CN108780094B

CN108780094B - 使用条件活性抗体的诊断方法

Info

Publication number: CN108780094B
Application number: CN201780016915.3A
Authority: CN
Inventors: 杰·M·肖特
Original assignee: Bioatla Inc
Current assignee: Bioatla Inc
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2037-01-10
Also published as: AU2017207263B2; EP3403098A4; AU2017207263A1; CN108780094A; EP3403098A1; WO2017123537A1; EP3403098B1

Abstract

本发明公开了一种检测来自个体的样品中的肿瘤细胞的方法。在该方法中，将样品包封以产生样品被包封在其中的胶囊。将胶囊在适于支持肿瘤细胞的细胞活性和生长的细胞培养条件下孵育，并使包封的样品与条件活性抗体接触，在肿瘤微环境中一条件的第一值下该条件活性抗体对一个或多个肿瘤细胞上的细胞表面蛋白的结合亲和力，与在该条件的第二值下该条件活性抗体对相同细胞表面蛋白的结合亲和力相比更高。

Description

使用条件活性抗体的诊断方法

相关申请数据

本申请是2016年1月12日提交的第62/277,750号美国临时申请的非临时申请，该美国临时申请的全部公开内容通过引用结合于此，如同其全文记载在本文中一样。

技术领域

本发明涉及通过检测来自个体的样品中的肿瘤细胞来进行癌症诊断的领域。具体地，本发明涉及通过使用条件活性抗体检测样品中的肿瘤细胞来诊断癌症的方法。

背景技术

在癌症的早期阶段，通常在出现临床症状之前，肿瘤开始将肿瘤细胞脱落到循环中。通常，直径约1mm的肿瘤血管化，导致多达4％的肿瘤细胞在24小时内脱落进入循环(Butler&Gullino，Cancer Res.，第35卷，第512-516页，1975)。这些肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(CTC)，并且通常(但并不完全)是从实体肿瘤脱落进入血流的上皮细胞。源于肿瘤的CTC是肿瘤的很好的指标，这对于诊断早期实体肿瘤尤为重要，早期实体肿瘤通常太小而无法通过常规方法检测，这些常规方法例如用于乳腺癌患者的乳房X光检查或用于肺癌患者的X射线检查。因此，在一些情况下，CTC的检测可以用作癌症的早期诊断工具，尤其是出现临床症状之前的早期癌症的诊断。

然而，CTC仅是循环中总的细胞中的非常小的一部分。例如，对于患有癌症的患者，估计血液中约一千万个细胞中仅一个是CTC。此外，各种类型的CTC在形态学及其包含的癌症特异性标志物方面根据其起源而彼此明显不同。例如，基于成纤维细胞的肿瘤细胞具有与由上皮细胞产生的乳腺癌细胞不同的形态。此外，源自乳腺癌的CTC通常具有CK+/DAPI+/CD45等标志物，而源自胰腺癌的CTC通常具有包括CK8+/CK19+的标志物。因此，区分源自不同癌症的CTC将需要使用不同的抗体靶向对不同癌症特异的不同标志物，并且任选地与收集细胞形态有关的信息组合。这些技术的复杂性使得通过在临床环境中检测CTC来进行癌症诊断非常具有挑战性。

用于检测、计数和/或表征血液样品中的CTC的自动化系统采用免疫磁性富集技术靶向癌症特异性细胞表面标志物。用于计数和/或表征CTC的另一种商业技术是光纤阵列扫描技术(FAST)，其使用针对癌症特异性细胞表面标志物的荧光标记抗体研究载玻片上的来自血液样品(作为细胞单层)的有核细胞，以鉴定载玻片上的CTC。第三种商业技术基于微流体或“CTC-芯片”技术。以乳腺癌为例，引导1-3mL全血流过78000个包被EpCam的微柱。EpCam+细胞与微柱结合，随后用针对乳腺癌特异性细胞表面标志物CK、CD45和DAPI的抗体进行染色。

除了这些商业方法之外，还提出了其他CTC检测方法。第8,445,225号美国专利公开了一种用于暴露、检测和表征患者血液中CTC的方法。该方法包括以下步骤：a)从患者获得血液样本；b)去除或降解与样品中存在的CTC的表面物理结合的蛋白、碳水化合物、细胞或它们的组合；c)分析步骤(b)中经暴露的CTC。步骤(b)用于显露出CTC的细胞表面而不会对CTC本身造成损害，从而暴露样品中的CTC。步骤(c)中的CTC分析涉及通过图像分析表征CTC的形态。该分析还可以包括检测CTC上的癌症特异性细胞表面标志物，其包括EGFR、HER2、ERCC1、CXCR4、EpCAM、E-钙粘着蛋白、粘蛋白-1、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRM1、雄激素受体、雌激素受体、孕酮受体、IGF1、cMET、EML4和白细胞相关受体(LAR)。

美国专利US 8,039,218公开了一种检测来自患者的体液中的CTC的方法。该方法包括从患者获得体液并检测体液中一组基因的表达，其中该组基因的表达表明体液中存在CTC。用于检测黑素瘤细胞的基因包括GalNAc-T、MAGE-A3、MART-1、PAX-3和TRP-2。用于检测癌细胞的基因包括C-Met、MAGE-A3、斯钙素-1、斯钙素-2、乳房珠蛋白、HSP27、GalNAc-T、CK20和β-HCG。

WO2014/126904公开了一种使用标记的垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)或血管活性肠肽(VIP)检测CTC的方法。由于VPAC1受体存在于来自许多不同癌症类型的CTC表面，PACAP和VIP均可与VPAC1受体结合并检测血液或尿液中存在的CTC。PACAP具有以下序列：His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gin-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys。据报道标记的肽能够以5个细胞/ml样品的浓度检测CTC，并正确地鉴定和区分CTC与样品中包含的上皮细胞和白细胞。

US 2012/0094275公开了一种高灵敏度测定法，其将免疫磁性富集与多参数流式细胞术或图像细胞术相结合，以检测、计数和表征血液样品中的CTC。该测定法使用铁磁流体，铁磁流体中掺入了用于检测源自不同类型癌症的CTC的不同抗体。存在于相同铁磁流体中的多种抗体似乎不会相互阻断或以其他方式相互干扰。这种铁磁流体能够特异性结合一种以上癌症的CTC。该测定法对于捕获具有低EpCAM表达但高表达其他癌症特异性标志物的CTC特别有用。

这些检测CTC的已知方法通常需要使用多种抗体来诊断不同类型的癌症，而无需提前知道个体可能具有的癌症类型。例如，为了能够检测大范围的常见癌症，抗体必须包括一种或多种特异性结合乳腺癌标志物的抗体，该乳腺癌标志物由MUC-1、雌激素、孕酮受体、组织蛋白酶D、p53、尿激酶型纤溶酶原激活物、表皮生长因子、表皮生长因子受体、BRCA1、BRCA2、CA27.29、CA15.5、前列腺特异性抗原、纤溶酶原激活物抑制剂和Her2-neu组成；一种或多种特异性结合前列腺癌标志物的抗体，该前列腺癌标志物由前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、胸腺素b-15、p53、HPC1基础前列腺基因、肌酸激酶和前列腺特异性膜抗原组成；一种或多种特异性结合结肠癌标志物的抗体，该结肠癌标志物由癌胚抗原、C蛋白、APC基因、p53和基质金属蛋白酶(MMP-9)组成；以及一种或多种特异性结合膀胱癌标志物的抗体，该膀胱癌标志物由核基质蛋白(NMP22)、Bard膀胱肿瘤抗原(BTA)和纤维蛋白降解产物(FDP)组成。当这些方法用于临床环境时，使用如此大量的抗体明显增加了成本和误诊率。

本发明提供了一种诊断方法，其在检测之前封装一个或多个CTC。细胞包封已在例如US 2014/0127290中描述，US 2014/0127290公开了将活细胞包封在微胶囊中的方法。在该方法中，细胞悬浮在微胶囊内的基质中。微胶囊包括具有悬浮或包封在其中的活细胞或细胞聚集体的核，以及围绕核的包含生物相容性水凝胶的壳。US 2012/0231443也公开了一种用于将细胞包封在微胶囊中的方法，微胶囊的直径小于约100μm。微胶囊可以进一步用壳聚糖和海藻酸盐包覆。

通常认为细胞的包封阻碍了被包封细胞的检测，因为包封将外层引入被包封的细胞，这使细胞的检测更加困难。本发明提供了一种诊断方法，其涉及被包封的CTC的检测。以使CTC更适合结合条件活性抗体(CAB)的方式包封CTC。

该技术使得能够以简单的程序使用单一抗体检测源自许多不同类型癌症的CTC。该诊断技术适用于许多不同类型的癌症，因此可以明显降低早期癌症的筛查和诊断成本，同时减少使用现有技术方法产生的假阳性的数量。

发明内容

一个方面，本发明提供一种检测含有细胞的样品中的肿瘤细胞的方法。该方法包括以下步骤：封装样品以产生样品封装在其中的胶囊；在适于支持肿瘤细胞的细胞活性和生长的细胞培养条件下孵育包封在胶囊中的样品；将来自经孵育的胶囊的被包封样品与条件活性抗体(CAB)接触，该条件活性抗体(CAB)在肿瘤微环境中一条件的第一值下对肿瘤细胞的细胞表面蛋白的结合亲和力，与在该条件的第二值下对相同细胞表面蛋白的结合亲和力相比更高。该条件的第二值可以是正常的生理条件。在每个实施方案中，肿瘤细胞可以是或可以包含循环肿瘤细胞。

另一个方面，前述方法的胶囊可包括核，核包含悬浮于其中的细胞；以及包含生物相容性聚合物的壳。该核可包含聚合物基质。

另一个方面，前述方法中的任何一种方法的核还包含适于支持核中肿瘤细胞的细胞活性和生长的蛋白和营养素。

另一个方面，前述方法中的任何一种方法的CAB在接触步骤之前可以首先与可检测标记缀合，该可检测标记可以是基于光吸收、荧光、反射、光散射、磷光、发光性质、放射性质、核磁共振性质或顺磁性质的可直接或间接检测的分子或离子。

另一个方面，前述方法中的任何一种方法的细胞表面蛋白可以是持家基因的蛋白产物，其可以选自AP2S1、CD81、GPAA1、LGALS9、MGAT2、MGAT4B、VAMP3、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13和SLC2A14。

另一个方面，前述方法中的任何一种方法的CAB在该条件的第一值下对细胞表面蛋白的结合亲和力与在该条件的第二值下对相同细胞表面蛋白的结合亲和力相比，高至少5倍，或至少10倍，或至少20倍，或至少50倍，或至少70倍，或至少100倍，或至少200倍，或至少500倍，或至少1000倍。

另一个方面，前述方法中的任何一种检测细胞的方法可以进一步包括扩增样品中的细胞群的步骤。

另一个方面，前述方法中的任何一种检测细胞的方法可以进一步包括富集样品中细胞群的步骤。

另一个方面，前述方法中的任何一种检测细胞的方法可以进一步包括暴露样品中的肿瘤细胞的步骤。

本发明还提供一种检测含有细胞的样品中的肿瘤细胞的方法。该方法包括以下步骤：

包封样品以产生样品被包封在其中的胶囊；

在适于支持肿瘤细胞的细胞活性和生长的细胞培养条件下孵育包封有样品的胶囊；

使该经孵育的胶囊的被包封样品与条件活性抗体接触，该条件活性抗体在肿瘤微环境中一条件的第一值下对肿瘤细胞上的细胞表面蛋白的结合亲和力，与在该条件的第二值下对相同细胞表面蛋白的结合亲和力相比更高。

在前述实施方案中，胶囊可包含核，该核包含其中悬浮有细胞的样品；以及包含生物相容性聚合物的壳。在每个前述实施方案中，核可包含聚合物基质。

在每个前述实施方案中，生物相容性聚合物可选自蛋白和多糖。

在每个前述实施方案中，蛋白可选自白蛋白、胶原蛋白、合成聚氨基酸和醇溶蛋白。

在每个前述实施方案中，多糖可选自海藻酸盐、纤维素和肝素。

在每个前述实施方案中，纤维素可以是酰基取代的纤维素。

在每个前述实施方案中，合成聚合物可选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯聚合物、酰基取代的纤维素醋酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃和聚环氧乙烷。

在每个前述实施方案中，核可包含适于支持核中肿瘤细胞的细胞活性和生长的蛋白和营养素。在前述实施方案中，蛋白可选自胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、弹性蛋白和弹性蛋白样多肽。

在每个前述实施方案中，营养素可包含营养素渗透剂。

在每个前述实施方案中，胶囊可具有约10μm～约1000μm、或约20μm～约1000μm、或约50μm～约1000μm、或约50μm～约800μm、或约100μm～约700μm的直径。

在每个前述实施方案中，培养步骤可以进行至少约3小时。

在每个前述实施方案中，培养步骤可以进行约12小时～约36小时，或约18小时～约24小时。

在每个前述实施方案中，条件活性抗体可以与可检测标记缀合。在前述实施方案中，可检测标记可以是基于光吸收、荧光、反射、光散射、磷光、发光性质、放射性质、核磁共振性质或顺磁性质的可直接或间接检测的分子或离子。

在每个前述实施方案中，可检测标记可以是荧光标记。

在每个前述实施方案中，细胞表面蛋白可以是持家基因的蛋白产物。

在每个前述实施方案中，持家基因可选自AP2S1、CD81、GPAA1、LGALS9、MGAT2、MGAT4B、VAMP3、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13和SLC2A14。

