NO166715B

NO166715B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive cytorodin s derivater.

Info

Publication number: NO166715B
Application number: NO872646A
Authority: NO
Inventors: Yukiko Tone; Toshiro Iwahashi; Etsuko Ohkouchi; Hiroshi Kitagawa; Isamu Sugawara; Hiroshi Okazaki; Akio Fukuda; Hans Gerd Berscheid; Hitoko Numata; Junko Usui; Shunji Senda; Akihiko Matsuo; Hiroshi Watanabe; Itsuo Kurobane
Original assignee: Hoechst Japan
Priority date: 1986-06-25
Filing date: 1987-06-24
Publication date: 1991-05-21
Also published as: DK321387D0; JPH0822869B2; US5028698A; EP0251088A3; PT85154B; FI872783A0; IL82978A0; JPH01104077A; HU198741B; NO872646D0; NO166715C; PT85154A; KR880000440A; CN87104384A; EP0251088A2; AU611087B2; HUT45076A; NZ220805A; AU7466987A; DK321387A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av terapeutisk virksomme cytorodin S derivater, spesielt cytorodin S-imunoglobulinkomplekser.

Cytorodin S derivatene som fremstilles virker selektivt på kreftceller og er nyttige som et antikreft middel.

Det er rapportert at cytorodin S fremstilles ved syrebehand-ling av rå cytorodin blanding fremstilt ved å kultivere Streptomvces Y-11472 (deponeringsnr. DSM-2658) og har antikreft aktivitet (japansk utlegningsskrift Sho 60-48994). Selv om cytorodin S i seg selv har meget høy antikreft aktivitet, er det fremdeles ønskelig å utvikle midler som selektivt virker på kreftceller og som har høy biotilgjenge-lighet.

Som et resultat av omfattende undersøkelser vedrører utviklingen av cytorodin S derivater som er overlegne når det gjelder selektiv spesifisitet for kreftceller, er det nå lykkes å tilveiebringe cytorodin S-immunoglobulinkomplekser som opprettholder antikreft aktivitetene av cytorodin S selv.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles et cytorodin S derivat representert ved den generelle formelen (I)

hvor X er

- NH2

- NH-R<1->SH

hvor R:<1> representer en C^-Cs-alkylengruppe eventuelt substituert med kairboksy,

- NH-R<1->GOOH

hvor Rs<1> representerer en Cj^-Cs-alkylengruppen eventuelt substituert med amino,

- NH-R<1->GOOCH2CH3

hvor R<1> representerer en C1-C5-alkylengruppe,

hvor: R2 representerer en Cj^-Cs-alkylengruppe, hvor R<1> representerer en Cj^-Cs-alkylengruppe eventuelt substituert med amino, IgG representerer en immunoglobulinenhet og n betyr et helt tall 1-15, hvor R<2> og R<4> er like eller forskjellige og betyr en C^-C5-alkylengruppe, IgG representerer en immunoglobulinenhet og n er et helt tall på 1-15,

hvor R<1> betyr en C^-Cs-alkylengruppe eventuelt substituert med karboksy, R<2> betyr en C^-Cs-alkylengruppe, IgG representerer en immunoglobulin og n er et helt tall på 1-15.

Cytorodin S derivatene med formel I fremstilles ifølge oppfinnelsen ved

a) reduksjon av cytorodin S med formel II

med et alkalimetallcyanoborhydrid i nærvær av et ammoniumsalt eller en forbindelse av formelen NH2-R<1->SH, Nr^-R<1->COOH, NH2-R<1->COOCH2CH3, hvor R<1> i hvert tilfelle er som definert ovenfor, hvorved det oppnås en forbindelse av

formel I hvor X er -NH, -NH-R^—SH, NH-R<1->COOH eller -NH-RI<->COOCH2-CH3,

b) eventuelt omsetning av en forbindelse av formel I hvor X er NH2 med en maleimidforbindelse med formel III

hvor R<2> er som definert ovenfor, hvorved det oppnås en forbindelse av formel I hvor X er

hvor R<2> er som definert ovenfor,

c) eventuelt: omsetning av en forbindelse av formel I hvor X er

hvor R<2> er som definert ovenfor, med et tiolert immunoglobulin som har formel IV hvor R<4> betyr en C^-Cs-alkylengruppe, IgG er som definert ovenfor og n' betyr et helt tall på 1-20, slik at man får en forbindelse av formel I hvor X er

d) eventuelt omsetning av en forbindelse av formel I hvor X er NH-R^-SH, hvor R<1> er som definert ovenfor, med en

forbindelse av formel V

hvor R<2> betyr en C^-Cs-alkylengruppe, IgG er som definert ovenfor og n' betyr et helt tall på 1-20, slik at det oppnås en forbindelse av formel I hvor X er s) eventuelt omsetning av en forbindelse av formel I, hvor X er -NH-R-^-COOH, hvor R<1> er som definert ovenfor, med et immunoglobulin som har formel VI hvor IgG og n> er som definert ovenfor, slik at det oppnås en forbindelse av formel I hvor X er Fig. 1 viser massespektrum for cytorodin S aminoderivat. Fig. 2 viser elueringsmønsteret for cytorodin S-immunoglobulin komplekset og cytorodin S ved kolonnekromato-grafi. Fig. 3 viser UV-spektret for cytorodin S-immunoglobulin

komplekset.

Fig. 4 viser grafisk cellevekst-inhiberende aktiviteter for cytorodin S og cytorodin S-kanin immunoglobulin komplekset mot L1210 celler. Fig. 5 viser grafisk cellevekst-inhiberende aktiviteter for cytorodin S, cytorodin S-MA 204 immunokomplekset, cytorodin S-kanin immunoglobulin komplekset og kontroll mot Colo 205 celler. Fig. 6 viser grafisk cellevekst-inhiberende aktiviteter for cytorodin S-immunoglobulin komplekset og aclacinomycin immunoglobulinkomplekset mot L1210 celler.

Immunoglobulinenheten representert ved IgG betyr en immunoglobulinenhet hvori n aminogrupper er fjernet fra et immunoglobulin., IgG i formelen (I) innbefatter et hvori noen av tiolgruppene (-NH-C-R2-SH) forblir

0

innført i immunoglobulinet. Dette skyldes at ikke alle tiolgruppene i det tiolerte immunoglobulinet (IV) er omsatt med cytorodin S' derivatet, og noen av tio]gruppene forblir ureagerte.

