JP2017521052A - 条件的活性型生物学的タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本開示は、野生型タンパク質、詳細には治療的タンパク質から、ある生理条件で可逆的又は不可逆的に不活性化される条件的活性型生物学的タンパク質を生成する方法に関する。例えば、条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍において活性であるが、他の体の部分では事実上不活性であるか、又は血液脳関門を通過する能力を有する条件的活性型抗体である。

Description

本開示は、タンパク質の発達（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）及び活性の分野に関する。具体的には、本開示は、野生型タンパク質、詳細には治療的タンパク質から、野生型の正常生理条件で可逆的又は不可逆的に不活性化される条件的活性型生物学的タンパク質を生成する方法、並びにかかる条件的活性型生物学的タンパク質及びかかる条件的活性型生物学的タンパク質の使用に関する。
様々な特徴においてタンパク質を発達させるための可能性、例えば、特に酵素を異なる条件下での操作のために安定させることについて記載している相当数の文献がある。例えば、酵素は、活性を変化させることで、より高い温度で安定するために発達した。高温での活性改良という状況において、この改良の実質的な部分は、摂氏１０度上昇するごとに代謝回転が倍増する酵素の場合において推定されるＱ１０ルールにより共通して記載される高い動的活性に起因していることがある。加えて、この分子の野生型活性温度のような、通常操作条件においてタンパク質を不安定化する自然の変異株の例も存在する。温度変異型において、これらの変異は、低温において活性化されることもあるが、通常は、この野生分子と比較して、低レベルでの活性となる（また、通常、Ｑ１０又は同様のルールにより導かれる活性において減少によって記載される）。
条件的に活性化される有用な分子を生成することは望ましい。例えば、野生型条件において実質的に不活性であるが、野生型条件以外の、野生型条件と等しい若しくはより良いレベルで活性化し、又は特定の微小環境において活性化若しくは不活性化し、又は経時的に活性化若しくは不活性化される。温度の他に、タンパク質を発達又は最適化させうる他の条件は、少なくともｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化及び電解質濃度を含む。発達の間、最適化されうる他の望ましい性質は、化学抵抗及びタンパク質分解抵抗を含む。
分子を発達させ、又は操作するための多くの戦略が発表されている。米国特許出願公開第２０１０／０１８９６５１号明細書は、マスキング部分が連結された抗体又は抗体フラグメントを含有する操作された抗体を開示している。かかる操作された抗体を開裂可能部分にさらにカップリングすると、条件的に活性化させることのできる抗体がもたらされうる。開裂可能部分は、開裂し、還元し、又は光分解することが可能である。この抗体は、開裂可能部分の開裂、還元、又は光分解によるマスキング部分の除去後に標的が抗体に到達し易くなるような高次構造を呈しうる。
米国特許出願公開第２０１３／０１０１５５５号明細書は、操作された活性化可能なプロタンパク質組成物を開示している。活性化可能なプロタンパク質が、ペプチドマスクにカップリングし、且つさらには活性化可能なリンカーにカップリングした機能タンパク質を含有する。非活性化状態では、ペプチドマスクが機能タンパク質とその標的又は結合パートナーとの結合を阻害する。活性化状態では、ペプチドマスクは機能タンパク質とその標的又は結合パートナーとの結合を阻害しない。プロタンパク質は、機能タンパク質が非治療部位でのその結合パートナーとの結合を阻害されなかった場合に本来であれば機能タンパク質がかかる非治療部位で結合することによって生じるであろう毒性及び有害な副作用の低下をもたらしうる。ペプチドマスクを含有するプロタンパク質はまた、ペプチドマスクを含有しない対応する機能タンパク質と比べて長い生体内又は血清中半減期も有しうる。
米国特許出願公開第２０１１／０２２９４８９号明細書は、抗原結合に対する親和性がエンドソームｐＨ（すなわちｐＨ６．０又は５．５）と比べて生理的ｐＨ（すなわちｐＨ７．４）でより高くなるような抗原に対するｐＨ依存的結合性を有する抗体を開示している。かかるｐＨ依存性抗体は、エンドソームにおいて抗原から優先的に解離する。これにより、抗原が抗原媒介性クリアランスを受ける抗原である場合（例えば、ＰＣＳＫ９）、ｐＨ７．４で同等のＫDSを有するもののｐＨ依存的結合は有しない抗体と比較したとき、抗体半減期が増加しうる。抗原が抗体に結合した後のクリアランスの低下を受けるとき、ｐＨ依存的結合を有する抗体は全抗原半減期を減少させうる。
米国特許出願公開第２０１３／０２６６５７９号明細書は、条件的活性型抗ＥＧＦＲ抗体を開示している。この抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する結合活性について、非腫瘍環境における条件に対する腫瘍環境における条件の比が少なくとも３．０を呈する。腫瘍環境における条件は、５．６〜６．８のｐＨ又は５ｍＭ〜２０ｍＭの乳酸濃度、及びタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの一方又は両方を含む。非腫瘍環境における条件は、７．０〜７．８のｐＨ又は０．５ｍＭ〜５ｍＭの乳酸濃度、及び１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の一方又は両方を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍微小環境に見ることのできる条件下で条件的に活性であると言われる。
Ｐａｒｄｏｌｌ ｅｔ ａｌ，“Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ ２５２−２６４，２０１２は、宿主の免疫系チェックポイントの遮断によって宿主抗腫瘍免疫を活性化させることを含む癌療法を記載している。かかる遮断は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）及び死タンパク質１（ＰＤ１）を含め、Ｔ細胞上の受容体などの免疫チェックポイントタンパク質を阻害することによって達成しうる。これらの免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体は、癌療法向けに開発されている。
タンパク質がその野生型操作条件では不活性又は事実上不活性（１０％未満の活性、特に１％の活性）となる一方で、新しい条件ではその野生型条件と同等か又はそれより良好な活性を維持するように操作し、又は発達させるには、不安定化させる突然変異が、その不安定効果を打ち消すことのない、活性を増加させる突然変異と共存する必要がある。不安定化により、Ｑｌ０など標準的法則によって予測される効果を超えてタンパク質の活性が低下するであろうことが予想され、従って、その正常な動作条件下では不活性になる一方で、例えば低温では効率的に機能するタンパク質を発達させることが可能になることにより、予期せぬ新規クラスの条件的活性型タンパク質が作り出される。
本出願の全体において、様々な刊行物は、著者及び日付により参照されている。その全体におけるこれらの刊行物の開示は、本明細書に記載され特許請求される本開示の日付以降、当該技術分野の水準を当業者に知られているように、より完全に記載するために、本出願内に参照により組み込まれている。
一態様において、本発明は、条件的活性型生物学的タンパク質を調製する方法を提供するものであり、この方法は、ｉ．野生型生物学的タンパク質を選択する工程と、ｉｉ．野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、ｉｉｉ．変異ＤＮＡを発現させて、変異生物学的タンパク質を得る工程と、ｉｖ．変異生物学的タンパク質及び野生型生物学的タンパク質を、滑液、腫瘍微小環境及び幹細胞ニッチからなる群から選択される第一位置の生理条件から選択される第一生理条件下での分析と、第一位置と異なる体内の第二位置の生理条件から選択される第二生理条件下での分析とに供する工程と、ｖ．（ａ）第一生理条件下での分析における野生型生物学的タンパク質と比較して増加した活性と、（ｂ）第二生理条件下での分析における野生型生物学的タンパク質と比較して低下した活性との両方を呈する変異生物学的タンパク質から条件的活性型生物学的タンパク質を選択する工程とを含む。
別の態様において、本発明は、血液脳関門を通過するための条件的活性型抗体を調製する方法を提供するものであり、この方法は、ｉ．血液脳関門受容体に対する野生型抗体を選択する工程と、ｉｉ．野生型抗体をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、ｉｉｉ．変異ＤＮＡを発現させて、変異抗体を得る工程と；ｉｖ．変異抗体及び野生型抗体を血漿中における第一生理条件下での分析と、脳細胞外液中における第二生理条件下での分析とに供する工程と、ｖ．（ａ）第一生理条件下での分析における野生型抗体と比較した血液脳関門受容体に対する親和性の低下と、（ｂ）第二生理条件下での分析における血液脳関門受容体に対する増加した親和性と第二生理条件下での分析における血液脳関門受容体に対する欠如した親和性とからなる群から選択される親和性との両方を呈する変異抗体から条件的活性型抗体を選択する工程とを含む。
さらに別の態様において、本発明の方法は、条件的活性型生物学的タンパク質を分子にコンジュゲートする工程をさらに含む。
さらに別の態様において、本発明の方法は、条件的活性型抗体のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入する工程をさらに含む。
さらに別の態様において、本発明の方法は、多重特異性となるように条件的活性型抗体を操作する工程をさらに含む。
さらに別の態様において、本発明は、条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。さらに別の態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は条件的活性型抗体である。
定義
本明細書に提供される実施例の理解を容易にするために、特定のしばしば登場する方法及び／又は用語は以下に記載される。
測定量と関連して本明細書で使用される用語「約」は、測定を行い、測定の目的に相応の注意レベルと使用される測定機器の精度を行使する当業者によって期待される測定量における通常の変動に関連するものである。特に明記しない限り、「約」は、与えられた値の＋／−１０％の変動に関連する。
用語「薬剤」は、化学化合物、化学化合物の混合物、空間的に局所化された化合物の配列（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチド配列、ポリヌクレオチド配列、及び／又はコンビナトリアル小分子配列）、生体高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリ、バクテリオファージ抗体（例えばｓｃＦＶ）ディスプレイライブラリ、ポリソームペプチドディスプレイライブラリ、又はバクテリア、植物、菌類又は動物（特に哺乳類）の細胞又は組織のような生体材料からつくられる抽出物を示すのに用いられる。薬剤は、本明細書の以下に記載されているスクリーニング分析に含まれることにより条件的活性型生物学的治療酵素として潜在的酵素活性のために評価される。薬剤は、以下の本明細書の以下に記載されているスクリーニング分析に含まれることにより条件的活性型生物学的治療酵素として潜在的活性のために評価される。
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、アミノ基（−ＮＨ２）及びカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含む任意の有機化合物である、好適には、自由群又はペプチドの部分として縮合後のどちらでも結合する。「アルファ−アミノ酸を形成する２０種の自然にエンコードされたポリペプチド」は従来技術において知られており、アラニン（ａｌａ又はＡ）、アルギニン（ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐ又はＤ）、システイン（ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕ又はＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（ｌｅｕ又はＬ）、リシン（ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（ｔｉｐ又はＷ）、チロシン（ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（ｖａｌ又はＶ）に関連するものである。
本明細書で使用される用語「増幅」は、ポリヌクレオチドのコピー数が増大することを意味する。
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳＣＡフラグメントなど、抗原のエピトープとの結合能を有する免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。これらの抗体フラグメントは、それが由来する抗体の抗原（例えばポリペプチド抗原）に選択的に結合する幾らかの能力を保持しているものであり、当該技術分野において周知の方法を用いて作製することができ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、前掲を参照されたい）、以下の通りにさらに記載される。抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる抗原の調製用分量の単離に使用することができる。かかる抗体の様々な他の使用は、疾患（例えば、新生物形成）の診断及び／又はステージ判定、及び例えば：新生物形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管疾患、感染症などの疾患を治療するための治療適用である。キメラ抗体、ヒト様抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が、ヒト患者への投与に特に有用である。
Ｆａｂフラグメントは抗体分子の一価抗原結合フラグメントからなり、全抗体分子を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなるフラグメントを生じさせることによって作製しうる。
抗体分子のＦａｂ’フラグメントは、全抗体分子をペプシンで処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる分子を生じさせることによって得られうる。このように処理した抗体分子１つにつき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。
抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントは、続く還元なしに全抗体分子を酵素ペプシンで処理することによって得られうる。（Ｆａｂ’）２フラグメントは、２つのジスルフィド結合によって共に保持される２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。
Ｆｖフラグメントは、２本の鎖として発現する軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。
用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合して、続いて細胞毒で標的細胞を死滅させることを可能にする、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に分泌免疫グロブリンが結合する細胞傷害の一形態を指す。標的細胞の表面に向けられるリガンド特異的高親和性ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ上のＡＤＣＣドメインに対する親和性を介して細胞傷害性細胞を刺激し、Ｆａｂ領域を介してＩｇＧ抗体に結合した細胞を攻撃する。標的細胞の溶解は細胞外であり、これには細胞間の直接接触が必要であり、補体は関与しない。
任意の特定の抗体がＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を媒介する能力は、分析することができる。ＡＤＣＣ活性を評価するには、目的の抗体を免疫エフェクター細胞と併せて標的リガンドを提示する標的細胞と混合し、免疫エフェクター細胞が抗原抗体複合体によって活性化されると、標的細胞の細胞溶解が生じうる。細胞溶解は、多くの場合に、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光色素又は天然細胞内タンパク質）の遊離によって検出される。かかる分析に有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。インビトロＡＤＣＣ分析の具体的な例は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１６６，ｐａｇｅ １３５１；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．２５８，ｐａｇｅ １８３；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１８４，ｐａｇｅ ２９（これらは各々、参照により援用される）に記載される。それに代えて又は加えて、目的の抗体のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐａｇｅ ６５２（この内容は全体として参照により援用される）に開示されるものなどの動物モデルにおいて、インビボで評価してもよい。
用語「抗体依存性細胞食作用」又は「ＡＤＣＰ」は、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食作用性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球及び樹状細胞）によって抗体被覆細胞が全体として、又は部分的にインターナライズされるプロセスを指す。
用語「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、たとえ尿素（６０ダルトン）などの極めて小さい分子であっても脳への分子の輸送を制限する緊密な障壁を作り出す、脳毛細血管内皮細胞膜内にタイトジャンクションによって形成される末梢循環と脳及び脊髄との間の生理的障壁を指す。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、及び網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の連続的な毛細血管障壁であり、本明細書ではまとめて「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」と称される。ＢＢＢにはまた血液脳脊髄液関門（脈絡叢）も包含され、この関門は毛細血管内皮細胞よりむしろ上衣細胞を含む。
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には制御されない細胞成長／増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理条件を指し、又はそれを記載する。「腫瘍」は１つ以上の癌性細胞を含む。癌の例としては、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。かかる癌のより詳細な例としては、有棘細胞癌（例えば、上皮有棘細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）又は胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌を含む）、膵癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）又は腎癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌が挙げられる。
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」は、少なくとも２０の隣接するヌクレオチドの部位の部分概念を意味するものであり、そこにおいて、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０の隣接するヌクレオチドの参照配列と比較され、及び比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、これらの２つの配列の最適な配置のための参照配列（付加又は削除を有さない）と比較して２０％パーセント以下の付加又は削除（すなわち、ギャップ）を有することもある。比較ウィンドウを配置するための配列の最適な配置は、スミスの局所的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ，２：４８２−４８９；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，“Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｅｏｒｙ”，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ，９１：３７９−３８０；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，１９８１，１４７：１９５−１９７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８１，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｅｔｒｉｃｓ”，Ｊ ＭｏＩ Ｅｖｏｌ，１８：３８−４６）によって、ニードルマンの相同性アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ，４８（３）：４４３−４５３）によって、ピアソンの相似性検索（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、又は調査によって導かれることがあり、及び選択された様々な方法によって生成される最高の配置（すなわち、比較ウィンドウ上で相同性の高い割合において結果として生じる）であることもある。
用語「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」は、補体因子Ｃ１ｑがほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部に結合することによって惹起されるプロセスを指す。Ｃ１ｑと抗体との結合は、いわゆる結合部位における定義されたタンパク質間相互作用によって生じる。かかるＦｃ部結合部位は、当該技術分野において公知である（上記を参照されたい）。かかるＦｃ部結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（付番はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）によって特徴付けられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含め、補体活性化を示し、一方ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３と結合しない。Ｃ１ｑは、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第一成分である複合体ＣＩを形成する。
用語「条件的活性型生物学的タンパク質」は、１つ以上の正常生理条件下の親又は野生型タンパク質よりも活性が多い又は少ない野生型又は親タンパク質の変異体又は変異を意味する。この条件的活性型タンパク質は、体の選択された領域でも活性を示し、又は異常又は感染に対して許容な生理条件下で活性の増加又は減少を示す。正常生理条件は、投与の部位での、又は対象への投与の部位又は作用部位での組織又は器官における通常範囲内で考慮される温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化及び電解質濃度である。異常条件は、通常受け入れられる範囲から逸脱する条件のことをさす。一態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型条件において実質的に不活性であるが、野生型条件と等しい又は野生型条件よりも良いレベルにおける他の野生型条件においては活性である。例えば、部位の多様において、発達した条件的活性型生物学的タンパク質は体温において実質的に不活性であるが、低温では活性である。他の態様において、この条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型条件において、可逆的又は不可逆的に不活性である。さらなる態様において、この野生型タンパク質は治療タンパク質である。他の態様において、この条件的活性型生物学的タンパク質は、薬又は治療薬剤として用いられる。さらにもう１つの態様において、このタンパク質は、例えば、肺を通過した後のような高い酸素濃度の血液中において、又は腎臓においてみられる低いｐＨにおいて、多い又は少ない活性を示す。
用語「条件的活性型抗体」は、１つ以上の正常生理条件下で親抗体又は野生型抗体と比較して活性がより高いか、又はより低い、野生型又は親抗体の変異体、又は突然変異体を指す。この条件的活性型抗体はまた、体の選択された領域で活性を呈し、及び／又は異常な、又は許容的な生理条件下で活性の増加又は減少を呈する。一態様において、条件的活性型抗体は、正常生理条件下では事実上不活性であるが、非正常生理条件下では正常生理条件下と同等か、又はそれより良好なレベルで活性である。例えば、発達させた条件的活性型抗体は、正常な体温では事実上不活性であるが、低体温では活性である。別の態様において、条件的活性型抗体は正常生理条件下では可逆的又は不可逆的に不活性化される。さらなる態様において、野生型抗体は治療用抗体である。別の態様において、条件的活性型抗体は、薬物、又は治療剤として使用される。さらに別の態様において、この抗体は、例えば肺の通過後の高度に酸素化した血液中又は腎臓に見られるより低いｐＨ環境では活性がより高いか、又はより低い。
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、カルボン酸側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニン、アミドを含む側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミン、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、アルギニン、及びヒスチジン、及び含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する一細胞集団が放出するタンパク質の総称である。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−ａ及び−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−ａ及びＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−ａ、−β、及び−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−ａ又はＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；並びにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語サイトカインには、天然の供給源又は組換え細胞培養物からのタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な均等物が含まれる。
用語「細胞傷害剤」は、本明細書で使用されるとき、細胞機能を阻害し、若しくは妨げ、及び／又は細胞死若しくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤としては、限定はされないが、放射性同位元素（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212及びＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド系（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖抑制剤；酵素及び核酸分解酵素などのそのフラグメント；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物由来の毒素、例えば小分子毒素又は酵素的に活性な毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）が挙げられる。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列のみに作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的開裂を指す。本明細書において使用される様々な制限酵素は市販されており、その反応条件、補因子及び他の要件は当業者に公知の通りに用いた。分析目的では、典型的には１マイクログラムのプラスミド又はＤＮＡフラグメントが約２０マイクロリットルの緩衝溶液中約２単位の酵素と共に使用される。プラスミド構築用のＤＮＡフラグメントを単離する目的では、典型的には５〜５０マイクログラムのＤＮＡが大容積中の２０〜２５０単位の酵素で消化される。特定の制限酵素に適切な緩衝液及び基質の量は製造者によって指定される。通常、３７℃で約１時間のインキュベーション時間が用いられるが、供給者の指示に従い変更してもよい。消化後、反応物をゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメントが単離される。
用語「ＤＮＡシャフリング」は、実質的に相同ではあるが、同一ではない配列間での組換えを示すために本明細書において使用され、実施形態によっては、ＤＮＡシャフリングは、ｃｅｒ／ｌｏｘ及び／又はｆｌｐ／ｆｒｔシステムなどを介してのように、非相同組換えを介しての乗換えを含むことがある。
用語「薬剤」又は「薬剤分子」は、ヒト又は動物の体に投与された際に、ヒト又は動物の体に有益な効果を有する物質を含む治療剤を意味する。好適には、この薬剤は、１つ以上の症状、病気、又はヒト若しくは動物の体における異常条件を治療する、治す又は緩和する、或いはヒト又は動物の体の健康を増進させることができるものである。
「有効量」は、若干の期間にわたって投与された者の生存生物における条件を治療する又は防止する、例えば、所望の投薬期間の間に治療的な効果を提供するのに有効的である、条件的活性型生物学的タンパク質又はフラグメントの量のことである。
本明細書で使用されているように、用語「電解質」は、血液又は電荷を運搬する他の体液内の鉱物を定義するために使用される。例えば、一態様において、正常生理条件及び異常条件は、「電解質濃度」の条件であることがある。一態様において、試験される電解質濃度は、イオン化されたカルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩化物、重炭酸塩、及びリン酸塩濃度の１つ以上から選択される。例えば、一態様において、血清カルシウムの通常範囲は、８．５〜１０．２ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清カルシウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清塩化物は１リットルあたり９６〜１０６ミリグラム当量（ｍＥｑ／Ｌ）である。この態様において、異常血清塩化物濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清マグネシウム濃度の通常範囲は１．７〜２．２ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清マグネシウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清リン酸塩の通常範囲は、２．４〜４．１ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清リン酸塩濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清又は血液のナトリウムの通常範囲は１３５〜１４５ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液ナトリウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清又は血液カリウムの通常範囲は、３．７〜５．２ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液カリウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。さらなる態様において、血清重炭酸塩の通常範囲は２０〜２９ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液重炭酸塩濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。異なる態様において、重炭酸塩レベルは、血液における酸性の通常レベル（ｐＨ）を示すために使用されることがある。用語「電解質濃度」は、組織、又は血液若しくは血漿以外の体液における特定の電解質濃度を定義するためにも使用されることがある。この場合において、正常生理条件は、その組織又は体液において臨床的通常範囲であるように考慮される。この態様において、異常組織又は体液電解質濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。
本開示において使用されるように、用語「抗原決定基」は、酵素ポリペプチドのような抗原上の抗原性決定要素に関連する。また、酵素特異抗体のような抗体の抗原結合部位が結合する。抗原決定基は通常、アミノ酸又は当側鎖のような分子の化学表面活性分属からなり、及び特異３次元構造性質も特異的な電荷性を有することがある。本明細書で使用されているように、「抗原決定基」は、抗原のその部分又は抗体の本体と結合する可変領域と相互に作用する結合相互佐用を形成することができる他の巨大分子を意味する。典型的には、このような結合相互作用は、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸残基との分子間作用として明らかにされる。
本明細書で使用されているように、「酵素」は特定の触媒作用の性質を有するタンパク質である。例えば、基質濃度、ｐＨ、温度及び阻害剤の有無などの要因は、触媒作用の割合に作用することがある。典型的には、野生型酵素において、Ｑ１０（温度係数）は温度が１０℃上昇するごとに反応割合の増加を記載する。野生型酵素において、Ｑ１０＝２〜３であり、換言すれば、反応割合は、温度が１０℃増加するごとに２倍又は３倍となる。高温にて、タンパク質は変性する。酵素最適値とわずかに異なるｐＨ値で、酵素及び場合により基質分子の電荷において小さな変化が生じる。イオン化における変化は、基質分子の結合に作用することがある。極端なｐＨレベルで、酵素は変性を生じ、そこにおいて、活性部位が歪められ、及び基質部位はもはや適合しない。
本明細書で使用されているように、用語「発達」又は「発達する」は、１つ以上の、新規なポリペプチドをエンコードする新規なポリヌクレオチドを生成する突然変異生成の方法を用いることを意味するものであり、新規なポリペプチドは改良された生体分子そのものであり、及び／又は他の改良された生体分子の生成に貢献する。特定の非限定的な態様において、本開示は親野生型タンパク質から条件的活性型生物学的タンパク質の発達に関するものである。一態様において、例えば、発達は、本明細書に参照により組み込まれた米国特許出願公開第２００９／０１３０７１８号明細書に開示される非確率的なポリヌクレオチドキメラ化及び非確率的に突然変異を指令された部位の両方を実行する方法を意味するものである。より詳しくは、本開示は、正常生理条件においては野生型親酵素と比較して活性の減少を示すが、１つ以上の異常条件下では野生型酵素と比較して活性を強化する条件的活性型生物学的酵素の発達のための方法を提供するものである。
用語「フラグメント」、「誘導体」及び「相似器官」は、参照ポリペプチドを参照する際に、少なくとも１つの、少なくとも本質的に参照ポリペプチドと同じ生理機能又は活性を保有するポリペプチドを有する。さらに、用語「フラグメント」、「誘導体」及び「相似器官」は、著しく高い活性を有する成熟した酵素を生成するために開裂により修飾されうる低活性前駆タンパク質のような「前形態」分子によって例示される。
用語「完全長抗体」は、抗原結合可変領域（ＶＨ又はＶＬ）並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む抗体を指す。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。
完全長抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なる「クラス」に割り当てられうる。完全長抗体の主要なクラスは５つあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、これらのうちの幾つかは「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分かれうる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。
「単一アミノ酸置換の全範囲」が各アミノ酸部位に示されている、テンプレートポリペプチドから子孫ポリペプチドを生成するための方法が本明細書において提供されている。本明細書に使用されるように、「単一アミノ酸置換の全範囲」は、本明細書に記載されているようにアルファ−アミノ酸を形成する、２０の自然にエンコードされたポリペプチドに関するものである。
用語「遺伝子」はポリペプチド鎖の生成において含まれるＤＮＡセグメントを意味し、個々のコーディングセグメント（エキソン）間に介在配列（ニトロン）と同様にコーディング領域（リーダー及びトレーダー）を先行する、及び続く領域を含む。
本明細書に使用されるように「遺伝的不安定性」は、反復配列の損失による配列簡易化を通常含む減少事象の工程によって失われる、反復性の高い配列の自然な傾向を意味する。欠失は、反復の１つのコピー及び反復間の全ての損失を含むことがある。
用語「成長因子」は、成長を促進するタンパク質であって、例えば、肝成長因子；線維芽細胞成長因子；血管内皮成長因子；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、及び−γなどのインターフェロン、及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）を含むタンパク質を指す。本明細書で使用されるとき、用語の成長因子には、天然の供給源由来又は組換え細胞培養物由来のタンパク質並びに合成的に産生される小分子実体及びその薬学的に許容可能な誘導体及び塩を含め、天然配列成長因子の生物学的に活性な均等物が含まれる。
用語「非相同」は、一本鎖核酸配列が、他の一本鎖核酸配列又はその相補的配列にハイブリダイズできないことを意味する。従って、非相同な部分は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、他の核酸又はポリヌクレオチドにハイブリダイズできない配列における部分又は領域を有することを意味する。このような領域又は部分は例えば変異の部分である。
用語「ホルモン」は、概して管路を有する腺器官によって分泌されるポリペプチドホルモンを指す。ホルモンには、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；エストラジオール；ホルモン補充療法；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、又はテストラクトンなどのアンドロゲン系；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモン；インヒビン；アクチビン；ミュラー管抑制物質；及びトロンボポエチンが含まれる。本明細書で使用されるとき、用語のホルモンには、天然の供給源由来又は組換え細胞培養物由来のタンパク質並びに合成的に産生される小分子実体及びその薬学的に許容可能な誘導体及び塩を含め、天然配列ホルモンの生物学的に活性な均等物が含まれる。
「同一な」又は「同一」は、２つの核酸が同じ配列又は相補的な配列を有することを意味する。従って、「同一の部分」は、ポリヌクレオチドの領域又は部分、又はポリヌクレオチド全体が、他のポリヌクレオチドの部分に対して同一又は相補的であることを意味する。
用語「免疫系チェックポイント」、又は「免疫チェックポイント」は、自己寛容の維持又は生理学的免疫応答の持続期間及び振幅の調節に寄与して付随する組織損傷を最小限に抑える免疫系における１つ以上の阻害経路を指す。免疫チェックポイントは、免疫系が宿主分子又は細胞を攻撃することを防ぐための保護手段として機能する（自己寛容）。免疫チェックポイントが阻害されると、免疫系、特にＴ細胞が活性化過剰となり、自己寛容が失われることにつながりうる。自己寛容が失われると、外来性分子又は細胞を攻撃することに加え、免疫系が宿主分子、細胞、及び／又は組織を攻撃し、それにより付随する組織損傷が引き起こされうる。これらの免疫チェックポイントが阻害されないとき、免疫系は自己寛容と体内の外来性分子及び細胞の攻撃との間の均衡をとることができる。
腫瘍組織及び場合によりある種の病原体は、免疫チェックポイントに対処して宿主免疫応答の有効性を低下させる能力を有し、腫瘍成長及び／又は慢性感染症をもたらすことが分かっている（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ ２５２−２６４，２０１２；Ｎｉｒｓｃｈｌ＆Ｄｒａｋｅ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１９，ｐａｇｅｓ ４９１７−４９２４，２０１３を参照されたい）。しかしながら、免疫チェックポイントの阻害によって惹起される活性化過剰の免疫系は感受性がはるかに高く、従って腫瘍を検出し、攻撃することができる。従って、癌療法には、免疫チェックポイント阻害は、腫瘍との闘いに免疫系を関与させるために望ましい目標である。対処しなければならない問題は、どのように体の他の部分に対する付随的損傷の可能性を最小限に抑えながら免疫系を活性化過剰にして腫瘍と闘わせるかである。
用語「免疫チェックポイント阻害薬」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全に、又は部分的に減少させ、阻害し、妨害し、又は調節する分子を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、免疫系、特にＴ細胞の活性化又は機能を調節する。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）及びそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６、並びにプログラム細胞死１タンパク質（ＰＤｌ）及びそのリガンドＰＤＬｌ及びＰＤＬ２など、数多くの免疫チェックポイントタンパク質が公知である（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ ２５２−２６４，２０１２）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞応答を阻害する相互作用に関与する。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容並びに生理学的免疫応答の持続期間及び振幅を調節して維持する。免疫チェックポイント阻害薬は抗体を含んでもよく、又は抗体から誘導されてもよい。例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、又はＰＤ−Ｌ１に結合する抗体が、免疫チェックポイント阻害薬として機能する。
用語「分離された」は、その材料が元の環境（例えば、それが自然に発生するものであれば、自然環境）から除去されることを意味する。例えば、自然に発生するポリヌクレオチド又は生きている動物内に存在する酵素は分離されていないが、同じポリヌクレオチド又は酵素でも、自然系において共存する材料の幾つか又は全てから離されたものは、分離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であることがあり、及び／又はこのようなポリヌクレオチド又は酵素は、組成物の一部であることがあり、及びこのようなベクター又は組成物はその自然環境の一部でないという点で、まだ分離される。
用語「分離された核酸」は核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を定義するのに用いられる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のような核酸は、それが誘導される有機体の自然発生遺伝子において存在するときに通常直接に隣接する５'及び３'隣接配列に、直接隣接しない。従って、用語は、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、異種細胞の遺伝子内（又は異種細胞の遺伝子ではあるが、自然は生のものとは異なる部位）に組み込まれた核酸、及び例えばＰＣＲ増幅又は制限酵素消化によってつくられたＤＮＡフラグメント、又は生体外転写でつくられたＲＮＡ分子のような分離された分子として存在する核酸のように、ベクター内に組み込まれる核酸を表す。この用語はまた、例えば溶融タンパク質の製造において用いることができる付加的タンパク質をエンコードする交雑遺伝子の一部を形成する組換え核酸も意味する。
用語「関節損傷」は、最も広義の意味で用いられ、結合組織及び軟骨を含む１つ以上の関節の任意の部分に対する任意の損傷又は部分的若しくは完全な破壊を指し、ここで損傷とは、任意の原因の構造的及び／又は機能的損傷を含み、関節の痛み／関節痛を引き起こすことも、又は引き起こさないこともある。損傷には、限定なしに、炎症性関節疾患並びに非炎症性関節疾患に関連するか、又はそれによって起こる関節損傷が含まれる。この損傷は、自己免疫疾患、例えば、ループス（例えば、全身性エリテマトーデス）、関節炎（例えば、急性及び慢性関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、例えば、若年発症関節リウマチ、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、又は若年性ＲＡ（ＪＲＡ））などの任意の病態によって引き起こされうる。他の病態及び疾患としては、リウマチ性滑膜炎、痛風又は痛風関節炎、急性免疫学的関節炎、慢性炎症性関節炎、変性性関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘発性関節炎、感染性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スチル病、脊椎関節炎、骨関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、反応性関節炎、閉経期関節炎、エストロゲン枯渇関節炎、及び強直性脊椎炎／リウマチ様脊椎炎）、ＲＡ以外のリウマチ性自己免疫疾患、ＲＡに続発する重大な全身性病変（限定はされないが、脈管炎、肺線維症又はフェルティ症候群を含む）、シェーグレン症候群、特定の続発性のかかる症候群が挙げられる。さらなる病態としては、ＲＡを伴う続発性限局性皮膚血管炎、血清反応陰性脊椎関節症、ライム病、炎症性腸疾患、強皮症、炎症性ミオパチー、混合結合組織病、任意の重複症候群、滑液包炎、腱炎、骨髄炎、感染症（インフルエンザ、麻疹（はしか）、リウマチ熱、エプスタイン・バーウイルス症候群、肝炎、ムンプス、風疹（三日はしか）、及び水痘（水疱瘡）を含む）、膝蓋軟骨軟化症、膠原性大腸炎、コラーゲン病に関連する自己免疫障害、関節炎、捻挫又は挫傷などの異常な労作又は使い過ぎ、傷害、例えば骨折、痛風、特に足の親指に見られるもの、並びに神経障害によって引き起こされるもの、血友病性障害（例えば、血友病性関節症）、筋障害、進行性障害、骨障害、軟骨障害、及び血管障害が挙げられる。本明細書の目的上、関節とは、骨格を取り囲んで支持する部分を含む（動物などの脊椎動物の）骨格の要素間の接触点であり、限定はされないが、股関節、脊椎の椎骨間の関節、脊椎と骨盤との間の関節（仙腸関節）、腱及び靱帯が骨に付着しているところの関節、肋骨と脊椎との間の関節、肩、膝、足、肘、手、指、足首及び足指、しかし特に手足の関節が挙げられる。
本明細書で使用されるように、「リガンド」はランダムペプチド又は可変セグメント配列のような特異的受容体によって認識される分子を意味する。当業者が認識しているように、分子（又は高分子複合体）は、受容体でもリガンドでもありうる。一般的に、より小さい分子量を有する結合対はリガンドと呼ばれ、より大きい分子量を有する結合対は受容体と呼ばれる。
