JPH07501692A

JPH07501692A - Ｃｂ　１９５４およびその類似体を細胞障害性の形態に還元するための細菌のニトロリダクターゼ

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Publication number: JPH07501692A
Application number: JP5507572A
Authority: JP
Inventors: アンレザーク，ギリアン; メルトン，ロジヤー; シャーウツド，ロジヤー; コナーズ，トーマス; フリードロス，フランク; ジヤーマン，マイケル; ノツクス，リチヤード; モーガン，アンソニー
Original assignee: キヤンサー・リサーチ・キヤンペーン・テクノロジー・リミテツド
Priority date: 1991-10-23
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2023-07-09
Also published as: ES2279506T3; EP0638123A1; US5633158A; JP2005040136A; AU681337B2; CA2122036C; ATE349534T1; EP0540263A1; US5977065A; DE69233669T2; CA2122036A1; DE69233669D1; JP4115514B2; EP0638123B1; WO1993008288A1; JP3995666B2; AU2776992A; US5780585A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＢ　１９５４およびその類似体を細胞障害性の形態に還元するための細菌のニトロリダクターゼ本発明は、新形成組織の増殖の抑制に関し、そしてとくに新規な抗腫瘍剤の提供およびプロドラッグを抗腫瘍剤に変換することができる酵素に関する。

アルキル化剤５−（アジリジン−１−イル）・−２，４−ジニトロベンズアミド（以後ＣＢ　１９５４と表示する）は、独特の選択性をもつ興味ある実験用化合物として、はとんど２０年間知られてきている。ＣＢ１９５４は比較的広い範囲の活性を有する多数の他の既知のアルキル化剤に構造的に非常に密接に関係するが、ＣＢ　１９５４はウォーカー（Ｗａ　ｌ　ｋ　ｅ　ｒ）腫瘍細胞に対してｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏでかなりの活性を示すが、他の腫瘍に対して事実上不活性である。

最近、ＣＢ　１９５４の選択性はそれがそれ自体抗腫瘍剤ではなく、ウォーカー細胞の中に見いだされるニトロリダクターゼ酵素によりＣＢ１９５４から発生する抗腫瘍剤のためにプロドラッグであるという事実から生ずることが発見された。引き続いて、ウォーカー細胞からのこのニトロリダクターゼは、ＥＣ，１，６，９９，２として分類されるＮＡＤ　（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）である他の源から既知の酵素であることが示された、参照、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６１．１５７９４−１５７９９　（１９８６）。

ＣＢ　１９５４を使用する従来の研究過程において、ウォーカー細胞の酵素ＥＣ，１，６，９９，２はＣＢ　１９５４の４−二トロ基を対応するヒドロキシルアミンに還元する能力を有すること、およびそれはその結果生ずる５−（アジリジン−１−イル）−２−ニトロ−４−ヒドロキシルアミノ−ベンズアミドであり、これは活性な抗腫瘍剤であることが発見された。

プロドラッグの使用は癌の治療において臨床的に価値ある概念を表す。

なぜなら、とくに腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体に結合できる酵素の影響下にプロドラッグを抗腫瘍剤に変換すべき場合、このようなプロドラッグとこのような酵素モノクローナル／抗体結合体との組み合わせは非常に強力な臨床剤を表すからである。

今回、われわれは新規なニトロリダクターゼを発見し、これらのニトロリダクターゼは細菌源から得ることができ、ＣＢ　１９５４を活性な抗腫瘍剤に変換することができるだけでなく、また、ＥＣ，１，６９９２と異なり、またプロドラッグであるＣＢ　１９５４類似体を活性な抗腫瘍剤に変換することもできる。

図面の説明第１図は実験の結果を示し、この実験においてＣＢ　１９５４　（１００μＭ）および還元型コファクター（５００μＭ）を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で、酵素（２ｍｇ／ｍｌ）大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）　ニトロリダクターゼ（Ａ）または２５　ｕ　ｇ／ｍ　Ｉのウォーカー（Ｗａ　Ｉ　ｋ　ｅ　ｒ）　ＤＴジアホラーゼ（Ｂ）と空気中で３７℃においてインキュベーションした。種々の時間において、アリコート（１０μｌ）をパーチンル（Ｐｒ　ｔ　ｉｓ　ｉ　Ｉ）ＳＣＸ　（２４０Ｘ４．７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で無勾配的に（２ｍｌ／分）溶離した。溶出液を連続的に３２０．２６０および３６０ｎｍにおける吸収についてモニターし、モしてＨＰＬＣの形跡上のこの化合物に相当するピークの積分によりＣＢ　１９５４の濃度を計算した。

第２図は、細胞へのアクチノマイシンＤ　（ＡＭＤ）のプロドラ・ノブと本発明のニトロリダクターゼとのインキュベーションの間のＡＭＤの形成を示す。　第３図は、マイトマイシン（ＭＣ）のプロドラッグと本発明のニトロリダクターゼとのインキュベーションの間のＭＣの形成を示す。

第４図は、本発明による抗体−酵素結合体のｉｎ　ｖｉｔｒｏの結合を示す。

本発明は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｂおよびバシラス・アミロリフファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）から分離されると例示される、細菌から得ることができる下記の特性を有するニトロリダクターゼを提供する１、２０〜６０キロダルトンの範囲の分子量を有するフラボタン／＜り質である：２　コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ　（Ｐ）Ｈまたはそれらの類似体を必要とする：３、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ　（Ｐ）Ｈについて１〜１００μＭの範囲のＫｍを有する。モして　− ４、ＣＢ　１９５４およびその類似体のいずれかまたは両者のニトロ基を細胞障害性の形態、例えば、ヒドロキシルアミンに還元することができる。

本発明のニトロリダクターゼは、大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）　Ｂ、大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）　Ｃおよび他の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株、例えば、Ｋ１２型ならびに他のグラム陰性生物、例えば、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、およびグラム陰性細菌、例えば、バシラス・アミロリフファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）またはバシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）の細胞内に天然に存在する。それらはこのような細胞から、細胞を崩壊させ、そして細胞内容物をクロマトグラフィーにより分離し、そしてニトロリダクターゼを単離することによって、回収することができる。

例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉ）　Ｂからの本発明のニトロリダクターゼは、均質性に精製され一表１参照、そしてアミノ酸配列分析して、表２に記載する結果を得た。上の配列は、渡辺ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１８．１０５９　（１９９０）に記載されているように、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から得られた２１９７−のニトロリダクターゼの推定されたアミノ酸配列を示す。肉太のタイプの下の配列は、本発明の１例として大腸菌（Ｅ、ｃ。

１１）Ｂのニトロリダクターゼの臭化シアンの断片の配列を示し、ある程度の均質性を示すが、それが渡辺らのニトロリダクターゼおよび最近記載されたエンテロバクタ−・クロアケ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）のニトロリダクターゼ、参照、Ｂｒｙａｎｔら、Ｊ５Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２６６．４１２６　（１９９１）またはウォーカー（Ｗａ　Ｉ　ｋ　ｅ　ｒ）細胞のニトロリダクターゼと異なるニトロリダクターゼであり、そして従来報告されたことのない酵素であることを確証するために十分な差を示す。

本発明の大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）　Ｈのニトロリダクターゼのアミノ酸配列を、また、ニトロリダクターゼ遺伝子の中のヌクレオチドの配列決定から誘導することができ、そしてこれらの配列を下表３に記載する。

表３のヌクレオチド配列を使用して、添付した配列のリストを作成した・表３の中の情報を使用して、宿主細胞の中に含有される適当な発現ベクターの中でニトロリダクターゼをエンコードするＤＮＡを発現させ、そしてニトロリダクターゼを回収することによって、本発明によるニトロリダクターゼを生産することができる。発現ベクターは、例えば・細菌、酵母菌、昆虫または哺乳動物の発現ベクターであることができ、そして宿主細胞はそのベクターと適合性であるように選択されるであろう。

上に示したように、本発明の新規な酵素は種々の基質分子の中のニトロ基を還元することができ、そしてこれらの酵素は細胞障害性化合物の種々のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体のニトロ基を還元して、自動的に分解して細胞障害性化合物を解放する「自己犠牲的」化合物を生成する能力においてとくに有用であることをわれわれは発見した。

本発明のアプローチにおける重要性は、アミノまたはヒドロキシ置換基、とくに芳香族アミノまたはヒドロキシ置換基を含有する種々の細胞障害性化合物の細胞障害性が、アミノまたはヒドロキシ親化合物よりかなり低い細胞障害性を示すアミノまたはヒドロキシ基のｐ−ニトロベンノルオキソカルボニル誘導体を生ずるという事実にある。こうして、腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体に結合できる酵素の影響下にプロドラッグを抗腫瘍剤に変換する前述の型の系において、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体をプロドラッグとして使用することができる。

