JP2003502287A - 腫瘍壊死因子レセプター５ - Google Patents

腫瘍壊死因子レセプター５

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ユン−フェイ ウェイ，
スティーブン エム． ルーベン，
レイナー エル． ジェンツ，
ジアン ニ，
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Human Genome Sciences Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであり、ＴＲＡＩＬを結合することがここで見出されているポリペプチドをコードする新規なヒト遺伝子に関する。より具体的に、腫瘍壊死因子レセプター５と名付けられ、ときどき「ＴＲＦＲ−５」または「ＴＲ５」といわれ、そして本明細書中で、細胞内ドメインのないＴＲＩＬレセプター」または「ＴＲＩＤ」といわれる、ヒトペプチドをコードする単離された核酸分子が、提供される。ＴＲＩＤポリペプチド（これは、ベクターである）、宿主細胞、およびこれらの作製するための方法が提供される。本発明はさらに、ＴＲＡＩＬポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。このような組成物を利用する診断方法または治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであり、そして現在ＴＲＡ
ＩＬに結合することが見出されているポリペプチドをコードする新規なヒト遺伝
子に関する。より詳細には、腫瘍壊死因子レセプター−５（これは、ときどき「
ＴＮＦＲ−５」または「ＴＲ５」と呼ばれ、ここで、本明細書中以下では「細胞
内ドメインを有さないＴＲＡＩＬレセプター」または「ＴＲＩＤ」と呼ぶ）と名
付けられたヒトポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。Ｔ
ＲＩＤポリペプチド、ならびにこれを生成するためのベクター、宿主、および組
換え方法もまた提供される。本発明はさらに、ＴＲＩＤポリペプチド活性のアゴ
ニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。こ
れらの組成物を使用する診断的および治療的方法もまた、提供される。
【０００２】 （関連分野） 多数の生物学的作用（例えば、特定の刺激への応答および天然の生物学的プロ
セス）は、サイトカインのような因子によって制御される。多くのサイトカイン
は、レセプターに結合し、そして細胞内応答を産生することによって、レセプタ
ーを通して作用する。
【０００３】 例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびβはサイトカインであり、これは多
数の生物学的プロセスを制御するＴＮＦレセプターを通して作用し、このプロセ
スとしては、感染およびショックの導入および炎症性疾患に対する防御が挙げら
れる。ＴＮＦ分子は、「ＴＮＦリガンド」スーパーファミリーに属し、そしてそ
れらのレセプターすなわちカウンターリガンド「ＴＮＦレセプター」スーパーフ
ァミリーとともに作用する。従来、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの９のメ
ンバーが同定されており、そしてＴＮＦレセプタースーパーファミリーの１０の
メンバーが特徴付けられている。
【０００４】 リガンドとしては、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴ−α、ＴＮＦβとして
もまた公知である）、ＬＴ−β（複合体異種三量体のＬＴ−α２−βに見出され
る）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４
０Ｌ、および神経成長因子（ＮＧＦ）が挙げられる。ＴＮＦレセプターのスーパ
ーファミリーとしては、ｐ５５ＴＮＦレセプター、ｐ７５ＴＮＦレセプター、Ｔ
ＮＦレセプター関連タンパク質、ＦＡＳ抗原、またはＡＰＯ−１、ＣＤ４０、Ｃ
Ｄ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、低親和性ｐ７５、およびＮＧＦレセ
プターが挙げられる（Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２２：２
９１−２９５（１９９４））。
【０００５】 ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化Ｔ細胞によっ
て発現され、このことは、細胞個体発生および機能の基礎となる他の細胞型との
Ｔ細胞相互作用に必要であることを意味する。（Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．，前出）。
【０００６】 ＴＮＦレセプターファミリーのいくつかのメンバーの必須の機能に関する考慮
すべき見識は、これらのタンパク質の発現を回避する変異体の同定および創生か
ら得られている。例えば、ＦＡＳ抗原およびそのリガンドに天然に存在する変異
は、リンパ球増殖性疾患を引き起こし（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ，
Ｒ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：３１４（１９９２））、これはおそらく、プ
ログラムされた細胞死の失敗を反映する。ＣＤ４０リガンドの変異は、血漿中の
高レベルの免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロブリンＧによって特徴付
けられるＸ連鎖免疫欠損状態を引き起こし、これは、欠陥のあるＴ細胞依存性Ｂ
細胞活性化を引き起こす（Ａｌｌｅｎ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：
９９０（１９９３））。低親和性神経成長因子レセプターの標的化変異は、末梢
構造の欠陥のある感覚性新機軸（ｓｅｎｓｏｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）によ
って特徴付けられる障害を引き起こす（Ｌｅｅ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ ６９：
７３７（１９９２））。
【０００７】 ＴＮＦおよびＬＴ−αは、２つのＴＮＦレセプター（５５ｋｄおよび７５ｋｄ
のＴＮＦレセプター）に結合し得る。ＴＮＦおよびＬＴ−αによって誘発される
（それらのレセプターを通じて作用する）多数の生物学的効果としては、移植さ
れた腫瘍の出血性壊死、細胞傷害性、内毒素ショックにおける役割、炎症、免疫
調節、増殖および抗ウイルス応答、ならびに電離放射線の有害な効果に対する防
御が挙げられる。ＴＮＦおよびＬＴ−αは、広範な疾患の病原性に関与し、これ
には、内毒素ショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、および
移植片−宿主拒絶が挙げられる（Ｂｅｕｔｌｅｒ，ＢおよびＶｏｎ Ｈｕｆｆｅ
ｌ，Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：６６７−６６８（１９９４））。ｐ５５レ
セプターにおける変異は、微生物感染に対する感受性を増加させる。
【０００８】 さらに、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）およびＦａｓのＣ末端付近の約８０アミノ酸ド
メインが、「死ドメイン」として報告され、これはプログラムされた細胞死につ
いての形質導入シグナル伝達を担う（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｅｌｌ ７４：
８４５（１９９３））。
【０００９】 アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発生お
よび恒常性に必須の生理学的プロセスである（Ｈ．Ｓｔｅｌｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６７：１４４５−１４４９（１９９５））。アポトーシスの撹乱は、ガ
ン、神経変性障害、および後天性免疫不全症候群を含むいくつかのヒト疾患の病
原性に寄与する（Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４５
６−１４６２（１９９５））。免疫媒介殺傷の１つの機構は、死レセプターの関
与である。近年、多くの注目が、２つの細胞表面死レセプターＦａｓ／ＡＰＯ−
１およびＴＮＦＲ−１のシグナル伝達および生物学的機能に集中している（Ｊ．
Ｌ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら、Ｃｅｌｌ ８１：４７９−４８２（１９９５）；Ａ
．Ｆｒａｓｅｒら、Ｃｅｌｌ ８５：７８１−７８４（１９９６）；Ｓ．Ｎａｇ
ａｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４４９−５６（１９９５））。両方とも
、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであり、これらはまた、とりわけ、Ｔ
ＮＦＲ−２、低親和性ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、およびＣＤ３０を含む（Ｃ．Ａ．Ｓ
ｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９−２３（１９９０）；Ｍ．Ｔｅ
ｗａｒｉら、Ｍｏｄｕｌａｒ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍ．Ｐｕｒｔｏｎ，Ｈｅｌｄｉｎ，Ｃａｒｌ編、
（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５））。ファミリ
ーメンバーは、それらの細胞外ドメインにおけるシステインリッチ反復の存在に
よって規定されるが、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１およびＴＮＦＲ−１もまた、細胞内相
同性の領域（適切には「死ドメイン」と称され、これはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ
自殺遺伝子ｒｅａｐｅｒとわずかに関連する）を共有する（Ｐ．Ｇｏｌｓｔｅｉ
ｎら、Ｃｅｌｌ ８１：１８５−１８６（１９９５）；Ｋ．Ｗｈｉｔｅら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６４：６７７−８３（１９９４））。この共有された死ドメイン
は、両方のレセプターが、最近まで未確認のままの、関連セットのシグナル伝達
分子と相互作用することを示唆する。Ｆａｓ／ＡＰＯ−１の活性化は、死ドメイ
ン含有アダプター分子ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら
、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−１２（１９９５）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：７７９５−８（１９９５）；Ｆ．Ｃ．Ｋｉｓｃｈ
ｋｅｌら、ＥＭＢＯ １４：５５７９−５５８８（１９９５））を補充し、これ
は次には、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ１（プロアポトーシスプロテアーゼのＩＣＥ／
ＣＥＤ−３ファミリーのメンバー）に結合し、そしておそらく活性化する（Ｍ．
Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７−８２７（１９９６）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌ
ｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３−８１５（１９９６））。Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１の中心的役割は、細胞死を引き起こすことであるが、ＴＦＮＲ−１は、その多
くがＮＦ−ｋＢを活性化する能力に由来する多くの様々な生物学的活性をシグナ
ル伝達し得る（Ｌ．Ａ．Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ
１３：１５１−３（１９９２））。従って、ＴＮＦＲ−１は、多価アダプター分
子ＴＲＡＤＤを補充し、これはＦＡＤＤに類似し、死ドメインもまた含む（Ｈ．
Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ ８１：４９５−５０４（１９９５）；Ｈ．Ｈｓｕら、Ｃｅ
ｌｌ ８４：２９９−３０８（１９９６））。ＦＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、およびＲ
ＩＰを含む多くのシグナル伝達分子との関連を通じて、ＴＲＡＤＤは、アポトー
シスおよびＮＦ−ｋＢ活性化の両方をシグナル伝達し得る（Ｈ．Ｈｓｕら、Ｃｅ
ｌｌ ８４：２９９−３０８（１９９６）；Ｈ．Ｈｓｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
４：３８７−３９６（１９９６））。
【００１０】 近年、新たなアポトーシス誘導性ＴＮＦリガンドが発見されている。Ｓ．Ｒ．
Ｗｉｌｅｙら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３−６８２（１９９５））は、この
分子を「ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド」または単に「ＴＲＡＩＬ］と
命名した。この分子はまた、「Ａｐｏ−２リガンド」または「Ａｐｏ−２Ｌ」と
も呼ばれている。Ｒ．Ｍ．Ｐｉｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２
６８７−１２６９０（１９９６）。この分子はまた、同時係属中の米国仮出願番
号６０／０１３，４０５においてもまた開示されている。便宜上、この分子は、
本明細書中でＴＲＡＩＬという。
【００１１】 ＦＡＳリガンド（この転写物は、刺激されたＴ細胞に非常に制限されるようで
ある）とは異なり、有意なレベルのＴＲＡＩＬが、多くのヒト組織（例えば、脾
臓、肺、前立腺、胸腺、卵巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、胎盤、腎臓）にお
いて検出され、そしていくつかの細胞株によって連続的に転写される。ＴＲＡＩ
ＬはＦａｓリガンドから独立して作用することが示されている（Ｗｉｌｅｙら、
前出）。ＴＲＡＩＬはＦａｓ／Ａｐｏ−１Ｌによる死シグナル伝達と同様の時間
枠内で、迅速にアポトーシスを活性化するが、ＴＮＦ誘導性アポトーシスより早
いこともまた示されている。Ｓ．Ａ．Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ６：７５０−７５２（１９９６）。ＴＲＡＩＬのＴＮＦＲ−１、
Ｆａｓ、または近年同定されたＤＲ３への結合の不能性は、ＴＲＡＩＬは、独特
のレセプターと相互作用し得ることを示唆する。
【００１２】 ＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＮＦファミリーレセプターの効果は変化し
、そして哺乳動物系の生物学的プロセスにおいて正常および異常の両方の多数の
機能に影響する。それゆえ、正常および疾患状態の両方において生物学的活性に
影響するようなレセプターおよびリガンドの同定および特徴づけのための明確な
必要性が存在する。特に、ＴＲＡＩＬに結合するさらなる新規なレセプターを単
離および特徴付ける必要性が存在する。
【００１３】 （発明の要旨） 本発明は、単離された核酸分子を提供し、これは、配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列または１９９６年１１月２０日にＡＴＣＣ受託番号９７７９８として寄
託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または代替的にその配列から
なる。配列番号１に示される寄託されたＴＲＩＤクローンを配列決定することに
よって決定されるヌクレオチド配列は、約２６アミノ酸のリーダー配列を伴う、
約２５９アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレー
ムを含む。
【００１４】 本発明はまた、組換えベクター（本発明の単離された核酸分子を含む）および
組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を
作製する方法、およびＴＲＩＤポリペプチドまたはペプチドの組換え技術による
産生のためにそれらを使用するための方法を提供する。
【００１５】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードさ
れるアミノ酸配列を有する単離されたＴＲＩＤポリペプチドを提供する。
【００１６】 本発明はまた、ＴＲＩＤタンパク質のレベルを検出するための定量的および診
断用アッセイのような診断用アッセイを提供する。従って、例えば、ＴＲＩＤま
たはその可溶性形態の発現を検出するための本発明に従う診断アッセイは、ＴＲ
ＡＩＬの有害な効果（例えば、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス）に抵抗するかまた
はその効果から保護する正常組織の能力を検出するために使用され得る。
【００１７】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドは、最も多面性のサイトカインの
中にあることが公知であり、これは、細胞傷害性、抗ウイルス活性、免疫調節活
性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む多数の細胞性応答を含む。ＴＮＦ
ファミリーリガンドに対する細胞性応答は、正常な生理学的応答だけでなく、増
加したアポトーシスに関連する疾患またはアポトーシスの阻害も含む。アポトー
シス（プログラムされた細胞死）は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する
生理学的機構であり、そしてその調節不全は、多数の異なる病原性プロセスを導
き得る。増加した細胞生存に関連する疾患、またはアポトーシスの阻害としては
、ガン、自己免疫疾患、ウイルス感染、炎症、移植片対宿主疾患、急性移植片拒
絶、および慢性移植片拒絶が挙げられる。増加したアポトーシスに関連する疾患
としては、ＡＩＤＳ、神経変性障害、脊髄形成異常症候群、虚血性障害、毒素誘
導性肝臓疾患、敗血症性ショック、悪液質、および摂食障害が挙げられる。
【００１８】 従って、本発明はさらに、ＴＮＦファミリーリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）
によって誘導されるアポトーシスを増強するための方法を提供し、これは、ＴＲ
ＩＤポリペプチドを発現する細胞に、ＴＲＡＩＬに結合するＴＲＩＤの能力を減
少し得る有効量のアンタゴニストを投与する工程を包含する。好ましくは、ＴＲ
ＩＤ結合は、疾患を処置するために減少され、ここで減少したアポトーシスが示
される。
【００１９】 さらなる局面において、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンド（例えば、ＴＲ
ＡＩＬ）によって誘導されるアポトーシスを阻害するための方法に関し、これは
、有効量のＴＲＩＤまたはＴＲＩＤ活性を増加し得るアゴニストを細胞に投与す
る工程を包含する。好ましくは、ＴＲＩＤ活性は、疾患を処置するために増加さ
れ、ここで増加したアポトーシスが示される。
【００２０】 本発明のいずれの候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」がアポトーシ
スを増強または阻害し得るかどうか、当該分野で公知のＴＮＦファミリーリガン
ド／レセプター細胞応答アッセイを用いて決定され得、これには以下により詳細
に記載されるものが挙げられる。従って、さらなる局面において、候補アゴニス
トまたはアンタゴニストがＴＮＦファミリーリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）に
対する細胞応答を増強または阻害し得るかどうかを決定するためのスクリーニン
グ方法が提供される。この方法は、ＴＲＡＩＬポリペプチドおよび第２のＴＮＦ
Ｒを同時発現する細胞を、候補化合物およびＴＮＦファミリーリガンドと接触さ
せる工程、細胞応答をアッセイする工程、ならびに細胞応答を標準的な細胞応答
と比較する工程を含み、この標準は、候補化合物の非存在下でリガンドとの接触
がなされる場合にアッセイされ、それにより、標準を超える増加した細胞応答は
、候補化合物がＴＲＩＤアンタゴニストであることを示し、そして標準に比べて
減少した細胞応答は、候補化合物が、ＴＲＩＤアンタゴニストであることを示す
。本発明によって、ＴＮＦＲポリペプチドを発現する細胞は、内因性または外因
的のいずれかで投与されたＴＮＦファミリーリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）と
接触させられ得る。
【００２１】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、クローニングされたｃＤＮＡを配列決定することによって決定され
た、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含むかまたは代替的にそれからなる、単離された核酸分
子を提供する。配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、ＨＰＲＣＢ５４クロ
ーンを配列決定することによって得られた。このクローンは、１９９６年１１月
２０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ
，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託され、そして受託番号ＡＴＣ
Ｃ９７７９８が与えられた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｐｌｌａ，ＣＡ）に挿
入されている。
【００２２】 本発明のＴＲＩＤタンパク質は、図２Ａ〜Ｐに図示されるように、ヒト神経増
殖因子（ｈＮＧＦ）ｍＲＮＡ（配列番号５）の翻訳産物と２１．７％同一であり
、そしてこの翻訳産物と複数の保存性システインリッチドメインを共有するアミ
ノ酸配列を有する。ｈＮＧＦは、ニューロン（Ｌｅｅ，Ｆ．Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ
６９：７３７）およびリンパ球（Ｔｏｒｃｉａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ８５：３３
６９（１９９６））の発生、生存、アポトーシス、および機能において重要な役
割を果たすと考えられている。
【００２３】 配列アラインメントおよびその比較は、ＴＲＩＤの細胞外システインリッチド
メインが、ＤＲ４およびＤＲ５の両方の対応するドメインと顕著に類似している
（それぞれ、６９％および５２％のアミノ酸同一性）ことを示す。さらに、ＤＲ
４およびＤＲ５と同様に、ＴＲＩＤはまた、ＣＡＲ１（ニワトリのＴＮＦレセプ
ターファミリーメンバー）のシステインリッチドメインと、４２〜４８％の範囲
のアミノ酸同一性で相同であることが見出された（Ｊ．Ｂｒｏｊａｔｓｈら、Ｃ
ｅｌｌ ８７：１（１９９６））。ＴＲＩＤについての潜在的な保護的役割は、
その転写物が多くの正常なヒト組織において検出可能であったが大部分の形質転
換細胞株中では検出されなかったという知見によって示唆された。
【００２４】 ＴＲＩＤは、細胞外ＴＲＡＩＬ結合ドメインおよび膜貫通ドメインを有するが
、驚くべきことに、推定シグナル伝達ドメインを欠き、このレセプターがリガン
ド結合後のシグナル伝達を行わないという可能性を保持している。細胞内ドメイ
ンが存在しない場合、このレセプターは、細胞内ドメインを有さないＴＲＡＩＬ
レセプターについては「ＴＲＩＤ」と呼ばれた。
【００２５】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ
のＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮ
Ａ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のよ
うに決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプ
ローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のよ
うに、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み
得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分
子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、よ
り代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の
配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチ
によってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の
配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は
、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決
定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定
されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列（このような挿入ま
たは欠失の点にて始まる）とは完全に異なる。
【００２６】 核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分
子またはポリヌクレオチドについては、デオキシリボヌクレオチドの配列、そし
てＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、対応するリボヌクレオチド（
Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）の配列が意図され、ここで、特定のデオキシリボヌクレ
オチド配列中の各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチ
ドウリジン（Ｕ）に置換されている。
【００２７】 本明細書中で提供される情報（例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配
列）を使用して、ＴＲＩＤポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、出発
物質としてｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡをクローニングするための手順のような
、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順を使用して得られ得る。本発
明の例示となる、配列番号１に記載されるＴＲＩＤ核酸分子は、前立腺組織由来
のｃＤＮＡライブラリー中で発現された。同じ遺伝子のさらなるクローンは、以
下の組織のｃＤＮＡライブラリーでもまた同定された：内皮組織、刺激された単
球、およびケラチノサイト（ｋｅｒｏｔｉｎｏｃｙｔｅ）。
【００２８】 配列番号１のＴＲＩＤ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列は、約２５９
アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、
配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１８３〜１８５位の開始コドンを
有する。
【００２９】 ＴＲＩＤ遺伝子のオープンリーディングフレームは、ＮＧＦＲについてのヒト
ｍＲＮＡの翻訳産物と配列相同性を共有する。これらの翻訳産物としては、以下
の保存されたドメインが挙げられる：（ａ）約２１４アミノ酸の細胞外ドメイン
（配列番号２の約２７から約２４０までのアミノ酸残基）；（ｂ）約１９アミノ
酸の膜貫通ドメイン（配列番号２の約２１４から約２５９までアミノ酸残基）；
および（ｃ）約９７アミノ酸のシステインリッチドメイン（配列番号２の約５３
から約１５０までのアミノ酸残基）。当業者が理解するように、上記で議論され
る配列決定誤差の可能性に起因して、寄託されたＤＮＡによりコードされる実際
の完全ＴＲＩＤポリペプチド（約２５９アミノ酸を含む）は、いくらか長くても
よいし、短くてもよい。より一般には、実際のオープンリーディングフレームは
、配列番号１に示されるＮ末端由来の最初のメチオニンコドンから推定されるオ
ープンリーディングフレームの±２０アミノ酸の範囲、より可能性が高いのは、
±１０アミノ酸の範囲のどこかであり得る。これは、各それぞれの図で示される
翻訳された配列とインフレームにある。種々の機能的ドメイン、細胞外のシステ
インリッチドメインの正確な「位置（ａｄｄｒｅｓｓ）」を同定するために使用
され得る分析基準に依存して、そしてＴＮＦＲポリペプチドの膜貫通ドメインは
、上記の推定位置とはわずかに異なり得ることがさらに理解される。例えば、配
列番号２の細胞外ドメイン、システインリッチドメインおよび膜貫通ドメインの
正確な位置は、ドメインを規定するために使用される基準に依存して、わずかに
異なり得る（約１から約２０まで、より可能性があるのは、約１から約５までの
残基により位置が「シフト」され得る）。この場合、膜貫通ドメインの開始点お
よび細胞外ドメインの終結点は、図３で示されるように、上記で示される位置で
の疎水性アミノ酸配列の同一性に基づいて予測された。いずれにしても、以下で
さらに議論されるように、本発明は、本明細書に記載される細胞外ドメインのＮ
末端に由来する１つ以上のアミノ酸を欠くポリペプチドを含む、種々の残基が完
全なＴＲＩＤのＮ末端から欠失されたポリペプチドをさらに提供する。このポリ
ペプチドはＴＲＩＤタンパク質の細胞外ドメインの可溶性形態を構成する。
【００３０】 （リーダー配列および成熟配列） ＴＲＩＤタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるように、リーダ
ー配列および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、ＴＲＩＤタンパ
ク質の成熟した形態をコードする核酸分子を提供する。従って、シグナルの仮説
によれば、粗面小胞体を通して成長しつつあるタンパク質鎖の輸送が一旦開始さ
れると、哺乳動物細胞から分泌されるタンパク質は、分泌される「成熟」した形
態のタンパク質を生成するために完全なポリペプチドから切断されるシグナルま
たは分泌リーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞もなお
、同じ特異性で分泌されるタンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分
泌されるタンパク質の切断は、完全には均一ではなく、これによってタンパク質
の２つ以上の成熟種が生じる。さらに、分泌されるタンパク質の切断特異性が完
全なタンパク質の一次構造によって究極的に決定される、すなわち、切断特異性
はポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが長い間知られている。従って
、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号第９７７９８号として同定されたｃＤＮＡクロー
ンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲＩＤポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を提供する。「ＡＴＣＣ受託番号第９７７９８号中のｃ
ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲＩＤポリペプ
チド」により、寄託されるプラスミド中に含まれるクローンのヒトＤＮＡ配列に
よりコードされる完全なオープンリーディングフレームを哺乳動物細胞（例えば
、以下に記載されるように、ＣＯＳ細胞）中に発現させることにより産生される
タンパク質の成熟形態が意味される。
【００３１】 分泌リーダーおよびそのリーダー配列のための切断点をタンパク質が有するか
否かを推定する方法が利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））の方法は、完全（切断されていない
）タンパク質の短いＮ末端荷電領域および続く非荷電領域からの情報を使用する
。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８
３−４６９０（１９８６））の方法は、切断部位、代表的には残基−１３〜＋２
（ここで、＋１は成熟タンパク質のアミノ末端を示す）の周囲の残基からの情報
を使用する。これらの各方法についての既知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点
を推定することの精度は、７５〜８０％の範囲である（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、
前出）。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質について常に同じ推定切断点
を生じるわけではない。
【００３２】 本発明の場合において、完全なＴＲＩＤポリペプチドの推定アミノ酸配列は、
コンピュータープログラム「ＰＳＯＲＴ」によって分析された。Ｋ．Ｎａｋａｉ
およびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１９
９２）を参照のこと。ＰＳＯＲＴはアミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞性
局在を予測するための専門システムである。このコンピューターによる局在の予
測の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が組み込ま
れている。ＰＳＯＲＴプログラムによる分析は、配列番号２におけるアミノ酸２
６と２７との間に切断部位を予測した。従って、完全なアミノ酸配列は、目視検
査によってさらに分析され、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの（−１，−３）法則の簡略
な形態を適用される。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前述。従って、ＴＲＩＤタンパク
質のためのリーダー配列は、配列番号２で下線を付した、約１から約２６までの
アミノ酸残基からなると推定され、一方、成熟ＴＲＩＤタンパク質は配列番号２
における約２７から約２５９までの残基からなると推定される。
【００３３】 当業者が理解するように、配列決定誤差の可能性、ならびに異なる公知のタン
パク質におけるリーダーの切断部位の可変性に起因して、寄託されたｃＤＮＡに
よりコードされる成熟ＴＲＩＤポリペプチドは、約２３３アミノ酸を含むが、約
２２３〜約２４３アミノ酸の範囲のどこかであり得、そしてこのタンパク質の推
定リーダー配列は約２６アミノ酸であるが、約１６〜約３６アミノ酸の範囲のど
こかであり得る。
【００３４】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、
またはＤＮＡ（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成
されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）の形態で存在し得る。ＤＮＡは、二
本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス
鎖としても知られる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼
ばれる）であり得る。
【００３５】 「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分
子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換え
ＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離された
ＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分
子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単
離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲ
ＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、そのような合成的に生
成された分子をさらに含む。
【００３６】 しかし、混合されたクローンライブラリー（例えば、ゲノムライブラリーまた
はｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであり、そしてこのライブラリーの他のク
ローンから単離されていない（このライブラリーの他のメンバーではないクロー
ンを含む均質な溶液の形態で）クローンに含まれる核酸分子、あるいは細胞もし
くは細胞溶解物から単離されたか、または取り出された染色体（例えば、核型に
おけるような、染色体スプレッド）は、本発明の目的に関しては、単離されてい
ない。
【００３７】 本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に示されるオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を含む、あるいはこれらからなるＤＮＡ分子；成熟ＴＲＩＤ
タンパク質のコード配列を含む、あるいはこれらからなるＤＮＡ分子；ならびに
遺伝コードの縮重に起因して上記の配列とは実質的に異なるが、なおＴＲＩＤタ
ンパク質をコードする配列を含むか、あるいはこれらからなるＤＮＡ分子を包含
する。当然のことながら、遺伝コードは、当業者に周知である。従って、このよ
うな縮重した改変体を生成することは当業者にとって慣用的である。
【００３８】 さらに、本発明は、配列番号１の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を有
する核酸分子を提供する。これは、以下の関連するｃＤＮＡクローンから決定さ
れた：ＨＥＬＢＰ７０Ｒ（配列番号１７）、ＨＰＲＣＢ５４Ｒ（配列番号１５）
、ＨＳＪＡＵ５７ＲＡ（配列番号１６）およびＨＵＳＣＢ５４Ｒ（配列番号１８
）。これらの遺伝子フラグメントの各々をコードするヌクレオチド配列は、図４
に示される。
【００３９】 別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号第９７７９８号として寄託さ
れたプラスミドプラスミド中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる
アミノ酸配列を有するＴＲＩＤポリペプチドをコードする単離された核酸分子を
提供する。さらなる実施態様において、各々がＮ末端メチオニンを欠いた成熟Ｔ
ＲＩＤポリペプチドまたは全長ＴＲＩＤポリペプチドをコードする核酸分子を提
供する。
【００４０】 本発明はさらに、配列番号１に示されるヌクレオチド配列または上記の寄託ク
ローンに含まれるＴＲＩＤ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離された核
酸分子、あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する
。このような単離された分子（特にＤＮＡ分子）は、染色体とのインサイチュハ
イブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、および例えば、ノーザ
ンブロット分析によるヒト組織におけるＴＲＩＤ遺伝子の発現を検出するための
プローブとして有用である。
【００４１】 本発明はさらに、本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関
する。寄託されたＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号第９７７９８号として寄託されたプ
ラスミドに含まれるｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列または配列番号１に示される
ヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、少なくと
も約２０ｎｔ長、そしてより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ長、そしてさらに
より好ましくは、少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、
３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、
７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１
１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、また
は１５００ｎｔ長のＤＮＡフラグメントを意図し、これらは本明細書中に議論さ
れるＤＮＡプローブとして有用である。当然のことながら、配列番号１に示され
るヌクレオチド配列の全てではないにしろ大部分に対応するＤＮＡフラグメント
はまた、ＤＮＡプローブとして有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフ
ラグメントとは、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１に示
されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続した塩基を含むフラグメントを意
図する。この状況において、「約（ほぼ）」は、いずれかの末端または両方の末
端においていくつかの（５、４、３、２または１）ヌクレオチドだけ大きいか、
または小さい特に示されたサイズを含む。
【００４２】 本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチドフラグメントの代表例は、例えば、配列番
号１の約ヌクレオチド１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜１８
２、１８３〜２６０、２６１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０
１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６００〜６５
０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０１〜８５０、８５
１〜９０２、９０３〜９５９、９６０〜１０００、１００１〜１０５０、１０５
１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０
、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０および／または１３５１〜１３９２
からの配列、またはそれら対する相補鎖、または寄託されたクローンに含まれる
ｃＤＮＡを含むか、またはこれらからなるフラグメントを含む。この状況におい
て、「約（ほぼ）」は、いずれかの末端または両方の末端においていくつかの（
５、４、３、２または１）ヌクレオチドだけ大きいか、または小さい特に示され
た範囲を含む。
【００４３】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ＴＲＩＤ機能活性を
実証するポリペプチドをコードする。ＴＲＩＤ「機能活性」を実証するポリペプ
チドによって、全長（完全）ＴＲＩＤタンパク質と関連する、１以上の既知の機
能活性を示し得るポリペプチドを意図する。このような機能活性としては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：生物学的活性（例えば、ＴＲＩＤを結
合する）、抗原性［抗ＴＲＩＤ抗体に結合する（すなわち、結合についてＴＲＩ
Ｄポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（ＴＲＩＤポリペプチドに結合す
る抗体を作製する能力）、本発明のＴＲＩＤポリペプチドとマルチマーを形成す
る能力、ならびにＴＲＩＤポリペプチドに対するレセプターまたはリガンド（例
えば、ＴＲＡＩＬ）に結合する能力。ＴＲＩＤポリペプチド、およびそのフラグ
メント、改変体、誘導体、ならびにそのアナログの機能的活性は、種々の方法に
よりアッセイされ得る。
【００４４】 例えば、抗ＴＲＩＤ抗体への結合について全長ＴＲＩＤポリペプチドに結合す
るか、または全長ＴＲＩＤポリペプチドと競合する能力をアッセイする１つの実
施形態において、当該分野で公知の種々のイムノアッセイが用いられ得、これら
のアッセイとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サ
ンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降
反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、金コロイド、
酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集
アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集素アッセイ）、補体結合アッ
セイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ
などのような技術を用いた競合的アッセイおよび非競合的アッセイ系。１つの実
施形態において、抗体結合を一次抗体上の標識を検出することにより検出する。
別の実施形態において、一次抗体を、二次抗体の結合または一次抗体に対する試
薬の結合を検出することにより検出する。さらなる実施形態において、二次抗体
を標識する。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの手段は当該分
野で公知であり、そして本発明の範囲内にある。
【００４５】 別の実施形態では、ＴＲＩＤリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）が同定される場
合、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体
化する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマト
グラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニ
ティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得
る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９
：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、その基質へのＴ
ＲＩＤ結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【００４６】 さらに、本明細書中に記載のアッセイ（例えば、実施例５および６を参照のこ
と）および当該分野で公知の他のアッセイは、ＴＲＩＤポリペプチドおよびそれ
らのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログが、ＴＲＩＤに関連した生
物学的活性を惹起する（インビトロまたはインビボのいずれかでＴＲＡＩＬ誘導
性アポトーシスをブロックする）能力を測定するために、慣用的に適用され得る
。
【００４７】 他の方法は当業者に公知であり、そして本発明の範囲内にある。
【００４８】 本発明の好ましい核酸フラグメントとしては、以下をコードする核酸分子が挙
げられる：図３において同定され、そして以下により詳細に記載されるＴＲＩＤ
ポリペプチドのエピトープ保有部分。
【００４９】 特に、本発明は、配列番号１の一部を示す（配列番号１の１８３位〜９５９位
からなる）ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。アミノ末端
メチオニンを欠くＴＲＩＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた意
図される。１つのこのような好ましい本発明のポリヌクレオチドは、アミノ末端
メチオニンをコードするヌクレオチドを欠いた全長ＴＲＩＤポリペプチドをコー
ドする（例えば、配列番号１のヌクレオチド１８６〜９５９）。なぜなら、メチ
オニンが天然には切断され、そしてこのような配列が遺伝子操作されたＴＲＩＤ
発現ベクターにおいて有用であり得ることが公知であるからである。このような
ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた提供される（例えば、
配列番号２の２〜２５９位のアミノ酸配列、またはアミノ末端メチオニンを欠い
た、ＡＴＣＣ受託番号第９７７９８号として寄託されたクローンによりコードさ
れるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチド）。
【００５０】 本発明の好ましい核酸フラグメントとしては、以下の群より選択されるメンバ
ーをコードする核酸分子が挙げられる：ＴＲＩＤ細胞外ドメイン（配列番号２の
約２７から約２４０までのアミノ酸残基）を含むか、あるいはこれからなるポリ
ペプチド；ＴＲＩＤシステインリッチドメイン（配列番号２の約５３から約１５
０までのアミノ酸残基）を含むか、あるいはこれからなるポリペプチド；ＴＲＩ
Ｄ膜貫通ドメイン（配列番号２の約２４１から約２５９までのアミノ酸残基）を
含むか、あるいはこれからなるポリペプチド；および１、２、３、４以上のＴＲ
ＩＤタンパク質のエピトープ保有部分を含むか、あるいはこれからなるポリペプ
チド。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、
上記のコードされたポリペプチドの実施形態の１、２、３、４のいずれかの組合
わせまたは５全てを含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードする
。これらのドメインの位置は、コンピューターグラフィックスにより推定されて
いるので、当業者は、これらのドメインを構成するアミノ酸残基が各ドメインを
規定するために使用した基準に依存してわずかに（例えば、約１〜１５残基だけ
）変化し得ることを理解する。
【００５１】 図１Ａ〜１Ｂに開示されるＴＲＩＤの細胞外システインリッチモチーフの一方
または両方がＴＲＩＤとそのリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）との間の相互作用
のために重要であると考えられる。従って、本発明の特定の実施形態は、図１Ａ
〜１Ｂに開示されるように、配列番号２のアミノ酸残基５３〜１１０、および／
または１１１〜１５０のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに関する。特定の実施形態において、本発
明のＴＲＩＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、図１Ａ〜１Ｂに開
示される細胞外システインリッチモチーフの両方を含むか、あるいはこれからな
る。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた本発明に
含まれる。
【００５２】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲＩＤの機能的
属性（ａｔｔｒｉｂｕｔｅ）をコードする。この点において本発明の好ましい実
施形態は、ＴＲＩＤのαヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）
、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領
域（「ターン領域」）、コイルまたはコイル形成領域（「コイル領域」）、親水
性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成
領域、および高抗原性指数領域を含むフラグメントを含む。
【００５３】 上記のように、図３および／または表１に示されるＴＲＩＤの構造的もしくは
機能的属性を示すデータは、デフォルトパラメーターに設定したＤＮＡ＊ＳＴＡ
Ｒの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて作製された。好ましい実施形
態において、表１のＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶ列において示され
たデータを使用して、抗原性について高い程度の可能性を示すＴＲＩＤの領域を
決定し得る。高い抗原性の領域は、免疫応答の開始プロセスにおいて抗原認識が
生じ得る環境下でポリペプチドの表面が露出されている可能性が高いポリペプチ
ドの領域を示す値を選択することにより、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／
またはＸＩＶ列において示されたデータから決定される。
【００５４】 この点において特定のこの好ましい領域は図３に示されるが、表１に示される
ように、図３に示されたデータかの表形式の表現を用いることにより示されても
よいし、同定されてもよい。図３を作製するために使用したＤＮＡ＊ＳＴＡＲコ
ンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターで設定）を、表
形式で図３におけるデータを示すために使用した（表１の参照のこと）。図３に
おけるデータの表形式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得
る。
【００５５】 図３および表１に示される上記の好ましい領域としては、配列番号２に示され
るアミノ酸配列の分析により同定される、上記の型の領域が挙げられるが、それ
らに限定されない。図３および表１に示されるように、このような好ましい領域
としては、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およ
びコイル領域（表１のＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩＩ列）、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａ
ｎのα領域、β領域、およびターン領域（表１のＩＩ、ＩＶおよびＶＩ列）、Ｋ
ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域（表１のＶＩＩＩ列）
、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領域（表１のＩＸ列）、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ α
およびβ両親媒性領域（表１のＸおよびＸＩ列）、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌ
ｚ可撓性領域（表１のＸＩＩ列）、高い抗原性指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ
領域（表１のＸＩＩＩ列）、ならびにＥｍｉｎｉ表面形成領域（表１のＸＩＶ列
）が挙げられる。この点において非常に好ましいポリヌクレオチドの中には、い
くつかの構造的特徴（例えば、上記に示された同じまたは異なる領域の特徴のい
くつか（例えば、１、２、３、または４））が組合わさったＴＲＩＤの領域を含
むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがあ
る。
【００５６】
【表１】 この点において、とりわけ非常に好ましいフラグメントは、いくつかの構造的
特徴（例えば、上記に示されるいくつかの特徴）をあわせもつ、ＴＲＩＤタンパ
ク質の領域を含むか、あるいはそれらから構成される、フラグメントである。本
発明の好ましい核酸フラグメントは、１、２、３、４、５以上のＴＲＩＤタンパ
ク質のエピトープ保有部分を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチ
ドをコードする核酸分子をさらに含む。詳細には、この文脈において「約（およ
そ）」は、特に記載されたサイズ（いずれかの末端もしくは両方の末端において
、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまた
は小さなサイズ）を含む。本発明の核酸フラグメントは、以下をコードする核酸
分子を含む：配列番号２におけるアミノ酸残基約Ｇｌｎ−４２〜約Ｇｌｕ−５２
を含むか、あるいはそれらから構成されるポリペプチド；配列番号２におけるア
ミノ酸残基約Ｈｉｓ−５８〜約Ｃｙｓ−６６を含むか、あるいはそれらから構成
されるポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基約Ｐｒｏ−６８〜約Ｔｈ
ｒ−７６を含むか、あるいはそれらから構成されるポリペプチド；配列番号２に
おけるアミノ酸残基約Ｓｅｒ−７９〜約Ｃｙｓ−８５を含むか、あるいはそれら
から構成されるポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基約Ｃｙｓ−９１
〜約Ｔｈｒ−１０２を含むか、あるいはそれらから構成されるポリペプチド；配
列番号２におけるアミノ酸残基約Ｇｌｎ−１１０〜約Ｐｒｏ−１２２を含むか、
あるいはそれらから構成されるポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸残基
約Ａｒｇ−１２６〜約Ｖａｌ−１３６を含むか、あるいはそれらから構成される
ポリペプチド；および配列番号２におけるアミノ酸残基約Ｔｈｒ−１４２〜約Ｇ
ｌｎ−１４８を含むか、あるいはそれらから構成されるポリペプチド。本発明者
らは、上記ポリペプチドフラグメントが、ＴＲＩＤタンパク質の抗原性領域であ
るということを決定した。ＴＲＩＤタンパク質のそのようなエピトープ保有部分
を決定するための方法が以下に詳細に記載される。
【００５７】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００００ｋｂ、
５００００ｋｂ、１００００ｋｂ、１０００ｋｂ、５００ｋｂ、４００ｋｂ、３
５０ｋｂ、３００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１７５ｋｂ、１５０ｋｂ、１
２５ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、
２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、または５ｋｂ長未満である。
【００５８】 さらならる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲＩＤコード
配列の少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、
または少なくとも２５０、少なくとも５００、または少なくとも１０００の連続
ヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成されるが、図１Ａ〜Ｄ（配列番
号１）に示される５’または３’コードヌクレオチドに隣接するゲノムＤＮＡの
１０００ｋｂ、５００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ
、７５ｋｂ、５０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、
または５ｋｂ以下から構成される。さらなる実施形態において、本発明のポリヌ
クレオチドは、ＴＲＩＤコード配列の少なくとも１５、少なくとも３０、少なく
とも５０、少なくとも１００、または少なくとも２５０、少なくとも５００、ま
たは少なくとも１０００の連続ヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成
されるが、ＴＲＩＤイントロンの全てもしくは一部を含まない。別の実施形態に
おいて、この核酸は、ゲノム隣接遺伝子のコード配列（すなわち、ゲノムにおけ
るＴＲＩＤ遺伝子に対して５’または３’）を含まないＴＲＩＤコード配列を含
むか、あるいはそれらから構成される。他の実施形態において、本発明のポリヌ
クレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、
１０、５、４、３、２、１、または１ゲノム隣接遺伝子よりも多くのコード配列
を含まない。
【００５９】 さらに、本発明は、配列番号１（残基１８３〜９５９）の少なくとも約３０ヌ
クレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの任意の部分を含むか、
またはそれらから構成されるポリヌクレオチドを含む。この文脈において「約（
およそ）」は、特に記載されたサイズ（いずれかの末端もしくは両方の末端にお
いて、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか
または小さなサイズ）を含む。
【００６０】 別の局面において、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ寄
託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡクローン）におけるポリヌクレオチドの一
部とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポ
リヌクレオチドを含むか、あるいはそれらから構成される単離された核酸分子を
提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫
酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含むか、また
はそれらから構成される溶液中における４２℃で一晩のインキュベーションに続
いて、約６５℃で０．１×ＳＳＣ中におけるフィルターの洗浄を意図する。これ
らの核酸分子によりコードされるポリペプチドもまた、本発明に包含される。
【００６１】 別の局面において、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ寄
託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡクローン）におけるポリヌクレオチドの一
部と低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含
むか、あるいはそれらから構成される単離された核酸分子を提供する。「低いス
トリンジェンシー条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ
ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ
変性剪断サケ精子ＤＮＡを含むか、あるいはそれらから構成される溶液中におけ
る３５℃または４２℃で一晩のインキュベーションに続いて、約３５℃、４５℃
、５５℃、または６５℃で３×、２×、１×または０．５×ＳＳＣ中におけるフ
ィルターの洗浄を意図する。これらの核酸分子によりコードされるポリペプチド
もまた、本発明に包含される。
【００６２】 ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参
照ポリヌクレオチドのうちの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてよ
り好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ
、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０（例えば、５０）ｎｔにハイブリダ
イズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。この
文脈において「約（およそ）」は、特に記載されたサイズ（いずれかの末端もし
くは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレ
オチドだけ大きいかまたは小さなサイズ）を含む。これらは、上記で議論される
ように、そして以下でより詳細に議論されるように、診断のプローブおよび診断
のプライマーとしての使用を有するが、それに限定されない。
【００６３】 例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部とは、参照ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または配列番
号１において示されるヌクレオチド配列）由来の２０個以上連続したヌクレオチ
ドを意図する。もちろん、ポリＡ配列（例えば、配列番号１において示されるＴ
ＲＩＤ ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクト）、あるいはＴ（またはＵ）残
基の相補的ストレッチのみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、そのよう
なポリヌクレオチドはポリ（Ａ）ストレッチ、またはその相補体（例えば、事実
上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズする
ので、本発明の核酸の一部へのハイブリダイズに使用される本発明のポリヌクレ
オチドに含まれない。
【００６４】 示されるように、ＴＲＩＤポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以
下を含み得るが、これらに限定されない：単独で成熟ポリペプチドをコードする
配列；この成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、プレタ
ンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列のような
、リーダー配列もしくは分泌配列をコードする配列）；さらなる非コード配列を
伴う、上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まない、この成熟ポリペプチ
ドのコード配列（さらなる非コード配列は、例えば、イントロンおよび非コード
５’配列および３’配列（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナ
ルを含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合
およびｍＲＮＡの安定性）を担う、転写される非翻訳配列を含むが、これらに限
定されない））；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードす
るさらなるコード配列。従って、例えば、このポリペプチドは、融合されたポリ
ペプチドの精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列と融合され得る。
本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態において、マーカー配列は、例えば
、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に提供されるタグのような、ヘ
キサヒスチジンペプチドである。中でも、これらの多くは市販されている。例え
ば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８
２１−８２４（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融
合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球
凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する、精製のために有用な別のペプチ
ドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８
４）によって記載されている。以下で考察されるように、他のそのような融合タ
ンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にてＦｃに融合されたＴＲＩＤレセプターを含
む。
【００６５】 （ポリヌクレオチドの改変体および変異体） 本発明はさらに、ＴＲＩＤレセプターの一部、アナログまたは誘導体をコード
する本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然に存在し得る（例えば
、天然対立遺伝子改変体）。「対立遺伝子改変体」とは、生物の染色体上の所定
の遺伝子座を占有する遺伝子の様々な代替形態の１つを意図する。Ｇｅｎｅｓ
ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を
使用して生成され得る。
【００６６】 そのような改変体は、ヌクオチドの置換、欠失または付加により生成される改
変体を含む。この置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドを含み得る。
改変体は、コード領域、非コード領域またはその両方の領域において変化し得る
。コード領域における改変は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失ま
たは付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、ＴＲＩＤポリペプチドま
たはその一部の特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付加および
欠失である。この点で、保存的置換もまた特に好ましい。
【００６７】 本発明のさらなる実施形態は、以下：（ａ）配列番号２におけるアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２におけ
るアミノ酸配列を有するが、アミノ末端メチオニンを欠失するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２における約１位〜約２５９位にお
けるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）
ＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番
号２における約２７位〜約２５９位におけるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲＩＤ
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７９
８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ
ＲＩＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号２における
約２７位〜約２４０位におけるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤ細胞外ドメインを
コードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤ細胞外ドメイ
ンをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）配列番号２における約５３位〜約１５
０位におけるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤシステインリッチドメインをコード
するヌクレオチド配列；（ｊ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤシステインリッチドメインを
コードするヌクレオチド配列；（ｋ）配列番号２における約２４１位〜約２５９
位におけるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤ膜貫通ドメインをコードするヌクレオ
チド配列；（ｌ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡクローンによ
りコードされるアミノ酸配列を有するＴＲＩＤ膜貫通ドメインをコードするヌク
レオチド配列；（ｍ）ＴＲＩＤ機能活性（例えば、抗原活性または生物学的活性
）を有する（ｅ）もしくは（ｆ）のポリペプチドのフラグメントをコードするヌ
クレオチド配列；ならびに（ｎ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）または（ｍ）に
おけるヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列と少なくとも９
０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、
あるいはそれらから構成される単離された核酸分子を含む。上記の（ａ）、（ｂ
）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ
）、（ｌ）または（ｍ）におけるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプ
チドもまた意図される。この文脈において「約（およそ）」は、特に記載された
サイズ（いずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、
３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さなサイズ）を含む。
【００６８】 本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）または（ｍ）に
おけるポリヌクレオチドと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、またはそれらから構成される
単離された核酸を含む。このポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下では、Ａ残基のみもしくはＴ残基のみから構成されるヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズしない。本発明のさら
なる核酸実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）
、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）または（ｍ）におけるアミ
ノ酸配列を有するＴＲＩＤポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を
コードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらから構成される単離され
た核酸分子に関する。
【００６９】 ＴＲＩＤポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なく
とも９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポ
リヌクレオチド配列が、ＴＲＩＤポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配
列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでのミスマッチを含み得ることを除いて
、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一であるこ
とを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同
一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配列の
ヌクレオチドの５％までが、欠失され得るかまたは別のヌクレオチドで置換され
得、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチド
が、その参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチ
ド配列の５’もしくは３’末端位置において、またはこれらの末端位置の間の任
意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１以
上の連続した群においての、いずれかで散在して生じ得る。参照（問い合わせ（
ｑｕｅｒｙ））配列は、本明細書中に記載されるような、配列番号１に示される
ＴＲＩＤコードヌクレオチド配列全体または任意のＴＲＩＤポリヌクレオチドフ
ラグメント（例えば、本明細書中に記載されるような任意のＴＲＩＤ Ｎ末端欠
失および／またはＣ末端欠失のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）、
改変体、誘導体もしくはアナログであり得る。
【００７０】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列に対して、あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド
配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９
％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＷＩ５３７１１）を使用して従来どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは
、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２
つの配列間の最も良好な相同性のセグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）
）。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列
が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定す
る場合は、当然のことながら、同一性のパーセントが参照ヌクレオチド配列の全
長にわたり計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの
相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【００７１】 特定の実施形態では、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配列と
の間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら、（Ｃｏ
ｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズ
ムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。同一
性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用され
る好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝
４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ
＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔ
ｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオ
チド配列の長さ（いずれかより短い方）である。この実施形態に従って、同一性
パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および
３’の短縮を考慮しないという事実を考慮するために、対象配列が、５’または
３’欠失のために（内部欠失が理由ではなく）、問い合わせ配列より短い場合、
手動の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対して、５’末端または
３’末端で短縮化された対象配列について、同一性パーセントは、問い合わせ配
列の総塩基のパーセントとして、一致／整列されない対象配列の５’および３’
である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌクレオ
チドが一致／整列されるか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントが、特定のパラメーターを用いて上記のＦ
ＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し引かれ、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施
