JPH05506563A - モノクローナル抗体、その製造法及び用途 - Google Patents
モノクローナル抗体、その製造法及び用途Info
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- JPH05506563A JPH05506563A JP91501001A JP50100191A JPH05506563A JP H05506563 A JPH05506563 A JP H05506563A JP 91501001 A JP91501001 A JP 91501001A JP 50100191 A JP50100191 A JP 50100191A JP H05506563 A JPH05506563 A JP H05506563A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
モノクローナル抗体、その製造法及び用途去・ 背景技術
本発明は癌治療剤として有用な二重特異性抗体−酵素複合体に関する。さら°′
に詳しくは、二重特異性の一方がヒト癌細胞に対するものであり、他方がプロ
ドラッグを活性化する酵素に対するものであるハイブリッド・モノクローナル抗
体(以下、ハイブリッドMoAbと略記することがある)8よび該抗体を産生す
るポリドーマに関する。
本発明はまた、上記のハイブリッドMoAbに該酵素を免疫結合させてなる抗ヒ
ト癌蛋白複合体に関する。
癌細胞の選択的破壊を同舟して、抗癌抗体に化学療法剤あるいは生物毒素を結合
させてなる抗癌免疫複合体は、抗体ミサイル療法剤については多くの研究がなさ
れ、白血病やリンパ腫などの血液関連の癌ではある程度の成果を挙げているが、
実際の臨床応用にあたっては必ずしも満足すべき結果を得ていない。
特に固型癌に関しては重篤な副作用の発現がみられることもあり、なお解決しな
ければならない多くの問題を抱えているのが現状である。この理由として、■)
癌細胞表面上の@癌関連抗原の細胞当りの数が必ずしも多くないため、十分な量
の抗癌剤を癌細胞内に導入できないこと、2)少ない腫瘍関連抗原を通してなお
かつ癌細胞に致死的効果をもたらすために、細胞毒性の強い生物毒素(例、リシ
ン、緑膿菌外毒素など)を用いるが、この場合は副作用が著しく臨床応用が難し
いこと、3)一般的にはヒト癌細胞は多様性に富み、全ての細胞が同一のI癌関
連抗原を有している可能性はほとんどなく、従って標的抗原を有さない癌細胞は
ミサイル療法剤の殺細胞効果を免れ増殖すること、などが挙げられる。特に癌細
胞の多様性を克服する治療法の確立は非常に難しく、例えば複数の抗癌抗体を用
いる療法(抗体カクテル療法)などが考えられているが、複数種の癌特異抗体を
作製することはきわめて困難で、この点からもカクテル療法は必ずしも現実的で
はない。
発明の開示
本発明者らは上記に示したような従来の癌ミサイル療法剤でみられた諸問題を解
決するため、近年開発された2重特異性抗体に着目して研究を進め、本発明を完
成した。すなわち、不活性型の抗癌プロドラッグを活性型に変換する酵素とヒト
癌細胞との両者に結合できる2重特異性抗体を作製し、かかる抗体と該酵素との
免疫複合体を癌患者に投与し、さらに不活性型のプロドラッグを別途投与するこ
とにより、癌細胞を選択的にしかもその多様性に影響されることなく殺細胞効果
を示す抗ヒト癌蛋白複合体を開発した。
プロドラッグそれ自体は血中および他の臓器ないし組織において不活性型で存在
し、標的癌組織近傍においてのみ、ヒト癌細胞に結合した本発明の抗ヒト癌蛋白
複合体により分解・活性化され抗癌活性を発揮するので、その副作用はほとんど
みられないことが本発明の抗ヒト癌蛋白複合体を用いる投与法の特長であり、ま
た標的癌組織近傍に存在するが、標的抗原を有していない癌細胞に対しても抗癌
活性が発揮され、癌細胞の多様性に影響されることなく殺細胞効果を示すことが
本発明の抗ヒト癌蛋白複合体を用いる投与法の特長である。すなわち本発明は、
二重特異性を有するハイブリッドMoAbであって、二重特異性の一方がヒト癌
細胞に対するものであり、他方がプロドラッグ活性化作用を有する酵素に対する
ものである抗体、およびこれを産生するポリドーマを提供するものである。
また本発明は、上記二重特異性ハイブリッドMoAbi:プロドラッグ活性化作
用を有する酵素を免疫結合させてなる抗ヒト癌蛋白複合体を提供するもので図面
の簡単な説明
第1[fflは、トリペプチド化ドラッグ(Boc−Gly−Gly−Arg−
ADR;−・−)およびその活性化体(ADR;−0−)の胃癌細胞株NUGC
4に対する細胞毒性を示す(実施例4参照)。
第2図は、トリペプチド化ドラッグ(Boc−Pro−Gly−Arg−TAN
−1120;−・−)およびその活性化体(TAN−1120;−0−)の腎癌
細胞株A)J−RC−6i:対する細胞毒性を示す(実施例4参照)。
第3図は、トリペプチド化ドラッグ(Boa−Gly−Gly−Arg−PM
;−・−)およびその活性化体(PM;−0−)の腎癌細胞株摺−Rc−6J二
対する細胞毒性を示す(実施例4参照)。
第4図は、Boa−Gly−GLy−Arg−ADRのトリプシン分解産物のク
ロマトパターンを示す(実施例6参照)。
第5図は、Boa−Gly−Gly−Arg−PMのUK分解産物のクロマトパ
ターンを示す(実施例6参照)。
第6図は、抗hTfR−抗UK二重特異性抗体産生マウステトラオーマUTF2
0−7培養上清の抗体希釈曲線を示す(実施例9参照)。
発明を実施するための最良の形態
リドーマとを融合することにより作製されるが、抗ヒト癌抗体産生ハイブリドー
マとしては、ヒト癌細胞と特異的に結合しうる抗体を産生するものであればいず
れでもよく、例えば抗ヒト・トランスフェリン・レセプター(以下、hTfRと
略記することがある)MoAb産生マウスハイプリドーマ22C6(IFO50
172、FERM BP−20543C特開平2−79970号公報参照〕ある
いは抗ヒト腎癌MoAb産生マウスハイブリドーマRCS−1[:IFO501
84、FERM BP−2333] (特願平1−62939号明細書参照〕な
どが挙げられる。これらのハイブリドーマの産生ずる抗ヒト癌抗体の標的抗原、
すなわち本発明の二重特異性ハイブリッドMoAbが特異的に結合する癌細胞の
標的抗原の代表的なものとして、癌細胞膜表面抗原である腫瘍関連抗原や免疫担
当細胞表面レセプター、ウィルス感染細胞表面抗原などがあげられる。この中、
腫瘍関連抗原としては、hTfRが良く利用されるが、この他癌胎児性抗原いわ
ゆるCEA、 α−7二トプロテイン、さらにCA19〜9を始めとする幾つか
の癌関連糖鎖抗原(S、 Hakomori:キャンサー・リサーチ(Canc
er Res、)、 45 、2405(1985))あるいはB細胞リンパ騰
の膜免疫グロブリン・イディオタイプ(:R,A、 Millerら二ニューイ
ングランド・ジャーナル・才ブ・メディンン(New Engl、 J、 Me
d、)、 306.517(1982):]やT細胞リンパ腫のレセプター・イ
ディオタイプ(L、 L、 Lan1erら:ジャーナル・オプ・イムノロジー
(J、 Immunol、)、土立ヱ、 2286 (1986))なども標的
抗原の例として挙げられる。
プロドラッグ活性化酵素に対する抗体産生ハイブリドーマの作製にあたっては、
通常のハイブリドーマ作製法が用いられる(G、 K5hlerら:ネーチャー
(Nature)、ヱ呈立、 495(1975))。例えば酵素を常法に従い
動物に免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融合させる方法が用い
られる。
免疫動物としては、例えばウサ嶋ラットマウス、モルモットなどが用いられるが
、MoAb製造の場合にはマウスが特に好ましく用いられる。接種方法としては
、通常実施される方法に従えばよく、例えばマウスに1回1〜100μg1好ま
しくは10〜25μgを等容量(0,1m12)の生理食塩水および70インド
の完全アジュバントで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に2〜3週毎
に3〜6回接種する方法がとられる。
これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫3〜5
日後C:牌′lilおよびあるいはリンパ節を採取し、それらJこ含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施でき、融
合促進剤としてはポリエチレングリコール(以下、PEGと略記することがある
)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。骨
髄腫細胞としてはN5−1、P3U1,5P210など、特にP3Ulが好まし
く用いられる。例えば牌臓細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率はl:1から10
:1で、これに分子量約1,000〜9,000のPEGが10〜80%の濃度
で添加され、20〜37°C1好ましくは30〜37°Cで3〜IO分インキュ
ベートするのが良い。
前記した抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
。例えば、マイクロプレートにヒト癌細胞あるいは酵素蛋白を吸着させ抗原感作
プレートを作成する。次いで細胞融合の結果得られるハイブリドーマの培養上清
を抗原感作プレートに添加し、プレートに結合した特異抗体を検出する酵素免疫
