KR20080080109A - 도파민성 뉴런의 신경돌기 성장 및 생존의 촉진 방법 - Google Patents

도파민성 뉴런의 신경돌기 성장 및 생존의 촉진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 도파민성 뉴런을 Sp35 길항제를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 도파민성 뉴런의 재생, 성장 및 생존을 촉진하기 위한 방법에 관한 것이다. 부가적으로는, 본 발명은 일반적으로 Sp35 길항제의 투여에 의한 도파민성 신경 퇴행 또는 사멸과 관련된 다양한 질환, 장애 또는 손상의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

도파민성 뉴런의 신경돌기 성장 및 생존의 촉진 방법 {METHODS FOR PROMOTING NEURITE OUTGROWTH AND SURVIVAL OF DOPAMINERGIC NEURONS}
본 발명은 신경학, 신경생물학 및 분자생물학에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 도파민성 신경돌기 재생, 도파민성 뉴런 (DA 뉴런) 의 성장 및 생존에 관한 것이다. 부가적으로는, 본 발명은 Sp35 (LINGO-1) 수용체 길항제의 투여에 의한 도파민성 신경 퇴행 또는 사멸을 포함하는 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
특정 신경퇴행성 장애는 도파민성 뉴런의 퇴행을 특징으로 한다. 예를 들어, 파킨슨 질환은 중뇌의 흑색질에서 도파민성 뉴런의 진행성 파괴와 관련된다. 상기 파괴는 화학적 전달물질 도파민의 수준의 감소를 야기한다. 파킨슨 질환의 물리적 증상은 특징적인 몸떨림을 도출하는 근육 군의 수의운동 및 제어불가 율동적 근 연축의 장애를 포함한다.
파킨슨 질환 치료에 가장 광범위하게 사용되는 치료는, 잔존 도파민 뉴런에 의해 주로 카르복실기가 제거된 후에, 결손 도파민을 치환함으로써 간접적으로 작용하는 도파민 전구체 L-도파 (L-3,4-디히드록시페닐알라닌) 을 투여하는 것이다. 그러나, L-도파의 사용과 관련하여 단점이 있다. 환자는 부작용, 예컨대 운 동장애, 메스꺼움, 구토, 복부팽만 및 정신적 부작용으로부터 자주 고통받고, 환자는 통상적으로 시간경과에 따른 L-도파 치료에 대한 반응성이 감소하게 된다. L-도파 치료가 시간경과에 따라 효능이 감소한다고 제안된 이유 중의 하나는, 생존 도파민성 뉴런의 수가 감소되고, 이에 따라 투여된 L-도파에 반응할 수 없다는 것이다. Isacson O., "Problems and solutions for circuits and synapses in Parkinson's disease," Neuron 43: 165-168 (2004) 참조. 또한, L-도파의 효능은, 도파민성 뉴런의 사멸에 기인하여 뉴런의 연결 (말단 또는 시냅스) 의 연속적인 손실에 따라 감소한다. Id 참조. 시냅스 후부의 도파민 작용제를 사용한 치료의 대안적인 형태도 또한 부작용과 관련된다. 또한, L-도파 치료가 환자의 삶의 질을 개선시킬 수 있을비장도, 질환의 진행을 중지시키지는 못한다.
기타 화합물, 예컨대 신경아교세포계 유래 신경영양인자 (glial-cell-line-derived neurotrophic factor; GDNF) 가 만성 주입이 될 때, 인간 환자의 파킨슨 질환 치료에 있어서 가능성을 보여왔다. 예컨대, Gill et al., "Direct brain infusion of glial cell line derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9: 589-95 (2003) 참조. 그러나, 상기 치료요법은 여전히 발달 초기 단계이다.
많은 기타 질환 및 장애는 도파민성 뉴런의 퇴행을 포함할 수 있다. 여기에는, 다계통 위축증, 선조체 퇴행, 올리브교 소뇌위축, 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군, 파킨슨증의 특징을 갖는 운동 뉴런 질환, 루이 소체 치매, 진행성 핵상 마비, 피질-기저 핵 변성, 전측두엽 치매, 파킨슨증이 있는 알쯔하이머 질환, 윌슨 (Wilson) 질환, 할러포르텐-스파츠 (Hallervordern-Spatz) 질환, 세디아크-히가시 (Chediak-Hagashi) 질환, SCA-3 척수소뇌성 실조증, X-연관 근육긴장 이상-파킨슨증 (DYT3), 헌팅톤 (Huntington) 질환 (웨스트팔 (Westphal) 변이체), 프리온 질환, 야콥-크루츠펠트 질환, 혈관 파킨슨증, 뇌성 마비, 반복된 두부 외상, 뇌염후 파킨슨증, 정신분열 및 신경매독이 포함된다.
따라서, 파킨슨 질환 및 도파민성 뉴런의 퇴행 또는 사멸을 특징으로 하는 다른 상태의 부가적인 치료방법이 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 LINGO-1 이 중뇌 도파민성 (DA) 뉴런에서 발현되고, 신경돌기 성장 및 DA 뉴런 생존을 네거티브하게 조절한다는 발견에 기초한 것이다. 상기 발견에 기초하여, 본 발명은 일반적으로 Sp35 길항제를 함유하는 조성물의 유효량과 상기 도파민성 뉴런을 접촉하는 것을 포함하는 도파민성 뉴런의 증식, 생존, 회복, 성장 및 재생을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 일반적으로 Sp35 길항제의 투여에 의해 도파민성 신경 퇴행 또는 사멸과 관련된 다양한 질환, 장애 또는 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Sp35 길항제를 함유하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 도파민성 뉴런의 재생, 성장 또는 생존을 촉진하는 방법을 포함한다.
부가적인 구현예에서, 도파민성 신경돌기 퇴행 또는 사멸을 포함하는 질환, 장애, 손상 또는 상태를 갖는 포유동물을 진단한다. 일부 구현예에서, 질환, 장애, 손상 또는 상태는 파킨슨 질환 (PD), 다계통 위축증, 선조체 퇴행, 올리브교 소뇌위축, 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군, 파킨슨증의 특징을 갖는 운동 뉴런 질환, 루이 소체 치매, 진행성 핵상 마비, 피질-기저 핵 변성, 전측두엽 치매, 파킨슨증이 있는 알쯔하이머 질환, 윌슨 (Wilson) 질환, 할러포르텐-스파츠 (Hallervordern-Spatz) 질환, 세디아크-히가시 (Chediak-Hagashi) 질환, SCA-3 척수소뇌성 실조증, X-연관 근육긴장 이상-파킨슨증 (DYT3), 헌팅톤 (Huntington) 질환 (웨스트팔 (Westphal) 변이체), 프리온 질환, 야콥-크루츠펠트 질환 (CJD), 혈관 파킨슨증, 뇌성 마비, 반복된 두부 외상, 뇌염후 파킨슨증, 신경매독 및 정신분열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 방법들의 다양한 구현예에서, Sp35 길항제는 도파민성 신경 재생, 성장 또는 생존을 네거티브하게 조절하기 위하여 Sp35의 기능을 방해하는 임의의 분자일 수 있다. 특정 구현예에서, Sp35 길항제는 가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 항체 또는 그의 조각, Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드 (예컨대, RNA 간섭), Sp35 압타머, 또는 2개 이상의 Sp35 길항제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, Sp35 길항제는 가용성 Sp35 폴리펩티드이다. 본 발명의 특정 가용성 Sp35 폴리펩티드에는, 하나 이상의 하기 도메인이 포함되거나 결손된 가용성 Sp35 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: (i) Sp35 류신-풍부 반복 (Leucine-Rich Repeat; LRR) 도메인, (ii) LRR 도메인으로의 Sp35 염기성 영역 C-말단, 및 (iii) Sp35 면역글로불린 (Ig) 도메인. 일부 구현예에서, 가용성 Sp35 폴리펩티드는 Sp35 Ig 도메인, Sp35 LRR 도메인, 막투과 도메인, 및 세포질 도메인이 결손되어 있다. 본 발명의 부가적인 Sp35 가용성 폴리펩티드에는, 막투과 도메인 및 세포질 도메인이 결손되어 있는 폴리펩티드가 포함된다. 일부 구현예에서, 가용성 Sp35 폴리펩티드는 Sp35 LRR 도메인을 포함하며, Sp35 Ig 도메인, Sp35 염기성 영역, 막투과 도메인, 및 세포질 도메인이 결손되어 있다. 일부 구현예에서, 가용성 Sp35 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 34-532 또는 SEQ ID NO:2 의 36-532 의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, Sp35 길항제는 비-Sp35 부분을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 비-Sp35 부분은 항체 Ig 부분, 혈청 알부민 부분, 표적 부분, 리포터 부분, 및 정제-용이 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 Ig 부분은 경첩 및 Fc 부분이다.
대안적인 구현예에서, Sp35 길항제는 하나 이상의 하기 Sp35 도메인을 포함하는 Sp35 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 그의 조각이다: (i) Sp35 류신-풍부 반복 (LRR) 도메인, (ii) LRR 도메인으로의 Sp35 염기성 영역 C-말단, 및 (iii) Sp35 면역글로불린 (Ig) 도메인. 부가적으로는, Sp35 항체 또는 그의 조각은 본원에 기재된 Sp35 폴리펩티드 조각을 포함하는 폴리펩티드 내에서 에피토프와 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, Sp35 길항제는 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 폴리뉴클레오티드, 압타머, 리보자임, 소형 간섭 RNA (small interfering RNA; siRNA), 또는 소형-헤어핀 RNA (small-hairpin RNA; shRNA) 이다.
부가적인 구현예에서, Sp35 길항제는 Sp35 압타머이다. Sp35 압타머는 소형 폴리펩티드 또는 Sp35 에 결합하는 폴리뉴클레오티드이고, 이는 도파민성 뉴런의 재생, 성장 및 생존을 네거티브하게 조절하는 Sp35 의 기능을 방해한다.
본 발명의 추가의 구현예에는, 손상의 부위에서 또는 그 근처에서, 도파민성 신경 재생, 성장 또는 생존의 억제를 감소시키는 충분한 양으로, Sp35 길항제가 포유동물의 뉴클레오티드 서열로부터 발현되도록 하는, Sp35 길항제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 질환, 장애 또는 손상의 부위에서 또는 그 근처에서, 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 생체내 ( in vivo ) 유전자 치료법에 의해, 도파민성 뉴런의 재생, 성장 및 생존을 촉진하는 방법, 또는 도파민성 신경돌기 퇴행 또는 사멸을 포함하는 질환, 장애 또는 손상을 치료하는 방법이 포함된다. 특정 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 엡스테인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 파보바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 경막내 투여, 경막하 투여 및 피하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 질환, 장애, 손상 또는 상태는 파킨슨 질환 (PD), 다계통 위축증, 선조체 퇴행, 올리브교 소뇌위축, 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군, 파킨슨증의 특징을 갖는 운동 뉴런 질환, 루이 소체 치매, 진행성 핵상 마비, 피질-기저 핵 변성, 전측두엽 치매, 파킨슨증이 있는 알쯔하이머 질환, 윌슨 (Wilson) 질환, 할러포르텐-스파츠 (Hallervordern-Spatz) 질환, 세디아크-히가시 (Chediak-Hagashi) 질환, SCA-3 척수소뇌성 실조증, X-연관 근육긴장 이상-파킨슨증 (DYT3), 헌팅톤 (Huntington) 질환 (웨스트팔 (Westphal) 변이체), 프리온 질환, 야콥-크루츠펠트 질환 (CJD), 혈관 파킨슨증, 뇌성 마비, 반복된 두부 외상, 뇌염후 파킨슨증, 신경매독 및 정신분열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
부가적으로, 본 발명에는 (a) Sp35 길항제를 코딩하는 도파민성 뉴런 폴리뉴클레오티드로 도입하는 단계; 및 (b) 상기 Sp35 길항제를 발현가능하도록 하는 단계를 포함하는, 도파민성 뉴런의 재생, 성장 및 생존을 촉진하는 방법, 또는 도파민성 신경돌기 퇴행 또는 사멸을 포함하는 포유동물의 질환, 장애 또는 손상을 치료하는 방법이 포함된다. 부가적으로, 본 발명은 (a) 발현 조절 서열에 작용할 수 있는 연결을 통하여, Sp35 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물에 투여하는 단계, 및 (b) 상기 Sp35 길항제를 발현가능하도록 하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 배양된 숙주 세포는 치료되는 포유동물로부터 유래된 것이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 트랜스펙션, 전기천공, 바이러스 형질도입 또는 직접 미세주사를 통해 숙주 세포 또는 도파민성 뉴런으로 도입된다. 특정 구현예에서, 치료되는 질환, 장애, 손상 또는 상태는 파킨슨 질환 (PD), 다계통 위축증, 선조체 퇴행, 올리브교 소뇌위축, 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군, 파킨슨증의 특징을 갖는 운동 뉴런 질환, 루이 소체 치매, 진행성 핵상 마비, 피질-기저 핵 변성, 전측두엽 치매, 파킨슨증이 있는 알쯔하이머 질환, 윌슨 (Wilson) 질환, 할러포르텐-스파츠 (Hallervordern-Spatz) 질환, 세디아크-히가시 (Chediak-Hagashi) 질환, SCA-3 척수소뇌성 실조증, X-연관 근육긴장 이상-파킨슨증 (DYT3), 헌팅톤 (Huntington) 질환 (웨스트팔 (Westphal) 변이체), 프리온 질환, 야콥-크루츠펠트 질환 (CJD), 혈관 파킨슨증, 뇌성 마비, 반복된 두부 외상, 뇌염후 파킨슨증, 신경매독 및 정신분열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 압타머 및 항체는 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴리알킬렌 글리콜, 당 중합체, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체는 1, 2, 3 또는 4 개의 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 중합체의 총분자량은 5,000 Da 내지 100,000 Da 이다.
도 1: Sp35 단백질이 없는 대조군 Fc (*p<0.003) 및 대조군 렌티바이러스 (*p<0.05) 에 비해, 벡터 대조군, FL-Sp35 (FL-LINGO-1) 및 DN-Sp35 (DN-LINGO-1) 으로 형질도입되거나, 또는 가용성 Sp35-Fc (LINGO-1-Fc) 단백질로 처리된 1차 래트 DA 뉴런 배양물의 도파민성 뉴런 성장을 보여주는 그래프.
도 2: 전장 Sp35 (FL-LINGO-1), 우세-음성 Sp35, (DN-LINGO-1) 또는 대조군 렌티바이러스를 생성하는 렌티바이러스로 감염되고, 10μM 1-메틸-페닐피리듐 이온 (MPP+) 또는 MPP+ 를 투여하는데 사용되는 운반체 조성물만로 처리된, 배양된 래트 의 배쪽 중간뇌 (VM) 뉴런의 생존을 보여주는 그래프. MPP+ 에 노출되었을 때, DN-SP35 와 함께 배양된 티로신 가수분해효소 (TH) 뉴런의 수는, FL-Sp35 및 대조군에 비해 특히 더 높았다 (*p<0.05, One-way ANOVA).
도 3: Sp35-Fc (LINGO-1-Fc) 또는 1A7 Sp35 길항제 항체 및 대조군 Fc 또는 대조군 항체로 처리된 VM 의 TH 뉴런 수를 보여주는 그래프. MPP+ 에 노출되었을 때, Sp35-Fc 또는 1A7 의 처리가 대조군 Fc 또는 대조군 항체에 비해, 더 많은 수의 뉴런을 야기하였다 (1A7 에 대해, *p<0.01 이고, Sp35-Fc 에 대해, *p<0.05, One-way ANOVA).
도 4: DN-LINGO-1, FL-LINGO-1 또는 대조군의 형질도입 후에, VM 일차 래트 뉴런 배양의 인산화된 Akt (p-Akt) 의 웨스턴 블럿. 인산화된 Akt 의 증가는 FL-LINGO-1 및 대조군과 비교할 때, DN-LINGO-1 로 형질도입된 세포에서 관찰된다.
도 5: 야생형 마우스에 대비한 Sp35 녹-아웃 마우스의 운동 비대칭 (motor asymmetry) 을 나타낸 그래프. 운동 비대칭은 야생형 (WT) 및 녹-아웃 (KO) 마우스의 왼쪽 선조체에 6-히드록시도파민 (6-OHDA) 을 주입하고, 1, 2, 3 및 4주 후에 평가되었다. 운동 비대칭은 야생형에 비해, 녹-아웃 마우스에서 특히 더 낮았다 (*p=0.001, Two-way ANOVA).
도 6A 내지 6F: 도 6A 는 6-OHDA 실험에서 야생형 및 녹-아웃 마우스의 비병변 중뇌의 TH 뉴런의 수를 보여주는 그래프이다. 도 6B 는 6-OHDA 실험에서 녹-아웃 마우스 및 야생형 마우스의 반대쪽 비병변 측의 TH 뉴런의 수를 보여주는 그래프이다. TH 뉴런의 백분율은 WT 마우스에서보다 KO 마우스에서 통계적으로 더 컸다 (*p=0.001, 짝지워지지 않은 t-검증법). 도 6C 는 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP) 실험에서 야생형 및 녹-아웃 마우스의 TH 뉴런의 수를 보여주는 그래프이다. TH 뉴런의 백분율은 WT 마우스에서보다 KO 에서 통계적으로 더 컸다 (*p=0.002, 짝지워지지 않은 t-검증법). 도 6D 는 MPTP 에 노출되지 않은 마우스에 대비해, MPTP 에 노출된 후 WT 및 KO 마우스의 인산환된 Akt (P-Akt) 의 수준을 보여주는 웨스턴 블럿이다. 도 6E 는 식염수 및 MPTP (각 군에 대해, n=6) 로 처리된 WT 및 KO VM 의 인산화된 Akt (p-Akt), Akt 및 베타-액틴의 웨스턴 블럿이다. 도 6F 는 MPTP 처리된 WT (*p<0.05) 및 식염수 처리된 KO VM (#p<0.05, 각 군에 대해 n=6) 에 대비해, MPTP 처리된 마우스에서 7일째의 p-Akt 수준이 특히 더 높았음을 보여주는 그래프이다.
도 7A 내지 7G: 도 7A 는 Sp35 항체 (1A7) 또는 대조군 항체로 처리된 VM TH 뉴런의 P-Akt 및 표피성장인자 수용체 (EGFR) 발현의 웨스턴 블럿이다. 도 7B 는 Sp35-Fc 또는 대조군으로 처리된 VM TH 뉴런의 EGFR 및 P-Akt 발현의 웨스턴 블럿이다. 도 7C 는 Sp35-Fc 또는 Sp35 항체 (1A7) 로 처리된 VM 배양의 EGFR, p-Akt, 총 Akt 및 베타-액틴의 웨스턴 블럿이다. 도 7D 는 Sp35 및/또는 EGFR 로 트랜스펙션된 배양 세포에서 EGFR 및 Sp35 의 공동-면역침전이다. + 또는 - 는 EGFR 및 Sp35 의 존재 (+) 또는 부재 (-) 를 나타낸다. IP 는 면역침전에 사용되는 항체를 나타내고, IB 는 웨스턴 블럿에 사용되는 항체를 나타낸다. 도 7E 는 WT 및 KO VM 에서 EGFR 및 LINGO-1 의 공동-면역침전이다. 도 7F 는 Sp35 항체 1A7 가 공동-트랜스펙션된 세포주에서 EGFR 로의 Sp35 의 결합을 차단하 는 것을 보여주는 웨스턴 블럿이다. 부가적으로는, 다른 Sp35 항체 2F3 은 EGFR 에 대한 Sp35 의 결합을 차단하지 않는다. 희소돌기아교세포-미엘린 당단백질 (OMgp) 의 트랜스펙션은 대조군으로서 사용되었다. 도 7G 는 대조군 및 Fc 조각에 대비해, 1A7 및 Sp35-Fc 처리된 배양에서 p-Akt 정도의 통계적 분석을 각각 보여주는 그래프이다.
도 8: 6-OHDA 유도 실험적 파킨슨증을 나타내는 WT 및 KO 마우스의 VM 의 비병변 및 병변 면에서 TH 뉴런 수를 보여주는 그래프.
도 9: 6-OHDA 병변 후, Sp35 단백질 값의 변화를 보여주는 그래프. 야생형 마우스에서 선조체의 6-OHDA 투여 3 일 후에, 반대쪽 면 (대조군) 에 비해, Sp35 는 병변 면 (6-OHDA) 에서 상향조절된다 (각각의 시점에서, n=3, 짝지워지지 않은 스튜던트 t-검증법, *p<0.05).
도 10: 식염수 (WT: n=7, KO: n=8) 및 MPTP (각 군에서, n=10) 로 처리된 WT 및 KO 마우스의 흑색질 치밀부분 (substantial niagra compacta; SNc) 에서 TH 뉴런의 수를 보여주는 그래프.
도 11: 식염수 또는 MPTP 로 처리된 KO 및 WT 마우스에서 선조체의 도파민 (DA) 수준 (ng/ml) 을 보여주는 그래프.
도 12: 0, 1 및 5 MOI 에서 FL-Sp35 를 발현하는 렌티바이러스로 트랜스펙션된 2 일 후의 COS-7 세포에서 Sp35 및 EGFR 발현을 보여주는 웨스턴 블럿.
도 13A-13B: 도 13A 는 대조군에 대비해, 파킨슨 질환 환자 (PD) 의 흑색질에서 Sp35 의 수준의 유의적 증가를 보여주는, 반-정량적 PCR 반응의 결과를 보여 주는 젤이다. 도 13B 는 대조군에 대비해, 파킨슨 질환 환자 (PD) 의 흑색질에서 Sp35 의 정규화된 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다.
도 14A-B: 도 14A 는 KO (-/-) 및 WT (+/+) 마우스 (각각의 군에서, n=6) 에서, 도파민 운반 (DAT) 수준을 보여주는 웨스턴 블럿이다. 도 14B 는 WT 및 KO 마우스의 상대적인 DAT 수준을 보여주는 그래프이다. WT 및 KO 마우스 (짝지워지지 않은 스튜던트 t-검증법, p>0.05) 의 DAT 발현의 유의적인 차이점은 없다.
도 15A-15C: 도 15A 는 MPTP (*p<0.05, n=9) 에 노출되었을 때, 대조군에 비해 Sp35-Fc 를 주사한 마우스의 SNc 에서 TH 뉴런의 수를 보여주는 그래프이다. 도 15B 는 MPTP (*p<0.05, n=9) 에 노출되었을 때, 대조군에 비해 Sp35-Fc 마우스의 선조체의 도파민 값을 보여주는 그래프이다. 도 15C 는 MPTP 에 노출되었을 때, 대조군에 비해 Sp35-Fc 를 주사한 마우스의 선조체의 MPP+ 수준을 보여주는 그래프이다.
본 발명의 상세한 설명
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 모순되는 경우, 정의를 포함하는 본 출원이 조절할 것이다. 문맥상 달리 필요하지 않다면, 단수의 용어는 복수를 포함하고, 복수의 용어는 단수를 포함하여야 한다. 본원에 언급된 모든 문헌, 특허 및 기타 참조는, 마치 각각의 개별적인 문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 삽입될 것으로 지시되는 것처럼, 모든 목적을 위해 완전히 참조로 삽입된다.
비록 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 적절한 방법 및 물질은 하기에 기재한다. 물질, 방법 및 실시예는 오직 실례일 뿐이고, 이에 제한시키려는 것은 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
본 발명을 더 명확히 하기 위하여, 하기의 용어 및 정의를 제시한다.
"하나의" 존재라는 용어는 하나 이상의 존재를 나타내는 것이 이해되어야 한다; 예를 들어, "면역글로불린 분자" 는 하나 이상의 면역글로불린 분자를 나타내는 것이 이해되어야 한다. 이와 같이, "하나의", "하나 이상의" 및 "적어도 하나의" 라는 용어는 본원에서 호환하여 사용될 수 있다.
본원 명세서 및 특허청구범위를 통해, "포함한다" 라는 용어, 또는 "포함하는" 과 같은 그의 변형은 임의의 정수 또는 정수 군의 포함을 의미하는 것이지, 임의의 다른 정수 또는 정수 군의 배제를 의미하는 것이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 은 바람직한 치료 결과를 달성하기 위하여, 필요한 시간 동안의 투여량에서 효과적인 양을 나타낸다. 치료 결과는, 예컨대 증상의 완화, 연장된 생존, 개선된 운동성 등일 수 있다. 치료 결과가 "치유" 일 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 이라는 용어는 질환의 증상을 개선하거나 완화시키기 위하여, 동물에게 작용제를 투여하는 것을 나타낸다. 부가적으로는, "치료" 또는 "치료하는" 이라는 용어는 질환의 진행을 방지하기 위하여, 동물에게 작용제를 투여하는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방 유효량" 은 바람직한 예방 결과를 달성하기 위하여, 필요한 시간 동안의 투여량에서 효과적인 양을 나타낸다. 통상적으로, 예방 투여량은 질환의 초기 단계에서 또는 그에 앞서 대상에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료적 유효량보다 더 작을 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 는 비번역 5' 및 3' 서열, 코딩 서열, 뿐만 아니라 핵산 서열의 조각, 에피토프, 도메인, 및 변이체를 포함하는, 전장 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA 일 수 있는, 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 단일- 및 이중-나선 DNA, 단일- 및 이중-나선 영역이 조합된 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA, 및 단일- 및 이중-나선 영역이 조합된 RNA, 단일-나선, 또는 더 통상적으로는, 이중-나선 또는 단일- 및 이중-나선 영역의 조합일 수 있는 DNA 및 RNA 를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 삼중-나선 영역으로 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 안정성 또는 다른 이유로 변형된 하나 이상의 변이된 염기 또는 DNA 또는 RNA 백본을 포함할 수 있다. "변형된" 염기에는, 예를 들어, 트리틸화 염기 및 특이한 염기, 예컨대 이노신이 포함된다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA 에 발생할 수 있다; 따라서, "폴리뉴 클레오티드" 는 화학적으로, 효소적으로, 또는 물질대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
본 발명에서, "폴리펩티드" 는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉, 펩티드 동배체 (isostere) 에 의해 서로 결합된 아미노산으로 이루어질 수 있고, 20 개의 유전자로 코딩되는 아미노산 외의 아미노산 (예컨대, 자연적으로 발생하지 않은 아미노산) 을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 자연적인 과정, 예컨대 번역 후의 과정, 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 상기 변형은 방대한 연구 논문에서뿐만 아니라, 기본 교재 및 더 자세한 전공논문에서 잘 기재되어 있다 변형은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는, 폴리펩티드의 어디에서도 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형은 주어진 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것이 인정될 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들어, 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 이는 분지되거나 또는 분지되지 않고 고리형이 될 수 있다. 고리형, 분지형, 및 분지된 고리형 폴리펩티드는 번역 후의 자연적인 과정으로부터 유래될 수 있거나, 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형에는, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 부분의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 교차-연결, 고리화, 이황 결합 형성, 탈메틸화, 공유 교차-연결의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포 르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 고정 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길화, 단백질 가수분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 아미노산의 운반-RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화가 포함된다. (예를 들어, Proteins - Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman 및 Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); rattan et al., Ann NY Acad Sci 663 :48-62 (1992) 참조.)
본 발명의 Sp35 길항제를 나타낼 때 "조각," "변이체," "유도체" 및 "유사체" 용어에는, Sp35 활성을 억제하는 일정 기능을 적어도 보유하는 임의의 길항제 분자가 포함된다. 본원에 기재된 Sp35 길항제에는, Sp35 길항제가 여전히 그의 기능을 제공하는 한, 조각, 변이체, 또는 유도체 분자가 포함될 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 가용성 Sp35 폴리펩티드에는, Sp35 단백질 가수분해 조각, 결실 조각, 및 특히 동물에게로 이동될 때 작용 부위에 더 용이하게 도달하는 조각이 포함될 수 있다. 폴리펩티드 조각에는 추가로, 3차원 에피토프 뿐만 아니라 선형 에피토프를 포함하는, 자연적인 폴리펩티드의 항원성 또는 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 임의의 부분이 포함된다. 본 발명의 가용성 Sp35 폴리펩티드에는, 상기 기재된 조각을 포함하는 변이체 Sp35 영역, 및 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 기인한 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 가 포함될 수 있다. 변이체는 자연적으로 발생할 수 있으며, 예컨대 대립형질 변이체일 수 있다. "대립형질 (allelic) 변이체" 는 유기체의 염색체 상에서 주어진 유전자 좌를 차지하는 유전자의 형태가 의도적으로 교체된다. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). 비자연적으로 발생된 변이체는 당업계에 알려진 돌연변이 생성 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 가용성 Sp35 폴리펩티드에는, 보존 또는 비보존 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 포함될 수 있다. 본 발명의 Sp35 길항제에는 또한 유도체 분자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 가용성 Sp35 폴리펩티드에는, 자연적인 폴리펩티드 상에서 발견되지 않는 부가적인 특징을 나타내기 위하여 변형된 Sp35 영역이 포함될 수 있다. 예에는, 융합 단백질 및 단백질 접합체가 포함된다.
본 발명에서, "폴리펩티드 조각" 은 Sp35 폴리펩티드의 짧은 아미노산 서열을 나타낸다. 단백질 조각은 "독립적"일 수 있거나, 또는 조각이 부분 또는 영역을 형성하는 더 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 조각의 대표적인 예에는, 예를 들어, 약 5개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 15개의 아미노산, 약 20개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 40개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 60개의 아미노산, 약 70개의 아미노산, 약 80개의 아미노산, 약 90개의 아미노산, 및 약 100개의 아미노산 또는 그 이상의 길이를 포함하는 조각이 포함된다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 Sp35 길항제는 "항체" 또는 "면역글로불린" 분자, 또는 그의 면역특이적 조각, 예컨대 자연 발생한 항체 또는 면역글로불린 분자, 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작 항체 분자 또는 조각이다. "항체" 및 "면역글로불린" 용어는 본원에 상호 호환적으로 사용된다. 부가적으로는, 본 발명의 방법에 사용되는 면역글로불린 분자는 또한 "면역특이" 또는 "항원-특이" 또는 "항원-결합" 분자로서 기재되고, 항체 분자 및 그의 조각을 나타내도록 상호 호환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 중쇄의 가변 도메인을 적어도 포함하고, 일반적으로는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 적어도 포함한다. 척추동물계의 기본적인 면역글로불린 구조는 상대적으로 잘 이해되어진다. 예컨대, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) 참조, 본원에 참조로 삽입됨.
하기에서 더 자세히 검토되는 바와 같이, "면역글로불린" 용어는 생화학적으로 구별될 수 있는 폴리펩티드의 5개의 광범위한 부류를 포함한다. 5개의 모든 부류는 본 발명의 범위 내에 있는 것이 명백하며, 하기의 검토는 면역글로불린 분자의 IgG 부류를 일반적으로 나타낼 것이다. IgG 와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 분자량이 대략 23,000 돌턴인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 분자량이 53,000-70,000 돌턴인 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4개의 쇄는 통상적으로 "Y" 배열로 이황 결합에 의해 연결되고, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작되고, 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄에 연결된다.
경쇄 및 중쇄 모두는 구조적 및 관능적으로 동종인 영역으로 나뉜다. "불 변" 및 "가변" 용어는 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인지 및 특이성을 결정한다는 것을 인식할 것이다. 반대로, 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3) 의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특징, 예컨대 분비, 태반통과 운동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 통상적으로, 불변 영역 도메인은 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 말단이 될수록, 그 수가 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고, C-말단 부분에서는 불변 영역이다; CH3 및 CL 도메인은 실제로 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 각각 포함한다.
