JP2005040136A - ニトロリダーゼをコードするｄｎａ分子 - Google Patents

ニトロリダーゼをコードするｄｎａ分子 Download PDF

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Abstract

【課題】効果的にプロドラッグを抗腫瘍剤に変換できるニトロリダクターゼをコードするＤＮＡ分子の提供。
【解決手段】既知のニトロリダクターゼ（ＥＣ．１．６．９９．２）に比べてよりブロードな基質特異性を有する、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂ由来の新規ニトロリダクターゼ（約２４ｋＤａの分子量を有するフラボタンパク質）をコードするＤＮＡ分子の単離。
【効果】本酵素をターゲッティング因子、例えば腫瘍関連抗原と結合するモノクローナル抗体に接合して使用する、癌の化学療法の系を提供することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、新形成組織の増殖の抑制に関し、そしてとくに新規な抗腫瘍剤の提供およびプロドラッグを抗腫瘍剤に変換することができる酵素をコードするＤＮＡ分子に関する。
アルキル化剤５−（アジリジン−１−イル）−２,４−ジニトロベンズアミド（以後ＣＢ １９５４と表示する）は、独特の選択性をもつ興味ある実験用化合物として、ほとんど２０年間知られてきている。ＣＢ １９５４は比較的広い範囲の活性を有する多数の他の既知のアルキル化剤に構造的に非常に密接に関係するが、ＣＢ １９５４はウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）腫瘍細胞に対してｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでかなりの活性を示すが、他の腫瘍に対して事実上不活性である。 最近、ＣＢ １９５４の選択性はそれがそれ自体抗腫瘍剤ではなく、ウォーカー細胞の中に見いだされるニトロリダクターゼ酵素によりＣＢ １９５４から発生する抗腫瘍剤のためにプロドラッグであるという事実から生ずることが発見された。引き続いて、ウォーカー細胞からのこのニトロリダクターゼは、ＥＣ．１．６．９９．２として分類されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）である他の源から既知の酵素であることが示された（例えば、非特許文献１参照）。
ＣＢ １９５４を使用する従来の研究過程において、ウォーカー細胞の酵素ＥＣ．１．６．９９．２はＣＢ １９５４の４−ニトロ基を対応するヒドロキシルアミンに還元する能力を有すること、およびそれはその結果生ずる５−（アジリジン−１−イル）−２−ニトロ−４−ヒドロキシルアミノ−ベンズアミドであり、これは活性な抗腫瘍剤であることが発見された。プロドラッグの使用は癌の治療において臨床的に価値ある概念を表す。なぜなら、とくに腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体に結合できる酵素の影響下にプロドラッグを抗腫瘍剤に変換すべき場合、このようなプロドラッグとこのような酵素モノクローナル／抗体結合体との組み合わせは非常に強力な臨床剤を表すからである。
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１、１５７９４−１５７９９（１９８６）。
今回、われわれは新規なニトロリダクターゼをコードするＤＮＡ分子を発見し、これらのニトロリダクターゼは細菌源から得ることができ、ＣＢ １９５４を活性な抗腫瘍剤に変換することができるだけでなく、また、ＥＣ．１．６．９９．２と異なり、またプロドラッグであるＣＢ １９５４類似体を活性な抗腫瘍剤に変換することもできる。
本発明は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂおよびバシラス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）から分離されると例示される、細菌から得ることができる下記の特性を有するニトロリダクターゼをコードするＤＮＡ分子提供する：
１．２０〜６０キロダルトンの範囲の分子量を有するフラボタンパク質である；
２．コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはそれらの類似体を必要とする；
３．ＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈについて１〜１００μＭの範囲のＫｍを有する；そして
４．ＣＢ １９５４およびその類似体のいずれかまたは両者のニトロ基を細胞障害性の形態、例えば、ヒドロキシルアミンに還元することができる。
より特定的には、本発明は、下記の特徴：
１：約２４ｋＤａの分子量を有するフラボタンパク質である；
２：コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする；
３：ＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈについて１〜１００μＭの範囲のＫｍを有する；および
４：ＣＢ １９５４のいずれかまたは両者のニトロ基を細胞障害性の形態に還元することができる、
を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂのニトロリダクターゼをコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。
本発明に関するニトロリダクターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃおよび他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えば、Ｋ１２型ならびに他のグラム陰性生物、例えば、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、およびグラム陰性細菌、例えば、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）またはバシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）の細胞内に天然に存在する。それらはこのような細胞から、細胞を崩壊させ、そして細胞内容物をクロマトグラフィーにより分離し、そしてニトロリダクターゼを単離することによって、回収することができる。
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂからの本発明のニトロリダクターゼは、均質性に精製され−表１参照、そしてアミノ酸配列分析して、表２に記載する結果を得た。上の配列は、渡辺ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、１０５９（１９９０）に記載されているように、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から得られた２１９マーのニトロリダクターゼの推定されたアミノ酸配列を示す。肉太のタイプの下の配列は、本発明の１例として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂのニトロリダクターゼの臭化シアンの断片の配列を示し、ある程度の均質性を示すが、それが渡辺らのニトロリダクターゼおよび最近記載されたエンテロバクター・クロアケ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｃｌｏａｃａｅ）のニトロリダクターゼ、参照、Ｂｒｙａｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、４１２６（１９９１）またはウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）細胞のニトロリダクターゼと異なるニトロリダクターゼであり、そして従来報告されたことのない酵素であることを確証するために十分な差を示す。
本発明の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂのニトロリダクターゼのアミノ酸配列を、また、ニトロリダクターゼ遺伝子の中のヌクレオチドの配列決定から誘導することができ、そしてこれらの配列を下表３に記載する。表３のヌクレオチド配列を使用して、添付した配列のリストを作成した。 表３の中の情報を使用して、宿主細胞の中に含有される適当な発現ベクターの中でニトロリダクターゼをコードするＤＮＡを発現させ、そしてニトロリダクターゼを回収することによって、本発明によるニトロリダクターゼを生産することができる。発現ベクターは、例えば、細菌、酵母菌、昆虫または哺乳動物の発現ベクターであることができ、そして宿主細胞はそのベクターと適合性であるように選択されるであろう。