測定法(以下、EiAと略記することがある)により培養上溝中の抗体価を測定
する。HAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)添加培地などで選
別・育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちにクローニングに供される
が、これは通常限界希釈法などで容易に実施される。クローン化されたハイブリ
ドーマ培養上清の抗体価も上記のEIAで同様にして測定し、安定的に力価の高
い抗体を産生するモノクローナルなハイブリドーマを選択・作出することができ
る。この場合、ウロキナーゼなどのプロドラッグ活性化酵素の中和抗体を産生ず
るハイブリドーマもポリドーマ作成時の親細胞として使用可能である。
本発明の二重特異性を有するハイブリッドMoAbを産生するポリドーマの作製
には幾つかの手法があり〔例、新本洋士ら:蛋白質)核酸・酵素、33,217
(19gg)など〕、いずれの方法を用いてもよいが例えば、1)上記のHA
T抵抗性のプロドラッグ活性化作用を有する酵素に対する抗体を産生ずるハイブ
リドーマを、5−ブロモデオキシウリジン(以下、BrdUと略記することがあ
る)添加の培養液に段階的に馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクローン化し
HAT惑受栓受性る。同様にHAT抵抗性の抗ヒト癌細胞特異抗体産生ハイブリ
ドーマを8−アザグアニン(以下、AZGと略記することがある)耐性とし、ヒ
ボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランス7エラーゼ欠損株をクローン
化しHA T感受性とする。次いで常法に従い両者を融合して得られるテトラオ
ーマをHAT添加培地で選別後、ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化作用を有
する酵素の両者に結合能を存するハイブリッドMoAbを分泌するテトラオーマ
をクローン化する。2)抗ヒト癌細胞特異抗体産生ハイブリドーマをフルオレセ
イン・イソチオシアネート(以下、FITCと略記することがある)で標識し、
もう一方のプロドラッグ活性化作用を有する酵素に対する抗体を産生ずるハイブ
リドーマをテトラメチル・ロダニン・インチオシアネート(以下、TRITCと
略記することがある)で標識後、常法に従い両者を融合する。
得られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティペイティラド・セルソーター(
以下、FAC3と略記することがある)に供し、FITCの緑色およびTRIT
Cの赤色の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別・クローン化するなどの方法
が挙げられる。また両親株のマーカーを全く逆にして使用し、テトラオーマを選
別・クローン化することも可能である。
これらの操作における細胞融合に当ってはセンダイウィルス、PEGなどの融合
促進剤やあるいは電気刺激などの方法が用いられる。好ましくはPEGが用いら
れ、以下にその一例を挙げるが、も元ろんこの方法に限定されるものではない。
すなわち、分子量約1.000〜9,000.濃度約10〜80%等のPEGが
用いられ、処理時間は約0.5〜30分であるが、好ましい条件の一例として、
約35〜55%のPEG 6,000を約4〜10分間、37℃で細胞と接触さ
せ、効率よく融合させることができる。
ポリドーマの選択は、上記のHAT添加培地などで実施できるが、このため8−
AZG、6−チオグアニン(6−TG)あるいは5−BrdUなどの薬剤馴化法
により、それぞれの薬物耐性株が取得される。また新しいマーカーの融合細胞へ
の導入により、種々の選択培地が用いられる。このような例として、ネオマイシ
ンやハイグロマイシンB添加培地などが挙げられるCB、 Sugdenら:モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mo1. Ce11. Bio
l、)、 5.410 (1985)]。
さらに前記したように、異なった蛍光色素で標識したハイブリドーマを融合し、
FAC3で二重標識されたハイプリント・ハイブリドーマをソーティングする方
法もあるCL、 Karawajewら:ジャーナル・オブ・イムノロジカル・
メソンズ(J、Immunol、 Methods)、 96 、 265 (
1987))。
ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
。例えば、(1)前述したヒト癌細胞や酵素を吸着させた抗原感作プレートを用
いる2種のEIAの併用、(2)ヒト癌細胞結合マイクロプレートに被検培養上
清を添加し、次に西洋ワサビ・パーオキシダーゼ(HRP)で標識したプロドラ
ッグ活性化作用を有する酵素を加えて二重特異性抗体を検出するEIA。
あるいは抗ヒト癌特異抗体と異なるサブクラスに属するプロドラッグ活性化酵素
に対する抗体を用いる場合は、(3)ヒト癌細胞結合マイクロプレートに被検培
養上清を添加し、次にHRP標識した該抗マウスIgGサブクラス特異抗体を加
えて二重特異性抗体を検出するEIA、およびこれらの変法などを適宜組み合せ
て用いることができる。 二重特異性抗体活性陽性のポリドーマは直ちにクロー
ニングに供されるが、これは通常限界希釈法などで容易に実施される。
クローン化されたポリドーマの培養上清については、上記の方法でその抗体価を
測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するポリドーマを選択することにより、
目的とするモノクローナルな二重特異性抗体産生ポリドーマ(例、後述の実施例
テ得らtl、f:マウステトラt−?UTF20−7(IFO50260゜FE
RM BP−3156)など)を取得することができる。
上記した本発明のポリドーマの培養は通常、液体培地中、または動物の腹腔内(
例えば、マウス等補乳動物の腹腔内)で公知の方法により実施できる。培養液お
よび腹水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を組み合わせて用いるこ
とによりできる。例えば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上溝を取り出
し、塩析(通常は硫酸アンモニウムもしくはa酸ナトリウムを用し1る)を実施
する。得られたタンパク沈澱物を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマトグ
ラフィー(イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロティンAカラム、ヒドロキ
シアパタイトカラム等)に付し、目的とする抗体を分離精製することができる。
以上のような分離精製操作により、例えばIQの培養上清から蛋白重量比で90
%以上の純度の二重特異性MoAbを約1〜10mg得ることができる。また、
20−の腹水液からは同様のMoAbが約2〜20og得られる。
以上のようにして得られた二重特異性MoAbは蛋白質として均一であり、蛋白
分解酵素(ペプシンなど)処理などにより、例えばヒト癌細胞およびプロドラッ
グ活性化作用を有する酵素に対する結合能を保持するF (ab’ )、断片な
どを得ることができる。これらの断片は本発明の二重特異性MoAbと同様の目
的で使用できる。
なお、本発明のハイブリッドMoAbを産生ずるポリドーマとして、抗ヒト癌細
胞MoAb産生ハイブリドーマとプロドラッグ活性化酵素に対する抗体を産生ず
るハイブリドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方のMoAbを産生ずる
ハイブリドーマと他方のMoAbを産生ずる細胞とのトリオーマあるいはそれぞ
れのMoAbを産生ずる細胞をエプスタイン・バー・ウィルスなどにより不滅化
後、細胞融合して得られるハイブリドーマなどであっても、本発明の二重特異性
MoAbを産生ずるものであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用いること
ができる。
まt:、これらのポリドーマがマウスIgGMoAbを産生する場合には、該二
重特異性ハイブリッドMoAbの抗原認識部位を含む可変領域もしくは超可変領
域をコードするDNAを取得し、これに遺伝子操作技術(Z、 Steplew
skiら:プロンーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス
ニーニスニー(Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 USA)、
85 、4852(198g))を用いてヒトIgGの定常領域をコードする遺
伝子を結合させ、マウス−ヒトキメラ抗体を作製することもできる。かかるキメ
ラ抗体はヒトへの投与に際し、抗原性が小さいため有利に用いられる。
本発明の二重特異性MoAbあるいはプロドラ・ノブ活性化酵素と該二重特異性
MoAbとから作製される選択的な抗ヒト癌蛋白複合体を用いる癌治療法におし
)では、例えば次に述べるいくつかの方法がある。(1)本発明の二重特異性M
OAbを予め担癌患者に投与し、癌組織・細胞に結合させるべく十分な時間経過
後に、酵素ついでプロドラッグを投与する。(2)該二重特異性MoAbと酵素
とを同時に投与し、ついでプロドラッグを投与する、あるいは(3)予め/%4