形態の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、
問い合わせ配列と一致／整列されいていない、対象配列の５’および３’塩基の
外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定され
る。例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００
塩基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従っ
て、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。
１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での
塩基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる
。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％
である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比
較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／
整列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴ
ＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合
わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正
される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【００７２】 本願は、配列番号１に示される核酸配列、または寄託されたｃＤＮＡの核酸配
列に対して、それらがＴＲＩＤ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに
関わらず、少なくとも９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８
％同一、または９９％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子が
ＴＲＩＤ活性を有するポリペプチドをコードしない場合ですら、当業者はこの核
酸分子を使用する方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているからである。Ｔ
ＲＩＤ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用として
は、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＴＲＩＤ遺伝子またはその対立遺伝
子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒ
ｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．（１９８８））に記載されるよう
な、ＴＲＩＤ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプ
レッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば
、「ＦＩＳＨ」）；および特定の組織におけるＴＲＩＤのｍＲＮＡ発現を検出す
るためのノーザンブロット分析が挙げられる。
【００７３】 しかし、実際にＴＲＩＤレセプター活性を有するポリペプチドをコードする、
配列番号１に示された核酸配列、または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して
少なくとも９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、ま
たは９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。「ＴＲＩＤレセプター
活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイで測定した場合、本
発明のＴＲＩＤレセプター（全長タンパク質または好ましくは成熟タンパク質も
しくは細胞外ドメイン単独）の活性と類似の（しかし、必ずしも同一である必要
はない）活性を示すポリペプチドを意図する。ＴＮＦファミリーリガンド（ＴＲ
ＡＩＬを含む）は、ＴＮＦファミリーレセプター（本発明のＴＲＩＤを含む）と
結合することによって、種々の細胞性応答を誘導する。ＴＲＩＤを発現する細胞
は、リガンド（ＴＲＡＩＬを含む）に対して強力な細胞性応答を有すると考えら
れている。「ＴＮＦファミリーリガンドに対する細胞性応答」とは、細胞、細胞
株、組織、組織培養物またはＴＮＦファミリーリガンドにより誘導される患者に
対する任意の遺伝子型変化、表現型変化、および／または形態学的変化を意図す
る。示されるように、そのような細胞性応答は、ＴＮＦファミリーリガンドに対
する正常な生理学的応答だけでなく、増加した細胞増殖または増加した細胞増殖
の阻害（例えば、アポトーシスの阻害による）に関連した疾患をもまた含む。
【００７４】 当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤ
ＮＡの核酸配列、もしくは配列番号１に示される核酸配列に対して、少なくとも
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する多く
の核酸分子が「ＴＲＩＤタンパク質活性」を有するポリペプチドをコードするこ
とを直ちに認識する。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体はすべて、
同じポリペプチドをコードするので、これは、上記の比較アッセイをたとえ行わ
なくとも、当業者に明らかである。縮重改変体ではないこのような核酸分子につ
いては、相応な数がまたＴＲＩＤタンパク質活性を有するポリペプチドをコード
することは当該分野でさらに認識される。このことは、以下でさらに記載される
ように、当業者が、タンパク質機能に顕著に影響する可能性が低いか、またはそ
の可能性が全くないかのいずれかであるアミノ酸の置換（例えば、１つの脂肪族
アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）を十分認識しているからであ
る。
【００７５】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６
−１３１０（１９９０）に提供される。ここで、この著者らは、タンパク質がア
ミノ酸置換に驚くほど許容性であることを示す。
【００７６】 （ポリヌクレオチドアッセイ） 本発明はまた、例えば、診断試薬としての、相補的なポリヌクレオチドを検出
するためのＴＲＩＤポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全と関連するＴＲ
ＩＤの変異形態の検出は、ＴＲＩＤまたはその可溶性形態の過少発現、過剰発現
、または発現の変更から生じる疾患または疾患に対する感受性（例えば、腫瘍ま
たは自己免疫疾患など）の診断を加え得るか、または定義し得る診断ツールを提
供する。
【００７７】 ＴＲＩＤ遺伝子に変異を保有する個体は、種々の技術により、ＤＮＡレベルで
検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組
織生検および剖検材料に由来する）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出に直
接使用され得るか、または分析前に、ＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅さ
れ得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１９８６））
。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で使用され得る。例として、ＴＲＩＤを
コードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、ＴＲＩＤの発現および
変異を同定および分析し得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比
較した際に、増幅産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、放射性標
識されたＴＲＩＤ ＲＮＡまたは代替的に、放射性標識されたＴＲＩＤアンチセ
ンスＤＮＡ配列に対して、増幅されたＤＮＡがハイブリダイズすることにより同
定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融解温度の差異
によって、一致しなかった二重鎖から区別され得る。
【００７８】 参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の差異もまた、直接的なＤＮＡ
配列決定（ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって示され得る
。さらに、クローニングされたＤＮＡセグメントは、特定のＤＮＡセグメントを
検出するためのプローブとして用いられ得る。このような方法の感度は、ＰＣＲ
または別の増幅方法を適切に使用することによって多いに増強され得る。例えば
、配列決定プライマーは、改変ＰＣＲによって作製された、二本鎖ＰＣＲ産物ま
たは一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列の決定は、放射性標識ヌクレオチド
を用いる従来の手順によってか、または蛍光タグを用いる自動配列決定手順によ
って行われる。
【００７９】 ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的試験は、変性剤を含むか、または含まないゲ
ルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成
され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高い分解能のゲル電気泳動により可
視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメント
の移動度が、それらの特異的な融解温度または部分融解温度により異なる位置で
ゲルにおいて遅延される変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて識別され得る（例え
ば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１２４２（１９８５）を参照のこ
と）。
【００８０】 特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例え
ば、ＲＮａｓｅおよびＳ１プロテクション、または化学切断方法）により明らか
にされ得る（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５））。
【００８１】 従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、ＲＮ
ａｓｅプロテクション、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（
例えば、制限酵素ＤＮＡ断片長多型（「ＲＦＬＰ」））、およびゲノムＤＮＡの
サザンブロッティングのような方法により達成され得る。
【００８２】 より従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、イン
サイチュ分析により検出され得る。
【００８３】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、本発明の組換
えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術よるＴＲＩＤポリペ
プチドまたはそのフラグメントの産生に関する。
【００８４】 宿主細胞は、核酸分子を組み込み、そして本発明のポリペプチドを発現するよ
うに遺伝子操作され得る。ポリヌクレオチドは、単独でか、または他のポリヌク
レオチドと共に導入され得る。このような他のポリヌクレオチドは、独立して導
入されても、同時に導入されても、本発明のポリヌクレオチドに連結されて導入
されてもよい。
【００８５】 本発明のこの局面に従って、ベクターは例えば、プラスミドベクター、一本鎖
または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖のＲＮＡウイルスベクター
またはＤＮＡウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、ＤＮＡおよ
びＲＮＡを細胞へ導入するための周知の技術により、ポリヌクレオチド（好まし
くは、ＤＮＡ）として細胞に導入され得る。ウイルスベクターは複製能を有する
かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は一般的に、補完的
宿主細胞においてのみ生じる。
【００８６】 特定の局面において、ベクターの中で好ましいのは、本発明のポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの発現のためのベクターである。一般的に、このようなベ
クターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結され、宿主における発
現に対して有効である、シス作用性調節領域を含む。適切なトランス作用性因子
は、宿主への導入において、宿主により供給されるか、補完的ベクターにより供
給されるか、またはベクター自身により供給されるかのいずれかである。
【００８７】 非常に様々な発現ベクターが、本発明のポリペプチドを発現するために使用さ
れ得る。このようなベクターは、染色体性ベクター、エピソーム性ベクター、お
よびウイルス由来のベクターを含み、これらには、例えば、細菌プラスミド由来
のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクタ
ー、酵母染色体エレメント由来のベクター、ウイルス（例えば、バキュロウイル
ス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
ニワトリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）由来の
ベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクター（例えば、コスミド
およびファージミドのような、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレ
メント由来のベクター）が挙げられ、これらのすべてが本発明のこの局面に従っ
て、発現のために使用され得る。一般的に、宿主中で、ポリペプチドを発現する
ためにポリヌクレオチドを維持、増殖、または発現するのに適切な任意のベクタ
ーが、これに関して、発現のために使用され得る。
【００８８】 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現調節配列に作動可能に連結されお
り、発現調節配列としては、例えば、ｍＲＮＡ転写を指向するプロモーターが挙
げられる。このようなプロモーターの代表例としては、ファージλＰＬプロモー
ター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔａｃ
プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、な
らびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる（周知のプロモーター
のほんのいくつかを列挙したにすぎない）。一般的に、発現構築物は、転写（開
始および終結）のための部位、そして転写された領域においては翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、
翻訳されるポリペプチドの始まりに翻訳開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切
に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００８９】 さらに、構築物は、発現を調節し、そして保証する調節領域を含み得る。一般
的に、このような領域は、とりわけ、リプレッサー結合部位およびエンハンサー
のように、転写を制御することにより作動する。
【００９０】 増殖および発現のためのベクターは一般的に、選択マーカーを含む。このよう
なマーカーはまた、増幅のために適切であり得るか、またはベクターはこの目的
のためにさらなるマーカーを含み得る。この点に関して、発現ベクターは、好ま
しくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する１つ以上
の選択マーカー遺伝子を含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞の培
養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、ならびにＥ．
ｃｏｌｉおよび他の細菌の培養については、テトラサイクリンもしくはアンピシ
リン耐性遺伝子が挙げられる。
【００９１】 本明細書中の他の箇所に記載したような適切なＤＮＡ配列を含むベクター、な
らびに適切なプロモーター、および他の適切な調節配列は、所望のポリペプチド
を宿主中に発現するのに適切な種々の周知の技術を使用して、適切な宿主に導入
され得る。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細
胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならび
に植物細胞が挙げられる。非常に様々な発現構築物について、その宿主は周知で
あり、そして当業者は、本開示によって、本発明のこの局面に従ってポリペプチ
ドを発現させるための宿主を容易に選択することが可能となる。
【００９２】 細菌における使用に好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、および
ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ から入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ
、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならび
にｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲ
ＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。好ましい真核生物ベクター
のには、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭ
ＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。これらのベ
クターは、単に、多くの市販のベクターおよび当業者が入手可能な周知のベクタ
ーの例示のために列挙されたにすぎない。
【００９３】 宿主細胞における発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選択は、
周知の手順であり、そして発現ベクターの構築、宿主へのベクターの導入および
宿主における発現に必須の技術は、当該分野で慣用的な技術である。
【００９４】 本発明はまた、本明細書中に記載された上記のベクター構築物を含む宿主細胞
に関し、そしてさらに、当該分野において公知の技術を使用して、１以上の異種
制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に結
合された、本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は、
高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞））もしくは
下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は、細菌
細胞のような原核生物細胞であり得る。挿入された遺伝子配列の発現を調節する
か、または所望される特異的な様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする
、宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定のインデュー
サーの存在下で上昇し得；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現は制御
され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシ
ングおよび修飾（例えば、リン酸化、切断）について特徴的および特異的な機構
を有する。適切な細胞株が、発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロ
セシングを保証するために選択され得る。
【００９５】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的実験室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００９６】 本明細書において考察されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ＴＲＩＤコード配列）
を欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明のＴＲＩＤ
ポリヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオ
チド配列）を含むように操作され、そして内因性のＴＲＩＤポリヌクレオチドを
活性化、変更、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相
同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハ
ンサー）ならびに内因性ＴＲＩＤポリヌクレオチド配列を作動可能に連結するた
めに使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，
６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／
２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６
５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は
、それら全体において本明細書中で参考として援用される）。
【００９７】 ＴＲＩＤレセプターポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、種々の適用、特
にＴＲＩＤの化学的特性および生物学的特性を利用する適用のために、本発明に
従って使用され得る。とりわけこの適用としては、腫瘍の処置；寄生虫、細菌、
ウイルスに対する抵抗性；Ｔ細胞、内皮細胞および特定の造血細胞の増殖を誘導
するため；再狭窄、対宿主移植片病を処置するため；抗ウイルス応答を調節する
ため；ならびにアゴニストまたはＴＲＡＩＬ結合促進剤によるＴＲＩＤの刺激後
の特定の自己免疫疾患の予防が挙げられる。さらなる適用は、細胞、組織および
生物体の障害の診断、および処置に関する。本発明のこれらの局面を、以下でさ
らに考察する。
【００９８】 （トランスジェニックおよび「ノックアウト」） 本発明のタンパク質はまた、トランスジェニック動物中で発現され得る。任意
の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミクロ
ピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長類（例
えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない）が、
トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施形態におい
て、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野の公知の技術が、遺伝子治療
プロトコルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現するために
使用される。
【００９９】 当該分野で公知の任意の技術が、導入遺伝子（すなわち、本発明の核酸）を動
物に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するために使用され得
る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏ
ｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−
６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１
１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特
許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺
伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へ
のレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞中への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエ
レクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１
８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例
えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照の
こと）；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の
再移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７
：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されない。このよ
うな技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用される、Ｇ
ｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．
Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。さらに、この
段落中で列挙される文書の各々の内容は、その全体が参考として本明細書中に援
用される。
【０１００】 当該分野で公知の任意の技術（例えば、休止状態へと誘導された、培養胚性細
胞、胎児細胞、成体細胞由来の核を、除核卵母細胞中に核移入する）が、本発明
のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを作製するために使用さ
れ得る（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；
Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）、これら
のそれぞれは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１０１】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイクまたはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に選択
的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要
とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明
らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、その内在性遺伝子の染色体部位に
組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手短に言えば
、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ないくつかのヌ
クレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同組換えを介して内在性遺
伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機能を破壊する
ことを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入
され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６（
１９９４））の教示に従って、その細胞型においてのみ内在性遺伝子が不活化さ
れる。そのような細胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の
細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。この段落に列挙された
文章の各々の内容が、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１０２】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが生じた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素
ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得
る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特
異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０１０３】 一旦、創始動物が作製されると、それらは、交配されるか、同系交配されるか
、異系交配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そ
のような交配ストラテジーの例は、以下を含むがこれらに限定されない：分離系
統を樹立するための１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；
各導入遺伝子の相加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現す
る複合トランスジェニックを作製するための分離系統の同系交配；発現の増強お
よびＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所
定の組み込み部位に対してホモ接合性の動物を作製するヘテロ接合性トランスジ
ェニック動物の交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための
分離ホモ接合性系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な、異なるバック
グラウンド上に導入遺伝子を配置するための交配。
【０１０４】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、ＴＲＩＤポリペ
プチドの生物学的機能の詳述、異常なＴＲＩＤ発現に関連する状態および／また
は障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合
物についてのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されな
い用途を有する。
【０１０５】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のタンパク質を発現するように遺
伝子操作される細胞、あるいは本発明のタンパク質を発現しないように遺伝子操
作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。このよ
うな細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから
入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細
胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞を、
例えば、形質導入、細胞中に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するため
に、あるいはこのコード配列および／または本発明のポリペプチドに結合してい
るコード配列および／または内因性の調節配列を破壊するために、組換えＤＮＡ
技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドのコード配
列を強力な構成的または誘導性のプロモーターまたはプロモーター／エンハンサ
ーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成
し得る。
【０１０６】 本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌する操作された細胞を、例
えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ全身的に導入し得る。あるいは
、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（例えば、遺
伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺伝子操作さ
れた内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る（例えば
、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；ならびにＭｕｌｌｉ
ｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと。こ
れらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１０７】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル型の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
【０１０８】 （ＴＲＩＤポリペプチドおよびフラグメント） 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。例えば
、ＴＲＩＤポリぺプチドの組換え的に生成されたバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）
は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８
）に記載される１工程の方法により実質的に精製され得る。本発明はさらに、寄
託されたｃＤＮＡ、または配列番号２のアミノ酸配列によりコードされるアミノ
酸配列、あるいは上記のポリペプチドの一部を含むか、またはこれらからなるペ
プチドまたはポリペプチドを有する単離されたＴＲＩＤポリペプチドを提供する
。
【０１０９】 本発明のポリペプチドフラグメントは、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮ
Ａによりコードされるか、あるいは寄託されたクローンに含まれるか、または配
列番号１に示される寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列、あるいは
それに対する相補鎖に、（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされる、配列番号２に含まれる
アミノ酸配列を含むか、またはこれらからなるポリペプチドを含む。タンパク質
フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、
あるいはより大きなポリぺプチド内（そのフラグメントが、部分または領域を、
最も好ましくは単一の連続した領域として形成する）に含まれ得る。本発明のポ
リペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下を含むかあるいは
以下からなる、フラグメントが挙げられる：配列番号２のアミノ酸残基およそ１
〜２６、２７〜５０、５１〜１００、１５１〜２００、２０１〜２４０、および
／または２４１〜２５９。本発明のポリペプチドフラグメントのさらなる代表的
な例としては、例えば、以下を含むかあるいは以下からなる、フラグメントが挙
げられる：配列番号２のアミノ酸残基およそ１〜６０、１１〜７０、２１〜８０
、３１〜９０、４１〜１００、５１〜１１０、６１〜１２０、７１〜１３０、８
１〜１４０、９１〜１５０、１０１〜１６０、１１１〜１７０、１２１〜１８０
、１３１〜１９０、１４１〜２００、１５１〜２１０、１６１〜２２０、１７１
〜２３０、１８１〜２４０、１９１〜２５０、および／または２０１〜２４９、
ならびにこれらのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。この
文脈における、「およそ」とは、いずれかの末端もしくは両末端において、特に
列挙された範囲のいくつか（５、４、３、２もしくは１）のアミノ酸だけ大きい
か、もしくは小さい範囲を含む。さらに、ポリぺプチドフラグメントは、少なく
とも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０
、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００アミノ酸長であり得る
。これらのポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドはまた本発明に含まれる
。
【０１１０】 特定の実施形態において、本発明のポリぺプチドフラグメントは、以下を含む
か、またあるいは以下からなる：配列番号２に示されるＴＲＩＤのアミノ酸残基
１〜２５９、２７〜２５９、２７〜２４０、５３〜１５０、および／または２４
１〜２５９。これらのポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドはまた本発明
に含まれる。
【０１１１】 さらなる実施形態では、本発明のフラグメントは、１つ以上のＴＲＩＤドメイ
ンを含むか、または１つ以上のＴＲＩＤドメインからなる。本発明の好ましいポ
リペプチドフラグメントは、以下の群から選択されるメンバーを含む：（ａ）Ｔ
ＲＩＤ膜貫通ドメイン（配列番号２のおよそ２４１〜およそ２５９のアミノ酸残
基を構成すると予想される）；（ｂ）ＴＲＩＤレセプター細胞外ドメイン（配列
番号２のおよそ２７〜およそ２４０のアミノ酸残基を構成すると予想される）；
（ｃ）ＴＲＩＤシステインリッチドメイン（配列番号２のおよそ５３〜およそ１
５０のアミノ酸残基を構成すると予想される）を含むか、またはこのドメインか
らなるポリペプチド；（ｄ）予想される成熟ＴＲＩＤポリペプチドのフラグメン
トを含むか、またはこれらのフラグメントからなる、ポリペプチド、ここで、こ
のフラグメントは、ＴＲＩＤの機能的活性（例えば、抗原性活性または生化学的
活性）を有する；あるいは（ｅ）ＴＲＩＤレセプタータンパク質の一部を保有す
る、１、２、３、４、またはそれ以上のエピトープを含むか、またはこれらから
なる。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドフラグメントは、上記メン
バーの（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）の任意の組合せを含むか
、またはこれらからなる。これらのポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド
はまた本発明に含まれる。
【０１１２】 上記のように、ＴＲＩＤの細胞外システインリッチモチーフの一方または両方
は、ＴＲＩＤとそのリガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）との間の相互作用に重要で
ある。従って、好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドフラグメントは、
配列番号２のアミノ酸残基５３〜１１０、および／または１１１〜１５３を含む
か、またはこれらからなる。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドフラグ
メントは、配列番号２に開示される細胞外システインリッチモチーフの両方を含
むか、またはこれらからなる。これらのポリぺプチドをコードするポリヌクレオ
チドはまた本発明に含まれる。
【０１１３】 とりわけ、特に好ましい本発明のフラグメントは、ＴＲＩＤの構造的特性また
は機能的特性により特徴付けられるフラグメントである。そのようなフラグメン
トは、完全な（すなわち、全長）ＴＲＩＤの、α−へリックスおよびα−へリッ
クス形成領域（「α領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β領域
」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形
成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親
媒性領域、表面形成領域、および高抗原性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメータを使用して同定されるように、１
．５以上の抗原性指標を有する４つ以上のアミノ酸を含む）を含むアミノ酸残基
を含む。特定の好ましい領域は、図３に示される領域であり、そして、配列番号
２に示されるアミノ酸配列の分析により、同定される上記の型の領域を含むが、
これらに限定されない。そのような好ましい領域としては、これらのコンピュー
タプログラムのデフォルトパラメーターを使用して推定されるような、Ｇａｒｎ
ｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ推定α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Ｃ
ｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｋｙ
ｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ推定親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領
域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ α両親媒性領域およびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表
面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域が挙げられる。
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により含ま
れる。
【０１１４】 この関係において非常に好ましいフラグメントの中には、上記に示す特徴のい
くつかのように、いくつかの構造特性を組合わせるＴＲＩＤの領域、を含むか、
またはこれらからなる。
【０１１５】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列を
含むＴＲＩＤタンパク質を含む。本発明のＴＲＩＤタンパク質は、モノマーまた
はマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマー、およびより高次の
マルチマー）であり得る。従って、本発明は、本発明のＴＲＩＤタンパク質のモ
ノマーおよびマルチマー、それらの調製物、およびそれらを含む組成物（好まし
くは、薬学的組成物）。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマ
ー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発
明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくと
もテトラマーである。
【０１１６】 本発明により包含されるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で使用される場合、用語「ホモマー」は、本発明のＴＲＩＤタンパ
ク質（本明細書中に記載されるような、ＴＲＩＤフラグメント、改変体、および
融合タンパク質を含む）のみを含む、マルチマーをいう。これらのホモマーは、
同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有する、ＴＲＩＤタンパク質を
含み得る。特定の実施形態において、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列
を有するＴＲＩＤタンパク質のみを含む、マルチマーである。別の特定の実施形
態において、本発明のホモマーは、異なるポリペプチド配列を有するＴＲＩＤタ
ンパク質を含む、マルチマーである。特定の実施形態において、本発明のマルチ
マーは、ホモダイマ−（例えば、同一のポリペプチド配列または異なるポリペプ
チド配列を有する、ＴＲＩＤタンパク質を含む）あるいはホモトリマー（例えば
、同一のポリペプチドおよび／または異なるポリペプチド配列を有する、ＴＲＩ
Ｄタンパク質を含む）。さらなる実施形態において、本発明のホモメリックマル
チマーは、少なくともホモダイマ−、少なくともホモトリマー、または少なくと
もホモテトラマーである。
【０１１７】 本明細書中で使用される場合、用語ヘテロマーは、本発明のＴＲＩＤタンパク
質に加えて、異種タンパク質（すなわち、ＴＲＩＤ遺伝子によりコードされるポ
リペプチド配列に対応しないポリペプチド配列のみを含むタンパク質）を含む、
マルチマーをいう。特定の実施形態において、本発明のマルチマーは、ヘテロダ
イマ−、ヘテロトリマー、またはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態に
おいて、本発明のヘテロメリックマルチマーは、少なくともヘテロダイマ−、少
なくともヘテロトリマー、または少なくともヘテロテトラマーである。
【０１１８】 本発明のマルチマーは、疎水性結合、親水性結合、イオン性結合および／また
は共有結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間
接的に連結され得る。従って、１つの実施形態において、本発明のマルチマー（
例えば、ホモダイマーまたはホモトリマー）は、本発明のポリペプチドが溶液中
で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態において、本発明のヘテロマ
ルチマー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマー）は、本発明のポリ
ペプチドが本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質中の異
種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と溶液中で接触する場合に形成される
。他の実施形態において、本発明のマルチマーは、本発明のＴＲＩＤタンパク質
との共有結合および／または本発明のＴＲＩＤタンパク質間での共有結合によっ
て形成し得る。このような共有結合は、（例えば、配列番号２中に列挙されるポ
リペプチド配列、またはｃＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチド）
ポリペプチド配列中に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。一例におい
て、この共有結合は、ネイティブな（すなわち、天然に存在する）ポリペプチド
において相互作用するタンパク質のポリペプチド配列中に位置するシステイン残
基の間での架橋である。別の例において、この共有結合は、化学的操作または組
換え的操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ＴＲＩＤ融合タン
パク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ残基を含み得る。
別の特定の例において、本発明の融合タンパク質の共有結合は、例えば、オステ
オプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）のような共有結合したマ
ルチマーを形成し得る別のＴＮＦＲファミリーメンバー由来の異種ポリペプチド
配列の間にある（例えば、国際公開番号：ＷＯ９８／４９３０５を参照のこと、
この内容は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。
【０１１９】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて作製され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質は、当該分野
で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋さ
れ得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５
，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分野
で公知の技術を用いて作製されて、そのマルチマーに含まれることが所望される
タンパク質のポリペプチド配列内に配置されるシステイン残基間の１以上の分子
間架橋を形成し得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチ
ドは、そのタンパク質のポリペプチド配列のＣ末端またはＮ末端へのシステイン
またはビオチンの付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技
術が、１以上のこれらの改変されたタンパク質を含むマルチマーを作製するため
に適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国
特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術が
、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質成分を含むリポソ
ームを作製するために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考とし
て援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１２０】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
作製され得る。１つの実施形態においては、本発明のマルチマーに含まれるポリ
ペプチドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の、融合タン
パク質技術を用いて組換え的に産生される（例えば、本明細書中にその全体が参
考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の
実施形態においては、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプ
チドをコードする配列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端へと、逆
方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配
列を欠く）に連結することによって作製される（例えば、本明細書中にその全体
が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別
の実施形態において、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組
換え技術は、膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソームに
取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを作製するのに適用される（例え
ば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９
２５号を参照のこと）。
【０１２１】 （Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体） ＴＲＩＤポリペプチドの特性を改善または改変するために、タンパク質操作が
用いられ得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、単一または複数のア
ミノ酸の置換、欠失、付加、または融合タンパク質を含む、新規の変異タンパク
質または「ムテイン」を作製し得る。このような改変型ポリペプチドは、例えば
、増大した活性または増加した安定性を示し得る。さらに、これらは、少なくと
も、特定の精製および保存条件下で、対応する天然のポリペプチドよりも、より
高い収量およびより良好な溶解性で精製され得る。
【０１２２】 例えば、多くのタンパク質（膜結合タンパク質または分泌タンパク質の成熟形
態を含む）について、１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能を実質的に損失する
ことなく、Ｎ末端またはＣ末端から欠失され得ることが当該分野で公知である。
例えば、Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４−２９８８（
１９９３）は、３、８、または２７Ｎ末端アミノ酸残基が欠失した場合でさえ、
ヘパリン結合活性を有する改変ＫＧＦタンパク質を報告した。本発明では、本発
明のタンパク質は、ＴＮＦＲポリペプチドファミリーのメンバーであるので、配
列番号２のＣ−５３位のシステインまでのＮ末端アミノ酸の欠失は、リンパ細胞
の増殖およびアポトーシスの調節のようないくつかの生物学的活性を保持し得る
。配列番号２のＣ−５３残基を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは
、このような生物学的活性を保持することが予想される。なぜならば、ＴＲＩＤ
関連ポリペプチド中のこれらの残基は、リガンド結合に必要とされる構造安定性
を提供するために、ジスルフィド架橋を形成するのに必要とされることが公知で
あるからである。
【０１２３】 しかし、タンパク質のＮ末端由来の１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質
の１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じる場合でさえ、他の機能的活
性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、ＴＲＩＡＬリガンドに結合する
能力）は、まだ保持される。例えば、短縮化タンパク質のＴＲＩＤタンパク質の
完全形態または成熟形態を認識する、抗体を誘導および／または結合する能力は
、完全タンパク質または細胞外ドメインの決して大多数ではない残基が、Ｎ末端
から除去される場合、一般に保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く
特定のポリペプチドが免疫学的活性を保持し得るか否かは、本明細書中に記載さ
れる慣用的な方法および当該分野で公知の他の方法により容易に決定され得る。
多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するＴＲＩＤムテインは、いくつかの生
物学的活性または免疫学的活性を保持することが予想される。実際、６と同じく
らい少ないＴＲＩＤアミノ酸残基からなるペプチドは、頻繁に、免疫応答を惹起
し得る。
【０１２４】 従って、本発明は、さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸末
端から、５３位に存在するシステイン残基までを欠失した１つ以上の残基を有す
るポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の残基ｎ1−２５９のアミノ酸配
列（ここで、ｎ1は、１〜５３の範囲の整数であり、ここで、５３は、ＴＲＩＤ
タンパク質の活性に必要とされると考えられる完全ＴＲＩＤポリペプチド（配列
番号２に示される）のＮ末端からの最初のシステイン残基の位置である）を含む
か、またはこれらからなる、ＴＲＩＤポリペプチドを提供する。
【０１２５】 より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１２６】
【化１】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１２７】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる
、核酸分子に関する。本発明は、さらに、上記のポリペプチドに、少なくとも８
０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９
％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または
これらからなる、核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列
に融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドによ
りコードされるポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１２８】 同様に、本発明は、さらに、配列番号２に示されるＴＲＩＤアミノ酸配列のア
ミノ酸末端から、２５５位のロイシン残基までを欠失した１つ以上の残基を有す
るポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の残基ｎ2−２５９のアミノ酸配
列（ここで、ｎ2は、配列番号２のアミノ酸残基の位置に対応する２〜２５４の
整数である）を含むか、またはこれらからなる、ポリペプチドを提供する。
【０１２９】 より詳細には、本発明は、配列番号２に示されるＴＲＩＤ配列の以下の残基の
アミノ酸配列を含むか、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列から構成されるポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１３０】
【化２】 これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
り包含される。
【０１３１】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリ
ヌクレオチド配列から構成される核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポ
リペプチドに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列から構成される核
酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記の
ポリヌクレオチド配列を包含する。これらのポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドもまた本発明により包含される。
【０１３２】 同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例
えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０のアミ
ノ酸残基を欠失することにより１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｅｂｅｌｉら、
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９〜２１６（１９８８））。この場
合、本発明のタンパク質は、ＴＮＦＲポリペプチドファミリーのメンバーである
ので、配列番号２の１４９位のシステインまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、リン
パ細胞の増殖およびアポトーシスの調節のようないくつかの生物学的活性を保持
し得る。配列番号２の１４９位のシステインを含むさらなるＣ末端欠失を有する
ポリペプチドは、このような生物学的活性を保持するとは期待されない。なぜな
ら、ＴＮＦレセプター関連ポリペプチドにおいてこの残基は、ジスルフィド結合
を形成して、リガンド結合に必要な構造的安定性を提供するのに必須であること
が公知であるからである。
【０１３３】 また、上記のようにタンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の喪失を改変するとしても、他の機能的活
性（例えば、生物学的活性、多量化する能力、ＴＲＩＤリガンドを結合する能力
）は依然として保持され得る。従って、短縮化タンパク質が、このタンパク質の
完全なまたは成熟の形態を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、
一般に、この完全なまたは成熟した形態のタンパク質の大部分よりも少ない残基
がＣ末端から除去される場合は保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠
く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細
書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により
容易に決定され得る。多数のＣ末端アミノ酸残基を欠失したＴＲＩＤムテインが
いくらかの生物学的活性または免疫学的活性を維持し得ることが予期される。実
際、６つのＴＲＩＤアミノ酸残基ほどの少ない残基から構成されるペプチドは、
しばしば免疫応答を惹起し得る。
【０１３４】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＴＲＩＤのアミノ酸配列のカ
ルボキシ末端から配列番号２の１４９位のシステインまで１つ以上の残基を有す
るポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。詳細には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基１〜ｍ1の
アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。ここでｍ1は、１４９〜２５９
の範囲の任意の整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた提供される。
【０１３５】 より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは、以
下の残基のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供する：
【０１３６】
【化３】 これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
り包含される。
【０１３７】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリ
ヌクレオチド配列から構成される核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポ
リペプチドに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列から構成される核
酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記の
ポリヌクレオチド配列を包含する。これらのポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドもまた本発明により包含される。
【０１３８】 本発明はさらに、配列番号２に示されるＴＲＩＤポリペプチドのアミノ酸配列
のカルボキシ末端から、位置数６のリジン残基まで１つ以上の残基を欠失するポ
リペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供する。詳細には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基１〜ｍ2のアミ
ノ酸配列を含むか、あるいはこのアミノ酸配列から構成されるポリペプチドを提
供する。ここでｍ2は、配列番号２におけるアミノ酸残基の位置に対応する６〜
２５８の範囲の任意の整数である。
【０１３９】 より詳細には、本発明は、配列番号２に示されるＴＲＩＤ配列の以下の残基の
アミノ酸配列を含むか、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列から構成されるポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１４０】
【化４】 これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
り包含される。
【０１４１】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリ
ヌクレオチド配列から構成される核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポ
リペプチドに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列から構成される核
酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記の
ポリヌクレオチド配列を包含する。これらのポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドもまた本発明により包含される。
【０１４２】 同様に、本発明はさらに、配列番号２に示されるＴＲＩＤポリペプチドの細胞
外ドメインのアミノ酸配列のカルボキシ末端から、位置数３３のグルタミン残基
まで１つ以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２のア
ミノ酸配列の残基２７〜ｍ3のアミノ酸配列を含むか、あるいはこのアミノ酸配
列から構成されるポリペプチドを提供する。ここでｍ3は、配列番号２における
アミノ酸残基の位置に対応する３３〜２５９の範囲の整数である。
【０１４３】 より詳細には、本発明は、配列番号２に示されるＴＲＩＤ細胞外ドメインの以
下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは、以下の残基のアミノ酸配列から構
成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１４４】
【化５】 これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
り包含される。
【０１４５】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリ
ヌクレオチド配列から構成される核酸分子に関する。本発明はさらに、上記のポ
リペプチドに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列から構成される核
酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記の
ポリヌクレオチド配列を包含する。これらのポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドもまた本発明により包含される。
【０１４６】 本発明はまた、配列番号２の残基ｎ1〜ｍ1、ｎ2〜ｍ1、ｎ1〜ｍ2、ｎ2〜ｍ2、
ｎ1〜ｍ3、またはｎ2〜ｍ3を有すると一般に記載され得る、アミノ末端およびカ
ルボキシ末端の両方からアミノ酸が１つ以上欠失されているポリペプチドを提供
する。ここでｎ1、ｎ2、ｍ1、ｍ2、およびｍ3は、上記のような整数である。
【０１４７】 ＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる
完全なＴＲＩＤアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列（ここでこの部分は、ＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡク
ローンによりコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端から１〜約４９アミ
ノ酸を除外するか、もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃＤＮＡク
ローンによりコードされる完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端から１〜約１１
０アミノ酸を除外する）、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７９８に含まれるｃＤＮ
Ａクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列の上記のアミノ末端およびカ
ルボキシ末端の欠失の任意の組合せもまた含まれる。上記の欠失変異体ポリペプ
チド形態の全てをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１４８】 （他の変異体） 上記で考察されるタンパク質の末端欠失形態に加えて、ＴＲＩＤポリヌクレオ
チドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能への有意な影響
なしに変化され得ることが、当業者によってまた認識される。配列中のこのよう
な差異が考慮される場合、タンパク質上に活性を決定する重要な領域が存在する
ことが記憶されねばならない。従って、本発明はさらにＴＲＩＤポリペプチドの
改変体を含む。この改変体は、実質的なＴＲＩＤポリペプチド活性を示すか、ま
たは以下に考察するタンパク質部分のようなＴＲＩＤタンパク質の領域を含む。
このような変異体は、欠失、挿入、反転、反復およびタイプ置換を含む。どのア
ミノ酸変化が表現型的にサイレントでありそうかに関するガイダンスは、Ｂｏｗ
ｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎ
ｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０
６〜１３１０（１９９０）に見出され得る。
【０１４９】 従って、配列番号２のポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）アミノ
酸残基の１つ以上が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは
保存アミノ酸残基、そしてより好ましくは、少なくとも１つ、しかし１０未満の
保存されたアミノ酸残基）で置換されたものであっても良いし、そしてこのよう
な置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであっても
、もしくはそうでなくてもよく、または（ｉｉ）アミノ酸残基の１つ以上が置換
基を含むものであってもよく、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドまたは可溶性
細胞外ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長する化合物のような別の化
合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されたものでもよく、または（
ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダ
ー配列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列
の精製に使用される配列）が成熟ポリペプチドと融合されたものでもよい。この
ようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書における教示から当業
者の範囲内であるとみなされる。
【０１５０】 従って、本発明のＴＲＩＤは、天然の変異か、または人為的操作のいずれかに
よる１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。示されるように、変
化は好ましくはわずかな性質の変化、例えば、タンパク質の折り畳みまたは活性
に有意に影響しない保存的アミノ酸置換である（表２を参照のこと）。
【０１５１】
【表２】 特定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列、および/または本明細
書中に記載の任意のポリペプチドフラグメント（例えば、細胞外ドメインまたは
細胞内ドメイン）における置換、付加または欠失の数は、７５、７０、６０、５
０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３
、２、１、あるいは３０〜２０、２０〜１５、２０〜１０、１５〜１０、１０〜
１、５〜１０、１〜５、１〜３または１〜２である。
【０１５２】 本発明のＴＲＩＤタンパク質中の、機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的
変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で公知の方法
によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中の全て
の残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生物
学的活性、例えば、レセプター結合活性またはインビトロ増殖活性について試験
される。
【０１５３】 特に興味深いことは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸、および中
性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、正電荷が低下
したタンパク質を生じ、ＴＲＩＤタンパク質の特性を改善する。凝集の阻止は、
非常に所望される。タンパク質の凝集は、薬学的処方物を調製する場合、活性を
減じるのみでなく、問題でもあり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得る
からである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３
３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３
８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７〜３７
７（１９９３））。
【０１５４】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンドの結合の選択性を変
化し得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（
１９９３）は、ＴＮＦ−αの、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型の１つのみへ
の選択的結合を生じる特定の変異を記載している。リガンド−レセプター結合の
ために重要な部位もまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構
造解析によって決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：
８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：
３０６−３１２（１９９２））。
【０１５５】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され
得る。これらの技術としては、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキ
ャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅ
ｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこ
と）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１
９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏ
ｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９
８６）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】 従って、本発明はまた、選択された宿主細胞における発現、スケールアップな
どについてより適したＴＲＩＤポリペプチドを生成するために、１以上のアミノ
酸残基が欠失、付加または置換されたＴＲＩＤの誘導体およびアナログを含む。
例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を除去するために欠失され得るか
、または別のアミノ酸残基で置換され得る；Ｎ結合型グリコシル化部位は、例え
ば、Ｎ結合部位を高グリコシル化する（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）こ
とが公知である酵母宿主からより容易に回収および精製される、均質な産物の発
現を達成するために改変または除去され得る。この目的のために、本発明のＴＲ
ＩＤポリペプチドの任意の１以上のグリコシル化認識配列上の第１または第３の
アミノ酸位置の一方あるいは両方での種々のアミノ酸置換、および／または任意
の１以上のこのような認識配列の第２位でのアミノ酸欠失は、その改変トリペプ
チド配列でのＴＲＩＤポリペプチドのグリコシル化を妨げる（例えば、Ｍｉｙａ
ｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ ５（６）：１１９３−１１９７を参照のこと）。
【０１５７】 本発明者らは、ＴＲＩＤポリペプチドが、２つの主要な構造ドメインを表す２
５９残基のタンパク質であることを発見した。第１に、細胞外ＴＲＡＩＬリガン
ド結合ドメインが、配列番号２の約２７〜約２４０の残基内に同定された。第２
に、膜貫通ドメインが、配列番号２の約２４１〜約２５９の残基内に同定された
。しかし、上記のように、驚くことに、ＴＲＩＤは、推定細胞内シグナルドメイ
ンを欠失し、従って「ＴＲＩＤ」（ＴＲＡＩＬ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｗｉｔｈｏ
ｕｔ ａｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍｅｉｎ（細胞内ドメインを有
さないＴＲＡＩＬレセプター））と命名される。
【０１５８】 本発明のポリペプチドは、以下を含む：寄託されたｃＤＮＡによりコードされ
るリーダーを含むポリペプチド；寄託されたｃＤＮＡによりコードされるリーダ
ーを含まない成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号２のア
ミノ酸およそ１〜およそ２５９を含むか、またはこれらからなる、ポリペプチド
；配列番号２のアミノ酸およそ２〜およそ２５９を含むか、またはこれらからな
る、ポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一
、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％または９５％同一、なおより好ま
しくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である、ポリペプ
チド。そして、本発明のポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸、そしてより
好ましくは、少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部も
また含む。
【０１５９】 ＴＲＩＤポリペプチドの参照アミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同
一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、このポリペプチドのアミノ酸
配列が、ＴＲＩＤポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり５
つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、このポリペプチドのアミノ酸配
列が、この参照配列に同一であることが意図される。換言すると、参照アミノ酸