Som immunoglobulinenhet er foretrukket antistoff som kombineres spesifikt med kreftceller. l/n indikerer antallet immunoglobulinmolekyler pr. molekyl av cytorodin S, som er fra 1/1 til 1/15. Dette betyr at 1-15 molekyler av cytorodin S er bundet til et molekyl av immunoglobulinet.

En forbindelse representert ved formelen (I) hvori X er -NH2,

-NHR^-COOH, -NHR^—SH. eller

er en mellomforbindelse for fremstilling av immunoglobulinkompleksene, som, naturligvis, bevarer antikreft aktivitetene for cytorodin S og også kan være et antikreft middel i seg selv.

Ved fremstilling av et kompleks mellom et antikreft middel og immunoglobulin, bindes generelt antikreft midlet til immunoglobulinet ved hjelp av en bifunksjonell kryssbindende reagens, et kondensasjonsmiddel og en avstandsgivergruppe. Det ovenfor nevnte formålet oppnås ved å kombinere et antikreft middel med et bifunksjonelt kryssbindingsmiddel, et kondensasjonsmiddel og en avstandsgiver via en funksjonell gruppe (så som amino-, karboksyl- eller tiolgruppe) av førstnevnte. Cytorodin S har imidlertid ingen slike funksjonelle grupper og bør nødvendigvis modifiseres kjemisk for å fremstille et derivat inneholdende amino, karboksyl eller tiolgruppe. For å fremstille slike derivater av cytorodin S uten å tape dens antikreft aktiviteter, kan også gruppen på sakkaridkjeden omvandles til aminogruppe. Generelle fremgangsmåter for reduksjonen av oksogruppen innbefatter anvendelse av litiumaluminiumhydrid (LialH4), natriumborhydrid (NaBH4) e.l. Reagensen som kan anvendes for selektivt å redusere oksogrupen på sakkaridkjeden, uten å redusere oksogruppen på antracyklinringen, er natriumcyanoborhydrid ((NaBCNH3) eller litiumcyanoborhydrid (LiBCNH3)• Når et slikt reduserende middel anvendes i nærvær av et ammoniumsalt, eller en organisk forbindelse inneholdende aminogruppe, reduseres oksogruppen på sakkaridkjeden selektivt til aminogruppe, slik at derivatet av cytorodin S dannes. Cytorodin S av formelen (II)

omvandles til et cytorodin S derivat (S) hvori X er -NH2 eller -NH-I^-COOH, -NHR<1>SH ved reduksjon med et alkalimetallcyanoborhydrid. i nærvær av et ammoniumsalt eller en organisk forbindelse inneholdende en aminogruppe representert ved NH2-R<1->COOH eller NH2-R<1->SH.

Eksempler på ammoniumsaltet innbefatter ammoniumacetat, ammoniumpropionat og ammoniumklorid. Som eksempler på den aminogruppeholdige organiske forbindelsen kan nevnes kjente a-aminosyrer så som lysin og cystein, 7- og u-aminosyrer så som 7-aminosmørsyre, aminosyreestere så som etylester av glycin, og tiolaminer så som aminoetantiol og aminotiofenol. Eksempler på alkalimetallcyanoborhydridet innbefatter litium (eller natrium) cyanoborhydrid.

Reaksjonen ovenfor utføres enkelt ved å oppløse cytorodin S og et ammoniumsalt eller en aminogruppeholdig organisk forbindelse i et vannblandbart organisk oppløsningsmiddel (som for eksempel metanol eller etanol), eller i en buffer-oppløsning som ikke inneholder primære eller sekundære aminer som er innstilt på pH 8 (som for eksempel en fosfat- eller boratpuffer eller 2,4,6-trimetylpyridin-saltsyrebuffer) og tilsetning til oppløsningen av et alkalimetallcyanoborhydrid ved romtemperatur eller under isavkjøling.

Produktet i reaksjonsblandingen kan utvinnes ved konvensjonelle" fremgangsmåter. For eksempel kan det utvinnes ved å innstille reaksjonsblandingen på pH 8, ekstrahere den med et egnet organisk oppløsningsmiddel, så som diklormetan og avdestillere oppløsningsmidlet fra ekstraktet eller ved hjelp av preparativ HPLC.

Aminoderivatet av cytorodin S som derved fremstilles hvori

X er -NH2 eller -NH-R<1->NH2 omsettes deretter med en maleimidforbindelse som har formelen (III) ovenfor, slik at det oppstår et cytorodin S derivat som har formelen (I) ovenfor, hvori X er

Som et biprodukt dannes N-hydroksysuccinimid.

Reaksjonen ovenfor kan lett utføres ved å behandle et cytorodin S aminoderivat med en maleimidforbindelse i et egnet oppløsndngsmiddel (for eksempel diklormetan, diklor-etan, kloroform, pyridin, trietylamin osv.) ved romtemperatur eller under isavkjøling.

Cytorodin S derivatet som derved oppnås, hvori en maleimidgruppe er innført, er i stand til å undergå en addisjonsreaksjon med et hvilket som helst av tiolgruppeholdige proteiner eller forbindelser. Dobbeltbindingen i maleimidgruppen deltar i dem elektrofile addisjonsreaksjonen med tiolgruppen. Som beskrevet nedenfor, muliggjør derfor addisjonsreaksjon mellom maleiimidgruppen og tiolgruppen innført i immunoglobulin dannelsen av et kompleks.

Generelt er immunoglobulin som anvendes for fremstilling av komplekser fortrinnsvis monoklonalt eller polyklonalt antistoff mot membranproteinet som spesifikt dannes i kreftceller. Det er også ønskelig ved klinisk anvendelse å benytte antistoffet hvorfra Fc delen er fjernet, dersom et antistoff av ikke-humant opphav benyttes. Tatt i betraktning effekti-viteten ved. addisjon av cytorodin S, anvendes imidlertid fortrinnsvis hele antistoffet.