ブリッドノドAbと酵素とを反応させ、未反応の酵素を分離後、得られた抗ヒト
蛋白複合体を担癌患者に投与し、ついでプロドラ・ノブを投与する、などの方法
が挙げられる。
本発明の二重特異性MoAbあるいはプロドラッグ活性化酵素、さらにはそれら
より作製される抗ヒト癌蛋白複合体は、必要により例えばメンブレン・フィルタ
ーなどによる濾過除菌操作後、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容されうる
担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、注射剤などとして製剤化し、各種の癌疾患
の治療に使用できる。またその投与量は、対象となる癌種、症状あるいは投与ル
ートなどにより異なるが、例えば成人の癌患者に静脈投与する場合、二重特異性
抗体として1日当り約0.02〜l 、 Omg/kg、好ましくは約0.04
〜0 、4 mg/kg、プロドラッグ活性化作用を有する酵素として1日当り
約0.01〜0 、5 mg/kgである。
本発明で用いられるプロドラッグ活性化酵素としては、プロドラッグ活性化作用
を有するいずれの酵素でもよいが、好ましくはペプチド結合を切断するプロテア
ーゼ(例、ウロキナーゼ(UK)、トリプシンなど)や糖鎖結合を切断するグリ
コンダーゼ(例、グルクロニダーゼなど)などが用いられる。上記酵素のなかで
もプロテアーゼとりわけウロキナーゼが好ましく用いられる。また、ヒト由来の
酵素でその血中濃度が低いか、もしくは血中に存在しない酵素が望ましく、さら
に癌細胞が産生する酵素が望ましい(J、C,Kirchheimerも:プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ニーニスニー(
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 USA)、 86 、542
4(1989)] 。例えばウロキナーゼの場合、薬物の活性体に適当なペプチ
ド(例、Gly−Gly−Arg、 Pro−Gly−Arg、 Pyr−Gl
y−Argなど)を結合させたプロドラッグが使用でき、またグルクロニダーゼ
の場合、薬物のグルクロン酸抱合体がプロドラッグとして使用できる。ペプチド
化薬物あるいは薬物のグルクロン酸抱合体のいずれの場合も、元の薬物活性体に
比べて毒性が極端に低いか、あるいは無いことが期待されるので、本発明の二重
特異性抗体にプロドラッグ活性化酵素を免疫結合させた抗ヒト癌蛋白複合体と併
わせで用いられることにより、癌組織近傍でプロドラ・ングが活性化され、癌組
織を選択的に破壊することができる。
上記のプロドラッグの元となる薬物としては、抗癌剤として使用されているいず
れのものを用いてもよいが、好ましい例として現在臨床応用されているアドリア
マイシン、シスプラチン、メルフアラン、メトトレキセート、マイトマイシンC
1ビンクリスチン、ビュロマイシン、フェニレンジアミンマスタードなどが挙げ
られる。さらには強力な細胞毒性を有するアンサマイトシン類、TAN−112
0(下記式(II)においてX=OH)およびそれらの関連化合物などを抗癌剤
として用いてもよい。このような例としては、例えば下記式(I)で表される化
合物〔特願平1−18560号明細書、EP公公開37617今る化合物〔特願
平1−178634号明細書,EP公公開37617芳いはTAN−1120関
連化合物としては、抗癌活性を有するものであればいずれのものでもよい。いず
れの場合も前述したように、毒性の無い、もしくは弱いプロドラッグの形として
患者に投与され、本発明の抗ヒト癌蛋白複合体により癌組織近傍において分解さ
れ、薬理活性を発揮する。
下記式で表わされる化合物を含むアンサマイトシン類〔式中、Rは水素原子また
はカルボン酸由来のアシル基を、Qは水酸基(OH)またはメルカプト基(S
H)を、Xは塩素原子または水素原子を、Yは水素原子。
低級アルキルスルホニル基または置換基を有していてもよし\アルキルはアラル
キル基を示す。〕
TAN−1 1 20関連化合物
〔式中、Xは水酸基または水素原子を示す。〕以下に参考例および実施例により
本発明を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでないこと
は言うまでもない。
なお、参考例および実施例で用いられている動物細胞は、以下の表に示すように
寄託が行なわれている。
マウスハイブリドーマ 50177 8P−2084UK 1−87
マウスハイブリドーマ 50208 BP−2548UK、 1−6
マウスハイブリドーマ 50184 BP−2333C5−1
マウスハイブリドーマ 50219 BP−2688GI−5
マウスハイブリドーマ 50172 BP−20542C6
マウステトラオー7 50260 8P−3156IFO:財団法人発酵研究所
(大阪)
FRI:通商産業省微生物工業技術研究所また、本明細書においてアミノ酸およ
びペプチドはIUPAC−IUB生化学命名委員会(CB N)で採用された略
記法により表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、アミノ酸などに関
し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
Glyニゲリシン残基
Proニブロリン残基
Arg:アルギニン残基
PyroGlu
参考例1 混合血球凝集法(MHA)
対象となる細胞のうち付着性の細胞は、24〜48時間前より60穴マイクロプ
レート(ヌンク社製)に500個/ウェルとなるよう分注して培養した。浮遊性
の細胞は、検査当唱こ血清無添加の培養液に浮遊後、同じ数の細胞を各ウェルに
分注し、400Xgで5分間遠心してプレートに付着させた。
指示血球の作製は、リン酸食塩緩衝液(20mMリン酸二ナトリウム、0゜15
M NaC+2 ;pH7,5X以下、PBSと略記することがある)で3回洗
浄したヒツジ赤血球をPBSで2%浮遊液とし、この浮遊液にPBSで最高凝集
価の2.5倍に希釈したマウス抗ヒツジ赤血球抗体(オルソ社製)を等量混合し
て37℃で30分反応させた。この血球をPBSで3回洗浄し2%に再浮遊した
。次にPBSで25倍に希釈したウサギ抗マウスIgG抗体(カペル社製)を等
量混合し、さらに37℃で30分間反応させた。その後PBSで3回洗浄して2
%浮遊液として保存した。
細胞を付着させたプレートを、O,LM MgC40−03M CaCl22−
〇、1%グルコース含有ペロナール食塩緩衝液(pH7−4;以下、VBSと略
記することがある)にさらに5%ウシ胎児血清(F CS)を含む溶液(5%F
C5−VBS)で洗浄後、マウス抗ヒト癌抗体を含有する被検液を各ウェルに分
注し、室温で1時間静置した。VBSでこのプレートを洗浄後、5%FC3−V
BSで0.2%に希釈した指示血球を各ウェルに分注し室温で40分間静置した
。次に未反応の血球をVBSで洗浄除去し、顕微鏡下で観察した。抗体非添加の
陰性コントロール試験でのロゼツト形成が1%以下であった。本試験のウェルに
おいて標的細胞の25%以上にロゼツト形成を認めた場合を反応場対象となる細
胞を培養後、0.02%EDTA−PBS溶液で細胞を浮遊させ、血清無添加の
培養液で洗浄し、次いでマウス抗ヒト癌抗体含有液を添加、4°Cで1時間反応
させた。培養液で洗浄後、フルオレセイン標識抗マウスIgG抗体を添加し4°
Cで1時間反応させた。PBSで洗浄後、蛍光顕微鏡で観察しtこ。
参考例3 肺癌細胞を用いるCe1l−E工Aヌンク社の96穴マイクロプレー
トに標的膿瘍細胞をウェル当り10.000〜40,000個播種口、炭酸ガス
・インキュベータ中で37℃、−昼夜培養した。培養上清を陳去後、マウス抗ヒ
ト癌抗体含有検液を添加し、室温で2時間反応させた。次いで0.2%牛血清ア
ルブミン(以下、 BSAと略記することがある)添加培地で洗浄後、西洋ワサ
ビ・パーオキシダーゼ(以下、HRPと略記することがある)で標識したウサギ
抗マウスIgG抗体を添加し、さらに室温で2時間反応させた。
洗浄後、酵素基買としてオルソ−フェニレン・ジアミンおよびHz O2ヲ含有
する0、1Mクエン酸緩衝液を各ウェルに加え、室温で酵素反応を実施した。
IN硫厳で反応停止後、マルチスキャン(フロー社製)を用いて波長492nm
で発色色素を測定した。
胃癌患者M蕩組織の2市角組織片をnu/nu−BALB/ cマウス皮下に移
植し、移植継代の安定した株AM−RC−3の移植継代時(通常は移植後3〜4
週)に血清を採取し、その移植マウスの血清0.5−を70インドの完全アジュ
バントと等量で混合・懸濁し、同系のBALB/cマウスに腹腔内投与した。以
後、約7〜lO日毎に上記の移植ヌードマウスの血清0.5mlを免疫した。計
7回免疫後の抗体価を測定した。
参考例1記載のMHA法で、胃癌細胞株AM−に−7に対して高い抗体価を示し
たマウスを以下の冥験に供した。
(2)ハイブリドーマの作成
(1)で得られた免疫マウスの肺臓細胞を常法によりマウス骨髄腫細胞N5−1
と融合しHAT添加培地で選択した。増殖するハイブリドーマ群を参考例1記載
のMHA法でスクリーニングに供し、抗体価の高いグループをさらにクローニン
グし目的の抗ヒト腎細胞癌MoAb産生マウスハイブリドーマRC5−1を得た
(FERM BP−2333,IFo 50184)。マウスハイフリトーマR
C,S−1が産生する1e−1抗体はIgG1サブクラスに属した。
(3)マウスMoAbの製造
マウスハイブリトーマRC3−15X10’個をMCI(AF )−rmマウス
