ES2279506T3 - Nitrorreductasa bacteriana para la reduccion de cb1954 y analogos del mismo a una forma citotoxica. - Google Patents
Nitrorreductasa bacteriana para la reduccion de cb1954 y analogos del mismo a una forma citotoxica. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2279506T3 ES2279506T3 ES92921908T ES92921908T ES2279506T3 ES 2279506 T3 ES2279506 T3 ES 2279506T3 ES 92921908 T ES92921908 T ES 92921908T ES 92921908 T ES92921908 T ES 92921908T ES 2279506 T3 ES2279506 T3 ES 2279506T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- compound
- formula
- nitroreductase
- compounds
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D203/00—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D203/04—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
- C07D203/06—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D203/08—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D203/14—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring nitrogen atom with carbocyclic rings directly attached to the ring nitrogen atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C219/34—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and esterified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
- C07C271/06—Esters of carbamic acids
- C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
- C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
- C07C271/18—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by doubly-bound oxygen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
- C07D487/14—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/048—Pyridine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01284—S-(hydroxymethyl)glutathione dehydrogenase (1.1.1.284), i.e. nitroreductase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA UNA NITROREDUCTASA, OBTENIBLE DE UNA BACTERIA QUE TIENE LAS SIGUIENTES CARACTERISTICAS QUE SON EJEMPLIFICADAS POR EJEMPLOS AISLADOS DE ESCHERICHIA COLI B Y BACILLUS AMILOLIQUIFACIENS: 1) ES UNA FLAVOPROTEINA QUE TIENE UN PESO MOLECULAR EN EL MARGEN DE 20-60 KILODALTONS; 2) REQUIERE NADH O NAD(P)H O ANALOGOS DE ELLOS COMO UN COFACTOR; 3) TIENE UN KM DE NADH O NAD(P)H EN EL MARGEN DE 1-100 (MU)M; Y 4) ES CAPAZ E REDUCIR ALGUNO O AMBOS GRUPOS NITRO DE CB 1954 Y ANALOGOS DE ELLOS A UNA FORMA DE CITOTOXINA P.EJ. HIDROXILAMINA. LA SECUENCIA DE UNA DE TALES NITROREDUCTASAS ES MOSTRADA EN SEQ. ID NO. 1. LA NITROREDUCTASA PUEDE SER CONJUGADA A UN AGENTE DE ELECCION DE OBJETIVOS TUMORALES TALES COMO UN ANTICUERPO MONOCLONICO Y USADO PARA CONVERTIR PRODROGAS EN AGENTES ANTI-TUMOR ACTIVOS. TALES PRODROGAS Y DROGAS TAMBIEN SE PROPORCIONAN.
Description
Nitrorreductasa bacteriana para la reducción de
CB1954 y análogos del mismo a una forma citotóxica.
La presente invención se refiere al control del
crecimiento de tejido neoplásico y se refiere particularmente a la
provisión de nuevos agentes antitumorales y a enzimas capaces de
convertir profármacos en agentes antitumorales.
El agente alquilante
5-(aziridín-1-il)-2,4-dinitrobenzamida
(en lo sucesivo denominada CB1954) se conoce, desde hace
prácticamente 20 años, como un interesante compuesto experimental de
selectividad única. Aunque CB 1954 estructuralmente se encuentra
bastante estrechamente relacionada con numerosos otros agentes
alquilantes conocidos que presentan un intervalo de actividad
relativamente amplio, CB 1954 muestra considerable actividad contra
las células tumorales de Walker in vivo o in vitro
pero se pensó que era virtualmente inactiva contra otros
tumores.
Recientemente se ha descubierto que la
selectividad de CB 1954 surge del hecho de que no es un agente
antitumoral per se sino un profármaco para un agente
antitumoral generado a partir de CB 1954 por un enzima
nitrorreductasa que se encuentra en la célula de Walker. Esta
nitrorreductasa de la célula de Walker posteriormente se ha
demostrado que es un enzima conocido de otras fuentes que era una
NAD(P)H deshidrogenasa (quinona) clasificada como
EC.1.6.99.2, ver Robertson et al., J. Biol. Chem.
261:15794-15799, 1986.
En el cuso de las investigaciones anteriores con
CB 1954, se descubrió que el enzima EC.1.6.99.2 de las células de
Walker presentaba la capacidad de reducir el grupo
4-nitro de CB 1954 a la hidroxilamina
correspondiente y que era la
5-(aziridín-1-il)-2-nitro-4-hidroxilamino-benzamida
resultante el agente antitumoral activo.
La utilización de profármacos representa un
concento clínicamente muy valioso en la terapia del cáncer debido a
que, particularmente en el caso de que el profármaco debe
convertirse en un agente antitumoral bajo la influencia de un enzima
que es ligable a un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno
asociado a tumor, la combinación de este profármaco con este
conjugado de enzima/anticuerpo monoclonal representa un agente
clínico muy
potente.
potente.
La patente EP nº A-0 330 432;
Knox et al., Biochem. Pharm.
37(24):4671-4677; y Knox et al.,
Biochem. Pharm. 37(24):4661-4669, describen
el compuesto CB1954
(5-(aziridín-1-il)-2,4-dinitrobenzamida)
y el enzima nitrorreductasa (NR) de células tumorales de Walker, y
el descubrimiento de que CB 1954 es sustrato para el enzima
nitrorreductasa (NR) que se encuentra en las células tumorales de
Walker, rindiendo una especie especialmente activa, el análogo
4-hidroxilamino.
Bryant et al. (J. Biochem.
266(7):4126-4130) describe la clonación, la
secuencia de nucleótidos, y la expresión en E. coli de un gen
nitrorreductasa de Enterobacter cloacae.
La patente EP nº A-0 441 218
describe profármacos antitumorales que son bencilcarbamatos y
carbonatos de orto/paradisulfuro.
La patente EP nº A-0 441 218
describe profármacos antracíclicos-glucosilo que
aparentemente pueden utilizarse como parte de ADEPT para el
cáncer.
Los presentes inventores ahora han descubierto
nuevas nitrorreductasas, obtenibles a partir de fuentes bacterianas,
que resultan de interés en que no sólo son capaces de convertir CB
1954 en un agente antitumoral activo, sino que también, al contrario
que EC.1.6.99.2, son capaces de convertir análogos de CB 1954, que
también son profármacos, en agentes antitumorales activos.
La figura 1 muestra los resultados de un
experimento en el que se incubaron CB 1954 (100 \muM) y cofactor
reducido (500 \muM) con enzima (2 mg/ml) nitrorreductasa de E.
coli (A) o con 25 \mug/ml de diaforasa de Walker DT (B) en
tampón fosfato sódico 10 mM (pH 7) en aire a 37ºC. En diversos
tiempos se inyectaron alícuotas (10 \mul) sobre una columna
Partisil SCX (240 x 4,7 mm) de HPLC y se eluyeron isocráticamente (2
ml/min) con NaH_{2}PO_{4} 100 mM. Se realizó un seguimiento
continuo del eluído para la absorción a 320, 260 y 360 nm y se
calculó la concentración de CB 1954 mediante integración del pico
correspondiente a este compuesto en el diagrama de HPLC.
La figura 2 muestra la formación de actinomicina
D (AMD) durante la incubación de un profármaco de AMD con una
nitrorreductasa de la presente invención.
La figura 3 muestra la formación de mitomicina C
(MC) durante la incubación de un profármaco de MC con una
nitrorreductasa de la presente invención.
La figura 4 muestra la unión in vitro a
células de un conjugado de anticuerpo-enzima de
acuerdo con la invención.
\newpage
La presente invención proporciona una
nitrorreductasa, obtenible a partir de una bacteria que presenta las
características siguientes, tal como se ejemplifica en ejemplos
aislados de Escherichia coli B y de Bacillus
amyloliquifaciens:
- 1.
- flavoproteína con un peso molecular comprendido en el intervalo entre 20 y 60 kilodaltons;
- 2.
- requiere NADPH o NAD(P)H o análogos de los mismos como factor;
- 3.
- presenta un K_{m} para NADH o NAD(P)H comprendido en el intervalo entre 1 y 100 \muM;
- 4.
- es capaz de reducir cualquiera o todos los grupos nitro de CB 1954 y análogos de los mismos formando una forma citotóxica, por ejemplo la hidroxilamina.
Las nitrorreductasas de la invención se hallan
naturalmente dentro de las células de E. coli B, de E.
coli C y de otras cepas de E. coli, por ejemplo del tipo
K12, así como en otros organismos gram-negativos,
por ejemplo Thermus aquaticus, y en bacterias
gram-positivas, tales como Bacillus
amyloliquifaciens y Bacillus caldotenax. Pueden
recuperarse de estas células rompiendo las células y sometiendo el
contenido de las células a separación cromatográfica y aislando la
nitrorreductasa.
Por ejemplo, la nitrorreductasa de la presente
invención de E. coli B ha sido purificada hasta la
homogeneidad, ver la Tabla 1, y ha sido sometida a análisis de
secuencia de aminoácidos con los resultados proporcionados en la
Tabla 2. La secuencia superior muestra la secuencia de aminoácidos
teórica de la nitrorreductasa 219-mero obtenida de
Salmonella typhimurium, tal como describen Watanabe et
al., Nucl. Acids Res. 18:1059, 1990. La secuencia inferior en
negrita muestra la secuencia de los fragmentos obtenidos con bromuro
de cianógeno de la nitrorreductasa de E. coli B como ejemplo
de la presente invención con cierto grado de homogeneidad pero con
suficientes diferencias para confirmar que es una nitrorreductasa
diferente de la de Watanabe et al. y de las nitrorreductasas
de Enterobacter cloacae recientemente descritas, ver Bryant
et al., J. Biol. Chem. 266:4126, 1991, o de la
nitrorreductasa de las células de Walker, y es un enzima no
informado con anterioridad.