上に示したように、本発明の新規な酵素は種々の基質分子の中のニトロ基を還元することができ、そしてこれらの酵素は細胞障害性化合物の種々のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体のニトロ基を還元して、自動的に分解して細胞障害性化合物を解放する「自己犠牲的」化合物を生成する能力においてとくに有用であることをわれわれは発見した。 本発明のアプローチにおける重要性は、アミノまたはヒドロキシ置換基、とくに芳香族アミノまたはヒドロキシ置換基を含有する種々の細胞障害性化合物の細胞障害性が、アミノまたはヒドロキシ親化合物よりかなり低い細胞障害性を示すアミノまたはヒドロキシ基のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体を生ずるという事実にある。こうして、腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体に結合できる酵素の影響下にプロドラッグを抗腫瘍剤に変換する前述の型の系において、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体をプロドラッグとして使用することができる。
したがって、本発明は、一般式：
Figure 2005040136
および：
Figure 2005040136
式中Ｒ１およびＲ２は化合物Ｒ１ＮＨ２およびＲ２ＯＨが細胞障害性化合物であるよ
うな基である、
の新規な化合物を提供する。
化合物Ｒ１ＮＨ２およびＲ２ＯＨは芳香族の細胞障害性化合物であることが好ましく、そして化合物Ｒ１ＮＨ２はよく知られているナイロジェンマスタード化合物、例えば、ｐ−フェニレンジアミンに基づく化合物の任意の１つであることができる。こうして、化合物Ｒ１ＮＨ２は、下記の化合物であることができる：
Figure 2005040136
一般構造式ＩＶ
Figure 2005040136
式中Ｒ'およびＲ"はＨ、ＦまたはＣＨ３であり、とくに
Ｒ'＝ＨかつＲ"＝ＣＨ３；または
Ｒ'＝ＣＨ３かつＲ"＝Ｈ；または
Ｒ'＝ＨかつＲ"＝Ｆ；または
Ｒ'＝ＦかつＲ"＝Ｈ；
をもつこの化合物の類似体。
本発明に従い使用することができるアミノ細胞障害性化合物の他のタイプは、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノマインおよびマイトマイシンＣのような化合物である。アクチノマイシンＤ、ドキソルビシンおよびマイトマイシンＣから誘導されるプロドラッグの構造式は、下に、それぞれ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩとして示される。
Figure 2005040136
同様に、ｐ−ニトロベンジルオキシ誘導体を前述のタイプの他のアクチノマイシン類および他の細胞障害性化合物のアミノ置換基においてつくることができる。
細胞障害性化合物上のアミノ基においてｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体を形成することに加えて、同様な誘導体は細胞障害性化合物のヒドロキシ基、とくにフェノール系ヒドロキシ基においてつくることができる。ここで、フェノール系窒素マスタード化合物が注目され、そしてこのタイプの本発明の特定の化合物は、式：
Figure 2005040136
を有する。
本発明の新規な酵素は、ある種のＣＢ １９５４のニトロ基の少なくとも１つばかりでなく、かつまたＣＢ １９５４類似体、例えば、デスカルボキシアミドＣＢ １９５４（１−アジリジン−１−イル−２,４−ジニトロベンズアミド−ＣＢ １８３７として知られている）およびＮ,Ｎ−ジメチルＣＢ １９５４［Ｎ,Ｎ−ジメチル−（５−アジリジン−１−イル−２,４−ジニトロベンズアミド、また、ＣＢ １０−１０７として知られている］のニトロ基の少なくとも１つを還元することができる。本発明の新規な酵素は、また、他のニトロ芳香族化合物、例えば、５−クロロ−２,４−ジニトロベンズアミド、３,５−ジニトロベンズアミド、３−ニトロベンズアミド、４−ニトロベンズアミドおよび５−ニトロ−２−フラルデヒドセミカルバゾン（ニトロフラゾン）のニトロ基を還元することができる。
本発明は、また、一般式Ｘ：
Figure 2005040136
式中Ｘ１およびＸ２は、同一であるか、あるいは異なることができ、各々はＮＨＯＲ
５またはＮＯ２であるが、ただしＸ１およびＸ２の両者はＮＯ２ではなく、ここでＲ
５はＨまたは式ＩＸに関して上に定義したカルボン酸アシルまたはヒドロカルビル基
であり、そしてＹはＨまたはＣＯＮ（ＣＨ３）２である、
のヒドロキシルアミノ誘導体を提供する。２つのヒドロキシルアミノ基を含有する式Ｘの化合物において、基Ｒは同一であるか、あるいは異なることができるが、通常同一であろう。
前述したように、式ＩおよびＩＩの本発明の新規なｐ−ニトロフェニルベンジルオキシ化合物は、それらを誘導する細胞障害性化合物Ｒ１ＮＨ２またはＲ２ＯＨのそれに比較して減少した細胞障害性を有し、そして本発明のニトロリダクターゼのための基質として作用することができることにおいて重要である。本発明は、その定義について、式ＩまたはＩＩの化合物へのニトロリダクターゼの作用の正確なモードに依存しないが、ｐ−ニトロフェニル−ベンジルオキシカルボニル残基のニトロ基は対応するアミノまたはヒドロキシルアミノ基に変換され、そして生ずるｐ−アミノベンジルオキシカルボニルまたはｐ−ヒドロキシル−アミノベンジルオキシカルボニル化合物は、下記の反応の概要に従い、酵素的還元に使用する反応条件下に自動的に分解して、細胞障害性化合物を解放し、そして副生物としてｐ−アミノベンジルアルコールおよび二酸化炭素を形成すると信じられる：
Figure 2005040136
本発明のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物は、それ自体知られている化学的合成法により有利に製造される。例えば、アミンまたはヒドロキシ細胞障害性化合物を４−ニトロベンジルクロロホルメートと無水条件下に塩化水素受容体、とくにアルキルアミン、例えば、トリエチルアミンの存在下に反応させることができる。この反応は乾燥有機溶媒、例えば、クロロホルム中で実施することができ、そして生ずる式ＩまたはＩＩの本発明の化合物を普通の方法、例えば、クロマトグラフィーにより有機溶媒から単離することができる。
本発明のＩＸおよびＸの新規な化合物は、通常、対応するジニトロ化合物に本発明の新規なニトロリダクターゼを作用させることによって製造されるであろう。また、化学的合成により、選択的還元剤を使用し、次いで生ずるヒドロキシルアミンをその対応するエステルまたはエーテルに変換することによって、本発明のＩＸおよびＸの新規な化合物を製造することは、もちろん、可能である。エステルおよびエーテルは、半合成的に、ニトロ基の還元を本発明のニトロリダクターゼを使用して実施して対応するヒドロキシルアミンを生成し、次いでこれを既知の化学的方法により対応するエステルまたはエーテルに変換することによって、いっそう有利に製造される。
本発明の新規なニトロリダクターゼを製造する最も便利な方法の１つは、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂの細胞内容物から材料を回収することである。あるいは、細菌から分離することができる、所望の酵素をエンコードする遺伝子をクローニングし、そしてクローニングした遺伝子を、適当なベクター系の中で、他の宿主細胞の中に移し、この宿主細胞からまたはその中でそれを発現することができる。
