JPH0347090A - 二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は二重特異性を有するハイブリットモノクローナ
ル抗体に関する。さらに詳しくは二重特異性の一方がア
ンサマイトシン類に対し、他方が標的抗原、特に癌細胞
表面膜上の腫瘍関連抗原に対するハイブリッドモノクロ
ーナル抗体（以下、ハイブリッドＭｏＡｂと略記するこ
とがある）、およびそれを産生ずるポリドーマに関する
。

本発明はまた、上記のハイブリットＭｏＡｂを用いてア
ンサマイトシン類を癌細胞に特異的に結合させ、癌細胞
に致死的作用を与える癌治療法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする課題］アン
サマイトシン（以下、ＡＮＳと略記することがある）は
放線菌（ノカルジア属）の醗酵生産物中に発見された強
力な抗腫瘍活性を有する薬物である［Ｅ、　Ｈｉｇａｓ
ｈｉｄｅら：ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、　２ユ０
．７２１（１９７７）］。類縁体としては既にメイタン
シン（以下、ＭＡＹと略記することがある）が植物由来
の抗腫瘍性物質として単離されていたが［Ｓ、　Ｍ、　
Ｋｕｐｃｈａｎら：ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサイテ４−（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ
ｏｃ、　）９４．１３５４（１９７２）］、ＭＡＹの収
量が悪いため菌体由来のＡＮＳが一躍注目されるところ
となった。いずれの薬物もビンカアルカロイド系薬剤［
例、ビンクリスチン（以下、ＶＣＲと略記することがあ
る）コと同様な作用機序を示し、腫瘍細胞内で微小細管
の形成を阻害して殺細胞効果を及ぼす。その細胞毒性は
従来の抗癌化学療法剤（例、メトトレキセート、ダウン
マイシンなど）の１０−１００倍の強さで、新しいタイ
プの抗癌剤として期待され、化学修飾および微生物変換
による誘導体の合成が実施されてきた［Ａ、　Ｋａｖａ
ｉら：ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブ
レタン（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、１３２．　
２１９４　（１９８４）　；　ｔｌ、　Ａｋｉｍｏｔｏ
ら：ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレ
タン（Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｔ　Ｂｕｌｌ、　）。

３２、　２５６５（１９８４）；　Ａ、Ｋａｗａｉら：
ケミカル令アンド・ファーマシューティカル・ブレタン
（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、）、　３２．３４
４１　（１９８４）］。

これ−らのアンサマイトシン誘導体について、ＭＡＹお
よびＶＣＲを対照薬として、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏおよび
ｉｎ　　ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果、さらには消化管障害
および神経毒性を含む亜急性毒性試験を実施したところ
、ＭＡＹおよびＶＣＲに比べ優れた薬効と安全性とを示
したアンサマイトシン誘導体が数種類見出された。特に
下図に示した９−チオメイタンシンは化学療法係数（毒
性Ｍ／薬薬量量的立場でＭＡＹおよびＶＣＲと比較評価
した時にもより優れた値を与えた。

Ｍｅ、　、ＣＯＭｅ ９〜チオメイタンシン しかしながら、ＡＮＳの有する強力な細胞毒性作用はそ
れ自身副作用の原因ともなり、ＭＡＹが消化管障害およ
び神経毒作用を示したため開発中止された経過と同じ道
をたどっているのが現状である。

一方、腫瘍細胞を選択的に殺す薬物として、抗癌抗体を
化学療法剤や生物毒素に結合させた抗腫瘍免疫複合体、
いわゆる“ミサイル療法剤”といわれるものが開発され
た。これらは腫瘍細胞上の腫瘍特異抗原もしくは腫瘍関
連抗原を認識結合し、かつこれら腫瘍細胞のＤＮＡ合成
、蛋白合成あるいは微小管形成を阻害せしめ死に至らし
めるという特性を有している。従って、腫瘍臓器・組織
・細胞に特異的で、正常細胞への副作用が少ない。

既に臨床応用された抗体−薬物あるいは抗体−毒素複合
体もあり、幾つかの良好な結果を挙げている。しかし、
抗体と薬物あるいは抗体と毒素蛋白との化学結合反応に
伴い、抗体活性あるいは薬物や毒素の薬理活性を損うこ
とがしばしばみられ、さらに強力な選択的抗癌剤の出現
が期待されている。

特に低分子抗癌剤の場合には、■抗体との結合に用いつ
る適当な官能基が必要なこと、■抗体との化学結合によ
り、通常薬理活性は１／ｌＯ〜１／１００以下に減少し
、毒素蛋白に比べその影響が大きいこと、従って■抗体
−薬物のリンカ一部が腫瘍細胞内で切断されうる条件を
賦与しなければならないこと、などの問題があった。

本発明者らはかかる技術的背景のもとに、強力な細胞毒
性作用を有したＡＮＳをさらに腫瘍特異的とするため、
抗癌抗体に結合させ従来にない抗体−薬物複合体を開発
することを目的として本研究を進めた。かかる抗体−薬
物複合体の作製においては前述したように幾つかの問題
が考えられた。

すなわち化学結合反応を利用する従来法では、■薬物の
抗腫瘍活性が著減し、さらには抗体の抗原結合能も低下
する、■選択的抗癌剤として不活性な抗体同志のホモポ
リマーあるいは代謝され易く生体内での有用性に欠ける
高分子重合体が副生される、■抗体に結合する薬物分子
数を制御することが難しく、品質の一定した抗体−薬物
腹合体が得られない、■抗体との結合に用いうる薬物は
適当な官能基を有したものに限定され、最も良好な治療
係数を示す薬物の使用か困難である、なとの問題点が挙
げられる。

また、最近のハイブリドーマ作成技術は新しいタイプの
トリオーマ、テトラオーマといったポリドーマの出現を
可能にしｌＩｃ、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎら：ネイチャ（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、３０５．　５３７（１９８３）；Ｍ、Ｒ
。

５ｕｒｅｓｈら：プロ／−ジンゲス・オブ・ナンヨナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス、ニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎｏｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　Ｕ、
　Ｓ、　Ａ、　）、８３．７９８９（１９８６）］、新
しい機能をもった二重特異性を有する抗体の作成を可能
にした［特開昭６３−１２２７６号（ハイブリチック）
、米国特許明細書第４゜７１４．６８１号（Ｕｎｉｖ、
　ｏｆ　Ｔｅｘａｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＣａｎｃｅｒＣｅ
ｎｔｅｒ）］。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記の問題点を解決するため、かかる新技
術を応用・発展させた結果、従来の抗体薬物腹合体の作
製に必須であった抗体と薬物分子との化学結合操作を不
要にし、かつ抗体および薬物の生物活性をｔ　Ｏ０％保
持した抗体−薬物免疫複合体の作製を可能にするハイブ
リッドＭ　ｏ　Ａ　ｂを開発し、それを用いた抗ヒト癌
蛋白′ｆｉ合体を作製した。すなわち本発明は、二重特
異性を有するハイブリッドＭｏＡｂであって、二重特異
性の一方がアンサマイトシン類に対し、他方が標的抗原
、例えば癌細胞膜上の腫瘍関連抗原などに対する抗体を
産生ずるポリドーマに関するものである。

また本発明はアンサマイト７ン頌に対する抗体（以下、
抗ＡＮＳ抗体と略記することもある）を産生ずるハイブ
リドーマと標的抗原、たとえば癌細胞１１１上に多く発
現されるヒトトランスフェリンレセプター（以下、ｈＴ
ｆＲと略記することかある）に対する抗体産生ハイブリ
ドーマとを融合し、その結果、得られるテトラオーマの
産生ずる二重特異性ハイブリ、ドＭｏＡｂに関するもの
であり、さらにこのハイブリッドＭｏＡｂを用いて得ら
れる選択的抗ヒト癌蛋白複合体に関するものである。