경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ) 로 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합할 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포, 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때, 2개의 중쇄의 "꼬리 (tail)" 부분은 공유 이황 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 분기점에서 N-말단으로부터 각각의 쇄의 하부에서 C-말단까지 진행된다. 당업자라면 중쇄가 특히 하위 분류 (예컨대, γ1-γ4) 를 갖는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε) 으로 분류된다는 것을 인식할 것이다. 이러한 쇄는 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE 로서 항체의 "부류"가 결정된다. 면역글로불린 하위부류 (이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특징지워 지고, 기능적 특이성을 부여한다고 알려져 있다. 이러한 각각의 부류 및 이소타입의 변형된 형태는 본원의 개시를 참조하여 당업자라면 용이하게 발명할 수 있을 것이므로, 본 발명의 범위 내에 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인은 3차원 항원 결합 부위를 특징짓는 가변 영역을 형성하기 위하여 결합한다. 상기 4차원 항체 구조는 Y의 각각의 팔의 끝에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로는, 항원 결합 부위는 각각의 VH 및 VL 쇄상에서 3개의 상보성 결정 영역 (CDR) 에 의해 특징지워진다. 특정 예에서는, 예컨대 카멜리드 (camelid) 종으로부터 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린에 기초하여 개선된 특정 면역글로불린 분자, 전체 면역글로불린 분자는 경쇄 없이 중쇄만으로 이루어져 있다. 예컨대, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 참조.
자연 발생 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 은, 항체가 수성 환경에서 그의 3차원 배열을 취하듯이, 항원 결합 도메인을 형성하기 위하여 특이적으로 위치한 짧은 비연속적 아미노산 서열이다. "골격" 영역으로 나타내는, 항원 결합 도메인에서 아미노산 잔기는 분자 사이의 다양성을 덜 보여준다. 골격 영역은 대부분 β-시트 배좌를 채택하며, CDR 은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하며, 어떤 경우에는 그의 부분을 형성한다. 따라서, 골격 영역은 쇄간, 비공유 상호작용에 의해 CDR 이 정확한 방 향으로 위치하도록 하는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 위치한 CDR 에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면으로 특징지워진다. 상기 상보적 표면은 그의 동종의 에피토프에 항체의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 골격 영역을 각각 포함하는 아미노산은 정확하게 정의되어 있기 때문에, 이는 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역과 용이하게 동정될 수 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al, U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987) 참조, 이는 전체로서 본원에 참조로 삽입됨).
그러나, 카멜리드 종에서, VHH 로 언급되는 중쇄 가변 영역은 전체 CDR 을 형성한다. 카멜리드 VHH 가변 영역 및 통상적인 항체 (VH) 유래의 가변 영역 사이의 주요 차이점에는, (a) VH 의 경쇄 접촉 표면에서, VHH 의 상응하는 영역에 비해, 더 소수성인 아미노산, (b) VHH 에서 더 긴 CDR3, 및 (c) VHH 에서 CDR1 및 CDR3 사이의 이황 결합의 빈번한 발생이 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄 CDR 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 2개 이상의 CDR 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 3개 이상의 CDR 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 4개 이상의 CDR 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 5개 이상의 CDR 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 6개 이상의 CDR 을 포함한다. 항원 결합 분자에 포함될 수 있는 1개 이상의 CDR 을 포함하는 대표적인 항체 분자는 당업계에 알려져 있고, 대표적인 분자는 본원에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체 또는 그의 면역특이적 조각에는, 폴리클론, 단일클론, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프-결합 조각, 예컨대 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일-쇄 Fv (scFv), 단일-쇄 항체, 이황 결합된 Fv (sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 조각, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 조각, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예컨대 본원에 개시된 분자에 결합된 항-Id 항체를 포함함) 가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. ScFv 분자는 당업계에 알려져 있고, 예컨대 미국특허 제 5,892,019 호에 기재되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.
단일-쇄 항체를 포함하는 항체 조각에는, 단독의 가변 영역(들) 또는 하기의 전체 또는 부분과 조합된 가변 영역(들)이 포함된다: 중쇄의 경첩 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인, 또는 경쇄의 CL. 또한, 본 발명에는, 경첩 영역, CH1, CH2, CH3, 또는 CL 도메인을 갖는 가변 영역(들)의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 조각이 포함된다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 항체 또는 그의 면역특이적 조각은 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 쥐과, 당나귀, 토끼, 염소, 기니어피그, 낙타, 라마, 말 또는 닭의 항체이다. 또다른 구현예에서, 가변 영역은 기원이 콘드릭토이드 (condricthoid) 일 수 있다 (예컨대, 상어 유래). 본원에 사용된 바와 같이, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 유전자 도입시키고, 내생성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 분리한 항체를 포함한다 (예를 들어, 미국특허 제 5,939,598 호 (Kucherlapati 등) 와 같이 상기에 기재되어 있음).
본원에 사용된 바와 같이, "중쇄 부분" 용어에는 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열이 포함된다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: CH1 도메인, 경첩 (예컨대, 상위, 중위, 및/또는 하위 경첩 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 변이체 또는 그의 조각. 예를 들어, 중쇄 부분에는, CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄; CH1 도메인, 적어도 경첩 도메인의 부분, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄; CH1 도메인 및 CH3 도 메인을 포함하는 폴리펩티드쇄; CH1 도메인, 적어도 경첩 도메인의 부분, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄, 또는 CH1 도메인, 적어도 경첩 도메인의 부분, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄가 포함될 수 있다. 중쇄 부분에는 또한 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 적어도 CH2 도메인의 부분 (예컨대, CH2 도메인의 전부 또는 부분) 을 결손할 수 있다. 앞서 언급된 것처럼, 상기 도메인 (예컨대, 중쇄 부분) 이 변형되어, 자연발생 면역글로불린 분자 유래의 아미노산 서열이 변화될 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 특정 Sp35 길항제 항체 또는 그의 면역특이적 조각인, 다중체의 1개의 폴리펩티드 쇄의 중쇄 부분은 다중체의 2번째 폴리펩티드 쇄의 중쇄 부분과 동일하다. 대안적으로는, 본원의 방법에 사용하기 위한 중쇄 부분-함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는, 예를 들어, 이중특이적 항체를 형성하는 다른 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 결합 폴리펩티드의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 부분에는 IgG1 분자 유래 CH1 도메인 및 IgG3 분자 유래 경첩 영역을 포함될 수 있다. 또다른 예에서, 중쇄 부분에는 IgG1 분자로부터 부분적으로 유래되고, IgG3 분자로부터 부분적으로 유래된 경첩 영역이 포함될 수 있다. 또다른 예에서, 중쇄 부 분에는 IgG1 분자로부터 부분적으로 유래되고, IgG4 분자로부터 부분적으로 유래된 키메라 경첩이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "경쇄 부분" 용어에는 면역글로불린 경쇄로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 부분은 하나 이상의 VL 또는 CL 도메인을 포함한다.
면역글로불린 유래 폴리펩티드 (예컨대, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분) 의 비자연적 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 분자는, 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열 내로 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 제조되어, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 코팅된 단백질 내로 도입될 수 있다. 변이는 표준 기술, 예컨대 부위-의존 돌연변이생성 및 PCR-매개 돌연변이생성에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존성 아미노산 치환은 하나 이상의 비필수적인 아미노산 잔기에서 이루어진다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 항체 또는 그의 면역특이적 조각은, 또한 본 발명의 폴리펩티드의 그의 결합 친화도의 면에서 기재되거나 열거될 수 있다. 바람직한 결합 친화도에는, 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 보다 더 낮은 해리 상수 또는 Kd 를 갖는 것을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 항체 또는 그의 면역특이적 조각은 본원에 기재된 바와 같이 Sp35 의 길항제로서 작용한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체는 Sp35 폴리펩티드의 억제 활성을 차단 또는 억제하는 길항제로서 작용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "키메라 항체" 용어는 면역반응성 영역 또는 부위는 1번째 종으로부터 수득되거나 유래되고, (본 발명에 따라, 손상되지 않거나, 부분적이거나, 또는 변형될 수 있는) 불변 영역은 2번째 종으로부터 수득되는, 임의의 항체를 의미하게 될 것이다. 특정 구현예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 원 (예컨대, 마우스 또는 영장류) 으로부터 유래될 것이고, 불변 영역은 인간이다.
본원에서 사용할 때, "조작 항체" 라는 용어는, 중쇄 및 경쇄 또는 둘 모두에서 가변 도메인을, 특이성이 알려진 항체의 하나 이상의 CDR 의 적어도 부분적인 치환에 의해서, 그리고, 필요하다면, 부분적 골격 영역 치환 및 서열 변경에 의해서 바꾼 항체를 가리킨다. CDR 은, 골격 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어는 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR 은 다른 부류의 항체로부터, 바람직하게는 다른 종의 항체로부터 유래된 것도 고려된다. 특이성이 알려진 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 "공여체" CDR 이 인간 중쇄 또는 경쇄 골격 영역으로 이식된 조작 항체를 본원에서는 "인간화 항체" 라고 칭한다. 한 가지 가변 도메인의 항원 결합능을 또다른 것으로 전이시키기 위해서, CDR 전부를 공여체 가변 영역의 완전 CDR 로 대체할 필요는 없을지도 모른다. 오히려, 표적 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기만 전이시킬 필요가 있을 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,180,370 호에서 설명하듯이, 기능상 조작 또는 인간화시킨 항체를 수득하는 것은 일상적인 실험의 수행에 의한 또는 시행착오 시험에 의한 당업자의 능력에 속할 것이다.
본원에서 사용할 때, "결합된", "융합된" 또는 "융합" 이라는 용어는 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 둘 이상의 요소 또는 성분이 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 어떠한 수단에 의해서든지, 함께 결합되는 것을 가리킨다. "인-프레임 (in-frame) 융합" 은 둘 이상의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 이 결합되어, 본래의 ORF 의 정확한 리딩 프레임을 유지하는 방식으로, 더 긴 연속 ORF 를 형성하는 것을 가리킨다. 따라서, 생성되는 재조합 융합 단백질은 본래의 ORF 로 암호화되는 폴리펩티드에 해당하는 둘 이상의 절편 (그 절편들은 성질상 보통은 그렇게 결합되지 않음) 을 포함하는 단일 단백질이다. 비록 인-프레임이 융합 절편을 통해 그와 같이 연속되게 만들어지지만, 그 절편들은 예를 들어 인-프레임 링커 서열에 의해서 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
폴리펩티드의 내용 중, "선형 서열" 또는 "서열" 은 아미노에서 카르복실 말단 방향으로의 폴리펩티드 내 아미노산의 순서인데, 여기서 서열 내에서 서로 이웃하는 잔기는 폴리펩티드의 일차 구조상 인접한다.
본원에서 사용할 때, "발현" 이라는 용어는 유전자가 생화학물, 예를 들어, RNA 또는 폴리펩티드를 생성하는 과정을 가리킨다. 그 과정은 유전자 녹다운 (knockdown) 뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정적 발현 모두를 제한하지 않고 포함하는, 세포 내에서 유전자의 기능적 존재의 임의의 발현을 포함한다. 이는, 제한없이, 유전자의 전령 RNA (mRNA), 전이 RNA (tRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA) 또는 임의의 기타 RNA 산물로의 전사 및 그와 같은 mRNA 의 폴리펩티드(들)로의 번역을 포함한다. 최종의 원하는 산물이 생화학물인 경우, 발현은 그 생화학물 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물" 은 진단, 예후, 또는 치유를 원하는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농경용 가축, 동물원 동물, 스포츠용 동물, 애완동물 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 및 침팬지; 개과 예컨대 개 및 늑대; 고양이과 예컨대 고양이, 사자, 및 호랑이; 말과 (equid) 예컨대 말, 당나귀, 및 얼룩말; 식용 동물 예컨대 젖소, 돼지, 및 양; 유제류 예컨대 사슴 및 기린; 설치류 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그 등을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 포유동물은 인간 대상체이다.
"RNA 간섭" 또는 "RNAi" 라는 용어는 siRNA 에 의한 유전자 발현의 침묵 또는 감소를 가리킨다. 그것은 침묵 유전자의 서열에 대하여 그의 이중 영역이 상동인 siRNA 에 의해 개시된, 동물 및 식물에서 서열-특이적, 전사후 유전자 침묵 의 과정이다. 유전자는 유기체에 대하여 내생성 또는 외생성일 수 있고, 염색체 속에 통합되어 존재하거나 게놈에 통합되지 않은 핵산전달 감염 벡터 내에 존재한다. 유전자의 발현은 완전히 또는 부분적으로 저해된다. RNAi 는 또한 표적 RNA 의 기능을 저해한다고 여겨지며; 표적 RNA 의 기능은 완전 또는 부분적일 수 있다.
Sp35 (LINGO-1/LRRN6)
본 발명은 Sp35 의 길항제가 DA 뉴런의 신경돌기 성장 및 생존을 촉진한다는 발견에 기초한 것이다. 자연발생 인간 Sp35 는 614개의 아미노산 (SEQ ID NO:2) 으로 이루어진 글리코실화 신경계-특이적 단백질이다. 인간 Sp35 폴리펩티드는 14개의 류신-풍부 반복단위 (N- 및 C- 말단 캡을 포함함), Ig 도메인, 막투과 영역, 및 세포질 도메인으로 이루어지는 LRR 도메인을 포함한다. 세포질 도메인은 정규의 티로신 인산화 부위를 포함한다. 또한, 자연발생 Sp35 단백질은 신호 서열, LRRCT 및 Ig 도메인 사이의 짧은 염기성 영역, 및 Ig 도메인 및 세포질 도메인 사이의 막투과 영역을 포함한다. 인간 Sp35 유전자는 대안적 번역 개시 코돈을 포함하여서, 6 개의 추가적인 아미노산 (MQVSKR; SEQ ID NO:3) 은 Sp35 신호 서열의 N-말단에 존재할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 표 1 은 Sp35 도메인 및 기타 영역을 SEQ ID NO:2 의 서열을 기초로 하여, 아미노산 잔기 번호에 따라 나열한다.
표 1
도메인 또는 영역 개시 잔기 종결 잔기
신호 서열 1 33 또는 35
LRRNT 34 또는 36 64
LRR 66 89
LRR 90 113
LRR 114 137
LRR 138 161
LRR 162 185
LRR 186 209
LRR 210 233
LRR 234 257
LRR 258 281
LRR 282 305
LRR 306 329
LRR 330 353
LRRCT 363 414 또는 416
염기성 415 또는 417 424
Ig 419 493
연결 서열 494 551
막통과 552 576
세포질 577 614
Sp35 의 조직 분포 및 발생적 발현이 인간 및 래트에서 연구되었다. Sp35 생물학은 실험 동물 (래트) 모델에서 연구되었다. 래트 Sp35 의 발현은 노던 블럿 및 면역조직화학적 염색에 의해서 측정된 바와 같이, 신경계 뉴런 및 뇌 희소돌기아교세포에 집중되어 있다. 래트 Sp35 mRNA 발현 수준은 출생 직후, 즉, 약 생후 1 일에 피크이며, 발달하면서 조절된다. 래트 척수 횡절단 손상 모델에서, Sp35 는 RT-PCR 로 측정한 바와 같이 손상 부위에서 상향 조절된다. 또한, Sp35 는 Nogo66 수용체 (Nogo 수용체) 와 상호작용하는 것으로 나타났다. 예컨대, 국제특허출원 PCT/US2004/00832, PCT 공보 제 WO2004/08564 호 참조.
Sp35 (LINGO-1) 은 Nogo 수용체-1-p75 신경성장인자 수용체 복합체의 추가 성분이다. Mi et al, Nat Neurosci. 7:221-228 (2004) 참조, 이는 본원에 참조로 삽입됨. Nogo 수용체 1 과 달리, 척수의 성숙 신경 세포가 외손상에 노출될 때, Sp35 유전자 발현이 증가하고, 이는 Sp35 가 CNS 신경 기능에 대해 생물학적으로 중요한 역할을 가짐을 제안한다. Id.
전장 Sp35 분자에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112008040245603-PCT00001
전장 Sp35 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
Figure 112008040245603-PCT00002
Sp35 의 길항제를 사용하는 방법
본 발명의 하나의 구현예는, 유효량의 Sp35 길항제 또는 Sp35 길항제를 포함 하는 조성물과 DA 뉴런을 접촉시키는 것을 포함하는, 도파민성 (DA) 뉴런의 재생, 성장 또는 생존을 촉진하는 방법을 제공하며, 여기서 Sp35 길항제는 가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 항체, Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드, Sp35 압타머, 및 상기 Sp35 길항제의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 Sp35 길항제 및 본 발명을 실시하기 위한 상기 분자를 수득하기 위한 방법 및 물질은 예컨대, 전체로서 본원에 참조로 삽입된, 국제출원번호 PCT/US2004/008323 호, PCT 공보 WO2004/085648 호에 기재되어 있거나, 및/또는 발견될 수 있다. 본 발명에 유용한 Sp35 수용체 길항제에는, 예를 들어, 전체로서 본원에 참조로 삽입된, PCT/US2005/022881, PCT 공보 WO2006/002437 호에 기재된 것이 포함된다.
본 발명의 부가적인 구현예는, 뉴런의 퇴행 또는 사멸과 연관된 질환, 장애 또는 손상 (예컨대, 파킨슨 질환) 으로 고통받는 동물 (예컨대, 포유동물) 을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 Sp35 길항제 또는 Sp35 길항제를 포함하는 조성물을 필요로 하는 동물에게 투여하는 것을 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 여기서 Sp35 길항제는 가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 항체, Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드, Sp35 압타머, 및 상기 Sp35 길항제의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 부가적인 구현예는, DA 뉴런의 재생, 성장 또는 생존의 억제를 감소시키기에 충분한 양으로 질환, 장애 또는 손상 부위에서 또는 그 근처에서 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, DA 뉴런 사멸과 관련되는 질환, 장애 또는 손상을 치료하기 위하여, DA 뉴런의 재생, 성장 또는 생존을 촉진하는 방법을 포함한 다.
본 발명의 방법에서, Sp35 길항제는 가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 항체 또는 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드, Sp35 압타머, 또는 그의 조합의 환자에게로의 직접 투여를 통해 투여할 수 있다. 대안적으로는, Sp35 길항제는 특이적 Sp35 길항제를 생성하는 발현 벡터를 통해 투여할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, Sp35 길항제는 하기를 포함하는 치료 방법으로 투여된다: (1) Sp35 길항제를 발현시키는 핵산, 예를 들어, 벡터로, 이식가능한 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션하는 것; 및 (2) 형질전환된 숙주 세포를 포유동물 내의 질환, 장애 또는 손상 부위에 이식하는 것. 예를 들어, 형질전환된 숙주 세포는 도파민 뉴런 유래의 특정 작용 부위, 예컨대 중뇌, 또는 그의 연결 표적, 예컨대 경막, 꼬리, 피질, 담창구 또는 사상하핵에서 이식될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 이식가능한 숙주 세포를 포유동물로부터 제거하고, 일시적으로 배양시키고, Sp35 길항제를 코딩하는 단리된 핵산으로 형질전환 또는 트랜스펙션시키고, 그것을 제거했던 동일한 포유동물로 다시 이식한다. 세포는 그것을 이식하는 동일한 부위에서 제거할 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 때때로 생체외 유전자 치유법으로 알려진 그와 같은 구현예는 한정된 시간 동안 작용 부위에 집중되는 Sp35 길항제의 연속적인 공급을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 치료되거나 개선될 수 있는 질환 또는 장애에는, DA 뉴런의 사멸, 퇴행, 또는 재생 또는 분화의 결손과 관련된 질환, 장애 또는 손상이 포함된다. 상기 질환에는, 파킨슨 질환 (PD), 다계통 위축증, 선조체 퇴행, 올 리브교 소뇌위축, 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군, 파킨슨증의 특징을 갖는 운동 뉴런 질환, 루이 소체 치매, 진행성 핵상 마비, 피질-기저 핵 변성, 전측두엽 치매, 파킨슨증이 있는 알쯔하이머 질환, 윌슨 (Wilson) 질환, 할러포르텐-스파츠 (Hallervordern-Spatz) 질환, 세디아크-히가시 (Chediak-Hagashi) 질환, SCA-3 척수소뇌성 실조증, X-연관 근육긴장 이상-파킨슨증 (DYT3), 헌팅톤 (Huntington) 질환 (웨스트팔 (Westphal) 변이체), 프리온 질환, 야콥-크루츠펠트 질환 (CJD), 혈관 파킨슨증, 뇌성 마비, 반복된 두부 외상, 뇌염후 파킨슨증, 신경매독 및 정신분열이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제, 예컨대 가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 항체, Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드, 또는 Sp35 압타머는, DA 신경돌기 성장, 생존 또는 재생을 네거티브하게 조절하는 Sp35 의 기능을 정지, 감소, 방지, 또는 억제하는 치료제로서 제조되고 사용될 수 있다.
가용성 Sp35 폴리펩티드
본 발명의 Sp35 길항제는 자연발생적 Sp35 의 생물학적 기능을 차단, 저해 또는 방해하는 폴리펩티드를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 가용성 Sp35 폴리펩티드는 가용성 Sp35 폴리펩티드의 단편, 변이체, 또는 그의 유도체를 포함한다. 상기 표 1 은 Sp35 폴리펩티드의 다양한 도메인을 기재한다. 가용성 Sp35 폴리펩티드는 막투과 도메인이 결손되어 있고, 통상적으로 Sp35 폴리펩티드의 세포내 도메인이 결손되어 있다. 예를 들어, 특정 가용성 Sp35 폴리펩티드는 Sp35 의 막통과 도메인을 포함하는 아미노산 552-576 이 결손되어 있고/있거나 Sp35 의 세포내 도메인을 포함하는 아미노산 577-614 가 결손되어 있다. 부가적으로, 특정 가용성 Sp35 폴리펩티드는 Sp35 폴리펩티드의 LRR 도메인, Ig 도메인, 염기성 영역 및/또는 전체 세포외 도메인 (SEQ ID NO:2 의 34 내지 532 의 아미노산에 해당) 을 포함한다. 당업자가 인식하듯이, Sp35 의 전체 세포외 도메인은 세포외 도메인 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 추가의 또는 더 적은 아미노산을 포함할 수 있다. 그러한 것으로서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 가용성 Sp35 폴리펩티드는, SEQ ID NO:2 의 41 내지 525; SEQ ID NO:2 의 40 내지 526; SEQ ID NO:2 의 39 내지 527; SEQ ID NO:2 의 38 내지 528; SEQ ID NO:2 의 37 내지 529; SEQ ID NO:2 의 36 내지 530; SEQ ID NO:2 의 35 내지 531; SEQ ID NO:2 의 34 내지 531; SEQ ID NO:2 의 46 내지 520; SEQ ID NO:2 의 45 내지 521; SEQ ID NO:2 의 44 내지 522; SEQ ID NO:2 의 43 내지 523; 및 SEQ ID NO:2 의 42 내지 524 의 아미노산을 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 Sp35 폴리펩티드 또는 그와 같은 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다. Sp35 폴리펩티드 길항제에는 표 1에 기재된 도메인의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 추가의 가용성 Sp35 폴리펩티드는, SEQ ID NO:2 의 1 내지 33; SEQ ID NO:2 의 1 내지 35; SEQ ID NO:2 의 34 내지 64; SEQ ID NO:2 의 36 내지 64; SEQ ID NO:2 의 66 내지 89; SEQ ID NO:2 의 90 내지 113; SEQ ID NO:2 의 114 내지 137; SEQ ID NO:2 의 138 내지 161; SEQ ID NO:2 의 162 내지 185; SEQ ID NO:2 의 186 내지 209; SEQ ID NO:2 의 210 내지 233; SEQ ID NO:2 의 234 내지 257; SEQ ID NO:2 의 258 내지 281; SEQ ID NO:2 의 282 내지 305; SEQ ID NO:2 의 306 내지 329; SEQ ID NO:2 의 330 내지 353; SEQ ID NO:2 의 363 내지 416; SEQ ID NO:2 의 417 내지 424; SEQ ID NO:2 의 419 내지 493; 및 SEQ ID NO:2 의 494 내지 551 의 아미노산을 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 Sp35 폴리펩티드 또는 그와 같은 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 추가의 가용성 Sp35 폴리펩티드는, SEQ ID NO:2 의 1 내지 33; SEQ ID NO:2 의 1 내지 35; SEQ ID NO:2 의 1 내지 64; SEQ ID NO:2 의 1 내지 89; SEQ ID NO:2 의 1 내지 113; SEQ ID NO:2 의 1 내지 137; SEQ ID NO:2 의 1 내지 161; SEQ ID NO:2 의 1 내지 185; SEQ ID NO:2 의 1 내지 209; SEQ ID NO:2 의 1 내지 233; SEQ ID NO:2 의 1 내지 257; SEQ ID NO:2 의 1 내지 281; SEQ ID NO:2 의 1 내지 305; SEQ ID NO:2 의 1 내지 329; SEQ ID NO:2 의 1 내지 353; SEQ ID NO:2 의 1 내지 416; SEQ ID NO:2 의 1 내지 424; SEQ ID NO:2 의 1 내지 493; SEQ ID NO:2 의 1 내지 551; SEQ ID NO:2 의 1 내지 531 및 SEQ ID NO:2 의 1 내지 532 의 아미노산을 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 Sp35 폴리펩티드 또는 그와 같은 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 더욱 또다른 가용성 Sp35 폴리펩티드는, SEQ ID NO:2 의 34 내지 64; SEQ ID NO:2 의 34 내지 89; SEQ ID NO:2 의 34 내지 113; SEQ ID NO:2 의 34 내지 137; SEQ ID NO:2 의 34 내지 161; SEQ ID NO:2 의 34 내지 185; SEQ ID NO:2 의 34 내지 209; SEQ ID NO:2 의 34 내지 233; SEQ ID NO:2 의 34 내지 257; SEQ ID NO:2 의 34 내지 281; SEQ ID NO:2 의 34 내지 305; SEQ ID NO:2 의 34 내지 329; SEQ ID NO:2 의 34 내지 353; SEQ ID NO:2 의 34 내지 416; SEQ ID NO:2 의 34 내지 424; SEQ ID NO:2 의 34 내지 493; 및 SEQ ID NO:2 의 34 내지 551 의 아미노산을 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 Sp35 폴리펩티드 또는 그와 같은 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 추가의 가용성 Sp35 폴리펩티드는, SEQ ID NO:2 의 34 내지 530; SEQ ID NO:2 의 34 내지 531; SEQ ID NO:2 의 34 내지 532; SEQ ID NO:2 의 34 내지 533; SEQ ID NO:2 의 34 내지 534; SEQ ID NO:2 의 34 내지 535; SEQ ID NO:2 의 34 내지 536; SEQ ID NO:2 의 34 내지 537; SEQ ID NO:2 의 34 내지 538; SEQ ID NO:2 의 34 내지 539; SEQ ID NO:2 의 30 내지 532; SEQ ID NO:2 의 31 내지 532; SEQ ID NO:2 의 32 내지 532; SEQ ID NO:2 의 33 내지 532; SEQ ID NO:2 의 34 내지 532; SEQ ID NO:2 의 35 내지 532; SEQ ID NO:2 의 36 내지 532; SEQ ID NO:2 의 30 내지 531; SEQ ID NO:2 의 31 내지 531; SEQ ID NO:2 의 32 내지 531; SEQ ID NO:2 의 33 내지 531; SEQ ID NO:2 의 34 내지 531; SEQ ID NO:2 의 35 내지 531; 및 SEQ ID NO:2 의 36 내지 531 의 아미노산을 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 Sp35 폴리펩티드 또는 그와 같은 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 더욱 추가적인 가용성 Sp35 폴리펩티드에는 SEQ ID NO:2 의 36 내지 64; SEQ ID NO:2 의 36 내지 89; SEQ ID NO:2 의 36 내지 113; SEQ ID NO:2 의 36 내지 137; SEQ ID NO:2 의 36 내지 161; SEQ ID NO:2 의 36 내지 185; SEQ ID NO:2 의 36 내지 209; SEQ ID NO:2 의 36 내지 233; SEQ ID NO:2 의 36 내지 257; SEQ ID NO:2 의 36 내지 281; SEQ ID NO:2 의 36 내지 305; SEQ ID NO:2 의 36 내지 329; SEQ ID NO:2 의 36 내지 353; SEQ ID NO:2 의 36 내지 416; SEQ ID NO:2 의 36 내지 424; SEQ ID NO:2 의 36 내지 493; 및 SEQ ID NO:2 의 36 내지 551 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 Sp35 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 부가적 가용성 Sp35 폴리펩티드에는 SEQ ID NO:2 의 36 내지 530; SEQ ID NO:2 의 36 내지 531; SEQ ID NO:2 의 36 내지 532; SEQ ID NO:2 의 36 내지 533; SEQ ID NO:2 의 36 내지 534; SEQ ID NO:2 의 36 내지 535; SEQ ID NO:2 의 36 내지 536; SEQ ID NO:2 의 36 내지 537; SEQ ID NO:2 의 36 내지 538; 및 SEQ ID NO:2 의 36 내지 539 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 Sp35 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
부가적 가용성 Sp35 폴리펩티드, 그의 조각, 변이체 또는 유도체에는 Sp35 의 Ig 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들어, SEQ ID NO:2 의 417 내지 493; SEQ ID NO:2 의 417 내지 494; SEQ ID NO:2 의 417 내지 495; SEQ ID NO:2 의 417 내지 496; SEQ ID NO:2 의 417 내지 497; SEQ ID NO:2 의 417 내지 498; SEQ ID NO:2 의 417 내지 499; SEQ ID NO:2 의 417 내지 500; SEQ ID NO:2 의 417 내지 492; SEQ ID NO:2 의 417 내지 491; SEQ ID NO:2 의 412 내지 493; SEQ ID NO:2 의 413 내지 493; SEQ ID NO:2 의 414 내지 493; SEQ ID NO:2 의 415 내지 493; SEQ ID NO:2 의 416 내지 493; SEQ ID NO:2 의 411 내지 493; SEQ ID NO:2 의 410 내지 493; SEQ ID NO:2 의 410 내지 494; SEQ ID NO:2 의 411 내지 494; SEQ ID NO:2 의 412 내지 494; SEQ ID NO:2 의 413 내지 494; SEQ ID NO:2 의 414 내지 494; SEQ ID NO:2 의 415 내지 494; SEQ ID NO:2 의 416 내지 494; SEQ ID NO:2 의 417 내지 494; 및 SEQ ID NO:2 의 418 내지 494 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 Sp35 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
다양한 대표적인 가용성 Sp35 폴리펩티드 및 본 발명의 실시를 위해 상기 분자들을 수득하기 위한 방법 및 물질이 이하에서 기술되고/거나, 본원에 참조로 인용된 예를 들어, 국제특허출원 번호 PCT/US2004/008323, PCT 공개 번호 WO2004/085648 에서 찾을 수 있다.
본원에 기술된 본 발명의 방법에 사용되는 가용성 Sp35 폴리펩티드는 고리형일 수 있다. 가용성 Sp35 폴리펩티드의 고리화는 선형 펩티드의 형태적 자유를 감소시키고 구조적으로 더욱 제한된 분자를 초래한다. 많은 펩티드 고리화 방법이 당 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들어, 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산 잔기 사이의 아미드 결합 형성에 의한 "백본 (backbone) 대 백본" 고리화이 다. "백본 대 백본" 고리화 방법에는 두 개의 ω-티오 아미노산 잔기 (예, 시스테인, 호모시스테인) 사이의 이황화 다리 형성이 포함된다. 본 발명의 특정 가용성 Sp35 펩티드는 펩티드의 N- 및 C- 말단에 변형을 포함하여 고리형 Sp35 폴리펩티드를 형성한다. 상기 변형에는 시스테인 잔기, 아세틸화 시스테인 잔기, NH2 부분을 갖는 시스테인 잔기 및 비오틴이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 펩티드 고리화 방법이 그 전체가 본원에 참조로 인용된 Li & Roller. Curr. Top. Med. Chem. 3:325-341 (2002) 에 기술되어 있다.
본원에 기술된 가용성 Sp35 폴리펩티드는 다양한 변경 예컨대, 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 예를 들어, 치환에는 하기 치환이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: SEQ ID NO:2 의 Sp35 폴리펩티드의 위치 6 에서 발린이 메티오닌으로; SEQ ID NO:2 의 Sp35 폴리펩티드의 위치 294 에서 세린이 글리신으로; SEQ ID NO:2 의 Sp35 폴리펩티드의 위치 348 에서 발린이 알라닌으로; Sp35 폴리펩티드의 위치 419 에서 아르기닌이 히스티딘으로; 위치 456 에서 아르기닌이 글루탐산으로; SEQ ID NO:2 의 위치 458 에서 히스티딘이 발린으로.