ＣＢ １９５４およびその類似体の本発明の新規な酵素による酵素的還元を発生させるために、反応系の中にコファクターを存在させることが必要である。この反応を発生させる本発明の酵素の能力は、コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの使用により実験的に実証することができるが、臨床的実施におけるこのようなコファクターの使用は、とくにＮＡＤ（Ｐ）Ｈが体の中に存在する他の酵素により酸化される容易さ、および種々の哺乳動物の酵素と非哺乳動物の酵素との間のコファクターの選択性の欠如にかんがみて問題を生ずることがある。今回、１,４−ジヒドロ−ニコチン酸のリボシドはＣＢ １９５４およびその類似体のニトロリダクターゼの還元においてコファクターと少なくとも同じように有効でありそして、そのうえ、本発明の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼに対するその選択性のために、臨床的使用においていっそう適当であり、これにより後述するタイプの多成分系の中のその組み込みをとくに価値あるものとすることをわれわれは発見した。 コファクターとして本発明において使用できる１,４−ジヒドロ−ニコチン酸のリボシドは新規な化合物であり、そして本発明の一部分を形成する。それは商業的に入手可能なニコチン酸リボチドから製造することができ、これらのリボチドをまず酵素的脱リン酸化により、例えば、アルカリ性ホスファターゼを使用して対応するリボシドに変換する。このような酵素的脱リン酸化により、あるいは化学的合成により、Ｊａｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（ｃ）９１８−９２０（１９６９）に記載されている方法を使用して、得られたリボシドを、次いで、例えば、アルカリ金属ハイドロサルファイトを使用して、還元して１,４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドを生成することができる。
本発明の新規な酵素の最も重要な実際的応用の１つは、それらを抗腫瘍剤のためのプロドラッグであるニトロ化合物と関連して使用し、こうして癌の化学療法の系を提供することができることであり、ここで細胞障害剤へ患者を暴露する程度は、プロドラッグと本発明のニトロリダクターゼとの間の相互作用が存在する領域に、出来る限り限定される。こうして、本発明の１つの面は、細胞障害性化合物のためのプロドラッグであるニトロ化合物と関連した本発明のニトロリダクターゼの共同使用を包含する化学療法の方法および化学療法の系を提供することである。
本発明の系を利用する最も便利な方法の大部分または１つは、本発明のニトロリダクターゼを、ターゲッティング因子、例えば、腫瘍関連抗原と結合するモノクローナル抗体に接合することである。
ここにおいて使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、単に伝統的なハイブリドーマ技術により生産される抗体を意味するばかりでなく、かつまた組換え手段により生産される抗体およびそれらの変異型を包含することを当業者は理解するであろう。これらは、例えば、ヒト化抗体、例えば、非ヒト抗体可変領域上にグラフトしたヒト抗体からの一定領域をもつ抗体（参照、例えば、欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０ １２０ ６９４号）、キメラ抗体、例えば、ヒト可変領域のフレームワークの中にグラフトした非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をもつ抗体（参照、例えば、欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０ ２３９ ４００号）および一本鎖抗体を包含する。それらの標的結合活性を保持するこのようなモノクローナル抗体の断片は、また、「モノクローナル抗体」の一般用語に包含される。これはＦａｂ'およびＦ（ａｂ'）２断片を包含する。
モノクローナル抗体の選択は標的腫瘍の性質により明瞭に影響を受けるであろうが、本発明を例示する目的で、抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７について言及することができる。
モノクローナル抗体の使用に対する別法として、また、本発明のニトロリダクターゼをコンジュゲートする他のターゲッティング因子を使用できることが考えられる。例えば、ある種の可溶性高分子をある種の腫瘍のタイプの受動的腫瘍ターゲッティングのために使用できることが知られている。多数の充実腫瘍は、高分子に対して超透過性である脈管構造を有する。この理由は明瞭には理解されないが、このような腫瘍が循環する高分子を選択的に蓄積することができる結果である。透過性の増大および保持作用（ＥＰＲ作用）は、現在日本においてヘパトーマの処置のために正規の臨床使用において、ＳＭＡＮＣＳ（スチレン／無水マレイン酸−ネオカルジノスタチン）の作用のメカニズムを構成すると考えられる。抗癌剤の活性について研究されている結合体の他のクラスは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー−アントラサイクリン結合体である（Ｌ．Ｓｅｙｍｏｕｒ、治療用薬物の担体系における批評的概観（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、９（２）１３５−１８７（１９９２））。こうして、スチレン／無水マレイン酸またはＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマーを包含するポリマー、および本発明のニトロリダクターゼの結合体を、モノクローナル抗体および酵素の結合体の代わりに使用することができる。
この系を使用して、癌の化学療法の過程において、処置を必要とする患者に、細胞障害性化合物のためのプロドラッグであるニトロ化合物および酵素／ターゲッティング因子の結合体を投与することがもちろん可能である。プロドラッグおよび結合体を同時に投与することができるが、臨床的実施において、酵素／ターゲッティング因子の結合体をプロドラッグの前に、例えば、７２時間前までに投与して、腫瘍標的の領域の中に局在化する機会を酵素／ターゲッティング因子の結合体に与えることがしばしば好ましいことが発見された。この方法で操作することによって、プロドラッグを投与するとき、酵素／ターゲッティング因子の結合体を局在化する領域、すなわち、標的腫瘍および細胞障害性因子の早期の解放により引き起こされる健康な細胞への損傷を最小とする領域に、プロドラッグの細胞障害性因子への変換は制限される傾向がある。
酵素／ターゲッティング因子の結合体の局在化の程度（自由に循環する活性結合体に対して局在化される比に関係して）は、ＷＯ８９／１０１４０号に記載されているクリアランスおよび／または不活性化系を使用してさらに増大させることができる。これは、通常結合体の投与後かつプロドラッグの投与前に、結合体のこのような部分に結合できる成分「第２成分」）を投与して、酵素を不活性化しおよび／または血液からの結合体のクリアランスを加速することを包含する。このような成分は、酵素を不活性化することができる本発明のニトロリダクターゼに対して抗体を包含することができる。
第２成分は、高分子、例えば、デキストラン、リポソーム、アルブミン、マクログロブリンまたは血液型Ｏの赤血球に結合させて、第２成分が脈管の隔室を去るのを拘束することができる。さらに、あるいは別法として、第２成分は十分な数の共有結合したガラクトース残基、または他の糖類、例えば、ラクトースまたはマンノースを含み、こうしてそれが血漿中の結合体に結合することができるが、肝臓の中のガラクトースまたは他の糖類のためのレセプターにより結合体と一緒に血漿から除去できるようにすることができる。第２成分は、いかなる感知し得る程度にも、プロドラッグの投与の前にまたは間に局在化した結合体を不活性化することができる腫瘍の脈管外の空間に入られないように、投与しかつデザインすべきである。
正確な投与の方法は、もちろん、個々の患者について個々の臨床医により決定される必要がありそしてこれは、引き続いて、プロドラッグの正確な性質およびプロドラッグから解放すべき細胞障害性因子によりコントロールされるであろうが、多少の一般的指針を与えることができる。このタイプの化学療法は、通常、プロドラッグおよび酵素／ターゲッティング因子の結合体の両者の非経口的投与を包含し、そして静脈内ルートによる投与はしばしば最も実際的であることがわかる。
本発明の酵素を使用する方法を考慮にいれて、本発明は、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤、通常非経口的投与に適当なものと関連して、酵素、好ましくはターゲッティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した酵素からなる薬剤組成物を包含する。
本発明は、また、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤、通常非経口的投与に適当なものと関連して、１種または２種以上の式Ｉ、式 ＩＩ、式Ｖ、式ＶＩまたは式ＶＩＩの本発明のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物からなる薬剤組成物を包含する。