したがって、本発明は、一般式：：式中Ｒ１およびＲ２は化合物ＲＩＮＨ２およびＲ２０Ｈが細胞障害性化合物であるような基である、の新規な化合物を提供する。

化合物ＲＩＮＨ２およびＲ２０Ｈは芳香族の細胞障害性化合物であることが好ましく、そして化合物ＲＩＮＨ２はよく知られているナイロジエンマスタード化合物、例えば、ｐ−フェニレンジアミンに基づく化合物の任意の１つであることができる。こうして、化合物ＲＩＮＨ２は、下記の化合物であることができる一般構造式ＩＶ　。

式中Ｒ′およびＲ′はＨ，ＦまたはＣＨ３であり、とくにＲ’　＝ＨかつＲ’＝ＣＨ，、またはＲ’＝ＣＨ３かつＲ″＝Ｈ：またはＲ’　＝ＨかつＲ’＝Ｆ、またはＲ’＝ＦかっＲ’＝Ｈ。

をもつこの化合物の類似体。

本発明に従い使用することができるアミノ細胞障害性化合物の他のタイプは、アクチノマイシンＤ１　ドキソルビシン、ダウツマインおよびマイトマイシンＣのような化合物である。アクチノマイシンＤ、ドキソルビンンおよびマイトマイシンＣから誘導されるプロドラッグの構造式は、下に、それぞれ、Ｖ、ＶｌおよびＶｌｌとして示される。

Ｖエエ同様に、ｐ−ニトロベンジルオキシ誘導体を前述のタイプの他のアクナノマイシン類および他の細胞障害性化合物のアミノ置換基においてつくることができる。

細胞障害性化合物上のアミン基においてｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体を形成することに加えて、同様な誘導体は細胞障害性化合物のヒドロキシ基、とくにフェノール系ヒドロキシ基においてつくることができる。ここで、フェノール系ナイトロジエンマスタード化合物が注目され、そしてこのタイプの本発明の特定の化合物は、式：本発明のさらなる態様では、本発明の新規な酵素が、ある種のＣＢ１９５４のニトロ基の少なくとも１つばかりでなく、かつまたＣＢ　１９５４類似体、例えば、デスカルボキシアミドＣＢ　１９５４　（ｉ−アジリジン−１−イル−２，４−ジニトロベンズアミド−ＣＢ　１８３７として知られている）およびＮ、Ｎ−ジメチルＣＢ　１９５４　［Ｎ、Ｎ−ツメチル−（５ −アジリジン−１−イル−２，４−ジニトロベンズアミド、また、ＣＢ　１０− １０７として知られている〕のニトロ基の少なくとも１つを還元することができるものとわれわれは決定した。本発明の新規な酵素は、また、他の芳香族ニトロ化合物、例えば、５−クロロ−２，４−ジニトロベンズアミド、３，５−ジニトロベンズアミド、３−ニトロベンズアミド、４−ニトロベンズアミドおよび５− ニトロ−２−フラルデヒドセミカルバゾン仲トロフラゾン）のニトロ基を還元することができる。

上述のように、本発明のニトロリダクターゼは、ＣＢ１９５４を活性抗腫瘍剤である２−ヒドロキシルアミノ−４−二トロー訃　（アジリジン−１−イル）へ変換できるので、本発明は２−ヒドロキシルアミノアシル化誘導体およびそのエステル誘導体と共に前記のような２−ヒドロキシルアミノ化合物にも関する。すなわち、本発明１は、一般式■の化合物も提供する。

式中、Ｒ３はＨｌまたは炭素原子６個まで含むアシル基もしくはヒドロカルビル基である。アシル基は、カルボキシルアンシルＲ’ＣＯを意味し、ここでＲ４は炭素原子１〜６個を含む炭化水素基、例えばアルキル、アルケニルまたはフェニル基である。

本発明は、また、一般式Ｘ式中ＸＩおよびｘｌは、同一であるか、あるいは異なることができ、各々はＮＨＯＲ’またはＮＯ，であるが、ただしｘｌおよびｘｌの両者はＮ０２ではなく、ここでＲ５はＨまたは式ＩＸに関して上に定義したカルボン酸アソルまたはヒドロカルビル基であり、そしてＹはＨまたはＣＯＮ　（ＣＨ．）！である、のヒドロキシルアミノ誘導体を提供する。２つのヒドロキシルアミノ基を含有する式Ｘの化合物において、基Ｒは同一であるか、あるいは異なることができるが、通常同一であろう。

前述したように、式■およびＩＩの本発明の新規なｐ−ニトロフェニルベンジルオキシ化合物は、それらを誘導する細胞障害性化合物ＲＩＮＨ２またはＲ２０Ｈのそれに比較して減少した細胞障害性を有し、そして本発明のニトロリダクターゼのための基質として作用することができることにおいて重要である。本発明は、その定義について、式ＩまたはＩＩの化合物へのニトロリダクターゼの作用の正確なモードに依存しないが、ｐ−ニトロフェニル−ベンジルオキシカルボニル残基のニトロ基は対応するアミノまたはヒドロキシルアミノ基に変換され、そして生ずるｐ−アミノベンノルオキシカルボニルまたはｐ−ヒドロキシルーアミノベンジルオキシカルボニル化合物は、下記の反応の概要に従い、酵素的還元に使用する反応条件下に自動的に分解して、細胞障害性化合物を解放し、そして副生物としてｐ−アミノベンジルアルコールおよび二酸化炭素を形成すると信じられる本発明のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物は、それ自体知られている化学的合成法により有利に製造される。例えば、アミンまたはヒドロキシ細胞障害性化合物を４−ニトロベンジルクロロホルメートと無水条件下に塩化水素受容体、とくにアルキルアミン、例えば、トリエチルアミンの存在下に反応させることができる。この反応は乾燥有機溶媒、例えば、クロロホルム中で実施することができ、そして生ずる式１またはＩＩの本発明の化合物を普通の方法、例えば、クロマトグラフィーにより有機溶媒から単離することができる。

本発明のＩＸおよびＸの新規な化合物は、通常、対応するジニトロ化合物に本発明の新規なニトロリダクターゼを作用させることによって製造されるであろう。

また、化学的合成により、選択的還元剤を使用し、次いで生ずるヒドロキシルアミンをその対応するエステルまたはエーテルに変換することによって、本発明のＩＸおよびＸの新規な化合物を製造することは、もちろん、可能である。エステルおよびエーテルは、半合成的に、ニトロ基の還元を本発明のニトロリダクターゼを使用して実施して対応するヒドロキシルアミンを生成し、次いでこれを既知の化学的方法により対応するエステルまたはエーテルに変換するこトニよって、いっそう有利に製造される。

本発明の新規なニトロリダクターゼを製造する最も便利な方法の１つは、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）Ｈの細胞内容物から材料を回収することである。あるいは、細菌から分離することができる、所望の酵素をエンコードする遺伝子をクローニングし、そしてクローニングした遺伝子を、適当なベクター系の中で、他の宿主細胞の中に移し、この宿主細胞からまたはその中でそれを発現することができる。

ＣＢ　１９５４およびその類似体の本発明の新規な酵素による酵素的還元を発生させるために、反応系の中にコファクターを存在させルコトが必要である。この反応を発生させる本発明の酵素の能力は、コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの使用により実験的に実証することができるが、臨床的実施におけるこのようなコファクターの使用は、とくにＮＡＤ　（Ｐ）Ｈが体の中に存在する他の酵素により酸化される容易さ、および種々の哺乳動物の酵素と非哺乳動物の酵素との間のコファクターの選択性の欠如にかんがみて問題を生ずることがある。今回、１．４−ジヒドロ−ニコチン酸のリボシドはＣＢ　１９５４およびその類似体のニトロリダクターゼの還元においてコファクターと少なくとも同じように有効でありそして、そのうえ、本発明の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）のニトロリダクターゼに対するその選択性のために、臨床的使用においていっそう適当であり、これにより後述するタイプの多成分系の中のその組み込みをとくに価値あるものとすることをわれわれは発見した。

コファクターとして本発明において使用できる１、４−ジヒドロ−ニコチン酸のリボシドは新規な化合物であり、そして本発明の一部分を形成する。それは商業的に入手可能なニコチン酸リボチドから製造することができ、これらのリボチドをまず酵素的脱リン酸化により、例えば、アルカリ性ホスファターゼを使用して対応するリボシドに変換する。このような酵素的脱リン酸化により、あるいは化学的合成により、Ｊａｒｍａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、（ｃ）　９１８ −９２０　（１９６９）に記載されている方法を使用して、得られたリボシドを、次いで、例えば、アルカリ金属ハイドロサルファイドを使用して、還元して１．４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドを生成することができる。

