PT99431A - Processo para a preparacao de novos pro-farmacos citotoxicos activos - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NQVOS PRÕ-FÃRMACOS CEFALOSPORlNICOS CONVERTÍVEIS PELA | !>-LACTAMASE EM FÂRMACOS CITOTÕXICOS ACTIVOS"

DESCRIÇÃO

Area técnica A presente invenção refere-se, de um modo geral, a novos pró-fármacos e a um método para libertação destes no sitio das células tumorais quando são convertido em agentes ci-totóxicos activos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a pró-fármacos cefalosporínicos, que quando administra dos com um conjugado β-lactamase-anticorpo específico do tumor, são convertidos, no sítio do tumor, em fármacos citotóx_i cos activos.

Antecedentes

Os sistemas de libertação de fãrmaco alvejados propor cionam um mecanismo para a libertação de agentes citotóxicos directamente nas células cancerosas. A libertação selectiva de agentes citotóxicos nas células tumorais ê desejável porque a administração sistémica destes agentes frequentemente extermina células normais do organismo, assim como as células tumorais que se deseja eliminar. Os sistemas de libertação de fár maco antitumoral actualmente usados, utilizam habitualmente um agente citotóxico conjugado com um anticorpo específico do tumor para formarem um imunoconjugado. Este imunoconjugado liga-se ãs células do tumor e portanto "liberta" o agente ci-totóxico no sítio do tumor. Os imunoconjugados utilizados nestes sistemas alvo incluem conjugados de anticorpos [cônsul, tar, por exemplo, Baldwin et al., Lancet (15 de Março de 1986) 603-605 ] e conjugados de toxinas-anticorpo [ver, por exemplo, Thorp, em Monoclonal Antibodies 84; Biological and Clinicai Appllications, (A. Oinchera et al., eds.) 1985, pp. 475-506. Têm sido utilizados anticorpos policlonais e monoclo-nais nestes imunoconjugados [consultar, por exemplo, Ohkawa et al., Câncer Immunol. Immunother., 23 (1986) 81; Rowland et al., Câncer Immunol. Immunother., 21 (1980) 183]. Os fármacos uti. lizados nestes imunoconjugados incluem a daunomicina [consultar, por exemplo, Gallego et al·., Ins. J. Câncer, 33 (1984) 737; Armon et al., Immunological Rev., 62 (1982) 5]; mexotrexato [Endo et al., Câncer Research, 47 (1987) 1076]; mitomicina C (Onkawa et al., supra), e vindesine (Rowland et al., supra) .

As toxinas utilizadas nos conjugados toxina-anticorpo incluem toxinas bacterianas como, por exemplo, ricin [consultar, por exemplo, Moolten et al., Immunol. Rev. 62, (1982) 47.

Apesar da grande investigação dirigida para aplicação de imunoconjugados com fins terapêuticos têm surgido diversas limitações relacionadas com estas vias de libertação (consultar, por exemplo, Embleton, Biochem. Society Transactions, 14: 393, 615th Meeting, Belfast, 1986). Por exemplo, a grande quantidade de fármacos que é necessário libertar nas células tumorais salvo para efectuar a morte das células é frequentemente inatingível devido às limitações impostas pelo número de antigénios associados a tumor na superfície celular e o número de moléculas de fármaco que devem ser ligados a uma dada molé cuia de anticorpo. Esta limitação tem conduzido ao uso de

-3- agentes citotóxicos raais potentes como, por exemplo, toxinas vegetais, nestes conjugados, e ao desenvolvimento de conjuga dos anticorpo-fármaco ligados a polímero tendo rácios de multiplicidade de fármaco muito altos (consultar, por exemplo, Thorpe, supra, p.p. 475-506 e Baldwin et al., in Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985), pp. 215-231). Contudo, ainda com grandes rácios de fármaco ou com a utilização de toxinas potentes, muitos conjugados ainda apre sentam actividade citotóxica subóptima e são incapazes de efec tuar a morte total nas doses às quais todos os sítios antigé-nios disponíveis estão saturados.

Também se tem reconhecido que a actividade citotóxica dum imunoconjugado frequentemente depende da sua captação, me diada pelo componente anticorpo do conjugado, pelas células tumorais [consultar, por exemplo, J. M. Lambert et al., J.

Biol. Chem., 260 (1985) 12035]. Esta internalização é crucial quando se utiliza um conjugado fãrmaco-anticorpo no qual o fár maco tem um sítio intracelular de actuação ou quando se utili za conjugados toxina-anticorpo.

Contudo, a grande maioria de antigénios associados a tumores e, portanto, os conjugados fármaco-anticorpo ou toxina-anticorpo ligados a esses antigénios, não são internaliza-dos. Aqueles conjugados que são internalizados, frequentemente são transportados para o lisosoma da célula onde o fármaco ou a toxina se degradam [ver Vitetta et al., Science, 238 (1987) 1098] .

Deste modo, embora o conjugado fármaco-anticorpo ou toxina-anticorpo possa apresentar características de ligação ao tumor excedentes, pode, no entanto, ter uma utilidade cito ! -4- ! -4- ί tóxica limitada devido a uma incapacidade para alcançar o sitio de actuação dentro da célula.

Além disso, está provado que as populações de células de tumores, são frequentemente heterogéneas no que se refere ã expressão de antigénios [consultar, por exemplo, Albino et al., J. Exp. Med., 154 (1981) 1764]. Além disso, ficou demons trado que as células de tumor positivas a antigénio podem originar uma progénie antigénio-negativa [consultar, por exemplo, Yeh et al., J. Immunol. 126 (1981) 1312]. Deste modo, qualquer população de células tumorais terá um certo número de células que não possuem o antigénio para o qual um dado imunoconjugado é específico. 0 imunocon jugado não estará portanto apto a li^ gar-se a estas células e a induzir a sua exterminação.

Devido a estes inconvenientes, os sistemas de fármacos antitumorais ou de libertação de toxinas actualmente utilizados têm tido sucesso limitado, especialmente quando utilizados para tratamento in vivo.

Além dos imunoconjugados citados anteriormente, têm sido estudados in vitro conjugados anticorpo-enzima, em associa ção com um segundo enzima não alvejado, para a conversão de io deto ou de arsphenamine nas suas formas tóxicas com o objecti-vo de aumentar a citotoxicidade mediada pelo anticorpo [cônsul, tar, por exemplo, Parker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 72 (1975) 338; Philpott et al., Câncer Research, 34 (1974) , 2159] .

De acordo com estes estudos in vitro, a enzima, gluco se oxidase, é ligada a um anticorpo e utilizada em associação com uma enzima de peroxidase não alvejada para converter iodeto ou arsphenamine em iodeto citotóxico ou arsenical citotõxico , respectivamente. Esta via, portanto, requer não apenas alve jar células tumorais com glucose oxidase, com anticorpo, mas também a presença no sítio do tumor de dois outros eventos não alvejados. A probabilidade de todos estes três agentes estarem presentes in vivo no sítio do tumor simultaneamente é pequena. A patente de invenção canadiana NQ 1 216 791 descreve a conjugação com um anticorpo onde uma enzima capaz de libertar iões amónio a partir dos substratos. Neste caso, diz-se que os iões amónio potenciam a acção citotóxica de certas imuno-tóxinas alvejadas para sítios de tumores. 0 pedido de patente de invenção europeu NQ 84302218.7, descreve um método para o tratamento de uma população de célu las doentes, tal como um tumor, em que é utilizado um anticor po para alvejar um antigénio não metabolizável nas células tu morais. 0 antigénio acumula-se pelo menos numa certa percentagem das células do tumor, que depois são lisadas para liber tar o antigénio em uma matriz formada no sítio do tumor e que captura a fibronectina uoíqua. Administra-se um ligado conten do iodo, que é específico e que se ligará ao antigénio fixado na matriz. 0 iodo citotóxico actua de modo a matar as células do tumor naquele sítio. Também se sugere a utilização de um conjugado de anticorpo para uma enzima alvo no sítio do tumor e a adição de um substrato não letal que a enzima é capaz de converter em material citotóxico (consultar, o pedido de paten te de invenção europeia NQ 84302218.7, pp. 34-35). Contudo, este pedido de patente de invenção não faz qualquer referência ã forma de realizar aquele aspecto. Identicamente, Hellstrom et al., em Controlled Druq Delivery, Robinson and Lee (edito- 1 1

res), 2â ed., 1987, pãg. 639, sugerem que numa outra via serão os fãrmacos que não são tóxicos até serem activados por um agente (por exemplo, uma enzima) localizado em um tumor... A patente de invenção norte-americana NO 4 975 278, incorporada aqui como referência, proporciona um método para a libertação de agentes citotóxicos nas células tumorais mediante a utilização conjunta de conjugados de anticorpo-enzi. ma e de pró-fármacos. De acordo com esta invenção, uma enz_i ma que é capaz de converter um pró-fãrmaco com pouca ou nenhu ma citotoxicidade num fármaco com actividade citotóxica é con jugado com um anticorpo específico do tumor. Este conjugado anticorpo-enzima é administrado a um hospedeiro mamífero con tendo um tumor e liga-se, devido à especificidade do anticor po, à superfície daquelas células tumorais que possuem o ant_i génio do tumor para o qual o anticorpo ê específico. O pró--fármaco é administrado ao hospedeiro, em seguida, e é conver tido no sitio do tumor pela acção da enzima ligada ao anticor po, num fármaco com maior actividade citotóxica.

As mostardas azotadas desde há muito conhecidas como agentes citotóxicos (consultar, por exemplo, Stock, in Drug Design, E. J., Ariens, ed., Nova Iorque, Academic Press, 1971, vol. II, pp. 532-571). Benn et al., J. Chem. Soc,, (1961) , 2365, prepararam uma diversidade de aminas, incluindo ureta-nas e ureias, a partir de N,N-di-21-cloroetil-para-fenileno-diamina que são úteis para reacções com vários grupos funcionais que têm valor potencial para ligação de mostardas azotadas e uma grande variedade de outras unidades. A ligação do grupo uretana, que atrai electrões desactiva a mostarda azotada de grande toxicidade. A reactivação da mostarda azota- -7- -7-

da no sitio do tumor pode ocorrer quando a uretana é decompo^ to por fissão do éster ou da ligação peptídica.

Mobashery, et al., [J. Am. Chem. Soc., 108 (1986) 1685] descrevem a utilização de [k -lactamases existentes em bacté-

para hidro rias resistentes aos antibióticos lisar derivados cefalosporina-toxoforo para efectuar a libertação do toxoforo dentro da bactéria.

Mobashery et al., [J^ Biol. Chem., 261 (1986) 7879] sintetizaram um agente antibacteriano constituído pelo pépti-do antibiótico, ΛCl-Lala- μCl-Lala ligado através de um és- ter ao núcleo cefem, de cefalosporina. A cisão hidroll- tica do anel

téria liberta o substituinte C^q ligado ao heteroátomo. A descrição geral da química das cefalosporinas é feita por Abraham, Quarterly reviews - Chemical Society, 21 (1967) 231 e Abraham et al., em Cephalosporins and Penincilins; Chemistry and Biology, E. H. Flynn, ed-, Academic Press., N. Y., 1971, pp. 1-26. A patente de invenção norte-americana NQ 3 484 437 descreve os derivados do ácido cefalosporânico formados pela reacção de um sal desacilado de cefalosporina com isocianatos para se obterem carbamatos. A patente de invenção norte-americana NO 3 355 452 descreve os derivados do ácido O-desacetil-O-carbamoil-7-acil. amino-cefalosporânico, do ácido 7-amino cefalosporânico, em que o grupo 7-N-acilo é um radical ácido carboxllico e o grupo CO está ligado a um átomo de carbono.

Descrição da Invenção -8- -8-

A presente invenção baseia-se na descoberta de novos pró-fármacos relacionados com a cefalosporina, capazes de se converterem em agentes anti-tumorais no sítio do tumor utili_ zando um conjugado anticorpo-^ -lactamase. 0 anticorpo actua contra um antigénio tumoral presente na superfície do tipo de tumor específico alvejado. A presente invenção proporciona cefalosporinas que são pró-fármacos de fórmula geral

(I) na qual Q representa um átomo de hidrogénio, um grupo pro-tector do radical amino, vulgarmente utilizado na síntese de cefalosporinas, ou um grupo acilo de antibiótico 7-acilaminocefalosporina conhecido; L representa uma ligação directa ou um grupo de fórmula geral -S-ÍCI^) - na qual n representa o número inteiro 2, 3 ou 4; R representa um agente capaz de exercer um efeito citotóxico sobre célu las tumorais quando libertado pelo referido pró-

-fármaco cefalosporínico; e m

L representa zero ou o número inteiro 1, com a condição de m representar o número inteiro 1 quando representa uma ligação directa e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Para os fins da presente invenção a natureza do subs-tituinte representado por Q não é crítica, porque o radical da cefalosporina serve como veículo do fármaco citotóxico e não contribui para o efeito terapêutico do fármaco. Assim, Q pode representar, por exemplo, um átomo de hidrogénio, um grupo protector correntemente utilizado na química das cefa-losporinas ou um substituinte de antibióticos cefalosporinas conhecidos. Os exemplos deste último incluem, mas não exclusivamente, fenilacetilo, 2-tienilacetilo, ¢( -hidroxifenilace tilo, fenilglicilo, p-hidroxifenilglicilo e (2-amino-4-tiazo-lil)-(metoxiimino)-acetilo.

Os compostos citotóxicos apresentam pelo menos um gru po funcional disponível para modificação química para proporcionar um pró-fármaco cefalosporínico. Geralmente, estes gru pos funcionais são escolhidos entre grupos amina, carboxilo e hidroxilo, de tal forma que a ligação entre o agente citotóxi. co e o componente cefalosporínico seja do tipo carbamato, anvi da, éster ou carbonato.

Em um aspecto desta invenção proporciona-se, como uma subclasse de compostos de fórmula geral (I), pró-fármacos cefa losporínicos de fórmula geral (II) na qual o agente citotóxico se liga ao núcleo da cefalosporina através de um grupo carbama to ou amida. -10-

na qual Q, L e m têm os significados definidos para a fórmula geral (I); e NR representa um fármaco citotóxico contendo azoto cl ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em outro aspecto da presente invenção proporcionam-se pró-fármacos de cefalosporina-mitomicina de fórmula geral

(Ha) na qual -U- -U-

na qual Q tem o significado definido antes para a fórmula geral (I); e representa um átomo de azoto ou um grupo alquilo

Em um outro aspecto da presente invenção apresenta-se um método para a libertação dum agente citotóxico em células de tumor mediante a administração de uma quantidade com eficácia farmacêutica de pelo menos um conjugado anticorpo-n- -lactamase contendo um anticorpo que reage com um antigénio na superfície das células tumorais. Também é administrada uma quantidade com eficácia farmacêutica de um pró-fármaco cefaloss porinico, sendo este constituído por cefalosporina ligada ao agente citotóxico.

