JP2003521931A - Ｔｎｆファミリーの異種ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、部分的に、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）（ＴＮＦ）ファミリーの新しく同定されたヘテロマーリガンド（本明細書中以下では「ＡＰＢＦ」という）、その改変体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにその使用に関する。詳細には、本発明は、非共有結合でＴＮＦファミリーメンバーＢＡＦＦサブユニットに連結されたＴＮＦファミリーメンバーＡＰＲＩＬサブユニットを有するＡＰＢＦに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、部分的に、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃ
ｔｏｒ）（ＴＮＦ）ファミリーの新しく同定されたヘテロマーリガンド（本明細
書中以下では「ＡＰＢＦ」という）、その改変体、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニスト；ならびにその使用に関する。詳細には、本発明は、非共有結合で
ＴＮＦファミリーメンバーＢＡＦＦサブユニットに連結されたＴＮＦファミリー
メンバーＡＰＲＩＬサブユニットを有するＡＰＢＦに関する。

【０００２】 （発明の背景） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバーは、細胞の生存および分化の両方
を制御する、免疫系におけるマスタースイッチとしてもっともよく説明され得る
。治療的利点（抗腫瘍活性ならびに免疫調節および炎症を含む）のためのＴＮＦ
ファミリーのメンバーの操作における現在の進歩を考慮すると、このファミリー
のメンバーが疾患を制御する独特の手段を提供する見込みがある。ＴＮＦリガン
ドおよびこのリガンドに対するアンタゴニストの医療有用性は、いくつかの系に
ついて示された。もっとも顕著なものはＴＮＦである。ＴＮＦは、広範な免疫プ
ロセス（急性炎症性反応の誘導、ならびにリンパ組織ホメオスタシスの維持を含
む）を制御する。種々の病理学的設定（ｓｅｔｔｉｎｇ）においてこのサイトカ
インが果たし得る二重の役割に起因して、アゴニスト試薬およびアンタゴニスト
試薬の両方が疾患の変更因子として開発されてきた。例えば、ＴＮＦおよびＬＴ
α（これはまた、ＴＮＦレセプターを経由してシグナル伝達する）は、癌（特に
、末梢部位に存在する癌（例えば、肢肉腫））のための処置として使用されてき
た。この設定において、レセプターを経由するこのサイトカインによる直接的シ
グナル伝達は、腫瘍細胞死を誘導する（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊ
ａｎ，１９９６．Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ ７：９３−１２４）。
免疫学的設定において、ＴＮＦレセプターシグナル伝達を遮断する因子（例えば
、抗ＴＮＦ ｍＡｂ、可溶性ＴＮＦ−Ｒ融合タンパク質）は、慢性関節リウマチ
および炎症性腸疾患のような疾患を処置するために使用されてきた。これらの病
理学において、ＴＮＦは、細胞増殖およびエフェクター機能を誘導するように作
用しており、それにより自己免疫疾患を増悪する。この設定において、そのレセ
プター（単数または複数）へのＴＮＦ結合を遮断することは、治療的利益を有す
る（Ｂｅｕｔｌｅｒ，１９９９．Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２６ Ｓｕｐｐｌ
５７：１６−２１）。

【０００３】 より最近に発見されたリガンド／レセプター系は、同様の操作に受け入れられ
ると思われる。リンホトキシンβ（ＬＴβ）（ＬＴαとヘテロトリマーを形成す
るＴＮＦファミリーメンバー）は、ＬＴβ−Ｒに結合する。ＬＴβ−Ｒを発現す
るいくつかの腺癌腫瘍細胞は、アゴニスト性抗ＬＴβ−Ｒ ｍＡｂで処理される
場合に、殺傷され得るかまたは分化され得る（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら，１９９６．
Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８３：８６７−８７８）。免疫学的設定において、抗Ｌ
Ｔβ ｍＡｂまたは可溶性レセプター融合タンパク質ＬＴβ−Ｒ−Ｉｇは、炎症
性腸疾患の発生を、おそらく樹状細胞とＴ細胞との相互作用に影響することによ
り、遮断し得ることが示された（Ｍａｃｋａｙら，１９９８．Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏｌｏｇｙ １１５：１４６４−１４７５）。

【０００４】 ＴＮＦＲ系およびＬＴβ−Ｒ系に加えて、ＴＲＡＩＬ経路（Ｇｕｒａ， １９
９７． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７： ７６８）およびＯＰＧ経路（Ｓｉｍｏｎｅ
ｔら１９９７．Ｃｅｌｌ ８９：３０９−３１９）の操作は、それぞれ癌および
骨損失の処置において治療的に有用であり得る。最近、データベース検索により
、ＴＮＦファミリーのリガンドおよびレセプターの多くの新しいメンバーが記載
されている。新しいメンバーの数に加えて、リガンド／レセプター相互作用の複
雑性もまた増加した。ＴＮＦ系およびＬＴ系が、１つより多くのレセプターと相
互作用するリガンドの能力において独特ではないということが現在では明らかで
ある。１つより多くのレセプターまたはおとりレセプターに結合すると報告され
たリガンドの中には、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、およびＬＩＧＨＴが
ある。

【０００５】 従って、ＴＮＦファミリーのメンバーであるさらなる分子を同定および特徴づ
けし、それにより疾患を制御しそして免疫系を操作するさらなる手段を提供する
明らかな必要性が存在する。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、ＴＮＦファミリーにおける新しく発見されたヘテロマー、ＡＰＢＦ
、そのヌクレオチド配列、そのタンパク質配列および得られるポリヌクレオチド
、ポリペプチドの同定、ならびにその可溶性形態；ＡＰＢＦに対するレセプター
ならびにＡＰＢＦに特異的な抗体およびそのレセプター；ならびにこれら由来の
使用に関する。

【０００７】 本発明は、非共有結合の相互作用を介してＢＡＦＦサブユニットに連結される
ＡＰＲＩＬサブユニットを含む単離されたポリペプチドに関する。１つの局面に
おいて、本発明は、ヒトＡＰＲＩＬ、部分的ヒトＡＰＲＩＬ、マウスＡＰＲＩＬ
もしくは部分的マウスＡＰＲＩＬからなる群から選択されるＡＰＲＩＬサブユニ
ット、またはそのアミノ酸置換改変体；ヒトＢＡＦＦ、部分的ヒトＢＡＦＦ、マ
ウスＢＡＦＦもしくは部分的マウスＢＡＦＦからなる群から選択されるＢＡＦＦ
サブユニット、またはそのアミノ酸置換改変体を含む単離されたポリペプチドで
あって、このＡＰＲＩＬサブユニットは、ＢＡＦＦサブユニットに非共有結合性
の相互作用を介して連結されている、単離されたポリペプチドに関する。好まし
い実施形態において、部分的ＢＡＦＦポリペプチドまたは部分的ＡＰＲＩＬポリ
ペプチドは、これらのポリペプチドの可溶性部分である。

【０００８】 本発明の好ましい実施形態において、異種ポリペプチドは、ＢＡＦＦサブユニ
ットに非共有結合で連結される１つより多くのＡＰＲＩＬサブユニット、および
より好ましくは２つのＡＰＲＩＬサブユニットを含む。代替の実施形態において
、異種ポリペプチドは、ＡＰＲＩＬサブユニットに非共有結合で連結される１つ
より多くのＢＡＦＦサブユニット、そしてより好ましくは２つのＢＡＦＦサブユ
ニットを含む。従って、好ましい実施形態において、本発明は、ＢＡＦＦサブユ
ニットおよびＡＰＲＩＬサブユニットの異種ポリペプチドトリマーに関し、ここ
でＡＰＲＩＬサブユニット対ＢＡＦＦサブユニットの比は、２：１であるかある
いは１：２である。

【０００９】 本発明はまた、本発明のヘテロマーを利用する治療方法に関する。本発明の１
つの局面は、単離されたＡＰＢＦ分子もしくはその活性フラグメント、組換えＡ
ＰＢＦ分子もしくはその活性フラグメント、およびＡＰＢＦに特異的な抗体もし
くはその活性フラグメントからなる群から選択される治療有効量の組成物を投与
することにより、動物におけるＢ細胞、Ｔ細胞または腫瘍細胞の増殖を阻害する
方法に関する。本発明の別の局面は、単離されたＡＰＢＦ分子もしくはその活性
フラグメント、組換えＡＰＢＦ分子もしくはその活性フラグメント、およびＡＰ
ＢＦに特異的な抗体もしくはその活性フラグメントからなる群から選択される治
療有効量の組成物を投与することにより、動物におけるＢ細胞、またはＴ細胞の
増殖を刺激する方法に関する。

【００１０】 （詳細な説明） （定義） 本明細書で使用される場合、用語「ＡＰＢＦ」または「ＡＰＢＦリガンド」は
、非共有結合性の相互作用を介してＢＡＦＦサブユニットに連結されたＡＰＲＩ
Ｌサブユニットを有する、任意のネイティブポリペプチドまたは組換え的に産生
されたポリペプチドを包含する。ＡＰＢＦは、種々の供給源から（例えば、マウ
スもしくはヒト組織型からまたはその他の供給源から）単離され得るか、または
組換え方法または合成方法により調製され得る。当業者に公知の多数の分析生化
学的方法は、ＡＰＢＦ、その改変体および誘導体の化学量論を決定するために利
用され得る。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、種々の化学
量論形態のうちのどれがアフィニティカラム由来の調製物中に存在するかを決定
し得る。また、精製された画分のゲルクロマトグラフィーは、各形態の分子量を
示す。ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの分子量は、公知である。例えば、全長ヒトＢ
ＡＦＦ（アミノ酸１〜２８５）の分子量は、各ポリペプチドについて３４．２ｋ
Ｄａであると推定される。可溶性ヒトＢＡＦＦ（アミノ酸１３２〜２８５）の分
子量は、１ポリペプチドあたり１８．２ｋＤａであると推定される。全長ヒトＡ
ＰＲＩＬ（アミノ酸１〜２５０）の分子量は、各ポリペプチドについて３０．０
ｋＤａであると推定される。可溶性ヒトＡＰＲＩＬ（アミノ酸１０５〜２５０）
の分子量は、１ポリペプチドあたり１７．５ｋＤａであると推定される。本発明
において企図される化学量論的組合せとしては、以下の式Ｘ ＡＰＲＩＬ：Ｙ
ＢＡＦＦが挙げられ、ここでＸおよびＹは、１以上の整数である。ヘテロマーが
可溶性分子として存在し得、ここで全てのサブユニットが可溶性ＡＰＲＩＬまた
はＢＡＦＦポリペプチドであるということが企図される。ヘテロマーが、細胞結
合分子として存在し得、ここで少なくとも１つのサブユニットが膜貫通ドメイン
を含む全長分子であり、かつその他のサブユニット（単数または複数）がＡＰＲ
ＩＬまたはＢＡＦＦの全長形態または可溶性形態を含み得るということがさらに
企図される。

