ES2913205T3 - Proteínas biológicas activas condicionalmente - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar una proteína biológica activa condicionalmente, el método comprende las etapas de: i. seleccionar una proteína biológica parental; ii.evolucionar el ADN que codifica la proteína biológica parental mediante el uso de una o más técnicas evolutivas para crear ADN mutantes; iii. expresar los ADN mutantes para obtener proteínas biológicas mutantes; iv. someter las proteínas biológicas mutantes y la proteína biológica parental a un ensayo bajo una primera condición fisiológica del líquido sinovial en una primera ubicación y a un ensayo bajo una segunda condición fisiológica seleccionada de las condiciones fisiológicas de una segunda ubicación en un cuerpo que es diferente de la primera ubicación; y v.seleccionar la proteína biológica activa condicionalmente de las proteínas biológicas mutantes que funcionan preferentemente en el líquido sinovial pero que no actúan o lo hacen en menor medida sobre otras partes del cuerpo y exhiben una actividad aumentada en el ensayo bajo la primera condición fisiológica en comparación con la misma actividad en el ensayo bajo la segunda condición fisiológica, en donde la primera condición fisiológica del líquido sinovial se selecciona de una baja concentración de glucosa, un pH diferente al pH del plasma sanguíneo y una baja concentración de proteínas.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas biológicas activas condicionalmente
Campo de la descripción
Esta descripción se relaciona con el campo de la evolución y actividad de proteínas. Específicamente, esta descripción se refiere a un método para generar proteínas biológicas activas condicionalmente a partir de proteínas de tipo salvaje, en particular proteínas terapéuticas, que se inactivan de manera reversible o irreversible en las condiciones fisiológicas normales de tipo salvaje, así como a tales proteínas biológicas activas condicionalmente y usos de tales proteínas biológicas activas condicionales.
Antecedentes de la descripción
Existe una cantidad considerable de literatura que describe el potencial de las proteínas evolutivas para una diversidad de características, especialmente enzimas, por ejemplo, para ser estabilizadas para operar en diferentes condiciones. Por ejemplo, han evolucionado enzimas para estabilizarse a temperaturas más altas, con actividad variable. En situaciones donde hay una mejora de la actividad a alta temperatura, una parte sustancial de la mejora se puede atribuir a la mayor actividad cinética comúnmente descrita por la regla Q10, donde se estima que en el caso de una enzima, el recambio se duplica por cada aumento de 10 grados Celsius. Además, existen ejemplos de mutaciones naturales que desestabilizan las proteínas en sus condiciones operativas normales, tales como la actividad de temperatura de tipo salvaje de la molécula. Para los mutantes de temperatura, estos mutantes pueden estar activos a la temperatura más baja, pero típicamente son activos a un nivel reducido en comparación con las moléculas de tipo salvaje (también típicamente descrito por una reducción en la actividad guiada por las reglas Q10 o similares).
Es deseable generar moléculas útiles que estén activadas condicionalmente, por ejemplo, virtualmente inactivas en condiciones de tipo salvaje pero que sean activas en condiciones distintas a las de tipo salvaje a un nivel que sea igual o mejor que en condiciones de tipo salvaje, o que estén activadas o inactivados en determinados microambientes, o que se activan o inactivan con el tiempo. Además de la temperatura, otras condiciones para las que pueden evolucionar u optimizar las proteínas incluyen al menos el pH, la presión osmótica, la osmolalidad, la oxidación y la concentración de electrolitos. Otras propiedades deseables que pueden optimizarse durante la evolución incluyen la resistencia química y la resistencia proteolítica.
Se han publicado muchas estrategias para la evolución o modificación de moléculas. El documento US 2010/0189651 describe un anticuerpo modificado que contiene un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo unido a un resto de enmascaramiento. Tal anticuerpo modificado puede acoplarse además a un resto escindible, lo que da como resultado un anticuerpo que puede activarse condicionalmente. El resto escindible es capaz de escindirse, reducirse o fotolizarse. El anticuerpo puede exhibir una conformación tal que el anticuerpo sea más accesible a una diana después de la eliminación del resto de enmascaramiento por escisión, reducción o fotólisis del resto escindible.
El documento US 2013/0101555 describe composiciones de proproteínas activables modificadas. Una proproteína activable contiene una proteína funcional acoplada a una máscara peptídica y acoplada además a un enlazador activable. En un estado no activado, la máscara peptídica inhibe la unión de la proteína funcional a su diana o pareja de unión. En un estado activado, la máscara peptídica no inhibe la unión de la proteína funcional a su diana o pareja de unión. Las proproteínas pueden proporcionar toxicidad reducida y efectos secundarios adversos que de otro modo podrían resultar de la unión de una proteína funcional en sitios sin tratamiento si no se inhibiera la unión a su pareja de unión en tales sitios sin tratamiento. Las proproteínas que contienen la máscara peptídica también pueden tener una vida media in vivo o en suero más larga que la proteína funcional correspondiente que no contiene la máscara peptídica.
El documento US 2011/0229489 describe anticuerpos con unión a antígenos dependiente del pH, de modo que la afinidad por la unión al antígeno a pH fisiológico (es decir, pH 7,4) es mayor que a pH endosomal (es decir, pH 6,0 o 5,5). Tales anticuerpos dependientes del pH se disocian preferentemente del antígeno en el endosoma. Esto puede aumentar la vida media del anticuerpo, en comparación con los anticuerpos con Kds equivalente a pH 7,4 pero sin unión dependiente del pH, cuando el antígeno es uno que se somete a eliminación mediada por antígenos (por ejemplo, PCSK9). Los anticuerpos con unión dependiente del pH pueden disminuir la vida media total del antígeno cuando el antígeno se somete a una eliminación reducida después de unirse a un anticuerpo.
El documento US 2013/0266579 describe un anticuerpo anti-EGFR activo condicionalmente. El anticuerpo anti-EGFR exhibe una relación de actividad de unión al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) para condiciones en un ambiente tumoral a condiciones en un ambiente no tumoral de al menos 3,0. Las condiciones en un ambiente tumoral comprenden uno o ambos de un pH de 5,6 a 6,8 o una concentración de lactato de 5 mM a 20 mM, y una concentración de proteína de 10 mg/mL a 50 mg/mL. Las condiciones en un ambiente no tumoral comprenden uno o ambos de un pH de 7,0 a 7,8 o una concentración de lactato de 0,5 mM a 5 mM y una concentración de proteína de 10 mg/mL a 50 mg/mL. Se dice que el anticuerpo anti-EGFR es activo condicionalmente en condiciones que pueden encontrarse en un microambiente tumoral.
Pardoll et al, "The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy", Nature Review Cancer, vol. 12, páginas 252-264, 2012 describe una terapia contra el cáncer que implica activar la inmunidad antitumoral del huésped mediante el bloqueo de los puntos de control del sistema inmunitario del huésped. Tal bloqueo se puede lograr mediante la inhibición de las proteínas de puntos de control inmunitario, tales como los receptores en las células T, que incluyen el antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA4) y la proteína de muerte 1 (PD1). Se han desarrollado anticuerpos contra estas proteínas de puntos de control inmunitario para la terapia contra el cáncer.
La modificación o la evolución de una proteína para que sea inactiva o virtualmente inactiva (menos del 10 % de actividad y especialmente del 1 % de actividad) en su condición de funcionamiento de tipo salvaje, mientras mantiene una actividad equivalente o mejor que su condición de tipo salvaje en nuevas condiciones, requiere que la(s) mutación(es) desestabilizadora(s) coexistan con mutaciones que aumentan la actividad y que no contrarrestan el efecto desestabilizador. Se espera que la desestabilización reduzca la actividad de la proteína más que los efectos predichos por las reglas estándar tales como Q10, por lo tanto, la capacidad de evolucionar proteínas que funcionan de manera eficiente a temperaturas más bajas, por ejemplo, mientras se inactivan en su condición de funcionamiento normal, crea una inesperada nueva clase de proteínas activas condicionalmente.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones por autor y fecha.
Resumen de la descripción
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una proteína biológica activa condicionalmente, el método comprende las etapas de: i. seleccionar una proteína biológica parental; ii. evolucionar el ADN que codifica la proteína biológica parental mediante el uso de una o más técnicas evolutivas para crear ADN mutantes; iii. expresar los ADN mutantes para obtener proteínas biológicas mutantes; iv. someter las proteínas biológicas mutantes y la proteína biológica parental a un ensayo bajo una primera condición fisiológica del líquido sinovial en una primera ubicación, y a un ensayo bajo una segunda condición fisiológica seleccionada de las condiciones fisiológicas de una segunda ubicación en un cuerpo que es diferente de la primera ubicación; y v. seleccionar la proteína biológica activa condicionalmente de las proteínas biológicas mutantes que funcionan preferentemente en el líquido sinovial pero que no actúan o lo hacen en menor medida sobre otras partes del cuerpo y exhiben una actividad aumentada en el ensayo bajo la primera condición fisiológica en comparación con la misma actividad en el ensayo bajo la segunda condición fisiológica, en donde la primera condición fisiológica del líquido sinovial se selecciona de una baja concentración de glucosa, un pH diferente al pH del plasma sanguíneo y una baja concentración de proteínas.
En otro aspecto más, el método de la presente invención comprende además la etapa de conjugar la proteína biológica activa condicionalmente con una citocina, una interleucina, una enzima, una hormona, un factor de crecimiento, un agente citotóxico, un fármaco quimioterapéutico, una partícula radioactiva o un agente de diagnóstico.
En otro aspecto más, el método de la presente invención comprende además la etapa de introducir al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc de un anticuerpo activo condicionalmente.
En otro aspecto más, el método de la presente invención comprende además la etapa de modificar el anticuerpo activo condicionalmente para que sea multiespecífico.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una proteína biológica activa condicionalmente. En otro aspecto más, la proteína biológica activa condicionalmente es un anticuerpo activo condicionalmente.
Definiciones
Para facilitar la comprensión de los ejemplos proporcionados en la presente descripción, se definirán en la presente descripción determinados métodos y/o términos que aparecen con frecuencia.
Como se usa en la presente descripción en relación con una cantidad medida, el término "aproximadamente" se refiere a la variación normal en esa cantidad medida que esperaría el experto en la técnica que realiza la medición y ejerce un nivel de atención acorde con el objetivo de la medición y la precisión del equipo de medición usado. A menos que se indique lo contrario, "aproximadamente" se refiere a una variación de /- 10 % del valor proporcionado.
El término "agente" se usa en la presente descripción para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, un arreglo de compuestos localizados espacialmente (por ejemplo, un arreglo de péptidos VLSIPS, un arreglo de polinucleótidos y/o un arreglo de moléculas pequeñas combinatorias), una macromolécula biológica, una biblioteca de presentación de péptidos de bacteriófagos, una biblioteca de presentación de anticuerpos de bacteriófagos (por ejemplo, scFv), una biblioteca de presentación de péptidos en polisomas o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos animales (mamíferos en particular). Se evalúa la actividad enzimática potencial de los agentes mediante su inclusión en los ensayos de cribado que se describen a continuación en la presente descripción. Se evalúa la actividad potencial de los agentes como enzimas terapéuticas biológicas activas condicionalmente mediante su inclusión en los ensayos de cribado descritos a continuación en la presente descripción.
El término "aminoácido" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier compuesto orgánico que contiene un grupo amino (--NH2) y un grupo carboxilo (-COOH); preferentemente como grupos libres o alternativamente después de la condensación como parte de enlaces peptídicos. Los "veinte alfa-aminoácidos formadores de polipéptidos codificados naturalmente" se comprenden en la técnica y se refieren a: alanina (ala o A), arginina (arg o R), asparagina (asn o N), ácido aspártico (asp o D), cisteína (cys o C), ácido glutámico (glu o E), glutamina (gln o Q), glicina (gly o G), histidina (his o H), isoleucina (ile o I), leucina (leu o L), lisina (lys o K), metionina (met o M), fenilalanina (phe o F), prolina (pro o P), serina (ser o S), treonina (thr o T), triptófano (trp o W), tirosina (tyr o Y) y valina (val o V).
El término "amplificación", como se usa en la presente descripción, significa que se aumenta el número de copias de un polinucleótido.
El término "anticuerpo", como se usa en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulina intactas, así como a fragmentos de moléculas de inmunoglobulina, tales como fragmentos Fab, Fab', (Fab')2, Fv y SCA, que pueden unirse a un epítopo de un antígeno. Estos fragmentos de anticuerpos, que retienen cierta capacidad de unirse selectivamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno polipeptídico) del anticuerpo del que se derivan, pueden prepararse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, supra) y se describen con más detalle, como sigue. Los anticuerpos pueden usarse para aislar cantidades preparativas del antígeno por cromatografía de inmunoafinidad. Otros usos diversos de tales anticuerpos son para diagnosticar y/o estadificar enfermedades (por ejemplo, neoplasia) y para aplicación terapéutica en el tratamiento de enfermedades, tales como, por ejemplo: neoplasia, enfermedad autoinmunitaria, SIDA, enfermedad cardiovascular, infecciones y similares. Los anticuerpos quiméricos, similares a los humanos, humanizados o completamente humanos son particularmente útiles para la administración a pacientes humanos.
Un fragmento Fab consiste en un fragmento monovalente de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo y puede producirse por digestión de una molécula de anticuerpo completa con la enzima papaína, para producir un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una parte de una cadena pesada.
Un fragmento Fab' de una molécula de anticuerpo puede obtenerse mediante el tratamiento de una molécula de anticuerpo completa con pepsina, seguido de reducción, para producir una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una parte de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo tratada de esta manera.
Un fragmento (Fab')2 de un anticuerpo puede obtenerse mediante el tratamiento de una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento (Fab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab', unidos por dos enlaces disulfuro.
Un fragmento Fv se define como un fragmento modificado genéticamente que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada expresadas como dos cadenas.
El término "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la inmunoglobulina secretada se une a los receptores Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) que permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de antígeno y, posteriormente, destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos IgG de alta afinidad específicos de ligando dirigidos a la superficie de las células diana estimulan las células citotóxicas a través de la afinidad con el dominio ADCC en la IgG para atacar la célula unida al anticuerpo IgG a través de la región Fab. La lisis de la célula diana es extracelular, lo que requiere un contacto directo de célula a célula y no implica complemento.
Puede ensayarse la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar la lisis de la célula diana por ADCC. Para evaluar la actividad de ADCC, se mezcla un anticuerpo de interés con las células diana que muestran el ligando diana en combinación con células efectoras inmunitarias, que pueden ser activadas por los complejos antígeno-anticuerpo que dan como resultado la citólisis de la célula diana. La citólisis a menudo se detecta mediante la liberación de un marcador (por ejemplo, sustratos radioactivos, tintes fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Los ejemplos específicos de ensayos de ADCC in vitro se describen en Bruggemann y otros, 1987, J. Exp. Med., vol. 166, página 1351 ; Wilkinson y otros, 2001, J. Immunol. Methods, vol. 258, página 183; Patel y otros, 1995 J. Immunol. Methods, vol. 184, página 29).
Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC del anticuerpo de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes y otros, 1998, PNAS USA, vol. 95, página 652,.
El término "fagocitosis celular dependiente de anticuerpos" o "ADCP" se refiere a un proceso mediante el cual las células recubiertas de anticuerpos son internalizadas, ya sea en su totalidad o en parte, por células inmunitarias fagocíticas (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas) que se unen a una región Fc de inmunoglobulina.
El término "barrera hematoencefálica" o "BBB" se refiere a la barrera fisiológica entre la circulación periférica y el cerebro y la médula espinal que está formada por uniones estrechas dentro de las membranas plasmáticas endoteliales de los capilares cerebrales, que crea una barrera estrecha que restringe el transporte de moléculas en el cerebro, incluso moléculas muy pequeñas tales como la urea (60 Dalton). La barrera hematoencefálica dentro del cerebro, la barrera hemato-médula espinal dentro de la médula espinal y la barrera hematorretiniana dentro de la retina son barreras capilares contiguas dentro del sistema nervioso central (SNC), y en la presente descripción se denominan colectivamente como la "barrera hematoencefálica" o "BBB". La BBB también abarca la barrera del líquido cefalorraquídeo hematoencefálico (plexo coroideo), donde la barrera está compuesta por células ependimales en lugar de células endoteliales capilares.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Un "tumor" comprende una o más células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer epitelial de células escamosas), cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas ("NSCLC"), adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
Una "ventana de comparación", como se usa en la presente descripción, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en donde una secuencia polinucleotídica puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en donde la parte de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, interrupciones) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende las adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith (Smith y Waterman, 1981 "Comparison of biosequences", Adv Appl Math, 2:482-489; Smith y Waterman, 1981, "Overlapping genes and information theory", J Theor Biol, 91: 379-380; Smith y Waterman, J Mol Biol, "Identification of common molecular subsequences", 1981, 147:195-197; Smith y otros, 1981, "Comparative biosequence metrics", J Mol Evol, 18:38-46), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman (Needleman y Wunsch, 1970, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins" J Mol Biol, 48(3):443-453), por el método de búsqueda de similitud de Pearson (Pearson y Lipman, 1988, "Improved tools for biological sequence comparison", Proc Nat Acad Sci USA, 85:2444-2448), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Software de Genética de Wisconsin Liberación del paquete 7.0, Grupo Computacional de Genética, 575 Dr. en Ciencias, Madison, Wis.), o mediante inspección y el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por los diversos métodos que son seleccionados.
El término "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)" se refiere a un proceso iniciado por la unión del factor del complemento C1q a la parte Fc de la mayoría de las subclases de anticuerpos IgG. La unión de C1q a un anticuerpo es causada por interacciones proteína-proteína definidas en el llamado sitio de unión. Tales sitios de unión de la parte Fc son conocidos en el estado de la técnica (ver anteriormente). Tales sitios de unión a la parte Fc se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, l235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Los anticuerpos de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 usualmente muestran activación del complemento, que incluye la unión a C1q y C3, mientras que la IgG4 no activa el sistema del complemento y no se une a Clq y/o C3. Clq es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. Clq junto con dos proteasas de tipo serino, Clr y Cls, forma el complejo CI, el primer componente de la vía de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
El término "proteína biológica activa condicionalmente" se refiere a una variante, o mutante, de una proteína de tipo salvaje o parental que es más o menos activa que la proteína parental o de tipo salvaje en una o más condiciones fisiológicas normales. Esta proteína activa condicionalmente también exhibe actividad en regiones seleccionadas del cuerpo y/o exhibe actividad aumentada o disminuida bajo condiciones fisiológicas aberrantes o permisivas. Las condiciones fisiológicas normales son aquellas de temperatura, pH, presión osmótica, osmolalidad, oxidación y concentración de electrolitos que se considerarían dentro de un intervalo normal en el sitio de administración, o en el tejido u órgano en el sitio de acción, a un sujeto. Una condición aberrante es aquella que se desvía del intervalo normalmente aceptable para esa condición. En un aspecto, la proteína biológica activa condicionalmente es virtualmente inactiva en condiciones de tipo salvaje pero es activa en condiciones distintas de las de tipo salvaje a un nivel que es igual o mejor que en condiciones de tipo salvaje. Por ejemplo, en un aspecto, una proteína biológica activa condicionalmente evolucionada es virtualmente inactiva a la temperatura corporal, pero es activa a temperaturas más bajas. En otro aspecto, la proteína biológica activa condicionalmente se inactiva de forma reversible o irreversible en las condiciones de tipo salvaje. En otro aspecto, la proteína de tipo salvaje es una proteína terapéutica. En otro aspecto, la proteína biológica activa condicionalmente se usa como un fármaco o agente terapéutico. En otro aspecto más, la proteína es más o menos activa en sangre altamente oxigenada, tal como, por ejemplo, después de pasar por el pulmón o en los ambientes de pH más bajos que se encuentran en el riñón.
El término "anticuerpo activo condicionalmente" se refiere a una variante o mutante de un anticuerpo de tipo salvaje o progenitor que es más o menos activo en comparación con el anticuerpo progenitor o de tipo salvaje en una o más condiciones fisiológicas normales. Este anticuerpo activo condicionalmente también exhibe actividad en regiones seleccionadas del cuerpo y/o exhibe actividad aumentada o disminuida bajo condiciones fisiológicas aberrantes o permisivas. En un aspecto, el anticuerpo activo condicionalmente es virtualmente inactivo bajo condiciones fisiológicas normales pero es activo bajo condiciones fisiológicas no normales a un nivel que es igual o mejor que bajo condiciones fisiológicas normales. Por ejemplo, un anticuerpo activo condicionalmente evolucionado es virtualmente inactivo a la temperatura corporal normal, pero es activo a temperaturas corporales más bajas. En otro aspecto, el anticuerpo activo condicionalmente se inactiva de forma reversible o irreversible en condiciones fisiológicas normales. En otro aspecto, el anticuerpo de tipo salvaje es un anticuerpo terapéutico. En otro aspecto, el anticuerpo activo condicionalmente se usa como un fármaco o agente terapéutico. En otro aspecto más, el anticuerpo es más o menos activo en sangre altamente oxigenada, por ejemplo, después de pasar por el pulmón o en los ambientes de pH más bajos que se encuentran en el riñón.
Las "sustituciones conservativas de aminoácidos" se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas hidroxiladas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.
El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas de crecimiento tales como hormonas de crecimiento humanas, hormonas de crecimiento humanas N-metionilo y hormonas de crecimiento bovinas; hormonas paratiroideas; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteína tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral-a y -p; sustancia inhibidora de Müller; péptido asociado a gonadotrofina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-p; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-a y TGF-p; factor de crecimiento tipo insulina-I y -II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferóna, -p e -y; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitosmacrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos ( G - C s F ) ; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-p; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Como se usa en la presente descripción, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes activos biológicamente de las citocinas de secuencia nativa.
El término "agente citotóxico", como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o causa la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas. La "digestión" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solo en determinadas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas en la presente descripción están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron como conoce el experto. Para propósitos analíticos, típicamente se usa 1 microgramo de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 microlitros de solución tampón. Con el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción de plásmidos, típicamente se digieren de 5 a 50 microgramos de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. El fabricante especifica los tampones y cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción particulares. Los tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37 grados C se usan comúnmente, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en un gel para aislar el fragmento deseado.
El término "transposición de ADN" se usa en la presente descripción para indicar la recombinación entre secuencias sustancialmente homólogas pero no idénticas, en algunas modalidades la transposición de ADN puede implicar un intercambio mediante recombinación no homóloga, tal como mediante sistemas cer/lox y/o flp/frt y similares. La transposición de ADN puede ser aleatoria o no aleatoria.
El término "fármaco" o "molécula de fármaco" se refiere a un agente terapéutico que incluye una sustancia que tiene un efecto beneficioso sobre un cuerpo humano o animal cuando se administra al cuerpo humano o animal. Preferentemente, el agente terapéutico incluye una sustancia que puede tratar, curar o aliviar uno o más síntomas, enfermedades o condiciones anormales en un cuerpo humano o animal o potenciar el bienestar de un cuerpo humano o animal.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad de una proteína o fragmento biológico activo condicionalmente que es eficaz para tratar o prevenir una afección en un organismo vivo al que se administra durante un período de tiempo, por ejemplo, proporciona un efecto terapéutico durante un intervalo de dosificación deseado.
Como se usa en la presente descripción, el término "electrolito" se usa para definir un mineral en la sangre u otros fluidos corporales que lleva una carga. Por ejemplo, en un aspecto, la condición fisiológica normal y la condición aberrante pueden ser condiciones de "concentración de electrolitos". En un aspecto, la concentración de electrolitos a ensayar se selecciona de una o más concentraciones de calcio, sodio, potasio, magnesio, cloruro, bicarbonato y fosfato ionizados. Por ejemplo, en un aspecto, el intervalo normal de calcio sérico es de 8,5 a 10,2 mg/dL. En este aspecto, la concentración aberrante de calcio sérico puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal, en otro ejemplo, en un aspecto, el intervalo normal de cloruro sérico es 96-106 miliequivalentes por litro (mEq/L). En este aspecto, la concentración aberrante de cloruro sérico puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal; en otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de magnesio sérico es de 1,7-2,2 mg/dL. En este aspecto, una concentración aberrante de magnesio sérico puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal; en otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de fósforo sérico es de 2,4 a 4,1 mg/dL. En este aspecto, la concentración aberrante de fósforo sérico puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal. En otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de sodio sérico o en sangre es de 135 a 145 mEq/L. En este aspecto, la concentración aberrante de sodio sérico o en sangre puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal. En otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de potasio sérico o en sangre es de 3,7 a 5,2 mEq/L. En este aspecto, la concentración aberrante de potasio sérico o en sangre puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal. En otro aspecto, un intervalo normal de bicarbonato sérico es de 20 a 29 mEq/L. En este aspecto, la concentración aberrante de bicarbonato sérico o en sangre puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal. En un aspecto diferente, los niveles de bicarbonato se pueden usar para indicar niveles normales de acidez (pH) en la sangre. El término "concentración de electrolitos" también se puede usar para definir la condición de un electrolito particular en un tejido o fluido corporal que no sea sangre o plasma. En este caso, se considera que la condición fisiológica normal es el intervalo clínicamente normal para ese tejido o fluido. En este aspecto, la concentración aberrante de electrolitos en tejidos o fluidos puede seleccionarse por encima o por debajo del intervalo normal.
Como se usa en esta descripción, el término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en un antígeno, tal como un polipéptido de enzima, al que se une el parátopo de un anticuerpo, tal como un anticuerpo específico de enzima. Los determinantes antigénicos usualmente consisten en grupos de moléculas de superficie activas químicamente, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Como se usa en la presente descripción, "epítopo" se refiere a la parte de un antígeno u otra macromolécula capaz de formar una interacción de unión que interactúa con el cuerpo de unión de la región variable de un anticuerpo. Típicamente, tal interacción de unión se manifiesta como un contacto intermolecular con uno o más residuos de aminoácidos de una CDR.
Como se usa en la presente descripción, una "enzima" es una proteína con propiedades catalíticas específicas. Los factores tales como, por ejemplo, la concentración de sustrato, el pH, la temperatura y la presencia o ausencia de inhibidores pueden afectar la velocidad de catálisis. Típicamente, para una enzima de tipo salvaje, Q10 (el coeficiente de temperatura) describe el aumento en la velocidad de reacción con un aumento en la temperatura de 10 grados C. Para enzimas de tipo salvaje, el Q10 = 2 a 3; en otras palabras, la velocidad de reacción se duplica o triplica con cada aumento en la temperatura de 10 grados. A altas temperaturas, las proteínas se desnaturalizan. A valores de pH ligeramente diferentes del valor óptimo de una enzima, se producen pequeños cambios en las cargas de la enzima y quizás en la molécula del sustrato. El cambio en la ionización puede afectar la unión de la molécula de sustrato. A niveles de pH extremos, la enzima producirá desnaturalización, donde el sitio activo se distorsionará y la molécula de sustrato ya no encajará.
Como se usa en la presente descripción, el término "evolución", o "en evolución", se refiere al uso de uno o más métodos de mutagénesis para generar un nuevo polinucleótido que codifica un nuevo polipéptido, cuyo nuevo polipéptido es en sí mismo una molécula biológica mejorada y/o contribuye a la generación de otra molécula biológica mejorada. En un aspecto particular no limitativo, la presente descripción se refiere a la evolución de proteínas biológicas activas condicionalmente a partir de una proteína parental de tipo salvaje. En un aspecto, por ejemplo, la evolución se relaciona con un método para realizar tanto la quimerización de polinucleótidos no estocástica como la mutagénesis puntual no estocástica dirigida al sitio descrita en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2009/0130718. Más particularmente, la presente descripción proporciona métodos para la evolución de enzimas biológicas activas condicionalmente que exhiben una actividad reducida en condiciones fisiológicas normales en comparación con una molécula parental de enzima de tipo salvaje, pero una actividad potenciada en una o más condiciones aberrantes en comparación con la enzima de tipo salvaje.
Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a un polipéptido de referencia comprenden un polipéptido que retiene al menos una función o actividad biológica que es al menos esencialmente igual a la del polipéptido de referencia. Además, los términos "fragmento", "derivado" o "análogo" se ejemplifican mediante una molécula "proforma", tal como una proproteína de baja actividad que puede modificarse por escisión para producir una enzima madura con una actividad significativamente mayor.
El término "anticuerpo de longitud completa" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de unión al antígeno (VH o VL), así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos.
En dependencia de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos de longitud completa pueden asignarse a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos de longitud completa: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. En la presente descripción se proporciona un método para producir a partir de un polipéptido molde un conjunto de polipéptidos descendientes en el que se representa un "intervalo completo de sustituciones de un solo aminoácido" en cada posición de aminoácido. Como se usa en la presente descripción, "intervalo completo de sustituciones de un solo aminoácido" se refiere a los 20 alfa-aminoácidos formadores de polipéptidos codificados naturalmente, como se describe en la presente descripción.