本発明の二重特異性を有するハイブリッドＭ。

Ａｂ産生ポリドーマの作成にあたっては、抗ＡＮＳ抗体
産生ハイブリドーマが用いられるが、かかるハイブリト
ーマは例えば下記の方法で作成されうる。

すなわち、まずアンサマイトシン類を動物に接種し、抗
ＡＮＳ抗体の産生を促す。この場合、通常ＡＮＳをその
まま免疫原として用いたのでは高力価の抗体産生を惹起
しえないので、適当な官能基を有したアンサマイトシン
類、例えば下図に示すＰＤＭ−３−Ｃ７゜−カルホキジ
メチルエーテルのカルボキシル基あるいはメイタンシノ
ールー３α−アミノフェニルアセテートやＰ　ＤＭ−３
−Ｃ１゜−ｐ−アミノベンジルエーテルのアミン基を介
してキャリヤ蛋白である牛血清アルブミン（以下、ＢＳ
Ａと略記することがある）やテログロブリンに結合させ
免疫原として用いる。

ＰＤＭ−３は２０−デメトキシ−２０ ヒドロキ シメイタンシ／−ル　３ インブチレートを示す。

接種動物としては、例えばつづギ、ラット、マウス、モ
ルモットなどが用いられるが、ＭｏＡｂ製造の場合には
マウスが特に好ましく用いられる。

接種方法としては、通常実施される方法に従えばよく、
例えばマウスに１回１〜１００μｇ１好ましくは１０〜
２５μｇを等容１ｔ（０，１ｄ）の生理食塩水およびフ
ロイントの完全アジュバントで乳化して、背部、腹部の
皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種する方
法がとられる。

これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個体
を選び、最終免疫３〜５日後に肺臓およびあるいはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施で
き、融合促進剤としてはポリエチレングリコール（以下
、ＰＥＧと略Ｓ己することがある）やセンダイウィルス
などが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。

骨髄細胞としてはＮ５−１、Ｐ２Ｏｌ、Ｓ　Ｐ　２１０
などが挙げられ、特にＰ２Ｏ１が好ましく用いられる。

例えば肺臓細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は１：１
〜１０：１で、これに分子量１，０００〜９，０００の
ＰＥＧか１０〜８０％の濃度で添加され、２０〜３７°
Ｃ１好ましくは３０〜３７°Ｃで３〜１０分インキュベ
ートするのが良い。

抗ＡＮＳ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば（メイタンシノール
３−α−アミノフェニルアセテート）−ヒト血清アルブ
ミン（以下、ＩＳＡと略記することがある）複合体を吸
着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を
添加し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標
識した抗マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレート固
相に結合した抗ＡＮＳモノクローナル抗体を検出するＥ
ＬＩＳＡ法などが挙げられる。ＨＡＴ（ヒポキサンチン
・アミ／プテリン・チミジン）添加培地で選別、育種さ
れた抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちにクローニン
グに供されるが、通常これは限界希釈法などで容易に実
施される。クローン化されたハイブリドーマ培養上清の
抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗体
を産生するハイブリドーマを選択し、目的とするモノク
ローナルな抗ＡＮＳ抗体産生ハイブリドーマを取得する
ことができる。

以上のような製造法に従って作成した抗ＡＮＳ抗体（Ｉ
ｇＧ１．λ鎖）産生ハイブリドーマの例として、マウス
ハイブリドーマＡＳ６−４４．９が挙げられる。

また標的抗原である腫瘍関連抗原としては、例えば多く
の腫瘍細胞に比較的豊富に発現されているｈＴｒＲが考
えられる。ｈＴ　ｆＲはヒト胎盤組織より公知の方法に
従って精製されるが［Ｐ、Ａ。

Ｓｅｌ　ｉｇｍａｎら：ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　
）、λ５４，９９４３（１９７９）］、通常下記の方法
により純度の高い標品が得られる。■ヒト胎盤組織を４
％トリトン−Ｘ−１００を含むｐＨ７，５のリン酸食塩
緩衝液（２０ｎＭリン酸二ナトリウム、０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１；以下、ＰＢＳと略記することがある）中でホモ
ゲナイズし、さらに超音波処理後、遠心分離する。

■得られた上澄液を硫酸アンモニウム塩析後、ヒトトラ
ンスフェリン（ｈＴｆ）に対する抗体を結合すせたカラ
ムに供し、０．５ＭＮａＣ１を含むｐＨ７゜５のリン酸
緩衝液（２０ｍＭリン酸二ナトリウム；以下、ＰＢと略
記することがある）で十分に洗浄する。次いでＱ、５Ｍ
ＮａＣ！および０．５％トリトン−ｘ−ｉｏｏを含む０
．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨＩｏ、ｏ）でｈＴ　ｆＲ
画分を溶出する。■上記ｈＴ　ｆＲ画分をざらにｈＴｆ
結合カラムに供しＩＭＮａＣＩを含むＰＢ（ｐＨ７，５
）で洗浄後、１ＭＮａＣ１および１％トリトン−Ｘ−１
００を含む０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１ｏ、ｏ）で
ｈＴｆＲ精製２標品を得る。あるいはｈＴ　ｆＲに対す
る抗体を結合させたカラムを用いて１段階で溶出・単離
することも可能である。

ｈＴｆＲの動物への免疫および抗ｈＴｆＲ抗体産生細胞
と骨髄腫細胞との融合操作はアンサマイトシン類につい
て述べた方法と同様にして実施できる。

抗ＡＮＳ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば抗マウスＩｇＧ抗体
を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上
清を添加し、次にＨＲＰ　ｔｉ識したｈＴｆＲＭ製標品
を加えてプレート固相に結合した抗ｈＴ　ｒＲモノクロ
ーナル抗体を検出するＥＬＩＳＡ法、あるいはＴｒＲを
細胞表面膜上に多く表現しているに５６２細胞株をマイ
クロプレートに固定化し、これにハイプリドーマ培養上
清を添加し、次にＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を
加えるｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。

以上のような製造法に従って作製した抗ｈＴ　ｆＲ抗体
（ＩｇＧ＋、に鎖）産生ハイブリドーマの例として、マ
ウスハイブリドーマ２２０６が挙げられる。

本発明の二重特異性を有するハイブリッドＭ。

Ａｂを産生ずるポリドーマの作成には幾つかの方法があ
り［新本洋上ら：蛋白質・核酸・酵素、３旦、２１７（
１９８８）］　、いずれの方法でもよいが、例えば、■
上記のＨＡＴ抵抗性の抗ＡＮＳ抗体産生ハイブリドーマ
を５−ブロモデオキシウリジン（以下、ＢｒｄＵと略記
することがある）添加の培養液に段階的に馴化させチミ
ジンキナーゼ欠損株をクローン化しＨＡＴ感受性とする
。同様にＨＡＴ抵抗性の抗ｈＴ　ｆＲ抗体産生ノ１イブ
リドーマを８−アザグアニン（以下、ＡＺＧと略記する
ことがある）耐性とし、ヒポキサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損株をクローン化しＨ
Ａ　Ｔ感受性とする。次いで常法に従い両者を融合して
得られるテトラオーマをＨＡＴ添加培地で選別後、アン
サマイトシン類およびｈＴｆＲの両者に結合能を有する
ハイブリッド抗体を分泌するテトラオーマをクローン化
する、■抗ＡＮＳ抗体産生ハイブリドーマをフルオレセ
イン・インチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略記する
ことがある）で標識、もう一方の抗ＡＮＳ抗体産生ハイ
ブリドーマをテトラメチル・ロダミン・インチオシアネ
ート（以下、ＴＲＩＴＣと略記すること、がある）で標
識後、常法に従い両者を融合する。

得られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティベイテ
ィラド・セルフ−ター（以下、ＦＡＣ３と略記すること
がある）に供しＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴＣの赤色
の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別・クローン化
する、などの方法が挙げられる。また両親株のマーカー
を全く逆にして使用し、テトラオーマを選別・クローン
化することも可能である。

これらの操作における細胞融合に当ってはセンダイウィ
ルス、ＰＥＧなどの融合促進剤やあるいは電気刺激など
の方法が用いられる。好ましくはＰＥＧが用いられ、以
下にその一例を挙げるが、もちろんこの方法に限定され
るものではない。すなわち、分子量約１，０００〜９，
０００、濃度約１０〜８０％等のＰＥＧが用いられ、処
理時間は約０．５〜３０分であるが、好ましい条件の一
例として、約３５〜５５％のＰＥＧ６，０００を約４〜
１０分間、３７°Ｃで細胞と接触させ、効率よく融合さ
せることができる。

