ES2429639A1 - Unión a glicosaminoglicanos de proteínas con dominio SECRET codificadas por poxvirus - Google Patents

Abstract

La presente invención hace referencia al uso de un dominio SECRET de proteínas con dominio SECRET codificadas por poxvírus (CrmB, CrmD, SCP-1, SCP-2 y SCP-3), sus homólogos funcionales, derivados o fragmentos, capaces de unirse a glicosaminoglicanos (GAGs) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias, caracterizado porque dicho dominio SECRET se selecciona de entre una de las siguientes secuencias: SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 26, y SEQ ID N° 28. La presente invención también protege el uso de dicho medicamento para incrementar la estabilidad y/o las propiedades inmunomoduladoras de una proteína seleccionada entre: CrmB, CrmD, SCP-1, SCP-2 y SCP-3, así como su fusión a un vTNFR, o a un anticuerpo humanizado anti-TNF.

Description

SECTOR DE LA TÉCNICA

Esta invención se refiere a la capacidad de unir glicosaminoglicanos (GAG s) del dominio de unión a quimioquinas SECRET (smallpox virus-encoded chemokine receptor) presente en los receptores del factor necrosante de tumores (TNFRs) denominados cytokine response modifier B y D (CrmB y CrmD) y en las proteínas denominadas SECRET-containing proteins 1, 2 Y 3 (SCP-1, SCP-2 y SCP-3) codificadas por poxvirus, y por homólogos, derivados o fragmentos de estos, para incrementar las propiedades inmunomoduladoras de las proteínas con dominio SECRET. También se refiere a polipéptidos de fusión, composiciones farmacológicas y a ensayos que utilicen las proteínas de la invención.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las citoquinas, como parte importante en la regulación de una respuesta anti-viral efectiva, constituyen la forma de comunicación entre los componentes celulares encargados de acabar con la infección. La convivencia con el hospedador a lo largo de años de evolución ha permitido a los poxvirus captar genes de sus hospedadores para adaptarlos en su propio beneficio. Así, estos virus son capaces de expresar versiones virales solubles de receptores (viroceptores) o de citoquinas (viroquinas) con el fin de manipular la regulación de la respuesta anti-viral para garantizar su expansión en el organismo. Al mismo tiempo, los poxvirus expresan proteínas sin similitud de secuencia con algún componente celular conocido pero con funciones específicas de unión e inhibición de citoquinas (Alcami, 2003).

El factor de necrosis tumoral a (TNFa) se activa poco después de que un virus infecte a su hospedador para poner en marcha la respuesta mediante la inducción de quimioquinas (CKs), moléculas de adhesión y otras citoquinas y regulando o tomando parte en los mecanismos efectores de las células del sistema inmunológico para eliminar las células infectadas lo antes posible. Es una molécula esencial para el establecimiento de una respuesta celular, o Th1, efectiva frente a una infección viral y, por ello, los poxvirus han adoptado elegantes estrategias para bloquear esta citoquina (Cunnion, 1999).

La expresión de homólogos solubles de los receptores celulares del TNFa (vTNFRs), es una de estas estrategias virales. Hasta la fecha se han descrito cuatro vTNFRs diferentes, los modificadores de la respuesta de citoquinas B (CrmB), CrmC, CrmD y CrmE. Las distintas especies de poxvirus expresan de manera diferencial estos vTNFRs. CrmB y CrmD, a diferencia de CrmC y CrmE, contienen un dominio C-terminal que inhibe la actividad in vitro de algunas CKs. Este dominio fue descrito por primera vez en nuestro laboratorio y se denominó SECRET por §.mallpox virus ~ncoded g,hemokine receptor. Así, CrmB y CrmD poseen una doble actividad, anti-TNFa y anti-CKs. Además, el dominio SECRET forma parte también de 3 proteínas secretadas codificadas por poxvirus, denominadas SECRET domain-containing proteins 1, 2 Y 3 (SCP-1, SCP-2 Y SCP-3) (Alejo y cols. 2006). Los genes que codifican los dominios SECRET se encuentran en el virus vaccinia (VACV), virus ectromelia (ECTV), virus cowpox (CPXV) o virus de la viruela (VARV).

En la clínica existen receptores solubles del factor necrosante de tumores (TNF) y anticuerpos monoclonales humanizados anti-TNF para el tratamiento de alteraciones inflamatorias.

La patente ES 2315037 describe el uso del dominio C-terminal (CTD) de los receptores del factor necrosante de tumores (TNFR) codificados por poxvirus y denominados "cytokine response modifier B y D" (CrmB y CrmD), y por homólogos, derivados o fragmentos de estos para modular la actividad de las quimioquinas y para incrementar las propiedades inmunomoduladoras de los TNFRs. También se refiere a polipéptidos de fusión, composiciones farmacológicas y a ensayos que utilicen las proteínas de la invención. Esta invención protege el uso de un nuevo dominio de unión a quimioquinas (denominado SECRET), presente en poxvirus, para aumentar la capacidad anti-inflamatoria de los TNFRs que se utilizan en la clínica como medicamento anti-inflamatorio.

Los glicosaminoglicanos (GAG s) son polisacáridos unidos a un núcleo proteico con un alto grado de sulfatación y carga. Se encuentran en la superficie celular y en la matriz extracelular y participan en importantes procesos biológicos como son la proliferación celular, morfogénesis, migración, patogénesis viral y unión de factores de crecimiento y citoquinas (Handel y cols., 2005). Por ejemplo, la unión de CKs a los GAGs es fundamental en la formación de gradientes quimiotácticos que guían la migración linfocitaria (Proudfoot y cols., 2003).

Algunas proteínas de modulación inmunológica de poxvirus, como el receptor soluble de interferón de VACV, B18 (Montanuy y cols., 2011), o el ortólogo de A41 en ECTV, E163 (Ruiz-Arguello y cols., 2008), son capaces de unirse a la superficie celular mediante la interacción con GAGs. De esta manera, consiguen aumentar su concentración local entorno a los receptores de las citoquinas con las que interaccionan. Al tratarse de una estrategia extendida entre las proteínas de modulación inmunológica de poxvirus, se ha estudiado la posible unión de CrmD a estos polisacáridos de superficie. A este respecto, se ha descubierto que CrmD, a través de su dominio SECRET, es capaz de interaccionar con GAGs con alta afinidad y bloquear el efecto del TNFa en las superficies celulares.

El TNFa se encuentra detrás de la patogénesis de numerosos trastornos inflamatorios sufridos por millones de personas en todo el mundo. Enfermedades como la artritis reumatoide, psoriasis, vasculitis, artritis crónica juvenil, espondilitis anquilosante o la enfermedad de Crohn están siendo tratadas mediante inhibidores del TNFa con cierto grado de éxito (Wong y cols., 2008).

Hoy en día existen cinco medicamentos aprobados para la clínica: Etanercept, adalimumab, infliximab, certolizumab y golimumab (Tak y Kalden, 2011). Todos, excepto etanercept, consisten en la aplicación de anticuerpos anti-TNFa de distinta naturaleza. Etanercept es una versión soluble de un dímero del TNFR2 fusionado a una porción Fc de una IgG humana. Etanercept, adalimumab y infliximab son los tratamientos más extendidos entre la población mundial con 500.000, 370.000 Y 1.136.000 pacientes respectivamente (Tak y Kalden, 2011).

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención demuestra que el dominio SECRET, además de inhibir quimioquinas, se une a la superficie celular a través de glicosaminoglicanos (GAGs). De esta manera, gracias a este dominio SECRET los TNFRs virales pueden incrementar su concentración local en torno a los receptores celulares de sus ligandos y así llevar a cabo sus funciones inhibitorias de manera más eficaz.