に腹腔内投与し約4週後に5〜lodの腹水液を採取した。腹水液は硫酸アンモ
ニウムで塩析処理後、DEAE−セルロース・カラムで精製した。50dの腹水
液から約200mgの精製マウス抗ヒト腎細胞癌MoAb RCS−1が得られ
た。
(4)マウスMoAbの性状
各種腫瘍細胞株に対するPC5−1抗体の反応性を、参考例1.2および3に示
した方法で測定した。RCS−1抗体は、腎癌細胞AM−RC−3,AM−RC
−6,AM−RC−7、膀胱癌細胞T248よび肺癌細胞Luci−10,PC
−10r:陽性であり、他の胃癌、腸瘍、乳癌、白血病細胞に対しては陰性であ
った。また正常腎組織に対して陰UK5μg/−溶液を96穴マイクロプレート
に1ooItaずつ分注し4℃で一夜放置後、2%カゼイン、O,O1%チメロ
サール含有PBS 150μQを添加し感作プレートを作成した。上記の液を除
去し0.05%Tveen 20含有PBS(以下、PBS−Twと略記するこ
とがある)で洗浄後、被検マウス抗体液100μaを添加し室温で2時間反応さ
せた。同様にPBS−Twでプレートを十分に洗浄後、HRP標識ウサつ抗マウ
スIgG抗体を添加しさらに2時間反応させた。
以下、参考例3に記載の方法に従い固相に結合したHRP活性を測定した。
参考例6 抗低分子UK抗体測定用ETA参考例5に記載のUKの代りに低分子
UK(二本鎖低分子UK、JCR社販売)を使用し、低分子UK感作グレートを
作成後、同様の方法で抗低分子UK抗体価を測定した。
参考例7 フィブリン溶解反応中和試験UK溶液(!!を終濃度25 ng/m
)に被検抗UK抗体溶液を添加し、37℃で1時間反応後、反応混液をフィブリ
ン・アガロース・プレートの1ウェル当り5μQ注入した。37℃で2〜6時間
後にフィブリンの溶解y1(直径)を測定し、UKの酵素活性に対する抗UK
MoAbの中和能を測定した。
市販のUK(日本製薬製造)200μg/m生理食塩水溶液に等量の70インド
完全アジユバントを添加し十分に乳濁後、BALB/cマウス(子20μg/
O−2−/マウス)に腹腔内および背部皮下投与し、2〜3週間隔で追加免疫を
実施した。3回の追加免疫後、10日で最大の血清抗体価を示した個体について
、UK抗原液(50μg/ 0 、1 m生理食塩水/マウス)を静脈内投与し
た。
(2)細胞融合
最終免疫後3日で肺臓を摘出し、膵臓細胞懸濁液を常法により調脹した(約10
@個)。次いでマウス骨髄腫細胞(P3U1)2XIO’個を添加し、PEG6
000を用いてケーラーとミルスタインの方法〔不一チャ−(Nature)、
256 、495 (1975)〕に準じて細胞融合に供した。
融合終了後、細胞混液をヒボキサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む
、いわゆるHAT培地中に懸濁し、10日間培養した。以後は、親細胞の選択が
終了次第、HA T培地からアミノプテリンを除いたHT培地に代え培養を続け
た。
(3)ハイブリドーマの選択およびクローニングUK結合マイクロプレートを用
いる参考例5に記載のEIAでハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。融
合10日から20日後にハイブリドーマの出現を認め、かつUKに特異結合する
抗体がみられた。特に結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法によ
るクローニングに供した。
クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様の方法でスクリーニングに供し
、UK結合能の強いものを選択した。これらの結果、UKに特異的に結合するM
oAb産生マウスハイブリドーマとして、UKI−3(FERM BP−208
3,1F0 50176)およびUKI−871:FERM BP−2084,
IFo 50177:]が得られた。これらのハイブリドーマが産生する抗体の
免疫グロブリン・クラスおよびサブクラスはオークタロニル法による測定で、そ
れぞれIgG1およびIgGzbであった。
参考例8−(1)に記載のUKの代りに市販の二本鎖低分子UKQCR社販売)
全販売て、以下全く同様の方法でマウスへの免疫を実施した。
(2)融合細胞
参考例8−(2)に記載の方法に従い細胞融合を実施した。
(3)ハイブリドーマの選択およびクローニング低分子UK結合マイクログレー
トを用いる参考例6記載のEIAでハイブリドーマをスクリーニングし、以下参
考例8−(3)と同じ方法で抗低分子UKMoAb産生ハイブリドーマを取得し
た。これらの中、フィブリン溶解能を損うことなくUKに特異結合する抗低分子
UK MoAb産生ハイブリドーマとしてマウスハイブリドーマ UKI−6〔
IFo 50208.FERM BF−4548’lが得られた。 得られたハ
イブリドーマから産生される抗体UKI−Bの免疫グロブリンクラスおよびサブ
クラスはオークタロニー法による測定で、tgc+(に鎖)であった。
参考例IO抗グルクロニダーゼ抗体測定用11jA参考例5に記載のUKの代わ
りにβ−グルクロニダーゼ(ングマ社製)を用いて抗原感作プレートを作成した
。次いで参考例5と同様の方法でEIAを実施し、抗グルクロニダーゼ抗体活性
を測定した。
参考例11 グルクロニダーゼ酵素反応中和試験参考例5に記載のUKの代わり
に抗マウスIgG抗体を用いて抗体感作プレートを作成した。次いで被検マウス
抗グルクロニダーゼ抗体液を添加し、室温で2時間反応させたのち、PBS−T
vで洗浄しl;。ざらにβ−グルクロニダーゼ溶液25μg/−を添加し室温で
2時間反応させ十分に洗浄後、0.14%トリトンX−100含有 0.14M
酢酸緩衝液(pH4,6)に溶解した合成基質パラ−ニトロフェニル−β−D−
グルクロニド1.o+nMを添加し酵素反応を実施した。37°Cで40分間反
応後、2.5M 2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオールで反応停
止後、マルチスキャンを用いて生成した色素量を415nmで測定した。
参考例12 抗hTfR抗体産生ハイブリドーマの作製(1)hTfRの精製
ヒト胎盤組織1.5kgを細かく切断しPBS (pH7,5)中でブレンドし
たのち、遠心分離した。得られた沈渣を4%トリトンX−100含有PBS中で
ホモゲナイズし、さらに超音波処理後再び遠心分離した。次いで上溝100m1
当たり約32gの硫酸アンモニウムを添加し塩析後、抗hTf抗体結合カラムに
供し0.5M NaCl2含有20mMリン酸2ナトリウム緩衝液(以下、PB
と略記することがあるXpH7,5)で十分に洗浄した。0.5M NaCQお
よび0.5%トリトンX−100含有0.02Mグリシン緩衝液(pH10゜0
)で溶出したhTfR画分を、さらにhTf結合カラムに供しIMNaCQ含有
PBで洗浄後、LM NaCQおよび1%トリトンX−100含有0゜05Mグ
リシン緩衝液(pH10,0)で溶出することによりhTfR精製標品約1.5
mgを得た。
(2)免 疫
上記のhTfR精製標品200μg/ 生理食塩水溶液に等量のフコインド完全
アンユハントを添加し十分乳濁後、BALB/cマウス(♀、n=10゜20μ
g/ml/マウス)に腹腔および背部皮下投与し、3週間隔で追加免疫を実施し
た。4回の追加免疫後、2過て最大の血清抗体価を示した固体について、同じh
TfRの抗原液(30μg10.1 生理食塩水/マウス)を静脈内投与した。
(3)細胞融合
最終免疫後3日で肺臓を摘出し、膵臓細胞懸濁液を常法により調製した(約10
8個)。次いでマウス骨髄腫細胞(P3U1)2xlO7個を添加し、参考例8
−(2)に記載の方法に従って細胞融合した。HAT培地中で親細胞の選択が終
了次第HAT培地からアミノプテリンを除いたHT培地に代え培養を続けた。
(4)ハイブリドーマの選択およびクローニング市販のウサギ抗マウスIgG抗
体液20μg/ を96穴マイクロプレートに100μβずつ分注し4℃で一夜
放置後、さらに2%BSA含有PBS (pH7,3)を添加して感作プレート
を作成した。また(1)で得たhTfR精製標品を常法に従いHRP標識後EI
Aに用いた〔北用常広:有機合成化学、42゜2.83 (1984)]。すな
わち、上記第2抗体感作プレートにハイブリドーマ培養上清を添加し室温で2時
間反応後、PBSで洗浄した。次いでHRP標識hTfRを添加しさらに室温で
2時間反応させた。以下、参考例3に記載の方法で酵素反応を実施し抗体価を測
定した。特に結合能の強いハイブリドーマについて限界希釈法によるクローニン
グを実施し、抗hTfR抗体産生ハイブリドーマ2206を得た。本抗体のサブ
クラスはIgG+(に鎖)で、ヒト白血病細胞株に562およびヒト類上皮癌細
胞株A431に高い親和性を示した。
実施例1 抗グルクロニダーゼ・モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作市
板のβ−グルクロニターゼ500μg/ml生理食塩水溶液に等量の70インド
完全アジユバントを添加し十分に乳濁後、BALB/cマウス(子50gg10
.2ml/マウス)に腹腔内および背部皮下投与し、2〜3週間隔で追加免疫を
実施した。3回の追加免疫後、10日で最大の血清抗体価を表した個体について
、β−グルクロニターゼ抗原溶液(100μg10.2ml生理食塩水/マウス
)を静脈内投与した。
(2)細胞融合
参考例1Oに記載のEIAで高い血清抗体価を示したマウスより肺臓を摘出し、
参考例8−(2)に記載の方法に従い細胞融合を実施した。
(3)バイブリドーマの選択およびクローニング融合lO日から20日後に出現