ポリドーマの選択は、上記のＨＡＴ添加培地などで実施
できるが、このため８−ΔＺＧ、６−チオグアニンある
いは５−　Ｂ　ｒｄＵなどの薬剤馴化法により、それぞ
れの薬物耐性株が取得される。また新しいマーカーの融
合細胞への導入により、種々の選択培地が用いられる。

このような例として、ネオマイシンやハイグロマインン
Ｂ添加培地などが挙げられる［Ｂ、　Ｓｕｇｄｅｎ、ら
：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

）、５，４１０（１９８５）コ。さらに前記したように
、異った蛍光色素で標識したハイブリドーマを融合し、
ＦＡＣ３で二重標識されたハイブリッド・ハイブリドー
マをソーティングする方法もある［Ｌ、　Ｋａｒａｗａ
ｊｅｗら：ジャーナル舎オブーイムノロジカル・メソッ
ズ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、　９
６　、　２６５（１９８７）］。

ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できる。例えば、■前述した抗ＡＮＳ
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングのためのＥＬ
ＩＳＡ、■固相に抗マウスイムノグロブリン抗体を吸着
させたマイクロプレートにポリドーマ培養上清を添加し
、次にＨＲＰ標識したｈＴｆＲを加えてプレート固相に
結合した抗ｈＴｒＲ抗体を検出するＥｌ、ＩＳＡ、およ
び■固相に（メイタンンノール３−α−アミノフェニル
アセテート）−Ｈ３Ａ複合体を吸着させたマイクロブレ
ートに被検培養上清を添加し、次にＨＲＰ標識したｈＴ
　ｆｌｋを加えて二重特異性を有するノ１イブリッド抗
体検出のためのＥＬＩＳＡ、あるいは抗ＡＮＳ抗体（λ
鎖）と異なる軽鎖を有する抗ＡＮＳ抗体（に鎖）を用い
る場合は、■固相に（タイタン／ノール３−α−アミノ
フェニルアセテート）Ｈ３Ａ複合体を吸着させたマイク
ロプレートに被検培養上清を添加し、次にＨＲＰあるい
はビオチン標識した該抗マウスＩｇＧ−に鎖特異抗体を
加えて二重特異性抗体を検出するＥＬＩＳＡ、およびこ
れらの変法などを適宜組み合わせて用いることかできる
。

ハイブリッド抗体活性陽性のポリドーマはクローニング
に供されるが、これは通常限界希釈法などで容易に実施
される。クローン化されたポリドーマの培養上清につい
ては、上記の方法でその抗体価を測定し、力価の高い抗
体を安定的に産生ずるポリドーマを選択することにより
、目的とするモノクローナルなハイブリッド抗体産生ポ
リドーマを取得することができる。

上記した本発明のポリドーマの培養は通常、液体培地中
、または動物の腹腔内（例えば、マウス等哺乳動物の暖
腔内）で公知の方法により実施できる。培養液および腹
水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を組み
合わせて用いることにより行われる。例えば、細胞培養
液もしくは腹水を遠心分離１２、上清を取り出し、塩析
（通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用
いる）を実施する。得られたタンパク沈殿物を適当な溶
液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィー（イオン
交換カラム、ゲルろ過カラム、プロティンＡカラム、ヒ
ドロキシアパタイトカラム等）に付し、目的とする抗体
を分離精製することができる。あるいは２種の異なった
抗原を不溶化したカラムを用いる操作で、１段階で分離
・精製できる。

以上のような分離精製操作により、例えばＩ＆の培養上
清からタンパク重量比で８０％以上の純度のハイブリッ
ドＭｏＡｂを約１〜５ｍｇ得ることができる。また、２
０滅の腹水液からは同様の抗体が３〜１０ｍｇ得られる
。

以上のようにして得られたハイブリッドＭｏＡｂは蛋白
質として均一であり、蛋白分解酵素（ペプシンなど）処
理などにより、アンサマイトシン類およびｈＴ　ｒＲな
どの癌関連抗原に対する結合能を保持するＦ（ａｂ’）
ｚ断片などを得ることができ、これらは本発明のハイブ
リッドＭｏＡｂと同様の目的で用いることができる。

以上のような製造法に従って作製したハイブリット抗体
産生ポリドーマの例として、後述の実施例２に示したテ
トラオーマＡ”「Ｆｌ−１７０が挙げられる。

なお本発明のハイブリッドＭｏＡ　ｂを産生ずるポリド
ーマとして、抗ＡＮＳＭｏＡｂ産生ハイブリドーマと抗
ｈＴｒＲＭｏＡｂ産生ハイブリドーマとのテｉ・ラオー
マの例を挙げたが、一方のＭｏＡｂを産生ずるハイブリ
ドーマと他方のＭｏＡｂを産生ずる細胞とのトリオーマ
あるいはそれぞれのＭｏＡｂを産生ずる細胞をエプスタ
イン・バー・ウィルスなどにより不死化後、細胞融合し
て得られたハイブリドーマなどであっても、本発明のハ
イブリッドＭｏＡｂを産生ずるものであれば、上記テト
ラオーマと同様の目的で用いることかできる。

また、これらのポリドーマがマウスＩｇＧＭ。

Δｂを産生ずる場合には、該二重特異性ハイブリッドＭ
ｏＡｂの抗原認識部位を含む可変領域をコードするＤＮ
Ａを取得し、これに遺伝子操作技術［Ｚ。

ＳＬｅｐｌｅｗｓｋｉらニブロン−デインゲス・オブ・
ナショナル・アカテミー・サイエンス　ニーニスニー（
Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　　Ｕ　　Ｓ　　Ａ）、　　　８　５．　　４　８　
５２（１９８８）］を用いてヒ）ＩｇＧの定常領域をコ
ードする遺伝子を結合させ、マウス−ヒトキメラ抗体を
作製することもできる。かかるキメラ抗体はヒＩ・への
投与に際し、抗原性が小さいため有利に用いられる。

本発明の二重特異性抗体あるいはアンサマイトシン類と
該二重特異性抗体とから作製される抗ヒト癌蛋白複合体
を用いる癌治療法においては、幾つかの方法が用いられ
る。例えば、■本発明の７１イブリッドＭ　ＯＡ　ｂを
予め担癌患者に投与し、癌組織・細胞に結合させるべく
十分な時間経過後にアフサマイトシン類を投与する、■
該ハイブリッドＭｏＡｂとアンサマイトシン類とを同時
に担癌患者に投与する、などの方法があげられるが、■
予め該ハイブリッドＭｏＡｂとアンサマイトシン類とを
反応させ、未反応のアンサマイトシン類を分離後、得ら
れた抗ヒト癌蛋白ｍ＝体を担癌患者に投与する方法が好
ましい。この場合用いられるアンサマイトシン類として
は、抗腫瘍活性を有し該抗ＡＮＳ抗体と反応しうるちの
であればいずれのものでもよい。このような例としては
、たとえば式［式中、Ｒは水素原子またはカルボン酸由
来のアシル基を、Ｑは水酸基（ＯＨ）またはメルカプト
基（ＳＨ）を、Ｘは塩素原子または水素原子を、Ｙは水
素原子、低級アルキルスルホニル基または置換基を有し
ていてもよいアルキル基もしくはアラルキル基を示す］
で表わされる化合物、およびそれらの４，５−デオキシ
体があげられる。

上記式（１）に関し、Ｒで示されるカルボン酸由来のア
シル基としては、分子量約３００程度以下のカルボン酸
から導かれるアシル基または炭素数１−２０程度のアシ
ル基があげられる。かかるアシル基は、たとえば飽和も
しくは不飽和の脂肪族アシル基、飽和もしくは不飽和の
脂環族アシル基。

芳香族アシル基およびＮ−アシル−α−アミノ酸型アシ
ル基などを包含し、たとえば式 ％式％（） ［式中　Ｒ１は水素原子、アルキル基、アルケニル基、
シクロアルキル基またはアリール基を示し、これらの基
は置換基を有していてもよい。また上記における環状基
はアルキレン鎖を介してカルボニル基に結合していても
よいコで表わすことができる。その中で特に置換基を有
する場合の例としては、式 ［式中、Ｒ２は水素原子１　アルキル基、シクロアルキ
ル基またはアリール基を示し、これらの基は置換基を有
していてもよく、また環状基はアルキレン鎖を介してα
位の炭素原子に結合していてもよい。Ｒ３は水素原子、
アルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を示し
、これらの基は置換基を有していてもよく、また環状基
はアル牛しン鎖を介してＮ原子に結合していてもよい。