本発明の新規な酵素の最も重要な実際的応用の１つは、それらを抗腫瘍剤のためのプロドラッグであるニトロ化合物と関連しで使用し、こうして癌の化学療法の系を提供することができることであり、ここで細胞障害剤へ患者を暴露する程度は、プロドラッグと本発明のニトロリダクターゼとの間の相互作用が存在する領域に、出来る限り限定される。こうして、本発明の１つの面は、細胞障害性化合物のためのプロドラッグであるニトロ化合物と関連した本発明のニトロリダクターゼの共同使用を包含する化学療法の方法および化学療法の系を提供することである。

本発明の系を利用する最も便利な方法の大部分または１つは、本発明のニトロリダクターゼを、ターゲツティング因子、例えば、腫瘍関連抗原と結合するモノクローナル抗体に接合することである。

ここにおいて使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、単に伝統的なハイブリドーマ技術により生産される抗体を意味するばかりでなく、かつまた組換え手段により生産される抗体およびそれらの変異型を包含することを当業者は理解するであろう。これらは、例えば、ヒト化抗体、例えば、非ヒト抗体可変領域上にグラフトしたヒト抗体からの一定領域をもつ抗体（参照、例えば、欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０１２０　６９４号）、キメラ抗体、例えば、ヒト可変領域のフレームワークの中にグラフトした非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をもつ抗体（参照、例えば、欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０　２３９　４００号）および一本舗抗体を包含する。それらの標的結合活性を保持するこのようなモノクローナル抗体の断片は、また、「モノクローナル抗体」の一般用語に包含される。これはＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を包含する。

モノクローナル抗体の選択は標的腫瘍の性質により明瞭に影響を受けるであろうが、本発明を例示する目的で、抗ＣＥＡ抗体Ａ　ｓ　Ｂ　ｖについて言及することができる。

モノクローナル抗体の使用に対する別法として、また、本発明のニトロリダクターゼをコンジュゲートする他のターゲツティング因子を使用できることが考えられる。例えば、ある種の可溶性高分子をある種の腫瘍のタイプの受動的腫瘍ターゲツティングのために使用できることが知られている。多数の充実腫瘍は、高分子に対して超透過性である脈管構造を有する。この理由は明瞭には理解されないが、このような腫瘍が循環する高分子を選択的に蓄積することができる結果である。透過性の増大および保持作用（ＥＰＲ作用）は、現在日本においてへパトーマの処置のために正規の臨床使用において、ＳＭＡＮＣ３（スチレン／無水マレイン酸−ネオカルジノスフチン）の作用のメカニズムを構成すると考えられる。

抗癌剤の活性について研究されている結合体の他のクラスは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー−アントラサイクリン結合体である（Ｌ、Ｓｅｙｍｏｕｒ、治療用薬物の担体系における批評的概観（Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）Ｓ９　（２）１３５−１８７　（１９９２）　）。こうして、スチレン／無水マレイン酸またはＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマーを包含するポリマー、および本発明のニトロリダクターゼの結合体を、モノクローナル抗体および酵素の結合体の代わりに使用することができる。

この系を使用して、癌の化学療法の過程において、処置を必要とする患者に、細胞障害性化合物のためのプロドラッグであるニトロ化合物および酵素／ターゲツティング因子の結合体を投与することがもちろん可能である。プロドラッグおよび結合体を同時に投与することができるが、臨床的実施において、酵素／ターゲツティング因子の結合体をプロドラッグの前に、例えば、７２時間前までに投与して、腫瘍標的の領域の中に局在化する機会を酵素／ターゲツティング因子の結合体に与えることがしばしば好ましいことが発見された。この方法で操作することによって、プロドラッグを投与するとき、酵素／ターゲツティング因子の結合体を局在化する領域、すなわち、標的腫瘍および細胞障害性因子の早期の解放により引き起こされる健康な細胞への損傷を量小とする領域に、プロドラッグの細胞障害性因子への変換は制限される傾向がある。

酵素／ターゲツティング因子の結合体の局在化の程度（自由に循環する活性結合体に対して局在化される比に関係して）は、ＷＯ３９／１０１４０号に記載されているクリアランスおよび／または不活性化系を使用してさらに増大させることができる。これは、通常結合体の投与後かつプロドラッグの投与前に、結合体のこのような部分に結合できる成分「第２成分」）を投与して、酵素を不活性化しおよび／または血液からの結合体のクリアランスを加速することを包含する。このような成分は、酵素を不活性化することができる本発明のニトロリダクターゼに対して抗体を包含することができる。

第２成分は、高分子、例えば、デキストラン、リポソーム、アルブミ　・ン、マクログロブリンまたは血液型Ｏの赤血球に結合させて、第２成分が脈管の隔室を去るのを拘束することができる。さらに、あるいは別法として、第２成分は十分な数の共有結合したガラクトース残基、または他の糖類、例えば、ラクトースまたはマンノースを含み、こうしてそれが血漿中の結合体に結合することができるが、肝臓の中のガラクトースまたは他の糖類のだめのレセプターにより結合体と一緒に血漿から除去できるようにすることができる。第２成分は、いかなる感知し得る程度にも、プロドラッグの投与の前にまたは間に局在化した結合体を不活性化することができる腫瘍の脈管外の空間に入られないように、投与しかつデザインすべきである。

正確な投与の方法は、もちろん、個々の患者について個々の臨床医により決定される必要がありそしてこれは、引き続いて、プロドラッグの正確な性質およびプロドラッグから解放すべき細胞障害性因子によりコントロールされるであろうが、多少の一般的指針を与えることができる。

このタイプの化学療法は、通常、プロドラ、グおよび酵素／ターゲツティング因子の結合体の両者の非経口的投与を包含し、そして静脈内ルートによる投与はしばしば最も実際的であることがわかる。

本発明の酵素を使用する方法を考慮にいれて、本発明は、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤、通常非経口的投与に適当なものと関連して、酵素、好ましくはターゲツティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した酵素からなる薬剤組成物を包含する。

本発明は、また、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤、通常非経口的投与に適当なものと関連して、１種または２種以上の式Ｉ、式ＩＩ、式Ｖ、式ＶＩまたは式ＶＩＩの本発明のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物からなる薬剤組成物を包含する。

本発明は、さらに、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤、通常非経口的投与に適当なものと関連して、式ＩＸまたは式Ｘの本発明のヒドロキシルアミノ抗腫瘍剤からなる薬剤組成物を包含する。

本発明は、また、抗腫瘍剤のためのプロドラッグである式■、ＩＩ、■、Ｖ［たはＶＩＴの少なくとも１種のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物および好ましくは酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボシドまたはリボチドと関連して、本発明のニトロリダクターゼ、好ましくはターゲツティング因子・例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明のニトロリダクターゼからなる、ヒトまたは動物の被検体における新形成の抑制において使用するだめの系を提供する。本発明は、有効量の抗腫瘍剤のためのプロドラッグである式［１１、Ｖ、ＶＩまたハＶＩ■のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物および本発明の酵素、好ましくはターゲツティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明の酵素を、処理を必要とするヒトまたは動物の宿主に投与することからなる、このような宿主において新形成を処置する方法を包含し、ここで前記酵素は好ましくは前記酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボチドまたはリボシドと関連して使用する。

本発明は、さらに、式ＩＸまたはＸの抗腫瘍剤のためのプロドラッグであるニトロ化合物および好ましくは酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボシドまたはリボチドと関連して、本発明のニトロリダクターゼ、好ましくはターゲツティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明のニトロリダクターゼからなる、ヒトまたは動物の被検体における新形成の抑制において使用するための系を提供する。本発明は、また、有効量の式ＩＸまたはＸの抗腫瘍剤のためのプロドラッグであるニトロ化合物およびおよび本発明の酵素、好ましくはターゲツティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明の酵素を、処理を必要とするヒトまたは動物の宿主に投与することからなる、このような宿主において新形成を処置する方法を提供し、ここで前記酵素は好ましくは前記酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボチドまたはリボシドと関連して使用する。

前述の新形成の処置において使用するための種々の系は、必要に応じて、前述のクリアランスを加速するための「第２成分」を含む。同様に、前述の新形成を処置する方法は、必要に応じて、その方法の一部分として、自由に循環する酵素に対して局在化する比を増加するために、第２成分の使用を包含し、その有効量を酵素の投与後に投与する。第２成分のそれ以上の特定の詳細はＷＯ３９／１０１４０号を参照することができ、そしてこのような詳細は本発明における使用のために加えることができる。