【００１１】 用語「ＡＰＲＩＬサブユニット」は、本明細書中で使用される場合、任意のネ
イティブＡＰＲＩＬポリペプチドまたは組換え的に産生されたＡＰＲＩＬポリペ
プチドを包含する。ＡＰＲＩＬサブユニットは、種々の供給源（例えば、マウス
もしくはヒト組織型または他の供給源から）単離され得るか、または組換え方法
もしくは合成方法により調製され得る。例えば、ＡＰＲＩＬサブユニットは、ヒ
トＡＰＲＩＬ（配列番号１）またはマウスＡＰＲＩＬ（配列番号２）によりコー
ドされるアミノ酸配列ならびにその改変体、誘導体および固有フラグメントを有
し得る。ヒトおよびマウス可溶性構築物形態のＡＰＲＩＬ（それぞれ配列番号２
および配列番号４）ならびにその改変体、誘導体および固有フラグメントも、具
体的に企図される。

【００１２】 用語「ＢＡＦＦサブユニット」は、本明細書中で使用される場合、任意のネイ
ティブＢＡＦＦポリペプチドまたは組換え的に産生されたＢＡＦＦポリペプチド
を包含する。ＢＡＦＦサブユニットは、種々の供給源（例えば、マウスもしくは
ヒト組織型から、または他の供給源から）単離され得るか、または組換え方法も
しくは合成方法により調製され得る。例えば、ＢＡＦＦサブユニットは、ヒトＢ
ＡＦＦ（配列番号５）またはマウスＢＡＦＦ（配列番号７）によりコードされる
アミノ酸配列ならびにその改変体、誘導体および固有フラグメントを有し得る。
ヒトおよびマウス可溶性構築物形態のＢＡＦＦ（それぞれ、配列番号６および配
列番号８）ならびにその改変体、誘導体および固有フラグメントが、具体的に企
図される。

【００１３】 本明細書中で規定される場合、タンパク質または核酸の「固有（ｕｎｉｑｕｅ
）フラグメント」は、特定の遺伝子またはポリペプチドに対して固有の配列（す
なわち、関連または関連しない遺伝子またはポリペプチドに共有されない配列）
を有するのに十分な長さのペプチドまたはオリゴヌクレオチドである。従って、
例えば、固有核酸フラグメントは、代表的には、少なくとも１６のヌクレオチド
残基を有し、そして固有ポリペプチドフラグメントは、代表的には少なくとも６
個のアミノ酸残基を有する。好ましくは、代表的な高等真核生物ゲノムにおける
実質的に固有の出現を確実にするために、固有核酸フラグメントは少なくとも２
０個のヌクレオチド残基を有するべきであり、そして固有ポリペプチドフラグメ
ントは、少なくとも８個のアミノ酸残基を有するべきである。

【００１４】 「単離された」ポリペプチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、抗体、または
その他の物質は、その物質もしくは類似の物質が天然に存在するかまたは最初に
その場所から得られる場所に存在し得る少なくともいくらかの他の成分を欠く物
質の調製物をいう。従って、例えば、単離された物質は、供給源混合物からその
物質を濃縮するための精製技術を使用して調製され得る。濃縮は、絶対的基準（
例えば、溶液の体積あたりの重量）に基づいて測定され得るか、または供給源混
合物中に存在する第２の潜在的に妨害する物質に関して測定される。本発明の実
施形態の濃縮を増加させることは、増加するほどより好ましい。従って、例えば
、２倍濃縮が好ましく、１０倍濃縮はより好ましく、１００倍濃縮は、より好ま
しく、１０００倍濃縮はなおさらに好ましい。物質はまた、人工的なアセンブリ
のプロセスにより（例えば、化学合成または組換え発現により）単離された状態
で提供され得る。

【００１５】 「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸鎖の非共有結合性の逆行性の結合
であり、ここで、ワトソン−クリック塩基対形成が確立されている。特異性を確
実にするために、ハイブリダイゼーションは、プローブ／標的二重鎖内の時折の
塩基対形成ミスマッチしか可能にしない、時間、温度、プローブの長さ、プロー
ブおよび／または標的の濃度、浸透圧の強度、ｐＨ、界面活性剤、キャリア核酸
などの条件として本明細書中に定義される、ストリンジェントな条件下で行われ
る。高度にストリンジェントな条件は、標的配列の１ｋｂあたり約１個の塩基対
ミスマッチ以外の全てのミスマッチを排除する。例示的な高度にストリンジェン
トな条件は、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在
下で６５℃の温度での膜に固定化した標的核酸へのハイブリダイゼーション、そ
の後の、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの存在下で６８℃での洗浄を含む。
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ
。比較的数少ないミスマッチ（例えば、標的の１ｋｂあたり約１０個までのミス
マッチ）が許容され得る状況下では、中程度にストリンジェントな条件が使用さ
れ得る。中程度のストリンジェンシーについては、上記の条件下で形成されるプ
ローブ／標的ハイブリッドは、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの存在下、４
２℃で洗浄される。

【００１６】 「個体」は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである
。哺乳動物としては、家畜動物、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウスおよ
びラットが挙げられるが、これらに限定されない。

【００１７】 「有効量」は、有利な臨床結果または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量
である。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のため
に、有効量は、ＡＰＢＦに関連する疾患状態（特に、ＡＰＢＦ関連腫瘍）の発症
を改善、安定化または遅延させるのに十分である、ＡＰＢＦ、ＡＰＢＦの改変体
および誘導体、ならびにＡＰＢＦのアゴニストおよびアンタゴニストの量である
。これらの効力の指標の検出および測定を、以下に議論する。

【００１８】 本明細書中で使用される場合、「処置」は、有利な臨床結果または所望の臨床
結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有利な臨床結果ま
たは所望の臨床結果は、以下の１以上を含むが、これらに限定されない：症状の
軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾
患の伝播（すなわち、転移）の予防、疾患の発生または再発の予防、疾患進行の
遅延または緩徐化、疾患状態の改善、および緩解（部分的または全体的のいずれ
での）。「処置」によって、ＡＰＢＦ関連腫瘍の病理学的結果の減少もまた包含
される。

【００１９】 本明細書中で使用される場合、用語「癌」とは、例えば、以下のような細胞性
の障害を含む、任意の新生物障害をいう：腎細胞癌、カポージ肉腫、慢性白血病
、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫
、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮癌、および胃腸癌または胃癌。好ましくは、癌は
、白血病、肥満細胞腫、黒色腫、リンパ腫、乳腺癌、および咽頭扁平上皮癌であ
る。

【００２０】 ２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「パーセント相同性」を決定するため
に、これらの配列を、最適比較の目的のために整列化する（例えば、第２のアミ
ノ酸配列または核酸配列との最適な整列化のために、第１のアミノ酸配列または
核酸配列の配列中に、ギャップを挿入し得る）。次いで、対応するアミノ酸位置
またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の
配列における位置が、第２の配列中のその対応する位置と同じアミノ酸残基また
はヌクレオチドによって占有される場合、この分子は、その位置で相同性である
（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は
、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。２つの配列間のパーセント
相同性は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すな
わち、相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間のパー
セント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配
列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌ
ｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８のアルゴリズム（これは、Ｋａｒｌｉｎおよ
びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：５８７３−７７のように改変される）である。

【００２１】 本発明は、従来の分子操作技術（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８
９）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ
ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹおよびＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８
９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに示される技
術）、およびＷａｔｓｏｎら（１９９２）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｗ．
Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹに記載および参照さ
れる教示によって産生、発現および／または操作され得る、本発明の全ての核酸
、ペプチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含する。

【００２２】 （発明の説明） 本発明は、ＴＮＦファミリーの新規に同定されたヘテロマーメンバーであるＡ
ＰＢＦに関し、ここで、ＡＰＢＦは、ＢＡＦＦサブユニットに非共有結合的に連
結されたＡＰＲＩＬサブユニットを含む。

【００２３】 ＡＰＲＩＬ（腫瘍細胞増殖の誘導における役割を有することが公知のＴＮＦリ
ガンド）は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１２９６５、ＷＯ９７／３３９０２、ＷＯ９
９／５０４１６および米国特許仮出願第６０／１０６，９７６号（これらの各々
は、参考として本明細書中に援用される）に詳細に記載されている。高レベルの
ＡＰＲＩＬ ｍＲＮＡが、いくつかの腫瘍細胞株、ならびに結腸癌、転移性リン
パ腫および甲状腺腫瘍において検出されることが示されている。さらに、組換え
ＡＰＲＩＬのインビトロ添加が、種々の細胞株の増殖を刺激することが示されて
いる。また、腫瘍細胞増殖の誘導に加えて、ＡＰＲＩＬが、インビトロおよびイ
ンビボで免疫系細胞の種々の機能を調節し得ることも認識されている（Ｈａｈｎ
ｅら、（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１８５−１１９０）。

【００２４】 ＡＰＢＦの第２の成分であるＢＡＦＦは、ナイーブＢ細胞の増殖の誘導におけ
る役割を有することが示されており、そしてこれは、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８
９２１、ＷＯ９８／２７１１４およびＷＯ９９／１２９６４（これらの各々は、
参考として本明細書中に援用される）に詳細に記載されている。ＡＰＲＩＬと同
様に、ＢＡＦＦもまた、インビトロ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、（１９９９）Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１７４７−１７５６）およびインビボ（Ｍａｃｋａｙ
ら、（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１６９７−１７１０；Ｍｏｏｒ
ｅら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：２６０−２６３）で免疫系細胞の
種々の機能を調節することが示されている。

【００２５】 現在のところ、全ての公知のＴＮＦファミリーメンバー（リンホトキシンを除
く）は、ホモマーを形成する。従って、本明細書中に記載の研究の結果として、
ＢＡＦＦサブユニットに非共有結合的に連結されたＡＰＲＩＬサブユニットを有
するヘテロマーポリペプチドを同定したことは、驚くべき発見であった。図１お
よび２は、それぞれ、哺乳動物ＡＰＲＩＬおよび哺乳動物ＢＡＦＦの全長および
部分的な核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。細胞内ドメイン、膜貫通ドメ
インおよび細胞外ドメインが同定され、そしてプロテアーゼ切断部位に印を付す
。全長マウスＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＥＢＮＡ
２９３細胞の培地中に分泌されたＡＰＲＩＬのＮ末端アミノ酸配列分析は、その
分泌形態中の最初のアミノ酸として第８７位のアラニンを同定した。ＥＢＮＡ２
９３細胞中に過剰発現されたヒトＢＡＦＦの同様の分析は、第１３４位のアラニ
ン（天然に存在するヒトＢＡＦＦ配列に対応するアミノ酸の番号付けは、例えば
、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８９：１７４７−
１７５６に見出される）が、アミノ酸２８５位までの分泌形態の最初のアミノ酸
であることを示した。

