ES2205872T3 - Pirrolobenzodiaepinas. - Google Patents

Abstract

Uso de un compuesto de fórmula I: para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, ya sea: (i) en conjunción con un enzima, a través del procedimiento de AEDPT o GDEPT; o ii) a través de procedimientos de NPEPT. en donde R10 es un grupo protector de nitrógeno adecuado, lábil para un adecuado enzima; R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre H, R, OH, OR, =O, =CH-R, , =CH2, CH2-CO2R, CH2-CO2H, CH2-SO2R, O-SO2-R, CO2R, COR y CN; R6, R7 y R9 se seleccionan independientemente de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me3Sn; o R7 y R8 conjuntamente forman un grupo -O-(CH2)p-O-, donde p es 1 ó 2; X es S, O ó NH; R11 es o bien H ó R; donde R es un grupo alquilo inferior que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo aralquilo, de hasta 12 átomos de carbono, en donde el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más grupos carbonilo, uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, los cuales pueden formar parte de un sistema conjugado, o un grupo arilo, de hasta 12 átomos de carbono; y está opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, hidroxi, amino o nitro y si R es un grupo alquilo, el mismo puede contener un heteroátomo que puede estar localizado en cualquier parte del grupo alquilo; y donde existe opcionalmente un doble enlace entre C1 y C2 o entre C2 y C3; y R8 se selecciona de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me3Sn, donde R es tal como se ha definido anteriormente o el compuesto es un dímero, siendo cada uno de los monómeros iguales o diferentes y de fórmula I, donde los grupos R8 de los monómeros forman conjuntamente un puente que tiene la fórmula -T-R¿-T-, e que uniendo a los monómeros, en donde R¿ es una cadena de alquileno que contiene de 3 a 12 átomos de carbono, pudiendo ser dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, y pueden contener uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, y cada uno de los T se selecciona independientemente de entre O, S o N.

Description

Pirrolobenzodiazepinas.

La presente invención está relacionada con pirrolobenzodiazepinas (PBDs) y, en particular, con el uso de estos compuestos como profármacos para terapia nzima-profármaco dirigida a anticuerpo (ADEPT), terapia enzima-profármaco dirigida a gen (GDEPT), terapia fotodinámica (PDT) y terapia enzima-profármaco de origen natural (NPEPT).

Antecedentes de la invención

Las pirrolobenzodiazepinas tienen la capacidad de reconocer y de unirse a secuencias específicas de DNA; la secuencia más preferida es PuGPu (Purina-Guanina-Purina). El primer antibiótico antitumoral PBD, la antramicina, fue descubierto en 1965 (Leimgruber et al., 1965 J. Am. Chem. Soc. 87, 5793-5795; Leimgruber et al., 1965 J. Am. Chem. Soc. 5791-5793). Desde entonces se ha informado acerca de la existencia de PBDs de origen natural y desarrollado mas de 10 rutas sintéticas para una variedad de análogos (Thurston et al., 1994 Chem. Rev. 1994, 433-465). Entre los miembros de la familia se incluyen la abbeimicina (Hochlowski et al., 1987 J. Antibiotics, 40, 145-148), la chicamicina (Konishi et al., 1984 J. Antibiotics, 37, 200-206), DC-81 (Patente japonesa 58-180487; Thurston et al, 1990, Chem. Brit., 26, 767-772; Bose et al, 1992 Tetrahedron, 48, 751-758), la mazetramicina (Kuminoto et al., 1980 J. Antibiotics, 33, 665-667), las neotramicinas A y B (Takeuchi et al., 1976 J. Antibiotics, 29, 93-96), la porotramicina (Tsunakawa et al., 1988 J. Antibiotics, 41, 1366-1373), la protracarcina (Shimizu et al, 1982 J. Antibiotics, 29, 2492-2503; Langley and Thurston, 1987 J. Org. Chem, 52, 91-97), la sibanomicina (DC-102) (Hara et al., 1988 J. Antibiotics 41, 702-702; Itoh et al., 1988 J. Antibiotics, 41, 1281-1284), la sibiromicina (Leber et al., 1988 J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993) y la tomamicina (Arima et al., 1972 J. Antibiotics, 25, 437-444). Las PBDs tienen la siguiente estructura general:

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Los mismos difieren en el número, en el tipo y en la posición de los sustituyentes, tanto en sus anillos aromáticos A como en sus anillos pirrolo C, y en el grado de saturación del anillo C. En el anillo B existe o bien una imina (N=C), una carbinolamina (NH-CH(OH))o una carbinolamina metil éter (NH-CH(=Me)) en la posición N10-C11, la cual constituye el centro electrófilo responsable de la alquilación del DNA. La totalidad de productos naturales conocidos presentan configuración S en la posición quiral C11a, la cual les proporciona una torsión hacia la derecha cuando son observados desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les proporciona la adecuada forma tridimensional para isohelicidad con el menor surco de DNA de forma B, conduciendo a una cómoda adaptación en el punto de unión (Kohn, 1975 en Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11; Hurley and Needham-VanDevanter, 1986 Acc. Chem. Res., 19, 230-237). Su capacidad para formar un aducto en el surco menor les permite interferir con el procesado de DNA, de ahí su utilización como agentes antitumorales.

La utilización de profármacos representa un concepto clínico muy valioso en la terapia del cáncer. Por ejemplo, un profármaco puede ser convertido en un agente antitumoral bajo la influencia de un enzima que esté unido a un anticuerpo monoclonal, con la finalidad de que el mismo pueda unirse a un antígeno asociado al tumor. La combinación del citado profármaco con el citado conjugado anticuerpo monoclonal enzima representa una estrategia terapéutica muy poderosa. Este enfoque para la terapia del cáncer, identificada a menudo como "terapia enzima/profármaco dirigida a anticuerpo" (ADEPT) se describe en el documento WO88/07378.

Un enfoque terapéutico adicional, denominado "terapia enzima profármaco dirigida a virus"(VDEPT) ha sido propuesto como un procedimiento para el tratamiento de células tumorales en pacientes utilizando profármacos. Las células tumorales constituyen el objetivo de un vector vírico que transporta un gen que codifica para un enzima capaz de activar un profármaco. El gen puede ser regulado transcripcionalmente por medio de secuencias de reforzador o favorecedor específico del tejido. El vector vírico penetra en la células tumorales y expresa el enzima, convirtiendo de este modo al profármaco en un producto activo dentro de las células tumorales (Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88, 8039). De manera alternativa, se han utilizado procedimientos no víricos para el suministro de genes. Entre los citados procedimientos se incluyen la co-precipitación con fosfato cálcico, la microinyección, los liposomas, la absorción directa de DNA, y la transferencia de DNA mediada por receptor. Las mismas han sido revisadas en Morgan & French, Annu. Rev. Biochem., 1993, 62; 191. El término "GDEPT" (terapia enzima profármaco dirigida a gen) se utiliza para incluir tanto los sistemas de suministro víricos como los no víricos.

La terapia fotodinámica (PDT) proporciona otro procedimiento que utiliza profármacos para suministrar cantidades deseadas de fármacos a puntos específicos en el cuerpo humano. Los avances en el campo del suministro de luz a áreas internas del organismo permiten el suministro a órganos y a otras áreas sin la necesidad de procedimientos quirúrgicos extensivos. El proceso de activación puede resultar extremadamente específico para un determinado punto, dado que la dirección del rayo láser puede ser controlada con gran precisión y el diámetro del rayo puede ser reducido a muy por debajo del de una simple célula, minimizando con ello cualquier posible daño a otro tejido vecino a partir de la activación no deseada del profármaco. La elevada energía de la luz ultravioleta (por ejemplo, 350 nm equivalen a 340 KJ/mol) resulta suficiente para romper una gama de enlaces químicos, dado que el espectro de energía de enlace de la mayoría de las moléculas orgánicas está situado entre 250 y 420 KJ/mol. Por ejemplo, existe una amplia aplicación para la desprotección fotoquímica de aminoácidos, péptidos y polisacáridos a partir de sus formas o-nitrobencilcarbamato, CBZ; y 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilcarbamato, a longitudes de onda superiores a los 350 nm.

Un nuevo tipo de profármacos es aquel en el cual el grupo protector es eliminado por medio de un enzima natural presente en el punto deseado de acción. Entre estos enzimas se incluyen la dopa-descarboxilasa, la L-\gamma-glutamiltranspeptidasa y oxidasas y reductasas de función mezclada (por ejemplo, DT-diafrasa). Este es un procedimiento denominado "terapia profarmaco-enzima de origen natural" (NPEPT) en esta solicitud. Un enzima de particular interés es la glutationa transferasa (GST), el cual forma parte de un importante mecanismo de defensa celular basado en la utilización del tripéptido glutationa, como eliminador de electrófilos tóxicos. La GST actúa como catalizador en la reacción entre la glutationa y sus electrófilos objetivo. Una consecuencia de este mecanismo de defensa es la activación de agentes terapéuticos electrófilos. Muchas células tumorales humanas muestran elevados niveles de GST, en comparación con las células normales y la asociación de GST con resistencia a los agentes alquilantes de DNA ha sido demostrada por Lewis et al., (Carcinogenesis 1988, 9, 1283-1287), Kuzmich et al., (Journal of Biochemistry 1992, 281, 219-224) y Tew et al., (Glutathione-S-transferase and anti-cancer drug resistance, in Mechanism of Drug Resistance in Neoplastic Cells; Wooley, P.V., Tew, K.D., Eds.; Academic Press; Orlando, FL, 1987; pp 141-159). Los agentes para quimioterapia que pueden sacar partido de esta propiedad intrínseca de las células cancerosas pueden resultar altamente útiles en el tratamiento de los cánceres resistentes.

Se han obtenido profármacos que hacen uso de este elevado nivel de GST /Satyam et al., Med. Chem. 1996, 39, 1736-1747). Los mismos tienen una molécula de glutationa unida a través de un producto de unión 2-sulfoniletiloxicarbonilo a una mostaza fosforodiamidato. Un tipo alternativo de profármaco ha hecho uso del grupo 2-fenilsulfoniletiloxicarbonilo (Psec), estrechamente relacionado (Nicolau et al., Science 1992, 256, 1172-1178). Los citados profármacos mostraron selectividad entre células de médula ósea de voluntarios sanos y promeocíticas y líneas tumorales de leucemia de células T.

Descripción de la invención

Un primer aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto con la fórmula I:

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para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, ya sea:

i)

En conjunción con un enzima, a través del procedimiento de AEDPT o GDEPT; o

ii)

a través de procedimientos de NPEPT.

en donde

R_{10} es un grupo protector de nitrógeno adecuado, lábil a los enzimas;

R_{2} y R_{3} son seleccionados independientemente de entre H, R, OH, OR, =O, =CH-R, =CH_{2}, CH_{2}-CO_{2}R, CH_{2}-CO_{2}H, CH_{2}-SO_{2}R, O-SO_{2}-R, CO_{2}R, COR y CN;

R_{6}, R_{7} y R_{9} son seleccionados independientemente de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn; o R_{7} y R_{8} conjuntamente forman un grupo -O-(CH_{2})-_{p}O-, donde p es 1 ó 2;

X es S, O ó NH;

R_{11} es o bien H ó R;

donde R es un grupo alquilo inferior que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono o un grupo aralquilo ( a saber, un grupo alquilo con uno o más sustituyentes arilo), preferiblemente de hasta 12 átomos de carbono, en donde el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más grupos carboxilo, uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, los cuales pueden formar parte de un sistema conjugado, o un grupo arilo, preferiblemente de hasta 12 átomos de carbono; y está opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, hidroxi, amino o nitro y si R es un grupo alquilo, el mismo puede contener un heteroátomo que puede estar localizado en cualquier parte del grupo alquilo; y donde existe opcionalmente un doble enlace entre C1 y C2 o entre C2 y C3.; y R_{8} es seleccionado de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn, donde R es tal como se ha definido anteriormente o el compuesto es un dímero con cada uno de los monómeros siendo o diferentes y de fórmula I, donde los grupos R_{8} de los monómeros forman conjuntamente un puente que tiene la fórmula -T-R'-T-, uniendo a los monómeros, en donde R' es una cadena de alquileno que contiene entre 3 y 12 átomos, pudiendo ser dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno, o piridina y puede contener uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono y cada uno de los grupos T es seleccionado independientemente de entre O, S ó N.

Si R es un grupo alquilo y contiene un heteroátomo, el heteroátomo puede estar localizado en cualquier parte del grupo alquilo, por ejemplo, -O-C_{2}H_{5}, -CH_{2}-S-CH_{3}.

R es preferiblemente seleccionado independientemente de entre un grupo alquilo inferior que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono o un grupo aralquilo, preferiblemente de hasta 12 átomos de carbono, o un grupo arilo, preferiblemente de hasta 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, hidroxi, amino o nitro. Resulta más preferido que los grupos R sean seleccionados independientemente a partir de un grupo alquilo inferior que tenga entre 1 y 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, hidroxi, amino o nitro. Resulta particularmente preferido que los grupos R sean grupos alquilo de cadena lineal o ramificada no sustituidos, teniendo entre 1 y 10, preferiblemente entre 1 y 6, y más preferiblemente entre 1 y 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo.

La eliminación del grupo protector debería dejar al resto de la estructura de la PBD desafectada.

Un enzima particularmente adecuado para ser utilizado en el primer aspecto es la nitrorreductasa, si bien entre los enzimas adecuados se incluyen también la penicilina V/G amidasa, la \beta-lactamasa, la fosfatasa, la L-\gamma-glutamiltranspeptidasa y la \alpha-galactosidasa. La acción de algunos de estos enzimas se describe en Jungheim, L.N., and Shepherd, T.A. Design of Antitumor Prodrugs: Substrates for Antibody Targeted Enzymes, Am. Chem. Soc. Chem. Rev., 1994, 94:6, 1553-1566. Otro enzima particularmente adecuado es la glutationa transferasa, tal como se ha discutido anteriormente.

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto tal como se describe en la reivindicación 13. La longitud de onda de la luz utilizada está comprendida entre 250 y 400 ó 500 nm.

Un tercer aspecto de la presente invención proporciona un compuesto tal como el que se describe en la reivindicación 22.

Las preferencias para R expresadas anteriormente son también de aplicación para estos dos aspectos.

Un posible grupo en el segundo y en el tercer aspecto es R_{10} de fórmula II:

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en donde n está comprendido entre 0 y 3, R^{(I)} es H ó R, y R^{(II)} son uno o más sustituyentes opcionales seleccionados independientemente de entre NO_{2}, OR, o R, donde R es tal como se ha definido en cualquiera de las definiciones anteriores y si dos sustituyentes R^{(II)} se encuentran en átomos adyacentes, los mismos pueden ser conjuntamente de fórmula -O-(CH_{2})_{m}-O-, donde m es 1 ó 2; R^{(II)} es preferiblemente NO_{2}.

Si el grupo R_{10} en el primer y en el tercer aspecto es uno que es susceptible a la nitrorreductasa, puede ser de fórmula III:

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en donde n está comprendido entre 0 y 3, R^{(I)} es H ó R y R^{(III)} es uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de entre NO_{2}, OR, ó R, donde R es tal como se ha definido en cualquiera de las definiciones anteriores y si dos sustituyentes R^{(III)} se encuentran sobre átomos adyacentes, los mismos puede ser conjuntamente de fórmula

\hbox{-O-(CH _{2} ) _{m} -O-,}

donde m es 1 ó 2.

Otro posible grupo, R_{10} en el primer y en el tercer aspecto, presenta la fórmula XI:

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en donde R es tal como se ha definido en cualquiera de las definiciones anteriores y n está comprendido entre 0 y 3, preferiblemente 0. Para esta fórmula, R es muy preferiblemente un grupo fenilo, sustituido o no sustituido. Este grupo protector puede ser eliminable a través de la acción de la glutationa transferasa (GST), la cual se encuentra presente a niveles elevados en muchas células tumorales humanas (ver lo indicado anteriormente).

En los compuestos de fórmula I resulta preferible que X sea O e, independientemente, que R_{11} sea H.

Si existe un doble enlace en el anillo C, el mismo se encuentra preferiblemente entre C2 y C3.

Adicionalmente, resulta preferido que R_{6} y R_{9} sean H y adicionalmente preferido que R_{7} y R_{8} sean independientemente seleccionados de entre H, OH y OR. Resulta adicionalmente preferido que R_{2} y R_{3} sean H.

Si el compuesto de fórmula I es un dímero, el puente dimérico puede tener la fórmula -O-(CH_{2})_{p}-O-, donde p está comprendido entre 1 y 12, preferiblemente entre 3 y 9. Además, R_{6} y R_{9} son preferiblemente H y R_{7} es preferiblemente seleccionado independientemente de entre O, OH y OR.

Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I, tal como se ha descrito en los aspectos de la invención mencionados anteriormente, en donde XR_{11} \neq OH, a partir de un compuesto correspondiente Ia, el cual es un compuesto de fórmula I en la cual XR_{11} = OH, es el siguiente. Un producto en el cual XR_{11} es OR puede ser preparado a través de la eterificación directa de los compuestos Ia. Un producto en el cual X es S puede ser preparado por medio del tratamiento del compuesto Ia con R_{11}SH y un catalizador (generalmente un ácido de Lewis tal como Al_{2}O_{3}). Un producto en el cual X es NH puede ser preparado por medio del tratamiento del compuesto Ia con una amina R_{11}NH y un catalizador (generalmente un ácido de Lewis, tal como Al_{2}O_{3})

Un procedimiento para la preparación de un compuesto Ia, tal como se describe anteriormente, consiste en la oxidación de un compuesto de fórmula IVa

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en donde los sustituyentes del compuesto de fórmula IVa son los mismos que para el compuesto de partida Ia que tiene que ser preparado. (para la preparación de compuestos diméricos, los monómeros unidos a través de C8 por medio de -T-R'-T-son ambos de fórmula IVa. Similares comentarios resultan de aplicación a otros productos intermedios en la síntesis de dímeros). El procedimiento de oxidación preferido es la oxidación Swern.

Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula IVa, tal como se ha descrito anteriormente, consiste en la reacción de un compuesto de fórmula Va:

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con un compuesto de fórmula VI:

\newpage

(VI)Y-R_{10}

en donde los sustituyentes de los compuestos de fórmula Va y VI son los mismos que para el compuesto IVa que tiene que ser preparado, e Y es un átomo de halógeno.

Si R_{10} tiene que ser de fórmula II, entonces resulta preferido que el compuesto de fórmula VI sea un haloformato de fórmula VIa:

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en donde los sustituyentes son tal como se ha definido para el grupo de fórmula II e Y es un átomo de halógeno.

Si R_{10} tiene que ser de fórmula XI, entonces resulta preferido que el compuesto de fórmula VI sea un haloformato de fórmula VIb:

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donde Y es un átomo de halógeno, y R y n son lo que se ha definido anteriormente para la fórmula XI.

Una síntesis alternativa de un compuesto de fórmula IVa, tal como se ha descrito anteriormente, se obtiene por reacción de un compuesto de fórmula VII:

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con un compuesto de fórmula VI:

(VI)Y-R_{10}

Para formar un compuesto de fórmula VIII

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y después haciendo reaccionar el compuesto de fórmula VIII con un compuesto de fórmula IXa

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(por ejemplo, por medio de (COCl)_{2}), en donde los sustituyentes para los compuestos de fórmulas VI, VII, VIII y IXa son los mismos que para el compuesto de fórmula IVa que tiene que ser preparado, donde Y es un átomo de halógeno.

Un nuevo procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula Ia, tal como se ha descrito anteriormente, consiste en el desenmascaramiento de un compuesto de fórmula IVb:

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en donde los sustituyentes del compuesto de fórmula IVb son los mismos que para el compuesto de fórmula Ia que tiene que ser preparado y Q es o bien S ó O y R^{(IV)} es independientemente seleccionado de entre Me ó Et o puede formar conjuntamente -(CH_{2})_{q}- donde q es 2 ó 3. (Para la preparación de compuestos dímeros, los monómeros unidos a través de C8 por medio de -T-R'-T- son ambos de fórmula IVb. Comentarios similares resultan de aplicación a otros intermedios en la síntesis de dímeros). El procedimiento de desenmascaramiento preferido cuando Q=S es el desenmascaramiento mediado por mercurio. El desenmascaramiento cuando Q=O se lleva a cabo a través de la utilización de condiciones ácidas, por ejemplo, TFA, metanol y agua o catálisis de paladio.

Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula IVb, tal como se ha descrito anteriormente, consiste en la reacción de un compuesto de fórmula Vb:

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con un compuesto de fórmula VI:

(VI)Y-R_{10}

En donde los sustituyentes de los compuestos de fórmula Vb y VI son los mismos que los del compuesto de fórmula IVb que tiene que ser preparado e Y es un átomo de halógeno.

Si R_{10} tiene que ser de fórmula II, entonces resulta preferido el que el compuesto de fórmula VI sea un haloformato de fórmula VIa:

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en donde los sustituyentes son lo que se ha definido anteriormente para el grupo de fórmula II e Y es un átomo de halógeno.

Una síntesis alternativa de un compuesto de fórmula IVb tal como se ha descrito anteriormente se obtiene por reacción de un compuesto de fórmula VII:

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con un compuesto de fórmula VI

(VI)Y-R_{10}

Para formar un compuesto de fórmula VIII:

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y haciendo reaccionar después el compuesto de fórmula VIII con un compuesto de fórmula IXb:

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(por ejemplo, por medio de (COCl)_{2}), en donde los sustituyentes para los compuestos de fórmula VI, VII, VIII y IXb son los mismos que los del compuesto de fórmula IVb que tiene que ser preparado, donde Y es un átomo de halógeno.

Los fármacos generados a partir de la rotura de R_{10} pueden ser utilizados para el tratamiento de cánceres u otras enfermedades que sean específicas de un punto, en las cuales resulta beneficioso para el paciente un incremento local de la toxicidad. Los cánceres que pueden se tratados son cánceres sólidos e incluyen cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer renal, de mama y de intestino, de CNS, melanoma, al igual que leucemias. Los citados fármacos pueden resultar también adecuados para el tratamiento de infecciones bacterianas, víricas o por parásitos, mediante la explotación de un único enzima producido en el punto de la infección, el cual no resulta natural para el huésped o mediante la explotación de una elevación en la cantidad de un enzima que se genera naturalmente en el huésped.