下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例工大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）　Ｂからのニトロリダクターゼ酵素の分離および精製２００ｇの大腸菌（Ｅ、ｃｏ］　ｉ）Ｂ細胞のぺ一’ｘトを、合計の体積１リツトルの０．３Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，０に再懸濁させた。細胞をＭＳＥソニブレプ（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ）１５０崩壊装置により超音波で破壊した（全電力で３×３０秒、６０秒の間隔で熱を消散させた）。抽出液の清浄化を促進するために、ＤＮアーゼ（２３，０００クニツツ（Ｋｕｎ　ｉ　ｔ　ｚ）単位／１）およびＲＮアーゼ（２４，０００クニツッ単位／１）を添加した後、８．０００ｇで３０分間遠心して細胞破片を除去した。

透明な黄色がかった上澄み液をクロマトグラフィーの前に０．４５μｍのフィルターに通過させた。

０．３Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７中のフェニル−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−５Ｂ（フフルマンア（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ））のカラム（２５Ｘ５ｃｍ）に、濾過した抽出液を適用した。２力ラム体積の出発緩衝液で洗浄した後、カラムをｌＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７，６で溶離した。活性の画分をプールし、そして２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６に対して１８時間透析して硫酸アンモニウムを除去した。透析した両分を５０ｍ１のアリコートて、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６の中のＱ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）−高性能に、４　ｍ　ｌ　／分の流速で適用した。溶離は０．５ＭのＫＣＩの勾配で実施し、ニトロリダクターゼは０．１〜０．１２Ｍ（７）ＫＣｌで溶出した。活性の両分をプールし、そしてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５媒質のカラム（３２ｘ６ｃｍ）を使用して２０ｍＭ　Ｂｉｓ　ＴｒｉｓプロパンｐＨ７の中に脱塩した。

これらの画分を、２０ｍＭ　Ｂｉｓ　ＴｒｉｓプロパンｐＨ７の中で平衡化したＱ−セファローズー高性能（ハイ−ロード（Ｈ４−Ｌｏａｄ）カラム２６／１０カラム、７フルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に適用した。溶離は０〜Ｏ，ＩＭの勾配のＫＣＩにより実施した。ニトロリダクターゼは０．０７〜０．０９ＭのＫＣＩにおいて最初の主要なピークとして溶出した。

最終生成物の均質性は、天然ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ファルマシア・ファストシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ）のための前辺てキャストした８〜２５％の勾配のゲルを使用して確認された。電気泳動は７５ｖｈの間実施した。

粗製の両分および部分的に精製した画分の中のニトロリダクターゼは、基質としてメナジオン、コファクターとしてＮＡＤＨおよび末端の電子アクセプターとしてシトクロムＣを使用して、そのキノンリダクターゼ活性により日常的にアッセイした。

等電点の決定ニトロリダクターゼの等電点は、等電点電気泳動（フフルマンア・ファストシステム、４００ｖｈの間のフォーカシング）およびモノ（Ｍ。

ｎｏ）Ｐカラム（ファルマソア・モノ（Ｐｈａｒｍａｃｉｓ　Ｍｏｎｏ）Ｐ　ＨＲ５／２０．２０ｍＭ　Ｂ１５−Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，３およびポリ緩衝液７４、ｐＨ４，０）を使用するクロマトフオーカシングにより決定した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼは、２５ｋＤａの分子量をもつ純粋なタンパク質として分離された（ポリアクリルアミドゲルの電気泳動およびゲル濾過クロマトグラフィーの両者により決定して）。

キノンリダクターゼ活性をもつが、ＣＢ　１９５４に対してニトロリダクターゼとして不活性である第２タンパク質は、フェニルセファ０−ズから部分的に同時に溶出し、モしてＱ−セファローズ高性能上のイオン交換クロマトグラフィーの工程（表１参照）によりｐＨ７，６において活性酵素から完全に分離された。２つの酵素は分子量（不活性５５ｋＤａ、活性２４ｋＤａ）および等電点（不活性５．２：活性５．１）において異なった。活性タンパク質は黄色であり、フラビン補酵素の存在を示唆する。７０℃に２０分間加熱した後、このフラビンは限外濾過によりアポ酵素から分離することができそして、ＨＰＬＣを使用して、ＦＡＤよりむしろＦＭＮであることが示された。

この酵素を臭化シアンで消化することによって、配列分析に適当な断片を製造した。これらの消化物から生ずるペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより、ＲＰ３００カラム（２５Ｘ４．６ｍｍ）（ブラウンリー（Ｂｒ。

ｗｎｌｅｅ））および各溶媒中に００６にのトリフルオロ酢酸助剤を含む水中の１０〜６０％のアセトニトリルの溶媒の勾配を使用して精製した。自動化エドマン分解法によりアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７０Ａ気相タンパク質配列決定装置（ケルビン・クロース（Ｋｅｌｖｉｎ　Ｃ１ｏｓｅ）、英国ワーリントン）を使用して、配列の分析を実施した。

ニトロリダクターゼのアミノ酸配列の分析上で分離された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼをアミノ酸配列の分析にかけた。ウォーカー（Ｗａ　］　ｋ　ｅ　ｒ）腫瘍から分離された酵素ＥＣ，１，６，９９，２と対照的に、本発明のニトロリダクターゼはＮ−末端においてブロックされず、モして３１アミノ酸残基の明瞭なＮ−末端配列および、臭化シアンを使用する消化により発生した、それ以上の４１残基のペプチドを与えた。これらの部分的配列を表２に記載する。

轟−ｌ大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）　Ｂのニトロリダクターゼを臭化シアンで消化した後得られたニトロリダクターゼのＮ−末端およびペプチドのアミノ酸配列（肉太のタイプ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からのニトロリダクターゼの推定されたタンパク質配列（渡辺ら、１９９０）との比較ニトロリダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼ遺伝子をクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を両者の鎮のジデオキシ配列分析により決定した。ニトロリダクターゼをエンコードする６５１ヌクレオチドのオーブンリーディングフレームを含有する１１６７塩基のＮｒｕＩ／Ｐｓｔ断片のヌクレオチド配列を表３に示す。シャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）の推定上の配列および転写停止シグナルを示す。

！！３ＧＡＡＧＡＴＴＴＡＧＣＧＧＧＴＡＴＴＧＡＧＡＴＣにＡＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＣＧＡＴＧＧＴにＡＴＧＡＴＴＴＴＣＧＧＴＡＴＴ　１０Q０実施例２ＣＢ　１９５４　（１００μＭそしてまた１、６Ｘ１０’ｄｐｍ／ｎｍｏ１で［Ｕ−３Ｈ］ＣＢ　１９５４を含有する）　、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ（５００μＭ）を、実施例１に記載するよう、にして得られた活性酵素（一般に２ μｇ／ｍｌの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼまたは３５　ｔｔ　ｇ／ｍ　］のウォーカー（Ｗａ　ｌ　ｋ　ｅ　ｒ）　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）ＥＣ，１，６，９９，２）と１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で空気またはヘリウム下に７ｚ７−　（Ｐａｒｔ　１ｓｐｈｅｒｅ）ＳＣＸ　（１１０Ｘ４．７ｍｍ））（ＰＬＣカラム上に注入し、そして１００ｍＭのＮａＨｚＰＯ４で無勾配的に（２ｍｌ／分）溶離した。

溶出液を３１０．２６０および３６０μｍにおける吸収について連続的にモニターし、そして溶離する成分のスペクトルをダイオード−アレイ（ｄｉ○ｄｅ−ａｒｒａｙ）検出器を使用して記録した。試料（０，５ｍ１）を集め、そして各々のトリチウム活性を液体シンチレーション計数により決定した。この分離系はすべての期待された還元生成物を分割することができた。

還元生成物の同一性をさらに確証するために、上の還元混合物を、また、○ＤＳ −５逆相ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中のメタノール勾配（３０分かけて０〜３０％の直線、１０分かけて３０〜１００％の直線）て溶離（１ｍｌ／分）した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼによるＣＢ　１９５４の還元は２つの生成物を形成し、これらは既知の標準との保持時間およびスペクトルの特性の比較により、５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２− ニトロベンズアミドおよび５−（アジリジン−１−イル）−２−ヒドロキシルアミノ−４−ニトロベンズアミドであることが示された。他のＣＢ　１９５４の代謝物質は発見されなかった。本発明のニトロリダクターゼによる前記２つおよび４−ヒドロキシルアミンの両者の形成のそれ以上の確証において、６７μＭのＣＢ　１９５４をニトロリダクターゼにより還元したとき、３３μＭの４−ヒドロキシルアミンが生成した。対照的に、ウォーカー（Ｗａ　ｌ　ｋ　ｅ　ｒ）による５０μＭのＣＢ　１９５４のデヒドロゲナーゼ（キノン）の還元により、５０ μＭの４−ヒドロキシルアミンが生成した。４−ヒドロキシルアミン生成ニトロリダクターゼの初期速度に基づいて、使用した標準的条件下に、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）より３１．２倍の活性７ｍｇタンパク質（またはＣＢ　１９５４還元により６２倍の活性）である。