配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために
、参照配列のアミノ酸残基の５％までが、欠失または、別のアミノ酸で置換され
てもよく、または参照配列の合計アミノ酸残基の５％までの幾らかのアミノ酸が
、その参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端位置かまたはカルボキシ末端位置で、あるいはこれらの末端位
置間の任意に場所で生じ得、参照配列の残基間で個々にか、または参照配列内で
１個以上連続する群としてかのいずれかで間に散在する。
【０１６０】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ
酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるか否かは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５
７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のよ
うな公知のコンピュータープログラムを使用して慣用的に決定され得る。特定の
配列が、本発明に従う参照配列に、例えば９５％同一か否かを決定するために、
ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用する場合、
もちろん、参照アミノ酸配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが算出さ
れるように、そして参照配列中のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性のギャ
ップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０１６１】 特定の実施形態において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配
列との間の同一性（全体的配列整列もいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍ
ｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズム
に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。ＦＡ
ＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｐ
ＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ
（どちらかより短い方）である。この実施形態に従うと、対象配列が、Ｎ末端ま
たはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い
場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に
、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないという事実を考慮して、
手動の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対する、Ｎ末端およびＣ
末端で短縮されている対象配列についての、同一性パーセントは、問い合わせ配
列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配
列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによっ
て補正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列
整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセント
から差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを
使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的
な同一性パーセントのスコアは、この実施形態の目的で使用されるものである。
問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基
のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。
すなわち、問い合わせ残基位置のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端
残基の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセ
ントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配
列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０
残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致して
いないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表
し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのス
コアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的
な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、
１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり
、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の
残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセン
トは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合
わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみ
が手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的のためにはなされ
ない。
【０１６２】 本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生させる
ための供給源として、および当業者に周知の方法を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおける分子量マーカーとしての用途を含む
が、これに限定されない用途を有する。
【０１６３】 本願はまた、配列番号２のｎ1−２５９、ｎ2−２５９、１−ｍ1、１−ｍ2、１
−ｍ3、ｎ1−ｍ1、ｎ2−ｍ1、ｎ1−ｍ2、ｎ2−ｍ2、ｎ1−ｍ3、またはｎ2−ｍ3
として本明細書中で示されるＴＲＩＤポリペプチド配列に、少なくとも９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリペプチドを含むタンパ
ク質に関する。好ましい実施形態では、本願は、本明細書中に列挙される特定の
ＴＲＩＤのＮ末端欠失型および/またはＣ末端欠失型のアミノ酸配列を有するア
ミノ酸に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一なポリペプチドを含むタンパク質に関する。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１６４】 特定の好ましい実施形態では、本発明のＴＲＩＤタンパク質は、本明細書中に
記載されるような融合タンパク質を含むか、またはこれらからなる。ここで、Ｔ
ＲＩＤポリペプチドは、、配列番号２のｎ1−２５９、ｎ2−２５９、１−ｍ1、
１−ｍ2、１−ｍ3、ｎ1−ｍ1、ｎ2−ｍ1、ｎ1−ｍ2、ｎ2−ｍ2、ｎ1−ｍ3、また
はｎ2−ｍ3として本明細書中で示されるポリペプチドであり、ｎ1、ｎ2、ｍ１、
ｍ2およびｍ3は、上記のような整数である。好ましい実施形態では、本願は、本
明細書中に列挙される特定のＮ末端欠失型および/またはＣ末端欠失型のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に、少なくとも９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸分子に関する。これらのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１６５】 （エピトープ保有部分） 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あ
るいはＡＴＣＣ受託番号９７７９８を付与されたｃＤＮＡに含まれるポリヌクレ
オチド配列によりコードされるポリペプチド配列のエピトープか、配列番号１の
配列の相補体またはＡＴＣＣ受託番号９７７９８を付与されたｃＤＮＡに含まれ
るポリヌクレオチド配列に、上記に定義されるようなストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下もしくは低いストリンジェンシーハイブリダイゼーショ
ン条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプ
チド配列のエピトープを含むか、またはこれらからなる、ポリペプチドを含む。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードするポリヌク
レオチド配列（例えば、配列番号１に開示される配列）、本発明のエピトープを
コードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および上記
に定義されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくは低いス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、相補鎖にハイブリダイズす
るポリヌクレオチド配列を含む。
【０１６６】 本明細書中で使用される用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物
、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポ
リペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、このポリペプ
チドをコードするエピトープならびにポリヌクレオチドを含むポリペプチドを含
む。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、当該分野で公知の
任意の方法（例えば、以下に記載された抗体作製の方法）によって測定されるよ
うに、動物において抗体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義される。
（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用され
る場合、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の任意の方法（例えば
、本明細書中に記載されたイムノアッセイ）によって測定されるように、抗体が
その抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫特
異的な結合は、非特異的な結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交差反応性
を除外する必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性を必要とはしな
い。
【０１６７】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６
３１，２１１号にさらに記載される）を参照のこと）。
【０１６８】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）（７７７）。
【０１６９】 本発明においては、抗原性エピトープは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配
列内に含まれる、好ましくは、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、
少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸の配列を含み、より好ましくは、
少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少な
くとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の配列
を含み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を
含む。免疫原性または抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少
なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０
、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さ
である。さらに、非排他的に好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書中で
開示される抗原性エピトープおよびその一部が挙げられる。抗原性エピトープは
、例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を
惹起するために有用である。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標
的分子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７６
７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６
６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１７０】 同様に、当該分野で周知の方法に従って、免疫原性エピトープを使用して、例
えば、抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏ
ｎら，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：
２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープ
として、分泌タンパク質を含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプ
チドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、
ウサギまたはマウス）に抗体応答を誘発するために提示され得るか、このポリペ
プチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドは、
キャリアなしで動物系に提示され得る。しかし、８〜１０程度の少ないアミノ酸
を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトー
プに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウ
ェスタンブロッティングにおいて）。
【０１７１】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およ
びＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９
８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用い
て免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチド
を結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプ
チドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチ
ドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに
結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチド
またはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１
００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバント、
あるいは免疫応答を刺激するための当該分野で公知の他のアジュバントを含む）
の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター
注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間
隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチ
ドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中
の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の
方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による）
により上昇し得る。
【０１７２】 抗原性エピトープ（すなわち、抗体が結合し得る、タンパク質分子の領域を含
む）を保有するペプチドまたはポリペプチドの選択については、タンパク質配列
の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣したタンパク質と反
応する抗血清を慣用的に誘発し得るということが当該分野において周知である。
例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ
Ｒｅａｃｔ Ｗｉｔｈ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参
照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、しばしは、タンパク
質の一次配列において表わされ、１セットの単純な化学法則によって特徴付けら
れ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピ
トープ）にも、アミノ末端もしくはカルボキル末端のいずれに対しても限定され
ない。それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトー
プ保有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体（モノク
ローナル抗体を含む）を惹起するのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃ
ｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７を参照のこと。
【０１７３】 ＴＲＩＤ特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドもしく
はペプチドの非限定例としては、配列番号２におけるほぼＧｌｎ−４２〜ほぼＧ
ｌｕ−５２のアミノ酸残基を含むかあるいはこのアミノ酸残基からなるポリペプ
チド；配列番号２におけるほぼＨｉｓ−５８〜ほぼＣｙｓ−６６のアミノ酸残基
を含むかあるいはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；配列番号２における
ほぼＰｒｏ−６８〜ほぼＴｈｒ−７６のアミノ酸残基を含むかあるいはこのアミ
ノ酸残基からなるポリペプチド；配列番号２におけるほぼＳｅｒ−７９〜ほぼＣ
ｙｓ−８５のアミノ酸残基を含むかあるいはこのアミノ酸残基からなるポリペプ
チド；配列番号２におけるほぼＣｙｓ−９１〜ほぼＴｈｒ−１０２のアミノ酸残
基を含むかあるいはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；配列番号２におけ
るほぼＧｌｎ−１１０〜ほぼＰｒｏ−１２２のアミノ酸残基を含むかあるいはこ
のアミノ酸残基からなるポリペプチド；配列番号２におけるほぼＡｒｇ−１２６
〜ほぼＶａｌ−１３６のアミノ酸残基を含むかあるいはこのアミノ酸残基からな
るポリペプチド；および配列番号２におけるほぼＴｈｒ−１４２〜ほぼＧｌｎ−
１４８のアミノ酸残基を含むかあるいはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド
。上記に示すように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントはＴＲＩ
Ｄタンパク質の抗原性領域であるということを決定した。これらのポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により含まれる。
【０１７４】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
よって産生され得る。*例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．「Ｇｅｎｅｒａｌ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ
：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと；この「同時複数ペプチド
合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎらに対する米国特許第４，６
３１，２１１号（１９８６）にさらに記載される）。
【０１７５】 さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第５，１９４，３９２号（１９９
０）は、本発明の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的である、エ
ピトープの位相幾何学的等価物（すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（
アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的方法を記載する
。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第４，４３３，０９２号（１
９８９）は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的である、リガ
ンドの形態学的（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）等価物であるモノマーの配列を
検出または決定する方法を記載する。同様に、ペルアルキル化オリゴペプチド混
合物についてのＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．らに対する米国特許第５，４８０，
９７１号（１９９６）は、直鎖状Ｃ１〜Ｃ７−アルキルペルアルキル化オリゴペ
プチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的
のアクセプター分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を
決定するためにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを使用す
るための方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチ
ドアナログはまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。
【０１７６】 （融合タンパク質および改変されたタンパク質） 当業者に理解されるように、本発明のＴＲＩＤレセプターポリペプチドおよび
本明細書に上記のそれらのエピトープ保有フラグメント（例えば、細胞外ドメイ
ンの一部に対応する（例えば、配列番号２のアミノ酸残基１〜２４０、２７〜２
４０、３０〜２４０、３５〜２４０、４０〜２４０および５０〜２４０を含むか
あるいはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド配列など））は、他のポリペプ
チド配列に融合される。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉ
ｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの一部（ＣＨ１、
ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの一部）と融合
され得、キメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容
易にし得、そしてインビボでの半減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポ
リペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖また
は軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されて
いる。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。ＩｇＧ部分のジスルフィド結
合に起因するジスルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた
、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合
および中和においてより効率的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏ
ｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９
５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ
（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはｆｌａｇタグ）として目的の遺伝
子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例え
ば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発現さ
れる非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、
１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−
８９７）。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフ
レームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳的に融合される
ように、ワクシニア組換えプラスミド中でサブクローンされる。このタグは、融
合タンパク質に対するマトリックス結合ドメインとして働く。組換えワクシニア
ウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸酸性アガロースカ
ラムにローディングされ、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質は、イミダゾ
ール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１７７】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングは、本発明のポリペプチドの活性を調節するために用いられ
得、このような方法は、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにこのポリ
ペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成するために用いられ得る。一
般には、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５
，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８
号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎ
ｚｏおよびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−
１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々はその全体が参考として援
用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１に対応するポリ
ヌクレオチドの変更およびこれらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリ
ングは、このポリヌクレオチド配列中にバリエーションを生成するための、相同
組換えまたは部位特異的組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメントのアセンブ
リを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはコードされ
るポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ
、ランダムなヌクレオチド挿入または他の方法により、ランダムな変異誘発に供
されることによって変更され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃ
ｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ
以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメ
ントなどと組み換えられ得る。
【０１７８】 当業者が理解するように、本発明のＴＲＩＤポリペプチドおよび本明細書に上
記のそのエピトープ保有フラグメント（例えば、細胞外ドメインの一部に対応す
る（例えば、配列番号２のアミノ酸残基１〜２４０など））は、免疫グロブリン
（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と結合され得、キメラポリペプチドを生じる。
これらの融合タンパク質は、精製を容易にして、そしてインビボで増大した半減
期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２つのドメインお
よび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインか
らなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒ
ａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。Ｉｇ
Ｇ部分に起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、
他の分子と結合しそして中和する際に、単量体ＴＲＩＤタンパク質もしくはタン
パク質フラグメント単独よりも効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら
、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。本発明の
エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段によって産生
され得る。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、「Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏ
ｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉ
ｄｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５
１３５（１９８５）。この「同時複数ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、
Ｈｏｕｇｈｔｅｎらに対する米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）にさ
らに記載される。
【０１７９】 このポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され
得、そして分泌シグナルのみならず、さらなる異種機能領域をも含み得る。従っ
て、例えば、さらなるアミノ酸（特に、荷電アミノ酸）の領域が、宿主細胞中の
、精製の間の、またはその後の取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性
を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分
が、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、
ポリペプチドの最終的な調製の前に除去され得る。特に、分泌または排出を生じ
させるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためにポリペプチ
ドにペプチド部分を付加することは、当該分野でよく知られておりかつ慣用的な
技術である。
【０１８０】 好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来
の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応出願
２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリ
ン分子の定常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。多くの場合
、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用にすっかり有利
であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰＡ ０２３
２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される
有利な様式で発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失され得ること
が望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用に対する障害で
あると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用さ
れるべき場合）である。薬物探索において、例えば、ｈＩＬ−５レセプターのよ
うなヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスル
ープットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｄ
．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔ
ｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２
７０：１６：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【０１８１】 別の実施形態では、本発明のＴＲＩＤレセプターポリペプチドおよび本明細書
に上記のそれらのエピトープ保有フラグメント（例えば、細胞外ドメインの一部
に対応する（例えば、配列番号２のアミノ酸残基１〜２４０、２７〜２４０、３
０〜２４０、３５〜２４０、４０〜２４０および５０〜２４０を含むかあるいは
このアミノ酸残基からなるポリペプチド配列など））は、融合タンパク質として
、リガンド結合によって活性化される細胞内シグナル伝達活性を有するポリペプ
チドと合わされ得る。例えば、本発明のＴＲＩＤポリペプチドは、異種ＴＮＦフ
ァミリーのレセプターの細胞内活性化ドメインと合わされ得る。このような融合
タンパク質は、宿主細胞内で発現される場合、ＴＲＡＩＬに結合されたとき、検
出可能なシグナル（例えば、アポトーシスまたはＮＦ−ｋＢの活性化であるがこ
れらに限定されない）を活性化する。このような融合タンパク質は、リガンド結
合についてスクリーニングするため、またはＴＲＩＤポリペプチドのアゴニスト
および／もしくはアンタゴニストについてスクリーニングするために有用である
。
【０１８２】 さらに、本発明のタンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され
得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９８３）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら
，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば
、本発明のＴＲＩＤポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチ
ド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸ま
たは化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてＴＲＩＤポリペプチド配
列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限
定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイ
ソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、
６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸
、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、
シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチル
アラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオ
ロアミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、ｂ−メチルア
ミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ
酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１８３】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して産生さ
れ得る。この技術としては、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発技術、アラニンス
キャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌ
ｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照の
こと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（
１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉ
ｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（
１９８６）を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８４】 本発明のＴＲＩＤポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈
澱、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない周
知の方法によって、回収および精製され得る。最も好ましくは、精製のために、
高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が使用される。
【０１８５】 本発明のポリペプチドとしては、天然精製された産物、化学合成手順の産物、
および組換え技術により原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌、酵母
、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含む）から産生された産物が挙げられ
る。組換え産生手順で使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グ
リコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明の
ポリペプチドはまた、最初の改変メチオニン残基を、いくつかの場合に、宿主に
媒介されたプロセスの結果として含む。
【０１８６】 本発明はさらに、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル
化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク
質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に
改変されたＴＲＩＤポリペプチドを包含する。多数の化学的改変のいずれもが、
以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シア
ン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4に
よる特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン
の存在下での代謝合成など。
【０１８７】 本発明によって包含されるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが
挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシ
ング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の
化学修飾、ならびに原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基
の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素
標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変されて、このタン
パク質の検出および単離を可能にし得る。
【０１８８】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ＴＲＩＤの
化学改変誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）
。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコ
ール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。
このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所
定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【０１８９】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の継続時間、（存在す
る場合には）生物学的活性に対する影響、取り扱いの容易さ、抗原性の程度また
は抗原性の欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレング
リコールの他の公知の影響）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、
ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００
、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、
６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９
５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０
００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５０
０、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００
、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、
２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５
０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５
，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または
１００，０００のｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０１９０】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する影響を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、例えば、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；
遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グ
ルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル基も
また、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得
る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合（例えば、Ｎ末端または
リジン基での結合）である。
【０１９１】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの連結を介して、タンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレン
グリコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基、またはシステイン残基への共有結合を介して、タンパク質に連結され得
る。１つ以上の反応化学を使用して、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば
、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）ま
たはタンパク質の１より多い型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、
アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびそれらの組み合わせ）にポ
リエチレングリコールを結合させ得る。
【０１９２】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによる）、反応混合物中でのタンパク質（またはペプチ
ド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法が選択され得る。Ｎ末
端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化
部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化
物質の精製により行われ得る。Ｎ末端改変で化学改変された選り抜きのタンパク
質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ
基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成
され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端
でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１９３】 上記で示されたように、本発明のタンパク質のペグ化は、多数の手段によって
達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的または介在リンカー
によってのいずれかで、タンパク質に結合され得る。タンパク質にポリエチレン
グリコールを結合させるためのリンカーレス（ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）系は、Ｄ
ｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ
Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．
Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４，００
２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およ
びＷＯ９８／３２４６６（これらの各々の開示は、本明細書中で参考として援用
される）に記載される。
【０１９４】 介在するリンカーを伴わずに、タンパク質のアミノ酸残基に直接的にポリエチ
レングリコールを結合させる１つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）
ＭＰＥＧ（これは、塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＣｌＳＯ 2 ＣＨ2ＣＦ3）を使用して、モノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレ
ングリコール（ＭＰＥＧ）を改変することによって生成される）を使用する。ト
レシル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応に際して、ポリエチレングリコールは、
タンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク
質と２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スル
ホニル基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって生成
される、タンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０１９５】 ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介在リンカーを使用して、タン
パク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示全
体が、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質にポリエチレングリ
コールを結合させるためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコー
ルがリンカーによってタンパク質に結合されているタンパク質−ポリエチレング
リコール結合体はまた、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉ
ｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１，１'−カルボニルジイミダゾールで
活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネー
ト（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニト
ロフェノールカルボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のよう
な化合物とのタンパク質の反応によって生成され得る。さらなる多くのポリエチ
レングリコール誘導体およびタンパク質にポリエチレングリコールを結合させる
ための反応化学が、ＷＯ９８／３２４６６（この開示全体が、本明細書中で参考
として援用される）に記載される。本明細書中に示される反応化学を使用して生
成されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１９６】 本発明の各タンパク質に結合されたポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）もまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０またはそれより多いポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、平
均の置換の程度は、タンパク質１分子あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、
５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２
〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、また
は１８〜２０ポリエチレングリコール部分のような範囲内である。置換の程度を
決定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．
Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において
考察される。
【０１９７】 上記のように、本発明のＴＲＩＤタンパク質は、翻訳後プロセシングのような
天然のプロセスまたは当該分野で周知の化学的改変技術のいずれかによって、改
変され得る。同じ型の改変が、所定のＴＲＩＤポリペプチドにおいていくつかの
部位で同じ程度に存在してもよいしまたは種々の程度存在してもよいことが理解
される。例えば、ＴＲＩＤポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状で
あり得、そして分枝してかまたは分枝せずに、環状でもあり得る。環状分枝ＴＲ
ＩＤポリペプチドおよび分枝環状ＴＲＩＤポリペプチドは、天然の翻訳後プロセ
スから生じ得るし、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセ
チル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム
部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質また
は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄ
ｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メ
チル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホ
ルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、
ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）
、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル
化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加（例えば
、アルギニル化）、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥ
Ｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩ
ＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０１９８】 （抗体） 本発明における使用のためのＴＲＩＤ特異的抗体が、インタクトなＴＲＩＤタ
ンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメント（これらは、アルブミンの
ようなキャリアタンパク質とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提
示され得るか、または十分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合は、キャリ
アなしで提示され得る）に対して惹起され得る。
【０１９９】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細
胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＧＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ
２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹを含む。本明細書中
で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａ
ｂ）とは、ＴＮＦＲタンパク質に特異的に結合し得る、インタクトな分子（例え
ば、抗体全体）、および抗体フラグメント（単鎖抗体全体およびその抗原結合フ
ラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）
を含む）を含むことが、意図される。ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２
フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅
速に消失し、そしてより少ないインタクトな抗体の非特異的組織結合を有し得る
（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｅｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５（１９８３））。
従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０２００】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶLドメイ
ンまたはＶHドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに
限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で
、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１
ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域
、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせ
もまた含む抗原結合フラグメントがまた、本発明に含まれる。本発明の抗体は、
鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗
体は、ヒト、ネズミ、ロバ、シップウサギ（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、
モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用される場
合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、
そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または１つ以上の
ヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックでありそして内因性免疫グロブ
リンを発現しない動物から単離された抗体（下に記載のように、そして例えば、
Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号において記
載のような）を含む。
【０２０１】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種の組成物（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）の両方に特異
的であり得る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０８８０２；Ｗ
Ｏ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０
号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，
６８１号、同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０２０２】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的結合する、本発明のポリペプチド
のエピトープまたは部分に関して、記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって、または表および図面に列挙されるよ
うに、本明細書中に記載されるように特定化され得る。本発明の任意のエピトー
プまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、
本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、そして本発明
の抗体の除外が可能である。
【０２０３】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満
、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満
、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書
中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する
抗体もまた、本発明に含まれる。さらに、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチドに
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのみを結
合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、それらの結合親和性に
ついて記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-2Ｍ
未満、１０-2Ｍ未満、５×１０-3Ｍ未満、１０-3Ｍ未満、５×１０-4Ｍ未満、１
０-4Ｍ未満、５×１０-5Ｍ未満、１０-5Ｍ未満、５×１０-6Ｍ未満、１０-6Ｍ未
満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、５×
１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×１０-1 1 Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×１０-13Ｍ
未満、１０-13Ｍ未満、５×１０-14Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０-15Ｍ未満
および１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０２０４】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの
結合を競合的に阻害する。
【０２０５】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのＴＲＡＩＬ結合促進剤またはアンタ
ゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセ
プター／リガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含
む。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を
有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活性化を妨害す
る、レセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグ
ナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技
術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、免疫沈降それに続くウェ
スタンブロット分析（例えば、上記のような）によってレセプターまたはその基
質のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）を検出することに
より、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在下で、リガン
ド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９０％、少なくとも８０
％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗
体が提供される。
【０２０６】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識しそして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識はし
ない抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合しそしてレセプタ
ーへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合しそれによりレ
セプター活性化を妨げるがリガンドがレセプターを結合することを妨げない抗体
を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの抗体
は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、リガンド媒介レセプター
活性化の生物学的活性化の全てまたは部分のいずれかを増強するかまたは活性化
し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特定の生物学
的活性を含む生物学的活性についての、アゴニスト、ＴＲＡＩＬ結合促進剤、ア
ンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定化され得る。従って、本発明はさら
に、本発明のポリペプチドのアゴニスト、ＴＲＡＩＬ結合促進剤、あるいはアン
タゴニストまたは逆アゴニストに関する。上記抗体アゴニストまたはＴＲＡＩＬ
結合促進剤は、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公
開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌ
ｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚ
ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８
）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１
９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２
４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２
０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉ
ｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒ
ｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌ
ｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；
Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（
これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２０７】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、そして標的化する
ための当該分野で公知の方法（インビトロおよびインビボの両方での診断方法お
よび治療方法を含む）を含むがこれらに限定されない用途を有する。例えば、こ
の抗体は、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的に
および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、
Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）
を参照のこと。
【０２０８】 本発明の抗体は、単独でかまたは他の化合物との組み合わせてのいずれかで使
用され得る。この抗体はさらに、Ｎ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに
組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の化合物へ化学的に
結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、
検出アッセイにおける標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬剤、
放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子に、組換え的に融合または結
合され得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９
／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３
８７号を参照のこと。
【０２０９】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、抗体が抗イディオタイプ応答を生成
するのを妨げないような、抗体への任意の型の分子の共有結合による）誘導体を
含む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセ
チル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉ
ｏｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ
）による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク
質への連結などによって改変された、抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改
変が、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成
などを含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに
、この誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０２１０】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、種々の宿主動物（ウサギ、
マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対し
て特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバ
ントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そし
てこれにはフロイント（完全および不完全）；水酸化アルミニウムのようなミネ
ラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）；リゾレシチンのような界面活性物質；プ
ルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール；ポリアニオン；ペプチド；油エマ
ルジョン；キーホールリンペットヘモシアニン；ジニトロフェノール；ならびに
ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐ
ａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定さ
れない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０２１１】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。用
語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に
限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、
またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそ
れが生成される方法に由来する抗体ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマの使用、組換え体、およびファージディスプレイ技術を含む、当該分野で
公知の広範な種類の技術を使用して調製され得る。
【０２１２】 例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る
（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９６（１９７５）；Ｋｏｅｈｌ
ｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅ
ｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌ
ｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌ
ｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８１）、５６
３〜６８１頁）。一般に、このような手順は、ＴＲＩＤタンパク質抗原（より好
ましくは、ＹＲＩＤタンパク質発現細胞）で動物を免疫する工程を包含する。適
切な細胞は、抗ＴＲＩＤタンパク質抗体を結合し得る能力により認識され得る。
このような細胞は、適切な任意の組織培養培地にて培養され得る；しかし、１０
％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須ア
ミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのスト
レプトマイシンを補充したイーグル改変イーグル培地にて細胞を培養することが
好ましい。このようなマウスの脾臓細胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株
と融合される。本発明に従って、適切な任意の骨髄腫細胞株が使用され得る；し
かし、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２
Ｏ）を使用することが好ましい。融合後、生じたハイブリドーマ細胞は、Ｗａｎ
ｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５〜２３２（１９８１
））により記載されるように、ＨＡＴ培地にて選択的に維持され、次いで限界希
釈によってクローン化される。このような選択を介して得られたハイブリドーマ
細胞は、次いで、所望のＴＲＩＤ抗原を結合し得る抗体を分泌するクローンを同
定するためにアッセイされる。
【０２１３】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
【０２１４】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０２１５】 ハイブリドーマ技術は、当該分野で公知である技術および以下で教示される技
術を含む：Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文
献は、その全体が参考として援用される）。本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａ
ｂ’）２フラグメントおよび他のフラグメントは、本明細書中に開示される方法
に従って使用され得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂ
フラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント
を産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、タンパク質分解切断によ
って産生され得る。あるいは、ＴＲＩＤタンパク質結合フラグメントは、組換え
ＤＮＡ技術の適用または合成化学を介して酸性され得る。
【０２１６】 あるいは、ＴＲＩＤ抗原に結合し得る追加の抗体は、抗イディオタイプ抗体の
使用を通して２工程の手順で産生され得る。このような方法は、抗体がそれ自体
抗原であり、それ故に第２の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという
事実を使用する。この方法に従って、ＴＲＩＤ−タンパク質特異的抗体は、動物
、好ましくはマウスを免疫化するために使用される。次いで、このような動物の
脾細胞が、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてこのハイブリ
ドーマ細胞は、抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーンされ、この
抗体のＴＲＩＤタンパク質特異的抗体に結合する能力は、ＴＲＩＤタンパク質抗
原によってブロックされ得る。このような抗体は、ＴＲＩＤタンパク質特異的抗
体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるＴＲＩＤタンパク質特
異的抗体の形成を誘発するために動物を免疫化するために使用され得る。
【０２１７】 ヒトにおける抗ＴＲＩＤのインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクロ
ーナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノ
クローナルを産生するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を使用して産生され
得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当業者に公知である。検討のために
、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）
；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉ
ｅｓら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７
１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｗ
Ｏ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎ
ｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０２１８】 あるいは、本発明の抗体は、組換えＤＮＡの適用、およびファージディスプレ
イ技術を介して、または当該分野で公知の方法を使用する合成化学を介して、産
生され得る。例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージデ
ィスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能
的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファー
ジ粒子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージは、レパートリー