【００２６】 １つの実施形態において、ＡＰＢＦは、哺乳動物ＡＰＲＩＬに由来するＡＰＲ
ＩＬサブユニットを含み、このＡＰＲＩＬサブユニットは、哺乳動物ＢＡＦＦ由
来のＢＡＦＦサブユニットに非共有結合性の相互作用を介して連結されている。
ＡＰＲＩＬサブユニットおよび／またはＢＡＦＦサブユニットは、それらの膜貫
通ドメインを介して細胞膜に結合されたまま維持され得、そしてこれは、膜結合
ＡＰＢＦの部分を含むことが考えられる。あるいは、ＡＰＢＦは、ＡＰＲＩＬお
よびＢＡＦＦの細胞外ドメインの天然で切断された形態、またはそれらの天然で
切断された形態に由来するフラグメントからなり得る。実施例１に例示されるよ
うに、ＦＬＡＧタグ化可溶性ＡＰＲＩＬを、全長ＢＡＦＦと共発現させた場合に
、可溶性ヘテロマー複合体が、形成される。これは、全長ＢＡＦＦが、容易に切
断され、そしてその人工的に生成した可溶性ＡＰＲＩＬ分子と複合体化すること
を示す。あるいは、実施例２は、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの両方を可溶性分子
として発現させた場合に複合体が形成され得ることを実証する。これは、膜貫通
ドメインとレセプター結合ドメイン（ストーク（ｓｔａｌｋ））との間の領域が
、会合に必要とされないことを示す。しかし、１以上のサブユニットが切断され
ていないままである場合、この複合体は、細胞表面に結合されたままである。あ
るいは、この複合体は、分泌される。さらなる改変が細胞表面からのタンパク質
分解性の切断後に生じ得るので、他のサブユニット形態が想定され、例えば、１
以上のサブユニットは、ストーク部分（第１のβシート前）が短縮化された場合
のように、細胞外ドメインの部分からなり得る。また、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦ
Ｆがグリコシル化部位を含む場合、１以上のサブユニットが、グリコシル化され
ないか（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）または差次的にグリコシル化され得るこ
とが考えられる。このような改変は、そのヘテロマーが発現される細胞に依存し
得る。

【００２７】 本明細書中に記載される研究（ここで、本発明者らが、共発現および差次的な
タグ化によってＡＰＢＦを同定した（実施例１および２を参照のこと））の結果
として、本発明者らは、当業者に公知の多くの技術のいずれか（例えば、アフィ
ニティー方法（例えば、実施例３において記載されるような）を含む）によって
、ＡＰＢＦを産生および単離し得る。タンパク質の単離のための公知の方法の別
の例としては、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、ＡＰＢＦ
は、可溶性ヒトＡＰＲＩＬ（すなわち、ｈＡＰＲＩＬ ｐＩ＝９．８１）および
可溶性ヒトＢＡＦＦ（ｈＢＡＦＦ ｐＩ＝４．７５）の広範囲にわたるｐＩ値に
基づいて、イオン交換クロマトグラフィーによって容易に分離され得る。ヘテロ
複合体は、一般に、本質的に付加的であるｐＩ値を有する。ＢＡＦＦタンパク質
およびＡＰＲＩＬタンパク質の化学量論的に異なる組み合わせは、所定のｐＨに
て有意に異なる親和性で、ＤＥＡＥおよびＳ−セファロースカラムを結合するこ
とが予測される。これらのヘテロ複合体の可視化はまた、等電点電気泳動（ＩＥ
Ｆ）、その後のブロッティングおよび抗体での検出によってなされ得る。ＩＥＦ
はまた、少量のタンパク質を単離するために使用され得る。ネイティブＩＥＦは
、一般に、タンパク質機能を破壊しないので、これは、それ自体を、細胞および
レセプターに対するタンパク質結合親和性をアッセイするためおよび種々のヘテ
ロマーが産生されるレベルについてトランスフェクションを評価するための有用
な方法として良好に示し得る。このような方法は、同時トランスフェクション後
に存在し得る異なるサブユニットの化学量論の分離において特に有用である。

【００２８】 本発明はさらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８のポ
リペプチドまたはその固有フラグメントをコードする縮重改変体核酸を提供する
。なおさらなる実施形態において、本発明は、改変体ＡＰＢＦポリペプチドをコ
ードする核酸を提供し、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番
号６および／または配列番号８と少なくとも７５％の配列類似性を共有するアミ
ノ酸配列を含む。好ましくは、これらの核酸は、配列番号２、配列番号４、配列
番号６および／または配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％またはよ
り好ましくは９５％のアミノ酸配列類似性を共有するポリペプチドをコードする
。これらのコードされる改変体ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列
番号６および／または配列番号８において任意のランダムまたは非ランダムな頻
度で分散されるアミノ酸変異（置換、欠失および／または挿入）を含む。本明細
書中で使用される場合「類似性」とは、対応する配列番号２、配列番号４、配列
番号６および配列番号８の残基と同一である整列化されたアミノ酸残基ならびに
それらに対する許容される点変異であるアミノ酸残基の合計をいう。整列化した
配列における中程度のギャップおよび／または挿入（例えば、約５０未満、好ま
しくは、約１５未満、より好ましくは、約５未満のアミノ酸残基）は、類似性計
算の目的には無視される。許容される点変異は、配列番号２、配列番号４、配列
番号６および／または配列番号８のその対応する整列化された残基に物理的およ
び／または機能的に類似する（例えば、類似のサイズ、形状、親水性または疎水
性性質、電荷および化学特性を有する）アミノ酸残基による置換である。

【００２９】 本発明は、前述の改変体ＡＰＢＦ核酸のいずれか（すなわち、配列番号２、配
列番号４、配列番号６および／または配列番号８と少なくとも７５％の配列類似
性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸）にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドを提供することが理解されるべきである。より詳細
には、本発明は、ＡＰＢＦをコードする核酸の１以上の固有フラグメントにハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。治療目的および／またはＰＣＲ
での研究もしくは診断目的のために、これらのオリゴヌクレオチドは、ＡＰＢＦ
核酸の５’非翻訳配列、転写開始部位、ＯＲＦすなわちポリペプチドコード配列
、イントロ−エキソン境界、ポリアデニル化部位または３’非翻訳領域を含む固
有フラグメントにハイブリダイズする。

【００３０】 本発明はまた、ヒトおよびマウスＡＰＲＩＬならびにヒトおよびマウスＢＡＦ
Ｆの部分配列で形成されるヘテロマーに関する。好ましくは、これらの部分配列
は、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの可溶性形態を含む。好ましい部分ヒトＡＰＲＩ
Ｌ分子は、全長ヒトＡＰＲＩＬ配列のＡ１０５〜Ｌ２５０、Ｋ１１０〜Ｌ２５０
およびＨ１１５〜Ｌ２５０のアミノ酸を含む。好ましい部分マウスＡＰＲＩＬ分
子は、全長マウスＡＰＲＩＬ配列のアミノ酸Ａ８７〜Ｌ２３３を含む。好ましい
部分ＢＡＦＦ配列は、全長ヒトＢＡＦＦ配列のアミノ酸Ａ１３４〜Ｌ２８５およ
びＱ１３６〜Ｌ２８５を含む（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１８９：１７４７−１７５６（本明細書中に参考として援用される）を
参照のこと）。

【００３１】 ヒトおよびマウスのＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの好ましい部分配列としてはま
た、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦのスプライシング改変体が挙げられる。好ましい
部分ヒトＡＰＲＩＬ配列としては、アミノ酸１１３〜１２８を欠失する完全ＡＰ
ＲＩＬヒト配列であるスプライシング改変体が挙げられる（Ｋｅｌｌｙら、２０
００、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６０：１０２１−１０２７（本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。好ましい部分ヒトＢＡＦＦ配列は、アミノ酸１４２
〜１６０を欠失する全長ＢＡＦＦ配列であるスプライシング改変体が挙げられる
（ＷＯ００／５０５９７を参照のこと）。好ましい部分マウスＢＡＦＦ配列とし
ては、アミノ酸１６６〜１８４を欠失する全長ＢＡＦＦ配列であるスプライシン
グ改変体が挙げられる。

【００３２】 本発明はまた、ＡＰＢＦの可溶性分泌形態を包含する。実施例２を参照のこと
。ＡＰＢＦの可溶性分泌形態を作製するために、例えば、ＡＰＲＩＬおよび／ま
たはＢＡＦＦのＮ末端膜貫通領域のいずれかをコードするＮ末端膜貫通領域、お
よび対応するストーク領域のいくらかの部分のＤＮＡレベルでの除去を含む、当
業者に公知の技術を使用し、そしてこれらの領域を、選択された発現系において
効率的なタンパク質分解性の切断を可能にするＩ型リーダー配列または代替的に
ＩＩ型リーダー配列で置き換える。当業者は、レセプター結合特性および分泌効
率の両方を最適化するために、分泌発現構築物中に保持されるストーク領域の量
を変化し得る。例えば、全ての可能なストーク長（すなわち、Ｎ末端切断）を含
む構築物は、ＡＰＲＩＬについてアミノ酸１０５〜１３５およびＢＡＦＦについ
てアミノ酸１３４〜１６４で開始するタンパク質が得られるように、調製され得
る。最適な長さのストーク配列は、この型の分析から得られる。

【００３３】 単離されたＡＰＢＦは、多くの目的（例えば、モノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体の産生、および生物学的機能に影響を及ぼす新規モジュレーター
（例えば、インヒビター）の同定、およびＡＰＢＦと相互作用するレセプターの
同定）に使用され得る。

【００３４】 本明細書中に記載される研究の結果として、同定されたＡＰＢＦに特異的な抗
体（ポリクローナルまたはモノクローナル）が、公知の方法（例えば、Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｈａｒｌｏｗおよび
Ｌａｎｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）
を参照のこと）を使用して産生され得る。このような抗体およびこれらの抗体を
産生する宿主細胞（すなわち、ハイブリドーマ細胞）もまた、本発明の対象であ
る。