する融合細胞を、参考例10に記載のEIAでスクリーニングした。特に結合活
性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングに供した。
クローン化したハイブリドーマを同様のEIAで選択した結果、グルクロニダー
ゼに特異的に結合するMoAb産生マウスハイブリドーマトーI−5(F E
RMBP−2688,IF○50219)が得られた。このハイブリドーマが産
生ずる抗体はIgG1であり、参考例11に記載の中和試験に供したところ、グ
ルクロニダーゼ酵素活性を中和しない抗体と判明した。
参考例4で取得した抗ヒト腎細胞癌MoAb産生ハイブリドーマRC3−1およ
び参考例9で取得した抗UK MoAb産生ハイプリドーマトーl−5とを、そ
れぞれ0.5μg/顧FITCおよび1.5μg/mT RI T C含有イス
コツ−ハムF・12混合培地で37°C930分間インキュベートし、蛍光染色
する。次いで、LSM溶液(和光純薬工業に、に、販売)を添加し死細胞を除去
したのち、両ハイブリドーマを1=1の割合で混じ、PEG6000を用いて参
考例8−(2)に記載の方法で細胞融合する。
37°Cで2時間インキュベート後、FACSに供することによりフルオレセイ
ンおよびローダミンで二重染色された細胞25000個を分取し、次にフィーダ
ーとしてマウス胸腺細胞を5X10’個/ウェル播種した96六マイクロプレー
トに、上記の二重染色細胞をlO個/ウェルの割合で播種し培養する。
(2)ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニング融合後1−2週
で細胞増殖のみられたウェルの培養上清をCe1l−E I Aに供し二重特異
性抗体活性を測定する。すなわち、参考例3で作成した胃癌細胞店−I?C−7
結合マイクロプレートに被検ハイブリッド・ハイブリドーマ培養上清を添加し、
室温で2時間反応後0.2%BSA添加培地で洗浄する。次いでビオチン標識し
f:UKを添加し、さらに室温で2時間反応後、HRP標識したアビジンを反応
させる。室温で1時間反応後洗浄し、固相に結合した酵素活性を参考例3に記載
の方法で測定する。
高い二重特異性抗体活性を示すウェルについて限界希釈法によるクローニングを
実施し、目的の二重特異性抗体産生テトラオーマを取得する。
(3)二重特異性抗体の精製
予め0.5−鉱油を腹腔的投与したBALB/cマウスに5XIC1’i/マウ
スツマウス・ハイブリッド・ハイブリドーマ(テトラオーマ)を腹腔内接種する
。約10〜20日後に貯溜がみられる腹水を採取し、さらに50%飽和硫酸アン
モニウムで塩析してIgG画分を得る。次いで2011IIM PBS(pH7
,5)で透析後、UK結結合セルフファインカラムに供し、1)H2,9の0.
2Mグリシン−塩酸緩衝液で溶出する。酸溶出画分をPBSで透析後、さらにと
ドロキシ・アパタイトカラムに供し目的の二重特異性抗ヒト癌細胞−抗UK抗体
を精製する。
実施例3 トリペプチド化ドラッグの合成1(1) Gly−Arg−OMeの
合成カルボベンジルオキシグリシン(ZGly) (4、6g)のジメチルホル
ムアミド(DMF)溶液(2011+2)に水冷下N−ヒドロキシー5−ノルボ
ルネン−2,3−ジカルボキシイミド(HONBX 4 、34 g )とジシ
クロへキシルカルボジイミド(DCC)(4。
9g)とを加えて3.5時間撹拌し、さらにHONB(0,7g)とDCC(0
,8g)とを追加して2時間撹拌した。反応液をろ通抜、氷冷下ろ液をアルギニ
ンメチルエステル(Arg−OMe)塩酸塩(5,22g)と共に、トリエチル
アミ7(2,81L12)のDMF(30d2)溶液メ;添加した。室温で2時
間撹拌後、−晩装置した。沈澱物をろ去したのち、ろ液を減圧下濃縮し、得られ
た残留物に水を加え酢酸エチルで洗浄した。水層を減圧下濃縮することにより無
色油状物(9,65g)を得た。この油状物を、IN HCl2(20gm)を
加えたメタノール(MeOHXl 70顧)に溶解し、パラジウム−黒(500
mg)存在下、水素気流中で接触還元を実施した。4.5時間水素気流中で撹拌
後、触媒をろ去し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残留物はDMF(30t1
2)溶液として保存し、次の反応に用いた。
(2) Boc−Gly−Gly−Arg−OHの合成し一ブチロキシカルボニ
ルグリシン(Boc−Gly) (176mg)のDMF(lim)溶液にHO
NB(197mg)とDCCC248rng)とを加え水冷下撹拌した。沈澱物
をろ去したのち、ろ液を(1)で取得したG 1 y−Arg−OMeのDMF
(21112)溶液とトリエチルアミン(187μQ)との混液にかきまぜなが
ら加えた。冷蔵庫に一部放置後沈澱物をろ去した。ろ液を減圧下濃縮して得た残
留物をシリカゲル(lOg)を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エ
チル−ピリジン−酢酸−水(60: 20:6:10)で溶出して、Boc−G
ly−Gly−Arg−OMe(210mg)を得た。次にBoc−Gly−G
ly−Arg−OMe(170mg)をIN NaQH(1m)溶液に水冷下溶
解し、反応液を陽イオン交換樹脂(バイオレックス70)に供してその素通り画
分を集め、IN HCuを加えてHCu塩とした。溶媒を減圧下留去してBoa
−Gly−Gly−Arg−OH(148mg)を得た。
N M R(D 20)δ: 1.42(9H,s、CHs)、1.57−1.
80(4H,m、CH2)、 3.19(2H,t、CHzm)。
3.81(2H,s、CH,Co)、 3.95(2H,s、CH,CO)、
4−13−4.30(IH,m。
N−C)ico)
MS m/z : 389 [M+H]”、 289 [M−Boc+2H]”
(3) Boc−Pro−Gly−Arg−OHの合成t−ブチロキシカルボニ
ルプロリン(Boa−Pro) (410mg)のDMF(2d)溶液にHON
B(430mg)とDCC(494mg)とを加え水冷下撹拌した。沈澱物をろ
去したのち、そのろ液を(1)で取得したGly−Arg−OMeのDMF(4
m)溶液とトリエチルアミン(374μ12)との混液にかき混ぜながら加えた
。混液を一晩放置後、沈澱物をろ去した。ろ液を減圧下濃縮して得た残留物をシ
リカゲル(20g)を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エチルルビ
リジン−酢酸−水 C60:20:6:10)で溶出してBoc−Pro−Gl
y−Arg−OMe(718mg)を得た。Boc−Pro−Gly−Arg−
OMe(398mg)のI N Na0H(2it)溶液を水冷下かきまぜ、反
応液を陰イオン交換樹脂(AG−I X 8 )に供してその素通り画分を集め
た。次いで陽イオン交換樹脂(バイオレックス70)に供してその素通り画分を
集め、IN HCuを加えHC(l塩とした。溶媒を減圧下留去してBoc−P
ro−Gly−Arg−OH(280mg)を得た。
MS m/z : 429 [M+Hじ、 329 [M−Boc+2H]”(
4) PyroGlu−Gly−Arg−OHの合成ピログルタミン酸(129
mg)のDMF(lII12)溶液にHONB(197mg)とDCCC248
rng)とを水冷下加え撹拌した。沈澱物をろ去し得られるろ液をcly−Ar
g−OMeのDMF(2d)とトリエチルアミン(187,uf2)との混液に
加え、(2)と同様の処理によりPyroGlu−Gly−Arg−OMe(2
44mg)を得た。PyroGlu−Gly−Arg−OMe(244mg)の
IN NaOH(1m12)溶液を水冷後かきまぜたのち、陽イオン交換*MC
バイオレックス70)に供してその素通り画分を集め、1NHcf2を加えてH
CQ塩とした。溶媒を減圧下留去してPyroGlu−Gly−Arg−OH(
200謹g)を得tこ。
MS m/z : 3 4 3 [M+H]”(5) Boc−Gly−Gly
−Arg−アドリアマイシンの合成りoa−Gly−Gly−Arg−OH(2
8mg)とl−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBTX l l mg)と
のpMp(0,3−)溶液を、アドリアマイシン(ADH)HCQ(6゜4 m
g)と、N−エチルモルホリン(3μQ)とのDMF(0,1im)溶液に加え
撹拌した。水溶液カルボジイミド(WSCX3.8mg)を上記反応液に加えた
のち、溶媒を減圧下留去した。DMFCo、2d>を残留物に加え、ざらにHO
NB(8mg)、N−xチルモルホリン(9p(1)、 WS C(24mg)
を加え室温で撹拌した。
反応液を減圧下濃縮したのち、残留物に水を加えた。逆相シリカゲル(RP−8
)の5%CH,CN−Hz○懸濁液に上記反応液を添加し、順次CHICN濃度
を上昇させ精製した。最終的にCHICN−H2O−2M酢酸アンモニウム(2
:2:l)で溶出し、その溶出画分のCH,CNを留去したのち、n−ブタノー
ルで抽出した。n−ブタノール抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下
留去してBoc−Gly−Gly−Arg−ADR(3、55mg)を得た。
MS m/z : 914 [M+Hド(6) Boc−Pro−Gly−Ar
g−ADRの合成ADH(5mg)、 N−5−チルモルホリン(3,uQ)の
DMF (0,5st)溶液にBoc−Pro−Gly−Arg−OH(18,