Ｒ４は水素原子、アルキル基１　アルケニル基、シクロ
アルキル基またはアリール基を示し、これらの基は置換
基を有していてもよく、また環状基はアルキレン鎖を介
してＮ原子上のカルボニル基に結合していてもよい。さ
らにＲ４はアルコキシ基またはベンジルオキシ基を示し
てもよい］で表わされるＮ−アシル−α−アミ／アシル
基があげられる。

以下、上記（Ａ）式で表わされるアシル基のＲ１につい
て詳述する。

Ｒ１で示されるアルキル基としては、たとえば炭素数１
−１８程度のアルキル基（例、メチル。

エチル、プロピル、イソプロピル　ブチル、イソブチル
、　５ｅｅ−ブチル、　　ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル
。

インペンチル、ｌ−メチルプロピル、ヘキシル。

ヘプチル、３−へブチル、オクチル、ノニル、デシル、
ウンデシル、ドデシル、トリデシル、ペンタデンル、ヘ
プタデシル基）などがあげられ、なかでも炭素数１６程
度の低級アルキル基が好ましい。

Ｒ１で示されるアルケニル基としては、たとえば炭素数
２−１０程度のアルケニル基（例、ビニル、アリル、■
−メチルービニル、２−メチルヒニル、１−オクテニル
、１−デセニル基）かあげられ、なかでも炭素数２−４
程度の低級アルケニル基が好ましい。

Ｒ１で示されるシクロアルキル基としては、たとえば炭
素数３−ＩＯ程度のシクロアルキル基（例、シクロプロ
ピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル
、シクロへブチル、シクロオクチル、ノニボルニル、ア
ダマンチル基）カアげられる。

Ｒ１で示されるアリール基としては、たとえばフェニル
基、ナフチル基などがあげられ、なかでもフェニル基が
好ましい。

上記Ｒ１としてのアルキル基、アルケニル基。

シクロアルキル基およびアリール基は置換基を有してい
てもよく、かかる置換基としては、たとえば炭素数１−
４の低級アルコキシ基（例、メトキシ、エトキン、プロ
ポキシ、インプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、　
５ｅｅ−ブトキシ、　ｔｅｒｔ　−ブトキシ基）、炭素
数２−４の低級アルカノイル基（例、アセチル、プロピ
オニル１　ブチリル、インブチリル基）、炭素数２−４
の低級アルカノイルオキシ基（例、アセチルオキシ、プ
ロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、インブチリルオキ
シ基）、炭素数２−４の低級アルコキシカルボニル基（
例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル。

プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル基）
、ハロゲン原子（例、塩素、フッ素、臭素。

沃素）、水酸基、ニトロ基、シア／基、トリフルオロメ
チル基、アミ７基、モノ低級（Ｃ、、）アルキルアミ７
基（例、メチルアミノ基）、ジ低級（Ｃ１４）アルキル
アミノ基（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミン、ジプ
ロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ　ジブチルアミノ
基）、炭素数１−４の低級アルキルチオ基（例、メチル
チオ、エチルチオ。

プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ。

インブチルチオ、　５ｅｃ−ブチルチオ＋　ｔｅｒｔ−
ブチルチオ基）、低級（Ｃ，−、）アルキルスルフィニ
ル基。

低級（ｃ　＋−４）アルカンスルホニル基、オキソ基。

チオキソ基、炭素数ｉ４の低級アルカノイルアミノ基（
例、ホルミルアミノ、アセチルアミ／。

プロピオニルアミノ　ブチリルアミノ、イソブチリルア
ミ／基）などがあげられる他、Ｒ’が環状基（シクロア
ルキルおよびアリール基）の場合には、炭素数１−４の
低級アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル、ブチル、イソブチル、　５ｅｃ−ブチル、　
ｔｅｒｔ−ブチル基）も置換基として例示される。これ
らの置換基は同一もしくは異なって１個以上３個まで置
換していてもよい。

なお、上記Ｒ１としての環状基（置換基を有していても
よいシクロアルキルおよびアリール基）はアルキレン鎖
を介して式−ＣＯＲ’におけるカルボニル基に結合して
いてもよ（、かかるアルキレン鎖としては、たとえば炭
素数１−４程度の直鎖状または分枝状の低級アルキレン
鎖（例、メチレン、エチレン、メチルメチレン（エチリ
デン）、フロピレン、ブチレン、１−．２−または３−
メチルプロピレン、ｌ−または２−エチルエチレン。

プロピルメチレン、ｌ、１−または１．２−ジメチルエ
チレン、イソプロピルメチレン）があげられ、このアル
キレン鎖も上記の各種置換基を有していてもよい。従っ
て上記環状基とアルキレン鎖が結合した場合、Ｒ＋は置
換基を有していてもよいシクロアルキルアルキル基また
はアラルキル基を表わすことになる。

Ｒ】で示される置換基を有する炭素数１−１８のアルキ
ル基の例としては、メトキシメチル、ブトキシメチル、
メチルチオメチル、メチルチオエチル、エチルチオエチ
ル、イソプロピルチオエチル、ブチルチオエチル、イン
ブチルチオエチル。

アセチルオキシメチル、アセチルオ牛ジエチルエトキシ
カルボニルメチル、ブトキンカルボニルエチル、フルオ
ロメチル、クロロメチル、クロロエチル、３−クロロプ
ロピル、４−クロロブチルトリフルオロメチル、ブロモ
メチル、４−ブロモブチル、５−ブロモペンチル、ヨー
ドメチル、２−ヨードエチル、シアノメチル、メチルス
ルフィニルエチル、メチルスルホニルメチルなどがあげ
られる。

Ｒ１で示される置換基を有する炭素数２−１０のアルケ
ニル基の例としては、２−エトキシカルボニルビニルな
どがあげられる。

Ｒ１で示される置換基を有する炭素数３−１０のシクロ
アルキル基の例としては、２，２−ジメチルシクロプロ
ピル、４−インブチルシクロヘキシル、　　２−７’ロ
モシク口プロピル、２−クロロシクロブチル、４−クロ
ロシクロヘキシル、　　２．２ジフルオロシクロブチル
、３−メ＋−、ｔ−ンシクロヘキシル、４−アセチルシ
クロヘキシル、２−シアノシクロブチル、４−シアノシ
クロヘキシル。

４−ジメチルアミノシクロヘキシルなどがあげられる。

Ｒ１で示される置換基を有するアリール基の例としては
、２−１３−または４−メチルフェニル。

４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、２−．３−または４ク
ロロフエニル、？−、３−または４−ブロモフェニル、
１−３−または４−ヨードフェニル。

２−３−または４−フルオロフェニル、２−または４−
メトキシフェニル、４−ブトキシフェニル、４−メトキ
シカルボニルフェニル、３−アセチルフェニル、２−．
３−または４−ニトロフェニル、３−または４−シアノ
フェニル、４−ジメチルアミノフェニル、４−ジエチル
アミノフェニル、４−アセトキシフェニル、４−ブチリ
ルオキシフェニル、３．４−ジメトキシフェニル、３，
４゜５−トリメトキシフェニル、３．４−メチレンジオ
キシフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−
メチルチオフェニル、４−メチルスルホニルフェニル　
４−アセタミドフェニルなどがあげられる。

上記で詳述したＲ１としての環状基［例、シクロアルキ
ル、アリール（とりわけフェニル）基コがアルキレン鎖
を介して式（Ａ）のアシルのカルボニル炭素に結合する
場合、実質的にＲ１はこれらの環状基とアルキレン鎖が
結合した形の基、たとえばシクロアルキルアルキル基、
アラルキル基ナトを表わすことになり、かかるシクロア
ルキルアルキル基の例としては、アダマンチルメチル、
シクロヘキシルメチル　３−シクロへキシルプロピル。

２−シクロペンテニルメチル、２−シクロペンチルエチ
ルなどが、アラルキル基の例としては、４ブロモベンジ
ル、２−．３−または４−クロロベンジル、２，５−ま
たは３，４−ジメトキンベンジル、４−エトキシベンジ
ル、４−フルオロベンジル、３−または４−メトキシベ
ンジル、４−メトキシフェニルエチル、■−または２−
ナフチルメチル、２−．３−および４−ニトロベンジル
。