Los TNFRs solubles utilizados en clínica, para mejorar su estabilidad, están fusionados a una porción Fc de inmunoglobulinas humanas, de lo que sin embargo se pueden derivar efectos secundarios adversos como resultado de la activación del sistema del complemento. Esta fusión a la porción Fc permite el transporte de los TNFRs por el torrente sanguíneo unidos a los receptores celulares de regiones Fc. La fusión del dominio SECRET a estos TNFRs, llevaría a estos inhibidores del TNF a la superficie celular, donde verían aumentada su concentración local y estabilidad, pudiendo transportarse unidos a los GAGs de superficie pero sin activar el sistema del complemento.

La presente invención identifica una nueva propiedad del dominio SECRET no descrita en otras patentes relacionadas, para el desarrollo de terapias anti-TNF más eficaces y con menores efectos adversos. Esta propiedad de unirse a GAGs de superficie se podría incorporar a los TNFRs humanos utilizados en la clínica.

Esta nueva propiedad del dominio SECRET, hace que este domino de receptores de TNF virales pueda ser fusionado a receptores solubles utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias, como es el caso de los. medicamentos anti-TNF, para llevar a estos inhibidores a la superficie celular. De esta manera se consigue un medicamento de mayor estabilidad y acción a nivel local.

La presente invención se refiere a la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET de los vTNFRs CrmB

o CrmD y SCPs (SCP-1, SCP-2 y SCP-3), incluyendo homólogos funcionales, derivados y fragmentos de todos ellos para incrementar las estabilidad y las propiedades inmunomoduladoras de estas proteínas.

La presente invención se refiere también a la capacidad de unión a GAG s del dominio SECRET de los vTNFRs CrmB o CrmD y SCPs (SCP-1, SCP-2 Y SCP-3), incluyendo homólogos funcionales, derivados y fragmentos de todos ellos para incrementar las estabilidad y las propiedades inmunomoduladoras de vTNFRs fusionados a ellos.

La presente invención también tiene como objeto de protección un polipéptido de fusion que comprende un dominio SECRET o homólogo del dominio SECRET descrito en la presente invención, donde dicho dominio SECRET u homólogo está fusionado a una secuencia polipeptídica del mismo o de diferente origen.

La presente invención también tiene como objeto de protección un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para el dominio SECRET o para un homologo del dominio SECRET, descrita en la presente invención, o para un polipéptido de fusión descrito en la presente invención.

Otro objeto de la presente invención es un vector viral o plásmido de expresión que comprende un polinucleótido descrito en la presente invención.

La presente invención también hace referencia a una composición farmacéutica que comprende el dominio SECRET y/o un homólogo del dominio SECRET descrito en la presente invención y/o un polipéptido de fusión descrito en la presente invención y/o un cassette de expresión y/o un vector viral descrito en la presente invención para su uso en el aumento de la actividad inmunomoduladora mediante unión a GAGs in vivo.

Por último, la presente invención tiene como objeto de protección el uso de la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET y/o un homologo del dominio SECRET tal y como se describe en la presente invención y/o un polipéptido de fusión tal y como se describe en la presente invención y/o un cassette de expresión y/o un vector viral tal y como se describe en la presente invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades anti-inflamatorias.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Los poxvirus codifican receptores solubles que inhiben las funciones proinflamatorias del factor necrosante de tumores (vTNFRs). Algunos de estos vTNFRs como CrmB o CrmO, presentan además un dominio denominado SECRET capaz de inhibir la función quimiotáctica de algunas quimioquinas. La capacidad del dominio SECRET de aumentar la capacidad anti-inflamatoria de los TNFRs humanos está protegida por una patente anterior de nuestro laboratorio, un aspecto que estamos explorando a través de un proyecto TRACE del MICINN y cuya patente está siendo financiada por la empresa Genetrix.

En la presente invención, mediante experimentos de unión a heparina y ensayos de citometría de unión a distintos tipos celulares hemos observado que CrmB y CrmO son capaces de interaccionar con los glicosaminoglicanos (GAG s) de superficie mediante su dominio SECRET ya que otros vTNFRs como CrmE y CrmC, carentes de este dominio, no lo hacen. Sin embargo, cuando fusionamos el dominio SECRET a CrmC conseguimos una proteína que se une de manera eficaz a la superficie de las células. Hemos comprobado también, mediante ensayos de citotoxicidad, que CrmO es capaz de unir y bloquear TNF mientras permanece unido a la superficie de las células. Por otra parte, aunque en la secuencia del dominio SECRET, no existe un motivo de unión a GAG s evidente, hemos definido experimentalmente algunos de los aminoácidos implicados en la interacción.

Esta capacidad de unirse a GAGs no es única de estos vTNFRs entre las moléculas con funciones de modulación inmunológica de poxvirus. De hecho, el receptor soluble viral de interferón B18 o el inhibidor de quimioquinas A41 L también son capaces de unirse a estas moléculas, con lo que puede tratarse de una característica importante a la hora de bloquear agentes proinflamatorios.

Significativamente, debido a que en la secuencia de aminoácidos del dominio SECRET no se pueden predecir sitios de unión a GAGs utilizando herramientas informáticas disponibles, esta propiedad no se puede predecir.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET de CrmB descrita anteriormente, donde el dominio SECRET de CrmB comprende la SEQ ID N° 26

o SEQ ID N° 28.

Otra realización de la presente invención hace referencia a la capacidad de unión a GAG s del dominio SECRET de CrmO descrita anteriormente, donde el dominio SECRET de CrmO comprende la SEQ ID N° 22

o SEQ ID N° 24.

Otra realización particular de la presente invención hace referencia a la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET de SCPs: SCP-1, SCP-2 o SCP-3 descrita anteriormente, donde los dominios SECRET comprenden cualquiera de las secuencias: SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 18 o SEQ ID N° 20.

Otra realización particular de la presente invención hace referencia a la capacidad de unión a GAGs de homólogos del dominio SECRET descrita anteriormente, que tengan al menos un 80% de homología de secuencia de aminoácidos.

Otro objeto preferente de la presente invención hace referencia a un polipéptido de fusión descrito anteriormente, donde el polipéptido de fusión consiste en el dominio SECRET de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, fusionado al dominio N-terminal de unión a TNF de los vTNFRs. Preferentemente, se hace referencia también al polipéptido de fusión descrito anteriormente, donde las proteínas de unión a TNF (TNFR) sean de origen humano.

Otro objeto preferente de la presente invención es una composición farmacéutica descrita anteriormente, para su uso como anti-inflamatorio. Preferentemente, la presente invención también hace referencia a dicha composición farmacéutica descrita anteriormente, donde dicha composición farmacéutica comprende además un inmunosupresor o una sustancia anti-inflamatoria adicional.

Otro objeto preferente de la presente invención es el uso del dominio SECRET y/o un homólogo del dominio SECRET. Otro objeto preferente de la presente invención es una para la obtención de anticuerpos específicos inhibidores de la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET. Preferentemente, la presente invención también hace referencia a dicho uso de los anticuerpos descritos anteriormente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los efectos adversos causados por la vacunación con el virus vaccinia o de la patología causada por el virus de la viruela.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. CrmD se une a GAGs con alta afinidad. A) Cinética mediante SPR de la unión de CrmD a un chip acoplado con 50 RUs de heparina. Se inyectaron distintas concentraciones de CrmD purificado (0300nM) sobre un chip acoplado con 50 RUs de heparina a 30 !JI/min. Los sensorgramas se alinearon y ajustaron a un modelo global de Langmuir 1 :1. Se presentan las constantes de asociación (Ka), disociación (Kd) Y afinidad (KD), junto con los errores estándar (EE). B) Competición de la unión de CrmD a heparina mediante GAGs solubles. Se incubaron concentraciones crecientes de distintos GAG s solubles (0-1.000 !Jg/ml), heparina ( .), CSA (.), CSB ( ... ) y HS (X), con 50nM de CrmD durante 15 min a 4°C, antes de pasar las mezclas sobre el chip de heparina. Se recogió la respuesta máxima en el equilibrio y se representaron los datos en porcentaje en relación a la respuesta detectada en ausencia de GAGs solubles.

