반한 다음에, 용매를 진공에서 제거하였다. 중간체를 DMF (1 mL)에 재용해시키고, 화합물 2 (22.3 mg, 0.095 mmol), HBTU (36.2 mg, 0.095 mmol) 및 DIPEA (33 μL, 0.191 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 3.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 불완전한 전환 (incomplete conversion)을 나타내었고, 추가의 화합물 2 (8.9 mg, 0.038 mmol), HBTU (14.5 mg, 0.038 mmol) 및 DIPEA (13 μL, 0.076 mmol)를 부가하였다. 혼합물을 추가로 1.5시간 동안 교반한 다음에, 역상 Combiflash 크로마토그래피 (0.1M 수성 NH4OH 중 10-70% MeCN)를 수행하여 생성물 206 (9.05 mg, 0.0060 mmol, 32%)을 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, 25 ℃): δ (ppm) = 7.73 (br s, 2H; H), 6.55 (dd, J = 16.9, 10.1 Hz, 14H), 6.39 (d, J = 17.3 Hz, 8H), 5.62 (d, J = 10.5 Hz, 8H), 2.38 (t, J = 7.1 Hz, 9H), 1.95 (qu, J = 6.6 Hz, 9H); 13CNMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 174.3, 163.4, 161.6, 136.4, 131.3, 121.3, 107.9, 105.2, 70.7, 70.7, 70.6, 70.6, 70.6, 70.2, 70.1, 70.1, 69.4, 59.0, 55.9, 53.8, 50.8, 48.2, 46.9, 40.9, 39.3, 37.3, 33.9, 26.3, 25.7, 24.8, 24.4; LRMS (ESI) C74H109N25O10 m/z: [M+포르메이트]- 1553.0 (계산치 1552.7).
실시예 26 - TetraDVP 스캐폴드 B의 합성
단계 1: 화합물 207의 합성
테트라 N-Boc 아민 205 (35 mg, 0.033 mmol)를 HCl/디옥산 (4M, 1 mL)에 현탁시키고, 1.5시간 동안 교반하였다. 질소 스트림하에 용매를 제거하여 백색 고체를 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. 중간체를 DMF (0.3 mL)에 현탁시키고, Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (51 mg, 0.13 mmol), HBTU (50 mg, 0.13 mmol) 및 DIPEA (70 μL, 0.40 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (20 mL)로 희석하고, EtOAc (2 x 20 mL)로 추출하였다. 유기 추출물들을 조합하고, 수성 LiCl (5 wt%, 30 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하였다. 조질의 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (4-10% MeOH/CH2Cl2)에 적용하여 생성물 207 (13 mg, 0.0059 mmol, 18%)을 백색 잔류물로서 수득하였다. R f : 0.10 (10% MeOH/CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, MeOD, 25 ℃): δ (ppm) = 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 8H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 8H), 7.36 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 7.27 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 4.58 (s, 2H), 4.46 (s, 1H), 4.32 (d, J = 6.8 Hz, 7H), 4.16 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.94 (s, 8H), 3.64-3.57 (m, 17H), 3.56-3.53 (m, 8H), 3.53-3.43 (m, 10H), 3.36 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.27 (t, J = 5.9 Hz, 18H), 3.20 (s, 2H), 3.18 (s, 4H), 3.05 (br s, 1H), 2.66 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.61 (t, J = 6.2 Hz, 8H); 13C NMR (101 MHz, MeOD): δ (ppm) = 174.2, 172.7, 158.8, 145.3, 142.6, 128.8, 128.2, 126.2, 121.0, 72.0, 71.6, 71.5, 71.4, 71.2, 71.1, 71.0, 67.7, 59.7, 55.9, 55.6, 48.5, 41.7, 40.0, 38.3; LRMS (ESI) C110H141N17O26 m/z: [M+포르메이트]- 2161.4 (계산치 2161.0).
단계 2: 화합물 208 (스캐폴드 B)의 합성
테트라-N-Fmoc 아민 207 (10 mg, 0.0047 mmol)을 DMF (0.3 mL)에 용해시키고, 피페리딘 (4.6 μL, 0.047 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 질소 스트림하에 용매를 제거하여 백색 고체를 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. 중간체를 DMF (0.3 mL)에 현탁시키고, 화합물 2 (5 mg, 0.021 mmol), HBTU (8 mg, 0.021 mmol) 및 DIPEA (7.4 μL, 0.043 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음에, 역상 Combiflash 크로마토그래피 (수중 10-80% MeCN)에 직접 적용하였다. 생성물을 함유하는 분획물들을 조합하고, 동결건조하여 생성물 208 (1.9 mg, 0.00089 mmol, 19%)을 황백색 고체 잔류물로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25 ℃): δ (ppm) = 7.85 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 7.81-7.74 (m, 3H), 7.69 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 7.04 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 6.76 (s, 4H), 6.57 (dd, J = 10.7, 17.3 Hz, 8H), 6.34 (d, J = 16.1 Hz, 8H), 5.57 (dd, J = 1.6, 10.5 Hz, 8H), 3.85 (s, 8H), 3.59-3.46 (m, 29H), 3.40 (t, J = 5.7 Hz, 8H), 3.23-3.11 (m, 23H), 3.07 (br s, 6H), 2.67 (t, J = 1.8 Hz, 3H), 2.59-2.53 (m, 7H), 2.33 (m, 5H), 2.13 (t, J = 7.6 Hz, 11H), 1.74 (t, J = 7.4 Hz, 11H); HRMS (ESI) C98H153O22N29 m/z: [M+H]+ 2089.1782 (계산치 2089.1818).
실시예 27 - TetraDVP 스캐폴드 C의 합성
단계 1: 화합물 209의 합성
화합물 204 (385 mg, 0.69 mmol)를 HCl 용액 (디옥산 중 4M, 4 mL) 및 CH2Cl2 (2 mL)에 용해시키고, 3시간 동안 교반하였다. 질소 스트림하에 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 DMF (2.5 mL)에 재용해시켰다. Fmoc-8-아미노3,6-디옥사옥탄산 (532 mg, 1.38 mmol), HBTU (523 mg, 1.38 mmol) 및 DIPEA (721 μL, 4.14 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 17시간 동안 교반하였다. 일부 산 출발 물질이 남아 있으므로, 추가의 HBTU (261 mg, 0.69 mmol) 및 DIPEA (120 μL, 0.69 mmol)를 부가하고, 혼합물을 추가 1시간 교반하였다. 혼합물을 역상 컬럼 크로마토그래피 (H2O 중 10-100% MeCN)에 직접 적용하여 생성물 209 (378 mg, 0.34 mmol, 50%)를 점성 오렌지색 잔류물로서 수득하였다. R f : 0.18 (CH2Cl2 중 7% MeOH); IR(neat): ν max (cm-1) = 3313 (N-H, medium), 2928 (C-H, medium), 2870 (C-H, medium), 2107 (N3, medium), 1714 (C=O, strong), 1658 (C=O, strong), 1529 (N-H, strong), 1448 (C-H, strong), 1247 (C-N, strong), 1102 (CO, strong); 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25 ℃): δ (ppm) = 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 7.60 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 7.30 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 7.18 (br s, 2H), 5.71 (br s, 2H), 4.40 (d, J = 6.4 Hz, 4H), 4.20 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.99 (s, 4H), 3.68-3.51 (m, 24H), 3.43 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.40-3.30 (m, 10H), 3.15 (s, 2H), 2.64 (t, J = 6.0 Hz, 4H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 171.4, 170.5, 156.8, 144.1, 141.5, 127.8, 127.2, 125.2, 120.1, 77.4, 71.1, 70.8, 70.7, 70.6, 70.6, 70.4, 70.2, 70.1, 70.1, 69.7, 66.7, 59.2, 54.8, 50.8, 47.4, 41.0, 39.0, 37.2; HRMS (ESI) C56H73O14N9 m/z: [M+H]+ 1096.5346 (계산치 1096.5350).
단계 2: 화합물 210의 합성
N-Fmoc 아민 209 (161 mg, 0.15 mmol)를 DMF (2 mL)에 용해시키고, 피페리딘 (116 μL, 1.18 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 질소 스트림하에 용매를 제거하여 백색 고체를 수득하였다. 잔류물을 DMF (1.5 mL)에 현탁시키고, 산 4 (133 mg, 0.37 mmol), HBTU (139 mg, 0.37 mmol) 및 DIPEA (128 μL, 0.73 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 교반하였다. 조질의 혼합물을 역상 컬럼 크로마토그래피 (10-100% MeCN/H2O)에 적용하여 생성물 210 (118 mg, 0.088 mmol, 59%)을 담황색 잔류물로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25 ℃): δ (ppm) = 7.49 (br s, 2H), 7.22 (br s, 1H), 5.60 (s, 2H), 4.09-3.93 (m, 4H), 3.70-3.59 (m, 25H), 3.57 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.50-3.41 (m, 7H), 3.38 (t, J = 5.0 Hz, 6H), 3.27-3.03 (m, 10H), 2.82-2.48 (m, 8H), 2.16 (br s, 2H), 1.44 (s, 36H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 171.0, 163.2, 156.6, 152.0, 82.9, 79.7, 71.0, 70.8, 70.7, 70.6, 70.3, 70.1, 70.1, 69.6, 69.5, 63.1, 55.9, 55.6, 55.1, 54.8, 53.7, 50.8, 47.2, 41.0, 39.2, 28.6; HRMS (ESI) C58H111N15O20 m/z: [M+2H]2+ 669.9153 (계산치 669.9138).
단계 3: 화합물 211 (스캐폴드 C)의 합성
테트라-N-Boc 아민 210 (25 mg, 0.019 mmol)을 HCl/디옥산 (4M, 1 mL)에 용해시키고, 1시간 동안 교반하였다. 질소 스트림하에 용매를 제거하였다. 화합물 2 (26.1 mg, 0.112 mmol), HBTU (42.5 mg, 0.112 mmol)를 부가하고, 고체들을 조합하고, DMF (0.75 mL)에 현탁시켰다. DIPEA (59 μL, 0.336 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 역상 컬럼 크로마토그래피 (0.1M NH4OH(aq) 중 10-100% MeCN)하여 생성물 211 (9.71 mg, 0.0054 mmol, 28%)을 갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 ℃): δ (ppm) = 7.80-7.72 (m, 7H), 7.68 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 7.04 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 6.76 (s, 4H), 6.58 (dd, J = 10.6, 17.3 Hz, 8H), 6.35 (d, J = 16.6 Hz, 8H), 5.58 (dd, J = 1.4, 10.3 Hz, 8H), 3.85 (s, 4H), 3.61-3.57 (m, 2H), 3.56-3.45 (m, 16H), 3.44-3.36 (m, 9H), 3.29 (q, J = 6.6 Hz, 9H), 3.24 (q, J = 5.9 Hz, 6H), 3.17 (q, J = 6.3 Hz, 4H), 3.11 (q, J = 6.2 Hz, 8H), 3.08-3.03 (m, 6H), 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.14 (t, J = 7.7 Hz, 8H), 1.76 (m, J = 7.2 Hz, 9H), 0.95 (d, J = 6.5 Hz, 4H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 172.1, 170.6, 170.5, 169.2, 163.1, 162.4, 136.1, 121.4, 104.5, 70.1, 70.0, 69.8, 69.7, 69.7, 69.5, 69.3, 69.2, 69.0, 70.0, 58.3, 58.0, 54.2, 54.1, 50.0, 40.3, 40.1, 39.9, 39.8, 39.6, 38.1, 36.8, 36.4, 33.1; HRMS (ESI) C86H132O16N27 m/z: [M+H]+ 1799.0355 (계산치 1799.0340).
실시예 28 - TetraDVP 스캐폴드 D의 합성
단계 1: 화합물 212의 합성
테트라-N-Boc 아민 210 (102 mg, 0.076 mmol)을 HCl 용액 (디옥산 중 4M, 2 mL)에 용해시키고, 1시간 동안 교반하였다. 질소 스트림하에 용매를 제거하고, 생성된 백색 고체를 DMF (2 mL)에 재용해시켰다. Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (176 mg, 0.46 mmol), HBTU (173 mg, 0.46 mmol) 및 DIPEA (239 μL, 1.37 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 19.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 역상 컬럼 크로마토그래피 (H2O 중 10-100% MeCN)에 적용하여 생성물 212 (50.6 mg, 0.021 mmol, 28%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 ℃): δ (ppm) = 7.87 (d, J = 7.5 Hz, 8H), 7.77-7.71 (m, 3H), 7.68 (m incl. d, J = 7.5 Hz, 13H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 7.31 (m incl. t, J = 7.4 Hz, 11H), 4.28 (d, J = 6.9 Hz, 8H), 4.20 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.87-3.84 (m, 11H), 3.58-3.47 (m, 32H), 3.44-3.39 (m incl. t, J = 5.2 Hz, 13H), 3.36 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.24 (q, J = 5.6 Hz, 6H), 3.15 (m, J = 6.4 Hz, 19H), 3.07 (s, 6H), 2.56 (t, J = 6.7 Hz, 11H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 170.6, 169.8, 169.3, 169.2, 142.6, 139.4, 137.4, 128.9, 127.3, 121.4, 120.0, 109.8, 70.2, 70.2, 70.0, 69.8, 69.7, 69.7, 69.5, 69.3, 69.0, 58.0, 54.1, 50.0, 40.3, 40.1, 39.8, 38.1, 36.4; HRMS (ESI) C122H164O32N19 m/z: [M+H]+ 2407.1743 (계산치 2407.1784).
단계 2: 화합물 213 (스캐폴드 D)의 합성
화합물 212 (24 mg, 0.01 mmol)를 DMF (1 mL)에 용해시키고, 피페리딘 (9.9 μL, 0.10 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 질소 스트림하에 용매를 제거하였다. 조질의 잔류물을 DMF (0.75 mL)에 재용해시켰다. 산 2 (14 mg, 0.06 mmol), HBTU (23 mg, 0.06 mmol) 및 DIPEA (31 μL, 0.18 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 조질의 혼합물을 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피 (0.1M NH4OH(aq) 중 0-100% MeCN)에 적용하여 생성물 213 (8.6 mg, 0.0036 mmol, 36%)을 담갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 ℃): δ (ppm) = 7.86 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 7.78-7.72 (m, 3H), 7.70-7.63 (m, 6H), 7.04 (t, J = 5.7 Hz, 4H), 6.76 (s, 4H), 6.57 (dd, J =10.7, 17.2 Hz, 8H), 6.35 (d, J = 16.8 Hz, 8H), 5.57 (dd, J = 1.4, 10.7 Hz, 8H), 3.86 (s, 12H), 3.60-3.47 (m, 36H), 3.45-3.36 (m, 17H), 3.30-3.22 (m, 18H), 3.22-3.13 (m, 21H), 3.07 (s, 6H), 2.56 (t, J = 6.4 Hz, 10H), 2.13 (t, J = 7.5 Hz, 8H), 1.74 (app. qu, J = 7.2 Hz, 9H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 172.1, 170.6, 170.5, 169.2, 169.2, 163.2, 162.4, 136.1, 121.4, 104.5, 70.2, 70.0, 69.8, 69.7, 69.7, 69.5, 69.3, 69.3, 69.2, 69.1, 69.0, 58.0, 54.1, 50.0, 40.3, 40.1, 39.9, 39.8, 39.6, 38.4, 38.1, 38.1, 36.4, 33.0, 28.3, 25.3; HRMS (ESI) C110H175O28N31 m/z: [M+H]+ 2379.3252 (계산치 2379.3296).
실시예 29 - TetraDVP 스캐폴드 E의 합성
단계 1: 화합물 216의 합성
DCM (100 mL) 중 화합물 214 (10 g, 45.61 mmol) 및 화합물 215 (4.9 g, 38.23 mmol)의 혼합물에 Bu4NBr (2.4 g, 7.44 mmol) 및 NaOH (9.85 g, 246.31 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (200 mL)에 붓고, DCM (200 mL * 2)으로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인 (200 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 컬럼 (SiO2, 석유 중 30% 내지 40% EtOAc)으로 정제하여 화합물 216 (5.2 g, 32.8% 수율)을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 3.73 - 3.69 (m, 2 H), 3.68 - 3.64 (m, 10 H), 3.64 - 3.59 (m, 4 H), 2.04 (s, 2 H), 1.44 (s, 9 H).
단계 2: 화합물 217의 합성
HCl/디옥산 (4M, 50 mL) 중 화합물 216 (5.2 g, 14.97 mmol)의 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 주요 생성물로서 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 217 (4.3 g, 98.6% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다. LCMS: rt = 0.502분, (292.2 [M+H]+), 74.6% 순도.
단계 3: 화합물 219의 합성
DCM (60 mL) 중 화합물 217 (4.3 g, 14.76 mmol) 및 화합물 218 (2.8 g, 16.24 mmol)의 혼합물에 HATU (5.6 g, 14.76 mmol) 및 DPIEA (9.5 g, 73.81 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% FA) - ACN; B%: 30%-50%)로 정제하였다. 혼합물을 NaHCO3 수용액으로 pH=8로 조정하고, 진공에서 농축하여 CH3CN을 제거하였다. 그 다음에 혼합물을 EtOAc (200 mL * 2)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인 (200 mL)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 진공에서 농축하여 화합물 219 (5 g, 75.7% 수율)를 연황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.740분, (448.3 [M+H]+), 100.00% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 3.72 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 3.69 - 3.61 (m, 14 H), 3.39 - 3.36 (m, 2 H), 3.21 (t, J= 6.8 Hz, 2 H), 3.07 (t, J= 6.8 Hz, 2 H), 2.43 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.66 - 1.58 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H).
단계 4: 화합물 220의 합성
디옥산 (30 mL) 중 화합물 219 (5 g, 11.17 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 30 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 220 (4.6 g, 97.9% 수율)을 연황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.610분, (348.2 [M+H]+), 100.00% 순도.