El término "gen" se refiere al segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones anteriores y posteriores a la región codificante (líder y remolque), así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
"Inestabilidad genética", como se usa en la presente descripción, se refiere a la tendencia natural de las secuencias altamente repetitivas a perderse a través de un proceso de eventos reductivos que generalmente implican la simplificación de secuencias a través de la pérdida de secuencias repetidas. Las eliminaciones tienden a implicar la pérdida de una copia de una repetición y todo lo que hay entre las repeticiones.
El término "factor de crecimiento" se refiere a proteínas que promueven el crecimiento e incluyen, por ejemplo, factores de crecimiento hepáticos; factores de crecimiento de fibroblastos; factores de crecimiento del endotelio vascular; factores de crecimiento nervioso tales como NGF-p; factores de crecimiento derivados de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-a y TGF-p; factor de crecimiento tipo insulina-I y -II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-a, -p e -y, y factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF). Como se usa en la presente descripción, el término factor de crecimiento incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes activos biológicamente del factor de crecimiento de secuencia nativa, que incluyen entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y derivados y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
El término "heterólogo" significa que una secuencia de ácido nucleico monocatenario no puede hibridar con otra secuencia de ácido nucleico monocatenario o su complemento. Por lo tanto, áreas de heterología significa que las áreas de polinucleótidos o polinucleótidos tienen áreas o regiones dentro de su secuencia que no pueden hibridarse con otro ácido nucleico o polinucleótido. Tales regiones o áreas son, por ejemplo, áreas de mutaciones.
El término "hormona" se refiere a hormonas polipeptídicas, que generalmente son secretadas por órganos glandulares con conductos. Entre las hormonas se incluyen, por ejemplo, hormonas de crecimiento tales como hormonas de crecimiento humanas, hormonas de crecimiento humanas N-metionilo y hormonas de crecimiento bovinas; hormonas paratiroideas; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; estradiol; terapia de reemplazamiento de hormonas; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano o testolactona; prorrelaxina; hormonas de glicoproteína tales como hormonas estimulantes del folículo (FSH), hormonas estimulantes de la tiroides (TSH) y hormonas luteinizantes (LH); prolactina, lactógeno placentario, péptido asociado a gonadotrofina de ratón, hormonas liberadoras de gonadotrofinas; inhibina; activina; sustancia inhibidora de Müller; y trombopoyesis. Como se usa en la presente descripción, el término hormona incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes activos biológicamente de la hormona de secuencia nativa, que incluyen entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y derivados y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas.
El término "idéntico" o "identidad" significa que dos secuencias de ácido nucleico tienen la misma secuencia o una secuencia complementaria. Por lo tanto, "áreas de identidad" significa que las regiones o áreas de un polinucleótido o el polinucleótido completo son idénticas o complementarias a las áreas de otro polinucleótido.
El término "punto de control del sistema inmunitario" o "punto de control inmunitario" se refiere a una o más vías inhibitorias en el sistema inmunitario que contribuyen al mantenimiento de la autotolerancia o a la modulación de la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas para minimizar los daños colaterales en los tejidos. El punto de control inmunitario funciona como salvaguarda para evitar que el sistema inmunitario ataque a las moléculas o células del huésped (autotolerancia). Cuando se inhiben los puntos de control inmunitarios, el sistema inmunitario, especialmente las células T, se sobreactiva, lo que puede conducir a una pérdida de la autotolerancia. La pérdida de la autotolerancia puede dar como resultado que las moléculas, células y/o tejidos del huésped sean atacados por el sistema inmunitario, lo que causa daños colaterales en los tejidos, además de atacar moléculas o células extrañas. Cuando estos puntos de control inmunitarios no se inhiben, el sistema inmunitario puede lograr un equilibrio entre la autotolerancia y el ataque de moléculas y células extrañas en el cuerpo.
Se ha encontrado que el tejido tumoral y posiblemente determinados patógenos tienen la capacidad de hacer frente a los puntos de control inmunitarios para reducir la eficacia de la respuesta inmunitaria del huésped, lo que da como resultado el crecimiento del tumor y/o una infección crónica (ver, por ejemplo, Pardoll, Nature Reviews Cancer, vol.
12, páginas 252-264, 2012; Nirschl y Drake, Clin Cancer Res, vol. 19, páginas 4917-4924, 2013). Sin embargo, un sistema inmunitario superactivado iniciado por la inhibición de los puntos de control inmunitarios es mucho más sensible y, por lo tanto, puede detectar y atacar tumores. Por lo tanto, para la terapia contra el cáncer, la inhibición del punto de control inmunitario es un objetivo deseable para permitir que el sistema inmunitario participe en la lucha contra los tumores. El problema que debe abordarse es cómo sobreactivar el sistema inmunitario para combatir los tumores, al mismo tiempo que se minimiza el potencial de daño colateral a otras partes del cuerpo.
El término "inhibidor del punto de control inmunitario", como se usa en la presente descripción, se refiere a moléculas que reducen, inhiben, interfieren o modulan total o parcialmente una o más proteínas de los puntos de control inmunitario. Las proteínas de los puntos de control inmunitario regulan el sistema inmunitario, especialmente las células T, la activación o la función. Se conocen numerosas proteínas de los puntos de control inmunitario, tales como el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4) y sus ligandos CD 80 y CD86, y la proteína de muerte celular programada 1 (PD1) y sus ligandos PDL1 y PDL2.Pardoll, Nature Reviews Cancer, vol. 12, páginas 252-264, 2012). Estas proteínas son responsables de las interacciones que inhiben las respuestas de las células T. Las proteínas de los puntos de control inmunitario regulan y mantienen la autotolerancia, así como la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas. Los inhibidores de los puntos de control inmunitario pueden incluir anticuerpos o pueden derivar de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a CTLA4, PD-1 o PD-L1 funcionan como inhibidores de los puntos de control inmunitario.
El término "aislado" significa que el material se extrae de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o enzima de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o enzima, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o enzimas podrían ser parte de una composición, y aún estar aislados porque tal vector o composición no es parte de su ambiente natural.
El término "ácido nucleico aislado" se usa para definir un ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN, que no es inmediatamente contiguo a las secuencias flanqueantes 5' y 3' con las que normalmente es inmediatamente contiguo cuando está presente en el genoma de origen natural del organismo del que se deriva. El término describe así, por ejemplo, un ácido nucleico que se incorpora a un vector, tal como un plásmido o un vector viral; un ácido nucleico que se incorpora al genoma de una célula heteróloga (o al genoma de una célula homóloga, pero en un sitio diferente del que se encuentra de forma natural); y un ácido nucleico que existe como una molécula separada, por ejemplo, un fragmento de ADN producido por amplificación por PCR o digestión con enzimas de restricción, o una molécula de ARN producida por transcripción in vitro. El término también describe un ácido nucleico recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica secuencias polipeptídicas adicionales que pueden usarse, por ejemplo, en la producción de una proteína de fusión.
El término "daño articular" se usa en el sentido más amplio y se refiere a cualquier daño o destrucción parcial o completa de cualquier parte de una o más articulaciones, que incluyen el tejido conectivo y el cartílago, donde el daño incluye daño estructural y/o funcional de cualquier causa, y puede o no causar dolor articular/artalgia. Incluye, sin limitación, daño articular asociado o resultante de enfermedad articular inflamatoria así como enfermedad articular no inflamatoria. Este daño puede ser causado por cualquier condición, tal como una enfermedad autoinmunitaria tal como lupus (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico), artritis (por ejemplo, artritis aguda y crónica, artritis reumatoide (RA), que incluye artritis reumatoide juvenil, artritis idiopática juvenil (JIA) o RA juvenil (JRA)). Otras afecciones y enfermedades incluyen sinovitis reumatoide, gota o artritis gotosa, artritis inmunológica aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis inducida por colágeno tipo II, artritis infecciosa, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, enfermedad de Still, artritis vertebral, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, artritis menopáusica, artritis por depleción de estrógenos y espondilitis anquilosante/espondilitis reumatoide), enfermedad reumática autoinmunitaria distinta de la RA, afectación sistémica significativa secundaria a la RA (que incluye pero no se limitan a vasculitis, fibrosis pulmonar o síndrome de Felty), síndrome de Sjogren, particularmente secundario a tal síndrome. Otras afecciones incluyen vasculitis cutánea limitada secundaria con RA, espondiloartropatía seronegativa, enfermedad de Lyme, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerodermia, miopatía inflamatoria, enfermedad mixta del tejido conectivo, cualquier síndrome de superposición, bursitis, tendinitis, osteomielitis, enfermedades infecciosas, que incluyen influenza, sarampión (rubeola), fiebre reumática, síndrome viral de Epstein-Barr, hepatitis, paperas, rebelde (sarampión alemán) y varicela (varicela), condromalacia rotuliana, colitis colágena, trastornos autoinmunitarios asociados con la enfermedad del colágeno, inflamación de las articulaciones, esfuerzo inusual o uso excesivo, tales como esguinces o distensiones, lesiones que incluyen fracturas, gota, especialmente en el dedo gordo del pie, así como causadas por trastornos neurológicos, trastornos hemofílicos (por ejemplo, artropatía hemofílica), trastornos musculares, trastornos progresivos, trastornos óseos, trastornos del cartílago y trastornos vasculares. Para los propósitos de la presente descripción, las articulaciones son puntos de contacto entre los elementos de un esqueleto (de un vertebrado tal como un animal) con las partes que lo rodean y lo sostienen, que incluyen, pero no se limitan a, las caderas, las articulaciones entre las vértebras de la columna vertebral, las articulaciones entre la columna vertebral y la pelvis (articulaciones sacroilíacas), articulaciones donde los tendones y ligamentos se unen a los huesos, articulaciones entre las costillas y la columna vertebral, hombros, rodillas, pies, codos, manos, dedos, tobillos y dedos de los pies, pero especialmente articulaciones en las manos y pies.
Como se usa en la presente descripción, "ligando" se refiere a una molécula, tal como un péptido aleatorio o una secuencia de segmento variable, que es reconocida por un receptor particular. Como reconocerá un experto en la técnica, una molécula (o complejo macromolecular) puede ser tanto un receptor como un ligando. En general, la pareja de unión que tiene un peso molecular más pequeño se denomina ligando y la pareja de unión que tiene un peso molecular mayor se denomina receptor.
"Ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico bicatenarios (Sambrook y otros, (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., p. 146; Sambrook y otros, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A menos que se indique de otro modo, la ligación puede realizarse mediante el uso de tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 microgramos de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.
Como se usa en la presente descripción, "enlazador" o "espaciador'' se refiere a una molécula o grupo de moléculas que conecta dos moléculas, tales como una proteína de unión al ADN y un péptido aleatorio, y sirve para colocar las dos moléculas en una configuración preferida, por ejemplo, de modo que el péptido aleatorio pueda unirse a un receptor con un impedimento estérico mínimo de la proteína de unión al ADN.
El término "presentación en la superficie celular de mamífero" se refiere a una técnica mediante la cual una proteína o anticuerpo, o una parte de un anticuerpo, se expresa y presenta en la superficie de una célula huésped de mamífero con propósitos de cribado; por ejemplo, mediante el cribado de la unión al antígeno específico mediante una combinación de esferas magnéticas y clasificación de células activada por fluorescencia. En un aspecto, los vectores de expresión de mamíferos se usan para la expresión simultánea de inmunoglobulinas tanto en forma secretada como unida a la superficie celular como en DuBridge y otros, documento US 2009/0136950. En otro aspecto, las técnicas se emplean para un vector viral que codifica para un biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se presentan en las membranas celulares cuando se expresan en una célula como en Gao y otros, documento US 2007/0111260,
Se conoce la presentación de IgG completas en la superficie en células de mamífero. Por ejemplo, Akamatsuu y otros desarrollaron un vector de presentación en la superficie de las células de mamífero, adecuado para aislar directamente moléculas de IgG basado en su afinidad de unión al antígeno y su actividad biológica. Mediante el uso de un vector episomal derivado del virus de Epstein-Barr, las bibliotecas de anticuerpos se presentaron como moléculas de IgG completas en la superficie celular y se cribaron para detectar la unión al antígeno específico mediante una combinación de esferas magnéticas y clasificación de células activada por fluorescencia. Los plásmidos que codifican los anticuerpos con las características de unión deseadas se recuperaron a partir de las células clasificadas y se convirtieron a la forma para la producción de IgG soluble. Ver Akamatsuu y otros J. Immunol. Methods, vol. 327, páginas 40-52, 2007, Ho y otros usaron células renales embrionarias humanas 293T que se usan ampliamente para la expresión transitoria de proteínas para la presentación en la superficie celular de anticuerpos Fv de cadena sencilla para la maduración de la afinidad. Las células que expresaban un anticuerpo mutante raro con mayor afinidad se enriquecieron 240 veces mediante una clasificación de células de un paso sencillo a partir de un gran exceso de células que expresan el anticuerpo WT con una afinidad ligeramente inferior. Además, se obtuvo un mutante altamente enriquecido con una mayor afinidad de unión por CD22 después de una selección sencilla de una biblioteca combinatoria que aleatorizaba un punto caliente de anticuerpo intrínseco. Ver Ho y otros, "Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 103, páginas 9637-9642, 2006,
También se pueden usar células B específicas para un antígeno. Tales células B se aislaron directamente de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes humanos. Las bibliotecas recombinantes de Fv de cadena sencilla (scFv) específicos de antígeno se generan a partir de este conjunto de células B y se criban mediante la presentación en la superficie celular de mamífero mediante el uso de un sistema de expresión de virus Sindbis. Este método permite aislar anticuerpos específicos de antígeno mediante una ronda sencilla de FACS. Las regiones variables (VR) de las cadenas pesadas (HC) y las cadenas ligeras (LC) se aislaron a partir de clones positivos y se produjeron anticuerpos recombinantes completamente humanos como IgG completas o fragmentos Fab. De esta manera, se aislaron varios anticuerpos hipermutados de alta afinidad que se unían a la partícula similar al virus Qp (VLP), un antígeno viral modelo, así como anticuerpos específicos para la nicotina. Todos los anticuerpos mostraron altos niveles de expresión en cultivo celular. Los AcM humanos específicos para la nicotina se validaron preclínicamente en un modelo de ratón. Ver Beerli y otros, "Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 105, páginas 14336-14341, 2008,
La presentación de la superficie de las células de levadura también se puede usar en la presente invención, por ejemplo, ver Kondo y Ueda, "Yeast cell-surface display-applications of molecular display," Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 64, páginas 28-40, 2004, que describe, por ejemplo, un sistema de modificación de superficie celular mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Varios sistemas de presentación representativos para la expresión en la levadura S. cerevisiae se describen en Lee y otros, "Microbial cell-surface display," TRENDS in Bitechnol., vol. 21, páginas 45-52, 2003. También Boder y Wittrup, "Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries," Nature Biotechnol., vol. 15, página 553, 1997.
Como se usa en la presente descripción, "microambiente" significa cualquier parte o región de un tejido o cuerpo que tiene diferencias físicas o químicas constantes o temporales con respecto a otras regiones del tejido o regiones del cuerpo.
Como se usa en la presente descripción, una "propiedad molecular a evolucionar" incluye la referencia a moléculas compuestas por una secuencia polinucleotídica, moléculas compuestas por una secuencia polipeptídica y moléculas compuestas en parte por una secuencia polinucleotídica y en parte por una secuencia polipeptídica. Los ejemplos particularmente relevantes- pero de ninguna manera limitantes- de propiedades moleculares a evolucionar incluyen actividades de proteínas en condiciones específicas, tales como relacionadas con la temperatura, salinidad; presión osmótica; pH; oxidación y concentración de glicerol, DMSO, detergente y/o cualquier otra especie molecular con la que se hace contacto en un ambiente de reacción. Los ejemplos particularmente relevantes adicionales- pero de ninguna manera limitantes- de las propiedades moleculares a evolucionar incluyen estabilidades- por ejemplo, la cantidad de una propiedad molecular residual que está presente después de un tiempo de exposición específico a un ambiente específico, tal como puede encontrarse durante el almacenamiento.
El término "anticuerpo multiespecífico", como se usa en la presente descripción, es un anticuerpo que tiene especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos multiespecíficos ilustrativos pueden unirse tanto a un BBB-R como a un antígeno cerebral. Los anticuerpos multiespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Se contemplan anticuerpos modificados que se unen a dos, tres o más (por ejemplo, cuatro) antígenos (ver, por ejemplo, el documento US 2002/0004587 A1). Se pueden modificar uno o más anticuerpos de tipo salvaje para que sean multiespecíficos, o se pueden modificar dos anticuerpos para que comprendan un anticuerpo multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser multifuncionales.
El término "mutaciones" significa cambios en la secuencia de una secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje o cambios en la secuencia de un péptido. Tales mutaciones pueden ser mutaciones puntuales tales como transiciones o transversiones. Las mutaciones pueden ser eliminaciones, inserciones o duplicaciones.
Como se usa en la presente descripción, la secuencia de nucleótidos degenerada "N,N,G/T" representa 32 tripletes posibles, donde "N" puede ser A, C, G o T.
El término "de origen natural" como se usa en la presente descripción como se aplica al objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (que incluye los virus) que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural. Generalmente, el término de origen natural se refiere a un objeto como está presente en un individuo no patológico (no enfermo), tal como sería típico para la especie.
Como se usa en la presente descripción, "condiciones fisiológicas normales" o "condiciones operativas de tipo salvaje" son aquellas condiciones de temperatura, pH, presión osmótica, osmolalidad, oxidación y concentración de electrolitos que se considerarían dentro de un intervalo normal en el sitio de administración, o el sitio de acción, en un sujeto.
Como se usa en la presente descripción, una "molécula de ácido nucleico" está compuesta por al menos una base o un par de bases, en dependencia de si es monocatenaria o bicatenaria, respectivamente. Además, una molécula de ácido nucleico puede pertenecer exclusivamente o quiméricamente a cualquier grupo de moléculas que contienen nucleótidos, como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, los siguientes grupos de moléculas de ácido nucleico: ARN, ADN, ácidos nucleicos genómicos, ácidos nucleicos no genómicos, ácidos nucleicos de origen natural y no natural, y ácidos nucleicos sintéticos. Esto incluye, a modo de ejemplo no limitante, los ácidos nucleicos asociados con cualquier orgánulo, tal como las mitocondrias, el ARN ribosomal y las moléculas de ácido nucleico compuestas quiméricamente por uno o más componentes que no son de origen natural junto con componentes de origen natural.
Además, una "molécula de ácido nucleico" puede contener en parte uno o más componentes que no se basan en nucleótidos como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, aminoácidos y azúcares. Así, a modo de ejemplo, pero no de limitación, una ribozima que está en parte basada en nucleótidos y en parte basada en proteína se considera una "molécula de ácido nucleico".
Además, a modo de ejemplo, pero no de limitación, una molécula de ácido nucleico que se marca con un resto detectable, tal como un marcaje radioactivo o alternativamente no radioactivo, también se considera una "molécula de ácido nucleico".
Los términos "secuencia de ácido nucleico que codifica" o una "secuencia de ADN codificante de" o una "secuencia de nucleótidos que codifica" una enzima particular- así como otros términos sinónimos-se refieren a una secuencia de ADN que se transcribe y traduce a una enzima cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Una "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo (dirección 3'). El promotor es parte de la secuencia de ADN. Esta región de secuencia tiene un codón de inicio en su extremo 3'. La secuencia promotora incluye el número mínimo de bases donde se encuentran los elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Sin embargo, después que la ARN polimerasa se une a la secuencia y se inicia la transcripción en el codón de inicio (extremo 3' con un promotor), la transcripción procede corriente abajo en la dirección 3'. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente por mapeo con nucleasa S1) así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.
Los términos "ácido nucleico que codifica una enzima (proteína)" o "ADN que codifica una enzima (proteína)" o "polinucleótido que codifica una enzima (proteína)" y otros términos sinónimos abarcan un polinucleótido que incluye solamente la secuencia codificante de la enzima, así como un polinucleótido que incluye una secuencia codificante adicional y/o no codificante.
En una modalidad preferida, una "especie de molécula de ácido nucleico específica" se define por su estructura química, como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, su secuencia primaria. En otra modalidad preferida, una "especie de molécula de ácido nucleico" específica se define por una función de la especie de ácido nucleico o por una función de un producto derivado de la especie de ácido nucleico. Por lo tanto, a modo de ejemplo no limitante, una "especie de molécula de ácido nucleico específica" puede definirse por una o más actividades o propiedades atribuibles a ella, que incluyen actividades o propiedades atribuibles a su producto expresado.
La presente definición de "ensamblar una muestra de ácido nucleico de trabajo en forma de una biblioteca de ácidos nucleicos" incluye el proceso de incorporar una muestra de ácido nucleico en una colección basada en vectores, tal como mediante la ligación en un vector y la transformación de un huésped. A continuación se proporciona una descripción de vectores, huéspedes y otros reactivos relevantes, así como ejemplos específicos no limitantes de los mismos. La presente definición de "ensamblar una muestra de ácido nucleico de trabajo en forma de una biblioteca de ácidos nucleicos" también incluye el proceso de incorporar una muestra de ácido nucleico a una colección que no se basa en vectores, tal como mediante ligación a adaptadores. Preferentemente, los adaptadores pueden hibridarse a los cebadores de PCR para facilitar la amplificación por PCR.
Por consiguiente, en una modalidad no limitante, una "biblioteca de ácidos nucleicos" está compuesta por una colección basada en vectores de una o más moléculas de ácido nucleico. En otra modalidad preferida, una "biblioteca de ácidos nucleicos" está compuesta por una colección que no se basa en vectores de moléculas de ácido nucleico. En otra modalidad preferida más, una "biblioteca de ácidos nucleicos" está compuesta por una colección combinada de moléculas de ácido nucleico que en parte se basa en vectores y en parte no se basa en vectores. Preferentemente, la colección de moléculas que comprenden una biblioteca puede buscarse y separarse de acuerdo con las especies de moléculas de ácido nucleico individuales.
La presente descripción proporciona una "construcción de ácido nucleico" o, alternativamente, una "construcción de nucleótidos" o, alternativamente, una "construcción de ADN". El término "construcción" se usa en la presente descripción para describir una molécula, tal como un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido de enzima) que opcionalmente puede unirse químicamente a uno o más restos moleculares adicionales, tales como un vector o partes de un vector. En un aspecto específico-pero de ninguna manera limitante- una construcción de nucleótidos se ejemplifica mediante una construcción de expresión de ADN adecuada para la transformación de una célula huésped.
Un "oligonucleótido" (o como sinónimo "oligo") se refiere a un polidesoxinucleótido monocatenario o a dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótido que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos pueden tener o no un fosfato en 5'. Los que no lo tienen no se ligarán a otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha desfosforilado. Para lograr la amplificación basada en polimerasa (tal como con PCR), se menciona un "oligonucleótido 32 veces degenerado que está compuesto, en serie, por al menos una primera secuencia homóloga, una secuencia degenerada N,N,G/T y una segunda secuencia homóloga". Como se usa en este contexto, "homólogo" se refiere a la homología entre el oligo y el polinucleótido parental que se somete a la amplificación basada en polimerasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "unido operativamente" se refiere a una unión de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o un potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Unido operativamente significa que las secuencias de ADN que se unen son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura.
Una secuencia codificante está "unida operativamente a" otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcribe las dos secuencias codificantes en un ARNm sencillo, que después se traduce en un polipéptido sencillo que tiene aminoácidos derivados de ambas secuencias codificantes. No es necesario que las secuencias codificantes sean contiguas entre sí siempre que a la larga las secuencias expresadas se procesen para producir la proteína deseada.
Como se usa en la presente descripción, el término "conjunto de polinucleótidos parentales" es un conjunto compuesto por una o más especies de polinucleótidos distintas. Usualmente, este término se usa en referencia a un conjunto de polinucleótidos descendientes que se obtiene preferentemente por mutagenización del conjunto parental, en cuyo caso los términos "parental", "inicial" y "molde" se usan indistintamente.
El término "paciente", "individuo" o "sujeto", se refiere a un animal, por ejemplo un mamífero, tal como un ser humano, que es el objeto del tratamiento. El sujeto, o paciente, puede ser hombre o mujer. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinadas modalidades, el individuo o sujeto es un ser humano.
Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones fisiológicas" se refiere a temperatura, pH, presión osmótica, fuerza iónica, viscosidad y parámetros bioquímicos similares que son compatibles con un organismo viable, y/o que típicamente existen intracelularmente en una célula de levadura o célula de mamífero cultivada viable. Por ejemplo, las condiciones intracelulares en una célula de levadura cultivada en condiciones de cultivo de laboratorio típicas son condiciones fisiológicas. Las condiciones de reacción in vitro adecuadas para cócteles de transcripción in vitro son generalmente condiciones fisiológicas. En general, las condiciones fisiológicas in vitro comprenden NaCl o KCl 50-200 mM, pH 6,5-8,5, 20-45 grados C y catión divalente (por ejemplo, Mg++", Ca++) 0,001­ 10 mM; preferentemente NaCl o KCl a aproximadamente 150 mM, pH 7,2-7,6, catión divalente 5 mM, y a menudo incluyen proteína inespecífica (por ejemplo, BSA) al 0,01-1,0 por ciento. A menudo puede estar presente un detergente no iónico (Tween, NP-40, Tritón X-100), usualmente a aproximadamente 0,001 a 2 %, típicamente 0,05­ 0,2 % (v/v). El profesional puede seleccionar condiciones acuosas particulares de acuerdo con métodos convencionales. Para orientación general, pueden aplicarse las siguientes condiciones acuosas tamponadas: NaCl 10-250 mM, Tris HCl 5-50 mM, pH 5-8, con adición opcional de catión(ones) divalente(s) y/o quelantes de metales y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana y/o agentes antiespumantes y/o centelleantes. Las condiciones fisiológicas normales se refieren a las condiciones de temperatura, pH, presión osmótica, osmolalidad, oxidación y concentración de electrolitos in vivo en un paciente o sujeto en el sitio de administración, o el sitio de acción, que se consideraría dentro del intervalo normal en un paciente.
La convención estándar (5' a 3') se usa en la presente descripción para describir la secuencia de polinucleótidos bicatenarios.
El término "especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de un anticuerpo multiespecífico o multifuncional para unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la misma diana o en diferentes dianas.
El término "epítopo" se refiere a una secuencia de aminoácidos específica, una secuencia de aminoácidos modificada o una estructura secundaria o terciaria de proteína que es reconocida por un anticuerpo.
El término "población" como se usa en la presente descripción significa una colección de componentes tales como polinucleótidos, partes o polinucleótidos o proteínas. Una "población mixta" significa una colección de componentes que pertenecen a la misma familia de ácidos nucleicos o proteínas (es decir, están relacionados) pero que difieren en su secuencia (es decir, no son idénticos) y, por lo tanto, en su actividad biológica.
Una molécula que tiene una "proforma" se refiere a una molécula que experimenta cualquier combinación de una o más modificaciones químicas covalentes y no covalentes (por ejemplo, glicosilación, escisión proteolítica, dimerización u oligomerización, cambio conformacional inducido por temperatura o inducido por pH, asociación con un cofactor, etcétera) en la vía hacia la obtención de una forma molecular más madura que tenga una diferencia de propiedad (por ejemplo, un aumento en la actividad) en comparación con la molécula proforma de referencia. Cuando se pueden distinguir dos o más modificaciones químicas (por ejemplo, dos escisiones proteolíticas, o una escisión proteolítica y una desglicosilación) en la vía hacia la producción de una molécula madura, la molécula precursora de referencia puede denominarse una molécula "preproforma".
Como se usa en la presente descripción, el término "pseudoaleatorio" se refiere a un conjunto de secuencias que tienen una variabilidad limitada, de manera que, por ejemplo, al grado de variabilidad de los residuos en otra posición, excepto cualquier posición pseudoaleatoria se le permite cierto grado de variación de los residuos, sin embargo circunscrito.
"Unidades cuasi repetidas", como se usa en la presente descripción, se refiere a las repeticiones a reordenar y, por definición, no son idénticas. De hecho, el método se propone no solo para unidades codificantes prácticamente idénticas producidas por mutagénesis de la secuencia inicial idéntica, sino también para el reordenamiento de secuencias similares o relacionadas que pueden discrepar significativamente en algunas regiones. No obstante, si las secuencias contienen homologías suficientes para reordenarlas mediante esta estrategia, pueden denominarse unidades "cuasi repetidas".
Como se usa en la presente descripción, "receptor" se refiere a una molécula que tiene una afinidad por un ligando dado. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas. Los receptores pueden emplearse en un estado inalterado o como agregados con otras especies. Los receptores pueden unirse, de manera covalente o no covalente, a un miembro de unión, directamente o mediante una sustancia de unión específica. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, que incluyen anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos (tales como virus, células u otros materiales), receptores de membrana celular, carbohidratos complejos y glicoproteínas, enzimas y receptores hormonales.
