JP2002542771A - ヒト腫瘍壊死因子レセプターｔｒ９ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍壊死因子ファミリーのレセプターの新規なメンバーに関する。詳細には、ヒトＴＲ９レセプターをコードする単離された核酸分子が、提供される。ＴＲ９ポリペプチドもまた、提供される。同様に、ＴＲ９ポリペプチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、および組換え方法も、提供される。本発明はさらに、ＴＲ９レセプター活性のアゴニストを同定するためのスクリーニング方法、およびＴＲ９レセプター活性のアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、腫瘍壊死因子ファミリーのレセプターの新規なメンバーに関連する
。より詳細には、新規ヒト腫瘍壊死因子レセプターＴＲ９（デスドメイン含有レ
セプター６（Ｄｅａｔｈ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ６）または単純にＤＲ６としてもまた公知）をコードする単離された核酸
分子を提供する。ＴＲ９ポリペプチドもまた提供され、ベクター、宿主細胞、お
よびこれらを作製するための組換え方法が同様に提供される。さらに本発明はＴ
Ｒ９レセプターポリペプチド活性の阻害および増強の両方、ならびにＴＲ９レセ
プター遺伝子発現を検出する診断方法に関する。本発明はさらに、ＴＲ９活性の
アゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する
。

【０００２】 （発明の背景） 多くの生物学的作用（例えば、特定の刺激および天然の生物学的プロセスに対
する応答）は、サイトカインのような因子により制御される。多くのサイトカイ
ンは、レセプターと連動し、そして細胞内応答を生じることによりレセプターを
介して作用する。

【０００３】 例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよび腫瘍壊死因子βは、多数の生物学的
プロセス（ショックおよび炎症性疾患の感染および誘発に対する防御を含む）を
制御するためのＴＮＦレセプターを介して作用するサイトカインである。ＴＮＦ
分子は「ＴＮＦリガンド」スーパーファミリーに属し、そしてこれらのレセプタ
ーまたは対のリガンド（「ＴＮＦレセプター」スーパーファミリー）と共に作用
する。現在までに、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの９種のメンバーが同定
されており、そしてＴＮＦレセプタースーパーファミリーの１０種のメンバーが
特徴付けられている。

【０００４】 リガンドの中には、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＴＮＦ−βとしてまた
公知であるＬＴ−α）、ＬＴ−β（複合体ヘテロトリマーＬＴ−α２−β中に見
出される）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、
ＯＸ４０Ｌ、および神経成長因子（ＮＧＦ）が含まれる。ＴＮＦレセプターのス
ーパーファミリーは、ｐ５５ＴＮＦレセプター、ｐ７５ＴＮＦレセプター、ＴＮ
Ｆレセプター関連タンパク質、ＦＡＳ抗原またはＡＰＯ−１、ＣＤ４０、ＣＤ２
７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、低親和性ｐ７５、およびＮＧＦレセプタ
ー（Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２２：２９１−２９５（１
９９４））を含む。

【０００５】 ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化Ｔ細胞により
発現される。これは、これらのメンバーが細胞個体発生および機能の根底にある
他の細胞型とのＴ細胞の相互作用に必要であることを意味する（Ｍｅａｇｅｒ，
Ａ．、前出）。

【０００６】 ＴＮＦレセプターファミリーのいくつかのメンバーの不可欠な機能についての
かなりの洞察が、これらのタンパク質の発現を消滅させる変異体の同定および作
製により得られている。例えば、ＦＡＳ抗原およびそのリガンド中の天然に存在
する変異は、リンパ球増殖疾患を生じ（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら
、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：３１４（１９９２））、これはおそらく、プログラム
された細胞死の失敗を反映する。ＣＤ４０リガンドの変異は、血漿中の高レベル
の免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロブリンＧにより特徴付けされるＸ
連鎖免疫不全状態を生じる。これは、不完全なＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化を意味
する（Ａｌｌｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９９０（１９９３））。低親和
性神経成長因子レセプターの標的化された変異は、末梢構造の不完全な知覚神経
支配（ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）により特徴付けられた障害を生じる（Ｌｅｅら、
Ｃｅｌｌ ６９：７３７ （１９９２））。

【０００７】 ＴＮＦおよびＬＴ−αは、２つのＴＮＦレセプター（５５ｋｄおよび７５ｋｄ
のＴＮＦレセプター）へ結合し得る。それらのレセプターを通して作用するＴＮ
ＦおよびＬＴ−αにより誘発される多くの生物学的効果は、移植された腫瘍の出
血性壊死、細胞傷害性、エンドトキシンショックにおける役割、炎症、免疫調節
、増殖および抗ウイルス応答、ならびに電離放射線の有害な効果に対する防御を
含む。ＴＮＦおよびＬＴ−αは、エンドトキシンショック、大脳マラリア、腫瘍
、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、および移植片宿主拒絶を含む広範囲な疾患の病因に
関与する（Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：６６７−６６８（１９
９４））。ｐ５５レセプター中の変異は、微生物感染に対して増加された感受性
を生じる。

【０００８】 さらに、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）およびＦａｓのＣ−末端付近の約８０アミノ酸
ドメインが、プログラムされた細胞死についてのシグナルを伝える原因である「
デスドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）」として報告された（Ｔａｒｔａｇ
ｌｉａら、Ｃｅｌｌ ７４：８４５（１９９３））。

【０００９】 アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発達お
よびホメオスタシスに不可欠である生理学的プロセスである（Ｓｔｅｌｌｅｒ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，１４４５−１４４９（１９９５））。アポトーシスの
撹乱は、ガン、神経変性障害、および後天性免疫不全症候群を含むいくつかのヒ
ト疾患の病因に寄与する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｃ．Ｂ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
６７， １４５６−１４６２ （１９９５））。最近、多くの注目が、２つの細
胞表面のデスレセプター（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１およびＴＮＦＲ−１）のシグナル伝達および生物学的機能に集中している（Ｃ
ｌｅｖｅｌａｎｄら，Ｃｅｌｌ ８１，４７９−４８２（１９９５）；Ｆｒａｓ
ｅｒら、Ｃｅｌｌ ８５，７８１−７８４（１９９６）；Ｓ．Ｎａｇａｔａら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，１４４９−５６（１９９５））。両方は、とりわけ、
ＴＮＦＲ−２、低親和性ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、およびＣＤ３０もまた含むＴＮＦ
レセプターファミリーのメンバーである（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
８，１０１９−２３ （１９９０）；Ｔｅｗａｒｉら、Ｍｏｄｕｌａｒ Ｔｅｘ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｍ．Ｐ
ｕｒｔｏｎ，Ｈｅｌｄｉｎ，Ｃａｒｌ編（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，
Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５）。ファミリーのメンバーはこれらの細胞外ドメイン
中のシステインリッチ反復の存在により定義されるが、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１およ
びＴＮＦＲ−１はまた、ショウジョウバエ自殺遺伝子ｒｅａｐｅｒ（Ｇｏｌｓｔ
ｅｉｎら，Ｃｅｌｌ ８１：１８５−６ （１９９５）；Ｗｈｉｔｅら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６４，６７７−８３（１９９４））の遠縁にあたる、細胞内相同性
の領域である、適切に命名された「デスドメイン」を共有する。この共有された
デスドメインは、両レセプターが最近まで未同定のままであった関連する対のシ
グナル伝達分子と相互作用することを示唆する。Ｆａｓ／ＡＰＯ−１の活性化は
、デスドメインを含むアダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１（Ｃｈｉｎｎａｉｙ
ａｎら，Ｃｅｌｌ ８１，５０５−５１２（１９９５）；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，７７９５−８（１９９５）；Ｋｉｓｃｈｋｅｌら
、ＥＭＢＯ １４：５５７９−５５８８（１９９５））を補強し、デスドメイン
を含むアダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１は次いで、プロアポトーシスプロテ
アーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーのメンバーであるＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ
１へ結合し、そしておそらく活性化する（Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１
７−８２７（１９９６）；Ｂｏｌｄｉｎら，Ｃｅｌｌ ８５，８０３−８１５（
１９９６））。Ｆａｓ／ＡＰＯ−１の中心的役割は細胞死を誘発することである
が、ＴＮＦＲ−１は、整然とした多様な生物学的活性（その多くは、ＮＦ−ｋＢ
を活性化する能力に由来する）の信号を送り得る（Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １３：１５１−１５３（１９９２））。従って、ＴＮ
ＦＲ−１は、多価アダプター分子ＴＲＡＤＤ（ＦＡＤＤを好む）を補強し、また
デスドメインを含む（Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８１：４９５−５０４（１９９５）
；Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８４：２９９−３０８ （１９９６））。ＦＡＤＤ、Ｔ
ＲＡＦ２、およびＲＩＰを含む多くのシグナル伝達分子との会合を通して、ＴＲ
ＡＤＤは、アポトーシスおよびＮＦ−ｋＢ活性化の両方へ信号を送り得る（Ｈｓ
ｕら、Ｃｅｌｌ ８４：２９９−３０８（１９９６）；Ｈｓｕら、Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ ４，３８７−３９６（１９９６））。

【００１０】 ＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＮＦファミリーレセプターの効果は変化し
、哺乳動物システムの生物学的プロセス中で、正常および異常の両方の多数の機
能に影響を与える。従って、正常状態および疾患状態の両方の生物活性に影響を
与えるさらなる新規ＴＮＦレセプターおよびリガンドの、同定および特徴付けを
する明らかな必要性がある。

【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列またはＡＴＣＣ
受託番号２０９０３７（１９９７年５月１５日）として寄託されたｃＤＮＡクロ
ーンによりコードされるアミノ酸配列を有するＴＲ９レセプターをコードするポ
リヌクレオチドを含むかあるいはこれらからなる、単離された核酸分子を提供す
る。

【００１２】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクターおよびその
組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細胞を
作製する方法および組換え技術によってＴＲ９レセプターポリペプチドまたはペ
プチドを産生するためこれらを使用する方法、に関する。

【００１３】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードさ
れるアミノ酸配列を有する単離されたＴＲ９ポリペプチドをさらに提供する。

【００１４】 特定の実施形態において、本発明のＴＲ９ポリペプチドまたはそのアゴニスト
は、免疫欠損（例えば、重篤な複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ
−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロ
ブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ病、先天性無ガンマグロブリン血症、
Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症
無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブ
リン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、非特
異的低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（
ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰
ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的Ｉｇ
Ａ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常な
Ｉｇまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失
、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠損、
退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗｉｓｓ型）、網様発育不全、新生児好中球減
少症、重篤な先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−発育
不全症または形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短肢（ｓｈｏｒｔ ｌｉｍ
ｂｅｄ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症
候群複合免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣ
クラスＩＩ欠失（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全）または免疫
欠損と関連する状態を、処置、予防、予後を判定および／または診断するために
投与される。

【００１５】 特定の実施形態において、本発明のＴＲ９のポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチドまたはそれらのアゴニストは、分類不能型免疫不全を処置、予防、予後を
判定および／または診断するために投与される。

【００１６】 特定の実施形態において、本発明のＴＲ９のポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチドまたはそれらのアゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症を処置、予
防、予後を判定および／または診断するために投与される。

【００１７】 別の特定の実施形態において、本発明のＴＲ９のポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチドまたはそれらのアゴニストは、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を処
置、予防、予後を判定および／または診断するために投与される。

【００１８】 別の特定の実施形態において、本発明のＴＲ９のポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチドまたはそれらのアゴニストは、ヴィスコット−オールドリッチ症候群
を処置、予防、予後を判定および／または診断するために投与される。

【００１９】 別の特定の実施形態において、本発明のＴＲ９のポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチドまたはそれらのアゴニストは、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ欠損を処
置、予防、予後を判定および／または診断するために投与される。

【００２０】 別の実施形態において、ＴＲ９アンタゴニスト（例えば、抗ＴＲ９抗体）は、
自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性血
小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、自己免
疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄
炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、Ｉ
ｇＡネフロパシー）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺
症、紫斑（例えば、ヘノッホ−シェーンライン（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌ
ｅｉｎ）紫斑病）、ライター病、Ｓｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群、自己免疫肺炎症、
ギヤン−バレー症候群、インシュリン依存性糖尿病（ｍｅｌｌｉｔｉｓ）、およ
び自己免疫炎症性眼、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲
状腺炎）、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（
ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インシュリン耐性など）
、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う
強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎
、悪性貧血、特発性アディソン病、不妊症、糸球体腎炎（原発性糸球体腎炎およ
びＩｇＡネフロパシーなど）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病お
よびアドレナリン作用性薬剤耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン
作用性薬剤耐性を含む）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺
不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）、心臓切開症候群、じんま
疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシーならびに他の炎症性障害、肉芽
腫性障害、変性障害および萎縮性障害）または自己免疫疾患に関連する状態を処
置、予防、予後を判定および／または診断するために投与される。特定の好まし
い実施形態において、慢性関節リウマチは、本発明の抗ＴＲ９抗体および／また
は他のアンタゴニストを用いて、処置、予防、予後を判定および／または診断さ
れる。別の特定の好ましい実施形態において、全身性エリテマトーデスは、本発
明の抗ＴＲ９抗体および／または他のアンタゴニストを用いて、処置、予防、予
後を判定および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、特
発性血小板減少性紫斑病は、本発明の抗ＴＲ９抗体および／または他のアンタゴ
ニストを用いて処置、予防、予後の判定および／または診断される。別の特定の
好ましい実施形態において、ＩｇＡネフロパシーは、本発明の抗ＴＲ９抗体およ
び／または他のアンタゴニストを用いて、処置、予防、予後の判定および／また
は診断される。好ましい実施形態において、自己免疫疾患および自己免疫障害な
らびに／または上記の疾患および障害と関連する状態は、抗ＴＲ９抗体を用いて
、処置、予防、予後の判定および／または診断される。

【００２１】 本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞におよびインビボで
細胞に、または多細胞器官に投与するための、ＴＲ９ポリヌクレオチド、ＴＲ９
ポリペプチドおよび／または抗ＴＲ９抗体を含む組成物を提供する。好ましい実
施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置のために宿主器官中でＴＲ９ポ
リペプチドを発現するための、ＴＲ９ポリヌクレオチドを含む。最も好ましい実
施形態において、本発明の組成物は、免疫欠損および／または免疫欠損と関連す
る状態の処置のために宿主器官中でＴＲ９ポリペプチドを発現するための、ＴＲ
９ポリヌクレオチドを含む。この点で特に好ましいのは、ＴＲ９遺伝子の異常な
内因性活性と関連する機能不全の処置のためにヒト患者で発現することである（
例えば、発現は、Ｂ細胞数を拡大させるかまたはＢ細胞の寿命を増加させること
によって正常なＢ細胞機能を増強させ：または発現は、Ｔ細胞数を拡大させるか
またはＴ細胞の寿命を増加させることによって正常なＴ細胞機能を増強する）。

【００２２】 本発明はまた、ＴＲ９レセプターによって誘導される細胞性応答を増強または
阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は
、ＴＲ９レセプターを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞性応答
をアッセイする工程、および標準の細胞性応答に対してその細胞性応答を比較す
る工程を包含し、この標準は、接触が候補化合物の非存在下でなされた場合にア
ッセイされる。これにより、標準に対して増加した細胞性応答は、その化合物が
アゴニストであることを示し、そして標準に対して減少した細胞応答は、その化
合物がアンタゴニストであることを示す。

【００２３】 別の局面において、アゴニストおよびアンタゴニストに関するスクリーニング
アッセイが提供され、このアッセイは、候補化合物が有する、細胞性リガンドの
ＴＲ９レセプターに対する結合に対する効果を決定する工程を包含する。特に、
この方法は、ＴＲ９レセプターをリガンドポリペプチドおよび候補化合物と接触
させる工程、およびＴＲ９レセプターに対するリガンドの結合が候補化合物の存
在に起因して増加または減少されるか否かを決定する工程を包含する。

【００２４】 本発明はさらに、ＴＲ９レセプタータンパク質のレベルを検出するための定量
的アッセイおよび診断アッセイのような、診断アッセイを提供する。従って、例
えば、正常なコントロール組織サンプルと比較することによる、ＴＲ９の過剰発
現またはその可溶性形態の検出に関する本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存
在を検出するために使用され得る。

【００２５】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドは、細胞傷害性、抗ウイルス活性
、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む多数の細胞性応答を
誘導する、最も多面的なサイトカインの一種であることが公知である。ＴＮＦフ
ァミリーリガンドに対する細胞性応答は、正常な生理学的応答のみでなく、増加
したアポトーシスまたはアポトーシスの阻害に関連する疾患を含む。アポトーシ
ス（プログラムされた細胞死）は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する生
理学的機構であり、そしてアポトーシス調節不全は、多数の異なる病原性プロセ
スを導き得る。増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患とし
ては、癌、自己免疫障害、ウイルス感染、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片
拒絶および慢性移植片拒絶が挙げられる。増加したアポトーシスと関連する疾患
としては、ＡＩＤＳ、神経変性障害、脊髄形成異常症候群、虚血性損傷、毒素誘
導性肝疾患、敗血症性ショック、悪液質および食欲不振が挙げられる。

【００２６】 従って、本発明はさらに、ＴＮＦファミリーリガンドによって誘導されたアポ
トーシスを増強する方法を提供し、この方法は、ＴＲ９ポリペプチドを発現する
細胞に有効量のアゴニスト（これは、ＴＲ９媒介シグナル伝達を増加し得る）を
投与する工程を包含する。好ましくは、ＴＲ９媒介シグナル伝達は、減少したア
ポトーシスが示される疾患を処置、予防、診断および／または検出するために増
加される。

【００２７】 さらなる局面において、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドによって誘導さ
れるアポトーシスを阻害するための方法に関し、この方法は、ＴＲ９ポリペプチ
ドを発現する細胞に有効量のアンタゴニスト（これは、ＴＲ９媒介シグナル伝達
を減少し得る）を投与する工程を包含する。好ましくは、ＴＲ９媒介シグナル伝
達は、増加したアポトーシスが示される疾患を処置、予防、診断および／または
検出するために減少される。

【００２８】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、図１Ａ〜Ｃ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するＴＲ９
レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、またはその代
わりに、そのポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子を提供し、このア
ミノ酸配列は、クローニングされたｃＤＮＡを配列決定することにより決定され
た。図２に示されるように、本発明のＴＲ９レセプタータンパク質は、Ｆａｓ（
配列番号３）、ＮＧＦＲ ｐ７５（配列番号４）、およびＴＮＦＲ１（配列番号
５）と配列相同性を共有する。配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、ｃＤ
ＮＡクローンを配列決定することによって得られ、このクローンは、１９９７年
５月１５日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓ
ａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２２９に寄託がなされ、そしてＡＴＣ
Ｃ受託番号２０９０３７が付与された。この寄託されたクローンは、ＥｃｏＲＩ
およびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
）に挿入されている。

【００２９】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を用
いて決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされる
ポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の
翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された任
意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定され
る任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定さ
れるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列
に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９
５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において
周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定さ
れ得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定され
たヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳
におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列
によってコードされる推定されるアミノ酸配列は、このような挿入または欠失の
点にて始まる配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配
列とは完全に異なる。

【００３０】 図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）におけるヌクレオチド配列のような、本明細書中に
提供される情報を使用して、ＴＲ９ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子
は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質として
ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡをクローニングするために使用するための手段）を
使用して得られ得る。本発明の例示として、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に記載さ
れる核酸分子は、ヒト微小血管内皮細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーにおい
て見出された。この遺伝子はまた、以下の組織由来のｃＤＮＡライブラリーにお
いて同定された：ヒト胎盤、間質細胞、ヒト扁桃（ａｍｙｇｄａｌａ）、ヒト臍
静脈内皮細胞、腎臓癌、ヒト胆嚢、ｓｏａｒｅｓ成人脳、正常ヒト肝臓、肝細胞
腫瘍、ケラチノサイト、骨髄、マクロファージ、ヒト滑膜肉腫、ヒト海馬、およ
びヒト扁桃（ｔｏｎｓｉｌ）。

【００３１】 図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）のＴＲ９ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列
は、約６１５アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレ
ームを含み、約４０アミノ酸残基の推定リーダー配列、および約７２ｋＤａの推
定分子量を有する。アミノ酸残基およそ１〜残基およそ６１５までの推定成熟Ｔ
Ｒ９レセプターのアミノ酸配列は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示される。図１
Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるＴＲ９タンパク質は、ＮＧＦＲ（図２）に対し
て、約２４％同一であり、そして約４３％類似である。

【００３２】 ＴＲ９と他のデスドメイン含有レセプターとの間で示される配列相同性によっ
て予測されるように（図４Ｃを参照のこと）、ＴＲ９は、哺乳動物細胞のアポト
ーシスを誘導する（図６を参照のこと）。ＴＲ９誘導性のアポトーシスは、デス
プロテアーゼ（ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅａｓｅ）のインヒビター（ｚ−ＶＡＤ−
ｆｍｋ（不可逆的に広いスペクトルのカスパーゼインヒビター）およびＣｒｍＡ
（先端の（ａｐｉｃａｌ）カスパーゼ（例えば、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ−１（カ
スパーゼ−８））を優先的に阻害する、牛痘ウイルスによってコードされている
セルピン）を含む）によって効率的にブロックされることが予想される。

【００３３】 示されるように、本発明はまた、本発明のＴＲ９レセプタータンパク質の成熟
形態を提供する。シグナル仮説に従って、哺乳動物細胞によって分泌されるタン
パク質は、シグナルまたは分泌リーダー配列を有し、この配列は、一旦、粗面小
胞体を横切って成長しつつあるタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパ
ク質から切断される。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞もなお、同じ特異
性で分泌されたタンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分泌されたタ
ンパク質の切断は、完全には同一ではなく、これによってタンパク質について２
つ以上の成熟種が生じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断の特異性が完全
なタンパク質の一次構造によって究極的に決定される、すなわち、切断の特異性
はポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが知られている。従って、本発
明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７として同定された宿主中に含まれ、そして
図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるｃＤＮＡクローンによってコードされるア
ミノ酸配列を有する成熟ＴＲ９レセプターポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を提供する。ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７として同定された宿主中に含
まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟したＴ
Ｒ９タンパク質は、寄託された宿主中のベクターに含まれるこのクローンのヒト
ＤＮＡ配列によってコードされる完全なオープンリーディングフレームの哺乳動
物細胞（例えば、以下に記載するようなＣＯＳ細胞）中での発現によって産生さ
れる、ＴＲ９レセプタータンパク質の成熟した形態を意味する。以下に示される
ように、ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ９レセプターは、コンピューター分析
に基づく推定の切断部位の正確性に依存して、配列番号２に示される推定の「成
熟」ＴＲ９レセプタータンパク質（およそ１からおよそ６１５までのアミノ酸）
とは異なっていてもよいし、異なっていなくてもよい。

【００３４】 タンパク質が分泌リーダーならびにこのリーダー配列のための切断点を有する
か否かを予測する方法が利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））
の方法が使用される。これらの各方法についての既知の哺乳動物分泌タンパク質
の切断点を予測することの正確さは、７５〜８０％の範囲である。ｖｏｎ Ｈｅ
ｉｎｊｅ、前出。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質の同じ予測される切
断点を常に生じるわけではない。

【００３５】 本発明の場合において、本発明の完全ＴＲ９ポリペプチドの推定アミノ酸配列
は、コンピュータープログラム（「ＰＳＯＲＴ」）によって分析された（Ｋ．Ｎ
ａｋａｉおよびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１
１（１９９２）。このプログラムは、アミノ酸配列に基づくタンパク質の細胞内
局在化を予測するための熟練したシステムである。局在化のこのコンピューター
による予測の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が
組み込まれている。ＰＳＯＲＴプログラムによる分析は、図１Ａ〜Ｄのアミノ酸
残基４０と４１（配列番号２のアミノ酸残基−１とアミノ酸残基１）との間の切
断部位を予測した。その後、完全なアミノ酸配列が、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの（
−１，−３）の規則の簡単な形態を適用される視覚的検査によってさらに分析さ
れた。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出。従って、ＴＲ９レセプタータンパク質につ
いてのリーダー配列は、図１Ａ〜Ｄのおよそアミノ酸残基１〜４０（配列番号２
のおよそ−４０〜およそ−１）からなることが予測されるが、成熟ＴＲ９タンパ
ク質は、図１Ａ〜Ｄの残基およそ４１〜６５５（配列番号２のおよそ１〜およそ
６１５）からなる。異なるコンピュータプログラムを用いる分析は、図１Ａ〜Ｄ
および４Ａにおいて示されているように、ＴＲ９の成熟タンパク質がアミノ酸４
２（Ｇｌｎ）で開始することを予測する。この分析の結果は、図４Ａに提供され
、そして実施例６に記載される。

【００３６】 当業者が理解するように、配列決定エラーの可能性、ならびに異なる既知のタ
ンパク質におけるリーダーについての切断部位の可変性に起因して、寄託された
ｃＤＮＡによってコードされる推定ＴＲ９レセプターポリペプチドは、約６５５
アミノ酸を含むが、６４５〜６６５アミノ酸の範囲内のどこかであり得；そして
このタンパク質の推定リーダー配列は、約４０アミノ酸であるが、約３０〜約５
０アミノ酸の範囲のどこかであり得る。本明細書中に記載されたドメインは、コ
ンピューター分析によって予測され、従って、種々の機能的ドメインを同定する
ために使用された分析の判断基準に依存して、ＴＲ９の、例えば、細胞外ドメイ
ン、細胞内ドメイン、デスドメイン、システインリッチモチーフ、および膜貫通
ドメインの正確な「アドレス」がわずかに異なることがさらに理解される。例え
ば、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）におけるＴＲ９細胞外ドメインの正確な位置は、
そのドメインおよび抗原性領域を規定するために使用される基準に依存してわず
かに変化し得る（例えば、このアドレスは、約１〜約２０残基、よりありそうな
のは約１〜約５残基で「シフト」し得る）。任意の場合において、以下にさらに
議論するように、本発明はさらに、完全ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ
末端から欠失された種々の残基を有するポリペプチドを提供し、これには、ＴＲ
９ポリペプチドの細胞外ドメインの可溶性形態を構成する、本明細書中に記載さ
れる細胞外ドメインのＮ末端から、１つ以上のアミノ酸を欠くポリペプチドを含
む。

【００３７】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）で
もまたはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られるか、もしくは合成
的に生成された、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であってもよい。このＤ
ＮＡは、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたは一
本鎖ＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としてもまた公知である）であってもよいし
、または非コード鎖（アンチセンス鎖としても呼ばれる）であってもよい。

【００３８】 「単離された」核酸分子とは、その天然の環境から取り除かれた核酸分子、Ｄ
ＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子
は、本発明の目的のために単離されたと見なされる。単離されたＤＮＡ分子のさ
らなる例は、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（
部分的に、または実質に）精製されたＤＮＡ分子を含む。しかし、混合されたク
ローンライブラリー（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバー
であり、かつライブラリーの他のクローンから単離されていないクローン中に含
まれた核酸（例えば、ライブラリーの他のメンバーを伴わないクローンを含む均
質な溶液の形態で）、または細胞もしくは細胞溶解物から単離または除去された
染色体（例えば、核型における場合「染色体スプレッド」）は、本発明の目的に
関して「単離されて」いない。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子の
インビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核
酸分子は、天然に、組換え的にまたは合成的に生成され得る。

【００３９】 本発明の単離された核酸分子は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるＤＮＡ
分子を含むか、またはその代わりに、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなるか；成熟ＴＲ９タンパク質につい
てのＤＮＡ分子を含むか、またはその代わりに、成熟ＴＲ９タンパク質について
のコード配列からなり；そして遺伝コードの縮重に起因して、上記の配列と実質
的に異なる配列を含むＤＮＡ分子は、しかし、なお図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に
示されるＴＲ９タンパク質をコードする。もちろん、遺伝コードは当該分野で周
知である。従って、このような縮重改変体を生成することは、当業者にとって慣
用的である。

【００４０】 さらに、本発明は、（配列番号１）の図１Ａ〜Ｄにおけるヌクレオチド配列の
広範な部分に関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。これは、
以下の関連するｃＤＮＡクローンから決定された：ＨＩＢＥＪ８６Ｒ（配列番号
６）、ＨＬＩＡＡ７９Ａ（配列番号７）、ＨＨＦＧＤ５７Ｒ（配列番号８）、Ｈ
ＳＡＢＧ３８Ｒ（配列番号９）、およびＨＨＰＤＺ３１Ｒ（配列番号１０）。

【００４１】 さらに、本発明は、図１Ａ〜Ｄのヌクレオチド６５５〜９０７（配列番号１の
ヌクレオチド６１５〜８６７）に開示されるヌクレオチド配列および／または図
１Ａ〜Ｄのヌクレオチド５４０〜１０２０（配列番号１に記載されるヌクレオチ
ド５００〜９８０）に開示されるヌクレオチド配列の、少なくとも約３０ヌクレ
オチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの任意の部分を含むか、また
はその代わりに、そのポリペプチドはその任意の部分からなる、ポリペプチドを
含む。

【００４２】 別の局面において、本発明は、１９９７年５月１５日にＡＴＣＣ受託番号２０
９０３７として寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
ドされるようなアミノ酸配列を有するＴＲ９レセプターポリペプチドをコ−ドす
る、単離された核酸分子を提供する。さらなる実施形態において、核酸分子は、
成熟ＴＲ９レセプターポリペプチドまたはＮ末端メチオニンを欠く全長ＴＲ９レ
セプターポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。本発明はまた、図１
Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子
、または上記に記載された寄託されたクローンに含まれるＴＲ９ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の配列の１つに相補的
な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単離された分子、特に、ＤＮＡ
分子は、染色体を用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッ
ピングのためのプローブとして、そして例えばノーザンブロット分析によるヒト
組織におけるＴＲ９レセプター遺伝子の発現を検出するためのプローブとしての
用途を有するがこれらに限定されない。

【００４３】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２９０３７として寄託された
クローン）のヌクレオチド配列または図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるヌク
レオチド配列、またはそれらに相補的な鎖を有する単離された核酸分子のフラグ
メントによって、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは、少なくとも約
２０ｎｔ、さらにより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、なおさらに好ましく
は、少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４０
０、または５００ｎｔ長のフラグメントが意図される。これらのフラグメントは
、本明細書中で議論されるように、診断用プローブおよびプライマーそしての多
数の用途を有するがこれらに限定されない。当然、５０〜１５００ｎｔまたは５
０１〜１５００ｎｔ長のより大きなフラグメントもまた、寄託されたｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列または図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列
の、すべてではないにしても大部分に対応するフラグメントであるので、本発明
に従って有用である。少なくとも約２０ｎｔ長のフラグメントによって、例えば
、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示
されるヌクレオチド配列からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意
図される。この文脈において、「約（およそ）」とは、特に列挙されるサイズの
、いずれかの末端または両方の末端において、数個（５、４、３、２、または１
）のヌクレオチドだけ、より大きいかまたはより小さいヌクレオチドが含まれる
。

【００４４】 本発明のＴＲ９ポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例には、例えば、配
列番号１の、またはその配列に相補的なＤＮＡ鎖、または寄託されたクローンに
含まれるｃＤＮＡの、およそのヌクレオチド１〜５０、５１〜１００、１０１〜
１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、
３５１〜４００、４０１〜４５０、４４５〜８７９、４５１〜５００、５０１〜
５５０、５５１〜６００、６１５〜６５１、６５１〜７００、７０１〜７５０、
７５１〜８００、８００〜８５０、８５０〜８６７、８５１〜９００、９０１〜
９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０
１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００
、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜
１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１
６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８
５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、２００
１〜２０５０、２０５１〜３０００、または３００１〜最後の配列を含むか、ま
たはその代わりに、それらの配列からなる、フラグメントを含む。この文脈にお
いて、「約（およそ）」とは、特に列挙される範囲の、いずれかの末端または両
方の末端において、数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけより
大きいかまたはより小さいヌクレオチドが含まれる。

【００４５】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ＴＲ９
の機能的活性を実証するポリペプチドをコードする。ＴＲ９の「機能的活性」を
実証するポリペプチドによって、完全な（全長）または成熟ＴＲ９ポリペプチド
に付随する１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドが意味される。
このような機能的活性としては、生物学的活性（例えば、そのポリペプチドを発
現する細胞においてアポトーシスを誘導する活性（例えば、実施例５を参照のこ
と）、単球を活性化する能力（例えば、ＴＮＦ−αおよび／またはＭＣＰ−１分
泌を単球から誘導する）、および単球の生存を増加させる能力（例えば、実施例
８を参照のこと）、抗原性（抗ＴＲ９抗体に結合する能力（または、結合につい
てＴＲ９ポリペプチドと競合する能力））、免疫原性（ＴＲ９ポリペプチドに結
合する抗体を生成する能力）、マルチマーを形成する能力、およびＴＲ９ポリペ
プチドについてレセプターまたはリガンドに結合する能力（例えば、単球の表面
で発現するＡＩＭ−ＩＩおよびＴＲ９リガンド）が挙げられるが、これらに限定
されない。

【００４６】 ＴＲ９ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およびア
ナログの機能的活性は、種々の方法によりアッセイされ得る。

【００４７】 例えば、抗ＴＲ９抗体との結合に関して完全（全長）ＴＲ９ポリペプチドと競
合する能力をアッセイする、１つの実施形態において、当該分野において公知の
種々のイムノアッセイが使用され得る。このようなアッセイとしては、放射免疫
アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫ア
ッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセ
イ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体
標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル
凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プ
ロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競
合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施
形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。
別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬
の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗
体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該
分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。

【００４８】 別の実施形態では、ＴＲ９リガンドが同定される場合（例えば、単球の表面で
発現されるＡＩＭ−ＩＩおよびＴＲ９リガンド）、または本発明のポリペプチド
フラグメント、改変体、または誘導体がマルチマー化する能力が評価される場合
、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフ
ィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのよう
な当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃ
ｋｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）
を参照のこと。別の実施形態では、その基質へのＴＲ９結合の生理学的相関（シ
グナル伝達）がアッセイされ得る。

【００４９】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例５および８を参照のこと）
、さもなくば当該分野で公知の他のアッセイは、ＴＲ９ポリペプチドならびにそ
のフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログが、インビトロまたはインビ
ボで、ＴＲ９関連生物学的活性を誘発する能力（例えば、ポリペプチドを発現す
る細胞においてアポトーシスを誘導する能力（例えば、実施例６を参照のこと）
）、単球を活性化する能力、および単球の生存を増加させる能力（例えば、実施
例８および９を参照のこと））を測定するために慣用的に適用され得る。例えば
、生物学的活性は、本質的に以前に記載されたように（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら
、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５−８（１９９５）；Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭ
ＢＯ １４：５５７９−５５８８（１９９５）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９６１−４９６５（１９９６））、および以下
の実施例５に記載されるように実行された細胞死アッセイを使用して慣用的に測
定され得る。ＭＣＦ７細胞を含む１つの実施形態において、全長ＴＲ９または候
補デスドメイン含有レセプターをコードするプラスミドは、グリーン蛍光タンパ
ク質をコードするｐＬａｎｔｅｒｎレポーター構築物で同時トランスフェクトさ
れる。ＴＲ９でトランスフェクトされた細胞の核は、ＤＡＰＩ染色によって評価
されるようなアポトーシスの形態を示す。