在每个前述实施方案中，细胞表面蛋白可选自ABCA7、ABCC1、ABCC5、ABHD3、ACKR3、ADAM10、AQP1、AQP3、ATP13A3、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B4、ATP6AP1、ATP6V0A2、BACE1、BMPR2、BNIP2、BST2、BTN2A1、BTN3A3、C12orf76、C17orf62、C1orf27、CCDC107、CD4、CD44、CD46、CD81、CD9、CD99L2、CDAN1、CDIPT、CLCN6、CNNM4、CYP20A1、DCBLD2、DHRS7B、ERBB2、ETNK1、FAM210B、GINM1、GPI、GRAMD1A、HELZ、HERPUD1、HMOX1、HPS3、ICAM1、IFI30、IFRD1、IL15RA、IL6ST、ITGA7、ITGB1、ITGB4、ITGB5、ITSN1、JAG1、LAIR1、LMTK2、LRBA、LRP12、LSR、MACF1、MADD、MCAM、MCOLN1、MET、MICAL3、MPV17L2、NCKIPSD、NDC1、NEO1、NOTCH2、PANX1、PDLIM5、PFDN1、PGAP3、PGRMC2、PHLDB2、PIGN、PIGQ、PIGW、PKN2、PTPRS、PVR、RALGAPA2、RNF145、RNF149、SC5D、SCAMP4、SDC2、SDC4、SLC12A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC17A5、SLC19A1、SLC1A5、SLC30A1、SLC38A6、SLC38A7、SLC39A14、SLC3A2、SLC43A1、SLC46A1、SLC46A3、SLC4A2、SLC4A7、SLC7A5、SLC9A1、SMAGP、SORT1、SPG11、SPINT2、SPPL2B、SPPL3、SRD5A3、SRPRB、STX18、STX4、SYVN1、TAPT1、TAZ、TBC1D5、TGFBR2、TM2D2、TMEM183A、TMEM205、TMEM218、TMEM222、TMEM245、TMEM258、TMEM50A、TMEM63B、TMEM97、TNFRSF12A、TXNDC11、UBR2、UQCC1、VSIG4、WWP1、YIPF4、ZDHHC20和ZDHHC5。

在每个前述实施方案中，该条件的第一值可以是6.0～6.8范围内的pH，该条件的第二值可以是7.0～7.8范围内的pH。

在每个前述实施方案中，该条件的第一值可以是6.2～6.8范围内的pH，该条件的第二值可以是7.2～7.6范围内的pH。

在每个前述实施方案中，该条件的第一值可以是约1mmHg～约20mmHg范围内的氧分压，该条件的第二值可以是约30mmHg～约50mmHg范围内的氧分压。

在每个前述实施方案中，该条件的第一值可以是约5mmHg～约10mmHg范围内的氧分压，该条件的第二值可以是约30mmHg～约50mmHg范围内的氧分压。

在每个前述实施方案中，该条件的第一值可以是约0.05mM～约0.5mM范围内的葡萄糖浓度，该条件的第二值可以是约2.5mM～约10mM范围内的葡萄糖浓度。

在每个前述实施方案中，条件活性抗体在该条件的第一值下对细胞表面蛋白的结合亲和力，比在该条件的第二值下对相同细胞表面蛋白的结合亲和力高至少约5倍，或至少约10倍，或至少约20倍，或至少约50倍，或至少约70倍，或至少约100倍，或至少约200倍，或至少约500倍，或至少约700倍，或至少约1000倍。

在每个前述实施方案中，条件活性抗体可以是多特异性抗体。

在每个前述实施方案中，该方法可以进一步包括扩增样品中细胞群的步骤。在前述实施方案中，扩增细胞群的步骤可包括在适于肿瘤细胞生长的细胞培养条件下培养样品中的细胞。在前述实施方案中，培养可以进行约3天～约21天，或约5天～约18天，或约7天～约15天。

在每个前述实施方案中，该方法可以进一步包括富集样品中细胞群的步骤。在前述实施方案中，富集步骤可包括使用选自分级分离、红细胞裂解、细胞分选、过滤、粘附、密度离心和氯化铵裂解的技术。

在每个前述实施方案中，该方法可以进一步包括暴露样品中的肿瘤细胞的步骤。在前述实施方案中，暴露步骤可包括使用选自酶处理、机械处理、电处理、电磁处理、化学处理及它们的组合的技术。

在每个前述实施方案中，该条件的第二值是正常生理条件。

在每个前述实施方案中，该方法可以进一步包括基于该条件活性抗体在该接触步骤中的结合来确定样品中肿瘤细胞的存在的步骤。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施方案的用于检测样品中CTC的方法流程图。

图2示出针对Axl的细胞外结构域的条件活性抗体。该条件活性抗体在pH6.0下比在pH7.4下更具活性。

图3示出条件活性抗体对Axl细胞外结构域的选择性。测定pH6.0下对一靶标的结合亲和力与pH7.4下对相同靶标的结合亲和力的比值作为选择性。

图4是尺寸排阻色谱，其表明条件活性抗体不聚集，如实施例1中所述。

图5示出通过如实施例1中所述的表面等离子共振(SPR)测定法测量的条件活性抗体的结合和解离速率。

图6A和图6B各自示出通过实施例1中的SPR测定法测量的条件活性抗体的选择性。

具体实施方式

定义

为了便于理解本文提供的实施方案，本文定义了某些经常出现的术语。

关于测量量，本文所用的术语“约”是指在进行测量并一定程度上谨慎操作下技术人员所预期的与测量目标和所用测量设备的精度相称的测量量的正常变化。除非另有说明，否则“约”是指所提供值的+/-10％的变化。本文所用的术语“生物相容”是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对材料的接受者无毒并且不会对接受者造成任何明显的不利影响。

本文所用的术语“结合”是指抗体的可变区或Fv与抗原的相互作用，该相互作用取决于抗原上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体可变区或Fv识别并结合特定蛋白结构而不是一般蛋白。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异地结合”是指与其他蛋白相比，抗体可变区或Fv以更频繁、更快速、更长时间和/或更大亲和力与特定抗原结合或缔合。例如，与和其他抗原结合相比，抗体可变区或Fv以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间特异性结合其抗原。再例如，抗体可变区或Fv与细胞表面蛋白(抗原)结合的亲和力大于其对相关蛋白或其他细胞表面蛋白或对由多反应性天然抗体(即已知与人类天然存在的各种抗原结合的天然存在的抗体)通常识别的抗原的亲和力。然而，“特异性结合”不必然需要另一种抗原的排他性结合或不可检测的结合，这是术语“选择性结合”的意思。在一个实例中，抗体可变区或Fv(或其他结合区)结合抗原的“特异性结合”，意指抗体可变区或Fv以100nM以下的平衡常数(KD)与抗原结合，例如50nM以下，例如20nM以下，例如15nM以下，或10nM以下，或5nM以下，2nM以下，或1nM以下。

本文所用的术语“样品”是指从个体获得的样品，个体通常是患有癌症的个体，怀疑患有癌症(例如，表现出与癌症相关的一种或多种症状)，具有患癌症风险的个体(例如，由于易感性或暴露于致癌物)，已经接受癌症治疗的个体或接受癌症筛查的个体。理想地，样品取自哺乳动物，例如犬科动物、猫科动物、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、牛、绵羊或灵长类动物(例如人类)。在一个具体实施方案中，样品取自人体。在一个优选的实施方案中，样品是体液，包括血液、淋巴液、唾液、粘液、痰液、脓液、尿液、粪便、胃肠分泌物、耳蜗液、滑液、脑脊液、泪液、玻璃体液、精液、阴道分泌物和乳腺分泌物中的或从它们中获取的一种或多种成分。在特定的实施方案中，样品是血液、尿液或脑脊髓液。

本文所用的术语“细胞表面蛋白”是指展示在细胞表面上使得其能够被另一种分子(例如抗体)结合的蛋白。细胞表面蛋白可以物理地嵌入细胞的脂质膜中，或者仅结合或聚集到细胞表面。在某些实施方案中，细胞表面蛋白可以是翻译后修饰的(例如，可以是糖蛋白或磷蛋白)，并且抗体可以与该修饰结合。在某些实施方案中，细胞表面蛋白可以是复合物的一部分，而抗体可以与作为复合物的一部分的蛋白或复合物结合。例如，细胞表面蛋白可包括但不限于表面抗原、跨膜受体或共受体、与表面结合的大分子，例如结合或聚集的蛋白或碳水化合物、内部细胞组分等。

本文所用的术语“循环肿瘤细胞”(CTC)是指从原发肿瘤释放或脱落并运输/释放到循环系统(例如血液和淋巴)中的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞可以进入与CTC从其脱落的肿瘤位置不同的组织或器官，并成为继发性肿瘤或转移性肿瘤。此外，为了本发明的目的，在患有白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的受试者的血液中发现的血癌细胞被认为是循环肿瘤细胞。

本文所用的术语“肿瘤”是指形成肿瘤细胞的异常包块的任何赘生性细胞生长和增殖。肿瘤可以是恶性的或良性的，包括所有癌前的和癌性的细胞及组织。已知许多类型的肿瘤会转移和脱落循环肿瘤细胞或者是转移性的，例如，由已经转移的原发性肿瘤引起的继发性肿瘤。肿瘤可发生在以下器官或系统中：脑、心脏、肺、胃肠道、泌尿生殖道、肝脏、骨骼、神经系统、妇科、血液、皮肤、乳房和肾上腺。非限制性的肿瘤类型包括神经胶质瘤(神经鞘瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤)、神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、甲状腺瘤、脑膜瘤、肾上腺皮质癌、成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾癌、各种类型的血管癌、成骨细胞性骨癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫平滑肌瘤、唾液腺癌、脉络丛癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和巨核细胞白血病，皮肤癌包括恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、痣发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩、肉瘤例如纤维肉瘤或血管肉瘤和黑色素瘤。

本文所用的术语“条件”是指在个体的微环境中可能遇到的任何条件，至少包括温度，pH，小有机分子例如葡萄糖、乳酸、丙酮酸、营养成分、其他代谢物等的浓度，诸如氧气、二氧化碳和电解质的分子的浓度，以及细胞类型，营养物可用性和渗透压。

本文所用的术语“条件活性抗体”或“CAB”是指变体或突变的野生型抗体，其在一个或多个条件下与CAB源自的亲本野生型抗体相比具有更高或更低的活性。该CAB还可以在身体的一个或多个选定区域中表现出活性和/或在异常或允许的生理条件下表现出增加的或降低的活性。正常的生理条件是在本文所述的样品中被认为是在正常范围内的温度，pH，小有机分子例如葡萄糖、乳酸、丙酮酸、营养成分、其他代谢物等的浓度，氧气、二氧化碳和电解质等分子的浓度，以及细胞类型，营养物可用性，渗透压，其中样品是基本上不含CTC的样品或具有不含CTC的胶囊的样品。异常条件是指偏离个体中某部位的通常可接受的范围的条件。例如，正常血液中遇到的条件被认为是正常的生理条件，而肿瘤微环境中遇到的一个或多个条件如果与该受试者中该部位的正常条件不同则可以被认为是异常条件。一个方面，CAB在一个或多个正常生理条件下实际上是无活性的，但在一个或多个异常条件下，例如在肿瘤微环境中的异常条件下是有活性的。例如，CAB在受试者的正常体温下实际上可以是无活性的，但可以在较高温度下，例如在该受试者的肿瘤微环境中可能遇到的温度下是有活性的。

另一个方面，CAB可以在正常生理条件下可逆地或不可逆地失活。另一个方面，CAB在正常含氧血液中是无活性的或具有低活性，而在含氧较少的环境中(例如可能存在于肿瘤中)更具活性。另一个方面，CAB在正常生理pH例如7.2～7.8下是无活性的或具有低活性，而在酸性pH例如6.0～7.0或6.2～6.8下(在肿瘤微环境中可能遇到)更具活性。

本文所用的术语“可检测标记”是指通过物理或化学方式直接或间接检测或测量的任何物质，其指示样品中一个或多个CTC的存在。有用的可检测标记的代表性实例包括但不限于以下：基于光吸收、荧光、反射、光散射、磷光或发光性质的可直接或间接检测的分子或离子；可通过其放射性质检测的分子或离子；可通过其核磁共振或顺磁性质检测的分子或离子。例如，基于光吸收或荧光可间接检测的分子的组中包括各种酶，所述酶引起适当的底物转化，例如从非光吸收分子转化为光吸收分子，或从非荧光分子转变为荧光分子。

本文所用的术语“诊断”是指确定个体对疾病或障碍的易感性，确定个体目前是否受疾病或障碍影响，受疾病或障碍影响的受试者的预后(例如，转移前或转移性癌症状态的鉴定，癌症的阶段，或癌症对治疗的反应性)和疗效测定(例如，监测受试者的状况以提供关于治疗的效果或功效的信息)。在某些实施方案中，本发明的诊断方法在检测早期癌症中特别有用。

本文所用的术语“早期癌症”是指处于发展的早期阶段，不能通过常规癌症筛查方法检测到的癌症。早期癌症的一个实例是肿瘤太小而不能通过常规方法检测到，例如用于乳腺癌患者的乳房X线照相术或用于肺癌患者的X射线。早期癌症包括在晚期癌症之前可发生的任何癌前状态或早期癌症状态，包括但不限于良性状态，侵袭性癌症之前的状态和/或形成癌性肿瘤之前的状态。晚期癌症是使用常规癌症筛查方法可检测到的癌症。关于乳腺癌，“早期癌症”包括在阶段I、阶段II、阶段III或阶段IV癌症之前的任何癌前状态，如下文中更详细描述的。早期乳腺癌的实例包括良性状态(例如，非增殖性病变、没有异型性的增殖性病变和具有异型性的增殖性病变)，发育不良和/或原位癌。对于乳腺癌以外的癌症(例如，胶质瘤、膀胱癌、结肠癌、食道癌、肝细胞癌、喉癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌或胃癌)，“早期癌症”包括晚期癌症之前的任何癌前状态，晚期癌症例如对应于乳腺癌的I期、II期、III期或IV期的那些状态。