コファクターがＮＡＤＨまたはＮＡＤ　（Ｐ）Ｈであったときおよび還元をヘリウム下に実施したとき、ＣＢ　１９５４の還元または生成物の生成の速度は同一であった。

ニトロリダクターゼが細胞障害仕種を生産していることを示すために、ＣＢ　１９５４に対して不感受性であるＶ７９細胞の存在下にＣＢ１９５４の還元を実施した。表４に示すように、劇的な細胞障害性作用がハムスターＶ７９細胞において観察されたーしかしニトロリダクターゼがＣＢ　１９５４を還元する条件下においてのみであった。

嚢−互種々のニトロベンズアミドおよびニトロベンゼンを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼ酵素で還元する相対的速度。ＮＡＤＨの生ずる酸化により還元速度を決定した。

すべての反応は、３７℃において空気中で、電子ドナーとしてＮＡＤＨ（５００ μＭ）を使用して、１００μＭの初期基質濃度で実施した。

ＣＢ　１９５４　１．０３．５−ンニトロペンズアミド　７５．５２−ニトロベンズアミド　０・０６２．４−ジニトロフェノール　＜０．０１実施例４酵素の反応速度論および阻害の研究分光光度測定法により基質としてメナジオンおよび末端の電子アクセプターとしてシトクロムＣを使用して、Ｋｎｏｘら、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｐｈａｒｍａｃ、３ヱ、４６７１−４６７７．１９８８に記載されているように、キノンリダクターゼ活性をアッセイした。線型回帰分析（ｒ＞０．９９５）およびＲＱｂｅｒｔｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃ、１旦、４１３７−４１４３．１９８９に記載されているように、生ずるプロットから決定された反応速度論のパラメーターにより、初期の反応速度を決定した。ラン血清アルブミンに対して目盛り定めされた普通のタンパク質アッセイ（パイオーラド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ）　）を使用して、タンパク質濃度を決定した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼおよびウォーカー（ＷａＩ　ｋｅ　ｒ）ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ，デヒドロゲナーゼ（キノン）　ＥＣ，１，６゜９９．２についての反応速度論のパラメーターを表６に記載する。両者の酵素はＣＢ　１９５４について匹敵するＫｍを有するが、ＮＡＤＨについてのニトロリダクターゼのＫｍはウォーカー（Ｗａ　Ｉ　ｋ　ｅ　ｒ）酵素より約１０倍小さい。２つの酵素によるＣＢ　１９５４の絶対速度（すなわち、飽和条件下の）はそれらのに１．１値であり、そしてこれは大腸Ｔｍ　（Ｅ、ｃｏ　ｌ　Ｄニトロリダクターゼについてより９０倍高い。メナジオンは、また、それぞれのｋえ、がほとんど異ならない両者の酵素のための基質であったが、この基質についてのニトロリダクターゼのＫｍは６０倍高かった。

ジクマロールはニトロリダクターゼのインヒビターであった。ＮＡＤＨに関して反応速度論のパラメーターを測定しなかった。メナジオンに関すると、ジクマロールは１．９０±０．３８μＭのＫｉをもつ非競合的インヒビターであった。

表６大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼおよびウォーカー（Ｗａ　Ｉ　ｋｅ　ｒ）ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）についての反応速度論パラメーター化合物　ニトロリダクターゼ　クオーカ−１（、、４，２ｘｌＯ’ｍｉｎ”　６．５ｘｌＯ’ｍ１ｎ−１実施例５ＣＢ　１９５４以外の化合物を細胞障害仕種に対して活性化する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼの能力表７に示すように、大きい細胞障害性作用はヒｈＭＡＷＩ細胞においてプロドラッグＣＢ　１８３７およびＣＢ　１０−１０７により観察されたが、それはプロドラッグがニトロリダクターゼ酵素により還元される条件下においてのみてあった。

表７ＭＡＷＩ細胞の生存率への酵素活性化プロドラッグの作用。

１ｍｌの体積のＭＡＷＩ細胞（２Ｘ１０’／ｍｌ）を５０μＭのプロドラッグ、５００μＭのＮＡＤＨ，および１０μｇ／ｍ１の実施例１の酵素とインキュベーションした。

３７℃において２時間インキュベーションした後、細胞を収獲し、そしてそれらのコロニー形成能力についてアッセイし、そして上澄み液を残留するプロドラッグの濃度についてＨＰＬＣによりアッセイした。

＋　５００μＭ　ＮＡＤＨ１００− ＋　５０μＭ　ＣＢ　１８３７　９７．４　（１，０↓　ＮＡＤＨ＋　ＣＢ　１８１７　９７．４　＜１・０＋　５０４１８　ＣＢ　１０−１０７　８５．６　＜１・０＋　ＮＡＤＨ＋　ＣＢ　１ｏ（０７’　８７．９　＜１．０＋　ＮＲ＋　ＣＢ　：ＬＢココア＋５００４１Ｍ　ＮＡＤＨ１，５６＞９５十　ドＲ＋　ＣＢ　１０−４０’７　＋　ＮＡＤＨ５，０４５実施例６（ｉ）ニコチン酸リボチドからのニコチン酸リボシドの製造水性緩衝液（トリスｌｏｏｍＭ；ｐＨ８，５；ＭｇＣ１ｚ　；２．５ｍ１）中のニコチン酸リボチドにコチン酸モノヌクレオチド）（シグマ（Ｓｉ　ｇｍａ）　、英国ブーレ）（２５ｍｇ）の溶液を、２０００単位のアルカリ性ホスファターゼ、Ｖｌｌ−３型（１００μｍ；２０，０００単位／ｍ１）（シグマ）で３７°Ｃにおいて１時間処理した。アルカリ性ホスファターゼを消化物から遠心分子濾過（１０，０００の分子量限界；「セントリコン（Ｃｅｎｔ　ｒ　ｉ　ｃａｎ）ＩＯＪ　：アミコン（ＡｍｉｃＯｎ）、英国ハイワイコンペ）により分離した。この溶液の希釈物を、アルカリ性ホスファターゼによる消化の前および後に、アニオン交換高性能液体クロマドグ）フィー（バーチスフェア−（Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ）５−３ＳＡＸカラム、０．１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５で無勾配的に溶離した、１．５ｍｌ／分、１０μｌの注入体積、２６０ｎｍ１．：おける紫外線吸収によりモニターした）により分析した。親化合物は１１８分の保持時間で溶出した。消化後の実験において、完全な変換が起こって、０．６３分の保持時間で溶出する新規な表題化合物が生成し、脱リン酸化の指示とすると、リボシドが生ずることが示された。

（１１）ニコチン酸リポノドの１，４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドへの還元ＪａｒｍａｎおよびＳｅａ　ｒ　Ｉ　ｅ　（１９７２）の方法を採用した。この方法を上で製造したニコチン酸リボシドおよび、また、化学的に合成した物質の両者に適用した（Ｊａｒｍａｎ　１９６９）。両者の由来源からの出発化合物を使用して同一の結果が得られた。

ニコチン酸リボシドの水溶液（５ｍｌ　；　４ｍｇ／ｍｌ）に、５０ｍｇの炭酸ナトリウム、５０ｍｇの重炭酸ナトリウム、および５０ｍｇの亜硫酸水素ナトリウムを添加した。栓をした溶液を３７℃において１時間インキュベーションし、そして還元生成物を調製用逆相ＨＰＬＣにより分離した。５ｍｌをマイクロソープ（ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）５ｕｍ　Ｃ１８（１０Ｘ２５０ｍｍ）逆相カラム（ライニン（Ｒａｉｎｉｎ））上に注入し、そしＴ１０ｍＭ　ＮＨ４ＣＨｓＣＯＯによりｐＨ５に緩衝化した水中のメタノールの勾配（０〜１００％、３０分かけて）により溶離した。溶出液を紫外線吸収および蛍光の両者により連続的にモニターし、そして還元生成物（１２〜１３分の保持時間における基線の分割を使用するクロマトグラフィー）を、３２６ｎｍにおけるその吸収最大（ｐＨ５において；　ｐＨ７において３４０ｎｍ）およびその蛍光（ジルソン（Ｇｉ　Ｉ　５ｏｎ）１２１フルオロメーター、帯域ガラスフィルターを装備した：３５０ｎｍにおける励起中心；４５０ｎｍにおいて放射）の両者により特性決定し、それらの性質のいずれも親化合物を表示しなかった。２ｍＭの溶液の４ｍｌの溶出液（６２００のε６４゜（すなわち、ＮＡＤＨと同一）を仮定する）は典型的であり、２．７ｍｇ、すなわち、はぼ１３％の収率を示した。実験の使用前に、調製物を分析用ＨＰＬＣにより分析しそして本質的に純粋であることが確証された。