【００５０】 他の方法は、当業者に公知であり、そして本明細書の範囲内にある。

【００５１】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下の群から選択されるメンバーをコ
ードする核酸分子を含む：ＴＲ９レセプター細胞外ドメイン（配列番号２のアミ
ノ酸残基およそ１〜およそ３１０を構成することが予測される）を含むか、また
はその代わりに、それらからなる、ポリペプチド；ＴＲ９の４つのＴＮＦＲ様シ
ステインリッチモチーフ（図１Ａ〜Ｄのアミノ酸残基６７〜２１１；配列番号２
のアミノ酸残基２７〜１７１）を含むか、またはその代わりに、それらからなる
、ポリペプチド；ＴＲ９レセプター膜貫通ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基
およそ３１１〜およそ３２７を構成することが予測される）を含むか、またはそ
の代わりに、それらからなる、ポリペプチド；推定成熟ＴＲ９ポリペプチド（こ
こでこのフラグメントは、ＴＲ９機能的活性（例えば、抗原性活性または生物学
的活性）を有する）を含むか、またはその代わりに、それらからなる、ポリペプ
チド；ＴＲ９レセプター細胞内ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基およそ３２
８〜およそ６１５を構成することが予測される）を含むか、またはその代わりに
、それらからなる、ポリペプチド；すべてまたは一部の膜貫通ドメインを欠失し
た、ＴＲ９レセプター細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むか、またはそ
の代わりに、それらからなる、ポリペプチド；ＴＲ９レセプターデスドメイン（
配列番号２のアミノ酸残基およそ３８９〜およそ４５５を構成することが予測さ
れる）を含むか、またはその代わりに、それらからなる、ポリペプチド；ならび
に、ＴＲ９レセプタータンパク質の１、２、３、４以上のエピトープ保有部分を
含むか、またはその代わりに、それらからなる、ポリペプチド。さらなる実施形
態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、上記のメンバーのうち
の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個すべての任意の組み
合わせを含むか、またはその代わりに、それらからなる、ポリペプチドをコード
する。上記のように、リーダー配列を伴って、ＴＲ９レセプター細胞外ドメイン
、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを構成するアミノ酸残基は、コンピュ
ータ分析によって予測された。従って、当業者は、これらのドメインを構成する
アミノ酸残基が、各ドメインを規定するために使用される判断基準に依存して、
わずかに（例えば、約１〜１５アミノ酸残基）変化し得ることを認識する。これ
らの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明に包含される。

【００５２】 図１Ａ〜Ｄおよび図４Ｂに開示されたＴＲ９の４つの細胞外システインリッチ
モチーフの１つ以上が、ＴＲ９とその（例えば、単球の表面で発現されるＡＩＭ
−ＩＩリガンドおよびＴＲ９リガンド）との間での相互作用のために重要である
と考えられる。従って、本発明の特定の実施形態は、図１Ａ〜Ｄおよび図４Ｂに
開示されるように、配列番号２のアミノ酸残基２７〜６５、６６〜１０５、１０
６〜１４５、および／または１４６〜１７１のアミノ酸残基の配列を含むか、ま
たはその代わりに、それらからなる、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図１Ａ〜Ｄおよび図４Ｂに開示され
る、１個、２個、３個、または４個すべての細胞外システインリッチモチーフの
任意の組み合わせを含むか、またはその代わりに、それらからなる、ＴＲ９ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチドもまた、本発明に包含される さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ９の機能的属
性をコードする。この点における本発明の好ましい実施形態は、ＴＲ９ポリペプ
チドのαへリックスおよびαへリックス形成領域（「α−領域」）、β−シート
およびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「
ターン−領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性
領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領
域および高度抗原性指標領域を含むか、あるいはこれらから構成されるフラグメ
ントを含む。

【００５３】 この点に関する特定の好ましい領域は、図３（表１）において示される。図３
において示されるデータおよび表１において示されるデータは、図１Ａ〜Ｄに開
示されるＴＲ９のアミノ酸配列が、ＤＮＡ^*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム
のデフォルトパラメータを使用して分析される場合に得られる同じ結果の、異な
る形式を単に示す。

【００５４】 図３および表１に示される上記の好ましい領域としては、図１Ａ〜Ｄにおいて
示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域が挙げられるが
、これらに限定されない。図３および表１に示されるように、そのような好まし
い領域としては、高い抗原性指標のＧａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎα−領域、β
−領域、ターン−領域、およびコイル−領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎα−領域
、β−領域およびコイル−領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域およ
び疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇα両親媒性領域およびβ両親媒性領域、Ｋａ
ｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域ならびにＪａｍ
ｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域が挙げられる。この点に関して非常に好ましいポリヌク
レオチドは、いくつかの構造的特徴（例えば、上記に示される同じまたは異なる
領域のいくつか（例えば、１、２、３または４）の特徴）を組み合わせるＴＲ９
の領域を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドである。

【００５５】 さらに、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶに示されるデータを
慣用的に使用して、抗原性について高度な潜在能力を示すＴＲ９の領域を決定し
得る。高い抗原性の領域は、免疫応答の開始のプロセスにおける抗原認識が生じ
得る環境において、ポリペプチドの表面上におそらく曝露されるポリペプチドの
領域を示す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよび／ま
たはＩＶにおいて示されるデータから決定される。

【００５６】

【表１】 本発明の好ましい核酸フラグメントとしてはまた、ＴＲ９レセプタータンパク
質の１個、２個、３個、４個、５個、またはそれより多くのエピトープ保有部分
を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げ
られる。特に、本発明のそのような核酸フラグメントとしては、以下をコードす
る核酸分子が挙げられる：配列番号２のアミノ酸残基およそ４〜およそ８１を含
むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残基およ
そ１１６〜およそ２７１を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド；配
列番号２のアミノ酸残基およそ２８３〜およそ３０８を含むか、あるいはそれら
からなる、ポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残基およそ３３６〜およそ３７
２を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残
基およそ３９３〜およそ４３４を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチ
ド；配列番号２のアミノ酸残基およそ４４５〜およそ５５９を含むか、あるいは
それらからなる、ポリペプチド；および配列番号２のアミノ酸残基およそ５７１
〜およそ５８８を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド。この文脈に
おいて、「およそ（約）」とは、特に列挙された範囲（いずれかの末端または両
方の末端において、いくつか（５、４、３、２または１）のヌクレオチドだけ大
きいかまたは小さい範囲）を意味する。本発明は、上記ポリペプチドフラグメン
トが、ＴＲ９レセプターの抗原領域であることを決定した。ＴＲ９のタンパク質
のそのようなエピトープ保有部分を決定するための方法が、以下に詳細に記載さ
れる。

【００５７】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１００，０００ｋｂ
長未満、５０，０００ｋｂ長未満、１０，０００ｋｂ長未満、１，０００ｋｂ長
未満、５００ｋｂ長未満、４００ｋｂ長未満、３５０ｋｂ長未満、３００ｋｂ長
未満、２５０ｋｂ長未満、２００ｋｂ長未満、１７５ｋｂ長未満、１５０ｋｂ長
未満、１２５ｋｂ長未満、１００ｋｂ長未満、７５ｋｂ長未満、５０ｋｂ長未満
、４０ｋｂ長未満、３０ｋｂ長未満、２５ｋｂ長未満、２０ｋｂ長未満、１５ｋ
ｂ長未満、１０ｋｂ長未満、７．５ｋｂ長未満、または５ｋｂ長未満である。

【００５８】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ９コード配列
の少なくとも１５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００
個、または少なくとも２５０個、少なくとも５００個、または少なくとも１００
０個連続するヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなるが、図１Ａ−Ｄ（
配列番号１）に示される５’コードヌクレオチドまたは３’コードヌクレオチド
に隣接するゲノムＤＮＡのうちの１０００ｋｂ以下、５００ｋｂ以下、２５０ｋ
ｂ以下、２００ｋｂ以下、１５０ｋｂ以下、１００ｋｂ以下、７５ｋｂ以下、５
０ｋｂ以下、３０ｋｂ以下、２５ｋｂ以下、２０ｋｂ以下、１５ｋｂ以下、１０
ｋｂ以下、または５ｋｂ以下からなる。さらなる実施形態において、本発明のポ
リヌクレオチドは、ＴＲ９コード配列の少なくとも１５個、少なくとも３０個、
少なくとも５０個、少なくとも１００個、または少なくとも２５０個、少なくと
も５００個、または少なくとも１０００個連続するヌクレオチドを含むか、ある
いはそれらからなるが、いかなるＴＲ９イントロンの全てまたは一部も含まない
。別の実施形態において、ＴＲ９コード配列を含むか、あるいはそれらからなる
、核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノムにおけるＴＲ９遺伝子に対して
５’側または３’側）のコード配列を含まない。別の実施形態において、本発明
のポリヌクレオチドは、１０００個より多く、５００個より多く、２５０個より
多く、１００個より多く、５０個より多く、２５個より多く、２０個より多く、
１５個より多く、１０個より多く、５個より多く、４個より多く、３個より多く
、２個より多く、または１個より多くのゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まな
い。

【００５９】 別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるように、本発明の
ポリヌクレオチドにおけるポリヌクレオチド配列の一部に、好ましくは、ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズするポリヌ
クレオチドを含むか、あるいはそれらからなる、単離された核酸分子、例えば、
図１Ａ−Ｄ（配列番号１）に示されるコード配列および／または非コード配列（
すなわち転写された配列、転写されていない配列）と相補的な配列、ＡＴＣＣ登
録番号２０９０３７を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンの配列、図５Ａ
および５Ｂ（配列番号１８）に示されるコード配列および／または非コード配列
と相補的な配列、ＡＴＣＣ寄託物２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンの配
列、ならびにＴＲ９ドメインまたはポリヌクレオチドフラグメントをコードする
配列を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０
％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナ
トリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液
、１０％デキストラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む
溶液中で４２℃にて一晩インキュベーションし、続いて約６５℃において０．１
×ＳＳＣでそのフィルターを洗浄することが意図される。

【００６０】 ポリヌクレオチドの「部分（一部）」とハイブリダイズするポリヌクレオチド
とは、少なくとも参照ポリヌクレオチドの約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、および
より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０
ｎｔ、およびさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔ、または８０〜１５０ｎｔ
、あるいは全長とハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡの
いずれか）が意図される。「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部
とは、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡ）または図１Ａ−Ｄ
（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列由来の２０個以上連続するヌクレオ
チドを意図する。この文脈において、「およそ（約）」とは、特に列挙されたサ
イズ（いずれかの末端または両方の末端において、いくつか（５、４、３、２ま
たは１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さいサイズ）を含む。これらは、
上記および以下に詳細に記載されるような診断プローブおよびプライマーとして
の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

【００６１】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２に示され
るようなアミノ酸残基４０−１５２、４０−４８、４０−５１、５１−６６、６
６−７３、７３−８３、８３−１０４、１０４−１１０、１１０−１２８、１２
８−１４６、および／または１４６−１５２をコードするポリヌクレオチドの相
補鎖とハイブリダイズする。

【００６２】 もちろん、ポリＡ配列（例えば、配列番号１に示されるＴＲ９レセプターｃＤ
ＮＡの３’末端ポリトラクト（ｔｒａｃｔ））、あるいはＴ（またはＵ）残基の
相補ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の
一部とハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含ま
れない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまた
はその相補体（例えば、特に、プライマーとしてオリゴｄＴを使用して生成され
た任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子とハイブリダイズする
ためである。

【００６３】 示されるように、ＴＲ９レセプターポリペプチドをコードする本発明の核酸分
子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：成熟ポリヌクレオチ
ドのアミノ酸配列を単独でコードするポリヌクレオチド；成熟ポリペプチドおよ
びさらなる配列のコード配列（例えば、アミノ酸リーダー配列または分泌配列（
例えば、プレタンパク質配列、もしくはプロタンパク質配列もしくはプレプロタ
ンパク質配列）をコードする配列）；さらなる非コード配列（例えば、転写、ｍ
ＲＮＡプロセシング（スプライシング、およびポリアデニル化シグナルを含む）
において役割（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を果たす転写
された非翻訳配列のようなイントロンおよび非コード５’および３’配列が挙げ
られるが、これらに限定されない）と共に、上述のさらなるコード配列を含むか
、または含まない成熟ポリペプチドのコード配列；さらなるアミノ酸（例えば、
さらなる機能性を提供するアミノ酸）をコードするさらなるコード配列。従って
、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチド
の精製を促進するペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局
面の特定の好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチ
ジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．）において提
供されるタグ）であり、中でも、これらの多くは商業的に入手可能である。Ｇｅ
ｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８
２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タ
ンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製のための有用な別のペプチ
ドであり、これは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によ
って記載されている。以下に議論されるように、他のそのような融合タンパク質
としては、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃと融合されたＴＲ９レセプターが挙げられ
る。

【００６４】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、その改変体は、ＴＲ９レ
セプターの部分、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、例えば、天然
の対立遺伝子改変体として天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」によって、
生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の中の
一つが意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、
当該分野で公知の変異誘発技術を使用して作製され得、それらの技術としては、
オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部
位定方向変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例え
ば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限
選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．
Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）を参照のこと）が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００６５】 そのような改変体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって産生
される改変体が挙げられる。置換、欠失または付加は、一つ以上のヌクレオチド
を含み得る。この改変体は、コード領域、非コード領域または両方において変更
され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠
失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレントな置換、
付加および欠失であり、これらはＴＲ９レセプターまたはそれら部分の特性なら
びに機能的活性を変更しない。この点において特に好ましいのは、保存的置換で
ある。

【００６６】 本発明のさらなる実施形態は、以下：（ａ）図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）
Ｎ末端メチオニンを除く図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２において、
およそ１位〜およそ６１５位アミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる、
推定成熟ＴＲ９ポリペプチド（任意の付加するリーダー配列が取り除かれた全長
ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ登録番号２０９
０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する
ＴＲ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２
０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有
する成熟ＴＲ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＴＲ９レセ
プター細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）１個、２個、３個
または４個すべてのＴＲ９ＴＮＦＲ様ステインリッチモチーフをコードするヌク
レオチド配列（図１〜Ｄのアミノ酸残基６７〜２１１；配列番号２のアミノ酸残
基２７〜１７１）；（ｈ）ＴＲ９レセプター膜貫通ドメインをコードするヌクレ
オチド配列；（ｉ）ＴＲ９レセプター細胞内ドメインをコードするヌクレオチド
配列；（ｊ）全てまたは一部削除された膜貫通ドメインを有するＴＲ９レセプタ
ー細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｋ）
ＴＲ９レセプターデスドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｌ）ＴＲ９ロ
イシンジッパーをコードするヌクレオチド配列；（ｍ）ＴＲ９機能活性（例えば
、抗原性活性または生物学的活性）を有する（ｃ）のポリペプチドのフラグメン
ト；および（ｎ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（
ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）または（ｍ）におけるヌクレオ
チド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一、そし
てより好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか
、あるいはそれらからなる、単離された核酸分子を含む。これらのポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。

【００６７】 ＴＲ９レセプターポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば
、少なくとも９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは
、そのポリヌクレオチド配列が、ＴＲ９レセプターをコードする参照ヌクレオチ
ド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでのミスマッチを含み得ることを除
いて、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一であ
ることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５
％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配
列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るかまたは別のヌクレオチドで置換
され得、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオ
チドが、その参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらのミスマッチは、参照
ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、またはこれらの末端位
置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配
列内の１個以上連続した群の状態のいずれかで散在して生じ得る。参照（照会（
ｑｕｅｒｙ））配列は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）または任意のフラグメント（
例えば、本明細書に記載されるようなＴＲ９のＮ末端および／またはＣ末端欠失
のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）に示されるような全ＴＲ９ヌク
レオチド配列であり得る。

【００６８】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１
）に示されるヌクレオチド配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列に対して、少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同
一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一であるか否かは、
Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに
決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で相同性の最も高いセグメント
を見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９、１９８１）
の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が本発明に従う参照配列に
対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔま
たは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性
のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして参
照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容され
るようにパラメーターを設定する。

【００６９】 特定の実施形態では、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の
同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａ
ｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づ
くＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。同一性パーセ
ントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好まし
いパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉ
ｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、
Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ
Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌ
ｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列
の長さ（いずれかより短い方）である。この実施形態に従って、同一性パーセン
トを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短
縮を考慮しないという事実を考慮するために、対象配列が、５’または３’欠失
のために（内部欠失が理由ではなく）、照会配列より短い場合、手動の補正が結
果に対してなされる。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化され
た対象配列について、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとし
て、一致／整列されない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を
計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かの決
定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセン
トが、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定
された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに
到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的に使用されるものである
。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と一致／整列されいていな
い、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのス
コアを手動で調整する目的で算定される。例えば、９０塩基の対象配列は、同一
性パーセントを決定するために１００塩基の照会配列に整列される。欠失は、対
象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０
塩基で一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致して
いない５’および３’末端での塩基の数／照会配列の塩基の総数）を表し、その
ため１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントの
スコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同
一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩
基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、照
会と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合
、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再
び、照会配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で
補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。

【００７０】 本願は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示される核酸配列、または寄託されたｃ
ＤＮＡの核酸配列に対して、それらがＴＲ９レセプターの機能的活性を有するポ
リペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％同一
、９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９
％同一である核酸分子に関する。これらのポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチドはまた、本発明によって包含される。特定の核酸分子が、ＴＲ９
レセプター機能活性を有するポリペプチドをコードしない場合ですら、当業者は
この核酸分子を使用する方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたは
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているからであ
る。ＴＲ９レセプター機能活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核
酸分子の使用としては、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＴＲ９レセプタ
ー遺伝子またはその対立遺伝子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら（Ｈ
ｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８））
に記載されるような、ＴＲ９レセプター遺伝子の正確な染色体位置を提供するた
めの、分裂中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブ
リダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および特定の組織におけるＴＲ９
レセプターのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げられる
。

【００７１】 しかし、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示される核酸配列、または寄託されたｃ
ＤＮＡクローンの核酸配列、またはそれらのフラグメントに対して、少なくとも
８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な
配列を有する核酸分子が好ましい。これらは、事実、ＴＲ９レセプターの機能的
活性を有するポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレオチドによってコ
ードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。「ＴＲ９レセプターの機能
的活性を有するポリペプチド」によって、特定の機能アッセイ（例えば、イムノ
アッセイおよび／または生物学的アッセイ）において測定されるように、本発明
のＴＲ９レセプター（全長（すなわち、完全）タンパク質または好ましくは成熟
タンパク質）の機能活性と類似する活性（しかし、同一である必要はない）を示
すポリペプチドが意図される。例えば、ＴＲ９ポリペプチド機能活性は、本明細
書中に記載されるポリペプチド配列が完全ＴＲ９とマルチマー（例えば、ホモダ
イマーおよびホモトリマー）を形成して、そしてＴＲ９リガンド（例えば、単球
の表面上に発現されるＴＲ９リガンド）を結合する能力によって測定され得る。
ＴＲ９ポリペプチド機能活性はまた、例えば、本発明のポリペプチドが単球を活
性化する能力、単球の細胞生存を増大する能力、またはこのポリペプチドを発現
している細胞でアポトーシスを誘導する能力を決定することによって測定され得
る。これらの機能活性は、本明細書中に記載される技術および当該分野で公知の
それ以外の技術を使用して慣用的に行われ得る。

【００７２】 例えば、ＴＲ９レセプター機能活性（例えば、生物学的活性）は、本質的に以
前に記載されたように（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５〜５
１２（１９９５）；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９
５〜８（１９９５）；Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ １４：５５７９〜５５８
８（１９９５）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：
４９６１〜４９６５（１９９６））、および以下の実施例５に示されるように行
われる細胞死アッセイを使用して慣用的に測定され得る。ＭＣＦ７細胞では、全
長ＴＲ９、または候補となるデスドメイン含有レセプターをコードするプラスミ
ドが、緑色蛍光タンパク質をコードするｐＬａｎｔｅｒｎレポーター構築物とと
もに同時トランスフェクトされる。ＴＲ９をトランスフェクトされた細胞の核は
、ＤＡＰＩ染色によってアッセイされるように、アポトーシスの形態を示す。Ｔ
ＮＦＲ−１およびＦａｓ／ＡＰＯ−１（Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７
〜８２７（１９９６）；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３〜８１５（１
９９６）；Ｔｅｗａｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３２５５〜６０
（１９９５））と同様に、ＴＲ９誘導性アポトーシスは、ＩＣＥ様プロテアーゼ
のインヒビター（ＣｒｍＡおよびｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）によってブロックされる
ことが予測される。さらに、ＴＲ９により誘導されるアポトーシスは、ＦＡＤＤ
（ＦＡＤＤ−ＤＮ）またはＦＬＩＣＥのドミナントネガティブバージョン（ＦＬ
ＩＣＥ−ＤＮ／ＭＡＣＨａｌＣ３６０Ｓ）によってブロックされることが予測さ
れる。

【００７３】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡクロ
ーンの核酸配列、もしくは図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示される核酸配列、また
はそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が「
ＴＲ９レセプターの機能的活性」を有するポリペプチドをコードすることを直ち
に認識する。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペ
プチドをコードするので、多くの場合において、これは、上記のアッセイを行う
ことなく、なお当業者に明らかである。縮重改変体ではないこのような核酸分子
については、妥当な数がまたＴＲ９レセプター機能活性を有するポリペプチドを
コードすることは当該分野でさらに認識される。これは、以下に記載されるよう
に、当業者が、タンパク質機能をあまり有意にもたらすようではないまたはもた
らさないようであるかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族ア
ミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）を十分認識しているためである
。

【００７４】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関するガイダンス
は、Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇ
ｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７
：１３０６−１３１０（１９９０）に提供される。ここで、著者らは、タンパク
質がアミノ酸置換に驚くほど許容性であることを示す。

【００７５】 （ポリヌクレオチドアッセイ） 本発明はまた、相補的なポリヌクレオチドを検出するためのＴＲ９ポリヌクレ
オチド（例えば、診断試薬として）の使用に関する。機能不全と関連するＴＲ９
の変異形態の検出は、ＴＲ９またはその可溶性形態の発現の低下、過剰発現、ま
たは発現の変更から生じる、疾患（例えば、腫瘍または自己免疫疾患など）また
は疾患に対する感受性の診断を加え得るか、または定義し得る診断ツールを提供
する。

【００７６】 ＴＲ９遺伝子に変異を保有する個体は、種々の技術により、ＤＮＡレベルで検
出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組織
生検および剖検材料に由来する）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出のため
に直接使用され得るか、または分析の前に、ＰＣＲを用いることにより酵素的に
増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１９８
６））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた同じ目的のために使用され得る。例として
、ＴＲ９をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、ＴＲ９の発
現および変異を同定および分析し得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝
子型と比較した際に、増幅産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、
放射性標識されたＴＲ９ ＲＮＡまたは代替的に、放射性標識されたＴＲ９アン
チセンスＤＮＡ配列に対して、増幅されたＤＮＡがハイブリダイズすることによ
り同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融解点の差
異により一致しなかった二重鎖から区別され得る。

【００７７】 参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の差異もまた、直接的なＤＮＡ
配列決定によって示され得る。さらに、クローニングされたＤＮＡセグメントは
、特定のＤＮＡセグメントを検出するプローブとして用いられ得る。このような
方法の感度は、ＰＣＲまたは別の増幅方法の適切な使用によっておおいに増強さ
れ得る。例えば、配列決定プライマーは、改変ＰＣＲによって作製された、二本
鎖ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子を用いて使用される。配列の決定は、放射性
標識ヌクレオチドを用いる従来の手順によってか、または蛍光タグを用いる自動
配列決定手順によって行われる。

【００７８】 ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を含むか、または含まないゲ
ルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成
され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高い分解能のゲル電気泳動により可
視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメント
の移動度が、それらの特異的な融解温度または部分融解温度により異なる位置で
ゲルにおいて遅延される変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて区別され得る（例え
ば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１２４２（１９８５）を参照のこ
と）。

【００７９】 特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護、または化学切断方法）により明らかにされ得る（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：４３
９７−４４０１（１９８５））。

【００８０】 従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、ＲＮ
ａｓｅ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制
限フラグメント長多型（「ＲＦＬＰ」））、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッ
ティングのような方法により達成され得る。

【００８１】 より従来のゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、インサ
イチュ分析により検出され得る。

【００８２】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝子操作された宿主細胞、またはそうでなければ本発明のポリペプチドを
産生するように操作された宿主細胞、および組換え技術または合成技術によるＴ
Ｒ９レセプターポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。

【００８３】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含むベクター
に連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のよ
うな沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイル
スである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してインビ
トロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【００８４】 １つの実施形態において、本発明のＤＮＡは、適切な異種調節エレメント（例
えば、プロモーターまたはエンハンサー）（いくつか挙げれば、例えば、ファー
ジλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期
プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連
結される。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。

【００８５】 ベクターが発現構築物を含む実施形態において、これらの構築物はさらに、転
写開始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソ
ーム結合部位を含む。この構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は
、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるべきポリペプチドの末
端に適切に位置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。

【００８６】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌にお
いて培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適
切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細
胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８
）））；昆虫細胞（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢ
ｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上
記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。

【００８７】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＨＥ４（ＡＴＣＣ登
録番号２０９６４５（１９９８年２月２５日に寄託））、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇ
ｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ
１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；
およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、
ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を含む。好ましい真核生物ベク
ターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐ
ＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系に
おける使用のために好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐ
ＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａ
ｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰ
ＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるがこれらに限定されな
い。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。

【００８８】 宿主細胞での発現のために適切なベクターおよびプロモーターの選択は、発現
ベクターの構築についての周知の手順および要求される技術であり、宿主へのベ
クターの導入および宿主中での発現は、当該分野における慣用的な技術である。

【００８９】 本発明はまた、本明細書中に議論されるベクター構築物を含む宿主細胞に関し
、そしてさらに、当該分野で公知の技術を使用して、１以上の異種制御領域（例
えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に連結されている
、本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は、哺乳動物
細胞（例えば、ヒト由来の細胞）のような高等真核生物細胞、または酵母細胞の
ような下等真核生物細胞であり得るか、あるいは宿主細胞は、細菌細胞のような
原核生物細胞であり得る。挿入された遺伝子配列の発現を調節するか、または所
望される特定の様式で遺伝子産物を改変および処理する宿主株が、選択され得る
。特定のプロモーターからの発現は、特定のインデューサーの存在下で増強され
得；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現が、制御され得る。さらに、
異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変（
例えば、リン酸化、切断）の特徴および特異的機構を有する。適切な細胞株は、
発現される外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを保障するように選
択され得る。

【００９０】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的研究室マニュアルに記載される。

【００９１】 ＴＲ９ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出
、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマト
グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグ
ラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして精
製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が
精製のために使用される。

【００９２】 ＴＲ９ポリペプチド、および好ましくは分泌形態はまた、以下から回収され得
る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織および細胞
を含む天然の供給源から精製された産物；化学的合成手順の産物；ならびに、例
えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含
む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物。

【００９３】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核細胞
系において、ＴＲ９タンパク質を発現させるために使用される。Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素供給源として代謝し得るメチ
ル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝経路に
おける主要な工程は、Ｏ₂を使用してのホルムアルデヒドへのメタノールの酸化
である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。その唯
一の炭素供給源としてメタノールを代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓは、Ｏ₂に対するアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性に部分的に
起因して、高レベルのアルコールオキシダーゼを生成する。結果的に、主要な炭
素供給源としてメタノールに依存する増殖培地において、２つのアルコールオキ
シダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領域は、非常に活性で
ある。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されるアルコールオキシ
ダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質のうち
のおよそ３０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．５：１１１１〜２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ
５：１６７〜７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９〜７６（１９８７）。従って、ＡＯＸ１調節
配列の全てまたは一部の転写調節下の異種コード配列（例えば、本発明のＴＲ９
ポリヌクレオチドなど）は、メタノールの存在下で増殖したＰｉｃｈｉａ酵母に
おいて、並外れて高レベルで発現される。

【００９４】 １つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「Ｐｉｃｈｉａ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ」，Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）において本質的に記載されるよ
うに、Ｐｉｃｈｅａ酵母系において、本明細書中に示されるように、本発明のＴ
Ｒ９ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させるために使用される。この発現
ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、
リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターによって、本発明のＴＲ９
タンパク質の発現および分泌を可能にする。

【００９５】 多くの他の酵母ベクター（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅ
ｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、およびＰＡＯ８１５）は、当業者が容易に理解するように、提案された発現構
築物が必要とされる場合インフレームのＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌（所望さ
れる場合）などの適切に配置されたシグナルを提供する限り、ｐＰＩＣ９Ｋの代
わりに使用され得る。

【００９６】 別の実施形態において、異種コード配列（例えば、本発明のＴＲ９ポリヌクレ
オチドなど）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクタ
ー（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺａｌｐｈａなど）中にクローニングし
、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させることによって達成され
得る。

【００９７】 組換え産生手段において用いられる宿主に依存して、ＴＲ９ポリペプチドは、
グリコシル化されてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、ＴＲ
９ポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合におい
て、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コ
ドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における
翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることは当該分野において周
知である。ほとんどのタンパク質のＮ末端メチオニンもまた、ほとんどの原核生
物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生
物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存
しており、非効率的である。

【００９８】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ＴＲ９コード配列）を
欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明のＴＲ９ポリ
ヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド
配列）を含むように操作され、そして内因性のＴＲ９ポリヌクレオチドを活性化
、変更、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換
えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー
）ならびに内因性ＴＲ９ポリヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用
され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，
６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／２９４１
１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０号；
１９９４年８月４日に公開された国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌ
ｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８
９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３
５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体にお
いて参考として援用される）。

【００９９】 本発明のポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質（（異な
るタンパク質の）異種タンパク質配列へのペプチド結合を介して連結されたポリ
ペプチドを含む））で発現または合成され得、そして分泌シグナルのみならず、
さらなる異種機能領域をも含み得る。このような融合タンパク質は、当該分野に
おいて公知の方法によって、適切なリーディングフレームにおいて、本発明のポ
リヌクレオチドおよび所望のアミノ酸配列をコードする所望の核酸配列を互いに
連結させる工程、ならびに当該分野において公知の方法によって、この融合タン
パク質産物を発現させる工程により作製され得る。あるいは、このような融合タ
ンパク質は、例えば、ペプチド合成装置を使用することにより、タンパク質合成
技術によって作製され得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に、荷電ア
ミノ酸）の領域が、精製の間または引き続く取り扱いおよび保存の間の宿主細胞
における安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加さ
れ得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドに付加さ
れ得る。このような領域は、ポリペプチドの最終的な精製の前に除去され得る。
特に、分泌または排出を生じさせるため、安定性を改善するため、および精製を
容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を付加することは、当該分野でよ
く知られておりかつ慣用的な技術である。例えば、１つの実施形態において、本
発明のＴＲ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、グラム陰性細菌に
おいてこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増加するためにｐｅｌ
Ｂペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合され得る。米国特許第５，５７６，１
９５号および同第５，８４６，８１８号を参照のこと、これらの内容は、本明細
書中でその全体が参考として援用される。

【０１００】 好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来
の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応出願
２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリ
ン分子の定常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。多くの場合
、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利で
あり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰＡ ０２３２
２６２）。従って、特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｆ
ｃポリペプチド配列に融合した、配列番号２のアミノ酸残基１〜３１０を含むか
、またはそれらからなる。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、
記載される有利な様式で発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失さ
れ得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の障
害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使
用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５レセプターの
ようなヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイス
ループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。
Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８
（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９
４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。

【０１０１】 本発明のＴＲ９ポリペプチドは、天然に精製された産物、化学的合成手順の産
物、ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および
哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって
産生された産物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本
発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されていなく
てもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果とし
て、いくつかの場合において、最初の修飾されたメチオニン残基を含み得るか、
またはＮ末端メチオニンを欠き得る。。

【０１０２】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら
，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば
、本発明のＴＲ９ポリペプチド配列のフラグメントに対応するポリペプチドは、
ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミ
ノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてＴＲ９ポリペプチ
ド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれら
に限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミ
ノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈ
ｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオ
ン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシ
ン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブ
チルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フ
ルオロアミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、ｂ−メチ
ルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のア
ミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得
る。

【０１０３】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して産生さ
れ得る。この技術としては、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発技術、アラニンス
キャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位指向性変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌ
ｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照の
こと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（
１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉ
ｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（
１９８６）を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。

【０１０４】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解
切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変さ
れたＴＲ９を含む。多数の化学的改変のうちのいずれをも、以下を含むがこれら
に限定されない公知の技術によって実施され得る：ブロモシアン、トリプシン、
キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄による特異的化学的
切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝
合成；など。

【０１０５】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシン
グ）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化
学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付
加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識
、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質
の検出および単離を可能にし得る。

【０１０６】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ＴＲ９の化
学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。
誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコー
ル、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。こ
のポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所定
の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。

【０１０７】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつか
の分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示
す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の時間、（
存在する場合には）生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程
度または抗原性の欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチ
レングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例
えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２
０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５
００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９００
０、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１
２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４
，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，
０００、１７，５００、１８，０００、１８、５００、１９，０００、１９，５
００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，００
０、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００
、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、
または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。

【０１０８】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエ
チレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒ
ｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２
（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら
、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）（これら
の各々の開示が、本明細書中で参考として援用される）において記載される。

【０１０９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、例えば、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；
遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グ
ルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル基も
また、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得
る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端または
リジン基での結合である。

【０１１０】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の多くのアミノ酸
残基への連結を介して、タンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレングリ
コールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残
基、またはシステイン残基への共有結合を介して、タンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学が使用されて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、
リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）また
はタンパク質の１より多い型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン、およびそれらの組み合わせ）
にポリエチレングリコールを結合させ得る。

【０１１１】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのタンパク質（または、ポ
リペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比、行われるべきペグ
化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法が選択され得
る。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモ
ノペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末
端ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選り抜きの
タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１
級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によ
って達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた
、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。

【０１１２】 上記で示されたように、本発明のタンパク質のペグ化は、かなり多数の手段に
よって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的または介在リ
ンカーによってのいずれかで、タンパク質に結合され得る。タンパク質にポリエ
チレングリコールを結合させるためのリンカーレス（ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）系
は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉ
ｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅ
ｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４
，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８
；およびＷＯ９８／３２４６６（これらの各々の開示は、本明細書中で参考とし
て援用される）に記載される。

【０１１３】 介在するリンカーを伴わずに、タンパク質のアミノ酸残基に直接的にポリエチ
レングリコールを結合させる１つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）
ＭＰＥＧ（これは、塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＣｌＳＯ ₂ ＣＨ₂ＣＦ₃）を使用して、モノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレ
ングリコール（ＭＰＥＧ）を改変することによって生成される）を使用する。ト
レシル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応に際して、ポリエチレングリコールは、
タンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク
質と２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スル
ホニル基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって生成
されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。

【０１１４】 ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介在リンカーを使用して、タン
パク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示全
体が、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質にポリエチレングリ
コールを結合させるためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコー
ルが、リンカーによってタンパク質に結合されるタンパク質−ポリエチレングリ
コール結合体はまた、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１，１'−カルボニルジイミダゾールで活
性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネート
（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロ
フェノールカルボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような
化合物とのタンパク質の反応によって生成され得る。さらなる多くのポリエチレ
ングリコール誘導体およびタンパク質にポリエチレングリコールを結合させるた
めの反応化学が、ＷＯ９８／３２４６６（この開示全体が、本明細書中で参考と
して援用される）に記載される。本明細書中に示される反応化学を使用して生成
されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。