（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、
ヒトまたはマウス）から、抗原（代表的には、固体表面またはビーズに結合また
は捕捉された抗原）を用いて直接的に選択することによって選択される。これら
の方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタン
パク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合さ
れたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有する
ファージから発現されたｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎ
ｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るフ
ァージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂ
ｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０
（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１
７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ
１８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／
１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／
１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国
特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４
８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５
０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５
，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；
同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，
１０８号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０２１９】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
【０２２０】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボの使用およびインビ
トロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体また
はヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当
該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４
（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；抗体は、
以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤ
Ｒ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；
米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５
８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシ
ング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，
５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（
４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏ
ｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェー
ンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５
，３３２号）。完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望され
る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた
上記のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製さ
れ得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；同第５
，５４５，８０６号および同第５，８１４，３１８号およびＰＣＴ公開ＷＯ ９
８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９
８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、およびＷ
Ｏ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援
用される）もまた参照のこと。
【０２２１】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４
１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第
５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号
；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（
これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎ
ｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択され
た抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０２２２】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０２２３】 上で議論されるように、本発明のＴＲＩＤタンパク質に対する抗体は、次いで
、当業者に周知の技術を使用してＴＲＩＤを「模倣する」抗イディオタイプ抗体
を発生するために利用され得る。（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ
、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉ
ｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１
）を参照のこと。）例えば、ＴＲＩＤに結合しそしてＴＲＩＤ多量体化および／
またはリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体は、ＴＲＩＤ多量体化および／
または結合ドメインを「模倣し」、結果として、ＴＲＩＤおよび／またはそのリ
ガンドを中性化する抗イディオタイプを発生するために使用され得る。このよう
な抗イディオタイプまたは抗イディオタイプのＦａｂフラグメントのこのような
中性化は、治療用レジメンにおいて、ＴＲＩＤリガンドを中性化するために使用
され得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体は、ＴＲＩＤを結合するた
め、またはＴＲＩＤリガンド／レセプターを結合するために使用され得、それに
よってアポローシスのＴＲＩＤ媒介阻害をブロックする。
【０２２４】 さらに、本発明に、本発明のポリペプチドに組換え可能に融合されたか、また
は化学的に結合された（共有結合および非共有結合を含む）抗体が含まれる。こ
の抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に対して特異的であり得る。例えば
、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特定
の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって、
特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体
が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、イ
ンビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において
使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２
１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌ
ｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと。
これらは、その全体が参考として援用される。
【０２２５】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のＴＲＩＤポリぺプチドを含むか、あるいはそのＴＲＩＤポリペプチドから
なる組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗体のＦｃ領域、または
その部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチドに融合されたこの抗
体の部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメ
イン、またはそのドメイン全体もしくは部分の任意の組合せを含み得る。本発明
のポリペプチドは、上記の抗体部分に融合されるかまたは結合され、ポリペプチ
ドのインビボ半減期または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにお
ける使用を増加し得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合
または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合さ
れたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成し
得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融
合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合ま
たは結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許
第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６
号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，
９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６
／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、ＰＮＡＳ ８８
：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌ，Ｈ．ら、
ＰＮＡＳ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその
全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２２６】 さらに、本発明は、本発明のタンパク質の多量体化する能力を破壊する抗体を
含む。別の実施例において、本発明は、本発明のタンパク質が多量体化すること
が可能であるが、本発明のタンパク質が１つ以上のＴＲＩＤレセプター／リガン
ド（例えば、ＴＲＡＩＬ）に結合する能力を破壊する抗体を含む。さらに別の実
施例において、本発明は、本発明のタンパク質が多量体化し、そしてＴＲＩＤレ
セプター／リガンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）に結合し得るが、ＴＲＩＤ／レセプ
ター／リガンド複合体に付随した生物学的活性をブロックする抗体を含む。
【０２２７】 （Ａ．抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。
【０２２８】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０２２９】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する
任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイ
ブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離さ
れた核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、その抗体をコードする
ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末
端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅
によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使
用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって生成された増幅された
核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニン
グベクターにクローニングされ得る。
【０２３０】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０２３１】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０２３２】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０２３３】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２３４】 （Ｂ．抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０２３５】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０２３６】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレ
オチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態に
おいて、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるよう
に、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０２３７】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベク
ター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用い
て形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のよう
な微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換され
た酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコード
する配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感
染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイ
クウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞
系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、
Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム
に由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳
動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモー
ター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保
有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞
）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そして
より好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組
換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由
来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされ
た、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗
体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０
１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（
１９９０））。
【０２３８】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレームで個別に連結され
得、その結果、融合タンパク質が産生される、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ
２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮ
ベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳｃ
ｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９
））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇ
ＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現するために使用さ
れ得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細
胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、そ
れに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐ
ＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むよう
に設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分
から放出され得る。
【０２３９】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウイルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２４０】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
イルスゲノムに挿入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウイルスを生じる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅ
ｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９
（１９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコ
ードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、Ａ
ＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部
分全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列の読み枠と相が同じで
なければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々
の起源（天然および合成の両方）であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハ
ンサー要素、転写ターミネーター、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔ
ｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１
９８７）を参照のこと）。
【０２４１】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で、かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された
外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得
る。この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン
酸化の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使
用され得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅ
Ｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、Ｂ
Ｔ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞
株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な
乳腺細胞株を含むが、これらに限定されない。
【０２４２】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生のために、安定発現が好ましい。例え
ば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含
む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、
プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位
、など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され
得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増
殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける
選択可能マーカーは、選択のために耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをそ
の染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今
度はクローニングし得、そして細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方
法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。この
ような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合
物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０２４３】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａおよ
びＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８
：２０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが、これ
らに限定されず、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細
胞においてそれぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の
選択の根拠として使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐
性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３
５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対
する耐性を与える（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミ
ノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍ
ａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：
８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒ
ｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９
１−２１７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１
５５−２１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性
を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。使用
され得る組換えＤＮＡ技術の分野で周知の方法は、以下に記載されている：Ａｕ
ｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３
）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら
（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒ
ｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（こ
れらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２４４】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０２４５】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードする。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を避け
るために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のた
めのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２４６】 一旦、本発明の抗体分子が、組換えにより発現されると、当該分野で公知の、
免疫グロブリン分子の精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（
例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に
対するアフィニティーによる）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠
心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によ
って、精製され得る。
【０２４７】 （Ｃ．抗体結合体） 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、もしくは５０個のアミノ酸）に、組換えにより
融合されるかまたは化学的に結合されて（共有結合および非共有結合の両方を含
む）、融合タンパク質を生成する抗体、を含む。この融合は、直接的である必要
はないが、リンカー配列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチ
ド（またはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、も
しくは５０個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、インビトロ
またはインビボのいずれかで、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面のレセプ
ターに特異的な抗体に融合または結合させることによって、特定の細胞型に対し
て、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が使用され得る。本発明の
ポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよ
び当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使用され得る。例えば、Ｈ
ａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０
９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１
９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８
９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと。これらは、その全体が参考
として援用される。
【０２４８】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、マルチマーを形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに
融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を
形成し得る。より高度の多重体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部
分に融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に
融合または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米
国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，
０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１
１２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９
９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１
９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考
として援用される）を参照のこと。
【０２４９】 上で考察されたように、本発明のポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビ
ボ半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的ア
ッセイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さ
らに、本発明のポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して、精製を
容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つの
ドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々
のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，８２７；
Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。
ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合または結
合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク
質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにより効率的で
あり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５
８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療
および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特
性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現
され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい
。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部
分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５
のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高ス
ループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている（
Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８
：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０２５０】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、それらの精製を容易にする
ペプチドのような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、
マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱ
Ｅベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃ
ｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、こ
れらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９
８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良
い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤
血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、
これに限定されない。
【０２５１】 本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメン
および／または予防レジメンの効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生
または進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出
可能な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例とし
ては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物
質、種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁
性金属イオン、が挙げられる。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のため
の抗体に結合され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号
を参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ
が挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオ
チンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウン
ベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミ
ン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィ
コエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物
発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げ
られ；ならびに、適切な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまた
は99Ｔｃが挙げられる。
【０２５２】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
に結合され得る。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬
剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラ
シンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポ
シド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン
、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒ
ドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉ
ｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒ
ドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカ
イン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまた
はホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサー
ト、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラ
シルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）
、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラ
ムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮ
Ｕ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファ
ン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびに
ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサ
イクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビ
シン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブ
レオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃ
ｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビン
ブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０２５３】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、血栓症薬もしくは抗
脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物
学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）
、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６
」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コ
ロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得
る。
【０２５４】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２５５】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２５６】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
【０２５７】 単独、あるいは細胞傷害性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投
与される、抗体に結合される治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬
として使用され得る。
【０２５８】 （Ｄ．抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、（いくつかの
ものについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ
、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ
、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集ア
ッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロ
テインＡイムノアッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッ
セイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的で
あり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参
考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例
示的なイムノアッセイが、以下に簡潔に記載される（しかし、これらは限定を目
的とすることが意図されない）。
【０２５９】 免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロ
テアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン
酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、１％ Ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体
を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュ
ベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ
を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶
解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、ならびにＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビー
ズを再懸濁する工程を含む。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、
例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、抗体の
抗原への結合を増加させ、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され
得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれ
いにすること）に関して、精通している。免疫沈降プロトコルに関するさらなる
考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．
１を参照のこと。
【０２６０】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８
％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動する工程、タンパク質サンプルをそ
のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのよ
うな膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉乳を
有するＰＢＳ）中でその膜をブロッキングする工程、その膜を洗浄緩衝液（例え
ば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を有するその膜をブロッキングする工程、その
膜を洗浄緩衝液中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、32Ｐまたは125Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いてその膜をブロッキングする工程、洗浄緩
衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を含む
。当業者は、検出されるシグナルを増加させ、そしてバックグラウンドノイズを
減少させるように改変され得るパラメータに関して、精通している。ウエスタン
ブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２６１】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合されている必要はない；その代わり、検出可能な化合
物に結合した二次抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さら
に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングさ
れ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した二次抗体が、コーティングされ
たウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出される
シグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において
公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、精通している。ＥＬＩＳＡに
関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１１．２．１を参照のこと。
【０２６２】 抗体の抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート
（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッ
セイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸
増量の非標識抗原の存在下での標識した抗原（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）と目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフ速度は、スキャ
ッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。二次抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識二次抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）に結合
した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２６３】 （Ｅ．抗体を基礎とした治療） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、本明細書中に記載される１つ以上の障害または状態を処置および／または予防
するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投
与する工程を含む。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に
記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならび
に本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体を含む）が挙げられるがこれらに限定されな
い。
【０２６４】 理論に束縛されることを意図しないが、ＴＲＩＤレセプターは、ＴＲＩＤリガ
ンド（例えば、ＴＲＡＩＬ）の結合を含むプロセス（このとき、このＴＲＩＤリ
ガンドは、プログラム細胞死を媒介するレセプターへの結合に利用できない）に
よってプログラム細胞死を阻害すると考えられる。従って、ＴＲＩＤへのリガン
ドの結合を妨げる薬剤（例えば、抗体）は、プログラム細胞死を高める。
【０２６５】 上記のように、ＴＲＩＤレセプターは、ＴＲＡＩＬを結合することが示されて
いる。ＴＲＩＤレセプターはまた、多くの組織、および多くの細胞型の表面に存
在することが公知である。
【０２６６】 ＴＲＡＩＬは、多くの腫瘍細胞株におけるアポトーシス細胞死を誘導すること
が示されているＴＮＦファミリーのサイトカインのメンバーであり、例えば、Ｄ
Ｒ４レセプターおよびＤＲ５レセプターとの相互作用を介してそのアポトーシス
誘導効果を媒介するようである。これらの死ドメイン含有レセプターは、カスパ
ーゼの切断を介するアポトーシスを開始する膜結合自己活性化シグナル伝達複合
体を形成することが考えられる。
【０２６７】 さらに、本明細書に記載されるように、ＴＲＡＩＬはまた、「おとり（ｄｅｃ
ｏｙ）」レセプター、例えば、ＴＲＩＤ、ＤｃＲ２（短縮型死ドメインを有する
レセプター）、ＤｃＲ１（ＧＰＩアンカーレセプター）およびＯＰＧ（ＴＮＦフ
ァミリーの別のメンバー、ＲＡＮＫＬに結合する分泌タンパク質）であることが
提案されるいくつかのレセプターに結合する。
【０２６８】 ＴＲＩＤレセプターに結合する抗体は、増加したまたは減少したアポトーシス
細胞死と関連する疾患および状態を処置および／または予防するのに有用である
。さらに、これらの抗体は、ＴＲＩＤレセプターに対して有する効果において様
々である。これらの効果は、抗体が結合するＴＲＩＤレセプターの特定の部分、
抗体分子自身の３次元コンフォメーション、および／またはそれらがＴＲＩＤレ
セプターと相互作用する様式に基づいて異なる。従って、ＴＲＩＤレセプターの
細胞外ドメインに結合する抗体は、ＴＲＩＤ活性（例えば、ＴＲＡＩＬの結合）
を刺激するかまたは阻害するかのいずれかであり得る。ＴＲＡＩＬに結合するＴ
ＲＩＤレセプターの能力を刺激する抗体は、ＴＲＡＩＬ結合促進剤であり、そし
てＴＲＩＤレセプター活性を阻害する（例えば、ＴＲＡＩＬの結合を遮断するこ
とによる）抗体は、ＴＲＩＤアンタゴニストである。さらに、ＴＲＩＤは、細胞
内シグナル伝達経路に関与し得る細胞内ドメインを有する。アゴニスト（抗体を
含む）は、細胞内シグナル伝達経路を刺激する様式でＴＲＩＤを結合する分子で
ある。
【０２６９】 アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにＴＲＩＤレセプターのＴＲＡＩＬ
結合促進剤として機能する本発明の抗体は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグ
メントのような抗原結合抗体フラグメント、Ｆｄ、単鎖ＦＶｓ（ｓｃＦｖ）、ジ
スルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶLまたはＶHドメインのいずれかを含
むフラグメント、ならびにポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびヒト
化抗体が挙げられる。これらの抗原結合抗体フラグメントおよび抗体のそれぞれ
は、本明細書中の他でより詳細に記載される。
【０２７０】 上記観点において、本発明の抗体、ならびに他のＴＲＩＤアンタゴニストは、
ＴＲＩＤ活性を阻害するのに有用であり、これによって、ＴＲＩＤレセプターを
発現する細胞（例えば、癌細胞）のアポトーシスを促進する。このタイプの抗体
は、増加した細胞生存および／またはアポトーシス誘導約因子（例えば、ＴＲＡ
ＩＬ）に対する非感受性に関連した疾患および状態、例えば、固形組織癌（例え
ば、皮膚癌、頭部および頸部の腫瘍、乳房腫瘍、内皮腫、肺癌、骨芽細胞腫、骨
巨細胞腫、およびカポージ肉腫）ならびに白血病を予防および／または処置する
のに有用である。
【０２７１】 本発明は、ＴＲＡＩＬ結合促進剤として本明細書中において示される、ＴＲＡ
ＩＬの結合を高める抗ＴＲＩＤ抗体を含む。ＴＲＡＩＬ結合促進剤は、アポトー
シスを妨げることによって機能し、増加したアポトーシス細胞死と関連した疾患
を予防および／または処置するのに有用である。このような疾患の例としては、
真性糖尿病、ＡＩＤＳ、神経変性障害、脊髄形成異常症候群、虚血性障害、毒素
誘導肝臓障害、敗血症性ショック、悪液質および食欲不振が挙げられる。
【０２７２】 本発明のアンタゴニストが、増加したＴ細胞集団または増加した細胞増殖（例
えば、癌）と関連する疾患または状態の処置および／または予防のために個体に
投与される場合、アンタゴニストは、アポトーシスを誘導する別の因子（例えば
、ＴＲＡＩＬ）か、またはそうでなければ細胞増殖を阻害する別の因子（例えば
、抗癌剤）と同時投与され得る。この性質の組み合わせ治療法、ならびに他の組
み合わせ治療法は、以下により詳細に議論される。
【０２７３】 さらに、本発明のＴＲＡＩＬ結合促進剤（例えば、ＴＲＡＩＬの結合を高める
ＴＲＩＤ抗体）はまた、Ｔ細胞媒介免疫応答を高めるため、そしてＴ細胞増殖に
関連する疾患および状態を予防および／または処置するために有用である。ＴＲ
ＩＤレセプターに対するＴＲＩＤレセプターリガンドの結合を高める本発明の抗
体は、Ｔ細胞アポトーシスを阻害し得る。アポトーシスの阻害は、例えば、イン
ビボＴ細胞集団の拡大速度の増加を生じ得るか、またはこのような集団のサイズ
の減少を妨げ得る。従って、本発明のＴＲＡＩＬ結合促進剤は、減少したＴ細胞
集団に関連するかまたはＴ細胞集団が減少する疾患または状態を予防および／ま
たは処置するために使用され得る。このような疾患および状態の例としては、後
天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連した苦痛（例えば、ＡＩＤＳ関連複
合体）、Ｔ細胞免疫不全、放射線宿酔、および放射線および／または化学療法に
起因するＴ細胞欠損が挙げられる。
【０２７４】 本発明のＴＲＡＩＬ結合促進剤が、減少したＴ細胞集団と関連した疾患または
状態の処置および／または予防のために個体に投与される場合、ＴＲＡＩＬ結合
促進剤は、リンパ球増殖（例えば、サイトカイン）を活性化および／または誘導
する薬剤と同時投与され得る。この性質の組み合わせ治療法、ならびに他の組み
合わせ治療法が、以下にさらに詳細に議論される。
【０２７５】 従って、ＴＲＩＤ抗体は、ＴＲＩＤレセプターを発現する組織型および細胞型
を含む悪性疾患、異常、疾患および／または状態を処置および／または予防する
のに有用である。さらに、ＴＲＩＤレセプターを発現する細胞にプログラム細胞
死を誘導することによって処置および／または予防され得る悪性疾患、異常、疾
患および／または状態は、本発明のＴＲＩＤレセプターアンタゴニストを使用し
て処置および／または予防され得る。同様に、ＴＲＩＤレセプターを発現する細
胞におけるプログラム細胞死を阻害することによって処置および／または予防さ
れ得る悪性疾患、異常、疾患および／または状態は、本発明のＴＲＩＤレセプタ
ーＴＲＡＩＬ結合促進剤を使用して処置および／または予防され得る。
【０２７６】 本発明のＴＲＡＩＬ結合促進剤、アゴニスト、およびアンタゴニストを使用し
て処置され得る多くのさらなる悪性腫瘍、異常、疾患および／または状態は、本
明細書中の他の場所に、例えば、「投与形態」と題された以下のセクションに記
載される。
【０２７７】 本発明の抗体は、多くの方法で治療的に使用され得る。例えば、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドに結合する抗体は、個体（例えば、ヒト）に局
所的または全身的に投与され得る。さらに、これらの抗体は、単独で、別の治療
剤と組み合わせて、あるい毒素と会合されるかまたは結合されて投与され得る。
【０２７８】 ＴＲＩＤ抗体は、他のモノクローナル抗体、キメラ抗体、リンホカイン、腫瘍
壊死因子、ＴＮＦ関連分子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−γ、Ｔ
ＮＦ−γ−α、ＴＮＦ−γ−β、およびＴＲＡＩＬ）、または造血成長因子（例
えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７）と組み合わせて利用され得る。例え
ば、アンタゴニストのＴＲＩＤ抗体は、本発明のＴＲＩＤレセプターを発現する
細胞にプログラム細胞死を誘導することを探す場合、ＴＲＡＩＬと組み合わせて
、投与され得る。この性質の組み合わせ治療法、ならびに他の組み合わせ治療法
は、以下にさらに詳細に議論される。
【０２７９】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２８０】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、そのフラグメント
、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、
または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そ
れらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性とし
ては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０ -8 Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、
１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０- 14 Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍより小さい解離定数すなわ
ちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２８１】 （免疫系関連障害） （診断法） 本発明者らは、ＴＲＩＤが、造血組織および他の異常なヒト組織で発現される
ことを発見した。多数の免疫系関連障害について、ＴＲＩＤ遺伝子発現の実質的
に変化された（増加または減少された）レベルが、このような障害を有する個体
から得た免疫系組織またはその他の細胞または体液（例えば、血清および血漿）
で、「標準」ＴＲＩＤ遺伝子発現レベル、すなわち、免疫系障害を有さない個体
からの免疫系組織または体液中のＴＲＩＤ発現レベルに比較して、検出され得る
。従って、本発明は、免疫系障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体からの免疫系組織またはその他の細胞または体液でのＴＲＩＤタンパク
質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および、測定された遺伝子
発現レベルを標準ＴＲＩＤ遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのこと
により、標準と比較される遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系障害の
指標となる。
【０２８２】 特に、癌を有する哺乳動物の特定の組織は、対応の「標準」レベルと比較した
とき、ＴＲＩＤタンパク質およびＴＲＩＤをコードするｍＲＮＡの有意に上昇し
たレベルで発現すると考えられる。さらに、ＴＲＩＤタンパク質の上昇レベルは
、癌を有さない同種の哺乳動物からの血清と比較したとき、このような癌を有す
る哺乳動物からの特定の体液（例えば、血清および血漿）中で、検出され得ると
考えられる。
【０２８３】 従って、本発明は、癌を含む免疫系障害の診断中に有用な診断方法を提供し、
この方法は、個体からの免疫系組織またはその他の細胞または体液でのＴＲＩＤ
タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および、測定され
た遺伝子発現レベルを標準ＴＲＩＤ遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、
そのことにより、標準と比較された遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫
系障害の指標となる。
【０２８４】 腫瘍の診断を含む免疫系における障害の診断が、すでに従来方法に従って実施
されたときに、本発明は、予後指標として有用である。この予後指標により、変
化した（特に、高められた）遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレ
ベルで遺伝子を発現する患者と比較して、より悪い臨床結果を経験する。
【０２８５】 「ＴＲＩＤタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」によ
って、ＴＲＩＤのレベル、またはＴＲＩＤをコードするｍＲＮＡレベルを、第一
の生物学的サンプルで、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍＲＮＡ
レベルの決定または評価によって）または相対的（例えば、第二の生物学的サン
プルのＴＲＩＤタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対する比較によって）
に、定性または定量的に決定または評価することを意図する。好ましくは、第一
の生物学的サンプル中のＴＲＩＤタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルは、測
定または評価され、標準ＴＲＩＤタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較
され、この標準は、障害を有さない個体から得た第二の生物学的サンプルから得
られるか、または免疫系の障害を有さない個体集団からのレベルを平均して決定
される。当該分野で理解されるように、一旦標準ＴＲＩＤタンパク質レベルまた
はｍＲＮＡレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用され得る
。
【０２８６】 「生物学的サンプル」によって、ＴＲＩＤタンパク質またはｍＲＮＡを含有す
る、個体、体液、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られた、任
意の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、Ｔ
ＲＩＤタンパク質の遊離細胞外ドメイン（または可溶性型）を含有する体液（血
清、血漿、尿、滑液、および髄液のような）、免疫系組織、および完全ＴＲＩＤ
、またはＴＲＩＤの細胞外ドメインを発現することが認められているその他の組
織供給源を包含する。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該分野
で周知である。生物学的サンプルが、ｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい
供給源である。
【０２８７】 本発明はまた、ＴＲＩＤ遺伝子中の変異を診断するための、本発明の遺伝子の
使用を意図する。例えば、本発明の遺伝子の１つに変異が存在するときは、症状
は、本発明のレセプターポリペプチド産生の欠如から生じる。さらに、レセプタ
ーポリペプチド活性を増強する変異が、レセプターポリペプチドの過剰発現に関
連する疾患、例えば、内毒素性ショックを導く。遺伝子中の変異は、欠陥遺伝子
の配列を正常遺伝子の配列と比較することによって検出され得る。次に、変異遺
伝子が、疾患症状または疾患症状に対する感受性に関連することを確証し得る。
すなわち、ＴＲＩＤの過剰発現を導く変異遺伝子は、ＴＲＡＩＬが腫瘍増殖を阻
害できないことと関連する。
【０２８８】 前出アッセイによって診断され得るその他の免疫系障害には、過敏症、アレル
ギー、感染性疾患、対宿主性移植片病（ｇｒａｆｔ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ
）、免疫不全症、自己免疫疾患などが挙げられる。
【０２８９】 本発明の遺伝子における変異を保有する個体は、種々の技術により、ＤＮＡレ
ベルで検出され得る。診断のために使用される核酸は、患者の細胞（他の組織の
中でも、例えば、血液、尿、唾液および組織生検）から得られ得る。ゲノムＤＮ
Ａは、検出のために直接使用され得るか、または分析の前に、ＰＣＲを用いるこ
とにより酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３
−１６６（１９８６））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた同じ目的のために使用さ
れ得る。例として、本発明の核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、本発
明のヒト遺伝子における変異を同定および分析し得る。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型と比較した際に、増幅産物のサイズの変化により検出され得
る。点変異は、放射性標識された本発明のＲＮＡまたは代替的に、放射性標識さ
れた本発明のアンチセンスＤＮＡ配列に対して、増幅されたＤＮＡがハイブリダ
イズすることにより同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化
または融解点の差異により一致しなかった二重鎖から区別され得る。このような
診断は、出生前試験のためまたは新生児の試験のためにさえも特に有用である。
【０２９０】 参照遺伝子と「変異体」との間の配列相違は、直接的なＤＮＡ配列決定方法に
よって明らかになり得る。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメントをプロー
ブとして使用して、特定のＤＮＡ配列を検出し得る。この方法の感度は、ＰＣＲ
と組み合わされた場合に非常に増強される。例えば、配列決定は、主に二本鎖Ｐ
ＣＲ産物または改変されたＰＣＲ産物によって産生された一本鎖鋳型分子と共に
使用される。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いる従来の手順によって、
または蛍光タグを用いる自動配列決定手順によって行われる。
【０２９１】 特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護、または化学切断方法）により明らかにされ得る（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５））
。
【０２９２】 生物学的サンプル中のＴＲＩＤタンパク質レベルをアッセイすることは、抗体
に基づく技術を用いて生じ得る。例えば、組織におけるＴＲＩＤタンパク質発現
は、古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて研
究され得る。ＴＲＩＤ遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法
としては、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放
射性免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該
分野で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）および
放射性同位元素（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ
）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴ
ｃ）、および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、およびビ
オチンが挙げられる。
【０２９３】 個体から得られた生物学的サンプル中のＴＲＩＤタンパク質レベルをアッセイ
することに加えて、ＴＲＩＤタンパク質もまた、イメージングによってインビボ
で検出され得る。ＴＲＩＤタンパク質をインビボでイメージングするための抗体
標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、ＮＭＲもしくはＥＳＲにより検出可能なもの
が挙げられる。Ｘ線撮影のために、適切な標識としては、検出可能な放射線を放
射するが、被験体に対して有害でない放射線同位元素（例えば、バリウムまたは
セシウム）が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとしては
、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水素）が挙げられ、
これらは、関連のハイブリドーマについて栄養素の標識化により抗体に取り込ま
れ得る。
【０２９４】 適切な検出可能イメージング部分（例えば、放射性同位元素（例えば、131Ｉ
、112Ｉｎ、99mＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能
な材料）で標識されたＴＲＩＤ特異的抗体または抗体フラグメントが、免疫系障
害について試験されるべき哺乳動物に（例えば、非経口で、皮下で、もしくは腹
腔内で）導入される。被験体およびイメージングシステムの大きさが、診断画像
を生じるのに必要とされるイメージング部分の量を決定することは、当該分野で
理解される。放射線同位元素部分の場合、ヒト被験体については、注入される放
射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの99mＴｃの範囲である。標識され
た抗体または抗体フラグメントは、次いで、ＴＲＩＤタンパク質を含む細胞の位
置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍イメージングは、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅ
ｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌ
ａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔ
」により記載される（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ、
Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ、Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇｔ Ｉｎｃ．（１９８２）の１３章）。
【０２９５】 （処置） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのリガンドは、多数の細胞応答（細胞傷害
性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む
）を含む、大部分の多面的なサイトカインの間にあることが知られている（Ｄ．
Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇ
ｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｉｅｓ」、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６
）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ａ
．Ｃｅｒａｍｉ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（
１９８８）；Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）
；Ｗ．Ｆｉｅｒｓ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１）
）。ＴＮＦファミリーのリガンドは、ＴＮＦファミリーのレセプターに結合する
ことによって、このような種々の細胞応答を誘導する。ＴＲＩＤポリペプチドを
発現し、そしてＴＮＦＲリガンドに対する強力な細胞応答を有すると考えられて
いる細胞としては、リンパ球、内皮細胞、ケラチノサイトおよび前立腺組織が挙
げられる。「ＴＮＦファミリーのリガンドに対する細胞応答」によって、ＴＮＦ
ファミリーのリガンドによって誘導される、細胞、細胞株、組織、組織培養物ま
たは患者に対する任意の遺伝子型変化、表現型変化および／または形態的変化が
意図される。示されるように、このような細胞応答は、ＴＮＦファミリーのリガ
ンドに対する正常な生理学的応答のみならず、増加したアポトーシスまたはアポ
トーシスの阻害に関連する疾患も含む。
【０２９６】 本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＴＲＡＩＬ結合促進
剤、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、不完全なＴＲＩＤまたは欠乏
したレベルのＴＲＩＤによって（直接的または間接的に）媒介される任意の疾患
または障害に罹患した患者（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト）に投与され得
る。あるいは、遺伝子治療アプローチは、このような疾患または障害を処置する
ために適用され得る。本発明の１つの実施形態においては、ＴＲＩＤポリヌクレ
オチド配列は、ムテインＴＲＩＤ遺伝子（欠損遺伝子を含む）を検出するために
使用される。ムテイン遺伝子は、インビボ診断アッセイにおいて、および本明細
書中で開示されるＴＲＩＤヌクレオチド配列を、この遺伝子において欠損を有し
ている疑いのある患者由来のＴＲＩＤ遺伝子の配列と比較することによって同定
され得る。欠損遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて正常なＴＲＩＤコード遺
伝子で置換され得る。
【０２９７】 別の実施形態においては、本発明のＴＲＩＤポリペプチド、ポリヌクレオチド
、ＴＲＡＩＬ結合促進剤、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、種々の
細胞型でのＴＲＡＩＬ／ＴＲＩＤ相互作用を阻害することから生じる表現型効果
を研究するための研究道具として使用される。ＴＲＩＤポリペプチドおよびアン
タゴニスト（例えば、ＴＲＩＤに対するモノクロナール抗体）はまた、ＴＲＡＩ
ＬまたはＴＲＩＤまたはそれらの相互作用を検出するためのインビトロアッセイ
において使用され得る。
【０２９８】 ＴＮＦファミリーの特定のリガンド（そのＴＲＡＩＬはメンバーである）が１
つより多い別の細胞表面レセプタータンパク質に結合することが報告されている
。例えば、ＤＲ４と命名されたレセプタータンパク質は、ＴＲＡＩＬに結合する
と報告されているが、本発明のＴＲＩＤとは異なる（Ｐａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７６：１１１−１１３（１９９７）；本明細書中に参考として援用される）
。別の実施形態においては、精製されたＴＲＩＤポリペプチド、ＴＲＡＩＬ結合
促進剤、アゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、内因性の細胞表
面ＴＲＡＩＬレセプターへのＴＲＡＩＬの結合を阻害する。ＴＲＡＩＬ結合と競
合することによって、本発明の可溶性ＴＲＩＤポリペプチドを使用して、細胞表
面ＴＲＩＤのみならず、ＴＲＩＤとは異なるＴＲＡＩＬレセプタータンパク質と
のＴＲＡＩＬの相互作用を阻害し得る。
【０２９９】 従って、さらなる実施形態において、本発明のＴＲＩＤポリペプチド、ポリヌ
クレオチド、ＴＲＡＩＬ結合促進剤、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト
を使用して、インビトロまたはインビボ手順においてＴＲＡＩＬの機能的活性を
阻害する。細胞表面レセプターへのＴＲＡＩＬの結合を阻害することによって、
ＴＲＩＤはまた、内因性レセプターに対するＴＲＡＩＬの結合により生じる生物
学的効果を阻害する。ＴＲＩＤの種々の形態（例えば、ＴＲＡＩＬを結合し得る
上記のＴＲＩＤフラグメント、誘導体および改変体が挙げられる）が使用され得
る。好ましい実施形態においては、可溶性ＴＲＩＤは、ＴＲＡＩＬの機能的活性
を阻害するため（例えば、このようなアポトーシスに影響されやすい細胞のＴＲ
ＡＩＬ媒介アポトーシスを阻害するため）に使用される。従って、さらなる実施
形態においては、ＴＲＩＤは、ＴＲＡＩＬ媒介障害を処置するために哺乳動物（
例えば、ヒト）に投与される。このようなＴＲＡＩＬ媒介障害としては、ＴＲＡ
ＩＬによって（直接的または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される状態
が挙げられる。
【０３００】 増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、以下が
挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモ
ン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細
胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内
皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カ
ポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））；自己免疫障
害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変
、Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよ
び免疫関連糸球体腎炎性慢性関節リウマチ）ならびにウイルス感染（例えば、ヘ
ルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）；炎症；対宿主性移
植片病；急性移植片拒絶および慢性移植片拒絶。好ましい実施形態においては、
本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニス
トは、癌（特に、上記および以下の段落に列挙される癌）の増殖、進行、および
／または転移を阻害するために使用される。
【０３０１】 増加した細胞生存に関連するさらなる疾患または状態としては、例えば、以下
の悪性腫瘍の増殖および／または転移および関連する障害が挙げられるがこれら
に限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨
髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性
白血病、および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（
顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、
リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデ
ンストレームマクロ大グロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（肉腫および癌
腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、
