JP2008511296A

JP2008511296A - ウイルス性ｔｎｆレセプター及び関連のタンパク質のケモカイン結合活性

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Publication number: JP2008511296A
Application number: JP2007528782A
Authority: JP
Inventors: ペルテジョアントニオアルカミ; ヘルベルグアリアレジョ; アレグエーロマリアベゴナルイス; インホ; マルガリダサライバ; ビセントピースミス
Original assignee: ペルテジョアントニオアルカミ
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2005-09-02
Publication date: 2008-04-17
Also published as: ES2315037A1; CN101044158A; CA2578904A1; US20090104178A1; US8759485B2; AU2005279294A1; EP1791859A1; WO2006024533A1; ES2315037B1

Abstract

ウイルス性ＴＮＦレセプター及び関連するタンパク質のケモカイン結合活性。本発明はケモカイン及びそれらの類似物を結合するため及び／又はＴＮＦＲｓの免疫賦活性特性を高めるために又はケモカインがそれに対応する細胞表面レセプターに結合するのを阻止ために及び／又はケモカイン生物学的活性を調整するために、誘導体及び断片を含んでいるポックスウイルスとそれらの機能的な同族体とからウイルス性腫瘍壊死因子レセプター（ｖＴＮＦＲｓ）ＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）のＣ−末端領域（ＣＴＤ）に関するものである。

Description

本発明はケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）活性を変更しかつ複数の腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲｓ）の免疫賦活特性を高めるために、ポックスウイルスによってコード化されかつサイトカイン応答変更因子Ｂ及びＤ（ＣｒｍＢ及びＣｒｍＤ）と呼ばれる複数の腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲｓ）及び同族体、誘導体又はその断片のＣ−末端領域（ＣＴＤ）の使用に関する。また本発明は本発明のタンパク質を含有する融解ポリペプチド、医薬組成物及び試験キットに関するものである。

ポックスウイルスは２００個の遺伝子までコード化されている複雑なＤＮＡウイルスである。天然痘ウイルス（ＶａＶ）はＷＨＯの世界的な撲滅キャンペーンにおいて疱瘡ワクチンとしてのワクシニア症ウイルス（ＶＶ）の使用の結果として撲滅された最も壊滅的な人間の病気の１つである疱瘡の作因病原体であった。牛痘ウイルス（ＣＰＶ）はＶＶに関連しかつ多数の哺乳動物における散発性感染を引き起こすケッ（齧）歯目のウイルスであると考えられている。先天性四肢欠損症ウイルス（ＥＶ）は天然のマウスの病原菌でありかつヒト疱瘡に類似して引き出されるマウス病であるマウスポックスの作因病原体である。

免疫応答はウイルスのごとき病原菌による感染からの有効な保護のメカニズムとして進化してきた。免疫性寄生体を複製するために、免疫応答を回避するためのウイルス性メカニズムが進化してきた（アルカミ及びコスジノウスキー、２０００年「Ａｌｃａｍｉ＆Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ，２０００」）。ポックスウイルスは寄生体免疫応答に対抗する広範囲のタンパク質をコード化している（アルカミ、２００３年、シート等、２００３年「Ａｌｃａｍｉ，２００３，Ｓｅｅｔｅｔａｌ．，２００３」）。ポックスウイルスによってコード化された免疫賦活のメカニズム１つは免疫応答を調整するタンパク質のファミリー、即ちサイトカインを結合する分泌タンパク質の生成である。

ポックスウイルスによってコード化された４つの分泌されたＴＮＦＲｓが説明され、そしてサイトカイン応答変更因子Ｂ（ＣｒｍＢ），ＣｒｍＣ，ＣｒｍＤ，及びＣｒｍＥと名づけられた（フー等、１９９４年、ラパレブ等、１９９８年、サライバ及びアルカミ、２００１年、スミス等、１９９６年「Ｈｕｅｔａｌ．，１９９４，Ｌｏｐａｒｅｖｅｔａｌ．，１９９８，Ｓａｒａｉｖａ＆Ａｌｃａｍｉ，２００１，Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９９６」）。これらのタンパク質はヒトＴＮＦＲｓに存在しかつＴＮＦ結合細胞外領域を構成しているシステインの豊富な領域（ＣＲＤｓ）と類似するアミノ酸配列を有している。ウイルス性タンパク質はＴＮＦＲｓの細胞膜透過領域及び細胞内領域を欠いている（図１及び図２）。

４つのすべてのウイルス性ＴＮＦレセプター（ｖＴＮＦＲｓ）はＴＮＦを結合しかつＴＮＦの生物学的活性を阻止するために、ウイルス感染細胞から分泌されるようになっている。ｖＴＮＦＲｓのＣＲＤｓはＴＮＦを結合するように予知され、そしてこれは粘液腫ウイルス（Ｍ−Ｔ２）によってコード化されたＣｒｍＢ同族体に関して証明され（シュライバー等、１９９７年「Ｓｃｈｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，１９９７」）、そして本発明の固有の実験はＣｒｍＤの３つのＮ−末端ＣＲＤｓがＴＮＦ結合及び抑制活性をコード化することを示している（下記参照）。

ＣｒｍＢ及びＣｒｍＤと名づけられたｖＴＮＦＲｓの２つの代表的な構成要素はＣＰＶＣｒｍＢ（ＳＥＱＩＤＮｏ．１１及び１２），ＶａＶＣｒｍＢ（ＳＥＱＩＤＮｏ．９及び１０），ＣＰＶＣｒｍＤ（ＳＥＱＩＤＮｏ．１及び２）及びＥＶＣｒｍＤ（ＳＥＱＩＤＮｏ．３及び４）である。ＣｒｍＢ及びＣｒｍＤはデータベース中の細胞タンパク質と類似するアミノ酸配列を持たない別のＣＴＤを有している（図１及び図２）。この領域はＴＮＦ結合に必要とされずそしてその機能は特定されていない。ポックスウイルスによってコード化された３つの開放読み取りフレーム（ＯＲＦｓ）はｖＴＮＦＲｓのＣＴＤに類似するアミノ酸配列を有している。これらのＯＲＦｓの代表的な構成要素は、ＥＶＥ１２（ＣＴＤ１）（ＳＥＱＩＤＮｏ．５及び６），ＥＶＥ１８４（（ＣＴＤ２）（ＳＥＱＩＤＮｏ．１９及び２０）及びＣＰＶＢ２１Ｒ／Ｖ２１８（ＣＴＤ３）（承認ＮＯ．０７２７５８及び（ＳＥＱＩＤＮｏ．１３及び１４）である（図１及び図２）。

ケモカインを結合する多数の分泌タンパク質が幾つかのポックスウイルス及びヘルペスウイルスに記載されている（アルカミ等、１９９８年、ブライアント等、２００３年、グラハム等、１９９７年、ララニ等、１９９７年、パリー等、２０００年、バン・ベルケル等、２０００年「Ａｌｃａｍｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｂｒｙａｎｔｅｔａｌ．，２００３，Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，１９９７，Ｌａｌａｎｉｅｔａｔ．，１９９７，Ｐａｒｒｙｅｔａｌ．，２０００，ＶａｎＢｅｒｋｅｌｅｔａｌ．，２０００」）（表１）。これらのウイルス性コード化ケモカイン結合タンパク質（ｖＣＫＢＰｓ）は７個の細胞膜透過領域ケモカインレセプター又は他の細胞タンパク質に類似するアミノ酸配列を持たない（アルカミ、２００３年、シート等、２００３年、シート及びマクファデン、２００２年「Ａｌｃａｍｉ，２００３，Ｓｅｅｔｅｔａｌ．，２００３，Ｓｅｅｔ＆ＭｃＦａｄｄｅｎ，２００２」）。ネズミのガンマヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ−６８）によってコード化されたＣＰＶ及びＭ３によってコード化された３５ｋＤａｖＣＫＢＰについての構造的及び機能的研究はこれらのウイルス性タンパク質が新規なタンパク質領域又はケモカインを結合する能力を有する構造を有することを実証した（アレキサンダー等、２００２年、カリフ等、１９９９年「Ａｌｅｘａｎｄｅｒｅｔａｌ．，２００２，Ｃａｒｆｉｅｔａｌ．，１９９９」）。感染した組織及びウイルス性病原中に入る白血球の遊走を阻止するような幾つかのｖＣＫＢＰｓの能力が実証された（ブリッジマン等、２００１年、グラハム等、１９９７年、ジョンソン及びマクファデン、２００４年、ララニ等、１９９９年、リーディング等、２００３年「Ｂｒｉｄｇｅｍａｎｅｔａｌ．，２００１，Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，１９９７，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ＆ＭｃＦａｄｄｅｎ，２００４，Ｌａｌａｎｉｅｔａｌ．，１９９１，Ｒｅａｄｉｎｇｅｔａｌ．，２００３」）。

ウイルス性ＴＮＦレセプター（ｖＴＮＦＲｓ）サイトカイン応答変更因子Ｂ（ＣｒｍＢ）及びＤ（ＣｒｍＤ）のＣ−末端領域（ＣＴＤ）は今日までその機能を発見されず、また宿主タンパク質に類似する配列を有していない。本発明はこの領域が多数のケモカインを結合する能力ｖＴＮＦＲｓに付与すること、及びｖＴＮＦＲｓのＴＮＦ結合領域から独立して発現されたＣＴＤがケモカインを結合することを見い出した。このタンパク質領域は分泌されるものと予測される３つの別のポックスウイルスでコード化タンパク質内に見い出され、そして本発明は先天性四肢欠損症ウイルス（ＥＶ）のＥ１２遺伝子及び牛痘ウイルス（ＣＰＶ）のＢ２１Ｒ遺伝子によってコード化されたそれらの２つがケモカインを結合することを示している。本発明はｖＴＮＦＲｓのＣＴＤがケモカインを結合する新規な構造的領域を特定することを提案する。これらのタンパク質は生体内でケモカイン活性を調整しかつ多数の人間の疾病状態における逆の免疫及び炎症応答を調整するのに使用され得る。可溶性ＴＮＦＲｓに溶解されたこのＣＴＤの発現はすでに診療所で使用されたＴＮＦＲｓの免疫賦活性の特性を高めることができる。加えて、ＣＴＤはｖＴＮＦＲｓのＮ−末端システインの豊富な領域のＴＮＦ結合活性を高め、そしてｖＴＮＦＲｓはＴＮＦリガンド上科の他の構成要素を結合する。

発明の概要

本発明の第１の態様はケモカイン及びそれらの類似物を結合するのに使用のため及び／又はＴＮＦＲｓの免疫賦活性の特性を高めるために、ポックスウイルスからのウイルス性ＴＮＦレセプターＣｒｍＢ及び／又はＣｒｍＤのＣ−末端領域（ＣＴＤ）及び機能的な同族体、誘導体、及び断片を含んでいるポックスウイルスからのそれらの同族体ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３を有している。

本発明の好適な態様はケモカインが対応する細胞表面レセプターに結合するのを阻止するのに使用するため及び／又はケモカイン結合活性を調整するために、ポックスウイルスからのＣｒｍＢ及び／又はＣｒｍＤからのＣＴＤおよび同族体、誘導体、及び断片を含んでいるポックスウイルスからのそれらの同族体ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３を有している。

ポックスウイルスからのＣｒｍＢ及び／又はＣｒｍＤからのＣＴＤの同族体は、例えば、ＣｒｍＢ及び／又はＣｒｍＤからのＣＴＤをコード化しているヌクレオチド配列の突然変異体及び突然変異配列からの発現、及び／又は関連の遺伝子配列からの使用又は誘導によって得ることができる。変形例において、それらは、例えば、タンパク質配列かまたはタンパク質をコード化しているヌクレオチド配列を包含しているデータベースをスクリーンすることによってＣｒｍＢ及び／又はＣｒｍＤからのＣＴＤに類似する遺伝子配列を識別することによって、例えば可能なアルゴリズムを使用するブラストプログラムを使用して同族（ホモロジ）が決定され得るスイスプロットデータベースを例えばスクリーンすることによって得ることができる。配列全体にわたる同族の許容し得るレベルは少なくとも約２０％、例えば、約３０％である。他のタンパク質を有するＣｒｍＢ及び／又はＣｒｍＤからのＣＴＤの機能的な断片の同族はこれより低く、例えば、約１０％にすることができる。

ＣｒｍＢ又はＣｒｍＤからのＣＴＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）の誘導体又は断片を含んでいる機能的な同族体は例えば放射性標識化されたケモカインを使用する交差結合アッセイと同等な適宜な方法によって又はサーフエイスプセスモンレゾナンス（ＳＰＲｍ、ＢｌＡｃｏｒｅ）のごときタンパク質−タンパク質相互作用を測定する他の方法によりケモカインを結合するようなそれらの能力に関してチェックされ得る。

本発明の非常に好適な実施形態において、ＣｒｍＢからのＣＴＤはＳＥＱＩＤＮｏ．２６又はＳＥＱＩＤＮｏ．２８のいずれかを含み、ＣｒｍＤからのＣＴＤはＳＥＱＩＤＮｏ．２２又はＳＥＱＩＤＮｏ．２４のいずれかを含み、そしてＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）は以下のＳＥＱＩＤＮｏ．８，ＳＥＱＩＤＮｏ．１４，ＳＥＱＩＤＮｏ．６，ＳＥＱＩＤＮｏ．２０，ＳＥＱＩＤＮｏ．１８，ＳＥＱＩＤＮｏ．１６及び遺伝子ＣＰＶＶ２０１（受け入れＮｏ．Ｑ８ＱＭＰ４），Ｄ１２Ｌ（受け入れＮｏ．Ｐ８７５９８），Ｂ６Ｒ（受け入れＮｏ．０７２７４３）又はＢ２１Ｒ（受け入れＮｏ．０７２７５８）によってコード化されたタンパク質のいずれかを含んでいる。

本発明の第２の態様は、同族体、誘導体、及び断片を含んでいる本発明のＣＴＤをコード化する核酸分子を備えている。また、本発明には、後述する核酸の補完ストランド及び遺伝子コードの縮退による同族体、誘導体、及び断片を含んでいる本発明によるＣＤＴをコード化する配列と異なる核酸分子が含まれている。

本発明の好適な実施形態において、ＣｒｍＢからＣＴＤをコード化するは、ＳＥＱＩＤＮｏ．２５又は２７のいずれかを含有し、ＣｒｍＤからＣＴＤをコード化する配列はＳＥＱＩＤＮｏ．２１又はＳＥＱＩＤＮｏ．２３のいずれかを有し、そして機能的同族体のＣＴＤをコード化する配列は以下の遺伝子、Ｖ１０４（ＳＥＱＩＤＮｏ．７），Ｖ２０１，Ｖ２１８（ＳＥＱＩＤＮｏ．１３），Ｄ１２Ｌ，Ｂ６Ｒ，Ｂ２１Ｒ，Ｅ１２（ＳＥＱＩＤＮｏ．５），Ｅ１８４（ＳＥＱＩＤＮｏ．１９），ＶＡＣＷＲ１８９（ＳＥＱＩＤＮｏ．１７）又はＶＡＣＷＲ２０６（ＳＥＱＩＤＮｏ．１５）によってコード化された配列のいずれを有している（図１及び図２）。

本発明の第３の態様によれば、溶融ポリペプチドは、同じ起源又は他の起源のポリペプチド配列に溶融された機能的な同族体、誘導体、及び断片を含んでいるＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）からのＣＴＤのいずれかを含有することにより産生され得る。

本発明の好適な実施形態において、機能的な同族体、誘導体、及び断片を含んでいるＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）からのＣＴＤは共有結合で又は共有結合なしで、他の物質と結合され得る。結合産生体は溶融タンパク質である。可溶性ＴＮＦＲｓに溶融されるＣＴＤの発現は診療所ですでに使用のＴＮＦＲｓの免疫賦活特性を高める。Ｃ−末端領域はＮ−末端ＣＲＤのＴＮＦ結合活性を高める分子枠組みを備え、例えば、ＣＲＤ（１，２）結合特性はこの方法において高められる。加えて、この強化はＴＮＦリガンド上科（スーパーファミリー）の他の構成要素にｖＴＮＦＲｓ結合を行なうことができる。

かくして、本発明のさらに他の態様において、溶融ポリペプチドはヒト起源のＴＮＦＲｓに溶融されたｖＴＮＦＲｓのＮ−末端ＴＮＦ結合領域に溶融された機能的な同族体、誘導体、及び断片を含んでいるＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はそれらのＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）からのＣＴＤを含有している。

本発明のさらに他の実施形態において、他の起源のポリペプチド配列に溶融された機能的な同族体、誘導体、及び断片を含んでいるＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）からのＣＴＤのいずれかを含んで生成される溶融タンパク質はポリペプチド配列にケモカイン結合特性を付与する。

一定の目的に関して、結合パートナーは公知の化学的結合方法、例えば、一方のパートナーのビオチン化及びアビジンのごとき、ビオチンの結合パートナーを有する他方の派生化によって、機能的な同族体、誘導体、及び断片を含んでいるＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）からのＣＴＤに結合され得る。

上述したような機能的な同族体、誘導体、及び断片を含んでいるＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）からのＣＴＤのいずれか（本発明のタンパク質）は例えばケモカイン及びそれらの類似体の両方を、タンパク質が到来する親ウイルスの寄生範囲に対応する動物種起源又は特異性と、及び／又はケモカイン及びそれらの類似体をヒト起源及び／又は特異性と結合するのに使用され得る。

本発明の範囲内にある本発明のタンパク質の誘導体の中には、欠失又は置換によって調整された本発明のタンパク質をコード化している配列を有しているポリペプチドがあり、これらは本発明のタンパク質のケモカイン結合特性を保持している。例えば、あらゆる免疫を生じるアミノ酸モチーフを削除すること又はかかるモチーフを少ない免疫を生じるアミノ酸配列と交換することが有用となる。変形例において、寄生内に免疫許容誤差を誘発することができる調整は本発明のタンパク質をコード化している配列に導入され得る。

本発明は、また、ヌクレオチド配列、例えば、本発明のタンパク質と断片又は他のポリペプチドを有するそれらの溶融生成物のごとき同族体を含んでいるその調整された形状をコード化している適宜なプロモーターを組み込んでいるＤＮＡカセット、及び適宜なプラスミド又は他のベクター、例えばウイルス性ベクターに包含される発現カセットに適用範囲を広げている。

本発明のタンパク質は例えばＣケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン又はＣＸ３Ｃケモカインを結合するのに使用され得る。本発明の態様によれば、本発明のタンパク質はかかるケモカインがそれらのレセプターに結合するのを阻止するか又は生体外で、例えば生物学的サンプル又は生体内で生物学的活性を抑制するのに使用され得る。

この作用は、例えば診療及び測定目的のため標識化された反応体を使用する特別な結合試験に利用することができる。標識化された反応体は手による所望の目的の試験の形態に応じて、本発明のタンパク質、又はケモカイン、又はケモカインレセプターのいずれかにすることができる。

従って、本発明の態様は、また、かかる試験を実施するための組成物、例えば、本発明のタンパク質の標識化している生成物と、それらのいずれかの基準化された試験アリコートと、本発明のタンパク質を以下に記載する特別な結合試験において処理するのに適する固体相に結合する生成物と、反応中の結合パートナーの一方の基準化された試験アリコートとかかる反応体の２つ又はそれ以上を関連付ける試験キッドとにある。その試験は、例えば、ケモカイン、又はケモカインレセプターの分析であってもよい。

結合作用は、また、本発明のタンパク質によって結合され得るケモカインによって実現された作用の抑制に利用され得る。

本発明のさらに他の態様によれば、ＣｒｍＢ及び／又はＣｒｍＤ及び／又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）からのＣＴＤ、及び／又は機能的な同族体、誘導体又はその断片及び／又は他のタンパク質との溶融及び／又は発現カセット及び／又はプラスミド又は他のベクターを含んでいる医薬組成物は生体内においてケモカイン又はケモカイン類似体に結合するのに使用できるか、又は免疫調整作用を発生させるために、生体内においてケモカインが対応する細胞表面レセプターに結合するのを阻止するのに使用することができる。

本発明のさらに他の態様によれば、医薬組成物は適切な治療（抗炎症）量において、抗炎症剤として使用するために、本発明のタンパク質を含有することができる。

本発明のタンパク質は治療されるべき被験者に供給するために従来の医薬賦形剤に適合するように調合され得る。

本発明の好適な実施形態によれば、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含んでいる溶融タンパク質のいずれかをコード化しているヌクレオチド配列は適宜なプロモーターの制御下で挿入され得る。遺伝子供給システムはウイルス性又は非ウイルス性ベクターシステムにすることができる。かかるベクターは目標細胞が治療の被験者である寄生の生体内にある時、例えば、抗炎症の目的のために本発明のタンパク質を製造する能力を目標の核酸を入れた細胞に付与するのに使用され得る。かかる抗炎症の目的はケモカイン、即ち、慢性間接リューマチのごとき炎症性疾患を促進するか又はこの疾患に関連付けられるケモカインによって提供された作用を抑制するような使用を包含することができる。抗炎症の目的は本発明のタンパク質を供給するベクターと同一のベクターから又はかかる他の供給された遺伝子用の別個の供給ベクターからであろうと、ベクター供給システムの要素に対する寄生免疫応答の低減及び／又はベクターシステムによる遺伝子供給後の目標細胞に発現される他の遺伝子生成物に対する寄生免疫応答の低減をも包含している。

本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を発現するベクターは例えば適宜にシステム化された供給ルートによって、生体内で細胞に投与され得る。変形例において、投与は目標細胞の場所及び／又は治療されるべき被験者の炎症場所の近傍での静脈注射によるような、例えば、直接注射により行うことができる。

投与の形式は本発明のタンパク質に対する寄生の免疫応答を制限するように選択され得る。例えば、本発明のタンパク質又はそれらを発現するベクターシステムは他の免疫抑制剤又は抗炎症物質とともに供給され得る。

本発明のさらに他の態様は本発明のタンパク質及び／又はｖＴＮＦＲｓなしに対するＶＶワクチンに関するものである。ｖＴＮＦＲｓ及びＣＴＤ関連のタンパク質はヒトの疱瘡ワクチンとして又は免疫性を誘導するような他の病状からのタンパク質の発現用の組み換え型のウイルス性ベクターとして使用されるＶＶ菌株によって発現される。これらのタンパク質のケモカイン結合活性の中和はウイルス性複製及び／又はウイルス誘導の免疫病理学を制限することにより、ＶＶによる疱瘡ワクチン種痘後に報告される逆作用を減少する。ｖＴＮＦＲｓ又はＣＴＤのケモカイン結合活性を中和する抗体又は反応体は人間の疱瘡を減じ、致命的な人間の疱瘡を保護しかつＶＶ疱瘡ワクチン種痘によって発生される逆作用を減少する。

本発明の他の態様は本発明のタンパク質を含有する反応体を有するケモカイン又はケモカイン類似体を含んでいるサンプルを培養することによるケモカイン又はケモカイン類似体の検出方法を包含している。

本発明の他の態様は本発明のタンパク質に対する抗体又はｖＴＮＦＲｓ又はＣＴＤ同族体のケモカイン結合活性を抑制する反応体に基づいて、ＶＶ疱瘡ワクチン種痘によって発生される逆作用又は疱瘡によって発生された病状を治療するための医薬を製造するために本発明のタンパク質を使用するタンパク質の使用方法に関するものである。

本発明の他の態様については当該技術分野において通常の技術を有する者であれば明らかに導き出すことができる。

図１は異なるウイルスにおけるｖＴＮＦＲｓ及びＣＴＤ同族体の概略を示している。各ウイルスにおける遺伝子の名前が示されている。

図２はＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの配列表を示している。

図３はＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）結合タンパク質としてのＥＶＣｒｍＤの同定を示している。（ａ）はＶＶによって発現されないＩＬ−８結合活性の存在を示したＥＣＶ感染細胞から培養基までの１２５Ｉ−ＩＬ−８の交差結合を示している。（ｂ）は組み換え型ＶＶから発現された全長のＣｒｍＤがＩＬ−８を結合するが、ＣｒｍＤＣＲＤ（１−４）は結合しないことを示している。（ｃ）は組み換え型ＣｒｍＤに対する１２５Ｉ−ＩＬ−８の結合が過剰なヒト又はマウスのＴＮＦの存在において抑制されなかったことを示している。（ｄ）はバキュロウイルスシステムにおいて発現されたＣＰＶＣｒｍＤ及びＣｒｍＢに対する１２５Ｉ−ＩＬ−８の交差結合を示している。

図４はＴＮＦ結合及び活性抑制におけるＣｒｍＤＣＲＤ及びＣＴＤの役割を示している。（ａ）はＥＶＣｒｍＤＣＲＤｓ及びＣＴＤの組み合わせを含んでいる構造の概略図を示している。（ｂ）は指示されたＣｒｍＤ構造を発現するＶＶ組み換え型により感染された細胞からの浮遊物によるＵ９３７細胞に対する１２５Ｉ−ＴＮＦの結合の競合を示している。（ｃ）は指示された組み換え型ＶＶｓ又はＶＶＷＲにより感染された細胞の浮遊物の増大投与量の存在におけるマウスＬ９２９細胞中のＴＮＦ−誘導の細胞毒性のパーセンテージとして測定された組み換え型ＣｒｍＤ構造の生物学的活性を示している。（ｄ）は指示された組み換え型バキュロウイルスにより感染された細胞からの浮遊物によるＴＮＦ−誘導の細胞毒性の抑制を示している。

図５はＥＶＣｒｍＤに結合するケモカインを示している。純化された組み換え型ＥＶＣｒｍＤタンパク質は５０００ＲＵのレベルまでＣＭ５バイオセンサチップにアミン結合された。このチップはバイアコレックス（スウェーデン国，ウプサラ）における市場で入手し得るすべてのヒトケモカインに対する結合をスクリーンするために使用された。すべての場合において、１００ｎＭのケモカイン溶液の３０μｌが１０μｌ／分の流量で注入された。最大結合レベルは各ケモカインに関して解離（複合体の安定化）の１２０秒後の結合レベルに対してプロットされた。ＳＰＲ運動分析によって測定されたような示されたケモカインに関する親和性定数を挿入する。運動分析に関して、純化された組み換え型ＥＶＣｒｍＤタンパク質は１２００ＲＵ（Ｒｍａｘ＜２００ＲＵ）のレベルまでＣＭ５バイオセンサチップにアミン結合された。異なるケモカイン濃度が２分間３０μｌ／分の流量で注入されかつ解離は追加の５分間で監視された。曲線の寸法合わせ（フィッティング）は１：１ラングマイアー（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを使用するバイア（ＢＩＡ）エバリュエーションソフトウエアにより実施された。

図６はラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）及びＶａＶＣｒｍＢタンパク質のアミノ酸配列表を示している。維持された残留物は星印によって示されている。突然変異させられた位置は赤で示されている。ＣＲＤ（１−４）及びＣＴＤが示されている。

図７はＴＮＦ及びケモカインに結合するＶａＶＣｒｍＢの種々の領域を示している。全長のＶａＶＣｒｍＢ，ＶａＶＣｒｍＢＣＲＤ（１−４）又はＶａＶＣｒｍＢＣＴＤの純化されたタンパク質に対するヒトＴＮＦα（赤）及びヒトＣＸＣＬ１２β（ＣＫ、青）の結合がＳＰＲによって分析された。

図８はＶａＶＣｒｍＢによるＴＮＦ及びケモカイン生物学的活性の抑制を示している。（ａ）はＴＮＦ−誘導の細胞毒性の抑制を示している。ＴＮＦはアクチノマイシンＤ（４□ｇ／ｍｌ）により補充された完全なＤＭＥＭの|□|における純化された組み換え型タンパク質の指示量により３７°Ｃで２時間予め培養された。混合物は次いで９６−ウエルプレートに前日に植えつけられた２×１０^４Ｌ９２９細胞に加えられそして細胞の死滅が１６〜１８時間後に評価された。Ｏ．Ｄ．４９０ｎｍのクアドルプリケイツ（平均±ＳＤ）が各場合にプロットされた。「細胞」／「セルアクトＤ」：細胞生存能力の制御；ＴＮＦ：細胞死滅の制御；「ＣｒｍＢ」：ＶａＶＣｒｍＢにより予め培養されたＴＮＦ；「ＣＲＤ」：ＣｒｍＢＣＲＤ（１−４）により予め培養されたＴＮＦ；「ＩｇＧ１」：ＩｇＧ１により予め培養されたＴＮＦ、特異性に関する制御。（ｂ）走化性分析。ヒトＣＣＬ２５（１００ｎＭ）が単独で又は純化された組み換え型タンパク質の増大量の存在において３０分間３７°Ｃで培養されかつ２４ウエル−トランスウエル室の下方の仕切り室内に置かれた。この期間後、５×１０^５ＭＯＬＴ−４細胞が頂部ウエルに対して０．１％ＦＣＳを含んでいる１００□|の完全なＲＰＭＩに加えられそしてプレートは４時間３７°Ｃで培養した。底部ウエルに向かうＭＯＬＴ−４細胞の泳動の％はＦＡＣＳ分析によって測定された。１００％の移動がケモカインのみの存在において泳動する細胞の数として設定された。

図９はＶａＶＣｒｍＢへのケモカイン結合を示している。純化された組み換え型ＶａＶＣｒｍＢタンパク質は５０００ＲＵのレベルまでＣＭ５バイオセンサチップにアミン結合された。このチップはバイアコレックス（スウェーデン国，ウプサラ）における市場で利用し得るすべてのヒトケモカインに対する結合をスクリーンするために使用された。すべての場合において、１００ｎＭのケモカイン溶液の３０μｌが１０μｌ／分の流量で注入された。最大結合レベルは各ケモカインに関して解離（複合体の安定化）の１２０秒後の結合レベルまでプロットされた。ＳＰＲ運動分析によって測定されたような示されたケモカインに関する親和性定数を挿入する。運動分析に関して、純化された組み換え型ＶａＶＣｒｍＢタンパク質は１２００ＲＵ（Ｒｍａｘ＜２００ＲＵ）のレベルまでＣＭ５バイオセンサチップにアミン結合された。異なるケモカイン濃度が２分間３０μｌ／分の流量で注入されかつ解離は追加の５分間で監視された。曲線の寸法合わせ（フィッティング）は１：１ラングマイアー（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを使用するバイア（ＢＩＡ）エバリュエーションソフトウエアにより実施された。

図１０はＶａＶＣｒｍＢのＣＲＤ（１−４）に対するＶＶｋＤａｖＣＫＢＰの溶融がケモカインを結合する能力をＣｒｍＢに付与することを示している。（ａ）ケモカイン結合に関する交差結合分析。組み換え型バキュロウイルス「ＢａｃＶａＶＣｒｍＢＣＲＤ（１−４）」（Ｂａｃ１０６），「ＢａｃＶａＶＣｒｍＢ」（Ｂａｃ１０７），及び「ＢａｃＶａＶＣｒｍＢＣＲＤ（１−４）／３５Ｋ」（Ｂａｃ１０９）により感染又は予備感染されたＨｉｇｈ５細胞からの浮遊物が^１ ^２ ^５ |−ＣＣＬ３により培養された。組み換え型タンパク質とＣＣＬ３との間の複合体はＥＤＣを使用することによって交差結合されそして生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び放射能写真撮影によって分析された。（ｂ）ＴＮＦ−誘導の細胞毒性の抑制を示している。ＴＮＦはアクチノマイシンＤ（４□ｇ／ｍｌ）により補充された完全なＤＭＥＭの|□|において対応する浮遊物により３７°Ｃで２時間予め培養された。混合物は次いで９６−ウエルプレートに前日に植えつけられた２×１０^４Ｌ９２９細胞に加えられそして細胞の死滅が１６〜１８時間後に評価された。Ｏ．Ｄ．４９０ｎｍが種々のサンプルに対してプロットされた。

本発明の実施の形態を実施するための物質及び方法を以下の例において詳しく説明するが、以下の例は本発明の範囲を限定するようなものではない。

例
実施例１：物質及び方法
１．１．−ポックスウイルス
ＣＰＶ，ＥＶ及びＶＶがＢｓｃ−Ｉ細胞の融合性分子フィルムを感染させることによって生体外で繁殖された。

１．２．−ラクダ痘ＣｒｍＢのクローニング及びＶａＶＣｒｍＢの発生
ＣｒｍＢ遺伝子に対応するラクダ痘ウイルスの菌株ＣＭＳのＯＲＦ２６４がオリゴヌクレオチドＣＭＬＶ２６４Ｅｃｏ（５；−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＴＡＴＡＣＴＣＧ）及びＣＭＬＶ２６４Ｘｃｏ（５；−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧ）を使用するＰＣＲによって増幅されそしてテンプレートとしてＣＭＬＶＤＮＡに純化された。ＰＣＲ生成物はプラスミドｐＲＡＴ１を発生させるためにＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ組織化されたｐＢａｃ−Ｉ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））にクローン化された。増幅された遺伝子中の突然変異の不存在がＤＮＡ配列決定によって確認された。ＶａＶ（菌株バングディシュ１９７５；ＯＲＦ１８８）に対応するＤＮＡが製造業者の指示に従っている「クィックチェンジマルチサイト指向突然変異生成キット（ストラタジン「Ｓｔｒａｔａｇｉｎｅ」）」を使用するプラスミドｐＲＡＴ１の多重サイト指向突然変異生成によって得られた。導入された突然変異は図６に示されている。サイト指向突然変異生成の幾つかの連続するラウンド後、プラスミドｐＲＡ１０５が得られた。このプラスミドはオリジナルのｐＢａｃ−Ｉミラスミドによって供給されたＣ−末端Ｈｉｓタグに溶解されたＶａＶ（ＢＳＨ１９７５菌株）ＣｒｍＢをコード化している配列を含んでいる。すべての突然変異の存在及び望まない追加の突然変異の不存在は直接配列決定によって確認された。

１．３．−ＥＶ又はＣＰＶからＣｒｍＤを発現する組み換え型バキュロウイルス及びワクシニア症ウイルスの構造
バキュロウイルスシステム中の発現に関して、ＣｒｍＤ（表３）のＤＮＡコード化全長又は截形バージョンが特定のオリゴヌクレオチド（表４）によりＰＣＲ−増幅され、かつｐＢＡＣ−１にクローン化された。組み換え型バキュロウイルスは組み換え型ｐＢａｃ−Ｉプラスミド及び記載された（アルカミ等、１９９８年）ように直線化されたバキュロウイルスＤＮＡによりトランスフェクトされた（該酸を入れられた）ＳＦ２１昆虫細胞中の同族組み換えによって発生された。

ｖＴＮＦＲｓは、また、ＶＶ発現システムから発現された。関心のある遺伝子が強力なＶＶプロモーター（デイビソン及びボス、１９９０年）からの遺伝子の発現に関してｐＭＪ６０１にクローン化された。関心のある遺伝子が同族組み換えによりＶＶゲノムのチミジンキナーゼローカスに挿入され、そして組み換え型ＶＶがブロモデオキシウリジンの存在において選択されかつカラー（色）選択（□−ガラクトシダーゼの発現及びＸ−ｇａｌによる色付け）によって識別された。ｖＴＮＦＲｓは、ＶＶウエスタンリザーブ、ＴＮＦ結合活性をコード化していないウイルス菌株（アルカミ等、１９９９年）から発現された。

１．４．−ＶａＶＣｒｍＢ，ＶａＶＣｒｍＢＣＲＤ（１−４），ＶａＶＣｒｍＢＣＴＤ，ＥＶＥ１２，ＥＶＥ１８４，ＣＰＶＶ２１８及びＣＰＶ３５ｋＤａタンパク質に溶解されたＶａＶＣｒｍＢＣＲＤ（１−４）を発現する組み換え型バキュロウイルスの発生
Ｃ−末端Ｈｉｓタグに溶解された全長ＶａＶＣｒｍＢ遺伝子がｐＲＡ１０７を発生するためにＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ分解ｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン「Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ」）にサブクローン化された。４つのＣＲＤｓを包含しかつ残留物１（Ｍ）〜１９２（Ｃ）に対応するＶａｖＣｒｍＢのＮ−末端領域がオリゴヌクレオチドＶａＶ１８８Ｅｃｏ（５；−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＧＴＡＴＴＡＴＡＣＴＴＧ）及びテンプレートとしてｐＲＡ１０７を使用するＶａＶ１８８ＣＲＤａ１−４Ｘｈｏ（５；−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＧＡＴＧＴＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡＣＴＧＧ）を使用するＰＣＲによって増幅された。増幅された断片はｐＲＡ９９を発生するためにＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ分解ｐＢａｃ１（ノバゲン「Ｎｏｖａｇｅｎ」）によって設けられたＣ−端末Ｈｉｓタグによりフレーム内でクローン化された。ｐＲＡ９９はＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩで分解されそしてＨｉｓタグに溶解されたＶａＶＣｒｍＢＣＲＤｓを支持する断片はｐＲＡ１０６を発生するために前のようにｐＦａｓｔＢａｃ１にクローン化された。ＶａＶＣｒｍＢ（残留物Ｔ１９４及びＬ３４８）のＣＴＤはオリゴヌクレオチドＶａＶ１８８Ｃｔｅｒ−ＰｆＩＭＩ（５；−ＣＧＣＣＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＡＧＧＡＣＧＡＣＣＡＣ−ＴＡＣＣＧＧ）及びテンプレートとしてｐＲＡ１０７を使用するＨ３４７ＲによりＰＶＲで増幅された。この断片はＰｆｍＩＩ及びＸｈｏＩにより分解されかつ同一の酵素により分解されたｐＲＡ１０７にクローン化された。これは、ｐＲＡ１０８、ＣｒｍＢのＣＴＤ及び追加のＨｉｓタグが続くＶａＶＢｒｍＢ（予想される信号ペプチドを包含する）の２９のＮ−末端残留物から構成される溶融タンパク質をコード化するプラスミドを発生する。ｐＲＡ１０６，ｐＲＡ１０７及びｐＲＡ１０８中の望ましくない突然変異の不存在がすべての場合に完全な挿入を配列決定することによって確認された。

ＥＶ遺伝子Ｅ１２はオリゴヌクレオチドＥ１（５；−ＧＣＧＧＧＡ−ＴＣＣＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣ）及びＥ２（５；−ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＡＴ−ＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＧＣＡＡＧ）を使用するＰＣＲによって増幅されそしてテンプレートとしてＥＶ（菌株、ｎａｖａｌ．Ｃａｍ）ＤＮＡを純化した。ＰＣＲ生成物はプラスミドｐＭＳ５１を発生するＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ分解ｐＢａｃ１（ノバゲン）にクローン化された。Ｅ１２遺伝子はｐＦａｓｔｂａｃ（インビトロゲン）バックボーン中のＨｉｓタグをコード化しているＣ−末端配列に溶解されたＥ１２遺伝子を含んでいるプラスミドｐＡＨ１８を付与するようにＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ分解ｐＲＡ１０６にサブクローン化された。ＣＰＶブライトンレッド菌株ＯＲＦＶ２１８は５；Ｖ２１８ＥｃｏＲＩ（５；−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡＣＧＧＡＴＴＡＡＴＡＧＣ）及び３；Ｖ２１８ＳａＩＩ（５；− ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＣＴＣＡＴＣ）を使用してＰＣＲで増幅されそしてテンプレートとしてウイルス性ＤＮＡを純化した。ＰＣＲ生成物はｐＦａｓｔｂａｃ（インビトロゲン）バックボーン中のＨｉｓタグをコード化しているＣ−末端配列に溶解されたＣＰＶＶ２１８遺伝子を含んでいるプラスミドｐＡＧ１７を発生するためにＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ分解ｐＲＡ１０６にクローン化された。ＣＰＶ（菌株ブライトンレッド）３５ｋＤａタンパク質の残留物Ｓ２３〜Ｖ２４６に対応する断片は、オリゴヌクレオチド５；３５ＫＢＲ−Ｓ２３（５；−ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣ）及び３；３５ＫＢＲ（−ストップ）（５；−ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣＧＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴＴＧＣ）を使用してＰＣＲで増幅されそしてテンプレートとしてウイルス性ＤＮＡを純化した。ＰＣＲ生成物は、プラスミドｐＲＡ１０９を発生するためにＸｈｏＩ分解ｐＲＡ１０６にクローン化された。このプラスミドはその信号ペプチドなしでかつＦａｓｔｂａｃ（インビトロゲン）バックボーン中のＣ−末端Ｈｉｓタグを有してＣＰＶ３５ｋＤａｖＣＫＢＰをコード化している配列にフレーム内で溶解されたＶａＶＣｒｍＢＣＲＤ（１−４）をコード化している配列を支持している。

組み換え型バキュロウイルスは製造業者によって記載されたようなＢａｃ対Ｂａｃ発現システム（インビトロゲン）を使用して得られた。簡単に、プラスミドｐＲＡ１０６，ｐＲＡ１０７，ｐＲＡ１０８，ｐＲＡ１０９，ｐＡＨ１７及びｐＡＨ１８は反応能力のあるＤＨ１０Ｂａｃバクテリヤに変換され、転移の場合は対応する組み換え型ｂａｃｍｉｄｓを発生する。これらは純化されかつＨｉｇｈ５昆虫細胞にトランスフェクト（核酸注入）されそしてトランスフェクト後３日で、組み換え型バキュロウイルスｖＢａｃ１０６，ｖＢａｃ１０７，ｖＢａｃ１０８，ｖＢａｃ１０９＜ｖＢａｃＡＨ１７及びｖＢａｃＡＨ１８が細胞培養浮遊物から採取された。これらのウイルスは更にタンパク質生成のために高いタイターの組み換え型ウイルスストックを発生するために１つの工程において増幅された。

ＥＶからのＥ１８４遺伝子はオリゴヌクレオチド５；Ｅ１８４（５；−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＴＡＡＣＧＴＴＴ）及び３５；Ｅ１８４ＸｈｏＩ（５；−ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＡＡＴＡＴＧＴＡ）で増幅され、そしてテンプレートとしてＥＶＤＮＡを純化した。ＰＣＲ生成物はｐＡＨ１１を発生しているＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ分解ｐＲＡ１０６プラスミドにクローン化された。正しいＤＮＡ配列が確認された。プラスミドｐＡＨ１１はタンパク質の純化を容易にするためにヒスチジンタグに溶解されたＥＶＥ１８４タンパク質を発現する上述のような組み換え型バキュロウイルスｖＢａｃＡＨ１１を発生するのに使用された。

１．５．−タンパク質発現及び純化
組み換え型タンパク質を発現するために、Ｈｉｇｈ５細胞が高重複度（１０ｐｆｕ／細胞）で感染させそして感染した培養組織からの浮遊物が感染後３日（ｄ．ｐ．ｉ．）で採取された。これらの浮遊物中のタンパク質の存在がウエスタンブロット及び／又は全長及びＮ−末端ＶａＶＣｒｍＢ構造の場合において溶液中のＴＮＦ結合分析（アルカミ等、１９９９年）によって確認された。サンプルはＹＭ−３膜（ミリポア）及びＰＤ−１０脱塩コラム（アメルシャム−ファラムシアバイオサイエンス）で結合バッファ（５０ｍＭの燐酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）に交換されたバッファを使用して攪拌された限外濾過セル（アミコン）でおよそ２．５ｍｌに濃縮された。Ｈｉｓ−タグが付けられた組み換え型タンパク質は製造業者の推奨に従っているビラピュア金属キレートコラム（ビバサイエンス）を使用して親和性で純化された。純化されたタンパク質の純度及び量はコーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）のブルーに色づけされたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでチェックされた。ＴＮＦ保護及び走化性の抑制分析に関して、組み換え型タンパク質がＰＢＳに対して透析された。

１．６．− サーフェイスプラスモンレゾナンス（ＳＰＲ）による生体分子相互作用分析
サイトカイン特異性及び親和性定数がバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）Ｘバイオセンサ（スウェーデン国，ウプサラ所在のバイアコア社）を使用し測定された。リガンドスクリーニング実験に関して、純化された組み換え型タンパク質が各場合におよそ５０００ＲＵ（５０００ｐｇ／ｍｍ^２）のレベルまでＣＭ５チップにアミン結合された。市場で入手可能なサイトカイン（ペプロテック、Ｒ＆Ｄシステムズ）が次いで５μ／分の流量においてＨＢＳ−ＥＰバッファ（１０ｍＭのヘペス、１５０ｍＭのＮａＣｌ，３ｍＭのＥＤＴＡ，０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０；ｐＨ７．４）において１００ｎＭで注入されそしてその結合及び分離が監視された。表面は１０ｍＭグリシン−ＨＣｌｐＨ２．０を使用する各注入後に再生された。運動分析に関して、組み換え型タンパク質は低い密度（Ｒｍａｘ＜２００ＲＵ）で固相化された。対応する分析物の種々の濃度が次いで２分の期間にわたって３０μｌ／分の流量で注入されかつ５分後にで分離させた。すべてのバイアコアセンサグラムはＢＩＡエバリュエーション３．２ソフトウエアを使用して分析された。大きな屈折率の変化は基準流量細胞応答を減算することによって除去されそしてブランク注入の平均応答は系統だった人為的結果を除去するためにすべての分析物のセンサグラムから減算された。運動データは１：１ラングマイアーモデルに全体的に適合した。

１．７．−ＴＮＦ−誘導の細胞毒性の抑止
ＴＮＦ−誘導の細胞毒性分析は前述したように、マウスＬ９２９細胞（ロパレフ等、１９９８年、サライバ及びアルカミ、２００１年、シュライバー等、１９９７年、スミス等、１９９６年「Ｌｏｐａｒｅｖｅｔａｌ．，１９９８，Ｓａｒａｉｖａ＆Ａｌｃａｍｉ，２００１，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒｅｔａｌ．，１９９７，Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９９６」）で実施された。ＴＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄシステムズ）がアクチノマイシンＤ（４□ｇ／ｍｌ）（シグマ）により補充された完全なＤＭＥＭの|□|において純化された組み換え型タンパク質により３７°Ｃで２時間予め培養された。混合物は次いで９６孔プレート中で前日に植え付けられた２×１０^４細胞に加えられそして細胞の死滅が製造業者の推奨に従った「セルタイター（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６（商標）水性１溶液細胞増殖分析」（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して１６〜１８時間後に評価された。

１．８．−走化性分析
ＭＯＬＴ−４細胞の移動が前記に記載（ザバロス等、１９９９年）したような３□ｍポアサイズフィルタ（コースター（Ｃｏｓｔａｒ））を有する２４孔トランスウエル（商標）プレートを使用して評価された。簡単に、ヒトＣＣＬ２５（１００ｎＭ）（Ｒ＆Ｄシステムズ）が単独で又は純化された組み換え型タンパク質の増大量の存在において３０分間３７°Ｃで培養されそして下方の仕切り室内に置かれた。この期間後、２×１０^５ＭＯＬＴ−４細胞が頂部孔に０．１％ＦＣＳを含んでいる１００□ｌの完全なＲＰＭＩに加えられそしてプレートは３７°Ｃ，５％ＣＯ_２，９５％に湿らされた培養器内で培養された。底の孔に向かうＭＯＬＴ−４細胞の移動が流量血球計算によって４時間後に測定された。

実施例２：結果
２．１．−ＥＶ及びＣＰＶによってコード化されたｖＴＮＦＲＣｒｍＤはケモカインを結合する。
ケモカインを結合する新規なウイルス性の分泌タンパク質を調べるために、本発明は１２５１−ＣＸＣＬ８による交差結合（クロスリンク）分析を実施しかつポックスウイルスＥＶ（図３ａ）によってコード化された新規な分泌ｖＣＫＢＰを同定した。この活性はＶＶサンプル中には不存在であり、ＶＶ及び他のポックスウイルスによってコード化された３５ｋＤａｖＣＫＢＰ及びＣＸＣＬ８に交差結合することができるが、ＣＸＣＬ８についてのその低い親和性によりその生物学的活性を阻止しないタンパク質（アルカミ等、１９９８年、グラハム等、１９９７年、ララニ等、１９９８年）、より大きい分子サイズからなっていた。予期しなかったが、ＴＮＦを結合することが知られておりかつＥＶによってコード化されているｖＴＮＦＲＣｒｍＤがＣＸＣＬ８を結合する追加の特性（図３ｂ）を有することを見い出した。ＶＶ発現システムで発現されたＣｒｍＢタンパク質の截形バージョンを使用して、ＣｒｍＤの３Ｎ−末端ＣＲＤｓがＴＮＦ活性を阻止するのに必要であり（図４ａ，ｂ，ｃ）そしてＣＴＤがＴＮＦ結合に必要ではないが、ＣＴＤがＣｒｍＤにケモカインを結合する能力を付与する（図３ｂ）ことを示した。ＣｒｍＤの各種の領域はＴＮＦに含まれると思われそしてＣｒｍＤに対するＣＸＣＬ８の交差結合からのケモカイン結合はＴＮＦ（図３ｃ）の存在においては阻止することはできずそしてＣｒｍＤに対するＴＮＦの結合はＣＸＣＬ８の存在においては抑制されない（図示せず）。サーフェイスプラスモンレゾナンス（ＳＰＲ，バイコアＸ）技術を使用して、ヒト及びマウス起源の市場で入手し得るすべてのケモカインに対する純化されたＥＶＣｒｍＤの潜在的な相互作用を試験し、そしてＣｒｍＤが高い親和性のケモカインを結合することを確認した（図５）。

２．２．−ＣＰＶ及びＶａＶによってコード化されたｖＴＮＦＲＣｒｍＢはケモカインを結合する。
拡張されたＣＴＤをコード化している他のｖＴＮＦＲがケモカインを結合するかどうかを試験するために、バキュロウイルスシステムにおいてＣＰＶからＣｒｍＢを発現させそしてそれが交差結合分析（図３ｄ）においてＣＸＣＬ８を結合することを示した。ＣｒｍＢはヒト病原菌ＶａＶ、疱瘡の原因となる作用物質によってコード化もされている。本発明は関連のラクダ痘ウイルスからのＣｒｍＢ遺伝子の幅広い場所に向けられた突然変異生成によってＶａＶのＣｒｍＢ遺伝子を発生させ（図６）そしてバキュロウイルスシステム中にタンパク質を発現させた。本発明は最初に、純化されたＶａＶＣｒｍＢタンパク質がＴＮＦを結合し（図７）そしてＴＮＦの生物学的活性を抑制する（図８ａ）ことを試験した。ＣｒｍＢはＳＰＲによって入手し得るすべてのヒトケモカインへの結合に関しても試験されそして本発明はＣｒｍＢが多数のケモカインに高い親和性で結合する（図９）ことを示した。ＣＴＤを欠いているＶａＶＣｒｍＢの截形バージョンはケモカインを結合しない（図７）。そのうえ、ＶａＶＣｒｍＢのＣＴＤの発現及び純化はＣＴＤがＣｒｍＢのケモカイン結合活性をコード化していることを示した（図７）。これはＴＮＦ及びケモカインがＣｒｍＢの種々の場所に結合する（図示せず）ことを示しているＳＰＡ分析によって裏付けられている。

２．３．−ＶａＶによってコード化されたｖＴＮＦＲＣｒｍＢは生体外でＣＣＬ２５によって誘導されたＭＯＬＴ−４細胞の泳動を阻止する。
幾つかのケモカインに関するｖＴＮＦＲＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの高い親和性はこれらのウイルス性タンパク質がケモカインを隔離しかつロイコサイト上のそれらの特別なレセプターに対する結合を防止しかつ細胞泳動をトリガする信号を誘発するおとりレセプターとして作用することを示唆している。本発明はケモカインＣＣＬ２５に応答して関連のレセプターを発現しているＭＯＬＴ−４細胞の泳動を抑制している（図８ｂ）ことを示している。

２．４．−ｖＴＮＦＲｓ（ＣＴＤ同族体）のＣＴＤに関連付けられたタンパク質はケモカインを結合する。
上述したように、ポックスウイルスによってコード化された３つのタンパク質はｖＴＮＦＲｓ（ＣｒｍＢ及びＣｒｍＤ）のＣＴＤと類似するアミノ酸配列を有している（図１及び図２）。ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３と名づけられたこれらのたんぱく質はそれらが分泌されていることを示唆しているＮ−末端信号ペプチドを有している。バキュロウイルスシステムにおけるこれらのタンパク質、ＥＶＥ１２（ＣＴＤ１），ＥＶ１８４（ＣＴＤ２）及びＣＰＶＢ２１Ｒ（ＣＴＤ３）のうちの２つの発現は両方のタンパク質が媒体に分泌されていることを示した。純化されたＥＶＥ１２タンパク質はすべてのマウスケモカインに対する結合に関して試験されそして高い親和性で幾つかのケモカインに結合することが見い出された（表２）。加えて、純化されたタンパク質ＣＰＶＢ２１Ｒ及びＶＥ１８４がマウスからのＣＣＬ２１，ＣＣＬ２４，ＣＣＬ２５，ＣＣＬ２７，ＣＣＬ２８，ＣＸＣＬ１０，ＣＸＣＬ１１，ＣＸＣＬ１２β，ＣＸＣＬ１３及びＣＸＣＬ１４に結合することをＳＰＲによって測定し、そしてヒトＣＣＬ２６ＴｈｅＶＶＷＲＢ７Ｒ（ＣＴＤ２）はエンドプラスミック細網の隙間に移動されるようにかつ分泌されるよりむしろ細胞の内部に保持されるように示された（プライス等、２０００年「Ｐｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００」）。ＣＴＤ同族体の幾つかは同様に細胞の内側で発現されるものと知られているＣＣＬ２７のごときケモカインの活性を阻止するように機能する（ゴルツ等、２００２年「Ｇｏｒｔｚｅｔａｌ．，２００２」）。Ｂ７Ｒ遺伝子を欠いているＶＶ突然変異体はネズミ皮肉モデル中で弱毒化される（プライス等、２０００年「Ｐｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００」）。

２．５．−ＥＶからのｖＴＮＦＲｓＣｒｍＤ及びＶａＶからのＣｒｍＢは他のＴＮＦリガンドスーパーファミリー構成要素を結合する。
ＴＮＦはＴＮＦリガンド（ＴＮＦＬ）スーパーファミリー（ロックスレイ等、２００１年、ワラック等、２００１年「Ｌｏｃｋｓｌｅｙｅｔａｌ．，２００１，Ｗａｌｌａｃｈ，２００１」）として知られる構造的な同一性を有する免疫媒介体の大きなファミリーの構成要素である。ＥＶＣｒｍＤ及びＶａＶＣｒｍＢは市場で入手可能なすべてのＴＮＦリガンドスーパーファミリー構成要素に対する結合に関してＳＰＲによって試験されそしてＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＬ１３）（ＣｒｍＤＫｄ１１０ｐＭ；ＣｒｍＢＫｄ２ｎＭ）及びＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＬ１４）（ＣｒｍＤＫｄ１４０ｎＭ；ＣｒｍＢＫｄ２ｎＭ）と結合することが見い出された。これはＣｒｍＤ及びＣｒｍＢ（及び他のｖＴＮＦＲｓ）が幾つかのＴＮＦリガンドスーパーファミリー構成要素の生物学的活性を抑制し得ることを示唆している。

２．６．−ｖＴＮＦＲｓのＣＴＤは高い親和性を有するＴＮＦに結合するＣＲＤｓの能力に影響を及ぼし得る。
上述されたように、Ｎ−末端ＣＲＤ（１，２）を含有する截形ｖＴＮＦＲｓＣｒｍＤはＴＮＦに対する親和性を遊離しかつＴＮＦ生物学的活性を阻止しないが、しかしＣＲＤ（１−３）はＴＮＦを結合しかつその活性を抑制する（図４ａ，ｂ，ｃ）。意外にも、ＣＲＤ（１，２）がＣＴＤに溶解されて発現されるとき、それはＣＴＤがｖＴＮＦＲ（図４ｄ）のＮ−末端ＣＲＤｓのＴＮＦ結合活性を高め得ることを示しているＴＮＦ抑制活性を回復する。

２．７．−ウイルスコード化タンパク質は独立して免疫リガンドを結合する領域から形成される。
ここで示されるデータはｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤが２つの独立した領域から構成される（図及び図２）ことを示している。Ｎ−末端ＣＲＤｓはＴＮＦを結合する能力を有する一方、ＣＴＤは独立した様式においてケモカインと結合する。これはＣｒｍＢからのＣＲＤ（１，４）がＴＮＦ結合活性を維持しかつＣｒｍＢからのＣＴＤが独立して発現されるときケモカイン結合活性を有するという知見によって示されている。ウイルス性のタンパク質のこれらの領域が構造的な分子又は免疫媒介物を結合する領域を有するという概念は、（１）ＶａＶＣｒｍＢの純化されたＣＴＤがケモカインと結合する（図７）；（２）ＣＰＶによってコード化されたＣｒｍＢ及びＣｒｍＤのＣＴＤが交換され得るしそしてさらにケモカイン結合活性をも付与し得る（図示せず）；（３）ｖＴＮＦＲＣＴＤ（ＣＥＥ１２，ＥＶｅ１８４ＣＰＶ及び６Ｂ２１Ｒ）に関連付けられる３つの異なるタンパク質がケモカイン結合活性をコード化する（表２）；（４）ＶａＶＣｒｍＢのＣＲＤ（１，４）に対するＣＰＶ３５ｋＤａｖＣＫＢＰの溶融がこのタンパク質にＴＮＦ−抑止活性に影響を与えることなく（図１０）ケモカインを結合する能力を付与する、という知見によって強調されている。それゆえ、これらのウイルス性領域は幾つかのサイトカインの活性を阻止する免疫調整タンパク質を発生するために交換又は組み合わされ得る。本発明はｖＴＮＦＲｓのＣＴＤがケモカイン又は免疫システムに含まれる他のタンパク質のような免疫タンパク質と結合する新規なタンパク質構造及び領域を特定しそしてＴＮＦに加えて他の免疫調整タンパク質を結合する能力をｖＴＮＦＲｓに付与することを提案する。

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表１ポックスウイルス及びヘルペスウイルスによってコード化されたケモカイン結合タンパク質
タンパク質ウイルス結合特異性参照
ｖＣＫＢＰ１Ｍ−１７ポックスウイルス：広いＣＣ（ララニ等、１９９
粘液腫ウイルス７）
ｖＣＫＢＰ２３５ｋＤａ，ポックスウイルス：ケモカイン（アルカミ等、
Ｍ−Ｔ１ワクシニア症ウイルス１９９８、グラハ
牛痘ウイルス、ム等、１９９７、
ｖＣＣＩ先天性四肢欠損症ウイルス、シート等、２００
粘液腫ウイルス、天然痘ウイルス、３、スミス等、１
ｏｒｆウイルス９９７、スミス及
びアルカミ２００
０）（パリー等、
２０００、バン・
ベルケット等、
２０００）
（ブライアント等、
２００３）
ｖＣＫＢＰ３Ｍ３ｇＧブロードブロード
ｖＣＫＢＰ４ガンマヘルペスウイルス
マウスガンマヘルペスウイルス
６８アルファヘルペスウイルス
馬ヘルペスウイルス、ウシ亜科
ヘルペスウイルス

表２ＳＰＲによって得られた各種のケモカインについてのＥＶＥ１２タンパク質の親和性定数（Ｋ_Ｄ）。純化された組み換え型タンパク質は低レベルでチオール結合されそしてＢＩＡコレックス（ＢＩＡｃｏｒｅＸ）を使用して高流量で注入された指示ケモカインの各種の濃度がＢＩＡエバリュエーションソフトウエアを使用して測定された。
ケモカインＫ_Ｄ（ｎＭ）
ｍＣＣＬ２１０．５
ｍＣＣＬ２５０．７
ｍＣＣＬ２７２
ｍＣＸＣＬ１１１
ｍＣＸＣＬ１３１．５
ｍＣＸＣＬ１４１．５

表３ｖＴＮＦＲｓを発現するために調製された組み換え型プラスミド。
参照の挿入は指示された一対のオリゴヌクレオチドを使用してウイルス性ＤＮＡからＰＣＲによって増幅された（オリゴヌクレオチド配列に関しては表４参照）。ＥＶは菌株ハンプステッドに関するものであり、そしてＣＰＶは菌株ブライトンレッドに関するものである。
ｐＢａｃ１
挿入オリゴＴａＲＳプラスミド
ＥＶｃｒｍＤ５；ＣｒｍＤ−７５５ＢａｍＨＩｐＭＳ１
３；ＣｒｍＤ−９ＸｈｏＩ
ＥＶｃｒｍＤ− ５；ＣｒｍＤ−７５０ＢａｍＨＩｐＭＳ４２
ＣＲＤ１，２３；ＣｒｍＤ−２９ＮｏｔＩ
ＥＶｃｒｍＤ− ５；ＣｒｍＤ−７５０ＢａｍＨＩｐＭＳ４６
ＣＲＤ１，２，３３；ＰＴ−３ＮｏｔＩ
ＥＶｃｒｍＤ− ５；ＣｒｍＤ−７５０ＢａｍＨＩｐＭＳ４８
ＣＲＤ１，２，３，４３；ＰＴ−４ＮｏｔＩ
ＥＶｃｒｍＤ− ５；ＰＴ−１５０ＮｏｔＩｐＰＴ６
ＣＴＤ３；ＰＴ−２ＸｈｏＩ
ＥＶｃｒｍＤ− ｐＭＳ４２のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩｐＰＴ１
ＣＲＤ１，２にサブクローン化されたＥＶｃｒｍＤＣｔ
−ＣＴＤ
ＥＶｃｒｍＤ− ｐＭＳ４６のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩｐＰＴ２
ＣＲＤ１，２，３にサブクローン化されたＥＶｃｒｍＤＣｔ
−ＣＴＤ
ＣＰＶｃｒｍＢ５；ＰＴ−５５０ＮｏｔＩｐＰＴ５
−ＣＴＤ３；ＰＴ−６ＸｈｏＩ
ＥＶｃｒｍＤ−
ＣＲＤ１，２，３，４ｐＭＳ４８のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩｐＰＴ３
ＣＰＶｃｒｍＢ−ＣＴＤにサブクローン化されたＥＶｃｒｍＤＣｔ
ＥＶｃｒｍＤ− ５；ＳＦ−１５０ＥｃｏＲＩｐＰＴ４
ＣＲＤ１，２，３，４３；ＰＴ−７ＮｏｔＩ
ＣＰＶｃｒｍＤ−ＣＴＤ
ＰＭＪ６０１
挿入オリゴＴａＲＳＲｐＭＪ６０１
ＥＶｃｒｍＤ５；ＣｒｍＤ−７５０ＢａｍＨＩｐＭＳ１１
３；ＣｒｍＤ−１５ＫｐｎＩ
ＥＶｃｒｍＤ− ５；ＣｒｍＤ−７５０ＢａｍＨＩｐＭＳ１２
ＣＲＤ１，２３；ＣｒｍＤ−２３ＨｉｎｄＩＩＩ

表４バキュロウイルス及びＶＶシステムにおいてＥＶｃｒｍＤ及びＣＰＶｃｒｍＢの発現のために使用されるオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド配列（５；＞３；）
５；ＣｒｍＤ−７ＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＣ
ＣＡＴＣＡＴＡ
３；ＣｒｍＤ−９ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＴＴ
ＧＧＴＧＧ
３；ＣｒｍＤ−１５ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＴＣＡ
ＴＴＴＧＧ
３；ＣｒｍＤ−２２ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧ
ＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣ
３；ＣｒｍＤ−２３ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＴＡＴＣＣＧ
ＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣ
３；ＣｒｍＤ−２４ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＴＣ
ＴＴＧＴＴＡＡＣＡＧＧＡＴＡＣ
３；ＣｒｍＤ−２９ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＴＣＣＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＡ
ＣＡＣ
５；ＰＴ−１ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＴＴＣＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡ
ＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣ
３；ＰＴ−２ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＴＴ
ＧＧＴＧＧ
３；ＰＴ−３ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＴＡＡＡＡＧＧ
ＡＣＡＧＡＴＣＡＣ
３；ＰＴ−４ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＡＡ
ＣＡＧＧＡＴＡＣ
３；ＰＴ−５ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＧＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡ
ＣＣＧＧＴＣＴＣ
３；ＰＴ−６ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＴＡＣ
ＴＧＧＧＡＡ
３；ＰＴ−７ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＧＡＴＧＴＧＴＣＧＴＴＧＡ
ＣＧＧＧＡＴＡＣ
５；ＳＦ−１ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＡＴ
ＡＴＡＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＣ

異なるウイルスにおけるｖＴＮＦＲｓ及びＣＴＤ同族体の概略を示している。ＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの多重配列表を示している。ＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの多重配列表を示している。ＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの多重配列表を示している。ＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの多重配列表を示している。ＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの多重配列表を示している。ＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの多重配列表を示している。ＣＴＤ同族体を有するｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ及びＣｒｍＤの多重配列表を示している。ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）結合タンパク質としてのＥＶＣｒｍＤの同定を示している。ＴＮＦ結合及び活性抑制におけるＣｒｍＤＣＲＤ及びＣＴＤの役割を示している。ＥＶＣｒｍＤに結合するケモカインを示している。ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）及びＶａＶＣｒｍＢタンパク質のアミノ酸配列表を示している。ＴＮＦ及びケモカインに結合するＶａＶＣｒｍＢの各種の領域を示している。ＶａＶＣｒｍＢによるＴＮＦ及びケモカイン生物学的活性の抑制を示している。ＶａＶＣｒｍＢに対するケモカイン結合を示している。ＶａＶＣｒｍＢのＣＲＤ（１−４）に対するＶＶｋＤａｖＣＫＢＰの溶融がケモカインを結合する能力をＣｒｍＢに付与することを示している。

Claims

ケモカイン及びそれらの類似物を結合するのに使用するため及び／又はＴＮＦＲｓの免疫賦活性特性を高めるために、誘導体及び断片を含んでいるポックスウイルスとそれらの機能的な同族体とからのウイルス性腫瘍壊死因子レセプター（ｖＴＮＦＲｓ）ＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）のＣ−末端領域（ＣＴＤ）。
ケモカインがそれに対応する細胞表面レセプターに結合するのを阻止するのに使用するため及び／又はケモカインの生物学的活性を調整するために、誘導体及び断片を含んでいるポックスウイルスとそれらの機能的な同族体とからのｖＴＮＦＲｓＣｒｍＢ又はＣｒｍＤ又はＣＴＤ同族体（ＣＴＤ１，ＣＴＤ２及びＣＴＤ３）のＣＴＤ。
ＣｒｍＢからのＣＴＤがＳＥＱＩＤＮｏ．２６又はＳＥＱＩＤＮｏ．２８を有していることを特徴とする請求項１又は２に記載のＣｒｍＢからのＣＴＤ。
ＣｒｍＤからのＣＴＤがＳＥＱＩＤＮｏ．２２又はＳＥＱＩＤＮｏ．２４を有していることを特徴とする請求項１又は２に記載のＣｒｍＤからのＣＴＤ。
ＣＴＤがＳＥＱＩＤＮｏ．８，ＳＥＱＩＤＮｏ．１４，ＳＥＱＩＤＮｏ．６，ＳＥＱＩＤＮｏ．２０，ＳＥＱＩＤＮｏ．１８又はＳＥＱＩＤＮｏ．１６を含有するか又は遺伝子Ｖ２０１，Ｄ１２Ｌ，Ｂ６Ｒ又はＢ２１Ｒによってコード化されたタンパク質のいずれかを含有することを特徴とする請求項１又は２に記載のＣＴＤ同族体。
同一又は他の起源のポリペプチド配列に溶解された請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ又はＣＴＤ同族体を含有している溶融ポリペプチド。
前記溶融ポリペプチドがｖＴＮＦＲｓのＮ−ＴＮＦ末端結合領域に溶解された請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤからなることを特徴とする溶融ポリペプチド。
ｖＴＮＦＲｓがヒト起源であることを特徴とする請求項７に記載の溶融ポリペプチド。
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ又はＣＴＤ同族体をコード化している配列又は請求項６乃至８のいずれか１項に記載の溶融ポリペプチドを含有していることを特徴とするポリヌクレオチド。
前記配列が組織特性又は構造性プロモータから発現される発現カセットを含有していることを特徴とする請求項６乃至９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列がウイルス性ベクター又は発現プラスミドの部分を形成することを特徴とする請求項６乃至９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
生体内においてケモカイン又はケモカイン類似体に結合するのに使用するために、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ又はＣＴＤ同族体及び／又は請求項６乃至９のいずれか１項に記載の溶融ポリペプチド及び／又は請求項１０又は１１に記載の発現カセット及び／又はウイルス性ベクターを含有していることを特徴とする医薬組成物。
ケモカインが対応する細胞表面ケモカインレセプターに結合するのを阻止するために又は生体内においてケモカインの生物学的活性を抑制するために使用する請求項１２に記載の医薬組成物。
抗炎症作用を発生するために使用する請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
別の免疫抑制剤又は抗炎症物質を含有することを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
生体内においてケモカイン、ケモカイン類似体、又はケモカインレセプターを検出又は測定するために、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤと標識化又は固相化された反応体とを含有していることを特徴とする試験キット。
抗炎症作用を発生するために被験者に投与するための薬剤を製造するために、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ又はＣＴＤ同族体及び／又は請求項６乃至９のいずれか１項に記載の溶融ポリペプチド、及び／又は請求項１０及び１１に記載の発現カセット及び／又はウイルス性ベクターを使用する使用方法。
細胞内にウイルス又は寄生虫の侵入を阻止するために前記ウイルス又は寄生虫中に存在するケモカイン類似体に結合する被験者に投与するための薬剤を製造するために請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ又はＣＴＤ同族体を使用する使用方法。
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ同族体の少なくとも１つ及び／又はｖＴＮＦＲｓの不活性化又は削除による天然痘ウイルスワクチン用の弱毒化方法。
ＣＴＤ同族体又はｖＴＮＦＲｓに対する抗原の誘導に基づいて、ワクシニア症ウイルス接種によって発生された逆作用及び／又はヒト疱瘡における天然痘ウイルスによって発生された病状の治療のための薬剤を使用するか又は請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ同族体又はｖＴＮＦＲｓのケモカイン結合活性を抑止する抗原又は反応体を使用する使用方法。
ケモカイン又はケモカイン類似体を結合するために、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＣＴＤ又はＣＴＤ同族体を含んでいる反応体で試験される物質を含んでいるサンプルに接触することに基づいていることを特徴とするケモカイン又はケモカイン類似体を含有する物質を検出する物質検出方法物質検出方法。