JPH05506563A - モノクローナル抗体、その製造法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体、その製造法及び用途去・　背景技術 本発明は癌治療剤として有用な二重特異性抗体−酵素複合体に関する。さら°′ 　に詳しくは、二重特異性の一方がヒト癌細胞に対するものであり、他方がプロ ドラッグを活性化する酵素に対するものであるハイブリッド・モノクローナル抗 体（以下、ハイブリッドＭｏＡｂと略記することがある）８よび該抗体を産生す るポリドーマに関する。

本発明はまた、上記のハイブリッドＭｏＡｂに該酵素を免疫結合させてなる抗ヒ ト癌蛋白複合体に関する。

癌細胞の選択的破壊を同舟して、抗癌抗体に化学療法剤あるいは生物毒素を結合 させてなる抗癌免疫複合体は、抗体ミサイル療法剤については多くの研究がなさ れ、白血病やリンパ腫などの血液関連の癌ではある程度の成果を挙げているが、 実際の臨床応用にあたっては必ずしも満足すべき結果を得ていない。

特に固型癌に関しては重篤な副作用の発現がみられることもあり、なお解決しな ければならない多くの問題を抱えているのが現状である。この理由として、■） 癌細胞表面上の＠癌関連抗原の細胞当りの数が必ずしも多くないため、十分な量 の抗癌剤を癌細胞内に導入できないこと、２）少ない腫瘍関連抗原を通してなお かつ癌細胞に致死的効果をもたらすために、細胞毒性の強い生物毒素（例、リシ ン、緑膿菌外毒素など）を用いるが、この場合は副作用が著しく臨床応用が難し いこと、３）一般的にはヒト癌細胞は多様性に富み、全ての細胞が同一のＩ癌関 連抗原を有している可能性はほとんどなく、従って標的抗原を有さない癌細胞は ミサイル療法剤の殺細胞効果を免れ増殖すること、などが挙げられる。特に癌細 胞の多様性を克服する治療法の確立は非常に難しく、例えば複数の抗癌抗体を用 いる療法（抗体カクテル療法）などが考えられているが、複数種の癌特異抗体を 作製することはきわめて困難で、この点からもカクテル療法は必ずしも現実的で はない。

発明の開示 本発明者らは上記に示したような従来の癌ミサイル療法剤でみられた諸問題を解 決するため、近年開発された２重特異性抗体に着目して研究を進め、本発明を完 成した。すなわち、不活性型の抗癌プロドラッグを活性型に変換する酵素とヒト 癌細胞との両者に結合できる２重特異性抗体を作製し、かかる抗体と該酵素との 免疫複合体を癌患者に投与し、さらに不活性型のプロドラッグを別途投与するこ とにより、癌細胞を選択的にしかもその多様性に影響されることなく殺細胞効果 を示す抗ヒト癌蛋白複合体を開発した。

プロドラッグそれ自体は血中および他の臓器ないし組織において不活性型で存在 し、標的癌組織近傍においてのみ、ヒト癌細胞に結合した本発明の抗ヒト癌蛋白 複合体により分解・活性化され抗癌活性を発揮するので、その副作用はほとんど みられないことが本発明の抗ヒト癌蛋白複合体を用いる投与法の特長であり、ま た標的癌組織近傍に存在するが、標的抗原を有していない癌細胞に対しても抗癌 活性が発揮され、癌細胞の多様性に影響されることなく殺細胞効果を示すことが 本発明の抗ヒト癌蛋白複合体を用いる投与法の特長である。すなわち本発明は、 二重特異性を有するハイブリッドＭｏＡｂであって、二重特異性の一方がヒト癌 細胞に対するものであり、他方がプロドラッグ活性化作用を有する酵素に対する ものである抗体、およびこれを産生するポリドーマを提供するものである。

また本発明は、上記二重特異性ハイブリッドＭｏＡｂｉ：プロドラッグ活性化作 用を有する酵素を免疫結合させてなる抗ヒト癌蛋白複合体を提供するもので図面 の簡単な説明 第１［ｆｆｌは、トリペプチド化ドラッグ（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− ＡＤＲ；−・−）およびその活性化体（ＡＤＲ；−０−）の胃癌細胞株ＮＵＧＣ ４に対する細胞毒性を示す（実施例４参照）。

第２図は、トリペプチド化ドラッグ（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＴＡＮ −１１２０；−・−）およびその活性化体（ＴＡＮ−１１２０；−０−）の腎癌 細胞株Ａ）Ｊ−ＲＣ−６ｉ：対する細胞毒性を示す（実施例４参照）。

第３図は、トリペプチド化ドラッグ（Ｂｏａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭ　 ；−・−）およびその活性化体（ＰＭ；−０−）の腎癌細胞株摺−Ｒｃ−６Ｊ二 対する細胞毒性を示す（実施例４参照）。

第４図は、Ｂｏａ−Ｇｌｙ−ＧＬｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲのトリプシン分解産物のク ロマトパターンを示す（実施例６参照）。

第５図は、Ｂｏａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭのＵＫ分解産物のクロマトパ ターンを示す（実施例６参照）。

第６図は、抗ｈＴｆＲ−抗ＵＫ二重特異性抗体産生マウステトラオーマＵＴＦ２ ０−７培養上清の抗体希釈曲線を示す（実施例９参照）。

発明を実施するための最良の形態 リドーマとを融合することにより作製されるが、抗ヒト癌抗体産生ハイブリドー マとしては、ヒト癌細胞と特異的に結合しうる抗体を産生するものであればいず れでもよく、例えば抗ヒト・トランスフェリン・レセプター（以下、ｈＴｆＲと 略記することがある）ＭｏＡｂ産生マウスハイプリドーマ２２Ｃ６（ＩＦＯ５０ １７２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０５４３Ｃ特開平２−７９９７０号公報参照〕ある いは抗ヒト腎癌ＭｏＡｂ産生マウスハイブリドーマＲＣＳ−１［：ＩＦＯ５０１ ８４、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３３３］　（特願平１−６２９３９号明細書参照〕な どが挙げられる。これらのハイブリドーマの産生ずる抗ヒト癌抗体の標的抗原、 すなわち本発明の二重特異性ハイブリッドＭｏＡｂが特異的に結合する癌細胞の 標的抗原の代表的なものとして、癌細胞膜表面抗原である腫瘍関連抗原や免疫担 当細胞表面レセプター、ウィルス感染細胞表面抗原などがあげられる。この中、 腫瘍関連抗原としては、ｈＴｆＲが良く利用されるが、この他癌胎児性抗原いわ ゆるＣＥＡ、　α−７二トプロテイン、さらにＣＡ１９〜９を始めとする幾つか の癌関連糖鎖抗原（Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ：キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、）、　４５　、２４０５（１９８５））あるいはＢ細胞リンパ騰 の膜免疫グロブリン・イディオタイプ（：Ｒ，Ａ、　Ｍｉｌｌｅｒら二ニューイ ングランド・ジャーナル・才ブ・メディンン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅ ｄ、）、　３０６．５１７（１９８２）：］やＴ細胞リンパ腫のレセプター・イ ディオタイプ（Ｌ、　Ｌ、　Ｌａｎ１ｅｒら：ジャーナル・オプ・イムノロジー （Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、土立ヱ、　２２８６　（１９８６））なども標的 抗原の例として挙げられる。

プロドラッグ活性化酵素に対する抗体産生ハイブリドーマの作製にあたっては、 通常のハイブリドーマ作製法が用いられる（Ｇ、　Ｋ５ｈｌｅｒら：ネーチャー （Ｎａｔｕｒｅ）、ヱ呈立、　４９５（１９７５））。例えば酵素を常法に従い 動物に免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融合させる方法が用い られる。

免疫動物としては、例えばウサ嶋ラットマウス、モルモットなどが用いられるが 、ＭｏＡｂ製造の場合にはマウスが特に好ましく用いられる。接種方法としては 、通常実施される方法に従えばよく、例えばマウスに１回１〜１００μｇ１好ま しくは１０〜２５μｇを等容量（０，１ｍ１２）の生理食塩水および７０インド の完全アジュバントで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎 に３〜６回接種する方法がとられる。

これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５ 日後Ｃ：牌′ｌｉｌおよびあるいはリンパ節を採取し、それらＪこ含まれる抗体 産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施でき、融 合促進剤としてはポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略記することがある ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨 髄腫細胞としてはＮ５−１、Ｐ３Ｕ１，５Ｐ２１０など、特にＰ３Ｕｌが好まし く用いられる。例えば牌臓細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率はｌ：１から１０ ：１で、これに分子量約１，０００〜９，０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度 で添加され、２０〜３７°Ｃ１好ましくは３０〜３７°Ｃで３〜ＩＯ分インキュ ベートするのが良い。

前記した抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる 。例えば、マイクロプレートにヒト癌細胞あるいは酵素蛋白を吸着させ抗原感作 プレートを作成する。次いで細胞融合の結果得られるハイブリドーマの培養上清 を抗原感作プレートに添加し、プレートに結合した特異抗体を検出する酵素免疫 測定法（以下、ＥｉＡと略記することがある）により培養上溝中の抗体価を測定 する。ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）添加培地などで選 別・育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちにクローニングに供される が、これは通常限界希釈法などで容易に実施される。クローン化されたハイブリ ドーマ培養上清の抗体価も上記のＥＩＡで同様にして測定し、安定的に力価の高 い抗体を産生するモノクローナルなハイブリドーマを選択・作出することができ る。この場合、ウロキナーゼなどのプロドラッグ活性化酵素の中和抗体を産生ず るハイブリドーマもポリドーマ作成時の親細胞として使用可能である。