본원에 기술된 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 일치하는 가용성 Sp35 폴리펩티드에 상응하는 조각이 또한 고려될 수 있다.
당 기술분야에서 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "서열 일치성"은 한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 두번째 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본원에서 검토되는 경우, 임의의 특정 폴리펩티드가 또다른 폴리펩티드 에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 일치하는지 여부는 당 기술분야에서 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어 예컨대 BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용하여 결정될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. BESTFIT 는 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) 의 국부 상동성 알고리즘을 이용하여, 두 서열 사이에서 최고의 상동성 분절을 찾는다. BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하여, 예를 들어, 특정 서열이 본 발명에 따른 참조 서열에 대해 95% 일치하는지 여부를 결정하는 경우, 변수들은 당연히, 참조 폴리펩티드 서열의 전체 길이에 대해 일치성 백분율이 계산되도록 그리고 참조 서열의 아미노산 총 수의 5% 까지의 상동성 차이가 허용되도록 설정된다.
본 발명의 방법에 사용되는 가용성 Sp35 폴리펩티드에는 둘 이상의 가용성 Sp35 폴리펩티드의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 조각
한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제는 항체 분자, 또는 그의 면역특이적 조각이다. 명확히 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된, 항체와 관련한 "그의 조각"은 면역특이적 조각, 즉, 항원-특이적 조각을 언급한다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 2중특이적 결합 분자, 결합 폴리펩티드, 또는 항체, 예를 들어, 2중특이적 항체, 소체 (minibody), 도메인 제거된 항체, 또는 하나 이상의 에피토프, 예를 들어, 동일한 항원 위의 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 융합 단백질이다. 한 구현예에서, 2중특이적 항체는 Sp35 위의 적어도 하나의 에피토프에 대해 특이적인 적어도 하나의 결합 도메인을 갖는다. 2중특이적 항체는 Sp35 의 에피토프에 대해 특이적인 두 개의 표적 결합 도메인 및 두번째 표적에 대해 특이적인 두개의 표적 결합 도메인을 갖는 4가 항체일 수 있다. 따라서, 4가 2중특이적 항체는 각 특이성에 대해 2가 일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제에는 또한 Sp35-특이적 항체 또는 항원-결합 조각, 변이체, 또는 Sp35 활성의 길항제인 유도체가 포함된다. 예를 들어, 특정 Sp35 항체의 DA 뉴런에서 발현된 Sp35 에 대한 결합은 DA 신경돌기 성장, 분화 및 생존을 차단한다.
본원에 기술된 방법에 사용되는 특정 길항제 항체는 특정 Sp35 폴리펩티드 조각 또는 도메인에 특이적으로 또는 선택적으로 결합한다. 상기 Sp35 폴리펩티드 조각에는 SEQ ID NO:2 의 34 내지 532; 34 내지 417, 34 내지 425, 34 내지 493, 66 내지 532, 66 내지 417 (LRR 도메인), 66 내지 426, 66 내지 493, 66 내지 532, 417 내지 532, 417 내지 425 (Sp35 염기성 영역), 417 내지 424 (Sp35 염기성 영역), 417 내지 493, 417 내지 532, 419 내지 493 (Sp35 Ig 영역), 또는 425 내지 532 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 Sp35 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:2 의 34 내지 532; 34 내지 417, 34 내지 425, 34 내지 493, 66 내지 532, 66 내지 417, 66 내지 426, 66 내지 493, 66 내지 532, 417 내지 532, 417 내지 425 (Sp35 염기성 영역), 417 내지 493, 417 내지 532, 419 내지 493 (Sp35 Ig 영역), 또는 425 내지 532 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 일치하는 Sp35 변이체 폴리펩티드가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 특정 Sp35 특이적 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체가 결합하는 부가적 Sp35 펩티드 조각에는 Sp35 의 하나 이상의 류신-풍부-반복 (LRR) 을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 조각들이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 조각에는, 예를 들어, SEQ ID NO:2 의 66 내지 89, 66 내지 113, 66 내지 137, 90 내지 113, 114 내지 137, 138 내지 161, 162 내지 185, 186 내지 209, 210 내지 233, 234 내지 257, 258 내지 281, 282 내지 305, 306 내지 329, 또는 330 내지 353 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 조각이 포함된다. SEQ ID NO:2 의 66 내지 89, 66 내지 113, 90 내지 113, 114 내지 137, 138 내지 161, 162 내지 185, 186 내지 209, 210 내지 233, 234 내지 257, 258 내지 281, 282 내지 305, 306 내지 329, 또는 330 내지 353 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 일치하는 변이체 Sp35 폴리펩티드의 상응하는 조각이 또한 고려된다.
본 발명의 특정 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체가 결합하는 부가적 Sp35 펩티드 조각에는 Sp35 의 LRR 측면에 있는 하나 이상의 시스테인 풍부 영역을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 조각이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 조각에는, 예를 들어, SEQ ID NO:2 의 34 내지 64 아미노산 (N-말단 LRR 측면 영역 (LRRNT)) 을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 조각, 또는 SEQ ID NO:2 의 363 내지 416 아미노산 (C-말단 LRR 측면 영역 (LRRCT)) 을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이루어진 조각이 포함된다. SEQ ID NO:2 의 34 내지 64 및 363 내지 416 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 일치하는 변이체 Sp35 폴리펩티드의 상응하는 조각이 또한 고려된다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용되는 Sp35 길항제에는 Sp35 의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함되고, 여기서 에피토프는 적어도 약 4 내지 5 SEQ ID NO:2 의 아미노산, 적어도 7, 적어도 9, 또는 적어도 약 15 내지 약 30 SEQ ID NO:2 의 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진다. 기술된 바와 같은 제시된 SEQ ID NO:2 의 에피토프의 아미노산은, 근접하거나 또는 선형일 수 있으나, 필수적이지는 않다. 특정 구현예에서, Sp35 의 적어도 하나의 에피토프는 세포 표면에 발현된 또는 가용성 조각으로서, 예를 들어 IgG Fc 영역에 융합된 Sp35 의 세포외 도메인에 의해 형성된 비선형 에피토프를 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어거나 또는 이들로 이루어진다. 따라서, 특정 구현예에서 Sp35 의 적어도 하나의 에피토프는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 약 15 내지 약 30 사이, 또는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 SEQ ID NO:2 의 근접 또는 비근접 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어지고, 여기서 비근접 아미노산은 단백질 폴딩 (folding) 을 통해 에피토프를 형성한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 Sp35 길항제에는 Sp35 의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 Sp35 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함되며, 여기서 에피토프는, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 이상의 상기 SEQ ID NO:2 의 근접 또는 비근접 아미노산에 더하여, 단백질을 변형시키는 부가적 부분을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지며, 예를 들어 Sp35 항체가 비변형 단백질 버전에 결합할 때보다 더 높은 친화도로 변형된 표적 단백질에 결합하도록 탄수화물 부분이 포함될 수 있다. 대안적으로, Sp35 항체는 표적 단백질의 비변형 버전에 전혀 결합하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 Sp35 길항제에는 적어도 하나의 Sp35 의 에피토프 또는 조각 또는 상기 변이체에 특이적으로 결합하고, 즉, 무관계, 또는 무작위 에피토프에 결합할 때보다 더 쉽게 상기 에피토프에 결합하고; Sp35 의 적어도 하나의 에피토프 또는 조각 또는 상기 변이체에 선택적으로 결합하고, 즉, 무관계, 유사, 상동, 또는 동종 에피토프에 결합할 때보다 더 쉽게 상기 에피토프에 결합하고; Sp35 의 특정 에피토프 또는 조각 또는 상기 변이체에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는; 또는 Sp35 의 적어도 하나의 에피토프 또는 조각 또는 상기 변이체에 해리 상수 KD 5 x 10-2 M, 약 10-2 M, 약 5 x 10-3 M, 약 10-3 M, 약 5 x 10-4 M, 약 10-4 M, 약 5 x 10-5 M, 약 10-5 M, 약 5 x 10-6 M, 약 10-6 M, 약 5 x 10-7 M, 약 10-7 M, 약 5 x 10-8 M, 약 10-8 M, 약 5 x 10-9 M, 약 10-9 M, 약 5 x 10-10 M, 약 10-10 M, 약 5 x 10-11 M, 약 10-11 M, 약 5 x 10-12 M, 약 10-12 M, 약 5 x 10-13 M, 약 10-13 M, 약 5 x 10-14 M, 약 10-14 M, 약 5 x 10-15 M, 또는 약 10-15 M 미만으로 특징되는 친화도로 결합하는 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함된다. 특정 관점에서, 항체 또는 그의 조각은 쥐과 Sp35 폴리펩티드 또는 그의 조각과 관련된 인간 Sp35 폴리펩티드 또는 그의 조각에 선택적으로 결합한다.
항체 결합 해리 상수의 문맥에서 사용된, 용어 "약" 은 항체 친화도 측정에 이용되는 방법에 내재한 변이의 정도를 고려한다. 예를 들어, 사용된 수단의 정밀성 수준, 측정된 샘플의 수에 기초한 표준 오차, 및 반올림 오차에 따라, 용어 "약 10-2 M" 는, 예를 들어, 0.05 M 에서 0.005 M 까지를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제에는 Sp35 폴리펩티드 또는 조각 또는 그의 변이체에 오프 율 (off rate) (k(off)) 5 X 10-2 초-1, 10-2 초-1, 5 X 10-3 초-1 또는 10-3 초-1 이하로 결합하는 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함된다. 대안적으로, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체는 Sp35 폴리펩티드 또는 조각 또는 그의 변이체에 오프 율 (k(off)) 5 X 10-4 초-1, 10-4 초-1, 5 X 10-5 초-1, 또는 10-5 초-1, 5 X 10-6 초-1, 10-6 초-1, 5 X 10-7 초-1 또는 10-7 초-1 이하로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제에는 Sp35 폴리펩티드 또는 조각 또는 그의 변이체에 온 율 (on rate) (k(on)) 103 M-1초-, 5 X 103 M-1초-1, 104 M-1초-1 또는 5 X 104 M-1초-1 이상으로 결합하는 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체가 포함된다. 대안적으로, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 조각, 변이체, 또는 유도체는 Sp35 폴리펩티드 또는 조각 또는 그의 변이체에 온 율 (k(on)) 105 M-1초-1, 5 X 105 M-1초-1, 106 M-1초-1 또는 5 X 106 M-1초-1 또는 107 M-1초-1 이상으로 결합한다.
본 발명의 특정 방법은 Sp35 길항제 항체, 또는 그의 면역특이적 조각의 투여를 포함하는데, 하나 이상의 불변 영역 도메인의 적어도 분획이 제거되거나 아니면 변경되어 원하는 생화학적 특성 예컨대 감소된 효과기 기능, 비-공유적 2합체화 능력, 종양 부위에서 증가된 국소화 능력, 감소된 혈청 반감기, 또는 전체와 비교했을 때 증가된 혈청 반감기, 대략 동일한 면역원성을 갖는 비변경 항체를 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 사용되는 특정 항체는 면역글로불린 중 쇄와 유사한 폴리펩티드 사슬을 포함하나, 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 부분이 결여된 도메인이 제거된 항체이다. 예를 들어, 특정 항체에서, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 제거될 것이며, 예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부가 제거될 것이다.
본원에 기술된 방법에 사용되는 특정 Sp35 길항제 항체 또는 그의 면역특이적 조각에서, Fc 부분은 당 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 돌연변이되어 효과기 기능을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화 (지점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해) 는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에 본 발명과 일관된 불변 영역 변형은 보체-결합을 완화시키고 따라서 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 연합을 감소시킬 수 있다. 그러나 불변 영역의 다른 변형들은 이황화 결합 또는 올리고당 부분을 변형시키는 데 사용되어 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인한 향상된 국부화를 허용할 수 있다. 결과로서 얻어지는 생리학적 프로필, 생체이용률 및 변형의 다른 생화학적 효과, 예컨대 종양 국소화, 체내분포 및 혈청 반감기는 공지된 면역학적 기술을 이용하여 쉽게 측정되고 정량화될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 항체 또는 그의 면역특이적 조각의 변형된 형태는 당 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 전체 전구체 또는 모 항체로부터 만들어질 수 있다. 대표적인 기술이 본원에서 더 자세히 검토된다.
특정 구현예에서 본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 항체 또는 그 의 면역특이적 조각의 가변 영역 및 불변 영역은 둘다 완전히 인간의 것이다. 완전한 인간 항체는 당 기술분야에서 공지된 기술을 이용하고 본원에 기술된 바와 같이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대항한 완전한 인간 항체는 항원 접종에 반응하여 상기 항체를 생산하도록 변형된, 그러나 그의 내생적 자리는 무능화된 유전자도입 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 항체를 만드는데 이용될 수 있는 대표적 기술이 미국 특허: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 에 기술되어 있다. 다른 기술들이 당 기술분야에 공지되어 있다. 완전한 인간 항체는 또한 본원의 다른 부분에서 더 자세히 기술된 바와 같이 다양한 디스플레이 기술, 예컨대, 파지 디스플레이 또는 다른 바이러스 디스플레이 시스템에 의해 제조될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 항체 또는 그의 면역특이적 조각은 당 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 만들어지거나 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 분자 또는 그의 조각은 "재조합적으로 생산된다," 즉, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산된다. 항체 분자 또는 그의 조각을 만드는 대표적 기술이 본원의 다른 부분에서 더 자세히 검토된다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 항체 또는 그의 면역특이적 조각에는 예를 들어, 공유 부착이 항체가 그의 동족 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 방해하지 않도록 임의의 유형의 분자를 항체에 공유 부착함으로써 변형된 유도체가 포함된다. 한정의 수단으로써가 아닌 예를 들면, 항체 유도체에는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의 한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결, 등에 의해 변형된 항체가 포함된다. 다수의 화학적 변형 중 임의는 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 부가적으로, 유도체는 하나 이상의 비전형적 아미노산을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 이용되는 Sp35 길항제 항체 또는 그의 면역특이적 조각은 치료되는 동물, 예를 들면 인간에 해로운 면역 반응을 유도하지 않는다. 한 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 항체 또는 그의 면역특이적 조각은 당업계에 인지된 기술을 이용하여 그의 면역원성을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체가 인간화, 영장류화, 탈면역화될 수 있고, 또는 키메라 항체가 만들어질 수 있다. 상기 유형의 항체는 모 항체의 항원-결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만, 인간에서는 덜 면역원성인 비-인간 항체, 전형적으로 쥐과 또는 영장류 항체에서 유래한다. 이는 (a) 전체 비-인간 가변 영역 도메인을 인간 불변 영역에 이식하여 키메라 항체를 생성함; (b) 하나 이상의 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 의 적어도 일부를 중요한 골격 잔기를 보유하거나 하지 않는 인간 골격 및 불변 영역에 이식함; 또는 (c) 전체 비-인간 가변 영역 도메인을 이식하나, 그들을 표면 잔기 교체에 의해 인간-유사 단면으로 "가리는 것 (cloaking) " 을 포함한 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 방법은 Morrison et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . 81:6851-6855 (1984); Morrison et al ., Adv . Immunol . 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al ., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 제 5,585,089 호, 제 5,693,761 호, 제 5,693,762 호, 및 제 6,190,370 호에 개시되었고, 이들 모두 그 전체가 참조로 본원에 인용되었다.
탈-면역화는 또한 항체의 면역원성 감소에 이용될 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "탈-면역화"에는 T 세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변경이 포함된다 (예, WO9852976A1, WO0034317A2 참조). 예를 들어, 출발 항체로부터의 VH 및 VL 서열이 분석되고, 상보성-결정 영역 (CDR) 와 관련하여 에피토프의 위치를 나타내는 각 V 영역 및 그 서열 내의 다른 핵심 잔기로부터 인간 T 세포 에피토프 "지도" 가 분석된다. 최종 항체의 활성을 변경할 위험이 적은 대체 아미노산 치환을 확인하기 위해 T 세포 에피토프 지도로부터 개별 T 세포 에피토프가 분석된다. 일정한 범위의 대체 VH 및 VL 서열이 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 고안되고 이들 서열이 이어서 일정한 범위의 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 항체 또는 그의 면역특이적 조각에 함입되고, 그후 기능에 대해 테스트된다. 전형적으로, 12 와 24 사이의 변이체 항체가 생성되고 테스트된다. 변형된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자가 그후 발현 벡터 내로 클로닝되고 생성된 플라스미드가 완전한 항체 생산을 위해 세포주 내로 도입된다. 항체가 그후 적절한 생화학적 및 생물학적 검정으로 비교되고, 최적의 변이체가 확인된다.
본 발명의 방법에 사용되는 p35 길항제 항체 또는 그의 조각은 당 기술분야에 공지된 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 다클론성 항체가 당 기술분야에 널리 공지된 다양한 절차에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, Sp35 면역특이적 조각이 토끼, 쥐과, 쥐, 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는 다양한 숙주 동물에 투여되어 그 항원에 특이적인 다클론성 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 숙주 종에 따라서 다양한 아주반트가 사용될 수 있으며, 프로인트 (Freund) (완전한 및 불완전한), 무기 겔 예컨대 알루미늄 히드록시드, 표면 활성 물질 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀전, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanins), 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 아주반트 예컨대 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르븀 (Corynebacterium parvun) 을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 상기 아주반트도 또한 당 기술분야에 공지되어 있다.
단일클론성 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 그의 조합의 이용을 포함한 당 기술 분야에 공지된 매우 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 당 기술분야에 공지된 기술 및, 예를 들어, Harlow et al ., Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981) (언급된 참조는 그 전체가 참조로 삽입됨) 에서 공지된 것을 포함한 하이브리도마 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단일클론 항체" 는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되지 않는다. 용어 "단일클론 항체" 는 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 포함한 단일 클론에서 유래된 항체를 언급하며, 그에 의해 생성되는 방법이 아니다. 이처럼, 용어 "단일클론 항체" 는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되지 않는다. 단일클론성 항체는 하이브리도마 및 재조합 및 파지 디스플레이 기술의 이용을 포함한 당 기술분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
당 기술분야에 인지된 프로토콜을 이용하여, 한 실시예에서, 적절한 항원 (예, 정제된 Sp35 항원 또는 상기 항원을 포함하는 세포 또는 세포 추출물) 및 아주반트의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 항체가 포유동물 내에서 길러진다. 상기 면역화는 전형적으로 활성화된 비장세포 또는 림프구로부터의 항원-반응성 항체의 생산을 포함한 면역 반응을 유도한다. 생성된 항체를 동물의 혈청에서 수집하여 다클론성 제제를 제공할 수 있는 한편, 개별 림프구를 비장, 림프절 또는 말초 혈로부터 분리하여 단일클론 항체 (mAbs) 의 균질 제제를 제공하는 것이 종종 바람직하다. 바람직하게는, 림프구는 비장에서 수득된다.
상기 공지된 방법에서 (Kohler et al ., Nature 256:495 (1975)) 항원으로 접종된 포유동물로부터의 비교적 단수명, 또는 죽을 운명의, 림프구가 불멸의 종양 세포주 (예, 골수종 세포주) 와 융합되어, 둘다 불멸이고 B 세포의 유전적으로 코딩된 항체를 생산할 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마" 를 생산한다. 생성된 하이브리드는 선별, 희석, 및 재성장에 의해 단일 유전 세포주로 분리되며 각각의 개별적 세포주는 단일 항체 형성을 위한 특정 유전자를 포함한다. 그들 은 목적 항원에 대해 균질한 항체를 생산하고, 순수한 유전적 태생과 관련하여 "단일클론" 으로 불린다.
이처럼 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적절한 배지에 심어지고 자란다. 당업자는 하이브리도마의 생산, 선별 및 생장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 다수의 출처에서 시판되고 표준화된 프로토콜이 잘 정립되어 있는 것에 대해 높이 평가할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 자라는 배지는 목적 항원에 대한 단일클론 항체의 생산을 위해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 시험관내 ( in vitro ) 검정 예컨대 면역침전, 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소 면역흡수 검정 (enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA)) 에 의해 측정된다. 하이브리도마 세포가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는지 확인된 후, 클론이 한계 희석 절차를 이용하여 서브클로닝되고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)) 에 의해 생장된다. 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체가 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 통상적인 정제 절차 예컨대, 단백질-A, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 삼투 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있음이 또한 높이 평가될 것이다.
특이적 에피토프를 인지하는 항체 조각이 공지된 기술에 의해 생성될 수 있 다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 조각이, 효소 예컨대 파파인 (Fab 조각을 생산하기 위해) 또는 펩신 (F(ab')2 조각을 생산하기 위해) 을 이용하여, 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 생산될 수 있다. F(ab')2 조각은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.
당업자는 또한 항체 또는 항체 조각 (예, 항원 결합 영역) 을 코딩하는 DNA 가 또한 항체 파이 라이브러리에서 유래될 수 있다는 점을 높이 평가할 것이다. 특히, 상기 파지는 레파토아 (repertoire) 또는 복합 항체 라이브러리 (예, 인간 또는 쥐과) 로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이하기 위해 이용될 수 있다. 대상 항원에 결합하는 결합 도메인을 발현하는 파지가 항원에 의해, 예를 들면, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선별 또는 동정될 수 있다. 상기 방법에 이용되는 파지는 전형적으로 필라멘트형 파지로서 Fab, Fv 또는 2황화 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파지로부터 발현된 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질과 재조합적으로 융합된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함한다. 대표적 방법이, 예를 들어, EP 368 684 B1; 미국 특허 제 5,969,108 호, Hoogenboom, H.R. and Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy et al . Nat . Med . 8:801 (2002); Huie et al ., Proc . Natl Acad . Sci. USA 98:2682 (2001); Lui et al ., J. MoI Biol . 315:1063 (2002) 에 설명되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 인용되어 있다. 몇몇 문헌 (예, Marks et al., Bio / Technology 10:779-783 (1992)) 이 대형 파지 라이브러리 구성 전략으로 서 복합 감염 및 생체 내 재조합 뿐만 아니라, 사슬 셔플링 (shuffling) 에 의한 고 친화성 인간 항체의 생산을 기술했다. 또다른 구현예에서, 리보솜 디스플레이가 디스플레이 플랫폼으로서 박테리오파지를 대체하는 데 이용될 수 있다 (예, Hanes et al ., Nat . Biotechnol . 18:1287 (2000); Wilson et al ., Proc . Natl . Acad. Sci. USA 95:3750 (2001); 또는 Irving et al., J. Immunol. Methods 248:31 (2001) 참조). 또다른 구현예에서, 세포 표면 라이브러리가 항체에 대해 스크리닝될 수 있다 (Boder et al ., Proc . Natl Acad . Sci . USA 97:10701 (2000); Daugherry et al ., J. Immunol . Methods 243:211 (2000)). 상기 절차는 단일클론 항체의 분리 및 이어지는 클로닝을 위한 전통적 하이브리도마 기술에 대한 대안을 제공한다.
파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인이 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 파지 입자 표면에 디스플레이될 수 있다. 특히, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 서열이 동물 cDNA 라이브러리 (예, 림프 조직의 인간 또는 쥐과 cDNA 라이브러리) 또는 합성 cDNA 라이브러리로부터 증폭된다. 특정 구현예에서, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 가 PCR에 의해 scFv 연결자로 함께 연결되고 파지미드 (phagemid) 벡터 (예, p CANTAB 6 또는 pComb 3 HSS) 로 클로닝된다. 벡터가 대장균 (E. coli) 에서 전기천공되고 그 대장균이 보조 파지로 감염된다. 상기 방법에 이용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13 을 포함하는 필라멘트형 파지이고, VH 및 VL 영역이 통상 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 과 재조합적으로 융 합된다. 관심 있는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지 (즉, Sp35 폴리펩티드 또는 그의 조각) 가, 예를 들면, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비이드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선별되거나 항원으로 확인될 수 있다.
항체를 만드는 데 이용되는 파지 디스플레이 방법의 부가적 예에는 Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원 번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제 5,698,426 호; 제 5,223,409 호; 제 5,403,484 호; 제 5,580,717 호; 제 5,427,908 호; 제 5,750,753 호; 제 5,821,047 호; 제 5,571,698 호; 제 5,427,908 호; 제 5,516,637 호; 제 5,780,225 호; 제 5,658,727 호; 제 5,733,743 호 및 제 5,969,108 호에 개시된 것이 포함되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 인용되었다.
상기 참조에 기술된 바와 같이, 파지 선별 후, 파지로부터 항체 코딩 영역이 분리되어 인간 항체, 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 조각을 포함하는 완전한 항체를 생성하는 데 이용되고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 조각을 재조합적으로 생산하는 기술이 또한 당 기술분야에 공지된 방법 예컨대 PCT 공개 WO 92/22324; Mullinax et al ., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai et al ., AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (상기 참조는 그 전체가 참조로 인용됨) 에 개시된 방법을 사용하여 이용될 수 있다.
단일-사슬 Fvs 및 항체를 생산하는 데 이용되는 기술의 예에는 미국 특허 제 4,946,778 호 및 제 5,258,498 호; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988) 에 기술된 바가 포함된다. 인간 내 항체의 생체내 이용 및 시험관내 검출 검정을 포함한 몇가지 이용에 있어서, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종에서 유래한 분자, 예컨대 쥐과 단일클론 항체에서 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체 생산 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 인용된 Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al ., J. Immunol . Methods 125:191-202 (1989); 미국 특허 제 5,807,715 호; 제 4,816,567 호; 및 제 4,816397 호 참조. 인간화 항체는 목적하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터의 항체 분자로서, 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 골 격 영역을 갖는다. 종종, 인간 골격 영역 내의 골격 잔기가 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 변경, 및 바람직하게는 향상시킬 것이다. 상기 골격 치환은 당 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면, 항원 결합에 중요한 골격 잔기를 확인하기 위한 CDR 과 골격 잔기의 상호작용의 모형화 및 특정 위치에서 보기 드문 골격 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예, 전체로 본원에 참조로 인용된 Queen et al ., 미국 특허 제 5,585,089 호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) 참조). 항체는 예를 들어, CDR-이식(EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 제 5,225,539 호; 제 5,530,101 호; 및 제 5,585,089 호), 베니어링 (veneering) 또는 표면치환 (resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al ., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al ., PNAS 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링 (미국 특허 제 5,565,332 호) 을 포함하는 당 기술분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 인간화될 수 있다.
완전한 인간 항체는 인간 환자의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열에서 유래된 항체 라이브러리를 이용한 상기 파지 디스플레이 방법을 포함한 당 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다. 또한, 미국 특허 제 4,444,887 호 및 제 4,716,111 호; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 참조; 이들 각각은 그 전체로 본원에 참조로 인용되었다.
인간 항체는 또한 기능적 내생적 면역글로불린을 발현할 수 없으나, 인간 면 역글로불린 유전자는 발현할 수 있는 유전자도입 마우스를 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체가 무작위적으로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 자리의 도입에 의해 개별적으로 또는 동시에 비-기능적으로 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동종접합성 결실은 내생적 항체 생산을 방해한다. 변형된 배아 줄기 세포가 팽창되고 키메라 마우스를 생산하기 위해 포배 내로 미세주사된다. 키메라 마우스는 그 후 번식되어 인간 항체를 발현하는 동종접합성 자손을 생산한다. 유전자도입 마우스는 선별된 항원, 예를 들어, 목적하는 표적 폴리펩티드의 전부 또는 부분에 의해 자연적 방법으로 면역화된다. 항원에 대항하는 단일클론성 항체가 통상적인 하이브리도마 기술을 이용하여 면역화된 유전자도입 마우스로부터 수득될 수 있다. 유전자도입 마우스가 품고 있는 인간 면역글로불린 전이유전자는 B-세포 분화 과정에 재배열되고, 이어서 계열 변환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 이렇게, 상기 기술을 이용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 상기 인간 항체 생산 기술의 개관을 위해, Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단일클론 항체 생산을 위한 상기 기술 및 상기 항체 생산을 위한 프로토콜의 자세한 논의에 관해, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 인용된 PCT 공개 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제 5,413,923 호; 제 5,625,126 호; 제 5,633,425 호; 제 5,569,825 호; 제 5,661,016 호; 제 5,545,806 호; 제 5,814,318 호; 및 제 5,939,598 호를 참조한다. 또한, 회사 예컨대 Abgenix, Inc.(Freemont, Calif.) 및 GenPharm(San Jose, Calif.) 가 관여하여 선별된 항원에 대항한 인간 항체를 상기와 유사한 기술을 이용하여 제공할 수 있다.
선별된 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체가 "안내된 선별" 로 언급되는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 상기 접근에서 비-인간 단일클론 항체, 예를 들어, 생쥐 항체가 이용되어 동일한 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체의 선별을 유도할 수 있다 (Jespers et al ., Bio / Technology 12:899-903 (1988)). 또한, 미국 특허 제 5,565,332 호 참조.
또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 목적하는 단일클론 항체를 코딩하는 DNA가 통상의 절차를 이용하여 (예, 생쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용하여) 쉽게 분리되고 서열분석될 수 있다. 분리되어 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 원천으로서의 역할을 한다. 일단 분리되면, DNA 는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이는 그후 원래 면역글로불린을 생산하지 않는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 예컨대 대장균 (E.coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 트랜스펙션된다. 더욱 특히, 분리된 DNA (본원에 기술된 바와 같이 합성일 수 있음) 는 본원에 참조로 인용된 Newman et al ., 미국 특허 제 5,658,570 호, 1995년 1월 25일자 출원에 기술된 항체 제조를 위한 불변 영역 및 가변 영역 서열을 클로닝하는 데 이용될 수 있다. 본질적으로, 상기는 선별된 세포로부터의 RNA 추출, cDNA 로의 전환, 및 특이적 프라이머를 이용한 PCR 에 의한 증폭을 수반한다. 상기 목적을 위한 적합한 프라이머가 또한 미국 특허 제 5,658,570 호에 기술되었다. 이하 더 자세히 논의될 바와 같이, 목적하는 항체를 발현하는 형질전환된 세포가 비교적 대량으로 자라서 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 중 및/또는 경쇄 가변 영역 도메인의 아미노산 서열이 상보성 결정 영역 (CDR) 을 확인하기 위해 당 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들어, 서열 과변이(hypervariability) 영역을 결정하기 위한 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과의 비교에 의해 검사될 수 있다. 상용 재조합 DNA 기술을 이용하여, 하나 이상의 CDR 이 골격 영역 내에, 예를 들어, 비-인간 항체를 인간화하기 위해 인간 골격 영역 내로 삽입될 수 있다. 골격 영역은 자연 발생적 또는 공통 골격 영역, 및 바람직하게는 인간 골격 영역 (예들 들어, 인간 골격 영역 목록은 Chothia et al ., J. Mol . Biol . 278:457-479 (1998) 참조). 바람직하게는, 골격 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 목적하는 폴리펩티드, 예를 들어, Sp35의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환이 골격 영역 내에 만들어질 수 있고, 바람직하게는, 아미노산 치환이 항체의 항원에 대한 결합을 향상시킨다. 부가적으로, 상기 방법은 아미노산 치환 또는 쇄내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 결실에 이용되어 하나 이상의 쇄 내 이황화 결합이 결여된 항체 분자를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 변경이 본 발명에 의해 및 당 분야의 기술 내에 포함된다.
또한, 적절한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자로부터의 유전자 및 적절한 생물학적 활성을 갖는 인간 항체 분자로부터의 유전자의 스플라이싱(splicing)에 의한, "키메라 항체" 생산을 위해 개발된 기술 (Morrison et al ., Proc . Natl . Acad. Sci 81:851-855 (1984); Neuberger et al ., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al ., Nature 314:452-454 (1985)) 이 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종에서 유래된 분자, 예컨대 쥐과 단일클론 항체에서 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것, 예를 들어, 인간화 항체이다.