本文所用术语“电解质”用于定义携带电荷的血液或其他体液中的矿物质。例如，一个方面，正常生理条件和异常条件可以是“电解质浓度”的条件。一个方面，待测试的电解质浓度选自离子化的钙、钠、钾、镁、氯化物、碳酸氢盐和磷酸盐浓度中的一种或多种。例如，一个方面，血清钙的正常范围(即正常生理条件)为8.5～10.2mg/dL。在这一方面，异常血清钙浓度可以选自高于或低于正常范围，在另一个实例中，一个方面，血清氯化物的正常范围(即正常生理条件)是每升96～106毫当量(mEq/L)。在这一方面，异常血清氯化物浓度可选自高于或低于正常范围，在另一个实例中，一个方面，血清镁的正常范围(即正常生理条件)为1.7～2.2mg/dL。在这一方面，异常血清镁浓度可选自高于或低于正常范围，在另一个实例中，一个方面，血清磷的正常范围为2.4～4.1mg/dL。在这一方面，异常血清磷浓度可选自高于或低于正常范围。在另一个实例中，一个方面，血清或血液钠的正常范围为135～145mEq/L。在这一方面，异常血清或血液钠浓度可选自高于或低于正常范围。在另一个实例中，一个方面，血清或血液钾的正常范围为3.7～5.2mEq/L。在这一方面，异常血清或血液钾浓度可选自高于或低于正常范围。另一个方面，血清碳酸氢盐的正常范围为20～29mEq/L。在这一方面，异常血清或血液碳酸氢盐浓度可选自高于或低于正常范围。在一个不同的方面，碳酸氢盐水平可用于指示血液酸度(pH)的正常水平。术语“电解质浓度”也可用于定义除血液或血浆之外的组织或体液中的特定电解质的条件。在这种情况下，正常生理条件被认为是该组织或体液的临床正常范围。在这一方面，异常组织或体液电解质浓度可以选自高于或低于正常范围，例如在肿瘤微环境中。

本文所用的术语“表位”是指抗原上的抗原决定簇，例如酶多肽，抗体(例如酶特异性抗体)的互补位与所述抗原决定簇相结合。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。因此，表位是能够形成与抗体可变区形成结合相互作用的抗原或其他大分子的一部分。通常，这种结合相互作用表现为与可变区CDR中的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。

本文所用的术语“演化”或“演化的”是指使用一种或多种诱变方法产生编码新多肽的新多核苷酸，该新多肽本身是改进的生物分子和/或有助于生成另一种改进的生物分子。在一个特定的非限制性方面，本发明涉及从亲本野生型蛋白演化条件活性生物蛋白。在一个方面，例如，演化涉及实施美国专利申请公开2009/0130718中公开的非随机多核苷酸嵌合和非随机定点诱变的方法。更具体地，本发明提供了用于演化条件活性生物酶的方法，该生物酶与野生型酶亲本分子相比在正常生理条件下表现出降低的活性，但与野生型酶相比在一个或多个异常条件下表现出增强的活性。

本文所用的术语“荧光标记”是指可以与另一分子(例如CAB)共价连接的荧光团，该连接通常通过使用选择性结合包含在靶分子中的官能团的荧光团的反应性衍生物来实现。荧光标记包括但不限于荧光素(FITC)、罗丹明(FAM、R6G、TET、TAMRA、JOE、HEX、钙红、VIC和ROX)、德克萨斯红、BODIPY、香豆素、花青染料(噻唑橙[TO]、恶唑黄[YO]、TOTO、YOYO、Cy3、Cy5)、Alexa染料、绿色荧光蛋白(GFP)和藻红蛋白(PE)。

术语“全长抗体”是指包含抗原结合可变区(V_H或V_L)以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将全长抗体分为不同的“类别”。全长抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

本文所用的术语“水凝胶”是指当有机聚合物(天然的或合成的)通过共价键、离子键或氢键交联形成捕获水分子的三维开放晶格结构以形成凝胶时形成的物质。生物相容性水凝胶是指形成凝胶的聚合物，其对包埋在其中的活细胞无毒，并且允许氧和营养物充分扩散到被包埋的细胞以维持活力。

本文所用的术语“微胶囊”是指平均直径为约10μm～约1000μm、或约20μm～约1000μm、或约50μm～约1000μm、或约50μm～约800μm、或约100μm～约700μm的胶囊，其具有围绕液体或生物相容性基质的壳。微胶囊可含有分散在液体或生物相容性基质中的一个或多个CTC，从而“包封”CTC。在某些实施方案中，CTC可以被包封在比微胶囊大的，大至2000μm或3000μm的胶囊中。在本申请中，微胶囊和较大的胶囊通常称为“胶囊”。CTC悬浮在胶囊内的液体或基质中。例如，基质可以是粘性含水液体或水凝胶。在某些实施方案中，液体或水凝胶含有适于促进细胞活性例如存活、附着或生长的蛋白。例如，蛋白可以是胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、弹性蛋白或弹性蛋白样多肽(ELP)或它们的衍生物。此外，液体或基质还可含有CTC存活和生长所必需的各种营养素。

本文所用的术语“微环境”是指组织或身体的任何部分或区域，其与组织的其他区域或身体的其他区域具有至少一个恒定的或暂时的、物理的或化学的差异。对于肿瘤，本文所用的术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的环境，其是肿瘤内的非细胞区域和直接位于肿瘤组织外的区域，但不属于癌细胞本身的细胞内区室。肿瘤与肿瘤微环境密切相关并不断相互作用。肿瘤可以改变其微环境，微环境可以影响肿瘤的生长和扩散。通常，肿瘤微环境具有6.0～7.0范围内的低pH，更通常在6.2～6.8的范围内，最通常在6.4～6.8的范围内。与血浆相比，还已知肿瘤微环境具有较低浓度的葡萄糖和其他营养素，以及较高浓度的乳酸。此外，肿瘤微环境的温度可以比正常生理温度高0.3℃～1℃。在下述其他出版物中已经讨论了肿瘤微环境，Gillies等，“MRI of the Tumor Microenvironment”，Journal ofMagnetic Resonance Imaging，第16卷，第430～450页，2002；“Tumor microenvironment”Dietmar W.Siemann编辑，Wiley-Blacwell，2010；“The tumor microenvironment”RebeccaG.Bagley编辑，Springer，2010；Swarts等，“Tumor Microenvironment Complexity:Emerging Roles in Cancer Therapy，”CancerRes，第72卷，第2473～2480页，2012；Estrella等，“Acidity Generated by the Tumor Microenvironment Drives LocalInvasion，”Cancer Res.，第73卷，第1524～1535页，2013；和Lorusso等，“The tumormicroenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis，”Histochem Cell Biol，第130卷，第1091～1103页，2008。术语“非肿瘤微环境”是指不临近肿瘤的微环境。

本文所用的术语“多特异性抗体”是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的多特异性抗体可以结合BBB-R和脑抗原。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)。还考虑了具有两个、三个或更多个(例如四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体(参见，例如，US 2002/0004587A1)。

本文所用的术语“突变”是指野生型核酸序列的改变或野生型肽序列的改变。此类突变可以是点突变，例如转换或颠换。突变可以是缺失、插入或重复。

如本文所用的应用于分子的术语“天然存在的”是指分子可以在自然界中发现。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，其可以从自然来源中分离出来并且没有在实验室中被人为修饰。通常，术语“天然存在的”是指存在于非病理(未患病)个体中的分子，例如为物种中的典型分子。关于氨基酸，天然存在的氨基酸包括通常在天然蛋白中发现的20种氨基酸。

本文使用的术语“正常生理条件”或“野生型操作条件”是指被认为落在实质上不含CTC的样品或具有不含CTC的胶囊的样品的正常范围内的温度、pH、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧分压和电解质浓度条件。正常生理条件包括37～37.5℃的正常生理温度，正常生理pH7.2～7.8和血浆中氧、乳酸和葡萄糖的正常浓度，它们可由本领域技术人员容易地确定。在某些实施方案中，该条件包括温度、pH、小有机分子(例如葡萄糖、乳酸、丙酮酸、营养成分、其他代谢物等)的浓度、分子(例如氧气，二氧化碳和电解质)的浓度以及细胞类型、营养素可用性和渗透压。

本文所用的术语“暴露”和“暴露于”通常涉及改变处于其天然状态的CTC，以使CTC更易于检测、分析、表征和/或进一步处理。一种暴露CTC的方法是富集。暴露CTC可以包括去除和/或降解所有的或一部分与在CTC的表面聚集和/或与CTC表面和/或表面组分结合的生物分子。例如，暴露CTC可以包括通过去除、降解或改变CTC表面聚集和/或物理结合的细胞(例如，血小板)，碳水化合物和/或蛋白(例如，纤维蛋白)来暴露或显露CTC，以接近一种或多种CTC细胞组分，例如表面组分，包括例如癌症表面标志物和其他表面结合的细胞组分以及细胞内组分，例如核酸和其他细胞内组分(例如，核蛋白和细胞溶质蛋白等)。因此，“暴露”和/或“显露”旨在改变处于其天然状态的CTC的特征，该特征有助于掩盖CTC使其免受宿主的免疫识别或响应，和/或使CTC更适合于检测、分析、表征和/或进一步处理。暴露CTC还可以包括改变CTC细胞组分，例如细胞表面标志物的表位，或与CTC物理结合和/或聚集的蛋白。

术语“患者”、“个体”或“对象”是指作为治疗目标的动物，例如哺乳动物，例如人类。个体或患者可以是雄性或雌性。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，例如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或对象是人。

本文所用的术语“生理条件”是指温度、pH、渗透压、离子强度、粘度等生物化学参数，所述参数与活的生物体相容，和/或通常存在于活的经培养的酵母细胞或哺乳动物细胞的细胞内。例如，在典型的实验室培养条件下生长的酵母细胞中的细胞内条件是生理条件。正常的生理条件是指在实质上不含CTC的样品或不含CTC的胶囊中，被认为落在患者的正常范围内的温度、pH、小有机分子(例如葡萄糖、乳酸、丙酮酸、营养成分、其他代谢物等)的浓度、分子(例如氧气、二氧化碳、电解质)的浓度以及细胞类型、营养物可用性和渗透压条件。

本文所用的术语“多表位特异性”是指多特异性抗体特异性结合相同靶标或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。

本文所用术语“重组抗体”是指由包含编码抗体的核酸的重组宿主细胞表达的抗体(例如嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段)。用于产生重组抗体的“宿主细胞”的实例包括：(1)哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包括Y0和NS0细胞)，幼仓鼠肾(BHK)、Hela和Vero细胞；(2)昆虫细胞，例如sf9、sf21和Tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属(Nicotiana)(例如烟草，Nicotiana tabacum)的植物；(4)酵母细胞，例如属于酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)或曲霉属(Aspergillus)(例如黑曲霉，Aspergillus niger)；(5)细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia.coli)细胞或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞等。

本文所用的术语“诊断剂”是指可以直接或间接检测并用于诊断目的的分子。可以将诊断剂施用于个体或样品。可以提供诊断剂本身，或者可以与诸如CAB的载体缀合。

本文所用的术语“治疗”包括：(1)预防或延迟可能患有或有倾向患有状态、障碍或病症但尚未经历或显示出所述状态、障碍或病症的临床或亚临床症状的动物出现所述状态、障碍或病症的临床症状；(2)抑制该状态、障碍或病症(即在维持治疗的情况下，阻止、减轻或延迟疾病的发展或其复发，阻止、减轻或延迟至少一种临床或亚临床症状)；和/或(3)缓解病症(即，使该状态、障碍或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种消退)。对待治疗的患者的益处在统计学上是明显的或至少对于患者或医生是可察觉的。

本文所用的术语“变体”是指在野生型蛋白亲本分子的一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基处(分别)被修饰的本发明的多核苷酸或多肽。变体可以通过许多方法产生，包括例如易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、组合PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变等方法、位点特异性诱变、基因重组、饱和诱变及它们的任何组合。本文公开了用于产生与野生型蛋白相比在正常生理条件下(例如温度、pH、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化和电解质浓度中的一种或多种条件下)具有降低的活性而在异常条件下具有增强的活性的变体蛋白的技术；与野生型蛋白相比，可以另外选择变体以获得增强的耐化学性和蛋白水解抗性。

本文所用术语“野生型”是指多核苷酸不包含任何突变。“野生型蛋白”，“野生-型蛋白”，“野生-型生物蛋白”或“野生型生物蛋白”是指可以从自然界分离的蛋白，其以自然界中发现的活性水平发挥作用，并包含自然界中发现的氨基酸序列。术语“亲本分子”和“靶蛋白”也指野生型蛋白。

出于说明性目的，通过参考各种示例性实施方案来描述本发明的原理。虽然本文具体描述了本发明的特定实施方案，但是本领域普通技术人员将容易认识到，相同的原理同样适合于并且可以用于其他系统和方法。在详细解释本发明所公开的实施方案之前，应该理解，本发明不限于其应用于所示的任何特定实施方案的细节。另外，这里使用的术语是出于描述的目的而非限制。此外，尽管参考本文以特定顺序呈现的步骤描述了某些方法，但在许多情况下，这些步骤可以以本领域技术人员可以理解的任何顺序执行；因此，新方法不限于本文所公开的特定步骤设置。

必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。此外，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。术语“包含”、“包括”、“具有”和“由......构成”也可以互换使用。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、性质例如分子量、百分比、比率、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下，无论是否存在“约”一词，均由“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明所要获得的所需性质而变化。至少，并不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据示出的有效位的数量并通过应用普通的舍入法来解释。尽管示出本发明的大范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报道在具体实施方案中描述的数值。然而，任何数值必然固有地包含由其各自的测试测量结果中存在的标准偏差引起的特定误差。

应理解，本文公开的每种组分、化合物、取代基或参数应被解释为单独使用或与本文公开的每种其他组分、化合物、取代基或参数中的一种或多种组合使用。

还应理解，本文公开的每种组分、化合物、取代基或参数的每个量/值或量/值范围应解释为还与本文公开的任何其他组分、化合物、取代基或参数的每个量/值或量/值范围组合公开，因此，为了说明的目的，本文公开的两种或更多种组分、化合物、取代基或参数的量/值或量/值范围的任何组合也彼此组合地被公开。