（ｉ）Ｍ、ＪａｒｍａｎおよびＦ、５ｅａｒｌｅ、潜在的な補酵素のインヒビター−ＶＳＢｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｖｏｌ。

２１、ｐｐ、４５５−４６４．１９７２゜（ｉ　ｉ）Ｍ、Ｊａｒｍａｎ、４−置換ニコチン酸およびニコチンアミド。第１１１部。４−メチルニコチン酸リボシドの製造。Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（ＣＬ　９１８−９２０．１９６９゜実施例７大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼのためのコファクターとして作用する１、４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドの能力ＣＢ　１９５４の還元のためにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの代わりに合成コファクターを使用するできるニトロリダクターゼ酵素の能力を、第１図に示す。ニトロリダクターゼ酵素は、ＣＢ　１９５４の還元のためのコファクターとして等しい効能をもつ１，４−ジヒドロ −ニコチン酸リボシドおよびＮＡＤＨの両者を使用することができる。対照的に、ウォーカー（Ｗａ　Ｉ　ｋ　ｅ　ｒ）　ＤＴジアホラーゼはこの合成コファクターを利用することができない。したがって、１．４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼ酵素のための選択的コファクターであり、そして哺乳動物のＤＴジアホラーゼにより使用されることができない。

以下の実施例において、「シリカゲル」は、メルク（Ｍｅｒｃｋ）シリカゲル６０．７０〜２３０メンツユを意味し、そしてプロトンＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ２中で３００ＭＨｚにおいて得た。

実施例８４−［ビス（２−クロロエチル）アミノコフェニルカルバミン酸４′−ニトロベンジルエステル乾燥ＣＨＣｌ３　（５ｍｌ）中の４−ニトロペンジルク口口ホルメート（２９５ｍｇ）の撹拌した溶液に、乾燥ＣＨＣＩ３（５ｍｌ）中の４−［ビス（２−クロロエチル）アミノコアニリン塩酸塩（３６７ｍｇおよびＮＥｔｓ（３７７μｍ）の溶液を５分がけて添加した。１時間後、この溶液を２０℃に１８時間保持し、次いで蒸発させた。残留物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけＣＨＣＩｇで溶離すると、標題生成物が黄色固体として得られ、これをベンゼン／石油エーテルがらプリズムとして再結晶化した、融点１１１−１１２’。収量、３６１ｇｍ（６４％）。ＣＨ，を使用する化学的イオン化質量スペクトル：ｍ／ｚ４１２におけるイオン（Ｍ＋１、相対強度１００）はＭ＝４１１を示ス。Ｃｌ８Ｈ＋＋＋ＮｘＣＬＣ１２はＭ＝４１１　（ＣＩ”アイソト　７’につぃ７）　を必Ｗとする。

４−［ビス（２−クロロエチル）アミノコフェニル４′−二トロペンジルカーボネート乾燥ＣＨＣｌ３　（１，５ｍ１）中の４−ニトロペンジルク口口ホルメート（５８ｍｇ）の溶液を、乾燥ＣＨＣｌ５　（２ｍｌ）中の４−［ビス（２−クロロエチル）アミノコフェノール塩酸塩（７２ｍｇ）およびＮＥｔ３（７４μｍ）の撹拌した水冷溶液に添加した。２１°において１８時間後、この溶液を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、ＣＨＣｌ！／石油エーテル（３２）で溶離すると、標題化合物が得られ、これはＥＴＯＡｃ／石油エーテルがら淡黄色プリズムとして結晶化した、融点７７−７９°（収量、１０２ｍｇ）、ＦＡＢ　ＭＳ：ｍ／ｚ４１３におけるイオンはＭ＝４１２を示す（Ｃ＋ａＨ＋５ＮｔＯｓＣ１＊はＭ＝４１２を必要とする）。

Ｎ）ＯＬ　（ＣＤＣ１，）：　ｌ　コ、６２　（ｍ、ＮＣＨ，ｏｒ　ＣＩＣＭ、）、３．６９　（ｍ、ＮＣＩ（、またはＣＩＣＭ、）。

５−３３（ｓ、　ＡｒＣＨ２）、　６．６４　（ｄ、　ＡｒＨ）、　７．０５　（ｄ、　ＡｒＨ）、　７．５９　（ｄ、計Ｈ１および８．２５　（ｄ、ＡｒＨｌ − ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のアクチノマイシンＤ　（ＡＭＤ、、４１ｍｇ）を１０％Ｐｄ／Ｃの存在下に２時間水素（ヒし、次いで真空蒸発させた。窒ジルクロロホルメートの溶液中に溶解し、そしてＣＨＣｌ５　（１，５ｍ１）中のＮＥｔｓ（１０μｌ）の溶液を添加した。窒素雰囲気下に２４時間撹拌した後、触媒を濾過し、そしてこの溶液をＭｅＯＨ（２００ｍｌ）で希釈した後、３日間通気した。

この溶液を蒸発させ、そして生成物をか広Ｈ１０中の５０〜１００％のＭｅＣＮの勾配で溶離してＡＭＤを除去した。標題化合物は酢酸エチル／石油エーテルから赤色プリズムとして結晶化した。収量、３１ｍｇ（６６％）、電子噴射質量スペクトル：ｍ／ｚ１４３４．５　（Ｍ＋Ｈ）および１４５６．４　（Ｍ十Ｎａ）におけるイオンはＭ＝１４３．５を示す。Ｃ７゜Ｈ，、Ｎ、３０２゜（最低の質量のアイソトープ）はＭ＝１４３３．６５を必要とする。ＮＭＲはＡＭＤと同一の信号子δ６．７１　（ｄ、ＩＨ，ＡｒＣＨ３）　、７．０９　（ｄ、　ＩＨ。

ＡｒＣＨｓ）および芳香族領域において追加の信号を示す。

実施例１１Ｎ−４−二トロペンジルオキシカルポニルードキソルビシンＶｌキンルビシン塩酸塩（２，２５ｍｇ）を、トリエチルアミン（ＮＥｔｓ）を含有するジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０，３ｍ１）中に溶解し、そしてＤＭＦ　（０，１ｍ１）中の４−ニトロベンジル−４′−二トロフェニルカーポネート（１，４ｍ１）を添加した。暗所で３日間撹拌した後、この混合物をＣＩｌ逆相シリカのカラム（直径１ｃｍ）上のＨＰＬＣにかけ、０．０１Ｍのギ酸塩緩衝液（ｐＨ４，０）中の２５〜１００％のＭｅＣＮの勾配で溶離することによって分離した。主要な赤色画分を濃縮し、モしてギ酸塩緩衝液の代わりにＨ，Ｏで再クロマトグラフィーにかけた。

真空蒸発させると、生成物（２，１ｍｇ）が非晶質赤色粉末として得られた。電子噴射ＭＳ　：　７２３　（Ｍ＋Ｈ）におけるイオンはＭ＝７２２を示す。Ｃｓ５Ｈｓ４ＮｘＯ＋ｓＭ＝７２２を必要とする。

ＮＥｔｓ（１４μｍ）を含有するジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２ｍｌ）中のマイトマイシンＣ（３６ｍｇ）の溶液を４−ニトロベンジルクロロポルメート（３０ｍｇ）に添加し、そしてこの混合物を２１０において４時間撹拌した。真空蒸発後、残留物をシリカゲルのカラムのクロマトグラフィーにかけ、ＥｔＯＡｃで溶離すると、標題化合物が暗色赤色固体（４９ｍｇ）として得られた。電子噴射ＭＳ：５１４（Ｍ＋Ｈ）におけるイオンはＭ＝５１３を示す。Ｃｘ５ＨｎＮｓＯ＊Ｍ＝５１３を必要とする。

Ｖ（１００μＭ）およびコファクター（５００μＭのＮＡＤＨ）を、酵素（２μ ｇ／ｍ１の実施例１の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼ）とｌＱｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で空気下に３７℃においてインキュベーションした。種々の時間において、アリコート（２０μｌ）をマイクロンーブ（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）Ｃ，、逆相（２４０Ｘ４．７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして水中の８０％アセトニトリルで無勾配的（１ｍｌ／分）に溶離した。溶出液を２８０μｍにおける吸収について連続的にモニターし、そしてＨＰＬＣの形跡上のこの化合物に相当するピークの積分により薬物の濃度を計算した。