Em um aspecto alternativo, a presente invenção refere--se a um método de libertação de um agente citotóxico em células tumorais, cuja região de ligação ao antigénio de um anticorpo que reage com o antigénio associado ao tumor se liga pe

lo menos a uma parte com actividade funcional e é administrado com uma quantidade eficaz do ponto de vista farmacêutico de um pró-fármaco cefalosporínico.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de tumores em mamíferos que compreende o passo de administração a um mamífero de uma quanti^ dade com eficácia farmacêutica de pelo menos um conjugado an ti-corpo- -lactamase e uma quantidade com eficácia farmacêu tica de pelo menos um pró-fármaco cefalosporínico.

Estes e outros aspectos desta invenção ocorrem facilmente aos especialistas na matéria. “12 ~ “12 ~

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 representa as estruturas dos novos pró-fár macos de acordo com a presente invenção, Q representa um grupo fenilacetilo ou tienilacetilo; n representa 1 ou 2. A Figura 2 representa um pró-fármaco de mostarda cefa losporínica representativo iCM) e a conversão deste num agente com actividade citotóxica, mostarda-fenilenodiamina (PDM). A Figura 3 representa a cinética da hidrólise de CM catalisada por amostras não purificadas de ^ -lactamases de E. coli e B. cereus. A Figura 4 representa a citotoxicidade de CM e de PDM, administrados isoladamente, comparados com CM administrado com ^-lactamases de E. coli não purificadas. Em 4(A), utiliza-se β -lactamase de B. cereus enquanto a experiência descrita em 4(B) utiliza β -lactamase de E. coli. A Figura 5 representa a toxicidade de CM e PDM, administrados isoladamente, comparados com CM administrado com β -lactamase de B. cereus purificada. A Figura 6 apresenta os resultados dum ensaio de cito toxicidade in vitro utilizando um conjugado de L6- β -lactamase libertado com CM. A Figura 7 representa a libertação da adriamicina quan do se tratou ADR-cef com β -lactamase de B. cereus em plasma humano, à temperatura de 37°C. A Figura 8 representa a libertação da adrimicina quan do se tratou ADR-cef com L6-lactamase de B. cereus, conjugada no plasma humano à temperatura de 37°C. A Figura 9 mostra a estabilidade comparativa de ADR-cef

em meio seleccionado, ã temperatura de 37°C.

Descrição Pormenorizada A prática da presente invenção utiliza, a menos que in dicado de outro modo, técnicas convencionais da química orgâni^ ca de síntese, química de proteínas, biologia molecular, micro biologia e tecnologia de ADN recombinante, que são conhecidas dos peritos. Estas técnicas são explicadas completamente na bibliografia. Ver, por exemplo, Scopes, R. K., Protein Purifi-cations Principies and Practices, (Springer-Verlag, 2s ed., 1987); Methods in Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Cold Spring Harbor, Press 2 ed., 1989; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds. Blackwell Scientific Publications, 1986); House, Modern Synthe tic Reactions, Menlo Park, Cal., Benjamin/Cummings, 2s ed., 1972.

Todas as patentes de invenção, pedidos de patentes de invenção e publicações aqui mencionadas, quer supra quer infra são aqui totalmente incorporadas como referência. A. Definições

Na definição da presente invenção as designações utili zadas que se seguem são definidas como indicado posteriormen-te. 0 termo ')?rõ-fãrmaco" como utilizado neste pedido de -14- 1 -14- 1

patente de invenção refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância com actividade farmacêutica que é menos tóxica para as células comparada com a substância inicial e que é capaz de ser activada por via enzimática ou convertida numa forma inicial mais activa. Consultar, por exemplo, Wilman , Biochem. Society Transactions, 14 (1986) 375 (615th Meeting , Belfast)? Stella et al., Directed Drug Delivery, R. Borchardt et al., ed., 247-267 (Human Press, 1985). As designações "fár maco inicial" e "agente citotóxico" são utilizadas de forma al^ ternativa. A designação "pró-fármaco cefalosporínico", como aqui se utiliza, refere-se a um pró-fármaco que é gerado por ligação de um composto inicial, tal como se referiu anteriormente, a uma cefalosporina, tal como se descreve a seguir. A designação " ^ -lactamase" aqui utilizada refere-se a uma enzima capaz de hidrolisar a ligação CO-N de um anel de

Existe uma revisão de

Antimicrobial, Agents Chemother., 32 (1989) 259. A designação "mostarda azotada" é utilizada aqui para referir um composto de fórmula geral RN (Cí^CI^Cl) ^, na qual R pode representar um grupo alquilo, arilo ou aralquilo, que com porta como substituinte um grupo funcional disponível para sub sequente modificação química, por exemplo, um grupo amino ou carboxilo. As mostardas azotadas com mais de um átomo de azo to também são abrangidas, de tal forma que os grupos cloroeti lo não necessitam de ligar-se ambos ao mesmo átomo de azoto.

Em algumas mostardas azotadas, os átomos de cloro podem ser substituídos por outros átomos de halogéneo, especialmente por bromo. Ver, por exemplo, Stock, in Drug Design, E. J., -15- /

Ariens, ed., Nova Iorque, Academic Press, 1971, Vol. II, pp. 532-571 . 0 termo "cefalosporina" aqui utilizado refere-se a derivados do ácido 7-aminocefalosporânico com o anel de di-hidro tiazina de β -lactama caracteristico da cefalosporina C quer de origem natural quer de síntese. Exemplos destes derivados e uma revisão da química das cefalosporinas encontram-se em Abraham, Quarterly reviews - Chemical Society, 21 (1967) 231. A designação "cefem" é algumas vezes utilizada aqui para refe rir uma cefalosporina. A estrutura da cefalosporina C é a se guinte:

A designação "mostarda cefalosporínica" é utilizada para referir uma cefalosporina, como descrita anteriormente, em que a cefalosporina foi modificada com uma mostarda azota da, como descrito antes. 0 termo "citotõxico" é utilizado aqui para referir a propriedade de retardamento do desenvolvimento das células ou a morte das células particularmente como avaliada pelo ensaio . _ 3 de inibição de colonias ou pelo ensaio da captaçao de H-timi dina (consultar, por exemplo, Hellstrom et al., em In Vitro

Methods in Cell-Mediated Immunity. Blom e Glade, eds., 1971 e os respectivos exemplos. -16 B. Metodologia Geral A presente invenção refere-se a um novo método para a libertação de agentes citotóxicos em células tumorais e pr porciona o reforço selectivo para a morte das células tu morais, no tratamento de cancros, tais como carcinomas e me-lanomas, assim como outros tumores.

De acordo com o método da presente invenção, é administrado um conjugado anticorpo-enzima a um hospedeiro mamífero com um tumor. Este conjugado anticorpo-enzima consiste

em um anticorpo selectivo para o tumor, ligado a uma tamase que é capaz de converter um pró-fármaco que é menos ci. totóxico para as células do que o fármaco inicial em um fãrma co inicial mais activo. Quando introduzido no hospedeiro, o componente anticorpo do conjugado, que reage com um antigénio que se encontra nas células do tumor, dirige o conjugado para o sítio do tumor e liga-se ãs células tumorais. 0 anticorpo liberta deste modo, a enzima, no sítio do tumor. Também é introduzido no hospedeiro um pró-fármaco que constitui um subjs tracto para a

no sítio do tumor, pela enzima, em um fármaco com acção citotóxica. O fármaco é pois activado extracelularmente e pode difundir-se em todas as células do tumor, nesse sítio, isto é, aquelas células que com portam o antigénio tumoral, em particular, para o qual o anticorpo do conjugado é específico e ao qual o anticorpo se ligou assim como para aquelas células que são negativas a esse antigénio mas que, no entanto, estão presentes no sítio do tumor. 0 método desta invenção, portanto, ultrapassa os problemas cor rentes da heterogeneidade dos antigénios tumorais e a necessi- -17- i -17- i

dade da internalização do conjugado/antigénio associadas ãs técnicas de libertação de fármacos imunoconjugados convencionais .

Além disso, devido ao facto de o presente método, não requerer que o fármaco se ligue directamente ao anticorpo, limitando assim a quantidade de fármacoque pode ser libertado não surge o problema usual da potência do fármaco no sítio do tumor. De facto, o presente método amplia o número de molécu las activas do fármaco presente no sítio do tumor, porque a enzima ligada ao anticorpo do conjugado pode sofrer numerosas mudanças de substrato , convertendo repetidamente, o pró-fár-maco em fármaco activo. Além disso, o método da presente invenção é capaz de libertar o fármaco activo, especificamente, no sítio do tumor, em oposição ã libertação em outros tecidos.

Isto deve-se ao facto de a concentração da enzima no sítio do tumor ser mais elevada do que a sua concentração em outros tecidos devido ao revestimento das células tumorais com o conjugado anticorpo-enzima. O anticorpo do imunoconjugado desta invenção inclui qualquer anticorpo que se ligue especificamente a um antigé-nio associado com um tumor. Os exemplos destes anticorpos in cluem, mas não exclusivamente aqueles que se ligam especifica mente aos antigénios que se encontram em carcinomas, melano-mas, linfomas e sarcomas do tecido ósseo e do tecido mole, assim como outros tumores. São preferidos os anticorpos que permanecem ligados à superfície celular por grandes períodos e que são internalizados muito lentamente. Estes anticorpos, que podem ser policlonais ou, de preferência, monoclonais, de vem ser moléculas do anticorpo intactas ou fragmentos que con ! -18- ! -18-

tenham a região de ligação activa do anticorpo, por exemplo,

Fab ou F(ab')2» e podem ser produzidos utilizando técnicas bem conhecidas nesta área. Consultar, por exemplo, R. A. De Weger et al., Immunological Rev., 62 (1982) 29-45 (anticor pos policlonais específicos do tumor produzidos e utilizados em conjugados); Yet et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76 (1979) 2927; Brown et al., J. Immun. 127 (1981) 539, (anticor pos monoclonais produzidos específicos de tumores); e Mach et al., em Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Thera-py, R. W. Baldwin et al., eds., Academic Press, pp. 53-64, (fragmentos de anticorpos produzidos e utilizados para local_i zar células tumorais). Além disso, se forem utilizados anticorpos monoclonais, estes podem ser de murganho cu de origem humana ou anticorpos quiméricos [consultar, por exemplo, Oi, Biotechniques, 4 (1986) 214].

Os exemplos de anticorpos que se podem utilizar para a libertação de β -lactamase no sítio do tumor incluem, mas não exclusivamente, L6, um anticorpo monoclonal IgG2a (hibri-doma depositada com o NQ ATCC HB8677) que se liga a um antigé nio glicoproteínico nas células de carcinoma de pulmão humano (Hellstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, (1986), 7059; 96,5, um anticorpo monoclonal IgG2a que é específico 9 7 para p , um antigénio associado a melanoma [Brown et al., J. Immunol. 127 (1981) 539] ; 1F5, um anticorpo monoclonal IgG2a (hibridoma depositada com o NO ATCC HB9645) que é específico para o antigénio CD-20 em células B normais e neoplásicas [Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82 (1985) 1766].

Uma estratégia alternativa é a utilização de anticorpos que se internalizam„ com a condição de que o prõ-fármaco pos -19-

sa também internalizar-se ou que uma quantidade suficiente de anticorpo permaneça também na superfície da célula. Um exemplo de anticorpos deste tipo pode encontrar-se em Câncer Research, 56 (1990) 2183. O componente enzimático do imunoconjugado da presente invenção inclui qualquer enzima capaz de hidrolisar a ligação CO-N de uma β -lactama. Algumas destas enzimas estão comercializadas, por exemplo as ^ -lactamases de E. coli ou de B. cereus . Estas e outras -lactamases podem ser clonadas e expressas utilizando técnicas de recombinação de ADN convencio nais.

As p -lactamases da presente invenção podem ser liga das de forma covalente a anticorpos mediante técnicas convencionais, por exemplo, a aplicação de reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais, SPDP [3-(2-piridilditio)-propiona to de N-succinimidilo] ou SMCC [4-(N-maleimidometil)-ciclohe-xano-l-carboxilato de succinimidilo], [consultar, por exemplo, Thorpe et al., Immunol. Rev., 62 (1982) 119; Lambert et al., supra, p. 12038; Rowland et al., supra, pp. 183-184; Gallego et al., supra, pp. 737-7138). Alternativamente, podem construir-se proteínas de fusão contendo pelo menos uma região de ligação com antigénio de um anticorpo ligado pelo menos a uma parte funcionalmente activa de uma β-lactamase, utilizando técnicas de recombinação de ADN convencionais [consultar, por exemplo, Neuberger et al., Nature, 312 (1984) 604. Estas pro teínas de fusão actuam essencialmente da mesma forma que os conjugados anticorpo-enzima referidos anteriormente.

Os pró-fármacos da presente invenção contêm um agente antitumoral ligado a uma cefalosporina ou a um derivado de ce -20 - falosporina. O agente antitumoral é activado ou de qualquer outro modo convertido numa forma mais activa após cisão do pró-fármaco com a ^-lactamase.

Num aspecto preferido, o agente antitumoral é uma mos tarda azotada, tal como se referiu anteriormente. Uma mostar da azotada representativa é a seguinte:

Outros agentes antitumorais conhecidos incluem a adriamicina que apresenta a fórmula

0 OH 0

OH -21- -21-

Os pró-fármacos da presente invenção são se limitam a estes compostos e podem incluir outros agentes antitumorais que podem ser convertidos em uma forma de prõ-fãrmaco para utilizar em conjugado de cefalosporina. Estes agentes antitumorais incluem o etoposido, teniposido, daunomicina, cariai nomicina, aminopterina, dactinomicina, cis-platina e análogos da cis-platina, bleomicinas, esperamicinas (ver a patente de invenção norte americana NQ 4 675 187) e 5-fluoro-uracilo.