Som spesielt- foretrukket immunoglobulin kan nevnes et monoklonalt antistoff mot kreft-spesifikt protein så som carcinomembryonisk antigen (CEA) eller a-fetoprotein (AFP). Det monoklonale antistoffet mot carsinomembryonisk antigen fremstilles ved en konvensjonell fremgangsmåte hvorved mus behandles med. antigenet, milten isoleres fra musen, miltcellene sammensmeltes med HAT-følsomme myelomceller ved polyetylenglykol-fremgangsmåten, og hybridomet utvelges ved å anvende HAT medium som det selektive mediet og transplanteres i mus.

Før reaksjonen mellom immunoglobulin med cytorodin S inneholdende maleimidgruppe for fremstillingen av et kompleks innføres en tiolgruppe i immunoglobulinet. For å innføre tiolgruppen omsettes immunoglobulinet med en N-succinimid forbindelse som har den generelle formelen (VII)

hvori R<4> har betydningene angitt ovenfor og R<5> står for en tiolbeskyttende gruppe, for eksempel en acylgruppe så som acetyl og en 2-pyridyltiogrupe slik at det oppstår et tiolert immunoglobulin som har den ovennevnte formelen (IV). Som et foretrukket eksempel på N-succinimid forbindelsen (Vil) kan nevnes N-succinimidyl-S-acetyltioacetat SATA). SATA omsettes med aminogruppen i immunoglobulinet slik at det dannes en amidbinding hvori tiolgruppen er beskyttet ved hjelp av en acetylgruppe, og N-hydroksysuccinimid dannes som et biprodukt. Avbeskytt-else av tiolgruppen bevirkes for eksempel med hydroksylamin ved pH 7,5 for å omdanne førstnevnte til den reaktive gruppen