３−ニトロフェネチル、ベンジル、　　２’−、３−ま
たは４−フェニルプロピル、２−．３−または４メチル
ベンジル、３，４．５４リメトキシベンジル、α−メチ
ルフェネチルなどがそれぞれあげられる。

前記式（Ｂ）で表わされるＮ−アシル−α−アミノアシ
ル基について以下に説明スル。

Ｒ’、Ｒ’またはＲ４において定義されるアルキル基、
アルケニル基、シクロアルキル基およびアリール基とし
ては、前記Ｒ＋としての６基と同様に例示される。これ
らの基は置換基を有していてもよく、その置換基も前記
Ｒ１における６基の置換基と同様に例示される。さらに
Ｒ”、Ｒ３またはＲ４としての環状基（すなわち、シク
ロアルキル。

アリール基）はアルキレン鎖を介して式（Ｂ）のα位の
炭素原子、Ｎ原子またはＮ原子に置換しているカルボニ
ル基に結合していてもよく、かかるアルキレン鎖も前記
Ｒ１に関して説明したアルキレン鎖と同様に例示される
。

Ｒ４で示されるアルコキシ基としては、たとえば炭素数
１−４程度の低級アルコキン基（例、メトキシ　エトキ
シ　プロポキシ、イソプロポキンブトキシ、イソブトキ
シ、　５ｅｃ−ブトキシ、　ｔｅｒｔ−ブトキン基）が
あげられる。

式（Ｂ）で表わされるＮ−アシル−α−アミノアシル基
の代表的な例としては、Ｎ−アセチル−Ｎメチル−グリ
シル、Ｎ−ベンゾイル−Ｎ−メチル−グリシル、Ｎ−（
４−クロロベンゾイル）−Ｎメチル−グリシル、Ｎ−ア
セチル−Ｎ−メチル−アラニル、Ｎ−アセチル−Ｎ−ベ
ンジル−？５ニル、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−ロイシ
ル、Ｎイソブチリル−Ｎ−メチル−アラニル、Ｎ−イン
バレリル−Ｎ−メチル−アラニル、Ｎ−プロピオニル−
Ｎ−メヂルーアラニル、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−フ
ェニルアラニル、２−、（Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル）
アミノ−３−メトキシカルボニルプロピオニル、２−（
Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル）アミノ−３−メチルメルカ
プトプロピオニル、２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル）
アミノ−３エチルメルカプトプロピオニル、Ｎ−アセチ
ルＮ−メチルイソロイシル　Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル
−ロイシル　Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルメチオニル、Ｎ
−アセチル−Ｎ−メチル−フェニルアラニル、Ｎ〜ルア
セチルＮ−メチル−４′アセトキシ−チロシェル、Ｎ−
ベンジル−Ｎ−メチル−バリル、Ｎ−アセチル−Ｎ−メ
チル−フェニルグリシル、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−
３シアノアラニル、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−（４′
−ジメチルアミノ）−フェニルアラニルなどがあげられ
る。

前記式（１）に関し、Ｙで示される低級アルキルスルホ
ニル基としては、たとえば炭素数１４程度のアルキルス
ルホニル基（Ｌメタンスルホニル、エタンスルホニル、
２−プロパンスルホニル。

２−ブタンスルホニル）などがあげられる。

Ｙで示されるアルキル基としては、たとえば、炭素数１
−８程度の低級アルキル基（例、メチル。

エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、　ｓｅｃブ
チル、ペンチル、インペンチル、ヘキシル。

ヘプチル、オクチル）があげられ、アラルキル基として
は、たとえばフェニル−低級（Ｃ、、）アルキル基（例
、ベンジル、２−フェネチル、３−フェニルプロピル）
があげられる。Ｙとしてのアルキル基およびアラルキル
基は置換基を有していてもよく、かかる置換基としては
、たとえば水酸基アミ７基、低級（ＣＩ−４）アシルア
ミ７基、低級（Ｃ４）アルキルオキシ基、ヘンシルオキ
シ基、オキソ基、ハロゲン（塩素、臭素、ヨー素）原子
、トリフルオロメチル基、低級（Ｃ＝−Ｓ）アルコキシ
カルボニル基、カルボキシル基、メチレンジオキシ基低
１（ＣＩ−、）アルキルチオ基などがあげられる。

対応する４、５−デオキシ体としては式［式中、各記号
は前記と同意義］で表わされる化合物があげられる。

上記アンサマイトシン類はたとえば、Ｋｕｐｃｈａｎｅ
Ｌ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、　９７　
、　５２９４　（１９７５）、　Ｈｉｇａｓｈｉｄｅｅ
ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　２７０．　２７１（１９
７７）、米国特許第４１３７２３０号、米国特許第４１
５１０４２号、米国特許第４１６２９４０号、米国特許
第４２２８２３９号、米国特許第４２２９５３３号、米
国特許第４２４８８７０号、米国特許第４２５６７４６
号、米国特許第４２６０６０８号米国特許第４２６３２
９４号、米国特許第４２６４５９６号、米国特許第４２
６５８１４号、米国特許第４２９４７５７号、米国特許
第４３０７０１６号、米国特許第４３０８２６８号、米
国特許第４３０８２６９号、米国特許第４３０９４２８
号、米国特許第４３１７８２１号、米国特許第４３２２
３４８号、米国特許第４３３１５９８号。

米国特許第４３５６２６５号、米国特許第４３６２６６
３号、米国特許第４３７１５３３号、米国特許第４４２
４２１９号に記載の方法またはそれらに準じる方法によ
り合成することかできる。

また本発明における標的抗原としては種々のものが考え
られるが、代表的なものとして癌細胞膜表面抗原である
腫瘍関連抗原や免疫担当細胞表面レセプター、ウィルス
感染細胞表面抗原などがある。この中、腫瘍関連抗原と
しては、ｈＴｆＲが良く利用されるが、この仙痛胎児性
抗原いわゆるＣＥＡ、α−フェトプロティン、さらにＣ
Ａ１９９を始めとする幾つかの癌関連糖鎖抗原［Ｓ。

Ｈａｋｏｍｏｒｉ　：キャンサーψリサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、）＋１旦、２４０５（１９８５）］ある
いはＢ細胞リンパ腫の膜免疫グロブリン・イディオタイ
プＪＲ，Ａ。

Ｍｉｌｌｅｒら：ニューイングランド・ジャーナル・オ
ブ・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌｉ、Ｍｅｄ、）、　
３０６．　５１７（１９８２）］やＴ細胞リンパ腫のレ
セプター・イディオタイプ［Ｌ、　Ｌ、　Ｌａｎ１ｅｒ
ら：ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　）、　ｌ　３７　、　２２８６（１９８６）
］、腎細胞癌に特異的に発現される膜糖蛋白抗原なども
挙げられる。

以上のように本発明のハイブリッドＭｏＡｂは標的抗原
に対してきわめて特異的に結合可能で、そして同時に結
合しているアンサマイトシン類の細胞毒性作用を介して
効果的に癌細胞を殺すことができ、癌治療を選択的、効
果的に実施できる。

本発明のハイブリッドＭｏＡｂは、アンサマイトシン類
と結合することによりアンサマイトシン類の細胞毒性を
中和し、かつ標的部位においてはアンサマイトシン類を
遊離し細胞毒性効果を発揮させる。すなわち、本発明の
ハイブリッドＭｏＡｂは標的部位以外においてはアンサ
マイトシン類を安定な不活性型として保持し、標的部位
においては活性型アンサマイトシン類を遊離しつるため
、持続性および選択性に優れ、かつ副作用の極めて低い
抗癌剤として調製することができる。