대안적으로, 단쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기술 (미국 특허 제 4,694,778 호; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883 (1988); 및 Ward et al ., Nature 334:544-554 (1989)) 을 단쇄 항체 생산에 적합시킬 수 있다. 단쇄 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 조각을 아미노산 다리를 통해 연결시켜, 단쇄 항체를 생성시킴으로써 형성된다. 대장균 내의 기능적 Fv 조각의 조립 기술이 또한 이용될 수 있다 (Skerra et al ., Science 242:1038-1041 (1988)).
Sp35 길항제 항체는 또한 내생적 면역글로불린 생산 능력이 없는 유전자도입 동물 (예, 마우스) 내에서 생성된 인간 또는 실질적으로 인간 항체일 수 있다 (예, 각각이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제 6,075,181, 5,939,598, 5,591,669 및 5,589,369 참조). 예를 들어, 키메라 및 생식세포계열 돌연변이체 마우스 내의 항체 중-쇄 접합 부위의 동종접합성 결실은 내생적 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다. 인간 면역글로불린 유전자 배열의 상기 생식세포계열 돌연변이체 마우스로의 전달은 항원 접종시 인간 항체의 생산을 초래한다. SCID 마우스를 이용한 인간 항체 생성의 또다른 바람직한 방법이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제 5,811,524 호에 개시되되어 있다. 상기 인간 항체와 관련된 유전 물질이 또한 본원에 기술된 바와 같이 분리되고 조작될 수 있다는 것이 높이 평가될 것이다.
그러나 재조합 항체 생성을 위한 또다른 고효율적 방법이 Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992) 에 의해 개시되었다. 특이적으로, 상기 기술은 원숭이 가변 영역 도메인 및 인간 불변 영역 서열을 함유한 영장류화 항체의 생성을 초래한다. 상기 참조는 그 전체가 본원에 참조로 인용되었다. 더욱이, 상기 기술은 또한 본원에 참조로 인용된 일반적으로 지정된 미국 특허 제 5,658,570 호, 5,693,780 호 및 제 5,756,096 호에 기술되어 있다.
또다른 구현예에서, 림프구가 미세조작에 의해 선별되고 가변 유전자가 분리될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포가 면역화된 포유동물로부터 분리되고 약 7일 동안 시험관내 배양될 수 있다. 스크리닝 기준을 충족하는 특이적 IgGs 에 대해 배양물이 스크리닝될 수 있다. 양성 웰로부터 세포가 분리될 수 있다. 개개의 Ig-생성 B 세포가 FACS 에 의해 또는 보체-매개 용혈판 검정법에서 그들을 식별함으로써 분리될 수 있다. Ig-생성 B 세포가 튜브 내로 미세조 작될 수 있고 VH 및 VL 유전자가, 예를 들어, RT-PCR 을 이용하여 증폭될 수 있다. VH 및 VL 유전자가 항체 발현 벡터 내로 클로닝되고 발현을 위해 세포(예, 진핵 또는 원핵 세포) 내로 트랜스펙션될 수 있다.
대안적으로, 항체-생산 세포주가 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 선별되고 배양될 수 있다. 상기 기술이 다양한 실험 메뉴얼 및 주요 문헌에 기술되어 있다. 이와 관련하여, 이하 기술된 바와 같은 본 발명의 이용에 적합한 기술이 그 전체가 첨부물을 포함하여 본원에 참조로 인용된 Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) 에 기술되어 있다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 항체가 당 기술분야에 공지된 항체 합성을 위한 임의의 방법에 의해, 특히, 화학적 합성에 의해 또는 바람직하게는, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 범위가 추가로 항원 결합 DNA 서열의 모든 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함한다는 것이 또한 높이 평가될 것이다.
공지된 바와 같이, RNA 는 본래 하이브리도마 세포로부터 또는 다른 형질전환된 세포로부터 표준 기술, 예컨대 구아니디니움 이소티오시아네이트 추출 및 침전에 이은 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 바람직하게는, mRNA 가 전체 RNA 로부터 표준 기술 예컨대 올리고 dT 셀룰로오스 상의 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 적합한 기술이 당 기술분야에 공지되어 있 다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA 가 역전사효소 및 DNA 중합효소를 이용하여 공지된 방법에 따라, 동시에 또는 개별적으로, 만들어질 수 있다. PCR 이 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초한 더욱 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의와 같이, PCR 이 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 클론을 단리하는 데 이용될 수 있다. 이 경우 라이브러리가 공통 프라이머 또는 더 큰 상동 탐침, 예컨대 마우스 불변 영역 탐침에 의해 스크리닝될 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA 가 당 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 세포로부터 분리되고, 예를 들어, 재조합 DNA 기술과 관련된 앞선 참조에서 자세히 설명된 잘 공지된 표준 기술에 따라 제한효소 지도가 만들어지고 서열분석될 수 있다. 물론, 단리 공정 또는 이어지는 분석 과정의 임의의 시점에서 DNA 는 본 발명에 따라 합성될 수 있다.
항체, 또는 그의 조각, 유도체 또는 유사체, 예를 들어, Sp35 길항제인 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 요구한다. 일단 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 부분 (바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유함) 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터가 당 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라 서, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에서 기술된다. 당업자에게 공지된 방법이 이용되어 항체를 코딩하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 상기 방법에는, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 본 발명은, 따라서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 분자, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고 (예, PCT 공개 WO 86/05807; PCT 공개 WO 89/01036; 및 미국 특허 제 5,122,464 호 참조) 항체의 가변 도메인이 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 상기 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터가 통상의 기술에 의해 숙주 세포로 전달되고 트랜스팩팅된 세포가 그후 통상의 기술에 의해 배양되어 본원에 기술된 방법에 사용되는 항체를 생산한다. 따라서, 본 발명은, 이종유래 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중-쇄 항체의 발현을 위한 바람직한 구현예에서, 중쇄 및 경쇄를 둘다 코딩하는 벡터가 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포 내에서 함께 발현될 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용되어 본원에 기술된 방법에 사용되는 항체 분자를 발현할 수 있다. 상기 숙주-발현 시스템은 그에 의해 관심 있는 코딩 서열이 생산되고 이어서 정제될 수 있는 운반체를 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 트랜스펙션되었을 때, 본 발명의 항체 분자를 제자리에서 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 항체를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물 예컨대 박테리아(예, 대장균, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)) 발현 벡터; 항체를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예, 사카로미세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia)); 항체를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 배큘로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 로 감염되거나 항체를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예, Ti 플라스미드) 로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 유전체에서 유래된 프로모터 (예, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터(예, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 를 함유하는 재조합 발현 구축물을 포함하는 포유동물 세포 시스템 (예, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포) 를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한, 박테리아 세포 예컨대 대장균, 및 더욱 바람직하게는, 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 이용된다. 예를 들어, 벡터 예컨대 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소와 결합된, 포유동물 세포 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO) 가 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이 다 (Foecking et al ., Gene 45:101 (1986); Cockett et al ., Bio / Technology 8:2 (1990)).
박테리아 시스템에서, 발현되는 항체 분자에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선별될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약학 조성물의 생성을 위해, 대량의 상기 단백질이 생산되는 경우, 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지도하는 쉽게 정제되는 벡터가 바람직할 것이다. 상기 벡터에는 융합 단백질을 생산하기 위해 항체를 코딩하는 서열이 개별적으로 벡터 내로 lacZ 를 코딩하는 부위와 같은 틀로 연결될 수 있는 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruther et al ., EMBO J. 2:1791 (1983)); pIN 벡터 (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res . 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol . Chem . 24:5503-5509 (1989)) 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. pGEX 벡터가 또한 사용되어 외래 폴리펩티드를 글루타티온 S-전이효소 (GST) 를 갖는 융합 단백질로서 발현할 수 있다. 일반적으로, 상기 융합 단백질은 가용성이고 매트릭스 글루타치온-아가로오스 비드에의 흡착 및 결합 후에 유리 글루타치온의 존재 하의 용리에 의해 용해한 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 방출될 수 있도록 pGEX 벡터가 트롬빈 또는 인자 Xa 단백질분해효소 절단 부위를 포함하도록 고안된다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카 핵 다한증 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhidrosis virus, AcNPV) 가 전형적으로 외래 유전자를 발현하는 벡터로서 이용된다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프로기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포 내에서 자란다. 항체를 코딩하는 서열이 바이러스의 비-필수적 부위 (예를 들어 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터 (예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓여질 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기재 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용되는 경우, 관심 있는 항체를 코딩하는 서열이 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 3 개로 이루어진 (tripartite) 선도 서열에 연결될 수 있다. 상기 키메라 유전자는 그후 아데노바이러스 유전체 내에 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 바이러스 유전체의 비-필수적 부위 (예, 부위 E1 또는 E3) 내의 삽입은 감염된 숙주 내에서 생존할 수 있고 항체 분자를 발현하는 능력이 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다 (예, Logan & Shenk, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:355-359 (1984) 참조). 삽입된 항체를 코딩하는 서열의 효율적 번역을 위해 특이적 개시 신호가 또한 요구될 수 있다. 상기 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 보장하기 위해 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 일치해야 한다. 상기 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 다양한 기원을 가질 수 있고, 둘다 천연 및 합성이다. 발현의 효율성이 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종료자, 등의 봉입에 의해 향상될 수 있다 (Bittner et al ., Methods in Enzymol . 153:51-544 (1987)).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하고, 또는 유전자 생성물을 원하는 특이적 형태로 변형하고 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 상기 변형 (예, 글리코실화) 및 가공 (예, 절단) 은 단백질의 기능에 중요하다. 상이한 숙주 세포는 번역-후 가공 및 단백질 및 유전자 생성물의 변형에 대한 특징적 및 특이적 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 가공을 보장하는 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사체의 적절한 가공, 글리코실화, 및 인산화를 위한 세포 기관을 소유하는 진핵 숙주 세포가 이용될 수 있다. 상기 포유동물 숙주 세포에는 CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 및 특히, 유방암 세포주 예컨대, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, 및 정상 유선 세포주 예컨대, CRL7030 및 Hs578Bst 가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
재조합 단백질의 장기적, 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 이용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주가 설계될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다, 숙주 세포가 적절한 발현 제어 요소 (예, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 등) 에 의해 제어되는 DNA 및 선별가능 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA 의 도입에 이어, 설계된 세포가 보강 배지 내에서 1-2 일 동안 자라도록 하고, 이후 선별 배지로 옮겨질 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선별가능 마커는 선별에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 그의 염색체 내로 안정하게 함입시키고 자라서 포사이 (foci) 를 형성하며 이것이 차례로 클로닝되고 세포주로 증식도록 해준다. 상기 방법은 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 설계하는 데 유리하게 이용된다.
단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 (Wigler et al ., Cell 11:223 (1977)), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스페라제 (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl Acad . Sci . USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트란스페라제(Lowy et al., Cell 22:817 1980) 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는, 다수의 선별 시스템이 이용될 수 있고, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 내에 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성이 하기 유전자의 선별의 근거로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al ., Natl . Acad . Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 75:1527 (1981)); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, Proc . Natl Acad. Sci . USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418 에 대한 내성을 부여하는 neo (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-211 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993)); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al ., Gene 30:147 (1984)). 재조합 DNA 기술 분야에서 공지된 이용될 수 있는 방법이 그 전체가 본원에 참조로 인용된 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Chapters 12 및 13, Dracopoli et al . (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre- Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준이 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (검토를 위해, Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987) 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양 내에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 부위가 항체 유전자와 연합되어 있으므로, 항체의 생산이 또한 증가할 것이다 (Crouse et al ., Mol . Cell . Biol. 3:257 (1983)).
숙주 세포가 본 발명의 두개의 발현 벡터, 중쇄 유도 폴리펩티드를 코딩하는 제 1 벡터 및 경쇄 유도 폴리펩티드를 코딩하는 제 2 벡터로 함께 트랜스펙션될 수 있다. 두개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능케 하는 동일한 선별가능 마커를 함유할 수 있다. 상기의 경우, 독성이 없는 중쇄의 과잉을 회피하기 위해 경쇄가 유리하게는 중쇄 앞에 배치된다 (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:2197 (1980)). 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 서열은 cDNA 또는 유전체 DNA 를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 당 기술분야에 공지된 면역글로불린 분자의 정제를 위한 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화, 특히 단백질 A 이후 특정 항원에 대한 친화, 및 크기순 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다 른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체의 친화도 증가를 위한 바람직한 방법이 US 2002 0123057 A1 에서 개시되었다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 결합 분자 또는 항원 결합 분자는 그안의 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 제거된 ("도메인-제거 항체") 합성 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서 호환성 변형 항체는 그안의 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 제거 구성 또는 변이체 (CH2 구축물) 를 포함할 것이다. 다른 구현예에 있어서 짧은 연결 펩티드가 제거된 도메인을 치환하여 가변 영역에 유연성 및 자유 운동성을 제공할 수 있다. 당업자는 항체 대사율에 대한 CH2 도메인의 조절 특성 때문에 상기 구축물이 특히 바람직하다는 점을 높이 평가할 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 변형된 항체는 소체이다. 소체는 당기술분야에 기술된 방법 (예, 미국 특허 제 5,837,821 호 또는 WO 94/09817A1 참조) 을 이용하여 만들어질 수 있다.
또다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 변형된 항체는 당 기술분야에 공지된 CH2 도메인이 제거된 항체이다. 도메인 제거된 구성은 IgG1 인간 불변 도메인 (예, WO 02/060955A2 및 WO02/096948A2 참조) 을 코딩하는 벡터 (예, Biogen IDEC Incorporated 사제) 를 이용하여 유도될 수 있다. 상기 대표적 벡터가 CH2 도메인을 제거하고 도메인이 제거된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공하도록 설계된다.
한 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 항체 또는 그의 조각은 약간의 또는 심지어 단일 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄를 그것이 단량체성 서브유닛 사이의 연합을 허용하는 한 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인의 선별된 영역 내의 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시키고 이로써 종양 국소화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 조정될 효과기 기능 (예, 보체 결합) 을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 단순히 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 불변 영역의 부분적 결실은 주제 불변 영역와 관계된 다른 바람직한 기능들은 그대로 놔두는 한편 항체의 선별된 특징 (혈청 반감기) 을 향상시킨다. 또한, 상기 암시된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성되는 구축물의 프로필을 증강시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 합성될 수 있다. 상기 관점에서 변형된 항체의 형상 및 면역원성 프로필을 실질적으로 유지하는 한편 보존 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예, Fc 결합) 을 중단시키는 것이 가능할 수 있다. 그러나 다른 구현예는 바람직한 특징 예컨대 효과기 기능을 향상시키거나 또는 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 하나 이상의 아미노산을 불변 영역에 첨가함을 포함한다. 상기 구현예에서 선별된 불변 영역 도메인에서 유래된 특정 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 항체 분자의 변이체 (유도체를 포함) (예, VH 영역 및/또는 VL 영역) 를 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나 또는 이들 로 이루어지고, 그 항체 또는 그의 조각이 면역특이적으로 Sp35 폴리펩티드에 결합하는 항체의 용도를 제공한다. 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 결합 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 돌연변이를 도입할 수 있으며, 지점 돌연변이유발 및 아미노산 치환을 초래하는 PCR-매개 돌연변이유발을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 변이체 (유도체를 포함) 는 기준 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3 과 관계된 50 미만의 아미노산 치환, 40 미만의 아미노산 치환, 30 미만의 아미노산 치환, 25 미만의 아미노산 치환, 20 미만의 아미노산 치환, 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 또는 2 미만의 아미노산 치환을 코딩한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하를 지닌 아미노산 잔기의 족이 당 기술분야에서 정의되어 있다. 상기 과에는 염기성 측쇄를 지닌 아미노산 (예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄 (예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄 ( 예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 가 포함된다. 대안적으로, 돌연변이가 코딩 서열의 전체 또는 부분을 따라서 무작위적으로, 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체가 생물학적 활성에 대해 스크리닝되어 활성을 유지하는 돌연변이체를 식별할 수 있다.
예를 들어, 돌연변이를 항체 분자의 오직 골격 영역 내에 또는 오직 CDR 부위 내에 도입하는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중립 착오 돌연변이, 즉 항체의 항원 결합 능력에 영향을 미치지 않거나 거의 미치지 않을 수 있다. 상기 유형의 돌연변이는 코돈 사용을 최적화하거나, 하이브리도마의 항체 생산을 향상시키는 데 유용하다. 대안적으로, 비-중립 과오 돌연변이가 항체의 항원 결합 능력을 변경할 수 있다. 절대적 요건은 아니지만, 대부분의 비-중립 과오 돌연변이의 위치가 CDR 내일 것 같은 한편, 대부분의 침묵 및 중립 과오 돌연변이의 위치는 골격 영역 내일 것 같다. 당업자는 목적하는 특성 예컨대 항원 결합 활성의 무변경 또는 결합 능력의 변경 (예, 항원 결합 활성의 향상 또는 항체 특이성의 변화) 을 갖는 돌연변이 분자를 고안하고 시험할 수 있을 것이다. 돌연변이유발 이후에, 코딩된 단백질이 일상적으로 발현될 수 있고 코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성이 본원에 기술된 기술을 이용하여 또는 당 기술분야에 공지된 일상적인 변형 기술에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 대표적 항체 또는 그의 조각에는 동일한 Sp35 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 조각이 포함되나 이에 한정되지는 않으며, 참조로서 단일클론 항체는 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), 및 1968 (L1a.13) 로 이루어진 군에서 선택되고, 이들은 모두 그 전체가 본원에 참조로 인용된 미국 가 특허 출원 제 60/697,336 호, 제 60/771,990 호 및 제 60/814,522 호에 기술된 바와 같다.
융합 단백질 및 접합 폴리펩티드 및 항체
본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 및 길항제 항체는 또한 이종유래 폴리펩티드에 N- 또는 C- 말단에서 재조합적으로 융합되거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합 (공유 및 비-공유 접합을 포함) 될 수 있다. 예를 들어, Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 및 항체는 검출 검정에서 표지로서 유용한 분자 및 효과기 분자 예컨대 이종유래 폴리펩티드, 약물, 방사선핵종, 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 접합될 수 있다. 예, PCT 공개 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제 5,314,995 호; 및 EP 396,387 참조.
본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 및 항체에는 변형된, 즉, 그 공유적 접착이 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체가 Sp35 의 생물학적 기능을 억제하는 것을 방지하지 않는 임의 유형의 분자의 공유적 접착에 의해 변형된 유도체가 포함된다. 제한하는 방식이 아닌, 예를 들면, 본 발명의 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 및 항체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스필화 (phosphylation), 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결 등에 의한 유도체화에 의해 변형될 수 있다. 특이적인 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는 공지 기술에 의해 임의의 다수의 화학적 변형이 수행될 수 있다. 부가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-전형적 아미노산을 함유할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 및 항체는 펩티드 결합 또는 변형 펩티드 결합, 즉, 펩티드 동배체에 의해 서로에게 연결된 아미노산으로 구성될 수 있고, 20 개 유전자-코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 및 항체는 자연 가공, 예컨대 번역후 가공에 의해, 또는 당 기술분야에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 상기 변형은 방대한 연구 논문에서뿐만 아니라, 기본 교재 및 더 자세한 전공논문에서 잘 기술되어 있다. 변형은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단, 또는 부분 예컨대 탄수화물 상을 포함한 Sp35 길항제 폴리펩티드 또는 항체 내의 어디에서나 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체 내의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것이 높이 평가될 것이다. 또한, 주어진 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다. Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체는, 예를 들어, 유비퀴틴화의 결과로서, 분지형일 수 있고, 분지가 있거나 없는 고리형일 수 있다. 고리형, 분지형 및 분지고리형 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 및 항체는 번역후 자연가공으로부터 생성될 수 있거나 합성 방법에 의해 만들어질 수 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 부분의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 교차-결합, 고리화, 이황결합 형성, 탈메틸화, 공유적 교차-결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 고정 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길화, 단백질분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 술파화, 단백질에의 아미노산의 전사-RNA 매개 첨가 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화가 포함된다 (예를 들어, Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci. 663:48-62 (1992) 참조).
본 발명은 또한 Sp35 기능을 억제하는 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체 융합을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체가 융합되는 이종유래 폴리펩티드는 기능에 유용하거나 Sp35 길항제 폴리펩티 드 또는 항체를 표적화하는데 유용하다. 본 발명의 특정 구현예에서 가용성 Sp35 길항제 폴리펩티드, 예를 들어, LRR 도메인, Ig 도메인, 또는 전체 세포외 도메인 (SEQ ID NO: 2 의 아미노산 34 내지 532 에 상응함) 을 포함하는 Sp35 폴리펩티드가, 이종유래 폴리펩티드 부분에 융합되어 Sp35 길항제 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있다. Sp35 길항제 융합 단백질, 압타머 및 항체는 다양한 목적 예를 들어, 증가된 혈청 반감기, 향상된 생체이용률, 특정 기관 또는 조직 유형에 대한 생체내 표적화, 향상된 재조합 발현 효율성, 향상된 숙주 세포 분비, 정제의 용이성, 및 높은 결합활성을 달성하는 데 이용될 수 있다. 달성될 목적에 따라서, 이종유래 부분이 비활성이거나 생물학적 활성일 수 있다. 또한, 시험관내 또는 생체내에서, Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 안정하게 융합되거나 절단가능하도록 선택될 수 있다. 상기 다른 목적을 달성하기 위한 이종유래 부분들이 당 기술분야에 공지되었다.
Sp35 길항제 융합 폴리펩티드, 압타머 또는 항체의 발현에 대한 대안으로서, 선택된 이종유래 부분이 기형성되고 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 화학적으로 접합될 수 있다. 대부분의 경우, 선택된 이종유래 부분은 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 융합되었든지 접합되었든지 여하간에 유사하게 기능할 것이다. 그러므로, 이종유래 아미노산 서열에 대한 하기 논의에서, 다른 언급이 없는 한, 이종유래 서열이 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 융합 단백질의 형태로서 또는 화학적 접합체로서 연결될 수 있다는 점이 이해되어야 한다.
약리학적 활성 폴리펩티드 예컨대 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체는 종종 신속한 생체내 제거를 나타내 치료적으로 효과적인 체내 농도를 달성하기 위해 많은 투여량을 필요로하게 한다. 또한, 약 60 kDa 보다 작은 폴리펩티드는 잠재적으로 사구체 여과를 거치고, 이는 때대로 신독성을 초래한다. 비교적 작은 폴리펩티드 예컨대 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체의 융합 또는 접합이 상기 신독성의 위험을 감소시키거나 회피하는데 이용될 수 있다. 치료적 폴리펩티드의 생체내 안정성, 즉, 혈청 반감기를 증가시키기 위한 다양한 이종유래 아미노산 서열, 즉, 폴리펩티드 부분 또는 "담체" 가 공지되었다.
긴 반감기, 광범위한 생체내 분포, 및 효소적 또는 면역학적 기능의 결여로 인해, 본질적으로 전장 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 HSA 조각이 흔히 이종유래 부분으로서 이용된다. Yeh et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 1904-08 (1992) 및 Syed et al ., Blood 89:3243-52 (1997) 에서 교시된 바와 같은 방법 및 물질의 적용을 통해, 예를 들어, 10-배 내지 100-배 높은 현저히 증가된 생체내 안정성을 나타내는 한편 Sp35 부분에 의한 약리학적 활성을 나타내는 Sp35 길항제 융합 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 폴리펩티드/항체 접합체를 형성하는 데 HSA 가 이용될 수 있다. HSA 의 C-말단이 Sp35 부분의 N-말단에 융합될 수 있다. HSA 가 자연적으로 분비되는 단백질이므로, 융합 단백질이 진핵, 예를 들어, 포유동물 발현 시스템 내에서 생산되는 경우 HSA 신호 서열이 활용되어 세포 배지 내로 가용성 Sp35 융합 단백질의 분비를 수득할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타 머, 항체 및 그의 항체 조각은 추가로 표적화 부분을 포함한다. 표적화 부분에는 신체의 특정 부분, 예를 들어, 뇌 또는 그안의 구역으로의 국소화를 유도하는 단백질 또는 펩티드가 포함된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 그의 항체 조각이 뇌 표적화 부분에 부착되거나 융합된다. 뇌 표적화 부분은 공유적으로 부착되거나 (예, 직접적, 번역 융합, 또는 직접적 또는 임의로 절단가능할 수 있는 스페이서 분자를 통한 화학적 연결에 의해) 비-공유적으로 부착된다 (예, 가역적 상호작용 예컨대 아비딘, 비오틴, 단백질 A, IgG, 등을 통해). 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 그의 항체 조각이 하나 더의 뇌 표적화 부분에 부착된다. 추가적인 구현예에서, 뇌 표적화 부분이 본 발명의 방법에 사용되는 다수의 Sp35 의 길항제 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 그의 항체 조각에 부착된다.
Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 그의 항체 조각과 관련된 뇌 표적화 부분은 상기 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 그의 항체 조각의 뇌 전달을 향상시킨다. 단백질 또는 치료제와 융합되었을 때, 혈뇌 장벽 (BBB) 을 통해 단백질 또는 치료제를 전달하는 다수의 폴리펩티드가 기술되었다. 한정하지 않는 예에는 단일 도메인 항체 FC5 (Abulrob et al . (2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214); mAB 83-14, 인간 인슐린 수용체에 대한 단일클론 항체 (Pardridge et al. (1995) Pharmacol . Res . 12, 807-816); 인간 트랜스페린 수용체 (hTfR) 에 대한 B2, B6 및 B8 펩티드 결합 (Xia et al. (2000) J. Virol . 74, 11359-11366); 트랜스페린 수용체에 대한 OX26 단일클론 항체 (Pardridge et al. (1991) J. Pharmacol. Exp . Ther . 259, 66-70); 및 미국 특허 제 6,306,365 호의 SEQ ID NO:1-18 이 포함된다. 상기 참조의 내용이 전체로서 본원에 참조로 인용되었다.
Sp35 조성물의 향상된 뇌 전달이 당기술분야에서 잘 정립된 다수의 수단에 의해 측정된다. 예를 들어, 뇌 표적화 부분과 연결된 방사성 표지된 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 그의 항체 조각을 동물에 투여함; 뇌 국소화를 측정함; 및 뇌 표적화 부분과 연합되지 않은 동등한 방사성 표지된 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머, 항체 또는 그의 항체 조각과 국소화를 비교함. 향상된 표적화를 측정하는 다른 방법이 상기 참조에 기술되어 있다.
신호 서열은 소포체 막을 통한 단백질 수송을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 면역융합체를 구축하는 데 유용한 신호 서열에는 항체 경쇄 신호 서열, 예를 들어, 항체 14.18 (Gillies et al ., J. Immunol . Meth . 125:191-202 (1989)), 항체 중쇄 신호 서열, 예를 들어, MOPC141 항체 중쇄 신호 서열 (Sakano et al ., Nature 286:5174 (1980)) 가 포함된다. 대안적으로, 다른 신호 서열이 이용될 수 있다. 예, Watson, Nucl . Acids Res . 12:5145 (1984) 참조. 신호 펩티드는 통상 소포체의 루멘 내에서 신호 펩티드분해효소에 의해 절단된다. 이는 Fc 부위 및 가용성 Sp35 부분을 함유하는 면역융합 단백질의 분비를 초래한다.
일부 구현예에서, DNA 서열이 단백질분해 절단 부위를 분비 카세트와 가용성 Sp35 부분 사이에 코딩할 수 있다. 상기 절단 부위가, 예를 들어, 코딩된 융합 단백질의 단백질분해 절단을 제공하고, 이로써 Fc 도메인을 표적 단백질로부터 분리해낼 수 있다. 유용한 단백질분해 절단 부위에는 단백질분해 효소 예컨대 트립신, 플라스민, 트롬빈, 인자 Xa, 또는 엔테로키나아제 K 에 의해 인지되는 아미노산 서열이 포함된다.
분비 카세트가 복제가능 발현 벡터 내로 함입될 수 있다. 유용한 벡터에는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드 등이 포함된다. 대표적 발현 벡터가 pdC 이고, 여기서 면역융합 DNA 의 전사는 인간 사이토메갈로바이러스의 인핸서 및 프로모터의 제어 아래 놓여진다. 예, Lo et al ., Biochim . Biophys . Acta 1088:712 (1991); 및 Lo et al ., Protein Engineering 11:495-500 (1998) 참조. 적절한 숙주 세포가 가용성 Sp35 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로 형질전환되거나 트랜스펙션되어 가용성 Sp35 폴리펩티드의 발현 및 분비에 이용된다. 전형적으로 사용되는 숙주 세포에는 불멸의 하이브리도마 세포, 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 및 COS 세포가 포함된다.
한 구현예에서, 가용성 Sp35 폴리펩티드가 경첩 및 Fc 영역, 즉, Ig 중쇄 불변 영역의 C-말단 부분에 융합된다. Sp35-Fc 융합의 잠재적 이점에는 용해도, 생체내 안정성, 및 다가성 (multivalency), 예를 들어, 이합체화가 포함된다. 사용되는 Fc 영역은 IgA, IgD, 또는 IgG Fc 영역 (경첩-CH2-CH3) 일 수 있다. 대안적으로, IgE 또는 IgM Fc 영역 (경첩-CH2-CH3-CH4) 일 수 있다. IgG Fc 영 역, 예를 들어, IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이 일반적으로 이용된다. 한 구현예에서, 파파인 절단 부위 바로 상류의 경첩 영역에서 시작하는 IgG Fc 를 화학적으로 정의하는 서열 (즉 잔기 216, Kabat 시스템에 따라 중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기가 114 임), 또는 다른 면역글로불린의 동종 부위가 융합에 사용된다. 융합이 이뤄지는 정확한 부위는 중요하지 않다; 특정 부위가 공지되어 있고 분자의 생물학적 활성, 분비, 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다. Fc 융합을 코딩하는 DNA 를 구축하고 발현하는 물질 및 방법이 당 기술분야에 공지되어 있고 가용성 Sp35 융합을 과도한 실험을 하지 않고 수득하는 데 적용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구현예는 Capon et al., 미국 특허 제 5,428,130 호 및 제 5,565,335 호에 기술된 바와 같은 Sp35 융합 단백질을 이용한다.
완전한 무손상, 야생형 Fc 영역은 본 발명의 방법에 이용되는 Fc 융합 단백질에서 보통 불필요하고 바람직하지 않은 효과기 기능을 나타낸다. 그러므로, 분비 카세트의 구성 과정에서 특정 결합 부위가 Fc 영역으로부터 전형적으로 제거된다. 예를 들어, 경쇄와의 공동발현이 불필요하기 때문에, 중쇄 결합 단백질, Bip (Hendershot et al ., Immunol . Today 8:111-14 (1987)) 에 대한 결합 부위가, IgE 의 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 제거되어, 이 부위가 면역융합의 효율적인 분비를 간섭하지 않게 된다. IgM 내에 존재하는 것과 같은 막투과 도메인 서열이 또한 일반적으로 제거된다.
IgG1 Fc 영역이 가장 흔히 사용된다. 대안적으로, 면역글로불린 감마의 다른 서브계열 (감마-2, 감마-3 및 감마-4) 의 Fc 부위가 분비 카세트 내에 사용될 수 있다. 면역글로불린 감마-1 의 IgG1 Fc 영역이 일반적으로 분비 카세트 내에 사용되고 경첩 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 감마-1 의 Fc 영역는, 경첩 영역 및 CH3 영역 부분은 포함하나, CH2 영역은 포함하지 않는 CH2-제거된-Fc 이다. CH2-제거된-Fc 가 Gillies et al. (1990) Hum . Antibod . Hybridomas 1:47 에 의해 기술되었다. 일부 구현예에서, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 중 하나의 Fc 영역이 사용된다.