La secuencia de aminoácidos de la
nitrorreductasa de E. coli B de la invención también puede
derivarse a partir de la secuenciación de los nucleótidos en el gen
nitrorreductasa y estas secuencias se proporcionan posteriormente,
en la Tabla 3. La secuencia de nucleótidos de la Tabla 3 se ha
utilizado para preparar los listados de secuencia adjuntos.
Mediante la utilización de la información en la
Tabla 3, puede prepararse una nitrorreductasa de acuerdo con la
presente invención expresando el ADN codificante de la
nitrorreductasa en un vector de expresión adecuado contenido en una
célula huésped, y recuperando la nitrorreductasa. El vector de
expresión puede ser, por ejemplo, un vector de expresión bacteriano,
levadura, de insecto o de mamífero y la célula huésped se selecciona
para que sea compatible con el vector.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
nuevos enzimas de la presente invención son capaces de reducir un
grupo nitro en diversas moléculas de sustrato y los presentes
inventores han descubierto que los enzima resultan particularmente
útiles por su capacidad de reducir el grupo nitro de diversos
derivados p-nitrobenciloxicarbonilo de compuestos
citotóxicos, proporcionando compuestos "autodestructivos" que
se descomponen automáticamente, liberando los compuestos
citotóxicos.
El interés en el presente enfoque reside en el
hecho de que la citotoxicidad de diversos compuestos citotóxicos que
contienen sustituyentes amino o hidroxi, particularmente
sustituyentes amino aromáticos o hidroxi da lugar a derivados
p-nitrobencilxicarbonilo del grupo amino o hidroxi
que muestran una citotoxicidad considerablemente inferior que la del
compuesto amino o hidroxi parental. De esta manera, resulta posible
utilizar los derivados p-nitrobenciloxicarbonilo
como profármacos en un sistema del tipo comentado anteriormente, en
el que el profármaco se convierte en un agente antitumoral bajo la
influencia de un enzima que es ligable a un anticuerpo monoclonal
que se unirá al antígeno asociado a tumor.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona nuevos compuestos con la fórmula general:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} y R^{2} son
grupos que permite que los compuestos R^{1}NH_{2} y R^{2}OH
sean compuestos
citotóxicos.
Resulta preferente que los compuestos
R^{1}NH_{2} y R^{2}OH son compuestos citotóxicos aromáticos y
los compuestos R^{1}NH_{2} pueden ser cualquiera de los bien
conocidos compuestos de mostaza nitrogenada, por ejemplo basados en
p-fenilendiamina. De esta manera, el compuesto
R^{1}NH_{2} puede ser:
o análogos de este compuesto con la
estructura general
IV:
en las que R' y R'' son H, F o
CH_{3}, y particularmente en los
que:
R'=H y R''=CH_{3};
o R'=CH_{3} y R''=H;
o R'=H y R''=F;
o R'=F y R''=H.
Un tipo adicional de compuesto aminocitotóxico
que puede utilizarse de acuerdo con la presente invención son
compuestos tales como la actinomicina D, la doxorubicina, la
daunomicina y la mitomicina C. La estructura de los profármacos
derivados de la actinomicina D, la doxorubicina y la mitomicina C se
muestran a continuación como V, VI y VII,
respectivamente.
Pueden prepararse derivados
p-nitrobenciloxi similares en el sustituyente amino
de otras actinomicinas de los otros compuestos citotóxicos del tipo
indicado anteriormente.
Además de formar derivados
p-nitrobenciloxicarbonilo en un grupo amino en un
compuesto citotóxico, pueden prepararse derivados similares en un
grupo hidroxi; particularmente un grupo hidroxi fenólico de un
compuesto citotóxico. En la presente invención se presta atención a
los compuestos de mostaza nitrogenada fenólico, y un compuesto
específico de la invención de este tipo presenta la fórmula:
En un aspecto adicional de la invención, los
presentes inventores han determinado que los nuevos enzimas de la
presente invención son capaces no sólo de reducir por lo menos uno
de los grupos nitro de CB 1954 sino también por lo menos uno de los
grupos nitro de determinados análogos de CB 1954, por ejemplo
descarboxamido CB1954
(1-aziridín-1-il-2,4-dinitrobenzamida,
conocido como CB 1837) y N,N-dimetil CB 1954
[N,N-dimetil-(5-aziridín-1-il-2,4-dinitrobenzamida,
también conocida como CB 10-107]. Los nuevos enzimas
de la presente invención también son capaces de reducir los grupos
nitro de otros compuestos nitro aromáticos, tales como
5-cloro-2,4-dinitrobenzamida,
3,5-dinitrobenzamida,
3-nitrobenzamida, 4-nitrobenzamida y
5-nitro-2-furaldehídodesemicarbazona
(nitrofurazona).
Tal como se ha indicado anteriormente, las
nitrorreductasas de la presente invención son capaces de convertir
CB 1954 en
2-hidroxilainino-4-nitro-5-(aziridín-1-il)benzamida,
que es un agente antitumoral activo.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
nuevos compuestos p-nitrofenilbenciloxi de la
invención de fórmulas I y II son de interés en que presentan una
citotoxicidad reducida en comparación con la del compuesto
citotóxico R^{1}NH_{2} o R^{2}OH del que se derivan y son
capaces de actuar como sustrato para la nitrorreductasa de la
presente invención. Aunque la presente invención no depende, por su
definición, del modo de acción exacto de la nitrorreductasa sobre el
compuesto de fórmula I o II, se cree que el grupo nitro del residuo
p-nitrofenil-benciloxicarbonilo se
convierte en el grupo amino o hidroxilamino correspondiente y que el
compuesto p-aminobenciloxicarbonilo o
p-hidroxil-aminobenciloxicarbonilo
se degrade automáticamente bajo las condiciones de reacción
utilizadas para la reacción enzimática, liberando el compuesto
citotóxico y formando alcohol p-aminobencilo o
alcohol p-hidroxilaminobencilo y dióxido de carbono
como productos secundarios de acuerdo con el esquema de reacción
siguiente:
Los compuestos
p-nitrobenciloxicarbonilo de la invención se
preparan convenientemente mediante procedimientos de síntesis
química conocidos per se. Por ejemplo, los compuestos amina o
hidroxi citotóxicos pueden reaccionarse con cloroformato de
4-nitrobencilo bajo condiciones anhidras en
presencia de un aceptor cloruro de hidrógeno, particularmente una
alquilamina, tal como trietilamina. Esta reacción puede llevarse a
cabo en un solvente orgánico seco, tal como cloroformo, y el
compuesto resultante de la invención de fórmula I o de fórmula II,
aislarse del solvente orgánico mediante procedimientos
convencionales, tales como la cromatografía.
Una de las maneras más convenientes para
producir la nueva nitrorreductasa de la invención es recuperar el
material a partir del contenido celular de bacterias tales como
E. coli B.
Alternativamente, resulta posible clonar el gen,
aislable de las bacterias, codificante del enzima deseado y
transferir el gen clonado, en un sistema vector adecuado, al
interior de otra célula huésped a partir de la que puede expresarse,
o en el interior de la cual puede expresarse.
Con el fin de producir la reducción enzimática
de CB 1954 y sus análogos con los nuevos enzimas de la presente
invención, resulta necesario disponer de un cofactor presentes en el
sistema de reacción. La capacidad del enzima de la presente
invención de producir esta reducción puede demostrarse
experimentalmente mediante la utilización de NADH o
NAD(P)H como el cofactor, pero la utilización de estos
cofactores en la práctica clínica puede resultar problemática en
vista de la facilidad con la que NAD(P)H en particular
resulta oxidado por otros enzimas presentes en el cuerpo y la falta
de selectividad de los cofactores entre los diversos enzimas de
mamífero y de no mamífero. Los presentes inventores ahora han
descubierto que el ribósido del ácido
1,4-dihidro-nicotínico es por lo
menos tan efectivo como cofactor en la reducción de la
nitrorreductasa de CB 1954 y análogos de la misma y además, debido a
su selectividad para la nitrorreductasa de E. coli de la
invención, resulta más adecuada para la utilización clínica, lo que
hace que su incorporación en un sistema multicomponente del tipo
descrito posteriormente resulte particularmente valiosa.
El ribósido del ácido
1,4-dihidro-nicotínico que puede
utilizarse en la presente invención como cofactor es un nuevo
compuesto y forma parte de la presente invención. Puede prepararse a
partir de ribósido de ácido nicotínico disponible comercialmente que
en primer lugar se convierte en el ribósido correspondiente mediante
desfosforilación enzimática, por ejemplo utilizando una fosfatasa
alcalina. El ribósido, obtenido mediante esta desfosforilación
enzimática, o mediante síntesis química, utilizando el procedimiento
descrito por Jarman, J. Chem. Soc. (c) 918-920,
1969, seguidamente puede reducirse, por ejemplo utilizando un
hidrosulfito de metal alcalino, proporcionando ribósido de ácido
1,4-dihidro-nicotínico.