Las composiciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas en la presente invención pueden comprender, además del ingrediente activo, a saber un compuesto de fórmula I, un excipiente farmacéuticamente aceptable, un vehículo, tampón, estabilizador u otros materiales bien conocidos para los expertos en la materia. Los citados materiales no deberían ser tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo o de otros materiales dependerá de la ruta de administración, la cual puede ser oral, o por medio de inyección, por ejemplo, subcutánea o intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden adoptar la forma de comprimidos, cápsulas, polvos o ser de forma líquida. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas comprenden generalmente un vehículo líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Las cápsulas pueden comprender un vehículo sólido tal como gelatina.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o para inyección en el punto de aflicción, el ingrediente activo se encontrará en forma de solución acuosa aceptable desde el punto de vista parenteral, la cual esté exenta de pirógenos y presente niveles de pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos expertos en la materia serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, solución de Ringer, o inyección de lactato de Ringer. Si hace falta pueden también incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/o otros aditivos.

Seguidamente se procederá a describir, de modo adicional, aspectos de la invención que hacen referencia a los gráficos que se acompañan, en los cuales:

La Fig. 1 es un esquema de síntesis según la presente invención.

Las Figs. 2a & 2b constituyen esquemas de síntesis para dímeros según la presente invención.

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La Fig. 3 es un esquema de síntesis que muestra una ciclación alternativa, para ser utilizado en la presente invención.

La Fig. 4 es una gráfica que ilustra los resultados de la citotoxicidad para el compuesto profármaco 7 (ver Ejemplo 1), tanto antes como después de la activación con nitrorreductasa/NADH en células SW1116 y en células LS174T.

La Fig, 5 es una gráfica que ilustra el porcentaje de compuesto 11 (ver ejemplo 3) roto por medio de exposición a UVA (365 nm), a lo largo de un período de tiempo superior a las 3 horas.

La Fig. 6 es una gráfica que ilustra la citotoxicidad in vitro (IC_{50},\muM) de bencilo DC-81 y del compuesto 11, con tiempos de irradiación variables, frente a células K562 de leucemia mieloide crónica humana en DMF, a una concentración inicial de fármaco 1 mM.

La Figura 7 es una gráfica que ilustra la citotoxicidad in vitro (IC_{50};\muM) de bencil DC-81 y del compuesto 11, con tiempos de irradiación variables, frente a células K562 de leucemia mieloide crónica humana en DMF, a una concentración inicial de fármaco 10 mM.

La Figura 8 es una gráfica que ilustra la citotoxicidad in vitro (IC_{50};\muM) de bencil DC-81 y del compuesto 11, con tiempos de irradiación variables, frente a células K562 de leucemia mieloide crónica humana en metanol, a una concentración inicial de fármaco 1 mM.

La Figura 9 es una gráfica que ilustra la citotoxicidad in vitro (IC_{50};\muM) de DSB-120 y del compuesto 32, con tiempos de irradiación variables, frente a células K562 de leucemia mieloide crónica humana en metanol, a una concentración inicial de fármaco 1mM.

Estrategias de síntesis preferidas

Un paso clave en una ruta de síntesis preferida para los compuestos de fórmula I consiste en la ciclación que genera el anillo B, lo cual conlleva la generación de un aldehído (o uno de sus equivalentes funcionales) en la que será la posición 11, y el ataque sobre la misma por el nitrógeno 10:

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El "aldehído enmascarado" -CPQ puede ser un acetal o un triacetal (por ejemplo, P=Q=Set ó Ome) que puede ser cíclico, en cuyo caso la ciclación conlleva el desenmascaramiento. De manera alternativa, el aldehído enmascarado puede ser un precursor de aldehído, tal como un alcohol, -CHOH, en cuyo caso, la reacción conlleva oxidación, por ejemplo por medio de TPAP o DMSO (oxidación de Swern).

El compuesto aldehído enmascarado puede ser producido mediante la condensación de la correspondiente pirrolidina 2-sustituida con un ácido 2-nitrobenzoico:

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El grupo nitro puede ser entonces reducido a –NH_{2} y protegido por medio de la reacción con un agente adecuado, por ejemplo, un cloroformato, el cual proporciona el grupo protector de nitrógeno R_{10}, terapéuticamente eliminable, en el compuesto de fórmula I.

En la Figura 1 se ilustra un procedimiento que conlleva la reacción de oxidación-ciclación (un tipo alternativo de ciclación se describirá más adelante en relación con la Figura 3). Si R_{11} es diferente de hidrógeno, el compuesto de fórmula I puede ser preparado mediante esterificación directa de un alcohol Ia. Si X=S y no es O, el alcohol Ia o el derivado OR, pueden ser tratados con H_{2}S y un catalizador tal como Al_{2}O_{3}, o por medio de la adición de un tiol, por ejemplo, EtSH. Si X es NH, entonces el tratamiento del alcohol Ia con la amina adecuada produce el compuesto de fórmula I deseado.

La exposición del alcohol (IVa) (en el cual el nitrógeno protegido en la posición 10 está generalmente protegido en forma de carbamato de amida) a perrutenato de tetrapropilamonio (TPAP)/N-metilmorfolina N-oxido (NMO) sobra mallas A4 da como resultado oxidación acompañada de cierre espontáneo del anillo B para proporcionar el producto deseado. Se ha averiguado que el procedimiento de oxidación TPAP/NMO resulta particularmente conveniente para reacciones a pequeña escala, mientras que el uso de procedimientos de oxidación basados en DMSO, en particular la oxidación Swern, resulta superior para trabajos a mayor escala (por ejemplo, >1g).

El alcohol no ciclado (IVa) puede ser preparado por medio de la adición de un reactivo de protección de nitrógeno de fórmula VI, que es preferiblemente un cloroformato o un cloruro de ácido, con el aminoalcohol (Va), generalmente en solución y en presencia de una base tal como piridina (preferiblemente 2 equivalentes) a una temperatura moderada (por ejemplo, a 0ºC). En estas condiciones, la O-acilación observada es nula o prácticamente nula.

El aminoalcohol clave (Va) puede ser preparado por reducción del correspondiente compuesto nitro (XIa), mediante la elección de un procedimiento que dejará al resto de la molécula intacta. El tratamiento de XIa con cloruro de estaño (II) en un disolvente adecuado, por ejemplo, metanol en reflujo, conduce a la obtención, después de la eliminación de las sales de estaño, del producto deseado con un rendimiento elevado.

La exposición de XIa a hidrazina/níquel Raney (o hidrogenación con un catalizador) evita la producción de sales de estaño y puede dar como resultado un rendimiento más elevado en Va, si bien este procedimiento es menos compatible con la banda de posibles sustituyentes de los anillos C y A. Por ejemplo, si existe una instauración en el anillo C (ya sea en el propio anillo o en R_{2} ó R_{3}) está técnica puede no resultar adecuada.

El compuesto nitro de fórmula XIa puede ser preparado por medio de acoplamiento entre el cloruro de o-nitrobenzol apropiado y un compuesto de fórmula IXa, por ejemplo, en presencia de K_{2}CO_{3} a -25ºC, en atmósfera de N_{2}. El cloruro de o-nitrobenzoilo es sintetizado a partir del ácido o-nitrobenzoico de fórmula XII. Muchos de ellos se encuentran disponibles en el comercio y se ha informado acerca de la síntesis de algunos ejemplos por parte de Althuis (Althuis, T.H. and Hess, H-J, 1977, Synthesis and Identification of the Major Metabolites of Prazosin Formed in Dog and Rat, Journal of Medicinal Chemistry, 20, 1: 146-266). Los compuestos de fórmula IXa pueden ser preparadas rápidamente, por ejemplo por olefinación de la cetona derivada de L-trans-hidroxiprolina. El intermedio cetona puede ser también explotado por medio de la conversión en el triflato enólico, para ser utilizado en reacciones de acoplamiento mediadas por paladio, tales como las reacciones de Heck, Stille y Suzuki.

Síntesis de dímeros (Figura 2)

Los dímeros de PBD pueden ser sintetizados utilizando la estrategia desarrollada para la síntesis de los monómeros PBD protegidos (Figura 2a). La Figura 2 muestra también una ruta de síntesis donde la unión dimérica es de fórmula -O-(CH_{2})_{n}-O-. El paso de la formación del dímero se lleva normalmente a cabo para obtener un bis(ácido nitro) XII' (Figura 2b).

El bis(ácido nitro) XII' puede ser obtenido por medio de nitración (por ejemplo, utilizando ácido nítrico al 70%) del bis (ácido carboxílico). Este puede ser sintetizado por medio de alquilación de dos equivalentes del ácido benzoico adecuado con el correspondiente diyodoalcano, en condiciones básicas (Ruta 2a). Muchos ácidos benzoicos se encentran disponibles comercialmente y otros pueden ser sintetizados a través de procedimientos convencionales.

Una síntesis alternativa del bis(ácido nitro) conlleva la oxidación del bis(nitro aldehído), por ejemplo, con permanganato potásico. Este puede ser obtenido, a su vez, por medio de nitración directa del bis (aldehído), por ejemplo con HNO_{3} al 70%. Finalmente, el bis(aldehído) puede ser obtenido por medio de la eterificación de Mitsunobu de dos equivalentes del aldehído benzoico con el alcanodiol adecuado (Ruta 2b).

Ciclación alternativa (Figura 3)

En las Figuras 1 y 2, el paso último o penúltimo es una ciclación oxidativa. Una alternativa, utilizando desenmascaramiento por acoplamiento con tioacetal, es mostrada en la Figura 3 (la cual muestra su aplicación a un dímero, con una unión dimérica de fórmula -O-(CH_{2})_{n}-O-). El desenmascaramiento mediado por mercurio provoca la ciclación del compuesto deseado (Ia').

El compuesto tioacetal puede ser preparado tal como se muestra en la Figura 3: el anillo C protegido con tioacetal (preparado de acuerdo con un procedimiento de la literatura; Langley, D.R. & Thurston, D.E., J. Organic Chemestry, 52, 91-97 (1987) es acoplado con el núcleo bis (ácido nitro carboxílico)utilizando un procedimiento de la literatura. El compuesto nitro resultante no puede ser reducido por hidrogenación, debido a la presencia del grupo tioacetal, por lo que se utiliza el procedimiento del cloruro de estaño (II) para obtener la bis(amina). Esta es posteriormente protegida en el nitrógeno, por ejemplo, por medio de reacción con un cloroformato o con un cloruro de ácido, tal como
p-nitrobencilcloroformato.

Una alternativa al acoplamiento con tioacetal consiste en la utilización de acoplamiento con acetal. El procedimiento es el mismo que el ilustrado en la Figura 3, pero con el grupo tioacetal reemplazado por un grupo acetal (por ejemplo, -CH(Ome)_{2}). El desenmascaramiento mediado por ácido o por paladio constituye el procedimiento preferido para provocar la ciclación en el compuesto deseado de fórmula Ia ó Ia'.

GDEPT Sistemas de vector

En general, el vector que se utiliza en terapia GDEPT puede ser cualquier vector de DNA o RNA adecuado.

Entre los vectores no víricos adecuados se incluyen liposomas y polímeros catiónicos. Entre los vectores víricos adecuados se incluyen aquellos que están basados en un retrovirus. Los citados vectores se encuentran ampliamente disponibles en la técnica. Huber et al., (ibid) informan al respecto de la utilización de retrovirus anfotrópicos para la transformación de células de hepatoma, mama, colon o piel. Culver et al., (Science (1992) 256, 1550-1552) describen también la utilización de vectores retrovíricos en GDEPT. Pueden ser también utilizados los citados vectores o los vectores derivados de los mismos. Para preparar vectores adecuados para ser utilizados en la presente invención pueden también utilizarse otros retrovirus. Entre los citados retrovirus se incluyen el virus de sarcoma de Rous (RSV).

Englehart et al., (Nature Genetics (1993) 4 27-34) describen la utilización de vectores basados en adenovirus en el suministro del producto de conductancia de transmembrana en fibrosis cística (CFTR) a las células y los citados vectores basados en adenovirus pueden ser también utilizados. Los vectores que utilizan favorecedores de adenovirus y otras secuencias de control pueden ser también utilizados en el suministro de un sistema según la invención a las células en el pulmón, y por tanto resultar de utilidad en el tratamiento de tumores de pulmón.

Se conocen también otros sistemas de vectores que incluyen vectores basados en el virus de leucemia murina Molony (Ram, Z et al., Cancer Research (1993) 53: 83-88; Dalton & Treisman, Cell (1992) 68: 597-612). Estos vectores contienen el reforzador de virus de leucemia murina (MLV) clonado aguas arriba a un favorecedor mínimo \beta-globina. La región no traducida \beta-globina 5' hasta el codon de iniciación ATG es suministrada para la traducción eficaz directa del enzima.

Entre los favorecedores adecuados que pueden ser utilizados en los vectores descritos anteriormente se incluyen MLV, CMV, RSV y favorecedores de adenovirus. Los favorecedores de adenovirus preferidos son los favorecedores de genes tempranos. Pueden resultar también adecuados los favorecedores de mamíferos fuertes. En ejemplo del citado tipo de favorecedores lo constituye el favorecedor EF-1\alpha, el cual puede ser obtenido en relación con Mizushima and Nagata ((1990)), Nucl. Acids Res. 18: 5322). Pueden ser también utilizadas variaciones de los citados favorecedores que conservan actividades transcripcionales sustancialmente similares.

Otros favorecedores adecuados incluyen favorecedores específicos de tejido y promotores activados por pequeñas moléculas, hipoxia o rayos X.

Si el enzima de elección para la activación de los compuestos de fórmula I es la nitrorreducata, entonces, preferiblemente, el enzima es una nitrorreductasa de no mamífero, tal como una nitrorreductasa bacteriana. Resulta particularmente preferida una E. Coli nitrorreductasa, tal como se describe en WO93/0828. El enzima puede ser modificado por medio de técnicas de DNA estándar, por ejemplo, por medio de clonación del enzima, determinación de su secuencia genética y alteración de su secuencia genética por medio de procedimientos tales como la truncación, sustitución, abandono o inserción de secuencias, por ejemplo, por medio de mutagénesis dirigida a un punto. Puede hacerse referencia a "Molecular Cloning" de Sambrook et al., (1989, Cold Spring Harbor) para la discusión de técnicas de DNA recombinantes estándar. La modificación efectuada puede ser cualquiera que deje todavía al enzima con la capacidad de reducir el grupo nitro en compuestos adecuados de fórmula I, pero que modifique otras propiedades del enzima, por ejemplo, su velocidad de reacción o su selectividad.

Además, como resultado de las manipulaciones requeridas para la producción de un vector en el cual un ácido nucleico y la secuencia que codifica para el enzima se encuentran unidos con las diversas secuencias de otros vectores, pueden tener lugar pequeñas truncaciones en la secuencia del N o del C terminales.

Para información acerca de la utilización de penicilina V/G amidasa y \beta-lactamasa en GDEPT, ver Jungheim, L.N. y Sheperd, T.A.. Design of Antitumor Prodrugs: Substrates for Antibody Targeted Encimes, Am. Chem. Soc. Chem. Rev., 1994, Vol. 94, Nº. 6, 1553-1566.

ADEPT

Para aplicaciones en sistemas ADEPT, un anticuerpo dirigido frente a un marcador tumoral específico se une al enzima relevante, el cual puede ser modificado tal como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. A los efectos de la presente invención, el término "anticuerpo", salvo que se indique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos los cuales conservan su actividad de unión para un antígeno tumoral objetivo. Entre los citados fragmentos se incluyen los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, al igual que anticuerpos de cadena simple. Además, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo, tales como los descritos en EP-A-239400.

Los anticuerpos pueden ser obtenidos a través de técnicas de hibridoma convencional o, en el caso de anticuerpos modificados o de fragmentos, por medio de tecnología de DNA recombinante, por ejemplo, a través de la expresión, en un vector huésped adecuado, de una construcción de DNA que codifica para el anticuerpo modificado o el fragmento unido operativamente a un favorecedor. Entre las células huésped adecuadas se incluyen células de bacterias (por ejemplo E. Coli), levaduras, insectos y mamíferos. Cuando el anticuerpo se obtiene a través de las citadas técnicas recombinantes, el enzima puede ser obtenido mediante la unión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para el enzima (opcionalmente modificada, tal como se describe anteriormente) con la terminación 3' ó 5' de la secuencia de la construcción que codifica para el anticuerpo o uno de sus fragmentos.

PDT

El procedimiento de activación en PDT puede ser altamente específico en un punto. La dirección del rayo láser puede ser controlada con gran precisión, y el diámetro del rayo puede ser reducido hasta una anchura muy por debajo de la de una simple célula. Por consiguiente, el mismo puede actuar sobre un área muy limitada, minimizando el daño al tejido colindante.

La luz ultravioleta resulta suficiente para romper una gama de enlaces químicos, dado que el espectro de energía para la rotura del enlace para la mayoría de las moléculas orgánicas oscila entre 250 y 420 KJ/mol y, por ejemplo, 350 nm son equivalentes a 340 KJ/mol. Por ejemplo, se ha demostrado la existencia de una amplia gama de reacciones de desprotección mediadas por luz, incluyendo la desprotección fotoquímica de aminoácidos, péptidos y polisacáridos a partir de sus formas CBZ y o-nitrobencilo y 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilcarbamato, a longitudes de onda superiores a 350 nm (Pillai, R.V. N., Photoremovable protecting groups in organic chemistry, Síntesis (1980), 1-26), (Bayley, H., Gasparro, F. And Edelson, R., Photoactivable drugs, TIPS (1987) 8, 138-143, (Star, W.M., Light delivery and light dosimetry for photodynamic therapy. Laser in Medical Science (1990) 5, 107-113. Por otro lado, las especies altamente reactivas, y por tanto citotóxicas, pueden obtenerse a partir de activaciones de energía relativamente baja. Por ejemplo, un estado excitado reactivo de oxígeno molecular, el estado singulete, difiere tan solo en 90 KJ/mol de su estado fundamental triplete. No obstante, esto permite la formación de concentraciones suficientes de las especies tóxicas a través de aquellos sensibilizadores que absorben a longitudes de onda superiores a los 600 nm, (Carruth, J.A.S., Clinical Applications for photodynamic therapy, J. Photochem Photobiol (1991) 9, 396-397).

La principal limitación de este planteamiento surge como consecuencia de las características físicas de la propia luz y de su interacción con el tejido humano. Se ha averiguado que la capacidad de penetración de la luz en el tejido humano depende de la longitud de onda. La capacidad de penetración se incrementa con el incremento de la longitud de onda pero surgen limitaciones como consecuencia de la dispersión y reflexión de la luz. En tejidos biológicos, el coeficiente de dispersión, por ejemplo de la luz roja, es muy superior al coeficiente de absorción, (Carruth, J.A.S., Clinical applications for photodynamic therapy, J. Photochem Photobiol (1991) 9, 396-397), (Kennedy, J.C., and Pottier, R.H., Endogenous photoporphyrin IX, a clinical useful photosensitiser for photodynamic therapy, J. Photochem Photobiol (1992) 14, 275-292). Como resultado, los fotones que penetran en el tejido son dispersados varias veces antes de que ser absorbidos o de que se propaguen. Si bien esto podría dar que pensar en un incremento de la energía suministrada a determinadas áreas, la reflexión interna se traduce en un descenso exponencial del flujo de energía, con distancias crecientes desde la interfase tejido-aire. Estas limitaciones han sido superadas parcialmente en el tratamiento de tumores relativamente voluminosos o cuando resulta necesaria una penetración más profunda, a través de la utilización de fibras ópticas intersticiales múltiples.

Se han identificado diversos tipos de tumores como objetivos potenciales de PDT. Entre los mismos se incluyen los tumores de cabeza y cuello, los carcinomas de los bronquios, los tumores cerebrales malignos, los tumores superficiales de la vejiga y la enfermedad vascular, los cuales han proporcionado prometedoras respuestas en la clínica, (Regula, J. Mac Roberts, A,J., Gorchein, A., Buonaccorsi, Thorpe, S.M., Spencer, G.M., Hartfield, A.R.W., y Bown,S.G., Photosensitisation and photodynamic therapy of oesophageal, duodenal and colorectal tumours using 5-aminoleavulic acid induced protoporphyrin IX-a pilot study, Gut (1995) 36, 67-75).

La técnica de PDT, tal como se ha discutido anteriormente, puede ser utilizada en combinación con compuestos adecuados de fórmula I, cuando el grupo protector del nitrógeno eliminable terapéuticamente es fotolábil. Las longitudes de onda UV utilizadas preferiblemente van de 250 a 400 ó 550 nm.

Aplicaciones de la invención

Los compuestos de la invención pueden ser utilizados in vivo o in vitro para una gama de aplicaciones. Por ejemplo, se ha desarrollado un determinado número de sistemas de vectores para la expresión de la nitrorreductasa en una célula. El desarrollo adicional de los citados sistemas (por ejemplo, el desarrollo de favorecedores adecuados para tipos específicos de células) requiere fármacos candidatos adecuados capaces de matar células cuando son activados por nitrorreductasa. Los compuestos profármaco de fórmula I, sensibles a la nitrorreductasa, pueden ser utilizados en los citados sistemas modelo.

Los sistemas modelo pueden ser sistemas modelo in vitro o sistemas modelo de xenotrasplante in vivo que comprenden, por ejemplo, células tumorales humanas implantadas en ratones atímicos. Los compuestos de fórmula I sensibles a diferentes enzimas pueden ser utilizados en sistemas similares, los cuales han sido modificados de manera adecuada.

Los compuestos de fórmula I que no son activables por medio de un enzima, pueden ser comprobados in vitro con otras formas de activación frente a grupos de tipos celulares tumorales diferentes, para determinar la eficacia frente a las citadas células tumorales. La eficacia de los compuestos de la invención frente a una gama de tipos celulares tumorales puede ser utilizada como punto de referencia para el desarrollo de nuevos compuestos antitumorales. Los compuestos de fórmula I pueden ser también objeto de comprobación en combinación con compuestos anticancerígenos adicionales, con vistas a determinar potenciales sistemas de combinación de fármacos, por ejemplo, combinaciones que sean sinérgicas.