本発明の二重特異性を有するハイブリッドＭｏＡｂを産生するポリドーマの作製 には幾つかの手法があり〔例、新本洋士ら：蛋白質）核酸・酵素、３３，２１７ 　（１９ｇｇ）など〕、いずれの方法を用いてもよいが例えば、１）上記のＨＡ Ｔ抵抗性のプロドラッグ活性化作用を有する酵素に対する抗体を産生ずるハイブ リドーマを、５−ブロモデオキシウリジン（以下、ＢｒｄＵと略記することがあ る）添加の培養液に段階的に馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクローン化し ＨＡＴ惑受栓受性る。同様にＨＡＴ抵抗性の抗ヒト癌細胞特異抗体産生ハイブリ ドーマを８−アザグアニン（以下、ＡＺＧと略記することがある）耐性とし、ヒ ボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランス７エラーゼ欠損株をクローン 化しＨＡ　Ｔ感受性とする。次いで常法に従い両者を融合して得られるテトラオ ーマをＨＡＴ添加培地で選別後、ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化作用を有 する酵素の両者に結合能を存するハイブリッドＭｏＡｂを分泌するテトラオーマ をクローン化する。２）抗ヒト癌細胞特異抗体産生ハイブリドーマをフルオレセ イン・イソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略記することがある）で標識し、 もう一方のプロドラッグ活性化作用を有する酵素に対する抗体を産生ずるハイブ リドーマをテトラメチル・ロダニン・インチオシアネート（以下、ＴＲＩＴＣと 略記することがある）で標識後、常法に従い両者を融合する。

得られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティペイティラド・セルソーター（ 以下、ＦＡＣ３と略記することがある）に供し、ＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴ Ｃの赤色の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別・クローン化するなどの方法 が挙げられる。また両親株のマーカーを全く逆にして使用し、テトラオーマを選 別・クローン化することも可能である。

これらの操作における細胞融合に当ってはセンダイウィルス、ＰＥＧなどの融合 促進剤やあるいは電気刺激などの方法が用いられる。好ましくはＰＥＧが用いら れ、以下にその一例を挙げるが、も元ろんこの方法に限定されるものではない。

すなわち、分子量約１．０００〜９，０００．濃度約１０〜８０％等のＰＥＧが 用いられ、処理時間は約０．５〜３０分であるが、好ましい条件の一例として、 約３５〜５５％のＰＥＧ　６，０００を約４〜１０分間、３７℃で細胞と接触さ せ、効率よく融合させることができる。

ポリドーマの選択は、上記のＨＡＴ添加培地などで実施できるが、このため８− ＡＺＧ、６−チオグアニン（６−ＴＧ）あるいは５−ＢｒｄＵなどの薬剤馴化法 により、それぞれの薬物耐性株が取得される。また新しいマーカーの融合細胞へ の導入により、種々の選択培地が用いられる。このような例として、ネオマイシ ンやハイグロマイシンＢ添加培地などが挙げられるＣＢ、　Ｓｕｇｄｅｎら：モ レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、）、　５．４１０　（１９８５）］。

さらに前記したように、異なった蛍光色素で標識したハイブリドーマを融合し、 ＦＡＣ３で二重標識されたハイプリント・ハイブリドーマをソーティングする方 法もあるＣＬ、　Ｋａｒａｗａｊｅｗら：ジャーナル・オブ・イムノロジカル・ メソンズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、　９６　、　２６５　（ １９８７））。

ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる 。例えば、（１）前述したヒト癌細胞や酵素を吸着させた抗原感作プレートを用 いる２種のＥＩＡの併用、（２）ヒト癌細胞結合マイクロプレートに被検培養上 清を添加し、次に西洋ワサビ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したプロドラ ッグ活性化作用を有する酵素を加えて二重特異性抗体を検出するＥＩＡ。

あるいは抗ヒト癌特異抗体と異なるサブクラスに属するプロドラッグ活性化酵素 に対する抗体を用いる場合は、（３）ヒト癌細胞結合マイクロプレートに被検培 養上清を添加し、次にＨＲＰ標識した該抗マウスＩｇＧサブクラス特異抗体を加 えて二重特異性抗体を検出するＥＩＡ、およびこれらの変法などを適宜組み合せ て用いることができる。　二重特異性抗体活性陽性のポリドーマは直ちにクロー ニングに供されるが、これは通常限界希釈法などで容易に実施される。

クローン化されたポリドーマの培養上清については、上記の方法でその抗体価を 測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するポリドーマを選択することにより、 目的とするモノクローナルな二重特異性抗体産生ポリドーマ（例、後述の実施例 テ得らｔｌ、ｆ：マウステトラｔ−？ＵＴＦ２０−７（ＩＦＯ５０２６０゜ＦＥ ＲＭ　ＢＰ−３１５６）など）を取得することができる。

上記した本発明のポリドーマの培養は通常、液体培地中、または動物の腹腔内（ 例えば、マウス等補乳動物の腹腔内）で公知の方法により実施できる。培養液お よび腹水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を組み合わせて用いるこ とによりできる。例えば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上溝を取り出 し、塩析（通常は硫酸アンモニウムもしくはａ酸ナトリウムを用し１る）を実施 する。得られたタンパク沈澱物を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマトグ ラフィー（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロティンＡカラム、ヒドロキ シアパタイトカラム等）に付し、目的とする抗体を分離精製することができる。

以上のような分離精製操作により、例えばＩＱの培養上清から蛋白重量比で９０ ％以上の純度の二重特異性ＭｏＡｂを約１〜１０ｍｇ得ることができる。また、 ２０−の腹水液からは同様のＭｏＡｂが約２〜２０ｏｇ得られる。

以上のようにして得られた二重特異性ＭｏＡｂは蛋白質として均一であり、蛋白 分解酵素（ペプシンなど）処理などにより、例えばヒト癌細胞およびプロドラッ グ活性化作用を有する酵素に対する結合能を保持するＦ　（ａｂ’　）、断片な どを得ることができる。これらの断片は本発明の二重特異性ＭｏＡｂと同様の目 的で使用できる。

なお、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生ずるポリドーマとして、抗ヒト癌細 胞ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマとプロドラッグ活性化酵素に対する抗体を産生ず るハイブリドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方のＭｏＡｂを産生ずる ハイブリドーマと他方のＭｏＡｂを産生ずる細胞とのトリオーマあるいはそれぞ れのＭｏＡｂを産生ずる細胞をエプスタイン・バー・ウィルスなどにより不滅化 後、細胞融合して得られるハイブリドーマなどであっても、本発明の二重特異性 ＭｏＡｂを産生ずるものであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用いること ができる。

まｔ：、これらのポリドーマがマウスＩｇＧＭｏＡｂを産生する場合には、該二 重特異性ハイブリッドＭｏＡｂの抗原認識部位を含む可変領域もしくは超可変領 域をコードするＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技術（Ｚ、　Ｓｔｅｐｌｅｗ ｓｋｉら：プロンーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス　 ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　 ８５　、４８５２（１９８ｇ））を用いてヒトＩｇＧの定常領域をコードする遺 伝子を結合させ、マウス−ヒトキメラ抗体を作製することもできる。かかるキメ ラ抗体はヒトへの投与に際し、抗原性が小さいため有利に用いられる。

本発明の二重特異性ＭｏＡｂあるいはプロドラ・ノブ活性化酵素と該二重特異性 ＭｏＡｂとから作製される選択的な抗ヒト癌蛋白複合体を用いる癌治療法におし ）では、例えば次に述べるいくつかの方法がある。（１）本発明の二重特異性Ｍ ＯＡｂを予め担癌患者に投与し、癌組織・細胞に結合させるべく十分な時間経過 後に、酵素ついでプロドラッグを投与する。（２）該二重特異性ＭｏＡｂと酵素 とを同時に投与し、ついでプロドラッグを投与する、あるいは（３）予め／％４ ブリッドノドＡｂと酵素とを反応させ、未反応の酵素を分離後、得られた抗ヒト 蛋白複合体を担癌患者に投与し、ついでプロドラ・ノブを投与する、などの方法 が挙げられる。

本発明の二重特異性ＭｏＡｂあるいはプロドラッグ活性化酵素、さらにはそれら より作製される抗ヒト癌蛋白複合体は、必要により例えばメンブレン・フィルタ ーなどによる濾過除菌操作後、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容されうる 担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、注射剤などとして製剤化し、各種の癌疾患 の治療に使用できる。またその投与量は、対象となる癌種、症状あるいは投与ル ートなどにより異なるが、例えば成人の癌患者に静脈投与する場合、二重特異性 抗体として１日当り約０．０２〜ｌ　、　Ｏｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０４ 〜０　、４　ｍｇ／ｋｇ、プロドラッグ活性化作用を有する酵素として１日当り 約０．０１〜０　、５　ｍｇ／ｋｇである。

本発明で用いられるプロドラッグ活性化酵素としては、プロドラッグ活性化作用 を有するいずれの酵素でもよいが、好ましくはペプチド結合を切断するプロテア ーゼ（例、ウロキナーゼ（ＵＫ）、トリプシンなど）や糖鎖結合を切断するグリ コンダーゼ（例、グルクロニダーゼなど）などが用いられる。上記酵素のなかで もプロテアーゼとりわけウロキナーゼが好ましく用いられる。また、ヒト由来の 酵素でその血中濃度が低いか、もしくは血中に存在しない酵素が望ましく、さら に癌細胞が産生する酵素が望ましい（Ｊ、Ｃ，Ｋｉｒｃｈｈｅｉｍｅｒも：プロ シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ニーニスニー（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　８６　、５４２ ４（１９８９）］　。例えばウロキナーゼの場合、薬物の活性体に適当なペプチ ド（例、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、　Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、　Ｐｙｒ−Ｇｌ ｙ−Ａｒｇなど）を結合させたプロドラッグが使用でき、またグルクロニダーゼ の場合、薬物のグルクロン酸抱合体がプロドラッグとして使用できる。ペプチド 化薬物あるいは薬物のグルクロン酸抱合体のいずれの場合も、元の薬物活性体に 比べて毒性が極端に低いか、あるいは無いことが期待されるので、本発明の二重 特異性抗体にプロドラッグ活性化酵素を免疫結合させた抗ヒト癌蛋白複合体と併 わせで用いられることにより、癌組織近傍でプロドラ・ングが活性化され、癌組 織を選択的に破壊することができる。