El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, humanizado o humano o un fragmento del mismo que se une al antígeno) que se expresa mediante una célula huésped recombinante que comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Los ejemplos de "células huésped" para producir anticuerpos recombinantes incluyen: (1) células de mamífero, por ejemplo, ovario de hámster chino (CHO), COS, células de mieloma (que incluyen las células Y0 y NS0), riñón de hámster bebé (BHK), células Hela y Vero; (2) células de insecto, por ejemplo, sf9, sf21 y Tn5; (3) células vegetales, por ejemplo, plantas que pertenecen al género Nicotiana (por ejemplo, Nicotiana tabacum); (4) células de levadura, por ejemplo, las que pertenecen al género Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) o al género Aspergillus (por ejemplo, Aspergillus niger); (5) células bacterianas, por ejemplo células de Escherichia. coli o células de Bacillus subtilis, etc.
Las enzimas "recombinantes" se refieren a enzimas producidas mediante técnicas de ADN recombinante, es decir, producidas a partir de células transformadas por una construcción de ADN exógeno que codifica la enzima deseada. Las enzimas "sintéticas" son aquellas preparadas por síntesis química.
"Reordenación reductiva", como se usa en la presente descripción, se refiere al aumento en la diversidad molecular que se acumula a través de eventos de eliminación (y/o inserción) que están mediados por secuencias repetidas.
Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial".
Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud completa dada en un listado de secuencias, o puede comprender una secuencia génica o de ADNc completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente al menos 25 nucleótidos de longitud y, a menudo, al menos 50 nucleótidos de longitud. Dado que cada uno de dos polinucleótidos puede (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos y (2) puede comprender además una secuencia que es discrepante entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente mediante la comparación de las secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.
"Índice de repetición (RI)", como se usa en la presente descripción, es el número promedio de copias de las unidades cuasi repetidas contenidas en el vector de clonación.
El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, nucleótido por nucleótido) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula mediante la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, la determinación del número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y la multiplicación del resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Esta "identidad sustancial", como se usa en la presente descripción, denota una característica de una secuencia polinucleotídica, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos 85 por ciento de identidad, a menudo 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, y lo más común al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia de una ventana de comparación de al menos 25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula mediante la comparación de la secuencia de referencia con la secuencia polinucleotídica que puede incluir eliminaciones o adiciones que suman 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación.
Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos enzimas se determina mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de una enzima con la secuencia de una segunda enzima. La similitud puede determinarse mediante procedimientos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, un programa BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineamiento local en el Centro Nacional de Información Biológica).
Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo de cadena sencilla" se refiere a un polipéptido que comprende un dominio VH y un dominio VL en enlace polipeptídico, generalmente unidos mediante un péptido espaciador y que puede comprender secuencias de aminoácidos adicionales en los extremos amino y/o carboxi terminales. Por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla puede comprender un segmento conector para la unión al polinucleótido codificante. Como ejemplo, un scFv es un anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla son generalmente proteínas que consisten en uno o más segmentos polipeptídicos de al menos 10 aminoácidos contiguos sustancialmente codificados por genes de la superfamilia de inmunoglobulinas (por ejemplo, ver The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams y A. N. Barclay, en Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt, y T.H. Rabbits, eds., (1989) Academic press: San Diego, Calif., pp. 361-368), codificados con mayor frecuencia por una secuencia génica de cadena pesada o cadena ligera de roedor, primate no humano, aviar, porcino, bovino, ovino, de cabra o seres humanos. Un anticuerpo de cadena sencilla funcional generalmente contiene una parte suficiente de un producto génico de la superfamilia de las inmunoglobulinas para retener la propiedad de unión a una molécula diana específica, típicamente un receptor o un antígeno (epítopo).
Se dice que los miembros de un par de moléculas (por ejemplo, un par anticuerpo-antígeno o un par de ácidos nucleicos) se "unen específicamente" entre sí si se unen entre sí con mayor afinidad que a otras moléculas inespecíficas. Por ejemplo, un anticuerpo generado contra un antígeno al que se une de manera más eficiente que a una proteína inespecífica puede describirse como unido específicamente al antígeno. (Del mismo modo, una sonda de ácido nucleico se puede describir como que se une específicamente a una diana de ácido nucleico si forma un dúplex específico con la diana mediante interacciones de apareamiento de bases (ver anteriormente).)
La "hibridación específica" se define en la presente descripción como la formación de híbridos entre un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que tiene una secuencia distinta pero sustancialmente idéntica al primer polinucleótido), en donde las secuencias polinucleotídicas sustancialmente no relacionadas no forman híbridos en la mezcla.
El término "tratar" incluye: (1) prevenir o retrasar la aparición de síntomas clínicos del estado, trastorno o condición que se desarrolla en un animal que puede estar afectado o predispuesto al estado, trastorno o condición pero que aún no experimenta o presenta síntomas clínicos o subclínicos del estado, trastorno o condición; (2) inhibir el estado, trastorno o condición (es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad, o una recaída de la misma en caso de tratamiento de mantenimiento, de al menos un síntoma clínico o subclínico de la misma); y/o (3) aliviar la afección (es decir, causar la regresión del estado, trastorno o afección o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos). El beneficio para un paciente a tratar es estadísticamente significativo o al menos perceptible para el paciente o para el médico.
El término "variante" se refiere a polinucleótidos o polipéptidos de la descripción modificados en uno o más pares de bases, codones, intrones, exones o residuos de aminoácidos (respectivamente) de una molécula parental de proteína de tipo salvaje. Las variantes se pueden producir por cualquier número de medios, que incluyen métodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a errores, transposición, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis en casete, mutagénesis de conjunto recursivo, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica de sitio, reensamblaje de genes, mutagénesis de saturación y cualquier combinación de los mismos. Las técnicas para producir proteínas variantes que tienen actividad reducida en comparación con la proteína de tipo salvaje en una condición fisiológica normal de, por ejemplo, una o más condiciones de temperatura, pH, presión osmótica, osmolalidad, oxidación y concentración de electrolitos; y actividad potenciada en una condición aberrante, se describen en la presente descripción. Las variantes pueden seleccionarse adicionalmente por las propiedades de resistencia química potenciada y resistencia proteolítica, en comparación con la proteína de tipo salvaje.
Como se usa en la presente descripción, el término "de tipo salvaje" significa que el polinucleótido no comprende ninguna mutación e incluye una proteína molde usada como molécula parental para la evolución u otra modificación. La "proteína de tipo salvaje" preferentemente tiene algunas propiedades deseadas, tales como una mayor afinidad de unión o actividad enzimática, que se pueden obtener mediante el cribado de una biblioteca de proteínas para las propiedades deseadas, que incluyen una mejor estabilidad en diferentes ambientes de temperatura o pH, o selectividad y/o solubilidad mejoradas. Una "proteína de tipo salvaje", "proteína de tipo salvaje", "proteína biológica de tipo salvaje" o "proteína biológica de tipo salvaje", se refiere a una proteína que se puede aislar de la naturaleza que será activa en un nivel de actividad encontrado en la naturaleza y comprenderá la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza. Los términos "molécula parental", "proteína diana" y "molde" también pueden referirse a la proteína de tipo salvaje.
Descripción detallada
La presente descripción está dirigida a métodos de modificación o evolución de proteínas para generar nuevas moléculas que funcionan preferentemente en el líquido sinovial pero que no actúan o lo hacen en menor medida sobre otras partes del cuerpo y exhiben una mayor actividad en el ensayo bajo una primera condición fisiológica en comparación con la misma actividad en el ensayo bajo la segunda condición fisiológica. Estas nuevas proteínas se denominan en la presente descripción proteínas activas condicionalmente. Los métodos para producir estas proteínas se han descrito en el documento US 2012/0164127.
Las proteínas activas condicionalmente son particularmente valiosas para el desarrollo de nuevas terapias que son activas durante períodos de tiempo cortos o limitados dentro del huésped. Esto es particularmente valioso cuando la operación prolongada de la proteína a la dosis dada sería dañina para el huésped, pero donde se requiere una actividad limitada para realizar la terapia deseada. Los ejemplos de aplicaciones beneficiosas incluyen tratamientos tópicos o sistémicos a dosis altas, así como tratamientos localizados en alta concentración. La inactivación en condiciones fisiológicas puede determinarse mediante una combinación de la dosificación y la velocidad de inactivación de la proteína. Esta inactivación basada en condiciones es especialmente importante para las terapias enzimáticas donde la actividad catalítica causa efectos negativos sustanciales en un período de tiempo relativamente corto.
La presente descripción también está dirigida a métodos de modificación o evolución de proteínas para generar nuevas moléculas que son diferentes de las moléculas de tipo salvaje en que se activan o inactivan de manera reversible o irreversible con el tiempo, o se activan o inactivan solo cuando están en determinados microambientes en el cuerpo, que incluyen en órganos específicos en el cuerpo. En algunas modalidades, las proteínas activas condicionalmente son anticuerpos contra un antígeno adecuado.
Proteínas de tipo salvaje dianas
Cualquier proteína terapéutica puede servir como una proteína diana, o proteína de tipo salvaje, para la producción de una proteína biológica activa condicionalmente. En un aspecto, la proteína diana es una enzima de tipo salvaje. Las enzimas terapéuticas usadas actualmente incluyen urocinasa y estreptocinasa, usadas en el tratamiento de coágulos sanguíneos; y hialuronidasa, usada como un adyuvante para mejorar la absorción y dispersión de otros fármacos, en un aspecto, la proteína de tipo salvaje seleccionada para la generación de una proteína biológica activa condicionalmente puede ser una enzima terapéutica usada actualmente, para evitar o minimizar los efectos secundarios nocivos asociados con la proteína o enzima de tipo salvaje. Alternativamente, se puede seleccionar una enzima que no se usa actualmente como un agente terapéutico para la generación de una proteína biológica activa condicionalmente. Determinados ejemplos no limitantes se discutirán con más detalle a continuación.
Las proteínas terapéuticas son aquellas que se pueden usar en medicina solas o junto con otras terapias para tratar diversas enfermedades o afecciones médicas, tales como anticuerpos, enzimas, reguladores inmunitarios, factores de crecimiento, hormonas y citocinas. Las proteínas biológicas activas condicionalmente de la descripción podrían ser apropiadas para usar en una o más indicaciones, que incluyen el tratamiento de trastornos circulatorios, artritis, esclerosis múltiple, trastornos autoinmunitarios, cáncer, afecciones dermatológicas y uso en diversos formatos de diagnóstico. En dependencia de la proteína y la indicación, la proteína biológica activa condicionalmente podría administrarse en formulaciones parenterales, tópicas u orales como se discutirá a continuación.
Algunas proteínas diana de tipo salvaje representativas incluyen enzimas, anticuerpos, citocinas, receptores, proteínas de unión al ADN, agentes quelantes y hormonas. Más ejemplos incluyen proteínas industriales y farmacéuticas, tales como ligandos, receptores de superficie celular, antígenos, factores de transcripción, módulos de señalización y proteínas del citoesqueleto. Algunas clases adecuadas de enzimas son hidrolasas tales como proteasas, carbohidrasas, lipasas; isomerasas tales como racemasas, epimerasas, tautomerasas o mutasas; transferasas, cinasas, oxidorreductasas y fosfatasas.
Las proteínas diana de tipo salvaje se pueden descubrir al generar y cribar una biblioteca para una proteína con las propiedades deseadas, tales como actividad enzimática, afinidad/selectividad de unión, termoestabilidad, tolerancia a pH alto o bajo, eficiencia de expresión u otras actividades biológicas.
Las proteínas diana de tipo salvaje pueden descubrirse al cribar una biblioteca de ADNc. Una biblioteca de ADNc es una combinación de fragmentos de ADNc (ADN complementario) clonados insertados en una colección de células huésped, que juntos constituyen una parte del transcriptoma del organismo. El ADNc se produce a partir de ARNm completamente transcrito y, por lo tanto, contiene la secuencia codificante de las proteínas expresadas de un organismo. La información en las bibliotecas de ADNc es una herramienta poderosa y útil para el descubrimiento de proteínas con las propiedades deseadas mediante el cribado de las bibliotecas de proteínas con la propiedad deseada.
En modalidades donde las proteínas de tipo salvaje diana son anticuerpos, los anticuerpos de tipo salvaje se pueden descubrir al generar y cribar bibliotecas de anticuerpos. Las bibliotecas de anticuerpos pueden ser bibliotecas de anticuerpos policlonales o bibliotecas de anticuerpos monoclonales. Se puede generar una biblioteca de anticuerpos policlonales contra un antígeno mediante la inyección directa del antígeno en un animal o mediante la administración del antígeno a un animal no humano. Los anticuerpos así obtenidos representan una biblioteca de anticuerpos policlonales que se unen al antígeno. Para la preparación de bibliotecas de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma, la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma EBV (ver, por ejemplo, Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Las técnicas descritas para la generación de anticuerpos monocatenarios (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4,946,778) pueden adaptarse para producir una biblioteca de anticuerpos monocatenarios.
Hay otros métodos para la generación y cribado de bibliotecas de anticuerpos para el descubrimiento del anticuerpo de tipo salvaje. Por ejemplo, se pueden utilizar bibliotecas de presentación de anticuerpos totalmente humanos. Tal biblioteca es una población de anticuerpos que se presentan en la superficie de la(s) célula(s) huésped(es). Preferentemente, la biblioteca de anticuerpos es representativa del repertorio humano de anticuerpos porque tienen la capacidad de unirse a un amplio intervalo de antígenos. Debido a que los anticuerpos se presentan en la superficie de las células, aumenta la afinidad efectiva (debido a la avidez) de cada anticuerpo en la biblioteca. A diferencia de otros tipos de bibliotecas populares, tales como las bibliotecas de presentación de fagos, donde la avidez de los anticuerpos para propósitos de cribado e identificación es menos deseable, es deseable la súper avidez proporcionada por la presentación en la superficie celular en la presente invención. Las bibliotecas de presentación en la superficie celular permiten la identificación de anticuerpos de afinidad de unión baja, media y alta, así como la identificación de epítopos débiles y no inmunogénicos en la etapa de cribado o selección.
Modificadores de la respuesta biológica activos condicionalmente de enfermedades autoinmunitarias
La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por mecanismos inmunitarios aberrantes que conducen a inflamación e hinchazón articular con destrucción progresiva de las articulaciones. La RA también puede afectar la piel, el tejido conectivo y los órganos del cuerpo. El tratamiento tradicional incluye fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inhibidores de la COX-2 y fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDS) tales como el metotrexato. Ninguno de los regímenes de tratamiento tradicionales es ideal, especialmente para uso a largo plazo.
Los modificadores de la respuesta biológica, que se dirigen a los mediadores inflamatorios, ofrecen un enfoque relativamente nuevo para el tratamiento de la artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunitarias. Tales modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos, o partes activas de los mismos, contra diversos mediadores inflamatorios tales como IL-6, receptor de IL-6, TNF-alfa, IL-23 e IL-12.
Algunos de los primeros modificadores de la respuesta biológica fueron medicamentos dirigidos al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), una citocina proinflamatoria implicada en la patogenia de la RA. Actualmente se comercializan varios medicamentos anti-TNF-alfa para el tratamiento de la RA. Por ejemplo, Enbrel® (etanercept, Amgen) es un bloqueador de TNF-alfa. El etanercept es una proteína de fusión dimérica que consta de la parte de unión al ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) humano de 75 kilodalton (p75) unida a la parte Fc de la IgGl humana. El componente Fc de etanercept contiene el dominio CH2, el dominio c H3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1 de IgG1. El etanercept se produce en un sistema de expresión de células de mamífero de ovario de hámster chino (CHO). Consta de 934 aminoácidos y un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kilodaltons. El Enbrel® se usa para tratar la artritis reumatoide, la artritis psoriásica, la espondilitis anquilosante y la psoriasis en placas. Los efectos secundarios graves de Enbrel® incluyen infecciones que incluyen tuberculosis, infección fúngica, infección bacteriana o viral debida a patógenos oportunistas. La sepsis también puede ocurrir. También se han informado linfomas u otras neoplasias malignas.
El Remicade® (infliximab) es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-TNF-alfa IgGkI compuesto por regiones variables murinas y constantes humanas. El Remicade se administra mediante inyección intravenosa y se usa para tratar la artritis reumatoide, la psoriasis, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la espondilitis anquilosante. Los efectos secundarios del Remicade incluyen infección grave o sepsis y, raramente, determinados linfomas de células T. Otros efectos secundarios incluyen hepatotoxicidad, determinados eventos hematológicos graves, reacciones de hipersensibilidad y determinados eventos neurológicos graves.
Otros modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos anti-receptor de interleucina-6 (IL-6) humanizados. La IL-6 es una citocina que contribuye a la inflamación, la hinchazón y el daño articular en la RA. Un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado, Actemra (tocilizumab, Roche), está aprobado por la FDA y la Comisión Europea para el tratamiento de pacientes adultos con artritis reumatoide. Actemra también está aprobado en Japón para el tratamiento de la RA y la artritis idiopática juvenil (sJIA). Los estudios de fase III demostraron que el tratamiento con Actemra como monoterapia, o una combinación con MTX u otros DMARD, redujo los signos y síntomas de la RA en comparación con otras terapias. Actemra es un anticuerpo monoclonal humanizado contra el receptor de IL-6 humano que bloquea de manera competitiva la unión de IL-6 a su receptor. Por lo tanto, inhibe los efectos proliferativos de la IL-6, que conducen al engrosamiento sinovial y la formación de pannus en la RA. Los efectos secundarios graves de Actemra incluyen infecciones graves y reacciones de hipersensibilidad, que incluyen algunos casos de anafilaxia. Otros efectos secundarios incluyen infección del tracto respiratorio superior, dolor de cabeza, nasofaringitis, hipertensión y ALT aumentada.
Otra enfermedad autoinmunitaria común es la psoriasis. Un sistema inmunitario hiperactivo puede conducir a niveles elevados de IL-12 e IL-23, dos proteínas de citocinas que se han encontrado en las placas de piel psoriásica. La IL-12 y la IL-23 participan en las respuestas inflamatorias e inmunitarias, tales como la activación de las células asesinas naturales y la diferenciación y activación de las células T CD4+.
Un tratamiento para la psoriasis moderada o grave implica la inyección subcutánea de Stelara™ (ustekinumab, Centocor Ortho Biotech, Inc.), un anticuerpo monoclonal IgGIk humanizado contra la subunidad p40 de las citocinas IL-12 e IL-23. Se ha demostrado que Stelara alivia determinados síntomas asociados con las placas psoriásicas, tales como el grosor, la descamación y el enrojecimiento de la placa. La formulación de Stelara incluye L-histidina y monoclorhidrato de L-histidina monohidrato, polisorbato 80 y sacarosa en solución acuosa. El uso de Stelara™ afecta el sistema inmunitario y puede aumentar las posibilidades de infección, que incluyen la tuberculosis, y las infecciones causadas por bacterias, hongos o virus; así como aumentar el riesgo de determinados tipos de cáncer. Los efectos secundarios de los modificadores de la respuesta biológica son significativos y son causados en parte por los altos niveles que siguen a la inyección en los pacientes, lo que los hace susceptibles a una infección grave o a la muerte. Este es un efecto secundario importante asociado con esta importante clase de fármacos. Un desafío es evitar el alto nivel inicial de actividad de la dosis de anticuerpo requerida para proporcionar un efecto de tratamiento prolongado después de la inyección.
El plasma sanguíneo es un líquido corporal muy diferente del líquido extracelular cerebral (ECF). Como se discutió por Somjen ("Ions in the Brain: Normal Function, Seizures, and Stroke," Oxford University Press, 2004, páginas 16 y 33) y Redzic ("Molecular biology of the blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: similarities and differences," Fluids and Barriers of the CNS, vol. 8:3, 2011), el fluido extracelular cerebral tiene significativamente menos K+, más Mg2+ y H+ que el plasma sanguíneo. Las diferencias en las concentraciones de iones entre el plasma sanguíneo y el líquido extracelular cerebral conducen a diferencias significativas en la presión osmótica y la osmolalidad entre los dos fluidos. La Tabla 1 muestra las concentraciones de iones comunes en milimoles tanto para el plasma sanguíneo como para el LEC cerebral.
Tabla 1 Iones comunes en plasma (plasma arterial) y líquido extracelular cerebral (CSF)
PLASMA ARTERIAL CSF HUMANO RATA HUMANO RATA
Na+ 150 148 147 152
K+ 4,6 5,3 2,9 3,4
Ca, total 2,4 3,1 1,14 1,1
Ca2+, pCa libre 1,4 1,5 1,0 1,0
Mg, totales 0,86 0,8 1,15 1,3
Mg2+, libre 0,47 0,44 0,7 0,88
H+ 0,000039 0,000032 0,000047 0,00005
pH 7,41 7,5 7,3 7,3
Cl- 99 119
HCO3- 26,8 31 23,3 28
Proteínas biológicas activas condicionalmente para el líquido sinovial
Las enfermedades articulares son una de las principales causas de invalidez y jubilación anticipada en los países industrializados. Las enfermedades articulares a menudo provocan daños en una articulación que es difícil de reparar. El líquido sinovial es un líquido corporal que se encuentra en la cavidad sinovial de las articulaciones (por ejemplo, rodilla, cadera, hombro) de un cuerpo humano o animal entre el cartílago y el sinovio de las superficies articuladas enfrentadas. El líquido sinovial nutre el cartílago y también sirve como lubricante para las articulaciones. Las células del cartílago y el sinovio secretan líquido que sirve como un lubricante entre las superficies articulares. El líquido sinovial humano comprende aproximadamente 85 % de agua. Se deriva del dializado del plasma sanguíneo, que a su vez está compuesto de agua, proteínas disueltas, glucosa, factores de coagulación, iones minerales, hormonas, etc. Las proteínas tales como la albúmina y las globulinas están presentes en el líquido sinovial y se cree que desempeñan un papel importante en la lubricación del área articular. Algunas otras proteínas también se encuentran en el líquido sinovial humano, que incluyen las glicoproteínas tales como alfa-1-glucoproteína ácida (AGP), alfa-1-antitripsina (A1AT) y lubricina.
El líquido sinovial tiene una composición muy diferente a la de otras partes del cuerpo. Así, el líquido sinovial tiene condiciones fisiológicas diferentes a otras partes del cuerpo, tales como el plasma sanguíneo. Por ejemplo, el líquido sinovial tiene menos de aproximadamente 10 mg/dL de glucosa, mientras que el nivel medio normal de glucosa en el plasma sanguíneo humano es de aproximadamente 100 mg/dL, que fluctúa dentro de un intervalo entre 70 y 100 mg/dL a lo largo del día. Además, el nivel de proteína total en el líquido sinovial es aproximadamente un tercio del nivel de proteína en el plasma sanguíneo, ya que las moléculas grandes, tales como las proteínas, no pasan fácilmente a través de la membrana sinovial hacia el líquido sinovial. También se ha encontrado que el pH del líquido sinovial humano es más alto que el pH del plasma humano (Jebens y otros, "On the viscosity and pH of synovial fluid and the pH of blood", The Journal of Bone and Joint Surgery, vol. 41 B, páginas 388-400, 1959; Farr y otros, "Significance of the hydrogen ion concentration in synovial fluid in Rheumatoid Arthritis", Clinical and Experimental Rheumatology, vol. 3, páginas 99-104, 1985).
Así, el líquido sinovial tiene varias condiciones fisiológicas que son diferentes a las de las otras partes del cuerpo, tales como las condiciones fisiológicas en el plasma sanguíneo. El líquido sinovial tiene un pH más alto que otras partes del cuerpo, especialmente el plasma sanguíneo. El líquido sinovial tiene una concentración de glucosa más baja que otras partes del cuerpo, tales como el plasma sanguíneo. El líquido sinovial también tiene una concentración más baja de proteína que otras partes del cuerpo, tales como el plasma sanguíneo.
Se han usado diversos anticuerpos para tratar la enfermedad de las articulaciones mediante la introducción de los anticuerpos en el líquido sinovial. Por ejemplo, se sabe que el líquido sinovial de una articulación lesionada contiene muchos factores que influyen en la progresión de la osteoartritis (ver, por ejemplo, Fernandes, y otros, " The Role of Cytokines in Osteoarthritis Pathophysiology ", Biorheology, vol. 39, páginas 237-246, 2002). Se sabe que las citocinas, tales como la interleucina-1 (IL-I) y el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), que son producidas por los sinoviocitos activados, regulan positivamente la expresión génica de la metaloproteinasa de matriz (MMP). La regulación positiva de MMP conduce a la degradación de las proteínas de matriz y no matriz en las articulaciones. Los anticuerpos que neutralizan las citocinas pueden detener la progresión de la osteoartritis.
El uso de anticuerpos como fármaco es una estrategia prometedora para el tratamiento de enfermedades articulares. Por ejemplo, se han desarrollado anticuerpos (tales como anticuerpos contra agrecano o agrecanasa) para tratar la osteoartritis, que tiene, con diferencia, la mayor prevalencia entre las enfermedades de las articulaciones (Documento WO1993/022429A1). Se ha desarrollado un anticuerpo contra la caja 1 del grupo de alta movilidad acetilado (HMGB1) para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades articulares que son enfermedades/trastornos inflamatorios, autoinmunitarios, neurodegenerativos o malignos, tales como la artritis. Este anticuerpo puede usarse para detectar la forma acetilada de HMGB1 en líquido sinovial (Documento WO 2011/157905A1). También se ha desarrollado otro anticuerpo (anticuerpo anti-CD20) para tratar el daño al tejido conectivo y al cartílago de las articulaciones.
Sin embargo, los antígenos de estos anticuerpos a menudo se expresan en otras partes del cuerpo y desempeñan funciones fisiológicas importantes. Los anticuerpos contra estos antígenos, aunque son eficaces en el tratamiento de enfermedades de las articulaciones, también pueden interferir significativamente con las funciones fisiológicas normales de estos antígenos en otras partes del cuerpo. Por lo tanto, los pacientes pueden experimentar efectos secundarios graves. Por lo tanto, es deseable desarrollar terapias, tales como anticuerpos contra citocinas u otros antígenos que puedan unirse preferentemente a sus antígenos (proteínas u otras macromoléculas) con mayor afinidad en el líquido sinovial, mientras que no se unen o solo se unen débilmente a los mismos antígenos en otras partes del cuerpo para reducir los efectos secundarios.
Tales proteínas biológicas activas condicionalmente pueden ser anticuerpos activos condicionalmente. En algunas modalidades, la presente invención también proporciona proteínas biológicas activas condicionalmente que son proteínas distintas de los anticuerpos. Por ejemplo, la presente invención puede desarrollar un regulador inmunitario activo condicionalmente para regular preferentemente la respuesta inmunitaria en el líquido sinovial, que puede tener un efecto menor o nulo sobre la respuesta inmunitaria en otras partes del cuerpo.
Las proteínas biológicas activas condicionalmente pueden ser supresores activos condicionalmente de la señalización de citocinas (SOCS). Muchos de estos SOCs están implicados en la inhibición de la vía de señalización JAK-STAT. Los supresores activos condicionalmente de la señalización de citocinas pueden suprimir preferentemente la señalización de citocinas en el líquido sinovial, mientras que no suprimen o suprimen en menor medida la señalización de citocinas en otras partes del cuerpo.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona una proteína biológica activa condicionalmente derivada de una proteína biológica parental. La proteína biológica activa condicionalmente muestra una actividad aumentada en el ensayo bajo la primera condición fisiológica en comparación con la misma actividad en el ensayo bajo la segunda condición fisiológica. Tales proteínas biológicas activas condicionalmente pueden funcionar preferentemente en el líquido sinovial, pero no actúan o lo hacen en menor medida sobre otras partes del cuerpo. En consecuencia, tales proteínas biológicas activas condicionalmente pueden tener efectos secundarios reducidos. En algunas modalidades, las proteínas biológicas activas condicionalmente son anticuerpos contra un antígeno en o expuesto al líquido sinovial. Tales antígenos pueden ser cualquier proteína implicada en la respuesta inmunitaria/inflamación en una enfermedad articular, aunque el antígeno suele ser una citocina. El anticuerpo activo condicionalmente tiene una menor afinidad por el antígeno que el anticuerpo de tipo salvaje por el mismo antígeno en al menos una condición fisiológica en otras partes del cuerpo (tales como el plasma sanguíneo), mientras que tiene una mayor afinidad por el antígeno que el anticuerpo de tipo salvaje bajo al menos una condición fisiológica del líquido sinovial. Tales anticuerpos activos condicionalmente pueden unirse débilmente o no unirse al antígeno en otras partes del cuerpo, pero unirse, por ejemplo, unirse fuerte y ajustadamente o unirse más fuerte al antígeno en el líquido sinovial.
Las proteínas activas condicionalmente para el líquido sinovial de la presente invención se generan mediante un método para evolucionar un ADN que codifica una proteína biológica parental para crear una biblioteca de ADN mutante. A continuación, la biblioteca de ADN mutante se expresa para obtener proteínas mutantes. Las proteínas mutantes y la proteína biológica parental se someten a un ensayo en al menos una condición fisiológica de una primera parte del líquido sinovial corporal y a un ensayo en una segunda condición fisiológica seleccionada de al menos una condición fisiológica en una segunda parte del cuerpo que es diferente de la primera parte del cuerpo. La segunda parte del cuerpo puede ser el plasma sanguíneo. Tales proteínas biológicas mutantes seleccionadas son proteínas biológicas activas condicionalmente que funcionan preferentemente en el líquido sinovial pero no actúan o lo hacen en menor medida sobre otras partes del cuerpo y exhiben una actividad aumentada en el ensayo bajo la primera condición fisiológica en comparación con la misma actividad en el ensayo bajo la segunda condición fisiológica.
