JP2008511296A - ウイルス性tnfレセプター及び関連のタンパク質のケモカイン結合活性 - Google Patents
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Abstract
Description
実施例1:物質及び方法
1.1.−ポックスウイルス
CPV,EV及びVVがBsc−I細胞の融合性分子フィルムを感染させることによって生体外で繁殖された。
CrmB遺伝子に対応するラクダ痘ウイルスの菌株CMSのORF264がオリゴヌクレオチドCMLV 264 Eco (5;−GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTCG)及びCMLV 264 Xco (5;−GCGCTCGAGTAAAAAGTGGGTGGGTTTGG)を使用するPCRによって増幅されそしてテンプレートとしてCMLVDNAに純化された。PCR生成物はプラスミドpRAT1を発生させるためにEcoRI/XhoI組織化されたpBac−I(ノバゲン(Novagen))にクローン化された。増幅された遺伝子中の突然変異の不存在がDNA配列決定によって確認された。VaV(菌株バングディシュ1975;ORF188)に対応するDNAが製造業者の指示に従っている「クィックチェンジマルチサイト指向突然変異生成キット(ストラタジン「Stratagine」)」を使用するプラスミドpRAT1の多重サイト指向突然変異生成によって得られた。導入された突然変異は図6に示されている。サイト指向突然変異生成の幾つかの連続するラウンド後、プラスミドpRA105が得られた。このプラスミドはオリジナルのpBac−Iミラスミドによって供給されたC−末端Hisタグに溶解されたVaV(BSH1975菌株)CrmBをコード化している配列を含んでいる。すべての突然変異の存在及び望まない追加の突然変異の不存在は直接配列決定によって確認された。
バキュロウイルスシステム中の発現に関して、CrmD(表3)のDNAコード化全長又は截形バージョンが特定のオリゴヌクレオチド(表4)によりPCR−増幅され、かつpBAC−1にクローン化された。組み換え型バキュロウイルスは組み換え型pBac−Iプラスミド及び記載された(アルカミ等、1998年)ように直線化されたバキュロウイルスDNAによりトランスフェクトされた(該酸を入れられた)SF21昆虫細胞中の同族組み換えによって発生された。
C−末端Hisタグに溶解された全長VaVCrmB遺伝子がpRA107を発生するためにEcoRI/SphI分解pFastBac1(インビトロゲン「Invitrogen」)にサブクローン化された。4つのCRDsを包含しかつ残留物1(M)〜192(C)に対応するVavCrmBのN−末端領域がオリゴヌクレオチドVaV 188 Eco (5;−GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTTG)及びテンプレートとしてpRA107を使用するVaV 188 CRDa1−4 Xho (5;−GCGCTCGAGACACGATGTGTCGTGGTTAACTGG)を使用するPCRによって増幅された。増幅された断片はpRA99を発生するためにEcoRI/XhoI分解pBac1(ノバゲン「Novagen」)によって設けられたC−端末Hisタグによりフレーム内でクローン化された。pRA99はEcoRI/SphIで分解されそしてHisタグに溶解されたVaVCrmBCRDsを支持する断片はpRA106を発生するために前のようにpFastBac1にクローン化された。VaVCrmB(残留物T194及びL348)のCTDはオリゴヌクレオチドVaV 188 Cter−PfIMI(5;−CGCCCACCCAATGGAACTAGGACGACCAC−TACCGG)及びテンプレートとしてpRA107を使用するH347RによりPVRで増幅された。この断片はPfmII及びXhoIにより分解されかつ同一の酵素により分解されたpRA107にクローン化された。これは、pRA108、CrmBのCTD及び追加のHisタグが続くVaVBrmB(予想される信号ペプチドを包含する)の29のN−末端残留物から構成される溶融タンパク質をコード化するプラスミドを発生する。pRA106,pRA107及びpRA108中の望ましくない突然変異の不存在がすべての場合に完全な挿入を配列決定することによって確認された。
組み換え型タンパク質を発現するために、High5細胞が高重複度(10pfu/細胞)で感染させそして感染した培養組織からの浮遊物が感染後3日(d.p.i.)で採取された。これらの浮遊物中のタンパク質の存在がウエスタンブロット及び/又は全長及びN−末端VaVCrmB構造の場合において溶液中のTNF結合分析(アルカミ等、1999年)によって確認された。サンプルはYM−3膜(ミリポア)及びPD−10脱塩コラム(アメルシャム−ファラムシア バイオサイエンス)で結合バッファ(50mMの燐酸塩、300mMのNaCl,10mMのイミダゾール、pH7.4)に交換されたバッファを使用して攪拌された限外濾過セル(アミコン)でおよそ2.5mlに濃縮された。His−タグが付けられた組み換え型タンパク質は製造業者の推奨に従っているビラピュア金属キレートコラム(ビバサイエンス)を使用して親和性で純化された。純化されたタンパク質の純度及び量はコーマシー(Coomassie)のブルーに色づけされたSDS−ポリアクリルアミドゲルでチェックされた。TNF保護及び走化性の抑制分析に関して、組み換え型タンパク質がPBSに対して透析された。
サイトカイン特異性及び親和性定数がバイアコア(BIAcore)Xバイオセンサ(スウェーデン国,ウプサラ所在のバイアコア社)を使用し測定された。リガンドスクリーニング実験に関して、純化された組み換え型タンパク質が各場合におよそ5000RU(5000pg/mm2 )のレベルまでCM5チップにアミン結合された。市場で入手可能なサイトカイン(ペプロテック、R&Dシステムズ)が次いで5μ/分の流量においてHBS−EPバッファ(10mMのヘペス、150mMのNaCl,3mMのEDTA,0.005%(v/v)界面活性剤P20;pH7.4)において100nMで注入されそしてその結合及び分離が監視された。表面は10mMグリシン−HClpH2.0を使用する各注入後に再生された。運動分析に関して、組み換え型タンパク質は低い密度(Rmax<200RU)で固相化された。対応する分析物の種々の濃度が次いで2分の期間にわたって30μl/分の流量で注入されかつ5分後にで分離させた。すべてのバイアコアセンサグラムはBIAエバリュエーション3.2ソフトウエアを使用して分析された。大きな屈折率の変化は基準流量細胞応答を減算することによって除去されそしてブランク注入の平均応答は系統だった人為的結果を除去するためにすべての分析物のセンサグラムから減算された。運動データは1:1ラングマイアーモデルに全体的に適合した。
TNF−誘導の細胞毒性分析は前述したように、マウスL929細胞(ロパレフ等、1998年、サライバ及びアルカミ、2001年、シュライバー等、1997年、スミス等、1996年「Loparev et al.,1998,Saraiva & Alcami,2001,Schreiber et al.,1997,Smith et al.,1996」)で実施された。TNF(20ng/ml(R&Dシステムズ)がアクチノマイシンD(4□g/ml)(シグマ)により補充された完全なDMEMの|□|において純化された組み換え型タンパク質により37°Cで2時間予め培養された。混合物は次いで96孔プレート中で前日に植え付けられた2×104 細胞に加えられそして細胞の死滅が製造業者の推奨に従った「セルタイター(CellTiter)96(商標)水性1溶液細胞増殖分析」(プロメガ(Promega))を使用して16〜18時間後に評価された。
MOLT−4細胞の移動が前記に記載(ザバロス等、1999年)したような3□mポアサイズフィルタ(コースター(Costar))を有する24孔トランスウエル(商標)プレートを使用して評価された。簡単に、ヒトCCL25(100nM)(R&Dシステムズ)が単独で又は純化された組み換え型タンパク質の増大量の存在において30分間37°Cで培養されそして下方の仕切り室内に置かれた。この期間後、2×105 MOLT−4細胞が頂部孔に0.1%FCSを含んでいる100□lの完全なRPMIに加えられそしてプレートは37°C,5%CO2 ,95%に湿らされた培養器内で培養された。底の孔に向かうMOLT−4細胞の移動が流量血球計算によって4時間後に測定された。
2.1.−EV及びCPVによってコード化されたvTNFRCrmDはケモカインを結合する。
ケモカインを結合する新規なウイルス性の分泌タンパク質を調べるために、本発明は1251−CXCL8による交差結合(クロスリンク)分析を実施しかつポックスウイルスEV(図3a)によってコード化された新規な分泌vCKBPを同定した。この活性はVVサンプル中には不存在であり、VV及び他のポックスウイルスによってコード化された35kDavCKBP及びCXCL8に交差結合することができるが、CXCL8についてのその低い親和性によりその生物学的活性を阻止しないタンパク質(アルカミ等、1998年、グラハム等、1997年、ララニ等、1998年)、より大きい分子サイズからなっていた。予期しなかったが、TNFを結合することが知られておりかつEVによってコード化されているvTNFRCrmDがCXCL8を結合する追加の特性(図3b)を有することを見い出した。VV発現システムで発現されたCrmBタンパク質の截形バージョンを使用して、CrmDの3N−末端CRDsがTNF活性を阻止するのに必要であり(図4a,b,c)そしてCTDがTNF結合に必要ではないが、CTDがCrmDにケモカインを結合する能力を付与する(図3b)ことを示した。CrmDの各種の領域はTNFに含まれると思われそしてCrmDに対するCXCL8の交差結合からのケモカイン結合はTNF(図3c)の存在においては阻止することはできずそしてCrmDに対するTNFの結合はCXCL8の存在においては抑制されない(図示せず)。サーフェイスプラスモンレゾナンス(SPR,バイコアX)技術を使用して、ヒト及びマウス起源の市場で入手し得るすべてのケモカインに対する純化されたEVCrmDの潜在的な相互作用を試験し、そしてCrmDが高い親和性のケモカインを結合することを確認した(図5)。
拡張されたCTDをコード化している他のvTNFRがケモカインを結合するかどうかを試験するために、バキュロウイルスシステムにおいてCPVからCrmBを発現させそしてそれが交差結合分析(図3d)においてCXCL8を結合することを示した。CrmBはヒト病原菌VaV、疱瘡の原因となる作用物質によってコード化もされている。本発明は関連のラクダ痘ウイルスからのCrmB遺伝子の幅広い場所に向けられた突然変異生成によってVaVのCrmB遺伝子を発生させ(図6)そしてバキュロウイルスシステム中にタンパク質を発現させた。本発明は最初に、純化されたVaVCrmBタンパク質がTNFを結合し(図7)そしてTNFの生物学的活性を抑制する(図8a)ことを試験した。CrmBはSPRによって入手し得るすべてのヒトケモカインへの結合に関しても試験されそして本発明はCrmBが多数のケモカインに高い親和性で結合する(図9)ことを示した。CTDを欠いているVaVCrmBの截形バージョンはケモカインを結合しない(図7)。そのうえ、VaVCrmBのCTDの発現及び純化はCTDがCrmBのケモカイン結合活性をコード化していることを示した(図7)。これはTNF及びケモカインがCrmBの種々の場所に結合する(図示せず)ことを示しているSPA分析によって裏付けられている。
幾つかのケモカインに関するvTNFRCrmB及びCrmDの高い親和性はこれらのウイルス性タンパク質がケモカインを隔離しかつロイコサイト上のそれらの特別なレセプターに対する結合を防止しかつ細胞泳動をトリガする信号を誘発するおとりレセプターとして作用することを示唆している。本発明はケモカインCCL25に応答して関連のレセプターを発現しているMOLT−4細胞の泳動を抑制している(図8b)ことを示している。
上述したように、ポックスウイルスによってコード化された3つのタンパク質はvTNFRs(CrmB及びCrmD)のCTDと類似するアミノ酸配列を有している(図1及び図2)。CTD1,CTD2及びCTD3と名づけられたこれらのたんぱく質はそれらが分泌されていることを示唆しているN−末端信号ペプチドを有している。バキュロウイルスシステムにおけるこれらのタンパク質、EVE12(CTD1),EV184(CTD2)及びCPVB21R(CTD3)のうちの2つの発現は両方のタンパク質が媒体に分泌されていることを示した。純化されたEVE12タンパク質はすべてのマウスケモカインに対する結合に関して試験されそして高い親和性で幾つかのケモカインに結合することが見い出された(表2)。加えて、純化されたタンパク質CPVB21R及びVE184がマウスからのCCL21,CCL24,CCL25,CCL27,CCL28,CXCL10,CXCL11,CXCL12β,CXCL13及びCXCL14に結合することをSPRによって測定し、そしてヒトCCL26TheVVWRB7R(CTD2)はエンドプラスミック細網の隙間に移動されるようにかつ分泌されるよりむしろ細胞の内部に保持されるように示された(プライス等、2000年「Price et al.,2000」)。CTD同族体の幾つかは同様に細胞の内側で発現されるものと知られているCCL27のごときケモカインの活性を阻止するように機能する(ゴルツ等、2002年「Gortz et al.,2002」)。B7R遺伝子を欠いているVV突然変異体はネズミ皮肉モデル中で弱毒化される(プライス等、2000年「Price et al.,2000」)。
TNFはTNFリガンド(TNFL)スーパーファミリー(ロックスレイ等、2001年、ワラック等、2001年「Locksley et al.,2001,Wallach,2001」)として知られる構造的な同一性を有する免疫媒介体の大きなファミリーの構成要素である。EVCrmD及びVaVCrmBは市場で入手可能なすべてのTNFリガンドスーパーファミリー構成要素に対する結合に関してSPRによって試験されそしてAPRIL(TNFL13)(CrmDKd110pM;CrmBKd2nM)及びLIGHT(TNFL14)(CrmDKd140nM;CrmBKd2nM)と結合することが見い出された。これはCrmD及びCrmB(及び他のvTNFRs)が幾つかのTNFリガンドスーパーファミリー構成要素の生物学的活性を抑制し得ることを示唆している。
上述されたように、N−末端CRD(1,2)を含有する截形vTNFRsCrmDはTNFに対する親和性を遊離しかつTNF生物学的活性を阻止しないが、しかしCRD(1−3)はTNFを結合しかつその活性を抑制する(図4a,b,c)。意外にも、CRD(1,2)がCTDに溶解されて発現されるとき、それはCTDがvTNFR(図4d)のN−末端CRDsのTNF結合活性を高め得ることを示しているTNF抑制活性を回復する。
ここで示されるデータはvTNFRsCrmB及びCrmDが2つの独立した領域から構成される(図及び図2)ことを示している。N−末端CRDsはTNFを結合する能力を有する一方、CTDは独立した様式においてケモカインと結合する。これはCrmBからのCRD(1,4)がTNF結合活性を維持しかつCrmBからのCTDが独立して発現されるときケモカイン結合活性を有するという知見によって示されている。ウイルス性のタンパク質のこれらの領域が構造的な分子又は免疫媒介物を結合する領域を有するという概念は、(1)VaVCrmBの純化されたCTDがケモカインと結合する(図7);(2)CPVによってコード化されたCrmB及びCrmDのCTDが交換され得るしそしてさらにケモカイン結合活性をも付与し得る(図示せず);(3)vTNFRCTD(CEE12,EVe184CPV及び6B21R)に関連付けられる3つの異なるタンパク質がケモカイン結合活性をコード化する(表2);(4)VaVCrmBのCRD(1,4)に対するCPV35kDavCKBPの溶融がこのタンパク質にTNF−抑止活性に影響を与えることなく(図10)ケモカインを結合する能力を付与する、という知見によって強調されている。それゆえ、これらのウイルス性領域は幾つかのサイトカインの活性を阻止する免疫調整タンパク質を発生するために交換又は組み合わされ得る。本発明はvTNFRsのCTDがケモカイン又は免疫システムに含まれる他のタンパク質のような免疫タンパク質と結合する新規なタンパク質構造及び領域を特定しそしてTNFに加えて他の免疫調整タンパク質を結合する能力をvTNFRsに付与することを提案する。
アルカミ、エー、(2003年)。サイトカイン、ケモカイン及びそれらのレセプターのウイルス性擬態。国内啓示逸疫学、第13巻、第36頁乃至第50頁(Alcami,A.(2003).Viral mimicry of cytokines,chemokines and their receptors.Nat Rev Immunol3,36−50)。
タンパク質 ウイルス 結合特異性 参照
vCKBP1 M−17 ポックスウイルス: 広いCC (ララニ等、199
粘液腫ウイルス 7)
vCKBP2 35kDa, ポックスウイルス: ケモカイン (アルカミ等、
M−T1 ワクシニア症ウイルス 1998、グラハ
牛痘ウイルス、 ム等、1997、
vCCI 先天性四肢欠損症ウイルス、 シート等、200
粘液腫ウイルス、天然痘ウイルス、 3、スミス等、1
orfウイルス 997、スミス及
びアルカミ200
0)(パリー等、
2000、バン・
ベルケット等、
2000)
(ブライアント等、
2003)
vCKBP3 M3gG ブロードブロード
vCKBP4 ガンマヘルペスウイルス
マウスガンマヘルペスウイルス
68アルファヘルペスウイルス
馬ヘルペスウイルス、ウシ亜科
ヘルペスウイルス
ケモカイン KD(nM)
mCCL21 0.5
mCCL25 0.7
mCCL27 2
mCXCL11 1
mCXCL13 1.5
mCXCL14 1.5
参照の挿入は指示された一対のオリゴヌクレオチドを使用してウイルス性DNAからPCRによって増幅された(オリゴヌクレオチド配列に関しては表4参照)。EVは菌株ハンプステッドに関するものであり、そしてCPVは菌株ブライトンレッドに関するものである。
pBac1
挿入 オリゴ Ta RS プラスミド
EVcrmD 5;CrmD−7 55 BamHI pMS1
3;CrmD−9 XhoI
EVcrmD− 5;CrmD−7 50 BamHI pMS42
CRD1,2 3;CrmD−29 NotI
EVcrmD− 5;CrmD−7 50 BamHI pMS46
CRD1,2,3 3;PT−3 NotI
EVcrmD− 5;CrmD−7 50 BamHI pMS48
CRD1,2,3,4 3;PT−4 NotI
EVcrmD− 5;PT−1 50 NotI pPT6
CTD 3;PT−2 XhoI
EVcrmD− pMS42のNotI/XhoI pPT1
CRD1,2 にサブクローン化されたEVcrmDCt
−CTD
EVcrmD− pMS46のNotI/XhoI pPT2
CRD1,2,3 にサブクローン化されたEVcrmDCt
−CTD
CPVcrmB 5;PT−5 50 NotI pPT5
−CTD 3;PT−6 XhoI
EVcrmD−
CRD1,2,3,4 pMS48のNotI/XhoI pPT3
CPVcrmB−CTD にサブクローン化されたEVcrmDCt
EVcrmD− 5;SF−1 50 EcoRI pPT4
CRD1,2,3,4 3;PT−7 NotI
CPVcrmD−CTD
PMJ601
挿入 オリゴ Ta RS RpMJ601
EVcrmD 5;CrmD−7 50 BamHI pMS11
3;CrmD−15 KpnI
EVcrmD− 5;CrmD−7 50 BamHI pMS12
CRD1,2 3;CrmD−23 HindIII
オリゴヌクレオチド配列(5;> 3;)
5;CrmD−7 CGCGTTTAAACGGATCCATGAAGAGACAC
CATCATA
3;CrmD−9 CGCCTCGAGATCTCTTTCACAATCATTT
GGTGG
3;CrmD−15 CGCGGTACCTCAATCTCTTTCACAATCA
TTTGG
3;CrmD−22 CGCGGTACCTTAATCTATGCTGTTAAAG
GACAGATCAC
3;CrmD−23 GCGAAGCTTTTACCATGGGTAGTATCCG
GATGGCACAGCCAC
3;CrmD−24 GCGAAGCTTTTACCATGGACAAGAGGTC
TTGTTAACAGGATAC
3;CrmD−29 GCGGCGGCCGCGTATCCGGATGCACAGA
CAC
5;PT−1 GCGGCGGCCGCCAATTCGAGTATAGGAA
GCAGCAGTAC
3;PT−2 GCGCTCGAGATCTCTTTCACAATCATTT
GGTGG
3;PT−3 GCGGCGGCCGCATCTATGCTGTAAAAGG
ACAGATCAC
3;PT−4 GCGGCGGCCGCACAAGAGGTCTTGTTAA
CAGGATAC
3;PT−5 GCGGCGGCCGCCACTCGGACGACCACTA
CCGGTCTC
3;PT−6 GCGCTCGAGTAAAAAGTGGGTGGGATAC
TGGGAA
3;PT−7 GCGGCGGCCGCACACGATGTGTCGTTGA
CGGGATAC
5;SF−1 GCGGGTACCGAATTCACCATGGAGTCAT
ATATATTGCTATTGC
Claims (21)
- ケモカイン及びそれらの類似物を結合するのに使用するため及び/又はTNFRsの免疫賦活性特性を高めるために、誘導体及び断片を含んでいるポックスウイルスとそれらの機能的な同族体とからのウイルス性腫瘍壊死因子レセプター(vTNFRs)CrmB又はCrmD又はCTD同族体(CTD1,CTD2及びCTD3)のC−末端領域(CTD)。
- ケモカインがそれに対応する細胞表面レセプターに結合するのを阻止するのに使用するため及び/又はケモカインの生物学的活性を調整するために、誘導体及び断片を含んでいるポックスウイルスとそれらの機能的な同族体とからのvTNFRsCrmB又はCrmD又はCTD同族体(CTD1,CTD2及びCTD3)のCTD。
- CrmBからのCTDがSEQ ID No.26又はSEQ ID No.28を有していることを特徴とする請求項1又は2に記載のCrmBからのCTD。
- CrmDからのCTDがSEQ ID No.22又はSEQ ID No.24を有していることを特徴とする請求項1又は2に記載のCrmDからのCTD。
- CTDがSEQ ID No.8,SEQ ID No.14,SEQ ID No.6,SEQ ID No.20,SEQ ID No.18又はSEQ ID No.16を含有するか又は遺伝子V201,D12L,B6R又はB21Rによってコード化されたタンパク質のいずれかを含有することを特徴とする請求項1又は2に記載のCTD同族体。
- 同一又は他の起源のポリペプチド配列に溶解された請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD又はCTD同族体を含有している溶融ポリペプチド。
- 前記溶融ポリペプチドがvTNFRsのN−TNF末端結合領域に溶解された請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTDからなることを特徴とする溶融ポリペプチド。
- vTNFRsがヒト起源であることを特徴とする請求項7に記載の溶融ポリペプチド。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD又はCTD同族体をコード化している配列又は請求項6乃至8のいずれか1項に記載の溶融ポリペプチドを含有していることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 前記配列が組織特性又は構造性プロモータから発現される発現カセットを含有していることを特徴とする請求項6乃至9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記配列がウイルス性ベクター又は発現プラスミドの部分を形成することを特徴とする請求項6乃至9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 生体内においてケモカイン又はケモカイン類似体に結合するのに使用するために、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD又はCTD同族体及び/又は請求項6乃至9のいずれか1項に記載の溶融ポリペプチド及び/又は請求項10又は11に記載の発現カセット及び/又はウイルス性ベクターを含有していることを特徴とする医薬組成物。
- ケモカインが対応する細胞表面ケモカインレセプターに結合するのを阻止するために又は生体内においてケモカインの生物学的活性を抑制するために使用する請求項12に記載の医薬組成物。
- 抗炎症作用を発生するために使用する請求項12又は13に記載の医薬組成物。
- 別の免疫抑制剤又は抗炎症物質を含有することを特徴とする請求項12乃至14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 生体内においてケモカイン、ケモカイン類似体、又はケモカインレセプターを検出又は測定するために、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTDと標識化又は固相化された反応体とを含有していることを特徴とする試験キット。
- 抗炎症作用を発生するために被験者に投与するための薬剤を製造するために、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD又はCTD同族体及び/又は請求項6乃至9のいずれか1項に記載の溶融ポリペプチド、及び/又は請求項10及び11に記載の発現カセット及び/又はウイルス性ベクターを使用する使用方法。
- 細胞内にウイルス又は寄生虫の侵入を阻止するために前記ウイルス又は寄生虫中に存在するケモカイン類似体に結合する被験者に投与するための薬剤を製造するために請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD又はCTD同族体を使用する使用方法。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD同族体の少なくとも1つ及び/又はvTNFRsの不活性化又は削除による天然痘ウイルスワクチン用の弱毒化方法。
- CTD同族体又はvTNFRsに対する抗原の誘導に基づいて、ワクシニア症ウイルス接種によって発生された逆作用及び/又はヒト疱瘡における天然痘ウイルスによって発生された病状の治療のための薬剤を使用するか又は請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD同族体又はvTNFRsのケモカイン結合活性を抑止する抗原又は反応体を使用する使用方法。
- ケモカイン又はケモカイン類似体を結合するために、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のCTD又はCTD同族体を含んでいる反応体で試験される物質を含んでいるサンプルに接触することに基づいていることを特徴とするケモカイン又はケモカイン類似体を含有する物質を検出する物質検出方法物質検出方法。
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