本発明は、さらに、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤、通常非経口的投与に適当なものと関連して、式ＩＸまたは式Ｘの本発明のヒドロキシルアミノ抗腫瘍剤からなる薬剤組成物を包含する。
本発明は、また、抗腫瘍剤のためのプロドラッグである式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩの少なくとも１種のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物および好ましくは酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボシドまたはリボチドと関連して、本発明のニトロリダクターゼ、好ましくはターゲッティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明のニトロリダクターゼからなる、ヒトまたは動物の被検体における新形成の抑制において使用するための系を提供する。本発明は、有効量の抗腫瘍剤のためのプロドラッグである式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩのｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物および本発明の酵素、好ましくはターゲッティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明の酵素を、処理を必要とするヒトまたは動物の宿主に投与することからなる、このような宿主において新形成を処置する方法を包含し、ここで前記酵素は好ましくは前記酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボチドまたはリボシドと関連して使用する。
本発明は、さらに、式ＩＸまたはＸの抗腫瘍剤のためのプロドラッグであるニトロ化合物および好ましくは酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボシドまたはリボチドと関連して、本発明のニトロリダクターゼ、好ましくはターゲッティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明のニトロリダクターゼからなる、ヒトまたは動物の被検体における新形成の抑制において使用するための系を提供する。本発明は、また、有効量の式ＩＸまたはＸの抗腫瘍剤のためのプロドラッグであるニトロ化合物および本発明の酵素、好ましくはターゲッティング因子、例えば、腫瘍関連抗原に結合できるモノクローナル抗体に接合した本発明の酵素を、処理を必要とするヒトまたは動物の宿主に投与することからなる、このような宿主において新形成を処置する方法を提供し、ここで前記酵素は好ましくは前記酵素のためのコファクターとして作用するニコチン酸またはニコチンアミドのリボチドまたはリボシドと関連して使用する。
前述の新形成の処置において使用するための種々の系は、必要に応じて、前述のクリアランスを加速するための「第２成分」を含む。同様に、前述の新形成を処置する方法は、必要に応じて、その方法の一部分として、自由に循環する酵素に対して局在化する比を増加するために、第２成分の使用を包含し、その有効量を酵素の投与後に投与する。第２成分のそれ以上の特定の詳細はＷＯ８９／１０１４０号を参照することができ、そしてこのような詳細は本発明における使用のために加えることができる。
下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。
＜実施例Ｉ＞
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂからのニトロリダクターゼ酵素の分離および精製
２００ｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ細胞のペーストを、合計の体積１リットルの０.３Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７.０に再懸濁させた。細胞をＭＳＥソニプレプ（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ）１５０崩壊装置により超音波で破壊した（全電力で３×３０秒、６０秒の間隔で熱を消散させた）。抽出液の清浄化を促進するために、ＤＮアーゼ（２３,０００クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）単位／ｌ）およびＲＮアーゼ（２４,０００クニッツ単位／ｌ）を添加した後、 ８,０００ｇで３０分間遠心して細胞破片を除去した。透明な黄色がかった上澄み液をクロマトグラフィーの前に０.４５μｍのフィルターに通過させた。
０.３Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭのリン酸塩緩衝液
ｐＨ７中のフェニル−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））のカラム（２５×５ｃｍ）に、濾過した抽出液を適用した。２カラム体積の出発緩衝液で洗浄した後、カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７.６で溶離した。活性の画分をプールし、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.６に対して１８時間透析して硫酸アンモニウムを除去した。透析した画分を５０ｍｌのアリコートで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.６の中のＱ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）−高性能に、４ｍｌ／分の流速で適用した。溶離は０．５ＭのＫＣｌの勾配で実施し、ニトロリダクターゼは０.１〜０.１２ＭのＫＣｌで溶出した。活性の画分をプールし、そしてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５媒質のカラム（３２×６ｃｍ）を使用して２０ｍＭ Ｂｉｓ ＴｒｉｓプロパンｐＨ７の中に脱塩した。これらの画分を、２０ｍＭ Ｂｉｓ ＴｒｉｓプロパンｐＨ７の中で平衡化したＱ−セファローズ−高性能（ハイ−ロード（Ｈｉ−Ｌｏａｄ）カラム２６／１０カラム、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に適用した。溶離は０〜０.１Ｍの勾配のＫＣｌにより実施した。ニトロリダクターゼは０.０７〜０.０９ＭのＫＣｌにおいて最初の主要なピークとして溶出した。
最終生成物の均質性は、天然ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ファルマシア・ファストシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ）のための前以てキャストした８〜２５％の勾配のゲルを使用して確認された。電気泳動は７５ｖｈの間実施した。
粗製の画分および部分的に精製した画分の中のニトロリダクターゼは、基質としてメナジオン、コファクターとしてＮＡＤＨおよび末端の電子アクセプターとしてシトクロムＣを使用して、そのキノンリダクターゼ活性により日常的にアッセイした。
等電点の決定
ニトロリダクターゼの等電点は、等電点電気泳動（ファルマシア・ファストシステム、４００ｖｈの間のフォーカシング）およびモノ（Ｍｏｎｏ）Ｐカラム（ファルマシア・モノ（Ｐｈａｒｍａｃｉｓ Ｍｏｎｏ）Ｐ ＨＲ５／２０、２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ６.３およびポリ緩衝液７４、ｐＨ４.０）を使用するクロマトフォーカシングにより決定した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼは、２５ｋＤａの分子量をもつ純粋なタンパク質として分離された（ポリアクリルアミドゲルの電気泳動およびゲル濾過クロマトグラフィーの両者により決定して）。キノンリダクターゼ活性をもつが、ＣＢ １９５４に対してニトロリダクターゼとして不活性である第２タンパク質は、フェニルセファローズから部分的に同時に溶出し、そしてＱ−セファローズ高性能上のイオン交換クロマトグラフィーの工程（表１参照）によりｐＨ７．６において活性酵素から完全に分離された。２つの酵素は分子量（不活性５５ｋＤａ；活性２４ｋＤａ）および等電点（不活性５.２；活性５.１）において異なった。活性タンパク質は黄色であり、フラビン補酵素の存在を示唆する。７０℃に２０分間加熱した後、このフラビンは限外濾過によりアポ酵素から分離することができそして、ＨＰＬＣを使用して、ＦＡＤよりむしろＦＭＮであることが示された。