进一步理解的是，本文公开的每个范围的每个下限应解释为与本文公开的相同组分、化合物、取代基或参数的每个范围的每个上限组合公开。因此，两种范围的公开将被解释为通过将每个范围的每个下限与每个范围的每个上限组合而得到的四个范围的公开。三种范围的公开被解释为通过将每个范围的每个下限与每个范围的每个上限组合而得到的九个范围的公开，诸如此类。此外，在说明书或实施方案中公开的组分、化合物、取代基或参数的具体量/值被解释为一个范围的下限或上限的公开，因此可以与本申请中其他部分公开的相同组分、化合物、取代基或参数的一个范围的任何其他下限或上限或具体量/值组合，以形成该组分、化合物、取代基或参数的一个范围。

本公开涉及一种使用CAB(图1)检测样品中肿瘤细胞的方法，肿瘤细胞可任选地包含循环肿瘤细胞(CTC)或由其组成。在一个实施方案中，诊断方法包括(步骤50)将CTC封装在胶囊中的步骤，(步骤60)将胶囊中的CTC孵育足够的时间，使得被包封的CTC可以存活和生长，由此改变胶囊中的环境，以及(步骤70)使经孵育的CTC与CAB接触。

本文使用的CAB可以是可特异性结合CTC上的细胞表面蛋白的完整抗体或者抗体片段。CAB在肿瘤微环境中一条件的第一值下与细胞表面蛋白结合的活性更高，而在不同于该条件的第一值的该条件的第二值下与相同细胞表面蛋白结合的活性较低。该条件可以选自，例如，温度、pH、小有机分子(例如葡萄糖、乳酸、丙酮酸、营养成分、其他代谢物等)的浓度、分子(例如氧气、二氧化碳和电解质)的浓度以及细胞类型、营养素可用性和渗透压。

例如，在一个实施方案中，CAB在第一pH(肿瘤微环境的典型pH)下，例如pH6.0～7或pH6.2～6.8下，与在第二pH例如pH5～6或pH7～7.8(正常生理pH)下相比，更具活性。在另一个实施方案中，该条件可以是流体中的氧水平(氧分压)，使得CAB在第一氧水平(肿瘤微环境的典型氧水平)下，例如氧分压为约1～20mmHg、或约5～10mmHg，与在作为典型正常生理条件的第二氧水平(例如可存在于静脉血浆中的约30～50mmHg的氧分压)下相比，更具活性。

可用于本发明的条件活性抗体可通过任何合适的方法产生。在某些实施方案中，可以使用US 2012/0164127A1中描述的方法生产CAB。还可以通过任何其他已知方法产生或选择CAB，所述方法可用于演化和/或选择抗体，该抗体在一种条件下比在另一种条件下更具活性。例如，可以通过筛选文库来选择CAB，优选突变体抗体文库，来选择在一条件的第一值下对特定细胞表面蛋白的结合亲和力与在该条件第二值下对相同细胞表面蛋白的结合亲和力相比更高的抗体。

该条件的第一值是在本发明中用于触发CAB的条件活性的条件。该条件的第一值优选是异常条件，其不同于在个体中其他部位发现的条件，例如正常生理条件。在一个实施方案中，该条件的第一值是在肿瘤微环境中发现的不同于个体的正常生理条件的条件。该条件可以是在癌症或肿瘤微环境中发现的任何条件，包括例如温度、pH、小有机分子(例如葡萄糖、乳酸、丙酮酸、营养成分、其他代谢物等)的浓度、分子(例如氧气、二氧化碳和电解质)的浓度以及细胞类型、营养物可用性和渗透压，或与正常生理条件不同的任何其他条件。

除了具有在数值上与该条件的第一值不同的值，该条件选自温度、pH、小有机分子(例如葡萄糖、乳酸、丙酮酸、营养成分、其他代谢物等)的浓度、分子(例如氧气、二氧化碳和电解质)的浓度以及细胞类型、营养素可用性和渗透压。因此，该条件的第二值可以是与该条件的第一值的pH不同的pH。该条件的第二值可以是与该条件的第一值的氧分压不同的氧分压。该条件的第二个值不必须是，但优选是正常的生理条件，例如正常的生理pH7.2～7.8，正常的生理温度37～37.5℃，或正常的生理氧分压。

本文使用的CAB可以以两种方式之一触发。一个方面，该条件的第一值可以是相对于该条件的第二值能提高CAB的期望活性的值，使得在该条件的第一值下CAB的期望活性比在该条件的第二值下更高。另一个方面，该条件的第二值可以是相对于该条件的第一值能抑制CAB的期望活性的值，由于抑制作用，使得在该条件的第一值下的CAB的期望活性同样比在该条件的第二值下更高。例如，如果发现特定的电解质或细胞类型能抑制CAB的期望活性并且在正常细胞的微环境中以比在肿瘤微环境中更高的浓度存在，则可以通过选择比该条件的第一值更高的该条件第二值的电解质浓度或细胞类型的浓度来触发期望活性。

在肿瘤微环境中发现的条件是技术人员已知的，例如，Gillies等，“MRI of theTumor Microenvironment”，JOURNAL OF MAGNETIC RESONANCE IMAGING，第16卷，第430～450页，2002；Swarts等，“Tumor Microenvironment Complexity:Emerging Roles inCancerTherapy”，Cancer Res，第72卷，第2473～2480页，2012；Estrella等，“AcidityGenerated by the Tumor Microenvironment Drives Local Invasion”，Cancer Res.，第73卷，第1524～1535页，2013；Lorusso等，“The tumor microenvironment and itscontribution to tumor evolution toward metastasis”，Histochem Cell Biol，第130卷，第1091～1103页，2008；其公开内容通过引用整体并入本文，并且用于描述在肿瘤微环境中发现的条件。在肿瘤微环境中发现的某些条件不同于同一个体的正常生理条件。正常生理条件例如在个体的正常组织、血液或其他正常环境(例如在没有肿瘤的部位中)发现的那些条件。Mayers等人还描述了肿瘤的影响，“Elevated circulating branched chainamino acids are an early event in pancreatic adenocarcinoma development”，Nature Medicine，第20卷，第1193～1198页，2014。

肿瘤细胞可以以几种方式影响它们的微环境。例如，已知肿瘤细胞的微环境可具有与个体的正常生理条件不同的pH、温度和/或氧分压。肿瘤细胞还可通过释放细胞外信号，促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响其环境。

肿瘤微环境通常是缺氧的。随着肿瘤质量增加，肿瘤内部变得远离血液供应，这导致难以向肿瘤内部充分供应氧气。结果，在超过50％的局部晚期实体瘤中，肿瘤微环境中的氧分压通常低于5mmHg。相比之下，静脉血浆中的氧分压通常约为40mmHg。在正常生理条件下，身体的其他部位通常不是缺氧的。缺氧肿瘤微环境通过下调核苷酸切除修复和错配修复途径导致遗传不稳定，其与癌症进展相关。缺氧还导致缺氧诱导因子1α(HIF1-α)的上调，其诱导血管生成，并且与较差的预后和与转移相关的基因的激活相关。参见Weber等，“Thetumor microenvironment，”Surgical Oncology，第21卷，第172～177页，2012；和Blagosklonny，“Antiangiogenic therapy and tumor progression，”Cancer Cell，第5卷，第13～17页，2004年。

此外，与通常为中性或略微碱性的身体其他部位相比，肿瘤微环境还具有酸性pH(pH 6.0～7.0或6.2～6.8)。例如，人血浆具有约7.4的正常生理pH。参见Estrella等，“Acidity Generated by the Tumor Microenvironment Drives Local Invasion”，Cancer Research，第73卷，第1524～1535页，2013。

还发现肿瘤微环境具有比正常生理环境中发现的更高的乳酸浓度。较高的乳酸浓度是肿瘤细胞乳酸发酵的结果。乳酸发酵是肿瘤细胞在厌氧条件下利用葡萄糖的过程。该过程厌氧地分解葡萄糖以产生丙酮酸，丙酮酸最终转化为乳酸。用于乳酸发酵的简单方程是葡萄糖→2丙酮酸→2乳酸。

还发现肿瘤微环境中的营养素可用性通常低于正常生理环境中的营养素可用性。这可能是由于与位于身体其他部位的细胞相比，增殖肿瘤细胞的营养需求相对较高。特别地，葡萄糖浓度通常在肿瘤微环境中较低，即浓度为约0.05mM～约0.5mM。相比之下，正常生理血糖浓度为约2.5mM～约10mM。

此外，肿瘤微环境还包含许多不同的细胞类型或不同浓度的特定细胞类型，这些细胞类型在身体的其他部位中不常见。这些细胞类型包括某些类型的内皮细胞及其前体、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、癌相关成纤维细胞、肌成纤维细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、T和B淋巴细胞、自然杀伤细胞和抗原呈递细胞(APC)例如巨噬细胞和树突细胞(Lorusso等，“The tumor microenvironment and its contributionto tumor evolution to metastasis，”Histochem Cell Biol，第130卷，第1091～1103页，2008)。在某些实施方案中，特定类型细胞的存在或不存在或者一类细胞的不同浓度可用作条件的第一值和第二值。

该条件的第一值可以是肿瘤微环境中特定类型细胞的存在或浓度。在这种情况下，该条件的第二值可以是不存在该特定类型细胞或该特定类型细胞的较低浓度。如果该类型细胞促进CAB的活性，则将选择这样的第一值和第二值。

该条件的第一值可以是肿瘤微环境中特定类型细胞的不存在或特定浓度。在这种情况下，该条件的第二值可以是特定类型细胞的存在或比该条件第一值的浓度更高的该特定类型细胞的浓度。如果该类型细胞抑制CAB的活性，则将选择这样的第一值和第二值。

存在于肿瘤微环境的各种电解质的浓度也可以不同于在正常生理环境中发现的相同电解质的浓度。在某些实施方案中，用于该条件的第一值和第二值的电解质浓度选自钙离子浓度、钠离子浓度、钾离子浓度、镁离子浓度、氯化物离子浓度、碳酸氢盐离子浓度或磷酸根离子浓度。

前面已经描述了可用于测量肿瘤微环境的条件的一些技术。测量氧分压描述于

等的“Two-photon high-resolution measurement of partial pressure ofoxygen in cerebral vasculature and tissue，”Nature Methods，第7卷，第755～759页，2010。肿瘤微环境中pH的测量描述于Gillies等的“MRI of the TumorMicroenvironment”，Journal of Magnetic Resonance Imaging，第16卷，第430～450页，2002。测量软组织的温度描述于Benjamin等的“Measurement of soft tissuetemperature and impedance following the application of transtrmal directcurrent，”Physiotherapy，第93卷，第114～120页，2007。测量组织中的葡萄糖浓度描述于Dunn-Meynell等的“Quantitative Measurement of Organic Acids in Tissues fromGastric Cancer Patients Indicates Increased Glucose Metabolism in GastricCancer”，PLoS ONE，第9卷：e98581，2014。

因此，肿瘤微环境具有至少几种与身体其他部位中发现的条件不同的条件。在本发明中，CAB依赖于这些条件差异中的至少一种差异作为在特定环境中增加CAB活性的触发因素。

在本发明中，样品取自个体并包封在胶囊壳中。样品可以包含一个或多个CTC，这取决于被取样的个体的当前状态。因此，如果样品含有一个或多个CTC，则将这些CTC包封在胶囊壳中。由于本发明的被包封的CTC仍然存活，其将被诱导或可以被诱导以改变胶囊内的微环境以产生通常在肿瘤微环境中发现的一个或多个条件。因此，如果被包封的样品中存在一个或多个CTC，则胶囊内部将成为肿瘤微环境。

含有被包封的CTC的胶囊在本文中称为“CTC胶囊”。其中未包封有CTC的胶囊在本文中称为“不含CTC的胶囊”。CTC胶囊将具有内部微环境，其不同于不含CTC的胶囊的正常生理微环境。当还存在肿瘤微环境的至少一个条件时，CAB被设计成与CTC胶囊中被包封的CTC上的细胞表面蛋白结合。由于CAB被设计成在肿瘤微环境中具有比在正常生理微环境中更高的活性，这将减少CAB与存在正常生理环境的不含CTC胶囊中的细胞上的相同细胞表面蛋白的结合。因此，由于CTC胶囊中肿瘤微环境条件对CAB活性的影响，CAB对CTC的检测更具选择性。

如果CAB在条件的第一值下相对于该条件的第二值具有足够高的选择性以使得能够区分其在该条件的第一值和第二值下与细胞表面蛋白的结合，则该条件的第一值与该条件的第二值之间的差异可以是小的。当条件是pH时，该条件的第一值和第二值之间的差异可以小至约0.3pH单位、约0.5pH单位、或约0.7pH单位、或约0.8pH单位、或约1pH单位、或约1.5个pH单位、或约2.0个pH单位。当条件是氧分压时，第一值和第二值之间的差可以小至约5mmHg、或约7mmHg、或约9mmHg、或约10mmHg、或约12mmHg、或约15mmHg、或约20mmHg、或约25mmHg、或约30mmHg。

CAB在肿瘤微环境中的条件的第一值下比在该条件的第二值下更具活性。在一个方面，CAB的活性是指其与细胞表面蛋白结合的结合亲和力。在这方面，CAB通常在该条件的第一值下与在CTC上发现的特定细胞表面蛋白的结合亲和力，比在该条件的第二值下与相同细胞表面蛋白的结合亲和力相比明显更高。在该条件的第一值下CAB的活性与在该条件的第二值下的相同CAB的活性的比值可以是至少约5、或至少约10、或至少约20、或至少约约50、或至少约70、或至少约100、或至少约200、或至少约500、或至少约700、或至少约1000。因此，在一些实施方案中，选择CAB以使在肿瘤微环境中存在的条件的第一值下对CTC的细胞表面蛋白的结合亲和力，与在不同于该肿瘤微环境中的该条件的第一值的该条件的第二值下对相同细胞表面蛋白的结合亲和力相比更高。

该条件的第二值可以是任何正常生理条件。然而，在一些罕见的情况下，正常生理条件可能从个体中的一个部位到另一个部位而变化。在本发明的实施方案中，将表示正常生理条件的该条件的第二值选择为预期存在于含有来自个体的包封样品的不含CTC的胶囊中的条件。因此，如果来自个体的样品是血液样品，则该条件的第二值将被选择为在诸如血浆的血液样品中发现的正常生理条件。如果来自个体的样品是不同的样品，例如脑脊液样品，则应选择该条件的第二值为在脑脊髓液样品中发现的正常生理条件。