FIGURA 2. CrmD se une a heparina y a la superficie celular a través del dominio SECRET. A) Ensayo de unión a heparina mediante SPR. 300 nM de las proteínas purificadas CrmD, CrmD163 y CRD-CrmD, se inyectaron a 10 !JI/min sobre chips de heparina. Se muestran los sensorgramas obtenidos para cada construcción. Las flechas invertidas indican el inicio y el fin de la inyección. B) Ensayo de unión a la superficie de células MOLT4 y L929 mediante citometría. 200 nM de las proteínas purificadas, vCCI de CPXV, E163 de ECTV, B18 de VACV, y CrmD, CrmD163 y CRD-CrmD de ECTV se incubaron con 300.000 células en hielo durante 30 mino Tras sucesivos lavados, se detectó la proteína retenida en la superficie mediante un anticuerpo de ratón anti-His (1 :400) seguido de un secundario apropiado conjugado con Alexa488 (1 :500). Se muestra la señal fluorescente (FL 1 :anti-mouseAlexa488) respecto al total de eventos analizados en porcentaje en muestras incubadas sin (gris) o con (blanco) proteína recombinante.

FIGURA 3. CrmD y CrmD163 se unen a la superficie celular gracias a su interacción con GAGs. Se incubaron 300.000 células CHO-K1 (expresión normal de GAGs), CHO-745 (expresión reducida de GAGs) y CHO-618 (sin GAGs) con 200 nM de las proteínas CrmD, CrmD163 y CRD-CrmD durante 30 min a 4°C. Tras varios lavados, las células fueron incubadas con una dilución 1 :400 del anticuerpo de ratón anti-His para marcar la proteína retenida y se detectó mediante un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa488 (1 :500). Se recogieron 20.000 eventos de cada muestra que fueron analizadas por el programa informático FlowJo. El área bajo la curva indica la fluorescencia respecto al total de eventos analizados, en porcentaje, de células incubadas sin (gris) o con (blanco) proteína recombinante.

FIGURA 4. Los vTNFRs con dominio SECRET son capaces de unirse a la superficie celular. Se realizó un ensayo de unión a la superficie de células L929 de las proteínas purificadas, CrmB_VARV, CrmE_CPXV, CrmD_CPXV, CrmC_CPXV y una construcción CrmC-SECRET. Este ensayo se realizó tanto por citometría de flujo (A) como por inmunofluorescencia (B). A) Se muestra la fluorescencia (60x) , respecto al total de eventos en porcentaje, en muestras incubadas con las distintas proteínas recombinantes indicadas (blanco) o sin proteína (gris). B) Los cubreobjetos sobre los que se sembraron células L929 fueron incubados con 100 nM de cada proteína durante 1 h a 4°C antes de la fijación con 4% PFA durante 30 min a RT. Se utilizaron los mismos anticuerpos que para la citrometría de flujo pero con una dilución 1 :500 del anticuerpo anti-His y

1 :900 para el secundario conjugado con Alexa488. Los cubreobjetos fueron montados y las muestras se analizaron mediante un microscopio Axioskop 2 Plus (Zeiss).

FIGURA 5. CrmD unido a GAGs puede interaccionar e inhibir el mTNFa. A) Ensayo mediante SPR en el que 100 nM de mTNFa se inyectaron a 101J1/min sobre un chip de heparina antes o después de pasar sobre el chip 500 nM de CrmD (azul) o B18 de VACV (verde), sin haber regenerado la superficie. Los triángulos invertidos indican el inicio y el fin de la inyección de proteína recombinante y el comienzo de la inyección de

mTNFa. B) Experimento de precipitación con resina de agarosa-heparina (HepAg). 400 nM de CrmD, CRD-CrmD y B18 de VACV fueron incubados con una resina de heparina durante 1 h. Tras los lavados, las resinas se incubaron con 400nM de mTNFa durante 30 min adicionales y se analizó la presencia de proteína recombinante y mTNFa mediante wesfem blof C) Ensayo de citotoxicidad de mTNFa sobre células L929. Para la unión a células, las proteínas, hTNFR2, CRD-CrmD, CrmC CrmC-SECRET y CrmD (10 !Jg/ml), se incubaron sobre 30.000 células L929 durante 30 minutos a 37°C. Esas mismas condiciones se repitieron para la incubación en solución de las proteínas con el mTNFa. Las mezclas se añadieron posteriormente sobre células L929. Las muestras se analizaron por triplicado y se muestran las medias y las desviaciones estándar de la supervivencia en porcentaje en relación a los valores recogidos en ausencia de mTNFa.

FIGURA 6. Expresión de los mutantes GAG1-4 y ensayos unión a células. A) Gel teñido con azul de Coomasie que muestra -500 ng de cada uno de los mutantes GAG1-4 expresados mediante baculovirus recombinantes y purificados por cromatografía de afinidad Ni-NTA. B) Ensayo de unión a la superficie de células CHO-K1 mediante citometría de flujo. Se incubaron 200 nM de cada uno de los mutantes (GAG1 :rojo, GAG2:morado, GAG3:azul, GAG4:verde) y de CrmD (negro) con 300.000 células. Se recogieron 10.000 eventos mediante un citómetro FACS Cantoll y se analizaron con el programa informático FlowJo. Se muestra la fluorescencia de cada muestra respecto al total de eventos analizados en porcentaje. La curva en gris marca la señal de fluorescencia de células incubadas en ausencia de proteína.

FIGURA 7. Las mutantes GAG1-4 inhiben la migración eficientemente. Experimento de quimiotaxis en transwell con células MOLT4. Se preincubaron cantidades crecientes de los mutantes GAG1-4 y CrmD con 70 nM de mCCL25. Se muestra la migración media, junto con su desviación estándar, de cada una de las muestras analizadas por triplicado, en porcentaje respecto a la migración en ausencia de proteína recombinante. Para normalizar se utilizaron los datos tomados en ausencia de CK.

FIGURA 8. Alineamientos de Secuencias -CLUSTAL W (1.82) "multiple sequence alignment"

FIGURA 9. Alineamientos de Secuencias -CLUSTAL W (1.82) "multiple sequence alignment (CrmB I CrmD)"

FIGURA 10. Alineamientos de Secuencias -CLUSTAL W (1.82) "multiple sequence alignment (CTDs)"

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1:

Materiales y métodos

Líneas celulares

La generación, amplificación y titulación de los stocks de baculovirus recombinantes se realizaron en células de insecto Spodoptera frugiperda Sf9 adherentes mantenidas en cultivo en medio TC100 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS, Sigma), 2 mM de L-glutamina (Sigma) y antibióticos, 100 !-Ig/ml de una mezcla de antibióticos penicilina-estreptomicina (Sigma) y 25 !-Ig/ml de gentamicina (Sigma). La expresión de proteína recombinante se hizo en células de insecto Hi5 en suspensión, mantenidas en medio Express Five (Gibco) con 8 mM de L-glutamina y antibióticos. Ambas líneas celulares se cultivaron a 27°C.