Una de la aplicaciones prácticas más importantes
de los nuevos enzimas de la presente invención es que pueden
utilizarse en asociación con compuestos nitro que son profármacos
para agentes antitumorales y de esta manera proporcionar un sistema
de quimioterapia del cáncer en el que el grado de exposición del
paciente al agente citotóxico se encuentre limitado, en lo posible,
a aquellas regiones en las que existe interacción entre el
profármaco y la nitrorreductasa de la invención. De esta manera, se
describe en la presente invención un procedimiento de quimioterapia
y un sistema para la quimioterapia que implica la utilización
conjunta de la nitrorreductasa de la presente invención en
asociación con un compuesto nitro que es un profármaco para un
compuesto citotóxico.
La manera más conveniente, o una de las más
convenientes, de utilizar el sistema de la presente invención es
conjugar la nitrorreductasa de la presente invención con un agente
de transporte, tal como un anticuerpo monoclonal que se unirá con un
antígeno asociado a tumor.
Tal como se utiliza en la presente invención, la
expresión "anticuerpo monoclonal" será entendida por los
expertos en la materia como referida no simplemente a anticuerpos
producidos mediante técnicas de hibridoma tradicionales, sino
también a anticuerpos y variantes de los mismos producidos por
medios recombinantes. Entre estos se incluyen, por ejemplo,
anticuerpos humanizados, tales como aquellos con una región
constante de un anticuerpo humano injertado en una región variable
de un anticuerpo no humano (ver, por ejemplo, la patente EP nº
A-0 120 694), anticuerpos quiméricos, tales como
aquellos con regiones determinantes de complementariedad (CDRs) no
humanas injertadas en un marco de región variable humana (ver, por
ejemplo, la patente EP nº A-0 239 400) y anticuerpos
de cadena única. Los fragmentos de estos anticuerpos monoclonales
que conservan su actividad de unión diana también se encuentran
incluidos en la expresión general "anticuerpo monoclonal". Ésta
incluye los fragmentos Fab' y F(ab')_{2}.
La selección de anticuerpo monoclonal se verá
claramente influida por la naturaleza del tumor diana, aunque para
los fines de la presente invención, puede hacerse referencia al
anticuerpo A_{5}B_{7} anti-CEA.
Como alternativa a la utilización de un
anticuerpo monoclonal, también se contempla que puedan utilizarse
otros agentes de transporte con los que se conjuga la
nitrorreductasa de la presente invención. Por ejemplo, es conocido
que pueden utilizarse determinadas macromoléculas solubles para el
transporte pasivo tumoral de determinados tipos tumorales. Muchos
tumores sólidos poseen vasculatura que es hiperpermeable a las
macromoléculas. Aunque no se entienden con claridad las razones de
ello, el resultado es que en estos tumores puede acumularse
selectivamente las macromoléculas circulantes. La permeabilidad y
efecto de retención incrementados (el efecto EPR) que cree que es
el mecanismo de acción de SMANCS
(estireno/maleico-anhídrido-neocarzinostina),
en la actualidad en uso clínico regular en Japón en el tratamiento
del hepatoma. Otra clase de conjugados bajo investigación para
actividad anticáncer son los conjugados de copolímero
N-(2-hidroxipropil)metacrilamida-antraciclina
(L. Seymour, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems
9(2):135-187, 1992). De esta manera, los
conjugados de un polímero, incluyendo el copolímero de
estireno/maleico-anhídrido o la
N-(2-hidroxipropil)metacrilamida y la
nitrorreductasa de la invención pueden utilizarse en lugar de
conjugados de un anticuerpo monoclonal y enzima.
Con este sistema, resulta posible durante un
curso de quimioterapia del cáncer, administrar al paciente que
requiere del tratamiento, el compuesto nitro que es el profármaco
del compuesto citotóxico y del conjugado de enzima/agente de
transporte. El profármaco y el conjugado pueden administrarse
simultáneamente pero con frecuencia resulta preferible, en la
práctica clínica, administrar el conjugado de enzima/agente antes
del profármaco, por ejemplo hasta 72 horas antes, con el fin de
proporcionar al conjugado de enzima/agente la oportunidad de
localizarse en la región del tumor diana. Realizando la operación de
esta manera, cuando se administra el profármaco, la conversión del
profármaco en el agente citotóxico tiende a confinarse a las
regiones en las que se localiza el conjugado de enzima/agente, es
decir se minimiza la región del tumor diana y el daño a las células
sanas causado por la liberación prematura del agente citotóxico.
El grado de localización del conjugado de
enzima/agente (en términos de la proporción entre conjugado activo
localizado y libre circulante) se puede incrementar adicionalmente
utilizando los sistemas de eliminación y/o de inactivación descritos
en la patente WO nº 89/10140. Esto implica, habitualmente tras la
administración del conjugado y antes de la administración del
profármaco, la administración de un componente (un "segundo
componente") capaz de unirse a una parte del conjugado que
inactive el enzima y/o acelere la eliminación del conjugado de la
sangre. Este componente puede incluir un anticuerpo a la
nitrorreductasa de la invención que es capaz de inactivar el
enzima.
El segundo componente puede unirse a una
macromolécula, tal como dextrano, un liposoma, albúmina,
macroglobulina o un eritrocito del grupo sanguíneo O, de manera que
el segundo componente tenga su salida restringida del compartimiento
vascular. Además, o alternativamente, el segundo componente puede
incluir un número suficiente de residuos de galactosa covalentemente
unidos, o residuos de otros azúcares, tal como lactosa o manosa, de
manera que puede unirse al conjugado en el plasma, pero eliminarse
del plasma junto con el conjugado por receptores de la galactosa o
de otros azúcares en el hígado. El segundo componente debe
administrarse y diseñarse para la utilización de manera que no
entre, en grado apreciable, en el espacio extravascular del tumor,
donde podría inactivar conjugado localizado antes y durante la
administración del profármaco.
El régimen de dosificación exacto evidentemente
deberá ser determinado por los médicos individuales para los
pacientes individuales y esto, a su vez, estará controlado por la
naturaleza exacta del profármaco y del agente citotóxico que debe
liberarse del profármaco, aunque pueden proporcionarse algunas
recomendaciones generales. La quimioterapia de este tipo normalmente
implica la administración parenteral de tanto el profármaco como el
conjugado de enzima/agente y se observa con frecuencia que la
administración por vía intravenosa es la más práctica.
Teniendo en cuenta la manera en la que deben
utilizarse los enzimas de la presente invención, en la presente
memoria también se describen composiciones farmacéuticas que
comprenden el enzima, preferentemente conjugadas con un agente de
transporte, tal como un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a un
antígeno asociado a tumor en asociación con un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable, normalmente uno adecuado para la
administración parenteral.
También se describen en la presente invención
composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los
compuestos p-nitrobenciloxicarbonilo de la presente
invención de fórmula I, fórmula II, fórmula V, fórmula VI o fórmula
VII en asociación con un portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable, normalmente uno para la administración parenteral.
La presente invención también proporciona un
sistema para la utilización en el control de la neoplasia en un ser
humano o animal que comprende las nitrorreductasas de la presente
invención, preferentemente conjugados con un agente de transporte,
tal como un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno asociado
a tumor, en asociación con por lo menos uno de entre el compuesto
p-nitrobenciloxicarbonilo de Fórmula I, II, V, VI o
VII, que es un profármaco para un agente antitumoral y
preferentemente un ribósido o ribótido del ácido nicotínico o de
nicotinamida, que actúa como cofactor para el enzima.
También se describe en la presente memoria un
procedimiento de tratamiento de la neoplasia en un huésped humano o
animal que requiere este tratamiento, que comprende administrar al
huésped una cantidad efectiva de un compuesto
p-nitrobenciloxicarbonilo de Fórmula I, II, V, VI o
VII, que es un profármaco para un agente antitumoral, y el enzima de
la presente invención, preferentemente conjugado con un agente de
transporte, tal como un anticuerpo monoclonal que se une a un
antígeno asociado a tumor, utilizando preferentemente el enzima en
asociación con un ribótido o ribósido del ácido nicotínico o de la
nicotinamida como cofactor para el enzima.
Los diversos sistemas para la utilización en el
tratamiento de la neoplasia descritos anteriormente opcionalmente
incluyen el "segundo componente" para la eliminación acelerada
descrita anteriormente. De manera similar, los procedimientos de
tratamiento de la neoplasia descritos anteriormente opcionalmente
incluyen como parte de ese procedimiento, la utilización de un
segundo componente, una cantidad efectiva del cual se administra
después de la administración del enzima, con el fin de incrementar
la proporción de enzima localizado a libremente circulante. Puede
hacerse referencia a la patente WO nº 89/10140 para más detalles
particulares del segundo componente, y estos detalles pueden
incorporarse par ala utilización en la presente invención.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los Ejemplos siguientes.
Se resuspendieron 200 gramos de pasta celular de
E. coli B en un volumen total de 1 litro de tampón fosfato
potásico 20 mM, pH 7, que contenía sulfato amónico 0,3 M. Las
células se rompieron ultrasónicamente utilizando un desintegrador
MSE Soniprep 150 (3 x 30 segundos a potencia máxima con intervalos
de 60 segundos para permitir la disipación del calor). Para ayudar a
clarificar el extracto, se añadió ADNasa (23.000 unidades de
Kunitz/l) y ARNasa (2.400 unidades Kunitz/l) previamente a la
centrifugación a 8.000 g durante 30 minutos para eliminar los
residuos celulares. Se pasó el sobrenadante amarillento transparente
a través de un filtro de 0,45 \mum previamente a la
cromatografía.