【００３５】 抗体産生は、適切な非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、シチメンチョウ、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマ）に１免疫学的用量以上の
ＡＰＢＦポリペプチド調製物（単離されているか細胞膜中に組み込まれているか
のいずれでも）を投与することを含む。免疫原性を増強するために、この調製物
は、従来のアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたは不完全ア
ジュバント）で乳化され得る。血清免疫グロブリンの日常的なモニタリング（開
始免疫またはその後の免疫後に適切な間隔（例えば、７〜１０日）で採取した末
梢血サンプルを使用する）を使用して、体液性免疫応答の発生および／または成
熟を検出し得る。ＡＰＢＦエピトープと選択的に反応性の免疫グロブリンの検出
（および、必要に応じて、定量）は、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、ウエスタ
ンブロッティングなどのような任意の従来の技術によって達成され得る。

【００３６】 「ＡＰＢＦエピトープと選択的に反応する」免疫グロブリンは、抗体／エピト
ープ複合体が、このような複合体の形成を一般に許容する条件下で（例えば、時
間、温度、イオン強度、ｐＨ、イオン性界面活性剤もしくは非イオン性界面活性
剤、キャリアタンパク質などの条件下で）形成するように、認識されたエピトー
プに対する結合特異性を有する。標準的な技術による連続希釈（力価）分析は、
ＡＰＢＦに特有の１以上のエピトープについて免疫血清サンプル中の抗体のアビ
ディティーを予測するに有用である。本明細書中で規定されるように、「ＡＢＰ
Ｆに特有のエピトープ」は、全長ＡＢＰＦポリペプチドの特有の免疫原性フラグ
メントである。特有の直鎖状エピトープは、代表的には、サイズが約１０〜約２
５アミノ酸残基に及び、頻繁には、約１２〜約１８残基の長さである。

【００３７】 高力価を有する免疫血清が、一般に、本明細書中では好まれる。少なくとも約
１：１０００、好ましくは少なくとも約１：１０，０００という特有のＡＰＢＦ
エピトープに対する最大半減アビディティーを有する血清は、ＡＢＰＦの検出お
よび／または定量において有用なポリクローナル抗体の供給源として使用するた
めに大量に回収され得る。ポリクローナル免疫グロブリンは、所望であれば、こ
のような血清が従来の分画技術により富化され得るか、または従来の免疫吸着技
術により（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧのクロマトグラフィー樹脂
を用いて）単離され得る。あるいは、免疫した、高力価のマウス、ラット、ハム
スターまたはモルモットの血清は、ＡＢＰＦと選択的に反応するモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマを生成およびスクリーニングするために、本明細
書中では好まれる。本発明のハイブリドーマは、周知の標準的技術に従って生成
され得る。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物上清から得ら
れ得るか、または従来のように生成した腹水から得られ得、そして必要に応じて
、ＡＢＰＦを検出および／または定量する薬剤として用いる前に、免疫吸着クロ
マトグラフィーまたは別の適切な分離技術により単離され得る。

【００３８】 好ましい抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に拘らず）は、
ＡＰＢＦ発現細胞の表面に提示されたか、またはこの細胞から分泌された特有の
ＡＢＰＦエピトープと選択的に反応する。従って、好ましい抗体は、ＡＰＢＦ発
現細胞（例えば、哺乳動物体組織またはその生検サンプル中の正常細胞または形
質転換細胞）を検出、そして必要に応じて定量するために用いられ得る。具体的
には、好ましい抗体は、ＡＰＢＦ発現細胞がＡＢＰＦを異常に発現する宿主細胞
または哺乳動物体組織細胞であるか否かにかかわらず、ＡＰＢＦ発現細胞を検出
するために用いられうる。有利には、特有のＡＰＢＦエピトープを提示するイン
タクトな（例えば、生存している）細胞は、標準的な免疫組織化学技術、放射線
画像化技術またはフローサイトメトリー技術により検出され得る。本発明の抗体
は、ＡＢＰＦポリペプチド生成を検出および／またはモニターするために用いら
れ得る。従って、この抗体は、ＡＢＰＦの天然の組織特異的生成を評価し、従っ
て、癌腫もしくは肉腫を発生する可能性のある組織を評価するために用いられ得
る。さらに、本発明の抗体は、腫瘍生検サンプルをモニターして、疾患管理の過
程の選択もしくは修正に関連するか、または異常にＡＰＢＦに影響を及ぼすこと
と関連した任意の疾患の診断、予後判定および／もしくは病期分類に関連する情
報を提供するために用いられ得る。さらに、本発明の抗体は、細胞分類手順また
は他の細胞単離手順において用いられて、ＡＢＰＦ発現細胞の実質的に純粋な調
製物またはＡＢＰＦ発現細胞が実質的に枯渇した細胞集団が生成され得る。前述
の各々は、慣用的な操作または周知技術の改変法を通じて達成され得る。これら
の操作または改変法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：検出
可能な部分（例えば、放射性核種、発蛍光団、発色団、結合対メンバーまたは酵
素）のＡＢＰＦ反応性抗体への結合体化。

【００３９】 本発明のＡＢＰＦ反応性モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマはさら
に、ＡＢＰＦ反応性抗体に由来する抗原結合フラグメントを含む融合ポリペプチ
ドの慣用的な構築のための適切な核酸の供給源を提供する。本発明の融合ポリペ
プチドは、Ｄｅｅｌｅｙら（１９９６）米国特許第５，４８９，５１９号（本明
細書中に参考として援用される）に記載される従来技術を慣用的に適合させるこ
とにより調製され得る。この融合ポリペプチドは、短縮化免疫グロブリン、所望
の定常領域を有する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭの代わりにＩｇＧ）、また
はヒト起源のフレームワーク領域に融合したＡＢＰＦ反応性Ｆｃ領域を有する「
ヒト化」免疫グロブリンであり得る。さらなる融合ポリペプチドは、ＡＢＰＦ反
応性抗原結合フラグメントに加えて、細胞傷害性ポリペプチドのような非免疫グ
ロブリンポリペプチド（例えば、ジフテリア毒素、リシン）または免疫エフェク
ター細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ）を刺激
して、ＡＰＢＦを提示する細胞を殺傷する誘引物質ポリペプチドを含み得る。当
該分野で周知の標準的な技術を用いて、本発明の適切な免疫グロブリン融合ポリ
ペプチドを生成し得る。

【００４０】 種々の形態の抗体もまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。
例えば、非ヒトＭａｂをヒトにおいてあまり抗原性でないようにするヒト化技術
が開発された。キメラ化手順によりＭａｂをヒト化するための方法は、ＥＰ０１
２０６９４、ＥＰ０１２５０２３、ＥＰ−Ａ−０１７１４９６、ＥＰ−Ａ−０１
７３４９４およびＷＯ８６／０１５３３（各々、本明細書中に参考として援用さ
れる）に記載されている。キメラ化手順は、一般に、マウスＭａｂ由来の可変性
ドメインおよびヒト免疫グロブリン由来の定常ドメインを有する抗体を調製する
工程を包含する。あるいは、ＣＤＲグラフト化によりＭａｂをヒト化するための
方法は、ＥＰ−Ａ−０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒ）、ＷＯ９０／０７８６１（
Ｑｕｅｅｎ）、ＷＯ９１／０９９６７（ＣｅｌｌＴｅｃｈ）、およびＷＯ９１／
０９９６７（ＣｅｌｌＴｅｃｈ）（本明細書中に参考として援用される）に記載
される。ＣＤＲグラフト化は、一般に、マウスＭａｂの相補性決定領域（ＣＤＲ
）をヒト免疫グロブリンの可変性ドメインのフレームワーク領域に、長鎖オリゴ
ヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発によってグラフト化する工程を包含す
る。ＷＯ９１／０９９６７においては、ＴＮＦ−αに対する特異性を有するヒト
化ＣＤＲグラフト化抗体産物の調製が記載される。特にＷＯ９１／０９９６７の
実施例５において、マウス抗ヒトＴＮＦ−α Ｍａｂから誘導された、ヒトＴＮ
Ｆ−αに対する特異的ヒト化ＣＤＲグラフト化抗体の調製が記載される。従って
、これらの公知の方法のいずれかを用いて、ＡＰＢＦに特異的な抗体を生成およ
び単離し得る。

【００４１】 本明細書中に開示されるポリペプチドおよび方法は、ＡＰＢＦまたはそのフラ
グメントと特異的に相互作用するレセプターの同定を可能にする。例えば、ＡＰ
ＢＦレセプターは、当業者に公知の技術（例えば、以下のアプローチの１以上が
挙げられる）のいずれかを用いてクローニングされ得る。

【００４２】 例えば、当業者は、哺乳動物細胞における発現クローニングを用いてＡＰＢＦ
レセプターを同定し得る。具体的には、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、目的のタ
ンパク質（すなわち、ＡＰＢＦ）に対するレセプターの最高レベルを発現するこ
とが示された細胞株または細胞集団から作製する。このアプローチは、レプチン
レセプターについて示された（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９５ Ｃｅｌｌ ８
３：１２６３−１２７１）。このｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡは、２〜３，０
００のｃＤＮＡのプールとして作製され、そしてこのレセプターを発現しない適
切な細胞株にトランスフェクトされる。プレートアッセイ様式を用いて、精製Ａ
ＰＢＦを使用するレセプターネガティブ細胞株の表面上でのレセプター発現を検
出し得る。サブユニットの１つまたはエピトープタグに対する抗体は、目的の結
合したタンパク質（すなわち、ＡＰＢＦ）を検出するために用いられ得、そして
アルカリフォスファターゼ結合体化二次抗体およびアルカリホスファターゼ基質
が、ポジティブ細胞を可視化するために用いられ得る。プレートのウェルは、顕
微鏡を用いてスクリーニングされ、ポジティブウェルからのｃＤＮＡプールの複
雑性を減少させて、再度スクリーニングされる。このスクリーニングは、単一の
ｃＤＮＡのトランスフェクションがポジティブシグナルを生成するまで続けられ
る。ｃＤＮＡのＤＮＡは配列決定され、そして推定アミノ酸配列を、ＴＮＦレセ
プターファミリーのメンバーと一致するモチーフおよび構造について分析する。
他の発現クローニング様式が、例えば、リガンドコーティングプレートに対する
パニング、またはＦＡＣＳ分析におけるタグ化リガンドでのソーティングにより
利用可能である。

【００４３】 別のアプローチにおいて、当業者は、直接ＤＮＡ配列分析を用いてＡＰＢＦレ
セプターを同定し得る。具体的には、方向性ｃＤＮＡライブラリーをレセプター
ポジティブ細胞株から作製し、そして５’末端を、ＡＢＩ自動化ＤＮＡ配列決定
技術を用いて配列決定して、オープンリーディングフレームを決定する。システ
イン残基の間隔、シグナル配列および膜貫通配列を検索するためのプログラムは
、潜在的ＴＮＦレセプターファミリーメンバーを同定するために用いられ得る。
次いで、全長クローンを単離し、発現させ、そしてＡＰＢＦを結合する能力につ
いて試験する。ライブラリーをまた、ＡＰＢＦレセプターネガティブ細胞株に対
して差し引いて、このライブラリーの複雑性を低減させる。