Las líneas celulares, L929 (fibroblastos de ratón) se mantuvieron en cultivo a 37°C, 95% HR Y 5% C02 en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% FCS, 2 mM de L-glutamina y antibióticos. Estas células se utilizaron para los experimentos de citotoxicidad del TNFa.

Las células MOLT4 usadas en los ensayos de quimiotaxis, se crecieron en medio RPMI 1640 (MP Biomedicals) suplementado con 10% FCS, 2 mM de L-glutamina y antibióticos, a 37°C, 95% HR y 5% C02.

Para los ensayos relacionados con el análisis de la unión de las proteínas a superficies celulares, se utilizaron las líneas derivadas de ovario de hámster, CHO-K1 y sus mutantes para la expresión de GAGs en superficie, CHO-618 (mutación en la enzima galactosiltransferasa) y CHO-745 (mutación en la enzima xilosiltransferasa). Estas lineas se crecieron en medio DMEM: F12-HAM (Gibco), 1:1 (v/v) , debidamente suplementado con 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina y antibióticos, a 37°C, 95% HR Y5% C02.

Clonajes

El gen E6 de ECTV Naval que codifica para la proteína CrmD (1-320), se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del vector pMS1 utilizando los oligonucleótidos 5'CrmD34 y 3'CrmD33 incorporando las dianas de BamHI y Xhol en 5' y 3', respectivamente. Así, se subclonó sin su péptido señal (21-320) en el vector pFastBac1, previamente digerido con BamHI y Xhol, de forma que el gen quedó en fase de lectura con el péptido señal de la melitina en 5' y con los tags V5 y 6xHis en 3' para facilitar su purificación por cromatografía de afinidad. El plásmido resultante de la ligación se nombró pSP3. La misma estrategia se siguió para el clonaje en este vector del dominio SECRET de CrmD, CrmD163 (CrmD163-320) utilizando los oligonucleótidos 5'CrmD36 y e13'CrmD33, generándose así el plásmido pSP4.

Igualmente, para el clonaje de la forma corta del dominio N-terminal de CrmD, CRD-CrmD (CrmD21-151), en molde pMS1. Tras la ligación del producto de PCR en el vector digerido con BamHI y Xhol se obtuvo el plásmido pSP6.

Un procedimiento similar se siguió para clonar en el vector pFastBac1 los otros vTNFRs, CrmE de CPXV 5

cepa Elephantpox, CrmC de CPXV cepa Brighton Red y CrmB de VARV cepa Bangladesh 1975. Los genes correspondientes se amplificaron por PCR a partir de construcciones preexistentes en el laboratorio, mediante una pareja de oligonucleótidos (Tabla 1) que añadiesen la diana BamHI en 5'y Xhol en 3'para posteriormente clonarlos en el pFastBac1 de la misma manera que lo anteriormente explicado. Las construcciones resultantes se denominaron pSP8, pSP9 y pSP12, respectivamente.

10 La construcción pSP24, para la expresión mediante baculovirus de una proteína CrmC fusionada al dominio SECRET de CrmD, se generó extrayendo por PCR el gen correspondiente del plásmido pSP22, que contenía esta fusión clonada en el vector pMS30. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos 5'CrmC-Sp BamHI y CrmD33 y pSP22 como molde. Seguidamente, se subclonó el producto de PCR en el vector pFastBac1 en

15 las dianas BamHI y Xhol. Todos los oligonucleótidos utilizados para las construcciones anteriores se listan en la Tabla 1.

Tabla 1. Lista de ollgonucleótldos utilizados para la generación de las distintas construcciones. Se indica el nombre y secuencia (S'a 3') de los distintos oligonucleótidos utilizados. Se señala también la construcción final y la proteína que se expresó con cada plásmido. En la secuencia se subraya los sitios de restricción Xhol (CTCGAG) o BamHI (GGATCC) que se incorporaron para el clonaje.

oligonucleótido secuencia construcción ~roteína CrmD33 GCGCTCGAGGCATCTCTTTCACAATCATTTGG pSP3 CrmD ECTV CrmD34 GCGGGATCCGATGTTCCGTATACACCCATTAATGGG pSP3 CrmD CrmD36 GCGGGATCCTTTAACAGCATAGATGTAGAAATTAATATGTATCC pSP4 CrmD163 CrmD87 GCGCTCGAGGCACATATTACATCTCCTTTAGATG pSP6 CRD-CrmD S'CrmE-SP _BamHI GGCGGATCCATGAAATGTGAACAAGGTGTCTC pSP8 CrmE CPXV 3'CrmE-SP _Xhol GGCCTCGAGGCTCTTGTCATTGGTTTACATTGATCAG pSP8 CrmE CPXV S'CrmC-Sp BamHI CCCGGATCCGATATACCTACTTCGTCACTGCC pSP9 CrmC CPXV 3'CrmC-Sp Xhol GCGCTCGAGGCATTACATTTAGATAGTTTGCATGG pSP9 CrmC CPXV S'CrmB VARV-Sp BamHI GCG GGATCC GCACCGTATACACCACCCAATGG pSP12 CrmB VARV 3'CrmB VARV-Sp Xhol GCGCTCGAGGCTAAAAAGCGGGTGGGTTTGG pSP12 CrmB VARV

20 Los mutantes puntuales de CrmD se realizaron utilizando el kit Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies). Este kit permite realizar mutaciones dirigidas siguiendo un protocolo sencillo. Brevemente, tomando como molde el vector pSP3 (CrmD en pFastBac1) en el que se encuentra clonado el gen diana, se realizó una PCR con dos oligonucleótidos complementarios que contienen la mutación deseada. De esta manera se copió todo el vector incorporando la mutación. A continuación, se

25 digirió con la enzima Dpnl el DNA original que, por encontrarse metilado, es susceptible a la digestión y se transformaron bacterias ultracompetentes XL 1 Gold. Finalmente, se comprobó la incorporación de la mutación por secuenciación del DNA extraído de colonias individuales. En la Tabla 2 se muestra la lista de oligonucleótidos utilizados para la generación de los mutantes puntuales de CrmD para la unión a GAGs.

Tabla 2. Ollgonucleótidos utilizados para la mutagénesis de CrmD. Se indican el nombre de la proteína mutante, la mutación incorporada, el nombre del oligonucleótido y la secuencia (S'a 3') con los residuos que difieren de la secuencia original resaltados en rojo.

protelna mutación oligonucleótldo secuencia

GAG1 K24SA CrmD97 GCAGTGCAAGATTAATCTAGAATCGCATGTAATTCTGGAAGAGAATCTAGA

GAG1 K24SA CrmD98 TCTAGATTCTCTTCCAGAATTACATGCGATTCTAGATTAATCTTGCACTGC

GAG2 R2S0AlR2S3A CrmD99 AGATTAATCTAGAAATCAAATGTAATTCTGGA GCAGAATCT GCACAACTAACACCCACGACGAAG

GAG2 R2S0AlR2S3A CrmD100 CTTCGTCGTGGGTGTTAGTTGTGCAGATTCTGCTCCAGAATTACATTTGATTTCTAGATTAATCT

GAG3 K177A CrmD101 GTAGAAATTAATATGTATCCTGTTAACGCGACCTCTTGTAATTCGAGTATAGGAAG

GAG3 K177A CrmD102 CTTCCTATACTCGAATTACAAGAGGTCGCGTTAACAGGATACATATTAATTTCTAC

GAG4 K218A CrmD103 TCTTTATTGGAGATTACTATTCAGTCGTTGATGCACTAGCAACTTCAGGTTT

GAG4 K218A CrmD104 AAACCTGAAGTTGCTAGTGCATCAACGACTGAATAGTAATCTCCAATAAAGA

Generación de baculovirus recombinanfes

30 Los baculovirus recombinantes se generaron utilizando el sistema de expresión Bac-to-Bac (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, los genes clonados en el vector pFastBac1 se pueden integrar en bácmidos del genoma del baculovirus bajo la actividad del promotor de la polihedrina mediante la transformación de células DH10bac competentes tras un proceso de transposición. El DNA de los bácmidos

35 recombinantes así obtenidos, se purificó y se transfectó con cellfectine (Invitrogen) en células de insecto Sf9 siguiendo las instrucciones del fabricante. Los baculovirus recombinantes se recogieron a las 72 h post-transfección de los sobrenadantes de las células transfectadas. Estos virus se denominaron PO (pase O) y se guardaron a 4°C y en oscuridad. Posteriormente, estos PO se titularon y se amplificaron en un solo paso mediante la infección de células Sf9 a muy baja multiplicidad de infección (moi =0,01-0,05 unidad formadora de placa (ufp)/cel) con el fin de generar un stock de baculovirus recombinante de alto título (superior a 5 x 107 ufp/ml) para la expresión de proteína recombinante.