【０１１５】 本発明の各タンパク質に結合されたポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）もまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０またはそれより多いポリエチレングリコール分子を連結し得る。同様に、平均
の置換の程度は、タンパク質１分子あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５
〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜
１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または
１８〜２０ポリエチレングリコール部分のような範囲内である。置換の程度を決
定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において考
察される。

【０１１６】 ＴＲ９は、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈澱、酸抽出、アニオン交
換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチン
クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない公知の方法によって
、回収および精製され得る。最も好ましくは、精製のために、高速液体クロマト
グラフィー（「ＨＰＬＣ」）が使用される。

【０１１７】 ＴＲ９レセプターポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、種々の適用につい
て、特にＴＲ９の化学的および生物学的特性を利用する適用について、本発明に
従って使用され得る。これらのうちでもとりわけ、腫瘍の処置、予防、診断、お
よび／または検出における、寄生生物、細菌およびウイルスに対する耐性、Ｔ細
胞、内皮細胞および他の造血細胞の増殖を誘導すること、再狭窄、対宿主性移植
片病を処置、予防、診断および／または検出すること、抗ウイルス応答を調節す
ること、そしてアゴニストによるＴＲ９の刺激の後に特定の自己免疫疾患を予防
することにおける適用である。さらなる適用は、診断ならびに細胞、組織および
生物の障害の処置、予防、診断および／または検出に関する。本発明のこれらの
局面は、以下にさらに議論される。 （トランスジェニックおよび「ノックアウト」） 本発明のＴＲ９ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物中で発現され得
る。任意の種（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミク
ロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長類（
例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない）が
、トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施形態にお
いて、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野の公知の技術が、遺伝子治
療プロトコルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現するため
に使用される。

【０１１８】 当該分野で公知の任意の技術が、導入遺伝子（すなわち、本発明の核酸）を動
物に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するために使用され得
る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏ
ｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−
６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１
１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特
許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺
伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へ
のレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚の
エレクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−
１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（
例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照
のこと）；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞
の再移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５
７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されない。この
ような技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用される、
Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ
．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。さらに、こ
の段落に列挙された資料の各々の内容が、本明細書中でその全体が参考として援
用される。

【０１１９】 当該分野で公知の任意の技術が、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジ
ェニッククローンを作製するために使用され得、そのような技術は、例えば、徐
核した卵母細胞への、休止期に誘導された培養した、胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
）細胞由来の核、胎児細胞由来の核または成体細胞由来の核の、核移入である（
Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍ
ｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）、これらのそれぞ
れは、本明細書中で参考として援用される）。

【０１２０】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイクまたはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に選択
的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要
とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明
らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染色体部位に組み
込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手短に言えば、こ
のような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ないくつかのヌクレ
オチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介して内在性遺伝
子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機能を破壊するこ
とを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入さ
れ得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６（１
９９４））の教示に従って、導入された細胞型においてのみ内在性遺伝子が不活
化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、目的の特
定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。この段落に列挙さ
れた資料の各々の内容が、本明細書中でその全体が参考として援用される。

【０１２１】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素
ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得
る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特
異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。

【０１２２】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがこれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。

【０１２３】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、ＴＲ９ポリペプ
チドの生物学的機能の詳述、異常なＴＲ９発現に関連する状態および／または障
害の研究、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物に
ついてのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用
途を有する。

【０１２４】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のタンパク質を発現するために遺
伝子操作される細胞、あるいは本発明のタンパク質を発現しないように遺伝子操
作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。このよ
うな細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから
入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細
胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞を、
例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝
子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラス
ミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームな
どの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペ
プチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／または
本発明のポリペプチドに結合しているコード配列および／または内因性の調節配
列を破壊するために、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する
。本発明のポリペプチドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導
性プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明の
ポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチド
を発現および好ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、ま
たは腹腔内で患者中へ全身的に導入し得る。あるいは、この細胞をマトリックス
に組み込み得、そして身体に移植し得る（例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を
皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片
または脈管移植片の一部として移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国
特許第５，３９９，３４９号；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、
米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中で
その全体が参考として援用される）。

【０１２５】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。

【０１２６】 （ＴＲ９レセプタータンパク質およびフラグメント） 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリぺプチ
ド配列を含むタンパク質を提供する。

【０１２７】 本発明のＴＲ９タンパク質は、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマ
ー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、
本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のＴＲ９タンパク質、それらの調
製ならびにそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する。特定の実
施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテ
トラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダ
イマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。

【０１２８】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のＴＲ９タンパク質（
本明細書中に記載されるＴＲ９フラグメント、改変体、および融合タンパク質を
含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるポ
リぺプチド配列を有するＴＲ９タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、本
発明のホモマーは、同一のポリぺプチド配列を有するＴＲ９タンパク質のみを含
むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるポ
リぺプチド配列を有するＴＲ９タンパク質を含むマルチマーである。特定の実施
形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるポ
リぺプチド配列を有するＴＲ９タンパク質を含む）あるいはホモトリマー（例え
ば、同一または異なるポリぺプチド配列を有するＴＲ９タンパク質を含む）であ
る。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモ
ダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。

【０１２９】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＴＲ９タンパク
質に加えて異種タンパク質（すなわち、ＴＲ９遺伝子によりコードされるペプチ
ド配列に対応しないポリぺプチド配列のみを含むタンパク質）を含むマルチマー
をいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロ
トリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のヘテ
ロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマー
または少なくともヘテロテトラマーである。

【０１３０】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のタンパク質が溶液中で互いに
接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（例
えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のタンパク質が
、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質におけ
る異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他
の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のＴＲ９タンパク質との、およ
び／または本発明のＴＲ９タンパク質間での共有結合によって形成される。この
ような共有結合は、タンパク質のポリぺプチド配列（例えば、配列番号２に記載
されるポリぺプチド配列）に含まれるか、または寄託されたｃＤＮＡクローンに
よってコードされるポリペプチドに含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。
１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプ
チドにおいて相互作用するタンパク質のポリペプチド配列内に存在するシステイ
ン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換
え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ＴＲ９融合タンパク質
中の異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。
１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（
例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この
共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＴＲ９−Ｆｃ融合タン
パク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク
質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のＴＮＦファミリーリ
ガンド／レセプターメンバー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐ
ｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例えば、国
際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考
として援用される）を参照のこと）。

【０１３１】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。
例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質は、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的に
架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは本明細書中で
その全体が参考として援用される）を参照のこと）さらに、本発明のマルチマー
は、当該分野で公知の技術を使用して生成されて、マルチマー中に含まれること
が所望されるタンパク質のポリぺプチド配列内に位置するシステイン残基間に、
１つ以上の分子間架橋を形成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号
（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。さ
らに、本発明のタンパク質は、このタンパク質のポリぺプチド配列のＣ末端また
はＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加により慣用的に改変され得、当該
分野で公知の技術が、１つ以上のこれらの改変されたタンパク質を含むマルチマ
ーを生成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（
これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さらに
、当該分野で公知技術は、本発明のマルチマーに含まれることを所望されるタン
パク質成分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、米国特許
第５，４７８，９２５号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される
）を参照のこと）。

【０１３２】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるタンパク質
は、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術
を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用さ
れる、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、
本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列
に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプチ
ドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結
することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、
本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、
膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得
る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体が
参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。

【０１３３】 １つの実施形態では、本発明は、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミ
ノ酸配列、もしくは図１Ａ−Ｄ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する単離され
たＴＲ９タンパク質、または上記ポリペプチドの一部（すなわち、フラグメント
）を含むか、あるいはそれらから構成されるポリペプチドを提供する。

【０１３４】 本発明のポリぺプチドフラグメントは、以下を含むか、またあるいは以下から
なる、ポリぺプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ酸配列、寄託されたク
ローン内に含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託さ
れたクローンに含まれるヌクレオチド配列に（例えば、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミ
ノ酸配列か、または図１Ａ−Ｄ（配列番号１）に示されるアミノ酸配列か、また
はそれらの相補鎖。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａ
ｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（そのフラグ
メントが、部分または領域を、最も好ましくは単一の連続した領域として形成す
る）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、
例えば、以下を含むかあるいは以下からなる、フラグメントが挙げられる：配列
番号２のコード領域のアミノ酸残基およそ−４０〜１、１〜２０、２１〜４０、
４１〜６０、６１〜８３、８４〜１００、１０１〜１２０、１２１〜１４０、１
４１〜１６０、１６０〜１６７、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２
２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、２８１〜３１０、３
１１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５５１〜６
００、または６００〜最後。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドはまた、本発明に含まれる。この文脈における、「およそ」とは、いずれかの
末端もしくは両末端において、特に列挙された範囲のいくつか（５、４、３、２
もしくは１）のアミノ酸だけ大きいか、もしくは小さい範囲を含む。さらに、ポ
リぺプチドフラグメントは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸
長であり得る。この文脈における、「およそ」とは、いずれかの末端もしくは両
末端において、特に列挙された値のいくつか（５、４、３、２もしくは１）のア
ミノ酸だけ大きいか、もしくは小さい値を含む。

【０１３５】 特定の実施形態において、本発明のポリぺプチドフラグメントは、以下を含む
か、またあるいは以下からなる：配列番号２に示されるアミノ酸残基４０〜４８
、４０〜５１、５１〜６６、６６〜７３、７３〜８３、８３〜１０４、１０４〜
１１０、１１０〜１２８、１２８〜１４６、１４６〜１５２、４０〜１５２、お
よび／または２８〜１７１。これらのポリぺプチドをコードするポリヌクレオチ
ドはまた本発明に含まれる。

【０１３６】 本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、以下の群から選択されるメン
バーを含む：ＴＲ９レセプター細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基およ
そ１〜およそ３１０を構成すると推定される）を含むか、あるいはそれらからな
る、ポリペプチド；ＴＲ９の４つのＴＮＦＲ様システインリッチモチーフ（図１
Ａ〜Ｄのアミノ酸残基６７〜２１１；配列番号２のアミノ酸残基２７〜１７１）
を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド；ＴＲ９レセプター膜貫通ド
メイン（配列番号２のアミノ酸残基およそ３１１〜およそ３２７を構成すると推
定される）を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド；推定成熟ＴＲ９
ポリペプチドのフラグメントを含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド
（ここで、そのフラグメントは、ＴＲ９機能活性（例えば、抗原性活性もしくは
生物学的活性）を有する）；ＴＲ９レセプター細胞内ドメイン（配列番号２のア
ミノ酸残基およそ３２８〜およそ６１５を構成すると推定される）を含むか、あ
るいはそれらからなる、ポリペプチド；欠失した膜貫通ドメインの全てか、もし
くは部分を有する、ＴＲ９レセプター細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含
むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド；ＴＲ９レセプターデスドメイン
（配列番号２のアミノ酸残基およそ３８９〜およそ４５５を構成すると推定され
る）を含むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチド；およびＴＲ９レセプタ
ータンパク質の１、２、３、４個以上のエピトープ保有部分を含むか、あるいは
それらからなる、ポリペプチド。さらなる実施形態において、本発明のポリペプ
チドフラグメントは、上記のメンバーの１、２、３、４、５、６、７または８個
全ての任意の組み合わせを含むか、あるいはそれらからなる。上記のように、リ
ーダー配列と共に、ＴＲ９レセプター細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細
胞内ドメインを構成するアミノ酸残基がコンピュータ分析によって推定される。
従って、当業者が理解するように、これらのドメインを構成するアミノ酸残基は
、各ドメインを定義するために使用される判定基準に依存して、わずかに変動し
得る（例えば、およそ１〜およそ１５アミノ酸残基）。これらのポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる。

【０１３７】 上記で議論されるように、ＴＲ９の一つ以上の４つの細胞外システインリッチ
モチーフが、ＴＲ９とそのリガンドとの間の相互作用のために重要であると考え
られる。従って、好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメン
トは、配列番号２のアミノ酸残基２７〜６５、６６〜１０５、１０６〜１４５お
よび／または１４６〜１７１を含むか、あるいはそれらからなる。これらのポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明の含まれる。本発明のさ
らなる実施形態は、図１Ａ〜Ｄおよび図４Ｂに開示される、１、２、３、または
４個全ての細胞外システインリッチモチーフの任意の組み合わせを含むか、ある
いはそれらからなる、ポリペプチドに関する。

【０１３８】 とりわけ、特に好ましい本発明のフラグメントは、ＴＲ９の構造的特性もしく
は機能的特性を含むか、あるいはそれらからなる、フラグメントである。そのよ
うなフラグメントは、ＴＲ９のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（
「α領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β領域」）、ターンお
よびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイ
ル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面
形成領域、および高抗原性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロ
グラムのデフォルトパラメータを使用して同定されるように、１．５以上の抗原
性指標を有するアミノ酸残基を構成するポリペプチドの領域）を含むアミノ酸残
基を含む。特定の好ましい領域は、図３および表１に開示される領域であり、そ
して、図１Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の
領域を含むが、それらに限定されず、そのような好ましい領域としては、これら
のコンピュータプログラムのデフォルトパラメーターを使用して推定されるよう
な、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ推定α領域、β領域、ターン領域、およびコ
イル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ推定α領域、β領域、ターン領域およびコイ
ル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ推定親水性領域および疎水性領域；Ｅｉ
ｓｅｎｂｅｒｇ α両親媒性領域およびβ両親媒性領域；Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃ
ｈｕｌｚ可撓性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌ
ｆ高抗原性指標領域が挙げられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドはまた、本発明により含まれる。

【０１３９】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドの１、２、３、４、５個
以上のエピトープ保有部分を含むか、あるいはそれらからなる、ペプチドもしく
はポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本明細書中
に記載されるポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである
。「免疫原性エピトープ」は、そのタンパク質全体が免疫原である場合、抗体応
答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体が結合し得るタン
パク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。タンパク質の免
疫原性エピトープの数は、一般的に抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば
、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３
９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。

【０１４０】 抗原性エピトープ（すなわち、抗体が結合し得る、タンパク質分子の領域を含
む）を保有するペプチドもしくはポリペプチドの選択については、タンパク質配
列の部分を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣したタンパク質と
反応する抗血清を慣用的に誘発し得るということが当該分野において周知である
。例えば、Ｊ．Ｇ．ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ
Ｒｅｚｃｔ Ｗｉｔｈ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｓｉｔｅ ｏｎ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照
のこと。タンパク質反応性抗血清を誘発し得るペプチドは、しばしは、タンパク
質の一次配列において表わされ、１セットの単純な化学的ルールによって特徴付
けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性
エピトープ）またはアミノ末端もしくはカルボキル末端のいずれに対しても限定
されない。

【０１４１】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ本発
明のポリペプチドと特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７
８（１９８４）の７７７を参照のこと。本発明の抗原性エピトープ保有ペプチド
およびポリペプチドは、好ましくは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に
含まれる、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個および最も好ましく
は少なくともおよそ１５〜３０個のアミノ酸の配列を含む。

【０１４２】 ＴＲ９レセプター特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチ
ドもしくはペプチドの非限定例としては、配列番号２におけるアミノ酸残基およ
そ４〜およそ８、配列番号２におけるアミノ酸残基およそ１１６〜およそ２７１
、配列番号２におけるアミノ酸残基およそ２８３〜およそ３０８、配列番号２に
おけるアミノ酸残基およそ３３６〜およそ３７２、配列番号２におけるアミノ酸
残基およそ３９３〜およそ４３４、配列番号２におけるアミノ酸残基およそ４４
５〜およそ５５９、および配列番号２におけるおよそ５７１〜およそ５８８を含
むか、あるいはそれらからなる、ポリペプチドが挙げられる。この文脈における
、「およそ」とは、いずれかの末端もしくは両末端において、特に列挙された範
囲のいくつか（５、４、３、２もしくは１）のヌクレオチドだけ大きいか、もし
くは小さい範囲を含む。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラ
グメントはＴＲ９レセプタータンパク質の抗原性領域であるということを決定し
た。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により
含まれる。

【０１４３】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
よって産生され得る。Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｈｅｓ
ｉｓ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉ
ｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１
−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｉｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈ
ｔｅｎらに対する米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）にさらに記載さ
れる。

【０１４４】 当業者が理解するように、上記の本発明のＴＲ９レセプターポリペプチドおよ
びそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域の
部分と結合され得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、
精製を促進させて、そしてインビボで増大した半減期を示す。これは、例えば、
ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリン
の重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質につ
いて示される（ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分に起因するジスルフィド結
合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ＴＲ９タンパク質もしくは
タンパク質フラグメント単独よりも、他の分子と結合しそして中和する際に、よ
り効率的であり得る（Ｆｏｕｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０
：３９５８−３９６４（１９９５））。

【０１４５】 ＴＲ９ポリペプチドの特徴を改善するか、または変更するために、タンパク質
工学が使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を使用して、新規な変異
体タンパク質または１個もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タ
ンパク質を含むムテインを作製し得る。そのような改変ポリペプチドは、例えば
増強した活性もしくは増大した安定性を示し得る。さらに、それらは、少なくと
も特定の精製条件および保存条件下において、より高い収率で精製され得、そし
て対応する天然のポリペプチドよりも良好な溶解性を示し得る。多くのタンパク
質（膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態を含む
）について、一つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的欠如を伴わずにＮ末
端もしくはＣ末端から欠失され得るということが当該分野において公知である。
しかし、タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端からの一つ以上のアミノ酸の欠失が
、そのタンパク質の一つ以上の生物学的機能の改変または欠如を生じる場合でさ
えも、他のＴＲ９機能活性はなおも保持され得る。例えば、多くの場合において
、ＴＲ９を認識する抗体（好ましくは、ＴＲ９と特異的に結合する抗体）を誘導
および／または結合する短くされたタンパク質の能力は、欠失のサイズまたは位
置に無関係に保持される。実際、わずか６個のＴＲ９アミノ酸残基からなるポリ
ペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。完全タンパク質のＮ末端および／
またはＣ末端残基を欠如する特定のポリペプチドがそのような免疫活性を保持す
るか否かは、本明細書に記載される慣用的な方法および当該分野において公知の
他の方法によって、容易に決定され得る。

【０１４６】 上記のように、タンパク質のＮ末端からの一つ以上のアミノ酸の欠失が、その
タンパク質の一つ以上の生物学的機能の改変もしくは欠如を生じる場合において
さえも、他の機能活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、ＴＲ９リガ
ンドに結合する能力）は、なおも保持され得る。例えば、完全もしくは成熟ポリ
ペプチドの過半数未満の残基が、Ｎ末端から除去される場合、ポリペプチドの完
全形態もしくは成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、短くさ
れたＴＲ９ムテインの能力は、一般的に保持される。完全ポリペプチドのＮ末端
残基を欠如する特定のポリペプチドが、そのような免疫活性を保持するか否かは
、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野において公知の他の方法
によって容易に決定され得る。おそらく、多数の欠失Ｎ末端アミノ酸残基を有す
るＴＲ９ムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫活性を保持し得る。実
際、わずか６個のＴＲ９アミノ酸残基からなるペプチドが、しばしば免疫応答を
惹起し得る。

【０１４７】 従って、一つの実施形態において、本発明は、図１Ａ−Ｄ（配列番号２）に示
されるＴＲ９ポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードさ
れるＴＲ９ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端から欠失された一つ以上の
残基を有するポリペプチドをさらに提供する。特に、一つの実施形態において、
ＴＲ９ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ〜６１５により記載され得、ここ
でｍは、配列番号２において同定されるアミノ酸の位置に対応する−３９〜６１
４の数であり、そして好ましくは、本明細書中で特定されるＮ末端欠失にて同定
されるＮ末端アミノ酸残基の一つに対応する。特定の実施形態において、本発明
のＴＲ９ポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号２の以下のアミノ酸残基：

【０１４８】

【化１】 を含むか、あるいはそれらからなる。これらのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドはまた、本発明により含まれる。本発明はまた、上記のＴＲ９ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％
、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレ
オチド配列を含むか、あるいはそれらか構成される核酸分子、およびそれらによ
ってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド
配列に融合した上記ポリヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペ
プチドを含む。

【０１４９】 別の実施形態において、ＴＲ９ポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号２に同
定されるアミノ酸に対応する、一般式ｍ〜３１０（ここで、ｍは、４０〜３０９
の数である）によって記載され得る。特定の実施形態において、本発明のＴＲ９
のＮ末端欠失は、以下のアミノ酸残基を含むか、あるいは以下からなる：

【０１５０】

【化２】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。
本発明はまた、上記のＴＲ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と
少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらから
なる、核酸分子、ならびにそれらによってコードされるポリペプチドに関する。
本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポリヌクレオチド配
列ならびにそれらによってコードされるポリペプチドを含む。

【０１５１】 また、上記のようにタンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の喪失を改変するとしても、他の機能的活
性（例えば、生物学的活性、多量化する能力、ＴＲ９リガンドを結合する能力）
は依然として保持され得る。例えば、短縮化ＴＲ９ムテインが、このポリペプチ
ドの完全なまたは成熟の形態を認識する抗体を誘導および／または結合する能力
は、一般に、この完全なまたは成熟したポリペプチドの大部分よりも少ない残基
がＣ末端から除去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を
欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細
書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により
容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するＴＲ９ムテイ
ンがいくらかの生物学的または免疫学的活性を維持し得ることはありそうでない
。実際、上で議論されるように、６ ＴＲ９アミノ酸残基ほどの少ないＴＲ９ア
ミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。

【０１５２】 従って、本発明のさらなる実施形態は、配列番号２に同定されるアミノ酸残基
の位置に対応する、そして好ましくは、本明細書中に詳細されるＣ末端欠失にお
いて同定されるＣ末端アミノ酸残基の１つに対応する、一般式１〜ｎ（ここで、
ｎが２〜６１４の数である）によって記載されるＴＲ９ポリペプチドのＣ末端欠
失に関する。特定の実施形態において、本発明のＴＲ９ポリペプチドのＣ末端欠
失は、以下のアミノ酸残基を含むか、あるいは以下からなる：

【０１５３】

【化３】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。
本発明はまた、上記のＴＲ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と
少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらから
なる、核酸分子、ならびにそれらによってコードされるポリペプチドに関する。
本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポリヌクレオチド配
列ならびにそれらによってコードされるポリペプチドを含む。

【０１５４】 本発明のさらなる実施形態は、一般式ｍ〜ｎ（ここで、ｍおよびｎは、それぞ
れこれらの記号について上で詳細されたアミノ酸残基の任意の１つに対応する）
によって記載されるアミノ酸を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドフ
ラグメントに関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもま
た、本発明に含まれる。

【０１５５】 しかし、多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可
能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列
のいくつかは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能で
あったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本
発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。同
様に、好ましくは、本発明からは、一般式ａ¹−ｂ¹により記載されるヌクレオチ
ド配列（ここで、ａ¹は配列番号１の１〜３４３７の任意の整数であり、ｂ¹は１
５〜３４５２の整数であり、ここでａ¹およびｂ¹の両方は配列番号１に示される
ヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂ¹はａ¹＋１４以上である）を
含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。

【０１５６】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ未満、２
００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、１５ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、
または７．５ｋｂ未満の長さである。さらなる実施形態においては、本発明のポ
リヌクレオチドは、ＴＲ９コード配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチド
を含むが、いかなるＴＲ９イントロンの全てまたは一部も含まない。別の実施形
態においては、ＴＲ９コード配列を含む核酸は、ゲノムの隣接遺伝子のコード配
列（すなわち、ゲノムにおけるＴＲ９遺伝子に対する５’または３’）を含まな
い。

【０１５７】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１００，０００ｋｂ
長未満、５０，０００ｋｂ長未満、１０，０００ｋｂ長未満、１，０００ｋｂ長
未満、５００ｋｂ長未満、４００ｋｂ長未満、３５０ｋｂ長未満、３００ｋｂ長
未満、２５０ｋｂ長未満、２００ｋｂ長未満、１７５ｋｂ長未満、１５０ｋｂ長
未満、１２５ｋｂ長未満、１００ｋｂ長未満、７５ｋｂ長未満、５０ｋｂ長未満
、４０ｋｂ長未満、３０ｋｂ長未満、２５ｋｂ長未満、２０ｋｂ長未満、１５ｋ
ｂ長未満、１０ｋｂ長未満、７．５ｋｂ長未満、または５ｋｂ長未満である。

【０１５８】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ９コード配列
の少なくとも１５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００
個、または少なくとも２５０個、少なくとも５００個、または少なくとも１００
０個連続するヌクレオチドを含むが、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示される５
’コード配列または３’コード配列に隣接するゲノムＤＮＡの１０００ｋｂ以下
、５００ｋｂ以下、２５０ｋｂ以下、２００ｋｂ以下、１５０ｋｂ以下、１００
ｋｂ以下、７５ｋｂ以下、５０ｋｂ以下、３０ｋｂ以下、２５ｋｂ以下、２０ｋ
ｂ以下、１５ｋｂ以下、１０ｋｂ以下、または５ｋｂ以下からなる。さらなる実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ９コード配列の少なくとも
１５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、または少
なくとも２５０個、少なくとも５００個、または少なくとも１０００個連続する
ヌクレオチドを含むが、任意のＴＲ９イントロンの全てまたは一部を含まない。
別の実施形態において、ＴＲ９コード配列を含む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（す
なわち、ゲノムにおけるＴＲ９遺伝子に対して５’または３’）のコード配列を
含まない。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００個よ
り多く、５００個より多く、２５０個より多く、１００個より多く、５０個より
多く、２５個より多く、２０個より多く、１５個より多く、１０個より多く、５
個より多く、４個より多く、３個より多く、２個より多く、または１個より多く
のゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。

【０１５９】 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、ま
たは図１Ａ〜１Ｄのアミノ酸配列（配列番号２）または上記ポリペプチドの一部
を含むペプチドまたはポリペプチドを有する単離されたＴＲ９ポリペプチドを提
供する。

【０１６０】 本発明のポリペプチドは、膜結合され得るか、可溶性の循環形態であり得る。
可溶性のペプチドは、膜貫通ドメインを欠失するポリペプチド配列を含むか、ま
たはこれらからなる、アミノ酸配列によって規定される。

【０１６１】 本発明のポリペプチドは、膜貫通領域および細胞内領域および細胞外領域を有
する膜結合レセプターとして存在するか、またはそれらは、膜貫通ドメインが欠
失している可溶性形態で存在し得る。ＴＲ９レセプターのこのような形態の一つ
の例は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＴＲ９レセプターであり、これ
は、リーダー配列に加えて、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインおよび細胞外ドメ
インを含む。このように、ＴＲ９レセプターのこの形態は、このタンパク質を発
現する細胞の細胞質膜に局在化されるようである。

【０１６２】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメント（すなわち本明
細書中に記載されるもの）は、６１０以下、６００以下、５８０以下、５７０以
下、５５０以下、５２５以下、５００以下、４７５以下、４５０以下、４００以
下、４２５以下、３９０以下、３８０以下、３７５以下、３５０以下、３３６以
下、３３４以下、３３１以下、３０５以下、３００以下、２９５以下、２９０以
下、２８５以下、２８０以下、２７５以下、２６０以下、２５０以下、２２５以
下、２００以下、１８５以下、１７５以下、１７０以下、１６５以下、１６０以
下、１５５以下、１５０以下、１４５以下、１４０以下、１３５以下、１３０以
下、１２５以下、１２０以下、１１５以下、１１０以下、１０５以下、１００以
下、９０以下、８０以下、７５以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下
、または２５以下のアミノ酸残基長である。

【０１６３】 ＴＲ９レセプターのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能
に対して有意な効果を有さないで変化され得ることが当該分野で認識される。配
列におけるこのような差が考慮される場合、活性を決定するタンパク質の重要な
領域が存在することを記憶しておくべきである。従って、本発明は、さらに、実
質的なＴＲ９レセプター機能活性（例えば、生物学的活性）を示すか、または本
明細書中で議論されるタンパク質部分のようなＴＲ９レセプターポリペプチドの
領域を含むＴＲ９レセプターの改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入
、逆位、反復、およびタイプ置換を含む。上記のように、アミノ酸変化が表現型
的にサイレントであるようなものに関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、
「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕ
ｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１
９９０））に見出され得る。

【０１６４】 特に興味深いのは、非常に望ましい改善された特徴（例えば、凝集が少ないこ
と）を有するタンパク質を産生し得る、他の荷電アミノ酸または中性アミノ酸で
の荷電アミノ酸の置換である。凝集は、活性を減少させ得るだけでなく、薬学的
処方物を調製する場合に問題があり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得
るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：
３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８
３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３
７７（１９９３）。

【０１６５】 従って、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）、または寄託されたｃＤＮＡによりコード
されるポリヌクレオチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）ア
ミノ酸残基の１つ以上が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好まし
くは保存アミノ酸残基、そしてより好ましくは、少なくとも１つ、しかし１０未
満の保存されたアミノ酸残基）で置換されたものであっても良いし、そしてこの
ような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであっ
ても、もしくはそうでなくてもよく、または（ｉｉ）アミノ酸残基の１つ以上が
置換基を含むものであってもよく、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリ
ペプチドの半減期を延長する化合物のような別の化合物（例えば、ポリエチレン
グリコール）と融合されたものでもよく、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成
熟ポリペプチド（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列も
しくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に
使用される配列）と融合されたものでもよい。このようなフラグメント、誘導体
およびアナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされ
る。

【０１６６】 格別興味深いことは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸、および中
性または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、タンパク質において低
下した正電荷を生じて、ＴＲ９レセプターの特性を改善する。凝集の阻止は、非
常に所望される。タンパク質の凝集は、薬学的処方物を調製する場合、活性を減
じるのみでなく、問題でもあり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得るか
らである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３
１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８
〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７〜３７７
（１９９３））。

【０１６７】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、ＴＮ
Ｆ−αの、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型の１つのみへの選択的結合を生じ
る特定の変異を記載している。従って、本発明のＴＲ９レセプターは、天然の変
異か、またはヒトの操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、欠失または
付加を含み得る。

【０１６８】 示されるように、変化は好ましくはわずかな性質の変化、例えば、タンパク質
の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換である（表ＩＩを
参照のこと）。

【０１６９】

【表２】 特定の実施形態において、図１Ａ〜Ｄのアミノ酸配列、および/または本明細
書中に記載の任意のポリペプチドフラグメント（例えば、細胞外ドメインまたは
細胞内ドメイン）における置換、付加または欠失の数は、７５、７０、６０、５
０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３
、２、１、あるいは３０〜２０、２０〜１５、２０〜１０、１５〜１０、１０〜
１、５〜１０、１〜５、１〜３または１〜２である。

【０１７０】 ＴＲ９タンパク質中の、機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的変異誘発ま
たはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で公知の方法によって同
定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４
：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中の全ての残基で単
一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生物学的活性、
例えば、レセプター／リガンド結合またはインビトロ増殖、および/または単球
における活性化活性について試験される。リガンド−レセプター結合のために重
要な部位もまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造解析に
よって決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−
９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−
３１２（１９９２））。

【０１７１】 さらに、ＴＲ９ポリペプチドの特徴を改善または改変するために、タンパク質
操作を用い得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、新規な変異体タンパク質
または単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加を含むムテイン、または融
合タンパク質を作製するために用いられ得る。このような改変されたポリペプチ
ドは、例えば、増強された活性または増加した安定性を示し得る。さらに、これ
らは、高収量で精製され得、そして少なくとも特定の精製条件および保存条件下
で対応する天然のポリペプチドよりも良好な溶解度を示し得る。

【０１７２】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され
得る。これらの技術としては、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキ
ャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅ
ｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこ
と）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１
９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏ
ｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９
８６）を参照のこと）変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。

【０１７３】 従って、本発明はまた、選択された宿主細胞において、発現、スケールアップ
などにより発現により適したＴＲ９ポリペプチドを生成するために、欠失、付加
または置換された１以上のアミノ酸残基を有する、ＴＲ９の誘導体およびアナロ
グを含む。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を除去するために欠失
され得るか、または別のアミノ酸残基で置換され得る；Ｎ結合型グリコシル化部
位は、例えば、Ｎ結合部位を高グリコシル化する（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌ
ａｔｅ）ことが公知である酵母宿主から、より容易に回収および精製される均質
な産物の発現を達成するために、改変または除去され得る。この目的のために、
本発明のＴＲ９ポリペプチドの任意の１以上のグリコシル化認識配列上の第１ま
たは第３のアミノ酸位置の一方あるいは両方での種々のアミノ酸置換、および／
または任意の１以上のこのような認識配列の第２位でのアミノ酸欠失は、その改
変トリペプチド配列でのＴＲ９ポリペプチドのグリコシル化を妨げる（例えば、
Ｍｉｙａｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ ５（６）：１１９３−１１９７を参照のこ
と）。

【０１７４】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリン
グ」といわれる）の技術を用いて、ＴＲ９の活性を調節し得、これにより、ＴＲ
９のアゴニストおよびアンタゴニストを効率良く生成し得る。一般には、米国特
許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２
１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびに
Ｐａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ
．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならび
にＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各
々が本明細書により参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態にお
いて、ＴＲ９のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの改変は、ＤＮＡ
シャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまた
は部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメントを所望のＴＲ９分子へ
とアセンブルすることを含む。別の実施形態において、ＴＲ９のポリヌクレオチ
ドまたはその対応するポリペプチドは、組換え前に、誤りがちのＰＣＲ、ランダ
ムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダム変異誘発に供されることに
よって改変され得る。別の実施形態において、ＴＲ９の１つ以上の成分、モチー
フ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の
、１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなど
と組み換えられ得る。好ましい実施形態では、例えば、異種分子としては以下が
挙げられるがこれらに限定されない：ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ
−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−
βの状態で見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ
４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ
９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩ
Ｍ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイン−α（国際公開番号
ＷＯ９８／０７８８０）、ニュートロカイン−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８
９２１）、ＯＰＧ、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性
形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０、可溶性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣ
Ｄ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９
０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号
ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ
７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ１０（国際公開番
号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）
、ＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、ＴＲ１１ＳＶ２、ＴＲ１２、およびＴＲＦ−Ｒ１
、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３／ＡＰＯ−３／ＷＳＬ／ＬＡＲＤ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／Ｄ
Ｒ４／ＡＰＯ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５、ＤｃＲ１／ＴＲＡＩＬ−Ｒ３／
ＴＲＩＤ／ＬＩＴ、ＤｃＲ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＣＡＤ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡ
ＭＰ、ｖ−ＦＬＩＰ。

【０１７５】 さらに好ましい実施形態では、異種分子はＴＮＦファミリーの任意のメンバー
である。

【０１７６】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供される。「単離された
ポリペプチド」によって、そのネイティブな環境から取り出されたポリペプチド
が意図される。従って、組換え宿主細胞中で産生され、そして／またはその中に
含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。組換
え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドもまた、「単離さ
れたポリペプチド」として意図される。例えば、ＴＲ９レセプターポリペプチド
の組換え産生されたバージョンが、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｇｅｎｅ
６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程の方法によって実質的に精
製され得る。

