JP7064769B2 - 条件的活性型ポリペプチド - Google Patents

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Description

本開示は、所望の活性を有する改良されたポリペプチドを提供する分野に関する。具体的には、本開示は、親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを生成する方法に関し、この条件的活性型ポリペプチドは、特定の化合物又はイオン種の存在下である条件下において別の条件下よりも活性が高い。
タンパク質、特に酵素又は抗体を様々な条件において活性又は安定であるように種々の特性に関して進化させる方法について記載している文献は多数ある。例えば、酵素を高温で安定であるように進化させることが行われている。高温で酵素活性が向上する状況では、その向上の実質的な部分は、一般にＱ１０法則（酵素の場合には１０℃の上昇につき代謝回転が二倍になると推定される）によって説明されるより高い速度論的活性によるものであり得る。
加えて、その正常な動作条件でタンパク質を不安定化させる、ひいては正常な動作条件でタンパク質活性を低下させる天然の突然変異が存在する。例えば、より低温で活性であるが、しかし典型的にはその由来である野生型タンパク質と比較して低いレベルで活性である公知の温度突然変異体がある。
条件的活性型のポリペプチド、例えば、ある条件では活性が低い又は事実上不活性であり、且つ別の条件では活性であるポリペプチドを生成することが望ましい。また、ある種の環境で活性化又は不活性化されるか、或いは時間の経過に伴い活性化又は不活性化されるポリペプチドを生成することも望ましい。温度以外にも、条件的活性となるようにポリペプチドを進化させ又は改良し得る他の条件として、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス；及び電解質濃度が挙げられる。進化させる際には、ポリペプチドの活性に加え、化学的抵抗性、及びタンパク質分解抵抗性を含めた他の特性を改良することが望ましい場合も多い。
タンパク質を進化させるための戦略はこれまで多数記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１００９８５号明細書は、鋳型ポリヌクレオチドの元の各コドン位置を天然に存在する２０アミノ酸をコードするコドンに置換することによって親の鋳型ポリヌクレオチドから一組の変異ポリヌクレオチドを作製する高速の且つ容易な方法を開示している。この方法は単純に飽和突然変異誘発と呼ばれ、他の突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ）方法、例えば、２つ以上の関係のあるポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入して組換え及び減少的再集合によりハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法と組み合わせて用いることができる。
Ｇｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．１２８０９－１２８１３（１９９８）は、インビトロ進化を用いて中温性エステラーゼにおける安定性と活性との関係を調べた。６世代のランダム突然変異誘発、組換え、及びスクリーニングにより、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐ－ニトロベンジルエステラーゼが低温でのその触媒活性を損なうことなく有意に安定化した（＞１４℃のＴｍの増加）。この研究では、低温活性を維持しながらも熱安定性を増加させる突然変異が極めてまれであることが見出された。これらの２つの特性が逆相関したか、それとも全く相関しなかったかに関わらず、アミノ酸置換の蓄積による一方の改良は、典型的には他方の犠牲の上に得られた。
親ポリペプチドがその通常の動作条件では不活性又は事実上不活性（５０％、３０％、又は１０％未満の活性及び特に１％の活性）であるが、異常条件では同等の又はより良好なその活性を維持するように進化させるためには、不安定化させる突然変異が、その不安定効果を打ち消すことのない、活性を増加させる突然変異と共存することが必要であり得る。不安定化させる突然変異は、Ｑ１０などの標準法則によって予測される効果を上回ってポリペプチドの活性を低下させるであろうことが予想され、従って、例えばその正常な動作条件下では活性が低い又は不活性である一方で、異常条件では効率的に機能するポリペプチドを進化させることが可能になると、条件的活性型ポリペプチドが作り出される。
このように、条件的活性型ポリペプチドは異常条件で親タンパク質と比較して活性が増加し、及び正常生理条件で親タンパク質と比較して活性が低下する。従って条件的活性型ポリペプチドは、治療用タンパク質として使用されるとき、好ましくは、腫瘍微小環境など、異常条件が存在する場所で作用する。このような優先的作用の結果として、条件的活性型ポリペプチドは、正常生理条件が存在する正常組織／器官に害を及ぼし難く、ひいては副作用を生じ難い可能性がある。これにより、条件的活性型ポリペプチドをより長期間の治療に、又はより高用量で使用することが可能になり、その療法のより高い有効性につながる。
国際公開第２０１０／１０４８２１号パンフレット及び国際公開第２０１１／００９０５８号パンフレットは、条件的活性型タンパク質を進化させてスクリーニングする方法を開示している。
特定の環境及び／又は特定の条件下で活性及び／又は選択性がより高い条件的活性型ポリペプチドが依然として必要とされている。
一実施形態において、本開示は、９００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量及び第１のｐＨから最大０．５、１、２又は４単位離れたｐＫａを有する少なくとも１つの種の存在下での第１のｐＨにおけるアッセイの活性の、同じ少なくとも１つの種の存在下での第２のｐＨにおけるアッセイの活性に対する比が少なくとも１．３である天然に存在しないポリペプチド又は単離ポリペプチドに関する。
一実施形態において、本開示は、９００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を有する少なくとも１つの種の存在下での第１のｐＨにおけるアッセイの活性の、同じ少なくとも１つの種の存在下での第２のｐＨにおけるアッセイの活性に対する比が少なくとも１．３である天然に存在しないポリペプチド又は単離ポリペプチドに関し、及び前記種は前記第１のｐＨ～前記第２のｐＨの間のｐＫａを有する。
一実施形態において、本開示は、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸イオン、重炭酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、二硫化物イオン、硫化水素、アンモニウムイオン、リン酸二水素イオン及びこれらの任意の組み合わせから選択される種の存在下での第１のｐＨにおけるアッセイの活性の、同じ種の存在下での第２のｐＨにおけるアッセイの活性に対する比が少なくとも１．３である天然に存在しないポリペプチド又は単離ポリペプチドに関する。
前述の実施形態のいずれかのポリペプチドは、第１のｐＨにおけるアッセイの活性の、第２のｐＨにおけるアッセイの活性に対する比が、少なくとも１．５、又は少なくとも１．７、又は少なくとも２．０、又は少なくとも３．０、又は少なくとも４．０、又は少なくとも６．０、又は少なくとも８．０、又は少なくとも１０．０、又は少なくとも２０．０、又は少なくとも４０．０、又は少なくとも６０．０、又は少なくとも１００．０であり得る。前述の実施形態のいずれかのポリペプチドは、酸性ｐＨである第１のｐＨ及びアルカリ性ｐＨ又は中性ｐＨである第２のｐＨでアッセイされ得る。第２のｐＨは、対象へのポリペプチドの投与部位における、又は対象のポリペプチドの作用部位の組織又は器官における生理条件の正常範囲内にある正常生理的ｐＨであってもよく、及び第１のｐＨは、ポリペプチドの投与部位における、又はポリペプチドの作用部位の組織又は器官における生理条件の正常範囲から逸脱した異常ｐＨであってもよい。
第１のｐＨは５．５～７．２の範囲、又は６．２～６．８の範囲であってもよい。第２のｐＨは７．２～７．６の範囲であってもよい。第１のｐＨは約６．０であってもよく、及び第２のｐＨは約７．４であってもよい。
前述の実施形態のいずれかのポリペプチドは、親ポリペプチドから進化させた天然に存在しない変異ポリペプチドであってもよい。前述の実施形態のいずれかの変異ポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドを含む野生型親ポリペプチドに由来してもよい。前述の実施形態のいずれかの変異ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。前述の実施形態のいずれかの変異ポリペプチドは、親ポリペプチドよりも高い割合の荷電アミノ酸残基を有し得る。
前述の実施形態のいずれかのポリペプチド又は変異ポリペプチドは、タンパク質又はタンパク質フラグメントであってもよい。前述の実施形態のいずれかのポリペプチド又は変異ポリペプチドは、抗体、一本鎖抗体、及び抗体フラグメントから選択されてもよく、及び活性は、抗原に対する結合活性である。本ポリペプチド又は変異ポリペプチドは抗体のＦｃ領域であってもよい。本ポリペプチド又は変異ポリペプチドは酵素であってもよく、及び活性は酵素活性であってもよい。本ポリペプチド又は変異ポリペプチドは、受容体、調節タンパク質、可溶性タンパク質、サイトカイン、及び受容体、調節タンパク質、可溶性タンパク質又はサイトカインのフラグメントから選択されてもよい。
前述の実施形態のいずれかの種は、硫化水素、重炭酸イオン又は二硫化物イオンであってもよい。前述の実施形態のいずれかの種は、６．２より高いｐＫａを有してもよい。
前述の実施形態のいずれかのポリペプチドは２つの機能ドメインを有してもよく、及び活性は、２つの機能ドメインのうちの一方の活性である。２つの機能ドメインの両方がｐＨ依存的活性を有してもよい。本ポリペプチドは二重特異性抗体であってもよい。
別の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのポリペプチドは、固形腫瘍、炎症関節、又は脳疾患若しくは障害の治療に用いられ得る。
別の実施形態において、本開示は、前述の実施形態のいずれかのポリペプチドを投与する工程を含む、固形腫瘍、炎症関節、又は脳疾患若しくは障害の治療方法に関する。本ポリペプチドは、本ポリペプチドを含むか又はナノ粒子に連結されたＴ細胞のキメラ抗原受容体の一部として、又は本ポリペプチドを含む抗体－薬物コンジュゲートとして投与されてもよい。
別の実施形態において、本開示は、本ポリペプチドを含むＴ細胞のキメラ抗原受容体に関する。前述の実施形態の各々において、本ポリペプチドはナノ粒子に連結されていてもよい。
別の実施形態において、本開示は、本ポリペプチドを含む抗体－薬物コンジュゲートに関する。
別の実施形態において、本開示は、条件的活性型生物学的タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様（ａｐｓｅｃｔ）において、本開示は、親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを作製する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）その活性部位外にある少なくとも１つの領域を突然変異させることにより親ポリペプチドを進化させる工程であって、それにより１つ以上の変異ポリペプチドを作製する工程；
（ｉｉ）１つ以上のポリペプチド及び親ポリペプチドを正常生理条件下の第１のアッセイに供して正常生理条件下での活性部位の活性を計測し、及び異常条件下の第２のアッセイに供して異常条件下での活性部位の活性を計測する工程であって、正常生理条件と異常条件とが同じ条件であるが異なる値を有する、工程；及び
（ｉｉｉ）１つ以上の変異ポリペプチドから、（ａ）第１のアッセイにおける親ポリペプチドの同じ活性と比較した活性の低下、及び（ｂ）第２のアッセイにおける親ポリペプチドの同じ活性と比較した活性の増加、の両方を呈する条件的活性型ポリペプチドを選択する工程を含む。
実施例９で作製した条件的活性型抗体及びｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０でのそれらの選択性を示す。 種々の緩衝溶液でアッセイした条件的活性型抗体の抗原への結合活性を示す。 クレブス緩衝液の組成の変更が条件的活性型抗体の結合活性に及ぼす効果を示す。 実施例１２に記載されるとおり、３つの異なる条件的活性型抗体の結合活性がｐＨ７．４で重炭酸塩の存在及び濃度に依存的であったことを示す。 キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構造を示す図である。 デオキシヘモグロビンにおける塩橋の形成を示す図であり、ここでは３つのアミノ酸残基が２つの塩橋を形成し、これらの塩橋がデオキシヘモグロビンのＴ四次構造を安定化させるため、酸素に対する親和性の低下につながる。 種々の緩衝溶液中での条件的活性型抗体のＲｏｒ２に対する活性を示す。 種々の緩衝溶液中での条件的活性型抗体のＡｘｌに対する活性を示す。 １０ｍＭの二硫化物イオンを含むアッセイ溶液を使用して発見された条件的活性型抗体のＡｘｌに対する活性を示す。
定義
本明細書に提供される例が容易に理解されるように、幾つかの高頻度で出現する方法及び／又は用語をここに定義するものとする。以下の用語の定義は米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書から参照によって援用される：「薬剤」、「曖昧な塩基要件」、「アミノ酸」、「増幅」、「キメラ特性」、「コグネイト」、「比較ウィンドウ」、「保存的アミノ酸置換」、「～に対応する」、「分解上有効な」、「定義された配列フレームワーク」、「定義された配列カーネル」、「消化」、「方向性ライゲーション」、「ＤＮＡシャフリング」、「薬物」又は「薬物分子」、「有効量」、「エピトープ」、「酵素」、「進化」又は「進化する」、「フラグメント」又は「誘導体」又は「類似体」、「全域単一アミノ酸置換」、「遺伝子」、「遺伝的不安定性」、「異種」、「同種」又は「同祖」、「産業上の利用」、「同一」又は「同一性」、「同一性範囲」、「単離された」、「単離核酸」、「リガンド」、「ライゲーション」、「リンカー」又は「スペーサー」、「微小環境」、「進化させる分子特性」、「突然変異」、「Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ」、「正常生理条件」又は「野生型動作条件」、「核酸分子」、「核酸分子」、「～をコードする核酸配列」又は「～のＤＮＡコード配列」又は「～をコードするヌクレオチド配列」、「酵素（タンパク質）をコードする核酸」又は「酵素（タンパク質）をコードするＤＮＡ」又は「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」、「特異的核酸分子種」、「ワーキング核酸試料を核酸ライブラリにアセンブルする」、「核酸ライブラリ」、「構築物」、「オリゴヌクレオチド」（又は同義語として「オリゴ」）、「同種」、「作動可能に連結された」、「親ポリヌクレオチドセット」、「患者」又は「対象」、「生理条件」、「集団」、「プロフォーム」、「擬似ランダム」、「準反復単位」、「ランダムペプチドライブラリ」、「ランダムペプチド配列」、「受容体」、「組換え」酵素、「合成」酵素、「関連ポリヌクレオチド」、「減少的再集合」、「参照配列」、「反復インデックス（ＲＩ）」、「制限部位」、「選択可能なポリヌクレオチド」、「配列同一性」、「類似性」、「特異的に結合する」、「特異的ハイブリダイゼーション」、「特異的ポリヌクレオチド」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」、「実質的に同一」、「実質的に純粋な酵素」、「実質的に純粋」、「処理する」、「可変セグメント」、及び「変異体」。
測定量と関連して本明細書で使用される用語「約」は、測定を行い、測定の目的に相応の注意レベルと使用される測定機器の精度を行使する当業者によって期待される測定量における通常の変動に関連するものである。特に明記しない限り、「約」は、与えられた値の＋／－１０％の変動に関連する。
用語「活性」は、本明細書で使用されるとき、反応の触媒及びパートナーとの結合を含め、タンパク質が果たし得る任意の機能を指す。酵素については、活性とは、酵素活性であり得る。抗体については、活性とは、抗体とその抗原との間の結合活性（即ち、結合活性）であり得る。受容体又はリガンドについては、活性とは、受容体とそのリガンドとの間の結合活性であり得る。
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）2、Ｆｖ、及びＳＣＡフラグメントなど、抗原のエピトープとの結合能を有する免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。これらの抗体フラグメントは、その由来である抗体の抗原（例えばポリペプチド抗原）に選択的に結合する能力をいくらか保持しているものであり、当該技術分野において周知の方法を用いて作製することができ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，前掲を参照）、以下のとおり、さらに説明される。抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる抗原の調製分量の単離に使用することができる。かかる抗体の他の様々な用途は、疾患（例えば新生物形成）の診断及び／又はステージ判定、並びに、例えば、新生物形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管疾患、感染症などの疾患を治療するための治療適用である。キメラ抗体、ヒト様抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が、ヒト患者への投与に特に有用である。
Ｆａｂフラグメントは抗体分子の一価抗原結合フラグメントからなり、全抗体分子を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなるフラグメントを生じさせることによって作製し得る。
抗体分子のＦａｂ’フラグメントは、全抗体分子をペプシンで処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる分子を生じさせることによって得ることができる。このように処理した抗体分子１つにつき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。
抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントは、続く還元なしに全抗体分子を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる。（Ｆａｂ’）2フラグメントは、２つのジスルフィド結合によって一体に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。
Ｆｖフラグメントは、２本の鎖として発現した軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。
一本鎖抗体（「ＳＣＡ」又はｓｃＦｖ）は、好適な可動性ポリペプチドリンカー（ｌｉｎｅｒ）によって連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作された単鎖分子であり、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端に追加のアミノ酸配列を含み得る。例えば、一本鎖抗体は、コードポリヌクレオチドに連結するための繋留セグメントを含み得る。機能性の一本鎖抗体は、概して、軽鎖の可変領域のうち十分な部分と重鎖の可変領域のうち十分な領域とを含み、そのため特異的標的分子又はエピトープへの結合に関して完全長抗体の特性を保持している。
用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に分泌免疫グロブリンが結合して、それによりこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒でそれらの標的細胞を死滅させることが可能となる細胞傷害の一形態を指す。標的細胞の表面に対するリガンド特異的高親和性ＩｇＧ抗体は細胞傷害性細胞を刺激するもので、かかる死滅に必要である。標的細胞の溶解は細胞外であり、細胞間の直接接触を必要とし、補体は関与しない。
任意の特定の抗体がＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を媒介する能力は、アッセイすることができる。ＡＤＣＣ活性を評価するには、免疫エフェクター細胞と併せて標的リガンドを提示する標的細胞に目的の抗体を加え、免疫エフェクター細胞が抗原抗体複合体によって活性化されると、標的細胞の細胞溶解が生じ得る。細胞溶解は、概して、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光色素又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出される。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。インビトロＡＤＣＣアッセイの具体的な例は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ，ｖｏｌ．１６６，ｐａｇｅ １３５１；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．２５８，ｐａｇｅ １８３；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１８４，ｐａｇｅ ２９に記載されている。それに代えて又は加えて、目的の抗体のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐ．６５２に開示されるものなど、例えば動物モデルにおいて、インビボで評価してもよい。
用語「抗原」又は「Ａｇ」は、本明細書で使用されるとき、免疫応答を惹起する能力を有する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、又は特異的免疫適格細胞の活性化の一方、又は両方が含まれ得る。当業者は、事実上全てのタンパク質又はペプチドを含めた任意の巨大分子が抗原として働き得ることを理解するであろう。抗原が生成され、合成されてもよく、又は生体試料に由来してもよいことは容易に明らかである。かかる生体試料としては、限定はされないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は生体液を挙げることができる。
用語「アンチセンスＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、第２のＲＮＡ分子と共にその第２のＲＮＡ分子との相補性又は部分的相補性によって二重鎖を形成する能力を有するＲＮＡ分子を指す。アンチセンスＲＮＡ分子は第２のＲＮＡ分子の翻訳領域又は非翻訳領域と相補的であり得る。アンチセンスＲＮＡは第２のＲＮＡ分子と完全に相補的である必要はない。アンチセンスＲＮＡは第２のＲＮＡ分子と同じ長さであっても、又はそうでなくてもよい；アンチセンスＲＮＡ分子は第２のＲＮＡ分子より長くても又は短くても、いずれであってもよい。第２のＲＮＡ分子がｍＲＮＡである場合、アンチセンスＲＮＡの結合によってｍＲＮＡが機能性タンパク質産物に翻訳されることが完全に又は部分的に妨げられることになる。
用語「バイオシミラー」又は「後発生物製剤」は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が公表している実用上の定義と一致する形で使用され、ＦＤＡはバイオシミラーを、基準製剤と（臨床的に不活性な成分は僅かに異なるものの）「高度に類似した」製剤と定義している。実際には、安全性、純度、及び効力の点で基準製剤とバイオシミラー製剤との間に臨床的に有意味な違いはないものとし得る（公衆衛生法（ＰＨＳ）第２６２条）。バイオシミラーはまた、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）のヒト用医薬品委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ：ＣＨＭＰ）によって２０１２年５月３０日に採択され、且つ欧州連合によって“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｓｉｍｉｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － ｎｏｎ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ”（文書参照ＥＭＡ／ＣＨＭＰ／ＢＭＷＰ／４０３５４３／２０１０）として発表された１つ以上のガイドラインを満たすものでもあり得る。例えば、「バイオシミラー抗体」は、典型的には別の企業によって作製される後発版の新薬抗体（基準抗体）を指す。バイオシミラー抗体と基準抗体との違いには、例えば抗体に他の生化学基、例えば、リン酸、様々な脂質及び炭水化物を付加することによるか；翻訳後のタンパク質分解切断によるか；アミノ酸の化学的性質を変化させること（例えばホルミル化）によるか；又は他の多くの機構による翻訳後修飾が含まれ得る。他の翻訳後修飾は、製造工程での操作の結果であり得る－例えば、製剤が還元糖に曝露して糖化が起こり得る。ある場合には、保存条件が、酸化、アミド分解、又は凝集などのある種の分解経路が起こることに関して許容的であり得る。これらの製剤に関する変種の全てがバイオシミラー抗体に含まれ得るとおり。
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には制御されない細胞成長／増殖によって特徴付けられる哺乳類における生理条件を指し、又はそれを記述する。「腫瘍」は１つ又はそれ以上の癌性細胞を含む。癌の例としては、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。かかる癌のより詳細な例としては、有棘細胞癌（例えば、上皮有棘細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）又は胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌を含む）、膵癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌が挙げられる。
用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲｓ」は、本明細書で使用されるとき、細胞傷害性細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージに抗原特異性をグラフトする、操作された受容体を指す。本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの抗原特異的標的領域（ＡＳＴＲ）、細胞外スペーサードメイン（ＥＳＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、１つ又はそれ以上の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含み得る。一部の実施形態において、ＥＳＤ及び／又はＣＳＤは任意選択である。一実施形態において、ＡＳＴＲは二重特異性であり、２つの異なる抗原又はエピトープを認識することができる。ＡＳＴＲが標的抗原に特異的に結合した後、ＩＳＤが細胞傷害性細胞の細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、ＩＳＤは、ＣＡＲの抗原結合特性に依存して、ＭＨＣの制限を受けない形でＴ細胞特異性及び細胞傷害性を選択の標的に向け直すことができる。ＭＨＣの制限を受けない抗原認識により、ＣＡＲを発現する細胞傷害性細胞が抗原プロセシングと独立した抗原認識能を得るため、従って主要な腫瘍エスケープ機構が回避される。さらに、Ｔ細胞で発現するとき、ＣＡＲは有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量体化しない。
用語「条件的活性型ポリペプチド」は、少なくとも１つの条件下で親ポリペプチドよりも活性が高く、且つ第２の条件下で親ポリペプチドよりも活性が低い、親ポリペプチドの変異体又は突然変異体を指し、或いは変異体又は突然変異体ポリペプチドが第１の条件下で第２の条件下より少なくとも１．３倍高い活性である、親ポリペプチドの変異体又は突然変異体を指す。この条件的活性型ポリペプチドは、１つ以上の選択された生体位置で活性を呈し、及び／又は生体の別の位置では活性の増加又は低下を呈し得る。例えば、一態様において、進化させた条件的活性型生物学的タンパク質は、体温では事実上不活性であるが、それより低い温度では活性である。条件的活性型ポリペプチドには、条件的活性型タンパク質、タンパク質フラグメント、抗体、抗体フラグメント、酵素、酵素フラグメント、受容体及び受容体のフラグメント、サイトカイン及びそのフラグメント、ホルモン及びそのフラグメント、リガンド及びそのフラグメント、調節タンパク質及びそのフラグメント、成長因子及びそのフラグメント、並びにタンパク質、例えば、ストレスタンパク質、ヴォールト関連タンパク質、ニューロンタンパク質、消化管タンパク質、成長因子、ミトコンドリアタンパク質、細胞質タンパク質、動物性タンパク質、構造タンパク質、植物性タンパク質及びこれらのタンパク質のいずれかのフラグメントが含まれる。本明細書に記載される条件的活性型ポリペプチドの各々は、好ましくは条件的活性型生物学的ポリペプチドである。
用語「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」又は「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）」は、本明細書で使用されるとき、免疫系の細胞を生じさせる／それに影響を及ぼす生体分子の一般的なクラスを指す。この定義には、限定はされないが、局所的に又は血液循環を通じて分泌部位から離れた他の位置で作用して個体の免疫応答を調節又は調整する生体分子が含まれることが意図される。例示的サイトカインとしては、限定はされないが、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－２９、詳細には、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－１８）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ－α及びＴＮＦ－β）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＭＩＰ３ａ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「電解質」は、電荷を帯びた血液中又は他の体液中のミネラルを定義して使用される。例えば、一態様において、正常生理条件と異常条件とは異なる値の「電解質濃度」であり得る。例示的電解質としては、限定はされないが、イオン化カルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩化物、クエン酸塩、乳酸塩、重炭酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。
用語「完全長抗体」は、抗原結合可変領域（ＶH又はＶL）並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む抗体を指す。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。完全長抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なる「クラス」に割り当てられ得る。完全長抗体の主要なクラスは５つあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、これらのうちの幾つかは「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分かれ得る。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
用語「成長因子」は、本明細書で使用されるとき、細胞の分化を生じさせる能力を有するポリペプチド分子を指す。成長因子の例としては、限定はされないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子－α（ＴＧＦα）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、ヒト内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＮＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が挙げられる。
用語「ホルモン」は、本明細書で使用されるとき、メディエーターとして同定されることが多い物質を指し、典型的には生物のある部分の細胞又は腺によって放出されて、その生物の他の部分へのメッセンジャーとして働くものである。例示的ホルモンには、血流中に直接放出される内分泌ホルモン、及び管路中に直接分泌され、及び管路からそれらが血流中に、又は細胞から細胞に、パラ分泌シグナル伝達として知られる過程で拡散によって流れ込む外分泌ホルモン（又はエクトホルモン）が含まれる。脊椎動物ホルモンは、３つの化学的クラス：ペプチドホルモン、脂質及びリン脂質由来ホルモン、及びモノアミンに分類することができる。ペプチドホルモンはポリペプチド鎖からなる。ペプチドホルモンの例としては、インスリン及び成長ホルモンが挙げられる。脂質及びリン脂質由来ホルモンは、リノール酸及びアラキドン酸などの脂質並びにリン脂質に由来する。主要なクラスは、コレステロール及びエイコサノイドに由来するステロイドホルモンである。ステロイドホルモンの例はテストステロン及びコルチゾールである。モノアミンは、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ酵素の作用によってフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなどの芳香族から得られる。モノアミンの例はチロキシン及びアドレナリンである。
用語「免疫調節薬」は、本明細書で使用されるとき、免疫系に対する作用が、免疫応答に関わる少なくとも１つの経路の活性の即時の又は遅延した増強又は低下をもたらす薬剤を指す。かかる応答は自然免疫系又は適応免疫系又は両方の一部として天然に存在するものか、又は人工的に惹起されるものであり得る。免疫調節薬（ｉｍｍｕｎｏｍｏｂｕｌａｔｏｒ）の例としては、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び造血因子、例えばインターロイキン類（例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球－コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、インターフェロン類（例えば、インターフェロン－α、－β及び－γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞成長因子、エリスロポエチン及びトロンボポエチンが挙げられる。好適な免疫調節薬部分の例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、インターフェロン類、ＴＮＦ（例えばＴＮＦ－α）などが挙げられる。
「個体」又は「対象」は哺乳類である。哺乳類としては、限定はされないが、家畜化された動物（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。
用語「ライブラリ」は、本明細書で使用されるとき、単一のプールとしてのタンパク質のコレクションを指す。ライブラリはＤＮＡ組換え技術を用いて作成し得る。例えば、ｃＤＮＡ又は任意の他のタンパク質コードＤＮＡのコレクションを発現ベクターに挿入してタンパク質ライブラリを作成し得る。また、ｃＤＮＡ又はタンパク質コードＤＮＡのコレクションをファージゲノムに挿入して野生型タンパク質のバクテリオファージディスプレイライブラリも作成し得る。ｃＤＮＡのコレクションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）によって開示される方法によるなどして、特定の細胞集団又は組織試料から作製し得る。特定の細胞型由来のｃＤＮＡコレクションはまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）などの供給業者から市販もされている。本明細書で使用されるとおりの野生型タンパク質のライブラリは、生物学的試料のコレクションではない。
用語「リガンド」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の結合部位において特定の受容体によって認識され且つその受容体に特異的に結合する分子を指す。リガンドの例としては、限定はされないが、細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト、毒素及び毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物（例えばアヘン製剤、ステロイド等）、レクチン、糖類、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴ糖類、タンパク質、及びモノクローナル抗体が挙げられる。典型的には、リガンドは２つの構造部分：リガンドのその受容体への結合に関与する第１の部分及びかかる結合に関与しない第２の部分を含む。
用語「受容体」は、本明細書で使用されるとき、所与のリガンドに親和性を有する分子を指す。受容体は天然に存在する分子又は合成分子であり得る。受容体は、改変されていない状態で、又は他の種との凝集体として用いられてもよい。受容体は、結合メンバーと直接、或いは特異的結合物質を介して、共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。受容体の例としては、限定はされないが、特定の抗原決定基（ウイルス、細胞、又は他の材料などにあるもの）との反応性を示すモノクローナル抗体を含めた抗体及び抗血清、細胞膜受容体、複合糖質及び糖タンパク質、酵素、及びホルモン受容体が挙げられる。リガンドのその受容体への結合は、特異的分子認識を介したリガンドとその受容体分子との組み合わせによる複合体の形成を示し、これは当業者に公知の種々のリガンド受容体結合アッセイによって検出することができる。
用語「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ｍｉＲＮＡ遺伝子からのプロセシングされていない又はプロセシングされたＲＮＡ転写物を指す。プロセシングされていないマイクロＲＮＡ遺伝子転写物は、典型的には約７０～１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写物を含む。転写されたマイクロＲＮＡは、ＲＮアーゼ（例えば、ダイサー、アルゴノート、又はＲＮアーゼＩＩＩ）による消化によってプロセシングを受けて、活性な１９～２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子になり得る。この活性な１９～２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、「プロセシングされた」マイクロＲＮＡ遺伝子転写物又は「成熟」マイクロＲＮＡとも称される。
用語「多重特異性抗体」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な多重特異性抗体はＢＢＢ－Ｒと脳抗原との両方に結合し得る。多重特異性抗体は完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）2二重特異性抗体）として調製することができる。２つ、３つ又はそれ以上（例えば４つ）の機能性抗原結合部位を含む操作された抗体もまた企図される（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７ Ａ１号明細書を参照）。
用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用されるとき、サイズがナノメートル（ｎｍ）単位であって、最大直線寸法が約１０００ｎｍ未満又は約５００ｎｍ未満、又は約２００ｎｍ未満、又は約１００ｎｍ未満、又は約５０ｎｍ未満の顕微鏡的粒子を指す。本明細書で使用されるとき、直線寸法とは、ナノ粒子上の任意の２点間を直線で計測したときの距離を指す。本発明のナノ粒子は、その形状及びサイズが結合相互作用を可能にする限り、不規則形状、長円形状、紡錘形状、ロッド形状、円盤形状、パンケーキ形状、円柱形状、赤血球様形状、球形状又は略球形状であってもよい。本発明のナノ粒子は、好ましくは生体適合性材料（ポリマー又は脂質）で作られる。
用語「自然発生」は、本明細書で使用されるとき、対象が自然において見られるという事実に関連して適用されるものである。例えば、自然において原料から分離され得る有機体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列で、実験室内で人によって意図的に修飾されたのではないものは自然発生である。より大きいポリペプチドから切り出されたポリペプチドは天然に存在するポリペプチドではなく、なぜなら、切り出されたポリペプチドの末端基は、それらの末端基がもはや隣接ポリペプチドに結合しなくなることに起因して切り出された形態ではそのより大きい天然に存在するポリペプチドのものと異なるであろうためである。一般に、天然に存在するという用語は、その種に典型的であり得るものなど、非病的な（罹患していない）個体に存在するとおりの物体を指す。
用語「親ポリペプチド」及び「親タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、本発明の方法を用いて条件的活性型ポリペプチド又はタンパク質を作製するため進化させ得るポリペプチド又はタンパク質を指す。親ポリペプチドタンパク質は、天然に存在しないタンパク質を含む野生型タンパク質であり得る。例えば、治療用ポリペプチド若しくはタンパク質又は突然変異体若しくは変異体ポリペプチド若しくはタンパク質を親ポリペプチド又はタンパク質として使用し得る。親ポリペプチド及びタンパク質の例としては、抗体、抗体フラグメント、酵素、酵素フラグメント、サイトカイン及びそのフラグメント、ホルモン及びそのフラグメント、リガンド及びそのフラグメント、受容体及びそのフラグメント、調節タンパク質及びそのフラグメント、並びに成長因子及びそのフラグメントが挙げられる。
用語「ｐＨ依存的」は、本明細書で使用されるとき、異なるｐＨ値で異なる特性又は活性を有するポリペプチドを指す。
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、単量体がアミノ酸であって、ペプチド又はジスルフィド結合によって一緒につながったポリマーを指す。ポリペプチドは、完全長の天然に存在するアミノ酸鎖又はフラグメント、その突然変異体又は変異体、例えば、結合相互作用において対象となるアミノ酸鎖の選択領域であり得る。ポリペプチドはまた、合成アミノ酸鎖、又は天然に存在するアミノ酸鎖若しくはそのフラグメントと合成アミノ酸鎖との組み合わせであってもよい。フラグメントは、完全長タンパク質の一部であるアミノ酸配列を指し、典型的には約８～約５００アミノ酸長、好ましくは約８～約３００アミノ酸、より好ましくは約８～約２００アミノ酸、さらにより好ましくは約１０～約５０又は１００アミノ酸長である。加えて、天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸、例えば、β－アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンが、タンパク質に含まれ得る。一般に見られる非遺伝子コードアミノ酸もまた、ポリペプチドに含まれ得る。アミノ酸は、Ｄ型光学異性体又はＬ型光学異性体のいずれかであり得る。特定の文脈での使用にはＤ型異性体が好ましく、以下に詳述する。加えて、他のペプチドミメティクスもまた、例えばポリペプチドのリンカー配列において有用である（Ｓｐａｔｏｌａ，１９８３，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７を参照）。一般に、用語「タンパク質」は、共有結合性又は非共有結合性の結合によって一体に保持された２個又は数個のポリペプチド鎖を含む構造を包含すること以外には、何ら用語「ポリペプチド」との大きな違いを伝えようと意図するものではない。
用語「組換え抗体」は、本明細書で使用されるとき、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞によって発現される抗体（例えばキメラ、ヒト化、又はヒト抗体又はそれらの抗原結合フラグメント）を指す。組換え抗体を産生する「宿主細胞」の例としては、以下が挙げられる：（１）哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（Ｙ０及びＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えばタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物（例えばニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属するもの（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属するもの（例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））；（５）細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞等。