Expresión y purificación de proteínas recombinantes

Se infectaron células de insecto Hi5 a alta moi (moi =2-5 ufp/cel) con los baculovirus recombinantes correspondientes. A las 72 h postinfección se recogieron los sobrenadantes de la infección (100 mi) y se clarificaron mediante dos centrifugaciones sucesivas durante 5 min a 1.200 rpm y 40 min a 6000 rpm, respectivamente. Posteriormente, se concentraron utilizando el sistema Stirred Ultrafiltration Cell 8200 (Amicon) hasta obtener un volumen final de 2,5 mi empleando membranas YM (Millipore) de un tamaño de diámetro de poro para un peso molecular límite (MWCO) de 10.000 Da. Los sobrenadantes así concentrados, se filtraron con filtros de 0,22 ¡.Jm y se dializaron en "tampón de unión" (50 mM fosfato sódico (pH 7,4), 300 mM NaCI, 10 mM imidazol) empleando columnas de gel filtración PD10 (Amersham Biosciences).

La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad a níquel (resina Níquel-NTA, Qiagen). Para ello, los sobrenadantes concentrados y dializados se incubaron en "tampón de unión" durante 1 h a 4°C con 0,5 mi de resina por cada 100 mi de sobrenadante inicial. A continuación, la resina se montó en columna (Poly-Prep, Bio-Rad) y se lavó con 40 mi de "tampón de lavado" (50 mM fosfato sódico (pH 7,4), 300 mM NaCI, 20 mM imidazol) para eliminar proteínas unidas inespecíficamente. Tras ello, se procedió a eluir la proteína de interés mediante "tampón de elución" con concentracion~s crecientes de imidazol (60, 100 Y 250 mM) en 50 mM fosfato sódico (pH 7,4), 300 mM NaCI. La proteína se recogió en fracciones de 0,5 mi cada una y se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie.

Posteriormente, se juntaron las fracciones con mayor grado de pureza y cantidad de proteína, se concentraron y se dializaron en PBS utilizando micro columnas Vivaspin 500 (Sartorius) con un MWCO de

10.000 Da. Finalmente, la concentración exacta de los stocks de proteína obtenidos se determinó mediante BCA (BCA protein assay kit, Pierce) y densitometría respecto a sendas calibraciones con BSA (Sigma).

Resonancia de los plasmones de superficie

Se generó un chip acoplado con heparina biotinilada (Calbiochem). Se acoplaron 2.000 RUs de estreptavidina (Sigma), diluida en acetato pH 4,0 a 0,2 mg/ml, en un chip CM4 mediante el sistema de inmobilización covalente por aminas en las dos celdas del chip. Se bloquearon los sitios activos de la matriz con etanolamina 1 M pH 8,5 Y seguidamente, se pasaron 5 ¡.Jg/ml de heparina biotinilada diluida en HBS-EP con 300 mM de NaCI por una de las dos celdas. La otra celda, en la que sólo se acopló estreptavidina, se utilizó como control de uniones inespecíficas. De esta manera, se consiguieron capturar 50 RUs de heparina de forma prácticamente irreversible debido a la altísima afinidad de la interacción estreptavidina-biotina (KD-10-14 M).

Para analizar la afinidad por la heparina, se pasaron distintas concentraciones de proteína recombinante purificada en tampón HBS-EP, regenerando posteriormente el chip con inyecciones de 1 min con 2 M MgCI2. Los sensorgramas se normalizaron y ajustaron a un modelo de Langmuir 1:1 para determinar las constantes de afinidad mediante el paquete informático Bioevaluation 3.2.

Se evaluó la especificidad de la interacción CrmD-heparina mediante un ensayo de competición con GAGs solubles, heparina, heparan-sulfato (HS) y condroitin sulfato A (CSA) y B (CSB) (Sigma). Para ello, se preincubó la proteína CrmD (30 nM), diluída en HBS-EP, con cantidades crecientes de los distintos GAGs solubles, en hielo durante 15 mino La mezcla se pasó por el chip de heparina y se recogió la respuesta en el equilibrio para cada muestra. Se analizó el porcentaje del aumento de señal en cada muestra respecto al valor obtenido para la proteína CrmD en ausencia de GAGs solubles.

Citometría de flujo

Se analizó la unión de proteína recombinante a la superficie de las líneas celulares, L929, MOLT4 y mutantes de células CHO para la expresión de GAGs en superficie, CHO-K1, CHO-618 Y CHO-745. Las células CHO-K1 tienen una expresión normal de GAGs en superficie, sin embargo, las células CHO-745 no sintetizan HS ni CS y las CHO-618 carecen absolutamente de cualquier tipo de GAGs en superficie (Zhang y cols., 2006). Se incubaron 300.000 células con 200 nM de proteína en 50 ¡.JI de PBS-staining (PBS suplementado con 1 % FCS Y 1 % BSA) durante 30 min en hielo. Para detectar las proteínas en la superficie, se incubó durante 20 min con una dilución 1 :400 en PBS-staining del anticuerpo de ratón monoclonal anti-PentaHis (Qiagen) seguida del marcaje con un anticuerpo secundario anti-mouse conjugado con Alexa488 (Invitrogen) a 1 :500 en PBS-staining en oscuridad durante 20 mino Se recogieron 10.000 eventos en un citómetro FACSCantoll (BD Bioscience) y se analizaron en el programa informático FlowJo 7.2.2 (Treestar).

Inmunofluorescencia

Se utilizaron células L929 sembradas en confluencia en cubreobjetos previamente lavados con etanol y expuestos a luz UV. Las células se incubaron con 150 ¡JI de 200 nM de la proteína recombinante en PBSstaining durante 30 min a 4°C y después se fijaron con 4% de PFA en PBS a temperatura ambiente (RT). Se lavaron los cubres tres veces y se procedió al bloqueo de los sitios inespecíficos incubando con PBS suplementado con 5% FCS durante 15 min a RT. Para detectar la proteína en superficie se utilizó una dilución 1 :600 en PBS suplementado con 1 % FCS del anticuerpo monoclonal de ratón anti-V5 (Invitrogen) seguido del marcaje con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa488 (Invitrogen) diluido

1 :900 en PBS suplementado con 1 % FCS. Para el montaje, se pasaron los cubres secuencialmente por PBS, agua y etanol y se colocaron sobre los portaobjetos con una gota de medio de montaje Prolong (Invitrogen). Las muestras se observaron y analizaron mediante un microscopio de fluorescencia Axioskop2 plus (Zeiss) acoplado a una cámara Coolsnap FX (Roper Scientific) controlada por el software MetaVue 5.07 (Molecular Devices).