Los compuestos de fórmula I pueden ser también utilizados en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal. El citado tratamiento incluye un procedimiento para tratar el crecimiento de células neoplásicas en un paciente con una enfermedad neoplásica, el cual comprende la administración a un paciente que precise de tratamiento de los compuestos de fórmula I como parte de un sistema o tratamiento ADEPT, GDEPT o PDT, únicamente con compuestos de fórmula I, en el que las enfermedades neoplásicas incluyen leucemia y tumores sólidos, tales como de ovario, colon, pulmón, renal, mama, intestino, CNS y melanomas. El tratamiento puede también consistir en el tratamiento de otras enfermedades específicas de un punto, en las que el incremento de la toxicidad local puede resultar beneficioso para el paciente.

Se entenderá que cuando se trata de tratamiento de tumores, el tratamiento incluye cualquier medida tomada por el médico para aliviar el efecto del tumor sobre el paciente. Por consiguiente, si bien la remisión total del tumor constituye un objetivo deseable, el tratamiento efectivo incluirá también medidas capaces de alcanzar la remisión parcial del mismo, al igual que una disminución en su velocidad de crecimiento, incluyendo su metástasis. Las citadas medidas pueden resultar eficaces a la hora de prolongar y/o de reforzar la calidad de vida y el alivio de los síntomas de la enfermedad.

Terapias

Los procedimientos ADEPT y GDEPT serán ahora descritos con relación a la nitrorreductasa, a pesar de que podrían utilizarse otros enzimas, tal como se ha descrito anteriormente, con las modificaciones adecuadas para los procedimientos descritos.

La base de PDT ha sido descrita anteriormente, pero la información acerca de la administración de los productos mencionados más adelante, se aplica también a este tipo de terapia. Esta información es también relevante para terapias en la cuales el profármaco es activado por medio de condiciones que se desarrollan de una manera natural dentro del organismo (por ejemplo, hipoxia, niveles elevados de GST -ver, la discusión de NPEPT anterior).

Terapia ADEPT

El conjugado anticuerpo/enzima para ADEPT puede ser administrado de manera simultánea pero a menudo se prefiere, en la práctica clínica, administrar el conjugado enzima/anticuerpo antes que el profármaco, por ejemplo, hasta 72 horas o incluso 1 semana antes, con vistas a proporcionarle al conjugado enzima/anticuerpo una oportunidad de localización en la región objetivo del tumor. Actuando de esta manera, cuando se administra el profármaco, la conversión de profármaco en agente citotóxico tiende a quedar confinada a las regiones en las que se localiza el enzima/agente conjugado, a saber, la región del tumor objetivo. De este modo, se minimiza la liberación prematura del compuesto producido por la acción de la nitrorreductasa sobre los profármacos de la presente invención.

En ADEPT, el grado de localización del conjugado enzima/agente (en términos de relación de conjugado activo localizado a circulante con libertad) puede ser reforzado de manera adicional utilizando los sistemas de paso y/o de inactivación descritos en el documento WO 89/10140. Esto conlleva, habitualmente después de la administración de la del conjugado y antes de la administración del profármaco, la administración de un componente ("un segundo componente"), el cual es capaz de unirse a parte del conjugado con vistas a inactivar el enzima en la sangre y/o acelerar el paso del conjugado desde la sangre. El citado componente puede incluir un anticuerpo para el componente enzima del sistema, el cual es capaz de inactivar al enzima.

El segundo componente puede estar unido a una macromolécula, tal como un dextrano, un liposoma, albúmina, macroglobulina o un grupo sanguíneo o eritrocito, con la finalidad de que se restrinja su salida del compartimento vascular. Además, o como alternativa, el segundo componente puede incluir un número suficiente de restos de galactosa unidos covalentemente o de restos de otros azúcares, tales como lactosa o manosa, con vistas a que pueda unirse al conjugado en el plasma pero pueda ser eliminado conjuntamente con el conjugado desde el plasma por parte de los receptores de la galactosa y de otros azúcares en el higado. El segundo componente debería ser diseñado para ser utilizado y administrado de tal forma que el mismo no pueda prácticamente penetrar en el espacio extravascular del tumor, donde el mismo podría inactivar al conjugado localizado, con anterioridad y durante la administración del profármaco.

En los sistemas ADEPT, las dosis de profármaco y de conjugado dependerán en última instancia del criterio del médico, quién tomará en consideración factores tales como el peso, la edad y el estado de la persona. En Bagshawe et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals (1991), 4 915-922, se proporcionan dosis adecuadas de profármaco y de conjugado. Una dosis adecuada de conjugado puede oscilar entre 500 y 200.000 unidades de enzima/m^{2} (por ejemplo, 20.000 unidades de enzima/m^{2}) y una dosis adecuada de profármaco puede oscilar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 mg/kg por paciente y día.

Con vistas a asegurar la presencia de la máxima concentración de conjugado en el punto deseado de tratamiento, resulta habitualmente deseable espaciar en el tiempo la administración de los dos componentes durante al menos 4 horas. El régimen exacto vendrá influenciado por diversos factores, entre los cuales se incluyen la naturaleza del tumor que debe ser tratado y la naturaleza del profármaco pero, habitualmente, existirá una concentración adecuada de conjugado en el punto deseado de tratamiento dentro de las 48 horas.

Cuando se utiliza el sistema ADEPT conjuntamente con nitrorreducatasa, el citado sistema comprende preferiblemente un cofactor adecuado para el enzima. Entre los cofactores adecuados pueden incluirse un ribósido o ribótido de ácido nicotínico o nicotinamida.

El conjugado anticuerpo/enzima puede ser administrado a través de cualquier ruta que resulte adecuada, habitualmente utilizada en terapia ADEPT. Se incluye la administración perenteral del anticuerpo, de una manera y bajo una formulación similar a la descrita más adelante.

Terapia GDEPT

Para la utilización de vectores en terapia, los vectores serán habitualmente ubicados en el interior de partículas víricas y las partículas se suministrarán en el punto de ubicación del tumor, tal como se describe en, por ejemplo, Ram et al., (supra). Las partículas víricas pueden ser modificadas con vistas a incluir un anticuerpo, un fragmento del mismo (incluyendo una cadena sencilla) o un ligando dirigido al tumor para reforzar el tratamiento del mismo.

De manera alternativa, los vectores pueden ser ubicados en el interior de liposomas. Los liposomas pueden ser dirigidos hacia un tumor en particular. Esto puede ser logrado por medio de la unión de un anticuerpo dirigido a un tumor a un liposoma. Las partículas víricas pueden ser también incorporadas en el interior de liposomas. Las partículas pueden ser suministradas al tumor por medio de cualquier medio que resulte adecuado, y que se encuentre a disposición del médico. Preferiblemente, las partículas víricas serán capaces de infectar selectivamente a las células tumorales. Por "infectar selectivamente" se quiere dar a entender que las partículas víricas infectarán en primer lugar a las células tumorales y la proporción de células no tumorales infectadas es tal que el daño a células no tumorales a través de la administración de un profármaco será aceptablemente bajo, dada la naturaleza de la enfermedad que esté siendo tratada. En última instancia, este aspecto deberá ser determinado por el médico.

Una ruta adecuada para la administración es a través de inyección de las partículas en una solución estéril. Los virus, por ejemplo, aislados a partir de líneas celulares envolventes, pueden ser también administrados a través de perfusión regional o de inyección intratumoral directa, o a través de inyección directa en el interior de una cavidad corporal (administración intracaviterial), por ejemplo, por medio de inyección intraperitoneal.

El régimen de dosificación exacto para GDEPT precisará ser, naturalmente, determinado por parte de los médico de manera individual para los pacientes en particular y esto, a su vez, será controlado por la naturaleza exacta del profármaco y del agente citotóxico que deba ser liberado a partir del profármaco. No obstante, puede proporcionarse algún tipo de orientación general a este respecto. La quimioterapia de estas características conllevará habitualmente la administración parenteral de virus modificados y la administración a través de la vía intravenosa es frecuentemente considerada como la más práctica.

En sistemas GDEPT, la cantidad suministrada de virus o de otros vectores será la suficiente para proporcionar una concentración celular similar de enzima como en el caso de ADEPT mencionado anteriormente. Habitualmente, el vector será administrado al paciente y se monitorizará posteriormente la absorción del mismo a través de células transfectadas o infectadas (en el caso de vectores víricos), por ejemplo, a través de la obtención y del análisis de una muestra obtenida por biopsia del tejido objetivo. Esto puede ser determinado a través de ensayos clínicos, los cuales conllevan la administración de una gama de dosis de ensayo a un paciente y la medición del grado de infección o de transfección de una célula o tumor objetivo. La cantidad necesaria de profármaco resultará similar o superior a la equivalente para los sistemas ADEPT.

Durante la utilización del sistema ADEPT, el profármaco será habitualmente administrado después de la administración del vector que codifica para un enzima. Las dosis adecuadas de profármaco oscilan entre aproximadamente 0,1 y 200 mg/kg, preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 mg/kg de paciente, por día.

Administración de profármacos

Si bien es posible efectuar la administración de los compuestos de fórmula I en solitario, resulta preferible la presentación de los mismos como formulaciones farmacéuticas para ser utilizadas con cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Las formulaciones comprenden los compuestos, conjuntamente con uno o más vehículos aceptables de los mismos y, opcionalmente, otros ingredientes o diluyentes. El vehículo o vehículos tienen que ser "aceptables", en el sentido de resultar compatibles con los restantes componentes de la formulación y no dañinos para los receptores de los mismos, por ejemplo, los liposomas. Entre los liposomas adecuados se incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden el lípido cargado positivamente (N[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA), aquellos que comprenden dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y los que comprenden 3\beta[N-(n'N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol).

Entre las formulaciones adecuadas para la administración parenteral o intramuscular se incluyen las soluciones para inyección estéril acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, tampones, bacterioestatos, antibióticos bacteriocíticos y solutos que convierten a la solución en isotónica con la sangre del receptor pretendido; suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes para suspensión y agentes espesantes, y liposomas u otros sistemas de macropartículas diseñados para dirigir el compuesto a los componentes de la sangre o a uno o más órganos. Las formulaciones pueden ser presentadas como dosis unitarias o con envases multi-dosis, por ejemplo ampollas y viales sellados y pueden ser almacenados en condiciones de desecado por congelación (liofilización) que requieren tan solo la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyectable, inmediatamente antes de la utilización. Las soluciones para inyección y las suspensiones pueden ser preparadas de manera extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.

Debe darse por entendido que, además de los ingredientes mencionados anteriormente a título particular, las formulaciones pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica, una vez tenido en cuenta el tipo de formulación en cuestión. De entre las posibles formulaciones, resultan preferidas las soluciones estériles exentas de pirógenos acuosas y no acuosas.

Las dosis pueden ser administradas de forma secuencia, por ejemplo, a intervalos horarios, diarios, semanales o mensuales, o como respuesta a una necesidad específica de un paciente. Las rutas de administración preferidas son el suministro oral y la inyección, habitualmente la inyección intramuscular o la parenteral o la inyección intratumoral. Para procedimientos PDT, puede resultar preferida la administración dérmica o la tópica, por ejemplo, la inyección subcutánea o las cremas o ungüentos y los citados procedimientos de administración resultan bien conocidos.

El régimen exacto de dosificación deberá ser, naturalmente, determinado por médicos individuales para pacientes individuales y este, a su vez, controlado a través de la naturaleza exacta del compuesto de fórmula I, pero puede proporcionarse algún tipo de orientación general a este respecto. Las bandas de dosificación habituales serán generalmente las descritas anteriormente, las cuales pueden ser administradas a través de dosis únicas o múltiples. Según el estado del paciente y de otros factores, pueden utilizarse otras dosis, a discreción del médico.

Ejemplos

Las realizaciones de la presente invención serán ahora descritas en detalle a través de la vía de ejemplos.

Procedimientos experimentales generales

Los puntos de fusión (pf) fueron determinados a través de un aparato de punto de fusión digital Gallenkamp P1384 y no han sudo corregidos. Los espectros de infrarrojo (IR) fueron registrados utilizando un espectrofotómetro Perkin-Elmer 297. Los espectros de ^{1}H- y ^{13}C- NMR fueron registrados en un espectrómetro Jeol GSX 270 MHz FT-NMR operando a 20ºC +/- 1ºC. Los desplazamientos químicos se notifican en partes por millón (\delta) descendiendo a partir de tetrametilsilano (TMS). Las multiplicidades de spin se describen como: s (singulete), bs (singulete amplio), d (doblete), dd (doblete de dobletes), t (triplete), q (cuartete), p (pentuplete) o m (multiplete). Los espectros de masa (MS) se registraron utilizando un espectrómetro de masas Jeol JMS-DX 303 GC (Modo EI: 70 eV, fuente 117-147ºC). Las masas moleculares ajustadas se determinaron por medio de correspondencia de picos, utilizando perfluoroqueroseno (PFK) como marcador de masa interna, y los espectros de masa FAB se obtuvieron a partir de una matriz de glicerol/tioglicerol/ácido trifluoroacético (1:1:0,1), con una fuente de temperatura de 180ºC. Las rotaciones ópticas en la línea Na-D se obtuvieron a temperatura ambiente, utilizando un polarímetro Perkin-Elmer 141. La cromatografía de desarrollo rápido se llevó a cabo utilizando cromatografía de desarrollo rápido Aldrich "Silica Gel-60" (E. Merck, malla 230-400). La cromatografía de capa fina (TLC) se llevó a cabo utilizando gel de sílice GF_{254} (con indicador fluorescente) sobre placas de vidrio. La totalidad de disolventes y de reactivos, salvo que se indique lo contrario, fueron suministrados por Aldrich Chemical Company Ltd y fueron utilizados tal como se recibieron sin purificación adicional. Se prepararon disolventes anhidros por destilación en atmósfera de nitrógeno seco, en presencia de un agente desecante adecuado y fueron almacenados sobre tamices moleculares de 4\ring{A} o varilla de sodio. Por éter de petróleo se entiende la fracción que hierve a entre 60-80ºC.

Ejemplo 1 Síntesis de un profármaco bencil DC-81 activado por nitrorreductasa, para ADEPT (7)

21

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Síntesis del ácido 4-benciloxi-3-metoxibenzoico (2)

Una solución de cloruro de bencilo (24,6 ml, 209 mmol; 1,1 eqiv.) en THF (100 ml) fue añadida gota a gota a 0ºC por espacio de 15 minutos a una solución agitada mecánicamente de ácido 4-hidroxi-3metoxibenzoico (ácido vanílico, 1) (30 g, 179 mmol) en THF (90 ml) y NaOH 2,0 M acuoso (225 ml). Se dejó calentar la mezcla hasta temperatura ambiente y se calentó posteriormente a reflujo por espacio de 48 horas. Una vez enfriada, la mezcla se lavó con hexano (2 x 100 ml) y se extrajo el THF al vacío. La fase acuosa restante fue acidificada hasta pH 1 con HCl concentrado. El precipitado resultante fue recogido por medio de filtración, lavado con agua y secado para proporcionar el ácido 4-benciloxi-3-metoxibenzoico (2), en forma de sólido amorfo de color pálido.

El rendimiento (después de recristalización con EtOAc) fue de 31 g (67%); pf 171-172ºC; IR (cm^{-1}) 3700-3200, 2820-3000, 2210, 2140, 1670, 1580, 1510, 1450, 1430, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1220, 1180, 1130-1110, 1030, 1010; ^{1}HNMR (CDCl_{3}+DMSO-d_{6}) \delta 7,60 (d, J=2Hz, 1H); 7,30-7,44 (m, 5H)7,55 (d, J=2 Hz, 1H); 7,30-7,44 (m, 5H); 6,90 (d, J=8,4 Hz, 1H); 5,19 (s, 2H); 3,91 (s, 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}+DMSO-d_{6}) \delta 168,3; 151,7; 148,8; 136,3; 128,5; 128,0; 127,2; 123,7; 123,5; 112,5; 70,6; 55,9; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 258 (M^{+},20), 91 (100), 79(3), 65(10), 51(3), EI-HRMS m/z 258,0949 (calculado para C_{15}H_{14}O_{4} m/z 258,0892).

Síntesis del ácido (3) 4-benciloxi-5-metoxi-2-nitrobenzoico

Procedimiento A

una mezcla recién preparada de SnCl_{4} (5g, 19,5 mmol) y de ácido nítrico fumante (1,67 g, 26,5 mmol) fue añadida gota a gota por espacio de 5 minutos a una solución agitada mecánicamente del compuesto 2 (4,35 g; 17 mmol) en DCM a -25ºC (hielo seco/tetracloruro de carbono). La mezcla fue mantenida a la misma temperatura por espacio de otros 15 minutos, apagada con agua (15 ml) y dejada calentar hasta la temperatura ambiente. Una vez separada la capa orgánica, se extrajo la fase acuosa con EtOAc (2 x 75 ml). La fase orgánica combinada fue secada (MgSO_{4}) y evaporada al vacío para proporcionar una goma de color marrón claro, la cual fue recristalizada para proporcionar el producto 3, en forma de agujas de color amarillo pálido. Rendimiento: 4,16 g (82%).

Procedimiento B

Se añadió ácido 4-benciloxi-3-metoxibenzoico (8,5 g; 32,5 mmol), en pequeñas proporciones, a lo largo de 30 min. A una solución agitada de ácido nítrico al 70% (100 ml). Una vez completada la adición, se dejo calentar la mezcla hasta 15ºC y se mantuvo a esta temperatura durante un nuevo período de 30 minutos. La mezcla de reacción fue entonces derramada sobre hielo y el precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con agua enfriada con hielo y se secó para proporcionar el producto nitrado 3, en forma de polvo de color amarillo.

El rendimiento (después de recristalización con EtOAc/hexano) era de 7,8 g (78%); pf 182-185ºC; IR (cm^{-1}) 3400-3200, 2820-2930, 1670, 1600, 1580, 1550, 1510, 1450, 1410, 1400, 1370, 1350, 1330, 1265, 1210, 1180, 1160, 1055, 1005; ^{1}HNMR (CDCl_{3}+DMSO-d_{6}) \delta 7,36-7,45 (m, 6H); 7,16 (s, 1H); 5,19 (s, 2H); 3,95 (s, 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}+DMSO-d_{6}) \delta 167,3; 152,7; 149,0; 135,2; 128,4; 127,6; 127,3; 111,1; 71,2; 56,5; MS (RI) (m/z, intensidad relativa) 303 (M^{+}, 64), 286 (36), 273(5), 259(5), 181 (7), 123(8), 105(13), 91(100), 77(8), 65(63), 51(23); EI-HRMS m/z 303,0824 (calculado para C_{15}H_{13}NO_{6} m/z 303,0743).

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Síntesis de (2S)-N-(4-benciloxi-5-metoxi-2-nitrobenzoil)pirrolidinometanol (4)

Una cantidad catalítica de DMF (3 gotas) fue añadida a una solución de ácido 4-benciloxi-5-metoxi-2-nitrobenzoico (3) (3,5 g; 11,55 mmol) y cloruro de oxalilo (1,75 g; 13,56 mmol; 1,2 eq.) en acetonitrilo anhidro (30 ml). La solución fue dejada en agitación en atmósfera de nitrógeno durante eltranscurso de toda una noche. La solución de cloruro de ácido resultante fue entonces añadida gota a gota por espacio de 30 minutos a una solución agitada de pirrolidinometanol (1,168 g; 11,56 mmol, 1 eq.) y K_{2}CO_{3} (3,675 g; 26,63 mmol; 2,3 eq.) en acetonitrilo (80ml) a -25ºC, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción fue sometida a agitación a la misma temperatura por espacio de 1 hora y después de dejó regresar a la temperatura ambiente y se apagó con agua (200 ml). La solución fue extraída después con cloroformo (4 x 100 ml) y la fase orgánica combinada se lavó con HCl 1M (2 x 50 ml), agua (2 x 75 ml), salmuera (2 x 50 ml) y agua (100 ml), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó el disolvente al vacío para obtener un aceite de color amarillo claro. El producto fue purificado de nuevo por medio de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 5%) para proporcionar el producto (4), en forma de aceite de color amarillo pálido, el cual cristalizó lentamente en reposo.

Rendimiento 3,92 g (88%); [\alpha]^{20}_{D}: -62,3º (c0,45; CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 3500-3250, 2860, 2910, 1600, 1580, 1520, 1455, 1430, 1370, 1330, 1275, 1220, 1210, 1185, 1150, 1110, 1060, 1025, 1000; ^{1}HNMR (CDCl_{3}) \delta 7,76 (s, 1H); 7,34-7,47 (m, 5H); 6,83 (s, 1H); 5,21 (s, 2H); 4,38-4,40 (bs, 1H); 3,98 (s, 3H); 3,80-3,95 (m, 2H); 3,15-3,20 (m, 2H);2,17-2.21 (m, 2H); 1,69-1,89 (m, 2H), ^{13}C-NMR(CDCl_{3}) \delta 155,0; 148,1; 136,9; 135,1; 128,8; 127,9; 127,6; 109,2; 109,1; 71,3; 66,1; 61,5; 56,8; 49,5; 28,4; 24,4; MS (EI)(m/z, intensidad relativa) 386 (M^{+},4), 355 (39), 286 (90), 121(4), 91(100); 65(4); EI-HRMS m/z 386,1531 (calculado para C_{20}H_{22}N_{2}O_{2} m/z 386,1478).

Síntesis de (2S)-N-2-amino-4-benciloxi-5-metoxibenzoil)pirrolidinometanol (5)

Procedimiento A

una solución del compuesto nitro (4) (1,4 g; 3,62 mmol) y SnCl_{2}.2H_{2}O (4,58 g; 20,08 g; 5,5 equ.) en metanol (70 ml) fue calentada a reflujo por espacio de 45 minutos. El disolvente fue extraído por evaporación al vacío y el aceite de color marrón resultante fue diluido con EtOAc (150 ml), tratado con NaHCO_{3} acuoso saturado (150 ml) y dejado en agitación en atmósfera de N_{2} durante toda una noche. La suspensión resultante fue filtrada a través de Celite, se separó entonces la capa orgánica y se lavó con salmuera (2 x 100 ml), se secó (MgSO_{4}) y el exceso de disolvente fue finalmente evaporado al vacío. El aceite de color marrón claro residual fue purificado de nuevo por medio de cromatografía de columna (MeOH/CHCl_{3} 5%), para proporcionar la amina (5), en forma de aceite de color amarillo claro. El rendimiento fue de 0,82 g (62%).