因此，本发明利用在CTC胶囊中产生模拟肿瘤微环境的优点，与在不含CTC的胶囊中发现的微环境形成对比，以改善该方法的选择性。因此，本发明能够使用针对非癌症特异性细胞表面蛋白(即，它可以存在于CTC以及非肿瘤细胞的表面上)的抗体。由于CAB与细胞表面蛋白的结合亲和力受微环境条件的影响，因为CTC在胶囊中产生肿瘤微环境，所以CAB对CTC上的细胞表面蛋白具有更高的结合亲和力，因此，本发明能够使用CAB来鉴定CTC的存在，CAB可以与CTC和非CTC中发现的细胞表面蛋白结合。该方法与已知方法形成对比，由于没有阻止抗体与非CTC上发现的标志物结合的次要因子，已知方法需要针对癌症特异性标志物的抗体。此外，细胞表面蛋白的存在和胶囊中肿瘤微环境条件的要求提供了对抗假阳性结果的额外保证。

因此，在一些实施方案中，本发明可以使用对来自个体的CTC和非CTC上的细胞表面蛋白都具有结合亲和力的CAB。这是因为次要因子即微环境中条件的第一值和第二值，可用于减少与非CTC上存在的细胞表面蛋白的结合。合适的细胞表面蛋白可选自例如持家基因的蛋白。在某些其他实施方案中，细胞表面蛋白可以是存在于大多数主要癌症类型的CTC上的蛋白，但不存在于罕见或非肿瘤癌细胞上。主要癌症类型包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、子宫内膜癌、白血病、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤和甲状腺癌。

在某些实施方案中，细胞表面蛋白可选自细胞膜蛋白，例如ABCA7、ABCC1、ABCC5、ABHD3、ACKR3、ADAM10、AQP1、AQP3、ATP13A3、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B4、ATP6AP1、ATP6V0A2、BACE1、BMPR2、BNIP2、BST2、BTN2A1、BTN3A3、C12orf76、C17orf62、C1orf27、CCDC107、CD4、CD44、CD46、CD81、CD9、CD99L2、CDAN1、CDIPT、CLCN6、CNNM4、CYP20A1、DCBLD2、DHRS7B、ERBB2、ETNK1、FAM210B、GINM1、GPI、GRAMD1A、HELZ、HERPUD1、HMOX1、HPS3、ICAM1、IFI30、IFRD1、IL15RA、IL6ST、ITGA7、ITGB1、ITGB4、ITGB5、ITSN1、JAG1、LAIR1、LMTK2、LRBA、LRP12、LSR、MACF1、MADD、MCAM、MCOLN1、MET、MICAL3、MPV17L2、NCKIPSD、NDC1、NEO1、NOTCH2、PANX1、PDLIM5、PFDN1、PGAP3、PGRMC2、PHLDB2、PIGN、PIGQ、PIGW、PKN2、PTPRS、PVR、RALGAPA2、RNF145、RNF149、SC5D、SCAMP4、SDC2、SDC4、SLC12A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC17A5、SLC19A1、SLC1A5、SLC30A1、SLC38A6、SLC38A7、SLC39A14、SLC3A2、SLC43A1、SLC46A1、SLC46A3、SLC4A2、SLC4A7、SLC7A5、SLC9A1、SMAGP、SORT1、SPG11、SPINT2、SPPL2B、SPPL3、SRD5A3、SRPRB、STX18、STX4、SYVN1、TAPT1、TAZ、TBC1D5、TGFBR2、TM2D2、TMEM183A、TMEM205、TMEM218、TMEM222、TMEM245、TMEM258、TMEM50A、TMEM63B、TMEM97、TNFRSF12A、TXNDC11、UBR2、UQCC1、VSIG4、WWP1、YIPF4、ZDHHC20和ZDHHC5。有关编码这些蛋白的基因的更多信息，请访问http://www.proteinatlas.org/。

在某些实施方案中，细胞表面蛋白可以是由持家基因编码的蛋白。此类蛋白的实例是AP2S1、CD81、GPAA1、LGALS9、MGAT2、MGAT4B和VAMP3。在一个实施方案中，细胞表面蛋白是来自持家基因的SLC2a家族的蛋白。SLC2a家族的细胞表面蛋白的实例包括SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13和SLC2A14。

在一个实施方案中，细胞表面蛋白是Axl，其存在于来自大多数癌症类型的CTC上，尽管不是所有主要癌症类型。如果目的是鉴定具有含有Axl细胞表面蛋白的细胞的一种或多种癌症的存在，则Axl是本发明特别合适的靶标。

可以使用本文所述的任何方法筛选和选择细胞表面蛋白的CAB。一旦被选择，CAB可以通过使用重组技术或蛋白合成技术商业化生产。可以使用本领域已知的任何方法在体外或体内重组表达CAB。CAB也可以使用化学方法全部或部分合成。CAB的生产已在WO2010104821A1中描述，其通过引用并入本文，用于描述如何生产CAB。

在某些实施方案中，可以用本文描述的一种或多种蛋白工程技术改造CAB。蛋白工程技术的非限制性实例包括抗体缀合和工程化多特异性抗体。

CAB可以与可检测标记缀合。可检测标记的实例包括但不限于以下：基于光吸收、荧光、反射、光散射、磷光或发光性质的可直接或间接检测的分子或离子；可通过其放射性质检测的分子或离子；可通过其核磁共振或顺磁性质检测的分子或离子。

CAB与可检测标记的缀合可以是共价缀合或非共价缀合。共价缀合可以是直接的或通过接头缀合。在特定的实施方案中，直接缀合是通过构建融合蛋白(即通过基因融合编码CAB和神经障碍药物的两种基因并作为单一蛋白表达)。在特定的实施方案中，直接缀合是通过在CAB的两个部分之一上的反应性基团与可检测标记上的相应基团或受体之间形成共价键。在特定的实施方案中，直接缀合是通过修饰(即遗传修饰)待缀合的两个分子之一以包含反应基团(作为非限制性实例，巯基或羧基)，该反应基团在适当条件下与另一个待缀合的分子形成共价结合。作为一个非限制性实例，可以将具有所需反应基团(即半胱氨酸残基)的分子(即氨基酸)引入例如CAB与神经药物形成的二硫键中。将核酸与蛋白共价缀合的方法也是本领域已知的(即光交联，参见例如Zatsepin等，Russ.Chem.Rev.，74：77-95(2005))。非共价缀合可以通过本领域普通技术人员容易理解的任何非共价连接手段，包括疏水键、离子键、静电相互作用等。

还可以使用多种接头进行缀合。例如，CAB和可检测标记可以使用多种双功能蛋白偶联剂缀合，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基己二胺)、双重氮基衍生物(例如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。还可以使用由通过肽键连接的1～20个氨基酸组成的肽接头。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些特定的其他实施方案中，一种或多种氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。用于抗体缀合的交联剂试剂的一些实例包括BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SLAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC和硫代-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

可以与CAB缀合的可检测标记还可以包括本领域已知的任何诊断剂，例如，如以下参考文献中所提供的：Armstrong等，Diagnostic Imaging，第5版，Blackwell Publishing(2004)；Torchilin，V.P.，Ed.，Targeted Delivery of Imaging Agents，CRC Press(1995)；Vallabhajosula，S.，Molecular Imaging：Radiopharmaceuticals for PET andSPECT，Springer(2009)。可以通过多种方法检测诊断剂，包括使用试剂来提供和/或增强可检测信号，可检测信号包括但不限于γ发射信号、放射性信号、回声信号、光学信号、荧光信号、吸收信号、磁性或断层扫描信号。用于对诊断剂进行成像的技术可以包括但不限于单光子发射计算机断层摄影(SPECT)、磁共振成像(MRI)、光学成像、正电子发射断层摄影(PET)、计算机断层摄影(CT)、X射线成像、伽马射线成像等。

在某些实施方案中，可检测标记可以是与例如金属离子结合的螯合剂，以用于各种诊断成像技术。示例性的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、[4-(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1-基)甲基]苯甲酸(CPTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、亚乙基双(氧乙烯硝基)四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)、1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)及它们的衍生物。

在某些实施方案中，可检测标记可以是放射性同位素，包括发射γ射线、正电子、β和α粒子以及X射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于Ac、As、At、ⁿB、¹²⁸Ba、²¹²Bi、⁷⁵Br、⁷⁷Br、¹⁴C、¹⁰⁹Cd、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁸F、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、³H、¹²³I、¹²⁵I、¹³⁰I、¹³¹I、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹³N、¹⁵O、³²P、³³P、²¹²Pb、¹⁰³Pd、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁴⁷Sc、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr、⁹⁹mTc、⁸⁸Y和⁹⁰Y。在某些实施方案中，放射性试剂可包括^mIn-DTPA、^99mTc(CO)3-DTPA、^99mTc(CO)3-ENPy2、^62/64/67Cu-TETA、^99mTc(CO)3-IDA和^99mTc(CO)₃三胺(环或线性的)。在其他实施方案中，该试剂可包括DOTA及其具有¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁵³Sm、^88/90Y、^62/64/67Cu或^67/68Ga的各种类似物。在某些实施方案中，脂质体可以是放射性标记的，例如，通过掺入与螯合物连接的脂质，例如DTPA-脂质，如以下参考文献中所提供的：Phillips等，Wiley Interdisciplinary Reviews：Nanomedicine andNanobiotechnology，第1卷，第69～83页(2008)；Torchilin，V.P.&Weissig，V.，Eds.Liposomes第二版：Oxford Univ.Press(2003)；Elbayoumi，T.A.&Torchilin，V.P.，Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging，33：1196-1205(2006)；Mougin-Degraef，M.等，Int'lJ.Pharmaceutics，344：110-117(2007)。

在其他实施方案中，可检测标记可包括光学试剂，例如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。许多试剂(例如染料、探针、标记或指示剂)是本领域已知的并且可用于本发明。参见，例如，Invitrogen，The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies，第10版(2005)。荧光剂可包括各种有机和/或无机小分子或各种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于花菁、酞菁、卟啉、吲哚菁、罗丹明、吩恶嗪、苯基蒽、吩噻嗪、苯硒嗪、荧光素、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶、蒽、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸菁、吖啶酮、菲啶、罗丹明、吖啶、蒽醌、硫属元素的吡喃盐类似物、二氢卟酚、萘酞菁、次甲基染料、吲哚染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂萘、三苯甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚菁、苯并吲哚菁、具有一般结构4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-苯并二茚的BODIPY^TM衍生物，和/或其任何共轭物和/或衍生物。可以使用的其他试剂包括但不限于荧光素、荧光素-聚天冬氨酸缀合物、荧光素-聚谷氨酸缀合物、荧光素-聚精氨酸缀合物、吲哚菁绿、吲哚菁-十二癸二酸缀合物、吲哚菁(NIRD)-聚天冬氨酸缀合物、异硫氰酸蓝、吲哚二磺酸盐、苯并吲哚二磺酸盐、双(乙基羧甲基)吲哚菁、双(戊基羧甲基)吲哚菁、聚羟基吲哚磺酸盐、多羟基苯并吲哚磺酸盐、刚性杂原子吲哚磺酸盐、吲哚菁双丙酸、吲哚菁二己酸、3,6-二氰基-2,5-[(N,N,N',N'-四(羧甲基)氨基]吡嗪、3,6-[(N,N,N',N'-四(2-羟乙基)氨基]吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(N-叠氮基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(N-吗啉代)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(N-哌嗪基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(N-硫代吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(N-硫代吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸-S-氧化物、2,5-二氰基-3,6-双(N-硫代吗啉基)吡嗪-S,S-二氧化物、吲哚菁四磺酸盐、氯吲哚菁和3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羧酸。

在其他实施方案中，可检测标记可包括本领域通常熟知的造影剂，包括例如超顺磁性氧化铁(SPIO)、钆或锰的络合物等。(参见，例如，Armstrong等，Diagnostic Imaging，第5版，Blackwell Publishing(2004))。在某些实施方案中，诊断剂可包括磁共振(MR)成像剂。示例性磁共振剂包括但不限于顺磁剂、超顺磁剂等。示例性顺磁剂可包括但不限于钆喷酸、钆特酸、钆双胺、钆、钆特醇、锰福地吡、钆弗塞胺、柠檬酸铁铵、钆硼酸、钆丁醇或钆塞酸。超顺磁性剂可包括但不限于超顺磁性氧化铁和氧化铁和氧化亚铁复合物。在某些实施方案中，诊断剂可包括X-射线造影剂，例如，在以下参考文献中提供的：H.S Thomsen，R.N.Muller和R.F.Mattrey，Eds.,Trends in Contrast Media，(柏林：施普林格出版公司，1999)；P.Dawson，D.Cosgrove and R.Grainger，Eds.，Textbook of Contrast Media(ISISMedical Media 1999)；Torchilin，V.P.，Curr.Pharm.Biotech.，第1卷，第183-215页(2000)；Bogdanov，A.A.等，Adv.Drug Del.Rev.，第37卷，第279-293页(1999)；Sachse，A.等，Investigative Radiology，第32卷，第44-50页(1997年)。X射线造影剂的实例包括但不限于碘帕醇、碘美普尔、碘海醇、异戊醇、碘普罗胺、碘乙酰亚胺、碘佛醇、碘曲仑、碘酞硫、碘克沙醇、碘西醇、碘葡糖酰胺、碘尿嘧啶、碘古酰胺、碘沙考、碘昔兰、碘帕醇、甲泛葡胺、碘比醇和碘美醇。在某些实施方案中，X射线造影剂可包括碘帕醇、碘美普尔、碘普罗胺、碘海醇、异戊醇、碘佛醇、碘比特醇、碘克沙醇、碘曲仑和碘美醇。