Figure 2005040136
この酵素を臭化シアンで消化することによって、配列分析に適当な断片を製造した。これらの消化物から生ずるペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより、ＲＰ３００カラム（２５×４.６ｍｍ）（ブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ））および各溶媒中に０.０６％のトリフルオロ酢酸助剤を
含む水中の１０〜６０％のアセトニトリルの溶媒の勾配を使用して精 製した。自動化エドマン分解法によりアプライド・バイオシステムス
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７０Ａ気相タンパク質配列決定装置（ケルビン・クロース（Ｋｅｌｖｉｎ Ｃｌｏｓｅ）、英国ワーリントン）を使用して、配列の分析を実施した。
ニトロリダクターゼのアミノ酸配列の分析
上で分離された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼをアミノ酸配列の分析にかけた。ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）腫瘍から分離された酵素ＥＣ．１．６．９９．２と対照的に、本発明のニトロリダクターゼはＮ−末端においてブロックされず、そして３１アミノ酸残基の明瞭なＮ−末端配列および、臭化シアンを使用する消化により発生した、それ以上の４１残基のペプチドを与えた。これらの部分的配列を表２に記載する。
Figure 2005040136
ニトロリダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼ遺伝子をクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を両者の鎖のジデオキシ配列分析により決定した。ニトロリダクターゼをエンコードする６５１ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有する１１６７塩基のＮｒｕＩ／Ｐｓｔ断片のヌクレオチド配列を表３に示す。シャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）の推定上の配列および転写停止シグナルを示す。
Figure 2005040136
＜実施例２＞
ＣＢ １９５４の酵素的還元
ＣＢ １９５４（１００μＭそしてまた１．６×１０５ｄｐｍ／ｎｍｏｌで［Ｕ−３Ｈ］ＣＢ １９５４を含有する）、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（５００μＭ）を、実施例１に記載するようにして得られた活性酵素（一般に２μｇ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼまたは３５μｇ／ｍｌのウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）ＥＣ．１．６．９９．２）と１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で空気またはヘリウム下にインキュベーションした。種々の時間において、アリコートをパーチスフェアー（Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ）ＳＣＸ（１１０×４.７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で無勾配的に（２ｍｌ／分）溶離した。
溶出液を３１０、２６０および３６０ｎｍにおける吸収について連続的にモニターし、そして溶離する成分のスペクトルをダイオード−ア レイ（ｄｉｏｄｅ−ａｒｒａｙ）検出器を使用して記録した。試料（０.５ｍｌ）を集め、そして各々のトリチウム活性を液体シンチレーション計数により決定した。この分離系はすべての期待された還元生成物を分割することができた。 還元生成物の同一性をさらに確証するために、上の還元混合物を、また、ＯＤＳ−５逆相ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして０.１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中のメタノール勾配（３０分かけて０〜３０％の直線、１０分かけて３０〜１００％の直線）で溶離（１ｍｌ／分）した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のニトロリダクターゼによるＣＢ １９５４の還元は２つの生成物を形成し、これらは既知の標準との保持時間およびスペクトルの特性の比較により、５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドおよび５−（アジリジン−１−イル）−２−ヒドロキシルアミノ−４−ニトロベンズアミドであることが示された。他のＣＢ １９５４の代謝物質は発見されなかった。本発明のニトロリダクターゼによる前記２つおよび４−ヒドロキシルアミンの両者の形成のそれ以上の確証において、６７μＭのＣＢ １９５４をニトロリダクターゼにより還元したとき、３３μＭの４−ヒドロキシルアミンが生成した。対照的に、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）による５０μＭのＣＢ １９５４のデヒドロゲナーゼ（キノン）の還元により、５０μＭの４−ヒドロキシルアミンが生成した。４−ヒドロキシルアミン生成ニトロリダクターゼの初期速度に基づいて、使用した標準的条件下に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）より３１．２倍の活性／ｍｇタンパク質（またはＣＢ １９５４還元により６２倍の活性）である。
コファクターがＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈであったときおよび還元をヘリウム下に実施したとき、ＣＢ １９５４の還元または生成物の生成の速度は同一であった。
ニトロリダクターゼが細胞障害性種を生産していることを示すため に、ＣＢ １９５４に対して不感受性であるＶ７９細胞の存在下にＣＢ １９５４の還元を実施した。表４に示すように、劇的な細胞障害性作用がハムスターＶ７９細胞において観察された−しかしニトロリダクターゼがＣＢ １９５４を還元する条件下においてのみであった。
Figure 2005040136
＜実施例４＞
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼ酵素の基質特異性
ＣＢ １９５４以外のニトロ化合物を還元する本発明の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼの能力を、ＨＰＬＣによりその酸化から生ずるＮＡＤＨのピーク区域の減少を追跡することによって決定した。実験は前述したように実施したが、アリコートをパーチスフェアー （Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ）ＳＡＸ（１１０×４.７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして７５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で無勾配的に（１ｍｌ／分）溶離した。
表５
種々のニトロベンズアミドおよびニトロベンゼンを大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼ酵素で還元する相対
的速度。ＮＡＤＨの生ずる酸化により還元速度を決定した。
すべての反応は、３７℃において空気中で、電子ドナーと
してＮＡＤＨ（５００μＭ）を使用して、１００μＭの初
期基質濃度で実施した。

ＮＡＤＨの酸化速度
基質 ニトロリダクターゼ
ＣＢ １９５４ １.０
２,４−ジニトロ−５−（２−ヒドロ
キシエチルアミノ）ベンズアミド ０.０４
２−アミノ−５−（アジリジン−１−
イル）−４−ニトロベンズアミド ＜０.０１
４−アミノ−５−（アジリジン−１−