Tales proteínas biológicas activas condicionalmente son ventajosas para reducir los efectos secundarios de la proteína de tipo salvaje, ya que la proteína biológica activa condicionalmente tiene menor actividad en otras partes del cuerpo donde no se pretende que actúe la proteína biológica activa condicionalmente.
Debido a los efectos secundarios reducidos, la proteína biológica activa condicionalmente permitirá que se use con seguridad una dosis significativamente mayor de la proteína, en comparación con la proteína biológica de tipo salvaje. Esto es especialmente beneficioso para un anticuerpo contra una citocina o un factor de crecimiento, porque los anticuerpos contra la citocina o el factor de crecimiento pueden interferir con las funciones fisiológicas normales de la citocina o el factor de crecimiento en otras partes del cuerpo. Mediante el uso de una proteína biológica activa condicionalmente, con efectos secundarios reducidos, se pueden usar dosis más altas para lograr una mayor eficacia.
Las proteínas biológicas activas condicionalmente para actuar en un líquido sinovial también pueden permitir el uso de nuevas dianas farmacológicas. El uso de proteínas biológicas tradicionales como agentes terapéuticos puede causar efectos secundarios inaceptables. Por ejemplo, la inhibición de un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) puede suprimir muy eficazmente el crecimiento tumoral. Sin embargo, un fármaco que inhiba el EGFR también suprimirá el crecimiento en la piel y el tracto gastrointestinal (GI). Los efectos secundarios hacen que el EGFR no sea adecuado como una diana farmacológica tumoral.
En otro ejemplo, la supresión de las citocinas suele ser beneficiosa para reparar el daño articular. Sin embargo, la supresión de las citocinas en otras partes del cuerpo también puede suprimir la respuesta inmunitaria del cuerpo, lo que provoca una deficiencia inmunitaria. Por lo tanto, las citocinas en el líquido sinovial no son dianas ideales para desarrollar fármacos de anticuerpos tradicionales para el tratamiento del daño articular. Sin embargo, mediante el uso de anticuerpos activos condicionalmente que se unen preferentemente a las citocinas en el líquido sinovial, mientras que no se unen a las mismas citocinas en otras partes del cuerpo o lo hacen sólo débilmente, el efecto secundario de la inmunodeficiencia puede reducirse drásticamente. Por lo tanto, las citocinas en el líquido sinovial pueden convertirse en dianas adecuadas para reparar el daño articular mediante el uso de anticuerpos activos condicionalmente.
Partículas virales activas condicionalmente
Las partículas virales se han usado durante mucho tiempo como vehículos de administración para transportar proteínas, moléculas de ácido nucleico, compuestos químicos o isótopos radioactivos a una célula o tejido diana. Las partículas virales que se usan comúnmente como vehículos de administración incluyen retovirus, adenovirus, lentivirus, virus del herpes y virus adenoasociados. Las partículas virales reconocen sus células diana a través de una proteína de superficie que sirve como proteína de reconocimiento para la unión específica a una proteína celular que sirve como proteína diana de las células diana, a menudo en un sistema de unión ligando-receptor Lentz, " The reognition event between virus and host cell receptor: a target for antiviral agents", J. of Gen. Virol., vol. 71, páginas 751-765, 1990,). Por ejemplo, la proteína de reconocimiento viral puede ser un ligando para un receptor en las células diana. La especificidad entre un ligando y un receptor permite que las partículas virales reconozcan específicamente y administren su contenido a una célula diana.
Las técnicas para desarrollar partículas virales artificiales a partir de virus de tipo salvaje son bien conocidas por un experto en la materia. Las partículas víricas artificiales conocidas como vehículos de administración incluyen las basadas en retrovirus (ver, por ejemplo, los documentos WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de Estados Unidos No. 5,219,740; documentos WO 93/11230; WO 93/10218; Patente de Estados Unidos No. 4,777,127; Patente de Reino Unido No. 2,200,651; documentos EP 0345 242 y WO 91/02805), alfavirus (por ejemplo, vectores del virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus del río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC Vr 1249; ATCC VR-532)), y virus adenoasociados (ver, por ejemplo, los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655).
Generalmente, las partículas virales artificiales se construyen al insertar una proteína de reconocimiento extraña en una partícula viral, al reemplazar a menudo la proteína de reconocimiento nativa mediante tecnología recombinante. La proteína de reconocimiento extraña puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un receptor, un ligando o un dominio de unión a colágeno. La presente invención proporciona una proteína de reconocimiento activa condicionalmente que es inactiva o menos activa para unirse a una célula en una condición fisiológica normal y que es activa o más activa para unirse a una célula en una condición aberrante. La proteína de reconocimiento activa condicionalmente por lo tanto puede unirse preferentemente a las células diana del tejido enfermo y/o en un sitio de la enfermedad basado en la presencia de una condición anormal en ese sitio y evitar o unirse mínimamente a las células del tejido normal donde una condición fisiológica normal existe La proteína de reconocimiento activa condicionalmente puede expresarse y presentarse en la superficie de una partícula viral.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para desarrollar una proteína de reconocimiento de tipo salvaje y cribar una proteína de reconocimiento activa condicionalmente. La proteína de reconocimiento activa condicionalmente es menos activa en la unión a una célula que la proteína de reconocimiento de tipo salvaje en una condición fisiológica normal, y más activa en la unión a una célula que la proteína de reconocimiento de tipo salvaje en condición aberrante. Tal proteína de reconocimiento activa condicionalmente puede insertarse en una partícula viral mediante tecnología recombinante bien conocida para generar una partícula viral activa condicionalmente.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una partícula viral activa condicionalmente que comprende una proteína de reconocimiento activa condicionalmente, que permite que la partícula viral activa condicionalmente reconozca y se una a las células diana del tejido enfermo o en un sitio de la enfermedad, pero no a las células del tejido normal. Tal partícula viral activa condicionalmente puede administrar preferentemente agentes terapéuticos dentro de la partícula viral al tejido enfermo o al sitio de la enfermedad, mientras que la partícula viral activa condicionalmente administra menos o no administra los agentes terapéuticos a las células del tejido normal.
En algunas modalidades, las células diana en un sitio de la enfermedad están dentro de una zona o microambiente con un pH anormal (por ejemplo, pH 6,5) o una temperatura anormal, en comparación con el pH o la temperatura en otras partes del cuerpo que están sanas o que no sufren de la enfermedad o estado de enfermedad en particular. En esta modalidad, la proteína de reconocimiento activa condicionalmente es menos activa que una proteína de reconocimiento de tipo salvaje en la unión con una proteína diana de una célula diana a un pH o temperatura fisiológicos normales, y más activa que una proteína de reconocimiento de tipo salvaje en la unión con la proteína diana de una célula diana a un pH o temperatura anormales. De esta manera, la proteína de reconocimiento se unirá preferentemente a un sitio donde se encuentre un pH o una temperatura anormales, de este modo administra un tratamiento en el sitio de una enfermedad.
En una modalidad, la partícula viral puede comprender un anticuerpo activo condicionalmente de la presente invención, y especialmente la región variable de un anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab', Fv). Tal anticuerpo activo condicionalmente puede unirse a la proteína diana (como antígeno) de una célula diana con menor afinidad que un anticuerpo de tipo salvaje en una condición fisiológica normal que puede encontrarse en un lugar con tejido normal, y con una afinidad mayor que la del anticuerpo de tipo salvaje en condición aberrante que puede encontrarse en un sitio de enfermedad o tejido enfermo. El anticuerpo activo condicionalmente puede derivar del anticuerpo de tipo salvaje de acuerdo con el método de la presente invención.
Método de generación de proteínas biológicas activas condicionalmente
Se emplean una o más técnicas de mutagénesis para evolucionar el ADN que codifica la proteína de tipo salvaje para crear una biblioteca de ADN mutante; el a Dn mutante se expresa para crear una biblioteca de proteínas mutantes; y la biblioteca se somete a un ensayo de cribado en condición fisiológica normal y en una o más condiciones aberrantes. Las proteínas biológicas activas condicionalmente se seleccionan de aquellas proteínas que exhiben tanto (a) una disminución en la actividad en el ensayo en la condición fisiológica normal en comparación con la proteína de tipo salvaje, y (b) un aumento en la actividad en el ensayo en la condición aberrante en comparación con la proteína de tipo salvaje. Alternativamente, las proteínas biológicas activas condicionalmente se seleccionan de aquellas proteínas que exhiben cambios en la actividad, de forma reversible o irreversible, en dos o más condiciones fisiológicas diferentes. En algunas modalidades, la proteína de tipo salvaje es un anticuerpo.
Generación de moléculas evolucionadas a partir de una molécula parental.
Las proteínas activas condicionalmente se pueden generar a través de un proceso de mutagénesis y cribado de mutaciones individuales para una reducción en la actividad en la condición de tipo salvaje, al permanecer la actividad en condiciones de tipo no salvajes igual o mejor que la actividad en la condición de tipo salvaje.
La descripción proporciona un método para generar una variante de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática, en donde la variante tiene una actividad biológica alterada de la de origen natural, el método comprende (a) modificar el ácido nucleico (i) al sustituir uno o más nucleótidos para un nucleótido diferente, en donde el nucleótido comprende un nucleótido natural o no natural; (ii) eliminar uno o más nucleótidos, (iii) añadir uno o más nucleótidos, o (iv) cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, el nucleótido no natural comprende inosina. En otro aspecto, el método comprende además ensayar la actividad enzimática alterada de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados, de este modo identifica el o los ácidos nucleicos modificados que codifican un polipéptido que tiene actividad enzimática alterada. En un aspecto, las modificaciones de la etapa (a) se realizan mediante PCR, PCR propensa a errores, transposición, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis en casete, mutagénesis de conjunto recursivo, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje del gen, mutagénesis saturada del sitio del gen, reacción en cadena de la ligasa, mutagénesis in vitro, reacción en cadena de la ligasa, síntesis de oligonucleótidos, cualquier técnica de generación de ADN y cualquier combinación de las mismas. En otro aspecto, el método comprende además al menos una repetición de la etapa de modificación (a).
La descripción proporciona además un método para hacer un polinucleótido a partir de dos o más ácidos nucleicos, el método comprende: (a) identificar regiones de identidad y regiones de diversidad entre dos o más ácidos nucleicos, en donde al menos uno de los ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico de la descripción; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos que correspondan en secuencia a al menos dos de los dos o más ácidos nucleicos; y (c) extender los oligonucleótidos con una polimerasa, de este modo produce el polinucleótido. Puede emplearse cualquier técnica de mutagénesis en diversas modalidades de la descripción. La mutagénesis aleatoria o estocástica se ejemplifica mediante una situación en la que se muta (modifica o cambia) una molécula parental para producir un conjunto de moléculas descendientes que tienen mutación(es) que no está(n) predeterminada(s). Así, en una reacción de mutagénesis estocástica in vitro, por ejemplo, no existe un producto predeterminado particular cuya producción se pretenda; más bien existe una incertidumbre, por lo tanto, aleatoriedad, con respecto a la naturaleza exacta de las mutaciones logradas y, por lo tanto, también con respecto a los productos generados. La mutagénesis estocástica se manifiesta en procesos tales como la PCR propensa a errores y la transposición estocástica, donde la(s) mutación(es) lograda(s) es(son) aleatoria(s) o no predeterminada(s). Las formas variantes pueden generarse mediante una transcripción propensa a errores, tal como una PCR propensa a errores o el uso de una polimerasa que carece de actividad de corrección de pruebas (ver, Liao (1990) Gen 88: 107-111), de la primera forma variante, o por replicación de la primera forma en una cepa mutante (las células huésped mutantes se analizan con más detalle a continuación y son generalmente bien conocidas). Una cepa mutante puede incluir cualquier mutante en cualquier organismo alterado en las funciones de reparación de errores de apareamiento. Estos incluyen productos de genes mutantes de mutS, mutT, mutH, mutL, ovrD, dcm, vsr, umuC, umuD, sbcB, recJ, etc. La alteración se lleva a cabo por mutación genética, reemplazamiento alélico, inhibición selectiva mediante un reactivo añadido tal como un compuesto pequeño o un ARN antisentido expresado, u otras técnicas. La alteración puede ser de los genes señalados o de genes homólogos en cualquier organismo. Los métodos de mutagénesis actuales de uso generalizado para crear proteínas alternativas a partir de una molécula inicial son las tecnologías de mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, reacciones en cadena de la polimerasa propensa a error (PCR propensa a error) y la mutagénesis por casete, en la que la región específica a optimizar se reemplaza con un oligonucleótido mutagenizado sintéticamente. En estos casos, se generan varios sitios mutantes alrededor de determinados sitios en la secuencia original.
En la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, una secuencia corta se reemplaza con un oligonucleótido mutagenizado sintéticamente. En la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, una secuencia corta del polinucleótido se elimina del polinucleótido mediante el uso de digestión con enzimas de restricción y se reemplaza con un polinucleótido sintético en el que se han alterado diversas bases de la secuencia original. La secuencia de polinucleótidos también puede alterarse mediante mutagénesis química. Los mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina o ácido fórmico. Otros agentes que son análogos de los precursores de nucleótidos incluyen nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina o acridina. Generalmente, estos agentes se añaden a la reacción de PCR en lugar del precursor de nucleótidos, de este modo muta la secuencia. También se pueden usar agentes intercalantes tales como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares. La mutagénesis aleatoria de la secuencia de polinucleótidos también puede lograrse mediante irradiación con rayos X o luz ultravioleta. Generalmente, los polinucleótidos de plásmidos así mutagenizados se introducen en E. coli y se propagan como un conjunto o biblioteca de plásmidos híbridos.
La PCR propensa a errores usa condiciones de polimerización de baja fidelidad para introducir aleatoriamente un bajo nivel de mutaciones puntuales en una secuencia larga. En una mezcla de fragmentos de secuencia desconocida, se puede usar PCR propensa a errores para mutagenizar la mezcla.
En la mutagénesis de casete, un bloque de secuencia de un molde sencillo se reemplaza típicamente por una secuencia (parcialmente) aleatoria. Reidhaar-Olson JF y Sauer RT: Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science 241(4861):53-57, 1988.
Alternativamente, cualquier técnica de mutagénesis no estocástica o no aleatoria puede emplearse en diversas modalidades de la descripción. La mutagénesis no estocástica se ejemplifica mediante una situación en la que se muta (modifica o cambia) una molécula parental para producir una molécula descendiente que tiene una o más mutaciones predeterminadas. Se aprecia que la presencia de productos de fondo en alguna cantidad es una realidad en muchas reacciones donde ocurre procesamiento molecular, y la presencia de estos productos de fondo no resta valor a la naturaleza no estocástica de un proceso de mutagénesis que tiene un producto predeterminado. La mutagénesis de saturación de sitio y el reensamblaje de ligación sintética son ejemplos de técnicas de mutagénesis en las que la(s) estructura(s) química(s) exacta(s) del(los) producto(s) deseado(s) está(n) predeterminada(s).
Un método de mutagénesis de saturación de sitio se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2009/0130718. Este método proporciona un conjunto de cebadores degenerados correspondientes a los codones de un polinucleótido molde y realiza la elongación con polimerasa para producir polinucleótidos descendientes, que contienen secuencias correspondientes a los cebadores degenerados. Los polinucleótidos descendientes se pueden expresar y cribar para la evolución dirigida. Específicamente, este es un método para producir un conjunto de polinucleótidos descendientes, que comprende las etapas de (a) proporcionar copias de un polinucleótido molde, cada uno comprende una pluralidad de codones que codifican una secuencia polipeptídica molde; y (b) para cada codón del polinucleótido molde, realizar las etapas de (1) proporcionar un conjunto de cebadores degenerados, donde cada cebador comprende un codón degenerado correspondiente al codón del polinucleótido molde y al menos una secuencia adyacente que es homóloga a una secuencia adyacente al codón del polinucleótido molde; (2) proporcionar condiciones que permitan que los cebadores se hibriden con las copias de los polinucleótidos molde; y (3) realizar una reacción de elongación con polimerasa a partir de los cebadores a lo largo del molde; de este modo produce polinucleótidos descendientes, cada uno de los cuales contiene una secuencia correspondiente al codón degenerado del cebador hibridado; de este modo produce un conjunto de polinucleótidos descendientes.
La mutagénesis de saturación de sitio se relaciona con la evolución dirigida de ácidos nucleicos y el cribado de clones que contienen los ácidos nucleicos evolucionados para la(s) actividad(es) resultante(s) de interés, tal(es) actividad(es) de ácido nucleico y/o proteína específica, particularmente actividad(es) enzimática(s) de interés.
Las moléculas mutagenizadas proporcionadas por esta técnica pueden tener moléculas quiméricas y moléculas con mutaciones puntuales, que incluyen moléculas biológicas que contienen un carbohidrato, un lípido, un ácido nucleico y/o un componente proteico, y ejemplos específicos pero no limitantes de estos incluyen antibióticos, anticuerpos, enzimas y hormonas esteroideas y no esteroideas.
La mutagénesis de saturación de sitio se refiere generalmente a un método para: 1) preparar una generación descendiente de molécula(s) (que incluyen una molécula que se compone de una secuencia de polinucleótidos, una molécula que se compone de una secuencia de polipéptidos y una molécula que se compone de parte de una secuencia polinucleotídica y en parte de una secuencia polipeptídica), que se mutageniza para lograr al menos una mutación puntual, adición, eliminación y/o quimerización, a partir de uno o más moldes de generación ancestrales o parentales; 2) cribar la(s) molécula(s) de generación descendiente, preferentemente mediante el uso de un método de alto rendimiento, para al menos una propiedad de interés (tal como una mejora en una actividad enzimática o un aumento en la estabilidad o un nuevo efecto quimioterapéutico); 3) opcionalmente obtener y/o catalogar información estructural y/o funcional con respecto a las moléculas de generación parentales y/o descendientes; y 4) opcionalmente repetir cualquiera de las etapas 1) a 3).
En la mutagénesis de saturación de sitio, se genera (por ejemplo, a partir de un molde de polinucleótido parental)-en lo que se denomina "mutagénesis de saturación de sitio de codón"- una generación de polinucleótidos descendientes, cada uno tiene al menos un conjunto de hasta tres mutaciones puntuales contiguas (es decir, diferentes bases que comprenden un nuevo codón), de modo que cada codón (o cada familia de codones degenerados que codifican el mismo aminoácido) se representa en cada posición de codón. En correspondencia con esta generación de polinucleótidos descendientes, y codificados por esta, también se genera un conjunto de polipéptidos descendientes, cada uno tiene al menos una mutación puntual de un solo aminoácido. En un aspecto preferido, se genera, en lo que se denomina "mutagénesis de saturación del sitio de aminoácidos", uno de tales polipéptidos mutantes para cada una de las 19 sustituciones de alfa-aminoácidos formadores de polipéptidos codificados naturalmente en todas y cada una de las posiciones de aminoácidos a lo largo del polipéptido. Esto produce, para todas y cada una de las posiciones de los aminoácidos a lo largo del polipéptido parental, un total de 20 polipéptidos descendientes distintos, que incluyen el aminoácido original, o potencialmente más de 21 polipéptidos descendientes distintos si se usan aminoácidos adicionales en lugar de o en adición a los 20 aminoácidos codificados naturalmente.
También se pueden emplear otras técnicas de mutagénesis que implican la recombinación y, más específicamente, un método para preparar polinucleótidos que codifican un polipéptido mediante un método de reagrupación in vivo de secuencias de polinucleótidos que contienen regiones de homología parcial, al ensamblar los polinucleótidos para formar al menos un polinucleótido y cribar los polinucleótidos para la producción de polipéptido(s) que tiene(n) una propiedad útil.
En otro aspecto, las técnicas de mutagénesis explotan la propiedad natural de las células para recombinar moléculas y/o mediar en procesos reductores que reducen la complejidad de las secuencias y la extensión de secuencias repetidas o consecutivas que poseen regiones de homología.
Se pueden usar diversas técnicas de mutagénesis solas o en combinación para proporcionar un método para generar polinucleótidos híbridos que codifican polipéptidos híbridos activos biológicamente con actividades potenciadas. Para lograr estos y otros objetivos, se ha proporcionado, de acuerdo con un aspecto de la descripción, un método para introducir polinucleótidos en una célula huésped adecuada y crecer la célula huésped en condiciones que producen un polinucleótido híbrido.
Se han producido genes quiméricos mediante la unión de 2 fragmentos de polinucleótidos mediante el uso de extremos cohesivos compatibles generados por enzima(s) de restricción, donde cada fragmento se deriva de una molécula progenitora (o parental) independiente. Otro ejemplo es la mutagénesis de una posición de codón sencilla (es decir, para lograr una sustitución, adición o eliminación de codón) en un polinucleótido parental para generar un polinucleótido descendiente sencillo que codifica un polipéptido mutagenizado en un sitio sencillo.
Además, se han utilizado sistemas de recombinación específica de sitio in vivo para generar híbridos de genes, así como métodos aleatorios de recombinación in vivo y recombinación entre genes homólogos pero truncados en un plásmido. También se ha informado de mutagénesis por extensión de superposición y PCR.
Se han usado métodos no aleatorios para lograr un mayor número de mutaciones puntuales y/o quimerizaciones, por ejemplo, se han usado estrategias integrales o exhaustivas para generar todas las especies moleculares dentro de un grupo particular de mutaciones, para atribuir funcionalidad a grupos estructurales específicos en una molécula molde (por ejemplo, una posición de un solo aminoácido específica o una secuencia compuesta por dos o más posiciones de aminoácidos), y para clasificar y comparar grupos específicos de mutaciones.
Cualquiera de estos u otros métodos de evolución pueden emplearse en la presente descripción para generar una nueva población de moléculas (biblioteca) a partir de una o más moléculas parentales.
Una vez formadas, las construcciones pueden, o no, fraccionarse por tamaño en un gel de agarosa de acuerdo con los protocolos publicados, insertarse en un vector de clonación y transfectarse en una célula huésped apropiada. En algunas modalidades, la etapa de evolución se dirige a la región Fc de un anticuerpo de tipo salvaje. En estas modalidades, la región Fc del anticuerpo de tipo salvaje se modifica en el anticuerpo activo condicionalmente resultante. Las regiones Fc que pueden modificarse incluyen la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, en un anticuerpo IgG de longitud completa que incluye anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de longitud completa, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado), o en un proteína de fusión que contiene una región Fc, o una parte de una región Fc (denominada "proteína de fusión de inmunoglobulina (Ig)", "proteína de fusión Fc" o "polipéptido de fusión Fc").
Se han descrito en la técnica regiones Fc modificadas de anticuerpos, que se incluyen en el documento US2006/0104989. Las regiones Fc modificadas pueden tener una sustitución de un solo aminoácido (también denominada variante Fc en la presente descripción) en relación con la secuencia de una región Fc no modificada correspondiente (de tipo salvaje o parental), y pueden tener una o más propiedades que difieren de una correspondiente de tipo salvaje o parental que tiene una región Fc no modificada, así como de otros anticuerpos que tienen regiones Fc modificadas que se han descrito en la técnica. Tales propiedades pueden incluir, por ejemplo, unión aumentada a uno o más receptores Fc y/o unión modificada en diferentes condiciones de pH.
Las regiones Fc modificadas pueden incorporarse en cualquier anticuerpo o polipéptido de fusión Fc mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular, y se pretende que todos estos anticuerpos modificados y polipéptidos de fusión Fc estén incluidos en la invención. Fc se refiere a los dos últimos dominios Ig de la región constante de IgA, IgD e IgG, y los últimos tres dominios Ig de la región constante de IgE e IgM, y la bisagra N-terminal flexible de estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Fc se une a los receptores, FcR, que están presentes en determinadas células. Como la afinidad de la interacción entre Fc y determinados FcR presentes en células particulares se correlaciona con la citotoxicidad específica, y la eficacia clínica en humanos se correlaciona con el alotipo de formas polimórficas de alta o baja afinidad de determinados FcR, un anticuerpo o polipéptido de fusión con una región Fc optimizada para la unión a uno o más FcR puede dar como resultado una destrucción más eficaz de las células cancerosas.
En determinadas modalidades, las regiones Fc modificadas confieren propiedades mejoradas a un polipéptido o un complejo que incluye un polipéptido en el que se incorpora la región Fc, por ejemplo, un complejo tal como un anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado que incluye una cadena pesada de Ig que tiene una región Fc modificada, tal como unión aumentada o modificada a uno o más FcR, y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) aumentada o modificada, en comparación con un polipéptido o complejo correspondiente, tal como un anticuerpo, que incorpora una región Fc no modificada correspondiente (de tipo salvaje o parental), o una región Fc modificada diferente. En algunas modalidades de la invención, las regiones Fc modificadas confieren una vida media aumentada o disminuida a una molécula.
En una modalidad de la invención, una región Fc modificada de la invención contiene una sustitución. En otras modalidades, una región Fc modificada de la invención contiene dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones en combinación, que pueden potenciar de forma aditiva o sinérgica las propiedades de las regiones Fc modificadas. En otra modalidad, la invención incluye un polipéptido que tiene una región Fc modificada, es decir, es un polipéptido de fusión Fc que contiene una de las sustituciones. En una modalidad, la región que no es Fc del polipéptido de fusión incluye una molécula de unión a la diana. En otras modalidades, la invención incluye un polipéptido que tiene una región Fc modificada de la invención que contiene dos, tres, cuatro, cinco, seis, diez, doce o más sustituciones en combinación.
Además del polipéptido, proteína u otro complejo, por ejemplo, un conjugado, que incorpora una región Fc modificada, la invención también abarca polinucleótidos y vectores de expresión que codifican una región Fc modificada o polipéptidos que tienen una región Fc modificada, que incluye bibliotecas de esos polinucleótidos y vectores de expresión, células huésped en las que se han introducido tales polinucleótidos o vectores de expresión, por ejemplo, para que la célula huésped produzca un polipéptido que tenga la región Fc modificada, bibliotecas de células huésped y métodos para producir, cultivar o manipular las células huésped o bibliotecas de células huésped. Por ejemplo, la invención incluye el cultivo de tales células huésped de modo que se produzca un polipéptido con una región Fc modificada, por ejemplo, se secrete o se libere de otro modo de la célula huésped. También se abarcan composiciones farmacéuticas y kits que incluyen un polipéptido, proteína u otro complejo con una región Fc modificada y/o polinucleótidos, vectores de expresión o células huésped que codifican polipéptidos que tienen tal región Fc modificada. Además, la invención también abarca el uso de un polipéptido, proteína o conjugado con una región Fc modificada, tal como en los ensayos de unión al receptor Fc o para inducir la actividad ADCC in vitro o in vivo. La invención también proporciona un polipéptido, proteína, conjugado, polinucleótido, vector de expresión y/o célula huésped de la invención para su uso en terapia médica, así como el uso de un polipéptido, proteína u otro complejo, polinucleótido, vector de expresión y /o célula huésped de la invención para la fabricación de un medicamento, por ejemplo, útil para inducir la actividad de ADCC in vitro o in vivo.
Una "Fc parental", como se usa en la presente descripción, puede ser una región Fc de origen natural de una clase de anticuerpo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. Alternativamente, la fuente de un Fc parental es una región Fc de un anticuerpo de origen natural, que incluye IgG1, IgG1, IgG3, IgG4, IgAl o IgA2. Una región Fc parental que se va a modificar puede seleccionarse por su afinidad de unión a FcR y/o patrón de unión a FcR, y una región Fc modificada tiene al menos una afinidad potenciada por al menos un FcR, pero de otro modo puede tener el mismo patrón de unión a FcR. como la región Fc parental.
Una región Fc parental es preferentemente una que interactúa con uno o más FcR, que incluyen, pero no se limitan a, FcyR, FcaR, PopR, Fc8R, FcRn y FcyR viral. Una región Fc modificada derivada de tal región Fc parental es aquella que tiene una interacción potenciada con uno o más FcR y ADCC potenciada, en relación con la región Fc parental. ADCC generalmente requiere que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo). Los métodos para detectar la unión de FcR y ADCC son conocidos en la técnica. Los FcR se definen por su especificidad para los isotipos de inmunoglobulina y son bien conocidos en la técnica. Una fusión que contiene Fc incluye un polipéptido donde una región Fc con unión a FcR favorable y, opcionalmente, farmacocinética favorable, está unida a una o más moléculas. El enlace puede ser de naturaleza sintética, por ejemplo, mediante conjugación química, o mediante expresión recombinante, es decir, se forma un polipéptido de fusión. Por lo tanto, la molécula unida a una región Fc puede ser una molécula útil para aislar o purificar la región Fc, por ejemplo, una etiqueta tal como Flag-tag, Strep-tag, glutatión S transferasa, proteína de unión a maltosa (MBP) o His-tag, u otro polipéptido heterólogo, por ejemplo, un ligando para un receptor, un dominio extracelular de un receptor, o una región variable de una cadena pesada de Ig, y/u otra molécula.