【０１７７】 本発明のポリペプチドは、以下を含む：リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドを含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド
；リーダーを含まない寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド
（すなわち、成熟タンパク質）を含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド
；配列番号２のアミノ酸およそ−４０〜およそ６１５を含むか、またはこれらか
らなる、ポリペプチド；配列番号２のアミノ酸およそ−３９〜およそ６１５を含
むか、またはこれらからなる、ポリペプチド；配列番号２のアミノ酸およそ１〜
およそ６１５を含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド；細胞外ドメイン
を含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド；ＴＲ９の４つのＴＮＦＲ様シ
ステインリッチモチーフ（図１Ａ〜Ｄのアミノ酸残基６７〜２１１；配列番号２
のアミノ酸残基２７〜１７１）を含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド
；膜貫通ドメインを含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド；細胞内ドメ
インを含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド；膜貫通ドメインの全てま
たは一部を除去された細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むか、またはこ
れらからなる、ポリペプチド；デスドメイン（図１Ａ〜Ｄのアミノ酸残基４２９
〜４９５；配列番号２のアミノ酸残基３８９〜４５５）を含むか、またはこれら
からなる、ポリペプチド；および/またはＴＲ９ロイシンジッパー（図１Ａ〜Ｄ
のアミノ酸残基４９７〜５１８；配列番号２のアミノ酸残基４５７〜４７８）を
含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに
対して少なくとも８０％同一、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％また
は９５％同一、なおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または
９９％同一である、ポリペプチド。そして、本発明のポリペプチドは、少なくと
も３０アミノ酸、そしてより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸を有するこの
ようなポリペプチドの一部もまた含む。これらのポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１７８】 ＴＲ９レセプターポリペプチドの参照アミノ酸配列に、例えば、少なくとも９
５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列が
、ＴＲ９レセプターの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸ごとに５つまでのア
ミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、参照
配列に同一であることが意図される。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくと
も９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のア
ミノ酸残基の５％までが、欠失または、別のアミノ酸で置換され得るか、または
参照配列の合計アミノ酸残基の５％までの幾らかのアミノ酸が、その参照配列に
挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置
かまたはカルボキシ末端位置でか、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ
得、参照配列の残基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続する群とし
てかのいずれかで間に散在する。

【０１７９】 実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１Ａ〜Ｄ（配
列番号２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンにより
コードされるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９
５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含むか、寄託され
たｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列であるか、またはこれらの
フラグメントであるか否かは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８
ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ
ｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコン
ピュータープログラムを使用して従来のように決定され得る。特定の配列が、本
発明に従う参照配列に、例えば９５％同一か否かを決定するために、ＢＥＳＴＦ
ＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用する場合、もちろん、
参照アミノ酸配列の全長に渡って同一性の百分率が算出されるように、そして参
照配列中のアミノ酸残基の合計の数の５％までの相同性のギャップが許容される
ように、パラメーターは設定される。

【０１８０】 特定の実施形態において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配
列との間の同一性（全体的配列整列もいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍ
ｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズム
に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。ＦＡ
ＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｐ
ＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ
（どちらかより短い方）である。この実施形態に従うと、対象配列が、Ｎ末端ま
たはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い
場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に
、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないという事実を考慮して、
手動の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対する、Ｎ末端およびＣ
末端で短縮されている対象配列についての、同一性パーセントは、問い合わせ配
列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配
列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによっ
て補正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列
整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセント
から差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを
使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的
な同一性パーセントのスコアは、この実施形態の目的で使用されるものである。
問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基
のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。
すなわち、問い合わせ残基位置のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端
残基の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセ
ントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配
列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０
残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致して
いないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表
し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのス
コアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的
な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、
１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり
、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の
残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセン
トは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合
わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみ
が手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的のためにはなされ
ない。

【０１８１】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を使用する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおける分子量マーカー、および本発明の
ポリペプチドに結合する抗体を産生させるための供給源を含むが、これに限定さ
れない用途を有する。

【０１８２】 本願はまた、ｍ−ｎとして本明細書中で示されるＴＲ９ポリペプチド配列に、
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９
９％同一なポリペプチドを含むタンパク質に関する。好ましい実施形態では、本
願は、本明細書中に列挙される特定のＴＲ９のＮ末端欠失および/またはＣ末端
欠失のアミノ酸配列を有するアミノ酸に、少なくとも８０％、８５％、９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリペプチドを含むタンパ
ク質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明に含まれる。

【０１８３】 特定の好ましい実施形態では、本発明のＴＲ９タンパク質は、上記のような融
合タンパク質を含むか、またはこれらからなる。ここで、融合タンパク質のＴＲ
９ポリペプチド成分は、ｍ−ｎとして本明細書中に示されるポリペプチド配列の
１つである。好ましい実施形態では、本発明のＴＲ９ポリペプチドに相同である
融合タンパク質のポリペプチド配列成分は、本明細書中に列挙される特定のＮ末
端欠失および/またはＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドに、少な
くとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％
同一なポリペプチドである。

【０１８４】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、ま
たはＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるポリヌクレオチド配列によりコー
ドされるポリペプチド配列のエピトープか、または配列番号１の配列の相補鎖、
もしくはＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれる配列の相補鎖に、上記に定義
されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくは低いス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズするポリヌ
クレオチドによりコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むか、または
これらからなる、ポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチド
配列（例えば、配列番号１に開示される配列）のエピトープをコードするポリヌ
クレオチド配列、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補
鎖のポリヌクレオチド配列、および上記に定義されるストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下もしくは低いストリンジェンシーハイブリダイゼーショ
ン条件下で、相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。

【０１８５】 本明細書中で使用される用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物
、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポ
リペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、このポリペプ
チドをコードするエピトープならびにポリヌクレオチドを含むポリペプチドを含
む。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、動物における抗体
応答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知の任意の方
法（例えば、以下に記載された抗体作製の方法）によって測定された。（例えば
、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３
９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、
用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細
書中に記載されたイムノアッセイ）によって測定されるように、抗体がその抗原
に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的な結
合は、非特異的な結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交差反応性を除外す
る必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性を必要とはしない。

【０１８６】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６
３１，２１１号にさらに記載される）を参照のこと）。

【０１８７】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４アミノ酸
、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸の配列
を含み、より好ましくは、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少な
くとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少な
くとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少な
くとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少な
くとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸の配列を含み、そして最も好まし
くは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む。免疫原性または抗原
性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。さらに、非排他的
に好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書中で開示される抗原性エピトー
プおよびその一部が挙げられる。抗原性エピトープは、例えば、エピトープに特
異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起するために、有用である
。好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書中で開示される抗原性エピトー
プ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任意の組合わせが
挙げられる。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使
用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１
９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（
１９８３）を参照のこと）。

【０１８８】 同様に、当該分野で周知の方法に従って、免疫原性エピトープを使用して、例
えば、抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏ
ｎら，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：
２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープ
として、本明細書中に開示される免疫原性エピトープ、およびこれらの免疫原性
エピトープの１、２、３、４、５以上の任意の組み合わせが挙げられる。１つ以
上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、
アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に抗体応答を誘発
するために提示され得るか、このポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約
２５アミノ酸）、このポリペプチドは、キャリアなしで動物系に提示され得る。
しかし、８〜１０程度の少ないアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくと
も変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分
であることが示されている（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。

【０１８９】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およ
びＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９
８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用い
て免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチド
を結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプ
チドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチ
ドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに
結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチド
またはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１
００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバント、
あるいは免疫応答を刺激するための当該分野で公知の他のアジュバントを含む）
の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター
注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間
隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチ
ドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中
の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の
方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による）
により上昇し得る。

【０１９０】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、それらの任意の組み合わせ、およびそれらの部分）と融合し得、
これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易に
し得、そしてインビボにおいて半減期を増加させ得る。これは、ヒトＣＤ４ポリ
ペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を示した。例えば、
ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４
〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮性関門を横切った免疫系への、抗原の増
強された送達は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたは
Ｆｃフラグメント（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ ９
９／０４８１３を参照のこと）に結合体化した抗原（例えば、インスリン）につ
いて実証されている。ＩｇＧ部分に起因してジスルフィド架橋二量体構造を有す
るＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメン
ト単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る。例え
ば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜
３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた
、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（
ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチ
ドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載
された系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の前精製を可
能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子は
、遺伝子の読み取り枠が、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳
的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中でサブクローンされる。
このタグは、融合タンパク質に対する膜結合ドメインとして働く。組換えワクシ
ニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ²⁺ニトリロ三酢酸酸性アガロ
ースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質は、イミダゾー
ル含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。

【０１９１】 別の実施形態では、本発明のＴＲ９ポリペプチドおよびそのエピトープ保有フ
ラグメントは、異種抗原（例えば、ポリペプチド、糖質、リン脂質、または核酸
）と融合される。特定の実施形態では、異種抗原は免疫原である。

【０１９２】 より特定の実施形態では、異種抗原は、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質または
そのフラグメントである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明に含まれる。

【０１９３】 別の実施形態では、本発明のＴＲ９ポリペプチドおよびそのエピトープ保有フ
ラグメントは、別のＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド配列（あ
るいはその生物学的に活性なフラグメントまたは改変体）と融合される。特定の
実施形態では、本発明のＴＲ９ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌポリペプチド配列と
融合される。好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌポリペプチド配列は、可溶性で
ある。

【０１９４】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングは、本発明のポリペプチドの活性を調節するために用いられ
得、このような方法は、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにこのポリ
ペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成するために用いられ得る。一
般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５
，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８
号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓ
ｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびに
Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各
々が参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号
１に対応するポリヌクレオチドの改変およびこれらのポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。
ＤＮＡシャッフリングは、このポリヌクレオチド配列中にバリエーションを生成
するための、相同組換えまたは部位特異的組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグ
メントのアセンブリを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド
またはコードされるポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐ
ｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムなヌクレオチド挿入または他の方法により、ランダ
ムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本
発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ
、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上
の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ド
メイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。

【０１９５】 好ましい実施形態において、本発明のＴＲ９ポリペプチド（その生物学的に活
性なフラグメントまたは改変体を含む）は、可溶性ＣＤ４０Ｌポリペプチド、ま
たはその生物学的に活性なフラグメントまたは改変体と融合される。

【０１９６】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の配列
番号２の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは
、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわ
ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫
グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブク
ラスであり得る。免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖の両方を有し得る。ＩｇＧ
、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ重鎖のアレイは、κ型または
λ型の軽鎖と対であり得る。

【０１９７】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまた
は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内
因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、そ
して例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８
号において記載のような）を含む。

【０１９８】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。

【０１９９】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチド
の排除を可能にする抗体を含む。

【０２００】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、
本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質
の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対
応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５
％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５
％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の
方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリ
ペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において
、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原性ま
たは免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性および
／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ハイブリダイゼ
ーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合
する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに
対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親
和性としては、５×１０^-2Ｍ未満、１０^-2Ｍ未満、５×１０^-3Ｍ未満、１０^-3Ｍ
未満、５×１０^-4Ｍ未満、１０^-4Ｍ未満、５×１０^-5Ｍ未満、１０^-5Ｍ未満、５
×１０^-6Ｍ未満、１０^-6Ｍ未満、５×１０^-7Ｍ未満、１０^-7Ｍ未満、５×１０^-8 Ｍ未満、１０^-8Ｍ未満、５×１０^-9Ｍ未満、１０^-9Ｍ未満、５×１０^-10Ｍ未満
、１０^-10Ｍ未満、５×１０^-11Ｍ未満、１０^-11Ｍ未満、５×１０^-12Ｍ未満、１
０^-12Ｍ未満、５×１０^-13Ｍ未満、１０^-13Ｍ未満、５×１０^-14Ｍ未満、１０^{-1 4} Ｍ未満、５×１０^-15Ｍ未満または１０^-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有
する親和性が挙げられる。

【０２０１】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。

【０２０２】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検
出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在
下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、少
なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提
供される。

【０２０３】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
い抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプタ
ーへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それにより
レセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することを妨げない
抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの
抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプター
の二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性
化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗
体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生
物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特
定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され
得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９
７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）
；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１
９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１
７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０
９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：
３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１
（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔ
ａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒ
ｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０
１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６
２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−
１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１
４−２０（１９９６）（これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用
される）を参照のこと。

【０２０４】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。

【０２０５】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子
へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９
５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９
９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。

【０２０６】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【０２０７】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、種々の宿主動物（ウサギ、
マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対し
て特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバ
ントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そし
てこれにはフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネ
ラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プ
ルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマ
ルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに
ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐ
ａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定さ
れない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。

【０２０８】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそれが生
成される方法に由来する抗体ではない。

【０２０９】 「モノクローナル抗体」は、２つのタンパク質（すなわち、重鎖および軽鎖）
を含み得るかまたはこれらからなり得る。

【０２１０】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される（例え
ば、実施例１１）。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチ
ドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応
用が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）
と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の
技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株
ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択お
よびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチド
に結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッ
セイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ
）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、
産生され得る。

【０２１１】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。

【０２１２】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。

【０２１３】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば
、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用さ
れ得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を
用いて選択または同定され得る（例えば、標識した抗原あるいは固体表面または
ビーズに結合または捕捉された抗原を使用する）。これらの方法において用いら
れるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ
遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまた
はジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現され
たｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ
ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージデ
ィスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋ
ｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９
５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１
８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７
９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ
９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３
７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３
６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５
，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；
同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５
３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７
，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，
６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号
（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。

【０２１４】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。

【０２１５】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボの使用およびインビ
トロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体また
はヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、
異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領
域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生
するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７
，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照
のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト
化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫
グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合する非
ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレ
ームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を変化さ
せるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置
換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって同定
され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲお
よびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における
異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅ
ｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考と
して本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の
技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４０
０号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；
同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（
ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（
欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９
１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７
（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９
６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓ
ｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。

【０２１６】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ
公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９
３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３
５、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本
明細書中に援用される）もまた参照のこと。

【０２１７】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。

【０２１８】 選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体を、「誘導された（ｇｕｉｄ
ｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選
択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープ
を完全に認識するヒト抗体の選択を誘導するために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒ
ｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。

【０２１９】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。

【０２２０】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。

【０２２１】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。

【０２２２】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。

【０２２３】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。

【０２２４】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。

【０２２５】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。

【０２２６】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。

【０２２７】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。

【０２２８】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。

【０２２９】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。

【０２３０】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロ
モーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスタ
ーの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系
である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋ
ｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。

【０２３１】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク
質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクタ
ーには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列が
ｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）
で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現
ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８
３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ
＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１
９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるため
に使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶
解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および
結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る
。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を
含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、Ｇ
ＳＴ部分から放出され得る。

【０２３２】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。

【０２３３】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ
ー、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。

【０２３４】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。

【０２３５】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外
来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させら
れ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能
マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体
内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクロ
ーニングし得、細胞株に拡大され得ることを可能にする。この方法は、抗体分子
を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作され
た細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニ
ングおよび評価において、特に有用であり得る。

【０２３６】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚ
ｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０
２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、こ
れらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ
使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使
用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与える
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１
８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８
−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９
９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘ
ｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ
Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（
１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５
）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える（Ｓ
ａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術
の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用
され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋ
ｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、
ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇ
ａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これらは
その全体が本明細書中に参考として援用される）。

【０２３７】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。

【０２３８】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、
過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである
（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８
０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含
み得る。

【０２３９】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。

【０２４０】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、
抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた
、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法にお
いて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３
／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇ
ｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこ
と。これらは、その全体が参考として援用される。

【０２４１】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。

【０２４２】 上記で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または
配列番号２の変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ
半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッ
セイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合体化され得る。
さらに、配列番号２に対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結
合体化させて、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペ
プチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（Ｅ
Ｐ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−
８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有す
る抗体に融合または結合体化される本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タ
ンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中
和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タン
パク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改
良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるい
は、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を
欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原とし
て使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の
発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニ
ストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦ
ｃ部分と融合されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃ
ｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。

【０２４３】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限
定されない。

【０２４４】 本発明は、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメン
トをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジ
メン（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生また
は進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能
な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては
、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、
種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金
属イオン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメン
ト）に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用
する媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結
合体化され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合
体化され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照の
こと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げら
れ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよ
びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェ
ロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジク
ロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリト
リンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質
の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；な
らびに、適切な放射性物質の例としては、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎまたは⁹⁹Ｔｃ
が挙げられる。

【０２４５】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合体化され得る。細
胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては
、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジン
Ｄ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔ
ｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌ
ｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン
ジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサン
トロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、
グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロー
ル、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げら
れる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプ
リン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５
−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例え
ば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラ
ン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファ
ミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニト
ール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジア
ミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダ
ウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例
えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラ
マイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、
ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含む
が、それらに限定されない。

【０２４６】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス性薬剤
（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８
９９号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参
照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２
３１０５号を参照のこと））、ＣＤ４０リガンド、血栓症薬もしくは抗脈管形成
薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答
改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インタ
ーロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺
激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。

【０２４７】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。

【０２４８】 このような治療部分を抗体に結合体化する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎ
ｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａ
ｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１
９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３
０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐ
ｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと
。

【０２４９】 あるいは、抗体は第二の抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（
これは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによ
る記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得
る。

【０２５０】 単独、あるいは細胞傷害性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投
与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬と
して使用され得る。

【０２５１】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対するモノクロナール抗体は、マーカーを発現する細
胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞
集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用され得、そ
してその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固
体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング」、な
らびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およ
びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこ
と）が挙げられる。

【０２５２】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可
能にする。

【０２５３】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。

【０２５４】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、
アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そしてバ
ックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロ
ースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認識し得
る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。

【０２５５】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に転写する工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱
脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中
で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄
緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、³²Ｐまたは¹²⁵Ｉ）に結合体化された二次抗体（一次抗
体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗
浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を
包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグ
ラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認識し得
る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、
Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。

【０２５６】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
体化された目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートす
る工程、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて
、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検
出可能な化合物に結合体化された第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェ
ルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体が
ウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合体化された
第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加
され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラ
メータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関し
て、認識し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。

【０２５７】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸増量の
非標識抗原の存在下での、目的の抗体との標識された抗原（例えば、３Ｈまたは
１２５Ｉ）のインキュベーション、および標識抗原に結合体化された抗体の検出
を含む。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、ス
キャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競
合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸
増量の非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、³Ｈまたは¹²⁵Ｉ）
に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。

【０２５８】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の開示された疾患、障害または状態を処置、検出および／または予防
するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投
与する工程を含む。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に
記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならび
に本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載するような、それらのフラ
グメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げ
られるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異
常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記
載する疾患、障害または状態（例えば、自己免疫疾患、障害またはこのような疾
患または障害と関連する状態）の任意の１つ以上を含むがこれらに限定されない
）を処置、診断、阻害または予防するために使用され得る。自己免疫疾患、障害
、またはこのような疾患または障害と関連した状態としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減
少、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂
質症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮膚炎、
アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球
体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼
炎、多発性内分泌腺症、紫斑病（例えば、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）、
ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症
候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性の眼、自己免疫性甲状腺
炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グ
ッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーブ
ス病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン耐性自己免疫性溶解性貧血
、自己免疫性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を有す
る強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、突発性アジソン
病、不妊症、糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡネフロパシー
）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、およびアドレナリン作動性
薬物耐性（喘息または嚢胞性線維症を有するアドレナリン薬物耐性を含む）、慢
性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、ＭＩ後
心臓切開症候群（ｐｏｓｔ−ＭＩ，ｃａｒｄｉｏｔｏｍｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）
、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシー、および他の炎症性障害
、肉芽腫性（ｇｒａｎｕｌａｍａｔｏｕｓ）障害、変性性障害、および萎縮性障
害））。

【０２５９】 特定の実施形態において、本発明の抗体を用いて、慢性関節リウマチを処置、
阻害、予知、診断または予防する。

【０２６０】 別の特定の実施形態において、本発明の抗体を用いて、全身性エリテマトーデ
スを、処置、阻害、予知、診断または予防する。本発明のポリペプチドの異常な
発現および／または活性と関連した疾患、障害なたは状態の処置、検出および／
または予防としては、これらの疾患、障害または状態と関連した症状を緩和する
ことが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知
のように、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物に
おいて提供され得る。

【０２６１】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわ
かる。

【０２６２】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。

【０２６３】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤、抗生物質、ならびに免疫グロブリ
ン）との組み合わせで投与され得る。一般的に、（抗体の場合には）患者の種と
同じ種である種起源または種反応性の生成物の投与が好ましい。従って、好まし
い実施形態においては、ヒトの抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または核
酸が、治療または予防のために、ヒトの患者に投与される。

【０２６４】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本
発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または
強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、そのフラグメント、ま
たはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、また
は領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフ
ラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５
×１０^-2Ｍ、１０^-2Ｍ、５×１０^-3Ｍ、１０^-3Ｍ、５×１０^-4Ｍ、１０^-4Ｍ、５
×１０^-5Ｍ、１０^-5Ｍ、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５
×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、
５×１０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^{- 13} Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、および１０^-15Ｍより小さい
解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。

【０２６５】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。

【０２６６】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。

【０２６７】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。

【０２６８】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。

【０２６９】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。

【０２７０】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、欠損性または
弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０
，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターまたはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、あるいは、リ
ポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは
、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより
、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与する
ことにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４
２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細
胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより達成され得る。
別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、リガンド
はエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペ
プチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さらに別の実施形
態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることにより、細胞特異的
な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例えば、ＰＣＴ公開
第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第ＷＯ９２／２０
３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２２１号を参照の
こと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより、
発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔ
ｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−
８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−
４３８（１９８９））。

【０２７１】 具体的な実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイル
スベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍ
ｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３
）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正
確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成
要素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ
以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
。：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１
９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；
ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌ
ｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．
３：１１０−１１４（１９９３）。

【０２７２】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染することができ
るという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概
説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０
（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルスベ
クターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）
；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａ
ｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（
１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好まし
い実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。

【０２７３】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。

【０２７４】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。

【０２７５】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。

【０２７６】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。

【０２７７】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。

【０２７８】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。

【０２７９】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔ
ｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１（１９８６）を参照のこと）。

【０２８０】 具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領
域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現
は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能である
。

【０２８１】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルを培養して増殖させ、そして
化合物に曝すか、そうでなければ化合物を投与し、そして、組織サンプルに対す
るそのような化合物の効果を観察する。

【０２８２】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。

【０２８３】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。

【０２８４】 様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可
能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば
、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１
９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核
酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔
内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物また
は組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射によ
り、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通
しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与
され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化
合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し
；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けら
れた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入すること
が望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用
いた処方により、肺投与もまた使用され得る。

【０２８５】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではない
が、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み
合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプ
ラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよ
うな膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達
成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。

【０２８６】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。

【０２８７】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、徐放系中で送達され得
る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）
；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２
０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９
８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８
９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉ
ｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ
．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６
１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（
１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９
）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もま
た参照のこと）。さらに別の実施形態において、徐放系は、治療標的、即ち、脳
の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏ
ｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を
参照のこと）。

【０２８８】 他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。

【０２８９】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。

【０２９０】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤がともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレ
ン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望される
ならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの
組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与形態に適するべきである。

【０２９１】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃ
ｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物とし
て供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌し
た薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が
注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌
水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【０２９２】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。

【０２９３】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、抑制および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用さ
れるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存
し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有
効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外
插され得る。

【０２９４】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。

【０２９５】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。

【０２９６】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。

【０２９７】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。

【０２９８】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（¹³¹Ｉ、¹²⁵Ｉ
、¹²³Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジ
ウム（^115mＩｎ、^113mＩｎ、¹¹²Ｉｎ、¹¹¹Ｉｎ）、およびテクネチウム（⁹⁹Ｔｃ
、^99mＴｃ）、タリウム（²⁰¹Ｔｉ）、ガリウム（⁶⁸Ｇａ、⁶⁷Ｇａ）、パラジウム
（¹⁰³Ｐｄ）、モリブデン（⁹⁹Ｍｏ）、キセノン（¹³³Ｘｅ）、フッ素（¹⁸Ｆ）、 ¹³⁵ Ｓｍ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁵⁹Ｇｄ、¹⁴⁹Ｐｍ、¹⁴⁰Ｌａ、¹⁷⁵Ｙｂ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙ、⁴⁷
Ｓｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁴²Ｐｒ、¹⁰⁵Ｒｈ、⁹⁷Ｒｕ）；発光標識（例えば、ル
ミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、
ならびにビオチンが挙げられる。

【０２９９】 当該分野で公知の技術は、本発明の抗体を標識するために適用され得る。この
ような技術として、二官能性の結合化剤の使用が挙げられるが、これらに限定さ
れない（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号
；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９
３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２
８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４
，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号（これらの各々の内容は
、本明細書において、全体を通して参考として援用される）を参照のこと）。

【０３００】 本発明の１つの局面は、動物（好ましくは哺乳動物であり、そして最も好まし
くはヒト）における目的のポリペプチドの異常な発現に関連する、疾患または障
害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、以下：（ａ）被
験体に、目的のポリペプチドに特異的に結合する、有効量の標識分子を投与（例
えば、非経口、皮下、または腹腔内）する工程；（ｂ）この投与に続いて、この
ポリペプチドが発現する被験体の部位において、標識分子が優先的に濃縮するこ
と（および結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで除去されるこ
と）を可能とする時間間隔を待つ工程；（ｃ）バックグラウンドレベルを決定す
る工程；および（ｄ）被験体において標識分子を検出する工程であって、その結
果、バックグラウンドレベルより上の標識分子の検出が、この被験体が目的のポ
リペプチドの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することを示す、
工程を包含する。バックグラウンドレベルは、検出した標識分子の量を、特定の
系に関して先に決定した標準値と比較することを含む、種々の方法によって、決
定され得る。

【０３０１】 本明細書中に記載されるように、本発明の特定の実施形態は、本発明の抗体を
使用して、Ｂ細胞株の細胞または単球株の細胞の濃縮を定量または定性すること
に関する。

【０３０２】 また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、免疫欠損を有
する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形態において、本
発明の抗体を使用して、分類不能型免疫不全疾患（ＣＶＩＤ）またはこの疾患の
サブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別の実
施形態において、本発明の抗体を使用して、血清（ｓｅｒｉｕｍ）免疫グロブリ
ン産生の欠損、再発性の感染、および／または免疫系機能不全により特徴付けら
れる障害を、診断、予後判定、処置または予防する。

【０３０３】 また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、自己免疫疾患
または障害を有する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形
態において、本発明の抗体を使用して、全身性エリテマトーデス、またはこの疾
患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別
の特定の実施形態において、本発明の抗体を使用して、慢性関節リウマチ、また
はこの疾患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定
する。

【０３０４】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムは、診断画像を作成するため
に必要とされる画像化部分の品質を決定することが、当該分野において理解され
る。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体に対して、注入される放射能の量
は、通常、^99mＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識され
た抗体または抗体フラグメントは、優先的に、特定のタンパク質を含む細胞の位
置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍ
ｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏ
ｒ Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．
Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）
）に記載される。

【０３０５】 いくつかの変数（使用される標識の型および投与の様式を含む）に依存して、
標識分子が優先的に被験体のある部位において濃縮されることを可能にし、かつ
結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで排除されるための、投与
に続く時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である
。別の実施形態において、投与に続く時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０
日間である。

【０３０６】 １つの実施形態において、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または
疾患を診断するための方法を、例えば、最初の診断の１ヵ月後、最初の診断の６
ヶ月後、最初の診断の１年後などに、繰り返すことによって、実施される。

【０３０７】 標識分子の存在は、当該分野において公知の方法を使用して、インビボ走査に
ついて、患者において検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依
存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発
明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスとしては、コンピュータ
連動断層撮影（ＣＴ）、陽電子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放射撮像断層（ＰＥＴ）の
ような全身走査、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが
、これらに限定されない。

【０３０８】 特定の実施形態において、分子は放射性同位体で標識され、そして放射応答性
の外科用器具を使用して、患者において検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、分子は蛍光化合物で標
識され、そして蛍光応答性の走査機器を使用して、患者において検出される。別
の実施形態において、分子は陽電子放射材料で標識され、そして陽電子放射断層
撮像法を使用して、患者において検出される。なお別の実施形態において、分子
は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を使用して患者にお
いて検出される。

【０３０９】 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、本発明のポリペプチドの同一および／または
異なる配列または領域を認識する、２つ以上の抗体（モノクローナルおよび／ま
たはポリクローナル）を備える。別の特定の実施形態において、本発明のキット
は、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば
、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物
もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、または一次抗体を認識する二次抗
体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。

【０３１０】 本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。

【０３１１】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。

【０３１２】 さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血
清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットを含む。この診断用キ
ットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である
実質的に単離された抗体、およびこの抗体に対するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド抗原の結合を検出する手段を含む。１つの実施形態では、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗
体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識化されたモノクローナル抗体を
含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化された競合抗原を
含み得る。

【０３１３】 １つの診断形態において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応される。試薬への特異的抗原抗体の結合および洗浄
による非結合血清成分の除去後、この試薬は、固体支持体上の結合された抗抗原
抗体の量に比例してレポーターを試薬に結合するように、レポーター標識抗ヒト
抗体と反応される。試薬は、再度、非結合標識抗体を除去するために洗浄され、
そして、試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、このレポー
ターは、適切な比蛍光（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質または比色基質（Ｓｉ
ｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で固相をインキュベートすることに
より検出される酵素である。

【０３１４】 上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材料（例えば、ポリマー性ビ
ーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター材料）にタ
ンパク質材料を付着するための公知の技術によって調製される。これらの付着方
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または固体支持体上の化
学反応基（例えば、活性型カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド
基）へのタンパク質（代表的には、遊離アミン基を介する）の共有結合を包含す
る。あるいは、ストレプトアビジンコーティングプレートは、ビオチン化抗原と
併用して使用され得る。

【０３１５】 従って、本発明は、本診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを提
供する。このキットは、一般に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体を含む。

【０３１６】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的にまたは完全にのいずれ
かで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する、抗
体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。
リガンドの結合を妨げないが、レセプター活性化を妨げるレセプター特異的抗体
が含まれる。レセプター活性化（すなわち、信号伝達）は、本明細書中に記載さ
れるかまたは他の当該分野において公知の技術によって、決定され得る。また、
リガンドの結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体が
含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を
妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を
妨げるが、リガンドがレセプターを結合することは妨げない抗体が含まれる。さ
らに、レセプターを活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、リガンドによ
り媒介されるレセプター活性化によって影響を受ける生物学的活性のすべてまた
は一部のいずれかに対するアゴニストとして作用し得る。これらの抗体は、本明
細書中に開示される特定の活性を含む生物学的活性に対するアゴニストまたはア
ンタゴニストとして特定化され得る。さらに、ＴＲ９がＴＲ９リガンドに結合す
るか否かにかかわらず、ＴＲ９に結合する抗体が含まれる。これらの抗体は、Ｔ
Ｒ９の、これらの抗体の存在下でのＴＲ９リガンドへの結合に応答する、細胞増
殖の増加に反映されるように、ＴＲ９のアゴニストとして作用する。上記の抗体
アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公
開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら
、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；
Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１
７９４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：
３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒ
ｄ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１
９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）
：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍ
ａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；
Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６
７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１
４−２０（１９９６）（上記の文献は、その全体が参考として援用される）を参
照のこと。

【０３１７】 本発明は、ＴＲ９がＴＲ９リガンドにインビトロおよび／またはインビボで結
合する能力を阻害または減少させる抗体を含む。特定の実施形態において、本発
明の抗体は、ＴＲ９が、ＴＲ９リガンドを、インビトロで結合する能力を、阻害
または減少する。別の非排他的な特定の実施形態において、本発明の抗体は、Ｔ
Ｒ９が、ＴＲ９リガンドを、インビボで結合する能力を阻害または減少する。こ
のような阻害は、本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の
技術を使用して、アッセイされ得る。

【０３１８】 本発明はまた、ＴＲ９に特異的に結合するが、ＴＲ９が、ＴＲ９リガンドに、
インビトロおよび／またはインビボで結合する能力を阻害しない、抗体を含む。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＴＲ９が、ＴＲ９リガンドを、イン
ビトロで結合する能力を、阻害も減少もしない。別の非排他的な特定の実施形態
において、本発明の抗体は、ＴＲ９が、ＴＲ９リガンドを、インビボで結合する
能力を、阻害も減少もしない。

【０３１９】 上述のように、本発明は、ＴＲ９により媒介される生物学的活性を、インビト
ロおよび／またはインビボで阻害または減少する抗体を含む。特定の実施形態に
おいて、本発明の抗体は、ＴＲ９により媒介されるＢ細胞増殖またはＴ細胞増殖
を、インビトロで阻害または減少する。このような阻害は、本明細書中に記載さ
れるかまたは他の当該分野において公知の、Ｂ細胞またはＴ細胞の増殖アッセイ
を慣用的に改変することによって、アッセイされ得る。別の非排他的な特定の実
施形態において、本発明の抗体は、ＴＲ９により媒介されるＢ細胞増殖またはＴ
細胞増殖を、インビボで阻害または減少する。

【０３２０】 あるいは、本発明はまた、ＴＲ９に特異的に結合するが、ＴＲ９により媒介さ
れる生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖またはＴ細胞増殖の刺激）を、インビト
ロおよび／またはインビボで阻害も減少もしない、抗体を含む。特定の実施形態
において、本発明の抗体は、ＴＲ９により媒介される生物学的活性を、インビト
ロで阻害も減少もしない。別の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、
ＴＲ９により媒介される生物学的活性を、インビボで阻害も減少もしない。

【０３２１】 上述のように、本発明は、インビトロおよび／またはインビボで、本明細書中
で特に参照される抗体の少なくとも１つと同じエピトープに特異的に結合する抗
体を含む。

【０３２２】 特定の実施形態において、上記特定の抗体は、本明細書中に記載されるかまた
は他の当該分野において公知の技術を使用してヒト化され、次いで本明細書中に
記載のように、治療剤として使用される。

【０３２３】 別の特定の実施形態において、上に列挙した任意の抗体を、可溶性形態で使用
し得る。

【０３２４】 別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかが、毒素または標
識と結合体化される（以下に記載のように）。このような結合体化抗体は、特定
の細胞の集団を殺傷するため、または特定の細胞の集団を定量するために使用さ
れる。好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、表面でＴＲ９を
発現するＢ細胞を殺傷するために使用される。別の好ましい実施形態において、
このような結合体化抗体は、表面でＴＲ９を発現するＢ細胞を定量するために使
用される。好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、表面でＴＲ
９を発現するＴ細胞を殺傷するために使用される。別の好ましい実施形態におい
て、このような結合体化抗体は、表面でＴＲ９を発現するＴ細胞を定量するため
に使用される。

【０３２５】 別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかは、毒素または標
識と結合体化される（以下に記載のように）。このような結合体化抗体は、特定
の細胞の集団を殺傷するため、または特定の細胞の集団を定量するために使用さ
れる。

【０３２６】 本発明の抗体はまた、治療薬および／または予防薬としての用途を有する。こ
れらの用途としては、ＴＲ９を細胞表面で発現する、リンパ球の不活化、または
リンパ球活性化のブロック、および／またはリンパ球系列の殺傷（例えば、骨髄
性白血病、リンパ球に基づく白血病およびリンパ腫、リンパ球増加、リンパ球減
少、慢性関節リウマチ、ならびに活性化リンパ球に関連する他の疾患または状態
を、処置、予防、および／または診断するため）が挙げられるが、これらに限定
されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、補体を結合する。他の特
定の実施形態において、本明細書中にさらに記載されるように、本発明の抗体（
またはそのフラグメント）は、異種ポリペプチドまたは核酸（例えば、内因性細
胞傷害性エフェクター系に結合してこれを活性化する化合物、および放射性同位
体；ならびに細胞傷害性プロドラッグのような、毒素）と会合する。