イル）−４−ニトロベンズアミド ＜０.０１
５−クロロ−２,４−ジニトロベ
ンズアミド ２２.４
３,５−ジニトロベンズアミド ７５.５
２−ニトロベンズアミド ０.０６
３−ニトロベンズアミド １.８
４−ニトロベンズアミド ５.１
２,４−ジニトロフェノール ＜０．０１
５−ニトロ−２−フラルデヒド
セミカルバゾン（ニトロフラゾン） ３.６
＜実施例４＞
酵素の反応速度論および阻害の研究
分光光度測定法により基質としてメナジオンおよび末端の電子アクセプターとしてシトクロムＣを使用して、Ｋｎｏｘら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃ．３７、４６７１−４６７７、１９８８に記載されているように、キノンリダクターゼ活性をアッセイした。線型回帰分析（ｒ＞０.９９５）およびＲｏｂｅｒｔｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃ．３８、４１３７−４１４３、１９８９に記載されているように、生ずるプロットから決定された反応速度論のパラメーターにより、初期の反応速度を決定した。ウシ血清アルブミンに対して目盛り定めされた普通のタンパク質アッセイ（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用して、タンパク質濃度を決定した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼおよびウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、デヒドロゲナーゼ（キノン）ＥＣ．１．６．９９．２についての反応速度論のパラメーターを表６に記載する。両者の酵素はＣＢ １９５４について匹敵するＫｍを有するが、ＮＡＤＨについてのニトロリダクターゼのＫｍはウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）酵素より約１０倍小さい。２つの酵素によるＣＢ １９５４の絶対速度（すなわち、飽和条件下の）はそれらのｋｃｓｔ値であり、そしてこれは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼについてより９０倍高い。メナジオンは、また、それぞれのｋｃｓｔがほとんど異ならない両者の酵素のための基質であったが、この基質についてのニトロリダクターゼのＫｍは６０倍高かった。
ジクマロールはニトロリダクターゼのインヒビターであった。ＮＡＤＨに関して反応速度論のパラメーターを測定しなかった。メナジオンに関すると、ジクマロールは１．９０±０．３８μＭのＫｉをもつ非競合的インヒビターであった。
Figure 2005040136
＜実施例５＞
ＣＢ １９５４以外の化合物を細胞障害性種に対して活性化する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼの能力
表７に示すように、大きい細胞障害性作用はヒトＭＡＷＩ細胞においてプロドラッグＣＢ １８３７およびＣＢ １０−１０７により観察されたが、それはプロドラッグがニトロリダクターゼ酵素により還元される条件下においてのみであった。
Figure 2005040136
＜実施例６＞
ニコチン酸リボシドまたはニコチン酸リボチドからの１,４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドの製造
（ｉ）ニコチン酸リボチドからのニコチン酸リボシドの製造
水性緩衝液（トリス１００ｍＭ；ｐＨ８.５；ＭｇＣｌ２；２.５ｍｌ）中のニコチン酸リボチド（ニコチン酸モノヌクレオチド）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国プーレ）（２５ｍｇ）の溶液を、２０００単位のアルカリ性ホスファターゼ、ＶＩＩ−Ｓ型（１００μｌ；２０,０００単位／ｍｌ）（シグマ）で３７℃において１時間処理した。アルカリ性ホスファターゼを消化物から遠心分子濾過（１０,０００の分子量限界；「セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０」；アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、英国ハイワイコンベ）により分離した。この溶液の希釈物を、アルカリ性ホスファターゼによる消化の前および後に、アニオン交換高性能液体クロマトグラフィー（パーチスフェアー（Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ）５−３ＳＡＸカラム、０.１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５で無勾配的に溶離した、１.５ｍｌ／分、１０μｌの注入体積、２６０ｎｍにおける紫外線吸収によりモニターした）により分析した。親化合物は１.１８分の保持時間で溶出した。消化後の実験において、完全な変換が起こって、０.６３分の保持時間で溶出する新規な表題化合物が生成し、脱リン酸化の指示とすると、リボシドが生ずることが示された。
（ｉｉ）ニコチン酸リボシドの１,４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドへの還元
ＪａｒｍａｎおよびＳｅａｒｌｅ（１９７２）の方法を採用した。この方法を上で製造したニコチン酸リボシドおよび、また、化学的に合成した物質の両者に適用した（Ｊａｒｍａｎ １９６９）。両者の由来源からの出発化合物を使用して同一の結果が得られた。
ニコチン酸リボシドの水溶液（５ｍｌ；４ｍｇ／ｍｌ）に、５０ｍｇの炭酸ナトリウム、５０ｍｇの重炭酸ナトリウム、および５０ｍｇの亜硫酸水素ナトリウムを添加した。栓をした溶液を３７℃において１時間インキュベーションし、そして還元生成物を調製用逆相ＨＰＬＣにより分離した。５ｍｌをマイクロソーブ（ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）５μｍ Ｃ１８（１０×２５０ｍｍ）逆相カラム（ライニン（Ｒａｉｎｉｎ））上に注入し、そして１０ｍＭ ＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯによりｐＨ５に緩衝化した水中のメタノールの勾配（０〜１００％、３０分かけて）により溶離した。溶出液を紫外線吸収および蛍光の両者により連続的にモニターし、そして還元生成物（１２〜１３分の保持時間における基線の分割を使用するクロマトグラフィー）を、３２６ｎｍにおけるその吸収最大（ｐＨ５において；ｐＨ７において３４０ｎｍ）およびその蛍光（ジルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）１２１フルオロメーター、帯域ガラスフィルターを装備した；３５０ｎｍにおける励起中心；４５０ｎｍにおいて放射）の両者により特性決定し、それらの性質のいずれも親化合物を表示しなかった。２ｍＭの溶液の４ｍｌの溶出液（６２００のε６４０（すなわち、ＮＡＤＨと同一）を仮定する）は典型的であり、２.７ｍｇ、すなわち、ほぼ１３％の収率を示した。実験の使用前に、調製物を分析用ＨＰＬＣにより分析しそして本質的に純粋であることが確証された。
（ｉ）Ｍ．ＪａｒｍａｎおよびＦ．Ｓｅａｒｌｅ、潜在的な補酵素のインヒビター−Ｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｖｏｌ．２１、ｐｐ．４５５−４６４、１９７２。
（ｉｉ）Ｍ．Ｊａｒｍａｎ、４−置換ニコチン酸およびニコチンアミド。第ＩＩＩ部。４−メチルニコチン酸リボシドの製造。Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）、９１８−９２０、１９６９。
＜実施例７＞
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼのためのコファクターとして作用する１,４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドの能力
ＣＢ １９５４の還元のためにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの代わりに合成コファクターを使用するできるニトロリダクターゼ酵素の能力を、第１図に示す。ニトロリダクターゼ酵素は、ＣＢ １９５４の還元のためのコファクターとして等しい効能をもつ１,４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドおよびＮＡＤＨの両者を使用することができる。対照的に、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ＤＴジアホラーゼはこの合成コファクターを利用することができない。したがって、１,４−ジヒドロ−ニコチン酸リボシドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼ酵素のための選択的コファクターであり、そして哺乳動物のＤＴジアホラーゼにより使用されることができない。