Un vector que codifica una región Fc modificada o un polipéptido que contiene una región Fc tal como una cadena pesada de Ig con una región Fc modificada u otro polipéptido de fusión Fc puede introducirse en una célula huésped, opcionalmente junto con otros vectores, por ejemplo, un vector que codifica una cadena ligera de Ig, o en una célula huésped modificada para expresar otro polipéptido tal como una cadena ligera de Ig, o en una transcripción/reacción de transcripción in vitro, para expresar el polipéptido codificado. La región Fc modificada, la cadena pesada de Ig y la cadena ligera de Ig también pueden expresarse en el mismo vector e introducirse en una célula huésped. Para algunos sistemas de expresión, las células huésped pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según corresponda para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar las secuencias deseadas. Un polipéptido resultante con una región Fc modificada se aísla opcionalmente, por ejemplo, a partir de sobrenadantes de células huésped, y se criba para una o más actividades.
En una modalidad, la región Fc puede ser una que esté anclada a la superficie de una célula, tal como una célula huésped, por ejemplo, mediante fusión con un dominio transmembrana.
Las células huésped adecuadas para expresar el polinucleótido en los vectores son las células procariotas, de levadura o eucarióticas superiores. Los procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Kiebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis, Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras también son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican variantes polipeptídicas. Pueden emplearse Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thermotolerans y K. marxianus; Pichia pastoris, Candida, Trichoderma reesia, Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus. Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados para la expresión del polipéptido glicosilado incluyen células de plantas e insectos. Los ejemplos de huéspedes de generación de células eucarióticas, cribado y producción incluyen células fibroblásticas de ratón 3T3, células fibroblásticas de hámster sirio BHK21, células epiteliales de perro, MDCK, células epiteliales humanas Hela, células epiteliales de rata canguro PtK1, células plasmáticas de ratón SP2/0, y células plasmáticas de ratón NS0, células renales embrionarias humanas HEK 293, células renales de mono COS, células de ovario de hámster chino CHO, CHO-S, células embrionarias de ratón R1, células embrionarias de ratón E14.1, células embrionarias humanas H1, células embrionarias humanas H9 y células embrionarias humanas PER C.6. Pueden usarse numerosas cepas y variantes de baculovirus y las células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes albopictus, Drosophila melanogaster y Bombyx mori. Por ejemplo, pueden usarse vectores virales para introducir un polinucleótido, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soya, petunia, tomate y tabaco. Los ejemplos de células de vertebrados útiles incluyen células de mamíferos, por ejemplo, células humanas, de simio, canino, felino, bovino, equino, caprino, ovino, porcino o de roedor, por ejemplo, células de conejo, rata, visón o ratón, tales como células CHO. Pueden emplearse plantas transgénicas y animales no humanos como sistemas de expresión, aunque los patrones de glicosilación en esas células pueden ser diferentes de las glicoproteínas humanas. En una modalidad, se emplean roedores transgénicos como sistemas de expresión. También se puede emplear la expresión bacteriana. Aunque las proteínas expresadas en bacterias carecen de glicosilación, otras alteraciones pueden compensar cualquier actividad reducida, tales como una estabilidad y solubilidad deficientes, que pueden resultar de la expresión procariota.
Opcionalmente, una región Fc o un polipéptido que contiene Fc se aísla de las células huésped, por ejemplo, de sobrenadantes de células huésped, o una mezcla de transcripción/traducción in vitro, lo que produce una composición. Un polipéptido aislado en la composición es uno que ha sido aislado de al menos otra molécula encontrada en células huésped, sobrenadantes de células huésped o la mezcla de transcripción/traducción, por ejemplo, por fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio de aniones tales como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel mediante el uso, por ejemplo, de Sephadex G-75; o cromatografía de afinidad a ligando. Para algunas aplicaciones, el polipéptido aislado en la composición es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferentemente comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar), más preferentemente más de aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % y aproximadamente 99 % de todas las especies macromoleculares presentes. La región Fc aislada o el polipéptido que contiene Fc puede someterse a más alteraciones in vitro, por ejemplo, tratarse con enzimas o productos químicos tales como proteasas, moléculas tales como las que alteran la glicosilación o las que son útiles para conjugar (acoplar) la región Fc aislada o Región Fc que contiene el polipéptido a otra molécula, tal como un marcador que incluye, pero no se limita a, marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánidos, fósforos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, /3-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, grupos de avidina o epítopos polipeptídicos reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de zipper de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos), azúcares, lípidos, grasas, moléculas paramagnéticas o emisores de ondas sonoras, metales o polímeros sintéticos.
Los métodos para cribar actividades asociadas con polipéptidos o complejos que incorporan una región Fc, incluyen, pero no se limitan a, la unión a FcR (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 6,737,056, la Patente de Estados Unidos No. 7,217,797, y la Patente de Estados Unidos No. 8,088 376), son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para evaluar la actividad ADCC de un polipéptido que contiene Fc, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro y/o in vivo mediante el uso de relaciones efector:diana variables, por ejemplo, células PBMC y NK o en un modelo animal, respectivamente. En una modalidad, los polipéptidos que contienen Fc expresados por las células huésped se criban para potenciar la afinidad o la actividad de unión al receptor FcR in vitro y/o in vivo y/o la actividad ADCC in vitro y/o in vivo. En una modalidad, la unión de un FcR por un polipéptido que contiene Fc con una región Fc modificada es mayor que la unión de ese receptor por un polipéptido correspondiente con una región Fc no modificada.
Por lo tanto, mediante la introducción de modificaciones de la secuencia de aminoácidos descritas en la presente descripción en una región Fc de tipo salvaje o parental o una región Fc que contiene un polipéptido, dicha región Fc de tipo salvaje o parental provoca preferentemente ADCC y, opcionalmente, es una región Fc humana, por ejemplo, una secuencia IgG humana de la región Fc humana de la secuencia nativa, se obtiene una región Fc modificada que se une a FcR con mejor afinidad y media ADCC en presencia de células efectoras humanas más eficazmente que la región Fc de tipo salvaje o parental o el polipéptido que contiene la región Fc. Se identifican los FcR solubles, tales como el CD16 humano soluble recombinante y el CD32 humano soluble recombinante, que se pueden poner en contacto con una o más regiones Fc modificadas diferentes en paralelo, y las regiones Fc modificadas que tienen una o más sustituciones que potencian la unión a CD16 humano pero no a CD32 humano, en relación con una región Fc no modificada. Esas sustituciones se pueden combinar con otras sustituciones que potencian la unión. Una combinación de sustituciones en una región Fc o un polipéptido que contiene una región Fc puede producir una región Fc modificada combinatoriamente, o un polipéptido que contiene una región Fc modificada combinatoriamente con propiedades potenciadas sinérgicamente.
Otros métodos para identificar polipéptidos con regiones Fc modificadas, incluyen anticuerpos con una región Fc modificada, con propiedades deseables y, por lo tanto, una secuencia de polinucleótidos correspondiente, pueden emplearse solos o en combinación con los métodos descritos anteriormente, incluyen el uso de modelados, por ejemplo, modelados 3D, de regiones Fc modificadas, preferentemente en el contexto de la molécula cuya actividad se va a cribar, por ejemplo, un anticuerpo con la región Fc, para seleccionar regiones Fc con características particulares. Las características que pueden cribarse mediante el modelado incluyen, pero no se limitan a, un ángulo particular cerca de los sitios de unión de FcR, arquitectura de bisagra e interacciones de cadenas intra- e intermoleculares, por ejemplo, sustituciones que promueven o interrumpen interacciones hidrofóbicas o estabilizan la conformación en una región en particular. Por lo tanto, se puede emplear un modelo 3D de un polipéptido que contiene una región Fc que tiene al menos una o más posiciones sustituidas para identificar combinaciones de sustituciones que se introducirán en un polinucleótido para la expresión en células huésped.
Las variantes de Fc, estén o no incorporadas en un polipéptido heterólogo, por ejemplo, incorporadas en una fusión de Fc con un ligando para un receptor de superficie celular, por ejemplo, ligando de CTLR-4 o cadena pesada de un anticuerpo, o conjugadas con una molécula de interés, así como polinucleótidos y células huésped que codifican esas variantes, opcionalmente en combinación con uno o más agentes, por ejemplo, reactivos terapéuticos o de investigación, son útiles en una diversidad de métodos, por ejemplo, en métodos de cribado, métodos profilácticos, métodos terapéuticos, métodos veterinarios y métodos agrícolas. El uno o más de los otros agentes incluyen otra región Fc o polipéptidos que contienen región Fc, que incluyen aquellos con regiones Fc no modificadas. En una modalidad, se incorpora una variante de Fc en un anticuerpo u otro polipéptido de fusión Fc y ese anticuerpo o polipéptido de fusión Fc, opcionalmente junto con una o más composiciones útiles, se emplea para dirigirse a células particulares.
En una modalidad, una variante de Fc que contiene un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une al antígeno se dirige y opcionalmente destruye las células diana que portan el antígeno diana. En otra modalidad, una variante de Fc que contiene un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une al antígeno se dirige y activa las células que portan el antígeno diana, por ejemplo, de ese modo aumenta la expresión de otro antígeno, tal como un antígeno viral o celular. En una modalidad, las variantes de Fc o los polipéptidos que incorporan una variante de Fc se pueden usar para prevenir, inhibir o tratar diversas afecciones o enfermedades, en humanos y no humanos, que incluyen los mamíferos no humanos. Por ejemplo, se puede administrar un anticuerpo que contiene una región Fc modificada a un ser humano o a un animal no humano que corre el riesgo de, por ejemplo, ser propenso a tener una enfermedad, antes del inicio de la enfermedad y así prevenir o inhibir una o más síntomas de esa enfermedad. Una región Fc o un polipéptido que contiene una región Fc, o un conjugado del mismo, puede administrarse después de la manifestación clínica de una enfermedad en un ser humano o en un animal no humano para inhibir o tratar la enfermedad. En una modalidad, se administra una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un polipéptido de fusión Fc a un ser humano o un animal no humano con una enfermedad autoinmunitaria, inmunológica, infecciosa, inflamatoria, neurológica o neoplásica, por ejemplo, cáncer.
Las regiones Fc o una región Fc que contiene polipéptidos pueden administrarse solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, que incluyen, pero no se limitan a, agentes citotóxicos, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de cinasa, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores u otros agentes terapéuticos, en cantidades que sean eficaces para el propósito previsto. El médico experto puede determinar empíricamente la dosis o dosis apropiadas de agentes terapéuticos que incluyen regiones Fc o polipéptidos que contienen regiones Fc, por lo que pueden administrarse concomitantemente con uno o más regímenes terapéuticos. Por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de fusión Fc puede administrarse a un paciente junto con quimioterapia u otra terapia, por ejemplo, otros agentes tales como un agente antiangiogénico, una citocina, terapia con radioisótopos o quimioterapia y otras terapias. En una modalidad, la fusión de anticuerpo o Fc se puede administrar junto con uno o más anticuerpos o fusiones de Fc, que pueden comprender o no una variante de Fc. En una modalidad, un polipéptido que contiene Fc se administra con un agente quimioterapéutico, es decir, un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Un agente quimioterapéutico u otro citotóxico puede administrarse como un profármaco, es decir, está en forma de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células en comparación con el fármaco y es capaz de convertirse en el fármaco.
También se contemplan composiciones farmacéuticas que tienen una región Fc, un polipéptido de fusión Fc, anticuerpos que tienen una región Fc o conjugados de los mismos, formulados opcionalmente con uno o más agentes. Las formulaciones de anticuerpos, regiones Fc o polipéptidos que contienen la región Fc, o conjugados, se preparan para el almacenamiento al mezclar los anticuerpos, regiones Fc o polipéptidos que contienen la región Fc, o conjugados, que tienen el grado deseado de pureza con vehículos opcionales farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores ( Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed., 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como antioxidantes; parabenos de alquilo; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); polímeros hidrofílicos; aminoácidos; monosacáridos; y otros carbohidratos; agentes quelantes; rellenos; agentes aglutinantes; aditivos; agentes colorantes; contraiones formadores de sal; complejos metálicos; y/o tensioactivos no iónicos. Otras formulaciones incluyen formulaciones basadas en lípidos o tensioactivos y formulaciones basadas en micropartículas o nanopartículas, que incluyen las formulaciones de dosificación de liberación sostenida, que se preparan mediante métodos conocidos en la técnica.
La concentración de la región Fc, anticuerpo u otro polipéptido que contiene la región Fc en la formulación puede variar de aproximadamente 0,1 a 100 % en peso. En una modalidad preferida, la concentración de la región Fc, el anticuerpo o el polipéptido de fusión Fc está en el intervalo de 0,001 a 2,0 M. Para tratar a un paciente, puede administrarse una dosis efectiva de la región Fc, o anticuerpo u otro polipéptido que contiene la región Fc y conjugados de los mismos.
Por "dosis terapéuticamente eficaz" se entiende en la presente descripción una dosis que produce los efectos para los que se administra. Las dosis pueden oscilar de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal o más, por ejemplo, 0,1, 1, 10 o 50 mg/kg de peso corporal, se prefiere de 1 a 30 mg/kg, aunque otras dosis pueden proporcionar resultados beneficiosos. La cantidad administrada se selecciona para prevenir el tratamiento de una condición o enfermedad particular. La administración de la región Fc, o anticuerpo u otro polipéptido que contiene la región Fc, y conjugados de los mismos, puede ser continua o intermitente, en dependencia, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración de la región Fc, o el anticuerpo u otro polipéptido que contiene la región Fc, y conjugados de los mismos, puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas. Se contempla tanto la administración local como la sistémica.
La administración de la composición farmacéutica que comprende una región Fc, un anticuerpo u otro polipéptido que contiene Fc y conjugados, preferentemente en forma de una solución acuosa estéril, se puede realizar en una diversidad de vías, que incluyen, pero no se limitan a, oralmente, subcutáneamente, intravenosamente, intranasalmente, intraóticamente, transdérmicamente, tópicamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonarmente, tecnología inhalable, vaginalmente, parenteralmente, rectalmente e intraocularmente. En algunos casos, por ejemplo, para el tratamiento de heridas, inflamación, etc., el anticuerpo o la fusión de Fc se pueden aplicar directamente como solución o pulverización.
Algunas referencias que describen técnicas que pueden usarse en l etapa de evolución de la presente invención incluyen Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook y otros, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Servicio de Salud Pública de Estados Unidos, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda (1991); Carter y otros, Nucleic Acids Res., 13:4431 (1985) Kunkel y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1987); Higuchi, en pCr Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Vallette y otros, Nuc. Acids Res., 17:723 (1989) Wells y otros, Gene, 34:315 (1985); Gazzano-Santoro y otros, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996); Green y otros, Nature Genet., 7:13 (1994); Lonberg y otros, Nature, 368:856 (1994); Taylor y otros, Int. Immun., 6:579 (1994); McCafferty y otros, Nature, 348:552 (1990); Johnson y Chiswell, Current Opinion in Structural Biology, 3_:5564 (1993); Dall'Acqua, y otros, The Journal of Immunology, 169: 5171­ 5180 (2002); Yeung, y otros, The Journal of Immunology, 182: 7663-7671 (2009); Zalevsky, y otros, Nature Biotechnology; doi: 10.1038/nbt.1601 (publicado en línea 17 de Enero de 2010); y Dall'Acqua, y otros, The Journal of Biological Chemistry, Vol 281, Núm 33, 23515-23524 (2006),.
Expresión de Moléculas Evolucionadas
Una vez que se genera una biblioteca de moléculas mutantes, el ADN se puede expresar mediante el uso de técnicas de biología molecular de rutina. Por lo tanto, la expresión de proteínas se puede dirigir mediante el uso de diversos métodos conocidos.
Por ejemplo, brevemente, se puede evolucionar un gen de tipo salvaje mediante el uso de cualquier diversidad de métodos aleatorios o no aleatorios tales como los indicados en la presente descripción. A continuación, las moléculas de ADN mutante se digieren y se ligan en el ADN del vector, tal como el ADN plasmídico, mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular. El ADN del vector que contiene mutantes individuales se transforma en bacterias u otras células mediante el uso de protocolos estándar. Esto se puede hacer en un pocillo individual de una bandeja de pocillos múltiples, tales como una bandeja de 96 pocillos para la expresión y el cribado de alto rendimiento. El proceso se repite para cada molécula mutante.
Los polinucleótidos seleccionados y aislados como se describe se introducen en una célula huésped adecuada. Una célula huésped adecuada es cualquier célula que sea capaz de promover la recombinación y/o el reordenamiento reductivo. Los polinucleótidos seleccionados preferentemente ya están en un vector que incluye secuencias de control apropiadas. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o preferentemente, la célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación (por ejemplo Ecker y Davis, 1986, Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense r Na , Proc Natl Acad Sci USA, 83:5372-5376).
Como ejemplos representativos de vectores de expresión que pueden usarse, se pueden mencionar partículas virales, baculovirus, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN viral (por ejemplo, vaccinia, adenovirus, virus de la viruela, pseudorrabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales basados en PI, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura y cualquier otro vector específico para huéspedes específicos de interés (tales como bacillus, aspergillus y levadura). Así, por ejemplo, el ADN puede incluirse en cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; Bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido u otro vector siempre que sea replicable y viable en el huésped. Pueden emplearse vectores de bajo número de copias o de alto número de copias con la presente descripción.
La secuencia de ADN en el vector de expresión se une operativamente a una secuencia o secuencias de control de expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis de ARN. Los promotores bacterianos mencionados en particular incluyen lad, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucarióticos incluyen CMV inmediatamente temprano, timidina cinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína-1 de ratón. La selección del vector y el promotor apropiados se encuentra dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Las regiones promotoras se pueden seleccionar de cualquier gen deseado mediante el uso de vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables. Además, los vectores de expresión contienen preferentemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas, tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.
Por lo tanto, en otro aspecto de la descripción, se pueden generar nuevos polinucleótidos mediante el proceso de redistribución reductiva. El método implica la generación de construcciones que contienen secuencias consecutivas (secuencias de codificación originales), su inserción en un vector apropiado y su posterior introducción en una célula huésped apropiada. El reordenamiento de las identidades moleculares individuales se produce mediante procesos combinatorios entre las secuencias consecutivas de la construcción que poseen regiones de homología, o entre unidades casi repetidas. El proceso de reordenamiento recombina y/o reduce la complejidad y extensión de las secuencias repetidas y da como resultado la producción de nuevas especies moleculares. Se pueden aplicar diversos tratamientos para mejorar la tasa de redistribución. Estos podrían incluir el tratamiento con luz ultravioleta, o productos químicos que dañan el ADN, y/o el uso de líneas de células huésped que muestran niveles potenciados de "inestabilidad genética". Por lo tanto, el proceso de reordenamiento puede implicar la recombinación homóloga o la propiedad natural de las secuencias cuasi-repetidas de dirigir su propia evolución.
En un aspecto, el organismo o célula huésped comprende una bacteria gramnegativa, una bacteria grampositiva o un organismo eucariótico. En otro aspecto de la descripción, la bacteria gramnegativa comprende Escherichia coli o Pseudomonas fluorescens. En otro aspecto de la descripción, la bacteria grampositiva comprende Streptomyces diversa, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris o Bacillus subtilis. En otro aspecto de la descripción, el organismo eucariótico comprende Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula plymorpha o Aspergillus niger. Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como levaduras; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; y células vegetales. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente descripción.
Con referencias particulares a diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos que pueden emplearse para expresar proteína recombinante, los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas en "SV40- transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants". (Gluzman, 1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas flanqueantes en 5'. Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40 y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.
A continuación, las células se propagan y se efectúa la "reordenación reductiva". La velocidad del proceso de redistribución reductiva puede estimularse mediante la introducción de daño en el ADN si se desea, la redistribución in vivo se enfoca en procesos "intermoleculares" denominados colectivamente como "recombinación", que en las bacterias generalmente se considera como un "fenómeno dependiente de RecA". La descripción puede basarse en los procesos de recombinación de una célula huésped para recombinar y reordenar secuencias, o en la capacidad de las células para mediar en procesos reductores para disminuir la complejidad de secuencias casi repetidas en la célula por eliminación. Este proceso de "reordenación reductiva" se produce mediante un proceso "intramolecular", independiente de RecA. El resultado final es una reorganización de las moléculas en todas las combinaciones posibles.
Las células huésped que contienen los polinucleótidos de interés pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según corresponda para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia.
La expresión de proteínas se puede inducir mediante una diversidad de métodos conocidos, y se han publicado muchos sistemas genéticos para la inducción de la expresión de proteínas. Por ejemplo, con sistemas apropiados, la adición de un agente inductor inducirá la expresión de proteínas. A continuación, las células se sedimentan mediante centrifugación y se elimina el sobrenadante. La proteína periplásmica se puede enriquecer al incubar las células con ADNasa, ARNasa y lisozima. Después de la centrifugación, el sobrenadante, que contiene la nueva proteína, se transfiere a una nueva bandeja de múltiples pocillos y se almacena antes del ensayo.
Las células normalmente se cosechan por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante se retiene para una mayor purificación. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método conveniente, que incluyen ciclos de congelación y descongelación, ultrasonidos, ruptura mecánica o uso de agentes de lisis celular. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. El polipéptido expresado o fragmento del mismo puede recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Las etapas de replegamiento de proteínas pueden usarse, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación.
Los clones que se identifican como que tienen la actividad deseada pueden entonces secuenciarse para identificar la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima que tiene la actividad potenciada.
Los polipéptidos que se identifican a partir de tales bibliotecas se pueden usar con propósitos terapéuticos, de diagnóstico, de investigación y relacionados, y/o se pueden someter a uno o más ciclos adicionales de transposición y/o selección. La descripción proporciona un fragmento de la proteína biológica activa condicionalmente que tiene una longitud de al menos 10 aminoácidos, y en el que el fragmento tiene actividad.
La descripción proporciona un polipéptido con codones optimizados o un fragmento del mismo, que tiene actividad enzimática, en donde el uso de codones está optimizado para un organismo o célula particular. Narum y otros, " Codon optimization of gene fragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccine protein expression and immunogenicity in mice". Infect. Immun. Diciembre de 2001, 69(12):7250-3 describe la optimización de codones en el sistema del ratón. Outchkourov y otros, "Optimization of the expression of Equistatin in Pichia pastoris, protein expression and purification", Protein Expr. Purif. Febrero de 2002; 24(1): 18-24 describe la optimización de codones en el sistema de levadura. Feng y otros, "High level expression and mutagenesis of recombinant human phosphatidylcholine transfer protein using a synthetic gene: evidence for a C-terminal membrane binding domain" Biochemistry 19 de diciembre de 2000, 39 (50): 15399-409 describe la optimización de codones en E. coli. Humphreys y otros, "High-level periplasmic expression in Escherichia coli using a eukaryotic signal peptide: importance of codon usage at the 5' end of the coding sequence", Protein Expr. Purif. 20 de noviembre de 2000 (2): 252-64 describe cómo el uso de codones afecta la secreción en E. coli.
La evolución de una proteína biológica activa condicionalmente puede verse favorecida por la disponibilidad de un proceso de cribado o selección conveniente de alto rendimiento.
Una vez identificados, los polipéptidos y los péptidos de la descripción pueden ser polipéptidos sintéticos o generados de forma recombinante. Los péptidos y las proteínas se pueden expresar de forma recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la descripción pueden prepararse y aislarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. El polipéptido y los péptidos de la descripción también se pueden sintetizar, en su totalidad o en parte, mediante el uso de métodos químicos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Caruthers (1980) "New chemical methods for synthesizing polynucleotides", Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980), "Synthesis of oligonucleotides on cellulose. Part II: design and synthetic strategy to the synthesis of 22 oligodeoxynucleotides coding for Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP)1", Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede realizar mediante el uso de diversas técnicas en fase sólida (ver, por ejemplo, Roberge (1995) "A strategy for a convergent synthesis of N-linked glycopeptides on a solid support", Science 269:202; Merrifield (1997) "Concept and early development of solid-phase peptide synthesis", Methods Enzymol. 289:3-13) y se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo, mediante el uso del sintetizador de péptidos ABI 43 IA (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Los péptidos y polipéptidos de la descripción también se pueden glicosilar. La glicosilación se puede añadir postraduccionalmente ya sea químicamente o mediante mecanismos biosintéticos celulares, en donde estos últimos incorporan el uso de motivos de glicosilación conocidos, que pueden ser nativos de la secuencia o pueden añadirse como un péptido o añadirse en la secuencia codificante del ácido nucleico. La glicosilación puede ser ligada a O o ligada a N.
Los péptidos y polipéptidos de la descripción, como se definen anteriormente, incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas". Los términos "mimético" y "peptidomimético" se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos de la descripción. El mimético puede estar completamente compuesto de análogos de aminoácidos sintéticos, no naturales, o bien, es una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos de aminoácidos parcialmente no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales siempre que tales sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético. Al igual que con los polipéptidos de la descripción que son variantes conservativas, la experimentación rutinaria determinará si un mimético está dentro del alcance de la descripción, es decir, si su estructura y/o función no se altera sustancialmente.
Las composiciones miméticas de polipéptidos de la descripción pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. En un aspecto alternativo, las composiciones miméticas de la descripción incluyen uno o todos de los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos distintos de los enlaces de unión amida natural ("enlace peptídico"); b) residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos de origen natural; o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, por ejemplo, un giro beta, giro gamma, hoja beta, conformación de hélice alfa y similares. Por ejemplo, un polipéptido de la descripción se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos se unen por medios químicos distintos de los enlaces peptídicos naturales. Los residuos peptidomiméticos individuales pueden unirse mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces amida tradicionales ("enlace peptídico") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, ~C(.dbd.O)~CH.sub.2~ para -C(.dbd.O))-NH-), aminometileno (CH.sub.2-NH), etileno, olefina (CH.dbd.CH), éter (CH.sub.2~O), tioéter (CH.sub.2~S), tetrazol (CN.sub.4--), tiazol, retroamida, tioamida o éster (ver, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, N. Y.).
Un polipéptido de la descripción también se puede caracterizar como un mimético porque contiene todos o algunos residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos de origen natural. Los residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patentes; a continuación se describen algunas composiciones no naturales ilustrativas útiles como miméticos de residuos de aminoácidos naturales y directrices. Pueden generarse miméticos de aminoácidos aromáticos al reemplazar, por ejemplo, por D- o L-nafilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2 tieneilalanina; D- o L- 1,-2, 3- o 4-pireneylalanina; D- o L-3 tieneilalanina; D- o L-(2-piridinil)-alanina; D- o L-(3-piridinil)-alanina; D- o L-(2-pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; D- o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D- o L-2-indol(alquil)alaninas; y D- o L-alquilaninas, donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, sec-isotilo, iso-pentilo o un aminoácido no ácido sustituido o no sustituido. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y piridilo.
Los miméticos de aminoácidos ácidos pueden generarse por sustitución, por ejemplo, por aminoácidos no carboxilatos mientras se mantiene una carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también se pueden modificar selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R'~N-C--N--R') tales como, por ejemplo, 1-ciclohexil-3(2-mocfolinil-(4-etil) carbodiimida o 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil) carbodiimida. El aspartilo o el glutamilo también se pueden convertir en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio. Los miméticos de aminoácidos básicos pueden generarse por sustitución con, por ejemplo, (además de lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina o ácido (guanidino)-acético, o ácido (guanidino)alquil-acético, donde alquilo se define anteriormente. El derivado de nitrilo (por ejemplo, que contiene el resto CN en lugar de COOH) se puede sustituir por asparagina o glutamina. Los residuos de asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar a los correspondientes residuos de aspartilo o glutamilo. Los miméticos de residuos de arginina se pueden generar al hacer reaccionar arginilo con, por ejemplo, uno o más reactivos convencionales, que incluyen, por ejemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona o ninhidrina, preferentemente en condiciones alcalinas. Los miméticos de residuos de tirosina pueden generarse al hacer reaccionar tirosilo con, por ejemplo, compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. El N-acetilimidizol y el tetranitrometano se pueden usar para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los miméticos de residuos de cisteína pueden generarse al hacer reaccionar residuos de cisteinilo con, por ejemplo, alfa-haloacetatos tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida y las aminas correspondientes; para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los miméticos de residuos de cisteína también pueden generarse al hacer reaccionar residuos de cisteinilo con, por ejemplo, bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil) propiónico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; disulfuro de metil 2-piridilo; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4 nitrofenol; o cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Pueden generarse miméticos de lisina (y pueden alterarse los residuos amino terminales) al hacer reaccionar lisinilo con, por ejemplo, succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La lisina y otros miméticos de residuos que contienen alfa-amino también pueden generarse al hacer reaccionar con imidoésteres, como metil picolinimidato, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4, pentanodiona y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Los miméticos de metionina pueden generarse al hacer reaccionar con, por ejemplo, sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, 3- o 4-hidroxi prolina, deshidroprolina, 3- o 4-metilprolina o 3,3,-dimetilprolina. Los miméticos de residuos de histidina pueden generarse al hacer reaccionar histidilo con, por ejemplo, dietilprocarbonato o bromuro de parabromofenacilo. Otros miméticos incluyen, por ejemplo, los generados por hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo; metilación de los grupos alfaamino de lisina, arginina e histidina; acetilación de la amina N-terminal; metilación de residuos de amida de la cadena principal o sustitución con N-metil aminoácidos; o amidación de grupos carboxilo C-terminales.
