HU198741B - Process for producing cytorodin s derivatives and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Process for producing cytorodin s derivatives and pharmaceutical compositions comprising same Download PDF

Info

Publication number
HU198741B
HU198741B HU872872A HU287287A HU198741B HU 198741 B HU198741 B HU 198741B HU 872872 A HU872872 A HU 872872A HU 287287 A HU287287 A HU 287287A HU 198741 B HU198741 B HU 198741B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
igg
immunoglobulin
derivative
cytorhodin
Prior art date
Application number
HU872872A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT45076A (en
Inventor
Yukiko Tone
Toshiro Iwahashi
Etsuko Ohkouchi
Hiroshi Kitagawa
Isamu Sugawara
Hiroshi Okazaki
Akio Fukuda
Hans G Berscheid
Hitoko Numata
Shunji Senda
Akihiko Matsuo
Hiroshi Watanabe
Itsuo Kurobane
Junko Usui
Original Assignee
Hoechst Japan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Japan filed Critical Hoechst Japan
Publication of HUT45076A publication Critical patent/HUT45076A/hu
Publication of HU198741B publication Critical patent/HU198741B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/12—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D493/14—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás citorodin S származékainak, különösen citorodin S immunoglobulin-komplexeinek, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására.
A találmány szerinti eljárással előállított citorodin S származékok szelektíven hatnak rákos sejtekre és így rákellenes szerekként alkalmazhatók.
A 60-48 994 számú japán szabadalmi leírásból ismeretes, hogy a citorodin S a Streptomyces Y-ll 472 (DSM 2658 számon letétbe helyezve) által termelt nyers citorodin-elegy savas kezelésével állítható elő, és rákellenes aktivitással rendelkezik. Bár a citorodin S jelentős rákellenes aktivitással rendelkezik, mégis szükség van olyan szerek kifejlesztésére, amelyek szelektíven hatnak a rákos sejtekre és biológiailag hozzáférhetők.
Kutatásokat folytattunk olyan citorodin S származékok kifejlesztésére, amelyek a rákos sejtekre nézve szelektivitásban felülmúlják a citorodin S-t, így találtuk a citorodin S immunoglobulin-komplexeketi amelyek megtartják a citorodin S rákellenes aktivitását.
A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletü citorodin S származékok valamint ezeket tartalmazó rákellenes gyógyszerkészítmények előállítására. Az (I) általános képletben
X jelentése -NH2, -NH-R3-C00H, -NH-R1-SH, -NH-RZ-COOCHz-CHa (a), (f), (g),
-NH-R^CO-NH-dgGli/n vagy -NH-R3-CO-NH-(IgG)i/n általános képletü csoport, ahol
R1 1-4 szénatomos alkiléncsoportot jelent,
R2 1-5 szénatomos alkiléncsoportot jelent,
R3 1-7 szénatomos, adott esetben tiovagy aminocsoporttal helyettesített alkiléncsoportot jelent,
IgG immunoglobulin maradékot jelent, n egész számot képvisel, értéke 1-15. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy egy (II) általános képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bór-hidriddel redukálunk ammóniumsó jelenlétében. A kapott citorodin S származékot, ahol X jelentése -NH2, kivánt esetben (III) általános képletű maleimiddel reagáltatjuk, ahol R2 jelentése a fenti, így olyan (I) általános képletű citorodin S származékot kapunk, ahol X jelentése (a) általános képletű csoport, és kivánt esetben ezt tovább reagáltatjuk egy (IV) általános képletű tiolozott immunoglobulinnal, ahol R2 és IgG jelentése a fenti, és n’ jelentése egész szám, értéke 1-20, így olyan (I) általános képletű citorodin S származékot kapunk, ahol X jelentése -NH-R2-CO-NH-(IgG)l/n.
A találmány szerinti eljárás ezen változata [a) eljárás] szerint előnyösen olyan (I) általános képletű citorodin S származékot állítunk eló, ahol X jelentése (g) általános képletű csoport.
Olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NH-R'-SH vagy (f) általános képletű csoport, ahol R1 jelentése 1-4 szénatomos alklléncsoport, R2 jelentése 1-5 szénatomos alkilén-csoport, IgG jelentése immunoglobulin maradék és n egész szám, értéke 1-15, egy (II) általános képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bór-hidriddel redulálunk egy NHz-R'-SH általános képletű vegyület jelenlétében, ahol R1 jelentése a fenti és így olyan (1) általános képletű citorodin S származékokat kapunk, ahol X jelentése -NH-R'-SH, és kivánt esetben a terméket egy (V) általános képletű immunoglobulin-maleimidáttal reagáltatjuk, ahol R2 és IgG jelentése a fenti, és n’ egész szám, értéke 1-20. így olyan (I) általános képletű citorodin S származékot kapunk, ahol X jelentése (f) általános képletű csoport, [b) eljárás]
A találmány szerinti eljárás ezen változata szerint előnyösen olyan (I) általános képletű vegyületeket állítunk elő, ahol X jelentése (f) általános képletü csoport.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan (I) általános képletű citorodin S származékok előállítására, ahol X jelentése -NH-R3-COOH, -NH-R^-COO-Czlls, -NH-R3-CO-NH-(IgG)l/n vagy -NH-R^CO-NH-dgGJi/n képletű csoport, ahol R2, R3, IgG és n jelentése a fenti. A találmány értelmében úgy járunk el. hogy egy (II) képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bór-hidriddel NH2-R3-COOH vagy NHz-R^COOCzHs általános képletű vegyület jelenlétében redukálunk, ahol R3 és R2 jelentése a fenti, és kivánt esetben a terméket egy (VI) általános képletű immunoglobulinnal reagáltatjuk, ahol IgG jelentése a fenti és n egész szám, értéke 1-15, így olyan (I) általános képletű citorodin S származékokat kapunk, ahol X jelentése -NH-R3-CO-NH- (IgG)iyn vagy -NH-R^CO-NH-dgGji/n. [c) eljárás]
A találmány tárgya továbbá eljárás rákellenes gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatóanyagként (I) általános képletű vegyületeket tartalmaznak.
Az 1. ábra az 1. példa szerint előállított citorodin S aminoszármazékának tömegspektrumát mutatja.
A 2. ábra a 3. példa szerinti citorodin S immunoglobulin-komplex (n=5) és a citorodin S oszlopkromatográfiás elúciós mintáját mutatja 280 nm-nél. A baloldali csúcs a komplexhez, a jobboldali pedig az el nem reagált citorodin S-hez tartozik.
A 3. ábra a 3. példa szerinti citorodin S immunoglobulin-komplex (n=12) UV spektrumát mutatja.
A 4. ábra a citorodin S (CYT) és a 3. példa szerinti citorodin S - nyúl immunoglobulin-komplex (n=7, CYT Rab IgG) sejtnövekedést gátló
HU 198741 Β aktivitását mutatja L1210 sejtekkel szemben.
Az 5. ábra a citorodin S (CYT), a 11. példa szerinti citorodin S - MA204 immunkomplex (CYT-MA204, n=4), a
3. példa szerinti citorodin S nyúl immunoglobulin - komplex (CYT-Rab IgG n=2), és CEA elleni monoklonális antitest (MA204) sejtnövekedést gátló aktivitását mutatja Colo 205 sejtekkel szemben.
A 6. ábra a citorodin S immunoglobulin-komplex és aklacinomicin immunoglobulin komplex sejt növekedést gátló aktivitást mutatja L1210 sejtekkel szemben.
A találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületekben R3 jelentése előnyösen olyan fenti jelentésű csoport, amely az ismert 1-7 szénatomos oC-aminosavak, /3—, γ- és ε-aminosavak maradéka, vagy a β-, ?- és ε-tiolaminok maradéka.
R1 és R2 jelentése előnyösen metilén-, etilén- vagy propiléncsoport.
Az IgG immunoglobulin maradék egy immunoglobulin maradéka, amelyből n aminosavat eltávolítottunk. Az (I) általános képletben IgG magába foglalja azokat az immunoglobulin maradékokat is, amelyekben az immunoglobulinba bevezetett tiolcsoportok (-NH-CO-R2-SH) némelyike megmarad. Ez azért lehetséges, mert a (IV) általános képletű tiolozott immunoglobulin nem minden tiolcsoportja reagál a citorodin S származékkal, és így néhány tiolcsoport elreagálatlan marad. így a kapott (I) általános képletű vegyületben n értéke kisebb lehet, mint a (IV) ill. (VI) általános képletű vegyületekben n’ értéke.
Immunoglobulin maradékként előnyösek a rákos sejtekkel specifikusan kapcsolódó antitestek.
Az 1/n érték azt mutatja, hogy hány immunoglobulin molekula kapcsolódik egy citorodin S molekulával. Ez az érték lehet 1/1-1/15. Ez azt jelenti, hogy 1-15 citorodin S molekula kapcsolódik egy immunoglobulin molekulával.
Az olyan (I) általános képletű vegyületek, melyekben X jelentése -NHz, -NHR3-COOH, -NH-RZ-COO-CzHs, -NH-R^SH, (a), (g) vagy (f) általános képletű csoport, immunoglobulin-komplexek előállításához intermedier vegyületek, amelyek a citorodin S rákellenes aktivitásával természetesen rendelkeznek, és önmagukban is alkalmazhatók rákellenes szerként.
A rákellenes hatóanyag és az immunoglobulin komplexének előállításakor általában úgy járunk el, hogy a rákellenes hatóanyagot az immunoglobulinhoz valamely bifunkciós térhálósítószer, kondenzálószer vagy térköztartó molekula segítségével kapcsoljuk. A kapcsolódás valamely funkciós csoporton keresztül, például amino-, karboxil- vagy tiol4 csoporton keresztül történhet. A citorodin S azonban nem tartalmaz ilyen funkciós csoportokat, így kémiailag módosítani kell, hogy amino-, karboxil- vagy tiolcsoportokat tartalmazó származékot kapjunk. Ilyen citorodin S származék előállítása céljából, amely megtartja rákellenes aktivitását, a szacharid lánc oxocsoportját alakítjuk át aminocsoporttá. Az oxocsoport redukcióját általában lítium-alumínium-hidriddel (LiAlHí), nátrium-bór-hidriddel (NaBHí) stb. végezzük. Az antraciklingyűrün levő oxocsoportot érintetlenül hagyó, a szacharid láncon levő oxocsoportot érintő szelektív redukcióhoz nátrium-ciano-bór-hidridet (NaBCIMb) vagy litium-ciano-bór-hidridet (LÍBCNH3) alkalmazunk. Ha ilyen redukálószert alkalmazunk, ammóniumsó vagy aminocsoportot tartalmazó szerves vegyület jelenlétében, a szacharid láncon levő oxocsoport szelektív módon aminocsoporttá redukálódik, így a megfelelő citorodin S származékot kapjuk.
Közelebbről (II) képletű citorodin S-t alakítunk át olyan (I) általános képletű citorodin S származékká, ahol X jelentése -NH2, -NH-R^COOII, -NH-RZ-COO-CzHs, -NH-R^SH, oly módon, hogy alkálifém-ciano-bór-hidrid segítségével redukciót végzünk egy ammóniumsó vagy NHz-R’-COOH, NHz-R^SH, NH2-R2-COOC2H5 általános képletű, aminocsoportot tartalmazó szerves vegyület jelenlétében.
Ammóniumsóként alkalmazhatunk ammónium-acetátot, ammónium-propionátot vagy ammóniumkloridot. Aminocsoportot tartalmazó, fenti általános képletű szerves vegyületként például az ismertetett oC-aminosavak említhetők, igy például lizin, cisztéin, továbbá a β-, χ- és ε-arainosavak, igy például ΐ-amino-vajsav, amino-ecetsavak, például glicin-etil-észter, és a tiolaminok, mint például amino-etán-tiol.
Alkálifém-ciano-bór-hidridként például lítium- (vagy nátrium-) -ciano-bór-hidridet alkalmazunk.
A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a citorodin S-t és egy ammóniumsót vagy aminocsoportot tartalmazó szerves vegyületet vízzel elegyedő szerves oldószerben (például metanolban vagy etanolban) vagy olyan puffer-oldatban oldjuk, amely nem tartalmaz primer vagy szekunder aminokat, és amelynek pH-ja 8 (például foszfát- vagy borót-puffer vagy 2,4,6-trimetil-piridin-hidroklorid-puffer), majd az oldathoz alkálifém-ciano-bór-hidridet adunk szobahőmérsékleten vagy jeges hűtés közben.
A reakcióelegybŐl a terméket ismert módon nyerjük ki. Eljárhatunk például ügy, hogy a reakcióelegy pH-ját 8 értékre állítjuk, alkalmas szerves oldószerrel, például diklór-metánnal extraháljuk, ledesztilláljuk az oldószert, vagy preparatív HPLC-vel nyerjük ki a terméket.
Az így előállított, citorodin S aminoszármazékokat, ahol X jelentése -NH2 egy (III)
HU 198741 Β általános képletű maleimiddel reagáltatjuk, így olyan (I) általános képletű citorodin S származékot kapunk, ahol X jelentése (a) vagy (g) képletű csoport. Melléktermékként N-hidroxi-szukcinimid képződik.
(III) általános képletű maleimidként például Ν-ϊ-maleimido-butiril-oxi-szukcinimid [GMBS, R2=-(CH2)3-1, szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexén-karboxilát alkalmazható.
A fenti reakciót előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy a citorodin S aminoszármazékát alkalmas oldószerben (például diklór-metánban, diklór-etánban, kloroformban, piridinben, trietil-aminban, stb.) szobahőmérsékleten vagy jeges hűtés közben maleimiddel kezeljük.
Az igy kapott citorodin S származékot, amelybe egy maleim idoc söpör tót vezettünk be, addíciós reakcióban bármely, tiolcsoportot tartalmazó proteinnel vagy vegyülettel reagáltatjuk. A maleimidocsoportban jelenlevő kettőskötés vesz részt a tiolcsoporttal végbemenő elektrofil addíciós reakcióban. így, ahogyan ezt később ismertetjük, a maleimidocsoport és az immunoglobulinban kialakított tiolcsoportok között végbemenő addíciós reakció lehetővé teszi a komplex képzését.
A komplex képzésére immunoglobulinként előnyösen rákos sejtekben specifikusán képződő membrán protein elleni monoklonális vagy poliklonális antitestet alkalmazunk. Klinikai alkalmazáskor az is kívánatos, hogy olyan antitestet alkamazzunk, amelyből az Fc proteineket eltávolitottuk, ha nem-humán eredetű antitestet alkalmazunk. A hatékonyság szempontjából azonban a citorodin S mellett a teljes antitestet célszerű alkalmazni.
Különösen előnyös immunoglobullnok a rák-specifikus proteinek, például karcinoembrionális antigén (CEA) vagy oC-fötoprotein (AFP) elleni monoklonális antitestek. Karcinoembrionólis antigén elleni monoklonális antitestet szokásos módon állíthatunk elő, amikor is egereket kezelünk antigénnel, kivesszük az egér lépét, a lépsejteket HAT-érzékeny mieloma sejtekkel fuzionáljuk polietilén-glikolos módszerrel, és a hibridóma sejteket szelektáljuk HAT-tápközegen, mint szelektív tápközegen, és a hibridóma sejteket egerekbe transzplantáljuk.
Mielőtt az immunoglobulint a komplex előállítása céljából maleimidocsoportokat tartalmazó citorodin S-sel reagáltatjuk, az immunoglobulinba tiolc söpör tokát vezetünk be. A tiolcsoport bevezetése céljából az immunoglobulint (VII) általános képletű N-szukcinimiddel reagáltatjuk, ahol R2 jelentése a fenti, és R5 jelentése tiol védőcsoport, például acilcsoport, mint például acetil- vagy 2-piridil-tio-csoport, így a fenti (IV) általános képletű tiolozott immunoglobulint kapjuk.
(VII) általános képletű N-szukcinimidként előnyösen N-szukcinimidil-S-acetil-tioacetát [(VIII) képletű vegyület, SATA] alkalmazható. A SATA-t az immunoglobulin aminocsoportjával reagáltatjuk, így egy -NH-CO-CH2-S-CO-CH3 amidkötés alakul ki, amelyben a tiolcsoport acetilcsoporttal védett formában van jelen, és melléktermékként N-hidroxi-szukcinimid képződik. A tiolcsoportról a védőcsoportot például úgy távolítjuk el, hogy
7,5 pH-nál hidroxil-aminnal reagáltatjuk, igy az előbbi csoportot egy reaktív -NH-CO-CHz-SH csoporttá alakítjuk.
A tiolcsoport bizonyos körülmények között hajlamos oxidálódni, így immunoglobulin polimei· képződik. Ezért kívánatos, hogy az acetilcsoport védőcsoportjának eltávolítását 25 °C-on, kb. 1 óra alatt hajtsuk végre, közvetlenül a maleimidocsoportot tartalmazó citorodin S származékkal végzett reakció előtt.
A tiolcsoportot 1-20, előnyösen 5-20 arányban vezetjük be immunoglobulin molekulánként, a SATA mennyiségétől függően. A bevezetés nem eredményezi az immunoglobulin antitest-aktivitásának elvesztését.
N~szukcinimidil-3-(2-piridil-ditio)-propionát alkalmazása tiolbevezetó reagensként SATA helyett és ditiotretol alkalmazása védőcsoport eltávolító reagensként az -NH-CO-CH2-CH2-SH csoportról az immunoglobulinban levő aminocsoporttal együtt
Az így előállított, tiolcsoportot tartalmazó (IV) képletű immunoglobulint a maleimidocsoportot tartalmazó citorodin S-sel reagáltatjuk, igy a találmány szerinti immunoglobulin-komplexet kapjuk.
A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a maleimidocsoportot tartalmazó citorodin S származék vízzel elegyedő szerves oldószerre] (pédául metanollal, etanollal, dimetil-formamiddal) készült oldatát 7,5 pH értéknél a tiolcsoportot tartalmazó immunoglobulin vizes oldatával keverjük.
A tiolcsoportot tartalmazó citorodin S származék, ahol X jelentése -NH-R1-SH, maleimidocsoportot tartalmazó proteinnel vagy más vegyülettel addíciós reakcióba lép. A maleimidocsoport kettőskötése a tiolcsoporttal elektrofil addíciós reakcióban reagál. Ahogyan ezt a későbbiekben ismertetjük, komplex képezhető úgy, hogy a tiolcsoportot és az immunoglobulinban jelenlevő maleimidocsoportot reagáltatjuk.
A találmány szerinti eljárásban a komplex képzésére alkalmazható immunoglobulint a későbbiekben írjuk le.
Mielőtt az immunoglobulint a tiolcsoportot tartalmazó citorodin S származékkal reagáltatjuk, az ímmunoglobulinba maleimidocsoportot vezetünk be. E célból egy (III) általános képletű maleimidszármazékot, ahol R2 jelentése a fenti, reagáltatunk immunoglobulinnal, igy az (V) általános képletű, maleimi5
HU 198741 Β docsoportot tartalmazó immunoglobulin származékot kapjuk.
(III) általános képletú maleimid-származékként előnyösen N-^-maleimido-butiril-oxi-szukcinimidet, stb. használunk.
A (III) általános képletú maleiinidszármazék amidkötést képez az immunoglobulin aminocsoportjaival nukleofil szubsztitúciós reakcióban, így (V) általános képletú, maleimidocsoportot tartalmazó immunoglobulin képződik, és melléktermékként N-hidroxi-szukcinimid.
A (III) általános képletú maleimidszármazék mennyiségétől függően a maleimidcsoportot immunoglobulin molekulánként 1-20, előnyösen 5-20 arányban visszük be. A bevezetés azonban nem eredményezi az immunoglobulin antitest-aktivitásának elvesztését.
A találmány szerinti immunoglobulin komplexet úgy állítjuk elő, hogy a maleimidocsoportokat tartalmazó, (V) általános képletú immunoglobulin-származékot a tiolcsoportot tartalmazó citorodin S származékkal reagáltatjuk.
A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a tiolcsoportokat tartalmazó citorodin S származék vizzel elegyedő szerves oldószerrel (például metanollal, etanollal, dimetil-formamiddal, stb.) készült oldatát 7,5 pH értéknél a maleimidocsoportokat tartalmazó immunoglobulin 7,5 pH-jú pufferrel (ugyanazzal, mint amelyet az immunoglobulin oldáséra használunk) készült oldatával keverjük.
A citorodin S származék, amelyben X jelentése -NH-R3-COOH, alkalmas kondenzálószer jelenlétében proteinek vagy más vegyületek aminocsoportjaival peptidkötésre képes. A peptidkötés a karboxilcsoport aktív észtere és a protein vagy más vegyület aminocsoportja között, kondenzélószer alkalmazása mellett nukleofil reakcióban alakul ki.
Ennek megfelelően komplexet úgy képezhetünk, hogy peptidkötést alakítunk ki a citorodin S származék bevezetett karboxilcsoportja és az immunoglobulinban eredetileg jelenlevő (oldallánc például lizinmaradék) aminocsoport között.
A citorodin S származékokat, amelyekben X jelentése -NH-R3-COOH, aktív észterré alakítjuk egy kondenzálószerrel, igy komplex képzéséhez alkalmazzuk. E célból az olyan citorodin S származékot, ahol X jelentése az (I) általános képletben -NH-R3-COOH, karbodiimiddel reagáltatjuk.
Karbodiimidként előnyösen diciklohexil-karbodiimidet, l,3-dimetil-amino-propil-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot, dietil-karbodiimidet, difenil-karbodiimidet, dibenzilkarbodiimidet, ciénamidot, stb. használunk. A reakciót úgy végezzük, hogy a citorodin S származékot karbodiimiddel reagáltatjuk egy vizzel elegyedő szerves oldószerben (például metanolban, etanolban, dimetil-formamidban, stb.) vagy egy 7,5 pH-jú pufferben (ugyanabban, mint amelyet az immunoglobulin oldé6 sára használunk), szobahőmérsékleten egy óra hosszat, majd a reakcióelegyet az immunoglobulin 7,5 pH-jú vizes oldatához adjuk.
A citorodin S származék mennyiségétől függően a citorodin S származékot immunoglobulin molekulánként 1-20, előnyösen 5-20 arányban kapcsoljuk. A kapcsolás azonban nem eredményezi a globulin antitest-aktivitásának elvesztését.
A citorodin S és az immunoglobulin kötési aránya a komplexben 1-15:1, azaz 1-15 molekula citorodin S kapcsolódik 1 molekula immunoglobulinhoz.
Az ilyen magas arányban alkalmazott rákellenes komponens eredményezi a nagy rákellenes aktivitás előállítását.
A találmány szerinti citorodin S származék klinikai dózisa az alkalmazás módjától függ, általában felnőtt esetén napi 1-20 mg citorodin S.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények intravénásán, intraperitoneálisan vagy rektálisan alkalmazhatók. Intravénás alkalmazás esetén a szokásos intravénás injekciók mellett az intravénás cseppek is alkalmazhatók.
Az (I) általános képletú citorodin S származékokat tartalmazó gyógyszerkészítmények a szokásos módon, szokásos hordozóés adalékanyagok alkalmazásával készíthetők.
Az injektálható készítmény lehet például injekciós célra szánt por alakú készítmény. Ezt úgy készíthetjük, hogy egy vagy több alkalmas segédanyagot, például mannitot, szacharózt, laktózt, maltózt, glükózt, vagy fruktózt adunk az (I) általános képletú citorodin S származékhoz, az elegyet feloldjuk vízben, és az oldatot flakonokba vagy ampullákba töltjük, majd liofilizáljuk, és lezárjuk.
A rektális készítményt liofilizált alapból, például szemiszintetikus alapból készíthetjük, amelyet úgy állítunk elő, hogy kakaóvajat vagy zsirsav-triglicerideket zsírsav-monogliceriddel vagy zsirsav-digliceriddel keverünk különböző arányban, vagy készíthetjük hidrofil alapból, például polietilén-glikolból vagy glicerozselatinból úgy, hogy az elegyet felmelegítve megolvasztjuk, homogén keveréket képezünk, és olvadt formájú készítményt állítunk elő.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa ml metanolban feloldottunk 10 mg citorodin S-t. Az oldathoz hozzáadtuk 5,8 mg ammóniuin-acetát 10 mg/ml-es metanolos oldatát, amely megfelel a citorodin S 10 mólegyenértékének, továbbá 1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidrid 10 mg/ml-es metanolos oldatát, amely megfelel 3 mólegyenértéknek. Az elegyet 25 °C-on 4 óra hosszat reagáltattuk. A
HU 198741 Β reakcióelegyet 20 ml lehűtött 0,5%-os vizes ecetsav-oldatba öntöttük, és az elegyet kétszer 5 ml diklór-metánnal extraháltuk az el nem reagált citorodin S eltávolítására. A kapott vizes ecetsavas oldat pH-ját telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal 8-ra állítottuk be. A vizes oldatot háromszor 20 ml diklór-metánnal extraháltuk, az aminoszármazék elválasztására. A diklór-metános fázist vízmentes nátrium-szulfáton megszorítottuk és a diklór-metánt vákuumban ledesztilláltuk. Így 4,8 mg citorodin S amino-származékot kaptunk, amelyet a továbbiakban amino-citorodin S-ként említünk. A termék tisztaságét nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) ellenőriztük. A körülmények a következők: SSC-Aquasil PE-2, 4,6 mm x 250 mm oszlop (Senshu Kagaku gyártmány); oldószer: 75% 2,0%-os trietil-ammónium-foszfát (pH=3), 25% acetonitril; retenciós idő citorodin S: 25,0 perc, aminocitorodin S: 12,9 perc. A HPLC-vel kapott citorodin S származék tömegszámát FAB/MS spektrométerrel (Nihon Denshi JMS-DX300) mértük meg, 942 (M+H*) tömegspektrumot kaptunk, amely megegyezik a számítottal.
A származék abszorpciós spektrumában specifikus abszorpció volt megfigyelhető 495 nm-nél, ami a citorodin S antraciklin gyűrűjének tulajdonítható. Ez ugyanolyan spektrummal rendelkezik, mint a kiindulási citorodin S, ami azt mutatja, hogy a származék rákellenes aktivitása nem veszett el.
2. példa ml diklór-metánban feloldottunk
4.8 mg, az 1. példa szerint előállított amino-citorodin S-t. Az oldathoz hozzáadtuk
3.8 mg N-'x-maleimido-butiril-oxi-szukcinimid (Behring Diagnostics gyártmány, a továbbiakban GMBS-ként említjük) 10 mg/ml-es diklór-metános oldatát, amely az amino-citorodin S 5 mólegyenértékének felel meg. A reakcióelegyet 25 °C-on 2 óra hosszat reagáltattuk. A reakcióelegyet ezután preparativ vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) tisztítottuk, és citorodin S GMBS-származékát nyertük ki. A vékonyréteg-kromatográfia körülményei: vékonyréteg lemez, 2 mm szilikagél 60F-254 (Merck gyártmány); kifejlesztő oldószer metanol és diklór-metán 1:4 térfogatarányú elegye; Rf-érték, GMBS-származék: 0,82, amino-citorodin S: 0,29. Az így előállított GMBS származékot extraháltuk a vékonyréteg-lemezről, az extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton megszárítottuk, az oldószert vákuumban ledesztilláltuk. így 2,7 mg citorodin S GMBS-származékot kaptunk.
A GMBS-származék tisztaságát HPLC-vel vizsgáltuk, és tisztítottuk. Az elemzéshez alkalmazott feltételek: 4,6 mm x 250 mm méretű SSC-Aquasil PE-2 (Senshu Kagaku) oszlop; oldószer: acetonitrilt adagoltunk 2,0%-os trietil-ammónium-foszfátban (TEAP, pH=3,0) 30 perc alatt 0%-30% lineáris gradiensnek megfelelően, majd a 30% acetonitril adagolását végeztük 30 percig; átfolyási arány 1 ml/perc; retenciós idő, citorodin S: 36 perc, GMBS származék: 38 és 38,6 perc. A tisztításhoz alkalmazott feltételek: 10 mm x x 250 mm méretű Senshu Pák NP-318-4252 oszlop (Senshu Kagaku); oldószer: acetonitrilt adagoltunk 2,0%-os TEAP-ban (pH=3,0) 20 percig 10%-30% lineáris gradiensnek megfelelően, majd a 30%-os acetonitril adagolást folytattuk további 15 percig. Hasonlóképpen 5 perc alatt változtattunk a 30%-100% gradiensnek megfelelően; átfolyási arány: 4 ml//perc; retenciós idő, GMBS-származék: 28 és
28.5 perc. A HPLC eluátumát SEP-PAK (Cis) töltetre vittük fe) (Nihon Waters gyártmány), ahol adszorbeáltattuk a citorodin S származékot, majd 0,5%-os vizes ecetsav-oldattal mostuk, és 0,5%-os metanolos ecetsav-oldattal eluáltuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson megszorítottuk, és így kb, 3,2 mg GMBS-származékot kaptunk. A termék tisztaságát HPLC-vel a fenti körülmények között vizsgáltuk.
A HPLC-vel kapott citorodin S származék tömegszámát FAB/MS spektrométerrel (Nihon Denshi gyártmány, JMS-DX300) mértük, 1215 (M+H*) tömegspektrumot kaptunk, mely megfelel a számítottnak, azaz a tömegspektrum mérésében alkalmazott tioglicerinnel alkotott komplex tömegszémának. A származék abszorpciós spektruma megtartotta az antraciklin gyűrű specifikus abszorpcióját 495 nm körül.
Emellett a maleimidocsoport bevezetését megerősítette az, hogy az aminoetán-tiollal végzett reakcióval megváltoztak a foltok és csúcsok helyei a TLC-ben és a HPLC-ben. Az elemzésre használt feltételek a HPLC-ben ugyanazok, mint fent, Retenciós idő, amino-citorodin S: 19,5 és 20,5 perc, GBMS-származék és amino-etán-tiol adduktum: 23 és
23.5 perc. (Kontroll kísérletként a kiindulási amino-citorodin S és amino-etán-tiol elegyét, amelyet ugyanolyan körülmények között készítettünk, mint a GMBS-származékkal, reagáltattuk. Úgy találtuk, hogy az amino-cítorodin S HPLC-csúcsait nem érintette a tiol beépítése).
3. példa mmól/l EDTA-t tartalmazó 1 ml 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldatban (pH=7,5) feloldottunk 18 mg nyúl immunoglobulint (Sigma gyártmány). Az oldathoz hozzáadtunk 10 pl 100 mmól/l-es dimetil-formamidos N-szukcinimidil-S-acetil-tioacetát-oldatot (Behring Diagnostics gyártmány, a továbbiakban SATA), és az elegyet 25 °C-on 20 percig reagáltattuk. A reakcióelegyhez hozzáadtunk 50 μΙ 1 mól/l-es trisz-hidrokloridot (pH=7,8),
-6π
HU 198741 Β és a reakcióelegyet 25 °C-on 5 percig állni hagytuk. A reakcióelegyet ezután PD-10 oszlopon (Pharmacia gyártmány) frakcionáltuk, az oszlopot előzetesen EDTA-t tartalmazó 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) kiegyensúlyoztuk. így az immunoglobulin SATA származékát kaptuk. A SATA származékhoz 0,25 mmól/1 EDTA-tartalmu 0,5 mmól/1-es vizes hidroxil-amin-oldatot (pH=7,5) adtunk, amely a SATA 50 mólegyenértékének felel meg. Az elegyet 25 °C-on egy óra hoszszat reagáltattuk, a dezacetilezés elvégzésére. A fenti, SH csoportokat tartalmazó immunoglobulin vizes oldatához az SH csoportok 10-szeres egyenértékének megfelelő citorodin S GMBS származékot adtunk 20 pl dimetil-forniamidban, és az elegyet 5 °C-on 12 óra hosszat reagáltattuk. A reakció befejezése utón a reakcióelegyet 20 mm x 400 mm méretű Sephadex G-25 (Pharmacia gyártmány) oszlopon frakcionáltuk, amelyet előzetesen 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) egyenlítettünk ki. A 160 000 globuláris proteinnek megfelelő frakciókat elválasztottuk. Az eluátumol 280 nm-nél és 495 nm-nél vizsgáltuk a citorodin S és protein frakciók azonosítására.
Az így kapott citorodin S - nyúl immunoglobulin-komplexet, amely megfelel olyan (I) általános képletű vegyületnek, ahol X jelentése (g) képletű csoport, dialízissel sótalanítottuk és liofilizáltuk, így 20 mg terméket kaptunk. Az immunoglobulin molekulánként megkötött citorodin S mennyiségét a 495 nm-nél mért, citorodin S-re specifikus abszorpció és a komplex száraz tömege alapján számítottuk, és úgy találtuk, hogy egy molekula immunoglobulin 5 molekula citorodin
S-t kötött meg. Továbbá, 12 molekula citorodin S-t lehetne megkötni a SATA mennyiségének növelésével.
A 3. ábra a komplex UV spektrumát mutatja, amelyben egy molekula immunoglobulin kb. 12 molekula citorodin S-t kötött meg. A komplex UV spektrumai azt mutatják, hogy amennyire a megkötött citorodin S aránya növekszik, annyira növekszik a citorodin S abszorpciós maximuma.
4. példa mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtunk 2,6 mg ^-amino-vajsav 1 mg/ml-es metanoios oldatét, amely megfelel 6 mólnak citorodin S mólonként. Miután az oldat pH-ját trietil-aminnal 8-ra állítottuk, hozzáadtunk 1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely megfelel 3 mólegyenértéknek. Az elegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. Az így kapott reakcióelegyet TLC-vel vizsgáltuk a termék jelenlétére, majd HPLC-vel elemeztük a tisztaságot és tisztítottuk. A TLC Rf értéke, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, citorodin S: 0,57, ϊ-amino-vajsav-szórmazék: 0,28. A HPLC-ben a retenciós idő, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, citorodin S: 36 perc, -amino-vajsav-származék: 29 perc. HPLC-vel végzett tisztítással, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, kb. 1,5 mg K-amino-vajsav-szórmazékot kaptunk.
A tömegszám meghatározása FAB/MS spektrométer (JMS-DX300) segítségével 1028 (M+H*) tömegspektrumot adott, amely megfelel a számítolt tömegszómnak.
Emellett a származék abszorpciós spektruma jól megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjének a 495 nm-nél megjelenő specifikus abszorpcióját.
5. példa
2,5 mg citorodin S ü-amino-vajsav-szórmazéka 50 mg/ml-es DMF-es oldatához hozzáadtuk 515 /jg diciklohexil-karbodiimid DMF-fel készült 50 mg/ml-es oldatát, amely a citorodin S ekvimoláris mennyiségének felel meg. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 óra hosszat reagáltattuk.
mg nyúl immunoglobulin (Sigma gyártmány) 1 ml 50 mmól/l-es foszfát-pufferrel (pH=7,5) készült oldatához hozzáadtuk a fenti, citorodin S származék DMF-es oldatot. Az elegyet szobahőmérsékleten 30 percig reagáltattuk. A citorodin S κ-amino-vajsav-származéka megfelel a nyúl immunoglobulin 20 mólegyenértékének. Ezután gyorsan hozzáadtunk 1 mól/1 trisz-hidroklorid-puffert (pH=7,8), a reakcióelegyet kevertük, majd 10 percig állni hagytuk. A kapott anyagot PD-10 oszlopra (Pharmacia gyártmány) vittük fel, amelyet előzőleg 50 mmól/l-es foszfát-pufferrel egyensúlyoztunk ki. A kapott komplex megfelel az (I) általános képletnek, ahol X jelentése -NH-R3-CO-NH-(JgG)i/n, ahol n értéke 12.
6. példa mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtuk 3,3 mg lizin 1 mól/l-es vizes ecetsavval készült 10 mg/ml koncentrációjú oldatát, amely a citorodin S 6 mólegyenértékének felel meg, és 14 mg nótrium-ciano-bór-hidridet, amely 3 mólegyenértéknek felel meg. Az elegyet 25 C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. A kapott reakcióelegyet, a termék jelenlétének ellenőrzése után, HPLC-vel tisztaságra nézve vizsgáltuk, majd tisztítottuk. A lizin-származék Rf értéke ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában 0,20. A lizin-származék retenciós ideje HPLC-ben ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 27 és 28 perc. HPLC-vel végzett tisztítás, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, kb.
2,6 mg lizin-származékot eredményezett.
-713
HU 198741 Β
A származék tömegszamát FAB/MS spektrométerrel (JMS-DX300) mértük, 1071 (M+H*) tömegspektrumot kaptunk, amely a számítottnak felel meg.
A származék abszorpciós spektruma megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjére jellemző specifikus abszorpciót 495 nm-nél.
7. példa mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtuk 1,7 mg amino-etán-tiol 1 mg/ml-es metanolos oldatát, amey megfelel a citorodin S 6 mólegyenértékének, és 1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely 3 mólegyenértéknek felel meg. A reakcióelegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. A kapott reakcióelegyet, miután TLC-vel ellenőriztük a termék jelenlétét, HPLC-vel vizsgáltuk tisztaságra, és tisztítottuk. Az amino-etán-tiol-származék Rf értéke a TLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában 0,25. Az amino-elán-tiol-származék retenciós ideje a HPLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 28 perc. A HPLC-vel végzett tisztítás, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, mintegy 1,6 mg amino-etán-tiol-származékot eredményezett.
Az említett származék tömegszáma FAB/MS spektrométerrel (JMS-DX300) mérve 1002 (M+H*) értéket adott, amely megegyezett a számítottal.
Az említett származék abszorpciós spektruma jól megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjére jellemző 495 nm körüli specifikus abszorpciót.
Másrészt az -SH csoportok bevezetését N-etil-maleimiddel végzett reakció után a TLC és HPLC foltok és csúcsok megváltozása igazolta (az amino-etán-tiol-származéknál megfigyelt változások nem jelentkeztek a citorodin
S.-nél és amino-citorodin S-nél).
8. példa mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatéhoz hozzáadtuk 2,7 mg cisztein 1 mg/ml-es metanolos oldatét, amely megfelel a citorodin S 6 mólegyenértékének, és 1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely megfelel 3 mólegyenértékének. A reakcióelegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. Az így kapott reakcióelegyet, miután TLC-vel ellenőriztük a termék jelenlétét, HPLC-vel tisztaságra vizsgáltuk, és tisztítottuk. A cisztein-származék Rf értéke a TLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 0,35. A cisztein-származék retenciós ideje a HPLC elemzésben ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 32 perc. A HPLC-vel végzett tisztítás, amelyet ugyanolyan körülmények között végeztünk, mint a
2. példában, kb. 1,8 mg cisztein-származékot eredményezett.
Az említett származék tömegszáma FAB/MS spektrométerrel (Nihon Denshi gyártmány) mérve 1046 (M+H*) értéket adott, amely megfelel a számítottnak.
Az -SH csoport bevezetését a 7. példában ismertetett módon igazoltuk, vagyis az N-etil-maleimiddel végzett reakció után a TLC és HPLC foltok és csúcsok helye megváltozott.
9. példa mg nyúl immunoglobulin (Sigma gyártmány) 1 ml 1 mmól/l EDTA-tartalmú 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) készült oldatához hozzáadtuk 191 pg N-^-maleimido-butiril-oxi-szukcinimid (Behring Diagrostics gyártmány, a továbbiakban GMBS) 50 mg/ml-es DMF-es oldatát. A reakcióelegyet 25 °C-on 2 óra hosszat reagáltattuk. Ezután a reakcióelegyhez hozzáadtunk 50 jul 1 mó)/l-es trisz-hidroklorid puffer-oldatot (pH=7,8), és az elegyet 25 °C-on 5 percig állni hagytuk. A reakcióelegyet ezután PD-10 oszlopon (Pharmacia gyártmány) frakcionáltuk, az oszlopot előzőleg 1 mmól/l EDTA-tartalmú 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) kiegyensúlyoztuk, így bevezetett maleimidocsoportokat tartalmazó nyúl immunoglobulint kaptunk.
A 7. példában előállított, bevezetett -SH csoportokat tartalmazó citorodin S származékot reagáltattuk a bevezetett maleimidocsoportokat tartalmazó nyúl immunoglobulinnal.
1,5 mg citorodin S amino-etán-tiol származék 100 mg/ml-es DMF-es oldatát, amely megfelel a maleiniidocsopor tokát tartalmazó nyúl immunoglobulin 2 mólegyenértékének, hozzáadtuk a fenti módon előállított, maleimidocsoportot tartalmazó nyúl immunoglobulinhoz. A reakcióelegyet 5 °C-on 12 óra hosszat reagáltattuk. A kapott komplex megfelel az (!) általános képletnek, ahol X jelentése (f) képletű csoport, n értéke 12.
10. példa mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtuk 3,2 mg glicin-etil-észter 1 mg/ml-es metanolos oldatát, amely megfelel a citorodin S 6 mólegyenértékének, és
1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely megfelel 3 mólegyenértéknek. Az elegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagáltattuk. Az így kapott reakcióelegyet, miután TLC-vel igazoltuk a termék jelenlétét, HPLC-vel tisztaságra vizsgáltuk, és tisztítottuk. A gliein-etil-észter-származék Rf értéke a TLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában 0,34. A glicin-etil-észter-származék retenciós 9
-815
HU 198741 Β
Eredmények
Vegyület Retenciós idő (perc)
1. vizsg. 2. vizsg. 3. vizsg.
ideje a HPLC-ben, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 32 és 33 perc. A HPLC-vel végzett tisztítás, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, kb.
1,4 mg glicin-etil-észter-származékot eredményezett.
Az említett származék tömegszáma FAB/MS spektrométerrel (JMS-DX300) mérve 1028 (M+H·) értéket adott, amely megfelel a számítottnak.
A származék abszorpciós spektruma jól megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjére jellemző, 495 nm-nél megjelenő abszorpcióját.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott citorodin S és előállított termékek kromatográfiás vizsgálati eredményei
1. Vizsgálat 254 nm-nél Oszlop: Senshu-Pak, reverz fázis ODS oszlop,
4,6x250 mm.
Mobil fázis: A oldószer: acetonitril
B oldószer: 2,0% trietil-ammóni
um-foszfát, pH=3,0
Gradiens: Idő A oldó- B oldó-
szer (%) szer (%)
0.0 perc 0.0 100
30.0 perc 30.0 70.0
40.0 perc 30.0 70.0
Átfolyási arány: 1,0 ml/perc
2. Vizsgálat 254 nm-nél Oszlop: Brown Lee Spheri 5 RP-18,
4,6x100 mm.
Mobil fázis: A oldószer: acetonitril
B oldószer: 2,0% trietil-ammónium-foszfát, pH=3,0
Gradiens: Idő A oldó- B oldó-
szer (%) szer (%)
0.0 perc 0.0 100
30.0 perc 30.0 70.0
40.0 perc 30.0 70.0
Átfolyási arány: 1,5 ml/perc.
3. Vizsgálat 280 nm-nél Oszlop: Toyosoda gél G 3000SW, 7,5x600 mm Mobil fázis: 20 mmól/1 foszfát, 200 mmól/1 NaCl, pH=7,0
Átfolyási arány: 0,5 ml/perc.
Eredmények
Vegyület Retenciós idő (perc)
1. vizsg. 2. vizsg. 3. vizsg.
Citorodin S 36.8 26.5 47.9
Amino-citorodin S 28.0 21.5 47.9
GMBS- 38.0 28.0 47.9
-Amino-citorodin S 38.7 29.0 47.9
NyúlIgG 0.97 30.2
Nyúl IgG konjugátum 10 28.6 22.5 47.9
3. példa, n=12)
MA208 (nio- - 0.97 32.2 noklonális antitest
CEA ellen)
MA208 kon- - 0.97 32.2 jugátum (n=12) * 3
Mivel az amino- és a GMBS-amino-citorodin S két diasztereoizomert tartalmaz, két retenciós idő jelentkezik.
Az 5. és 9. példa szerint előállított nyúl IgG konjugátum retenciós ideje megegyezik a
3. példa szerint előállítottéval, illetve a hibahatáron belüli eltérés mutatkozik. Az MA208 és MA208 konjugátum előállítását a 11. példa szerinti módon végeztük.
11. példa
Nőstény, 7-10 hetes BALB/C egereknek intraperitoneálisan adagoltunk 25 pg tisztított humán CEA-t komplett Freund-féle adjuvánssal együtt. 10 hét után intravénásán adagoltunk 25 pg CEA-t fiziológiás sóoldatban. Az adagolás utáni 3. napon eltávolítottuk az állatok lépét, a lépsejteket fuzionáltuk nem-termelő típusú mieloma X63-Ag 8653 sejtekkel. A sejtfúziót és a tenyésztést Oi és munkatársai módszerével végeztük (Oi, V. T. és Herzenberg, L. A., Selected Methods in Cellular Immunology, Β. B. Mishell and S. M. Shiigi kiadó, 351. oldal, Freeman and Co., San Francisco, 1980). A lépsejtek és mielomasejtek aránya 10:1 volt. Az elegyet rövid centrifugálással ülepítettük. Az üledékhez cseppenként hozzáadtunk 0,5 ml 42,5%-os polietilén-glikolt (móltömeg 2000, 15% dimetil-szulfoxidot tartalmazott), és az elegyet lassan kevertük 37 °C-on 2 percig. A kapott elegyet 20:1 arányban hígítottuk RPMI tápközeggel. Centrifugálás után szarvasmarha embríószérumot tartalmazó RPMI-1640 tápközegben szuszpendáltuk. A szuszpenziót lyukanként 5xl05 sejt mennyiségben egy 96 lyukú míkrotiter lemezre vittük. 37 °C-on egy éjszakán át végzett tenyésztés után mindegyik lyukba egy csepp HAT-tápközeget juttattunk (100 pmól/1 hipoxantin, 4x10** pmól/1 aminopterin, l,6xl02 timidin). A hibridoma sejtek szelektálását a HAT tápközeggel úgy végeztük, hogy a 2., 3., 5., 7., 10. és 13. napon kicseréltük minden lyukban a tápközeg felét friss HAT tápközeggel. A tenyészetek felülúszójának anti-CEA aktivitását RIA és EIA módszerrel mértük. Az aktívnak talált sejteket nagyobi) tenyésztő rendszerbe
-917
HU 198741 Β vittük át, vagy határhígításos módszerrel klónoztuk. Az így kapott fuzionált sejteket ugyanazon törzsből származó, előzetesen 0,5 ml tetrametil-pentadekánnal kezelt egerek hasüregébe transzplantáltuk. A transzplantálás után egy-két héttel néhány ml hasűri folyadékot vettünk, amely homogén monoklón antitestet tartalmazott 5-10 mg/ml koncentrációban.
Az így kapott monoklonális, CEA (MA 204) elleni antitest citorodin S komplexét a 3. példa szerinti módon készítettük.
Citorodin S immunoglobulin komplex rákellenes aktivitásának vizsgálata lyukú mikrolemezen elosztottunk 200 pl 5xl04 sejt/ml koncentrációjú L1210 tumor sejtvonalat, amelyet RPMI 1640-10% fetal borjúszérum tápközegben tenyésztettünk (lxlO4 sejt/lyuk). A sejttenyészethez hozzáadtunk lyukanként 10 pl citorodin S-t (CYT) és citorodin S immunoglobulin-komplexet (CYT-nyúl IgG). Az elegyet 37 °C-on 6 óra hosszat inkubáltuk. Ezután hozzáadtunk 25 pl triciummal jelzett timidint 0,5 pCi/lyuk koncentrációban, és az elegyet 37 °C-on 6 óra hosszat inkubáltuk. Ezután a sejteket sejtszűrón összegyűjtöttük, szárítottuk és folyadék szcintillációs számlálóval meghatároztuk a beépült jelzett timidint, a sejt DNS-szintetizáló aktivitásának összehasonlítása céljából. Az eredményeket a 4. ábra mutatja. Az ábrából kitűnik, hogy a CYT-nyúl IgG-ben lényegében véve megmaradt a CYT rákellenes aktivitása.
Hasonlóképpen vizsgáltuk a citorodin S származékot (citorodin S-anti CEA monoklonális antitest komplex) Colo 205 esetén, amely CEA-termelő sejt. Az eredményeket az 5. ábra mutatja. A használt teszt-anyagok menynyisége a következő:
minta hatóanyag/antitest arány
CYT 0.2 pg/ml
CYT-MA 204· 0.2 pg“/6.3 pg/ml 4:1
CYT-rab IgG 0.2 pg*/12.5 pg/ml 2:1
MA 204’ 0.5 pg/ml
Sejt Colo 205, 5xl04/lyuk
* MA 204: anti CEA monoklonális antitest “CYT aktivitás egyenértéket jelöl (CYT eq)
Mivel az MA 204 szelekciós fajlagossága nagyobb, mint a Rab IgG, az 5. ábrán látható, CYT-ΜΑ 204-hez tartozó, a CAT-Rab IgG-hez tartozónál nagyobb növekedésgátló aktivitás arra utal, hogy a találmány szerinti citorodin S immunoglobulin-komplex szelektíven hat a rákos sejtekre.
Összehasonlítás az aklacinomicin-immunoglobulin-komplexszel
Összehasonlításképpen az (X) képletű aklacinomicin A immunoglobulin-komplexét állítottuk elő, a 3. példa szerinti módon. Az aklacinomicin A szerkezetileg hasonló a citorodin S-hez. Mig a citorodin S-t antitest molekulánként 5-12 molekula arányban adagoltuk, az aklacinomicint antitest molekulánként 2 molekula mennyiségben adtuk. A két antitest komplex L1210 esetén kifejtett DNS-szintetizálás gátló aktivitását a sejtekbe beépített triciummal jelzett timidin mennyiségével mértük. Az eredményeket a 6. ábra mutatja. Az ábrából kitűnik, hogy a citorodin S komplex aktivitása magasabb, mint az aklacinomicin komplexé.

Claims (5)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű citorodin S származékok elóállitására - ahol X jelentése -Nlk, -NH-R3-COOH, -NH-R1-SH, -NH-R^COOCHz-CHa, (a), (f), (g)
    -NH-Rz-CO-NH-(IgG)i/n vagy -NH-R3-CO-NH-(IgG)i/n általános képletű csoport, ahol
    R1 1-4 szénatomos lent, alkiléncsoportot je- R2 1-5 szénatomos lent, alkiléncsoportot je- R3 1-7 szénatomos, adott esetben tiovagy aminocsoporttal helyettesített alkiléncsoportot jelent, IgG immunoglobulin maradékot jelent, n egész számot 1-15 -, képvisel, értéke
    azzal jellemezve, hogy
    a) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NH2, (a), (g) vagy -NH-R2-CO-NH-(IgG)i/n általános képletű csoport, (II) képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bór-hidriddel ammóniumsó jelenlétében redukálunk, így olyan (I) általános képletű vegyületet kapunk, ahol X jelentése -NH2 képletű csoport, amelyet kívánt esetben egy (III) általános képletű maleimid-származékkal reagáltatunk - ahol R2 jelentése a fenti -, így olyan (I) általános képletű vegyületeket kapunk, ahol X jelentése (a) általános képletű csoport, amelyet kívánt esetben egy (IV) általános képletű immunoglobulin-származékkal reagáltatunk - ahol R2 és IgG jelentése a fenti, n’ egész szám, értéke 1-20 -, így olyan (I) általános képletű vegyületeket kapunk, ahol X jelentése (g) vagy -NH-R2-CO-NH-(lgG)i/n általános képletű csoport, vagy
    b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NH-RJ-SH vagy (f) általános képletű csoport, a (II) képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bór-hidriddel egy NI^R^SH képletű vegyület
    -1019
    HU 198741 Β jelenlétében redukálunk, ahol R1 jelentése a fenti, így olyan (I) általános képletű vegyületeket kapunk, ahol X jelentése -NH-R^SH általános képletű csoport, amelyet kívánt esetben egy (V) általános képletű immunoglobulin-származékkal reagáltatunk, ahol R2, IgG és n’ jelentése a fenti, igy olyan (I) általános képletű vegyületeket kapunk, ahol X jelentése (f) általános képletű csoport, vagy
    c) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NH-R3-COOH, -NH-RZ-COOCzHs -NH-RZ-CO-NH-(IgG)i/n vagy -NH-R3-CO-NH-(IgG)i/n általános képletű csoport, egy (II) képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bót’-hidriddel NHz-R3-COOH vagy NHz-R2-COOC2ll5 általános képletű vegyület jelenlétében redukálunk, ahol R3 és R2 jelentése a fenti, így olyan (I) általános képletű vegyületet kapunk, ahol X jelentése -N11-R3-COOH vagy -NH-R2-COO-CzHs általános képletű csoport, amelyet kívánt esetben egy (VI) általános képletű im— munoglobulin-származékkal reagáltatunk, ahol IgG és n jelentése a fenti, így olyan (I) általános képletű vegyületekeL kapunk, ahol X jelentése -NH-RZ-CO-NH-ÍTgGh/,, vagy -NH-R3-CO-NH-(IgG)i/„. (Elsőbbsége: 1987. 03.
    30.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése (f) vagy (g) általános képletű csoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 30.)
  3. 3. Eljárás rákellenes gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti a), b) vagy c) eljárással előállított (I) általános képletű
  4. 5 vegyületet, ahol X jelentése az 1. igénypont szerinti, a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészitménynyé alakítunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 30.)
  5. 10 4. Eljárás (I) általános képletű citorodin
    S származékok előállítására, ahol X jelentése -NH2, (a) vagy (g) általános képletű csoport, ahol
    R2 jelentése 1-5 szénatomos alkílén'5 csoport,
    IgG immunoglobulin maradékot jelent, n egész számot képvisel, értéke
    1-15 -, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános
    20 képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NHz, (a) vagy (g) általános képletű csoport, a (II) képletű citorodin S-t alkálifém- ciano-bőr-hidriddél ammóniumsó jelenlétében redukáljuk, így olyan (I) általános
    25 képletű vegyületet kapunk, ahol X jelentése -NHz képletű csoport, amelyet kivánt esetben egy (III) általános képletű maleimid-származékkal reagáltatunk - ahol R2 jelentése a fenti -, igy olyan (I) általános képletű ve30 gyületeket kapunk, ahol X jelentése (a) általános képletű csoport, amelyet kívánt esetben egy (IV) általános képletű immunoglobulinnal reagáltatjuk - ahol R2 és IgG jelentése a fenti, n* egész szám, értéke 1-20 -, így
    35 olyan (I) általános képlelű vegyületeket kapunk, ahol X jelentése (g) képletű csoport.
HU872872A 1986-06-25 1987-06-24 Process for producing cytorodin s derivatives and pharmaceutical compositions comprising same HU198741B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14711986 1986-06-25
JP62074259A JPH0822869B2 (ja) 1986-06-25 1987-03-30 サイトロジンｓ誘導体およびそれを含有する抗癌剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT45076A HUT45076A (en) 1988-05-30
HU198741B true HU198741B (en) 1989-11-28

Family

ID=26415387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU872872A HU198741B (en) 1986-06-25 1987-06-24 Process for producing cytorodin s derivatives and pharmaceutical compositions comprising same

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5028698A (hu)
EP (1) EP0251088A3 (hu)
JP (1) JPH0822869B2 (hu)
KR (1) KR880000440A (hu)
CN (1) CN87104384A (hu)
AU (1) AU611087B2 (hu)
DK (1) DK321387A (hu)
FI (1) FI872783A (hu)
HU (1) HU198741B (hu)
IL (1) IL82978A0 (hu)
NO (1) NO166715C (hu)
NZ (1) NZ220805A (hu)
PT (1) PT85154B (hu)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3722699A1 (de) * 1987-07-09 1989-01-19 Behringwerke Ag Zytostatisch wirksame anthacyclin-konjugate
US6428781B1 (en) 1996-12-27 2002-08-06 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Composition of an endogenous insulin-like growth factor-II derivative

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4263279A (en) * 1975-08-19 1981-04-21 Yeda Research & Development Co. Ltd Pharmaceutically active compositions containing adriamycin and daunomycin
US4102345A (en) * 1977-04-21 1978-07-25 American Optical Corporation Pacer demand-rate test mode control
DE3325957A1 (de) * 1983-07-19 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Anthracyclin-derivate, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika
DE3641833A1 (de) * 1986-12-08 1988-06-09 Behringwerke Ag Zytostatisch wirksame anthracyclinderivate

Also Published As

Publication number Publication date
DK321387D0 (da) 1987-06-24
JPH0822869B2 (ja) 1996-03-06
US5028698A (en) 1991-07-02
NO166715B (no) 1991-05-21
EP0251088A3 (en) 1988-04-27
PT85154B (pt) 1989-12-29
FI872783A0 (fi) 1987-06-23
IL82978A0 (en) 1987-12-20
JPH01104077A (ja) 1989-04-21
NO872646D0 (no) 1987-06-24
NO166715C (no) 1991-08-28
PT85154A (en) 1987-07-01
KR880000440A (ko) 1988-03-25
CN87104384A (zh) 1988-01-13
EP0251088A2 (en) 1988-01-07
AU611087B2 (en) 1991-06-06
HUT45076A (en) 1988-05-30
NZ220805A (en) 1989-01-06
AU7466987A (en) 1988-01-07
DK321387A (da) 1987-12-26
NO872646L (no) 1987-12-28
FI872783A (fi) 1987-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA3093327C (en) Targeted cd73 antibody and antibody-drug conjugate, and preparation method therefor and uses thereof
EP0217577B1 (en) Antibody complexes of hapten-modified diagnostic or therapeutic agents
US20220088212A1 (en) C-terminal lysine conjugated immunoglobulins
US6511663B1 (en) Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
US5273743A (en) Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
JP3095415B2 (ja) 免疫複合体の調製及び使用
US5591593A (en) Minimum recognition unit of a PEM mucin tandem repeat specific monoclonal antibody and detection method using same
US5094848A (en) Cleavable diphosphate and amidated diphosphate linkers
JP3645283B2 (ja) リソゾーム酵素開裂性抗腫瘍剤結合体
PL172824B1 (pl) Nowe koniugaty tioeterowe PL PL PL PL PL
US20210171998A1 (en) Lysine conjugated immunoglobulins
TW201625315A (zh) Ｈｅｒ２抗體－藥物共軛物
CA3095067A1 (en) An antibody-drug conjugate having an acidic self-stabilization junction
JPH06228091A (ja) 三機能性抗体を合成する際の中間体としてのトリス−マレインイミド化合物
HU205135B (en) Process for producing monoclonal antibody nucleoside conjugates
CN110312730B (zh) 细胞毒素和偶联物、其用途和制备方法
HU198741B (en) Process for producing cytorodin s derivatives and pharmaceutical compositions comprising same
US12077606B2 (en) Cyclic peptide analogs and conjugates thereof
US5762906A (en) Further improvements relating to radiolabelling of proteins
Hermentin et al. Attachment of rhodosaminylanthracyclinone-type anthracyclines to the hinge-region of monoclonal antibodies
US20210308275A1 (en) Linkers and conjugates
KR20220087519A (ko) 촉매 항체 38c2를 위한 신규 접합 화학

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628