以下の実施例において、「シリカゲル」は、メルク（Ｍｅｒｃｋ）シリカゲル６０、７０〜２３０メッシュを意味し、そしてプロトンＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ３中で３００ＭＨｚにおいて得た。
＜実施例８＞
４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバミン酸４’−ニトロベンジルエステル：
乾燥ＣＨＣｌ３（５ｍｌ）中の４−ニトロベンジルクロロホルメート（２９５ｍｇ）の撹拌した溶液に、乾燥ＣＨＣｌ３（５ｍｌ）中の４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］アニリン塩酸塩（３６７ｍｇおよびＮＥｔ３（３７７μｌ）の溶液を５分かけて添加した。１時間後、この溶液を２０℃に１８時間保持し、次いで蒸発させた。残留物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけＣＨＣｌ３で溶離すると、標題生成物が黄色固体として得られ、これをベンゼン／石油エーテルからプリズムとして再結晶化した、融点１１１−１１２゜。収量、３６１ｇｍ（６４％）。ＣＨ４を使用する化学的イオン化質量スペクトル：ｍ／ｚ４１２におけるイオン（Ｍ＋１、相対強度１００）はＭ＝４１１を示す。Ｃ１８Ｈ１９Ｎ２Ｏ４Ｃｌ２はＭ＝４１１（Ｃｌ３５アイソトープについて）を必要とする。
Figure 2005040136
＜実施例９＞
４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル４'−ニトロベンジルカーボネート
乾燥ＣＨＣｌ３（１.５ｍｌ）中の４−ニトロベンジルクロロホルメート（５８ｍｇ）の溶液を、乾燥ＣＨＣｌ３（２ｍｌ）中の４−［ビス （２−クロロエチル）アミノ］フェノール塩酸塩（７２ｍｇ）およびＮＥｔ３（７４μｌ）の撹拌した氷冷溶液に添加した。２１゜において１８時間後、この溶液を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、ＣＨＣｌ３／石油エーテル（３：２）で溶離すると、標題化合物が得られ、これはＥＴＯＡｃ／石油エーテルから淡黄色プリズムとして結晶化した、融点７７−７９゜（収量、１０２ｍｇ）。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｚ４１３におけるイオンはＭ＝４１２を示す（Ｃ１８Ｈ１８Ｎ２Ｏ５Ｃｌ２はＭ＝４１２を必要とする）。
Figure 2005040136
＜実施例１０＞
Ｎ−４−ニトロベンジルオキシカルボニル−アクチノマイシンＤ：
ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のアクチノマイシンＤ（ＡＭＤ、４１ｍｇ）を１０％Ｐｄ／Ｃの存在下に２時間水素化し、次いで真空蒸発させた。窒素雰囲気下に残留物を乾燥ＣＨＣｌ３（１.５ｍｌ）中の４−ニトロベンジルクロロホルメートの溶液中に溶解し、そしてＣＨＣｌ３（１.５ｍｌ）中のＮＥｔ３（１０μｌ）の溶液を添加した。窒素雰囲気下に２４時間撹拌した後、触媒を濾過し、そしてこの溶液をＭｅＯＨ（２００ｍｌ）で希釈した後、３日間通気した。この溶液を蒸発させ、そして生成物を逆相Ｃ１８結合シリカの直径１ｃｍのカラム上で半調製用ＨＰＬＣに２回かけ、Ｈ２Ｏ中の５０〜１００％のＭｅＣＮの勾配で溶離してＡＭＤを除去した。標題化合物は酢酸エチル／石油エーテルから赤色プリズムとして結晶化した。収量、３１ｍｇ（６６％）、電子噴射質量スペクトル：ｍ／ｚ１４３４.５（Ｍ＋Ｈ）および１４５６.４（Ｍ＋Ｎａ）におけるイオンはＭ＝１４３.５を示す。Ｃ７０Ｈ９１Ｎ１３Ｏ２０（最低の質量のアイソトープ）はＭ＝１４３３.６５を必要とする。ＮＭＲはＡＭＤと同一の信号＋δ６.７１（ｄ、１Ｈ、ＡｒＣＨ２）、７.０９（ｄ、１Ｈ、ＡｒＣＨ３）および芳香族領域において追加の信号を示す。
＜実施例１１＞
Ｎ−４−ニトロベンジルオキシカルボニル−ドキソルビシンＶＩ
キソルビシン塩酸塩（２.２５ｍｇ）を、トリエチルアミン（ＮＥｔ３）を含有するジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０.３ｍｌ）中に溶解し、そしてＤＭＦ（０.１ｍｌ）中の４−ニトロベンジル−４'−ニトロフェニルカーボネート（１.４ｍｌ）を添加した。暗所で３日間撹拌した後、この混合物をＣ１８逆相シリカのカラム（直径１ｃｍ）上のＨＰＬＣにかけ、０.０１Ｍのギ酸塩緩衝液（ｐＨ４.０）中の２５〜１００％のＭｅＣＮの勾配で溶離することによって分離した。主要な赤色画分を濃縮し、そしてギ酸塩緩衝液の代わりにＨ２Ｏで再クロマトグラフィーにかけた。真空蒸発させると、生成物（２.１ｍｇ）が非晶質赤色粉末として得られた。電子噴射ＭＳ：７２３（Ｍ＋Ｈ）におけるイオンはＭ＝７２２を示す。Ｃ３５Ｈ３４Ｎ２Ｏ１５Ｍ＝７２２を必要とする。
＜実施例１２＞
実施例１１Ｎ−４−ニトロベンジルオキシカルボニル−マイトマイシンＣ
ＮＥｔ３（１４μｌ）を含有するジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
（２ｍｌ）中のマイトマイシンＣ（３６ｍｇ）の溶液を４−ニトロベンジルクロロホルメート（３０ｍｇ）に添加し、そしてこの混合物を２１゜において４時間撹拌した。真空蒸発後、残留物をシリカゲルのカラムのクロマトグラフィーにかけ、ＥｔＯＡｃで溶離すると、標題化合物が暗色赤色固体（４９ｍｇ）として得られた。電子噴射ＭＳ：５１４（Ｍ＋Ｈ）におけるイオンはＭ＝５１３を示す。Ｃ２３Ｈ２３Ｎ５Ｏ９Ｍ＝５１３を必要とする。
＜実施例１３＞
プロドラッグＶへのニトロリダクターゼの作用によるアクチノマイシンＤの形成
Ｖ（１００μＭ）およびコファクター（５００μＭのＮＡＤＨ）を、酵素（２μｇ／ｍｌの実施例１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼ）と１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で空気下に３７℃においてインキュベーションした。種々の時間において、アリコート（２０μｌ）をマイクロソーブ（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）Ｃ１８逆相（２４０×４.７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして水中の８０％アセトニトリルで無勾配的（１ｍｌ／分）に溶離した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸収について連続的にモニターし、そしてＨＰＬＣの形跡上のこの化合物に相当するピークの積分により薬物の濃度を計算した。酵素が存在するときにのみ、アクチノマイシンＤはプロドラッグから解放された。
実施例１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼとのインキュベーションの間における、プロドラッグＮ−４−ニトロ−ベンジルオキシカルボニル−アクチノマイシンＤ（Ｖ）の消失およびアクチノマイシンＤの形成を第２図に示す。
＜実施例１４＞
プロドラッグＶＩＩへのニトロリダクターゼ酵素の作用によるマイトマイシンＣの形成
プロドラッグＶＩＩ（１００μＭ）およびコファクター（５００μＭのＮＡＤＨ）を酵素（５μｇ／ｍｌの実施例１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂニトロリダクターゼ）と、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中の空気下に３７℃においてインキュベーションした。種々の時間において、アリコート（１０μｌ）をパーチシスフェアーＣ１８逆相 （１５０×４.７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして水中の５０％メタノールで無勾配的（２.０ｍｌ／分）に溶離した。溶出液を２６０および３４０ｎｍにおける吸収について連続的にモニターし、そしてＨＰＬＣの形跡上のこの化合物に相当するピークの積分により薬物の濃度を計算した。