血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユー
イング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺
癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌
、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精
上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀
胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞
腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎ
ｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫を含むが、これらに
限定されない））。
【０３０２】 増加したアポトーシスに関連する疾患としては、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ
；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬
化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または先に関連する疾患）；自己免
疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝
硬変、Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス
および免疫関連糸球体腎炎性慢性関節リウマチ）；脊髄形成異常性症候群（例え
ば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発
作および再灌流障害によって引き起こされる障害）、肝障害（例えば、肝炎関連
肝障害、虚血／再灌流障害、胆汁うっ滞（胆管障害）および肝臓癌）、毒素誘導
肝疾患（例えば、アルコールによって引き起こされる障害）、敗血症性ショック
、悪液質および食欲不振。好ましい実施形態においては、ＴＲＩＤポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、ＴＲＡＩＬ結合促進剤、および／またはアゴニストを使用
して、上記に列挙される疾患および障害を処置する。
【０３０３】 ＨＩＶに関連する多くの病理（ＨＩＶ誘導腎症およびＨＩＶ脳炎を含む）は、
アポトーシスによって媒介される。従って、さらなる好ましい実施形態において
は、本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチド、ポリペプチド、ＴＲＡＩＬ結合促進剤
、および／またはＴＲＩＤアゴニストは、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳに関連する病
理を処置するために使用される。
【０３０４】 本発明の別の実施形態は、ＨＩＶ感染患者におけるＴ細胞のＴＲＡＩＬ媒介死
を減少させるためのＴＲＩＤの使用に関する。ＡＩＤＳの発症におけるＴ細胞ア
ポトーシスの役割は、多くの研究の目的である（例えば、Ｍｅｙａａｒｄら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５７：２１７〜２１９、１９９２；Ｇｒｏｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．，１７５：３３１，１９９２；およびＯｙａｉｚｕら、Ｃｅｌｌ Ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ，ＡｎｄｒｉｅｕおよびＬｕ（編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９９５，１０１〜１１４頁を参照のこと）。Ｆａｓ媒介アポトー
シスは、ＨＩＶ個体におけるＴ細胞の損失に関係してきた（Ｋａｔｓｉｋｉｓら
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９〜２０３６，１９９５）。ＡＩＤＳを
特徴付ける免疫不全の状態は、ＣＤ４+Ｔリンパ球の数および機能を二次的に減
少させる。最近の報告は、ＣＤ４+Ｔ細胞の１日の損失は、３．５×１０7細胞と
２×１０9細胞との間であると見積もる（Ｗｅｉ Ｘら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３
：１１７〜１２２（１９９５））。ＨＩＶ感染の状況におけるＣＤ４+Ｔ細胞欠
乏の１つの原因は、ＨＩＶ誘導アポトーシスであると考えられている。実際に、
ＨＩＶ誘導性アポトーシス細胞死は、インビトロで実証されただけではなく、よ
り重要なことに、感染した個体において実証された（Ａｍｅｉｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．
、ＡＩＤＳ ８：１１９７−１２１３（１９９４）；Ｆｉｎｋｅｌ，Ｔ．Ｈ．お
よびＢａｎｄａ，Ｎ．Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６０５
−６１５（１９９５）；Ｍｕｒｏ−Ｃａｃｈｏ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５４：５５５５−５５６６（１９９５））。さらに、アポトーシスおよび
ＣＤ４+Ｔリンパ球の枯渇は、ＡＩＤＳの異なる動物モデルに密接に相関し（Ｂ
ｒｕｎｎｅｒ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１−４４４（１９９５）；
Ｇｏｕｇｅｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕ
ｓｅｓ ９：５５３−５６３（１９９３））、そしてアポトーシスは、ウイルス
複製がＡＩＤＳを生じないこれらの動物モデルにおいては観察されない（Ｇｏｕ
ｇｅｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ
９：５５３−５６３（１９９３））。さらなるデータは、ＨＩＶに感染した個
体由来の感染していないＴリンパ球であるが、プライムされるか活性化されたＴ
リンパ球が、ＴＮＦファミリーのリガンドＦａｓＬと遭遇した後にアポトーシス
を受けることを示す。ＨＩＶ感染後に死を生じる単球細胞株を使用して、Ｕ９３
７細胞のＨＩＶでの感染が、ＦａｓＬの新規の発現を生じ、そしてＦａｓＬが、
ＨＩＶ誘導性アポトーシスを媒介することが実証された（Ｂａｄｌｅｙ，Ａ．Ｄ
．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９９−２０６（１９９６））。さらに、ＴＮＦ
ファミリーのリガンドは、感染されていないマクロファージにおいて検出可能で
あり、そしてその発現は、上方制御され、その後ＨＩＶ感染が、感染されていな
いＣＤ４ Ｔリンパ球の選択的殺傷を生じる（Ｂａｄｌｅｙ，Ａ．Ｄ．ら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７０：１９９−２０６（１９９６））。Ｔ細胞アポトーシスが複数
の機構を介して生じることもまた可能である。
【０３０５】 従って、本発明によって、ＨＩＶ個体を処置するための方法が提供される。こ
の方法は、本発明の可溶性ＴＲＩＤ（例えば、細胞外ドメイン）および／または
ＴＲＩＤアゴニストを投与して、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の選択的な死滅を減少させ
る工程を包含する。投与の様式および用量は、以下に詳細に考察される。理論に
縛られることは望まないが、活性化ヒトＴ細胞は、ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター複
合体（活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）と呼ばれるプロセス）を通じる誘発の際
に、プログラム細胞死（アポトーシス）を受けることを誘導されると考えられる
。ＨＩＶに感染した無症候の個体から単離されたＣＤ４ Ｔ細胞のＡＩＣＤが報
告された（Ｇｒｏｕｘら、前出）。従って、ＡＩＣＤは、ＣＤ４+Ｔ細胞の枯渇
およびＨＩＶに感染した個体におけるＡＩＤＳの進行に役割を果たし得る。従っ
て、本発明は、ＨＩＶ患者におけるＴＲＡＩＬ媒介性Ｔ細胞死を阻害する方法で
あって、患者に、本発明のＴＲＩＤポリペプチド（好ましくは、可溶性ポリペプ
チド）および／または本発明のＴＲＩＤアゴニストを投与する工程を包含する方
法を提供する。投与の様式および用量は、以下に詳細に考察される。一つの実施
形態において、ＴＲＩＤでの処置を開始する場合、患者は無症候である。所望で
あれば、処置の前に、末梢血Ｔ細胞は、ＨＩＶ患者から抽出され得、そして当該
分野において公知の手順によるＴＲＡＩＬ媒介性細胞死に対する感受性を試験さ
れ得る。一つの実施形態において、患者の血液または血漿は、エキソビボで本発
明のＴＲＩＤポリペプチドと接触される。本発明のＴＲＩＤポリペプチドは、当
該分野で公知の手順によって、適切なクロマトグラフィーマトリックスに結合さ
れ得る。患者の血液または血漿は、患者に戻される前に、マトリックスに結合し
たＴＲＩＤを含むクロマトグラフィーカラムを通って流れる。固定されたＴＲＩ
ＤポリペプチドはＴＲＡＩＬを結合し、従って、患者の血液からＴＲＡＩＬタン
パク質を取り除く。
【０３０６】 さらなる実施形態においては、本発明のＴＲＩＤポリペプチドおよび／または
アゴニストは、Ｔ細胞アポトーシスの他のインヒビターと組み合わせて投与され
る。例えば、上記で考察されるように、Ｆａｓ媒介アポトーシスはまた、ＨＩＶ
個体におけるＴ細胞の損失に関係してきた（Ｋａｔｓｉｋｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１８１：２０２９〜２０３６，１９９５）。従って、Ｆａｓリガンド媒
介およびＴＲＡＩＬ媒介Ｔ細胞死の両方に対して感受性の患者は、ＴＲＡＩＬ／
ＴＲＡＩＬレセプター相互作用をブロックする薬剤およびＦａｓリガンド／Ｆａ
ｓ相互作用をブロックする薬剤の両方を用いて処置され得る。Ｆａｓに対するＦ
ａｓリガンドの結合をブロックするための適切な薬剤としては、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：可溶性Ｆａｓポリペプチド；可溶性Ｆａｓポリペ
プチドの多量体形態（例えば、ｓＦａｓ／Ｆｃの二量体）；アポトーシスを生じ
る生物学的シグナルを伝達することなく、Ｆａｓに結合する抗Ｆａｓ抗体；Ｆａ
ｓへのＦａｓリガンドの結合をブロックする抗Ｆａｓリガンド抗体；およびＦａ
ｓに結合するが、アポトーシスを生じる生物学的シグナルを伝達しないＦａｓリ
ガンドのムテイン。好ましくは、この方法に従って使用される抗体は、モノクロ
ナール抗体である。Ｆａｓリガンド／Ｆａｓ相互作用をブロックする（抗Ｆａｓ
モノクロナール抗体をブロックすることを含む）ための適切な薬剤の例は、国際
出願公開ＷＯ９５／１０５４０（本明細書中に参考として援用される）に記載さ
れる。
【０３０７】 ＴＲＩＤポリペプチドまたは本発明のＴＲＩＤをコードするポリヌクレオチド
を使用して、四肢虚血のような心血管障害（末梢動脈疾患を含む）を処置し得る
。
【０３０８】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症症候群（
ＨＵＳ）、および心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０３０９】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。
【０３１０】 不整脈としては、以下が挙げられる：洞不整脈、心房細動、心房粗動、徐脈、
期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞ブロック、長ＱＴ症候
群、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マハイム型早期興奮症候
群、ウォルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心
室細動。頻拍としては、以下が挙げられる：発作頻拍、上室頻拍、加速性心室固
有調律、房室結節性再入頻拍、異所性心房頻拍、異所性接合部頻拍、洞房結節性
再入頻拍、洞頻拍、Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ Ｐｏｉｎｔｅｓおよび心室頻拍。
【０３１１】 心臓弁疾患としては、以下が挙げられる：大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、雑音
（ｈｅａｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁脱出、僧帽弁脱出、三尖弁脱出、僧帽
弁不全、僧帽弁狭窄、肺動脈弁閉鎖、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖
、三尖弁不全、および三尖弁狭窄。
【０３１２】 心筋疾患としては、以下が挙げられる：アルコール性心筋症、うっ血性心筋症
、肥大型心筋症、弁下部大動脈狭搾症、弁下部肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シ
ャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋
再灌流障害、および心筋炎。
【０３１３】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０３１４】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎
、肺静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症
候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉ
ａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤
、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患
が挙げられる。
【０３１５】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０３１６】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０３１７】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイド血管症、大脳動脈瘤、大脳
無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の閉塞症お
よび血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜
上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室
周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、
血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉ
ｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０３１８】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０３１９】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、区画症候群、前区画症候群、心筋虚
血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎
、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群
、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライ
ン紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギ
ー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０３２０】 一つの実施形態において、本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチド、ＴＲＡＩＬ結
合促進剤（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）ならびに／あるいはアゴニストは、血栓性
微小血管症の処置および／または予防のために使用される。このような障害の一
つは、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である（Ｋｗａａｎ，Ｈ．Ｃ．、Ｓ
ｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７１（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｂ
ｌｏｏｄ ８０：１８９０（１９９２））。漸増ＴＴＰ関連死亡率が、米国疾病
管理センターによって報告されている（Ｔｏｒｏｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．５０：８４（１９９５））。ＴＴＰで冒された患者（ＨＩＶ＋およびＨＩＶ
−患者を含む）由来の血漿は、皮膚の微小血管起源のヒト内皮細胞のアポトーシ
スを誘導するが、大血管起源のヒト内皮細胞のアポトーシスは誘導しない（Ｌａ
ｕｒｅｎｃｅら、Ｂｌｏｏｄ ８７：３２４５（１９９６））。従って、国際特
許出願番号ＷＯ９７／０１６３３（本明細書により参考として援用される）に記
載されるように、ＴＴＰ患者の血漿は、直接的または間接的にアポトーシスを誘
導する１つ以上の因子を含むと考えられる。ＴＲＡＩＬは、ＴＴＰ患者の血清に
存在し、そして微小血管内皮細胞のアポトーシスを誘導する役割を果たすようで
ある。別の血栓微小血管症は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）である（Ｍｏａｋ
ｅ，Ｊ．Ｌ．、Ｌａｎｃｅｔ、３４３：３９３、（１９９４）；Ｍｅｌｎｙｋら
、（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１５５：２０７７、（１９９５）；Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎら、前出）。従って、一つの実施形態において、本発明は、しば
しば、「成人ＨＵＳ」（子供も同様に襲われ得るが）といわれる状態を処置およ
び／または予防するためのＴＲＩＤの使用に関する。小児期／下痢に関連するＨ
ＵＳとして公知の障害は、成人ＨＵＳとは病因において異なる。別の実施形態に
おいて、小血管の凝固によって特徴付けられる状態は、ＴＲＩＤを使用して処置
および／または予防され得る。このような状態としては、本明細書中に記載され
る状態が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、約５〜１０％の小児Ａ
ＩＤＳ患者において見られる心臓の問題は、小血管の凝固が関与すると考えられ
る。心臓における微小血管の崩壊が、複数の硬化症患者において報告されている
。さらなる例としては、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の処置および／または予防
が意図される。一つの実施形態において、患者の血液または血漿は、本発明のＴ
ＲＩＤポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと接触される。ＴＲＩＤは
、当該分野で公知の手順によって、適切なクロマトグラフィーマトリックスに結
合され得る。この実施形態に従って、患者の血液または血漿は、患者に戻される
前に、マトリックスに結合した本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチドを含むクロマトグラフィーカラムを通って流れる。固定されたＴ
ＲＩＤは、ＴＲＡＩＬを結合し、従って、患者の血液からＴＲＡＩＬタンパク質
を取り除く。あるいは、本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチドおよび／またはポリ
ペプチドは、血栓性微小血管症に冒された患者にインビボで投与され得る。一つ
の実施形態において、本発明のＴＲＩＤポリペプチドの可溶性形態が、患者に投
与される。従って、本発明は、有効量のＴＲＩＤの使用を含む、血栓性微小血管
症を処置および／または予防するための方法を提供する。ＴＲＩＤポリペプチド
は、インビボ手順またはエキソビボ手順で使用され、（例えば、アポトーシスの
）微小血管内皮細胞に対するＴＲＡＩＬ媒介性損傷を阻害し得る。
【０３２１】 本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチドならびに／またはポリペプチドは、特定の
障害を処置および／または予防する際に有用な他の薬剤と組み合わせて使用され
得る。例えば、Ｌａｕｒｅｎｃｅら（Ｂｌｏｏｄ ８７：３２４５、１９９６）
によって報告されたインビトロ研究において、微小血管内皮細胞のＴＴＰ血漿媒
介アポトーシスのいくぶんかの減少が、抗Ｆａｓブロッキング抗体、オーリント
リカルボン酸、または寒冷沈降物を枯渇した正常血漿を使用することによって達
成された。従って、患者は、内皮細胞のＦａｓリガンド媒介アポトーシスを阻害
するさらなる薬剤（例えば、上記に記載した薬剤など）と組み合わせて本発明の
ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを用いて処置され得る。１つの実
施形態において、本発明のＴＲＩＤポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチ
ドならびに抗ＦＡＳブロッキング抗体は、ＴＴＰまたはＨＵＳのような血栓性細
小血管症によって特徴付けられる障害に罹患した患者に両方投与される。Ｆａｓ
抗原（ＣＤ９５）を指向するブロッキングモノクローナル抗体の例は、本明細書
によって参考として援用される、国際出願公開番号ＷＯ９５／１０５４０におい
て記載される。
【０３２２】 内因性刺激因子と新脈管形成のインヒビターとの間の天然に存在するバランス
は、阻害的な影響が優勢であるものである。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ
５６：３４５−３５５（１９８９）。新生血管形成が通常の生理学的条件下（
例えば、創傷治癒、組織再生、胚発生、および女性の生殖プロセス）で起こるま
れな例において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的かつ時間的に限
定される。固形腫瘍増殖を特徴付けるような病理学的な新脈管形成の条件下で、
これらの調節制御は失敗する。調節されない新脈管形成は、病理学的になり、そ
して多くの腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患の進行を持続する。多くの重篤な疾患
は、異常な新生血管形成（固形腫瘍増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害、および乾癬を含む）によって支配される。例えば、Ｍｏｓｅｓら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．９：６３０−６３４（１９９１）による概説；Ｆｏｌｋｍａｎら、
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１７５７−１７６３（１９９５）；Ａｕｅ
ｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１−４１１（１９
８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５−２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．Ｊ．
Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５−７４３（１９８２）；およびＦｏｌｋｍａ
ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９−７２５（１９８３）を参照のこと。多
くの病理学的な状態において、新脈管形成のプロセスは、疾患状態に寄与する。
例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存していることを示唆する有意なデー
タが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３５：４４２−４４７（１９８７）。
【０３２３】 本発明は、本発明のＴＲＩＤのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド
（ＴＲＩＤアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）の投与による新生
血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドを用いて処置され得る悪性および転移性の状態には、本明
細書中に記載され、そしてさもなくば当該分野で公知の悪性疾患、固形腫瘍、お
よび癌が含まれるがこれらに限定されない（このような障害の概説としては、Ｆ
ｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ
Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）。
【０３２４】 さらに、本発明のＴＲＩＤのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（
ＴＲＩＤアゴニストおよびＴＲＩＤアンタゴニストを含む）で処置され得る、新
生血管形成と関連した眼の障害には、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽
細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児黄斑変性の網膜症、角膜移植
新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹
彩の新生血管形成に関連する疾患が含まれるがこれらに限定されない。例えば、
Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４−７１０（１９７
８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１−３１
２（１９７８）を参照のこと。
【０３２５】 さらに、本発明のＴＲＩＤのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ＴＲＩＤ
アゴニストおよびＴＲＩＤアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る障害に
は、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム硬化性斑、創傷治癒の遅延
、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節破損、オースラー−ウェーバー
症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および脈管接着が含まれるがこれ
らに限定されない。
【０３２６】 同種移植片の拒絶においては、レシピエント動物の免疫系が、応答するために
あらかじめプライムされていない。なぜなら、大部分についての免疫系は、環境
抗原によってのみプライムされるからである。同一の種の他のメンバー由来の組
織は、同じ様式（例えば、ウイルスおよび細菌が提示されている）で提示されて
いない。同種移植片拒絶の場合、免疫抑制性レジメンは、免疫系がエフェクター
期に到達するのを妨げるように設計される。しかし、異種移植片拒絶の免疫プロ
フィールは、同種移植片拒絶よりも疾患の再発に類似し得る。疾患の再発の場合
、天然の島細胞の破壊によって証明されるように、免疫系はすでに活性化されて
いる。従って、疾患の再発において、免疫系はすでにエフェクター期である。本
発明のアンタゴニストは、同種移植片および異種移植片の両方に対する免疫応答
を抑制し得る。なぜなら、活性化リンパ球およびエフェクター細胞に分化したリ
ンパ球が、ＴＲＩＤポリペプチドを発現し、それによって、ＴＲＩＤ活性を高め
る化合物に対して感受性であるからである。従って、本発明は、さらに免疫特権
のある組織（ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ ｔｉｓｓｕｅ）を作製する
ための方法を提供する。
【０３２７】 本発明のＴＲＩＤアンタゴニストまたはアゴニストは、炎症性腸疾患（例えば
、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、敗血症および炎症性腸疾患）の処置
および／また予防に有用であり得る。
【０３２８】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範な疾患および／または状態
の診断および処置または予防において有用である。このような疾患および状態に
は、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌（例えば、免疫細胞関連癌、
乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または変化と関連した
癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺の非小細胞癌、肺の
小細胞癌、胃癌など）、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節症）、微生物（例
えば、ウイルス、細菌など）感染（例えば、ＨＩＶ−感染、ＨＩＶ−２感染、ヘ
ルペスウイルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、
ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むがこれらに限定されない）、アデノウイルス感染、ポ
ックスウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ
、ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染、侵襲
性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉａなど）、寄生生物感染、腎炎、骨疾患（例えば
、骨粗しょう症）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心臓血管障害（例えば、新
生血管形成、低血管形成または循環の減少（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋
梗塞、発作など）））、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性性疾患（例えば
、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小
脳変性など）、移植拒絶（急性および慢性）、対宿主性移植片病、骨髄形成異常
症に起因する疾患（例えば、再生不良性貧血など）、リウマチにおける関節組織
破壊、肝臓疾患（例えば、急性および慢性肝炎、肝臓損傷、および肝硬変）、自
己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
ス、免疫複合体性糸球体腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑
病、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖
尿病、糖尿病性合併症（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿
病性網膜症）、インフルエンザ、ぜん息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック
、および潰瘍性大腸炎。
【０３２９】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／あるいは
そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成の促進、創傷治
癒（例えば、創傷、熱傷、および骨折）、ならびに造血調節において有用である
。本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
のアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原に対する免疫
応答性、抗ウイルス免疫応答を増強するためのアジュバントとして有用である。
【０３３０】 より一般的には、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドな
らびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応答を
調節する（すなわち、上昇または減少させる）際に有用である。例えば、本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線治療、
化学療法、および移植からの準備または回復において有用であり得、また、高齢
のおよび免疫無防備状態の個体において免疫応答および／または回復をブースト
するために使用され有る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしく
はポリペプチドならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニス
トは、例えば、自己免疫障害の処置または予防おける免疫抑制剤として有用であ
る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペ
プチドは、慢性的炎症、アレルギーまたは自己免疫状態（例えば、本明細書中に
記載されるか、またはさもなくば当該分野で公知の状態）を処置または予防する
ために使用される。
【０３３１】 従って、１つの局面において、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドによって
誘導されるアポトーシスを増強するための方法に関し、この方法は、ＴＮＦＲポ
リペプチドを発現する細胞に、有効量のＴＲＩＤポリペプチドのアンタゴニスト
を投与して、ＴＲＩＤ発現またはそのリガンド結合能力（例えば、ＴＲＡＩＬに
対して）の阻害を可能にし得ることを包含する。好ましくは、ＴＮＦＲ媒介シグ
ナルが増大され、疾患を処置し、ここで、減少したアポトーシスが示される。ア
ンタゴニストは、ＴＲＩＤポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体
を含む。
【０３３２】 「アンタゴニスト」によって、アポトーシスを増強または強化し得る天然に存
在する化合物および合成の化合物が意図される。「アゴニスト」によって、アポ
トーシスを阻害し得る天然に存在する化合物および合成の化合物が意図される。
本発明の任意の候補「アンタゴニスト」または「アゴニスト」がアポトーシスを
増強し得るかまたは阻害し得るかは、当該分野で公知のＴＮＦ−ファミリーリガ
ンド／レセプター細胞応答アッセイ（以下により詳細に記載されるものを含む）
を用いて決定され得る。
【０３３３】 １つのこのようなスクリーニング手順は、トランスフェクトされてＴＮＦＲレ
セプターを同時発現するメラニン保有細胞の使用を包含し、ＴＮＦＲレセプター
は、ＴＲＡＩＬ（例えば、本明細書中の他で記載される、ＤＲ４またはＤＲ５）
、および本発明のＴＲＩＤレセプターを結合する。このようなスクリーニング技
術は、１９９２年２月６日に公開された、ＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０に記載
される。このようなアッセイは、例えば、本発明のレセプターポリペプチドの活
性化を阻害（または増強）する化合物についてスクリーニングするために使用さ
れ得る。このアッセイは、レセプターをコードするメラニン保有細胞をＴＮＦフ
ァミリーリガンドおよび候補アンタゴニスト（またはアゴニスト）の両方と接触
させることによる。リガンドによって生成されるシグナルの阻害または増強は、
その化合物が、ＴＲＩＤ活性のアンタゴニストまたはアゴニストであることを示
す。ＴＲＩＤポリペプチドおよびそのアゴニストは、ＴＮＦＲレセプター（例え
ば、ＴＲＡＩＬレセプター）の活性を阻害するが、アンタゴニストは活性を増加
させる。
【０３３４】 他のスクリーニング技術には、レセプター活性化によって引き起こされる細胞
外ｐＨ変化を測定する系においてＴＲＡＩＬレセプターおよびＴＲＩＤを発現す
る細胞（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）の使用が含まれる（例え
ば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１８１−２９６（１９８９年１０月）に記載され
るように）。例えば、化合物は、本発明のＴＲＡＩＬレセプターポリペプチドお
よびＴＲＩＤを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答
（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）が測定され得、潜在的な化合物がＴＲ
ＩＬレセプターを活性化するかまたは阻害するかを決定し有る。
【０３３５】 別のこのようなスクリーニング技術は、そのレセプターをコードするＲＮＡを
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入して、ＴＲＩＤおよびＴＲＡＩＬレセプターを一
過性に発現する工程を包含する。次いで、そのレセプター卵母細胞は、レセプタ
ーリガンドと接触され得、そして化合物がスクリーニングされ得、続いてレセプ
ターの活性化を阻害すると考えられている化合物についてのスクリーニングの場
合、カルシウムシグナルの阻害または活性化の検出が行われ得る。
【０３３６】 別のスクリーニング技術には、構築物を細胞中で発現することが含まれ、ここ
でそのＴＲＡＩＬレセプターは、ホスホリパーゼＣまたはＤに連結されている。
このような細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎臓細胞なとが含まれる。この
スクリーニングは、候補化合物と共に可溶性形態で同時発現されるか、または添
加されるかのいずれかのＴＲＩＤの存在下で、ホスホリパーゼシグナルから、レ
セプターの活性化またはレセプターの活性化の阻害の検出により、本明細書中上
記のように達成され得る。
【０３３７】 別の方法は、同時発現されるかまたは可溶性形態でのいずれかで、本発明のＴ
ＲＩＤポリペプチドの存在下、ＴＲＡＩＬレセプターポリペプチドの活性化を阻
害する化合物をスクリーニングすることを包含する。本発明のアゴニストは、そ
の表面上にＴＲＡＩＬレセプターを有する細胞への標識されたリガンドの結合の
阻害を決定することにより同定される。このような方法は、ＴＲＡＩＬ結合レセ
プターをコードするＤＮＡで真核生物細胞をトランスフェクトして、その結果そ
の細胞がその表面でＴＲＡＩＬ結合レセプターを発現する工程、および標識した
ＴＲＡＩＬおよびＴＲＩＤの存在下で細胞を化合物と接触させる工程を包含する
。ＴＲＡＩＬは、例えば、放射能によって標識され得る。レセプターに結合した
標識されたＴＲＡＩＬの量は、例えば、レセプターの放射能を測定することによ
って測定される。その化合物が、ＴＲＡＩＬレセプターに結合する標識されたＴ
ＲＡＩＬの増加によって決定されるようにＴＲＩＤレセプターに結合する場合、
その化合物は、ＴＲＩＤアンタゴニストである。
【０３３８】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニング
アッセイは、Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．およびＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）に記
載される。
【０３３９】 従って、さらなる局面において、候補ＴＲＩＤアンタゴニストまたはアゴニス
トがＴＮＦファミリーリガンドに対する細胞応答を増強し得るかまたは阻害し得
るか否かを決定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法は、ＴＮ
ＦＲポリペプチドを発現する細胞を候補化合物、ＴＲＩＤ、およびＴＮＦファミ
リーリガンドと接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、ならびにその細
胞応答を標準的な細胞応答と比較する工程を包含し、その標準は、ＴＲＩＤの存
在下であるが、候補化合物の非存在下でリガンドとの接触がなされた場合にアッ
セイされ、それによって、標準を上回る細胞応答の増加は、その候補化合物がア
ンタゴニストであることを示し、そして標準と比較して減少した細胞応答は、そ
の候補化合物がアゴニストであることを示す。「細胞応答をアッセイする」によ
って、候補化合物および／またはＴＮＦファミリーリガンドに対する細胞応答を
定性的または定量的に測定すること（例えば、Ｔ細胞増殖の、またはトリチウム
化されたチミジン標識の増加または減少を決定または評価すること）が意図され
る。本発明によって、ＴＮＦＲポリペプチドを発現する細胞は、内因性または外
因性のいずれかで与えられたＴＮＦファミリーリガンドと接触され得る。
【０３４０】 本発明に従うアンタゴニストには、天然に存在する化合物および合成化合物（
例えば、ＴＮＦファミリーリガンドペプチドフラグメント、トランスホーミング
増殖因子、神経伝達物質（例えば、グルタメート、ドパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−
アスパルテート）、腫瘍サプレッサー（ｐ５３）、細胞傷害性Ｔ細胞、および代
謝拮抗物質）が含まれる。好ましいアゴニストには、化学療法剤（例えば、シス
プラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロ
ジェンマスタード、メトトレキサート、およびビンクリスチン）が含まれる。他
のアゴニストには、エタノールおよびアミロイドペプチドが含まれる（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６７：１４５７−１４５８（１９９５））。さらに好ましいアンタゴ
ニストには、ＴＲＩＤポリペプチドまたはそのフラグメントに対して惹起された
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。
【０３４１】 本発明に従うアゴニストには、天然に存在する化合物および合成化合物（例え
ば、ＣＤ４０リガンド、天然アミノ酸、亜鉛、エストロゲン、アンドロゲン、ウ
イルス遺伝子（例えば、アデノウイルス ＥｌＢ、バキュロウイルスｐ３５およ
びＩＡＰ、牛痘ウイルスｃｒｍＡ、エプスタイン−バーウイルスＢＨＲＦ１、Ｌ
ＭＰ−１、アフリカ豚コレラウイルスＬＭＷ５−ＨＬ、およびヘルペスウイルス
ｙｌ３４．５）、カルパインインヒビター、システインプロテアーゼインヒビタ
ー、および腫瘍プロモーター（例えば、ＰＭＡ、フェノバルビタール、およびヘ
キサクロロシクロヘキサン））が含まれる。他のアンタゴニストには、ＴＲＡＩ
Ｌポリペプチドまたはそのフラグメントに対して惹起されたポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体が含まれる。
【０３４２】 他の潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。特定
の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、ＴＲＩＤにおいて含まれ
る配列に対応する核酸、またはその相補鎖、および／あるいはＡＴＣＣ受託番号
９７７９８において含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実
施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実施
形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏｋａｎｏ Ｈ
．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）およびＯｌｉｇｏｄ
ｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃ
ａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照のこと。アンチセンス技術を使用して
、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介してか、または３重らせんの形成を介
して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ
，ＦＬ（１９８８）に考察される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏ
ｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａ
ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３６０（１９９１）において考察される。こ
れらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づ
く。
【０３４３】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の
領域に対して相補的になるように設計され、それによって、このレセプターの転
写および産生を妨害する。このアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン
ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてレセプターポリペプチドへのｍＲＮ
Ａ分子の転写をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達さ
れ、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、インビボで発現され、この
レセプターの産生を阻害し得る。
【０３４４】 １つの実施形態において、本発明のＴＲＩＤアンチセンス核酸は、外来の配列
からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写
され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなＴＲＩＤベ
クターは、アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、
それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームのま
まであり得るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分
野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊
椎動物細胞において複製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラ
スミド、ウイルスなどであり得る。ＴＲＩＤをコードする配列またはそのフラグ
メントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当該分野で
公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導性また
は構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領
域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３
１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモー
ター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８０））、
ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチ
オネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９
−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４５】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくともＴＲＩＤ遺伝子のＲＮＡ転写物の一
部に相補的な配列を含むか、あるいはこの配列からなる。しかし、完全に相補的
であることは好ましいが、必要ではない。本明細書中で言及される「少なくとも
ＲＮＡの一部に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補
性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味し；従って、二本鎖ＴＲＩＤアン
チセンス核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または
三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およ
びアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核
酸が長いほど、ＴＲＩＤ ＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含み得、これ
は、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そしてなお形成
し得る。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するために標準的な
手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。
【０３４６】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（１９９
４）を参照のこと。従って、配列番号１に示されるＴＲＩＤの５’−または３’
−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｎ
ＴＲＩＤ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。
ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドン
の相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従
って使用され得る。ＴＲＩＤ ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域
にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸
は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５
０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、こ
のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレ
オチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである
。
【０３４７】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改
変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔ
ｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９
８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）
を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１
３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘
引切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇ
ｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば
、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと
）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、
ペプチド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショ
ン誘引切断剤など）に結合体化され得る。
【０３４８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むが、それらに限定されない群から選択され
る：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨ
ードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カ
ルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−
２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラ
シル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルア
デニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン
、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチル
シトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラ
シル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュ
ーオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、
２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（
ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キ
ューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラ
シル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチ
ルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル
、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３
）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０３４９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０３５０】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０３５１】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のβ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、
２’−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２
７−３３０（１９８７））。
【０３５２】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例えば、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））により合成され得、メチルホ
スホネートオリゴヌクレオチドは、制御化ポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））など
の使用により調製され得る。
【０３５３】 ＴＲＩＤコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用され得
、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０３５４】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを
使用して、ＴＲＩＤ ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの
使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基
対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。唯一の必
要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有することである：５’−Ｕ
Ｇ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該分野で周知であ
り、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５
８５−５９１（１９８８）により十分に記載される。ＴＲＩＤ（配列番号１）の
ヌクレオチド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存
在する。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がＴＲＩＤ ｍＲＮＡの
５’末端付近に位置するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲ
ＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作される。
【０３５５】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、改良された安定性、標的化など）から構成され得、そして
インビボにおいてＴＲＩＤを発現する細胞に送達されるべきである。リボザイム
をコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入のための
上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法は、強力な
構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｌ ＩＩプ
ロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を
使用することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因性ＴＲＩＤメッ
セージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する。リ
ボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が
効率のために必要とされる。
【０３５６】 内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用してＴＲＩＤ遺伝子
および／またはそのプロモーターを不活化あるいは「ノックアウトする」ことに
よって減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２
３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ
５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１
３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体
が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子
のコード領域または調節領域のいずれか）と相同なＤＮＡに隣接される、本発明
の変異体の非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）
を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用いず
に使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクト
し得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含む
が、これを発現しない細胞中でノックアウトを生じるために使用する。標的化さ
れた相同性組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の
不活化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な
標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究およ
び農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ（１９
８７）およびＴｈｏｍｐｓｏｎ（１９８９）、前出を参照のこと）。しかし、こ
のアプローチは、当業者に明白な、適切なウイルスベクターを使用して、組換え
ＤＮＡ構築物がインビボで必要とされる部位に直接投与されるか、または標的化
される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。この段落において引用
された文書の各々の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０３５７】 本発明に従うさらなるアゴニストは、ＴＲＩＤの可溶型（すなわち、全長レセ
プターの細胞外領域からのリガンド結合ドメインを含むＴＲＩＤフラグメント）
を含む。このような可溶型のレセプター（これは、天然に存在するか、または合
成であり得る）は、ＴＮＦファミリーリガンドへの結合について細胞表面ＴＮＦ
Ｒと競合することによって、ＴＮＦＲ媒介シグナル伝達をアンタゴナイズする。
従って、リガンド結合ドメインを含むＴＲＩＤレセプターの可溶型は、ＴＮＦフ
ァミリーリガンドによって誘導されたアポトーシスを阻害し得る新規なサイトカ
インである。他のこのようなサイトカインは当該分野で公知であり、そしてＦａ
ｓリガンドによって誘導されるアポトーシスを制限するように生理学的に作用す
るＦａｓＢ（マウスＦａｓレセプターの可溶型）（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｄ．Ｐ．およ
びＣｒｉｓｐｅ，Ｉ．Ｎ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３９５−１４０１
（１９９５））を含む。
【０３５８】 細胞外ドメインに結合するタンパク質および他の化合物もまた、本発明に従う
候補のアゴニストまたはアンタゴニストである。このような結合化合物は、酵母
ツーハイブリッド系を使用して「捕捉され」得る（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ
、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９））。酵母ツーハイブリッ
ド系の改変されたバージョンは、Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔおよび共同研究者らに
よって記載されている（Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０
３（１９９３）；Ｚｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２
（１９９３））。
【０３５９】 「ＴＮＦファミリーリガンド」によって、ＴＮＦレセプターファミリーのメン
バーに結合し得、そしてそのリガンド／レセプターシグナル伝達経路を誘導およ
び／またはブロックし得る、天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および
合成リガンドが意図される。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーには、以下が
含まれるがこれらに限定されない：ＴＮＦ−α、リンフォトキシンα（ＬＴ−α
（ＴＮＦ−βとしても公知である））、ＬＴ−β（複合体ヘテロ三量体ＬＴ−α
２−β中に見いだされる）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２７Ｌ、Ｃ
Ｄ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−ｌＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国
際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号 ＷＯ９７／３
３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際出願公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、ＡＰＲ
ＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイ
ン−α（国際出願公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際出願公開番号
ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、
ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０、可溶性形態のＣＤ２７、
可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４
（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０
６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９
（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５
４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１
２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形
態のＣＤ１５３。
【０３６０】 ＴＮＦ−αは、１型単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）による感染からマウスを
防御することが示されている（Ｒｏｓｓｏｌ−Ｖｏｔｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ
ｏｌ．７２：１４３−１４７（１９９１））。ＴＮＦ−αの防御効果の機構は、
未知であるが、インターフェロンもＮＫ細胞殺害もどちらも関与しないようであ
る。このファミリーの１つのメンバーは、ＨＳＶ−１の細胞への侵入を媒介する
ことが示されている（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎ
ｅｗｔ．７：１５９（１９９６））。さらに、このメンバーの細胞外ドメインに
特異的な抗体は、細胞へのＨＳＶ−１の侵入をブロックする。従って、本発明の
ＴＲＩＤアンタゴニストとしては、ＴＲＩＤアミノ酸配列およびウイルスの細胞
への侵入の媒介を妨害し得る、抗体の両方が挙げられる。このような配列および
抗体は、ウイルスに結合するために位置されている細胞表面と競合することか、
または細胞表面レセプターへのウイルスの結合を直接ブロックすることかのいず
れかによって機能し得る。
【０３６１】 示されるように、本発明に従う、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体のアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｔａｒｔａｇｌｉａ Ｌ．Ａ．および
Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｄ．Ｖ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４
−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌｉａ Ｌ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ７３：
２１３−２１６（１９９３）、ならびに国際出願公開番号ＷＯ ９４／０９１３
７（これらの３つの出願の各々の内容は、その全体が参考として本明細書中に援
用される）に記載される方法に従って惹起され得、そして好ましくは、配列番号
２のアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドに特異的である。本明細書中で
使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ
）は、インタクトな分子、ならびに抗原に結合し得る抗体のフラグメント（例え
ば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメント）を含むことを意味する。Ｆａｂ
およびＦ（ａｂ’）2フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを
欠き、循環からより迅速にクリアランスされ、そしてインタクトな抗体のあまり
非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４
：３１６−３２５（１９８３））。
【０３６２】 本発明に従う抗体は、本発明のＴＲＩＤレセプター免疫原を用いる種々の標準
的方法のいずれか（例えば、上記の方法および当該分野で公知の方法）によって
調製され得る。このようなＴＲＩＤレセプター免疫原としては、配列番号２に示
されるＴＲＩＤタンパク質（これは、リーダー配列を含んでも含まなくてもよい
）およびＴＲＩＤのリガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、
細胞内ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、あるいはこれらか
らなるレセプターのポリペプチドフラグメントが挙げられる。
【０３６３】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害および／または予防するために、遺伝子治療の目的で
投与される。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体へ
の投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、そ
れらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する
。
【０３６４】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれかが、本発明に従って
使用され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０３６５】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，１９９
３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕおよび
Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅ
ｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：
５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２
６−９３２；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５を参照のこと。使用され得る、組換えＤ
ＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１
９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＫｒｉｅｇ
ｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹに記載される。
【０３６６】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って，抗体をコードする核酸の
染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。特
定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの核
酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方またはそのフラグメントをコードす
る配列を含む。
【０３６７】 患者内への核酸の送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベク
ターに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビト
ロで核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。こ
れらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝
子治療としてそれぞれ公知である。
【０３６８】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、欠損性または
弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０
，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、または、裸のＤＮＡの直接注
射により、または、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質または細胞表面のレセプター
またはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または、リポソーム
、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル化により、または、それら
を核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、または
、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与する
ことにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２：４４２９−４４３２を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細胞
の型を標的化するために用いられ得る）などのいずれかにより達成され得る。別
の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、リガンドは
エンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペプ
チドを含み、核酸にリソソーム分解を回避させる。さらに別の実施形態において
、核酸は、特異的なレセプターを標的化することにより、細胞特異的な取り込み
および発現についてインビボで標的とされ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２
／０６１８０号（１９９２年４月１６日付（Ｗｕら））；同第ＷＯ９２／２２６
３５号（１９９２年１２月２３日付（Ｗｉｌｓｏｎら））；同第ＷＯ９２／２０
３１６号（１９９２年１１月２６日付（Ｆｉｎｄｅｉｓら））；同第ＷＯ９３／
１４１８８号（１９９３年２月２２日付（Ｃｌａｒｋｅら））、同第ＷＯ９３／
２０２２１号（１９９３年１０月１４日付（Ｙｏｕｎｇ））を参照のこと）。あ
るいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより、発現のため
に宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，
１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−
８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４
３８）。
【０３６９】 具体的な実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイル
スベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍ
ｉｌｌｅｒら，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムのパッ
ケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要ではないレトロウイル
ス配列が欠失されている。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸
配列は、一つ以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の
送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓ
ｅｎら，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（これは、幹細
胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性幹細胞に
送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。
遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、
以下である：Ｃｌｏｗｅｓら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：
６４４−６５１；Ｋｉｅｍら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７
３；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉ
ｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖ
ｅｌ．３：１１０−１１４。
【０３７０】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染することができ
るという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概説
を示す。Ｂｏｕｔら，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：
３−１０は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベ
クターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，１９９５，Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３に見出され得る。好ましい実施形
態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０３７１】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ
．２０４：２８９−３００；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０３７２】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養物中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移
入の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入
された遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するための選沢下に置かれる
。次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０３７３】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボでの投与の前に、核
