ES2315037A1 - Actividad de union a quimioquinas codificada por receptores de tnf y proteinas relacionadas. - Google Patents
Actividad de union a quimioquinas codificada por receptores de tnf y proteinas relacionadas. Download PDFInfo
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Abstract
Esta invención se refiere al uso del dominio C-terminal (CTD) de los receptores del factor necrosante de tumores (TNFR) codificados por poxvirus y denominados cytokine response modifier B y D (CrmB y CrmD), y por homólogos, derivados o fragmentos de estos para modular la actividad de las quimioquinas y para incrementar las propiedades inmunomoduladoras de los TNFRs. También se refiere a polipéptidos de fusión, composiciones farmacólogicas y a ensayos que utilicen las proteínas de la invención.
Description
Actividad de unión a quimioquinas codificada por
receptores de TNF y proteínas relacionadas.
Esta invención se refiere al uso del dominio
C-terminal (CTD) de los receptores del factor
necrosante de tumores (TNFR) codificados por poxvirus y denominados
cytokine response modifier B y D (CrmB y CrmD), y por
homólogos, derivados o fragmentos de estos para modular la
actividad de las quimioquinas y para incrementar las propiedades
inmunomoduladoras de los TNFRs. También se refiere a polipéptidos
de fusión, composiciones farmacológicas y a ensayos que utilicen las
proteínas de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los poxvirus son virus DNA complejos que
codifican hasta 200 genes. El virus de la viruela (variola virus,
VaV) fue el agente causal de la viruela (smallpox), una de las
enfermedades humanas más devastadoras que fue erradicada como
resultado del uso del virus vaccinia (VV) como vacuna en la campaña
global de erradicación liderada por la Organización Mundial de la
Salud (OMS). El virus cowpox (CPV) está relacionado con W y se
piensa que es un virus de roedores que causa infecciones esporádicas
en diversos mamíferos. El virus ectromelia (EV) es un patógeno
natural de ratones y el agente causal de mousepox, una infección
generalizada que tiene similaridades con la viruela
humana.
humana.
La respuesta inmune ha evolucionado como un
mecanismo eficaz para protegernos de la infección por patógenos
como virus. Para poder replicar en el hospedador inmunocompetente,
los virus han desarrollado mecanismos para evadir la respuesta
inmune (Alcami & Koszinowski, 2000). Los poxvirus codifican una
gran variedad de proteínas que contraatacan la respuesta inmune del
hospedador (Alcami, 2003, Seet et al., 2003). Uno de los
mecanismos inmunomoduladores codificados por los poxvirus es la
producción de proteínas secretadas que unen citoquinas, una familia
de proteínas que regulan la respuesta inmune.
Se han descrito cuatro TNFRs secretados que
están codificados por los poxvirus, que se han denominado
Cytokine response modifier B (CrmB), CrmC, CrmD y CrmE (Hu
et al., 1994, Loparev et al., 1998, Saraiva &
Alcami, 2001, Smith et al., 1996). Esta proteínas tienen
similitud de secuencia de aminoácidos con los dominios ricos en
residuos de cisteína (cysteine-rich domains,
CRDs) presentes en los TNFRs humanos y que constituyen el dominio
extracelular de unión a TNF. Las proteínas virales carecen de los
dominios transmembrana e intracelular presentes en los TNFRs
celulares (Fig. 1 y 2).
Se ha descrito que los cuatro vTNFRs (receptores
del factor necrosante de tumores virales) son secretados por las
células que han sido infectadas por estos virus, unen TNF y
bloquean la actividad biológica del TNF. Los CRDs de los vTNFRs se
predice que unen TNF. Esto se ha demostrado para el homólogo de CrmB
codificado por el virus myxoma (M-T2) (Schreiber
et al., 1997), y en nuestros propios experimentos que
muestran que los tres CRDs N-terminales de CrmD
codifican actividad de unión e inhibidora de TNF.
Dos de los vTNFRs, CrmB y CrmD, tienen un CTD
adicional que no muestra similitud de secuencia de aminoácidos con
proteínas celulares del banco de datos Swissprot (Fig. 1 y 2). Este
dominio no es necesario para unir TNF y su función no ha sido
definida. Tres fases de lectura abierta (open reading frames,
ORFs) codificadas por poxvirus tienen similitud en la secuencia de
aminoácidos con los CTDs de los vTNFRs. Miembros representativos de
estas ORFs son EV E12 (CTD1) (SEQ ID N° 5), EV E184 (CTD2) (SEQ ID
N° 19), y CPV B21R (CTD3) (Accession No. 072758) (Fig. 1, tabla V y
fig. 2).
Varias proteínas secretadas que unen
quimioquinas han sido identificadas en algunos poxvirus y
herpesvirus (Alcami et al., 1998, Bryant et al., 2003,
Graham et al., 1997, Lalani et al., 1997, Parry et
al., 2000, van Berkel et al., 2000) (Tabla 1). Estas
proteínas virales de unión a quimioquinas
(virus-encoded chemokine binding proteins,
vCKBPs) carecen de similitud de secuencia de aminoácidos con los
receptores celulares de quimioquinas, que poseen 7 dominios
transmembrana, o con otras proteínas celulares (Alcami, 2003, Seet
et al., 2003, Seet & McFadden, 2002). Estudios
estructurales y funcionales con la vCKBP de 35 kDa codificada por
CPV y con M3 codificada por el gammaherspesvirus murino 68
(MHV-68) han demostrado que estas proteínas virales
representan nuevos dominios o estructuras proteicas que tienen la
capacidad de unir quimioquinas (Alexander et al., 2002, Carfi
et al., 1999). La capacidad de algunas de estas vCKBPs de
inhibir la migración de leucocitos hacia tejidos infectados y
afectar a la patogénesis viral ha sido demostrada (Bridgeman et
al., 2001, Graham et al., 1997, Johnston & McFadden,
2004, Lalani et al., 1999, Reading et al., 2003).
El CTD de los vTNFRs CrmB y CrmD no tiene una
función conocida hasta la fecha y carece de similitud de secuencia
de aminoácidos con proteínas del hospedador. Nosotros hemos
demostrado que este dominio confiere a los vTNFRs la capacidad de
unir algunas quimioquinas, y que los CTDs expresados
independientemente del domino de unión a TNF son capaces de unir
quimioquinas. Este dominio proteico también se encuentra en otras
tres proteínas codificadas por poxvirus que se predice que son
secretadas por la célula infectada, y nosotros hemos demostrado que
las proteínas E12 codificada por EV, B21R codificada por CPV y E184
codificada por EV unen quimioquinas. Proponemos que el CTD de los
vTNFRs define un nuevo dominio estructural de unión a quimioquinas.
Estas proteínas pueden modular la actividad de las quimioquinas
in vivo y ser utilizadas para modular las respuestas inmune e
inflamatoria adversas que tienen lugar en gran número de
enfermedades humanas. La expresión del CTD fusionada a TNFRs
solubles puede incrementar las propiedades inmunomoduladoras de los
TNFRs utilizados actualmente en clínica. Además, demostramos que
los CTDs incrementan la actividad de unión a TNF de los dominios
CRDs N-terminales de los vTNFRs, y que los vTNFRs
unen otros miembros de la superfamilia de los ligandos del
TNF.
TNF.