El extracto filtrado se aplicó a una columna (25
x 5 cm) de fenil-sefarosa CL-6B
(Pharmacia) en tampón fosfato potásico 20 mM, pH 7, que contenía
sulfato amónico 0,3 M. Tras lavar con 2 volúmenes de columna de
tampón de inicio, la columna se eluyó con tampón
Tris-HCl 10 mM, pH 7,6. Se agruparon las fracciones
activas y se dializaron durante 18 horas frente a
Tris-HCl 20 mM, pH 7,6, para eliminar las trazas de
sulfato amónico. Las fracciones dializadas se aplicaron en alícuotas
de 50 ml a una columna Q-sefarosa de alto
rendimiento en Tris-HCl 20 mM, pH 7,6 a un caudal de
4 ml por minuto. La elución se realizó con un gradiente de 0 a 0,2 M
de KCl, eluyendo la nitrorreductasa entre 0,1 y 0,12 M de KCl. Se
agruparon las fracciones activas y se desalaron en
Bis-tris-propano 2 mM, pH 7,
utilizando una columna (32 x 6 cm) de medio Sephadex G25. Estas
fracciones se aplicaron a una columna de Q-sefarosa
de alto rendimiento (columna Hi-Load 26/10,
Pharmacia) equilibrada en
Bis-Tris-propano 20 mM, pH 7. La
elución se llevó a cabo con un gradiente de 0 a 0,1 M de KCl. La
nitrorreductasa se eluyó como el primer pico importante, entre 0,07
y 0,09 M de KCl.
Se determinó la homogeneidad del producto final
utilizando geles premoldeados de gradiente 8% a 25% para
electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (Pharmacia
Phastsystem). La electroforesis se llevó a cabo durante 75 vh.
La nitrorreductasa en crudo y en fracciones
parcialmente purificadas se sometió a ensayo rutinariamente a partir
de su actividad de quinona reductasa utilizando menadiona como
sustrato, NADH como cofactor y citocromo C como aceptor terminal de
electrones.
Se determinó el punto isoeléctrico de la
nitrorreductasa mediante enfoque isoeléctrico (Pharmacia
Phastsystem, enfoque durante 400 vh) y cromatoenfoque con una
columna Mono P (Pharmacia Mono P HR5/20, Bis-Tris 20
mM, pH 6,3, y politampón 74, pH 4,0).
Se aisló nitrorreductasa de E. coli en
forma de proteína pura con un peso molecular de 24 kDa (según
determinación mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y cromatografía por filtración en
gel). Una segunda proteína, que presentaba actividad quinona
reductasa pero que era inactiva como nitrorreductasa con CB 1954,
coeluyó parcialmente de la fenil-sefarosa y pudo
separarse completamente del enzima activo mediante etapa de
cromatografía de intercambio iónico en Q-sefarosa de
alto rendimiento (ver la Tabla 1) a pH 7,6. Los dos enzimas difieren
en peso molecular (inactivo, 55 kDa; activo, 24 kDa) y en punto
isoeléctrico (inactivo, 5,2; activo, 5,1). La proteína activa
presenta una coloración amarillenta, sugiriendo la presencia de un
coenzima flavina. Tras calentar a 70ºC durante 20 minutos, esta
flavina pudo separarse del apoenzima mediante ultrafiltración y se
demostró que era FMN, y no FAD, mediante HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron fragmentos adecuados para el
análisis de secuencia mediante digestión del enzima con bromuro de
cianógeno. Los péptidos que resultaron de estas digestiones se
purificaron mediante HPLC en fase reversa utilizando una columna RP
300 (25 x 4,6 mm) (Brownlee) y un gradiente de solvente de 10% a 60%
de acetonitrilo en agua con ácido trifluoroacético al 0,06% en cada
solvente. Se llevó a cabo el análisis de secuencias mediante
degradación de Edman automatizada utilizando un secuenciador de
proteínas en fase gaseosa Applied Biosystems 470A (Kelvin Close,
Warrington, U.K.).
Se sometió la nitrorreductasa de E. coli
tal como se ha aislado anteriormente a análisis de secuencia de
aminoácidos. E contraste con el enzima aislado del tumor de Walker,
EC.1.6.99.2, la nitrorreductasa de la presente invención no se
bloqueó en el extremo N-terminal y proporcionó una
clara secuencia N-terminal de 31 residuos
aminoácidos y un péptido, generado mediante digestión con bromuro de
cianógeno, de 41 residuos adicionales. Se proporcionan estas
secuencias parciales en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen nitrorreductasa de E. coli ha sido
clonado y su secuencia de nucleótidos determinada mediante análisis
de secuencia dideoxi de ambas cadenas. En la Tabla 3 se muestra la
secuencia de nucleótidos del fragmento NruI/Pst de 1.167 bases que
contiene un marco de lectura abierta de 651 nucleótidos codificante
de la nitrorreductasa. Se indican la secuencia putativa de
Shine-Delgarno y la señal de terminación
transcripcional.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Reducción enzimática de CB 1954. Se incubaron CB
1954 (100 \mum y que también contenía [U-^{3}H]
CB 1954 a 1,6 x 105 dpm por nmol), NADH o NAD(P)H (500
\muM) con el enzima activo obtenido tal como se ha descrito en el
Ejemplo 1 (generalmente 2 \mug/ml de nitrorreductasa de E.
coli o 35 \mug/ml de NAD(P)H deshidrogenasa de
Walker (quinona) EC 1.6.99.2) en tampón fosfato sódico (pH 7) bajo
aire o helio. En diversos tiempos, se inyectaron alícuotas (10
\mul) en una columna de HPLC Partisphere SCX (110 x 4,7 mm) y se
eluyó isocráticamente (2 ml/min) con NaH_{2}PO_{4} 100 mM.
Se realizó el seguimiento continuo del eluído
para la adsorción a 310, 260 y 360 nm y se registraron los espectros
de los componentes eluídos utilizando un detector de matriz de
diodos. Se recogieron muestras (0,5 ml) y se determinó la actividad
de tritio de cada uno mediante contaje de centelleo líquido. Este
sistema de separación pudo resolver todos los productos de reducción
esperados.
Con el fin de confirmar adicionalmente la
identidad de cualquiera de los productos de reducción, la mezcla de
reducción anterior también se inyectó en una columna HPLC de fase
reversa ODS-5 y se eluyó (1 ml/min) con un gradiente
de metanol (lineal entre 0% y 30% a lo largo de 30 minutos, lineal
entre 30% y 100% a lo largo de 10 minutos) en tampón fosfato sódico
0,1 M (pH 7).
La reducción de CB 1954 por la nitrorreductasa
de E. coli resultó en la formación de dos productos, que se
demostró que eran, por comparación de los tiempos de retención y las
características espectrales con estándares conocidos,
5-(aziridín-1-il)-4-hidroxilamino-2-nitrobenzamida
y
5-(aziridín-1-il)-2-hidroxilamino-4-nitrobenzamida.
No se encontraron otros metabolitos de CB 1954. Como confirmación
adicional de la formación de la 2-hidroxilamina y de
la 4-hidroxilamina por la nitrorreductasa de la
invención, se formaron 33 \muM de 4-hidroxilamina
al resultar reducidas 67 \muM de CB 1954 por la nitrorreductasa.
En contraste, se formaron 50 \muM de
4-hidroxilamina por la reducción de 50 \muM de CB
1954 por la NAD(P)H deshidrogenasa (quinona) de
Walker. Basándose en las tasa iniciales de formación de
4-hidroxilamina, la nitrorreductasa es 31,2 veces
más activa por mg de proteína que la NAD(P)H
deshidrogenasa (quinona) (o 62 veces más activa que la reducción de
CB 1954) bajo las condiciones estándares utilizadas.
La tasa de reducción de CB 1954 o de formación
de producto era la misma cuando el cofactor era
NAD(P)H o NADH y al llevar a cabo la reducción bajo
helio.
Con el fin de mostrar que la nitrorreductasa
producía una especie citotóxica, se llevó a cabo la reducción de CB
1954 en presencia de células V79, que son insensibles a CB 1954. Tal
como se muestra en la Tabla 4, se observó un drástico efecto
citotóxico en células V79 de hámster, pero sólo bajo aquellas
condiciones en las que la nitrorreductasa reducía CB 1954.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la capacidad de la nitrorreductasa
de E. coli de la invención de reducir compuestos nitro
diferentes de CB 1954 mediante HPLC siguiendo la reducción del área
de pico del NADH resultante de su oxidación. Los experimentos se
llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente, aunque las
alícuotas se inyectaron en una columna de HPLC Partisphere SAX (110
x 4,7 mm) y se eluyeron isocráticamente (1 ml/min) con
NaH_{2}PO_{4} 75 mM. Se muestran los resultados en la Tabla
5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a ensayo actividades de quinona
reductasa mediante un procedimiento espectrofotométrico utilizando
menadiona como sustrato y citocromo c como aceptor terminal de
electrones tal como se describe en Knox et al., Biochem.