「結紮」は２つの二本鎖核酸フラグメント間でリン酸ジエステル結合を形成する方法に関連する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，ｐ．１４６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。提供された方法でなければ、結紮は、結紮されるＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０．５マイクログラムにつき１０ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を有する既知のバッファー及び条件を使用して達成されることもある。
本明細書で使用されるように、「リンカー」又は「スペーサー」は、例えば、ランダムペプチドが、タンパク質を結合するＤＮＡから最少の立体障害を有する受容体に結合することができるように、タンパク質及びランダムペプチドを結合するＤＮＡのような２つの分子を結合し、及び好適な立体配置に２つの分子を配置するのに役立つ。
用語「哺乳類細胞表面ディスプレイ」は、スクリーニング目的で（例えば、磁気ビーズと蛍光活性化細胞選別との組み合わせによって特異的抗原結合に関してスクリーニングすることによる）、タンパク質又は抗体、又は抗体の一部分を哺乳類宿主細胞表面に発現させて提示する技術を指す。一態様において、ＤｕＢｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００９／０１３６９５０号明細書（この態様の開示について参照により本明細書に援用される）にある通り、免疫グロブリンを分泌型及び細胞表面結合型の両方として同時発現させるため哺乳類発現ベクターが用いられる。別の態様において、この技術は、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００７／０１１１２６０号明細書（この態様の開示について参照により本明細書に援用される）にある通り、細胞で発現すると細胞膜上に提示される抗体又は抗体フラグメントのライブラリをコードするウイルスベクターに用いられる。
哺乳類細胞上の全ＩｇＧ表面ディスプレイが公知である。例えば、Ａｋａｍａｔｓｕｕらは、ＩｇＧ分子をその抗原結合親和性及び生物学的活性に基づき直接単離するのに好適な哺乳類細胞表面ディスプレイベクターを開発した。エプスタイン・バーウイルス由来のエピソームベクターを使用して抗体ライブラリが細胞表面上に全ＩｇＧ分子として提示され、磁気ビーズと蛍光活性化細胞選別との組み合わせによって特異的抗原結合に関してスクリーニングされた。選別された細胞から所望の結合特性を有する抗体をコードするプラスミドが回収され、可溶性ＩｇＧを産生するための形態に変換された。Ａｋａｍａｔｓｕｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３２７，ｐａｇｅｓ ４０−５２，２００７（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。Ｈｏらは、親和性成熟のための単鎖Ｆｖ抗体の細胞表面ディスプレイに、一過性のタンパク質発現に広く用いられるヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を使用した。親和性がやや低いＷＴ抗体を発現する大過剰の細胞から、より高い親和性を備えた稀な変異抗体を発現する細胞が１回のパスの細胞選別によって２４０倍エンリッチされた。さらに、固有の抗体ホットスポットをランダム化するコンビナトリアルライブラリの１回の選択後に、ＣＤ２２に対する結合親和性が増加した、高度にエンリッチされた突然変異体が得られた。Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ＣＤ２２ Ｆｖ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｙ Ｆｖ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，ｖｏｌ．１０３，ｐａｇｅｓ ９６３７−９６４２，２００６（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
抗原に特異的なＢ細胞も使用することができる。かかるＢ細胞は、ヒトドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から直接単離された。このＢ細胞プールから組換え抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリが作成され、シンドビスウイルス発現系を使用することにより哺乳類細胞表面ディスプレイによってスクリーニングされる。この方法は、１回のＦＡＣＳラウンドによる抗原特異的抗体の単離を可能にする。陽性クローンから重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域（ＶＲ）が単離され、全ＩｇＧ又はＦａｂフラグメントとして組換え完全ヒト抗体が産生された。このようにして、Ｑβウイルス様粒子（ＶＬＰ）を結合する幾つかの超変異高親和性抗体、モデルウイルス抗原、並びにニコチンに特異的な抗体が単離された。全ての抗体が細胞培養物において高い発現レベルを示した。ヒトニコチン特異的ｍＡｂは、前臨床でマウスモデルにおいてバリデートされた。Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，ｖｏｌ．１０５，ｐａｇｅｓ １４３３６−１４３４１，２００８（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
酵母細胞表面ディスプレイも本発明において使用することができ、例えば、Ｋｏｎｄｏ ａｎｄ Ｕｅｄａ，“Ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｐｌａｙ”，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．６４，ｐａｇｅｓ ２８−４０，２００４を参照されたく、これは、例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用した細胞表面操作系について記載している。酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用の幾つかの代表的なディスプレイ系が、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ”，ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ ４５−５２，２００３に記載される。また、Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，“Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５，ｐａｇｅｓ ５５３，１９９７。
本明細書で使用されるように、「微小環境」は、組織の他の領域又は体の領域とは、一定又は時間的に、物理的又は化学的な差異を有する組織又は体の任意の部分又は領域を意味する。
本明細書で使用されるように、「発達する分子性質」は、ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチド配列からなる分子、及びポリヌクレオチド配列の一部及びポリペプチド配列の一部からなる分子を参照することを含む。特に関連して、これに限定することは意味しないが、発達する分子性質の実施例は、温度、塩分濃度、浸透圧、ｐＨ、酸化、及びグリセロール、ＤＭＳＯ、洗浄剤及び／又は反応環境において接触させる任意の他の分子の種類の濃度のような特異的条件でのタンパク質活性を含む。加えて特に関連して、これに限定することは意味しないが、発達する分子性質の実施例は、安定性、例えば、指定された環境に指定された露出時間の後にある残余分子性質の量を含む。
用語「多重特異性抗体」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な多重特異性抗体はＢＢＢ−Ｒと脳抗原との両方に結合しうる。多重特異性抗体は完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。２つ、３つ又はそれを超える（例えば４つの）抗原に結合する操作された抗体が企図される（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７ Ａ１号明細書を参照されたい）。１つ以上の野生型抗体が多重特異性となるように操作されてもよく、又は２つの抗体が多重特異性抗体を含むように操作されてもよい。多重特異性抗体は多機能性でありうる。
用語「変異」は、野生型核酸配列の配列における変化、又はペプチドにおける配列の変化を意味する。このような変異は、転移又は塩基転換のような点変異であることもある。変異には、欠失、挿入、又は複製であることがある。
本明細書で使用されるように、縮退「Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔ」ヌクレオチド配列は、３２の可能な三重項を表し、ここにおいて、「Ｎ」は、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴでありうる。
用語「自然発生」は、本明細書で使用されているように、対象が自然においてみられるという事実に関連して適用されるものである。例えば、自然において原料から分離されうる有機体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列で、実験室内で人によって意図的に修飾されたのではないものは自然発生である。一般的に、用語「自然発生」は、種において典型的であるように、非病理学的な（病気ではない）個体において存在するような対象に関連する。
本明細書で使用されるように、「正常生理条件」又は「野生型操作条件」は、対象への投与の部位又は作用部位での通常範囲内で考慮される温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化及び電解質濃度の条件である。
本明細書で使用されるように、「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖であるかによって、それぞれ少なくとも一塩基又は一塩基対からなる。さらに、核酸分子は、非限定ではあるが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子核酸、非遺伝子核酸、自然発生及び非自然発生核酸、及び合成核酸など核酸分子の群などのような分子を含むヌクレオチドの任意の群にのみ、又はキメラ的に属することができる。これは、非限定的な実施例として、ミトコンドリア、リボソームＲＮＡ、及び１つ以上の自然発生の成分と自然発生ではない成分からキメラ的になる核酸分子のような任意の細胞小器官に関連した核酸を含む。
加えて、「核酸分子」は、非限定ではあるが、部分的に１つ以上のアミノ酸及び糖などのようなヌクレオチドに基づいていない成分を含むことがある。従って、実施例であり、限定するものではないが、部分的にヌクレオチドに基づき、部分的にタンパク質に基づくリボザイムは「核酸分子」とみなされる。
加えて、これに限定されるわけではないが、実施例として、放射性又は非放射性ラベルのような検出可能な部分によってラベル化される核酸分子は、同様に「核酸分子」とみなされる。
用語「〜をコードする核酸配列」、又は「〜の配列をコードするＤＮＡ」、又は「〜をエンコードするヌクレオチド配列」、特に酵素をエンコードするヌクレオチド配列 − 他の同義の用語と同様に − 適当な調節配列の制御下におかれた際に、転写され、及び酵素内に転換されたＤＮＡ配列に関するものである。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合し、配列をコード化する下流方向（３'方向）の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、３'末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な成分である、最小限の塩基を含む。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼが配列を稀有合資、転写が開始コドン（プロモーターを有する３'末端）で開始された後、転写は３'方向において下流に進行する。プロモーターにおいて、配列は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を負う領域（共通配列）を結合するタンパク質と同様に、転写開始部位（便宜上、ヌクレアーゼＳＩを有するマッピングによって定義される）で見つかる。
用語「酵素（タンパク質）をエンコードする核酸」又は「酵素（タンパク質）をエンコードするＤＮＡ」又は「酵素（タンパク質）をエンコードするポリヌクレオチド」及び他の同義の用語は、酵素のためのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドも付加的コーディング配列及び／又は非コーディング配列を含むポリヌクレオチドも包括するものである。
好適な一実施形態において、「特異的核酸分子種」は、これに限定されるわけではないが、その一時配列によって例示されるように、その化学的構造により定義される。他の好適な実施形態において、「特異的核酸分子種」は、核酸種の機能によって、又は核酸種から誘導された生成物の機能によって定義される。従って、非限定的な実施例として、「特異的核酸分子種」は、その発現した生成物に起因する活性又は性質を含む、１つ以上のそれに起因する活性又は性質によって定義される。
「核酸ライブラリ中に作用核酸試料を構築すること」の即時定義は、ベクター内の結紮及び宿主の変換によるような、収集に基づいたベクター内へ核酸試料を組み込む工程を含む。関連するベクター、宿主及び他の試薬の記載は、それらの特異的非限定の実施例と同様に以下に提供される。「核酸ライブラリ中に作用核酸試料を構築すること」の即時定義はまた、接着体への結紮によるような、収集に基づいた非ベクター内へ核酸試料を組み込む工程も含む。好適には接着体は、ＰＣＲによる増幅を容易にするためのＰＣＲプライマーへアニールすることができる。
従って、非限定的な実施形態において、「核酸ライブラリ」は、１つ以上の核酸分子のコレクションに基づいたベクターからなる。他の好適な実施形態において、「核酸ライブラリ」は、核酸分子のコレクションに基づいた非ベクターからなる。さらに他の好適な実施形態において、「核酸ライブラリ」は、部分的にベクターに基づき、部分的に非ベクターに基づく核酸分子のコレクションの結合からなる。好適には、ライブラリからなる分子のコレクションは、個々の核酸分子の種類に応じて検索可能及び分離可能である。
本開示は「核酸構築物」又は「ヌクレオチド構築物」、又は「ＤＮＡ構築物」を提供するものである。用語「構築物」は、ベクター又はベクターの部分のような１つ以上の付加的分子部分に任意に化学結合されることもあるポリヌクレオチド（例えば酵素ポリヌクレオチド）のような分子を記載するのに本明細書において用いられる。特定の態様において、態様の限定を意味するわけではないが、ヌクレオチド構築物は、宿主細胞の形質転換に適したＤＮＡ発現構築物によって例証されている。
「オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴ」と同義語）は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は化学合成された相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖に関するものである。このような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸塩を有することも有さないこともある。これらは、キナーゼの存在下においてＡＴＰとリン酸を加えることなく他のオリゴヌクレオチドに連結することはない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されないフラグメントに連結される。ポリメラーゼに基づいた増幅（例えばＰＣＲによる）を得るため、「連続して少なくとも第一相同配列、変性Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列、及び第二相同配列からなる３２倍変性オリゴヌクレオチド」は言及される。この文脈で用いられているように、「相同」は、オリゴ及びポリメラーゼに基づいた増幅に供される親ポリヌクレオチド間で相同性に参照されるものである。
本明細書で使用されるように、用語「操作可能な状態で結合」は、機能的関係性におけるポリヌクレオチド要素の結合を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的関係性におかれた際に「操作可能な状態で結合」である。例えば、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコーディング配列に操作可能な状態で結合される。操作可能な状態で結合は、結合されているＤＮＡ配列が、典型的には隣接しており、及び２つのタンパク質コーディング領域を接合するのに必要な場合、隣接し、リーディングフレーム内にあることを意味する。
ＲＮＡポリメラーゼが単一ｍＲＮＡにおいて２つのコーディング配列を転写するときに、コーディング配列は、他のコーディング配列に「操作可能な状態で結合」し、両方のコーディング配列に由来したアミノ酸を有する単一ポリペプチド内に翻訳される。発現された配列が所望のタンパク質をつくるために最終的に処理される限り、コーディング配列は、互いに隣接する必要はない。
本明細書で使用されるように、用語「親のポリヌクレオチドセット」は１つ以上の異なるポリヌクレオチド種からなる。通常、この用語は、好適には親のセットの突然変異生成により得られる子孫ポリヌクレオチドセットを参照するのに用いられ、この場合において、用語「親の」、「起動」及び「テンプレート」は、互換性がある。
用語「患者」、「個体」又は「対象」は、治療の対象となる動物、例えばヒトなどの哺乳動物を指す。対象、又は患者は、雄又は雌のいずれであってもよい。哺乳動物としては、限定はされないが、家畜化された動物（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特定の実施形態において、個体又は対象はヒトである。
本明細書で使用されるように、用語「生理条件」は、温度、ｐＨ、浸透圧、イオン化強度、粘度など、生菌に適合できる、及び／又は生存可能な培養酵母又は哺乳類細胞において通常細胞内に存在する生化学的限定要素を意味するものである。例えば、典型的な実験培養条件下で成長した酵母細胞内において細胞内条件とは生理的条件である。生体外転写カクテルにおける適当な生体外反応条件は正常生理的条件である。一般的に、生体外生理的条件は、５０〜２００ｍＭの塩化ナトリウム又は塩化カリウム、ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５℃及び０．００１〜１０ｍＭの二価陽イオン（例えばＭｇ＋＋、Ｃａ＋＋）、好適には、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム又は塩化カリウム、ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭの二価陽イオン及びしばしば、０．０１〜１．０％非特異的タンパク質（例えばＢＳＡ）からなる。非イオン洗剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、トリトンＸ−１００）がしばしば存在することがあり、通常、約０．００１〜２％であり、典型的には０．０５〜０．２％である（ｖ／ｖ）。特定の水溶条件は、従来技術によると実行者によって選択される。一般的な手引きにおいて、以下の緩衝水溶液条件は適用可能である。１０〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、５〜５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ５〜８、任意の二価陽イオンの添加及び／又は金属キレート剤及び／又は非イオン洗剤及び／又は膜画分及び／又は消泡剤及び／又はシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔｓ）。正常生理条件は、患者において通常範囲とみなされる、患者の生体内又は投与の部位における対象、又は作用部位における温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化及び電解質濃度を意味する。
標準規定（５'〜３'）は二本鎖ポリヌクレオチドの配列を記載するために本明細書において用いられる。
用語「多エピトープ特異性」は、多重特異性又は多機能性抗体が同じ標的上又は異なる標的上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。
用語「エピトープ」は、抗体によって認識される特異的アミノ酸配列、修飾アミノ酸配列、又はタンパク質二次若しくは三次構造を指す。
用語「個体群」は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの部分又はタンパク質のような組成物の収集を意味する。「混合された個体群」は、核酸又はタンパク質の同じ属ではある（すなわち関連している）が、その配列において異なり（すなわち同一ではない）従ってその生理的知的活性において異なる組成物の収集である。
「代用形」を有する分子とは、参照代用形分子との比較において、異なる性質（例えば活性の増加）を有するより成熟した分子形態を得るために、１つ以上の共有結合及び非共有結合化学的修飾（例えば、グリコシル化、タンパク質分解開裂、二量体化又はオリゴマー化、温度による誘発又はｐＨによって誘発された高次構造的変化、補助因子との会合など）の任意の組み合わせを途中で経た分子を意味する。２つ以上の化学的修飾（例えば、２つのタンパク質分解開裂、又はタンパク質分解開裂及び非グリコシル化）が成熟した分子の製造への途中で区別されることができるときに、参照前駆体分子は、「前駆代用形」分子と称される。
本明細書で使用されているように、用語「擬似ランダム」は、限られた可変性を有する一組の配列を意味する。例えば、他の位置の残基可変性の程度は、任意の擬似ランダム位置以外の残基変異のある程度を与えられるが、制限はされる。
本明細書で使用されるように、「準繰り返しユニット」は、再集合された繰り返しに関連するものであり、定義上同一ではない。実際この方法は、同一開始配列の突然変異誘発によって製造された実際に同一なエンコーディングユニットだけでなく、幾つかの領域において著しく分岐することのある類似又は関連した配列の再集合も提唱される。それにもかかわらず、配列がこの方法によって再集合するのに十分な相同を含む場合、「準繰り返し」ユニットと呼ばれることができる。
本明細書で使用されるように、「受容体」は与えられたリガンドに親和性を有する分子を意味するものである。受容体は自然発生又は合成分子であることがある。受容体は、不変状態で使用される、又は他の種との集合体として使用されることがある。受容体は、直接的に又は特異的結合物質を介して結合メンバーに共有結合で、又は非共有結合で結合されることがある。受容体の実施例は、これに限定されないが、単クローン抗体及び特異的抗原決定基（例えばウイルス、細胞、又は他の材料）との抗血清試薬、細胞膜受容体、糖及び糖タンパク質複合体、酵素、及びホルモン受容体を含む。
用語「組換え抗体」は、本明細書で使用されるとき、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞によって発現される抗体（例えばキメラ、ヒト化、又はヒト抗体又はそれらの抗原結合フラグメント）を指す。組換え抗体を産生する「宿主細胞」の例としては、以下が挙げられる：（１）哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（Ｙ０及びＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えばタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物（例えばニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属するもの（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属するもの（例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））；（５）細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞等。
「組換え」酵素は、組換えＤＮＡ技術によって生成される酵素、すなわち、所望の酵素をエンコードする外因性ＤＮＡ構成によって形質転換された細胞から生成される。「合成」酵素は、化学合成によって調製される。
本明細書で使用されるように、「減少的再集合」は繰り返し配列によって媒介される欠失（及び／又は挿入）を介して生じる分子多様性における増加を意味するものである。
以下の用語「参照配列」、「比較ウィンドゥ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」及び「実質的に同一」は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係性を記載するのに用いられる。
「参照配列」は配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長ｃＤＮＡのセグメント又は配列リストにおいて与えられる遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列からなることがある。一般的に、参照配列は長さにおいて少なくとも２０ヌクレオチドであり、しばしば、長さにおいて少なくとも２５ヌクレオチドであり、及びしばしば長さにおいて少なくとも５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドが、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の部分）からなり、及び（２）さらに、２つのポリヌクレオチド間で分岐する配列からなることがあるため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間での配列比較は、配列類似性の局所的領域を同定し、及び比較するために、「比較ウィンドゥ」上で２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって典型的に実行される。
「反復インデックス（ＲＩ）」は、本明細書で使用されているように、クローニングベクター内に含まれる準繰り返しユニットのコピーの平均数である。
用語「配列同一性」は、比較ウィンドゥ上で、２つのポリヌクレオチド配列が同一である（すなわちヌクレオチド単位でヌクレオチドごとに）ことを意味する。用語「配列同一性の割合」は、比較ウィンドゥ上で最適に整列された２つの配列を比較する工程、適合位置数を得るために同一核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ又はＩ）が両配列において発生する位置の数を決定する工程、適合位置数を比較ウィンドゥにおける位置の全数（すなわちウィンドゥサイズ）によって割る工程、配列同一性の割合を得るために結果に１００を掛ける工程、によって計算される。本明細書で使用される、この「実質的に同一」は、ポリヌクレオチドの配列の特徴を示すものであり、ここにおいて、ポリヌクレオチドは、少なくとも２５〜５０ヌクレオチドの比較ウィンドゥの参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好適には少なくとも８５％の同一性、しばしば９０〜９５％の配列同一性、及び最も一般には少なくとも９９％配列同一性からなり、ここにおいて、配列同一性の割合は、比較ウィンドゥ上で参照配列の全２０％以下の欠失又は付加を含むことのあるポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することによって計算される。
当該技術分野において知られているように、２つの酵素間の「類似性」は、第二酵素の配列にアミノ酸配列及びその酵素の保存されているアミノ酸サブユニットを比較することによって決定される。類似性は、当業者においてよく知られているように、ＢＬＡＳＴプログラム（国立生物工学情報センターでのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）の手順によって決定される。
本明細書で使用されるとき、用語「一本鎖抗体」は、概してスペーサーペプチドを介して連結された、ポリペプチド連鎖にＶＨドメインとＶＬドメインとを含むポリペプチドであって、且つアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に追加的なアミノ酸配列を含みうるものを指す。例えば、一本鎖抗体は、コードポリヌクレオチドに連結するための係留セグメントを含みうる。例として、ｓｃＦｖは一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、概して、最も多くの場合にげっ歯類、非ヒト霊長類、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、又はヒト重鎖又は軽鎖遺伝子配列によってコードされる、免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によって実質的にコードされる少なくとも１０連続アミノの１つ以上のポリペプチドセグメントからなるタンパク質である（例えば、“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ”，Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ａ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ，ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，Ｔ．Ｈｏｎｊｏ，Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，ａｎｄ Ｔ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｓ，ｅｄｓ．，（１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ｐｐ．３６１−３６８（参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。機能性一本鎖抗体は、概して特異的標的分子、典型的には受容体又は抗原（エピトープ）との結合特性を保持するため免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分を含有する。
分子対（例えば、抗体−抗原対又は核酸対）のメンバーは、他の非特異的分子に対してよりも強い親和性で互いに結合している際に、互いに「特異的に結合している」といわれる。例えば、抗体は、抗原に対して非特異的タンパク質よりも効率よく結合するため、抗原と特異的に結合すると記載されることができる。（同様に、塩基対相互作用によって標的と特異的に二本鎖を形成している場合、核酸プローブは、標的核酸と特異的に結合すると記載されることができる（上記を参照されたい）。）
「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、第一ポリヌクレオチド及び第二ポリヌクレオチド（例えば、第一ポリヌクレオチドと違いを有するが、実質的には同一な配列を有するポリヌクレオチド）間での交雑の形態として定義したものであり、ここにおいて、実質的に無関係なポリヌクレオチド配列は混合物において交雑を形成しない。
用語「治療する」は、（１）状態、疾患又は条件の臨床的又は潜在的症状に苦しむ、又はそれらに罹患し易いが、状態の臨床的又は潜在的症状、疾患又は条件をまだ経験していない又は示していない動物において進行する状態、疾患又は条件の臨床的症状の出現を防止する又は遅延させること、（２）状態、疾患又は条件を阻害すること（すなわち、疾患又は維持療法の場合においてはそれらの逆戻り又は少なくとも１つの臨床的又は潜在性症状の進行を抑制し、減少させ、又は遅延させること）並びに／或いは（３）状態を楽にすること（すなわち、状態、疾患、又は条件又は臨床又は潜在性症状の少なくとも１つの後退を引き起こすこと）治療される患者の利点は、統計学的にも有意であり、又は少なくとも患者又は医師に少なくとも認知可能である。
用語「変異体」は、１つ以上の野生型タンパク質親分子の塩基対、コドン、イントロン、エキソン又はアミノ酸残基（それぞれ）において修飾された開示のポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。変異体は、例えば、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異、アセンブリＰＣＲ、性的ＰＣＲ突然変異、生体内での突然変異、カセット突然変異、再帰的アンサンブル突然変異、指数的アンサンブル突然変異、位置特異的突然変異、遺伝子再構築、飽和突然変異及びそれらの任意の組み合わせのような方法を含む手段の任意の数によって製造される。野生型タンパク質と比較して、正常生理的条件、例えば温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化及び電解質濃度の１つ以上の条件において活性が減少し、及び異常条件において活性が増強される変異体タンパク質を製造するための技術は、本明細書に開示される。変異体は、野生型タンパク質と比較して、化学的耐性及びタンパク質分解耐性を増強する性質において付加的に選択される。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、ポリヌクレオチドがいかなる突然変異も含まず、発達させるため又は他の操作のための親分子として使用される鋳型タンパク質を含むことを意味する。「野生型タンパク質」は、好ましくは、より高い結合親和性、又は酵素活性など、何らかの所望の特性を有し、それらは、種々の温度又はｐＨ環境におけるより良好な安定性、又は向上した選択性及び／又は溶解度を含む所望の特性に関してタンパク質のライブラリをスクリーニングすることによって得られうる。「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」、又は「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」は、天然に見られる活性レベルで活性な、且つ天然に見られるアミノ酸配列を含む、自然から単離することのできるタンパク質を指す。用語「親分子」、「標的タンパク質」及び「鋳型」も野生型タンパク質を指しうる。
本開示は、野生型条件では可逆的又は不可逆的に不活性化されるが、非正常条件では野生型条件における活性と同じ又は同等のレベルで活性である新規分子が生成されるようにタンパク質を操作し、又は発達させる方法に関する。これらの新規タンパク質は、本明細書では条件的活性型タンパク質と称される。これらのタンパク質の作製方法は、米国特許出願公開第２０１２／０１６４１２７号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。条件的活性型タンパク質は、宿主内で短期間又は限られた期間にわたって活性である新規治療薬の開発に特に有用である。これは、所与の用量のタンパク質が長期間機能すると宿主にとって有害となりうるが、所望の療法を実施するために限られた活性は必要である場合に特に有用である。有益な適用例には、高用量での局所的又は全身的治療、並びに高濃度での限局的治療が含まれる。生理条件下における不活性化は、用量投与とタンパク質の不活性化速度との組み合わせによって決まりうる。この条件に基づく不活性化は、触媒活性が比較的短期間で実質的な悪影響を生じる酵素療法薬にとって特に重要である。
本開示はまた、時間が経つと可逆的又は不可逆的に活性化又は不活性化されるか、或いは体内の特定の器官を含め、体内のある種の微小環境にある場合に限り活性化又は不活性化される点で野生型分子と異なる新規分子が生成されるようにタンパク質を操作し、又は発達させる方法にも関する。一部の実施形態において、この条件的活性型タンパク質は、好適な抗原に対する抗体である。
標的野生型タンパク質
任意の治療的タンパク質は、条件的活性型生物学的タンパク質の製造において、標的タンパク質又は野生型タンパク質としての機能を果たす。一態様において、標的タンパク質は野生型酵素である。現在使用されている治療的タンパク質酵素は、凝血塊の治療において使用されるウロキナーゼ及びストレプトキナーゼ、他の薬剤の吸収及び分散を増加させる補助剤として使用されるヒアルロニダーゼを含む。一態様において、条件的活性型生物学的タンパク質の生成のために選択される野生型タンパク質は、野生型タンパク質又は酵素に関連した有害な副作用を回避する又は最小限にするために、現在では治療的タンパク質が使用される。或いは、治療としての使用が現在されていない酵素は、条件的活性型生物学的タンパク質の生成のために選択されることがある。特定の非限定的実施例は、以下に詳細に議論される。
治療的タンパク質とは、抗体、酵素、免疫調節因子、成長因子、ホルモン及びサイトカインなど、様々な疾患又は医学的状態を治療するため薬物治療において単独で、或いは他の療法と併せて使用しうるものである。本開示の条件的活性型生物学的タンパク質は、循環障害、関節炎、多発性硬化症、自己免疫障害、癌、皮膚病変の治療を含む１つ以上の適応における使用及び様々な診断フォーマットにおける使用に適切でありうる。タンパク質及び適応に応じて、条件的活性型生物学的タンパク質は、以下で考察する通り、非経口、局所又は経口製剤で投与されうる。
幾つかの代表的な標的野生型タンパク質には、酵素、抗体、サイトカイン、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、キレート剤、及びホルモンが含まれる。さらなる例には、工業用及び医薬用タンパク質、例えば、リガンド、細胞表面受容体、抗原、転写因子、シグナル伝達モジュール、及び細胞骨格タンパク質が含まれる。幾つかの好適な酵素クラスは、ヒドロラーゼ、例えば、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ；イソメラーゼ、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、又はムターゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼ、オキシドレダクターゼ、及びホファターゼ（ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）である。
標的野生型タンパク質は、ライブラリを作成し、酵素活性、結合親和性／選択性、熱安定性、高ｐＨ又は低ｐＨ耐性、発現効率、又は他の生物学的活性など、所望の特性を有するタンパク質に関してスクリーニングすることにより発見しうる。
標的野生型タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより発見してもよい。ｃＤＮＡライブラリは、宿主細胞のコレクションに挿入されるクローニングされたｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）フラグメントの組み合わせであり、一緒になって生物のトランスクリプトームのある一部を構成するものである。ｃＤＮＡは完全に転写されたｍＲＮＡから作製され、従って生物の発現タンパク質のコード配列を含有する。ｃＤＮＡライブラリにおける情報は、所望の特性を有するタンパク質に関してライブラリをスクリーニングすることによって所望の特性を有するタンパク質を発見するための強力且つ有用なツールである。
標的野生型タンパク質が抗体である実施形態において、野生型抗体は、抗体ライブラリを作成してスクリーニングすることにより発見しうる。抗体ライブラリは、ポリクローナル抗体ライブラリ又はモノクローナル抗体ライブラリのいずれであってもよい。ある抗原に対するポリクローナル抗体ライブラリは、その抗原を動物に直接注射することによるか、又はその抗原を非ヒト動物に投与することによって作成しうる。このように得られた抗体は、その抗原に結合するポリクローナル抗体のライブラリに相当する。モノクローナル抗体ライブラリの調製には、連続細胞株培養によって産生される抗体をもたらす任意の技術を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法が挙げられる（例えば、Ｃｏｌｅ（１９８５）ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照されたい）。一本鎖抗体の作成について記載される技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）は、一本鎖抗体ライブラリの作製に適合させることができる。
野生型抗体を発見するための抗体ライブラリの作成及びスクリーニング方法は他にもある。例えば、完全ヒト抗体ディスプレイライブラリを利用することができる。かかるライブラリは、宿主細胞の表面上に提示された抗体の集合である。好ましくは、抗体ライブラリは、それが多種多様な抗原との結合能を有する点でヒト抗体レパートリーを代表する。抗体は細胞の表面上に提示されるため、ライブラリにおける各抗体の（アビディティに起因する）有効親和性は増加する。ファージディスプレイライブラリなどの他の一般的なライブラリタイプ（スクリーニング及び同定目的の抗体のアビディティがあまり望ましくない）と異なり、本発明における細胞表面ディスプレイによって提供される超アビディティは望ましい。細胞表面ディスプレイライブラリは、スクリーニング又は選択工程において、結合親和性が低い、中程度の、及び高い抗体の同定、並びに非免疫原性の及び弱いエピトープの同定を可能にする。
循環障害 − 血栓症及び血栓溶解療法
血栓（凝血塊）は、循環系において形成される血液構成要素に由来する固体の塊として定義される。血栓は、血液凝固因子、血小板、赤血球及び血管壁との相互作用を含む一連の事象により形成される。血小板は、血小板、フィブリン及び脈管障害の原因となることがある補足された血液細胞の血管内凝集である。血流を妨げる、又は遮断することによって、血栓は、組織への酸素供給を奪う。血栓の断片（塞栓）は、剥離することができ、より小さい血管を妨げることができる。動脈血栓形成は、潜在性の狭窄−アテローム性動脈硬化症、低流量状態の心機能、癌における凝固亢進若しくは凝固因子欠乏、又はステント若しくはカテーテルなどの異物を含む任意の様々な要因のいずれかによって誘発される。動脈虚血につながる血栓は、肢又は組織の損傷、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳卒中、切断又は腸梗塞に結果としてなることがある。疾病率及び死亡率の大きな原因は、動脈血栓（冠状動脈血栓及び脳動脈血栓）及び肺血栓の形成である。静脈血栓形成は、外傷、例えば静止による鬱血、又は凝固亢進などの内皮損傷によって生じることがあるが、アテローム性動脈硬化は要因とはならない。治療法は、機械的血栓摘出術、薬力学的血栓摘出術及び血栓溶解を含む。血栓症の治療は、血栓の形成を最小化し、除去を助けるために用いられる。
血栓症の治療は、血小板の活性化を阻害する抗血小板薬剤の使用、抗凝固性治療、及び／又は凝血を分解するための血栓溶解治療を含む。抗血小板物質の例としては、アスピリン、ジピリダモール及びチクロピジンが挙げられる。抗凝固剤の例は、ヘパリン、ワルファリン、ヒルジン、及び活性型ヒトタンパク質Ｃを含む。血栓溶解剤の例は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）／ｔＰＡ変異体、ウロキナーゼ及びストレプトキナーゼを含む。血栓溶解剤は、作用の触媒型を示す。
急性心筋梗塞における血栓溶解治療は、確立されている。血栓溶解剤の使用は、標準的な救急治療となった。効果的であるにもかかわらず、これらの製品は、完全な再灌流を患者の約５０％においてのみ成し遂げ、副作用は、高血圧と同様に出血（特に頭蓋内出血）の危険を含む。傷害性又は疾患性血管からの凝血塊の分解は、「線維素溶解」又は「線維素溶解方法」と称される。タンパク質プラスミノーゲンを活性化するプラスミノーゲン活性剤によって、線維素溶解はタンパク質分解方法であり、それによって、プラスミンを形成する。タンパク質分解性プラスミンは、凝血塊を溶かすために、フィブリンストランドを分解する。フィブリン特異性プラスミノーゲン活性剤は、組織プラスミノーゲン活性化因子又は変異体を含む。非特異的プラスミノーゲン活性剤は、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼを含むことがある。
特定の一般的に用いられる血栓溶解治療は、幾つかの利用できる組織プラスミノーゲン活性剤（ｔＰＡ）変異体の１つを利用する。例えば、以前使用のために承認された製品に基づくｔＰＡ変異体は、Ａｌｔｅｐｌａｓｅ（ｒｔ−ＰＡ）、Ｒｅｔｅｐｌａｓｅ（ｒ−ＰＡ）及びＴｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ（ＴＮＫ）である。ｔＰＡ変異体の承認された用途は、例えば、ＡＭＩに続く心室機能改善における急性心筋梗塞、鬱血性心不全の発病率の減少、及びＡＭＩと関連した死亡率の減少、神経病学的回復を改善するための成人における虚血性脳卒中の管理及び障害の発病率の減少、急性肺塞栓の溶解のため、及び不安定な血行動態が付随する肺塞栓の溶解のため、成人における急性大量肺塞栓の管理を含む。
他の一般的に用いられる血栓溶解治療は、ウロキナーゼを利用する。ウロキナーゼは、抹消血管疾患の処置において使用する標準的溶解剤である。
ストレプトキナーゼは、ヒトプラスミノーゲンを結合及び活性化することができる連鎖球菌の幾つかの種類から分泌されるタンパク質である。ヒトプラスミノーゲンとストレプトキナーゼの複合体は、プラスミンを生成するための結合開裂で活性化されることによって、他の非結合プラスミノーゲンを加水分解的に活性化することができる。プラスミノーゲンの通常の活性は、Ａｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２結合のタンパク質分解によって起こる。Ｖａｌ５６２のアミノ基は、Ａｓｐ７４０と塩橋を形成し、活性プロテアーゼプラスミンをつくるため高次構造的な変化を生じさせる。プラスミンは、凝血の主要成分であるフィブリンを分解するために血中でつくられる。
ストレプトキナーゼは、心筋梗塞（心臓発作）、肺塞栓症（肺凝血）及び深部静脈血栓症（脚凝血）の幾つかの場合において、有効な凝血塊溶解薬剤として用いられる。ストレプトキナーゼは線維素溶解剤と呼ばれている薬剤の群に帰属する。ストレプトキナーゼは、心臓壁の動脈における凝血塊を溶かし、心筋への損傷を減らすために、心臓発作の発症後、可能な限り早く与えられる。ストレプトキナーゼは、細菌製品であるため、本体はタンパク質に対して免疫を確立する能力を有する。従って、この製品は、最初の投与から４日後以降は、有効ではない可能性があり、及びアレルギー反応を引き起こす可能性があるため、与えないことが推奨される。このため、通常、最初の心臓発作の後のみ与えられ、さらなる血栓症は典型的には組織プラスミノーゲン活性剤（ＴＰＡ）により治療される。ストレプトキナーゼは、術後癒着を防止するために用いられることもある。
ストレプトキナーゼの副作用は、出血（多量及び少量）、低血圧、及び呼吸抑制及びアレルギー反応を含む。加えて、抗凝血剤、血小板機能を変える薬剤（例えば、アスピリン、他のＮＳＡＩＤ、ジピリダモール）は、出血の危険性を高めることがある。
血栓溶解剤の投与は、通常、注射によって、又は急速静注投与によって、又は機械的注入システムによって行われる。副作用は、重篤には頭蓋内、胃腸、後腹膜、又は心嚢の出血を含むことがある。出血が生じた場合には、直ちに投与を中断しなければならない。
本開示の特定の実施形態において、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼは、標的又は野生型タンパク質として選択される。
一実施形態において、本開示の方法は、通常の生理的条件よりも低い異常温度条件で高い活性を有し、通常の生理的条件（例えば３７℃）で実質的に非活性又は不活性である、条件的活性型組換え、又は合成ストレプトキナーゼ変異体を選択するのに用いられる。一態様において、異常温度条件は、室温、例えば２０〜２５℃である。他の態様において、本開示は、脳卒中又は心臓発作を治療する方法を提供するものであり、この方法は、凝血塊を消去し、ストレプトキナーゼ変異体の急速な不活性化が過剰な出血を回避できるように、条件的活性型ストレプトキナーゼ変異体の高用量を脳卒中又は心臓発作患者に投与することからなる。
循環障害 − レニン／アンギオテンシン