Tiolgruppen er utsatt for å bli oksydert under visse betingelser med det resultat at det dannes immunoglobulin-polymerer. Det er derfor hensiktsmessig å gjennomføre avbeskyttelsen av acetylgruppen ved 25<*>C i ca. 1 time like før reaksjonen med et cytorodin S derivat inneholdende maleimidgriippe. ;Tiolgruppen:innføres i en andel på 1-20, fortrinnsvis 5-20, pr. molekyl, immunoglobulin, avhengig av mengden SATA som benyttes. Innføringen resulterer ikke i tap av antistoff-aktivitet for immunoglobulinet. ;Anvendelsen av N-succinimidyl 3-(2-pyridylditio)propionat ;;som en tiolinnførende ;reagens i stedet for SATA og anvendelse av ditiotreitol som et avbeskyttende middel danner gruppen -NH-C-CH2CH2-SH ;med aminogruppen i immunoglobulinet. ;Immunoglobulinet (IV) inneholdende tiolgruppe som derved fremstilles omsettes med cytorodin S inneholdende maleimid, slik at immunoglobulinkomplekset fremstilles. ;Den ovennevnte reaksjonen kan lett utføres ved å blande en oppløsning; av cytorodin S derivatet inneholdende maleimidgrupper i et vannblandbart organisk oppløsningsmiddel (for eksempel metanol, etanol, dimetylformamid) med en vandig oppløsningf av immunoglobulinet inneholdende tiolgrupper ved pH 7,5. ;Cytorodin S derivater med en tiolgruppe innført hvori X er -NH-R<1>-SH er i stand til å undergå addisjonsreaksjon med et hvilket som-, helst protein eller en hvilken som helst forbindelse- med maleimidgruppe innført. Dobbeltbindingen på maleimidgruppen omsettes med tiolgruppen ved elektrofil addisjonsreaksjon. Som beskrevet nedenfor, kan det derfor dannes et kompleks ved addisjon av tiolgruppen til maleimidgruppen i immunoglobulinet med maleimidgruppe innført. ;Immunoglobulinet som benyttes for fremstilling av komplekset er som beskrevet ovenfor. ;Før reaksjonen mellom immunoglobulin og cytorodin S med en tiolgruppe innført, innføres maleimidgrupper i immunoglobulinet. For å innføre maleimidgruppene omsettes immunoglobulin med en maleimidforbindelse som har formelen (III) ;hvori R<2> har betydningen definert ovenfor, slik at det fremstilles et maleimidert immunoglobulin som har den ovennevnte formelen (V). Foretrukne eksempler på maleimidforbindelsen (III) er N-^-maleimidobutyryloksysuccinimid og andre som angitt ovenfor. Maleimidforbindelsene (III) danner en amidbinding med aminogrupper i immunoglobulinet ved nukleofil substitusjons-reaksjon slik at det dannes et maleimidert immunoglobulin av formelen (V) ;og, som et biprodukt, N-hydroksysuccinimid. ;Avhengig av mengden av maleimidforbindelsen (III) innføres maleimidgrupperr i en andel på 1-20, og fortrinnsvis 5-20 pr. molekyl av immunoglobulinet. Innføringen medfører imidlertid ikke tap av aktiviteten av immunoglobulinet som antistoff. ;Immunoglobulinkompleksene fremstilles ved å omsette immunoglobulinet (V) med maleimidgrupper innført med cytorodin S med en tiolgruppe innført. ;Reaksjonen kan lett utføres ved blanding ved pH 7,5 av en oppløsning av den tiolgruppeholdige cytorodin S i et vannblandbart oppløsningsmiddel (for eksempel metanol, etanol, dimetylformamid e.l.) eller en bufferoppløsning ved pH 7,5 (den samme som- anvendes for oppløsning av immunoglobulin) med en vandig oppløsning av det maleimidgruppeholdige immunoglobulinet. ;Cytorodin S derivatene hvori X er -NH-R<1>-COOH er i stand til binding med aminogrupper av et protein eller en forbindelse ved peptidbinding ved hjelp av et egnet kondensasjonsmiddel. Peptidbindingen dannes ved nukleofil reaksjon av en aktiv ester på karboksylgruppen dannet ved hjelp av kondensasjons-midlet med aminogruppen i proteinet eller forbindelsen. ;Derfor kan et. kompleks dannes ved innføring av cytorodin S derivat via peptidbinding med den nyinnførte karboksylgruppen inn i aminogruppen (sidekjede, så som lycinrest) som opprin-nelig finnes i. immunoglobulinet. ;Cytorodin S derivatene hvori X er -NH-R-L-COOH omvandles til en aktiv ester.- ved hjelp av et kondensasjonsmiddel slik at det dannes et kompleks. For å fremstille den aktive esteren omsettes cytorodin S derivatet hvori X i den ovennevnte formel (I) er -NH-R<1->C00H med et karbodiimid. ;Som foretrukne eksempler på karbodiimidet kan nevnes dicykloheksylkarbodiimid, 1,3-dimetylaminopropyl-3-etylkarbodiimid-hydroklorid, dietylkarbodiimid, difenylkarbodiimid, dibenzyl-karbodiimid, dibenylkarbodiimid, cyanamid o.l. Reaksjonen utføres ved å omsette en oppløsning av cytorodin S derivatet med karbodiimid i et vannblandbart organisk oppløsningsmiddel (for eksempel metanol, etanol, dimetylformamid e.l.) eller i en bufferoppløsning ved pH 7,5 (den samme som benyttes for oppløsning av immunoglobulin) ved romtemperatur i 1 time etterfulgt av tilsats av reaksjonsblandingen til en vandig oppløsning av immunoglobulinet ved pH 7,5. ;Avhengig av mengden av cytorodin S derivat som skal anvendes for reaksjonen, bindes cytorodin S derivatet i en andel på 1-20, og fortrinnsvis 5-20, pr. molekyl av immunoglobulinet. Bindingen medfører imidlertid ikke tap av aktiviteten av immunoglobulin som antistoff. ;Bindingsforholdet mellom cytorodin S og immunoglobulin i komplekset er 1-15:1, dvs. 1-15 molekyler cytorodin S bindes pr. molekyl immunoglobulin. ;En slik høy andel av antikreft komponenten er effektiv for tilveiebringelse av høye antikreft aktiviteter. ;Den kliniske dosen som anvendes av cytorodin S derivatet kan varieres avhengig av administrasjonsmåten, og ligger i et område fra 1 til 20 mg pr. dag for voksne uttrykt ved cytorodin S. ;Det kan tilføres ved intravenøs, intraperitoneal eller rektal administrering. I tilfellet intravenøs administrering kan en intravenøs drypping også anvendes i tillegg til den vanlige intravenøse injeksjonen. ;Farmasøytiske preparater inneholdende cytorodin S derivatet (I) fremstilles ved en konvensjonell fremgangsmåte ved anvendelse av konvensjonelle bærere og additiver. ;Det injiserbare preparatet kan for eksempel være et pulver-formet preparat for injeksjon. Det fremstilles ved å tilsette en eller flere egnede excipienter som for eksempel mannitol, sukrose, laktose, maltose, glukose og fruktose til cytorodin S derivatet (I), oppløsning av blandingen i vann, og oppdelingen av oppløsningen i flasker eller ampuller etterfulgt av lyofilisering og forsegling. ;Det rektale preparatet kan fremstilles fra en lipofil basis så som den semisyntetiske basisen fremstilt ved å blande kakaoolje eller en fettsyretriglycerid med et fettsyremono-glycerid eller et fettsyrediglycerid i forskjellige andeler eller en hydrofil basis så som en polyetylenglykol eller glycerogelatin, ved oppvarming av/blandingen til en oppløs-ning og tilsetning av oppløsningen til en homogen blanding og forming av. preparatet i en form. ;Eksempler på oppfinnelsen vil bli angitt nedenfor. ;Eksempel 1. ;I 2 ml metanol ble det oppløst 10 mg cytorodin S. Til oppløsningen ble det tilsatt en metanoloppløsning (konsentrasjon 10 mg/ml) av 5,8 mg ammoniumacetat, hvilket tilsvarer 10 mol ekvivalenter av cytorodin S og en metanoloppløsning ;(konsentrasjon 10 mg/ml) av 1,4 mg natriumcyanoborhydrid som tilsvarer 3 mol ekvivalenter. Blandingen ble omsatt ved 25"C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble helt i 20 ml avkjølt 0,5% vandig eddiksyre, og blandingen ble ekstrahert med 2 porsjoner av 5 ml diklormetan for å fjerne uomsatt cytorodin S. Den resulterende vandige eddiksyreoppløsningen ble innstilt på pH 8 med en mettet vandig oppløsning av natriumbikarbonat. Den vandige opplesningen ble ekstrahert med 3 porsjoner 2 0 ml ;diklormetan slik at det oppsto et aminoderivat. Diklor-metanoppløsningen ble tørket over vannfritt natriumsulfat, og diklormetanet ble fjernet ved vakuumdestillasjon. Det ble oppnådd 4,8 mg av et aminoderivat av cytorodin S (nedenfor betegnet aminocytorodin S). Produktet ble analysert