Precipitación con resina de heparina

Las proteínas recombinantes utilizadas para este ensayo se incubaron en presencia o ausencia de TNFa, durante 1 h a RT en agitación rotatoria con 20 ¡JI de una resina de heparina acoplada a agarosa (50%, v/v) en 400 ¡JI de tampón de unión (PBS suplementado con 0,2% FCS). Tras ese tiempo se recuperaron las esferas de agarosa centrifugando 1 min a 13.000 rpm. Se decantaron los sobrenadantes y las esferas se lavaron con tampón de unión tres veces. La proteína unida se eluyó de la resina añadiendo 25 ¡JI de tampón de carga para SDS-PAGE e hirviendo la muestra durante 5 mino Las proteínas se detectaron mediante inmunoelectrotransferencia (Westem blot) con los anticuerpos anti-PentaHis (1 :2.000) (Qiagen) y anti-TNFa

(1: 1.000) (R&D Systems) y los secundarios conjugados con peroxidasa anti-ratón (1 :5.000) (GE Healthcare) y anti-cabra (1 :1.000) (R&D Systems), respectivamente.

Ensayos de citotoxicidad con TNFa

Para valorar la actividad in vitro de las distintas construcciones de CrmD, se llevaron a cabo experimentos de citotoxicidad en células L929, una línea de fibroblastos de ratón, siguiendo un protocolo puesto a punto en el laboratorio (Alejo y cols., 2006). Para ello, se incubó 6 pM de TNFa de ratón en ausencia o presencia de 10ug/ml de proteína recombinante. Tras 1 h de incubación a 37°C en DMEM suplementado con 2% FBS, se añadió la mezcla sobre células L929 sembradas el día anterior en placas M96 a 10.000 células/pocillo. Para acelerar el efecto citotóxico de la citoquina empleada en cada caso, se añadió a las células el inhibidor de la transcripción, actinomicina D (Sigma), a una concentración final de 4 ¡Jg/ml. Para evaluar si efectivamente, las proteínas retenidas en la superficie celular podían inhibir la acción del TNFa, se repitió el experimento incubando previamente las proteínas con las células. Tras 30 minutos de incubación y los procedentes lavados con medio fresco, se añadió el TNFa en las mismas condiciones que lo explicado anteriormente.

Tras 18 h de incubación, se midió la viabilidad celular añadiendo 20 ¡JI por pocillo de Cell Titter AQueous One Solution (Promega) y determinando la absorbancia a 492 nm en un lector de placas Sunrise (Tecan).

Ensayos de quimiotaxis

Con el objetivo de evaluar la capacidad anti-CK de CrmD y otras proteínas recombinantes, se realizaron experimentos de inhibición de la migración inducida por CKs en transwell (Zaballos y cols., 1999).

El día del ensayo se recogieron las células MOLT4 en crecimiento exponencial y, tras lavarlas con PBS, se resuspendieron a 10 x 106 células/mi en RPMI suplementado con 0,1% de FCS. Para estos ensayos se utilizaron placas M96 en transwell (Neuroprobe). En los pocillos inferiores se incubó la CK CCL25 en ausencia o presencia de cantidades crecientes de proteína purificada en RPMI suplementado con 0,1% FCS, a 37°C durante 30 mino Se colocó la membrana sobre la placa y se repartieron 25¡J1 de la suspensión de células en cada uno de los compartimentos superiores. Tras 3-4 h de migración a 37 oC, se lavaron las células restantes de los compartimentos superiores con PBS y se centrifugaron las placas dos min a 1.000 rpm antes de retirar la membrana. Se cuantificó el número de células que atravesaron la membrana hacia los pocillos inferiores donde se encontraba la CK añadiendo 5 ¡JI/pocillo de Cell Titter AQueous One Solution (Promega) y midiendo la absorbancia a 492 nm. Los resultados se representaron como el porcentaje en relación a la migración en ausencia de proteína recombinante. Los datos se normalizaron previamente con la absorbancia en ausencia de CK.

Resultados

Dominios SECRET codificados por poxvirus que interaccionan con GAGs

Los genes y proteínas virales que incluyen un domino SECRET de unión a quimioquinas con la capacidad de CrmD de CPXV: gen V221 (SEO ID No 1) y proteína (SEO ID No 2)

CrmD de ECTV: gen E3 (SEO ID No 3) y proteína (SEO ID No 4)

SCP-1 de ECTV: gen E12 (SEO ID No 5) y proteína (SEO ID No 6)

SCP-1 de CPXV: gen V014 (SEO ID No 7) y proteína (SEO ID No 8)

CrmB de VARV: gen G2R (SEO ID No 9) y proteína (SEO ID No 10)

CrmB de CPXV: gen V005 (SEO ID No 11) y proteína (SEO ID No 12)

SCP-3 de CPXV: gen V218 (SEO ID No 13) y proteína (SEO ID No 14)

SCP-3 de VACV: gen VACWR206 (SEO ID No 15) y proteína (SEO ID No 16)

SCP-2 de VACV: gen VACWR189 (SEO ID No 17) y proteína (SEO ID No 18)

SCP-2 de ECTV: gen E184 (SEO ID No 19) y proteína (SEO ID No 20)

Dominio SECRET de CrmD de CPXV: gen (SEO ID No 21) y proteína (SEO ID No 22)

Dominio SECRET de CrmD de ECTV: gen (SEO ID No 23) y proteína (SEO ID No 24)

Dominio SECRET de CrmB de CPXV: gen (SEO ID No 25) y proteína (SEO ID No 26)

Dominio SECRET de CrmB de VARV: gen (SEO ID No 27) y proteína (SEO ID No 28)

Diferentes alineamientos de secuencia mostrando la homología de aminoácidos se muestran en los

Alineamientos de Secuencias.

CnnD se une a GAGs con alta afinidad

Primeramente, se analizó la posible interacción de CrmD a GAG s mediante estudios de SPR con chips de heparina. Se acoplaron 50 RUs de heparina biotinilada a chips CM4 en los que previamente se habían inmovilizado 2.000 RUs de streptavidina. Seguidamente, se inyectó sobre el chip 300 nM de CrmD recombinante en buffer HBS-EP observándose una respuesta muy significativa e indicativa de una fuerte unión entre CrmD y la heparina. De hecho, se calculó la afinidad de esta interacción CrmD-heparina, inyectando distintas concentraciones de CrmD sobre el chip, obteniendo una constante de afinidad KD= 3,30 nM (Figura 1A) lo que la sitúa en el mismo orden que las interacciones de B18 (Montanuy y cols., 2011) Y E163 (Ruiz-Arguello y cols., 2008) con heparina.

Se estudió también la especificidad de la interacción de CrmD con GAGs realizando experimentos de competición en los que la unión de CrmD al chip de heparina se compitió con concentraciones crecientes de distintos GAGs solubles. La heparina soluble fue la que presentó mejor eficacia a la hora de inhibir la unión de CrmD a la superficie. Sin embargo tanto el HS como el CSA y el CSB, con menor grado de sulfatación, bloquearon también la interacción CrmD-heparina de manera dosis dependiente aunque con peor eficiencia que la heparina. Mientras que con menos de 1IJg/ml de heparina se consiguió inhibir el 50% de la unión de CrmD a la superficie, se necesitaron al menos 10IJg/ml de CSA, CSB o HS para bloquear el 50% de la interacción (Figura 1 B). No se encontraron diferencias significativas entre HS, CSA y CSB. Estos datos sugieren que CrmD es capaz de interaccionar con distintos tipos de GAGs pero presenta una mayor afinidad por la heparina.