酵素が存在するときにのみ、アクチノマイシンＤはプロドラッグから解放された。

実施例１の大腸菌（Ｅ、ｃｏ　］　ｉ）Ｂニトロリダクターゼとのインキュベーションの間における、プロドラッグＮ−４−二トローペンシルオキシ力ルポニルーアクチノマインンＤ　（Ｖ）の消失およびアクチノマインンＤの形成を第２図に示す。

プロドラッグＶＩＩ（１００μＭ）およびコファクター（５００μＭのＮＡＤＨ）を酵素（ＥＢｚｇ／ｍｌの実施例１の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼ）と、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中の空気下に３７℃ においてインキュベーションした。種々の時間において、アリコート（１０μｍ）をバーチシスフェアーＣ１８逆相（１５０Ｘ４．７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入シ、ソシテ水中ノ５０％メタノールで無勾配的（２，０ｍ　ｌ　／分）に溶離した。溶出液を２６０および３４０μｍにおける吸収について連続的にモニターし、そしてＨＰＬＣの形跡上のこの化合物に相当するピークの積分により薬物の濃度を計算した。

このインキュベーションの間のプロドラッグＶＩＩの消失およびマイトマイシンＣの形成を第３図に示す。酵素のの存在下においてのみ、マイトマイシンＣはプロドラッグから解放された。

プロドラッグ４−［ビス（２−クロロエチル）アミン］フェニルカルバミン酸４ ′−二トロペンジルエステルＩ（ＩここでＲＩＮＨ２＝Ｉ　Ｉ　Ｉ）およびＮ− ４−ニトロペンジルオキシー力ルポニルーアクチノマインンＤ　（Ｖ）への実施例１の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼの作用による細胞障害性の発生を表８に示す。

表８Ｖ７９細胞の生存率への酵素活性化プロドラッグの作用。

１ｍｌの体積のＶ７９細胞（２Ｘ１０’／ｍｌ）を、プロドラッグ、５００　μ Ｍ（７）ＮＡＤＨ，および１０μｇ／ｍｌの酵素とインキュベーションした。３７℃において２時間インキュベーションした後、細胞を収獲し、それらのコロニー形成能力についてアッセイし、そして上澄み液を残留するプロドラッグの濃度についてＨＰＬＣによりアッセイした。

＋　５００μＭ　ＮＡＤＨ１００＋　５０ｕＭ　（工　こ夕で　Ｒ’ＮＨ２＝エエエ）　２７．１　く１．０＋　ＮＲ＋５０μＭ　（工　ココテＲ１ＮＨ２＝ｘｘＸ）＋５００μＭ　ＮＡＤＨ、Ｏ，ＯＯｌ　コ〇＋　１μＭＶ　９８ｊ　＜１０＋　１０μＨＶ　：１９．：ｌ　＜１．０＋　ＮＲ＋　ｌμＭＶ＋５００　ｐＨＮＡＤＨ２７，４９０，５十神＋１０μｌ（Ｖ＋ｓｏｏ４１ＭＮＡＤＨ、Ｏ，０Ｏ０１９３＋　ＮＲ＋　ＣＢ　１０−１０７　＋　ＮＡＤＨ５，０４５実施例１６ヘテロ２官能性剤のスクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）を使用して活性マレイミド基を免疫グロブリンの中に挿入し、モして２−メルカプト−［Ｓ−アセチル］酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＡＴＡ）を使用して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼをチオレート化することによって、Ａ３７Ｂ７　Ｆ（ａｂ）ｚの抗体：酵素結合体：ニトロリダクターゼを製造した。タンパク質を混合すると、マレイミド基はチールと反応してチオエーテル結合を形成した。使用したＳＭＰＢ　：免疫グロブリンのモル比は１ｏ：１であり、モして５ＡＴＡ　：ニトロリダクターゼのモル比は４：１であった。こうして製造された抗体：酵素結合体を、高分子量の凝集体および結合しない成分から、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２００の目盛り定めしたカラム（１６Ｘ７００ｍｍ）を使用する濾過クロマトグラフィーにより単離した。このカラムをリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で平衡化し、そして同一緩衝液で１．０ｍｌ／分の流速において溶離した。

分子量が２，１および１．１結合体（それぞれ、３１６ｋＤａおよび２３３ｋＤａ）に相当する物質を含有する両分をプールし、そして同一カラム上の再クロマトグラフィーにかけ、そしてプールした画分がらの試料を非還元性条件下に目盛り定めタンパク質と一緒に４〜１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ファーマノア・ファストゲル、６０ｖｈの間の展開）上で展開した。結合体は分子量１２５ｋＤａの物質（１：１のＦ（ａｂ’）２：ニトロリダクターゼおよびより高い分子量の結合体ならびに少量の遊離のＦ（ａｂ’）２およびニトロリダクターゼに相当する）として存在した。

この結合体の酵素活性は、基質としてＣＢ１９５４を使用する日常的アッセイにより確立された。この結合体は１μｇ／ｍ１ｃＥＡで被覆したプレートに結合し、そしてウサギ抗マウス免疫グロブリンおよびウサギ抗二トロリダクターゼ二次抗体の両者のための結合部位を含有することが示された（第４図）。結合しなかったＦ（ａｂ’）ｚおよびニトロリダクターゼの試料を使用して、二次抗体の結合の特異性を確証した。

標準のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）比色ＥＬＩＳＡアッセイを使用して抗体の結合を決定し、結果を４０５ｎｍにおいて読んだ。第４図上の倒立白抜き三角形は、結合したＡ３７Ｂ７Ｆ　（ａｂ’）２−ニトロリダクターゼ結合体をヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体で検出できることを示し、そして閉じた閉じた三角形は結合体が、また、ウサギ抗ＮＲ抗体により検出されることを示す（抗ＮＲ抗体はヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体の使用を介して検出される。第４図に示す対照は次の通りである　閉じた円＝接合しなかったＡ３７Ｂ７Ｆ　（ａｂ’）２の結合、白抜きの正方形＝ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンで検出されたＡ３７Ｂ７Ｆ　（ａｂ′）２　ＮＲ結合体、閉じた正方形＝ウサキ抗ＮＲでのみ検出されたＮＲ，白抜きの三角形＝ヤギ抗マウス免疫グロブリンでのみ検出されたＮＲｏ弐■のアクチノマイノンＤプロドラッグ（ＡＭＤＰＤ）をマウスにおいて毒性について試験した。３匹のマウスのグループに、１．１０または１００ｍｇ／ｋｇ体重１ｐ、のＡＭＰＤを与え、そして３匹のマウスの他のグループに、落花生油中に溶解した１およびｌＱｍｇ／ｋｇ体重１．ｐ、のアクチノマイシンＤ　（ＡＭＤ）を与えた。３匹のマウスの他のグループは未処置であり、そして３匹の最後のグループに落花生油ｉ、ｐ　のみを与えた。

マウスの体重を９日かけてモニターした。結果を表９に示す。１０ｍｇ／ｋｇのＡＭＤで処置したすべてのマウスは第１日に死亡した。５ｍｇ／ｋｇの投与量で同様な結果が得られた。これらのデータが示すように、ＡＭＤＰＤは入ＭＤより少なくとも２０〜１００倍毒性が低い。実際に、ＡＭＤＰＤの毒性はなおいっそう低いように思われる。なぜなら、使用したＡＭＤＰＤの調製物は約１％の未変換のＡＭＤを含有するからである。

表９ＡＭＤおよびＡＭＤＰＤの毒性１．０　１０２　１０１　１０１　１０３活性藁物　１０　すべでは第１日に死亡した。

工・０　９Ｂ、６　９５　１０１．６　１０３対Ｐａ　ｏｌ　１ｏ４　１ｏコ　１ｏ６　１ｏ６油　９９　９９　１０１　１０２配列のリスト（１）一般的情報゛　（ｉ）出願人（Ａ）名称：キャンサー・リサーチ・キャンペーン・テクノロジー・リミテッドＣＢ）街路：リージェントバーク、ケンブリッジ・テラス６−１０、ケンブリッジ・ハウス（Ｃ）市：ロンドン、英国（Ｆ）郵便番号：ＮＷｌ　４ＪＬ（ｉ　ｉ）発明の名称：薬物送り出し系に関する改良（ｉｉＤ配列の数：２（ｉｖ）コンピューター読み取り可能な形態二適用不可能（Ｖ）現在の出願のデータ：出願番号：ＰＣＴ／Ｇｂ９２／、、、、、。