vedrør-ende renhet ved høytrykks væskekromatografi. Betingelsene var som følger: Kolonne, "SSC-Aguasil PE-2", 4,6 mm x 250 mm (Senshu Kagaku); oppløsningsmiddel, 2,0% trietylammoniumfosfat (pH 3), 75% og acetonitril, 25%; retensjonstid, cytorodin S (25,0 min.)» aminocytorodin S (12,9 min.). I tillegg ble massetallet målt for nevnte cytorodin S derivat oppnådd ved HPLC ved hjelp av et FAB/MS spektrometer ("Nihon Denshi JMS-DX300") for å fremstille et massespektrum på 942 (M+M<+>), som var identisk med det beregnede massetallet. ;I absorbsjonsspektret for derivatet ble det observert en ;spesifikk absorbsjon ved 495 nm avledet fra antracyklinringen av cytorodin S. Dette viser det samme spektret som utgangs-cytorodin S, hvilket indikerer at antikreft aktivitetene ikke tapes i derivatet. ;Eksempel 2 ;I 2 ml diklormetan ble det oppløst 4,8 mg av aminocytorodin S fremstilt i eksempel 1. Til oppløsningen ble det tilsatt en diklormetanoppløsning (konsentrasjon 10 mg/ml) av 3,8 mg N-7-maleimidobutyryloksysuccinimid (fremstilt av Behring Diagnostics, heretter betegnet GMBS) som tilsvarer 5 mol ekvivalenter av aminocytorodin S. Blandingen ble omsatt ved 25"C i 2 timér. Reaksjonsblandingen ble renset ved preparativ tynnsjiktkromatografi slik at det oppsto et GMBS derivat av cytorodin S. Betingelser for tynnsjiktkromatografien var som følger: tynnsjiktplate, 2 mm silikagel "60F-254" (fremstilt av Merck); utviklingsoppløsningsmiddel, metanol:diklormetan = 1:4; Rf verdi, GMBS derivatet (0,82), aminocytorodin S (0,29). GMBS derivatet som derved var fremstilt ble ekstrahert fra tynnsjiktplaten, ekstraktet ble tørket over vannfritt natriumsulfat, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved vakuumdestillasjon. Det ble oppnådd 2,7 mg av GMBS derivatet av cytorodin S;. ;Videre ble renheten av GMBS derivatet analysert ved hjelp av HPLC, og rensing ble utført. Kolonnen og betingelsene som ble anvendt for analysen var som følger:, kolonne, "SSC-Aquasil PE-2", 4,6 mm x 250 mm (Senshu Kagaku); oppløsnings-middel, acetonitril ble tilsatt i 2,0% trietylammoniumfosfat (TEAP, pH 3,0); i løpet av et tidsrom på 30 minutter i en 0-30% lineær gradient utførelse og tilstanden for 30% acetonitril ble fortsatt i ytterligere 30 minutter; strøm-ningshastighet, 1 ml/min.; retensjonstid, 36 minutter for cytorodin S og 38 minutter og 38,6 minutter for GMBS derivatet. Kolonnen og betingelsene som ble anvendt for rensingen var som følger: kolonne, "Senshu Pak NP-318-4252", 10 mm x 250 mm (Senshu Kagaku); oppløsningsmiddel, acetonitril i 2,0% TEAP (pH 3,0) ble tilsatt i løpet av et tidsrom på 20 minutter i en 10-30% lineær gradient utførelse og tilstanden for 30% acetonitril ble fortsatt i ytterligere 15 minutter. På samme måte ble det utført en endring i løpet av et tidsrom på 5 minutter i en 30-100% gradient; strømnings-hastighet, 4 ml/min.: retensjonstid 28 minutter og 28,5 minutter for GMBS derivatet. Eluat fra HPLC ble behandlet med SEP-PAK (C18) patron (fremstilt av Nihon Waters) for å adsorbere cytorodin S derivatet, etterfulgt av vasking med 0,5% vandig eddiksyre og eluering med 0,5% eddiksyre-metanol oppløsning. Eluatet ble utvunnet og tørket under redusert trykk slik at det oppsto ca. 3,2 mg av GMBS derivatet. Renheten av produktet ble igjen analysert ved HPLC under de samme betingelsene som beskrevet ovenfor. ;Videre ble massetallet for nevnte cytorodin S derivat oppnådd ved hjelp av HPLC målt ved hjelp av et FAM/MS spektrometer (fremstilt av Nihon Denshi, "JMS-DX300") slik at man fikk et massespektrum på 1215 (M+H<+>), som ble bekreftet å være massetallet som beregnet, og var massetallet for et kompleks med triglycerol anvendt ved målingen av massespektrum. Videre opprettholdt absorbsjonspektret for derivatet godt den spesifikke absorbsjonen for antracyklinringen rundt 495 nm. ;Videre ble innføring av maleimidgruppen igjen bekreftet ved reaksjonen med aminoetantiol som endret punkt- og topp-posisjonene på TLC og HPLC. Kolonnen og betingelsene for HPLC anvendt for analysen var de samme som beskrevet ovenfor. Retensjonstid: 19,5 minutter og 20,5 minutter for aminocytorodin S og 23 minutter og 23,5 minutter for GMBS derivat aminoetantiol addisjonsproduktet. (Som et kontrollforsøk ble det omsatt en blanding av utgangsaminocytorodin S med aminoetantiol fremstilt under samme betingelser som med GMBS derivatet. Det ble funnet at toppen ved HPLC av aminocytorodin S ikke ble påvirket i det hele tall av inkorporeringen av tiolen). ;Eksempel 3 ;I 1 ml 40 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7,5) inneholdende ;1 mM EDTA ble det oppløst 18 mg kanin immunoglobulin (fremstilt av Sigma). Til oppløsningen ble det tilsatt 10 pl av 100 mM dimetylformamid oppløsning av N-succinimid-S-acetyl tioacetat (fremstilt av Behring Diagnostics, nedenfor betegnet SATA), og blandingen ble omsatt ved 25"C i 20 minutter. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt 50 pl av IM trishydrokloridoppløsning (pH 7,8), og blandingen fikk stå ved 25'C i 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter fraksjonert på en "PD-10" kolonne (fremstilt av Pharmacia) for-ekvilibrert med 50 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7,5) inneholdende EDTA. Det ble oppnådd et SATA derivat av immunoglobulinet. Til SATA derivatet ble det tilsatt 0,5 mM vandig hydroksylaminoppløsning (pH 7,5) inneholdende 0,25 mM EDTA som tilsvarer 50 ekvivalenter av SATA. Blandingen ble omsatt ved 25°C i 1 time for å bevirke deacetylering. Til den vandige oppløsningen ovenfor inneholdende immunoglobulin med SH gruppe innført, ble det tilsatt en oppløsning av GMBS derivatet 10 ganger ekvivalent med SH gruppen i 20 pl dimetylforraamid, og blandingen ble omsatt ved 5'C i 12 timer. Etter fullstendig reaksjon ble reaksjonsblandingen fraksjonert på en 20 mm x 400 mm kolonne av "Sephadex G-25" (fremstilt av Pharmacia) bragt til likevekt med 50 mM fosfatbuf-feroppløsning (pH 7,5) inneholdende 1 mM EDTA. Det ble isolert en fraksjon svarende til globulært protein 160 000. Eluatet ble overvåket ved 280 nm og 496 nm for å identifisere protein og cytorodin S fraksjonene. ;Cytorodin S-immunoglobulin komplekset som derved ble oppnådd ble avsaltet ved dialyse og lyofilisert slik at man fikk 20 mg av et produkt. Mengden bundet cytorodin S pr. molekyl av immunoglobulinet ble beregnet ved absorbsjon ved 495 nm spesifikt for cytorodin S og tørrvekt av komplekset for å finne at 5 molekyler cytorodin S var bundet pr. molekyl immunoglobulin.. Videre kunne 12 molekyler cytorodin S bindes ved å øke mengden SATA. ;Fig. 3 viser UV.-spekteret for komplekset hvori ca. 12 molekyler av cytorodin S er bundet pr. molekyl av immunoglobulinet. UV-spektra for kompleksene demonstrerer at ettersom andelen av bundet cytorodin S økes, forøkes absorbsjonsmak-simum for cytorodin S. ;Eksempel 4 ;Til en oppløsning av 5 mg cytorodin S i 1 ml metanol ble det tilsatt en metanoloppløsning av 2,6 mg 'y-aminosmørsyre (konsentrasjon 1 mg/ml) som tilsvarte 6 mol pr. mol cytorodin S. Etter innstilling av pH med trietylamin til 8 ble det tilsatt 1,4 mg natriumcyanoborhydrid som tilsvarer 3 mol-ekvivalenter, og blandingen ble omsatt ved 25<*>C i 24 timer. Reaksjonsblandingen som derved var fremstilt, ble undersøkt ved TLC for nærvær eller fravær av produktet, etterfulgt av analyse av produktet ved HPLC og rensing. Rf verdier på TLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 0,57 for cytorodin S og 0,28 for ■y-aminobutyrat-derivatet. Reten-sjonstider ved HPLC analysen under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 3 6 minutter for cytorodin S og 29 minutter for 'y-aminobutyrat-derivatet. Rensing ved HPLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 ga ca. 1,5 mg av •y-aminobutyrat-derivatet .