\vskip1.000000\baselineskip
Un primer aspecto de la presente invención
incluye el dominio C-terminal (CTD) de los
receptores virales de TNF (vTNFRs), CrmB o CrmD y los homólogos de
CTD: CTD1, CTD2 o CTD3, codificados por poxvirus incluyendo
homólogos funcionales y derivados y fragmentos de todos ellos, para
su uso en la unión a quimioquinas o sus análogos y/o para
incrementar las propiedades inmunomoduladoras de los TNFRs.
Un aspecto preferido de la invención incluye el
CTD de CrmB o CrmD y los homólogos de CTD: CTD1, CTD2 o CTD3,
codificados por poxvirus incluyendo homólogos funcionales,
derivados y fragmentos de todos ellos para su uso en el bloqueo de
la unión de quimioquinas a sus correspondientes receptores en la
superficie celular y/o para modular la actividad de las
quimioquinas.
Homólogos de los CTDs de CrmB o CrmD codificados
por poxvirus pueden ser obtenidos, por ejemplo por mutación de la
secuencia de nucleótidos que codifica el CDT de CrmB o CrmD y
expresión de la secuencia mutada, y/o mediante el uso o derivación
de secuencias de genes relacionados. Alternativamente, pueden ser
obtenidos por ejemplo mediante la identificación de secuencias de
genes homólogos a los CTDs de CrmB o CrmD mediante el escrutinio de
bases de datos que contengan secuencias de proteínas o secuencias
de nucleótidos que codifican proteínas, por ejemplo mediante la
realización de búsquedas en el banco de datos Swissprot en el que la
homología de secuencia se puede determinar utilizando el programa
Blast, por ejemplo utilizando cualquiera de los posibles
algoritmos. Un nivel aceptable de similitud de secuencia de
aminoácidos sobre la secuencia completa es de al menos alrededor del
20%, por ejemplo alrededor del 30%. La similitud de la secuencia de
aminoácidos de un fragmento funcional del CTD de CrmB o CrmD con
otras proteínas puede ser menor que esto, por ejemplo alrededor de
un
10%.
10%.
Los homólogos funcionales, incluyendo derivados
o fragmentos de los CTDs de CrmB o CrmD o de los homólogos de CTD
(CTD1, CTD2 y CTD3) pueden ser ensayados por su capacidad de unir
quimioquinas por métodos apropiados equivalentes al ensayo de
cross-linking utilizando por ejemplo quimioquinas
radioactivas, o mediante otras metodologías que miden interacciones
proteína-proteína tales como Resonancia de Plasmon
de Superficie (SPR,
BIAcore).
BIAcore).
En un aspecto aún más preferido de la invención,
el CTD de CrmB incluye cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 26 o
SEQ ID N° 28; el CTD de CrmD incluye cualquiera de las secuencias
SEQ ID N° 22 o SEQ ID N° 24; y los homólogos de CTD (CTD1, CTD2 o
CTD3) incluyen cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID N° 8,
SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 6, SEQ ID N°20, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 16
o las proteínas codificadas por los genes de CPV V201 (Número de
Acceso UniProtKB/TrEMBL Q8QMP4), D12L (Número de Acceso P87598),
B6R (Número de Acceso O72743) o B21R (Número de Acceso O72758).
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
una molécula de ácido nucleico que codifica para los CTDs de la
invención incluyendo derivados, homólogos o fragmentos. La hebra
complementaria de estos ácidos nucleicos también forma parte de la
invención al igual que aquellas moléculas de ácido nucleico que
difieran de la secuencia que codifica los CTDs de acuerdo con la
invención, incluyendo homólogos, derivados y fragmentos, debido a
la degeneración del código genético.
En un aspecto más preferido de la invención, las
secuencias que codifican por el CTD de CrmB incluyen pero no se
limitan a cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 25 o 27; las
secuencias que codifican por el CTD de CrmD incluyen pero no se
limitan a cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 21 o SEQ ID N° 23;
y las secuencias que codifican por los CTDs: CTD1, CTD2 o CTD3,
incluyen pero no se limita a cualquiera de las secuencias
codificadas por los siguientes genes: V014 (SEQ ID N° 7), V201
(Número de Acceso UniProtKB/TrEMBL Q8QMP4), V218 (SEQ ID N° 13),
D12L, B6R, B21R, E12 (SEQ ID N° 5), E184 (SEQ ID N° 19), VACWR189
(SEQ ID N° 17) o VACWR206 (SEQ ID N° 15) (Tabla V, fig. 1 y 2).
De acuerdo con un tercer aspecto de la
invención, un polipéptido de fusión puede ser generado de forma que
incluya cualquiera de los CTDs de CrmB o CrmD o de los homólogos de
CTD (CTD1, CTD2 y CTD3) incluyendo homólogos, derivados y
fragmentos de todos ellos fusionados a una secuencia polipeptídica
del mismo o diferente origen.
En un aspecto preferido de la invención, el CTD
de CrmB o CrmD, y los homólogos de CTD (CTD1, CTD2 y CTD3)
incluyendo homólogos, derivados y fragmentos de todos ellos, pueden
ser acoplados a otras sustancias, covalentemente o no
covalentemente. Dichos productos de acoplamiento pueden ser
proteínas de fusión. La expresión del CTD fusionado a TNFRs
solubles puede incrementar las propiedades inmunomoduladoras de los
TNFRs que se están utilizando actualmente en clínica. El dominio
C-terminal da lugar a un plegamiento molecular que
aumenta la actividad de unión a TNF de los CRDs
N-terminales; por ejemplo las propiedades de unión
de CRD (1, 2) se aumentan de esta forma. Además, este aumento puede
hacer que los vTNFRs unan otros miembros de la superfamilia de los
ligandos de TNF.
Por tanto, en otro aspecto de la invención, el
polipéptido de fusión incluye el CTD de CrmB o CrmD u homólogos de
CTD (CTD1, CTD2 y CTD3) incluyendo homólogos funcionales, derivados
o fragmentos de todos ellos fusionados al dominio
N-terminal de unión a TNF de los vTNFRs o de los
TNFRs humanos.
En todavía un aspecto más preferido de la
invención, las proteínas de fusión incluyen cualquiera de los CTDs
de CrmB o CrmD o los homólogos de CTD (CTD1, CTD2 o CTD3)
incluyendo homólogos, derivados y fragmentos de todos ellos
fusionados a una secuencia polipeptídica de origen diferente y que
le confiere la capacidad de unión a quimioquinas a esta última.
Para algunos propósitos, cualquier secuencia
polipeptídica de origen diferente puede ser acoplada a los CTDs de
CrmB o CrmD o a los homólogos de CTD (CTD1, CTD2 o CTD3) incluyendo
homólogos funcionales, derivados o fragmentos de todos ellos por
métodos de acoplamiento químico conocidos.
Cualquiera de los CTDs de CrmB o CrmD o de los
homólogos de CTD (CTD1, CTD2 o CTD3) incluyendo homólogos
funcionales, derivados y fragmentos de todos ellos, en adelante
Proteínas de la Invención, pueden por ejemplo ser utilizados para
unir bien quimioquinas o bien sus análogos con especificidad u
origen de especie animal correspondiente al rango de hospedador del
virus parental que codifica la proteína, y/o quimioquinas o sus
análogos con especificidad y/o origen humanos.
Entre los derivados de las Proteínas de la
Invención se encuentran polipéptidos que contienen secuencias de
las Proteínas de la Invención modificadas por delección o
sustitución que retienen la capacidad de unión a quimioquinas. Por
ejemplo, puede ser útil deleccionar cualquier motivo de aminoácido
que sea inmunogénico, o reemplazar tales motivos por una secuencia
de aminoácidos menos inmunogénica. Alternativamente, una
modificación que puede inducir tolerancia inmunológica en un
individuo (hospedador) puede ser introducida en las secuencias que
codifican por las Proteínas de la Invención.