Num aspecto preferido da presente invenção, é sinteti zado um pró-fármaco antraciclina-cefalosporina mediante reac-ção de uma antraciclina com uma 3-[(carboniloxi)-metil]-cefem do grupo carboxilo protegidos tal como os ésteres difenilmet_I licos de 3-(£-nitrofenoxi)-carboniloxi]-metil]-cefem e 3-(1,2,2,--tetracloroetoxi)-carboniloxi]-metil]-cefem. 0 pró-fármaco resultante contém uma antraciclina ligado à cefalosporina por um grupo amino da primeira através de uma ligação carbamato.

Num outro aspecto preferido desta invenção é sintetizada uma mostarda cefalosporínica mediante a reacção de um sal de 3-hidroximetil-cefalosporina com um isocianato, como se descreve nas patentes de invenção norte-americanas NQs 3 355 452 e 3 484 437 e na patente de invenção belga nQ 741 381 aqui incorporadas na sua totalidade como referência. Uma reacção deste tipo está também descrita em pormenor nos exemplos.

De um modo mais geral, a presente invenção proporcio na pró-fármacos cefalosporínicos de fórmula geral ς.

C02H

QNH (I) na qual Q representa um átomo de hidrogénio, um grupo pro tector de amino utilizando convencionalmente na síntese da cefalosporina ou um grupo acilo ou um antibiótico 7-acilaminocefalosporina conhecido; L representa uma ligação directa ou um grupo de fórmula geral -S-ÍCI^) R representa um agente capaz de exercer um efeito citotóxico nas células tumorais quando libertado do referido pró-fármaco cefalosporínico; n representa o número inteiro 2, 3 ou 4; e m representa zero ou 1 com a condição de que quando -23- -23-

L representa uma ligação directa m representa 1; ou os seus sais aceitáveis em farmácia.

Para os fins da presente invenção a natureza do subjs tituinte representado por Q não é crítica, uma vez que a par te cefalosporínica serve como um veículo do fãrmaco citotõxi co e não contribui para o efeito terapêutico deste fãrmaco. Deste modo, Q pode representar, por exemplo, um átomo de hidrogénio, um grupo protector correntemente utilizado na química das cefalosporinas ou um substituinte de antibióticos cefalosporínicos conhecidos. Os exemplos deste último incluem, mas não exclusivamente; os grupos fenilacetilo, 2-tienilacetilo; -hidroxifenilacetilo, fenilglicilo, £-hidroxifenilglicilo e (2-amino-4-tiazolil)-(metoxiimino)--acetilo. "Um grupo protector de amino" do tipo dos utilizados correntemente na síntese das cefalosporinas, inclui, mas não exclusivamente, alcanoílo inferior eventualmente substituído, por exemplo, formilo, acetilo, cloroacetilo ou trifluoroace-tilo; aroílo eventualmente substituído, por exemplo, benzoí-lo, 4-metoxibenzoílo ou 4-nitrobenzoílo; aralquilo eventualmente substituído, aralquilideno eventualmente substituído , por exemplo, benzilo, difenilmetilo, tritilo, nitrobenzolo, metoxibenzilo ou benzilideno; alquilo halogenado, por exemplo, triclorometilo, tricloroetilo ou trifluorometilo; alcoxicarbo nilo eventualmente substituído, por exemplo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, ciclo-hexiloxicarbonilo ou tricloroetoxicarbonilo; aralcoxicarbonilo eventualmente substituído, por exemplo, benziloxicarbonilo, metoxibenziloxi. carbonilo ou nitrobenziloxicarbonilo; trialquilsililoxicarbo- -24- ! nilo ou triarilsililoxicarbonilo eventualmente substituídos; e grupos trialquilsililo ou triarilsililo, por exemplo,dime tilsililo ou t-butildimetilsililo. "Grupo acilo de um antibiótico 7-acilaminocefalospo-rino conhecido" refere-se a um substituinte no grupo 7-amino de um antibiótico cefalosporínico conhecido e pode ser repre sentado pela fórmula geral R-C(O)-. Os exemplos de grupos represnetados por R incluem mas não exclusivamente: a) grupos de fórmula geral G-CH- G' na qual G pode representar um grupo arilo eventualmente substituído, heterocíclico ou ciclo-hexadienilo, por exemplo, fenilo, tienilo, tiazolilo, tiadia zolilo, imidazolilo, piridilo, tetrazolilo, 1,4-ciclo-hexadienilo e furilo; os substituintes para os grupos podem ser 1 a 3, iguais ou diferen tes, escolhidos entre átomos de halogéneo e grupos hidroxi, amino, alcoxi, alquilamino, dialquiJL amino, alcanoiloxi, carboxi, nitro, ciano e alco-xicarbonilo; G' pode representar um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcanoilamino, alcanoiloxi, carboxi ou sulfo; b) grupos de fórmula geral G-C-

N-OY -25-

U na qual ( » G tem o significado definido antes; e Y representa um átomo de hidrogénio ou um grupo a_l quilo ou alcanoílo C^_g; c) grupos de fórmula geral G-B-CH2 na qual G tem o significado definido antes e B representa um átomo de oxigénio ou de enxofre; e d) grupos de fórmula geral G-(B) -CH_-C-NH-CH_- m 2 | 2 na qual G e B têm os significados definidos antes e m repre senta zero ou 1.

Alguns exemplos de "grupos acilo de um antibiótico 7-acilaminocefalosporina conhecido" incluem 2-amino-2-fenil-acetilo, 2-amino-2-(4-hidroxi)-fenilacetilo, 2-tienilacetilo, fenilacetilO/ 2-hidroxi-2-fenilacetilo, 2-acetoxi-2-fenilace-tilo, 1-tetrazolilacetilo, [(2-amino-4-tiazolil)-(metoxiimino)]--acetilo, glutaroilfenoxiacetilo e [(2-furanil)-metoxiiminol--acetilo. 0 composto citotóxico é um composto que contém pelo menos um grupo funcional disponível para por modificação químjL ca proporcionar o pró-fármaco cefalosporínico. Geralmente, es^ tes grupos funcionais são escolhidos entre grupos amino, carbo xilo e hidroxilo, de tal forma que a ligação entre o agente ci' totóxico e o componente cefalosporínico seja do tipo carbamato, amida, éster ou carbonato.

Um método geral para a preparação de pró-fármacos cito tóxicos cefalosporínicos da presente invenção compreende pri- meiro a protecção, se apropriado, de quaisquer grupos reacti-vos não reagindo na cefalosporina ou no fármaco citotóxico ou num seu precursor; o deslocamento de um grupo removível na ce falosporina ou no fármaco citotóxico ou num seu precursor por um grupo nucleófilo no fármaco citotóxico ou na cefalosporina; ou adição de uma 3-hidroximetil-cefalosporina a um precursor isocianato do fármaco citottóxico; e, finalmente, remoção dos grupos protectores. Os grupos reactivos que não reagem são , por exemplo, o grupo ácido carboxílico da cefalosporina ou o grupo amino de melfalan. A química dos grupos protectores é bem conhecida e está descrita na bibliografia, por exerrnio, Green e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wi ley & Sons, Inc., 2â. ed. , 1991. Um precursor de um agente citotóxico é, por exemplo, a mitomicina A ou Ν,Ν-bis[2-cloro-etil)-4-isocianatobenzenoamina que quando se faz reagir com uma cefalosporina apropriada proporciona um pró-fármaco cefa-losporínico citotóxico que liberta mitomicina C ou Ν,Ν-bis[2--cloroetil]-fenil]-enodiamina, respectivamente, após hidróli- se com uma

Um grupo removível é, por exemplo, um átomo de halogéneo , um grupo de activação de éster, tal como 4-nitrofenilo ou 1,2,2,2-tetracloroetilo, que possa ser deslocado por um grupo nucleófilo.

Em um aspecto da presente invenção, proporciona-se uma subclasse de compostos de fórmula geral (I), pró-fármacos cefa losporínicos, nos quais o agente citottóxico se liga ao núcleo da cefalosporina através de um grupo carbamato ou amida e que têm a fórmula geral -ζ

NR a na qual Q, L e m têm os significados definidos para a fórmula geral (I); e NRa representa um fármaco citotóxico que contém um átomo de azoto, ou um seu sal aceitável em farmácia.

Os compostos de fórmula geral (II) na qual L represen ta uma ligação directa podem ser preparados mediante as sequências reaccionais representadas no Esquema I. Assim, faz--se reagir uma 3-hidroximetil-cefalosporina (III), de preferência sob a forma de um sal de metal alcalino,tal como um sal de sódio ou de potássio, com um derivado isocianato de um agente citotóxico, na presença de uma base amina terciária, no seio de um dissolvente aprótico, para se obterem compostos de fórmula geral (V).

Alternativamente, trata-se um carbonato de cefalospo-rina de grupo carboxilo protegido de fórmula geral (IV) com um agente citotóxico contendo azoto, seguido de desprotecção do grupo carboxilo para se obter o pró-fármaco cefalosporíni^ co pretendido (V). 0 carbonato de cefalosporina (IV) pode, por sua vez, ser preparado a partir de uma 3-hidroximetil-ce -28- -28-

falosporina de grupo carboxilo protegido, após reacção com um cloroformato, por exemplo, cloroformato de 4-nitrofenilo ou cloroformato de 1,2,2,2-tetracloroetilo. No Esquema I, Q e NR têm os significados definidos para as fórmulas gerais (I) cl e (II) , representa um grupo de activação de éster, de preferência 4-nitrofenilo ou 1,2,2,2-tetracloroetilo; e R^ representa um grupo protector de carboxilo, por exemplo, benzi-lo, t-butilo, difenilmetilo, alilo, etc. 0 grupo protector de carboxilo pode ser removido utilizando técnicas convencionais como, por exemplo, a hidrólise catalisada por ácido e a catálise por redução com paládio.

Esquema I

(III)

QNH

co2h (b) NR + α

2 2

QNH (V) )

Os compostos de fórmula geral (II) , na qual L representa um grupo de fórmula geral -S-ÍCI^) - e m representa 1, podem preparar-se por um método análogo ã via (b) do Esquema I. A preparação do reagente cefalosporínico (VI) e a sua subsequente transformação para se obter o pró-fármaco cefaloj; porínico de fórmula geral (VII) estão representados no Esquema II. No Esquema II, Q, NR , n, R. e Rn têm os significados

α. X A definidos anteriormente; X representa um átomo de halogéneo, por exemplo, cloro ou iodo. A cefalosporina inicial de fõrmu la geral (VI) pode ser preparada fazendo reagir uma 3-haloge-nometilcefalosporina de grupo carboxilo protegido de fórmula qeral (VIII) com um mercaptoalcanol e tratando a 3-hidroxial-quiltiometilcefalosporina resultante com um cloroformato de fórmula geral CICC^R^, por exemplo, cloroformato de 4-nitrofe nilo, na presença de uma base amina terciária, para se obter um composto de fórmula geral (VI). -30- À

Esquema II

1. HS(CH„) OH δ n 2. C1C02R1

ONH

0 (VII)

Os compostos de fórmula geral (II) , na qual L represen ta um grupo de fórmula geral -S-(CH2)n~ e m representa zero , podem ser preparados pelos métodos representados no Esquema III.

Esquema III

0 II CNR

QNH

(VIII) -2 2- -2 2-

No Esquema III, Q, NR , η, X, R, e R_ têm os signifi-

ci 1 Z cados definidos anteriormente. Deste modo, faz-se reagir um agente ci+otóxico contendo azoto com um derivado de cefalospo rina 3-tioalquilcarboxilato-substituído (IX) para se obter um pró-fármaco carbamato de fórmula geral (XI). 0 derivado de cefalosporina de fórmula geral (IX), por sua vez, pode obter--se fazendo reagir um tioalquilcarboxilato de fórmula geral SH(CI^), com uma 3-halogenometil-cefalosporina ou median te reacção de uma 3-halogenometil-cefalosporina, de grupo car-boxilo protegido, com um ácido tioalcanóico, seguido de activa ção do grupo ácido. Por exemplo, o grupo representado por R^ do composto de fórmula geral (IX) pode ser um grupo succinim_i da ou um grupo de fórmula geral -CO^R^ e pode representar um anidrido misto.

Alternativamente, pode primeiro transformar-se um agen te citotõxico para formar um composto de N-tioalquilcarbonilo de fórmula geral (X) mediante reacção de um composto de fórmu la geral NR com um tioalquilcarboxilato de fórmula geral cl SH(CH2)nC02R1. Em seguida, faz-se reagir um composto de fórmu la geral (X) com uma 3-halogenometil-cefalosporina do grupo carboxilo protegido de fórmula geral (VIII) para se obter o produto pretendido. Para a preparação dos compostos de fórmu la geral (XI), R^ pode representar, por exemplo, um grupo suc cinimidaou o grupo de fórmula geral -CC^R-^, pode representar um anidrido misto. O componente fármaco citotõxico de fórmula geral NR& pode ser um membro da família das mostardas azotadas, tal como se referiu anteriormente. As mostardas particularmente pre feridas são melfalano e Ν,Ν-bis(2-cloroetil)-1,4-benzenodiami- -33-

na (mostarda-fenilenodiamina). Além disso, o componente fárma co citotóxico NR pode ser um membro da família das antracicli a — nas. Os exemplos de antraciclinas incluem, mas não exclusivamente, adriamicina, daunomicina, carminomicina e outras em que a ligação ã cefalosporina se faz através do grupo amino de açúcar. De preferência a antraciclina será a adriamicina. O componente fármaco citotóxico NR pode também ser um cl membro da família das mitomicinas. As mitomicinas são caracte rizadas pela fórmula geral seguinte: 0

Tem sido referido grande número de análogos de mitomi cina com diferentes substituintes na posição 7. Para a finalidade da presente invenção o substituinte na posição 7 não é crítico visto que a ligação da mitomicina ã cefalosporina se faz através do átomo de azoto de aziridina. Uma mitomicina preferida para o pró-fármaco é a mitomicina C, isto é, Y repre senta um grupo NI^ . Outros exemplos de análogos de mitomicina apropriados para os presentes pró-fármacos podem ser os descritos nas patentes de invenção norte-americanas nQs. 24- 4 691 023, 4 803 212, 4 487 769, 4 888 341 e o pedido de paten te de invenção europeia publicado 294 828, aqui incorporados como referências.