以下に参考例・実施例により本発明を具体的に説明する
が、これらが本発明の範囲を制限するものでないことは
いうまでもない。

ＢＰ−２２３３ ＢＰ−２０５４ ＢＰ−２２３４ ＢＰ−２３３３ ＢＰ−２６８７ マウスハイブリドーマＡＳ６−４４．９　　５０１８１
マウス−マウスハイブリドーマ２２Ｃ６５０１７２マウ
スハイブリドーマＡＴＦＩ−１７０５０１８２マウスハ
イブリドーマＲＣＳ−１５０１８４マウスハイブリドー
マＲＣＡＳＩ−４８８５０２１８ＩＦＯ：財団法人発酵
研究所（大阪） ＦＲＩ：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 Ｎ−（γ−マレイミド・ブチリロキシ）−スフシイミド
でマレイミド化したメイタンシノール　３α−アミノフ
ェニルアセテートを、予めＮ−サクシミジルビリジルジ
チオプロピオネートで修飾還元したＨ３Ａに添加し、チ
オール交換反応で（メイタンシノール　３−α−アミノ
フェニルアセテート）−ＩＳＡ複合体を作製した。次い
でこの蛋白複合体５０μｇ／ｄを９６穴マイクロプレー
トに１００μｍ２／ウエルの割合で添加し、固相抗原を
調製した。

■　アッセイ法 被検ハイブリドーマ培養上清１００μＣを上記の抗原感
作プレートに添加し、室温で２時間反応させた。０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０含有２０ｍＭリン酸食塩緩衝液（ｐ
Ｈ７，３：以下、ＰＢＳ−Ｔｗと略記する）でプレート
を十分に洗浄後、ＨＲＰ標識ウサつ抗マウス■ｇＧ抗体
を添加し、さらに室温で２時間反応させた。

洗浄後、酵素基質としてオルソ−フェニレンジアミンお
よびＨ，Ｏ，を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液を各ウ
ェルに加え、室温で酵素反応を実施した。ＩＮ硫酸で反
応停止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長
４９２ｎｍで発色色素量を測定した。

参考例２　抗ｈＴｆＲ抗体産生ハイブリドーマの作成 ■ｈＴ　ｒＲの精製 ヒト胎盤組織１．５ｋｇを細かく切断しＰＢＳ（ｐＨ７
，５）中でブレンドしたのち、遠心分離した。

得られた沈渣を４％トリトンＸ−１００ａ有ＰＢＳ中で
ホモゲナイズし、さらに超音波処理後再び遠心分離した
。次いで上清１００−当り約３２ｇの硫酸アンモニウム
を添加し塩析後、抗ｈＴｒ抗体結合カラムに供し０．５
Ｍ　ＮａＣ１含有ＰＢ（ｐＨ７゜５）で十分に洗浄した
。Ｑ、５ＭＮａＣ１および０゜５％トリトンＸ−１００
含有０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨＩ　Ｏ’、　Ｏ）
で溶出したｈＴ　ｆＲ画分を、さらにｈＴｒ結合カラム
に供し１ＭＮａｃｌ含有ＰＢで洗浄後、１ＭＮａｃＩお
よび１％トリトンＸ−１００含有０．０５Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ１ｏ、ｏ）で溶出することによりｈＴｆＲ精
製標品約１　、５　ｍｇを得た。

■　鳩 上記のｈＴ　ｆＲ精製標品２００μｇ／ｒｎｌ生理食塩
水溶液に等量のフロイント完全アジュバントを添加し十
分乳濁後、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウス（♀、ｎ＝１
０：２０μｇ／ｒｎｌ／マウス）に腹腔および背部皮下
投与し、３週間隔で追加免疫を実施した。４回の追加免
疫後、２週で最大の血清抗体価を示した固体について、
同じｈＴ　ｆＲの抗原液（３０μｇ１０、ｌｄ生理食塩
水／マウス）を静脈内投与した。

■　帆鳳貴令 最終免疫後３日で肺臓を摘出し、肺臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０”個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ　１）２Ｘ　１０７個を添加し、ＰＥＧ６０
００を用いてケーラーとミルスタインの方法［ネーチ＋
−（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６．　４９５（１９７５）］
に準じて細胞融合に供した。

融合終了後、細胞混液をヒボキサンチン・アミノプテリ
ンおよびチミジンを含む、いわゆるＨ　ＡＴ培地中に懸
濁し、ＩＯ日間培養した。以後は、親細胞の選択が終了
次第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地
に代え培養を続けた。

■　ハイブリドーマの選択およびクローニング市販のウ
サギ抗マウスＩｇＧ抗体液２０μｇ／ｄを９６穴マイク
ロプレートに１００μｇづつ分注し４℃で一夜放置後、
さらに２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７，３）を添加して
感作プレートを作成した。

また■で得たｈＴｆＲ精製標品を常法に従いＨＲＰ標識
後ＥＬＩＳＡに用いた［北用常広：有機合成化学、す、
２８３（１９８４）］。すなわち、上記第２抗体感作プ
レートにハイブリドーマ培養上清を添加し室温で２時間
反応後、ＰＢＳで洗浄した。次いでＨＲＰ［識ｈＴ　ｒ
Ｒを添加しさらに室温で２時間反応させた。以下、参考
例１−■に記載の方法で酵素反応を実施し抗体価を測定
した。

特に結合能の強いハイブリドーマについて限界希釈法に
よるクローニングを実施し、抗ｈＴ　ｆＲ抗体産生ハイ
ブリドーマ２２０６を得た。本抗体のサブクラスはＩｇ
Ｇ＋（に鎖）で、ヒト腫瘍細胞株に５６２に高い親和性
を示した。

参考例３　混合血球凝集法（ＭＨＡ） 対象となる細胞のうち付着性の細胞は、２４〜４８時間
前より６０穴マイクロプレート（ヌンク社製）に５００
個／ウェルとなるよう分注して培養した。浮遊性の細胞
は、検査当日に血清無添加の培養液に浮遊後、同じ数の
細胞の各ウェルに分注し、４００Ｘｇで５分遠心してプ
レートに付着させた。

指示血球の作製は、ＰＢＳで３回洗浄したヒツジ赤血球
をＰＢＳで２％浮遊液とし、この浮遊液にＰＢＳで最高
凝集価の２．５倍希釈したマウス抗ヒツジ赤血球抗体（
オルソ社製）を等量混合して３７°Ｃで３０分反応させ
た。この血球をＰＢＳで３回洗浄し２％に再浮遊した。

次にＰＢＳで２５倍に希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ抗
体（カベル社製）を等量混合し、さらに３７°Ｃで３０
分反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄して２％浮遊液
として保存した。

細胞を付着させたプレートを、０．１ＭＭｇＣＱ２−０
．’０３Ｍ、ＣａＣｌ２ｔ−ｏ、１％グルコース含有ベ
ロナール食塩緩衝液（ｐＨ７，４；以下、ＶＢＳと略記
することがある）にさらに５％ＦＣ３を含む溶液で洗浄
後、培養上清あるいは腹水を各ウェルに分注し、室温で
１時間静置した。ＶＢＳでこのプレートを洗浄後、５％
ＦＣ３−ＶＢＳで０．２％に希釈した指示血球を各ウェ
ルに分注し室温で４０分静置した。次に未反応の血球を
ＶＢＳで洗浄除去し、顕微鏡下で観察した。抗体非添加
の陰性コントロール試験でのロゼツト形成力１％以下で
あり、本試験のウェルにおいて標的細胞の２５％以上に
ロゼツト形成を認めた場合を反応陽性とした。

腎癌患者腫瘍組織の２ｍｍ角組織片をｎｕ／ｎｕ−ＢＡ
　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス皮下に移植し、移植継代の安定
移植し、３〜４週後に血清を採取し、その移植マウスの
血清０．５ｄをフロイントの完全アジュバントと等量懸
濁し、同系のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに腹腔内投
与した。以後約７〜１０日毎に５回上記の移植ヌードマ
ウスの血清０．５蔵および等量のフロイントの完全アジ
ュバントで免疫した後、血清１．０戒を腹腔内投与した
（最終免疫）。最終免疫後、抗体価を参考例３に記載の
ＭＨＡ法で測定した。

■　ハイブリドーマの作成 ■で得られた高い抗体価を示した免疫マウスの肺臓細胞
を常法（ＰＥＧ６０００，３７℃で１〜１０分間処理）
によりマウス骨髄腫細胞Ｎ５−１と融合しＨＡＴ（ヒポ
キサンチン：１Ｘ１０−’Ｍ。