上記のプロドラッグの元となる薬物としては、抗癌剤として使用されているいず れのものを用いてもよいが、好ましい例として現在臨床応用されているアドリア マイシン、シスプラチン、メルフアラン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ １ビンクリスチン、ビュロマイシン、フェニレンジアミンマスタードなどが挙げ られる。さらには強力な細胞毒性を有するアンサマイトシン類、ＴＡＮ−１１２ ０（下記式（ＩＩ）においてＸ＝ＯＨ）およびそれらの関連化合物などを抗癌剤 として用いてもよい。このような例としては、例えば下記式（Ｉ）で表される化 合物〔特願平１−１８５６０号明細書、ＥＰ公公開３７６１７今る化合物〔特願 平１−１７８６３４号明細書，ＥＰ公公開３７６１７芳いはＴＡＮ−１１２０関 連化合物としては、抗癌活性を有するものであればいずれのものでもよい。いず れの場合も前述したように、毒性の無い、もしくは弱いプロドラッグの形として 患者に投与され、本発明の抗ヒト癌蛋白複合体により癌組織近傍において分解さ れ、薬理活性を発揮する。

下記式で表わされる化合物を含むアンサマイトシン類〔式中、Ｒは水素原子また はカルボン酸由来のアシル基を、Ｑは水酸基（ＯＨ）またはメルカプト基（Ｓ　 Ｈ）を、Ｘは塩素原子または水素原子を、Ｙは水素原子。

低級アルキルスルホニル基または置換基を有していてもよし＼アルキルはアラル キル基を示す。〕 ＴＡＮ−１　１　２０関連化合物 〔式中、Ｘは水酸基または水素原子を示す。〕以下に参考例および実施例により 本発明を具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでないこと は言うまでもない。

なお、参考例および実施例で用いられている動物細胞は、以下の表に示すように 寄託が行なわれている。

マウスハイブリドーマ　５０１７７　８Ｐ−２０８４ＵＫ　１−８７ マウスハイブリドーマ　５０２０８　ＢＰ−２５４８ＵＫ、　１−６ マウスハイブリドーマ　５０１８４　ＢＰ−２３３３Ｃ５−１ マウスハイブリドーマ　５０２１９　ＢＰ−２６８８ＧＩ−５ マウスハイブリドーマ　５０１７２　ＢＰ−２０５４２Ｃ６ マウステトラオー７　５０２６０　８Ｐ−３１５６ＩＦＯ：財団法人発酵研究所 （大阪） ＦＲＩ：通商産業省微生物工業技術研究所また、本明細書においてアミノ酸およ びペプチドはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢ　Ｎ）で採用された略 記法により表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、アミノ酸などに関 し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

Ｇｌｙニゲリシン残基 Ｐｒｏニブロリン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 ＰｙｒｏＧｌｕ 参考例１　混合血球凝集法（ＭＨＡ） 対象となる細胞のうち付着性の細胞は、２４〜４８時間前より６０穴マイクロプ レート（ヌンク社製）に５００個／ウェルとなるよう分注して培養した。浮遊性 の細胞は、検査当唱こ血清無添加の培養液に浮遊後、同じ数の細胞を各ウェルに 分注し、４００Ｘｇで５分間遠心してプレートに付着させた。

指示血球の作製は、リン酸食塩緩衝液（２０ｍＭリン酸二ナトリウム、０゜１５ Ｍ　ＮａＣ＋２　；ｐＨ７，５Ｘ以下、ＰＢＳと略記することがある）で３回洗 浄したヒツジ赤血球をＰＢＳで２％浮遊液とし、この浮遊液にＰＢＳで最高凝集 価の２．５倍に希釈したマウス抗ヒツジ赤血球抗体（オルソ社製）を等量混合し て３７℃で３０分反応させた。この血球をＰＢＳで３回洗浄し２％に再浮遊した 。次にＰＢＳで２５倍に希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を等 量混合し、さらに３７℃で３０分間反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄して２ ％浮遊液として保存した。

細胞を付着させたプレートを、Ｏ，ＬＭ　ＭｇＣ４０−０３Ｍ　ＣａＣｌ２２− 〇、１％グルコース含有ペロナール食塩緩衝液（ｐＨ７−４；以下、ＶＢＳと略 記することがある）にさらに５％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含む溶液（５％Ｆ Ｃ５−ＶＢＳ）で洗浄後、マウス抗ヒト癌抗体を含有する被検液を各ウェルに分 注し、室温で１時間静置した。ＶＢＳでこのプレートを洗浄後、５％ＦＣ３−Ｖ ＢＳで０．２％に希釈した指示血球を各ウェルに分注し室温で４０分間静置した 。次に未反応の血球をＶＢＳで洗浄除去し、顕微鏡下で観察した。抗体非添加の 陰性コントロール試験でのロゼツト形成が１％以下であった。本試験のウェルに おいて標的細胞の２５％以上にロゼツト形成を認めた場合を反応場対象となる細 胞を培養後、０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液で細胞を浮遊させ、血清無添加の 培養液で洗浄し、次いでマウス抗ヒト癌抗体含有液を添加、４°Ｃで１時間反応 させた。培養液で洗浄後、フルオレセイン標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し４° Ｃで１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、蛍光顕微鏡で観察しｔこ。

参考例３　肺癌細胞を用いるＣｅ１ｌ−Ｅ工Ａヌンク社の９６穴マイクロプレー トに標的膿瘍細胞をウェル当り１０．０００〜４０，０００個播種口、炭酸ガス ・インキュベータ中で３７℃、−昼夜培養した。培養上清を陳去後、マウス抗ヒ ト癌抗体含有検液を添加し、室温で２時間反応させた。次いで０．２％牛血清ア ルブミン（以下、　ＢＳＡと略記することがある）添加培地で洗浄後、西洋ワサ ビ・パーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略記することがある）で標識したウサギ 抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、さらに室温で２時間反応させた。

洗浄後、酵素基買としてオルソ−フェニレン・ジアミンおよびＨｚ　Ｏ２ヲ含有 する０、１Ｍクエン酸緩衝液を各ウェルに加え、室温で酵素反応を実施した。

ＩＮ硫厳で反応停止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長４９２ｎｍ で発色色素を測定した。

胃癌患者Ｍ蕩組織の２市角組織片をｎｕ／ｎｕ−ＢＡＬＢ／　ｃマウス皮下に移 植し、移植継代の安定した株ＡＭ−ＲＣ−３の移植継代時（通常は移植後３〜４ 週）に血清を採取し、その移植マウスの血清０．５−を７０インドの完全アジュ バントと等量で混合・懸濁し、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。以 後、約７〜ｌＯ日毎に上記の移植ヌードマウスの血清０．５ｍｌを免疫した。計 ７回免疫後の抗体価を測定した。

参考例１記載のＭＨＡ法で、胃癌細胞株ＡＭ−に−７に対して高い抗体価を示し たマウスを以下の冥験に供した。

（２）ハイブリドーマの作成 （１）で得られた免疫マウスの肺臓細胞を常法によりマウス骨髄腫細胞Ｎ５−１ と融合しＨＡＴ添加培地で選択した。増殖するハイブリドーマ群を参考例１記載 のＭＨＡ法でスクリーニングに供し、抗体価の高いグループをさらにクローニン グし目的の抗ヒト腎細胞癌ＭｏＡｂ産生マウスハイブリドーマＲＣ５−１を得た （ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３３３，ＩＦｏ　５０１８４）。マウスハイフリトーマＲ Ｃ，Ｓ−１が産生する１ｅ−１抗体はＩｇＧ１サブクラスに属した。

（３）マウスＭｏＡｂの製造 マウスハイブリトーマＲＣ３−１５Ｘ１０’個をＭＣＩ（ＡＦ　）−ｒｍマウス に腹腔内投与し約４週後に５〜ｌｏｄの腹水液を採取した。腹水液は硫酸アンモ ニウムで塩析処理後、ＤＥＡＥ−セルロース・カラムで精製した。５０ｄの腹水 液から約２００ｍｇの精製マウス抗ヒト腎細胞癌ＭｏＡｂ　ＲＣＳ−１が得られ た。

（４）マウスＭｏＡｂの性状 各種腫瘍細胞株に対するＰＣ５−１抗体の反応性を、参考例１．２および３に示 した方法で測定した。ＲＣＳ−１抗体は、腎癌細胞ＡＭ−ＲＣ−３，ＡＭ−ＲＣ −６，ＡＭ−ＲＣ−７、膀胱癌細胞Ｔ２４８よび肺癌細胞Ｌｕｃｉ−１０，ＰＣ −１０ｒ：陽性であり、他の胃癌、腸瘍、乳癌、白血病細胞に対しては陰性であ った。また正常腎組織に対して陰ＵＫ５μｇ／−溶液を９６穴マイクロプレート に１ｏｏＩｔａずつ分注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン、Ｏ，Ｏ１％チメロ サール含有ＰＢＳ　１５０μＱを添加し感作プレートを作成した。上記の液を除 去し０．０５％Ｔｖｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Ｔｗと略記するこ とがある）で洗浄後、被検マウス抗体液１００μａを添加し室温で２時間反応さ せた。同様にＰＢＳ−Ｔｗでプレートを十分に洗浄後、ＨＲＰ標識ウサつ抗マウ スＩｇＧ抗体を添加しさらに２時間反応させた。

以下、参考例３に記載の方法に従い固相に結合したＨＲＰ活性を測定した。

参考例６　抗低分子ＵＫ抗体測定用ＥＴＡ参考例５に記載のＵＫの代りに低分子 ＵＫ（二本鎖低分子ＵＫ、ＪＣＲ社販売）を使用し、低分子ＵＫ感作グレートを 作成後、同様の方法で抗低分子ＵＫ抗体価を測定した。