Pharmacol. 37:4671-4677, 1988. Se determinaron las
tasas iniciales de reacción mediante análisis de regresión lineal
(r>0,995) y se determinaron los parámetros cinéticos a partir de
los gráficos resultantes tal como describen Roberts et al.,
Biochem. Pharmacol. 38:4137-4143, 1989. Se determinó
la concentración de proteínas utilizando un ensayo convencional de
proteínas (Bio-Rad) calibrado frente a la albúmina
de suero bovino.
En la Tabla 6 se proporcionan los parámetros
cinéticos para la nitrorreductasa de E. coli y la
NAD(P)H deshidrogenasa (quinona) de Walker
EC.1.6.99.2. Aunque ambos enzimas presentan K_{m}s comparables
para CB 1954, la K_{m} de la nitrorreductasa para NADH es
aproximadamente 10 veces inferior que la del enzima de Walker. Las
tasas absolutas de reducción de CB 1954 (es decir, bajo condiciones
saturantes) por los dos enzimas son sus valores de k_{cat} y ésta
es 90 veces más elevada para la nitrorreductasa de E. coli.
La menadiona también era un sustrato para ambos enzimas con poca
diferencia en sus k_{cat}s respectivas, aunque la K_{m} de la
nitrorreductasa para este sustrato era 60 veces más elevada.
El dicoumarol es un inhibidor de la
nitrorreductasa. No pudo medirse ningún parámetro cinético con
respecto al NADH. Con respecto a la menadiona, el dicoumarol era un
inhibidor no competitivo con una K_{i}' de 1,90 \pm 0,38
\muM.
La capacidad de la nitrorreductasa de E.
coli B de activar compuestos diferentes de CB 1954 formando una
especie citotóxica.
Tal como se muestra en la Tabla 7, se observó un
gran efecto citotóxico en células MAWI humanas por parte de los
profármacos CB 1837 y CB 10-107, aunque sólo bajo
aquellas condiciones en las que el profármaco resultaba reducido por
el enzima nitrorreductasa.
Se trató una solución de ribótido de ácido
nicotínico (mononucleótido ácido nicotínico) (Sigma, Poole, U.K.)
(25 mg) en tampón acuoso (tris 100 mM; pH 8,5; MgCl_{2}; 2,5 ml)
con 2.000 unidades de fosfatasa alcalina, tipo VII-S
(100 \mul; 20.000 unidades/ml) (Sigma) a 37ºC durante 1 hora. La
fosfatasa alcalina se separó del digerido mediante filtración
molecular centrífuga (límite de peso molecular: 10.000; "Centricon
10"; Amicon, High Wycombe, U.K.). Se analizaron diluciones
(1:100) de la solución tanto antes como después de la digestión con
fosfatasa alcalina mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento de intercambio aniónico (columna Partisphere
5-SAX eluída isocráticamente con NaH_{2}PO_{4}
0,1 M, pH 5, 1,5 ml/min, volumen de inyección: 10 \mul,
seguimiento mediante absorbancia de UV a 260 nm). El compuesto
parental eluyó con un tiempo de retención de 1,18 minutos. El examen
posterior a la digestión indicó que se había producido una
conversión completa proporcionando el nuevo compuesto del título,
eluyendo con un tiempo de retención de 0,63 minutos, considerado
indicativo de desfosforilación, rindiendo el ribósido.
Se adoptó el procedimiento de Jarman y Searle
(1972). Se aplicó el procedimiento tanto al ribósido de ácido
nicotínico tal como se había producido anteriormente, como al
material sintetizado químicamente (Jarman 1969). Se obtuvieron
resultados idénticos con un compuesto de partida de cualquiera de
los dos orígenes.
Se añadieron 50 mg de carbonato sódico, 50 mg de
bicarbonato sódico, y 50 mg de hidrosulfito sódico a una solución
acuosa de ribósido de ácido nicotínico (5 ml; 4 mg/ml). La solución
tapada se incubó a 37ºC durante 1 hora y el producto de reducción se
separó mediante HPLC en fase reversa preparativa. Se inyectaron los
5 ml en una columna en fase reserva microsorb 5 \mum C18 (10 x 250
mm) (Rainin) y se eluyeron en un gradiente de metanol en agua (0% a
100% a lo largo de 30 minutos) tamponado a pH 5 con
KH_{4}CH_{3}COO 10 mM a 4 ml/min. Se realizó un seguimiento
continuo del eluído mediante absorbancia de UV y mediante
fluorescencia y el producto de reducción (cromatografía con
resolución de línea base a un tiempo de retención de
12-13 minutos) se caracterizó tanto por su máximo de
absorbancia a 326 nm (a pH 5; 340 nm a pH 7) como por su
fluorescencia (fluorómetro Gilson 121 con filtros de vidrio de banda
amplia; excitación centrada en 350 nm; emisión a 450 nm),
propiedades que no mostraba el compuesto parental. Los eluídos de 4
ml de una solución 2 mM (suponiendo una \varepsilon_{340} de
6200 (es decir, igual a la del NADH) eran típicos, indicando un
rendimiento de 2,7 mg, es decir, de aproximadamente el 13%.
Previamente al uso experimental, las preparaciones se analizaron
mediante HPLC analítica y se confirmó que eran esencialmente
puras.
(i) M. Jarman y F. Searle,
Potential Coenzyme Inhibitors-V, Biochem.
Pharmacol. vol. 21, páginas 455-464,
1972.
(ii) M. Jarman,
4-Substituted Nicotinic acids and Nicotinamides.
Part III. Preparation of 4-Methylnicotinic acid
Riboside. J. Chem. Soc. (C), 918-920,
1969.
Se muestra en la figura 1 la capacidad del
enzima nitrorreductasa de utilizar un cofactor sintético en lugar de
NADH o de NADPH para la reducción de CB 1954. El enzima
nitrorreductasa puede utilizar tanto ribósido de ácido
1,4-dihidro-nicotínico como NADH con
igual eficiencia como cofactores para la reducción de CB 1954. En
contraste, la DT diaforasa de Walker no puede utilizar este cofactor
sintético. Por lo tanto, el ribósido de ácido
1,4-dihidro-nicotínico es un
cofactor selectivo para el enzima nitrorreductasa de E. coli
y no puede ser utilizado por la DT diaforasa de mamífero.
En los Ejemplos 8 a 12 siguientes, "gel de
sílice" se refiere a gel de sílice Merck 60, malla 70 a 230 y se
obtuvieron espectros de RMN Proton a 300 MHz en CDCl_{3}. Las
temperaturas se indican en ºC.
A una solución agitada de cloroformato de
4-nitrobencilo (295 mg) en CHCl_{3} seco (5 ml),
se añadió a lo largo de 5 minutos una solución de hidrocloruro de
4-[bis(2-cloroetil)amino]anilina
(367 mg y NEt_{3} (377 \mul) en CHCl_{3} seco (5 ml). Tras 1
hora, la solución se mantuvo a 20ºC durante 18 horas, y después se
evaporó. El residuo se cromatografió en una columna de gel de sílice
con CHCl_{3}, proporcionando el producto del título en forma de
sólido amarillo que recristalizó a partir de benceno/éter de
petróleo en forma prismática, p.f.: 111ºC a 112ºC. Rendimiento: 361
mg (64%). Espectro de masas de ionización química con CH_{4}: ión
a m/z 412 (M+1, intensidad relativa 1,00) indica M=411.
C_{18}H_{19}N_{2}O_{4}Cl_{2} requiere M=411 (para el
isótopo Cl^{35}). RMN: \delta3,57 (m, 4H, CH_{2}Cl o
CH_{2}N), 3,69 (M, 4H, CH_{2}Cl o CH_{2}N), 5,28 (s, 2H,
ArCH_{2}), 6,65 (d, 4H, ArH), 7,51 (d, 2H, ArH) y 8,23 (d, 2H,
ArH).
Se añadió una solución de cloroformato de
4-nitrobencilo (58 mg) en CHCl_{3} seco (1,5 ml) a
una solución helada agitada de hidrocloruro de
4-[bis(2-cloroetil)amino]fenil
(72 mg) y NEt_{3} (74 \mul) en CHCl_{3} seco (2 ml). Tras 18
horas a 21ºC, la solución se evaporó y el residuo se cromatografió
en una columna de gel de sílice con CHCl_{3}/éter de petróleo
(3:2), proporcionando el compuesto del título, que cristalizó a
partir de EtOAc/éter de petróleo en forma de prismas de color
amarillo pálido, p.f.: 77ºC a 79ºC (rendimiento: 102 mg). EM FAB:
ion en m/z 413 indica M=412 (C_{18}H_{18}N_{2}O_{5}Cl_{2}
requiere M=412). RMN (CDCl_{3}): \delta 3,62 (m, NCH_{2} o
ClCH_{2}), 3,69 (m, NCH_{2} o ClCH_{2}), 5,33 (s, ArCH_{2}),
6,64 (d, ArH), 7,05 (d, ArH), 7,59 (d, ArH) y 8,25 (d, ArH).