【００４４】 別のアプローチにおいて、当業者は、公知のレセプターまたはオーファンレセ
プターを試験することによりＡＰＢＦレセプターを同定し得る。具体的には、精
製ＡＰＢＦを、オーファンレセプターおよびリガンドが知られたレセプターのパ
ネルに対して、ＦＡＣＳ、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、またはＢｉａｃｏｒｅアッ
セイにおいて用い得る。ＡＰＢＦのレセプターは、これらのアッセイ全てにおい
てポジティブである。

【００４５】 なお別のアプローチにおいて、当業者は、タンパク質配列分析方法を用いてＡ
ＰＢＦレセプターを同定し得る。具体的には、ＡＰＢＦは、標準的な試薬を用い
てレセプターポジティブであると決定された細胞の表面に架橋され得る。この架
橋した複合体を、サブユニットの１つまたはサブユニット上のエピトープタグに
対する抗体を用いて免疫沈降させ得る。この複合体をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル上で分離し、膜にブロットし、そしてアミノ酸分析に供し得る。一旦アミノ
酸配列決定によりレセプターについての情報が明らかになると、縮重オリゴヌク
レオチドプローブを合成し、そしてレセプターポジティブ細胞株から作製された
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにこのプローブが用いられ得る
。

【００４６】 あるいは、当業者は、質量および配列を具体的に同定するために質量分析と組
み合わせて公知の生化学的アプローチを用いて、ＡＢＰＦレセプターを同定し得
る。３つの説明的例が以下に示される。

【００４７】 ストラテジー１：［^１２５Ｉ］標識ＡＰＢＦの異なる細胞株への結合。適切な
細胞株を選択した後、［^１２５Ｉ］−ＡＰＢＦの細胞への架橋、続いてポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびオートラジオグラフィーに
より、質量分析により分析されるレセプタータンパク質が明らかになる。

【００４８】 ストラテジー２：［^１２５Ｉ］標識ＡＰＢＦの細胞株への架橋、続いて特異的
抗体を用いた免疫沈降およびポリアクリルアミドゲル電気泳動。

【００４９】 ストラテジー３：ＡＰＢＦを結合する適切な細胞株の選択。精製ＡＰＢＦを添
加することにより、レセプターへのヘテロマー結合を可能にする。このヘテロマ
ーに特異的な抗体を用いた免疫沈降、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジ
グラフィーにより、レセプターを同定するために単離され、質量分析により分析
される特定のバンドが明らかになる。

【００５０】 前述の組成物は、多くの目的のために用いられ得る。これらの目的としては、
細胞ＡＰＢＦ遺伝子の構造および／または発現の異常性の評価（例えば、診断目
的で）ならびにＡＰＢＦ活性の異常に高い発現または異常に低い発現を含む状態
の診断が挙げられる。例えば、ＷＯ９９／１２９６５において、ＡＰＲＩＬの転
写は通常組織において低量であるが、高レベルのｍＲＮＡがいくつかの腫瘍細胞
株において検出されることが示された。ＡＰＲＩＬの腫瘍細胞上での発現および
この細胞に対する増殖刺激効果は、腫瘍発生におけるＡＰＲＩＬの役割を示唆し
た。同様に、１以上の腫瘍生検サンプルにおける、ＡＰＢＦ転写またはポリペプ
チド生成、あるいは遺伝子発現レベルまたはその変動のモニタリングは、癌患者
における新生物疾患の診断、予後判定および／または病期分類に関連した情報を
提供すると予測される。

【００５１】 ＡＰＢＦ転写物またはポリペプチド生成または安定化、あるいは遺伝子発現レ
ベルを検出するための任意の適切な手段が、本発明の診断目的のために適用され
得る。適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載される。

【００５２】 標準的分析方法により、リガンド結合に応答した細胞による活性の検出が可能
である。例えば、ＡＰＢＦヘテロマーの調製は、細胞増殖、分化およびアポトー
シスの分析において有用である。このようにして多くの細胞型が標準的方法（例
えば、放射活性チミジン組み込み、細胞周期分析、およびＭＴＴ取り込みおよび
変換（Ｃｅｌｉｓら，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ（１９９７）に詳述）を用いて迅速にスクリーニングされ得る。活性を
評価するために用いられ得る分析の１つの方法としては、例えば、核因子κＢ転
写因子（ＮＦκＢ）またはｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のタンパク質
リン酸化分析（例えば、Ｍａｃｋａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２
４９３４−２４９３８（１９９６）；Ｗｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２：２５１９０−２５１９４（１９９７））が挙げられる。他の容易に利用し
やすいアッセイとしては、サイトカイン分泌の測定（例えば、ＩＬ−８：Ｃｈｉ
ｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２４０１−３
２４１０（１９９７））、カルシウムフラックス、ｐＨ変化、細胞／細胞接着な
ど（参考文献あり）が挙げられる。

【００５３】 これらの読み出しに加えて、アップレギュレートされた遺伝子またはダウンレ
ギュレートされた遺伝子の分析は、例えば、ノザンブロット、標的化アレイ、ま
たは遺伝子アレイ分析（例えば、Ｔｅａｇｕｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１２６９１−１２６９６（１９９９）；Ｌｏｃｋｈ
ａｒｔら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５−１６８０（１９９
６））により容易に行われる。このような差示的遺伝子発現研究により、リガン
ド活性に応答する遺伝子の特定のセットが同定され、そしてリガンド機能の詳細
なプロフィールが提供され得る（Ｊｉａｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１：１１
７９−１１８９（１９９５））。細胞増殖の変更因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（例
えば、とりわけ、成長ホルモンレセプター遺伝子、転写因子、タンパク質が細胞
死を誘導またはブロックする遺伝子、および細胞周期メディエーター）は、この
ような分析に特に感受性である。

【００５４】 本発明は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害の診
断または処置に有用である。このような障害としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：細胞障害（例えば、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、
乳癌、肉腫、卵巣癌腫、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫
、肺癌、乳腺腫、咽頭扁平上皮癌、および胃腸癌または胃癌）が挙げられるが、
これらに限定されない癌。さらに、本発明は、腫瘍とはみなされない増殖状態（
すなわち、細胞過剰増殖（過形成））の処置に有用である。これらの増殖状態と
しては、以下が挙げられる：例えば、強皮症、慢性関節リウマチにおけるパンヌ
ス形成、術後瘢痕化、ならびに肺、肝臓および子宮の繊維症。さらに、本発明は
、免疫欠損、炎症性疾患、リンパ節症、自己免疫疾患、および対宿主性移植片病
の処置に有用である。

【００５５】 １つの実施形態において、個体における通常レベルのＡＰＢＦ活性の低下によ
り引き起こされる状態は、ＡＰＢＦまたはＡＰＢＦに対するアゴニストの投与に
より処置され得る。ここで、ＡＰＢＦに対するアゴニストとは、機能を強化する
任意の天然組成物または合成組成物をいう。ここで、機能とは、任意の公知のイ
ンビトロまたはインビボアッセイにおいて測定される、細胞、組織または器官と
のＡＰＢＦ相互作用の任意の測定可能な効果をいう。この効果は、ＡＰＢＦによ
り媒介される。１つの実施形態において、ＡＰＢＦは、可溶性形態である。本発
明はまた、個体における通常レベルのＡＰＢＦ活性の上昇により引き起こされる
障害をＡＰＢＦに対するアンタゴニストの投与により処置する方法を提供する。
ここで、ＡＰＢＦに対するアンタゴニストとは、機能をブロックする任意の天然
組成物または合成組成物をいう。ここで機能とは、任意の公知のインビトロまた
はインビボアッセイにおいて測定される、細胞、組織または器官とのＡＰＢＦ相
互作用の任意の測定可能な効果をいう。この効果は、ＡＰＢＦヘテロマーにより
媒介される。

【００５６】 本発明の薬学的組成物は、治療的に有効な量のＡＰＢＦ、またはそのレセプタ
ー、またはそのフラグメントもしくは模倣物を含み得、そして必要に応じて、薬
学的に受容可能なキャリアを含み得る。従って、本発明は、癌の処置のための方
法、および免疫系を刺激する方法、特定の場合においては、免疫系またはその一
部を阻害する方法、本発明の化合物またはその薬学的に受容可能な塩もしくは誘
導体の薬学的に有効な量を投与することにより提供する。特定の好ましい実施形
態において、本発明は、Ｂ細胞増殖、Ｔ細胞増殖または腫瘍細胞増殖を、治療的
に有効な量の単離されたＡＰＢＦポリペプチドもしくはその活性フラグメント、
または組換えＡＰＢＦ分子もしくはその活性フラグメント、またはＡＢＰＦもし
くはその活性フラグメントに特異的な抗体を投与することにより阻害するための
方法に関する。本発明の状況において、「阻害」は、活性（細胞死（アポトーシ
ス）の誘導を含む）を低下または改善するための任意かつすべての機構に関する
。当然のことながら、本発明の組成物および方法は、種々の処置のための他の治
療と組み合わせて用いられ得ることが理解されるべきである。

【００５７】 この組成物は、種々の投与経路（全身投与、局所的投与または局部投与を含む
）のために処方され得る。全身投与については、注射が好ましく（注射について
は筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下が挙げられる）、本発明の組成物は、好
ましくは生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液またはリンゲル溶液
）で液体溶液に処方され得る。さらに、この組成物は、固体形態に処方され得、
必要に応じて、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた、本
発明に含まれ得る。

【００５８】 この組成物は、経口投与してもよく、または経粘膜もしくは経皮手段でも投与
できる。経粘膜投与または経皮投与のためには、浸透されるべきバリアに適切な
浸透剤が処方物中に用いられる。このような浸透剤は、当該分野で公知であり、
そして例えば、経粘膜投与のために、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体、および界面
活性剤を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーを通じてまたは座剤を用いて行われ
得る。経口投与については、この組成物は、従来の経口投与形態（例えば、カプ
セル、錠剤、およびトニック）中に処方される。局所投与のために、本発明の組
成物は、当該分野で公知のように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ、ｓａｌｖｅ）、ゲ
ル、またはクリーム中に処方される。