参考例７　フィブリン溶解反応中和試験ＵＫ溶液（！！を終濃度２５　ｎｇ／ｍ ）に被検抗ＵＫ抗体溶液を添加し、３７℃で１時間反応後、反応混液をフィブリ ン・アガロース・プレートの１ウェル当り５μＱ注入した。３７℃で２〜６時間 後にフィブリンの溶解ｙ１（直径）を測定し、ＵＫの酵素活性に対する抗ＵＫ　 ＭｏＡｂの中和能を測定した。

市販のＵＫ（日本製薬製造）２００μｇ／ｍ生理食塩水溶液に等量の７０インド 完全アジユバントを添加し十分に乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（子２０μｇ／　 Ｏ−２−／マウス）に腹腔内および背部皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を 実施した。３回の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体について 、ＵＫ抗原液（５０μｇ／　０　、１　ｍ生理食塩水／マウス）を静脈内投与し た。

（２）細胞融合 最終免疫後３日で肺臓を摘出し、膵臓細胞懸濁液を常法により調脹した（約１０ ＠個）。次いでマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）２ＸＩＯ’個を添加し、ＰＥＧ６ ０００を用いてケーラーとミルスタインの方法〔不一チャ−（Ｎａｔｕｒｅ）、 　２５６　、４９５　（１９７５）〕に準じて細胞融合に供した。

融合終了後、細胞混液をヒボキサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む 、いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。以後は、親細胞の選択が 終了次第、ＨＡ　Ｔ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に代え培養を続け た。

（３）ハイブリドーマの選択およびクローニングＵＫ結合マイクロプレートを用 いる参考例５に記載のＥＩＡでハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。融 合１０日から２０日後にハイブリドーマの出現を認め、かつＵＫに特異結合する 抗体がみられた。特に結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法によ るクローニングに供した。

クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様の方法でスクリーニングに供し 、ＵＫ結合能の強いものを選択した。これらの結果、ＵＫに特異的に結合するＭ ｏＡｂ産生マウスハイブリドーマとして、ＵＫＩ−３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０８ ３，１Ｆ０　５０１７６）およびＵＫＩ−８７１：ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０８４， ＩＦｏ　５０１７７：］が得られた。これらのハイブリドーマが産生する抗体の 免疫グロブリン・クラスおよびサブクラスはオークタロニル法による測定で、そ れぞれＩｇＧ１およびＩｇＧｚｂであった。

参考例８−（１）に記載のＵＫの代りに市販の二本鎖低分子ＵＫＱＣＲ社販売） 全販売て、以下全く同様の方法でマウスへの免疫を実施した。

（２）融合細胞 参考例８−（２）に記載の方法に従い細胞融合を実施した。

（３）ハイブリドーマの選択およびクローニング低分子ＵＫ結合マイクログレー トを用いる参考例６記載のＥＩＡでハイブリドーマをスクリーニングし、以下参 考例８−（３）と同じ方法で抗低分子ＵＫＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを取得し た。これらの中、フィブリン溶解能を損うことなくＵＫに特異結合する抗低分子 ＵＫ　ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマとしてマウスハイブリドーマ　ＵＫＩ−６〔 ＩＦｏ　５０２０８．ＦＥＲＭ　ＢＦ−４５４８’ｌが得られた。　得られたハ イブリドーマから産生される抗体ＵＫＩ−Ｂの免疫グロブリンクラスおよびサブ クラスはオークタロニー法による測定で、ｔｇｃ＋（に鎖）であった。

参考例ＩＯ抗グルクロニダーゼ抗体測定用１１ｊＡ参考例５に記載のＵＫの代わ りにβ−グルクロニダーゼ（ングマ社製）を用いて抗原感作プレートを作成した 。次いで参考例５と同様の方法でＥＩＡを実施し、抗グルクロニダーゼ抗体活性 を測定した。

参考例１１　グルクロニダーゼ酵素反応中和試験参考例５に記載のＵＫの代わり に抗マウスＩｇＧ抗体を用いて抗体感作プレートを作成した。次いで被検マウス 抗グルクロニダーゼ抗体液を添加し、室温で２時間反応させたのち、ＰＢＳ−Ｔ ｖで洗浄しｌ；。ざらにβ−グルクロニダーゼ溶液２５μｇ／−を添加し室温で ２時間反応させ十分に洗浄後、０．１４％トリトンＸ−１００含有　０．１４Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４，６）に溶解した合成基質パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ− グルクロニド１．ｏ＋ｎＭを添加し酵素反応を実施した。３７°Ｃで４０分間反 応後、２．５Ｍ　２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールで反応停 止後、マルチスキャンを用いて生成した色素量を４１５ｎｍで測定した。

参考例１２　抗ｈＴｆＲ抗体産生ハイブリドーマの作製（１）ｈＴｆＲの精製 ヒト胎盤組織１．５ｋｇを細かく切断しＰＢＳ　（ｐＨ７，５）中でブレンドし たのち、遠心分離した。得られた沈渣を４％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ中で ホモゲナイズし、さらに超音波処理後再び遠心分離した。次いで上溝１００ｍ１ 当たり約３２ｇの硫酸アンモニウムを添加し塩析後、抗ｈＴｆ抗体結合カラムに 供し０．５Ｍ　ＮａＣｌ２含有２０ｍＭリン酸２ナトリウム緩衝液（以下、ＰＢ と略記することがあるＸｐＨ７，５）で十分に洗浄した。０．５Ｍ　ＮａＣＱお よび０．５％トリトンＸ−１００含有０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０゜０ ）で溶出したｈＴｆＲ画分を、さらにｈＴｆ結合カラムに供しＩＭＮａＣＱ含有 ＰＢで洗浄後、ＬＭ　ＮａＣＱおよび１％トリトンＸ−１００含有０゜０５Ｍグ リシン緩衝液（ｐＨ１０，０）で溶出することによりｈＴｆＲ精製標品約１．５ ｍｇを得た。

（２）免　疫 上記のｈＴｆＲ精製標品２００μｇ／　生理食塩水溶液に等量のフコインド完全 アンユハントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、ｎ＝１０゜２０μ ｇ／ｍｌ／マウス）に腹腔および背部皮下投与し、３週間隔で追加免疫を実施し た。４回の追加免疫後、２過て最大の血清抗体価を示した固体について、同じｈ ＴｆＲの抗原液（３０μｇ１０．１　生理食塩水／マウス）を静脈内投与した。

（３）細胞融合 最終免疫後３日で肺臓を摘出し、膵臓細胞懸濁液を常法により調製した（約１０ ８個）。次いでマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）２ｘｌＯ７個を添加し、参考例８ −（２）に記載の方法に従って細胞融合した。ＨＡＴ培地中で親細胞の選択が終 了次第ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に代え培養を続けた。

（４）ハイブリドーマの選択およびクローニング市販のウサギ抗マウスＩｇＧ抗 体液２０μｇ／　を９６穴マイクロプレートに１００μβずつ分注し４℃で一夜 放置後、さらに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（ｐＨ７，３）を添加して感作プレート を作成した。また（１）で得たｈＴｆＲ精製標品を常法に従いＨＲＰ標識後ＥＩ Ａに用いた〔北用常広：有機合成化学、４２゜２．８３　（１９８４）］。すな わち、上記第２抗体感作プレートにハイブリドーマ培養上清を添加し室温で２時 間反応後、ＰＢＳで洗浄した。次いでＨＲＰ標識ｈＴｆＲを添加しさらに室温で ２時間反応させた。以下、参考例３に記載の方法で酵素反応を実施し抗体価を測 定した。特に結合能の強いハイブリドーマについて限界希釈法によるクローニン グを実施し、抗ｈＴｆＲ抗体産生ハイブリドーマ２２０６を得た。本抗体のサブ クラスはＩｇＧ＋（に鎖）で、ヒト白血病細胞株に５６２およびヒト類上皮癌細 胞株Ａ４３１に高い親和性を示した。

実施例１　抗グルクロニダーゼ・モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作市 板のβ−グルクロニターゼ５００μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量の７０インド 完全アジユバントを添加し十分に乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（子５０ｇｇ１０ ．２ｍｌ／マウス）に腹腔内および背部皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を 実施した。３回の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を表した個体について 、β−グルクロニターゼ抗原溶液（１００μｇ１０．２ｍｌ生理食塩水／マウス ）を静脈内投与した。

（２）細胞融合 参考例１Ｏに記載のＥＩＡで高い血清抗体価を示したマウスより肺臓を摘出し、 参考例８−（２）に記載の方法に従い細胞融合を実施した。

（３）バイブリドーマの選択およびクローニング融合ｌＯ日から２０日後に出現 する融合細胞を、参考例１０に記載のＥＩＡでスクリーニングした。特に結合活 性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングに供した。

クローン化したハイブリドーマを同様のＥＩＡで選択した結果、グルクロニダー ゼに特異的に結合するＭｏＡｂ産生マウスハイブリドーマトーＩ−５（Ｆ　Ｅ　 ＲＭＢＰ−２６８８，ＩＦ○５０２１９）が得られた。このハイブリドーマが産 生ずる抗体はＩｇＧ１であり、参考例１１に記載の中和試験に供したところ、グ ルクロニダーゼ酵素活性を中和しない抗体と判明した。

参考例４で取得した抗ヒト腎細胞癌ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマＲＣ３−１およ び参考例９で取得した抗ＵＫ　ＭｏＡｂ産生ハイプリドーマトーｌ−５とを、そ れぞれ０．５μｇ／顧ＦＩＴＣおよび１．５μｇ／ｍＴ　ＲＩ　Ｔ　Ｃ含有イス コツ−ハムＦ・１２混合培地で３７°Ｃ９３０分間インキュベートし、蛍光染色 する。次いで、ＬＳＭ溶液（和光純薬工業に、に、販売）を添加し死細胞を除去 したのち、両ハイブリドーマを１＝１の割合で混じ、ＰＥＧ６０００を用いて参 考例８−（２）に記載の方法で細胞融合する。