Se hidrogenó sobre 10% de Pd/C durante 2 horas
actinomicina D (AMD, 41 mg) en MeOH (5 ml), después se evaporó en el
vacío. El residuo bajo N_{2} se disolvió en una solución de
cloroformato de 4-nitrobencilo (18 mg) en CHCl_{3}
seco (1,5 ml) y después se añadió una solución de NEt_{3} (10
\mul) en CHCl_{3} (1,5 ml). Tras agitar bajo N_{2} durante 2
horas, se separó el catalizador mediante filtración y la solución,
tras diluir con MeOH (200 ml), se aireó durante 3 días. La solución
se evaporó y el producto se purificó para eliminar el AMD mediante
HPLC semipreparativa dos veces en una columna de 1 cm de diámetro de
sílice unido a C18 en fase reversa con un gradiente de 50% a 100%
de MeCN en H_{2}O. El compuesto del título se cristalizó a partir
de acetato de etilo/éter de petróleo en forma de prismas rojos.
Rendimiento: 31 mg (66%). Espectro de masas de electropulverización:
iones a m/z 1434,5 (M+H) y 1456,4 (M+Na) indica M=1433,5.
C_{70}H_{91}N_{13}O_{20} (isótopo de menor masa) requiere
M=1433,65. La RMN proporcionó las mismas señales que AMD más 66,71
(d, 1H, ArCH_{2}), 7,09 (d, 1H, ArCH_{2}) y señales adicionales
en la región aromática.
Se disolvió hidrocloruro de doxorubicina (2,25
mg) en dimetilformamida (DMF) (0,3 ml) que contenía trietilamina
(NEt_{3}) (0,55 \mul) y se añadió una solución de
4-nitrobencil-4'-nitrofenilcarbonato
(1,4 ml) en DMF (0,1 ml). Tras agitar en la oscuridad durante 3
días, la mezcla se separó mediante HPLC en una columna (diámetro de
1 cm) de sílice C18 en fase reversa con un gradiente de 25% a 100%
de MeCN en tampón formato 0,01 M (pH 4,0). La fracción roja
principal se concentró y se recromatografió con H_{2}O en lugar de
tampón formato. La evaporación en el vacío proporcionó el producto
(2,1 mg)en forma de polvos rojos amorfos. EM por
electropulverización: ión en 723 (M+H) indica M=722.
C_{35}H_{34}N_{2}O_{15} requiere M=722.
Se añadió una solución de mitomicina C (36 mg)
en dimetil formamida (DMF) (2 ml) que contenía NEt_{3} (14 \mul)
a cloroformato de 4-nitrobencilo (30 mg) y la mezcla
se agitó a 21ºC durante 4 horas. Tras la evaporación en el vacío, el
residuo se cromatografió en una columna de gel de sílice con EtOAc,
proporcionando el compuesto del título en forma de sólido rojo
oscuro (49 mg). EM por electropulverización: ión en 514 (M+H) indica
M=513. C_{23}H_{23}N_{5}O_{9} requiere M=513.
Se incubaron V (100 \muM) y cofactor (NADH 500
\muM) con enzima (2 \mug/ml de nitrorreductasa de E. coli
del Ejemplo 1 en tampón fosfato sódico 10 mM (pH 7) en aire a 37ºC.
En diversos tiempos, se inyectaron alícuotas (20 \mul) en una
columna de HPLC Microsorb C18 en fase reversa (240 x 4,7 mm) y se
eluyeron isocráticamente (1 ml/min) con 80% de acetonitrilo en agua.
Se realizó un seguimiento continuo del eluído para la absorción a
280 nm y se calculó la concentración de fármaco mediante integración
del pico correspondiente a este compuesto en el diagrama de HPLC.
Sólo cuando se encontraba presente el enzima se liberaba la
actinomicina D del profármaco.
Se muestra en la figura 2 la desaparición del
profármaco
N-4-nitro-benciloxicarbonil-actinomicina
D (V) y la formación de actinomicina D durante la incubación con
nitrorreductasa de E. coli B del Ejemplo 1.
Se incubaron el profármaco VII (100 \muM) y
cofactor (NADH 500 \muM) con enzima (5 \mug/ml de
nitrorreductasa de E. coli B del Ejemplo 1) en tampón fosfato
sódico 10 mM (pH 7) en aire a 37ºC. En diversos tiempos, se
inyectaron alícuotas (10 \mul) en una columna de HPLC Partisphere
C18 en fase reversa (150x4,7 mm) y se eluyeron isocráticamente (2,0
ml/min) con 50% de metanol en agua. Se realizó un seguimiento
continuo del eluído para la absorción a 260 nm y a 340 nm y se
calculó la concentración de los fármacos mediante integración del
pico correspondiente al compuesto en el diagrama de HPLC.
En la figura 3 se muestra la desaparición del
profármaco II y la formación de mitomicina C durante esta
incubación. Sólo en presencia del enzima se liberó la mitomicina C
del profármaco.
Se muestran en la Tabla 8 la generación de
citotoxicidad por la acción de la nitrorreductasa de E. coli
del Ejemplo 1 sobre los profármacos 4'-nitrobencil
éster del ácido
4-[bis(2-cloroetil)amino]fenilcarbámico
(I donde R^{1}NH_{2}=III) y
N-4-nitrobenciloxi-carbonil-actinomicina
D (V).
Se preparó el conjugado anticuerpo:enzima de
F(ab)_{2} A5B7:nitrorreductasa utilizando los
agentes heterobifuncionales succinimidil
4-(p-maleimidofenil)butirato (SMPB) para
insertar grupos maleimido activos en la inmunoglobulina, y
2-mercapto-[S-acetil]ácido acético
N-hidroxisuccinimida (SATA) para tiolar la
nitrorreductasa de E. coli. Al mezclar las proteínas, los
grupos maleimida reaccionan con tioles formando un enlace tioéter.
La proporción molar de SMPB:inmunoglobulina utilizada era de 10:1 y
la proporción molar de SATA:nitrorreductasa era de 4:1. De esta
manera, se preparó conjugado anticuerpo:enzima a partir de
conjugados de elevado peso molecular y componentes no acoplados
mediante cromatografía por filtración en gel utilizando una columna
calibrada (16 x 700 mm) de Superdex G200. La columna se equilibró en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se eluyó con el mismo
tampón a un caudal de 1,0 ml/min. Las fracciones que contenían
material correspondiente a conjugado de peso molecular comprendido
entre 2:1 y 1:1 (316 kDa y 233 kDa, respectivamente) se agruparon y
se recromatografiaron en la misma columna y las muestras procedentes
de fracciones agrupadas se corrieron en geles
SDS-PAGE 4-15% (Pharmacia Phastgels,
corridos durante 60 vh) bajo condiciones no reductoras junto con
proteínas de calibración. El conjugado se encontraba presente como
material con M_{r} de 125 kDa (correspondiente a 1:1
F(ab')_{2}:nitrorreductasa y conjugados de peso molecular
más elevado junto con cantidades menores de F(ab')_{2}
libre y nitrorreductasa.
Se estableció la actividad enzimática del
conjugado mediante ensayo rutinario utilizando CB 1954 como
sustrato. Se demostró que el conjugado se unía a placas recubiertas
con 1 \mug/ml de antígeno CEA y que contenía sitios de unión tanto
para inmunoglobulina de conejo antirratón y anticuerpos secundarios
de conejo anti-nitrorreductasa (figura 4). Se
utilizaron muestras de F(ab')2 no acoplada y de
nitrorreductasa para confirmar la especificidad de la unión del
anticuerpo secundario.
Se determinó la unión del anticuerpo utilizando
un ensayo ELISA colorimétrico estándar con peroxidasa de rábano
picante, leyendo los resultados a 405 nm. Los triángulos invertidos
abiertos en la figura 4 muestran que el conjugado
F(ab')_{2} A5B7-nitrorreductasa unido puede
detectarse con un anticuerpo inmunoglobulina de cabra antiratón, y
los triángulos invertidos cerrados muestran que el conjugado también
se detecta con un anticuerpo anti-NR de conejo
(detectando el anticuerpo anti-NR mediante la
utilización de un anticuerpo inmunoglobulina de cabra anticonejo).
Los controles mostrados en la figura 4 son: círculos cerrados=unión
de F(ab')_{2} A5B7 no conjugado; cuadrados
abiertos=conjugado F(ab')_{2} A5B7-NR
detectado con inmunoglobulina de cabra anticonejo; cuadrados
cerrados=NR detectada únicamente con anti-NR de
conejo; triángulos abiertos=NR detectada únicamente con
inmunoglobulina de cabra antiratón.
Se sometió a ensayo para toxicidad en ratones el
profármaco de la actinomicina D (AMPDP) de fórmula V. Se administró
a grupos de 3 ratones 1, 10 ó 100 mg/kg de peso corporal i.p. de
AMPD, y dos grupos más de 3 ratones recibieron 1 y 10 mg/kg de peso
corporal i.p. de actinomicina D (ADM) disuelto en aceite de araquis.
Un grupo adicional de 3 ratones se dejaron sin tratar, y un grupo
final de 3 ratones recibieron aceite de araquis i.p. únicamente.
Se realizó un seguimiento del peso corporal de
los ratones a lo largo de 9 días. Se muestran los resultados en la
Tabla 9. Todos los ratones tratados con 10 mg/kg de AMD se
encontraban muertos el día 1. Se obtuvo un resultado similar con una
dosis de 5 mg/kg. Estos datos indican que AMPDPF es por lo menos 20
a 100 veces menos tóxico que AMD. En la práctica, la toxicidad de
AMDPD es probablemente incluso más baja, debido a que la preparación
de AMDPD utilizada contiene aproximadamente 1% de AMD no
convertido.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Cancer Research Campaign Technology Limited
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: Cambridge House, 6-10 Cambridge Terrace Regent's Park
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LONDRES, GB
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: NW1 4JL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mejoras referentes a sistemas de administración de fármacos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:\vspace{9pt}
\hspace{44pt}No aplicable
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/GB92/...