Videre ga måling av massetallet for nevnte derivat ved hjelp av et FAB/MS spektrometer ("JMS-DX300") et massespektrum på 1028 (m+H<+>) som var identisk med det beregnede massetallet.

Videre bevarte absorbsjonsspekteret for derivatet den spesifikke absorbsjonen rundt 495 nm for antracyklinringen av cytorodin S.

Eksempel 5

Til en oppløsning av 2,5 mg cytorodin S "y-aminobutyratderivat i DMF (konsentrasjon 50 mg/ml) ble det tilsatt en DMF oppløsning av 515 pg dicykloheksylkarbodiimid (konsentrasjon 50 mg/ml) som tilsvarte en ekvimolar mengde av cytorodin S derivatet. Blandingen ble omsatt ved romtemperatur i 1 time.

Til en oppløsning av 20 mg kanin immunoglobulin (fremstilt av Sigma) i 1 ml 50 mM fosfatbuffer oppløsning (pH 7,5) ble tilsatt den ovenfor fremstilte DMF oppløsningen av cytorodin S derivatet. Blandingen ble omsatt ved romtemperatur i 30 minutter. Cytorodin S 'y-aminobutyrat-derivatet svarer til 20 mol ekvivalenter til kanin immunoglobulinet. Deretter ble IM tris-saltsyrebuffer oppløsning (pH 7,8) raskt tilsatt, og blandingen ble omrørt og fikk stå i 10 minutter. Den resulterende massen ble undersøkt på en "PD-10"-kolonne (fremstilt av Pharmacia) for-ekvilibrert med 50 mM fosfatbuffer oppløsning for separasjon og rensing.

Eksempel 6

Til en oppløsning av 5 mg cytorodin S i 1 ml metanol ble det tilsatt 1 molar vandig eddiksyreoppløsning av 3,3 mg lysin (konsentrasjon 10 mg/ml) som tilsvarer 6 mol ekvivalenter til cytorodin S og 14 mg natriumcyanoborhydrid som tilsvarer 3 mol ekvivalenter. Blandingen ble omsatt ved 25°C i 24 timer. Reaksjonsblandingen som derved ble oppnådd ble, etter bekreftelse av nærværet eller fraværet av produktet, analysert ved hjelp av HPLC med hensyn på renhet etterfulgt av rensing. Rf verdien som lysinderivatet på TLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 0,20. Reaksjonstid for lysinderivatet ved HPLC analyse under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 27 minutter og 28 minutter. Rensing ved HPLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 ga 2,6 mg av lysinderivatet.

Videre ble massetallet for nevnte derivat målt ved hjelp av et FAB/MS spektrometer ("JMS-DX300") slik at det ble oppnådd et massespektrum på 1071 (M+H<+>) som var identisk med det beregnede massetallet.

Dessuten beholdt absorbsjonsspekteret for derivatet en spesifikk absorbsjon rundt 495 nm for antracyklinringen av cytorodin S.

Eksempel 7

Til en oppløsning av 5 mg cytorodin S i 1 ml metanol ble det tilsatt en metanoloppløsning av 1,7 mg aminoetantiol (konsentrasjon 1 mg/ml) som tilsvarte 6 mol ekvivalenter til cytorodin S og 1,4 mg av natriumcyanoborhydrid som tilsvarte 3 mol ekvivalenter. Blandingen ble omsatt ved 25°C i 24 timer. Reaksjonsblandingen som derved ble oppnådd, ble, etter bekreftelse av nærvær eller fravær av produktet ved hjelp av TLC, analysert vedrørende renhet ved hjelp av HPLC etterfulgt av rensing. Rf verdien for aminoetantiolderivatet på TLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 0,25. Retensjonstid for aminoetantiolderivatet i HPLC analysen under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 28 minutter. Rensing ved HPLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 ga ca. 1,6 mg av aminoetantiolderivatet.

Videre ble massetallet for nevnte derivat målt ved hjelp av et FAB/MS spektrometer ("JMS-DX300") slik at man fikk et masse-spektrum på 1002 (M+H<+>) som var identisk med det beregnede massetallet.

På den annen side ble innføringen av -SH gruppen igjen bekreftet ved reaksjonen med N-etylmaleimid ved endring av punkt- og topp-posisjonene ved TLC og HPLC. (Endringene observert med aminoetantiolderivatet ble ikke observert med cytorodin S og aminocytorodin S) .