단계 5: 화합물 221의 합성
DCM (50 mL) 중 화합물 220 (2.3 g, 5.99 mmol) 및 화합물 203 (2.17 g, 5.99 mmol)의 혼합물에 DIPEA (2.3 g, 17.97 mmol) 및 HATU (2.28 g, 5.99 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 8시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% HCl) - ACN; B% 10%-54%)로 정제하였다. 혼합물을 NaHCO3 수용액으로 pH=8로 조정하고, 진공에서 농축하여 CH3CN을 제거하였다. 그 다음에 혼합물을 EtOAc (100 mL * 2)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 농축하여 화합물 221 (3.8 g, 88.5% 수율)을 황색 오일로서 제공하였다. m/z 691.4 (M+H)+ (ES+). LCMS: rt = 0.530분, (691.4 [M+H]+), 96.41% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 3.76 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 3.69 - 3.61 (m, 14 H), 3.37 (t, J= 5.2 Hz, 2 H), 3.29 - 3.24 (m, 4 H), 3.19 - 3.11 (m, 6 H), 2.60 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 2.48 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.68 (q, J= 6.4 Hz, 2 H), 1.44 (s, 18 H).
단계 6: 화합물 222의 합성
디옥산 (20 mL) 중 화합물 221 (3.8 g, 5.50 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 20 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 222 (3.2 g, 96.9% 수율)를 연황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.404분, (491.2 [M+H]+), 82.75% 순도.
단계 7: 화합물 223의 합성
DCM (20 mL) 중 화합물 222 (1.65 g, 2.75 mmol) 및 화합물 203 (2.09 g, 5.78 mmol)의 혼합물에 DIPEA (2.13 g, 16.50 mmol) 및 HATU (2.20 g, 5.78 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% FA) - ACN; B% 50%-70%)로 정제한 다음에, 진공에서 농축하여 화합물 223 (2.7 g, 79.8% 수율)을 연황색 고체로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.739분, (1178.0 [M+H]+), 95.74% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 3.73 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 3.70 - 3.67 (m, 2 H), 3.66 - 3.65 (m, 4 H), 3.64 - 3.63 (m, 4 H), 3.62 - 3.58 (m, 4 H), 3.39 - 3.33 (m, 6 H), 3.29 - 3.22 (m, 6 H), 3.17 (s, 4 H), 3.13 (t, J= 6.0 Hz, 8 H), 2.74 (t, J= 6.4 Hz, 4 H), 2.60 (t, J= 6.0 Hz, 8 H), 2.46 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.75 - 1.67 (m, 2 H), 1.44 (s, 36 H).
단계 8: 화합물 224의 합성
디옥산 (4 mL) 중 화합물 223 (600 mg, 0.51 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 2 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 8시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 224 (525 mg, 99.8% 수율)를 연황색 고체로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.390분, (777.3 [M+H]+), 93.39% 순도.
단계 9: 화합물 225 (스캐폴드 E)의 합성
DCM (8 mL) 중 화합물 2 (593.2 mg, 2.54 mmol) 및 화합물 224 (525 mg, 0.51 mmol)의 혼합물에 DIPEA (1.31 g, 10.17 mmol)를 부가하였다. 그 다음에, HATU (773.58 mg, 2.03 mmol)를 상기 용액에 서서히 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 mm * 25 mm * 5 um; 이동상: [물 (암모니아 하이드록시드 v/v)-ACN]; B%: 37%-67%, 9분)로 정제하고, 동결건조하여 225, 스캐폴드 E (236 mg, 25.7% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다. 그 다음에 생성물을 즉시 DMSO (13 mL)에 용해시켰다. LCMS: rt = 1.022분, (1638.9 [M+H]+), 93.22% 순도.
실시예 30 - TetraDVP 스캐폴드 F의 합성
단계 1: 화합물 226의 합성
디옥산 (50 mL) 중 화합물 202 (10 g, 22.15 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 50 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 8시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 226 (7.9 g, 98.9% 수율)을 백색 고체로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.435분, (252.3 [M+H]+), 100.00% 순도.
단계 2: 화합물 228의 합성
DCM (100 mL) 중 화합물 226 (5 g, 12.59 mmol) 및 화합물 227 (6.96 g, 26.44 mmol)의 혼합물에 DIPEA (11.39 g, 88.12 mmol) 및 HATU (10.05 g, 26.44 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% FA) - ACN; B% 70%-90%)로 정제하였다. 혼합물을 NaHCO3 수용액으로 pH=8로 조정하고, 진공에서 농축하여 CH3CN을 제거하였다. 그 다음에 혼합물을 EtOAc (100 mL * 2)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인 (100 mL)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 진공에서 농축하여 화합물 228 (6.1 g, 57.4% 수율)을 황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.555분, (742.6 [M+H]+), 87.94% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.39 - 7.31 (m, 5 H), 5.16 (s, 2 H), 3.99 (s, 4 H), 3.63 - 3.69 (m, 8 H), 3.55 (s, 2 H) 3.51 (t, J= 5.6 Hz, 4 H), 3.34 - 3.31 (m, 4 H), 3.22 (t, J= 5.6 Hz, 4 H), 2.79 (t, J= 6.0 Hz, 4 H), 1.43 (s, 18 H).
단계 3: 화합물 229의 합성
MeOH (200 mL) 중 화합물 228 (6.1 g, 8.22 mmol)의 혼합물에 N2하에 Pd/C (800 mg, 10% 순도)를 부가하였다. 반응 혼합물을 H2 (15 psi)하에 20℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 촉매를 여과하였다. 여과물을 진공에서 농축하여 화합물 229 (5.3 g, 98.9% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.823분, (652.5 [M+H]+), 100.00% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.04 (s, 4 H), 3.74 - 3.68 (m, 4 H), 3.68 - 3.62 (m, 6 H), 3.55 (t, J= 6.0 Hz, 8 H), 3.26 - 3.17 (m, 8 H), 1.44 (s, 18 H).
단계 4: 화합물 230의 합성
DCM (20 mL) 중 화합물 229 (700 mg, 1.17 mmol) 및 화합물 221 (1.52 g, 2.33 mmol)의 혼합물에 DIPEA (904.73 mg, 7.00 mmol) 및 HATU (887.23 mg, 2.33 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% FA) - ACN; B% 50%-70%)로 정제하고, 동결건조하여 화합물 230 (800 mg, 39.0% 수율)을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.02 (s, 8 H), 3.73 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 3.71 - 3.68 (m, 10 H), 3.67 - 3.66 (m, 10 H), 3.65 - 3.61 (m, 10 H), 3.53 (t, J= 6.0 Hz, 8 H), 3.43-3.40 (m, 2 H), 3.35 (t, J= 6.0 Hz, 12 H), 3.27 - 3.22 (m, 18 H), 2.75 - 2.67 (m, 12 H), 2.47 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.74 - 1.67 (m, 2 H), 1.44 (s, 36 H).
단계 5: 화합물 231의 합성
디옥산 (5 mL) 중 화합물 230 (800 mg, 0.46 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 5 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 4시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 231 (700 mg, 95.4% 수율)을 황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.471분, (1357.7 [M+H]+), 59.49% 순도.
단계 6: 화합물 232 (스캐폴드 F)의 합성
DCM (20 mL) 중 화합물 2 (343.6 mg, 1.47 mmol) 및 화합물 231 (400 mg, 294.64 umol)의 혼합물에 DIPEA (571.2 mg, 4.42 mmol)를 부가하였다. 그 다음에 HATU (448.1 mg, 1.18 mmol)를 상기 용액에 서서히 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 mm * 25 mm * 5um; 이동상: [물 (암모니아 하이드록시드 v/v)-ACN]; B%: 30%-60%, 9분)로 정제하고, 동결건조하여 232, 스캐폴드 F (155 mg, 22.7% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다. 그 다음에, 생성물을 즉시 DMSO (7 mL)에 용해시켰다. LCMS: rt = 0.961분, (1110.3 [[M+H]/2] +), 97.65% 순도.
실시예 31 - TetraDVP 스캐폴드 G의 합성
단계 1: 화합물 233의 합성
DCM (30 mL) 중 화합물 229 (3 g, 4.60 mmol) 및 화합물 219 (1.93 g, 4.60 mmol)의 혼합물에 DIPEA (2.97 g, 23.02 mmol) 및 HATU (1.75 g, 4.60 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 수득하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% FA) - ACN; B% 40%-60%)로 정제하였다. 혼합물을 NaHCO3 수용액으로 pH=8로 조정하고, 진공에서 농축하여 CH3CN을 제거하였다. 그 다음에, 혼합물을 EtOAc (200 mL*2)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인 (200 mL)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 진공에서 농축하여 화합물 233 (2.0 g, 44.3% 수율)을 황색 오일로서 수득하였다. LCMS: rt = 0.533분, (981.4 [M+H]+), 94.19% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.00 (s, 4 H), 3.74 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 3.69 - 3.61 (m, 22 H), 3.53 (t, J= 6.0 Hz, 4 H), 3.40 - 3.34 (m, 6 H), 3.28 - 3.22 (m, 10 H), 2.71 (t, J= 6.8 Hz, 4 H), 2.46 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.70 (q, J= 6.4 Hz, 2 H) 1.44 (s, 18 H).
단계 2: 화합물 234의 합성
디옥산 (10 mL) 중 화합물 233 (2 g, 2.04 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 9.1 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 4시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 234 (1.81 g, 100% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.354분, (781.5 [M+H]+), 55.4% 순도.
단계 3: 화합물 235의 합성
DCM (5 mL) 중 화합물 203 (487.1 mg, 1.35 mmol)의 혼합물에 HATU (512.5 mg, 1.35 mmol) 및 DIPEA (348.4 mg, 2.70 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 그 다음에, DCM (5 mL) 중 화합물 234 (600 mg, 0.67 mmol) 및 DIPEA (522.6 mg, 4.04 mmol)의 용액을 상기 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 추가로 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% FA) - ACN; B% 40%-60%)로 정제하였다. 혼합물을 NaHCO3 수용액으로 pH=8로 조정하고, 진공에서 농축하여 CH3CN을 제거하였다. 그 다음에, 혼합물을 EtOAc (100 mL * 2)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인 (100 mL)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 진공에서 농축하여 화합물 235 (360 mg, 34.5% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.739분, (1468.1 [M+H]+), 100.00% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.01 (s, 4 H), 3.76 - 3.70 (m, 4 H), 3.70 - 3.59 (m, 28 H), 3.45 (t, J= 5.6 Hz, 4 H), 3.40 - 3.34 (m, 6 H), 3.29 - 3.22 (m, 6 H), 3.18 - 3.10 (m, 14 H), 2.71 (t, J= 6.6 Hz, 4 H), 2.60 (br t, J= 6.0 Hz, 8 H), 2.46 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.74 - 1.66 (m,2 H), 1.45 (s, 36 H).
단계 4: 화합물 236의 합성
디옥산 (4 mL) 중 화합물 235 (250 mg, 0.17 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 1 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 236 (225 mg, 99% 수율)을 황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.354분, (1167.8 [M+H]+), 75.55% 순도.
단계 5: 화합물 237 (스캐폴드 G)의 합성
DCM (10 mL) 중 화합물 236 (225 mg, 0.17 mmol)의 혼합물에 DIPEA (439.7 mg, 3.40 mmol) 및 화합물 2 (198.4 mg, 0.85 mmol)를 부가하였다. 그 다음에 HATU (323.5 mg, 0.85 mmol)를 상기 용액에 조금씩 서서히 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 출발 물질이 소비되었고 목적하는 물질이 검출되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 mm * 25 mm * 5 μm; 이동상: [물 (암모니아 하이드록시드 v/v)-ACN]; B%: 36%-66%, 9분)로 정제하고, 동결건조하여 237, 스캐폴드 G (278 mg, 78.2% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다. 그 다음에 생성물을 즉시 DMSO (13 mL)에 용해시켰다. LCMS: rt = 0.958분, (1929.4 [M+H]+), 95.17% 순도.
실시예 32 - TetraDVP 스캐폴드 H의 합성
단계 1: 화합물 238의 합성
DCM (10 mL) 중 화합물 229 (878.5 mg, 1.35 mmol)의 혼합물에 DIEA (174.2 mg, 1.35 mmol) 및 HATU (512.5 mg, 1.35 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 그 다음에, DCM (5 mL) 중 화합물 234 (600 mg, 0.67 mmol) 및 DIEA (522.61 mg, 4.04 mmol)의 용액을 상기 용액에 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 추가로 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 역상 Combiflash (물 (0.1% FA) - ACN; B% 60%-80%)로 정제하였다. 혼합물을 NaHCO3 수용액으로 pH=8로 조정하고, 진공에서 농축하여 CH3CN을 제거하였다. 그 다음에 혼합물을 EtOAc (100 mL * 2)로 추출하였다. 유기층들을 조합하고, 브라인 (100 mL)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 진공에서 농축하여 화합물 238 (360 mg, 26.1% 수율)을 황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.740분, (1025.2 [[M+H]/2]+), 100.00% 순도. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.02 (s, 12 H), 3.76 - 3.71 (m, 4 H), 3.70 - 3.64 (m, 32 H), 3.63 - 3.58 (m, 8 H), 3.53 (t, J= 5.6 Hz, 8 H), 3.47 - 3.42 (m, 4 H), 3.41 - 3.34 (m, 14 H), 3.28 - 3.22 (m, 18 H), 2.71 (t, J= 6.4 Hz, 12 H), 2.47 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.74-1.67 (m, J=6.4 Hz, 2 H), 1.44 (s, 36 H).
단계 2: 화합물 239의 합성
디옥산 (5 mL) 중 화합물 238 (300 mg, 0.15 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산 (4M, 5 mL)을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 화합물 239 (270 mg, 96.9% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다. LCMS: rt = 0.414분, (1647.9 [M+H]+), 44.49% 순도.
단계 2: 화합물 240 (스캐폴드 H)의 합성
DCM (5 mL) 중 화합물 239 (270 mg, 0.14 mmol) 및 화합물 2 (165.5 mg, 0.71 mmol)의 혼합물에 DIEA (366.7 mg, 2.84 mmol)를 부가하였다. 그 다음에, HATU (215.8 mg, 0.57 mmol)를 상기 용액에 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 잔류물을 제공하고, 이를 prep-HPLC (컬럼: Waters Xbridge 150 mm * 25 mm * 5 um; 이동상: [물 (암모니아 하이드록시드 v/v)-ACN]; B%: 34%-64%, 9분)로 정제하고, 동결건조하여 240, 스캐폴드 H (131 mg, 34.4% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다. 그 다음에 생성물을 즉시 DMSO (4.7 mL)에 용해시켰다. LCMS: rt = 0.946분, (1255.3 [[M+H]/2]+), 100.00% 순도.
실시예 32 - DBCO 시약 247의 합성
단계 1: Fmoc-Val-Cit-OH (241)의 합성
DME (1.5 mL) 중 L-시트룰린 (85 mg, 0.486 mmol)을 0℃에서 H2O (3 mL) 및 THF (4 mL) 중 Fmoc-Val-OSu (202 mg, 0.463 mmol) 및 NaHCO3 (42.8 mg, 0.509 mmol)의 용액에 부가하였다. 반응을 실온으로 가온하고, 48시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 포화 K2CO3 수용액으로 pH 10으로 조정하고, EtOAc (2 x 20 mL)로 세척하였다. 수성층을 10% 시트르산 수용액으로 pH 4로 산성화하고, 형성된 젤라틴 혼합물을 여과하고, 진공에서 건조하여 Fmoc-Val-Cit-OH 241 (141 mg, 0.284 mmol, 61%)을 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δppm: 7.89 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.75 (dd, 2H, J = 11.7, 7.8 Hz), 7.41 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 7.34-7.30 (m, 2H), 6.00 (s, 1H), 4.31-4.26 (m, 1H), 4.27-4.19 (m, 2H), 4.17-4.13 (m, 1H), 3.94-3.87 (m, 1H), 2.99-2.92 (m, 2H), 1.98 (app sx, 1H, J = 6.8 Hz), 1.74-1.66 (m, 1H), 1.61-1.53 (m, 1H), 1.46-1.35 (m, 2H), 0.89 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.86 (d, 3H, J = 6.8 Hz). 13C NMR (176 MHz, DMSO-d6) δppm: 173.4, 171.3, 158.8, 156.1, 143.9, 143.9, 140.7, 127.7, 127.1, 125.4, 120.1, 65.7, 59.8, 51.9, 46.7, 38.8, 30.6, 28.4, 26.6, 19.2, 18.2. HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 497.2394, C26H33N4O6 + 계산치 497.2395.
단계 2: Fmoc-Val-Cit-PABA (242)의 합성