1mg)、 HONB (10mg)およびWSC(Lomg)のDMF溶液を
加え撹拌したのち、(5)と同様lこ処理してBoc−Pro−Gly−Arg
−ADRを得Iこ。
MS m/z : 954 [M+H]”(7) PyroGIu−Gly−A
rg−ADRの合成ADH(5mg)、N−エチルモルホリン(3,u4)のD
MF (0,5d)溶液にPyroGlu−Gly−Arg−OH(20,1m
g) 、 HONB (l Omg)およびWSC(10mg)のDMF溶液を
加えかきまぜたのち、(5)と同様に処理してPyroGlu−Gly−Arg
−ADR(0−14g )を得た。
MS m/z : 8 6 7 [M十H]”(8) Boc−Pro−Gly
−Arg−TAN−1120の合成TAN −1120(1,7mg) 、 B
oc−Pro−Gly−Arg−OH(4,2mg) 、 HONB(1,3m
g)のDMF(0−5d)溶液にWSC(3,0mg)を加えて室温で撹拌シタ
。
(5)と同様に処理して、40%CHs CN ’ H20で溶出する両分より
&に−Pro−Gly−Arg−TAN−1120を得た。
M S ffl/z : l O82[M+H]”(9) Boc−Gly−G
ly−Arg−ピュロマイシンの合成ピュロマイシン(PM)2H(j2(6,
2mg)、N−r−チルモルホリン(6,u12)のDMF(0,1st)溶液
にBoc−Gly−Gly−Arg−OH(17、7mg)、1−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール(7mg)および水溶性カルボジイミド(4mg)を加え室温
で一晩撹拌した。溶媒を減圧下留去したのち残留物に水を加え、逆相シリカゲル
(RP−8)を用いるカラムクロマトグラフィーに供して5%CH3CN H2
0より順次C1hCN濃度を増加させて精製した。CHs CN −H! 0
2 M酢酸アンモニウム(2:2:1)の溶出画分を採取し、CH3CNを減圧
下留去したのちn−ブタノール抽出を実施した。n−ブタノール抽出液を無水硫
酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去して、Boc−Gly−Gly−Ar
g−PM(3、0mg)を得た。
MS m/z : 842 [M+H]”、 742 [M−Boc+2H]”
実施例4 トリペプチド化ドラッグの細胞毒性実施f13で取得した3種のトリ
ペプチド化ドラッグ(それぞれBoc−G 1y−G ly−Arg−ADR,
Boc−Pro−Gly−Arg−TAN−1120およびBoc−Gly−G
ly−Arg−PM) [第1〜3図ニー・−]の胃癌細胞株NUGC4あるい
は腎癌細胞株AM−RC−6に対する細胞毒性を、その活性化体(それぞれAD
H,TAN−1120およびPM)[第1〜3図−一〇−]のそれと比較した。
すなわち、マイクロプレートに播種した培養ヒト癌細胞5×103個/ウェルに
種々の濃度の薬物を添加し、4日間培養後、公知の方法に従い3− (4,5−
ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム ブロマ
イド(MTT)を用いて生細胞数を算定した[H,Tadaら:ジャーナル・オ
ブ・イムノロジカル・メソ7ズ(J、 1mmunol。
Methods)、 93 、I 57(1986)]。
結果は1〜3図に示した通りであった。NUGC4あるいはバーに一6癌細胞に
対してADHのプロドラッグ体[第1図ニー・−]は活性化体[第1図;−0−
1の約J%の活性を示し、TAN−1120のプロドラッグ体[第2図ニー・−
]は活性化体[第2図;−0−]のl/10〜l/100以下の細胞毒性を示し
、PMのプロドラッグ体[第3図;−・−1は活性化体[第3図;−〇−]の約
1/4の活性を示した。
実施例5 トリペプチド化ドラッグの活性化反応(1)マイクロプレートに播種
した胃癌細胞賎−に−65XIO”個/ウェルに、実施例3で取得したBoc−
Gly−Gly−Arg−ADRあるいはBoc−G 1y−G Iy−Arg
−PMを添加し、さらにBoc−G 1y−G ly−Arg−ADRの細胞混
液にトリプシンを、Boc−Gly−G ly−Arg−PMの細胞混液にUK
を添加して37°Cで培養した。3a後、生細胞数を実施例4に記載の方法で算
定し、トリプシンあるいはUKによるプロドラッグ活性化反応を測定した。
結果はwllおよび2表tこ示した通りであった。飲−Gly−Gly−Arg
−ADRはトリプシンにより分解され、有意な細胞毒性の増加を示した。また、
Boc−Gly−Gly−Arg−PMについてもUKにより分解され細胞毒性
の顕著な増加が観察された。
第1表
%細胞増加
Boc−Gly−Gly−Arg−ADR” トリプシン(μg/−)0 1.
0 10 100
2.0Hg/d 100 67 45 324.0Hg/llI2100 64
54 2813トリペプチド化アドリアマイシン
第2表
%細胞増加
Boc−Gly−Gly−Arg−PM” ウロキナーゼ(μg/−)1.0H
g/di 100 90 551ゝ トリペプチド化ピュロマイシン
実施例6 トリペプチド化ドラッグの活性化反応(2)実施例5で取得したBo
c−Gly−Gly−Arg−ADRのトリズシン分解産物および肚−Gly−
GIV−Arg−PM U K分解産物をODSカラム(YMCA−3020D
S 12OAカラム4.6X150市、株式会社ワイ・エム・シー販売)を用い
る逆相高速液体クロマトグラフィーに供し、そのクロマトパターンをそれぞれの
活性化体ADHおよびPMと比較した。溶出液は30%アセトニトリル10.0
1Mリン酸緩衝液(pH3,0)、溶出速度は1.od/分で、254nmにお
けるカラム溶出液の紫外吸収強度をモニターした。
結果は第4および5図に示した通りであった。第4図からBoc−Gly−Gl
y−Arg−ADR(ビークB:溶出時間1O22分)はトリプシンにより分解
されADH(ビークA;溶出時間3.6分)に、また第5図からBoc−Gly
−Gly−Arg−PM (ピークB;溶出時間32分)はUKにより分解され
PM(ピークA:溶出時間1.8分)に活性化されることが判明した。
公知の方法[W、 C,J、 Ross :ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサ
イティ(J。
Chem、 Soc、)、 l 83頁(1949)およびJ、 L、 Eve
rettら:ジャーナル・才ブ・ケミカル−ソサイティ(J、 Chem、 5
oc)、 1972頁(1949)]に従いフェニレンジアミンマスタード(P
DM)を合成した。
PDM(6,1mg)、N−エチルモルホリン(5μQ)のDMF(0,3m)
溶液に奴−Gly−Gly−Arg−OH(9,0mg) 、 HOBT (7
,7mg)及びWSC(6mg)のDMF溶液を加え撹拌したのち、実施例3−
(5)と同様に処理してBoc−Gly−Gly−Arg−PDMを得た。
MS m/z : 603 [M+Hド、 503 [M−Boc+28]”(
2) Boc−Gly−Gly−Arg−Val−ADRの合成ADR(20m
g)、N−エチルモルホリン(4μ+2)、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェ
ニル−し−バリン(Npys−Val) (28mg) 、HOBT(12mg
)およびWSC(24mg)のDMF(1m)溶液を室温で撹拌した。反応速時
N−エチルモルホリン(4μQ)を2回追加添加した。溶媒を減圧下に留去した
のち酢酸エチルで抽出した。抽出液は水洗後乾燥し、溶媒を減圧上留去し、得ら
れた残留物をシリカゲル(3g)を用いるカラムクロマトグラフィーで精製した
。2%メタノール−クロロホルム溶出画分を減圧下濃縮して、橙赤色結晶のNp
ys−Val−ADR(27mg)を得た。Npys−Val−ADR(13、
1mg)のジオキサ7(1m)溶液にIN塩酸水溶液(0,1m)を加え室温で
40分間撹拌し、次いで重そう水を加えて中和したのちn−ブタノール抽出を実
施した。抽出液を水洗、乾燥後減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をンリカ
ゲル(3g)を用いるカラムクロマトグラフィーで精製して、10%メタノール
−クロロホルム溶出画分より橙赤色油状物のVal−ADR(7mg)を得た。
MS m/z:643[M+Hド
Val−ADR(2、0mg)、Boc−Gly−Gly−Arg−OH(7、
1mg)、 HOB T (6、9mg)のDMF溶液にwsc(7,On+g
)を加えて室温で撹拌した。溶媒を減圧上留去し得られた残留物を実施例3−(
5)と同様に処理してBoc−Gly−Gly−Arg−Vat−ADRを得た
。
MS m/z : 1035 [M+Nal”(3) QS4−Gly−Gly
−Arg−PMの合成グリシンエチルエステル(Gly−OEt 、 628
mg)のDMF(5i112)懸濁液に’pJ −エチルモルホリン(630μ
Q)を加え室温で撹拌した。6−(3−カルボキンプロピル)−2,3−ジメト
キシ−5−メチル−1,4−ベンゾキノン(QS−4,l 、 178g)のD
MF(3iLI2)溶液を加え、さらにWS C(955mg)を加えたのち室
温で一晩かき混ぜた。溶媒を減圧上留去したのち、残渣に水を加えて酢酸エチル
抽出を実施した。抽出液は水洗乾燥後溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲル(