Eksempel 8

Til en oppløsning av 5 mg cytorodin S i-l ml metanol ble det tilsatt en metanoloppløsning av 2,7 mg cystein (konsentrasjon 1 mg/ml) som tilsvarte 6 mol ekvivalenter til cytorodin S og 1,4 mg natriumcyanoborhydrid som tilsvarte 3 mol ekvivalenter. Blandingen ble omsatt ved 25"C i 24 timer.

Reaksjonsblandingen som derved ble oppnådd ble, etter

bekreftelse av nærvær eller fravær av produktet ved hjelp av TLC, analysert ved hjelp av HPLC vedrørende renhet etterfulgt av rensing. Rf verdien for cysteinderivatet ved TLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 0,35. Retensjonstid for cysteinderivatet"i HPLC analysen under de samme betingelsene som i eksempel 2, var 32 minutter. Rensing ved HPLC

under de samme betingelsene som i eksempel 2, ga ca. 1,8 mg av cysteinderivatet.

Videre ble massetallet for nevnte derivat målt ved hjelp av et FAB/MS spektrometer (fremstilt av Nihon Denshi) og ga et massespektrum på 1046 (M+H<+>) som var identisk med det beregnede massetallet.

Dessuten ble innføringen av -SH gruppen bekreftet på samme måte som i eksempel 7 ved reaksjonen med N-etylmaleimid ved endring av punkt- og topp-posisjonene (TLC og HPLC).

Eksempel 9

Til en oppløsning av 11 mg kanin-immunoglobulin (fremstilt av Sigma) i 1 ml 50 mM fosfatbuffer oppløsning (pH 7,5) inneholdende 1 mM EDTA ble det tilsatt en DMF oppløsning av 191 jjg N-"Y-maleimidobutyryloksysuccinimid (fremstilt av Behring Diagostics, i det følgende betegnet DMBS) konsentrasjon 50 mg/ml). Blandingen ble omsatt ved 25°C i 2 timer. Til reaksjonsoppløsningen ble det tilsatt 50 pl av 1 M tris-saltsyrebuffer oppløsning (pH 7,8), og blandingen fikk stå ved 25'C i 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter fraksjonert ved hjelp av en "PD-10" kolonne (fremstilt av Pharmacia) for-ekvilibrert med 50 mM fosfatbuffer oppløsning (pH 7,5) inneholdende 1 mM EDTA slik at det oppsto et kanin-immunoglobulin av maleimidinnført type.

En oppløsning av 1,5 mg av cytorodin S aminoetandiolderivatet i DMF (konsentrasjon 100 mg) som tilsvarte 2 mol ekvivalenter av maleimidgruppen innført i kanin-immunoglobulin ble tilsatt til en vandig oppløsning av kanin-immunoglobulinet av maleimidinnført type, fremstilt ovenfor. Blandingen ble omsatt ved 5°C i 12 timer.

Eksempel 10

Til en oppløsning av 5 mg cytorodin S i 1 ml metanol ble det tilsatt en metanoloppløsning av 3,2 mg glycinetylester (konsentrasjon 1 mg/ml) som tilsvarte 6 mol ekvivalenter til cytorodin S og 1,4 mg natriumcyanoborhydrid som tilsvarte 3 mol ekvivalenter. Blandingen ble opptatt ved 25'C i 24 timer. Reaksjonsblandingen som derved ble oppnådd ble, etter bekreftelse ved hjelp av TLC vedrørende nærvær eller fravær av produktet, analysert med hensyn på renhet ved hjelp av HPLC etterfulgt av rensing. Rf verdien for glycinetylesterderivatet ved TLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 0,34. Retensjonstid for glycinetylesterderivatet ved HPLC analyse under de samme betingelsene som i eksempel 2 var 32 minutter og 33 minutter. Rensing ved HPLC under de samme betingelsene som i eksempel 2 ga ca. 1,4 mg av glycinetylesterderivatet .

Videre ble massetallet for nevnte derivat målt ved hjelp av et FAB/MS spektrometer (("JMS-DX300") slik at man fikk et massespektrum på 1028 (M+H<+>) som var identisk med det beregnede massetallet.

Videre bevarte absorbsjonsspekteret for derivatet en spesifikk absorbsjon rundt 495 nm for antracyklinringen av cytorodin S.

Eksempel 11

BALB/C hunn-mus 7-10 uker gamle, ble intraperitonealt administrert 25 pg av renset humant CEA pr. mus sammen med fullstendig Freud's adjuvans. Etter 10 uker ble det intravenøst administrert en oppløsning av 25 pg av CEA i fysiologisk saltvannsoppløsning. Den tredje dagen etter administreringen ble milten isolert, og miltcellene ble smeltet sammen med myelomaceller X63-Ag 8,653 av den ikke-produktive typen. Cellefusjonen og etterfølgende kultivering og kloning ble i det vesentlige utført ved fremgangsmåten ifølge Oi et al. (Oi V.T. & Herzenberg, L.A., "Selected Methods in Cellular Immunology", B.B. Mishell & S.M. Shiigi Eds., side 351, Freeman & Co., San Francisco 1980). Forholdet mellom miltcelle og myelomacelle var 10:1. Blandingen ble sentrifugert i et kort tidsrom for å gi en pellet. Til pelleten ble det dråpevis tilsatt 0,5 ml 42,5% polyetylenglykol (MW 2000, inneholdende 15% dimetylsulfok-syd) , og blandingen ble langsomt omrørt ved 37'C i 2 minutter. Den resulterende blandingen ble fortynnet 20:1 med RPMI medium. Etter sentrifugering ble den suspendert i RPMI-1640 medium inneholdende bovint embryonisk serum. Suspen-sjonen ble fordelt i en 96 brønns mikrotiterplate i en mengde på 5 x IO<5> celler hver. Etter kultivering ved 37°C over natten ble en dråpe HAT medium tilsatt (100 pM hypoxantin, 4 x IO-<4> pM aminopterin, 1,6 x 10-<2> tymidin). Seleksjon av hybridomer ved hjelp av HAT medium ble gjennomført på den 2., 3., 5., 7., 10. og 13. dagen ved å bytte halvparten av medium i hver brønn med nytt HAT medium. Anti-CEA aktivitet for supernatanten fra kulturen ble analysert ved hjelp av RIA eller EIA. Cellene som var funnet aktive ble overført til et større kultursystem eller klonet ved hjelp av en fremgangsmåte med begrenset fortynning. De fusjonerte cellene som derved ble oppnådd ble transplantert inn i bukhulen på mus av den samme stammen, på forhånd behandlet med 0,5 ml tetra-metylpentadekan. 1 til 2 uker etter transplantasjonen ble det oppnådd noen få milliliter bukvæske hvori det homogene monoklonale antistoffet fantes i en konsentrasjon på 5-10 mg/ml.