La invención también se extiende a las
secuencias de nucleótidos, por ejemplo a cassettes de DNA, que
incorporen promotores adecuados (específicos de tejido o
constitutivos) que controlen la transcripción de las Proteínas de la
Invención y sus formas modificadas incluyendo homólogos, tales como
fragmentos o productos de fusión con otras proteínas, y tales
cassettes de expresión incluyen plásmidos u otros vectores, por
ejemplo vectores virales.
Las Proteínas de la Invención pueden por ejemplo
ser utilizadas para unir quimioquinas C, quimioquinas CC,
quimioquinas CXC o quimioquinas CX3C. De acuerdo con otro aspecto
de la invención, las Proteínas de la Invención pueden ser
utilizadas para inhibir la unión de tales quimioquinas a sus
receptores o para bloquear la actividad biológica de las
quimioquinas, bien in vitro, por ejemplo en muestras
biológicas, o in vivo.
Este efecto puede ser explotado por ejemplo en
ensayos de unión específica utilizando reactivos marcados, por
ejemplo con el propósito de diagnóstico y mediciones. El reactivo
marcado puede ser bien de las Proteínas de la Invención, o una
quimioquina, o un receptor de quimioquina, de acuerdo a la
configuración del ensayo para diferentes propósitos.
Por tanto, otro aspecto de la invención incluye
composiciones para llevar a cabo tales ensayos, por ejemplo el
producto marcado de las Proteínas de la Invención; alícuotas
calibradas de cualquiera de éstas; el producto de unir las Proteínas
de Invención a una fase sólida capaz de tomar parte en un ensayo de
unión específico; alícuotas calibradas de uno de las parejas de
unión en la reacción; y ensayos que asocien dos o más de estos
reactivos. El ensayo puede ser por ejemplo un ensayo para una
quimioquina o un receptor de quimioquinas.
El efecto de unión puede también ser explotado
en la inhibición de efectos mediados por quimioquinas que pueden
ser unidas por las Proteínas de la Invención.
Un tercer aspecto de la invención comprende una
composición farmacéutica que incluya un CTD de CrmB y/o CrmD y/o
los homólogos de CTD (CTD1, CTD2 o CTD3) y/o homólogos funcionales,
derivados o fragmentos de todos ellos y/o productos de fusión con
otras proteínas y/o cassettes de expresión y/o plásmidos u otros
vectores, para su uso en la unión a quimioquinas o análogos de
quimioquina in vivo.
Un aspecto más preferido de la invención
comprende una composición farmacéutica que incluya un CTD de CrmB
y/o CrmD y/o los homólogos de CTD (CTD1, CTD2 o CTD3) y/o homólogos
funcionales, derivados o fragmentos de todos ellos y/o productos de
fusión con otras proteínas y/o cassettes de expresión y/o plásmidos
u otros vectores, para su uso en el bloqueo de la unión de
quimioquinas a su correspondiente receptor en la superficie celular
in vivo y/o para producir un efecto inmunomodulador.
De acuerdo a un aspecto adicional de la
invención una composición farmacéutica puede comprender una
Proteína de la Invención para su uso como agente
anti-inflamatorio en dosis terapéuticas
apropiadas.
Las proteínas de la invención pueden ser
formuladas con excipientes farmacéuticos convencionales
compatibles.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la
invención, una secuencia que codifica cualquiera de las Proteínas
de la Invención o proteínas de fusión que incluyen las Proteínas de
la Invención pueden ser insertadas bajo el control de un promotor
adecuado. El vector puede ser viral o no viral. El vector mencionado
puede ser utilizado para conferir a una célula diana transfectada
la capacidad de producir las Proteínas de la Invención. Por
ejemplo, con propósitos anti-inflamatorios cuando la
célula diana se encuentra in vivo en un individuo que es
sujeto de tratamiento. Tales propósitos
anti-inflamatorios pueden incluir por ejemplo el uso
para inhibir efectos mediados por quimioquinas, por ejemplo por
quimioquinas que promuevan o estén asociadas con enfermedades, por
ejemplo la arthritis reumatoide. Los propósitos
anti-inflamatorios también incluyen la reducción de
la respuesta inmune del hospedador frente a elementos del vector
y/o contra otros productos de genes expresados en la célula diana,
bien sea a partir del mismo vector que aquél que expresa las
Proteínas de la Invención o a partir de otro vector.
Las Proteínas de la Invención o vectores
expresando las Proteínas de la Invención pueden ser administradas a
células in vivo. Alternativamente, la administración puede
ser dirigida, por ejemplo mediante inyección directa, tal como
inyección intravenosa en el sitio o cercano al sitio donde se
encuentra la célula diana y/o el sitio de inflamación en el sujeto
tratado.
Las formas de administración pueden ser
seleccionadas para limitar la respuesta inmune del individuo frente
a las Proteínas de la Invención. Por ejemplo, las Proteínas de la
Invención o un vector capaz de expresarlas pueden ser administradas
junto con otras sustancias inmunosupresoras o
anti-inflamatorias.
Otro aspecto adicional de la invención está
relacionado con vacunas de VV libres de las Proteínas de la
Invención y/o vTNFRs. Algunos TNFRs y proteínas relacionadas con
CTDs son expresados por algunas estirpes de VV que son utilizadas
como vacuna de la viruela en humanos o como vector viral
recombinante para expresar proteínas de otros patógenos e inducir
inmunidad. La neutralización de la actividad de unión a
quimioquinas de estas proteínas puede disminuir los efectos adversos
descritos tras la vacunación con VV, limitando la replicación viral
y/o la inmunopatología inducida por el virus. Anticuerpos o
reactivos que neutralizan la actividad de unión a quimioquinas de
los CTDs pueden atenuar la viruela humana o reducir las
complicaciones tras la vacunación con
VV.
VV.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de detección de una quimioquina o análogo de quimioquina que
comprende poner en contacto una muestra que incluya una quimioquina
o análogo de quimioquina, para ser evaluado con un reactivo que
comprenda las Proteínas de la Invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de las Proteínas de la Invención para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de los efectos adversos de la
vacunación con VV o la patología causada por la viruela, o para la
fabricación de anticuerpos o reactivos capaces de inhibir la
actividad de unión a quimioquinas de los
CTD.
CTD.
En aún otro aspecto de la invención se incluye
el uso de las Proteínas de la Invención para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de los efectos adversos de la
vacunación con VV o de la patología causada por la viruela, con
anticuerpos o reactivos capaces de inhibir la actividad de unión a
quimioquinas de CTD.
También se incluye el uso de las Proteínas de la
Invención para la elaboración de un medicamento para su
administración in-vivo para bloquear la
entrada de virus y parásitos en la célula y así inhibir la
infección por estos virus o parásitos. El virus de la
inmunodeficiencia humana y el parásito Plasmodium vivax
utilizan receptores de quimioquinas para infectar la célula, y las
proteínas de estos patógenos implicadas en la unión a la célula
mimetizan la estructura de las quimioquinas. Un aspecto de la
invención incluye el uso de los CTD que unen quimioquinas para
reconocer a las proteínas de estos patógenos que mimetizan
quimioquinas y de esta forma bloquear la entrada del mencionado
virus o parásito en al célula.
Otros aspectos de la presente invención
resultarán obvios para el experto medio en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1. Representación esquemática de los vTNFRs
y de los homólogos de CTD en diferentes virus.
Fig. 2. Alineamiento múltiple de las secuencias
de los vTNFRs CrmB y CrmD con los homólogos de CTD.
Fig. 3. Identificación de EV CrmD como una
proteína de unión de IL-8 (CXCL8). (a)
Cross-linking de
1251-IL-8 a sobrenadante obtenido de
células infectadas con EV mostró la presencia de una actividad de
unión de IL-8 no expresada en VV. (b) La proteína
completa CrmD de EV expresada en un recombinante de VV une
IL-8 mientras que los dominios
CRD(1-4) de CrmD no unen
EL-8. (c) Unión de
1251-IL-8 a CrmD recombinante no
fue inhibido en presencia de un exceso de TNF humano o de ratón. (d)
Cross-linking de
1251-IL-8 a CPV CrmD y CrmB
expresados en el sistema de baculovirus.
Fig. 4. Papel de los dominios CRD y CTD de CrmD
en la inhibición de la unión y actividad biológica de TNF. (a)
Representación esquemática de las construcciones que expresan
diferentes combinaciones de los dominios CRD y CTD de EV CrmD. (b)
Competición por la unión de 125I-TNF a células U937
por sobrenadantes de células infectadas por recombinantes de VV que
expresan las construcciones de CrmD que se indican. (c) Actividad
biológica de las construcciones recombinantes de CrmD determinada
como el porcentaje de citotoxicidad inducida por TNF en células de
ratón L929 en presencia de cantidades crecientes de sobrenadante de
células infectadas con los recombinantes de VV indicados o VV WR.
(d) Inhibición de la citotoxicidad inducida por TNF por
sobrenadantes de células infectadas con los baculovirus
recombinantes indicados.
Fig. 5. Unión de quimioquinas a EV CrmD. La
proteína purificada recombinante CrmD de EV fue acoplada mediante
grupos amino a un CM5 biosensor chip hasta un nivel de 5000RU. Este
chip se utilizó para determinar la posible unión de CrmD a todas
las quimioquinas humanas disponibles comercialmente en un BIAcoreX
(Uppsala, Sweden). En todos los casos, 30 \mul de una solución
100 nM de quimioquina fueron inyectados con un flujo de 10
\mul/min. El nivel de unión máximo se representó frente al nivel
de unión después de 120 s de disociación (estabilidad del complejo)
para cada quimioquina. La constante de afinidad para las
quimioquinas indicadas viene determinada por análisis cinético
mediante SPR. Para los análisis cinéticos, proteína recombinante
purificada CrmD de EV se acopló mediante grupos amino a un CM5
biosensor chip hasta un nivel de 1200RU (Rmax<200RU). Diferentes
concentraciones de quimioquina se inyectaron con un flujo de 30
\mul/min durante 2 min y la disociación se monitorizó durante 5
min adicionales. El ajuste de las curvas fue realizado con el
programa de ordenador BIAevaluation utilizando un modelo de unión
Langmuir 1:1.
Fig. 6. Alineamiento de la secuencia de
aminoácidos de la proteína CrmB codificada por el virus camelpox
(CMLV) y VaV. Los residuos conservados se indican con un asterisco.
Los residuos sin asterisco corresponden a las posiciones mutadas.
Los dominios CRD(1-4) y CTD están
indicados.
Fig. 7. Diferentes dominios de VaV CrmB unen TNF
y quimioquinas. Unión de TNF\alpha humano (TNF\alpha) y
CXCL12\beta humano (CK) a las proteínas purificadas VaV CrmB
completa, VaV CrmB CRD (1-4) o VaV CrmB CTD
analizado por SPR.
Fig. 8. Inhibición de la actividad biológica de
TNF y quimioquina por VaV CrmB. (a) Inhibición de citotoxicidad
inducida por TNF. TNF fue preincubado durante 2 h a 37°C con las
cantidades indicadas de proteína recombinante purificada en 100
\mul de DMEM completo suplementado con actinomicina D
(4\mug/ml). La mezcla fue añadida a 2x10^{4} células L929
sembradas en día anterior en placas de 96 pocillos y la muerte
celular se evaluó 16-18 h más tarde. O.D. 490 nm de
cuadruplicados (media \pm SD) se representan en cada caso.
"Celulas"/"cel ActD": controles de viabilidad celular;
"TNF": control de muerte celular; "CrmB": TNF preincubado
con VaV CrmB; "CRD": TNF preincubado con VaV CrmB
CRD(1-4); "IgG1": TNF preincubado con
IgG1, control de especificidad. (b) Ensayo de quimiotaxis. CCL25
humano (100 nM) sólo o en presencia de cantidades crecientes de
proteína recombinante purificada fue incubada a 37°C durante 30 min
y añadida al compartimento inferior de una cámara Transwell de 24
pocillos. Después de este periodo, 5 x 10^{5} células
MOLT-4 fueron añadidas en 100 \mul de RPMI
completo conteniendo 0.1% FCS al pocillo superior y la placa
incubada a 37°C durante 4 h. El porcentaje de migración de células
MOLT-4 hacia el pocillo inferior fue determinado por
análisis por FACS. 100% de migración fue calculado como el número
de células que migran en presencia de quimioquina sola.
Fig. 9. Unión de quimioquinas a VaV CrmB.
Proteína purificada recombinante CrmB de VaV fue acoplada mediante
grupos amino a un CM5 biosensor chip hasta un nivel de 5000RU. Este
chip se utilizó para determinar la posible unión de CrmB a todas
las quimioquinas humanas disponibles comercialmente en un BIAcoreX
(Uppsala, Sweden). En todos los casos, 30 \mul de una solución
100 nM de quimioquina fueron inyectados con en flujo de 10
\mul/min. El nivel de unión máximo se representó frente al nivel
de unión después de 120 s de disociación (estabilidad del complejo)
para cada quimioquina. La constante de afinidad para las
quimioquinas indicadas viene determinada por análisis cinético
mediante SPR. Para los análisis cinéticos, proteína recombinante
purificada CrmD de EV se acopló mediante grupos amino a un CM5
biosensor chip hasta un nivel de 1200RU (Rmax<200RU). Diferentes
concentraciones de quimioquina se inyectaron con un flujo de 30
\mul/min durante 2 min y la disociación se monitorizó durante 5
min adicionales. El ajuste de las curvas fue realizado con el
programa de ordenador BlAevaluation utilizando un modelo de unión
Langmuir 1:1.
Fig. 10. Fusión de CPV 35kDa vCKBP a
CRD(1-4) de VaV CrmB
CRD(1-4) confiere CrmB la capacidad de unir
quimioquinas. (a) Ensayo de unión de cross-linking
a quimioquinas. Sobrenadantes de células High5 no infectadas o
infectadas con los baculovirus recombinantes "Bac VaV CrmB
CRD(1-4)" (Bac106), "Bac VaV CrmB"
(Bac107), "Bac VaV CrmB CRD(1-4)/35K"
(Bac109), y Bac35K fueron incubados con 400 pM de
^{125}I-CCL3. Los complejos entre las proteínas
recombinantes y CCL3 fueron sometidos a
cross-linking con EDC y los productos se analizaron
por SDS-PAGE y autorradiografía. (b) Inhibición de
citotoxicidad inducida por TNF. TNF fue preincubado durante 2 h a
37°C con los sobrenadantes correspondientes en 100 \mul de DMEM
completo suplementado con actinomicina D (4 \mug/ml). La mezcla
fue añadida a 2x10^{4} células L929 sembradas el día anterior en
una placa de 96 pocillos y la muerte celular se monitorizó
espectrofotométricamente 16-18 h más tarde. O.D. 490
nm obtenido con las diferentes muestras se representa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar, pero no limitan la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
CPV, EV y W fueron propagados in vitro
infectando monocapas confluentes de células
Bsc-I.
\vskip1.000000\baselineskip
La ORF 264 de la estirpe CMS del virus camelpox,
correspondiente al gen CrmB fue amplificado por PCR utilizando los
oligonucleotidos CMLV 264 Eco (5'- GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTCG) y
CMLV 264 Xho (5'- GCGCTCGAGTAAAAAGTGGGTGGGTTTGG) y DNA purificado
del virus camelpox como molde. El producto de PCR fue clonado en
pBacI (Novagen) digerido con EcoRI/ XhoI para generar el plásmido
pRA1. La ausencia de mutaciones en el gen amplificado fue
confirmada por secuenciación de DNA. El DNA correspondiente a VaV
(estirpe Bangladesh 1975; ORF 188) fue obtenido por mutagénesis
dirigida en múltiples posiciones del plásmido pRA1 utilizando el
"QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit
(Stratagene)" siguiendo las instrucciones del proveedor. Las
mutaciones introducidas se muestran en la Fig. 6. Después de
consecutivas rondas de mutagénesis dirigida se generó el plásmido
pRA105. Este plásmido contiene la secuencia que codifica CrmB de
VaV (estirpe BSH 1975) fusionada a un 6xHis-tag
C-terminal proporcionado por el plásmido pBac1
original. La presencia de todas las mutaciones y ausencia de
mutaciones adicionales no deseadas fue confirmada por secuenciación
de
DNA.
DNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la expresión en el sistema de baculovirus,
DNA codificando versiones completas o truncadas de CrmD (Tabla III)
fue amplificado por PCR con oligonucleótidos específicos (Tabla IV),
y clonado en pBAC-1. Baculovirus recombinantes
fueron generados por recombinación homóloga en células de insecto
Sf21 transfectadas con plásmidos pBAC-1
recombinantes y DNA de baculovirus linearizado como se ha descrito
anteriormente (Alcami et al.,
1998).
1998).
Los vTNFRs se expresaron también en el sistema
de VV. Los genes de interés se clonaron en pMJ601 para su expresión
desde un promotor fuerte de VV (Davison & Moss, 1990). El gen
de interés se inserta en el locus de la timidina quinasa del genoma
de VV por recombinación homóloga y el VV recombinante se selecciona
en presencia de bromodeoxiuridina y se identifica por selección con
color (expresión de \beta-galactosidasa y tinción
con X-gal). Los vTNFRs se expresaron en VV Western
Reserve, una estirpe viral que no codifica actividad de unión a TNF
(Alcami et al., 1999).
\vskip1.000000\baselineskip
El gen E184 de EV se amplifico mediante PCR
utilizando los oligonucleotidos 5'E184 (5'- GCGGAATTCA TGTATAAAAA
ACTAATAACG TTT) y 3'E184 XhoI (5'- CGCCTCGAGA AAATCATATT TTGAATAATA
TGTA) y DNA de EV purificado como molde. El producto de PCR se
clono en el plásmido pRA106 digerido previamente con EcoRI y XhoI,
generando el plásmido pAH11. Se comprobó la ausencia de errores en
la secuencia amplificada mediante secuenciación.
El plásmido pAH11 se utilizo para generar el
baculovirus vBacAH11 recombinante tal como se ha descrito
previamente. El virus vBacAH11 expresa la proteína E184 de EV
fusionada a un epitopo de histidinas para facilitar su
purificación.
El gen completo VaV CrmB fusionado a un
6xhis-tag C-terminal fue subclonado
en pFastBac1 (Invitrogen) digerido con EcoRI/SphI para generar
pRA107. El dominio N-terminal de VaV CrmB incluyendo
los cuatro CRDs y correspondiendo a los residuos de aminoácido 1
(M) a 192 (C) fue amplificado por PCR utilizando los
oligonucleótidos VaV 188 Eco
(5'-GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTTG) y VaV 188
CRDs1-4 Xho (5'- GCGCTCGAGA
CACGATGTGTCGTTAACTGG) usando pRA107 como molde. El fragmento amplificado fue clonado en fase con un 6xhis-tag C-terminal proporcionado por pBAC-1 (Novagen) digerido con EcoRI/XhoI para generar pRA99. pRA99 fue digerido con EcoRI/SphI y el fragmento que contenía VaV CrmB CRD(1-4) fusionado al 6xhis-tag fue clonado en pFastBac1 como se indica anteriormente para generar pRA106. El CTD de VaV CrmB (residuos T194 a L348) fue amplificado por PCR con los oligonucleotidos VaV 188 Cter-PfIMI (5'-CGCCCACCCAATGGAACTAGGACGAC
CACTACCGG) y H347R 3 utilizando pRA107 como molde. Este fragmento fue digerido con PfmII/XhoI y clonado en pRA107 digerido con los mismos enzimas. Esto generó pRA108, un plásmido que codifica una proteína de fusión compuesta por los 29 residuos N-terminales de VaV CrmB (que incluye el péptido señal) seguido del CTD de CrmB y un 6xhis-tag adicional. La ausencia de mutaciones no deseadas en pRA106, pRA107 y pRA108 fue confirmada por secuenciación de DNA de los insertos.
CACGATGTGTCGTTAACTGG) usando pRA107 como molde. El fragmento amplificado fue clonado en fase con un 6xhis-tag C-terminal proporcionado por pBAC-1 (Novagen) digerido con EcoRI/XhoI para generar pRA99. pRA99 fue digerido con EcoRI/SphI y el fragmento que contenía VaV CrmB CRD(1-4) fusionado al 6xhis-tag fue clonado en pFastBac1 como se indica anteriormente para generar pRA106. El CTD de VaV CrmB (residuos T194 a L348) fue amplificado por PCR con los oligonucleotidos VaV 188 Cter-PfIMI (5'-CGCCCACCCAATGGAACTAGGACGAC
CACTACCGG) y H347R 3 utilizando pRA107 como molde. Este fragmento fue digerido con PfmII/XhoI y clonado en pRA107 digerido con los mismos enzimas. Esto generó pRA108, un plásmido que codifica una proteína de fusión compuesta por los 29 residuos N-terminales de VaV CrmB (que incluye el péptido señal) seguido del CTD de CrmB y un 6xhis-tag adicional. La ausencia de mutaciones no deseadas en pRA106, pRA107 y pRA108 fue confirmada por secuenciación de DNA de los insertos.
El gen E12 codificado por EV fue amplificado por
PCR utilizando los oligonucleótidos E1
(5'-GCGGGA-TC
CATGATAAACATAAACATAAACACAATAC) y E2 (5'-GCGGCGGCCGCAT-TAATAGTTCTAGTAGCGCAAG) y DNA purificado de EV (estirpe Naval.Cam) como molde. El producto de PCR fue clonado en pBac1 (Novagen) y digerido con Bam HI/Not I generando el plásmido pMS51. El gen E12 fue subclonado en pRA106 digerido con Bam HI/Xho I para dar el plásmido pAH18, que contiene el gen E12 fusionado a un 6xhis-tag C-terminal en el vector pFastbac (Invitrogen). La ORF V218 de la estirpe Brighton Red de CPV Brighton Red fue amplificada por PCR utilizando los oligonucleótidos 5'V218 EcoRI (5'- CGCGAATTCATGATGATATACGGATTAATAGC) y 3'V218 SaII (5'- GCGGTCGACACCATCGACACCACTCATC) y DNA viral purificado como molde. El producto de PCR se clonó en pRA106 digerido con Eco RI/Xho I para generar el plásmido pAH17, que contiene el gen CPV V218 fusionado a un 6xhis-tag C-terminal en el vector pFastbac (Invitrogen). El fragmento correspondiente a los residuos S23 a V246 de la proteína 35 kDa de CPV (estirpe Brighton Red) fue amplificado por PCR utilizando los oligonucleótidos 5'35KBR-S23 (5'-CGCCTCGAGTCATTCTCATCCTCATCCTC) y 3' 35KBR (-stop)(5'-CGCCTCGAGGA
CACACGCTATAAGTTTTGC) y DNA viral purificado como molde. El producto de PCR fue clonado en pRA106 digerido con Xho I para generar el plásmido pRA109. Este plásmido lleva la secuencia del gen que codifica por VaV CrmB CRD (1-4) fusionado en fase a la secuencia que codifica CPV 35 kDa vCKBP sin su péptido señal y con un 6xhis-tag C-terminal en el vector pFastBac (Invitrogen).
CATGATAAACATAAACATAAACACAATAC) y E2 (5'-GCGGCGGCCGCAT-TAATAGTTCTAGTAGCGCAAG) y DNA purificado de EV (estirpe Naval.Cam) como molde. El producto de PCR fue clonado en pBac1 (Novagen) y digerido con Bam HI/Not I generando el plásmido pMS51. El gen E12 fue subclonado en pRA106 digerido con Bam HI/Xho I para dar el plásmido pAH18, que contiene el gen E12 fusionado a un 6xhis-tag C-terminal en el vector pFastbac (Invitrogen). La ORF V218 de la estirpe Brighton Red de CPV Brighton Red fue amplificada por PCR utilizando los oligonucleótidos 5'V218 EcoRI (5'- CGCGAATTCATGATGATATACGGATTAATAGC) y 3'V218 SaII (5'- GCGGTCGACACCATCGACACCACTCATC) y DNA viral purificado como molde. El producto de PCR se clonó en pRA106 digerido con Eco RI/Xho I para generar el plásmido pAH17, que contiene el gen CPV V218 fusionado a un 6xhis-tag C-terminal en el vector pFastbac (Invitrogen). El fragmento correspondiente a los residuos S23 a V246 de la proteína 35 kDa de CPV (estirpe Brighton Red) fue amplificado por PCR utilizando los oligonucleótidos 5'35KBR-S23 (5'-CGCCTCGAGTCATTCTCATCCTCATCCTC) y 3' 35KBR (-stop)(5'-CGCCTCGAGGA
CACACGCTATAAGTTTTGC) y DNA viral purificado como molde. El producto de PCR fue clonado en pRA106 digerido con Xho I para generar el plásmido pRA109. Este plásmido lleva la secuencia del gen que codifica por VaV CrmB CRD (1-4) fusionado en fase a la secuencia que codifica CPV 35 kDa vCKBP sin su péptido señal y con un 6xhis-tag C-terminal en el vector pFastBac (Invitrogen).
Los baculovirus recombinantes fueron obtenidos
utilizando el sistema de expresión
Bac-to-Bac (Invitrogen) tal y como
se describe por el proveedor. Brevemente, los plásmidos pRA106,
pRA107, pRA108, pRA109, pAH17 y pAH18 fueron transformados en
bacterias DH10Bac competentes, en las que un evento de
transposición genera el correspondiente bacmido recombinante. Estos
fueron purificados y transfectados en células de insecto High5 y
tres días después de la transfección los baculovirus recombinantes
vBac106, vBac107, vBac108, vBac109, vBacAH17 y vBacAH18 fueron
recogidos a partir de los sobrenadantes de los cultivos. Estos
virus fueron amplificados en un paso posterior para generar stocks
de virus recombinantes de alto título para ser utilizados para la
producción de proteína recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresar las proteínas recombinantes, las
células High5 fueron infectadas a alta multiplicidad (10
pfu/célula) y los sobrenadantes de los cultivos infectados fueron
recogidos tres días post-infección (d.p.i.). La
presencia de proteína recombinante en estos sobrenadantes fue
confirmada por Western blot y/o, en el caso de las construcciones
completas y N-terminal de VaV CrmB, fue confirmado
mediante un ensayo de unión a TNF en solución (Alcami et
al., 1999). Las muestras fueron concentradas a aproximadamente
2.5 ml en una celda de ultrafiltración (Amicon) utilizando
membranas YM-3 (Millipore) y la solución cambiada a
tampón de unión (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH
7.4) en columnas PD-10
(Amersham-Pharmacia Biosciences). Las proteínas
recombinantes con el his-tag fueron purificadas por
cromatografía de afinidad utilizando columnas Vivapure Metal Chelate
(Vivascience) siguiendo las recomendaciones del proveedor. La
pureza y cantidad de proteína purificada fue analizada en geles de
SDS-polyacrylamide teñidos con
Coomassie-blue. Para los ensayos de inhibición de
protección de TNF y quimiotaxis, las proteínas recombinantes se
dializaron frente a PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
La especificidad de unión a citoquinas y las
constantes de afinidad fueron determinadas utilizando un BIAcore X
biosensor (Biacore, Uppsala, Sweden). Para los experimentos de
screening de ligandos, las proteínas recombinantes purificadas
fueron acopladas mediante grupos amino a CM5 chips hasta un nivel de
aproximadamente 5000 RU (5000 pg/mm^{2}) en cada caso. Citoquinas
disponibles comercialmente (Peprotech, R&D Systems) fueron
inyectadas a una concentración de 100 nM en tampón
HBS-EP (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005%
(v/v) surfactant P20; pH 7.4) a un flujo de 10 \mul/min y la
asociación y disociación fueron monitorizados. La superficie fue
regenerada después de cada inyección utilizando 10 mM
glicina-HCl pH2.0. Para los análisis cinéticos, las
proteínas recombinantes fueron inmovilizadas a bajas densidades
(Rmax < 200RU). Diferentes concentraciones del analito
correspondiente fueron inyectadas a un flujo de 30 \mul/min
durante un periodo de 2 min y posteriormente disociado durante un
periodo adicional de 5 min. Todos los Biacore sensorgrams
fueron analizados con el programa de ordenador BIAevaluation 3.2.
Los cambios no específicos en el índice refractivo no fueron
considerados al sustraerse la respuesta en la celda de referencia y
la respuesta media de una inyección sin analito para eliminar
artefactos. Los datos de cinética fueron ajustados globalmente al
modelo Langmuir 1:1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de citotoxicidad inducidos por TNF
se llevaron a cabo en células de ratón L929 como se ha descrito
previamente (Loparev et al., 1998, Saraiva & Alcami,
2001, Schreiber et al., 1997, Smith et al., 1996). TNF
(20 ng/ml) (R&D Systems) fue preincubado durante 2 h a 37°C con
proteína recombinante purificada en 100 \mul de DMEM completo
suplementado con actinomycin D (4 \mug/ml) (Sigma). La mezcla fue
entonces añadida a 2x10^{4} células sembradas el día anterior en
placas de 96 pocillos y la muerte celular monitorizada
16-18 h más tarde utilizando el "CellTiter 96®
Aqueous One Solution cell proliferation assay" (Promega)
siguiendo las recomendaciones del
proveedor.
proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
La migración de células MOLT-4
fue determinada utilizando placas Transwell® de 24 pocillos con
filtro de tamaño de poro de 3 \mum (Costar) como se ha descrito
previamente (Zaballos et al., 1999). Brevemente, CCL25 humana
(100 nM) (R&D Systems) sola o en presencia de cantidades
crecientes de proteína recombinante purificada fue incubada a 37°C
durante 30 min en el compartimento inferior. Después de este
periodo, 5 x 10^{5} células MOLT-4 se añadieron en
100 \mul de RPMI completo con 0.1% FCS al compartimento superior y
la placa incubada a 37°C. La migración de las células
MOLT-4 hacia el compartimento inferior fue
determinada después de 4 h por citometría de
flujo.
flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
Buscando nuevas proteínas viral secretadas que
unen quimioquinas, llevamos a cabo un ensayo de
cross-linking con 125I-CXCL8 e
identificamos una nueva vCKBP secretada codificada por el poxvirus
EV (Fig. 3a). Esta estaba ausente en las muestras de VV y era de
mayor tamaño molecular que la vCKBP de 35 kDa codificada por VV y
otros poxvirus, se trata de una proteína que puede unir por
cross-linking CXCL8 pero que no bloquea su
actividad biológica debido a una baja afinidad por CXCL8 (Alcami
et al., 1998, Graham et al., 1997, Lalani et
al., 1998). De forma inesperada encontramos que el vTNFR CrmD
codificado por EV tiene la propiedad adicional de unir CXCL8 (Fig.
3b). Utilizando versiones truncadas de la proteína CrmD producidas
en el sistema de expresión de VV hemos demostrado que los tres CRDs
N-terminales de CrmD son necesarios para bloquear
la actividad TNF (Fig. 4a,b,c) y que el CTD no es necesario para
unir TNF pero confiere a CrmD la capacidad de unir quimioquinas
(Fig. 3b). Diferentes dominios de CrmD parecen estar implicados en
la unión a TNF y quimioquinas ya que el
cross-linking de CXCL8 a CrmD no puede ser bloqueado
en presencia de TNF (Fig. 3c) y la unión de TNF a CrmD no se inhibe
en presencia CXCL8. Utilizando la tecnología Surface Plasmon
Resonance (SPR, BIAcore X) hemos ensayado la potencial
interacción de EV CrmD purificada con todas las quimioquinas
humanas y murinas comercialmente disponibles, y hemos identificado
que CrmD une con alta afinidad algunas quimioquinas (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si el otro vTNFR que codifica un
CTD une quimioquinas, expresamos CrmB de CPV en el sistema de
baculovirus y mostramos que une CXCL8 en ensayos de
cross-linking (Fig. 3d). CrmB también está
codificado por el patógeno humano VaV, el agente causal de la
viruela (smallpox). Hemos generado el gen CrmB de VaV mediante
extensiva mutagénesis dirigida del gen CrmB codificado por el
poxvirus relacionado virus camelpox (Fig. 6) y hemos expresado la
proteína en el sistema de baculovirus. Primero determinamos que la
proteína purificada CrmB de VaV une TNF (Fig. 7) e inhibe la
actividad biológica del TNF (Fig. 8a). También determinamos si CrmB
era capaz de unir otras quimioquinas de la colección completa de
quimioquinas humanas mediante SPR y demostramos que CrmB une con
alta afinidad varias quimioquinas (Fig. 9). Una versión truncada de
CrmB que carece del CTD no presenta capacidad de unión a
quimioquinas (Fig. 7). Además, la expresión y purificación del CTD
de VaV CrmB ha demostrado que el CTD codifica para la actividad de
unión a quimioquinas de CrmB (Fig. 7). Esta conclusión se confirmó
mediante análisis SPR mostrando que TNF y quimioquinas se unen a
diferentes sitios en
CrmB.
CrmB.
\vskip1.000000\baselineskip
La alta afinidad de los vTNFRs CrmB y CrmD por
algunas quimioquinas sugiere que estas proteínas virales pueden
actuar como receptores solubles que secuestran quimioquinas e
impiden la unión de las quimioquinas a receptores específicos en
leucocitos y la inducción de señales intracelulares que llevan a
activar la migración celular. Hemos encontrado que VaV CrmB inhibe
la migración de células MOLT4, que expresan receptores de
quimioquinas relevantes, en respuesta a la quimioquina CCL25 (Fig.
8b).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se indica más arriba, tres proteínas
codificadas por poxvirus tienen similitud de secuencia de
aminoácidos con el CTD de los vTNFRs (CrmB y CrmD) (Fig. 1 y 2).
Estas proteínas, denominadas CTD1, CTD2 y CTD3 tienen un péptido
señal N-terminal que sugiere que son secretadas por
la célula infectada. La expresión de estas proteínas, EV E12
(CTD1), EV E184 (CTD2) y CPV B21R (CTD3), en el sistema de
baculovirus ha mostrado que estas proteínas son secretadas al medio
extracelular. La proteína purificada EV E12 se testó frente a todas
las quimioquinas de ratón y se encontró que une algunas
quimioquinas con alta afinidad (Tabla 2). Además, hemos determinado
por SPR que las proteínas purificadas CPV B21R y EV E184 unen CCL21,
CCL24, CCL25, CCL27, CCL28, CXCL10, CXCL11, CXCL12\beta, CXCL13 y
CXCL14 de ratón, y CCL26 humana. La proteína B7R codificada por VV
WR (CTD2) se ha descrito que es traslocada al lumen del retículo
endoplasmático y es principalmente retenida dentro de la célula en
lugar de ser secretada (Price et al., 2000). Alguno de los
homólogos de CTD podrían funcionar para bloquear la actividad de
quimioquinas como CCL27 que se sabe que también se expresan dentro
de la célula (Gortz et al., 2002). Un mutante de VV que
carece del gen B7R es atenuado en un modelo murino de infección
intradermal (Price et al., 2000).
\vskip1.000000\baselineskip
TNF es un miembro de una gran familia de
mediadores inmunológicos con similitudes estructurales, conocida
como superfamilia de los ligandos TNF (TNFL) (Locksley et
al., 2001, Wallach, 2001). Analizamos por SPR si EV CrmD y VaV
CrmB eran capaces de unir otros miembros de la colección completa
de la superfamilia de TNFL que están disponibles comercialmente y
encontramos que estos vTNFRs unen también APRIL (TNFL13) (CrmD Kd
110 pM; CrmB Kd 2 nM) y LIGHT (TNFL14) (CrmD Kd 140 nM; CrmB Kd 2
nM). Este resultado sugiere que CrmD y CrmB (y quizás otros vTNFRs)
pueden inhibir la actividad biológica de otros miembros de la
superfamilia de los TNFL.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra más arriba, una versión truncada
del vTNFR CrmD que incluye los CRD(1,2)
N-terminales pierde afinidad por TNF y no inhibe la
actividad biológica del TNF, mientras que la construcción que
incluye los CRD(1-3) une TNF e inhibe su
actividad biológica (Fig. 4a,b,c). Sorprendentemente, cuando los
CRD(1,2) se expresan fusionados a CTD recuperan la actividad
de inhibir TNF. Demostrando que el CTD puede incrementar la
actividad de unión a TNF de los CRDs N-terminales de
vTNFR (Fig. 4d).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados mostrados indican que los vTNFRs
CrmB y CrmD están formados de dos dominios independientes (Fig. 1 y
2). Los CRDs N-terminales tienen la capacidad de
unir TNF mientras que el CTD une quimioquinas de forma
independiente. Esto se demuestra mediante la expresión
independiente de CRD(1,4) de CrmB, que conserva la capacidad
de unión a TNF, y de CTD de CrmB, que conserva la capacidad de unir
quimioquinas. El concepto de que estas regiones de las proteínas
virales representan módulos o dominos estructurales que unen
mediadores inmunológicos se ve reforzado por los resultados que
demuestran que: (1) el CTD purificado de VaV CrmB une quimioquinas
(Fig. 7); (2) los CTDs de CrmB y CrmD codificados por CPV pueden
ser intercambiados y confieren la actividad de unión a quimioquinas;
(3) tres proteínas diferentes relacionadas con el CTD de vTNFRs (EV
E12, EV E184 y CPV B21R) codifican actividad de unión a
quimioquinas (Tabla 2) y (4) la fusión de la proteína 35 kDa vCKBP
codificada por CPV a los CRD(1,4) de VaV CrmB confiere a los
CRD(1-4) la capacidad de unir quimioquinas
sin afectar a su capacidad de inhibir la actividad biológica del
TNF (Fig. 10). En conclusión, estos dominios de proteínas virales
se pueden intercambiar o combinar para generar proteínas moduladoras
inmunológicas que bloquean la actividad de varias citoquinas.