Un residuo, por ejemplo, un aminoácido, de un polipéptido de la descripción también puede reemplazarse por un aminoácido (o residuo peptidomimético) de quiralidad opuesta. Por lo tanto, cualquier aminoácido de origen natural en la configuración L (que también puede denominarse R o S, en dependencia de la estructura de la entidad química) puede reemplazarse con el aminoácido del mismo tipo estructural químico o un peptidomimético, pero de quiralidad opuesta, denominado D-aminoácido, pero también puede denominarse forma R o S.
Los polipéptidos miméticos de la presente invención se pueden sintetizar mediante el uso de cualquier técnica de síntesis química de proteínas. En un proceso típico de síntesis de proteínas in vitro, la longitud de un péptido se prolonga en un aminoácido mediante la formación de un enlace peptídico entre el péptido y un aminoácido. La formación del enlace peptídico se lleva a cabo mediante una reacción de ligación, que puede usar un aminoácido natural o un aminoácido no natural. Por lo tanto, de esta manera se pueden introducir aminoácidos no naturales en los polipéptidos de la presente invención para hacer miméticos.
Las proteínas biológicas activas condicionalmente también se pueden sintetizar, en su totalidad o en parte, mediante el uso de métodos de síntesis química de proteínas bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Caruthers (1980) "New chemical methods for synthesizing polynucleotides", Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980), "Synthesis of oligonucleotides on cellulose. Part II: design and synthetic strategy to the synthesis of 22 oligodeoxynucleotides coding for Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP)1", Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede realizar mediante el uso de diversas técnicas en fase sólida (ver, por ejemplo, Roberge (1995) "A strategy for a convergent synthesis of N-linked glycopeptides on a solid support", Science 269:202; Merrifield (1997) "Concept and early development of solid-phase peptide synthesis", Methods Enzymol. 289:3-13) y la síntesis automatizada se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el uso del Sintetizador peptídico ABI 43 IA (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Los métodos de síntesis química de péptidos en fase sólida también pueden usarse para sintetizar el polipéptido o fragmentos del mismo. Tale métodos se conocen en la técnica desde principios de la década de 1960 (Merrifield, RB, "Solid-phase synthesis.I. The synthesis of a tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154, 1963) (Ver también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, 111., pp. 11­ 12)) y se han empleado recientemente en kits de síntesis y diseño de péptidos de laboratorio disponibles comercialmente (Cambridge Research Biochemicals). Tales kits de laboratorio disponibles comercialmente han utilizado generalmente las enseñanzas de HM Geysen y otros, "Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid," Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984) y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "barras" o "clavijas", todas las cuales están conectadas a una placa sencilla.
Los polipéptidos miméticos de la presente invención también se pueden producir mediante técnicas recombinantes, que producen un polipéptido al insertar una secuencia codificante del polipéptido en un vector de expresión y al utilizar la maquinaria de traducción de proteínas de un huésped de producción de células eucariotas. La maquinaria de traducción de proteínas lee los codones de la secuencia de codificación y usa el ARNt para traer el aminoácido codificado para producir el polipéptido. Se pueden usar varias técnicas para alterar la maquinaria de traducción de proteínas para permitirle incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido recombinante. Un enfoque comprobado depende del reconocimiento del aminoácido no natural por parte de las aminoacil-ARNt sintetasas que, en general, requieren una alta selectividad para asegurar la fidelidad de la traducción de la proteína. Estas sintetasas pueden diseñarse para relajar la especificidad del sustrato de modo que un aminoácido no natural pueda enlazarse a un ARNt, que luego lleva el aminoácido no natural a la maquinaria de traducción de proteínas para incorporarlo en un polipéptido. Por ejemplo, se encontró que el reemplazo de Ala 294 por Gly en la fenilalanil-tRNA sintetasa (PheRS) de Escherichia coli aumenta el tamaño del bolsillo de unión al sustrato y da como resultado la acilación del ARNtPhe por p-Clfenilalanina (p-Cl-Phe). Ver, M. Ibba, P. Kast y H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994). Una cepa de Escherichia coli que alberga este PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Ver, por ejemplo, M. Ibba y H. Hennecke, fEb S Lett., 364:272 (1995); y, N. Sharma, R. Furter, P. Kast y DA Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Del mismo modo, se demostró que una mutación puntual Phel30Ser cerca del sitio de unión de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa de Escherichia coli permite que la azatirosina se incorpore de manera más eficiente que la tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll y S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000).
El primer método consiste en reasignar el codón sentido, que genera al menos una aminoacil-ARNt sintetasa. La enzima normalmente añade un aminoácido natural a un ARNt para ser transportado a la maquinaria de traducción de proteínas para la síntesis de proteínas. Sin embargo, una aminoacil-ARNt sintetasa para un ARNt particular puede alterarse de modo que pueda tener determinado nivel de promiscuidad para cargar un aminoácido no natural de manera no específica al ARNt para activar el ARNt. El ARNt activado puede llevar el aminoácido no natural a la maquinaria de traducción de proteínas (por ejemplo, ribosomas) y añadir el aminoácido no natural a un péptido donde un codón de la secuencia codificante requiere ese ARNt particular. En otras palabras, el codón para ese ARNt en particular ha sido reasignado a aminoácidos no naturales. El polipéptido recombinante comprende 19 aminoácidos naturales y al menos un aminoácido no natural. El único aminoácido natural del polipéptido ha sido reemplazado por al menos un aminoácido no natural. La sustitución satisfactoria de un aminoácido natural por un aminoácido no natural se basa en el uso de huéspedes de expresión auxotrófica deficientes en la biosíntesis de ese aminoácido natural. El empleo de tales huéspedes limita la competencia del aminoácido natural por el codón de sentido reasignado y mejora la eficiencia de incorporación y el rendimiento de las proteínas diana. Se han reasignado codones para muchos aminoácidos (que incluyen Met, Pro, Tyr, Phe, Leu, Val, etc.) y se han incorporado más de 60 aminoácidos no naturales en proteínas a través de este método. Ver Hendrickson y otros, "Incorporation of nonnatural amino acids into proteins," Annu. Rev. Biochem., vol. 73, páginas 147-176, 2004; Voloshchuk y otros, "Incorporation of unnatural amino acids for synthetic biology," Mol. Biosyst., vol. 6, páginas 65-80, 2010,
La principal limitación de este método es que el aminoácido no natural reemplazará al aminoácido natural en toda la secuencia polipeptídica, lo que puede restringir su aplicación si tal sustitución global no es deseable. Una solución es mutar los sitios en los que la sustitución no es deseable por otros aminoácidos naturales, de modo que sólo se reserven los sitios deseados para el aminoácido no natural. Con esta modificación, el método puede introducir un sitio específico de aminoácido no natural en cualquier sitio deseado para producir polipéptidos miméticos.
Otro método para producir polipéptidos recombinantes miméticos es mediante el uso de codones oscilantes. Los codones oscilantes se refieren a los codones que son decodificados por los ARNt a través del apareamiento de bases no clásico de Watson-Crick. El apareamiento no clásico (u oscilación) se habilita mediante la modificación en la primera base del anticodón del ARNt (que se aparea con la tercera base del triplete de codones), como se propone en la "Hipótesis de la oscilación". Por ejemplo, muchos organismos tienen solo un ARNt para decodificar dos codones para Phe: UUU y UUC. Como resultado, el anticodón GAA en el ARNt se une al codón UUC a través del apareamiento de bases de Watson-Crick, y al codón UUU a través del apareamiento de bases de "oscilación".
Debido al apareamiento oscilante entre el codón y el anticodón, un ARNt puede aparearse con varios codones y un codón dado puede aparearse con más de un ARNt. Al aprovechar esta propiedad, se puede asignar un codón oscilante a un aminoácido no natural para generar una proteína recombinante que contenga aminoácidos naturales y al menos un aminoácido no natural. Por ejemplo, la Phe normalmente está codificada por dos codones UUC y UUU, y ambos codones son reconocidos por un único ARNt. Al expresar un par ortogonal de aminoacil- ARNt sintetasa y ARNt, con especificidad por un aminoácido no natural y que contiene el anticodón "AAA", se puede lograr la introducción eficiente del aminoácido no natural en los codones UUU (Kwon y otros, "Breaking the degeneracy of the genetic code," J. Am. Chem. Soc., vol. 125, páginas 7512-7513, 2003, . Con este método, la Phe puede asignarse esencialmente cuantitativamente al codón UUC y un aminoácido no natural al codón oscilante UUU. Además, se pueden introducir múltiples copias de un aminoácido no natural de forma específica en un polipéptido.
El tercer método para generar un polipéptido mimético recombinante es mediante el uso de codones sesgados. Los codones preferidos difieren entre organismos, e incluso entre diferentes tejidos o tipos de células del mismo organismo. El contenido celular de las especies de ARNt es un factor determinante en las tasas y cantidades de proteína sintetizada. Como consecuencia, la producción de proteínas recombinantes en células huésped heterólogas a menudo se optimiza por codones para que coincida con el sesgo de codones preferido de la célula huésped (la base de datos de uso de codones para diferentes organismos y el análisis de codones de un gen determinado se puede encontrar en: http://www. kazusa.or.jp/codon/).
El uso de codones sesgados proporciona otro método para introducir aminoácidos no naturales en polipéptidos recombinantes. Por ejemplo, de los seis codones degenerados para Arg, AGG y AGA rara vez se usan en E. coli. La introducción de un par ortogonal de aminoacil- ARNt sintetasa y ARNt que se aparea con el codón AGG en un huésped de expresión de E. coli puede permitir la unión de un aminoácido no natural al ARNt. Por lo tanto, el ARNt con un aminoácido no natural unido al mismo puede llevar el aminoácido no natural al codón AGG, donde normalmente se puede codificar Arg. Se ha demostrado que este método es factible con un sistema sesgado libre de células in vitro, donde se incorporó ARNt unido a aminoácidos no naturales sintetizado químicamente que se aparea con el codón AGG en los codones AGG (Hohsaka y otros, FEBS Letters, vol. 344, páginas 171-174, 1994). El método podría adaptarse a un sistema de expresión basado en células de E. coli si se puede diseñar una aminoacil-ARNt sintetasa para vincular un ortogonal no natural a un ARNt.
Del mismo modo, se puede asignar un codón sesgado a un aminoácido no natural en células de mamífero que exhiben sesgo de codones. Por ejemplo, a través del estudio de la expresión génica del virus del papiloma humano en diferentes células de mamíferos, Frazer y sus colegas descubrieron que la expresión de la proteína del virus del papiloma está determinada por el uso de codones y la disponibilidad de ARNt. Se descubrieron diferencias sustanciales en los conjuntos de ARNt entre queratinocitos diferenciados e indiferenciados (Zhao y otros, "Gene codon composition determines differentiationdependent expression of a viral capsid gene in keratinocytes in vitro and in vivo," Mol. Cell Biol., vol. 25, páginas 8643-8655, 2005),y el sesgo observado en su ARNt puede ser la razón por la que el virus del papiloma humano se replica exclusivamente en las células epiteliales. Por ejemplo, en células CHO y Cos1, parece que TCG es un sesgo y, por lo tanto, podría asignarse a un aminoácido no natural.
Dado que el fenómeno de sesgo de codones está muy extendido en diferentes organismos eucariotas, la utilización de tales codones para la incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales podría aplicarse en muchos huéspedes de producción de células eucariotas. La limitación sería la modificación de la aminoacil-ARNt sintetasa para unir un ortogonal no natural a un ARNt que pueda aparearse con un codón sesgado en los huéspedes de producción.
Un cuarto método para producir un polipéptido mimético es mediante la supresión de un codón de terminación. Generalmente, la traducción de proteínas termina en uno de los tres codones de parada (codificados por UAG (ámbar), UAA (ocre) y UGA (ópalo)) por la acción de los factores de liberación de proteínas (RF). Sin embargo, se ha observado que la lectura ocasional de un codón de parada con un aminoácido ocurre naturalmente en una diversidad de especies. La supresión es causada por mutaciones en el anticodón de ARNt o por errores de apareamiento del codón-anticodón (Beier & Grimm, "Misreading of termination codons in eukaryotes by natural nonsense suppressor tRNAs," Nucleic Acids Res., vol. 29, pages 4767-4782, 2001). La utilización de la supresión del codón de parada representa otra forma de producir proteínas que contienen aminoácidos no naturales y, en general, implica la introducción de una aminoacil-ARNt sintetasa que puede enlazar un aminoácido no natural a un ARNt que puede aparearse con un codón de parada. Por ejemplo, se ha desarrollado una aminoacil- ARNt sintetasa y un ARNt que se aparea con el codón de parada ámbar para introducir un aminoácido no natural específico del sitio en los codones ámbar, ya que es el codón de parada menos frecuentemente usado en eucariotas (23 % en humanos) y genomas procariotas (7 % en E. coli) (Liu y otros, "Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells," Nat. Methods, vol. 4, páginas 239-244, 2007). Los codones de parada ocre y ópalo también se han usado para la introducción de aminoácidos no naturales (Kohrer y otros, "Complete set of orthogonal 21st aminoacyl-tRNA synthetaseamber, ochre and opal suppressor tRNA pairs: concomitant suppression of three different termination codons in an mRNA in mammalian cells," Nucleic Acids Res., vol. 32, páginas 6200-6211, 2004). Hasta ahora, más de 70 aminoácidos no naturales se han incorporado de forma específica en proteínas recombinantes mediante este método Liu & Schultz, "Adding new chemistries to the genetic code," Annu. Rev. Biochem., vol. 79, páginas 413-444, 2010). Por lo general, se puede obtener una eficiencia de incorporación de aminoácidos no naturales de más del 95 % (definida como la tasa de ocupación de aminoácidos no naturales en el producto de longitud completa) en el sitio deseado, lo que lo convierte en uno de los métodos más frecuentemente usados para la incorporación de aminoácidos no naturales.
La presente invención también engloba cualquier otra técnica conocida por un experto en la técnica para introducir aminoácidos no naturales en un polipéptido recombinante. Algunas de las técnicas implican el uso de codones de cuatro pares de bases (Anderson y otros, "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 101, páginas 7566-7571, 2004). Se puede encontrar más discusión sobre la producción de polipéptidos recombinantes miméticos en la Patente de Estados Unidos No. 7,045,337 y el documento WO2010132341A2,
La descripción también proporciona métodos para modificar los polipéptidos de la descripción mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional (por ejemplo, fosforilación, acilación, etc.), o mediante técnicas de modificación química. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte del polipéptido, que incluyen el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en varios grados en varios sitios en un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, PEGilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfatidilinositol, ciclación de enlaces cruzados, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristolación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación y adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación. Ver, por ejemplo, Creighton, TE, Proteins-Structure and Molecular Properties 2a Ed., WH Freeman and Company, Nueva York (1993)); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, BC Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, pp 1-12 (1983).
Los métodos de síntesis de péptidos químicos en fase sólida también se pueden usar para sintetizar el polipéptido o los fragmentos de la descripción. Tales métodos se conocen en la técnica desde principios de la década de 1960 (Merrifield, RB, "Solid-phase synthesis.I. The synthesis of a tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154, 1963) (Ver también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, 111., pp. 11-12)) y se han empleado recientemente en kits de síntesis y diseño de péptidos de laboratorio disponibles comercialmente (Cambridge Research Biochemicals). Tales kits de laboratorio disponibles comercialmente han utilizado generalmente las enseñanzas de HM Geysen y otros, "Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid," Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984) y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "barras" o "clavijas", todas las cuales están conectadas a una placa sencilla. Cuando se utiliza un sistema de este tipo, se invierte una placa de varillas o pasadores y se inserta en una segunda placa de pozos o depósitos correspondientes, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoácido apropiado a las puntas de las varillas o pasadores. Al repetir tal etapa del proceso, es decir, al invertir e insertar las puntas de la barra y el pasador en soluciones apropiadas, los aminoácidos se construyen en los péptidos deseados. Además, hay varios sistemas de síntesis de péptidos FMOC disponibles. Por ejemplo, el ensamblaje de un polipéptido o fragmento puede llevarse a cabo sobre un soporte sólido mediante el uso de un sintetizador de péptidos automatizado Modelo 431 A™ de Applied Biosystems, Inc. Tal equipo proporciona fácil acceso a los péptidos de la descripción, ya sea por síntesis directa o por síntesis de una serie de fragmentos que pueden acoplarse mediante el uso de otras técnicas conocidas.
El polipéptido sintético o fragmento del mismo puede recuperarse y purificarse mediante métodos conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Las etapas de replegamiento de proteínas pueden usarse, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación.
La descripción proporciona una preparación o formulación de variante de proteína activa condicionalmente que comprende al menos una de las variantes de proteína, en donde la preparación es líquida o seca. La formulación de proteínas incluye opcionalmente un tampón, un cofactor, una segunda proteína o una proteína adicional, o uno o más excipientes. En un aspecto, la formulación se utiliza como una proteína biológica activa condicionalmente terapéutica que es activa en condiciones aberrantes o no fisiológicas, pero menos activa o inactiva en condiciones fisiológicas normales de, por ejemplo, temperatura, pH o presión osmótica, oxidación u osmolalidad.
Pueden emplearse técnicas de purificación estándar para proteínas biológicas activas condicionalmente recombinantes o sintéticas.
Cribado de mutantes para identificar mutantes reversibles o no reversibles
La identificación de moléculas deseables se logra más directamente al medir la actividad de la proteína en la condición permisiva y la condición de tipo salvaje. A continuación, se pueden seleccionar los mutantes con la mayor relación de actividad (permisivo/tipo salvaje) y se generan permutaciones de las mutaciones puntuales al combinar las mutaciones individuales mediante el uso de métodos estándar. A continuación, la biblioteca de proteínas de permutación combinada se criba en busca de aquellas proteínas que muestren la mayor actividad diferencial entre la condición permisiva y la de tipo salvaje.
La actividad de los sobrenadantes se puede cribar mediante el uso de una diversidad de métodos, por ejemplo, mediante el uso de ensayos de actividad de alto rendimiento, tales como ensayos de fluorescencia, para identificar mutantes de proteínas que son sensibles a cualquier característica que se desee (temperatura, pH, etc.). Por ejemplo, para detectar mutantes temporalmente sensibles, la actividad enzimática o de anticuerpos de cada mutante individual se determina a temperaturas más bajas (tales como 25 grados Celsius) y a temperaturas a las que funciona la proteína original (tales como 37 grados Celsius), mediante el uso de sustratos disponibles comercialmente. Las reacciones pueden realizarse inicialmente en un formato de ensayo de multi pocillos, tales como un ensayo de 96 pocillos, y confirmarse mediante el uso de un formato diferente, tal como un formato de tubo de 14 ml.
La descripción proporciona además un ensayo de cribado para identificar una enzima, el ensayo comprende: (a) proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos o polipéptidos; (b) obtener candidatos polipeptídicos para analizar la actividad enzimática de la pluralidad; (c) probar los candidatos para la actividad enzimática; y (d) identificar aquellos polipéptidos candidatos que exhiben actividad enzimática elevada en condiciones aberrantes o no fisiológicas, y actividad enzimática disminuida en comparación con la proteína enzimática de tipo salvaje en condiciones fisiológicas normales de, por ejemplo, temperatura, pH, oxidación, osmolalidad, concentración de electrolitos o presión osmótica.
En un aspecto, el método comprende además modificar al menos uno de los ácidos nucleicos o polipéptidos antes de probar los candidatos para la actividad biológica condicional, en otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la expresión mejorada del polipéptido en un célula huésped u organismo huésped, en un aspecto adicional, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la actividad enzimática dentro de un intervalo de pH de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 12. En otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la actividad enzimática dentro de un intervalo de pH de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 10. En un aspecto adicional, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la actividad enzimática dentro de un intervalo de pH de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8. En otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la actividad enzimática a pH 6,7 y pH 7,5. En otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además la prueba de actividad enzimática dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 4 grados C a aproximadamente 55 grados C. En otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además la prueba de actividad enzimática dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 15 grados C a aproximadamente 47 grados C. En otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la actividad enzimática dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 20 grados C a aproximadamente 40 grados C. En otro aspecto, el ensayo de la etapa (c) comprende además el ensayo de actividad enzimática a temperaturas de 25 grados C y 37 grados C. En otro aspecto, el ensayo de la etapa (c) comprende además el ensayo de actividad enzimática bajo presión osmótica normal y presión osmótica aberrante (positiva o negativa). En otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la actividad enzimática bajo una concentración de electrolitos normal y una concentración de electrolitos aberrante (positiva o negativa). La concentración de electrolitos a probar se selecciona de una concentración de calcio, sodio, potasio, magnesio, cloruro, bicarbonato y fosfato, en otro aspecto, la prueba de la etapa (c) comprende además probar la actividad enzimática que da como resultado un producto de reacción estabilizado.
En otro aspecto, la descripción proporciona un anticuerpo purificado que se une específicamente al polipéptido de la descripción o un fragmento del mismo, que tiene actividad enzimática. En un aspecto, la descripción proporciona un fragmento del anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que tiene actividad enzimática.
Anticuerpos y métodos de cribado basados en anticuerpos
La descripción proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen específicamente a un antígeno de la descripción. Estos anticuerpos pueden usarse para aislar, identificar o cuantificar los antígenos de la descripción o polipéptidos relacionados. Estos anticuerpos pueden usarse para aislar otros polipéptidos dentro del alcance de la descripción u otras proteínas relacionadas. Los anticuerpos pueden diseñarse para unirse a un sitio activo de una enzima. Por lo tanto, la descripción proporciona métodos para inhibir enzimas mediante el uso de los anticuerpos de la descripción.
Los anticuerpos pueden usarse en columnas de inmunoprecipitación, tinción, inmunoafinidad y similares. Si se desea, las secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos específicos pueden generarse mediante inmunización seguida del aislamiento del polipéptido o ácido nucleico, amplificación o clonación e inmovilización del polipéptido en un arreglo de la descripción. Alternativamente, los métodos de la descripción se pueden usar para modificar la estructura de un anticuerpo producido por una célula que se va a modificar, por ejemplo, se puede aumentar o disminuir la afinidad de un anticuerpo. Además, la capacidad para producir o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo diseñado en una célula mediante los métodos de la descripción.
Los métodos de inmunización, producción y aislamiento de anticuerpos (policlonales y monoclonales) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en la literatura científica y de patentes, ver, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, Calif. ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, N. Y. (1986); Kohler (1975) "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York. Los anticuerpos también se pueden generar in vitro, por ejemplo, mediante el uso de bibliotecas de presentación de fagos que expresan sitios de unión de anticuerpos recombinantes, además de los métodos tradicionales in vivo que usan animales. Ver, por ejemplo, Hoogenboom (1997) "Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies", Trends Biotechnol. 15:62-70; y Katz (1997) "Structural and mechanistic determinants of affinity and specificity of ligands discovered or engineered by phage display", Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45. Pueden usarse polipéptidos o péptidos para generar anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos, por ejemplo, las enzimas, de la descripción. Los anticuerpos resultantes pueden usarse en procedimientos de cromatografía de inmunoafinidad para aislar o purificar el polipéptido o para determinar si el polipéptido está presente en una muestra biológica. En tales procedimientos, una preparación de proteínas, como un extracto o una muestra biológica, se pone en contacto con un anticuerpo capaz de unirse específicamente a uno de los polipéptidos de la descripción.
En los procedimientos de inmunoafinidad, el anticuerpo se une a un soporte sólido, como una perla u otra matriz de columna. La preparación de proteínas se pone en contacto con el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo se une específicamente a uno de los polipéptidos de la descripción. Después de un lavado para eliminar las proteínas no unidas específicamente, se eluyen los polipéptidos unidos específicamente.
La capacidad de las proteínas en una muestra biológica para unirse al anticuerpo puede determinarse mediante el uso de cualquiera de una diversidad de procedimientos familiares para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la unión se puede determinar al marcar el anticuerpo con un marcador detectable tal como un agente fluorescente, un marcador enzimático o un radioisótopo. Alternativamente, la unión del anticuerpo a la muestra puede detectarse mediante el uso de un anticuerpo secundario que tenga un marcador detectable de este tipo. Los ensayos particulares incluyen ensayos ELISA, ensayos sándwich, radioinmunoensayos y transferencias Western.
Los anticuerpos policlonales generados contra los polipéptidos de la descripción pueden obtenerse mediante inyección directa de los polipéptidos en un animal o mediante la administración de los polipéptidos a un animal no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá luego al propio polipéptido. De esta manera, incluso una secuencia que codifica solo un fragmento del polipéptido puede usarse para generar anticuerpos que pueden unirse al polipéptido nativo completo. Tales anticuerpos se pueden usar luego para aislar el polipéptido de las células que expresan ese polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma, la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma EBV (ver, por ejemplo, Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96).
Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4,946,778) puede adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios contra los polipéptidos de la descripción. Alternativamente, pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados contra estos polipéptidos o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de la descripción se pueden usar en el cribado de polipéptidos similares (por ejemplo, enzimas) de otros organismos y muestras. En tales técnicas, los polipéptidos del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan aquellos polipéptidos que se unen específicamente al anticuerpo. Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente puede usarse para detectar la unión de anticuerpos.
Metodologías de Cribado y Dispositivos de Monitoreo "En-línea"
En la práctica de los métodos de la descripción, se puede usar una diversidad de aparatos y metodologías junto con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la descripción, por ejemplo, para detectar polipéptidos en busca de actividad enzimática, para detectar compuestos como moduladores potenciales, por ejemplo, activadores o inhibidores, de una actividad enzimática, de anticuerpos que se unen a un polipéptido de la descripción, de ácidos nucleicos que hibridan con un ácido nucleico de la descripción, para detectar células que expresan un polipéptido de la descripción y similares.
Arreglos o "Biochips"
Los ácidos nucleicos o los polipéptidos de la descripción se pueden inmovilizar o aplicar a un arreglo. Los arreglos se pueden usar para seleccionar o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) por su capacidad para unirse o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la descripción. Por ejemplo, en un aspecto de la descripción, un parámetro monitorizado es la expresión de transcritos de un gen de enzima. Uno o más, o todos los transcritos de una célula, pueden medirse por hibridación de una muestra que comprende transcritos de la célula, o ácidos nucleicos representativos o complementarios a los transcritos de una célula, por hibridación con ácidos nucleicos inmovilizados en un arreglo, o "biochip". Mediante el uso de un "arreglo" de ácidos nucleicos en un microchip, se pueden cuantificar simultáneamente algunos o todos los transcritos de una célula. Alternativamente, también se pueden usar arreglos que comprenden ácido nucleico genómico para determinar el genotipo de una cepa modificada nuevamente mediante los métodos de la descripción. Los arreglos de polipéptidos también se pueden usar para cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas. La presente descripción se puede practicar con cualquier "matriz" conocido, también denominado "micromatriz" o "matriz de ácidos nucleicos" o "matriz de polipéptidos" o "matriz de anticuerpos" o "biochip", o una variación de los mismos. Los arreglos son genéricamente una pluralidad de "manchas" o "elementos diana", cada elemento diana comprende una cantidad definida de una o más moléculas biológicas, por ejemplo, oligonucleótidos, inmovilizados en un área definida de la superficie de un sustrato para unión específica a una molécula de muestra, por ejemplo, transcritos de ARNm.
En la práctica los métodos de la descripción, pueden incorporar en su totalidad o en parte cualquier arreglo y/o método conocido para fabricar y usar arreglos, o variaciones de los mismos, como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,277,628; 6,277,489; 6,261,776; 6,258,606; 6,054,270; 6,048,695; 6,045,996; 6,022,963; 6,013,440; 5,965,452; 5,959,098; 5,856,174; 5,830,645; 5,770,456; 5,632,957; 5,556,752; 5,143,854; 5,807,522; 5,800,992; 5,744,305; 5,700,637; 5,556,752; 5,434,049; ver también, por ejemplo, los documentos WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; ver también, por ejemplo, Johnston (1998) "Gene chips: Array of hope for understanding gene regulation", Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) "Inexpensive Handheld Device for the Construction of High-Density Nucleic Acid Arrays", Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) "Direct hybridization of large-insert genomic clones on high-density gridded cDNA filter arrays", Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) "Matrix-Based Comparative Genomic Hybridization: Biochips to Screen for Genomic Imbalances", Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) "Options Available-From Start to Finish~for Obtaining Expression Data by Microarray", Nature Genetics Supp. 21:25-32. Ver también las solicitudes de patentes de Estados Unidos publicadas Nos. 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448;20010012537; 20010008765.