（２）配列識別番号：１についての情報（ｉ）配列の特性（Ａ）長さ　１１６７塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎮　二重鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｉ　ｉ）分子の型　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｖｌ）もとの源：（Ａ）生物　大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位置：１７６、．８２９（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１：ＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴ　ＣＭ、ＡＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴｒＴにＣＡＴ　ＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴ　ＣＡＧＣＣＧＴＣＡＴ　ＣＡＴＡににＣＴＧb９１６ＴＧＴｒＧＴＡＴ入Ａ　ＡＧＧＡＧＡＣＧＴＴ　ＡＴＧＣＡＧにＡＴＴ　ＴＡＡＴＡＴＣＣＣＡ　ＧにＴｒｌＧ入ＡＧ入Ｔ　ＴＴＡにＣＧＧfＴＡ　９７６ＴＴＧＡＧＡＴＣＧＡ　ＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＣｃＡＴにＧＴにＡ　ＴＧＡＴＴＴＴＣにＧ　ＴＡＴｒＡＴＴＴＴＴ　ＣＴＧ＾ＣＣＧＣＣf　１０３６ＴＣにＴＣＧＴＧＣＡ　ＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧ　ＣＡＴＴＧＧＧＴＧＧ　ＴＡＣＴＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＡＡＡｋ　ＣＧＴＣ；ＣＣＡＴbＧ　１０９６ＣＣ入ＧＴＴＣＡＣＧ　ＧＣＴＴＴＧＧＴｒＧ　Ｃ入ＡＡＴＣＡＴＴＡ　ＣＣＣＡＧ入ＡＴ入Ａ　ＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＴ’ＴＡＧＣsＴ　１５６（２）配列識別番号＝１についての情報（ｉ）配列の特性二（Ａ）長さ＝２１７アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子の型：タンパク質（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２：時間（分）時間（分）補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８−平成６年４月２２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記の特性：１、２０〜６０キロダルトンの範囲の分子量を有するフラボタンパク質である；２、コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはそれらの類似体を必要とする；３、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈについて１〜１００μＭの範囲のＫｍを有する；および４、ＣＢ１９５４およびその類似体のいずれかまたは両者のニトロ基を細胞障害性の形態、例えば、ヒドロキシルアミンに還元することができる、を有する細菌から得ることができるニトロリダクターゼ。
２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）またはバシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）の細胞から得ることができる請求の範囲１のニトロリダクターゼ。
３．配列識別番号：２のアミノ酸配列を有するニトロリダクターゼ。
４．請求の範囲３のニトロリダクターゼをエンコードするＤＮＡ。
５．配列識別番号：１のＤＮＡの残基１７６〜８２９からなる請求の範囲４のＤＮＡ。
６．請求の範囲１〜３のいずれか１つのニトロリダクターゼを結合することができる抗体。
７．天然または組換えのモノクローナル抗体またはそれらの断片である請求の範囲６の抗体。
８．必要に応じて製剤学的に許容されうる担体または希釈剤と関連付けられた、（ｉ）腫瘍のためのターゲッティング因子および（ｉｉ）請求の範囲１〜３のいずれか１つのニトロリダクターゼの接合体。
９．ターゲッティング因子が腫瘍関連抗原と結合するモノクローナル抗体である請求の範囲８の接合体。
１０．式（Ｉ）または（ＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉまたは ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ式中Ｒ１およびＲ２は化合物Ｒ１ＮＨ２およびＲ２ＯＨが細胞障害性化合物であるような基である、の化合物。
１１．化合物Ｒ１ＮＨ２がナイトロジェンマスタード化合物である請求の範囲の化合物。
１２．式（ＩＶ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＶ式中Ｒ′およびＲ′′がＨ、ＦまたはＣＨ３である、の請求の範囲１１の化合物。
１３．Ｒ′およびＲ′′の両者が水素である請求の範囲１２の化合物。
１４．フェノール系ナイトロジェンマスタードである請求の範囲１０の化合物である。
１５．式（ＶＩＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ＶＩＩＩの請求の範囲１４の化合物。
１６．式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＩＩＩ）：▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼ＶＩ▲数式、化学式、表等があります▼ＶＩＩの化合物。
１７．製剤学的に許容されうる担体または希釈剤と関連付けられた請求の範囲９〜１６のいずれか１つの化合物からなる薬剤組成物。
１８．式（ＩＸ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＸ式中、Ｒ３はＨまたは炭素原子６個まで含むアシル基もしくはヒドロカルビル基である、の化合物。
１９．式（Ｘ）： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｘ式中Ｘ１およびＸ２は、同一であるか、あるいは異なることができ、各々はＮＨＯＲ５またはＮＯ２であるが、ただしＸ１およびＸ２の両者はＮＯ２ではなく、ここでＲ５はＨまたはカルボン酸アシルまたはヒドロカルビル基であり、そしてＹはＨまたはＣＯＮ（ＣＨ３）２である、の化合物。
２０．製剤学的に許容されうる担体または希釈剤と関連付けられた請求の範囲１８または１９の化合物からなる薬剤組成物。
２１．（ｉ）請求の範囲８または９の結合体および（ｉｉ）請求の範囲１０〜１６のいずれか１つのプロドラッグ；または請求の範囲１７の組成物；または請求の範囲１８または１９の化合物のニトロ前駆体または製剤学的に許容されうる担体または希釈剤と関連付けられたこのような化合物からなる薬剤組成物からなる系。
２２．ヒトまたは動物の体の処置の方法において使用するための請求の範囲２１の系。
２３．必要に応じて製剤学的に許容されうる担体または希釈剤と関連付けられた、１，４−ジヒドロ−ニコチン酸のリボシド。
２４．（ｉｉｉ）請求の範囲２３のリボシドをさらに含む請求の範囲２０の系。
２５．ヒトまたは動物の体の処置の方法において使用するための請求の範囲２４の系。
２６．ニトロリダクターゼを含有する細菌の細胞を崩壊させ、そして細胞内容物をクロマトグラフィーにより分離し、そしてニトロリダクターゼを単離することからなる、下記の特性：１、２０〜６０キロダルトンの範囲の分子量を有するフラボタンパク質である；２、コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはそれらの類似体を必要とする；３、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈについて１〜１００μＭの範囲のＫｍを有する；および４、ＣＢ１９５４およびその類似体のいずれかまたは両者のニトロ基を細胞障害性の形態、例えば、ヒドロキシルアミンに還元することができる、を有するニトロリダクターゼを生産する方法。
２７．前記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ・ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）またはバシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）の細胞から得ることができる請求の範囲２６の方法。
２８．宿主細胞の中に含有される適当な発現ベクターの中でニトロリダクターゼをエンコードするＤＮＡを発現させ、そしてニトロリダクターゼを回収することからなる、配列識別番号：２のアミノ酸配列を有するニトロリダクターゼを製造する方法。
２９．対応する薬物前駆体を４−ニトロベンジルクロロホルメートと無水条件下に反応させることからなる、請求の範囲１０において定義する式（Ｉ）または（ＩＩ）のプロドラッグあるいは請求の範囲１６において定義する式（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）のプロドラッグを製造する方法。
３０．対応するジニトロ化合物に請求の範囲１〜３のいずれか１つのニトロリダクターゼを作用させることからなる、請求の範囲１９の式（Ｘ）の化合物を製造する方法。
３１．ニコチン酸リボシドを還元することからなる１，４−ジヒドローニコチン酸のリボシドを製造する方法。
３２．腫瘍のためのターゲッティング因子を酵素に共有結合リンカーを使用して結合することからなる、請求の範囲１〜３のいずれか１つにおいて定義した前記ターゲッティング因子と酵素との結合体を製造する方法。
３３．ターゲッティング因子がモノクローナル抗体である請求の範囲３２の方法。
３４．有効量の（ｉ）腫瘍のためのターゲッティング因子と結合した請求の範囲１〜３のニトロリダクターゼ；および（ｉｉ）請求の範囲１０において定義した式ＩまたはＩＩのｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物あるいは抗腫瘍剤のためのプロドラッグである請求の範囲１６において定義した式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩの化合物を宿主に投与することからなる、処置を必要とするヒトまたは動物の宿主における新形成を処置する方法。
３５．成分（ｉ）および（ｉｉ）を順次に投与する請求の範囲３４の方法。
３６．（ｉｉｉ）酵素のためのコファクターとしてニコチン酸またはニコチンアミドの１種または２種以上のリボシドの投与をさらに含む請求の範囲３４の方法。
３７．（ｉ）腫瘍のためのターゲッティング因子と結合した請求の範囲１または３のニトロリダクターゼおよび（ｉｉ）有効量の請求の範囲１９において定義された式Ｘの抗腫瘍剤のためのプロドラッグであるニトロ化合物を宿主に投与することからなる、処置を必要とするヒトまたは動物の宿主における新形成を処置する方法。
３８．（ｉｉｉ）酵素のためのコファクターとしてニコチン酸またはニコチンアミドの１種または２種以上のリボシドの投与をさらに含む請求の範囲３６の方法。