可以工程化改造本发明的CAB以产生多特异性CAB。多特异性CAB及其制备方法描述于WO2013/170168中。多特异性抗体包括但不限于包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的抗体，其中V_HV_L单元具有多表位特异性；具有两个或更多个V_L和V_H结构域的抗体，其中每个V_HV_L单元结合不同的表位；具有两个或更多个单个可变结构域的抗体，每个单个可变结构域结合不同的表位；以及包含一个或多个抗体片段的抗体以及包含已共价连接或非共价连接的抗体片段的抗体。

在一个实施方案中，可以工程化改造多特异性抗体以对在不同类型的癌细胞上发现的两种或更多种细胞表面蛋白具有结合亲和力。以这种方式，在不同癌细胞表达不同细胞表面蛋白的情况下，可以改造单个多特异性抗体以靶向不同癌细胞类型。这种类型的工程化改造可用于在单次测试中筛选各种不同类型的癌症患者。

可以工程化改造多特异性抗体对一种或多种靶标CTC的亲和力，多特异性抗体可以结合全部或大部分靶标(细胞表面蛋白)。例如，可以通过工程化改造CAB以结合由相同靶细胞表达的两种不同细胞表面蛋白，与仅表达该两种细胞表面蛋白的一种或两种细胞表面蛋白都不表达的非靶细胞相比，可以工程化改造双特异性抗体以提供对某些特定靶细胞的选择性。因此，由于系统的动力机制，使用这种方法，与非靶细胞相比，更多的双特异性抗体可以在平衡时与靶细胞结合。

这两种蛋白工程技术可用于本发明。将可检测标记缀合至CAB使得能够在CAB与CTC上的细胞表面蛋白结合后检测CTC。多特异性CAB使得能够靶向多种细胞表面蛋白，所述多种细胞表面蛋白可以全部与一种多特异性CAB结合。这可能是有利的，因为靶向一种以上细胞表面蛋白可提供检测更广谱癌症的能力。例如，每种细胞表面蛋白能够检测重叠的癌症组，所有癌症组的总和是覆盖更广谱的癌症的组，所述癌症可以通过使用多特异性CAB检测。

因此，本发明提供了一种简单的方法，用于通过(步骤50)将CTC封装在胶囊中而仅使用单一抗体来检测来自个体的样品中的CTC，该胶囊的内部环境将被改变为与肿瘤微环境相同或相似(图1)。

在某些实施方案中，在图1的方法的步骤10中从个体获得的样品中的CTC可能处于对于检测而言太低的浓度。可以单独或组合地使用两个步骤来增加样品中的CTC群：(1)(步骤20)扩增液体中的CTC群或(2)(步骤30)使液体中的CTC群富集(图1)。

扩增CTC群(步骤20)意味着相对于其他非CTC，CTC的数量增加，优先增加样品中CTC的数量(即产生新的CTC)。扩增CTC群(步骤20)可以通过在适合于CTC群优先扩增(步骤20)的条件下培养来自样品的整个细胞群来实现。在某些癌细胞的情况下，使用任何合适的细胞培养基可以实现该结果，原因是某些类型的癌细胞比可能存在于样品中的其他类型的细胞增殖更快。结果，仅通过培养整个细胞群，可以扩增已知比其他细胞增殖更快的CTC细胞群(步骤20)。

整个细胞群可以通过任何合适类型的培养方式培养，例如悬浮培养，球形培养(spheroid culture)或在基质中培养。可以使用任何有助于细胞附着、生长、分化、迁移和组织形态形成的包被或未包被的容器，烧瓶或三维细胞外基质。例如，基质可以是甲基纤维素、羧甲基纤维素、胶原蛋白、Matrigel^TM(从Enelbreth-Holm-Swam小鼠肉瘤中提取的基底膜制剂；BD Biosciences)等。

在一个实施方案中，整个细胞群来自个体的外周血样品。将细胞群添加到培养基中并在适于CTC优先扩增的条件下培养(例如，5％CO₂，37℃培养箱)。可以将细胞群培养约1周、约2周、约3周、约4周、约1～2周或约2～4周，以达到所需的CTC扩增水平。

培养基可以是适合哺乳动物(例如人类)细胞生长的任何培养基，通常含有盐，氨基酸和其他营养素，并且如果需要可以补充抗生素和其他组分。许多合适的培养基配方是本领域公知的和常规的，例如RPMI培养基、敲除血清替代培养基、F12K和DMEM。培养基优选补充有低浓度的血清、血浆或生长因子(即5％以下(v/v)的血清或血浆)或不含血清或血浆。这些条件有利于在上皮细胞-间充质转化(或“干细胞样”)条件下肿瘤细胞(CTC)的生长。另一方面，在没有添加特定生长因子和没有更高血清浓度的这些条件下，液体中的白细胞不会增殖。

细胞培养基可包含约0.1％至约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％的血清或血浆(例如人血清或血浆)、约0.5％至约2.5％、约1％至约2％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.2％、约1.4％、约1.6％、约1.8％、约2.0％、约2.2％、约2.4％、约2.6％、约2.8％或约3％的血清或血浆(例如人血清或血浆)。培养基优选补充有约1.0％至约2.0％的人血清或血浆。培养基也可以是不含血清的。

合适的培养条件可包括在约35℃至约40℃(例如，约36℃、约37℃、约38℃、约39℃)下，在含有约3％至约7％的二氧化碳(例如，约5％的二氧化碳)的潮湿气氛中(例如95％相对湿度)培养。

对于富集CTC(步骤30)，在样品中不产生实质上新的CTC，而是相对于样品中其他非CTC群，CTC的相对群体增加。富集(步骤30)可用于将样品中经暴露的CTC的相对量增加25％、50％、100％、200％、500％或更多。

外周血样品中CTC的富集(步骤30)可以使用被设计用于使用一种或多种常规分离技术(例如，分级分离技术、红细胞裂解、细胞分选、过滤、粘附、密度离心、氯化铵裂解)去除血液样品中通常发现的红细胞和/或其他类型的非CTC细胞的技术来实现。例如，可以通过密度梯度沉降从全血样品中除去红细胞。然而，当采用可导致细胞损伤的富集方法时应小心，因为需要在富集的样品中保存活的CTC。

在某些实施方案中，富集(步骤30)可以基于CTC的物理特征，例如形状、大小、密度或电荷(Vona等，“Isolation by size of epithelialtumor cells-A new method forthe immunomorphological and molecular characterization of circulating tumorcells，”“American Journal Of Pathology，第156卷，第57-63页，2000)。在一个实施方案中，可以利用过滤富集CTC。过滤在富集(步骤30)经暴露的CTC方面特别有效，因为经暴露的CTC破坏细胞聚集体，从而使过滤更有效。

在某些实施方案中，可以处理样品中的CTC(任选地经扩增(步骤20)和/或经富集(步骤30))以暴露(步骤40)其上的细胞表面蛋白(图1)。发现仍然检测不到循环中相当数量的CTC，因为它们被在CTC表面聚集的细胞、蛋白、生物分子和其他因子“掩蔽”或“遮盖”，从而使它们不能被CAB检测到。例如，血小板、纤维蛋白和其他凝血蛋白充当掩蔽或遮蔽细胞表面蛋白的“遮盖装置”，使它们逃脱检测。类似地，其他因素可以实现CTC的掩蔽或遮蔽，例如表面蛋白标记物的糖基化或细胞表面组分与其他生物分子(例如脂质)的结合。暴露CTC的步骤可包括去除、降解或改变在CTC表面聚集或与CTC表面物理结合的蛋白、碳水化合物、细胞或它们的组合。然后，经显露的CTC的一种或多种细胞表面蛋白比在进行显露步骤之前更容易被CAB接近。

用于暴露CTC的合适技术可包括酶促(例如，酶介导的生化反应)处理、机械(例如，机械力)处理、电(例如，电力)处理、电磁(例如，电磁波谱的电磁辐射)处理、化学处理细胞或它们的任何组合处理细胞，以去除或改变与CTC表面相结合的血小板、蛋白、碳水化合物、细胞或其他生物分子，从而暴露(步骤40)细胞表面蛋白。

在某些实施方案中，从CTC表面降解凝血蛋白和/或细胞通过对CTC进行酶促处理来进行。酶促处理可以通过纤维蛋白溶解发生，纤维蛋白溶解是酶促过程，其中纤维蛋白和/或凝固产物，例如纤维蛋白凝块等被降解。在一个方面，通过纤维蛋白溶解进行的降解是通过用纤溶酶处理CTC来进行的。纤溶酶是存在于血液中的丝氨酸蛋白酶，其降解纤维蛋白以及在纤维蛋白溶解中起关键作用的其他血浆蛋白。已知纤溶酶可酶促切割蛋白，例如纤维蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白和冯维勒布兰德因子。各种天然和合成的纤溶酶是本领域已知的，并且可以用于本发明，只要该酶在纤维蛋白溶解方面保留一些作用即可。

纤溶酶衍生自纤溶酶原，纤溶酶原从肝脏排泄到循环中。一旦进入循环，纤溶酶原可被多种因子激活以产生纤溶酶，所述因子例如组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、凝血酶、纤维蛋白和因子XII(Hageman因子)。因此，在本发明的某些实施方案中，通过酶促激活纤溶酶原产生纤维蛋白溶解。纤维蛋白溶解也可以通过其他天然或合成产生的试剂来实现。例如，通过用天然或合成的动物毒液或毒素处理CTC可以发生纤维蛋白溶解。例如，已知有毒动物，例如但不限于蝙蝠、蛇和昆虫，具有能够直接或间接酶促激活纤维蛋白溶解的毒液或毒素。

除了酶促降解被掩蔽的CTC的表面上凝血蛋白和细胞之外，还可以机械地，电学地或化学地处理CTC。例如，机械力可用于处理CTC以剪切CTC表面上的凝血蛋白和细胞。因此，可以用能够暴露CTC的任何类型的机械力或动作来处理CTC。另外，可利用各种电力处理CTC来暴露CTC，例如但不限于电磁、静电、电化学、电辐射、超声力等。电磁辐射可以包括施加来自电磁波谱的任何区域的辐射。

在一个实施方案中，机械力可以在用于生物医学研究和诊断学研究的微流体装置中产生。构成微流体系统的微型装置由在基板中蚀刻或模制的多个柱、凹槽或微通道，以及腔室组成，所述基板通常由硅、塑料、石英、玻璃或塑料组成。这些微型特征的尺寸、形状、构造以及它们的相互连接决定对流过该装置的流体样品的成分(例如悬浮在流体中的细胞或细胞簇)产生的物理力。预期微流体装置的微型特征以及诸如流体流速的因素可以被配置和利用以产生足够的机械力来暴露流体样品中的CTC。

用于暴露(步骤40)CTC的化学处理使用化学试剂，例如但不限于可以激活或抑制纤维蛋白溶解途径中的各种步骤并导致凝血因子降解的天然或合成分子、有机化合物、非有机化合物、药物、治疗剂等。可用于暴露CTC的其他化学试剂包括抗血小板剂、抗凝血剂和/或血液稀释剂，它们降解和/或抑制CTC表面上的血小板和纤维蛋白活化。可以使用的常见抗血小板剂、抗凝血剂和血液稀释剂包括但不限于环加氧酶抑制剂，例如阿司匹林；二磷酸腺苷(ADP)受体抑制剂，例如氯吡格雷和噻氯匹定；磷酸二酯酶抑制剂，例如西洛他唑；糖蛋白IIB/IIIA抑制剂，例如阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班和去纤维蛋白多核苷酸；腺苷再摄取抑制剂，例如双嘧达莫；维生素K拮抗剂；肝素和肝素衍生物质；氯吡格雷(Plavix^TM)；苯并吡喃酮(香豆素)；以及直接凝血酶抑制剂。

重要的是在暴露步骤(40)中选择处理和/或限制处理的持续时间，以避免损害CTC的活力或完整性并避免损害意图被CAB结合的细胞表面蛋白。因此，在各种实施方案中，应当将细胞处理足够的时间以从CTC去除凝血蛋白/细胞，以便可以进一步检测和/或鉴定CTC。虽然这个时间可以根据应用于CTC的处理类型而变化，但是通过常规测定确定这样的时间是在本领域技术人员的知识范围内的。另外，当酶促或化学处理CTC时，可通过添加特异性抑制剂来控制酶促反应的持续时间以减缓或停止此类反应。

包含在经处理样品中的经暴露的CTC(步骤40)的总数部分取决于初始样品体积。初始样品体积可小于约25μl、50μl、75μl、100μl、125μl、150μl、175μl、200μl、225μl、250μl、300μl、400μl、500μl、750μl、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml或大于约10ml。在一个示例性方面，初始样品体积为约100μl至200μl。在另一个示例性方面，如本文所述的暴露步骤(40)之后的样品包括大于约1、2、5、7、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900甚至1000个经暴露的CTC。在某些实施方案中，经处理的样品每100微升样品具有大于约5、7.5、10、50、100或200个经暴露的CTC。

含有CTC的样品被封装在胶囊中(步骤50)，所述含有CTC的样品可以是经扩增的(步骤20)或未扩增的，经富集的(步骤30)或未富集的，经暴露的(步骤40)或未暴露的，或它们的任何组合。待包封(步骤50)的CTC悬浮在含水介质中，或者在样品或其一部分中，或者在任选补充有营养素的样品或其一部分中或者在不同的含水介质中。细胞包封是众所周知的技术，其中将含水介质分散成乳化的含水液滴，然后用通过在液滴周围沉积聚合物或通过界面聚合的凝聚作用而制备的半透膜包封液滴。胶囊的核是具有悬浮在其中的一个或多个CTC的含水介质，并且可以包括样品的其他组分，以及另外添加的组分，例如生长培养基、营养素等。壳通常是半透膜。例如，在第5,573,934号美国专利中描述了这种封装过程。

先前已经公开了其他合适的细胞包封方法，至少包括第4,353,888、4,391,909、4,689,293、4,803,168、4,806,355、5,227,298、6,790,455、6,818,230、7,041,504、7,297,331、8,202,701号美国专利，以及第2002/0098559、2004/0029241、2004/0086493、2004/0170612、2005/0037029、2005/0118425、2005/0202096、2005/0214377、2006/0251630、2009/0214660、2009/0269313、2011/0064797、2012/0213708、2012/0231443、2012/0308650、2013/0277872、2014/0127290和2014/0271843号美国专利申请，它们的公开内容通过引用并入本文，用于描述合适的细胞包封技术。

在Burgess,D.J.(1994)Complex Coacervation：Microcapsule Formation，Dubin，P.，Bock，J，Davis，R.，Schulz，D.N.和Thies，C.(编辑)，Macromolecular Complexesin Chemistry and Biology，施普林格出版公司，第285-300页中描述了合适的凝聚方法。

胶囊壳优选是生物相容性聚合物，这意味着胶囊壳的代谢物或降解产物通常对被包封的细胞无毒。此外，应该选择胶囊壳使得胶囊壳的代谢物或降解产物不会实质上改变胶囊内被选择用于触发CAB的微环境的至少一种条件。例如，如果CAB被设计为由pH差异触发，那么应该选择胶囊壳使得它至少在从封装到最终测试的时间段内不会实质上影响被封装的材料的pH。

胶囊壳中使用的聚合物可以是天然或合成聚合物。可以使用的合成聚合物包括可生物降解的聚合物，例如聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(己内酯)(PCL)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酸酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯和可生物降解的聚氨酯；不可生物降解的聚合物，例如聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯聚合物和其他酰基取代的纤维素醋酸酯及其衍生物；聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃和聚环氧乙烷。天然聚合物的实例包括蛋白，例如白蛋白、胶原蛋白、合成的聚氨基酸和醇溶蛋白；多糖，例如海藻酸盐、肝素；以及其他天然存在的可生物降解的糖单元聚合物。或者，可以使用上述聚合物的组合。

胶囊的壳是半透性的。胶囊壳的孔隙率可通过本领域技术人员已知的技术控制，例如通过优化壳中一种或多种聚合物的交联度。与较厚的胶囊壳相比，较薄的胶囊壳将使溶剂更容易扩散通过壳。

在某些实施方案中，代替含水介质，胶囊的核可包含CTC或其他细胞悬浮于其中的基质。基质可以是分布在含水介质中的交联聚合物，因此使核成为粘性含水液体或水凝胶。在某些实施方案中，核的粘度可以是25℃下水的粘度的至少2倍、4倍、6倍、8倍、10倍或20倍。

形成水凝胶的聚合物单元之间的交联可以是共价键、离子键或氢键，以形成三维开放晶格结构，该结构捕获水分子以形成水凝胶。在某些实施方案中，基质含有适于促进细胞活性的蛋白和营养素，所述细胞活性例如被包封的CTC的存活和/或生长。蛋白可以是胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、弹性蛋白或弹性蛋白样多肽(ELP)或它们的衍生物。营养素可以是营养素渗透剂，所述营养素渗透剂为溶质，其是CTC的营养素并且有助于维持溶液的渗透平衡以保护CTC免于肿胀、破裂或脱水。葡萄糖是渗透剂中的常见营养素。葡萄糖的量可为约30mM～约300mM，或约40mM～约250mM，或约50mM～约200mM，或约70mM～约170mM，或约100mM～约170mM，或约130mM～约150mM。

可用于形成核的合适水凝胶的聚合物的实例包括多糖，例如海藻酸盐、聚磷腈、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(环氧烷)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(丙烯酰胺)例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以及它们的共聚物和共混物。在某些实施方案中，可以使用嵌段共聚物。例如，可以使用含有疏水性聚(环氧烷)链段(即聚环氧丙烷)和亲水性聚(环氧烷)链段(即聚环氧乙烷)的泊洛沙姆。

在一些情况下，聚合物选自阴离子聚合物，例如海藻酸盐，以形成水凝胶基质(即核)。海藻酸盐可以在二价阳离子存在下通过离子交联形成凝胶，可以通过添加二价金属阳离子(例如，钙离子或钡离子)，或通过与聚阳离子聚合物(例如，氨基酸聚合物，例如聚赖氨酸)交联来进行。如果需要，水凝胶基质可任选地交联。基质也可以由粘性溶液形成，例如纤维素及其衍生物(例如羧甲基纤维素)的溶液。

在某些实施方案中，核、壳或两者都包含壳聚糖或其衍生物。壳聚糖是通过将几丁质(一种天然的非哺乳动物多糖)部分去乙酰化而制成的，几丁质与哺乳动物多糖非常相似，使其对细胞包封而言具有吸引力。主要由溶菌酶通过乙酰化残基的水解来降解壳聚糖。较高程度的去乙酰化导致降解时间较长。在稀酸条件下(pH<6)，壳聚糖带正电荷并且是水溶性的，而在生理pH下，壳聚糖是中性且疏水的，导致形成固体物理交联的水凝胶。多元醇盐的添加使得能够在中性pH下包封细胞，其中凝胶化变得与温度有关。

在某些实施方案中，核、壳或两者都包含透明质酸或其衍生物。透明质酸(HA)是存在于全身许多组织中的糖胺聚糖，其在胚胎发育，伤口愈合和血管生成中起重要作用。此外，HA通过细胞表面受体与细胞相互作用以影响细胞内信号传导途径。可以用可交联的部分(例如甲基丙烯酸酯和硫醇)修饰HA，用于细胞包封。交联后的HA凝胶仍然易被透明质酸酶降解，透明质酸酶将HA分解成不同分子量的寡糖片段。耳廓软骨细胞可以被包封在光聚合的HA水凝胶中，其中凝胶结构由大分子单体浓度和大分子单体分子量控制。此外，光聚合的HA和葡聚糖水凝胶可以维持未分化的人胚胎干细胞的长期培养。还通过迈克尔型加成反应机制制备HA水凝胶，其中丙烯酸化的HA与PEG(聚乙二醇)-四硫醇反应，或经硫醇改性的HA与PEG二丙烯酸酯反应。

在某些实施方案中，核、壳或两者都包含软骨素或其衍生物。硫酸软骨素在许多组织(包括皮肤、软骨、肌腱和心脏瓣膜)中发现的结构蛋白聚糖中占很大百分比，使其成为一系列组织工程应用的有吸引力的生物聚合物。光交联的硫酸软骨素水凝胶可以通过用甲基丙烯酸酯基团改性硫酸软骨素来制备。在聚合之前，通过甲基丙烯酸酯取代度和大分子单体在溶液中的浓度容易地控制水凝胶性质。此外，带负电的聚合物产生增大的溶胀压力，使凝胶吸收更多的水而不牺牲其机械性能。也可以使用硫酸软骨素和惰性聚合物例如PEG或PVA(聚乙酸乙烯酯)的共聚物水凝胶。

在某些实施方案中，核、壳或两者都包含合成聚合物或聚合物。聚乙二醇(PEG)是最广泛使用的合成聚合物，用于产生用于细胞包封的大分子单体。许多研究使用聚(乙二醇)二(甲基)丙烯酸酯来包封各种细胞。可生物降解的PEG水凝胶可由聚(α-羟基酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(α-羟基酯)的三嵌段共聚物制备，该三嵌段共聚物被(甲基)丙烯酸酯官能团封端以使交联聚(乳酸)(PLA)和聚(8-己内酯)(PCL)，是产生用于细胞包封的可生物降解的PEG大分子单体的最常用的聚(α-羟基酯)。通过可降解嵌段的长度和化学过程控制降解曲线和速率。酯键也可能被存在于血清中的酯酶降解，这加速了降解。可生物降解的PEG水凝胶也可由PEG-双-[2-丙烯酰氧基丙酸酯]的前体制备。作为线性PEG大分子单体的替代，可以使用聚(甘油-琥珀酸)-PEG的PEG基树枝状大分子，其中每个PEG分子含有多个反应性乙烯基团。这些材料的一个吸引人的特征是能够控制支化程度，从而影响水凝胶的整体结构性质及其降解。降解通过树枝状大分子骨架中存在的酯键而发生。

在某些实施方案中，核、壳或两者都包含聚磷酸酯或聚磷酸盐，其中磷酸酯键易于水解降解，导致磷酸基的释放。例如，可以将磷酸酯掺入可交联的PEG大分子单体(聚(乙二醇)-二-[乙基磷脂酰(乙二醇)甲基丙烯酸酯](PhosPEG-dMA)的主链中，以形成可生物降解的水凝胶。碱性磷酸酶(一种由骨细胞合成的细胞外基质(ECM)成分)的添加增强了降解。降解产物磷酸基与培养基中的钙离子反应，产生不溶性磷酸钙，诱导水凝胶内的自身钙化。聚(6-氨基乙基丙烯磷酸酯)，是一种聚磷酸酯，可以用甲基丙烯酸酯改性以产生多乙烯基大分子单体，其中降解速率由聚磷酸酯聚合物的衍生化程度控制。

在某些实施方案中，核、壳或两者都包含聚磷腈，聚磷腈具有由被交替的单键和双键分开的氮和磷组成的主链。每个磷原子与两个侧链共价键合。适用于交联的聚磷腈具有大多数是酸性的侧链基团，这些侧链基团能够与二价或三价阳离子形成盐桥。优选的酸性侧链基团的实例是羧酸基团和磺酸基团。水解稳定的聚磷腈由具有羧酸侧链基团的单体形成，羧酸侧链基团通过二价或三价阳离子例如Ca²⁺或Al³⁺交联。聚合物可以通过掺入具有咪唑、氨基酸酯或甘油侧链基团的单体来合成。可生物溶蚀的聚磷腈具有至少两种不同类型的侧链：能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧链基团，以及在体内条件下水解的侧链基团，例如咪唑基团、氨基酸酯基，甘油和葡糖基。水解侧链的实例是未取代的和取代的咪唑和氨基酸酯基，其中基团通过氨基键与磷原子键合。

本发明的胶囊可具有1000μm或更小的直径，其通常称为微胶囊。例如，微胶囊的直径可以为约10μm至约1000μm，或约20μm至约1000μm，或约50μm至约1000μm，或约50μm至约800μm，或约100μm至约700μm。然而，在一些情况下，如果需要，胶囊可具有高达2000μm或3000μm的直径，特别是当可能需要更大的样品体积时。

孵育CTC胶囊和不含CTC的胶囊(步骤60)以使被包封的细胞能够存活和生长(图1)。核中的营养素可以支持CTC活性和生长。对于CTC胶囊，被包封的CTC的活性和生长将改变CTC胶囊核中的环境的一种或多种性质，以产生模拟的肿瘤微环境。因此，由于CTC的细胞活性和生长，CTC胶囊核中的环境通常具有较低的pH以及如上所述的其他差异。另一方面，不含CTC的胶囊不会产生模拟的肿瘤微环境。

如本文所述和本领域通常已知的，以类似于培养分离的细胞的方式进行胶囊孵育(步骤60)。因此，胶囊(CTC胶囊和不含CTC的胶囊)孵育(步骤60)可以持续至少约3小时，更优选约12小时～约36小时，或约18小时～约24小时。优选地，将胶囊在含有以下物质中的至少一种或其组合的培养基中培养(步骤60)：抗生素、抗氧化剂、抗细胞因子和抗内毒素。

在某些实施方案中，将胶囊铺展在用于孵育期的支持表面上。或者，可以将孵育后的胶囊铺展在支持表面上。支持表面可以由硝化纤维素、纤维素、葡聚糖、尼龙、金属、塑料、乳胶、琼脂糖、玻璃、海藻酸盐或硅材料制成。该表面是固体的或半固体的。在某些实施方案中，玻璃或塑料表面可包覆有胶原蛋白。

然后将经孵育的胶囊与CAB接触(步骤70)，其中CAB任选地与可检测标记缀合(图1)。由于CTC胶囊在孵育(步骤60)后具有模拟肿瘤微环境的至少一种条件的内部环境，所以CAB可以优先由内部胶囊环境触发以与CTC胶囊中CTC上的细胞表面蛋白相结合。在不含CTC的胶囊中，由于内部胶囊环境中没有触发条件，CAB对相同细胞表面蛋白的结合亲和力明显较低。利用缀合的可检测标记，从而可以检测与CTC胶囊中的CTC结合的CAB。

在某些实施方案中，不将胶囊铺展到支持表面上，但是将胶囊在悬浮液中孵育(步骤60)并保持。可以将优选与可检测标记缀合的CAB加入到胶囊悬浮液的悬浮介质中。由于胶囊壳的渗透性，CAB可以渗透到胶囊中并与CTC胶囊中的CTC上的细胞表面蛋白结合。

可以使用选自荧光显微术、荧光酶标仪、流式细胞术、荧光激活细胞分选、荧光测定和吸收光谱的技术检测与缀合有可检测标记的CAB相结合的CTC。检测还可以借助于图像分析系统，其利用了与数字转换器或其他图像采集系统接口的摄像机。检测还可以通过荧光显微镜下的过滤器借助于可视化实现。显微镜可以仅提供操作员可视的信号。但是，该信号可以记录在摄影胶片上或使用视频分析系统记录。也可以使用图像分析系统或者仅使用光度计简单地实时量化该信号。

本发明提供的CTC的检测、计数和/或表征可用于筛选癌症，评估癌症预后和监测疗效，以早期检测出可能导致疾病复发的治疗失败。此外，本发明能够检测已完成治疗过程的症状前患者的早期复发。这是可能的，因为CTC的存在与肿瘤进展和扩散，对治疗的不良反应，疾病复发和/或在一段时间内存活率降低相关和/或关联。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于筛选或诊断个体中的癌症和/或为该个体制定预后的方法。该方法包括检测从个体获得的样品中的CTC。因此，本发明的方法可用于例如评估癌症患者和/或筛选具有癌症风险的患者。在如本文所述的筛选、诊断或预后的任何方法中，CTC的存在或不存在，和/或CTC的计数和/或表征可用于作出诊断或预后。

在某些实施方案中，可以在在特定时间内以不同的时间间隔检测个体样品中的CTC，以评估个体的进展和病理状况。例如，可以以有规律的时间间隔进行分析，例如一天、两天、三天、一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月或一年，以便跟踪CTC的水平和表征随时间的变化。在现有癌症患者的情况下，这可用于提供癌症进展的迹象并帮助医疗从业者做出适当的治疗选择。例如，CTC随时间的增加可能是癌症进展的指标。随着时间的推移，CTC的任何减少可以是疾病稳定，缓解和/或患者对治疗的反应的指标。对于那些没有癌症或有癌症风险的人，检测到的CTC数量的突然增加可以提供患者肿瘤已经发展的早期警告，从而提供早期诊断。

一旦确认了个体样品中CTC的存在，可以进行后续分析以表征CTC从而确定CTC的起源和/或身份以及关于癌症的其他信息。例如，除了图像分析和堆积个数测量之外，可以使用PCR技术，例如使用对特定癌症标志物特异性的引物的多路复用，以获得诸如CTC起源的癌症的类型，转移状态和恶性程度的信息。可以使用对一种或多种以下标志物特异性的PCR引物：EGFR、1-IER2、ERCC1、CXCR4、EpCAM、E-钙粘着蛋白、粘蛋白-1、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRM1、雄激素受体、雌激素受体、孕酮受体、IGF1、cMET、EML4或白细胞相关受体(LAR)。另外，可以进行细胞大小，DNA或RNA分析，蛋白组分析或代谢组分析，作为获得关于患者癌症特征的额外信息的手段。表1列出了一些癌症标志物，包括DNA、RNA和蛋白癌症标志物。

表1癌症DNA、RNA和蛋白标志物

在某些实施方案中，CTC表征可包括使用靶向蛋白癌症标志物的抗体用于特定癌症类型，尤其是CTC表面上的癌症标志物。表1中的蛋白癌症标志物可用于确定某些CTC的癌症类型。例如，源自乳腺癌的CTC通常具有诸如CK+/DAPI+/CD45-的表面标志物，而源自胰腺癌的CTC通常具有包括CA19-9+/EpCAM+的表面标志物。其他癌症标志物包括乳腺癌标志物：MUC-1、雌激素、孕酮受体、组织蛋白酶D、p53、尿激酶型纤溶酶原激活物、表皮生长因子、表皮生长因子受体、BRCA1、BRCA2、CA27.29、CA15.5、前列腺特异性抗原、纤溶酶原激活物抑制剂和Her2-neu；前列腺癌标志物：前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、胸腺素b-15、p53、HPC1基础前列腺基因、肌酸激酶和前列腺特异性膜抗原；结肠癌标志物：癌胚抗原、C蛋白、APC基因、p53和基质金属蛋白酶(MMP-9)；以及膀胱癌标志物：核基质蛋白(NMP22)、Bard膀胱肿瘤抗原(BTA)和纤维蛋白降解产物(FDP)。

因此，本发明还提供了一种通过进一步表征从个体获得的样品中的CTC来诊断癌症的方法。使用本发明的这种方法，可以检测和诊断多种癌症，包括但不限于前列腺癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、咽喉癌、子宫癌、脑癌、血液癌或睾丸癌。例如，可以在尿样中检测来自前列腺癌、膀胱癌和肾癌的CTC，而在血液样品中可以检测乳腺癌、肺癌和卵巢癌。

以下是本发明的软明胶胶囊的说明性而非限制性的实施例。对通常在本领域中遇到的各种条件和参数的其他合适的修改和调整(对于本领域技术人员而言是显而易见的)都落在本发明的范围内。

实施例1:针对Ax1的CAB

Axl是跨膜酪氨酸激酶，其具有可被CAB接近的细胞外结构域。该细胞表面蛋白在甲状腺癌组织中高度表达，并在许多诸如骨髓增生性疾病、前列腺癌细胞或乳腺癌的其他癌症中过表达。为了检测CTC，开发了针对Axl蛋白的细胞外结构域的CAB。

选择针对Axl的野生型抗体作为模板抗体。演化编码野生型抗体的DNA以产生突变体抗体文库。通过在pH6.0和pH7.4下同时筛选对Axl的选择性结合亲和力来产生文库中的突变体抗体。同时，还优化了突变体抗体的表达水平，以便在制造过程中提供更高的产率。使用FLAG标签在血清中进行筛选，因为血清中存在可能导致筛选的假阳性的人抗体。筛选缓冲液是碳酸盐缓冲液(Krebs缓冲液与ringer-标准缓冲液，但不同于PBS)。与野生型抗体相比，发现产生的条件活性抗体在pH6.0下对Axl的结合亲和力高于在pH7.4下对Axl的结合亲和力。一些选择的突变体抗体(scFv)在图2中表示，它们在pH6.0下比在pH7.4下具有更高的活性，而且它们在pH6.0下的活性与在pH7.4下的活性的活性比为至少11倍(图3)。

此外，这些条件活性抗体都具有高表达水平，如下表2所示，在列“克隆”中显示抗体，而在第二列中显示表达水平“mg/ml”。

将这些抗体的克隆以所请求的表达水平(“订购量”，预期表达水平)发送给服务提供者。这些抗体的实际表达水平(“交付量”)非常高并超过预期的表达水平。

表2具有高表达水平的条件活性抗体

克隆	mg/ml	订购量	交付量
				BAP063.6-hum10F10-FLAG	7	150	294
BAP063.6-HC-H100Y-FLAG	6.6	150	238

BAP063.8-LC046HC04-FLAG	7	200	332.5
				BAP063.8-LC062HC02-FLAG	5.8	200	220.4

				BAP063.9-13-1-FLAG	5.3	50	123
BAP063.9-29-2-FLAG	4.9	50	102
				BAP063.9-45-2-FLAG	5.4	50	129
BAP063.9-13-3-FLAG	5.9	50	130
				BAP063.9-21-3-FLAG	5.3	50	117
BAP063.9-21-4-FLAG	7	50	176
				BAP063.9-29-4-FLAG	8.2	50	196
BAP063.9-48-3-FLAG	7	50	125
				BAP063.9-49-4-FLAG	5.3	50	126
BAP063.9-61-1-FLAG	5.1	50	97
				BAP063.9-61-2-FLAG	5	50	92

如图4所示，使用BAP063.9-13-1抗体作为实例，条件活性抗体在缓冲液中未显示聚集。通过尺寸排阻色谱分析BAP063.9-13-1抗体。在图4中，仅检测到一个峰，表明抗体很少聚集或没有聚集。

还使用表面等离子共振(SPR)测定条件活性抗体以测量它们对Axl的结合和解离速率。已知SPR测定法用于测量条件活性抗体的结合和解离速率。SPR测定在碳酸氢盐存在下进行。条件活性抗体的体内结合和解离速率(在动物和人类中)是条件活性抗体的活性和/或选择性的重要特征。

观察到，与阴性对照(BAP063 10F10，其在pH6.0和pH7.4下具有相似的结合速率)(图5)相比，条件活性抗体在pH6.0下具有快的结合速率而在pH7.4下具有较慢的结合速率。此外，将温度从室温升至60℃不会明显改变SPR测定结果(图5)。SPR测定还显示，与在pH7.4相比，这些条件活性抗体在pH6.0下具有高选择性(图6A-6B显示了一种抗体作为实例)。

条件活性抗体总结在表3中。抗体中的两种表达为scFv(BAP063.9-13.3和BAP063.9-48.3)，它们准备好将被插入至包括CAR(CAR-T)平台的t细胞的嵌合抗原受体(CAR)中。将抗体在60℃孵育1小时不会改变大多数抗体的亲和力(“热稳定性”)。在报告使用SPR测量pH6.0和pH7.4下的结合亲和力的数据的两列中(表3的最后两列)，与“BAP063.6-hum10F10-FLAG”(阴性对照，表3第二行)进行了比较。这些抗体的选择性可以通过最后两列中的数据之间的差异来确定。两种scFv抗体具有非常高的选择性(pH6下为75％和50％，pH7.4下为0％)。

根据本发明，CAB可用于检测CTC表面上的Axl蛋白。类似的程序可用于制备针对其他细胞表面蛋白和/或由不同于pH的条件触发的其他CAB。

然而，应该理解，尽管在前面的描述中已经阐述了本发明的许多特征和优点以及本发明的结构和功能的细节，但是本发明仅是说明性的，可以在本发明的原理内，在由所附权利要求中的术语所表达的广泛一般含义所指示的全部范围内具体地进行改变，特别是在部件的形状、尺寸和布置方面的改变。

本文提及的所有文献均通过引用整体并入本文，或者提供具体引用部分的公开内容。申请人无意于向公众展示任何被公开的实施方案，并且任何已公开的修改或变化中在文字上可能未落入权利要求书的范围内的内容，但也以等同替代物的名义构成本发明的一部分。

Claims

1.条件活性抗体在制备用于检测包含细胞的样品中的循环肿瘤细胞的产品中的用途，所述条件活性抗体在6.0-6.8的异常pH下对循环肿瘤细胞的细胞表面蛋白的结合亲和力，与在7.0-7.8的正常生理pH下所述条件活性抗体对相同的细胞表面蛋白的结合亲和力相比更高，

所述用于检测包含细胞的样品中的循环肿瘤细胞的产品还包括适于包封所述样品的胶囊，所述胶囊为核-壳结构，所述胶囊的核包含适于支持核中循环肿瘤细胞的细胞活性和生长的蛋白和营养素，细胞悬浮在所述胶囊的核中，所述胶囊的壳为生物相容性聚合物壳，所述胶囊的壳具有半透性，所述条件活性抗体可通过所述胶囊的壳渗透到胶囊中并与循环肿瘤细胞的细胞表面蛋白结合。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述条件活性抗体与可检测标记缀合。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述异常pH的范围为6.2-6.8。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述异常pH的范围为6.4-6.8。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述正常生理pH的范围为7.2-7.8。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述正常生理pH的范围为7.2-7.6。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述核包含聚合物基质。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物相容性聚合物选自蛋白和多糖。

9.根据权利要求8所述的用途，其中作为所述生物相容性聚合物的所述蛋白选自白蛋白、胶原蛋白、合成聚氨基酸和醇溶蛋白。

10.根据权利要求8所述的用途，其中作为所述生物相容性聚合物的所述多糖选自海藻酸盐、纤维素和肝素。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述纤维素是酰基取代的纤维素。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物相容性聚合物选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯聚合物、酰基取代的纤维素醋酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃和聚环氧乙烷。

13.根据权利要求1所述的用途，其中在所述核中的所述蛋白选自胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、弹性蛋白和弹性蛋白样多肽。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述营养素包含营养素渗透剂。

15.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中所述胶囊的直径为10 μm至1000 μm。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述胶囊的直径为20 μm至1000 μm。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述胶囊的直径为50 μm至1000 μm。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述胶囊的直径为50 μm至800 μm。

19.根据权利要求15所述的用途，其中所述胶囊的直径为100 μm至700 μm。

20.根据权利要求2所述的用途，其中所述可检测标记是基于光吸收、荧光、反射、光散射、磷光、发光性质、放射性质、核磁共振性质或顺磁性质的、可直接或间接检测的分子或离子。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述可检测标记是荧光标记。

22.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中所述细胞表面蛋白是持家基因的蛋白产物。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述持家基因选自AP2S1、CD81、GPAA1、LGALS9、MGAT2、MGAT4B、VAMP3、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13和SLC2A14。

24.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中所述细胞表面蛋白选自ABCA7、ABCC1、ABCC5、ABHD3、ACKR3、ADAM10、AQP1、AQP3、ATP13A3、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B4、ATP6AP1、ATP6V0A2、BACE1、BMPR2、BNIP2、BST2、BTN2A1、BTN3A3、C12orf76、C17orf62、C1orf27、CCDC107、CD4、CD44、CD46、CD81、CD9、CD99L2、CDAN1、CDIPT、CLCN6、CNNM4、CYP20A1、DCBLD2、DHRS7B、ERBB2、ETNK1、FAM210B、GINM1、GPI、GRAMD1A、HELZ、HERPUD1、HMOX1、HPS3、ICAM1、IFI30、IFRD1、IL15RA、IL6ST、ITGA7、ITGB1、ITGB4、ITGB5、ITSN1、JAG1、LAIR1、LMTK2、LRBA、LRP12、LSR、MACF1、MADD、MCAM、MCOLN1、MET、MICAL3、MPV17L2、NCKIPSD、NDC1、NEO1、NOTCH2、PANX1、PDLIM5、PFDN1、PGAP3、PGRMC2、PHLDB2、PIGN、PIGQ、PIGW、PKN2、PTPRS、PVR、RALGAPA2、RNF145、RNF149、SC5D、SCAMP4、SDC2、SDC4、SLC12A2、SLC16A1、SLC16A3、SLC17A5、SLC19A1、SLC1A5、SLC30A1、SLC38A6、SLC38A7、SLC39A14、SLC3A2、SLC43A1、SLC46A1、SLC46A3、SLC4A2、SLC4A7、SLC7A5、SLC9A1、SMAGP、SORT1、SPG11、SPINT2、SPPL2B、SPPL3、SRD5A3、SRPRB、STX18、STX4、SYVN1、TAPT 1、TAZ、TBC1D5、TGFBR2、TM2D2、TMEM183A、TMEM205、TMEM218、TMEM222、TMEM245、TMEM258、TMEM50A、TMEM63B、TMEM97、TNFRSF12A、TXNDC11、UBR2、UQCC1、VSIG4、WWP1、YIPF4、ZDHHC20和ZDHHC5。

25.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中所述条件活性抗体在所述异常pH下对所述细胞表面蛋白的结合亲和力，是在所述正常生理pH下对相同的细胞表面蛋白的结合亲和力的至少5倍。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述条件活性抗体在所述异常pH下对所述细胞表面蛋白的结合亲和力，是在所述正常生理pH下对相同的细胞表面蛋白的结合亲和力的至少10倍。

27.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中所述条件活性抗体是多特异性抗体。

28.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中所述样品是体液，包括血液、淋巴液、唾液、粘液、痰液、脓液、尿液、粪便、胃肠分泌物、耳蜗液、滑液、脑脊液、泪液、玻璃体液、精液、阴道分泌物和乳腺分泌物中的或从它们中获取的一种或多种成分。

29.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中所述样品选自血液、尿液和脑脊液。