Arreglos Capilares
En los métodos de la descripción se pueden usar arreglos capilares, tales como GIGAMATRIX™ Diversa Corporation, San Diego, California. Los ácidos nucleicos o los polipéptidos de la descripción se pueden inmovilizar o aplicar a un arreglo, que incluyen los arreglos capilares. Los arreglos se pueden usar para seleccionar o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) por su capacidad para unirse o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la descripción. Los arreglos capilares proporcionan otro sistema para sostener y cribar muestras. Por ejemplo, un aparato de cribado de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en una serie de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprende al menos una pared que define un lumen para retener una muestra. El aparato puede incluir además material intersticial dispuesto entre capilares adyacentes en el arreglo, y uno o más indicadores de referencia formados dentro del material intersticial. Un capilar para cribar una muestra, en donde el capilar está adaptado para unirse a un arreglo de capilares, puede incluir una primera pared que define un lumen para retener la muestra, y una segunda pared formada por un material filtrante, para filtrar la energía de excitación proporcionada al lumen para excitar la muestra. Un polipéptido o ácido nucleico, por ejemplo, un ligando, puede introducirse en un primer componente en al menos una parte de un capilar de un arreglo de capilares. Cada capilar del conjunto de capilares puede comprender al menos una pared que define un lumen para retener el primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente. Puede introducirse un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente está separado del primer componente por la burbuja de aire. Una muestra de interés puede introducirse como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de una arreglo de capilares, en donde cada capilar del arreglo de capilares comprende al menos una pared que define un lumen para retener el primer líquido y la partícula detectable, y en donde al menos una pared está recubierta con un material aglutinante para unir la partícula detectable a al menos una pared. El método puede incluir además retirar el primer líquido del tubo capilar, en donde la partícula detectable unida se mantiene dentro del capilar, e introducir un segundo líquido en el tubo capilar. El arreglo de capilares puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprenden al menos una pared exterior que define un lumen. La pared exterior del capilar puede ser una o más paredes fusionadas entre sí. Del mismo modo, la pared puede definir un lumen que sea cilíndrico, cuadrado, hexagonal o de cualquier otra forma geométrica siempre que las paredes formen un lumen para la retención de un líquido o una muestra. Los capilares del conjunto de capilares se pueden mantener juntos en estrecha proximidad para formar una estructura plana. Los capilares se pueden unir, al fusionar (por ejemplo, cuando los capilares están hechos de vidrio), al pegar, al unir o al sujetar uno al lado del otro. El arreglo de capilares puede estar formado por cualquier número de capilares individuales, por ejemplo, un intervalo de 100 a 4000000 de capilares. Un arreglo de capilares puede formar una microplaca de titulación que tiene alrededor de 100000 o más capilares individuales unidos entre sí.
Modificación de Proteínas Biológicas Activas Condicionalmente
Las proteínas biológicas activas condicionalmente de la presente invención, que incluyen los anticuerpos activos condicionalmente contra BBB-R y los anticuerpos activos condicionalmente para el líquido sinovial, pueden diseñarse mediante una o más técnicas de modificación de proteínas descritas en la presente descripción. Los ejemplos no limitativos de técnicas de modificación de proteínas también incluyen la conjugación de anticuerpos, la modificación de anticuerpos multiespecíficos, la modificación de la región Fc de los anticuerpos.
Conjugación de proteínas biológicas activas condicionalmente
Las proteínas biológicas activas condicionalmente proporcionadas por la presente invención pueden conjugarse con una molécula. Debido a que la proteína biológica activa condicionalmente actúa preferentemente en el líquido sinovial, la proteína biológica activa condicionalmente puede conjugarse con una molécula (agente terapéutico o de diagnóstico), que se transportará al líquido sinovial con las proteínas biológicas activas condicionalmente. En algunas modalidades, la molécula tiene una toxicidad no específica, que puede reducirse al conjugarse con las proteínas biológicas activas condicionalmente, para actuar así preferentemente en el sitio de la enfermedad.
En algunas modalidades, la molécula conjugada en la proteína biológica activa condicionalmente puede liberarse opcionalmente de la proteína biológica activa condicionalmente una vez que la proteína biológica activa condicionalmente ha alcanzado su ubicación prevista, tal como un líquido sinovial. En estas modalidades, las proteínas biológicas activas condicionalmente pueden actuar como un vehículo de administración para transportar las moléculas conjugadas (tales como terapéuticas o diagnósticas) al líquido sinovial. Una vez dentro del líquido sinovial, la molécula conjugada puede liberarse para el tratamiento de la enfermedad.
La conjugación de la proteína biológica activa condicionalmente con una molécula (terapéutica o de diagnóstico) puede ser una conjugación covalente o no covalente. La conjugación covalente puede ser directa o a través de un enlazador. En determinadas modalidades, la conjugación directa se realiza mediante la construcción de una proteína de fusión (es decir, mediante la fusión genética de los dos genes que codifican el anticuerpo activo condicionalmente y el fármaco para el trastorno neurológico y la expresión como una proteína sencilla). En determinadas modalidades, la conjugación directa se realiza mediante la formación de un enlace covalente entre un grupo reactivo en una de las dos porciones del anticuerpo activo condicionalmente y un grupo o aceptor correspondiente en el fármaco neurológico/agente de formación de imágenes. En determinadas modalidades, la conjugación directa es por modificación (es decir, modificación genética) de una de las dos moléculas a conjugar para incluir un grupo reactivo (como ejemplos no limitantes, un grupo sulfhidrilo o un grupo carboxilo) que forma un enlace covalente a la otra molécula se conjuga en condiciones apropiadas. Como ejemplo no limitante, se puede introducir una molécula (es decir, un aminoácido) con un grupo reactivo deseado (es decir, un residuo de cisteína), por ejemplo, en el anticuerpo activo condicionalmente y formar un enlace disulfuro con el fármaco neurológico. También se conocen en la técnica métodos para la conjugación covalente de ácidos nucleicos con proteínas (es decir, fotoentrecruzamiento, ver, por ejemplo, Zatsepin y otros, Russ. Chem. Rev., 74: 77-95 (2005)) La conjugación no covalente puede ser por cualquier medio de unión no covalente, que incluyen enlaces hidrofóbicos, enlaces iónicos, interacciones electrostáticas y similares, como comprenderá fácilmente un experto en la materia.
La conjugación también se puede realizar mediante el uso de una diversidad de enlazadores. Por ejemplo, un anticuerpo activo condicionalmente y un fármaco neurológico se pueden conjugar mediante el uso de una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano -1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bisactivos (como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenceno). También se pueden usar enlazadores peptídicos, que comprenden de uno a veinte aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. En determinadas modalidades de este tipo, los aminoácidos se seleccionan de los veinte aminoácidos de origen natural. En determinadas otras modalidades de este tipo, uno o más de los aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. El enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilite la liberación del fármaco neurológico tras la administración al cerebro. Por ejemplo, puede ser usado un enlazador lábil a ácidos, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari y otros, Cancer Res., 52:127-131 (1992); Patente de Estados Unidos No. 5,208,020). Algunos ejemplos de reactivos de entrecruzamiento para la conjugación de anticuerpos incluyen BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato).
El agente terapéutico conjugado puede ser tóxico para el organismo, tal como una partícula radioactiva, un fármaco quimioterapéutico o una toxina celular (es decir, una citotoxina). Estos agentes terapéuticos son altamente tóxicos para el cuerpo. El uso de los anticuerpos activos condicionalmente de la presente invención para administrar el agente terapéutico conjugado al sitio de la enfermedad puede reducir significativamente los efectos tóxicos de estos agentes terapéuticos. La tecnología para conjugar partículas radioactivas con anticuerpos es conocida en la técnica. Ibritumomab tiuxetan (Zevalin®) y tositumomab (Bexxar®) son ejemplos de anticuerpos monoclonales conjugados con partículas radioactivas. Ambos son anticuerpos contra el antígeno CD20 conjugados con una partícula radioactiva diferente. Del mismo modo, también se conoce en la técnica la tecnología para conjugar fármacos quimioterapéuticos con anticuerpos. Hay dos anticuerpos comercializados que se conjugan con un fármaco quimioterapéutico: brentuximab vedotina (Adcetris®) y ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla™). Brentuximab vedotin se compone de un anticuerpo que se dirige al antígeno CD30 (que se encuentra en las células B y T), unido a un fármaco quimioterapéutico llamado MMAE. La ado-trastuzumab emtansina está hecha de un anticuerpo que se dirige a la proteína HER2 unida a un fármaco quimioterapéutico llamado DM1. La tecnología para conjugar una toxina celular con un anticuerpo también se conoce en la técnica. Por ejemplo, la denileucina diftitox (Ontak®, un fármaco contra el cáncer) consta de una proteína del sistema inmunitario conocida como interleucina-2 (IL-2) unida a una toxina del germen que causa la difteria.
Se contempla que cualquier partícula radioactiva, fármacos quimioterapéuticos y toxinas celulares pueden conjugarse con las proteínas biológicas activas condicionalmente de la presente invención para reducir los efectos secundarios de estos agentes.
En algunas modalidades, las partículas radioactivas conjugadas con proteínas biológicas activas condicionalmente para el tratamiento de un tejido anormal comprenden partículas impregnadas con uno o más isótopos radioactivos y tienen suficiente radioactividad para la ablación locorregional de células en el tejido anormal. Las partículas pueden comprender vidrio, metal, resina, albúmina o polímero. El metal en las partículas radioactivas se puede seleccionar de hierro, gadolinio y calcio. Los ejemplos de uno o más isótopos radioactivos en las partículas radioactivas se seleccionan del grupo que consiste en galio-67 (67Ga), itrio-90 (90Y), galio-68 (68Ga), talio-201 (201Tl), Estroncio-89 (89 Sr), Indio-III (111In), Yodo-131 (131I), Samario-153 (153Sm), Tecnecio-99m (99mTc), Renio-186 (186Re), Renio -188 (188Re), Cobre-62 (62Cu) y Cobre-64 (64Cu). Preferentemente, los isótopos radioactivos en la composición emiten radiaciones beta, radiaciones gamma y/o positrones.
En algunas modalidades, los fármacos quimioterapéuticos conjugados con las proteínas biológicas activas condicionalmente se seleccionan del grupo que consiste en antraciclinas, inhibidores de topoisomerasa I y/o II, alcaloides de plantas venenosas del huso, agentes alquilantes, antimetabolitos, elipticina y harmina.
Las antraciclinas (o antibióticos de antraciclina) se derivan de la bacteria Streptomyces. Estos compuestos se usan para tratar una amplia gama de cánceres, que incluyen, por ejemplo, carcinoma hepatocelular, leucemias, linfomas y cánceres de mama, útero, ovario y pulmón. Las antraciclinas incluyen, pero no se limitan a, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, valrrubicina, pirarrubicina, zorrubicina, aclarubicina, detorrubicina, carminomicina, morfolinodoxorrubicina, morfolinodaunorrubicina, metoximorfolinildoxorrubicina y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Las topoisomerasas son enzimas esenciales que mantienen la topología del ADN. La inhibición de las topoisomerasas tipo I o tipo II interfiere tanto con la transcripción como con la replicación del ADN alterando el superenrollamiento adecuado del ADN. Algunos inhibidores de la topoisomerasa tipo I incluyen derivados de camptotecinas. Los derivados de camptotecinas se refieren a análogos de camptotecinas como irinotecán, topotecán, hexatecán, silatecán, lutortecán, karenitecina (BNP1350), gimatecán (ST1481), belotecán (CKD602) o sus sales farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de inhibidores de topoisomerasa de tipo II incluyen, pero no se limitan a, amsacrina, etopósido, etopósido fosfato y tenipósido. Estos son derivados semisintéticos de las epipodofilotoxinas, alcaloides de origen natural en la raíz de la manzana americana (Podophyllum peltatum).
Los alcaloides vegetales del veneno del huso se derivan de las plantas y bloquean la división celular al prevenir la función de los microtúbulos, esencial para la división celular. Estos alcaloides incluyen, entre otros, alcaloides de la vinca (como vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina y vinpocetina) y taxanos. Los taxanos incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, docetaxel, larotaxel, cabazitaxel, ortataxel, tesetaxel y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los agentes alquilantes se denominan así debido a su capacidad para añadir grupos alquilo a muchos grupos electronegativos en las condiciones presentes en las células. Deterioran la función celular al formar enlaces covalentes con los grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo y fosfato en moléculas biológicamente importantes. Cabe destacar que se cree que su citotoxicidad es el resultado de la inhibición de la síntesis de ADN. Los agentes alquilantes incluyen, pero no se limitan a, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida y compuestos de platino tales como oxaliplatino, cisplatino o carboplatino.
Un antimetabolito es una sustancia química que inhibe el uso de un metabolito, que forma parte del metabolismo normal. Estas sustancias suelen tener una estructura similar al metabolito con el que interfieren. La presencia de antimetabolitos detiene el crecimiento celular y la división celular.
Los análogos de purina o pirimidina impiden la incorporación de nucleótidos en el ADN, lo que detiene la síntesis de ADN y, por lo tanto, la división celular. También afectan la síntesis de ARN. Los ejemplos de análogos de purina incluyen azatioprina, mercaptopurina, tioguanina, fludarabina, pentostatina y cladribina. Los ejemplos de análogos de pirimidina incluyen 5-fluorouracilo (5FU), que inhibe la timidilato sintasa, la floxuridina (FUDr ) y el arabinósido de citosina (citarabina).
Los antifolatos son fármacos quimioterapéuticos que alteran la función de los ácidos fólicos. Un ejemplo bien conocido es el metotrexato, que es un análogo del ácido fólico que inhibe la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) y, por lo tanto, previene la formación de tetrahidrofolato. El tetrahidrofolato es esencial para la síntesis de purinas y pirimidinas. Esto conduce a una inhibición de la producción de ADN, ARN y proteínas (ya que el tetrahidrofolato también participa en la síntesis de los aminoácidos serina y metionina). Otros antifolatos incluyen, pero no se limitan a, trimetoprima, raltitrexed, pirimetamina y pemetrexed.
Otros fármacos quimioterapéuticos también pueden conjugarse con las proteínas biológicas activas condicionalmente, tales como elipticina y harmina. La elipticina es un producto alcaloide vegetal natural aislado del árbol de hoja perenne de la familia Apocynaceae. La elipticina y sus derivados tales como 9-hidroxiellipticinio, N2-metil-9-hidroxiellipticinio, acetato de 2-(dietilamino-2-etil)9-hidroxiellipticinio, acetato de 2-(diisopropilamino-etil)9-hidroxiellipticinio y 2-(beta piperidino-2-etil)9-hidroxiellipticinio son todos fármacos quimioterapéuticos eficaces. La harmina es un producto alcaloide vegetal natural que se aisló de las semillas de Peganum harmala. Los medicamentos de quimioterapia a base de harmina incluyen harmine, harmalina, harmol, harmalol y harman, y derivados de quinazolina: vasicina y vasicinona.
En algunas modalidades, las toxinas celulares conjugadas con las proteínas biológicas activas condicionalmente incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracinediona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Otras toxinas incluyen, por ejemplo, ricina, CC-1065 y análogos, las duocarmicinas. Otras toxinas más incluyen la toxina diftérica y el veneno de serpiente (por ejemplo, veneno de cobra).
En una modalidad, una pirrolobenzodiazepina puede conjugarse con una proteína biológica activa condicionalmente. Los dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) son una clase de agentes de entrecruzamiento selectivos de secuencia, de surco menor de ADN diseñados racionalmente, que entrecruzan las dos cadenas de ADN lo que evita así la replicación del ADN y la división celular. Los PBD pueden usarse como agentes quimioterapéuticos. Esta clase de agentes quimioterapéuticos exhibe actividad picomolar o subpicomolar en la inhibición del crecimiento de células tumorales. Los PBD sintéticos, cuando se conjugan con un anticuerpo activo condicionalmente, pueden guiarse hacia un sitio tumoral para inhibir el crecimiento de células tumorales. Los PBD pueden usar diferentes sitios de conjugación para unirse a un anticuerpo activo condicionalmente. Por ejemplo, a continuación se muestran dos PBD adecuados.
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En algunas modalidades, las proteínas biológicas activas condicionalmente de la presente invención pueden conjugarse con un agente de diagnóstico. Un agente de diagnóstico usado en la presente invención puede incluir cualquier agente de diagnóstico conocido en la técnica, como se proporciona, por ejemplo, en las siguientes referencias: Armstrong y otros, Diagnostic Imaging, 5a Ed., Blackwell Publishing (2004); Torchilin, V. P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995); Vallabhajosula, S., Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET and SPECT, Springer (2009). Un agente de diagnóstico puede detectarse mediante una diversidad de métodos, que incluyen el uso del agente para proporcionar y/o mejorar una señal detectable que incluye, pero no se limita a, emisores de rayos gamma, radioactivos, ecogénicos, ópticos, fluorescentes, absorbentes, magnéticos o señales de tomografía. Las técnicas para obtener imágenes del agente de diagnóstico pueden incluir, entre otras, tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), imágenes por resonancia magnética (MRI), imágenes ópticas, imágenes por fluorescencia, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada (CT), formación de imágenes por rayos X, formación de imágenes por rayos gamma y similares.
En algunas modalidades, un agente de diagnóstico puede incluir quelantes que se unen, por ejemplo, a iones metálicos para usar en una diversidad de técnicas de diagnóstico por imágenes. Los quelantes ilustrativos incluyen, entre otros, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido [4-(1,4,8, 11-tetraazaciclotetradec-1-il)metiljbenzoico (CPTA), ácido ciclohexanodiaminotetraacético (CDTA), ácido etilenbis(oxietilennitrilo)tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido cítrico, ácido hidroxietiletilendiaminotriacético (HEDTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido trietilentetraaminohexaacético (TTHA), 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-1,4,7, 10-tetra(ácido metilenfosfónico) (DOTP), 1,4,8,11-tetraazaciclododecano-1,4,8, ácido 11-tetraacético (TETA), 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-1,4,7, 10-tetraacético (DOTA) y derivados del mismo.
Se puede incorporar un radioisótopo en algunos de los agentes de diagnóstico descritos en la presente descripción y puede incluir radionúclidos que emiten rayos gamma, positrones, partículas beta y alfa y rayos X. Los radionucleidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, Ac, As, At, nB, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 123I, 125I, 130I 131I, 111In, 177Lu, 13N, 150, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y y 90Y. En determinadas modalidades, los agentes radioactivos pueden incluir mIn-DTPA, 99mTc(CO)3-DTPA, 99mTc(CO)3-ENPy2 , 62/64/67Cu-TETA, 99mTc(CO)3-IDA, and 99mTc(CO)3 triaminas (cíclicas o lineales). En otras modalidades, los agentes pueden incluir DOTA y sus diversos análogos con 111In, 177Lu, 153 Sm, 88/90Y, 62/64/67Cu o 67/68Ga. En algunas modalidades, los liposomas se pueden radiomarcar, por ejemplo, mediante la incorporación de lípidos unidos a quelatos, tales como el lípido DTPA, como se proporciona en las siguientes referencias: Phillips y otros, Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, vol. 1, páginas 69-83 (2008); Torchilin, V.P. & Weissig, V., Eds. Liposomes 2a ed. : Oxford Univ. Press (2003); Elbayoumi, T.A. & Torchilin, V.P., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 33: 1196-1205 (2006); Mougin-Degraef, M. y otros, Int'l J. Pharmaceutics, 344: 110-1 17 (2007).
En otras modalidades, los agentes de diagnóstico pueden incluir agentes ópticos tales como agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimioluminiscentes y similares. Numerosos agentes (por ejemplo, colorantes, sondas, etiquetas o indicadores) son conocidos en la técnica y pueden usarse en la presente invención. (Ver, por ejemplo, Invitrogen, The Handbook -- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition (2005)). Los agentes fluorescentes pueden incluir una diversidad de pequeñas moléculas orgánicas y/o inorgánicas o una diversidad de proteínas fluorescentes y derivados de las mismas. Por ejemplo, los agentes fluorescentes pueden incluir, pero no se limitan a, cianinas, ftalocianinas, porfirinas, indocianinas, rodaminas, fenoxacinas, fenilxantenos, fenotiazinas, fenoselenazinas, fluoresceínas, benzoporfirinas, escaraínas, dipirrolopirimidonas, tetracenos, quinolinas, pirazinas, corrinas, croconios, acridonas, fenantridinas, rodaminas, acridinas, antraquinonas, análogos de calcogenopirilio, clorinas, naftalocianinas, colorantes de metina, colorantes de indolenio, compuestos azoicos, azulenos, azaazulenos, colorantes de trifenilmetano, indoles, benzoindoles, indocarbocianinas, benzoindocarbocianinas y derivados de BODIPY™ que tienen la estructura general de 4,4-difluoro-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene, y/o conjugados y/o derivados de cualquiera de estos. Otros agentes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, conjugados de fluoresceína-ácido poliaspártico, conjugados de fluoresceína-ácido poliglutámico, conjugados de fluoresceína-poliarginina, verde de indocianina, conjugados de indocianina-ácido dodecaaspártico, conjugados de indocianina (NIRD)-ácido poliaspártico, isosulfán azul, disulfonatos de indol, disulfonato de benzoindol, bis(etilcarboximetil)indocianina, bis(pentilcarboximetil)indocianina, sulfonatos de polihidroxiindol, sulfonato de polihidroxibenzoindol, sulfonato de indol heteroatómico rígido, ácido indocianinabispropanoico, ácido indocianinabishexanoico, 3,6-diciano-2,5-[(N,N,N',N'-tetrakis(carboximetil)amino]pirazina, ácido 3,6-[(N,N,N',N'-tetrakis(2-hidroxietil)amino]pirazina-2,5-dicarboxílico, ácido 3,6-bis(N-azatedino)pirazina-2,5-dicarboxílico, ácido 3,6-bis(N-morfolino)pirazina-2,5-dicarboxílico, ácido 3,6-bis(N-piperazino)pirazina-ácido 2,5-dicarboxílico, ácido 3,6-bis(N-tiomorfolino)pirazina-2,5-dicarboxílico, ácido 3,6-bis(N-tiomorfolino)pirazina-2, S-óxido de ácido 5-dicarboxílico, S,S-dióxido de 2,5-diciano-3,6-bis(N-tiomorfolino)pirazina, tetrasulfonato de indocarbocianina, cloroindocarbocianina y ácido 3,6-diaminopirazina-2,5-dicarboxílico.
En aún otras modalidades, los agentes de diagnóstico pueden incluir agentes de contraste que generalmente son bien conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, óxido de hierro superparamagnético (SPIO), complejos de gadolinio o manganeso y similares. (Ver, por ejemplo, Armstrong y otros, Diagnostic Imaging, 5a Ed., Blackwell Publishing (2004)). En algunas modalidades, un agente de diagnóstico puede incluir un agente de formación de imágenes por resonancia magnética (MR). Los ejemplos de agentes de resonancia magnética incluyen, pero no se limitan a, agentes paramagnéticos, agentes superparamagnéticos y similares. Los agentes paramagnéticos ilustrativos pueden incluir, pero no se limitan a, ácido gadopentético, ácido gadotérico, gadodiamida, gadolinio, gadoteridol, mangafodipir, gadoversetamida, citrato de amonio férrico, ácido gadobénico, gadobutrol o ácido gadoxético. Los agentes superparamagnéticos pueden incluir, pero no se limitan a, óxido de hierro superparamagnético y ferristeno. En determinadas modalidades, los agentes de diagnóstico pueden incluir agentes de contraste de rayos X como se proporciona, por ejemplo, en las siguientes referencias: HS Thomsen, RN Muller y RF Mattrey, Eds., Trends in Contrast Media, (Berlín: Springer-Verlag, 1999); P. Dawson, D. Cosgrove y R. Grainger, Eds., Textbook of Contrast Media (ISIS Medical Media 1999); Torchilín, VP, Curr. Pharm. Biotech., vol. 1, páginas 183-215 (2000); Bogdanov, A.A. y otrosl, Adv. Drug Del. Rev., Vol. 37, páginas 279-293 (1999); Sachse, A. y otros, Investigative Radiology, vol. 32, páginas 44-50 (1997). Los ejemplos de agentes de contraste de rayos X incluyen, sin limitación, iopamidol, iomeprol, iohexol, iopentol, iopromide, iosimida, ioversol, iotrolan, iotasul, iodixanol, iodecimol, ioglucamida, ioglunida, iogulamida, iosarcol, ioxilan, iopamiron, metrizamide, iobitridol y iosimenol. En determinadas modalidades, los agentes de contraste de rayos X pueden incluir iopamidol, iomeprol, iopromide, iohexol, iopentol, ioversol, iobitridol, iodixanol, iotrolan e iosimenol.
En algunas modalidades, las proteínas biológicas activas condicionalmente pueden conjugarse con otra proteína, tales como interleucinas, citocinas, enzimas, factores de crecimiento u otros anticuerpos. Algunos ejemplos de tales proteínas incluyen, por ejemplo, factor de necrosis tumoral, interferón a (EFN-a), interferón p (IFN-p), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), activador del plasminógeno tisular (TPA), un agente apoptótico (por ejemplo, TNF-a, TNF-p, AIM I como se describe en el documento WO 97/33899), A iM II (ver el documento w O 97/34911), ligando Fas (Takahashi y otros, J. Immunol., vol. 6, páginas 1567-1574, 1994), y VEGI ( el documento WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico (por ejemplo, angiostatina o endostatina); o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-I"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), granulocitos factor estimulante de colonias de macrófagos ("GM-CSF"), y factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF"), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento ("GH")).
En algunas modalidades, los anticuerpos activos condicionalmente para cruzar la BBB según lo proporcionado por la presente invención pueden conjugarse con un fármaco para tratar un trastorno neurológico. El fármaco se transportará a través de la BBB con los anticuerpos y permanecerá en el cerebro para tratar el trastorno neurológico. El trastorno neurológico se refiere a una enfermedad o trastorno que afecta al SNC y/o que tiene una etiología en el SNC. Las enfermedades o trastornos del SNC ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, neuropatía, amiloidosis, cáncer, una enfermedad o trastorno ocular, infección viral o microbiana, inflamación, isquemia, enfermedad neurodegenerativa, convulsiones, trastornos del comportamiento y una enfermedad de almacenamiento lisosomal. para los propósitos de esta solicitud, se entenderá que el SNC incluye el ojo, que normalmente está aislado del resto del cuerpo por la barrera hematorretiniana. Los ejemplos específicos de trastornos neurológicos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas (que incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de cuerpos de Lewy, el síndrome postpoliomielitis, el síndrome de Shy-Draeger, la atrofia olivopontocerebelosa, la enfermedad de Parkinson, la atrofia multisistémica, la degeneración nigroestriatal, las tauopatías (que incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Alzheimer y la parálisis supranuclear), enfermedades priónicas (que incluyen, pero no se limitan a, la encefalopatía espongiforme bovina, la tembladera, el síndrome de Creutzfeldt-Jakob, el kuru, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la enfermedad consuntiva crónica e insomnio familiar), parálisis bulbar, enfermedad de la neurona motora y trastornos heterodegenerativos del sistema nervioso (que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Canavan, enfermedad de Huntington, lipofuscinosis ceroide neuronal, enfermedad de Alexander, síndrome de Tourette, síndrome del cabello rizado de Menkes, síndrome de Cockayne, síndrome de Halervorden-Spatz síndrome, enfermedad de lafora, síndrome de Rett, degeneración hepatolenticular, síndrome de Lesch-Nyhan, y síndrome de Unverricht-Lundborg), demencia (que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Pick y ataxia espinocerebelosa), cáncer (por ejemplo, del SNC y/o cerebro, que incluyen metástasis cerebrales resultantes de cáncer en otras partes del cuerpo).
Los fármacos para tratar el trastorno neurológico incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, péptidos, proteínas, ligandos naturales de una o más dianas del SNC, versiones modificadas de ligandos naturales de una o más dianas del SNC, aptámeros, ácidos nucleicos inhibidores (es decir, ARN inhibidores pequeños (ARNip) y ARN de horquilla corta (ARNhc)), ribozimas y moléculas pequeñas, o fragmentos activos de cualquiera de los anteriores. Los fármacos para trastornos neurológicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos, aptámeros, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos inhibidores y moléculas pequeñas y fragmentos activos de cualquiera de los anteriores que son ellos mismos o reconocen específicamente y/o actúan sobre ellos (es decir, inhibir, activar o detectar) un antígeno del SNC o una molécula diana tales como, pero que no se limitan a, proteína precursora de amiloide o partes de la misma, amiloide beta, betasecretasa, gamma-secretasa, tau, alfa-sinucleína, parkina, huntingtina, DR6, presenilina, ApoE, glioma u otros marcadores de cáncer del SNC y neurotrofinas. Los ejemplos no limitativos de fármacos para trastornos neurológicos y trastornos para los que se pueden usar incluyen anticuerpos anti-BACEl para tratar el Alzheimer, lesiones cerebrales agudas y crónicas, apoplejía; anticuerpo anti-Abeta para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer; neurotrofina para el tratamiento de accidentes cerebrovasculares, lesiones cerebrales agudas, lesiones de la médula espinal; factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2) para el tratamiento de lesiones cerebrales crónicas (neurogénesis); anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) para el tratamiento del cáncer de cerebro; factor neural derivado de la línea celular glial (GDNF) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson; factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica y la depresión; enzima lisosomal para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosomal del cerebro; factor neurotrófico ciliar (CNTF) para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica; Neuregulin-1 para el tratamiento de la esquizofrenia; y anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, trastuzumab) para tratar la metástasis cerebral del cáncer positivo para HER2.