【００５９】 用量および投与レジメンは、疾患のタイプ、患者および患者の病歴に依存する
。１つの実施形態において、この疾患は癌である。この量は、疾患の進行を処置
、抑制、または変更するのに有効でなければならない。この用量は、単回用量で
も、複数用量であってもよい。複数用量を使用する場合、好ましくは、投与の頻
度は、例えば、宿主のタイプおよび疾患のタイプ、投薬量などに依存する。いく
つかのタイプの癌または癌細胞について、毎日の投与が有効であるが、他の場合
は、１日おきまたは３日ごとの投与が有効である。一回の処置においてまたは処
置の経過にわたって投与される活性な化合物の量は、多くの因子に依存する（例
えば、被験体の年齢およびサイズ、処置されている疾患の重篤度および経過、投
与の様式および形態、ならびに処置している医師の判断）。しかし、有効用量は
、約０．００５〜約５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．０５〜約０．５ｍｇ／
ｋｇ／日の範囲であり得る。最も有効な投与量は、腫瘍の出現を生じないか、ま
たは腫瘍の完全な後退（退縮）を生じ、かつ患者に毒性でない投与量である。当
業者は、より少ない用量およびより高用量もまた有用であり得ることを認識する
。

【００６０】 （実施例） （実施例１） 本実施例は、哺乳動物細胞への同時トランスフェクション後の、免疫沈降によ
るＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦヘテロマーの検出を記載する。

【００６１】 （方法） ＦＬＡＧ標的化ヒト可溶性ＡＰＲＩＬをコードするプラスミド（Ａ１０５（Ｌ
Ｔ０３３）またはＫ１１０（ＰＬ４４８）残基で開始）、可溶性ＦＬＡＧ標的化
ヒトＴＷＥＡＫ（Ａ１０６（ＰＳ２８８）で開始）、または可溶性ＦＬＡＧ標的
化ヒトＥＤＡ（Ａ２４２（ＰＳ５４８）で開始）、または空のベクター（ＣＨ２
６９）を、全長ヒトＢＡＦＦ構築物（ＰＳ５４４）とともに、リポフェクタミン
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、２９３Ｔ細胞へ同時トラン
スフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、順化培地を回収し、そし
て免疫沈降実験のために用いた。免疫沈降サンプルは、２００μｌの順化培地、
５μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）および８００μｌのＤＭＥＭ
（１０％ＦＣＳ含有）、グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ，Ｇ４１８およびアジ
化ナトリウムを含み、そしてこれを攪拌しながら４℃で１時間インキュベートし
た。次いで、３０μｌのプロテインＡ−セファロース（ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をサンプルに添加し、そしてこ
の混合物を攪拌しながら４℃で１晩インキュベートした。このビーズを遠心分離
によって回収し、次いで上記のＤＭＥＭ培地で１回、次いでＰＢＳで３回洗浄し
た。次いで、ビーズを含有する最終ペレットを２×ＳＤＳ非還元サンプル緩衝液
中に懸濁し、そして５分間煮沸した。このビーズを沈殿させて、２５μｌの上清
を４〜２０％の２分離ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上にロードした
。リガンド発現のレベルを検討するため、同時トランスフェクト細胞由来の免疫
沈降しなかった順化培地もロードした。これらのサンプルを２×非還元サンプル
緩衝液で２倍に希釈し、２分間煮沸し、次いで２５μｌを各レーンにロードした
。各ゲルは、１セットの免疫沈澱物および１セットの非免疫沈降順化培地を含ん
だ。ＢｉｏＲａｄ装置を用いてゲルをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）フィルターに転写した後、このフィルターを５％脱脂粉乳（ＴＢＳＴに希釈）
中で室温で１時間ブロックした。次いでこのフィルターを分離し、そして１つを
５μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体とともに、Ｍ２および他を、１μｇ／
ｍｌの抗ヒトＢＡＦＦ抗体５３．１４（ラット ＩｇＭ）とともに室温で約１時
間インキュベートした。このフィルターをＴＢＳＴを３回交換して洗浄し、次い
で１：３０００希釈のストレプトアビジンーＨＲＰまたは抗ラットＩｇＭ−ＨＲ
Ｐ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）中で室温で３０分間イン
キュベートした。このフィルターを、再度３回洗浄し、次いでＥＣＬ試薬（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。このフィルターを異なる時間、Ｘ線フィルム
に曝露した。

【００６２】 同時発現実験の結果を図３に示す。パネルＡのレーン１〜５は、種々のヒト可
溶性ＴＮＦファミリーリガンドおよびヒト全長ＢＡＦＦコードプラスミドで同時
トランスフェクトした細胞由来の順化培地そのままのウエスタンブロットを示す
。パネルＡのレーン７〜１２は、抗ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降後の上清そのまま
のウエスタンブロットを示す。パネルＡで用いた検出試薬は、抗ＦＬＡＧ抗体で
ある。レーン１：ＦＬＡＧ標的化ヒト可溶性ＡＰＲＩＬ Ａ１０５（残基Ａ１０
５で開始）＋ヒト全長ＢＡＦＦ；レーン２：ＦＬＡＧ標的化ヒト可溶性ＡＰＲＩ
Ｌ Ｋ１１０（残基Ｋ１１０で開始）＋ヒト全長ＢＡＦＦ；レーン３：ＦＬＡＧ
標的化ヒト可溶性ＴＷＥＡＫ＋ヒト全長ＢＡＦＦ；レーン４：ＦＬＡＧ−標的化
ヒトＥＤＡ＋ヒト全長ＢＡＦＦ；レーン５：空のコントロールベクター；レーン
６：１８５ｋＤａ、１１９ｋＤａ、８５ｋＤａ、６２ｋＤａ、５１ｋＤａ、３８
．２ｋＤａ、２６．０ｋＤａ、２０．２ｋＤａ、１４．５ｋＤａ、９．１ｋＤａ
の分子量標準（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；レ
ーン７〜１１は、それぞれ、抗ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降後のレーン１〜５に相
当する；レーン１２：精製ヒトＦＬＡＧ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６，５ｎｇ。

【００６３】 パネルＢのレーン１〜５は、種々のＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦコードプラスミ
ドで同時トランスフェクトした細胞由来の上清そのままのウエスタンブロットを
示す。検出試薬は、抗ＢＡＦＦ抗体である。パネルＢのレーン７〜１１は、細胞
を種々のＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦコードプラスミドで同時トランスフェクトし
、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した、免疫沈降のウエスタンブロットを示す。検出
試薬は、抗ＢＡＦＦ抗体である。レーン１：ＦＬＡＧ標的化ヒト可溶性ＡＰＲＩ
Ｌ Ａ１０５（残基Ａ１０５で開始）＋ヒト全長ＢＡＦＦ；レーン２：ＦＬＡＧ
標的化ヒト可溶性ＡＰＲＩＬ Ｋ１１０（残基Ｋ１１０で開始）＋ヒト全長ＢＡ
ＦＦ；レーン３：ＦＬＡＧ標的化ヒト可溶性ＴＷＥＡＫ Ａ１０６＋ヒト全長Ｂ
ＡＦＦ；レーン４：ＦＬＡＧ−標的化ヒトＥＤＡ Ａ２４２＋ヒト全長ＢＡＦＦ
；レーン５：空のコントロールベクター；レーン６：１８５ｋＤａ、１１９ｋＤ
ａ、８５ｋＤａ、６２ｋＤａ、５１ｋＤａ、３８．２ｋＤａ、２６．０ｋＤａ、
２０．２ｋＤａ、１４．５ｋＤａ、９．１ｋＤａの分子量標準（Ｂｅｎｃｈｍａ
ｒｋ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；レーン７〜１１は、それぞれ、抗
ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降後のレーン１〜５に相当する；レーン１２：精製ヒト
ＦＬＡＧ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６，５ｎｇ。

【００６４】 パネルＡにおいて、抗ＦＬＡＧ抗体、Ｍ２での検出は、ＦＬＡＧ−エピトープ
標的化可溶性リガンドの全てが発現され、トランスフェクション細胞の細胞培養
中に分泌されることを示す。レーン１および２に示される２つのＡＰＲＩＬ構築
物は、ＴＷＥＡＫ（レーン３）またはＥＤＡ（レーン４）の約５分の１で発現さ
れる。コントロールベクターのレーンであるレーン５ではタンパク質は見えない
。レーン７〜１１は、免疫沈降した後のＦＬＡＧ標的化タンパク質を示す。ここ
で、両方のＡＰＲＩＬタンパク質（レーン７および８）、ＴＷＥＡＫ（レーン９
）およびＥＤＡ（レーン１０）を沈殿させ、そしてＭ２で検出する。レーン１２
は、標準としての約５ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＦＦである。

【００６５】 パネルＢにおいて、レーン１〜５は、同時トランスフェクトした細胞培養培地
でのＢＡＦＦの検出を示す。ＢＡＦＦは、ＦＬＡＧ−エピトープ標的化可溶性リ
ガンドの全てと組み合わせて発現され、そしてＡＰＲＩＬ同時トランスフェクシ
ョンにおいてわずかに高い（レーン１および２）。パネルＢのブロットの右側は
、抗ＢＡＦＦ抗体５３．１４で検出されたＭ２免疫沈降である。ここで、ＢＡＦ
Ｆは、ＡＰＲＩＬと組み合わせてのみ免疫沈降され（レーン７および８）、そし
てＴＷＥＡＫまたはＥＤＡでは免疫沈降されない。レーン１２における標準は、
２９３Ｔ細胞で発現された可溶性ＦＬＡＧ−ＢＡＦＦ分子のサイズを示す。これ
は天然に切断される分子のおよその分子量である。これは、ＢＡＦＦおよびＡＰ
ＲＩＬがヘテロマー複合体を形成することを実証する。同時免疫沈降はまた、１
Ｍ ＮａＣｌの存在下で評価され、そして結果は同じである。