DCM (2.5 mL) 및 MeOH (1.5 mL) 중 Fmoc-Val-Cit-OH 241 (104 mg, 0.210 mmol), 4-아미노벤질 알코올 (PABA, 52.0 mg, 0.419 mmol) 및 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ, 104 mg, 0.419 mmol)의 용액을 실온에서 22시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 혼합물을 Et2O (10 mL)로 희석하고, 여과하고, Et2O (2 x 4 mL)로 세척하여 Fmoc-Val-Cit-PABA 242 (66.4 mg, 0.110 mmol, 53%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δppm: 9.98 (s, 1H), 8.12 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.89 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.74 (t, 2H, J = 8.1 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.46-7.39 (m, 3H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.23 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.00 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 5.41 (s, 2H), 5.09 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 4.43-4.39 (m, 3H), 4.33-4.20 (m, 3H), 3.95-3.91 (m, 1H), 3.06-2.89 (m, 2H), 2.04-1.95 (m, 1H), 1.74-1.55 (m, 2H), 1.50-1.32 (m, 2H), 0.89-0.84 (m, 6H); 13C NMR (176 MHz, DMSO-d6) δppm: 171.3, 170.4, 158.9, 156.1, 143.9, 140.7, 137.5, 137.4, 127.7, 127.1, 126.9, 125.4, 120.1, 118.9 , 65.7, 62.6, 60.1, 53.1, 46.7, 38.6, 30.5, 29.5, 26.8, 19.2, 18.3; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 602.2968, C33H40N5O6 + 계산치 602.2973.
단계 3: Boc-PEG4-Val-Cit-PABA (243)의 합성
DMF (1.5 mL) 중 Fmoc-Val-Cit-PABA 242 (100 mg, 0.166 mmol) 및 디에틸아민 (343 μL, 3.33 mmol)의 용액을 실온에서 19시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 용매를 감압하에 증발시키고, 생성물을 DCM으로 크래쉬 (crash)하고, 여과하고, EtOAc 및 Et2O로 세척하여 H-Val-Cit-PABA (52.3 mg, 0.138 mmol, 83%)를 백색 고체로서 제공하고, 이는 추가 정제 없이 수행하였다. DMF (3 mL) 중 H-Val-Cit-PABA (52.3 mg, 0.138 mmol), Boc-PEG4-COOH (50.0 mg, 0.138 mmol), HBTU (52.5 mg, 0.138 μmol) 및 DIPEA (48.0 μL, 0.276 μmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하고, 조질의 잔류물을 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피 (용매 A 중 5-100% 용매 B; 용매 A: 0.1 M NH4OH (aq), 용매 B: MeCN)로 정제하고, 동결건조하여 Boc-PEG4-Val-Cit-PABA 243 (50.5 mg, 69.4 μmol, 51%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δppm: 9.87 (s, 1H), 8.07 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.86 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.53 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.73 (t, 1H, J = 5.0 Hz), 6.00 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 5.39 (s, 2H), 5.09 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 4.41 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 4.39-4.31 (m, 1H), 4.23-4.17 (m, 1H), 3.63-3.53 (m, 2H), 3.50-3.43 (m, 12H), 3.07-2.96 (m, 3H), 2.96-2.87 (m, 1H), 2.47-2.42 (m, 1H), 2.40-2.31 (m, 1H), 1.95 (h, 1H, J = 6.8 Hz), 1.76-1.63 (m, 1H), 1.62-1.52 (m, 1H), 1.45-1.38 (m, 2H), 1.37-1.35 (s, 9H), 0.82 (dd, 6H, J = 6.8 Hz); 13C NMR (176 MHz, DMSO-d6) δppm: 171.6, 170.8, 159.3, 156.0, 137.9, 127.4, 119.3, 78.1, 70.2, 70.2, 70.1, 69.9, 69.9 69.6, 67.4, 63.0, 58.0, 53.5, 39.0, 36.4, 31.0, 29.8, 28.7, 27.3, 19.6, 18.5; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 726.8, C34H59N6O11 + 계산치 727.4273.
단계 4: Boc-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE (244)의 합성
DMF (2 mL) 중 Boc-PEG4-Val-Cit-PABA 243 (60.0 mg, 82.5 μmol), 비스(4-니트로페닐) 카보네이트 (50.2 mg, 0.165 mmol) 및 DIPEA (43.0 μL, 0.248 mmol)의 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 혼합물을 Na2CO3 (10 mL)로 희석하고, DCM (10 mL)으로 추출하였다. 수성층을 DCM (4 x 20 mL)으로 세척하고, 유기층들을 합하고, Na2CO3 (2 x 10 mL)으로 세척하였다. 유기 분획물들을 조합하고, 건조시키고 (MgSO4), 진공에서 농축하여 Boc-PEG4-Val-Cit-PABC-PNP를 갈색 오일로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. DMF (2 mL) 중 MMAE (25.0 mg, 34.8 μmol), Boc-PEG4-Val-Cit-PABC-PNP (25.9 mg, 29.0 μmol), HOBt·H2O (4.70 mg, 34.8 μmol) 및 DIPEA (12.1 μL, 69.6 μmol)의 용액을 실온에서 21시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하였다. 조질의 생성물을 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피 (용매 A 중 5-100% 용매 B; 용매 A: 0.1M NH4OH (aq), 용매 B: MeCN)로 정제하고, 동결건조하여 Boc-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE 244 (45.6 mg, 31.0 μmol, 89%)를 연황색 고체로서 수득하였다. HPLC (20분에 걸쳐 5-95% MeCN/H2O) 체류 시간 10.370분; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 1470.9042, C74H124N11O19 + 계산치 1470.9075.
단계 5: Fmoc-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-NH2 (245)의 합성
Boc-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE 244 (40.0 mg, 27.2 μmol), TIPS (100 μL), TFA (500 μL) 및 DCM (950 μL)의 용액을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하고, 추가 정제 없이 수행하였다. DMF (2 mL) 중 H-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE (37.3 mg, 27.2 μmol), Fmoc-PEG2-Glu-PEG2-Glu-NH2 (8.57 mg, 10.9 μmol), HATU (18.7 mg, 49.1 μmol) 및 DIPEA (12.3 μL, 70.9 μmol)의 용액을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하고, 조질의 생성물을 분취용 HPLC로 정제하고, 동결건조하여 Fmoc-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE) 245 (1.10 mg, 0.315 μmol, 3%)를 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (20분에 걸쳐 5-95% MeCN/H2O) 체류 시간 12.721분; LRMS (ESI) m/z 실측치 [M+2H]+ 1165.3, [M+3H]+ 1747.7, [M+4H]+ 873.9, C175H276N27O46 + 계산치 3492.0073.
단계 6: Fmoc-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-NH2 (246)의 합성
Boc-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE 244 (38.0 mg, 25.8 μmol), TIPS (100 μL), TFA (500 μL) 및 DCM (950 μL)의 용액을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응 혼합물을 N2 스트림하에 농축하고, H2O (5 mL)에 용해시키고, 동결건조하고, 추가 정제 없이 수행하였다. DMF (0.5 mL) 중 Fmoc-PEG2-Glu-PEG2-PEG2-Glu-NH2 (10.9 mg, 11.7 μmol), BTTFH (7.77 mg, 24.6 μmol) 및 DIPEA (8.55 μL, 49.2 μmol)의 용액을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 상기 용액에 DMF (0.5 mL) 중 TFA.HN-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE (33.7 mg, 23.0 μmol) 및 DIPEA (6.09 μL, 35.0 μmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하고, 조질의 생성물을 분취용 HPLC로 정제하고, 동결건조하여 Fmoc-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-NH2 246 (6.39 mg, 1.76 μmol, 15%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (20분에 걸쳐 5-95% MeCN/H2O) 체류 시간 12.720분; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 3637.140, C181H387N28O49 + 계산치 3637.0773.
단계 7: DBCO-PEG5-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-NH2 (247)의 합성
폴리머-결합된 피페라진 (30 mg, mmol, 200-400 메시, 1.0-2.0 mmol/g 로딩, 디비닐벤젠과 2% 가교)을 DMF (200 μL) 중 Fmoc-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-NH2 246 (3.60 mg, 0.989 μmol)의 용액에 부가한 후에, 0.1% DBU를 부가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 용매를 N2 스트림하에 증발시키고, 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다. DMF (100 μL) 중 H-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE) (3.38 mg, 0.989 μmol), DBCO-PEG5-COOH (1.60 mg, 2.68 μmol), HATU (1.02 mg, 2.68 μmol) 및 DIPEA (0.932 μL, 5.36 μmol)의 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 시에, 반응을 N2 스트림하에 농축하고, 조질의 생성물을 분취용 HPLC로 정제하여 DBCO-PEG5-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-PEG2-PEG2-Glu(-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAE)-NH2 247 (0.60 mg, 0.150 μmol, 16%)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC (20분에 걸쳐 5-95% MeCN/H2O) 체류 시간 13.208분; HRMS (ESI) m/z 실측치 [M+H]+ 3995.4700, [M+2H]+ 1997.1381, [M+3H]+ 1331.7620 및 [M+4H]+ 999.0757, C198H315N30O55 + 계산치 3993.2773.
실시예 33 - 펩티드 합성
매뉴얼 펩티드 합성: Merck LL MHBA 저부하 연결 아미드 수지 (Merck LL MHBA low-loading Rink amide resin) (0.308 mmol/g, 100-200 메시, 1 eq)에서 매뉴얼 펩티드 합성을 수행하여 C-말단 아미드를 제공하였다. DMF 중 Fmoc-보호된 아미노산 (3 eq), HATU (3 eq) 및 DIPEA (6 eq)를 사용하여 1-3시간 동안 아미노산 커플링을 수행하였다. Fmoc 탈보호는 DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 10분 동안 수행하였다.
수지 절단: TFA/TIPS/H2O (95:2.5:2.5)를 함유하는 TFA 절단 칵테일을 사용하여 실온에서 3시간 동안 측쇄 탈보호 및 수지로부터의 절단을 달성하였다. N2 스트림하에 여과 및 증발 시에, 펩티드를 빙냉한 Et2O에서 침전시켰다. 조질의 펩티드를 동결건조하고, 물질을 LCMS로 분석하고, 순도를 분석용 HPLC로 결정하였다. 조질의 펩티드를 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS 및 펩티드의 순도
펩티드 서열, LCMS로 관찰된 질량, 펩티드 순도 및 수율, 분석용 HPLC에 의해 결정된 체류 시간을 하기 표 1 및 2에 나타내었다.
펩티드 서열, 관찰된 질량 및 순도.
펩티드 서열 질량 m/z
실측치 		m/z
계산치 		종 순도 (%)
P1 Fmoc-XEXE-NH2 787.3 787.8 788.3 M+H 81
P2 Fmoc-XEXXE-NH2 932.4 933.0 933.4 M+H 78
X = Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산.
펩티드 서열, 분석용 HPLC 체류 시간 및 수율.
펩티드 서열 R t (min)† R t (min)‡ 수율 (%)
P1 Fmoc-XEXE-NH2 8.637 8.960 64
P2 Fmoc-XEXXE-NH2 8.614 8.938 79
† 20분에 걸쳐 5-95% B 구배 (A: H2O 중 0.05% (v/v) TFA, B: MeCN 중 0.05% (v/v) TFA)의 Rt; ‡ 20분에 걸쳐 10-80% B 구배 (A: H2O 중 0.05% (v/v) TFA, B: MeCN 중 0.05% (v/v) TFA)의 Rt; X = Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산.
바이오접합
트라스투주맙 바이오접합을 위한 일반적인 방법
TBS 버퍼 중 트라스투주맙의 용액 (1X, pH 8, [Tras] = 2.5 mgml-1, 200 μL, 3.4 nmol)에 TCEP (TBS 중 5 mM 스톡, 6.8 μL, 34 nmol, 10 당량)를 부가하고, 혼합물을 400 rpm의 열 진탕기 (thermal shaker)에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 유기 용매 농도가 5-10%가 되도록 DMSO를 부가하였다. 링커/스캐폴드 (DMSO 중 1-10 mM 스톡, 2-10 당량)를 부가하고, 혼합물을 400 rpm의 열 진탕기에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 접합체를 PBS (3 x 300 μL)로 평형화된 Zeba™ Spin 탈염 컬럼 (MW 컷-오프 40,000 Da, Thermo Fisher Scientific)으로 정제하였다. 유기 용매를 Amicon-Ultra 원심분리 필터 (MW 컷-오프 10,000 Da, Merck Millipore)를 사용하여 PBS 정용여과에 의해 ＜ 0.01%로 감소시켰다.
클릭 화학을 위한 일반적인 방법
PBS 중 트라스투주맙-링커 접합체의 용액 ([Tras] = 1.0 mgml-1, 60 μL, 0.4 nmol)에 DMSO 중 DBCO 클릭 시약의 용액 (10 mM 스톡 농도, 0.4 μL, 4 nmol, 10 당량)을 부가하고, 혼합물을 400 rpm의 열 진탕기에서 37℃에서 4-24시간 동안 인큐베이션하였다. 접합체를 PBS (3 x 300 μL)로 평형화된 Zeba™ Spin 탈염 컬럼 (MW 컷-오프 40,000 Da, Thermo Fisher Scientific)으로 정제하였다. 유기 용매를 Amicon-Ultra 원심분리 필터 (MW 컷-오프 10,000 Da, Merck Millipore)를 사용하여 PBS 정용여과에 의해 ＜0.01%로 감소시켰다.
실시예 34 - ALC 1의 합성
스캐폴드 A (206)를 사용하여 바이오접합을 수행하였다. SDS-PAGE (12% 폴리아크릴아미드 겔, 200 V에서 50분 동안 실행, Coomassie Brilliant Blue 염색으로 시각화됨)로 완전히 재-브릿징된 항체가 주요 생성물이었음을 나타낸다. HRMS (ESI) [M+H]+ 146,687 Da (계산치 146,687 Da).
실시예 35 - ALC 2의 합성
스캐폴드 B (208)를 사용하여 바이오접합을 수행하였다. SDS-PAGE (12% 폴리아크릴아미드 겔, 200 V에서 50분 동안 실행, Coomassie Brilliant Blue 염색으로 시각화됨)로 완전히 재-브릿징된 항체가 주요 생성물이었음을 나타낸다. HRMS (ESI) [M+H]+ 147,269 Da (계산치 147,267 Da).
실시예 36 - ALC 3의 합성
스캐폴드 C (211)를 사용하여 바이오접합을 수행하였다. SDS-PAGE (12% 폴리아크릴아미드 겔, 200 V에서 50분 동안 실행, Coomassie Brilliant Blue 염색으로 시각화됨)로 완전히 재-브릿징된 항체가 주요 생성물이었음을 나타낸다. HRMS (ESI) [M+H]+ 146,979 Da (계산치 146,978 Da).
실시예 37 - ALC 4의 합성
스캐폴드 D (213)를 사용하여 바이오접합을 수행하였다. SDS-PAGE (12% 폴리아크릴아미드 겔, 200 V에서 50분 동안 실행, Coomassie Brilliant Blue 염색으로 시각화됨)로 완전히 재-브릿징된 항체가 주요 생성물이었음을 나타낸다. HRMS (ESI) [M+H]+ 147,559 Da (계산치 147,557 Da).
실시예 38-41 - ADC 1-4의 합성
ALC 1, ALC 2, ALC 3 및 ALC 4를 각각 사용하여 클릭 반응을 수행하였다. 각 반응에서 클릭 파트너로서 DBCO-PEG5-Val-Cit-PAB-MMAE (248), 및 상기 혼합물을 24시간 동안 인큐베이션하여 목적하는 ADC를 생성하였다.
ADC 1: HRMS (ESI) [M+H]+ 148,390 Da (계산치 148,388 Da).
ADC 2: HRMS (ESI) [M+H]+ 148,971 Da (계산치 148,968 Da).
ADC 3: HRMS (ESI) [M+H]+ 148,681 Da (계산치 148,679 Da).
ADC 4: HRMS (ESI) [M+H]+ 149,262 Da (계산치 149,258 Da).
화합물 248:
실시예 42-45 - ALC 5-8의 합성
PBS 중 브렌툭시맙 (5.7 mg/mL)의 용액의 pH를 500 mM Tris 및 25 mM EDTA 를 5% v/v로 부가하여 조정하였다 (pH 8.5). 실온에서 90분 동안 TCEP (10eq)를 부가하여 혼합물을 환원시켰다. 그 다음에, 상기 용액을 50 mM Tris (pH 8.0)를 사용하여 2.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. DMSO 중 접합 시약 (스캐폴드 E, F, G 및 H)의 10 mM 용액 5 eq를 부가하고, 추가 용매를 최종 농도 5% v/v로 부가하였다. 반응을 실온에서 24시간 동안 진행시켰다. 그 다음에 혼합물을 NAP 25 탈염 컬럼을 사용하여 PBS (pH 7.4)로 탈염시켜서 과량의 시약을 제거하고, RP-HPLC (PLRP) 및 HRMS로 재-브릿징을 확인하고 ALC 5, ALC 6, ALC 7 및 ALC 8을 각각 수득하였다.
ALC 5: HPLC 체류 시간 13.59분; HRMS 관찰된 Mw 149,727 Da (계산치 149,728 Da).
ALC 6: HPLC 체류 시간 13.60분; HRMS 관찰된 Mw 150,308 Da (계산치 150,308 Da).
ALC 7: HPLC 체류 시간 13.59분; HRMS 관찰된 Mw 150,017 Da (계산치 150,018 Da).
ALC 8: HPLC 체류 시간 13.58분; HRMS 관찰된 Mw 150,599 Da (계산치 150,599 Da).
실시예 46-49 - ADC 5-8의 합성
각 재-브릿징된 mAb 샘플 (ALC 5, ALC 6, ALC 7 및 ALC 8)을 10 eq의 DBCO-링커-워헤드 (DBCO-linker-warhead)를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 DBCO-VC-MMAE와 접합시키고, 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. RP-HPLC (PLRP) 및 HRMS로 접합을 확인하고 ADC 5-8을 각각 수득하였다.
ADC 5: HPLC 체류 시간 13.96분; HRMS 관찰된 Mw 151,170 Da (계산치 151,167 Da).
ADC 6: HPLC 체류 시간 13.96분; HRMS 관찰된 Mw 151,751 Da (계산치 151,747 Da).
ADC 7: HPLC 체류 시간 13.97분; HRMS 관찰된 Mw 151,459 Da (계산치 151,650 Da).
ADC 8: HPLC 체류 시간 13.98분; HRMS 관찰된 Mw 152,041 Da (계산치 152,038 Da).
실시예 50-53 - ADC 9-12의 합성
각 재-브릿징된 mAb 샘플 (ALC 5, ALC 6, ALC 7 및 ALC 8)을 10 eq의 DBCO-링커-워헤드를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 DBCO-PBD와 접합시키고, 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. RP-HPLC (PLRP) 및 HRMS로 접합을 확인하고 ADC 9-12를 각각 수득하였다.
ADC 9: HPLC 체류 시간 13.92분; HRMS 관찰된 Mw 151,368 Da (계산치 151,360 Da).
ADC 10: HPLC 체류 시간 13.92분; HRMS 관찰된 Mw 151,948 Da (계산치 151,942 Da).
ADC 11: HPLC 체류 시간 13.94분; HRMS 관찰된 Mw 151,658 Da (계산치 151,650 Da).
ADC 12: HPLC 체류 시간 13.93분; HRMS 관찰된 Mw 152,239 Da (계산치 152,232 Da).
실시예 54-57 - ALC 9-12의 합성