【０３２７】 別の実施形態において、１つ以上のモノクローナル抗体が産生され、ここで、
これらはＴＲ９および／またはそのムテインを認識または結合するが、ＴＲ９お
よび／またはそのムテインを認識または結合しない。関連する実施形態において
、１つ以上のモノクローナル抗体が産生され、ここでこれらは、ＴＲ９および／
またはそのムテインを認識または結合するが、ＴＲ９および／またはそのムテイ
ンを認識または結合しない。

【０３２８】 上記で議論されるように、本発明のＴＲ９ポリペプチドは、次に、当業者に周
知の技術を使用して、ＴＲ９を「模倣する」抗イデオタイプ抗体を生成するため
に利用され得る（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ
．７（５）：４３７−４４４（１９８９）、ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと
）。例えば、ＴＲ９を結合し、そしてＴＲ９の多量体化および／またはリガンド
への結合を競合的に阻害する抗体を使用して、ＴＲ９ＴＮＦの多量体化および／
または結合ドメインを「模倣」し、そして結果として、ＴＲ９および／またはそ
のリガンドを結合し、そして中和する抗イデオタイプを作製し得る。抗イデオタ
イプまたはこのような抗イデオタイプのＦａｂフラグメントのこのような中和は
、ＴＲ９リガンドを中和するための治療レジメンにおいて使用され得る。例えば
、このような抗イデオタイプ抗体を使用して、ＴＲ９を結合し得るか、またはＴ
Ｒ９をＢ細胞またはＴ細胞系統の細胞表面上で結合し得、これによってＴＲ９お
よび／またはＴＲ９ＳＶにより媒介されるＢ細胞またはＴ細胞の活性化、増殖、
および／または分化をブロックし得る。

【０３２９】 （ポリぺプチドアッセイ） 本発明はまた、細胞および組織におけるＴＲ９レセプタータンパク質またはそ
の可溶性形態のレベルを検出する（正常および異常なレベルの判定を含む）ため
の定量的アッセイおよび診断アッセイのような診断アッセイに関する。従って例
えば、正常コントロール組織サンプルと比較して、ＴＲ９またはその可溶性形態
の過剰発現を検出するための、本発明に従う診断アッセイは、例えば腫瘍の存在
を検出するために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいて、タンパク質（例
えば、本発明のＴＲ９タンパク質またはその可溶性形態のレベルを決定するため
に使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法
としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。

【０３３０】 生物学的サンプル中のＴＲ９タンパク質レベルのアッセイは、任意の当該分野
で公知の方法を使用して起こり得る。「生物学的サンプル」により、ＴＲ９レセ
プタータンパク質またはｍＲＮＡを含む、個体、細胞株、組織培養物、または他
の供給源から得られた任意の生物学的サンプルが意図される。抗体に基づく技術
が、生物学的サンプル中のＴＲ９タンパク質レベルをアッセイするために好まし
い。例えば、組織におけるＴＲ９タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法
で研究され得る。（Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９
７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０５：３０８７−３０９６（１９８７））。ＴＲ９レセプター遺伝子発現を検出
するために有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、
酵素結合免疫吸着アッセイ検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ））が挙げられる。

【０３３１】 適切な標識は、当該分野で公知であり、これらとしては、酵素標識（例えば、
グルコースオキシダーゼ）および放射性同位体（例えば、ヨウ素（¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ
）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉｎ）
およびテクネチウム（^99mＴｃ））；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセイ
ンおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。

【０３３２】 （治療薬） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドが、細胞傷害性、抗ウイルス活性
、免疫調節活性、および数種の遺伝子の転写制御を含む、多数の細胞応答を誘導
する、最も多面的なサイトカインに属することは、公知である（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅ
ｄｄｅｌら、「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、
Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６）、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｃｅｒａ
ｍｉ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（１９８８）
；Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）；Ｗ．Ｆｉ
ｅｒｓ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１））。ＴＮＦ
−ファミリーリガンドは、ＴＮＦ−ファミリーレセプター（本発明のＴＲ９を含
む）と結合することによって、このような種々の細胞応答を誘導する。ＴＲ９を
発現し、かつＴＲ９リガンドに対する有効な細胞応答を有すると考えられる細胞
としては、胎児肝臓、ＰＢＬ、肺、腎臓、小腸、結腸、ケラチノサイト、内皮細
胞、および単球活性化組織が挙げられる。「ＴＮＦファミリーリガンドに対する
細胞応答」により、ＴＮＦファミリーリガンドにより誘導される、細胞、細胞株
、組織、組織培養物または患者に対する、遺伝子型、表現型、および／または形
態型の変化が意図される。示されるように、このような細胞応答は、ＴＮＦファ
ミリーのリガンドに対する正常な生理学的応答だけでなく、増加したアポトーシ
スまたはアポトーシスの阻害に関連する疾患をも含む。アポトーシスをプログラ
ムされた細胞死は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する生理学的メカニズ
ムであり、その調節不全は、多くの異なる病原性のプロセスを導き得る（Ｊ．Ｃ
．Ａｍｅｉｓｅｎ、ＡＩＤＳ ８：１１９７−１２１３（１９９４）；Ｐ．Ｈ．
Ｋｒａｍｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７９−２８９
（１９９４））。

【０３３３】 増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、以下が
挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモ
ン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細
胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内
皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カ
ポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））；自己免疫障
害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変
、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマ
トーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および慢性関節リウマチ）；ウイルス感染（
例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）；炎症；
対宿主性移植片病；急性移植片拒絶および慢性移植片拒絶。好ましい実施形態に
おいて、本発明のＴＮＦＲポリヌクレオチド、ポリぺプチド、および／またはア
ンタゴニストは、特に上記に列挙され、そして以下の段落に列挙される癌の、増
殖、進行および／または転移を阻害するために使用される。

【０３３４】 増加した細胞生存に関連するさらなる疾患または状態としては、以下のような
悪性腫瘍および関連する障害の進行、および／または転移が挙げられるが、これ
らに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性
骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球
性白血病、および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性
（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症
、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァル
デンストレームマクロ大グロブリン血症、Ｈ鎖病、および充実性腫瘍（肉腫およ
び癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索
腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、
ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前
立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状
腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌
、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌
、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣
細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎ
ａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫を含むが、これ
らに限定されない）。

【０３３５】 増加したアポトーシスに関連する疾患としては、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ
；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬
化症、色素性網膜炎、小脳変性；および脳腫瘍または事前の関連する疾患）；自
己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁
性肝硬変、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）病、クローン病、多発性筋炎、全身性
エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および慢性関節リウマチ）脊髄形成
異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（例え
ば、心筋梗塞、発作および再灌流障害により引き起こされる虚血性傷害）、肝臓
傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁不全（ｃｈｏｌｅｓ
ｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒素誘導肝臓疾患（例えば、アルコ
ールにより引き起こされるような）、敗血症性ショック、悪液質および食欲不振
）好ましい実施形態においては、ＴＲ９ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、上記に
列挙される疾患および障害を処置、予防、診断および／または検出する。

【０３３６】 本発明のＴＲ９ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＴＲ９
アゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗ＴＲ９抗体）を用いて処置、予
防、診断および／または予後判断され得る免疫欠損としては以下から選択される
１つ以上の免疫欠損が挙げられるがこれらに限定されない：重症複合型免疫不全
（ＳＣＩＤ）Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ
欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン病、先天性無ガ
ンマグロブリン血症、Ｘ連鎖小児性低ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグ
ロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、遅発性発症無ガンマグロブリ
ン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、新生児期の一過
性低ガンマグロブリン血症、特定されていない低ガンマグロブリン血症、無ガン
マグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天的）、ヴィスコット
−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰のＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不全、過剰
のＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫不全、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（
ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常なもしくは上昇したＩｇを伴う抗体
欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖性障
害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス
型）、細網発育不全、新生児好中球減少、重症先天性白血球減少症、免疫欠損を
伴う胸腺リンパ形成不全症−無形成症または形成異常症、毛細血管拡張性運動失
調、短四肢小人症、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ）ネゼロフ症候群と組み合
わせたＩｇＧを伴う免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ
）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球症候群）および重得な複合型免疫欠損
）または免疫欠損に関連する状態。

【０３３７】 本発明のＴＲ９ポリヌクレオチドもしくはポリぺプチドまたはＴＲ９アゴニス
トもしくはアンタゴニスト（例えば、抗ＴＲ９抗体）を用いて処置、診断、また
は予後判断され得る自己免疫疾患としては、以下のうちの１つ以上が挙げられる
が、これらに限定されない：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減
少、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂
質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウ
マチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎造影法）、多発性硬化症、神経炎
、ブドウ膜炎眼結膜炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘーノホ−シェーン
ライン紫斑病）、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎、ギヤン−
バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼、自己免疫性
甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデ
ス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グ
レーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性、自己免疫性
溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗
体を伴う強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、突発性ア
ジソン病、不妊症、一次性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症のような糸球体腎炎、水
疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、およびアドレナリン作用性薬物耐
性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）、慢性
活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞（
ＭＩ）後、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパ
シー、および他の炎症性、肉芽腫性、変性性、および萎縮性の障害。

【０３３８】 本発明のＴＲ９のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニ
ストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患または障害または状態の１つ
以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る：原発性免
疫不全、免疫媒介血小板減少症、川崎病、骨髄移植（例えば、成人または子供に
おける最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成
人性または小児のＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、および輸血後
紫斑病。

【０３３９】 さらに、本発明のＴＲ９のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそ
のアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患、障害または状態の
１つ以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る：ギャ
ン−バレー症候群、貧血症（例えば、パルボウイルスＢ１９関連貧血症、感染（
例えば、再発性感染）の高い危険にある安定多発性骨髄腫（ｓｔａｂｌｅ ｍｕ
ｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）を有する患者、自己免疫溶血性貧血（例えば、
温型（ｗａｒｍ−ｔｙｐｅ）自己免疫溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新
生児血小板減少症）および免疫媒介好中球減少症）、移植（例えば、サイトメガ
ロウイルス（ｃｙｔａｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）−陽性器官のＣＭＶ
−陰性レシピエント）、低ガンマグロブリン血症（例えば、感染または罹患の危
険因子を有する低ガンマグロブリン血症新生児）、癲癇（例えば、難治性癲癇）
、全身性血管炎症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ ｓｙｎｄｒ
ｏｍｅ）、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎
、および多発性筋炎）。

【０３４０】 １つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の量の増加
を産生するための免疫系をブーストするための、より高い親和性抗体の産生（例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導するための、そして／また
は免疫応答を増加させるための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハム
スター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラク
ダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒト（
最も好ましくはヒト）への投与。特定の非限定的実施形態では、本発明のＴＲ９
ポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＧの量の増加を産生する
ための免疫系をブーストするために投与される。別の特定の非限定的な実施形態
において、本発明のＴＲ９ポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、Ｉ
ｇＡの量の増加を産生するための免疫系をブーストするために投与される。別の
特定の非限定的な実施形態において、本発明のＴＲ９ポリペプチド、および／ま
たはそのアゴニストは、ＩｇＭの量の増加を産生するための免疫系をブーストす
るために投与される。

【０３４１】 可溶性レセプターのレベルを検出するために有用なアッセイは、当業者に公知
であり、例えば、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロッ
ト分析、および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが行われ得る。

【０３４２】 従って、さらなる好ましい実施形態においては、本発明は、ＴＮＦファミリー
のリガンドによって誘導されるアポトーシスを増強させるための方法に関し、こ
の方法は、ＴＲ９ポリぺプチドを発現する細胞に、ＴＲ９媒介シグナル伝達を増
加または減少させ得るに有効な量の、ＴＲ９リガンド、アナログまたはアゴニス
トを投与する工程を包含する。好ましくは、ＴＲ９媒介シグナル伝達は、減少し
たアポトーシスまたは減少したサイトカインおよび接着分子発現が提示される疾
患を、処置、予防、予後判断および／または診断するために増加される。アゴニ
ストとしては、可溶形態のＴＲ９、ならびにＴＲ９ポリペプチドを指向する抗体
（好ましくはモノクロナール抗体）が挙げられ得る。

【０３４３】 さらなる局面においては、本発明は、ＴＮＦ−ファミリーのリガンドによって
誘導されるアポトーシスを阻害するための方法に関し、この方法は、ＴＲ９媒介
シグナル伝達を減少させ得るに有効な量の、アンタゴニストを、ＴＲ９ポリぺプ
チドを発現する細胞に投与する工程を包含する。好ましくは、ＴＲ９媒介シグナ
ル伝達は、増加したアポトーシス、ＮＦ−κＢ発現および／またはＪＮＫ発現が
提示される疾患を、処置、予防、予後判断および／または診断するために減少さ
れる。アンタゴニストとしては、可溶形態のポリぺプチドおよびＴＲ９ポリペプ
チドを指向する抗体（好ましくはモノクロナール抗体）が挙げられるがこれらに
限定されない。

【０３４４】 実施例８に開示されるように、細胞外ドメインに位置するポリぺプチド配列を
含むＴＲ９−Ｆｃ融合タンパク質は、単球を活性化し、そして単球生存を増加さ
せる。従って、特定の実施形態において、本発明は、炎症応答を刺激する方法を
包含し、この方法は、細胞（例えば、インビトロまたはインビボにおける単球）
に、本発明のポリヌクレオチド、ポリぺプチド、アゴニスト、またはアンタゴニ
ストを投与する工程を包含する。

【０３４５】 さらに、本発明は、マクロファージ活性を増強する方法を包含し、この方法は
、細胞（例えば、インビトロまたはインビボでの単球）に、本発明のポリヌクレ
オチド、ポリぺプチド、アゴニスト、またはアンタゴニストを投与する工程を包
含する。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、ポリぺプチド、アゴ
ニスト、またはアンタゴニストは、病原体に対する耐性を生じさせるために、予
防薬または治療剤として投与される。

【０３４６】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリぺプチド、アゴニス
ト、またはアンタゴニスト（これは、抗炎症活性を実証し、そして／またはＴＲ
９−Ｆｃ融合ポリぺプチドに対するアンタゴニストとして作用する）は、炎症性
疾患を処置、予防、診断、および／または検出するために投与される。別の実施
形態では、本発明のポリヌクレオチド、ポリぺプチド、アゴニスト、またはアン
タゴニスト（これは、抗炎症活性を実証し、そして／またはＴＲ９−Ｆｃ融合ポ
リぺプチドに対するアンタゴニストとして作用する）は、ＴＨ１関連状態を、処
置、予防、診断、および／または検出するために投与される。特定の実施形態で
は、本発明のポリヌクレオチド、ポリぺプチド、アゴニスト、またはアンタゴニ
スト（これは、抗炎症活性を実証し、そして／またはＴＲ９−Ｆｃ融合ポリぺプ
チドに対するアンタゴニストとして作用する）は、本明細書中に開示されるよう
な自己免疫障害を、処置、予防、診断、および／または検出するために投与され
る。

【０３４７】 「アゴニスト」によって、アポトーシスを増強または強化し得る天然に存在す
る化合物および合成の化合物が意図される。「アンタゴニスト」によって、アポ
トーシスを阻害し得る天然に存在する化合物および合成の化合物が意図される。
本発明の任意の候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」がアポトーシスを
阻害し得るかまたは増強し得るかは、当該分野で公知のＴＮＦ−ファミリーリガ
ンド／レセプター細胞応答アッセイ（以下により詳細に記載されるものを含む）
を用いて決定され得る。

【０３４８】 １つのこのようなスクリーニング手順は、トランスフェクトされて本発明のレ
セプターを発現するメラニン保有細胞の使用を包含する。このようなスクリーニ
ング技術は、１９９２年２月６日に公開された、国際出願公開番号ＷＯ９２／０
１８１０に記載される。このようなアッセイは、例えば、本発明のレセプターポ
リペプチドの活性化を阻害（または増強）する化合物についてスクリーニングす
るために使用され得る。このアッセイは、レセプターをコードするメラニン保有
細胞をＴＮＦファミリーリガンドおよび候補アンタゴニスト（またはアゴニスト
）の両方と接触させることによる。リガンドによって生成されるシグナルの阻害
および増強は、その化合物が、リガンド／レセプターシグナル伝達経路のアンタ
ゴニストまたはアゴニストであることを示す。

【０３４９】 他のスクリーニング技術には、レセプター活性化によって引き起こされる細胞
外ｐＨ変化を測定する系においてレセプターを発現する細胞（例えば、トランス
フェクトしたＣＨＯ細胞）の使用が含まれる（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６
：１８１−２９６（１９８９）に記載されるように）。例えば、化合物は、本発
明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッ
センジャー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）が測定され得、潜在的
な化合物がレセプターを活性化するかまたは阻害するかを決定し有る。

【０３５０】 別のこのようなスクリーニング技術は、そのレセプターをコードするＲＮＡを
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入して、そのレセプターを一過性に発現する工程を
包含する。次いで、そのレセプター卵母細胞は、レセプターリガンドと接触され
得、そして化合物がスクリーニングされ得、続いてレセプターの活性化を阻害す
ると考えられている化合物についてのスクリーニングの場合、カルシウムシグナ
ルの阻害または活性化の検出が行われ得る。

【０３５１】 当該分野で周知の別のスクリーニング技術には、構築物を細胞中で発現するこ
とが含まれ、ここでそのレセプターは、ホスホリパーゼＣまたはＤに連結されて
いる。例示的な細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎臓細胞なとが含まれる。
このスクリーニングは、本明細書中上記のように、ホスホリパーゼシグナルから
、レセプターの活性化またはレセプターの活性化の阻害の検出によって達成され
得る。

【０３５２】 別の方法は、その表面上にレセプターを有する細胞に対する標識されたリガン
ドの結合の阻害を決定することによって、本発明のアンタゴニストのレセプター
ポリペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングする工程を包含する。
このような方法は、レセプターをコードするＤＮＡで真核生物細胞をトランスフ
ェクトして、その結果その細胞がその表面でそのレセプターを発現する工程、お
よび標識した形態の既知のリガンドの存在下で細胞を化合物と接触させる工程を
包含する。そのリガンドは、例えば、放射能によって標識され得る。レセプター
に結合した標識されたリガンドの量は、例えば、レセプターの放射能を測定する
ことによって測定される。その化合物が、レセプターに結合する標識されたリガ
ンドの減少によって決定されるようにレセプターに結合する場合、そのレセプタ
ーに対する標識されたリガンドの結合は阻害される。

【０３５３】 本発明のポリペプチドの可溶形態は、上記のリガンド結合アッセイにおいて使
用され得る。ＴＲ９レセプターのこれらの形態は、これらが分泌された後、細胞
外培地中のリガンドと接触する。次いで、分泌されたタンパク質がＴＲ９レセプ
ターリガンドと結合するか否かに関する決定がなされる。

【０３５４】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニング
アッセイは、Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：
４３０４−４３０７（１９９２）に記載される。

【０３５５】 従って、さらなる局面において、候補アゴニストまたはアンタゴニストがＴＮ
Ｆファミリーリガンドに対する細胞応答を増強し得るかまたは阻害し得るかを決
定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法は、ＴＲ９ポリペプチ
ドを発現する細胞を候補化合物およびＴＮＦファミリーリガンドと接触させる工
程、細胞応答をアッセイする工程、ならびにその細胞応答を標準的な細胞応答と
比較する工程を包含し、その標準は、候補化合物の非存在下でリガンドとの接触
がなされた場合にアッセイされ、それによって、標準を上回る細胞応答の増加は
、その候補化合物がリガンド／レセプターシグナル伝達経路のアゴニストである
ことを示し、そして標準と比較して減少した細胞応答は、その候補化合物がリガ
ンド／レセプターシグナル伝達経路のアンタゴニストであることを示す。「細胞
応答をアッセイする」によって、候補化合物および／またはＴＮＦファミリーリ
ガンドに対する細胞応答を定性的または定量的に測定すること（例えば、Ｔ細胞
増殖のまたはトリチウム化されたチミジン標識の増加または減少を決定または見
積もること）が意図される。本発明によって、ＴＲ９ポリペプチドを発現する細
胞は、内因性または外因性のいずれかで与えられたＴＮＦファミリーリガンドと
接触され得る。

【０３５６】 本発明に従うアゴニストには、天然に存在する化合物および合成化合物（例え
ば、ＴＮＦファミリーリガンドペプチドフラグメント、トランスホーミング増殖
因子、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸、ドパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アス
パラギン酸）、腫瘍サプレッサー（ｐ５３）、細胞溶解性Ｔ細胞、および代謝拮
抗物質）が含まれる。好ましいアゴニストには、化学療法剤（例えば、シスプラ
チン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェ
ンマスタード、メトトレキサート、およびビンクリスチン）が含まれる。他のア
ゴニストには、エタノールおよびアミロイドペプチドが含まれる（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６７：１４５７−１４５８（１９９５））。さらに好ましいアゴニストに
は、ＴＲ９ポリペプチドまたはそのフラグメントに対して惹起されたポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。ＴＮＦファミリーレセプターに
対して惹起されたこのようなアゴニスト抗体は、Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９２９２−９２９６（１９９
１）；ならびにＴａｒｔａｇｌｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）
：４３０４−４３０７（１９９２）に開示される。国際出願公開番号ＷＯ ９４
／０９１３７もまた参照のこと。

【０３５７】 本発明に従うアンタゴニストには、天然に存在する化合物および合成化合物（
例えば、ＣＤ４０リガンド、天然アミノ酸、亜鉛、エストロゲン、アンドロゲン
、ウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルス ＥｌＢ、バキュロウイルスｐ３５
およびＩＡＰ、牛痘ウイルスｃｒｍＡ、エプスタイン−バーウイルスＢＨＲＦ１
、ＬＭＰ−１、アフリカ豚コレラウイルスＬＭＷ５−ＨＬ、およびヘルペスウイ
ルスｙｌ３４．５）、カルパインインヒビター、システインプロテアーゼインヒ
ビター、および腫瘍プロモーター（例えば、ＰＭＡ、フェノバルビタール、およ
び＿−ヘキサクロロシクロヘキサン））が含まれる。

【０３５８】 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、図１Ａ〜Ｄに含ま
れる配列もしくはその相補鎖、および／または寄託されたクローンに含まれるヌ
クレオチド配列に対応する核酸である。１つの実施形態において、アンチセンス
配列は、生物によって内部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配
列は、別に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
．５６：５６０（１９９１）およびＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８
８）を参照のこと）。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ
を通して、または三重ヘリックス形成を通して、遺伝子発現を制御するために使
用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８
）において議論される。三重ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅ
ｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３００（１９９１）において議論される。この方法
は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。

【０３５９】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分は、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドを設計
するために使用され得る。ＤＮＡポリヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の
領域に相補的なように設計され、それによってレセプターの転写および産生を妨
害する。アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてレセプターポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロック
する。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、そ
れによってアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、インビボで発現され、ＴＲ９レ
セプターの産生を阻害し得る。

【０３６０】 １つの実施形態において、本発明のＴＲ９アンチセンス核酸は、外因性配列か
らの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分は、転
写されて、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクタ
ーは、ＴＲ９アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは
、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するために転写され得る限りにおいて、エピ
ソームのままであり得るか、または染色体に組み込まれ得る。このようなベクタ
ーは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクタ
ーは、脊椎動物細胞中での複製および発現のために使用される、プラスミド、ウ
イルス、または当該分野において公知の他のものであり得る。ＴＲ９またはその
フラグメントをコードする配列の発現は、当該分野において公知の任意のプロモ
ーターによって、脊椎動物（好ましくは、ヒト）の細胞において作用するためで
あり得る。このようなプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。このよ
うなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔおよ
びＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウ
ス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら
、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモー
ター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列
（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（１９８２））など
が含まれるがこれらに限定されない。

【０３６１】 本発明のアンチセンス核酸は、ＴＲ９遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部
に相補的な配列を含む。しかし、完全な相補性は、好ましいものの、必要なわけ
ではない。「ＲＮＡの少なくとも一部に相同な」配列とは、本明細書中で引用さ
れる場合、ＲＮＡにハイブリダイズし得るのに十分な相補性を有して、安定な二
重鎖を形成する配列を意味する。二本鎖ＴＲ９アンチセンス核酸の場合、従って
、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得
る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの
両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それが含み得
、そしてなお安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成するＴＲ９
ＲＮＡとの塩基のミスマッチがより多くなる。当業者は、ハイブリダイズした複
合体の融点を決定するための標準的な手段の使用によってミスマッチの許容でき
る程度を確認し得る。

【０３６２】 メッセージの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開始コ
ドンまでのおよびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳を阻害する
際に最も効率的に働くはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示されてきた
。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（
１９９４）を参照のこと。従って、図１Ａ〜Ｄに示されるＴＲ９の５’非翻訳、
非コード領域または３’ 非翻訳、非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌ
クレオチドは、内因性ＴＲ９ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスア
プローチにおいて使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌ
クレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領
域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、より効率的でない翻訳のイン
ヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。ＴＲ９ ｍＲＮＡの５’、３
’、またはコード領域にハイブリダイズするように設計されたかどうかに関わら
ず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そし
て好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。
特定の局面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド、
少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、または少なく
とも約５０ヌクレオチドである。

【０３６３】 本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡま
たはそのキメラ混合物または誘導体または修飾バージョンであり得る。オリゴヌ
クレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されて、例えば、分
子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善し得る。オリゴヌクレオチドは
、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボで宿主細胞レセプター
を標的化するために）または細胞膜を横切る輸送を容易にするための薬剤（例え
ば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４．６４８−６５２（１９８７）
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照
のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（
１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーションによって
誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）または挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉ
ｎｇ）薬剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９
８８）を参照のこと）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、
別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋
剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断剤など）と結合体
化され得る。

【０３６４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含む群から選択されるがこれらに
限定されない、少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る：５−フルオロウラシ
ル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサ
ンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチ
ル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カ
ルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシ
ルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニ
ン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２
−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン
、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ
メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカ
ルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソ
ペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗ
ｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシ
ン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５
−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−
オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ
−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミ
ノプリン。

【０３６５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビ
ノース、キシルロース、およびヘキソースから選択されるがこれらに限定されな
い、少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。

【０３６６】 なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチ
オエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデ
ート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタ
ールまたはそれらのアナログを含む群から選択されるがこれらに限定されない、
少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。

【０３６７】 なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、＿−アノマ
ー性オリゴヌクレオチドである。α−アノマー性オリゴヌクレオチドは、相補的
ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβユニットとは反
対に、その鎖は互いに平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。そのオリゴヌクレオチドは
、２＿−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナ
ログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７
））である。

【０３６８】 本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法によって（例え
ば、自動ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているようなもの）の使用によって）
合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉ
ｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））の方法に
よって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御されたポア
のガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によって
調製され得る。

【０３６９】 ＴＲ９コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが
、転写された非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。

【０３７０】 本発明に従う潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、１９９０年１０月４日に公開された国際出願公開番号ＷＯ
９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２
２５（１９９０）を参照のこと）。部位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断する
リボザイムはＴＲ９ ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッ
ド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮ
Ａと相補的な塩基対を形成する隣接境域によって指示される位置においてｍＲＮ
Ａを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列：５’−Ｕ
Ｇ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は
、当該分野において周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ
、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）においてより十分に記載
される。ＴＲ９（図１Ａ〜Ｄ）のヌクレオチド配列中において、多数の潜在的な
ハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、リボザイムは、
切断認識部位がＴＲ９ ｍＲＮＡの５’末端の近傍に位置するように；すなわち
、効率を増大させ、そして非機能的なＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するよ
うに操作される。

【０３７１】 アンチセンスアプローチにおけるのと同様に、本発明のリボザイムは、修飾さ
れたオリゴヌクレオチドから構成され得（例えば、安定性の改善、標的化などの
ために）、そしてインビボでＴＲ９を発現する細胞に送達されるべきである。リ
ボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入
についての上記と同様の様式で細胞に導入され得る。送達の好ましい方法は、強
力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩ
プロモーター）の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用して
、その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性のＴＲ９メッセージを破壊
し、そして翻訳を妨害するのに十分な量のリボザイムを産生することを包含する
。このようなリボザイムは、アンチセンス分子とは違って触媒性であり、より低
い細胞内濃度が効率のために必要である。

【０３７２】 内因性遺伝子発現はまた、ＴＲ９遺伝子および／またはそのプロモーターを、
標的化された相同組換えを用いて、不活性化または「ノックアウトする」ことに
よって減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２
３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ
５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１
３−３２１（１９８９）（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中で
援用される）を参照のこと）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（その遺伝
子のコード領域または調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡと隣接する、本発明
の変異体、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関連しないＤＮＡ配列）が
、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーとともに、またはこれら
の選択マーカーなしで使用され、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細
胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野において公知の
技術が使用されて、目的の遺伝子を含むがその遺伝子を発現しない、細胞中でノ
ックアウトを生成する。標的化された相同組換えを介するＤＮＡ構築物の挿入は
、標的遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、研究分野および農
業分野において特に適しており、ここでは胚性幹細胞への改変が不活性な標的さ
れた遺伝子を有する動物子孫を生成するために使用され得る（例えば、Ｔｈｏｍ
ａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、
前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が、当業
者に明らかである適切なウイルスベクターを使用して、インビボで必要とされる
部位に直接的に投与されるかまたは標的化されるならば、ヒトにおける使用に慣
用的に適合され得る。この段落に引用される文書のそれぞれの内容は、その全体
が参考として本明細書中で援用される。

【０３７３】 本発明に従うさらなるアンタゴニストは、ＴＲ９の可溶型（例えば、全長レセ
プターの細胞外領域からのリガンド結合ドメインを含む、図１Ａ〜Ｄに示される
ＴＲ９フラグメント）を含む。このような可溶型のレセプター（これは、天然に
存在するか、または合成であり得る）は、ＴＮＦファミリーリガンドへの結合に
ついて細胞表面ＴＲ９と競合することによって、ＴＲ９媒介シグナル伝達を拮抗
する。従って、リガンド結合ドメインを含むレセプターの可溶型は、ＴＮＦファ
ミリーリガンドによって誘導されたアポトーシスを阻害し得る新規なサイトカイ
ンである。これらは、好ましくはダイマーまたはトリマーとして発現する。なぜ
なら、これらは、アンタゴニストとして（例えば、ＩｇＧＦｃ−ＴＮＦレセプタ
ーファミリー融合として）モノマー形態の可溶レセプターより優れていることが
示されているからである。他のこのようなサイトカインは当該分野で公知であり
、そしてＦａｓリガンドによって誘導されるアポトーシスを制限するように生理
学的に作用するＦａｓＢ（マウスＦａｓレセプターの可溶型）（Ｈｕｇｈｅｓ，
Ｄ．Ｐ．およびＣｒｉｓｐｅ，Ｉ．Ｎ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３９
５−１４０１（１９９５））を含む。「ＴＮＦファミリーリガンド」とは、ＴＮ
Ｆレセプターファミリーのメンバーと結合し得、そしてリガンド／レセプターシ
グナル伝達経路を誘導および／またはブロックする、天然に存在するリガンド、
組換えリガンド、および合成リガンドを意図する。ＴＮＦリガンドファミリーの
メンバーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＮＦ−ａ、
リンホトキシン−ａ（ＬＴ−ａ、ＴＮＦ−ｂとしても知られる）、ＬＴ−ｂ（複
合ヘテロトリマーＬＴ−ａ２−ｂにおいて見出される）、ＦａｓＬ、ＴＮＦ−γ
（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／
３３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、ＡＰＲＩ
Ｌ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイン
−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ニュートロカイン−α（国際公開
番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１Ｂ
ＢＬ、ＯＸ４０Ｌおよび神経成長因子（ＮＧＦ）。実施例５および６に記載され
る実験は、ＴＲ９レセプターは、他の相同なタンパク質と同様に、アポトーシス
を引き起こしうるデスドメイン含有分子（これは、免疫系の制御において重要で
ある）であることを示す。さらに、以下に記載の実験は、ＴＲ−９誘導アポトー
シスは、ＩＣＥ様プロテアーゼ（ＣｒｍＡおよびｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）のインヒ
ビターによってブロックされることを示唆する。重要なことには、ＴＲ９によっ
て誘導されるアポトーシスは、ＦＡＤＤ（ＦＡＤＤ−ＤＮ）またはＦＬＩＣＥ（
ＦＬＩＣＥ−ＤＮ／ＭＡＣＨａｌＣ３６０Ｓ）（これらは、以前に、Ｆａｓ／Ａ
ＰＯ−１およびＴＮＦＲ−１によってデスシグナル（ｄｅａｔｈ ｓｉｇｎａｌ
）伝達を阻害することが示された）のドミナントネガティブなバージョンによっ
てブロックされることもまた予想される。従って、ＩＣＥ様プロテアーゼ、ＦＡ
ＤＤ−ＤＮおよびＦＬＩＣＥ−ＤＮ／ＭＡＣＨａｌＣ３６０Ｓはまた、ＴＲ９活
性のアンタゴニストとして使用され得る。

【０３７４】 本発明のアンタゴニストはまた、本発明のＴＮＦファミリーリガンドまたはＴ
Ｒ９ポリペプチドに対して特異的な抗体を含む。本明細書中で使用する場合、用
語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、インタクトな
分子、ならびに抗原に結合し得る抗体のフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ
（ａｂ’）₂フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂ フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅
速にクリアランスされ、そしてインタクトな抗体のあまり非特異的でない組織結
合を有し得る（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１
９８３））。

【０３７５】 本発明に従う抗体はまた、本発明のＴＲ９免疫源を用いる任意の種々の標準的
方法によって調製され得る。示されるように、このようなＴＲ９免疫原としては
、図１Ａ〜Ｄに示される全長（完全）ＴＲ９ポリペプチド（配列番号２）（これ
は、リーダー配列を含んでも含まなくてもよい）およびＴＲ９ポリペプチドフラ
グメント（例えば、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、
細胞内ドメイン、デスドメイン、不完全デスドメインまたはそれらの任意の組み
合わせを含むか、あるいはこれらからなる）が挙げられる。

【０３７６】 本発明に従う、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアゴニストま
たはアンタゴニストは、本明細書中に開示される方法および／または当該分野で
公知の方法（例えば、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌ
ｉａら、Ｃｅｌｌ ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびに国際出願公開
番号ＷＯ ９４／０９１３７（これらの３つの適用の各々の内容は、その全体が
参考として本明細書中に援用される）に記載される方法）に従って惹起され得、
そして好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドに
特異的（すなわち、唯一結合する）である。

【０３７７】 好ましい方法においては、本発明に従う抗体は、ｍＡｂである。このようなｍ
Ａｂは、ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌ
ｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）および米国
特許第４，３７６，１１０；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
Ｙ，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．
１９８０；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第
１３巻（Ｂｕｒｄｏｎら編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８
４））。

【０３７８】 ＴＲ９ドメインに結合するタンパク質および他の化合物もまた、本発明に従う
候補アゴニストおよびアンタゴニストである。このような結合化合物は、酵母ツ
ーハイブリッド系を使用して「捕捉され」得る（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、
Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９））。酵母ツーハイブリッド
系の改変されたバージョンは、Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔおよび共同研究者らによ
って記載されている（Ｇｙｕｒｉ Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３（１９９３
）；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２（１９９３））。好まし
くは、酵母ツーハイブリッド系は、本発明に従って使用され、ＴＲ９のリガンド
結合ドメイン、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、およびデス
ドメインに結合する化合物を捕捉する。