レニン−アンギオテンシン系は、血圧及び水（流体）バランスを調節するホルモン系である。腎臓は、血液量が低いときにレニンを分泌する。レニンは、ペプチドアンギオテンシンＩに肝臓から分泌されるアンギオテンシノーゲンを加水分解する酵素である。アンギオテンシンＩは、アンギオテンシンＩＩに内皮結合したアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によって、肺においてさらに切断される。アンギオテンシンＩＩは、血管を収縮させ、結果として血圧を増加させる。しかしながら、アンギオテンシンπも副腎皮質からホルモンアルドステロンの分泌を促進する。アルドステロンは、腎細管でのナトリウム及び水の再吸収を増加させる。この増加は、体の流体を増加させ、血圧を増加させる。過剰に活発なレニン−アンギオテンシン系は、血管収縮、及びナトリウム及び水の保持につながる。これらの効果は高血圧につながる。血圧を下げるために、このシステムにおいて異なる工程を中断する多くの薬がある。これらの薬は、高血圧（高血圧症）、心不全、腎不全及び糖尿病の有害な影響を制御するための主要な方法の１つである。
血液量減少性ショックは緊急状態であり、大量の血液及び／又は流体を失うことにより、心臓は体細胞に酸素を含ませた血液を適切に灌流することができなくなる。失血は、外傷、損傷及び内出血によりおこりうる。循環血液の量は、火傷、下痢、過剰な汗又は嘔吐による過剰な流体損失のため減少することがある。血液量減少性ショックの兆候には、不安、冷たくじっとりした肌、混乱、呼吸促迫又は意識消失を含む。検査は低血圧、低体温及び弱い又は弱々しいこともある速い脈拍を含むショックの徴候を示す。治療は、輸液、血液又は血液製剤、ショックの治療、及び血圧及び心拍出量を増加させるためのドーパミン、ドブタミン、エピネフリン及びノルエピネフリンのような薬剤を含む。
一実施形態に置いて、本開示は、通常の生理的温度では可逆的に不活性化されるが、血液量減少性ショックにより患者が異常低温であるときには再び活性化される条件的組換えレニン変異体を選択するための方法を提供する。条件的活性型タンパク質は、体内の流体量の増加及び血圧の増加を促すために血液量減少性ショックを治療するのに用いられることがある。
循環障害 − レイノー現象
レイノー現象（ＲＰ）は、指、つま先及び時には他の末端の変色を引き起こす血管攣縮性疾患である。感情的ストレス及び冷えがこの減少の典型的な引き金である。冷温にさらされると、末端は熱を失う。指及びつま先に供給される血液は、体の核心温度を保つために通常ゆっくりとなる。血流は、末端の皮下の小さな動脈の狭窄によって減少する。ストレスは、体が冷えるのと同じような反応を引き起こす。レイノー現象においては、通常の反応が肥大したものである。状態としては、痛み、変色、及び冷え及び麻痺の感覚を引き起こすことがある。この現象は結果としてそれぞれの領域への血液供給を減少させる血管攣縮である。レイノー疾患（初期レイノー現象）において、疾患は突発性である。レイノー症候群（第二レイノー現象）において、現象は、他の扇動因子によって引き起こされる。手の温度勾配の測定は、初期及び第二形態間の識別を行う１つの手段である。初期形態は、第二形態に進行することがあり、極端な場合においては、第二形態は指先の壊死又は壊疽に進行することがある。
レイノー現象は、冷え又は感情的ストレスへの反応の肥大したものである。初期のＲＰは、微小血管攣縮によって基本的にもたらされる。交感神経系の過剰活性化は、末梢血管の過度の血管収縮を引き起こし、低酸素症につながる。慢性、再発性の場合は、皮膚、皮下組織及び筋肉の萎縮となることがある。稀に潰瘍形成及び虚血性壊疽となることもある。
レイノー現象のための従来の治療選択肢は、血管を拡張し、循環を促進する処方薬物治療を含む。これらは、ニフェピジン又はジルチアゼムのようなカルシウムチャンネル遮断薬、ノルアドレナリン、血管を収縮させるホルモンの作用を相殺するプラゾシン又はドキサゾシンのようなアルファ遮断薬、及びニトログリセリンクリーム又はアンギオテンシンＩＩ阻害剤ロサルタン、シルデナフィル又はプロスタグランジンのような血管を緩めるための血管拡張薬を含む。フルオキセチン、選択的セロトニン再摂取阻害剤及び他の抗鬱剤は、生理的ストレッサーによる発症の頻度及び重症度を低減することができる。これらの薬剤は、頭痛、潮紅及びくるぶし浮腫のような副作用を引き起こすことがある。薬剤は経時的に効果を失うこともある。
皮膚血管収縮及び血管拡張の調節は、変更した交感神経活性及び多くの神経調節を含み、ＲＥＤＯＸシグナル伝達及びＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ経路のような他のシグナル伝達と同様に、アドレナリン性及び非アドレナリン性を含む。皮膚の血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）の血管収縮は、アルファ１及びアルファ２アドレナリン受容体によって伝達されるノルエピネフリンによって活性化されると考えられる。アルファ２Ｃ−ＡＲｓは、トランスゴルジから刺激に応答するｖＳＭＣの細胞表面に転座させ、及びこれらの応答のシグナル伝達は、ＲｈｏＡ／Ｒｈｏｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路を含む。皮膚動脈の冷たい刺激は、ｖＳＭＣのミトコンドリアの反応性酸素種（ＲＯＳ）の即時の生成につながる。ＲＯＳは、ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ経路を介したＲＥＤＯＸシグナル伝達に含まれる。ＲｈｏＡは、ｖＳＭＣにおける遊走及び細胞収縮のようなアクチン−ミオシン依存工程の調節の役割をもつＧＴＰ−結合タンパク質である。ＲＰとの可能な包含を有する脈管構造の周知の機能を有する非アドレナリンニューロペプチドは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ（ＳＰ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）を含む。Ｆｏｎｓｅｃａ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｙｎａｕｄ'ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ｃｕｒｒ．Ｖａｓｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：３４−３９。
ＲＰのための新しい治療は、アルファ−２Ｃアドレナリン受容体遮断薬、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドを含む。
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）はペプチドのカルシトニン族のメンバーであり、及びアルファ−ＣＧＲＰ及びベータ−ＣＧＲＰの２つの形態で存在する。アルファ−ＣＧＲＰは、カルシトニン／ＣＧＲＰ遺伝子の選択的スプライシングによって形成された３７−アミノ酸ペプチドである。ＣＧＲＰは、末梢神経及び中枢神経においてつくられる最もありふれたペプチドの１つである。それは、効能のあるペプチド血管拡張薬であり、痛みの伝導に作用することができる。片頭痛はＣＧＲＰの濃度上昇に関連する共通の神経疾患である。ＣＧＲＰは、脳内血管を拡張し、及び血管痛覚を伝導する。ＣＧＲＰ受容体拮抗薬は、片頭痛の治療として実験された。Ａｒｕｌｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，“Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｉｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｍｉｇｒａｉｎｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５００（１−３）：３１５−３３０．少なくとも３つの受容体サブタイプが同定され、ＣＧＲＰは、Ｇタンパク質共役型受容体を介して作用し、様々な組織におけるペプチドの作用を調節する機能において変化する。受容体を介したＣＧＲＰの情報伝達は、２つの補助的タンパク質、受容体活性修飾因子タンパク質１（ＲＡＭＰ１）及び受容体構成タンパク質（ＲＣＰ）に依存している。Ｇｈａｔｔａ ２００４、カルシトニン遺伝子関連ペプチドは、その役割が理解されている。Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６（５）：２７７−２８３。３つの血管拡張薬、内皮依存性血管拡張薬アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、内皮非依存性血管拡張薬プロスタサイクリン（エポプロステロール、ＰＧＩ２）及びＣＧＲＰのレイノー現象の患者への静注の効果の１つ、及びＣＧＲＰの研究は、レイノー現象をもつ患者及びＣＧＲＰ及びレーザードップラー血流測定法（ＬＤＦ）を用いて制御に適合した年齢及び性別の同程度の数に対して、レイノー患者においては、皮膚血流増大によって顔及び手の潮赤がＣＧＲＰによって誘導されるが、制御群においては、ＣＧＲＰは顔のみの潮赤を引き起こしたことを示した。ＰＧ１２は、両群の手及び顔の血流に同様のことを引き起こした。ＡＴＰは、患者の手又は顔の血流にいかなる重大な変化も引き起こさなかったが、制御群の顔における血流は増加させた。Ｓｈａｗｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｐｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｎｄｓ ｉｎ Ｒｅｙｎａｕｄ'ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ”．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，３３４（８６７６）：１３５４−１３５７。一態様において、野生型タンパク質標的分子はＣＧＲＰである。
一実施形態において、本開示は、通常の生理的温度において可逆的に不活性であるが、指が異常低温であるときには再活性される、レイノー症候群に関連するタンパク質の条件的活性型組換えタンパク質変異体を選択するための方法を提供する。条件的活性型タンパク質は、レイノー現象を治療するため、低循環による指機能の喪失を防止する又は低減させるために用いられることがある。
循環障害 − バソプレッシン
アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ、バソプレッシン、抗利尿性ホルモン（ＡＤＨ））は、組織浸透性に関する腎細管での分子の再吸収を制御する多くの哺乳類でみられるペプチドホルモンである。バソプレッシンの最も重要な役割の１つは、体内における水分保持を調節することである。高濃度においては、適度な血管収縮が導かれることで血圧を上昇させる。バソプレッシンは、尿浸透圧（高濃度）の上昇及び水分排泄の減少を結果として引き起こす３つの効果を有する。第一に、バソプレッシンは、水分の再吸収及び濃縮尿（抗利尿）のより少ない量の排出を可能とする腎臓において、集合管細胞の水の透過性の増大を引き起こす。これは、集合管細胞の頂端膜において、アクアポリン２水分チャンネルの挿入を介して起こる。第二に、バソプレッシンは、尿素に集合管の内側髄部分透過性の増大を引き起こし、髄質間質において尿の再吸収の増加を可能にする。第三に、バソプレッシンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体の活性を増加することによって、ナトリウムの刺激及びヘンレ係蹄の厚みのある上肢における塩化物の再吸収が起こる。塩化ナトリウム再吸収は、逆流増加の過程によるものであり、集合管髄質での水分再吸収をもたらすアクアポリンにおいての浸透勾配を提供する。
腎臓の集合管周辺の高張性間質性流体は、水の除去において高い浸透圧を提供する。アクアポリンと呼ばれるタンパク質によってつくられる膜貫通チャンネルは、水への浸透性を非常に高める血漿膜に挿入される。開いているとき、アクアポリンチャンネルは、毎秒３０億分子の水を透過させることができる。アクアポリン２チャンネルの挿入は、バソプレッシンによるシグナル伝達を必要とする。バソプレッシンは、集合管細胞の基底側表面で受容体（Ｖ２受容体と呼ばれる）と結合する。ホルモンの結合は、細胞内におけるｃＡＭＰのレベルを引き上げる引き金となる。この「第二メッセンジャー」は、集合管細胞の頂端膜でアクアポリン２チャンネルの挿入に結果としてなる連鎖を開始する。アクアポリンは、腎単位の外へ水を排出し、血流に尿を戻すことから水分の再吸収量を増加させる。
脳下垂体からのバソプレッシンの放出においての主要な刺激は、血漿のオスモル濃度を増加させる。激しい発汗のような体の脱水はいかなるものでも血中のオスモル濃度を増加させ、アクアポリン２経路にＶ２受容体へのバソプレッシンを作動させる。結果として、尿の０．５リットル／日と同じくらい少量が、もとの腎ろ液１８０リットル／日が残存することがある。尿における塩濃度は血中の４倍であることがある。大量の水を飲むなどして、血液があまりにも希薄となると、バソプレッシン分泌が阻害され、アクアポリン２チャンネルは、エンドサイトーシスによって細胞内に戻される。その結果、血中の４分の１程度の少量の塩濃度で大量の薄い尿が生成される。
減少させたバソプレッシン放出又は減少させたＡＶＰへの腎臓の感受性は、尿崩症、高ナトリウム血症状態（血中のナトリウム濃度の増加）、多尿症（過剰な尿生成）及び多飲症（口渇）。
ＡＶＰ分泌の高レベル（不適当な抗利尿ホルモン（ＳＩＡＤＨ）症候群）及び結果として生じる低ナトリウム血症（低い血液ナトリウム濃度）は、脳疾患及び肺（小さな細胞肺癌）の条件において生じる。周術期間において、外科的ストレス及び幾つかの一般的に用いられる薬物（例えば、阿片剤、シントシノン、制吐剤）の作用は、過剰なバソプレッシン分泌の同様の状態につながる。これは、数日間程度の低ナトリウム血症を引き起こすことがある。
バソプレッシン作動薬は、様々な条件において治療的に使用され、及びその長時間作用性の合成類似デスモプレッシンは、出血（フォン・ウィルブラント病のいろいろな形において）の制御及び児童による寝小便の極端な場合の制御と同様に、低バソプレッシン分泌を特徴とする条件において使用される。テルリプレッシン及び関連する類似体は、特定の条件において血管収縮剤として用いられる。バソプレッシン注入は、イノトロープ（例えばドーパミン又はノルエピネフリン）の高投与に応じない感染性ショック患者において、管理の第二ラインとして用いられる。バソプレッシン受容体アンタゴニストは、バソプレッシン受容体で作用を妨げる薬剤である。それらは低ナトリウム血症の治療においても使用されることがある。
一実施形態において、本開示は、通常の生理的浸透圧においては可逆的に不活性であるが、血中における異常浸透圧下においては再活性される、バソプレッシン応答において含まれるタンパク質の条件的生物学的組換え又は合成タンパク質のための選択の方法を提供する。他の実施形態において、バソプレッシン応答において含まれるタンパク質の変異体は、ナトリウム欠乏状態において活性化されるが、通常の血清ナトリウム濃度では不活性化される。一態様において、ナトリウム欠乏状態は、血清ナトリウム＜１３５ｍＥｑ／Ｌである。
癌 − アンギオスタチン
アンギオスタチンは幾つかの動物種において自然発生するタンパク質である。それは、内因性血管新生阻害剤（すなわち、新しい血管の成長を阻害する）として作用する。アンギオスタチンは、内皮細胞の増殖及び転移を阻害することで腫瘍細胞の成長及び転移を抑制する。アンギオスタチンはプラスミン（それ自身、プラスミノーゲンのフラグメントである）の３８ｋＤフラグメントである。アンギオスタチンは、プラスミノーゲンの１〜３クリングルからなる。アンギオスタチンは、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼによる細胞外ジスルフィド結合還元を含むプラスミノーゲンの自己融解開裂によってつくられる。アンギオスタチンは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ１２及びＭＭＰ９を含む異なる基質メタロプロテイナーゼ、及びセリンプロテアーゼ（好中級エラスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ））によるプラスミノーゲンから開裂することができる。生体内において、アンギオスタチンは、腫瘍の成長を阻害し、及び実験的転移を休眠状態に維持する。アンギオスタチンは、初期腫瘍、及び他の炎症性及び変性疾患の動物内で上昇する。
アンギオスタチンは、アンギオモチン及び内皮細胞表面ＡＴＯシンターゼ、インテグリン、アネキシンπ、Ｃ−ｍｅｔ受容体、ＮＧ２−プロテオグリカン、組織プラスミノーゲン活性体、コンドロイチン表面糖タンパク質、及びＣＤ２６を含む多くのタンパク質と結合することで知られている。ある研究は、強力な抗血管新生活性を有するＩＬ−１２、ＴＨ１サイトカインはアンギオスタチンの活性のメディエーターであることを示している。Ａｌｂｉｎ”．，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊａｎ．４，２００９，７：５。アンギオスタチンは、内皮細胞表面で結合し、及びＡＴＰ合成を阻害する。ＡＴＰ合成はまた、様々な癌細胞表面で生じる。腫瘍細胞表面ＡＴＰ合成は、低細胞外ｐＨ、腫瘍微小環境の特徴にてより活発にみられる。アンギオスタチンは、酸性細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）での腫瘍細胞表面ＡＴＰ合成活性に作用するとみられる。低細胞外ｐＨで、アンギオスタチンは、直接的に抗腫瘍化である。低ｐＨで、アンギオスタチン及び抗ベータサブユニット抗体は、細胞外ＡＴＰ合成の低レベルな腫瘍細胞において欠けている直接的毒性と同様に、Ａ５４９癌細胞の細胞内酸性化を導く。腫瘍細胞毒性の機構は、細胞表面ＡＴＰ合成の阻害に起因して細胞内ｐＨ調節解除によっていることが仮定されている。Ｃｈｉ ａｎｄ Ｐｉｚｚｏ，“Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ ｉｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｔ ｌｏｗ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００６，６６（２）：８７５−８２。
一実施形態において、本開示は通常の生理的血液ｐＨにおいては野生型アンギオスタチンよりも活性が低いが、低ｐＨにおいては、活性の増強を示す条件的活性型アンギオスタチン変異体の同定のための方法を提供する。低ｐＨは、通常の生理的ｐＨよりも低いものとして定義される。一態様において、低ｐＨはｐＨ約７．２以下である。特定の態様において、低ｐＨはｐＨ約６．７である。
一態様において、条件的活性型アンギオスタチン変異体は抗癌剤として処方され、利用されることがある。
自己免疫疾患 − 条件的活性型生物学的応答修飾因子
リウマチ性関節炎は、関節炎及び関節の進行的破壊による腫れにつながる、異常免疫機構によって特徴付けられた自己免疫疾患である。ＲＡ（リウマチ性関節炎）は皮膚、結合組織及び体内の器官にも作用することがある。従来の治療は、非ステロイドの抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤＳ）、ＣＯＸ−２阻害剤及びメトトレキサートのような疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）を含む。従来の治療方式は、特に長期間の使用において、どれも理想的ではない。
炎症メディエーターを標的とする生物学的応答修飾因子は、リウマチ性関節炎及び他の自己免疫疾患の治療に、相対的に新規な手法を提供する。このような生物学的応答修飾因子には、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２３及びＩＬ−１２のような様々な炎症メディエーターに対する抗体又はそれらの活性部分を含む。
第一生物学的応答修飾因子の幾つかは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）、ＲＡの病因において含まれる炎症促進性サイトカインを標的とする薬物である。幾つかの抗ＴＮＦアルファ薬剤は、ＲＡの治療のため現在市販されている。例えば、エンブレル（登録商標）（エタネルセプト、アムゲン）はＴＮＦ−アルファ遮断薬である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧＩのＦｃ部分に結合されるヒト７５キロドルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外連結結合部分からなる二量体溶融タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含むが、ＩｇＧＩのＣｈ１ドメインは含まない。エタネルセプトはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳類細胞発現系でつくられる。それは、９３４アミノ酸からなり、見かけの分子量は約１５０キロドルトンである。エンブレル（登録商標）はリウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び尋常性乾癬の治療に使用される。エンブレル（登録商標）の重大な副作用には、結核、真菌感染、日和見病原体によるウイルス感染を含む感染症を含む。敗血症が生じることもある。リンパ腫又は他の悪性腫瘍も報告されている。
レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）は、ヒト恒常的領域及びネズミ可変領域からなるキメラ抗−ＴＮＦ−アルファＩｇＧＫＩ単一クローン抗体である。レミケードは静注で投与され、及びリウマチ性関節炎、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎及び強直性脊椎炎の治療に使用される。レミケードの副作用は、重篤な感染症又は敗血症、及び稀に特定のＴ細胞リンパ腫を含む。他の副作用は、肝毒性、特定の重篤な血液学的事象、過敏性反応及び特定の神経学的事象を含む。
他の生物学的応答修飾因子は、ヒト化抗インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体抗体を含む。ＩＬ−６は、炎症、腫れ、及びＲＡにおける関節損傷に寄与するサイトカインである。１つのヒト化抗ＩＬ−６受容体抗体、アクテムラ（トシリズマブ、Ｒｏｃｈｅ）は、ＦＤＡ及び欧州委員会によって、リウマチ性関節炎の成人患者を治療するとして承認されている。アクテムラはまた、日本においてもＲＡ及び若年性関節リウマチ（ｓＪＩＡ）の治療において承認されている。段階ＩＩＩ研究は、他の治療薬と比較して、アクテムラによる治療は、単独治療としても、また、ＭＴＸ又は他のＤＭＡＲＤとの組み合わせでも、ＲＡの兆候及び症状を減少させると示している。アクテムラは、その受容体にＩＬ−６の結合を競合的に遮断するヒト化ＩＬ−６受容体単クローン抗体である。従って、それは、ＲＡにおける滑膜肥厚及びパンヌス形成につながるＩＬ−６の増殖作用を阻害する。アクテムラの重大な副作用は、重篤な感染症及びアナフィラキシーの幾つかの場合を含む過敏反応を含む。他の副作用は、上気道感染症、頭痛、鼻咽頭炎、高血圧及び増加ＡＬＴが含まれる。
他の共通な自己免疫疾患は、乾癬である。免疫系の過剰活性は、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３、乾癬皮膚斑でみられる２つのサイトカインタンパク質の高濃度につながることがある。ＩＬ−１２及びＩＬ−２３は、ナチュラルキラー細胞活性化及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化及び活性化のような、炎症性及び免疫性応答において含まれる。
中程度の、又は重症な乾癬における一治療は、ステラーラ（商標）（ウステキマヌブ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）ＩＬ−１２及びＩＬ−２３サイトカインのｐ４０サブユニットに対するヒト化ＩｇＧＩｋ単クローン抗体の皮下注射を含む。ステラーラは、斑肥厚、皮膚のはがれ、赤みなどの乾癬斑に関する特定の症状からの軽減を提供することが示されている。ステラーラ用製剤は、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−ヒスチジン塩酸塩水和物、ポリソルベート８０、及び水溶液中のショ糖を含む。ステラーラ（商標）の使用は、免疫系に作用し、及び特定の型の癌の危険性を増すのと同様に、結核及びバクテリア、真菌又はウイルスによって引き起こされる感染症を含む感染症の機会を増やす。
生物学的応答修飾因子の副作用は、重篤であり、患者への高レベルの注入によって、患者を重篤な感染症又は死に影響され易くすることがある。これが薬剤のこの重要な種類に関連する大きな副作用である。１つの課題は、注入後に長い治療効果を提供するために必要な抗体の投与から活性の高い初期レベルを回避することである。
脳に対する条件的活性型生物学的抗体
薬物の脳透過性はほぼ不透過性のＢＢＢによって極度に制限されているため、薬物、特に抗体などの大型分子を脳に送達することは、長年の課題となっている。幸運にも、ＢＢＢは、ＢＢＢ受容体（ＢＢＢ−Ｒ）によって媒介される内因性の輸送系を有し、ＢＢＢ−Ｒは、ＢＢＢを通る巨大分子の輸送を可能にする特異的受容体である。例えば、ＢＢＢ−Ｒに結合することのできる抗体は、この内因性輸送系を用いてＢＢＢを通って輸送されうる。かかる抗体は、ＢＢＢを通り抜ける内因性のＢＢＢ受容体媒介性の輸送系を使用することによりＢＢＢを通って薬物又は他の作用物質を輸送するための輸送手段として機能しうる。かかる抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して高親和性を有する必要はない。米国特許出願公開第２０１２／０１７１１２０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載される通り、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低い条件的活性型抗体でない抗体が、高親和性抗体より効率的にＢＢＢを通過するものとして記載されている。従来の抗体と異なり、条件的活性型抗体は、ＢＢＢを通過するためＢＢＢ−Ｒに対して低親和性を有する必要はなく、脳の内部に留まる。条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側でＢＢＢ−Ｒに対して高親和性を有し、且つＢＢＢの脳側で親和性がほとんど又は全くないものでありうる。薬物コンジュゲートなどの薬物を条件的活性型抗体にカップリングして、抗体と共にＢＢＢを通って脳内へと輸送しうる。
ＢＢＢ−Ｒは脳内皮細胞上に発現する膜貫通受容体タンパク質であり、血液脳関門を通じて分子を輸送する能力を有する。ＢＢＢ−Ｒの例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体、例えば限定なしに、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。本明細書における例示的ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。ＴｆＲは、脊椎動物における鉄の取り込みに関与する２つのジスルフィド結合したサブユニット（各々の見かけの分子量約９０，０００）で構成される膜貫通糖タンパク質（分子量約１８０，０００）である。
一部の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対する親抗体又は野生型抗体から生成される条件的活性型抗体を提供する。この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側ではＢＢＢ−Ｒに結合し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が親抗体又は野生型抗体より低い。一部の他の実施形態において、この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側では野生型抗体又は親抗体と比べてＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有しない。
血漿は、脳細胞外液（ＥＣＦ）と大きく異なる体液である。Ｓｏｍｊｅｎ（“Ｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ：Ｎｏｒｍａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｓｅｉｚｕｒｅｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ”，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００４，ｐａｇｅｓ １６ ａｎｄ ３３）及びＲｅｄｚｉｃ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ：ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ”，Ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＮＳ，ｖｏｌ．８：３，２０１１）によって考察される通り、脳細胞外液は血漿と比べてＫ+が大幅に少なく、Ｍｇ2+及びＨ+が多い。血漿と脳ＥＣＦとのイオン濃度の違いにより、これらの２つの体液に浸透圧及び重量オスモル濃度の著しい違いがもたらされる。表１は、血漿及び脳ＥＣＦの両方の共通イオンの濃度（ミリモル単位）を示す。
脳ＥＣＦはまた、血漿と比べて含有する乳酸塩が大幅に多く、血漿と比べてグルコースが大幅に少ない（Ａｂｉ−Ｓａａｂ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｉｋｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ Ｌａｃｔａｔｅ Ｌｅｖｅｌｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂｒａｉｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｉｄ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ ｉｎ Ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ａｎｄ Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ ２７１−２７９，２００２）。
従って、ｐＨ、様々な物質の濃度（ラクトース、グルコース、Ｋ＋、Ｍｇ２＋など）、浸透圧及び重量オスモル濃度など、ＢＢＢの両側間で異なる幾つかの生理条件がある。ｐＨの生理条件に関して、ヒト血漿はヒト脳ＥＣＦより高いｐＨを有する。Ｋ＋濃度の生理条件に関して、脳ＥＣＦはヒト血漿より低いＫ＋濃度を有する。Ｍｇ２＋濃度の生理条件に関して、ヒト脳ＥＣＦはヒト血漿より大幅に高いＭｇ２＋を有する。浸透圧の生理条件に関して、ヒト脳ＥＣＦはヒト血漿と異なる浸透圧を有する。一部の実施形態において、脳ＥＣＦの生理条件は、特定の神経障害を有する患者の脳ＥＣＦの組成、ｐＨ、浸透圧及び重量オスモル濃度であってもよく、これは一般集団の脳ＥＣＦの生理条件と異なりうる。
従って本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対する鋳型抗体をコードするＤＮＡを発達させて変異ＤＮＡライブラリを作成する方法を提供する。次にこの変異ＤＮＡライブラリを発現させると、変異抗体が得られる。この変異抗体は、少なくとも１つの血漿生理条件下でＢＢＢ−Ｒに結合し、且つ脳ＥＣＦ中の少なくとも１つの脳生理条件下で鋳型抗体と比較してＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いか、又はそれを有しない条件的活性型抗体に関してスクリーニングされる。従って、選択された変異抗体は、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに対して低親和性又は高親和性を有し、脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いか、又はそれを有しない。この選択された変異抗体は、ＢＢＢを通って輸送するための条件的活性型抗体として有用である。
かかる条件的活性型抗体は、ＢＢＢの通過及び脳ＥＣＦへの滞留に有利である。脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いため、鋳型抗体と比べ、条件的活性型抗体が脳からＢＢＢを通って血液中へと輸送し戻される速度を低下させる（又はそのようなことをなくす）。
一部の他の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対する鋳型抗体をコードするＤＮＡを発達させて変異ＤＮＡライブラリを作成する方法を提供する。次にこの変異ＤＮＡライブラリを発現させると、変異抗体が得られる。この変異抗体は、少なくとも１つの血漿生理条件下でＢＢＢ−Ｒに結合し、且つ少なくとも１つの脳生理条件下でＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど又は全くない条件的活性型抗体に関してスクリーニングされる。従って、選択された変異抗体は、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有し、脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど又は全くない。この選択された変異抗体が、条件的活性型抗体である。
かかる条件的活性型抗体は、ＢＢＢの通過及び脳ＥＣＦへの滞留に有利である。血漿側でＢＢＢ−Ｒに結合した後、条件的活性型抗体はＢＢＢを通って輸送され、及び脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんどないし全くなく、これは、条件的活性型抗体が脳から運び出される可能性が低いことを意味する。
ＢＢＢ−Ｒに対する条件的活性型抗体の親和性は、その最大半数阻害濃度（ＩＣ５０）によって計測することができ、ＩＣ５０は、ＢＢＢ−Ｒに対する既知のＢＢＢ−Ｒリガンドの結合を５０％阻害するためにどの程度の抗体が必要かの尺度である。一般的な手法は、競合ＥＬＩＳＡ分析などの競合的結合分析を実施することである。ＴｆＲ（ＢＢＢ−Ｒ）に関するＩＣ５０を計測する例示的競合ＥＬＩＳＡ分析は、漸増濃度の抗ＴｆＲ抗体がＴｆＲとの結合についてビオチン化ＴｆＲAと競合するものである。抗ＴｆＲ抗体競合ＥＬＩＳＡは、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌの精製マウスＴｆＲ細胞外ドメインでコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ、Ｎ．Ｊ．）において４℃で一晩実施しうる。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎ．Ｈ．）を使用してブロックする。個々の抗ＴｆＲ抗体（１：３段階希釈）それぞれのタイトレーションをビオチン化抗ＴｆＲA（０．５ｎＭ最終濃度）と組み合わせて、室温で１時間プレートに加える。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、プレートにＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）を加え、室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、プレートに結合したビオチン化抗ＴｆＲAをＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を使用して検出する。
高いＩＣ５０は、ＢＢＢ−Ｒの既知のリガンドの結合を阻害するためにより多くの条件的活性型抗体が必要であり、従ってそのＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が比較的低いことを示す。逆に、低いＩＣ５０は、既知のリガンドの結合を阻害するために必要な条件的活性型抗体がより少なくてすみ、従ってそのＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が比較的高いことを示す。
一部の実施形態において、血漿中のＢＢＢ−Ｒからの条件的活性型抗体のＩＣ５０は、約１ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５０ｎＭ〜約１００μＭ、又は約１００ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５ｎＭ〜約１０μＭ、又は約３０ｎＭ〜約１μＭ、又は約５０ｎＭ〜約１μＭでありうる。
滑液に対する条件的活性型生物学的タンパク質
関節疾患は、工業先進国における身体障害及び早期退職の主な原因である。関節疾患は多くの場合に関節の損傷をもたらし、これは修復が困難である。滑液は、ヒト又は動物の体の関節（例えば、膝、股関節部、肩）の滑膜腔において向かい合う関節表面の軟骨と滑膜との間に見られる体液である。滑液は軟骨に栄養を供給し、また関節の潤滑剤としての役割も果たす。軟骨及び滑膜の細胞は、関節表面間の潤滑剤としての役割を果たす体液を分泌する。ヒト滑液は約８５％の水を含む。これは血漿の透析液に由来し、この透析液それ自体は、水、溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、無機イオン、ホルモン等からなる。アルブミン及びグロブリンなどのタンパク質が滑液中に存在し、関節領域の潤滑において重要な役割を果たすと考えられる。ヒト滑液中には、α−１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）及びルブリシンなどの糖タンパク質類を含め、幾つかの他のタンパク質も見られる。
滑液は、体の他の部分と極めて異なる組成を有する。従って、滑液は、血漿などの体の他の部分とは異なる生理条件を有する。例えば、滑液は約１０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコースを有するが、ヒト血漿の平均正常グルコース値は約１００ｍｇ／ｄＬであり、１日を通して７０〜１００ｍｇ／ｄＬの範囲内で変動する。加えて、タンパク質などの大型分子が滑膜を通過して滑液中に入ることは容易でなく、従って滑液の全タンパク質レベルは血漿タンパク質レベルの約３分の１である。また、ヒト滑液のｐＨはヒト血漿のｐＨより高いことも分かっている（Ｊｅｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐＨ ｏｆ ｂｌｏｏｄ”，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．４１ Ｂ，ｐａｇｅｓ ３８８−４００，１９５９；Ｆａｒｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ ９９−１０４，１９８５）。
従って、滑液は、血漿中の生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる幾つかの生理条件を有する。滑液は、体の他の部分、特に血漿と比べてｐＨが高い。滑液は、血漿などの体の他の部分と比べてグルコースの濃度が低い。滑液はまた、血漿などの体の他の部分と比べてタンパク質の濃度も低い。
滑液に抗体を導入することにより、関節疾患の治療に幾つかの抗体が用いられている。例えば、傷害された関節の滑液は、骨関節炎の進行に影響を及ぼす多くの因子を含有することが知られている（例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ”，Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３９，ｐａｇｅｓ ２３７−２４６，２００２を参照されたい）。インターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインは、活性化した滑膜細胞によって産生されるものであり、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子発現を上方制御することが知られている。ＭＭＰが上方制御されると、関節におけるマトリックス及び非マトリックスタンパク質の分解が引き起こされる。サイトカインを中和する抗体は、骨関節炎の進行を止めることができる。
抗体を薬物として使用することは、関節疾患の治療に有望な戦略である。例えば、関節疾患のうちで群を抜いて高い罹患率を有する骨関節炎を治療するため、抗体（アグレカン又はアグリカナーゼに対する抗体など）が開発されている（国際公開第１９９３／０２２４２９Ａ１号パンフレット）。関節炎などの炎症性、自己免疫性、神経変性又は悪性疾患／障害である関節疾患の診断又は治療に、アセチル化高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）に対する抗体が開発されている。この抗体は、滑液中のアセチル化形態のＨＭＧＢ１を検出するために使用しうる（国際公開第２０１１／１５７９０５Ａ１号パンフレット）。関節の結合組織及び軟骨の損傷を治療するため、別の抗体（ＣＤ２０抗体）も開発されている。
しかしながら、これらの抗体の抗原は、多くの場合に、重要な生理学的機能を有する体の他の部分で発現する。これらの抗原に対する抗体は、関節疾患の治療に有効であるものの、体の他の部分におけるこれらの抗原の正常な生理学的機能も著しく妨げうる。従って、患者に重度の副作用が起こりうる。このように、副作用を低減するため、滑液中ではより高い親和性でそれらの抗原（タンパク質又は他の巨大分子）に優先的に結合しうる一方、体の他の部分では同じ抗原に結合しないか、又は弱く結合するのみである療法薬、例えばサイトカイン又は他の抗原に対する抗体を開発することが望ましい。
かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、条件的活性型抗体でありうる。一部の実施形態において、本発明はまた、抗体以外のタンパク質である条件的活性型生物学的タンパク質も提供する。例えば、本発明によって、滑液中で免疫応答を優先的に調節するための、体の他の部分では免疫応答に対する効果が低いか、又はないものでありうる条件的活性型免疫調節因子が開発されうる。
条件的活性型生物学的タンパク質は、サイトカインシグナル伝達（ＳＯＣＳ）の条件的活性型サプレッサーでありうる。これらのＳＯＣＳの多くはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害に関与する。サイトカインシグナル伝達の条件的活性型サプレッサーは、滑液中ではサイトカインシグナル伝達を優先的に抑制しうる一方、体の他の部分ではサイトカインシグナル伝達を抑制しないか、又は抑制の程度が低い。
一部の実施形態において、本発明は、野生型生物学的タンパク質に由来する条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿などの体の特定の部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、滑液における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、滑液中で優先的に機能しうるが、体の他の部分には作用せず、又は作用の程度が低い。結果的に、かかる条件的活性型生物学的タンパク質は副作用が低減しうる。
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は、滑液中にあるか、又は滑液に曝露している抗原に対する抗体である。かかる抗原は、関節疾患における免疫応答／炎症に関与する任意のタンパク質であってもよく、しかし抗原は多くの場合にサイトカインである。条件的活性型抗体は、体の他の部分（血漿など）における少なくとも１つの生理条件下では同じ抗原に対する野生型抗体と比べて抗原に対する親和性が低いが、滑液の少なくとも１つの生理条件下では抗原に対する親和性は野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合するか、又は全く結合しないが、滑液中では抗原に結合し、例えば強く緊密に結合し、又はより強く結合しうる。
腫瘍に対する条件的活性型生物学的タンパク質
固形腫瘍における癌細胞は、その周囲に腫瘍微小環境を形成して癌細胞の成長及び転移を支援する能力を有する。腫瘍微小環境は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、並びに新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、及び潜伏転移が発育するためのニッチを提供することのできる機械的キューを含め、腫瘍が存在する細胞環境である。腫瘍及びその周囲微小環境は密接に関係し、常に相互作用している。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、及び末梢性免疫寛容を誘導することによってその微小環境に影響を与えうる一方、微小環境における免疫細胞が癌性細胞の成長及び発達に影響を及ぼしうる。Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．“Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｒｏｌｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．，７２，ｐａｇｅｓ ２４７３−２４８０，２０１２を参照されたい。
腫瘍微小環境は、多くの場合に低酸素である。腫瘍塊が増加するに従い、腫瘍の内部が既存の血液供給からさらに離れて成長し、それにより酸素を腫瘍微小環境に完全に供給することが困難になる。腫瘍環境における酸素分圧は、局所進行固形腫瘍の５０％超で５ｍｍＨｇ未満であり、対して血漿中では約４０ｍｍＨｇの酸素分圧である。対照的に、体の他の部分は低酸素でない。低酸素環境はヌクレオチド除去修復及びミスマッチ修復経路の下方制御を介して遺伝的不安定性につながり、この遺伝的不安定性は癌の進行に関連する。低酸素はまた、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１−α）の上方制御も引き起こし、ＨＩＦ１−αは血管新生を誘導し、予後不良及び転移に関連する遺伝子の活性化に関連する。Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、“Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ”，Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ １７２−１７７，２０１２及びＢｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，“Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ １３−１７，２００４を参照されたい。
加えて、腫瘍細胞は、酸素を必要としない乳酸発酵によって生成されるエネルギーに頼る傾向がある。そのため腫瘍細胞は、酸素を必要とする通常の好気的呼吸を使用することが少ない。乳酸発酵を使用する結果、腫瘍微小環境は酸性となり（ｐＨ６．５〜６．９）、これは典型的に中性又は弱塩基性のいずれかである体の他の部分と対照的である。例えば、ヒト血漿は約７．４のｐＨを有する。Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ａｃｉｄｉｔｙ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｄｒｉｖｅｓ Ｌｏｃａｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．７３，ｐａｇｅｓ １５２４−１５３５，２０１３を参照されたい。腫瘍微小環境においては、増殖癌細胞の栄養素要求が比較的高いことに起因して、体の他の部分に位置する細胞と比較して栄養素の利用可能性も低い。
さらに、腫瘍微小環境はまた、体の他の部分にはあまり見られない多くの特徴的な細胞型も含有する。これらの細胞型には、内皮細胞及びその前駆体、周皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、癌関連線維芽細胞、筋線維芽細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、Ｔ及びＢリンパ球、ナチュラルキラー細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ及び樹状細胞が含まれる（Ｌｏｒｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏｗａｒｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１３０，ｐａｇｅｓ １０９１−１１０３，２００８）。
従って、腫瘍微小環境は、血漿中における生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる少なくとも幾つかの生理条件を有する。腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿（ｐＨ７．４）と比べてｐＨ（酸性）が低い。腫瘍微小環境は、血漿などの体の他の部分と比べて酸素濃度が低い。また、腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿と比べて栄養素の利用可能性も低い。腫瘍微小環境はまた、体の他の部分、特に血漿にはあまり見られない幾つかの特徴的な細胞型も有する。