Sp35-Fc 융합 단백질이 여러가지 상이한 형상으로 구성될 수 있다. 한 형상에서 가용성 Sp35 부분의 C-말단이 Fc 경첩 부분의 N-말단에 직접 융합된다. 약간 상이한 형상에서, 짧은 폴리펩티드, 예를 들어, 2-10 아미노산이 가용성 Sp35 부분의 N-말단과 Fc 부분의 C-말단 사이의 융합으로 함입된다. 상기 연결자가 입체형태의 유연성을 제공하고, 이는 몇몇 상황에서 생물학적 활성을 향상시킨다. 경첩 영역의 충분한 부분이 Fc 부분 내에서 유지된 경우, Sp35-Fc 융합이 이합체화하여, 2가 분자를 형성할 것이다. 단량체성 Fc 융합의 균질 집단은 단일특이적, 2가 2합체를 생산할 것이다. 각각 상이한 특이성을 갖는 두개의 단량체성 Fc 융합의 혼합물은 이중특이성 2가 2합체를 생산할 것이다.
상응하는 아미노-반응기 및 티올-반응기를 함유하는 다수의 교차-연결자 중 임의의 것이 Sp35 길항제 폴리펩티드를 혈청 알부민에 연결하는 데 이용될 수 있다. 적합한 연결자의 예에는 티올-반응성 말레이미드를 삽입하는 아민 반응성 교차-연결자, 예를 들어, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, 및 GMBS 가 포함된다. 다른 적합한 연결자는 티올-반응성 할로아세테이트기를 삽입하고, 예를 들어, SBAP, SIA, SIAB 이다. 환원성 연결을 생산하기 위한 술프히드릴 기와의 반응에 대해 보호되거나 보호되지 않은 티올을 제공하는 연결자에는 SPDP, SMPT, SATA, 및 SATP 가 포함된다. 상기 시약은 시판된다 (예, Pierce Chemicals).
접합이 혈청 알부민 상의 티올 부분 또는 가용성 Sp35 폴리펩티드의 N-말단을 수반해야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 가용성 Sp35-알부민 융합은 가용성 Sp35 부분이 혈청 알부민 유전자와 그의 N-말단, C-말단, 또는 둘다에서 융합되는 유전 공학 기술을 이용하여 수득될 수 있다.
가용성 Sp35 폴리펩티드가 이종유래 펩티드와 융합되어 가용성 Sp35 부분의 정제 및 식별을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 히스티딘 태그가 가용성 Sp35 폴리펩티드에 융합되어 시판중인 크로마토그래피 매질을 이용하는 정제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 가용성 Sp35 융합 구성이 이용되어 박테리아 내에서 가용성 Sp35 부분의 생산을 강화시킬 수 있다. 상기 구성에서 보통 높은 농도로 발현되고/거나 분비되는 박테리아 단백질이 가용성 Sp35 폴리펩티드의 N-말단 융합 상대로서 이용될 수 있다. 예, Smith et al., Gene 67:31 (1988); Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988); La Vallie et al., Biotechnology 11:187 (1993) 참조.
적합한 융합 상대의 아미노 및 카르복시 말단에 가용성 Sp35 부분을 융합시킴으로써, 가용성 Sp35 폴리펩티드의 2가 또는 4가 형태가 수득될 수 있다. 예를 들어, 가용성 Sp35 부분이 Ig 부분의 아미노 및 카르복시 말단에 융합되어 두개의 가용성 Sp35 부분을 함유하는 2가 단량체성 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 상기 단량체 두개를 2합체하면, Ig 부분의 특성으로 인해, 가용성 Sp35 단백질의 4가 형태가 수득된다. 상기 다가 형태는 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 획득하는 데 이용될 수 있다. 가용성 Sp35 의 다가 형태는 또한 가용성 Sp35 부분을 일렬로 배치하여 연쇄체 (concatamer) 를 형성함으로써 수득될 수 있고, 이는 단독으로 또는 융합 상대 예컨대 Ig 또는 HSA 와 융합되어 이용될 수 있다.
접합 중합체 (폴리펩티드 이외의 것)
본 발명의 일부 구현예는 하나 이상의 중합체가 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 접합 (공유적으로 연결) 된 가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 압타머, 또는 Sp35 항체를 수반한다. 상기 접합에 적합한 중합체의 예에는 폴리펩티드 (상기 논의됨), 압타머, 당 중합체 및 폴리알킬렌 글리콜 사슬이 포함된다. 전형적으로, 그러나 필수적이지는 않게, 중합체가 하기, 용해도, 안정성, 또는 생체이용률 중 하나 이상을 향상시킬 목적으로 가용성 Sp35 폴리펩티드, 압타머 또는 Sp35 항체에 접합된다: .
Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에의 접합에 일반적으로 이용되는 중합체의 종류는 폴리알킬렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 가장 빈번히 사용된다. PEG 부분, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 PEG 중합체가 각각의 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머, 또는 항체에 접합되어 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체 단독일 때와 비교할 때 혈청 반감기를 향상시킬 수 있다. PEG 부분은 비-항원성이고 본질적으로 생물학적 비활성이다. 본 발명의 실시에 사용된 PEG 부분은 분지형 또는 비분지형일 수 있다.
Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 부착된 PEG 부분의 개수 및 개별 PEG 사슬의 분자량은 다를 수 있다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 클수록, 폴리펩티드에 부착된 중합체 사슬이 적다. 통상, Sp35 길항제 폴리펩티드 압타머 또는 항체에 부착된 중합체 총충량은 20 kDa 에서 40 kDa 까지이다. 따라서, 하나의 중합체 사슬이 부착된 경우, 사슬의 분자량은 일반적으로 20-40 kDa 이다. 두개의 사슬이 부착된 경우, 각 사슬의 분자량은 일반적으로 10-20 kDa 이다. 세개의 사슬이 부착된 경우, 분자량은 일반적으로 7-14 kDa 이다.
중합체, 예를 들어, PEG 가 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 폴리펩티드 상의 임의의 적합한, 노출된 반응기를 통해 연결될 수 있다. 노출된 반응기(들) 은, 예를 들어, 내부 리신 잔기의 N-말단 아미노기 또는 엡실론 아미노기, 또는 둘다일 수 있다. 활성화된 중합체가 반응하여 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체 상의 임의의 유리 아미노기에 공유적으로 연결될 수 있다. Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체 (입수할수 있는 경우) 의 유리 카르복실기, 적절히 활성화된 카르보닐기, 히드록실, 구아니딜, 이미다졸, 산화 탄수화물 부분 및 메르캅토기가 또한 중합체 부착을 위한 반응기로서 이용될 수 있다.
접합 반응에서, 폴리펩티드 농도에 따라, 폴리펩티드의 몰 당 약 1.0 내지 약 10 몰의 활성화된 중합체가 전형적으로 이용된다. 통상, 선택된 비율은 Sp35 길항제 폴리펩티드 또는 항체의 바람직한 약리학적 활성을 손상할 수 있는 부작용 (흔히 비-특이적임) 을 최소화하는 한편 반응을 최대화하는 것 사이의 균형을 나타낸다. 바람직하게는, Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체의 생물학적 활성의 적어도 50% (예를 들어, 본원에 기술된 또는 당 기술분야에서 공지된 검정 중 임의의 것에서 설명된 바와 같이) 가 유지되고, 가장 바람직하게는 거의 100% 가 유지된다.
중합체가 통상적인 화학을 이용하여 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 부분이 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체의 리신 엡실론 아미노기에 커플링될 수 있다. 리신 측쇄에 대한 연결이 N-히드록실숙신이미드 (NHS) 활성 에스테르 예컨대 PEG 숙신이미딜 숙시네이트 (SS-PEG) 및 숙신이미딜 프로피오네이트 (SPA-PEG) 에 의해 수행될 수 있다. 적합한 폴리알킬렌 글리콜 부분에는, 예를 들어, 카르복시메틸-NHS 및 노르류신-NHS, SC 가 포함된다. 상기 시약들이 시판중이다. 부가적 아민-반응성 PEG 연결자로 숙신이미딜 부분이 치환될 수 있다. 상기에는, 예를 들어, 이소티오시아네이트, 니트로페닐카르보네이트 (PNP), 에폭시드, 벤조트리아졸 카르보네이트, SC-PEG, 트레실레이트, 알데히드, 에폭시드, 카르보닐이미다졸 및 PNP 카르보네이트가 포함된다. 선택성 및 반응의 정도를 최대화하도록 조건이 통상 최적화된다. 반응 조건의 상기 최적화는 당 기술분야의 통상의 기술이다.
페길화가 당 기술분야에 공지된 임의의 페길화 반응에 의해 수행될 수 있다. 예, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992), 및 유럽 특허 출원 EP 0 154 316 및 EP 0 401 384 참조. 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 동종 반응성 물-가용성 중합체) 에 의한 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 이용하여 페길화가 수행될 수 있다.
아실화에 의한 페길화는 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜의 활성 에스테르 유도체를 반응시킴을 수반한다. 임의의 반응성 PEG 분자가 페길화에 이용될 수 있다. N-히드록시숙신이미드 (NHS) 로 에스테르화된 PEG 가 빈번히 사용되는 활성화된 PEG 에스테르이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "아실화" 는 치료적 단백질과 물-가용성 중합체 예컨대 PEG 사이의 하기 유형의 연결을 제한없이 포함한다: 아미드, 카르바메이트, 우레탄, 등. 예, Bioconjugate Chem. 5:133-140, 1994 참조. 반응 변수들은 일반적으로, 가용성 Sp35 폴리펩티드, 압타머 또는 항체를 손상 또는 비활성화시킬 수 있는 온도, 용매, 및 pH 조건을 회피하도록 선택된다.
일반적으로, 연결하는 연결은 아미드이고 전형적으로 적어도 95% 의 생성되는 산물이 모노-, 디- 또는 트리-페길화 된다. 그러나, 높은 정도의 페길화를 갖는 일부 종이 사용된 특정 반응 조건에 따른 양으로 형성될 수 있다. 임의로, 정제된 페길화 종이 혼합물, 특히 미반응 종으로부터 분리되고, 예를 들어, 투석, 염석, 초여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 교환 크로마토그래피, 및 전기영동을 포함하는 통상적인 정제 방법에 의해 분리된다.
알킬화에 의한 페길화는 일반적으로 PEG 의 말단 알데히드 유도체를 Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체와 환원제의 존재 하에 반응시킴을 수반한다. 또한, Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체의 실질적으로 오직 N-말단 아미노기에서만의 페길화, 즉 모노-페길화 단백질이 선호되도록 반응 조건이 조작될 수 있다. 모노-페길화 또는 폴리-페길화 중 어느 경우에도, PEG 기가 전형적으로 단백질에 -CH2-NH- 기를 통해 부착된다. -CH2- 기와의 특별한 관련으로, 상기 유형의 연결은 "알킬" 연결로 알려졌다.
N-말단이 표적화된 모노-페길화 생성물을 생산하기 위한 환원성 알킬화를 통한 유도체화는, 유도체화에 이용가능한 상이한 유형의 1차 아미노기 (리신 대 N-말단) 의 차별적인 반응성을 활용한다. 리신 잔기의 엡실론-아미노기와 단백질의 N-말단 아미노기의 그것 사이의 pKa 차이를 이용함을 허용하는 pH 에서 반응이 수행된다. 상기 선택적 유도체화에 의해, 반응기, 예컨대 알데히드를 함유하는 물-가용성 중합체의 단백질로의 부착이 제어된다: 중합체와의 접합이 단백질의 N-말단에서 우세하게 발생하고 다른 반응기, 예컨대 리신 측쇄 아미노기의 어떠한 의미있는 변형도 발생하지 않는다.
아실화 및 알킬화 접근 둘다에 이용된 중합체 분자는 물-가용성 중합체 중에서 선택된다. 선별된 중합체가 전형적으로 단일 반응기, 예컨대 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드를 갖도록 변형되어, 본 방법에서 제공된 바와 같이 중합의 정도가 제어될 수 있다. 대표적 반응성 PEG 알데히드가, 물에서 안정한, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드이고, 또는 그의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다 (예, Harris et al., 미국 특허 제 5,252,714 호 참조). 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 아실화 반응에 있어서, 선별된 중합체(들) 은 전형적으로 단일 반응성 에스테르기를 갖는다. 환원성 알킬화에 있어서, 선별된 중합체(들) 은 전형적으로 단일 반응성 알데히드기를 갖는다. 일반적으로, 물-가용성 중합체가 자연적으로 발생하는 글리코실 잔기로부터 선택되지 않는 이유는, 이들이 통상 포유동물 재조합 발현 시스템에 의해 더 편리하게 만들어질 수 있기 때문이다.
페길화 가용성 Sp35 폴리펩티드, 압타머 또는 항체의 제조 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함한다: (a) Sp35 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체를 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 PEG 의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체) 과 분자가 하나 이상의 PEG 기에 부착되는 조건 하에 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 산물(들) 을 수득하는 단계. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건이 공지된 변수 및 목적하는 결과에 기초하여 개별적으로 결정될 것이다. 예를 들어, PEG 대 단백질의 높은 비율은 일반적으로 더 높은 백분율의 폴리-페길화 생성물을 초래한다.
모노-중합체/가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 압타머 또는 Sp35 항체의 실질적으로 균질한 집단을 생산하기 위한 환원성 알킬화는 일반적으로 하기 단계를 포함한다: (a) 가용성 Sp35 단백질 또는 폴리펩티드를 반응성 PEG 분자와 환원성 알킬화 조건 하에, 폴리펩티드 또는 항체의 N-말단 아미노기의 선택적 변형을 허용하는 적합한 pH 에서 반응시키는 단계; 및 (b) 반응 산물(들) 을 수득하는 단계.
모노-중합체/가용성 Sp35 폴리펩티드, Sp35 압타머 또는 Sp35 항체의 실질적으로 균질한 집단을 위한, 환원성 알킬화 반응 조건은 물-가용성 중합체 부분의 폴리펩티드, 또는 항체의 N-말단으로의 선택적 부착을 허용하는 조건이다. 상기 반응 조건은 일반적으로 리신 측쇄 아미노기와 N-말단 아미노기 사이의 pKa 차이를 제공한다. 본 발명의 목적을 위한, pH 는 일반적으로 3-9, 전형적으로 3-6 의 범위이다.
가용성 Sp35 폴리펩티드, 압타머 또는 항체에는 태그, 예를 들어, 단백질분해의 결과로서 방출될 수 있는 부분이 포함된다. 따라서, 먼저 His-태그를 반응시켜 저-분자량 연결자 예컨대 리신 및 N-말단 둘다와 반응하는 Traut's 시약 (Pierce) 으로 변형시키고, 그후 His 태그를 방출시킴으로써, 리신 부분이 선택적으로 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 그후 티올-반응성 머리 그룹 (head group), 예컨대 말레이미드기, 비닐술폰기, 할로아세테이트기, 또는 유리 또는 보호된 SH 를 함유하는 PEG 로 선택적으로 변형될 수 있는 유리 SH 기를 함유할 수 있다.
Traut's 시약이 PEG 부착을 위한 특정 부위를 설정할 임의의 연결자로 대체될 수 있다. 예를 들어, Traut's 시약은 SPDP, SMPT, SATA, 또는 SATP (Pierce) 로 대체될 수 있다. 유사하게, 단백질을 말레이미드 (예를 들어 SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, 또는 GMBS), 할로아세테이트기 (SBAP, SIA, SIAB), 또는 비닐술폰기를 삽입하는 아민-반응성 연결자와 반응시키 고, 생성 산물을 유리 SH 를 함유하는 PEG 와 반응시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분이 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 의 길항제 폴리펩티드, 압타머 또는 항체의 시스테인기와 커플링된다. 커플링은 예를 들어, 말레이미드기, 비닐술폰기, 할로아세테이트기, 또는 티올기를 이용하여 이루어질 수있다.
임의로, 가용성 Sp35 폴리펩티드, 압타머 또는 항체가 불안정 결합을 통해 폴리에틸렌-글리콜 부분에 접합될 수 있다. 불안정 결합이, 예를 들어, 생화학적 가수분해, 단백질분해, 또는 술프히드릴 절단으로 절단될 수 있다. 예를 들어, 결합이 생체내 (생리학적) 조건 하에 절단될 수 있다.
반응이 생물학적 활성 물질을 비활성 중합체와 반응시키는 데 이용되는 임의의 적절한 방법에 의해, 반응기가 N-말단의 알파 아미노기 상에 있는 경우, 일반적으로 약 pH 5-8, 예를 들어, pH 5, 6, 7, 또는 8 에서 일어날 수 있다. 일반적으로 공정은 활성화된 중합체를 제조하고 그후 단백질을 활성화된 중합체와 반응시켜 제형에 적합한 가용성 단백질을 생산함을 수반한다.
Sp35 폴리뉴클레오티드 길항제
본 발명의 방법의 Sp35 길항제에는 Sp35 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 포함하는 Sp35 폴리뉴클레오티드 길항제가 포함된다. Sp35 폴리뉴클레오티드 길항제는 Sp35 의 발현을 방지한다 (녹다운). Sp35 폴리뉴클레오티드 길항제에는 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, shRNA, RNAi 가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 전형적으로, 상기 결합 분자는 동물에 개별적으로 투여되나 (예를 들어, O'Connor, J. Neurochem . 56:560 (1991) 참조), 상기 결합 분자는 또한 숙주 세포에 의해 흡수되어 생체내 발현된 폴리뉴클레오티드로부터 생체내 발현될 수 있다. 또한, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) 참조.
RNAi 는 표적 mRNA 의 발현을 간섭하는 RNA 의 발현을 말한다. 특이적으로, RNAi 는 siRNA (짧은 간섭 RNA) 를 통해 특정 mRNA (예, Sp35) 와 상호작용함으로써 표적 유전자를 침묵시킨다. ds RNA 복합체가 세포에 의한 분해를 위해 표적화된다. 부가적 RNAi 분자는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 또한 짧은 간섭 헤어핀을 포함한다. shRNA 분자는 루프로 연결된 표적 유전자로부터의 센스 및 안티센스 서열을 함유한다. shRNA 가 핵으로부터 세포질 내로 수송되고, mRNA 와 함께 분해된다. Pol III 또는 U6 프로모터가 RNAi 에 대한 RNAs 를 발현하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, shRNA 가 렌티바이러스 벡터 (예, pLL3.7) 로부터 발현된다.
RNAi 는 그들의 "표적" mRNAs 에 대해 서열-특이적 상동성을 갖는 2중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 매개된다 (Caplen et al ., Proc Natl Acad Sci . USA 98:9742-9747, 2001). 초파리 무균 용해물에 대한 생화학적 연구는 RNA-의존 유전자 침묵의 매개자가 21-25 뉴클레오티드 "소형 간섭" RNA 두가닥 (siRNAs) 임을 지시한다. 따라서, siRNA 분자가 본 발명의 방법에 유리하게 이용된다. siRNAs 는 DICER (Bernstein et al ., Nature 409:363-366, 2001) 로 알려진 RNA 분해효소에 의한 dsRNA 의 가공으로부터 유래한다. siRNA 두가닥 생성물이 RISC (RNA Induced Silencing Complex: 유도된 침묵 복합체) 로 언급되는 다-단백질 siRNA 복합체로 동원되는 것으로 여겨진다. 임의의 특정 이론에 구속됨을 바라지 않지만, RISC 가 표적 mRNA 로 안내되어, 여기서 siRNA 두가닥이 서열-특이적으로 상호작용하여 촉매 방식으로 절단을 매개한다고 생각된다 (Bernstein et al ., Nature 409:363-366, 2001; Boutla et al ., CurrBiol 11:1776-1780, 2001).
RNAi 는, 한정하지 않는 예로서 뉴런(Krichevsky et al., Proc Natl Acad Sci. USA 99:11926-11929, 2002)을 포함하는, 포유동물 세포 내의 유전자 기능 분석 및 필수적 유전자 식별에 이용되어 왔다 (Elbashir et al ., Methods 26:199-213, 2002; Harborth et al ., J Cell Sci . 114:4557-4565, 2001). RNAi 는 또한, 예컨대 한정하지 않으면서 폴리오바이러스 (Gitlin et al ., Nature 418:379-380, 2002) 및 HIV(Capodici et al ., J Immunol 169:5196- 5201, 2002) 를 포함하는 바이러스의 감염, 복제 및/또는 성장을 억제 또는 차단하고, 종양유전자 (예, bcr-abl gene; Scherr et al ., Blood 101(4):1566-9, 2002)의 발현을 감소시키는 치료법에 대해 평가받고 있다. RNAi 는 포유동물 (마우스) 및 양서류 (제노프스) 배아 (각각, Calegari et al ., Proc Natl Acad Sci . USA 99:14236-14240, 2002; 및 Zhou, et al ., Nucleic Acids Res 30:1664-1669, 2002) 에서, 및 생후 마우스 (Lewis et al., Nat Genet 32:107-108, 2002) 에서 유전자 발현을 조정하고, 성체 유전자도입 마우스 (McCaffrey et al ., Nature 418:38-39, 2002) 에서 전이유전자 발현을 감소시키는 데 이용되어 왔다. 세포 배양 내 및 생체내 siRNAs 의 효능 및 특이성을 측정하기 위한 방법들이 기술되어 왔다(예, Bertrand et al ., Biochem Biophys Res Commun 296: 1000-1004, 2002; Lassus et al ., Sci . STKE 2002(147):PL13, 2002; 및 Leirdal et al., Biochem Biophys Res Commun 295:744-748, 2002 참조).
siRNA 를 한정 없이 포함하는 RNAi 를 매개하는 분자가, 화학적 합성 (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), dsRNA 의 가수분해 (Yang et al ., Proc Natl Acad Sci . USA 99:9942-9947, 2002) 에 의해, T7 RNA 중합효소 (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al ., Proc Natl Acad Sci . USA 99:6047-6052, 2002) 에 의한 시험관내 전사에 의해, 및 핵산분해효소 예컨대 대장균 RNA 분해효소 III (Yang et al ., Proc Natl Acad Sci . USA 99:9942-9947, 2002)을 이용하는 2중가닥 RNA 의 가수분해에 의해 시험관내 생산될 수 있다.
siRNA 분자는 두개의 올리고뉴클레오티드를 서로 어닐링시킴으로써 형성될 수 있고, 전형적으로 2중가닥 및 외가닥 부분을 둘다 포함하는 하기 일반적 구조를 갖는다:
Figure 112008040245603-PCT00003
여기서 N, X 및 Y 는 뉴클레오티드이다; X 가 Y 에 수소결합한다; ":" 는 두 염기 사이의 수소결합을 의미한다; x 는 1 과 약 100 사이의 값을 갖는 자연수이다; 그리고 m 및 n 은 독립적으로 0 과 약 100 사이의 값을 갖는 정수이다. 일 부 구현예에서, N, X 및 Y 는 독립적으로 A, G, C 및 T 또는 U 이다. 비-자연으로 발생하는 염기 및 뉴클레오티드가, 특히 합성 siRNA (즉, 두개의 올리고뉴클레오티드의 어닐링 산물)의 경우에 존재할 수 있다. 2중가닥 중심부는 "코어"로 불리고 염기쌍 (bp) 을 측정 단위로 한다; 외가닥 부분이 오버행 (overhang) 이고, 뉴클레오티드 (nt) 를 측정단위로 한다. 제시된 오버행은 3' 오버행이나, 5' 오버행을 갖는 분자 또한 본 발명의 범위 내이다. 또한 본 발명의 범위 내에 오버행이 없는 siRNA 분자 (즉, m = 0 및 n = 0), 및 코어 한쪽에는 오버행을 가지나 다른쪽에는 갖지 않는 분자 (예, m = 0 및 n ≥ 1, 또는 그 반대) 도 있다.
처음에는, RNAi 기술이 포유동물 시스템에 쉽게 적용가능할 것 같지 않았다. 이는, 포유동물에서, dsRNA 가 dsRNA-활성화 단백질 키나아제 (PKR) 를 활성화시켜 세포자살 연속단계 및 세포 사멸 (Der et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:3279-3283, 1997) 을 초래하기 때문이다. 또한, dsRNA 가 포유동물 세포 내의 인터페론 연속단계를 활성화시켜, 변경된 세포 생리를 또한 초래할 수 있다는 것이 오래전에 공지되었다 (Colby et al ., Annu . Rev . Microbiol . 25:333, 1971; Kleinschmidt et al ., Annu . Rev . Biochem . 41:517, 1972; Lampson et al ., Proc . Natl. Acad. Sci. USA 58L782, 1967; Lomniczi et al., J. Gen. Virol. 8:55, 1970; 및 Younger et al., J. Bacteriol. 92:862, 1966). 그러나, PKR 의 dsRNA-매개 활성화 및 인터페론 연속단계는 30 염기쌍보다 긴 dsRNA 를 요한다. 대조적으로, 30 염기쌍 미만 길이의 dsRNA 가 포유동물 세포 내에서 RNAi 를 초래한다는 것이 증명되었다 (Caplen et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:9742- 9747, 2001). 따라서, 긴 dsRNA 로부터 실질적으로 유리된 짧은 RNA 를 제조함으로써 긴 dsRNA 분자와 관련된 바람직스럽지 못한 비-특이적 효과가 회피될 수 있다고 예상된다.
siRNA 에 관한 참조: Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001; Boutla et al., CurrBiol 11:1776-1780, 2001; Cullen, Nat Immunol. 3:597-599, 2002; Caplen et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747, 2001; Hamilton et al., Science 286:950-952, 1999; Nagase et al., DNA Res. 6:63-70, 1999; Napoli et al., Plant Cell 2:279-289, 1990; Nicholson et al., Mamm. Genome 13:67-73, 2002; Parrish et al., Mol Cell 6:1077-1087, 2000; Romano et al., Mol Microbiol 6:3343-3353, 1992; Tabara et al., Cell 99: 123-132, 1999; 및 Tuschl, Chembiochem. 2:239-245, 2001.
Paddison et al . (Genes & Dev . 16:948-958, 2002) 은 RNAi 를 달성하기 위한 수단으로서 헤어핀으로 접힌 소형 RNA 분자를 이용했다. 따라서, 상기 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자가 또한 본 발명의 방법에 유리하게 이용될 수 있다. 기능적 shRNAs 의 줄기 및 루프의 길이는 다양하다; 줄기 길이는 약 25 에서 약 30 nt 까지의 어딘가에 분포할 수 있고, 루프 크기는 침묵 활성에 영향을 주지 않으면서 4 에서 약 25 사이에 분포할 수 있다. 특정 이론에 구속됨을 바라지 않으면서, 상기 shRNAs 가 DICER RNA 분해효소의 dsRNA 생성물과 유사하고, 여하튼 간에, 특정 유전자의 발현을 억제하는 동일한 능력을 가진다고 생각된다.
안티센스 기술이 안티센스 DNA 또는 RNA 를 통해, 또는 3중-나선 형성을 통 해 유전자 발현을 제어하는 데 이용될 수 있다. 안티센스 기술은, 예를 들어, Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) 에서 논의되었다. 3중나선 형성은, 예를 들어, Lee et al ., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al ., Science 241:456 (1988); 및 Dervan et al ., Science 251:1300 (1991) 에서 논의되었다. 상기 방법들은 폴리뉴클레오티드의 상보적 DNA 또는 RNA 에 대한 결합에 기초한다.
예를 들어, Sp35 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 코딩 부분이 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안하는데 이용될 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드가 전사에 관여하는 유전자 부위에 상보적이도록 고안됨으로써, 표적 단백질의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드가 mRNA 에 생체내 혼성화되어 mRNA 분자가 표적 폴리펩티드로 번역되는 것을 차단한다.
한 구현예에서, Sp35 유전자에 특이적인 안티센스 핵산이 세포내에서 전사에 의해 외인성 서열로부터 생산된다. 예를 들어, 그의 벡터 또는 부분이 전사되어, 안티센스 핵산 (RNA) 을 생산한다. 상기 벡터는, 그것이 전사되어 원하는 안티센스 RNA 를 생산할 수 있는 한, 염색체에 통합되거나 에피솜에 잔존할 수 있다. 상기 벡터는 당 기술분야의 표준 재조합 DNA 기술 방법에 의해 구성될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스성, 또는 기타 척추동물 세포 내의 복제 및 발현에 이용되는 당 기술분야에 공지된 것일 수 있다. 안티센스 분자의 발현 은, 척추동물, 바람직하게는 인간 세포 내에서 활동하는 당 기술분야에 공지된 임의의 프로모터, 예컨대 본원의 다른 부분에 기술된 것에 의할 수 있다.
안티센스 분자의 절대 상보성이, 바람직함에도 불구하고, 요구되지는 않는다. Sp35 를 코딩하는 RNA 의 적어도 부분에 대해 상보적인 서열은 RNA 와 혼성화하여, 안정한 두가닥을 형성할 수 있을 정도로 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하거나; 또는 3중가닥 형성이 검정될 수 있다. 혼성화 능력은 상보성의 정도 및 안티센스 핵산의 길이 둘다에 의존할 것이다. 일반적으로, 혼성화되는 핵산이 클수록, 더 많은 염기 불일치를 함유하고도 여전히 안정한 두가닥을 형성할 수 있다 (또는 경우에 따라 3중가닥일 수 있음). 당업자는 혼성화된 복합체의 융해점을 측정하는 표준 공정을 이용하여 허용가능한 불일치의 정도를 확정할 수 있다.
전령 RNA 의 5' 말단, 예를 들어, AUG 개시 코돈까지 그리고 이를 포함하는 5' 미번역 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 번역을 억제하는 데 가장 효율적으로 작동할 것이다. 그러나, mRNA 의 3' 미번역 서열에 상보적인 서열도 또한 mRNA 의 번역을 억제하는 데 효과적임이 밝혀졌다. 일반적으로, Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994) 참조. 따라서, 5'- 또는 3'- 미번역, 비-코딩 부위에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 Sp35 의 번역을 억제하는 안티센스 접근에 이용될 수 있다. mRNA 의 5' 미번역 부위에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 상보적 부분을 포함해야 한다. mRNA 코딩 부위에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 덜 효율적인 번역 억제자이지만 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 안티센스 핵산은 적어도 6 뉴클레오티드 길이여야 하고, 바람직하게는 길이가 6 내지 약 50 뉴클레오티드 범위의 길이인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 관점에서 올리고뉴클레오티드는 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 25 뉴클레오티드 또는 적어도 50 뉴클레오티드이다.
그러나 또다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 α-아노머 올리고뉴클레오티드이다. α-아노머 올리고뉴클레오티드는 상보성 RNA 와 특이적 2중-가닥 혼성을 형성하고, 통상의 상황과 반대로, 가닥이 서로에 대해 평행이다 (Gautier et al ., Nucl . Acids Res . 15:6625-6641(1987)). 올리고뉴클레오티드는 2'-0-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al., Nucl . Acids Res . 15:6131-6148(1987)), 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (Inoue et al ., FEBS Lett . 215:327-330(1987)) 이다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 폴리뉴클레오티드 조성물은 추가로 촉매성 RNA, 또는 리보자임 (예, PCT 국제 공개 WO 90/11364, 공개일 October 4, 1990; Sarver et al ., Science 247:1222-1225 (1990)) 을 포함한다. 망치머리형 리보자임의 이용이 바람직하다. 망치머리형 리보자임은 표적 mRNA 와 상보적 염기쌍을 형성하는 측면 부위에 의해 지령되는 위치에서 mRNA 를 절단한다. 유일한 요건이 표적 mRNA 가 두개의 염기로 이루어진 하기 서열을 갖는 것이다: 5'-UG-3'. 망치머리형 리보자임의 구성 및 생산이 당 기술분야에 공지되었고 Haseloff and Gerlach, Nature 334:585-591 (1988) 에 더 완전히 기술되어 있다. 바람직하게는, 절단 인지 부위가 표적 mRNA 의 5' 말단 근처에 위치하도록; 즉, 효율성을 증가시키고 비-기능적 mRAN 전사체의 세포내 축적을 최소화하도록 리보자임이 설계된다.