48g)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。1%メタノール−
クロロホルム溶出画分を減圧下濃縮し、残留物を酢酸エチル−n−ヘキサンより
結晶化して、橙黄色針状晶の4−(2,3−ジメトキシ−5−メチル−1゜4−
ベンゾキノン−6−イル)ブタノールグリシンエチルエステル(O3−4−Gl
y−OEt、 561 mg)を得た。QS−4−Gly−OEt (94mg
)の酢酸エチル溶液を/hイドロサルファイト水溶液で振とう混和しヒドロキノ
ンにしたのち、酢酸エチルを減圧上留去した。残留物をMeOH溶液としたのち
、N2気流下lNNaOHを加え加水分解した。INHCQで酸性とし酢酸エチ
ルで抽出した。抽出液は水洗乾燥後減圧下溶媒を留去した。得られた残留物のD
MF(0,2iffl)溶液にC,ly−Arg−OMe(141mg)、HO
BT (39mg) 、WSC(110mg)を加えて室温で一晩かき混ぜ、さ
らにHOBT(39mg)、WSC(55mg)を追加してかき混ぜた。
溶媒を減圧上留去したのち水を加え、未反応物をエーテル抽出した。水溶液を減
圧下a縮して得られた残留物をノリ力ゲル(5g)を用いるカラムクロマトグラ
フィーに供し、酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水(60:20・6:10)で溶
出してQS−4−Gly−Gly−^rg−OMeを得た。得られたQS−4−
Gly−Gly−Arg−OMeの水溶液にハイドロサルファイド水溶液を加え
て撹拌したのち、lNNaOHを加えて加水分解し、さらにINHCII’で中
和したのち、陽イオン交換樹脂(バイオレックス70)に供し、その素通り画分
とINピリジン溶出画分とを混ぜ、溶媒を減圧上留去してQS−4−Gly−G
ly−Arg(80mg)を得た。ビュロマインン塩酸塩(Pト2HCN) (
10mg)とN−エチルモルホリン(10μl)のDMF溶液に上記QS−4−
Gly−GI Y−Arg(2Qmg)、 HOBT(7mg)およびWSC(
4゜5 mg)を加えて一晩室温でかき混ぜた。減圧下溶媒を留去し、残留物を
MeOHに溶解し塩化第二鉄水溶液でキノン体に酸化したのち、さらにその溶媒
を減圧上留去した。残留物を実施例3−(5)と同様に処理してQS−4−Gu
y−Guy−^rg−PMの黄色油状物を得た。
MS Ql/Z・994 [M+31](4) QS−10−Gly−Gly−
Arg−PMの合成6−(9−カルボキンノニル−2,3−ジメトキシ−5−メ
チル−1,4−ベンゾキノン(QS−10)を出発原料として上記(3)と同様
に処理して10−(2,3−ジフトキン−5−メチル−1,4−メチル−ベンゾ
キノン−6−イル)デカノイルグリシンエチルエステル(QS−10−Guy−
OEt)が橙黄色針状晶(mp、7フー775℃)として酢酸エステル−〇−へ
キサンより結晶化された。
NMR(CD(J3)δ:1.23−1.40(15t1.m、CH3,CIz
)、 1.63(2H,i、CTIx)、 2.01(3HCs。
核CHs)、 2.24(38,t、 CH2C0N)、 2.44(20,t
、核CHり、 3.99(6H,S、 0CR3)、 4.03(2L d、N
CR2C00)、 4.22(21,Q、 0CR2)QS−10−Gly−O
Etを加水分解したのち、cty−^rg−OMeのジペプチドと縮合してQS
−10−Gly−Gly−Arg−OMeを黄色油状物として得た。
M S rx/z : 639 [M+3H]OS−1005−1O−Gly−
Gly−Arを加水分解後、WSCを用いてPMと縮合してO5−105−1O
−Gly−Gly−Arを黄色油状物として得た。
MS m/z : l 076 [M+H]”(5) Bz−Gly−Ala−
Pro−Gly−Arg−PMの合成りz−Gly−Ala−Pro (70m
g ;ペプチド研究会)のDMF(1m)溶液にHONB(50mg)、DCC
(58mg)を加え室温で2時間かき混ぜた。この反応液はろ過して沈殿物をろ
過除去後、ろ液をGly−Arg−OMe塩酸塩(112mg)とトリエチルア
ミン(30μQ)のDMF (1m)溶液に加え、室温で一晩かき混ぜた。再び
沈殿物をろ去したのちる液を減圧下濃縮した。得られた残留物をシリカゲル(6
g)を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エチル−ピリジン−酢酸−
水(60:20:6:10)で溶出してBz−Gly−Ala−Pro−Gly
−Arg−OMeを得た。
得られたBz−Gly−Ala−Pro−Gly−Arg−OMeの水溶液に1
NNaOHを入れて室温でかき混ぜ、反応液を陽イオン交換樹脂(バイオレック
ス70)に供した。素通り画分とINピリジン溶出画分とを集め、溶媒を減圧上
留去してBz−Gly−Ala−Pro−Gly−Arg (70mg)を無色
油状物として得た。P M(10,3mg)、N−エチルモルホリン(10μ1
2)のDMF(300pQ’)溶液に、上記Bz−Gly−Ala−Pro−G
ly−Arg(20mg)のDMF (300pQ’)溶液とHOBT(7mg
)とを加え、さらにWSC(9,0mg)を加えて室温で4時間かき混ぜた。−
晩低温室に放置したのち溶媒を減圧上留去し、残留物を実施例3−(5)と同様
に処理してBz−G 1y−A la−Pro−Gly−Arg−PMを無色油
状物として得た。
M S m/z : l Ol 4 [M+H”](6) Z−C1y−Pro
−Leu−Gly−Gly−Arg−PMの合成市販のZ−Gly−Pro−L
eu−Glyを原料として上記(5)と同様の操作によりZ−Gly−Pro−
Leu−Gly−Gly−Arg−PMを無色油状物として得た。
M S m/z : l l 43 [M+H”]実施例8 プロドラッグの活
性化反応(3)マイクロプレートに播種したヒト類上皮癌細胞株A431 7X
IO3個/ウェルに、実施例7で取得したBoc−Gly−Gly−Arg−P
DIJ、 Boc−Gly−Gly−Arg−Val−ADR,O5−405−
4−Gly−Gly−Ar、 O5−105−1O−−Gly−Gly−Arお
よびBz−Gly−Ala−Pro|
Gly−Arg−PMを添加し、ざらにUKを添加して37℃で培養した。以下
、実施例5に記載の方法でUKによるプロドラッグ活性化反応を測定した。
結果は第3表に示した通りであった。いずれのプロドラッグ体もUKにより第3
表
参考例12で取得した抗hTfRMoAb産生ハイブリドーマ22C6および参
考例9で取得しI;抗UK MoAb産生ハイブリドーマトーI−6とを、それ
ぞれ0.5μg/mFITcおよび1.5μg/5v2TRITc含有イスコア
ーハムF−12混合培地で37°C230分間インキュベートし、蛍光染色した
。次いで、LSM溶液(和光紬薬工業に、に販売)を添加し死細胞を除去したの
ち、両ハイブリドーマを1:1の割合で混じ、PEG6000を用いて参考例8
−(2)に記載の方法で細胞融合した。
37℃で2時間インキュベート後、FAC3に供することによりフルオレセイン
およびローダミンで二重染色された細胞25000個を分取し、次にフィーダー
としてマウス脚線細胞を5XIO’個/ウェル播種した96穴マイクロプレート
に、上記二重染色細胞を10個/ウェルの割合で播種し培養した。
(2)ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニング融合後1−2週
で細胞増層のみられたウェルの培養上清をCe1l−EIAに供し二重特異性抗
体活性を測定した。すなわち、参考例3で作成したヒト癌細胞A431結合マイ
クロプレートに被検ハイブリッド・ハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で2
時間反応後0.2%BSA添加培地で洗浄した。次いでビオチン標識したUKを
添加し、さらに室温で2時間反応後、HRP標識したアビジンを反応させた。室
温で1時間反応後洗浄し、固相に結合した酵素活性を参考例3に記載の方法で測
定した。
高い二重特異性抗体活性を示すウェルについて限界希釈法によるクローニングを
寅施し、目的の二重特異性抗体産生マウステトラオーマUTF 20−7を取得
した。結果は第6図に示した通りであった。
(3)二重特異性抗体の精製
予め0.5顧鉱油を腹腔的投与したB A L B / cマウスに5X10’
個/マウスのマウス・ハイブリッド・ハイブリドーマ(テトラオーマ)を腹腔内
接種した。約10〜20日後に貯溜がみられる腹水を採取し、さらに50%飽和
硫酸アンモニウムで塩析してIgG画分を得た。次いで20mM PBS (、
pH7−5)で透析後、UK結結合セルフファインカラムに供し、pH2,9の
0.2Mグリノ〉−塩酸緩衝液で溶出した。酸溶出画分をPBSで透析後、さら
にヒドロキシ・アパタイトカラムJこ洪し目的の二重特異性抗hTfR−抗UK
抗体を精製した。本方法により、腹水20−から約8.2mgの二重特異性抗体
UTF20−7を得ることができた。
実施例1〇 二重特異性抗体によるプロドラッグ活性化反応マイクロプレートを
播種したヒト類上皮癌細胞A4318よびマウス白血病細胞P338 1.0X
10’個/ウェルに、実施例9で取得した精製二重特異性抗体とUKとのl:l
(モル比)免疫複合体を添加し5°Cで30分反応させた。低温下で細胞を洗浄
後、実施例7−(2)に記載のプロドラッグBoc−Gly−Gly−Arg−
Val−ADRあるいは実施例7−(4)に記載のプロドラッグO5−105−
1O−Gly−Gly−Arを、それぞれ最終濃度5.0μg/−あるいは0.