CnnD interacciona con GAGs a través del dominio SECRET

Se ha demostrado que CrmD es capaz de interaccionar con GAGs, lo que potencialmente le atribuiría la capacidad de unirse a las superficies celulares o a la matriz extracelular. Con el fin de conocer si esta interacción con GAG s estaba mediada por uno u otro dominio o si por el contrario era una propiedad de la proteína completa, se inyectaron 300 nM de las proteínas recombinantes CRD-CrmD y CrmD163 sobre el chip de heparina. La proteína CrmD163, que contiene el dominio SECRET, fue capaz de interaccionar con heparina, sin embargo, para CRD-CrmD no se detectó unión (Figura 2A).

Las superficies celulares son ricas en GAGs. Para confirmar que la unión a GAGs de CrmD y CrmD163, permitía a estas proteínas retenerse en las superficies celulares, se utilizó un ensayo de citometría de flujo en el que se incubaron 200 nM de las distintas proteínas recombinantes con células L929 y MOL T4. Como se puede ver en la figura 2B, sólo CrmD y CrmD163 quedaron retenidos en la superficie de estas dos líneas celulares, mientras que no se detectó la presencia de CRD-CrmD. Las proteínas E163 y B18 se muestran como controles positivos de la interacción con la superficie y vCCI como control negativo.

Con el fin de confirmar que la interacción de CrmD con la superficie celular estaba mediada por GAGs, se realizó un experimento de citometría de flujo similar al anterior en el que se utilizaron tres líneas celulares con distinto patrón de expresión de GAGs en superficie (Figura 3): i) células CHO-K1 que presentan un 40-70% de HS y un 30-55% de CS , ii) células CHO-745 con una expresión de GAGs reducida y iii) la línea CHO-618 que carece completamente de GAGs. Como se muestra en la Figura 43, mientras que CrmD y CrmD163, pero no CRD-CrmD, se unieron a la superficie de células CHO-K1, ninguna de las proteínas se retuvo en la superficie de células CHO-745 o CHO-618. Estos resultados corroboraron que CrmD es capaz de unirse a los GAGs presentes en las membranas celulares y que lo hace a través del dominio SECRET.

Se llevó a cabo un experimento similar para la unión a células L929 utilizando los cuatro vTNFRs distintos purificados, CrmD_ECTV, CrmB_VARV, CrmC_CPXV y CrmE_CPXV. Como se ve en la Figura 4, sólo Crm8_VARV y CrmD_ECTV se unieron a células CHO-K1 mientras que CrmC_CPXV y CrmE_CPXV, carentes del dominio SECRET, como era de esperar, no quedaron retenidas (Figura 4A). Sin embargo, una construcción generada en baculovirus que expresaba CrmC fusionada al SECRET de CrmD (CrmC-SECRET) sí que interaccionó con la superficie de estas células (Figura 4A). Este mismo resultado se confirmó realizando una inmunofluorescencia de células L929 incubadas con 200 nM de cada vTNFR. Se observó marca fluorescente sólo en aquellas células que fueron incubadas con CrmD_ECTV, Crm8_VARV o CrmC-SECRET (Figura 48). De esta manera, se pudo concluir que los vTNFRs, CrmD y Crm8, se unen a GAGs gracias a su dominio de unión a CKs SECRET.

Mediante la unión a GAGs, CrmD puede interaccionar con TNFa en la superficie celular

Para conocer si el CrmD unido a GAGs es capaz de interaccionar con TNFa se utilizaron dos aproximaciones distintas, un ensayo por SPR y una precipitación con heparina acoplada a una resina de agarosa.

Mediante SPR, se comprobó que el mTNFa fue capaz de interaccionar con CrmD previamente unido a la superficie de heparina. Se inyectaron 300 nM de CrmD sobre el chip de heparina y sin regenerar la superficie se pasaron 100 nM de mTNFa. Se observó un aumento en la señal al inyectar el mTNFa que no se detectó cuando se pasó la citoquina tras la unión de 300 nM de 818 de VACV, una proteína no relevante para la unión de mTNFa pero que sí se une GAGs (Figura 5A). Por tanto, CrmD puede interaccionar simultáneamente con mTNFa y con GAGs.

Estos resultados se confirmaron mediante una precipitación con una resina de agarosa-heparina. Esta resina se incubó durante 1h con 200 nM de 818 de VACV, CRD-CrmD y CrmD. Tras esta incubación y los lavados correspondientes se añadió a la resina 200 nM de mTNFa y se analizaron las muestras mediante westem blot para detectar la presencia de mTNFa y de la proteína recombinante. Como se muestra en la Figura 58, CrmD (linea 4) y 818 de VACV (línea 9), pero no CRD-CrmD (linea 6), se unieron a la resina y además el mTNFa quedó retenido sólo en la resina previamente incubada con CrmD (linea 4) (Figura 58). Con el fin de conocer también si esta interacción de CrmD con mTNFa en superficie, era además efectiva para bloquear los efectos de la citoquina, se realizó un experimento de citotoxicidad con células L929 con una variación. Las proteínas a estudiar, CrmD, CRD-CrmD, CrmC, CrmC-SECRET y hTNFR2 se incubaron previamente sobre las células a 10IJg/ml. Tras una serie de lavados se añadió una cantidad activa de mTNFa (6 pM) Y a las 16 h se comprobó la viabilidad celular. Como control, se repitieron las condiciones de este experimento pero preincubando las proteínas recombinantes con mTNFa y añadiendo la mezcla sobre células L929 después de 1 h. Se observó que, efectivamente, en solución, todas las proteínas inhibieron la muerte celular. Sin embargo, sólo CrmD y la proteína CrmC-SECRET se retuvieron tras los lavados en la superficie de las células pudiendo interaccionar posteriormente con el mTNFa inhibiendo su efecto (Figura 5C). Estos resultados sugieren que la unión de CrmD con GAGs no interfiere con la unión del TNFa y que, de esta manera, CrmD puede inhibir el TNF en la superficie de las células. Además, al añadir el dominio SECRET a CrmC se consiguió una proteína (CrmC-SECRET) capaz de retenerse en la membrana celular y proteger del efecto citotóxico posterior del mTNFa.

Identificación de residuos implicados en la unión a GAGs presentes en el dominio SECRET

Se han definido dos secuencias consenso para la unión a GAGs, -X888XX8X-y -X88X8X-, donde 8 es un residuo básico y X un residuo hidropático (Hileman y cols., 1998). Sin embargo, existe una gran diversidad en los motivos existentes en las proteínas de unión a GAGs. Se pueden encontrar este tipo de motivos en la secuencia de algunas proteínas de unión a GAGs como 818 de VACV (Montanuy y cols., 2011) o E163 de ECTV (Ruiz-Arguello y cols., 2008).

Por su parte, en la secuencia del dominio SECRET no se pueden identificar motivos similares que pudiesen estar mediando la interacción de GAGs. Para conocer las bases moleculares de la interacción de CrmD con GAGs, se construyeron cuatro mutantes puntuales en los que uno o varios residuos básicos se cambiaron por alaninas. Estos cuatro mutantes se denominaron GAG1 (K245A), GAG2 (R250AlR253A), GAG3 (K177A) Y GAG4 (K177A1K218A) Yse expresaron mediante el sistema de baculovirus (Figura 6A).

Con estos mutantes purificados se realizaron experimentos de unión a células con la linea celular CHO-K1. 200 nM de cada mutante y de CrmD como control, se incubaron con células CHO-K1 a 4°C durante 30 mino Como se muestra en la Figura 68, los mutantes GAG3 y GAG4 se unieron a la superficie celular con un grado similar que CrmD, mientras que la retención de la proteína GAG1 se vio claramente afectada y el mutante GAG2 apenas interaccionó con la superficie de las células CHO-K1. Este resultado sugiere que los residuos K245, R250 Y R253, están involucrados en el establecimiento de los contactos con las cargas negativas de los GAGs de superficie.