Procedimiento B

A una solución del compuesto nitro 4 (7,0 g; 18,13 mmol) en metanol anhidro (20 ml) se le añadió hidrazina hidrato (4,53 g; 90,67 ml, 5 equv.) gota a gota y una cantidad catalítica de Ni Raney (0,544 g) sobre gránulos anti-ebullición violenta, mientras se mantenía un reflujo moderado. La mezcla fue calentada a reflujo durante otro período adicional de 15 minutos, cuando la TLC (MeOH/CHCl_{3} 5%) indicó que la reacción se había completado. El catalizador de Ni fue entonces extraído por medio de filtración a través de Celite y se extrajo el disolvente por evaporación al vacío. El producto fue purificado de nuevo por medio de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3}, 5%), para proporcionar la amina 5, en forma de aceite inestable de color amarillo claro, el cual requería condiciones de almacenamiento a baja temperatura.

Rendimiento 5,2 g (81%); [\alpha]^{20}_{D}: -15,4º (c0,13; CHCl_{3});, ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,28-7,42 (m,5H); 6,76 (s, 1H); 6,26 (s, 1H); 5,09 (s, 2H); 4,37-4,42 (bs, 1H), 3,78 (s, 3H); 3,58-3,77 (m, 4H); 2,04-2,10 (m, 2H); 1,69-1,92 (m, 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 171,8; 151,0; 141,2; 136,5; 128,6; 127,6; 127,1; 112,9; 102,9; 70,6; 66,8; 60,9; 57,1; 51,0; 28,5; 24,9; IR (cm^{-1}) 3500-3100, 2950, 1680, 1620, 1510, 1450, 1425, 1400, 1330, 1260, 1230, 1170, 1165, 1130, 1100, 1080, 1055, 1030; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 356 (M^{+}, 100), 256 (68), 237 (14), 226(4), 164(6), 138(15), 100(8), 91(96), 84(22), 65(8); EI-HRMS m/z 356,1785 (calculada para C_{20}H_{24}N_{2}O_{4} m/z 356,1736).

Síntesis de (2S)-N-[2-(p-nitrobenciloxi)carboxamido-4-benciloxi-5 metoxibenzoilo]pirrolidinometanol (6)

Una solución de 4-nitrofenilcloroformato (0,6 g; 2,8 mmol, 1 eqv.) en DCM anhidro (15 ml) fue añadida gota a gota por espacio de 20 minutos a una solución de la amina (5) (1 g; 2,8 mmol) y piridina (0,44 g; 5,6 mmol, 2 eqv.) en DCM anhidro (20 ml) en atmósfera de N_{2}. Una vez completada la adición, se dejó a la solución en agitación durante un período de 1,5 horas. La mezcla de reacción fue entonces lavada con CuSO_{4} acuoso saturado (2 x 100 ml), agua (150 ml), se secó (MgSO_{4}) y se eliminó el exceso de disolvente al vacío. El aceite resultante fue sometido a cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CDCl_{3} 3%) para proporcionar la amina protegida (6), en forma de aceite amarillo pálido.

Rendimiento 1,16 g (77%); IR (cm^{-1}) 3500-3100; 2950, 1680, 1620, 1590, 1510, 1450, 1425, 1400, 1330, 1260, 1230, 1170, 1165, 1130, 1100, 1080, 1055, 1030, ^{1}H NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 9,04 (s, 1H); 8,20 (d, J=2Hz, 2H); 7,81 (s, 1H); 7,28-7,55 (m, 5H); 6,86 (s, 1H); 5,14-5,24 (bs, 4H); 4,39 (bs, 1H); 3,55-3,89 (m, 4H); 2,04-2,14 (m, 2H); 1,70-1,87 (m, 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 170,7; 153, 2; 150,3; 147,5; 143,6; 136,1; 128,7-127,7; 123,7; 111,5; 106,0; 70,6; 65,2; 60,9; 56,5; 51,7; 28,2; 25,1; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 535 (MH^{+}, 4); 435 (2), 356(3), 256(9), 192(2), 185(4), 166(3),136(13), 120(5), 102(26), 91(100), 84(5).

Síntesis de (11aS)-8-benciloxi-7-metoxi-1,2,3,10,11,11a-hexahidro-11-hidroxi-10-(p-nitrobenciloxi)carboxi-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5-ona (7)

Una solución del carbamato 6 (0,4 g, 0,75 mmol), NMO (0,131 g; 1,12 mmol, 1,5 equv.) sobre un tamiz molecular de 4\ring{A} (0,375 g) en una mezcla de disolvente de DCM:CH_{3}CN anhidro (9:3 ml) se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante un período de 15 min. Una parte de TPAP (13 mg) se añadió posteriormente y la solución se mantuvo en agitación durante un nuevo período de dos horas. La TLC (MeOH/CHCl_{3}, 2%) indicó que la reacción estaba incompleta y se añadió una cantidad adicional de NMO (65 mg; 0,845 mmol, 0,75 equv.) y TPAP (6,5 mg). Transcurridos 15 min., la TCL indicaba una completa pérdida de los materiales de partida. El tamiz molecular fue extraído mediante filtración a través de Celite y se extrajo el disolvente a presión reducida. El resto de color negro fue purificado mediante cromatografía de columna (MeOH/CHCl 1%, seguido de EtOAc:éter de petróleo, 95:5) para proporcionar el producto final ciclado 7.

Rendimiento 0,124 (31%); IR (cm^{-1}) 3600-3200, 2820-3000, 1710, 1600, 1510, 1450, 1430, 1400, 1370, 1350, 1305, 1270, 1220, 1120-1100, 1050, 1030, 1010; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 8,10 (d, J= 8,43 Hz; 2H); 7,27-7,53 (m, 6H); 7,20 (d, J=8,4 Hz, 2H); 6,70 (s, 1H); 5,62 (d, J=10,2 Hz, 1H), 5,07 (d, J=10,7 Hz, 4H); 3,94 (s, 3H); 3,52-3,72 (m, 3H); 2,04-2,10 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 166,83; 149,26; 142,85; 136,03; 128,79; 127,17; 126,38; 114,58; 112,53; 111,00; 105,92; 86,23; 71,12; 66,21; 59,90; 56,21; 47,32; 46,42; 28,68; 23,05; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 535, (M^{+} +2,2), 353 (6), 337(10), 286(5), 256(3), 241(2), 228(2), 192(3), 136(7), 91(100); EI-HRMS m/z 533,1813 (calculado para C_{28}H_{27}N_{3}O_{8} m/z 533,1798).

Ejemplo 2 Síntesis de un profármaco bencil DC-81 para el PGA ADEPT (9)

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Síntesis de (2S)-N-[2-fenilacetamido-4-benciloxi-5-metoxibenzoil]pirrolidinometanol (8)

Una cantidad catalítica de DMF (4 gotas) fue añadida a una solución de ácido fenilacético (0,42 g, 3,3 mmol; 1,2 equv.) y cloruro de oxalilo (0,51 g; 3,96 mmol; 1,4 eqv.) en acetonitrilo anhidro (10 ml) y la mezcla de reacción de mantuvo en agitación en atmósfera de nitrógeno durante el transcurso de toda una noche. El cloruro de ácido resultante fue añadido gota a gota por espacio de 20 minutos a una mezcla de la amina (5) (1 g; 2,8 mmol) y K_{2}CO_{3} (0,97 g; 7,02 mmol; 2,5 eqv.) en acetonitrilo anhidro (60 ml) a -25ºC, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción fue mantenida en agitación durante un período adicional de 2 horas a -25ºC y después se dejó calentar hasta temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml) y se extrajo con CHCl_{3} (4 x 100 ml). La fase orgánica combinada se lavó con HCl 1M (2 x 50 ml), agua (2 x 75 ml) y salmuera (100 ml) y se secó sobre MgSO_{4}. Se extrajo el disolvente al vacío y el aceite residual fue de nuevo purificado a través de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 5%) para proporcionar la fenilacetamida (8) en forma de aceite de color pálido.

Rendimiento 0,91 g (68%); IR(cm^{-1}) 3400, 2093, 1660, 1613, 1519, 1495, 1454, 1435, 1401, 1345, 1262, 1218, 1175, 1101, 1028, 1003, 969; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 9,27 (s, 1H); 7,90 (s, 1H); 7,26-7,48 (m, 10H); 6,77 (s, 1H); 5,11 (s, 2H); 4,19-4,29 (bs, 1H); 3,78 (s, 3H); 3,65 (s, 2H); 3,35-3,60 (m, 4H); 1,81-2,08 (m, 2H); 1,62-1,81 (m, 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 169,8; 149,9; 145,0; 136,2; 134,5; 129,3-127,3; 110,9; 107,8; 70,6; 66,2; 61,2; 56,5; 51,2; 44,8; 28,3; 24,9; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 474 (M^{+},7), 374(44), 284(7), 256(9), 228(3), 166(9), 105(14), 102(25), 91(100), 84(5); EI-HRMS m/z 474,2142 (calculado para C_{28}H_{30}N_{2}O_{5} m/z 474,2155).

Síntesis de (11aS)-8-benciloxi-7-metoxi-1,2,3,11,11a-pentahidro-11-hidroxi-10-fenilacetil-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzadiazepin-5-ona (9)

Una solución de la fenilacetamida (8) (0,5 g; 1,05 mmol) y NMO (0,184 g; 1,57 mmol; 1,5 equv.) sobre tamiz molecular (0,525 g) en un sistema de disolvente que comprende DCM anhidro y CH_{3}CN (9:3 ml) se dejó en agitación por espacio de 15 minutos a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. Se añadió entonces TPAP (19 mg, 5% molar) y la mezcla de dejó en agitación durante 1 hora, cuando la TLC (MeOH/CHCl_{3} 5%) señaló el consumo completo de los materiales de partida. La mezcla de reacción fue filtrada y evaporada al vacío. El producto fue purificado de nuevo por medio de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 2%) para proporcionar la PBD protegida 9, en forma de aceite opaco.

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Rendimiento 0,15 g (30%); [\alpha]^{20}_{D}: +1325º (c0,04, CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 3400, 2956, 2927, 2094, 1631, 1553, 1514, 1454, 1433, 1407, 1379, 1352, 1278, 1219, 1202, 1181, 1136, 1067, 1009, 752; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 7,19-7,38 (m, 11H); 6,47 (s, 1H); 5,76 (d, J=10,1Hz, 1H); 4,87 (d, J=12,1 Hz, 2H); 3,95 (s, 3H); 3,42-3,67 (m, 3H); 2,62 (s, 2H); 1,98-2,11 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 173,56; 166,54; 149,74; 135,81; 134,84; 130,94-126,56; 114,77; 111,45; 84,38; 70,60; 59,87; 56,28; 46,41; 28,54; 22,67; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 472 (M^{+},40), 374(25), 352(15), 326(6), 284(7), 136(5), 91(100), 70(17); EI-HRMS m/z 472,1944 (calculado para C_{28}H_{28}N_{2}O_{5}) m/z 472,1998).

Ejemplo 3 Síntesis de un profármaco bencil DC-81 fotolábil (11)

23

Síntesis de (2S)-N-[2-(2'-nitro-4',5'-dimetoxibenciloxi)carboxamido-4-benciloxi-5-metoxibenzoil]pirrolidinometanol (10)

Una solución de cloroformato de 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo (NVOC-CI) (0,77 g; 2,8 mmol; 1 eqv.) en DCM anhidro (10 ml) fue añadida gota a gota durante un período de 15 minutos a una solución de la amina (5) (1g; 2,8 mmol) y piridina (0,44 g; 5,6 mmol, 2 eqv.) en DCM anhidro a 0ºC, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción fue entonces sometida a agitación a 0ºC por espacio de 2,5 horas adicionales, cuando la TLC (MeOH/CHCl_{3} 3%) indicó la finalización de la reacción. La solución fue lavada después con CuSO_{4} acuoso saturado (2 x 75 ml), agua (2 x 100 ml), salmuera (150 ml) y secada sobre MgSO_{4}. El exceso de disolvente fue eliminado a presión reducida para dar el producto crudo. Una posterior purificación a través de cromatografía de columna (MeOH/CHCl_{3} 5%) proporcionó el producto 10 en forma de aceite de color amarillo.

Rendimiento 1,45 g(87%); [\alpha]^{20}_{D}: -175,5º (c0,225; CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 4330, 4253, 3428, 2924, 2854, 1711, 1626, 1513, 1463, 1377, 1266, 1216, 1173, 761, 722; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 8,90 (s, 1H); 7,82 (s, 1H); 7,73 (s, 1H); 7,26-7,47 (m, 6H); 6,85 (s, 1H); 5,58 (d, J=15 Hz; 2H); 5,16 (s, 2H); 4,29-4,39 (bs, 1H); 3,95-3,99 (s, 6H); 3,84 (s, 3H); 3,49-3,72 (m, 4H); 1,86-2,17 (m, 2H); 1,72-1,86(m, 2H); 1,72-1,86 (m, 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 153,7; 153,2; 150,4; 148,1; 144,5; 139,6; 136,1; 128,5; 128,1; 127,8; 127,6; 111,5; 110,8; 109,9; 108,1; 70,7; 66,4; 63,7; 62,7; 61,0; 56,7-56,4; 51,6, 28,3; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 596 (M^{+}+1, 16), 356(6), 256(19), 196(95), 181(21), 166(20), 149(14), 102(32), 91(100), 87(10), 73(44), 61(22), 57(31).

Síntesis de (11aS)-8-benciloxi-7-metoxi-1,2,3,10,11,11a-hexahidro-10-(2'-nitro-4',5'-dimetoxibenciloxi)carboxi-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5-ona (11)

Una solución de la amina 10 protegida con NVOC (0,4 g; 0,67 mmol) y NMO (0,236 g; 20,17 mmol; 3 eqv.) sobre un tamiz molecular (0,335 g) en una mezcla de DCM:CH_{3}CN (9:3 ml) se dejó en agitación durante un período de 15 minutos a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. A la mezcla de reacción se le añadió posteriormente TPAP (23 mg; 10% molar) y se mantuvo la agitación durante un período adicional de 2 horas, cuando se averiguó que la reacción se había completado por medio de TLC (MeOH/CHCl_{3} 2%). Se extrajo el tamiz molecular por medio de filtración a través de Celite y la solución remanente se evaporó al vacío. El aceite oscuro resultante fue sometido a cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 1%) para proporcionar la PBD protegida fotolábicamente (11).

Rendimiento 0,21 g (49%); [\alpha]^{20}_{D}: 212,5º (c0,08, CHCl_{3}); IR(cm^{-1}) 4329, 4258, 3405, 2925, 2361, 1713, 1620, 1602, 1579, 1514, 1463, 1377, 1342, 1277, 1219, 1103, 1065, 1012, 968, 870, 791, 722; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 7,66-7,71 (s, 1H); 7,11-7,39 (m, 6H); 6,80-6,92 (s, 1H); 6,32 (s, 1H); 5,14-5,67 (m, 5H); 3,85-4,15 (m, 9H); 3,49-3,67 (m, 3H); 2,01-2,15 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 170,41; 166,73; 194,97; 149,03; 135,92; 128,67-126,30; 124,52; 114,64; 112,24; 110,87; 109,82; 108,92; 107,97; 86,02; 71,51; 66,38; 65,03; 60,40; 56,48-56,19; 46,67; 28,70; 26,41; 23,65; 21,05; IR (cm^{-1}) 3600-3100, 3020, 2400, 2105, 1765, 1640, 1525, 1430, 1385, 1350, 1310, 1280, 1215, 1170, 1110, 1045; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 594 (MH_{+},9), 353(5), 337(4), 282(6), 256(4), 241(8), 196(100), 180(15), 166(16), 151(13), 136(6), 123(5), 105(17), 91(98); EI-HRMS m/z 593,2010 (calculado para C_{30}H_{31}N_{3}O_{10} m/z 593,2042).

Ejemplo 4 Síntesis de un profármaco benciltomaymicina para ADEPT nitrorreductasa (147)

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Síntesis del ácido (2S,4S)-N-(aliloxicarbonil)-4-hidroxipirrolidin-2-carboxílico (13)

Una solución de cloroformato de alilo (33,17 g; 275 mmol; 1,2 equiv) en THF (30 ml) fue añadida gota a gota por espacio de 30 minutos a una suspensión de trans-4-hidroxiprolina (30g; 229 mmol) en THF (150 ml) y agua (150 ml) a pH 9, ajustado con NaOH 4M) y a 0ºC). La mezcla de reacción se sometió a agitación a 0ºC y pH 9 durante un período adicional de una hora. La capa acuosa fue separada y se saturó con NaCl, se lavó con EtOAc (4 x 100 ml) y el pH de la fase acuosa fue ajustado a 2 con HCl concentrado. El aceite resultante se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La fase orgánica combinada fue secada (MgSO_{4}) y evaporada al vacío para proporcionar la hidroxiprolina protegida con Alloc (13), en forma de un aceite transparente espeso, el cual fue utilizado para el siguiente paso sin purificación adicional.

Rendimiento 41 g (84%); [\alpha]^{20}_{D}= -236º (c0,25; CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 3429, 2522, 2340, 2258, 2130, 1688, 1437, 1415, 1345, 1277, 1222, 1177, 1133, 1085, 1047, 1025, 994, 827, 768, ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 5,80-5,99 (m,1H); 5,13-5,34 (m, 2H); 4,52-4,63 (m, 2H); 4,37-4,44 (m, 2H); 3,53-3,60 (m, 2H); 2,00-2,36 (m, 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 174,7; 174,5; 154,8; 154,5; 132,8; 132,7; 117,1; 116,7; 69,2; 68,5; 65,7; 65,6; 57,9; 57,6; 54,9; 54,4; 38,9; 38,2; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 215 (M^{+}, 14), 170(100), 130(95), 126(34), 108(35), 68(51), 56(21); EI-HRMS m/z 215,0759 (calculado para C_{9}H_{13}NO_{5} m/z 215,0743).

Síntesis del ácido (2S)-N-(aliloxicarbonil)-4-oxopirrolidin-2-carboxílico (14)

La hidroxiprolina (13) protegida con alloc (18 g; 83,72 mmol) fue disuelta en acetona (1260 ml). El reactivo de Jone [CrO_{3}:26,6 g/H_{2}SO_{4}:21,3 ml y la solución fue preparada hasta 100 ml con agua] (87 ml) se añadió por espacio de 10 minutos. La mezcla resultante fue sometida a agitación durante un período adicional de 45 minutos y el exceso de oxidante fue apagado con metanol (15 ml). Las sales de cromo de color verde fueron extraídas por filtración mediante Celite y el filtrado se diluyó con CHCl_{3} (1.000 ml). La fase orgánica combinada fue lavada con salmuera varias veces (5 x 500 ml) y se evaporó el disolvente en condiciones de presión reducida, para proporcionar la cetona 14, la cual fue utilizada sin llevar a cabo ningún tipo de purificación.

Rendimiento 14,68 (82%); IR (cm^{-1})3471, 3020, 2932, 2610, 2041, 1761, 1691, 1649, 1547, 1411, 1343, 1266, 1195, 1164, 1128, 972, 939, 877, 759; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 9,20 (bs, 1H); 5,86-6,00(m, 1H); 5,21-5,35 (m, 2H); 4,87-4,91 (m, 2H); 4,87-4,91 (m, 1H); 3,87-3,99 (s, 2H); 2,68-2,95 (m, 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 207,6; 207,1; 175,8; 175,3; 155,3; 154,2; 131,9; 118,4; 118,2; 67,0; 66,8; 55,8; 52,5; 52,3; 41,0; 40,3; MS (EI) (m/z, intensidad relativa)= 213 (M^{+},19), 168(81), 152(8), 128(100), 112(15), 100(37), 96(36), 68(14), 58(13), 56(37); EI-HRMS m/z 213,0641 (calculado para C_{9}H_{11}NO_{5} m/z 213,0637).

Síntesis del ácido (2S)-(E,Z)-N-(aliloxicarbonil)-4-etilidenpirrolidin-2-carboxílico (15)

Una mezcla de NaH (suspensión al 60%) (4g, 100 mmol, 4eqv.) y de bromuro de etiltrifenilfosfonio (37 g, 100mmol, 4 eqv.) en THF recién destilado (250 ml) fue sometida a reflujo durante un período de 4 horas en atmósfera de nitrógeno. Se le añadió, gota a gota y durante un período de 40 minutos, una solución de la cetona 14 (5,325 g, 25 mmol) en THF recién destilado (50 ml). Posteriormente se enfrió y se derramó sobre una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (5% peso/volumen) (500 ml) y se sometió a agitación durante un período de 10 minutos. La mezcla fue después lavada con EtOAc (2 x 250 ml). La capa acuosa se acidificó a pH 3 con HCl diluido (se observó una efervescencia vigorosa). Se extrajo la emulsión con EtOAc (4 x 200 ml) y se lavó la fase orgánica combinada con salmuera (250 ml) y se secó (MgSO_{4}). Se evaporó entonces el disolvente al vació para obtener un aceite de color naranja, el cual fue utilizado en el siguiente paso sin posterior purificación. El rendimiento crudo fue de 3,81 g (68%).

Síntesis de (2S)-(E,Z)-N-(aliloxicarbonil)-4-etilidenpirrolidin-2-carboxilato de metilo (16)

Cloruro de oxalilo y DMF (4 gotas) fueron añadidos a una solución del producto Wittig 15 (3,5 g; 16 mmol) en tolueno anhidro (15 ml) y se sometió a agitación durante el transcurso de toda una noche a temperatura ambiente y en atmósfera de nitrógeno. Se añadió después metanol recién destilado (20 ml) y la mezcla fue sometida de nuevo a agitación durante un período adicional de 4 horas cuando la TLC (EtOAc:éter de petróleo, 1:1) reveló la pérdida completa de los materiales de partida. Se evaporó después el disolvente al vacío. El aceite resultante fue disuelto en EtOAc (60 ml) y se lavó la solución con NaHCO_{3} acuoso saturado (4 x 25 ml), se secó (MgSO_{4}) y se extrajo el disolvente en condiciones de presión reducida, para obtener el producto Wittig 16 esterificado.