PBS 중 트라스투주맙 (25.6 mg/mL) 용액의 pH를 500 mM Tris 및 25 mM EDTA 를 5% v/v로 부가하여 조정하였다 (pH8.5). 실온에서 90분 동안 TCEP (6eq)를 부가하여 혼합물을 환원시켰다. 그 다음에, 상기 용액을 50 mM Tris (pH 8.0)를 사용하여 2.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. DMSO 중 접합 시약 (스캐폴드 E, F, G 및 H)의 10 mM 용액 5 eq를 부가하고, 추가 용매를 최종 농도 5% v/v로 부가하였다. 반응을 실온에서 24시간 동안 진행시켰다. 그 다음에 혼합물을 NAP 25 탈염 컬럼을 사용하여 PBS (pH 7.4)로 탈염시켜서 과량의 시약을 제거하고, RP-HPLC (PLRP) 및 HRMS로 재-브릿징을 확인하고 ALC 9, ALC 10, ALC 11 및 ALC 12를 각각 수득하였다.
ALC 9: HPLC 체류 시간 12.64분; HRMS 관찰된 Mw 149,866 Da (계산치 149,867 Da).
ALC 10: HPLC 체류 시간 12.63분; HRMS 관찰된 Mw 150,447 Da (계산치 150,447 Da).
ALC 11: HPLC 체류 시간 12.60분; HRMS 관찰된 Mw 150,157 Da (계산치 150,157 Da).
ALC 12: HPLC 체류 시간 12.62분; HRMS 관찰된 Mw 150,738 Da (계산치 150,738 Da).
실시예 58-61 - ADC 13-16의 합성
각 재-브릿징된 mAb 샘플 (ALC 9, ALC 10, ALC 11 및 ALC 12)을 10 eq의 DBCO-링커-워헤드를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 DBCO-VC-MMAE와 접합시키고, 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. SEC, HIC, PLRP 및 MS로 접합을 확인하고 ADC 13-16을 각각 수득하였다.
ADC 13: HPLC 체류 시간 13.15분; HRMS 관찰된 Mw 151,308 Da (계산치 151,306 Da).
ADC 14: HPLC 체류 시간 13.20분; HRMS 관찰된 Mw 151,888 Da (계산치 151,886 Da).
ADC 15: HPLC 체류 시간 13.20분; HRMS 관찰된 Mw 151,598 Da (계산치 151,596 Da).
ADC 16: HPLC 체류 시간 13.19분; HRMS 관찰된 Mw 152,179 Da (계산치 152,177 Da).
실시예 50-53 - ADC 17-20의 합성
각 재-브릿징된 mAb 샘플 (ALC 9, ALC 10, ALC 11 및 ALC 2)을 10 eq의 DBCO-링커-워헤드를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 DBCO-PBD와 접합시키고, 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. SEC, HIC, PLRP 및 MS로 접합을 확인하고 ADC 17-20을 각각 수득하였다.
ADC 17: HPLC 체류 시간 13.07분; HRMS 관찰된 Mw 151,506 Da (계산치 151,500 Da).
ADC 18: HPLC 체류 시간 13.08분; HRMS 관찰된 Mw 152,086 Da (계산치 152,080 Da).
ADC 19: HPLC 체류 시간 13.10분; HRMS 관찰된 Mw 151,796 Da (계산치 151,790 Da).
ADC 20: HPLC 체류 시간 13.10분; HRMS 관찰된 Mw 152,377 Da (계산치 152,371 Da).
DBCO-VC-MMAE:
DBCO-VC-MMAE는 Syntabio LLC로부터 구입하였다.
DBCO-PBD:
DBCO-PBD는 Levena biopharma로부터, catalogue code SET0317을 구입하였다.
실시예 42 내지 61 각각에 대해, 하기 역상-HPLC (PLRP) 조건을 사용하였다:
컬럼: Polymer Labs PLRP-S 2.1 mm x 50 mm, 5 μm, 1000 Å
이동상 A: 0.1% v/v TFA/물
이동상 B: 0.1% v/v TFA/아세토니트릴
컬럼 온도: 80℃
검출 파장: 214 nm
참조: 440 nm, 80 nm
피크 폭: ＞0.4분, 슬릿 8 nm
보고: 214 nm
스펙트럼 수집 200 내지 600 nm, 스텝 1.2nm
실시예 42 내지 61 각각에 대해, 하기 HRMS 조건을 사용하였다:
질량 분광분석계: SCIEX X500B Q-ToF
소프트웨어: SCIEX OS
UHPLC: ExionLC AD
LC 컬럼: bioZen™ 3.6 μm Intact XB-C8, 50 x 2.1 mm
각 항체에 대한 주요 글리코형 (glycoform)의 측정된 질량을 사용하여 이론 (계산된) 분자량을 계산하였다.
실시예 54 - 브렌툭시맙을 사용한 재-브릿징 및 접합 시험
5.7 mg/ml의 브렌툭시맙의 pH를 500 mM Tris, 25 mM EDTA pH 8.5를 5% v/v로 부가하여 조정한 다음에, 실온에서 90분 동안 10당량의 트리스(2-카복시에틸)포스핀 염산염 (TCEP)으로 환원시켰다. RP-HPLC 분석으로부터 완전한 환원이 달성된 것으로 나타났다. 환원된 브렌툭시맙을 50 mM Tris pH 8.0을 사용하여 2.5 mg/ml로 희석하고, DMSO 중 10 mM 스캐폴드 (각각 스캐폴드 E, F, G 및 H) 5당량 및 추가 용매를 전체 5% v/v까지 부가하여 재-브릿지하였다. 재-브릿징 반응을 실온에서 24시간 동안 진행하였다. 그 다음에 재-브릿징된 항체 샘플을 NAP 25 탈염 컬럼을 사용하여 PBS pH 7.4로 탈염하여 용매 및 잔류 스캐폴드를 제거하였다. UV 분석으로부터 모든 샘플들이 탈염 후에 대략 [P] = 2 mg/ml을 갖는 것으로 나타났다. 분석은 SEC, HIC, PLRP (intact) 및 MS (intact)를 사용하여 수행하였다. 각 재-브릿징된 항체 샘플을 분할하고, 10% v/v DMA 중 10 당량의 DBCO-화합물을 사용하여 DBCO-Sulfo-Gly3, DBCO-VC-MMAE 및 DBCO-PBD와 같은 클릭 화합물과 접합시켰다. 접합 반응을 실온에서 밤새 인큐베이션하고, SEC, HIC, PLRP (intact) 및 MS (intact) 분석을 반복하였다.
그 결과는 하기 표 1에 요약하였다.
하기 표에서:
- "L"은 항체 경쇄의 상대 양을 나타내고;
- "HHL"은 항체 중쇄-중쇄-경쇄의 상대 양을 나타내고;
- "intact"는 완전히 재-브릿징된 (온전한) 항체의 상대 양을 나타내고;
- "[P]"는 탈염 후 UV 분석에 의한 측정 시에 단백질 농도를 나타낸다.
실시예 55 - 트라스투주맙을 사용한 재-브릿징 및 접합 시험
25.6 mg/ml의 트라스투주맙의 pH를 500 mM Tris, 25 mM EDTA pH 8.5를 5% v/v로 부가하여 조정한 다음에, 실온에서 90분 동안 6당량의 TCEP로 환원시켰다. RP-HPLC 분석으로부터 완전한 환원이 달성된 것으로 나타났다. 그 다음에 환원된 트라스투주맙을 50 mM Tris pH 8.0을 사용하여 2.5 mg/ml로 희석한 다음에, DMSO 중 10 mM 스캐폴드 (각각 스캐폴드 E, F, G 및 H) 5당량 및 추가 용매를 전체 5% v/v까지 부가하여 재-브릿지하였다. 재-브릿징 반응을 실온에서 23시간 동안 진행하였다. 그 다음에 재-브릿징된 항체 샘플을 NAP 25 탈염 컬럼을 사용하여 PBS pH 7.4로 탈염하여 용매 및 잔류 스캐폴드를 제거하였다. UV 분석으로부터 모든 샘플들이 탈염 후에 [P] = 1.8 mg/ml을 갖는 것으로 나타났다. 분석은 SEC, HIC, PLRP (intact) 및 MS (intact)를 사용하여 수행하였다. 각 재-브릿징된 항체 샘플을 분할하고, 10% v/v DMA 중 10 당량의 DBCO-화합물을 사용하여 DBCO-Sulfo-Gly3 , DBCO-vcE 및 DBCO-PBD와 같은 클릭 화합물과 접합시켰다. 접합 반응을 실온에서 밤새 인큐베이션하고, SEC, HIC, PLRP (intact) 및 MS (intact) 분석을 반복하였다.
그 결과는 하기 표 2에 요약하였다.
본 발명의 특정 구체예는 참조 및 예시의 목적으로 서술되었고, 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 당업자에게 명백할 것이다.
번호가 매겨진 문단
하기 번호가 매겨진 문단들은 본 발명의 특정 양상들 및 구체예들을 서술한다:
(1) 항체, 링커 및 적어도 하나의 활성제를 포함하는 접합체로서,
i) 상기 링커는 적어도 하나의 활성제(들)를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며; 및
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성되는
것인 접합체.
(2) 번호가 매겨진 문단 (1)에 있어서, 상기 항체 상의 황 원자는 상기 항체의 시스테인 잔기 상에 존재하는 황 원자인 것인 접합체.
(3) 번호가 매겨진 문단 (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 항체 상의 황 원자와 반응하는 관능기는 마이클 수용체 (Michael Acceptors)인 것인 접합체.
(4) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 6 내지 8개 (바람직하게는 7 내지 8개)의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되어 상기 링커가 상기 항체에서 2 내지 4개 (바람직하게는 3 내지 4개)의 환원된 사슬간 디설파이드 결합을 재-브릿지하는 것인 접합체.
(5) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 상의 황 원자와 반응하는 관능기는 알켄, 알킨, 말레이미드, 할로-말레이미드, 설폰, 아릴렌-프로피올로니트릴, 피리다진디온 또는 β-불포화 케톤을 포함하는 기로부터 선택되는 것인 접합체.
(6) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 1 내지 4개 (바람직하게는 2 내지 4개 또는 3 내지 4개) 포함하는 것인 접합체:
여기서:
ZA는 기능성 연결 기이고;
Pep는 상기 모이어티가 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 위치를 나타내고;
는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
(7) 번호가 매겨진 문단 (6)에 있어서, 상기 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티는 독립적으로 하기 그룹들 중 하나로부터 선택되는 것인 접합체:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 1개 또는 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 1개 또는 2개는 CH이거나, 또는 A1, A2 및 A3 중 3개 모두는 N 또는 CH이고;
a 및 b는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
X는 N, NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R3은 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 부재하거나, 또는 O, NR4, C(=O), C(=O)NR4 또는 NR5C(=O)로부터 선택되고;
p 및 q는 독립적으로 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
Q는 CR6, N 또는 아릴이고;
R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Pep는 상기 모이어티가 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 위치를 나타내고;
는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
(8) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 재-브릿징 모이어티는 각각 하기에 나타낸 화학식 (IIIa)을 갖는 것인 접합체:
여기서 각 A1, A2, A3, X, Pep 및 는 번호가 매겨진 문단 (7)에 정의된 바와 같다.
(9) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것인 접합체.
(10) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 종양 관련 항원에 대한 것인 접합체.
(11) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성제는 라벨링 모이어티인 것인 접합체.
(12) 번호가 매겨진 문단 (11)에 있어서, 상기 라벨링 모이어티는 형광단, 비오틴 태그 또는 PET 추적자인 것인 접합체.
(13) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성제는 약물인 것인 접합체.
(14) 번호가 매겨진 문단 (13)에 있어서, 상기 약물은 세포독소인 것인 접합체.
(15) 번호가 매겨진 문단 (14)에 있어서, 상기 세포독소는 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 튜불리신, 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀, 캄프토테신 유사체 및 독소루비신을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 접합체.
(16) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합체는 1 내지 8개의 활성제를 포함하는 것인 접합체.
(17) 번호가 매겨진 문단 (6) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 상기 재-브릿징 모이어티들 중 적어도 2개는 10 내지 60개의 원자에 의해 분리되어 있는 것인 접합체.
(18) 번호가 매겨진 문단 (6) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 상기 재-브릿징 모이어티들 중 적어도 2개는 20 내지 40개의 원자에 의해 분리되어 있는 것인 접합체.
(19) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 알킬렌디아민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기, 아릴렌-함유 모이어티, 헤테로아릴렌-함유 모이어티, 헤테로사이클릴-함유 모이어티, 사이클로알킬-함유 모이어티 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 그룹들로부터 선택된 하나 이상의 그룹을 포함하는 것인 접합체.
(20) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 알킬렌디아민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 및 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 그룹을 포함하는 것인 접합체.
(21) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)를 갖는 것인 접합체:
여기서:
Z1은 상기 번호가 매겨진 문단 (7) 또는 (8)에 정의된 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (III)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
각 Q1은 독립적으로 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=O)NR7, C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고,
W1은 화학식 IVc 또는 화학식 IVe의 기이고:
여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 각 X1은 독립적으로 CH 또는 N으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C12 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C12 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
W1C는 화학식 WC1 또는 화학식 WC2로부터 선택되고:
여기서:
WQ1은 화학식 WC3의 기이고:
여기서:
QW1은 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
XW1은 O 또는 NH로부터 선택되고;
XW2는 수소, C1-C4 알킬, ORx1 및 NRx1Rx2로부터 선택되고, 여기서 Rx1 및 Rx2는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 XW1이 화학식 WQ2의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
는 WQ1이 화학식 R24의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
WQ2는 화학식 WC4의 기이고:
여기서:
QW1A는 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2A는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
XW3은 O 또는 NH로부터 선택되고;
는 XW4가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 XW4가 수소 또는 -C(=O)RX3 기 중 하나에 부착되는 위치를 나타내고, 여기서 Rx3은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 QW2A가 화학식 WQ1의 기에 XW1 기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내고;
XW4는 O 또는 NH로부터 선택되고;
LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
t는 1 내지 8로부터 선택된 정수이고;
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 상기 번호가 매겨진 문단 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 활성제이고;
W2는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6알킬렌으로부터 선택되고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
FG', L1 및 D는 상기 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
(22) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)를 갖는 것인 접합체:
여기서:
Z1은 상기 번호가 매겨진 문단 (7) 또는 (8)에 정의된 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (III)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
각 Q1은 독립적으로 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=O)NR7, C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
W1은 화학식 IVc1 또는 화학식 IVe1의 기이고:
여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미도, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 X1은 CH 또는 N으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 상기 번호가 매겨진 문단 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 활성제이고;
W2는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
FG', L1 및 D는 상기 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
(23) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)를 갖는 것인 접합체:
여기서:
Z1은 상기 번호가 매겨진 문단 (7) 또는 (8)에 정의된 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (III)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
각 Q1은 독립적으로 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
W1은 화학식 IVc1의 기이고:
여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
L1은 링커이고;
D는 상기 번호가 매겨진 문단 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 활성제이고;
W2는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6알킬렌으로부터 선택되고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
FG', L1 및 D는 상기 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
(24) 번호가 매겨진 문단 (21) 또는 (23)에 있어서, 상기 FG'는 결합, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되는 것인 접합체.
(25) 번호가 매겨진 문단 (21) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 상기 L1은 결합, C1-C10알킬렌, 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10알킬렌 및 화학식 Va1의 기로부터 선택되는 것인 접합체:
여기서:
Q4는 단일 결합 또는 이고, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 활성제에 부착하기 위한 기이다.
(26) 번호가 매겨진 문단 (21) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서,
Q1은 화학식 IVa의 기이고;
Q1A는 C(=O) 및 NR7C(=O)로부터 선택되고;
Q1B는 N 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R9 및 R10은 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌 으로부터 선택되고;
v는 1이고;
Q2는 N 또는 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Q3은 화학식 IVb의 기이고;
Q3A는 O이고;
Q3B는 결합이고;
Q3C는 NR13이고;
R13은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌 으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
W1A는 N이고;
LW는 C1-C4 알킬렌이고;
W1B는 -NR15C(=O)- 및 -C(=O)NR15로부터 선택된 기이고;
R15는 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
W2A는 N이고;
W2B는 N이고;
W2C는 -C(=O)NH-이고;
L2W는 C1-C4 알킬렌이고;
R25 및 R26은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
r은 0 내지 10으로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 5로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 10이 되도록 선택된다.
(27) 번호가 매겨진 문단 (21) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 Z1은 하기에 나타낸 화학식 (IIIa)의 재-브릿징 모이어티인 것인 접합체:
여기서 각 A1, A2, A3, X, Pep 및 는 상기 번호가 매겨진 문단 (7)에 정의된 바와 같다.
(28) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (27) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합체는 상기 페이지 49 내지 60 (바람직하게는 페이지 49 내지 54)에 열거된 접합체 화합물들 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 접합체.
(29) 하기에 나타낸 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물:
여기서:
FG는 다른 하나의 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 관능기이고;