Se comprobó que los cambios de aminoácidos generados en los mutantes GAG1, GAG2, GAG3 Y GAG4, no afectaban a la actividad anti-CK del dominio SECRET. Para ello, se realizó un experimento de quimiotaxis in vitro en el que se preincubaron concentraciones crecientes de estos mutantes (GAG1-4) con 70 nM de mCCL25. Se comparó la capacidad de inhibir la migración de células MOL T4 en estas condiciones, de cada mutante respecto a la proteína CrmD. Tanto GAG1, GAG2, GAG3 como GAG4 inhibieron la migración inducida por mCCL25 de manera comparable a la proteína CrmD, reduciéndola al 50% o menos cuando se incubaron con 140 nM (relación molar 1 :2) de las proteínas recombinantes con la CK (Figura 7). De esta manera, se demostró que los residuos mutagenizados en los mutantes GAG1-4 no están implicados en la interacción con CKs. Por lo tanto, se ha generado un mutante, GAG2, incapaz de unirse a las superficies celulares pero que no interfiere con la actividad anti-CK de CrmD.

De esta manera, mediante la mutación R250AlR253A (GAG2) se ha generado una versión de CrmD que presenta la misma capacidad de bloquear el TNFa y las CKs en suspensión que la proteína parental, pero que carece de los residuos implicados para la interacción con GAGs y consecuente retención en la superficie celular.

Discusión

Datos previos del laboratorio, aportan al dominio SECRET una gran importancia en la evasión del sistema inmunológico llevada a cabo por CrmD. Siempre en un contexto de infección en el que el TNFa esté inhibido. La eliminación de este dominio anti-CK, da como resultado un ECTV RevCRDs con una atenuación de cinco órdenes de magnitud respecto a ECTV RevCrmD. Dado que ECTV expresa otras proteínas con capacidades anti-CKs (E163, vCCI, SCP2 y SCP3), resulta sorprendente que la eliminación de un dominio que sólo bloquea un pequeño grupo de CKs, tenga un efecto tan drástico sobre la virulencia de ECTV. Por ello, se podría esperar que la adición de este dominio anti-CKs a una proteína con actividad anti-TNFa podría suponer una ventaja sustancial para el virus. La acción del dominio SECRET parece tener que ver con la función anti-TNFa de CrmD pero no se observó una cooperatividad positiva en la unión de los distintos ligandos y ambos dominios son estructural y funcionalmente independientes.

Sin embargo, hemos descubierto que el dominio SECRET es capaz de interaccionar con GAGs de superficie con gran afinidad. Además, gracias a esta nueva función del dominio SECRET, CrmD puede inhibir la acción del TNFa en la membrana celular, próximo a los receptores de la citoquina. Mediante la interacción con GAGs, CrmD no sólo podría conseguir aumentar su estabilidad in vivo, sino que también le permitiría aumentar su concentración en torno a los TNFRs celulares. Al mismo tiempo, su gran afinidad por los GAGs le podrían permitir a CrmD desplazar a las CKs de las superficies impidiendo la formación de los gradientes quimiotácticos, una estrategia utilizada, por ejemplo, por la proteína E163 para interferir con las funciones de las CKs (Ruiz-Arguello y cOls., 2008).

Aunque no existe un motivo de unión a GAGs en la secuencia de aminoácidos de CrmD, hemos definido algunos residuos en la secuencia del dominio SECRET importantes para la unión a GAGs, K245, R250 Y R253.

Desde otro punto de vista, el TNFa es una molécula implicada en algunos desórdenes inflamatorios crónicos tales como la artritis reumatoide o la enfermedad de Crohn. Los nuevos tratamientos clínicos se basan en el uso de fármacos biológicos que consisten en anticuerpos recombinantes (infliximab, adalimumab) o, más recientemente, moléculas menos inmunogénicas, como etanercept que consiste en un dímero del dominio extracelular del TNFR2 fusionada a un fragmento Fc humano. En consonancia a lo observado en la patogénesis de ECTV, es probable que además del TNFa, las CKs jueguen un papel importante en el desarrollo de la enfermedad, por lo tanto, previsiblemente, la adición de un dominio SECRET a etanercept podría potenciar el efecto anti-inflamatorio de esta molécula, gracias al efecto anti-CK. Por otro lado, una de la funciones del fragmento Fc es la de garantizar la estabilidad y el transporte del fármaco, gracias a su interacción con los receptores celulares de Fc, en el organismo. Un dominio SECRET podría remplazar con éxito estas dos funciones de la porción Fc, aportando estabilidad y transporte de la molécula gracias a su interacción con los GAGs en las superficies celulares. Además, de esta forma, se evitarían algunos efectos secundarios debidos a la activación del sistema del complemento producida por el Fc de etanercept (Horiuchi y cols., 2010).

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Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Uso de un dominio SECRET de una proteína seleccionada entre: CrmB, CrmD, SCP-1, SCP-2 y SCP-3, su homólogo funcional, derivado o fragmento, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias, caracterizado por que dicho dominio SECRET es capaz de unirse a GAGs y se setecciona de entre una de tas siguientes secuencias: SEa ID N° 6, SEa ID N° 8, SEa ID N° 14, SEa ID N° 16, SEa ID N° 18, SEa ID N° 20, SEa ID N° 22, SEa ID N° 24, SEa ID N° 26, Y SEa ID N° 28.
2. 2." Uso segun la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio SECRET de CrmB, su homólogo funcional, derivado o fragmento es SEa ID N° 26 o SEa ID N° 28.
3. 3." Uso segun la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio SECRET de CrmO, su homólogo funcional, derivado o fragmento es SEa ID N° 22 o SEa ID N° 24.
4. 4." Uso segun la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio SECRET de SCP-1, SCP-2 y SCP-3, su homólogo funcional, derivado o fragmento !ie selecciona de entre una de las siguientes secuencias: SEa ID N° 6, SEa ID N° 8, SEa ID N° 14, SEa ID N° 16, SEa ID N° 18 Y SEa ID N° 20.
5. 5." Uso segun las reivindicaciones 1-4, caracterizado por que el homólogo funcional del dominio SECRET tiene al menos un 80% de homología de secuencia de aminoácidos.
6. 6." Uso segun las reivindicaciones 1-5, caracterizado por que dicho medicamento incrementa la estabilidad y/o las propiedades inmunomoduladoras de al menos una proteina seleccionada entre: CrmB, CrmO, SCP-1, SCP-2 y SCP-3.
7. 7.-Uso segun las reivindicaciones 1-6, caracterizado por que el dominio SECRET, su homólogo funcional, derivado o fragmento está fusionado al menos a un vTNFR, o a un anticuerpo humanizado anti-TNF.
8. 8.-Uso segun la reivindicación 7, caracterizado por que el dominio SECRET, su homólogo funcional, derivado o fragmento está fusionado al dominio N-terminal de unión a TNF del vTNFR.
9. 9.- Uso segun la reivindicación 7 u 8, caracterizado por que el vTNFR es CrmB o CrrnO.
10. 10.- Uso según las reivindicaciones 7-9, caracteri¡~ado por que el vTNFR es de origen humano.
11. 11.-Uso según las reivindicaciones 1-10, C::lracterizado por que el medicamento comprende un inmunosupresor o una suslancia anti-inflamatoria adicional.
12. 12.-Uso segun las reivindicaciones 1-11, caracterizado por que el medicamento comprende al menos un anticuerpo especifico inhibidor de la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET.