CN115364238B - 一种阿特珠单抗-mmad结合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种阿特珠单抗‑MMAD结合物及其制备方法与应用。以阿特珠单抗作为抗体，以含马来酰亚胺的二肽类化合物作为连接子，以MMAD作为细胞毒素，所述抗体通过连接子将细胞毒素连接，所述连接子的化学结构式为：所述MMAD的化学结构式为：本发明将阿特珠单抗与MMAD偶联，通过提高MMAD靶向性和免疫系统杀伤性，来高效准确的抑制肿瘤细胞。结果表明，该抗体偶联药物可以有效杀伤高表达PD‑L1的肿瘤细胞，抑制活性随着PD‑L1表达量的降低而下降，较MMAD具有更好的的选择性，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种阿特珠单抗-MMAD结合物及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
研究表明，单甲基奥瑞他汀D(monomethyl auristatin D，MMAD)与海兔毒素10(Dolastatins 10，D10)的毒性相当，是一种有效的抗有丝分裂药，其抗肿瘤机制主要是通过与β微管蛋白的氨基酸残基结合，影响新的异二聚体的加入，导致二聚体间的界面产生弯曲，累积后导致原来直纤丝弯曲，抑制微管的形成和聚合，并使其解聚，同时阻碍微管蛋白依赖的GTP的水解，阻碍细胞的有丝分裂，使细胞停滞在细胞间期，且对多种癌细胞有诱导凋亡作用，是一类来源于海洋生物的新型细胞生长抑制剂。但是MMAD的毒副作用强，应用受到限制。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种阿特珠单抗-MMAD结合物及其制备方法与应用，能够提高MMAD靶向性，降低毒副作用，增强机体对肿瘤细胞的免疫作用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种阿特珠单抗-MMAD结合物，以阿特珠单抗作为抗体，以含马来酰亚胺的二肽类化合物作为连接子，以MMAD作为细胞毒素，所述抗体通过连接子将细胞毒素连接，所述连接子的化学结构式为：
记为化合物1；
所述MMAD的化学结构式为：
记为化合物2。
另一方面，一种阿特珠单抗-MMAD结合物的制备方法，包括以下步骤：
以二(对硝基苯基)碳酸酯作为偶联剂，将连接子与MMAD连接，获得连接子-MMAD偶联物；
采用硫醇还原剂对阿特珠单抗还原处理，使阿特珠单抗产生巯基，将带有巯基的阿特珠单抗与连接子-MMAD偶联物进行加成反应，即得；
所述连接子和MMAD的化学结构如上所述。
第三方面，一种连接子-MMAD偶联物，其化学结构式如下所示：
记为化合物3。
第四方面，一种药物制剂，包括活性成分及药学上可接受的载体，所述活性成分为上述阿特珠单抗-MMAD结合物。
第五方面，一种上述阿特珠单抗-MMAD结合物或药物制剂在抑制肿瘤细胞活性中的应用。
第六方面，一种上述阿特珠单抗-MMAD结合物或药物制剂在制备肿瘤细胞活性抑制剂或抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的阿特珠单抗-MMAD结合物具有良好的抗肿瘤活性，对高表达PD-L1的细胞(MC38、MDA-MB-231、A431、U-2OS、M059K、Caki-1、PC-9、U-937和Caski)的抑制效果较好，可以有效杀伤高表达PD-L1的肿瘤细胞。对中表达PD-L1的细胞(H520)的抑制活性降低，对低表达PD-L1的细胞(AsPC-1、HepG2、Daudi和SW480)的抑制活性进一步降低。结合物对细胞的抑制活性显著低于MMAD，抑制活性随着PD-L1表达量的降低而下降，提高了MMAD的选择性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的ADC对各肿瘤细胞的抑制率曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于MMAD毒副作用强，应用受到限制，本发明提出了一种阿特珠单抗-MMAD结合物及其制备方法与应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种阿特珠单抗-MMAD结合物，以阿特珠单抗作为抗体，以含马来酰亚胺的二肽类化合物作为连接子，以MMAD作为细胞毒素，所述抗体通过连接子将细胞毒素连接，所述连接子的化学结构式为：
记为化合物1；
所述MMAD的化学结构式为：
记为化合物2。
免疫检查点涉及程序性死亡受体(programmed death protein，PD-1)与其相应的配体(programmed deathligand 1，PD-L1)之间的相互作用。抗原呈递细胞上的PD-L1与活化T细胞上的PD-1结合，T细胞的活性受到抑制。肿瘤细胞过度表达PD-L1，使肿瘤微环境中PD-1/PD-L1通路持续激活，抑制人体免疫系统反应，逃避免疫监视与攻击。
阿特珠单抗(Atezolizumab)是一种针对PD-L1的选择性人源化单克隆IgG1抗体，作用于PD-L1，阻止其与PD-1的相互作用，阻断T淋巴细胞负性调控的来源，逆转肿瘤免疫耐受性并重新建立针对肿瘤细胞的适应性免疫应答，以此来达到免疫治疗的目的。将细胞毒性药物与抗PD-L1抗体偶联的尝试将是一个重要的方向，偶联药物不仅可以识别肿瘤部位，发挥药物毒性，还可以通过作用于免疫系统杀伤肿瘤细胞。
同时，本发明采用含马来酰亚胺的二肽类化合物作为连接子在血浆中更稳定，且能更好的控制药物释放。
研究表明，本发明将阿特珠单抗与MMAD通过含马来酰亚胺的二肽类化合物作为连接子连接成结合物能够提高MMAD靶向性，降低毒副作用，增强机体对肿瘤细胞的免疫作用。
在一些实施例中，连接子中的羟基与MMAD中的仲胺基通过形成连接。
在一些实施例中，阿特珠单抗与连接子通过形成硫醚键连接。
在一些实施例中，化学结构式如下：
记为化合物4；
其中，mAb为阿特珠单抗，n(药物抗体比)为1～8。
在一种或多种实施例中，n的平均值为3.6。
本发明的另一种实施方式，提供了一种阿特珠单抗-MMAD结合物的制备方法，包括以下步骤：
以二(对硝基苯基)碳酸酯作为偶联剂，将连接子与MMAD连接，获得连接子-MMAD偶联物；
采用硫醇还原剂对阿特珠单抗还原处理，使阿特珠单抗产生巯基，将带有巯基的阿特珠单抗与连接子-MMAD偶联物进行加成反应，即得；
所述连接子和MMAD的化学结构如上所述。
在一种实施例中，所述连接子-MMAD偶联物的化学结构如下所示：
即化合物3。
在一种或多种实施例中，其过程为：将连接子溶解，加入二(对硝基苯基)碳酸酯和N,N-二异丙基乙胺在室温条件下进行反应获得中间体化合物；将中间体化合物溶解，加入1-羟基苯并三唑、MMAD和N,N-二异丙基乙胺在室温条件下进行反应，即得。具体地，将连接子用无水N,N-二甲基甲酰胺完全溶解，然后向溶液中依次加入二(对硝基苯基)碳酸酯和N,N-二异丙基乙胺，室温下过夜反应；待反应结束后，将反应液减压浓缩，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝50：1至10：1梯度洗脱，V/V)分离纯化，收集所得中间体化合物；取所得中间体化合物用无水N,N-二甲基甲酰胺完全溶解，然后依次向溶液中加入1-羟基苯并三唑、MMAD和N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌过夜。待反应结束后将反应液减压浓缩，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝70：1至15：1梯度洗脱)分离纯化，即得连接子-MMAD偶联物。
在一些实施例中，阿特珠单抗与连接子-MMAD偶联物制成阿特珠单抗-MMAD结合物的过程为：阿特珠单抗的溶液中添加TCEP(三(2-羧乙基)膦，一种硫醇类还原剂)进行孵育，然后置于冰上，加入连接子-MMAD偶联物进行反应，即得。具体地，阿特珠单抗的PBS溶液中加入TCEP，37±1℃孵育，置于冰上，加入连接子-MMAD偶联物反应，加入L-半胱氨酸终止反应，样品过柱脱盐，即得。
本发明的第三种实施方式，提供了一种连接子-MMAD偶联物，其化学结构式如下所示：
记为化合物3。
本发明的第四种实施方式，提供了一种药物制剂，包括活性成分及药学上可接受的载体，所述活性成分为上述阿特珠单抗-MMAD结合物。