このインキュベーションの間のプロドラッグＶＩＩの消失およびマイトマイシンＣの形成を第３図に示す。酵素の存在下においてのみ、マイトマイシンＣはプロドラッグから解放された。
＜実施例１５＞
ニトロリダクターゼによるＲ１ＮＨ２＝ＩＩＩのプロドラッグＩおよびプロドラッグＶによる活性化
プロドラッグ４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバミン酸４'−ニトロベンジルエステルＩ（ＩここでＲ１ＮＨ２＝ＩＩＩ）およびＮ−４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル−アクチノマイシンＤ（Ｖ）への実施例１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼの作用による細胞障害性の発生を表８に示す。
Figure 2005040136
＜実施例１６＞
抗体：酵素結合体の製造および結合
ヘテロ２官能性剤のスクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）を使用して活性マレイミド基を免疫グロブリンの中に挿入し、そして２−メルカプト−［Ｓ−アセチル］酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＡＴＡ）を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼをチオレート化することによって、Ａ５７Ｂ７ Ｆ（ａｂ）２の抗体：酵素結合体：ニトロリダクターゼを製造した。タンパク質を混合すると、マレイミド基はチールと反応してチオエーテル結合を形成した。使用したＳＭＰＢ：免疫グロブリンのモル比は１０：１であり、そしてＳＡＴＡ：ニトロリダクターゼのモル比は４：１であった。こうして製造された抗体：酵素結合体を、高分子量の凝集体および結合しない成分から、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２００の目盛り定めしたカラム（１６×７００ｍｍ）を使用する濾過クロマトグラフィーにより単離した。このカラムをリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で平衡化し、そして同一緩衝液で１.０ｍｌ／分の流速において溶離した。分子量が２：１および１：１結合体（それぞれ、３１６ｋＤａおよび ２３３ｋＤａ）に相当する物質を含有する画分をプールし、そして同一カラム上の再クロマトグラフィーにかけ、そしてプールした画分から の試料を非還元性条件下に目盛り定めタンパク質と一緒に４〜１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ファーマシア・ファストゲル、６０ｖｈの間の展 開）上で展開した。結合体は分子量１２５ｋＤａの物質（１：１のＦ （ａｂ'）２：ニトロリダクターゼおよびより高い分子量の結合体ならびに少量の遊離のＦ（ａｂ'）２およびニトロリダクターゼに相当する）として存在した。
この結合体の酵素活性は、基質としてＣＢ１９５４を使用する日常的アッセイにより確立された。この結合体は１μｇ／ｍｌＣＥＡで被覆したプレートに結合し、そしてウサギ抗マウス免疫グロブリンおよびウサギ抗ニトロリダクターゼ二次抗体の両者のための結合部位を含有することが示された（第４図）。結合しなかったＦ（ａｂ'）２およびニトロリダクターゼの試料を使用して、二次抗体の結合の特異性を確証した。
標準のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）比色ＥＬＩＳＡアッセイを使用して抗体の結合を決定し、結果を４０５ｎｍにおいて読んだ。第４図上の倒立白抜き三角形は、結合したＡ５７Ｂ７Ｆ（ａｂ'）２−ニトロリダクターゼ結合体をヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体で検出できることを示し、そして閉じた三角形は結合体が、また、ウサギ抗ＮＲ抗体により検出されることを示す（抗ＮＲ抗体はヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体の使用を介して検出される。第４図に示す対照は次の通りである：閉じた円＝接合しなかったＡ５７Ｂ７Ｆ（ａｂ'）２の結合；白抜きの正方形＝ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンで検出されたＡ５７Ｂ７Ｆ（ａｂ'）２−ＮＲ結合体；閉じた正方形＝ウサギ抗ＮＲでのみ検出されたＮＲ；白抜きの三角形＝ヤギ抗マウス免疫グロブリンでのみ検出されたＮＲ。
＜実施例１７＞
プロドラッグのｉｎ ｖｉｖｏ活性
式ＶのアクチノマイシンＤプロドラッグ（ＡＭＤＰＤ）をマウスにおいて毒性について試験した。３匹のマウスのグループに、１、１０または１００ｍｇ／ｋｇ体重ｉ．ｐ．のＡＭＰＤを与え、そして３匹のマウスの他のグループに、落花生油中に溶解した１および１０ｍｇ／ｋｇ体重ｉ．ｐ．のアクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）を与えた。３匹のマウスの他のグループは未処置であり、そして３匹の最後のグループに落花生油ｉ．ｐ．のみを与えた。
マウスの体重を９日かけてモニターした。結果を表９に示す。１０ｍｇ／ｋｇのＡＭＤで処置したすべてのマウスは第１日に死亡した。５ｍｇ／ｋｇの投与量で同様な結果が得られた。これらのデータが示すように、ＡＭＤＰＤはＡＭＤより少なくとも２０〜１００倍毒性が低い。実際に、ＡＭＤＰＤの毒性はなおいっそう低いように思われる。なぜなら、使用したＡＭＤＰＤの調製物は約１％の未変換のＡＭＤを含有するからである。
Figure 2005040136
実験の結果を示し、この実験においてＣＢ １９５４（１００μＭ）および還元型コファクター（５００μＭ）を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で、酵素（２ｍｇ／ｍｌ）大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）ニトロリダクターゼ（Ａ）または２５μｇ／ｍｌのウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ＤＴジアホラーゼ（Ｂ）と空気中で３７℃に おいてインキュベーションした。種々の時間において、アリコート（１０μｌ）をパーチシル（Ｐｒｔｉｓｉｌ）ＳＣＸ（２４０×４.７ｍｍ）ＨＰＬＣカラム上に注入し、そして１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で無勾配的に（２ｍｌ／分）溶離した。溶出液を連続的に３２０、２６０および３６０ｎｍにおける吸収についてモニターし、そしてＨＰＬＣの形跡上のこの化合物に相当するピークの積分によりＣＢ １９５４の濃度を計算した。 細胞へのアクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）のプロドラッグと本発明のニトロリダクターゼとのインキュベーションの間のＡＭＤの形成を示す。 マイトマイシン（ＭＣ）のプロドラッグと本発明のニトロリダクターゼとのインキュベーションの間のＭＣの形成を示す。 本発明による抗体−酵素結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏの結合を示す。

Claims (2)

  1. 下記の特徴：
    １：約２４ｋＤａの分子量を有するフラボタンパク質である；
    ２：コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする；
    ３：ＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈについて１〜１００μＭの範囲のＫｍを有する；および
    ４：ＣＢ １９５４のいずれかまたは両者のニトロ基を細胞障害性の形態に還元することができる、
    を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂのニトロリダクターゼをコードする単離されたＤＮＡ分子。
  2. 配列番号：２のアミノ酸配列を有するニトロリダーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子。
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