En algunas modalidades, la conjugación de las proteínas biológicas activas condicionalmente puede estar en la región Fc de los anticuerpos. Las moléculas, compuestos o fármacos de conjugación descritos anteriormente pueden conjugarse con la región Fc, como se describe en la Patente de Estados Unidos No 8,362,210. Por ejemplo, la región Fc puede conjugarse con una citocina o una toxina para administrarse en el sitio donde el anticuerpo activo condicionalmente muestra actividad preferencial. Los métodos para conjugar polipéptidos con la región Fc de anticuerpos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las Patente de Estados Unidos Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,723,125, 5,783,181, 5,908,626, 5,844,095, y 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; las publicaciones PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, y WO 99/04813; Ashkenazi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, páginas 10535-10539, 1991; Traunecker y otros, Nature, vol. 331, páginas 84-86, 1988; Zheng y otros, J. Immunol., vol. 154, páginas 5590-5600, 1995; y ViI y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, páginas 11337-11341, 1992,.
Modificación de anticuerpos activos condicionalmente multiespecíficos
Cuando las proteínas biológicas activas condicionalmente son anticuerpos activos condicionalmente, los anticuerpos activos condicionalmente pueden diseñarse para generar anticuerpos multiespecíficos activos condicionalmente. El anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo con especificidad poliepitópica, como se describe en el documento WO 2013/170168,. Los anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (VL), donde la unidad VhVl tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más Vl y dominios Vh en los que cada unidad VhVl se une a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos y cada dominio variable único se une a un epítopo diferente, y anticuerpos que comprenden uno o más fragmentos de anticuerpos, así como anticuerpos que comprenden anticuerpos fragmentos que han sido enlazados covalentemente o no covalentemente.
Para construir anticuerpos multiespecíficos, que incluyen los anticuerpos biespecíficos, se obtienen fragmentos de anticuerpos que tienen al menos un grupo sulfhidrilo libre. Los fragmentos de anticuerpos se pueden obtener a partir de anticuerpos activos condicionalmente de longitud completa. Los anticuerpos activos condicionalmente pueden digerirse enzimáticamente para producir fragmentos de anticuerpos. Los métodos de digestión enzimática ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, pepsina, papaína y Lis-C. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacuerpos (Db); diacuerpos en tándem (taDb), anticuerpos lineales (ver la Patente de Estados Unidos No. 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata y otros, Protein Eng., vol. 8, páginas 1057-1062 (1995)); anticuerpos de un solo brazo, anticuerpos de dominio variable sencillos, minicuerpos (Olafsen y otros (2004) Protein Eng. Design & Sel., vol. 17, páginas 315-323), moléculas de anticuerpos monocatenarios, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), CDR (región determinante complementaria) y fragmentos de unión a epítopos. Los fragmentos de anticuerpos también se pueden producir mediante el uso de tecnología de ADN recombinante. El ADN que codifica los fragmentos de anticuerpos puede clonarse en vectores de expresión de plásmidos o vectores de fagémidos y expresarse directamente en E. coli. Los métodos de digestión enzimática de anticuerpos, la clonación de ADN y los métodos de expresión de proteínas recombinantes son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los fragmentos de anticuerpos se pueden purificar mediante el uso de técnicas convencionales y se someten a reducción para generar un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos que tienen un grupo tiol libre se hacen reaccionar con un reticulante, por ejemplo, bis-maleimida. Tales fragmentos de anticuerpos entrecruzados se purifican y luego se hacen reaccionar con un segundo fragmento de anticuerpo que tiene un grupo tiol libre. Se purifica el producto final en el que se entrecruzan dos fragmentos de anticuerpo. En determinadas modalidades, cada fragmento de anticuerpo es un Fab y el producto final, en el que los dos Fab están unidos a través de bismaleimida, se denomina en la presente descripción bismaleimido-(tio-Fab)2 o bis-Fab. Tales anticuerpos multiespecíficos y análogos de anticuerpos, que incluyen los bis-Fab, pueden aprovecharse para sintetizar rápidamente un gran número de combinaciones de fragmentos de anticuerpos o variantes estructurales de anticuerpos nativos o combinaciones de fragmentos de anticuerpos particulares.
Los anticuerpos multiespecíficos se pueden sintetizar con agentes de entrecruzamiento modificados de modo que se puedan unir restos funcionales adicionales al anticuerpo multiespecífico. Los reticuladores modificados permiten la unión de cualquier resto reactivo con sulfhidrilo. En una modalidad, se une N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SAT A) a bis-maleimida para formar bis-maleimidoacetiltioacetato (BMata). Después de la desprotección del grupo tiol enmascarado, cualquier grupo funcional que tenga un resto reactivo con sulfhidrilo (o reactivo con tiol) puede unirse a los anticuerpos multiespecíficos.
Los reactivos que reaccionan con tiol ilustrativos incluyen un reactivo enlazador multifuncional, un reactivo marcador de captura, es decir, de afinidad (por ejemplo, un reactivo enlazador de biotina), un marcador de detección (por ejemplo, un reactivo fluoróforo), un reactivo de inmovilización en fase sólida (por ejemplo, SEPHAROSE™, poliestireno, o vidrio), o un intermediario enlazador a fármaco. Un ejemplo de un reactivo que reaccionan con tiol es N-etil maleimida (NEM). Tales anticuerpos multiespecíficos o análogos de anticuerpos que tienen agentes de entrecruzamiento modificados se pueden hacer reaccionar adicionalmente con un reactivo de resto de fármaco u otro marcador. La reacción de un anticuerpo multiespecífico o un análogo de anticuerpo con un intermediario enlazador a fármaco proporciona un conjugado de anticuerpo multiespecífico o un conjugado de fármaco análogo de anticuerpo, respectivamente.
En la presente invención también pueden usarse muchas otras técnicas para fabricar anticuerpos multiespecíficos. Las referencias que describen estas técnicas incluyen: (1) Milstein y Cuello, Nature, vol. 305, página 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker y otros, EMBO J., vol. 10, página 3655 (1991) sobre la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes; (2) la Patente de Estados Unidos No. 5,731,168 en la modificación de "perilla en el agujero"; (3) el documento WO 2009/089004A1 en la modificación de efectos de dirección electrostática para fabricar moléculas heterodiméricas Fc de anticuerpos; (4) la Patente de Estados Unidos No. 4,676,980, y Brennan y otros, Science, vol. 229, página 81 (1985) sobre el entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos; (5) Kostelny y otros, J. Immunol., vol. 148, páginas 1547­ 1553 (1992) sobre el uso de zippers de leucina para producir anticuerpos biespecíficos; (6) Hollinger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, páginas 6444-6448 (1993) sobre el uso de la tecnología de "diacuerpos" para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos; (7) Gruber y otros, J. Immunol., vol. 152, página 5368 (1994) sobre el uso de dímeros Fv (sFv) monocatenarios; (8) Tut y otros J. Immunol. 147: 60 (1991) sobre la preparación de anticuerpos triespecíficos; y (9) el documento US 2006/0025576A1 y Wu y otros, Nature Biotechnology, vol. 25, páginas 1290­ 1297 (2007) en anticuerpos modificados con tres o más sitios de unión a antígenos funcionales, que incluyen los "anticuerpos Octopus" o las "inmunoglobulinas de doble dominio variable" (DVD).
Los anticuerpos multiespecíficos de la presente invención también podrían generarse como se describe en el documento WO/2011/109726,
En una modalidad, el anticuerpo activo condicionalmente para cruzar la BBB se modifica para producir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico). Este anticuerpo multiespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a un BBB-R y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a un antígeno cerebral. Al menos el primer sitio de unión al antígeno para BBB-R es activo condicionalmente. Un antígeno cerebral es un antígeno expresado en el cerebro, que se puede atacar con un anticuerpo o una molécula pequeña. Los ejemplos de tales antígenos incluyen, sin limitación: betasecretasa 1 (BACE1), beta amiloide (Abeta), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), Tau, apolipoproteína E4 (ApoE4), alfa-sinucleína, c D20, huntingtina, proteína priónica (PrP), cinasa 2 repetida rica en leucina (LRRK2), parkina, presenilina 1, presenilina 2, gamma secretasa, receptor de muerte 6 (DR6), proteína precursora de amiloide (APP), receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) y caspasa 6. En una modalidad, el antígeno es BACE1.
Los anticuerpos multiespecíficos tienen una alta selectividad para dirigirse preferentemente a tejidos que contienen todos o la mayoría de las dianas (antígenos) a los que se puede unir un anticuerpo multiespecífico. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico proporciona selectividad para las células diana al mostrar una mayor preferencia por las células diana que expresan ambos antígenos reconocidos por el anticuerpo biespecífico, en comparación con las células no diana que pueden expresar solo uno de los antígenos. Por lo tanto, debido al dinamismo del sistema, hay más anticuerpos biespecíficos unidos a las células diana que células no diana en equilibrio.
Modificación de la región Fc de anticuerpos activos condicionalmente
Cuando las proteínas biológicas activas condicionalmente son anticuerpos activos condicionalmente, los anticuerpos activos condicionalmente pueden diseñarse en su región cristalizable de fragmento (región Fc). La región Fc es la región de la cola de un anticuerpo que interactúa con los receptores de la superficie celular llamados receptores Fc y algunas proteínas del sistema del complemento. A diferencia de la región Fab que es específica para cada antígeno, la región Fc de todos los anticuerpos de una clase es la misma para cada especie, independientemente del antígeno al que se una el anticuerpo.
Los receptores Fc son miembros de la superfamilia de proteínas del gen de la inmunoglobulina. Los receptores Fc se encuentran en varias células del sistema inmunitario, que incluyen fagocitos como macrófagos y monocitos, granulocitos como neutrófilos y eosinófilos, y linfocitos del sistema inmunitario innato (células asesinas naturales) o del sistema inmunitario adaptativo (por ejemplo, células B). Después de unirse con un anticuerpo, el receptor Fc activa estas células y permite que estas células identifiquen y eliminen antígenos (como patógenos microbianos) que están unidos a la región Fab del anticuerpo. Los mecanismos de destrucción mediados por el receptor Fc incluyen la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
En algunas modalidades, la región Fc está modificada para introducir mutaciones tales como sustituciones de aminoácidos en la región Fc. Tal sustitución en la región Fc puede aumentar la vida media del anticuerpo mutado en el suero. Por ejemplo, la vida media de un anticuerpo IgG se correlaciona con su unión dependiente del pH al receptor neonatal FcRn, que se expresa en la superficie de las células endoteliales y protege a la IgG de la degradación de una manera dependiente del pH. Varias sustituciones de aminoácidos en la región Fc, tales como T250Q/M428L y M252Y/S254T/T256E H433K/N434F, han mostrado una afinidad de unión aumentada del anticuerpo a FcRn y prolongan la vida media del anticuerpo.
También se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en la región Fc para alterar las funciones efectoras. Por ejemplo, los anticuerpos humanos de la clase IgG se unen a los receptores Fcy (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa), el receptor inhibidor FcyRIIb y el primer componente del complemento (Clq) con diferentes afinidades, lo que produce funciones efectoras muy diferentes entre los diferentes anticuerpos. La unión del anticuerpo IgG a FcyR o Clq depende de los residuos ubicados en el dominio bisagra y el dominio CH2 del anticuerpo. Las sustituciones de aminoácidos en los residuos IgG1 o IgG2 de los anticuerpos humanos en las posiciones 233-236 y los residuos de IgG4 del anticuerpo en las posiciones 327, 330 y 331 pueden reducir en gran medida la ADCC y la CDC. Además, la sustitución de alanina en diferentes posiciones en la región Fc, que incluye K322, redujo significativamente la activación del complemento. Muchos más ejemplos de modificación de la región Fc se describen en el documento US 8,362,20.
En algunas modalidades, la región Fc de un anticuerpo puede modificarse para que sea capaz de reconocer un antígeno (documento US 200/0256340). . Al menos uno, preferentemente dos, fragmentos Fab adicionales pueden enlazarse a la región Fc de un anticuerpo. En algunas modalidades, los fragmentos Fab extra son activos condicionalmente. Por ejemplo, el anticuerpo de la presente invención para cruzar la BBB puede contener tal fragmento Fab adicional con afinidad por una BBB-R en el lado del plasma y poca o ninguna afinidad por la BBB-R en el lado del cerebro. El anticuerpo también puede unirse a múltiples antígenos cerebrales, por lo que puede tener una mayor selectividad para actuar preferentemente en los sitios donde están presentes estos antígenos.
Composiciones farmacéuticas
La presente descripción proporciona al menos una composición que comprende (a) una proteína biológica activa condicionalmente; y (b) un vehículo o diluyente adecuado. La presente descripción también proporciona al menos una composición que comprende (a) una proteína biológica activa condicionalmente que codifica un ácido nucleico como se describe en la presente descripción; y (b) un vehículo o diluyente adecuado. El vehículo o diluyente puede ser opcionalmente farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con los vehículos o diluyentes conocidos. La composición puede comprender además opcionalmente al menos otro compuesto, proteína o composición. En alguna modalidad, la proteína biológica activa condicionalmente es un anticuerpo activo condicionalmente.
La proteína biológica activa condicionalmente puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Sales farmacéuticamente aceptables significa que pueden usarse generalmente como sales de una proteína terapéutica en la industria farmacéutica, que incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio y similares, y sales de amina de procaína, dibencilamina, etilendiamina, etanolamina, metilglucamina, taurina, y similares, así como sales de adición de ácidos tales como clorhidratos y aminoácidos básicos y similares.
La presente descripción proporciona además al menos un método o composición de proteína biológica activa condicionalmente, para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva para modular o tratar al menos una condición relacionada con la molécula parental en una célula, tejido, órgano, animal o paciente y/o, antes de, posterior a, o durante una condición relacionada, como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente descripción. Por lo tanto, la descripción proporciona un método para diagnosticar o tratar una condición asociada con la proteína de tipo salvaje en una célula, tejido, órgano o animal, que comprende poner en contacto o administrar una composición que comprende una cantidad efectiva de al menos una proteína biológica activa condicionalmente de la descripción con, o a, la célula, tejido, órgano o animal. El método puede comprender opcionalmente además el uso de una cantidad efectiva de 0,001-50 mg/kilogramo de una proteína biológica activa condicionalmente de la descripción para las células, tejidos, órganos o animales. Opcionalmente, el método puede comprender además el uso del contacto o la administración mediante al menos un modo seleccionado entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico. Opcionalmente, el método puede comprender además administrar, antes, al mismo tiempo o después de que la proteína biológica activa condicionalmente entre en contacto o administre al menos una composición que comprenda una cantidad eficaz de al menos un compuesto o proteína seleccionada de al menos uno de un reportero o marcador detectable, un antagonista del factor de necrosis tumoral, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE)), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o un análogo de la misma, un citotóxico u otro agente anticancerígeno, un antimetabolito tal como metotrexato o un agente antiproliferativo.
La presente descripción proporciona además al menos un método de proteína biológica activa condicionalmente para diagnosticar al menos una condición relacionada con proteína de tipo salvaje en una célula, tejido, órgano, animal o paciente y/o, antes, después o durante una condición relacionada, como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente descripción.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables están determinados en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Se puede usar una diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia indeseada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. La concentración de proteína biológica activa condicionalmente en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente.
Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del ácido nucleico empaquetado suspendido en diluyentes, tales como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, bolsitas o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, en forma de líquido, sólido, gránulo o gelatina; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la invención para administración oral se pueden formular mediante el uso de vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas y apropiadas. Tales vehículos permiten que los productos farmacéuticos se formulen en formas de dosificación unitaria como comprimidos, píldoras, polvos, grageas, cápsulas, líquidos, pastillas, geles, jarabes, pastas, suspensiones, etc., adecuados para la ingestión por parte del paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden formular como un excipiente sólido, opcionalmente al moler una mezcla resultante y al procesar la mezcla de gránulos, después de añadir compuestos adicionales adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes sólidos adecuados son rellenos de carbohidratos o proteínas que incluyen, por ejemplo, azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropiletilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; y gomas que incluyen arábiga y tragacanto; y proteínas, por ejemplo, gelatina y colágeno. Se pueden añadir agentes disgregantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato sódico. Las formas de tabletas pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de patata, tragacanto, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscanelosa sódica, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, rellenos, aglutinantes, diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes, agentes disgregantes y vehículos farmacéuticamente aceptables.
La invención proporciona suspensiones acuosas que comprenden una proteína biológica activa condicionalmente, mezclada con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen un agente de suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma acacia, y agentes dispersantes o humectantes tales como un fosfátido de origen natural (por ejemplo, lecitina), un producto de condensación de un alquileno óxido de etileno con un ácido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetileno oxicetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitol), o un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitol). La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservantes tales como p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más colorantes, uno o más aromatizantes y uno o más edulcorantes, tales como sacarosa, aspartamo o sacarina. Las formulaciones se pueden ajustar según la osmolalidad.
Las formas de pastillas pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tales como gelatina y glicerina o sacarosa y emulsiones de acacia, geles y similares que contienen, en adición al ingrediente activo, los vehículos conocidos en la técnica. Se reconoce que la proteína biológica activa condicionalmente, cuando se administra por vía oral, debe protegerse de la digestión. Esto se logra típicamente al formar complejos con la proteína biológica activa condicionalmente con una composición para hacerla resistente a la hidrólisis ácida y enzimática o al empaquetar la proteína biológica activa condicionalmente en un vehículo resistente apropiado tal como un liposoma. Los medios para proteger las proteínas de la digestión son bien conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas se pueden encapsular, por ejemplo, en liposomas o en una formulación que proporcione una liberación lenta del ingrediente activo.
La proteína biológica activa condicionalmente empaquetada, sola o en combinación con otros componentes adecuados, puede convertirse en formulaciones de aerosol (por ejemplo, pueden "nebulizarse") para administrarse por inhalación. Las formulaciones de aerosol se pueden colocar en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Las formulaciones adecuadas para la administración rectal incluyen, por ejemplo, supositorios, que consisten en el ácido nucleico empaquetado con una base de supositorio. Las bases de óvulos adecuadas incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos de parafina, además, también es posible usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación del ácido nucleico empaquetado con una base, que incluye, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles e hidrocarburos de parafina.
Las composiciones de administración dérmica o tópica de la invención pueden incluir, en adición a una proteína biológica activa condicionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable en una formulación de crema, ungüento, solución o hidrogel, y otros compuestos siempre que el componente añadido no afecte negativamente la administración de la proteína terapéutica. También se pueden añadir emulsionantes, tensioactivos, agentes de suspensión, antioxidantes, potenciadores osmóticos, diluyentes, diluyentes y conservantes farmacéuticamente aceptables convencionales. Los polímeros solubles en agua también se pueden usar como vehículos.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, por vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones inyectables isotónicas estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes, en la práctica de esta invención, las composiciones pueden ser administradas, por ejemplo, por infusión intravenosa, oralmente, tópicamente, intraperitonealmente, intravesicalmente o intratecalmente. En un aspecto, los modos de administración parenteral son métodos de administración preferidos para composiciones que comprenden una proteína biológica activa condicionalmente. Las composiciones se pueden administrar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton Pa., 18a Ed., 1990. Las formulaciones para la administración intravenosa pueden contener un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tal como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Ver también y adaptar la descripción en la patente de Estados Unidos No. 4,318,905.
Las formulaciones de composiciones empaquetadas que comprenden una proteína biológica activa condicionalmente pueden presentarse en contenedores sellados monodosis o multidosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo descrito anteriormente.
La presente descripción también proporciona al menos una composición de proteína biológica activa condicionalmente, un dispositivo y/o un método de administración para el diagnóstico de al menos una afección relacionada con una proteína de tipo salvaje, de acuerdo con la presente descripción.
También se proporciona una composición que comprende al menos una proteína biológica activa condicionalmente y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la composición puede comprender además una cantidad eficaz de al menos un compuesto o proteína seleccionada de al menos uno de un indicador o indicador detectable, un agente citotóxico u otro agente anticancerígeno, un antimetabolito como metotrexato, un agente antiproliferativo, un citocina, o un antagonista de citocina, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o un análogo.
También se proporciona un dispositivo médico, que comprende al menos una proteína biológica activa condicionalmente de la descripción, en donde el dispositivo es adecuado para contactar o administrar al menos una proteína biológica activa condicionalmente mediante al menos un modo seleccionado entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.
En un aspecto adicional, la descripción proporciona un kit que comprende al menos una proteína biológica activa condicionalmente o un fragmento de la descripción en forma liofilizada en un primer recipiente, y un segundo recipiente opcional que comprende agua estéril, agua estéril tamponada o al menos un conservante seleccionado del grupo formado por fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. En un aspecto, en el kit, la concentración de proteína biológica activa condicionalmente o parte específica o variante en el primer contenedor se reconstituye a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 500 mg/mL con el contenido del segundo contenedor, en otro aspecto, el segundo contenedor comprende además un agente de isotonicidad. En otro aspecto, el segundo contenedor comprende además un tampón fisiológicamente aceptable. En un aspecto, la descripción proporciona un método para tratar al menos una afección mediada por proteínas de tipo salvaje, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una formulación proporcionada en un kit y reconstituida antes de la administración.
También se proporciona un artículo de fabricación para uso farmacéutico o de diagnóstico humano, que comprende material de empaquetado y un contenedor que comprende una solución o una forma liofilizada de al menos una proteína biológica activa condicionalmente de la presente descripción. El artículo de fabricación puede comprender opcionalmente tener el contenedor como componente de un sistema parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico. Dispositivo o sistema de administración intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.
La presente descripción proporciona además cualquier descripción descrita en la presente descripción.
Ejemplo 1: Descripción general de un ensayo multipocillos (por ejemplo, ensayo de 96 pocillos) para mutantes de temperatura:
Se añade sustrato fluorescente a cada pocillo de una placa multipocillos, a temperaturas de reacción más bajas tanto de tipo salvaje como nuevas (por ejemplo, 37 °C o 25 °C como se mencionó anteriormente) durante un período de tiempo adecuado. La fluorescencia se detecta al medir la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes con espectros de excitación y emisión apropiados (por ejemplo, excitación de 320 nm/emisión de 405 nm). Se determinan las unidades de fluorescencia relativas (RFU). El sobrenadante de la molécula de tipo salvaje y las células transformadas con plásmido/vector se usan como controles positivo y negativo. Se realizan reacciones por duplicado para cada muestra, temperatura de reacción y control positivo y negativo.
Los mutantes que son activos a la temperatura más baja (por ejemplo, los mutantes activos a 25 °C) y que tienen una disminución de la actividad a la temperatura de tipo salvaje (por ejemplo, un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o más disminución en la actividad a 37 °C), así tiene una relación de actividades mayor o igual a aproximadamente 1,1 o más (por ejemplo, la relación de las actividades a 25 °C o 37 °C (25 °C/37 °C) es mayor o igual a 1,1 o más), pueden considerarse aciertos primarios putativos sensibles a la temperatura. Estos aciertos putativos primarios sensibles a la temperatura pueden luego volver a cribarse, mediante el uso del mismo ensayo, para confirmar cualquier acierto primario.
Ejemplo 2: Descripción general de un formato de ensayo diferente para la confirmación de la actividad (por ejemplo, un ensayo de 14 mL) para mutantes de temperatura:
Los mutantes que se identifican como aciertos primarios sensibles a la temperatura se expresan en tubos de cultivo de 14 mL y su actividad enzimática se mide en el tipo salvaje (por ejemplo, 37 °C) y la temperatura más baja (por ejemplo, 25 °C). La proteína se expresa y purifica como se describe anteriormente para el formato multipocillos, con la excepción de que la expresión se realiza en un formato diferente (tubos de 14 mL) en lugar del formato multipocillos (placa de 96 pocillos).
Cada sobrenadante mutante se transfiere a una placa multipocillos, por ejemplo, una microplaca de 96 pocillos. El sustrato fluorescente se añade a cada tubo a las temperaturas de reacción indicadas (tipo salvaje, temperatura más baja) durante un período de tiempo requerido. Las moléculas de tipo salvaje se usan como control positivo y el sobrenadante de las células transformadas solo con el vector se usa como control negativo. La fluorescencia se detecta al medir la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes en los espectros de emisión apropiados (por ejemplo, excitación de 320 nm/emisión de 405 ran). Se determinan las unidades de fluorescencia relativas (RFU). Se pueden realizar reacciones por duplicado para cada muestra, temperatura de reacción y control positivo y negativo. Los mutantes que son activos a las temperaturas más bajas (por ejemplo, 25 °C) pero que demuestran al menos un 30 % o más de actividad reducida en el tipo salvaje (por ejemplo, 37 °C), por lo tanto, tienen una relación de actividad a temperaturas más bajas (por ejemplo, 25 °C) a una temperatura de tipo salvaje (por ejemplo, 37 °C) igual o superior a 1,5, se identifican como aciertos sensibles a la temperatura.
Las actividades de los mutantes a la temperatura más baja (por ejemplo, 25 °C) se comparan con la actividad de la molécula de tipo salvaje a la temperatura de tipo salvaje (por ejemplo, 37 °C). Si las moléculas son más activas que las moléculas de tipo salvaje a la temperatura más baja (por ejemplo, 25 °C), como lo indica una actividad residual > 1, preferentemente 2 o mayor que 2, y si los mutantes muestran una disminución general de la actividad cuando se compara con la molécula de tipo salvaje a la temperatura de tipo salvaje (37 °C), se puede confirmar el fenotipo de los mutantes como mutantes sensibles a la temperatura.
Ejemplo 3: Descripción general de la evolución adicional de los aciertos descubiertos:
Si se desea, se genera una nueva biblioteca de variantes combinatorias a partir de todos los aciertos mutantes seleccionados previamente identificados. La nueva biblioteca se puede diseñar para que contenga todas las combinaciones posibles de variantes de aminoácidos para cada uno de los mutantes seleccionados, y se puede volver a cribar como se describe para nuevos aciertos.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar una proteína biológica activa condicionalmente, el método comprende las etapas de: i. seleccionar una proteína biológica parental;
ii. evolucionar el ADN que codifica la proteína biológica parental mediante el uso de una o más técnicas evolutivas para crear a Dn mutantes;
iii. expresar los ADN mutantes para obtener proteínas biológicas mutantes;
iv. someter las proteínas biológicas mutantes y la proteína biológica parental a un ensayo bajo una primera condición fisiológica del líquido sinovial en una primera ubicación y a un ensayo bajo una segunda condición fisiológica seleccionada de las condiciones fisiológicas de una segunda ubicación en un cuerpo que es diferente de la primera ubicación; y
v. seleccionar la proteína biológica activa condicionalmente de las proteínas biológicas mutantes que funcionan preferentemente en el líquido sinovial pero que no actúan o lo hacen en menor medida sobre otras partes del cuerpo y exhiben una actividad aumentada en el ensayo bajo la primera condición fisiológica en comparación con la misma actividad en el ensayo bajo la segunda condición fisiológica,
en donde la primera condición fisiológica del líquido sinovial se selecciona de una baja concentración de glucosa, un pH diferente al pH del plasma sanguíneo y una baja concentración de proteínas.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína biológica activa condicionalmente es un anticuerpo activo condicionalmente.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además una etapa de conjugar la proteína biológica activa condicionalmente a una citocina, una interleucina, una enzima, una hormona, un factor de crecimiento, un agente citotóxico, un fármaco quimioterapéutico, una partícula radioactiva o un agente de diagnóstico.
4. El método de la reivindicación 3, en donde la etapa de conjugación emplea un enlace covalente o un enlace no covalente.
5. El método de la reivindicación 3, cuando depende de la reivindicación 2, en donde la citocina, interleucina, enzima, hormona, factor de crecimiento, agente citotóxico, fármaco quimioterapéutico, partícula radioactiva o agente de diagnóstico se conjuga con una región Fc del anticuerpo activo condicionalmente.
6. El método de la reivindicación 2, que comprende además una etapa de introducir al menos una sustitución de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo activo condicionalmente.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la al menos una sustitución de aminoácidos es dos o más sustituciones de aminoácidos.
8. El método de la reivindicación 2, que comprende además una etapa de modificación del anticuerpo activo condicionalmente para que sea multiespecífico.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo modificado activo condicionalmente se une específicamente a al menos dos antígenos.
10. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína biológica parental es un anticuerpo y la etapa de evolución comprende la mutación de una región Fc del anticuerpo parental.
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