안티센스 접근에서와 같이, 본원에 개시된 방법에 사용되는 리보자임은 변형 올리고뉴클레오티드 (예, 향상된 안정성, 표적화, 등을 위해) 로 구성될 수 있고 Sp35 를 생체내 발현하는 세포 내로 전달될 수 있다. 안티센스를 코딩하는 DNA 의 도입에 대한 상기 기술된 바와 동일한 방법으로 리보자임을 코딩하는 DNA 구성이 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직한 전달 방법은 강한 구성 프로모터, 예컨대, pol III 또는 pol II 프로모터의 제어 하에 리보자임을 "코딩하는" DNA 구성의 이용을 포함함으로써, 트랜스펙팅된 세포가 내생적 Sp35 메시지를 파괴하고 번역을 억제하기에 충분한 양의 리보자임을 생산하도록 한다. 리보자임이 안티센스 분자와는 달리 촉매성이므로, 낮은 세포내 농도가 효율성을 위해 요구된다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 하기 압타머를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, DNA 또는 RNA 또는 키메라 혼합물 또는 그의 유도체 또는 변형 버전, 외가닥 또는 2중가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 염기 부분, 당 부분, 또는 인산염 백본에서, 예를 들어, 분자, 혼성화 등의 안정성을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에는 다른 부속기 예컨대 펩티드 (예, 생체내 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위해), 또는 세포막을 통한 수송을 용이하게 하는 작용제 (예, Letsinger et al ., Proc . Natl Acad . Sci . U.S.A. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . 84:648-652 (1987); PCT 공개 번호 WO88/09810, 공개일 December 15, 1988 참조) 또는 혈뇌 장벽 (예, PCT 공개 번호 WO89/10134, 공개일 April 25, 1988), 혼성화-유발되는 절단 작용제 (예, Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988)) 또는 중격제 (예, Zon, Pharm . Res . 5:539-549(1988)) 가 포함될 수 있다. 이 때문에, 폴리뉴클레오티드가 또다른 분자, 예를 들어, 펩티드, 혼성화 유발되는 교차-결합 제제, 수송 제제, 혼성화-유발되는 절단 제제 등에 접합될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용되는 압타머를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함하는 군으로부터 선택되나, 이에 한정되지는 않는 하나 이상의 변형된 염기 부분을 포함할 수 있다: 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N-6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N-6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3(3-아미노-3-N2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린.
본원에 개시된 방법에 사용되는 압타머를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 아라 비노오스, 2-플루오로아라비노오스, 크실룰로오스, 및 헥소오스를 포함하는 군으로부터 선택되나, 이에 한정되지는 않는 하나 이상의 변형된 당 부분을 포함할 수 있다.
그러나 또다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 압타머를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 포르포로티오에이트, 포르포로디티오에이트, 포스포라미도티오에이트, 포스포라미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 그의 유사체를 포함하는 군으로부터 선택되나, 이에 한정되지는 않는 하나 이상의 변형된 인산염 백본을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 압타머를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 당 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들어 자동 DNA 합성기 (이는 Biosearch, Applied Biosystems 등으로부터 시판됨) 를 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 포르포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 Stein et al ., Nucl . Acids Res . 16:3209 (1988) 의 방법에 의해 합성될 수 있고, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드가 제어된 세공 유리 중합체 지지체 (Sarin et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 85:7448-7451 (1988)) 등을 이용하여 제조될 수 있다.
압타머
또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 Sp35 길항제는 압타머이다. 압타머는 독특한 서열을 갖고, 원하는 표적 (예, 폴리펩티드) 에 특이적으로 결합하는 특성을 갖고, 주어진 표적에 대한 특이적 리간드인 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 압타머에는 Sp35 에 결합하는 2중 가닥 DNA 및 외가닥 RNA 분자가 포함된다.
핵산 압타머가 당 기술분야에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어 "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX)" 공정을 통해 선별된다. SELEX 는 예를 들어 본원에 그 전체가 참조로 인용된 미국 특허 제 5,475,096 호, 제 5,580,737 호, 제 5,567,588 호, 제 5,707,796 호, 제 5,763,177 호, 제 6,011,577 호, 및 제 6,699,843 호에 기술된 바와 같은 표적 분자에 고도로 특이적인 결합을 하는 핵산 분자의 시험관내 진화 (evolution) 방법이다. 압타머를 식별하는 또다른 스크리닝 방법이 미국 특허 제 5,270,163 호 (또한 본원에 참조로 인용됨) 에서 기술되었다. SELEX 공정은, 다른 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함하는, 단위체성 또는 중합체성인, 거의 모든 화학적 화합물과 리간드로서 활동 (특이적 결합 쌍을 형성) 하는 뉴클레오티드 단위체 내에서 이용할 수 있는 화학적 다능성 (versatility) 뿐만 아니라, 핵산의 다양한 2- 및 3-차원 구조 형성 능력에 기초한다.
SELEX 방법은 원하는 결합 친화성 및 선택성을 달성하기 위해, 동일한 일반적 선별 설계 (scheme) 를 이용하는, 후보 올리고뉴클레오티드 혼합물로부터의 선별 및 결합, 분리 및 증폭의 단계적 반복을 수반한다. 바람직하게는 무작위 서열의 분절을 포함하는 핵산 혼합물로부터 시작하는, SELEX 방법은 혼합물을 결합에 유리한 조건 하에 표적과 접촉시키고; 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 미결합 핵산을 분리시키고; 핵산-표적 복합체를 해리시키고; 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭시켜 리간드가 추가된 핵산 혼합물을 수득하는 단계를 포함한다. 결합, 분리, 해리 및 증폭 단계가 표적 분자에 대해 매우 특이적인 높은 친화성의 핵산 리간드를 수득하는데 필요한 만큼 수회에 걸쳐 반복된다.
뉴클레오티드 압타머는, 예를 들어, 진단 도구로서 또는 세포내 신호전달 및 수송 경로를 절단하는 특이적 억제제(James (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1:540-546)로서 이용될 수 있다. 뉴클레오티드 압타머의 높은 친화성 및 특이성은 이를 약물 발견에 대한 좋은 후보로 만든다. 예를 들어, 리신 독소에 대한 압타머 길항제가 분리되었고 나노몰 범위에서 IC50 값을 갖는다 (Hesselberth JR et al. (2000) J Biol Chem 275:4937-4942). 뉴클레오티드 압타머는 또한 세포 감염성을 감소시키기 위해 감염성 질환, 악성종양 및 바이러스 표면 단백질에 대항해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 이용되는 뉴클레오티드 압타머는 다른 폴리뉴클레오티드에 대하여 본원에서 기술된 바와 같이 변형 (예, 백본 또는 염기를 변형시키거나 펩티드에 접합시킴으로써) 될 수 있다.
Sp35 의 단백질 구조를 이용하는, Sp35 에 대해 활동하는 압타머의 SELEX 공정을 이용한 스크리닝은 Sp35-매개 과정을 억제 (예, 축삭 재생의 Sp35-매개 억제) 하는 압타머의 식별을 허용할 것이다.
본 발명의 방법에 이용되는 폴리펩티드 압타머는 결합함으로써 Sp35 의 활동을 차단하는 능력에 대해 선별된 무작위 펩티드이다. 폴리펩티드 압타머에는 단백질 스캐폴드의 양쪽 끝에 부착된 짧은 가변 펩티드 도메인이 포함될 수 있다. 상기 이중 구조적 제약은 펩티드 압타머의 결합 친화도를 항체의 그것에 비견할 수준으로 (나노몰 범위) 크게 증가시킨다. 예를 들어, Hoppe-Seyler F et al. (2000) J Mol Med 78(8):426-430 참조. 짧은 가변 펩티드의 길이는 전형적으로 약 10 내지 20 아미노산이고, 스캐폴드는 양호한 용해성 및 컴패서티 (compacity) 특성을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 스캐폴드 단백질의 한 비-제한성 예는 박테리아 단백질 티오레독신-A 이다. 예를 들어, Cohen BA et al. (1998) PNAS 95(24): 14272-14277 참조. 본 발명의 방법에 이용되는 폴리펩티드 압타머의 추가적인, 비-제한성 예는 리간드 조절 펩티드 압타머 (Ligand Regualted Peptide Aptamer: LiRPA) 이다. LiRPA 스캐폴드는 세 개의 단백질 도메인으로 구성될 수 있다: FK506 결합 단백질 (FK506 binding protein: FKBP), FRBP-라파마이신 결합 도메인 (FRBP-Rapamycin binding domain: FRB) 및 글루타티온-S-전이효소 (glutathione-S-transferase: GST). 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 Binkowski BF et al., (2005) Chem & Biol 12(7): 847-855 참조.
폴리펩티드 압타머는 단백질 기능의 지배적 억제제로서 활동하는 펩티드 또는 소형 폴리펩티드이다. 펩티드 압타머는 표적 단백질에 특이적으로 결합하여 그들의 기능적 능력을 차단한다 (Kolonin et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14,266-14,271). 표적 단백질에 높은 친화성 및 특이성으로 결합하는 펩티드 압타머가 당 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해 분리될 수 있다. 펩티드 압타머는 무작위 펩티드 라이브러리로부터 효모 2-하이브리드 스크린 (Xu, C.W., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:12,473-12,478) 에 의해 또는 리보솜 표시 (Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937-4942) 에 의해 분리될 수 있다. 이는 또한 파지 라이브러리 (Hoogenboom, H.R., et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20) 로부터 또는 화학적으로 생성된 펩티드 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 펩티드 압타머가 합성되는 어려운 방법이 그 이용을 폴리뉴클레오티드 압타머보다 더 복잡하게 만듬에도 불구하고, 그들은 제한되지 않는 화학적 다양성을 갖는다.
본 발명의 방법에 이용되는 펩티드 압타머는 본원의 다른 곳에서 다른 폴리펩티드에 대해 기술된 바와 같이 변형 (예를 들어, 중합체에 접합 또는 단백질에 융합) 될 수 있다.
벡터
Sp35 길항제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 또한 본 발명의 방법에 이용되는 길항제를 생산하는 데 이용될 수 있다. 상기 핵산이 작동가능하게 연결되는 벡터 및 발현 제어 서열의 선택은 원하는 기능적 특성, 예컨대 단백질 발현, 및 형질전환되는 숙주 세포에 의존한다.
작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현 조절에 유용한 발현 제어 요소가 당 기술분야에 공지되었다. 예에는 유도성 프로모터, 구성 프로모터, 분비 신호, 및 다른 조절 요소가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 유도 프로모터가 사용되는 경우, 이는, 예를 들어, 숙주 세포 배지 내의 영양 상태 변화, 또는 온도 변화에 의해 제어될 수 있다.
벡터는 원핵성 레플리콘 (replicon), 즉, 박테리아 숙주 세포 내의 염색체 외에서 재조합 DNA 분자의 자율 복제 및 유지를 지도하는 능력을 지닌 DNA 서열을 포함할 수 있다. 상기 레플리콘이 당 기술분야에서 공지되었다. 추가로, 원핵성 레플리콘을 포함하는 벡터는 또한 그의 발현이 탐지가능 마커 예컨대 약물 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 박테리아 약물-내성 유전자의 예는 암피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 것이다.
원핵성 레플리콘을 포함하는 벡터는 또한 박테리아 숙주 세포 내에서 코딩 유전자 서열의 발현을 지도하는 원핵 또는 박테리오파지 프로모터를 포함할 수 있다. 박테리아 숙주와 호환성인 프로모터 서열은 발현될 DNA 분절의 삽입을 위한 편리한 제한효소 절단위치를 함유하는 플라스미드 벡터 내에서 전형적으로 제공된다. 상기 플라스미드 벡터의 예는 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329 (BioRad), pPL 및 pKK223 (Pharmacia)이다. 임의의 적합한 원핵 숙주가 본 발명의 방법에 이용되는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 발현하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 종류의 벡터는 동물 바이러스 예컨대 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 우두 바이러스, 바큐로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스에서 유래된 DNA 요소를 이용한다. 다른 것은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 다시스트론성 시스템의 이용을 포함한다. 부가적으로, 트랜스팩팅된 숙주 세포의 선별을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 DNA 를 자신의 염색체 내로 통합시킨 세포가 선별될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에게 독립영양성 (prototrophy) 을, 살생제 내성 (예, 항생제) 또는 중금속 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별가능 마커 유전자 는 발현되는 DNA 서열에 직접 연결되거나, 또는 동일한 세포에 공동형질전환 (cotransformation) 에 의해 도입될 수 있다. 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 (neo) 유전자가 선별가능 마커 유전자의 예이다 (Southern et at , J. Mol . Anal . Genet. 1:327-341 (1982)). mRNA 의 최적의 합성을 위해 부가적 요소가 또한 요구될 수 있다. 상기 요소에는 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호 뿐만 아니라 신호 서열 또는 스플라이싱 신호가 포함될 수 있다.
한 구현예에서, NEOSPLA (미국 특허 제 6,159,730 호) 로 불리는 Biogen IDEC, Inc.의 상품 발현 벡터가 이용될 수 있다. 상기 벡터는 거대세포바이러스 프로모터/인핸서, 생쥐 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 선도 서열을 함유한다. 상기 벡터는 CHO 세포를 트랜스펙팅시킨 후 G418-함유 배지로 선별하고 메토트렉세이트 증폭시켰을 때, 매우 높은-수준의 발현을 초래한다는 것이 밝혀졌다. 물론, 진핵 세포 내의 발현 유발 능력을 갖는 임의의 발현 벡터가 본 발명에 이용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2; pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2 (Invitrogen, San Diego, CA 로부터 입수가능), 및 플라스미드 pCI (Promega, Madison, WI 로부터 입수가능) 가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 추가적 진핵 세포 발현 벡터가 당 기술분야에서 공지되었고 시판중이다. 전형적으로, 상기 벡터는 원하는 DNA 분절의 삽입을 위한 편리한 제한효소 절단위치를 함유한 다. 대표적 벡터에는 pSVL 및 pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pml2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC 31255), 레트로바이러스 발현 벡터 pMIG 및 pLL3.7, 아데노바이러스 셔틀 벡터 pDC315, 및 AAV 벡터가 포함된다. 다른 대표적 벡터 시스템이 예를 들어, 미국 특허 제 6,413,777 호에 개시되었다.
일반적으로, 다수의 형질전환 세포를 적절히 높은 수준의 길항제를 발현하는 것에 대해 스크리닝하는 것은, 예를 들어, 로봇을 이용하는 시스템에 의해 수행될 수 있는 일상적인 실험이다.
빈번히 사용되는 포유동물 숙주 세포 발현에 대한 조절 서열에는 포유동물 세포 내에서 높은 수준의 단백질 발현을 지도하는 바이러스 요소, 예컨대 레트로바이러스 LTRs, 거대세포바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예, 아데노바이러스 주 후기 프로모터 (AdmlP)), 폴리오마에서 유래된 프로모터 및 인핸서 및 강한 포유동물 프로모터 예컨대 자연 면역글로불린 및 액틴 프로모터가 포함된다. 바이러스 조절 요소, 및 그의 서열에 대한 추가 설명을 위해, 예를 들어, Stinski, 미국 특허 제 5,168,062 호; Bell, 미국 특허 제 4,510,245 호; 및 Schaffner, 미국 특허 제 4,968,615 호를 참조한다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예, 복제 기원) 및 선별가능 마커 유전자를 가질 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 벡터가 그 안에 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예, Axel, 미국 특허 제 4,399,216 호; 제 4,634,665 호 및 제 5,179,017 호 참조). 예를 들어, 전형적 으로 선별가능 마커 유전자는 벡터가 그 안에 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 종종 사용되는 선별가능 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 갖는 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위해) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위해) 가 포함된다.
Sp35 길항제를 코딩하는 벡터는 적합한 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 형질전환은 임의의 적합한 방법에 의해 가능하다. 포유동물 세포 내에 외인성 DNA 를 도입하는 방법은 잘 알려져 있고, 덱스트란-매개 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개 트랜스펙션, 원형질 융합, 전기천공, 리포좀 내 폴리뉴클레오티드(들) 의 캡슐화를 통한 트랜스펙션, 및 핵 내로 DNA 의 직접 미세주사가 포함된다. 또한, 핵산 분자를 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입할 수 있다. 포유동물 세포를 또한 포유동물 세포 내에 도입되는 외인성 DNA 를 함유하는 재조합 바이러스에 의해 형질도입될 수 있다.
숙주 세포의 형질전환은 사용되는 벡터 및 숙주 세포에 적합한 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 원핵 숙주 세포의 형질전환을 위해, 전기천공 및 염 처리법을 사용할 수 있다 (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-14 (1972)). 척추동물 세포의 형질전환을 위해, 전기천공, 양이온성 지질 또는 염 처리법을 사용할 수 있다. 예, Graham et al., Virology 52:456-467 (1973); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7(5:1373-76 (1979) 참조.
단백질 발현에 사용되는 숙주 세포주는 가장 바람직하게는 포유동물 기원의 것들이며; 당업자는 그 안에서 발현되는 바람직한 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우선적으로 선택할 능력이 있다. 예시적 숙주 세포주에는 NSO, SP2 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예, Hep G2), A549 세포 DG44 및 DUXB11 (중국 햄스터 난소 주, DHFR -), HELA (인간 자궁경부 암종), CVI (원숭이 신장 주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI 의 유도체), R1610 (중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3 (마우스 섬유모세포), HAK (햄스터 신장 주), SP2/0 (마우스 골수종), P3x63-Ag3.653 (마우스 골수종), BFA-Ic1BPT (소 내피 세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장) 이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 숙주 세포주는 전형적으로 시판 업체, 미국 미생물 보존센터 (American Tissue Culture Collection) 에서 구입가능하거나 또는 공개 문헌으로부터 이용가능하다.
생성 세포주로부터의 폴리펩티드의 발현은 공지된 기술을 사용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 (GS) 시스템이 특정 조건 하에서 발현을 향상시키기 위해 통상적으로 사용된다. 예, 유럽 특허 제 0 216 846 호, 제 0 256 055 호, 및 제 0 323 997 호 및 유럽 특허 출원 번호 89303964.4 호 참조.
숙주 세포
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 Sp35 길항제의 발현을 위한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 예시적 진핵 숙주 세포에는 효모 및 포유동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (ATCC Accession No. CCL61), NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH-3T3 (ATCC Accession No. CRL1658), 및 아기 햄스터 신 장 세포 (BHK) 가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 유용한 진핵 숙주 세포에는 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 예시적 원핵 숙주 세포는 대장균 (E. coli) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 이다.
유전자 치료법
Sp35 길항제는 DA 뉴런 퇴행, 사망 또는 결핍 또는 재생과 관련된 질환, 장애 또는 손상의 치료에 대한 유전자-치료법 접근법을 사용하여, 생체 내에서 포유동물, 예, 인간 환자에서 생성될 수 있다. 이것에는 적합한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 적합한 Sp35 길항제-코딩 핵산의 투여가 포함된다. 일반적으로, 상기 서열은 바이러스 벡터 내에 도입된다. 이러한 유전자 치료법을 위한 적합한 바이러스 벡터에는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 엡스타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터가 포함된다. 바이러스 벡터는 복제-결핍 바이러스 벡터일 수 있다. El 유전자 또는 E3 유전자에 결실이 있는 아데노바이러스 벡터가 전형적으로는 사용된다. 아데노바이러스 벡터가 사용되는 경우, 벡터는 종종 선별가능 마커 유전자를 가지지 않는다.
약학 조성물
본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제는 인간을 포함하는 포유동물에 대한 투여를 위한 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 약 학 조성물은 예를 들어, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 성분, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 술페이트, 2나트륨 수소 포스페이트, 칼륨 수소 포스페이트, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리케이트, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스-기재 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌- 폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 조성물은 임의의 적합한 방법으로, 예를 들어, 비경구, 심실내, 경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 코, 구강, 질 내로 또는 이식 저장소를 거쳐 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "비경구" 에는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 수막강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술이 포함된다. 이전에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제는 희소돌기아교세포의 생존, 재생 및 분화 및 뉴런의 및 미엘린화를 촉진하기 위해 신경계에서 작용한다. 따라서, 본 발명의 방법에서, Sp35 길항제는 혈뇌 장벽을 교차하는 방식으로 투여된다. 상기 교차는 Sp35 길항제 분자 그 자체에 고유한 물리-화학적 특성, 약학 제형 중의 다른 성분, 또는 혈뇌 장벽을 돌파하기 위한 바늘, 캐뉼라 또는 수술 기구와 같은 기계 장비의 사용으로부터 기인할 수 있다. Sp35 길항제가 혈뇌 장벽을 고유하게 가로지르 지 않는 분자, 예를 들어, 교차를 용이하게 하는 부분에 대한 융합인 경우, 적합한 투여 경로는, 예를 들어, 수막강내 또는 두개내, 예, MS 의 만성 병변 내 직접적인 경로이다. Sp35 길항제가 혈뇌 장벽을 고유하게 가로지르는 분자인 경우, 투여 경로는 하기 기재되는 다양한 경로 중 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
본 발명에 사용되는 조성물의 멸균 주사가능 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균, 주사가능 제제는 또한 무독성 비경구 허용가능 희석액 또는 용매 중의 멸균, 주사가능 용액 또는 현탁액 (예를 들어 1,3-부탄디올 중의 현탁액) 일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 운반체 및 용매 중에는 물, 링거 (Ringer) 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균, 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 상기 목적으로는, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 혼화 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방선, 예컨대 올레산 및 그의 글리세라이드 유도체는 천연의 약학적으로 허용가능한 오일, 예컨대 올리브유 또는 피마자유, 특히 폴리옥시에틸화 형태로, 주사가능 제제에 사용된다. 상기 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알코올 희석액 또는 분산제, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 에멀젼 및 현탁액을 포함하는 약학적으로 허용가능한 투여 형태의 제형에 통상적으로 사용되는 유사 분산제를 함유할 수 있다. 기타 통상적으로 사용가능한 계면활성제, 예컨대 트윈 (Tweens), 스팬 (Spans) 및 약학적으로 허용가능한 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 통상 사용되는 기타 유화제 또는 생물학적 이용가능성 향상제가 또한 제형화 목적을 위해 사용될 수 있다.
비경구 제형은 단일 환약 투여형, 주입 또는 적재 환약 투여형에 이은 유지 투여형일 수 있다. 상기 조성물은 특정의 고정된 또는 변경가능한 간격으로, 예를 들어, 1 일 1 회 또는 "필요시" 를 기본으로 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 특정 약학 조성물은 예, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용가능한 투여 형태로 경구로 투여될 수 있다. 특정 약학 조성물은 또한 코 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 생물학적 이용가능성을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 기타 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 중의 용액으로 제조될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합할 수 있는 Sp35 길항제의 양은 치료되는 숙주, 사용되는 길항제의 유형 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 단일 투여량, 복합 투여량으로 또는 흡입으로 설정된 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 또한 투여 섭생은 최적의 바람직한 반응 (예, 치료적 또는 예방적 반응) 을 제공하기 위해 조정될 수 있다.
본 발명의 방법은 Sp35 길항제의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량" 으로 사용된다. 이러한 치료적 또는 예방적 유효량은 개개인의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 치료적 또는 예방적 유효량은 또한 임의의 독성 또는 역효과가 치료적 이득 효과를 넘지 않는 것이다.
임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 및 치료 섭생은 사용된 특정 Sp35 길 항제, 환자의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 식이, 및 투여 시기, 배출율, 약물 조합, 및 치료되는 특정 질환의 경중도를 포함하는 다양한 인자에 따라 다르다. 의사의 이러한 인자에 대한 판단은 당업계의 기술 내에 있다. 또한 양은 치료되는 개별 환자, 투여 경로, 제형의 유형, 사용되는 화합물의 특성, 질환의 경중도, 및 원하는 효과에 따라 다를 것이다. 사용되는 양은 당업계에 잘 공지된 약물학적 및 약동학적 원칙에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, Sp35 길항제는 일반적으로 신경계에 직접, 뇌혈관내로, 또는 수막내로, 예를 들어, MS 의 만성 병변 내로 투여된다. 본 발명의 방법에 따른 투여용 조성물은 Sp35 길항제 폴리펩티드가 1 일 당 0.001 - 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여되도록 제형화될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 투여량은 1 일 당 0.01 - 1.0 mg/kg 체중이다. 일부 구현예에서, 투여량은 1 일 당 0.001 - 0.5 mg/kg 체중이다.
Sp35 길항제 항체로의 치료를 위해, 투여량은 예를 들어, 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더욱 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg (예, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 등) 의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg 의 범위 내, 바람직하게는 1 mg/kg 이상일 수 있다. 상기 범위의 중간 투여량은 또한 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 대상에 이러한 매일, 격일, 격주 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 기타 스케쥴로 투여할 수 있다. 예시적 치료는 연장된 기간에 걸친 복합 투여량, 예를 들어, 6 개월 이상의 투여를 수 반한다. 부가적인 예시적 치료 섭생은 매 2 주마다 1 회 또는 1 달마다 1 회 또는 매 3 내지 6 개월마다 1 회의 투여를 수반한다. 예시적 투여량 스케쥴에는 연속 일에 1-10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일에 30 mg/kg 또는 매주 60 mg/kg 이 포함된다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가진 2 개 이상의 단일클론 항체가 동시에 투여되고, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 있다.
특정 구현예에서, 대상은 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 분자로 치료될 수 있다. 핵산에 대한 투여량은 환자 당 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 μg 내지 10 mg, 또는 30-300 μg DNA 범위이다. 감염성 바이러스 벡터에 대한 투여량은 투여량 당 10-100 이상의, 바이러스로 다양하다.
보충 활성 화합물은 또한 본 발명의 방법에 사용되는 조성물 내에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 가용성 Sp35 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 1 개 이상의 부가적 치료제와 함께 제형화되고/되거나 함께 투여될 수 있다.
본 발명에는 수용액의 환약 주사 또는 서방성 시스템의 이식물을 포함하는, 선택된 표적 조적에 Sp'35 길항제에 대한 임의의 적합한 전달 방법이 포함된다. 서방성 이식물의 사용은 반복되는 주사의 필요를 감소시킨다.
본 발명의 방법에 사용되는 Sp35 길항제는 뇌 내에 직접적으로 주입될 수 있다. 화합물의 직접적인 뇌 주입에 대한 다양한 이식물은 공지되어 있고, 신경계 장애를 겪고 있는 인간 환자에 대한 치료적 화합물의 전달에 유효하다. 여기에는 펌프를 사용하여 뇌 내로 장기간 주입, 정위 이식된, 일시적 근접 카테터, 영구적 근접 카테터 이식물, 및 수술적으로 이식된 생분해성 이식물이 포함된다. 예를 들어, Gill et al., supra; Scharfen et al., "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4):583-591 (1992); Gaspar et al., "Permanent 1251 Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 45(5) :977-982 (1999); chapter 66, pages 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy," in Gilderiberg et ah, Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); 및 Brem et al., "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial," J. Neuro - Oncology 26:111-23 (1995) 을 참조한다.
또한 조성물은 화합물에 대한 적합한 전달 또는 지지체 시스템으로서 작용하는 생혼화성 담체 물질 내에 분산된 Sp35 길항제를 포함할 수 있다. 지연 방출 담체의 적합한 예에는 좌약 또는 캡슐과 같은 성형 물품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스가 포함된다. 이식가능 또는 마이크로캡슐의 지연 방출 매트릭스에는 폴리락타이드 (U.S. Patent No. 3,773,319; EP 58,481), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., Biopolvmers 22:547-56 (1985)); 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 75:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. /2:98-105 (1982)) 또는 폴리-D-(-)-3히드록시부티르산 (EP 133,988) 이 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에서, Sp35 길항제는 뇌의 적합한 영역 내에 직접적인 주입에 의해 환자에게 투여된다. 예를 들어, Gill et al., "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9: 589-95 (2003) 을 참조한다. 대안적인 기술이 이용가능하고, 본 발명에 따른 Sp35 길항제를 투여자에게 적용할 수 있다. 예를 들어, 카테터 또는 이식물의 정위 배치는 Riechert-Mundinger 단위 및 ZD (Zamorano-Dujovny) 다목적 위치화 단위를 사용하여 달성될 수 있다. 2 mm 슬라이스 두께로, 120 ml 의 옴니파큐, 350 mg 요오드/ml 를 주입하는, 조영 증강 전산화 단층촬영 (CT) 스캔은 3-차원 다평면 치료 계획을 허용할 수 있다 (STP, Fischer, Freiburg, Germany). 상기 장치는 명확한 표적 확인을 위해 CT 및 MRI 표적 정보를 융합하는 자기 공명 영상 연구를 기초로 하는 계획을 가능하게 한다.
GE CT 스캐너 (General Electric Company, Milwaukee, WT) 와 사용하기 위해 변형된 Leksell 정위 시스템 (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) 뿐 아니라, Brown-Roberts-Wells (BRW) 정위 시스템 (Radionics, Burlington, MA) 을 상기 목적을 위해 사용할 수 있다. 그러므로, 이식물의 모니터링 시, BRW 정위 프레임의 고리모양 기반의 고리를 환자의 두개골에 부착시킬 수 있다. 연속 CT 섹션을 기저 면에 고정된 흑연 봉 위치화 프레임으로 (표적 조직) 영역을 통해 3 mm 간격으로 수득할 수 있다. 전산화 처리 계획 프로그램은 CT 스페이스와 BRW 스페이스 사이의 맵에 대한 흑연 봉 이미지의 CT 좌표를 사용하는 VAX 11/780 컴퓨터 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) 에서 수행한다.
본원에 기재된 장애의 치료 방법은 전형적으로 시험관 내에서 시험된 다음, 인간에 사용하기 전에, 바람직한 치료 또는 예방 활성에 대해, 허용가능한 동물 모델에서 생체내에서 시험된다. 유전자도입 (transgenic) 동물을 포함하는 적합한 동물 모델은 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, Sp35 길항제의 분화 및 생존 효과를 증명하기 위한 시험관 내 검정법이 본원에 기재된다. 엑손의 미엘린화에 대한 Sp35 길항제의 효과는 하기 실시예에서 기재되는 바와 같이 시험관 내에서 시험될 수 있다. 최종적으로, 생체 내 시험을 Sp35 길항제를 발현하는 유전자도입 마우스를 제작하거나 본원에 기재된 모델의 Sp35 길항제를 마우스 또는 래트에게 투여하여 수행할 수 있다.
본 발명의 실시는, 다르게 언급되지 않는다면 당업계 내에 있는, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자도입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 전체적으로 설명되어 있다. 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), J. Sambrook, D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); Genes Vm, B. Lewin, Prentice Hall (2003); PCR Primer, CW. Dieffenbach and G.S. Dveksler, CSHL Press (2003); DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), P. Herdewijn (Ed.), Humana Press (2004); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th edition, R. I. Freshney, Wiley-Liss (2000); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (Ed.), (1984); Mullis et al. U.S. Pat. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Nucleic Acid Hybridization, M. L. M. Anderson, Springer (1999); Animal Cell Culture and Technology, 2nd edition, M. Butler, BIOS Scientific Publishers (2004); Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (Practical Approach Series), J. Woodward, M Pr (1992); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins (Eds.) (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); A Practical Guide To Molecular Cloning, 3rd edition, B. Perbal, John Wiley & Sons Inc. (1988); the treatise, Methods Li Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155, Wu et al. (Eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, (Eds.), Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell (Eds.), (1986); Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (4 Volume Set), 1st edition, I. Lefkovits, Academic Press (1997); Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002); 및 in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) 를 참조한다.
항체 공학의 일반적인 원리는 Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), B.L. Lo (Ed.), Humana Press (2003); Antibody engineering, R. Kontermann and S. Dubel (Eds.), Springer Verlag (2001); Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck (Ed.), Oxford Univ. Press (1995) 에 언급된다. 단백질 공학의 일반적인 원리는 Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al. (Eds.), IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995) 에 언급된다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원리는: Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2nd edition, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); and Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984) 에 언급된다. 부가적으로, 당업계에 공지되고 구체적으로 기재되지 않은 면역학의 표준 방법은 일반적으로 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (Eds.), Immunochemical Protocols (Methods in Molecular Biology), 2nd edition, J. D. Pound (Ed.), Humana Press (1998), Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th edition, D. M. Weir (Ed.), Blackwell Publishers (1996), Methods in Cellular Immunology, 2nd edition, R. Fernandez-Botran, CRC Press (2001); Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) and Mishell and Shiigi (Eds.), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980) 을 따른다.