Rendimiento 3,48 g (94%); [\alpha]^{20}_{D}: -377,7º (c0,045, CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 4214, 3452, 3019, 2955, 2862, 2400, 1746, 1704, 1649, 1437, 1410, 1343, 1310, 1274, 1215, 1179, 1120, 1072, 1029, 991, 932, 755; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 5,83-6,00 (m,1H); 5,16-5,48 (m, 3H); 4,56-4,68 (m, 3H); 4,05-4,14 (s, 2H); 3,87-3,99 (m, 3H); 2,53-2,97 (m, 2H); 1,60-1,63 (m, 3H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) (isómeros E/Z) \delta 172,9; 154,8; 134,1; 134,0; 133,1; 133,0; 132,8; 132,7; 118,2; 118,1; 117,8; 117,7; 117,4; 117,1; 66,1; 66,0; 65,9; 58,8; 58,6; 58,4; 52,3; 51,1; 50,6; 48,3; 47,7; 36,6; 35,7; 32,6; 31,7; 14,7; 14,6; 14,4; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 239 (M^{+},4), 180(70),154(100), 136(55), 94(33), 80(10), 67(19), 59(8); EI-HRMS m/z 239,1030 (calculado para C_{12}H_{17}NO_{4} m/z 239,1158).

Síntesis de (2S)-(E,Z)-N-(aliloxicarbonil)-4-etilidenpirrolidinometanol (17)

Una solución del éster de anillo C (16) protegido con Alloc (2,5 g; 10,46 mmol) fue disuelta en THF recién destilado (50 ml) y se procedió a su agitación a 0ºC en atmósfera de nitrógeno. Se le añadió lentamente borohidruro de litio (0,4 g; 17,95 mmol; 1,7 eq.) y en pequeñas porciones a la citada solución (se observó efervescencia). Se dejó calentar la mezcla hasta temperatura ambiente y se mantuvo en agitación durante un nuevo período de 4 horas, una vez completada la reacción según indicaba la TLC (EtOAc: éter de petróleo, 1:1). Se procedió después al enfriamiento de nuevo a 0ºC y se detuvo la reacción mediante la adición de agua (40 ml) gota a gota, durante un período de 15 minutos. La mezcla fue neutralizada con HCl 2M (40 ml), el cual fue añadido muy lentamente generándose una vigorosa efervescencia. Se extrajo seguidamente con EtOAc (3 x 100 ml), se lavó la fase orgánica combinada con agua (150 ml) y salmuera (100 ml), se secó (MgSO_{4}) y se extrajo el disolvente a presión reducida para obtener un aceite que fue purificado de nuevo a través de cromatografía de desarrollo rápido (EtOAc:éter de petróleo, 60:40), para proporcionar el producto 17 puro.

Rendimiento 1,57 g (71%) IR (cm^{-1}) 3425. 2947, 2864, 2085, 1678, 1547, 1536, 1411, 1349, 1308, 1236, 1203, 1114, 1047, 975, 931, 883, 851, 769; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 5,87-601 (m, 1H); 5,19-5,40 (m, 3H); 4,59-4,61 (s, 2H); 3,64-4,15 (m,5H); 2,37-2,80 (m, 2H); 1,62-1,64 (m, 3H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) (isómeros E/Z) \delta 156,3; 154,5; 133,1; 132,8; 131,8; 131,7; 130,9; 130,7; 128,7; 128,6; 125,5; 117,5, 115,9; 66,1; 65,9; 65,7; 64,6; 60,4; 59,9; 57,9; 57,3; 51,6; 51,3; 48,3; 48,1; 34,7; 34,4; 34,2, 34,1; 30,6; 30,3; 29,9; 29,5; 25,6; 14,5; 14,4; 14,2.

Síntesis de (2S)-(E/Z)-N-(aliloxicarbonil)-4-etiliden-O-(terc-butildimetilsilil)-pirrolidinometanol (18)

A una solución del compuesto hidroxi 17 (1,3 g; 6,36 mmol) e imidazol (1,05 g; 15,41 mmol; 2,5 eqv.) en DMF anhidra (3ml) se le añadió cloruro de terc-butildimetilsililo (1,11 g; 7,37 mmol; 1,2 eqv.) y se procedió a agitar la mezcla de reacción en atmósfera de nitrógeno durante el transcurso de una noche. La mezcla de reacción fue posteriormente saturada con agua (200 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La capa orgánica se lavó con agua (100 ml), salmuera (150 ml), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó el exceso de disolvente al vacío para proporcionar un aceite de color marrón claro, el cual fue sometido a cromatografía de desarrollo rápido (EtOAc: éter de petróleo, 50:50), para proporcionar el silil éter 18 en estado puro.

Rendimiento 1,54 g (75%); IR (cm^{-1}) 3416, 2093, 1642, 1406, 1253, 1189, 1104, 775; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 5,89-5,95 (m, 1H); 5,18-5,34 (m, 3H); 4,62 (s, 2H); 3,53-4,08 (m, 5H); 2,49-2,70 (m, 2H); 1,43- 1,59 (m, 3H); 0,91 (bs, 9H); 0,02-0,03 (bs, 6H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) (isómeros E/Z) \delta 162,5; 154,4; 136,2; 135,1; 133,1; 130,9; 128,8; 117,4; 117,1; 116,7; 116,1; 65,9; 65,7; 63,9; 63,6; 63,1; 58,6; 58,2; 58,1; 51,2; 48,3; 48,1; 36,5; 34,6; 33,9; 31,8; 31,4; 30,4; 30,3; 29,7; 29,2; 22,7; 18,1; 18,0; 14,5; 14,4; 14,1; -3,6; -5,4; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 325 (M^{+},6), 310(3), 268(100), 256(6), 240(18), 224(7), 182(22), 180(38), 168(10), 154(5), 136(24), 115(8), 94(6), 75(13), 73(21), 57(17), EI-HRMS m/z 325,2003 [(M-isobutil) m/z 268,1233] (calculado para C_{17}H_{31}NO_{3} m/z 325,2073[(M-isobutil)m/z 268,1369).

Síntesis de (2S)-(E,Z)-4-etiliden-O-(terc-butildimetilsil)-pirrolidinometanol (19)

A una solución de 18 (1,5g; 4,63 mmol) en DCM (30 ml) en presencia de agua (0,48 g; 27,11 mmol, 6 eqv.) y de una cantidad catalítica de Pd(PPh_{3})_{2}Cl_{2} (0,132 g; 0,189 mmol, 4% molar) se le añadió hidruro de tributilestaño (1,49g; 5,1 mmol; 1,1 eqv), y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación por espacio de 5 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (40ml), se secó (MgSO_{4}) y se extrajo el exceso de disolvente en condiciones de vacío. La amina pura 19 se aisló por medio de cromatografía de desarrollo rápido (EtOAc:éter de petróleo, 50:50), para proporcionar un aceite de un color marrón claro.

Rendimiento 0,67 g(60%); IR (cm^{-1})4329, 4257, 3426, 2923, 2728, 2672, 2360, 2341, 2035, 1777, 1713, 1641, 1512, 1463, 1377, 1302, 1242, 1169, 1019, 890, 760, 721; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 5,33-5,37 (m, 1H); 4,06 (s, 1H); 3,28-3,75 (m, 4H); 2,17-2,47 (m, 2H); 1,54-1,63(m, 3H); 0,89 (bs, 9H); 0,06-0,07 (bs,6H).

Síntesis de (2S)-(E/Z)-N-(4-benziloxi-5-metoxi-2-nitrobenzoil)-2-etiliden-O-(terc-butildimetilsilil)-pirrolidinometanol (20)

A una solución de ácido 4-benciloxi-5-metoxi-2-nitrobenzoico (3) (2,5 g; 8,25 mmol) y cloruro de oxalilo (1,25 g; 9,84 mmol; 1,2 eqv.) en THF anhidro (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de DMF (4 gotas) y la mezcla se mantuvo en agitación durante el transcurso de toda una noche a temperatura ambiente. El cloruro resultante fue añadido gota a gota, por espacio de 20 minutos, a una solución de 19 con el anillo C desprotegido (1,98,; 8,25 mmol, 1 eqv); TEA (1,75g; 17,35 mmol; 2,1 eqv) y agua (0,6 ml) a 0ºC, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante un período adicional de 2,5 horas, en cuyo momento la TLC (EtOAc:éter de petróleo, 40:60) indicó que la reacción se había completado. La capa orgánica fue entonces extraída a presión reducida y el resto se dividió entre EtOAc (150 ml) y agua (150 ml) y se separaron las capas. La capa acuosa se lavó con EtOAc (100 ml) y la fase orgánica combinada se lavó con NH_{4}Cl saturado (100 ml), salmuera (150 ml), se secó (MgSO_{4}) y evaporó al vacío para proporcionar, después de la cromatografía de desarrollo rápido, (EtOAc:éter de petróleo, 70:30), el producto acoplado 20.

Rendimiento 2,85 g (66%); [\alpha]^{20}_{D}:-11,7º (c0,305, CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 4328, 3424, 2960, 2855, 2359, 2332, 2084, 1709, 1641, 1548, 1526, 1462, 1377, 1278, 1215, 1107, 1058, 836, 761, 722, ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,37-7,47 (m, 6H); 6,77 (s,1H); 5,33-5,37 (m, 1H); 5,22 (s, 2H); 4,43-4,59 (bs, 1H); 3,95 (s, 3H); 3,59-3,86 (m, 4H); 2,47-2,75 (m, 2H); 1,60-1,67 (m, 3H); 0,89 (bs, 9H); 0,087-0,09 (bs, 6H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) (isómeros E/Z) \delta 154,8; 135,3; 128,9; 127,6; 109,2; 71,3; 58,0; 57,6; 56,6; 30,3; 29,7; 25,7; 14,6; 14,4; -5,4; -5,6: MS (CI) (intensidad relativa, m/z) 527 (MH^{+}, 25),418(82), 388(6), 359(9), 328(7), 304(25), 279(45);, 258(13), 240(35), 219(11), 184(10), 161(51), 147(21), 133(41), 113(21), 107(100), 91(25), 81(8), 73(40); EI-HRMS m/z 626,2642 (calculado para C_{28}H_{38}N_{2}O_{6}Si m/z 526,2499.

Síntesis de (2S)-(E/Z)-N-(4-benziloxi-5-metoxi-2-nitrobenzoil)-2-etilidenpirrolidinometanol (21)

Una solución de TBAF (solución 1M en THF; 1,75 ml; 1,75 mmol; 1,2 eqv,) fue añadida gota a gota durante un período de 15 minutos a 0ºC en atmósfera de nitrógeno a una solución del intermedio 20 protegido con TBDMS (0,75 g; 1,42 mmol) en THF anhidro (30 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se mantuvo en agitación durante un período adicional de 30 minutos, cuando la TLC (EtOAc) indicó el consumo total de los materiales de partida. La mezcla de reacción fue diluida con NH_{4}Cl saturado acuoso (150ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La fase orgánica fue lavada con salmuera (150 ml), secada (MgSO_{4}) y evaporada en condiciones de presión reducida para producir el producto 21 desprotegido, el cual fue utilizado en el siguiente paso sin necesidad de posterior purificación.

Rendimiento 0,64 g (109%, algo de TBDMSF asociado con el producto; Rendimiento_{max} 0,57 g); IR (cm^{-1}) 4214, 3406, 3020, 2958, 2925, 2854, 2400, 2085, 1631, 1581, 1523, 1463, 1453, 1433, 1378, 1335, 1278, 1215, 1053, 870, 754; ^{1}H-NMR(CDCl_{3},) \delta 7,37-7,47 (m, 6H); 6,77 (s, 1H); 5,33-5,37 (m, 1H); 5,22 (s, 2H); 4,43-4,59 (bs, 1H); 3,95 (s, 3H); 3,59-3,86 (m,4H); 2,47-2,75 (m, 2H); 1,60-1,67 (m, 3H); 0,89 (bs, 9H); 0,087-0,009 (bs, 6H).

(2S)-(E,Z)-N-(2-amino-4-benziloxi-5-metoxibenzoil)-2-etilidenpirrolidinometanol (22)

Una solución del compuesto nitro 21 (0,64 g; 1,38 mmol, asumiendo rendimiento cuantitativo en el paso anterior) en MeOH (30 ml) y SnCl_{2}.2H_{2}O (1,58 g; 7 mmol; 5 eqv) fue calentada a reflujo por espacio de 40 minutos, cuando la TLC (MeOH/CHCl_{3}, 5%) indicó que la reacción se había completado. El exceso de disolvente se evaporó al vacío y el aceite residual fue dividido entre EtOAc (100 ml) y NaHCO_{3} acuoso saturado (100 ml) y se mantuvo en agitación durante el transcurso de una noche, en atmósfera de nitrógeno. La capa orgánica fue entonces separada y lavada con salmuera (150 ml), secada (MgSO_{4}) y evaporada al vacío. El resto fue purificado por medio de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 5%), para proporcionar el intermedio amina 22 puro, en forma de aceite de color amarillo claro.

Rendimiento 0,32 g (61%); IR (cm^{-1}) 4329, 4257, 3427, 2923, 2727, 2360, 2341, 2036, 1712, 1624, 1513, 1463, 1377, 1264, 1215, 1172, 1120, 1002, 872, 761, 722, ^{1}H-NMR(CDCl_{3}) \delta 7,35-7,51 (m, 5H); 6,87 (s, 1H); 6,27 (s, 1H); 5,28-5,42 (m, 1H); 5,17 (s, 2H); 4,43-4,59 (bs, 1H); 3,84 (s, 3H); 3,59-3,78 (m, 4H); 2,25-2,75 (m, 2H); 1,60 (d, J= 6,8 Hz, 3H); ^{13}C-NMR(isómeros E/Z)(CDCl_{3}) \delta 150,9; 141,5; 136,6; 134,5; 128,8; 127,9; 127,1; 117,7; 117,3; 112,6;103,0; 70,6; 66,1; 60,4; 59,8; 57,2; 34,3; 30,0; 29,4; 21,0; 14,6; 14,3; 13,6.

Síntesis de (2S)-(E/Z)-N-[2-(p-nitrobenciloxi)carboxamido-4-benciolxi-5-metoxibenzoil]-2-etilidenpirrolidinometanol (23)

La amina recién preparada 22 (0,5 g; 1,31 mmol) y piridina anhidra (0,207 g; 2,62 mmol; 2 eq.) fueron disueltas en DCM (30ml) a 0ºC, en atmósfera de nitrógeno. A la solución de amina se le añadió, gota a gota y por espacio de 20 minutos, una solución de cloroformato de 4-nitrobencilo (0,282 g; 1.31 mmol, 1eq.). La mezcla de reacción se mantuvo en agitación en las mismas condiciones por espacio de 2 horas, en cuyo momento la TLC (MeOH/CHCl_{3} 5%) indicaba el consumo completo de los materiales de partida. La mezcla fue entonces disuelta en DCM (100 ml) y lavada con CuSO_{4} acuoso saturado (2 x 75ml), agua (2 x 100 ml), salmuera (150 ml) y secada (MgSO_{4}). El disolvente orgánico se evaporó al vacío y después de la purificación por medio de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 3%) se aisló el carbamato de p-nitrobencilo.

Rendimiento 0,56 g (76,3%); [\alpha]^{20}_{D}: +204,6 (c0,22,CHCl_{3}) 4329, 4257, 3426, 2924, 2853, 2093, 1710, 1628, 1524, 1462, 1406, 1377, 1346, 1269, 1219, 1175, 1118, 722; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 8,81 (bs, 1H); 8,19 (d, J=8,6 Hz; 2H); 7,80 (s, 1H); 7,31-7,61 (m, 7H); 6,85 (s,1H); 5,29-5,35 (m. 1H); 5,24 (s, 2H); 5,15 (s, 2H); 4,08-4,13 (bs, 1H); 3,83 (s, 3H); 3,66-3,86 (m, 4H); 2,39-3,86 (m, 4H); 2,39-2,75 (m, 2H); 1,51 (d, J=6,6 Hz, 3H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) (isómeros E/Z) \delta 153,2; 150,3; 147,6; 143,6; 136,1; 134,1; 128,7; 128,4; 128,1; 127,7; 126,9; 123,7; 117,8; 111,2; 70,7; 65,2; 63,8; 56,6; 29,7; 14,6; 14,4; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 562 (MH^{+}, 15), 279(77), 256(15), 240(35), 231(37), 136(13), 128(25), 106(14), 91(100), 73(11); 57(11); EI-HRMS m/z 561,2150 (calculado para C_{30}H_{31}N_{3}O_{8} m/z 561,2111).

Síntesis de (11aS)-8-benciloxi-7-metoxi-1,3,10,11,11a,-tetrahidro-2-etiliden-11-hidroxi-10-(p-nitrobenciloxi)carboxi-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5-ona (24)

Una solución del carbamato no ciclado 23 (0,3 g; 0,535 mmol), NMO (94 mg, 0,803 mmol; 1,5 eqv.) y tamiz molecular (0,267) en una mezcla de (DCM:CH_{3}CN, 9:3 ml) anhidra, se mantuvo en agitación a temperatura ambiente y en atmósfera de nitrógeno, por espacio de 15 minutos,. Se le añadió posteriormente TPAP (9,4 mg; 0,026 mmol; 5% molar) y la mezcla se mantuvo en agitación en las mismas condiciones durante un período adicional de 2,5 horas. La mezcla de reacción fue filtrada a través de Celite y se evaporó el filtrado al vacío. El resto fue sometido a cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 1%) para obtener el compuesto objetivo (24).

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Ejemplo 5 Síntesis de profármacos diméricos de PBD

Ejemplo 5(a)

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(4nitrobenciloxicarboxamido)]bis[(11aS)-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (30)

26

Síntesis de 1',3'-bis(4-carboxi-2-metoxifenoxi)propano (25)

Una solución de diyodopropano (4,2 g; 14,2 mmol) se disolvió en THF (30 ml) y se añadió, gota a gota, a una solución de ácido vanílico (1) (ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico) (5 g; 29,8 mmol, 2,1 eqv) y NaOH acuoso saturado (70 ml) en THF (50 ml), agitada enérgicamente. La mezcla de reacción fue sometida a reflujo por espacio de 48 horas y se extrajo el disolvente orgánico en condiciones de baja presión. La fase acuosa restante fue lavada con éter de petróleo 40-60 (3x 100 ml) y acidificada con HCl concentrado a pH 2, hasta que no se observó nueva precipitación. El precipitado fue recogido por filtración, lavado con agua y secado, para proporcionar el ácido dimérico (25), en forma de cristales de color blanco.

Rendimiento 7,63 g (68%); ^{1}H-NMR (CDCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 7,64 (dd, J_{1}=8,3 Hz; J_{2}=8,3 Hz; 2H); 7,54 (s, 2H); 6,96 (d, J= 8,4 Hz; 2H); 4,29 (t, J=6,1 Hz; 4H); 3,88 (s, 6H); 2,38 (t, J= 6,2 Hz; 2H); ^{13}C-NMR (CdCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 173,1; 168,1;100 151,9; 148,6; 123,5; 112,4; 111,45; 65,21; 55,8; 28,8; IR (cm^{-1})= 3600-3100, 2925, 2855, 1713, 1680, 1597, 1516, 1459, 1377, 1344, 1309, 1275, 1223, 1178, 1133, 1045, 1021, MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 376 (M^{+}, 34); 208(31), 168(43), 152(15), 101(100), 69(87); EI-HRMS m/z 376,1136 (calculado para C_{19}H_{20}O_{8} m/z 376, 1158).

Síntesis de 1',3'-bis(4-carboxi-2-metoxi-5-nitrofenoxi)propano (26)

El ácido dimérico 25 (5g; 13,3 mmol) fue añadido lentamente en pequeñas porciones, por espacio de 30 minutos, a una solución agitada de HNO_{3} al 70% (50 ml) a 0ºC. Una vez completada la adición, se dejó calentar la mezcla de reacción hasta 15ºC y se continuó con la agitación durante un nuevo período de 2 horas. La mezcla de reacción fue derramada sobre hielo provocando la precipitación del producto. El precipitado de color blanco fue recogido por filtración, lavado con agua fría y secado para proporcionar el núcleo ácido dimérico nitrado (26), en forma de sólido de color amarillo pálido. Rendimiento 4,52 g (73%); pf 241-246ºC; IR (cm^{-1}) 3500-3200, 2924, 1713, 1604, 1582, 1523, 1459, 1377, 1282, 1218, 1189, 1053, ^{1}H-NMR (CDCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 7,44 (s, 2H); 7,16 (s, 2H); 4,32 (t, J= 6,5 Hz; 4H); 3,94 (s, 6H); 2,44 (t, J= 6,4Hz; 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 172,3; 167,11; 152,5; 149,2; 141,1; 132,1; 128,6; 122,7; 111,2; 108,3; 65,2; 56,4; 33,9; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 467 (MH^{+}, 1) 436(5), 423(10), 376(2), 256(6), 210(4), 183(10), 164(10), 153(3), 91(9), 77(4), 51(13),44(100); EI-HRMS m/z 466,0876 (calculado para C_{19}H_{18}N_{2}O_{12} 466,0858).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[(2-nitro-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]bis[pirrolidinometanol] (27)

Una solución del núcleo dimérico nitrado 26 (1g; 2,14 mmol) en una mezcla anhidra de CH_{3}CN/THF (30:5 ml) fue tratada, durante el transcurso de una noche, con cloruro de oxalilo (0,64 g; 5,14 mmol; 2,4 eqv) y DMF (5 gotas). El cloruro de ácido resultante fue después añadido, gota a gota, por espacio de 30 minutos, a una suspensión de pirrolidinometanol (0,432 g; 4,28 mmol, 2 eq) y K_{2}CO_{3} (1,2 g; 8,56 mmol; 4 eq) en acetonitrilo anhidro (80 ml) a -25ºC, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante fue mantenida en agitación a -25ºC durante un período adicional de 1,5 horas, cuando la mezcla de reacción fue diluida con agua (100 ml). La solución fue entonces objeto de extracción con cloroformo (4 x 100 ml). La fase orgánica combinada fue lavada con HCl 1M acuoso (2 x 75 ml), agua (2 x 75 ml), salmuera (100 ml), secada (MgSO_{4}) y evaporada al vacío. El aceite de color naranja resultante fue purificado mediante cromatografía de columna (MeOH/CHCl_{3} 10%), para proporcionar el producto 27 puro, en forma de un aceite viscoso de color amarillo.