n은 0 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
L은 링커이고;
Z는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이다.
(30) 번호가 매겨진 문단 (29)에 있어서, 상기 Z 기들 중 적어도 2개는 10 내지 60개의 원자에 의해 분리되어 있는 것인 화합물.
(31) 번호가 매겨진 문단 (29) 또는 (30)에 있어서, 상기 Z 기들 중 적어도 2개는 20 내지 40개의 원자에 의해 분리되어 있는 것인 화합물.
(32) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (31) 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 알킬렌디아민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 및 아미노산 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 것인 화합물.
(33) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (32) 중 어느 하나에 있어서, 상기 FG는 알켄, 알킨, 아지드, 하이드록실, 아민, 카복실산, 알데히드, 아실 할라이드, 테트라진, 알콕시아민 (예: 하이드록실아민), 하이드라진, 전자-풍부 친디엔체 (예: 1,3-니트론 알켄) 및 전자-부족 디엔 (예: 테트라진), 니트론, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트로부터 선택된 관능기인 것인 화합물.
(34) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (33) 중 어느 하나에 있어서, 상기 FG는 알킨, 아지드, 하이드록실, 아민, 카복실산, 알데히드 및 아실 할라이드로부터 선택된 관능기인 것인 화합물.
(35) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (34) 중 어느 하나에 있어서, 상기 FG는 아민, 카복실산, 아지드 및 알킨으로부터 선택된 관능기인 것인 화합물.
(36) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (35) 중 어느 하나에 있어서, 상기 Z는 마이클 수용체인 것인 화합물.
(37) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (36) 중 어느 하나에 있어서, 상기 Z는 알켄, 알킨, 말레이미드, 할로-말레이미드, 설폰, 아릴렌-프로피올로니트릴, 피리다진디온, 디브로모메틸렌-피리딘 또는 β-불포화 케톤을 포함하는 기로부터 선택되는 것인 화합물.
(38) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (37) 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ia)를 갖는 것인 화합물:
여기서:
Z2는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
L, FG 및 n은 상기 번호가 매겨진 문단 (29)에 정의된 바와 같다.
(39) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (38) 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 하기 그룹들 중 하나로부터 선택되는 것인 화합물:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 1개 또는 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 1개 또는 2개는 CH이거나, 또는 A1, A2 및 A3 중 3개 모두는 N이고;
X는 N, NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R3은 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 부재하거나, 또는 O, NR10, C(=O), C(=O)NR10 또는 NR11C(=O)로부터 선택되고;
Q는 CR12, N 또는 아릴이고;
p 및 q는 독립적으로 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
R10, R11 및 R12는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Ts는 토실레이트이고;
L 및 FG는 상기 번호가 매겨진 문단 (29)에 정의된 바와 같다.
(40) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (39) 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ib)를 갖는 것인 화합물:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 하나는 CH이고;
X는 N, O 및 S로부터 선택되고;
FG, L 및 n은 상기 번호가 매겨진 문단 (29)에 정의된 바와 같다.
(41) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (40) 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ic)를 갖는 것인 화합물:
여기서:
Z2는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
각 Q1은 독립적으로 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
W1은 화학식 IVc2, 화학식 IVe2 또는 화학식 IVc의 기이고:
여기서:
W1A 및 W1c는 독립적으로 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 X1은 CH 또는 N으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
W1C는 화학식 WC2의 기이고:
여기서:
WQ1은 화학식 WC3의 기이고:
여기서:
QW1은 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
XW1은 O 또는 NH로부터 선택되고;
XW2는 수소, C1-C4 알킬, ORx1 및 NRx1Rx2로부터 선택되고, 여기서 Rx1 및 Rx2는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 XW1이 화학식 WQ2의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
는 WQ1이 화학식 R24의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
WQ2는 화학식 WC4B의 기이고:
여기서:
QW1A는 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2A는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
XW3은 O 또는 NH로부터 선택되고;
는 XW4가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 XW4가 수소 또는 -C(=O)RX3 기 중 하나에 부착되는 위치를 나타내고, 여기서 Rx3은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 QW2A가 화학식 WQ1의 기에 XW1 기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내고;
XW4는 O 또는 NH로부터 선택되고;
LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
t는 1 내지 8로부터 선택된 정수이고;
FG는 상기 번호가 매겨진 문단 (29) 또는 (33) 내지 (35) 중 어느 하나에 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
(42) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (41) 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ic)를 갖는 것인 화합물:
여기서:
Z2는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
각 Q1은 독립적으로 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
W1'은 화학식 IVc1의 기이고:
여기서:
W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
FG는 상기 번호가 매겨진 문단 (29) 또는 (33) 내지 (35) 중 어느 하나에 정의된 바와 같고;
W2'는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고, 여기서 R17은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
FG는 상기 번호가 매겨진 문단 (30)에 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
(43) 번호가 매겨진 문단 (41) 또는 (42)에 있어서, 상기 Z2는 하기에 나타낸 화학식 III의 기인 것인 화합물:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 하나는 CH이고;
X는 N, NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
는 Q1에 대한 부착 지점을 나타낸다.
(44) 번호가 매겨진 문단 (29) 내지 (43) 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 상기 페이지 95 내지 103 (바람직하게는 페이지 95 내지 97)에 열거된 화합물들 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 화합물.
(45) 하기에 나타낸 화학식 (II)의 접합 시약, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물:
여기서:
FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
n은 0 내지 20으로부터의 정수이고;
L 및 L'은 독립적으로 링커이고;
Z는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이고;
D는 활성제이다.
(46) 번호가 매겨진 문단 (45)에 있어서, 상기 Z 기들 중 적어도 2개는 10 내지 60개의 원자에 의해 분리되어 있는 것인 접합 시약.
(47) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (46) 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 알킬렌디아민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 및 아미노산 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 것인 접합 시약.
(48) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (47) 중 어느 하나에 있어서, 상기 FG'는 및 -C(=O)NH-로부터 선택되는 것인 접합 시약.
(49) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (48) 중 어느 하나에 있어서, 상기 L1은 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌 및 화학식 Va의 기로부터 선택되는 것인 접합 시약:
여기서:
LQ는 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O 또는 NH를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
Q4는 단일 결합 또는 이며, 여기서 QX는 Q4가 아미노산 잔기, 디펩티드 잔기 또는 트리펩티드 잔기인 것이고;
LD는 활성제에 부착하기 위한 기이다.
(50) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (49) 중 어느 하나에 있어서, 상기 Z는 마이클 수용체인 것인 접합 시약.
(51) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (50) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIa)를 갖는 것인 접합 시약:
여기서:
Z2는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
L, L1, FG' 및 n은 상기 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (49) 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
(52) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (51) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합 시약은 하기 그룹들 중 하나로부터 선택되는 것인 접합 시약:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 1개 또는 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 1개 또는 2개는 CH이거나, 또는 A1, A2 및 A3 중 3개 모두는 N이고;
X는 N, NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R3은 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 부재하거나, 또는 O, NR10, C(=O), C(=O)NR10 또는 NR11C(=O)로부터 선택되고;
Q는 CR12, N 또는 아릴이고;
p 및 q는 독립적으로 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
R10, R11 및 R12는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
Ts는 토실레이트이고;
FG', L, L1, n 및 D는 상기 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (51) 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
(53) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (52) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIb)를 갖는 것인 접합 시약:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 하나는 CH이고;
X는 NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
FG', L, L1, n 및 D는 상기 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (51) 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
(54) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (53) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIc)를 갖는 것인 접합 시약:
여기서:
Z2는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
각 Q1은 독립적으로 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
W1은 화학식 IVc 또는 화학식 IVe의 기이고:
여기서:
W1A 및 W1c는 독립적으로 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 X1은 CH 또는 N으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
W1C는 화학식 WC1 또는 화학식 WC2로부터 선택되고:
여기서:
WQ1은 화학식 WC3의 기이고:
여기서:
QW1은 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
XW1은 O 또는 NH로부터 선택되고;
XW2는 수소, C1-C4 알킬, ORx1 및 NRx1Rx2로부터 선택되고, 여기서 Rx1 및 Rx2는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 XW1이 화학식 WQ2의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
는 WQ1이 화학식 R24의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
WQ2는 화학식 WC4의 기이고:
여기서:
QW1A는 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
QW2A는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
XW3은 O 또는 NH로부터 선택되고;
는 XW4가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
는 XW4가 수소 또는 -C(=O)RX3 기 중 하나에 부착되는 위치를 나타내고, 여기서 Rx3은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
는 QW2A가 화학식 WQ1의 기에 XW1 기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내고;
XW4는 O 또는 NH로부터 선택되고;
LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
t는 1 내지 4로부터 선택된 정수이고;
FG', L1 및 D는 상기 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (50) 중 어느 하나에 정의된 바와 같고;
W2'는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고, 여기서 R17은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25 및 R26은 독립적으로 결합, C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
FG', L1 및 D는 상기 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (50) 중 어느 하나에 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합 시약 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
(55) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (53) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIc)를 갖는 것인 접합 시약:
여기서:
Z2는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
각 Q1은 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:
여기서:
Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
각 Q2는 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
각 Q3은 화학식 IVb의 기이고:
여기서:
Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
W1'은 화학식 IVc1 또는 화학식 IVe1의 기이고:
여기서:
W1A 및 W1c는 독립적으로 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 X1은 CH 또는 N으로부터 선택되고;
W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고 (적합하게는 m은 1이고);
FG', L1 및 D는 상기 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (50) 중 어느 하나에 정의된 바와 같고;
W2'는 화학식 IVd의 기이고:
여기서:
W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고, 여기서 R17은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6알킬렌 및 백본에 하나 이상의 O 또는 N을 함유하는 C1-C6알킬렌으로부터 선택되고;
R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R25 및 R26은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
FG', L1 및 D는 상기 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (50) 중 어느 하나에 정의된 바와 같고;
r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
여기서 r 및 s는 접합 시약 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
(56) 번호가 매겨진 문단 (54) 또는 (55)에 있어서, 상기 Z2는 하기에 나타낸 화학식 III의 기인 것인 접합 시약:
여기서:
A1, A2 및 A3 중 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 하나는 CH이고;
X는 NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
는 Q1에 대한 부착 지점을 나타낸다.
(57) 번호가 매겨진 문단 (45) 내지 (56) 중 어느 하나에 있어서, 상기 접합 시약은 상기 페이지 74 내지 86 (바람직하게는 페이지 74 내지 79)에 열거된 접합 시약들 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 접합 시약.
(58) 항체, 링커, 및 또 다른 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 적어도 하나의 관능기를 포함하는 중간 접합체 (intermediate conjugate)로서:
i) 상기 링커는 적어도 하나의 관능기를 상기 항체에 연결하고;
ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며; 및
iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성되는
것인 중간 접합체.
(59) 번호가 매겨진 문단 (58)에 있어서, 상기 중간 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 1 내지 4개 (바람직하게는 2 내지 4개 또는 3 또는 4개) 포함하는 것인 중간 접합체:
여기서:
ZA는 상기 번호가 매겨진 문단 (6) 내지 (8) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 기능성 연결 기이고;
Pep는 상기 모이어티가 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 위치를 나타내고;
는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
(60) 번호가 매겨진 문단 (58) 또는 (59)에 있어서, 상기 중간 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (VI)의 화합물인 것인 중간 접합체:
여기서, Z1, Q1, Q2, Q3은 상기 번호가 매겨진 문단 (21) 내지 (23) 중 어느 하나에 정의된 바와 같고;
W1', W2', r 및 s는 상기 번호가 매겨진 문단 (41) 내지 (42) 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
(61) 번호가 매겨진 문단 (58) 내지 (60) 중 어느 하나에 있어서, 상기 중간 접합체는 상기 페이지 105 내지 1134 (바람직하게는 페이지 105 내지 107)에 열거된 중간 접합체들 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 중간 접합체.
(62) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (28) 중 어느 하나에 따른 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
(63) 번호가 매겨진 문단 (1) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 것인 접합체.
(64) 번호가 매겨진 문단 (63)에 있어서, 상기 증식성 질환은 암인 것인 접합체.