本发明所述的药学上可接受的载体，例如水、生理盐水、缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)等。
本发明的第五种实施方式，提供了一种上述阿特珠单抗-MMAD结合物或药物制剂在抑制肿瘤细胞活性中的应用。
所述肿瘤细胞包括MC38、MDA-MB-231、A431、U-2OS、M059K、Caki-1、PC-9、U-937、Caski、H520、AsPC-1、HepG2、Daudi和SW480，其中，MC38、MDA-MB-231、A431、U-2OS、M059K、Caki-1、PC-9、U-937、Caski为高表达PD-L1的细胞，研究表明结合物对于这些高表达PD-L1的细胞的抑制活性更强，因而在一些实施例中，所述肿瘤细胞包括MC38、MDA-MB-231、A431、U-2OS、M059K、Caki-1、PC-9、U-937和/或Caski等高表达PD-L1的细胞。
本发明的第六种实施方式，提供了一种上述阿特珠单抗-MMAD结合物或药物制剂在制备肿瘤细胞活性抑制剂或抗肿瘤药物中的应用。
在一些实施例中，所述肿瘤细胞包括MC38、MDA-MB-231、A431、U-2OS、M059K、Caki-1、PC-9、U-937和/或Caski等高表达PD-L1的细胞。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中，提供化合物3的制备方法：
S1、连接子中间体的制备
将化合物1(589.5mg)用30mL无水N,N-二甲基甲酰胺完全溶解，然后向溶液中依次加入二(对硝基苯基)碳酸酯(626.7mg)和N,N-二异丙基乙胺(199.3mg)，室温下过夜反应。
S2、连接子中间体的纯化
将S1所得反应液减压浓缩，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝50：1至10：1梯度洗脱，V/V)分离纯化，收集所得化合物。
S3、化合物3的制备
取S2所得化合物(88.5mg)用15mL无水N,N-二甲基甲酰胺完全溶解，然后依次向溶液中加入1-羟基苯并三唑(15.06mg)、MMAD(84.8mg)和N,N-二异丙基乙胺(28.43mg)，室温下搅拌过夜。
S2、化合物3的纯化
将S3所得反应液减压浓缩，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝70：1至15：1梯度洗脱)分离纯化，得到连接子和MMAD的偶联物(化合物3)。使用Varian500MHz仪器(Bruker，USA)在0-15ppm范围内的DMSO-d6中进行1H-NMR测量。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.28(s,1H),7.76(d,J＝4.6Hz,1H),7.58–7.51(m,3H),7.42(dd,J＝15.7,8.8Hz,2H),7.33(dt,J＝7.8,1.0Hz,2H),7.27–7.20(m,2H),7.20–7.14(m,3H),7.13(d,J＝4.6Hz,1H),6.71(s,2H),6.03(t,J＝4.8Hz,1H),5.27(s,2H),5.24(dt,J＝8.6,5.9Hz,1H),5.13(q,J＝1.2Hz,2H),4.59(dd,J＝8.8,6.4Hz,1H),4.37(dd,J＝9.7,6.4Hz,1H),4.30–4.23(m,2H),4.21–4.10(m,2H),3.92–3.80(m,2H),3.72–3.64(m,1H),3.66–3.59(m,1H),3.62–3.54(m,1H),3.41–3.34(m,1H),3.30(d,J＝3.5Hz,6H),3.17(ddt,J＝15.2,5.9,0.9Hz,1H),3.14–3.07(m,3H),2.97–2.92(m,6H),2.79–2.69(m,2H),2.63(dd,J＝15.4,6.8Hz,1H),2.27–2.13(m,4H),1.96–1.63(m,10H),1.65–1.45(m,4H),1.41–1.23(m,4H),1.14(d,J＝7.1Hz,3H),0.96(d,J＝7.5Hz,3H),0.92–0.83(m,20H).