３７°Ｃで２時間インキュベート後、ＦＡＣＳに供することによりフルオレセイ ンおよびローダミンで二重染色された細胞２５０００個を分取し、次にフィーダ ーとしてマウス胸腺細胞を５Ｘ１０’個／ウェル播種した９６六マイクロプレー トに、上記の二重染色細胞をｌＯ個／ウェルの割合で播種し培養する。

（２）ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニング融合後１−２週 で細胞増殖のみられたウェルの培養上清をＣｅ１ｌ−Ｅ　Ｉ　Ａに供し二重特異 性抗体活性を測定する。すなわち、参考例３で作成した胃癌細胞店−Ｉ？Ｃ−７ 結合マイクロプレートに被検ハイブリッド・ハイブリドーマ培養上清を添加し、 室温で２時間反応後０．２％ＢＳＡ添加培地で洗浄する。次いでビオチン標識し ｆ：ＵＫを添加し、さらに室温で２時間反応後、ＨＲＰ標識したアビジンを反応 させる。室温で１時間反応後洗浄し、固相に結合した酵素活性を参考例３に記載 の方法で測定する。

高い二重特異性抗体活性を示すウェルについて限界希釈法によるクローニングを 実施し、目的の二重特異性抗体産生テトラオーマを取得する。

（３）二重特異性抗体の精製 予め０．５−鉱油を腹腔的投与したＢＡＬＢ／ｃマウスに５ＸＩＣ１’ｉ／マウ スツマウス・ハイブリッド・ハイブリドーマ（テトラオーマ）を腹腔内接種する 。約１０〜２０日後に貯溜がみられる腹水を採取し、さらに５０％飽和硫酸アン モニウムで塩析してＩｇＧ画分を得る。次いで２０１１ＩＩＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７ ，５）で透析後、ＵＫ結結合セルフファインカラムに供し、１）Ｈ２，９の０． ２Ｍグリシン−塩酸緩衝液で溶出する。酸溶出画分をＰＢＳで透析後、さらにと ドロキシ・アパタイトカラムに供し目的の二重特異性抗ヒト癌細胞−抗ＵＫ抗体 を精製する。

実施例３　トリペプチド化ドラッグの合成１（１）　Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅの 合成カルボベンジルオキシグリシン（ＺＧｌｙ）　（４、６ｇ）のジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）溶液（２０１１＋２）に水冷下Ｎ−ヒドロキシー５−ノルボ ルネン−２，３−ジカルボキシイミド（ＨＯＮＢＸ　４　、３４　ｇ　）とジシ クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（４。

９ｇ）とを加えて３．５時間撹拌し、さらにＨＯＮＢ（０，７ｇ）とＤＣＣ（０ ，８ｇ）とを追加して２時間撹拌した。反応液をろ通抜、氷冷下ろ液をアルギニ ンメチルエステル（Ａｒｇ−ＯＭｅ）塩酸塩（５，２２ｇ）と共に、トリエチル アミ７（２，８１Ｌ１２）のＤＭＦ（３０ｄ２）溶液メ；添加した。室温で２時 間撹拌後、−晩装置した。沈澱物をろ去したのち、ろ液を減圧下濃縮し、得られ た残留物に水を加え酢酸エチルで洗浄した。水層を減圧下濃縮することにより無 色油状物（９，６５ｇ）を得た。この油状物を、ＩＮ　ＨＣｌ２（２０ｇｍ）を 加えたメタノール（ＭｅＯＨＸｌ　７０顧）に溶解し、パラジウム−黒（５００ ｍｇ）存在下、水素気流中で接触還元を実施した。４．５時間水素気流中で撹拌 後、触媒をろ去し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残留物はＤＭＦ（３０ｔ１ ２）溶液として保存し、次の反応に用いた。

（２）　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨの合成し一ブチロキシカルボニ ルグリシン（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ）　（１７６ｍｇ）のＤＭＦ（ｌｉｍ）溶液にＨＯ ＮＢ（１９７ｍｇ）とＤＣＣＣ２４８ｒｎｇ）とを加え水冷下撹拌した。沈澱物 をろ去したのち、ろ液を（１）で取得したＧ　１　ｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅのＤＭＦ （２１１１２）溶液とトリエチルアミン（１８７μＱ）との混液にかきまぜなが ら加えた。冷蔵庫に一部放置後沈澱物をろ去した。ろ液を減圧下濃縮して得た残 留物をシリカゲル（ｌＯｇ）を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エ チル−ピリジン−酢酸−水（６０：　２０：６：１０）で溶出して、Ｂｏｃ−Ｇ ｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（２１０ｍｇ）を得た。次にＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（１７０ｍｇ）をＩＮ　ＮａＱＨ（１ｍ）溶液に水冷下溶 解し、反応液を陽イオン交換樹脂（バイオレックス７０）に供してその素通り画 分を集め、ＩＮ　ＨＣｕを加えてＨＣｕ塩とした。溶媒を減圧下留去してＢｏａ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（１４８ｍｇ）を得た。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（Ｄ　２０）δ：　１．４２（９Ｈ，ｓ、ＣＨｓ）、１．５７−１． ８０（４Ｈ，ｍ、ＣＨ２）、　３．１９（２Ｈ，ｔ、ＣＨｚm）。

３．８１（２Ｈ，ｓ、ＣＨ，Ｃｏ）、　３．９５（２Ｈ，ｓ、ＣＨ，ＣＯ）、　 ４−１３−４．３０（ＩＨ，ｍ。

Ｎ−Ｃ）ｉｃｏ） ＭＳ　ｍ／ｚ　：　３８９　［Ｍ＋Ｈ］”、　２８９　［Ｍ−Ｂｏｃ＋２Ｈ］” （３）　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨの合成ｔ−ブチロキシカルボニ ルプロリン（Ｂｏａ−Ｐｒｏ）　（４１０ｍｇ）のＤＭＦ（２ｄ）溶液にＨＯＮ Ｂ（４３０ｍｇ）とＤＣＣ（４９４ｍｇ）とを加え水冷下撹拌した。沈澱物をろ 去したのち、そのろ液を（１）で取得したＧｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅのＤＭＦ（４ ｍ）溶液とトリエチルアミン（３７４μ１２）との混液にかき混ぜながら加えた 。混液を一晩放置後、沈澱物をろ去した。ろ液を減圧下濃縮して得た残留物をシ リカゲル（２０ｇ）を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エチルルビ リジン−酢酸−水　Ｃ６０：２０：６：１０）で溶出してＢｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（７１８ｍｇ）を得た。Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− ＯＭｅ（３９８ｍｇ）のＩ　Ｎ　Ｎａ０Ｈ（２ｉｔ）溶液を水冷下かきまぜ、反 応液を陰イオン交換樹脂（ＡＧ−Ｉ　Ｘ　８　）に供してその素通り画分を集め た。次いで陽イオン交換樹脂（バイオレックス７０）に供してその素通り画分を 集め、ＩＮ　ＨＣｕを加えＨＣ（ｌ塩とした。溶媒を減圧下留去してＢｏｃ−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（２８０ｍｇ）を得た。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　４２９　［Ｍ＋Ｈじ、　３２９　［Ｍ−Ｂｏｃ＋２Ｈ］”（ ４）　ＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨの合成ピログルタミン酸（１２９ ｍｇ）のＤＭＦ（ｌＩＩ１２）溶液にＨＯＮＢ（１９７ｍｇ）とＤＣＣＣ２４８ ｒｎｇ）とを水冷下加え撹拌した。沈澱物をろ去し得られるろ液をｃｌｙ−Ａｒ ｇ−ＯＭｅのＤＭＦ（２ｄ）とトリエチルアミン（１８７，ｕｆ２）との混液に 加え、（２）と同様の処理によりＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（２ ４４ｍｇ）を得た。ＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（２４４ｍｇ）の ＩＮ　ＮａＯＨ（１ｍ１２）溶液を水冷後かきまぜたのち、陽イオン交換＊ＭＣ バイオレックス７０）に供してその素通り画分を集め、１ＮＨｃｆ２を加えてＨ ＣＱ塩とした。溶媒を減圧下留去してＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（ ２００謹ｇ）を得ｔこ。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　３　４　３　［Ｍ＋Ｈ］”（５）　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ａｒｇ−アドリアマイシンの合成りｏａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（２ ８ｍｇ）とｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴＸ　ｌ　ｌ　ｍｇ）と のｐＭｐ（０，３−）溶液を、アドリアマイシン（ＡＤＨ）ＨＣＱ（６゜４　ｍ ｇ）と、Ｎ−エチルモルホリン（３μＱ）とのＤＭＦ（０，１ｉｍ）溶液に加え 撹拌した。水溶液カルボジイミド（ＷＳＣＸ３．８ｍｇ）を上記反応液に加えた のち、溶媒を減圧下留去した。ＤＭＦＣｏ、２ｄ＞を残留物に加え、ざらにＨＯ ＮＢ（８ｍｇ）、Ｎ−ｘチルモルホリン（９ｐ（１）、　ＷＳ　Ｃ（２４ｍｇ） を加え室温で撹拌した。