ある種の癌薬物には、腫瘍微小環境内に侵入して、そこで癌細胞に作用することのできる抗体が含まれる。抗体ベースの癌療法は十分に確立されており、血液系悪性腫瘍及び固形腫瘍患者の治療に関して最も成功している重要な戦略の１つになっている。ヒト癌細胞が発現する細胞表面抗原であって、正常組織と比較して癌細胞で過剰発現するか、突然変異するか、又は選択的に発現する細胞表面抗原は多岐にわたる。これらの細胞表面抗原は、抗体癌療法の優れた標的である。
抗体が標的としうる癌細胞表面抗原は、幾つかの異なる種類に分類される。造血分化抗原は、通常分化クラスター（ＣＤ）分類に関連する糖タンパク質類であり、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３及びＣＤ５２が含まれる。細胞表面分化抗原は、正常細胞及び腫瘍細胞の両方の表面上に見られる多様な糖タンパク質及び炭水化物の群である。成長及び分化シグナル伝達に関与する抗原は、多くの場合に成長因子及び成長因子受容体である。癌患者において抗体の標的となる成長因子には、ＣＥＡ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１としても知られる）１２、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られる）１３、ＥＲＢＢ３（文献１８）、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られる）１９、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）２０、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）２１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られる）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られる）及び核内因子κＢの受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦＳＦ１１としても知られる）２２が含まれる。血管新生に関与する抗原は、通常、新しい微小血管系の形成を支援するタンパク質又は成長因子であり、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３及びインテグリンα５β１が含まれる（文献１０）。腫瘍間質及び細胞外マトリックスは、腫瘍にとって不可欠な支持構造である。治療標的となる間質性及び細胞外マトリックス抗原には、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びテネイシンが含まれる。Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ ２７８−２８７，２０１２を参照されたい。
抗体に加えて、他の生物学的タンパク質も癌の治療において有望となっている。例としては、腫瘍抑制因子、例えば、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）、ｐ５３、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、及びＳＴ１４が挙げられる。腫瘍サイズを縮小させるため、癌細胞においてアポトーシスを誘導する一部のタンパク質も腫瘍に導入しうる。腫瘍においてアポトーシスを誘導することのできる機構は少なくとも２つある：腫瘍壊死因子によって誘導される機構及びＦａｓ−Ｆａｓリガンドによって媒介される機構。これらの２つのアポトーシス機構のいずれかに関与するタンパク質の少なくとも一部を、治療のため腫瘍に導入しうる。
癌幹細胞は、特定の癌試料に見られるあらゆる細胞型を生じる能力を有する癌細胞であり、従って腫瘍形成性である。癌幹細胞は、自己再生して複数の細胞型へと分化する幹細胞プロセスを通じて腫瘍を生じさせうる。癌幹細胞は腫瘍において特徴的な集団として存続し、新たな腫瘍を生じさせることによって再発及び転移を引き起こすと考えられる。癌幹細胞を標的とする特異的療法の開発は、癌患者、特に転移性疾患患者について、生存及びクオリティオブライフを向上させうる。
これらの腫瘍治療薬は、多くの場合に、腫瘍以外の体の他の部分で正常な生理学的機能を妨げる。例えば、腫瘍においてアポトーシスを誘導するタンパク質はまた、体の他の何らかの部分においてもアポトーシスを誘導し、ひいては副作用を引き起こしうる。抗体を使用して腫瘍を治療する実施形態において、抗体の抗原はまた、正常な生理学的機能を果たす体の他の部分においても発現しうる。例えば、腫瘍血管成長を止めるモノクローナル抗体ベバシズマブ（血管内皮成長因子を標的化する）。この抗体はまた、体の他の部分における血管成長又は修復も阻止しうるため、出血、創傷治癒不良、血餅、及び腎臓損傷を引き起こしうる。より有効性の高い腫瘍治療法には、主に又は専ら腫瘍を標的化することに集中する条件的活性型生物学的タンパク質の開発が極めて望ましい。
一部の実施形態において、本発明は、腫瘍治療候補でありうる野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿などの腫瘍微小環境以外の体の部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、腫瘍微小環境における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、腫瘍を治療するため腫瘍微小環境で癌細胞に優先的に作用することができ、従って副作用を引き起こしにくい。生物学的タンパク質が腫瘍細胞の表面上の抗原（抗原が腫瘍微小環境に曝露している）に対する抗体である実施形態において、条件的活性型抗体は、体の他の部分、例えば非腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より低く、一方、腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合しうるか、又は全く結合せず、しかし、腫瘍微小環境では抗原により高い結合性を有し、又は強力且つ緊密に結合する。
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体であり、免疫チェックポイントの阻害をもたらす。かかる条件的活性型抗体は、腫瘍微小環境では、その条件的活性型抗体が由来する野生型抗体と比較して免疫チェックポイントタンパク質に対する結合親和性が増加しており、非腫瘍微小環境では、その条件的活性型抗体が由来する野生型抗体と比較して免疫チェックポイントタンパク質に対する結合親和性が低下している。
免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、且つ抗原刺激、すなわち外来性の分子、細胞及び組織に対する免疫応答の持続時間及び程度を調節する免疫系の内因性阻害経路として機能する。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ ２５２−２６４，２０１２を参照されたい。１つ以上のチェックポイントタンパク質を抑制することによる免疫チェックポイントの阻害は、免疫系、特にＴ細胞の過剰な活性化を引き起こし、ひいては免疫系が誘導されて腫瘍を攻撃しうる。本発明に好適なチェックポイントタンパク質としては、ＣＴＬＡ４及びそのリガンド８０及び８６、ＰＤ１及びそのリガンドＰＤＬ１及びＰＤＬ２、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質−３（ＴＩＭ３）及びそのリガンドＧＡＬ９、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）及びそのリガンドＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）などの受容体、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）及びアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、並びにリガンドＢ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４が挙げられる。さらなる好適な免疫チェックポイントタンパク質が、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ ２５２−２６４，２０１２及びＮｉｒｓｃｈｌ＆Ｄｒａｋｅ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１９，ｐａｇｅｓ ４９１７−４９２４，２０１３（これらの開示は本明細書によって参照により本明細書に援用される）に記載されている。
ＣＴＬＡ−４及びＰＤ１は、最もよく知られている免疫チェックポイントタンパク質の２つである。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化経路を下方制御しうる（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（２）：６０９−６１５，２００９；及びＷｅｂｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５８：８２３−８３０，２００９）。ＣＴＬＡ−４を遮断すると、Ｔ細胞活性化及び増殖が増大することが示されている。ＣＴＬＡ−４の阻害薬としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ−４に結合してＣＴＬＡ−４とそのリガンドＣＤ８０又はＣＤ８６との相互作用を遮断し、それによりＣＴＬＡ−４とそのリガンドとの相互作用によって誘発される免疫応答の下方制御を遮断する。
チェックポイントタンパク質ＰＤ１は、感染に対する炎症反応が起こったときに末梢組織におけるＴ細胞の活性を抑制し、自己免疫を抑えることが知られている。インビトロでＰＤ１を遮断すると、特異的抗原標的によるか、又は混合リンパ球反応における同種細胞による刺激に応答したＴ細胞増殖及びサイトカイン産生が増強されうる。ＰＤ１発現と免疫応答低下との間の強い相関は、ＰＤ１の阻害機能、すなわち免疫チェックポイントの誘導によって生じることが示された（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１２：２５２−２６４，２０１２）。ＰＤ１の遮断は、ＰＤ１又はそのリガンドＰＤＬ１又はＰＤＬ２に結合する抗体を含め、種々の機構によって達成することができる。
これまでの研究において、幾つかのチェックポイントタンパク質（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体が発見されている。これらの抗体は、免疫チェックポイントを阻害して、それにより腫瘍を攻撃するため免疫系、特にＴ細胞を過剰に活性化させることにより、腫瘍の治療に有効となる（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ ２５２−２６４，２０１２）。しかしながら、活性化過剰のＴ細胞はまた、宿主細胞及び／又は組織も攻撃しうるため、患者の体に付随的損傷をもたらしうる。従って、免疫チェックポイントを阻害するためのこれらの公知の抗体の使用に基づく治療法は管理が難しく、患者のリスクが重大な懸念事項である。例えば、ＦＤＡが承認済みのＣＴＬＡ−４に対する抗体は、その高い毒性のため黒枠警告を有する。
本発明は、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体を提供することにより、活性化過剰のＴ細胞による付随的損傷の問題に対処する。これらの条件的活性型抗体は、腫瘍微小環境において免疫チェックポイントを優先的に活性化する。同時に、非腫瘍微小環境、例えば正常な生体組織における免疫チェックポイントは条件的活性型抗体によって阻害されないか、又は阻害が少なく、従って非腫瘍微小環境では体に対する付随的損傷の可能性が低減される。この目標は、非腫瘍微小環境と比べて腫瘍微小環境においてより高活性となるように条件的活性型抗体を操作することによって達成される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は、非腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質との結合活性に対する腫瘍微小環境における同じ免疫チェックポイングタンパク質との結合活性の比が、少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．６、又は少なくとも約１．８、又は少なくとも約２、又は少なくとも約２．５、又は少なくとも約３、又は少なくとも約５、又は少なくとも約７、又は少なくとも約８、又は少なくとも約９、又は少なくとも約１０、又は少なくとも約１５、又は少なくとも約２０でありうる。抗体の結合活性を計測するための典型的な分析は、ＥＬＩＳＡ分析である。
高免疫原性腫瘍、例えば悪性黒色腫は、免疫系の操作によって達成される活性化過剰の免疫系に対して最も脆弱である。従って、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は、かかる高免疫原性腫瘍の治療に特に有効でありうる。しかしながら、他のタイプの腫瘍も活性化過剰の免疫系に対して脆弱である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は併用療法で用いられうる。例えば、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体とを含みうる。一実施形態において、腫瘍細胞表面分子に対する条件的活性型抗体の結合活性と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体の結合活性との両方が単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示される通りの二重特異性条件的活性型抗体であってもよい。一部のさらなる実施形態において、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と２つ以上の異なる免疫チェックポイントタンパク質に対する２つ以上の条件的活性型抗体とを含んでもよい。一実施形態において、これらの結合活性の全てが単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示される通りの多重特異性抗体であってもよい。
条件的活性型抗体は、その条件的活性型抗体が由来する野生型抗体の活性と比較して、同じ腫瘍細胞表面分子又はチェックポイントタンパク質に対し腫瘍微小環境においてより高活性であるため、これらの併用療法は、有効性の増強及び毒性の大幅な低下の両方をもたらしうる。これらの条件的活性型抗体、特に免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体の毒性の低下は、強力な抗体、例えば本明細書に記載される通りのＡＤＣ抗体、並びにより高用量の抗体の安全な使用を可能にしうる。
一部の実施形態において、チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体はプロドラッグ形態であってもよい。例えば、条件的活性型抗体は、開裂されて薬物形態に変わる前は所望の薬物活性を有しないプロドラッグでありうる。プロドラッグは、かかる開裂を触媒する酵素が腫瘍微小環境に優先的に存在するか、又は条件的活性型抗体が非腫瘍微小環境における開裂部位への到達し易さと比較して腫瘍微小環境では開裂部位に到達し易くなるかのいずれかの理由により、腫瘍微小環境で優先的に開裂しうる。
腫瘍幹細胞を含む幹細胞ニッチに対する条件的活性型生物学的タンパク質
幹細胞は体の幹細胞ニッチと呼ばれる環境に存在し、幹細胞ニッチは組織生理学の基本的な単位を成し、生物の要求に対する幹細胞の応答を媒介するシグナルを統合する。しかしニッチは、幹細胞又は他の標的に異常機能を課すことによって病理も誘導しうる。幹細胞とそれらのニッチとの間の相互作用により、組織の持続及び幹細胞療法の最終設計に必要な動的システムが作り出される（Ｓｃａｄｄｅｎ，“Ｔｈｅ ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ａｓ ａｎ ｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐａｇｅｓ １０７５−１０７９，２００６）。脊椎動物における一般的な幹細胞ニッチには、生殖細胞系列幹細胞ニッチ、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸幹細胞ニッチ、及び心血管幹細胞ニッチが含まれる。
幹細胞ニッチは、体の他の部分（例えば血漿）と異なる特殊化した環境である（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ−Ｂａｒｂｏｓａ，“Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｎｉｃｈｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：Ａｎ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ”，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１８０，ｐａｇｅｓ １７８７−１７９７，２００８；Ｆｕｃｈｓ，“Ｓｏｃｉａｌｉｚｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｎｉｃｈｅ”，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１６，ｐａｇｅｓ ７６９−７７８，２００４）。幹細胞ニッチは低酸素であり、酸化的ＤＮＡ損傷が低下している。酸素レベルを直接計測することにより、一般に骨髄が血漿と比較して事実上低酸素である（約１％〜２％Ｏ２）ことが明らかになっている（Ｋｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ”，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１２９，ｐａｇｅｓ ４６５−４７２，２００７；Ｍｏｈｙｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｘｙｇｅｎ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎｉｃｈｅ”，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７，ｐａｇｅｓ １５０−１６１，２０１０）。加えて、幹細胞ニッチは、ニッチ内で幹細胞特性を調節するため幾つかの他の因子：細胞外マトリックス成分、成長因子、サイトカイン、及び環境の生理化学的性質の因子、例えば、ｐＨ、イオン強度（例えばＣａ2+濃度）及び代謝産物を有しなければならない。
従って、幹細胞ニッチは、血漿中の生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる少なくとも幾つかの生理条件を有する。幹細胞ニッチは、体の他の部分、特に血漿と比べて酸素濃度が低い（１〜２％）。ｐＨ及びイオン強度を含む幹細胞ニッチの他の生理条件も体の他の部分と異なりうる。
幹細胞治療は、疾患又は傷害を治療するため新規の成体幹細胞を損傷組織に導入するインターベンショナルな戦略である。この戦略は、幹細胞が自己再生して、分化能の程度が様々な続く子孫を生じる能力に依存する。幹細胞治療は、拒絶反応及び副作用のリスクを最小限に抑えつつ体の罹患及び損傷した範囲を置き換えることが潜在的に可能な組織を再生する大きな潜在的可能性をもたらす。従って、幹細胞の再生及び分化に影響を及ぼすため幹細胞ニッチに薬物（生物学的タンパク質（例えば抗体）又は化学的化合物）を送達することは、幹細胞治療の重要な部分である。
幹細胞ニッチが哺乳動物における幹細胞の再生及び／又は分化にどのように影響を及ぼすかに関する幾つかの例がある。第一の例は皮膚におけるものであり、ここではβ−１インテグリンが原始細胞上で差次的に発現し、且つマトリックス糖タンパク質リガンドとの相互作用を介した幹細胞集団の制約的な局在化に関与することが知られている。第二に、神経系においては、テネイシンＣが存在しないことにより脳室下帯の神経幹細胞の数及び機能が変化する。テネイシンＣは、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）及び骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）に対する幹細胞感受性を調節して幹細胞性向の増加をもたらすものと思われる。第三に、別のマトリックスタンパク質、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するシアロタンパク質、オステオポンチン（ＯＰＮ）は、現在、造血幹細胞調節に寄与することが実証されている。ＯＰＮは、造血幹細胞、ＣＤ４４、並びにα４及びα５β１インテグリン上にあることが知られる幾つかの受容体と相互作用する。ＯＰＮ産生は、特に骨芽細胞の活性化によって著しく変化しうる。ＯＰＮを欠く動物は、ＯＰＮの欠損によって刺激条件下で超生理学的な幹細胞増大が生じるため、ＨＳ細胞数が増加している。従って、ＯＰＮは、恒常条件下又は刺激下で幹細胞の数を制限する造血幹細胞数の制約としての役割を果たすものと思われる。Ｓｃａｄｄｅｎ，“Ｔｈｅ ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ａｓ ａｎ ｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐａｇｅｓ １０７５−１０７９，２００６を参照されたい。
Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ ８０９９−８１０４，２０１３）は、抗体を使用して幹細胞分化に影響を及ぼす方法を開示している。この抗体は、顆粒球コロニー刺激因子受容体のアゴニストである。細胞を活性化して所定の経路に沿って分化させる天然の顆粒球コロニー刺激因子と異なり、この単離アゴニスト抗体はヒト骨髄系統ＣＤ３４＋骨髄細胞を神経前駆細胞に分化転換させた。Ｍｅｌｉｄｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（“Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ １７８０２−１７８０７，２０１３）も、抗体を使用してＦＧＦ４とその受容体ＦＧＦＲ１βとの間の相互作用に干渉し、従ってオートクリンＦＧＦ４媒介性胚性幹細胞分化を遮断する方法を開示している。
幹細胞分化におけるリガンド／受容体の機能の理解により、幹細胞分化を調節し、又はさらには指図するため生物学的タンパク質を利用してこれらのリガンド／受容体に干渉する戦略が可能となっている。遺伝子修飾されていないヒト幹細胞の分化を幹細胞ニッチへの抗体の投与によって制御可能であることにより、幹細胞ベースの療法の新規エキソビボ又はインビボ手法がもたらされうる。一部の実施形態において、本発明は、癌幹細胞を含め、幹細胞ニッチに侵入して幹細胞又は腫瘍の発育を調節する能力を有する野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、体の他の部分における少なくとも１つの生理条件下では野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、幹細胞ニッチ、例えば癌幹細胞環境における少なくとも１つの生理条件下では野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は副作用を生じにくく、幹細胞ニッチで優先的に作用して幹細胞の再生及び分化を調節する。一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は抗体である。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分ではその抗原に弱く結合し、又は全く結合せず、しかし幹細胞ニッチでは抗原に強く緊密に結合しうる。
本発明の滑液、腫瘍微小環境及び幹細胞ニッチに対する条件的活性型タンパク質は、野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを発達させて変異ＤＮＡライブラリを作成する方法によって生成される。次にこの変異ＤＮＡライブラリを発現させると、変異タンパク質が得られる。この変異タンパク質は、滑液、腫瘍微小環境、及び幹細胞ニッチからなる群から選択される体の第一部分の少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有し、且つ体の第一部分と異なる体の第二部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有する条件的活性型生物学的タンパク質に関してスクリーニングされる。体の第二部分は血漿であってもよい。かかる選択された変異生物学的タンパク質が、体の第一部分では高い活性を有するが体の第二部分では低い活性を有する条件的活性型生物学的タンパク質である。
条件的活性型生物学的タンパク質が作用することが意図されない体の他の部分では条件的活性型生物学的タンパク質は活性がより低いため、かかる条件的活性型生物学的タンパク質は野生型タンパク質の副作用を低下させるのに有利である。例えば、条件的活性型生物学的タンパク質を腫瘍微小環境に導入することが意図される場合、腫瘍微小環境以外の体の部分で条件的活性型生物学的タンパク質の活性が低いということは、かかる条件的活性型生物学的タンパク質が腫瘍微小環境以外の体の部分で正常な生理学的機能に干渉する可能性が低いことを意味する。同時に、条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍微小環境では活性が高く、これにより条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍の治療における有効性がより高いものとなる。
副作用が低いため、条件的活性型生物学的タンパク質では、野生型生物学的タンパク質と比較して大幅に高い用量のタンパク質を安全に使用できるようになる。サイトカイン又は成長因子に対する抗体は体の他の部分におけるサイトカイン又は成長因子の正常な生理学的機能を妨げうるため、これはサイトカイン又は成長因子に対する抗体について特に有益である。副作用が低い条件的活性型生物学的タンパク質を使用することにより、より高用量を用いてより高い有効性を達成しうる。
滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチの１つにおいて作用するための条件的活性型生物学的タンパク質はまた、新規薬物標的の使用も可能にしうる。従来の生物学的タンパク質を療法薬として使用すると、許容できない副作用が生じうる。例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害は腫瘍成長の抑制に極めて有効でありうる。しかしながら、ＥＧＦＲを阻害する薬物はまた、皮膚及び胃腸（ＧＩ）管における成長も抑制しうる。この副作用によってＥＧＦＲは腫瘍薬標的として不適となる。腫瘍微小環境においてのみＥＧＦＲに高親和性で結合するが、体の任意の他の部分では全く又は極めて低い親和性でのみ結合する条件的活性型抗体を使用すると、副作用を大幅に低減すると同時に腫瘍成長を抑制しうる。この場合、条件的活性型抗体を使用することにより、ＥＧＦＲが有効な新規腫瘍薬標的となりうる。
別の例では、関節損傷の修復において多くの場合にサイトカインの抑制が有益である。しかしながら、体の他の部分におけるサイトカインの抑制はまた体の免疫応答も抑制し、免疫不全を引き起こしうる。従って、滑液中のサイトカインは、関節損傷治療用の従来の抗体薬の開発に理想的な標的ではない。しかしながら、滑液中ではサイトカインに優先的に結合する一方で、体の他の部分では同じサイトカインに全く又は弱くのみ結合する条件的活性型抗体を使用することにより、免疫不全の副作用を劇的に低減することができる。従って、条件的活性型抗体を使用することにより、滑液中のサイトカインが関節損傷の修復に好適な標的となりうる。
条件的活性型ウイルス粒子
ウイルス粒子は、長年、タンパク質、核酸分子、化学的化合物又は放射性同位元素を標的細胞又は組織に輸送するための送達媒体として使用されている。送達媒体として一般的に用いられているウイルス粒子としては、レトウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。ウイルス粒子は、多くの場合にリガンド−受容体結合系において標的細胞の標的タンパク質として機能する細胞タンパク質との特異的結合のための認識タンパク質として機能する表面タンパク質を介してその標的細胞を認識する（Ｌｅｎｔｚ，“Ｔｈｅ ｒｅｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７１，ｐａｇｅｓ ７５１−７６５，１９９０（参照により本明細書に援用される））。例えば、ウイルス認識タンパク質は、標的細胞上の受容体に対するリガンドでありうる。リガンドと受容体との間の特異性により、ウイルス粒子が標的細胞を特異的に認識してその内容物を標的細胞に送達することが可能となる。
野生型ウイルスから人工ウイルス粒子を開発する技術は当業者に周知である。送達媒体として公知の人工ウイルス粒子には、レトロウイルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号パンフレット；国際公開第９４／０３６２２号パンフレット；国際公開第９３／２５６９８号パンフレット；国際公開第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号パンフレット；国際公開第９３／１０２１８号パンフレット；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；欧州特許第０ ３４５ ２４２号明細書；及び国際公開第９１／０２８０５号パンフレットを参照されたい）、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、及びアデノ随伴ウイルス（例えば、国際公開第９４／１２６４９号パンフレット、国際公開第９３／０３７６９号パンフレット；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；国際公開第９４／２８９３８号パンフレット；国際公開第９５／１１９８４号パンフレット及び国際公開第９５／００６５５号パンフレットを参照されたい）をベースとするものが含まれる。
概して、人工ウイルス粒子は、ウイルス粒子への外来性認識タンパク質の挿入、多くの場合に組換え技術による天然認識タンパク質の置換によって構築される。外来性認識タンパク質は、例えば、抗体、受容体、リガンド又はコラーゲン結合ドメインでありうる。本発明は、正常生理条件では細胞に対する結合が不活性又は低活性であり、且つ異常条件では細胞に対する結合が活性又は高活性である条件的活性型認識タンパク質を提供する。従って条件的活性型認識タンパク質は、罹患組織及び／又は疾患部位の標的細胞にその部位における異常条件の存在に基づき優先的に結合し、且つ正常生理条件が存在する場合には正常組織の細胞との結合を回避し、又はその結合がごく最小限でありうる。条件的活性型認識タンパク質はウイルス粒子の表面上に発現し、提示されうる。
一部の実施形態において、本発明は、野生型認識タンパク質を発達させて、条件的活性型認識タンパク質に関してスクリーニングする方法を提供する。条件的活性型認識タンパク質は、正常生理条件下では野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が低く、異常条件下では野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が高い。かかる条件的活性型認識タンパク質を公知の組換え技術によってウイルス粒子に挿入すると、条件的活性型ウイルス粒子が生成されうる。
別の実施形態において、本発明は、条件的活性型認識タンパク質を含む条件的活性型ウイルス粒子を提供し、これは、条件的活性型ウイルス粒子が罹患組織又は疾患部位の標的細胞を認識してそれに結合するが、正常組織の細胞は認識及び結合しないことを可能にするものである。かかる条件的活性型ウイルス粒子はウイルス粒子内の療法薬を疾患組織又は疾患部位に優先的に送達することができる一方、この条件的活性型ウイルス粒子は正常組織の細胞にはより少ない療法薬を送達するか、又は送達しない。
一部の実施形態において、疾患部位における標的細胞は、健常な、又は特定の疾患又は病状に罹患していない体の他の部分におけるｐＨ又は温度と比較して異常なｐＨ（例えば、ｐＨ６．５）又は異常な温度を有する領域又は微小環境の内部にある。この実施形態において、条件的活性型認識タンパク質は、正常な生理的ｐＨ又は温度では野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が低く、異常なｐＨ又は温度では野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が高い。このように、認識タンパク質は、異常なｐＨ又は温度が起こる部位に優先的に結合し、それによって治療を疾患部位に送達しうる。
一実施形態において、ウイルス粒子は本発明の条件的活性型抗体、特に抗体の可変領域（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ）を含みうる。かかる条件的活性型抗体は、正常組織を含む部位で起こりうる正常生理条件下では野生型抗体より低い親和性で、及び疾患部位又は罹患組織で起こりうる異常条件下では野生型抗体より高い親和性で、標的細胞の標的タンパク質（抗原として）に結合しうる。条件的活性型抗体は、本発明の方法に従い野生型抗体から誘導しうる。
ある実施形態では、標的細胞上の標的タンパク質には、例えば多くの腫瘍において細胞表面上で過剰発現するチロシンキナーゼ成長因子受容体が含まれる。例示的チロシンキナーゼ成長因子は、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦ−α受容体、ＴＧＦ−β受容体、ＨＢ−ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、及びＥｒｂＢ４受容体である。
条件的活性型ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質
新規ゲノム操作ツールの一形態としてＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質、特にＣＲＩＳＰＲと呼ばれるものが発見されており、これらによれば、研究者は遺伝子にマイクロサージェリーを実施して、染色体上の厳密な位置にあるＤＮＡ配列を正確且つ容易に変化させることが可能となる（ゲノム編集、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｓ９ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ９５７−９６３，２０１３）。例えば、鎌状赤血球貧血は単一塩基突然変異によって引き起こされ、これは潜在的にＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質を使用して修正しうるものである。この技術は、染色体の小片を、一塩基対の変更による場合であっても、正確に欠失させ、又は編集しうる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ ４６７−４７７，２０１１）。
ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集は、細胞に複数の遺伝子変化を迅速且つ同時に作製する能力を有する。多くのヒトの病気は、心疾患、糖尿病、及び神経系疾患を含め、複数の遺伝子における突然変異の影響を受ける。このＣＲＩＳＰＲベースの技術は、疾患を引き起こす突然変異を復帰させ、これらの疾患を治癒し、又は少なくともこれらの疾患の重症度を低減しうる可能性を有する。ゲノム編集は、ゲノムＤＮＡの切断についてＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（酵素ファミリー）に頼る。典型的には、Ｃａｓタンパク質は、小さいガイドＲＮＡによってゲノム内の標的領域に案内され、ここでガイドＲＮＡは標的領域と一致している。Ｃａｓタンパク質は配列特異性がほとんど又は全くないため、ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質が正確なゲノム編集を達成するための指示者としての役割を果たす。一実施形態では、１つのＣａｓタンパク質を複数のガイドＲＮＡと共に使用して、複数の遺伝子突然変異を同時に修正しうる。
多くのＣａｓタンパク質が存在する。例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４が挙げられる（（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ ４６７−４７７，２０１１）。
ゲノム編集を行うには、Ｃａｓタンパク質が標的細胞に侵入する必要がある。対象の細胞は、細胞内部において異なる細胞内ｐＨを有しうる。罹患組織の一部の細胞は異常な細胞内ｐＨを有する。例えば、一部の腫瘍細胞は約７．１２〜７．６５のアルカリ性の細胞内ｐＨを有する傾向があり、一方、正常組織の細胞は６．９９〜７．２０の範囲の中性の細胞内ｐＨを有する。Ｃａｒｄｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｐＨ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａ（＋）／Ｈ（＋）ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｉｎ ｍｅｔａｔａｓｉｓ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ ７８６−７９５，２００５を参照されたい。慢性低酸素では、罹患組織の細胞は約７．２〜７．５の細胞内ｐＨを有し、これも正常組織の細胞内ｐＨより高い（Ｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ ｅｌｅｖａｔｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｎａ＋／Ｈ＋ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９，ｐａｇｅｓ Ｌ８６７−Ｌ８７４，２００５）。さらに、虚血細胞では、細胞内ｐＨは典型的に６．５５〜６．６５の範囲であり、これは正常組織の細胞内ｐＨより低い（Ｈａｑｂｅｒｇ，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ｄｕｒｉｎｇ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ，ｔｉｓｓｕｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ＡＴＰ”，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．，ｖｏｌ．４０４，ｐａｇｅｓ ３４２−３４７，１９８５）。罹患組織における異常な細胞内ｐＨのさらなる例が、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ”，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ ２７０９−２７２８，２０１０において考察されている。
本発明は、野生型Ｃａｓタンパク質から条件的活性型Ｃａｓタンパク質を作製する方法を提供し、ここで条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、正常細胞内部の正常生理条件下では野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて低下した酵素活性を有し、上記で考察した罹患細胞の１つなどの標的細胞内部の異常条件下では野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて増加した酵素活性を有する。一部の実施形態において、正常生理条件はほぼ中性の細胞内ｐＨであり、異常条件は、中性より高いか、又はそれより低い異なる細胞内ｐＨである。ある実施形態では、異常条件は、７．２〜７．６５の細胞内ｐＨ又は６．５〜６．８の細胞内ｐＨである。
一部の実施形態において、条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、本発明の条件的活性型ウイルス粒子を使用して標的細胞に送達しうる。条件的活性型ウイルス粒子は、条件的活性型Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質がゲノムＤＮＡを編集することになる位置にＣａｓタンパク質を導くための少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含む。
条件的活性型生物学的タンパク質の生成方法
１つ以上の突然変異誘発技術は、変異ＤＮＡのライブラリをつくるための野生型タンパク質をエンコードするＤＮＡを発達させるのに使用される。変異ＤＮＡは、変異タンパク質のライブラリをつくるために発現され、及びこのライブラリは、正常生理的条件下及び１つ以上の異常条件下でスクリーニング分析するために対象とされる。条件的活性型生物学的タンパク質は、（ａ）野生型タンパク質と比較して正常生理的条件下での分析において活性が減少し、（ｂ）野生型タンパク質と比較して異常条件下での分析において活性が増大する、両方を示すこれらのタンパク質から選択される。或いは、条件的活性型生物学的タンパク質は、２つ以上の異なる生理的条件において、可逆的に又は不可逆的に活性の変化を示すこれらのタンパク質から選択される。
親分子からの発達した分子の生成
条件的活性型タンパク質は、突然変異誘発プロセスと、非野生型条件での活性が野生型条件での活性と同じにとどまるか、又はそれより良好でありながら野生型条件では活性が低下することに関する個々の突然変異のスクリーニングとによって生成することができる。
本開示は酵素活性を有するポリペプチドをエンコードする核酸変異体を生成するための方法を提供するものであって、ここにおいて、この変異体は、自然発生のものから異常生理的活性を有するものであり、この方法は、（ａ）（ｉ）異なるヌクレオチドと１つ以上のヌクレオチドを置換する工程。ここにおいてヌクレオチドは自然又は非自然のヌクレオチドからなる。（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチドを欠失する工程。（ｉｉｉ）１つ以上のヌクレオチドを付加する工程、又は（ｉｖ）任意のこれらの組み合わせによって核酸を修飾する工程、からなる。一態様において、非自然のヌクレオチドは、イノシンからなる。他の態様において、この方法は、異常酵素活性のために修飾された核酸によってエンコードされたポリペプチドを分析する工程、それによって、異常酵素活性を有するポリペプチドをエンコードする修飾された核酸を同定する工程からなる。一態様において、工程（ａ）の修飾は、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異、アセンブリＰＣＲ、性的ＰＣＲ突然変異、生体内突然変異、カセット突然変異、再帰的アンサンブル突然変異、指数的アンサンブル突然変異、位置特異的突然変異、遺伝子再構築、遺伝子位置飽和突然変異、リガーゼ鎖反応、生体外突然変異、リガーゼ鎖反応、オリゴヌクレオチド合成、任意の遺伝子生成技術、及びこれらの組み合わせによってなされる。他の態様において、この方法はさらに修飾工程（ａ）の少なくとも１回の繰り返しからなる。
本開示はさらに、２つ以上の核酸からポリヌクレオチドを製造するための方法を提供する。この方法は、次の（ａ）〜（ｃ）からなる。（ａ）２つ以上の核酸間で同一の領域及び多様な領域を同定する工程。そこにおいて、この核酸の少なくとも１つは、本開示の核酸からなる。（ｂ）２つ以上の核酸の少なくとも２つの配列に対応するオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程。及び（ｃ）ポリメラーゼでオリゴヌクレオチドを延長し、それにより、ポリヌクレオチドを製造する工程。
任意の突然変異誘発の技術は、本開示の様々な実施形態において使用されることがある。確率的又はランダムな突然変異誘発は、予定されていない突然変異を有する一連の子孫分子を得るために、親分子が変異する（修飾される又は変えられる）状況によって例証される。従って、生体外確率的突然変異誘発反応は、例えば、その製造が意図されたものではない、特に予定されていない製造物である。むしろ、得られる変異の正確な性質に関して、従って、生成される製造物に関して、不確定、従ってランダムである。確率的突然変異誘発は、エラープローンＰＣＲ及び確率的シャフリングのような、変異がランダム又は予定されていない方法において示される。変異体形成は、エラープローンＰＣＲのようなエラープローン転写や、プルーフリーディング活性が欠けるポリメラーゼの使用（Ｌｉａｏ（１９９０）Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１を参照されたい）、又は変異株（変異宿主細胞は以下にさらに詳細に議論されており、これは一般的によく知られている）において第一形態の複製によるものである。突然変異誘発因子株は、不整合な修復の機能において欠損される任意の変異体を含むことができる。これらは、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｏｖｒＤ、ｄｃｍ、ｖｓｒ、ｕｍｕＣ、ｕｍｕＤ、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＪなどの変異遺伝子生成物を含む。欠損は、遺伝子突然変異、対立遺伝子交換、微小化合物又は発現されたアンチセンスＲＮＡ又は他の技術によって得られる。欠損は、記述された遺伝子又は任意の有機体における相同遺伝子であることがある。
開始分子から選択的タンパク質をつくるために、現在、広く使われている突然変異誘発の方法は、オリゴヌクレオチド指定突然変異技術、エラープローンポリメラーゼ鎖反応（エラープローンＰＣＲ）及びカセット突然変異誘発であり、そこにおいて、最適化される特定の領域は、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドと置換される。これらの場合において、多くの突然変異部位はもとの配列における特定の部位の周辺で発生する。
オリゴヌクレオチド指定突然変異において、短い配列は、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドと置換される。オリゴヌクレオチド指定突然変異において、ポリヌクレオチドの短い配列は、制限酵素消化を使用する合成ポリヌクレオチドから除かれ、様々な塩基がもとの配列から変更された合成ポリヌクレオチドと置換される。ポリヌクレオチド配列は化学的突然変異誘発によって変更されることもある。化学的突然変異ゲ原は、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、又はギ酸を含む。ヌクレオチド前駆体と類似の他の薬剤は、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般的に、これらの薬剤は、それにより配列を変位させるヌクレオチド前駆体の代わりにＰＣＲ反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのような薬剤の挿入が使用されることもある。ポリヌクレオチド配列のランダムな突然変異誘発は、Ｘ線又は紫外線照射によって得られることがある。一般的に、突然変異誘発されたプラスミドポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ内に導入され、交雑プラスミドのプール又はライブラリとして伝播される。
エラープローンＰＣＲは、長い配列にわたってランダムに点突然変異の低レベルを導入するための低忠実度重合条件を使用する。未知の配列のフラグメントの混合物において、エラープローンＰＣＲは、混合物を突然変異誘発するのに用いられることがある。
カセット突然変異誘発において、単一テンプレートの配列遮断は、典型的にはランダム配列によって（部分的に）置換される。Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ Ｊ Ｆ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ Ｒ Ｔ：タンパク質配列の情報内容のプローブとしての組み合わせカセット突然変異誘発。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１（４８６１）：５３−５７，１９８８。
或いは、非確率的又は非ランダムな遺伝子突然誘発の任意の技術も本開示の様々な実施形態において使用することができる。非確率的突然変異誘発は、１つ以上の予め決定された変異を有する分子を得るために、親分子が変異される（修飾される、又は変化される）状況によって例証される。ある程度の量におけるバックグラウンド製造物の存在が、分子プロセシングの起こる多くの反応において実在し、及びバックグラウンド製造物の存在が、予定されていない製造物を有する突然変異誘発工程の非確率的性質から減じないことはよく理解されている。部位−飽和突然変異誘発及び合成結紮リアセンブリは、遺伝子突然変異誘発技術の例であり、そこにおいて意図された製造物の正確な化学的構造は、予定されたものである。