【０３７９】 上記のツーハイブリッドアッセイを用いることにより、ＴＲ９レセプターの細
胞内ドメイン（またはその部分）は、インビボでレセプターと相互作用する細胞
タンパク質を同定するために使用され得る。このようなアッセイはまた、ＴＲ９
レセプター機能の強力なアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有するリガ
ンドを同定するために使用され得る。このスクリーニングアッセイは、以前に、
マウスＴＮＦ−ＲＩＩの細胞質ドメインと相互作用するタンパク質を同定するた
めに使用され、そして２つのレセプター結合タンパク質の同定を導いてきた。Ｒ
ｏｔｈｅら、Ｃｅｌｌ ７８：６８１（１９９４）。ＴＲ９レセプターの細胞質
ドメインに結合するこのようなタンパク質配列およびアミノ酸配列は、本発明の
優れた候補アゴニストおよびアンタゴニストである。

【０３８０】 他のスクリーニング技術は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１８１−１９
６（１９８９）に記載されるようなレセプター活性化によって引き起こされる、
細胞外のｐＨ変化を測定するシステムにおける、本発明のポリペプチドを発現す
る細胞（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）の使用を包含する。別の
例においては、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のポリペプ
チドを発現する細胞と接触し得、そして潜在的なアンタゴニストまたはアゴニス
トが有効であるか否かを決定するために、第２のメッセンジャー応答（例えば、
シグナル変換）が測定され得る。

【０３８１】 「ＴＮＦファミリーリガンド」とは、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバー
と結合し得、そしてリガンド／レセプターシグナル伝達経路を誘導し得る、天然
に存在するリガンド、組換えリガンドおよび合成リガンドを意図する。ＴＮＦリ
ガンドファミリーとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＲ
９リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ
−βとしても知られる）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−β）、Ｆ
ａｓＬ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、および神経成
長因子（ＮＧＦ）ならびに本明細書中に記載される他のＴＮＦリガンドファミリ
ーのメンバー。

【０３８２】 本発明の代表的な治療適用は、下記により詳細に考察される。ＡＩＤＳを定義
する免疫不全の状態は、ＣＤ４⁺ Ｔリンパ球の数および機能の減少に副次的で
ある。最近の報告は、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞の日々の減少が、３．５×１０⁷および２
×１０⁹細胞の間であると評価している（Ｗｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：１
１７−１２２（１９９５））。ＨＩＶ感染の環境下でのＣＤ４⁺ Ｔ細胞枯渇の
１つの原因は、ＨＩＶ誘導アポトーシスであると考えられている。事実、ＨＩＶ
誘導アポトーシス細胞死は、インビトロだけでなく、より重要なことに、感染個
体でも実証された（Ａｍｅｉｓｅｎ，ＡＩＤＳ ８：１１９７−１２１３（１９
９４）；Ｆｉｎｋｅｌ，およびＢａｎｄａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：６０５−６１５（１９９５）；Ｍｕｒｏ−Ｃａｃｈｏ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５５５−５５６６ （１９９５））。さらに、ア
ポトーシスおよびＣＤ４⁺ Ｔ−リンパ球枯渇は、ＡＩＤＳの異なる動物モデル
で密接に相関し（Ｂｒｕｎｎｅｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１−４４４
（１９９５）；Ｇｏｕｇｅｏｎ，ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ ９：５５３−５６３（１９９３））、アポトーシスは、ウイル
ス複製がＡＩＤＳをもたらさないこれらの動物モデルでは認められない。すなわ
ち、さらなるデータは、ＨＩＶ感染個体からの非感染だが感作または活性化され
たＴリンパ球は、ＴＮＦ−ファミリーリガンドＦａｓＬと遭遇後に、アポトーシ
スを経ることを示す。ＨＩＶ感染後に死をもたらす単球細胞株を使用して、Ｕ９
３７細胞のＨＩＶによる感染が、ＦａｓＬのデノボ発現をもたらすこと、および
ＦａｓＬが、ＨＩＶ誘導アポトーシスを媒介することが実証されている（Ｂａｄ
ｌｅｙ，ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９９−２０６（１９９６））。さらに、
ＴＮＦ−ファミリーリガンドは、非感染マクロファージで検出可能であり、その
発現は、ＨＩＶ感染後にアップレギュレートされ、非感染ＣＤ４ Ｔリンパ球の
選択的殺傷をもたらした。従って、本発明によって、ＨＩＶ⁺個体を処置、予防
、診断、および／または検出するための方法が提供され、この方法は、本発明の
アンタゴニストを、ＣＤ４ Ｔリンパ球の選択的殺傷を減少させるために投与す
ることを包含する。投与様式および投与量は、下記に詳細に考察されている。

【０３８３】 同種移植片拒絶では、レシピエント動物の免疫系は、ほとんどの場合免疫系は
周囲抗原によってのみ感作されるので、応答するように前もって感作されていな
い。同種のその他のメンバーからの組織は、例えば、ウイルスおよび細菌が提示
されるのと同じようには、提示されていない。同種移植片拒絶の場合、免疫抑制
養生法は、免疫系がエフェクター期に到達することを阻むように設計される。し
かし、異種移植片拒絶の免疫プロフィールは、同種移植片拒絶よりも疾患再発に
より類似し得る。疾患再発の場合、免疫系は、天然の島細胞の破壊によって示さ
れるように、すでに活性化されている。従って、疾患再発では、免疫系はすでに
エフェクター期にある。活性化され、エフェクター細胞へ分化されたリンパ球は
、ＴＲ９ポリペプチドを発現するので、本発明のアゴニストは、同種移植片およ
び異種移植片の両方に対する免疫応答を抑制し得、そのことによって、アポトー
シスを増強する化合物に感受性である。従って、本発明はさらに、免疫学的寛容
組織を作製するための方法を提供する。

【０３８４】 本発明のＴＲ９アンタゴニストは、炎症疾患およびストレス応答性関連疾患（
例えば炎症腸疾患、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、および敗血症）の
処置、予防、診断および／または検出おいて、さらに使用され得る。

【０３８５】 さらに、リンパ芽球のＴＲ９の発現に起因して、可溶性ＴＲ９アゴニスト、ま
たはアンタゴニスト抗体（例えば、ｍＡＢ）この形態の癌の処置、予防、診断お
よび／または検出に使用され得る。さらに、可溶性ＴＲ９または中和ｍＡＢは、
種々の慢性および急性な形態の炎症（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症
、乾癬、敗血症および炎症性腸疾患）の処置、予防、診断および／または検出に
使用され得る。

【０３８６】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範な疾患および／または状態
の診断および処置、予防、診断および／または検出において有用である。このよ
うな疾患および状態には、癌（例えば、免疫細胞関連癌、乳癌、前立腺癌、卵巣
癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または変化と関連した癌、脳腫瘍、膀胱癌、
子宮頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺の非小細胞癌、肺の小細胞癌、胃癌など）
、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節症）、微生物（例えば、ウイルス、細菌
など）感染（例えば、ＨＩＶ−感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウイルス感染（
ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを
含むがこれらに限定されない）、アデノウイルス感染、ポックスウイルス感染、
ヒトパピローマウイルス感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなど
）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染、侵襲性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｉａなど）、寄生生物感染、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗しょう症）、ア
テローム性動脈硬化症、疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、低血管形
成または循環の減少（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作など）））
、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性性疾患（例えば、アルツハイマー病、
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性など）、移植拒
絶（急性および慢性）、対宿主性移植片病、骨髄形成異常症に起因する疾患（例
えば、再生不良性貧血など）、リウマチにおける関節組織破壊、肝臓疾患（例え
ば、急性および慢性肝炎、肝臓損傷、および肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、
多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体性糸球
体腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーヴズ病、橋
本甲状腺炎など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症
（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性網膜症）、インフ
ルエンザ、ぜん息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、および潰瘍性大腸炎
が挙げられるがこれらに限定されない。

【０３８７】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／あるいは
そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成の促進、創傷治
癒（例えば、創傷、熱傷、および骨折）において有用である。

【０３８８】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
のアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原に対する免疫
応答性および／または抗ウイルス免疫応答を増強するためのアジュバントとして
有用である。

【０３８９】 より一般的には、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドな
らびに／あるいはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応答
を調節する（すなわち、上昇または減少させる）際に有用である。例えば、本発
明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線治療
、化学療法、および移植からの準備または回復において有用であり得、また、高
齢のおよび／または免疫無防備状態の個体において免疫応答および／または回復
をブーストするために使用され有る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよ
び／もしくはポリペプチドならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはア
ンタゴニストは、例えば、自己免疫障害の処置、予防、診断および／または検出
における免疫抑制剤として有用である。特定の実施形態において、本発明のポリ
ヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、慢性的炎症、アレルギーまたは自
己免疫状態（例えば、本明細書中に記載されるか、またはさもなくば当該分野で
公知の状態）を処置、予防、診断、および／または検出するために使用される。

【０３９０】 （投与形態） 本明細書中に記載されるアゴニストまたはアンタゴニストは、インビトロ、エ
キソビボ、またはインビボで、細胞に投与され得る。それらは、本発明のレセプ
ターを発現する。アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」の投与とは、化
合物の量を意図する。これは、ＴＮＦファミリーリガンドの細胞応答を、十分に
増強または阻害し、そしてポリペプチドを含む。特に、アゴニストまたはアンタ
ゴニストの「有効量」の投与とは、ＴＲ９媒介性アポトーシスを増強または阻害
する有効量を意図する。もちろん、アポトーシスが増強されることが望まれる場
合、本発明に従うアゴニストは、ＴＮＦファミリーリガンドと共に投与され得る
。当業者は以下のことを理解する。アゴニストまたはアンタゴニストの有効量が
、経験的に決定され得、そして純粋な形態または薬学的に受容可能な塩の形態、
エステルの形態、あるいはプロドラッグの形態で使用され得ることを理解する。
アゴニストまたはアンタゴニストは、１以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み
合わされた組成物において投与され得る（すなわち、キャリア）。

【０３９１】 以下のことが理解される。ヒト患者に投与される場合、本発明の化合物および
組成物の全体の日々の使用は、主治医である医師によって信頼できる医療の判断
の範囲内で決定される。任意の特別な患者に対する特定の治療有効量の用量レベ
ルは、医療分野で周知の因子に依存する。

【０３９２】 一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるＴＲ−９７ポリペプチド
の総薬学的有効量は、患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ましく
は、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒ
トについて、ホルモンに関して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日と
の間である。連続的に与えられる場合、ＴＲ−９ポリペプチドは、代表的には、
約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜
４回の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかによ
り投与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。

【０３９３】 投与はまた、患者に特異的な様式でアレンジされ、決定された濃度のアゴニス
トまたはアンタゴニストを血液に提供する（ＲＩＡ技術によって決定されたよう
に）。従って、患者に投与することは、調節され得、ＲＩＡによって測定される
血液レベルによってレギュラーな継続を達成する。そのオーダーは、５０〜１０
００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１５０〜５００ｎｇ／ｍｌである。

【０３９４】 薬学的組成物は、以下を含んで提供される。ＴＲ９のアゴニスト（ＴＲ９レセ
プターポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドまたは抗体を含む）またはアゴ
ニスト（例えば、ＴＲ９ポリヌクレオチド、本発明のポリペプチド、またはその
抗体）および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。これらは経口的、直腸
内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所
的（粉剤、軟膏、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口ま
たは鼻腔スプレーとして投与され得る。１つの実施形態において、「薬学的に受
容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液状充填剤、希釈剤、カ
プセル化材料または任意の型の処方補助物を意味する。具体的な実施形態におい
て、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトに
おける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、また
は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する
。この実施形態に従う、適切な薬学的キャリアの非限定的な例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａ
ｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような薬学的なキャリアは、水および油（
石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、
大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、
薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩
水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射
可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。

【０３９５】 用語「非経口的」とは本明細書中において使用される場合、静脈内、筋肉内、
腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

【０３９６】 非経口注射のための本発明の薬学的組成物は、使用の直前に滅菌注射溶液また
は分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）への再形成のために以下を含み得る。薬学的
に受容可能な滅菌された水性または非水性溶液、分散剤、懸濁液またはエマルジ
ョン、ならびにの滅菌粉末。

【０３９７】 可溶性ＴＲ９ポリペプチドに加えて、膜貫通領域を含むＴＲ９ポリペプチドは
また、以下の場合に使用され得る。界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳまたはＮＰ
−４０）を含むことによって緩衝液に適切に可溶化される場合。

【０３９８】 本発明の組成物は、単独でか、または他の治療薬剤と組み合わせて投与され得
る。本発明の組成物と組み合わされて投与され得る治療薬剤としては、ＴＮＦフ
ァミリーの他のメンバー、化学療法薬剤、抗生物質、ステロイドならびに非ステ
ロイド抗炎症性の従来の免疫療法薬剤、サイトカインおよび／または増殖因子が
挙げられるが、これらに限定されない。組み合わせは、同時に（例えば、混合物
として、別々に同時にか、あるいは連続して）か、または連続して投与され得る
。これは、組み合わされた薬剤が一緒に治療混合物として投与される提示を含み
、そして組み合わされた薬剤が別々に、しかし同時に投与される手順（例えば、
同じ個体の別の静脈を介して）もまた含む。「組み合わされた」投与は、さらに
、初めに与えられる１つの化合物または薬剤、続いて第２の化合物または薬剤の
、別個の投与を含む。

【０３９９】 一つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わされて投与され得る。本発明の組成物と投与され得るＴＮＦ分子、
ＴＮＦ関連分子、ＴＮＦ様分子としては、可溶性形態のＴＮＦα、リンフォトキ
シン−α（ＬＴ−α、またＴＮＦ−βとしても公知である）、ＬＴ−β（複合体
へテロトリマーＬＴ−α−２−βとして見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、Ｃ
Ｄ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、Ｔ
ＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号Ｗ
Ｏ９７／３４９１１）、ＡＩＭ−ＩＩ（（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）
、エンドカイン−α（国際公開番号Ｏ９８／０７８８０））、ＴＲ６（国際公開
番号９８／３０６９４）ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（国際公開番号Ｗ
Ｏ９８／１８９２１）、ＯＸ４０および神経増殖因子（ＮＧＦ）、および可溶性
形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、Ｃｄ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際
公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４
）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ
９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（
国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ
９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号９８／５４２０２）、３１２Ｃ２
（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ２、Ｔ
Ｒ１２、および可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【０４００】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、エンドカイン−αと組み合わ
されて投与される。

【０４０１】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０
Ｌ）、可溶性形態のＣＤ４０Ｌ（例えば、ＡＶＲＥＮＤ^TM）、ＣＤ４０Ｌの生物
学的に活性なフラグメント、改変体、または誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば
、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）および／または抗ＣＤ４０抗体（
例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）と組み合わされて投与され
る。

【０４０２】 従来の非特異的免疫抑制薬剤（本発明の組成物と組み合わされて投与され得る
）としては、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似体、シクロホス
ファミド、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６
、１５−デオキシスパガリン、およびＴ細胞に応答する機能を抑制することによ
って作用する他の免疫抑制剤が挙げられるがこれらに限定されない。

【０４０３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質薬剤と組み合わされ
て投与される。本発明の組成物と組み合わされ得る抗生物質薬剤としては、テト
ラサイクリン、メトロニダゾール、アモキシシリン、β−ラクタマーゼ、アミノ
グリコシド、マクロライド、キノロン、フルオロキノロン、セファロスポリン、
エリスロマイシン、シプロフロキサシンおよびストレプトマイシンが挙げられる
が、これらに限定されない。

【０４０４】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、およ
び／またはプロテアーゼインヒビターとの組み合わせで投与される。本発明の組
成物との組み合わせで投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビターは、Ｒ
ＥＴＲＯＶＩＲ^TM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸ^TM（ジダノシン／ｄｄｌ
）、ＨＩＶＩＤ^TM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴ^TM（スタブジン（ｓｔ
ａｖｕｄｉｎｅ）／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ^TM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉ
ｎｅ）／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲ^TM（ジドブジン／ラミブジン）が挙
げられるがこれらに限定されない。本発明の組成物との組み合わせで投与され得
る非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターは、ＶＩＲＡＭＵＮＥ^TM（ネビラピン
（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ））、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ^TM（デラビジン（ｄｅｌａ
ｖｉｒｄｉｎｅ））、およびＳＵＳＴＩＶＡ^TM（エファビレン（ｅｆａｖｉｒｅ
ｎｚ））が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の組成物との組み合わせ
で投与され得るプロテアーゼインヒビターは、ＣＲＩＸＩＶＡＮ^TM（インディナ
ビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲ^TM（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖ
ｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥ^TM（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ））、およ
びＶＩＲＡＣＥＰＴ^TM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））が挙げられ
るがこれらに限定されない。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、
ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター
、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳの処置、および／また
はＨＩＶ感染を予防または処置するために、本発明の組成物との任意の組み合わ
せにおいて使用され得る。

【０４０５】 他の実施形態において、本発明の組成物は、抗日和見感染薬剤と組み合わせて
投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見感染薬剤は
、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳ
ＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ^TM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TM、ＩＳＯＮＩＡ
ＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、ＥＴＨＡＭＢＵ
ＴＯＬ^TM、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、ＡＺＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、ＣＩ
ＤＯＦＯＶＩＲ^TM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、
ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ ^TM 、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ^TM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TM、ＮＥＵＰＯＧＥ
Ｎ^TM（フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥ
ＵＫＩＮＥ^TM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ
）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組
成物は、日和見性のニューモシスティス肺炎感染を予防的に処置または予防する
ために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、Ｄ
ＡＰＳＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ^TM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯ
ＮＥ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態では、本発明の
組成物は、日和見性のトリ菌感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯ
ＮＩＡＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、および／
またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の
実施形態では、日和見性の結核菌感染を予防的に処置または予防するために、本
発明の組成物は、ＲＩＦＡＢＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、およ
び／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別
の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見性のサイトメガロウイル
ス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯ
ＳＣＡＲＮＥＴ^TM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲ^TMとの任意の組み合わせ
で使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見性の真
菌症感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、Ｉ
ＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ^TMとの任
意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は
、日和見性の単純性疱疹ウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防的に処置
または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TMおよび／またはＦＡＭＣＩＣＯＬ
ＶＩＲ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本
発明の組成物は、日和見性のＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的
に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ^TMおよび／またはＬ
ＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態
において、本発明の組成物は、日和見性の細菌感染を予防的に処置または予防す
るために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ^TMとの任意
の組み合わせで使用される。

【０４０６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗ウイルス薬剤と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス薬剤は、アシクロ
ビル、リバビリン、アマンタジン、およびリマンタジンが挙げられるがこれらに
限定されない。

【０４０７】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質薬剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質薬剤は、アモキシリン
、アミノグリコシド、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタマーゼ、ク
リンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシ
ン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド
、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン、リファンピン、ストレプトマイシン
、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリムトプリム、トリムトプリム−スル
ファメトキサゾールおよびバンコマイシンが挙げられるがこれらに限定されない
。

【０４０８】 本発明の組成物と組み合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤として
は、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似体、シクロホスファミド
、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−
デオキシスパガリン、およびＴ細胞に応答する機能を抑制することによって作用
する他の免疫抑制剤が挙げられるがこれらに限定されない。

【０４０９】 さらに、本発明の組成物と組み合わせて投与され得る免疫抑制剤調製物は、Ｏ
ＲＴＨＯＣＬＯＮＥ^TM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ^TM／ＮＥＯＲＡＬ^TM ／ＳＡＮＧＤＹＡ^TM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ^TM（タクロリムス）、
ＣＥＬＬＣＥＰＴ^TM（マイコフェノラート）、アザチオプリン、グルコミコステ
ロイド（ｇｌｕｃｏｍｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥ^TM（シ
ロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））が挙げられるがこれらに限定されない。特定
の実施形態において、免疫抑制薬が、器官の拒絶または骨髄移植の拒絶を予防す
るために使用され得る。

【０４１０】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド治療と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るステロイドとしては
、経口コルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロン（例え
ば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられる。特定の実施形態において、本発
明の組成物は、プレドニゾンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形
態において、本発明の組成物は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物およびプレドニゾンとともに投与され得る免疫抑制
剤は、本明細書中に記載され、そしてこの免疫抑制剤としては、アザチオプリン
、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるが、これら
に限定されない。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレ
ドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態において、本発
明の組成物は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与され
る。本発明の組成物およびメチルプレドニゾロンとともに投与され得る免疫抑制
剤は、本明細書中に記載され、そしてこの免疫抑制剤としては、アザチオプリン
、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるが、これら
に限定されない。

【０４１１】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗マラリア剤としては、ヒド
ロキシクロロキン、クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【０４１２】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投
与される。

【０４１３】 非限定的な実施形態において、本発明の組成物は、以下の薬物の１、２、３、
４、５、１０以上と組み合わせて投与され得る：ＮＲＤ−１０１（Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅｔｈａｉｄ）
、オキサプロジンカリウム（ｏｘａｐｒｏｚｉｎ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）（Ｍｏ
ｎｓａｎｔｏ）、メカセルミン（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）
、ペムトレキシド二ナトリウム（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ）（
Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、アトレレウトン（ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ）（Ａｂｂｏｔ
ｔ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、エルテ
ナック（ｅｌｔｅｎａｃ）（Ｂｙｋ Ｇｕｌｄｅｎ）、カンパス（ｃａｍｐａｔ
ｈ）、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ
Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３
０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢ
Ｆ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、（ＩＬ−１Ｒａ遺伝子治療）ＩＬ−１
Ｒａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａ
ｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（Ａｎｇ
ｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ Ｗｈａ）、ダルブフェロンメシ
レート（ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍ
ｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；Ａｍｇｅｎ）、Ｉ
ＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、トロカード（ｔｒｏｃａｄｅ）（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ
Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）
、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＢＩＩＦ
−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｌｅｕｋｏ Ｖａ
ｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ−１４８
２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）、およびブチキソコートプロピオネート（ｂｕｔｉｘ
ｏｃｏｒｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。

【０４１４】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、以下の薬物の１、２、３、４
、５以上と組み合わせて投与される：メトトレキサート、スルファサラジン、ア
ウロチオリンゴ酸ナトリウム、アウラノフィン（ａｕｒａｎｏｆｉｎ）、シクロ
スポリン、ペニシルアミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、本明細書
中で記載されるような）、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＮＢＲ
ＥＬ^TM（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。

【０４１５】 より好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤、メトトレ
キサート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＮＢＲＥＬ^TMおよび／またはスルファサラジンと組
み合わせて投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、メトトレ
キサートと組み合わされて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物
は、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の
組成物は、メトトレキサートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別
の実施形態において、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わせて投与
される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキサート、
抗ＴＮＦ抗体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形
態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMと組み合わせて投与される。別
の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMおよびメトトレキサー
トと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮ
ＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与され
る。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサ
ートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態において
、１つ以上の抗マラリア剤は、上記の組み合わせのうちの１つと組み合わせる。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤（例えば、ヒドロキ
シクロロキン）、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと
組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗
マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗ＴＮＦ抗
体、およびメトトレキサートと組み合わせて投与される。

【０４１６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投
与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲ^TM、ＩＶＥＥＧ
ＡＭ^TM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮ^TM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／Ｄ^TMおよび
ＧＡＭＩＭＵＮＥ^TMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫
グロブリン調製物と組み合わせて投与される。

【０４１７】 ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４０Ｌの可溶性形態（例えば、ＡＶＲ
ＥＮＤ^TM）、ＣＤ４０Ｌの生物学的に活性なフラグメント、改変体、または誘導
体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）、
および／または抗ＣＤ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト
抗体）。

【０４１８】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。

【０４１９】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【０４２０】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。

【０４２１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ
−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示
されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０
７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびド
イツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（
ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本
明細書で参考として援用される。

【０４２２】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。

【０４２３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。

【０４２４】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に価値がある。その配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得
る。本発明による、ＤＮＡの染色体へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子と
それらの配列とを相関付ける際の重要な第１の工程である。

【０４２５】 この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中において開示さ
れるｃＤＮＡを使用して、ＴＲ９レセプター遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニン
グする。このことは、一般に市販されている種々の周知の技術およびライブラリ
ーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡを、インサイチュ染色体マッ
ピングのために、この目的のための周知の技術を使用して使用される。

【０４２６】 さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー
（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピング
され得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮ
Ａにおける１より多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、そ
れによって増幅プロセスは複雑にされる。次いで、これらのプライマーを、個々
のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用す
る。

【０４２７】 中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色体位置を提
供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブ
とともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参
照のこと。

【０４２８】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上のその配列の
物理的位置を、遺伝マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉ
ｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見られ
る。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、
連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定する。

【０４２９】 次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体の
いくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察され
ない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。

【０４３０】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照してより容
易に理解される。以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定を意図さ
れない。

【０４３１】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＲ９レセプターの発現および精製） 細菌発現ベクターｐＱＥ６０が、本実施例において細菌発現のために使用され
る。（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔ
ｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性
（「Ａｍｐ^r」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘
導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ
．（上述）により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」
）親和性樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコー
ドする６コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これらのエレ
メントは、ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチド
のカルボキシル末端に共有結合で連結された６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６
×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを産生するように挿入され得るように配
置される。しかし、本実施例において、６つのＨｉｓコドンの翻訳が妨げられ、
従ってこのポリペプチドが、６×Ｈｉｓタグを有しないで産生されるようにこの
ポリペプチドコード配列は、挿入される。

【０４３２】 疎水性リーダー配列を欠失するＴＲ９レセプタータンパク質の所望の部分をコ
ードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託
されたｃＤＮＡクローンから増幅する。このプライマーは、ＴＲ９レセプタータ
ンパク質の所望の部分のアミノ末端配列およびｃＤＮＡコード配列の３’側の寄
託された構築物中の配列にアニールする。ｐＱＥ６０ベクターにおけるクローニ
ングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、５’配列およ
び３’配列にそれぞれ付加する。

【０４３３】 成熟タンパク質をクローニングするために、５’プライマーは、配列：

【０４３４】

【化４】 （配列番号１１）を有する。これは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位、続いて、
図１Ａ〜Ｄ中の成熟ＴＲ９レセプター配列のアミノ末端コード配列に相補的な１
７ヌクレオチドを含有する。当然、当業者は、タンパク質コード配列中における
、５’プライマーが開始する地点が、全タンパク質の所望の部分（成熟形態より
短いまたはより長い）を増幅するために変動され得ることを理解する。３’プラ
イマーは、配列：

【０４３５】

【化５】 （配列番号１２）を有する。これは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続
いて、図１Ａ〜Ｄ中のＴＲ９レセプターＤＮＡ配列中の非コード配列の３’末端
に相補的な１９ヌクレオチドを含有しする。

【０４３６】 増幅されたＴＲ９レセプターＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を
、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして次いで、消化されたＤＮＡを
共に連結する。ＴＲ９レセプターＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿
入は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターから下流に、かつ開始ＡＵＧとインフレーム
に、その関連する終止コドンを含むＴＲ９レセプタータンパク質コード領域を配
置する。この結合された終止コドンは、挿入位置の６つのヒスチジンコドン下流
の翻訳を妨げる。

【０４３７】 この連結混合物は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されているような標準的な手順
を使用して、コンピテントＥ．Ｃｏｌｉ細胞に形質転換される。Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｍ１５／ｒｅｐ４株（多コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含有する。これは、ｌ
ａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎ^r」）を与える
）が、本明細書中に記載の例示的な実施例を実施することにおいて使用される。
この株は、ＴＲ９レセプタータンパク質の発現に適した多くのうちの唯一の１つ
であり、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（前出）から市販されている。形質転換体は、
アンピシリンおよびカナマイシンの存在下におけるＬＢプレート上で増殖するそ
れらの能力によって同定される。プラスミドＤＮＡは耐性コロニーから単離され
、そしてクローン化ＤＮＡの正体は制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によ
って確認される。

【０４３８】 所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およ
びカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中での液体培養に
おいて、一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。このＯ／Ｎ培養物を、約１：２５〜１
：２５０の希釈で大きな培養物を接種するために使用する。細胞を、６００ｎｍ
での光学密度（「ＯＤ６００」）が０．４と０．６との間になるまで増殖させる
。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を
最終濃度１ｍＭに添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することによりｌａ
ｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞を、続けてさら
に３〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を、遠心分離により採取する。

【０４３９】 次いで、この細胞を６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８中で、４℃で３〜４時間、
攪拌する。この細胞破片を遠心分離によって除去し、そしてＴＲ９レセプターを
含む上清を、２００ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６に対して透析する。あるいは、このタンパク質は、プロテアーゼインヒビ
ターを含む５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／
ＨＣｌ ｐＨ７．４に対して透析することによって首尾よく再折り畳みされ得る
。再変性後、このタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作
用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得
る。あるいは、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフィー工程が、
純粋なＴＲ９レセプタータンパク質を得るために使用され得る。この精製された
タンパク質を４℃で保存するかまたは−８０℃で凍結した。

【０４４０】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＴＲ９レセプタータンパク質の
クローニングおよび発現） この例示的な実施例において、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂ
ｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されるように、標準的手法
を使用して、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、天然に存在する関
連分泌シグナル（リーダー）配列を含む完全タンパク質をコードするクローン化
されたＤＮＡをバキュロウイルスに挿入し、成熟ＴＲ９レセプタータンパク質を
発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力な多角体病プロモーター、続いて
都合の良い制限酵素部位（例えば、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。シ
ミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位は、有効なポリアデ
ニル化のために使用される。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラス
ミドは、同方向の弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデ
ニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、クローン化されたポリヌクレオチ
ドを発現する生存可能なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒
介性の相同組換えのためのウイルス配列と両方の側で隣接する。

【０４４１】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。

【０４４２】 図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）において示されるＡＵＧ開始コドンおよび天然に関
連するリーダー配列を含む寄託されたクローン中の全長ＴＲ９タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。５’プライマーは、配列：

【０４４３】

【化６】 （配列番号１３）を有し、この配列は、下線部のＳｍａＩ制限酵素部位、真核生
物細胞における翻訳開始のための有能なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるような）、そ
れに続いてＡＵＧ開始コドンから始まる図１Ａ〜Ｄに示される完全ＴＲ９レセプ
タータンパク質の多数の配列の塩基を含む。

【０４４４】 ３’プライマー（可溶性形態をクローニングするための）は、配列：

【０４４５】

【化７】 （配列番号１４）を有し、この配列は、下線部のＡｓｐ７１８制限部位、それに
続く、図１Ａ〜Ｄの３’非コード配列に相補的なヌクレオチドを含む。

【０４４６】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲル
から単離する。次いで、このフラグメントを、ＳｍａＩおよびＡｓｐ７１８で消
化し、そして１％アガロースゲル上で、再度、精製した。このフラグメントを、
本明細書中で「Ｆ１」と称した。

【０４４７】 このプラスミドを、制限酵素ＳｍａＩおよびＡｓｐ７１８を用いて消化し、そ
して当該分野で公知の慣用的な手順を使用して必要に応じて仔ウシ腸ホスファタ
ーゼを使用して脱リン化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａ．）を使
用して１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で
「Ｖ１」と称した。

【０４４８】 フラグメントＦ１および脱リン酸したプラスミドＶ１を、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼを用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂ
ｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合物で形質
転換し、そして培養プレート上に拡げる。ＰＣＲ法を使用してヒトＴＲ９レセプ
ター遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。ＰＣＲ法において、使用
されたプライマーの１つはこの遺伝子を増幅するためであり、そして第２のプラ
イマーは十分にベクターの内部からであり、その結果ＴＲ９レセプター遺伝子フ
ラグメントを含有する細菌コロニーのみがＤＮＡの増幅を示す。クローン化され
たフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドを
、本明細書においてｐＢａｃＴＲ９と称する。

【０４４９】 ５μｇのプラスミドｐＢａｃＴＲ９を、 Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７ （１９８７）
によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の線状化
バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同
時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮＡおよ
び５μｇのプラスミドｐＢａｃＴＲ９を、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含
む、マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μ
ｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で
１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清
グレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細
胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。このプレートを前後に揺
らして新たに添加した溶液を混合する。次いで、このプレートを２７℃で５時間
インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をそのプレートから
除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加
する。このプレートをインキュベーターに戻し、そして培養を２７℃で４日間継
続する。

【０４５０】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載さ
れたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むアガロース
ゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容易な同定
および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッセイ」の詳
細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，ＭＤによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の
ための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。適切なインキュベーシ
ョンの後、青色に染色したプラークを、マイクロピペッターのチップ（例えば、
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μ
ｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして組換えバ
キュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９
細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し、次いで４
℃に貯蔵する。この組換えウイルスを「Ｖ−ＴＲ９」と称する。

【０４５１】 Ｖ−ＴＲ９遺伝子の発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充した
グレース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染効率（「
ＭＯＩ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させ
る。６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳ
Ｆ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可能）に置き換える。放射性標識したタンパク
質を所望する場合には、４２時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣ
ｉの³⁵Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。この細胞
をさらに１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中
のタンパク質ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いで
オートラジオグラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。精製タンパ
ク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、成熟タンパク質
のアミノ末端配列、従って、分泌シグナルペプチドの切断位置および長さをを決
定し得る。

【０４５２】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるＴＲ９のクローニングおよび発現） 代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリ
アデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コ
ザック（Ｋｏｚａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部
位およびアクセプター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、
ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、
ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細胞内エレ
メント（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。本発明を
実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴ
ＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、およびｐＢ
Ｃ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを含む。使用され得る哺
乳動物宿主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびジ
ャーカット細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細
胞、Ｃｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細
胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。

【０４５３】 あるいは、この遺伝子は、染色体に組み込まれた遺伝子を含む、安定な細胞株
中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのよう
な選択マーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた
細胞の同定および単離を可能にする。

【０４５４】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍ
ｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂ
ｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５
（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増
殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、
染色体に組み込まれた、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。

【０４５５】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、
Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５））の強力な
プロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃ
ｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））のフラグメントを含む。例えば
、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制限酵素切断部位を有するマル
チプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。この
ベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデ
ニル化シグナルおよび終結シグナルを含む。

【０４５６】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現プラスミドであるｐＴＲ９−ＨＡを、ＴＲ９をコードするｃＤＮＡを、発
現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ．より入手可能）にクローニングすることによって、作製する。

【０４５７】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよ
び他の原核生物細胞中での増殖のために効果的な、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；（
２）プラスミドを含有する原核生物細胞の選択のための、アンピシリン耐性遺伝
子；（３）真核生物細胞中での増殖のためのＳＶ４０の複製起点；（４）ＣＭＶ
プロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡを、都合よ
くＣＭＶプロモーターの発現制御下に配置し得、そしてＳＶ４０イントロンおよ
びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結し得るように配置される、赤血球凝
集素フラグメントをコードするいくつかのコドン（すなわち、精製を容易にする
ための「ＨＡ」タグ）、続いて終止コドンおよびポリアデニル化シグナル。この
ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら（Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４））
によって記載されるインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに
対応する。標的タンパク質に対するＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識す
る抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。さらに
、ｐｃＤＮＡＩＩＩは、選択可能ネオマイシンマーカーを含む。

【０４５８】 ＴＲ９をコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域中に
クローン化し、その結果、組換えタンパク質発現を、ＣＭＶプロモーターによっ
て指向する。プラスミド構築の戦略は、以下のとおりである。寄託されたクロー
ンのＴＲ９ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＴＲ９の発現のためのベクターの構
築に関して、上記に十分に記載されるような都合よい制限部位を含有するプライ
マーを使用して増幅する。本実施例において使用される適切なプライマーとして
は、以下が挙げられる。