反応液を減圧下濃縮したのち、残留物に水を加えた。逆相シリカゲル（ＲＰ−８ ）の５％ＣＨ，ＣＮ−Ｈｚ○懸濁液に上記反応液を添加し、順次ＣＨＩＣＮ濃度 を上昇させ精製した。最終的にＣＨＩＣＮ−Ｈ２Ｏ−２Ｍ酢酸アンモニウム（２ ：２：ｌ）で溶出し、その溶出画分のＣＨ，ＣＮを留去したのち、ｎ−ブタノー ルで抽出した。ｎ−ブタノール抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下 留去してＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲ（３、５５ｍｇ）を得た。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　９１４　［Ｍ＋Ｈド（６）　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒ ｇ−ＡＤＲの合成ＡＤＨ（５ｍｇ）、　Ｎ−５−チルモルホリン（３，ｕＱ）の ＤＭＦ　（０，５ｓｔ）溶液にＢｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（１８， １ｍｇ）、　ＨＯＮＢ　（１０ｍｇ）およびＷＳＣ（Ｌｏｍｇ）のＤＭＦ溶液を 加え撹拌したのち、（５）と同様ｌこ処理してＢｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ＡＤＲを得Ｉこ。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　９５４　［Ｍ＋Ｈ］”（７）　ＰｙｒｏＧＩｕ−Ｇｌｙ−Ａ ｒｇ−ＡＤＲの合成ＡＤＨ（５ｍｇ）、Ｎ−エチルモルホリン（３，ｕ４）のＤ ＭＦ　（０，５ｄ）溶液にＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（２０，１ｍ ｇ）　、　ＨＯＮＢ　（ｌ　Ｏｍｇ）およびＷＳＣ（１０ｍｇ）のＤＭＦ溶液を 加えかきまぜたのち、（５）と同様に処理してＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ＡＤＲ（０−１４ｇ　）を得た。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　８　６　７　［Ｍ十Ｈ］”（８）　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −Ａｒｇ−ＴＡＮ−１１２０の合成ＴＡＮ　−１１２０（１，７ｍｇ）　、　Ｂ ｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（４，２ｍｇ）　、　ＨＯＮＢ（１，３ｍ ｇ）のＤＭＦ（０−５ｄ）溶液にＷＳＣ（３，０ｍｇ）を加えて室温で撹拌シタ 。

（５）と同様に処理して、４０％ＣＨｓ　ＣＮ　’　Ｈ２０で溶出する両分より ＆に−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＴＡＮ−１１２０を得た。

Ｍ　Ｓ　ｆｆｌ／ｚ　：　ｌ　Ｏ８２［Ｍ＋Ｈ］”（９）　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−ピュロマイシンの合成ピュロマイシン（ＰＭ）２Ｈ（ｊ２（６， ２ｍｇ）、Ｎ−ｒ−チルモルホリン（６，ｕ１２）のＤＭＦ（０，１ｓｔ）溶液 にＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（１７、７ｍｇ）、１−ヒドロキシベ ンゾトリアゾール（７ｍｇ）および水溶性カルボジイミド（４ｍｇ）を加え室温 で一晩撹拌した。溶媒を減圧下留去したのち残留物に水を加え、逆相シリカゲル （ＲＰ−８）を用いるカラムクロマトグラフィーに供して５％ＣＨ３ＣＮ　Ｈ２ ０より順次Ｃ１ｈＣＮ濃度を増加させて精製した。ＣＨｓ　ＣＮ　−Ｈ！　０　 ２　Ｍ酢酸アンモニウム（２：２：１）の溶出画分を採取し、ＣＨ３ＣＮを減圧 下留去したのちｎ−ブタノール抽出を実施した。ｎ−ブタノール抽出液を無水硫 酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去して、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒ ｇ−ＰＭ（３、０ｍｇ）を得た。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　８４２　［Ｍ＋Ｈ］”、　７４２　［Ｍ−Ｂｏｃ＋２Ｈ］” 実施例４　トリペプチド化ドラッグの細胞毒性実施ｆ１３で取得した３種のトリ ペプチド化ドラッグ（それぞれＢｏｃ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲ， Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＴＡＮ−１１２０およびＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭ）　［第１〜３図ニー・−］の胃癌細胞株ＮＵＧＣ４あるい は腎癌細胞株ＡＭ−ＲＣ−６に対する細胞毒性を、その活性化体（それぞれＡＤ Ｈ，ＴＡＮ−１１２０およびＰＭ）［第１〜３図−一〇−］のそれと比較した。

すなわち、マイクロプレートに播種した培養ヒト癌細胞５×１０３個／ウェルに 種々の濃度の薬物を添加し、４日間培養後、公知の方法に従い３−　（４，５− ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム　ブロマ イド（ＭＴＴ）を用いて生細胞数を算定した［Ｈ，Ｔａｄａら：ジャーナル・オ ブ・イムノロジカル・メソ７ズ（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ）、　９３　、Ｉ　５７（１９８６）］。

結果は１〜３図に示した通りであった。ＮＵＧＣ４あるいはバーに一６癌細胞に 対してＡＤＨのプロドラッグ体［第１図ニー・−］は活性化体［第１図；−０− １の約Ｊ％の活性を示し、ＴＡＮ−１１２０のプロドラッグ体［第２図ニー・− ］は活性化体［第２図；−０−］のｌ／１０〜ｌ／１００以下の細胞毒性を示し 、ＰＭのプロドラッグ体［第３図；−・−１は活性化体［第３図；−〇−］の約 １／４の活性を示した。

実施例５　トリペプチド化ドラッグの活性化反応（１）マイクロプレートに播種 した胃癌細胞賎−に−６５ＸＩＯ”個／ウェルに、実施例３で取得したＢｏｃ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲあるいはＢｏｃ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｒｇ −ＰＭを添加し、さらにＢｏｃ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲの細胞混 液にトリプシンを、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭの細胞混液にＵＫ を添加して３７°Ｃで培養した。３ａ後、生細胞数を実施例４に記載の方法で算 定し、トリプシンあるいはＵＫによるプロドラッグ活性化反応を測定した。

結果はｗｌｌおよび２表ｔこ示した通りであった。飲−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ＡＤＲはトリプシンにより分解され、有意な細胞毒性の増加を示した。また、 Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭについてもＵＫにより分解され細胞毒性 の顕著な増加が観察された。

第１表 ％細胞増加 Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲ”　トリプシン（μｇ／−）０　１． ０　１０　１００ ２．０Ｈｇ／ｄ　１００　６７　４５　３２４．０Ｈｇ／ｌｌＩ２１００　６４ 　５４　２８１３トリペプチド化アドリアマイシン 第２表 ％細胞増加 Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭ”　ウロキナーゼ（μｇ／−）１．０Ｈ ｇ／ｄｉ　１００　９０　５５１ゝ　トリペプチド化ピュロマイシン 実施例６　トリペプチド化ドラッグの活性化反応（２）実施例５で取得したＢｏ ｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲのトリズシン分解産物および肚−Ｇｌｙ− ＧＩＶ−Ａｒｇ−ＰＭ　Ｕ　Ｋ分解産物をＯＤＳカラム（ＹＭＣＡ−３０２０Ｄ Ｓ　１２ＯＡカラム４．６Ｘ１５０市、株式会社ワイ・エム・シー販売）を用い る逆相高速液体クロマトグラフィーに供し、そのクロマトパターンをそれぞれの 活性化体ＡＤＨおよびＰＭと比較した。溶出液は３０％アセトニトリル１０．０ １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３，０）、溶出速度は１．ｏｄ／分で、２５４ｎｍにお けるカラム溶出液の紫外吸収強度をモニターした。

結果は第４および５図に示した通りであった。第４図からＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌ ｙ−Ａｒｇ−ＡＤＲ（ビークＢ：溶出時間１Ｏ２２分）はトリプシンにより分解 されＡＤＨ（ビークＡ；溶出時間３．６分）に、また第５図からＢｏｃ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭ　（ピークＢ；溶出時間３２分）はＵＫにより分解され ＰＭ（ピークＡ：溶出時間１．８分）に活性化されることが判明した。

公知の方法［Ｗ、　Ｃ，Ｊ、　Ｒｏｓｓ　：ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサ イティ（Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）、　ｌ　８３頁（１９４９）およびＪ、　Ｌ、　Ｅｖｅ ｒｅｔｔら：ジャーナル・才ブ・ケミカル−ソサイティ（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　５ ｏｃ）、　１９７２頁（１９４９）］に従いフェニレンジアミンマスタード（Ｐ ＤＭ）を合成した。

ＰＤＭ（６，１ｍｇ）、Ｎ−エチルモルホリン（５μＱ）のＤＭＦ（０，３ｍ） 溶液に奴−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（９，０ｍｇ）　、　ＨＯＢＴ　（７ ，７ｍｇ）及びＷＳＣ（６ｍｇ）のＤＭＦ溶液を加え撹拌したのち、実施例３− （５）と同様に処理してＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＤＭを得た。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　６０３　［Ｍ＋Ｈド、　５０３　［Ｍ−Ｂｏｃ＋２８］”（ ２）　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＡＤＲの合成ＡＤＲ（２０ｍ ｇ）、Ｎ−エチルモルホリン（４μ＋２）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェ ニル−し−バリン（Ｎｐｙｓ−Ｖａｌ）　（２８ｍｇ）　、ＨＯＢＴ（１２ｍｇ ）およびＷＳＣ（２４ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍ）溶液を室温で撹拌した。反応速時 Ｎ−エチルモルホリン（４μＱ）を２回追加添加した。溶媒を減圧下に留去した のち酢酸エチルで抽出した。抽出液は水洗後乾燥し、溶媒を減圧上留去し、得ら れた残留物をシリカゲル（３ｇ）を用いるカラムクロマトグラフィーで精製した 。２％メタノール−クロロホルム溶出画分を減圧下濃縮して、橙赤色結晶のＮｐ ｙｓ−Ｖａｌ−ＡＤＲ（２７ｍｇ）を得た。Ｎｐｙｓ−Ｖａｌ−ＡＤＲ（１３、 １ｍｇ）のジオキサ７（１ｍ）溶液にＩＮ塩酸水溶液（０，１ｍ）を加え室温で ４０分間撹拌し、次いで重そう水を加えて中和したのちｎ−ブタノール抽出を実 施した。抽出液を水洗、乾燥後減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をンリカ ゲル（３ｇ）を用いるカラムクロマトグラフィーで精製して、１０％メタノール −クロロホルム溶出画分より橙赤色油状物のＶａｌ−ＡＤＲ（７ｍｇ）を得た。