Num outro aspecto, a presente invenção proporciona, co mo uma suciasse de compostos de fórmula geral (I), pró-fãrmacos cefalosporínicos nos quais o agente citotóxico se liga ao núcleo da cefalosporina através de um grupo carbonato ou de um grupo éster e que têm a fórmula geral

QNH

co2h (XII) na qual Q, L e m têm os significados definidos antes; OR^ representa um fármaco citotóxico contendo um gru po hidroxilo; ou os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Os compostos de fórmula geral (XII) podem ser prepara dos de acordo com os métodos gerais descritos nos Esquemas I a III (com excepção da via (a) do Esquema I) utilizando OR^ em vez de NR utilizado ali. d

Como um exemplo da presente invenção, o componente ci. totõxico representado por OR^ é escolhido no grupo constituído por agentes anti-tumorais de epipodofilotoxina de fórmula geral

na qual Z representa o substituinte de um glucosido de epi podofilotoxina conhecido, por exemplo um grupo al quilo, tienilo, furilo ou fenilo. São particularmente preferidos os compostos em que Z represen ta um grupo metilo (etoposido) ou 2-tienilo (teniposido). Estes compostos podem ser ligados ao núcleo da cefalosporina através de um grupo 4'-fenólico.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma subclasse de prõ-fãrmacos cefalosporínicos de fórmula geral -3 6-

na qual Q tem o significado definido antes; e RçCOO representa um composto citotóxico contendo um grupo carboxilo ou os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Por exemplo, o componente citotóxico melfalano, pode ligar-se ao núcleo da cefalosporina através do grupo carboxi^ lo. 0 pró-fãrmaco mefalan-cefalosporina de fórmula geral (XIV) pode preparar-se pelo procedimento representado no Esquema IV. -37- C-

Esquema IV «

1. NaHCC>2 2~. -R2,-t-Bof

(XIV)

No Esquema IV, Q e R2 têm os significados definidos an tes. De preferência, R2 representa um grupo lábil pela acção de um ácido, por exemplo, um grupo benzilo ou t-butilo. t-BOC significa o grupo t-butoxicarbonilo. Assim, faz-se reagir a 3-iodocefalosporina carboxi-protegida com melfalano protegido por N-t-BOC na presença de uma base, por exemplo hidrogenocar bonato de sódio; o intermédio diprotegido resultante é tratado com um ácido para dar o produto pretendido de fórmula geral (XIV) . -38- -38-

Um pró-fãrmaco cefalosporínico representativo, prepar do de acordo com o procedimento geral da via (a), do Esquema está representado na Equação (i). Especificamente, faz-se reagir, a 3-hidroximetilcefalosporina (1) com isocianato (2) para gerar uma mostarda cefalosporínica (3) (Equação i). Como se representa na Figura 2, apôs cisão com -lactamase, a mos tarda cefalosporínica hidrolisa-se para fornecer a mostarda--fenilenodiamina PDM.

Outros pró-fármacos representativos para a utilização da presente invenção estão representados na Figura 1. Estes pró--fármacos representados na Figura 1 podem ser sintetizados de acordo com os procedimentos gerais descritos nos Esquemas I a IV. Estas técnicas são bem conhecidas pelos especialistas na matéria.

Outro aspecto da presente invenção diz respeito a prõ--fãrmacos de cefalosporina-mitomicina de fórmula geral -39

-39 QNH

(Ha) na qual Q e têm os significados definidos antes.

Os compostos de fórmula geral (lia) são preparados fazendo reagir uma 3-aminometil-cefalosporina com mitomicina A 1 a 1 a ou com um seu derivado N -alquilo (N refere-se ao átomo de azoto do grupo aziridina de mitomicina). A reacção é realiza da no seio de um dissolvente orgânico, por exemplo, etanol ou metanol, a uma temperatura que conduza à formação do produto, por exemplo, ã temperatura ambiente. A reacção, de um modo ge ral, completa-se em 24 horas. De preferência, efectua-se a reacção sob atmosfera inerte. 0 composto inicial, 3-aminometil-cefalosporina obtém-se a partir da correspondente 3-azido metil-cefalosporina; ambas, a 3-aminometil- e a 3-azidometil--cefalosporina e os métodos para a sua preparação estão descr_i tos em Cocker, J. D. et al., J. Chem. Soc., (1965) 5015 e 5027-5029, cujas partes relevantes são aqui incorporadas como referência.

Deve entender-se que a síntese dos pró-fármacos cefa-losporínicos abrangidos pela presente invenção não está limi- -40 - tada àqueles processos e reagentes especificaraente descritos anteriormente, mas pode ser realizada mediante outras técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas de síntese orgânica. A selecção de grupos protectores, grupos activado res de éster (e sua introdução e remoção, quando aplicável) , dissolvente e condições reaccionais ê do conhecimento do quí mico de síntese e pode ser realizada sem demasiada experimen tação. A presente invenção também inclui as composições far macêuticas e métodos para o tratamento de cancros e outros tu mores. Mais particularmente, a presente invenção inclui composições que contêm pró-fármacos cefalosporínicos que são sus ceptíveis de ser cindidos por conjugados anticorpo-β -lactama se. Os pró-fármacos e os conjugados de enzima são utilizados em um método para o tratamento de tumores que consiste em admi nistrar a um hospedeiro mamífero uma quantidade com eficácia farmacêutica de um conjugado anticorpo-enzima ou de conjugados e uma quantidade farmacêutica eficaz de um prõ-fãrmaco ou pró--fãrmacos. As composições e métodos desta invenção são úteis para o tratamento de qualquer mamífero, incluindo seres humanos, cães, gatos e equídeos.

De acordo com um aspecto preferido, o conjugado anticorpo -enzima é administrado antes da introdução do pró-fárma co no hospedeiro. Deve deixar-se decorrer um tempo suficiente entre a administração do conjugado e a do pró-fármaco para permitir ao anticorpo do conjugado chegar ao alvo e localizar a enzima no sítio do tumor. O tempo pode variar entre 12 horas e uma semana, dependendo do conjugado utilizado.

Os conjugados e pró-farmacos da presente invenção podem ser administrados por meios convencionais de administração -41- -41-

incluindo, mas não exclusivamente, as vias endovenosa, intrape ritoneal, oral e intralinfática e a administração directa sobre o tumor. Prefere-se a administração endovenosa.

As composições da presente invenção podem apresentar--se sob diversas formas de dosagem que incluem, mas não exclu sivamente, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílu las, põs, supositórios, microcápsulas poliméricas ou microve-sículas, lipossomas e soluções injectáveis ou perfundíveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica. Por exemplo, a administração oral do conjugado anticorpo-β -lactamase pode ser desaconselhada porque as proteínas do conjugado tendem a degradar-se no estômago quando administradas por via oral, por exemplo, sob a forma de um com primido.

As composições do conjugado ou do pró-fármaco também incluem de preferência, veículos aceitáveis sob o ponto de vi£ ta farmacêutico convencionais, assim como adjuvantes conhecidos nesta área tal como albumina sérica humana, permutadores de iões, alumina, lecitina, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio e sais ou electróLi tos como, por exemplo, o sulfato de protamina. O modo mais eficaz de administração e a posologia para as composições desta invenção dependem da gravidade e do curso da doença, da saúde e resposta ao tratamento dos doentes e da avaliação do médico assistente. Deste modo, as dosagens de imunoconjugados e prõ-fármacos devem ser fixadas para o doen te individual. Os métodos de determinação de dosagens são bem conhecidos na técnica.

No entanto, uma dose eficaz de um conjugado anticorpo- -42 -

I

-42 - I

--enzima desta invenção deve situar-se entre cerca de 1,0 e 2 - cerca de 1 000 mg/m , dependendo a dose do pro-farmaco do pró-fãrmaco em causa utilizado, e do fármaco inicial onde es te deriva. Uma vez que o pró-fármaco é menos citotóxico que o fármaco inicial, podem aplicar-se dosagens superiores ãs estabelecidas para o fármaco inicial.

Para que a presente invenção aqui descrita possa ser melhor compreendida, apresentam-se os exemplos que se seguem. Deve entender-se que estes exemplos são apenas ilustrativos e não devem ser considerados como limitativos do âmbito da pre sente invenção, em qualquer sentido. C. Parte Experimental 1. Preparação de compostos químicos 1.1. Preparação de compostos intermédios 1.1.1. Ν,Ν-bis(2-cloroetil)-4-isocianato-benzenamina.

Dissolveram-se 4 g (16,2 mmoles) de Ν,Ν-bis(2-cloroetil) -4-isocianato-benzenamina, [preparada de acordo com o mé todo de Everett et al., J. Chem. Soc., (1972) 1949], em 80 ml de ácido clorídrico concentrado e arrefeceu-se em um banho de água. Adicionaram-se 6 g de tri-hidrato de cloreto de estanho, em uma porção, e deixou-se a mistura reaccional sob agitação durante 10 minutos. Retirou-se a mistura reaccional do banho de arrefecimento e agitou-se durante mais 35 minutos . 0 produto sólido bege foi recolhido por filtração sob sucção, num funil de vidro sinterizado e lavado com 20 ml de ácido clorídrico concentrado. Dissolveu-se o sólido beje em 100 ml de água e arrefeceu-se num banho de gelo. Adicionou-se hidrõ xido de sódio IN arrefecido até o pH da solução atingir o valor de 8. Extraiu-se a solução branca turva , com 150 ml de éter dietílico, lavou-se com 80 ml de solução aquosa de clore to de sódio saturada e secou-se sobre sulfato de sódio anidro. Adicionaram-se 2,7 ml de piridina à solução contendo o agente de secagem. Misturou-se a solução e filtrou-se imedia tamente através de lã de vidro, directamente para uma solução agitada de fosgénio (8,4 ml de uma solução 1,93 M em tolueno) Fluka Chem Co) em 50 ml de éter dietílico à temperatura de 2°C. Formou-se um sólido branco. Agitou-se a mistura reac-cional durante 60 minutos à temperatura de 2°C e, em seguida, durante 15 minutos à temperatura ambiente. Filtrou-se a mistura reaccional por sucção e concentrou-se sob vazio para se obterem 2,81 g do isocianato não purificado sob a forma de um óleo viscoso, verde escuro. No espectro de infravermelho, o isocianato preparado deste modo apresentou as bandas caracte-rísticas. 1.1.2. 3-(hidroximetil)-8-oxo-7-(fenilacetamido)-5-tia-l- -azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-carboxilato de potássio .

Preparou-se uma solução de 3-(acetoximetil)-8-oxo-7--(fenilacetamido)-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-car-boxilato de sódio, (também designado por cefaloram) mediante dissolução de 8,5 g (20,6 mmoles) deste sal em 55 ml de água e 27 ml de metanol e arrefeceu-se até ã temperatura de -10°C. Ajustou-se o pH para um valor compreendido entre 11,5 e 12,0 mediante a adição de 2,0 ml de hidróxido de sódio a 20% e em -44- -44-

seguida 5 ml de uma mistura água/metanol a 2:1. k temperatu ra de -5°C, adicionou-se ácido fosfórico H^PO^ concentrado, gota a gota, com agitação vigorosa até não se formar mais pre cipitado. Verteu-se a solução resultante em 900 ml de acetato de etilo e 100 ml de água. Extraíu-se a mistura e secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a so lução para uma solução agitada vigorosamente de 2 litros de acetato de etilo â qual se tinha adicionado uma solução de 5g de 2-etilo-hexanoato de potássio em 50 ml de acetona. Filtrou--se por sucção o precipitado resultante e lavou-se com acetato de etilo obtendo-se um sólido de cor creme. Secou-se o sólido durante 12 horas à temperatura de 60°C sobre Ρ2°5' sob va2i° 1 obtendo-se 5,63 g de um sólido duro amarelo intenso. 1.1.3. 3-iodometil-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo-[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxilato de 3-propenilo A. Preparação do éster 3-propenIlico de cefaloram

Arrefeceu-se até à temperatura de 0°C uma solução de 8 g de cefaloram sódjco em 150 ml de água e, em seguida, aci. dificou-se até um pH de cerca de 2, com ácido clorídrico IN. Filtrou-se o sódio que precipitou e secou-se sob alto vácuo para se obterem 5,9 g (rendimento de 78%) de ácido cefalospo-rínico. Em seguida, fez-se uma suspensão de 5,86 g (15,0 mmo les) deste produto em 32 ml de uma solução de dimetilformami-da/dioxano a 5:3, juntamente com 1,39 g (16,5 mmoles) de hi-drogenocarbonato de sódio e 2,05 ml (22,5 mmoles) de iodeto de alilo. Agitou-se a mistura reaccional durante 42 horas e, em seguida, verteu-se numa mistura de 400 ml de acetato de etilo e 75 ml de solução saturada de cloreto de sódio. Ex-traíu-se a fase orgânica com 3 x 75 ml de solução saturada de cloreto de sódio, 75 ml de água, 3 x 75 ml de solução sa turada de hidrogenocarbonato de sódio e 75 ml de água e, em seguida, secou-se sobre sulfato de sódio. A remoção dos dij> solventes por evaporação rotativa, sob alto vácuo, deu 4,2 g de produto não purificado que se purificou por cromatografia rápida numa coluna de gel de sílica de 4,8 x 10 cm com o gra diente de eluição hexano/acetato de etilo seguinte: (1) 3:1, 1 litro, (2) 1:1, 1 litro e (3) 1:3, 1 litro.

Reuniram-se as fracções apropriadas contendo o produ to, concentraram-se até à secura por evaporação rotativa e secaram-se sob alto vácuo obtendo-se 1,702 g do produto pretendido (rendimento de 26,4%).

Análise calc. para C„.Ho_No0,S 0,5 H-0: C, 57,39; H, 5,28;

Δ1 Z Z Z D Z N, 6,37.