Proponemos que el CTD de los vTNFRs define un nuevo dominio o
estructura proteica que une proteínas inmunológicas, tales como
quimioquinas u otras proteínas implicadas en el sistema inmune, y
confiere a los vTNFRs la capacidad de unir otras proteínas
inmunomoduladoras además de
TNF.
TNF.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> Alcami, Antonio
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codificadas por receptores de TNF y proteínas relacionadas
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Bangladesh
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(CrmB)
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<221> gene
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<223> Gen E184
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cowpox virus cepa Brighton Red
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> C_region
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(480)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier D
(CmrD)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cowpox virus cepa Brighton Red
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(159)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier D
(CrmD)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ectromelia virus cepa Naval
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> C_region
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(477)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier D
(CrmD)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ectromelia virus cepa Naval
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(159)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier D
(CrmD)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cowpox virus cepa Brighton Red
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> C_region
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(546)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier B
(CrmB)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cowpox virus cepa Brighton Red
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(181)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier B
(CrmB)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Variola major virus cepa
Bangladesh
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> C_region
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(528)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier B
(CrmB)
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Variola major virus cepa
Bangladesh
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (175)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTD del Cytokine Response Modifier B
(CrmB)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
Claims (21)
1. CTD de los vTNFRs CrmB o CrmD y homólogos de
CTD: CTD1, CTD2 o CTD3, incluyendo homólogos funcionales, derivados
y fragmentos de todos ellos para su uso en la unión a quimioquinas
y sus análogos y/o para incrementar las propiedades
inmunomoduladoras de los TNFRs.
2. CTD de los vTNFRs CrmB o CrmD y homólogos de
CTD: CTD1, CTD2 o CTD3, incluyendo homólogos funcionales, derivados
y fragmentos de todos ellos para su uso en el bloqueo de la unión
de quimioquinas a sus correspondientes receptores de superficie y/o
en la modulación de la actividad de quimioquinas.
3. CTD de CrmB de acuerdo con las
reivindicaciones 1-2, donde el CTD de CrmB
comprende la SEQ ID N° 26 o SEQ ID N° 28.
4. CTD de CrmD de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde el CTD de CrmD
comprende la SEQ ID N° 22 o SEQ ID N° 24.
5. Homólogos de CTD: CTD1, CTD2 o CTD3 de
acuerdo con las reivindicaciones 1-2, donde los
homólogos comprenden cualquiera de las secuencias: SEQ ID N° 8, SEQ
ID N° 14, SEQ ID N° 6, SEQ ID N°20, SEQ ID N° 18 o SEQ ID N° 16 o
comprenden cualquiera de las proteínas codificadas por los genes
V201, D12L, B6R o B21R.
6. Polipéptido de fusión que comprende un CTD o
un homologo de CTD de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde dicho CTD u homologo
está fusionado a una secuencia polipeptídica del mismo o de
diferente origen.
7. Polipéptido de fusión de acuerdo con la
reivindicación anterior, donde el polipéptido de fusión consiste en
el dominio C-terminal de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, fusionado al dominio
N-terminal de unión a TNF de los vTNFRs.
8. Polipéptido de fusión de acuerdo con la
reivindicación 6, donde las proteínas de unión a TNF (TNFR) sean de
origen humano.
9. Polinucleótido que comprende una secuencia
que codifica para el CTD o para un homologo de CTD, de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o para un
polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6-8.
10. Vector viral o plásmido de expresión que
comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Composición farmacéutica que comprende el
CTD y/o un homologo de CTD de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 y/o un polipéptido de fusión de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9
y/o un cassette de expresión y/o un vector viral de acuerdo con la
reivindicación 10 para su uso en la unión a quimioquinas o análogos
de quimioquinas in vivo.
12. Composición farmacéutica según la
reivindicación anterior, para su uso en el bloqueo de la unión de
quimioquinas a su correspondientes receptores en la superficie
celular o en la inhibición de la actividad biológica de quimioquinas
in vivo.
13. Composición farmacéutica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11-12, para su
uso como anti-inflamatorio.
14. Composición farmacéutica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde
dicha composición farmacéutica comprende además un inmunosupresor o
una sustancia anti-inflamatoria adicional.
15. Kit diagnóstico que comprende un CTD de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5
y un reactivo marcado o inmovilizado, para su uso en determinación
cualitativa o cuantitativa de quimioquinas, análogos de quimioquinas
o receptores de quimioquinas in vitro.
16. Uso de un CTD y/o un homologo de CTD según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y/o un
polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6-9 y/o un cassette de expresión
y/o un vector viral de acuerdo con la reivindicación 10 en la
elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades
anti-inflamatorias.
17. Vacuna del virus vaccinia atenuado que
carece de, al menos, un CTD de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 y/o un vTNFRs.
18. Uso de un CTD y/o un homólogo de CTD según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la
elaboración de un medicamento para el tratamiento de los efectos
adversos causados por la vacunación con VV o de la patología
causada por el virus de la viruela.
19. Uso de un CTD y/o un homólogo de CTD según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la
obtención de anticuerpos específicos inhibidores de la capacidad de
unión a quimioquinas de los homólogos de CTD o vTNFRs de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
20. Uso de los anticuerpos descritos en le
reivindicación 19 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de los efectos adversos causados por la vacunación con
VV o de la patología causada por el virus de la viruela.
21. Método de detección de una quimioquina o
análogo de quimioquina que comprende poner en contacto una muestra
que incluya una quimioquina o análogo de quimioquina, para ser
evaluado con un reactivo que comprenda un CTD de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
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|---|---|---|---|---|
| WO2013153250A1 (es) * | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Antonio Alcami Pertejo | Unión a glicosaminoglicanos de proteínas con dominio secret codificadas por poxvirus |
| ES2429639A1 (es) * | 2012-04-11 | 2013-11-15 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Unión a glicosaminoglicanos de proteínas con dominio SECRET codificadas por poxvirus |
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|---|---|
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| AU2005279294A1 (en) | 2006-03-09 |
| CA2578904A1 (en) | 2006-03-09 |
| WO2006024533A1 (en) | 2006-03-09 |
| CN101044158A (zh) | 2007-09-26 |
| JP2008511296A (ja) | 2008-04-17 |
| US8759485B2 (en) | 2014-06-24 |
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