部位−飽和点突然変異誘発の１つの方法は、米国出願公報２００９／０１３０７１８に記載されており、本明細書に参照により組み込まれている。この方法は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する一連の変性プライマーを提供し、及び変性プライマーに対応する配列を含む子孫ポリヌクレオチドを製造するためのポリメラーゼ伸長を実行する。子孫ポリヌクレオチドは、直接的発達において発現され、及びスクリーニングされる。具体的には、これは、一連の子孫ポリペプチドを製造するための方法であって、工程（ａ）テンプレートポリペプチド配列をエンコードするコドンの複数からそれぞれなるテンプレートポリペプチドのコピーを提供する工程、及び（ｂ）テンプレートポリヌクレオチドの各コドンにおいて、（１）一連の変性プライマーを提供する工程、そこにおいて、各プライマーはテンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する変性コドンからなり、少なくとも１つの隣接配列は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに隣接する配列に相同である、（２）プライマーがテンプレートポリヌクレオチドのコピーにアニール可能な条件を提供する工程、及び（３）テンプレートに沿ったプライマーからのポリメラーゼ伸長反応を実行する工程、の（１）〜（３）の工程を実行し、それによって子孫ポリヌクレオチドを提供し、それぞれがアニールされたプライマーの変性コドンに対応する配列を含み、それによって一連の子孫ポリヌクレオチドを製造する。
部位−飽和突然変異誘発は、核酸の誘導された発達、及び例えば核酸活性及び／又は特異的タンパク質、特に酵素、対象の活性のような結果として生じる対象の活性において発達した核酸を含むクローンのスクリーニングに関するものである。
この技術によって提供された突然変異誘発された分子は、糖、脂質、核酸及び／又はタンパク質組成物を含む生物学的分子を含む、キメラ分子及び点突然変異を有する分子を有することがあり、及び特異的であるが非限定的なこれらの実施例は、抗生物質、抗体、酵素、及びステロイド及び非ステロイドホルモンを含む。
部位飽和突然変異誘発は、１）分子の子孫世代を調製する工程（ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチドからなる分子、及びポリヌクレオチド配列の部分及びポリペプチド配列の部分からなる分子を含む）、これは少なくとも１つの点突然変異、付加、欠失及び／又はキメラ化を１つ以上の祖先又は親世代テンプレートから得るための突然変異誘発である、２）子孫生成分子をスクリーニングする工程 − 好適には、対象の少なくとも１つの性質（例えば、酵素活性における改良、又は安定性の増加、又は新規の化学療法的効果）において、高スループット法を使用する工程、３）親及び／又は子孫世代分子に関する構造及び／又は機能的情報を随意に得る及び／又は一覧にする工程、及び４）任意の工程１）〜３）を随意に繰り返す工程からなる方法を一般的に意味する。
部位飽和突然変異誘発において、生成された（例えば、親ポリヌクレオチドテンプレートから）「コドン部位飽和突然変異誘発」と称されるポリヌクレオチドの子孫世代は、全てのコドン（又は同じアミノ酸をエンコードする変性コドンの全系統）が各コドン位置で表れるように、それぞれが、３つ以上の隣接点突然変異（すなわち、新しいコドンからなる異なる塩基）の少なくとも１組を有する。このポリヌクレオチドの子孫世代に対応する、及びこのポリヌクレオチドの子孫世代によってエンコードされるのは、それぞれ少なくとも１つの単一アミノ酸点突然変異を有する、生成された一連の子孫ポリペプチドである。好適な態様において、生成された「アミノ酸部位飽和突然変異誘発」と称される一例は、ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置でアルファアミノ酸置換を形成する、自然にエンコードされる１９のポリペプチドのそれぞれにおける変異ポリペプチドである。この収量は − 親ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置 − もとのアミノ酸を含む２０の異なる子孫ポリペプチドの全て、又は付加アミノ酸が、２０の自然にエンコードされたアミノ酸の代わりに、又は付加されてのどちらかで使用される場合、潜在的に２１以上の異なる子孫ポリペプチドである。
他の突然変異誘発技術は、組換えを含んで用いられることがあり、より具体的には、部分的相同の領域を含むポリヌクレオチド配列の生体内再集合の方法によって、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを調製するための方法、少なくとも１つのポリヌクレオチドを形成するためのポリヌクレオチドをアセンブリする方法、有用な性質を有するポリペプチドの製造のためにポリヌクレオチドをスクリーニングする方法を含む。
他の態様において、突然変異誘発技術は、分子を組換えるため、及び／又は配列及び相同領域を有する反復又は連続した配列の範囲の煩雑さを減らす縮小した方法を伝達するため、細胞の本来の性質を利用する。
様々な突然変異誘発技術は、活性を強化された生物学的活性交雑ポリペプチドをエンコードする交雑ポリペプチドを生成するための方法を提供するため、単独で、又は組み合わせて用いられることがある。これら及び他の目的を達成することにおいて、本開示の一態様に従って、適当な宿主細胞内にポリペプチドを導入し、交雑ポリヌクレオチドエオ製造するための条件下で宿主細胞を成長させる方法が設けられている。
キメラ遺伝子は、制限酵素によって生成される互換性のある粘着末端を使用する２つのポリヌクレオチドフラグメントを接合することによってつくられる。ここにおいて、各フラグメントは、別々の祖先（親）分子に由来する。他の実施例は、単一部位突然変異誘発されたポリペプチドのためにエンコードする単一子孫ポリヌクレオチドを生成するための親ポリヌクレオチドにおいて、単一コドン位置の突然変異誘発（すなわち、コドン置換、付加、欠失を得るため）である。
さらに、生体内部位特異的組換え系は、生体内組換えのランダムな方法と同様に、遺伝子の交雑の生成、及び相同であるが、プラスミド上で切断された遺伝子間の組換えの生成のために利用される。突然変異誘発はまた、重複拡張及びＰＣＲによっても報告された。
非ランダムな方法は、点突然変異及び／又はキメラ化のより大きい数を得るために使用し、例えば、総合的又は包括的な方法は、テンプレート分子において特異的構造群（例えば、特異的単一アミノ酸位置又は２つ以上のアミノ酸位置からなる配列）に機能的に属するために、及び突然変異の特異的な群化を分類し、比較するために、特定の突然変異の群化において全ての分子種を生成するために用いられる。
これらの、又は他の任意の発達させる方法は、本開示において、１つ以上の親分子から新規な分子の個体群（ライブラリ）を生成する。
一度形成されると、構造物は、発表されたプロトコルに従ってアガロースゲルに分別され、クローニングベクターに挿入され、及び適当な宿主細胞に形質移入されるサイズであることもそうでないこともある。
一部の実施形態において、発達させる工程は、野生型抗体のＦｃ領域が対象となる。これらの実施形態では、得られる条件的活性型抗体において野生型抗体のＦｃ領域は修飾されている。修飾しうるＦｃ領域には、抗体のＦｃ領域（例えば、完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体を含む完全長ＩｇＧ抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体におけるもの）、又はＦｃ領域、若しくはＦｃ領域の一部を含有する融合タンパク質（「免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質」、「Ｆｃ融合タンパク質」、又は「Ｆｃ融合ポリペプチド」と称される）におけるものが含まれる。
抗体の修飾Ｆｃ領域については、米国特許出願公開第２００６／０１０４９８９号明細書を含め、当該技術分野において記載されている。修飾Ｆｃ領域は、対応する非修飾（野生型又は親）Ｆｃ領域の配列と比べて単一アミノ酸置換を有してもよく（本明細書ではＦｃ変異体とも称される）、非修飾Ｆｃ領域を有する対応する野生型又は親並びに当該技術分野において記載されている修飾Ｆｃ領域を有する他の抗体と異なる１つ以上の特性を有してもよい。かかる特性としては、例えば、異なるｐＨ条件下での１つ以上のＦｃ受容体との結合性の増加及び／又は修飾された結合性を挙げることができる。
修飾Ｆｃ領域は、標準的な分子生物学的技術を用いて任意の抗体又はＦｃ融合ポリペプチドに組み込むことができ、かかる修飾された抗体及びＦｃ融合ポリペプチドは全て、本発明に包含されることが意図される。Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域Ｉｇドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域Ｉｇドメイン、及びこれらのドメインのＮ末端側の可動性ヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭに関しては、ＦｃはＪ鎖を含みうる。Ｆｃには、ある種の細胞上に存在する受容体ＦｃＲが結合する。Ｆｃと特定の細胞上に存在するある種のＦｃＲとの間の相互作用の親和性は標的化される細胞傷害性と相関し、且つヒトにおける臨床的有効性は高親和性又は低親和性多形形態のある種のＦｃＲのアロタイプと相関するため、１つ以上のＦｃＲとの結合に最適化されたＦｃ領域を有する抗体又は融合ポリペプチドが、癌細胞のより有効な破壊をもたらしうる。
特定の実施形態において、修飾Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域が組み込まれているポリペプチド又はポリペプチドを含む複合体、例えば、修飾Ｆｃ領域を有するＩｇ重鎖を含む完全長抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体などの複合体に、対応する非修飾（野生型又は親）Ｆｃ領域、又は異なる修飾Ｆｃ領域を組み込む対応するポリペプチド又は複合体、例えば抗体と比較したとき、向上した特性、例えば、１つ以上のＦｃＲとの結合性の増加又は修飾、及び／又は抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加又は修飾を付与する。本発明の一部の実施形態において、修飾Ｆｃ領域は分子に半減期の増加又は低下を付与する。
本発明の一実施形態において、本発明の修飾Ｆｃ領域は１個の置換を含有する。他の実施形態では、本発明の修飾Ｆｃ領域は、２、３、４、５個又はそれを超える置換を組み合わせて含有し、これらの置換は修飾Ｆｃ領域の特性を相加的又は相乗的に増強しうるものである。別の実施形態において、本発明は、修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチドを含み、すなわちそれは、それらの置換のうちの１つを含有するＦｃ融合ポリペプチドである。一実施形態において、融合ポリペプチドの非Ｆｃ領域は標的結合分子を含む。他の実施形態では、本発明は、２、３、４、５、６、１０、１２個、又はそれを超える置換を組み合わせて含有する本発明の修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチドを含む。
修飾Ｆｃ領域を組み込むポリペプチド、タンパク質又は他の複合体、例えばコンジュゲートに加えて、本発明はまた、修飾Ｆｃ領域又は修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び発現ベクター（それらのポリヌクレオチド及び発現ベクターのライブラリを含む）、かかるポリヌクレオチド又は発現ベクターが例えば導入されていて、修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチドを産生する宿主細胞、宿主細胞のライブラリ、及び宿主細胞又は宿主細胞のライブラリの作製、培養又は操作方法も包含する。例えば、本発明は、修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチドが産生され、例えば宿主細胞から分泌されるか、又は他に放出されるように、かかる宿主細胞を培養する工程を含む。修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチド、タンパク質又は他の複合体、及び／又はかかる修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター又は宿主細胞を含む医薬組成物及びキットも包含される。さらに、Ｆｃ受容体結合分析などにおける、又はＡＤＣＣ活性をインビトロ又はインビボで誘導するための、修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチド、タンパク質又はコンジュゲートの使用も本発明に包含される。本発明はまた、薬物療法において使用される本発明のポリペプチド、タンパク質、コンジュゲート、ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び／又は宿主細胞、並びに例えばＡＤＣＣ活性をインビトロ又はインビボで誘導するのに有用な医薬を製造するための本発明のポリペプチド、タンパク質又は他の複合体、ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び／又は宿主細胞の使用も提供する。
「親Ｆｃ」は、本明細書で使用されるとき、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭクラスの抗体の天然に存在するＦｃ領域でありうる。或いは、親Ｆｃの供給源は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、又はＩｇＡ２を含む天然に存在する抗体のＦｃ領域である。修飾する親Ｆｃ領域は、そのＦｃＲ結合親和性及び／又はＦｃＲ結合パターンに関して選択されてもよく、修飾Ｆｃ領域は少なくとも１つのＦｃＲに対する親和性が少なくとも増強されているが、他の点では親Ｆｃ領域と同じＦｃＲ結合パターンを有してもよい。
親Ｆｃ領域は、好ましくは、限定はされないが、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲ、ＦｃＲｎ、及びウイルスＦｃγＲを含む１つ以上のＦｃＲと相互作用するものである。かかる親Ｆｃ領域に由来する修飾Ｆｃ領域は、親Ｆｃ領域と比べて１つ以上のＦｃＲとの相互作用が増強されており、且つＡＤＣＣが増強されているものである。ＡＤＣＣは、概して、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせになる必要がある。ＦｃＲ結合及びＡＤＣＣを検出する方法は、当該技術分野において公知である。
ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性によって定義され、当該技術分野において周知である。
Ｆｃ含有融合物には、有利なＦｃＲ結合性、及び任意選択で有利な薬物動態を有するＦｃ領域が１つ以上の分子に連結されているポリペプチドが含まれる。この連結は、本質的に合成であって、例えば化学的コンジュゲーションを介するか、又は組換え発現を介してもよく、すなわち融合ポリペプチドが形成される。従って、Ｆｃ領域に連結される分子は、Ｆｃ領域の単離又は精製に有用な分子、例えば、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）又はＨｉｓタグなどのタグ、又は他の異種ポリペプチド、例えば、受容体に対するリガンド、受容体の細胞外ドメイン、又はＩｇ重鎖の可変領域、及び／又は別の分子であってもよい。
修飾Ｆｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチド、例えば修飾Ｆｃ領域を有するＩｇ重鎖又は他のＦｃ融合ポリペプチドをコードするベクターが、任意選択で他のベクター、例えばＩｇ軽鎖をコードするベクターと共に宿主細胞に導入されてもよく、又はＩｇ軽鎖などの別のポリペプチドを発現するように修飾された宿主細胞に導入されてもよく、又はコードされたポリペプチドを発現するように、インビトロ転写／転写反応に導入されてもよい。修飾Ｆｃ領域、Ｉｇ重鎖及びＩｇ軽鎖はまた、同じベクターで発現させて、宿主細胞に導入してもよい。発現系によっては、宿主細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列の増幅に適切であるように修飾された従来の栄養培地で培養しうる。得られる修飾Ｆｃ領域を有するポリペプチドは、任意選択で、例えば宿主細胞上清から単離され、１つ以上の活性に関してスクリーニングされる。
一実施形態において、Ｆｃ領域は、宿主細胞などの細胞の表面に、例えば膜貫通ドメインとの融合によってアンカリングしたものでありうる。
ベクターにおけるポリヌクレオチドの発現に好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞である。本目的に好適な原核生物としては、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセスキャンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。糸状菌類又は酵母などの真核微生物も、ポリペプチド変異体をコードするベクターに好適なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｋ．ウィッケルアミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルクシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワンニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及び糸状菌類、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主を使用しうる。
グリコシル化ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。グリコシル化ポリペプチドを発現させるための無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。真核細胞作成、スクリーニング及び産生宿主の例としては、３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞、ＭＤＣＫ、イヌ上皮細胞、Ｈｅｌａヒト上皮細胞、ＰｔＫ１ネズミカンガルー上皮細胞、ＳＰ２／０マウス形質細胞、及びＮＳ０マウスマウス形質細胞、ＨＥＫ ２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＯＳサル腎細胞、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｒ１マウス胚細胞、Ｅ１４．１マウス胚細胞、Ｈ１ヒト胚細胞、Ｈ９ヒト胚細胞、ＰＥＲ Ｃ．６、及びヒト胚細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株及び変異体並びにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞を使用しうる。例えば、ウイルスベクターを使用して、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクション用に、ポリヌクレオチドを導入しうる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。有用な脊椎動物細胞の例としては、哺乳類細胞、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、又はげっ歯類、例えば、ウサギ、ラット、ミンク又はマウス細胞、例えばＣＨＯ細胞が挙げられる。トランスジェニック植物及び動物を発現系として用いてもよく、但しそれらの細胞におけるグリコシル化パターンはヒト糖タンパク質類と異なりうる。一実施形態において、トランスジェニックげっ歯類が発現系として用いられる。また細菌発現が用いられてもよい。細菌で発現させたタンパク質はグリコシル化を欠いているが、原核細胞発現によって生じうる低い安定性及び溶解度などの任意の活性低下を他の改変が補償しうる。
任意選択で、宿主細胞、例えば宿主細胞上清、又はインビトロ転写／翻訳混合物からＦｃ領域又はＦｃ含有ポリペプチドが単離され、組成物を生じる。組成物中の単離ポリペプチドは、例えば、イムノアフィニティー又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はＤＥＡＥなどの陰イオン交換樹脂でのクロマトグラフィ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫安塩析；例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５を使用したゲルろ過；又はリガンドアフィニティークロマトグラフィーによって宿主細胞、宿主細胞上清又は転写／翻訳混合物に見られる少なくとも１つの他の分子から単離されているものである。適用によっては、組成物中の単離ポリペプチドは、存在する優勢種であり（すなわち、モル基準で組成物中において他のどの個別的な種よりも豊富にある）、好ましくは、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）、より好ましくは約８５％、約９０％、約９５％、及び約９９超を占める。単離されたＦｃ領域又はＦｃ含有ポリペプチドは、さらなるインビトロ改変に供されてもよく、例えば、プロテアーゼ、グリコシル化を改変するものなどの分子、又は単離されたＦｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチドを別の分子、例えば標識、限定はされないが、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、／３−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチニル基、アビジン基、又は二次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、糖類、脂質、脂肪、常磁性分子又は音波エミッター、金属、又は合成ポリマーとコンジュゲート（カップリング）するのに有用なものなどの酵素又は化学物質で処理されてもよい。
限定はされないがＦｃＲ結合を含め、Ｆｃ領域を組み込むポリペプチド又は複合体に関連する活性のスクリーニング方法（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２１７，７９７号明細書、及び米国特許第８，０８８，３７６号明細書（全て参照により本明細書に援用される）を参照されたい）は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドのＡＤＣＣ活性を評価するため、様々なエフェクター：標的比、例えばＰＢＭＣ及びＮＫ細胞を使用するか、又は動物モデルにおいて、それぞれインビトロ及び／又はインビボＡＤＣＣ分析を実施しうる。一実施形態において、宿主細胞によって発現されるＦｃ含有ポリペプチドが、インビトロ及び／又はインビボでのＦｃＲ受容体結合親和性又は活性及び／又はインビトロ及び／又はインビボでのＡＤＣＣ活性の増強に関してスクリーニングされる。一実施形態において、修飾Ｆｃ領域を含むＦｃ含有ポリペプチドによるＦｃＲの結合性は、対応する非修飾Ｆｃ領域を含むポリペプチドによるその受容体の結合性より高い。
従って、野生型若しくは親Ｆｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチド（この野生型又は親Ｆｃ領域は、好ましくはＡＤＣＣを誘発し、且つ任意選択でヒトＦｃ領域、例えば、天然配列ヒトＦｃ領域ヒトＩｇＧ配列である）に、本明細書に記載されるアミノ酸配列修飾を導入することにより、より良好な親和性でＦｃＲに結合し、且つヒトエフェクター細胞の存在下で野生型又は親Ｆｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチドと比べてより有効にＡＤＣＣを媒介する修飾Ｆｃ領域が得られる。可溶性ＦｃＲ、例えば組換え可溶性ヒトＣＤ１６及び組換え可溶性ヒトＣＤ３２を１つ以上の異なる修飾Ｆｃ領域と並行して接触させてもよく、非修飾Ｆｃ領域と比べてヒトＣＤｌ６との結合性を増強するがヒトＣＤ３２との結合性は増強しない１つ以上の置換を有する修飾Ｆｃ領域が同定される。これらの置換は、結合性を増強する他の置換と組み合わせてもよい。Ｆｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチドにおける置換の組み合わせは、相乗的に増強された特性を有するコンビナトリアルに修飾されたＦｃ領域、又はコンビナトリアルに修飾されたＦｃ領域含有ポリペプチドをもたらしうる。
望ましい特性を有する修飾Ｆｃ領域を含むポリペプチド、例えば修飾Ｆｃ領域を含む抗体、従って対応するポリヌクレオチド配列を同定する他の方法が、単独で、又は上記に記載する方法と組み合わせて用いられてもよく、そうした方法には、好ましくは活性に関してスクリーニングされる分子、例えばＦｃ領域を含む抗体のコンテクストにおける修飾Ｆｃ領域のモデル化、例えば３Ｄモデル化を使用して、特定の特徴を有するＦｃ領域を選択することが含まれる。モデル化によってスクリーニングしうる特徴としては、限定はされないが、ＦｃＲ結合部位近傍の特定の角度、ヒンジ構造、及び分子鎖内及び分子鎖間相互作用、例えば、疎水性相互作用を促進し、若しくは破壊するか、又は特定の領域における高次構造を安定化させる置換が挙げられる。従って、少なくとも１つ以上の置換された位置を有するＦｃ領域含有ポリペプチドの３Ｄモデルを用いて、宿主細胞で発現させるためのポリヌクレオチドに導入する置換の組み合わせを同定しうる。
Ｆｃ変異体（異種ポリペプチドに導入されるか、例えば、細胞表面受容体に対するリガンド、例えばＣＴＬＲ−４リガンド又は抗体の重鎖とのＦｃ融合物に導入されるか、又は目的の分子にコンジュゲートされるか否かに関わらず）、並びにそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド及び宿主細胞は、任意選択で１つ以上の他の薬剤、例えば治療用又は研究用試薬との組み合わせで、種々の方法、例えば、スクリーニング方法、予防方法、治療方法、獣医学方法及び農学方法において有用である。１つ以上の他の薬剤には、非修飾Ｆｃ領域を含むものを含め、他のＦｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチドが含まれる。一実施形態では、Ｆｃ変異体が抗体又は他のＦｃ融合ポリペプチドに組み込まれ、及びその抗体又はＦｃ融合ポリペプチドが、任意選択で１つ以上の他の有用な組成物と併せて、特定の細胞の標的化に用いられる。
一実施形態において、Ｆｃ変異体含有抗体又はその抗原結合フラグメントは、標的抗原を担持する標的細胞を標的化し、及び任意選択で死滅させる。別の実施形態において、Ｆｃ変異体含有抗体又はその抗原結合フラグメントは、標的抗原を担持する細胞を標的化して活性化させ、例えばそれにより別の抗原、例えばウイルス抗原又は細胞性抗原の発現を増加させる。一実施形態において、Ｆｃ変異体又はＦｃ変異体を組み込むポリペプチドを使用して、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む非ヒトにおける様々な病態又は疾患を予防し、阻害し、又は治療しうる。例えば、修飾Ｆｃ領域を含有する抗体が、疾患に罹るリスクがある、例えば疾患に罹り易いヒト又は非ヒト動物に疾患の発症前に投与され、それによりその疾患の１つ以上の症状が予防又は阻害されうる。Ｆｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチド、又はそのコンジュゲートは、疾患を阻害又は治療するためヒト又は非ヒト動物における疾患の臨床症状が現れた後に投与されてもよい。一実施形態では、抗体又はＦｃ融合ポリペプチドを含む医薬組成物が、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症疾患、神経疾患、又は新生物疾患、例えば癌を有するヒト又は非ヒト動物に投与される。
Ｆｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチドは、単独で、又は１つ以上の他の治療剤、限定はされないが、細胞傷害剤、例えば、化学療法剤、サイトカイン、増殖抑制剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害薬、抗血管新生剤、心保護薬、又は他の治療剤と組み合わせて、意図される目的に有効な量で投与されてもよい。熟練した医師は、Ｆｃ領域又はＦｃ領域含有ポリペプチドを含む治療剤の適切な１つ以上の用量を実験的に決定することができ、従って、１つ以上の他の治療レジメンと同時に投与されてもよい。例えば、抗体又はＦｃ融合ポリペプチドは、化学療法薬又は他の療法薬、例えば、抗血管新生剤、サイトカイン、放射性同位元素療法薬、又は化学療法薬と他の療法薬との両方など、他の薬剤と共に患者に投与されてもよい。一実施形態において、抗体又はＦｃ融合物は、Ｆｃ変異体を含んでも、又は含まなくてもよい１つ以上の他の抗体又はＦｃ融合物と併せて投与されてもよい。一実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、化学療法剤、すなわち、癌の治療において有用な化学的化合物と共に投与される。化学療法剤又は他の細胞傷害剤はプロドラッグとして投与されてもよく、すなわちそれは、薬物と比較して細胞に対する細胞毒性が低く、且つ薬物に変換されることが可能な形態の薬学的に活性な物質である。
任意選択で１つ以上の他の薬剤と共に製剤化された、Ｆｃ領域、Ｆｃ融合ポリペプチド、Ｆｃ領域を有する抗体、又はそれらのコンジュゲートを有する医薬組成物も企図される。抗体、Ｆｃ領域、又はＦｃ領域含有ポリペプチド、又はコンジュゲートの製剤は、所望の程度の純度を有する抗体、Ｆｃ領域、又はＦｃ領域含有ポリペプチド、又はコンジュゲートを、任意選択の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵用に調製される。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、緩衝剤、例えば抗酸化剤；アルキルパラベン；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；親水性ポリマー；アミノ酸；単糖類；及び他の炭水化物；キレート剤；充填剤；結合剤；添加剤；着色剤；塩形成対イオン；金属錯体；及び／又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。他の製剤としては、当該技術分野において公知の方法により調製される脂質又は界面活性剤ベースの製剤、及びマイクロ粒子又はナノ粒子ベースの製剤が、徐放剤形製剤を含め、挙げられる。
製剤中のＦｃ領域、抗体又は他のＦｃ領域含有ポリペプチドの濃度は、約０．１から１００重量％まで異なりうる。好ましい実施形態において、Ｆｃ領域、抗体又はＦｃ融合ポリペプチドの濃度は０．００１〜２．０Ｍの範囲である。患者を治療するため、Ｆｃ領域、又は抗体又は他のＦｃ領域含有ポリペプチド、及びそのコンジュゲートの有効用量が投与されうる。
「治療有効用量」とは、本明細書では、その投与目的の効果を生じさせる用量を意味する。投薬量は０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれを超える範囲、例えば０．１、１、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、１〜３０ｍｇ／ｋｇが好ましいが、他の投薬量が有益な結果をもたらしうる。投与量は、特定の病態又は疾患が予防され、治療されるように選択される。Ｆｃ領域、又は抗体又は他のＦｃ領域含有ポリペプチド、及びそのコンジュゲートの投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療か、それとも予防か、及び当業者に公知の他の要因に応じて連続的であっても、又は間欠的であってもよい。Ｆｃ領域、又は抗体又は他のＦｃ領域含有ポリペプチド、及びそのコンジュゲートの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、又は一連の間隔を置いた投与であってもよい。局所投与及び全身投与の両方が企図される。
好ましくは滅菌水溶液の形態の、Ｆｃ領域、抗体又は他のＦｃ含有ポリペプチド及びコンジュゲートを含む医薬組成物の投与は、限定はされないが、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、肺内、吸入可能技術、経腟、非経口、経直腸、及び経眼を含む種々の方法で行われうる。場合によっては、例えば創傷、炎症等の治療に、抗体又はＦｃ融合物は溶液又はスプレーとして直接適用されてもよい。
本発明の発達させる工程に用いうる技術について記載している幾つかの文献として、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２００１）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９９１）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４４３１（１９８５）Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８（１９８７）；Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；Ｖａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：７２３（１９８９）Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）；Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，７：１３（１９９４）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６：５７９（１９９４）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２（１９９０）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３＿：５５６４（１９９３）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６９：５１７１−５１８０（２００２）；Ｙｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８２：７６６３−７６７１（２００９）；Ｚａｌｅｖｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１６０１（２０１０年１月１７日にオンライン刊行）；及びＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ２８１，Ｎｕｍ ３３，２３５１５−２３５２４（２００６）（これらの開示は本明細書によって全体として参照により援用される）が挙げられる。
発達分子の発現
一旦変異分子のライブラリが生成されると、ＤＮＡは通常の分子生物学的技術を使用して発現されることができる。従って、タンパク質発現は、様々な周知の方法を使用して管理されることができる。
例えば、野生型遺伝子は本願明細書において示されるような任意の種々のランダム法又は非ランダム法を使用して発達されることができる。変異ＤＮＡ分子はその後消化され、標準の分子生物学的技術を用いてプラスミドＤＮＡ等のベクターＤＮＡにライゲーションされる。個々の変異体を含むベクターＤＮＡは、標準プロトコルを使用して細菌又は他の細胞に形質転換される。これは、ハイスループットな発現及びスクリーニングのための９６穴トレイ等のマルチウェルトレイの個々のウェルにおいて行われうる。この方法は、変異分子ごとに繰り返される。
このようにして選抜され単離されたポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は、遺伝子組換え及び／又は減少的再集合を促進することができる任意の細胞である。選抜されたポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な制御配列を含むベクターに既にあるものである。宿主細胞は、哺乳細胞等の高等真核細胞であり、又は酵母細胞等の下等真核細胞であっても良く、又は好ましくは宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞であっても良い。宿主細胞へのコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって遂行されることができる（例えば、Ｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９８６，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８３：５３７２−５３７６）。
使用可能な発現ベクターの代表例として、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ｆｏｕｌ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ、仮性狂犬病、及びＳＶ４０派生物）ｐｌに基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び特定の目的宿主に特異的な任意の他のベクター（例えば桿菌、アスペルギルス、及び酵母）が言及されうる。従って、例えば、ＤＮＡは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含まれうる。このようなベクターは、染色体性のＤＮＡ配列、非染色体性のＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含む。多数の適切なベクターは当業者に周知であり、市販されている。例として以下のベクターを挙げる。細菌性：ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、ラムダＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ρＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核性：ｐＸＴｌ、ρＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、それらが宿主において複製可能であり且つ生存可能である限り、他のいかなるプラスミドも又は他のベクターも使用可能である。低コピー数ベクター又は高コピー数ベクターが、本開示において使用されることができる。
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ＲＮＡ合成を導くための適切な発現制御配列（プロモーター）と操作可能に連結される。特定の名付けられた細菌プロモーターは、ｌａｄ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ、及びｔｒｐを含む。真核生物プロモーターは、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−１を含む。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者の水準の範囲内にある。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含む。このベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含んでも良い。プロモーター領域は、選択可能なマーカーを有するクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベクター、又は他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択されることができる。加えて、発現ベクターは、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性等、又は大腸菌におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性等の、形質転換された宿主細胞の選抜のための表現型の特徴を提供するために、好ましくは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
従って、本願発明の他の態様においては、新規なポリヌクレオチドは、減少的再集合の方法によって生成されることができる。方法は、連続的な配列（オリジナルのコード配列配列）、適切なベクターへのそれらの挿入、及び適切な宿主細胞へのその後のそれらの導入を含むコンストラクトの生成を含む。個々の分子同一性の再集合は、相同領域を有するコンストラクトにおける連続的な配列間での、又は擬似繰り返し単位間での組み合わせ方法によって発生する。再集合方法は、複雑さ及び反復配列の範囲を再結合させ及び／又は減少させ、新しい分子種の生成をもたらす。様々な処理を、再集合の割合を増強させるために適用することができる。これらは、紫外線処理又はＤＮＡ損害性化学薬品、及び／又は増強した水準の「遺伝的不安定性」を示す宿主細胞株の使用を含むことができる。従って、再集合方法は、それら自身の発達を導くために、相同組換え又は準反復配列の自然の特性を含むことができる。
一態様において、宿主生物又は細胞は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、又は真核生物からなるものである。本開示の他の態様において、グラム陰性細菌は、大腸菌又は蛍光菌からなるものである。本開示の他の態様において、グラム陽性細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉｖｅｒｓａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなるものである。本開示の他の態様において、真核生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｌｙｍｏｒｐｈａ又は黒色麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からなるものである。適切な宿主の代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はボーズ黒色腫（Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）等の動物細胞；アデノウイルス；及び植物細胞が言及されうる。適切な宿主の選択は、本願明細書における教示から当業者の範囲内であると考えられる。
組換えタンパク質を発現するために使用されうる様々な哺乳細胞培養系に特に関連して、哺乳類の発現系の例は、「ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ＳＶ４０ ｍｕｔａｎｔｓ」（Ｇｌｕｚｍａｎ、１９８１）に記載されるサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７株、及びＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株等の相性の良いベクターを発現することができる他の細胞株を含む。哺乳類の発現ベクターは複製開始点、適切なプロモーター、及びエンハンサー、及び任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスのドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、及び５'隣接非転写配列をも含むであろう。ＳＶ４０スプライシングに由来するＤＮＡ配列、及びポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝因子を提供するために使用されることができる。
細胞はその後増殖し、「減少的再集合」は達成される。減少的再集合方法の割合は、必要に応じて、ＤＮＡ損傷の導入によって刺激されうる。インビボでの再集合は「遺伝子組換え」とまとめて呼ばれる「分子間の」方法に向けられ、これは細菌においては、「ＲｅｃＡ依存性」の現象として通常観察される。本開示は、配列を組換え且つ再集合させるための宿主細胞の遺伝子組換え方法、又は欠損によって細胞における準反復配列の複雑性を減少させるための縮小方法を調節する細胞の能力に依存することができる。「縮小再集合」のこの方法は、「分子内の」、ＲｅｃＡ非依存性の方法によって生じる。最終結果は、全ての可能な組み合わせへの分子の再集合である。
目的のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターを活性化させ、形質転換細胞を選択し、又は遺伝子を増幅させるのに適切なように改変された従来の栄養培地で培養されることができる。この培養条件（例えば温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主細胞と共に以前使用されたものであり、また当業者にとって明らかである。
タンパク質発現は様々な周知の方法によって誘導されることができ、多くの遺伝系がタンパク質発現の誘導のために公表されている。例えば、適切な系については、誘導剤品の追加によってタンパク質発現が誘導される。細胞はその後、遠心分離によってペレットにされ、上澄みが取り除かれる。ペリプラズムタンパク質は、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ及びリソチームを有する細胞を培養することによって高められうる。遠心分離後、新規なタンパク質を含む上澄みは、アッセイ前に新しいマルチウェルトレイに移され、保存される。
細胞は一般的には遠心分離によって採取され、物理的又は化学的手段によって分離され、及び得られたクルードの抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現のために使用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械分離、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の都合のよい方法によって分離されることができる。このような方法は当業者に周知である。発現したポリペプチド又はその断片は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィを含む方法によって、組換え細胞培養物から回収され、精製されうる。タンパク質のリフォールディング過程が、必要に応じて、ポリペプチドの構造を仕上げる際に用いられることができる。必要に応じて、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製過程のために使用されることができる。
所望の活性を有すると特定されるクローンは、その後シーケンスされることができ、増強した活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を特定する。
このようなライブラリから特定されるポリペプチドが、治療、診断、研究、及び関連する目的のために使用されることができ、並びに／又はシャッフリング及び／若しくは選択の１つ以上の追加的なサイクルにさらされることができる。本開示は、少なくとも１０アミノ酸の長さである条件的活性型生物学的タンパク質の断片を提供するものであり、その断片は活性を有するものである。
本開示は、酵素活性を有するコドン最適化ポリペプチド又はその断片を提供するものであり、コドンの使用は特定の生物又は細胞のために最適化される。Ｎａｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｅｒｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ”．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，６９（１２）：７２５０−３には、マウス系におけるコドン最適化が記載される。Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｑｕｉｓｔａｔｉｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２４（１）：１８−２４には、酵母系におけるコドン最適化が記載される。Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００ Ｄｅｃ．１９，３９（５０）：１５３９９−４０９には、大腸菌におけるコドン最適化が記載される。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ａｔ ｔｈｅ ５'ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０００ Ｎｏｖ．２０（２）：２５２−６４には、大腸菌においてコドンの使用がどのように分泌に影響するかが記載される。