アミノプテリン：　４　Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ、チミジン１
．６Ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍ）添加培地で選択した。増殖する
ハイブリドーマ群を参考例３に記載のＭＨＡ法でスクリ
ーニングに供し、抗体価の高いグループをさらにクロー
ニングし目的の抗ヒト腎細胞癌ＭｏＡｂ産生マウスハイ
ブリドーマＲＣ３−１を得た。マウスハイブリドーマＲ
ＣＩＩから産生されるＲＣｓ−１抗体はＩｇＧ１サブク
ラスに属した。

■　マウスＭｏＡｂの製造 マウスハイブリドーマＲＣ５ｉ　　５Ｘ１０’個をＭＣ
Ｉ（ＡＦ）−ｎｕマウスに腹腔内投与し約４週後に５〜
１０ｄの腹水液を採取した。腹水液は硫酸アンモニウム
で塩析処理後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムで精製した
。５０蔵の腹水液から約２００ｍｇの精製マウス抗ヒト
腎細胞癌ＭｏＡｂＲｃｓ−ｉが得られた。

■　マウス抗ヒト腎細胞癌ＭｏＡｂの特性■で得られた
マウスＭｏΔｂ　　ＲＣ３−１を参考例３に記載のＭＨ
Ａ法に供し、各種ヒト腫瘍細胞株および正常腎組織に対
する反応性を測定した。

結果は下表に示した通りであった。

表から明らかなように正常腎組織に反応することなく、
測定に供した全ての腎癌細胞株に対して強い反応性を示
した。また一部の肺癌、膀胱癌およびＴ白血病細胞株に
も陽性であった。

マウスモノクローナル抗体ＲＣ３−１の反応性１）陽性
細胞群：　胃癌（ＡＭ−ＲＣ−３，ＡＭ−ＲＣ−６，Ａ
Ｍ−ＲＣ−７，５Ｋ−ＲＣ−１゜５Ｋ−ＲＣ−９，５Ｋ
−ＲＣ−１８）、膀胱癌（Ｔ−２４）、肺癌（Ｌｕｃｉ
−１０，Ｃａ１ｕ−６ＰＣ−１０）、　Ｔ細胞白血病（
ＨＵＴ−７８）陰性細胞群：　膀胱癌（ＫＫ−４７，Ｍ
ＧＨ−Ｕ−１）、前立腺癌（ＤＵ−１４５）。

胃癌（ＮｔｌＧＣ−２，ＮＵＧＣ−３，ＮＵＧＣ−４，
ＭＫＮ−２８，ＮＡＴＯ−１１１，ＭＲＫ−１）。

腸瘍（Ｓ！−４０３，５Ｗ−６２０，Ｓ！−１１１，６
，５Ｗ−１２２２，Ｃａ０Ｖ−４，ＨＴ−２９）、子宮
頚癌（ＭＥ−１８０）、　　メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ
−３３，ＳＫ−ＭＥＬ−３７）、乳癌（ＭＣＦ−７）、
　グリオーマ（ＭＧ−１７８）、肺癌（ＡＤＬＣ−ＤＡ
、　５ＢＣ−３，５ＣＬＣ−ＳＡ、Ｌｕｃｉ−６，ＣＡ
ＤＯ−ＬＣ３，０ＫＡＤＡ、ＱＧ−５６）、　Ｔ細胞白
血病（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、　ＨＰＢ−ＡＬＬ、　Ｈ８Ｂ
−２，ＨＵＴ−１０２，ＲＰＭＩ−８４０２，Ｐｉ　２
／　Ｉｃｈｉｋａｗａ、　ＭＴ−１，ＭＴ−２）、　　
Ｂ細胞白血病（Ｒａｊ　ｉ、　Ｄａｕｄ　ｉ、　ＢＡＬ
Ｌ−１，ＲＰＭ　ｌ−１７８８゜Ｌｙ−１６）、　　ヌ
ル細胞白血病（ＮＡＬＬ−１，ＮＡＬＭ−６，ＮＡＬＭ
−１８，ＫＯＰＮ−Ｋ。

Ｐ３０１０ｈｋｕｂｏ）、骨髄腫性白血病（ＨＬ−６０
）陰性組織群：　正常腎５種。

■）参考例３記載のＭＨＡ法で測定 実施例１　抗ＡＮＳ抗体産生ノ＼イブリドーマの作成の
免疫 ＰＤＭ−３−Ｃ，。−カルボキシメチルエーテルをＮ−
ヒドロキシスクシンイミドとジシクロへキシルカルボジ
イミドとで活性エステル化し、次いでキャリヤ蛋白であ
るＢＳＡに結合させ免疫原を調製した。

上記の（ＰＤＭ　　３　　、Ｃｔｏ−カルボキシメチル
エーテル）−Ｂ　Ｓ　Ａ複合体２００μｇ／ｄ生理食塩
水溶液に等量のフロイント完全アジュバントを添加し十
分乳濁後、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀、２０μ
ｇ１０．２ｎｄｌ／マウス）に腹腔および背部皮下投与
し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回の追加免
疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体について
、（ＰＤＭ−３−Ｃ，。−力ルボキシメチルエーテル）
　　Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｈ合体液（５０ｕｇ１０．１ｄ生理食
塩水／マウス）を静脈内投与した。

■　細胞融合 参考例２−■に記載の方法に従い、細胞融合を実施した
。

■　ハイブリドーマの選択およびクローニング（メイタ
ンシノール　３−α−アミ／フェニル７セテート）　　
ＨＳ　Ａｉａ合マイクロプレートを用いる参考例１記載
のＥＬＩＳＡでハイブリドーマをスクリーニングし、以
下参考例２−■と同じ方法で抗ＡＮＳＭｏＡｂ産生ハイ
プリドーマを取得した。これらの中、免疫原であるＰＤ
Ｍ−３−Ｃ１゜−カルボキシメチルエーテルのみならず
９−チオメイタンシン、ＭＡＹ、さらにはＡＮＳにも強
い結合反応を示すＭｏＡｂ産生マウスノ１イブリドーマ
ＡＳ６−４４．９が得られた。本抗体の免疫グロブリン
クラス、サブクラス、軽鎖の種類はオークターロニー法
、ＥＬＩＳＡ法による測定で１ｇＧ１−λ鎖と決定され
た。またＡＮＳの細胞毒性に対する中和能を有していた
。

第１図にハイブリドーマＡＳ６−４４．９の培養上清の
ＥＬＩＳＡにおける抗体希釈曲線を、第２図にＡＮＳの
細胞毒性（標的細胞：マウス白血病細胞Ｐ３８８Ｄ１お
よびヒト白血病細胞に５６２）に対する中和活性曲線を
示した。

製造 ■　細胞融合 実施例１で取得した抗ＡＮＳ抗体産生ハイブリドーマＡ
Ｓ６−４４．９および参考例２で取得した抗ｈＴ　ｒＲ
抗体産生ハイブリドーマ２２Ｃ６を、それぞれ０．５μ
ｇ／ＭｌＦＩＴｃおよび１．５μｇ／ｄＴＲＩＴｃ含有
イスコフーハムＦ１２混合培地で３７℃、３０分間イン
キュベートし、蛍光染色した。次いで、ＬＳＭ溶液（和
光純薬玉業に、　Ｋ、販売）を添加し死細胞を除去した
のち、両ノ＼イブリドーマをｌ：１の割合で混じ、ＰＥ
Ｇ６０００を用いて細胞融合した。

３７℃で２時間インキュベート後、ＦＡＣ８に供するこ
とによりフルオレセインおよびローダミンで二重染色さ
れた細胞２５，０００個を分取し、次にフィーダーとし
てマウス胸腺細胞を５×１０５個／ウェル播種した９６
穴マイクロプレートに、上記の二重染色細胞をｌＯ個／
ウェルの割合で播種し培養した。

■　ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクローニ
ング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウェルの培養上清
を、下記に示す二重特異性抗体測定用ＥＬ［ＳＡに供し
抗体活性を測定した。すなわち、参考例１−■で作成し
たくメイタンシノール　３α−アミノフェニルアセテー
ト）−Ｈ３Ａ感作プレートに被検ハイブリッド・ハイプ
リドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応後ＰＢＳ
−ＴＷで洗浄した。次いでビオチン標識した抗マウスＩ
ｇＧ−に鎖特異抗体を添加し、さらに室温で２時間反応
後、ＨＲＰ標識したアビジンを加えて洗浄し、固相に結
合した酵素活性を参考例１−■に記載の方法で測定した
。