【００６６】 （実施例２） 本実施例は、哺乳動物細胞への２つの可溶性構築物の同時トランスフェクショ
ン後の免疫沈降によるＡＰＢＦヘテロマーの検出を記載している。

【００６７】 方法： 以下のヒト可溶性ＴＮＦファミリーリガンドをコードするプラスミドを、ＰＣ
Ｒ３ベースの哺乳動物細胞発現ベクターで示されたリガンドアミノ酸残基で開始
する示されたＮ末端エピトープタグを用いて構築した：ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬ（
残基Ａ１０５（プラスミド＃ＬＴ０３３）、またはＨ１１５（プラスミド＃ＬＴ
０３８）で開始）、ＦＬＡＧ−ＴＷＥＡＫ Ａ１０６（プラスミド＃ＰＳ２８８
）、ｍｙｃ−ＡＰＲＩＬ Ａ１０５（プラスミド＃ＪＳＴ５５７）、およびｍｙ
ｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６（プラスミド＃ＪＳＴ５５６）。ＦＬＡＧ標的化リガン
ドをコードする種々の構築物、全長マウスＡＰＲＩＬ（プラスミド＃ＬＴ０２２
）、または空のベクターコントロール（プラスミド＃ＣＨ２６９）を、リポフェ
クタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）を用いて、ｍｙｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６構築物とともに２９３Ｔ細胞中に
それぞれ、同時トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、順
化培地を回収して、免疫沈降実験に用いた。免疫沈降サンプルは、１００μｌの
順化培地、５μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ
，ＭＯ）および９００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ含有）、グルタミン、Ｐｅ
ｎ−Ｓｔｒｅｐ，Ｇ４１８およびアジ化ナトリウムを含み、そしてこれを攪拌し
ながら４℃で１時間インキュベートした。次いで、３０μｌのプロテインＡ−セ
ファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ，ＮＪ）をサンプルに添加し、そしてこの混合物を攪拌しながら４℃で１晩
インキュベートした。このビーズを遠心分離によって回収し、次いで上記のＤＭ
ＥＭ培地で１回、次いでＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ビーズを含有する最終
ペレットを２×ＳＤＳ非還元サンプル緩衝液中に懸濁し、そして５分間煮沸した
。このビーズを沈殿させて、２５μｌの上清を４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾
配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上にロードした。ＢｉｏＲａ
ｄ装置を用いてゲルをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ，ＭＡ）に転写した後、このフィルターを５％脱脂粉乳（ＴＢＳＴに希釈）中
で室温で１時間ブロックした。次いでこのフィルターを１μｇ／ｍｌの抗ｍｙｃ
抗体９Ｅ１０とともにインキュベートした。このフィルターをＴＢＳＴを３回交
換して洗浄し、次いで１：３０００希釈の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）中で室温
で３０分間インキュベートした。このフィルターを、再度３回洗浄し、次いでＥ
ＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
Ｊ）を用いて検出した。このフィルターを異なる時間、Ｘ線フィルムに曝露した
。

【００６８】 図４に示す結果は、種々の可溶性ＡＰＲＩＬおよび可溶性ＢＡＦＦタンパク質
をコードするプラスミドで同時トランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ標的化抗体で免
疫沈降した、細胞由来の順化培地の免疫沈降のウエスタンブロットを示す。ウエ
スタンブロットのための検出試薬は、抗ｍｙｃ抗体、９Ｅ１０である。

【００６９】 レーン１〜６は、種々のヒト可溶性ＴＮＦファミリーリガンドおよびヒト可溶
性ｍｙｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６をコードするプラスミドで同時トランスフェクト
した細胞由来の順化培地そのままのウエスタンブロットを示す。レーン７は分子
量マーカーである。レーン８〜１２は、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した後の順化
培地のウエスタンブロットを示す。検出試薬は、抗ＭＹＣ抗体、９Ｅ１０を用い
た。レーン１：ＦＬＡＧ標的化ヒト可溶性ＴＷＥＡＫ Ａ１０６＋ヒト可溶性ｍ
ｙｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６；レーン２：ＦＬＡＧ標的化ヒト可溶性ＡＰＲＩＬ
Ｈ１１５＋ヒト可溶性ｍｙｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６；レーン３：ＭＹＣ−標的化
ヒト可溶性ＡＰＲＩＬ Ａ１０５＋ヒト可溶性ｍｙｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６；レ
ーン４：ＦＬＡＧ−標的化ヒト可溶性ＡＰＲＩＬ Ａ１０５＋ヒト可溶性ｍｙｃ
−ＢＡＦＦ Ｑ１３６；レーン５：全長マウスＡＰＲＩＬ＋ヒト可溶性ｍｙｃ−
ＢＡＦＦ Ｑ１３６；レーン６：空のコントロールベクター＋ヒト可溶性ｍｙｃ
−ＢＡＦＦ Ｑ１３６；レーン７：３８．２ｋＤａ、２６．０ｋＤａ、２０．２
ｋＤａ、１４．５ｋＤａの分子量標準（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、ＬｉｆｅＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）；レーン８〜１２は、それぞれ、抗ＦＬＡＧ抗体での免疫沈
降後のレーン１〜５に相当する。

【００７０】 レーン１〜６において、抗ＭＹＣ抗体９Ｅ１０で検出されたような順化培地の
ウエスタンブロットは、全ての同時トランスフェクトした２９３Ｔ細胞が、ＦＬ
ＡＧ−ＴＷＥＡＫ＋ｍｙｃ−Ｂａｆｆ Ｑ１３６（レーン１）（これは、有意に
低量のｍｙｃ−ＢＡＦＦを示す）を除いて、ほぼ等量でｍｙｃ−Ｂａｆｆ Ｑ１
３６を発現し細胞培養培地中に分泌することを示す。レーン８〜１２は、抗ＦＬ
ＡＧ抗体での順化培地の免疫沈降に続く抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０でのウエスタンブ
ロット上の検出を示す。レーン１０および１２は、それぞれ、ｍｙｃ−ＡＰＲＩ
Ｌ Ａ１０５または全長マウスＡＰＲＩＬで同時トランスフェクトしたｍｙｃ−
ＢＡＦＦの順化培地を示し、そしてこれはネガティブコントロールとして働く（
すなわち、いずれのＡＰＲＩＬ構築物もｆｌａｇエピトープを含まず、従って抗
ｆｌａｇ抗体で免疫沈降されない）。ＦＬＡＧ−ＴＷＥＡＫ同時トランスフェク
ションは、ｍｙｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６に相当するバンドを、過剰曝露でさえも
、示さず、従ってＭＹＣ−ＢＡＦＦと相互作用しない。レーン９および１１のみ
（それぞれ、ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬ分子Ｈ１１５およびＡ１０５で同時発現され
たｍｙｃ−Ｂａｆｆ Ｑ１３６を含む）は、抗ＦＬＡＧ免疫沈降後のｍｙｃ−ｂ
ａｆｆバンドを示す。約１８ｋＤａのバンド（ｍｙｃ−ＢＡＦＦ Ｑ１３６の予
想されるサイズ）が各レーンで観察される。ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬ Ａ８７で同
時発現されたバンド（レーン３）の強度は、ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬ Ｈ９７で同
時発現されたもの（レーン４）より大きい。これは、可溶性ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩ
Ｌリガンドのみが可溶性ＭＹＣ−ＢＡＦＦと相互作用して、ヘテロマー複合体を
形成し得ることを示す。

【００７１】 このことは、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの可溶性形態がヘテロマー複合体を形
成する能力を有すること、ならびに細胞会合形態はヘテロマー形成のためには必
要とされないようであることを実証する。

【００７２】 （実施例３：親和性方法によるＡＰＢＦの生成および単離） 以下のヒト可溶性ＴＮＦファミリーリガンドをコードするプラスミドをＮ末端
ＦＬＡＧまたは６×Ｈｉｓエピトープタグ（哺乳動物細胞発現ベクターに基づく
ＰＣＲ３に示されるアミノ酸残基で開始する）で構築した：ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩ
Ｌ（残基Ａ８７（プラスミド ＬＴ０３３）で開始する）およびＲＧＳ（Ｈ）６
−ＢＡＦＦ Ｑ１３４。次いで、これらのプラスミドを、リポフェクタミン（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用い
て、２９３Ｔ細胞中に、同時トランスフェクトし、トランスフェクション後４８
時間で、順化培地を回収する。順化培地を、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ８
．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ：１０ｍＭ イミダゾールに対して透析して、Ｎｉ
−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ
）に流す。６×Ｈｉｓタグ化ＢＡＦＦサブユニットを含むホモマーおよびヘテロ
マーは、Ｎｉカラムに結合し；ホモマー性ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬ分子は流出する
。このカラムを５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ
：２０ｍＭ イミダゾール（カラム容量の５〜１０倍）で洗浄する。このカラム
をカラム容積の５倍の５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ８．０；３００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ：２５０ｍＭ イミダゾールで溶出する。溶出した物質は、ＲＧＳ（Ｈ）
６−ＢＡＦＦ Ｑ１３４ホモマーおよびヘテロマー（ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬを有
する）を含む。この溶出した物質を、Ｍ１またはＭ２抗ＦＬＡＧ Ａｂアフィニ
ティーカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に供する。１５０ｍＭ
ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０の緩衝液交換を実施し、そしてＭ１
カラム（このＡｂは結合にＣａを要する）を用いる場合は、２ｍＭ ＣａＣｌ_２ に緩衝液を調節する。このカラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．０（Ｍ１については２ｍＭのＣａＣｌ_２を含有する）で洗浄する。Ｍ
１カラムを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０−２ｍＭ
ＥＤＴＡを用いて３０分間インキュベートすることにより、続いて１５０ｍＭ
ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０−２ｍＭ ＥＤＴＡのアリコート
によって１０分間のインキュベーションを６回行うことによって、このカラムを
溶出する。あるいは、Ｍ１カラムおよびＭ２カラムの両方を、ＦＬＡＧペプチド
との競合によって溶出させ得る。この溶出は、このカラムを完全に流出させるこ
と、および１カラム容積での５回（それぞれ１５０ｍＭ ＮａＣｌ−５０ｍＭ
ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０（１００μｇ／ｍｌ ＦＡＬＧペプ
チド含有））で溶出することによる。溶出された物質は、ネイティブのＦＬＡＧ
−ＡＰＲＩＬ：：ＲＧＳ（Ｈ）６−ＢＡＦＦ Ｑ１３４ヘテロマーのみを含む。

【００７３】 あるいは、上記のように、全長または非標的可溶性ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦ
構築物をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞株または細胞を、Ａ
ＰＲＩＬおよびＢＡＦＦの細胞外ドメインの領域に対して惹起された抗ペプチド
抗体とのＡＰＢＦ複合体を単離するための供給源として用い得る。これらの抗体
を、従来の手段で樹脂に結合させ得る。このような細胞の順化培地または細胞抽
出物を、まずリガンドの１つに対する結合抗体（例えば、抗ＢＡＦＦ抗体）を含
むカラムに流す。この場合、ＢＡＦＦサブユニットを含むホモマーおよびヘテロ
マーのみが抗ＢＡＦＦカラムに結合し；ヘテロマー性ＡＰＲＩＬ分子は流出する
。１５０ｍＭ ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０中でカラムを洗浄し
た後、結合した分子は、抗ＢＡＦＦ抗体を惹起するために用いた同じＢＡＦＦペ
プチドとの競合によって溶出され得る。この溶出は、このカラムを完全に流出さ
せること、および１カラム容積での５回（それぞれ１５０ｍＭ ＮａＣｌ−５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０（１００μｇ／ｍｌ以上のペプチド含有））で溶出
することによる。溶出した物質を、透析して、ペプチドを取り出し得、次いで他
のリガンド（この例では、ＡＰＲＩＬ）に対して惹起された抗ペプチド抗体を含
むカラムに同様に流す。この場合、ホモマーＢＡＦＦ分子は、カラムに結合せず
に、流出する。残りのＡＰＢＦヘテロマーのみが抗ＢＡＦＦカラムに結合する。
これらのＡＰＢＦヘテロマーは、抗ＡＰＲＩＬ抗体を生成するために用いた同じ
ＡＰＲＩＬペプチドとの競合によって同様に溶出され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】 図１ａは、ヒトＡＰＲＩＬのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定膜貫通
領域（ＴＭ、枠内）、潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位（星印）および組換え可
溶性ＡＰＲＩＬ配列のＮ末端が示される。