酸が細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法
により実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェク
ション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターで
の感染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、
スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野に
おいて多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，１
９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎら，
１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，
１９８５，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照のこと）、そし
てレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないならば、
本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を提供
するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、そして好
ましくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０３７４】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０３７５】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様
々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０３７６】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
系である。
【０３７７】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８（１９９４年４月２８日付）：Ｓｔ
ｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８
５；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１９８０，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２
２９；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，１９８６，Ｍａｙｏ Ｃ
ｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１を参照のこと）。
【０３７８】 具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領
域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現
は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能である
。
【０３７９】 （投与形態） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。
【０３８０】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方物および投
与の方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方物および投与の経路は、本明
細書中以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０３８１】 本明細書中に記載されるアゴニストまたはアンタゴニストは、インビトロ、エ
キソビボ、またはインビボで、細胞に投与され得る。それらは、本発明のレセプ
ターを発現する。アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」の投与とは、化
合物の量を意図する。これは、ＴＮＦファミリーリガンドの細胞応答を、十分に
増強または阻害し、そしてポリペプチドを含む。特に、アゴニストまたはアンタ
ゴニストの「有効量」の投与とは、ＴＲＩＤ活性を増強または阻害する有効量を
意図する。もちろん、アポトーシスが増強されることが望まれる場合、本発明に
従うＴＲＩＤアゴニストは、ＴＮＦファミリーリガンドと共に投与され得る。当
業者は以下のことを理解する。アゴニストまたはアンタゴニストの有効量が、経
験的に決定され得、そして純粋な形態または薬学的に受容可能な塩の形態、エス
テルの形態、あるいはプロドラッグの形態で使用され得ることを理解する。アゴ
ニストまたはアンタゴニストは、１以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わ
された組成物において投与され得る。
【０３８２】 以下のことが理解される。ヒト患者に投与される場合、本発明の化合物および
組成物の全体の日々の使用は、主治医である医師によって信頼できる医療の判断
の範囲内で決定される。任意の特別な患者に対する特定の治療有効量の用量レベ
ルは、医療分野で周知の因子に依存する。
【０３８３】 一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるＴＲＩＤポリペプチドの
総薬学的有効量は、患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範
囲であるが、上記のように、これは治療的裁量に供される。より好ましくは、こ
の用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトにつ
いて、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続的に与
えられる場合、ＴＲＩＤアゴニストまたはアンタゴニストは、代表的には、約１
μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回
の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかにより投
与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。
【０３８４】 投与はまた、患者に特異的な様式でアレンジされ、所定の濃度のアゴニストま
たはアンタゴニストを血液に提供する（ＲＩＡ技術によって決定されたように）
。従って、患者に投与することは、ＲＩＡによって測定される血液レベルによっ
てレギュラーな継続を達成するように調節され得る。そのオーダーは、５０〜１
０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１５０〜５００ｎｇ／ｍｌである。
【０３８５】 非経口注射のための本発明の薬学的組成物は、以下を含み得る：使用の直前に
滅菌注射溶液または分散系（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）への再形成のための、薬学
的に受容可能な滅菌された水性または非水性溶液、分散剤、懸濁液またはエマル
ジョン、ならびにの滅菌粉末。
【０３８６】 可溶性ＴＲＩＤポリペプチドに加えて、膜貫通領域を含むＴＲＩＤポリペプチ
ドはまた、以下の場合に使用され得る。界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳまたは
ＮＰ−４０）を含むことによって緩衝液に適切に可溶化される場合。
【０３８７】 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０３８８】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態では、薬
学的組成物は、以下を含んで提供される。ＴＲＩＤのアゴニストまたはアゴニス
トおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。これらは経口的、直腸内、
非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（
粉剤、軟膏、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または
鼻腔スプレーとして投与され得る。重要には、ＴＲＩＤアンタゴニストおよびＴ
ＮＦファミリーリガンドを同時投与することにより、医学的副作用が、リガンド
およびアンタゴニストの両方のより低い用量を使用することにより減少され得る
。アンタゴニストが特定の治療的適用の緊急性に依存して、ＴＮＦファミリーリ
ガンド投与の前、後または同時のいずれかで「同時投与」され得ることが理解さ
れる。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半流動性または液
状の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意の型の処方補助物を意味する。
具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能」とは、動物における、そ
してより具体的にはヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府
により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に
列挙されたことを意味する。用語「非経口的」とは本明細書中において使用され
る場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入
を含む投与の様式をいう。用語「キャリア」とは、治療剤がともに投与される、
希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキ
ャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（
例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した
液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキ
ャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの
水溶液はまた、特に注射可能な溶液のための、液体キャリアとして使用され得る
。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロー
ス、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナ
トリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳
、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩
衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセ
ル剤、散剤、徐放性処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤
およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経
口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸
マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのよ
うな標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔ
ｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、患者への適切な投与のための
形態を提供するように、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含む。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０３８９】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために適合された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０３９０】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０３９１】 ＴＲＩＤポリペプチドはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放
性組成物の適切な例は、例えば、成形品の形態（フィルムまたはマイクロカプセ
ル）の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスとしては
、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−
グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ
，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポ
リ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート；Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＲ．Ｌ
ａｎｇｅｒ，，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチ
レンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，ら同上）またはポリ−Ｄ−（−）−
３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性ＴＲＩＤポリ
ペプチド組成物はまた、リポソームに封入されたＴＲＩＤポリペプチドを包含す
る。ＴＲＩＤポリペプチドを含有するリポソームは、当該分野においてそれ自体
公知である方法により調製される（ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９
２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ
ＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，
６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国
特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第
４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２，３２４）。通常、リポソームは、
小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、
約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された比率は、最適ＴＲＩＤポリ
ペプチド治療のために調整される。
【０３９２】 キャリアは、等張性および化学安定性を増強する物質のような、微量の添加物
を適切に含有する。このような物質は、使用される投与量および濃度でレシピエ
ントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および
その他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化
剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたは
トリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタ
ンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、
およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキスト
リンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソ
ルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；ならびに／あ
るいはポリソルベート、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ）、またはＰＥＧ
のような非イオン界面活性剤が挙げられる。
【０３９３】 ＴＲＩＤポリペプチドは、代表的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ約３〜８でこのようなビヒク
ル中に処方される。特定の上記賦形剤、キャリア、または安定剤の使用が、ＴＲ
ＩＤポリペプチド塩の形成をもたらすことは、理解される。
【０３９４】 治療投与に使用されるＴＲＩＤポリペプチドは、滅菌されなければならない。
滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通す濾過によって、容易に
完了される。治療ＴＲＩＤポリペプチド組成物は、一般的に、滅菌出入口を有す
る容器（例えば、皮下注射針によって穿刺し得る栓を有する静脈内点滴用溶液バ
ッグまたはバイアル）へ入れられる。
【０３９５】 一般的に、ＴＲＩＤポリペプチドは、単位または多数回投与容器（例えば、密
封アンプルまたはバイアル）中に、水溶液または再構成用の凍結乾燥処方物とし
て貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌバイアルは、滅菌濾過され
た１％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＤポリペプチド水溶液（５ｍｌ）で満たされ、得られた
混合物は、凍結乾燥される。注入溶液は、注射用静菌水を用いて、凍結乾燥ＴＲ
ＩＤポリペプチドを再構成することによって調製される。
【０３９６】 上記のように、本発明の組成物は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて
投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得る治療剤としては、以下が挙
げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの他のメンバー、化学療
法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療
法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わせは、例えば、混合物
として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいず
れかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに
投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例え
ば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。
「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または
薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０３９７】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ、Ｔ
ＮＦ関連分子またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、それらに限定
されない：ＴＮＦ−αの可溶性形態、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−
βとしてもまた公知）、ＬＴ−β（複合体ヘテロトリマーＬＴ−α２−βにおい
て見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、
４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際出願公開番号ＷＯ９６
／１４３２８）、（国際出願公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＴＮＦ−γ−α
、ＴＮＦ−γ−β（国際出願公開番号ＷＯ００／０８１３９）、ＴＲＡＩＬ、Ａ
ＩＭ−ＩＩ（国際出願公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイン−α（国際出
願公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際出願公開番号ＷＯ９８／３０
６９４）ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（国際出願公開番号ＷＯ９８／１
８９２１）、および神経増殖因子（ＮＧＦ）および可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３
０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際出願公開番号ＷＯ９６
／３４０９５）、ＤＲ３（国際出願公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（
国際出願公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ６（国際出願公開番号ＷＯ９８
／３０６９４）、ＴＲ７（国際出願公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮ
Ｋ、ＴＲ９（国際出願公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際出願公
開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際出願公開番号ＷＯ９８／０６
８４２）およびＴＲ１２、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、
および可溶性形態ＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３。
【０３９８】 別の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）
、可溶性形態のＣＤ４０Ｌ（例えば、ＡＶＲＥＮＤTM）、ＣＤ４０Ｌの生物学的
に活性なフラグメント、改変体、または誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、ア
ゴニストの抗体またはアンタゴニストの抗体）および/または抗ＣＤ４０抗体（
例えば、アゴニストの抗体またはアンタゴニストの抗体）と組み合わされて投与
される。
【０３９９】 また別の実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５またはそ
れ以上の以下の組成物と組み合わされて投与される：ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（Ｆ
ｕｊｉｓａｗａ）、サリドマイド（例えば、Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗Ｔａｃ（Ｆｖ
）−４０（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）、ｉｎｏｌｉｍ
ｏｍａｂ（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、ＭＡＫ−１９５Ｆ（Ｋｎｏｌｌ）、ＡＳＭ−９８
１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、インターロイキン−１レセプター（例えば、Ｉｍｍｕ
ｅｘ）、インターロイキン４レセプター（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ）、ＩＣＭ３
（ＩＣＯＳ）、ＢＭＳ−１８８６６７（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉ
ｂｂ）、抗ＴＮＦ Ａｂ（例えば、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ）、ＣＧ−１０８８（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗Ｂ７モノクローナル抗体（例え
ば、Ｉｎｎｏｇｅｔｉｃｓ）、ＭＥＤＩ−５０７（Ｂｉｏ Ｔｒａｎｓｐｌａｎ
ｔ）、ＡＢＸ−ＣＢＬ（Ａｂｇｅｎｉｘ）。
【０４００】 本発明に従って、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）媒介性およびＴＲＡＩＬ媒介
性細胞死の両方に感受性の患者は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｌ相互作用を阻害
する薬剤およびＦａｓ−Ｌ／Ｆａｓ相互作用を阻害する薬剤の両方で処置され得
る。ＦａｓへのＦａｓ‐Ｌリガンドの結合をまたブロックする適切な薬剤として
は、可溶性Ｆａｓポリペプチド；可溶性Ｆａｓポリペプチドの多量体形態（例え
ば、ｓＦａｓ／Ｆｃの二量体）；アポトーシスを生じる生物学的シグナルを伝達
せずにＦａｓを結合する抗Ｆａｓ抗体；ＦａｓリガンドのＦａｓ−Ｌへの結合を
ブロックする抗Ｆａｓ−Ｌリガンド抗体；およびＦａｓを結合するが、アポトー
シスを生じる生物学的シグナルを伝達しないＦａｓ−Ｌのムテインが挙げられる
が、これらに限定されない。好ましくは本発明に従って使用される抗体は、モノ
クローナル抗体である。抗Ｆａｓモノクローナル抗体のブロックを含むＦａｓ−
Ｌ／Ｆａｓ相互作用をブロックするための適切な薬剤の例は、本明細書によって
参考として援用される国際出願公開番号ＷＯ ９５／１０５４０において記載さ
れる。
【０４０１】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、およ
び／またはプロテアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の組成
物と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン
／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビ
ン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブ
ジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）。本発
明の組成物と組み合わせて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（
ネビラピン），ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲTM（デラビルジン），およびＳＵＳＴＩＶ
ＡTM（エファビレンツ）。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るプロテア
ーゼインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲ
ＩＸＩＶＡＮTM（インディナビル），ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル），ＩＮＶＩ
ＲＡＳＥTM（サキナビル），およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル）。特
定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒ
ビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、および／またはプロテアーゼ
インヒビターを本発明の組成物と任意の組み合わせで用いて、ＡＩＤＳを処置お
よび／またはＨＩＶ感染を予防または処置し得る。
【０４０２】 他の実施形態において、本発明の組成物は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【０４０３】
【化６】 。特定の実施形態において、本発明の組成物を、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−Ｓ
ＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮ
ＥTM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTMとの任意の組み合わせにおいて使
用して、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に
処置または予防し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物をＩＳＯ
ＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／
またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTMとの任意の組み合わせにおいて用いて、日和見Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置または予防し得
る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ TM 、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMとの任意の組
み合わせにおいて用いて、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置または予防し得る。別の特定の実施形態において
、本発明の組成物は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM 、および/またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMとの任意の組み合わせにおいて用
いて、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防し得る。別の
特定の実施形態において、本発明の組成物をＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲ
ＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMとの任意の
組み合わせにおいて用いて、日和見真菌感染を予防的に処置または予防し得る。
別の特定の実施形態において、本発明の組成物をＡＣＹＣＬＯＶＩＲTMおよび／
またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMとの任意の組み合わせにおいて用いて、日和見
単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型の感染を予防的に処置または予
防し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物をＧＡＮＣＩＬＩＶＩ
ＲＴＭTMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMとの任意の組み合わせにおいて
用いて、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置または
予防し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物をＬＥＵＣＯＶＯＲ
ＩＮTM、および／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMとの任意の組み合わせにおいて用い
て、日和見細菌感染を予防的に処置または予防し得る。
【０４０４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を抗ウイルス剤と組み合わせて投
与する。本発明の組成物とともに投与され得る抗ウイルス剤としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：アシクロビル、リバビリン、アマンタジン
、およびリマンタジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）。
【０４０５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質薬剤と組み合わせて
投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得る抗生物質としては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：アモキシリン、アミノグリコシド、β−
ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェ
ニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、シプロフロキサシン、エリ
スロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、メトロニダゾール、ペニシリ
ン、キノロン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホナミド、テトラサイ
クリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファントキサゾール（ｔｒｉｍ
ｅｔｈｏｐｒｉｍ−ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびバンコマイシン
。
【０４０６】 本発明の組成物と組み合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤として
は、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ステロイド、シクロスポリン
、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、メチルプレドニゾン、プレド
ニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン、およ
び応答するＴ細胞の機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤。
【０４０７】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の組成物とともに投与され得る免疫抑制剤調製物としては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）
、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリ
ン）、ＰＲＯＧＲＡＭTM（タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴTM（ミコフェノラ
ート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ））、アザチオプリン、グルココルチコステ
ロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM （シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））。特定の実施形態において、免疫抑制剤
を使用して、器官移植または骨髄移植の拒絶を予防し得る。
【０４０８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶ
ＥＥＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTM およびＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施
形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０４０９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独で、または抗炎症剤と組
み合わせて投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤として
は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グルココルチコイドおよび非
ステロイド系抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体
、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピ
ラゾール、ピラゾロン（ｐｙｒａｚｏｌｅｎｅ）、シアル酸誘導体、チアジンカ
ルボキサミド（ｔｈｉａｚｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ｅ−アセトアミド
カプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、ア
ミキセトリン、ベンザダック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、
ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オル
ゴテイン、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキ
サール、ピフォキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプ。
【０４１０】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド療法と組み合わされ
て投与される。本発明の組成物と組み合わされて投与され得るステロイドとして
は、経口コルチコステロイド、プレドニソン、およびメチルプレドニソン（例え
ば、ＩＶメチルプレドニソロン）が挙げられるが、これらに限定されない。特定
の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニソンと組み合わされて投与さ
れる。さらに特異的な実施形態において、本発明の組成物は、プレドニソンおよ
び免疫抑制薬剤と組み合わされて投与される。本発明の組成物およびプレドニソ
ンと共に投与され得る免疫抑制薬剤は、本明細書中に記載される薬剤であり、そ
してそれらとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホス
ファミドＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。別の特定の実施形態にお
いて、本発明の組成物は、メチルプレドニソロンと組み合わされて投与される。
さらに特定の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニソロンおよ
び免疫抑制薬剤と組み合わされて投与される。本発明の組成物およびメチルプレ
ドニソロンと共に投与され得る免疫抑制薬剤は、本明細書中に記載される薬剤で
あり、そしてそれらとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびシ
クロホスファミドＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１１】 別の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤と組み合わさて投与
される。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア剤としては、ヒドロキシ
クロロキン、クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるが、これらに
限定されない。
【０４１２】 また別の実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと共に投与される
。
【０４１３】 非排他的な実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０
またはそれ以上の薬剤（以下）と組み合わされて投与される：ＮＲＤ−１０１（
Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅ
ｔｈａｉｄ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、ｍｅｃａｓｅｒ
ｍｉｎ（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ
ｄｉｓｏｄｉｕｍ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ（Ａｂｂｏ
ｔｔ）、ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、ｅｌｔｅｎａｃ（Ｂｙｋ
Ｇｕｌｄｅｎ）、ｃａｍｐａｔｈ、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤ
Ｐ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１（
ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（Ｋ
Ｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＩＬ−
１ Ｒａ遺伝子療法（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ Ｔａ
ｂａｃｃｏ）、パクリタキセル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄ
ｏｎ Ｗｈａ）、ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ（Ｗａｒｎｅｒ−
Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（ｓｙｎｃｇｅｎ；Ａｍｇｅｎ）
、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｒｅｓｅａｃｈ）、ｔｒｏｃａｄｅ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、
ＥＦ−５（Ｓｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＬＬ−２８４
（Ｂｏｅｈｒｉｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｌｅｕｋｏ Ｖａｘ（Ｉｎｆｌａｍａｔ
ｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａ
ｕ）、およびｂｕｔｉｘｏｃｏｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＷａｒｎｅｒＬａｍ
ｂｅｒｔ）。
【０４１４】 また別の実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、または
それ以上の薬物（以下）と組み合わされて投与される：メトトレキサート、スル
ファサラジン、金チオリンゴナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリン、ペ
ニシラミン、アザチオプリン、抗マラリア剤（例えば、本明細書中に記載される
）、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＮＢＲＥＬTM（Ｅｔａｎｅｒ
ｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニソロン。より好ましい実施形態にお
いて、本発明の組成物は、抗マラリア剤、メトトレキサート、抗ＴＮＦ抗体、Ｅ
ＮＢＲＥＬTM、および／またはスルファサラジンと組み合わされて投与される。
【０４１５】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキサートと組み合わさ
れて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗ＴＮＦ抗体と組
み合わされて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレ
キサートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わされて投与される。別の実施形態におい
て、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わさて投与される。別の特異
的の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキサート、抗ＴＮＦ抗体、
およびスルファサラジンと組み合わされて投与される。別の実施形態において、
本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTMと組み合わされて投与される。別の実施形態
において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTMおよびメトトレキサートと組み合
わされて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ TM 、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わされて投与される。他
の実施形態において、１以上の抗マラリア剤は、上に列挙された組み合わせの１
つと組み合わされる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア
剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、ＥＮＢＲＥＬTM、メトトレキサートおよ
びスルファサラジンと組み合わされて投与され得る。別の特定の実施形態におい
て、本発明の組成物は、抗マラリア剤（例えば、ヒドロクロロキン）、スルファ
サラジン、抗ＴＮＦ抗体、およびメトトレキサートと組み合わされて投与される
。
【０４１６】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、以下が挙げら
れるが、これらに限定されない：抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブ
レオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン（
例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗物質（例えば、フルオロウラシル、５−Ｆ
Ｕ、メトトレキセート、フロクスウリジン、インターフェロンα−２ｂ、グルタ
ミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞
傷害性薬剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシ
ンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、
プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、および硫酸ビ
ンクリスチン）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムス
チンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メ
ゲストロール、メチルテストステロン、二リン酸ジエチルスチルベストロール、
クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導
体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロラムブシル、メクロレタミ
ン（ナイトロジェンマスタード）、およびチオテパ）；ステロイドおよび組み合
わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；および他（例えば、ジカルバ
ジン、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチ
ンおよびエトポシド）。
【０４１７】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０４１８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際
公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮
増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これら
に限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【０４１９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０４２０】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療など）と組み合わせて投与される。
【０４２１】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上のケモカインと組合せ
て投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群よ
り選択されるα（ＣｘＣ）ケモカイン：γ−インターフェロン誘導タンパク質−
１０（γＩＰ−１０）、インタロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板第４因子（Ｐ
Ｆ４）、好中球活性化因子（ＮＡＰ−２）、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−
γ、好中球活性化ペプチド（ＥＮＡ−７８）、顆粒球化学誘導タンパク質−２（
ＧＣＰ−２）および間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１、すなわち前Ｂ細胞刺激
因子（ＰＢＳＦ）（ｐｒｅ−Ｂ−ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔ
ｏｒ））；および／または以下からなる群より選択されるβ（ＣＣ）：ＲＡＮＴ
ＥＳ（活性化の際にレギュレートされ、正常なＴ発現され、そして分泌される）
、マクロファージ炎症タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症
タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）、単球走化タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、
単球走化タンパク質−２（ＭＣＰ−２）、単球走化タンパク質−３（ＭＣＰ−３
）、単吸走化タンパク質−４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症タンパク質−
１γ（ＭＩＰ−１γ）、マクロファージ炎症タンパク質−３α（ＭＩＰ−３α）
、マクロファージ炎症タンパク質−３β（ＭＩＰ−３β）、マクロファージ炎症
タンパク質−４（ＭＩＰ−４／ＤＣ−ＣＫ−１／ＰＡＲＣ）、エオタキシン（ｅ
ｏｔａｘｉｎ）、ＥｘｏｄｕｓおよびＩ−３０９；および／またはγ（Ｃ）ケモ
カイン、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）と組合せて投与される。
【０４２２】 様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可
能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば
、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１
９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核
酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔
内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物また
は組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射によ
り、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通
しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与
され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化
合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し
；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けら
れた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入すること
が望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用
いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０４２３】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成
され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク
質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０４２４】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０４２５】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で
送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ
（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．
１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０
７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４
（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得
る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，
Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅ
ｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編
），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐ
ａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８
：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１
（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９
８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された徐放系は
、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要と
する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１
３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０４２６】 他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０４２７】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。
【０４２８】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、抑制および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用さ
れる正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、
そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用
量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外插さ
れ得る。
【０４２９】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）など）による抗体の取り込みおよび組織浸透（
例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０４３０】 １つの実施形態において、本発明は、標的細胞に本発明のポリペプチドを含む
組成物（例えば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグを関
連するＴＲＩＤポリペプチドまたは抗ＴＲＩＤ抗体（例えば、アゴニスト抗体ま
たはアンタゴニスト抗体）を含む組成物）を送達し、それらの表面にＴＲＩＤの
膜結合形態を発現する方法を提供する。本発明のＴＲＩＤポリペプチドまたは抗
ＴＲＩＤ抗体は、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用および／
または共有相互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロド
ラッグと係合し得る。
【０４３１】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドたは異種核酸と係合す
る本発明のポリペプチド（例えば、ＴＲＩＤまたは抗ＴＲＩＤ抗体）を投与する
ことによって、細胞に本発明の組成物を特異的に送達するための方法を提供する
。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的細胞に送達するための方
法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンス
またはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得る
かまたはエピソーム的に複製され得、そして転写され得るＤＮＡ）を標的細胞に
送達するための方法を提供する。
【０４３２】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと係合
して本発明のポリペプチド（例えば、ＴＲＩＤポリペプチドまたは抗ＴＲＩＤ抗
体）を投与することによる、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のた
めの方法を提供する。
【０４３３】 特定の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと係
合してＴＲＩＤポリペプチドまたは抗ＴＲＩＤ抗体を投与することによる、ＴＲ
ＩＤレセプターをその表面上に発現する細胞（例えば、活性化Ｔ細胞、癌細胞、
または白血病細胞）の特異的破壊のための方法を提供する。
【０４３４】 別の特定の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグ
と係合して抗ＴＲＩＤ抗体を投与することによる、ＴＲＩＤの膜結合形態をその
表面上に発現する細胞（例えば、脾臓、骨髄、腎臓およびＰＢＬ）の特異的破壊
のための方法を提供する。
【０４３５】 「毒素」とは、内因性細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位元素、ホロ毒素（
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、細胞毒（細胞毒
因子）、または細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない規定の条件下で細胞
死を引き起こす任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味
する。本発明の方法に従って使用され得る毒素には、当該分野で公知の放射性同
位元素、先天性または誘導性の内因性細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物
（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）、チミジンキナーゼ、エンド
ヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲ
ロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓ
ａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素が含まれるが、これらに限定されない。「毒素」
としてはまた、細胞増殖抑制性因子もしくは細胞殺傷性（ｃｙｔｏｃｉｄａｌ）
因子、治療剤または放射性金属イオン（例えば、αエミッター（例えば、213Ｂ
ｉ）、または、例えば103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85
Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓ
ｃ、113Ｓｎ、90Ｙｔｔｒｉｕｍ、117Ｔｉｎ、186Ｒｈｅｎｉｕｍ、166Ｈｏｌｍ
ｉｕｍ、および188Ｒｈｅｎｉｕｍのような他の放射性同位元素など）；発光標
識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよび
ローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０４３６】 当該分野で公知の技術は、本発明の標識タンパク質（抗体を含む）に適用され
得る。そのような技術は、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５
６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５
，６５２、３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；
同第５，４３５、９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２、６０
４号；同第５，２７４、１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，
８０８，００３号（これらの各々の内容は、その全体が本明細書によって参考と
して援用される））を含むがこれに限定されない。細胞毒または細胞傷害性薬剤
は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａ
ｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エ
メチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、
ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシ
ン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉ
ｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ，
１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン
、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナ
ログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトト
レキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フル
オロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメチン（ｍｅｃｈ
ｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メル
ファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホ
スファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマ
ンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロ
ロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例え
ば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物
質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、
ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ
））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）
、を含むが、それらに限定されない。
【０４３７】 「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞
傷害性化合物に変換される、非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って
使用し得る細胞傷害性プロドラッグには、安息香酸マスタードアルキル化剤のグ
ルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシン
アラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミ
ド誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０４３８】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販
売に関する政府機関による承認を表す。
【０４３９】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０４４０】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０４４１】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８
５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７
−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するため
に有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合
イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙
げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵
素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位元素（例えば、ヨウ素
（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジ
ウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミ
ノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンが挙げられる。
【０４４２】 本発明の１つの局面は、動物（好ましくは哺乳動物であり、そして最も好まし
くはヒト）における目的のポリペプチドの異常な発現に関連する、疾患または障
害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、以下：ａ）被験
体に、目的のポリペプチドに特異的に結合する、有効量の標識分子を投与（例え
ば、非経口、皮下、または腹腔内）する工程；ｂ）この投与に続いて、このポリ
ペプチドが発現する被験体の部位において、標識分子が優先的に濃縮すること（
および結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで除去されること）
を可能とする時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程
；および、ｄ）被験体において標識分子を検出する工程であって、その結果、バ
ックグラウンドレベルより上の標識分子の検出が、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することを示す、工程を
包含する。バックグラウンドレベルは、検出した標識分子の量を、特定の系に関
して先に決定した標準値と比較することを含む、種々の方法によって、決定され
得る。
【０４４３】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断画像を作成するため
に必要とされる画像化部分の品質を決定することは、当該分野において理解され
る。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体に対して、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識さ
れた抗体または抗体フラグメントは、優先的に、特定のタンパク質を含む細胞の
位置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍ
ｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍ
ｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ
．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２
））に記載される。
【０４４４】 いくつかの変数（使用される標識の型および投与の様式を含む）に依存して、
標識分子が優先的に被験体のある部位において濃縮されることを可能にし、かつ
結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで排除されるための、投与
に続く時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である
。別の実施形態において、投与に続く時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０
日間である。
【０４４５】 １つの実施形態において、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または
疾患を診断するための方法を、例えば、最初の診断の１ヵ月後、最初の診断の６
ヶ月後、最初の診断の１年後などに、繰り返すことによって、実施される。
【０４４６】 標識分子の存在は、当該分野において公知の方法を使用して、インビボ走査に
ついて、患者において検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依
存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発
明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスとしては、コンピュータ
連動断層撮影（ＣＴ）、陽電子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ）
のような全身走査、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０４４７】 特定の実施形態において、分子は放射性同位体で標識され、そして放射応答性
の外科用器具を使用して、患者において検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、分子は蛍光化合物で標
識され、そして蛍光応答性の走査機器を使用して、患者において検出される。別
の実施形態において、分子は陽電子放射材料で標識され、そして陽電子放射断層
撮像法を使用して、患者において検出される。なお別の実施形態において、分子
は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を使用して患者にお
いて検出される。
【０４４８】 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０４４９】 本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
【０４５０】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０４５１】 さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血
清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットを含む。この診断用キ
ットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である
実質的に単離された抗体、およびこの抗体に対するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド抗原の結合を検出する手段を含む。１つの実施形態では、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗
体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識化されたモノクローナル抗体を
含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化された競合抗原を
含み得る。
【０４５２】 １つの診断形態において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応される。試薬への特異的抗原抗体の結合および洗浄
による非結合血清成分の除去後、この試薬は、固体支持体上の結合された抗抗原
抗体の量に比例してレポーターを試薬に結合するように、レポーター標識抗ヒト
抗体と反応される。試薬は、再度、非結合標識抗体を除去するために洗浄され、
そして、試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、このレポー
ターは、適切な比蛍光（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質または比色基質（Ｓｉ
ｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で固相をインキュベートすることに
より検出される酵素である。
【０４５３】 上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材料（例えば、ポリマー性ビ
ーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター材料）にタ
ンパク質材料を付着するための公知の技術によって調製される。これらの付着方
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または固体支持体上の化
学反応基（例えば、活性型カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド
基）へのタンパク質（代表的には、遊離アミン基を介する）の共有結合を包含す
る。あるいは、ストレプトアビジンコーティングプレートは、ビオチン化抗原と
併用して使用され得る。
【０４５４】 従って、本発明は、本診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを提
供する。このキットは、一般に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体を含む。
【０４５５】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に価値がある。その配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得
る。さらに、染色体上の特定の部位を同定することを、現在必要とする。実際の
配列データ（繰り返し多形性）に基づく染色体作製試薬は、染色体の位置を作製
するために現状で利用可能である。本発明による、ＤＮＡの染色体へのマッピン
グは、疾患と関連する遺伝子とそれらの配列とを相関付ける際の重要な第１の工
程である。
【０４５６】 この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中において開示さ
れるｃＤＮＡを使用して、ＴＲＩＤタンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニ
ングする。このことは、一般に市販されている種々の周知の技術およびライブラ
リーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡを、インサイチュ染色体マ
ッピングのために、この目的のための周知の技術を使用して使用される。
【０４５７】 さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー
（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピング
され得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮ
Ａにおける１より多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、そ
れによって増幅プロセスは複雑にされる。次いで、これらのプライマーを、個々
のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用す
る。中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダ
イゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色体位置を
提供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプロー
ブとともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を
参照のこと。
【０４５８】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上のその配列の
物理的位置を、遺伝マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉ
ｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見られ
る。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、
連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定する。
【０４５９】 次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体の
いくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察され
ない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。
【０４６０】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照してより容
易に理解される。以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定を意図さ
れない。
【０４６１】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＲＩＤ「Ｈｉｓ標的化」細胞外形態の発
現および精製） 細菌発現ベクターｐＱＥ９（ｐＤ１０）が、本実施例において細菌発現のため
に使用される。（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ
，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生