条件的活性型生物学的タンパク質の発達は、都合のよいハイスループットスクリーニング又は選択過程の利用によって補助されることができる。
一旦特定されると、本開示のポリペプチド及びペプチドは、合成されたもの、又は組換えによって生成されたポリペプチドでありえる。ペプチド及びタンパク質は、インビトロで又はインビボで、組換え技術によって発現されることができる。本開示のペプチド及びポリペプチドは、公知技術の任意の方法を使用して作製され、且つ単離されることができる。本開示のポリペプチド及びペプチドはまた、全体又は一部において、公知技術の化学的方法を使用して合成されることができる。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０）“Ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３；Ｈｏｒｎ（１９８０），“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｐａｒｔ ＩＩ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２２ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＩＰ）１”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２；Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９５）Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａを参照。例えば、ペプチド合成は様々な固相法を使用して実行されることができ（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ（１９９５）“Ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ａ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９９７）“Ｃｏｎｃｅｐｔ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３−１３）、例えば、製造者によって提供される指示書に従ってＡＢＩ ４３ ＩＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用することにより、オートメーション化した合成を成し遂げることができる。
本開示のペプチド及びポリペプチドは、グリコシル化されることもできる。グリコシル化は、化学的に又は細胞生合成機構によってポスト翻訳的に加えられることができ、後者は周知のグリコシル化のモチーフの使用を組み込むものであり、それは配列固有でありえるか、又はペプチドとして加えられることができるか、又は核酸コード配列に加えられうる。グリコシル化はＯ結合型又はＮ結合型であることができる。
本開示のペプチド及びポリペプチドは、上術の通り、全ての「模倣の」及び「ペプチド模倣の」形態を含む。用語「模倣の」及び「ペプチド模倣の」は、実質的に本開示のポリペプチドと同じ構造及び／又は機能的特徴を有する合成化学化合物について言及するものである。模倣体は、合成の、非天然のアミノ酸類似体から完全になることができ、又は部分的に天然のペプチドアミノ酸のキメラ分子、及び部分的に非天然のアミノ酸類似体である。模倣体の構造及び／若しくは活性を実質的には変えない限り、模倣のものは天然アミノ酸の保存的置換を幾らでも組み込むことができる。保存的変形である本開示のポリペプチドと同様に、ルーチン試験は、模倣体が本開示の範囲内かどうか、すなわち、その構造及び／又は機能が実質的に変えられていないかどうかを決定するだろう。
本開示のポリペプチド模倣体組成物は、非天然の構造成分の任意の組み合わせを含むことができる。他の態様において、本開示の模倣体組成物は、以下の３つの構造グループの１つ又は全てを含む。ａ）天然のアミド結合「ペプチド結合」）以外の残基結合グループ。ｂ）自然発生的なアミノ酸残基の代わりの非天然の結合。又は、ｃ）二次構造模倣を誘導する、すなわち、二次構造（例えば、βターン、γターン、βシート、αヘリックスコンフォメーション等）を誘導し、又は安定化させるための残基。例えば、本開示のポリペプチドは、その残基の全て又は一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段で結合される際に、模倣体として特徴付けられることができる。個々のペプチド模倣の残基は、ペプチド結合、他の化学結合、又はカップリング手段（例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又はＮ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等）で結合されることができる。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代替手段でありえる連結基は、例えば、ケトメチレン（例えば、−−Ｃ（．ｄｂｄ．Ｏ）−−ＣＨ．ｓｕｂ．２−−ｆｏｒ−−Ｃ（．ｄｂｄ．Ｏ）−−ＮＨ−−）、アミノメチレン（ＣＨ．ｓｕｂ．２−−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ）、エーテル（ＣＨ．ｓｕｂ．２−−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ．ｓｕｂ．２−−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ．ｓｕｂ．４−−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステルを含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３）ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ ２６７−３５７，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
本開示のポリペプチドは、自然発生的なアミノ酸残基の代わりに全て又は一部の非天然の残基を含むことによって、模倣体として特徴付けられることもできる。非天然の残基は、科学文献及び特許文献によく記載されている。次に、天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な非天然の組成物の少ない例示及びガイドラインを以下に説明する。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えばＤ−又はＬ−ナフチルアラニン；Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−Ｌ−２チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−１、−２、３−又は４−ピレニルアラニン；Ｄ−又はＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフロロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフロロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；及びＤ−又はＬ−アルキルアミンによって置換されることによって生成されることができ、ここでアルキルは、非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソペンチル又は非酸性アミノ酸であるありうる。非天然アミノ酸の芳香環は、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル及びピリジル芳香環を含む。
酸性アミノ酸の模倣体は、負電荷；（ホスホノ）アラニン；硫酸化スレオニンを維持すると共に、例えば非カルボン酸塩アミノ酸によって置換されることによって生成されうる。カルボキシル側基（例えば、アスパルチル又はグルタミル）はまた、例えば１−シクロヘキシル−３（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミド、又は１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミド等のカルボジイミド（Ｒ'−−Ｎ−−Ｃ−−Ｎ−−Ｒ'）との反応によって、選択的に修飾されることもできる。アスパルチル又はグルタミルは、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル及びグルタミニル残基に変換されることもできる。塩基性アミノ酸の模倣体は、例えば、（リシン及びアルギニンに加えて）アミノ酸オルニチン、シトルリン、又は（グアニジノ）−酢酸、又は（グアニジノ）アルキル−酢酸によって置換されることによって生成されることができ、ここでアルキルは上記の通りである。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ部分を含む）は、アスパラギン又はグルタミンに置換されることができる。アスパラギニル及びグルタミニル残基は、対応するアスパルチル又はグルタミル残基に非アミノ化されることができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルを、好ましくはアルカリ条件下で、例えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、又はニンヒドリンを含む、例えば１つ以上の従来の試薬と反応させることによって生成されることができる。チロシン残基模倣体は、チロシルを、例えば芳香族のジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることによって生成させることができる。Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンは、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために用いられることができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を、例えば、２−クロロ酢酸酸又は塩化アセトアミド、及び対応するアミン等のα−ハロ酢酸塩と反応させ、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与えることによって生成させることができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を、例えば、ブロモ−トリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸；塩化アセチルリン酸塩、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル２−ピリジルジスルフィド；ｐ−クロロ第二水銀安息香酸塩；２−クロロメルクリ−４ニトロフェノール；又はクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによって生成させることができる。リシン模倣体は、リシニルを、例えば、コハク酸又は他のカルボン酸酸無水物と反応させることによって生成させることができ、（且つアミノ末端残基を変更させることができる）。リシン及び他のα−アミノ含有残基模倣体は、メチルピコリンアミド塩、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロ−ベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４，ペンタンジオン、及びグリオキシル酸とのトランスアミダーゼ触媒反応等のイミドエステルとの反応によって生成されることができる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成されることができる。プロリンの模倣体は、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−又は４−ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３−又は４−メチルプロリン、又は３，３−ジメチルプロリンを含む。ヒスチジン残基模倣体は、ヒスチジルを、例えば、ジエチルプロカルボン酸塩又はパラ−ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成させることができる。他の模倣体は、例えば、プロリン及びリシンのヒドロキシル化；セリル又はトレオニル残基の水酸基のリン酸化；リシン、アルギニン及びヒスチジンのα−アミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基又はＮ−メチルアミノ酸での置換のメチル化；又はＣ末端カルボキシル基のアミド化によって生成されるものを含む。
本開示のポリペプチド（例えばアミノ酸）の残基は、逆のキラリティのアミノ酸（又はペプチド模倣体残基）によって置き換えられることもできる。従って、Ｌ−構造（化学物質の構造によってＲ又はＳとも呼ばれる）において自然発生している任意のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸と呼ばれ、同じくＲ−又はＳ−形と呼ばれる逆のキラリティ以外の、同じ化学構造タイプ又はペプチド模倣体のアミノ酸によって置き換えられることができる。
本発明の模倣ポリペプチドは、任意のタンパク質化学合成技術を用いて合成しうる。典型的なインビトロタンパク質合成プロセスでは、ペプチドとアミノ酸との間のペプチド結合の形成によってペプチドの長さを１アミノずつ伸長させる。ペプチド結合の形成はライゲーション反応を用いて行い、これには天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を用いうる。従って、このように非天然アミノ酸を本発明のポリペプチドに導入して、模倣体を作製することができる。
条件的活性型生物学的タンパク質はまた、全体として、又は部分的に、当該技術分野において周知の化学的タンパク質合成方法を用いて合成することもできる。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０）“Ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３；Ｈｏｒｎ（１９８０），“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｐａｒｔ ＩＩ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２２ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＩＰ）1”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２；Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”（１９９５），Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａを参照されたい。例えば、ペプチド合成は様々な固相技術を用いて実施することができ（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ（１９９５）“Ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ａ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９９７）“Ｃｏｎｃｅｐｔ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３−１３を参照されたい）、及び例えば製造者によって提供される指示に従いＡＢＩ ４３ ＩＡペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動化された合成を実現しうる。
固相化学的ペプチド合成方法もポリペプチド又はそのフラグメントの合成に用いることができる。かかる方法は１９６０年代初頭から当該技術分野において公知となっており（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，“Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９−２１５４，１９６３）（また、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１．，ｐｐ．１１−１２）も参照されたい）、最近では、市販の実験用ペプチド設計及び合成キット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に用いられている。かかる市販の実験用キットは、概してＨ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｔｏ ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：３９９８（１９８４）の教示を利用しており、全てが単一のプレートに結合した複数の「ロッド」又は「ピン」の先端にペプチドを合成することを提供する。
本発明の模倣ポリペプチドはまた、組換え技術によって作製されてもよく、組換え技術は、ポリペプチドのコード配列を発現ベクターに挿入し、且つ真核細胞産生宿主のタンパク質翻訳機構を利用することによってポリペプチドを産生する。タンパク質翻訳機構はコード配列のコドンを読み取り、ｔＲＮＡを使用してコードされたアミノ酸を繰り込み、ポリペプチドを産生する。タンパク質翻訳機構を改変して組換えポリペプチドへの非天然アミノ酸の導入を可能にするために用いうる幾つかの技術がある。立証済みの手法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸の認識に依存し、このシンテターゼは一般に、タンパク質翻訳の忠実度を保証するため高い選択性を必要とする。非天然アミノ酸がｔＲＮＡに連結し、次にはｔＲＮＡが非天然アミノ酸をポリペプチドへの組み込みのためタンパク質翻訳機構に持ち込みうるように、これらのシンテターゼを操作して基質特異性を緩和しうる。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）においてＡｌａ294をＧｌｙに置き換えると、基質結合ポケットのサイズが増加し、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡPheのアシル化がもたらされることが分かった。Ｍ．Ｉｂｂａ，Ｐ．Ｋａｓｔ ａｎｄ Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７１０７（１９９４）を参照されたい。この変異ＰｈｅＲＳを担持する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は、フェニルアラニンに代えてｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能にする。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ ａｎｄ Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐ．Ｋａｓｔ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照されたい。同様に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位近傍における点突然変異Ｐｈｅｌ３０Ｓｅｒが、チロシンより効率的なアザチロシンの組み込みを可能にすることが示された。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，Ｔ．Ｉｗａｍａ，Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ，Ｋ．Ｔａｋａｋｕ，Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｄ．Ｓｏｌｌ ａｎｄ Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照されたい。
最初の方法は、センスコドンを割り当てし直す工程を含み、これは少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを操作する。この酵素は、通常、タンパク質合成のためタンパク質翻訳機構に輸送されるようにｔＲＮＡに天然アミノ酸を付加する。しかしながら、特定のｔＲＮＡに対するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、それが非天然アミノ酸を非特異的にｔＲＮＡにチャージしてｔＲＮＡを活性化するあるレベルの混乱を有しうるように改変しうる。活性化されたｔＲＮＡは、非天然アミノ酸をタンパク質翻訳機構（例えばリボソーム）に運び、コード配列のコドンがその特定のｔＲＮＡを要求するペプチドに非天然アミノ酸を付加しうる。換言すれば、その特定のｔＲＮＡのコドンが非天然アミノ酸に割り当てし直されている。組換えポリペプチドは、１９個の天然アミノ酸と少なくとも１個の非天然アミノ酸とを含む。ポリペプチドにおける１個の天然アミノ酸が少なくとも１個の非天然アミノ酸に置き換えられている。非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換の成功は、その天然アミノ酸の生合成が欠損した栄養要求性の発現宿主の使用に依存する。かかる宿主を用いると、割り当てし直されたセンスコドンに関する天然アミノ酸からの競合が制限され、標的タンパク質の組み込み効率及び収率が向上する。多くのアミノ酸のコドン（Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ等を含む）が割り当てし直されており、６０を超える非天然アミノ酸がこの方法によってタンパク質に組み込まれている。Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７３，ｐａｇｅｓ １４７−１７６，２００４；Ｖｏｌｏｓｈｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ ６５−８０，２０１０（両方ともに参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
この方法の主な制約は、非天然アミノ酸がポリペプチド配列全体にわたって天然アミノ酸を置き換えることであり、かかる大域的置換が望ましくない場合には、これによってその適用が限られたものとなりうる。１つの解決法は、置換が望ましくない部位を他の天然アミノ酸に突然変異させて、所望の部位のみを非天然アミノ酸のために取っておくことである。この修飾により、この方法は非天然アミノ酸を任意の所望の部位に部位特異的に導入して模倣ポリペプチドを作製しうる。
模倣組換えポリペプチドを作製する別の方法は、ゆらぎコドンを使用することによる。ゆらぎコドンとは、ｔＲＮＡによって非古典的ワトソン・クリック型塩基対合を介して解読されるコドンを指す。非古典的（又はゆらぎ）対合は、「ゆらぎ仮説」において提唱される通り、ｔＲＮＡの１番目のアンチコドン塩基（これはコドントリプレットに対して３番目の塩基と対合する）の修飾によって可能となる。例えば、多くの生物がＰｈｅの２つのコドン：ＵＵＵ及びＵＵＣを解読するため唯１つのｔＲＮＡを有する。結果として、ｔＲＮＡ上のＧＡＡアンチコドンがワトソン・クリック型塩基対合でＵＵＣコドンに結合し、「ゆらぎ」塩基対合でＵＵＵコドンに結合する。
コドンとアンチコドンとの間のゆらぎ対合のため、１つのｔＲＮＡが幾つかのコドンと対合し、所与のコドンが２つ以上のｔＲＮＡと対合しうる。この特性を利用して、ゆらぎコドンを非天然アミノ酸に割り当てて、天然アミノ酸と少なくとも１つの非天然アミノ酸とを含む組換えタンパク質を生成しうる。例えば、Ｐｈｅは、通常、２つのコドンＵＵＣ及びＵＵＵによってコードされ、両方のコドンとも単一のｔＲＮＡによって認識される。アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼと、非天然アミノ酸に対して特異性を有し、且つ「ＡＡＡ」アンチコドンを含有するｔＲＮＡとの直交ペアを発現させることにより、ＵＵＵコドンでの非天然アミノ酸の効率的な導入を実現しうる（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．、“Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２５，ｐａｇｅｓ ７５１２−７５１３，２００３、参照により本明細書に援用される）。この方法では、Ｐｈｅが本質的に定量的にＵＵＣコドンに割り当てられ、及び非天然アミノ酸がＵＵＵゆらぎコドンに割り当てられうる。さらに、非天然アミノ酸の複数のコピーをポリペプチドに部位特異的に導入することができる。
組換え模倣ポリペプチドを生成するための第三の方法は、バイアスを有するコドンを使用することによる。好ましいコドンは生物間で異なり、さらには同じ生物の異なる組織又は細胞型の間でも異なる。ｔＲＮＡ種の細胞内容が、タンパク質の合成速度及び量の決定要因である。結果として、異種宿主細胞における組換えタンパク質産生は、多くの場合に好ましい宿主細胞コドンバイアスに適合するようにコドンが最適化される（種々の生物のコドン使用データベース及び所与の遺伝子のコドン分析については、以下を参照することができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）。
バイアスを有するコドン使用は、組換えポリペプチドに非天然アミノ酸を導入するための別の方法をもたらす。例えば、Ａｒｇの６個の縮重コドンのうち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてはＡＧＧ及びＡＧＡは稀にのみ使用される。アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼとＡＧＧコドンと対合するｔＲＮＡとの直交ペアを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主に導入すると、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに連結することが可能になりうる。従って、非天然アミノ酸が連結しているｔＲＮＡは、通常ＡｒｇがコードされうるコドンＡＧＧに非天然アミノ酸を持ち込むことができる。この方法は、インビトロ無細胞バイアス系で実現可能であることが分かっており、ここではＡＧＧコドンと対合するｔＲＮＡに連結した化学合成非天然アミノ酸がＡＧＧコドンに組み込まれた（Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３４４，ｐａｇｅｓ １７１−１７４，１９９４）。この方法は、ｔＲＮＡに非天然直交を連結するようにアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを操作しうる場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ベースの発現系に適合させることができる。
同様に、コドンバイアスを呈する哺乳類細胞においてバイアスコドンを非天然アミノ酸に割り当てうる。例えば、Ｆｒａｚｅｒ及び共同研究者らは、種々の哺乳類細胞におけるヒトパピローマウイルス遺伝子発現の研究を通じて、パピローマウイルスタンパク質発現がコドン使用及びｔＲＮＡの利用可能性によって決まることを見出している。分化及び未分化ケラチノサイト間にｔＲＮＡプールの実質的な違いが発見されており（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｃｏｄｏｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２５，ｐａｇｅｓ ８６４３−８６５５，２００５）、及びそれらのｔＲＮＡに観察されたバイアスが、パピローマウイルスが専ら上皮細胞で複製する理由でありうる。例えば、ＣＨＯ及びＣｏｓ１細胞においては、ＴＣＧがバイアスであり、従って非天然アミノ酸に割り当てうるものと見られる。
コドンバイアス現象は種々の真核生物に広範に存在するため、かかるコドンを利用した非天然アミノ酸の部位特異的組み込みは、多くの真核細胞産生宿主において応用しうる。制約があるとすれば、産生宿主におけるバイアスを有するコドンと対合しうるｔＲＮＡに非天然直交を連結するためのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの操作でありうる。
模倣ポリペプチドを作製する第四の方法は、終止コドンの抑制による。概して、タンパク質翻訳は、タンパク質終結因子（ＲＦ）の作用によって３つの終止コドン（ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）及びＵＧＡ（オパール）によってコードされる）のうちの１つで終結する。しかしながら、あるアミノ酸を有する終止コドンの偶発的なリードスルーが様々な種において天然で起こることが観察されている。この抑制は、ｔＲＮＡアンチコドンの突然変異又はコドン−アンチコドンのミスマッチのいずれかによって引き起こされる（Ｂｅｉｅｒ＆Ｇｒｉｍｍ，“Ｍｉｓｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２９，ｐａｇｅｓ ４７６７−４７８２，２００１）。終止コドン抑制の利用は、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を作製するための別の方法に相当し、概して、終止コドンと対合しうるｔＲＮＡに非天然アミノ酸を連結することのできるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの導入が関わる。例えば、アンバーコドンは真核生物ゲノム（ヒトにおいて２３％）及び原核生物ゲノム（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において７％）の両方で使用頻度が最も低い終止コドンであることに伴い、アンバーコドンに部位特異的に非天然アミノ酸を導入するため、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ及びアンバー終止コドンと対合するｔＲＮＡが開発されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．４，ｐａｇｅｓ ２３９−２４４，２００７）。オーカー及びオパール終止コドンも同様に非天然アミノ酸の導入に使用されている（Ｋｏｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｔ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ２１st ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ａｍｂｅｒ，ｏｃｈｒｅ ａｎｄ ｏｐａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡ ｐａｉｒｓ：ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ ａｎ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３２，ｐａｇｅｓ ６２００−６２１１，２００４）。これまでに、この方法によって７０を超える非天然アミノ酸が組換えタンパク質に部位特異的に組み込まれている（Ｌｉｕ＆Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７９，ｐａｇｅｓ ４１３−４４４，２０１０）。典型的には、所望の部位において９５％を超える非天然アミノ酸組み込み効率（完全長産物における非天然アミノ酸の占有率として定義される）を達成することができ、非天然アミノ酸組み込みに最も高頻度で使用される方法の１つとなっている。
本発明はまた、非天然アミノ酸を組換えポリペプチドに導入するための当業者に公知の任意の他の技術も包含する。それらの技術のあるものは、４塩基対コドンの使用を含む（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｃｏｄｏｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．１０１，ｐａｇｅｓ ７５６６−７５７１，２００４）。模倣組換えポリペプチドの作製に関するさらなる考察については、米国特許第７，０４５，３３７号明細書及び国際公開第２０１０１３２３４１Ａ２号パンフレット（両方ともに本明細書によって参照により本明細書に援用される）を参照しうる。
本開示はまた、翻訳後プロセシング等の天然の過程（例えばリン酸化、アシル化等）によって、又は化学的修飾技術によって本開示のポリペプチドを修飾するための方法を提供するものである。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミン又はカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこに起きても良い。同じタイプの修飾が、与えられたポリペチドの幾つかの部位において同じ又は様々な程度で存在しても良いことはいうまでもない。また、与えられたポリペチドは、多くの種類の修飾を有することができる。修飾は、アセチル化、アシル化、ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋性環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ｍｙｒｉｓｔｏｌｙａｔｉｏｎ、酸化、ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ、硫酸化、及びａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ等のタンパク質への運搬ＲＮＡ媒介性のアミノ酸の追加を含む。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３）を参照。
固相化学ペプチド合成方法を、本開示のポリペプチド又は断片を合成するために用いることもできる。このような方法は１９６０年代初期から本分野において周知であり（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，“Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９−２１５４，１９６３）（また、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１．，ｐｐ．１１−１２も参照されたい）、最近になって市販の実験用のペプチドデザイン及び合成キットにおいて使用された（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。このような市販の実験用のキットは通常、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｔｏ ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：３９９８（１９８４）の教示を使用しており、、その全てが単一のプレートに接続している複数の「ロッド」又は「ピン」の先端上にペプチドを合成することを提供する。このような系が利用される際には、ロッド又はピンのプレートは逆さにされ、対応するウェル又はリザーバーの第二のプレートに挿入され、この第二のプレートは適切なアミノ酸をピン又はロッドの先端に取り付け、又は固定するための溶液を含む。このようなプロセス工程を繰り返すことによって、すなわち、ロッド及びピンの先端を適切な溶液に逆さにして挿入することによって、アミノ酸は所望のペプチドに組み込まれる。加えて、多くの利用可能なＦＭＯＣペプチド合成システムを利用できる。例えば、ポリペプチド又は断片の組み立ては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の４３１Ａ（登録商標）オートメーション化ペピチド合成機を用いた固体支持体上で行われることができる。このような装置は、直接合成によって、又は他の周知の技術を使用した結合されうる一連の断片の合成によって、本開示のペプチドの容易な利用を提供する。
合成ポリペプチド又はその断片は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ及びレクチンクロマトグラフィを含む周知の方法によって回収され、精製されることができる。タンパク質のリフォールディング過程が、必要に応じて、ポリペプチドの構造を仕上げる際に用いられることができる。必要に応じて、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製過程のために使用されることができる。
本開示は、少なくとも１つのタンパク質変異体を有する条件的活性型タンパク質変異体製剤又は剤形を提供するものであり、製剤は液体又は乾燥物である。タンパク質製剤は、選択的に、緩衝液、補因子、第ニの又は追加のタンパク質、又は１つ以上の賦形剤を含むものである。一態様において、製剤は、治療的な条件的活性型生物学的タンパク質として利用され、これは例えば、温度、ｐＨ、又は浸透圧、酸化又はオスモル濃度について、異常又は非生理的条件下で活性型であり、正常又は生理的条件下では低活性又は不活性なものである。
標準的な精製技術を、いずれの組換え体又は合成条件的活性型生物学的タンパク質のために使用することができる。
変異体のスクリーニングによる可逆的又は非可逆的変異体の同定
望ましい分子の同定は、許容型の条件及び野生型の条件におけるタンパク質活性を測定することによって、非常に直接的に達成される。最も高い活性の比（許容型／野生型）を示す変異体を、次いで選択し、標準的な方法を用いて個々の変異を組み合わせることで、点変異の並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を生成することができる。次いで、この組み合わせた並べ替えタンパク質ライブラリから、許容型と野生型の活性に最も大きい差を示すタンパク質をスクリーニングする。
上清の活性を、様々な方法、例えば、蛍光アッセイなどのハイスループットな活性アッセイを使ってスクリーニングして、希望する特性（温度、ｐＨなど）に感受性をもつ、タンパク質変異体を同定することが可能である。例えば、時間的感受性の変異体をスクリーニングするには、個々の変異体ごとに、低い温度（２５℃など）と、元のタンパク質が機能する温度（３７℃など）とにおいて、商業的に利用可能な基質を用いて、酵素活性又は抗体活性の測定を行う。反応は、最初は９６ウェルアッセイなどのマルチウェルアッセイの形式で行われ、１４ｍｌチューブ形式などの異なる形式を用いて確認されてもよい。
本開示は、酵素を同定するためのスクリーニングアッセイをさらに提供するものであって、アッセイは、（ａ）複数の核酸又はポリペプチドを提供する工程と、（ｂ）複数の核酸又はポリペプチドから、酵素活性をテストするためのポリペプチドの候補を得る工程と、（ｃ）候補の酵素活性をテストする工程と、（ｄ）これらのポリペプチドの候補であって、例えば、温度、ｐＨ、酸化、浸透圧性、電解質濃度、又は浸透圧の条件が、異常な条件又は非生理的な条件下において、野生型酵素タンパク質に比べてより高い酵素活性を示し、通常の生理的な条件下において、より低い酵素活性を示すものである、ポリペプチドの候補を同定する工程とを、有するものである。
一態様においては、本方法はさらに、候補の条件的生理活性をテストする前に、少なくとも１つの核酸又はポリペプチドを改変する工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の上昇をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ３〜約ｐＨ１２のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ５〜約ｐＨ１０のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ６〜約ｐＨ８のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ６．７〜約ｐＨ７．５のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約４℃〜約５５℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約１５℃〜約４７℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約２０℃〜約４０℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約２５℃〜約３７℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、通常の浸透圧下での酵素活性と、（正方向又は負方向に）異常な浸透圧下での酵素活性とをテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、通常の電解質濃度下での酵素活性と、（正方向又は負方向に）異常な電解質濃度下での酵素活性とをテストする工程を有するものである。テストされる電解質濃度は、カルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩素、重炭酸、及びリン酸の濃度から選択されるものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、安定した反応産物をもたらす酵素活性をテストする工程を有するものである。
別の態様においては、本開示は、酵素活性を持つ本開示のポリペプチド又はその断片に特異的に結合する、精製抗体を提供するものである。一態様においては、本開示は、酵素活性を持つポリペプチドに特異的に結合する抗体の断片を提供するものである。
抗体及び抗体ベースのスクリーニング方法
本開示は、本開示の酵素に特異的に結合する、単離された抗体又は組換え抗体を提供する。これらの抗体を用いて、本開示の酵素、又は関連するポリペプチドの抗原を、単離、同定、又は定量化することができる。これらの抗体を用いて、本開示の範囲内の他のポリペプチド、又は他の関連するタンパク質を単離することができる。抗体は、酵素の活性部位に結合するように設計することができる。従って、本開示は、本開示の抗体を用いて、酵素を抑制する方法を提供する。
抗体は、免疫沈降、染色、及び免疫親和性カラムなどで用いることができる。必要な場合、特定の抗原をエンコードする核酸配列は、免疫処置とそれに続くポリペプチド又は核酸の単離、増幅又はクローニング、並びに本開示のアレイへのポリペプチドの固定化によって生成することができる。或いは、本開示の方法を用いて、細胞によって生産された抗体の構造を改変することが可能であり、抗体を改変し、例えば抗体の親和性を上昇又は低下させることが可能である。さらに、抗体を作成又は改変する能力を、本開示の方法により細胞中に設計された表現型とすることができる。
免疫処置、抗体の作製及び単離（ポリクローナル及びモノクローナル）の方法は、本技術分野の当業者に公知であり、科学文献及び特許文献に記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ（１９９１）；Ｓｔｉｔｅｓ（ｅｄｓ．）ＢＡＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（７ｔｈ ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．（“Ｓｔｉｔｅｓ”）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ（１９７５）“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５；Ｈａｒｌｏｗ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．を参照されたい。抗体はまた、例えば、従来的な動物を用いたインビボの方法に加えて、組換え抗体の結合部位を発現するファージディスプレイライブラリを用いることで、インビトロで作製することも可能である。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９７）“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０；ａｎｄ Ｋａｔｚ（１９９７）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７−４５．を参照されたい。
ポリペプチド又はペプチドを用いて、特異的に本開示のポリペプチド、例えば酵素に結合する抗体を作製することができる。結果的に得られる抗体は、ポリペプチドを単離又は精製するため、或いはポリペプチドが生体サンプル中に存在するかどうかを決定するために、免疫親和性クロマトグラフィ手順において用いられてもよい。そうした手順においては、抽出物などのタンパク質調製物、又は生体サンプルを、本開示のポリペプチドのうちの１つに特異的に結合することができる抗体と接触させる。
免疫親和性手順においては、抗体を、ビーズ又はその他のカラム基材などの固体支持体に結合させる。タンパク質調製物を、本開示のポリペプチドのうちの１つに特異的に抗体が結合する条件下で、抗体と接触するように置く。洗浄を行い、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出する。
生体サンプル中のタンパク質の、抗体対する結合能力を、本技術分野の当業者に公知の様々な手順を用いて決定することができる。例えば、蛍光物質、酵素ラベル、放射性同位体などの検出可能な標識を用いて抗体を標識することによって、結合能を決定してもよい。或いは、表面にそうした検出可能な標識を持つ二次抗体を用いて検出することによって、サンプルに対する抗体の結合能を決定してもよい。特定のアッセイとしては、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及びウェスタンブロットが含まれる。
本開示のポリペプチドに対して製作されるポリクロ―ナル抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射か、又は非ヒト動物へのポリペプチドの投与によって、得ることができる。そうして得られた抗体を、次いでポリペプチドそれ自体に結合させる。この方法においては、ポリペプチドの断片のみをエンコードする配列さえ、未変性の全長ポリペプチドに結合する可能性のある抗体を作成するのに用いることができる。次いで、そうした抗体を用いて、ポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体を調整するために、継代培養細胞株によって生産される抗体を提供する、任意の技術を用いることができる。例として、ハイブリドーマ法、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶハイブリドーマ法（例えば、Ｃｏｌｅ（１９８５）ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照されたい）が含まれる。
単鎖抗体を作製するために記載された技術（例えば、米国特許第４９４６７７８号明細書を参照されたい）を、本開示のポリペプチドに対する単鎖抗体を作製するために適応することができる。或いは、トランスジェニックマウスを用いて、ポリペプチド又はその断片に対するヒト化抗体を発現させてもよい。本開示のポリペプチドに対して製作される抗体を用いて、他の生物及びサンプル由来の類似のポリペプチド（例えば、酵素）をスクリーニングすることができる。そうした技術においては、生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、抗体と特異的に結合するポリペプチドを検出する。上述した手順から任意のものを、抗体の結合を検出するために用いてもよい。
スクリーニング方法、及び「オンライン」モニタリング装置
本開示の方法の実施においては、様々な装置及び方法を本開示のポリペプチド及び核酸と併せて使用することができる。その装置及び方法には、例えば、酵素活性によるペプチドのスクリーニングするためのもの、酵素活性に対してアクチベーター又はインヒビターなどの潜在モジュレーターとなる化合物のスクリーニングするためのもの、本開示のポリペプチドに結合する抗体のためのもの、本開示の核酸にハイブリダイズする核酸のためのもの、本開示のポリペプチドを発現する細胞をスクリーニングするためのものなどが挙げられる。
アレイ又は「バイオチップ」