【０４５９】 下線のＳｍａＩ部位、コザック配列、ＡＵＧ開始コドンおよび完全ＴＲ９レセ
プターの５’コード領域のコドンを含む５’プライマーは、以下の配列：

【０４６０】

【化８】 （配列番号１３）を有する。

【０４６１】 下線のＸｂａＩ部位、終止コドン、３’コード配列のヌクレオチドを含む３’
プライマーは、（３’末端で）以下の配列：

【０４６２】

【化９】 （配列番号１５）を有する。

【０４６３】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、
ＳｍａＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで連結する。この連結混合物を、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、そして形質転換
した培養物をアンピシリン培地プレート上にプレーティングし、次に、インキュ
ベートして、アンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐性
コロニーから単離し、そしてＴＲ９コードフラグメントの存在について制限分析
または他の手段によって試験する。

【０４６４】 組換えＴＲ９の発現のために、上記のようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使用
して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（
１９８９））、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクトする。細胞をベク
ターによるＴＲ９の発現のための条件下でインキュベートする。

【０４６５】 ＴＲ９−ＨＡ融合タンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降（例えば、
Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）
に記載される方法を使用する）によって検出する。この目的のために、トランス
フェクションの２日後、この細胞を³⁵Ｓ−システインを含有する培地中で８時間
インキュベーションすることによって標識する。この細胞および培地を収集し、
そして細胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液（上記に引用される
Ｗｉｌｓｏｎらに記載されるように、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０
、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩ
Ｓ、ｐＨ ７．５）を用いて溶解する。タンパク質を細胞溶解物、および培養培
地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用して沈殿する。次に、沈殿したタ
ンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーによって分析す
る。予想されたサイズの発現産物が細胞溶解物中に見出される。この予想された
サイズの発現産物は、ネガティブコントロール中では見られない。

【０４６６】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４をＴＲ９タンパク質の発現のために使用する。プラスミドｐＣ
４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体
である。このプラスミドが、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤＨＦ
Ｒ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされた、ジヒドロ葉酸
活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を、化学治療剤メト
トレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）において細胞を増殖することによっ
て選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）耐性の細胞中のＤＨＦＲ遺伝子の増
幅が、十分に証明されている（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅ
ｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１０７−１４３（１９９０）；およ
びＰａｇｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参
照のこと）。漸増濃度のＭＴＸ中の細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果と
して、標的酵素であるＤＨＦＲの過剰発現による薬物の耐性をもたらす。第２の
遺伝子が、ＤＨＦＲ遺伝子と連結している場合、その遺伝子は、通常、同時に増
幅され、そして過剰発現される。この試みを使用して、１，０００コピーを超え
る増幅した遺伝子のコピーを保有する細胞株を開発することは、当該分野におい
て公知である。引き続いて、メトトレキサートが取り除かれた場合、宿主細胞の
１つ以上の染色体中に組み込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞株を得る。

【０４６７】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５）およびヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサーより単離されたフラグメント
（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜５３０（１９８５））を含有す
る。プロモーターの下流は、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８制限酵
素切断部位であり、遺伝子の組み込みを可能とする。これらのクローニング部位
の後に、このプラスミドは、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロ
ンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のた
めに使用され得る（例えば、ヒトβ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロ
モーターまたは後期プロモーター、あるいは他のレトロウイルス（例えば、ＨＩ
ＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｔｅｔ−Ｏｆｆ
遺伝子発現系およびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系ならびに同様の系を使用して、哺
乳動物において調節された方法でＴＲ９を発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９９
２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のための他のシグナル（例えば、ヒト成長ホ
ルモンまたはグロビン遺伝子由来）もまた同様に使用され得る。染色体中に組み
込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８または
ハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフェクションの際
に選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、Ｇ４１８および
メトトレキサート）を使用することが有利である。

【０４６８】 プラスミドｐＣ４を制限酵素ＳｍａＩおよびＡｓｐ７１８を用いて消化し、次
いで、当該分野において公知の手順によって、仔ウシ小腸ホスファターゼを使用
して脱リン酸化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルより単離する。

【０４６９】 完全ＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡ配列（そのリーダー配列を含む）を
、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して増幅する。

【０４７０】 ５’プライマーは、配列：

【０４７１】

【化１０】 （配列番号１３）を有し、制限酵素部位、Ｋｏｚａｃ、Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１９６：９４７〜９５０（１９８７）に記載されるように、真核生物細胞中
の翻訳開始のための効率的なシグナル、続いて、図１Ａ〜Ｄに（配列番号１）お
いて示されるＴＲ９レセプタータンパク質のコード配列をの多数の塩基を含む。

【０４７２】 ３’プライマー（可溶性形態をクローニングするために）は、配列：

【０４７３】

【化１１】 （配列番号１４）を有し、下線のＡｓｐ７１８制限酵素部位、続いて図１Ａ〜Ｄ
（配列番号１）において示されるＴＲ９レセプター遺伝子の非翻訳領域に相補的
なヌクレオチドを含む。

【０４７４】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＳｍａＩで消化し、次いで１％
アガロースゲルで再び精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン
酸化したベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば、制
限酵素分析を使用してプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を
同定する。

【０４７５】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェ
クチング方法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐ
ＳＶ２−ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。このプラスミドｐＳＶ２−
ｎｅｏは優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵
素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この細胞をトリプシン
処理し、１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／
ｍｌ Ｇ４１８を補充したα−ＭＥＭにおいてハイブリドーマクローニングプレ
ート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。約１０〜１４日培養後
、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（
５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６
ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトト
レキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、
２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。
同じ手順を、１００μＭ〜２００μＭの濃度で増殖するクローンを得るまで繰り
返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン
ブロット分析によってか、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。

【０４７６】 （実施例４：ＴＲ９ ｍＲＮＡ発現の組織分布） ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）によっ
て記載される方法を用いて、ヒト組織におけるＴＲ９遺伝子発現を調べる。ＴＲ
９タンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、
ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ^TM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて³²Ｐで標識する。標識後、プロ
ーブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に
従って用いて精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組
織をＴＲ９ ｍＲＮＡについて調べる。

【０４７７】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む複数組織のノーザ
ン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓ
Ｈｙｂ^TMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコ
ル番号ＰＴ１１９０−１に従って用いて標識プローブを用いて調べる。ハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩
フィルムに曝し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。

【０４７８】 （実施例５：ＴＲ９誘導アポトーシス） Ｆａｓ／ＡＰＯ−１およびＴＮＦＲ−１の哺乳動物細胞における過剰発現は、
レセプター活性を模倣する（Ｍ．Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７−８２
７（１９９６）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３−８１５（
１９９６））。従って、この系は、ＴＲ９の機能的役割を研究するために利用す
る。ＴＲ９のＭＣＦ７乳癌腫細胞および２９３ヒト胚性腎臓細胞における一過性
発現を、アポトーシスの誘導のために調査した。

【０４７９】 （実験設計） 細胞死アッセイを、以前に記載されたように本質的に行った（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉ
ｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）；Ｍ．Ｐ．Ｂ
ｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５−８（１９９５）；
Ｆ．Ｃ．Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ １４：５５７９−５５８８（１９９５
）；Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９
６１−４９６５（１９９６））簡潔には、ＣｒｍＡ発現構築物（Ｍ．Ｔｅｗａｒ
ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３２５５−６０（１９９５））か、ま
たはＦＡＤＤ−ＤＮ発現構築物（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９６１−４９６５（１９９６））のいずれかの単独の
ベクターで安定にトランスフェクトされたＭＣＦ−７ヒト乳癌腫細胞クローン細
胞株を、リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて１０倍過剰の示さ
れたタンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３発現構築物の存在下でｐＣＭＶ−ＴＲ
９−ガラクトシダーゼを用いて一過性にトランスフェクトする。２９３細胞を、
ＣａＰＯ₄法を使用して同様にトランスフェクトする。トランスフェクトから５
時間後、ＩＣＥファミリーインヒビターｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）を、この細胞に１０μ
Ｍの濃度で添加する。トランスフェクトから３２時間後、細胞を固定し、そして
以前に記載されたようにＸ−Ｇａｌを用いて染色する（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉ
ｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉ
ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５−８（１９９５）；Ｆ．Ｃ．
Ｋｉｓｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ １４：５５７９−５５８８（１９９５）。

【０４８０】 （結果） 罹患した細胞は、アポトーシスを受ける代表的な細胞の形態学的改変を示し、
皿状から丸くなり、凝縮し、そして分離する。ＴＮＦＲ−１およびＦａｓ／ＡＰ
Ｏ−１（Ｍ．Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７−８２７（１９９６）；Ｍ
．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３−８１５（１９９６）；Ｍ．Ｔ
ｅｗａｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３２５５−６０（１９９５）
）に類似である、ＴＲ９誘導性アポトーシスは、ＩＣＥ様プロテアーゼ、Ｃｒｍ
Ａおよびｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋのインヒビターによってブロックする。 （実施例６：ＴＲ９の特徴付け） ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーは、炎症および細胞免疫応答の重要な
モジュレーターであり、そして細胞増殖、分化およびアポトーシスから細胞生存
までの多様な種々の生物学的機能を媒介する（Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ
８８：３５５−３６５（１９９７）；Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ．６：４０７−４１３（１９９４）；Ｇｏｌｓｔｅｉｎ，
Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ７５０−Ｒ７５３（１９９７）；Ｂａｉｃｈ
ｗａｌら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ９４−Ｒ９６（１９９７）；Ｓｍｉｔｈ
ら、Ｃｅｌｌ ７６：９５９−９６２（１９９４）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３９０：１７５−１７９（１９９７）；およびＣｌｅｖｅｌａｎｄら
、Ｃｅｌｌ ８１：４７９−４８２（１９９５））。このレセプターのファミリ
ーは、リガンド結合ドメインを構成するいくつかの細胞外モチーフ、システイン
リッチモチーフによって特徴付けられる（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ．６：４０７−４１３（１９９４）；およびＳｍｉ
ｔｈら、Ｃｅｌｌ ７６：９５９−９６２（１９９４））。これらの同族のリガ
ンドによる連結の際に、これらのレセプターは、アポトーシス、免疫応答および
ストレス応答に関与する遺伝子の発現を調節するＮＦ＿Ｂ経路およびＪＮＫ経路
の活性化を含む多数のシグナル伝達経路に関与する（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ
７６：９５９−９６２（１９９４））。

【０４８１】 ＴＮＦレセプターファミリーにおいて、６つのメンバーは、デスレセプターと
いわれる異なるサブ群として現れる：これらは細胞質デスドメインを含み、そし
てこれらのレセプターの活性化は、細胞死経路の構成要素の関与をもたらす（Ｎ
ａｇａｔａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ ８８：３５５−３６５（１９９７）；およびＧｏ
ｌｓｔｅｉｎ，Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ７５０−Ｒ７５３（１９９７
））。このデスシグナルの伝達は、アダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１および
デスプロテアーゼカスパーゼ８に存在するように本来定義されているデスドメイ
ンおよびデスエフェクタードメインに関する一連の同種親和性のタンパク質−タ
ンパク質相互作用によって媒介される（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｅｍｍｉｎ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：６６−６７（１９９７））。例えば、デスレセプターＣ
Ｄ９５／Ｆａｓが、同族リガンドまたはアゴニスト抗体によって連結される場合
、アダプター分子ＦＡＤＤおよびデスプロテアーゼカスパーゼ８は、それぞれデ
スドメインおよびデスエフェクタードメインに関与する相互作用を介してシグナ
ル伝達複合体に補充される（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｅｍｍｉｎ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．９：６６−６７（１９９７）；Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７
−８２７（１９９６）；およびＢｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３−８１
５（１９９６））。近似して、カスパーゼ８は、活性化を受け、下流カスパーゼ
の活性化、デス（ｄｅａｔｈ）基質の切断およびこの細胞の崩壊を開始する（Ｍ
ｕｚｉｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９５２−２９５６（１９９７
）；Ｂａｒｉｎａｇｅ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：３２−３４（１９９８
）；Ｓａｌｖｅｓｅｎら、Ｃｅｌｌ ９１：４４３−４４６（１９９７）；およ
びＭａｒｔｉｎら、Ｃｅｌｌ ８２：３４９−３５２（１９９５））。ＦＡＤＤ
−カスパーゼ８経路に直接関与するＣＤ−９５とは対象的に（Ｍｕｚｉｏら、Ｃ
ｅｌｌ ８５：８１７−８２７（１９９６）；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５
：８０３−８１５（１９９６）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５
０５−５１２（１９９５）；およびＢｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７０：７７９５−７７８９（１９９５））、ＴＮＦＲ１およびＤＲ３の両方は
、ＴＲＡＤＤといわれる主要なアダプター分子を利用する。ＴＲＡＤＤの周りに
アダプター分子ＴＲＡＦ２によって媒介させるデスドメイン含有Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
キナーゼＲＩＰおよびＪＮＫ活性化経路に関与するＦＡＤＤカスパーゼ８経路、
ＮＦ＿Ｂ活性化経路が集まる（Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８１：４９５−５０４（１
９９５）；Ｈｓｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３８７−３９６（１９９６）；Ｃ
ｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０−９９２（１９９６）
；Ｋｉｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３７２−３７５（１９９６）；Ｙｅ
ｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：７１５−７２５（１９９７）；Ｌｅｅら、Ｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ ７：７０３−７１３（１９９７）；およびＫｅｌｌｉｈｅｒら、Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ ８：２９７−３０３（１９９８））。最終的には、カスパーゼ
２に結合するデスドメイン含有アダプターＲＡＩＤＤに関与する補助的死経路が
存在し、ＴＮＦＲ１レセプター複合体の一部を示すが、この不必要な経路の正確
な生理学的な関与は、不明確なままである（Ｄｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５
：８６−８９（１９９７）；およびＡｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７
：６１５−６１９（１９９７））。

【０４８２】 ここで、本発明者らは、ＴＲ９の同定および最初の特徴づけを報告し、ＴＮＦ
レセプターファミリーの新規なメンバーは、細胞質デスドメインを有する。ＴＲ
９は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導し、そしてＮＦ＿Ｂ経路および
ＪＮＫ経路に関わり得た。

【０４８３】 （材料および方法） （発現構築物） ＴＲ９（図１Ａ〜Ｄに示されるようなアミノ酸残基４２〜６５５；配列番号２
に示されるようなアミノ酸残基２〜６１５）およびＴＲ９デルタ（図１Ａ〜Ｄに
示されるようなアミノ酸残基４２〜４６０；配列番号２に示されるようなアミノ
酸残基２〜４２０）を、ベクターによってコードされたＴＲ９末端プレプロトリ
プシン（Ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）リーダー配列およびＦＬＡＧタグへのイ
ンフレーム融合のように、ｐＣＭＶ１ＦＬＡＧ（ＩＢＩ−Ｋｏｄａｋ）にクロー
ニングした。ｃＤＮＡを、ＴＲ９についてのＤＮＡオリゴプライマー：

【０４８４】

【化１２】 およびＴＲ９デルタについてのオリゴプライマー：

【０４８５】

【化１３】 を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって得た。ＤＲ４、ＦＡＤＤ、ＣＤ９５
、ＤＲ３、ＴＲＡＤＤ、ＩＣＨ１−ｐｒｏ、ＲＡＩＤＤおよびＲＩＰをコードす
る構築物は、以前に記載されている（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１
：５０５−５１２（１９９５）；Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８１：４９５−５０４（
１９９５）；Ｈｓｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３８７−３９６（１９９６）；
Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０−９９２（１９９６
）；Ｋｅｌｌｉｈｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２９７−３０３（１９９８）
；およびＰａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９９７））。

【０４８６】 （アポトーシスアッセイ） 細胞死アッセイを、以前に記載された通りに行った（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら
、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）；およびＰａｎら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９９７））。Ｈｅｌａ細胞およびＭＣＦ７細
胞の両方を、製造業者の使用説明書に従ったリポフェクトアミン手順（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、トランスフェクトした。

【０４８７】 （同時免疫沈降アッセイ） インビボ相互作用アッセイは、他の場所に記載されている（Ｃｈｉｎｎａｉｙ
ａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）；およびＰａｎら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９９７））。２９３細胞を、標準的な
リン酸カルシウム沈殿を使用して、ＦＬＡＧ−ＴＲ９、ＦＬＡＧ−ＴＲ９デルタ
、ＦＬＡＧ−ＣＤ９５、ＦＬＡＧ−ＤＲ３、ＦＬＡＧ−ＴＮＦＲ１およびＩＣＨ
−１ｐｒｏ−ＦＬＡＧ発現構築物とともに、同時トランスフェクトした。トラン
スフェクション後（３８〜４０時間で）、細胞溶解物を調製し、そしてＦＬＡＧ
−タグ化発現タンパク質を、ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（ＩＢＩ−Ｋｏｄ
ａｋ）を用いて免疫沈降し、そしてＦＡＤＤの存在下で、ｍｙｃタグ化ＴＲＡＤ
ＤおよびＲＩＰ（ｍｙｃ−ＴＲＡＤＤおよびｍｙｃ−ＲＩＰ）またはＲＡＩＤＤ
を、ｍｙｃ（ＢＭＢ）に対する抗体を結合体化したＦＡＤＤ西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）に対するポリクローナル抗体、またはＲＡＩＤＤに対するポ
リクローナル抗体とのイムノブロッティングによって検出した。

【０４８８】 （ＮＦ−＿Ｂルシフェラーゼアッセイ） ＮＦ＿Ｂルシフェラーゼアッセイを、他の場所に記載される通りに行った（Ｃ
ｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）：および
Ｐａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９９７））。

【０４８９】 （ＪＮＫ活性化アッセイ） ２９３細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＭＥＭ中で培養した。細胞を、６ウェル
プレートでプレーティングし、そして製造業者の使用説明書に従ったリポフェク
トアミン法によって、６０〜７０％のコンフルーエンシーで、ＴＲ９発現プラス
ミドまたはベクター単独でトランスフェクトした。トランスフェクション４０時
間後、細胞抽出物を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ
、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮＰ−４０、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン
、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、 ０．５μｇ／ｍｌ ベン
ズアミド、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ オルトバナデート（ｏｒｔｈｏｖａｎ
ａｄａｔｅ）を含む溶解緩衝液中で調製した。Ｃ−ｊｕｎキナーゼアッセイを、
記載されるような改変された方法によって行った（Ｈａｒｉｄａｓら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６０：３１５２−３１６２（１９９８））。手短に言えば、細胞抽出
物（７０μｇ）を、４℃で３０分間０．０３ｇの抗ＪＮＫ抗体との免疫沈降に供
した。免疫複合体を、４℃で３０分間タンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズとと
もにインキュベートすることによって収集した。このビーズを、溶解緩衝液（４
×４００μｌ）およびキナーゼ緩衝液（２×４００μｌ：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、ｐＨ ７．４、１ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ ＮａＣｌ）で広範に洗浄し、そし
てキナーゼ反応を、３０℃で１５分間、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴおよび１０μＣｉ ［γ³²Ｐ］ＡＴＰを
含む２μｌ中の２μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ（１〜７９）を用いて行った。反応を、
１５μｌのＳＤＳサンプル緩衝液の添加によって停止し、そしてＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ＧＳＴ−Ｊｕｎ（１〜７９）を、
クーマシーブルーで染色することによって可視化し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒｉ
ｍａｇｅｒ分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ；Ｓｕｎｙｖａｌｅ，
ＣＡ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ）による定量後に、乾燥されたゲルを可視化した。ＪＮＫ活性
の特異的なアッセイは、リン酸カルシウム沈殿法を使用して、ベクターとの３×
１０⁶個の２９３細胞の同時トランスフェクション、またはＪＮＫ−ｍｙｃ発現
プラスミドの２．４μｇとともに、ＣＤ４０、ＴＲ９またはＴＲ９デルタ発現構
築物（６．４μｇ）を含む。トランスフェクション後（約３６時間）、細胞抽出
物を、ＮＰ４０緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．０、１３７ｍＭ
ＮａＣｌ、１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ Ｎａ₂Ｖ
Ｏ₄、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび１％ ＮＰ４０）およびプロテアーゼインヒ
ビターカクテル（ＢＭＢ）での溶解によって調製した。ＪＮＫ−ｍｙｃの免疫沈
降を、モノクローナル抗ｍｙｃ抗体（１０μｇ、Ｂａｂｃｏ）を使用して行い、
そして免疫複合体を、２０μｌのタンパク質Ｇセファロース（５０％ スラリー
、Ｓｉｇｍａ）を用いて沈殿させ、そして抗ｍｙｃ−ＨＲＰを用いたブロッティ
ングによって検出した。ＦＬＡＧタグ化ＣＤ４０、ＴＲ９およびＴＲ９デルタを
、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲルを用いて免疫沈降し、そして抗ＦＬＡＧ抗
体を用いてブロッティングすることによって検出した。キナーゼアッセイは、基
質として２μｇのＧＳＴ Ｊｕｎ（１〜７９）、３０μｌのキナーゼ緩衝液（３
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、７ｍＭ ＭｎＣｌ₂、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂お
よび１ｍＭ ＤＴＴ）中の５０ｍＭ ＡＴＰおよび５μＣｉの［γ³²Ｐ］ＡＴＰ
を利用した。

【０４９０】 （結果および考察） ＴＲ９は、推定シグナル配列（図１Ａ〜Ｄおよび４Ａに示されるようなアミノ
酸残基１〜４１；配列番号２におけるアミノ酸残基−４０〜１）を有し、成熟形
態は、図１Ａ〜Ｄおよび４Ａに示されるようなアミノ酸４２（Ｇｌｎ）で開始す
ることが予測される（Ｎｉｅｌｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ．１０：１−
６（１９９７））。細胞外部分（図１Ａ〜Ｄおよび４Ａに示されるようなアミノ
酸残基４２〜３５０；配列番号２におけるアミノ酸残基２〜３１０）は、ＴＲ９
の４つのＴＮＦＲ様システインリッチモチーフ（図１Ａ〜Ｄに示されるようなア
ミノ酸残基６７〜２１１；配列番号２におけるアミノ酸残基２７〜１７１）を含
み、これは、それぞれ３６％および４２％のアミノ酸同一性を有するオステオプ
ロテジェリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（ＯＰＧ）およびＴＮＦＲ２
のモチーフに最も関連する（図４Ｂ；データは示さず）。膜貫通ドメイン（図１
Ａ〜Ｄおよび４Ａに示されるようなアミノ酸３５１〜３７０；配列番号２の残基
３１１〜３３０）は、あらゆる公知のデス（ｄｅａｔｈ）レセプターのデスドメ
インに関連するデスドメインを含む分子の２８５アミノ酸長の細胞質部分に続き
（図４Ｃ）、これは、ＴＮＦＲ１のデスドメインに最も関連し（２７．２％）、
そしてＤＲ５のデスドメインと最もかけ離れている（１９．７％）。奇妙にも、
ＣＯＯＨ末端に存在するデスドメインを有する他のデスレセプターと異なって、
ＴＲ９のデスドメインは、１５０アミノ酸テイルの後の膜貫通ドメインに近接し
て位置した。興味深いことに、以下のデスドメインは、ＳＨ３ドメイン結合モチ
ーフのプロリンリッチ領域レミネッセント（ｒｅｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）と重複す
る推定ロイシンジッパー配列であった（図４Ａ）（Ｐａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７８：２０７５−２０８０（１９９７））。

【０４９１】 （ヒト組織および癌細胞株におけるＴＲ９ ｍＲＮＡ発現） ４ｋｂのＴＲ９転写物は、製造業者の使用説明書に従ってＴＲ９ ｃＤＮＡを
用いて調べられたノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で表された大半のヒト成
人組織、免疫組織および癌細胞株で見出された（データは示さず）。転写物は、
心臓、脳、胎盤、膵臓、リンパ節、胸腺および前立腺に豊富であった。より低い
レベルでは、肺、骨格筋、腎臓、精巣、子宮、小腸、結腸、脾臓、骨髄および胎
児肝臓で検出された。しかし、成人肝臓および末梢血白血球は、ＴＲ９ ｍＲＮ
Ａをほとんど発現しなかった。さらに、３．１ｋｂおよび２．４ｋｂのより小さ
な転写物が、それぞれ精巣および胎児肝臓で観察された。

【０４９２】 ヒト癌細胞株の間で、４ｋｂの転写物の豊富なレベルが、いくつかの非リンパ
系腫瘍細胞（頸部癌腫Ｈｅｌａ Ｓ３、結腸直腸腺癌ＳＷ４８０、肺癌腫Ａ５４
９および黒色腫Ｇ３６１細胞を含む）で検出された。顕著に、造血起源の系統に
おいては、ほとんど発現が観察されないか、または発現はまったく観察されなか
った（例えば、Ｒａｊｉ、Ｋ５６２およびＨＬ−６０；データは示さず）。

【０４９３】 （ＴＲ９は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する） デスレセプターの異所性発現が、リガンド非依存性様式で細胞死を誘導し得る
ので（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）
；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５−７７８９（１
９９５）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０−９９２
（１９９６）；Ｋｉｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３７２−３７５（１９
９６）；およびＰａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９９７
））、本発明者らは、ＴＲ９が、過剰発現に際してアポトーシスを誘導し得るか
否かを試験した。Ｈｅｌａ Ｓ３頸部癌腫細胞を、ＴＲ９発現構築物でトランス
フェクトすると、トランスフェクトされた細胞の４３％が、アポトーシスに特徴
的な形態学的変化を受けた（図５）。期待されたように、推定デスドメイン（Ｔ
Ｒ９デルタ）の欠失が、その殺傷活性を排除した。顕著に、ＴＲ９は、ヒト乳房
癌腫ＭＣＦ７細胞において細胞死を誘導することができなかったが、これらの細
胞は、ＤＲ４殺傷に非常に敏感であった（図５および示さないデータ）。このこ
とは、ＴＲ９が関与する細胞死経路が、他のデスレセプターが関与する細胞死経
路とは異なり得ることを示唆する。あるいは、ＴＲ９のアポトーシス活性は、活
性化する他のシグナル伝達経路によって調節され得る（以下を参照のこと）か、
またはリガンド結合は、その完全な殺傷能力を明かすために必要とされ得る。

【０４９４】 （インビボでのアダプター分子とのＴＲ９の相互作用） デスレセプターは、アダプター分子ＦＡＤＤ（ＣＤ９５についての）または、
ＴＲＡＤＤおよびＦＡＤＤの両方（ＴＮＦＲ１およびＤＲ３についての）を利用
して、デスシグナルを伝達する（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５
０５−５１２（１９９５）；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０
：７７９５−７７８９（１９９５）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７４：９９０−９９２（１９９６）；およびＫｉｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ
３８４：３７２−３７５（１９９６））。従って、本発明者らは、ＴＲ９が、
ヒト胚性腎臓２９３細胞において、これらのアダプター分子のいずれかを結合し
得るか否かを決定した。ＴＲ９は、ＦＡＤＤと相互作用しなかったが、ＣＤ９５
とＦＡＤＤとの間の会合は、類似の条件下で容易に検出された（データは示さず
）。興味深いことに、ＴＲ９は、ＴＲＡＤＤと結合することが見出されたが、こ
の相互作用は、ＤＲ３とＴＲＡＤＤとの間の相互作用よりも弱かった（データは
示さず）。この知見は、ＴＲ９は、より弱い殺傷能力を有する知見と一致する。
あるいは、ＴＲ９は、アダプターとしてＴＲＡＤＤ関連分子を使用し得るか、ま
たはこの観察された会合は、別のアダプタータンパク質によって架橋され得る。
相互作用は、ＴＲ９とＲＡＩＤＤまたはＲＩＰとの間で検出不可能であり、２つ
の他のアダプター分子は、ＴＮＦＲ１およびＤＲ３シグナル伝達複合体に補充さ
れることが公知であった（データは示さず）。

【０４９５】 （ＴＲ９は、核因子（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ）κＢを活性化する） ＴＮＦＲ１およびＤＲ３の両方は、ＮＦ−κＢの活性化を導くシグナル伝達経
路に関与し得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ ７６：９５９−９６２（１９９４）
；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０−９９２（１９９
６）；Ｋｉｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３７２−３７５（１９９６）；
およびＢａｋｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２：１−９（１９９６））。ＴＲ９
のＮＦ−κＢを活性化する能力を、ルシフェラーゼレポーターアッセイで試験し
、そして用量依存性様式におけるＮＦ−κＢ活性化を誘導することが見出された
（図６）。おそらく、レセプターの過剰発現により、ＮＦ−κＢ系をシグナル伝
達し得る活性配置が達成された。興味深いことに、アポトーシス活性を排除する
ＴＲ９の細胞質欠失は、同様にＮＦ−κＢを活性化する能力を排除し（データは
示さず）、このことは、これらの２つのシグナル伝達経路が、共通のレセプター
に隣接するアダプター分子によって媒介され得ことを示唆する。

【０４９６】 （ＴＲ９の異所性発現が、ＪＮＫ活性化を誘導する） ＪＮＫ活性化は、いくつかのＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ１およびＣＤ４０を
含む）によって誘導されることが公知である（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ ７６：
９５９−９６２（１９９４）；Ｙｅｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：７１５−７２
５（１９９７）；Ｌｅｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：７０３−７１３（１９９７
）；およびＢａｋｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２：１−９（１９９６））。次
いで、本発明者らは、ＴＲ９の過剰発現が、インビトロキナーゼアッセイを使用
して、ＪＮＫ活性化を導き得るか否かを決定した。ＴＲ９が、用量依存様式にお
いて、ＪＮＫ活性化を誘導することを見出した（データは示さず）。細胞死また
はＮＦκＢ活性化を減弱する細胞質切断は、ＪＮＫ活性化に対して驚く程ほとん
ど影響を与えなかった（データは示さず）。これは、ＪＮＫ活性化が、アポトー
シスおよびＮＦ−κＢ誘導を担うセグメントとは異なる細胞質セグメントによっ
て媒介される概念と一致する。２つの可能性のあるＴＲＡＦ結合モチーフが、膜
貫通ドメインＰＲＱＤＰ（図１Ａ〜Ｄに示されるようなアミノ酸残基３８１〜３
８５；配列番号２に示されるアミノ酸残基３４１〜３４５）、およびＰＴＱＮＲ
（図１Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸残基４００〜４０４；配列番号２に示されるア
ミノ酸残基３６０〜３６４）に隣接して存在することに注目すべきである（Ｇｅ
ｄｒｉｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２８５２−１２８５８（１
９９６）およびＢｏｕｃｈｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉ．２３３：５９２−６００（１９９７））。

【０４９７】 結論として、本発明者らは、ＴＲ９と命名された新規のデスドメイン含有ＴＮ
Ｆレセプターを同定した。ＴＲ９は、ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１またはＴＲＡＩＬ／
Ａｐｏ２Ｌレセプターによって開始される経路とは異なる細胞死経路に関与する
。さらに、ＴＲ９はまた、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫ、すなわちＴＮＦＲ１によっ
て共有された２つのシグナル伝達経路を活性化する。従って、ＴＮＦレセプター
ファミリーの他のメンバーのように、ＴＲ９は、炎症応答および免疫調節におけ
る役割を果たすようである。

【０４９８】 （実施例７：内因性ＴＲ９遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性ＴＲ９配列を、例えば、米国特
許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日出願）；国際公開第ＷＯ ９
６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開第ＷＯ ９４／１２
６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺ
ｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）に記載
されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合する工程を包
含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現されない
かまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包含する
。プロモーターおよび標的配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。この
標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ＴＲ９の５’非コード配列と相同
である。この標的配列は、このＴＲ９の５’末端に十分に近く、その結果、この
プロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連結される。こ
のプロモーターおよび標的配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、
この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位
を含む。好ましくは、第１の標的配列の３’末端は、増幅したプロモーターの５
’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的配列の５’末端は、増幅し
たプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。

【０４９９】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的配列を、適切な制限酵素で消化
し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消化
した標的配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混合物
を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築物を
アガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿
により精製する。

【０５００】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）と共に投与され得る。このような送達方法は
、当該分野で公知である。

【０５０１】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが起こり、この内因性ＴＲ
９配列に作動可能に連結されるプロモーターを生じる。これは、この細胞中にお
けるＴＲ９の発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の
任意の方法により、検出され得る。

【０５０２】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に置く。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を、ト
リプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸
濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供
する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ
、０．７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この細胞
を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミン１
ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細胞懸
濁物は、約３×１０⁶細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸濁直
後に実施すべきである。

【０５０３】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ＴＲ９の遺伝子
座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（Ｍ
ＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化す
る。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨ
Ｉ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのＴＲ９非コード配列をＰＣＲを介
して増幅する：一方のＴＲ９非コード配列（ＴＲ９フラグメント１）を、５’末
端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位を備えて増幅する；他方
のＴＲ９非コード配列（ＴＲ９フラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位
および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモータ
ーおよびＴＲ９フラグメントを、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩお
よびＢａｍＨＩ；ＴＲ９フラグメント１−ＸｂａＩ；ＴＲ９フラグメント２−Ｂ
ａｍＨＩ）で消化し、そして共に連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩ
で消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。

【０５０４】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０⁶細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合は劇的に増加する。これらのパラメーターを考慮すると、パルス時間約１４〜
２０ｍＳｅｃが観察されるはずである。

【０５０５】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。

【０５０６】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注射する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。

【０５０７】 （実施例８：ＴＲ９は単球を活性化し、そして単球生存を増加する） ＴＲ９−Ｆｃ（ＩＳＧ１ ｆｃ融合タンパク質に融合した、図１Ａ〜Ｄに示さ
れた配列のアミノ酸残基Ｍ１〜Ｌ３５０を含む）の単球への効果を、単球生存お
よびＴＮＦ−α放出機能的アッセイを使用して評価した。

【０５０８】 （方法） （単球生存） 単球を、ポリプロピレンチューブで４８時間培養した：無血清培地（陽性コン
トロール）；１００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−αの存在下（陰性コントロール）：な
らびに２μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌのＴＲ９−Ｆｃの存在下。培養された
細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖおよびプロピジウムヨウ素（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ
ｉｏｄｉｎｅ）で染色し、アポトーシス細胞および死細胞の数を決定した。

【０５０９】 （ＴＮＦ−α放出） 単球（５×１０⁵）を、固定化ＴＲ９−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）上で１日イン
キュベートした。馴化培地を収集し、そしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓキットを使
用して、ＴＮＦ−α含量についてＥＬＩＳＡで分析した。

【０５１０】 （ＭＣＰ−１放出） 単球（５×１０⁵）を、ＴＲ９−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした
ウェル上で１日インキュベートした。馴化培地を収集し、そしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓキットを使用して、ＥＬＩＳＡによってＭＣＰ−１含量について分析し
た。

【０５１１】 （結果） 単球活性化に対するＴＲ９−Ｆｃの効果を、上記の単球生存およびＴＮＦ−α
放出アッセイを使用して調べた。

【０５１２】 単球生存アッセイにおいて、単球を無血清培地およびＴＲ９−Ｆｃを含む無血
清培地（２μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌの濃度で）、またはＴＮＦ−α（１
００ｎｇ／ｍｌ）で培養した。４８時間後、アポトーシス細胞または死細胞の割
合を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖおよびプロピジウムヨウ素での染色によって決定した
。結果は、８１％の未処理細胞が、アポトーシス細胞または死細胞であった一方
、ＴＮＦ−αで処理された細胞の２５％のみが、殺傷されたことを明らかにした
。２０μｇ／ｍｌのＴＲ９−Ｆｃで処理した単球は、４８％がアポトーシスであ
り、このことは、ＴＲ９−Ｆｃが、単球生存を増強することを示す。