实施例2
本实施例中，化合物3和抗体的偶联方法：
2mL阿特珠单抗(PBS，10mg/mL)中加入40μL 20mM TCEP，37℃孵育2h，置于冰上，还原出的巯基用10倍于抗体的化合物3反应1h，加入20倍量的L-半胱氨酸终止反应。PBS过柱(G25)脱盐，得到抗体偶联药物Atezolizumab-MMAD(ADC，化合物4)。UV-Vis法测定药物/抗体比率(DAR)对化合物4进行表征。MMAD在214nm处有特征吸收峰，阿特珠单抗在280nm处有特征吸收峰，分别计算抗体和MMAD在214nm和280nm处的摩尔吸收系数，标记为εAb.214、εM.214、εAb.280和εM.280。在214nm和280nm处测量化合物4的吸光度值，根据公式R＝A214/A280计算吸光度比率R。将以上数值代入公式DAR＝(εAb.214-RεAb.280)/(RεM.280-εM.214)，计算得出DAR的平均值为3.6。
实施例3
检测各细胞系表面PD-L1表达水平：
将细胞以1×105个/mL的密度接种于12孔板中，每孔1mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。次日取出，用0.25％胰酶-EDTA消化，收集细胞并将其悬浮在含有0.5％牛血清白蛋白的PBS中，将细胞密度调整至1×106个/mL。细胞与别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗一起孵育1h，与原代PD-L1抗体在4℃条件下孵育1h。用PBS将样品离心洗涤2次以除去背景荧光，流式细胞仪检测细胞荧光度。结果如表1所示。
表1各肿瘤细胞系表面PD-L1的表达(％)
实施例4
检测ADC和MMAD对各肿瘤细胞的毒性：
将细胞以1×105个/mL的细胞密度接种在96孔板中，每孔100μL，用无菌PBS填充边缘孔以消除边缘效应。将96孔板置于5％CO2的37℃培养箱中过夜培养。将MMAD和ADC配制成0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100、200nM共10个浓度，每个浓度设三个复孔。弃去细胞上清，每孔加入100μL稀释好的样品，置于5％CO2的37℃培养箱中培养72h，CCK-8试剂盒检测样品对肿瘤细胞的抑制率。
结果如图1所示，MMAD对各系肿瘤细胞均具有良好的杀伤作用，为有效的细胞毒素。结合表1数据可知，结合物对高表达PD-L1细胞系具有更好的杀伤作用，如A431、MC38、MDA-MB-231等，随着细胞表面PD-L1抗原表达水平的降低，结合物对细胞的抑制作用也在降低，如Caki-1和HepG2等。结合物提高了药物对细胞的选择性，或可在临床应用时降低MMAD的毒副作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种阿特珠单抗-MMAD结合物，其特征是，以阿特珠单抗作为抗体，以含马来酰亚胺的二肽类化合物作为连接子，以MMAD作为细胞毒素，所述抗体通过连接子将细胞毒素连接，所述连接子的化学结构式为：
所述MMAD的化学结构式为：
阿特珠单抗-MMAD结合物的化学结构式如下：
其中，mAb为阿特珠单抗，n的平均值为3.6；
连接子中的羟基与MMAD中的仲胺基通过形成连接；
阿特珠单抗与连接子通过形成硫醚键连接；
连接子-MMAD偶联物的制备过程为：将连接子溶解，加入二(对硝基苯基)碳酸酯和N,N-二异丙基乙胺在室温条件下进行反应获得中间体化合物；将中间体化合物溶解，加入1-羟基苯并三唑、MMAD和N,N-二异丙基乙胺在室温条件下进行反应，即得；
连接子-MMAD偶联物，其化学结构式如下所示：
采用硫醇还原剂对阿特珠单抗还原处理，使阿特珠单抗产生巯基，将带有巯基的阿特珠单抗置于冰上与连接子-MMAD偶联物进行加成反应，即得阿特珠单抗-MMAD结合物；
所述阿特珠单抗-MMAD结合物用于制备肿瘤细胞活性抑制剂或抗肿瘤药物；
所述肿瘤细胞为高表达PD-L1的细胞，包括MC38、MDA-MB-231、A431、U-2OS、M059K、Caki-1、PC-9、U-937和/或Caski。
2.如权利要求1所述的阿特珠单抗-MMAD结合物，其特征是，阿特珠单抗与连接子-MMAD偶联物制成阿特珠单抗-MMAD结合物的过程为：阿特珠单抗的溶液中添加TCEP进行孵育，然后置于冰上，加入连接子-MMAD偶联物进行反应，即得。
3.一种药物制剂，包括活性成分及药学上可接受的载体，其特征是，所述活性成分为权利要求1-2任一所述的阿特珠单抗-MMAD结合物。
4.如权利要求3所述的药物制剂，其特征是，所述的药学上可接受的载体为水、生理盐水或缓冲溶液。
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