Et cytorodin S kompleks med det monoklonale antistoffet mot CEA (MA 204) som derved ble oppnådd, ble fremstilt på samme måte som i eksempel 3.

Undersøkelse av antikreft aktivitet av cytorodin S-immunoglobulin-komplekset.

I en 96 brønns mikrotiterplate ble det fordelt 200 pl av tumor cellelinje L1210 (5 x IO<4> celler/brønn). Til cellekul-turen ble det tilsatt 10 pl av hver av cytorodin S (CYT) og cytorodin S-immunoglobulinkomplekset (CYT-kanin IgG). Blandingen ble inkubert ved 37"C i 18 timer. Deretter ble 25 pl av tritium-merket tymidin tilsatt ved en konsentrasjon på 0,5 pCi/brønn, og blandingen ble inkubert ved 37"C i 6 timer. Deretter ble cellene samlet på et filter ved hjelp av en celle-kollektor, tørket og mengden av merket tymidin inkorporert i cellen, ble bestemt ved hjelp av en væske-scintillasjonsteller for sammenligning av DNA-syntetiserings-aktiviteten av cellen. Resultatene er vist i fig. 4. Fig. 4 demonstrerer at antikreft aktiviteten av CYT tilnærmet opprettholdes i CYT-kanin IgG.

Tilsvarende ble virkningen av cytorodin S derivatet (cytorodin S-anti CEA monoklonalt antistoffkompleks) undersøkt vedrørende Colo 2 05 som er en CEA-produserende celle. Resultatene er vist i fig. 5. Mengdene av forsøksmaterialene som ble benyttet var som følger:

Siden MA 204 er høyere i seleksjonsspesifisitet enn kanin IgG tyder den høyere cellevekst-inhiberende aktiviteten av CYT-MA 204 enn av CYT-kanin IgG vist i fig. 5 på at cytorodin S-immunoglobulinkomplekset fremstilt ifølge oppfinnelsen selektivt virker på kreftceller.

Sammenligning med aclacinomcyin-immunoglobulin-kompleks

For sammenligning ble et immunoglobulin-kompleks med aclacinomycin A

som strukturelt ligner på cytorodin S, fremstilt på samme måte som i eksempel 3. Mens cytorodin S ble addert i en andel på 5-12 molekyler pr. molekyl av antistoffet, ble aclacinomycin addert i et forhold så lavt som to molekyler pr. molekyl av antistoffet. DNA synteseinhiberende aktivitet for de to antistoffkompleksene i L1210, ble bestemt ved mengden av tritium-merket tymidin inkorporert i cellene. Resultatene er gjengitt i fig. 6. Fig. 6 viser at aktiviteten av cytorodin S komplekset mot cellene var høyere enn aktiviteten av aclacinomycin-komplekset.

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive cytorodin S derivater representert ved formelen I hvor X er - NH2- NH-R<1->SH

hvor R<1> representer en C1-C5-alkylengruppe eventuelt substituert med karboksy, - NH-R^—COOH

hvor R<1> representerer en C^-Cs-alkylengruppen eventuelt substituert med amino, - NH-R<1->COOCH2CH3

hvor R<1> representerer en C^-Cs-alkylengruppe,

hvor R<2> representerer en C-^-Cs-alkylengruppe,

hvor R<1> representerer en C1-C5-alkylengruppe eventuelt substituert med amino, IgG representerer en immunoglobulinenhet og n betyr et helt tall på 1-15,

hvor R<2> og R<4> er like eller forskjellige og betyr en C- ±-C5-alkylengruppe, IgG representerer en immunoglobulinenhet og n er et helt tall på 1-15,

hvor R<1> betyr en C1-C5-alkylengruppe eventuelt substituert med karboksy, R<2> betyr en C1-C5~alkylengruppe, IgG representerer en immunoglobulin og n er et helt tall på 1-15,

karakterisert ved at den innbefatter a) reduksjon av cytorodin S med formel II med et alkalimetallcyanoborhydrid i nærvær av et ammoniumsalt eller en forbindelse av formelen NH2-R1-SH, NH2-r!<->COOH, NH2-R<1->COOCH2CH3, hvor R<1> i hvert tilfelle er som definert ovenfor, hvorved det oppnås en forbindelse av formel I hvor X er -NH, -NH-R^—SH, NH-R^COOH eller -NH-R<1->COOCH2-CH3, b) eventuelt omsetning av en forbindelse av formel I hvor X er NH2 med en maleimidforbindelse med formel III hvor R<2> er som definert ovenfor, hvorved det oppnås en forbindelse av formel I hvor X er hvor R<2> er som definert ovenfor, c) eventuelt omsetning av en forbindelse av formel I hvor X

er

hvor R<2> er som definert ovenfor, med et tiolert immunoglobulin som har formel IV

hvor R<4> betyr en C1-C5-alkylengruppe, IgG er som definert ovenfor og n' betyr et helt tall på 1-20, slik at man får en forbindelse av formel I hvor X er d) eventuelt omsetning av en forbindelse av formel I hvor X er NH-R^—SH, hvor R<1> er som definert ovenfor, med en forbindelse av formel V

hvor R<2> betyr en C1-C5~alkylengruppe, IgG er som definert ovenfor og n' betyr et helt tall på 1-20, slik at det oppnås en forbindelse av formel I hvor X er

eventuelt omsetning av en forbindelse av formel I, hvor X er -NH-R<1>-COOH, hvor R<1> er som definert ovenfor, med et immunoglobulin som har formel VI

hvor IgG og n er som definert ovenfor, slik at det oppnås en forbindelse av formel I hvor X er