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.167 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 176.829
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 217 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
Claims (26)
1. Sistema para la utilización en quimioterapia
que comprende dos constituyentes:
(i) una nitrorreductasa, obtenible de una
bacteria y que presenta las características siguientes:
- 1:
- es una flavoproteína con un peso molecular comprendido en el intervalo entre 20 y 60 kilodaltons;
- 2:
- requiere NADH o NAD(P)H o análogos de los mismos como cofactor;
- 3:
- presenta una Km para NADH o NAD(P)H comprendido en el intervalo entre 1 y 100 \muM; y,
- 4:
- es capaz de reducir cualquiera o ambos grupos nitro de CB-1954 y análogos del mismo a una forma citotóxica; y,
(ii) un compuesto seleccionado de entre:
- (a)
- compuestos de fórmula (I):
en la que R^{1} se selecciona de
manera que el compuesto R^{1}NH_{2} es un compuesto
citotóxico;
- (b)
- compuestos de fórmula (II):
en la que R^{2} se selecciona de
manera que el compuesto R^{2}OH es un compuesto
citotóxico;
- (c)
- un compuesto de fórmula (V):
\newpage
- (d)
- un compuesto de fórmula (VI):
- (e)
- un compuesto de fórmula (VII):
2. Sistema según la reivindicación 1, en el que
la nitrorreductasa puede obtenerse de las células de E. coli
B.
3. Sistema según la reivindicación 1, en el que
la nitrorreductasa presenta la secuencia de aminoácidos de la Sec.
ID nº 2.
4. Sistema según la reivindicación 1, en el que
el compuesto se selecciona de entre los compuestos de fórmula
(I).
5. Sistema según la reivindicación 4, en el que
R^{1} se selecciona de manera que el compuesto R^{1}NH_{2} es
un compuesto de mostaza nitrogenada.
6. Sistema según la reivindicación 5, en el que
R^{1} se selecciona de manera que el compuesto R^{1}NH_{2} es
un compuesto de mostaza nitrogenada de fórmula (IV):
en la que R' y R'' son H, F o
CH_{3}.
7. Sistema según la reivindicación 6, en el que
R^{1} se selecciona de manera que el compuesto R^{1}NH_{2} es
un compuesto de mostaza nitrogenada de fórmula (III):
8. Sistema según la reivindicación 1, en el que
el compuesto se selecciona de entre los compuestos de fórmula (V),
(VI) y (VII).
9. Sistema según la reivindicación 1, en el que
el compuesto se selecciona de entre los compuestos de fórmula
(II).
10. Sistema según la reivindicación 9, en el que
R^{2} se selecciona de manera que el compuesto R^{2}OH es un
compuesto de mostaza nitrogenada fenólica.
\newpage
11. Sistema según la reivindicación 10, en el
que el compuesto es de fórmula (VIII):
12. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto se asocia a un
portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
13. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la nitrorreductasa se conjuga
con un agente de transporte para un tumor.
14. Sistema según la reivindicación 13, en el
que el agente de transporte es un anticuerpo monoclonal que se unirá
a un antígeno asociado a tumor.
15. Sistema según la reivindicación 13, en el
que la nitrorreductasa se encuentra unida covalentemente al agente
de transporte.
16. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprende además un ribósido del
ácido 1,4-dihidro-nicotínico,
opcionalmente asociado con un portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
17. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para la utilización en un procedimiento
de tratamiento del cuerpo humano o animal.
18. Compuesto de fórmula (I):
en la que R^{1} se selecciona de
manera que el compuesto R^{1}NH_{2} es un compuesto de mostaza
nitrogenada de fórmula
(IV):
en la que R' y R'' son H, F o
CH_{3}.
19. Compuesto según la reivindicación 18, en el
que R^{1} se selecciona de manera que el compuesto R^{1}NH_{2}
es un compuesto de mostaza nitrogenada de fórmula (III):
20. Compuesto de fórmula (V), (VI) o (VII):
21. Compuesto de fórmula (II):
en la que R^{2} se selecciona de
manera que el compuesto R^{2}OH es un compuesto de mostaza
nitrogenada
fenólica.
22. Compuesto según la reivindicación 21, de
fórmula (VIII):
23. Nitrorreductasa con la secuencia de
aminoácidos de SEC ID nº 2.
24. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 18, que comprende
hacer reaccionar una mostaza nitrogenada de fórmula (IV) según la
reivindicación 18, con cloroformato de
4-nitrobencilo bajo condiciones anhidras.
25. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (V), (VI) o (VII) según la reivindicación 20,
que comprende hacer reaccionar actinomicina D, doxorubicina, o
mitomicina C, respectivamente, con cloroformato de
4-nitrobencilo bajo condiciones anhidras.
26. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (II) según la reivindicación 21, que comprende
hacer reaccionar una mostaza nitrogenada fenólica con cloroformato
de 4-nitrobencilo bajo condiciones anhidras.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9122496 | 1991-10-23 | ||
| GB919122464A GB9122464D0 (en) | 1991-10-23 | 1991-10-23 | Further improvements relating to cytotoxic agents |
| GB9122464 | 1991-10-23 | ||
| GB919122496A GB9122496D0 (en) | 1991-10-23 | 1991-10-23 | Improvements relating to cytotoxic agents |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2279506T3 true ES2279506T3 (es) | 2007-08-16 |
Family
ID=26299729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES92921908T Expired - Lifetime ES2279506T3 (es) | 1991-10-23 | 1992-10-23 | Nitrorreductasa bacteriana para la reduccion de cb1954 y analogos del mismo a una forma citotoxica. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5633158A (es) |
| EP (2) | EP0638123B1 (es) |
| JP (2) | JP4115514B2 (es) |
| AT (1) | ATE349534T1 (es) |
| AU (1) | AU681337B2 (es) |
| CA (1) | CA2122036C (es) |
| DE (1) | DE69233669T2 (es) |
| ES (1) | ES2279506T3 (es) |
| WO (1) | WO1993008288A1 (es) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9314960D0 (en) * | 1992-07-23 | 1993-09-01 | Zeneca Ltd | Chemical compounds |
| AU691820B2 (en) * | 1993-07-15 | 1998-05-28 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Prodrugs of protein tyrosine kinase inhibitors |
| GB9315494D0 (en) * | 1993-07-27 | 1993-09-08 | Springer Caroline | Improvements relating to prodrugs |
| GB9323008D0 (en) * | 1993-11-05 | 1994-01-05 | Connors Thomas | Improvements relating to cancer therapy |
| JPH07155188A (ja) * | 1993-12-06 | 1995-06-20 | Chisso Corp | ニトロ還元酵素遺伝子 |
| US6416754B1 (en) * | 1994-03-03 | 2002-07-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Anaerobe targeted enzyme-mediated prodrug therapy |
| US6984513B2 (en) * | 1994-03-03 | 2006-01-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Anaerobe targeted enzyme-mediated prodrug therapy |
| GB9415167D0 (en) | 1994-07-27 | 1994-09-14 | Springer Caroline J | Improvements relating to cancer therapy |
| GB9422264D0 (en) * | 1994-11-04 | 1994-12-21 | Cancer Res Campaign Tech | Inducible cell ablation |
| GB9501052D0 (en) * | 1995-01-19 | 1995-03-08 | Cancer Res Campaign Tech | Improvements relating to prodrugs |
| JP3632246B2 (ja) * | 1995-06-19 | 2005-03-23 | チッソ株式会社 | 大腸菌のフラビン還元酵素 |
| GB9517001D0 (en) * | 1995-08-18 | 1995-10-18 | Denny William | Enediyne compounds |
| GB9516943D0 (en) * | 1995-08-18 | 1995-10-18 | Cancer Soc Auckland Div Nz Inc | Novel cyclopropylindoles and their secoprecursors,and their use as prodrugs |
| US6130237A (en) * | 1996-09-12 | 2000-10-10 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Condensed N-aclyindoles as antitumor agents |
| WO1998022577A1 (en) * | 1996-11-15 | 1998-05-28 | Maria Grazia Masucci | Fusion proteins having increased half-lives |
| AU5676398A (en) * | 1997-01-31 | 1998-08-25 | University Of Alberta, The | Method for detecting exogenous gene expression |
| GB9712370D0 (en) * | 1997-06-14 | 1997-08-13 | Aepact Ltd | Therapeutic systems |
| CA2325050A1 (en) * | 1998-04-06 | 1999-10-14 | Dalhousie University | A novel nitroreductase and therapeutic uses therefor |
| GB9818731D0 (en) | 1998-08-27 | 1998-10-21 | Univ Portsmouth | Compounds |
| GB9818730D0 (en) | 1998-08-27 | 1998-10-21 | Univ Portsmouth | Collections of compounds |
| DE69930328T2 (de) | 1998-08-27 | 2006-12-14 | Spirogen Ltd., Ryde | Dimere Pyrrolobenzodiazepine |