Rendimiento 0,88 g (65%); [\alpha]^{20}_{D} + 246,1º (c0,067, CHCl_{3}), IR (cm^{-1}) 4329, 4257, 3370, 2916, 2728, 1787, 1713, 1614, 1574, 1513, 1462, 1377, 1337, 1274, 1215, 1058, 868, 823, 749, 723; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,73 (s, 2H); 6,80 (s, 2H); 4,31-4,36 (m, 6H); 3,94 (s, 6H); 3,74-3,87 (m, 4H); 3,17 (t, J=6 Hz, 4H); 2,44 (t, J=5,9 Hz); 2,12-2,22 (m, 4H); 1,70-1,92 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta154,8; 148,3; 137,0; 128,0; 109,1; 108,4; 66,0; 65,6; 61,4; 56,7; 49,5, 28,6; 24,4; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 633 (M* +1,52), 449(12), 236(11); 219(17), 206(12); 196(15), 191 (22), 178(20), 166(20), 151(34), 135(23), 128(11), 122(33), 115(11), 102(47), 91(100), 84(45).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[2-amino-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]bis[pirrolidinometanol] (28)

A una solución del intermedio nitro (27) (1g; 1,58 mmol) sobre Niquel Raney (0,25 g), se le añadió gota a gota hidracina hidrato (0,87 g; 1,74 mmol, 10 eq.) en metanol refluyendo suavemente (20 ml). (para asegurar una ebullición igualada se añadieron gránulos anti-ebullición violenta. La mezcla de reacción fue calentada a reflujo por espacio de 15 minutos adicionales, en cuyo momento la TLC (MeOH/CHCl_{3} 10%) indicaba que la reacción se había completado. Se extrajo entonces el catalizador por medio de filtración (causación, Ni piróforo) y se evaporó el filtrado al vacío, para obtener un aceite de color marrón oscuro, el cual fue purificado por cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 7,5%) para proporcionar la amina dimérica acoplada (28), en forma de aceite de color amarillo claro.

Rendimiento 0,632 g (70%); IR (cm^{-1}) 3100-3600, 2925, 1611, 1460, 1377, 1275, 1216, 1175; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 6,74 (s, 2H); 6,33 (s, 2H); 4,31-4,42 (m, 2H); 4,19-4,23 (m, 4H); 3,76 (s, 6H); 3,50-3,66 (m, 8H); 2,27-2,40 (m, 2H); 2,02-2,15 (m, 4H); 1,71-1,87 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 151,1; 141,0; 112,8; 102,3; 65,1; 60,8; 57,1; 50,9; 28,7; 28,4; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 574 (M^{+}+2,44), 503(3), 473(30), 389(11), 371(31), 219(14), 206(50), 198(13), 192(27), 180(30), 166(18), 149(28), 137(23), 128(17), 102(43), 93(68), 84(57), 70(33), 57(35).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis([2-4-nitrobenciloxicarboxamido)-5-metoxi-1,4-fenilen]carbonil]bis-pirrolidinometanol (29)

Una solución de cloroformato de 4-nitrobencilo (0,347g; 1,61 mmol; 2,3 eqv) en DCM anhidro (10 ml) fue añadida gota a gota, por espacio de 20 minutos y en atmósfera de nitrógeno, a una solución recién preparada de la amina dimérica 28 (0,4 g; 0,7 mmol) en DCM anhidro (15 ml) y piridina (0,193 g; 2,45 mmol; 3,5 eqv) a 0ºC. La mezcla de reacción resultante se dejó en agitación durante un período adicional de 1,5 horas a 0ºC, en cuyo momento, la TLC (MeOH/CHCl_{3} 10%) indicó el completo consumo de los materiales de partida. La mezcla de reacción fue diluida con cloroformo (50 ml) y se lavó con solución acuosa saturada de CuSO_{4} (2 x 50 ml), agua (2 x 50 ml), salmuera (100 ml) y se secó (MgSO_{4}). Se extrajo el disolvente orgánico al vacío y el carbamato dímero puro 29 fue obtenido por medio de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 7%), en forma de espuma de color amarillo claro.

Rendimiento 0,53 g (81%); IR (cm^{-1}) 3424, 2088, 1641, 1502, 1247; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 9,02 (bs, 2H); 8,21 (d, J=8,8 Hz; 4H); 7,72 (s, 2H); 7,56(d, J=8,8 Hz, 4H); 6,82 (s, 2H); 5,26 (s, 4H); 4,28-4,38 (m, 2H); 4,26 (t, J=6Hz; 4H); 3,79(2, 6H); 3,42-3,79 (m, 8H); 2,27-2,42 (m, 2H); 2,11- 2,18 (m, 4H); 1,71-1,88 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 170,7; 153,2; 150,6; 147,6; 143,6; 128,5; 126,9; 123,9; 111,5; 105,9; 65,3; 61,0; 56,6; 51,6; 30,3; 28,4; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 932 (M^{+}+2, 3), 753(5), 551(5), 249(7), 232(13), 222(8), 206(23), 192(32), 179(27), 166(46), 149(28), 136(66), 120(22), 106(45), 102(100), 91(80), 84(48), 73(71), 57(47).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(4-nitrobenciloxicarboxamido)]bis[(11aS)-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (30)

A una solución del bis carbamato 29 (0,35 g; 0,37 mmol) y NMO (0,134 g; 1,14 mmol; 3,1 eqv.) en DCM/CH_{3}CN anhidra (9:3 ml), la cual había sido agitada previamente sobre un tamiz molecular (0,350 g) por espacio de 15 minutos en atmósfera de nitrógeno y a temperatura ambiente, se le añadió, de una sola vez, TPAP (13,4 mg; 0,114 mmol; 0,3 eqv). El avance de la reacción se siguió a través de TLC (MeOH(CHCl_{3} 7%). Transcurridas dos horas, la reacción todavía no se había completado, resultando necesaria la adición de una nueva cantidad de NMO (67 mg; 0,55 mmol; 1,5 eqv) y de TPAP (6,7 mg; 0,05 mmol; 0,15 eqv). Tras agitación durante un período adicional de 30 minutos, la TLC reveló el consumos completo de los materiales de partida. La mezcla de reacción fue filtrada a través de Celite y se evaporó el filtrado al vacío. El resto resultante, de color negro, fue sometido a cromatografía de columna (MeOH/CHCl_{3} 1,5%) para proporcionar el producto en forma de un aceite opaco de color amarillo pálido.

Rendimiento 0,143 (42%); IR (cm^{-1}) 3500-3000, 2933, 2253, 1728, 1599, 1523, 1465, 1431, 1409, 1348, 1270, 1206, 1174, 1111, 1060; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 8,18 (d, J= 8,8 Hz, 4H); 7,74 (s, 2H),; 7,48 (d, J=8,8 Hz; 4H); 6,71 (s, 2H); 5,65 (d, J=10 Hz, 2H); 5,26 (s, 4H); 4,29 (t, J=6Hz; 4H); 4,07-4,16 (m, 2H); 3,83 (s, 6H); 3,42-3,75 (m, 8H); 2,25-2,32 (m, 2H); 2,10-2,22 (m, 4H); 1,68-1,75 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 166,9; 153,2; 147,6; 143,8; 142,8; 128,2; 123,9; 113,9; 110,9; 108,3; 86,2; 69,1; 66,3; 65,6; 60,0; 56,4; 46,4; 29,7; 28,7; 23,1; 14,8; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 925 (M^{+}-1,1), 889(5), 711(6), 501(3), 286(10), 252(7), 213(15), 192(32), 197(11), 185(22), 181(42), 165(15), 149(47), 131(18), 119(16), 105(29), 91(96), 73(100), 57(54).

Ejemplo 5b

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(2,3-dimetoxi-5-nitrobenciloxicarboxamido)]bis[(11aS)-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (32)

27

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(2,3-dimetoxi-5-nitrobenciloxicarboxamido)-5-metoxi-1,4-fenilen]carbonil[bis-pirrolidinometanol (31)

Una solución de cloroformato de 2-nitro-4,5-dimetoxibencilo (0,443 g; 1,61 mmol; 2,3 eqv) en DCM anhidro (10 ml) fue añadida gota a gota, por espacio de 20 minutos, a una solución agitada del aminoalcohol 28 (0,4 g; 0,7 mmol) y piridina (0,193 g; 2,54 mmol; 3,5 eqv) en DCM anhidro (15 ml), a 0ºC y atmósfera de nitrógeno. La TLC (MeOH/CHCl_{3} 10%) reveló que la reacción se había completado una vez transcurridas 2 horas. La mezcla de reacción fue entonces diluida con cloroformo (50 ml) y se lavó con solución acuosa saturada de CuSO_{4} (2 x 50 ml), agua (2 x 50 ml), salmuera (100 ml) y se secó (MgSO_{4}). La eliminación del disolvente a presión reducida proporcionó un aceite de color amarillo oscuro, el cual fue purificado de nuevo a través de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 7%), para proporcionar el producto puro en forma de espuma amarilla.

Rendimiento 0,564 (77%); [\alpha]^{20}_{D}-43,3º (c0,485, CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 4214, 3416, 3020, 2973, 2940, 2613, 2400, 2254, 2075, 1727, 1618, 1585, 1522, 1465, 1438, 1408, 1331, 1278, 1216, 1174, 1118, 1071, 1030, 987, 909, 874, 850, 754; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 8,93 (bs, 2H); 7,71 (s, 2H); 7,69 (s, 2H); 7,10 (s, 2H); 6,82 (s, 2H); 5,60 (m,4H); 4,34 (m, 2H); 4,26 (t, J=6Hz, 4H); 3,99 (s, 12H); 3,94 (s, 6H); 3,51-3,79 (m, 8H); 2,26-2,36 (m, 2H); 2,05-2,17 (m, 4H); 1,80-1,88 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 170,6; 153,7; 150,45; 148,1; 139,5; 132,9; 127,8; 111,2; 110,4; 109,9; 108,1; 65,4; 63,8; 62,4; 60,8; 56,4; 53,5; 51,4; 50,6; 28,2; 25,0; 21,0; 14,2; MS (FAB) (m/z intensidad relativa) 1053, (M^{+}-2,7), 814(6), 416(3), 306(13), 292(5), 280(27), 246(46), 197(81), 186(38), 180(25), 166(37), 151(19), 102(23), 93(100), 84(10), 75(37), 57(42).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(2,3-dimetoxi-5-nitrobenciloxicarboxamido)]bis[(11aS)-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona

A una solución sometida a agitación del carbamato dímero NVOC 31 (0,4 g; 0,38 mmol) en DCM anhidra y acetonitrilo (9:3 ml), en atmósfera de nitrógeno, se le añadió NMO (0,138 g, 1,16 mmol; 3,1 eqv) y tamiz molecular (350 mg). Esta mezcla se mantuvo en agitación por espacio de 15 minutos antes de la adición de TPAP (13,8 mg; 0,116 mmol; 0,3 eqv). Una agitación adicional de la mezcla de reacción por espacio de 2 horas a temperatura ambiente fue seguida de la adición de una cantidad adicional de TPAP (6,9 mg, 0,058 mmol; 0,15 eqv) y NMO (69 mg, 1,58 mmol; 1,5 eqv) para conducir a la reacción hasta su finalización [TLC (MeOH/CHCl_{3}) 5%], después de un período adicional de agitación vigorosa. El disolvente orgánico se evaporó al vacío para proporcionar un resto de color negro, el cual fue purificado de nuevo a través de una columna de cromatografía (MeOH/CHCl_{3} 1%) para proporcionar el producto final puro, en forma de aceite de color amarillo oscuro.

Rendimiento 0,162 (39%); [\alpha]^{20}_{D} -121,5º (c 1,07, CHCL_{3}) IR (cm^{-1}) 4329, 4258, 3426, 2926, 2854, 2728, 2360, 2341, 2046, 1712, 1620, 1583, 1523, 1464, 1408, 1330, 1278, 1219, 1172, 1149, 1071, 1030, 987, 871, 796, 759; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros() \delta 7,71 (s, 2H); 7,62 (s, 2H); 7,10 (s, 2H); 6,43 (s, 2H); 5,48-5,59 (m, 6H); 4,29-4,36 (m, 2H); 4,24-4,28 (t, J= 6Hz, 4H); 3,95 (s, 12H); 3,88 (s, 6H); 3,47-3,53 (m, 8H); 2,32-2,43 (m, 2H); 2,07-2,17 (m, 4H); 1,67-1,92 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 170,4; 153,8; 150,2; 148,9; 139,6; 130,9; 128,8; 127,6; 111,5; 110,6; 108,1; 86,0; 65,4; 65,0; 63,8; 60,9; 56,4; 46,4; 31,9; 28,2; 25,9; 22,7; 14,1.

Ejemplo 5(c)

Síntesis de 1,1'-[[propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(fenilacetamido)bis[11aS)-7-metoxi-1,2, 3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (34)

28

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(fenilacetamido)-5-metoxi-1,4-fenilen]carbonil]bis-pirrolidinometanol [33]

A una solución agitada de ácido fenilacético (0,2 g; 1,47 mmol, 2,1 eqv) y de cloruro de oxalilo (0,224 g; 1,76 g; 2,5 eqv) en acetonitrilo anhidro (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de DMF (4 gotas) y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante el transcurso de una noche a temperatura ambiente y en atmósfera de nitrógeno. La solución del cloruro de ácido resultante fue añadida gota a gota, durante un período de 30 minutos, a una solución agitada de la amina 28 (0,4 g; 0,7 mmol) en acetonitrilo anhidro (40 ml) sobre K_{2}CO_{3} (0,406 g; 2,94 mmol; 4,2 eqv) a -25ºC, en atmósfera de nitrógeno, y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante un nuevo período de 1,5 horas. La mezcla de reacción fue diluida en cloroformo (50 ml) y lavada con HCl 1M (2 x 50 ml), agua (2 x 75 ml), salmuera (100 ml), secada (MgSO_{4}). El exceso de disolvente fue evaporado al vacío para proporcionar un aceite de color amarillo oscuro el cual, después de ser sometido a cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 10%), proporcionó el amino alcohol dímero puro protegido con fenilacetamida, en forma de aceite de color amarillo pálido.

Rendimiento 0,344 (64%); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 9,31 (bs, 2H); 7,59 (s, 10H); 6,68 (s, 2H); 4,20-4,28 (m, 6H); 4,14-4,18 (m, 4H); 3,71 (s, 6H); 3,24-3,56 (m, 8H); 2,27-2,39 (m, 2H); 2,02-2,17 (m, 4H); 1,64-1,81 (m, 4H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 169,7; 150,1; 134,7; 130,2 129,4; 128,9; 127,3; 110,5; 108,2; 65,3; 61,1; 56,3; 50,8; 44,7; 29,7; 28,3; 24,7.

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil]dioxi]bis[[2-fenilacetamido)]bis[(11aS)-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona(34)

A una solución agitada del carbamato dímero protegido con acetamida 33 (0,3 g; 0,38 mmol) en DCM anhidro y acetonitrilo (9:3 ml) y en atmósfera de nitrógeno se le añadió NMO (0,141 g; 1,2 mmol; 3,1 eqv) y tamiz molecular (350 mg). Esta mezcla se mantuvo en agitación durante un período de 20 minutos antes de la adición de TPAP (14,1 mg; 0,12 mmol; 0,31 eqv). Una nueva agitación de la mezcla de reacción durante un período de 1,5 horas fue seguida de la adición de una cantidad adicional de TPAP (7 mg; 0,06 mmol; 0,15 eqv) y NMO (70 mg; 0,6 mmol; 1,5 eqv), para conducir la reacción hacia su finalización [TLC (MeOH/CHCl_{3} 5%)], después de un nuevo período de 45 minutos de enérgica agitación. El disolvente orgánico fue evaporado al vacío para proporcionar un residuo de color negro, el cual fue purificado de nuevo a través de cromatografía de columna (MeOH/CHCl_{3} 1%), para proporcionar el producto final puro en forma de aceite de color amarillo oscuro.

Rendimiento 0,138 g (47,5%); [\alpha]^{20}_{D} +132º (c0,265, CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 3412, 2959, 2924, 2854, 2094, 1642, 1462, 1377; ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 7,28-7,39 (s, 10H); 7,15 (s, 2H); 6,46 (s, 2H); 5,75-5,78 (d, J= 10 Hz; 2H); 4,10-4,35 (m, 10H); 3,89 (s, 6H); 3,35-3,73 (m, 8H); 2,27-2,32 (m, 2H); 1,68-2,05 (m, 8H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}) \delta 169,9; 153,2; 147,6; 143,8; 142,8; 128,2; 123,9; 113,9; 110,9; 108,3; 86,5; 69,1; 66,3; 60,0; 56,4; 46,4; 29,7; 28,7; 23,1; 14,8.

Ejemplo 5(d)

Síntesis alternativa de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(4-nitrobenciloxicarboxamido)]bis[(11aS)-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (30)

29

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[(2-nitro-5-metoxi-4-fenilen)carbonil]]bis[pirrolidin-2-carboxaldehidodietilditioacetal] (35)

A una suspensión del ácido nitro dímero 26 (0,25 g; 1,01 mmol) y cloruro de oxalilo (0,3 g; 2,33 mmol; 2,3 eqv.) en un volumen de THF anhidro, se le añadieron 3-4 gotas de DMF y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante el transcurso de toda una noche, en atmósfera de nitrógeno. El cloruro de ácido resultante fue añadido, gota a gota y por espacio de 20 minutos, a una solución agitada de (2S)-pirrolidin-2-carbaldehido-dietiltioacetal (0,416 g; 2,02 mmol; 2 eqv) y trietilamina (0,41 g; 4,04 mmol; 4 eqv.) a 0ºC, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se continuó con la agitación durante un período adicional de 1,5 horas. El exceso de THF fue entonces eliminado y el resto diluido con agua (5 ml) y extraído con EtOAc (15 ml). El pH de la fase acuosa fue ajustado a pH 3 con dos gotas de HCl concentrado y subsiguientemente se llevó a cabo la extracción con EtOAc (3 x 10 ml). La fase orgánica combinada fue lavada con agua (2 x 10 ml), salmuera (15 ml), secada (MgSO_{4}) y se evaporó el disolvente orgánico al vacío para proporcionar un aceite amarillo oscuro. La purificación por medio de cromatografía de desarrollo rápido (EtOAc:éter de petróleo 40-60, 1:1) proporcionó el producto puro 35.

Rendimiento 0,558 g (66%); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,72 (s, 2H); 6,83 (s, 2H); 4,89 (d, J=4,0 Hz; 2H); 4,64-4,70 (m, 2H); 4,30-4,40 (m, 4H); 3,91 (s,6H); 3,15-3,30 (m, 4H); 2,59-2,76 (m, 8H); 1,70-2,38 (m, 8H); 1,30-1,38 (m, 12H).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[(2-amino-5 metoxi-1,4-fenilen)carbonil]]bis[pirrolidin-2-carboxaldehidodietilditioacetal (36)

Una solución del nitro-tioacetal 35 (0,4 g, 0,47 mmol) y SnCl_{2}.2H_{2}O (1,4 g; 6,22 mmol; 13,2 eqv) en metanol (7 ml) fue calentada a reflujo por espacio de 40 minutos, en cuyo momento la TLC (EtOAc:éter de petróleo 40-60:1:1) indicaba que la reacción se había completado. Una vez se hubo permitido que la mezcla de reacción regresase a la temperatura ambiente, se procedió a ajustar el pH hasta el valor de 8, mediante la adición de NaHCO_{3} saturado acuoso. La suspensión resultante fue diluida con EtOAc (100 ml) y se mantuvo en agitación durante el transcurso de una noche en atmósfera de nitrógeno. La fase orgánica fue separada y lavada con salmuera (50 ml), secada (MgSO_{4}) y se extrajo el disolvente a presión reducida para proporcionar una goma de color amarillo oscuro, la cual fue de nuevo purificada por medio de cromatografía de desarrollo rápido (EtOAc:éter de petróleo 40-60, 3:7), para proporcionar el amino-tioacetal dímero puro, en forma de un aceite de color amarillo claro.

Rendimiento 0,281 (56%); ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) \delta 6,82 (2, 2H); 6,29 (s, 2H); 5,30 (d, J=4,0 Hz; 2H); 4,69-4,87 (m, 2H); 4,08-4,21 (m, 4H); 3,76 (s, 6H); 3,60-3,66 (m, 4H) 2,65-2,73 (m, 8H); 1,80-2,35 (m, 8H); 1,22-1,31 (m, 12H).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[(2-(4-nitrobenciloxicarbonilamino-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]]bis[pirrolidin-2-carboxaldehidodietilditioacetal] (37)

Una solución de cloroformato de 4-nitrobencilo (0,100 g; 0,46 mmol; 2 eqv) en DCM anhidra (10 ml) fue añadida gota a gota a una solución de la bis amina 36 (0,18 g; 0,23 mmol) y piridina (0,101 g; 1,28 mmol; 5,5 eqv) en DCM anhidro (15 ml), por espacio de 20 minutos, a 0ºC y en atmósfera de nitrógeno. La solución de reacción se mantuvo en agitación a 0ºC por espacio de 1,5 horas (TLC: MeOH/CHCl_{3} 7%), después de lo cual se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se diluyó con cloroformo (50 ml). La fase orgánica fue lavada con CuSO_{4} saturado acuoso (2 x 50 ml), agua (75 ml), salmuera (75 ml) y se secó (MgSO_{4}) y el exceso de disolvente fue evaporado al vacío para proporcionar un aceite de color amarillo oscuro. Después de purificación por medio de cromatografía de desarrollo rápido (MeOH/CHCl_{3} 7%), se obtuvo el producto puro en forma de aceite de color amarillo oscuro.

Rendimiento 0,179 (68%); [\alpha]^{20}_{D} + 100º (c0,232, CHCl_{3}); IR (cm^{-1}) 4214, 3426, 3020, 2400, 2085, 1658, 1609, 1525, 1466, 1452, 1408, 1348, 1268, 1216, 1174, 1112, 1052, 1015, 908, 753, ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, rotámeros) \delta 9,18 (bs, 2H); 8,19-8,24 (d, J=8,8 Hz; 4H); 6,82 (s, 2H); 6,29 (s, 2H); 5,30 (d, J=4,0 Hz, 2H); 4,69-4,87 (m, 2H); 4,08-4,21 (m, 4H); 3,76 (s, 6H); 3,60-3,66 (m, 4H); 2,65-2,73 (m, 8H); 1,80-2,35 (m, 8H); 1,22-1,31 (m, 12 H).