【０５１３】 上記のようにＴＮＦ−α放出アッセイにおいて、単球を、単独でかまたは固定
化ＴＲ９−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、そしてＴＮＦ−α
の産生を標準のＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。ＴＲ９−Ｆｃ処理した単球
のＴＮＦ−α放出の濃度は、試験した４つのドナーのロットの全てにおいて、Ｔ
Ｒ９−Ｆｃの非存在下で観察した濃度の５倍高かった（表ＩＩＩを参照のこと）
。興味深いことに、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ（５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅ
ｃｈ）の存在下または非存在下であることを除いて上記のように行ったさらなる
実験は、ＴＲ９−ＦｃとＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γとの組み合わせが、相乗的な
ＴＮＦ−αの放出を生じることを明らかにした（表ＩＩＩ、ドナー４を参照のこ
と）。

【０５１４】

【表３】 単球（５×１０⁵）を、ＴＲ９−Ｆｃ（１０＿ｇ／ｍｌ）でコートしたウェル上
で１日間インキュベートした。馴化培地を回収し、そしてＴＮＦ−α含有量につ
いてＥＬＩＳＡにより分析した。

【０５１５】 上記のようにＭＣＰ−１放出アッセイにおいて、単球を、単独でかまたは固定
化ＴＲ９−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、そしてＭＣＰ−１
の産生を標準のＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。ＴＲ９−Ｆｃ処理した単球
のＭＣＰ−１放出の濃度は、ＴＲ９−Ｆｃの非存在下で観察した濃度よりも高か
った（表ＩＶを参照のこと）。

【０５１６】

【表４】 単球（５×１０⁵）を、ＴＲ９−Ｆｃ（１０＿ｇ／ｍｌ）でコートしたウェル上
で１日間インキュベートした。馴化培地を回収し、そしてＴＮＦ−α含有量につ
いてＥＬＩＳＡにより分析した。

【０５１７】 （実施例９：単球活性化および／または増加した生存についてのアッセイ） 単球を活性化（あるいは、不活性化）する分子および／または単球の生存を増
加する（あるいは、単球の生存を減少する）分子についてのアッセイは、当該分
野で公知であり、そしてこれらのアッセイは、本発明の分子がＴＲ９アゴニスト
（あるいは、ＴＲ９アンタゴニスト）として機能するか否かを決定するために慣
用的に適用され得る。３種類のこのようなアッセイを以下に記載する。

【０５１８】 （方法） （単球生存アッセイ） 単球を、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、およ
び試験される種々の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血
清培地（陽性コントロール）中で、４８時間培養する。アンタゴニストについて
のアッセイにおいて、このアッセイは、２０μｇ／ｍｌのＴＲ９−Ｆｃの存在下
で試験される組成物の濃度を変化する工程を包含する。単球生存を、Ａｎｎｅｘ
ｉｎ Ｖおよびヨウ化プロピジウムで細胞を染色し、そしてアポトーシス細胞お
よび死細胞の数を決定することによりアッセイする。

【０５１９】 実施例８において例示されるように、ＴＲ９アゴニストとして機能する化合物
は、培地単独（すなわち、ポジティブコントロール）と比較する場合、単球生存
を増強する。

【０５２０】 対照的に、ＴＲ９アンタゴニストとして機能する化合物は、細胞をＴＲ９−Ｆ
ｃタンパク質単独と接触させた場合に観測される生存と比較する場合、単球生存
を減少する。

【０５２１】 （ＴＮＦ−α放出） ＴＲ９−Ｆｃアゴニストを同定するために、単球（５×１０⁵）を種々の濃度
の試験する化合物と共に１日間インキュベートする。培養培地を収集し、そして
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍキットを使用してＴＮＦ−α含有量についてＥＬＩＳＡに
おいて分析する。単球細胞を試験化合物の非存在下であることを除いて同じ条件
下で１日間インキュベートする場合に観測される濃度と比較する場合、ＴＲ９−
ＦＣアゴニストは、ＴＮＦ−α放出より高い濃度を誘導する。

【０５２２】 ＴＲ９−Ｆｃアンタゴニストを同定するために、単球（５×１０⁵）を固定化
ＴＲ−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下および不在下で、種々の濃度の試験する
化合物と共に１日間インキュベートする。培養培地を収集し、そしてＲ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍキットを使用してＴＮＦ−α含有量についてＥＬＩＳＡにおいて分析
する。単球細胞を試験化合物の非存在下であることを除いて固定化ＴＲ９−Ｆｃ
の存在下でインキュベートする場合に観測される濃度と比較する場合、ＴＲ９−
Ｆｃアンタゴニストは単球からの減少したＴＮＦ−α放出を誘発する。

【０５２３】 （ＭＣＰ−１放出） ＴＲ９−Ｆｃアゴニストを同定するために、単球（５×１０⁵）を種々の濃度
の試験する化合物と共に１日間インキュベートする。培養培地を収集し、そして
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍキットを使用してＭＣＰ−１含有量についてＥＬＩＳＡに
おいて分析する。単球細胞を試験化合物の非存在下であることを除いて同じ条件
下で１日間インキュベートする場合に観測される濃度と比較する場合、ＴＲ９−
Ｆｃアゴニストは、ＭＣＰ−１の放出のより高い濃度を誘導する。

【０５２４】 ＴＲ９−Ｆｃアンタゴニストを同定するために、単球（５×１０⁵）を種々の
濃度の固定化ＴＲ９−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下および不在下で試験する
化合物と共に１日間インキュベートする。培養培地を収集し、そしてＲ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍキットを使用してＭＣＰ−１含有量についてＥＬＩＳＡにおいて分析
する。単球細胞を試験化合物の非存在下であることを除いて固定化ＴＲ９−Ｆｃ
の存在下でインキュベートする場合に観測される濃度と比較する場合、単球から
の減少したＭＣＰ−１放出を誘発する。

【０５２５】 （実施例１０：ＴＲ９のタンパク質融合物） 本発明のＴＲ９ポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に動作可能に融
合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用のために使用され得る。例え
ば、ＴＲ９ポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメ
イン、およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（ＥＰ
Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−
８６（１９８８）もまた参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およ
びアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。ＴＲ９ポリぺプチ
ドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に標的化し得
る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク質の活
性を増大または減少し得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有する
キメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較
して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融
合タンパク質の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する以下
のプロトコルを使用するかまたは慣用的に改変することによって作製され得る。

【０５２６】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、好ましくは、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのク
ローニングを容易にする都合の良い制限酵素部位を含むべきである。

【０５２７】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）発現ベクターが使用される場合
、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨ
Ｉ部位が破壊されるべきであることに注意のこと。次いで、ヒトＦｃ部分を含む
ベクターが、ＢａｍＨＩで再制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に
記載するＰＣＲプロトコルによって単離されたＴＲ９ポリヌクレオチドが、この
ＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドが、終止コドンなしにクロ
ーン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意するこ
と。

【０５２８】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含
むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。

【０５２９】 ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域：

【０５３０】

【化１４】 （実施例１１：抗体の産生） （（ａ）ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本
発明のポリぺプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、本発明のポリペプチ
ドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよ
うにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するため
に、このような調製物は、動物に導入される。

【０５３１】 本発明のポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４
９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１
１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２
（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，
Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくは、マウ
ス）を本発明のポリぺプチドで免疫すること、またはより好ましくは、分泌ポリ
ぺプチド発現細胞で免疫する。このようなポリペプチド発現細胞を、任意の適切
な組織培養培地（好ましくは、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を
補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシ
リン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改
変イーグル培地）において培養する。

【０５３２】 このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株と融合す
る。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、
ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好まし
い。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持
し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−
２３２（１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。次いで、このような選択を介して得られるハイブリドーマ細胞を、本発明の
ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイす
る。

【０５３３】 あるいは、本発明のポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可
能であるという事実を使用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使
用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾
細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ
細胞を、抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力が本発明のポリぺプチドに
よってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニン
グする。このような抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗
体を含み、そして動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導す
るために使用され得る。

【０５３４】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体を「ヒト化」する。このよう
な抗体を、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する
遺伝的構築物を使用することによって産生し得る。キメラ抗体およびヒト化抗体
を産生するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に記載される（総説
については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５
）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉ
ｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １
７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら
、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕ
ｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。

【０５３５】 （（ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのポリぺプチドに対する抗体フラグメ
ントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、本発明のポリペプチドに
対する反応性を含む抗体フラグメントのライブラリーに構築する。このポリペプ
チドは、ドナーが曝露されていてもよいし、曝露されていなくてもよい（例えば
、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書中に援用さ
れる）を参照のこと）。

【０５３６】 （ライブラリーのレスキュー） ＰＣＴ公開第ＷＯ ９２／０１０４７号に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡ
からｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファー
ジをレスキューするため、ファージミドを保有する約１０９ Ｅ．ｃｏｌｉを用
いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に播種し、そして振盪しながら
０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×
ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに播種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３
Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）を添加し
、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪し
ながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ
．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ
／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁
し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号に
記載のように調製する。

【０５３７】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原へのより大きい結合アビデ
ィティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供
給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させる
ことにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで
３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらなる時間イ
ンキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．ｐ
．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００
ｍｌ中に再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ粒子
を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精
製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター
（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０１３形
質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。

【０５３８】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリぺプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをそのチューブに適
用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次
いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルア
ミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージ
を溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７
．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０
分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中
期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、そのＥ．ｃｏｌｉを１％グル
コースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレ
ーティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子
３ヘルパーファージでレスキューし、引き続く回の選択のためのファージを調製
する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、
３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２
０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。

【０５３９】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリぺプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣ
Ｒフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号を
参照のこと）、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。これらのＥＬ
ＩＳＡ陽性クローンをまた、当該分野で公知の技術（例えば、エピトープマッピ
ング、結合親和性、レセプターシグナル伝達、抗体／抗原結合をブロックするか
または競合的に阻害する能力、および競合的なアゴニスト活性またはアンタゴニ
スト活性）によりさらに特徴付ける。

【０５４０】 （実施例１２：ＴＲ９遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者からＲＮ
Ａを単離する。次いで、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知
のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。次いで、
このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用いる
ＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用する、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；お
よび７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルから構成される。

【０５４１】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い
、それらの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使
用して配列決定する。（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｔ
Ｒ９の選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、そしてゲノ
ムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、疑わしい変異を有するＰ
ＣＲ産物をクローン化し、そして配列決定し、直接配列決定の結果を確認する。

【０５４２】 ＴＲ９のＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．ＡおよびＧｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１
）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患した個
体を、罹患していない個体には存在しないＴＲ９における変異により同定する。

【０５４３】 ゲノム再配置もまた、ＴＲ９遺伝子における変化を決定する方法として観察さ
れる。当該分野で公知の技術を使用して単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲ
ニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉ
ｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．ら、
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１）に記載の
ようにＦＩＳＨを行う。ＴＲ９ゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーシ
ョンのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイ
ブリダイゼーションを行う。

【０５４４】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルターとを組み合わせて用いて得る。（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａ
ｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉ
ｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、イメージ収集、分析および
染色体部分長測定を行う。（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）。ＴＲ９のゲノム領域の染色体変化（プローブによりハイ
ブリダイズされる）を、挿入、欠失および転座として同定する。これらのＴＲ９
変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。

【０５４５】 （実施例１３：生物学的サンプル中のＴＲ９の異常レベルを検出する方法） ＴＲ９ポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＴＲ９の上昇
または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定の表現型についてのマ
ーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下のアッセイ
をそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。

【０５４６】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、サンプル中、好ましくは、
生物学的サンプル中のＴＲ９を検出する。マイクロタイタープレートのウェルを
、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌにおけるＴＲ９に対して特異的な抗体でコー
ティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかで
あって、そして当該分野で公知の技術を使用して産生される。ウェルに対するＴ
Ｒ９の非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。

【０５４７】 次に、コーティングしたウェルを、ＴＲ９含有サンプルを用いて室温で２時間
を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの段階希釈を使用して結果
を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄し、
非結合ＴＲ９を除去する。

【０５４８】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、そして室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イ
オン水または蒸留水で３回洗浄し、未結合の結合体を除去する。

【０５４９】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートして基質と蛍光とを切断する。蛍光をマイクロタイタープレートリーダ
ーにより測定する。コントロールサンプルの段階希釈からの実験結果を使用して
標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数スケール）にポリペプチド濃度を、そして
Ｙ軸（直線スケール）に蛍光または吸光度をプロットする。次いで、このサンプ
ルの測定された蛍光に基づいた標準曲線を用いてサンプル中のＴＲ９ポリペプチ
ド濃度を補間する。

【０５５０】 （実施例１４：ＴＲ９のレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内におけるＴＲ９の生物学的活性のレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＴＲ９アゴニス
トを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明における使
用のために好ましいアンタゴニストは、ＴＲ９特異的抗体である。

【０５５１】 さらに、個体におけるＴＲ９の標準または正常発現レベルの低下により引き起
こされる状態は、ＴＲ９を、好ましくは可溶および／または分泌形態で投与する
ことにより処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＴＲ９ポリ
ペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、この
ような個体に、このような個体でＴＲ９の生物学的活性レベルを増加させる量の
ＴＲ９を含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。

【０５５２】 例えば、ＴＲ９ポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、１
日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペプ
チドは可溶および／または分泌形態である。

【０５５３】 （実施例１５：ＴＲ９のレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内におけるＴＲ９の生物学的活性のレベルを減少させる必要
のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＴＲ９また
はそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。

【０５５４】 アンチセンス技術を使用してＴＲ９の産生を阻害する。この技術は、癌のよう
な様々な病因に起因するＴＲ９ポリペプチド、好ましくは可溶および／または分
泌形態のポリペプチドのレベルを低下させる方法の１つの例である。

【０５５５】 例えば、ＴＲ９のレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセンス
ポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ
／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、７日
間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。

【０５５６】 （実施例１６：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、可溶性および／または成熟ＴＲ９ポリペプチドを
発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮
膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小
片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約１０片を各
フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉め、そして室温で一晩放
置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定
させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびス
トレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコ
を３７℃で約１週間インキュベートする。

【０５５７】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後、単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。

【０５５８】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。

【０５５９】 ＴＲ９をコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端配列に対応する
ＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏ
ＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、
Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。
得られた混合物を二つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。次に、
連結混合物を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換する。次に、それを
、カナマイシン含有寒天上にプレーティングし、ベクターが適切に挿入されたＴ
Ｒ９を有することを確認する。

【０５６０】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、ＴＲ９遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、
そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージン
グ細胞はＴＲ９遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケー
ジング細胞をプロデューサー細胞という）。

【０５６１】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過して、はがれ
たプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽
細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈ
ｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、ＴＲ
９タンパク質が産生されているか否かを決定する。

【０５６２】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。

【０５６３】 （実施例１７：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ＴＲ９ポリペプチドの
発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およ
びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ＴＲ９配列の導入に関する。ＴＲ９ポリヌ
クレオチドは、プロモーター、または標的組織によるＴＲ９ポリペプチドの発現
に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような
遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｗ
Ｏ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同
第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ Ｈ．ら、Ｃａｒｄ
ｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏ Ｊ．ら
、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆ
ｆ Ｊ．Ａ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３１４−３１８（
１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：４０５−４
１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：
３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照
のこと。

【０５６４】 ＴＲ９ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任
意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間へ
の注入）によって送達され得る。ＴＲ９ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受
容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。

【０５６５】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、ＴＲ９ポリヌクレオチドはまた、当業者に周
知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ
．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３
９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（１
）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。

【０５６６】 この遺伝子治療方法において使用されるＴＲ９ポリヌクレオチドベクター構築
物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まな
い構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を
駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を
標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合
成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて
、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。

【０５６７】 ＴＲ９ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓
、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、
腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の
間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維間
のムコ多糖マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラ
ーゲン線維、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリクス（ｔｈａｔ
ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じマトリクス（ｔ
ｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循環の血漿および
リンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間
への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を
含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分
化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、
送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血
液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細
胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、特
に適格である。

【０５６８】 裸のＴＲ９ポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量
は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましく
は、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そし
てより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん
、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。
核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして
処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙
空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路（例えば、特
に肺もしくは気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処
方物の吸入）もまた用いられ得る。さらに、裸のＴＲ９ポリヌクレオチド構築物
が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルによって動脈に
送達され得る。

【０５６９】 インビボで筋肉に注入されたＴＲ９ポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下
のようにして決定する。ＴＲ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のため
の適切なＴＲ９鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。
鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして
使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マ
ウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。

【０５７０】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＴＲ９鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌ
のキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、
筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注
入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚
をステンレス鋼クリップで閉じる。

【０５７１】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｔ
Ｒ９タンパク質発現について組織化学的に染色する。ＴＲ９タンパク質発現につ
いてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以
外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のＴＲ９ＤＮＡの持続性を、注入
したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清
を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実
験の結果を、裸のＴＲ９ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投
薬量および他の処置パラメーターを外挿するために使用し得る。

【０５７２】 （実施例１８：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化へのＴＲ９の効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。

【０５７３】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、ＴＲ９またはＬＰＳ
（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび０．
０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の適
切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体ととも
に、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡ
ＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーに
より分析する。

【０５７４】 （サイトカインの生成への効果） 樹状細胞により生成されるサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免
疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応
答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘
導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞
（１０⁶／ｍｌ）を、ＴＲ９の漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１０
０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞
培養からの上清を収集し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量につ
いて分析する。キットに提供される標準的プロトコールを用いる。

【０５７５】 ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果。

【０５７６】 細胞表面抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、
およびＦｃレセプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原およ
び他の同時刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−Ｉ）の発現の調節は、単球
の抗原提示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレ
セプターの発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用
の改善と相関し得る。

【０５７７】 ＦＡＣＳ分析は、以下のような表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、ＴＲ９またはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日処理し、
１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次
いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノ
クローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後
、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフ
ローサイトメトリーにより分析する。

【０５７８】 （単球活性化および／または生存の増加） 単球を活性化する（あるいは、不活化する）および／または単球の生存を増加
する（あるいは、単球生存を低下させる）分子についてのアッセイは、当該分野
で公知であり、そして本発明の分子が単球のインヒビターまたはアクチベーター
として機能するか否かを決定するために慣用的に適用され得る。ＴＲ９、ＴＲ９
のアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてス
クリーニングされ得る。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離に
より、単一のドナーｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓ
ｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエー
ション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔ
ｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離する。

【０５７９】 （１．単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下
で培養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス
（アポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、
劇的に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨー
ド（ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１０
０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種
々の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コ
ントロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを
含有するＰＢＳ中で２×１０⁶／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分
析の前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイ
ムにおけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。

【０５８０】 （２．サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺
激後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団への調節活性である。
サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。ヒト
単球を、５×１０⁵細胞／ｍｌの密度で、ＴＲ９の漸増する濃度とともに、およ
び同じ条件下でＴＲ９の非存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の生成に
ついては、この細胞を、ＴＲ９の存在下でＩＦＮ−＿（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩
プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４
時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−＿、ＩＬ
−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用い、キットに
提供される標準的プロトコールを適用して実施する。

【０５８１】 （３．酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を
９６ウェルプレートに２〜１×１０⁵細胞／ウェルでプレートする。ＴＲ９の漸
増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣ
Ｓ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベーション後、
このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロファージの単
層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭ デキストロース
、０．５６ｍＭ フェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激物
質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２時間イ
ンキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加して反
応を停止する。吸光度を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成されるＨ ₂ Ｏ₂の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ₂Ｏ₂溶液の標準曲線をそれぞれの
実験について実施する。

【０５８２】 この実施例において記載された研究は、ＴＲ９タンパク質の活性を試験した。
しかし、当業者はＴＲ９ポリヌクレオチド、ＴＲ９のアゴニスト、および／また
はアンタゴニストの活性を試験するために（例えば、遺伝子治療）、例示された
研究を容易に改変し得る。

【０５８３】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。

【０５８４】 本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の教示を考慮して可能であ
り、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。

【０５８５】 本明細書中で引用された全ての刊行物（特許、特許出願、学術文献、実験マニ
ュアル、書籍または他の文書を含む）の開示全体は、本明細書中に参考として援
用される。

【０５８６】 さらに、本明細書とともに提出された配列表ならびに米国仮出願番号第６０／
１２６，０１９（１９９９年３月２４日）および米国仮出願番号第６０／１３４
，２２０（１９９９年５月１４日）とともに提出された配列表は、コンピュータ
ーおよび紙の両方の形式において、本明細書中にその全体が参考として援用され
る。

【０５８７】

【表５】 ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。

【０５８８】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリストに記載された任意の
者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得
る。

【０５８９】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の失効、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を
有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対して
のみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（
３）号規定）。

【０５９０】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（国立特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に
より）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および登録委員会（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｉｓｔｒａ
ｔｉｏｎ）による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対
してのみ行われる旨を、請求する。

【０５９１】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。 ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリストに記載された任意の
者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得
る。

【０５９２】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリストに記載さ
れた任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の
者であり得る。

【０５９３】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは失効される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生
物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求
は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可
能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工
業所有権局に対して提出されるものとする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ〜Ｄは、ＴＲ９レセプターのヌクレオチド配列（配列番号１）および推
定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。コンピュータープログラムＰＳＯＲＴを
用いた分析によって、このタンパク質が約４０アミノ酸残基（下線）の推定リー
ダー配列および約７２ｋＤａの推定分子量を有することが明らかとなった。さら
に、約４１〜約３５０までのアミノ酸残基が細胞外ドメインを構成し（配列番号
２のアミノ酸残基約１〜約３１０）；約３５１〜約３６７までのアミノ酸残基が
膜貫通ドメインを構成し（配列番号２のアミノ酸残基約３１１〜約３２７）；約
３６８〜約６５５までが細胞内ドメインを構成し（配列番号２のアミノ酸残基約
３２８〜約６１５）；そして約４２９〜約４９５がデスドメインを構成すること
（配列番号２のアミノ酸残基約３８９〜約４５５）が、予想される。

【図２】 図２は、ＴＲ９レセプター（配列番号２）とＦａｓ（配列番号３）、ＮＧＦＲ
ｐ７５（配列番号４）およびＴＮＦＲ １（配列番号５）との間のアミノ酸配
列の類似性の領域を示す。コンセンサスと一致する残基は、影をつける。

【図３】 図３は、ＴＲ９アミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン領域およ
びコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；フレキシブル領域；抗原性
インデックスおよび表面可能性（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）を
、図１Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列について、再び引用されるコンピューター
プログラムのデフォルトパラメーターを用いて予想したように示す。「抗原性イ
ンデックス−Ｊａｍｓｏｎ−Ｗｉｌｆ」グラフにおいて、図１Ａ〜Ｄ中のアミノ
酸残基約４４〜約１２１、約１５６〜約３１１、約３２３〜約３４８、約３７６
〜約４１２、約４３３〜約４７４、約４８５〜約５９９および約６１１〜約６２
８は、ＴＲ２タンパク質の示される高度な抗原性領域に対応する。図１Ａ〜Ｄに
おけるこれらの高度に抗原性なフラグメントは、それぞれ、配列番号２中の以下
のフラグメントに対応する：アミノ酸残基約４〜約８１、約１１６〜約２７１、
約２８３〜約３０８、約３３６〜約３７２、約３９３〜約４３４、約４４５〜約
５５９および約５７１〜約５８８。

【図４】 ＴＲ９の推定アミノ酸配列を強調する。 図４Ａ：ＴＲ９に対する読み取り枠は、６５５アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク
質を規定する（配列番号２）。ＰＳＯＲＴ以外のコンピュータープログラムの適
用によって、アミノ酸４２（Ｇｌｎ、黒い三角で示される）で開始する成熟タン
パク質が推定された。推定シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインには、それぞ
れ一本の下線および二本の下線を付す。６つの可能性のあるＮグリコシル化部位
が、黒い点によって示される。細胞質デスドメインを、四角で囲む。プロリンリ
ッチな配列と重複する潜在的なロイシンジッパーモチーフを含む細胞内領域は、
太線で下線を付す。図４Ｂ：ＴＲ９（配列番号１９）およびオステオプロテゲリ
ン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（配列番号２０）の細胞外システインリ
ッチドメインの配列整列。整列は、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフト
ウェアを用いて行った。影は、同一の残基を示す。図４Ｃ：ＴＲ９（配列番号２
１）、ＣＤ９５（配列番号２２）、ＴＮＦＲ１（配列番号２３）、ＤＲ３（配列
番号２４）、ＤＲ４（配列番号２５）およびＤＲ５（配列番号２６）のデスドメ
インの配列比較。整列は、図４Ｂと同じ方法で実施し、そして示した。ＯＰＧ；
オステオプロテゲリン。

【図５】 ＴＲ９は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する。ＴＲ９の異所性の
発現は、Ｈｅｌａ細胞においてアポトーシスを誘導するが、ＭＣＦ７細胞では誘
導しない。Ｈｅｌａ細胞およびＭＣＦ７細胞は、空ベクター、ＴＲ９、ＴＲ９デ
ルタまたはＤＲ４を用いて、βガラクトシダーゼ発現レポーター構築物と共に、
製造者らの指示書（ＢＲＬ）に従ってリポフェクトアミン方法を用いて同時トラ
ンスフェクトした。トランスフェクションの１９時間後、細胞を５−ブロモ−４
−クロロ−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を用いて
染色し、Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５
）に記載されるように試験した。このデータ（平均値±ＳＤ）は、全βガラクト
シダーゼ陽性細胞の関数としてアポトーシス細胞を回のパーセンテージで表す（
ｎ＝４）。

【図６】 ＴＲ９は、核因子ＮＦκＢ活性化を媒介する。２９３細胞の同時トランスフェ
クションを示される発現構築物およびＮＦκＢルシフェラーゼレポーター構築物
を用いて実施した。トランスフェクションの（３６時間）後、以前に記載された
ように（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０−９９２（
１９９６）；およびＰａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１１−１１３（１９
９７））細胞抽出物を調製し、そしてルシフェラーゼ活性を測定した。トランス
フェクション効率は、βガラクトシダーゼ活性によってモニターした。トランス
フェクトされた細胞の部分を使用して、ＴＲ９またはＴＲ９デルタの発現をモニ
ターした。細胞溶解物を調製し、そしてＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルを用
いて免疫沈降し、そしてＴＲ９またはＴＲ９デルタの存在を抗ＦＬＡＧを用いて
ブロットすることによって検出した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 1/04 9/10 ４Ｈ０４５ 1/16 11/04 9/10 17/00 11/04 19/02 17/00 21/00 19/02 25/00 21/00 25/16 25/00 25/28 25/16 27/02 25/28 29/00 27/02 １０１ 29/00 31/12 １０１ 31/22 31/12 35/00 31/22 35/02 35/00 37/00 35/02 37/02 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/715 37/02 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/564 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:19 33/564 1:91 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロー ド 5502 (72)発明者 ジェンツ， レイナー エル． アメリカ合衆国 メリーランド 20850， ロックビル， マウント プロスペクト ドライブ 13608 (72)発明者 ユ， グオ−リアン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレイ， グラバット ドライブ 242 (72)発明者 ファン， ピン アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザーズバーグ， ウエスト サイド ドライブ 335， アパートメント 302 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CA25 CB01 CB03 CB07 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 HA17 4B064 AG20 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA05 DA13 DA14 4B065 AA26X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 CA53 CA56 DA53 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA021 ZA161 ZA331 ZA361 ZA451 ZA591 ZA751 ZA891 ZA941 ZA961 ZB071 ZB111 ZB151 ZB261 ZB271 ZB331 ZC551 ZC781 4C085 AA13 AA14 BB11 CC05 DD22 DD23 EE01 EE06 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 BA41 CA40 DA50 DA76 DA86 EA22 EA28 EA29 EA50 FA74

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一
   のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： （ａ）配列番号２のアミノ酸およそ−４０〜およそ６１５を含むポリペプチド
   をコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２のアミノ酸およそ−３９〜およそ６１５を含むポリペプチド
   をコードするヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２のアミノ酸およそ１〜およそ６１５を含むポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
   ドされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
   ドされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ９ポリペプチドをコードするヌクレオチ
   ド配列； （ｆ）ＴＲ９細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｇ）ＴＲ９膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｈ）ＴＲ９細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｉ）膜貫通ドメインのうちのすべてまたは一部が欠失されている、ＴＲ９レ
   セプター細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｊ）ＴＲ９デスドメインをコードするヌクレオチド配列；ならびに （ｋ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
   （ｉ）または（ｊ）におけるヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチ
   ド配列。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１におけるヌクレオチド
   配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１におけるヌクレオチド
   配列を有し、該ヌクレオチド配列が配列番号２におけるアミノ酸配列を有するＴ
   Ｒ９レセプターをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１におけるヌクレオチド
   配列を有し、該ヌクレオチド配列は、配列番号２におけるアミノ酸配列を有する
   成熟ＴＲ９レセプターをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に
   含まれるｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸
   分子。
6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが、ＴＲ９レセプターをコードするヌ
   クレオチド配列を有し、該ＴＲ９レセプターは、ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７
   に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、請求項
   １に記載の核酸分子。
7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが、成熟ＴＲ９レセプターをコードす
   るヌクレオチド配列を有し、該成熟ＴＲ９レセプターは、ＡＴＣＣ受託番号２０
   ９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する
   、請求項１に記載の核酸分子。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
   、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）におけるヌクレオチド
   配列と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェント
   なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む
   、単離された核酸分子であって、 ここで該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基の
   みからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな
   ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、核酸分子。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
   、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）におけるアミノ酸配列を有する
   ＴＲ９レセプターのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
   オチドを含む、単離された核酸分子。
10. 【請求項１０】 以下からなる群より選択されるＴＲ９レセプターのエピト
    ープ保有部位をコードする、請求項９に記載の単離された核酸分子：配列番号２
    のアミノ酸残基およそ４〜およそ８１を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ
    酸残基およそ１１６〜およそ２７１を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸
    残基およそ２８３〜およそ３０８を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残
    基およそ３３６〜およそ３７２を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残基
    およそ３９３〜およそ４３４を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残基お
    よそ４４５〜およそ５５９を含むポリペプチド；ならびに配列番号２のアミノ酸
    残基およそ５７１〜およそ５８８を含むポリペプチド。
11. 【請求項１１】 ＴＲ９レセプター細胞外ドメインをコードする、請求項１
    に記載の単離された核酸分子。
12. 【請求項１２】 ＴＲ９レセプター膜貫通ドメインをコードする、請求項１
    に記載の単離された核酸分子。
13. 【請求項１３】 ＴＲ９レセプター細胞内ドメインをコードする、請求項１
    に記載の単離された核酸分子。
14. 【請求項１４】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同
    一の配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： （ａ）クローンＨＩＢＥＪ８６Ｒのヌクレオチド配列（配列番号６）； （ｂ）クローンＨＬ１ＡＡ７９Ｒのヌクレオチド配列（配列番号７）； （ｃ）クローンＨＨＦＧＤ５７Ｒのヌクレオチド配列（配列番号８）； （ｄ）クローンＨＳＡＢＧ３８Ｒのヌクレオチド配列（配列番号９）； （ｅ）クローンＨＨＰＤＺ３１Ｒのヌクレオチド配列（配列番号１０）； （ｆ）配列番号１に示される配列の一部のヌクレオチド配列であって、該一部
    がヌクレオチド５００〜ヌクレオチド９８０の少なくとも５０個連続するヌクレ
    オチドを含む、ヌクレオチド配列；ならびに （ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけ
    るヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列。
15. 【請求項１５】 請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入す
    る工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって作製される、組換えベク
    ター。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する
    工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法によって作製される、組換え宿主
    細胞。
19. 【請求項１９】 ＴＲ９ポリペプチドを産生するための組換え方法であって
    、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項１８に記載の組換え宿主細
    胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同
    一のアミノ酸配列を有する、単離されたＴＲ９ポリペプチド： （ａ）配列番号２におけるアミノ酸およそ−４０〜およそ６１５； （ｂ）配列番号２におけるアミノ酸およそ−３９〜およそ６１５； （ｃ）配列番号２におけるアミノ酸およそ１〜およそ６１５； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有するＴＲ９ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ９ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ）ＴＲ９レセプター細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｇ）ＴＲ９レセプター膜貫通ドメインのアミノ酸配列； （ｈ）ＴＲ９レセプター細胞内ドメインのアミノ酸配列； （ｉ）膜貫通ドメインのうちのすべてまたは一部が欠失されている、ＴＲ９レ
    セプター細胞内ドメインおよび細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｊ）ＴＲ９レセプターデスドメインのアミノ酸配列；ならびに （ｋ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）または（ｊ）のポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保有部分
    のアミノ酸配列。
21. 【請求項２１】 ＴＲ９レセプタータンパク質のエピトープ保有部分を含む
    単離されたポリペプチドであって、該部分が以下からなる群より選択される、単
    離されたポリペプチド：配列番号２におけるアミノ酸残基およそ４〜およそ８１
    を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基およそ１１６〜およそ２
    ７１を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基およそ２８３〜およ
    そ３０８を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基およそ３３６〜
    およそ３７２を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基およそ３９
    ３〜およそ４３４を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基およそ
    ４４５〜およそ５５９を含むポリペプチド；ならびに配列番号２におけるアミノ
    酸残基およそ５７１〜およそ５８８を含むポリペプチド。
22. 【請求項２２】 請求項２０に記載のＴＲ９レセプターポリペプチドに特異
    的に結合する、単離された抗体。
23. 【請求項２３】 ＴＲ９レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チドを含む単離された核酸分子であって、該ポリペプチドが、少なくとも１つの
    保存的アミノ酸置換以外は、以下からなる群より選択される配列を有する、単離
    された核酸分子： （ａ）配列番号２におけるアミノ酸およそ−４０〜およそ６１５を含むポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２におけるアミノ酸およそ−３９〜およそ６１５を含むポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２におけるアミノ酸およそ１〜およそ６１５を含むポリペプチ
    ドをコードするヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ９ポリペプチドをコードするヌクレオチ
    ド配列； （ｆ）ＴＲ９細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｇ）ＴＲ９膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｈ）ＴＲ９細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｉ）膜貫通ドメインのうちのすべてまたは一部が欠失されている、ＴＲ９レ
    セプター細胞外ドメインおよび細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列； （ｊ）ＴＲ９デスドメインをコードするヌクレオチド配列；ならびに （ｋ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）または（ｊ）におけるヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチ
    ド配列。
24. 【請求項２４】 単離されたＴＲ９レセプターポリペプチドであって、少な
    くとも１つの保存的アミノ酸置換以外は、以下からなる群より選択される配列を
    有する、単離されたＴＲ９レセプターポリペプチド： （ａ）配列番号２におけるアミノ酸およそ−４０〜およそ６１５； （ｂ）配列番号２におけるアミノ酸およそ−３９〜およそ６１５； （ｃ）配列番号２におけるアミノ酸およそ１〜およそ６１５； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有するＴＲ９ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ９ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ）ＴＲ９レセプター細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｇ）ＴＲ９レセプター膜貫通ドメインのアミノ酸配列； （ｈ）ＴＲ９レセプター細胞内ドメインのアミノ酸配列； （ｉ）膜貫通ドメインのうちのすべてまたは一部が欠失されている、ＴＲ９レ
    セプター細胞外ドメインおよび細胞内ドメインのアミノ酸配列； （ｊ）ＴＲ９レセプターデスドメインのアミノ酸配列；ならびに （ｋ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）または（ｊ）のポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保有部分
    のアミノ酸配列。