| GB9903019D0 (en) * | 1999-02-10 | 1999-03-31 | Microbiological Res Authority | Nitroreductase enzymes |
| US20040014191A1 (en) * | 1999-02-10 | 2004-01-22 | Nigel Minton | Nitroreductase enzymes |
| GB9909612D0 (en) * | 1999-04-26 | 1999-06-23 | Cancer Res Campaign Tech | N-protected amines and their use as prodrugs |
| GB0002261D0 (en) * | 2000-02-02 | 2000-03-22 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Fluorescent detection method & reagent |
| AU783128B2 (en) | 2000-03-02 | 2005-09-29 | Innovata Plc | TCF responsive element |
| US7582778B2 (en) | 2001-12-03 | 2009-09-01 | Universitatsklinikum Charite Der Humboldt-Universitat Zu | Podophyllotoxin |
| GB0226593D0 (en) | 2002-11-14 | 2002-12-24 | Consultants Ltd | Compounds |
| US7514595B2 (en) | 2003-03-13 | 2009-04-07 | Washington University In St. Louis | Targeted and regional cellular ablation in zebrafish |
| GB0306908D0 (en) * | 2003-03-26 | 2003-04-30 | Angiogene Pharm Ltd | Bioreductively activated stilbene prodrugs |
| GB0306907D0 (en) * | 2003-03-26 | 2003-04-30 | Angiogene Pharm Ltd | Boireductively-activated prodrugs |
| ZA200507752B (en) * | 2003-03-28 | 2007-01-31 | Threshold Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods for treating cancer |
| GB0321295D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Spirogen Ltd | Synthesis of protected pyrrolobenzodiazepines |
| GB0326798D0 (en) * | 2003-11-17 | 2003-12-24 | Crusade Lab Ltd | Methods for generating mutant virus |
| US7897146B2 (en) | 2003-11-17 | 2011-03-01 | Crusade Laboratories Limited | Treatment using herpes simplex virus |
| WO2005086951A2 (en) * | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Threshold Pharmaceuticals, Inc. | Hypoxia-activated anti-cancer agents |
| GB0421294D0 (en) * | 2004-09-24 | 2004-10-27 | Angiogene Pharm Ltd | Bioreductively-activated prodrugs |
| AU2006263433B8 (en) | 2005-06-29 | 2011-06-09 | Immunogenesis, Inc. | Phosphoramidate alkylator prodrugs |
| GB0517957D0 (en) * | 2005-09-03 | 2005-10-12 | Morvus Technology Ltd | Method of combating infection |
| GB0526552D0 (en) | 2005-12-29 | 2006-02-08 | Morvus Technology Ltd | New use |
| GB2442202A (en) | 2006-09-30 | 2008-04-02 | Morvus Technology Ltd | Vermin poison |
| ES2884044T3 (es) * | 2006-12-26 | 2021-12-10 | Immunogenesis Inc | Profármaco alquilante de fosforamidato para el tratamiento del cáncer |
| US20090118031A1 (en) * | 2007-11-01 | 2009-05-07 | Qualizza Gregory K | Shaft Structure with Configurable Bending Profile |
| US20110312001A1 (en) | 2010-06-15 | 2011-12-22 | Emile Nuwaysir | Compendium of ready-built stem cell models for interrogation of biological response |
| US10357577B2 (en) | 2010-07-16 | 2019-07-23 | Auckland Uniservices Limited | Bacterial nitroreductase enzymes and methods relating thereto |
| JP2014520551A (ja) | 2011-07-11 | 2014-08-25 | セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド | 細胞のリプログラミング方法およびゲノムの改変方法 |
| WO2014132137A2 (en) | 2013-03-01 | 2014-09-04 | Université De Genève | Transgenic cell selection |
| GB201313465D0 (en) * | 2013-07-29 | 2013-09-11 | Queens University Of The Belfast | Methods of preparing nicotinamide riboside and derivatives thereof |
| CN107531738B (zh) * | 2015-03-16 | 2021-02-19 | 可劳迈戴斯有限公司 | 烟酸核苷或烟酰胺核苷组合物、其还原衍生物及其用途 |
| CN112359079B (zh) * | 2020-11-10 | 2022-07-26 | 江苏八巨药业有限公司 | 一种伊马胺的制备方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4472312A (en) * | 1979-11-07 | 1984-09-18 | Research Corporation | p-Nitrocarbobenzoxy naphthazarin |
| US4617398A (en) * | 1982-04-12 | 1986-10-14 | The Research Foundation Of State University Of New York | Phosphoaziridine compounds useful for treatment of tumors |
| US4680382A (en) * | 1986-02-03 | 1987-07-14 | Trustees Of Boston University | Analogues of actinomycin D |
| JPH0674251B2 (ja) * | 1986-02-07 | 1994-09-21 | 全薬工業株式▲会▼社 | ビス−ジオキソピペラジン誘導体 |
| ZA886812B (en) * | 1987-11-23 | 1989-07-26 | Bristol Myers Co | Anti-tumor prodrugs |
| ZA886810B (en) * | 1987-12-18 | 1989-08-30 | Bristol Myers Co | Epipodophyllotoxin glucoside 4'-acyl derivatives |
| GB8804068D0 (en) * | 1988-02-22 | 1988-03-23 | Roberts J R | Improvements relating to control of neoplastic tissue growth |
| DE4002888A1 (de) * | 1990-02-01 | 1991-08-08 | Behringwerke Ag | Anthracyclin-glycosyl-prodrugs, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in kombination mit funktionalisierten tumorspezifischen enzymkonjugaten |
-
1992
- 1992-10-23 JP JP50757293A patent/JP4115514B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 AU AU27769/92A patent/AU681337B2/en not_active Expired
- 1992-10-23 AT AT92921908T patent/ATE349534T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-23 WO PCT/GB1992/001947 patent/WO1993008288A1/en active IP Right Grant
- 1992-10-23 ES ES92921908T patent/ES2279506T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 EP EP92921908A patent/EP0638123B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 US US08/232,018 patent/US5633158A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 CA CA002122036A patent/CA2122036C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 DE DE69233669T patent/DE69233669T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 EP EP92309740A patent/EP0540263A1/en active Pending
-
1995
- 1995-06-07 US US08/504,047 patent/US5780585A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-06-01 US US09/087,855 patent/US5977065A/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-07-26 JP JP2004217649A patent/JP3995666B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0540263A1 (en) | 1993-05-05 |
| JP3995666B2 (ja) | 2007-10-24 |
| WO1993008288A1 (en) | 1993-04-29 |
| JP4115514B2 (ja) | 2008-07-09 |
| DE69233669T2 (de) | 2007-10-25 |
| CA2122036C (en) | 2002-09-17 |
| EP0638123A1 (en) | 1995-02-15 |
| JP2005040136A (ja) | 2005-02-17 |
| US5633158A (en) | 1997-05-27 |
| US5780585A (en) | 1998-07-14 |
| ATE349534T1 (de) | 2007-01-15 |
| AU681337B2 (en) | 1997-08-28 |
| EP0638123B1 (en) | 2006-12-27 |
| JPH07501692A (ja) | 1995-02-23 |
| US5977065A (en) | 1999-11-02 |
| DE69233669D1 (de) | 2007-02-08 |
| CA2122036A1 (en) | 1993-04-29 |
| AU2776992A (en) | 1993-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2279506T3 (es) | Nitrorreductasa bacteriana para la reduccion de cb1954 y analogos del mismo a una forma citotoxica. | |
| ES2205872T3 (es) | Pirrolobenzodiaepinas. | |
| KR102076364B1 (ko) | 사람 아르기나제 및 페길화된 사람 아르기나제 및 그의 용도 | |
| US5773435A (en) | Prodrugs for β-lactamase and uses thereof | |
| CA2030564A1 (en) | Immunoconjugates and prodrugs and their use in association for drug delivery | |
| WO2014081301A1 (en) | Bio-orthogonal drug activation | |
| ES2257810T3 (es) | Conjugados de quinona reductasa humana para adept y gdept. | |
| de Bont et al. | Synthesis and biological activity of β-glucuronyl carbamate-based prodrugs of paclitaxel as potential candidates for ADEPT | |
| AU716920B2 (en) | Enediyne compounds | |
| WO2007102888A2 (en) | Methods of treating cancer with doxazolidine and prodrugs thereof | |
| Lee et al. | Peptide-based scaffolds for in vivo immobilization and enzyme attachment in therapeutic applications | |
| EP0475230A1 (en) | Methods of conjugating actinomycin D | |
| Hay et al. | Antibody-directed enzyme-prodrug therapy (ADEPT) | |
| Aloysius et al. | Improving the Specificity of the Prostate‐Specific Antigen Substrate Glutaryl‐Hyp‐Ala‐Ser‐Chg‐Gln as a Promoiety | |
| AU725236B2 (en) | Novel prodrugs and system including such prodrugs | |
| EP0429454A1 (en) | Improvements relating to the control of neoplastic tissue growth | |
| AU2016361668A1 (en) | MMP-sensitive taxane prodrug | |
| Gali et al. | In vitro and in vivo characterization of a new receptor specific indium‐111 labeled DOTA‐ST conjugate for targeting guanylin receptors in human colon cancer cells | |
| NO166715B (no) | Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive cytorodin s derivater. | |
| Sayyad | Design, synthesis and biological evaluation of bioconjugates for selective drug delivery and tumour targeting | |
| PT99431A (pt) | Processo para a preparacao de novos pro-farmacos citotoxicos activos |