本開示の核酸又はポリペプチドは、アレイに固定化又は適用することができる。アレイを用いることで、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリに対して、本開示の核酸又はポリペプチドに結合する能力、又はそれらの活性を調整する能力によって、スクリーニング又はモニターすることができる。例えば、本開示の一態様においては、モニターされるパラメーターは酵素遺伝子の転写発現である。ある細胞の転写産物の、１つ又は複数、或いは全てを、その細胞の転写産物或いは細胞の転写産物の代表的又は相補的な核酸を有するサンプルを、アレイ又は「バイオチップ」に固定化した核酸にハイブリダイズすることで、測定することが可能である。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を用いることで、転写産物の一部又は全部を同時に定量化する事ができる。或いは、ゲノム核酸を有するアレイを用いることで、本開示の方法によって作られた、新たに設計された株の遺伝子型を決定することもできる。ポリペプチド「アレイ」を用いることで、同時に複数のタンパク質を定量化することもできる。本開示は、任意の既知の「アレイ」と共に実施することが可能であって、この「アレイ」は、「マイクロアレイ」又は「核酸アレイ」又は「ポリペプチドアレイ」又は「抗体アレイ」又は「バイオチップ」又はそれらの変型とも見なされる。アレイは一般的に、複数の「スポット」又は「標的要素」であって、それぞれの標的要素は、規定の量の１つ又は複数の生体分子、例えば、オリゴヌクレオチドを有するものであり、サンプル分子、例えばｍＲＮＡ転写産物に特異的に結合する基質表面の規定の領域に、固定化されているものである。
本開示の方法の実施においては、以下の文献中に記載されているような、任意の既知のアレイ及び／又はアレイを作成及び使用する方法が、それらの全体又は一部、或いはそれらの変型について援用されうる。例えば、米国特許第６２７７６２８号明細書；同第６２７７４８９号明細書；同第６２６１７７６号明細書；同第６２５８６０６号明細書；同第６０５４２７０号明細書；同第６０４８６９５号明細書；同第６０４５９９６号明細書；同第６０２２９６３号明細書；同第６０１３４４０号明細書；同第５９６５４５２号明細書；同第５９５９０９８号明細書；同第５８５６１７４号明細書；同第５８３０６４５号明細書；同第５７７０４５６号明細書；同第５６３２９５７号明細書；同第５５５６７５２号明細書；同第５１４３８５４号明細書；同第５８０７５２２号明細書；同第５８００９９２号明細書；同第５７４４３０５号明細書；同第５７００６３７号明細書；同第５５５６７５２号明細書；同第５４３４０４９号明細書；例えば、国際公開９９／５１７７３号パンフレット；国際公開９９／０９２１７号パンフレット；国際公開９７／４６３１３号パンフレット；国際公開９６／１７９５８号パンフレットも参照されたい；例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）“Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐｓ：Ａｒｒａｙ ｏｆ ｈｏｐｅ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）“Ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ Ｈａｎｄｈｅｌｄ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｒｒａｙｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０８７−１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７）“Ｄｉｒｅｃｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｌｏｎｅｓ ｏｎ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒｉｄｄｅｄ ｃＤＮＡ ｆｉｌｔｅｒ ａｒｒａｙｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１２０−１２４；Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９７）“Ｍａｔｒｉｘ−Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｃｈｉｐｓ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ”，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ ２０：３９９−４０７；Ｂｏｗｔｅｌｌ（１９９９）“Ｏｐｔｉｏｎｓ Ａｖａｉｌａｂｌｅ−Ｆｒｏｍ Ｓｔａｒｔ ｔｏ Ｆｉｎｉｓｈ〜ｆｏｒ Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄａｔａ ｂｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐ．２１：２５−３２も参照されたい。米国特許出願公開第２００１００１８６４２号明細書；米国特許出願公開第２００１００１９８２７号明細書；米国特許出願公開第２００１００１６３２２号明細書；米国特許出願公開第２００１００１４４４９号明細書；米国特許出願公開第２００１００１４４４８号明細書；米国特許出願公開第２００１００１２５３７号明細書；米国特許出願公開第２００１０００８７６５号明細書も参照されたい。
キャピラリーアレイ
ＧＩＧＡＭＡＴＲＩＸ（商標）（Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ）などのキャピラリーアレイを、本開示の方法において用いることができる。本開示の核酸又はポリペプチドを、キャピラリーアレイを含むアレイに対して固定化又は適用することができる。アレイを用いることで、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリに対して、本開示の核酸又はポリペプチドに結合する能力、又はそれらの活性を調整する能力によって、スクリーニング又はモニターすることができる。キャピラリーアレイは、サンプルを保持且つスクリーニングするためのもう１つのシステムを提供する。例えば、サンプルスクリーニング装置は、隣接したキャピラリーアレイとして形成される複数のキャピラリーを含むことができ、ここで各キャピラリーは少なくとも１つの、サンプルを保持する管腔を形成する壁を有するものである。装置は、さらに、アレイ中の隣接したキャピラリーの間に配置される間質材を含みうるものであって、その間質剤中に１つまた複数の参照指標が形成されているものである。サンプルをスクリーニングするためのキャピラリーは、キャピラリーアレイに結合するように適合されたものであって、サンプルを保持するための管腔を形作る第一の壁と、サンプルを励起するために管腔に与えられる励起エネルギーをフィルターするフィルター材から形成される第二の壁を含みうるものである。ポリペプチド又は核酸、例えばリガンドを、キャピラリーアレイの少なくとも一部のキャピラリーの第一成分に、導入することができる。キャピラリーアレイの各キャピラリーは、少なくとも１つの、第一成分を保持する管腔を形作る壁を有することができる。キャピラリー中の第一成分の後ろに、気泡を導入することができる。第二成分をキャピラリーに導入することが可能であり、ここでこの第二成分は気泡によって第一成分と分離される。対象サンプルは、検出可能粒子で標識された第一液として、キャピラリーアレイ中の１つのキャピラリーに導入され、このキャピラリーアレイ中の各キャピラリーは、第一液と検出可能粒子とを保持するための管腔を形作る少なくとも１つの壁を有するものであって、少なくとも１つの壁は、検出可能粒子を結合させるための結合材料で被覆されている。本方法は、さらに、結合した検出可能粒子が保持されているキャピラリーチューブから第一液を除去する工程と、そのキャピラリーに第二液を導入する工程とを含むものである。キャピラリーアレイは、管腔を形作る少なくとも１つの外壁を有する、複数の個々のキャピラリーを含むものである。外壁は、互いに融合した１つ又は複数の壁であってもよい。同様に、壁は、その壁が液体又はサンプルを保持する管腔を形成する限り、円筒形、四角形、六角形、又はその他の幾何学的形態の管腔を形作ることができる。キャピラリーアレイ中のキャピラリーは、平面構造を形成するように近接して互いに支え合うことができる。キャピラリーは、隣同士を融合（例えば、ここではキャピラリーはガラス製）、接着、粘結、又は固定することによって、互いに結合することができる。キャピラリーアレイは、任意の数、例えば１００〜４，０００，０００の、個々のキャピラリーから形成することが可能である。キャピラリーアレイは、約１００，０００又はそれより多くの、互いに結合した個々のキャピラリーを持つ、マイクロタイタープレートを形成することができる。
条件的活性型生物学的タンパク質の操作
本発明の条件的活性型生物学的タンパク質は、ＢＢＢ−Ｒに対する条件的活性型抗体及び滑液、腫瘍微小環境及び癌幹細胞を含む幹細胞ニッチに対する条件的活性型抗体を含め、本明細書に記載される１つ以上のタンパク質操作技術によって操作しうる。タンパク質操作技術の非限定的な例としてはまた、抗体コンジュゲーション、多重特異性抗体の操作、抗体のＦｃ領域の操作も挙げられる。
条件的活性型生物学的タンパク質のコンジュゲーション
本発明によって提供される条件的活性型生物学的タンパク質は分子にコンジュゲートしうる。条件的活性型生物学的タンパク質は脳、滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチにおいて優先的に作用するため、条件的活性型生物学的タンパク質は、条件的活性型生物学的タンパク質と共に脳、滑液、腫瘍微小環境又は幹細胞ニッチに輸送されることになる分子（療法剤又は診断剤）にコンジュゲートしうる。一部の実施形態において、分子は非特異的毒性を有し、これは条件的活性型生物学的タンパク質にコンジュゲートすることによって低減しうるものであり、従って疾患部位で優先的に作用する。
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質上のコンジュゲートされた分子は、任意選択で、条件的活性型生物学的タンパク質が脳、滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチなどのその意図される位置に達した時点で条件的活性型生物学的タンパク質から遊離してもよい。これらの実施形態では、条件的活性型生物学的タンパク質は、コンジュゲートされた分子（療法薬又は診断薬など）を脳、滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチに輸送する送達媒体として作用しうる。脳、滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチに入ると、コンジュゲートされた分子は疾患の治療ため遊離しうる。
条件的活性型生物学的タンパク質と分子（療法薬又は診断薬）とのコンジュゲーションは、共有結合性のコンジュゲーションであっても、又は非共有結合性であってもよい。共有結合性のコンジュゲーションは、直接か、又はリンカーを介するかのいずれかでありうる。特定の実施形態において、直接のコンジュゲーションは融合タンパク質の構築による（すなわち、条件的活性型抗体及び神経障害薬物をコードする２つの遺伝子の遺伝子融合並びに単一のタンパク質としての発現による）。特定の実施形態において、直接のコンジュゲーションは、条件的活性型抗体の２つの部分のうちの一方の反応基と神経薬／造影剤上の対応する基又はアクセプターとの間の共有結合の形成による。特定の実施形態において、直接のコンジュゲーションは、適切な条件下でコンジュゲートされる他の分子との共有結合を形成する反応基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含めるための、コンジュゲートされる２つの分子のうちの一方の修飾（すなわち、遺伝子修飾）による。１つの非限定的な例として、所望の反応基（すなわち、システイン残基）を有する分子（すなわち、アミノ酸）が例えば条件的活性型抗体に導入され、神経薬とジスルフィド結合が形成されうる。核酸とタンパク質との共有結合性のコンジュゲーション方法も当該技術分野において公知である（すなわち、光架橋、例えば、Ｚａｔｓｅｐｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、７４：７７−９５（２００５）を参照されたい）。非共有結合性のコンジュゲーションは、当業者が容易に理解するであろう通り、疎水結合、イオン結合、静電相互作用などを含む任意の非共有結合手段によることができる。
コンジュゲーションはまた、種々のリンカーを使用して実施してもよい。例えば、条件的活性型抗体と神経薬とは、種々の二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二機能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用してコンジュゲートしうる。ペプチド結合によってつながった１〜２０アミノ酸で構成されるペプチドリンカーも使用しうる。特定のかかる実施形態において、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。特定の他のかかる実施形態において、アミノ酸の１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。リンカーは、脳への送達時に神経薬の遊離を促進する「開裂可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）が用いられてもよい。抗体コンジュゲーション用の架橋剤試薬の幾つかの例としては、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＬＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられる。
コンジュゲートされた治療剤は、放射性粒子、化学療法薬、又は細胞毒素（すなわちサイトトキシン）など、体にとって毒性でありうる。これらの治療剤は体にとって極めて毒性が高い。本発明の条件的活性型抗体を使用してコンジュゲートされた治療剤を疾患部位に送達すると、これらの治療剤の毒性作用を大幅に低減することができる。放射性粒子を抗体にコンジュゲートする技術は当該技術分野において公知である。イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））及びトシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））は、放射性粒子がコンジュゲートされたモノクローナル抗体の例である。両方とも、異なる放射性粒子がコンジュゲートされたＣＤ２０抗原に対する抗体である。同様に、化学療法薬を抗体にコンジュゲートする技術も当該技術分野において公知である。化学療法薬がコンジュゲートされた２つの市販の抗体がある：ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））及びａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（商標））。ブレンツキシマブベドチンは、ＭＭＡＥと呼ばれる化学療法薬に結合した、ＣＤ３０抗原（Ｂ細胞及びＴ細胞に見られる）を標的化する抗体でできている。ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシンは、ＤＭ１と呼ばれる化学療法薬に結合した、ＨＥＲ２タンパク質を標的化する抗体でできている。細胞毒素を抗体とコンジュゲートする技術も当該技術分野において公知である。例えば、デニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ（登録商標）、制癌薬）は、ジフテリアを引き起こす細菌に由来する毒素に結合したインターロイキン−２（ＩＬ−２）として知られる免疫系タンパク質からなる。
任意の放射性粒子、化学療法薬、及び細胞毒素が、これらの薬剤の副作用を低減するため本発明の条件的活性型生物学的タンパク質にコンジュゲートされうることが企図される。
一部の実施形態において、異常組織の治療のため条件的活性型生物学的タンパク質にコンジュゲートされる放射性粒子は、１つ以上の放射性同位元素を含浸させた粒子を含み、異常組織における細胞の局所領域的アブレーションに十分な放射能を有する。粒子は、ガラス、金属、樹脂、アルブミン、又はポリマーを含みうる。放射性粒子における金属は、鉄、ガドリニウム、及びカルシウムから選択されうる。放射性粒子における１つ以上の放射性同位元素の例は、ガリウム−６７（67Ｇａ）、イットリウム−９０（90Ｙ）、ガリウム−６８（68Ｇａ）、タリウム−２０１（201Ｔｌ）、ストロンチウム−８９（89Ｓｒ）、インジウム−ＩＩＩ（111Ｉｎ）、ヨウ素−１３１（131Ｉ）、サマリウム−１５３（153Ｓｍ）、テクネチウム−９９ｍ（99mＴｃ）、レニウム−１８６（186Ｒｅ）、レニウム−１８８（188Ｒｅ）、銅−６２（62Ｃｕ）、及び銅−６４（64Ｃｕ）からなる群から選択される。好ましくは、組成物中の放射性同位元素は、ベータ線、ガンマ線、及び／又は陽電子を放射する。
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質にコンジュゲートされる化学療法薬は、アントラサイクリン類、トポイソメラーゼＩ及び／又はＩＩ阻害薬、紡錘体毒植物性アルカロイド、アルキル化剤、抗代謝産物、エリプチシン及びハルミンからなる群から選択される。
アントラサイクリン類（又はアントラサイクリン系抗生物質）は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細菌に由来する。これらの化合物は、例えば、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、並びに乳癌、子宮癌、卵巣癌、及び肺癌を含む多種多様な癌の治療に用いられる。アントラサイクリン類としては、限定はされないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、及びこれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
トポイソメラーゼ類は、ＤＮＡのトポロジーを維持する必須酵素である。Ｉ型又はＩＩ型トポイソメラーゼの阻害は、適切なＤＮＡ超らせん形成を混乱させることによってＤＮＡの転写及び複製の両方を妨げる。一部のＩ型トポイソメラーゼ阻害薬にはカンプトテシン誘導体が含まれる。カンプトテシン誘導体とは、イリノテカン、トポテカン、ヘキサテカン（ｈｅｘａｔｅｃａｎ）、シラテカン、ルトルテカン（ｌｕｔｏｒｔｅｃａｎ）、カレニテシン（ＢＮＰ１３５０）、ギマテカン（ＳＴ１４８１）、ベロテカン（ＣＫＤ６０２）、又はこれらの薬学的に許容可能な塩などのカンプトテシン類似体を指す。ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害薬の例としては、限定はされないが、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド及びテニポシドが挙げられる。アメリカミヤオソウ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍａｙａｐｐｌｅ）（ポドフィルム・ペルタツム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ））の根に天然に存在するアルカロイドであるエピポドフィロトキシン系の半合成誘導体がある。
紡錘体毒植物性アルカロイドは植物に由来し、細胞分裂に必須の微小管機能を妨げることによって細胞分裂を遮断する。これらのアルカロイド類としては、限定はされないが、ビンカアルカロイド類（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン及びビンポセチンなど）及びタキサン類が挙げられる。タキサン類としては、限定はされないが、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、オルタタキセル、テセタキセル、及びこれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
アルキル化剤は、細胞に存在する条件下で多くの電気陰性基にアルキル基を付加するその能力から、そのように呼ばれる。アルキル化剤は、生物学的に重要な分子におけるアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、及びリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なう。注目すべきことに、その細胞傷害性はＤＮＡ合成の阻害によって生じると考えられている。アルキル化剤としては、限定はされないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド及び白金化合物、例えば、オキサリプラチン、シスプラチン又はカルボプラチンが挙げられる。
抗代謝産物は、正常な代謝の一部である代謝産物の使用を阻害する化学物質である。かかる物質は、多くの場合に、それが妨害する代謝産物と構造が類似している。抗代謝産物が存在すると、細胞成長及び細胞分裂が停止する。
プリン又はピリミジン類似体は、ＤＮＡへのヌクレオチドの組み込みを妨げて、ＤＮＡ合成、ひいては細胞分裂を停止させる。これらはまた、ＲＮＡ合成にも影響を及ぼす。プリン類似体の例としては、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン及びクラドリビンが挙げられる。ピリミジン類似体の例としては、チミジル酸シンターゼを阻害する５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）及びシトシンアラビノシド（シタラビン）が挙げられる。
抗葉酸剤は、葉酸の機能を弱める化学療法薬である。周知の例はメトトレキサートであり、これは、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を阻害し、ひいてはテトラヒドロ葉酸塩の形成を妨げる葉酸類似体である。テトラヒドロ葉酸塩はプリン及びピリミジン合成に必須である。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の産生阻害につながる（テトラヒドロ葉酸塩はまた、アミノ酸セリン及びメチオニンの合成にも関与するため）。他の抗葉酸剤としては、限定はされないが、トリメトプリム、ラルチトレキセド、ピリメタミン及びペメトレキセドが挙げられる。
エリプチシン及びハルミンなど、他の化学療法薬も条件的活性型生物学的タンパク質にコンジュゲートされうる。エリプチシンは、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）の常緑樹から単離される天然の植物性アルカロイド生成物である。エリプチシン及びその誘導体、例えば、９−ヒドロキシエリプチシニウム、Ｎ２−メチル−９−ヒドロキシエリプチシニウム、２−（ジエチアミノ（ｄｉｅｔｈｙｉａｍｉｎｏ）−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシ−エリプチシニウムアセテート及び２−（βピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムは、全てが有効な化学療法薬である。
ハルミンは、ペガヌム・ハルマラ（Ｐｅｇａｎｕｍ ｈａｒｍａｌａ）の種子から単離された天然の植物性アルカロイド生成物である。ハルミン系化学療法薬としては、ハルミン、ハルマリン、ハルモール、ハルマロール及びハルマン、並びにキナゾリン誘導体：バシシン及びバシシノンが挙げられる。
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質にコンジュゲートされる細胞毒素としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、リシン、ＣＣ−１０６５及び類似体、デュオカルマイシン類が挙げられる。さらに他の毒素としては、ジプテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、及びヘビ毒（例えばコブラ毒）が挙げられる。
一実施形態において、ピロロベンゾジアゼピンが条件的活性型生物学的タンパク質にコンジュゲートされてもよい。ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体は、２つのＤＮＡ鎖を架橋して、それによってＤＮＡ複製及び細胞分裂を妨げる合理的に設計されたＤＮＡ副溝の配列選択的架橋剤の一クラスである。ＰＢＤは化学療法剤として用いられうる。このクラスの化学療法剤は、腫瘍細胞成長の阻害においてピコモル濃度又はピコモル濃度未満の活性を呈する。合成ＰＢＤは、条件的活性型抗体にコンジュゲートされると、腫瘍細胞成長を阻害するため腫瘍部位に向かって案内されうる。ＰＢＤは条件的活性型抗体との連結に種々のコンジュゲーション部位を使用しうる。例えば、２つの好適なＰＢＤを以下に示す。
一部の実施形態において、本発明の条件的活性型生物学的タンパク質は診断用薬剤にコンジュゲートされうる。本発明で使用される診断用薬剤には、例えば以下の文献に提供される通りの当該技術分野において公知の任意の診断用薬剤が含まれうる：Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ”，５th Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｅｄ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｉｍａｇｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ，Ｓ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ＰＥＴ ａｎｄ ＳＰＥＣＴ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００９）。診断用薬剤は、限定はされないが、ガンマ線放射性、放射性、エコー源性、光学的、蛍光性、吸収性、磁性又は断層撮影法のシグナルを含む検出可能なシグナルを提供し、及び／又は増強する薬剤の使用を含め、種々の方法によって検出することができる。診断用薬剤のイメージング技術としては、限定はされないが、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学イメージング、蛍光イメージング、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、Ｘ線イメージング、ガンマ線イメージングなどを挙げることができる。
一部の実施形態において、診断用薬剤には、種々の画像診断技術に用いられる、例えば金属イオンに結合したキレーターが含まれうる。例示的キレーターとしては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、［４−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イル）メチル安息香酸（ＣＰＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
放射性同位元素は、本明細書に記載される一部の診断用薬剤に組み込むことができ、ガンマ線、陽電子、β及びα粒子、及びＸ線を放射する放射性核種を含みうる。好適な放射性核種としては、限定はされないが、Ａｃ、Ａｓ、Ａｔ、nＢ、128Ｂａ、212Ｂｉ、75Ｂｒ、77Ｂｒ、14Ｃ、109Ｃｄ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、18Ｆ、67Ｇａ、68Ｇａ、3Ｈ、123Ｉ、125Ｉ、130Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、13Ｎ、15Ｏ、32Ｐ、33Ｐ、212Ｐｂ、103Ｐｄ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、47Ｓｃ、153Ｓｍ、89Ｓｒ、99mＴｃ、88Ｙ及び90Ｙが挙げられる。特定の実施形態において、放射性薬剤には、mＩｎ−ＤＴＰＡ、99mＴｃ（ＣＯ）３−ＤＴＰＡ、99mＴｃ（ＣＯ）3−ＥＮＰｙ２、62/64/67Ｃｕ−ＴＥＴＡ、99mＴｃ（ＣＯ）3−ＩＤＡ、及び99mＴｃ（ＣＯ）3トリアミン（環状又は直鎖状）が含まれうる。他の実施形態では、これらの薬剤には、111Ｉｎ、177Ｌｕ、153Ｓｍ、88/90Ｙ、62/64/67Ｃｕ、又は67/68Ｇａを有するＤＯＴＡ及びその様々な類似体が含まれうる。一部の実施形態では、以下の文献に提供される通り、例えばＤＴＰＡ−脂質などのキレートに結合した脂質の組み込みによってリポソームを放射性標識することができる：Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ ６９−８３（２００８）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．＆Ｗｅｉｓｓｉｇ，Ｖ．，Ｅｄｓ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ２ｎｄ Ｅｄ．：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｅｌｂａｙｏｕｍｉ，Ｔ．Ａ．＆Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，３３：１１９６−１２０５（２００６）；Ｍｏｕｇｉｎ−Ｄｅｇｒａｅｆ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３４４：１１０−１ １７（２００７）。
他の実施形態では、診断用薬剤が、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤などの光学的薬剤を含みうる。数多くの薬剤（例えば、色素、プローブ、標識、又は指示薬）が当該技術分野において公知であり、本発明に使用することができる。（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、“Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ−−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ”，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）を参照されたい）。蛍光剤には、種々の有機及び／又は無機小分子又は種々の蛍光タンパク質及びその誘導体が含まれうる。例えば、蛍光剤としては、限定はされないが、シアニン、フタロシアニン、ポルフィリン、インドシアニン、ローダミン、フェノキサジン、フェニルキサンテン、フェノチアジン、フェノセレナジン、フルオレセイン、ベンゾポルフィリン、スクアライン、ジピロロピリミドン、テトラセン、キノリン、ピラジン、コリン、クロコニウム、アクリドン、フェナントリジン、ローダミン、アクリジン、アントラキノン、カルコゲノピリリウム類似体、クロリン、ナフタロシアニン、メチン色素、インドレニウム色素、アゾ化合物、アズレン、アザアズレン、トリフェニルメタン色素、インドール、ベンゾインドール、インドカルボシアニン、ベンゾインドカルボシアニン、及び４，４−ジフィウオロ（ｄｉｆｉｕｏｒｏ）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの一般構造を有するＢＯＤＩＰＹ（商標）誘導体、及び／又はこれらの任意のコンジュゲート及び／又は誘導体を挙げることができる。使用することのできる他の薬剤としては、限定はされないが、フルオレセイン、フルオレセイン−ポリアスパラギン酸コンジュゲート、フルオレセイン−ポリグルタミン酸コンジュゲート、フルオレセイン−ポリアルギニンコンジュゲート、インドシアニングリーン、インドシアニン−ドデカアスパラギン酸コンジュゲート、インドシアニン（ＮＩＲＤ）−ポリアスパラギン酸コンジュゲート、イソスルファンブルー、インドールジスルホネート、ベンゾインドールジスルホネート、ビス（エチルカルボキシメチル）インドシアニン、ビス（ペンチルカルボキシメチル）インドシアニン、ポリヒドロキシインドールスルホネート、ポリヒドロキシベンゾインドールスルホネート、リジッドヘテロ原子インドールジスルホネート、インドシアニンビスプロパン酸、インドシアニンビスヘキサン酸、３，６−ジシアノ−２，５−［（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（カルボキシメチル）アミノ］ピラジン、３，６−［（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−アザテジノ（ａｚａｔｅｄｉｎｏ））ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−モルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−ピペラジノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸Ｓ−オキシド、２，５−ジシアノ−３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジンＳ，Ｓ−ジオキシド、インドカルボシアニンテトラスルホネート、クロロインドカルボシアニン、及び３，６−ジアミノピラジン−２，５−ジカルボン酸が挙げられる。
さらに他の実施形態において、診断用薬剤には、例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、ガドリニウム又はマンガンの錯体などを含め、当該技術分野において概して周知の造影剤が含まれうる。（例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ”，５th Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）を参照されたい）。一部の実施形態において、診断用薬剤には、磁気共鳴（ＭＲ）造影剤が含まれうる。例示的磁気共鳴剤としては、限定はされないが、常磁性薬剤、超常磁性薬剤などが挙げられる。例示的常磁性薬剤としては、限定はされないが、ガドペンテト酸、ガドテル酸、ガドジアミド、ガドリニウム、ガドテリドール、マンガホジピール、ガドベルセタミド、クエン酸鉄アンモニウム、ガドベン酸、ガドブトロール、又はガドキセト酸を挙げることができる。超常磁性薬剤としては、限定はされないが、超常磁性酸化鉄及びフェリステンを挙げることができる。特定の実施形態において、診断用薬剤には、例えば以下の文献に提供される通りのＸ線造影剤が含まれうる：Ｈ．Ｓ Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｒ．Ｎ．Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｆ．Ｍａｔｔｒｅｙ，Ｅｄｓ．，“Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ”，（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）；Ｐ．Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｃｏｓｇｒｏｖｅ ａｎｄ Ｒ．Ｇｒａｉｎｇｅｒ，Ｅｄｓ．，“Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ”（ＩＳＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ １９９９）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ １８３−２１５（２０００）；Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．３７，ｐａｇｅｓ ２７９−２９３（１９９９）；Ｓａｃｈｓｅ，Ａ．ｅｔ ａｈ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２，ｐａｇｅｓ ４４−５０（１９９７）。Ｘ線造影剤の例としては、限定なしに、イオパミドール、イオメプロール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオシミド、イオベルソール、イオトロラン、イオタスル、イオジキサノール、イオデシモール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオサルコール、イオキシラン、イオパミロン、メトリザミド、イオビトリドール及びイオシメノールが挙げられる。特定の実施形態において、Ｘ線造影剤としては、イオパミドール、イオメプロール、イオプロミド、イオヘキソール、イオペントール、イオベルソール、イオビトリドール、イオジキサノール、イオトロラン及びイオシメノールを挙げることができる。
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は、別のタンパク質、例えば、インターロイキン、サイトカイン、酵素、成長因子、又は他の抗体にコンジュゲートされうる。かかるタンパク質の幾つかの例としては、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン（ＥＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、国際公開第９７／３３８９９号パンフレットに開示される通りのＡＩＭ Ｉ）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号パンフレットを参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ １５６７−１５７４，１９９４）、及びＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号パンフレット）、抗血栓症剤又は抗血管新生剤（例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン）；又は生物学的反応修飾物質、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−Ｉ」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、又は成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明によって提供される通りのＢＢＢを通過するための条件的活性型抗体が、神経障害の治療用薬物にコンジュゲートされうる。この薬物は、抗体と共にＢＢＢを通って輸送され、神経障害を治療するため脳内に留まりうる。神経障害とは、ＣＮＳに影響を及ぼし、及び／又はＣＮＳに病因がある疾患又は障害を指す。例示的ＣＮＳ疾患又は障害としては、限定はされないが、ニューロパチー、アミロイドーシス、癌、眼疾患又は眼障害、ウイルス又は微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、及びリソソーム蓄積症が挙げられる。本願の目的上、ＣＮＳは、通常は血液−網膜関門によって体の残りの部分から隔絶されている眼を含むものと理解されるであろう。神経障害の具体的な例としては、限定はされないが、神経変性疾患（例えば限定はされないが、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドラエーガー（Ｓｈｙ−Ｄｒａｅｇｅｒ）症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパチー（限定はされないが、アルツハイマー病及び核上性麻痺を含む）、プリオン病（限定はされないが、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含む）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性障害（限定はされないが、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群を含む）、認知症（限定はされないが、ピック病、及び脊髄小脳失調症を含む）、癌（例えば、体の別の場所の癌から生じる脳転移を含め、ＣＮＳ及び／又は脳の癌）が挙げられる。
神経障害の治療用薬物としては、限定はされないが、抗体、ペプチド、タンパク質、１つ以上のＣＮＳ標的の天然リガンド、１つ以上のＣＮＳ標的の天然リガンドの修飾型、アプタマー、阻害性核酸（すなわち、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、及び小分子、又は前述のいずれかの活性フラグメントが挙げられる。例示的神経障害薬物としては、限定はされないが、以下が挙げられる：抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸及び小分子並びに前述のいずれかの活性フラグメントであって、それら自体であるか、又はＣＮＳ抗原又は標的分子、例えば、限定はされないが、アミロイド前駆体タンパク質又はその一部分、アミロイドβ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、τ、α−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫又は他のＣＮＳ癌マーカー、及びニューロトロフィンを特異的に認識し、及び／又はそれに作用する（すなわち、阻害し、活性化し、又は検出する）もの。神経障害薬及びそれらが治療に用いられうる障害の非限定的な例としては、アルツハイマー病、急性及び慢性脳損傷、脳卒中の治療用の抗ＢＡＣＥ１抗体；アルツハイマー病の治療用の抗Ａβ抗体；脳卒中、急性脳損傷、脊髄損傷の治療用のニューロトロフィン；慢性脳損傷（神経形成）の治療用の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）；脳癌の治療用の抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体；パーキンソン病の治療用のグリア細胞株由来神経因子（ＧＤＮＦ）；筋萎縮性側索硬化症及びうつ病の治療用の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳のリソソーム蓄積障害の治療用のリソソーム酵素；筋萎縮性側索硬化症の治療用の毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；統合失調症の治療用のニューレグリン−１；及びＨＥＲ２陽性癌からの脳転移の治療用の抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ）が挙げられる。
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質のコンジュゲーションは抗体のＦｃ領域上にありうる。上記に記載したコンジュゲート分子、化合物又は薬物が、米国特許第８，３６２，２１０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載される通り、Ｆｃ領域にコンジュゲートされうる。例えば、Ｆｃ領域は、条件的活性型抗体が優先的に活性を示す部位に送達されるサイトカイン又は毒素にコンジュゲートされうる。ポリペプチドを抗体のＦｃ領域にコンジュゲートする方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、同第５，７２３，１２５号明細書、同第５，７８３，１８１号明細書、同第５，９０８，６２６号明細書、同第５，８４４，０９５号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書；欧州特許第３６７，１６６号明細書；欧州特許第３９４，８２７号明細書；国際公開第９１／０６５７０号パンフレット、国際公開第９６／０４３８８号パンフレット、国際公開第９６／２２０２４号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット、及び国際公開第９９／０４８１３号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８８，ｐａｇｅｓ １０５３５−１０５３９，１９９１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３３１，ｐａｇｅｓ ８４−８６，１９８８；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ５５９０−５６００，１９９５；及びＶｉＩ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐａｇｅｓ １１３３７−１１３４１，１９９２（これらは全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
多重特異性条件的活性型抗体の操作
条件的活性型生物学的タンパク質が条件的活性型抗体である場合、条件的活性型抗体を操作して多重特異性条件的活性型抗体を生成しうる。多重特異性抗体は、国際公開第２０１３／１７０１６８号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載される通りの多エピトープ特異性を有する抗体である。多重特異性抗体には、限定はされないが、ＶHＶL単位が多エピトープ特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶHＶL単位が異なるエピトープに結合する２つ以上のＶL及びＶHドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、及び１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体並びに共有結合的又は非共有結合的に連結されている抗体フラグメントを含む抗体が含まれる。
二重特異性抗体を含む多重特異性抗体を構築するため、少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を有する抗体フラグメントが入手される。抗体フラグメントは完全長条件的活性型抗体から入手されてもよい。条件的活性型抗体を酵素消化すると、抗体フラグメントが生じうる。例示的酵素消化方法としては、限定はされないが、ペプシン、パパイン及びＬｙｓ−Ｃが挙げられる。例示的抗体フラグメントとしては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，ｖｏｌ．８，ｐａｇｅｓ １０５７−１０６２（１９９５）を参照されたい）；１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ（Ｏｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌ．，ｖｏｌ．１７，ｐａｇｅｓ ３１５−３２３）、一本鎖抗体分子、Ｆａｂ発現ライブラリによって作製されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及びエピトープ結合フラグメントが挙げられる。抗体フラグメントはまた、ＤＮＡ組換え技術を用いて作製されてもよい。抗体フラグメントをコードするＤＮＡをプラスミド発現ベクター又はファージミドベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において直接発現させうる。抗体酵素消化方法、ＤＮＡクローニング及び組換えタンパク質発現方法は、当業者に周知である。
抗体フラグメントは従来技術を用いて精製してもよく、還元に供すると遊離チオール基が生成されうる。遊離チオール基を有する抗体フラグメントは架橋剤、例えばビスマレイミドと反応する。かかる架橋された抗体フラグメントを精製し、次に遊離チオール基を有する第二抗体フラグメントと反応させる。２つの抗体フラグメントが架橋された最終産物は精製される。特定の実施形態において、各抗体フラグメントはＦａｂであり、２つのＦａｂがビスマレイミドを介して連結した最終産物は、本明細書ではビスマレイミド−（チオ−Ｆａｂ）２、又はビス−Ｆａｂと称される。かかる多重特異性抗体及び抗体類似体は、ビス−Ｆａｂを含め、多数の抗体フラグメントの組み合わせ、又は天然抗体の構造変異体又は特定の抗体フラグメントの組み合わせを迅速に合成するために利用することができる。
多重特異性抗体は、多重特異性抗体に追加的な機能性部分が付加されうるように修飾架橋剤と合成することができる。修飾架橋剤は任意のスルフヒドリル反応性部分の結合を可能にする。一実施形態において、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）がビスマレイミドに結合してビスマレイミドアセチルチオアセテート（ＢＭａｔａ）を形成する。マスクされたチオール基の脱保護後、スルフヒドリル反応性（又はチオール反応性）部分を有する任意の官能基が多重特異性抗体に結合しうる。
例示的チオール反応性試薬としては、多機能性リンカー試薬、捕捉、すなわちアフィニティー標識試薬（例えばビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えばフルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ポリスチレン、又はガラス）、又は薬物−リンカー中間体が挙げられる。チオール反応性試薬の一例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。修飾架橋剤を有するかかる多重特異性抗体又は抗体類似体は、薬物部分試薬又は他の標識とさらに反応させてもよい。多重特異性抗体又は抗体類似体と薬物−リンカー中間体との反応は、それぞれ多重特異性抗体薬物コンジュゲート又は抗体類似体薬物コンジュゲートをもたらす。