Síntesis de 1,1'-[[(propano-1,3-diil)dioxi]bis[[2-(4-nitrobenciloxicarboxamido)]bis[(11aS)-7 metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-11-hidroxi-5H-pirrolo[1,2-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (30)

A una solución de agitada lentamente del amino-tioacetal con N protegido 37 (0,15 g; 0,13 mmol) y CaCO_{3} (65 mg; 0,65 mmol; 5 eqv) en acetonitrilo/agua (4:1, 5 ml) se le añadió cloruro de mercurio (1,6 g; 5,88 mmol; 4,5 eqv) y la agitación continuó a temperatura ambiente por espacio de 24 horas. La mezcla de reacción fue diluida con EtOAc (20 ml) y fue filtrada a través de Celite. El filtrado se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 15 ml), salmuera (20 ml), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó a presión reducida para proporcionar un aceite de color amarillo, el cual fue purificado adicionalmente a través de cromatografía de columna (MeOH/CHCl_{3}, de 0 a 2%), para proporcionar el compuesto profármaco dímero 30 (rendimiento= 67,3 mg (56%)).

Ejemplo 5(e)

Síntesis alternativa del intermedio (26) en los Ejemplos 5(a) a 5(d)

30

Síntesis de 1',3'-bis(4-carbonil-2-metoxifenoxi)propano (39)

Una solución de azodicarboxilato de dietilo (4,57 g; 26,3 mmol, 1 eq) en THF anhidro (15 ml) fue añadida gota a gota durante un período de 15 minutos a una solución de vanilina (38) (10,4 g; 68,3 mmol; 2,6 eqv); 1,3-propanodiol (2 g; 26,3 mmol, 1 eqv) y trifenilfosfina (6,87 g; 26,3 mmol, 1 eqv) en THF anhidro (50 ml) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante el transcurso de una noche y se diluyó con cloroformo (70 ml) y se lavó con NaOH 1M (2 x 75 ml). El disolvente orgánico fue extraído por medio de evaporación rotatoria y el resto triturado con tolueno (150 ml) por espacio de 24 horas.

Se extrajo el óxido de trifenilfosfina por filtración y se lavó el filtrado con NaOH (100 ml), se secó (MgSO_{4}), se evaporó al vacío y el aceite opaco restante se purificó por medio de cromatografía de desarrollo rápido (CHCl_{3} 100), para proporcionar un sólido de color blanco.

Rendimiento = 6,27 (70%); ^{1}H-NMR (CDCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 9,84 (s, 2H); 7,62-7,66 (d, J=8,3 Hz; 2H); 7,38 (s, 2H); 7,02-7,05 (d; J= 8,4 Hz; 2H); 4,24-4,28 (t; J=6,1Hz; 4H); 3,91 (s, 6H); 2,05-2,12 (t, J= 6,2 Hz; 1H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 190,8; 154,0; 149,6; 131,9; 129,7; 128,5; 126,7; 11,5; 109,1; 66,6; 61,4; 58,8; 55,9; 31,8; 14,5; MS (FAB) (m/z, intensidad relativa) 344 (M^{+},2); 210(54); 152(100), 123(9), 109(14); 81(11), 65(10), 51(11).

Síntesis de 1',3'-bis(4-carbonil-2-metoxi-5-nitrofenoxi)propano (40)

El aldehído dímero (39) (5 g; 14,5 mmol) fue añadido en pequeñas porciones, durante un período de 30 minutos, a HNO_{3} (100 ml, 70%) a 0ºC. La suspensión resultante fue sometida a agitación durante un nuevo período de 30 minutos a 15ºC, momento en el que fue derramado sobre agua helada y se recogió el precipitado de color amarillo claro por filtración, se lavó con agua fría y se secó para proporcionar el intermedio nitrado.

Rendimiento 4,63 g (74%); ^{1}H-NMR (CDCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 10,41 (s, 2H); 7,67 (s, 2H); 7,37 (s, 2H); 4,41-4,45 (t, J= 6,1 Hz; 4H); 3,99 (s, 6H); 2,87-2,92 (t; J= 6,2 Hz; 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3} + DMSO-d_{6}) \delta 187,7; 172,2; 153,4; 151,5; 143,6; 132,0; 128,6; 125,6; 110,3; 109,9; 108,4; 65,8; 56,6; 33,8; MS (EI) (m/z, intensidad relativa) 434 (M^{+}, 1); 277(33), 269(37), 214(13), 197(21), 167(100), 152(21), 122(20), 111(15), 96(10), 79(13),72(32).

Síntesis de 1',3'-bis(4-carboxi-2-metoxi-5-nitrofenoxi)propano (26)

A una solución del aldehído (40) (4 g; 9,21 mmol) en acetona (300 ml) se le añadió gota a gota KMnO_{4} acuoso caliente (10% peso/volumen, 200 ml), por espacio de 15 minutos. La mezcla resultante fue sometida a agitación por espacio de 40 minutos y el material insoluble fue extraído por filtración a través de Celite. El filtro fue lavado con agua caliente y el filtrado combinado concentrado al vacío. La fase acuosa restante fue acidificada con HCl concentrado para proporcionar un precipitado de color amarillo pálido, el cual fue recogido por filtración, lavado con agua y secado para proporcionar el ácido dímero (26) (rendimiento 3,08 g (71,8%)).

Ejemplo 6 Síntesis de una PBD protegida con Psec (52) y de PBD relacionadas protegidas con Ptec (55a/b) (para comparar)

31

32

Síntesis de la amina secundaria 45

Tetrahidroborato de litio (2,6 g; 0,12 mol) fue añadido en porciones a una solución de ester metílico de N-carbobenciloxi-L-prolina 41 (21 g; 0,08 mol) en THF (500 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente por espacio de 48 horas. La solución fue enfriada después a 0ºC y se le añadió agua helada (150 ml) para apagar el exceso de tetrahidroborato de litio. La suspensión resultante fue ajustada a pH 4,0 con HCl acuoso (1,0 N) y se extrajo con Et_{2}O (250ml). La fase orgánica fue separada y lavada con H_{2}O (3x100 ml), salmuera (2 x 100 ml), secada (MgSO_{4}) y concentrada para dar el alcohol 42 en forma de un aceite amarillo pálido (18,6 g, 99%). ^{1}HNMR (270 MHz, CDCl_{3}) d 2,1-1,77 (m, 4H); 3,76-3,35 (m, 4H); 4,1-3,77 (m, 1H); 5,14 (2 x s, 2H); 7,38-7,28 (m, 5H); CIMS 236 (M^{+}).

Una solución de trietilamina (32 ml; 0,23 mol) y de complejo SO_{3}-piridina (37 g; 0,23 mol) en DMSO (210 ml) fue añadida a una solución de alcohol 42 (18 g; 0,077 mol) en CH_{2}Cl_{2} (250 ml) a -10ºC, en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó por espacio de 30 minutos, derramándose posteriormente sobre agua helada (200 ml) y extrayéndose con Et_{2}O. La fase orgánica fue lavada con HCl acuoso (1,0 N; 3x 150 ml), H_{2}O (3x 150 ml), salmuera (2 x 150 ml), secada (MgSO_{4}) y se concentró para dar un aceite amarillo. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía de desarrollo rápido (gel de sílice, EtOAc) para dar el aldehído 43, en forma de aceite incoloro (12,6 g, 71%). ^{1}HNMR (270 MHz, CDCl_{3})\delta 2,16-1,8(m, 4H); 3,66-3,5(m,2H); 4,33-4,17 (m, 1H); 5,22-5,13 (m, 2H); 7,37-7,3 (m, 5H); 9,59 (2 x s, 1H). CIMS 234 (M^{+} +1).

A una solución del aldehído 43 (11 g, 0,047 mol) y ortoformato de trimetilo (36 ml, 0,33 mol) en MeOH (55 ml) se le añadió cloruro de tionilo (5,5 ml), a 0ºC. La mezcla de reacción fue calentada a 60ºC por espacio de 2 horas. La solución fue dejada enfriar hasta temperatura ambiente y tratada con un exceso de Na_{2}CO_{3} sólido y diluida con Et_{2}O (60 ml). La solución fue filtrada para eliminar los productos sólidos insolubles y el filtrado resultante fue concentrado al vacío y después redisuelto en EtOAc. La solución orgánica fue lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado (3 x 50 ml), salmuera (2 x 50 ml), secada (MgSO_{4}) y concentrada para proporcionar el acetal 44 en forma de líquido amarillo (12,5 g; 95%). ^{1}HNMR (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,16-1,7 (m, 4H); 3,64-3,33 (m,8H); 4,02-3,91 (br. m, 1H); 4,4 y 4,6 (2x br.s, 1H); 5,17-5,1 (m, 2H); 7,47-7,28 (m, 5H).

Una solución del acetal 44 (5,8 g, 0,02 mol) en EtOH (50 ml) fue sometida a agitación por espacio de 16 horas a temperatura ambiente, sobre níquel Raney (0,2 g), con vistas a eliminar las cantidades en forma de traza de impurezas de azufre con anterioridad a la hidrogenación. El níquel Raney fue eliminado por filtración a través de Celite.

A la solución alcohólica sometida a hidrogenación bajo presión (c. 50 psi) se le añadió paladio al 10% sobre carbón (580 mg). Transcurridas 16 horas, la mezcla de reacción fue filtrada a través de Celite y se lavó el filtro con EtOAc, las soluciones orgánicas combinadas fueron concentradas para proporcionar la amina secundaria 45, en forma de líquido verde pálido (2,9 g, 100%). ^{1}HNMR (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,93-1,59 (m, 4H); 3,1-2,92 (m, 2H); 3,4-3,3 (d, J=6,9 Hz, 1H); 3,41 (2x s, 6H); 3,53 (br,s, 1H); 4,2 (d, J=6,8 Hz, 1H).

Síntesis de la amina 48

Una solución de acetal 45 (1g; 6,9 mol), ácido 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzoico 46 (1,6 g; 6,9 mmol), TBTU (2,2 g; 6,9 mmol) y DIPEA (1,2 ml; 6,9 mmol) en DMF (30 ml) fue sometida a agitación a temperatura ambiente por espacio de 16 horas. La mezcla de reacción fue concentrada al vacío y el material crudo extraído con EtOAc y lavado con NaHCO_{3} acuoso saturado (3 x 30 ml), HCl (1,0 N, 3 x 30 ml), H_{2}O (3 x 30 ml), salmuera (3 x 30 ml), secada (MgSO_{4}) y concentrada para proporcionar un producto semisólido de color amarillo. El material crudo fue purificado mediante cromatografía de columna de desarrollo rápido (gel de sílice, 2:1 EtOAc:éter de petróleo 40-60) para dar el compuesto nitro 47, en forma de sólido de color nata pálido (1,28 g; 51%). ^{1}HNMR (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,26-1,67 (m, 4H); 3,19-3,06 (m, 2H); 3,59 y 3,57 (2 x s, 6H); 3,98 (s, 6H); 4,45-4,4 (m, 1H); 4,95-4,94 (d, J=2,6 Hz, 1H); 6,76 (s, 1H); 7,71 (s, 1H); CIMS 355 (M^{+} +1).

A una solución del compuesto nitro 47 (1,28g; 3,6 mmol) en EtOH (50 ml) se le añadió paladio al 10% sobre carbón (130 g), sometiéndola posteriormente a hidrogenación bajo presión (c. 50 psi). Transcurridas 20 horas, la mezcla de reacción fue filtrada a través de Celite y el filtro se lavó con EtOAc, las soluciones orgánicas combinadas fueron concentradas para proporcionar la amina secundaria 48, en forma de aceite pálido (1,26 g, 98%). ^{1}HNMR (270 MHz, CDCL_{3}) \delta 2,18-1,65 (m, 4H); 3,57-3,47 (m, 8H); 3,85 (2 x s,6H); 4,42-4,38 (m, 1H); 6,3 (s, 1H); 6,77 (s, 1H); ^{13}C-NMR (68,7 MHz; CDCl_{3}) \delta 24,03; 25,07; 50,56; 55,8; 56,24; 56,86; 57,65; 58,82; 101,07; 105,01; 111,75; 112,52; 141,07; 151,81; 169,76 EIMS 324 (M^{+}).

Síntesis de PBD 52 protegida con Psec

A una solución de 2-(fenilsulfonil)etanol 49 (375 mg, 2,01 mmol) y tiofosgeno (200 mg; 0,67 mmol) en CH_{2}Cl_{2} a 0ºC se le añadió piridina (55 \mul, 0,67 mmol). La mezcla de reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente por espacio de 16 horas.

A una solución de la amina 48 (0,5 g; 1,5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) a 0ºC, se le añadió piridina (150 \mul; 1,85 mmol) y cloroformato 50 crudo. La mezcla de reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente por espacio de 3 horas. Después, la solución se concentró al vacío y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica fue lavada con ácido cítrico al 10% (2 x 20 ml), H_{2}O (20 ml), salmuera (20 ml), se secó (MgSO_{4}) y concentró para proporcionar un aceite de color amarillo. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía de desarrollo rápido (gel de sílice, EtOAc) para dar el carbamato 51, en forma de aceite incoloro (770 mg, 93%). ^{1}H-NMR (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,17-1,72 (m, 6H); 3,55-3,34 (m, 10H); 3,92 y 3,84 (2 x s, 6H); 4,5-4,4 (m, 2H); 4,75 (br. s, 1H); 6,82 (s, 1H), 7,97-7,56 (m, 6H); 8,89 (br.s; 1H); ^{13}C-NMR (68,7 MHz, CDCl_{3}) \delta 14,19; 21,04; 23,88; 55,31; 56,12; 56,31; 56,39; 57,52; 58,25; 58,94; 60,38; 103,91; 104,74; 111,15; 127,97; 128,09; 129,43; 133,98; 134,05; 139,29; 143,75; 151,09; 152,72; 168;83; FABMS 536 (M^{+}).

A una solución del carbamato 51 en acetona anhidra (14 ml) se le añadió cloruro de trans-bis(acetonitrilo)paladio (II) (107 mg; 0,41 mmol). La mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente por espacio de 16 horas. La solución fue concentrada al vacío para proporcionar una espuma de color marrón. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía de desarrollo rápido (gel de sílice, EtOAc), para proporcionar el éter metílico 52, en forma de aceite de color naranja (690 mg, 85%).

^{1}H-NMR (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,12-1,78 (m, 6H); 3,22-3,17 (m, 1H); 3,98 y 3,94 (2xs, 6H); 4,69-4,65 (m, 1H); 5,46-5,43 (d, J= 9,3 Hz; 1H); 7,03 (s, 1H); 7,22 (s, 1H); 7,87-7,53 (m, 5H); ^{13}C-NMR (68,7 MHz, CDCL_{3}) \delta 14,19; 21,06; 23,21; 28,98; 46,33; 54,74; 56,15; 56,39; 56,45; 58,58; 60,09; 60,39; 93,33; 110,18; 113,32; 126,24; 128,07; 128,27; 129,49; 134,13; 138,59; 148;77; 151,15; 155,65; 167,36; EIMS 504 (M^{+}).

Síntesis de Ptec-PBD 55a/b

33

A una solución de 2-(feniltio)etanol 53 (355 mg, 2,3 mmol) y tiofosgeno (230 mg; 0,77 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) a 0ºC, se le añadió piridina (65 \mul; 0,77 mmol). La mezcla de reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente por espacio de 16 horas.

A una solución de la amina 47 (0,5g; 1,5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) a 0ºC, se le añadió piridina (150 \mul, 1,85 mmol) y cloroformato crudo 54. La mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente por espacio de 3 horas. Posteriormente, la solución fue concentrada al vacío y se procedió a la extracción con CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica fue lavada con HCl, (1,0 N; 2 x 20 ml), H_{2}O (20 ml), salmuera (20 ml), se secó (MgSO_{4}) y concentró para proporcionar un aceite de color marrón. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía de desarrollo rápido (gel de sílice, 2:1 EtOAc;éter de petróleo 40-60), para dar una mezcla de la carbinolamina 55a y del éster metílico 55b, en forma de una goma de color amarillo (510 mg, 66%)

^{1}H-NMR (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,1-1,99 (m, 4H); 3,15-2,98 (m, 2H); 3,71-3,44 (m, 4H); 3,93 y 3,89 (2 x s, 6H); 4,38-4,07(m, 1H); 5,45-5,41 (d, J=9,3 Hz, 1H); 5,65-5,61 (d, J=9,5 Hz, 1H); 6,76(s, 1H); 7,29-7,19 (m, 6H); ^{13}C-NMR (68,7 MHz, CDCl_{3}) \delta 23,05; 23,21; 28,7; 28,98; 29,36; 29,68; 32,72; 32,99; 46,36; 56,13; 56,19; 56,59; 59,9; 60,13; 63,91; 64,19; 86,07; 93,37; 110,36; 112,55; 125,67; 126,69; 128,3; 129,15; 129;97; 134,85; 148;36; 150;83; 156,02; 167,05; EIMS 458 (M^{+}, 55a), 472 (M^{+},55b).

Ejemplo 7 Activación por nitrorreductasa del profármaco bencil DC-81 (Compuesto 7)

El compuesto 7, sintetizado según el ejemplo 1, fue objeto de evaluación en dos diferentes líneas celulares, a saber, SW1116 y LS174T. Ambas líneas SW1116 y LS174T son líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano, las cuales fueron cultivadas en el hospital de Charing Cross. Las células, a una concentración de 2.500 células/ml, se ubicaron en placas de microvaloración de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC por espacio de 1 hora con diferentes concentraciones del profármaco, en presencia o ausencia de conjugado anticuerpo monoclonal-nitrorreductasa de E.coli, en solución salina con tampón fosfato (obtenible en Sigma) y NADH (el cofactor necesario para la función enzima) en DMSO. Las células fueron después lavadas e incubadas durante un período adicional de 3 días a 37ºC. A la finalización de este período, las células se fijaron (TCA) y se tiñeron. La concentración de las células viables restantes adheridas a las placas fue cuantificada por medio de un colorante sulforodamina B (SRB). Los programas de control de las células tratadas con el profármaco en solitario fueron utilizados con vistas a evaluar la citotoxicidad del compuesto con anterioridad a la activación enzimática

Los resultados se ilustran en la Figura 4. Se averiguó que el profármaco en solitario resultaba esencialmente no tóxico en las células SW1116, incluso a concentraciones de hasta 500 \muM. Se observó una ligera toxicidad en la línea celular LS174T a concentraciones más elevadas de 100 \muM. En presencia del enzima y del cofactor, la IC_{50} del compuesto 7 se estableció entre 1 y 5\muM, en ambas líneas celulares.

El fármaco de origen, bencil DC-81 (Thurston et al., 1990, Chem. Brit., 26, 767-772), fue también evaluado en las mismas líneas celulares y bajo las mismas condiciones, con vistas a establecer la extensión de la activación lograda por el sistema profármaco/enzima. Se observó una diferencia entre el valor IC_{50} del fármaco de origen (IC_{50}=0,008 \muM) y el del profármaco activado por nitrorreductasa (IC_{50}= 1-5 \muM), de 20-100 veces.

Ejemplo 8 Activación por medio de nitrorreductasa del profármaco DSB-120 (Compuesto 30)

El compuesto 30, ver ejemplos 5(a) y (c), fue objeto de evaluación en la línea celular LS174T, en las mismas condiciones que las utilizadas en el ejemplo 6. El valor encontrado para IC_{50} era de 215,3 \muM (promedio de dos determinaciones), el cual se reducía a 13,7 \muM tras la adición del enzima y del cofactor, representando un factor de activación de entre 15-16 veces. Se averiguó que la citotoxicidad (IC_{50}) del agente de origen DSB-120 en esta línea celular era 0,0005 \muM, indicando una activación menos eficaz del profármaco dimérico en comparación con el compuesto 7.

Ejemplo 9 Activación por medio de nitrorreductasa del profármaco bencil-tomaymicina (Compuesto 24)

El compuesto 24, ver ejemplo 4, fue examinado en las mismas líneas celulares que en el ejemplo 6, y bajo las mismas condiciones. El mismo mostró un valor IC_{50} de 86,2 \muM (promedio de dos experimentos) el cual, después de la adición del conjugado enzima y de NADH, cayó a 6,4 \muM, indicando un factor de activación de aproximadamente 13,5. En este caso, no se dispuso de la bencil tomaymicina de origen para evaluación como control. No obstante, asumiendo que la adición de un grupo bencilo a la posición C-8 del anillo A de la tomaymicina no modifica la citotoxicidad del compuesto de una manera significativa (tal como ocurre en el caso de DC-81/C8-bencil DC-81), la citotoxicidad de la C8-bencil tomaymicina debería ser del orden de 0,01 a 0,001 \muM.

Ejemplo 10 Activación mediante luz del profármaco bencil DC-81 (Compuesto 11)

Este experimento conlleva la irradiación del compuesto 11, ver ejemplo 3, en DMF, a una concentración de 1 mM, utilizando un Stratagene UVA Crosslinker (365 nm). Pequeñas alícuotas (100 \muL) fueron extraídas a los 30 minutos, 1 hora, 2 horas y 3 horas y la rotura del grupo fotolabil NVOC fue monitorizada por medio de HPLC, utilizando una columna de fase invertida de 300 Angstrom Waters C4 y una fase móvil de 50% metanol/50% agua. El compuesto 11 tenía un tiempo de retención de 11,25 minutos y como consecuencia de la radiación producía un nuevo pico con un tiempo de retención de 8,58 minutos. El bencil DC-81 auténtico tiene un tiempo de retención idéntico de 8,58 minutos. El desarrollo del tiempo de desprotección se muestra en la figura 5. La conversión completa se logra a las dos horas de irradiación a 365 nm, bajo las condiciones utilizadas.