高いハイブリッド抗体活性を示したウェルにつ・いて限
界希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特異
性抗体産生テトラオーマＡＴＦ１−１７０を取得した。

第３図にＡＴＦＩ−１７０培養上清の抗体希釈曲線を示
した。

■　ユエス仄工上坑体久１１ 予め０．５滅鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／Ｃマウス
６匹に５Ｘ１０”個／マウスのテトラオーマを腹腔内接
種した。約１４〜１８日後に腹水の貯溜がみられたので
それを採取し、４５〜５０％飽和硫酸アンモニウムで塩
析してＩｇＧ画分を得た。２０ｎ＋Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ７
，５）で透析後、ＰＤＭ　　３　　Ｃｚｏ−ｐ−アミノ
ベンジルエーテル結合セルロファイン力ラムに供しｐＨ
２，９の０．２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出した。酸
溶出画分をＰＢＳで透析後、さらにヒドロキシアパタイ
トカラムを用いる高速液体クロマトで本発明の抗ＡＮＳ
−抗ｈＴ　ｒＲ二重特異性を有するハイブリッド抗体を
得た。

腹水２０−より約７　、３　ｍｇの二重特異性抗体を得
ることができた。

単離 実施例２−■に記載の方法でテトラオーマＡＴＦｌ−１
７０をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスで腹水化した。

採取した腹水液を４５〜５０％飽和硫酸アンモニウムで
塩析後、さらにプロティンＡカラムで精製しＩｇＧ画分
を取得した。酸溶出画分を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６，２）　で透析Ｌ、同じ緩衝液で平衡化した
ヒドロ牛シアパタイト力ラムに供した。ｌＱｍＭから３
００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，２）の濃度
勾配溶出法により各種免疫グロブリン種を相互分離し、
第４図の結果を得た。

第４図のピーク１は抗ＡＮＳ抗体ＡＳ６−４４゜９、ピ
ーク３は抗ｈＴ　ｒＲ抗体２２Ｃ６の溶出位置に相当し
た。各ピークの抗体溶出画分を実施例２■に記載の二重
特異性抗体測定用ＥＬＩＳＡに供したところ、ピーク２
のみ強い抗体活性を示したことから、目的の二重特異性
ハイブリッド抗体ＡＴＦＩ−１７０はピーク２に溶出さ
れたことがわかった。

本方法により腹水５滅より約２．２ｍｇの二重特異性抗
体を得ることができた。

加し５°Ｃで１時間反応させてから、ＰＢＳで平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラムに供し、ＡＮＳと二重
特異性抗体との複合体を分取した。

次にヒト白血病細胞株に５６２およびマウス白血病細胞
株Ｐ３８８Ｄ、を予め１．０Ｘ１０’個１０、ＥＭ！／
ウェル播種したプレート（リンプロ社製）に上記のＡＮ
Ｓ−抗体複合体溶液０．５ｄ／ウエルを添加し３７℃で
４日間培養した。培養終了後、コルターカウンターで細
胞数を測定し、ＡＮＳ抗体複合体の細胞毒性能を評価し
た。結果は第５図に示した通りであった。

本発明の二重特異性抗体と強く結合しｈＴ　ｆＲを有す
るヒト白血病細胞に５６２に対しては強い細胞傷害活性
を示すが、ｈＴｆＲを有さないマウス白血病細胞Ｐ３８
８Ｄ、に対してはほとんと細胞傷害活性を示さなかった
。

胎毒性 実施例３で取得した精製抗ＡＮＳ−抗ｈＴｆＲ二重特異
性抗体に５倍モルのアンサマイトシンを添抗体の製造 ■　細胞融合 実施例１で取得した抗ΔＮＳ抗体産生ハイブリドーマＡ
Ｓ６−、−４４．９および参考例４で取得した抗ヒト腎
細胞癌抗体産生ハイブリドーマＲＣ３ｌを実施例２の方
法に従い、それぞれ０．５μｇ／、−ＦＩＴＣおよび１
．５μｇ／藏ＴＲＩＴＣ含有イスコフーハムＦ１２混合
培地で３７°Ｃ，３（１間インキュベートし、蛍光染色
した。次いで、ＬＳＭ溶液（和光純薬玉業に、Ｋ、販売
）を添加し死細胞を除去したのち、両ハイブリドーマを
ｌ＝１の割合で混じ、ＰＥＧ６０００を用いて細胞融合
した。

３７°Ｃで２時間インキュベート後、ＦＡＣ３に供する
ことによりフルオレセインおよびローダミンで二重染色
された細胞２５，０００個を分取し、次にフィーダーと
してマウス胸腺細胞を５×１０５個／ウェル播種した９
６六マイクロプレートに、上記の二重染色細胞を１０個
／ウェルの割合で播種し培養した。

■　ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクローニ
ング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウェルの培養上清
を、下記に示す二重特異性抗体測定用ＥＬＩＳＡに供し
抗体活性を測定した。すなわち、腎癌細胞株ＡＭ−ＲＣ
−７１０’個／ウェルを吸着させたマイクロプレートに
被検ハイブリッドハイブリドーマ培養上清を添加し、室
温で２時間反応後、細胞培養液で洗浄した。次いでＨＲ
Ｐ標識した（メイタンシノール　３−α−アミノフェニ
ルアセテート）−Ｈ８Ａを添加し、さらに室温で２時間
反応後、洗浄し、固相に結合した酵素活性を参考例１−
■に記載の方法で測定した。

高イハイブリノド抗体活性を示したウェルについて限界
希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特異性
抗体産生テトラオーマＲＣＡＳ　１４８８を取得した。

第６図にＲＣＡＳＩ−４８８培養上清の抗体希釈曲線を
示した。

■　ハイブリッド抗体の精製 予め０．５７ｎ１．鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／Ｃ
マウス６匹に５ＸｌＯ”個／マウスのテトラオーマを腹
腔内接種した。約１４〜１８日後に腹水の貯溜がみられ
たのでそれを採取し、４５〜５０％飽和硫酸アンモニウ
ムで塩析してＩｇＧ画分を得た。２０ｍＭ、ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７，５）で透析後、ＰＤＭ−３−Ｃ，。−ｐ−アミノ
ベンジルエーテル結合セルロファイン力ラムに供しｐＨ
２，９の０．２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出した。酸
溶出画分をＰＢＳで透析後、さらにヒドロキシアパタイ
トカラムを用いる高速液体クロマトで本発明の抗ＡＮＳ
−抗ヒト腎細胞癌二重特異性を有するハイブリッド抗体
を得た。

腹水２０旋より約５．８ｍｇの二重特異性抗体を得るこ
とができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で作成した抗ＡＮＳ抗体ＡＳ６−４４
．９を参考例１記載のＥＬＩＳＡに供して得た抗体希釈
曲線である。第２図は同じＡＳ６４４．９抗体のＡ　Ｎ
　Ｓ　（１ｎｇ／ｍｌ＞に対する中和活性曲線を示す。 第３図は実施例２で作製したハイブリッド抗体ＡＴＦ１
．−１７０の二重特異性抗体活性を示す。第４図は実施
例３で調製したテトラオーマＡＴＦＩ−１７０の産生ず
る免疫グロブリン種のヒドロキシアパタイトカラム溶出
曲線である。検出は２８０ｎｍにおける吸収により示さ
れた。 第５図は実施例３で作成した抗ＡＮＳ−抗ｈＴｆＲ二重
特異性抗体の細胞毒性試験結果を示す。第６図はＲＣＡ
Ｓ　ｌ−４８８の培養上清の抗体希釈曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アンサマイトシン類および標的抗原の両方に対し
   て結合親和性を有するハイブリッドモノクローナル抗体
   。 （２）標的抗原が腫瘍関連抗原である請求項１記載のハ
   イブリッドモノクローナル抗体。（３）腫瘍関連抗原が
   ヒトトランスフェリンレセプターである請求項２記載の
   ハイブリッドモノクローナル抗体。 （４）腫瘍関連抗原がヒト腎細胞癌関連糖蛋白である請
   求項２記載のハイブリッドモノクローナル抗体。 （５）請求項１記載のハイブリッドモノクローナル抗体
   にアンサマイトシン類を結合させてなる複合体。 （６）請求項１記載のハイブリッドモノクローナル抗体
   を産生するポリドーマ。