2μg/−となるように添加した。以下、実施例5に記載の方法で細胞表面に結
合したUK/二重特異性抗体免疫複合体によるプロドラッグ活性化反応を測定し
た。
結果は第4表に示した通りであっt;。標的細胞A431に対しては、いずれの
プロドラッグ体もUK/二重特異性抗体免疫複合体により活性化され強い細胞毒
性を発揮した。一方、非標的細胞P388に対しては、細胞毒性がほとんど認め
られなかった。
(0,5μg/m) 3 75 103O3−10−Gly−Gly−Arg−
PM 0 100 100(2,0μg/m) 3 84 98
Fig、I
Q O,1251−020嬢/d)
orug concant:ation (conv@rted to adr
iamycix)Fig−2
0L 10 100 11000(p/−)Drug concentrati
on (convertad to TAN−41201F工q、3
0 0.1 0.5 1 2 5 10Cμg/−)Drug coneent
rat工on (convertedto puromyc工n)
Fiq、4
0.00 3.75 7.50 11.25E工ution time (wi
n)F工q、5
Elution time (min)F工q、6
2 4 B 10
要約書
本発明は、ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化酵素に対して特異性を有するハ
イブリッド・モノクローナル抗体、該抗体を産生ずるポリドーマおよび該抗体に
プロドラッグ活性化酵素を免疫結合させてなる抗ヒト癌蛋白複合体、さらに該抗
体と抗癌剤のプロドラッグを併用する癌治療法を提供する。
補正書の写しく翻訳文)提出書(特許法第184条の8)平成4年4月7日
Claims (33)
- 1.ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化酵素に対して特異性を有する二重特異 性ハイブリッド・モノクローナル抗体。
- 2.プロドラッグ活性化酵素がプロテアーゼである請求項1記載の抗体。
- 3.プロテアーゼがウロキナーゼである請求項2記載の抗体。
- 4.プロドラッグ活性化酵素がグリコシダーゼである請求項1記載の抗体。
- 5.グリコシダーゼがグルクロニダーゼである請求項4記載の抗体。
- 6.プロドラッグ活性化酵素が不活性型のプロドラッグを活性型の抗癌剤に変換 する酵素である請求項1記載の抗体。
- 7.プロドラッグがペプチド化抗癌剤である請求項6記載の抗体。
- 8.プロドラッグがトリペプチド化抗癌剤である請求項6記載の抗体。
- 9.プロドラッグが抗癌剤のグルクロニン酸抱合体である請求項6記載の抗体。
- 10.抗癌剤がアドリアマイシン,シスプラチン,メルファラン,メトトレキセ ート,ミトマイシンC,ピンクリスチン,ピュウロマイシン,フェニレンジアミ ンマスタード,アンサマイトシン類,TAN−1120およびそれらの関連化合 物である請求項6記載の抗体。
- 11.抗癌剤がアドリアマイシン,ピュウロマイシン,フェニレンジアミンマス タード,アンサマイトシン類,TAN−1120である請求項6記載の抗体。
- 12.請求項1記載の抗体を産生するポリドーマ。
- 13.抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマと抗ウロキナーゼ抗体産生ハイプリドー マとを融合して得られるテトラオーマであって、ヒト癌細胞およびプロドラッグ 活性化酵素両者に対して特異性を有する二重特異性ハイブリッド・モノクローナ ル抗体を産生するテトラオーマ。
- 14.抗ヒト癌抗体産生ハイプリドーマが抗ヒト癌細胞膜表面抗原抗体産生ハイ プリドーマである請求項13記載のテトラオーマ。
- 15.抗ヒト癌抗体産生ハイプリドーマが抗ヒト・トランスフェリン・レセプタ ー抗体産生ハイブリドーマである請求項13記載のテトラオーマ。
- 16.抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマがマウス・ハイプリドーマ22C6であ る請求項13記載のテトラオーマ。
- 17.抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマがマウス・ハイプリドーマUK1−6で ある請求項13記載のテトラオーマ。
- 18.マウス・テトラオーマUTF20−7。
- 19.請求項1記載の抗体にプロドラッグ活性化酵素を免疫結合させてなる抗ヒ ト癌蛋白複合体。
- 20.抗ヒト癌細胞抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞と抗プロドラッグ 活性化酵素抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞とを融合することを特徴と する、ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化酵素両者に対して特異性を有する二 重特異性ハイブリッド・モノクローナル抗体産生ポリドーマの製造法。
- 21.プロドラッグ活性化酵素がプロテアーゼである請求項20記載の製造法。
- 22.プロテアーゼがウロキナーゼである請求項20記載の製造法。
- 23.プロドラッグ活性化酵素がグリコシダーゼである請求項20記載の製造法 。
- 24.グリコシダーゼがグルクロニダーゼである請求項20記載の製造法。
- 25.ポリドーマが抗ヒト癌細胞抗体を産生するハイプリドーマと抗プロドラッ グ活性化酵素抗体を産生するハイブリドーマとを融合して得られる、ヒト癌細胞 およびプロドラッグ活性化酵素両者に対して特異性を有する二重特異性ハイブリ ッド・モノクローナル抗体産生テトラオーマである請求項20記載の製造法。
- 26.ポリドーマが抗ヒト癌細胞抗体を産生するハイブリドーマと抗ウロキナー ゼ抗体を産生するハイブリドーマとを融合して得られる、ヒト癌細胞およびプロ ウロキナーゼ両者に対して特異性を有する二重特異性ハイブリッド・モノクロー ナル抗体産生テトラオーマである請求項20記載の製造法。
- 27.請求項12記載のポリドーマを液体培地または動物腹空内で培養し、培養 上清または腹水から採集することを特徴とするヒト癌細胞およびプロドラッグ活 性化酵素に対して特異性を有する二重特異性ハイブリッド・モノクローナル抗体 の製造法。
- 28.プロドラッグ活性化酵素がプロテアーゼである請求項27記載の製造法。
- 29.プロテアーゼがウロキナーゼである請求項27記載の製造法。
- 30.プロドラッグ活性化酵素がグリコシダーゼである請求項27記載の製造法 。
- 31.グリコシダーゼがグルクロニダーゼである請求項27記載の製造法。
- 32.哺乳類に効果的な量の請求項1記載の抗体と抗癌剤の不活性型プロドラッ グとを併せて投与することを特徴とする哺乳類の癌治療法。
- 33.抗癌剤の不活性型プロドラッとを併用して癌の治療に用いることを特徴と する請求項1記載の抗体の利用法。
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