物質耐性（「Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、Ｉ
ＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ
，Ｉｎｃ．（上述）により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−
ＮＴＡ」）親和性樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残
基をコードする６コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これ
らのエレメントは、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが
、そのポリペプチドのアミノ末端に共有結合で連結された６つのＨｉｓ残基（す
なわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置され
る。
【０４６２】 ＴＲＩＤアミノ酸配列の細胞外形態を含むか、あるいはＴＲＩＤタンパク質の
所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを
使用して、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅する。このプライマーは、ＴＲ
ＩＤタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列をコードする配列および寄託され
たｃＤＮＡにおけるＴＲＩＤタンパク質の細胞外形態の所望の部分のカルボキシ
末端配列にアニールする。ｐＱＥ９ベクターにおけるクローニングを容易にする
ための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、５’配列および３’配列にそれ
ぞれ付加する。
【０４６３】 ＴＲＩＤタンパク質の細胞外形態をクローニングするために、５’プライマー
は、配列：
【０４６４】
【化７】 （配列番号１９）を有する。これは、下線を付したＢａｍＨ２制限部位、続いて
、１８ヌクレオチドを含有する。当然、当業者は、タンパク質コード配列中にお
ける、５’プライマーが開始しそして３’プライマーが終結する地点が、全ＴＲ
ＩＤタンパク質の任意の所望の部分（成熟形態より短いまたはより長い）をコー
ドするＤＮＡセグメントを増幅するために変動され得ることを理解する。３’プ
ライマーは、配列：
【０４６５】
【化８】 （配列番号２０）を有する。これは、下線を付したＸｂａＩ制限部位、続いて、
配列番号２の細胞外ＴＲＩＤ配列のアミノ末端コード配列の１８ヌクレオチドを
含有しする。
【０４６６】 増幅されたＴＲＩＤ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ９を、Ｂａｍ
ＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして次いで、消化されたＤＮＡを共に連結する
。ＴＲＩＤ ＤＮＡの制限されたｐＱＥ９ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導性
プロモーターから下流に、かつ開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジンコドンとイン
フレームに、ＴＲＩＤタンパク質コード領域を配置する。
【０４６７】 この連結混合物は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されているような標準的な手順
を使用して、コンピテントＥ．Ｃｏｌｉ細胞に形質転換される。Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｍ１５／ｒｅｐ４株（多コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含有する。これは、ｌ
ａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr」）を与える
）が、本明細書中に記載の例示的な実施例を実施することにおいて使用される。
この株は、ＴＲＩＤタンパク質の発現に適した多くのうちの唯一の１つであり、
ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）から市販されている。形質転換体は、アンピシ
リンおよびカナマイシンの存在下におけるＬＢプレート上で増殖するそれらの能
力によって同定される。プラスミドＤＮＡは耐性コロニーから単離され、そして
クローン化ＤＮＡの正体は制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認
される。
【０４６８】 所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およ
びカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中での液体培養に
おいて、一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。このＯ／Ｎ培養物を、約１：２５〜１
：２５０の希釈で大きな培養物を接種するために使用する。細胞を、６００ｎｍ
での光学密度（「ＯＤ６００」）が０．４と０．６との間になるまで増殖させる
。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を
最終濃度１ｍＭに添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することによりｌａ
ｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞を、続けてさら
に３〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を、遠心分離により採取する。
【０４６９】 次いで、細胞を、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で４℃にて３〜４時
間撹拌する。細胞細片を、遠心分離により除去し、そしてＴＲＩＤを含有する上
清を、ニッケル−二トリロ−トリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂
カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、前出）上にロードする。６×Ｈｉｓタグを有
するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高親和性で結合し、そして単一の１工程
手順で精製され得る（例えば、詳細については、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎｉｓｔ，１９９５，ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出を参照のこと）。手短に
は、この上清を、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中のカラムにロードし、
このカラムを、第１に１０容量の６Ｍ グアニジン−ＨＣｌで洗浄し、ついで、
１０容量の６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ６）で洗浄し、そして最終的にＴＲ
ＩＤを、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ５）で溶出する。
【０４７０】 次いで、精製されたタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または
５０ｍＭのＮａアセテート緩衝液（ｐＨ６）および２００ｍＭのＮａＣｌに対し
てこれを透析することによって再生する。あるいは、このタンパク質を、首尾よ
く再折り畳みし、その間Ｎｉ−ＮＴＡカラム上で固定化する。推奨される条件は
、以下の通りである：５００ｍＭ ＮａＣｌ中の直線的な６Ｍ−１Ｍ尿素勾配、
２０％のグリセロール、プロテアーゼインヒビターを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて再生する。再生を、１．５時間以上の期間に
わたって実行するべきである。再生の後、タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾ
ールの添加によって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳに対する最終透析工程
または５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ６）緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌ
によって除去する。精製されたタンパク質を、４℃にて貯蔵するか、または−８
０℃にて凍結する。
【０４７１】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＴＲＩＤのクローニングおよび
発現） この例示的な実施例において、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂ
ｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されるように、標準的手法
を使用して、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、天然に存在する関
連分泌シグナル（リーダー）配列を含む完全タンパク質をコードするクローン化
されたＤＮＡをバキュロウイルスに挿入し、成熟ＴＲＩＤタンパク質を発現する
。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角
体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力な多角体病プロモーター、続いて都合の良
い制限酵素部位（例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。
シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位は、有効なポリア
デニル化のために使用される。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラ
スミドは、同方向の弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリア
デニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、クローン化されたポリヌクレオ
チドを発現する生存可能なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞
媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と両方の側で隣接する。
【０４７２】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０４７３】 配列番号２において示されるＡＵＧ開始コドンおよび天然に関連するリーダー
配列を含む寄託されたクローン中の全長ＴＲＩＤタンパク質をコードするＤＮＡ
配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅する。ＴＲＩＤについての５’プライマーは、配列：
【０４７４】
【化９】 （配列番号２１）を有し、この配列は、下線部のＸｂａＩ制限酵素部位を含む。
記載されたプライマーは、真核生物細胞における翻訳開始のための有能なシグナ
ル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９
８７）に記載されるような）をコードする。
【０４７５】 ＴＲＩＤについての３’プライマーは、配列：
【０４７６】
【化１０】 （配列番号２２）を有し、この配列は、下線部のＸｂａＩ制限部位を含む。
【０４７７】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲル
から単離する。次いで、このフラグメントを、上記で特定化されるような、使用
されるプライマーの各々についての適切な制限酵素で消化し、そして１％アガロ
ースゲル上で、再度、精製した。
【０４７８】 このプラスミドを、同じ制限酵素を用いて消化し、そして当該分野で公知の慣
用的な手順を使用して必要に応じて仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン化
し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲ
ルから単離する。
【０４７９】 フラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い
て互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合物で形質転換し、
そして培養プレート上に拡げる。上記で迅速に使用した酵素を用いて個々のコロ
ニーからＤＮＡを消化し、次いで、ゲル電気泳動によって消化産物を分析するこ
とによってヒトＴＮＦレセプター遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定す
る。クローン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した
。このプラスミドを、本明細書においてｐＡ２−ＴＲＩＤと称する。５μｇのプ
ラスミドｐＡ２−ＴＲＩＤを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７ （１９８７） によって記載
されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイ
ルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時トランスフ
ェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプ
ラスミドＰＡ２−ＴＮＦＲを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレ
ース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。このプレートを前後に揺らし
て新たに添加した溶液を混合する。次いで、このプレートを２７℃で５時間イン
キュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をそのプレートから除去し
、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。
培養を２７℃で４日間継続する。
【０４８０】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載さ
れたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むアガロース
ゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容易な同定
および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッセイ」の詳
細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイル
ス学のための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。適切なインキュ
ベーションの後、青色に染色したプラークを、マイクロピペッターのチップ（例
えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２
００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして組
換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播種した
Ｓｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し、次
いで４℃に貯蔵する。この組換えウイルスを「Ｖ−ＴＲＩＤ」と称する。
【０４８１】 Ｖ−ＴＲＩＤの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染効率（「ＭＯ
Ｉ」）で、組換えバキュロウイルスＶ−ＴＲＩＤで感染させる。放射標識タンパ
ク質が望まれる場合、６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステ
インを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可能）に置き換える。４２時
間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。この細胞をさらに１６時間インキュベー
トし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質ならびに細胞内タ
ンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオートラジオグラフィーによっ
て（放射性標識した場合）分析する。
【０４８２】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、成
熟タンパク質のアミノ末端配列、従って、分泌シグナルペプチドの切断位置およ
び長さを決定し得る。
【０４８３】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるＴＲＩＤのクローニングおよび発現） 代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリ
アデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コ
ザック（Ｋｏｚａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部
位およびアクセプター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、
ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、
ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細胞内エレ
メント（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。本発明を
実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴ
ＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、およびｐＢ
Ｃ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを含む。使用され得る哺
乳動物宿主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ２９３細胞、Ｈ９細胞およびジャーカ
ット細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、Ｃ
ｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、お
よびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０４８４】 あるいは、この遺伝子は、染色体に組み込まれた遺伝子を含む、安定な細胞株
中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのよう
な選択マーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた
細胞の同定および単離を可能にする。
【０４８５】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍ
ｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂ
ｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５
（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増
殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、
染色体に組み込まれた、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０４８６】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：４３８
−４４７（１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ
−エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９
８５））のフラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ
７１８の制限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺
伝子のクローニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラッ
トプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルを含
む。
【０４８７】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現プラスミドであるｐＴＲＩＤ−ＨＡを、ＴＲＩＤをコードするｃＤＮＡを
、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ，Ｉｎｃ．より入手可能）にクローニングすることによって、作製する。
【０４８８】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよ
び他の原核生物細胞中での増殖のために効果的な、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；（
２）プラスミドを含有する原核生物細胞の選択のための、アンピシリン耐性遺伝
子；（３）真核生物細胞中での増殖のためのＳＶ４０の複製起点；（４）ＣＭＶ
プロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡを、都合よ
くＣＭＶプロモーターの発現制御下に配置し得、そしてポリリンカーの制限部位
によりＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルと作動可能に連結し得
るように配置される、赤血球凝集素フラグメントをコードするいくつかのコドン
（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）、続いて終止コドンおよび
ポリアデニル化シグナル。このＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら（Ｃｅｌｌ ３７：
７６７（１９８４））によって記載されるインフルエンザ赤血球凝集素タンパク
質由来のエピトープに対応する。標的タンパク質に対するＨＡタグの融合は、Ｈ
Ａエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出および回収
を可能にする。さらに、ｐｃＤＮＡＩＩＩは、選択可能ネオマイシンマーカーを
含む。
【０４８９】 ＴＲＩＤをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域中
にクローン化し、その結果、組換えタンパク質発現を、ＣＭＶプロモーターによ
って指向する。プラスミド構築の戦略は、以下のとおりである。寄託されたクロ
ーンのＴＲＩＤｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＴＮＦレセプターの発現のため
のベクターの構築に関して、上記に十分に記載されるような都合よい制限部位を
含有するプライマーを使用して増幅する。本実施例において使用される適切なプ
ライマーとしては、以下が挙げられる。下線のＥｃｏＲＩ部位を含むＴＮＦＲ−
５の５’プライマーは、以下の配列：
【０４９０】
【化１１】 （配列番号２３）を有する。
【０４９１】 下線のＸｂａＩ部位を含む３’プライマーは、以下の配列：
【０４９２】
【化１２】 （配列番号２４）を有する。
【０４９３】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、
ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いで連結する。この連結混合物を
、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、そして形質転
換した培養物をアンピシリン培地プレート上にプレーティングし、次に、インキ
ュベートして、アンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐
性コロニーから単離し、そしてＴＲＩＤポリぺプチドコードフラグメントの存在
について制限分析または他の手段によって試験する。
【０４９４】 組換えＴＲＩＤの発現のために、上記のようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使
用して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８９））、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクトする。
細胞をベクターによるＴＲＩＤの発現のための条件下でインキュベートする。
【０４９５】 ｐＴＲＩＤ−ＨＡ融合タンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降（例え
ば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）に記載される方法を使用する）によって検出する。この目的のため
に、トランスフェクションの２日後、この細胞を35Ｓ−システインを含有する培
地中で８時間インキュベーションすることによって標識する。この細胞および培
地を収集し、そして細胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液（上記
に引用されるＷｉｌｓｏｎらに記載されるような、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％
ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０
ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５）を用いて溶解する。タンパク質を細胞溶解物、
および培養培地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用して沈殿する。次に
、沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによっ
て分析する。予想されたサイズの発現産物が細胞溶解物中に見出される。この予
想されたサイズの発現産物は、ネガティブコントロール中では見られない。
【０４９６】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４をＴＲＩＤポリぺプチドの発現のために使用する。プラスミド
ｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘
導体である。このプラスミドが、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤ
ＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされた、ジヒドロ
葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を、化学治療剤
メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）において細胞を増殖することによって選択し得る。メトトレ
キサート（ＭＴＸ）耐性の細胞中のＤＨＦＲ遺伝子の増幅が、十分に証明されて
いる（例えば、Ａｌｔ．Ｆ．Ｗ．，Ｋｅｌｌｅｍｅｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｅｒｔｉ
ｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，
Ｃ．、１９９０ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７
：１０７−１４３；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、１
９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８を参照のこと）。漸増濃
度のＭＴＸ中の細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素であ
るＤＨＦＲの過剰発現による薬物の耐性をもたらす。第２の遺伝子が、ＤＨＦＲ
遺伝子と連結している場合、その遺伝子は、通常、同時に増幅され、そして過剰
発現される。このアプローチを使用して、１，０００コピーを超える増幅した遺
伝子のコピーを保有する細胞株を開発することは、当該分野において公知である
。引き続いて、メトトレキサートが取り除かれた場合、宿主細胞の１つ以上の染
色体中に組み込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞株を得る。
【０４９７】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：４３８−４４７（１９８５）
およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサーより
単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜５３０
（１９８５））を含有する。プロモーターの下流は、遺伝子（ＢａｍＨＩ、Ｘｂ
ａＩ、およびＡｓｐ７１８）の組み込みを可能とする単一の制限酵素切断部位に
続く。これらのクローニング部位の後に、このプラスミドは、ラットプレプロイ
ンシュリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効
率プロモーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒトβ−アクチン
プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたは後期プロモーター、あるいは他
のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｔｅｔ−Ｏｆｆ遺伝子発現系およびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系
ならびに同様の系を使用して、哺乳動物細胞において調節された方法でＴＲＩＤ
レセプターポリぺプチドを発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ
，Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５
５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のための他のシグナル（例え
ば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）もまた同様に使用され得る。
染色体中に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、ｇｐｔ、
Ｇ４１８またはハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフ
ェクションの際に選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、
Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有利である。
【０４９８】 プラスミドｐＣ４を以下の概説される用にＴＲＩＤを増幅するために使用され
る特異的プライマーに適切な制限酵素を用いて消化し、次いで、当該分野におい
て公知の手順によって、仔ウシ小腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。
次いで、ベクターを１％アガロースゲルより単離する。
【０４９９】 ＴＲＩＤポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列を、遺伝子の所望の部分の５’
および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅
する。
【０５００】 下線のＸｂａＩ部位を含むＴＲＩＤの５’プライマーは、以下の配列：
【０５０１】
【化１３】 （配列番号２５）を有する。
【０５０２】 下線のＸｂａＩ部位を含む、ＴＲＩＤの３’プライマーは、以下の配列：
【０５０３】
【化１４】 （配列番号２６）を有する。
【０５０４】 増幅したフラグメントを、処理された制限部位（単数または複数）を切断する
エンドヌクレアーゼＳｍａＩで消化し、次いで１％アガロースゲルで再び精製す
る。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクターをＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−
１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば、制限酵素分析を使用してプラス
ミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０５０５】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェ
クチング方法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐ
ＳＶ２−ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。このプラスミドｐＳＶ２−
ｎｅｏは優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵
素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この細胞をトリプシン
処理し、１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／
ｍｌ Ｇ４１８を補充したα−ＭＥＭにおいてハイブリドーマクローニングプレ
ート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。約１０〜１４日培養後
、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（
５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６
ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトト
レキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、
２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。
同じ手順を、１００μＭ〜２００μＭの濃度で増殖するクローンを得るまで繰り
返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン
ブロット分析によってか、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０５０６】 （実施例４：ＴＲＩＤのタンパク質融合物） 本発明のＴＲＩＤポリぺプチドは、必要に応じて他のタンパク質に動作可能に
融合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用のために使用され得る。例
えば、ＴＲＩＤポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧ
ドメイン、およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（Ｅ
Ｐ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８
４−８６（１９８８）もまた参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、
およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。ＴＲＩＤポリ
ぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に標的
化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク
質の活性を増大または減少し得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を
有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質
と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上
記の融合タンパク質の全ての型は、当該分野で高ちの技術を使用するか、または
ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する以下のプロトコルを使用するかま
たは慣用的に改変することによって作製され得る（配列番号２７）。
【０５０７】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、配列番号２７の５’および３’末端
にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーはまた
、好ましくは、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクロー
ニングを容易にする都合の良い制限酵素部位を含む。
【０５０８】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）発現ベクターが使用される場合
、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨ
Ｉ部位が破壊されることに注意のこと。次いで、ヒトＦｃ部分を含むベクターが
、ＢａｍＨＩで再制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載するＰ
ＣＲプロトコルによって単離されたＴＲＩＤポリヌクレオチドが、このＢａｍＨ
Ｉ部位に連結される。このポリヌクレオチドが、終止コドンなしにクローン化さ
れ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。
【０５０９】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含
むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０５１０】 （実施例５：ＴＲＩＤの細胞外ドメインは、細胞傷害性リガンド−ＴＲＡＩＬ
に結合し、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスを遮断する） 上記で議論したように、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
リガンドファミリーに属する細胞傷害性リガンドであり、そして多くの形質転換
された細胞株の急速な細胞死を誘導するが、両方の細胞型で発現される死ドメイ
ン含有レセプター（ＤＲ４）にもかかわらず、正常組織の細胞死は誘導しない。
本実施例は、「細胞内ドメインを含まないＴＲＡＩＬレセプター」または「ＴＲ
ＩＤ」と称されるアンタゴニストおとり（ｄｅｃｏｙ）レセプターを同定し、こ
れはまた、ＴＲＡＩＬに結合し、そして正常組織の耐性表現型を部分的に説明し
得る。すなわち、ＴＲＩＤ（拮抗レセプター）は、ＴＲＡＩＬに結合しかつ分離
するが、細胞内シグナルを伝達し得ない。
【０５１１】 ＴＲＩＤおよびＤＲ４の細胞外リガンド結合システインリッチドメインの類似
性を仮定して、本発明者らは、ＴＲＩＤもまたＴＲＡＩＬに結合すると理論付け
た。これを確かめるために、ＴＲＩＤの可溶性細胞外リガンド結合ドメインを、
ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃ部分ヘの融合物として発現させた。
【０５１２】 図５Ａに示されるように、ＴＲＩＤ−ＦｃはＴＲＡＩＬに特異的に結合したが
、関連する細胞傷害性リガンドＴＮＦαには結合しなかった。この実験において
、ＴＲＩＤ、ＤＲ５、ＤＲ４、またはＴＮＦＲ１のＦｃ細胞外ドメインおよび対
応するリガンドを調製し、そしてＰａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１１（
１９９７）に記載されるように結合アッセイを行った。それぞれのＦｃ融合物を
プロテインＧ−セファロースと共に沈降させ、共沈澱した可溶性リガンドを抗Ｆ
ｌａｇ（Ｂａｂｃｏ）または抗−ｍｙｃ−ＨＲＰ（ＢＭＢ）を用いて免疫ブロッ
ティングにより検出した。図５Ａの下部パネルは、結合アッセイにおいて存在す
るインプットＦｃ融合物を示す。
【０５１３】 さらに、ＴＲＩＤ−Ｆｃは、ＴＲＡＩＬのアポトーシスを誘導する能力を遮断
した（図５Ｂ）。ＭＣＦ７細胞を、等量のＦｃ融合物またはＦｃ単独の存在下で
可溶性ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。６時間後、細胞を固定し、
そしてＰａｎら（同上）に記載されるように試験した。図５Ｂに示されるデータ
（平均値±ＳＤ）は、計数された全ての核（ｎ＝４）の中のアポトーシス核の割
合である。
【０５１４】 さらに、ＴＲＩＤ−Ｆｃは、ＴＮＦＲ１−Ｆｃが完全にＴＮＦα殺傷を廃止す
る条件下で、ＴＮＦα誘導アポトーシスに効果を有さない（図５Ｃ）。ＭＣＦ７
細胞を等量のＦｃ融合物またはＦｃ単独の存在下でＴＮＦα（４０ｎｇ／ｍｌ；
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）で処理した。核を染色して、１１〜１５時間後に
試験した。
【０５１５】 （実施例６：ＴＲＩＤは、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスから細胞を保護する） 図６に示されるように、ＴＲＩＤを発現する細胞は、ウイルスにコードされる
カスパーゼインヒビターＣｒｍＡを発現する細胞と同様に、ＴＲＡＩＬ誘導アポ
トーシスから保護される。
【０５１６】 細胞内シグナル伝達ドメインの非存在を仮定して、ネイティブのＴＲＩＤは、
それ自身ＴＲＡＩＬ誘導細胞死を同様に減弱し得るようであった。ことことは、
ＴＲＡＩＬ感受性細胞（ＭＣＦ７）におけるネイティブＴＲＩＤの過剰発現がそ
れらをＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスから保護するかどうかを問うことによって確
認される。自身によるＴＲＩＤの過剰発現は、アポトーシスを誘導しなかった。
しかし、細胞がＴＲＡＩＬに曝露される場合、ＴＲＩＤを発現する細胞は、ウイ
ルスにコードされるカスパーゼインヒビターＣｒｍＡを発現する細胞と同様に、
ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスから保護された（図６）。
【０５１７】 ＭＣＦ７細胞をＴＲＩＤで、またはｂ−Ｇａｌレポーター構築物と共にＣｒｍ
Ａ発現構築物もしくはベクター単独でトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョンの２４時間後、ＴＲＡＩＬを５０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌで加え
た。６時間後、以前に記載されたように（Ａ．Ｍ．Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃ
ｅｌｌ ８１，５０５−１２（１９９５）；Ｍ．Ｐ．Ｂｏｌｄｉｎら、Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：７７９５−８（１９９５）；Ｆ．Ｃ．Ｋｉｓｃｈｋｅ
ｌら、ＥＭＢＯ １４，５５７９−５５８８（１９９５））、細胞をＸ−ｇａｌ
で染色し、そして顕微鏡で調べる。
【０５１８】 ひとまとめにしてこれらの発見は、正常組織が、構成的に発現されるＴＲＡＩ
Ｌの潜在的な有害効果に耐えることを可能にする、ＴＲＩＤについての防御的役
割と一致する。
【０５１９】 ＴＲＡＩＬのレセプターとしてのアンタゴニストおとりレセプターＴＲＩＤの
新しい同定は、ＴＲＡＩＬ開始シグナル変換の生物学にさらなる複雑さを加える
。
【０５２０】 （実施例７：抗体の産生） （Ａ．ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ａｕｓｕｂｅｌら編、
１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＩｎｃＮｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、ＴＲＩＤを発
現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投
与される。好ましい方法において、ＴＲＩＤタンパク質の調製物が調製され、そ
して精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、より
大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、このような調製物は、
動物に導入される。
【０５２１】 ＴＲＩＤに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用
して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）
；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋ
ｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａ
ｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−
６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくは、マウス）をＴＲＩＤポリ
ぺプチドで免疫するか、またはより好ましくは、分泌ＴＲＩＤポリぺプチド発現
細胞で免疫する。このようなポリペプチド発現細胞を、任意の適切な組織培養培
地（好ましくは、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そし
て約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および
約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培
地）において培養する。
【０５２２】 このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株と融合す
る。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、
ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好まし
い。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持
し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−
２３２（１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。次いで、このような選択を介して得られるハイブリドーマ細胞を、ＴＲＩＤ
ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイす
る。
【０５２３】 あるいは、ＴＲＩＤポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可
能であるという事実を使用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使
用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾
細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ
細胞を、抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力がＴＲＩＤによってブロッ
クされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングする。この
ような抗体は、ＴＲＩＤタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を
含み、そして動物を免疫してさらなるＴＲＩＤタンパク質特異的抗体の形成を誘
導するために使用され得る。
【０５２４】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体を「ヒト化」する。このよう
な抗体を、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する
遺伝的構築物を使用することによって産生し得る。キメラ抗体およびヒト化抗体
を産生するための方法は当該分野で公知であり、以下に議論される（総説につい
ては、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏ
ｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙ
ら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４
９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ
８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎ
ｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０５２５】 （Ｂ．ｓｃＦｖｓのライブラリーからの本発明のポリぺプチドに対する抗体フ
ラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、本発明のポリペプチドに
対する反応性を含む抗体フラグメントの大きなライブラリーに構築する。このポ
リペプチドは、ドナーが曝露されていてもよいし、曝露されていなくてもよい（
例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書中に
援用される）を参照のこと）。
【０５２６】 （ライブラリーのレスキュー） ＰＣＴ公開第ＷＯ ９２／０１０４７号に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡ
からｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファー
ジをレスキューするため、ファージミドを保有する約１０9 Ｅ．ｃｏｌｉを用
いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に播種し、そして振盪しながら
０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×
ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに播種し、２×１０8ＴＵの遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３遺
伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）を添加し、そ
して培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しなが
ら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ
．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍ
ｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、
そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号に記載
のように調製する。
【０５２７】 Ｍ１３遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３遺伝子ＩＩＩヘルパーフ
ァージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグメン
トを提示するファージ（ファージミド）は、抗原へのより大きい結合アビディテ
ィーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給す
るｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させること
により、感染性Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで３７℃
で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらなる時間インキュ
ベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．ｐ．ｍ．
で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナ
マイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００ｍｌ中
に再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ粒子を、２
回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））により培養培地から精製および濃縮し、２ｍ
ｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ
ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13形質導入単位／ｍｌ（アン
ピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０５２８】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、ＴＲＩＤポリぺプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをそのチューブに適用
し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次い
でさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミ
ンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを
溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分
間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期
のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、そのＥ．ｃｏｌｉを１％グルコ
ースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレー
ティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のように遺伝子ＩＩ
Ｉヘルパーファージでレスキューし、引き続く回の選択のためのファージを調製
する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、
３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２
０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
【０５２９】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリぺプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣ
Ｒフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号を
参照のこと）、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０５３０】 （実施例８：ＴＲＩＤ ｍＲＮＡ発現の組織分布） ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）によって記載される
方法を用いて、ヒト組織におけるＴＲＩＤ遺伝子発現を調べた。ＴＲＩＤタンパ
ク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉ
ｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて32Ｐで標識する。標識後、プローブを、
ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って用
いて精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をＴＲ
ＩＤ ｍＲＮＡについて調べる。
【０５３１】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む複数組織のノーザ
ン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から
入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って用いて標識プロ
ーブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウン
トし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標準的な手順
に従って現像する。ＴＲＩＤの発現は、多くの正常なヒト組織（例えば、心臓、
脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、末梢血白血球（ＰＢＬ）、リン
パ節、骨髄、および胎児肝臓）において検出されたが、ほとんどの形質転換ガン
細胞株においては検出されなかった。
【０５３２】 ＴＲＩＤの発現はまた、以下の癌細胞株におけるノーザンブロットによってア
ッセイされ、そしてＳＷ４８０およびＨｅｌａ細胞Ｓ３においてのみ検出された
：ＨＬ６０（前骨髄球白血球）、Ｈｅｌａ細胞Ｓ３、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血
病）、ＭＯＬＴ４（リンパ芽球性白血病）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、
ＳＷ４８０（結腸直腸腺癌）、Ａ５４９（肺癌）、およびＧ３６１（黒色腫）。
【０５３３】 （実施例９：ＴＲＩＤ遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者からＲＮ
Ａを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知の
プロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版；Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）を参照のこと）。次に、このｃＤ
ＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲの
テンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，
Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝溶液を使用
し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７０℃で６０
〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０５３４】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ＴＲＩＤの選択
したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分
析してその結果を確認する。次に、ＴＲＩＤに疑わしい変異を有するＰＣＲ産物
のクローン化および配列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
【０５３５】 ＴＲＩＤのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ Ｍ．
Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９
９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕ
ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個
体を、非罹患個体には存在しないＴＲＩＤにおける変異により同定する。
【０５３６】 ゲノム再配置もまた、ＴＲＩＤ遺伝子における改変を決定する方法として観察
する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−
ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニ
ックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９（１９９１）に記載のようにＦＩＳＨを行
う。ＴＲＩＤゲノム遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのために、大過
剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブリダイゼーション
を行う。
【０５３７】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピングの
ための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐ
ｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィルター
（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５
（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および染色体部
分長測定を行う。（プローブがハイブリダイズした）ＴＲＩＤゲノム領域の染色
体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これらのＴＲＩＤの変化を関
連疾患の診断マーカーとして使用する。
【０５３８】 （実施例１０：生物学的サンプル中の異常レベルのＴＲＩＤを検出する方法） ＴＲＩＤポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＴＲＩＤの
上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表現型のマーカー
である。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下のアッセイをそれ
らの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【０５３９】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＴＲＩＤを検出する。マイクロタイタープレートのウェルを
、ＴＲＩＤに特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティン
グする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって
、実施例１０に記載の方法により産生される。ウェルに対するＴＲＩＤの非特異
的結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０５４０】 次に、コーティングしたウェルを、ＴＲＩＤ含有サンプルを用いて室温で２時
間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用して結
果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗浄し
、非結合ＴＲＩＤを除去する。
【０５４１】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０５４２】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートし、基質を切断する。蛍光をマイクロタイタープレートリーダーにより
測定する。コントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そし
てＸ軸（対数スケール）にＴＲＩＤポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（線形スケ
ール）に蛍光または吸光度をプロットする。次いで、標準曲線を用いてサンプル
中のＰＲＩＤポリペプチド濃度を、そのサンプルの測定された蛍光に基づいて補
間する。
【０５４３】 （実施例１１：ＴＲＩＤのレベルを低下させる方法） 本発明は、体内におけるＴＲＩＤ活性のレベルを低下させる必要のある個体を
処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＴＲＩＤアンタゴニスト
を含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明において使用
するための好ましいアンタゴニストは、ＴＲＩＤ特異的抗体である。
【０５４４】 さらに、アンチセンス技術を使用して、ＴＲＩＤの産生を阻害する。この技術
は、様々な病因（例えば、癌）に起因する、ＴＲＩＤポリペプチド、好ましくは
可溶性および／または分泌形態のレベルを増加させる方法の一例である。
【０５４５】 例えば、ＴＲＩＤのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセン
スポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋ
ｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、７
日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。
【０５４６】 （実施例１２：ＴＲＩＤのレベルを低下させる方法） 本発明は、体内におけるＴＲＩＤ活性のレベルを低下させる必要のある個体を
処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＴＲＩＤアンタゴニスト
を含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明において使用
するための好ましいアンタゴニストは、ＴＲＩＤ特異的抗体である。
【０５４７】 さらに、個体におけるＴＲＩＤの標準または正常発現レベルの増加により引き
起こされる状態は、ＴＲＩＤを、好ましくは可溶性および／または分泌形態で投
与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＴＲＩ
Ｄポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は
、このような個体に、このような個体でＴＲＩＤの活性レベルを増加させる量の
可溶性ＴＲＩＤを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０５４８】 例えば、ＴＲＩＤポリペプチドのレベルが増加した患者は、ポリペプチドを、
１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペ
プチドは可溶性および／または分泌形態である。
【０５４９】 （実施例１３：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、可溶性および／または成熟ＴＲＩＤポリペプチド
を発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、
皮膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、
小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約１０片を
各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放
置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定
させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびス
トレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコ
を３７℃で約１週間インキュベートする。
【０５５０】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。
【０５５１】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
【０５５２】 ＴＲＩＤをコードするｃＤＮＡを、実施例１に記載のそれぞれ５’および３’
末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’
プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部
位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅した
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在
下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するのに適した
条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する
。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングし、ベクターが正
確に挿入されたＴＲＩＤを有することを確認する。
【０５５３】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベ
ッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増
殖させる。次に、ＴＲＩＤ遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパ
ッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞は
、ＴＲＩＤ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージン
グ細胞をプロデューサー細胞という）。
【０５５４】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させ
る。線維芽細胞のコンフルエント未満のプレートから培地を除去し、そしてプロ
デューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新
鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞
が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓ
のような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要で
ある。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、ＴＲＩ
Ｄタンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０５５５】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
【０５５６】 （実施例１４：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ＴＲＩＤポリペプチド
の発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ＴＲＩＤ配列の導入に関する。ＴＲＩＤ
ポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるＴＲＩＤポリペプチ
ドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。こ
のような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知である。例
えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２
２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ Ｈ．ら（
１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：４７０−４７９；Ｃｈａｏ
Ｊら（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５：５１７−５２２；Ｗｏｌ
ｆｆ Ｊ．Ａ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３１４−３１８
（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：４０５−
４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４
：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参
照のこと。
【０５５７】 ＴＲＩＤポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞へ送達する
任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間隙空間への
注射）によって送達され得る。ＴＲＩＤポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受
容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０５５８】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、
ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む）
も含まない配列をいう。しかし、ＴＲＩＤポリヌクレオチドはまた、リポソーム
処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．７７２：１２６〜１３９（１９９５）、およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂら、Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｅｌｌ８５（１）：１〜７（１９９５）に教示されるようなもの）の
形態で送達され得、そして、当業者に周知の方法によって調製され得る。
【０５５９】 この遺伝子治療方法において使用されるＴＲＩＤポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含ま
ない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現
を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列
を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド
合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入され
て、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示さ
れた。
【０５６０】 ＴＲＩＤポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）
の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（
器官組織の細網線維、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織における
コラーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔
中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネル
のリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下
に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注入
によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非
分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は
、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または
皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレ
オチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【０５６１】 裸のＴＲＩＤポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬
量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好まし
くは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そ
してより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろ
ん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する
。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そし
て処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間
隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用い
られ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜へ
の送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＴＲＩＤポ
リヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテ
ーテルによって動脈に送達され得る。
【０５６２】 インビボでの筋肉における注入ＴＲＩＤポリヌクレオチドの用量応答効果を、
以下のようにして決定する。ＴＲＩＤのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生
成のための適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する
。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとし
て使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、
マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【０５６３】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＴＲＩＤ鋳型ＤＮＡを、０．１ｍ
ｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって
、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで
注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮
膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
【０５６４】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｔ
ＲＩＤタンパク質発現について組織化学的に染色する。ＴＲＩＤタンパク質発現
についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取するこ
と以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のＴＲＩＤ ＤＮＡの持続性
を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩ
ＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおけ
る上記実験の結果を、ＴＲＩＤ裸のＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物におい
て適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するために使用し得る。
【０５６５】 （実施例１５：Ｂ細胞増殖および分化のアッセイ検出刺激または阻害） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性、増殖、分化、ホーミング
、耐性、および細胞死を誘導し得る。Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究され
たクラスの１つがＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリー内で、ＣＤ
４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４
、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に種々の免疫応答を調節することが見出されて
いる。これらのＢ細胞集団およびそれらの前駆細胞の増殖および分化の検出およ
び／または観察を可能にするアッセイは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集
団上に、増殖および分化の点で有し得る効果を決定する際に価値のあるツールで
ある。以下に列挙するのは、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、ま
たは阻害の検出を可能にするように設計された２つのアッセイである。
【０５６６】 （実験手順） （インビトロアッセイ）−本発明の精製されたＴＲＩＤポリペプチド、または
それらの短縮化形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖
、分化もしくは阻害および／または細胞死を誘導する能力について評価する。精
製したヒト扁桃腺Ｂ細胞でのＴＲＩＤタンパク質の活性（定性的に０．１〜１０
，０００ｎｇ／ｍＬの用量範囲にわたって測定した）を、標準的なＢリンパ球同
時刺激アッセイにおいて評価する。このアッセイでは、精製した扁桃腺Ｂ細胞を
、プライミング因子として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のい
ずれかの存在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナル
は、トリチウム化チミジン取り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架
橋と協同してＢ細胞増殖を誘発する。新規な協同因子を、このアッセイを用いて
容易に同定し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）
枯渇によりヒト扁桃腺Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、
ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価する場合、９５％のＢ細胞より大きい
。種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ βＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のＳＡＣを
含有するＲＰＭ１６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０5Ｂ細胞を
添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、3Ｈ−チミ
ジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量する
。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地であ
る。
【０５６７】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または２ｍｇ／
ｋｇのＴＲＩＤタンパク質、またはそれらの短縮形態を、１日２回注射（ｉ．ｐ
．）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠殺し
、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正常な脾臓およびＴＲ
ＩＤタンパク質で処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞でのこ
のＴＲＩＤタンパク質の活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘の拡散および
／または赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ細胞集団の
分化および増殖の活性化を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカーである、抗
ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞への任
意の生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤す
る漠然と規定されたＢ細胞区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定す
る。
【０５６８】 ＴＲＩＤタンパク質で処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析
を用いて、このＴＲＩＤタンパク質が、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）
ｄｕｌｌ Ｂ細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特異的に増
加するか否かを示す。
【０５６９】 同様に、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価が相対的に増加である。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを緩衝液
処置マウスとＴＲＩＤタンパク質処置マウスとの間で比較する。
【０５７０】 本実施例において記載する試験は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験した。し
かし、当業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤ
のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示す
る研究を容易に改変し得る。
【０５７１】 （実施例１８：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして3Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、コ
ートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆｉｃｏｌ
ｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離により単離し、そしてＴＲＩＤタンパク質（２
００μｌの全容積）の種々の濃度での存在下で、１０％胎児ウシ血清、約１，０
００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを
含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプレートの４通りのウェル（５×１０ 4 ／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）。関連するタンパク質緩衝液および
培地単独がコントロールである。３７℃での培養の４８時間後、プレートを１０
００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００μｌの上清を除去し、そして、増殖
への効果が観察される場合、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のため
に−２０℃で貯蔵した。ウェルに０．５μＣｉの3Ｈチミジンを含有する１００
μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し
、そして3Ｈチミジンの取り込みを増殖の指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増
殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強
するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体を
ＴＲＩＤタンパク質の効果についての陰性コントロールとして用いる。
【０５７２】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験した。
しかし、当業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲＩＤのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを試験するために、例示す
る研究を容易に改変し得る。
【０５７３】 （実施例１７：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化へのＴＲＩＤの効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。
【０５７４】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、ＴＲＩＤまたはＬＰ
Ｓ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび０
．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の
適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体とと
もに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦ
ＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリー
により分析する。
【０５７５】 （サイトカインの生成への効果） 樹状細胞により生成されるサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免
疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応
答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘
導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞
（１０6／ｍｌ）を、ＴＲＩＤの漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１
００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして細胞培養に添加する。次いで、細
胞培養からの上清を収集し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量に
ついて分析する。キットに提供される標準的プロトコールを用いる。
【０５７６】 （ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果） 細胞表面抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、
およびＦｃレセプターが、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および
他の同時刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−Ｉ）の発現の調節は、単球の
抗原提示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセ
プターの発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の
改善と相関し得る。
【０５７７】 ＦＡＣＳ分析は、以下のような表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、ＴＲＩＤまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日処理し
、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、
次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モ
ノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄
後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での
フローサイトメトリーにより分析する。
【０５７８】 （単球活性化および／または生存の増加） 単球を活性化する（あるいは、不活化する）および／または単球の生存を増加
する（あるいは、単球生存を低下させる）分子についてのアッセイは、当該分野
で公知であり、そして本発明の分子が単球のインヒビターまたはアクチベーター
として機能するか否かを決定するために慣用的に適用され得る。ＴＲＩＤ、ＴＲ
ＩＤのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用い
てスクリーニングされ得る。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核
細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分
離により、単一のドナーｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒ
ｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルトリ
エーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉ
ａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離する。
【０５７９】 （１．単球生存アッセイ） ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培養した場合、次第に生
存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（アポトーシス）から生じ
る。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的に、細胞生存を改善し
、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（ＰＩ）染色を用いて、
以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α
（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の濃度の化合物の存在下
で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コントロール）中で、４８時
間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有するＰＢＳ中で２×１
０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の前に５分間室温でイン
キュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムにおけるＤＮＡの断片化
と相関することを示している。
【０５８０】 （２．サイトカイン放出への影響） 単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカインの放出を通じた
免疫系の他の細胞集団への調節活性である。サイトカイン放出を測定するための
ＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。ヒト単球を、５×１０5細胞／ｍｌの密
度で、ＴＲＩＤの漸増する濃度とともに、および同じ条件下でこのポリペプチド
の非存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の生成については、この細胞を
、ＴＲＩＤの存在下でＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、
ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして
使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およ
びＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用い、そしてキットに提供される標準的プ
ロトコールを適用して実施する。
【０５８１】 （３．酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）） 精製した単球を９６ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレート
する。ＴＲＩＤの漸増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １
６４０＋１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のイン
キュベーション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。
マクロファージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（
１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍ
Ｍデキストロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰ
Ｏ）を、刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３
７℃で２時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯ
Ｈを添加して反応を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより
生成されるＨ2Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準曲線
をそれぞれの実験について実施する。
【０５８２】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験した。
しかし、当業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
のアゴニストの活性および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例
示する研究を容易に改変し得る。
【０５８３】 （実施例１８：血管内皮細胞の増殖へのＴＲＩＤの効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０4細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。配列番号２んおＴＲＩＤタンパク質および陽性コントロール（例え
ば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する。４日
目および６日目に、培地を除去する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ
を用いて細胞数を決定する。
【０５８４】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、ＴＲＩＤが血管内皮細胞を増殖し得ることを示す
。
【０５８５】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤの活性を試験した。しかし、当
業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤの
アゴニストおよび／またはアンタゴニストを試験するために、例示する研究を容
易に改変し得る。
【０５８６】 （実施例１９：血管内皮細胞の増殖へのＴＲＩＤの刺激効果） 増殖因子の分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ165または０．５％ＦＢＳ中のＴ
ＲＩＤ）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（１：
０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートさ
せ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸収を測定する。コント
ロールウェル（培地あり、細胞なし）のバックグラウンドの吸収を差し引きし、
そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施する。Ｌｅａｋら、
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１２〜５１８（１
９９４）を参照のこと。
【０５８７】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験した。
しかし、当業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲＩＤアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示す
る研究を容易に改変し得る。
【０５８８】 （実施例２０：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ組み込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖するコンフルエント未満の静止期細胞を、Ｃ
ＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２４
時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液へ
の曝露後、ビオチン化マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を顕微
鏡試験のために標本にし、そしてＢｒｄ Ｕｒｄ−陽性細胞を計数する。Ｂｒｄ
Ｕｒｄ係数は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞の割合として計算され
る。さらに、個々の細胞について、明野照明および暗野ＵＶ蛍光照明の同時使用
により、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出
を実行する。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（３
６）：２１９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと。
【０５８９】 本実施例において記載した研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。し
かし、当業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、Ｔ
ＲＩＤのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、
例示する研究を容易に改変し得る。
【０５９０】 （実施例２１：内皮遊走の刺激） 本実施例は、ＴＲＩＤがリンパ性の内皮細胞遊走を刺激し得る可能性を探索す
るために用いられる。
【０５９１】 内皮細胞遊走アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗ．，Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｈ．Ｊ．，およびＬｅｏｎａｒｄ，Ｅ，Ｊ．「Ａ
４８ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆ
ｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３：２３９〜２４７）。ポリビニルピロリドン
を含まないポリカーボネートフィルター（これは８μｍの孔径を備える）（Ｎｕ
ｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも
６時間０．１％ゼラチンでコートし、そして滅菌空気のもとで乾燥する。０．２
５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＭ１９９中で試験物質を適切な濃
度に希釈し、そして２５μｌの最終希釈を改変Ｂｏｙｄｅｎ装置の底部チャンバ
に置く。コンフルエント未満の、早期継代（２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥ
Ｃ培養物を洗浄し、そして細胞の脱離に必要な最小の時間トリプシン処理する。
底部チャンバと上部チャンバとの間のフィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含
有する５０μｌ Ｍ１９９中に懸濁した２．５×１０5細胞を上部コンパートメ
ントに播種する。次いでこの装置を、５％ＣＯ２を用いて湿潤にしたチャンバ中
で３７℃で５時間インキュベートして細胞を遊走させた。インキュベーション期
間後、このフィルターを取り出し、そして非遊走細胞を有するフィルターの上部
側をゴム性のポリスマン（ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターを
メタノールで固定し、そしてＧｉｅｍｓａ溶液で染色する（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃ
ｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ，ＩＬ）。遊走は、それぞれのウェ
ルにおいて、３つの無作為の高出力視野（４０×）の細胞を計数することにより
定量する。そしてすべての群を４連で実行する。
【０５９２】 本実施例において記載した研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。し
かし、当業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、Ｔ
ＲＩＤのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、
例示する研究を容易に改変し得る。
【０５９３】 （実施例２２：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激） 血管内皮による一酸化窒素の放出は、血管内皮弛緩の介在物質であると考えら
れている。従って、ＴＲＩＤの活性は、ＴＲＩＤに応答する内皮細胞による一酸
化窒素産生を測定することによってアッセイされ得る。一酸化窒素を、２４時間
の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（例えば、ＶＥＧＦ−１）お
よびＴＲＩＤへの４時間の曝露の後のコンフルエントな微小血管内皮細胞の９６
ウェルプレート中で測定する。培地中の一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用
により定量して、硝酸還元酵素による一酸化窒素由来の硝酸の還元後の亜硝酸の
総量を測定する。一酸化窒素放出の際のＴＲＩＤの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて
試験する。
【０５９４】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。ＮＯエレメン
トの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ2＋２ＫＩ＋２Ｈ2ＳＯ4６２ＮＯ＋Ｉ2＋２Ｈ2Ｏ＋Ｋ2ＳＯ4 検量線を、ＫＩおよびＨ2ＳＯ4を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ2（
０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添
加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オーセン
ティックなＮＯ気体からのＮＯを測定することにより、事前に決定する。この培
養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食
塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５ｍｌのろ過した
Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プレートを、３７
℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブをウェルに垂直
に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面の２ｍｍ下で保
持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽性コントロール
として用いる。放出したＮＯの量を、１×１０6内皮細胞あたりのピコモル濃度
として表す。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数）における４〜６
の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこと。
【０５９５】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。
【０５９６】 （実施例２３：新脈管形成における索形成に対するＴＲＩＤの効果） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合の微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【０５９７】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代）としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５継
代で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養プ
レートのウェルをＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ
Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００μｌ／ウェル）を用いて、３７℃にて３
０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、７，５００細胞／ウェルでコートしたウェ
ルに播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、このＧｒ
ｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液またはＴＲＩＤ（０．１〜１０
０ｎｇ／ｍｌ）を含む３００μｇのＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ｃｈ
ｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの細胞をさらに
４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ ＶＩＡ
−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのアッセイを三連で
行った。
【０５９８】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。
【０５９９】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。
【０６００】 （実施例２４：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。ＴＲ
ＩＤのＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。
【０６０１】 Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の受精
卵および日本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｕｔｕｒｎｉｘ）を
、３７．８℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリの分
化したＣＡＭおよび１３日齢のウズラの胚を以下の方法で研究する。
【０６０２】 発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１
３日までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ，Ｎ
ａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切断する。滅菌およ
び無塩成長因子ならびに試験されるべきタンパク質を滅菌水に溶解し、そして約
３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペットで移す。風乾後、逆さにしたディスク
をＣＡＭに適用する。３日後、標本を３％グルタルアルデヒドおよび２％ホルム
アルデヒド中に固定し、そして０．１２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液でリンス
する。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８］を用いて写真撮影し、上記のよう
に半薄層切片化および超薄層切片化のために包埋する。コントロールを、キャリ
アディスクのみを用いて行う。
【０６０３】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。 （実施例２５：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成アッ
セイ） ＴＲＩＤタンパク質活性を試験するための新脈管形成についてのインビボモデ
ルを確立するために、マウスおよびラットを、２０ｍｇのＢＳＡ（陰性コントロ
ール）、１ｍｇのＴＲＩＤ、または０．５ｍｇのＶＥＧＦ−１（陽性コントロー
ル）のいずれかを含むメチルセルロースディスクを用いて皮下移植する。この陰
性コントロールディスクは、血管新生をほとんど含まないはずであるが、陽性コ
ントロールディスクは、脈管形成の徴候を示すはずである。
【０６０４】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。
【０６０５】 （実施例２６：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出） ＴＲＩＤの虚血に対するインビボでの効果を研究するため、ウサギ後肢虚血モ
デルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈ
ｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大腿動脈の外科
的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性伝播および外腸骨動脈
の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は、内腸骨動脈から生じる側副血
管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １４７
：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で、ウサギの手術後の回復
および内因性の側副血管の発達を可能にする。手術（０日）後１０日目に、ベー
スライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、５００ｍｇの裸のＴＲＩ
Ｄ発現プラスミドを用いて、（Ｒｉｅｓｓｅｎ，Ｒ．ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｇら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））に記載されるように、
ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺伝子移入技術により、トラン
スフェクトする。ＴＲＩＤを処置に用いる場合、５００ｍｇのＴＲＩＤタンパク
質またはコントロールの単回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間にわた
り、虚血肢の内腸骨動脈中に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを、こ
れらのウサギで測定する：（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期血圧 対 正常肢の収
縮期血圧の比；（ｂ）血流および逆流−停止ＦＬ：非拡張性状態の間の血流、お
よび最大ＦＬ：完全な拡張性状態の間の血流（これはまた、血管量の間接的測定
）、そして逆流は、最大ＦＬ：停止ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影値（
ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｏｒｅ）−これを側副血管の血管造影により測
定する。スコアを、オーバーレイグリッド（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ ｇｒｉｄ）
内の円の百分率（ウサギ大腿の総数ｍで割った横断不透明化動脈を用いる）によ
り決定する；（ｄ）毛細管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度−側副毛細管の数は、後
肢から得た光学顕微鏡用切片において決定した。
【０６０６】 本実施例において記載した研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。し
かし、当業者は、ＴＲＩＤポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、Ｔ
ＲＩＤのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、
例示する研究を容易に改変し得る。
【０６０７】 （実施例２７：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免
疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間
のＴＲＩＤの発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用いて研究する。
【０６０８】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： ａ）虚血皮膚 ｂ）虚血皮膚創傷 ｃ）通常の創傷。
【０６０９】 実験プロトコルは以下を含む： ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の
下背部にわたる筋皮弁）を生じさせる。
【０６１０】 ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくる（直径４〜６ｍｍ） ｃ）次の種々の投薬範囲のＴＲＩＤによる、切除創傷（創傷後の０、１、２、
３、４日目）の局所的な処置：１ｍｇ〜１００ｍｇ ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集する。
【０６１１】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。
【０６１２】 （実施例２８：末梢動脈疾患モデル） ＴＲＩＤを用いる脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合の虚血の周囲の血流の
回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以下を含む： ａ）一方の片側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方
の片側の後肢は、コントロールの役割をする。
【０６１３】 ｂ）ＴＲＩＤタンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あた
り静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜３週間、
送達する。
【０６１４】 ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、ＴＲＩＤの発現の分析および組
織学のために、１、２、および３週間目に収集する。生検もまた、他方の片側の
対側後肢の正常な筋肉において行う。
【０６１５】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。
【０６１６】 （実施例２９：虚血性心筋疾患モデル） ＴＲＩＤを、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後の新しい血管を
再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ＴＲＩＤの発現の変化を、イ
ンサイチュで調査する。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる。
【０６１７】 ｂ）ＴＲＩＤタンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あた
り静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜４週間、
送達する。
【０６１８】 ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定のために取り出しそして横断切片
化し、そしてインサイチュで分析する。
【０６１９】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。
【０６２０】 （実施例３０：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、ＴＲＩＤの、新生血管形成に対する効果を示す。実験プロ
トコルは、以下を含む： ａ）角膜の中心から間質層へと１〜１．５ｍｍの長い切開を作る ｂ）目の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する ｃ）ポケットを作る（その基底は、目の縁から（ｆｏｒｍ）１〜１．５ｍｍで
ある） ｄ）５０ｎｇ〜５μｇ（ｕｇ）のＴＲＩＤを含む小丸剤を、ポケット内に配置
する ｅ）ＴＲＩＤでの処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲内で（毎日の
処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。
【０６２１】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤのポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。
【０６２２】 （実施例３１：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） ＴＲＩＤが治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷治癒の遺伝的
糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層（ｆｕｌ
ｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、障害性の創傷治癒の十分に特徴付
けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである。糖尿病性創
傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａ
ｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）；
Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３
５（１９９０））。
【０６２３】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体上に単一の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａ
ｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａ
ｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１
−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：
４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、
基底膜肥厚、および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（
Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（
１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６
７（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）
：４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高
血糖症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対し
て耐性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３
７７（１９７８））。
【０６２４】 これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖
尿病において観察される治癒に類似し得ることを示す（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら
、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））
。
【０６２５】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）ヘテロ接合性同腹仔を、この研究に用いる（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入し、
そしてこれらの動物は研究の開始時に８週齢である。動物を個別に飼育し、そし
て自由に食物および水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この実
験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ
Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラ
インに従って行う。
【０６２６】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を
剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲
を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、
Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創
傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷を開放させる。処
置の適用を、創傷させた日から開始して５日間連続で、局所的に与える。処置の
前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する
。
【０６２７】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎカリパスを
用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創
傷を連続した上皮が覆う場合に治癒したとみなす。
【０６２８】 ＴＲＩＤを、ビヒクル中で８日間、ＴＲＩＤの異なる用量の範囲（１日あたり
創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群に
は、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【０６２９】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの
間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０６３０】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）ＴＲＩＤを、評価する。
【０６３１】 創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行った： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、ＴＲＩＤを用いる処置によって改
変したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、線維芽
細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ
，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。目
盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖ
ｅｒ）が用いる。
【０６３２】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上
皮形成の程度を評価することによって決定する。
【０６３３】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし得、そして
ヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱
落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位
は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい
増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【０６３４】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【０６３５】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎ
ｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔ
ｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅ
ｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７
：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成を阻害
すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｈ．ら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ
．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合
成（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｓ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４
（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１
：７０３−７９７（１９７８））を低下させること、ならびに循環する単球の一
過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏ
ｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎ
ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によって創傷治癒を遅延させる。障
害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラットにおいて十分に確立さ
れた現象である（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：
２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８） ；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．，「Ｇ
ｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎ
ｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ
ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２２２９−２２３３
（１９８９））。
【０６３６】 ＴＲＩＤが治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治癒が、メチル
プレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除皮膚創傷に対
するＴＲＩＤの複数の局所適用の効果を評価する。
【０６３７】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢であった。ラット
の治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／
ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に
食物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔ
ｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏ
ｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って
行う。
【０６３８】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５ｍ
ｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動
物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄
する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷
をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷を開放したまま
にする。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与
した日から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、
創傷を滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【０６３９】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、形について、１〜５日目の毎日および８日目の
測定により決定する。創傷を目盛り付きＪａｍｅｓｏｎカリパスを用いて水平お
よび垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続した
上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。
【０６４０】 ＴＲＩＤを、ビヒクル中で８日間、ＴＲＩＤの異なる用量の範囲（１日あたり
創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群は
、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【０６４１】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０６４２】 各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイ
ドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラシ
ーボコントロール、および３）ＴＲＩＤ処置群。
【０６４３】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）であった。計算を以
下の式を用いて行った： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態的な外見を、ＴＲＩＤを用いる処置によって改善したかどうかを評
価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者が用
いて、創傷の隙間の距離を決定する。
【０６４４】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【０６４５】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質における活性を試験
する。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤポリヌクレ
オチド（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアンタ
ゴニストの活性を試験し得る。
【０６４６】 （実施例３２：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立におけるＴＲＩＤの治
療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製すること
である。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパの脈管の量の定量、総血漿タ
ンパク質、および組織病理学により測定される。急性リンパ水腫は、７〜１０日
間観察される。おそらくより重要なことは、水腫の慢性進行は、３〜４週間まで
続く。
【０６４７】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へ色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に、
０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素の
注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【０６４８】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離す
る。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位
置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固するか、または縫
合結紮する。
【０６４９】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付
随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【０６５０】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。
【０６５１】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【０６５２】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。
【０６５３】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をしたレ
ベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚
をしるしを付けた領域まで漬ける。
【０６５４】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【０６５５】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。
【０６５６】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０℃にて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍光
顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【０６５７】 本実施例において記載される研究は、ＴＲＩＤタンパク質における活性を試験
する。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲＩＤポリヌクレ
オチド（例えば、遺伝子治療）、ＴＲＩＤのアゴニスト、および／またはアンタ
ゴニストの活性を試験し得る。
【０６５８】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【０６５９】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書（特許、特許
出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）の全開示
は、本明細書中に参考として援用される。
【０６６０】 さらに、本明細書にとともに紙形態で提出された配列表は、本明細書中にその
全体が参考として援用される。
【０６６１】
【表３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｂは、ＴＲＩＤのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ
酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｂ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｃ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｄ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｅ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｆ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｇ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｈ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｉ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｊ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｋ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｌ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｍ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｎ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｏ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図２Ｐ】 図２Ａ〜Ｐは、ＤＮＡ Ｓｔａｒスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを
使用するＣｌｕｓｔａｌ法によって作製されるアラインメントを示す。このプロ
グラムは、ＴＮＦＲ−５（本明細書では「ＴＲＩＤ」と呼び、図では「ＴＮＦＲ
様」と示される）のアミノ酸配列を、以下の他のＴＮＦレセプター：ＴＮＦＲ１
（配列番号３）；ＴＮＦＲ２（配列番号４）；ＮＧＦＲ（配列番号５）；ＬＹｂ
Ｒ（配列番号６）；ＦＡＳ（配列番号７）；ＣＤ２７（配列番号８）；ＣＤ３０
（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；４−１ＢＢ（配列番号１１）；Ｏ
Ｘ４０（配列番号１２）；ＶＣ２２（配列番号１３）；およびＣＲＭＢ（配列番
号１４）のアミノ酸配列と比較する。コンセンサスと一致した残基には影を付け
ている。
【図３】 図３は、ＴＲＩＤアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル
領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数、および表
面確率を、配列番号２に示されるアミノ酸配列について、列挙されたコンピュー
タープログラムのデフォルトパラメーターを用いて予想されたように示す。「抗
原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」のグラフでは、このタンパク質の高度に
抗原性の位置（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドがそこから得られ得
る領域）を示す。
【図４】 図４は、本発明のＴＲＩＤ遺伝子に関連する遺伝子フラグメントのヌクレオチ
ド配列を示す。この配列には、ＨＰＲＣＢ５４Ｒ（配列番号１５）、ＨＳＬＡＵ
５７ＲＡ（配列番号１６）、ＨＥＬＢＰ７０Ｒ（配列番号１７）、およびＨＵＳ
ＣＢ５４Ｒ（配列番号１８）が含まれ、これらのすべてが配列番号１に関連する
。
【図５Ａ】 図５Ａは、ＴＲＩＤ−Ｆｃ（ならびにＤＲ４およびＤＲ５）がＴＲＡＩＬを特
異的に結合するが、関連する細胞傷害性リガンドＴＮＦαを結合しないことを示
すイムノブロットである。図５Ａの下のパネルは、インプットＦｃ融合物が結合
アッセイにおいて存在することを示す。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、ＴＲＩＤ−ＦｃがＴＲＡＩＬのアポトーシスを誘導する能力をブロ
ックしたことを示す棒グラフである。図５Ｂにおいて示されるデータ（平均±Ｓ
Ｄ）は、計数した全部の核（ｎ＝４）の間のアポトーシス性の核のパーセンテー
ジである。
【図５Ｃ】 図５Ｃは、ＴＮＦＲ−Ｆｃが完全にＴＮＲα殺傷を無効にした条件下で、ＴＲ
ＩＤ−ＦｃはＴＮＦα誘導性のアポトーシスに対して効果を有さなかったことを
示す棒グラフである。
【図６】 図６は、ＴＲＩＤを発現するＭＣＦ７細胞が、細胞がウイルス性にコードされ
たカスパーゼインヒビターＣｒｍＡを発現した場合に、ＴＲＡＩＬ誘導性のアポ
トーシスから保護されたことを示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/66 Ａ６１Ｋ 31/66 ４Ｃ０８６ 31/711 31/711 ４Ｃ２０６ 38/00 39/395 Ｄ ４Ｈ０４５ 38/21 Ｎ 39/395 45/00 48/00 45/00 Ａ６１Ｐ 1/04 48/00 1/16 Ａ６１Ｐ 1/04 3/10 1/16 5/14 3/10 7/00 5/14 7/06 7/00 9/10 7/06 １０１ 9/10 11/06 １０１ 13/12 11/06 17/02 13/12 17/06 17/02 19/00 17/06 19/02 19/00 19/10 19/02 21/04 19/10 25/16 21/04 25/28 25/16 27/02 25/28 29/00 27/02 １０１ 29/00 31/04 １０１ 31/12 31/04 31/16 31/12 31/18 31/16 31/22 31/18 33/00 31/22 35/00 33/00 35/02 35/00 37/02 35/02 37/06 37/02 37/08 37/06 Ｃ０７Ｋ 16/28 37/08 19/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/19 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 5/10 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ 37/66 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウェイ， ユン−フェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレー， グラバッツ ドライブ 242 (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルニー， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 ジェンツ， レイナー エル． アメリカ合衆国 メリーランド 20850， ロックビル マウント プロスペクト ドライブ 13608 (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロー ド 5502 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 4B064 AG27 CA20 CC24 DA05 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA13 AA19 BA44 DA11 DA12 DA14 DA15 DA16 DA17 DA18 DA24 DA25 MA02 NA14 ZA021 ZA081 ZA151 ZA161 ZA331 ZA361 ZA451 ZA511 ZA551 ZA591 ZA75 ZA811 ZA891 ZA941 ZA961 ZA971 ZB051 ZB071 ZB072 ZB111 ZB131 ZB151 ZB261 ZB262 ZB271 ZB272 ZB331 ZB332 ZB351 ZB371 ZC061 ZC351 ZC551 4C085 AA13 AA14 BB11 CC02 CC05 DD22 DD23 4C086 AA01 AA02 CB07 CB22 DA10 DA35 EA16 MA02 MA04 NA14 ZA02 ZA08 ZA15 ZA16 ZA33 ZA36 ZA45 ZA51 ZA55 ZA59 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB05 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB33 ZB35 ZB37 ZC06 ZC35 ZC55 4C206 AA01 AA02 GA03 GA25 MA02 MA04 MA12 MA21 MA24 MA28 NA14 ZA02 ZA08 ZA15 ZA16 ZA33 ZA36 ZA45 ZA51 ZA55 ZA59 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB05 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB33 ZB35 ZB37 ZC06 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 EA22 EA28 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 対宿主性移植片病、ウイルス感染、癌、白血病、免疫不全ま
    たは自己免疫を処置するための方法であって、治療有効量の以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸２７〜２５９からなるポリペプチドに結合し得る
    抗体を含有する、第１の治療剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療剤： （ｉ）ＴＲＡＩＬ； （ｉｉ）腫瘍壊死因子； （ｉｉｉ）腫瘍壊死因子遮断薬； （ｉｖ）免疫抑制剤； （ｖ）抗生物質； （ｖｉ）抗炎症剤； （ｖｉｉ）化学治療剤；および （ｖｉｉｉ）サイトカイン を個体に投与する工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療剤が
    、配列番号２のアミノ酸２７〜２４０からなるポリペプチドに結合する抗体を含
    む、方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体が、モノク
    ロナール抗体である、方法。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体が、ポリク
    ロナール抗体である、方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体が、ヒト化
    抗体である、方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記抗体が、抗体フ
    ラグメントである、方法。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、ここで前記抗体フラグメン
    トが、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、方法。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の方法であって、ここで前記抗体フラグメン
    トが、Ｆａｂ抗体フラグメントである、方法。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療剤お
    よび第２の治療剤が、同時に前記個体へ投与される、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療剤
    および第２の治療剤が、異なるときに前記個体へ投与される、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、前記第２の治療剤が、Ｔ
    ＲＡＩＬである、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍壊死因子
    遮断薬が、以下： （ａ）ＴＮＦ−α； （ｂ）ＴＮＦ−β； （ｃ）ＴＮＦ−γ； （ｄ）ＴＮＦ−γ−α；および （ｅ）ＴＮＦ−γ−β からなる群より選択されるタンパク質に結合する抗体を含む、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記免疫抑制剤
    が、以下： （ａ）シクロスポリン； （ｂ）シクロホスファミド； （ｃ）メチルプレドニゾン； （ｄ）プレドニゾン； （ｅ）アザチオプリン； （ｆ）ＦＫ−５０６；および （ｇ）１５−デオキシスペルグアリン からなる群より選択される、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記サイトカイ
    ンが、以下： （ａ）ＩＬ−２； （ｂ）ＩＬ−３； （ｃ）ＩＬ−４； （ｄ）ＩＬ−５； （ｅ）ＩＬ−６； （ｆ）ＩＬ−７； （ｇ）ＩＬ−１０； （ｈ）ＩＬ−１２； （ｉ）ＩＬ−１３； （ｊ）ＩＬ−１５；および （ｋ）ＩＦＮ−γ からなる群より選択される、方法。
  15. 【請求項１５】 組成物であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜２５９からなるポリペプチドに結合する抗体
    を含有する、第１の治療剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療剤： （ｉ）ＴＲＡＩＬ； （ｉｉ）腫瘍壊死因子； （ｉｉｉ）腫瘍壊死因子遮断薬； （ｉｖ）免疫抑制剤 （ｖ）抗生物質； （ｖｉ）抗炎症剤； （ｖｉｉ）化学療法剤；および （ｖｉｉｉ）サイトカイン を含有する、組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の組成物であって、薬学的に受容可能な
    キャリアまたは賦形剤をさらに含む、組成物。
  17. 【請求項１７】 配列番号２のアミノ酸２７〜２４０に少なくとも９０％同
    一なアミノ酸配列を含有する単離されたポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
    チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
    ０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
    からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 配列番号２のアミノ酸２７〜２４０に少なくとの９５％同
    一であるアミノ酸配列を含有する、請求項１７に記載のポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１８のポリペプチドであって、ここで、前記アミノ
    酸配列が、配列番号２のアミノ酸２７〜２４０を含む、ポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１７に記載のポリペプチドであって、ここで、前記
    ポリペプチドは、ポリエチレングリコールとの、１〜３、２〜４、３〜５、４〜
    ６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１および１０〜１２からなる群
    より選択される範囲内にある平均置換度を有する、ポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 組換え宿主細胞によって産生される、請求項１７に記載の
    ポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 前記組換え宿主細胞が、真核生物宿主細胞である、請求項
    ２１に記載のポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 異種ポリペプチドを含む、請求項１７に記載のポリペプチ
    ド。
  24. 【請求項２４】 前記異種ペプチドが、抗体のＦｃ部分を含む、請求項２３
    に記載のポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 請求項１７に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能
    なキャリアを含む、組成物。
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