用語「調節タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、別のポリペプチド又はＲＮＡ分子の活性を増加又は減少させる；別のポリペプチド又はＲＮＡ分子の存在量を増加又は減少させる；別のポリペプチド又はＲＮＡ分子と他のポリペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、又は任意の他の結合基質との間の相互作用を変化させる；及び／又は別のポリペプチド又はＲＮＡ分子の細胞位置を変化させる任意のタンパク質を指す。調節タンパク質は、遺伝子の転写速度を増加又は減少させる場合、それは、遺伝子のプロモーター又はエンハンサー領域に効果を及ぼす転写因子と称されることが多い。転写因子の例としては、哺乳類転写因子、例えば、ＮＦｋＢ、ＮＦ１、サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、ＭｙｏＤｌ、ホメオボックス転写因子、Ｓｐｌ、癌遺伝子及びｊｕｎ、Ｍｅｐ－１、ＧＡＴＡ－１、Ｉｓｌ－１、ＬＦＢ１、ＮＦＡＴ、Ｐｉｔ－１、ＯＣＡ－Ｂ、Ｏｃｔ－１及びＯｃｔ－２、酵母Ａ／α、ｃＥｒｂ－Ａ、ｍｙｃ、ｍａｄ及びｍａｘ、ｐ５３、ｍｄｍｌ、及びＬａｔｃｈｍａｎ，１９９８，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，３ｒｄ．Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるとおりの他のものが挙げられる。結合特異性を提供する、融合タンパク質の少なくともＤＮＡ結合モチーフが小分子調節因子結合部位に融合した、これら又は他の転写因子の融合タンパク質誘導体もまた使用し得る。
用語「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡと配列相同性を共有するｍＲＮＡ分子と相互作用してその破壊を生じさせることのできるＲＮＡ又はＲＮＡ様分子を指す（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１８８－２００，２００１）。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボ核タンパク質複合体に組み込まれ得ると考えられる。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ配列を用いて、組み込まれたｓｉＲＮＡ鎖と少なくとも部分的に相補的なｍＲＮＡ分子を同定し、次にこれらの標的ｍＲＮＡ分子を切断し、又はその翻訳を阻害する。典型的なｓｉＲＮＡは、各鎖が約１９～約２８ヌクレオチド（即ち、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８ヌクレオチド）の二本鎖核酸分子である。ｓｉＲＮＡはまた一本鎖ＲＮＡであってもよく、但し二本鎖ｓｉＲＮＡと比べると効率が低い。一本鎖ｓｉＲＮＡは約１９～約４９ヌクレオチドの長さを有する。一本鎖ｓｉＲＮＡは５’リン酸を有するか、又は５’位置においてインサイチュー若しくはインビボでリン酸化される。一本鎖ｓｉＲＮＡは化学的に又はインビトロ転写によって合成し、発現ベクター又は発現カセットから内因的に発現させることができる。５’リン酸基はキナーゼを介して付加されてもよく、又はＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果であってもよい。
用語「小分子」は、典型的には９００ａ．ｍ．ｕ．未満、又はより好ましくは５００ａ．ｍ．ｕ．未満又はより好ましくは２００ａ．ｍ．ｕ．未満又はさらにより好ましくは１００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を有する分子又はイオンを指す。本発明のアッセイ及び環境において、小分子は多くの場合に、主としてアッセイ又は環境のｐＨに依存して、分子と分子の脱プロトン化イオンとの混合物として存在し得る。
用語「治療用タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、例えば研究者又は臨床医によって探究されている組織、システム、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を生じさせるため哺乳類に投与することのできる任意のタンパク質及び／又はポリペプチドを指す。治療用タンパク質は、２つ以上の生物学的又は医学的応答を生じさせ得る。治療用タンパク質の例としては、抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン、調節タンパク質、及びこれらのフラグメントが挙げられる。
用語「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、かかる量の投与を受けていない対応する対象と比較したときに、限定はされないが、疾患、障害、若しくは副作用の治癒、予防、若しくは改善、又は疾患若しくは障害の進行速度の低下をもたらす任意の量を意味する。この用語にはまた、その範囲内に、正常な生理学的機能を増強するのに有効な量並びに第２の医薬品の治療効果を増強又は補助する生理学的機能を患者に生じさせるのに有効な量も含まれる。
用語「腫瘍微小環境」は、本明細書で使用されるとき、固形腫瘍内及びその周囲の、腫瘍細胞の成長及び転移を支援する微小環境を指す。腫瘍微小環境には、新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を発達させ、及び潜伏転移が育つニッチを提供することのできる周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的キューが含まれる。腫瘍とその周囲微小環境とは緊密に関係し、常に相互作用している。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、及び末梢性免疫寛容を誘導することによってその微小環境に影響を与えることができ、一方、微小環境中の免疫細胞は癌性細胞の成長及び進化に影響を及ぼすことができる。Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．“Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｒｏｌｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖｏｌ．，７２，ｐａｇｅｓ２４７３－２４８０，２０１２；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ１７２－１７７，２０１２；Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，“Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ１３－１７，２００４；Ｓｉｅｍａｎｎ，“Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｗｉｌｅｙ，２０１０；及びＢａｇｌｅｙ，“Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１０を参照のこと。
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」とは、ポリヌクレオチドがいかなる突然変異も含まないことを意味する。「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」、又は「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」は、天然に見られる活性レベルで活性であり得るとともに天然に見られるアミノ酸配列を含み得る、自然から単離することのできるタンパク質を指し得る。用語「親分子」及び「標的タンパク質」もまた、野生型タンパク質を包含する。
詳細な説明
Ａ．ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチド
一態様において、本発明は、活性が所望されるｐＨの０．５、１、２又は４単位の範囲内にあるｐＫａを有する種の存在下でｐＨ依存的活性を有する条件的活性型ポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、約４～約１０、又は約４．５～約９．５又は約５～約９、又は約５．５～約８、又は約６．０～約７．０のｐＫａを有する種の存在下でｐＨ依存的活性を有する条件的活性型ポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸イオン、重炭酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、二硫化物イオン、硫化水素、アンモニウムイオン、リン酸二水素イオン及びこれらの任意の組み合わせから選択される種の存在下でｐＨ依存的活性を有する条件的活性型ポリペプチドに関する。
条件的活性型ポリペプチドの活性に大きい影響を有するアッセイ媒体中に存在する種は、少なくとも２つのイオン化状態：非荷電状態又は低荷電状態と荷電又は高荷電状態とを有する種である傾向がある。結果として、条件的活性型ポリペプチドの活性に影響を与える種のｐＫａは、その種がポリペプチドの特定の活性に対して及び／又は特定のｐＨで有し得る影響の程度を決定する役割を果たし得る。
ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドは、第１のｐＨにおいて第２の異なるｐＨにおけるよりも活性が高い（両方の活性とも、上記に列挙した種のうちの１つ以上の存在下におけるアッセイで計測される）。条件的活性型ポリペプチドのｐＨ依存性を決定するには、ポリペプチドの同じ活性を同じアッセイ媒体中で２つの異なるｐＨ値においてアッセイする。
同じアッセイ媒体中での第１のｐＨにおける活性の第２のｐＨにおける同じ活性に対する比は、ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドの選択性と称することができる。ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドは、少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．５、又は少なくとも約１．７、又は少なくとも約２．０、又は少なくとも約３．０、又は少なくとも約４．０、又は少なくとも約６．０、又は少なくとも約８．０、又は少なくとも約１０．０、又は少なくとも約２０．０、又は少なくとも約４０．０、又は少なくとも約６０．０、又は少なくとも約１００．０の選択性を有する。
ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドが、その条件的活性型（ｃｏｎｄｉｔｉａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）ポリペプチドの由来である親ポリペプチドのアミノ酸残基と比較して増加した数（又は割合）の荷電アミノ酸残基を含むことが観察されている。３つの正電荷アミノ酸残基：リジン、アルギニン及びヒスチジン；及び２つの負電荷アミノ酸残基：アスパラギン酸及びグルタミン酸がある。これらの荷電アミノ酸残基は、ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドの由来である親ポリペプチドと比較してｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドに過剰に存在する。結果として、ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドは、荷電アミノ酸残基の数が増加しているため、アッセイ媒体中の荷電種と相互作用する可能性が高くなる。これが、ひいては条件的活性型ポリペプチドの活性に影響する。
また、ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドが、典型的にはアッセイ媒体中の異なる種の存在下で異なる活性を有することも観察されている。少なくとも２つのイオン化状態：非荷電又は低荷電状態と荷電又は高荷電状態とを有する種は特定のｐＨでｐＫａ値に依存して解離の程度が大きくなり、それにより条件的活性型ポリペプチドに存在する荷電アミノ酸残基と相互作用する可能性が増加し得る。この要因を用いて条件的活性型ポリペプチドの選択性及び／又はｐＨ依存的活性を増強し得る。
条件的活性型ポリペプチド上の電荷の性質は、条件的活性型ポリペプチドの活性に影響を与えるのに好適な種の決定に用いられる一つの要因であり得る。一部の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは親ポリペプチドと比較してより多くの正電荷アミノ酸残基：リジン、アルギニン及びヒスチジンを有し得る。従って条件的活性型ポリペプチドは、活性が所望される環境に存在する特定の種と所望のレベルの相互作用を有するように、及び／又は活性の低下が所望される環境に存在する特定の種と所望のレベルの相互作用を有するように選択することができる。同様に、条件的活性型ポリペプチドは親ポリペプチドと比較してより多くの負電荷アミノ酸残基：アスパラギン酸及びグルタミン酸を有し得る。
ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチド上の荷電アミノ酸残基の位置もまた、活性に影響を与え得る。例えば、条件的活性型ポリペプチドの結合部位への荷電アミノ酸残基の近接性を用いてポリペプチドの活性に影響を与え得る。
一部の実施形態において、荷電環境種が条件的活性型ポリペプチドと相互作用すると、ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドの活性が遮断又は妨害され得る。例えば、荷電環境種と相互作用する荷電アミノ酸は、条件的活性型ポリペプチドの結合部位に対してアロステリック効果を示し得る。
他の実施形態において、荷電環境種が条件的活性型ポリペプチドと相互作用すると、ポリペプチド上の異なる部分間、特に荷電又は極性部分間に塩橋が形成され得る場合があり得る。塩橋の形成はポリペプチド構造を安定化させることが知られている（Ｄｏｎａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｔ Ｂｒｉｄｇｅｓ：Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｄｅｓｉｇｎａｂｌｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，７９（３）：８９８－９１５，２０１１；Ｈｅｎｄｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｏ ｓａｌｔ ｂｒｉｄｇｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ？ Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３：２１１－２２６，１９９４）。塩橋は、通常「ブリージング（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」と呼ばれる軽微な構造変動を起こすタンパク質構造を安定化させ又は固定することができる（Ｐａｒａｋ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ，”Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，１３（５）：５５２－５５７，２００３）。タンパク質構造の「ブリージング」は、この構造ゆらぎによって条件的活性型タンパク質がそのパートナーを効率的に認識してそれに結合することが可能になるため、タンパク質機能及びそのパートナーとのその結合に重要である（Ｋａｒｐｌｕｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，”ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．６６７９－６６８５，２０１５）。塩橋の形成により、恐らくは塩橋がパートナーの結合部位への到達を直接阻止し得るため、条件的活性型ポリペプチド上の結合部位、特に結合ポケットにそのパートナーが到達しにくくなり得る。結合部位から離れた塩橋であっても、アロステリック効果により結合部位のコンホメーションが変化して結合が阻害され得る。従って、塩橋が条件的活性型ポリペプチドの構造を安定化させた（固定した）後、ポリペプチドはそのパートナーとの結合の点で低活性になり、活性の低下がもたらされ得る。
ポリペプチド及びその構造が塩橋によってどのように安定化するかの一つの公知の例は、ヘモグロビンである。構造的及び化学的研究から、塩橋には少なくとも２組の化学基：ヒスチジンβ１４６及びα１２２（これらはｐＨ７に近いｐＫａ値を有する）のアミノ末端及び側鎖が関与していることが明らかになっている。デオキシヘモグロビンでは、β１４６の末端カルボキシレート基が、他方のαβ二量体のαサブユニットにおけるリジン残基と塩橋を形成する。この相互作用によってヒスチジンβ１４６の側鎖が同じ鎖の負電荷アスパラギン酸９４との塩橋に関与し得る位置に固定されるが、但しヒスチジン残基のイミダゾール基がプロトン化されていることが条件である（図６）。高いｐＨでは、ヒスチジンβ１４６の側鎖はプロトン化されておらず、塩橋は形成されない。しかしながら、ｐＨが下がるにつれヒスチジンβ１４６の側鎖がプロトン化されるようになり、ヒスチジンβ１４６とアスパラギン酸β９４との間に塩橋が形成され、それがデオキシヘモグロビンの四次構造を安定化させることにより、活発に代謝している組織（ｐＨがより低い）で酸素が放出される傾向が高まることにつながる。ヘモグロビンは酸素に対してｐＨ依存的結合活性を示し、ここでは低ｐＨで、塩橋の形成に起因して酸素に対する結合活性が低下する。他方で、高ｐＨでは、塩橋がないため酸素に対する結合活性は増加する。
同様に、重炭酸塩などの小分子は、条件的活性型ポリペプチドのそのパートナーへの結合活性を条件的活性型ポリペプチドにおける塩橋の形成によって低下させ得る。例えば、６．４のそのｐＫａより低いｐＨでは、重炭酸塩はプロトン化され、従って荷電していない。非荷電重炭酸塩は塩橋を形成することができず、そのため条件的活性型ポリペプチドのそのパートナーとの結合にほとんど効果を有しない。従って、条件的活性型ポリペプチドは低ｐＨでそのパートナーとの高い結合活性を有する。他方で、重炭酸塩のｐＫａより高いｐＨでは、重炭酸塩はプロトンを失うことによりイオン化され、そのため負電荷になる。負電荷重炭酸塩は条件的活性型ポリペプチド上の正電荷部分又は極性部分の間に塩橋を形成し、条件的活性型ポリペプチドの構造が安定化することになる。これにより条件的活性型ポリペプチドのそのパートナーとの結合が遮断され又は低下し得る。従って条件的活性型ポリペプチドは高ｐＨで低い活性を有する。このように条件的活性型ポリペプチドは重炭酸塩の存在下では、高ｐＨと比べて低ｐＨで結合活性が高い条件的活性型活性を有する。
アッセイ媒体に重炭酸塩などの種が存在しないとき、条件的活性型ポリペプチドはその条件的活性を失い得る。これは、条件的活性型ポリペプチド上にこのポリペプチドの構造を安定化させる（固定する）塩橋がないことが原因である可能性が高い。従って、パートナーはいかなるｐＨでも条件的活性型ポリペプチド上の結合部位に同様に到達することができ、第１のｐＨと第２のｐＨとで同程度の活性を生じることになる。
他の実施形態において、小分子又はイオンと条件的活性型ポリペプチドとの間の相互作用により、ポリペプチドの構造がその活性を増加させる形で変化し得る。例えば、構造が変化すると、結合親和性に要求される結合部位の位置、立体障害又は結合エネルギーが変化することによって条件的活性型ポリペプチドの結合親和性が向上し得る。そのような場合、活性が所望されるところのｐＨで条件的活性型ポリペプチドに結合する小分子を選択することが望ましい場合もある。
塩橋（イオン結合）は化合物及びイオンが条件的活性型ポリペプチドの活性に影響を及ぼす最も強力且つ最も一般的な形であるが、かかる化合物及びイオンと条件的活性型ポリペプチドとの間の他の相互作用もまた、条件的活性型ポリペプチドの構造の安定化（固定）に寄与し得ることが理解されるべきである。そのような他の相互作用としては、水素結合、疎水性相互作用、及びファンデルワールス相互作用が挙げられる。
一部の実施形態において、好適な化合物又はイオンを選択するため、条件的活性型ポリペプチドが、それを進化させる元になった親ポリペプチドと比較され、条件的活性型ポリペプチドがより高い割合の負電荷アミノ酸残基又は正電荷アミノ酸残基を有するかどうかが決定される。次に、それぞれ第２のｐＨで好適な電荷を有する化合物が、条件的活性型ポリペプチドの活性（ａｃｔｉｖｔｙ）に影響を与えるように選択され得る。例えば、条件的活性型ポリペプチドが親ポリペプチドよりも高い割合の正電荷アミノ酸残基を有するとき、好適な小分子は典型的には、第２のｐＨで条件的活性型ポリペプチドと相互作用するように負電荷でなければならない。他方で、条件的活性型ポリペプチドが親ポリペプチドよりも高い割合の負電荷アミノ酸残基を有するとき、好適な小分子は典型的には、第２のｐＨで条件的活性型ポリペプチドと相互作用するように正電荷でなければならない。
他の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドの活性は、小分子又はイオンと条件的活性型ポリペプチドの結合パートナーである標的ポリペプチドとの相互作用によって制御される。この場合、目標が小分子又はイオンと標的ポリペプチドとの間に相互作用を作り出すことである点を除き、上記の考察と同じ原理を同様に適用可能である。標的ポリペプチドは、例えば、条件的活性型抗体に対する抗原、又は条件的活性型受容体に対するリガンドであり得る。
好適な小分子は、第１のｐＨにおける非荷電又は低荷電状態から第２のｐＨにおける荷電又は高荷電状態に移行する任意の無機又は有機分子であってもよい。従って、小分子は、典型的には第１のｐＨ～第２のｐＨの間のｐＫａを有しなければならない。例えば、重炭酸塩は６．４のｐＫａを有する。従って、ｐＨ７．４など、より高いｐＨでは、負電荷重炭酸塩が条件的活性型ポリペプチドの荷電アミノ酸残基に結合して活性を低下させ得る。他方で、ｐＨ６．０など、より低いｐＨでは、低荷電重炭酸塩は条件的活性型ポリペプチドに同じ分量で結合せず、条件的活性型ポリペプチドのより高い活性が可能となり得る。
二硫化物はｐＫａ７．０５を有する。従って、ｐＨ７．４など、より高いｐＨでは、より多くの負電荷二硫化物が条件的活性型ポリペプチドの正電荷アミノ酸残基に結合し、その活性を低下させ得る。他方で、ｐＨ６．２～６．８など、より低いｐＨでは、低荷電硫化水素／二硫化物は条件的活性型ポリペプチドに同じレベルで結合せず、そのため条件的活性型ポリペプチドのより高い活性が可能となる。
本発明での使用には、第１～第２ｐＨの間のｐＫａを有する小分子が好ましい。好ましい種は、二硫化物、硫化水素、ヒスチジン、ヒスタミン、クエン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、及び乳酸塩から選択される。これらの小分子の各々が、６．２～７．０の間のｐＫａを有する。さらに、トリシン（ｐＫａ８．０５）及びビシン（ｐＫａ８．２６）などの他の小分子もまた使用し得る。他の好適な小分子については、本願の原理を用いたテキストブック、例えば、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，９６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２０１５；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，１９９８を参照し得る。
アッセイ媒体又は環境中の小分子の濃度は、好ましくは対象における小分子の生理的濃度であるか又はそれに近いものである。例えば、重炭酸塩の（ヒト血清中における）生理的濃度は１５～３０ｍＭの範囲である。従って、アッセイ媒体中の重炭酸塩の濃度は１０ｍＭ～４０ｍＭ、又は１５ｍＭ～３０ｍＭ、又は２０ｍＭ～２５ｍＭ、又は約２０ｍＭであってもよい。二硫化物の生理的濃度もまた低い。アッセイ媒体中の二硫化物の濃度は３～５００ｎＭ、又は５～２００ｎＭ、又は１０～１００ｎＭ、又は１０～５０ｎＭであってもよい。
本発明では、条件的活性型ポリペプチドは、環境中における特定の種の正常生理的濃度が目的のｐＨ範囲における条件的活性型ポリペプチドの活性に有意な効果を及ぼし得るような濃度で選択及び利用される。従って、多くの療法的治療では、血流を介した療法的治療の送達を条件的活性型ポリペプチドの活性化を最小限に抑え又は防止しつつ可能にするため、血液又はヒト血清の約ｐＨ７．２～７．４で条件的活性型ポリペプチドが低い活性を有することが有利であり得る。結果として、かかる治療には、血流ｐＨで条件的活性型ポリペプチドの活性に有意な効果を及ぼすのに十分な量のイオン化された小分子が確保されるように、ｐＨ７．２～７．４未満のｐＫａを有する小分子を選択することが有利となり得る。同時に、小分子のｐＫａは、小分子がプロトン化して条件的活性型ポリペプチド上の結合部位が空くことによる条件的活性型ポリペプチドの活性化を確実にするため条件的活性型ポリペプチドの活性が望ましいｐＨ以上でなければならない。
小分子は、立体障害を最小限に抑えることにより標的ポリペプチド又は条件的活性型ポリペプチド上の小さいポケットへの最大限の到達が確保されるように、好ましくは低分子量及び／又は比較的小型のコンホメーションを有する。このため、小分子は、典型的には９００ａ．ｍ．ｕ．未満、又はより好ましくは５００ａ．ｍ．ｕ．未満又はより好ましくは２００ａ．ｍ．ｕ．未満又はさらにより好ましくは１００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を有する。例えば、硫化水素、二硫化物及び重炭酸塩は全て、以下の実施例１３及び実施例１４に示すとおり、標的ポリペプチド又は条件的活性型ポリペプチド上のポケットへの到達をもたらす低分子量及び小型構造を有する。
小分子は、アッセイ又は環境中に実質的に同じ濃度、例えば重炭酸塩について約２０μＭで存在し得る。一部の実施形態において、小分子は異なる環境において異なる濃度で存在することもあり、従ってアッセイでこれを模擬することが望ましい場合もある。例えば、二硫化物は腫瘍微小環境中においてヒト血清中よりも高い濃度を有する。従って、一つのアッセイが酸性ｐＨ及びより高濃度の二硫化物の腫瘍微小環境を模擬し得る一方、第２のアッセイが中性又は弱塩基性ｐＨ及びより低濃度の二硫化物のヒト血清を模擬し得る。酸性ｐＨは６．０～６．８の範囲であってもよく、一方、中性又は弱塩基性ｐＨは約７．４であってもよい。第１のアッセイのより高い二硫化物は３０μＭであってもよく、一方、第２の緩衝液のより低い二硫化物は１０μＭ以下、又は５μＭであってもよい。
一部の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、２つ以上の異なる小分子、例えば重炭酸塩とヒスチジンとの組み合わせが存在するときｐＨ依存的である。
小分子が存在しないとき、条件的活性型ポリペプチドはそのｐＨ依存性を失い得る。従って、小分子の非存在下では、条件的活性型ポリペプチドは小分子の非存在下における第１のｐＨと第２のｐＨとの間で同様の活性を有し得る。
一部の実施形態において、第１のｐＨは酸性ｐＨであり、一方、第２のｐＨは塩基性又は中性ｐＨである。他の実施形態において、第１のｐＨは塩基性ｐＨであり、一方、第２のｐＨは酸性又は中性ｐＨである。例えば、第１のｐＨは、約５．５～７．２、又は約６．０～７．０、又は約６．２～６．８の範囲のｐＨであってもよい。第２のｐＨは、約７．０～７．８、又は約７．２～７．６の範囲のｐＨであってもよい。
酸性ｐＨで活性がより高く、且つ塩基性又は中性ｐＨで活性がより低い条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨが約５．５～７．２、又は約６．２～６．８で酸性である腫瘍微小環境を標的化することができる。
他の実施形態において、ｐＨ依存的ポリペプチドがより高活性となる第１のｐＨは、滑液など、例えば７．６～７．９の塩基性ｐＨであってもよい（Ｊｅｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｂｌｏｏｄ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．４１ Ｂ，ｐｐ．３８８－４００，１９５９を参照のこと）。第２のｐＨは、条件的活性型ポリペプチドがより低活性である約７．２～７．６の血液のｐＨであってもよい。これらの条件的活性型ポリペプチドは、関節疾患、特に関節の炎症を標的化するのに好適であり得る。
他の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは脳を標的化するように設計され得る。血液脳関門の両側にはｐＨの差があり、脳側のｐＨは血液ｐＨよりも約０．２ｐＨ単位低い。従って、条件的活性型ポリペプチドがより高活性である脳の第１のｐＨは約７．０～７．２（脳ｐＨ）であってもよく、一方、第２のｐＨは約７．４（血液ｐＨ）であってもよい。
条件的活性型ポリペプチドは、酵素、サイトカイン、受容体、特に細胞受容体、調節性ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、抗体、又はホルモンであってもよい。
条件的活性型ポリペプチドは親ポリペプチドのフラグメントであってもよい。例えば、条件的活性型ポリペプチドは、抗体フラグメント、一本鎖抗体、酵素のフラグメント、受容体のフラグメント、サイトカインのフラグメント、又はホルモンのフラグメントであってもよい。抗体フラグメントは抗体のＦｃフラグメントであってもよい。
Ｆｃフラグメントは、第１のｐＨにおける補体との結合活性が第２のｐＨにおける同じ補体との結合活性よりも高い条件的活性型Ｆｃフラグメントを生成するための親ポリペプチドとして使用し得る。Ｆｃフラグメントの補体との結合を用いて抗体依存的細胞媒介性細胞傷害をもたらすことができる。第１のｐＨは、腫瘍微小環境のｐＨなど、５．５～７．２又は６．２～６．８の範囲の酸性であってもよく、一方、第２のｐＨは７．２～７．６の範囲である。第１のｐＨは、ｐＨが典型的には約４．０であるリソソームのｐＨと異なる。さらに、リソソームは、Ｆｃフラグメントが任意の他のポリペプチドと同じく分解の標的となる場所である。リソソームには補体がなく、リソソームを介して細胞媒介性細胞傷害が生じることはない。
条件的活性型ポリペプチドは２つの機能ドメインを有してもよく、その機能ドメインの少なくとも一方、好ましくは両方がｐＨ依存的活性を有し得る。これらの２つの機能ドメインを同時に進化させて選択を行うことにより、同じ変異ポリペプチドに両方の機能ドメインを同定し得る。或いは、これらの２つの機能ドメインは独立して進化させて選択し、ｐＨ依存的活性を別個に同定してもよい。２つの機能ドメインが同じ変異ポリペプチドにない場合、別個に同定された機能ドメインの両方を有するキメラポリペプチドとしてそれらを融合してもよい。
一態様において、条件的活性型ポリペプチドは、いずれもタンパク質などの因子の存在下で、第１のｐＨにおいて親ポリペプチドと比較して活性の増加を示し、及び第２のｐＨにおいて親ポリペプチドと比較して活性の低下を示す。タンパク質は、血液、ヒト血清、又は生体の微小環境、例えば、腫瘍微小環境、炎症部位等に存在するタンパク質であってもよい。一つの好適なタンパク質はアルブミン、特にウシアルブミン又はヒトアルブミンなどの哺乳類アルブミンであり得る。
一態様において、アルブミンなどのタンパク質は、進化工程によって作製される変異ポリペプチドからの条件的活性型ポリペプチドのスクリーニング及び選択に使用されるアッセイ溶液中に存在する。別の態様において、アルブミンなどのタンパク質を含むアッセイ溶液はまた、同じ又は異なる条件下での選択された条件的活性型ポリペプチドの活性に関する試験にも使用される。
Ｂ．条件的活性型ポリペプチドの操作
条件的活性型ポリペプチドは、本明細書に記載される１つ以上のタンパク質操作技法によって操作し得る。タンパク質操作技法の非限定的な例としては、核酸への条件的活性型ポリペプチドのコンジュゲーション、ナノ粒子への条件的活性型ポリペプチドのコンジュゲーション、キメラ抗原受容体における条件的活性型ポリペプチドの操作、及びマスキングされた条件的活性型ポリペプチドの操作が挙げられる。
本発明の条件的活性型ポリペプチドは、リンカーを介して核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ分子にコンジュゲートし得る。この条件的活性型ポリペプチドは、その条件が存在しない他の位置と比べて条件的活性型ポリペプチドが高活性である条件を有する対象の標的位置に核酸分子を送達する助けとなり得る。例えば、条件的活性型ポリペプチドは、ヒト血清などの他の位置における条件と比べて腫瘍微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｅｍｎｔ）における条件下でその抗原に対する結合活性がより高い条件的活性型抗体であり得る。この効果を用いると、核酸分子を条件的活性型ポリペプチドにコンジュゲートして、且つそのコンジュゲートを対象に投与することにより、核酸分子を腫瘍微小環境に送達することができる。
一部の実施形態において、核酸分子は、標的位置における遺伝子の発現を調節する薬剤であってもよい。異常な遺伝子発現は多くの疾患と関連付けられる。従って異常な遺伝子発現を修正することは、これらの疾患の制御又はさらにはその治癒に寄与し得る。例えば、異常な遺伝子発現は大多数の癌細胞の特徴であり、癌細胞では、多くの癌遺伝子など、一部の遺伝子の発現レベルが上昇している（例えば、乳癌細胞では上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）が過剰発現する）。癌遺伝子の構成的に上昇した発現の選択的阻害は、癌細胞の増殖を阻害する機会をもたらす。
遺伝子発現を阻害し得る核酸分子としては、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、オリゴＤＮＡ、及び核酸塩基を連結する非荷電アキラルポリアミド骨格を有するオリゴヌクレオチド模倣体が挙げられる（Ｐｏｏｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，１（３）：２３１－９，２００１；Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，９（８）：９７５－８９，２００９）。
アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡの特異的相補領域に塩基対合によって結合してｍＲＮＡの発現を配列特異的に阻害することのできる短いＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡには、アンチセンスＲＮＡとの結合部位でｍＲＮＡを切断するか、又は翻訳若しくはその他のｍＲＮＡプロセシング及びタンパク質合成における工程を物理的に遮断することのできるＲＮアーゼＨが含まれ得る。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、典型的には、翻訳を遮断しようとするｍＲＮＡ配列とその配列の少なくとも一部分が相補的である短い二本鎖ＲＮＡセグメントである。ｓｉＲＮＡは、クロマチンリモデリング、タンパク質翻訳の阻害、又は直接的なｍＲＮＡ分解を用いた遺伝子サイレンシングの転写後機構によって機能し、これは真核細胞に遍在する（Ｃａｐｌｅｎ，“Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１１（１６）：１２４１－１２４８，２００４）及びＢｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２９６（４）：１０００－１００４，２００２。
特に、ＲＩＳＣを通じて、ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡと相同性を有するｍＲＮＡの配列特異的分解の強力なカスケードを開始させることができる（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６－８１１，１９９８）。ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、それはダイサーと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ酵素によってプロセシングされ、ダイサーによって長いｓｉＲＮＡが切断されて、対称な２～３ヌクレオチドの３’オーバーハング並びに５’リン酸基及び３’ヒドロキシル基を有する短い２１～２３ヌクレオチドの二重鎖になる（Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，”Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３：３１９１－３１９７，１９９９；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，“Ａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｉｎ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９５０－９５２，１９９９。従って有効なｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングを惹起するｍＲＮＡとの対合に、連続相補配列の小さいセグメントを必要とするに過ぎない（Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｎｓｌｅｙ，“Ｎｏｉｓｅ ａｍｉｄｓｔ ｔｈｅ ｓｉｌｅｎｃｅ：ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ？”Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，２０：５２１－５２４，２００４）。ｓｉＲＮＡはゲノムに組み込まれず、従ってプラスミド又はウイルス媒体と比べて高い安全性を提供する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、天然に存在する２１～２５ヌクレオチド長の小さい非コードＲＮＡ分子のクラスである。マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡが作用するｍＲＮＡ分子と部分的に相補的である。マイクロＲＮＡの主な機能は、翻訳抑制、ｍＲＮＡ切断、及び脱アデニル化によって遺伝子発現を低下させることである。ｍｉＲＮＡ種、配列データ、アノテーション、及び標的予測の中央オンラインリポジトリは、ｍｉＲＢａｓｅと呼ばれ、英国のサンガー・インスティテュート（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が管理している。マイクロＲＮＡ遺伝子がＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されると、５’キャップ及びポリＡテールを有するプリｍｉＲＮＡが産生される。核内で、ＲＮアーゼＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａ及び二本鎖ＲＮＡ Ｐａｓｈａ／ＤＧＣＲ８からなるマイクロプロセッサー複合体によってプリｍｉＲＮＡがプロセシングされ、プレｍｉＲＮＡが生成される。これらのプレｍｉＲＮＡはカリオフェリンエクスポーチン（Ｅｘｐ５）及びＲａｎ－ＧＴＰ複合体によって細胞質に輸送され、そこでＲａｎ ＧＴＰアーゼがＥｘｐ５と結合してプレｍｉＲＮＡと核ヘテロ三量体を形成する。これらのプレｍｉＲＮＡがＲＮアーゼＩＩＩ酵素ダイサーによってさらにプロセシングされると、成熟マイクロＲＮＡが生成される。
条件的活性型ポリペプチドによって送達し得る別のクラスの核酸は、核酸塩基が連結する非荷電アキラルポリアミド骨格を含むオリゴヌクレオチド模倣体である。このオリゴヌクレオチド模倣体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれることが多い。より具体的には、ＰＮＡは、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシンポリアミドがリン酸－リボース環骨格に置き換わり、且つメチレンカルボニルリンカーが天然並びに非天然核酸塩基をＮ－（２－アミノエチル）グリシンの中心アミンに結合しているＤＮＡ類似体である。骨格構造の極端な変化にも関わらず、ＰＮＡはワトソン・クリック塩基対合則に従うＤＮＡ及びｍＲＮＡへの配列特異的結合能を有する。
ＰＮＡは天然核酸よりも高い親和性で相補ＤＮＡ／ＲＮＡに結合し、これは一部には、骨格に負電荷がなく、結果的に電荷間の斥力が低下すること、並びに幾何学的要因が有利であることに起因する。ＰＮＡとＤＮＡ／ｍＲＮＡとの複合体は生体液中で極めて安定しており、ＤＮＡ又はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることによる標的遺伝子の転写及び翻訳の阻害につながる。概して、ＰＮＡは周知の固相ペプチド合成プロトコルを用いて合成される。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５，６４７７－６４８１，１９９３；Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，７９６４－７９７０，１９９４；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５，５６６－５６８，１９９３；Ｄｕｅｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２１，１９－３１，１９９７；Ｗｉｔｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，７０４９－７０５４，１９９６；Ｌｅｉｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，９８２０－９８２５，１９９４、Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９，４７２－４８０，１９９５；Ｔｏｍａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，５５４４－５５５２，１９９６を参照のこと）。強酸で処理すると脱プリン化し、及び水酸化アルカリ中で加水分解するＤＮＡと対照的に、ＰＮＡは完全に酸安定性であり、弱塩基に対して十分に安定している。
条件的活性型ポリペプチドによって送達し得る別のクラスの核酸は、オリゴＤＮＡである。オリゴＤＮＡは、細胞性血漿への侵入時にそのオリゴＤＮＡと相補的な配列を含む遺伝子の発現を選択的に阻害することができるＤＮＡの短い一本鎖セグメントである。アンチセンス適用については、オリゴＤＮＡは標的ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体と相互作用して二重鎖を形成し、その翻訳又はプロセシングを阻害して、結果的にタンパク質生合成を阻害する。抗原適用については、オリゴＤＮＡは細胞核に侵入しなければならず、二本鎖ゲノムＤＮＡと三重鎖を形成して遺伝子の転写を阻害し、ひいては産生されるｍＲＮＡが減り、産生されるタンパク質の遺伝子産物の減少につながる。
条件的活性型ポリペプチドによって送達し得るさらなるクラスの核酸は、球状核酸（ＳＮＡ、Ｚｈａｎｇ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１３４（４０）：１６４８８－１６４９１，２０１２を参照のこと）である。ＳＮＡは、金属性、半導体性、又は絶縁性の無機又はポリマーコア材料の表面に共有結合的に取り付けられた、高密度に官能化され且つ高度に配向した核酸を含む。ＳＮＡはまた、ほぼ全体が核酸分子で構成された、コアの無い中空構造であってもよい。かかる球状核酸は、外因性核酸に対する対象の自然防御を回避する能力を有する。球状核酸は、その高密度に充填された高配向の核酸シェルから生じるユニークな特性を利用して核酸の保護及び効率的な送達を実現する。かかるシェルは高い局所塩濃度の領域を作り出し、これが立体阻害と組み合わさると、ヌクレアーゼ活性を低下させ、及び核酸を酵素分解から保護する働きをする。加えて、これらの球状核酸はスカベンジャータンパク質を天然細胞外環境からその表面に動員し、これによりエンドサイトーシスが促進される。
細胞質への侵入後、球状核酸はアンチセンス経路又はｓｉＲＮＡ経路のいずれかによって標的遺伝子の発現を阻害することができる。結果的に、球状核酸はウイルスベクター及び他の多くの合成系と比べて、低毒性、低免疫原性、酵素分解耐性、及びより持続的な遺伝子ノックダウンを含めた幾つかの利点を提供する。条件的活性型ポリペプチド、特に条件的活性型抗体は、球状核酸を罹患組織又は炎症組織（例えば腫瘍及び炎症関節）などの標的位置に送達することができる。
条件的活性型ポリペプチドはまた、リンカーを介してナノ粒子にコンジュゲートすることにより、その条件的活性型ポリペプチドがより高活性となる条件を有する標的位置へのナノ粒子の送達を助けることができる。ナノ粒子は、毒素、放射性薬剤又は他の治療剤の公知の媒体であり、これらはナノ粒子に封入される。
ナノ粒子に封入される治療剤は、腫瘍細胞を脱分化させ、ひいては腫瘍細胞を逆転させて正常細胞に戻す可能性のあるタンパク質であってもよい（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ－Ｍｏｒｖｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｖｅｒｍａ，“Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１５（３）：２４４－２５３，２０１４）。ナノ粒子を条件的活性型抗体に連結することにより、条件的活性型抗体が最も高活性な環境へと、連結されたナノ粒子及び封入された治療剤を選択的に送達し得る。