多重特異性抗体を作製するための他の多くの技術も本発明において用いることができる。それらの技術について記載している文献（参照により本明細書に援用される）としては、以下が挙げられる：（１）異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組換え共発現に関して、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐａｇｅ ５３７（１９８３））、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅ ３６５５（１９９１）；（２）「ノブインホール」操作に関して米国特許第５，７３１，１６８号明細書；（３）静電ステアリング効果を操作することによる抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子の作製に関して国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号パンフレット；（４）２つ以上の抗体又はフラグメントの架橋結合に関して米国特許第４，６７６，９８０号明細書、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２９，ｐａｇｅ ８１（１９８５）；（５）ロイシンジッパーを使用した二重特異抗体の作製に関してＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４８，ｐａｇｅｓ １５４７−１５５３（１９９２）；（６）「ダイアボディ」技術を用いた二重特異性抗体フラグメントの作製に関してＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐａｇｅｓ ６４４４−６４４８（１９９３）；（７）単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用に関してＧｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５２，ｐａｇｅ ５３６８（１９９４）；（８）三重特異性抗体の調製に関してＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）；及び（９）「オクトパス抗体」又は「デュアル可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含め、３つ以上の機能性抗原結合部位を有する操作された抗体に関して米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号明細書及びＷｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２５，ｐａｇｅｓ １２９０−１２９７（２００７）。
本発明の多重特異性抗体はまた、国際公開第２０１１／１０９７２６号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載される通りに生成してもよい。
一実施形態では、ＢＢＢを通過するための条件的活性型抗体を操作して多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）が作製される。この多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第一抗原結合部位と脳抗原に結合する第二抗原結合部位とを含む。少なくともＢＢＢ−Ｒに対する第一抗原結合部位は条件的活性型である。脳抗原は、脳で発現する抗原であり、抗体又は小分子によって標的化されうる。かかる抗原の例としては、限定なしに、以下が挙げられる：β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドβ（Ａβ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６。一実施形態において、抗原はＢＡＣＥ１である。
多重特異性抗体は、多重特異性抗体が結合しうる標的（抗原）の全て又はほとんどを含有する優先的標的組織に高い選択性を有する。例えば、二重特異性抗体は、抗原のうち一方のみを発現しうる非標的細胞と比較して、その二重特異性抗体によって認識される抗原の両方を発現する標的細胞に高い優先性を示すことにより、標的細胞に関する選択性を提供する。従って、この系のダイナミズムに起因して、平衡状態では非標的細胞と比べて標的細胞に結合する二重特異性抗体がより多くある。
条件的活性型抗体のＦｃ領域の操作
条件的活性型生物学的タンパク質が条件的活性型抗体である場合、条件的活性型抗体は、そのフラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ領域）で操作しうる。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する抗体のテール領域である。各抗原に特異的なＦａｂ領域と異なり、クラス内の全ての抗体のＦｃ領域が、抗体がいずれの抗原に結合するかに関わらず、各種について同じである。
Ｆｃ受容体は、タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。Ｆｃ受容体は、マクロファージ及び単球などの食細胞、好中球及び好酸球などの顆粒球、及び自然免疫系のリンパ球（ナチュラルキラー細胞）又は適応免疫系のリンパ球（例えばＢ細胞）を含む免疫系の幾つもの細胞に見られる。抗体と結合すると、Ｆｃ受容体によってこれらの細胞が活性化し、これらの細胞が抗体のＦａｂ領域に結合する抗原（微生物病原体など）を同定して取り除くことが可能となる。Ｆｃ受容体によって媒介される死滅機構には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が含まれる。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域を操作してＦｃ領域にアミノ酸置換などの突然変異が導入される。Ｆｃ領域に対するかかる置換により、血清中における変異抗体の半減期が増加しうる。例えば、ＩｇＧ抗体の半減期は、内皮細胞の表面上に発現してＩｇＧをｐＨ依存的様式で分解から保護する新生児受容体ＦｃＲｎとのそのｐＨ依存的結合と相関する。Ｆｃ領域における幾つかのアミノ酸置換、例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆが、ＦｃＲｎに対する抗体の結合親和性の増加及び抗体の半減期の延長を示している。
アミノ酸置換はまた、エフェクター機能を改変するためＦｃ領域に導入されてもよい。例えば、ＩｇＧクラスのヒト抗体はＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び補体第一成分（Ｃ１ｑ）に異なる親和性で結合し、異なる抗体間で極めて異なるエフェクター機能を生じる。ＩｇＧ抗体とＦｃγＲ又はＣ１ｑとの結合は、抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。２３３〜２３６位のヒト抗体ＩｇＧ１又はＩｇＧ２残基及び３２７、３３０及び３３１位の抗体ＩｇＧ４残基のアミノ酸置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大きく低減しうる。さらに、Ｋ３２２を含め、Ｆｃ領域における種々の位置のアラニン置換は、補体活性化を大幅に低減する。Ｆｃ領域を操作するさらに多くの例が、米国特許第８，３６２，２１０号明細書（全体として参照により援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、抗体のＦｃ領域は、抗原の認識が可能となるように操作しうる（米国特許出願公開第２０１０／０２５６３４０号明細書、参照により本明細書に援用される）。少なくとも１つ、好ましくは２つの余分なＦａｂフラグメントが抗体のＦｃ領域に連結されうる。一部の実施形態において、これらの余分なＦａｂフラグメントは条件的活性型である。例えば、ＢＢＢを通過するための本発明の抗体が、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに親和性を有し、且つ脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど又は全くないかかる余分なＦａｂフラグメントを含有しうる。この抗体はまた、複数の脳抗原に結合することもでき、従ってこれらの抗原が存在する部位に優先的に作用することに関してより高い選択性を有しうる。
医薬組成物
本開示は、少なくとも１つの組成物を提供するものであって、この組成物は、（ａ）条件的活性型生物学的タンパク質、及び（ｂ）適当な担体又は希釈剤、を有するものである。本開示はまた、少なくとも１つの組成物を提供するものであって、この組成物は、（ａ）本明細書に記載の核酸をエンコードする条件的活性型生物学的タンパク質、及び（ｂ）適当な担体又は希釈剤、を有するものである。担体又は希釈剤は、選択的に、既知の担体又は希釈剤に従って、薬学的に許容可能なものにすることができる。組成物はさらに、選択的に、追加して少なくとも１つの化合物、タンパク質、又は組成物を有することができる。
条件的活性型生物学的タンパク質は、薬学的に受容可能な塩の形をとっていてもよい。薬学的に受容可能な塩とは、製薬産業において治療用タンパク質の塩として一般的に用いられるものであって、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムなどの塩、並びにプロカイン、ジベンジルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、メチルグルカミン、タウリンなどのアミン塩、並びに塩酸塩、及び塩基性アミノ酸などの酸添加塩含むものである。
本開示は、さらに、本技術分野に既知である通り、及び／又は本明細書に記載されている通り、細胞、組織、臓器、動物又は患者における、少なくとも１つの親分子が関連する症状を、及び／或いは関連症状の前に、後に、又は間に、調節又は治療するための、治療有効量を投与するための、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の方法又は組成物を提供する。従って、本開示は、本開示の少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の有効量を有する組成物を、細胞、組織、臓器又は動物に接触させる工程或いはそれに投与する工程を有する、細胞、組織、臓器又は動物における、野生型タンパク質に関連する症状を、診断又は処置する方法を提供するものである。本方法は選択的に、さらに、細胞、組織、臓器又は動物に対し、有効量である０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇの、本開示の条件的活性型生物学的タンパク質を使用する工程を有していてもよい。本方法は選択的に、さらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）、ボーラス、膣、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される少なくとも１つの形態により、接触させる工程又は投与する工程を、使用する工程を有していてもよい。本方法は選択的に、さらに、条件的活性型生物学的タンパク質の接触又は投与の前に、同時に、又は後に、検出可能な標識又はレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗欝薬、抗精神病薬、興奮剤、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリン又はその類似物、細胞毒性薬又は他の抗癌剤、メトトレキセートのような代謝拮抗剤、増殖抑制剤、サイトカイン、或いはサイトカインアンタゴニストの少なくとも１つから選択される、少なくとも１つの化合物又はタンパク質の有効量を有する、少なくとも１つの組成物を投与する工程を有していてもよい。
本開示はさらに、本技術分野において既知である通り、及び／又は本明細書に記載されている通り、細胞、組織、臓器、動物又は患者における少なくとも１つの、野生型タンパク質が関連する症状を、及び／或いは関連症状の前に、後に、又は間に、診断するための、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の方法を提供する。
薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、及びその組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。従って、本発明の医薬組成物に好適な製剤は多種多様である。様々な液体担体、例えば緩衝生理食塩水などが使用されてもよい。そうした溶液は、無菌であり、一般的に不都合となる物質は入っていない。そうした溶液は、従来的な、既知の滅菌方法によって滅菌されてもよい。組成物は生理学的条件に近付けるのに必要とされる薬学的に受容される、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、等張性調節剤などの補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含んでいてもよい。こうした製剤中での条件的活性型生物学的タンパク質の濃度は幅広く変えてもよく、選んだ特定の投与形態に従って、流体容積、粘度、体重などに主に基づいて選択されるであろう。
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、又はＰＥＧ４００などの希釈剤中に懸濁された、有効量の放送された核酸のような、液体の液剤、（ｂ）それぞれ予め決定された量の活性成分を、液体、固形物、顆粒又はゼラチンとして含有する、カプセル剤、サシェ剤又は錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁剤、並びに（ｄ）好適な乳剤からなることができる。本発明の、経口投与のための医薬組成物及び製剤は、本技術分野で公知の薬学的に受容可能な担体を、適切な用量使用して配合することができる。そうした担体は、医薬品が、錠剤、丸剤、散剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、トローチ剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤など、患者の服用に好適な単位用量形に製剤化されることを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤によって製剤化されるが、場合により、錠剤又は糖衣剤の中核部を得るため、得られた混合物を磨り潰し、好適な追加の化合物を加えた後にその顆粒剤の混合物を処理する。好適な固体賦形剤は炭水化物又はタンパク質充填剤であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールなどの糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ又は他の植物に由来するデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；並びにアラビア及びトラガカントを含むガム：並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質を含む。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩のような、崩壊剤又は可溶化剤を加えてもよい。錠剤形は、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微晶質セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、水和剤、保存剤、香味料、色素、崩壊剤、及び薬学的に受容可能な担体のうちの１つ又は複数を含むことができる。
本発明は、水性懸濁剤の製造に適する賦形剤との混合物中に、条件的活性型生物学的タンパク質を有する水性懸濁剤を提供する。そのような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアガムのような懸濁化剤、及び天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えばポリエチレンソルビトールモノオレート）、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）のような核酸剤又は湿潤剤を含むことができる。水性懸濁剤はまた、エチル又はｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つ又は複数の保存剤、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の香味料、並びにスクロース、アスパルテーム又はサッカリンなどの１つ又は複数の甘味料を含有することができる。製剤は浸透圧について調整されてもよい。
トローチ剤形は、活性成分を通常、スクロース及びアカシア又はトラガカントといった香味料中に有し、また、香錠剤は、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア乳剤、ゲル剤などの不活性基材中に活性成分を有し、これらの活性成分に加え本技術分野で既知の担体を有することができる。条件的活性型生物学的タンパク質は、経口投与されるとき、消化から保護されていなければならないと理解されている。これは、一般的には、条件的活性型生物学的タンパク質を、酸性的及び酵素的な加水分解への耐性を付与する組成物と複合体を作ることによって、或いは条件的活性型生物学的タンパク質を、リポソームなどの適切な耐性を持つ担体中に包装することによって、達成される。タンパク質を消化から保護する方法は、本技術分野において公知である。医薬組成物は、例えば、リポソーム中に、又は活性成分を徐放できるようにする製剤中に、封入することができる。
包装された条件的活性型生物学的タンパク質は、単独で、又は他の好適な成分との組み合わせによって、エアロゾル製剤（例えば、噴霧吸入が可能なもの）に製剤化して、吸入法によって投与することができるエアロゾル製剤は、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素などの圧縮された許容される噴射剤に入れることができる。直腸投与に好適な製剤は、例えば、包装された核酸と坐剤基材からなる坐剤を含む。好適な坐剤は、天然又は合成のトリグリセリド又はパラフィン炭化水素を含み、さらに、包装された核酸と基材の組み合わせからなるゼラチンの直腸用カプセルを使うことも可能であり、その基材には、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、及びパラフィン炭化水素が含まれる。
本発明の経皮又は局所の送達組成物は、条件的活性型生物学的タンパク質に加えて、薬学的に受容可能な担体が、クリーム、軟膏、液体又はハイドロゲルの製剤中に含んでもいてもよく、添加成分が治療用タンパク質の送達に悪影響を与えない限り、その他の化合物を含んでいてもよい。従来の薬学的に受容可能な乳化剤、界面活性剤、懸濁化剤、抗酸化剤、浸透圧上昇剤、増量剤、希釈剤、保存剤を、加えてもよい。水に可溶のポリマーも担体として使用することができる。
非経口投与、例えば、関節内（関節部中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下の経路などによる投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、及び対象の被投与者の血液に対する等張性を製剤に与える溶質を含有しうる水性及び非水性の等張性無菌注射溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤を含有しうる水性及び非水性の無菌懸濁溶液とを含む。本発明の実施においては、組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、又はくも膜下腔内に投与することができる。一態様においては、非経口投与の形態は、条件的活性型生物学的タンパク質を有する組成物の投与に好適な方法である。組成物は、便宜的に、単位用量形で投与されてもよく、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．，１８ｔｈ Ｅｄ．，１９９０に記載されているような、医薬分野で公知である任意の方法によって調製されてもよい。静脈内投与の製剤は、無菌の水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、野菜由来のオイル、水素化ナフタレンなどの薬学的に受容可能な担体を含有していてもよい。米国特許第４３１８９０５号明細書の記載も参照及び適用のこと。
条件的活性型生物学的タンパク質を有する、包装された組成物の製剤は、アンプル及びバイアルのような、単位用量又は複数容量を封入された容器に入れることができる。注射用溶液及び懸濁液は、以前に記載した種類の無菌の散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
本開示はまた、本開示に従って、少なくとも１つの野生型タンパク質に関連する症状を診断するための、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の、組成物、装置及び／又は送達方法を提供するものである。
また提供するものは、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質及び少なくとも１つの薬学的に受容可能な担体又は希釈剤を有する組成物である。組成物は選択的に、さらに、検出可能な標識又はレポーター、細胞毒性薬又は他の抗癌剤、メトトレキセートのような代謝拮抗剤、増殖抑制剤、サイトカイン、又はサイトカインアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗欝薬、抗精神病薬、興奮剤、喘息薬、βアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリン又は類似物の少なくとも１つから選択される、少なくとも１つの化合物又はタンパク質の有効量を有することができる。
また提供するものは、本開示の少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質を有する医療装置であり、ここで装置は、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質を、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される、少なくとも１つの形態により接触させる工程又は投与する工程に好適なものである。
さらなる態様においては、本開示は、少なくとも１つの本開示の条件的活性型生物学的タンパク質又は断片を凍結乾燥された形態で有する第一の容器と、場合により、無菌の水、無菌の緩衝化水、或いはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール又はそれらの混合物からなる群から選択され、水性希釈剤中に入れられた少なくとも１つの保存剤を有する第二の容器とを、有するキットを提供するものである。一態様において、キットの第一の容器中の、条件的活性型生物学的タンパク質又は特定部分又は変異体の濃度は、第二の容器の内容物によって、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成される。別の態様においては、第二の容器はさらに等張剤を有する。別の態様においては、第二の容器はさらに生理学的に受容可能な緩衝液を有する。一態様においては、本開示は、少なくとも１つの野生型タンパク質が介在する症状を治療する方法であって、それを必要とする患者に、キットに提供されている製剤を投与する工程と、投与の前に再構成する工程とを有する、治療する方法を提供する。
また提供されるものは、ヒトの医薬品又は診断用途のための製品の物品であって、この製品の物品は、包装素材と、溶液又は少なくとも１つの本開示の条件的活性型生物学的タンパク質を凍結乾燥したものとを有する。製品の物品は、選択的に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）、ボーラス、膣、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮の、送達装置又は送達システムを、構成要素とする容器を有することができる。
本開示はさらに、本明細書中に記載されるあらゆる開示を提供するものである。
実施例１：温度変異体についてのマルチウォールアッセイ（例えば、９６ウェルアッセイ）についての概要
マルチウォールプレートの各ウェルに蛍光基質を加え、野生型の温度と、新規の型で低い反応温度の両方（例えば、上述の通り３７℃又は２５℃のいずれか）に適切な時間おく。蛍光プレートリーダーによって、適切な励起及び発光スペクトル（例えば、３２０ｎｍの励起スペクトル、４０５ｎｍの発光スペクトル）において、蛍光を測定することによって、蛍光を検出する。相対蛍光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔ：ＲＦＵ）を決定する。野生型分子からの上清及びプラスミド／ベクターで形質転換された細胞を、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして用いる。各サンプル、反応温度、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールにおいて、複製反応を行う。
低い温度（例えば、２５℃で活性化する変異体）で活性化し、野生型の温度（例えば、３７℃で、１０％、２０％、３０％、４０％、又はそれを超えて活性が低下する）で活性が低下し、すなわち活性の比が１．１以上か又はより大きい値以上（例えば２５℃又は３７℃における活性の比（２５℃／３７℃）が１．１以上か又はより大きい値以上）である、変異体を、推定温度感受性の一次ヒットとしてみなすことができる。この温度感受性一次ヒットを、次いで、同じアッセイを用いてスクリーニングし、全ての一次ヒットを確かめることができる。
実施例２：温度変異体の確認試験のための異なるアッセイ形式（例えば、１４ｍＬアッセイ）についての概要
温度感受性一次ヒットとして同定された変異体を、１４ｍＬの培養チューブで発現させ、それらの酵素活性を野生型の温度（例えば、３７℃）とより低い温度（例えば、２５℃）とにおいて測定する。タンパク質を発現させ、上述の通りにマルチウォール形式で用いるために精製するが、マルチウォール（９６ウェルプレート）でない異なる形式（１４ｍｌチューブ）における発現も別に行う。
各変異体の上清を、マルチウォールプレート、例えば９６ウェルのマイクロプレートに移動する。各チューブに蛍光基質を加え、指定の温度（野生型の温度、より低い温度）に適切な時間おく。野生型分子をポジティブコントロールとして使用し、ベクターのみにより形質転換した細胞からの上清をネガティブコントロールとして使用する。蛍光プレートリーダーによって、適切な発光スペクトル（例えば、３２０ｎｍの励起スペクトル、４０５ｎｍの発光スペクトル）において、蛍光を測定することによって、蛍光を検出する。相対蛍光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔ：ＲＦＵ）を決定する。各サンプル、反応温度、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールにおいて、複製反応を行う。
低い温度（例えば、２５℃）で活性化するが、野生型の温度（例えば、３７℃）で、少なくとも３０％以上の活性の低下を見せ、すなわち野生型の温度（例えば、３７℃）での活性に対する、低い温度（例えば２５℃）での活性の比が１．１以上である変異体を、温度感受性ヒットとして同定する。
低い温度（例えば、２５℃）における変異体の活性を、野生型の温度（例えば、３７℃）における野生型分子の活性と比較する。もし、低い温度（例えば、２５℃）において野生型分子よりも活性が高いことが、残存活性が１より大きく、好ましくは２以上であることで示される場合、且つ変異体が野生型の温度（３７℃）において野生型分子と比べたときに、全体的な活性の低下を示す場合、変異体の表現型が温度感受性変異体であると確認できる。
実施例３：発見したヒットのさらなる発達についての概要
必要な場合、新規のコンビナトリアル変異体ライブラリを、上述において同定した変異体ヒットの全て又は選択したものから作成する。この新規のライブラリを、選択した変異体それぞれについて、可能な全てのアミノ酸変異体を含むようにデザインし、新しいヒットについての記載の通り再度スクリーニングをすることができる。
しかしながら、前述の説明に本発明の多数の特徴及び利点が本発明の構造及び機能の詳細と共に示されているとはいえ、本開示は例示に過ぎず、添付の特許請求の範囲の表現に用いられる用語の広義の一般的意味による指示が及ぶ限りにおいて本発明の原理の範囲内で詳細、特に部分の形状、サイズ及び配置の内容に変更を加えうることが理解されるべきである。

Claims (84)

  1. 条件的活性型生物学的タンパク質を調製する方法であって、
    ｉ．野生型生物学的タンパク質を選択する工程と、
    ｉｉ．前記野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、
    ｉｉｉ．前記変異ＤＮＡを発現させて、変異生物学的タンパク質を得る工程と、
    ｉｖ．前記変異生物学的タンパク質及び前記野生型生物学的タンパク質を、滑液、腫瘍微小環境、幹細胞ニッチ及び罹患組織の細胞質からなる群から選択される第一位置の生理条件から選択される第一生理条件下での分析と、前記第一位置と異なる体内の第二位置の生理条件から選択される第二生理条件下での分析とに供する工程と、
    ｖ．（ａ）前記第一生理条件下での前記分析における前記野生型生物学的タンパク質と比較して増加した活性と、（ｂ）前記第二生理条件下での前記分析における前記野生型生物学的タンパク質と比較して低下した活性との両方を呈する前記変異生物学的タンパク質から前記条件的活性型生物学的タンパク質を選択する工程と
    を含む方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、前記タンパク質が抗体である、方法。
  3. 請求項１に記載の方法において、前記条件的活性型生物学的タンパク質を分子にコンジュゲートする工程をさらに含む、方法。
  4. 請求項２に記載の方法において、前記条件的活性型抗体を分子にコンジュゲートする工程をさらに含む、方法。
  5. 請求項４に記載の方法において、前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に共有結合を形成する工程を含む、方法。
  6. 請求項４に記載の方法において、前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に非共有結合を形成する工程を含む、方法。
  7. 請求項４に記載の方法において、前記分子が、サイトカイン、インターロイキン、酵素、ホルモン、成長因子、細胞傷害剤、化学療法薬、放射性粒子及び診断用薬剤からなる群から選択される、方法。
  8. 請求項４に記載の方法において、前記条件的活性型抗体のＦｃ領域に分子がコンジュゲートされる、方法。
  9. 請求項２に記載の方法において、前記条件的活性型抗体のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入する工程をさらに含む、方法。
  10. 請求項９に記載の方法において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が２つ以上のアミノ酸置換である、方法。
  11. 請求項１に記載の方法において、多重特異性となるように前記条件的活性型抗体を操作する工程をさらに含む、方法。
  12. 請求項１１に記載の方法において、前記操作された条件的活性型抗体が少なくとも２つの抗原に特異的に結合することができる、方法。
  13. 請求項１に記載の方法において、前記野生型生物学的タンパク質が抗体であり、且つ前記発達させる工程が、前記抗体のＦｃ領域を突然変異させる工程を含む、方法。
  14. 請求項１に記載の方法によって調製される条件的活性型生物学的タンパク質。
  15. 請求項１４に記載の条件的活性型生物学的タンパク質において、前記第二生理条件下で可逆的に不活性化される、条件的活性型生物学的タンパク質。
  16. 請求項１４に記載の条件的活性型生物学的タンパク質において、前記第一生理条件下で遊離する分子にコンジュゲートされる、条件的活性型生物学的タンパク質。
  17. 請求項１４に記載の条件的活性型生物学的タンパク質において、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴イメージング、光学イメージング、蛍光イメージング、陽電子放射断層撮影法、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線イメージング、ガンマ線イメージング、及びそれらの組み合わせから選択されるイメージング技術によって検出されうる診断用薬剤にコンジュゲートされる、条件的活性型生物学的タンパク質。
  18. 血液脳関門を通過するための条件的活性型抗体を調製する方法であって、
    ｉ．血液脳関門受容体に対する野生型抗体を選択する工程と、
    ｉｉ．前記野生型抗体をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、
    ｉｉｉ．前記変異ＤＮＡを発現させて、変異抗体を得る工程と、
    ｉｖ．前記変異抗体及び前記野生型抗体を血漿中における第一生理条件下での分析と、脳細胞外液中における第二生理条件下での分析とに供する工程と、
    ｖ．（ａ）前記第一生理条件下での前記分析における前記血液脳関門受容体に対する親和性と、（ｂ）前記第二生理条件下での前記分析における前記血液脳関門受容体に対する低下した親和性と前記第二生理条件下での前記分析における前記血液脳関門受容体に対する欠如した親和性とからなる群から選択される親和性との両方を呈する前記変異抗体から前記条件的活性型抗体を選択する工程と
    を含む方法。
  19. 請求項１８に記載の方法において、前記条件的活性型抗体を分子にコンジュゲートする工程をさらに含む、方法。
  20. 請求項１９に記載の方法において、前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に共有結合を形成する工程を含む、方法。
  21. 請求項１９に記載の方法において、前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に非共有結合を形成する工程を含む、方法。
  22. 請求項１９に記載の方法において、前記分子が、サイトカイン、インターロイキン、酵素、ホルモン、成長因子、細胞傷害剤、化学療法薬、放射性粒子、抗体及び診断用薬剤からなる群から選択される、方法。
  23. 請求項１９に記載の方法において、前記分子が前記条件的活性型抗体のＦｃ領域にコンジュゲートされる、方法。
  24. 請求項１８に記載の方法において、前記条件的活性型抗体のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入する工程をさらに含む、方法。
  25. 請求項２４に記載の方法において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が２つ以上のアミノ酸置換である、方法。
  26. 請求項１８に記載の方法において、多重特異性となるように前記条件的活性型抗体を操作する工程をさらに含む、方法。
  27. 請求項２６に記載の方法において、前記操作された条件的活性型抗体が少なくとも２つの抗原に特異的に結合することができる、方法。
  28. 請求項１８に記載の方法において、前記血液脳関門受容体が、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子からなる群から選択される、方法。
  29. 請求項１８に記載の方法において、前記第一生理条件下での前記分析における前記血液脳関門受容体に対する前記親和性が、前記血液脳関門受容体の天然リガンドの結合の阻害についてのＩＣ５０によって計測され、前記条件的活性型抗体の前記ＩＣ５０が約１ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５０ｎＭ〜約１００μＭ、又は約１００ｎＭ〜約１００μＭである、方法。
  30. 請求項１８に記載の方法において、前記発達させる工程が、前記抗体のＦｃ領域を突然変異させる工程を含む、方法。
  31. 請求項１８に記載の方法によって調製される条件的活性型抗体。
  32. 請求項２６に記載の方法によって調製される条件的活性型抗体。
  33. 請求項３１に記載の条件的活性型抗体において、前記第二生理条件下で可逆的に不活性化される、条件的活性型抗体。
  34. 請求項３１に記載の条件的活性型抗体において、前記第二生理条件下で遊離する分子にコンジュゲートされる、条件的活性型抗体。
  35. 請求項１に記載の方法において、タンパク質化学合成技術及び組換え技術から選択される技術によって前記条件的活性型生物学的タンパク質又は前記条件的活性型生物学的タンパク質の模倣体を作製する工程をさらに含む、方法。
  36. 請求項３５に記載の方法において、前記条件的活性型生物学的タンパク質が、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む模倣体である、方法。
  37. 請求項３５に記載の方法において、前記条件的活性型生物学的タンパク質が模倣体であり、且つ前記タンパク質化学合成技術によって作製される、方法。
  38. 請求項３７に記載の方法において、少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記タンパク質化学合成技術によって前記模倣体に導入される、方法。
  39. 請求項３５に記載の方法において、前記条件的活性型生物学的タンパク質が、前記組換え技術によって作製される組換えタンパク質である、方法。
  40. 請求項３９に記載の方法において、少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記組換え技術によって前記組換えタンパク質に導入される、方法。
  41. 請求項１に記載の方法において、前記野生型タンパク質が、ライブラリをスクリーニングすることによって同定される、方法。
  42. 請求項３７に記載の方法において、前記ライブラリがｃＤＮＡライブラリである、方法。
  43. 請求項３７に記載の方法において、前記野生型生物学的タンパク質が野生型抗体である、方法。
  44. 請求項３８に記載の方法において、前記野生型抗体が、ライブラリをスクリーニングすることによって選択される、方法。
  45. 請求項４０に記載の方法において、前記ライブラリが、ポリクローナル抗体ライブラリ、ファージディスプレイ抗体ライブラリ、モノクローナル抗体ライブラリから選択される、方法。
  46. 請求項１又は１８に記載の方法において、前記発達させる工程が、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、インビトロ突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド合成、及びそれらの組み合わせから選択される技術を含む、方法。
  47. 請求項１又は１８に記載の方法において、前記発現工程が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、アデノウイルス、及び植物細胞から選択される宿主細胞において前記変異ＤＮＡを発現させる工程を含む、方法。
  48. 請求項４３に記載の方法において、前記真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・プリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来の細胞から選択される、方法。
  49. 請求項４３に記載の方法において、前記昆虫細胞が、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞及びスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞から選択される、方法。
  50. 請求項４３に記載の方法において、前記哺乳類細胞が、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞及びＢＨＫ細胞から選択される、方法。
  51. 条件的活性型抗体コンジュゲートを調製する方法であって、
    ｉ．野生型抗体を選択する工程と、
    ｉｉ．前記野生型抗体をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、
    ｉｉｉ．前記変異ＤＮＡを発現させて、変異抗体を得る工程と、
    ｉｖ．前記変異抗体及び前記野生型抗体を正常生理条件下での分析と、異常条件下での分析とに供する工程と、
    ｖ．（ａ）前記正常生理条件下での前記分析における前記野生型抗体と比較した活性の低下と、（ｂ）前記異常条件下での前記分析における前記野生型抗体と比較した活性の増加との両方を呈する条件的活性型抗体を選択する工程と、
    ｖｉ．前記条件的活性型抗体を分子にコンジュゲートして、前記条件的活性型抗体コンジュゲートを作製する工程と
    を含む方法。
  52. 請求項４７に記載の方法において、前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に共有結合を形成する工程を含む、方法。
  53. 請求項４７に記載の方法において、前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に非共有結合を形成する工程を含む、方法。
  54. 請求項４７に記載の方法において、前記分子が、サイトカイン、インターロイキン、酵素、ホルモン、成長因子、細胞傷害剤、化学療法薬、放射性粒子及び診断用薬剤からなる群から選択される、方法。
  55. 請求項４７に記載の方法において、前記条件的活性型抗体のＦｃ領域に分子がコンジュゲートされる、方法。
  56. 請求項４７に記載の方法において、タンパク質化学合成技術及び組換え技術から選択される技術によって前記条件的活性型抗体又は前記条件的活性型抗体の模倣体形態を作製する工程をさらに含む、方法。
  57. 請求項５２に記載の方法において、条件的活性型抗体が、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む模倣体である、方法。
  58. 請求項５２に記載の方法において、前記条件的活性型抗体が、前記タンパク質合成技術によって作製される合成抗体である、方法。
  59. 請求項５５に記載の方法において、少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記タンパク質化学合成技術によって前記合成抗体に導入される、方法。
  60. 請求項５２に記載の方法において、前記条件的活性型抗体が、前記組換え技術によって作製される組換え抗体である、方法。
  61. 請求項５４に記載の方法において、少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記組換え技術によって前記組換え抗体に導入される、方法。
  62. 請求項４７に記載の方法において、前記野生型抗体が、ライブラリをスクリーニングすることによって選択される、方法。
  63. 請求項５６に記載の方法において、前記ライブラリが、ポリクローナル抗体ライブラリ、ファージディスプレイ抗体ライブラリ、及びモノクローナル抗体ライブラリから選択される、方法。
  64. 請求項４７に記載の方法において、前記発達させる工程が、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、インビトロ突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド合成、及びそれらの組み合わせから選択される技術を含む、方法。
  65. 請求項４７に記載の方法において、前記発現工程が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、アデノウイルス、及び植物細胞から選択される宿主細胞において前記変異ＤＮＡを発現させる工程を含む、方法。
  66. 請求項５９に記載の方法において、前記真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・プリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来の細胞から選択される、方法。
  67. 請求項５９に記載の方法において、前記昆虫細胞が、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞及びスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞から選択される、方法。
  68. 請求項５９に記載の方法において、前記哺乳類細胞が、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞及びＢＨＫ細胞から選択される、方法。
  69. 請求項４７に記載の方法によって調製される条件的活性型抗体コンジュエートにおいて、前記条件的活性型抗体が前記正常生理条件で不可逆的に不活性化される、条件的活性型抗体コンジュエート。
  70. 請求項４７に記載の条件的活性型抗体コンジュエートにおいて、前記条件的活性型抗体が前記野生型の正常生理条件で可逆的に不活性化される、条件的活性型抗体コンジュエート。
  71. 条件的活性型ウイルス粒子を調製する方法であって、
    ｉ．標的細胞上の標的タンパク質と結合する野生型生物学的タンパク質を選択する工程と、
    ｉｉ．前記野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、
    ｉｉｉ．前記変異ＤＮＡを発現させて、変異生物学的タンパク質を得る工程と、
    ｉｖ．前記変異生物学的タンパク質及び前記野生型生物学的タンパク質を正常生理条件下での分析と、異常条件下での分析とに供する工程と、
    ｖ．（ａ）前記正常生理条件での前記分析における前記野生型生物学的タンパク質と比較した前記標的タンパク質との結合親和性の低下と、（ｂ）前記異常条件下での前記分析における前記野生型生物学的タンパク質と比較した前記標的タンパク質との結合親和性の増加との両方を呈する条件的活性型生物学的タンパク質を選択する工程と、
    ｖｉ．前記条件的活性型生物学的タンパク質をウイルス粒子に挿入して、前記条件的活性型ウイルス粒子を作製する工程と
    を含む方法。
  72. 請求項６５に記載の方法において、前記条件的活性型生物学的タンパク質が組換え技術を用いて前記ウイルス粒子に挿入される、方法。
  73. 請求項６５に記載の方法において、前記標的タンパク質が前記標的細胞上の受容体である、方法。
  74. 請求項６５に記載の方法において、前記野生型タンパク質が、抗体、リガンド、受容体、又はそれらのフラグメントから選択される、方法。
  75. 請求項６５に記載の方法において、前記ウイルス粒子が、レトウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、方法。
  76. 請求項６５に記載の方法によって作製される条件的活性型ウイルス粒子。
  77. 請求項７０に記載の条件的活性型ウイルス粒子において、レトウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、条件的活性型ウイルス粒子。
  78. 請求項１に記載の方法において、前記第一生理条件が腫瘍微小環境における生理条件である、方法。
  79. 請求項７２に記載の方法において、前記生物学的タンパク質が、免疫チェックポイントにおけるタンパク質に対する抗体である、方法。
  80. 請求項７４に記載の方法において、前記免疫チェックポイントにおける前記タンパク質が、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、Ａ２ａＲ、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４から選択される、方法。
  81. 請求項７４に記載の方法において、前記抗体が、少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．６、又は少なくとも約１．８、又は少なくとも約２、又は少なくとも約２．５、又は少なくとも約３、又は少なくとも約５、又は少なくとも約７、又は少なくとも約８、又は少なくとも約９、又は少なくとも約１０、又は少なくとも約１５、又は少なくとも約２０の、前記腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質との結合活性の、非腫瘍微小環境における同じ免疫チェックポイングタンパク質との結合活性に対する比を有する、方法。
  82. 請求項７２に記載の方法において、前記腫瘍微小環境が悪性黒色腫の微小環境である、方法。
  83. 少なくとも２つの条件的活性型抗体であって、その各々が免疫チェックポイントにおける異なるタンパク質に対するものである、少なくとも２つの条件的活性型抗体を含む組成物。
  84. 請求項７７に記載の組成物において、表面分子に対する少なくとも１つの条件的活性型抗体をさらに含む、組成物。
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