Para evaluar la capacidad de que las alícuotas de los análogos activados, las cuales fueron extraídas a intervalos temporales, de inhibir el crecimiento de las células K562 de leucemia histiocítica humana crónica en cultivo, se utilizó un ensayo MTT. Después de efectuar el tratamiento de las células con una gama de dosis de productos, las células fueron transferidas a placas de microvaloración de 96 pocillos, a razón de 10^{4} células por pocillo, 8 pocillos por muestra. Las placas fueron incubadas a 37ºC en atmósfera humidificada conteniendo un 5% de CO_{2}. El ensayo se basaba en la capacidad de las células viables de reducir una sal tetrazolio soluble de color amarillo, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), a un precipitado de formazán púrpura insoluble. Después de la incubación de las placas por espacio de 4 días (para permitir el que las células control pudieran incrementarse 10 veces en número), se añadieron a cada uno de los pocillos 20 \muL de una solución de 5 mg/mL de MTT en solución salina tamponada con fosfato y las placas fueron incubadas durante un período adicional de 5 horas. Las placas fueron entonces centrifugadas por espacio de 5 minutos a 300g y se eliminó la masa del centro a partir del pellet celular.

Se añadió DMSO (200\muL) a cada uno de los pocillos y se agitaron las muestras para asegurarse de que el mezclado era completo. La densidad óptica fue entonces determinada a una longitud de onda de 550 nm en un lector de placa ELISA Titertek Multiscan y se expresaron en porcentaje de la densidad óptica control.

\newpage

Para cada una de las curvas, se tomó lectura de un valor IC_{50} como la dosis requerida para reducir la densidad óptica final al 50% del de del valor control.

Se demostró que el compuesto profármaco de PBD 11 investigado mostraba, a su vez, poseer una prácticamente nula toxicidad (IC_{50}=47,5 \muM; Figura 6). Después de la irradiación, se observó un incremento significativo de la citotoxicidad (Figura 6) con un valor IC_{50} de 0,6 \muM, alcanzado después de una hora de irradiación. El valor IC_{50} del auténtico bencil DC-81, en similares condiciones, era 0,5 \muM.

Compuesto	Tiempo de irradiación(horas)^{+}	IC_{50} (\muM)
Bencil DC-81*	0	0,5
11	0	47,5
	0,5	0,98
	1,0	0,60
	2,0	0,60
*Ejemplo comparativo
^{+}La irradiación se produjo en DMF, a una concentración 1mM de fármaco

A la concentración más elevada de 10 mM de profármaco en DMF, la eficacia de la rotura fotoinducida resultaba reducida, cuando tras dos horas de irradiación, el valor proporcionado para la IC_{50} era de 1,75\muM, tal como se muestra en la Figura 7.

Compuesto	Tiempo de irradiación(horas)^{+}	IC_{50} (\muM)
Bencil DC-81*	0	0,5
11	0	48,5
	0,5	4,33
	1,0	2,17
	2,0	1,75
*Ejemplo comparativo
^{+}La irradiación se produjo en DMFa una concentración de fármaco 10mM

Se pensaba que la elevada concentración de profármaco podría evitar la absorción eficaz de la luz UV. Además, el cambio de disolvente de DMF a metanol dio como resultado una conversión menos eficaz, tal como se muestra en la Figura 8.

Compuesto	Tiempo de irradiación(horas)^{+}	IC_{50} (\muM)
Bencil DC-81*	0	0,5
11	0	47,5
	0,5	4,5
	1,0	4,0
	2,0	3,2
*Ejemplo comparativo
^{+}La irradiación se produjo en DMFa una concentración de fármaco 1 mM

Ejemplo 11 Activación por medio de luz del profármaco dimérico DSB-120 (Compuesto 32)

Se averiguó que el derivado dimérico 32, ver ejemplo 5(b), era significativamente citotóxico ante la irradiación UV, con una IC_{50} de 4,5 \muM. La incubación de una solución del compuesto 32 con células, después de dos horas de irradiación reducía la IC_{50} a 1,25 \muM (figura 9). Este valor fue reducido adicionalmente a 0,85 \muM tras 5 horas de irradiación. El dímero PBD de origen DSB-120 proporcionó una IC_{50} de 0,55 \muM en la misma línea celular, ver Figura 9.

Compuesto	Tiempo de irradiación(horas)^{+}	IC_{50} (\muM)
Bencil DC-81*	0	0,55
32	0	4,50
	0,5	1,90
	1,0	1,75
	2,0	1,25
	5,0	0,85
*Ejemplo comparativo
^{+}La irradiación se produjo en DMFa una concentración de fármaco 1 mM

Para estos experimentos, los datos de HPLC (no mostrados) sugirieron que, aproximadamente a las dos horas de irradiación, se había producido la práctica totalidad de la conversión del profármaco 32 (tiempo de retención = 5,18 minutos) en un producto con tiempo de retención = 3,64 minutos, teniendo lugar la conversión completa a las 5 horas. El auténtico DSB-120 fue eluido con un tiempo de retención de 3,64 minutos.

Ejemplo 12 Comparación de la actividad biológica de PBDs protegidas con Psec y Ptec (Compuestos 52 y 55)

Los compuestos 52 (UP 2073) y el compuesto comparativo 55b (UP 2090) fueron evaluados a los efectos de comprobar su actividad citotóxica en líneas celulares por el grupo del Dr. Lloyd R. Kelland, en The Institute of Cancer Research, Sutton, UK. Las cinco líneas celulares investigadas fueron SKOV-3, A2780/A2780cisR y CH1/CH1cisR (cisR significa que la línea celular es resistente a cisplatino).

Se sembraron células viables sencillas en medio de crecimiento (160 \muL) en placas de microvaloración de 96 pocillos y se dejaron unir durante el transcurso de una noche. Los compuestos objeto de comprobación fueron después disueltos en DMSO (para proporcionar concentraciones de fármaco 20 mM) inmediatamente antes de la adición de las células en pocillos cuadruplicados. Las concentraciones finales en los pocillos oscilaron entre 100 \muM y 2,5 nM, de acuerdo con lo siguiente: 100; 25; 10; 2,5; 1\muM; 250; 100; 25; 10; 2,5 nM (los fármacos se diluyeron en medio de crecimiento y posteriormente se añadieron 40 \muL al volumen presente de 160 \muL, para obtener una concentración final como la mencionada anteriormente). Transcurridas 96 horas, el medio fue extraído y el resto de las células fueron fijadas a ácido tricloroacético sobre hielo, por espacio de 30 minutos. Los pocillos fueron después lavados 3-4 veces con agua corriente, secados al aire durante el transcurso de una noche y tratados con 100 \muL de sulforodamina B (0,4%) disuelta en ácido acético al 1%. Se permitió que el teñido continuase durante un período de entre 10 y 15 minutos, después de lo cual se lavaron los pocillos 3-4 veces con ácido acético 1%, se secaron con aire y se añadió base Tris (100 \muL de 10 mM). Las placas fueron después agitadas y de determinaron lecturas de absorbancia a 540 nM, utilizando un lector de placa. Se calcularon los valores IC_{50} a partir de gráficas de concentración frente a porcentajes de absorbancia (comparado con los 8 pocillos no tratados).

El ensayo fue también llevado a cabo utilizando el compuesto 56 (UP2025)

34

el cual corresponde a la versión no protegida del compuesto 52.

Los resultados se muestran más abajo:

Lineas celulares	UP2090 IC_{50} (\muM)	UP2073 IC_{50} (\muM)	UP2025 IC_{50} (\muM)
A2780	>25	0,48	0,064
A2780cisR	>25	0,49	0,155
RF	N/D	1	2,4
CH1	>25	0,4	0,082
CHIcisR	>25	0,47	0,11
RF	N/D	1,2	1,3
SKOV3	>25	0,56	1,7

RF es el factor de resistencia. Que indica la citotoxicidad del compuesto en la línea celular resistente al cisplatino, dividido por la citotoxicidad en la línea celular normal.

La PBD (55b) protegida con Ptec, UP2090, se mostró esencialmente inactiva frente a las líneas celulares ováricas, tal como era de esperar ya que el grupo protector Ptec carece de los protones ácidos que se considera necesarios para desencadenar la fragmentación del grupo protector cuando el mismo se expone a GST. No obstante, se averiguó que el profármaco (52) UP2073, protegido con Psec, resultaba al menos 50 veces más tóxico que el control Ptec. El compuesto resultó particularmente activo frente a la línea celular SKOV3; teniendo esto relevancia dado que esta línea celular es intrínsicamente resistente a los agentes cititóxicos eletrófilos, debido a la presencia de elevados niveles de glutationa/glutationa transferasa. De manera interesante, el profármaco Psec UP2073, resultaba realmente más activo en esta línea celular que la PBD en que estaba basado en UP2025. Sin que ello suponga quedar vinculados por ninguna teoría, es posible que el profármaco esté protegido frente a la glutationa y otros nucleófilos biológicos hasta que es desprotegido en las proximidades del punto de actuación.

El UP2073 fue también objeto de cribado, llevado a cabo por The National Cancer Institute (NCI), Bethesda, Maryland, USA. El NCI dispone de una criba para citotoxicidad in vitro, la cual comprende aproximadamente 60 líneas celulares tumorales humanas, frente a las cuales se comprueban los compuestos a un mínimo de cinco concentraciones cada uno, difiriendo 10 veces. Se utilizó un protocolo de exposición contínua durante 48 horas, en el cual el crecimiento o la viabilidad celular fue estimada con un ensayo de la proteína SRB.

Procedimiento

El compuesto de prueba fue evaluado frente a aproximadamente 60 líneas celulares tumorales humanas. Los procedimientos de cribado de NCI fueron descritos en detalle por Monks y colaboradores (Monks, A. et al., Journal of the National Cancer Institute, 1991, 83, 757). Brevemente, se prepararon suspensiones de células según el tipo de célula en particular y la densidad de la célula objetivo pretendida (5.000-40.000 células por pocillo, en base a las características de crecimiento celular) y se adicionaron a través de pipeta (100 \muL) en el interior de placas de microvaloración de 96 pocillos. Se permitió que las células tuvieran un período de pre-incubación de 24 horas a 37ºC, para su estabilización. A tiempo cero se añadieron a los pocillos diluciones del doble de la concentración buscada en la prueba, en alícuotas de 100 \muL. Los compuestos de prueba fueron objeto de evaluación con cinco diluciones múltiplos de 10 (10^{-4}, 10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7} y 10^{-8} \muM). Los compuestos objeto de comprobación fueron objeto de incubación por espacio de 48 horas en una atmósfera con un 5% de CO_{2} y una humedad del 100%. Las células fueron posteriormente objeto de ensayo utilizando el ensayo de la sulforodamina B. Para leer las densidades ópticas se utilizó un lector de placa y una microcomputadora procesó las lecturas en forma de valores LC_{50}, que corresponde a la dosis requerida para destruir a la mitad de las células. Los valores de IC_{50}, la dosis requerida para inhibir el crecimiento de la mitad de las células fueron también determinados.

El UO2073 se comportó bien en el cribado, mostrando actividad frente a líneas celulares en grupos de líneas celulares de tumores de pulmón, colon, CNS, melanoma, y tumores renales y de mama. De manera interesante, los análisis de datos de LC_{50} a través de 53 líneas celulares sugirieron alguna correlación con la actividad de la glutationa transferasa. En la siguiente tabla se aportan resultados seleccionados

\newpage

Líneas celulares	IC_{50} (\muM)	LC_{50} (\muM)
Pulmón, NCI-H552	0,11	1,38
Colon, Colo 205	0,19	0,71
CNS, SNB-75	0,72	9,00
Melanoma, SK-MEL-5	0,29	6,78
Renal, RXF 393	0,24	2,97
Mama, MDA-MB-231	0,45	4,33

Clave para las figuras

Figura 4: SW1116-(\blacksquare) Compuesto 7; (\newmoon) Compuesto 7 + enzima NADH.

LS174T-(\blacktriangle) Compuesto 7; (\blacktriangledown) Compuesto 7 + enzima + NADH

Figuras 6&7: (\blacksquare) Bencil DC-81; (\square) Compuesto 11; ( \newmoon) Compuesto 11 + UVA 30 minutos; (\medcirc) Compuesto 11 + UVA 1h; (\blacktriangle) Compuesto 11 + UVA 2 h.

Figura 8: (\blacksquare) Bencil DC-81; (\square) Compuesto; (\newmoon) Compuesto 11 + UVA 30 minutos; (\medcirc) Compuesto 11 + UVA 1 h; (\blacktriangle) Compuesto 11 + UVA 2h.

Figura 9: (\blacksquare) DSB-120; (\square) Compuesto; (\newmoon) Compuesto 32 + UVA 30 minutos; (\medcirc) Compuesto 32 + UVA 1 h; (\blacktriangle) Compuesto 32 + UVA 2 h; (\vartriangle) Compuesto 32 + UVA 5 h.

Claims (30)

1. Uso de un compuesto de fórmula I:

35

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, ya sea:

(i)

en conjunción con un enzima, a través del procedimiento de AEDPT o GDEPT; o

ii)

a través de procedimientos de NPEPT.

en donde

R_{10} es un grupo protector de nitrógeno adecuado, lábil para un adecuado enzima;

R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de entre H, R, OH, OR, =O, =CH-R, =CH_{2}, CH_{2}-CO_{2}R, CH_{2}-CO_{2}H, CH_{2}-SO_{2}R, O-SO_{2}-R, CO_{2}R, COR y CN;

R_{6}, R_{7} y R_{9} se seleccionan independientemente de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn; o R_{7} y R_{8} conjuntamente forman un grupo -O-(CH_{2})_{p}-O-, donde p es 1 ó 2;

X es S, O ó NH;

R_{11} es o bien H ó R;

donde R es un grupo alquilo inferior que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo aralquilo, de hasta 12 átomos de carbono, en donde el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más grupos carbonilo, uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, los cuales pueden formar parte de un sistema conjugado, o un grupo arilo, de hasta 12 átomos de carbono; y está opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, hidroxi, amino o nitro y si R es un grupo alquilo, el mismo puede contener un heteroátomo que puede estar localizado en cualquier parte del grupo alquilo;

y donde existe opcionalmente un doble enlace entre C1 y C2 o entre C2 y C3.;

y R_{8} se selecciona de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn, donde R es tal como se ha definido anteriormente o el compuesto es un dímero, siendo cada uno de los monómeros iguales o diferentes y de fórmula I, donde los grupos R_{8} de los monómeros forman conjuntamente un puente que tiene la fórmula -T-R'-T-, que uniendo a los monómeros, en donde R' es una cadena de alquileno que contiene de 3 a 12 átomos de carbono, pudiendo ser dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, y pueden contener uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, y cada uno de los T se selecciona independientemente de entre O, S ó N.

2. Uso según la reivindicación 1, en donde R_{10} es un grupo lábil para la nitrorreductasa, el enzima es nitrorreductasa y el medicamento es utilizado en procedimientos de ADEPT o GDEPT.

3. Uso según la reivindicación 2, en donde R_{10} es de fórmula III:

36

en donde n es de 0 a 3; R^{(1)} es H ó R, y R^{(III)} son uno o más sustituyentes opcionales seleccionados independientemente de entre NO_{2}, OR ó R, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 1 y si dos sustituyentes R^{(III)} se encuentran sobre átomos adyacentes, los mismos pueden ser conjuntamente de fórmula -O-(CH_{2})_{m}-O-, donde m es 1 ó 2.

4. Uso según la reivindicación 1, en donde R_{10} es un grupo lábil para la glutationa transferasa y el medicamento se utiliza en procedimientos de NPEPT.

5. Uso según la reivindicación 4, en donde R_{10} es de fórmula XI:

37

en donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 1, y n está comprendido entre 0 y 3.

6. Uso según la reivindicación 5, en donde R en el grupo de fórmula XI es un grupo fenilo sustituido o no sustituido.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde X es O.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R_{11} es H.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R_{6} y R_{9} son H.

10. Uso según la reivindicación 9, en donde R_{7} y R_{8} se seleccionan independientemente de entre H, OH y OR, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 1.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el compuesto es un dímero C8, en donde R_{6} y R_{9} son H y R_{7} se selecciona independientemente de entre H, OH y OR, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 1.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el compuesto es un dímero C8, cada uno de T es O y R' es (CH_{2})_{p}, en donde p está comprendido entre 3 y 12.

13. Uso de un compuesto de fórmula I:

38

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, en conjunción con luz de longitudes de onda comprendidas entre 250 y 550 nm, a través de procedimientos de PDT,

en donde

R_{10} es un grupo fotolábil protector de nitrógeno adecuado;

R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente de entre H, R, OH, OR, =O, =CH-R, =CH_{2}, CH_{2}-CO_{2}R, CH_{2}-CO_{2}H, CH_{2}-SO_{2}R, O-SO_{2}-R, CO_{2}R, COR y CN;

R_{6}, R_{7} y R_{9} se seleccionan independientemente de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn; ó R_{7} y R_{8} conjuntamente forman un grupo -O-(CH_{2})_{p}-O-, donde p es 1 ó 2;

X es S, O ó NH;

R_{11} es o bien H ó R;

donde R es un grupo alquilo inferior que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo aralquilo de hasta 12 átomos de carbono, en donde el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más grupos carbonilo, uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, los cuales pueden formar parte de un sistema conjugado, o un grupo arilo, de hasta 12 átomos de carbono; y está opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, hidroxi, amino o nitro y si R es un grupo alquilo, el mismo puede contener un heteroátomo que puede estar localizado en cualquier parte del grupo alquilo; y donde existe opcionalmente un doble enlace entre C1 y C2 o entre C2 y C3.;

y R_{8} se selecciona de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn, donde R es tal como se ha definido anteriormente o el compuesto es un dímero con cada uno de los monómeros siendo iguales o diferentes y siendo de fórmula I, donde los grupos R_{8} de los monómeros forman conjuntamente un puente que tiene la fórmula -T-R'-T-, que une a los monómeros, en donde R' es una cadena de alquileno que contiene de 3 a 12 átomos, pudiendo estar dicha cadena interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, y puede contener uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono y cada uno de los T se selecciona independientemente de entre O, S ó N.

14. Uso según la reivindicación 13, en donde R_{10} es de la fórmula II:

39

en donde n está comprendido entre 0 y 3, R^{(I)} es H ó R y R^{(II)} es uno o más sustituyentes independientemente seleccionados de entre NO_{2}, OR o R, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 1 y si dos sustituyentes R^{(II)} se encuentran sobre átomos adyacentes, los mismos pueden ser conjuntamente de fórmula -O-(CH_{2})_{m}-O-, donde m es 1 ó 2.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en donde R_{10} es rompible por medio de luz con una longitud de onda de 250 a 550 nm.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde X es O.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en donde R_{11} es H.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en donde R_{6} y R_{9} son H.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en donde R_{7} y R_{8} se seleccionan independientemente de entre H, OH y OR, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 13.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en donde el compuesto de un dímero C8, en donde R_{6} y R_{9} son H y R_{7} se selecciona independientemente de entre H, OH y OR, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 13.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en donde el compuesto es un dímero C8, cada uno de los T es O y R' es (CH_{2})_{p} donde p está comprendido entre 3 y 12.

22. Compuesto con la fórmula I:

40

en donde

R_{10} es un grupo seleccionado de entre

(i)

41

en donde n está comprendido entre 0 y 3, R^{(I)} es H ó R, y R^{(II)} es uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de entre NO_{2}, OR ó R y si dos sustituyentes R^{(II)} se encuentran sobre átomos adyacentes, los mismos pueden ser conjuntamente de fórmula -O-(CH_{2})_{m}-O-, donde m es 1 ó 2; y

(ii)

42

en donde n está comprendido entre 0 y 3; y

R_{2} y R_{3} se selecciona independientemente de entre H, R, OH, OR, =O, =CH-R, =CH_{2}, CH_{2}-CO_{2}R, CH_{2}-CO_{2}H, CH_{2}-SO_{2}R, O-SO_{2}-R, CO_{2}R, COR y CN;

R_{6}, R_{7} y R_{9} se selecciona independientemente de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn; o R_{7} y R_{8} conjuntamente forman un grupo -O-(CH_{2})_{p}-O-, donde p es 1 ó 2;

X es S, O ó NH;

R_{11} es o bien H ó R;

donde R es un grupo alquilo inferior que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo aralquilo de hasta 12 átomos de carbono, en donde el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más grupos carbonilo, uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, los cuales pueden formar parte de un sistema conjugado, o un grupo arilo, de hasta 12 átomos de carbono; y está opcionalmente sustituido por uno o más grupos halo, hidroxi, amino o nitro y si R es un grupo alquilo, el mismo puede contener un heteroátomo que puede estar localizado en cualquier parte del grupo alquilo;

y donde existe opcionalmente un doble enlace entre C1 y C2 o entre C2 y C3;

y R_{8} se selecciona de entre H, R, OH, OR, halo, amino, nitro, Me_{3}Sn, donde R es tal como se ha definido anteriormente o el compuesto es un dímero con cada uno de los monómeros siendo iguales o diferentes y siendo de fórmula I, donde los grupos R_{8} de los monómeros forman conjuntamente un puente que tiene la fórmula -T-R'-T-, que une a los monómeros, en donde R' es una cadena de alquileno que contiene de 3 a 12 átomos, pudiendo estar interrumpida dicha cadena por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos y puede contener uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono y cada uno de los T se selecciona independientemente de entre O, S ó N.

23. Compuesto según la reivindicación 22, en donde R_{10} es de fórmula (III):

43

en donde n está comprendido entre 0 y 3, R^{(I)} es H ó R, y R^{(III)} es uno más sustituyente opcionales seleccionados independientemente de entre NO_{2}, OR ó R, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 1 y si dos sustituyentes R^{(III)} se encuentran en átomos adyacentes, los mismos pueden ser conjuntamente de fórmula -O-(CH_{2})_{m}-O-, donde m es 1 ó 2.

24. Compuesto según la reivindicación 22, en donde R en el grupo de fórmula XI es un grupo fenilosustituido o no sustituido.

25. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde X es O.

26. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde R_{11} es H.

27. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde R_{6} y R_{9} son H.

28. Compuesto según la reivindicación 27, en donde R_{7} y R_{8} se seleccionan independientemente de entre H, OH y OR, en donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 22.

29. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en donde el compuesto es un dímero C8, en donde R_{6} y R_{9} son H, y R_{7} se selecciona independientemente de entre H, OH y OR, donde R es tal como se ha definido en la reivindicación 22.

\newpage

30. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en donde el compuesto es un dímero C8, cada uno de los T es O y R' es (CH_{2})_{p}, donde p está comprendido entre 3 y 12.