면역학의 일반적인 원리를 언급하는 표준 참조 작업에는 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J.; Kuby Immunology, 4th edition, R. A. Goldsby, et al., H. Freeman & Co. (2000); Basic and Clinical Immunology, M. Peakman, et al., Churchill Livingstone (1997); Immunology, 6th edition, I. Roitt, et al., Mosby, London (2001); Cellular and Molecular Immunology, 5th edition; A.K. Abbas, A.H. Lichtman, Elsevier - Health Sciences Division (2005); Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (4 Volume Set), 1st edition, I. Lefkovits, Academic Press (1997) Immunology, 5th edition, R.A. Goldsby, et al., W. H. Freeman (2002); Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, 3rd Edition , J.W. Goding, Academic Press (1996); Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., et al. (Eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" in Burden, R., et al. (Eds.), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984) 가 포함된다. 상기 언급된 모든 참조 뿐 아니라 본원에 언급된 모든 참조는 그 전체가 참조로서 본원에 인용된다.
실시예 1
Sp35 (LINGO-1) 는 래트 중뇌 도파민성 (DA) 뉴런에서 발현된다
Sp35 의 발현을 출생후 제 7 일 (P7 단계) 래트 뇌, 성체 래트 뇌 및 래트 일차 배아 배양물 (E15) 에서 면역조직화학 및/또는 제자리 혼성화에 의해 평가하였다. 동결 래트 뇌 섹션을 P7 및 상기 언급된 발달의 성체 단계에서 래트로부터 준비하였다. 뇌 섹션을 하기 프로토콜을 사용하고 Mi et al. Neurosci. 7:221-228 (2004) 에 기재된 바와 같이 제자리 혼성화에 대해 준비하였다. 동물을 CO2 로 마취하였다. 뇌를 빠르게 제거하고, 10% 중성 완충 포르말린으로 48 시간 동안 고정하였다. 뇌를 동결방지를 위해 PBS 중 30% 수크로오스로 평형화시키고, 연속으로 섹션화하였다. 제자리 혼성화를 총 배쪽 중뇌의 매 6 번째를 함유하는 무작위로 선택된 일련의 섹션에 수행하였다.
뇌 섹션을 디곡시게닌-표지된 Sp35 안티센스 및 센스 RNA 로 탐침하였다. 섹션을 제조사의 지침에 따라 TSA ＋ 형광 및 항-디곡시게닌 접합 항체 키트 (Perkin Elmer) 를 사용하여 염색하였다. 그 다음 섹션을 DAPI (Sigma) 및 항-티로신 수산화효소 (TH) 항체 (Chemicon) 로 염색하였다. P7 단계에서, Sp35 mRNA 가 중뇌 티로신 수산화효소 (TH)-양성 DA 뉴런에서 적절하게 발현되었다. 또한 이전에 보고된 바와 같이 소뇌에서 강한 Sp35 mRNA 발현 및 선조체에서 약한 발현이 있었다. Mi et al. Nat. Neurosci. 7: 221-228 (2004) 참조. 그러나 성체 중뇌에서, TH 양성 DA 뉴런에서 더 적은 Sp35 mRNA 발현이 있었다.
일차 배아 배쪽 중간뇌 (VM) 배양물을 Lin, L. et al. Mol. Cell Neurosci. 28:547- 555 (2005) 에 기재된 바와 같이 E15 Sprague Dawley 래트 (Charles River, MA) 로부터 단리하였다. 간략하게는, 뇌 조직을 열-불활성화 말 혈청 (10%), 글루코오스 (6.0 mg/ml), 페니실린 (10,000 U/ml), 스트렙토마이신 (10 mg/ml; Sigma), 및 글루타민 (2mM; Gibco) 을 함유하는 냉각 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM; Gibco, NY) 에서 연마 (polished) 파스퇴르 파이펫으로 기계적으로 해리시켰다. 2 × 105 세포를 배지에 재현탁시키고, 24-웰 트레이 (Falcon) 의 각 웰에 15 mg/ml 폴리-L-오르니틴 (Sigma) 및 1 mg/ml 피브로넥틴 (Sigma) 으로 미리 코팅된 커버슬립에 시딩하였다.
형광 면역조직화학을 Lin, L., et ah, Mol. Cell. Neurosci. 28:547-555 (2005) 에 기재된 바와 같이 뇌 섹션 및 VM 일차 배양물에 수행하였다. 간략하게는, 대략 2 × 105 세포를 함유하는 커버슬립을 10% 정상 염소 혈청 (Jackson Laboratories, Maine) 및 0.1 M 인산염-완충 식염수 (PBS) 중의 0.1% Triton X-100 으로 30 분 동안 실온에서 처리하였다. 이어서, 커버슬립을 1차 항체로 4℃ 에서 밤새 인큐베이션한 다음, 구별되는 형광으로 접합된 적합한 2차 항체로 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 티로신 수산화효소 (TH) 에 대항하는 항체, DA 뉴런에 대한 마커, (Chemicon) 를 1:300 희석하여 사용하였다. Alexa 488 (Molecular Probes) 으로 접합된 2차 항체를 1:500 의 농도로 사용하였다. 1차 항체의 생략 또는 과량의 항원으로 미리 인큐베이션된 항체를 대조군으로서 사용하 였다. 형광 신호를 공초점 이미지 시스템 (LSM510 META, Carl Zeiss, NY) 에 의해 측정하였다.
일차 VM 배양물에서, Sp35 이 Sp35 및 TH-염색이 함께 위치하는 DA 뉴런에서 관찰되었다. Sp35 특이적 항체를 과량의 Sp35 단백질와 미리 인큐베이션한 경우 염색이 검출되지 않았다. Sp35 는 또한 인간 흑색질 및 설치류 중뇌 모두에서 비-TH 뉴런에서 발현된다.
상기 실험은 Sp35 이 중뇌 배아 (E15) 및 P7 DA 뉴런에서 발현되고, 성체 VM 보다 더 적은 범위로 발현된다는 것을 나타낸다. 면역조직화학적 연구는 또한 Sp35 단백질이 신경돌기에서 뿐 아니라, 중뇌 일차 배양물 중의 DA 뉴런의 원형질 막에서도 발현된다는 것을 보여준다.
실시예 2
Sp35 (LINGO-I) 길항제는 시험관 내 DA 신경돌기 성장 및 생존을 촉진한다.
Sp35 의 세포질 도메인은 정규 EGFR-유사 티로신 인산화 부위를 함유하여, 신호에 직접 또는 간접 관여에 대한 잠재력을 가진다. 세포질 도메인의 중요성을 평가하기 위해, 세포질 도메인이 결핍된 Sp35 (DN-Sp35) 의 절단된 형태를 제작하였다 (SEQ ID NO:2 의 아미노산 34-581 또는 34-548). 세포질 도메인이 결실된 Sp35 의 절단된 형태가, Nogo 수용체 1 (NgR1) 및 p75NTR 및/또는 TAJ/TROY 와 같은 또다른 수용체와 복합체를 형성하여 우세 음성 (DN) 분자로서 작용하여, 신호를 방해한다는 것을 보여준다. Shao et al. Neuron 45: 353-359 (2005) 및 Park et al. Neuron 45:345-351 (2005) 를 참조한다.
렌티바이러스를 하기 방법 및 Mi et al. Neurosci. 7: 221-228 (2004) 에 기재된 방법을 사용하여 전장 (FL)-Sp35 (SEQ ID NO:2 의 아미노산 34-614) 또는 우세 음성 (DN)-Sp35 를 발현하도록 제작하였다. 전장 및 절단된 (DN-Sp35) 인간 Sp35 의 cDNA 서열을 pSECTAG-A (Invitrogen) 내에 서브클로닝하여 HA-태그된 융합 단백질을 발현하도록 한 다음, HRST-IRESeGFP 벡터에 라이게이션시켰다. 렌티바이러스 구축물을 293T 세포 내에 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSV-G) 및 HTV-I 패키징 벡터 델타 8.9 로 공동트랜스펙션시켜, Wang eVal. Nature 417:941-944 (2002) 에 기재된 바와 같이 재조합 렌티바이러스를 발생시켰다.
래트 일차 VM 뉴런의 배양물을 FL-Sp35, 우세 DN-Sp35 를 생성하는 렌티바이러스 또는 벡터 대조군으로 형질도입시켰다. 각 그룹의 바이러스를 VM 뉴런 배양물에 1 또는 5 의 감염 다중도 (MOI) 로 첨가하였다. 세포를 24 시간 동안 배양한 다음, PB 중 4% 포름알데하이드 (pH 7.4) 로 30 분 동안 실온에서 고정하였다. 신경돌기 성장을 상기 감염된 뉴런에서 시험하였다. 신경돌기 신장 또는 세포 수 시험을 위해, 통합 Axioskop 2 현미경 (Carl Zeiss, NY) 및 Steroinvestigator 이미지 캡쳐 장비 및 소프트웨어 (MicroBrightField, VT) 를 사용하여 각 웰로부터 여러 구역을 캡쳐하였다.
신경돌기 성장은 DN-Sp35 감염된 TH-양성 뉴런에서 촉진되었다. 반대로, TH-양성 뉴런은 FL-Sp35 으로 형질도입된 경우 신경돌기 길이에 차이가 없는 것으로 나타났다. 상기 관찰은 DN-Sp35 가 내인성 Sp35 의 기능을 파괴하여 DA 신경돌기 성장을 촉진하는 것을 나타낸다. 도 1 을 참조한다.
DA 뉴런에서 DA 신경돌기 성장을 촉진하여, FL-Sp35 기능의 길항제로서 작용할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 Sp35-Fc 단백질 (Fc 도메인에 융합된 SEQ ID NO:2 의 아미노산 1-532) 을 사용하였다. 대조군-Fc 및 Sp35-Fc 를 Mi et al. Nat. Neurosci. 7:221-228 (2004) 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략하게는, 인간 Sp35 의 아미노산 1-532 를 인간 IgG1 의 경첩 및 Fc 영역에 융합시켰다. Sp35-Fc 폴리펩티드를 CHO 세포에서 발현시키고, Protein A Sepharose (Pharmacia) 로 정제하였다. 정제된 단백질 (>95% 순도) 의 분자량은 환원 조건하에서 SDS-PAGE 젤 상의 젤 전기영동에 의해 측정되고 공지된 단백질 표준에 비교하여 9OkDa 였다. 단백질의 분자량은 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE 젤 상에 수행하고 공지된 단백질 표준에 비교하는 경우 180 kDa 였다.
정제된 Sp35-Fc 폴리펩티드를 VM 뉴런 배양물에 외인성으로 제공하였다. 과량의 Sp35-Fc 를 첨가하여 신경돌기 성장을 촉진하였다. 도 1 을 참조한다. 외인성으로 공급된 대조군 IgG 폴리펩티드는 DA 신경돌기 성장을 촉진하지 않았다. 부가적으로는, DN-Sp35 를 발현하는 렌티바이러스로 처리된 배양물의 TH 신경돌기 길이를 시험하였다. DN-Sp35 및 Sp35-Fc 로 처리된 배양물은 대조군 렌티바이러스 (p<0.05, One-way ANOVA) 및 대조군 Fc (p<0.003) 로의 치료에 비해 유의하게 더 길었다.
또한 DN-Sp35 의 효과를 1-메틸-페닐피리듐 이온 (MPP+) 으로 처리된 일차 VM 배양물에 대해 시험하였다. MPP+ 는 일차 DA 뉴런 세포의 세포 사멸을 정상적으로 유도하고, PD 연구에 대해 잘 정립된 모델 시스템이다. Gille et al., Ann NY Acad Sci 1018:533-540 (2004) 를 참조한다. VM 뉴런을 상기 기재된 바와 같이 렌티바이러스로 감염시켰다. 배양된 세포에 10 μM MPP+ 를 제 4 일에 48 시간 동안 노출시킨 후 고정하였다 (제 6 일). DN-Sp35 보호된 TH-양성 뉴런을 래트 중뇌 일차 배양물 중에 10 μM MPP+ 에 노출시켰다. 도 2 를 참조한다. MPP+ 에 노출된 경우 TH 뉴런의 수는 DN-Sp35 에서보다 유의하게 더 높았다. 형질도입된 세포를 FL-Sp35 및 대조군 형질도입 뉴런과 비교하였다 (p<0.05, One-way ANOVA). 부가적으로는, MPP+ 에 노출된 일차 VM 배양물은 본원에 그 전체가 참조로서 인용된, 미국 가출원 특허 제 60/697,336 호에 기재된, 항체 1A7, Sp35-Fc 및 Sp35 길항제에 대한 노출에 의해 세포 사멸로부터 보호되었다. Sp35-Fc 및 1A7 항체 처리된 세포는 대조군 Fc 또는 대조군 IgG 처리된 배양물에 비교해, TH-양성 뉴런에서 MPP+ 독성에 대항하여 유의한 보호 효과를 나타내었다 (1A7 에 대해 p <0.01 및 Sp35-Fc 에 대해 p<0.05, One-way ANOVA). 도 3 을 참조한다. 상기 결과는 내인성 Sp35 의 억제는 MPP+ 신경독 노출에 대항하여 DA 뉴런을 보호한다는 것을 나타낸다.
실시예 3
Sp35 활성의 차단은 Akt 인산화를 유도한다
Akt 는 PI3 키나아제 생존 경로의 하류방향 효과기이다. Williams and Doherty Mol. Cell. Neurosci. 13:272-280 (1999). 래트 일차 VM 배양물 중의 정상 Akt 인산화의 수준을 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석으로 평가하였다. 래트 일차 VM 뉴런을 실시예 2 에서 기재된 바와 같이 FL-Sp35 또는 DN-Sp35 (HA- 태그된) 를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입된 래트 일차 VM 뉴런을 48 시간 후 수확하고, 500μl 용해 완충액 (50 mM HEPES (pH 7.5); 150 mM NaCl; 1.5 mM MgCl2; 1mM EDTA; 1% Triton X-100 및 10% 글리세롤) 으로 30 분 동안 4℃ 에서 용해시켰다. 상청액을 4-20% SDS-PAGE 젤 (Bio-Rad, CA) 상에서 전기영동시키고, 면역블롯 막으로 옮기고, 항-HA 친화성 매트릭스 (Roche, Switzerland) 또는 항-포스포 Akt 항체 (Cell Signaling, MA), 또는 항-총 Akt 항체 (Cell Signaling, MA) 로 탐침하였다.
DN-Sp35 발현 렌티바이러스로 래트 일차 VM 뉴런 형질도입 후 Akt 인산화는 FL-Sp35 또는 대조군 벡터를 발현하는 렌티바이러스로의 형질도입과 비교해 유의하게 증가하였다. 도 4 를 참조한다. 상기 결과는 DN-Sp35 이 PI3/Akt 신호 경로의 관여에 의해, TH-양성 뉴런의 생존에, 부분적으로 영향을 준다는 것을 암시한다.
실시예 4
Sp35 녹-아웃 (Knock-Out) 마우스의 발생
Sp35 녹-아웃 마우스를 Schiemann et al. (Science 293: 2111-2114 (2001) 에 기재된 바와 같이 Sp35 의 전체, 단일 엑손 코딩 서열을 표적하는 GFP/Neo (녹색 형광 단백질/네오마이신) 교체 벡터로 발생시켰다. 마우스 게놈 129/SvJ DNA 를 람다 게놈 라이브러리 (Stratagene #946313) 로부터 단리하였다. 14.6-kb EcoRV 조각 pBSK+ 내로 서브클로닝한 다음, 개시 ATG 에 eGFP Q40 리포터 유전 자를 삽입하기 위해 박테리아에서 상동 재조합에 의해 표적화하였다. 최종 구축물은 Sp35 의 단일-엑손 코딩 서열의 전체 1-1,841 뉴클레오티드가 결실되었다. 상기 구축물은, D3 (129/Sv) 배아 줄기 세포 중의 Sp3.5 유전자 좌에 표적화하기 위해 사용되었다. 올바르게 표적된 세포를 EcoRI-소화된 배아 줄기 세포 DNA 의 서던 (Southern) 블롯팅에 의해 확인하고, C57B1/6 포배 내에 주사하여 키메라 마우스를 발생시켰다. 키메라를 C57B1/6 마우스와 교차시켜 이종접합 설립 마우스를 발생시켰다. 꼬리 DNA 의 3-프라이머 PCR 에 의해 유전형을 결정하였다. 정방향 프라이머, 5'- CTATCCAAGCACTGCCTGCTC-3' (SEQ ID NO:6), 및 2 개의 역방향 프라이머, 5'- GAGTTCTAGCTCCTCCAGGTGTG-3' (SEQ ID NO:7) 및 5'-GATGCCCTTCAGCTCGATGCG- 3' (SEQ ID NO:,8) 로, 35-사이클 반응 (20 초 94℃, 30 초 65℃, 30 초 72℃) 에서 각각, 275 bp 야생형 및 356 bp 돌연변이체 대립유전자 생성물을 산출하였다. Mi, S. et al., Nat. Neurosci. 7: 221-228 (2004) 를 참조한다. Sp35 유전자 결실의 확인은 서던 블롯, RT-PCR 및 노던 블롯 분석에 의해 달성되었다. 야생형 마우스의 노던 블롯 및 RT-PCR 에서 현저한 밴드가 검출되었으나, 녹-아웃 마우스에서 밴드가 완전히 소실되었다. 이종접합체의 서던 블롯은 야생형 및 변형 Sp35 대립유전자 모두에서 나타났다. Sp35 녹-아웃 마우스는 뚜렷한 물리적 비정상 또는 행동, 이동 또는 번식에서 변화를 보이지 않은, 정상으로 보였다. 이종접합 F1 자손의 한배 새끼는 크기가 다양하였다. Sp35 녹-아웃 마우스의 발생은 본원에 참조로서 인용된, Mi et al. Nat. Neuroscience 7:221-228 (2004) 에 기재되어 있다.
실시예 5
Sp35 녹-아웃 마우스에서의 DA 뉴런 생존 및 재생에 대한 생체 내 6-OHDA 검정법
Sp35 이 없는 마우스가 증가된 뉴런 생존 및 손상 후 뇌에서의 도파민성 경로 중 증가된 기능의 회복을 나타내는지의 여부를 측정하기 위해 Sp35 녹-아웃 마우스를 시험하였다. 13 마리 Sp35 녹-아웃 마우스 및 13 마리 야생형 한배 새끼 대조군 마우스를 케타민 및 자일라진 (100 및 10 mg/kg ip, 각각) 을 사용하여 마취하고, 6-히드록시도파민 HCl (6-OHDA) 의 한쪽 선조체내에 주사를 주기 위해 정위적 프레임에 위치시켰다. 수술 부위를 베타딘 및 알코올로 닦아내고, 0.5 cm 정중선 시상 절개를 하여 정수리점을 노출시켰다. 주사 부위 위의 두개골 내에 작은 천두공을 내고, 0.02% 아스코르베이트/식염수 (Sigma) 에 용해된 10μg 6-OHDA 를 좌표 AP+04, 측면 1.5 mm, 측면에서 정중선, DV-2.5 mm 배쪽에서 두개골의 표면에서, 좌측 선조체 내에 주사하였다. 6-OHDA 를 26 게이지 10 μl Hamilton 주사기를 사용하여 2 분 이상 0.5 μl/분의 속도로 주입하였다.
6-OHDA5 의 주입 후 캐뉼라를 추가 2 분 동안 방치한 다음 천천히 철수시켰다. 1 개의 오토 클립을 사용하여 절개를 봉하고, 마우스가 마취에서 회복될 때까지 마우스를 따뜻한 패드 위에 두었다. 마우스의 선조체 내의 6-OHDA 주사는 DA 엑손 및 뉴런을 점진적으로 손실시키며, PD 의 연구를 위해 잘 정립된 모델 시스템이다. Brundin et al. Brain Res. 366:346-349 (1986) 을 참조한다.
회전 시험을 6-OHDA 주입-후 1, 2, 3, 및 4 주에 수행하였다. 회전 시험을 위해, 마우스에 0.02% 아스코르베이트 중의 아포모르핀을 피하로 0.4 mg/kg 의 투여량으로 주사하였다. 병변-부위에 대한 반대쪽 회전을 30 분 간격으로 계수하였다.
"회전 행동" 은 흑질선조체의 도파민 경로에 대한 한쪽 손상을 가진 동물에게 도파민 작용제, 예컨대 아포르모르핀 또는 도파민 방출제, 예컨대 암페타민을 투여한 경우 나타내는 행동이다. 동물은 반복적으로 더 큰 선조체의 도파민 수용체 자극을 경험하는 뇌의 면으로부터 벗어나 원을 그리면서 돈다. 회전 반응의 크기 (즉, 수행된 회전 수) 는 흑질선조체의 도파민 경로에 대한 손상 정도에 직접적으로 비례한다. 예를 들어, Fuxe et al. Pharmacol. Ther. 2:41-47 (1976) 를 참조한다.
회전 행동 측정 후 적어도 24 시간에, 마우스를 CO2 질식에 의해 안락사시켰다. 뇌를 빠르게 제거하고, 10% 중성 완충 포르말린으로 48 시간 동안 고정하였다. 뇌를 동결방지를 위해 PBS 중 30% 수크로오스로 평형화시키고, 연속으로 섹션화하였다. 정규 ABC 면역조직화학을 총 배쪽 중뇌의 매 6 번째를 함유하는 무작위 선택된 일련의 섹션에 수행하였다. 섹션을 항-티로신 수산화효소 (TH) (1:300, Pel Freez, AK) 로 밤새 4℃ 에서 인큐베이션한 후 비오티닐화 염소 항-양 2차 항체 (1:300, Vector Laboratories, CA) 및 스트렙타비딘-비오틴 복합체로 1 시간 동안 실온에서 각각 인큐베이션시켰다. 니켈 증강 3,3'-디아미노벤지딘 용액 (Vector Laboratories, CA) 으로 인큐베이션하여 염색을 가시화하였다. 1차 항체의 생략을 대조군으로 설정하였다. 통합 Axioskop 2 현미경 (Carl Zeiss, NY) 및 Stereo Investigator 이미지 캡쳐 장비 소프트웨어 (MicroBrightField, VT) 를 사용하여 염색된 섹션상에서 입체학을 수행하였다. 광학 단편 탐침을 사용하여 TH 양성 세포를 계수하였다. 세포의 추정 총 수는 Microbrightfield 소프트웨어를 사용하여 수득되었다. 그룹 처리에 대해 모르는 조사자에 의해 입체학적 분석을 수행하였다.
운동 불균형은 시험되는 모든 시점에서 야생형 한배 새끼 대조군과 비교하여 녹-아웃 마우스에서 유의하게 더 낮았다 (p<0.001 two-way ANOVA). 도 5 를 참조한다. 6-OHDA 주사 후 제 32 일에 사후 분석은 병변 중뇌의 TH 뉴런의 수가 현저히 감소하였다는 것을 보여주었다. 입체학적 분석은 중뇌의 TH 뉴런의 수가 야생형 및 녹-아웃 마우스 (p > 0.05, 짝지워지지 않은 t-검증법) 에서 상이하지 않았다는 것을 보여주었다. 도 6A 를 참조한다. 유전형에 의해 발생된 차이를 정정하기 위해, 병변 중뇌의 TH 뉴런의 수는 각 동물의 미병변 면의 수의 % 로서 나타내졌다. 입체학적 분석은 야생형 마우스보다 녹-아웃 마우스에서 TH 뉴런이 더 높은 % 를 보여, 야생형 새끼 대조군과 비교하여 녹-아웃 마우스가 6-OHDA 모델에서 보호된다는 것을 나타내었다 (p = 0.002, 짝지워지지 않은 t-검증법). 도 6B 를 참조한다.
TH 뉴런의 수는 Blum, M., Nat. Neurosci. 1:374-377 (1998) 에서 기재된 비편향 광학 분별계 방법을 사용하여 배쪽 피개 영역 (VTA, A10 영역) 및 흑질 치밀층 (SNc, A9 영역) 영역에서 입체학적으로 계수하였다. KO 와 WT 마우스 사이의 TH 뉴런의 수에는 차이가 없었다 (F1>48 = 1.321, p>0.05). 그러나, TH 세 포 수는 병변 및 비-병변 면 (F1,48 = 27.53, pO.OOO1) 사이에 유의하게 차이가 났었고, 병변 및 비-병변 면 사이의 TH 세포 수의 차이는 유전형 (유전형과 뇌 면 사이의 상호작용) 에 의해 크게 영향을 받았다 (F1,48 = 4.34, p>0.05). 도 8 을 참조한다. 병변 면 상의 뉴런의 수는, 유전형의 임의의 영향을 방지하기 위해 각 동물에서 비-병변 면에 대해 표준화하였다. 통계학적 분석은 WT 마우스 (56% ± 5.5%) 보다 KO (평균 ± s.e.m.: 79% ± 4.5%) 에서 더 많은 수의 TH 뉴런을 나타내었고 (짝지워지지 않은 스튜던트 (Student) t-검증법, t(24) = 3.34; p = 0.003), 상기 마우스에서 녹-아웃의 신경보호 효과를 증명한다.
6-OHDA 유도된 실험적 파킨슨증 모델에 적용된 야생형 마우스에서, Sp35 단백질은 손상 후 제 3 일에 선조체에서 증가하였다. 도 9 를 참조한다. Sp35 는 야생형 마우스에 선조체의 6-OHDA 투여 후 제 3 일에 반대쪽 면 (대조군) 과 비교해 병변 면 (6-OHDA) 에서 상향조절된다. 3 마리 마우스를 각 시점에서 시험하였다 (제 0 일, 제 3 일, 제 7 일 및 제 15 일) (짝지워지지 않은 스튜던트 t-검증법, p<0.05).
실시예 6
Sp35 녹-아웃 마우스에서의 DA 뉴런 생존 및 재생에 대한 생체 내 MPTP 검정법
Sp35 가 없는 마우스가 증가된 뉴런 생존 및 손상 후 뇌에서 도파민성 경로의 증가된 기능 회복을 보인다는 것을 추가로 확인하기 위해, 또한 마우스를 PD 의 MPTP 모델에서 평가하였다. 13 마리 WT 및 14 마리 Sp35 녹-아웃 마우스에 25 mg/kg 의 MPTP 히드로클로라이드 (Sigma) 를 각 주사 사이에 2 시간마다, 4 회 복막내로 주사하였다. 예를 들어, Battaglia G. et al., Neuropharmacology 45:155-166 (2003) 을 참조한다. 모든 동물을 주사 후 제 7 일에 희생시켰다. 마우스를 CO2 질식에 의해 안락사시켰다. 뇌를 빠르게 제거하고, 10% 중성 완충 포르말린으로 48 시간 동안 고정하였다. 뇌를 동결방지를 위해 PBS 중 30% 수크로오스로 평형화시키고, 연속으로 섹션화하였다. 통합 Axioskop 2 현미경 (Carl Zeiss, NY) 및 Stereo Investigator 이미지 캡쳐 장비 소프트웨어 (MicroBrightField, VT) 를 사용하여 염색된 섹션상에서 입체학을 수행하였다. 광학 단편 탐침을 사용하여 TH 양성 세포를 계수하였다. 세포의 추정 총 수는 Microbrightfield 소프트웨어를 사용하여 수득되었다. 그룹 처리에 대해 모르는 조사자에 의해 입체학적 분석을 수행하였다. MPTP 처리 후 제 7 일에 사후 입체학적 분석은 WT 에 비해 KO 마우스의 중뇌에서 더 많은 수의 TH 뉴런이 있음을 밝혔다. 도 6C 를 참조한다.
또 다른 실험에서, 10 마리 KO 마우스 및 10 마리 WT 한배 새끼를 PD 의 MPTP 모델에서 평가하였다. 식염수를 주사한 WT (n=7) 및 KO 마우스 (n=8) 를 대조군으로서 설정하였다. MPTP 처리 후 제 7 일에 사후 입체학적 분석은 흑색질 치밀층 (SNc, A9 영역) 중의 TH 세포 수가 대조군 WT 및 KO 마우스 사이에서 상이하지 않았다는 것을 밝혔다. 그러나, TH 뉴런의 수는 운반체 처리된 WT 및 KO 마우스와 비교하여 MPTP 로 처리된 WT 마우스의 SNc 에서 감소하였다 (Kruskal- Wallis 검증법, p<0.001, 각각). 도 10 을 참조한다. TH 뉴런의 수는 대조군과 MPTP 처리된 KO 마우스 사이에서 통계적으로 상이하지 않았다.
대조군 및 MPTP 처리된 KO 및 WT 마우스의 선조체의 도파민 수준을 또한 시험하였다. 절개된 선조체를 초음파분쇄하고, 냉동된 0.1M 과염소산 (PCA, 약 100 μl/mg 조직) 에서 원심분리하였다. Yang, L. et ah, Exp. Neurol. 191:86-93 (2005) 에 기재된 바와 같이 도파민의 측정을 위해 상청액을 취하였다. 간략하게는, 15 μl 의 상청액을 0.1M LiH2PO4, 0.85mM 1-옥탄술폰산 및 10%(v/v) 메탄올을 함유하는 이동상이 있는 80 x 4.6 mm C18 컬럼 (ESA, Inc., Chelmsford, MA) 을 통해 등용매적으로 (isocratically) 용출시키고, 2-채널 Coulochem II 전기화학 검출기 (ESA, Inc., Chelmsford, MA) 로 검출하였다. 도파민의 농도를 단백질 밀리그람 당 나노그람으로 표현하였다. 조직 균질액의 단백질 농도는 Bradford 방법 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 및 Perkin Elmer Bio Assay Reader (Norwalk, CT) 를 사용하여 측정하였다. 선조체의 도파민 수준은 대조군 WT 마우스 (Kruskal-Wallis 검증법, p<0.01) 및 대조군 KO 마우스 (p<0.05) 와 비교해 MPTP 처리된 WT 에서 더욱 낮았다. 도 11 을 참조한다. 도파민 수준은 6-OHDA 모형 (paradigm) 에서 신경보호가 또한 일관적으로 관찰되는 MPTP 처리된 KO 마우스 및 대조군 사이에 통계적으로 차이가 없었다.
Sp35 유전적 제거가 MPTP 독소 섭취 및 대사기작을 변형시키는 지를 측정하기 위해, Sp35 KO 및 WT (각 군 당 n=6) 중의 선조체의 MPP+ 수준을 MPTP 처리 후 90 분에 측정하였다. MPP+ 를 측정하기 위해, 선조체 조직을 초음파분쇄하고 0.1M PCA 에서 원심분리하고, 상청액의 분취액을 META 250 x 4.6 C18 컬럼 (ESA, Inc., Chelmsford, MA) 상에 주사하였다. 샘플을 3mM 테트라부틸암모늄 히드로겐술페이트, 0.25mM 1-헵탄술폰산 및 10% 이소프로판올을 함유하는 20 mM 붕산-나트륨 보레이트 완충액 (pH 7.75) 으로 등용매적으로 용출시켰다. 295nm 에서 여기 및 375nm 에서 방출로의 형광 검출기 설정으로 MPP+ 를 검출하였다. MPTP 처리 후, KO 및 WT 에서의 MPP+ 수준은 유의하게 상이하지 않았다 (짝지워지지 않은 스튜던트 검증법; t(10)=1.69; p>0.05, 평균 ± s.e.m., WT 에 대해 39.68 ± 3.92 및 KO 에 대해 62.06 ± 12.67). 웨스턴 블롯 분석은 또한 도파민 수송 (DAT) 수준이 Sp35 KO 마우스에서 변경되지 않았음을 보여주었다. 도 14 를 참조한다.