本発明においては、異なる構成の幾つかのタイプのナノ粒子を使用し得る。ナノ粒子は、生体安定性ポリマー、生分解性ポリマー、フラーレン、脂質、又はこれらの組み合わせを含めた、様々な生体適合性材料で作られ得る。生体安定性ポリマーとは、インビボで分解しないポリマーを指す。生分解性ポリマーとは、患者への送達後に分解されることが可能なポリマーを指す。例えば、このポリマーが血液などの体液に曝露されると、ポリマーは体内で酵素によって徐々に吸収及び／又は排出され得る。様々な分解速度のナノ粒子を作製する方法が当業者に公知であり、例えば、米国特許第６，４５１，３３８号明細書、米国特許第６，１６８，８０４号明細書及び米国特許第６，２５８，３７８号明細書を参照されたい。
本発明の例示的ナノ粒子には、リポソーム、ポリマーソーム及びポリマー粒子が含まれる。リポソームとは、典型的にはリン脂質で構成される二重層によって完全に囲まれたコンパートメントを指す。リポソームは、当業者に公知の標準的技法に従い調製することができる。一つの技法は、好適な脂質、例えばホスファチジルコリンを水性媒体中に懸濁し、続いてその混合物を音波処理することによるものである。別の技法は、エタノール－水中の脂質の溶液を、例えば撹拌エタノール－水溶液中に針を用いて脂質を注入することによって急速混合することによるものである。一部の実施形態において、リポソームはまた、それに加えて又は代えて、他の両親媒性物質、例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）又はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含有する脂質も含み得る。
ポリマーソームは、修飾されることによりリポソームに類似した二重層構造を形成するジブロック又はトリブロック共重合体を含む。ブロック共重合体の長さ及び組成に応じて、ポリマーソームはリポソームよりも実質的にロバストであり得る。加えて、ブロック共重合体の各ブロックの化学を制御可能であるため、ポリマーソームの組成を所望の用途に適合するように調整することが可能である。例えば、ポリマーソームの膜厚さ、即ち二重層構造体の厚さは、ブロック共重合体中の個々のブロックの鎖長を変えることにより制御し得る。共重合体の各ブロックのガラス転移温度を調整すると、ポリマーソームの膜の流動性、従って透過性が影響を受け得る。共重合体の特性を変化させることにより、封入された薬剤の放出機構を修飾することさえできる。
ポリマーソームは、（ｉ）ブロック共重合体を有機溶媒中に溶解すること、（ｉｉ）得られた溶液をベッセル表面に塗布すること、及び次に（ｉｉｉ）溶媒を除去し、それによりベッセル壁に共重合体の薄膜を残すことを含むプロセスによって調製することができる。次に薄膜を水和させると、ポリマーソームが形成される。或いは、ブロック共重合体を溶媒中に溶解し、次に共重合体のブロックのうちの１つに対する弱溶媒を添加してもまた、ポリマーソームが作り出され得る。
治療剤は、幾つかの技法を用いてポリマーソームに封入することができる。例えば、治療剤を水中に混合し、次にそれを用いて共重合体薄膜を再水和させてもよい。別の例は、予め形成したポリマーソームのコアに治療剤を浸透圧で押し込むことによるものであり、強制的負荷として知られるプロセスである。もう一つの例は、ダブルエマルション法を用いることによるものであり、これは比較的単分散度で且つ高い負荷効率のポリマーソームを生成し得る。ダブルエマルション法は、マイクロ流体技術を用いて有機溶媒層に囲まれた水滴を含むダブルエマルションを生成することを含む。次に、液滴中に小液滴が入った（ｄｒｏｐｌｅｔ－ｉｎ－ａ－ｄｒｏｐ）この構造体を連続水相中に分散させる。ブロック共重合体は有機溶媒中に溶解し、ダブルエマルションの同心円状の界面上に自己集合してプロトポリマーソームになる。最終的なポリマーソームは、プロトポリマーソーム（ｐｒｏｔｏ－ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｎｅ）のシェルから有機溶媒を完全に蒸発させた後に形成される。この技法では、ポリマーソームのサイズを微調整することが可能である。加えて、プロセス全体を通じて内側の流体を外側の流体と完全に分離して保つことが可能なため、治療剤を極めて効率的に封入することが可能である。
ポリマー粒子とは、リポソーム及びポリマーソームのシェル構造体と対照的に、固体又は多孔質の粒子を指す。ポリマー粒子の構造体の表面に治療剤を付着させる方法又はそれに生物活性剤を組み込む方法は当業者に公知である。
本発明のナノ粒子の調製に使用し得るポリマーとしては、限定はされないが、ポリ（Ｎ－アセチルグルコサミン）（キチン）、キトサン、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシバレレート）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（グリコリド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリエステルアミド、ポリ（グリコール酸－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ｃｏ－ポリ（エーテルエステル）類（例えばＰＥＯ／ＰＬＡ）、ポリホスファゼン類、生体分子（フィブリン、フィブリン糊、フィブリノゲン、セルロース、デンプン、コラーゲン及びヒアルロン酸、エラスチン及びヒアルロン酸など）、ポリウレタン類、シリコーン類、ポリエステル類、ポリオレフィン類、ポリイソブチレン及びエチレン－αオレフィン共重合体、ポリアクリレート類以外のアクリル系ポリマー及びコポリマー、ハロゲン化ビニルポリマー及びコポリマー（ポリ塩化ビニルなど）、ポリビニルエーテル類（ポリビニルメチルエーテルなど）、ハロゲン化ポリビニリデン類（ポリ塩化ビニリデンなど）、ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン類、ポリビニル芳香族（ポリスチレンなど）、ポリビニルエステル類（ポリ酢酸ビニルなど）、アクリロニトリル－スチレン共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）樹脂、ポリアミド類（ナイロン６６及びポリカプロラクタムなど）、チロシン系ポリカーボネート類を含むポリカーボネート類、ポリオキシメチレン類、ポリイミド類、ポリエーテル類、ポリウレタン類、レーヨン、三酢酸レーヨン、セルロース、酢酸セルロース、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、セロファン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースエーテル類、及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
一部の実施形態において、ナノ粒子はまた、条件的活性型ポリペプチドに由来する選択性に加え、コーティングによる組織選択性も提供し得る。例えば、ナノ粒子を静電的に吸着したポリ（グルタミン酸）ベースのペプチドコーティングによって被覆して、コア粒子の外側の組成を変化させてもよい。アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）リガンドを含有する負電荷ポリグルタミン酸ベースのペプチドは、ＲＧＤの代わりにＲＤＧを含有した配列をスクランブルしたコーティング粒子と比較して内皮細胞へのインビトロ遺伝子送達を増加させることができる。このペプチドは、３つの成分：一続きの、負電荷を提供するポリ（グルタミン酸）、ポリグリシンのリンカー、及び電荷が様々な、且つ粒子の生物物理学的特性及び組織選択性を変化させる可能性のある末端配列からなる。このコーティング並びに粒子それ自体は、それぞれそのアミド結合及びエステル結合によって生分解性である。Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｉｓｓｕｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏａｔｉｎｇ，”Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｖｏｌ．３１，ｐｐ．９９８－１００６，２０１０）を参照のこと。
Ｔ細胞は、哺乳類免疫系によって、外来抗原を有する物質又は細胞との闘いに用いられる。Ｔ細胞は固形腫瘍に遭遇すると、多くの場合に有効な応答を開始することができない。Ｔ細胞が腫瘍部位に到達した場合であっても、Ｔ細胞は、癌細胞が免疫系からエスケープすることを可能にする免疫抑制因子の集中攻撃に直面する。ＣＡＲ－Ｔ技術は、遺伝子工学的方法を用いてＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を挿入することにより天然の循環Ｔ細胞を再プログラム化して高度に特異的なＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するものであり、ＣＡＲ－Ｔ細胞においてはＣＡＲが標的組織の表面上の抗原に特異的に結合することにより、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を標的組織に導く。従って、ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍細胞を特異的に標的化することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞は天然の循環Ｔ細胞と比べてはるかに有効性が高いものとなる。ＣＡＲ－Ｔ細胞はまた、炎症関節及び脳組織などの他の標的組織を標的化するように操作することもできる。
本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの抗原特異的標的領域（ＡＳＴＲ）、細胞外スペーサードメイン（ＥＳＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、１つ以上の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含む。図５及びＪｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ，”Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．２５７，ｐｐ．１２７－１４４，２０１４を参照されたい。ＡＳＴＲが腫瘍又は他の標的組織上の標的抗原に特異的に結合した後、ＩＳＤがＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、ＩＳＤは、抗体の抗原結合特性を利用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞特異性及び反応性をＭＨＣの制限を受けない形で選択の標的（例えば、腫瘍細胞又は他の標的細胞）へと向け直させる。このＭＨＣの制限を受けない抗原認識によってＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍細胞を認識して抗原プロセシングを開始することが可能であり、従って免疫系の監視からの腫瘍エスケープの主要な機構を回避する。ある実施形態において、ＥＳＤ及び／又はＣＳＤは任意選択である。別の実施形態において、ＡＳＴＲは二重特異性を有し、そのため２つの異なる抗原又はエピトープに特異的に結合することが可能である。
本発明の条件的活性型ポリペプチドはＡＳＴＲ又はその一部分として操作してもよく、それによりＣＡＲが標的抗原への結合に関して血液又は異なる環境が存在する別の生体部位と比べて腫瘍微小環境又は滑液などの特定の環境でより高活性となる。かかるＣＡＲはＴ細胞を疾患部位に優先的に送達することができ、従ってＴ細胞が正常組織を攻撃することによって引き起こされる副作用が劇的に低下し得る。これにより、さらに高用量のＴ細胞を使用することが可能となって治療有効性が増加し、及び対象の治療への忍容性が向上する。
これらのＣＡＲは、対象の体内にある期間が短い又は限られている必要がある新規治療薬の開発に特に有効である。有益な適用例としては、高投薬量での全身治療、並びに高濃度での局所治療が挙げられる。Ｍａｈｅｒ，“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｕｓｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，”ＩＳＲＮ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０１２，ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２７８０９３，２０１２を参照のこと。
ＡＳＴＲは、腫瘍又は他の標的組織上の抗原に特異的に結合する条件的活性型ポリペプチド、例えば抗体、特に一本鎖抗体、又はそのフラグメントを含み得る。ＡＳＴＲに好適なポリペプチドの一部の例としては、連結されたサイトカイン（これはサイトカイン受容体を担持する細胞の認識をもたらす）、アフィボディ、天然に存在する受容体由来のリガンド結合ドメイン、及び例えば腫瘍細胞上の受容体に対する可溶性タンパク質／ペプチドリガンドが挙げられる。事実上、所与の抗原と高親和性で結合する能力を有するほぼ全ての分子をＡＳＴＲに使用することができる。
一部の実施形態において、本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原又は同じ抗原上の２つのエピトープを標的化する少なくとも２つのＡＳＴＲを含む。一実施形態において、本ＣＡＲは、少なくとも３つ又はそれ以上の異なる抗原又はエピトープを標的化する３つ以上のＡＳＴＲを含む。ＣＡＲに複数のＡＳＴＲが存在するとき、ＡＳＴＲはタンデムに配置されてもよく、且つリンカーペプチドによって隔てられていてもよい（図５）。
さらに別の実施形態において、ＡＳＴＲはダイアボディを含む。ダイアボディでは、２つの可変領域が一緒になって折り畳まれるには短過ぎるためｓｃＦｖの二量化を駆動するリンカーペプチドを伴いｓｃＦｖが作成される。さらに短いリンカー（１又は２アミノ酸）は、三量体、いわゆるトリアボディ又はトリボディの形成につながる。テトラボディもまたＡＳＴＲに使用し得る。
ＣＡＲによって標的化される抗原は、腫瘍、腺（例えば前立腺）過形成、疣贅、及び望ましくない脂肪組織など、除去の標的となる組織の細胞の表面上又は内部に存在する。表面抗原はＣＡＲのＡＳＴＲによってより効率的に認識及び結合されるが、細胞内抗原もまたＣＡＲによって標的化され得る。一部の実施形態において、標的抗原は、好ましくは、癌、炎症性疾患、ニューロン障害、糖尿病、心血管疾患、又は感染性疾患に特異的である。標的抗原の例には、様々な免疫細胞、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、並びに様々な血液疾患、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患に関連する細胞によって発現される抗原が含まれる。
ＡＳＴＲによって標的化され得る癌に特異的な抗原としては、４－ＩＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、αフェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、ＬＩ－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンανβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒ ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２又はビメンチンのうちの１つ以上が挙げられる。
ＡＳＴＲによって標的化され得る炎症性疾患に特異的な抗原としては、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のａ鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンａ４、インテグリンα４β７、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ－５２８、ミオスタチン、ＯＸ－４０、ｒｈｕＭＡｂ β７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ－ａ又はＶＥＧＦ－Ａのうちの１つ以上が挙げられる。
本発明のＡＳＴＲによって標的化され得るニューロン障害に特異的な抗原としては、βアミロイド又はＭＡＢＴ５１０２Ａのうちの１つ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る糖尿病に特異的な抗原としては、Ｌ－Ｉβ又はＣＤ３のうちの１つ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る心血管疾患に特異的な抗原としては、Ｃ５、心臓ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα－ｌｉｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）及びスフィンゴシン－１－リン酸のうちの１つ以上が挙げられる。
本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る感染性疾患に特異的な抗原としては、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、エンドトキシン、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１、Ｈｓｐ９０、インフルエンザＡ型ヘマグルチニン、リポタイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス及びＴＮＦ－ａのうちの１つ以上が挙げられる。
標的抗原のさらなる例としては、癌細胞上に特異的な又は増幅された形で見られる表面タンパク質、例えばＩＬ－１４受容体、Ｂ細胞リンパ腫のＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０、種々の癌のルイスＹ及びＣＥＡ抗原、乳癌及び結腸直腸癌のＴａｇ７２抗原、肺癌のＥＧＦ－Ｒ、ヒト乳癌及び卵巣癌で増幅されることが多い葉酸結合タンパク質及びＨＥＲ－２タンパク質、又はウイルスタンパク質、例えばＨＩＶのｇｐ１２０及びｇｐ４１エンベロープタンパク質、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスからのエンベロープタンパク質、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂ及び他のエンベロープ糖タンパク質、並びにカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのオンコウイルスからのエンベロープタンパク質が挙げられる。他の潜在的な標的抗原としては、リガンドがＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質であるＣＤ４、及び他のウイルス受容体、例えばヒトライノウイルスの受容体であるＩＣＡＭ、及びポリオウイルスの関連受容体分子が挙げられる。
別の実施形態において、本ＣＡＲは、ＮＫ細胞などの癌治療細胞が会合する抗原を標的化して、免疫エフェクター細胞として働くことによりそれらの癌治療細胞を活性化させ得る。この一例は、ＣＤ１６Ａ抗原を標的化してＮＫ細胞を会合させることによりＣＤ３０発現悪性病変と闘わせるＣＡＲである。二重特異性四価ＡＦＭ１３抗体は、この効果を送達し得る抗体の例である。この種の実施形態のさらなる詳細については、例えば、Ｒｏｔｈｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｐｈａｓｅ １ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉ－ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＡＦＭ１３ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ，”Ｂｌｏｏｄ，２５ Ｊｕｎｅ ２０１５，Ｖｌ．１２５，ｎｏ．２６，ｐｐ．４０２４－４０３１を参照することができる。
一部の実施形態において、細胞外スペーサードメイン及び膜貫通ドメインはユビキチン化抵抗性であってもよく、これによりＣＡＲ－Ｔ細胞シグナル伝達を増強し、ひいては抗腫瘍活性を増大させることができる（Ｋｕｎｉｉ ｅｔ ｌａ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２７－３７，２０１３）。この領域内で、細胞外スペーサードメインはＣＡＲ－Ｔ細胞の外側にあり、従って異なる条件に露出しており、潜在的に条件的ユビキチン化抵抗性をなすことができる。
Ｃ．マスキングされた条件的活性型ポリペプチドの操作
本発明の条件的活性型ポリペプチド、特に条件的活性型抗体は、マスキング部分によってその条件的活性がマスキングされた、及び／又はそのコンジュゲート薬剤の活性がマスキングされたものであってもよい。マスキングされた活性は、マスキング部分が条件的活性型ポリペプチドから取り除かれるか又は切断されると利用可能になり得る。好適なマスキング技術については、例えば、Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｕｍｏｒ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＥＧＦＲ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｂｏｄｙ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ，”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０７ｒａ１４４，２０１３に記載されている。
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は、条件的活性及び／又はそのコンジュゲート薬剤の活性をマスキングするマスキング部分と連結される。例えば、条件的活性型抗体がマスキング部分とカップリングされると、かかるカップリング又は修飾によって構造変化が生じてもよく、この構造変化は条件的活性型抗体がその抗原と特異的に結合する能力を低下させ又は阻害するものである。条件的活性型抗体が標的組織又は微小環境に到達すると、マスキング部分が標的組織又は微小環境に存在する酵素によって切断され、ひいてはマスキングされていた活性が放出される。例えば、酵素は、腫瘍微小環境で一般に活性なプロテアーゼであってもよく、これがマスキング部分を切断すると、腫瘍組織内において活性を有する条件的活性型抗体が放出され得る。
一部の実施形態において、活性は、元の活性の約５０％未満、又は元の活性の約３０％未満、又は元の活性の約１０％未満、又は元の活性の約５％未満、又は元の活性の約２％未満、又は元の活性の約１％未満、又は元の活性の約０．１％未満、又は元の活性の約０．０１％未満となるようにマスキングされる。一部の実施形態では、例えば、送達に適切な時間を確保するため、マスキング効果は、インビボで又は標的移動インビトロ免疫吸収アッセイで計測したとき少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれ以上続くように設計される。
特定の実施形態において、マスキング部分は条件的活性型抗体の天然結合パートナー（抗原）と構造的に類似している。マスキング部分は条件的活性型抗体の天然結合パートナーが修飾されたものであってもよく、これは、条件的活性型抗体との結合の親和性及び／又はアビディティを少なくとも僅かに低下させるアミノ酸変化を含有する。一部の実施形態において、マスキング部分は条件的活性型抗体の天然結合パートナーとの相同性を含まないか、又は実質的に含まない。他の実施形態において、マスキング部分は条件的活性型抗体の天然結合パートナーと５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以下の配列同一性を有する。
マスキング部分は種々の異なる形態で提供され得る。特定の実施形態において、マスキング部分は条件的活性型抗体の既知の結合パートナーであってもよく、但し、マスキング部分が標的との所望の結合の妨げとなることを低減するため、マスキング部分は、マスキング部分の切断後に条件的活性型抗体の標的となる標的タンパク質よりも低い親和性及び／又はアビディティで条件的活性型抗体に結合するものとする。従って、マスキング部分は、好ましくは、マスキング部分の切断前は標的結合から条件的活性型抗体をマスキングするが、抗体からマスキング部分が切断された後になると、標的との活性分子の結合を実質的に若しくは大幅に妨げたり、又はそれに関して競合したりしないものである。具体的な実施形態において、条件的活性型抗体及びマスキング部分は、天然に存在する結合パートナーペアのアミノ酸配列を含まず、従って条件的活性型抗体及びマスキング部分の少なくとも一方が、天然に存在する結合パートナーのメンバーのアミノ酸配列を有しない。
或いは、マスキング部分は条件的活性型抗体に特異的に結合するのでなく、むしろ立体障害などの非特異的相互作用によって条件的活性型抗体－標的結合を妨げ得る。例えば、マスキング部分は、抗体の構造又はコンホメーションによってマスキング部分が条件的活性型抗体を例えば電荷ベースの相互作用によってマスキングすることが可能となり、それによって条件的活性型抗体への標的の到達が妨げられるような位置にあり得る。
一部の実施形態において、マスキング部分は条件的活性型抗体に共有結合性の結合によってカップリングされる。別の実施形態において、条件的活性型抗体は、マスキング部分を条件的活性型抗体のＮ末端に結合することにより、その標的との結合が阻止される。さらに別の実施形態において、条件的活性型抗体は、マスキング部分と条件的活性型抗体との間のシステイン間ジスルフィド架橋によってマスキング部分にカップリングされる。
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は切断可能部分（ＣＭ）とさらにカップリングされる。ＣＭは酵素によって切断される能力を有し、又はＣＭは還元剤によって還元される能力を有し、又はＣＭは光分解される能力を有する。一実施形態において、ＣＭのアミノ酸配列はマスキング部分とオーバーラップしているか、又はその範囲内に含まれ得る。別の実施形態において、ＣＭは条件的活性型抗体とマスキング部分との間にある。ＣＭの全て又は一部分が切断前の条件的活性型抗体のマスキングを促進し得ることに留意しなければならない。ＣＭが切断されると、条件的活性型抗体はその抗原に対する結合の活性が高くなる。
ＣＭは、対象の治療部位に標的抗原と共存する酵素の基質であってもよい。それに代えて、又は加えて、ＣＭは、ジスルフィド結合が還元される結果として切断可能なシステイン間ジスルフィド結合を有してもよい。ＣＭはまた、光源によって活性化可能な光解離性基質であってもよい。
条件的活性型抗体の所望の標的組織には、ＣＭを切断する酵素が優先的に位置するはずであり、ここで条件的活性型抗体は、罹患組織又は腫瘍組織などの標的組織において示される条件（異常条件）でより高活性である。例えば、幾つもの癌、例えば固形腫瘍においてレベルが増加する既知のプロテアーゼがある。例えば、Ｌａ Ｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９０（７）：１４１４－１４２１を参照のこと。かかる疾患の非限定的な例としては、あらゆる種類の癌（乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、膵癌等）、関節リウマチ、クローン病、黒色腫、ＳＬＥ、心血管損傷、虚血等が挙げられる。従って、腫瘍組織に存在するプロテアーゼ、特に非癌性組織と比較したとき腫瘍組織に高レベルで存在するプロテアーゼによって切断可能なペプチド基質を含む好適なＣＭが選択され得る。
一部の実施形態において、ＣＭは、レグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ－３／４、ＭＭＰ－９、ＭＴｌ－ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、β－セクレターゼ、ｕＰＡ及びＰＳＡから選択される酵素の基質であり得る。ＣＭを切断する酵素は、非治療部位の組織（例えば健常組織）と比べて治療部位の標的組織（例えば罹患組織又は腫瘍組織；例えば療法的治療又は診断的治療の対象となるもの）に比較的高いレベルで存在する。従って、罹患組織又は腫瘍組織で活性がより高いものであり得る抗体の条件的活性に加えて、罹患組織又は腫瘍組織に示される酵素はＣＭを切断することができ、これが条件的活性型抗体の活性、又はコンジュゲート薬剤の活性をさらに増強する。修飾又は切断を受けていないＣＭは、条件的活性型抗体の活性の効率的な阻害又はマスキングを可能にすることができ、従って条件的活性型抗体は正常組織（正常生理条件）では活性が低い。正常組織での条件的活性型抗体の活性を抑制する二重の機構（条件的活性及びマスキング部分）により、重大な有害作用を引き起こすことなしにはるかに高い投薬量の条件的活性型抗体の使用を用いることが可能となる。
一部の実施形態において、ＣＭは、以下の表１に掲載する酵素（ｅｎｚｙｍｅｒｓ）から選択される酵素の基質であり得る。
Figure 0007064769000001
それに代えて又は加えて、ＣＭはシステインペアのジスルフィド結合を含んでもよく、従ってこれは、グルタチオン（ＧＳＨ）、チオレドキシン、ＮＡＤＰＨ、フラビン、アスコルビン酸塩などを含めた、固形腫瘍の組織、又はその周囲に多量に存在し得る細胞性還元剤などの還元剤によって切断可能である。
一部の実施形態において、条件的活性型抗体はＣＭ及びマスキング部分の両方を含有する。条件的活性型抗体の活性は、酵素によってＣＭが切断されるとアンマスキングされる。一部の実施形態において、１つ以上のリンカー、例えば可動性リンカーを抗体、マスキング部分及びＣＭの間に挿入して可動性を付与することが望ましい場合もある。例えば、マスキング部分及び／又はＣＭは、所望の可動性を付与するのに十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙ及びＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含有しないこともある。そのため、１つ以上のアミノ酸を導入して可動性リンカーを提供することが有益であり得る。例えば、マスキングされた条件的活性型抗体は以下の構造を有し得る（ここで以下の式は、Ｎ末端からＣ末端への方向又はＣ末端からＮ末端への方向のいずれかのアミノ酸配列を表す）：
（ＭＭ）－Ｌ1－（ＣＭ）－（ＡＢ）
（ＭＭ）－（ＣＭ）－Ｌ1－（ＡＢ）
（ＭＭ）－Ｌ1－（ＣＭ）－Ｌ2－（ＡＢ）
シクロ［Ｌ1－（ＭＭ）－Ｌ2－（ＣＭ）－Ｌ3－（ＡＢ）］
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは条件的活性型抗体であり；Ｌ1、Ｌ2、及びＬ3は各々独立して、且つ任意選択で存在又は非存在を表し、少なくとも１つの可動性アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含む同じ又は異なる可動性リンカーであり；及びシクロは、存在する場合、構造のＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍のシステインペアの間にジスルフィド結合が存在するため構造全体が環状構造の形態である。
本発明での使用に好適なリンカーは、概して、マスキング部分に可動性を付与して条件的活性型抗体の活性の阻害を促進するものである。かかるリンカーは、概して可動性リンカーと称される。好適なリンカーは容易に選択することができ、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸、例えば、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、又は７アミノ酸～８アミノ酸など、好適な種々の長さのいずれであってもよく、１、２、３、４、５、６、又は７アミノ酸であり得る。
例示的可動性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）n、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）n、（ＧＳＧＧＳ）n及び（ＧＧＧＳ）n［式中、ｎは少なくとも１の整数である］を含む、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野において公知の他の可動性リンカーが挙げられる。例示的可動性リンカーとしては、限定はされないが、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙなどが挙げられる。
条件的活性型抗体の活性のマスキングに用いられる技法の幾つかが、国際公開第２０１００８１１７３Ａ２号パンフレットに記載されている。
本開示は、野生型ポリペプチド又は治療用ポリペプチドなどの親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを調製する方法を提供する。本方法は、親ポリペプチドをコードするＤＮＡを１つ以上の進化技法を用いて進化させて変異ＤＮＡを作成する工程；変異ＤＮＡを発現させて変異ポリペプチドを得る工程；変異ポリペプチド及び親ポリペプチドを第１の条件下でのアッセイ及び第２の条件下でのアッセイに供する工程；及び変異ポリペプチドから、（ａ）親ポリペプチドと比較した第１の条件でのアッセイにおける活性の低下、及び（ｂ）親ポリペプチドと比較した第２の条件下でのアッセイにおける活性の増加、の両方を呈する条件的活性型ポリペプチドを選択する工程を含む。第１の条件下でのアッセイ及び第２の条件下でのアッセイは、無機化合物、イオン及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分を含有するアッセイ溶液中で実施される。一部の実施形態において、第１の条件は正常生理条件であり、及び第２の条件は異常条件である。
条件的活性型ポリペプチドは第１の条件又は正常生理条件では可逆的又は不可逆的に不活性化されるが、第２の条件又は異常条件では第１の条件又は正常生理条件と同じ又は等価なレベルで活性である。これらの条件的活性型生物学的ポリペプチド及びこれらのポリペプチドの作製方法は、米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書に記載されている。条件的活性型生物学的ポリペプチドは、宿主体内で短期間又は限られた期間だけ活性である新規治療薬の開発に特に価値がある。宿主に有害であるが、限定された活性が、所望の治療を実行するのに必要である、投与される治療薬の拡張された作用において、これは特に価値がある。有益な適用の実施例は、高濃度においての局所的治療と同様に、高投与量での局所的又は全身的治療を含む。第１の条件又は正常生理的条件下での不活性化は、投与の組み合わせ及びポリペプチドの不活性化の割合によって決定されることがある。この条件に基づいた不活性化は、触媒活性が比較的短い期間において実質的に負の影響を引き起こすとき、酵素治療において特に重要である。
本開示はまた、親ポリペプチドを操作し又は進化させることにより、時間の経過に伴い可逆的又は不可逆的に活性化又は不活性化されるか、又は生体の特定の器官（腫瘍微小環境、滑液、膀胱又は腎臓など）を含め、生体のある種の微小環境中にあるときに限り活性化又は不活性化される条件的活性型ポリペプチドを生成する方法にも関する。一部の実施形態において、本条件的活性型ポリペプチドは、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の標的タンパク質（抗原）に対する抗体又は抗体フラグメントである。
本条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ依存的活性を有する単離ポリペプチドであってもよく、ここで第１のｐＨにおける活性は、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸イオン、重炭酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、二硫化物イオン、硫化水素、アンモニウムイオン、リン酸二水素イオン及びこれらの任意の組み合わせから選択される種の存在下で第２のｐＨにおける活性の少なくとも約１．３倍である。同じ活性が、小分子の非存在下ではｐＨ依存的でない。一部の実施形態において、第２の（ｓｅｏｎｃｄ）ｐＨにおける同じ活性の少なくとも約１．５、又は少なくとも約１．７、又は少なくとも約２．０、又は少なくとも約３．０、又は少なくとも約４．０、又は少なくとも約６．０、又は少なくとも約８．０、又は少なくとも約１０．０、又は少なくとも約２０．０、又は少なくとも約４０．０、又は少なくとも約６０．０、又は少なくとも約１００．０倍である第１のｐＨにおける活性。第１のｐＨは約５．５～７．２、又は約６．２～６．８の範囲の異常ｐＨであってもよく、一方、第２のｐＨは約７．２～７．６の範囲の正常生理的ｐＨであってもよい。
Ｄ．親ポリペプチド
親ポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドを含めた野生型ポリペプチド、野生型ポリペプチドに由来する変異ポリペプチド、例えば、治療用ポリペプチド、異なる野生型ポリペプチドに由来するキメラポリペプチド、又はさらには合成ポリペプチドであり得る。親ポリペプチドは、抗体、酵素、サイトカイン、調節タンパク質、ホルモン、受容体、リガンド、バイオシミラー、免疫調節薬、成長因子、及びこれらのポリペプチドのフラグメントから選択され得る。
好適な野生型ポリペプチド並びに条件的活性型ポリペプチドの作製に向けてそれらを進化させ及び選択し得る方法についての説明は、米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書に記載されている。
一部の実施形態において、親ポリペプチドは、バクテリオファージディスプレイライブラリなど、野生型ポリペプチド又は変異ポリペプチドのライブラリから選択され得る。かかる実施形態では、バクテリオファージライブラリにおいて、特に表面ディスプレイ技術によって多数の候補ポリペプチドを発現させる。ライブラリからの候補ポリペプチドは、好適な親ポリペプチドに関してスクリーニングされる。典型的なバクテリオファージライブラリは、細菌宿主において数千又はさらには数百万もの候補ポリペプチドを発現するバクテリオファージを含み得る。一実施形態において、バクテリオファージライブラリは複数のバクテリオファージを含み得る。
バクテリオファージライブラリの構築には、典型的には繊維状大腸菌ファージＭ１３などの繊維状バクテリオファージが、候補ポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをバクテリオファージコートタンパク質のうちの１つのコード配列に挿入することによって遺伝子修飾される。続いてバクテリオファージのコートタンパク質が候補ポリペプチドと共に発現すると、バクテリオファージ粒子の表面上に候補ポリペプチドが提示される。次に、提示された候補ポリペプチドを好適な親ポリペプチドに関してスクリーニングし得る。
好適な親ポリペプチドに関してスクリーニングする一つの一般的な技法は、所望の候補ポリペプチドを含むバクテリオファージ粒子を支持体上に固定化することによるものである。支持体は、望ましい候補ポリペプチドと結合し得る「ベイト」で被覆されたプラスチックプレートであり得る。未結合のバクテリオファージ粒子をプレートから洗い流し得る。プレートに（望ましい候補と共に）結合しているバクテリオファージ粒子を洗浄によって溶出させ、溶出したバクテリオファージ粒子を細菌で増幅する。次に、選択されたバクテリオファージ粒子の候補ポリペプチドをコードする配列をシーケンシングによって決定し得る。候補ポリペプチドとベイトとの間の関係は、例えば、リガンド－受容体又は抗原－抗体の関係であり得る。
好適な親ポリペプチドに関してスクリーニングする別の一般的な技術は、候補ポリペプチドが呈する所望の酵素活性に関する個々のバクテリオファージクローンの酵素アッセイを用いることによるものである。比酵素活性に応じて、当業者は、所望のレベルの酵素活性を有する親ポリペプチドをスクリーニングする適切なアッセイを設計することができる。
一部の実施形態において、バクテリオファージライブラリは、各バクテリオファージクローンがアレイ上の特定の位置を占めるようなアレイとして提供される。かかるアレイは固体支持体、例えば、膜、寒天プレート又はマイクロタイタープレート上に提供されてもよく、マイクロタイタープレートの場合、ライブラリの各バクテリオファージクローンは固体支持体上の特定の所定位置でそれに配置され又は付着する。寒天プレートの場合、好ましくはかかるプレートは細菌成長培地を含んで細菌の成長を補助する。アレイが膜上、例えば、ニトロセルロース又はナイロン膜上に提供される場合、細菌培養物は膜上に加えられ、その膜が栄養成長培地に浸漬される。加えて、バクテリオファージクローンはまたビーズ上に提供されてもよく、この場合単一のバクテリオファージクローンを単一のビーズに付着させることができる。或いはバクテリオファージクローンは各々が光ファイバーの端部に提供されてもよく、この場合、ファイバーを使用して光源からの紫外線放射が光学的に伝達される。
典型的なバクテリオファージライブラリには１０6～１０10個のバクテリオファージが含まれることもあり、その各々が、異なるポリペプチドを担持するコートタンパク質（例えばファージＭ１３の場合ｇｐ３又はｇｐ８）によって区別される。バクテリオファージライブラリの細菌宿主は、例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及び大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）を含む細菌属から選択され得る。
候補ポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、野生型ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのコレクションであり得る。好適な親ポリペプチドを発現し得る生物学的試料からｃＤＮＡを合成する方法は公知である。転写物を介して生理活性を示す任意の遺伝情報をｃＤＮＡとして収集し得る。ｃＤＮＡの作製時には、完全長ｃＤＮＡを合成することが不可欠である。完全長ｃＤＮＡの合成に用い得る方法は幾つかある。例えば、好適な方法としては、５’キャップ部位の標識に酵母又はＨｅｌａ細胞のキャップ結合タンパク質を利用する方法（Ｉ．Ｅｄｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｔｏ Ｉｓｏｌａｔｅ Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｍＲＮＡ Ｃａｐ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＣＡＰｔｕｒｅ）”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５，ｐａｇｅｓ ３３６３－３３７１，１９９５）；及び５’キャップを有しない不完全ｃＤＮＡのリン酸をアルカリホスファターゼを用いて取り除き、次に全ｃＤＮＡをタバコモザイクウイルスのデキャッピング酵素で処理すると完全長ｃＤＮＡのみがリン酸を有するようになる方法（Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｐｌａｃｅ ｔｈｅ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１３８，ｐａｇｅｓ １７１－１７４，１９９５及びＳ．Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｂａｎｋ”，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１５０，ｐａｇｅｓ ２４３－２５０，１９９５）が挙げられる。
親ポリペプチドが抗体である実施形態において、候補抗体のライブラリは、ある生物の完全な抗体レパートリーに由来する組換え抗体を用いて作製し得る。レパートリーを表す遺伝情報が完全抗体の大規模コレクションとしてアセンブルされ、これを、所望の抗原結合活性及び／又は１つ以上の他の機能的特性を有する好適な親抗体に関してスクリーニングし得る。一部の実施形態では、抗原で免疫した動物由来のＢ細胞、例えば、免疫したヒト、マウス、又はウサギなどを単離する。単離したＢ細胞からｍＲＮＡを回収してｃＤＮＡに変換し、次に塩基配列決定する。軽鎖をコードする最も頻度の高いｃＤＮＡフラグメント及び重鎖をコードする最も頻度の高いｃＤＮＡフラグメントをアセンブルして抗体にする。一実施形態では、軽鎖をコードする１００個の最も頻度の高いｃＤＮＡフラグメント及び重鎖をコードする１００個の最も頻度の高いｃＤＮＡフラグメントをアセンブルして候補抗体を作製する。別の実施形態において、最も頻度の高いｃＤＮＡフラグメントは重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域をコードするのみであり、アセンブルされて、抗体は可変領域のみを含有し、定常領域は含有しない抗体フラグメントを作製する。
一部の実施形態において、ＩｇＧ重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡフラグメントがＩｇＫ又はＩｇＫ軽鎖の最も頻度の高い可変領域とアセンブルされる。アセンブルされた抗体は、ＩｇＧ由来の重鎖可変領域とＩｇＫ由来の軽鎖可変領域又はＩｇＫとを含有する。
次に、アセンブルした抗体をコードするｃＤＮＡを、好ましくはプレートベースのフォーマットでクローニングして発現させる。発現した抗体の結合活性はビーズベースのＥＬＩＳＡ分析で分析してもよく、好適な親抗体はＥＬＩＳＡ分析に基づき選択し得る。アセンブルした抗体をコードするｃＤＮＡはまた、バクテリオファージディスプレイライブラリで発現させてもよく、次にはこれを本明細書に開示される技法のいずれか一つによって１つ以上の望ましい親抗体に関してスクリーニングし得る。
親ポリペプチドが抗体である実施形態において、親抗体は好ましくは、それを条件的活性型抗体に進化させることを容易にする少なくとも１つの特定の特性を有する。特定の実施形態において、親抗体は、正常生理条件下及び異常条件下の両方で類似した結合活性及び／又は特性を有し得る。かかる実施形態において、親抗体は、正常生理条件下及び異常条件下の両方で最も類似した結合活性及び／又は最も類似した１つ以上の特性の組み合わせを有することに基づき選択される。例えば、正常生理条件及び異常条件がそれぞれｐＨ７．４及びｐＨ６．０である場合、ｐＨ７．４及び６．０での類似性が低い結合活性を有する抗体よりも、ｐＨ７．４及び６．０で最も類似した結合活性を有する親抗体が選択され得る。
Ｅ．条件的活性型ポリペプチドの同定
親ポリペプチドの選択後、その親ポリペプチドをコードするＤＮＡを好適な突然変異誘発技法を用いて進化させて変異ＤＮＡを作製し、次にこれを発現させることにより、条件的活性型ポリペプチドを同定するためスクリーニングにかける変異タンパク質を作製し得る。一部の実施形態において、進化させるのは最小限であってよく、例えばごく少数の突然変異のみを親ポリペプチドに導入して、所望の条件的活性を有する変異ポリペプチドを作製する。例えば、好適な条件的活性型ポリペプチドの作製には、各部位に約２０個未満の変化、場合により約１８個未満の変化をコンプリヘンシブ・ポジショナル・エボリューション（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ＣＰＥ）によって導入することで十分であり得る。コンプリヘンシブ・ポジショナル・シンテシス（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＣＰＳ）については、望ましい条件的活性型ポリペプチドの作製に、親ポリペプチドにおける約６個未満のアップ突然変異、又は約５個未満のアップ突然変異、又は約４個未満のアップ突然変異、又は約３個未満のアップ突然変異、又は約２個未満のアップ突然変異の組み合わせが十分であり得る。
一部の実施形態において、候補ポリペプチドのライブラリ（例えばバクテリオファージライブラリ及び／又は組換え抗体ライブラリ）が十分に大きい場合、進化及び発現工程は不要であり得る。かかる大規模ライブラリは、条件的活性型特性を有する（両方ともに基準ポリペプチドとの比較において、正常生理条件下のアッセイで低い活性及び異常条件下のアッセイで高い活性の両方を有する、又は異常条件下のアッセイと比べて正常生理条件下のアッセイでより低い活性を有する）候補ポリペプチドを含有し得る。これらの実施形態では、ライブラリ中の候補ポリペプチドを選択工程に供することにより、異常条件下でのアッセイにおける同じポリペプチドと比べて正常生理条件下でのアッセイで活性が低い条件的活性型ポリペプチドが発見される。一実施形態において、ライブラリ中の候補ポリペプチドが、参照ポリペプチドと共に、正常生理条件下でのアッセイ及び異常条件下でのアッセイに個別に供される。ライブラリから選択される条件的活性型ポリペプチドは、両方ともに参照ポリペプチドとの比較において、正常生理条件下でより低い活性を呈し、且つ異常条件下で同じポリペプチドのより高い活性を呈するものである。この実施形態では、ライブラリが十分に大きいため、条件的活性型特性を備えた候補ポリペプチドがライブラリに既に存在する。条件的活性型ポリペプチドを発見するために親ポリペプチドを進化させる必要はない。
一部の実施形態において、参照ポリペプチドは、正常生理条件下及び異常条件下の両方で類似した又は同じ活性を有する点で条件的活性型ではないものであり得る。参照ポリペプチドは、ライブラリ中の候補ポリペプチドと同種のポリペプチド、例えば、同種の酵素、サイトカイン、調節タンパク質、抗体、ホルモン又は機能ペプチドである。参照ポリペプチドはまた、同種の組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、レニン、ヒアルロニダーゼ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ（ＳＰ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＴＰ）、バソプレシン又はアンジオスタチンであってもよい。例えば、ライブラリに、ある抗原に対する候補抗体が多数含まれる場合、参照ポリペプチドは、正常生理条件及び異常条件の両方でその抗原との同じ又は類似した結合活性を有する同じ抗原に対する抗体である。
従って、一実施形態において、ライブラリ中の候補ポリペプチドが、参照ポリペプチドと共に、正常生理条件下でのアッセイ及び異常条件下でのアッセイに個別に供される。ライブラリから、（ａ）参照ポリペプチドとの比較で正常生理条件下における活性の低下、及び（ｂ）参照ポリペプチドとの比較で異常条件下における活性の増加、の両方を呈する条件的活性型ポリペプチドが選択される。
Ｆ．条件的活性型ポリペプチドの生成方法
親ポリペプチドをコードするＤＮＡを１つ以上の突然変異誘発技法を用いて進化させることにより変異ＤＮＡを作成する；この変異ＤＮＡを発現させて変異ポリペプチドを作製する；及び変異ポリペプチドを、正常生理条件であり得る第１の条件下のスクリーニングアッセイ、及び異常条件であり得る第２の条件下のスクリーニングアッセイに供する。条件的活性型ポリペプチドは、（ａ）親ポリペプチドと比較した第１の条件におけるアッセイの活性の低下、及び（ｂ）親ポリペプチドと比較した第２の条件下におけるアッセイの活性の増加、の両方を呈する変異ポリペプチドから選択される。条件的活性型ポリペプチドについての第１の条件又は正常生理条件における活性の低下は可逆的又は不可逆的であってもよい。
一部の実施形態において、進化させるポリペプチドは、野生型ポリペプチドのフラグメント、治療用ポリペプチドのフラグメント、又は抗体フラグメントであってもよい。一部の他の実施形態において、親ポリペプチドは、突然変異誘発プロセスによって生成された変異ポリペプチドから選択されるポリペプチドであってもよく、ここでこのポリペプチドは、高い結合活性、高い発現レベル又はヒト化などの所望の特性を有することに関して選択される。選択されたポリペプチドは、本明細書に開示される方法で進化させる親ポリペプチドとして用いられ得る。
親ポリペプチドをコードするＤＮＡからの変異ＤＮＡの生成方法については、米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書に記載されている。
親ポリペプチドをコードするＤＮＡを進化させることによる変異ＤＮＡの作製は、点突然変異（置換、挿入、及び／又は欠失）、又はＤＮＡ内の大きいセグメントの突然変異を用いて行い得る。一部の態様において、進化工程が親ポリペプチドの活性部位を変化させることはなく、代わりに活性部位を取り囲む領域のうちの１つ以上、及び／又は活性部位から離れた１つ以上の領域を変化させるのみである。
一態様において、進化工程は、親完全長抗体を一本鎖抗体に変換することを含む。この場合、活性部位、即ち可変領域、特にＣＤＲが親抗体と比べていかなる突然変異も有しないものであり得るとしても、その活性部位が存在するコンテクストは定常領域の除去によって変化している。一例において、親完全長抗体はＩｇＧ抗体であり、変異抗体は、それに由来する一本鎖抗体である。
一部の態様において、一本鎖抗体は、各々が異なるエピトープに結合する２本のアームを有する二重特異性抗体である。一方のアーム上の突然変異は他方のアームの活性に影響を及ぼし得る。従って、進化工程は、二重特異性抗体である親ポリペプチドの一方のアームのみを突然変異させることを含み得る。一例において、欠失によってアームを短くするか、又は挿入によってアームを長くすることにより、一方のアームの長さを進化させてもよい。或いは、進化工程は、二重特異性抗体の両方のアームを同じ進化工程又は逐次的な進化工程で、任意選択で各工程後にスクリーニングを伴い進化させてもよい。
さらに別の態様において、親ポリペプチドは抗体又は抗体フラグメントである。進化工程はＦｃ領域を突然変異させるものであり得る。Ｆｃ領域の突然変異は、置換、挿入、及び／又は欠失であってもよい。Ｆｃ領域はＦｃ領域のフラグメントの欠失によって短くしてもよく、又はＦｃ領域へのフラグメントの挿入によって長くしてもよい。
さらに別の態様において、親ポリペプチドは、フレームワーク領域によって分断化された複数の相補性決定領域を含む。かかる親ポリペプチドは、例えば、抗体、軽鎖又は重鎖の可変領域であってもよい。特定の実施形態において、進化工程はフレームワーク領域のみ又は相補性決定領域とフレームワーク領域との組み合わせを突然変異させるものであり得る。フレームワーク領域及び相補性決定領域の進化は、一段階又は複数の逐次段階で、任意選択で各工程後にスクリーニングを伴い行い得る。
さらに別の態様において、親ポリペプチドはその活性部位以外に幾つかの領域を有する。これらの幾つかの領域は、複数の進化工程で順次、任意選択で進化工程のうちの１つ以上の後にスクリーニングを伴い突然変異させてもよい。例えば、進化工程は、ポリペプチドの領域のうちの一つを進化させ、続いて条件的活性型ポリペプチドに関してスクリーニングし；次にポリペプチドの領域のうちのもう一つを進化させ、続いて条件的活性型ポリペプチドに関してスクリーニングし；及び次にポリペプチドのさらに別の領域を進化させ、条件的活性型ポリペプチドに関してスクリーニングするさらに別の工程が続くものであってもよい。
状況によっては、活性部位以外の親ポリペプチド及び／又は突然変異条件的活性型ポリペプチドの１つ以上の領域（例えば周囲領域又は遠隔領域）の進化により、活性部位の活性が変化し得る。活性部位よりむしろ周囲領域又は遠隔領域を突然変異させることにより、状況によっては、特定の条件で変異ポリペプチドの活性部位が親ポリペプチドの活性部位よりも高活性又は低活性になり得る。他の実施形態において、活性部位を含む領域以外の親ポリペプチド又は変異ポリペプチドの１つ以上の領域を進化させることにより改良した場合に所望の条件的活性又は選択性が実現する。
一部の態様において、活性部位を含有する領域以外の親ポリペプチドの領域を進化させることにより得られた条件的活性型ポリペプチドは、少なくとも２、又は少なくとも３、又は少なくとも５の選択性を生じ得る。
生成された変異ＤＮＡを発現させて変異ポリペプチドを作製する好適な方法が、米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書に記載されている。
条件的活性型ポリペプチドを選択するための変異ポリペプチドのスクリーニング方法が、米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書に記載されている。
条件的活性型ポリペプチドをスクリーニング及び選択するためのアッセイ条件
スクリーニング工程で用いるアッセイの第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス、電解質濃度、並びに２つ以上のかかる条件の組み合わせから選択される条件を用いて行い得る。例えば、温度の正常生理条件は３７．０℃の正常ヒト体温であってもよく、一方、温度の異常条件は３７．０℃の温度と異なる温度、例えば正常生理的温度よりも１～２℃高いものであり得る腫瘍微小環境における温度であってもよい。別の例において、正常生理条件及び異常条件はまた、７．２～７．８、又は７．２～７．６の範囲の正常生理的ｐＨ及び腫瘍微小環境に存在する５．５～７．２、６～７、又は６．２～６．８の範囲などの異常ｐＨであってもよい。
第１の条件下及び第２の条件下、又は正常生理条件下及び異常条件下の両方のアッセイとも、アッセイ媒体中で実施し得る。アッセイ媒体は、例えば緩衝液並びに他の成分を含有し得る溶液であり得る。アッセイ媒体に用いることのできる一般的な緩衝液としては、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、クレブス緩衝液などの重炭酸塩緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。アッセイに好適な当業者に公知の他の緩衝液が用いられてもよい。これらの緩衝液は、血漿又はリンパ液など、ヒト又は動物の体液の組成の特性又は成分を模擬するために用いられ得る。
本発明の方法において有用なアッセイ溶液は、無機化合物、イオン及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分、好ましくはヒト又は動物などの哺乳類の体液中に一般に見出されるものを含有し得る。かかる構成成分の例としては、栄養構成成分及び代謝産物、並びに体液中に見出され得る任意の他の構成成分が挙げられる。本発明は、この構成成分が緩衝液系の一部であっても、又はそうでなくてもよいことを企図する。例えば、アッセイ溶液は、重炭酸イオンを加えたＰＢＳ緩衝液であってもよく、ここで重炭酸塩はＰＢＳ緩衝液の一部ではない。或いは、重炭酸イオンはクレブス緩衝液の一成分である。
構成成分が両方のアッセイ溶液（第１及び第２の条件用の）に実質的に同じ濃度で存在し、一方、これらの２つのアッセイ溶液は、ｐＨ、温度、電解質濃度、又は浸透圧など、他の点で異なってもよい。従って、構成成分は、第１及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の２つの条件間の違いでなく、むしろ定数として用いられる。
一部の実施形態において、構成成分は両方のアッセイ溶液に、その構成成分の哺乳類、特にヒトにおける正常生理的濃度に近い又はそれと同じ濃度で存在する。
無機化合物又はイオンは、ホウ酸、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、リン酸二アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸一アンモニウム、リン酸一カリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硝酸カルシウム、カルシウムキレート、銅キレート、鉄キレート、マンガンキレート及び亜鉛キレート、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウム、重炭酸カリウム、硝酸カリウム、塩酸、二酸化炭素、硫酸、リン酸、炭酸、尿酸、塩化水素、尿素、リンイオン、硫酸イオン、塩化物イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン及び銅イオンのうちの１つ以上から選択され得る。
無機化合物の一部の正常生理的濃度の例としては、２～７．０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の尿酸、８．２～１１．６ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のカルシウムイオン、３５５～３８１ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の塩化物イオン、０．０２８～０．２１０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の鉄イオン、１２．１～２５．４ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のカリウムイオン、３００～３３０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のナトリウムイオン、１５～３０ｍＭの濃度範囲の炭酸、約８０μＭのクエン酸イオン、０．０５～２．６ｍＭの範囲のヒスチジンイオン、０．３～１μＭの範囲のヒスタミン、１～２０μＭの範囲のＨＡＰＴイオン（水素付加アデノシン三リン酸）、及び１～２０μＭの範囲のＨＡＤＰイオンが挙げられる。
一部の実施形態において、第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在するイオンは、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン（塩化物、臭化物、ヨウ化物）、オキシハロゲン化物イオン、硫酸イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、重硫酸イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、スルホン酸イオン、オキシハロゲン化物イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、過硫酸イオン、モノ過硫酸イオン、ホウ酸イオン、アンモニウムイオン、又は有機イオン、例えばカルボン酸イオン、フェノラートイオン、スルホン酸イオン（硫酸メチルなどの有機硫酸塩）、バナジウム酸イオン、タングステン酸イオン、ホウ酸イオン、有機ボロン酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、酢酸イオン、五ホウ酸イオン、ヒスチジンイオン、及びフェノラートイオンから選択される。
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、例えば、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、ピロリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシンなどのアミノ酸及びこれらの混合物から選択され得る。
アミノ酸の一部の正常生理的濃度の例としては、３．９７±０．７０ｍｇ／ｄＬのアラニン、２．３４±０．６２ｍｇ／ｄＬのアルギニン、３．４１±１．３９ｍｇ／ｄＬのグルタミン酸、５．７８±１．５５ｍｇ／ｄＬのグルタミン、１．７７±０．２６ｍｇ／ｄＬのグリシン、１．４２±０．１８ｍｇ／ｄＬのヒスチジン、１．６０±０．３１ｍｇ／ｄＬのイソロイシン、１．９１±０．３４ｍｇ／ｄＬのロイシン、２．９５±０．４２ｍｇ／ｄＬのリジン、０．８５±０．４６ｍｇ／ｄＬのメチオニン、１．３８±０．３２ｍｇ／ｄＬのフェニルアラニン、２．０２±６．４５ｍｇ／ｄＬのスレオニン、１．０８±０．２１ｍｇ／ｄＬのトリプトファン、１．４８±０．３７ｍｇ／ｄＬのチロシン及び２．８３±０．３４ｍｇ／ｄＬのバリンが挙げられる。
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、尿酸、アラントイン、アデノシン、尿素、アンモニア及びコリンなどの非タンパク質窒素含有化合物から選択され得る。これらの化合物の一部の正常生理的濃度の例としては、１．０７±０．７６ｍｇ／ｄＬのクレアチン、０．９～１．６５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン、０．２６±０．２４ｍｇ／ｄＬのグアニジノ酢酸、４．０±２．９ｍｇ／ｄＬの尿酸、０．３～０．６ｍｇ／ｄＬのアラントイン、１．０９±０．３８５ｍｇ／ｄＬのアデノシン、尿素２７．１±４．５ｍｇ／ｄＬ及び０．３～１．５ｍｇ／ｄＬのコリンが挙げられる。
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、クエン酸、α－ケトグルタル酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、アセト酢酸、β－ヒドロキシ酪酸、乳酸、ピルビン酸、α－ケトン酸、酢酸、及び揮発性脂肪酸などの有機酸から選択され得る。これらの有機酸の一部の正常生理的濃度の例としては、２．５±１．９ｍｇ／ｄＬのクエン酸、０．８ｍｇ／ｄＬのα－ケトグルタル酸、０．５ｍｇ／ｄＬのコハク酸、０．４６±０．２４ｍｇ／ｄＬのリンゴ酸、０．８～２．８ｍｇ／ｄＬのアセト酢酸、０．５±０．３ｍｇ／ｄＬのβ－ヒドロキシ酪酸、８～１７ｍｇ／ｄＬの乳酸、１．０±０．７７ｍｇ／ｄＬのピルビン酸、０．６～２．１ｍｇ／ｄＬのａ－ケトン酸、１．８ｍｇ／ｄＬの揮発性脂肪酸が挙げられる。
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、グルコース、ペントース、ヘキソース、キシロース、リボース、マンノース及びガラクトースなどの糖類（炭水化物）、並びに、ラクトース、ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌ、Ｇａｌα１－４Ｇａｌ、Ｍａｎα１－２Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃβ１－３Ｇａｌ及びＯ－、Ｎ－、Ｃ－、又はＳ－グリコシドを含めた二糖類から選択され得る。これらの糖類の一部の正常生理的濃度の例としては、８３±４ｍｇ／ｄＬのグルコース、１０２±７３ｍｇ／ｄＬの多糖類（ヘキソースとして）、７７±６３ｍｇ／ｄＬのグルコサミン、０．４～１．４ｍｇ／ｄＬのヘキスロン酸塩（グルクロン酸として）及び２．５５±０．３７ｍｇ／ｄＬのペントースが挙げられる。
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、コレステロール、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン及び胆汁酸などの脂肪又はその誘導体から選択され得る。これらの化合物の一部の正常生理的濃度の例としては、４０～７０ｍｇ／ｄＬの遊離コレステロール、１００～２００ｍｇ／ｄＬのレシチン、０～３０ｍｇ／ｄＬのセファリン、１０～３０ｍｇ／ｄＬのスフィンゴミエリン及び０２．～０．３ｍｇ／ｄＬの胆汁酸（コール酸として）が挙げられる。
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、フィブリノゲン、抗血友病グロブリン、免疫γ－グロブリン、免疫オイグロブリン、同種凝集素、β－偽グロブリン、糖タンパク質、リポタンパク質及びアルブミンなどのタンパク質から選択され得る。例えば、哺乳類血清アルブミンの正常生理的濃度は３．５～５．０ｇ／ｄＬである。一実施形態において、アルブミンはウシ血清アルブミンである。
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＥ、アスコルビン酸、チアミン、イノシトール、葉酸、ビオチン、パントテン酸、リボフラビンなどのビタミン類から選択され得る。これらのビタミン類の一部の正常生理的濃度の例としては、０．０１９～０．０３６ｍｇ／ｄＬのビタミンＡ、０．９０～１．５９ｍｇ／ｄＬのビタミンＥ、０．４２～０．７６ｍｇ／ｄＬのイノシトール、０．００１６２～０．００１９５ｍｇ／ｄＬの葉酸及びビオチン０．０００９５～０．００１６６ｍｇ／ｄＬが挙げられる。
アッセイ溶液中（第１の条件下及び第２の条件下、又は正常生理条件下及び異常条件下の両方のアッセイ）の無機化合物、イオン、又は有機分子の濃度は、ヒト又は動物血清中のその無機化合物、イオン、又は有機分子の正常生理的濃度の範囲内であり得る。しかしながら、生理的正常範囲外の濃度もまた用いられ得る。例えば、ヒト血清中におけるマグネシウムイオンの正常範囲は１．７～２．２ｍｇ／ｄＬ、及びカルシウムは８．５～１０．２ｍｇ／ｄＬである。アッセイ溶液中のマグネシウムイオン濃度は約０．１７ｍｇ／ｄＬ～約１１ｍｇ／ｄＬであってもよい。アッセイ溶液中のカルシウムイオン濃度は約０．８５ｍｇ／ｄＬ～約５１ｍｇ／ｄＬであってもよい。一般則として、アッセイ溶液中の無機化合物、イオン、又は有機分子の濃度は、ヒト血清中のその無機化合物、イオン、又は有機分子の正常生理的濃度の５％、又は１０％、又は２０％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％もの低さであるか、又はヒト血清中のその無機化合物、イオン、又は有機分子の正常生理的濃度の１．５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍又は５倍、又は７倍又は９倍又は１０倍又はさらには２０倍もの高さであってもよい。アッセイ溶液の種々の構成成分を、それぞれの正常生理的濃度と異なる濃度レベルで使用し得る。
第１の条件下及び第２の条件下、又は正常生理条件下及び異常条件下でのアッセイを用いて変異ポリペプチドの活性を計測する。アッセイ中、変異ポリペプチド及びその結合パートナーの両方がアッセイ溶液中に存在する。変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の関係は、例えば、抗体－抗原、リガンド－受容体、酵素－基質、又はホルモン－受容体であり得る。変異ポリペプチドがその活性を発現するには、変異ポリペプチドがその結合パートナーと接触してそれに結合することが可能でなければならない。次には変異ポリペプチドとその結合パートナーとの結合後に変異ポリペプチドのその結合パートナーに対する活性が発現し、それを計測する。
一部の実施形態において、アッセイで用いられるイオンは、スクリーニングする変異ポリペプチドとその結合パートナー、特に荷電アミノ酸残基を含むものとの間の架橋の形成において機能し得る。従ってイオンは、変異ポリペプチド及びその結合パートナーの両方との水素結合及び／又はイオン結合による結合能を有し得る。これは、巨大分子（変異ポリペプチド又はその結合パートナー）には到達し難いこともある部位にイオンが到達可能であることにより、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助し得る。場合によっては、アッセイ溶液中のイオンは、変異ポリペプチド及びその結合パートナーが互いに結合する可能性を増加させ得る。さらに、イオンは、それに加えて又は代えて、大型分子（変異ポリペプチド又はその結合パートナー）に結合することによって変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助し得る。この結合は、結合パートナーとの結合を促進する特定のコンホメーションに大型分子のコンホメーションを変化させ、及び／又は大型分子をそのようなコンホメーションに保持し得る。
イオンが変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を、恐らくは変異ポリペプチド及びその結合パートナーとのイオン結合の形成によって補助し得ることが観察されている。従って、イオンのない同じアッセイと比較してスクリーニングがはるかに効率的となり得るとともに、より多くのヒット（候補条件的活性型ポリペプチド）を同定することができる。好適なイオンは、マグネシウムイオン、硫酸イオン、重硫酸イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、ＨＡＰＴイオン、ＨＡＤＰイオン、重炭酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、過硫酸イオン、モノ過硫酸イオン、ホウ酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、ヒスチジンイオン、ヒスタミンイオン、及びアンモニウムイオンから選択され得る。
イオンは、そのイオンのｐＫａに近いｐＨで変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するよう機能することが分かっている。かかるイオンは、好ましくは変異ポリペプチドのサイズと比べて比較的小さい。
一実施形態において、異常条件が正常生理条件下における正常生理的ｐＨと異なるｐＨである場合、候補条件的活性型ポリペプチドのヒット数を増加させるのに好適なイオンは、アッセイで試験する異常ｐＨに近いｐＫａを有するイオンから選択され得る。例えば、イオンのｐＫａは、異常ｐＨから最大２ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大１ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．８ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．６ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．５ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．４ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．３ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．２ｐＨ単位離れていてもよく、又は異常ｐＨから最大０．１ｐＨ単位離れていてもよい。
本発明において有用なイオンの例示的ｐＫａ（このｐＫａは温度が異なるとごく僅かに変わり得る）は、以下のとおりである：アンモニウムイオンはｐＫａが約９．２４であり、リン酸二水素はｐＫａが約７．２であり、酢酸はｐＫａが約４．７６であり、ヒスチジンはｐＫａが約６．０４であり、重炭酸イオンはｐＫａが約６．４であり、クエン酸塩はｐＫａが６．４であり、乳酸イオンはｐＫａが約３．８６であり、ヒスタミンはｐＫａが約６．９であり、ＨＡＴＰはｐＫａが６．９５であり（ＨＡＴＰ3-⇔ＡＴＰ4-＋Ｈ+）、及びＨＡＤＰはｐＫａが６．８８である（ＨＡＤＰ3-⇔ＡＤＰ4-＋Ｈ+）。
一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは二硫化物の存在下でアッセイ及び選択される。二硫化物はｐＫａが７．０５である。一部の実施形態では、正常生理条件に相当するアッセイと異常生理条件に相当するアッセイとに異なる二硫化物濃度が用いられ得る。或いは、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ媒体は二硫化物濃度がほぼ同じで、また特定の条件の値が何らか異なるものであり、例えばこのアッセイは異なるｐＨで行われ得る。アッセイで用いられる二硫化物濃度は１ｍＭ～１００ｍＭであり得る。好ましくは、アッセイ媒体は、２～５００ｎＭ、又は３～２００ｎＭ、又は５～１００ｎＭの二硫化物濃度を有する。一部の態様において、二硫化物濃度は１ｍＭ～２０ｍＭ、又は２ｍＭ～１０ｍＭであり得る。二硫化物の存在下で行われるアッセイは公知である。
特定の実施形態において、異常条件のｐＨ（即ち異常ｐＨ）が分かると、候補条件的活性型ポリペプチドのヒットを増加させるのに好適なイオンが、異常ｐＨの又はそれに近いｐＫａを有するイオンから選択されてもよく、例えば、候補イオンは、異常ｐＨから最大４ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大３ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大２ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大１ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．８ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．６ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．５ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．４ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．３ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．２ｐＨ単位離れた、又は異常ｐＨから最大０．１ｐＨ単位離れたｐＫａを有し得る。
前述のとおり、イオンは、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するのに、そのイオンのｐＫａの又はそれに近いｐＨで最も有効である。例えば、ｐＨ７．２～７．６のアッセイ溶液では、重炭酸イオン（ｐＫａが約６．４である）は、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するのにあまり有効でないことが分かっている。アッセイ溶液のｐＨを６．７、さらには約６．０にまで低下させるに従い、重炭酸イオンは、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の補助に次第に有効となる。結果として、ｐＨ６．０のアッセイであれば、ｐＨ７．２～７．６のアッセイと比較してより多くのヒットが同定され得る。同様に、ヒスチジンは、ｐＨ７．４では、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するのにあまり有効でない。アッセイ溶液のｐＨを６．７、さらには約６．０にまで低下させるに従い、ヒスチジンは変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の補助に次第に有効となり、また、例えば約６．２～６．４の範囲のｐＨでは、より多くのヒットを同定することも可能になる。
本発明では、意外にも、正常生理条件のアッセイ溶液のｐＨ（即ち、正常生理的ｐＨ）と異常条件のアッセイ溶液のｐＨ（即ち、異常ｐＨ）とが異なる場合、正常生理的ｐＨと異常ｐＨとのほぼ中点からほぼ異常ｐＨに至る範囲のｐＫａを有するイオンが、スクリーニングする変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を大幅に補助し得ることが見出された。結果として、このスクリーニングアッセイは、異常条件で活性が高いヒット又は候補条件的ポリペプチドをより多く見付けるのに、はるかに効率的である。
一部の実施形態では、ｐＫａはさらには異常ｐＨから少なくとも１ｐＨ単位離れていてもよい。異常ｐＨが酸性ｐＨである場合、好適なイオンのｐＫａは、（異常ｐＨ－１）から異常ｐＨと正常生理的ｐＨとの中点に至るまでの範囲であり得る。異常ｐＨが塩基性ｐＨである場合、好適なイオンのｐＫａは、（異常ｐＨ＋１）から異常ｐＨと正常生理的ｐＨとの中点に至るまでの範囲であり得る。イオンは、本願に記載されるものから選択され得る。しかしながら、本願に明示的に記載されていないさらに多くのイオンもまた用いることができる。スクリーニングアッセイの異常ｐＨ及び正常生理的ｐＨが選択されると、当業者は、本発明の指針を用いて、異常条件で高い活性を有するヒットをより多く同定する点でスクリーニングの効率を増加させるのに好適なｐＫａを有する任意のイオンを選択し得ることが理解される。
例えば、ある例示的スクリーニングについて異常ｐＨが８．４であり、正常生理的ｐＨが７．４である場合、約７．９（中点）～９．４（即ち、８．４＋１）の範囲のｐＫａを有する任意のイオンをスクリーニングに用い得る。この範囲のｐＫａを有する幾つかのイオンとしては、トリシン（ｐＫａ ８．０５）、ヒドラジン（ｐＫａ ８．１）、ビシン（ｐＫａ ８．２６）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（４－ブタンスルホン酸）（ｐＫａ ８．３）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ｐＫａ ８．４）、タウリン（ｐＫａ ９．０６）に由来するイオンが挙げられる。別の例では、ある例示的スクリーニングについて異常ｐＨが６であり、正常生理的ｐＨが７．４である場合、約５（即ち、６－１）～６．７（中点）の範囲のｐＫａを有する任意のイオンをスクリーニングに用い得る。この範囲のｐＫａを有する幾つかのイオンとしては、リンゴ酸塩（ｐＫａ ５．１３）、ピリジン（ｐＫａ ５．２３）、ピペラジン（ｐＫａ ５．３３）、カコジル酸塩（ｐＫａ ６．２７）、コハク酸塩（ｐＫａ ５．６４）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＫａ ６．１０）、クエン酸塩（ｐＫａ ６．４）、ヒスチジン（ｐＫａ ６．０４）及びビス－トリス（６．４６）に由来するイオンが挙げられる。当業者は、膨大な数の化学マニュアル及びテキストを参考にして、無機化学化合物及び有機化学化合物の両方を含め、その範囲内にあるｐＫａを有するイオンに変換し得る既知の化学化合物を同定することが可能であろう。好適なｐＫａを有する化学化合物の中では、より小さい分子量のものが好ましいこともある。
従って、本発明では、予想外にも、最終的に同定される条件的活性型ポリペプチドの作製が正しいポリペプチド変異体の生成に依存するのみならず、アッセイ溶液中における好適なｐＫａのイオンの使用にも依存することが見出された。イオンは大規模ライブラリからの高活性の変異体の効率的な選択を促進し得るため、本発明では、変異ポリペプチドの大規模ライブラリの（例えば、ＣＰＥ及びＣＰＳによる）生成に加えて、アッセイ溶液中に使用する好適なイオン（適切なｐＫａを有するもの）を見付けることに労力を注ぐべきであると考えられる。さらに、好適なイオンがない場合、スクリーニングの効率が低く、高活性の変異体が見付かる可能性が低下することが考えられる。結果的に、好適なイオンなしに同じ数の高活性の変異体を得るためには、複数回のスクリーニングラウンドが必要となり得る。
アッセイ溶液中のイオンはアッセイ溶液の構成成分からインサイチューで形成されてもよく、又はアッセイ溶液に直接含められてもよい。例えば、空気からＣＯ2をアッセイ溶液に溶解させて炭酸イオン及び重炭酸イオンを提供してもよい。別の例では、リン酸二水素ナトリウムをアッセイ溶液に添加してリン酸二水素イオンを提供してもよい。
アッセイ溶液中におけるこの構成成分の濃度は（第１の又は正常生理条件下のアッセイ及び第２の又は異常条件下のアッセイの両方について）、ヒトなどの哺乳類の天然に存在する体液中で典型的に見られる同じ構成成分の濃度と同じ又は実質的に同じであってもよい。他の実施形態において、構成成分の濃度は、特に変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するように機能し得るイオンである構成成分の場合にはより高くてもよく、これは、かかるイオンの濃度が高いほど変異ポリペプチド及びその結合パートナーとのイオン結合が形成され、事実上結合が促進されて、より多くのヒット又は候補条件的活性型ポリペプチドが見付かる可能性が高まり得ることが観察されているためである。
一部の実施形態において、アッセイ溶液中のイオン濃度は、特に正常生理的濃度を超える濃度が用いられる場合に、アッセイを用いてより多くのヒットが見付かる可能性と正の相関があり得る。例えば、ヒト血清は約１５～３０ｍＭの重炭酸イオン濃度を有する。一例において、アッセイ溶液中の重炭酸イオン濃度を３ｍＭから１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ及び１００ｍＭに増加させたとき、重炭酸塩濃度が増加する毎にアッセイにおけるヒットの数もまた増加した。これを踏まえると、アッセイ溶液には、約３ｍＭ～約２００ｍＭ、又は約５ｍＭ～約１５０ｍＭ又は約５ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１００ｍＭ又は約２０ｍＭ～約１００ｍＭ又は約２５ｍＭ～約１００ｍＭ又は約３０ｍＭ～約１００ｍＭ又は約３５ｍＭ～約１００ｍＭ又は約４０ｍＭ～約１００ｍＭ又は約５０ｍＭ～約１００ｍＭの範囲の重炭酸塩濃度を用いることができる。
別の実施形態において、アッセイ溶液中のクエン酸塩濃度は、約３０μＭ～約１２０μＭ、又は約４０μＭ～約１１０μＭ、又は約５０μＭ～約１１０μＭ、又は約６０μＭ～約１００μＭ、又は約μＭ～約９０μＭ、又は約μＭであり得る。
一実施形態において、正常生理条件は７．２～７．６の範囲の正常生理的ｐＨであり、異常条件は５．５～７．２、６～７、又は６．２～６．８の範囲の異常ｐＨである。正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は正常生理的ｐＨ及び５０ｍＭの重炭酸イオンを有する。異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は異常ｐＨ及び５０ｍＭの重炭酸イオンを有する。重炭酸イオンのｐＫａは約６．４であるため、重炭酸イオンは、ｐＨ ｐｆ６．０～６．４、例えばｐＨ６．０又は６．２の異常ｐＨで変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助することができる。
さらに別の実施形態において、正常生理条件は７．２～７．６の範囲の正常生理的ｐＨであり、及び異常条件は５．５～７．２、６～７、又は６．２～６．８の範囲の異常ｐＨである。正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は正常生理的ｐＨ及び８０μＭのクエン酸イオンを有する。異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は異常ｐＨ及び８０μＭのクエン酸イオンを有する。クエン酸イオンはｐＫａが６．４であるため、クエン酸イオンは、ｐＨ６．０～６．４の異常条件のアッセイ溶液中で変異ポリペプチドと結合パートナーとの間の結合を有効に補助することができる。従って、ｐＨ６．０～６．４の条件下でより高い結合活性を有し且つ７．２～７．８のｐＨ条件下でより低い活性を有する候補条件的活性型ポリペプチドがより多く同定され得る。酢酸塩、ヒスチジン、重炭酸塩、ＨＡＴＰ及びＨＡＤＰを含めた他のイオンも同様に機能し、こうしたイオンを含有するアッセイ溶液によって、イオンのｐＫａ前後のｐＨでより高い結合活性を有し且つイオンのｐＫａと異なるｐＨ（例えば正常生理的ｐＨ）でより低い結合活性を有する変異ポリペプチドを有効にスクリーニングすることが可能となる。
さらに別の実施形態において、正常生理条件は３７℃の正常生理的温度であり、異常条件は３８～３９℃の異常温度（一部の腫瘍微小環境における温度）である。正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は正常生理的温度及び２０ｍＭの重炭酸イオンを有する。異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は異常温度及び２０ｍＭの重炭酸イオンを有する。
さらに別の実施形態において、正常生理条件は正常ヒト血清中の電解質の特定の濃度であり、異常条件は、動物又はヒトにおいて異なる位置に存在し得るか又はヒト血清中の正常生理的電解質濃度を変化させる動物又はヒトの状態によって生じ得る異なる異常な濃度である同じ電解質の濃度である。
変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーの間の結合にはまた、幾つもの他の方法で影響を与えることができる。典型的には、この影響は、アッセイ溶液に１つ以上の追加的な構成成分を含めることによって及ぼされ得る。これらの追加的な構成成分は、変異ポリペプチド、結合パートナーのいずれか一方又は両方と相互作用するように設計され得る。加えて、これらの追加的な構成成分は、２つ以上の相互作用の組み合わせ並びに２つ以上のタイプの相互作用の組み合わせを用いて結合に影響を与え得る。
一実施形態において、目的の結合相互作用は抗体と抗原との間である。この実施形態では、１つ以上の追加的な構成成分をアッセイ溶液に含めることにより、抗体、抗原又は両方に影響を及ぼし得る。このようにして、所望の結合相互作用を増強し得る。
変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとイオン結合を形成して変異ポリペプチドと結合パートナーとの間の結合を補助し得るイオンに加え、本発明はまた、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するために利用し得る他の構成成分も含む。一実施形態では、変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーと水素結合を形成し得る分子を利用し得る。別の実施形態では、変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの疎水性相互作用能を有する分子を使用し得る。さらに別の実施形態では、変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとのファンデルワールス相互作用能を有する分子が企図される。
本明細書で使用されるとき、用語「水素結合」は、炭素、窒素、酸素、硫黄、塩素、又はフッ素などの電気陰性原子に共有結合的に結合した水素（水素結合供与体）と、窒素、酸素、硫黄、塩素、又はフッ素などの電子供与原子の非共有電子対（水素結合受容体）との間の比較的弱い非共有結合性の相互作用を指す。
変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの水素結合形成能を有する構成成分には、極性結合を伴う有機分子並びに無機分子が含まれる。変異ポリペプチド及び／又は変異ポリペプチドの結合パートナーは、典型的には、水素結合を形成し得るアミノ酸を含有する。好適なアミノ酸は、水素結合形成能を有する極性基を備えた側鎖を有する。好適なアミノ酸の非限定的な例としては、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ） アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
これらのアミノ酸は水素供与体及び水素受容体の両方として機能し得る。例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒに見られ得るような－ＯＨ基の酸素原子、Ｇｌｕ及びＡｓｐに見られ得るような－Ｃ＝Ｏ基の酸素原子、Ｃｙｓ及びＭｅｔに見られ得るような－ＳＨ基又は－ＳＣ－の硫黄原子、Ｌｙｓ及びＡｒｇに見られ得るような－ＮＨ3 +基の窒素原子、並びにＴｒｐ、Ｈｉｓ及びＡｒｇに見られ得るような－ＮＨ－基の窒素原子は、全て水素受容体として機能し得る。また、このリスト中の基で水素原子を含むもの（例えば－ＯＨ、－ＳＨ、ＮＨ3 +及び－ＮＨ－）は水素供与体としても機能し得る。
一部の実施形態では、変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーの骨格もまた、１つ以上の水素結合の形成に関与し得る。例えば、骨格は、ペプチド結合にあるように、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－の反復構造を有し得る。この構造の酸素及び窒素原子が水素受容体として機能し得る一方、水素原子が水素結合に関与し得る。
水素結合に用いられ得る水素又は酸素原子が関わる少なくとも１つの極性結合を有する無機化合物としては、例えば、Ｈ2Ｏ、ＮＨ3、Ｈ2Ｏ2、ヒドラジン、炭酸塩、硫酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。アルコール類；フェノール類；チオール類；脂肪族アミン類、アミド類；エポキシド類、カルボン酸類；ケトン類、アルデヒド類、エーテル類、エステル類、有機塩化物、及び有機フッ素などの有機化合物。水素結合を形成し得る化合物は、例えば、“Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｏｎｄ，”Ｌｉｎｕｓ Ｐａｕｌｉｎｇ，Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９４０，ｐａｇｅｓ ２８４～３３４で考察されているものなど、化学文献において周知である。
一部の実施形態において、アルコール類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、１－ヘキサノール、２－オクタノール、ｌ－デカノール、シクロヘキサノール、及び高級アルコール類；ジオール類、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ジエチレングリコール、及びポリアルキレングリコール類を挙げることができる。好適なフェノール類としては、ヒドロキノン、レソルシノール、カテコール、フェノール、ｏ－、ｍ－、及びｐ－クレゾール、チモール、α及びβ－ナフトール、ピロガロール、グアヤコール、及びフロログルシノールが挙げられる。好適なチオール類としては、メタンチオール、エタンチオール、１－プロパンチオール、２－プロパンチオール、ブタンチオール、ｔｅｒｔ－ブチルメルカプタン、ペンタンチオール類、ヘキサンチオール、チオフェノール、ジメルカプトコハク酸、２－メルカプトエタノール、及び２－メルカプトインドールが挙げられる。好適なアミン類としては、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、ジメチルアミン及びメチルエチルアミン、トリメチルアミン、アジリジン、ピペリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ベンジジン、シクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｏ－、ｍ－、及びｐ－トルイジン及びＮ－フェニルピペリジンが挙げられる。好適なアミド類としては、エタンアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド及びＮ－メチル－Ｎ－ｐ－シアノエチルホルムアミドが挙げられる。エポキシド類としては、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、スチレンオキシド、エポキシドグリシドール、シクロヘキセンオキシド、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド又はエチルベンゼンヒドロペルオキシド、イソブチレンオキシド、及び１，２－エポキシオクタンを挙げることができる。カルボン酸類としては、テレフタル酸、イソフタル酸、フタル酸、サリチル酸、安息香酸、酢酸、ラウリン酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、アクリル酸、グリシン、ヘキサヒドロ安息香酸、ｏ－、ｍ－、及びｐ－トルイル酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、及びパラアミノ安息香酸を挙げることができる。ケトン類としては、アセトン、３－プロパノン、ブタノン、ペンタノン、メチルエチルケトン、ジイソブチルケトン、エチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルｔｅｒｔ－ブチルケトン、シクロヘキサノン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルブチルケトン、メチルアミルケトン、メチルヘキシルケトン、ジエチルケトン、エチルブチルケトン、ジプロピルケトン、ジイソブチルケトン、ジアセトンアルコール、ホロン、イソホロン、シクロヘキサノン、メチルシクロヘキサノン、及びアセトフェノンを挙げることができる。アルデヒド類としては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、イソブチルアルデヒド（ｓｏｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、バレルアルデヒド、オクトアルデヒド、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、シクロヘキサノン、サリチルアルデヒド、及びフルフラールを挙げることができる。エステル類としては、酢酸エチル、酢酸メチル、ギ酸エチル、酢酸ブチル、乳酸エチル、酪酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸アミル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸アミル、酢酸メチルイソアミル、酢酸メトキシブチル、酢酸ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸アミル、酪酸メチル、酪酸エチル、酪酸ブチル、酪酸アミル、アセト酢酸メチル、及びアセト酢酸エチルが挙げられる。本発明で用い得るエーテル類としては、ジメチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、及びジメトキシエタンが挙げられる。エーテル類は、エチレンオキシド、テトラヒドロフラン、及びジオキサンなど、環状であってもよい。
有機塩化物としては、クロロホルム、ペンタクロロエタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、四塩化炭素、テトラクロロメタン、テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、及び二塩化エチレンが挙げられる。有機フッ素としては、フルオロメタン、ジフルオロメタン、トリフルオロメタン、トリフルオロエタン、テトラフルオロエタン、ペンタフルオロエタン、ジフルオロプロパン、トリフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ペンタフルオロプロパン、ヘキサフルオロプロパン、及びヘプタフルオロプロパンを挙げることができる。
水素結合は結合の強度によって、強い、中程度の、又は弱い水素結合に分類することができる（Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｇｅｏｒｇｅ Ａ．；Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）。強い水素結合は、２．２～２．５Åの供与体－受容体距離及び１４～４０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のエネルギーを有する。中程度の水素結合は、２．５～３．２Åの供与体－受容体距離及び４～１５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のエネルギーを有する。弱い水素結合は、３．２～４．０Åの供与体－受容体距離及び＜４ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のエネルギーを有する。水素結合の幾つかの例は、エネルギーレベルと共に、Ｆ－Ｈ・・・：Ｆ（３８．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｏ－Ｈ・・・：Ｎ（６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｏ－Ｈ・・・：Ｏ（５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｎ－Ｈ・・・：Ｎ（３．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びＮ－Ｈ・・・：Ｏ（１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である。さらに詳しくは、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｏｎｇ”ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４８，ｐａｇｅｓ ５１１－５４４，１９９７；Ｇｕｔｈｒｉｅ，“Ｓｈｏｒｔ ｓｔｒｏｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｓ：ｃａｎ ｔｈｅｙ ｅｘｐｌａｉｎ ｅｎｚｙｍｉｃ ｃａｔａｌｙｓｉｓ？”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｒｃｈ １９９６，３：１６３－１７０を参照のこと。
一部の実施形態において、本発明に用いられる構成成分は変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーと強い水素結合を形成することができる。これらの構成成分は、高い電気陰性度の原子を有する傾向がある。最も高い電気陰性度を有することが知られる原子は、順にＦ＞Ｏ＞Ｃｌ＞Ｎである。従って、本発明は好ましくは、水素結合の形成において、フッ素、ヒドロキシル基又はカルボニル基を含む有機化合物を使用する。一実施形態では、強い水素結合を形成するため本発明において有機フッ素を使用し得る。
別の実施形態において、変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの疎水性相互作用能を有する構成成分が利用される。かかる構成成分には、疎水基を有する有機化合物が含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「疎水性相互作用」は、疎水性化合物又は化合物の疎水性領域と別の疎水性化合物又は他の化合物の疎水性領域との間の可逆的引力相互作用を指す。この種の相互作用については、“Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ａ．Ｂｅｎ－Ｎａｉｒｎ（１９８０），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
疎水性材料は、その非極性の性質のため、水分子の反発力を受ける。水溶液中の比較的非極性の分子又は基が水よりむしろ他の非極性分子と会合するとき、それは「疎水性相互作用」と呼ばれる。
変異ポリペプチド及びその結合パートナーは、典型的には、疎水性相互作用能を有するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的には、疎水性相互作用能を有する非極性基を有する少なくとも１つの側鎖を有することによって特徴付けられ得る。疎水性アミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、程度は小さいが、メチオニン（Ｍｅｔ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの疎水性相互作用能を有する構成成分には、疎水性分子又は少なくとも１つの疎水性部分を含有する分子である有機化合物が含まれる。一部の実施形態において、これらの疎水性構成成分は、芳香族炭化水素、置換芳香族炭化水素、多環芳香族炭化水素、芳香族又は非芳香族複素環、シクロアルカン類、アルカン類、アルケン類、及びアルキン類から選択される炭化水素であり得る。疎水基には、芳香族基、アルキル、シクロアルキル、アルケニル及びアルキニル基が含まれ得る。用語「アルキル」、「アルケニル」及び「アルキニル」は、本明細書で使用されるとき、直鎖アルケニル／アルキニル基、分枝鎖アルケニル／アルキニル基、シクロアルケニル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルケニル／アルキニル基を含めた、１～３０個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基を指す。かかる炭化水素部分はまた、１つ以上の炭素原子上で置換されていてもよい。
疎水性相互作用の強度は、互いに相互作用し得る利用可能な「疎水性物質」の量に基づくことが理解され得る。従って、疎水性相互作用は、例えば、疎水性相互作用に関わる分子中の疎水性部分の量及び／又は「疎水性」の性質を増加させることにより調整し得る。例えば、疎水性部分（その本来の形態では炭化水素鎖を含み得る）を修飾して、その炭素骨格の炭素の１つに疎水性側鎖を付加することによってその疎水性（その部分が関与する疎水性相互作用の強度を増加させる能力）を増加させることができる。本発明の好ましい実施形態において、これは、例えば様々なステロイド化合物及び／又はそれらの誘導体、例えばステロール系化合物、より詳細にはコレステロールを含めた様々な多環式化合物の付加を含み得る。一般に、側鎖は、直鎖、芳香族、脂肪族、環式、多環式、又は当業者によって企図されるとおりの他の任意の様々なタイプの疎水性側鎖であってよい。
変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとのファンデルワールス相互作用能を有するタイプの構成成分は、必ずしもというわけではないが、通常は、極性部分を有する化合物である。本明細書で使用されるとき、「ファンデルワールス相互作用」は、双極子間相互作用及び／又は量子動力学の結果としての隣接する原子、部分、又は分子の変動する極性の相互関係によって生じる原子間、部分間、分子間、及び表面間の引力を指す。
本発明におけるファンデルワールス相互作用は、変異ポリペプチド又は結合パートナーと構成成分との間の引力である。ファンデルワールス相互作用は３つの供給源から生じ得る。第一に、一部の分子／部分が、電気的には中性であっても、永久電気双極子であり得る。一部の分子／部分の構造における電子電荷分布の固定的な歪みのため、分子／部分の片側が常に幾らか正であり、反対側が幾らか負である。かかる永久双極子が互いに整列しようとする傾向により、正味の引力がもたらされる。これが２つの永久双極子の間の相互作用（ケーソム力）である。
第二に、永久双極子である分子の存在は、他の隣接する極性又は非極性分子の電子電荷を一時的に歪ませ、それによってさらなる分極を誘起し得る。永久双極子が隣接する誘起双極子と相互作用することによって追加的な引力が生じる。これは永久双極子と対応する誘起双極子との間の相互作用であり、デバイ力と称され得る。第三に、関与する分子が永久双極子でないとしても（例えば有機液体ベンゼン）、分子における２つの瞬間的に誘起される双極子によって分子間に引き付ける力は存在する。これは２つの瞬間的に誘起される双極子間の相互作用であり、ロンドン分散力と称され得る。
変異ポリペプチド及び／又は結合パートナーには、ファンデルワールス相互作用能を有するアミノ酸が多数ある。これらのアミノ酸は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）を含め、極性側鎖を有し得る。これらのアミノ酸はまた、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）を含め、非極性基を有する側鎖も有し得る。
変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとのファンデルワールス相互作用能を有する構成成分には、アッセイ溶液に可溶性の極性又は非極性無機化合物が含まれる。アッセイ溶液は概して水溶液であり、従ってこれらの極性又は非極性無機化合物は、好ましくは水に可溶性である。ファンデルワールス相互作用に好ましい材料は、双極子間相互作用能を有するような極性のものである。例えばＡｌＦ3は極性Ａｌ－Ｆ結合を有し、水に可溶性である（２０℃で約０．６７ｇ／１００ｍｌ水）。ＨｇＣｌ2は極性Ｈｇ－Ｃｌ結合を有し、２０℃で７．４ｇ／１００ｍｌで水に可溶性である。ＰｒＣｌ2は極性Ｐｒ－Ｃｌ結合を有し、２０℃で約１ｇ／１００ｍｌで水に可溶性である。
ファンデルワールス相互作用能を有する好適な極性化合物としては、アルコール類、チオール類、ケトン類、アミン類、アミド類、エステル類、エーテル類、及びアルデヒド類が挙げられる。これらの化合物の好適な例は、水素結合に関連して上記に記載している。ファンデルワールス相互作用能を有する好適な非極性化合物としては、芳香族炭化水素、置換芳香族炭化水素、多環芳香族炭化水素、芳香族又は非芳香族複素環、シクロアルカン類、アルカン類、アルケン類、アルキン類が挙げられる。
水素結合構成成分、疎水性構成成分及びファンデルワールス構成成分を利用して、幾つもの方法で変異ポリペプチドとその結合パートナーとの結合に影響を与えることができる。一実施形態では、水素結合、疎水性相互作用及び／又はファンデルワールス相互作用によって変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間に架橋が形成され得る。かかる架橋は変異ポリペプチドと結合パートナーとを互いに近接させて結合を促進し、及び／又は変異ポリペプチド及び／又は結合パートナーを互いに対して結合を促進するような位置に置き得る。
別の実施形態において、水素結合及び／又は疎水性相互作用は、例えば、結合可能性が増加する形でポリペプチド及び結合パートナーを互いに集合又は会合させることにより、変異ポリペプチドがその結合パートナーに結合する可能性を増加させ得る。従って、これらの相互作用のうちの１つ以上を単独で又は組み合わせて用いることで、例えば、結合部位が互いのより近くに引き寄せられるようにするか、又は分子の非結合部分を互いに離して配置し、それによって結合部位を互いのより近くに位置させることにより、変異ポリペプチド及び結合パートナーを互いにより近接して集合させ、又は変異ポリペプチド及び結合パートナーを結合が促進される形で配置し得る。
なおも別の実施形態において、水素結合及び／又は疎水性相互作用は変異ポリペプチド及び／又はその結合パートナーのコンホメーションに影響を与えて、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの結合の一層の助けとなるコンホメーションをもたらし得る。具体的には、変異ポリペプチド及び／又は結合パートナーのアミノ酸の１つ以上との結合又は相互作用により、変異ポリペプチド又は結合パートナーにおける変異ポリペプチド／結合パートナー結合反応に有利な１つ以上のコンホメーション変化が生じ得る。
本発明は２つのアッセイペアを実施し、１つは、正常生理条件における変異ポリペプチドの由来となった元の親ポリペプチドと比較したときの正常生理条件でのアッセイにおける変異ポリペプチドの活性の低下を求めるものであり、及び第２のアッセイは、異常条件における変異ポリペプチドの由来となった元の親ポリペプチドと比較したときの異常条件下でのアッセイにおける変異ポリペプチドの活性の増加を求めるものである。
本発明のアッセイペアで用いられる条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス、電解質濃度及びアッセイ溶液又は媒体の任意の他の構成成分の濃度から選択され得る。従って、アッセイ媒体の特定の構成成分は、アッセイの両方のペアにおいて実質的に同じ濃度で用いられ得る。そのような場合、構成成分は典型的には、血清、腫瘍微小環境、滑液環境、神経環境又は投与ポイントで直面し得るか、投与された治療が通過し得るか、若しくは治療ポイントで直面し得る任意の他の環境など、ヒト又は動物における特定の環境を模擬する目的で存在する。これらの環境を模擬する１つ以上の構成成分の選択の重要な一側面は、それによってアッセイペアを用いて実施される選択プロセスの結果が向上し得ることである。例えば、特定の環境を模擬することにより、選択過程において当該環境の特定の構成成分が変異ポリペプチドに及ぼす様々な効果を評価することが可能となる。特定の環境の構成成分は、例えば、変異ポリペプチドを変化させ、又はそれと結合し、変異ポリペプチドの活性を阻害し、変異ポリペプチドを不活性化するなどし得る。
一部の実施形態において、アッセイ溶液の１つ以上の構成成分は、好ましくは、二硫化物、硫化水素、ヒスチジン、ヒスタミン、クエン酸塩、重炭酸塩、乳酸塩、及び酢酸塩などの小化合物である。一実施形態において、小分子構成成分は、好ましくはアッセイ溶液中に約１００μｍ～約１００ｍＭ、又はより好ましくは約０．５～約５０ｍＭ、又は約１～約１０ｍＭの濃度で存在する。
アッセイ溶液中の構成成分の濃度は、ヒトなどの哺乳類の天然に存在する体液中に典型的に見られる同じ構成成分の濃度と同じ又は実質的に同じであってもよい。これは、体液中の構成成分の正常生理的濃度と称することができる。他の実施形態において、アッセイ溶液中の特定の構成成分の濃度は、ヒトなどの哺乳類の天然に存在する体液中に典型的に見られる同じ構成成分の濃度より低くてもよく、又はそれより高くてもよい。
別の実施形態において、構成成分は、アッセイペアの各々で実質的に異なる濃度で存在し得る。そのような場合、正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液と異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液とを区別する条件であるのは構成成分の濃度であるため、構成成分の存在、非存在又は濃度が、アッセイされる条件となる。従って、本発明の方法のこの実施形態によって作製される条件的活性型ポリペプチドは、構成成分の濃度に少なくとも部分的に依存する活性に関して選択され得る。
一部の実施形態において、構成成分はアッセイ溶液の一方のペアに存在し、しかしアッセイ溶液の他方のペアには全く存在しなくてもよい。例えば、異常条件のアッセイ溶液中の乳酸塩濃度が、腫瘍微小環境の乳酸塩濃度を模擬するレベルに設定されてもよい。乳酸塩は、正常生理条件のアッセイ溶液のペアには存在しなくてもよい。
一実施形態において、正常生理条件は正常生理条件を代表する第１の乳酸塩濃度であり、異常条件は、体内の特定の位置に存在する異常条件を代表する第２の乳酸塩濃度である。
別の例において、腫瘍微小環境に見られ得るようにグルコースが存在しないことを模擬するため、異常条件のアッセイ溶液中にグルコースが存在しなくてもよく、一方、正常生理条件のアッセイ溶液のペアにおいては、グルコースは血漿グルコース濃度を模擬するレベルに設定されてもよい。この特徴を用いると、条件的活性型ポリペプチドを輸送中には不活性又は最小限の活性で位置又は環境に優先的に送達し、異常条件のアッセイ溶液中の構成成分の濃度が存在する環境に到達したときに条件的活性型ポリペプチドを活性化させることができる。
例えば、腫瘍微小環境は典型的には、ヒト血清と比較して低いグルコース濃度及び高い乳酸塩濃度の両方を有する。グルコースの正常生理的濃度は血清中で約２．５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲である。他方で、腫瘍微小環境ではグルコース濃度は０．０５ｍＭ～０．５ｍＭの範囲で典型的には極めて低い。一実施形態において、正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約２．５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲のグルコース濃度を有し、異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約０．０５ｍＭ～約０．５ｍＭの範囲のグルコース濃度を有する。このように作製された条件的活性型ポリペプチドは、低グルコース環境（腫瘍微小環境中）では高グルコース環境（正常組織又は血液中）よりも高い活性を有する。この条件的活性型ポリペプチドは腫瘍微小環境において機能性であるが、血流を通過中は低い活性を有し得る。
血清中の乳酸塩の正常生理的濃度は約１ｍＭ～約２ｍＭの範囲である。他方で、腫瘍微小環境では乳酸塩濃度は典型的には１０ｍＭ～２０ｍＭの範囲である。一実施形態において、正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約１ｍＭ～約２ｍＭの範囲の乳酸塩濃度を有し、異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約１０ｍＭ～約２０ｍＭの範囲の乳酸塩濃度を有する。このように作製された条件的活性型ポリペプチドは、高乳酸塩濃度環境（腫瘍微小環境中）では低乳酸塩環境（正常組織又は血液中）よりも高い活性を有する。従ってこの条件的活性型ポリペプチドは腫瘍微小環境において機能性であるが、血流を通過中は低い活性を有し得る。
同様に、筋肉痛では乳酸塩の濃度が正常より高い（異常である）ことが知られている。従って、筋肉痛環境で活性となり得る変異ポリペプチドを探すとき、異常条件のアッセイペアはより高い濃度の乳酸塩の存在下で実施して筋肉痛環境を模擬することができ、一方、正常生理条件のアッセイペアは、より低い濃度の乳酸塩で、又は乳酸塩の非存在下で実施することができる。このようにして、筋肉痛環境において乳酸塩濃度の増加に伴い活性が向上する変異ポリペプチドを選択することができる。かかる条件的活性型ポリペプチドは、例えば抗炎症剤として有用であり得る。
別の実施形態において、アッセイ溶液の両方のペアに２つ以上の構成成分を使用し得る。このタイプのアッセイでは、条件的活性型ポリペプチドは、上記に記載した２つのタイプのアッセイの両方の特徴を用いて選択し得る。或いは、２つ以上の構成成分を用いて条件的活性型ポリペプチドの選択性を増加させることができる。例えば、腫瘍微小環境に戻ると、異常条件のアッセイペアは、高乳酸塩濃度及び低グルコース濃度の両方を備えるアッセイ媒体で実施することができ、一方、対応する正常生理条件のアッセイペアは、比較的低い乳酸塩濃度及び比較的高いグルコース濃度の両方を備えるアッセイ媒体で実施することができる。
本発明は、無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される各構成成分を単独で又は組み合わせで用いて、構成成分のある濃度において同じ構成成分の異なる濃度と比べて活性が高い条件的活性型ポリペプチドを選択し得ることを企図する。
正常環境（正常生理条件）と異常環境（異常条件）とを区別する条件として１つ以上の代謝産物の異なる濃度に頼るアッセイは、血漿中よりも腫瘍微小環境中で活性が高い条件的活性型ポリペプチドの選択に特に好適となることができ、なぜなら腫瘍微小環境は典型的には、血漿中の同じ代謝産物の濃度と比較して異なる濃度を有する代謝産物を数多く有するためである。
Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”ＮＭＲ ＩＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．２－１２，１９９７は、正常脳及び脳腫瘍における代謝産物を比較した。このグループは、Ｎ－アセチルアスパラギン酸が正常脳では５０００～６０００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では僅か３００～４００μＭ、星状細胞腫では１５００～２０００μＭ、及び未分化星状細胞腫では６００～１５００μＭであることを発見した。さらに、イノシトールは正常脳では１５００～２０００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では２５００～４０００μＭ、星状細胞腫では２７００～４５００μＭ、及び未分化星状細胞腫では３８００～５８００μＭである。ホスホリルエタノールアミンは正常脳では９００～１２００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では２０００～２８００μＭ、星状細胞腫では１１７０～１３７０μＭ、及び未分化星状細胞腫では１５００～２５００μＭである。グリシンは正常脳では６００～１１００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では４５００～５５００μＭ、星状細胞腫では７５０～１１００μＭ、及び未分化星状細胞腫では１９００～３５００μＭである。アラニンは正常脳では７００～１１５０μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では２９００～３６００μＭ、星状細胞腫では８００～１２００μＭ、及び未分化星状細胞腫では３００～７００μＭである。これらの代謝産物はまた、血中で異なる濃度を有することもあり、例えば、Ｎ－アセチルアスパラギン酸は血中で約８５０００μＭの濃度を有し；イノシトールは血中で約２１７００μＭの濃度を有し；グリシンは血中で約２２０～４００μＭの濃度を有し；アラニンは血中で約２２０～３００μＭの濃度を有する。
従って、これらの代謝産物は、少なくともＮ－アセチルアスパラギン酸、イノシトール、グリシン及びアラニンを含め、脳腫瘍で活性であるが血中又は正常脳組織では活性でない条件的活性型ポリペプチドを選択するためアッセイ溶液中において異なる濃度で使用し得る。例えば、膠芽腫の腫瘍微小環境で活性であるが、血中又は正常脳組織では活性でないか又は少なくとも活性が低い条件的活性型ポリペプチドを選択するため、Ｎ－アセチルアスパラギン酸が８５０００μＭの濃度のアッセイ溶液を正常生理条件下のアッセイペアに用いてもよく、Ｎ－アセチルアスパラギン酸が３５０μＭの濃度のアッセイ溶液を異常条件下のアッセイペアに用いてもよい。
Ｍａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｒｅ ａｎ ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１１９３－１１９８，２０１４は、膵臓の患者の診断前血漿中における分枝鎖アミノ酸を含む種々の異なる代謝産物の濃度を調べた。膵腫瘍患者には、膵癌を有しないヒトの血中における同じ代謝産物の濃度と比べて血流中に異なる濃度で存在する幾つかの代謝産物があることが分かった。Ｍａｙｅｒｓらはまた、膵癌患者が正常対象と比較してその血漿中に分枝アミノ酸の有意な上昇を有することも見出した。高濃度で存在する分枝アミノ酸には、イソロイシン、ロイシン及びバリンが含まれる（Ｍａｙｅｒｓらの表１）。正常な健常ヒトと比べて膵癌患者の血漿中で有意に異なる濃度で存在するＭａｙｅｒｓの図１に示される他の代謝産物がある。これらの代謝産物には、少なくともアセチルグリシン、グリシン、フェニルアラニン、チロシン、２－アミノアジピン酸、タウロデオキシコール酸塩／タウロケノデオキシコール酸塩、アコニット酸塩、イソクエン酸塩、乳酸塩、ａ－グリセロリン酸塩及び尿酸塩が含まれる。従って、特定の代謝産物が膵癌患者と正常な健常患者との血漿中において異なる濃度で存在するという知見に基づけば、膵癌の腫瘍微小環境もまたこれらの代謝産物に関して健常患者の膵臓微小環境に存在し得るものと異なる濃度を有するであろうことを予測し得る。
従って、一実施形態において、これらの代謝産物の１つ以上が、正常生理条件のアッセイ溶液中に、健常人の血漿中におけるこれらの代謝産物の濃度（即ち、それらの代謝産物の正常生理的濃度）を近似する量で用いられ得る。例えば、健常人の血漿中における既知の正常生理的濃度は、イソロイシンについて約１．６０±０．３１ｍｇ／ｄＬ、ロイシンについて約１．９１±０．３４ｍｇ／ｄＬ、及びバリンについて約２．８３±０．３４ｍｇ／ｄＬである。正常生理条件のアッセイ溶液は、これらの分枝アミノ酸の１つ以上のこれらの範囲内の正常生理的濃度を有し得る。異常条件のアッセイ溶液は、対応する分枝アミノ酸の健常人における正常生理的濃度よりも約５倍、又は約１０倍、又は約２０倍、又は約５０倍、又は約７０倍、又は約１００倍、又は約１５０倍、又は約２００倍、又は約５００倍高い濃度の同じ分枝アミノ酸を有し得る。これは、Ｍａｙｅｒｓらによって見出された血漿中に見られるこれらの分枝アミノ酸のより高い濃度は腫瘍微小環境から生じて血流中で希釈されるため、Ｍａｙｅｒｓらの知見に基づけば膵腫瘍微小環境でこれらの分枝アミノ酸の濃度が有意に上昇していると予想され得ることを反映したものであり得る。同様に、異常条件下でのアッセイは、特定の代謝産物の濃度が正常な個体と比べて癌患者で有意に低かったとしても、膵癌患者の血中の他の代謝産物の濃度を反映するものであってよい。このようにして、スクリーニングが実際の環境を模擬し、それによって当該の特定の環境について最も高い活性の変異体が選択されることを確実にし得る。
一部の他の実施形態において、正常生理条件のアッセイ溶液は、膵癌患者の血漿中の濃度を模擬してこれらの患者の実際の血漿環境を模擬する濃度の１つ以上の分枝アミノ酸を含み得る。かかる実施形態において、異常条件のアッセイ溶液は、膵癌患者の血漿中における対応する分枝アミノ酸の濃度よりも約２倍、又は約３倍、又は約４倍、又は約５倍、又は約７倍、又は約８倍、又は約１０倍、又は約１５倍、又は約２０倍、又は約５０倍高い濃度の同じ分枝アミノ酸を有して、これらのより高い濃度が腫瘍微小環境で起こり、血流中の濃度が腫瘍微小環境の実際の濃度の希釈に相当するという事実を反映し得る。同様に、他の代謝産物もまた、正常生理条件と異常条件とのアッセイ溶液中で異なる濃度を有してもよく、血流に関して収集されたデータから予想される実際の違いを反映し得る。場合によっては、膵臓の患者の血流中に特定の代謝産物の欠損が認められることもあり、その場合、計測された血流中濃度を反映する濃度を正常生理条件のアッセイに用いることができ、さらに低い濃度を異常条件のアッセイに用いて、前記代謝産物が腫瘍微小環境で消費されるものと見込まれるという予想を考慮に入れることができる。このようにアッセイ溶液を用いて選択された条件的活性型ポリペプチドは、膵癌患者の血漿中と比べて膵癌微小環境で活性がより高いものとなり得る。
一部の実施形態では、本発明に膵癌患者の血漿全体を使用し得る。例えば、一実施形態において、正常生理条件下及び異常条件下のアッセイの一方又は両方についてアッセイ溶液に膵癌患者の血漿の１つ以上の構成成分の模擬を用い得る。例示的実施形態において、正常生理条件のアッセイ溶液は７．２～７．６の範囲のｐＨを有し、且つ３０ｗｔ．％の膵癌患者の血漿が添加され、異常条件のアッセイ溶液は６．２～６．８の範囲のｐＨを有し、且つ３０ｗｔ．％の膵癌患者の血漿が添加される。この実施形態において、膵癌患者の血漿は、（１）条件的活性型ポリペプチドがｐＨ７．２～７．６の血中で活性化されないよう確実にすること、及び（２）また、条件的活性型ポリペプチドが膵癌患者の血中に見られるこの代謝産物組成の存在下であっても腫瘍微小環境でｐＨ５．５～７．２、６～７、又は６．２～６．８によって活性化され得るよう確実にすることの両方のために存在する。これにより、治療が膵癌患者に合わせて調整されることになる。
別の例示的実施形態において、正常生理条件のアッセイ溶液は７．２～７．６の範囲のｐＨを有し、且つ３０ｗｔ．％の膵癌患者の血漿が添加され、異常条件のアッセイ溶液は５．５～７．２又は６．２～６．８の範囲のｐＨを有し、且つ膵癌患者の血漿は一切添加されない。
上記で考察した幾つかのタイプのアッセイの各々において、無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される同じ構成成分を使用し得る。例えば、乳酸塩の場合、乳酸塩は、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液のペアにおいて実質的に同じ濃度で使用し得る。正常生理条件と異常条件とは、次には１つ以上の他の側面、例えば、温度、ｐＨ、別の構成成分の濃度等が異なることになる。異なる実施形態において、乳酸塩は正常生理条件と異常条件とを区別する因子の一つとして使用してもよく、それにより、乳酸塩が正常生理条件（非腫瘍微小環境）と比べて異常な腫瘍微小環境でより高い濃度であることを反映し得る。
一部の実施形態において、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液に２つ以上の構成成分が実質的に同じ濃度で添加される。例えば、クエン酸塩及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の両方がこれらのアッセイ溶液に添加される。両方のアッセイ溶液においてクエン酸塩濃度は約８０μＭであってもよく、ＢＳＡ濃度は約１０～２０％であってもよい。より具体的には、正常生理条件下のアッセイペア用のアッセイ溶液は７．２～７．６の範囲のｐＨを有し、クエン酸塩が約８０μＭの濃度及びＢＳＡが濃度約１０～２０％であってもよい。異常条件下のアッセイペア用のアッセイ溶液は６．２～６．８の範囲のｐＨを有し、クエン酸塩が約８０μＭの濃度及びＢＳＡが濃度約１０～２０％であってもよい。
一実施形態では、血清が正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液に実質的に同じ濃度で添加され得る。血清は多数の無機化合物、イオン、有機分子（ポリペプチドを含む）を有するため、アッセイ溶液は、これらの２つのアッセイ溶液間で実質的に同じ濃度で存在する無機化合物、イオン、有機分子から選択される構成成分を複数且つ多数有し得る。アッセイ溶液は、５～３０ｖｏｌ．％、又は７～２５ｖｏｌ．％、又は１０～２０ｖｏｌ．％、又は１０～１５ｖｏｌ．％の血清を有し得る。一部の他の実施形態では、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液が血清を含まない。血清は、ヒト血清、ウシ血清、又は任意の他の哺乳類由来の血清であってもよい。一部の他の実施形態では、アッセイ溶液は血清を含まない。
正常生理条件及び異常条件のアッセイ溶液は異なるｐＨを有し得る。かかるアッセイ溶液のｐＨは、重炭酸塩を使用して緩衝液中のＣＯ2及びＯ2レベルを用いて調整し得る。
一部の他の実施形態において、２つ以上の構成成分のうちの少なくとも一方が、正常生理条件と異常条件とのアッセイ溶液に異なる濃度で添加される。例えば、乳酸塩及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の両方がアッセイ溶液に添加される。乳酸塩濃度は正常生理条件と異常条件とのアッセイ溶液間で異なり得る一方、ＢＳＡは両方のアッセイ溶液で同じ濃度を有し得る。乳酸塩は異常条件のアッセイ溶液で３０～５０ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度及び正常生理条件のアッセイ溶液で８～１５ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度を有してもよい。他方で、ＢＳＡは、約１０～２０％など、両方のアッセイ溶液で同じ濃度を有する。これらのアッセイ溶液を用いることによってこのように選択された条件的活性型ポリペプチドは、ＢＳＡの存在下で８～１５ｍｇ／ｄＬの低乳酸塩濃度と比べて３０～５０ｍｇ／ｄＬの高乳酸塩濃度でより高活性である。
一部の実施形態において、アッセイ溶液は、活性が２つ以上の条件に依存する条件的活性型ポリペプチドを選択するように設計されてもよい。一例示的実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ及び乳酸塩の両方に依存する活性を有し得る。かかる条件的活性型ポリペプチドを選択するためのアッセイ溶液は、正常生理条件について、ｐＨが７．２～７．６、乳酸塩が８～１５ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度のアッセイ溶液であり得る。異常条件のアッセイ溶液は、ｐＨが６．２～６．８、乳酸塩が３０～５０ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度であり得る。任意選択で正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液が、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助して、ひいては候補生物学的活性ポリペプチドのヒット数を増加させるイオンもまた含み得る。
さらに別の例示的実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ、グルコース及び乳酸塩に依存する活性を有し得る。かかる条件的活性型ポリペプチドを選択するためのアッセイ溶液は、正常生理条件について、ｐＨが７．２～７．６、グルコースが２．５～１０ｍＭの範囲の濃度、乳酸塩が８～１５ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度のアッセイ溶液であり得る。異常条件のアッセイ溶液は、ｐＨが６．２～６．８、グルコースが０．０５～０．５ｍＭの範囲の濃度、乳酸塩が３０～５０ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度であり得る。任意選択で正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液が、変異ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助して、ひいてはｐＨ６．２～６．８で結合パートナーに結合する候補生物学的活性ポリペプチドの数を増加させるイオンもまた含み得る。かかるアッセイ溶液を用いて選択された条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ７．２～７．６、グルコース濃度２．５～１０ｍＭ及び乳酸塩濃度８～１５ｍｇ／ｄＬの環境と比べてｐＨ６．２～６．８、グルコース濃度０．０５～０．５ｍＭ及び乳酸塩濃度３０～５０ｍｇ／ｄＬの環境でより高活性である。
無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される２つ以上の構成成分は、選択された条件的活性型ポリペプチドを送達することになる位置／部位（即ち、標的部位）の環境を模擬する異常条件のアッセイ溶液を作り出すためものである。一部の実施形態において、標的部位の環境にある少なくとも３つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよく、又は標的部位の環境にある少なくとも４つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよく、又は標的部位の環境にある少なくとも５つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよく、又は標的部位の環境にある少なくとも６つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよい。
一実施形態において、標的部位（条件的活性型ポリペプチドがより高活性となり得るところ）から採取された体液が異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液として直接使用されてもよい。例えば、対象、好ましくは治療を必要としている関節疾患を有する対象から滑液が採取されてもよい。採取された滑液は、任意選択で希釈され、条件的活性型ポリペプチドを選択するため異常条件のアッセイペアにおけるアッセイ溶液として用いられ得る。採取された滑液を、任意選択で希釈して、異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液、及び正常生理条件下のアッセイ用のヒト血漿を模擬するアッセイ溶液として用いることにより、選択される条件的活性型ポリペプチド（例えば、ＴＮＦ－α）は関節において他の位置又は器官におけるよりも高活性となり得る。例えば、炎症関節（関節炎など）を有する対象はＴＮＦ－αで治療し得る。しかしながら、ＴＮＦ－αは典型的には、他の組織及び器官に損傷を与える重度の副作用を有する。滑液では活性が高いが血中では活性でないか又は活性が低い条件的活性型ＴＮＦ－αは、体の他の部分に対するＴＮＦ－αの副作用を低減し又は潜在的に取り除きながらもＴＮＦ－αの活性を関節に送達し得る。
複数の条件に依存した活性を有する条件的活性型ポリペプチドの開発により、対象の体内の標的部位に対する条件的活性型ポリペプチドの選択性の向上がもたらされることになる。理想的には、条件のうちの一部のみが存在する他の位置では、条件的活性型ポリペプチドは活性でないか、又は少なくとも活性が大幅に低い。一実施形態において、ｐＨ６．２～６．８、グルコース濃度０．０５～０．５ｍＭ及び乳酸塩濃度３０～５０ｍｇ／ｄＬで活性な条件的活性型ポリペプチドは、腫瘍微小環境にはこれらの条件が全て存在するため、腫瘍微小環境に特異的に送達することができる。他の組織又は器官はこれらの条件のうちの１つ又は２つしか存在せず、３つ全ては有しないものであり得るため、この条件的活性型ポリペプチドを他の組織又は器官で完全に活性化させるには不十分である。例えば、運動後の筋肉は６．２～６．８の範囲の低ｐＨを有し得る。しかしながら、それは別のアッセイ条件を有しないものであり得る。従って運動後の筋肉では条件的活性型ポリペプチドは活性でないか、又は少なくとも活性が低い。
一部の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドの活性が、条件的活性型ポリペプチドの選択に用いた条件に本当に依存することを確認する工程が行われ得る。例えば、条件的活性型ポリペプチドは、３つの条件：ｐＨ６．２～６．８、グルコース濃度０．０５～０．５ｍＭ及び乳酸塩濃度３０～５０ｍｇ／ｄＬに依存するように選択される。選択された条件的活性型ポリペプチドは、次にこれらの３つの条件の各々で個別に、及び３つの条件のペアを含む環境で試験され、これらの試験条件又は環境で条件的活性型ポリペプチドが活性でない又は活性が低いことが確認され得る。
一部の実施形態において、血清のある種の構成成分がアッセイ媒体から意図的に最小限に抑えられ、又は除外される。例えば、抗体のスクリーニング時、抗体と結合するか又は抗体を吸着する血清の構成成分をアッセイ媒体中では最小限に抑え、又はそこから除外することができる。かかる結合した抗体は偽陽性を生じ、それによって、条件的活性型ではない、むしろ種々の異なる条件下で単に血清中に存在する構成成分に結合するに過ぎない結合変異抗体が含まれることになり得る。従って、アッセイ中の変異体と潜在的に結合し得る構成成分が最小限に抑えられ又は除外されるようなアッセイ構成成分の慎重な選択を用いることにより、所望の結合パートナー以外のアッセイ中の構成成分に結合するために条件的活性に関して誤って陽性と同定され得る非機能性変異体の数を低減することができる。例えば、ヒト血清中の構成成分と結合する傾向のある変異ポリペプチドをスクリーニングする一部の実施形態では、ヒト血清の構成成分に結合する変異ポリペプチドによって生じる偽陽性の可能性を低減し又は排除するため、アッセイ溶液中にＢＳＡを使用し得る。同じ目標を達成するため詳細な例において他の類似の置き換えもまた行うことができる。
一部の実施形態において、アッセイ条件は、細胞膜の内側、細胞膜上又は細胞膜の外側など、細胞膜近傍の環境、又は関節の環境を模擬する。細胞膜環境におけるスクリーニング時の結合活性に影響を及ぼし得る幾つかの要因としては、受容体の発現、インターナリゼーション、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）力価等が挙げられる。
アッセイのフォーマットは当業者に公知の任意の好適なアッセイであってよい。例としては、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、インビトロ（臓器等）での実組織スクリーニング、組織スライド、全動物、細胞株及び３Ｄシステムの使用が挙げられる。例えば、好適な細胞ベースのアッセイについては国際公開第２０１３／０４０４４５号パンフレットに記載されており、組織ベースのアッセイについては米国特許第７，９９３，２７１号明細書に記載されており、全動物ベースのスクリーニング方法については米国特許出願公開第２０１０／０２６３５９９号明細書に記載されており、３Ｄシステムベースのスクリーニング方法については米国特許出願公開第２０１１／０１４３９６０号明細書に記載されている。
一部の実施形態において、進化工程により、上記で考察した条件的活性特性に加えて他の所望の特性を同時に有し得る変異ポリペプチドを作製し得る。進化させ得る好適な他の所望の特性としては、結合活性、発現、ヒト化等を挙げることができる。従って、本発明を用いて、これらの他の所望の特性のうちの少なくとも１つ以上もまた向上した条件的活性型ポリペプチドを作製し得る。
一部の実施形態において、本発明は条件的活性型ポリペプチドを作製する。選択された条件的活性型ポリペプチドは、例えば第２の進化工程において、本明細書に開示される突然変異誘発技法のうちの１つを用いてさらに変異させることができ、それにより結合活性、発現、ヒト化など、選択された条件的活性型ポリペプチドの別の特性を向上させ得る。この第２の進化工程の後、条件的活性及び向上させた特性の両方に関して変異ポリペプチドをスクリーニングし得る。
一部の実施形態において、親ポリペプチドを進化させて変異ポリペプチドを作製した後、第１の条件的活性型ポリペプチドが選択され、これは（ａ）正常生理条件下でのアッセイにおける親ポリペプチドと比較した第１の活性の低下、及び（ｂ）異常条件下でのアッセイにおける親ポリペプチドと比較した第１の活性の増加、の両方を呈する。次に第１の条件的活性型ポリペプチドが１つ以上の追加的な進化、発現及び選択工程にさらに供され、（１）（ａ）正常生理条件下でのアッセイにおける親ポリペプチドと比較した第２の活性の低下、及び（ｂ）異常条件下でのアッセイにおける親ポリペプチドと比較した第２の活性の増加、の両方を呈するか、又は（２）第１の条件的活性型ポリペプチド及び／又は親ポリペプチドと比較して、異常条件での第１の活性と正常生理条件での第１の活性とのより大きい比を呈する少なくとも第２の条件的活性型ポリペプチドが選択され得る。第２の条件的活性型ポリペプチドは親ポリペプチドと比較して異常条件下でより高い第１の活性及び第２の活性、並びに親ポリペプチドと比較して正常生理条件下でより低い第１の活性及び第２の活性の両方を有し得ることに留意されたい。
特定の実施形態において、本発明は、異常条件（又は第２の条件）での活性と正常生理条件（又は第１の条件）での活性との活性比が大きい（例えば、異常条件と正常生理条件との間での選択性がより大きい）条件的活性型ポリペプチドを作製することを目標とする。異常条件（又は第２の条件）での活性と正常生理条件（又は第１の条件）での活性との比、即ち選択性は、少なくとも約２：１、又は少なくとも約３：１、又は少なくとも約４：１、又は少なくとも約５：１、又は少なくとも約６：１、又は少なくとも約７：１、又は少なくとも約８：１、又は少なくとも約９：１、又は少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１１：１、又は少なくとも約１２：１、又は少なくとも約１３：１、又は少なくとも約１４：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約１６：１、又は少なくとも約１７：１、又は少なくとも約１８：１、又は少なくとも約１９：１、又は少なくとも約２０：１、又は少なくとも約３０：１、又は少なくとも約４０：１、又は少なくとも約５０：１、又は少なくとも約６０：１、又は少なくとも約７０：１、又は少なくとも約８０：１、又は少なくとも約９０：１、又は少なくとも約１００：１であり得る。
一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは抗体であり、これは、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が少なくとも約５：１、又は少なくとも約６：１、又は少なくとも約７：１、又は少なくとも約８：１、又は少なくとも約９：１、又は少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約２０：１、又は少なくとも約４０：１、又は少なくとも約８０：１であり得る。一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドを用いて腫瘍部位が標的化され、ここで条件的活性型ポリペプチドは腫瘍部位（腫瘍微小環境中）で活性であり、且つ非腫瘍部位（正常生理条件）では活性が大幅に低いか又は不活性である。
一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、本明細書の他の部分に開示するものなど、別の薬剤とコンジュゲートされることが意図される抗体である。この条件的活性型抗体は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比がより高いものであり得る。例えば、別の薬剤とコンジュゲートされる条件的活性型抗体は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１１：１、又は少なくとも約１２：１、又は少なくとも約１３：１、又は少なくとも約１４：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約１６：１、又は少なくとも約１７：１、又は少なくとも約１８：１、又は少なくとも約１９：１、又は少なくとも約２０：１であり得る。これは、コンジュゲートする薬剤が例えば毒性又は放射性である場合に、かかるコンジュゲート薬剤は疾患又は治療部位（異常条件が存在するところ）に集中させることが望ましいため、特に重要であり得る。
Ｇ．条件的活性型ポリペプチドの作製
可逆的又は不可逆的活性を有する選択の条件的活性型ポリペプチドは、治療、診断、研究及び関連する目的で作製されることもあり、及び／又は１つ以上の追加の進化及び選択サイクルに供され得る。
条件的活性型ポリペプチドは、ポリペプチド発現細胞産生宿主又は生物を用いて作製し得る。作製プロセスをより効率的にするため、条件的活性型ポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞産生宿主又は生物に対するコドン最適化にかけることができる。コドン最適化についてはこれまでに記載があり、例えば、Ｎａｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｅｒｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ"．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，６９（１２）：７２５０－３には、マウス系におけるコドン最適化が記載される。Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｑｕｉｓｔａｔｉｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２４（１）：１８－２４ には、酵母系におけるコドン最適化が記載される。Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ"Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００ Ｄｅｃ．１９，３９（５０）：１５３９９－４０９ には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコドン最適化が記載される。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ａｔ ｔｈｅ ５'ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０００ Ｎｏｖ．２０（２）：２５２－６４には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてコドンの使用がどのようにタンパク質分泌に影響するかが記載される。
細胞産生宿主は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＩＭ９、ＤＳ－Ｉ、ＴＨＰ－Ｉ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｃ３３ａ、Ａ５４９、Ａ３７５、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＤＵ １４５、ＰＣ－３、ＨＣＴ １１６、Ｍｉａ ＰＡＣＡ－２、ＡＣＨＮ、ジャーカット、ＭＭｌ、Ｏｖｃａｒ ３、ＨＴ １０８０、Ｐａｎｃ－１、Ｕ２６６、７６９Ｐ、ＢＴ－４７４、Ｃａｃｏ－２、ＨＣＣ １９５４、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＬｎＣＡＰ、ＮＲＫ－４９Ｆ、及びＳＰ２／０細胞株；及びマウス脾細胞及びウサギＰＢＭＣからなる群のうちの１つから選択される哺乳類系であってもよい。一実施形態において、哺乳類系はＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞株から選択される。具体的な一態様において、哺乳類系はＣＨＯ－Ｓ細胞株である。別の実施形態において、哺乳類系はＨＥＫ２９３細胞株である。
一部の実施形態において、細胞産生宿主は、酵母細胞系、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞又はピキア属（ｐｉｃｃｈｉａ）酵母細胞である。一部の実施形態において、細胞産生宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞である（Ｏｗｅｎｓ ＲＪ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ ＲＪ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，ｖｏｌ．１６８，ｐ．１４９，１９９４；Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｓ ａｎｄ Ｂｉｒｄ ＲＥ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．２０３，ｐ．８８，１９９１）。条件的活性型ポリペプチドはまた、植物においても作製し得る（Ｆｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．８６１，１９９３）。
条件的活性型ポリペプチドはまた、当該技術分野において周知の化学的方法を用いた合成方法によっても作製し得る。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，“Ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５－２２３，１９８０；Ｈｏｒｎ，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｐａｒｔ ＩＩ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２２ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＩＰ）1”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５－２３２，１９８０；Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ，１９９５を参照のこと。例えば、ペプチド合成は様々な固相技法を用いて実施することができ（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ“Ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ａ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２，１９９５；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ “Ｃｏｎｃｅｐｔ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３－１３，１９９７を参照のこと）、例えばＡＢＩ ４３ ＩＡペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者が提供する指示に従い使用して自動合成を達成してもよい。
固相化学的ペプチド合成方法は１９６０年代初頭から当該技術分野において公知となっており（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，“Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉ．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９－２１５４，１９６３）（また、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１．，ｐｐ．１１－１２も参照のこと））、近年では市販の実験室ペプチド設計及び合成キット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に用いられている。かかる市販の実験室キットは、概して、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｔｏ ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：３９９８，１９８４の教示を利用しており、全てが単一のプレートに結合した多数の「ロッド」又は「ピン」の先端におけるペプチドの合成を提供する。かかるシステムを利用する際は、ロッド又はピンのプレートを逆さにして対応するウェル又はリザーバーの第２のプレートに挿入し、この第２のプレートには、適切なアミノ酸をピン又はロッドの先端に取り付け又は固定するための溶液が入っている。このようなプロセス工程、すなわちロッド及びピンの先端を逆さにして適切な溶液に挿入することを繰り返すことにより、アミノ酸が構築されて所望のペプチドになる。加えて、多くの利用可能なＦＭＯＣペプチド合成システムが利用可能である。例えば、ポリペプチド又はフラグメントのアセンブリは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ４３１ Ａ（商標）自動ペプチドシンセサイザーを使用して固体支持体上で行うことができる。かかる装置は、直接合成か、或いは他の公知の技法を用いてカップリングし得る一連のフラグメントの合成かのいずれかによる本開示のペプチドの容易な入手をもたらす。
条件的活性型ポリペプチドはまた、グリコシル化することもできる。グリコシル化は、化学的に、或いは細胞生合成機構によって翻訳後に加えることができ、ここで細胞生合成機構は、既知のグリコシル化モチーフ（これは配列にとって天然であってもよく、又はペプチドとして加えられるか、若しくは核酸コード配列に加えられてもよい）の利用を取り入れるものである。グリコシル化はＯ結合型又はＮ結合型であり得る。
条件的活性型ポリペプチドには、あらゆる「模倣体」及び「ペプチド模倣体」の形態が含まれる。用語「模倣体」及び「ペプチド模倣体」は、本開示のポリペプチドと実質的に同じ構造的及び／又は機能的特性を有する合成の化学的化合物を指す。模倣体は、完全に合成非天然アミノ酸類似体で構成されてもよく、又は部分的に天然のペプチドアミノ酸と部分的に非天然のアミノ酸類似体とのキメラ分子である。模倣体はまた、置換が模倣体の構造及び／又は活性も実質的に変化させるものでない限り、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を組み込むことができる。保存された変異体である本開示のポリペプチドと同じく、模倣体が本開示の範囲内にあるかどうか、すなわち、その構造及び／又は機能が実質的に改変されないことは、ルーチンの実験によって決定されることになる。
本開示のポリペプチド模倣体組成物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含有し得る。代替的な態様において、本開示の模倣体組成物は、以下の３つの構造基：ａ）天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基；又はｃ）二次構造の模倣を誘導する、すなわちそれにより二次構造、例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックスコンホメーションなどを誘導し又は安定化させる残基のうちの１つ又は全てを含む。例えば、本開示のポリペプチドは、その残基の全て又は一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段によってつなぎ合わされるとき、模倣体として特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学結合又はカップリング手段、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などによってつなぎ合わされ得る。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代わりとなり得る連結基としては、例えば、ケトメチレン（例えば、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－に対する－Ｃ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ2－）、アミノメチレン（ＣＨ2－ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ2Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4－－）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステルが挙げられる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ ２６７－３５７，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
本開示のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全て又は一部の非天然残基を含有することによっても模倣体として特徴付けることができる。非天然残基については、科学文献及び特許文献に十分な記載がなされている；天然アミノ酸残基の模倣体として有用な幾つかの例示的な非天然組成物及び指針は、以下に記載する。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば、Ｄ－又はＬ－ナフィルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ－又はＬ－フェニルグリシン；Ｄ－又はＬ－２チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ－又はＬ－１，－２、３－、又は４－ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ－又はＬ－３チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ－又はＬ－（２－ピリジニル）－アラニン；Ｄ－又はＬ－（３－ピリジニル）－アラニン；Ｄ－又はＬ－（２－ピラジニル）－アラニン；Ｄ－又はＬ－（４－イソプロピル）－フェニルグリシン；Ｄ－（トリフルオロメチル）－フェニルグリシン；Ｄ－（トリフルオロメチル）－フェニルアラニン；Ｄ－ｐ－フルオロ－フェニルアラニン；Ｄ－又はＬ－ｐ－ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ－又はＬ－ｐ－メトキシ－ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ－又はＬ－２－インドール（アルキル）アラニン；及びＤ－又はＬ－アルキルアニン類（ａｌｋｙｌａｎｉｎｅｓ）［ここで、アルキルは、置換又は非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ－イソチル（ｉｓｏｔｙｌ）、イソ－ペンチル、又は非酸性アミノ酸であってもよい］による置換によって作成することができる。非天然アミノ酸の芳香環としては、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、及びピリジル芳香環が挙げられる。
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば、負電荷を維持する一方での非カルボキシル化アミノ酸；（ホスホノ）アラニン；硫酸化スレオニンによる置換によって作成することができる。カルボキシル側基（例えば、アスパルチル又はグルタミル）も、カルボジイミド（Ｒ’～Ｎ－Ｃ－Ｎ－Ｒ’）、例えば、１－シクロヘキシル－３（２－モルホリニル－（４－エチル）カルボジイミド又はｌ－エチル－３（４－アゾニア－４，４－ジメトールペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾することができる。アスパルチル又はグルタミルはまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することもできる。塩基性アミノ酸の模倣体は、例えば、（リジン及びアルギニンに加えて）アミノ酸オルニチン、シトルリン、又は（グアニジノ）酢酸、又は（グアニジノ）アルキル酢酸（ここで、アルキルは、上記に定義される）による置換によって作成することができる。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ部分を含む）は、アスパラギン又はグルタミンを置換することができる。アスパラギニル及びグルタミニル残基は、対応するアスパルチル又はグルタミル残基に対して脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルと、例えば１つ以上の従来の試薬、例えばフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロ－ヘキサンジオン、又はニンヒドリンとの、好ましくはアルカリ性条件下での反応によって作成することができる。チロシン残基模倣体は、チロシルと、例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって作成することができる。Ｎ－アセチルイミジゾール（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基と、例えば２－クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα－ハロ酢酸及び対応するアミン類との反応によって；カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得て作成することができる。システイン残基模倣体はまた、システイニル残基と、例えばブロモ－トリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミドゾイル（ｉｍｉｄｏｚｏｙｌ））プロピオン酸；クロロアセチルリン酸塩、Ｎ－アルキルマレイミド類、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド；メチル２－ピリジルジスルフィド；ｐ－クロロメルクリ安息香酸塩；２－クロロメルクリ－４ニトロフェノール；又はクロロ－７－ニトロベンゾ－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応によって作成することもできる。リジン模倣体は、リシニルと、例えばコハク酸又は他のカルボン酸無水物との反応によって作成することができる（及びアミノ末端残基を改変することができる）。リジン及び他のα－アミノ含有残基模倣体はまた、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ－メチルイソウレア、２，４、ペンタンジオンとの反応、及びグリオキシル酸塩とのトランスアミダーゼ触媒反応によって作成することもできる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって作成することができる。プロリンの模倣体には、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３－又は４－ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３－又は４－メチルプロリン、又は３，３，－ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体は、ヒスチジルと、例えばジエチルプロカーボネート又はパラブロモフェナシルブロミドとの反応によって作成することができる。他の模倣体としては、例えば、プロリン及びリジンのヒドロキシル化；セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニン及びヒスチジンのα－アミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化又はＮ－メチルアミノ酸による置換；又はＣ末端カルボキシル基のアミド化によって作成されるものが挙げられる。
本開示のポリペプチドの残基、例えばアミノ酸はまた、逆のキラリティーのアミノ酸（又はペプチド模倣体残基）によって置換されてもよい。従って、Ｌ－配置（化学的実体の構造に応じてＲ又はＳとも称することができる）で天然に存在する任意のアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸と称されるが、Ｒ型又はＳ型とも称することができる同じ化学構造タイプの、しかし逆のキラリティーのペプチド模倣体のアミノ酸で置換することができる。
本開示はまた、翻訳後プロセシング（例えばリン酸化、アシル化等）などの天然の過程によるか、或いは化学修飾技術による条件的活性型ポリペプチドの修飾方法を提供する。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミン又はカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこに行われてもよい。同じタイプの修飾が、所与のポリペチドの幾つかの部位に同じ又は様々な程度で存在し得ることは理解されるであろう。また、所与のポリペチドが多くの種類の修飾を有することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＰＥＧ化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋性環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、及びアルギニル化等のトランスファーＲＮＡ媒介性のタンパク質へのアミノ酸付加が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，ａ ｓ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１－１２（１９８３）を参照のこと。
Ｈ．条件的活性型抗体の操作
本発明の条件的活性型抗体は、本明細書に記載される１つ以上の抗体操作技法によって操作し得る。抗体操作技法の非限定的な例としては、抗体コンジュゲーション、多重特異性抗体の操作、免疫エフェクター細胞表面抗原と標的抗原とに対する二重特異性条件的活性型抗体の操作、抗体のＦｃ領域の操作が挙げられる。
条件的活性型抗体のコンジュゲーションに好適な方法については、国際公開第２０１５／１７５３７５号パンフレットに記載されている。一実施形態において、本明細書に開示されるコンジュゲーションに用いられる条件的活性型抗体は、好ましくは、異常条件における活性と正常生理条件における活性との比が少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１２：１、又は少なくとも約１４：１、又は少なくとも約１６：１、又は少なくとも約１８：１、又は少なくとも約２０：１、又は少なくとも約２２：１、又は少なくとも約２４：１、又は少なくとも約２６：１である。
一部の実施形態において、条件的活性型抗体はこの抗体のＦｃ領域上にコンジュゲートされ得る。上記に記載したコンジュゲート分子、化合物又は薬物が、米国特許第８，３６２，２１０号明細書に記載されるように、Ｆｃ領域にコンジュゲートされ得る。例えば、Ｆｃ領域は、条件的活性型抗体が優先的な活性を示す部位に送達されるサイトカイン又は毒素にコンジュゲートされ得る。ポリペプチドを抗体のＦｃ領域にコンジュゲートする方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、同第５，７２３，１２５号明細書、同第５，７８３，１８１号明細書、同第５，９０８，６２６号明細書、同第５，８４４，０９５号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書；欧州特許第３６７，１６６号明細書；欧州特許第３９４，８２７号明細書；国際公開第９１／０６５７０号パンフレット、国際公開第９６／０４３８８号パンフレット、国際公開第９６／２２０２４号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット、及び国際公開第９９／０４８１３号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８８，ｐａｇｅｓ １０５３５－１０５３９，１９９１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３３１，ｐａｇｅｓ ８４－８６，１９８８；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ５５９０－５６００，１９９５；及びＶｉＩ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐａｇｅｓ １１３３７－１１３４１，１９９２を参照のこと。
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は、１つが条件的活性型抗体と反応し且つ１つがコンジュゲート薬剤と反応する少なくとも２つの反応基を有する中間リンカーを介してコンジュゲート薬剤に共有結合的に付加され得る。リンカー（任意の適合性有機化合物を含み得る）は、条件的活性型抗体又はコンジュゲート薬剤との反応が条件的活性型抗体の反応性及び／又は選択性に悪影響を与えないように選択することができる。さらに、コンジュゲート薬剤へのリンカーの付加がコンジュゲート薬剤の活性を破壊してはならない。最大３：１、又は４：１、又は５：１、又は６：１の、コンジュゲートされる抗癌剤の分子と条件的活性型ポリペプチド分子との比。一例において抗癌剤と条件的活性型ポリペプチドとの比は約４：１である。
酸化型条件的活性型抗体に好適なリンカーとしては、第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基から選択される基を含有するものが挙げられる。還元型条件的活性型抗体に好適なリンカーとしては、還元型条件的活性型抗体のスルフヒドリル基との反応能を有する特定の反応基を有するものが挙げられる。かかる反応基としては、限定はされないが、反応性ハロアルキル基（例えばハロアセチル基を含む）、ｐ－安息香酸水銀基及びマイケル型付加反応能を有する基（例えば、マレイミド類及びＭｉｔｒａ ａｎｄ Ｌａｗｔｏｎ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１０１，ｐａｇｅｓ ３０９７－３１１０，１９７９によって記載されるタイプの基を含む）が挙げられる。
多重特異性条件的活性型抗体の操作に好適な方法については、国際公開第２０１５／１７５３７５号パンフレットに記載されている。
条件的活性型抗体は、免疫エフェクター細胞表面抗原と標的抗原とに対する二重特異性条件的活性型抗体が生成されるように操作し得る。本発明の二重特異性条件的活性型抗体は、標的抗原が存在する疾患部位に免疫エフェクター細胞を誘引することができる。二重特異性条件的活性型抗体は、２つの異なる抗原：免疫エフェクター細胞表面抗原及び標的抗原に特異的に結合することのできる抗体である。二重特異性抗体は、一方のアームが免疫エフェクター細胞表面抗原に結合し、且つ他方のアームが標的抗原に結合する２本のアームを含む完全長抗体であってもよい。二重特異性抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖可変ドメイン（ＶL）のみを含む抗体フラグメントであってもよい。一実施形態において、抗体フラグメントは、一方が免疫エフェクター細胞表面抗原に結合するためのものであり、且つ他方のアームが標的抗原に結合する少なくとも２つのＶHＶL単位を含む。別の実施形態において、抗体フラグメントは、一方が免疫エフェクター細胞表面抗原に結合するためのものであり、且つ他方のアームが標的抗原に結合する少なくとも２つのシングル可変ドメイン（ＶH又はＶL）を含む。一部の実施形態において、二重特異性条件的活性型抗体は、一方が免疫エフェクター細胞表面抗原に結合し、且つ他方が標的抗原に結合する２つのｓｃＦｖを含む。
誘引される免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞と罹患細胞又は罹患組織上の標的抗原との両方に対するその結合活性により、標的抗原を含有する罹患細胞又は罹患組織に免疫エフェクター細胞を誘引し得る。免疫エフェクター細胞は罹患細胞又は罹患組織を抑制し又はさらには破壊する能力を有するため、次には誘引された免疫エフェクター細胞が罹患細胞又は罹患組織を攻撃し、そのようにして疾患の治癒を助け得る。例えば、免疫エフェクター細胞は腫瘍細胞又は感染細胞を破壊することができる。免疫エフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及びＴ細胞が挙げられる。
二重特異性条件的活性型抗体は、各一つずつが免疫エフェクター細胞表面抗原及び標的抗原に対する２つの結合活性を有する。一実施形態では、両方の結合活性が条件的であり、つまり、免疫エフェクター細胞表面抗原及び標的抗原に対する二重特異性条件的活性型抗体の結合活性は正常生理条件下で野生型抗体の結合活性よりも低く、且つ異常条件下で野生型抗体よりも高いということになる。一実施形態では、２つの結合活性のうちの一方のみが条件的であり、つまり、免疫エフェクター細胞表面抗原に対する二重特異性条件的活性型抗体の結合活性又は標的抗原に対する二重特異性条件的活性型抗体の結合活性のいずれか一方が条件的であるということになる。この場合、免疫エフェクター細胞表面抗原に対する二重特異性条件的活性型抗体の結合活性又は標的抗原に対する二重特異性条件的活性型抗体の結合活性の一方は、正常生理条件下で野生型抗体の対応する活性よりも低く、且つ異常条件下で野生型抗体の対応する活性よりも高い。
二重特異性条件的活性型抗体の２本のアーム（例えば、２つのＶHＶL単位又は２つのｓｃＦｖ）は、従来の方法を用いてつなぎ合わされ得る。当該分野で周知のとおり、完全な抗原結合部位を含有する最小限の抗体フラグメントは、非共有結合的に会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメイン（ＶH及びＶL）の二量体を有する。この構成は、各可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が相互作用してＶH－ＶL二量体の表面上の抗原結合部位を画定する天然抗体に見られるものと一致する。集合的には、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。ＣＤＲに隣接するフレームワーク（ＦＲ）が、ヒト及びマウスと同程度に多様な種の天然免疫グロブリンにおいて本質的に保存されている三次構造を有する。これらのＦＲは、ＣＤＲをそれらの適切な向きに保持する働きをする。定常ドメインは結合機能に必要ないが、ＶH－ＶL相互作用の安定化に役立ち得る。シングル可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む半分のＦｖ）であっても、抗原を認識して結合する能力を有するが、通常は結合部位全体と比べると親和性が低い（Ｐａｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１ ｐａｇｅｓ １３２７－１３３７，１９７２）。従って、二重特異性条件的活性型抗体の結合部位の前記ドメインは、異なる免疫グロブリンのＶH－ＶL、ＶH－ＶH又はＶL－ＶLドメインのペアとして構築し得る。
一部の実施形態において、二重特異性条件的活性型抗体は、組換えＤＮＡ技法を用いて連続ポリペプチド鎖として、例えば連続ポリペプチド鎖を構築するため二重特異性条件的活性型抗体をコードする核酸分子を発現させるような方法で構築し得る（例えば、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｓｍａｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９２，ｐａｇｅｓ ７０２１－７０２５，２００５を参照）。ポリペプチド鎖内でのＶH及びＶLドメインの順序は、抗原結合部位が適切に折り畳まれて免疫エフェクター細胞表面抗原に対する１つの結合部位と標的抗原に対する１つの結合部位とを形成し得るようにＶH及びＶLドメインが配置される限り、本発明において重要ではない。
免疫エフェクター細胞表面抗原及び標的抗原に対する二重特異性条件的活性型抗体の生成においては、多重特異性条件的活性型抗体の操作に関して本明細書に記載される技法の一部を用い得る。
シングルポリペプチド鎖として構成された二重特異性抗体は公知であり、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７、Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３、Ｂｒｕｈｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６に記載されている。二重特異性抗体に特に好ましい構成は、ＶH及びＶL領域がリンカードメインによって互いに連結されているポリペプチド構築物である。シングルポリペプチド鎖におけるＶH及びＶL領域の順序は重要ではない。一実施形態において、シングルポリペプチド鎖は、ＶH1－リンカードメイン－ＶL1－リンカードメイン－ＶH2－リンカードメイン－ＶL2として構成される。別の実施形態において、シングルポリペプチド鎖は、ＶL1－リンカードメイン－ＶH1－リンカードメイン－ＶL2－リンカードメイン－ＶH2として構成される。別の実施形態において、シングルポリペプチド鎖は、ＶH1－リンカードメイン－ＶH2－リンカードメイン－ＶL1－リンカードメイン－ＶL2として構成される。別の実施形態において、シングルポリペプチド鎖は、ＶH1－リンカードメイン－ＶL2－リンカードメイン－ＶL1－リンカードメイン－ＶH2として構成される。シングルポリペプチド鎖は、各々が免疫エフェクター細胞表面抗原又は標的抗原との結合能を有する２本のアームに折り畳まれ得る。
二重特異性条件的活性型抗体のリンカードメインは、これらのＶH及びＶLドメイン間の分子間会合を可能にするのに十分な長さのペプチドフラグメントである。この目的に好適なリンカーの設計については、先行技術、例えば、欧州特許第６２３ ６７９ Ｂ１号明細書、米国特許第５，２５８，４９８号明細書、欧州特許第５７３ ５５１ Ｂ１号明細書及び米国特許第５，５２５，４９１号明細書に記載されている。リンカードメインは、好ましくは、グリシン、セリン及び／又はグリシン／セリンから選択される１～２５アミノ酸の親水性可動性リンカーである。一実施形態において、リンカードメインは配列（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3の１５アミノ酸リンカーである。
追加的なリンカードメインは、オリゴマー形成ドメインを含む。オリゴマー形成ドメインは、その２つ又は数個のＶH及びＶLドメインの組み合わせが折り畳まれて、免疫エフェクター細胞表面抗原又は標的抗原との結合能を各々有する２本のアームになるのを促進することができる。オリゴマー形成ドメインの非限定的な例には、ロイシンジッパー（ｊｕｎ－ｆｏｓ、ＧＣＮ４、Ｅ／ＥＢＰなど；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２），１５４７－１５５３；Ｚｅｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４（１９９７），３６７３－３６７８、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５（１９９１），１５５３－１５６３；Ｓｕｔｅｒ，“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，（１９９６），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、定常ドメインＣＨ１及びＣＬなどの抗体由来オリゴマー形成ドメイン（Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４２２（１９９８），２５９－２６４）及び／又はＧＣＮ４－ＬＩなどの四量体化ドメイン（Ｚｅｒａｎｇｕｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７（２０００），３５９１－３５９５）が含まれる。
一部の実施形態では、ノブ・イン・ホール技術を用いてシングルポリペプチド鎖二重特異性条件的抗体の折り畳みを安定化させてもよい。ノブ・イン・ホール技術については、Ｒｉｄｇｗａｙら（“‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６ Ｊｕｌ；９（７）：６１７－２１）によって記載されている。この手法は、隣接するａヘリックス間のアミノ酸側鎖のパッキングに用いられており、ここではａヘリックスの残基の側鎖が、円筒形の表面上にホールと交互に間隔を置いて配置されたノブとして表され、これらのホールには隣接するａヘリックスのノブが嵌まり得る（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，５３９－５４４）。
免疫エフェクター細胞表面抗原は、１つ又はあるクラスの免疫エフェクター細胞に特異的であるはずである。多くの免疫エフェクター細胞に対する表面抗原が既知である。ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＫＩＲファミリー受容体、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ１６１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ３、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体を含めた表面抗原を有する（Ａｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ５６－ｎｅｇａｔｉｖｅ，ＣＤ１６－ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ＫＩＲ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１１；１２６（１）：１３－２０；Ｄａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）５７，６４９－６５５；Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｏｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；４（１）：７９－９１）
マクロファージは、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＭＡＣ２、ＣＤ１１ｃ、ＬＹ６Ｇ、ＬＹ６Ｃ、ＩＬ－４Ｒα、ＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０（マウス）／ＥＭＲ１（ヒト）、ＣＤ６８及びＭＡＣ－１／ＭＡＣ－３、ＰＥＣＡＭ－１（ＣＤ３１）、ＣＤ６２、ＣＤ６４、ＣＤ４５、Ｙｍ１、ＣＤ２０６、ＣＤ４５ＲＯ、２５Ｆ９、Ｓ１００Ａ８／Ａ９、及びＰＭ－２Ｋを含めた表面抗原を有する（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｕｂｓｅｔｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１，７２３－７３７；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；２３：９０１－４４；Ｐｉｌｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｋｅｒｓ ｔｈａｔ Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，”ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４（１０）：ｅ７４７５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７４７５，２００９）。
リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は、Ｔ３、Ｔ４ Ｔ１１、Ｔ８、ＴＩＩ、Ｌｅｕ７、Ｌｅｕ１１を含めた表面抗原を有する（Ｆｅｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，”Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９８７ Ｊａｎ １５；３９（１）：１８－２４；Ｂａｇｎａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｃ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９８７ Ｊｕｎ １５；３９（６）：７０３－７；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｍａｎｉｆｅｓｔ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ－ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｕｇｕｓｔ １，１９８７，ｖｏｌ．１３９ ｎｏ．３ ９７７－９８２）。
Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｔ５８、ＣＤ２７、ＣＤ４５、ＣＤ８４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＴＣＲ、Ｔ１０、Ｔ１１、及びＣＤ４５ＲＯを含めた表面抗原を有する（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ，”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ Ｆｅｂ；２６（２）：１３７－４５；Ｊｏｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，“ＳＵＲＦＡＣＥ ＭＡＲＫＥＲＳ ＯＮ ＨＵＭＡＮ Ｔ ＡＮＤ Ｂ ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ，”ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬＵＭＥ １３６，１９７２，２０７－２１５；Ｍｉｎｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｒｉｃ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ．１９８２ Ｊｕｌ－Ｓｅｐ；１２（３）：４３９－４４８）。
二重特異性条件的活性型抗体は、免疫エフェクター細胞との結合後、標的抗原が好ましくは表面上に存在する細胞又は組織へと免疫エフェクター細胞を導くことができる。二重特異性条件的活性型抗体（免疫エフェクター細胞を有する）が標的抗原に結合すると、免疫エフェクター細胞が罹患細胞又は罹患組織を攻撃し得る。ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ＬＡＫ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性）などの免疫エフェクター細胞は、いずれも、罹患細胞又は組織を死滅させ及び／又は破壊する能力、例えば腫瘍組織を破壊する能力を有する。
罹患細胞又は罹患組織は、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管疾患、又は感染症から選択され得る。標的抗原の例としては、様々な免疫細胞、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、並びに様々な血液疾患、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患に関連する細胞が発現する抗原が挙げられる。
二重特異性条件的活性型抗体が標的とし得る癌に特異的な標的抗原としては、４－ＩＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、αフェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧｌ、ＬＩ－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンανβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒ ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２又はビメンチンのうちの１つ以上が挙げられる。
本発明の遺伝子操作された細胞傷害性細胞又は医薬組成物で治療される癌の種類としては、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及びある種の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、及び悪性病変、例えば、肉腫、癌腫、及び黒色腫が挙げられる。癌は非固形腫瘍（血液腫瘍など）又は固形腫瘍であってもよい。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌もまた含まれる。
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液癌（又は血行性癌）の例としては、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病並びに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性型及び高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病及び骨髄形成異常が挙げられる。
固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の異なるタイプは、それを形成する細胞のタイプ（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）にちなんで命名される。治療し得る固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合性神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移など）を含めた肉腫及び癌腫が挙げられる。
二重特異性条件的活性型抗体が標的とし得る炎症性疾患に特異的な標的抗原としては、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体の鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンａ４、インテグリンα４β７、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ－５２８、ミオスタチン、ＯＸ－４０、ｒｈｕＭＡｂ β７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ－ａ又はＶＥＧＦ－Ａのうちの１つ以上が挙げられる。
本発明の二重特異性条件的活性型抗体が標的とし得る神経障害に特異的な標的抗原としては、βアミロイド又はＭＡＢＴ５１０２Ａのうちの１つ以上が挙げられる。本発明の二重特異性条件的活性型抗体が標的とし得る糖尿病に特異的な抗原としては、Ｌ－Ιβ又はＣＤ３のうちの１つ以上が挙げられる。本発明の二重特異性条件的活性型抗体が標的とし得る心血管疾患に特異的な抗原としては、Ｃ５、心臓ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα－ｌｉｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）及びスフィンゴシン－１－リン酸のうちの１つ以上が挙げられる。
本発明の二重特異性条件的活性型抗体が標的とし得る感染症に特異的な標的抗原としては、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、エンドトキシン、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１、Ｈｓｐ９０、インフルエンザＡ型赤血球凝集素、リポタイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス及びＴＮＦ－ａのうちの１つ以上が挙げられる。
標的抗原のさらなる例としては、癌細胞に特異的な又は増幅された形で見られる表面タンパク質、例えば、Ｂ細胞リンパ腫についてのＩＬ－１４受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０、種々の癌腫についてのＬｅｗｉｓ Ｙ及びＣＥＡ抗原、乳癌及び結腸直腸癌についてのＴａｇ７２抗原、肺癌についてのＥＧＦ－Ｒ、ヒト乳癌及び卵巣癌で増幅されることの多い葉酸結合タンパク質及びＨＥＲ－２タンパク質、又はウイルスタンパク質、例えばＨＩＶのｇｐ１２０及びｇｐ４１エンベロープタンパク質、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス由来のエンベロープタンパク質、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂ及び他のエンベロープ糖タンパク質、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのオンコウイルス由来のエンベロープタンパク質が挙げられる。他の潜在的標的抗原としてはＣＤ４（リガンドはＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質である）、及び他のウイルス受容体、例えばヒトライノウイルスに対する受容体であるＩＣＡＭ、及びポリオウイルスに対する関連する受容体分子が挙げられる。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、初めに細胞表面上の２つの鍵分子、ＣＤ４及び共受容体に結合しない限りヒト細胞に侵入できない。最初に認識される共受容体はＣＣＲ５であり、ウイルスのライフサイクルにおいて後に別のケモカイン受容体ＣＸＣＲ４がＨＩＶ－１に対する共受容体になる（Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，１２９３（１９９６）；Ｐｒｅｍａｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，１１７４；Ｆａｕｃｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３８４，５２９（１９９６））。性的接触によるウイルス感染のほとんどを引き起こすＨＩＶ－１株は、Ｍトロピックウイルスと呼ばれる。これらのＨＩＶ－１株（非合胞体誘導（ＮＳＩ）初代ウイルスとしても知られる）は初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びマクロファージで複製し、その共受容体としてケモカイン受容体ＣＣＲ５（及び、頻度は低いがＣＣＲ３）を用いることができる。Ｔトロピックウイルス（時に合胞体誘導（ＳＩ）初代ウイルスと呼ばれる）もまた初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞で複製することができるが、加えてインビトロで樹立ＣＤ４＋ Ｔ細胞株を感染させることができ、これをケモカイン受容体ＣＸＣＲ４（フーシン）を介して行う。これらのＴトロピック株の多くはＣＸＣＲ４に加えてＣＣＲ５を用いることができ、一部は、少なくとも特定のインビトロ条件下で、ＣＣＲ５を介してマクロファージに侵入することができる（Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，１２９３（１９９６）；Ｐｒｅｍａｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，１１７４；Ｆａｕｃｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３８４，５２９（１９９６））。ＨＩＶの性感染の約９０％にＭトロピックＨＩＶ－１株が関与するとされているため、ＣＣＲ５が患者におけるこのウイルスの優勢な共受容体である。
標的細胞上の共受容体分子の数及びアイデンティティ、並びにＨＩＶ－１株が異なる共受容体を介して細胞に侵入するものと思われる能力は、疾患進行の決定因子のように見える。ホジキン病患者に由来するリンパ節のＴ細胞及びＢ細胞においてもＣＣＲ３及びＣＣＲ５の高発現が観察された。Ｉ型糖尿病は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患であると考えられている。関連する動物モデルにおいて、膵臓におけるＣＣＲ５受容体の発現がＩ型糖尿病の進行と関連付けられた（Ｃａｍｅｒｏｎ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１１０２－１１１０）。一実施形態において、二重特異性条件的活性型抗体は標的抗原としてＣＣＲ５に結合し、これを用いて宿主細胞のＨＩＶ感染を抑制し得るとともに他の疾患の進行を減速させ得る。
（ヒト）ＣＣＲ５に特異的に結合する幾つかの抗体が当該技術分野において公知であり、ＭＣ－１（Ｍａｃｋ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，１２１５－１２２４又はＭＣ－５（Ｂｌａｎｐａｉｎ，（２００２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１３：７２３－３７、Ｓｅｇｅｒｅｒ（１９９９）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５６：５２－６４、Ｋｒａｆｔ（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４；２７６：３４４０８－１８）が含まれる。従って、二重特異性条件的活性型抗体は、例えば、ＣＣＲ５、好ましくはヒトＣＣＲ５に特異的な抗体のＶL及びＶHドメイン（即ちＩｇ由来の第２ドメイン）、並びにＴ細胞上のＣＤ３抗原に特異的な抗体のＶH及びＶLドメインを含むことが好ましい。
別の実施形態において、本発明は、標的抗原としてのＣＤ１９及びＴ細胞上のＣＤ３に対する二重特異性条件的活性型抗体を提供する。ＣＤ１９は、極めて有用な医学的標的であることが分かっている。ＣＤ１９は、プロＢ細胞から成熟Ｂ細胞までの全Ｂ細胞系統で発現するとともに全てのリンパ腫細胞上で一様に発現し、幹細胞には存在しない（Ｈａａｇｅｎ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９０（１９９２），３６８－７５；Ｕｃｋｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８），８６０３－７）。ＣＤ１９に対する抗体と追加的な免疫調節抗体との両方を用いる併用療法が、Ｂ細胞悪性病変（国際公開第０２／０４０２１号パンフレット、米国特許出願公開第２００２００６４０４号明細書、米国特許出願公開第２００２０２８１７８号明細書）及び自己免疫疾患（国際公開第０２／２２２１２号パンフレット、米国特許出願公開第２００２０５８０２９号明細書）の治療向けに開示されている。国際公開第００／６７７９５号パンフレットは、緩徐進行型及び侵襲性の強い形態のＢ細胞リンパ腫、並びに急性型及び慢性型のリンパ性白血病の治療に向けたＣＤ１９に対する抗体の使用を開示している。国際公開第０２／８０９８７号パンフレットは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫又はＢ細胞白血病（例えばＢ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、（例えばヘアリー細胞リンパ腫）、Ｂ細胞前駆体急性リンパ性白血病（プレＢ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ））などの疾患の治療に向けた抗原ＣＤ１９に対する抗体に基づいた免疫毒素の治療的利用を開示している。
さらなる実施形態において、本発明は、標的抗原としてのＣＤ２０及びＴ細胞上のＣＤ３に対する二重特異性条件的活性型抗体を提供する。ＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の一つである。ＣＤ２０抗原は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％超に見られるものを含め、正常な及び悪性のプレＢリンパ球及び成熟Ｂリンパ球に見られる。この抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織には存在しない。ほとんどがマウス起源である幾つかの抗体が記載されている：１Ｆ５（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｂｌｏｏｄ ６９／２，５８４－５９１）、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、１Ｈ４（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，３５２１－３５２６；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，米国特許第５，７３６，１３７号明細書；Ｈａｉｓｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２，１８４－１９０；Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，６５８９－６５９５）。
キャリアータンパク質に連結されたｓｃＦｖをコードするＤＮＡによるワクチン接種を用いた形質細胞悪性病変治療の免疫療法ストラテジーにおいてＣＤ２０が記載されており（Ｔｒｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７（５），５９８）、ＣＤ２０抗体（ＩＤＥＣ－Ｃ２Ｂ８）を用いた免疫療法治療が非ホジキンＢ細胞リンパ腫の治療において有効であることが示されている。
一部の実施形態において、二重特異性条件的活性型抗体は、ポリヌクレオチド分子によってコードされるシングルポリペプチド鎖である。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成的に作製されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はそれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独或いは組み合わせで含む組換えによって作製されたキメラ核酸分子であってもよい。ポリヌクレオチドは、プラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを含めたベクター、例えば発現ベクター、又は遺伝子操作において従来用いられている任意の発現系の一部であり得る。ベクターは、好適な宿主細胞における好適な条件下でのベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでもよい。
一態様において、ポリヌクレオチドは、原核細胞又は真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている。哺乳類細胞へのポリヌクレオチド又はベクターの送達には、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターが用いられ得る。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターは周知の方法によって宿主細胞に移すことができ、方法は細胞宿主のタイプに応じて変わる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションが良く利用される一方、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理又は電気穿孔が用いられ得る。
別の態様において、条件的活性型ポリペプチドを操作して二重特異性条件的活性型ポリペプチドを作製し得る。二重特異性条件的活性型ポリペプチドの操作方法は、国際公開第２０１５／１７５３７５号パンフレットに記載されるとおりの二重特異性条件的活性型抗体の操作方法と同様である。例えば、二重特異性条件的活性型ポリペプチドは２つの活性部位を有し、各々が条件的活性を有する、即ち、正常生理条件下で親部位よりも活性が低く、異常条件下で親部位よりも活性が高いものであり得る。これらの２つの条件的活性型部位は、独立して進化させてスクリーニングし、続いて２つの活性部位をリンカーで同じ二重特異性条件的活性型ポリペプチドに連結してもよい。一態様において、二重特異性条件的活性型抗体に使用し得るリンカーは、条件的活性型ポリペプチドの２つの条件的活性型部位を連結することによる二重特異性条件的活性型ポリペプチドの生成に好適な公知のリンカーである。
条件的活性型抗体のＦｃ領域の操作に好適な方法については、国際公開第２０１５／１７５３７５号パンフレットに記載されている。
条件的活性型ウイルス粒子の操作に好適な方法については、国際公開第２０１５／１７５３７５号パンフレットに記載されている。
一部の態様において、条件的活性型ポリペプチドは、国際公開第２０１５／１７５３７５号パンフレットに記載される方法を用いて、腫瘍崩壊ウイルスであるウイルス粒子に挿入されてもよい。腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍細胞と接触するとそれらの腫瘍細胞を死滅させる能力を有するウイルスである。腫瘍崩壊ウイルスに挿入される条件的活性型ポリペプチドは、腫瘍微小環境で活性がより高く、対象の他の部位で活性がより低いものであり得る。例えば、条件的活性型ポリペプチドは、腫瘍微小環境に存在するｐＨ又は他の条件（例えばｐＨ６．２～６．８）で活性がより高く、正常生理条件など、対象の別の部位に存在するｐＨ又は他の条件（例えばｐＨ７．２～７．６）で活性がより低いものであり得る。腫瘍崩壊ウイルスに挿入される条件的活性型ポリペプチドを使用すると、腫瘍への腫瘍崩壊ウイルスの送達を促進することができ、腫瘍において腫瘍崩壊ウイルスは腫瘍細胞を標的化して死滅させ得る。
目的の腫瘍崩壊ウイルスとしては、アデノウイルス；単純ヘルペスウイルス１型；ワクシニアウイルス；パルボウイルス；レオウイルス；ニューカッスル病ウイルスなどが挙げられる。ワクシニアウイルスが特に興味深い。
一態様において、腫瘍崩壊ウイルスは、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される。さらなる態様において、パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルス、及びムンプスウイルスからなる群から選択される。別の態様において、ＮＤＶは、ＭＴＨ６８／Ｈ、ＰＶ－７０１、及び７３－Ｔからなる群から選択される株由来である。
別の態様において、腫瘍崩壊ウイルスは、ヘルペスウイルス、レオウイルス、Ｅ１Ｂ欠失アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及びポックスウイルスから選択される。これらの腫瘍崩壊ウイルスは腫瘍細胞を破壊するのみならず、破壊された腫瘍細胞から抗原を放出させて、それにより免疫応答を惹起する潜在的能力も有する。
腫瘍崩壊ウイルスの具体的な例としては、限定なしに、アデノウイルス（例えばΔ－２４、Δ－２４－ＲＧＤ、ＩＣＯＶＩＲ－５、ＩＣＯＶＩＲ－７、Ｏｎｙｘ－０１５、ＣｏｌｏＡｄ１、Ｈ１０１、ＡＤ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦ）、レオウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＭＣＳＦ）、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、ポックスウイルス（例えばコペンハーゲン株、ウエスタンリザーブ株、ワイス株を含むワクシニアウイルス）、粘液腫ウイルス、ラブドウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ））、ピコルナウイルス（例えばセニカ・バレーウイルス；ＳＷ－００１）、コクサッキーウイルス、及びパルボウイルスが挙げられる。
一態様において、腫瘍崩壊ウイルスは、その５７種のヒト血清型（ＨＡｄＶ－１～５７）のいずれかのメンバーを含むアデノウイルスである。一実施形態において、アデノウイルスはＡｄ５血清型である。或いは、アデノウイルスは、Ａｄ５成分を含んでも又は含まなくてもよいハイブリッド血清型であってもよい。好適なアデノウイルスの非限定的な例としては、Δ－２４、Δ－２４－ＲＧＤ、ＩＣＯＶＩＲ－５、ＩＣＯＶＩＲ－７、ＯＮＹＸ－０１５、ＣｏｌｏＡｄ１、Ｈ１０１、及びＡＤ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦが挙げられる。ＯＮＹＸ－０１５は、Ｅ１Ｂ－５５Ｋ及びＥ３Ｂ領域に欠失を有して癌選択性が増強されたウイルス血清型Ａｄ２とＡｄ５とのハイブリッドである。Ｈ１０１は、Ｏｎｙｘ－０１５の修飾されたバージョンである。ＩＣＯＶＩＲ－５及びＩＣＯＶＩＲ－７はＥ１ＡのＲｂ結合部位欠失及びＥ２ＦプロモーターによるＥ１Ａプロモーターの置換を含む。Ｃｏｌｏ Ａｄ １はキメラＡｄｄｌ ｌｐ／Ａｄ３血清型である。ＡＤ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦ（ＣＧＴＧ－１０２）は、ＧＭ－ＣＳＦをコードする血清型５／３カプシド修飾アデノウイルスである（Ａｄ５カプシドタンパク質ノブが血清型３由来のノブドメインに置換されている）。
特に好ましい一実施形態において、腫瘍崩壊ウイルスはΔ－２４又はΔ－２４－ＲＧＤアデノウイルスである。Δ－２４については、米国特許出願公開第２００３／０１３８４０５ Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２００６／０１４７４２０ Ａ１号明細書に記載されている。Δ－２４アデノウイルスはアデノウイルス５型（Ａｄ－５）に由来し、Ｅ１Ａ遺伝子のＣＲ２部分内に２４塩基対の欠失を含む。Δ－２４－ＲＧＤは、繊維状ノブタンパク質のＨＩループへのＲＧＤ－４Ｃ配列（ανβ３及びανβ５インテグリンに強力に結合する）の挿入をさらに含む（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：５４２－５４６，１９９７）。
腫瘍崩壊アデノウイルスはまた、腫瘍崩壊アデノウイルスが癌を治療する能力を改善するためさらに修飾されてもよい。腫瘍崩壊アデノウイルスのかかる修飾については、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｏｃｔ ９（５）：４２２－４２７）によって記載されており、また米国特許出願公開第２００６／０１４７４２０ Ａ１号明細書も参照のこと。
条件的活性型ポリペプチドを含む腫瘍崩壊ウイルスは、局所投与又は全身投与し得る。例えば、限定なしに、腫瘍崩壊ウイルスは、血管内（動脈内又は静脈内）、腫瘍内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、経口的、非経口的、鼻腔内、気管内、経皮的、脊髄内、眼内、又は頭蓋内に投与することができる。
腫瘍崩壊ウイルスは単回投与又は複数回投与で投与し得る。ウイルスは、少なくとも１×１０5プラーク形成単位（ＰＦＵ）、少なくとも５×１０5ＰＦＵ、少なくとも１×１０6ＰＦＵ、少なくとも５×１０6又は少なくとも５×１０6ＰＦＵ、１×１０7、少なくとも１×１０7ＰＦＵ、少なくとも１×１０8又は少なくとも１×１０8ＰＦＵ、少なくとも１×１０8ＰＦＵ、少なくとも５×１０8ＰＦＵ、少なくとも１×１０9又は少なくとも１×１０9ＰＦＵ、少なくとも５×１０9又は少なくとも５×１０9ＰＦＵ、少なくとも１×１０10ＰＦＵ又は少なくとも１×１０10ＰＦＵ、少なくとも５×１０10又は少なくとも５×１０10ＰＦＵ、少なくとも１×１０11ＰＦＵ又は少なくとも１×ｌ０11ＰＦＵ、少なくとも１×１０12ＰＦＵ、又は少なくとも１×１０13ＰＦＵの投薬量で投与し得る。例えば、腫瘍崩壊ウイルスは、約１０7～１０13ＰＦＵ、約１０8～１０13ＰＦＵ、約１０9～１０12ＰＦＵ、又は約１０8～１０12ＰＦＵの投薬量で投与し得る。
特定の態様において、腫瘍崩壊ウイルスで治療される癌としては、任意の固形腫瘍、例えば、肺癌、卵巣癌、乳癌、頸部癌、膵癌、胃癌、結腸癌、皮膚癌、喉頭癌、膀胱癌、及び前立腺癌が挙げられる。一態様において、癌は中枢神経系の癌である。癌は、神経上皮腫瘍、例えば、星細胞系腫瘍（例えば、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、膠芽腫、神経膠肉腫、毛様細胞性星状細胞腫、巨細胞性星状細胞腫、多形黄色星状細胞腫）、乏突起膠腫、上衣腫、乏突起星細胞腫、海綿芽細胞腫、星状芽細胞腫、脈絡叢乳頭腫（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｐａｐｉｌｏｍａ）、脈絡叢癌、神経節細胞腫、神経節膠腫、神経細胞腫、神経上皮腫瘍、神経芽細胞腫、松果体部腫瘍（松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、又は混合型松果体細胞腫／松果体芽細胞腫（ｐｉｎｅｏｂａｓｔｏｍａ）など）、髄上皮腫、髄芽腫、神経芽細胞腫又は神経節芽細胞腫、網膜芽細胞腫、又は上衣芽細胞腫であり得る。癌は、中枢神経系新生物、例えば、トルコ鞍部腫瘍（下垂体腺腫、下垂体癌、又は頭蓋咽頭腫など）、造血器腫瘍（原発性悪性リンパ腫、形質細胞腫、又は顆粒球性肉腫など）、胚細胞腫瘍（胚細胞腫、胚性癌腫、卵黄嚢腫瘍、絨毛癌、奇形腫又は混合型胚細胞腫瘍など）、髄膜腫、間葉系腫瘍、黒色細胞腫、又は頭蓋若しくは脊髄神経腫瘍（シュワン腫、又は神経線維腫など）であり得る。癌は、低悪性度神経膠腫（例えば、上衣腫、星状細胞腫、乏突起膠腫又は混合性神経膠腫）又は高悪性度（悪性）神経膠腫（例えば多形性膠芽腫）であり得る。癌は、原発性又は転移性脳腫瘍であり得る。条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物は、医薬組成物中に使用し得る。一部の好適な医薬組成物が、米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書に記載されている。
医薬組成物は、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及びある種の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、及び悪性病変、例えば、肉腫、癌腫、及び黒色腫を含めた、各種の癌の治療に用いることができる。癌は、非固形腫瘍（血液腫瘍など）又は固形腫瘍であり得る。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌もまた含まれる。
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液癌（又は血行性癌）の例としては、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病並びに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性型及び高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病及び骨髄形成異常が挙げられる。
固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の異なるタイプは、それを形成する細胞のタイプにちなんで命名される（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）。治療し得る固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合性神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移など）を含めた肉腫及び癌腫が挙げられる。
条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物を含む医薬組成物は、公知の医薬組成物調製方法によって製剤化することができる。かかる方法において、条件的活性型ポリペプチドは、典型的には、薬学的に許容可能な担体を含有する混合物、溶液又は組成物と組み合わされる。
薬学的に許容可能な担体は、レシピエント患者によって忍容され得る材料である。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容可能な担体の一例である。他の好適な薬学的に許容可能な担体が当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）を参照のこと）。製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を防ぐアルブミン等をさらに含み得る。
医薬組成物の形態、投与経路、投薬量及びレジメンは、必然的に、治療する病態、病気の重症度、患者の年齢、体重、及び性別等に依存する。これらの事項が、好適な医薬組成物を製剤化するため当業者によって考慮され得る。本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与用などに製剤化され得る。
好ましくは、医薬組成物は、注入可能な製剤用に薬学的に許容可能な媒体を含有する。このような媒体は、詳細には等張性滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウムなど又はかかる塩の混合物）、又は例えば滅菌水又は生理食塩水を添加すると注射用溶液を再構成することが可能な、乾燥した、特にフリーズドライの組成物であってもよい。
一部の実施形態において、組成物における液体の浸透圧を調整又は維持するため、時に「安定剤」として知られる等張化剤が存在する。タンパク質及び抗体などの大型の荷電生体分子と共に使用する場合、等張化剤は、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用して、それにより分子間及び分子内相互作用の可能性を低下させることができるため、「安定剤」と呼ばれることが多い。等張化剤は、重量基準で医薬組成物の０．１％～２５％、好ましくは１～５％の任意の量で存在し得る。好ましい等張化剤としては、多価糖アルコール類、好ましくは三価又はそれより高級な糖アルコール類、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。
追加の賦形剤には、以下：（１）増量剤、（２）溶解促進剤、（３）安定剤及び（４）及び変性又は容器壁への付着を防ぐ薬剤のうちの１つ以上として働くことのできる薬剤が含まれる。かかる賦形剤としては、多価糖アルコール類（上記に列挙される）；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等；有機糖類又は糖アルコール類、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトーズ（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖類、例えば、ラフィノース；及び多糖類、例えば、デキストリン又はデキストランを挙げることができる。
非イオン性界面活性剤又はデタージェント（「湿潤剤」としても知られる）を用いると、治療剤を可溶化する助けとなるとともに撹拌誘発性の凝集から治療用タンパク質を保護することができ、これはまた、活性治療用タンパク質又は抗体の変性を引き起こすことなく製剤を剪断表面応力に曝露することも可能にする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在し得る。
好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート類（２０、４０、６０、６５、８０等）、ポロキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８等）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール類、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０等）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｏｓｅ）及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用し得るアニオン性デタージェントとしては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチル（ｄｉｏｃｔｙｌｅ）スルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン性デタージェントとしては、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
投与に用いる用量は、様々なパラメータに応じて、及び詳細には、用いる投与方法、関連する病理学、或いは所望の治療期間に応じて適合させることができる。医薬組成物を調製するには、有効量の条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドからさらに操作された生成物を薬学的に許容可能な担体又は水性媒体中に溶解し又は分散させ得る。
注射用途に好適な医薬製剤としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又はプロピレングリコール水溶液などの担体；及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調合用の滅菌粉末が挙げられる。いずれの場合にも、製剤は無菌でなければならず、及び易注射針通過性が存在する程度に流動性でなければならない。製剤は製造及び保管条件下で安定していなければならず、及び細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての条件的活性型ポリペプチドの溶液は、界面活性剤と好適に混合した水中に調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中及び油中に調製することもできる。通常の保管及び使用条件下では、これらの調製物には、微生物の成長を防ぐ保存剤が含まれる。
条件的活性型ポリペプチド及び条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物は、塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）及び、例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導することができる。
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらし得る。
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に必要な量の条件的活性型ポリペプチドを、必要に応じて上記に列挙される他の成分のうちの１つ以上と共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製される。概して、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙されるものからの他の必要な成分を含有する滅菌媒体中に様々な滅菌活性成分を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過されたその溶液から活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を得る真空乾燥及び凍結乾燥技法である。
直接の注射用のより高濃度の又は高度に濃縮された溶液の調製もまた企図され、ここでは溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用することにより、極めて急速な透過がもたらされ、小さい腫瘍範囲に高濃度の活性薬剤が送達されることが想定される。
製剤化されると、溶液は、投薬製剤と適合性のある形で、且つ治療上有効であるような量で投与され得る。製剤は、上記に記載した注射用溶液のタイプなど、種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた用いることができる。
水溶液中での非経口投与について、例えば、溶液は必要に応じて好適に緩衝されなければならず、及び初めに希釈液が十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、利用し得る滅菌水性媒体は、本開示を踏まえて当業者には公知であり得る。例えば、ある投薬量が１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され、及び１０００ｍｌの皮下点滴液に添加されるか、又は提案される注入部位に注射されるかのいずれかであり得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照）。治療下の対象の病態に応じて投薬量の幾らかの変動は必然的に起こり得る。いずれにしろ、投与責任者が個々の対象に適切な用量を決定することになる。
条件的活性型ポリペプチド及び条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物は、用量当たり約０．０００１～１０．０ミリグラム、又は約０．００１～５ミリグラム、又は約０．００１～１ミリグラム、又は約０．００１～０．１ミリグラム、又は約０．１～１．０又はさらには約１０ミリグラムを送達するように治療用混合物中に製剤化し得る。複数回用量もまた、選択された時間間隔で投与し得る。
静脈内又は筋肉内注射など、非経口投与用に製剤化される化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態としては、例えば錠剤又は他の経口投与用固体；時間放出カプセル；及び現在用いられている任意の他の形態が挙げられる。
特定の実施形態において、条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドからさらに操作された生成物を宿主細胞に導入するための、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が企図される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は当業者に公知である。
ナノカプセルは、概して化合物を安定した且つ再現可能な方法で捕捉し得る。細胞内ポリマーの過負荷に起因する副作用を回避するため、かかる超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は概してインビボで分解可能なポリマーを使用して設計される。このような要件に合致する生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用に企図される。
リポソームは、水性媒体中に分散させると自然に多重膜の同心状二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、概して２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶを音波処理すると、コアに水溶液を含有する２００～５００Åの範囲の直径の小さい単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理特性は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。
本明細書に記載されるとおりの条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物を含有する医薬製剤は、１つ以上の任意選択の薬学的に許容可能な担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容可能な担体としては、限定はされないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びその他の、グルコース、マンノース、又はデキストリン類を含めた炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
本明細書における例示的な薬学的に許容可能な担体としては、間質液（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含め、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書及び同第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰはコンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
例示的凍結乾燥抗体製剤が、米国特許第６，２６７，９５８号明細書に記載されている水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号明細書及び国際公開第２００６／０４４９０８号パンフレットに記載されるものが挙げられ、後者の製剤は酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。
本明細書における製剤はまた、治療下の詳細な適応の必要に応じて２つ以上の活性成分も含有し得る。好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有する成分が単一の製剤中に組み合わされ得る。例えば、本発明の条件的活性型抗体、抗体フラグメント又はイムノコンジュゲートに加え、ＥＧＦＲアンタゴニスト（エルロチニブなど）、抗血管新生剤（抗ＶＥＧＦ抗体であってもよいＶＥＧＦアンタゴニストなど）又は化学療法剤（タキソイド又は白金剤など）を提供することが望ましい場合もある。かかる活性成分は、使用目的に有効な量で組み合わせで好適に存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技法によるか、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中又はマクロエマルション中のそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ－（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルを利用し得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
徐放製剤もまた調製し得る。徐放製剤の好適な例としては、抗体又は抗体フラグメントを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、付形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態であってもよいマトリックスが挙げられる。
一部の実施形態において、条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物を使用して、記載される障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含有する製品を作製し得る。この製品は、容器と、容器上にある又は容器に関連付けられたラベル又は添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなど、種々の材料で形成され得る。容器は、単独で又は別の組成物との組み合わせで病態の治療、予防及び／又は診断に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドからさらに操作された生成物である。ラベル又は添付文書は、その組成物が選択の病態の治療に用いられるものであることを指示する。さらに、製品は、（ａ）中に組成物が入った第１の容器（ここで組成物は条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物を含む）；及び（ｂ）中に組成物が入った第２の容器（ここで組成物はさらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む）を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、その組成物を特定の病態の治療に使用し得ることを指示する添付文書をさらに含み得る。それに代えて、又は加えて、本製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。さらに製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含め、商業的な及び使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。
本製品は、任意選択で、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｅｌｌａｒ）、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、腟、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、又は経皮送達装置又はシステムの構成要素としての容器を含み得る。
条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物は医療器具に含まれてもよく、ここで器具は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｅｌｌａｒ）、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、腟、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される少なくとも１つの方法によって条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドからさらに操作された生成物を接触させる又は投与するのに好適である。
一部のさらなる実施形態において、条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物は、キットにおいて第１の容器に凍結乾燥形態で含まれてもよく、及び任意選択の第２の容器が、滅菌水、滅菌緩衝用水、又は水性希釈剤中の少なくとも１つの保存剤であって、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、又はこれらの混合物からなる群から選択されるものを含む。一態様において、このキットにおいては、第１の容器内の条件的活性型ポリペプチド、又は条件的活性型ポリペプチドから操作された生成物の濃縮物が第２の容器の内容物で約０．１ｍｇ／ｍｌ～約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で再構成される。別の態様において、第２の容器には等張化剤がさらに含まれる。別の態様において、第２の容器には生理学的に許容可能な緩衝液がさらに含まれる。一態様において、本開示は、親タンパク質が媒介する少なくとも１つの病態を治療する方法であって、それを必要としている患者に、キットに提供され且つ投与前に再構成される製剤を投与する工程を含む方法を提供する。
以下の実施例は本開示の例示であり、限定ではない。当業者には明らかな、現場で通常直面する種々の条件及びパラメータの他の好適な変更及び適合が、本開示の範囲内にある。
条件的活性型ポリペプチドの作製に関する実施例１～５は、米国特許第８，７０９，７５５ Ｂ２号明細書（本明細書によって参照により本明細書に援用される）に記載されている。
実施例６：抗体の軽鎖又は重鎖を進化させる
抗体Ｆ１－１０Ｆ１０の重鎖及び軽鎖をＣＰＥを用いて別個に進化させた。軽鎖変異体をスクリーニングすると、条件的活性を有する２６個の軽鎖変異体が見付かり、この場合、変異体は、ｐＨ６．０では野生型と比べて活性がより高く、且つ変異体はｐＨ７．４で野生型と比べて活性が低かった。２６個の軽鎖変異体は、軽鎖の８つの異なる位置にその突然変異を有した。それらの８つの位置のうちの３つは、２６個の軽鎖変異体のうちの６個以上に見られた。これらの３つの位置を、軽鎖におけるホットスポットと見なした。重鎖変異体をスクリーニングすると、条件的活性を有する２８個の重鎖変異体が見付かった。これらの２８個の重鎖変異体は、重鎖の８つの異なる位置にその突然変異を有した。それらの８つの位置のうちの３つは、２８個の重鎖変異体のうちの６個以上に見られた。これらの３つの位置を、重鎖におけるホットスポットと見なした。軽鎖変異体及び重鎖変異体の条件的活性は、ＥＬＩＳＡ分析によって確認した。
この例で生成された最良の条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４でのその活性に対するｐＨ６．０でのその活性が１７倍の差であった。加えて、条件的活性型抗体の多くが、７．４の正常生理的ｐＨと６．０の異常ｐＨとの間のｐＨで可逆の活性を有した。興味深いことに、ＥＬＩＳＡ分析によって５．０～７．４のｐＨ範囲で条件的活性型抗体の活性を試験したとき、この例で生成された条件的活性型抗体のほとんどが約５．５～６．５のｐＨで最適な結合活性を呈した。
この例で生成された条件的活性型抗体の活性はまた、全細胞を使用したＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析によっても確認し、ここではＣＨＯ細胞を使用して、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で抗体の抗原を発現させた。条件的活性型抗体をＣＨＯ細胞に加えることにより、結合活性を計測した。ＦＡＣＳ分析により、ｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０での条件的活性型抗体の選択性に関するＥＬＩＳＡ分析の結果に一般的な傾向が確認された。
実施例７：特殊緩衝液中における条件的活性型抗体の選択
本発明における進化させる工程によって生成した変異体抗体を、７．４の正常生理的ｐＨでの分析及び６．０の異常なｐＨでの分析に供した。両方の分析とも、ヒト血清に見られる重炭酸塩を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を使用して実施した。溶液中の重炭酸塩の濃度は、ヒト血清中の典型的な重炭酸塩濃度、すなわち生理的濃度であった。重炭酸塩を含有しない同じＰＢＳ溶液を使用して、比較試験を行った。
この例における変異抗体又は条件的活性型抗体の結合活性を計測するアッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、これは以下のとおり実施した：
１．ＥＬＩＳＡ前日：ＰＢＳで１ｕｇ／ｍｌの１００ｕｌの抗体Ａｂ－Ａ ＥＣＤ ｈｉｓタグ（２．０８ｍｇ／ｍｌ）抗原によってウェルをコーティングした。
３．抗体Ａｂ－Ａ－Ｈｉｓ抗原でコーティングした９６ウェルプレートから緩衝溶液を振り払い、ペーパータオルで拭き取って乾燥させた。
４．プレートを緩衝液Ｎ又はＰＢＳで３回洗浄した、
５．プレートを２００ｕｌの指定緩衝液によって室温で１時間ブロックした、
６．選択されたＣＰＥ／ＣＰＳ変異体及び野生型タンパク質をレイアウトに従い指定緩衝溶液中に７５ｎｇ／ｍｌに希釈した。緩衝溶液のｐＨは６．０又は７．４のいずれかに設定した（以下、「当該指定緩衝溶液」）、
６．緩衝液を振り払い、１００ｕｌの７５ｎｇ／ｍｌ試料をプレートレイアウトに従い各ウェルに加えた、
７．プレートを室温で１時間インキュベートした、
８．９６ウェルプレートから緩衝液を振り払い、ペーパータオルで拭き取った、
９．プレートをレイアウトに従い２００ｕｌの指定緩衝溶液で合計３回洗浄した、
１０．抗Ｆｌａｇ ＨＲＰを指定緩衝溶液中に１：５０００希釈で調製し、レイアウトに従い各ウェルに１００ｕｌの抗Ｆｌａｇセイヨウワサビ過酸化物（ＨＲＰ）を加えた、
１１．プレートを室温で１時間インキュベートした、
１３．プレートを２００ｕｌの指定緩衝溶液で合計３回洗浄した、
１４．プレートを５０ｕｌの３，３’，５，５；－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で１．５分間発色させた。
重炭酸塩を含有するＰＢＳ緩衝溶液における分析は、条件的活性型抗体の選択に関して有意に高い成功率をもたらしたことが分かった。加えて、重炭酸塩を含有するＰＢＳ緩衝溶液を使用して選択された条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０でのその活性の比がはるかに高い傾向があり、従って有意に高い選択性をもたらした。
さらに、選択された条件的活性型抗体（重炭酸塩を含むＰＢＳ緩衝溶液を使用）を、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中で試験したとき、ｐＨ７．０と比べたｐＨ６．０での条件的活性型抗体の選択性は有意に低下したことが確認された。しかしながら、このＰＢＳ緩衝溶液に生理的量の重炭酸塩を添加すると、同じ条件的活性型抗体の選択性が回復した。
別の分析において、選択された条件的活性型抗体を、重炭酸塩を添加したクレブス緩衝溶液で試験した。ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性のより高い比が、重炭酸塩を添加したこのクレブス緩衝溶液においても観察された。これは、少なくとも部分的には、クレブス緩衝溶液中の重炭酸塩の存在に起因した可能性があるものと思われる。
ＰＢＳ緩衝溶液中で重炭酸塩濃度をその生理的濃度未満の濃度に低下させると、７．４の正常な生理的ｐＨにおける条件的活性型抗体の活性が増加したことが観察された。ｐＨ７．４での条件的活性型抗体の活性の増加は、ＰＢＳ緩衝溶液中の重炭酸塩濃度の低下に関係することが観察された。
野生型抗体は、ｐＨ７．４で分析したとき、条件的活性型抗体について試験したＰＢＳ緩衝溶液中の同じ重炭酸塩濃度のいずれにおいてもその活性が同じままであったため、ＰＢＳ緩衝溶液中の重炭酸塩量の違いによる影響は受けなかった。
実施例８：異なる緩衝液における条件的活性型抗体の選択
本発明に係る進化させる工程によって生成した変異体抗体を、正常な生理的ｐＨ（７．４）でのＥＬＩＳＡ分析及び異常なｐＨ（６．０）でのＥＬＩＳＡ分析に供した。いずれのＥＬＩＳＡ分析も、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有クレブス緩衝液ベースの緩衝液、並びに重炭酸塩及びＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液ベースの緩衝液を含む種々の緩衝液を使用して実施した。
ＥＬＩＳＡアッセイは以下のとおり実施した：
１．ＥＬＩＳＡ前日：コーティング緩衝液（炭酸塩－重炭酸塩緩衝液）で１ｕｇ／ｍｌの１００ｕｌの抗体Ａｂ－Ａ ＥＣＤ ｈｉｓタグ（２．０８ｍｇ／ｍｌ）抗原によってウェルをコーティングした。
２．抗体Ａｂ－Ａ－Ｈｉｓ抗原でコーティングした９６ウェルプレートから緩衝溶液を振り払い、ペーパータオルで拭き取って乾燥させた。
３．プレートを２００ｕｌの２０種の緩衝液で３回洗浄した。
４．プレートを２００ｕｌの２０種の緩衝液によって室温で１時間ブロックした。
５．変異体及びキメラをレイアウトに従い２０種の緩衝液中７５ｎｇ／ｍｌに希釈した。
６．緩衝液を振り払い、１００ｕｌの希釈試料をプレートレイアウトに従い各ウェルに加えた。
７．プレートを室温で１時間インキュベートした。
８．９６ウェルプレートから緩衝液を振り払い、ペーパータオルを使用してプレートを拭き取って乾燥させた。
９．プレートを２００ｕｌの２０種の緩衝液で合計３回洗浄した。
１０．抗ｆｌａｇ ＩｇＧ ＨＲＰを２０種の緩衝液中に１：５０００希釈で調製した。各ウェルに１００μｌの抗ｆｌａｇ ＩｇＧ ＨＲＰ溶液を加えた。
１１．プレートを室温で１時間インキュベートした。
１２．プレートを２００ｕｌの２０種の緩衝液で合計３回洗浄した。
１３．プレートを５０ｕｌ ３，３’，５，５；－テトラメチルベンジジンで３０秒間発色させた。
重炭酸塩含有ＰＢＳ緩衝溶液中での分析を用いて選択された条件的活性型抗体は、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中での分析を用いて選択されたものとの比較において、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性の比がはるかに高かった。加えて、重炭酸塩が添加されたクレブス緩衝溶液も、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中での分析と比較したとき、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性の比がより高かった。望ましい条件的活性型抗体の選択に重炭酸塩が重要であるものと思われる。
実施例９：種々の緩衝液中における条件的活性型抗体の選択
この例では、ｐＨ６．０で野生型抗体よりも活性が高く、且つｐＨ７．４で野生型抗体よりも活性が低い、ある抗原に対する条件的活性型抗体をスクリーニングした。スクリーニング工程は以下の表２及び表３の緩衝液を使用して実施した。表２の緩衝液はクレブス緩衝液をベースとし、表２の第１列に示されるとおりの追加的な構成成分を加えたものであった。
Figure 0007064769000002
追加的な構成成分を含むＰＢＳ緩衝液をベースとする一部のアッセイ緩衝液を以下の表３に示した。表２及び表３の緩衝液中の構成成分は１リットルの緩衝液中に加えられたグラム単位の量で提供されることに留意されたい。しかしヒト血清の濃度は緩衝液の１０ｗｔ．％である。
Figure 0007064769000003
これらのアッセイ緩衝液によるＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングを実施した。ＥＬＩＳＡアッセイは実施例７～８に記載されるとおり実施した。１０種のアッセイ緩衝液の各々に対して選択された条件的活性型抗体を以下の表４に示した。ＯＤ ４５０吸光度はＥＬＩＳＡアッセイの結合活性と逆相関する。
Figure 0007064769000004
緩衝液８及び９を用いて、選択された条件的活性型抗体の一部の選択性を確認し、図１に示すとおり、それらがｐＨ７．４と比べてｐＨ６．０で実に所望の選択性を有することが分かった。異なる緩衝液を用いると、条件的活性型抗体の選択性に影響が及んだことに留意されたい。
実施例１０：種々の緩衝液中における条件的活性型抗体の活性
それぞれ２つのモノクローナル抗体（親抗体としてのｍＡｂ ０４８－０１及びｍＡｂ ０４８－０２）から進化させた条件的活性型抗体の活性を２つの異なる緩衝液で計測した（図２）。これらの２つの緩衝液はリン酸緩衝液（条件ＩＶ）及びクレブス緩衝液（条件Ｉ）であった。ｍＡｂ ０４８－０１からは６つの条件的活性型抗体：ＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０１、ＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０２、ＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０３、ＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０４、ＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０５、及びＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０６を進化させた。ｍＡｂ ０４８－０２からは３つの条件的活性型抗体：ＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０７、ＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０８、及びＣＡＢ Ｈｉｔ ０４８－０９を進化させた。
この試験から、条件的活性型抗体の選択性（ｐＨ６．０におけるアッセイの活性の、ｐＨ／７．４におけるアッセイの活性に対する比）がアッセイに使用した緩衝液の影響を受けたことが示された。野生型ｍＡｂ ０４８－０２から進化させた条件的活性型抗体は、リン酸緩衝液と比べてクレブス緩衝液中で有意に高い選択性を示した（図２）。
実施例１１：条件的活性型抗体の選択性及び重炭酸塩
実施例１０では、リン酸緩衝液中（条件ＩＶ）よりもクレブス緩衝液中（条件Ｉ）で条件的活性型抗体のより高い選択性が観察された。このことから、実施例１０で観察されたこのより高い選択性に最も大きい寄与をなしたクレブス緩衝液中の構成成分を同定することになった。クレブス緩衝液から様々な構成成分を一つずつ抜いて得られる緩衝液中で１つの条件的活性型抗体の選択性を再試験した（図３、左側のバー群）。完全なクレブス緩衝液を使用したとき、条件的活性型抗体の選択性は高く、約８のｐＨ６．０／７．４活性比である。構成成分Ａ～Ｆを各々クレブス緩衝液から抜いたとき、条件的活性型抗体の選択性が失われることはなかったが、構成成分Ｃ及びＤの各々を抜いたとき条件的活性型抗体は選択性が低くなった。しかしながら、クレブス緩衝液から構成成分Ｇ（重炭酸塩）を抜いたとき、条件的活性型抗体の選択性は完全に失われた。図３を参照。これは、重炭酸塩がクレブス緩衝液中における条件的活性型抗体の高い選択性に少なくとも部分的に（ｐａｒｔｉｃａｌｌｙ）関与していることを示している。
次に、重炭酸塩を有しないリン酸緩衝液中（条件ＩＶ）で同じ条件的活性型抗体の選択性を計測し、リン酸緩衝液中では条件的活性型抗体の選択性が完全に失われたことが観察された。リン酸緩衝液に重炭酸塩を添加すると、条件的活性型抗体の選択性はクレブス緩衝液で観察されるレベルに回復した。これにより、この条件的活性型抗体の選択性には重炭酸塩が必要であることが確認された。
実施例１２：重炭酸塩はｐＨ７．４における結合を抑制する
本例では、３つの条件的活性型抗体（ＣＡＢ Ｈｉｔ Ａ、ＣＡＢ Ｈｉｔ Ｂ、及びＣＡＢ Ｈｉｔ Ｃ）について、０～生理的重炭酸塩濃度（約２０ｍＭ、図４）の範囲の異なる濃度の重炭酸塩を有する緩衝液中でｐＨ７．４における結合活性を計測した。重炭酸塩の濃度が０から生理的濃度に増加するに従い、ｐＨ７．４における３つ全ての条件的活性型抗体の結合活性が用量依存的に低下したことが観察された（図４）。他方で、野生型抗体の結合活性は重炭酸塩の影響を受けなかった。この試験から、重炭酸塩の存在下での条件的活性型抗体の選択性が、少なくとも一部には、重炭酸塩との相互作用に起因する条件的活性型抗体のｐＨ７．４における結合活性の喪失による可能性が高いことが示された。
実施例１３：種々の緩衝液中における条件的活性型抗体のＲＯＲ２に対する活性
重炭酸ナトリウムを含有するアッセイ溶液を用いて選択した（実施例９に記載されるとおり）ＲＯＲ２に対する条件的活性型抗体を種々の緩衝液で試験した：ＣＡＢ－Ｐは、６．０又は７．４のｐＨで使用した標準リン酸生理食塩緩衝液（ＰＢＳ緩衝液）であった；ＣＡＢ－ＰＳＢは、１５ｍＭの重炭酸ナトリウムを補足したｐＨ６．０又は７．４のＰＢＳ緩衝液であった；及びＣＡＢ－ＰＳＳは、１０ｍＭの硫化ナトリウム九水和物を補足したｐＨ６．０又は７．４のＰＢＳ緩衝液であった。
これらの条件的活性型抗体の活性は、以下のＥＬＩＳＡプロトコルに従い計測した：
１．ＥＬＩＳＡ前日：プレートを４℃のＰＢＳ中１００ｕｌの１ｕｇ／ｍｌ抗原によって一晩コーティングする。
２．プレートをプレートレイアウトに従い２００ｕｌのＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、又はＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液で２回洗浄する。
３．プレートをプレートレイアウト（ｐａｌｔｅ ｌａｙｏｕｔ）に従い２００ｕｌのＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、又はＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液によって室温で１時間ブロックする。
４．抗体試料及び陽性対照をプレートレイアウトに指示されるとおりＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、又はＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液に希釈する。
５．９６ウェルプレートからブロッキング緩衝液を振り払い、ペーパータオルで拭き取って乾燥させる。
６．プレートレイアウトに従い１００ｕｌの希釈抗体試料、陽性対照又は陰性対照を各ウェルに加える。
６．プレートを室温で１時間インキュベートする。
７．プレートレイアウト（ｐａｌｔｅ ｌａｙｏｕｔ）に従いＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、又はＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液中に二次抗体を調製する。
８．９６ウェルプレートから緩衝液を振り払い、ペーパータオルで拭き取って乾燥させる。
９．プレートをプレートレイアウトに従い２００ｕｌのＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、又はＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液によって合計３回洗浄する。
１０．プレートレイアウトに従いＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、又はＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液中の希釈二次抗体を各ウェルに加える。
１１．プレートを室温で１時間インキュベートする。
１２．９６ウェルプレートから緩衝液を振り払い、ペーパータオルで拭き取って乾燥させる。
１３．プレートをＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、又はＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液によって合計３回洗浄する。
１４．３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を室温に至らせる。
１５．プレートから緩衝液を振り払い、ペーパータオルで拭き取って乾燥させる。
１６．５０ｕｌのＴＭＢ基質を加える。
１７．５０ｕｌ １Ｎ ＨＣｌで発色を停止させる。発色時間は３分であった。
１８．プレートリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍで読み取る。
ＲＯＲ２に対するこれらの条件的活性型抗体の活性を図７に示す。条件的活性型抗体は、ＣＡＢ－ＰＳＢ緩衝液中でｐＨ７．４よりもｐＨ６．０において高い活性、即ちｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０における選択性を示した。この選択性は幾つかの条件的活性型抗体についてＣＡＢ－Ｐ緩衝液中で失われ、又は大幅に低下した。しかしこの選択性はまた、ＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液中でもｐＨ７．４と比べてｐＨ６．０で観察された。逆に、野生型抗体はいずれの緩衝液でも比較的最小限の選択性を示したか、又は選択性を示さなかった。
本例は、試験した条件的活性型抗体のＲＯＲ２に対する条件的結合の媒介に関して二硫化物が重炭酸塩と同様の機能を有することを実証している。
実施例１４：種々の緩衝液中における条件的活性型抗体のＡｘｌに対する活性
重炭酸ナトリウムを含有するアッセイ溶液を用いて選択した（実施例９に記載されるとおり）Ａｘｌに対する条件的活性型抗体を種々の緩衝液：ＣＡＢ－Ｐ、ＣＡＢ－ＰＳＢ、及びＣＡＢ－ＰＳＳ（実施例１３に記載されるとおり）で試験した。これらの条件的活性型抗体のＡｘｌに対する活性を、実施例１３に記載されるものと同じＥＬＩＳＡプロトコルを用いて計測した。これは図８に示す。条件的活性型抗体は、ＣＡＢ－ＰＳＢ緩衝液中でｐＨ７．４よりもｐＨ６．０において高い活性、即ちｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０における選択性を示した。この選択性はこれらの条件的活性型抗体についてＣＡＢ－Ｐ緩衝液中で失われ、又は大幅に低下した。選択性はまた、ＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液中でもｐＨ７．４と比べてｐＨ６．０で観察された。逆に、野生型抗体はいずれの緩衝液でも本質的に選択性を示さなかった。
本例もまた、試験した条件的活性型抗体のＡｘｌに対する条件的結合の媒介に関して二硫化物が重炭酸塩と同様の機能を有したことを実証している。
実施例１５：二硫化物イオンを含むアッセイ溶液中におけるＡｘｌに対する条件的活性型抗体の生成
この例で使用したアッセイ溶液は以下のとおり作製した：
ＣＡＢ－ＰＳＢ緩衝液ｐＨ６．０（１％ＢＳＡ含有）
１．１５ｍＭの最終濃度である１．２６ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５７６１）をＰＢＳ－Ｃｅｌｌｇｒｏに添加する
２．ＢＳＡを１％の最終濃度（１リットル中）となるように添加する（ＭＰ、カタログ番号０２１８０５４９９１）
３．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整する
４．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
ＣＡＢ－ＰＳＢ緩衝液ｐＨ７．４（１％ＢＳＡ含有）
１．１５ｍＭの最終濃度である１．２６ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５７６１）をＰＢＳ－Ｃｅｌｌｇｒｏに添加する
２．ＢＳＡを１％の最終濃度（１リットル中）となるように添加する（ＭＰ、カタログ番号０２１８０５４９９１）
３．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを７．４に調整する
４．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
１０ｍＭの二硫化物を含むＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液ｐＨ６．０（１％ＢＳＡ含有）
１．１０ｍＭの最終濃度である２．４ｇ／Ｌ硫化ナトリウム九水和物（Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）（ＡＣＲＯＳ、番号４２４４２５０００）をＰＢＳ－Ｃｅｌｌｇｒｏに添加する
２．ＢＳＡを１％の最終濃度（１リットル中）となるように添加する（ＭＰ、カタログ番号０２１８０５４９９１）
３．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整する
４．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
１０ｍＭの二硫化物を含むＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液ｐＨ７．４（１％ＢＳＡ含有）
１．１０ｍＭの最終濃度である２．４ｇ／Ｌ硫化ナトリウム九水和物（Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）（ＡＣＲＯＳ、番号４２４４２５０００）をＰＢＳ－Ｃｅｌｌｇｒｏに添加する
２．ＢＳＡを１％の最終濃度（１リットル中）となるように添加する（ＭＰ、カタログ番号０２１８０５４９９１）
３．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを７．４に調整する
４．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
１ｍＭの二硫化物を含むＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液ｐＨ６．０（１％ＢＳＡ含有）
１．１／１０倍希釈のＢｉｏＡｔｌａ ＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液ｐＨ６．０（１％ＢＳＡ含有）１０Ｍ、これは１ｍＭの最終濃度である
２．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整する
３．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
１ｍＭの二硫化物を含むＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液ｐＨ７．４（１％ＢＳＡ含有）
１．１／１０倍希釈のＢｉｏＡｔｌａ ＣＡＢ－ＰＳＳ緩衝液ｐＨ７．４（１％ＢＳＡ含有）１０Ｍ、これは１ｍＭの最終濃度である
２．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを７．４に調整する
３．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
ＣＡＢ－Ｐ緩衝液ｐＨ６．０（１％ＢＳＡ含有）
１．ＢＳＡを１％の最終濃度（１リットル中）となるようにＰＢＳ－Ｃｅｌｌｇｒｏに添加する
２．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整する
３．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
ＣＡＢ－Ｐ緩衝液ｐＨ７．４（１％ＢＳＡ含有）
１．ＢＳＡを１％の最終濃度（１リットル中）となるようにＰＢＳ－Ｃｅｌｌｇｒｏに添加する
２．撹拌１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを７．４に調整する
３．４℃で保存する。使用前にｐＨを再度確認する。必要に応じてｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整する
本発明の方法をＡｘｌに対する野生型抗体に対して実施することにより、前出の実施例に記載されるものと同様のプロトコルを用いて変異抗体を作製した。１０ｍＭ二硫化物イオンを含有するｐＨ６．０又はｐＨ７．４のアッセイ溶液を使用して変異抗体をアッセイし、条件的活性型抗体を選択した。選択された条件的活性型抗体（ＢＡＰ０６３．１－ＣＡＢ１－８）を図９に示す。
選択された条件的活性型抗体は、１０ｍＭの二硫化物濃度を有するアッセイでアッセイしたとき、Ａｘｌに対してｐＨ７．４よりもｐＨ６．０において高い結合活性を有した。しかしながら、僅か１ｍＭの二硫化物濃度のアッセイ溶液では、選択された条件的活性型抗体の１つを除く全てについて、ｐＨ６．０とｐＨ７．４との間の活性の差が大幅に小さくなった。図９を参照。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には複数形の参照が含まれることに留意しなければならない。さらに、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及び「～で構成される（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ）」も同義的に用いられ得る。
特に指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、分子量、百分率、比、反応条件など、成分、特性の量を表す全ての数値は、全ての例において、用語「約」が存在するか否かに関わらず、用語「約」によって修飾されているものと理解されるべきである。従って、反する旨が示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは近似であり、本開示によって達成しようとする所望の特性に応じて変わり得る。最低限でも、且つ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとすることなしに、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効桁の数字を踏まえて、且つ通常の丸め法を適用することによって解釈されなければならない。本開示の広い範囲を示す数値の範囲及びパラメータは近似であるにも関わらず、具体的な例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、そのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる特定の誤差を本質的に含む。
本明細書に開示される各成分、化合物、置換基又はパラメータは、単独での使用、又は本明細書に開示される他のあらゆる成分、化合物、置換基又はパラメータの１つ以上と組み合わせた使用について開示されるものと解釈されるべきであることが理解されなければならない。
また、本明細書に開示される各成分、化合物、置換基又はパラメータの各量／値又は量／値の範囲は、本明細書に開示される任意の他の１つ又は複数の成分、１つ又は複数の化合物、１つ又は複数の置換基又は１つ又は複数のパラメータについて開示される各量／値又は量／値の範囲との組み合わせでも開示されるものと解釈されるべきであること、従って、本明細書に開示される２つ以上の成分、化合物、置換基又はパラメータの量／値又は量／値の範囲の任意の組み合わせも本記載の目的上、互いに組み合わせて開示されることも理解されなければならない。
さらに、本明細書に開示される範囲の各々は、同じ有効桁数を有する開示される範囲内にある具体的な各値の開示として解釈されるべきであることが理解される。従って、１～４の範囲は、値１、２、３及び４の明示的な開示と解釈されるべきである。さらに、本明細書に開示される各範囲の各下限は、同じ成分、化合物、置換基又はパラメータについての本明細書に開示される各範囲の各上限及び各範囲内にある具体的な各値と組み合わせて開示されるものと解釈されるべきであることが理解される。従って、この開示は、各範囲の各下限を各範囲の各上限又は各範囲内の具体的な各値と組み合わせることによるか、又は各範囲の各上限を各範囲内の具体的な各値と組み合わせることによって得られる全ての範囲の開示と解釈されるべきである。
さらに、説明又は例に開示される成分、化合物、置換基又はパラメータの具体的な量／値は、範囲下限又は上限のいずれかの開示として解釈されるべきであり、従って本出願の他の場所に開示される同じ成分、化合物、置換基若しくはパラメータの任意の他の範囲下限若しくは上限、又は具体的な量／値との組み合わせで、成分、化合物、置換基又はパラメータの範囲を形成することができる。
本明細書で言及される文献は全て、本明細書によって全体として、又はそれらが具体的に頼りとされた開示を提供する代わりに参照により援用される。本出願人らは、開示されるいかなる実施形態も公衆に提供する意図はなく、及び任意の開示される変形例又は代替例が字義的に特許請求の範囲に含まれないこともあり得る程度まで、それらは均等論の下で本明細書の一部と見なされる。
しかしながら、前述の説明に本発明の数値的な特徴及び利点が本発明の構造及び機能の詳細と共に示されているとしても、本開示は例示的なものに過ぎず、詳細、特に要素の形状、サイズ及び配置の点で、添付の特許請求の範囲を表現している用語の広義の一般的な意味によって示される最大限の範囲まで本発明の原理の範囲内で変更形態をなし得ることが理解されるべきである。

Claims (16)

  1. 親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントから条件的活性型抗体、条件的活性型一本鎖抗体または条件的活性型抗体フラグメントを作製する方法であって、
    （ｉ）少なくとも１つのアミノ酸を変異させることにより前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントを進化させて、１つ以上の変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントを作製する工程であって、抗体フラグメントが抗原のエピトープに結合可能なＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）2、Ｆｖ、およびＳＣＡフラグメントから選択される、工程；
    （ｉｉ）前記１つ以上の変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントを、１００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量及び第１のｐＨから最大４ｐＨ単位離れたｐＫａを有する小分子又はイオンの存在下で第１のｐＨのもとで前記１つ以上の変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントの結合活性のための第１のＥＬＩＳＡアッセイ、および前記小分子又はイオンの存在下でさらに第２のｐＨのもとで前記１つ以上の変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントの結合活性のための第２のＥＬＩＳＡアッセイに供する工程；
    （ｉｉｉ）第１のアッセイにおける結合活性の、第２のアッセイにおける結合活性に対する比が少なくとも３．０である変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントを選択する工程；および
    （ｉｖ）小分子またはイオンの非存在下で結合活性がｐＨ依存性ではない、工程（ｉｉｉ）で選択された１つの変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントを選択することによって条件的活性型抗体、条件的活性型一本鎖抗体または条件的活性型抗体フラグメントを得る工程
    を含み、
    前記小分子又はイオンおよびその濃度が、０．０５～２．６ｍＭヒスチジン、０．３～１μＭヒスタミン、１～２０μＭ水素付加アデノシン二リン酸、１～２０μＭ水素付加アデノシン三リン酸、３０μＭから１２０μＭクエン酸イオン、３ｍＭから２００ｍＭ重炭酸イオン、１００μｍから１００ｍＭ酢酸イオン、１００μｍから１００ｍＭ乳酸イオン、１０ｍＭから１００ｍＭ二硫化物イオン、１００μｍから１００ｍＭ硫化水素及びこれらの任意の組み合わせから選択される、方法。
  2. 前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントが抗体の重鎖又は軽鎖であり、及び前記少なくとも１つのアミノ酸が前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントの相補性決定領域にある、請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも１つのアミノ酸が前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントのＦｃ領域にある、請求項２に記載の方法。
  4. 前記進化工程が、前記Ｆｃ領域を別個の抗体の可変領域に置換して二重特異性抗体を形成することを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記進化工程が、前記Ｆｃ領域を別個の抗体の可変領域に置換して一本鎖抗体を形成することを含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つのアミノ酸が前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントのフレームワーク領域にある、請求項２に記載の方法。
  7. 前記進化工程が、置換、挿入、欠失、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程（ｉｉ）が前記１つ以上の変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントを、前記小分子又はイオンの非存在下で第１のｐＨのもとで前記１つ以上の変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントの結合活性のためのアッセイ、および前記小分子又はイオンの非存在下で第２のｐＨのもとで前記１つ以上の変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントの結合活性のためのアッセイに供することを更に含み；
    工程（ｉｉｉ）前記小分子またはイオンの非存在下でｐＨ依存性でない結合活性を有する変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントを選択することを更に含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記第１のアッセイにおける結合活性の、前記第２のアッセイにおける結合活性に対する比が少なくとも４．０である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記小分子又はイオンが、重炭酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、二硫化物イオン、硫化水素、アンモニウムイオン及び硫化ナトリウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記小分子又はイオンが第１のｐＨから最大０．５、１、２、３又は４ｐＨ単位離れたｐＫａを有する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記小分子又はイオンが第１のｐＨと第２のｐＨの間のｐＫａを有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記小分子又はイオンが６．２より大きく７．２未満のｐＫａを有する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記第１のｐＨが５．５～７．２の範囲にあり、前記第２のｐＨが７．２～７．６の範囲にある、請求項１に記載の方法。
  15. 前記抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントが、前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントから進化した天然に存在しない変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
  16. 前記変異抗体、変異一本鎖抗体または変異抗体フラグメントが、前記親抗体、親一本鎖抗体または親抗体フラグメントよりも高い割合の荷電アミノ酸残基を有する、請求項１５に記載の方法。
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