【図１ｂ】 図１ｂは、ヒトＡＰＲＩＬをコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号１（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．１））。

【図１ｃ】 図１ｃは、ヒトＡＰＲＩＬのアミノ酸配列を示す（配列番号２）。

【図１ｄ】 図１ｄは、マウスＡＰＲＩＬをコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。

【図１ｅ】 図１ｅは、マウスＡＰＲＩＬのアミノ酸配列を示す（配列番号４）。

【図２ａ】 図２ａは、ヒトＢＡＦＦをコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号５）。

【図２ｂ】 図２ｂは、ヒトＢＡＦＦのアミノ酸配列を示す（配列番号６）。配列番号６由
来のアミノ酸１〜４６は、細胞内ドメインを表し、配列番号６由来のアミノ酸４
７〜７２は膜貫通ドメインを表し、そして配列番号６由来のアミノ酸７３〜２８
５は、細胞外ドメインを表す。

【図２ｃ】 図２ｃは、マウスＢＡＦＦをコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号７）。こ
の配列を図２ｃから図２ｄに渡り、示す。

【図２ｄ】 図２ｄは、マウスＢＡＦＦのアミノ酸配列を示す（配列番号８）。

【図３】 図３ａおよび３ｂは、種々のＡＰＲＩＬコードプラスミドおよびＢＡＦＦコー
ドプラスミドで同時トランスフェクトされた細胞由来の２つのウエスタンブロッ
トの比較を示す。図３ａで使用された検出試薬は抗ＦＬＡＧ抗体である。図３ｂ
において使用される検出試薬は、抗ＢＡＦＦ抗体である。

【図４】 図４は、種々の可溶性ＡＰＲＩＬおよび可溶性ＢＡＦＦタンパク質をコードす
るプラスミドで同時トランスフェクトされた細胞由来の、抗ＦＬＡＧタグ化抗体
で免疫沈降された馴化培地の免疫沈降のウエスタンブロットを示す。このウエス
タンブロットの検出試薬は、抗ｍｙｃタグ化抗体である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 15/00 11/00 17/00 15/00 17/02 17/00 19/02 17/02 19/04 19/02 29/00 19/04 １０１ 29/00 35/00 １０１ 37/02 35/00 37/04 37/02 37/06 37/04 43/00 １０５ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/525 ＺＮＡ 43/00 １０５ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/525 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 トンプソン， ジェフリー エス． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02180， ストーナム， ニューコーム ロード 60 (72)発明者 アンブローズ， クリスティン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01867， レディング， ウェイクフィー ルド ストリート 197 (72)発明者 カチェーロ， テレーサ ヘー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02446， ブルックライン， ロングウッ ド アベニュー 105 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA28 CA04 CA07 CA09 DA03 EA04 GA13 HA01 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA02 BA08 BA13 BA22 CA18 CA23 CA53 DA25 DA58 NA14 ZA36 ZA59 ZA75 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB08 ZB09 ZB15 ZB21 ZB26 4C085 AA13 AA14 BB11 BB17 CC02 CC04 CC05 CC07 CC08 CC21 CC31 DD23 DD62 DD63 EE01 FF20 4H045 AA10 AA30 BA10 BA40 CA40 DA14 EA28

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非共有結合性の相互作用を介してＢＡＦＦサブユニットに連
   結されたＡＰＲＩＬサブユニットを含む、単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 単離されたポリペプチドであって、以下： ａ）以下からなる群より選択される、ＡＰＲＩＬサブユニット： ｉ）部分的なヒトＡＰＲＩＬ（配列番号２）、ヒトＡＰＲＩＬ（配列番号２
   ）、部分的なマウスＡＰＲＩＬ（配列番号４）、およびマウスＡＰＲＩＬ（配列
   番号４）、または ｉｉ）部分的なヒトＡＰＲＩＬ（配列番号２）、ヒトＡＰＲＩＬ（配列番号
   ２）、部分的なマウスＡＰＲＩＬ（配列番号４）、およびマウスＡＰＲＩＬ（配
   列番号４）のアミノ酸置換改変体；および ｂ）以下からなる群より選択される、ＢＡＦＦサブユニット： ｉ）部分的なヒトＢＡＦＦ（配列番号６）、ヒトＢＡＦＦ（配列番号６）、
   部分的なマウスＢＡＦＦ（配列番号８）、およびマウスＢＡＦＦ（配列番号８）
   、または ｉｉ）部分的なヒトＢＡＦＦ（配列番号６）、ヒトＢＡＦＦ（配列番号６）
   、部分的なマウスＢＡＦＦ（配列番号８）、およびマウスＢＡＦＦ（配列番号８
   ）のアミノ酸置換改変体 を含み、該ＡＰＲＩＬサブユニットは、該ＢＡＦＦサブユニットに非共有結合性
   の相互作用を介して連結される、単離されたポリペプチド。
3. 【請求項３】 単離されたポリペプチドであって、以下： ａ）哺乳動物ＤＮＡによってコードされるＡＰＲＩＬサブユニットのアミノ酸配
   列を含むＡＰＲＩＬサブユニットであって、該哺乳動物ＤＮＡは、高ストリンジ
   ェンシーの条件下で、以下からなる群より選択されるＡＰＲＩＬヌクレオチド配
   列の相補体の配列を有するプローブとハイブリダイズする、ＡＰＲＩＬサブユニ
   ット： ｉ）部分的なヒトＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡ（配列番号１）、ヒトＡＰＲＩＬ
   ｃＤＮＡ（配列番号１）、部分的なマウスＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡ（配列番号３）
   、およびマウスＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡ（配列番号３）、または ｉｉ）部分的なヒトＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡ（配列番号１）、ヒトＡＰＲＩＬ
   ｃＤＮＡ（配列番号１）、部分的なマウスＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡ（配列番号３
   ）、およびマウスＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡ（配列番号３）から選択される配列の縮
   重改変体；および ｂ）哺乳動物ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含むＢＡＦＦサブユニ
   ットであって、該哺乳動物ＤＮＡは、高ストリンジェンシーの条件下で、以下か
   らなる群より選択されるＢＡＦＦヌクレオチド配列の相補体の配列を有するプロ
   ーブにハイブリダイズする、ＢＡＦＦサブユニット： ｉ）部分的なヒトＢＡＦＦ ｃＤＮＡ（配列番号５）、ヒトＢＡＦＦ ｃＤ
   ＮＡ（配列番号５）、部分的なマウスＢＡＦＦ ｃＤＮＡ（配列番号７）、およ
   びマウスＢＡＦＦ ｃＤＮＡ（配列番号７）、または ｉｉ）部分的なヒトＢＡＦＦ ｃＤＮＡ（配列番号５）、ヒトＢＡＦＦ ｃ
   ＤＮＡ（配列番号５）、部分的なマウスＢＡＦＦ ｃＤＮＡ（配列番号７）、お
   よびマウスＢＡＦＦ ｃＤＮＡ（配列番号７）から選択される配列の縮重改変体
   を含み、該ＡＰＲＩＬサブユニットは、該ＢＡＦＦサブユニットに非共有結合性
   の相互作用を介して連結される、単離されたポリペプチド。
4. 【請求項４】 ＢＡＦＦサブユニットに非共有結合的に連結された、１つよ
   り多いＡＰＲＩＬサブユニットをさらに含む、請求項１および請求項２に記載の
   単離されたポリペプチド。
5. 【請求項５】 ２つのＡＰＲＩＬサブユニットが、ＢＡＦＦサブユニットに
   非共有結合的に連結されている、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
6. 【請求項６】 ＡＰＲＩＬサブユニットに非共有結合的に連結された、１つ
   より多いＢＡＦＦサブユニットをさらに含む、請求項１に記載の単離されたポリ
   ペプチド。
7. 【請求項７】 ２つのＢＡＦＦサブユニットが、ＡＰＲＩＬサブユニットに
   非共有結合的に連結される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
8. 【請求項８】 動物におけるＢ細胞の増殖を阻害する方法であって、以下か
   らなる群より選択される治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法： （ａ）単離されたＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント； （ｂ）組換えＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント；および （ｃ）ＡＰＢＦに特異的な抗体、またはその活性フラグメント。
9. 【請求項９】 動物におけるＴ細胞の増殖を阻害する方法であって、以下か
   らなる群より選択される治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法： （ａ）単離されたＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント； （ｂ）組換えＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント；および （ｃ）ＡＰＢＦに特異的な抗体、またはその活性フラグメント。
10. 【請求項１０】 動物における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、以
    下からなる群より選択される治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方
    法： （ａ）単離されたＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント； （ｂ）組換えＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント；および （ｃ）ＡＰＢＦに特異的な抗体、またはその活性フラグメント。
11. 【請求項１１】 動物におけるＢ細胞の増殖を刺激する方法であって、以下
    からなる群より選択される治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法
    ： （ａ）単離されたＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント； （ｂ）組換えＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント；および （ｃ）ＡＰＢＦに特異的な抗体、またはその活性フラグメント。
12. 【請求項１２】 動物におけるＴ細胞の増殖を刺激する方法であって、以下
    からなる群より選択される治療有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法
    ： （ａ）単離されたＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント； （ｂ）組換えＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント；および （ｃ）ＡＰＢＦに特異的な抗体、またはその活性フラグメント。
13. 【請求項１３】 前記ＡＰＢＦポリペプチドが可溶性である、請求項１また
    は請求項２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 治療有効量の単離されたＡＰＢＦポリペプチドまたはその
    フラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
15. 【請求項１５】 所望されない細胞増殖に関連する状態について哺乳動物を
    治療的に処置する方法であって、該方法が、薬学的に受容可能な賦形剤とともに
    ＡＰＢＦアンタゴニストを含む治療有効量の組成物を哺乳動物に投与する工程を
    包含する、方法。
16. 【請求項１６】 哺乳動物における非Ｂ細胞の増殖を阻害する方法であって
    、以下からなる群より選択される治療有効量の組成物を投与する工程を包含する
    、方法： （ａ）単離されたＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント； （ｂ）組換えＡＰＢＦ分子、またはその活性フラグメント；および （ｃ）ＡＰＢＦに特異的な抗体、またはその活性フラグメント。