ＭＳ　ｍ／ｚ：６４３［Ｍ＋Ｈド Ｖａｌ−ＡＤＲ（２、０ｍｇ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（７、 １ｍｇ）、　ＨＯＢ　Ｔ　（６、９ｍｇ）のＤＭＦ溶液にｗｓｃ（７，Ｏｎ＋ｇ ）を加えて室温で撹拌した。溶媒を減圧上留去し得られた残留物を実施例３−（ ５）と同様に処理してＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｔ−ＡＤＲを得た 。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　１０３５　［Ｍ＋Ｎａｌ”（３）　ＱＳ４−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ａｒｇ−ＰＭの合成グリシンエチルエステル（Ｇｌｙ−ＯＥｔ　、　６２８　 ｍｇ）のＤＭＦ（５ｉ１１２）懸濁液に’ｐＪ　−エチルモルホリン（６３０μ Ｑ）を加え室温で撹拌した。６−（３−カルボキンプロピル）−２，３−ジメト キシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン（ＱＳ−４，ｌ　、　１７８ｇ）のＤ ＭＦ（３ｉＬＩ２）溶液を加え、さらにＷＳ　Ｃ（９５５ｍｇ）を加えたのち室 温で一晩かき混ぜた。溶媒を減圧上留去したのち、残渣に水を加えて酢酸エチル 抽出を実施した。抽出液は水洗乾燥後溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲル（ ４８ｇ）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。１％メタノール− クロロホルム溶出画分を減圧下濃縮し、残留物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンより 結晶化して、橙黄色針状晶の４−（２，３−ジメトキシ−５−メチル−１゜４− ベンゾキノン−６−イル）ブタノールグリシンエチルエステル（Ｏ３−４−Ｇｌ ｙ−ＯＥｔ、　５６１　ｍｇ）を得た。ＱＳ−４−Ｇｌｙ−ＯＥｔ　（９４ｍｇ ）の酢酸エチル溶液を／ｈイドロサルファイト水溶液で振とう混和しヒドロキノ ンにしたのち、酢酸エチルを減圧上留去した。残留物をＭｅＯＨ溶液としたのち 、Ｎ２気流下ｌＮＮａＯＨを加え加水分解した。ＩＮＨＣＱで酸性とし酢酸エチ ルで抽出した。抽出液は水洗乾燥後減圧下溶媒を留去した。得られた残留物のＤ ＭＦ（０，２ｉｆｆｌ）溶液にＣ，ｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（１４１ｍｇ）、ＨＯ ＢＴ　（３９ｍｇ）　、ＷＳＣ（１１０ｍｇ）を加えて室温で一晩かき混ぜ、さ らにＨＯＢＴ（３９ｍｇ）、ＷＳＣ（５５ｍｇ）を追加してかき混ぜた。

溶媒を減圧上留去したのち水を加え、未反応物をエーテル抽出した。水溶液を減 圧下ａ縮して得られた残留物をノリ力ゲル（５ｇ）を用いるカラムクロマトグラ フィーに供し、酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水（６０：２０・６：１０）で溶 出してＱＳ−４−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−ＯＭｅを得た。得られたＱＳ−４− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅの水溶液にハイドロサルファイド水溶液を加え て撹拌したのち、ｌＮＮａＯＨを加えて加水分解し、さらにＩＮＨＣＩＩ’で中 和したのち、陽イオン交換樹脂（バイオレックス７０）に供し、その素通り画分 とＩＮピリジン溶出画分とを混ぜ、溶媒を減圧上留去してＱＳ−４−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ（８０ｍｇ）を得た。ビュロマインン塩酸塩（Ｐト２ＨＣＮ）　（ １０ｍｇ）とＮ−エチルモルホリン（１０μｌ）のＤＭＦ溶液に上記ＱＳ−４− Ｇｌｙ−ＧＩ　Ｙ−Ａｒｇ（２Ｑｍｇ）、　ＨＯＢＴ（７ｍｇ）およびＷＳＣ（ ４゜５　ｍｇ）を加えて一晩室温でかき混ぜた。減圧下溶媒を留去し、残留物を ＭｅＯＨに溶解し塩化第二鉄水溶液でキノン体に酸化したのち、さらにその溶媒 を減圧上留去した。残留物を実施例３−（５）と同様に処理してＱＳ−４−Ｇｕ ｙ−Ｇｕｙ−＾ｒｇ−ＰＭの黄色油状物を得た。

ＭＳ　Ｑｌ／Ｚ・９９４　［Ｍ＋３１］（４）　ＱＳ−１０−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−ＰＭの合成６−（９−カルボキンノニル−２，３−ジメトキシ−５−メ チル−１，４−ベンゾキノン（ＱＳ−１０）を出発原料として上記（３）と同様 に処理して１０−（２，３−ジフトキン−５−メチル−１，４−メチル−ベンゾ キノン−６−イル）デカノイルグリシンエチルエステル（ＱＳ−１０−Ｇｕｙ− ＯＥｔ）が橙黄色針状晶（ｍｐ、７フー７７５℃）として酢酸エステル−〇−へ キサンより結晶化された。

ＮＭＲ（ＣＤ（Ｊ３）δ：１．２３−１．４０（１５ｔ１．ｍ、ＣＨ３，ＣＩｚ ）、　１．６３（２Ｈ，ｉ、ＣＴＩｘ）、　２．０１（３ＨCｓ。

核ＣＨｓ）、　２．２４（３８，ｔ、　ＣＨ２Ｃ０Ｎ）、　２．４４（２０，ｔ 、核ＣＨり、　３．９９（６Ｈ，Ｓ、　０ＣＲ３）、　４．０３（２Ｌ　ｄ、Ｎ ＣＲ２Ｃ００）、　４．２２（２１，Ｑ、　０ＣＲ２）ＱＳ−１０−Ｇｌｙ−Ｏ Ｅｔを加水分解したのち、ｃｔｙ−＾ｒｇ−ＯＭｅのジペプチドと縮合してＱＳ −１０−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅを黄色油状物として得た。

Ｍ　Ｓ　ｒｘ／ｚ　：　６３９　［Ｍ＋３Ｈ］ＯＳ−１００５−１Ｏ−Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ａｒを加水分解後、ＷＳＣを用いてＰＭと縮合してＯ５−１０５−１Ｏ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒを黄色油状物として得た。

ＭＳ　ｍ／ｚ　：　ｌ　０７６　［Ｍ＋Ｈ］”（５）　Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ− Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭの合成りｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ　（７０ｍ ｇ　；ペプチド研究会）のＤＭＦ（１ｍ）溶液にＨＯＮＢ（５０ｍｇ）、ＤＣＣ （５８ｍｇ）を加え室温で２時間かき混ぜた。この反応液はろ過して沈殿物をろ 過除去後、ろ液をＧｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅ塩酸塩（１１２ｍｇ）とトリエチルア ミン（３０μＱ）のＤＭＦ　（１ｍ）溶液に加え、室温で一晩かき混ぜた。再び 沈殿物をろ去したのちる液を減圧下濃縮した。得られた残留物をシリカゲル（６ ｇ）を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エチル−ピリジン−酢酸− 水（６０：２０：６：１０）で溶出してＢｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −Ａｒｇ−ＯＭｅを得た。

得られたＢｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＭｅの水溶液に１ ＮＮａＯＨを入れて室温でかき混ぜ、反応液を陽イオン交換樹脂（バイオレック ス７０）に供した。素通り画分とＩＮピリジン溶出画分とを集め、溶媒を減圧上 留去してＢｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　（７０ｍｇ）を無色 油状物として得た。Ｐ　Ｍ（１０，３ｍｇ）、Ｎ−エチルモルホリン（１０μ１ ２）のＤＭＦ（３００ｐＱ’）溶液に、上記Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ（２０ｍｇ）のＤＭＦ　（３００ｐＱ’）溶液とＨＯＢＴ（７ｍｇ ）とを加え、さらにＷＳＣ（９，０ｍｇ）を加えて室温で４時間かき混ぜた。− 晩低温室に放置したのち溶媒を減圧上留去し、残留物を実施例３−（５）と同様 に処理してＢｚ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭを無色油 状物として得た。

Ｍ　Ｓ　ｍ／ｚ　：　ｌ　Ｏｌ　４　［Ｍ＋Ｈ”］（６）　Ｚ−Ｃ１ｙ−Ｐｒｏ −Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭの合成市販のＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌ ｅｕ−Ｇｌｙを原料として上記（５）と同様の操作によりＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭを無色油状物として得た。

Ｍ　Ｓ　ｍ／ｚ　：　ｌ　ｌ　４３　［Ｍ＋Ｈ”］実施例８　プロドラッグの活 性化反応（３）マイクロプレートに播種したヒト類上皮癌細胞株Ａ４３１　７Ｘ ＩＯ３個／ウェルに、実施例７で取得したＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐ ＤＩＪ、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＡＤＲ，Ｏ５−４０５− ４−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒ、　Ｏ５−１０５−１Ｏ−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒお よびＢｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ| Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＭを添加し、ざらにＵＫを添加して３７℃で培養した。以下 、実施例５に記載の方法でＵＫによるプロドラッグ活性化反応を測定した。

結果は第３表に示した通りであった。いずれのプロドラッグ体もＵＫにより第３ 表 参考例１２で取得した抗ｈＴｆＲＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ２２Ｃ６および参 考例９で取得しＩ；抗ＵＫ　ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマトーＩ−６とを、それ ぞれ０．５μｇ／ｍＦＩＴｃおよび１．５μｇ／５ｖ２ＴＲＩＴｃ含有イスコア ーハムＦ−１２混合培地で３７°Ｃ２３０分間インキュベートし、蛍光染色した 。次いで、ＬＳＭ溶液（和光紬薬工業に、に販売）を添加し死細胞を除去したの ち、両ハイブリドーマを１：１の割合で混じ、ＰＥＧ６０００を用いて参考例８ −（２）に記載の方法で細胞融合した。

３７℃で２時間インキュベート後、ＦＡＣ３に供することによりフルオレセイン およびローダミンで二重染色された細胞２５０００個を分取し、次にフィーダー としてマウス脚線細胞を５ＸＩＯ’個／ウェル播種した９６穴マイクロプレート に、上記二重染色細胞を１０個／ウェルの割合で播種し培養した。