Claims (36)

  1. 항체, 링커 및 적어도 하나의 활성제를 포함하는 접합체 (conjugate)로서,
    i) 상기 링커는 적어도 하나의 활성제(들)를 상기 항체에 연결하고;
    ii) 상기 링커는 5 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되며;
    iii) 상기 링커 및 상기 항체 간의 각 공유 결합은 상기 항체 상의 황 원자 및 상기 링커 상의 관능기 간의 반응으로부터 형성되는
    것인 접합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 6 내지 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되어 상기 링커가 상기 항체에서 2 내지 4개의 환원된 사슬간 디설파이드 결합들을 재-브릿지 (re-bridges)하는 것인 접합체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 링커는 8개의 독립 공유 결합을 통해 상기 항체에 부착되어 상기 링커가 상기 항체에서 4개의 환원된 사슬간 디설파이드 결합들을 재-브릿지하는 것인 접합체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티 (re-bridging moieties)를 1 내지 4개 포함하는 것인 접합체:

    여기서:
    ZA는 기능성 연결 기이고;
    Pep는 상기 모이어티가 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 위치를 나타내고;
    는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 접합체는 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티를 3 내지 4개 포함하는 것인 접합체.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티는 독립적으로 하기 그룹들 중 하나로부터 선택되는 것인 접합체:


    여기서:
    A1, A2 및 A3 중 1개 또는 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 1개 또는 2개는 CH이거나, 또는 A1, A2 및 A3 중 3개 모두는 N 또는 CH이고;
    a 및 b는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
    X는 N, NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    R3은 수소 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    Y1 및 Y2는 독립적으로 부재하거나, 또는 O, NR4, C(=O), C(=O)NR4 또는 NR5C(=O)로부터 선택되고;
    p 및 q는 독립적으로 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
    Q는 CR6, N 또는 아릴이고;
    R4, R5 및 R6은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    Pep는 상기 모이어티가 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 위치를 나타내고;
    는 상기 모이어티가 링커에 부착되는 위치를 나타낸다.
  7. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재-브릿징 모이어티는 각각 하기에 나타낸 화학식 (IIIa)을 갖는 것인 접합체:

    여기서 각 A1, A2, A3, X, Pep 및 는 청구항 6에 정의된 바와 같다.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)를 갖는 것인 접합체:

    여기서:
    Z1은 청구항 6 또는 7에 정의된 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (III)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
    각 Q1은 독립적으로 결합 (bond) 또는 화학식 IVa의 기이고:

    여기서:
    Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
    Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
    R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
    v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
    각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
    각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:

    여기서:
    Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
    Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
    R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C10 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C10 알킬렌으로부터 선택되고;
    Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
    W1은 화학식 IVc 또는 화학식 IVe의 기이고:

    여기서:
    W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 X1은 CH 또는 N으로부터 선택되고;
    W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C12 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C12 알킬렌으로부터 선택되고;
    m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
    W1C는 화학식 WC1 또는 화학식 WC2로부터 선택되고:

    여기서:
    WQ1은 화학식 WC3의 기이고:

    여기서:
    QW1은 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
    QW2는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
    y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
    XW1은 O 또는 NH로부터 선택되고;
    XW2는 수소, C1-C4 알킬, ORx1 및 NRx1Rx2로부터 선택되고, 여기서 Rx1 및 Rx2는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    는 XW1이 화학식 WQ2의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
    는 WQ1이 화학식 R24의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
    WQ2는 화학식 WC4의 기이고:

    여기서:
    QW1A는 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
    QW2A는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
    LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
    XW3은 O 또는 NH로부터 선택되고;
    는 XW4가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
    는 XW4가 수소 또는 -C(=O)RX3 중 하나에 부착되는 위치를 나타내고, 여기서 Rx3은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    는 QW2A가 화학식 WQ1의 기에 XW1 기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내고;
    XW4는 O 또는 NH로부터 선택되고;
    LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
    t는 1 내지 8로부터 선택된 정수이고;
    FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
    L1은 링커이고;
    D는 활성제이고;
    W2는 화학식 IVd의 기이고:

    여기서:
    W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고;
    W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
    W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R25 및 R26은 독립적으로 결합, C1-C6 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    FG', L1 및 D는 상기 정의된 바와 같고;
    r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
    s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
    여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 하기에 나타낸 화학식 (IIIA)를 갖는 것인 접합체:

    여기서:
    Z1은 청구항 6 또는 7에 정의된 화학식 (III)의 재-브릿징 모이어티이고, 이는 화학식 (III)에 나타낸 위치에서 항체에 부착되고;
    각 Q1은 독립적으로 결합 또는 화학식 IVa의 기이고:

    여기서:
    Q1A는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR7C(=O), C(=NR8) 및 C(=S)로부터 선택되고;
    Q1B는 O, N, S 및 CR9CR10으로부터 선택되고;
    R7, R8, R9 및 R10은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R20 및 R21은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    v는 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
    각 Q2는 독립적으로 N 및 CR11로부터 선택되고, 여기서 R11은 수소 및 C1-C4알킬로부터 선택되고;
    각 Q3은 독립적으로 화학식 IVb의 기이고:

    여기서:
    Q3A는 NR12, O 및 S로부터 선택되고;
    Q3B 및 Q3C는 독립적으로 결합, O 및 NR13으로부터 선택되고;
    R12 및 R13은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R22 및 R23은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    Q3D는 부재하거나, 또는 C(=O), OC(=O), NR12C(=O) 및 C(=O)NR12로부터 선택되고;
    W1은 화학식 IVc1 또는 화학식 IVe1의 기이고:

    여기서:
    W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 X1은 CH 또는 N으로부터 선택되고;
    W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
    FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
    L1은 링커이고;
    D는 활성제이고;
    W2는 화학식 IVd의 기이고:

    여기서:
    W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고;
    W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
    W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R25 및 R26은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    FG', L1 및 D는 상기 정의된 바와 같고;
    r은 0 내지 12로부터 선택된 정수이고;
    s는 0 내지 6으로부터 선택된 정수이고;
    여기서 r 및 s는 접합체 1개당 활성제의 전체 수가 1 내지 12가 되도록 선택된다.
  10. 청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 Z1은 하기에 나타낸 화학식 (IIIa)의 재-브릿징 모이어티인 것인 접합체:

    여기서 각 A1, A2, A3, X, Pep 및 는 청구항 6에 정의된 바와 같다.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것인 접합체.
  12. 청구항 4 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재-브릿징 모이어티들 중 적어도 2개는 10 내지 60개의 원자에 의해 분리되어 있는 것인 접합체.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 하기 접합체들 중 하나로부터 선택되는 것인 접합체:






    여기서:
    는 항체가 부착되는 위치를 나타내고;
    상기 항체는 트라스투주맙 또는 브렌툭시맙, 적합하게는 트라스투주맙이다.
  14. 하기에 나타낸 화학식 (II)의 접합 시약 (conjugating reagent), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물:

    여기서:
    FG'는 기능성 연결 모이어티이고;
    n은 0 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
    L 및 L'은 독립적으로 링커이고;
    Z는 항체의 시스테인으로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이고;
    D는 활성제이다.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIa)을 갖는 것인 접합 시약:

    여기서:
    Z2는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
    L, L', FG' 및 n은 청구항 14에 정의된 바와 같다.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 접합 시약은 하기 그룹들 중 하나로부터 선택되는 것인 접합 시약:



    여기서:
    A1, A2, A3, X, R1, R2, R3, Y1, Y2, Q, p 및 1은 각각 청구항 6에 정의된 바와 같고;
    Ts는 토실레이트이고;
    FG', L, L1, n 및 D는 청구항 14에 정의된 바와 같다.
  17. 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합 시약은 하기에 나타낸 화학식 (IIc)를 갖는 것인 접합 시약:

    여기서:
    Z2는 항체의 시스테인으로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
    Q1, Q2, Q3, W1, W2', r 및 s는 청구항 8 또는 9에 정의된 바와 같다.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 Z2는 하기에 나타낸 화학식 III의 기인 것인 접합 시약:

    여기서:
    A1, A2 및 A3 중 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 하나는 CH이고;
    X는 NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
    는 Q1에 대한 부착 지점을 나타낸다.
  19. 청구항 14 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합 시약은 하기로부터 선택되는 것인 접합 시약:






    .
  20. 하기에 나타낸 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물:

    여기서:
    FG는 다른 하나의 모이어티와 반응하여 기능성 연결 모이어티를 형성할 수 있는 관능기이고;
    n은 0 내지 20으로부터 선택된 정수이고;
    L은 링커이고;
    Z는 항체의 시스테인 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 관능기이다.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ia)을 갖는 것인 화합물:

    여기서:
    Z2는 항체의 시스테인 또는 리신 모이어티로부터의 황 원자와 반응할 수 있는 2개의 관능기들을 포함하는 재-브릿징 연결 기이고;
    L, FG 및 n은 청구항 20에 정의된 바와 같다.
  22. 청구항 20 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 그룹들 중 하나로부터 선택되는 것인 화합물:


    여기서:
    A1, A2, A3, X, R1, R2, R3, Y1, Y2, Q, p 및 1은 각각 청구항 6에 정의된 바와 같고;
    Ts는 토실레이트이고;
    L 및 FG는 각각 청구항 20에서 정의된 바와 같다.
  23. 청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ic)를 갖는 것인 화합물:

    여기서:
    Z2는 청구항 18 또는 21에 정의된 바와 같거나, 또는 Z2는 청구항 6에 정의된 바와 같은 화학식 (III)의 기이고;
    Q1, Q2, Q3, r 및 s는 청구항 8 또는 9에 정의된 바와 같고;
    W1은 화학식 IVc2, 화학식 IVe2 또는 화학식 IVc의 기이고:


    여기서:
    W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    고리 A는 6원 아릴, 6원 헤테로아릴, 6원 헤테로사이클릴 또는 6원 사이클로알킬이고, 여기서 X1은 CH 또는 N으로부터 선택되고;
    W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
    W1C는 화학식 WC2의 기이고:

    여기서:
    WQ1은 화학식 WC3의 기이고:

    여기서:
    QW1은 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
    QW2는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
    y는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
    XW1은 O 또는 NH로부터 선택되고;
    XW2는 수소, C1-C4 알킬, ORx1 및 NRx1Rx2로부터 선택되고, 여기서 Rx1 및 Rx2는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    는 XW1이 화학식 WQ2의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
    는 WQ1이 화학식 R24의 기에 부착되는 위치를 나타내고;
    WQ2는 화학식 WC4B의 기이고:

    여기서:
    QW1A는 부재하거나, 또는 C1-C12알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C12알킬렌으로부터 선택되고;
    QW2A는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, 및 -C(=O)NH-로부터 선택되고;
    XW3은 O 또는 NH로부터 선택되고;
    는 XW4가 화학식 WQ2의 또 다른 기에 QW2A 치환기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내거나, 또는
    는 XW4가 수소 또는 -C(=O)RX3 기 중 하나에 부착되는 위치를 나타내고, 여기서 Rx3은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    는 QW2A가 화학식 WQ1의 기에 XW1 기를 경유하여 부착되는 위치를 나타내고;
    XW4는 O 또는 NH로부터 선택되고;
    LQ1은 C1-C20 알킬렌, 알킬렌디아민 모이어티, (폴리)에틸렌 글리콜 모이어티, 아미노산 잔기 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 링커이고;
    t는 1 내지 8로부터 선택된 정수이고;
    FG는 청구항 20에 정의된 바와 같고;
    W2'는 화학식 IVd의 기이고:

    여기서:
    W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고, 여기서 R17은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
    W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 아미노, O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    FG는 청구항 20에 정의된 바와 같다.
  24. 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기에 나타낸 화학식 (Ic)를 갖는 것인 화합물:

    여기서:
    Z2는 청구항 18 또는 21에 정의된 바와 같고;
    Q1, Q2, Q3, r 및 s는 청구항 8 또는 9에 정의된 바와 같고;
    W1'은 화학식 IVc2의 기이고:

    여기서:
    W1A는 N 및 CR14로부터 선택되고, 여기서 R14는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    LW는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    W1B는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR15C(=O)-, -C(=O)NR15-, -NR15C(=O)NR16-, -C(=NR15)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    R15 및 R16은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R23 및 R24는 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    m은 1 또는 2로부터 선택된 정수이고;
    FG는 청구항 20에 정의된 바와 같고;
    W2'는 화학식 IVd의 기이고:

    여기서:
    W2A는 N 및 CR17로부터 선택되고, 여기서 R17은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    W2B는 N, CR18, -C(=O)N- 및 -C(=O)CR18-로부터 선택된 기이고;
    W2C는 -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NR17C(=O)-, -C(=O)NR17-, -NR17C(=O)NR18-, -C(=NR17)- 및 -C(=S)-로부터 선택된 기이고;
    L2W는 부재하거나, 또는 C1-C6 알킬렌 및 백본에 O 또는 N을 함유하는 C1-C6 알킬렌으로부터 선택되고;
    R17 및 R18은 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
    R25, R26 및 R27은 독립적으로 결합, C1-C8 알킬렌 및 백본에 O를 함유하는 C1-C8 알킬렌으로부터 선택되고;
    FG는 청구항 20에 정의된 바와 같다.
  25. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 Z2는 하기에 나타낸 화학식 III의 기인 것인 화합물:

    여기서:
    A1, A2 및 A3 중 2개는 N이고, A1, A2 및 A3 중 다른 하나는 CH이고;
    X는 N, NRN, O 및 S로부터 선택되고, 여기서 RN은 H 또는 C1-2 알킬이고;
    는 Q1에 대한 부착 지점을 나타낸다.
  26. 청구항 20 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FG는 알켄, 알킨, 아지드, 하이드록실, 아민, 카복실산, 알데히드, 아실 할라이드, 테트라진, 알콕시아민 (예: 하이드록실아민), 하이드라진, 전자-풍부 친디엔체 (electron-rich　dienophile) (예: 1,3-니트론 알켄) 및 전자-부족 디엔 (electron-poor　diene) (예: 테트라진), 니트론, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트로부터 선택되는 것인 화합물.
  27. 청구항 20 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FG는 알킨 또는 아지드로부터 선택되는 것인 화합물.
  28. 청구항 20 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기로부터 선택되는 것인 화합물:



    .
  29. 청구항 20 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기로부터 선택되는 것인 화합물:



    .
  30. 청구항 8 내지 13 중 어느 한 항, 또는 청구항 15 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FG'는 , -NH(=O)C- 및 -C(=O)NH-로부터 선택되는 것인 접합체 또는 접합 시약.
  31. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항, 또는 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제는 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 튜불리신, 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀, 캄프토테신 유사체 및 독소루비신을 포함하는 그룹으로부터 선택적으로 선택된 세포독소 (cytotoxin)인 것인 접합체 또는 접합 시약.
  32. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항, 또는 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 1 내지 8개의 활성제를 포함하는 것인 접합체 또는 접합 시약.
  33. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항, 또는 청구항 13 내지 15 중 어느 한 항, 또는 청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 (L)는 알킬렌디아민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 및 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함하는 것인 접합체, 접합 시약 또는 화합물.
  34. 청구항 14 또는 청구항 20에 있어서, 상기 Z는 마이클 수용체 (Michael Acceptor)인 것인 접합 시약 또는 화합물.
  35. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  36. 청구항 1 내지 13 및 30 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 질환 (proliferative disease)의 치료에 사용하기 위한 접합체.
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