Determinada: C, 57,48; H, 5,10; N, 6,25. B. 3-iodometil-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo-[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxilato de 3 propenilo

Agitou-se uma solução de 0,800 ml (5,6 mmoles) de iodeto de trimetilsililo e 1,20 g (2,8 mmoles) de éster 3-propenílico de cefaloram [obtido no Passo (a)] em 30 ml de cloreto de metileno, sob atmosfera de azoto, ã temperatura ambiente durante 1 hora. Adicionaram-se mais 20 ml de cloreto de metileno e, em seguida, extraíu-se a mistura reaccio nal com 30 ml de ãgua, 2 x 50 ml de metabissulfito de sódio e -46 ς 30 ml de água. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de só dio e removeram-se os dissolventes por evaporação rotativa e secou-se sob alto vácuo obtendo-se 1,10 g do composto em título (rendimento de 79%). RMN 1H (cdci3 ) cíT : 7,4-7,1 (m, 5H), 6,1 (d, 1H), 6,1-5,8 (m, 1H) , 5,8 (dd, 1H), 5,4-5, 2 (m, 2H) , 4, 9 (d, 1H), 4,72 (d, 2H) , 4,32 (q» 2H), 3,7 e 3,4 (q), 3,6 (d) . 1.1.4 3-[[(2-hidroxi)-etil]-tiometil]-7-fenilacetamido-8- -oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxi-lato de 3-propenilo

Agitou-se uma solução de 1,10 g (2,21 mmoles) do éster alílico de 3-iodometil-cefalosporina da Preparação I an terior, 0,309 ml (4,42 mmoles) de 2-mercaptoetanol e 0,386 ml (3,32 mmoles) de 2,6-lutidina, durante 1 hora ã temperatura ambiente, sob atmosfera de azoto, em 30 ml de cloreto de me tileno. Após extracção com 4 x 50 ml de ácido acético 0,1N secou-se a fase orgânica e concentrou-se por evaporação rota tiva. A análise por ressonância magnética nuclear indicou que todo o composto inicial não tinha sido consumido; portanto , redissolveu-se o resíduo em 30 ml de cloreto de metileno e tratou-se de novo com 0^150 ml (2,20 mmoles) de mercaptoeta-nol e 0,190 ml (3,30 mmoles) de 2,6-lutidina, sob atmosfera de azoto durante 3 dias. Tratou-se a mistura reaccional como anteriormente. Realizou-se a cromatografia numa coluna de gel de sílica de 2,54 x 7,62 cm (1" x 3") utilizando um gradiente crescente de acetato de etilo em hexano (25%—75% acetato de etilo). Eluíu-se o produto com uma concentração em acetato de etilo de 35%-45%, isolou-se por evaporação rotativa e se-cou-se sob alto vácuo. 0 produto pesava 175 mg (rendimento de 18%).

Análise Cale. para C2iH24N2°5S2 H20: C' H' 5,51; N, 6,12.

Determ.: C, 55,44; H, 5,28; N, 6,05. ΕΜ-FAB: MH+ 449; PM observado 448. RMN 1H (CDC13) é : 7,3 (m, 5H) , 6,1 (d, 1H) , 5,85 (m, 1H) , 5,73 (dd, 1H), 5,4-5,2 (m, 2H), 4,9 (d, 1H), 4,64 (d, 2H), 3,85 e 3,2 (q) , 3,6 (d), 2,75-2,5 (m, 2H) . RMN 3C (CDC13) : 171,0 , 164,0, 134,0, 131,0, 129,9, 129,3, 129,1, 127,6, 119,5, 66,7, 61,2, 59,0, 57,9, 43,2, 33,9, 32,9, 27,4. 1.1.5 3-[[(2-hidroxi)-etil]-tiometil]-7-fenilacetamido-8- -oxo—5-tia-l-azabiciclo [4.2.0] octa-2-eno-2-carbox_i lato de difenilmetilo A uma solução de 6,0 g (9,8 nunoles) de 3-iodometil--7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2--carboxilato de difenilmetilo e 1,14 ml (9,9 mmoles) de 2,6--lutidina em 50 ml de dimetilformamida anidra, adicionou-se O, 69 ml (10,1 mmoles) de 2-mercaptoetanol puro e agitou-se à temperatura de 25°C sob atmosfera de azoto. Agitou-se a mis^ tura reaccional durante 52 horas e, em seguida, verteu-se num funil de separação contendo 450 ml de uma mistura a 8:1 de acetato de etilo e éter dietílico e 450 ml de água. Agitou--se a mistura reaccional e descartou-se a fase aquosa. Secou--se o extracto orgânico sobre sulfato de sódio anidro e con- -48 centrou-se sob vazio. A cromatografia rápida em gel de sílica utilizando como eluente uma mistura 20% até 40% de acetato de etilo/hexano proporcionou 1,85 g (rendimento de 32%) do pro duto pretendido sob a forma de um sólido quase branco. RMN χΗ (CDC13) 6 : 7,44-7,22 (m, 15H), 6,87 (s, 1H), 6,07 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,80 (dd, J = 9,0, 4,9 Hz, 1H), 4,96 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 3,74 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 3,62 (m, 2H), 3,56 (m, 2H), 3,50 (d, J = 4,9 Hz), 3,7-3,4 (m, 2H, parcialmente encoberto), 2,50 (m, 2H). 1.1.6 Acido 3-[[(2-hidroxi)-etil]-tiometil]-fenilacetamido-8- -oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxíli- co

Fez-se uma suspensão de 1,21 g (2,10 mmoles) de 3 —[[(2— -hidroxi)-etil]-tiometil]-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-aza-biciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxilato de difenilmetilo sólido em 4 ml de anisol. Assegurou-se que todo o sólido ficasse molhado com o dissolvente. Arrefeceu-se o recipiente num banho de água com gelo e, em seguida, com o auxílio de uma serin ga, adicionaram-se 10 ml (0,13 mmoles) de ácido tricloroacéti-co previamente arrefecido até ã temperatura de 2°C. Agitou-se a mistura reaccional durante 5 minutos e, em seguida, retirou--se o banho de arrefecimento. Agitou-se a mistura reaccional durante 30 minutos ã temperatura ambiente (25°C) e, em seguida, removeram-se os produtos voláteis sob alto vácuo. A análise por cromatografia em camada fina em gel de sílica revelou 3 produtos principais quando visualizados sob radiação ultravioleta após eluição com uma mi stura a 8:1:0,5 de clorofór- ./

-49-

mio/álcool isopropílico/ácido acético. A cromatografia rápi^ da utilizando-se misturas a 8:0,5:0,5, depois a 8:1:0,5 e, em seguida, a 8:2:1 dos mesmos dissolventes como eluentes pro porcionou os três produtos. 0 produto mais polar foi tritura do com éter dietílico para dar 154 mg (rendimento de 18%) do produto pretendido, sob a forma de um sólido branco. Reco-lheram-se as fases de lavagem etéreas e conservaram-se no con gelador após concentração, para se obter um óleo. RMN H (DMSO-dg) 6 : 9,07 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,29-7,19 (m, 5H), 5,57 (m, 1H), 3,71-3,2 (m, 8H), 2,5-2,46 (m, 2H). 1.1.7 3-[(2-carboxietil)-tiometil]-7-fenilacetamido-8-oxo- -5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxilato de difenilmetilo A uma solução de 3,244 g (5,31 mmoles) de 3-iodome-til-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2--eno-a^carboxilato de difenilmetilo e 1,86 ml (15,93 mmoles) de 2,6-lutidina, adicionou-se 0,93 ml (10,6 mmoles) de ácido -3-mercaptopropiõnico puro e agitou-se ã temperatura de 25°C eu» 50 ml de diclorometano, sob atmosfera de azoto. Após agi tação durante 24 horas verteu-se a mistura reaccional em ãc_i do clorídrico 0,5N e extraíu-se com 3 porções de cloreto de metileno. Reuniram-se os extractos orgânicos, secaram-se com sulfato de sódio, concentraram-se e purificaram-se por croma-tografia rápida em SiC^ utilizando como eluente um gradiente de 40 a 100% de acetato de etilo/hexano para se obter o produ to pretendido sob a forma de um sólido quase branco, na quantidade de 1,28 g .(rendimento de 41%). -5 0- RMN 1H (CDC13) & : 7,4-7,2 (m, 15H), J = 10 Hz, 1H), 5,80 (dd, J = 9,3, 4,8 = 5,9 Hz, 1H), 3,65 (m, 2H), 3,56 (ABQ 2H), 3,52 (m, 2H) , 2,8-2,4 (m, 4H) . 6,92 (s, 1H), 6,22 (d Hz, 1H), 5,00 (d, J = J = 94,3, 14,0 Hz , / r 1.1.8 Ácido 3-[(2-carboxietil)-tiometil]-7-fenilacetamido--8-oxo-5-tia-l-azabiciclo [4.2.0] octa-2-eno-2-carboxí. lico

Molha-se com 3 ml de anisol 1,01 g (1,71 mmoles) de 3-[(2-carboxietil)-tiometil]-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l--azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxilato de difenilbutilo em um frasco de fundo redondo de 50 ml. Arrefeceu-se o reci_ piente da reacção num banho de água com gelo e adicionaram-se 10 ml (0,13 mmoles) de ácido trifluoroacético previamente arrefecido até à temperatura de 2°C. Decorridos 5 minutos, re-tirou-se o banho de arrefecimento e agitou-se a mistura duran te 35 minutos, ã temperatura ambiente, removendo-se em seguil da os produtos voláteis sob alto vácuo. O sólido amarelo restante dissolveu-se momentaneamente em 25 ml de diclorome-tano precipitando em seguida um sólido branco. Mediante filtração por sucção e secagem sob vazio obtiveram-se 402 mg (rendimento de 56%) do diácido pretendido. EM-FAB (ΝΟΒΑ): 436 RMN 13C (DMSO-dg) £ : 172,8, 170,9, 164,5 , 163,0, 135,8, 128,9, 128,2, 128,1, 126,4, 124,6, 58,8, 57,9, 41,5 , 34,3, 32,3, 26,7, 25,6. -51- -51-

1-1.9 3-[[(4-nitrofenoxi)-carboniloxi]-metil]-7-fenilaceta mido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-car boxilato de difenilraetilo

Adicionou-se 0,200 ml (2,5 ramoles) de piridina a 1,030 g (2,0 mraoles) de 3-hidroximetil-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia--1-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxilato de difenilmetilo e 444mg (2,2 inmoles) de cloroformato de £-nitrofenilo em 20 ml de cloreto de metileno, sob atmosfera de azoto, ã temperatura ambiente. Após agitação durante 75 minutos, removeu-se o diíã solvente num evaporador rotativo. A cromatografia rápida foi realizada numa coluna de gel de sílica de 1 x 5 cm com um gra diente crescente de acetato de etilo em hexano (25%-50% de acetato de etilo). Por repouso, aquelas fracções que continham o produto carbonato produziram cristais que se filtraram, reu niram e lavaram com acetato de etilo/hexano a 1:1. Secou-se o produto sob alto vácuo. Obtiveram-se 517 mg (rendimento de 38%) de produto. P.F.: 161°-162,5°C.

Análise Cale. para C3gH29N3°9S: C, 63,62; H, 4,30; N, 6,18. Determ.: C, 63,35; H, 4,10; N, 6,10. EM FAB: MH+ 680. RMN jH (CDC13) & : 8,25 (d, 2H), 7,2-7,4 (m, 17H), 6,9 (s, 1H), 6,0 (d, 1H), 5,87 (dd, 1H), 5,2 e 4,95 (q, 2H), 4,95 (d, 1H) , 3,6 (d, 2H), 3,5 (q, 2H) . -5 2-

1.1.10 7-fenilacetamido-3-[[(1,2,2,2-tetracloroetoxi)-carbo niloxi]-metil]-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa--2-eno-2-carboxilato de difenilmetilo

Agitaram-se 5,15 g (0,010 mole ; de 3-hidroximetil--7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-ai,<..oic^clo [4.2.0] octa-2-eno--2-carboxilato de difenilmetilo e 1,53 ml (0,010 nole) de cio roformato de 1,2,2,2-tetracloroetilo, que se dissolveram parcialmente ã temperatura de 0°C era 125 ml de cloreto de metile no sob atmosfera de azoto. Adicionou-se 0,97 ml (0,012 mole) lentamente, mantendo-se a temperatura a 0°C. Após estar completa a adição, todo o produto estava dissolvido, deixando-se a mistura reaccional retomar a temperatura ambiente, com agitação durante, 30 minutos. Transferiu-se o conteúdo do recipiente de reacção para um funil de separação e extraíu-se a fase orgânica por duas vezes com 75 ml de ácido clorídrico 0,5N arrefecido e uma vez com 75 ml de água. Separou-se a fa se orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Evaporou-se esta fase num evaporador rotativo formando-se uma espuma que em seguida se secou sob alto vácuo, ã temperatura de 35°C, obten do-se 7,15 g do produto (rendimento de 99%). RMN 1H (CDC13) : 7,4 - 72 (m, 15H), 6,90 (s, 1H), 6,60 3, 1H) , 5,97 (d, 1H), 5,87 (dd, 1H), 5,1 (m, 2H), 4,93 (d, 1H), 3,62 (dd, 2H), 3,45 (dd, 2H). RMN 13C (CDC13) : 171,5, 165,3, 160,7, 151,8, 139,2, 139,1, 133,9, 129,7-129,6, (picos múltiplos), 124,8, 124,7, 91,3, 80,3, 68,43, 68,37, 59,4, 57,7, 43,4, 26,4. EM FAB: (ΝΟΒΑ + Kl) [M+K]+ a m/e 763. -53-

Microanálise Calculada para C22H26N2°7C'*'4S: Cf 53,05; H, 3,62 N, 3,87.

Determ.: C, 52,97; H, 3,47; N, 3,80. 1.2 Preparação de Pró-Fármacos Agentes Citotóxicos Cefa- losporínicos 1.2.1 Acido 3-[[[4-[bis-(2-cloroetil)-amino]-fenil]-amino-carboniloxi]-metil]-8-oxo-7-(fenilacetamido)-5-tia--1-azabiciclo[4,2;0]octa-2-eno-2-carboxílico (referido daqui em diante como CM)

Adicionou-se uma solução de 3,92 g (0,0151 mole) do isocianato não purificado preparado anteriormente, em 10 ml de dimetilformamida anidra, a uma solução de 2,65 g (0,00688 mole ) do sal de potássio de cefalosporina preparado anterior mente, com agitação ã temperatura de 25°C e sob atmosfera de azoto. Adicionaram-se imediatamente 2,7 ml (0,020 mmole) de trietilamina. Agitou-se mistura reaccional durante 26 horas e, em seguida, verteu-se em 500 ml de uma mistura a 1:1 de ace tato de etilo/água. Após agitação, adicionaram-se 100 ml de éter dietílico à emulsão. Separou-se a fase orgânica. Acidi -5 4-

ficou-se a fase aquosa até pH 5 com ácido clorídrico IN e ex-traíu-se com 200 ml de éter dietílico. Separou-se o extracto orgânico e acidificou-se ainda a fase aquosa restante até pH 3. Separou-se a fase orgânica formada e secaram-se as três fases orgânicas, separadamente, com sulfato de sódio anidro e concentraram-se, também separadas, sob vazio. Submeteu-se ca da fracção a cromatografia rápida, separadamente, em Baker Octadecyl C^g utilizando primeiro 20% e depois 30% e 40% de cianeto de metilo/ãgua^ como eluente. Concentrou-se cada fracção pura, separadamente, num evaporador rotativo sob vazio à temperatura de 30°C até ã remoção de quase todo o ace-tonitrilo. Filtraram-se as soluções aquosas através de lã de vidro para remoção dos sólidos oleosos vermelho escuro que tinham precipitado. Eliminou-se a ãgua num liofilizador e reuniram-se os restantes sólidos, floculentos brancos, ligei_ ramente amarelados, e secou-se durante 12 horas sob vazio à temperatura de 25°C sobre pentõxido de fósforo. Reuniram-se as fracções sobrepostas, ligeiramente impuras, provenientes da cromatografia e reuniram-se os sólidos vermelhos removidos previamente e submeteu-se a nova cromatografia como anterior-mente para se obter mais produto após secagem sob vazio. A quantidade total do produto foi 280 mg (9%) de um sólido flo-culento branco, ligeiramente amarelado. IV (KBr) 3404 b, 3060, 2958, 1780, 1724, 1666, 1666, 1522, 1392, 658 cm"1; FAB/NOBA MH+ calc. para C27H2gN406Cl2S = = 607,1185; determ.: 607,1171; 1H RMN [DMSO- dc]<£ 13,85-13,55

O

[bs, 1H], 9,41 [bs, 1H], 9,09 [d, J = 8,2 Hz, 1H], 7,30-7,18 (m, 7H), 5,65 [m, 1H], 5,07 [d, J = 4,8 Hz, 1H], 5,01, 4,72

[2d, J = 12,6 Hz, 2H], 3,66 [bs, 8H], 3,70 - 3,44 [m, 4H], BMN13C -55- -55- 142,7, 57,6,

[DMSO - dg] 171,5, 165,2, 163,5, 153,9, 128,6, 126,9, 120,6, 112,7, 63,1, 59,2, 41,3, 25,7). 1.2.2 Ãcido 3-[[(N-adriamicinil)-carboniloxi]-metil]-7-fe nilacetamido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2--eno-2-carboxílico (referido aqui posteriormente por ADR-cef) 0 OH o

(A) Éster difenilmetílico de ADR-cef

Agitaram-se em 25 ml de dimetilformamida durante 45 horas 116 mg (0,2 mmole ) de cloridrato de adriamicina, 122 mg (0,18 mmole) do carbonato de £-nitrofenil-cefalosporina do Exemplo 1.1.9 e 33 jil de trietilamina (0,24 mmole). Removeu--se o dissolvente num evaporador rotativo. Redissolveu-se o resíduo em 100 ml de acetato de etilo e extraíu-se com 150 ml de ácido acético a 0,1%. Extraíu-se a fase aquosa com aceta-

X -56- / to de etilo e reuniram-se as fases orgânicas que se concentra ram até à secura por evaporação rotativa. Realizou-se a croma tografia rápida numa coluna de gel de sílica 1,27 x 15,24 cm (0,5" x6") utilizando como eluente cloreto de metileno segui^ do de uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 97:3. Reu niram-se as fracções vermelhas, concentraram-se e cromatogra faram-se como anteriormente numa coluna de 1,26 x 6,72 cm (0,5" x 3"). Reuniram-se as fracções apropriadas que continham o componente vermelho, concentraram-se por evaporação rotativa e secaram-se sob alto vácuo para se obterem 80 mg do produto (rendimento de 41%). EM-FAB: MH+ 10 85,' M+ 1084 RMN χΗ (picos seleccionados S : 7,9 (m), 7,7 (m), 7,1-7,4 (m) , 5, 7 (dd) , 6,8 (s) , 4,0 (d), 1,2 (d). (B) Processo alternativo para a preparação do éster dife nilmetílico de ADR-cef

Dissolveram-se 72 mg (0,10 mmole) do intermédio cefa losporínico do Exemplo 1.1.10, em 2 ml de tetra-hidrofurano.

Em seguida, adicionou-se esta solução, gota a gota, a uma so lução agitada de 44 mg (0,076 mmole) de cloridrato de adria-micina e 13 mg (0,15 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio parcialmente dissolvidos em 2 ml de ãgua/1 ml de tetra-hidro furano à temperatura ambiente. Decorrida 1 hora, a cromato-grafia em camada fina e a cromatografia líquida de alta resolução (riPLC) mostraram que a reacção estava completa. Diluíu-se o conteúdo do recipiente com 25 ml de acetato de etilo e extraíu--se uma vez com 25 ml com ácido acético 0,1N. Concentrou-se a fase orgânica por evaporação rotativa e, em seguida, purificou-se o resíduo por cromatografia rápida em gel de sílica Merck 60 com a série de eluente seguinte: (1) 200 ml de cio reto de metileno, (2) 100 ml de cloreto de metileno/acetato de etilo a 9:1, (3) 100 ml de cloreto de metileno/acetato de etilo a 8:2, (4) 100 ml de cloreto de metileno/metanol a 98:2, (5) 100 ml de cloreto de metileno/metanol a 96:4 e (6) 100 ml de cloreto de metileno/metanol a 92:8. A fracção pro duzida pura foi recolhida durante a eluição com 2-4% de meta nol. Concentrou-se esta fracção até à secura por evaporação rotativa e, em seguida, secou-se sob alto vácuo ã temperatura de 35°C obtendo-se 66 mg (rendimento de 80%) do carbamato de adramicina.

RMN 1H (CDC13): 13,95 (s, 1H), 13,18 (s, 1H), 7,99 (d, 1HJ 7,75 (t , 1H) , - 7, 36 (d , 1H) , 7,3 (m, 15H) , 6,8 1 (s , 1H 667 (d, 1H) , i 3,76 (dd, 1H) , 5,48 (s, 1H) , 5,22 (m, 2H) 4,86 (d, 1H) , 4,7 (m, 2H) , 4,55 (s, 1H) , 4,08 (m, 1H) , (s, 3H) , 3,75 (q, 1H) , 3,5 (largos, 3H) , 3,3-2 ,85 (m, 2,58 (d, 1H), 2,34-2,12 (dd, 2H), 1,26 (d, 3H). RMN 13C (CDC13): 186,9, 186,5, 171,3, 165,2, 160,9, 160,6, 156,1, 155,5, 154,9, 139,0, 138,9, 135,7, 135,2, 133,7, 133,5 130.4, 129,3-126,8, (picos múltiplos), 124,8, 120,6, 119,7, 118.4, 111,4, 111,2, 100,6, 79,6, 69,5, 69,0, 67,2, 65,4, 62,8, 59,1, 57,6, 56,5, 47,1, 43,1, 35,5, 33,8, 29,8, 29,6, 26,0, 16,7. EM FAB: [M+K]+ a m/e 1123 C, 58,04;

Microanálise: Calculado para C^H^N^O^S. 5,31^0 H, 5,43; N, 3,56.

Determ.: C, 57,99; H, 4,66; N, 3,60. -58- -58-

(C) Preparação de ADR-cef

Adicionaram-se 2,5 ml de ácido trifluoroacético rapi_ damente a uma solução agitada, arrefecida com banho de gelo e água, de 1,0 g (0,922 mmole) do éster difenilmetílico de ADR-cef e 2,5 ml de anisol em 10 ml de cloreto de metileno. Agitou-se continuadamente durante 1 minuto após o que se ver teu a solução numa mistura agitada de água contendo gelo. Au mentou-se rapidamente o pH até 7,4 mediante a adição de uma quantidade inferior a 1 equivalente de hidróxido de sódio di^ luido, seguida da adição de solução aquosa diluída de hidro-genocarbonato de sódio. Lavou-se a mistura com acetato de etilo. Filtrou-se a fase aquosa através de terra de diatomá ceas. Bombou-se o resultado para uma coluna de HPLPLC de Mi^ chel-Miller (22x300 mm) (adquirida a ACE Glass, coluna concebida por K. H. Michel e R. F. Miller, patente de invenção nor te-americana nQ 4 131 547) contendo Partisil Prep 40 ODS-3 (Whatman Chemical Separation, Inc., Clifton, N. J.) que pre-viamente tinha sido equilibrada com tampão de fosfato de amó nio 0,02M (pH 6,5) contendo 10% de acetonitrilo. Eluíu-se a coluna com 150 ml deste tampão e, em seguida, com uma solução--tampão contendo 40% de acetonitrilo, com o que o composto em título eluíu rapidamente sob a forma de uma banda vermelha discreta. Reuniram-se as fracções contendo o produto e di-luíu-se com ãgua. Adicionou-se acetato de etilo à solução aquosa e reduziu-se o pH até 3,4 mediante a adição de ácido clorídrico diluído. Lavou-se a fase aquosa de acetato de eti^ lo sequencialmente com água e com solução saturada de cloreto de amónio e, finalmente, secou-se com sulfato de sódio. A re -59-

L moção do acetato de etilo deu 102 mg do composto em titulo sob a forma de um sólido cor de laranja claro. Reuniram--se as lavagens aquosas e reduziu-se o pH até 2,5 com ácido clorídrico diluído. Extraíu-se novamente com acetato de eti. lo, como descrito anteriormente, recolhendo-se mais 25 mg do composto em título. A análise por cromatografia líquida de alta resolução mostrou que cada fracção tinha a mesma percentagem de pureza (>99). HPLC: (tempo de retenção = 8,14 minutos) .Cartucho radial C18

Waters. 2,0 ml/minuto: 60% da bomba A (0,05 .·., pH 6,5, fosfato de amónio + cianeto de metilo a 5%) e 40% da bomba B (cianeto de metilo, 80% -água, 20%). Detecç ão a 254 nm. RMN 1. H : < DMSO '~d6 ' 300 MHz) s 13 ,99 (1H , s) , 13,23 (1H, s), 9,05 (1H, d) , 7,90 -7,86 (2H , rn) , 7, 60 (1H, dd) , 7,27 -7,19 (5H, m) , 6 ,91 (1H, d), 5,60 (1H, dd) , 5,42 (1H, s) , 5,20 (1H, s) , 5 ,01 (1H, d), 4,88 (3H, m) , 4 ,73 (1H, m) , 4 ,57 (3H, m 4,14 (1H, m) , 3,95 (3H, s), 3,67 (1H, m) , 3,56- 3,33 (6H, m) , 2,96 (1H, d) , 2,87 (1H, d), 2,18 (1H, d) , 2,07 (1H, dd) , 1,82 (1H, m) , 1,45 (1H, m), i,n (3H, d) . RMN 13C (DMSO- d6' 360 MHz) 6 213 ,8 , i 86,6 , 186 ,4, 170,9 t 164, 7, 162 ,8, 160, 8, 156,1, 155,1 / 154 ,5, 136,2 , 135 ,8, 135,6, 134, 7, 134 129, 0, 128,2, 126,4 t 126 ,0, 124,5 , 120 ,1, 119, 8, 119 ,0, 110, 8, 110,7, 100,3 r 75, 0, 69,9, 68,0, 66, 7, 63,7, 62,5, 59,1, 57,4, 56,6, 47,2, 41,6, 36,7, 32,1, 29,8, 25,4, 17,0.

Espectro de massa: (ião positivo FAB, ΝΟΒΑ + Kl) m/z 956 (M+K)+. -60 1.2.3 7-fenilacetamido-3-[(N-t-BOC-melfananil)-metil]-8--oxo-5-tia-l-azabiciclo [4.2.0] octa-2-eno-2-carboxi1 lato de 4-metoxibenzilo

-60 =hCH,C

n<ch2ch2ci)2

Agitou-se uma suspensão de 0,946 mg (2,0 mmoles) de 3-clorometil-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0J_ octa-2-eno-2-carboxilato de 4-metoxibenzilo e 1,20 g (8,0 ramo les) de iodeto de sódio em 90 ml de acetona, durante 2 horas à temperatura ambiente. Removeu-se o dissolvente por evapo ração rotativa. Dissolveu-se o resíduo em 75 ml de cloreto de metileno e extraíu-se com 3 x 50 ml de metabissulfito de sódio a 5% e 50 ml de água. Secou-se o produto sobre sulfato de sódio e concentrou-se até ã secura por evaporação rota tiva, obtendo-se 758 mg (rendimento de 67%) do éster y-iodo-metílico de cefalosporina correspondente. Em seguida, agitaram-se 678 mg (1,2 mmoles), deste iodeto de cefalosporina em 25 ml de dimetilformamida com 101 mg (1,2 mmoles) de hidro genocarbonato de sódio e 486 mg ( 1,2 mmoles) de N-t-BOC-mel-fano durante 3 horas à temperatura ambiente. Após a remoção do dissolvente por evaporação rotativa, dissolveu-se o resíduo em 75 ml de acetato de etilo e extraíu-se com 3 x 50 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio e 50 ml -61- de água. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio , ’ concentrou-se por evaporação rotativa e purificou-se por dois procedimentos de cromatografia rápida. No primeiro pro cedimento realizou-se a eluição numa coluna de gel de sílica de 5,1 x 20,3 cm (2" x 8") com clorofórmio/metanol a 97:3.

No segundo procedimento, o produto parcialmente purificado foi eluído em uma coluna de gel de sílica com as mesmas dimensões, com 500 ml de clorofórmio seguidos de 400 ml da mi£ tura clorofórmio/metanol a 97:3. Reuniram-se as fracções apro priadas e concentraram-se parcialmente os dissolventes por evaporação rotativa. Precipitou-se um sólido mediante a adi_ ção de uma solução de éter dietílico/hexano. Filtrou-se o sólido e secou-se sob alto vácuo. Obtiveram-se 200 mg (rendi men co de 19,5%) de produto. EM FAB: MH+ 855; PM observado 854. EMN χΗ (CDC13) 6 : 7,5-7,2 (m) , 7,0 (d), 6,9 (d), 6,6 (d), 6,0 (T) , 5,8 (dd), 5,2 (s), 4,9 (d), 4,32 (q), 3,8 (s), 3,8-3,4 (m), 1,4 (s). 1.2.4. 7-fenilacetamido-3-[(N-t-BOC-melfananil]-8-oxo-5-tia--l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxilato de dife- nilmetilo

«-©h N<CH2CH2C1>2 3 -6 2-

Agitou-se uma suspensão de 1,038 g (2,0 mmoles) de 3-clorometil-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0J_ octa-2-eno-2-carboxilato de difenilmetilo e 1,20 g (8,0 mmo-les) de iodeto de sódio em 25 ml de acetona, durante 2 horas ã temperatura ambiente. Removeu-se o dissolvente por evaporação rotativa. Dissolveu-se o resíduo em 75 ml de acetato de etilo e extraíu-se com 3 x 75 ml de solução saturada de cloreto de sódio. Secou-se o produto sobre sulfato de sódio e concentrou-se até à secura por evaporação rotativa, obtendo-se o correspondente éster 3-iodometílico de cefalosporina.

Em seguida, agitaram-se 610 mg (1,0 mmole) deste iodeto de cefalosporina em 10 ml de dimetilformamida com 84 mg (1,0 mmo l-.-s) de hidrogenocarbonato de sódio e 405 mg de N-t-BOC-melfalo no (1,0 mmole), durante dois dias à temperatura ambiente.

Após a remoção do dissolvente por evaporação rotativa, dissol^ veu-se o resíduo em 100 ml de acetato de etilo e extraíu-se com 3 x 75 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de só dio e 50 ml de água. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, concentrou-se por evaporação rotativa e purificou--se por cromatografia rápida numa coluna de gel de sílica de 5,1 x 12,9 cm (2" x 9") com o gradiente de eluição seguinte: (1) 600 ml de CHC13/CH30H a 95:5, (2) 400 ml de CHC13/CHC130H a 90:10; e (3) 600 ml de CHC13/CH30H a 80:20. Reuniram-se as fracções apropriadas e concentraram-se os dissolventes por evaporação rotativa. Isolou-se o produto sólido por tritura ção com hexano. Filtrou-se e secou-se sob alto vácuo. Obti-veram-se 117 mg (rendimento de 13%) de produto. EM FAB: PM observado 900. -63 RMN 1Η : 7,5-7,2 (m) , 6,9 (d), 6,6 (d), 5,6 (dd) , 5,2 (d), 3,7-3,5 (m), 3,15 (q), 1,4 (s). 1.2.5 Acido 7-fenilacetamido-3-(7-mitomicina C)-8-oxo-5--tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-carboxílico

Reduziu-se uma solução de 100 mg de ácido 3-azidome- til-7-fenilacetamido-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2- -eno-2-carboxílico [preparado de acordo com Crocker, J. D. et al., J. Chem. Soc., (1965) 5015 a 5027-5028] em 10 ml de etanol contendo 100 ul de ácido perclórico a 70%, à pressão 2 de 2,46 kg/cm (35 psi), sobre 20 mg de platina. Apos 18 ho ras, a cromatografia em camada fina em gel de sílica, utilizando álccol n-butílico: ácido acético: água a 4:1:1 como eluente, indicou a formação de um único produto mais polar que era positivo ao teste da ninidrina para as aminas primárias. Adicionaram-se 175 jil de diisopropiletilamina e removeram--se os produtos voláteis sob vazio. Fez-se uma suspensão do resíduo em 10 ml de metanol e, em seguida, tratou-se com 100 jil de diisopropiletilamina e 70 mg de mitomicina A. Agitou-se a mistura escura sob atmosfera de azoto durante 18 horas. A cro matografia em camada fina em gel de sílica, com o sistema di^ solvente indicado anteriormente, mostrou que a reacção estava completa com a formação de um composto mais polar do que a mitomicina A. Adsorveu-se a mistura reaccional escura em 2 g de gel de sílica C-18 e introduziu-se o pó seco numa co luna C-18 de 15 cm x 2,5 cm, equilibrada com água, e eluíu--se com 150 ml de água e com uma mistura metanol/água a 3:7. Reuniram-se as fracções que continham o derivado cefalospor^L nico de mitomicina foram reunidas e evaporou-se sob vazio, obtendo-se o composto em título sob a forma de um sólido azul (60 mg). A uma solução azul-esverdeado de 0,3 mg do composto em título, em 1 ml de PBS adicionou-se BCP II penicilase de Bacillus cereus II; 10 ul, com a concentração em proteínas de 4,1 mg/ml). Imediatamente se modificou a cor para azul. A cromatografia em camada fina em Si02 com uma mistura de metanol/clorofõrmio a 1:9 e álcool n-butílico/ácido acético/ /água (vidé supra) indicou a conversão completa em mitomicina C. 1.2.6 Acido 3-[[[4-[bis(2-cloroetil)-amino]-fenil]-amino-carboxi]-metil]-7-glutaroilamino-8-oxo-5-tia-l-aza-biciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxílico

1 1

Converteu-se ácido 7-glutaroilamino-3-hidroximetil--8-oxo-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]octa-2-eno-2-carboxílico (descrito na patente de invenção norte-americana NO 3 912 589) no correspondente sal de bistrietilamónio por dissolução do ácido em 4 ml de acetato de trietilamónio e aplicando-se a solução a uma coluna de 100 g de C-18, com 24 cm x 3 cm, equilibrada com o mesmo tampão. Eluiu-se a coluna com Et^NHOAc 0,1M sob pressão de azoto e reuniram-se as fracções que continham o sal pretendido e evaporou-se, obtendo-se o sal de bistrietilamónio do ácido 7-glutaroilamino-3-hidroxi. metil-8-oxo-5-tia-l-azabiciclo [4.2.0] octa-2-eno-2-carboxí li. co sob a forma de uma goma amarela clara, após secagem sobre pentóxido de fósforo, sob vazio. Este produto foi utilizado tal e qual para o acoplamento subsequente com o isocianato de fenilenodiamina-mostarda. A uma suspensão verde, agitada por via magnética , de 969 mg ( 3,6 mmoles) de cloridrato de fenilenodiamina-mos tarda em 40 ml de tetra-hidrofurano absoluto, sob atmosfera de azoto, à temperatura de 0°C, adicionaram-se 630 ^il (3,6 mmo les) de diisopropiletilamina. Decorridos 10 minutos adicionou--se, gota a gota, uma solução de fosgénio em tolueno (1,95 ml, 1,9 M). Após 1 hora à temperatura de 0°C a cromatografia em camada fina sobre SiO^ com acetato de etilo/hexano a 1:4 in dicou que a reacção aitava completa com a formação do isocianato como o principal produto, menos polar. A uma solução de 1,64 g do sal de bistrietilamónio em 10 ml de dimetilformamida anidra, ã temperatura de 0°C sob atmosfera de azoto, adicionaram-se 1,6 ml de diisopropiletil^ amina. Decorridos 5 minutos a solução de isocianato arrefeci -66- !

da com gelo (vidé supra) foi introduzida através de um tubo em corrente fraca, na solução de dimetilformamida. Agitou--se a solução cor de laranja à temperatura de 0°C durante 3 horas. 0 pH aparente da mistura reaccional era 5 e não hou ve mais conversão, por cromatografia fina em gel de sílica (múltiplos desenvolvimentos com clorofõrmio/metanol/ãcido acético). Diluíu-se a mistura reaccional com 30 ml de aceto nitrilo. Adicionaram-se 10 g de gel de sílica C-18. Remove ram-se os produtos voláteis sob vazio. Aplicou-se o resíduo a uma coluna C-18, de 12 x 12 cm, e elulu-se com acetonitri-lo a 30%, 40% e 50% em ácido acético a 1% em água. Reuniram--se as fracções que continham o composto pretendido e evaporou-se sob vazio, obtendo 500 mg de uma goma amarela pálida. A adição de 6 ml de acetato de etilo a este produto resultou na formação de uma solução amarela na qual cristalitou o com posto em título (350 mg) sob a forma de um sólido macio e le ve.

Espectro de massa de alta resolução: M+ = 602,1022 (observado); 602,1005 (calculado). RMN 1H (DMSO-dg): 9,42 (s, 1H), 8,83 (d, 1H, NH, J = 9 Hz), 7,26 (d, 2H, Ar-H, J = 9 Hz), 6,68 (d, 2H, Ar-H, J = 9 Hz), 5,66 (dd, 2H, ' 7-H, J = 6 Hz e J = 9 Hz) , 5, 10 (d, 1H, 6-H J = 6Hz) , 4,87 (dd , 2H, , 3-CH20-, J = 12 Hz) , 3,67 (s, 8H, NCH2 CH2C1) 2' 3< ,58 (dd, 2H, 2-H, J = 18 Hz) , 2,21 (m, 4H, 4'-H), 1,71 (m, 2H, 3'-H). 2. Avaliação biológica 2.1. Preparação de materiais 2.1.1. Purificação e propriedades de -lactamase de B-cereus -67 -67 l· -lactamases de E. coli e B. cereus comercializa das estavam contaminadas com outras proteínas resultando em actividades específicas baixas. A análise da ^ -lactamase de B. cereus (Sigma Chemical Co.), por SDS-PAGE indicou a presença de uma banda principal a 30 KD e uma banda menor a 25 KD. A separação parcial das proteínas foi conseguida por cromatografia de permuta iónica. A análise das suas actividades utilizando mostarda cefalosporínica como um substrato indicou que o constituinte menor a 25 KD era responsável pela reacção de hidrólise.

As proteínas foram separadas de uma maneira similar ã descri_ ta por Davies et al., Biochem J. 143 (1974) 115-127 que com preende primeiro a desnaturação por aquecimento e depois a cromatografia em uma coluna de permuta catiónica Mono 5 (Pharmacia). A enzima de 25 KD tinha uma elevada pureza, como indicou a análise por SDS-PAGE. EDTA 2,5 mM inibiu completamente a actividade enzimática utilizando-se como um substrato mostarda cefalosporínica. Estes resultados são consisten tes com a qualificação desta enzima como β-lactamase (II) de B. cereus. Colsultar Bush, Antimicrobial Aqents Chemother., 33 (1989) 259. A ^-lactamase de cereus foi hidrolisada com mostarda cefalosporínica com uma Kn de 25 uH e uma Vmáx. -1-1 ~ de 250 jimole-min mg . Com a concentração de 1,4 jig/ml a ^-lactamase (II) de B. cereus purificada reforçou a activi^ dade citotóxica da mostarda cefalosporínica até ao nível obser vado para PDM (Figura 5). -68- -68-

2.1.2. Conjugação de β -lactamase com anticorpo

Ajustou-se uma solução de anticorpo monoclonal L6 (1-10 mg/ml) em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), para 0,015 mM em SMCC (Pierce Chemical Co., 3 mM em dimetilformamida). Decorridos 30 minutos aplicou-se a solução a uma coluna de Sephadex G-25 e eluiu--se com 4 vezes solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (4 x PBS).

Submeteu-se uma solução de β -lactamase de B_^ cereus (Sigma Chemical Co.) ã temperatura de 4°C, em fosfato 10 mM/ /cloreto de sódio, 200 mM, pH 7,5 (1-10 mg/ml) a tratamento com iminotiolano (Pierce Chemical Co., 16,5 mM em borato de sódio 0,5 M, pH 8,5) de forma a que a concentração final de iminotiolano fosse de 1,5 mM. Deixou-se a reacção processar--se à temperatura de 4°C durante 90 minutos e purificou-se a proteína do modo anteriormente descrito.

Deixaram-se reagir as duas proteínas modificadas por via química, a uma relação molar de 1:1, à temperatura de 23°C, durante 1 hora. Bloquearam-se os grupos reactivos mediante a adição de 2-aminoetanotiol (como uma concentração fi nal de 0,01-1 mM) seguido 10 minutos depois por N-etilmaleimi da ou iodoacetamida (concentração final 0,01-1,1 mM) . Purifi_ caram-se os conjugados por uma técnica em dois passos compreendendo cromatografia de exclusão sobre uma coluna de Sepha-cril S-300 (Pharmacia) utilizando como eluente PBS e em segui da cromatografia de permuta iónica em uma coluna de permuta catiõnica Mono S Pharmacia: aplicou-se em PBS e eluiu-se com alta concentração em sal). O rendimento do conjugado (Mab -69- l· lactamase a 1:1) neste procedimento variou entre 15 e 30%.

2.2. Hidrólise enzimática de pró-fármaco citotóxico cefa losporínico 2.2.1. Hidrólise de mostarda cefalosporínica por ^-lactama se

Determinou-se a actividade de diversas ^-lactama-ses comercializadas, utilizando o derivado mostarda cefalo£ porinica (CM). A capacidade destes derivados para hidroli-sar CM foi controlada por HPLC ou por análise espectrofoto-métrica UV/visível. Amostras parcialmente purificadas de l'?-lactamase de B. cereus (Sigma Chem. e Co.) e de ^-lacta mase de E. coli (Boeringer Mannheim Biochemicals) conseguiram hidrolisar CM para libertação da mostarda azotada, PDM. (Figura 3). A soluções de CM 50 ^iM em PBS, ã temperatura de 37°C adicionaram-se amostras comercializadas de β -lactamases de B. cereus e de E. coli (3 ^ig de proteína total/ml) . Diluíram-se aliquotas de 100 ji 1 p^la adição a 100 jil de metanol, à temperatura de 4°C, removendo-se as proteínas precipitadas por centrifugação. Analisaram-se amostras de 100 jil por HPLC utilizando uma coluna C-18 de fase inversa IBM de 4,6 x 250 mm e com as condições de gradiente seguintes: 50-100% de tampão A para tampão B (o tampão A é uma solução aquosa de di-etilamina a 0,08% tamponada a pH 2,3 com ácido fosfórico; o tampão B contém 90% de acetonitrilo e 10% de tampão A) duran te 15 minutos a 1 ml/minuto. Observaram-se as fracções a 266 nm. -70- -70-

ί 2.2.2.

Hidrólise de ADR-cef por -lactamase e conjugado L6-^-lactamase

Avaliou-se a capacidade de |V-lactamase purificada, proveniente de cereus e de conjugado lactamase-L6 para ca talisar a libertação da adriamicina de ADR-cef, em plasma hu mano, à temperatura de 37°C.

Preparam-se soluções de reserva de β-lactamase e de conjugado lactamase-L6 em tampão Hepes 0,05 M (pH 7), adicio naram-se aliquotas dessas soluções de reserva a soluções de ADR-cef em plasma humano termoestatizado a 37°C. A concentra ção final de ADR-cef foi de 572 jig/ml na experiência com β -lactamase e 896 jig/ml na experiência com L6-lactamase; as concentrações finais de β-lactamase e do conjugado L6-lacta mase foram de 0,45 jig/ml e 5,4 jig/ml, respectivamente.

Retiraram-se periodicamente aliquotas e adicionaram--se a dois volumes de metanol arrefecido até ã temperatura de 4°C. Removeram-se as proteínas precipitadas por centrifugação. Analisaram-se sobrenadantes por HPLC utilizando um car tuxo C^g radial Pak, Waters Associates (8x100 mm). Eluíu-se a coluna a 2,0 ml/minuto com uma fase móvel de 60% de fosfato de amónio 0,05 M, pH 6,5, contendo 5% de acetonitrilo, e 40% de uma mistura acetonitrilo/água a 80:20- Detectaram-se os picos por UV a 254 nm . Nestes ensaios os tempos de retenção respectivos para adriamicina e ADR-cef foram 3,8 e 7,5 minutos. A Figura 7 apresenta as áreas dos picos por HPLC de ADR-cef e de adriamicina em função do tempo quando se expôs ADR-cef a β -lactamase, demonstrando que ADR-cef se hidroli- sa de forma eficaz com M-lactamase de B. cereus originando a libertação rápida da adriamicina. Identicamente, a Figura 8 demonstra que o conjugado lactamase-L6 também liberta de forma eficaz a adriamicina a partir de ADR-cef com uma se mi-vida de 15 minutos ãs concentrações pró-fármaco e enzimas utilizadas.

Examinaram-se as actividades específicas de mases escolhidas para a ADR-cef. Estas enzimas foram jp-lacta mase de Β_^ cereus, conjugado lactamase-L6, penicilinase Sigma de cloacae (Sigma Chemical) e cefalosporinase P99 de E. cloacae. Diluiram-se todas as enzimas para se obterem concen trações de proteína de 0,20 + 0,01 mg/ml (no que se refere a β-lactamase). Os doseamentos foram realizados por via espec trofotométrica para tampão de fosfato 0,05 M, pH 7,0, à temperatura de 25°C. Utilizou-se cefaloridina como substrato de referência para as enzimas.

Os resultados desta experiência estão apresentados no Quadro 1. A cefalosporinase P99 mostrou a maior actividade específica para cefaloridina e ADR-cef. O conjugado L6-lactamr -

foi ligeiramente mais activo do que a isolada, provavelmente devido a esta última enzima ter sido diluída para fins de ensaio, implicando, portanto, a possibilidade de perda da actividade na solução diluída. A penicilinase Sigma, apresentou a menor actividade em todas as prepa rações. Esta enzima tinha o mesmo ponto isoeléctrico que a enzima P99, sugerindo que as duas enzimas seriam a mesma. As diferenças na actividade são provavelmente devidas a diferenças de pureza entre as duas preparações.

Determinaram-se os parâmetros cinéticos para o conju- -72- -72-

1 . ι gado L6-lactamase e cefalosporinase P99, que se apresentam no Quadro II. A Vmax foi 3,5 vezes superior para a enzima P99. Contudo, devido ã enzima P99 possuir o valor de Km maior, as eficácias de hidrólise (Vmax/Km) das duas enzimas diferiram apenas de duas vezes. Portanto, as duas enzimas são muito semelhantes no que se refere ãs suas propriedades hidrolít_i cas.

Quadro 1. Hidrólise de substratos de cefalosporina por Π -lactamases

Enzima Substrato ^ímoles/minuto/jig de (100 ^ig/ml) proteína -lactamase Cefaloridina 0,038 de B. cereus ADR-cef 0,016 Conjugado Cefaloridina 0,045 L6-lactamase ADR-cef 0,021 (B. cereus) Penicilinase Cefaloridina 0,026 Sigma de ADR-cef 0,0030 E. cloacae Cefalosporinase Cefaloridina 0,30 P99 ADR-cef 0,060 de E. cloacae -7

Quadro 2. Parâmetros de hidrólise para ADR-cef Enzima Km Vmax. Vmax/km (JiM) ^ímoles/min/jag ^ uno 1 e s / m i n / jig de proteina de proteína/mMS Conjugado 120 0,047 0,40 L6-lactamase (B. cereus) P99 200 0,164 0,82 2.3. Outras avaliações biológicas 2.3.1. Citoxicidade in vitro de CM com A-lactamase

Os efeitos citotóxicos de CM e PDM foram controlados utilizando uma linha de células de adenocarcinoma de pulmão humano, H2981. Plaquearam-se as células (em meio de Dulbecco modificado por Iscove com soro de vitela fetal a 15% (IMDM) em placas microtituladoras de 96 cavidades a 8000 células/ca vidade em 100 jil de IMDM e deixou-se a aderir durante a noite, à temperatura de 37°C. As enzimas em 50 jil de IMDM segui das dos fármacos PDM ou CM em 50 jil de IMDM foram adicionadas ãs cavidades de forma a que a concentração final da enzima fo£ se de 3 jig de enzima não purif icada/ml ou de 1,4 jig de enzima pura/ml. Decorrida 1 hora, lavaram-se as cavidades 3 vezes com IMDM, adicionaram-se 200 ml de IMDM em cada cavidade e incubou-se durante 17 horas seguidas à temperatura de 3^0. Removeu-se o meio e adicionaram-se 200 jil de IMDM contendo [3H]-timidina (1 jiCi/cavidade) e decorridas 6 horas congela- -74 ram-se as células, ã temperatura de -70°C, descongelando-se e recolhendo-se para discos de fibra de vidro. Determinaram-se „ 3 os efeitos citotoxicos medindo-se a quantidade de [ H]-timid_i na incorporada no ADN relativamente ao controlo não tratado. A CM (CI50 aproximadamente 100 jiM] é muito menos cito tóxica do que PDM (CIj-q aproximadamente 1 uM) (Figura 4). As -lactamases de B. cereus e de E. coli reforçaram a activi. dade de CM 50 a 100 vezes. Isto é provavelmente devido ã hidrólise de CM pela acção das enzimas e subsequente libertação de PDM. 2.3.2. Citoxicidade in vitro de CM com conjugado L6-^ -lactamase

Os efeitos citotóxicos de CM administrada com o conjugado anticorpo-β-lactamase, foram observados do modo descrito anteriormente para CM e PDM no Exemplo 2.3.1.. Preparam-se células de pulmão H2981, do modo descrito anteriormen te e, depois, expuseram-se a conjugados L6- β -lactamase durante 1 hora à temperatura de 37°C em meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) contendo soro de bovino fetal a 15%, lavou-se duas vezes e, em seguida, tratou-se com CM como de£ crito no Exemplo 2.3.1 anterior. As células tratadas com CM ou PDM, como descrito no Exemplo 2.3.1., forammtilizadas como controlos. Os resultados, apresentados na Figura 6, demonstram o efeito citotõxico reforçado da administração de CM com o conjugado anticorpo- A-lactamase.

-7 5-2.3.3. Estabilidade e toxicidade in vivo de CM

Determinou-se a estabilidade de CM e PDM em plasma mu rino ã temperatura de 37°C por doseamento HPLC do seu consumo. Incubou-se pDM ou CM (0,5 mM) em plasma murino ou meio de desenvolvimento de células IMDM à temperatura de 37°C, dilulu--se e analisou-se por HPLC do modo descrito anteriormente. A PDM = 20 minutos) foi, significativamente, mais reactiva no plasma murino do que CM (reacção de 12% após 150 minutos). Observou-se uma diferença na estabilidade de 10 vezes no meio utilizado para a cultura de tecidos para PDM e CM igual a 3 e 30 minutos, respectivamente).

Determinaram-se os efeitos citotóxicos de PDM e CM em ratinhos Balb C nu/nu. Administraram-se os fármacos por via endovenosa em doses com intervalos de 24 horas e repetiu--se o tratamento após 1 semana. Nestas condições, PDM apresen tou toxicidade a 50 jig/injecção e um valor tolerado máximo de aproximadamente 38 |ag/injecção. Não se observou toxicidade para CM nas doses de 900 ^ig/injecção. Numa base molar isto representa uma diferença de toxicidades superior a 11 vezes. 2.3.4. Estabilidade de ADR-cef

Utilizando o mesmo ensaio de HPLC descrito no Exemplo 2.2.2 as semi-vidas respectivas de ADR-cef ã temperatura de 37°C em plasma murino, com tampão de pH 7,4, e, em plasma humano, são 8, 20 e ^ 12 horas (Figura 9).

Deste modo, descreveram-se novos pró-fãrmacos cefalos-porínicos e métodos para a sua utilização. Embora os aspectos preferidos da presente invenção tenham sido descritos com a_l gum pormenor, entende-se que podem efectuar-se variações óbvias sem afastamento do espírito e âmbito desta invenção, tal como se definem nas reivindicações apensas.

Claims (5)

1. 1

   REIVINDICAÇÕES ce 1·— Processo para a preparação de pró-fármacos falosporlnicos citotóxicos de fórmula geral

   (I) 1 na qual Q representa um átomo de hidrogénio, um grupo protector convencional do radical amino utili zado na síntese de cefalosporinas ou o grupo acilo de uma 7-acilaminocefalosporina; L representa uma ligação directa ou um grupo de fórmula geral -S-tCí^) - na qual n represen ta o número inteiro 2, 3 ou 4; R representa um agente capaz de exercer efeito citotóxico sobre células tumorais quando liber tado pelo pró-fármaco cefalosporínico citotóxi co; n representa o número inteiro 2, 3 ou 4; e m representa zero ou o número inteiro 1; com a condição de m represebtar o número inteiro 1 quando L representa uma ligação directa; ou dos seus sais aceitáveis em farmácia, caracterizado pelo facto: (a) de se proteger, eventualmente, quaisquer grupos reactivos em repouso presentes na cefalosporina, ou no fármaco citotóxico ou em um seu precursor; (b) de se remover um grupo eliminável presente na cefalosporina, ou no fármaco citotóxico ou em um seu precursor com um grupo nucleofílico presente no fármaco citotóxico ou na 3 3

   cefalosporina; ou de se adicionar uma 3-hicLroximetil-cefalospo-rina ao precursor isocianato do fármaco citotóxico; e (c) de se remover um qualquer dos grupos protecto-res ; utilizando-se como fármaco citotóxico a adriamicina, a mitomi-cina, o melfalan ou o 4-[bis-(2-cloroetil)-amino]-fenilamino.
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de pró-fãrmacos cefalosporínicos citotóxicos de fórmula α oh α

   caracterizado pelo facto: (a) de se fazer reagir um composto intermédio de cefalosporina protegido no grupo carboxilo de fórmula geral

   R, (IV) na qual Q tem os significados definidos na reivindicação 1; representa um grupo activador da função éster; e representa um grupo protector do radical car boxilo; com adriamicina; e (b) de se remover o grupo protector.
3. 3,- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de pró-fãrmacos cefalosporínicas citotóxicos de fórmula geral QNH CH2-0-C (0)-ÇH-CH2_V \\__n (CH2CH2C1) co2H NU, 3 na qual Q tem os significados definidos na reivindicação 1 ; caracterizado pelo facto: (a) de se fazer reagir um composto intermédio de cefalosporina protegido no radical carboxilo de fórmula geral

   QNH (VIII) na qual Q tem os significados definidos na reivindicação 1; í*2 tem os significados definidos na reivindicação 2; e X representa um átomo de halogéneo; com melfalan protegido no radical amino; e (b) de se removerem os grupos protectores presentes.
4. 4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de pró-fãrmacos cefalosporínicos citotóxicos, de fórmula 6 H02C(CH2)3ccnk

   CO-H

   N (CH.,CH2C 1) 2 caracterizado pelo facto de se fazer reagir o ácido 3-hidroxime-til-7-glutaroilamino-5-tia-l-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno~2-carbo-xílico com N,N-bis(2-cloroetil)-4-isocianatobenzenoamina.
5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de pró-fármacos cefalosporínicos citotóxicos de fórmula geral

   (Il-a) na qual Q tem os significados definidos na reivindicação 1; e r, representa um átomo de hidrogénio ou um gru- d po alquilo 7 caracterizado pelo facto de se fazer reagir uma cefalosporina de fórmula geral QNH 'N .WH. c°2r2 na qual Q tem os significados definidos na reivindicação 1; e 1*2 tem os significados definidos na reivindica ção 2; com mitomicina A ou um seu derivado alquilo em que N^a diz respeito ao azoto do radical aziridina da mitomicina. O Agente Oficial do Propriedade Industriai V 8

   RESUMO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS PRÕ-FÃRMACOS CEFALOSPORlNI-COS CONVERTIVEIS PELA j^-LACTAMASE EM FÃRMACOS CITOTOXICOS ACTI VOS" A presente invenção diz respeito a um novo método pa ra a libertação de fãrmacos antitumorais em células tumorais me diante a administração de um conjugado anticorpo selectivo rela tivamente ao tumor/ ^-lactamase que se liga ãs células tumorais, e à administração adicional de um prõ-fãrmaco cefalosporí nico de fórmula geral

   QNE 0

   :o„h 0

   R (I) que é convertido localmente no tumor, na presença do conjugado 9

   anticorpo/ jS -lactamase, em um íãrmaco citotóxico activo. De acordo com o aspecto preferido da presente invenção preparou--se uma mostarda cefalosporínica que, quando cindida pela ^ -lacnamase, origina uma mostarda azotada citotõxica. Os métodos, os conjugados anticorpo/enzima, os pró-fãrmacos, as composições farmacêuticas e as associações de acordo com a pre sente invenção permitem a destruição selectiva reforçada de células tumorais pelo que são úteis no tratamento de cancro e de outros tumores·. 0 processo para a preparação do prõ-fãrmaco em questão é caracterizado pelo facto: (a) de se proteger, eventualmente, quaisquer grupos reactivos em repouso presentes na cefalosporina, ou no fármaco citotóxico ou em um seu precursor; (b) de se remover um grupo eliminável presente na cefalosporina, ou no fármaco citotóxico ou em um seu precursor com um grupo nucleofílico presente no fármaco citotóxico ou na cefalosporina; ou de se adicionar uma 3-hidroximetil-ce-falosporina ao precursor isocianato do fármaco citotóxico; e (c) de se remover um qualquer dos grupos protecto- res; utilizando-se como fármaco citotóxico a adriamicina, a mitomi-cina, o melfalan ou o 4-[bis-(2-cloroetil)-amino]-fe- nilamino . Ο Λβ«η»β Oficial da Propriedade Industria»