부가적으로는, MPTP 에 노출된 KO 및 WT 마우스 뿐 아니라 대조군으로부터 VM 조직의 용해물 상에 웨스턴 블롯을 수행하였다. 마우스 조직을 500 μl 용해 완충액 [50 mM HEPES, pH 7.5,, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1% Triton x-100, Complete Protease Inhibitors (Roche, Basel, Switzerland) 및 Phosphatase Inhibitors (Sigma) 를 함유하는 10% 글리세롤] 에 용해하였다. 상청액을 4-20% 또는 10% SDS-PAGE 겔 (Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 전기영동하고, 항-포스포-Akt, 항-Akt, 및 항-EGFR 항체 (Cell Signaling, Beverly, MA) 로 면역블롯팅하였다. 또한 MPTP 에 노출된 WT 한배 새끼 대조군의 것들과 비교하 여 MPTP 에 노출된 KO 마우스의 배쪽 중뇌에서의 인산화 Akt 의 증가가 발견되었다. 도 6D-6F 를 참조한다.
부가적으로는, 우세-음성 분자로서 작용하는 Sp35 의 절단된 형태인, Sp35-Fc 단백질 (6.5μg/μl, 총 2 μl) 을 C57BL/6 마우스 (n=9) 의 선조체에 한쪽으로 주사하였다. 상기 마우스에게 수술 후 제 6 일에 MPTP 를 준 다음, 추후 7 일 동안 생존시켰다. 상기 동물에서의 TH 뉴런 수의 사후 분석은 반대쪽 SNc 보다 같은측 SNc 에서 더 큰 수를 나타내었다 (짝지워지지 않은 스튜던트 t-검증법; t(16)=2.114; p<0.05). 도 15A 를 참조한다. 선조체의 도파민 수준은 Sp35-Fc 주사된 뇌에서보다 더 컸고 (Mann-Whitney 검증법, p<0.05), 그러므로 신경보호 효과를 나타냈다. 도 15B 를 참조한다. 게다가, MPTP 주사 후 90 분에 시험된 선조체의 MPP+ 수준은 Sp35-Fc 주사된 면과 뇌의 반대쪽 면 사이에서 상이하지 않았다. 도 15C 를 참조한다.
실시예 7
RNAi 녹다운 (knockdown) 렌티바이러스의 발생
Sp35 가 DA 신경돌기 생존, 재생 및 분화에 어떻게 기여하는지를 시험하기 위해, DA 뉴런에서 Sp35 발현을 제거하기 위해 Sp35-특이적 RNAi 를 사용하였다. DA 뉴런 배양물을 하기와 같이 제조된 Sp35-특이적 RNAi 서열 또는 대조군 RNAi 를 가지고 있는 렌티바이러스로 감염시켰다.
후보자 소형-헤파린 RNAs (shRNA) 에 대해 사용하기 위한 상동 영역을 찾기 위해 쥣과 및 래트 Sp35 DNA 서열을 비교하였다. Sp35 RNAi 의 렌티바이러스 발현에 대한 CH324 를, 올리고뉴클레오티드 LV1-035 및 LV1-036 를 어닐링하고 HpaI 및 XhoI 소화된 pLL3.7 에 라이게이션시켜 구축하였다. pLL3.7 벡터, 부가적 방법론 및 바이러스 생성은 Rubinson et ah, Nat . Genet . 33, 401-06 (2003) 에 기재되어 있다. Sp35 RNAi 올리고뉴클레오티드를 MWG 로부터 구입하였고 하기 서열을 갖는다:
LV1-035 (센스 올리고)-
Figure 112008040245603-PCT00004
(SEQ ID NO: 9) 및
LV1-036 (안티센스 올리고)
5'-
Figure 112008040245603-PCT00005
대조군 RNAi 를 소문자로 표시된 뉴클레오티드 변화를 제외하고는 동일한 올리고뉴클레오티드 서열로 디자인하였다:
Figure 112008040245603-PCT00006
(SEQ ID NO: 11) 및
Figure 112008040245603-PCT00007
렌티바이러스의 제조 전, pLL3.7 중의 pLL3.7 또는 후보자 shRNA 로부터의 DNA 를 쥣과 Sp35-HA 태그된 플라스미드를 5 내지 1 의 비로 6-웰 포맷으로 CHO 세 포 내로 공동트랜스펙션시켰다. 녹다운을 트랜스펙션된 CHO 세포 용해물로부터 Sp35-HA 태그의 웨스턴 블롯 검출 뿐 아니라 2중 웰로부터 준비된 총 RNA 의 노던 블롯에 의해 분석하였다. 블롯을 Sp35 cDNA 의 조각으로 탐침하였다. 트랜스펙션-후 48 시간에 검정법을 수행하였다. 예상과 같이, CH324 RNAi-처리된 CHO 세포에서 대조군-처리된 세포에 비해 Sp35 mRNA 가 10 배 감소하였다.
실시예 8
Sp35 발현의 Sp35-특이적 RNAi 녹다운은 DA 뉴런 생존 및 분화를 촉진한다
DA 뉴런에서 Sp35 발현의 결핍의 효과를 측정하기 위해, 실시예 7 에 기재된 바와 같이, Sp35 발현이 제거된 RNAi 분자를 발현하는 렌티바이러스를 래트 일차 VM 뉴런을 감염시키기 위해 사용하였다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 가지고 있는 렌티바이러스를 Rubinson et al. 및 실시예 7 에 기재된 바와 같이 발생시켰다. 래트 일차 VM 뉴런 배양물을 대조군 또는 Sp35 RNAi 으로 1-5 의 감염 다중도 (MOI) 로 감염시켰다. GFP 양성 세포는 렌티바이러스에 감염된 DA 뉴런을 나타낸다. Sp35 녹다운의 효과는 DA 뉴런 신장 및 생존에 의해 측정된다.
실시예 9
Sp35-Fc 및 Sp35 1A7 항체는 MPP+-처리된 VM 배양물 중의 EGFR 발현 및 Akt 의 인산화를 증가시킨다.
MPP+ 로 처리된 VM 배양물 중의 Akt 의 인산화 및 Sp35 와 EGFR 사이의 상호작용을 시험하기 위해, DA 뉴런의 일차 배양물을 E15 또는 E16 Sprague Dawley 래트 (Charles River, MA) 의 배쪽 중뇌로부터 수득하였다. Shah et al., J Cell Physiol 발행을 참조한다. 간략하게는, 조직을 열-불활성화 말 혈청 (10%), 글루코오스 (6.0 mg/ml), 페니실린 (10,000 U/ml), 스트렙토마이신 (10 mg/ml; Sigma), 및 글루타민 (2mM; Gibco) 을 함유하는 냉각 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; Gibco, NY) 에서 연마 파스퇴르 파이펫으로 기계적으로 해리시켰다. 2 × 105 세포를 배지에 재현탁시키고, 24-웰 트레이 (Falcon) 의 각 웰에 15 mg/ml 폴리-L-오르니틴 (Sigma) 및 1 mg/ml 피브로넥틴 (Sigma) 으로 미리 코팅된 커버슬립에 시딩하였다. 제 4 일에 미부착 세포를 흡입 제거하고, LINGO-I-Fc, 1A7, 대조군 IgG 또는 대조군-Fc 를 함유하는 1 ml 의 신선한 배지를 10 μg/ml 의 농도로 첨가하였다. 8 시간 후, 배양된 세포를 10 μM MPP+ 에 48 시간 동안 노출시켰다. 배양된 VM 세포를 500 μl 용해 완충액 [50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1% Triton x-100, Complete Protease Inhibitors (Roche, Basel, Switzerland) 및 Phosphatase Inhibitors (Sigma) 를 함유하는 10% 글리세롤] 에 용해하였다. 상청액을 4-20% 또는 10% SDS-PAGE 겔 (Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 전기영동하고, 항-포스포-Akt, 항-EGFR 항체 (Cell Signaling, Beverly, MA) 또는 항-Actin 항체로 면역블롯팅하였다. EGFR 및 Akt 의 인산화가 대조군 IgG 및 대조군-Fc 단백질과 비교해 1A7 항체 및 Sp35-Fc 단백질로 인큐베이션된 MPP+-처리된 VM 뉴런 배양물에서, 각각 증가하였다 (F3,12 = 23.645; 1A7 에 대해 p<0.001; F3,12 = 18.89, Sp-Fc 에 대해 p<0.001). 도 7A - 7C 및 7G 를 참조한다.
부가적으로는, 전장 Sp35 는 EGFR 발현을 감소시킨다. COS7 세포에 실시예 2 에서 기재된, FL-Sp35 렌티바이러스를, 0, 1 및 5 MOI 로 2 일 동안 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포 중의 EGFR 단백질의 발현을 각 MOI 에서 측정하였다. 도 12 에서 볼 수 있는 것과 같이, EGFR 의 발현 수준은 용량 의존적 방식으로 감소하였다.
배양된 세포 및 WT 및 KO 마우스로부터의 VM 뇌 조직 중의 Sp35 와 EGFR 사이의 직접적 상호작용은 항-Sp35 (1A7 또는 2F3) 또는 항-EGFR 항체를 사용하는 면역침전에 의해 증명되었다 (도 7D-7F 를 참조한다). COS-7 또는 HEK 293 세포 (100mm 디쉬) 를 Sp35, EGFR 및 Sp35/EGFR 로 트랜스펙션시켰다. 48 시간 후에 세포를 수확하고, 1 ml 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1% Triton x-100, 10% 글리세롤) 또는 RIPA 완충액 (50mM TRIS, pH 7.2, 1% Triton X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 5% 글리세롤) 으로 30 분 동안 4℃ 에서 용해시켰다. 14,000xg 에서 15 분 동안 원심분리 후, 상청액을 Protein A/G-Sepharose 비이드 (Santa Cruz Biotechnology) 로 4℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 200 μl 의 사전에 보증된 (precleared) 용해물을 항-EGFR (Santa Cruz Biotechnology) 로 4℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 항-Sp35 항체 (Biogen Idee, 본원에 그 전체가 참조로서 인용된 미국 가출원 특허 제 60/697,336 호에 기재됨) 를 Protein A/G-Sepharose 비이드로의 처리에 수반하였다. 비이드를 용해 완충액으로 3 회 세 척하고, Laemmeli 샘플 완충액에서 끓이고, 4-20% SDS-PAGE 에 적용하고, 항-EGFR 항체 또는 항-Sp35 항체로 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. EGFR 및 Sp35 항체는 항-토끼 IgG-HRP 를 사용하여 가시화되었다.
Sp35 KO 또는 WT VM 을 RDPA 완충액으로 용해하고 상기 기재된 바와 같이 Protein A/G plus-Sepharose 비이드에 의해 사전에 보증하였다. 그 다음 1 mg 의 배쪽 중뇌 추출물을 항-Sp35 at 4℃ 에서 밤새 면역침전에 적용한 후, Protein A/G plus-Sepharose 비이드로 1 시간 인큐베이션하였다. 또한 Sp35 와 EGFR 사이의 직접 상호작용이 배쪽 중뇌 배양물에서 관찰되었다. 도 7E 를 참조한다.
부가적으로는, Sp35 및 EGFR 공동-트랜스펙션된 세포주로의 IP 실험에서, 항-Sp35 항체 1A7 은 EGFR 에 대한 Sp35 의 결합을 차단하는 반면, 항-Sp35 항체 2F3 은 결합을 차단하지 않는다. 도 7F 를 참조한다. 상기 실험에서, OMgp 를 항체 결합에 대한 대조군으로서 사용하였다.
실시예 10
사후 파킨슨 질환 (Parkinson Disease; PD) 환자의 흑색질 (SN) 로부터 생존하는 도파민성 뉴런 중의 Sp35 발현을 시험하였다. 사후 조직을 하버드 뇌 조직 공급 센터 (Harvard Brain Tissue Resource Center) 로부터 동의를 얻어 수득하였다. 하기 표 2 는 본 실시예에 기재된 실험에 사용된 PD 환자 및 대조군과 매치된 그의 연령에 관한 정보를 담고 있다.
표 2
PD 환자 및 연령-매치 대조군에 관한 정보
Figure 112008040245603-PCT00008
상기 기재된 환자로부터 Sp35 발현을 생존 도파민성 뉴런 중에서, 제자리 혼성화에 의해 시험하였다. SN 조직을 Optimum Cutting Temperature (OCT) 화합물에 함침시켰다. 동결 섹션을 준비하고, Mi et al. Nat. Neurosci. 7:221-228 (2004) 에 기재된 바와 같은 디곡시게닌-표지된 Sp35 안티센스 및 센스 KNA 로 처리하고 탐침하였다. 제조사의 지침에 따라 TSA ＋ 형광 및 항-디곡시게닌 접합된 항체 키트 (Perkin Elmer, Wellesley, MA) 를 사용하여 섹션을 염색하였다. 그 다음 섹션을 항-TH (Chemicon, Temecula, CA) 및 DAPI (Sigma) 로 염색하였다. PD 사후 조직 (n=6) 의 SN 중 생존 도파민성 뉴런 중의 Sp35 는 연령 매치된 대조군 (n=6) 과 비교해 상향조절되었다.
또한 표 2 에 기재된 환자에서의 Sp35 발현을 시험하기 위해 반-정량적 PCR 을 사용하였다. 제조사의 지침에 따라 Absolutely RNA miniprep 키트 (Strategene) 를 사용하여 인간 SN 조직으로부터 mRNA 를 추출하였다. Sp35 mRNA 를 Sp35 정방향 프라이머
Figure 112008040245603-PCT00009
및 역방향 프라이머
Figure 112008040245603-PCT00010
를 사용하여 증폭시켰다. 도 13A 에서 보여주는 바와 같이, PD 사후 조직의 SN 중 생존 도파민성 뉴런 중의 Sp35 는 연령 매치된 대조군과 비교해 상향조절되었다. Sp35 mRNA 수준은 대조군보다 PD SN 에서 통계적으로 더 높았다 (짝지워지지 않은 스튜던트 T-검증법; t(10) = 2.280; p<0.05). 도 13B 를 참조한다.
본 발명은 본 발명의 개별 양상의 단일 예증으로서 의도되는 것으로 기재되는 특정 구현예에 의해 범주가 제한되지 않으며, 작용이 동등한 임의의 조성물 또는 방법도 본 발명의 범주 내에 있다. 게다가, 본원에 기재되고 제시된 것들 이외의 본 발명의 다양한 변형이 하기 명세서 및 수반되는 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 청구의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 각 개별 문헌 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로서 인용되는 경우와 동일한 범위로 본원에 참조로서 인용된다.
<110> BIOGEN IDEC INC. Mi, Sha Isacson, Ole <120> METHODS FOR PROMOTING NEURITE OUTGROWTH AND SURVIVAL OF DOPAMINERGIC NEURONS <130> 2159.073PC03 <140> PCT/US2006/042990 <141> 2006-11-03 <150> US 60/814,523 <151> 2006-06-19 <150> US 60/733,166 <151> 2005-11-04 <150> US 60/733,166 <151> 2005-11-04 <150> US 60/800,009 <151> 2006-05-15 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1845 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60 ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc 120 gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcagtcccc 180 gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc 240 aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tggagctcaa cgagaacatc 300 gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctccggac gctgggtctc 360 cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc 420 aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg 480 tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc 540 ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc 600 cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgaggctccg gcacctcaac 660 atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc 720 tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg 780 tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta 840 gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg 900 ttgcatgagc tgctccggct gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960 gagccctatg ccttccgcgg cctcaactac ctgcgcgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020 ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg 1080 gactccaacc cgctggcctg cgactgtcgg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140 ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag 1200 ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc 1260 cgggaccgca aggcccagca ggtgtttgtg gacgagggcc acacggtgca gtttgtgtgc 1320 cgggccgatg gcgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc 1380 tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440 gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac 1500 tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac 1560 aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc 1620 actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680 tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag 1740 ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgga cgcaggcatc 1800 agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga tatga 1845 <210> 2 <211> 614 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Ala Gly Gly Val Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys 1 5 10 15 Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser 20 25 30 Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala 35 40 45 Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro 50 55 60 Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Thr Leu 65 70 75 80 Asn Gln Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu 85 90 95 Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu 100 105 110 Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile 115 120 125 Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile 130 135 140 Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu 145 150 155 160 Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile 165 170 175 Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu 180 185 190 Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu 195 200 205 His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile 210 215 220 Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile 225 230 235 240 Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly 245 250 255 Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Val 260 265 270 Pro Tyr Leu Ala Val Arg His Leu Val Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu 275 280 285 Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu 290 295 300 Leu Arg Leu Gln Glu Ile Gln Leu Val Gly Gly Gln Leu Ala Val Val 305 310 315 320 Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Val Leu Asn Val 325 330 335 Ser Gly Asn Gln Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Val Phe His Ser Val 340 345 350 Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp 355 360 365 Cys Arg Leu Leu Trp Val Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn 370 375 380 Arg Gln Gln Pro Thr Cys Ala Thr Pro Glu Phe Val Gln Gly Lys Glu 385 390 395 400 Phe Lys Asp Phe Pro Asp Val Leu Leu Pro Asn Tyr Phe Thr Cys Arg 405 410 415 Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gln Gln Val Phe Val Asp Glu 420 425 430 Gly His Thr Val Gln Phe Val Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro 435 440 445 Ala Ile Leu Trp Leu Ser Pro Arg Lys His Leu Val Ser Ala Lys Ser 450 455 460 Asn Gly Arg Leu Thr Val Phe Pro Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Tyr 465 470 475 480 Ala Gln Val Gln Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ala 485 490 495 Gly Gly Asn Asp Ser Met Pro Ala His Leu His Val Arg Ser Tyr Ser 500 505 510 Pro Asp Trp Pro His Gln Pro Asn Lys Thr Phe Ala Phe Ile Ser Asn 515 520 525 Gln Pro Gly Glu Gly Glu Ala Asn Ser Thr Arg Ala Thr Val Pro Phe 530 535 540 Pro Phe Asp Ile Lys Thr Leu Ile Ile Ala Thr Thr Met Gly Phe Ile 545 550 555 560 Ser Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Trp 565 570 575 Ser Arg Gly Lys Gly Asn Thr Lys His Asn Ile Glu Ile Glu Tyr Val 580 585 590 Pro Arg Lys Ser Asp Ala Gly Ile Ser Ser Ala Asp Ala Pro Arg Lys 595 600 605 Phe Asn Met Lys Met Ile 610 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gln Val Ser Lys Arg 1 5 <210> 4 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic general structure for an oligonucleotide used in preparation of siRNA molecule <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, g, c, t, or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> nucleotide may be missing <400> 4 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200 <210> 5 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic general structure for an oligonucleotide used in preparation of siRNA molecule <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, g, c, t, or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> nucleotide may be missing <400> 5 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 ctatccaagc actgcctgct c 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 gagttctagc tcctccaggt gtg 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 gatgcccttc agctcgatgc g 21 <210> 9 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LV1-035 (sense oligo) <400> 9 tgatcgtcat cctgctagac ttcaagagag tctagcagga tgacgatctt ttttc 55 <210> 10 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LV1-036 (antisense oligo) <400> 10 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tctagcagga tgacgatca 59 <210> 11 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Control RNAi (sense oligo) <400> 11 tgatcctcat ccttctatac ttcaagagag tgtagcagga tgacgatctt ttttctcga 59 <210> 12 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNAi (antisense oligo) <400> 12 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tatagaagga tgacgatca 59 <210> 13 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic shRNA <400> 13 ugaucgucau ccugcuagac uucaagagag ucuagcagga ugacgaucuu uuuuc 55 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 14 agagacatgc gattggtga 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Reverse Primer <400> 15 agagatgtag acgaggtcat t 21

Claims (56)

  1. 도파민성 뉴런을 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 Sp35 길항제를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 도파민성 뉴런의 재생, 성장 또는 생존의 촉진 방법:
    (i) 가용성 Sp35 폴리펩티드;
    (ii) Sp35 항체 또는 그의 면역특이적 조각;
    (iii) Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) Sp35 압타머; 및
    (v) 2 개 이상의 상기 Sp35 길항제의 조합.
  2. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 Sp35 길항제를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 도파민성 뉴런의 재생, 성장 또는 생존의 촉진 방법:
    (i) 가용성 Sp35 폴리펩티드;
    (ii) Sp35 항체 또는 그의 조각;
    (iii) Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) Sp35 압타머; 및
    (v) 2 개 이상의 상기 Sp35 길항제의 조합.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 포유동물이 도파민성 신경 퇴행과 관련된 질환, 장애, 또는 손상을 겪고 있는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 손상이 파킨슨 질환 (PD), 다계통 위축증, 선조체 퇴행, 올리브교 소뇌위축, 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군, 파킨슨증의 특징을 갖는 운동 뉴런 질환, 루이 소체 치매, 진행성 핵상 마비, 피질-기저 핵 변성, 전측두엽 치매, 파킨슨증이 있는 알쯔하이머 질환, 윌슨 (Wilson) 질환, 할러포르텐-스파츠 (Hallervordern-Spatz) 질환, 세디아크-히가시 (Chediak-Hagashi) 질환, SCA-3 척수소뇌성 실조증, X-연관 근육긴장 이상-파킨슨증 (DYT3), 헌팅톤 (Huntington) 질환 (웨스트팔 (Westphal) 변이체), 프리온 질환, 야콥-크루츠펠트 (Jacob-Creutzfeldt) 질환 (CJD), 혈관 파킨슨증, 뇌성 마비, 반복된 두부 외상, 뇌염후 파킨슨증, 신경매독 및 정신분열로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 손상이 파킨슨 질환 (PD) 인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제가 가용성 Sp35 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 Sp35 영역을 포함하는 방법:
    (i) Sp35 Ig 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체,
    (ii) Sp35 LRR 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체,
    (iii) Sp35 세포질 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체,
    (iv) Sp35 막투과 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체,
    (v) LRR 도메인에 대한 Sp35 염기성 영역 C-말단 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체, 및
    (vi) (i) 내지 (v) 의 상기 Sp35 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체 중 2 이상의 조합.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 Sp35 영역이 결핍된 방법:
    (i) Sp35 Ig 도메인,
    (ii) Sp35 LRR 도메인,
    (iii) Sp35 세포질 도메인,
    (iv) Sp35 막투과 도메인,
    (v) LRR 도메인에 대한 Sp35 염기성 영역 C-말단, 및
    (vi) (i) 내지 (v) 의 상기 Sp35 도메인 중 2 이상의 조합.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 Sp35 막투과 도메인 및 Sp35 세포질 도메인이 결핍된 방법.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 하기를 포함하는 방법:
    (i) Sp35 LRR 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체,
    (ii) LRR 도메인에 대한 Sp35 염기성 영역 C-말단 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체, 및
    (iii) Sp35 면역글로불린 (Ig) 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체.
  11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 Sp35 LRR 도메인을 일부 이상 포함하나, Sp35 Ig 도메인, Sp35 염기성 영역, Sp35 막투과 도메인, 및 Sp35 세포질 도메인이 결핍된 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 조각을 포함하는 방법:
    (i) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 33;
    (ii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 35;
    (iii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 64;
    (iv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 64;
    (v) SEQ ID NO:2 의 아미노산 66 내지 89;
    (vi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 90 내지 113;
    (vii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 114 내지 137;
    (viii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 138 내지 161;
    (ix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 162 내지 185;
    (x) SEQ ID NO:2 의 아미노산 186 내지 209;
    (xi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 210 내지 233;
    (xii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 234 내지 257;
    (xiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 258 내지 281;
    (xiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 282 내지 305;
    (xv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 306 내지 329;
    (xvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 330 내지 353;
    (xvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 363 내지 416;
    (xviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 417 내지 424;
    (xix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 419 내지 493;
    (xx) SEQ ID NO:2 의 아미노산 494 내지 551;
    (xxi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 64;
    (xxii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 89;
    (xxiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 113;
    (xxiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 137;
    (xxv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 161;
    (xxvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 185;
    (xxvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 209;
    (xxviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 233;
    (xxix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 257;
    (xxxx) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 281;
    (xxxxi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 305;
    (xxxxii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 329;
    (xxxxiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 353;
    (xxxxiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 416;
    (xxxxv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 424;
    (xxxxvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 493;
    (xxxxvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 551;
    (xxxxviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 531;
    (iL) SEQ ID NO:2 의 아미노산 1 내지 532;
    (Li) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 89;
    (Lii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 1l3;
    (Liii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 137;
    (Liv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 161;
    (Lv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 185;
    (Lvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 209;
    (Lvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 233;
    (Lviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 257;
    (Lix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 281;
    (Lx) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 305;
    (Lxi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 329;
    (Lxii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 353;
    (Lxiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 416;
    (Lxiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 424;
    (Lxv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 493;
    (Lxvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 551;
    (Lxxi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 530;
    (Lxxii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 531;
    (Lxxiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 532;
    (Lxxiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 533;
    (Lxxv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 534;
    (Lxxvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 535;
    (Lxxvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 536;
    (Lxxviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 537;
    (Lxxix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 538;
    (Lxxx) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 539;
    (Lxxxi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 30 내지 532;
    (Lxxxii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 31 내지 532;
    (Lxxxiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 32 내지 532;
    (Lxxxiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 33 내지 532;
    (Lxxxv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 532;
    (Lxxxvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 35 내지 532;
    (Lxxxvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 532;
    (Lxxxviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 30 내지 531;
    (Lxxxix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 31 내지 531;
    (Lxxxx) SEQ ID NO:2 의 아미노산 32 내지 531;
    (Lxxxxi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 33 내지 531;
    (Lxxxxii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 531;
    (Lxxxxiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 35 내지 531;
    (Lxxxxiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 531;
    (Lxxxxv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 89;
    (Lxxxxvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 ll3;
    (Lxxxxvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 137;
    (Lxxxxviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 161;
    (Lxxxxvc) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 185;
    (c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 209;
    (ci) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 233;
    (cii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 257;
    (ciii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 281;
    (civ) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 305;
    (cv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 329;
    (cvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 353;
    (cvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 416;
    (cviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 424;
    (cix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 493;
    (cx) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 551;
    (cxi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 530;
    (cxii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 531;
    (cxiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 532;
    (cxiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 533;
    (cxv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 534;
    (cxvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 535;
    (cxvii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 536;
    (cxviii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 537;
    (cxix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 538;
    (cxx) SEQ ID NO:2 의 아미노산 36 내지 539;
    (cxxi) 상기 폴리펩티드 조각 중 임의의 것의 변이체 또는 유도체, 및
    (cxxii) 상기 폴리펩티드 조각 또는 그의 변이체 또는 유도체 중 임의의 2 이상의 조합.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 34-532 또는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 36-532 를 포함하는 방법.
  14. 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 Sp35 Ig 도메인 또는 그의 조각, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 방법.
  15. 제 6 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 의 아미노산 417-493 을 포함하는 방법.
  16. 제 6 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 비-Sp35 부분을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 비-Sp35 부분이 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드에 융합된 폴리펩티드인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 비-Sp35 부분이 항체 Ig 부분, 혈청 알부민 부분, 표적화 부분, 리포터 부분, 및 정제-용이 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 비-Sp35 부분이 항체 Ig 부분인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 항체 Ig 부분이 경첩 및 Fc 부분인 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 중합체에 접합된 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 중합체가 폴리알킬렌 글리콜, 당 중합체, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 중합체가 폴리알킬렌 글리콜인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 인 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 가용성 Sp35 폴리펩티드가 1, 2, 3 또는 4 개의 중합체에 접합된 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 중합체의 총 분자량이 5,000 Da 내지 100,000 Da 인 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제가 Sp35 항체, 또는 그의 조각을 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 Sp35 항체 또는 그의 조각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 조각으로 본질적으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 방법:
    (i) SEQ ID NO:2 의 아미노산 66 내지 89;
    (ii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 66 내지 113;
    (iii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 66 내지 137;
    (iv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 90 내지 113;
    (v) SEQ ID NO:2 의 아미노산 114 내지 137;
    (vi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 138 내지 161;
    (vii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 162 내지 185;
    (viii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 186 내지 209;
    (ix) SEQ ID NO:2 의 아미노산 210 내지 233;
    (x) SEQ ID NO:2 의 아미노산 234 내지 257;
    (xi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 258 내지 281;
    (xii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 282 내지 305;
    (xiii) SEQ ID NO:2 의 아미노산 306 내지 329;
    (xiv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 330 내지 353;
    (xv) SEQ ID NO:2 의 아미노산 34 내지 64;
    (xvi) SEQ ID NO:2 의 아미노산 363 내지 416;
    (xvii) 상기 폴리펩티드 조각 중 임의의 것의 변이체 또는 유도체; 및
    (xviii) 상기 폴리펩티드 조각 또는 그의 변이체 또는 유도체 중 2 이상의 조합.
  29. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제가 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
    (i) 안티센스 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 리보자임;
    (iii) 소형 간섭 RNA (siRNA); 및
    (iv) 소형-헤파린 RNA (shRNA).
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드가 Sp35 mRNA 의 코딩 부분에 상보적인 10 개 이상의 염기를 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드인 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드가 리보자임인 방법.
  33. 제 30 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드가 siRNA 인 방법.
  34. 제 30 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드가 shRNA 인 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 shRNA 가 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법:
    Figure 112008040245603-PCT00011
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제가 환약 주사 또는 장기간 주입에 의해 투여되는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제가 중추 신경계에 직접 투여되는 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 발현 조절 서열에 작동가능한 연결을 통해 상기 Sp35 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 도파민성 뉴런에 도입하는 것, 및 (b) 상기 Sp35 길항제를 발현시키는 것을 포함하는 방법.
  39. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 상기 도파민성 뉴런 내에 도입되는 방법:
    (a) 트랜스펙션;
    (b) 전기천공;
    (c) 형질도입; 및
    (d) 직접 미세주사.
  40. 제 2 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 서열에 작동가능한 연결을 통해 상기 Sp35 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물에 투여하는 것, 및 (b) 상기 Sp35 길항제를 발현시키는 것을 포함하는 방법.
  41. 제 39 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 배양된 숙주 세포 내에 투여되는 방법.
  42. 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터로서 투여되는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 발현 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  44. 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 포유동물 내로 신경계 질환, 장애 또는 손상 부위에 또는 그 근처에 도입되는 방법.
  45. 제 41 항에 있어서, 상기 배양된 숙주 세포가 (a) 수용자 숙주 세포를 제 40 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 42 항 또는 제 43 항의 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션하는 것, 및 (b) 상기 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 만들어지는 방법.
  46. 제 41 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 치료되는 포유동물 유래의 것인 방법.
  47. 제 1 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Sp35 길항제가 신경계 질환, 장애 또는 손상 부위에 또는 그 근처에서 도파민성 신경 재생, 성장 또는 생존의 억제를 감소시키기에 충분한 양으로 발현되는 방법.
  48. 제 43 항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 파보바이러스 및 폭스바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 헤르페스바이러스 벡터가 단순 헤르페스 바이러스 벡터 및 엡스테인 바르 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  50. 제 48 항에 있어서, 상기 폭스바이러스 벡터가 백시니아 바이러스 벡터인 방법.
  51. 제 48 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 pLL3.7 인 방법.
  52. 제 48 항에 있어서, 상기 파보바이러스가 아데노-관련 바이러스 (AAV) 인 방법.
  53. 제 43 항, 또는 제 48 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 경막내 투여, 경막하 투여 및 피하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 방법.
  54. 도파민성 뉴런을 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 Sp35 길항제를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 도파민성 뉴런에서 EGFR 과 Sp35 상호작용을 억제하는 방법:
    (i) 가용성 Sp35 폴리펩티드;
    (ii) Sp35 항체 또는 그의 조각;
    (iii) Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) Sp35 길항제 압타머; 및
    (v) 상기 Sp35 길항제의 2 이상의 조합.
  55. 도파민성 뉴런을 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 Sp35 길항제를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 도파민성 뉴런에서 Akt 인산화를 증가시키는 방법:
    (i) 가용성 Sp35 폴리펩티드;
    (ii) Sp35 항체 또는 그의 조각;
    (iii) Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) Sp35 길항제 압타머; 및
    (v) 상기 Sp35 길항제의 2 이상의 조합.
  56. 도파민성 뉴런을 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 Sp35 길항제를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 도파민성 뉴런에서 EGFR 발현 을 증가시키는 방법:
    (i) 가용성 Sp35 폴리펩티드;
    (ii) Sp35 항체 또는 그의 조각;
    (iii) Sp35 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) Sp35 길항제 압타머; 및
    (v) 상기 Sp35 길항제의 2 이상의 조합.
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