（２）ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニング融合後１−２週 で細胞増層のみられたウェルの培養上清をＣｅ１ｌ−ＥＩＡに供し二重特異性抗 体活性を測定した。すなわち、参考例３で作成したヒト癌細胞Ａ４３１結合マイ クロプレートに被検ハイブリッド・ハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で２ 時間反応後０．２％ＢＳＡ添加培地で洗浄した。次いでビオチン標識したＵＫを 添加し、さらに室温で２時間反応後、ＨＲＰ標識したアビジンを反応させた。室 温で１時間反応後洗浄し、固相に結合した酵素活性を参考例３に記載の方法で測 定した。

高い二重特異性抗体活性を示すウェルについて限界希釈法によるクローニングを 寅施し、目的の二重特異性抗体産生マウステトラオーマＵＴＦ　２０−７を取得 した。結果は第６図に示した通りであった。

（３）二重特異性抗体の精製 予め０．５顧鉱油を腹腔的投与したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに５Ｘ１０’ 個／マウスのマウス・ハイブリッド・ハイブリドーマ（テトラオーマ）を腹腔内 接種した。約１０〜２０日後に貯溜がみられる腹水を採取し、さらに５０％飽和 硫酸アンモニウムで塩析してＩｇＧ画分を得た。次いで２０ｍＭ　ＰＢＳ　（、 ｐＨ７−５）で透析後、ＵＫ結結合セルフファインカラムに供し、ｐＨ２，９の ０．２Ｍグリノ〉−塩酸緩衝液で溶出した。酸溶出画分をＰＢＳで透析後、さら にヒドロキシ・アパタイトカラムＪこ洪し目的の二重特異性抗ｈＴｆＲ−抗ＵＫ 抗体を精製した。本方法により、腹水２０−から約８．２ｍｇの二重特異性抗体 ＵＴＦ２０−７を得ることができた。

実施例１〇　二重特異性抗体によるプロドラッグ活性化反応マイクロプレートを 播種したヒト類上皮癌細胞Ａ４３１８よびマウス白血病細胞Ｐ３３８　１．０Ｘ １０’個／ウェルに、実施例９で取得した精製二重特異性抗体とＵＫとのｌ：ｌ （モル比）免疫複合体を添加し５°Ｃで３０分反応させた。低温下で細胞を洗浄 後、実施例７−（２）に記載のプロドラッグＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− Ｖａｌ−ＡＤＲあるいは実施例７−（４）に記載のプロドラッグＯ５−１０５− １Ｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒを、それぞれ最終濃度５．０μｇ／−あるいは０． ２μｇ／−となるように添加した。以下、実施例５に記載の方法で細胞表面に結 合したＵＫ／二重特異性抗体免疫複合体によるプロドラッグ活性化反応を測定し た。

結果は第４表に示した通りであっｔ；。標的細胞Ａ４３１に対しては、いずれの プロドラッグ体もＵＫ／二重特異性抗体免疫複合体により活性化され強い細胞毒 性を発揮した。一方、非標的細胞Ｐ３８８に対しては、細胞毒性がほとんど認め られなかった。

（０，５μｇ／ｍ）　３　７５　１０３Ｏ３−１０−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− ＰＭ　０　１００　１００（２，０μｇ／ｍ）　３　８４　９８ Ｆｉｇ、Ｉ Ｑ　Ｏ，１２５１−０２０嬢／ｄ） ｏｒｕｇ　ｃｏｎｃａｎｔ：ａｔｉｏｎ　（ｃｏｎｖ＠ｒｔｅｄ　ｔｏ　ａｄｒ ｉａｍｙｃｉｘ）Ｆｉｇ−２ ０Ｌ　１０　１００　１１０００（ｐ／−）Ｄｒｕｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉ ｏｎ　（ｃｏｎｖｅｒｔａｄ　ｔｏ　ＴＡＮ−４１２０１Ｆ工ｑ、３ ０　０．１　０．５　１　２　５　１０Ｃμｇ／−）Ｄｒｕｇ　ｃｏｎｅｅｎｔ ｒａｔ工ｏｎ　（ｃｏｎｖｅｒｔｅｄｔｏ　ｐｕｒｏｍｙｃ工ｎ） Ｆｉｑ、４ ０．００　３．７５　７．５０　１１．２５Ｅ工ｕｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　（ｗｉ ｎ）Ｆ工ｑ、５ Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　（ｍｉｎ）Ｆ工ｑ、６ ２　４　Ｂ　１０ 要約書 本発明は、ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化酵素に対して特異性を有するハ イブリッド・モノクローナル抗体、該抗体を産生ずるポリドーマおよび該抗体に プロドラッグ活性化酵素を免疫結合させてなる抗ヒト癌蛋白複合体、さらに該抗 体と抗癌剤のプロドラッグを併用する癌治療法を提供する。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年４月７日

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化酵素に対して特異性を有する二重特異 性ハイブリッド・モノクローナル抗体。
2. ２．プロドラッグ活性化酵素がプロテアーゼである請求項１記載の抗体。
3. ３．プロテアーゼがウロキナーゼである請求項２記載の抗体。
4. ４．プロドラッグ活性化酵素がグリコシダーゼである請求項１記載の抗体。
5. ５．グリコシダーゼがグルクロニダーゼである請求項４記載の抗体。
6. ６．プロドラッグ活性化酵素が不活性型のプロドラッグを活性型の抗癌剤に変換 する酵素である請求項１記載の抗体。
7. ７．プロドラッグがペプチド化抗癌剤である請求項６記載の抗体。
8. ８．プロドラッグがトリペプチド化抗癌剤である請求項６記載の抗体。
9. ９．プロドラッグが抗癌剤のグルクロニン酸抱合体である請求項６記載の抗体。
10. １０．抗癌剤がアドリアマイシン，シスプラチン，メルファラン，メトトレキセ ート，ミトマイシンＣ，ピンクリスチン，ピュウロマイシン，フェニレンジアミ ンマスタード，アンサマイトシン類，ＴＡＮ−１１２０およびそれらの関連化合 物である請求項６記載の抗体。
11. １１．抗癌剤がアドリアマイシン，ピュウロマイシン，フェニレンジアミンマス タード，アンサマイトシン類，ＴＡＮ−１１２０である請求項６記載の抗体。
12. １２．請求項１記載の抗体を産生するポリドーマ。
13. １３．抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマと抗ウロキナーゼ抗体産生ハイプリドー マとを融合して得られるテトラオーマであって、ヒト癌細胞およびプロドラッグ 活性化酵素両者に対して特異性を有する二重特異性ハイブリッド・モノクローナ ル抗体を産生するテトラオーマ。
14. １４．抗ヒト癌抗体産生ハイプリドーマが抗ヒト癌細胞膜表面抗原抗体産生ハイ プリドーマである請求項１３記載のテトラオーマ。
15. １５．抗ヒト癌抗体産生ハイプリドーマが抗ヒト・トランスフェリン・レセプタ ー抗体産生ハイブリドーマである請求項１３記載のテトラオーマ。
16. １６．抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマがマウス・ハイプリドーマ２２Ｃ６であ る請求項１３記載のテトラオーマ。
17. １７．抗ヒト癌抗体産生ハイブリドーマがマウス・ハイプリドーマＵＫ１−６で ある請求項１３記載のテトラオーマ。
18. １８．マウス・テトラオーマＵＴＦ２０−７。
19. １９．請求項１記載の抗体にプロドラッグ活性化酵素を免疫結合させてなる抗ヒ ト癌蛋白複合体。
20. ２０．抗ヒト癌細胞抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞と抗プロドラッグ 活性化酵素抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞とを融合することを特徴と する、ヒト癌細胞およびプロドラッグ活性化酵素両者に対して特異性を有する二 重特異性ハイブリッド・モノクローナル抗体産生ポリドーマの製造法。
21. ２１．プロドラッグ活性化酵素がプロテアーゼである請求項２０記載の製造法。
22. ２２．プロテアーゼがウロキナーゼである請求項２０記載の製造法。
23. ２３．プロドラッグ活性化酵素がグリコシダーゼである請求項２０記載の製造法 。
24. ２４．グリコシダーゼがグルクロニダーゼである請求項２０記載の製造法。
25. ２５．ポリドーマが抗ヒト癌細胞抗体を産生するハイプリドーマと抗プロドラッ グ活性化酵素抗体を産生するハイブリドーマとを融合して得られる、ヒト癌細胞 およびプロドラッグ活性化酵素両者に対して特異性を有する二重特異性ハイブリ ッド・モノクローナル抗体産生テトラオーマである請求項２０記載の製造法。
26. ２６．ポリドーマが抗ヒト癌細胞抗体を産生するハイブリドーマと抗ウロキナー ゼ抗体を産生するハイブリドーマとを融合して得られる、ヒト癌細胞およびプロ ウロキナーゼ両者に対して特異性を有する二重特異性ハイブリッド・モノクロー ナル抗体産生テトラオーマである請求項２０記載の製造法。
27. ２７．請求項１２記載のポリドーマを液体培地または動物腹空内で培養し、培養 上清または腹水から採集することを特徴とするヒト癌細胞およびプロドラッグ活 性化酵素に対して特異性を有する二重特異性ハイブリッド・モノクローナル抗体 の製造法。
28. ２８．プロドラッグ活性化酵素がプロテアーゼである請求項２７記載の製造法。
29. ２９．プロテアーゼがウロキナーゼである請求項２７記載の製造法。
30. ３０．プロドラッグ活性化酵素がグリコシダーゼである請求項２７記載の製造法 。
31. ３１．グリコシダーゼがグルクロニダーゼである請求項２７記載の製造法。
32. ３２．哺乳類に効果的な量の請求項１記載の抗体と抗癌剤の不活性型プロドラッ グとを併せて投与することを特徴とする哺乳類の癌治療法。
33. ３３．抗癌剤の不活性型プロドラッとを併用して癌の治療に用いることを特徴と する請求項１記載の抗体の利用法。